【手続補正書】
【提出日】平成31年1月10日(2019.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断型プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）を生じる遺伝子編集されたＰＲＬＲアレルを含む、家畜動物であって、編集されたＰＲＬＲは、編集されたアレル合成の中断から下流に挿入されたヌクレアーゼ制限部位をさらに含むものである、家畜動物。
【請求項２】
前記ＰＲＬＲがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定されるタンパク質の残基４３３のチロシンの後で切断される、請求項１に記載の家畜動物。
【請求項３】
前記ＰＲＬＲがＡＡ４６１のアラニン残基の後で切断される、請求項１または２に記載の家畜動物。
【請求項４】
前記ＰＲＬＲが４９６のプロリン残基の後で切断される、請求項１または２に記載の家畜動物。
【請求項５】
前記ＰＲＬＲが４６４のアラニン残基の後で切断される、請求項１または２に記載の家畜動物。
【請求項６】
前記動物が暑さのストレスを受けにくい、請求項１〜５のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項７】
前記動物が偶蹄目である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項８】
前記遺伝子編集が非減数分裂性の遺伝子移入により行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項９】
前記遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術によって行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１０】
前記遺伝子編集がヘテロ接合性またはホモ接合性である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１１】
前記ＰＲＬＲ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）によって同定されるｍＲＮＡの残基１３８３の後で編集される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１２】
前記ＰＲＬＲ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定されるペプチドの残基Ｙ４３３とＹ５１２との間で切断されるように編集される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１３】
前記編集が前記遺伝子のタンパク質合成の中断を生じる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１４】
前記動物がＳＬＩＣＫ表現型を発現する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１５】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）を有するｍＲＮＡによって同定される残基１３８３の後のＰＲＬＲ遺伝子の編集を含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように遺伝子改変された家畜動物。
【請求項１６】
前記編集が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術を用いた非減数分裂性の遺伝子移入によって行われる、請求項１５に記載の家畜動物。
【請求項１７】
前記遺伝子編集がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定される４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、請求項１５または１６に記載の家畜動物。
【請求項１８】
前記編集が体細胞に対して行われ、前記動物が体細胞から除核卵への核移植によってクローン化される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１９】
前記編集が、遺伝子リーディングフレームの欠失、挿入または突然変異を提供することによってタンパク質合成を中断する突然変異を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２０】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定されるアミノ酸残基４３３の後のプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）タンパク質の合成を中断するように編集された前記プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現すること、および遺伝子合成の中断の下流にヌクレアーゼ制限部位を挿入すること、を含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する家畜動物の遺伝子編集方法。
【請求項２１】
前記編集が、ＴＡＬＥＮペア、およびフレームシフト突然変異または終止コドンを導入するように設計された前記ＰＲＬＲの一部に相同的な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレート、を提供することによって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記改変がガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術によって行われる、請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）によって同定されるｍＲＮＡのヌクレオチド１３８３の後に、前記合成の中断が導入される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子編集が体細胞に対して行われ、前記体細胞の核が同一種の除核卵へ移植される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように変換されたＰＲＬＲアレルを含む、遺伝子編集された家畜動物。
【請求項２６】
