【手続補正書】
【提出日】平成19年5月17日(2007.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
前記鮮度の推定を、予め発色強度とＫ値の検量線を作成し、測定した発色強度からＫ値を求めることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記発色強度の測定および鮮度の推定を、色見本を用いて目視法で行うことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
前記発色強度の測定および鮮度の推定を、色見本を用いて目視法で行うことを特徴とする請求項６ないし８のいずれか１項に記載の生鮮魚類の生可食残存日数の推定方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（１）  ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入して発色媒体とし、該発色媒体を生鮮魚介類、獣肉または家禽肉と一緒に保蔵し、任意の時点で発色媒体の発色強度を測定し、測定した発色強度の強弱をもとに生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度を推定することを特徴とする生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（２）  前記発色剤がテトラゾリウム塩であることを特徴とする（１）に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（３）  前記溶媒が、不凍性の極性溶媒であることを特徴とする（１）または（２）に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（４）  前記鮮度の推定を、予め発色強度とＫ値の検量線を作成し、測定した発色強度からＫ値を求めることを特徴とする（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（５）  前記発色強度の測定および鮮度の推定を、色見本を用いて目視法で行うことを特徴とする（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（６）  ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入して発色媒体とし、該発色媒体を生鮮魚類が保蔵された保蔵容器内に配置し、任意の時点で発色媒体の発色強度を測定し、測定した発色強度の強弱をもとに生鮮魚類のＫ値を推定し、式（１）
ＲＤＶｔ＝［Ｔｔ（Ｋ２−Ｋ’）／（Ｋ２−Ｋ０）］  （１）
（ただし式（１）中、ＲＤＶｔ：ｔ℃貯蔵における生可食残存日数
Ｔｔ：ｔ℃保存における生食としての許容限界日数
Ｋ２：生食として食せる許容限界のＫ値
Ｋ０：非常に新鮮な生鮮魚類のＫ値
Ｋ’：測定した時点のＫ値の推定値を示す。）
で表される式により生可食残存日数を算定することを特徴とする生鮮魚介類の生可食残存日数の推定方法。
（７）  前記発色剤がテトラゾリウム塩であることを特徴とする（６）に記載の生鮮魚類生可食残存日数の推定方法。
（８）  前記溶媒が、不凍性の極性溶媒であることを特徴とする（６）または（７）に記載の生鮮魚類生可食残存日数の推定方法。
（９）  前記発色強度の測定および鮮度の推定を、色見本を用いて目視法で行うことを特徴とする（６）ないし（８）のいずれか１項に記載の生鮮魚介類の生可食残存日数の推定方法。
（１０）  ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入したことを特徴とする生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度推定用のキット。
（１１）  ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入したことを特徴とする生鮮魚類生可食残存日数推定用のキット。
（１２）  前記発色剤がテトラゾリウム塩であることを特徴とする（１０）または（１１）に記載のキット。
（１３）  前記溶媒が、不凍性の極性溶媒であることを特徴とする（１０）または（１１）に記載のキット。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
生鮮魚介類等の鮮度指標Ｋ値は生鮮魚介類等の筋肉中に含まれるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」と略称する）の分解過程から関数として導き出される。ＡＴＰはアデノシン二リン酸（以下、「ＡＤＰ」と略称する）を経てアデノシン一リン酸（アデニル酸、以下、「ＡＭＰ」と略称する）へと脱リン酸される。続いて、塩基部分の構造の一部が変化してイノシン酸（以下、「ＩＭＰ」と略称する）となる。ＩＭＰはカツオ節の旨み成分としてよく知られている。ＡＴＰの分解に際してここまでの過程は比較的早い。ＩＭＰの蓄積は旨み成分の蓄積であり、ここまでの分解は生鮮魚介類等の美味しさにとって重要な過程である。ＩＭＰ  は脱リン酸されてイノシン（以下、「ＨｘＲ」と略称する）となり、さらに酵素反応を受けてヒポキサンチン（以下、「Ｈｘ」と略称する）となる。Ｈｘはさらに酵素分解を受けてキサンチン・尿酸へと分解していく。この一連の過程の中で、ＩＭＰの分解速度が比較的小さいため、
