(57)【要約】本発明は、ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：（１−ａ）前記疎水性薬物を低級アルコールに溶解または分散し、（１−ｂ）親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーからなる前記ポリマーミセルを含有する水性媒体を準備し、（１−ｃ）該疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、前記ポリマーミセルを含有する該水性媒体とを混合することで、該ポリマーミセル中に該疎水性薬物を内包させる；を含んでなり、ここで前記疎水性薬物の水溶解度は、前記低級アルコール中での溶解度よりも低い、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：
（１−ａ）前記疎水性薬物を低級アルコールに溶解または分散し、
（１−ｂ）親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーからなる前記ポリマーミセルを含有する水性媒体を準備し、
（１−ｃ）該疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、前記ポリマーミセルを含有する該水性媒体とを混合することで、該ポリマーミセル中に該疎水性薬物を内包させる；
を含んでなり、ここで前記疎水性薬物の水溶解度は、前記低級アルコール中での溶解度よりも低い、方法。
【請求項２】
前記段階（１−ｃ）が、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、前記ポリマーミセルを含有する前記水性媒体に添加することを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記段階（１−ｃ）が、前記ポリマーミセルを含有する前記水性媒体を、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液に添加することを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記段階（１−ｃ）において、さらに前記低級アルコール溶液又は分散液と前記水性媒体との混合物にエネルギーを与えることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記段階（１−ｃ）の後、さらに前記低級アルコールを除去または濃度を低下させる段階を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：
（２−ａ）前記疎水性薬物及び親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーの両者を低級アルコールに溶解または分散し、
（２−ｂ）該疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、水性媒体とを混合することで、該ブロックコポリマーからポリマーミセルを形成するとともに、該ミセル中に該疎水性薬物を内包させる；
を含んでなり、ここで前記疎水性薬物の水溶解度は、前記低級アルコール中での溶解度よりも低い、方法。
【請求項７】
前記段階（２−ｂ）が、前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、前記水性媒体に添加することを含んでなる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記段階（２−ｂ）が、前記水性媒体を、前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液に添加することを含んでなる、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記段階（２−ｂ）において、さらに前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した水性媒体と低級アルコールとの混合物にエネルギーを与えることを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記段階（２−ｂ）の後、さらに前記低級アルコールを除去または濃度を低下させる段階を含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記水性媒体が水又は水性緩衝液である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記ブロックコポリマーの親水性領域がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記疎水性領域がアミノ酸および／又はその誘導体からなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アミノ酸および／又はその誘導体がグルタミン酸またはアスパラギン酸および／又はそれらの誘導体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記疎水性薬物が抗がん剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗生物質、中枢神経薬、末梢神経系薬、ホルモン剤、麻酔薬及び鎮痛剤からなる群から選ばれる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノール等の低級アルコールを薬物導入媒体として用いることにより、疎水性薬物をポリマーミセルに内包させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水難溶性または疎水性の薬物の生物学的利用能を高めるべく、薬物をリポソームやポリマーミセルなどの粒子に内包した系が知られている。