【手続補正書】
【提出日】平成19年11月21日(2007.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】        明細書
【発明の名称】    ヌクレオチド類似体を有する非凝集性、非消光性の結合体及びオリゴヌクレオチドプローブ
【特許請求の範囲】
【請求項１】（ａ）複数のモノマー単位を有するポリマーと、
（ｂ）前記ポリマーと共有結合したフロオロホアと、を備え、
前記のモノマー単位の内の単数又は複数は、下記の構造を有するピラゾロピリミジン及びピロロピリミジンから成るグループから、それぞれ独立的に選択される塩基類似体を含み、
当該塩基類似体が、それらが置換される塩基の塩基対合特異性を保持し、前記フルオロホアの消光の減少、前記ポリマーの自己会合の減少、或いは、前記フルオロホアの消光の減少と前記ポリマーの自己会合の減少との両方をもたらす結合体。
【化１】
2003527579.tif 000001
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立的に、−Ｈ，−ＯＨ，−ＳＨ，又は−ＮＨ２であり、Ｒ３は、−Ｈ，−ＣＮ，ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，又はＩ），又は−Ｒ１２−Ｙであり、Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ１２のアルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、Ｙは、−Ｈ，−ＯＨ，−ＮＨ２，又は−ＳＨであり、Ｘは、＝ＣＨ−，又は＝Ｎ−であって、Ｒ１が−ＮＨ２であり、Ｒ２がＨである場合にはＸは＝Ｎ−である。）
【請求項２】更に、蛍光クエンチャーを有する請求項１に記載の結合体。
【請求項３】前記ポリマーはＤＮＡを含む請求項１に記載の結合体。
【請求項４】前記ポリマーはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む請求項１に記載の結合体。
【請求項５】前記ポリマーは、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラを含む請求項１に記載の結合体。
【請求項６】前記塩基類似体は前記ポリマーの前記ＤＮＡの部分に存在する請求項５に記載の結合体。
【請求項７】前記塩基類似体は前記ポリマーの前記ＰＮＡの部分に存在する請求項５に記載の結合体。
【請求項８】Ｘは、＝Ｎ−である請求項１に記載の結合体。
【請求項９】前記塩基類似体は、ピラゾロピリミジニルアデニン（ＰＰＡ）、ピラゾロピリミジニルグアニン（ＰＰＧ）、及びピラゾロピリミジニルヒポキサンチン（ＰＰＩ）から成るグループから選択される請求項８に記載の結合体。
【請求項１０】前記ポリマーの中に、少なくとも４つの連続するプリン残基を有し、これら少なくとも4つの連続するプリン残基の内の少なくとも1つは、塩基類似体によって置換されている請求項１に記載の結合体。
【請求項１１】Ｘは、＝ＣＨ−である請求項１に記載の結合体。
【請求項１２】前記塩基類似体は、７−デアザアデニン、７−デアザヒポキサンチン、及び７−デアザグアニンから成るグループから選択される請求項１０に記載の結合体。
【請求項１３】前記フルオロホアは、４００〜８００ｎｍで蛍光放出する請求項２に記載の結合体。
【請求項１４】前記クエンチャーは、４００〜８００ｎｍで蛍光吸収する請求項１３に記載の結合体。
【請求項１５】更に、小溝バインダを有する請求項１に記載の結合体。
【請求項１６】前記塩基類似体は、ピラゾロピリミジニルアデニン（ＰＰＡ）、ピラゾロピリミジニルグアニン（ＰＰＧ）、及びピラゾロピリミジニルヒポキサンチン（ＰＰＩ）から成るグループから選択される請求項１に記載の結合体。
【請求項１７】前記塩基類似体はピラゾロピリミジニルグアニン（ＰＰＧ）である請求項１６に記載の結合体。
【請求項１８】前記プリン残基はグアニンである請求項１０に記載の結合体。
【請求項１９】前記塩基類似体は、ピラゾロピリミジニルアデニン（ＰＰＡ）、ピラゾロピリミジニルグアニン（ＰＰＧ）、及びピラゾロピリミジニルヒポキサンチン（ＰＰＩ）から成るグループから選択される請求項１８に記載の結合体。
【請求項２０】前記塩基類似体はピラゾロピリミジニルグアニン（ＰＰＧ）である請求項１８に記載の結合体。
【請求項２１】置換が行われた後の前記ポリマーの中に、三つ以下の連続するプリン残基が残る請求項１０に記載の結合体。
【請求項２２】前記プリン残基はグアニンである請求項２１に記載の結合体。
【請求項２３】置換が行われた後の前記ポリマーの中に、二つ以下の連続するプリン残基が残る請求項１０に記載の結合体。
【請求項２４】前記プリン残基はグアニンである請求項２３に記載の結合体。
【請求項２５】２〜９の連続するグアニン残基を有し、当該２〜９のグアニン残基は、同数のピラゾロピリミジニルグアニン（ＰＰＧ）によって置換される請求項２４に記載の結合体。
【請求項２６】Ｘは、＝Ｎ−である請求項２１に記載の結合体。
