【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年3月12日(2008.3.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ドナー・フルオロフォア;
(b)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重複する吸収スペクトルを有するアクセプター;および
(c)ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列を含むＢｏＮＴ／Ａ認識配列（ただし、P>5の位置のアミノ酸残基が、該ドナー・フルオロフォアまたは該アクセプターのいずれか一方と結合したアミノ酸で置換され、P>5'の位置のアミノ酸残基が、他方と結合したアミノ酸で置換される）；
を含み、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間で共鳴エネルギー転移が見られるＡ血清型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ／Ａ）基質。
【請求項２】
該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が、ＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続する残基であってＧｌｎ−Ａｒｇを含むもの、またはその模擬ペプチドを含む、請求項１記載の基質。
【請求項３】
該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が、ヒトＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続する残基であってＧｌｎ１９７−Ａｒｇ１９８を含むもの、またはその模擬ペプチドを含む、請求項２記載の基質。
【請求項４】
該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が、配列番号：1のアミノ酸配列またはその模擬ペプチドを含む、請求項３記載の基質。
【請求項５】
該ＢｏＮＴ／Ａ認識配列が、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：２のアミノ酸残基１３７−２０６、配列番号：２のアミノ酸残基１３４−２０６および配列番号：２からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその模擬ペプチドを含む、請求項３記載の基質。
【請求項６】
(a)ドナー・フルオロフォア;
(b)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重複する吸収スペクトルを有するアクセプター;および
(c)ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列を含むＢｏＮＴ／Ａ認識配列（ただし、該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間に介在する）；
を含み、
ここで、該ドナー・フルオロフォア、該アクセプター、または該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターの両方が、該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列内に位置せず；そして、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間で共鳴エネルギー転移が見られるＡ血清型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ／Ａ）基質。
【請求項７】
該ドナー・フルオロフォアが、該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列内に位置しない、請求項６記載の基質。
【請求項８】
該アクセプターが、該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列内に位置しない、請求項６記載の基質。
【請求項９】
該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターが、該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列内に位置しない、請求項６記載の基質。
【請求項１０】
該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が、ＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続する残基であってＧｌｎ−Ａｒｇを含むもの、またはその模擬ペプチドを含む、請求項６記載の基質。
【請求項１１】
該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が、ヒトＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続する残基であってＧｌｎ１９７−Ａｒｇ１９８を含むもの、またはその模擬ペプチドを含む、請求項６記載の基質。
【請求項１２】
該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が、配列番号：1のアミノ酸配列またはその模擬ペプチドを含む、請求項６記載の基質。
【請求項１３】
該ＢｏＮＴ／Ａ認識配列が、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：２のアミノ酸残基１３７−２０６、配列番号：２のアミノ酸残基１３４−２０６および配列番号：２からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその模擬ペプチドを含む、請求項６記載の基質。
【請求項１４】
(a)ドナー・フルオロフォア;
(b)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重複する吸収スペクトルを有するアクセプター;および
(c)ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列を含むＢｏＮＴ／Ａ認識配列（ただし、該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間に介在する）；
を含み、
