【手続補正書】
【提出日】平成19年1月26日(2007.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【実施例】
実施例１．キサントモナス産生リシルエンドペプチダーゼ（X-LEP）のクローニング
（１）ゲノムDNAの抽出
キサントモナス属IB-9374を0.5％ミルクカゼイン、１％スクロース、１％肉エキス、0.01％リン酸-カリウム、0.01％リン酸二カリウム及び0.01％硫酸マグネシウム（pH7.2）から構成される培地（100ml）に植菌し、30℃で16時間、振とう培養した後、培地から取り出した菌体を遠心分離し、集菌した。取得した菌体に、50mM EDTAを含む50mMトリス-塩酸緩衝液（pH8.0）10mlを添加し、均一に懸濁した。その懸濁液に、10mg/mlリゾチームを含む250mM トリス-塩酸緩衝液（pH8.0）1mlを添加し、時々混合しながら氷上に45分間おいた後、さらに、0.5％SDS、0.4M EDTA及び１mg/mlプロテイナーゼKを含有する50mM トリス-塩酸緩衝液（pH8.0）（STEP緩衝液）2mlを添加し、50℃で16時間インキュベートした。この操作で完全に溶菌した溶液に1mM EDTAを含む10mM トリス-塩酸緩衝液（pH8.0）（TE緩衝液）11mlを添加し、穏やかに混合した。次いで、該溶液に24mlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)（PCI）を添加し、穏やかに混合した後、遠心分離により該溶液から変成タンパク質を除去した。この除去操作を変成タンパク質が溶液中から完全になくなるまで繰り返した後、上清にクロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）を等量混合し溶媒層と水溶液層の2層に分離させた。2層に分離させることにより水溶液層からPCIを完全に除去し、その水溶液層を分液し、DNA溶液を得た。更に、当該DNA溶液に該溶液の2.5倍量のエタノールを重層し、ガラス棒を用いて界面をゆっくりとかき回し、糸状に析出したDNAをガラス棒で巻き取った。巻き取ったDNAを70％エタノールでリンスし、風乾した後、5mlのTE緩衝液に溶解した。これらの操作により、キサントモナス属IB-9374のゲノムDNA6.5mgを取得した。
（２）ゲノムDNAのBamHI処理
（１）で得られたゲノムDNA 25μgに10ユニットのBamHI（ニッポンジーン社製）を添加し、37℃で3分間インキュベートした。次いで、BamHIで部分消化したゲノムDNA溶液をPCI処理、クロロホルム処理し、エタノール沈殿を行った後、得られた沈殿物を20μlのTE緩衝液に溶解し、BamHI部分消化ゲノムDNA溶液とした。
（３）コスミドベクターLorist６のBamHI処理及びBamHI部分消化ゲノムDNA断片との結合
コスミドベクターLorist６（ニッポンジーン社製）をBamHIで消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化を行った。得られたコスミドベクターLorist６ 60ng及び（２）で取得したBamHI部分消化ゲノムDNA溶液９μl（11μg-DNA）を混合した後、DNA ライゲーションキットVer.2（宝酒造（株）製）のライゲーションＩ液を等量添加し、16℃で16時間ライゲーションした。その後、当該溶液をエタノール沈殿処理した後、得られた沈殿物を20μlのTE緩衝液に溶解し、DNA溶液とした。
（４）バクテリオファージλへのin vitroパッケージング
本操作は、Packagene Lambda DNA パッケージングシステム（プロメガ社製）を用いて、以下のように行った。即ち、50μlのPackagene Extractを氷上で融解した後、（3）で取得したDNA溶液5μl（３μg-DNA）を添加し、22℃で3時間インキュベートした。その後、本溶液に445μlのファージバッファーと25μlのクロロホルムを添加し、穏やかに混合してパッケージング溶液を調製し、その溶液を4℃で保存した。
（５）ゲノムDNAのE.coliDH5αMCRへの感染
E.coliDH5αMCRを、0.2％マルトース及び10mM硫酸マグネシウムを含むLeuria-Bertani培地（以下、LB培地と略記する）20mlで37℃で16時間浸透培養した。その後、滅菌したコルベンに該培養液10mlを移し、そこに（4）で調製したパッケージング溶液0.2mlを添加した。次いで、37℃で30分静置した後、予め37℃に温めておいた25mlのLB培地を添加し、1時間振とう培養した。さらに、該培養液を室温、500gで15分間遠心した後、沈殿した菌体を1.2mlのLB培地に懸濁して、菌体溶液とした。
