【手続補正書】
【提出日】令和1年9月2日(2019.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象から得られた、臨床検査用の生存疾患細胞の試料を調製する方法であって、
前記ヒト対象から得られた生存疾患細胞の前記試料を、６〜１７％の酸素を含む条件下、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む培地中、水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコートした細胞培養容器表面上で培養すること、を含む方法。
【請求項２】
前記試料が、１０％の酸素を含む条件下で培養される、および／または生存疾患細胞の前記試料が、２０％の酸素を含む条件下で、アノイキス阻害剤を欠く前記培地に移される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、少なくとも１種の内因性アノイキス経路の阻害剤および少なくとも１種の外因性アノイキス経路の阻害剤を含む培地中で培養される、および／または前記少なくとも１種のアノイキス阻害剤が、抗アノイキス経路をアゴナイズする、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種のアノイキス阻害剤が、必要に応じて、キナーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ストレス阻害剤、デスレセプター阻害剤、チトクロムＣ阻害剤および接着関連アノイキス阻害剤からなる群から選択される；または必要に応じて、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、カスパーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト、レドックス緩衝剤、活性酸素種阻害剤、ＴＮＦ−α阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、チトクロムＣ放出阻害剤、カルシウムチャネル活性化のない炭酸脱水酵素アンタゴニスト、インテグリン安定剤、インテグリンリガンド、Ｆａｓ阻害剤、ＦａｓＬ阻害剤、Ｂａｘ阻害剤およびＡｐａｆ−１阻害剤からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、少なくとも３種のアノイキス阻害剤を含む培地中で培養され、必要に応じて、前記少なくとも３種のアノイキス阻害剤が、少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤、少なくとも１種のＭＭＰ３阻害剤および少なくとも１種のＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
生存疾患細胞の前記試料が、培養の前に、消化培地に一定時間接触され、前記消化培地が、アノイキス、細胞表面接着分子損傷または非アノイキス手段による細胞死を生ずることなく、組織を消化し、必要に応じて、前記消化培地が、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
生存疾患細胞の前記試料が、
（ｉ）少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む前記培地中で少なくとも１時間培養される；および／または
（ｉｉ）必要に応じて、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、トリヨードサイロニン、テトラヨードサイロニン、フェチュイン、溶液型の細胞外マトリックス成分、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、細胞間ＣＡＭ、血管ＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、および増殖因子からなる群から選択される、接着経路の活性化を促進する少なくとも１つの成分を含む培地中で培養される；および／または
（ｉｉｉ）必要に応じて、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、二価の金属イオンキレート化剤などのＣａ２＋、Ｍｇ２＋、および／またはＭｎ２＋キレート化剤、ディスパーゼ、ＴｒｙｐＬＥ、トリプシン、アクターゼ、アキュマックス、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、トリプシン阻害剤、ＳＴＥＭｘｙｍｅ、プロナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼからなる群から選択される、接着の一時的反転を促進し、細胞の１つの容器から別の容器への移動を容易にする少なくとも１つの成分を含む培地中で培養される；および／または
（ｉｖ）無血清培地中で培養される；および／または
（ｖ）必要に応じて、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、希少必須金属、ｐＨ緩衝剤（単一または複数）、塩（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ）、亜セレン酸塩、ケイ酸塩、ブドウ糖またはその他の生物学的に実用的な炭素源、脂質、リポ酸などの脂肪酸、ピルビン酸塩、トランスフェリン、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、マイトジェン、エタノールアミン、アルブミン、ホルモン（例えば、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール）、プトレシン、ピルビン酸塩、チミジン、リノール酸、葉酸、フォリン酸、コリン、ピリドキサール塩酸塩、ビオチン、ヒポキサンチン、プリンおよびプリン誘導体、ピリミジンおよびピリミジン誘導体、からなる群から選択される、前記生存疾患細胞の生理特性またはゲノム特性を保存する少なくとも１つの成分を含む培地中で培養される；および／または