【請求項２７】Ｒ３は、−ＣＮ，ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，又はＩ），又は−Ｒ１２−Ｙであり、Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ１２のアルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、Ｙは、−Ｈ，−ＯＨ，−ＮＨ２，又は−ＳＨであり、Ｘは、＝ＣＨ−である請求項１に記載の結合体。
【請求項２８】５´末端、３´末端の単数又は複数の検出可能な蛍光標識と、当該単数又は複数の蛍光標識の蛍光放出を消光するクエンチャーとを有するオリゴヌクレオチドプローブであって
前記プローブは、少なくとも４つの連続するグアニン残基を含み、これら４つの連続グアニン残基のうちの少なくとも１つはＰＰＧ残基によって置換されており、前記残基の置換によって前記単数又は複数の蛍光標識の消光の減少を示すオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２９】更に、結合した小溝バインダを有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３０】前記小溝バインダは、前記オリゴヌクレオチドの５´末端に位置している請求項２９に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３１】前記小溝バインダは、前記オリゴヌクレオチドの３´末端に位置している請求項２９に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３２】前記標識は、前記オリゴヌクレオチドの５´末端に位置している請求項２８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３３】前記標識は、前記オリゴヌクレオチドの３´末端に位置している請求項２８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３４】前記小溝バインダは、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートの三量体（ＣＤＰＩ３）と、Ｎ−メチルピロロ−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ５）とから成るグループから選択される請求項２９に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３５】更に、複数の蛍光標識を有する請求項２９に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３６】前記複数の蛍光標識のうちの１つの放出波長は、前記複数の蛍光標識のうちの別の１つの吸収波長と重なっている請求項３５に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３７】４〜９の連続するグアニン残基を有し、当該グアニン残基のうちの少なくとも１つはＰＰＧ残基によって置換されている請求項２８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３８】少なくとも4つの連続するグアニン残基を有し、当該少なくとも4つの連続するグアニン残基の全部がＰＰＧ残基によって置換されている請求項２８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３９】４〜９の連続するグアニン残基を有し、当該グアニン残基の全部がＰＰＧ残基によって置換されている請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４０】前記蛍光標識に直接隣接した少なくとも１つのグアニンラジカルが、ＰＰＧ残基によって置換されている請求項２８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４１】前記蛍光標識に直接隣接した４〜９の連続したグアニンラジカルを有し、当該グアニンラジカルのうち少なくとも１つはＰＰＧ残基によって置換されている請求項４０に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４２】４〜９の連続するグアニン残基を有し、当該グアニン残基の全部がＰＰＧ残基によって置換されている請求項４１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本開示は、ＤＮＡ及びＲＮＡプローブ、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）等の修飾核酸プローブ、更に、二種類以上の核酸及び／又は修飾核酸を含有するキメラプローブを含む、ハイブリダイゼーションプローブに、改良特性を提供するためのヌクレオチド類似体の使用に関する。
【０００２】
背景