これらのうち、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントを有するブロックコポリマーを用い、疎水性ポリマーセグメントと薬物との疎水性結合形成能を始めとする相互作用を介して薬物を該ポリマーのミセル中に内包する方法は、広範な薬物への適用が可能であり、しかもナノメーターサイズの非常に小さな薬物内包ポリマーミセルを提供できることから、特に関心が持たれている（特許第２７７７５３０号）。腫瘍部位では新生血管に２００ｎｍ程度の間隙があることが知られており、ナノメーターサイズの粒子はその間隙から漏れ出し、腫瘍へ蓄積することが知られている。薬物内包ポリマーミセルはその粒子径が大きいと腫瘍への薬物の集積性が減少してしまうことが考えられる。そのため、粒子径は２００ｎｍ以下、好ましくは１５０ｎｍ以下であることが望ましい。また、治療効果の観点から、ポリマーミセルに内包される薬物量は多い方が望ましい。更に、薬物は往々にして高価であり、経済的及び生産的効率を考慮すると、薬物が高い収率でポリマーミセル内に内包されることが所望される。
親水性セグメントおよび疎水性セグメントを有するブロックコポリマーを使用して疎水性薬物を内包したポリマーミセルの製造方法としては、薬剤の内包率の高さやミセル粒子径の小ささの観点から、いわゆる乾固法が有利である（特開２００３−３４２１６８号公報）。乾固法は、ブロックコポリマーと疎水性薬物を揮散性の有機溶媒に分散溶解して溶液を形成した後、該有機溶媒を除去し、こうして得られる残存物を水と一緒にし、次いで該残存物が水に均一分散するのに十分な時間、所定の温度で撹拌することで、制御された粒子径の薬物内包ポリマーミセルを含有する製剤を製造する。
しかしながら、乾固法は一般に薬物とポリマーミセルを長時間、例えば一晩中攪拌することを要し、また生成される薬物の内包率や粒子径も満足たる成果が得られない場合もあった。また、乾固法ではジクロロメタンやクロロホルムといった有機溶媒が一般に使用され、その毒性が懸念されてもいる。従って、そのような毒性の高い有機溶媒を使用することなく、薬物をブロックコポリマーに内包させる簡便な方法が所望される。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、短時間でかつ簡単に、しかも高い内包率において粒子径の小さい薬物内包ポリマーミセルの形成を可能にする方法の提供を課題とする。
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、薬物導入媒体としてエタノールやメタノールといった低級アルコールを用いることにより、親水性及び疎水性領域を有するブロックコポリマーからなるミセル内に薬物を簡単に導入出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
本願発明は以下の態様を含む。
［１］ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：
（１−ａ）前記疎水性薬物を低級アルコールに溶解または分散し、
（１−ｂ）親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーからなる前記ポリマーミセルを含有する水性媒体を準備し、
（１−ｃ）該疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、前記ポリマーミセルを含有する該水性媒体とを混合することで、該ポリマーミセル中に該疎水性薬物を内包させる；
を含んでなり、ここで前記疎水性薬物の水溶解度は、前記低級アルコール中での溶解度よりも低い、方法。
［２］前記段階（１−ｃ）が、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、前記ポリマーミセルを含有する前記水性媒体に添加することを含んでなる、［１］の方法。
［３］前記段階（１−ｃ）が、前記ポリマーミセルを含有する前記水性媒体を、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液に添加することを含んでなる、［１］の方法。
［４］前記段階（１−ｃ）において、さらに前記低級アルコール溶液又は分散液と前記水性媒体との混合物にエネルギーを与えることを含む、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］前記段階（１−ｃ）の後、さらに前記低級アルコールを除去または濃度を低下させる段階を含む、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：
（２−ａ）前記疎水性薬物及び親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーの両者を低級アルコールに溶解または分散し、
（２−ｂ）該疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、水性媒体とを混合することで、該ブロックコポリマーからポリマーミセルを形成するとともに、該ミセル中に該疎水性薬物を内包させる；
を含んでなり、ここで前記疎水性薬物の水溶解度は、前記低級アルコール中での溶解度よりも低い、方法。
［７］前記段階（２−ｂ）が、前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、前記水性媒体に添加することを含んでなる、［６］の方法。
［８］前記段階（２−ｂ）が、前記水性媒体を、前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液に添加することを含んでなる、［６］の方法。
［９］前記段階（２−ｂ）において、さらに前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した水性媒体と低級アルコールとの混合物にエネルギーを与えることを含む、［６］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］前記段階（２−ｂ）の後、さらに前記低級アルコールを除去または濃度を低下させる段階を含む、［６］〜［９］のいずれかの方法。
