【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年11月7日(2008.11.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性ペプチド混合物の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）病原体の超可変免疫原性エピトープ配列をデータベースから得ること、ここで、前記免疫原性エピトープ配列が共通残基領域、及び前記配列がそれによって相互に相違する、少なくとも１の可変残基を有する；
（ｂ）上記免疫原性エピトープ配列の少なくとも１の可変残基において見出される、異なるアミノ酸の出現頻度を決定すること、ここで、上記少なくとも１の可変残基が、上記病原体の免疫原性エピトープ配列中の可変残基において最も高い出現頻度で見出されるアミノ酸から選ばれ、該可変残基において１０％〜３０％の頻度閾値よりも高い出現頻度で見出されるアミノ酸を含み；
（ｃ）可変残基において見出されるアミノ酸の出現頻度を至近２５％に概数化すること、ここで、ゼロでない概数化された出現頻度を有するアミノ酸のみが上記ペプチド混合物のペプチド中の上記可変残基位置に含まれ、ここで、４以下の異なるアミノ酸が可変残基について選択され、ここで、可変残基において個々に上記頻度閾値未満で見出される類似するアミノ酸の出現頻度がプールされて、プールされた出現頻度を形成し、プールされた出現頻度は上記概数化された出現頻度を計算するために上記類似するアミノ酸のうちの最も高頻度に見出されたアミノ酸に割り当てられ、ここで、上記類似するアミノ酸は、以下の：芳香族アミノ酸；脂肪族アミノ酸；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸；塩基性アミノ酸；酸性アミノ酸；アミド含有アミノ酸；及び含硫アミノ酸から成る群に属するアミノ酸から選ばれ；及び
（ｄ）２〜６４の異なるペプチドを含むペプチド混合物を合成すること、ここで、各ペプチドは上記共通残基領域、及び上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において見出されるゼロでない概数化された出現頻度を有するアミノ酸から選ばれるアミノ酸を可変残基位置に有し、ここで、上記可変残基において現れる異なるアミノ酸が、上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において現れる各異なるアミノ酸の概数化された出現頻度に比例して、相互に相対的に存在する；
を含む、前記方法。
【請求項２】
免疫原性ペプチド混合物の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）病原体の超可変免疫原性エピトープ配列をデータベースから得ること、ここで、前記免疫原性エピトープ配列が共通残基領域、及び前記配列がそれによって相互に相違する、少なくとも３の可変残基を有する；
（ｂ）上記免疫原性エピトープ配列の少なくとも３の可変残基において見出される、異なるアミノ酸の出現頻度を決定すること、ここで、各可変残基が、上記病原体の免疫原性エピトープ配列中の可変残基において最も高い出現頻度で見出されるアミノ酸から選ばれ、該可変残基において１０％〜３０％の頻度閾値よりも高い出現頻度で見出されるアミノ酸を含み；
（ｃ）アミノ酸が可変残基において見出される出現頻度を至近２５％に概数化すること、ここで、ゼロでない概数化された出現頻度を有するアミノ酸のみが上記ペプチド混合物の上記ペプチド中の上記可変残基位置に含まれ、ここで、可変残基において個々に上記頻度閾値未満で見出される類似するアミノ酸の出現頻度がプールされて、プールされた出現頻度を形成し、プールされた出現頻度は上記概数化された出現頻度を計算するために上記類似するアミノ酸のうちの最も高頻度に見出されたアミノ酸に割り当てられ、ここで、上記類似するアミノ酸は、以下の：芳香族アミノ酸；脂肪族アミノ酸；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸；塩基性アミノ酸；酸性アミノ酸；アミド含有アミノ酸；及び含硫アミノ酸から成る群に属するアミノ酸から選ばれ；及び
（ｄ）８〜６４の異なるペプチドを含むペプチド混合物を合成すること、ここで、可変残基については４以下のアミノ酸が選ばれ、ここで、各ペプチドが上記共通残基領域、及び上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において見出されるゼロでない概数化された出現頻度を有するアミノ酸から選ばれるアミノ酸を可変残基位置に有し、さらにここで、上記可変残基において現れる異なるアミノ酸が、上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において現れる各異なるアミノ酸の概数化された出現頻度に比例して、相互に相対的に存在する；