ハイブリダイゼーション分析は、遺伝子クローニング、遺伝子同定、法医分析、薬物ゲノム学(pharmacogenomics)，遺伝子ポリモリフィズムの同定を含む、分子生物学及び診断における種々の技術にとって中心的役割を果している。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズされたプローブの存在がそのアッセイの読み取りを構成するアッセイのエンドポイントとして使用可能であり、或いは、ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションに続く事象（例えば、ハイブリダイズしたプライマの伸張、又はハイブリダイズしたプローブの加水分解等）が読み取りとして使用される、アッセイにおける最初の工程に使用することができる。
【０００３】
従来、ハイブリダイゼーションプローブ及びプライマは、ＤＮＡ分子であったが、ＤＮＡをプローブ又はプライマとして使用することにはいくつかの欠点がある。例えば、ＤＮＡ分子の塩基組成によって、いくつかの方法で、プローブ又はプライマとしてのその有効性が影響を受けうる。Ｇ残基の濃度が高いＤＮＡ分子は、多くの場合取り扱いが困難であり（例えば、凝集と低い溶解性との問題）、ハイブリダイゼーション反応において高いバックグランドを作り出す可能性がある。又、ＧリッチＤＮＡ分子は、それらの分析が行われる変性条件にも拘わらず、恐らくは、それら分子が二次構造を採ることにより、ゲル電気泳動によるＤＮＡ配列分析において人為構造を産出しやすいこともよく知られている。
【０００４】
ＤＮＡ分子をプローブ及びプライマとして使用することの問題点のいくつかを克服する試みとして、種々の修飾形態のＤＮＡ及びＤＮＡ類似体が使用されてきた。それらの中には、ペプチド核酸（ＰＮＡ，ポリアミド核酸としても知られる）がある。ニールセン(Nielsen)等、(1991) Science 254:1497-1500。ＰＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡの糖−燐酸骨格鎖特徴の代りに、ポリアミド骨格鎖によって結合された、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるもののような、複素環塩基単位を含有している。ＰＮＡは、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ標的配列にハイブリダイゼーションすることができ、事実、対応の核酸プローブよりもより強力にハイブリダイズする。更に、ＰＮＡは、前記糖−燐酸ＤＮＡ及びＲＮＡ骨格鎖を攻撃する多種類のヌクレアーゼに対する耐性を有している。ＰＮＡのその他の利点には、特異的に修飾されたＰＮＡが血液−脳バリアを超えることができること、そして、ＰＮＡの鞘内注射によって、イン・ヴィヴォでアンチセンス・アフェクトを媒介することが可能であることが観察されることが挙げられる。デューリング(During)等、(1999) Nature Biotechnol. 17:753-754。
【０００５】
ＰＮＡオリゴマーの合成及びＰＮＡオリゴマーの合成に使用される反応性モノマーは、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、第５，７７３，５７１号、第５，７３６，３３６号及び第５，７６６，８５５号に記載されている。ＰＮＡ合成とＰＮＡ合成用のモノマーに対する別の方法が要約されている。ウールマン(Uhlmann)等、(1998)Angew. Chem. Int. Ed.37:2796-2823。
【０００６】
しかしながら、それらがより広く使用されるにつれて、ＰＮＡの欠点も明らかになってきた。例えば、長いＰＮＡオリゴマーは、それらの配列により、凝集しやすく、精製が困難で、キャラクタライズが困難である。更に、プリンリッチなＰＮＡオリゴマーは、凝集する傾向があり、水性媒質中での溶解性が悪い。ギャンガマニ(Gangamani)等、(1997) Biochem. Biophys. Res. Comm.240:778-782;エグホルム(Egholm), Camridge Healthtech Institute´s Seventh Annual Nucleic Acid-Based Technologies,１９９９年６月２１−２３、Washington, D.C; ウールマン(Uhlmann), Camridge Healthtech Institute´s Seventh Annual Nucleic Acid-Based Technologies,１９９９年６月２１−２３、Washington, D.C。その結果、ハイブリダイゼーションにおけるＰＮＡの有効な使用は、連続するプリンが４−５以下で、その配列のどの１０塩基部分においてもプリンが６個以下で、及び／又は、連続するＧ残基が３以下である配列に限られている。例えば、http://www.resgen.com/perseptivedesign.htmlを参照。更に、ＰＮＡ−ＰＮＡ相互作用は、ＰＮＡ−ＤＮＡ相互作用よりも更に強力ある為、自己相補的配列を含有するＰＮＡ含有プローブ及びプライマは、一般に、標的配列へのハイブリダイゼーションに使用することはできない。ＰＮＡと相補的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子間の相互作用が非常に強力であることによるもう一つの結果は、ＰＮＡプローブを使用して単一ヌクレオチドミスマッチ識別を得ることが困難であることである。デミトフ(Demidov)等、(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2637-2641。