ＨＤＲテンプレートが使用されない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子編集が、非相同末端結合によって生じる、請求項２６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本明細書は、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する、正確に交配され、遺伝子編集された家畜動物およびそれを提供する方法を開示する。本明細書において開示される動物は、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子の切断型アレルを発現する。発現すると、家畜動物は、タンパク質の末端１４８アミノ酸（ａａ）残基まで欠損しているＰＲＬＲを産生する。一部の実施形態において、動物は、１４７または１４６ａａが切断されたタンパク質を発現する。一部の場合において、動物は、末端１２１ａａを欠損している。一部の実施形態において、家畜動物は、末端６９ａａを欠損しているＰＲＬＲを発現し、ＳＬＩＣＫ表現型を示す。当業者は、明示範囲内の全ての範囲および値、例えば１４８〜６９、が企図されることを直ちに認識するだろう。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）を有すると同定されたｍＲＮＡから翻訳された、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）を有するタンパク質の位置４３３の最後のアミノ酸であるチロシンとして発現する、任意のＰＲＬＲである。ＳＬＩＣＫを発現する動物は、非ＳＬＩＣＫ動物と比較して優れた体温調節能力を有し、夏季の乳量にあまり劇的な低下を受けない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
種々の例示的な実施形態において、本開示は、改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現するように遺伝子改変された家畜動物を提供し、その結果、切断型ＰＲＬＲが生じる。一部の実施形態において、ＰＲＬＲは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定される残基である残基４３３のチロシンの後で切断される。種々の実施形態において、ＰＲＬＲは、ＡＡ４６１、４９６または４６４の残基の後で切断される。これらの例示的な実施形態において、家畜動物は暑さのストレスを受けにくい。種々の例示的な実施形態において、動物は偶蹄目である。一部の例示的な実施形態において、偶蹄目はウシである。種々の例示的な実施形態において、精密遺伝子編集によって行われる遺伝子改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術を用いた非減数分裂性の遺伝子移入の遺伝子編集によって行われる。一部の例示的な実施形態において、遺伝子改変はヘテロ接合性である。他の例示的な実施形態において、遺伝子改変はホモ接合性である。一部の例示的な実施形態において、ＰＲＬＲ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）によって同定されるｍＲＮＡの残基１３８３の後で改変される。種々の例示的な実施形態において、改変は、遺伝子のタンパク質合成の中断を生じる。これらの例示的な実施形態において、動物はＳＬＩＣＫ表現型を発現する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
さらに他の例示的な実施形態において、本開示は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）を有するｍＲＮＡによって同定される残基１３８３の後のＰＲＬＲ遺伝子の改変を含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように遺伝子改変された家畜動物を提供する。種々の実施形態において、改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術を用いた非減数分裂性の遺伝子移入の遺伝子編集によって行われる。一部の例示的な実施形態において、遺伝子改変はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定される４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる。これらの例示的な実施形態において、遺伝子改変は、４３３アミノ酸、４６１アミノ酸、４６４アミノ酸、４９６アミノ酸、５１１アミノ酸、または４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を終止する残基、を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる。種々の例示的な実施形態において、改変は体細胞に対して行われ、上記動物は体細胞から除核卵への核移植によってクローン化される。一部の例示的な実施形態において、改変は、遺伝子リーディングフレームの欠失、挿入または突然変異を提供することによってタンパク質合成を中断する突然変異を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
さらに他の例示的な実施形態において、本開示は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術、およびフレームシフト突然変異または終止コドンを導入するように設計されたＰＲＬＲの一部に相同的な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレートを含む、精密遺伝子編集技術を使用することにより、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定されるアミノ酸残基４３３の後のプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）タンパク質の合成を破壊するように改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現することを含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する家畜動物の遺伝子改変方法を提供する。これらの例示的な実施形態において、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）によって同定されるｍＲＮＡのヌクレオチド１３８３の後に、合成の中断が導入される。一部の実施形態において、本開示は、遺伝子改変に近接したヌクレアーゼ制限部位を導入することをさらに含む。種々の実施形態において、ヌクレアーゼ制限部位は遺伝子改変の下流にある。他の実施形態において、ヌクレアーゼ制限部位の導入は、同一のＨＤＲテンプレートによって指向される。種々の例示的な実施形態において、遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入は、異なるＨＤＲテンプレートによって指向される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