を含む、前記方法。
【請求項３】
２以下の異なるアミノ酸が各可変残基について選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ステップ（ｄ）がアミノ酸結合を用いて実施され、且つ、アミノ酸をステップ（ｃ）において決定されたそれらの概数化された出現頻度に比例して付加することによって上記可変残基位置が結合される、前記方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記病原体がHCV、インフルエンザウイルス又はHIVである、前記方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により製造される免疫原性ペプチド混合物。
【請求項７】
病原体に対して免疫原性であるペプチド混合物であって、２〜６４の異なるペプチドを含み、各ペプチドが共通残基領域、及び可変残基位置を有し、ここで、
異なるペプチドの上記共通残基領域は、病原体の免疫原性エピトープ配列の可変残基に隣接する、上記病原体の免疫原性エピトープ配列の非可変アミノ酸であり；
上記可変残基位置は、以下の：
（ａ）４以下の異なるアミノ酸が、上記ペプチド混合物の上記異なるペプチドの上記
可変残基位置において存在し；且つ
（ｂ）上記異なるペプチドの上記可変残基位置において存在するアミノ酸は、上記免
疫原エピトープ配列の上記可変残基において、１０％〜３０％の頻度閾値よりも高い出
現頻度で出現する；
という条件下で、上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において最も高頻度で発生するアミノ酸から成る群から選ばれるアミノ酸によって占められる、前記ペプチド混合物。
【請求項８】
請求項７に記載のペプチド混合物であって、ここで、アミノ酸が可変残基位置において現れる出現頻度が以下のスキーム：
上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において発生するアミノ酸の上記出現頻度が、至近２５％に概数化され；そして
ゼロでない概数化された出現頻度を有するアミノ酸が、上記異なるペプチドの上記可変残基位置において、上記概数化された出現頻度に比例した出現頻度で見出される；
によって決定される、前記ペプチド混合物。
【請求項９】
請求項８に記載のペプチド混合物であって、ここで、概数化された出現頻度が２５％未満である類似するアミノ酸が、可変残基位置において現れる出現頻度が、以下のスキーム：
類似するアミノ酸の上記出現頻度がプールされ、そして至近２５％に概数化される、ここで、上記類似するアミノ酸は、以下の：芳香族アミノ酸；脂肪族アミノ酸；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸；塩基性アミノ酸；酸性アミノ酸；アミド含有アミノ酸；及び含硫アミノ酸から成る群に属するアミノ酸から選ばれ；
ゼロでない概数化された出現頻度については、上記概数化された出現頻度は、上記類似するアミノ酸のうちの最も高頻度で発生するアミノ酸に割り当てられる；そして
上記最も高頻度で発生する上記類似するアミノ酸は、上記異なるペプチドの上記可変残基位置において、上記概数化された出現頻度に比例した出現頻度で見出される；
によって決定される、前記ペプチド混合物。
【請求項１０】
脂質部分に結合された請求項７に記載のペプチド混合物を含む、結合ペプチド組成物。
【請求項１１】
タンパク質担体部分に結合された請求項７に記載のペプチド混合物を含む、結合ペプチド組成物。
【請求項１２】
請求項７にしたがって形成された複数のペプチド混合物を含む、免疫原性組成物であって、ここで、前記ペプチド混合物のそれぞれが同じ病原体に対して免疫原性である、前記組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の免疫原性組成物であって、ここで、前記複数のペプチド混合物のそれぞれが、上記同じ病原体の異なる免疫原性エピトープ配列を目標としており、且つ上記異なる免疫原性エピトープ配列が上記病原体表面の密接した近傍の領域中に見出される、前記組成物。
【請求項１４】
請求項７に記載のペプチド混合物及び薬剤として許容可能な担体を含む、病原体に対する免疫応答を引き起こすためのワクチン。
【請求項１５】
病原体による対象の感染のインビトロのアッセイ方法であって、以下のステップ：