【０００７】
前述したウールマン(Uhlmann)等は、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラの合成、及びＰＮＡオリゴマーへの末端リジン残基の付加を含む、ＰＮＡの溶解性を増大させるためのいくつかの方法を検討した。彼らは、ＰＮＡオリゴマーの溶解性を増大させ、それらのハイブリダイゼーション特性を改善するためにヌクレオチド類似体を使用することは開示しなかった。
【０００８】
非ＰＮＡ含有オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマの合成においても、同様の設計制約条件が必要とされる。例えば、「配列検出システム定量的アッセイ設計及び最適化」PE Biosystems, Stock No.117MI02-01と題された刊行物を参照。これらの場合、オリゴマーのＧ／Ｃ含有量は、２０−８０％の範囲に留めなければならず、同じヌクレオチド、特に、グアニン（Ｇ）のランは避けなければならない。特に、上述した刊行物は、４つ以上のＧ残基が連続してはならないこと、そして、５´蛍光標識プローブの５´末端にＧ残基が存在してはならないとアドバイスしている。プライマの場合、３´末端の５つのヌクレオチドに含まれるＧ及び／又はＣ残基は２以下とすべきである。
【０００９】
ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン及び７−デアザプリンヌクレオチドの合成、及び、それらのホスホルアミダイト(phosphoramidte)モノマーのオリゴマー合成における使用が記載されている。シーラ(Seela) 等、(1985) Nucl. Acids. Res. 13:911-926; シーラ(Seela) 等(1986a) Helv. Chim. Acta 69:1191-1198; シーラ(Seela) 等(1986b) Helv. Chim. Acta 69:1813-1823;及びシーラ(Seela) 等(1987) Biochem. 26:2232-2238。ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン及び７−デアザプリンヌクレオチドの、ＤＮＡ配列決定における使用、及びそれらの抗ウイルス因子としての使用は、EP 286 028に開示されている。共有ＰＣＴ公開公報WO99/51775は、ハイブリダイゼーションと、ミスマッチ識別に対するピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン含有オリゴヌクレオチドの使用を開示している。ＤＮＡに２´デオキシ−７−デアザグアノシンを導入することによって、ゲル電気泳動によるＤＮＡ配列分析中のＧＣリッチストレッチ中のバンド圧縮が無くなり(米国特許第５，８４４，１０６号)、Ｇリッチ配列による四倍体(tetraplex)形成が減少し(Murchie等 (1994) EMBO J. 13:993-1001)、２´―デオキシグアノシンを含有するＤＮＡ分子の特徴である凝集物形成が減少する（米国特許第５，４８０，９８０号）ことが報告されている。しかしながら、オリゴヌクレオチドを、７−デアザアデノシン（Ａの代りに）又は７−デアザグアノシン（Ｇの代りに）によって置換することによって、その置換されたオリゴヌクレオチドによって形成するハイブリッドのＴｍが低下し、置換された塩基一つ当たりＴｍが１度以上低下する。シーラ(Seela) 等(1987)、前出、及びシーラ(Seela) 等、(1986) Nucl. Acids. Res. 14:2319-2332。
【００１０】
他方、ピラゾロピリミジン塩基類似体による二本体の安定化が報告されている。シーラ(Seela) 等(1988) Helv. Chim. Acta 71:1191-1198; シーラ(Seela) 等(1988) Helv. Chim. Acta 71:1813-1823;及びシーラ(Seela) 等、(1989) Nucl. Acids. Res. 17: 901-910。ベローソフ(Belousov)等、(1998) Nucleic Acids Res. 26: 1324-1328;米国特許第５，５９４，１２１号及び共有ＰＣＴ公報WO98/49180に開示されているように、単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドは、より高い二倍体及び三倍体形成能力を示した。オリゴヌクレオチド中のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基は、又、オリゴヌクレオチドに対する種々のペンダント基の付着部位としても有用である。共有ＰＣＴ公報WO90/14353，１９９０年１１月２９日、及び米国特許第５，８２４，７９６号を参照。これらの参考文献は、いずれも、凝集を減少させる及び／又はオリゴマーの溶解性を増加させるため、又は、オリゴマーに接合したフルオロホアの消光を減少させるために、ピラゾロピリミジン又は、その他のタイプの塩基類似体を使用することを開示するものではない。