［１１］前記水性媒体が水又は水性緩衝液である、［１］〜［１０］のいずれかの方法。
［１２］前記ブロックコポリマーの親水性領域がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、［１］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］前記疎水性領域がアミノ酸および／又はその誘導体からなる、［１］〜［１２］のいずれかの方法。
［１４］前記アミノ酸および／又はその誘導体がグルタミン酸またはアスパラギン酸および／又はそれらの誘導体である、［１３］の方法。
［１５］前記疎水性薬物が抗がん剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗生物質、中枢神経薬、末梢神経系薬、ホルモン剤、麻酔薬及び鎮痛剤からなる群から選ばれる、［１］〜［１４］のいずれかの方法。
本発明により、短時間でかつ簡単に、しかも高い内包率において粒子径の小さい薬物内包ポリマーミセルの形成が可能となる。また、本発明において使用する空ミセルは大量調製が可能である。それ故本発明によれば大量に調製しておいた空ミセルに薬物を簡単に内包させることができるため、本発明は薬物内包ミセルのスクリーニングにも利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明者は、驚くべきことに、薬物導入媒体としてエタノールやメタノールといった低級アルコールを用いることにより、親水性及び疎水性領域からなるブロックコポリマーのミセル内に薬物を、短時間でかつ簡単に、しかも高い内包率で粒子径の小さい薬物内包ポリマーミセルの形成が可能となることを見出した。
本発明は内包すべき疎水性薬物の水／低級アルコール中での溶解度の違いを利用した方法である。疎水性薬物は水よりも有機溶媒中で高い溶解度を有する。従って、疎水性薬物を予め有機溶媒に溶解又は分散させておき、その後薬物の周囲を水性環境に置換して該疎水性薬物の溶解度を下げることで該疎水性薬物を高分子ポリマーミセルの疎水性部分内に内包させることができると考え、有機溶媒としてエタノールやメタノールといった低級アルコールを利用してみたところ、驚くべきことに薬物は空ミセルに混合されて瞬時にミセル内に内包されることを見出した。
具体的には、本発明の方法の一つの態様は以下の段階を含む。
（１−ａ）疎水性薬物を低級アルコールに溶解または分散し、
（１−ｂ）親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーからなるポリマーミセルを含有する水性媒体を準備し、
（１−ｃ）該疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、前記ポリマーミセルを含有する該水性媒体とを混合することで、該ポリマーミセル中に該疎水性薬物を内包させる。
上記段階（１−ａ）における「溶解または分散」の“分散”とは、低級アルコール中で溶質が均一に分散され、沈殿を生じていない状態を意味する。
上記段階（１−ｂ）におけるポリマーミセルの形成は、例えばブロックコポリマーを含む溶液を攪拌することで行うことができる。好ましくは、ミセルの形成には超音波、圧力および／または剪断力の如きエネルギーをかけて行う。超音波を使用する場合、例えばＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（日本精機）を用い、レベル４、氷冷しながら１秒間欠、５分〜１０分間照射することによって行うことができる。
上記段階（１−ｃ）では、疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、ポリマーミセルを含有する前記水性媒体に添加してもよいし、ポリマーミセルを含有する前記水性媒体を、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液に添加して混合してもよい。添加は、添加される側の溶液又は媒体などを攪拌しながら、徐々に行うのが好ましい。また混合は、混合溶液又は媒体に超音波、圧力および／または剪断力の如きエネルギーをかけて行ってよい。超音波を使用する場合、例えば上記ポリマーミセルの形成と同じ条件で行うことができる。
本発明の方法のもう一つの態様は以下の段階を含む。
（２−ａ）疎水性薬物及び親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーの両者を低級アルコールに溶解または分散し、
（２−ｂ）該疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、水性媒体とを混合することで、該ブロックコポリマーからポリマーミセルを形成するとともに、該ミセル中に該疎水性薬物を内包させる。
上記段階（２−ａ）における「溶解または分散」の“分散”も、低級アルコール中で溶質が均一に分散され、沈殿を生じていない状態を意味する。
上記段階（２−ｂ）では、疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、水性媒体に添加してもよいし、水性媒体を、疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液に添加してもよい。添加は、添加される側の溶液又は媒体などを攪拌しながら、徐々に行うのが好ましい。
上記段階（２−ｂ）におけるミセル形成も、例えばブロックコポリマーを含む溶液を攪拌することで行うことができ、好ましくは、ミセルの形成には超音波、圧力および／または剪断力の如きエネルギーをかけて行う。超音波を使用する場合、例えば上記（１−ｂ）におけるポリマーミセルの形成の形式と同じ条件で行うことができる。
