【手続補正書】
【提出日】平成20年2月28日(2008.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
炎症中に組織内に引き寄せられる細胞は、種々の白血球、特に好中性および好酸性顆粒球および単球のような炎症性貪食細胞を含む。好中球は、慢性気管支炎およびそれに関連する気腫を含む慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、および成人呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性大腸疾患、および関節リウマチのような好中球関連呼吸器疾患における炎症および組織破壊に関連している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
Ｇ−プロテイン結合レセプターは、それらが広範囲の生理学的および病理学的過程に関与しているため、治療的適用における重要な標的である。６０−７０％の現在市販されている医薬が、ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーに実際作用すると概算される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
好中球関連介在炎症性疾患状態で炎症性細胞に発現されるＧ−プロテイン結合レセプター遺伝子の同定は、炎症性状態の理解に重要な機会を提供し、そこから多くの重要な適用が発生するであろう。同定されたＧＰＣＲは、該遺伝子または該遺伝子のタンパク質産物を直接標的とした治療(小分子医薬、アンチセンス分子、抗体分子)の開発を導き得、または、このような医薬の開発が、該遺伝子のターゲティングより容易な場合、上流または下流での生化学的経路を標的とし得る。該遺伝子および配列変異体を含むポリヌクレオチド配列を使用し、好中球関連炎症性疾患状態の診断的試験を開発し得る。最後に、これらの炎症性状態に関与するＧＰＣＲのＤＮＡ配列および、これらの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に関する情報は、組換え技術によるタンパク質の大規模製造、および天然に該タンパク質を生成する組織および細胞の同定を促進する。このような配列情報はまたＧＰＣＲ遺伝子によりコードされるタンパク質と特異的反応する抗体物質または他の新規結合分子の製造を可能にし、これはタンパク質が関与するリガンド／抗リガンド結合反応の調節に使用し得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
配列番号２のような参照配列とｘ％同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列の１００アミノ酸当たり、１００−ｘアミノ酸変化以外、参照配列と同一の配列を意味する。例えば、参照配列と少なくとも８０％同一性を有する対象アミノ酸配列において、参照配列における２０％までのアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基により置換、欠失または挿入されていてよい。アミノ酸配列間の同一性パーセントは、コンピュータープログラム、例えばBrutlag et al(Comp.App.Biosci.(1990)6:237-245)のアルゴリズムをベースにしたＦＡＳＴＤＢプログラムを慣用的に使用して決定できる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
ポリペプチド(Ａ)は、前記のポリヌクレオチド配列を、転写のためのプロモーターおよび他の適当な調節要素を含む発現ベクターにクローニングし、細菌、植物、昆虫、酵母、動物またはヒト細胞に導入させ、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を、適当な条件下で培養することにより製造し得る。このようなポリペプチドの組換え発現のための技術は既知であり、例えば、J.Sambrook et al, Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Press, 1990に記載されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド(Ｄ)はＤＮＡ、ＤＮＡのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートアナログのようなＤＮＡのアナログ、ＲＮＡ、ＲＮＡのアナログ、またはペプチド核酸(ＰＮＡ)であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは慣用法で、例えば自動固相法を使用して合成できる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明が適用できる好中球関連炎症性疾患は、好中球関連炎症性または閉塞性気道疾患、特に慢性気管支炎および気腫を含む慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、および成人(または急性)呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、関節リウマチおよびクローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性大腸疾患を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明を、以下の実施例により説明する。実施例で使用する略語は、以下の意味を有する：
ＢＬＡＳＴ：ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ｃＡＭＰ：環状アデノシン一リン酸
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＤＴＡ：エチレン−ジアミン四酢酸
ＥＩＡ：酵素免疫アッセイ
ＥＳＴ：発現配列タグ
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球マクロファージ刺激因子
ＧＰＣＲ：Ｇ−プロテイン結合レセプター
ＨＥＰＥＳ：４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−エタンスルホン酸
ＩＰＴＧ：イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド
ＩＬ１：インターロイキン１
ＭＯＩ：感染多重度
ＰＢＳ：リン酸緩衝化食塩水
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフウロリド
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＮＦ：腫瘍壊死因子
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
ヒト末梢血白血球の中のＥＸ３３発現を測定するために、種々の白血球を、血液から標準法により分離する。例えば、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を顆粒球および赤血球から、Ficoll Hypaque(Pharmacia)遠心により、実施例１に記載のように分離し、ＴおよびＢ細胞を、ＰＢＭＣからＭＡＣＳ(磁気補助細胞ソーター、Miltenyi Biotec)により単離する。ＲＮＡを、実施例１に記載のように種々の血液細胞タイプから単離する。ＲＴ−ＰＣＲ分析を行ない、白血球の中のＥＸ３３の発現を測定する。ＥＸ３３は優勢的に白血球の中で発現され、好中球および好酸球のような顆粒球で強く発現されるが、ＴまたはＢリンパ球ではない。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
実施例６
本実施例は、ＡＴＧ開始コドン後に６ヒスチジンタグを有する完全長ＥＸ３３の、Spodoptera frugiperda Sf9細胞中のバキュロウイルス系を使用した発現、および得られたポリペプチドの精製に関する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
免疫化
ウサギを、皮下部位４箇所を、５００μｇ精製ＥＸ３３タンパク質で以下のスケジュールにしたがって免疫化する：
【表１】
2003525624.tif 000001
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
ＥＬＩＳＡスクリーニング
Nunc-Immuno Plate Maxisorp  ９６ウェルプレート(Nunc, Basle, CH)を固体し自体として使用し、精製ＥＸ３３タンパク質(１００ng／ウェル)で４℃でコーとする。プレートを３時間、３７℃で２％ＢＳＡ(Sigma)および０.０２％ＮａＮ３(Sigma)含有ＰＢＳで遮断する。遮断後、プレートを一晩室温で、異なる希釈のＰＢＳと共にインキュベートする。ポリクローナル抗体の存在を、ウサギに対するビオチン標識ＩｇＧ−抗体(ヤギ抗−ＩｇＧ抗血清、１：２５０００希釈)で、４０分のインキュベーション時間でチェックする。アルカリホスファターゼ接合ストレプトアビジン(Immununo Research, Dianova, CH)を、次いで１：１００００の希釈で添加する。反応の展開を、ジエタノールアミンに溶解したホスフェート基質(Sigma、f.c.  １mg／mlの添加により行なう。４５分後、４０５ｎｍの吸光度を４９０ｎｍを参照して、ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Biorad)で読む。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
免疫化
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、腹腔内(ｉｐ)で１００μｇのＥＸ３３タンパク質で下記のスケジュールにしたがって免疫化する：
【表２】
2003525624.tif 000002