【００１１】
小溝バインダ（ＭＧＢ）と、単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ＰＺＰ）残基によって置換されているオリゴヌクレオチドと、フルオロホアと、蛍光クエンチャーとを有する接合体が、共有ＰＣＴ公報WO99/51621及びWO99/51775に開示されている。それらの接合体は、とりわけ、ハイブリダイゼーションプローブ、プライマ、５´−ヌクレアーゼに基づく増幅アッセイにおける加水分解可能プローブとして使用される。これらの接合体中にＭＧＢを含ませることによって、その接合体のオリゴヌクレオチド部分によって形成されるハイブリッドの安定性が増大し、より短いプローブを設計することが可能となる。更に、ＭＧＢとＰＺＰとの両方は、そのような接合体がより高いミスマッチ識別を示す能力に貢献する。上述した公報はいずれも、凝集を減少させる及び／又はオリゴマーの溶解性を増加させるため、又は、オリゴマーに接合したフルオロホアの消光を減少させるために、ＰＺＰ又はその他のタイプの塩基類似体を使用することを開示するものではない。
【００１２】
要旨
そのサブユニットの少なくとも一つがピラゾロピリミジン及び／又はピロロピリミジン塩基類似体を有するオリゴマーが提供される。これらオリゴマーは、ＤＮＡ，ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はそれらの組み合わせ、又は、それらのキメラとすることができる。前記オリゴマー中の任意の数のプリン残基を塩基類似体と置換することができる。上述したオリゴマーはいずれも、フルオロホア、蛍光クエンチャー、及び／又は小溝バインダ等の追加の部分（ｍｏｉｅｔｙ）を有することができる。
【００１３】
そのサブユニットの少なくとも一つがピラゾロピリミジン及び／又はピロロピリミジン塩基類似体を有するオリゴマーは、ハイブリダイゼーションに使用された時、凝集及び自己会合しにくく、溶解性が高く、ミスマッチ識別性が高く、接合された蛍光標識の蛍光放出を消光しない。
【００１４】
少なくとも一つのＰＮＡ残基を含み、前記ＰＮＡ残基の少なくとも一つがピラゾロピリミジン及び／又はピロロピリミジン塩基類似体を有するオリゴマーも提供される。これらオリゴマーは、ＰＮＡ残基のみを有するものとすることができ、或いは、これらオリゴマーは、ＰＮＡ及び／又はＤＮＡ及び／又はＲＮＡ残基の両方を備えて、ＰＮＡ／ＤＮＡ，ＰＮＡ／ＲＮＡ又はＰＮＡ／ＤＮＡ／ＲＮＡキメラを構成するものとすることができる。前記オリゴマー中の任意の数のプリン残基を塩基類似体によって置換することができる。上述したオリゴマーはいずれも、フルオロホア、蛍光クエンチャー、及び／又は小溝バインダ等の追加の部分を有することができる。
【００１５】
別実施例において、ポリマーとフルオロホアとを有する組成物が提供され、ここで、前記ポリマーの単数又は複数のプリン含有残基は、ピラゾロピリミジン及び／又はピロロピリミジン塩基類似体を有する残基によって置換される。ポリマーは、ＤＮＡ，ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はそれらの組み合わせ、又は、それらのキメラとすることができ、前記塩基類似体は、キメラポリマーのＰＮＡ，ＤＮＡ又はＲＮＡ部分のいずれに存在してもよい。前記ポリマー中の任意の数のプリン残基は、ＰＡＮ，ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ部分のいずれかにおいて、塩基類似体によって置換することができる。上述した組成物は、オプションとして、蛍光クエンチャー及び／又は小溝バインダを有するものとすることができる。
【００１６】
上記ポリマー−フルオロホア組成物において、そのポリマー中のプリン残基によるフルオロホアの消光は、単数又は複数のプリンが塩基類似体によって置換されることによって減少する。追加的に蛍光クエンチャーを有するそのような組成物は、例えば、前記蛍光クエンチャーによるフルオロホアの消光が、プローブのハイブリダイゼーション依存加水分解によって軽減される、加水分解可能プローブアッセイにおけるプローブとして有用である。プリンの塩基類似体による置換によって提供される消光の減少によって、加水分解後の蛍光出力の増加、従って、そのようなアッセイにおける感度の増加が得られる。
【００１７】
塩基類似体を有するＰＮＡ含有オリゴマーの合成のための新規な中間体も提供される。一実施例において、ピラゾロピリミジン又はピロロピリミジンののＮ1が酢酸部分のＣ２に結合し、官能基がブロックされた、ピラゾロピリミジンとピロロピリミジン塩基類似体の酢酸誘導体が提供される。これらの誘導体は、置換ＰＮＡ及びＰＮＡ／ＤＮＡキメラの自動合成用のモノマーの作成に有用である。これら中間体の好適実施例には、２−｛６−［（１Ｅ）−１−アザ−２−（ジメチルアミノ）ビニル］−４−ヒドロキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル｝酢酸、２−（６−アミノ−４−ヒドロキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）酢酸、及び２−（−４−アミノピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）酢酸が含まれる。