（６）ネオマイシン耐性形質転換体の選択
25μg/mlネオマイシンを含むLB寒天培地に（5）で取得した菌体溶液を50μlずつ撒き、37℃で16時間培養した。次いで、当該LB寒天培地プレートに15％グリセロールを含むLB培地を1ml添加し、形質転換体をかき集めた後、滅菌した1.5ml容のプラスチックチューブにこの菌体溶液を移し、-80℃で保存した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
（７）特異的プローブの作成
電気泳動的に均一に生成したX-LEPのN末端のアミノ酸配列を42残基解析した結果、その配列はアクロモバクターリティカスM497-1が産生するアクロモバクタープロテアーゼI（API）のN末端のアミノ酸配列と完全に一致した。そこで、X-LEPのアミノ酸配列はAPIのアミノ酸配列とほぼ同じと仮定し、APIの6残基から13残基までの配列である6-CNIDVVCP-13から予想したプライマーF＊１及び177残基から184残基までの配列である177-HLNVQWWP-184から予想したプライマーR＊２をそれぞれ合成した。4μMプライマーF、4μMプライマーR、0.5μgの（1）で調製したキサントモナスのゲノムDNA、5μlの10×PCRバッファー（組成：500mM塩化カリウム、15mM塩化マグネシウム、0.01%(wt/vol)ゼラチン含有100mMトリス-塩酸緩衝液(pH8.3)）、0.2mM dNTPミックス及び1.25Uのアンプライタックゴールド（ABI社製）を含む全容50μlの反応液を、以下のプログラム＊３を用いてPCRを行った。先ず、増幅された500bpの断片をアガロースゲルから切り出し、DNAライゲーションキットVer.2（宝酒造社製）を用いてpGEM T-vector（プロメガ社製）にライゲーションし、E.coli JM109に形質転換した。次いで、形質転換体からプラスミドを生成し、挿入断片の塩基配列を決定した。その結果、500bpの断片の塩基配列から予想されるアミノ酸配列はX-LEPのN末端のそれと完全に一致した。そこで、本断片を熱変成させ、1本鎖化した後、AlkPhosダイレクトシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてDNAをアルカリホスファターゼでラベル化し、特異的プローブとした。尚、塩基配列決定の際にはサンガー法を用いたABI プリズムサイクルシークエンシングキット（ABI社製）を使用した。
＊１  プライマーＦ（23-mer）：
TG(T/C)AA(T/C)AT(T/C/A)GA(T/C)GT(T/C/A/G)GT(T/C/A/G)TG(T/C)CC
＊２  プライマーＲ（23-mer）：
GG(T/C)TGCCA(T/C)TG(T/C/A/G)AC(A/G)TT(T/C/A/G)A(A/G)(A/G)TG
＊３  PCRプログラム
ステップ１  94℃  ９分  １サイクル
ステップ２  94℃  ９分  40サイクル
45℃  １分
72℃  １分
ステップ３  94℃  ９分  １サイクル
45℃  １分
72℃  ５分
（８）コロニーハイブリダイゼーション
（６）で取得した形質転換体を氷上で融解し、滅菌した生理食塩水で希釈した後、25μg/mlのネオマイシンを含むLB寒天培地に撒き、37℃で16時間培養した。次いで、600個のシングルコロニーを当該LB寒天培地に釣菌し、コロニーハイブリダイゼーション用のプレートを作成した。さらに、ハイボンド-N+ナイロンメンブランフィルター（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を該プレートにかぶせ、菌体をフィルターに移した後、該フィルターを0.5M NaOH及び1.5M NaClからなる変成溶液をしみこませた濾紙状に7分間おき、菌体を溶菌させた。その後、1.5M NaCl、1mM EDTA及び0.5Mトリス-塩酸緩衝液（pH7.2）から成る中和溶液をしみこませた濾紙状にフィルターを3分間おき、フィルターを中和した。この中和操作を更に繰り返し行い、フィルターを完全に中和した。そして、2X SSPEでフィルターを洗浄し、濾紙上で風乾した後、0.4M NaOH溶液をしみこませた濾紙上にフィルターを20分間おき、DNAを1本化させると共にフィルターへの固定を行った。