【手続補正書】
【提出日】令和1年6月12日(2019.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
【化１】
2019518066.tif 000001
ただし、R1は、水素、ヒドロキシ、アミノから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキルおよびC3-6シクロアルキルから選択されるものであり;
R2は、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキル、C3-6シクロアルキル、およびフェニルから選択されるものであり;
R3は、水素から選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキル基から選択されるものであり;
任意に、R2およびR3は一緒に結合し、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよい一つ5〜6員環を形成し；
R4およびR5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲンから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキルおよびC1-3ヘテロアルキルから選択されるものであり;
Lは、単結合、-（CRR）1-3-から選択されるものであり；
RはF、Cl、Br、I、CN、OH、NH2、COOHから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のR'で置換されていてもよいC1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C3-6シクロアルキル、3〜6員ヘテロシクロアルキル、フェニル基および5〜6員のヘテロアリールから選択されるものであり；
R'はF、Cl、Br、I、OH、CN、NH2、COOH、Me、Et、CF3、CHF2、CH2F、NHCH3、N（CH3）2から選択されるものであり；
「ヘテロ」は、ヘテロ原子またはヘテロ原子団を指し、-C(=O)N(R)-、-N(R)-、-C(=NR)-、-S(=O)2 N(R)-、-S(=O)N(R)-、-O-、-S-、=O、=S、-O-N=、-C(=O)O-、-C(=O) -、-C(=S)-、-S(=O) -、-S(=O)2-、-N(R)C(=O)N(R)-から選択されるものであり；
上記場合のいずれにおいても、ヘテロ原子またはヘテロ原子団の数は、それぞれに独立して1、2または3から選択される。
【請求項２】
前記Rは、F、Cl、Br、I、CN、OHから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のR'で任意に置換されていてもよいC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、フェニルから選択されるものであることを特徴とする、請求項1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記Rは、F、Cl、Br、I、CN、OH、メチル、CHF2、エチル、プロピル、シクロプロピルおよびフェニルから選択されるものであることを特徴とする、請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
前記R1は、水素から選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいメチル、エチルおよび
【化２】
2019518066.tif 000002
から選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
前記R1は、水素、メチル、エチル、
【化３】
2019518066.tif 000003
、
【化４】
2019518066.tif 000004
から選択されるものであることを特徴とする、請求項４に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
前記R2は、1、2または3個のRで置換されていてもよいメチル、エチル、イソプロピル、シクロペンチルおよびフェニルから選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
前記R2は、メチル、エチル、イソプロピル、シクロペンチル、
【化５】
2019518066.tif 000005
および
【化６】
2019518066.tif 000006
から選択されるものであることを特徴とする、請求項６に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
前記R2およびR3が一緒に連結され、構造単位
【化７】
2019518066.tif 000007
が
【化８】
2019518066.tif 000008
であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
前記R4およびR5は、それぞれ独立して、水素、F、Cl、Br、メチルおよびエチルから選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
前記構造単位
【化９】
2019518066.tif 000009
は
【化１０】
2019518066.tif 000010
、
【化１１】
2019518066.tif 000011
、
【化１２】
2019518066.tif 000012
、および
【化１３】
2019518066.tif 000013
から選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
前記Lは、単結合、-（CH2）1-3-から選択されるものであることを特徴とする、請求項
１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