【００１８】
又、ブロックされたグリシル部分のαアミノ基が、前記アセテートの酢酸Ｃ１と、エチルアミン部分のＣ２とに誘導される、上述したピラゾロピリミジン及びピロロピリミジン塩基類似体の酢酸誘導体のアミノエチルグリシル誘導体も提供される。これらの誘導体は、「ＰＮＡモノマー」としても知られる。それらの組成物は、上述したオリゴマー及びポリマーの自動合成に有用である。ＰＰＧ−含有ＰＮＡモノマー（ＰＰＰＧとしても知られる）の好適実施例には、５−［４−ヒドロキシ−６−（２−メチルプロパノイルアミノ）ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル］−３−（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）−４−オクソペンタン酸、及び１−｛６−［（１Ｅ）−アザ−２−（ジメチルアミノ）ビニル］−４−ヒドロキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル｝−Ｎ−（２−｛［４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）−Ｎ−（２−オキシプロピル）アセタミドが含まれる。ＰＰＡ含有ＰＮＡモノマーの好適実施例は、２−［Ｎ−（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）−２−｛４−［（４−メトキシフェニル）カルボニルアミノ］ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル｝アセチルアミノ］酢酸である。
【００１９】
又、ＰＮＡ，ＤＮＡ，ＲＮＡ及び／又はそれらのキメラを有するオリゴマーの合成方法も提供され、ここで、上述したＰＮＡモノマーは前記合成における単数又は複数の工程に使用される。これらの方法によって合成されるオリゴマーも提供される。
【００２０】
別実施例において、ＤＮＡ，ＰＮＡ又はＰＮＡ／ＤＮＡオリゴマーを有するプローブであって、そのプローブ中の単数又は複数の残基が、ピラゾロピリミジン又はピロロピリミジン塩基類似体を有するプローブに対するハイブリダイゼーションによってポリヌクレオチド中の標的配列を検出するための方法が提供される。これらの方法の実施において、前記プローブは、追加的に、リボヌクレオシド、フルオロホア、蛍光クエンチャー、及び／又は小溝バインダのいずれか一つ又は複数を含むことができる。
【００２１】
別実施例において、ポリマー部分（ポリマーを有する）と、蛍光発生性部分（単数又は複数のフルオロホアを有する）組成物であって、前記ポリマーの単数又は複数のプリン含有残基が、ピラゾロピリミジン及び／又はピロロピリミジン塩基類似体によって置換された組成物を利用する、ポリヌクレオチド中の標的配列を検出するための方法が提供される。この方法に使用されるポリマーは、ＰＮＡ，ＤＮＡ，ＲＮＡ又はそれらのキメラを有することができ、前記塩基類似体は、キメラポリマーのＰＡＮ，ＤＮＡ又はＲＮＡ部分の何れかの中に存在するものとすることができる。前記ポリマー中の任意の数のプリン残基を、塩基類似体によって置換することができる。好適実施例において、前記方法は、前記蛍光発光性部分の間近の前記ポリマー部分中のブリン残基がピラゾロピリミジン又はピロロピリミジンによって置換された組成物を使用して実行される。別の好適実施例において、三つ以上の連続するＧ残基を含有するオリゴマーは、それらの連続するＧ残基がＰＰＧによって置換される。この方法に使用される組成物は、オプションとして、蛍光クエンチャー及び／又は小溝バインダを含むものとすることができる。
【００２２】
更に別の実施例において、本発明の前記組成物を利用して、増幅反応中の標的配列を検出する方法が提供される。一好適実施例において、前記増幅反応は、加水分解可能プローブアッセイである。
【００２３】
ここに記載したオリゴマーの少なくとも一つがアレイに存在するオリゴマーマイクロアッセイも提供される。
【００２４】
ここに記載の組成物に対するハイブリダイゼーションによって、サンプル中に存在するポリヌクレオチド中の標的配列を検出するための方法も提供される。一好適実施例において、前記標的配列は、前記サンプル中に同様に存在する関連配列に対して単一ヌクレオチドミスマッチを有し、前記組成物は、前記標的配列とはハイブリッドを形成するが、前記関連配列とはハイブリッドを形成しない。
【００２５】
具体的実施例の説明
