【手続補正書】
【提出日】平成19年12月25日(2007.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  ＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片を、被験薬剤と接触させること；および
（ｂ）  被験薬剤が、ＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片のキナーゼ活性をモジュレートしたかどうかを判定することを含み、
ここで、被験薬剤の存在下におけるＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片のキナーゼ活性の変化は、ＰＫＣ−θタンパク質のモジュレーターを示す、ＰＫＣ−θタンパク質のモジュレーターの同定方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、ＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片を被験薬剤およびＰＫＣ−θ基質と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キナーゼ活性がＰＫＣ−θ基質のリン酸化である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＫＣ−θ基質がＲ−Ｘ−Ｘ−ＳモチーフまたはＲ−Ｘ−Ｘ−Ｔモチーフを含む（式中、Ｒはアルギニンであり、Ｘは、未知または既知いずれかのアミノ酸であり、Ｓはセリンであり、Ｔはトレオニンである）、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＰＫＣ−θ基質が、ＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫ（配列番号：５）、ＦＡＲＫＧＳＬＲＱＫＮ（配列番号：６）、ＦＡＲＫＧＳＬＲＱ（配列番号：１５）、ＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫ（配列番号：１６）、ＱＫＲＰＳＱＲＳＫＹＬ（配列番号：１７）、ＫＩＱＡＳＦＲＧＨＭＡ（配列番号：１８）、ＬＳＲＴＬＳＶＡＡＫＫ（配列番号：１９）、ＡＫＩＱＡＳＦＲＧＨＭ（配列番号：２０）、ＶＡＫＲＥＳＲＧＬＫＳ（配列番号：２１）、ＫＡＦＲＤＴＦＲＬＬＬ（配列番号：２２）、ＰＫＲＰＧＳＶＨＲＴＰ（配列番号：２３）、ＡＴＦＫＫＴＦＫＨＬＬ（配列番号：２４）、ＳＰＬＲＨＳＦＱＫＱＱ（配列番号：２５）、ＫＦＲＴＰＳＦＬＫＫＳ（配列番号：２６）、ＩＹＲＡＳＹＹＲＫＧＧ（配列番号：２７）、ＫＴＲＲＬＳＡＦＱＱＧ（配列番号：２８）、ＲＧＲＳＲＳＡＰＰＮＬ（配列番号：２９）、ＭＹＲＲＳＹＶＦＱＴ（配列番号：３０）、ＱＡＷＳＫＴＴＰＲＲＩ（配列番号：３１）、ＲＧＦＬＲＳＡＳＬＧＲ（配列番号：３２）、ＥＴＫＫＱＳＦＫＱＴＧ（配列番号：３３）、ＤＩＫＲＬＴＰＲＦＴＬ（配列番号：３４）、ＡＰＫＲＧＳＩＬＳＫＰ（配列番号：３５）、ＭＹＨＮＳＳＱＫＲＨ（配列番号：３６）、ＭＲＲＳＫＳＰＡＤＳＡ（配列番号：３７）、ＴＲＳＫＧＴＬＲＹＭＳ（配列番号：３８）、ＬＭＲＲＮＳＶＴＰＬＡ（配列番号：３９）、ＩＴＲＫＲＳＧＥＡＡＶ（配列番号：４０）、ＥＥＰＶＬＴＬＶＤＥＡ（配列番号：４１）、ＳＱＫＲＰＳＱＲＨＧＳ（配列番号：４２）、ＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫ（配列番号：４３）、ＡＦＲＲＴＳＬＡＧＧＧ（配列番号：４４）、ＡＬＧＫＲＴＡＫＹＲＷ（配列番号：４５）、ＶＶＲＴＤＳＬＫＧＲＲ（配列番号：４６）、ＫＲＲＱＩＳＩＲＧＩＶ（配列番号：４７）、ＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦ（配列番号：４８）、ＧＴＦＲＳＳＩＲＲＬＳ（配列番号：４９）、ＲＶＶＧＧＳＬＲＧＡＱ（配列番号：５０）、ＬＲＱＬＲＳＰＲＲＴＱ（配列番号：５１）、ＫＴＲＫＩＳＱＳＡＱＴ（配列番号：５２）、ＮＫＲＲＡＴＬＰＨＰＧ（配列番号：５３）、ＳＹＴＲＦＳＬＡＲＱＶ（配列番号：５４）、ＮＳＲＲＰＳＲＡＴＷＬ（配列番号：５５）、ＲＬＲＲＬＴＡＲＥＡＡ（配列番号：５６）、ＮＫＲＲＧＳＶＰＩＬＲ（配列番号：５７）、ＧＫＲＲＰＳＲＬＶＡＬ（配列番号：５８）、ＱＫＫＲＶＳＭＩＬＱＳ（配列番号：５９）、およびＲＬＲＲＬＴＡＲＥＡＡ（配列番号：６０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）  ＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片を発現する細胞を、被験薬剤と接触させること；および
（ｂ）  被験薬剤がＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片の自己リン酸化を低減させたかどうかを、細胞内において判定することを含み、
ここで、被験薬剤の存在下におけるＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片の自己リン酸化の変化は、ＰＫＣ−θタンパク質のモジュレーターを示す、ＰＫＣ−θタンパク質のモジュレーターの同定方法。
【請求項７】
キナーゼ活性を低下させるＰＫＣ−θタンパク質のモジュレーターが、ＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片のインヒビターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
キナーゼ活性を増大させるＰＫＣ−θタンパク質のモジュレーターが、ＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片のアクチベーターである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＰＫＣ−θタンパク質が完全長ＰＫＣ−θタンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＫＣ−θタンパク質が、完全長ＰＫＣ−θタンパク質の機能性バリアントである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
該機能性断片が、ＰＫＣ−θキナーゼドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記判定工程が、被験薬剤のキナーゼ活性を被験薬剤の非存在のときと比較することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＫＣ−θタンパク質のモジュレーターが喘息の処置に有用である、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）で同定された被験薬剤の効力を、インビトロまたはインビボ喘息モデルにおいて評価することをさらに含み、対照薬剤と比べ、インビトロまたはインビボ喘息モデルにおいて増大した効力を示す被験薬剤を、喘息の処置に有用であると認める、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が原核生物細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
原核生物細胞が大腸菌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片の自己リン酸化が、配列番号：１の６９５位のセリン残基、６８５位のセリン残基、５３８位のトレオニン残基および５３６位のトレオニン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基において起こる、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
自己リン酸化が、配列番号：１の５３８位のトレオニン残基において起こる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