薬物内包ポリマーミセルを調製した後に低級アルコールを除去する場合は、限外ろ過、透析などにより、所望の水性媒体に置き換えることができ、さらに、低級アルコールの揮発、超遠心などの方法によっても行うことができるがこれらの方法に限定されない。また、低級アルコールの濃度を低下させる場合は、水、緩衝液または生理食塩水などにより希釈することで行うことができるがこれらの方法に限定されない。また、上記の低級アルコールを除去する方法によっても、低級アルコールを希釈できることは言うまでもない。
・低級アルコール
本発明でいう「低級アルコール」とは、疎水性薬物が水性媒体に比べその中で高い溶解度を示し、かつ水と混和するものをいい、特に限定されるわけではないが、好ましくは炭素数が１〜７個、より好ましくは１〜４個の低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロピルアルコール、ｉｓｏ−プロピルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等である。特にエタノールまたはメタノールが好ましい。
・疎水性薬物
本発明の方法に従い、ポリマーミセルに効率よく内包できる疎水性薬物は、水溶解度が低級アルコール中での溶解度よりも低い、あらゆる薬物であってよく、各種抗がん剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗生物質、中枢神経薬、末梢神経系薬、ホルモン剤、麻酔薬、鎮痛剤など、様々である。抗がん剤の例として、ドセタキセル、タミバロテン、エキセメスタン、フルタミド等が挙げられる。中枢神経系薬の例として、プロホフール、ブコローム、ビペリデン、トリアゾラム、ケトプロフェン、フェイトニン、アモバルビタール、イブプロフェン、インドメタシン等が挙げられる。末梢神経系薬の例として、リドカイン、キシロカイン、フロプロピオン等が挙げられる。ホルモン剤の例として、オキセンドロン、テストステロン、エストラジオール、マキサカルシトール等が挙げられる。その他、アルプロスタジル、ピレタニド、フロセミド、ミコナゾール、各種疎水性ビタミン類、ヒノキチオール等が挙げられる。尚、本発明においては、「薬物」は医薬品に限定されず、生体内で生理作用を発揮する、あらゆる低分子化合物を意味する。ここで低分子とは分子量が１５００以下のものをいう。
使用する薬物の量は特に制限されないが、一般的にはブロックコポリマーと薬物の総重量に対して、０．１〜５０、好ましくは０．１〜３０重量％が使用される。
・水性媒体
本発明でいう水性媒体とは、疎水性薬物のその中での溶解度が、本発明の低級アルコール中での溶解度よりも低いあらゆる水性媒体であってよく、例えば水、生理食塩水、緩衝能を有する水性緩衝液、例えばリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液などが上げられる。特に好ましいのは水である。
・疎水性薬物及び親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマー
本発明の薬物内包ポリマーミセルを形成するのに用いることのできるポリマーは、親水性領域と疎水性の領域からなるブロックコポリマーであり、これらのブロックコポリマーは、本発明の目的に沿うものであれば、いかなる親水性領域といかなる疎水性領域とを含むものであってもよいが、具体的には、次のようなものを包含する。
限定されるものでないが、親水性領域としては、ポリ（エチレングリコール）［またはポリ（エチレンオキシド）］、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸あるいはこれらの誘導体由来の領域が挙げられる。ここでポリサッカライドとしては、デンプン、デキストラン、フルクタン、ガラクタン等が挙げられる。これらのうち、ポリ（エチレングリコール）セグメントは片末端に種々の官能基を有するものが提供されており、また、領域の大きさも制御されたものが容易に利用できることから、好ましい。
他方、限定されるものではないが、全体として、疎水性の領域としては、酸性アミノ酸、特に、ポリ（アスパラギン酸）及び／又はその誘導体、ポリ（グルタミン酸）及び／又はその誘導体を挙げることができる。具体的には、限定されるものではないが、例えばポリ（β−ベンジルアスパルテート）、ポリ（β−ベンジルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アルキルアスパルテート）、ポリ（β−アルキルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アリルアスパルテート）、ポリ（β−アリルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アリルアスパルテート）、ポリ（β−アラルキルアスパルテート−コ−アスパラギン酸）、ポリ（β−アラルキルアスパルテート）、ポリ（γ−ベンジルグルタメート）、ポリ（γ−ベンジルグルタメート−コ−グルタミン酸）、ポリ（γ−アルキルグルタメート）、ポリ（γ−アルキルグルタメート−コ−グルタミン酸）、ポリ（γ−アラルキルグルタメート）、ポリ（γ−アラルキルグルタメート−コ−グルタミン酸）、ポリ（β−アルキルアスパルタミド−コ−アスパラギン酸）、ポリ（γ−アラルキルグルタミド−コ−グルタミン酸）などのポリ（酸性アミノ酸誘導体）を挙げることができる。
本発明で用いることのできるブロックコポリマーは、上記の親水性領域と疎水性の領域からなり、水性媒体（例えば、水または緩衝化された水もしくは水混和性溶媒、メタノール、ポリエチレングリコール、糖類、等を含有する水性溶液）中でポリマーミセルを形成しうる、それぞれの分子量を有する領域の組み合わせからなるすべてを挙げることができるが、好ましくは、親水性領域がポリ（エチレングリコール）からなり、疎水性の領域が上記のポリ（アミノ酸）及び／又はその誘導体からなるものである。