（ｖｉ）必要に応じて、腫瘍または疾患微小環境に関連する増殖因子、ＨＧＦ、ＦＧＦ（１〜４型）、エキソソーム、ｍｉＲＮＡ、その他の低分子タンパク質非コードＲＮＡ、より長いタンパク質非コードＲＮＡ、ホルモン、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、および前記疾患細胞中およびその周辺の細胞により産生されるオートクリンまたはパラクリン因子、からなる群から選択される、細胞成長、細胞分裂または細胞周期を促進して細胞増殖を容易にする少なくとも１つの成分を含む無血清培地中で培養される、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記水和細胞外マトリックスが、
（ｉ）必要に応じて、フィブリルおよび親水性表面を含む、フィブロネクチンおよびコラーゲン；または
（ｉｉ）ラミニン３３２（ラミニンＶ）またはコラーゲン−ラミニン３３２（ラミニンＶ）共構造
からなり、必要に応じて、水和され、折り畳まれている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生存疾患細胞が癌細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生存疾患細胞の試料を、水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含むバイオセンサー表面に付着させるステップであって、前記ＥＣＭが、（ｉ）フィブロネクチンおよびコラーゲン；（ｉｉ）コラーゲンおよびラミニン３３２（ラミニンＶ）または；（ｉｉｉ）ラミニン３３２（ラミニンＶ）からなり、それにより、臨床試験のための前記試料を調製する、ステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
臨床検査が、バイオセンサーを使って前記試料で実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
６％〜１７％の酸素を含む条件下、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む培地中で培養される初代ヒト癌細胞を含む、細胞培養組成物。
【請求項１３】
前記培地が少なくとも３種のアノイキス阻害剤を含み、前記細胞が１０％の酸素を含む条件下で培養され、必要に応じて、前記少なくとも３種のアノイキス阻害剤が、少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤、少なくとも１種のＭＭＰ３阻害剤および少なくとも１種のＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を含む、請求項１２に記載の細胞培養組成物。
【請求項１４】
水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコートした細胞培養容器表面上で培養される、請求項１２または１３に記載の細胞培養組成物。
【請求項１５】
前記水和細胞外マトリックスが、（ｉ）必要に応じて、フィブリル表面および親水性表面を含む、フィブロネクチンおよびコラーゲン；または（ｉｉ）ラミニン３３２（ラミニンＶ）またはコラーゲン−ラミニン３３２（ラミニンＶ）共構造からなり；必要に応じて、水和され、折り畳まれている、請求項１４に記載の細胞培養組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明の種々の実施形態の詳細は、下記説明に記述される。本発明の他の特長、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト対象から得られた、臨床検査用の生存疾患細胞の試料を調製する方法であって、
前記ヒト対象から得られた生存疾患細胞の試料を、２％超および２０％未満の酸素を含む条件下、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む培地中で培養すること、および
前記生存疾患細胞の試料で臨床検査を実施すること、を含む方法。
（項目２）
ヒト対象から得られた、臨床検査用の生存疾患細胞の試料を調製する方法であって、
前記ヒト対象から得られた生存疾患細胞の前記試料を、６〜１７％の酸素を含む条件下、少なくとも１種の消化酵素および少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む培地中で培養すること、
前記試料を、６〜１７％の酸素を含む条件下、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含み、消化酵素を欠く培地中で培養すること、を含む方法。
（項目３）
ヒト対象から得られた、臨床検査用の生存疾患細胞の試料を調製する方法であって、
前記ヒト対象から得られた生存疾患細胞の前記試料を、６〜１７％の酸素を含む条件下、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む培地中、水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコートした細胞培養容器表面上で培養すること、を含む方法。
（項目４）
ヒト対象から得られた、臨床検査用の生存疾患細胞の試料を調製する方法であって、
前記ヒト対象から得られた生存疾患細胞の前記試料を、６〜１７％の酸素を含む条件下、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む培地中、水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む細胞培養容器表面上で培養すること、および
（ｉ）フィブロネクチンおよびコラーゲン、（ｉｉ）コラーゲンおよびラミニン３３２（ラミニンＶ）または（ｉｉｉ）ラミニン３３２（ラミニンＶ）からなる水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含むバイオセンサー表面に生存疾患細胞の前記試料を付着させ、それにより、臨床検査用の前記試料を調製すること、を含む方法。
（項目５）
ヒト対象から得られた、臨床検査用の生存疾患細胞の試料を調製する方法であって、
前記ヒト対象から得られた生存疾患細胞の前記試料を、６〜１７％の酸素を含む条件下、少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤、少なくとも１種のＭＭＰ３阻害剤および少なくとも１種のＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を含む培地中で培養し、それにより、臨床検査用の前記試料を調製すること、を含む方法。