喘息を患うか、または喘息症状を患う哺乳動物に、ＰＫＣ−θタンパク質またはその機能性断片の該キナーゼ活性を低下させるか、または機能性ＰＫＣ−θタンパク質の産生を低減する薬剤の治療有効量を投与することを含む、喘息の処置方法。
【請求項２０】
内因性ＰＫＣ−θタンパク質の発現を欠く単離されたマスト細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
従って、図３Ｂは、ｍ／ｚ  ７０５．５２におけるペプチドＮＦｐＳＦＭＮＰＧＭＥＲ（配列番号：６４）（６９３〜７０３位に広がる）の生成物イオンスペクトルを示し、これはＳｅｒ６９５がリン酸部位であることを確証した。図３Ｃは、ｍ／ｚ  ７６０．４８におけるペプチドＡＬＩＮｐＳＭＤＱＮＭＦＲ（配列番号：６５）（６８１〜６９２位に広がる）の生成物イオンスペクトルを示し、これはＳｅｒ６８５がリン酸部位であることを確証した。図３Ｄは、ｍ／ｚ  １１５９．７１におけるペプチドＴＮＴＦＣＧＴＰＤＹＩＡＰＥＩＬＬＧＱＫ（配列番号：６６）（５３６〜５５５位に広がる）の生成物イオンスペクトルを示す。図３Ｄの生成物イオンスペクトルは、このペプチド上の１つのリン酸を示し、これはまた、リン酸化部位がＴｈｒ５３６またはＴｈｒ５３８のいずれかであることを示した。５４０位のシステイン残基（図３Ｄにおいて＃によって示される）はヨードアセトアミドによってアルキル化されていることに注意のこと。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
発現された活性ＰＫＣ−θ  ＫＤのリン酸化部位の関連性が確立されたので、次に、詳細な酵素機構の研究が、キナーゼ触媒反応を試験するために着手された。ＰＫＣ−θの反応速度論的機構を決定する際の使用のために試験されるペプチド基質が表１に示される。
【表１】
2007525210.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ヒトＴ細胞のＴＣＲ共刺激時のＰＫＣ−θ膜移動および誘導性活性化ループリン酸化を示す、ウェスタンブロッティング解析の写真の表示である。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ＰＫＣ−θ活性化ループの自己リン酸化が、細胞内のキナーゼ活性に必要とされることを示す写真（図２Ａおよび２Ｃ）ならびにグラフ（図２Ｂ）の表示である。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、ＰＫＣ−θキナーゼドメイン（ＰＫＣ−θ  ＫＤ）自己リン酸化のキャラクタリゼーション（図３Ａ）、ならびにペプチドＮＦｐＳＦＭＮＰＧＭＥＲ（配列番号：６４；式中、「ｐＳ」は、セリンがリン酸化されていることを示す；６９３〜７０３位の範囲）、ｍ／ｚ  ７０５．５２（図３Ｂ）、ペプチドＡＬＩＮｐＳＭＤＱＮＭＦＲ（配列番号：６５；６８１〜６９２位の範囲）、ｍ／ｚ  ７６０．４８（図３Ｃ）およびペプチドＴＮＴＦＣＧＴＰＤＹＩＡＰＥＩＬＬＧＱＫ（配列番号：６６；５３６〜５５５位の範囲）、ｍ／ｚ  １１５９．７１  （図３Ｄ）の生成スペクトル（質量分析法で測定）を示す模式図である。注：図３Ｄにおいて、ヨードアセトアミドでアルキル化したシステインを＃で示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、表示したＰＫＣ−θ  ＫＤタンパク質および変異体の大腸菌ライセートのウェスタンブロッティング解析である。抗ｐＴ５３８  ＰＫＣ−θでのイムノブロッティング（図４Ａ）、および同等の発現を確認するための抗Ｈｉｓ（図４Ｂ）、表示したＰＫＣ−θ  ＫＤタンパク質および変異体のインビトロライセート活性を示すグラフ（図４Ｃ）。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、切片再プロット  対  １／［ペプチド１］（１００ｍＭ  ＮａＣｌ）（図５Ａ）；傾き再プロット  対  １／［ペプチド１］（１００ｍＭ  ＮａＣｌ）（図５Ｂ）；切片再プロット  対  １／［ペプチド１］（６２５ｍＭ  ＮａＣｌ）（図５Ｃ）；および傾き再プロット  対  １／［ペプチド１］（６２５  ＮａＣｌ）（図５Ｄ）を示す一連のグラフである。