【手続補正書】
【提出日】令和1年5月9日(2019.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆ１からＦ４、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６で表される４つ、５つまたは６つのフィンガーを含み、各フィンガーが標的サブサイトを認識する認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質であって、前記タンパク質は、
（ｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＳＴＧＮＬＴＮ（配列番号７）、
Ｆ２：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ３：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ４：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、または
（ｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、
Ｆ２：ＲＰＹＴＬＲＬ（配列番号３）、
Ｆ３：ＳＲＧＡＬＫＴ（配列番号８）、
Ｆ４：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ５：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ６：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、
（ｉｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、
Ｆ２：ＲＮＦＳＬＴＭ（配列番号９）、
Ｆ３：ＳＮＧＮＬＲＮ（配列番号１０）またはＳＴＧＮＬＴＮ（配列番号７）またはＳＳＹＮＬＡＮ（配列番号１１）、
Ｆ４：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ５：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ６：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、または
（ｉｖ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＳＧＨＬＡＲ（配列番号１４）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）、
Ｆ４：ＲＨＲＤＬＳＲ（配列番号１８）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＮＤＨＲＴＴ（配列番号１９）、
Ｆ２：ＱＫＡＨＬＩＲ（配列番号２０）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）、
Ｆ４：ＲＧＲＤＬＳＲ（配列番号２１）またはＬＫＲＴＬＫＲ（配列番号２５）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＲＡＨＬＴＲ（配列番号２２）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）またはＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＨＲＮＴＬＶＲ（配列番号２３）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＫＡＨＬＩＲ（配列番号２０）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）またはＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＲＧＲＤＬＳＲ（配列番号２１）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＳＧＨＬＡＲ（配列番号１４）、
Ｆ３：ＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号１６）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）
からなる群から選択される、前記ジンクフィンガータンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質及び機能性ドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項３】
前記機能性ドメインは、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、または、切断ドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２もしくは請求項３に記載の融合タンパク質または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項６】
前記細胞は、幹細胞または前駆細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞はヒト細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞のゲノムは融合タンパク質により改変される、請求項５〜７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
前記ゲノム改変は、挿入、欠失及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ゲノム改変は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列の＋５８領域内にある、請求項８または９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれかに記載の細胞から作製される、細胞または細胞株。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれかに記載の細胞または細胞株に由来する、部分的または完全に分化した細胞。
【請求項１３】
前記細胞は、ゲノム改変を行わない細胞と比較した場合にガンマ及び／またはベータグロビンの発現増加を示す、請求項５〜１２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１４】
請求項２もしくは請求項３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド、または請求項５〜１３のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
細胞の内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列を改変するための組成物であって、請求項２もしくは請求項３に記載の融合タンパク質または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含み、前記内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列が改変されるように、前記組成物が前記細胞に投与されることを特徴とする、前記組成物。
【請求項１６】
外来配列が前記細胞にさらに導入され、前記内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列に前記外来配列が挿入されるようにすることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記改変は欠失を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
対象においてグロビン生成を増加させるための組成物であって、請求項５〜１３のいずれかに記載の細胞を含み、前記組成物が前記対象に投与されることを特徴とする、前記組成物。
【請求項１９】
前記対象はヒトであり、前記細胞はヒト幹細胞またはヒト前駆細胞である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が骨髄移植で投与され、前記細胞は前記対象内で生着し、分化し、かつ成熟することを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記対象は異常ヘモグロビン症に罹患している、請求項１８〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記異常ヘモグロビン症はベータサラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内にゲノム改変を含む遺伝子改変細胞を作製する方法であって、
ａ）細胞と、請求項２または請求項３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを接触させ、ここで、前記融合タンパク質は切断ドメインを含み、
ｂ）前記ポリヌクレオチドから前記融合タンパク質の発現が導かれる条件に前記細胞を供し、かつ
ｃ）遺伝子改変細胞を作製するために十分な発現融合タンパク質を用いて前記内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を改変する、各工程を含む、前記方法。
【請求項２４】