このようなポリ（アミノ酸誘導体）セグメントは、それ自体公知の、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルまたは、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸ベンジルエステルから調製することができる。ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルまたは、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸ベンジルエステルの調製は、肩末端が保護され、もう一方の末端がアミノ基であるポリエチレングリコール、例えば、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２を開始剤として、脱水された有機溶媒中で、Ｎ−カルボキシ−β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ−ＮＣＡ）もしくは、Ｎ−カルボキシ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート（ＢＬＧ−ＮＣＡ）を所望の重合度（アミノ酸ユニット数）となるように添加し、反応させることにより得ることができる。
上記で得られたブロックコポリマーの末端をアセチルクロライドまたは無水酢酸よりアセチル化を施した後、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去してポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸またはポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸とした後、有機溶媒中で、所望のエステル化率となるようにベンジルアルコールを添加し、縮合剤、例えば、Ｎ−Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ−Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）存在下で反応させることにより、部分的にベンジルエステルを有するブロックコポリマーを得ることができる。
さらに、例えば、ベンジルアルコールの代わりに、１−オクタノールを反応させれば、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸オクチルエステル、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸オクチルエステルが得られ、同様に１−ドデカノールを用いれば、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ドデシルエステルが、１−ヘキサデカノールを用いればポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ヘキサデシルエステルをそれぞれ得ることが出来る。
また、アミド結合により疎水性側鎖を導入する場合は、前述の通り、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルまたは、ポリエチレングリコール−コ−ポリグルタミン酸ベンジルエステルをアセチル化を施した後、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去したカルボキシル基にアミノ基を有する疎水性側鎖を反応させるか、ポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルと一級アミンを有する化合物を反応させ、アミノリシスを利用してエステル結合からアミド結合へ変換して導入することができる。
さらに、はじめに所望のアミド化率になるように有機溶媒中で１−オクチルアミンなどをポリエチレングリコール−コ−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルに添加して一定時間反応させた後、未変換のベンジルエステルに対して大過剰量の１，８−ジアミノオクタンなどを加えることにより、疎水性基の末端がアミノ基で置換された疎水性側鎖とアミノ基で置換されていない疎水性側鎖が混在するポリ（アミノ酸誘導体）セグメントにすることもできる。エステル化又はアミド化の割合は、アミノ酸ユニット数全体に対して４０％〜１００％である。アスパラギン酸、グルタミン酸は、いずれかの光学活性型のものであるか、それらの混合物であることができる。以上の親水性セグメントと疎水性のセグメントは、それ自体既知の例えば、エステル結合、アミド結合、イミノ結合、炭素−炭素結合、エーテル結合等で連結されうる。
特に、製造容易であり、本発明で都合よく使用できるブロックコポリマーとしては、下記式（Ｉ）および（ＩＩ）で示すことのできるものを挙げることができる。
2007136134.tif 000002
または
2007136134.tif 000003
上記各式中Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子または保護されていてもよい官能基が置換したもしくは未置換の低級アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ２９脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し、Ｒ４は水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し、Ｒ５は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、Ｒ６は、水素原子、フェニル基、−（ＣＨ２）４−フェニル基、未置換もしくは、アミノ基またはカルボキシル基で置換されたＣ４〜Ｃ１６アルキル基、またはベンジル基を