ＳＬＩＣＫ表現型を発現する、精密編集された家畜動物およびそれを提供する方法が本明細書において開示される。本明細書において開示される動物は、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子の切断型アレルを発現する。発現すると、家畜動物は、タンパク質の末端１４８アミノ酸（ａａ）残基まで欠損しているＰＲＬＲを産生する。一部の実施形態において、動物は、１４７または１４６ａａが切断されたタンパク質を発現する。一部の場合において、動物は、末端１２１ａａを欠損している。一部の実施形態において、家畜動物は、末端６９ａａを欠損しているＰＲＬＲを発現し、ＳＬＩＣＫ表現型を示す。当業者は、明示範囲内の全ての範囲および値、例えば１４８〜６９、が企図されることを直ちに認識するだろう。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）を有するｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の位置４３３における、最後のアミノ酸であるチロシンとして発現する任意のＰＲＬＲは、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する。ただし、チロシン５１２の後の切断がＳＬＩＣＫ表現型を発現しない可能性がある。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
他の牛の品種もＳＬＩＣＫ表現型を発現し、最近、研究者らは切断型ＰＲＬＲペプチドを生じるＰＲＬＲ遺伝子の２つの他のアイソフォームを単離した。ＳＬＩＣＫ２（本明細書において造られた語として）は、カロラ／リモネロ牛によって発現され、４９６ＡＡのペプチドを生じる未成熟終止コドンを生じる単一塩基変異である。ＳＬＩＣＫ３はリモネロ牛によって発現され、４６４ＡＡで切断されたタンパク質を生じる単一塩基変異である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）によって同定されたＰＲＬＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す、図１および図２Ａを参照。残基９４０に示されるのは、エクソン１０の開始であり、チロシン４３３のコード部位は１３８１〜１３８３の残基「ｔａｃ」でコードされている。ＳＬＩＣＫ１を導く突然変異は１４６６の「ｃ」の欠失であり；ＳＬＩＣＫ３は１４７８の「ｃ」であり、ＳＬＩＣＫ２を生じる突然変異は１５７３の「ｃ」の突然変異である。ペプチド中のアミノ酸およびそれらの位置を図２Ｂに示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
最大１４８個の末端アミノ酸を欠いたＰＲＬＲペプチドを生じる、挿入、欠失、未成熟終止コドンまたは他の改変をコードする突然変異に起因する、ＰＲＬＲペプチド合成の中断を有するＰＲＬＲ遺伝子を発現するように、遺伝的に改変されることにより、特にＳＬＩＣＫ表現型を発現する、所与の家畜動物、一実施形態においては偶蹄目およびウシを開示する。種々の例示的な実施形態において、ＰＲＬＲ遺伝子の改変は、右側および左側の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）構築物および適切な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレートを用いたＰＲＬＲ遺伝子の非減数分裂性の遺伝子移入によって達成され、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）を有するペプチド配列中で同定される位置４３３のチロシン残基の後のペプチドのある点において、ＰＲＬＲにおけるタンパク質合成の中断をもたらす突然変異を導入する。一部の実施形態において、タンパク質合成の中断は、ペプチドの５１２におけるチロシン残基の前である。非減数分裂性の遺伝子移入の使用は、当技術分野で公知であり、米国特許出願公開第２０１２／０２２２１４３号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１１７８７０号明細書および米国特許出願公開第２０１５／００６７８９８号明細書に記載され、全ての目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
１〜７３まで連続して列挙される以下の段落は、本発明の種々のさらなる態様を提供する。最初のパラグラフ１における一実施形態では：
１  本開示は、切断型ＰＲＬＲを生じるプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現するように遺伝子改変された家畜動物を提供する。
２．ＰＲＬＲがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定される残基である残基４３３のチロシンの後で切断される、パラグラフ１の家畜動物。
３．ＰＲＬＲがＡＡ４６１の残基の後で切断される、パラグラフ１および２の家畜動物。
４．ＰＲＬＲがＡＡ４９６の残基の後で切断される、パラグラフ１〜３の家畜動物。
５．ＰＲＬＲがＡＡ４６４の残基の後で切断される、パラグラフ１〜４の家畜動物。
６．動物が暑さのストレスを受けにくい、パラグラフ１〜５の家畜動物。
７．動物が偶蹄目である、パラグラフ１〜６の家畜動物。
８．偶蹄目がウシである、パラグラフ１〜７の家畜動物。
９．遺伝子改変が非減数分裂性の遺伝子移入により行われる、パラグラフ１〜８の家畜動物。
１０．遺伝子改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術によって行われる、パラグラフ１〜９の家畜動物。