[(HxR+Hx)/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx)×100(%)]  （２）
を便宜的にＫ値と定義すると、Ｋ値は死後の時間経過と温度の関数となり、Ｋ値の増加速度が死後の生鮮魚介類等に起きる諸変化と概略平行する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
図２は、貯蔵温度とＫ値上昇率の関係を示すグラフであり、このグラフより１日当たりのＫ値上昇率を求めると、例えば、５℃貯蔵では１日当たりのＫ値は生可食限界値に達するまで１２．５％ずつ増大していくことになる。図２はこの状態を示したもので、−１０℃以下の貯蔵であればＫ値の増加は穏やかであるが、−１０℃を超えるとＫ値は急激に増大している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
貯蔵中のＫ値変化が一次反応であると仮定して、貯蔵中におけるＫ値変化を図３に示した。ここで、Ｋ２は生可食限界のＫ値、Ｋ０は限りなく新鮮な状態のＫ値、すなわち漁獲あるいは水揚げ直後の生鮮魚介類のＫ値を示す。
貯蔵管理の徹底を図ることにより、任意の時点におけるＫ値は積算温度の影響を表していると考えることができる。それ故に、任意の時点のＫ値（Ｋ）は、
Ｋ＝ΣＥｔ×Ｘｔ＝（Ｋ２−Ｋ０）Σ（Ｘｔ／Ｔｔ）  （４）
と表すことができる。ここでＥｔはｔ℃におけるＫ値上昇率で、（Ｋ２−Ｋ０）／Ｔｔで表すことができる。Ｔｔはｔ℃で保存された生鮮魚介類の生可食（刺身）としての許容日数を、Ｘｔはｔ℃に保存された日数を表す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
図３にＲＤＶｔの関係式を示した。例えば、−２０℃に貯蔵した場合に、刺身として食べることが可能な残存日数（ＲＤＶ−２０）を式（１）あるいは式（５）により求めることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
さらに、保存温度毎に検量線を作成し、生鮮魚介類の種別や鮮度変化の特徴や様式をデータベース化することで、個々の種類だけでなく、多種の生鮮魚類にも対応が可能となる。鮮度の推定を簡便に行うには例えば、図４に示したように発色強度と生可食残存日数や鮮度値Ｋ値を印刷した色見本を発色媒体に貼付しておけば、発色媒体の発色強度を目視で測定し、生可食残存日数や鮮度を簡便に推定することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
一方、本発明の方法はある意味で温度記録計と類似する点を持つ。温度記録計は一定時間毎の温度を一定回数記録するが、ＰＣに取り込んで処理することによって、積算温度や平均温度、温度の変化等の解析が可能である。これらの内、積算温度は時間の関数であり、被対象物の温度履歴の総和に等しい。一定に温度環境に被対象物が置かれた場合、特に本発明の被対象物のように温度依存性のある酵素反応を指標とするものでは、冷蔵・冷凍環境下と、常温環境下とでは同じ積算温度であっても後者の反応時間は早いものとなる。すなわち、被対象物の置かれた温度環境に依存する。このことは、被対象物がどのような温度環境に置かれていたかの温度履歴を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
本発明を実施する一形態としては、極性溶媒に基質Ｈｘとテトラゾリウム塩を加え、例えば、テトラゾリウム塩としてＭＴＴを用いた場合はＴｒｉｓ−塩酸緩衝液でｐＨ７．８に調製した溶液をガラス管等の透明容器に注入し、所定単位のＸＯＤを加えて密栓し発色媒体を調製し、この発色媒体を貯蔵される生鮮魚介類等と一緒にセットする。保蔵容器の置かれた環境が常温で温度履歴が増加する場合は発色し、氷蔵された場合は発色しない（図５）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
具体的には、極性溶媒の一定量に基質（Ｈｘ）とテトラゾリウム塩の一定量を作成し、このｐＨを調整した後、内径１０ｍｍのガラス管等の透明容器に収めた発色液を準備する。次に、一定の酵素単位（ｕｎｉｔ）になるように溶解したＸＯＤの酵素液を用意する。酵素液は一定量をバイアル瓶に溶解しておき、必要に応じて、その一部を注射筒などで取り出し、発色液と混合して透明容器を密封して発色媒体とする。あるいは、酵素の必要単位をガラス管等の透明容器に取り、必要時に溶媒に溶解して酵素液とし、これを発色液と混合して透明容器を密封し、発色媒体としてもよい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