さらに、5X SSPEで1分間フィルターを洗浄した後、5X SSPEをしみこませたペーパータオルを用いて菌体のかすを除去した。さらにまた、80℃で10分間乾燥し、コロニーハイブリダイゼーション用のフィルターとした。尚、コロニーハイブリダイゼーションのプローブには、（７）で作成した特異的プローブを使用し、コロニーハイブリダイゼーション用緩衝液はAlkPhosダイレクトシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に付属した緩衝液を使用した。最後に、60℃で軽く振とうしながらハイブリダイゼーションを16時間行った後、予め60℃に保温しておいた、2M尿素、0.1％（wt/vol）SDS、150mM NaCl、10mM塩化マグネシウム及び0.2％（wt/vol）ブロッキングリエージェント（キット付属）を含有する50mMリン酸-ナトリウム緩衝液（pH7.0）（プライマリーウォッシュバッファー）で、フィルターを60℃で10分間洗浄した。その後、プライマリーウォッシュバッファーで、更に2回洗浄した後、100mM NaCl及び100mM 2塩化マグネシウムを含有する50mMトリス-塩酸緩衝液（pH10.0）（セカンダリーウォッシュバッファー）でもう一度洗浄した後、フィルターを100mM NaCl及び50mM塩化マグネシウムを含有する100mM トリス-塩酸緩衝液（pH9.5）（カラーディテクションバッファー）に浸け、ニトロブルーテトラゾリウム溶液(NBT溶液)及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸溶液(BCIP)（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を添加した。さらに、30℃で暗所にてインキュベートし、青いシグナルが観察された後純水でフィルターを洗浄し、反応を終了した。これにより、2つの陽性クローン、XP4/4及びXP4/77が得られた。その結果を図1に示す。
（９）陽性クローンの選抜及びサブクローニング
本形質転換体からアルカリミニプレップ法でコスミドベクター、pXP4-4及びpXP4-77を取得し、BamHIで消化したところ、両ベクターとも13-、12-、7-，6-及び1.6kbのBamHI断片を有していることが判った。そこで、pXP4-4をBamHIで消化し、アガロースゲルから各断片を精製した後、それら断片を鋳型として（7）で使用したプライマーＦ及びプライマーＲを用いて、（7）と同じ条件でPCRを行った。その結果、12-kb BamHI断片のみが500bpの増幅が確認されたため、12-kb BamHI断片にX-LEP遺伝子がコードされていることが判明した。そこで、本断片を制限酵素で消化した後、pUC118にサブクローニングし、これらをABI プリズムサイクルシークエンシングキット（ABI社製）とDNAシークエンシンサー373A（ABI社製）でシークエンスし、X-LEP遺伝子の塩基配列を決定した。  
このようにして得られたX-LEP遺伝子を含むゲノムDNAをDNAシークエンサーで分析して得られた結果を配列番号１に、得られた塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号2に示す。また、参考のために、アクロモバクタープロテアーゼIの塩基配列を配列番号３に、この塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号4に、また、リゾバクター産生リシルエンドペプチダーゼの塩基配列を配列番号５に、この塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号６に夫々示す。
また、配列番号１、３、５についての比較を図２に、アミノ酸配列２、４、６についての比較を図３に夫々示す。X-LEPとAPIの各領域の配列を比較すると、prepro-peptide領域及びmature-enzyme領域では遺伝子レベルで６および７塩基の置換がそれぞれ観察されるが、アミノ酸レベルでは完全に一致していた。しかしながら、Ｃ-terminal extended peptide領域のＣ末端側には２塩基の欠失があるためフレームがシフトしており、その結果、９アミノ酸の置換と１８アミノ酸の延長が起こっていた。これらの置換と延長が本菌株の高生産性に関与している可能性があると考えられる。