１１．遺伝子改変がヘテロ接合性である、パラグラフ１〜１０の家畜動物。
１２．遺伝子改変がホモ接合性である、パラグラフ１〜１１の家畜動物。
１３．ＰＲＬＲ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）によって同定されるｍＲＮＡの残基１３８３の後で改変される、パラグラフ１〜１２の家畜動物。
１４．改変が遺伝子のタンパク質合成の中断を生じる、パラグラフ１〜１３の家畜動物。
１５．動物がＳＬＩＣＫ表現型を発現する、パラグラフ１〜１４の家畜動物。
１６．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）を有するｍＲＮＡによって同定される残基１３８３の後のＰＲＬＲ遺伝子の改変を含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように遺伝子改変された家畜動物。
１７．改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術によって行われる非減数分裂性の遺伝子移入である、パラグラフ１６の家畜動物。
１８．遺伝子改変がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定される４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ１６および１７の家畜動物。
１９．遺伝子改変が４３３アミノ酸を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、パラグラフ１６〜１８の家畜動物。
２０．遺伝子改変が４６１アミノ酸を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、パラグラフ１６〜１９の家畜動物。
２１．遺伝子改変が４６４アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ１６〜２０の家畜動物。
２２．遺伝子改変が４９６アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ１６〜２１の家畜動物。
２３．遺伝子改変が５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ１６〜２２の家畜動物。
２４．改変が体細胞に対して行われ、動物が体細胞から除核卵への核移植によってクローン化される、パラグラフ１６〜２３の家畜動物。
２５．改変が、遺伝子リーディングフレームの欠失、挿入または突然変異を提供することによってタンパク質合成を中断する突然変異を含む、パラグラフ１６〜２４の家畜動物。
２６．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定されるアミノ酸残基４３３の後のプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）タンパク質の合成を中断するように改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現することを含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現する家畜動物の遺伝子改変方法。
２７．改変が、ＴＡＬＥＮペア、およびフレームシフト突然変異または終止コドンを導入するように設計されたＰＲＬＲの一部に相同的な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレート、を提供することによって行われる、パラグラフ２６の方法。
２８．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）によって同定されるｍＲＮＡのヌクレオチド１３８３の後に、合成の中断が導入される、パラグラフ２６および２７の方法。
２９．改変がガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術によって行われる、パラグラフ２６〜２８の方法。
３０．遺伝子改変に近接したヌクレアーゼ制限部位を導入することをさらに含む、パラグラフ２６〜２９の方法。
３１．ヌクレアーゼ制限部位が遺伝子改変の下流にある、パラグラフ２６〜３０の方法。
３２．遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入が、同一のＨＤＲテンプレートによって指向される、パラグラフ２６〜３１の方法。
３３．遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入が、異なるＨＤＲテンプレートによって指向される、パラグラフ２６〜３２の方法。
３４．遺伝子改変が体細胞に対して行われ、体細胞の核が同一種の除核卵へ移植される、パラグラフ２６〜３３の方法。
３５．再核化卵が代理母へ移植される、パラグラフ２６〜３４の方法。
３６．ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように変換されたＰＲＬＲアレルを含む、前記のいずれかのパラグラフによる遺伝子改変された家畜動物。
３７．切断型ＰＲＬＲを生じる遺伝子改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）アレルを含む、家畜動物細胞。
３８．ＰＲＬＲがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定されるタンパク質の残基４３３のチロシンの後で切断される、パラグラフ３７の家畜動物細胞。
３９．ＰＲＬＲがＡＡ４６１のアラニン残基の後で切断される、パラグラフ３７または３８のいずれかの家畜動物細胞。
４０．ＰＲＬＲが４９６のプロリン残基の後で切断される、パラグラフ３７〜３９のいずれかの家畜動物細胞。
４１．ＰＲＬＲが４６４のアラニン残基の後で切断される、パラグラフ３７〜４０のいずれかの家畜動物細胞。
４２．動物が暑さのストレスを受けにくい、パラグラフ３７〜４１のいずれかの家畜動物細胞。
４３．動物が偶蹄目である、パラグラフ３７〜４２のいずれかの家畜動物細胞。
４４．偶蹄目がウシである、パラグラフ３７〜４３のいずれかの家畜動物細胞。
４５．遺伝子改変が非減数分裂性の遺伝子移入により行われる、パラグラフ３７〜４４のいずれかの家畜動物細胞。
４６．遺伝子改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術によって行われる、パラグラフ３７〜４５のいずれかの家畜動物細胞。