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、ＰＫＣ−θ  ＫＤが動力学的に挙動し得る種々の機構を示す一連の模式図である。図６Ａは、ＡＤＰが放出される最終生成物である時系列（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｄｅｒｅｄ）機構を示す。図６Ｂは、ＡＤＰが放出される最終生成物である動力学的機構を示し、図６Ｃは、ランダム機構を示す。図６Ａ〜６Ｃにおいて、「Ｅ」は、酵素を表し、「Ａ」は、基質Ａを表し、「Ｂ」は、基質Ｂを表し、「Ｐ」は、生成物Ｐを表し、「Ｑ」は、生成物Ｑを表す（ｉｓ  ｆｏｒ）。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ＰＫＣ−θ  ＫＤに関するｋｃａｔ（図７Ａおよび７Ｃ）ならびにｋｃａｔ／Ｋｍ（図７Ｂおよび７Ｄ）に対する溶媒粘度効果を示す。図７Ａは、種々のペプチド１でのｋｃａｔ効果を示し、ＡＴＰを２．０ｍＭに保持した。図７Ｂは、ペプチド１でのｋｃａｔ／Ｋｍを示し、ＡＴＰを０．１２５ｍＭに保持した。図７Ｃは、種々のペプチド３でのｋｃａｔ効果を示し、ＡＴＰを２．０ｍＭに保持した。図７Ｄは、ペプチド３でのｋＣａｔ／Ｋｍを示し、ＡＴＰを２．０ｍＭに保持した。白丸記号（○）は、スクロース増量における１００ｍＭ  ＮａＣｌを示す；白逆三角記号（▽）は、スクロース増量における２５０ｍＭ  ＮａＣｌを示す；黒丸記号（●）は、Ｆｉｃｏｌｌ  ４００増量における１００ｍＭ  ＮａＣｌを示す；および黒逆三角記号（▼）は、Ｆｉｃｏｌｌ  ４００増量における２５０ｍＭ  ＮａＣｌを示す。図７Ａ〜７Ｄ中の点線は、傾き１を示す。
【図８】図８は、インヒビター基質がＰＫＣ−θ  ＫＤ触媒活性を干渉し得る異なる機構を示す模式図である。図８において「Ｅ」は、酵素を表し、「Ａ」は、基質Ａを表し、「Ｂ」は、基質Ｂを表し、「Ｐ」は、生成物Ｐを表し、「Ｑ」は、生成物Ｑを表す。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、いくつかのＰＫＣ−θのペプチド基質配列を同定したペプチドアレイスキャン（図９Ａ）およびＰＫＣ−θによってリン酸化されたことが確認されたペプチド（発現の順における各々の配列番号：１７、４２、５５、５８、６０、３４、５７、５３、２８、３９、６７、４４、１９、６８、５０、６、３８、２３、３５、２９、３２、４５、４０、５４、５、２６、および１８）（図９Ｂ）の表示である。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）でのＩｇＥレセプター架橋時に、ＰＫＣ−θ活性化ループが誘導的にリン酸化されたことを示すウェスタンブロッティング解析の写真の表示である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＩｇＥレセプター架橋ＢＭＭＣの膜画分（図１１Ａ）、界面活性剤不溶性画分（ＤＩ）（図１１Ｂ）および全細胞抽出物（ＷＣＥ）（図１１Ｃ）のウェスタンブロッティング解析の写真の表示である。これは、ＩｇＥレセプター刺激ＢＭＭＣ内でのＰＫＣ−θ膜移動を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＰＫＣ−δ（図１２Ａ）およびＰＫＣ−β（図１２Ｂ）分布は、ＢＭＭＣでのＩｇＥレセプター架橋時に有意に変化しないことを示すウェスタンブロッティング解析の写真の表示である。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＰＫＣ−θノックアウトマウス由来ＢＭＭＣは、野生型マウス由来ＢＭＭＣよりも少ない顆粒を含むことを示す組織学的（図１３Ａ）およびグラフによる（図１３Ｂ）表示である。図１３Ｂのデータは、時間の関数としての、またはＤＮＰ−ＢＳＡ濃度の関数としての細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＰＫＣ−θノックアウトマウス由来の腹腔マスト細胞は、野生型マウス由来細胞よりも低いレベルの細胞表面ＩｇＥを有する（図１４Ａ）が、同様のレベルの細胞表面ｃｋｉｔを有する（図１４Ｂ）ことを示すグラフ表示である。