ここで、該ドナー・フルオロフォア、該アクセプター、または該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターの両方のいずれかが、遺伝的にコードされており；そして、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間で共鳴エネルギー転移が見られるＡ血清型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ／Ａ）基質。
【請求項１５】
該ドナー・フルオロフォアが、遺伝的にコードされている、請求項１４記載の基質。
【請求項１６】
該アクセプターが、遺伝的にコードされている、請求項１４記載の基質。
【請求項１７】
該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターが遺伝的にコードされている、請求項１４記載の基質。
【請求項１８】
該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が、ＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続する残基であってＧｌｎ−Ａｒｇを含むもの、またはその模擬ペプチドを含む、請求項１４記載の基質。
【請求項１９】
該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が、ヒトＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続する残基であってＧｌｎ１９７−Ａｒｇ１９８を含むもの、またはその模擬ペプチドを含む、請求項１４記載の基質。
【請求項２０】
該ＢｏＮＴ／Ａ P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位配列が、配列番号：１のアミノ酸配列またはその模擬ペプチドを含む、請求項１４記載の基質。
【請求項２１】
該ＢｏＮＴ／Ａ認識配列が、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：２のアミノ酸残基１３７−２０６、配列番号：２のアミノ酸残基１３４−２０６および配列番号：２からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその模擬ペプチドを含む、請求項１４記載の基質。
【請求項２２】
該基質が、少なくとも１ナノモル／分／ミリグラム毒素の活性で切断され得る、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項２３】
該基質が、少なくとも２０ナノモル／分／ミリグラム毒素の活性で切断され得る、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項２４】
該基質が、少なくとも５０ナノモル／分／ミリグラム毒素の活性で切断され得る、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項２５】
該基質が、少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラム毒素の活性で切断され得る、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項２６】
該基質が、少なくとも１５０ナノモル／分／ミリグラム毒素の活性で切断され得る、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項２７】
最大４００残基を有するペプチドまたは模擬ペプチドである、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項２８】
最大３００残基を有するペプチドまたは模擬ペプチドである、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項２９】
最大２００残基を有するペプチドまたは模擬ペプチドである、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３０】
最大１００残基を有するペプチドまたは模擬ペプチドである、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３１】
最大５０残基を有するペプチドまたは模擬ペプチドである、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３２】
最大４０残基を有するペプチドまたは模擬ペプチドである、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３３】
最大２０残基を有するペプチドまたは模擬ペプチドである、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３４】
該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターが、最大４０残基で隔てられている、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３５】
該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターが、最大３０残基で隔てられている、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３６】
該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターが、最大２０残基で隔てられている、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３７】
該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターが、最大１５残基で隔てられている、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３８】
該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターが、最大１０残基で隔てられている、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項３９】
該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターが、最大８残基で隔てられている、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項４０】
該ドナー・フルオロフォアおよび該アクセプターが、最大６残基で隔てられている、請求項１−２１のいずれかに記載の基質。