４７．遺伝子改変がヘテロ接合性である、パラグラフ３７〜４６のいずれかの家畜動物細胞。
４８．遺伝子改変がホモ接合性である、パラグラフ３７〜４７のいずれかの家畜動物細胞。
４９．ＰＲＬＲ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）によって同定されるｍＲＮＡの残基１３８３の後で改変される、パラグラフ３７〜４８のいずれかの家畜動物細胞。
５０．ＰＲＬＲがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定されるペプチドの残基Ｙ４３３とＹ５１２との間で切断されるように改変される、パラグラフ３７〜４９のいずれかの家畜動物細胞。
５１．改変が遺伝子のタンパク質合成の中断を生じる、パラグラフ３７〜５０のいずれかの家畜動物細胞。
５２．動物がＳＬＩＣＫ表現型を発現する、パラグラフ３７〜５１のいずれかの家畜動物細胞。
５３．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）を有するｍＲＮＡによって同定される残基１３８３の後のＰＲＬＲ遺伝子の改変を含む、ＳＬＩＣＫ表現型を発現するように遺伝子改変された家畜動物細胞。
５４．改変が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術を用いた非減数分裂性の遺伝子移入によって行われる、パラグラフ５３の家畜動物細胞。
５５．遺伝子改変がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定される４３３アミノ酸〜５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ５３または５４のいずれかの家畜動物細胞。
５６．遺伝子改変が４３３アミノ酸以上を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、パラグラフ５３〜５５のいずれかの家畜動物細胞。
５７．遺伝子改変が４６１アミノ酸を有するＰＲＬＲタンパク質を生じる、パラグラフ５３〜５６のいずれかの家畜動物細胞。
５８．遺伝子改変が４６４アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ５３〜５７のいずれかの家畜動物細胞。
５９．遺伝子改変が４９６アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ５３〜５８のいずれかの家畜動物細胞。
６０．遺伝子改変が５１１アミノ酸を有するＰＲＬＲを生じる、パラグラフ５３〜５９のいずれかの家畜動物細胞。
６１．改変が体細胞に対して行われ、動物が体細胞から除核卵への核移植によってクローン化される、パラグラフ５３〜６０のいずれかの家畜動物細胞。
６２．改変が、遺伝子リーディングフレームの欠失、挿入または突然変異を提供することによってタンパク質合成を中断する突然変異を含む、パラグラフ５３〜６１のいずれかの家畜動物細胞。
６３．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５１４１７（配列番号６４）によって同定されるアミノ酸残基４３３の後のプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）タンパク質の合成を中断するように改変されたプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）遺伝子を発現することを含む、ＳＬＩＣＫ遺伝子型を有する家畜動物細胞の遺伝子改変方法。
６４．改変が、ＴＡＬＥＮペア、およびフレームシフト突然変異または終止コドンを導入するように設計されたＰＲＬＲの一部に相同的な相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレート、を提供することによって行われる、パラグラフ６３の方法。
６５．改変がガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ技術によって行われる、パラグラフ６３または６４のいずれかの方法。
６６．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３９７２６（配列番号６５）によって同定されるｍＲＮＡのヌクレオチド１３８３の後に、合成の中断が導入される、パラグラフ６３〜６５のいずれかの方法。
６７．遺伝子改変に近接したヌクレアーゼ制限部位を導入することをさらに含む、パラグラフ６３〜６６のいずれかの方法。
６８．ヌクレアーゼ制限部位が遺伝子改変の下流にある、パラグラフ６３〜６７のいずれかの方法。
６９．遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入が、同一のＨＤＲテンプレートによって指向される、パラグラフ６３〜６８のいずれかの方法。
７０．遺伝子改変およびヌクレアーゼ制限部位の導入が、異なるＨＤＲテンプレートによって指向される、パラグラフ６３〜６９のいずれかの方法。
７１．遺伝子改変が体細胞に対して行われ、体細胞の核が同一種の除核卵へ移植される、パラグラフ６３〜７０のいずれかの方法。
７２．除核卵が再核化され代理母へ移植される、パラグラフ６３〜７１のいずれかの方法。
７３．ＳＬＩＣＫ遺伝子型を発現するように変換されたＰＲＬＲアレルを含む、遺伝子改変された家畜動物細胞。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2018531003000001.app
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2018531003.tif 000001
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2018531003.tif 000002
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2018531003.tif 000003
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2018531003.tif 000004
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
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