上記対象から得られた生物学的サンプルを、上記病原体の免疫原性エピトープ配列に基づく、請求項１又は２に記載の方法により製造された免疫原性ペプチド混合物と接触させること；及び
前記ペプチド混合物との前記サンプルの免疫原性の応答を測定すること；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
病原体による対象の感染を決定するための診断キットであって、以下の：
上記病原体の免疫原性エピトープ配列に基づく、請求項１又は２に記載の方法により製造された免疫原性ペプチド混合物；及び
上記免疫原性ペプチド混合物との、抗体を含有する対象の生物学的サンプルの免疫原性の応答を評価するための指示書；
を含む、前記キット。
【請求項１７】
病原体に対して免疫原性である抗体の単離方法であって、以下のステップ：
請求項７に記載のペプチド混合物をヒト以外の対象に投与すること；及び
上記ペプチド混合物の投与によって誘導された抗体を上記対象から得ること；
を含む、前記方法。
【請求項１８】
病原体に対して免疫原性である抗体をコードする遺伝子の単離方法であって、以下のステップ：
請求項７に記載のペプチド混合物をヒト以外の対象に投与すること；
上記ペプチド混合物の投与によって誘導された抗体を対象から得ること；及び
上記抗体をコードする遺伝子を単離すること；
を含む、前記方法。
【請求項１９】
病原体と反応性である抗体のすべて又は部分をコードする遺伝子又は遺伝物質の部分の単離方法であって、以下のステップ：
請求項７に記載のペプチド混合物をヒト以外の対象に投与すること；
上記ペプチド混合物の投与によって誘導された、上記病原体と反応性である抗体又はその部分を上記対象から得ること；及び
上記病原体と反応性である抗体又はその部分をコードする遺伝子又は遺伝物質の前記部分を単離すること；
を含む、前記方法。
【請求項２０】
病原体に対する免疫療法のための医薬組成物であって、請求項１９に記載の方法によって得られた遺伝子又は遺伝物質の部分によってコードされるペプチド又はタンパク質を含む、前記医薬組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
脂質部分に結合した、又はタンパク質担体部分に結合した発明のペプチド混合物を含む結合ペプチド組成物は、本発明によって形成されることができる。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
図１に、ＨＥＣの製造方法の模式的ダイアグラムを例解する。すなわち、ステップ１において、病原体の免疫原性エピトープの配列が得られる。該エピトープは、多様な既知の配列中の異なるアミノ酸によって表される、少なくとも１の可変残基を有する。各異なるアミノ酸がエピトープ配列の可変残基において発生する出現頻度は、ステップ２において決定され、そして所定の頻度閾値と比較される。頻度閾値は、エピトープ配列中で比較的少量あらわされるアミノ酸が閾値以下に含まれ、したがって、得られるペプチド混合物中にはあらわされないように、設定される。頻度閾値を満たすアミノ酸は、ペプチド合成の間のステップ３において可変残基位置における付加のための候補である。頻度閾値未満の量で表されるアミノ酸はペプチド合成の間、可変残基位置では使用されない。最終的に、ペプチド混合物の合成は、可変残基位置において、頻度閾値を超えるアミノ酸が免疫原性エピトープ中での発生出現頻度に比例する量で付加されるように、いずれかの合成経路を用いて行われる。頻度閾値は、１０％〜３０％の範囲であることができ、得られた合成ペプチド混合物は約１００を超える異なる配列を含むような、あまり複雑のものであってはならない。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４８】
ステップ６において、可変残基において見出され、ゼロでない概数化された出現頻度（例えば、２５％、５０％、７５％又は１００％の出現頻度）を有するアミノ酸が、ペプチド合成の間にそれらの概数化された出現頻度に比例する量で付加される。もし、概数化された出現頻度の合計が１００％に満たない場合、概数化された出現頻度の合計は可変残基においてアミノ酸を付加するときに使用する比例パーセンテージに達するように、それによって各概数化された出現頻度が割られる分母として使用される。例えば、第１アミノ酸が６０％の出現頻度で可変残基に存在し、第２アミノ酸が３０％の出現頻度で可変残基に存在する場合、他のアミノ酸又はプールされたアミノ酸の組み合わせはゼロでない出現頻度で存在すると概数化されない。したがって、第１アミノ酸は５０％と切り下げられ、第２のアミノ酸は２５％と切り下げられる。第１及び第２の概数化された出現頻度の合計が７５％であるため、合成の間に付加される各アミノ酸の比率は、各概数化された出現頻度を合計である７５％で割ることによって計算されることができる。したがて、第１のアミノ酸が５０％割る７５％（又は６６．７％）の量で付加され、第２のアミノ酸は２５％割る７５％（又は３３．３％）の量で付加される。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