【請求項４１】
ＢｏＮＴ／Ａプロテアーゼ活性を測定する方法であって、
(a)サンプルを、ＢｏＮＴ／Ａプロテアーゼ活性に好適な条件下で、請求項１−４０のいずれかに記載のＢｏＮＴ／Ａ基質を含む、ＢｏＮＴ／Ａ基質で処理し；
(b) 該ドナー・フルオロフォアを励起し；そして、
(c)該処置済基質の共鳴エネルギー転移を対照基質と対比して測定する、段階を含み、
該対照基質と比較した場合の該処置済基質の共鳴エネルギー転移における相違がＢｏＮＴ／Ａプロテアーゼ活性を示す方法。
【請求項４２】
該試料が未精製細胞溶解物である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
該試料が単離ＢｏＮＴ／Ａである、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
該試料が単離ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖である、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
該試料が製剤化ＢｏＮＴ／Ａ製品である、請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
該アクセプターがフルオロフォアであり、そして段階(c)が該処置済基質のドナー蛍光強度を検出することを含み、ここで、基質切断の増加により、該対照基質と比較して該処置済基質のドナー蛍光強度が増加し、該増加したドナー蛍光強度が、ＢｏＮＴ／Ａ毒素プロテアーゼ活性を示す、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
該アクセプターがフルオロフォアであり、そして段階(c)が該処置済基質のアクセプター蛍光強度を検出することを含み、ここで、基質切断の増加により、該対照基質と比較して該処置済基質のアクセプター蛍光強度が減少し、該減少したアクセプター蛍光強度が、ＢｏＮＴ／Ａ毒素プロテアーゼ活性を示す、請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
該アクセプターがフルオロフォアであり、そして段階(c)が、アクセプター発光極大およびドナーフルオロフォア発光極大を検出することを含み、ここで、基質切断の増加により、該アクセプター発光極大付近から該ドナー・フルオロフォア発光極大付近への発光極大におけるシフトが生じ、該発光極大のシフトが、ＢｏＮＴ／Ａ毒素プロテアーゼ活性を示す、請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
該アクセプターがフルオロフォアであり、そして段階(c)が、アクセプター発光極大付近の蛍光振幅のドナー・フルオロフォア発光極付近の蛍光振幅に対する比率を検出することを含み、ここで、基質切断の増加により、該対照基質と比較して該処置済基質の比率が減少し、該減少した比率が、ＢｏＮＴ／Ａ毒素プロテアーゼ活性を示す、請求項４１記載の方法。
【請求項５０】
該アクセプターがフルオロフォアであり、そして段階(c)が、ドナー発光極大付近の蛍光振幅のアクセプター・フルオロフォア発光極付近の蛍光振幅に対する比率を検出することを含み、ここで、基質切断の増加により、該対照基質と比較して該処置済基質の比率が増加し、該増加した比率が、ＢｏＮＴ／Ａ毒素プロテアーゼ活性を示す、請求項４１記載の方法。
【請求項５１】
該アクセプターがフルオロフォアであり、そして段階(c)が、該処置済基質におけるドナー・フルオロフォアの励起状態寿命を検出することを含み、ここで、基質切断の増加により、該対照基質と比較して該処置済基質におけるドナー・フルオロフォア励起状態寿命が増加し、該増加した励起状態寿命がＢｏＮＴ／Ａ毒素プロテアーゼ活性を示す、請求項４１記載の方法。
【請求項５２】
該アクセプターがクエンチャーであり、そして段階(c)が、該接触された細胞のドナー蛍光強度を検出することを含み、ここで、基質切断の増加により、該対照基質と比較して該処置済基質におけるドナー蛍光強度が増加し、該増加したドナー蛍光強度がＢｏＮＴ／Ａ毒素プロテアーゼ活性を示す、請求項４１記載の方法。
【請求項５３】
さらに、段階(c)を１またはそれ以上の時間間隔をおいて繰り返すことを含む、請求項４１記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも９０％の該ＢｏＮＴ／Ａ基質が切断される、請求項４１記載の方法。
【請求項５５】
最大２５％の該ＢｏＮＴ／Ａ基質が切断される、請求項４１記載の方法。
【請求項５６】
最大１５％の該ＢｏＮＴ／Ａ基質が切断される、請求項４１記載の方法。
【請求項５７】
最大５％の該ＢｏＮＴ／Ａ基質が切断される、請求項４１記載の方法。
【請求項５８】
アッセイが線形となるようＢｏＮＴ／Ａプロテアーゼ活性に適した条件が選択される、請求項４１記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
本発明のクロストリジウム毒素基質は、ドナー・フルオロフォアと、ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重複する吸収スペクトルを有するアクセプターの間に「介在」する切断部位を含む。つまり切断部位は、その部位における切断によってフルオロフォアを含む第一の分子とアクセプターを含む第二の分子を生じるように、フルオロフォアとアクセプターの間に位置する。クロストリジウム毒素認識配列の全てまたは一部のみが、ドナー・フルオロフォアとアクセプターの間に介在することができることが理解される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７２】
ＦＲＥＴ基質 X1-Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu-Z2-NH2 （配列番号：８５）は、Alpha Diagnostics International (San Antonio, TX)により合成された。本基質は、フルオレセイン修飾リジン残基（「Ｘ１」）およびカルボキシ末端アミドが続くテトラメチルローダミン修飾リジン残基（「Ｚ２」）に挟まれた、ＢｏＮＴ／Ａのための認識配列を含む。Ａ血清型ボツリヌス毒素によるタンパク分解に続いて、切断産物 X1-Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln （配列番号：８６）およびArg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu-Z2-NH2 （配列番号：８７）が産生される。