（項目６）
ヒト対象から得られた、臨床検査用の生存疾患細胞の試料を、バイオセンサーを使って調製する方法であって、
フィブロネクチンおよびコラーゲンからなる水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含むバイオセンサー表面に生存疾患細胞の前記試料を付着させること、および
バイオセンサーを用いて、生存疾患細胞の前記試料で臨床検査を実施すること、を含む方法。
（項目７）
前記試料が、６〜１７％の酸素を含む条件下で培養される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記試料が、１０％の酸素を含む条件下で培養される、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記試料が、少なくとも１種の内因性アノイキス経路の阻害剤および少なくとも１種の外因性アノイキス経路の阻害剤を含む培地中で培養される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記少なくとも１種のアノイキス阻害剤が、抗アノイキス経路をアゴナイズする、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも１種のアノイキス阻害剤が、キナーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ストレス阻害剤、デスレセプター阻害剤、チトクロムＣ阻害剤および接着関連アノイキス阻害剤からなる群から選択される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記少なくとも１種のアノイキス阻害剤が、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、カスパーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト、レドックス緩衝剤、活性酸素種阻害剤、ＴＮＦ−α阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、チトクロムＣ放出阻害剤、カルシウムチャネル活性化のない炭酸脱水酵素アンタゴニスト、インテグリン安定剤、インテグリンリガンド、Ｆａｓ阻害剤、ＦａｓＬ阻害剤、Ｂａｘ阻害剤およびＡｐａｆ−１阻害剤からなる群から選択される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記試料が、少なくとも３種のアノイキス阻害剤を含む培地中で培養される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
生存疾患細胞の前記試料を、培養の前に、消化培地に一定時間接触させる方法であって、前記消化培地が、アノイキス、細胞表面接着分子損傷または非アノイキス手段による細胞死を生ずることなく、組織を消化する、項目１および項目３〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記消化培地が、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
生存疾患細胞の前記試料が、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む前記培地中で少なくとも１時間培養される、項目１および項目３〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
生存疾患細胞の前記試料が、２０％の酸素を含む条件下で、アノイキス阻害剤を欠く前記培地に移される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
生存疾患細胞の前記試料が、接着経路の活性化を促進する少なくとも１つの成分を含む培地中で培養される、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記少なくとも１つの成分が、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、トリヨードサイロニン、テトラヨードサイロニン、フェチュイン、溶液型の細胞外マトリックス成分、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、細胞間ＣＡＭ、血管ＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、および増殖因子からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
生存疾患細胞の前記試料が、接着の一時的反転を促進し、細胞の１つの容器から別の容器への移動を容易にする少なくとも１つの成分を含む培地中で培養される、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記少なくとも１つの成分が、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、二価の金属イオンキレート化剤などのＣａ２＋、Ｍｇ２＋、および／またはＭｎ２＋キレート化剤、ディスパーゼ、ＴｒｙｐＬＥ、トリプシン、アクターゼ、アキュマックス、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、トリプシン阻害剤、ＳＴＥＭｘｙｍｅ、プロナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼからなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
生存疾患細胞の前記試料が、無血清培地中で培養される、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