ステップ５はまた、可変残基については４以下のアミノ酸が選ばれるという但し書きを含む。この場合、例えば、５の異なるアミノ酸が可変残基位置において約２０％の等しい出現頻度で発生する場合、各アミノ酸は２５％の概数化された出現頻度を有する。したがって、すべてのゼロでない概数化された出現頻度の合計は１２５％となる。しかしながら、４のアミノ酸の最大値がこのステップにおいて合算されることができるため、５の異なるアミノ酸のうちの最も高頻度で発生する４つが選択され、そしてゼロでない出現頻度の合計が１００％となる。この場合、４つの最も高頻度で発生するアミノ酸のそれぞれが、この可変残基において２５％の量で加えられる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７８】
ペプチド混合物を冷エーテルで抽出する。ペプチド／TFA溶液を、窒素ガス下での蒸発によって小容量（約１ml）に減少させる。（２５容量の）エーテルをペプチド溶液に添加し、混合する。ドライアイス上での５分間のインキュベーションに続いて、サンプルを１，０００×ｇで５分間遠心分離し、エーテルを除去する。この抽出方法を３回繰り返す。続いて、ペプチド混合物溶液を、エーテル抽出と同じやり方で酢酸エチル：エーテル（v/v）（１．５：１）で３回抽出する。最後のエーテル抽出に続いて、残留エーテルを窒素ガス下で蒸発させ、ペプチド混合物を水に再懸濁して凍結乾燥する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８２】
ELISAアッセイ
所定のHECに対する応答の試験を、標準的な方法を使用して、固相酵素結合免疫アッセイ（ELISA）によって実施した。すなわち、HEC、ペプチド、又はタンパク質を０．０５M炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH９．５に溶解し、そして平底マイクロタイタープレート（Corning, NY）に適用した。ペプチド及びタンパク質を１ng／ウエルでプレートに加えた一方、ウイルスは５００μg／ウエルでプレートに加えた。試験血清とのインキュベーションに続いて、アルカリホスファターゼ標識二次抗体（抗マウス又は抗サル）（Fisher, Pittsburgh, PA）によって抗原結合一次抗体を検出した。光学密度を４０５nmにおいて、自動プレートリーダー（BioRad 3550）を使用して測定した。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８４】
T細胞増殖反応
抗原及びマイトゲン（PHA-P、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を１〜１０μg／ウエルの濃度で３連で９６穴丸底プレートに入れた。全血を免疫化したサルから得て、PBS中１：２に希釈し、Ficollグラジエント（LSM, Organon Teknika Corp., Durham, NC）上へ重ね、室温で２００×ｇで３０分間遠心分離した。リンパ細胞を集め、洗浄し、計数し、そして１０％FCS,L-グルタミン及び抗生物質を含むRPMI-1640培地中、１×１０6生細胞／mlの濃度に調節した。０．１mlのリンパ細胞懸濁液を傾けて抗原を含む９６穴プレートの各ウエルに注いだ。プレートを３７℃、及び５％CO2でインキュベートした。マイトゲンとともに３日間、又は抗原とともに６日間インキュベートした後、１μCiの3H-チミジンとともに１６〜１８時間インキュベートし、ただちにWallac（登録商標）セルハ−ベスタ−のグラスファイバーフィルターペーパー上へ採集した。水性シンチレーション液（Scintisafe, Fisher Scientific）の添加後、3H−チミジンの取り込みを、LKB Wallac 1209 Rackbeta（登録商標）液体シンチレーションカウンターによって測定した。結果を平均し刺激指数（SI）で表し、実験（抗原又はマイトゲン）の毎分の平均カウント（CPM）割る対照（細胞のみ）の平均cpmを計算した。２より高い平均SI値を顕著であるとみなした。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８５】
CTLアッセイ