表し、Ｒ７はメチレン基またはエチレン基を表し、ｎは１０〜２５００の整数であり、ｘは１０〜３００となる整数であり、ｍは０〜３００となる整数であり（但し、ｍが存在する場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＲ７ＣＨＮＨ）のユニット、又は（ＮＨＣＨＣＯ）と（ＮＨＣＨＲ７ＣＯ）のユニットはランダムに存在し、Ｒ６は１つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ユニットにおいて任意に選択可能であるが、Ｒ６が水素原子である場合、ｘ＋ｍの全体の６０％未満である）、ｙは１又は２の整数を表し、Ｌ１は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｚ−Ｓ−Ｚ−および−ＯＣＯ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ１〜Ｃ６アルキレン基である。）からなる群より選ばれる連結基を表し、Ｌ２が−ＯＣＯ−Ｚ−ＣＯ−および−ＮＨＣＯ−Ｚ−ＣＯ−（ここで、Ｚは独立してＣ１〜Ｃ６アルキレン基である。）から選択される連結基を表す。保護されていてもよい官能基としては、ヒドロキシル基、アセタール基、ケタール基、アルデヒド基、糖残基等が挙げられる。Ｒ１およびＲ３が保護されていてもよい官能基が置換した低級アルキル基を表す場合の親水性セグメントは、例えば、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９７／０６２０２に記載の方法に従うことができる。低級アルキルとは炭素数が例えば７個以下、好ましくは４個以下の直鎖又は分枝鎖アルキル基を意味し、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基などが含まれる。
形成した薬物内包ポリマーミセルについて、必要であれば、それを含有する水性溶液を孔径０．２２μｍの親水性フィルターでろ過する。０．２２μｍのフィルターは、通常、注射剤（静脈注射用、動脈注射用、筋肉注射用、腹腔内注射用、等）の調製に際して、使用されることが公知である。薬物内包ポリマーミセル水溶液は、０．２２μｍのフィルターを用いて除菌ろ過しても、極めて高収率で除菌済み薬物内包ポリマーミセル水溶液を得ることができる。すなわち、本発明によれば、注射剤が効率よく提供できる。このような注射剤は、本発明の好適な態様の一つとして、各種の糖類および／または各種のポリエチレングリコール（マクロゴール）を、低級アルコールの濃度を低下させたおよび／または除去した除菌ろ過前の薬物内包ポリマーミセル水溶液（または水性溶液）に加える工程をさらに含んでなる方法により製造できる。限定されるものでないが、使用できる糖類としては、マルトース、トレハロース、キシリトール、グルコース、スクロース、フルクトース、ラクトース、マンニトールおよびデキストリン等が挙げられ、使用できるポリエチレングリコールとしては、分子量が約１０００〜約３５０００であって、例えば、マクロゴール１０００、１５４０、４０００、６０００、２００００および３５０００等が挙げられる。こうして、本発明によれば、注射剤中で薬物内包ポリマーミセルを安定化しうる助剤を注射剤に簡易、かつ、安全に加えることができる。
このような注射剤は簡易、かつ、安全に製造できるだけでなく、それらを凍結乾燥した場合には、乾燥製剤を水または水性溶液を用いて薬物内包ポリマーミセル含有溶液に再溶解または再構成するときでも、ミセル粒子間での凝集がほとんど起こらない注射液が提供できる。
凍結乾燥製剤が上記のような作用効果を奏するには、凍結乾燥前の溶液における糖類は、その最終濃度が０．１〜１５％（ｗ／ｖ）になるように加え、ポリエチレングリコールはその最終濃度が０．５〜１０％（ｗ／ｖ）になるように加えるのがよい。通常、ブロックコポリマーと糖類またはポリエチレングリコールとの割合は、それぞれ重量で１：１〜１：１０または１：０．５〜１：１０である。
以下に比較例、実施例を示し、本発明を具体的に示す。
以下においては、ポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸）ブロックコポリマーをＡ、ポリエチレングリコール−ポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸）ブロックコポリマーをＧと略す。また、例えばブロックコポリマーのＰＥＧ鎖の平均分子量１２，０００、ポリアミノ酸鎖４０残基、ポリアミノ酸側鎖のベンジル基の導入率が６０％の場合、各ブロックコポリマーの後に、１２−４０（６０）と表記する。従って、例えばポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸）ブロックコポリマーのＰＥＧ鎖の平均分子量が１２，０００、ポリアミノ酸鎖が４０残基、ポリアミノ酸側鎖のベンジル基の導入率が６０％の場合、Ａ１２−４０（６０）と表記する。
【実施例】
【０００５】
＜実施例１：エタノール法−１＞
ブロックコポリマー、Ａ１２−４０（１００）、Ａ１２−４０（６０）、Ｇ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（６０）をそれぞれ２０ｍｇ各スクリュー管に秤量し、水３ｍＬを添加した後、超音波処理（レベル４、１秒間欠１０分、日本精機）を行い空ミセルとした。この各空ミセル溶液２ｍＬを撹拌しておき、そこへエタノールに溶解したドセタキセル（３．５ｍｇ／ｍＬ）２００ｕＬを徐々に添加し、再度超音波処理を行いドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比５％（ｗ／ｗ）、最終エタノール濃度１０％（ｖ／ｖ））。