生存疾患細胞の前記試料が、前記生存疾患細胞の生理特性またはゲノム特性を保存する少なくとも１つの成分を含む培地中で培養される、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記生存疾患細胞の生理特性またはゲノム特性を保存する少なくとも１つの成分が、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、希少必須金属、ｐＨ緩衝剤（単一または複数）、塩（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ）、亜セレン酸塩、ケイ酸塩、ブドウ糖またはその他の生物学的に実用的な炭素源、脂質、リポ酸などの脂肪酸、ピルビン酸塩、トランスフェリン、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、マイトジェン、エタノールアミン、アルブミン、ホルモン（例えば、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール）、プトレシン、ピルビン酸塩、チミジン、リノール酸、葉酸、フォリン酸、コリン、ピリドキサール塩酸塩、ビオチン、ヒポキサンチン、プリンおよびプリン誘導体、ピリミジンおよびピリミジン誘導体、からなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
生存疾患細胞の前記試料が、細胞成長、細胞分裂または細胞周期を促進して細胞増殖を容易にする少なくとも１つの成分を含む無血清培地中で培養される、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
細胞増殖、細胞分裂、または細胞周期を促進する前記少なくとも１つの成分が、腫瘍または疾患微小環境に関連する増殖因子、ＨＧＦ、ＦＧＦ（１〜４型）、エキソソーム、ｍｉＲＮＡ、その他の低分子タンパク質非コードＲＮＡ、より長いタンパク質非コードＲＮＡ、ホルモン、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、および前記疾患細胞中およびその周辺の細胞により産生されるオートクリンまたはパラクリン因子、からなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
生存疾患細胞の前記試料が、水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む表面に付着される、項目１、２および５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＥＣＭが水和され、折り畳まれている、項目３、４、６および２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記表面がバイオセンサー表面である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記表面が細胞培養容器表面である、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記水和細胞外マトリックスが、フィブロネクチンおよびコラーゲンからなる、項目３、４および２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞外マトリックスが水和され、折り畳まれている、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記フィブロネクチンおよびコラーゲンが、フィブリルおよび親水性表面を含む、項目６または項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記水和細胞外マトリックスが、ラミニン３３２（ラミニンＶ）またはコラーゲン−ラミニン３３２（ラミニンＶ）共構造からなる、項目３、４および２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記ＥＣＭが水和され、折り畳まれている、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
臨床検査が、バイオセンサーを使って前記試料で実施される、項目１〜６および２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記臨床検査が、生存疾患細胞の前記試料を少なくとも１種の薬剤に接触させ、前記試料の前記少なくとも１種の薬剤との接触の前後に、細胞接着または付着を測定することを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記生存疾患細胞が癌細胞である、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
６％〜１７％の酸素を含む条件下、少なくとも１種のアノイキス阻害剤を含む培地中で培養される初代ヒト癌細胞を含む、細胞培養組成物。
（項目４０）
前記培地が少なくとも３種のアノイキス阻害剤を含み、前記細胞が１０％の酸素を含む条件下で培養される、項目３９に記載の細胞培養組成物。
（項目４１）
バイオセンサー表面であって、水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を介して前記バイオセンサー表面に付着した初代ヒト癌細胞を含み、前記ＥＣＭが、（ｉ）フィブロネクチンおよびコラーゲン、（ｉｉ）コラーゲンおよびラミニン３３２（ラミニンＶ）または（ｉｉｉ）ラミニン３３２（ラミニンＶ）からなる、バイオセンサー表面。
（項目４２）
前記水和ＥＣＭが、フィブリル表面および親水性表面を含むフィブロネクチンおよびコラーゲンからなる、項目４１に記載のバイオセンサー表面。
（項目４３）
細胞培養容器表面であって、水和細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を介して前記細胞培養表面に付着した初代ヒト癌細胞を含み、前記ＥＣＭが、（ｉ）フィブロネクチンおよびコラーゲン、（ｉｉ）コラーゲンおよびラミニン３３２（ラミニンＶ）または（ｉｉｉ）ラミニン３３２（ラミニンＶ）からなる、細胞培養容器表面。
（項目４４）
前記水和ＥＣＭが、フィブリル表面および親水性表面を含むフィブロネクチンおよびコラーゲンからなる、項目４３に記載の細胞培養容器表面。
（項目４５）
前記水和ＥＣＭが折り畳まれている、項目４１〜４４に記載の方法。