脾臓細胞をRPM1640組織培養培地中に懸濁する。特異的再刺激のために、３×１０7の反応細胞を１．５×１０6の同系の抗原パルスした脾臓細胞（２０，０００radで照射）と、５日間、加湿したCO2大気中、３７℃において直立２５ml組織培養フラスコ中の１０mlの培地中で同時培養した。非特異的再刺激のために、反応細胞をインターロイキン２（IL-2）を１０IU/mlで含む培地中で一夜培養した。抗原特異的に及び非特異的に刺激された脾臓細胞を５日間の培養後に採集し、培地で２回洗浄した；これらは、エフェクター細胞として働く。エフェクターの特異的細胞溶解活性を、９６丸底ウエル中の２００μlの培地中、エフェクター細胞の希釈液と２×１０3の51Cr-標識標的細胞（抗原で４時間パルスした同系の脾臓細胞）を使用して試験する。１００μlの上清を集め、ガンマカウンターで読み取った。特異的溶解を以下のように計算した。
【化１】
2005531499.tif 000001
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０２】
実施例４：SIV由来HECと脂質部分の結合
強力なTヘルパー細胞及び抗体の応答の誘導に加えて、脂質部分に結合した場合、HECは、細胞障害性Tリンパ細胞（CTL）応答を誘導することもできる。CTLの誘導に使用するリポ-HECを、パム（Pam）を樹脂に結合した、SIVに基づくHECに結合させることによって調製する。これは、リポタンパクを作製するための標準的な方法である。マウスをリポーHEC及びアジュバント（リポーHEC）又はPBS及びアジュバント（A-PBS）で免疫化し、これらのマウス並びに未処理マウスからの脾臓細胞を、HECとともにインキュベートした標的細胞に対するCTL活性について試験した。図１５に示すデータは、非特異的バックグラウンド溶解を差し引いた後の特異的溶解のパーセントを示す。観察された特異的溶解は、２の免疫化を受けた動物からのみ得られた。一回の免疫化のみの後には溶解は観察されなかった（データは示さない）。図１５は、リポ−HECによる免疫化が顕著なCTL活性を誘導することを実証する。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０７】
本発明の実施態様が、添付された図面を参考にして、例示のみによって記載される。
【図１】図１は、本発明の実施態様によるHECの合成のための単純化されたスキームである。
【図２】図２は、本発明の実施態様によるペプチド混合物の製造方法のダイアグラムによる表現である。
【図３】図３は、本発明による、1型ヒト免疫不全症候群ウイルス（HIV-1）に基づく５のHECの合成のために選ばれたアミノ酸を例解する。
【図４】図４は、HIV-1HECによる非ヒト霊長類（サル）の免疫化がTヘルパー細胞応答を誘導することを実証する。
【図５】図５は、HIV-1HEC１〜５による免疫化によってサルにおいて誘導された強力な抗体力価を例解する。
【図６】図６は、HIV-1HECによる免疫化によって誘導された抗体が、異なる系統のHIV-1からのエピトープに結合することを実証する。
【図７】図７は、HIV-1HEC1〜５によって免疫化したサルから得られた抗体が、ヒト末梢血リンパ細胞（PBLｓ）の異なる系統のHIV-1感染を中和することを示す。
【図８】図８は、異なるHIV-１サブタイプA、B、C、D、E、及びFに感染した血清陽性の患者からの抗体がHIV-1に基づくHEC１〜５を認識することを実証する。
【図９】図９は、C型肝炎ウイルス（HCV）に基づく２のHECの設計を説明する。
【図１０】図１０は、インフルエンザAのヘマグルチニンエンベロープタンパク質上に見出される抗原シフトコンビネーション部位に基づく４のHECの設計を説明する。
【図１１】図１１は、図１０のインフルエンザHECによって免疫化したマウスのTヘルパー細胞応答を実証する。
【図１２】図１２は、図１０のインフルエンザHECによって免疫化したマウスの抗体応答と非関連ペプチドによる免疫化との比較を例解する。
【図１３】図１３は、SIV由来HECで免疫化後のBalb/cマウスの免疫応答を例解する。この図は、それらの主要組織適合性（MHC）遺伝型によって、単一のSIV由来エピトープに対して免疫応答を引き起こすことのできないBalb/cマウスにおいては、同じエピトープに基づくHECによる免疫化が免疫応答を引き起こすことを実証する。
【図１４】図１４は、マウスからの抗体とSIVとの結合を実証する。データは、SIV HECによる非反応系統のマウスの免疫化によって生じる抗体が、多様なHECがそれに基づくところのウイルスへ結合することができることを実証する。
【図１５】図１５は、HECの脂質部分への結合が細胞障害性Tリンパ細胞（CTL）応答を可能とすることを示す。
【図１６】図１６は、本発明によって決定された多数のペプチドを含む、５のペプチド混合物の組成を例解する。