調製したミセルの粒子径は、ＮＩＣＯＭＰ（商標）３８０ＺＬＳ（ＰＳＳ・ＮＩＣＯＭＰ）にて測定し、ガウス分布、またはＮｉｃｏｍｐ分布の強度の平均値を用いた。内包率は、ミセルをＭＩＬＬＥＸ（登録商標）−ＧＶ  ＰＶＤＦ，０．２２ｕｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてろ過し、ろ液を超遠心分離（２００，０００ｇ、１時間、２０℃）した。ろ過前サンプル、ろ液、超遠心分離後の上清の２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計にて測定した。
ドセタキセルの最大吸光度は２８０ｎｍであり、ブロックコポリマーも２８０ｎｍの吸光がみられるため、内包率は以下の方法によって求めた。
ろ過前サンプル、ろ液および同時にコントロールとして同条件で調製した空ミセル溶液のそれぞれを５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで２０〜２００倍に希釈し、ポリマーミセルを崩壊させた。同様に、超遠心分離後の上清を５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで希釈した。
上記ろ液中のポリマーミセルを崩壊させた液の２８０ｎｍにおける吸光度から上記空ミセル溶液中のポリマーミセルを崩壊させた液の２８０ｎｍにおける吸光度を差し引き、ろ液中のドセタキセルに由来する２８０ｎｍにおける吸光度を求めた。更に、ろ液にはエタノールが含まれるためミセルに内包されていないドセタキセルがわずかに溶解していることから、超遠心分離後の上清の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル希釈液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。それぞれの吸光度をドセタキセルの検量線に当てはめ、得られた値に希釈率を乗算してそれぞれの液中のドセタキセル量を求めた。
ミセルに内包されたドセタキセル量は、ろ液中のドセタキセル量から超遠心分離後の上清中のドセタキセル量を差し引いて求めた。
またろ過前サンプル中のポリマーミセルを崩壊させた液の２８０ｎｍにおける吸光度から、空ミセル溶液中のポリマーミセルを崩壊させた液の２８０ｎｍにおける吸光度を差し引き、検量線からろ過前サンプルのドセタキセル量を求めた。内包率は、ミセルに内包されたドセタキセル量をろ過前サンプルのドセタキセル量で除し求めた。
内包率（％）
＝ミセルに内包されたドセタキセル量／ろ過前サンプルのドセタキセル量×１００
調製したドセタキセル内包ミセルの粒子径および内包率を表１に示した。
【表１】
2007136134.tif 000004
＜実施例２：エタノール法−１＞
ドセタキセルの代わりにインドメタシンを用いた以外は実施例１と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、以下の方法により内包率を求めた。インドメタシンの最大吸光度は３２０ｎｍであり、ブロックコポリマーも３２０ｎｍに吸光がみられるため、ろ過前サンプル、ろ液、空ミセル溶液のそれぞれを５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで２０〜２００倍に希釈しポリマーミセルを崩壊させ、それぞれの３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。同様に、超遠心分離後の上清を５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで２０〜２００倍に希釈し３２０ｎｍにおける吸光度を測定し、実施例１と同様の方法により、インドメタシンの検量線から内包率を求めた。その結果を表２に示した。
【表２】
2007136134.tif 000005
＜実施例３：エタノール法−１＞
ドセタキセルの代わりにα−トコフェロールを用いた以外は実施例１と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、以下の方法により内包率を求めた。α−トコフェロールの最大吸光度は２９１ｎｍであり、ブロックコポリマーも２９１ｎｍに吸光がみられるため、ろ過前サンプル、ろ液、空ミセル溶液のそれぞれを５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで２０〜２００倍に希釈しポリマーミセルを崩壊させ、それぞれの２９１ｎｍにおける吸光度を測定した。同様に、超遠心分離後の上清を５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで２０〜２００倍に希釈し２９１ｎｍにおける吸光度を測定し、実施例１と同様の方法により、α−トコフェロールの検量線から内包率を求めた。その結果を表３に示した。
【表３】
2007136134.tif 000006
＜実施例４：エタノール濃度の影響＞
ブロックコポリマー、Ａ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（１００）をそれぞれ２０ｍｇ各スクリュー管に秤量し、水３ｍＬを添加した後、超音波処理を行い空ミセルとした。この各空ミセル溶液２ｍＬを撹拌しておき、そこへエタノールに溶解したドセタキセル（７．０ｍｇ／ｍＬ）１００ｕＬを徐々に添加し、再度超音波処理を行いドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比５％（ｗ／ｗ）、最終エタノール濃度５％（ｖ／ｖ））。同様に、Ａ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（１００）をそれぞれ２０ｍｇ秤量し、それに対し水２．４ｍＬを添加し、超音波処理を行った。そのうち各１．６ｍＬにドセタキセル（１．８ｍｇ／ｍＬ）４００ｕＬを徐々に添加し、再度超音波処理を行った（最終エタノール濃度２０％（ｖ／ｖ））。またＡ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（１００）をそれぞれ２０ｍｇ秤量し、それに対し水２．１ｍＬを添加し、超音波処理を行った。そのうち各１．４ｍＬにドセタキセル（１．２ｍｇ／ｍＬ）６００ｕＬを徐々に添加し、再度超音波処理を行った（最終エタノール濃度３０％（ｖ／ｖ））。