発色媒体を生鮮魚介類等を収蔵あるいは貯蔵する容器に入れて、経時的に発色する強度を光電比色計で測定し、その吸光度から、その時点の鮮度の度合い、すなわちＫ値を推定する。予め作成しておいた色見本と目視で比べることで発色強度を測り、鮮度を推定しても構わない。また、実験室的に分光光度計を用いてもよい（図６）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
図４に本発明の発色媒体を用いて生可食残存日数を推定する一実施形態を示す。図４に示した発色媒体は、試験管状の内径１０ｍｍ、容量７〜８ｍｌのガラス管に上述の発色剤組成物を注入し、密栓したものである。発色媒体は、温度履歴の増加によって、発色剤が発色するので、例えば図示したように発色媒体に刺身としての残存賞味期限を色見本で印刷したものを添付しておけば、発色媒体の発色強度を目視で観察することにより、発色媒体と一緒に保蔵した生鮮魚介類の生可食残存日数を簡便に推定することができる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
酵素濃度・基質濃度・発色剤濃度の検討
基質Ｈｘにテトラゾリウム塩ＭＴＴの存在下でそれぞれの濃度の酵素ＸＯＤを作用させ、生成したホルマザン色素の発色強度を吸光度５６５ナノメートルで測定した。Ｈｘの濃度を０．５グラム毎リットルとし、ＸＯＤの濃度を０．１・０．３・０．５・１．０酵素単位とし、エタノール（以下、「ＥｔＯＨ」と略称する）８０パーセント不凍液中で室温（２５．５℃）で反応させた（図７）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
テトラゾリウム塩ＭＴＴ、酵素ＸＯＤの存在下でそれぞれの濃度の基質Ｈｘを添加し、生成したホルマザン色素の発色強度を吸光度５６５ナノメートルで測定した。ＭＴＴの濃度は０．５グラム毎リットル、ＸＯＤの濃度は０．３酵素単位とし、ＨｘＲの濃度を０．１、０．２５、０．４、０．５５グラム毎リットルとし、ＥｔＯＨ８０パーセント不凍液中で室温（２５．５℃）で反応させた（図８）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
基質Ｈｘ、酵素ＸＯＤの存在下でそれぞれの濃度のテトラゾリウム塩ＭＴＴを添加し、生成したホルマザン色素の発色強度を吸光度５６５ナノメートルで測定した。Ｈｘの濃度は０．４グラム毎リットル、ＸＯＤの濃度は０．３酵素単位とし、ＭＴＴの濃度を０．１、０．２５、０．４、０．５５グラム毎リットルとし、ＥｔＯＨ８０パーセント不凍液中で室温（２５．５℃）で反応させた（図９）。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
Ｋ値と発色強度との関係
実施例１で作成したキットをサンマ・マサバ・イワシの小型魚種とともに５℃および０℃環境下に置いた。発色媒体の発色強度の経時変化を測定するとともに、サンマ・マサバ・イワシの５℃および０℃環境下、ＨＰＬＣでＫ値を測定し、検量線を作成した（図１０，図１１）。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
サンマ・マサバ・イワシのＫ値変化のパターンはほぼ同じで、これらと発色媒体との間には良好な相関関係（０℃：Ｒ＝０．９５、５℃：Ｒ＝０．９５）があった。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
【図１】キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の反応様式を示す説明図
【図２】貯蔵温度とＫ値上昇率との関係を示すグラフ
【図３】貯蔵日数とＫ値から導き出した生可食残存日数の関係を示すグラフ
【図４】発色媒体により生可食残存日数を推定する一実施形態を示す説明図
【図５】発色媒体の一実施形態を示すフロー図
【図６】発色強度の計測の一実施形態を示すフロー図
【図７】実施例１、酵素濃度の検討を示すグラフ
【図８】実施例１、基質濃度の検討を示すグラフ
【図９】実施例１、発色剤濃度の検討を示すグラフ
【図１０】実施例２、Ｋ値と吸光度との関係（５℃）を示すグラフ
【図１１】実施例２、Ｋ値と吸光度との関係（０℃）を示すグラフ
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
2005345263.tif 000003
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005345263.tif 000007
【図８】
2005345263.tif 000008
【図９】
2005345263.tif 000009
【図１０】
2005345263.tif 000010
【図１１】
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