【手続補正書】
【提出日】令和1年5月29日(2019.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質を作製する方法であって、該方法は、
ａ）第１のタンパク質と第２のタンパク質とを、これらのタンパク質間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第１のタンパク質および該第２のタンパク質は、いずれもペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、反応することによって、該第１のタンパク質を該第２のタンパク質に結合して結合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを接触させることと、
ｂ）前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを、該第３のタンパク質と該結合タンパク質との間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることであって、該第３のタンパク質は、（ａ）の結合タンパク質のさらなるペプチドリンカーと反応するペプチドリンカーを含み、これらのペプチドリンカーは、反応することによって、該第３のタンパク質を該結合タンパク質に結合して融合タンパク質とするイソペプチド結合を形成するペプチドリンカー対である、前記（ａ）の結合タンパク質と第３のタンパク質とを接触させることと、を含む、方法であって、
（ａ）において用いられる該ペプチドリンカー対は、（ｂ）において用いられる前記ペプチドリンカー対に対して直交している、方法。
【請求項２】
融合タンパク質を作製する方法であって、該方法は、
ａ）第１のペプチドリンカーを含む第１のタンパク質を提供することと、
ｂ）該第１のタンパク質と、第２のペプチドリンカーおよび第３のペプチドリンカーを含む第２のタンパク質とを、該第１のペプチドリンカーと該第２のペプチドリンカーとの間にイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させ、それによって該第１のタンパク質と該第２のタンパク質とを結合することと、
ｃ）該結合された第１のタンパク質および第２のタンパク質と、第４のペプチドリンカーを含む第３のタンパク質とを、該第３のペプチドリンカーと該第４のペプチドリンカーがイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させ、それによって該第２のタンパク質と該第３のタンパク質とを結合して融合タンパク質を形成することと、を含む、方法であって、
該第１のペプチドリンカーと該第２のペプチドリンカーとが、該第３のペプチドリンカーと該第４のペプチドリンカーとからなるペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対である方法であり、
場合によっては、前記方法は、前記融合タンパク質を伸長させるステップをさらに含み、前記融合タンパク質に結合される新規タンパク質は、前記融合タンパク質中で先にイソペプチド結合を形成するのに用いられた前記ペプチドリンカー対に対して直交するペプチドリンカー対の一部を成すペプチドリンカーを含み、前記新規タンパク質のペプチドリンカーは、前記融合タンパク質中のタンパク質のペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができる、方法であり、該方法は、該新規タンパク質と該融合タンパク質とを、該新規タンパク質が前記融合タンパク質のペプチドリンカーとイソペプチド結合を形成することができる条件下で接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質は、分岐構造、直鎖構造、または環状構造を有しており、
場合によっては、前記融合タンパク質は、環状化可能である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成は、自発的である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成は、前記反応に添加された成分によって誘導されており、
好ましくは、前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成を誘導する前記成分は、ペプチドリガーゼであり、
好ましくは、前記ペプチドリガーゼは、前記ペプチドリンカー間における前記イソペプチド結合の形成を誘導するグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含み、さらに好ましくは、前記ペプチドリガーゼは、イソペプチドタンパク質由来であり、さらにより好ましくは、前記ペプチドリガーゼは、イソペプチド結合の形成を誘導する前記ペプチドリンカー対と同じイソペプチドタンパク質由来であり、
場合によっては、前記ペプチドリガーゼは、アミノ酸を５０〜３００個含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドリンカー対は、それぞれイソペプチドタンパク質由来であり、好ましくは、前記ペプチドリンカー対は、それぞれ異なるイソペプチドタンパク質由来であり、
場合によっては、前記イソペプチドタンパク質は、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有しているか、あるいは配列番号２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ペプチドリンカー対の各ペプチドリンカーは、アミノ酸を少なくとも６個含んでおり、
場合によっては、各対の一方のペプチドリンカーは、アミノ酸を６〜５０個含み、該対のもう一方のペプチドリンカーは、アミノ酸を５０〜３００個含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
各対の一方のペプチドリンカーは、リジン残基を含み、該対のもう一方のペプチドリンカーは、アスパラギン残基またはアスパラギン酸残基を含み、これらの残基は、イソペプチド結合の形成に関わる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記直交したペプチドリンカー対は、
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列、または配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号２に示すアミノ酸配列、または配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、５５位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、９４位にスレオニン残基を含み、１００位にグリシン残基を含み、１０６位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（２）配列番号５に示すアミノ酸配列、または配列番号５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号６に示すアミノ酸配列、または配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（３）配列番号９に示すアミノ酸配列、または配列番号９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号１０に示すアミノ酸配列、または配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含み、７０位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（４）配列番号１０９に示すアミノ酸配列、または配列番号１０９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１１位にグリシン残基を含み、場合によっては２０位にイソロイシン残基を含み、２１位および２２位にプロリン残基を含み、２３位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号１０に示すアミノ酸配列、または配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含み、７０位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（５）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、７位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号１４に示すアミノ酸配列、または配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、５６位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１０位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