ｐ値はｔ−検定により決定した。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＰＫＣ−θノックアウトマウスが、野生型マウスと比べ、低下したレベルの血清ＩｇＥ  （図１５Ａ）およびＩｇＧ１（図１５Ｂ）を有するが、増加したレベルのＩｇＡ  （図１５Ｃ）を有することを示すグラフ表示である。ｐ値はｔ−検定により決定した。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＩｇＥレセプター架橋後、ＰＫＣ−θノックアウトマウス由来ＢＭＭＣは、以下のサイトカイン：ＴＮＦ−α（図１６Ａ）、ＩＬ−１３  （図１６Ｂ）およびＩＬ−６（図１６Ｃ）の産生を欠くことを示すグラフ表示である。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、ＰＫＣ−θノックアウトマウス由来の休止ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＴＨ１細胞およびＴＨ２細胞が、ＩＬ−２の非存在下および０．５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３の存在下での培養後、ＩＬ−４（図１７Ａ）およびＩＬ−５（図１７Ｂ）のレベルの低下を示したことを示すグラフ表示である。
【図１８】図１８は、ＰＫＣ−θノックアウトマウスが、以下の実施例７に記載の受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）モデルにおいて、抗ＩｇＥに応答した耳の腫脹の増大を有しないことを示すグラフ表示である。耳の腫脹は、ベースラインからのΔ変化量で示した。統計学的解析は、ｓｔｕｄｅｎｔ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ検定を用いて行った。ｐ値は、野生型対ＰＫＣ−θノックアウト動物の比較を示す。
【図１９】図１９は、ＰＫＣ−θノックアウトマウスが、以下に記載する受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）モデルにおいて、外因性ＩｇＥの存在下で耳の腫脹の増大を有しないことを示すグラフ表示である。耳の腫脹は、ベースラインからのΔ変化量で示した。統計学的解析は、ｓｔｕｄｅｎｔ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ検定を用いて行った。ｐ値は、野生型対ＰＫＣ−θノックアウト動物の比較を示す。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｄは、ＰＫＣ−θノックアウトマウス由来のＴＨ１およびＴＨ２両Ｔ細胞は、ＰＫＣ−θ野生型マウス由来のＴＨ１およびＴＨ２両Ｔ細胞と比べ、抗ＣＤ３刺激に対する増強の低下（０．５μｇ／ｍｌ）を示すことを示す棒グラフの表示である。ＰＫＣ−θ野生型マウス由来（薄灰色バー）またはＰＫＣ−θノックアウトマウス由来（濃灰色バー）のＴＨ０、ＴＨ１またはＴＨ２細胞は、抗ＣＤ２８  （図２０Ａ）、抗ＣＤ２８＋ＩＬ−２  （図２０Ｂ）、抗ＣＤ２８なし、およびＩＬ−２なし（図２０Ｃ）、ならびにＩＬ−２あり、抗ＣＤ２８の非存在下（図２０Ｄ）でさらに刺激した。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｄは、ＰＫＣ−θノックアウトマウス由来のＴＨ１およびＴＨ２両Ｔ細胞は、ＰＫＣ−θ野生型マウス由来のＴＨ１およびＴＨ２両Ｔ細胞と比べ、抗ＣＤ３刺激に対する増強の低下（０．０５μｇ／ｍｌ）を示すことを示す棒グラフの表示である。ＰＫＣ−θ野生型マウス由来（薄灰色バー）またはＰＫＣ−θノックアウトマウス由来（濃灰色バー）のＴＨ０、ＴＨ１またはＴＨ２細胞は、抗ＣＤ２８  （図２１Ａ）、抗ＣＤ２８＋ＩＬ−２  （図２１Ｂ）、抗ＣＤ２８なし、およびＩＬ−２なし（図２１Ｃ）、ならびにＩＬ−２あり、抗ＣＤ２８の非存在下（図２１Ｄ）でさらに刺激した。