前記細胞を少なくとも１つのサイトカインで刺激することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド及び／または請求項５〜１３のいずれかに記載の細胞を含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
開示は、明瞭な理解を目的とした説明及び実施例で一部が提供されてはいるが、本開示の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく多様な変更及び修正を行うことが可能であることは当業者には明らかとなろう。したがって、上述の記載内容及び実施例により限定されると解釈されるべきではない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｆ１からＦ４、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６で表される４つ、５つまたは６つのフィンガーを含み、各フィンガーが標的サブサイトを認識する認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質であって、前記タンパク質は、
（ｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＳＴＧＮＬＴＮ（配列番号７）、
Ｆ２：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ３：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ４：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、または
（ｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、
Ｆ２：ＲＰＹＴＬＲＬ（配列番号３）、
Ｆ３：ＳＲＧＡＬＫＴ（配列番号８）、
Ｆ４：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ５：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ６：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、
（ｉｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、
Ｆ２：ＲＮＦＳＬＴＭ（配列番号９）、
Ｆ３：ＳＮＧＮＬＲＮ（配列番号１０）またはＳＴＧＮＬＴＮ（配列番号７）またはＳＳＹＮＬＡＮ（配列番号１１）、
Ｆ４：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ５：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ６：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、または
（ｉｖ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＳＧＨＬＡＲ（配列番号１４）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）、
Ｆ４：ＲＨＲＤＬＳＲ（配列番号１８）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＮＤＨＲＴＴ（配列番号１９）、
Ｆ２：ＱＫＡＨＬＩＲ（配列番号２０）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）、
Ｆ４：ＲＧＲＤＬＳＲ（配列番号２１）またはＬＫＲＴＬＫＲ（配列番号２５）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＲＡＨＬＴＲ（配列番号２２）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）またはＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＨＲＮＴＬＶＲ（配列番号２３）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＫＡＨＬＩＲ（配列番号２０）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）またはＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＲＧＲＤＬＳＲ（配列番号２１）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＳＧＨＬＡＲ（配列番号１４）、
Ｆ３：ＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号１６）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）
からなる群から選択される、前記ジンクフィンガータンパク質。
（項目２）
項目１に記載のジンクフィンガータンパク質及び機能性ドメインを含む、融合タンパク質。
（項目３）
前記機能性ドメインは、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、または、切断ドメインである、項目２に記載の融合タンパク質。
（項目４）
項目１〜３のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目５）
項目２もしくは項目３に記載の融合タンパク質または項目４に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
（項目６）
前記細胞は、幹細胞または前駆細胞である、項目５に記載の細胞。
（項目７）
前記細胞はヒト細胞である、項目６に記載の細胞。
（項目８）
前記細胞のゲノムは融合タンパク質により改変される、項目５〜７のいずれかに記載の細胞。
（項目９）
前記ゲノム改変は、挿入、欠失及びその組み合わせからなる群から選択される、項目８に記載の細胞。
（項目１０）
前記ゲノム改変は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列の＋５８領域内にある、項目８または９に記載の細胞。
（項目１１）
項目５〜１０のいずれかに記載の細胞から作製される、細胞または細胞株。
（項目１２）
項目５〜１１のいずれかに記載の細胞または細胞株に由来する、部分的または完全に分化した細胞。
（項目１３）
前記細胞は、ゲノム改変を行わない細胞と比較した場合にガンマ及び／またはベータグロビンの発現増加を示す、項目５〜１２のいずれかに記載の細胞。
（項目１４）
項目２もしくは項目３に記載の融合タンパク質、項目４に記載のポリヌクレオチド、または項目５〜１３のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
（項目１５）
細胞の内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列を改変する方法であって、前記内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列が改変されるように、項目２もしくは項目３に記載の融合タンパク質または項目４に記載のポリヌクレオチドを、前記細胞に投与することを含む、前記方法。
（項目１６）
前記細胞に外来配列を導入し、前記内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列に前記外来配列が挿入されるようにすることをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記改変は欠失を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
対象においてグロビン生成を増加させる方法であって、
前記対象に項目５〜１３のいずれかに記載の細胞を投与することを含む、前記方法。
（項目１９）
前記対象はヒトであり、前記細胞はヒト幹細胞またはヒト前駆細胞である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞を骨髄移植で投与し、前記細胞は前記対象内で生着し、分化し、かつ成熟する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記対象は異常ヘモグロビン症に罹患している、項目１８〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記異常ヘモグロビン症はベータサラセミアまたは鎌状赤血球症である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内にゲノム改変を含む遺伝子改変細胞を作製する方法であって、
ａ）細胞と、項目２または項目３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを接触させ、ここで、前記融合タンパク質は切断ドメインを含み、
ｂ）前記ポリヌクレオチドから前記融合タンパク質の発現が導かれる条件に前記細胞を供し、かつ
ｃ）遺伝子改変細胞を作製するために十分な発現融合タンパク質を用いて前記内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を改変する、各工程を含む、前記方法。
（項目２４）
前記細胞を少なくとも１つのサイトカインで刺激することをさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
項目１〜３のいずれかに記載のタンパク質、項目４に記載のポリヌクレオチド及び／または項目５〜１３のいずれかに記載の細胞を含む、キット。