（６）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、７位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号３３に示すアミノ酸配列、または配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、および、
（７）配列番号１７に示すアミノ酸配列、または配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１１位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列を有するペプチドリンカーと、配列番号１８に示すアミノ酸配列、または配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、２４１位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１６２位にリジン残基を含む、配列を有するペプチドリンカー、
のいずれか１つから選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記直交したペプチドリンカー対は、（１）と（４）、（１）と（５）、（１）と（６）、（１）と（３）、（１）と（２）、（２）と（５）、（２）と（６）、（３）と（５）、（３）と（６）、（４）と（５）、または（４）と（６）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、固相上で行われる方法であり、
場合によっては、前記方法は、前記融合タンパク質を、前記固相から溶出させるステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列、または配列番号１に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含む、配列、
（ｉｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列、または配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、５５位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、９４位にスレオニン残基を含み、１００位にグリシン残基を含み、１０６位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列、
（ｉｉｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列、または配列番号５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にアスパラギン酸残基もしくはアスパラギン残基を含む、配列、
（ｉｖ）配列番号６に示すアミノ酸配列、または配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、８位にリジン残基を含む、配列、
（ｖ）配列番号９に示すアミノ酸配列、または配列番号９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列であって、好ましくは、配列番号１０９に示すアミノ酸配列、または配列番号１０９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、１７位にアスパラギン残基もしくはアスパラギン酸残基を含み、１１位にグリシン残基を含み、場合によっては２０位にイソロイシン残基を含み、２１位および２２位にプロリン残基を含み、２３位にリジン残基を含む、配列、あるいは、
（ｖｉ）配列番号１０に示すアミノ酸配列、または配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、９位にリジン残基を含み、７０位にグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基を含む、配列、
を有する、ペプチドリンカー。
【請求項１３】
（ａ）前記（ｉ）のペプチドリンカーは、前記（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり；
（ｂ）前記（ｉｉ）のペプチドリンカーは、前記（ｉ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり；
（ｃ）前記（ｉｉｉ）のペプチドリンカーは、前記（ｉｖ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり；
（ｄ）前記（ｉｖ）のペプチドリンカーは、前記（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり；
（ｅ）前記（ｖ）のペプチドリンカーは、前記（ｖｉ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり；および/または
（ｆ）前記（ｖｉ）のペプチドリンカーは、前記（ｖ）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーであり、好ましくは、配列番号９または配列番号１０９に示すアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと自発的にイソペプチド結合を形成することができるペプチドリンカーである請求項１２に記載のペプチドリンカー。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法で用いるペプチドリンカー対であって、該ペプチドリンカー対は、
（１）請求項１２の（ｉ）に記載のペプチドリンカーと請求項１２の（ｉｉ）に記載のペプチドリンカー、
（２）請求項１２の（ｉｉｉ）に記載のペプチドリンカーと請求項１２の（ｉｖ）に記載のペプチドリンカー、または
（３）請求項１２の（ｖ）に記載のペプチドリンカーと請求項１２の（ｖｉ）に記載のペプチドリンカー、
を含む、ペプチドリンカー対。
【請求項１５】
ポリペプチドおよび請求項１２または１３に記載のペプチドリンカーを含む、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１２または１３に記載のペプチドリンカーまたは請求項１５に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸分子および／または請求項１７に記載のベクターを含有する、組み換え宿主細胞。
【請求項１９】
（ａ）請求項１２の（ｉ）、（ｉｉｉ）、もしくは（ｖ）、または請求項１３（ａ）、（ｃ）もしくは（ｅ）に記載のペプチドリンカーを含む、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド、および
（ｂ）請求項１２の（ｉｉ）、（ｉｖ）、もしくは（ｖｉ）、または請求項１３（ｂ）、（ｄ）もしくは（ｆ）に記載のペプチドリンカーを含む、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチド、および／または、
（ｃ）請求項１２の（ｉ）、（ｉｉｉ）、もしくは（ｖ）、または請求項１３（ａ）、（ｃ）もしくは（ｅ）に記載のペプチドリンカーをコードする核酸分子、および／または、
（ｄ）請求項１２の（ｉｉ）、（ｉｖ）、もしくは（ｖｉ）、または請求項１３（ｂ）、（ｄ）もしくは（ｆ）に記載のペプチドリンカーもしくはポリペプチドリンカーをコードする核酸分子、
を含むキットであって、
場合によっては、前記（ａ）および／または（ｂ）の組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドは、前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのペプチドリンカーに対して直交しているペプチドリンカー対の一部である、さらなるペプチドリンカーを含む、キット。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法で得た、または得ることができる、融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法で得た、または得ることができる、融合タンパク質を少なくとも１つ含む、固体基質であり、
場合によっては、前記基質は、アレイである、固体基質。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法で得た、または得ることができる、融合タンパク質を少なくとも２つ含む、融合タンパク質のライブラリ。
【請求項２３】
融合タンパク質を作製するための、少なくとも２つの直交したペプチドリンカー対の使用であって、各ペプチドリンカー対は、反応してイソペプチド結合を形成する、使用であり、
場合によっては、前記融合タンパク質、イソペプチド結合、ペプチドリンカー、およびペプチドリガーゼは、請求項１〜１４のいずれか１項に記載されたものである、使用。