【手続補正書】
【提出日】平成19年10月17日(2007.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、ニテンピラム（化学名：（Ｅ）−Ｎ−（６−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）−Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎｉｔｒｏｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）のハプテン化合物、ニテンピラムに対する抗体、抗体を産生
するハイブリドーマおよびその測定手段、測定用キットまたは測定方法に関する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
前記モノクローナル抗体は、ニテンピラムに対する特異性と他の物質に対する交差反応性とを明確にするため、下記のようなＩＣ５０値を有することが好ましい。ここでＩＣ５０値とは、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡにより標準阻害曲線を求めて、５０％阻害を示す検体の濃度をいう。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
すなわち、本抗体は、ニテンピラムを測定対象とする場合は、直接競合ＥＬＩＳＡによるニテンピラムに対するＩＣ５０が５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
前記のように調製した抗原を２ｍｇ／ｍＬ程度になるように生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与する。その後、約２週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出し、無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、組織片等を取り除いた後に新しい培地中に移し、脾細胞を完全に培地中に浮遊させる。遠心、上清除去を数回繰り返し、細胞を洗った後、マウスのミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と細胞数の比５：１〜１０：１（脾細胞：ミエローマ）で混合する。細胞を沈殿させ上清を取り除いたあと、攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）をゆっくり加え細胞融合を行う。細胞融合後、遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が５×１０5 個／ｍＬになるようにＨＡＴ培地を加えて懸濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに２５０μＬ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。１週間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換して、１０日から１４日間培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、抗ニテンピラム抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
このＢＳＡ溶液に、先に調製したニテンピラムハプテン溶液を徐々に滴下し、暗所にて室温で１．５時間攪拌した。反応終了後、４℃で一晩生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に対して透析した後、３０℃で貯蔵した。このようにして得られたニテンピラムハプテンとＢＳＡとの結合体を固相化抗原として使用した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
＜実施例４＞（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例２で調製した免疫原を２ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、これに等量の完全アジュバント（商品名：フロイント完全アジュバント；ＦＣＡ）を等量混合しエマルジョン化し、その１００μＬを６〜７週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔投与した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
摘出した脾臓を無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で余分な組織片を切除したあと、脾臓から完全に細胞を取り出し、培地中に浮遊させた。浮遊している大きな組織片を沈降させるために５分間静置、細胞浮遊液を遠沈管に集め、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を吸引除去して、新しい無血清ＤＭＥＭを添加して細胞を浮遊させた。この操作を２回繰り返した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
それぞれの細胞数を計数して脾細胞とミエローマ細胞との比率が１０：１〜７．５：１になるように混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心して、上清を吸引除去した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
＜実施例５＞（モノクローナル抗体の作製）
実施例４で得られたハイブリドーマ株を１０％牛胎児血清入りＤＭＥＭで培養し、約２×１０６個の細胞をＢａｌｂ／ｃ  メスＲｅｔｉｒｅ  マウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。得られた腹水はプロテインＧカラムによりＩｇＧ精製を行った。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
ニテンピラムハプテン１．７５ｍｇを６０μＬのＤＭＳＯで溶解し、その溶液に３０．０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解したＮ−ヒドロキシスクシンイミド溶液４０μＬと１９．０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩溶液１００μＬを加えた。その混合液を室温において１．５時間、暗所に静置、反応させた。反応後、西洋ワサビペルオキシダーゼ１０ｍｇをｐＨ８．０のホウ酸緩衝液１ｍＬに溶解した溶液を混和しながら少量ずつ加えた。混合した溶液を室温において１．５時間暗所に静置、反応させた。反応終了後、４℃で一晩生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に対して透析した後、３０℃で貯蔵した。ゲル濾過で精製を行い、濃度の測定はＤＣプロテインアッセイで行った。  
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
＜実施例７＞（直接競合ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５の測定）
（１）抗マウスＩｇＧヤギ抗体をＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＰＢ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μｇ／ウェルづつ分注し、４℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、ＰＢＳ緩衝液（０．４％ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＮａＰＢ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を３００μｇ／ウェル分注し、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
（２）実施例５で得られたモノクローナル抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５をＰＢＳ緩衝液（０．２％ＢＳＡ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で２．０μｇ／ｍＬに希釈し、（１）で作製した抗マウスＩｇＧヤギ抗体固相化プレートに１００μｇ／ウェルづつ分注した、２０℃で１時間静置した後、ＰＢＳで洗浄し抗体固相化プレートとした。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
（３）ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とニテンピラムハプテンの結合体をＰＢＳ緩衝液（０．４％ＢＳＡ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で０．２５μｇ／ｍＬに希釈しＨＲＰ希釈液とした。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
モノクローナル抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５溶液についての直接競合阻害法によるニテンピラムの標準阻害曲線を図１に示す。モノクローナル抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５溶液を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法によるニテンピラムの測定可能な範囲は１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ５０値）は２７ｎｇ／ｍＬであった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
実施例８（抗体のニテンピラム構造類似化合物に対する交差反応性）
ニテンピラムと化学構造が類似している農薬について抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５の交差反応性を調べた。交差反応性は、実施例７に記載の方法と同様にして試験化合物のＩＣ５０値を求め、次式により計算し交差反応率を算出した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
交差反応率（％）＝（ニテンピラムのＩＣ５０値／試験化合物のＩＣ５０値）×１００
その結果、殺虫剤のアセタミプリド、イミダクロプリド、チアクロプリド、チアメトキサ
ム、クロチアニジン、ジノテフラン、硫酸ニコチンおよび殺菌剤のピリフェノックスに対
しいずれも交差反応性は０．１％以下であり、抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５はニテンピラ
ムに特異的な抗体であった。