調製したミセルの粒子径および内包率を、実施例１と同様に求めた。ただし、超遠心分離は最終エタノール濃度が５％（ｖ／ｖ）の際には２００，０００ｇ、１時間、２０℃、最終エタノール濃度が２０および３０％（ｖ／ｖ）の際には５００，０００ｇ、１時間、２０℃とした。その結果を表４に示した。
【表４】
2007136134.tif 000007
＜実施例５：エタノール濃度の影響＞
ドセタキセルの代わりにインドメタシンを用いた以外は実施例４と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定、内包率を実施例２に記載の方法により求めた。その結果を表５に示した。
【表５】
2007136134.tif 000008
＜実施例６：エタノール法−２＞
ブロックコポリマー、Ａ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（６０）をそれぞれ２０ｍｇ各スクリュー管に秤量し、水３ｍＬを添加した後、超音波処理を行い空ミセルとした。エタノールに溶解したドセタキセル（３．５ｍｇ／ｍＬ）２００ｕＬを撹拌しておき、そこへ各空ミセル溶液２ｍＬを徐々に添加し、再度超音波処理を行いドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比５％（ｗ／ｗ）、最終エタノール濃度１０％（ｖ／ｖ））。調製したミセルの粒子径および内包率を実施例１と同様に求め、その結果を表６に示した。
【表６】
2007136134.tif 000009
＜実施例７：エタノール法−２＞
ドセタキセルの代わりにインドメタシンを用いた以外は実施例６と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、実施例２に記載の方法により内包率を求めた。その結果を表７に示した。
【表７】
2007136134.tif 000010
＜実施例８：エタノール法−３＞
ブロックコポリマー、Ａ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（６０）をそれぞれ２０ｍｇ各スクリュー管に秤量し、さらにドセタキセル各１ｍｇを秤量し、エタノール３００ｕＬを添加して４０℃に加温することで分散溶解した。これを撹拌しておき、そこへ水３ｍＬを徐々に添加した後、超音波処理を行った。これをドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比５％（ｗ／ｗ）、最終エタノール濃度１０％（ｖ／ｖ））。調製したミセルの粒子径および内包率を実施例１と同様に求め、その結果を表８に示した。
【表８】
2007136134.tif 000011
＜実施例９：エタノール法−３＞
ドセタキセルの代わりにインドメタシンを用いた以外は実施例８と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、実施例２に記載の方法により内包率を求めた。その結果を表９に示した。
【表９】
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＜比較例１：乾固法＞
ブロックコポリマー、Ａ１２−４０（１００）、Ａ１２−４０（６０）、Ｇ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（６０）をそれぞれ２０ｍｇ各スクリュー管に秤量し、さらにドセタキセル各１ｍｇを秤量し、ジクロロメタン１ｍＬを添加して溶解した。これを窒素ガスにより乾燥させ、さらにデシケータ内で減圧乾燥を行った。そこへ水３ｍＬを添加し、４℃にて一晩撹拌した後、超音波処理を行うことでドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比５％（ｗ／ｗ））。調製したミセルの粒子径および内包率を実施例１と同様に求め、その結果を表１０に示した。
【表１０】
2007136134.tif 000013
＜比較例２：乾固法＞
ドセタキセルの代わりにインドメタシンを用いた以外は比較例１と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、実施例２に記載の方法で内包率を求めた。その結果を表１１に示した。
【表１１】
2007136134.tif 000014
＜比較例３：分散法＞
ブロックコポリマー、Ａ１２−４０（１００）、Ａ１２−４０（６０）、Ｇ１２−４０（１００）、Ｇ１２−４０（６０）をそれぞれ２０ｍｇ各スクリュー管に秤量し、水３ｍＬを添加し４℃にて撹拌した。ドセタキセル１０ｍｇをジクロロメタン１ｍＬに溶解し、そのうち１００ｕＬを撹拌している各ポリマー分散溶液３ｍＬ中に添加し、激しく撹拌した。その後、スクリュー管の蓋をとり、一晩撹拌しながらジクロロメタンを揮発させ、超音波処理を行ったものをドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比５％（ｗ／ｗ））。調製したミセルの粒子径および内包率を実施例１と同様に求め、その結果を表１２に示した。
【表１２】
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＜比較例４：分散法＞
ドセタキセルの代わりにインドメタシンを用いた以外は比較例３と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、実施例２に記載の方法で内包率を求めた。その結果を表１３に示した。
【表１３】
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【国際調査報告】
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