前記Lは、単結合、-CH2-、-CH2CH2-から選択されるものであることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１３】
前記化合物は、
【化１４】
2019518066.tif 000014
から選択されるものであり、ただし、R1、R2、R3、R4、R5およびLは請求項１〜１２のいずれかに定義した通りであり、R4およびR5は同時にHではないことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
前記化合物は、
【化１５】
2019518066.tif 000015
から選択されるものであり、ただし、R1、R2、R4、R5およびLは請求項１３で定義した通りであり、R4およびR5は同時にHではないことを特徴とする、請求項１３に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
以下からなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容される塩。
【化１６】
2019518066.tif 000016
【請求項１６】
治療有効量の請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
癌を治療するための請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
前記癌は乳癌であることを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】ＴＧＦ−βＲＩ阻害剤としてのベンゾトリアゾール由来のα、β−不飽和アミド系化合物
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、TGF-βRI阻害剤としてのベンゾトリアゾール由来のα、β-不飽和アミド系
化合物に関し、具体的には、式（I）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩
を開示した。
［背景技術］
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本発明のさらに他の形態は、前記変数を任意に組み合わせて得たものである。
技術的効果
本発明化合物の使用は、主としてTGF-βRIの阻害剤であり、これはTGF-βRIを阻害することによりTGF-βの下流シグナル伝達経路を遮断し、それにより所望の薬理作用を発揮する。先行技術とは異なり、本発明化合物において、ベンゾトリアゾール構造は、TGF-βRIに結合する重要なファルマコフォアである。本発明化合物の化学構造の組み合わせは、先行技術より優れた生物学的活性をもたらすことは予想外である。同じ用量で、マウスのCT-26同系モデルにおいて、本発明化合物は、単独投与時およびPDL-1と併用投与時の腫瘍阻害効果のいずれもが、従来技術より優れることにより、本発明化合物がより優れた抗腫瘍免疫活性化作用を有することが分かった。マウス4T1同所性移植抗転移性乳癌モデルでは、本発明化合物は、従来技術と比較して有意に優れた抗転移能を有する。本発明化合物は、多組織臓器における腫瘍の転移および転移の強さに対して明らかな阻害効果を有し、治療薬としての大きな可能性を示す。本発明化合物は、乳癌の転移阻害剤として非常に有望であり、乳癌の併用療法において転移阻害に重要な役割を果たし、乳癌の臨床治療に潜在的な新しい治療策を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
【表１】
2019518066.tif 000017
実験例2：NIH/3T3マウス胚細胞の増殖阻害実験
実験原理：
Promega社のLuminescent Cell Viability Assay（CellTiter-Glo（登録商標）法、即ちATP蛍光活性アッセイ）で、化合物を細胞培養プレートに添加し、インキュベーションした。検出当日に、細胞内ATP含量を検出するための基質緩衝液を加えた。わずかに振とうし、1000rpmで1分間遠心した。
10分間放置した後、検出を行った。検出プレートに対し、PerkinElmer社のEnvision多機能マイクロプレートリーダーを用いて分析し、アッセイモードは蛍光検出であり、データは化学発光シグナルが400〜700nmでの読み数値として表現された。
実験ステップ：
1）細胞増殖カバー率が約70％である場合、先ず細胞層を無カルシウム、無マグネシウムダルベッコリン酸緩衝液（D-PBS）10mLで洗浄し、0.25％トリプシン-EDTA消化液2mLを添加し、細胞培養フラスコを37℃でCO2二酸化炭素インキュベーターに置き3〜5分間インキュベートし、次に、2％FBSを含むDMEM細胞完全培地8mLを添加し、細胞を単一細胞に吹き込み、Vi-cellセルカウンターで計数し、NIH/3T3細胞懸濁液を0.375×105/mL細胞まで希釈した。
2）384ウェル細胞培養プレートの周囲に50μLの2％DMEM培地を添加し、残りのウェルに40μLの細胞懸濁液を1ウェルあたり1500個の細胞に加え、顕微鏡下で細胞の均一な分布を観察し、細胞プレートを37℃、5％CO2細胞培養インキュベーター中に置き、インキュベートした。
3）化合物の希釈について、化合物の製造を参照した。
4）化合物の中間プレートにおいて、1ng/mLのTGF-β1を含有する2％ウシ胎仔血清のDMEM培地の混合物を化合物プレートに20μL/ウェルで手動で加えた。
5）化合物の中間プレートを1000rpm/分で10秒間わずかに振盪し、10秒間遠心分離した後、予備品とした。
6）ブラボー（Bravo）液体ワークステーションを使用して、最終体積を50μLにするように、ステップ4および5で混合された液体を1ウェルあたり10μLで接種した細胞プレートに移し、TGF-β1の最終濃度を0.2ng/mLに希釈した。1000回転数/分で10秒間遠心分離を行った。プレートを37℃、5％二酸化炭素の培養インキュベーターに72時間置いた。化合物の最終濃度は、（単位：μM）