本発明の実施には、特に明記されない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成及び修飾、生接合(bioconjugate)化学、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝子学、組み換えＤＮＡ、及びそれらに関連する分野における当業者の範囲内の従来技術が使用される。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、マニアティス（Maniatis）,フリッシュ（Fritsh）及びサムブルック（Sambrook）, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982); サムブルック（Sambrook）、フリッシュ（Fritsh）及びマニアティス（Maniatis）, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);オースベル(Ausbel)等、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ジョン  ウィリ（John Wiley）及びサンズ（Sons） (1987及びそれの年次更新版)；ゲイト（Gait） (編集), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS; A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1984); エクスタイン（Eckstein） (編集), OLIGONUCLEOTIDES AND ALALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)を参照。
【００２６】
ここに挙げたすべての刊行物及び特許の開示内容の全体を、ここに参考文献として合体させる。
【００２７】
定義
デアザプリンとピロロピリミジンという用語は、下記の一般式による、融合ピリミジン及びピロロ環を有する複素環核を示すために交換可能に使用される。
【００２８】
【化２】
2003527579.tif 000002
【００２９】
ピラゾロピリミジンという用語は、下記の一般式による、融合ピリミジン及びピラゾール環を有する複素環核を指す。
【００３０】
【化３】
2003527579.tif 000003
【００３１】
「モノマー」とは、反応性部分に共有結合され、そのモノマーが、オリゴマー又はポリマーの一部として前記反応性部分を介して導入可能な、塩基又は塩基類似体を有する組成物をいう。或る種の場合において、前記塩基／塩基類似体部分及び／又は前記反応性部分上の官能基は、重合中に反応性にならないように、ブロックされる。好適実施例において、前記反応性部分は、アミノエチルグリシン部分であり、その場合、前記モノマーは「ＰＮＡモノマー」と称することができる。
【００３２】
「オリゴマー」は、結合した複数のモノマーユニットを有するポリマーである。オリゴマーは、公知のように、複数のモノマーを、それらの反応性部分を介して、連続結合させることによって合成することができる。オリゴマーは、ＤＮＡオリゴマー、ＲＮＡオリゴマー、ＰＮＡオリゴマー、又は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はＰＮＡモノマーから成るいかなるキメラオリゴマーであってもよい。
【００３３】
「ブロック基」又は「保護基」は、それが無ければＮ，Ｓ又はＯ原子が反応性となる可能性がある条件下において、それが付着する、Ｎ，Ｓ，又はＯ原子の反応性を阻止することが可能なすべての化学成分（ｍｏｉｅｔｙ）をいう。保護基の具体例としては、非限定的に、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ），４−メトキシフェニルジフェニルメチル（ＭＭＴｒ），イソブチリル（ｉＢｕ），９−フルオロニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ），−Ｃ6Ｈ5（ベンジル），ジフェニルカルバモイル（ＤＰＣ），２−Ｎ−ジメチルビニル（Ｄｍｖ），ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ），ベンゾイル（ｂｚ）、イソブタノイル、アセチル、及びアニソイル（Ａｎ）基が含まれる。核酸及びＰＮＡオリゴマーの合成に有用な、これら及びその他の保護基が、当該技術において公知である。ウールマン(Uhlmann)等、(1998) Angew. Chem. Int. Ed. 37:2796-2823; グリーン(Green)等、Protective Groups in Organic Synthesis第２版、John Wiley and Sons, Inc. NY.,pp.441-452, 1991。
【００３４】
オリゴマー
本発明は、単数又は複数のプリン塩基が、それが置換するプリンと同じ塩基対合特異性を有する塩基類似体によって置換されるオリゴマーを提供する。前記類似体は、ピラゾロピリミジン又はピロロピリミジンとすることができる。オリゴマーは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＰＮＡオリゴマー、又は、それらのキメラを有することができる。キメラとは、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ、ＲＮＡ／ＰＮＡキメラ、又はＰＮＡ／ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ等の、一種以上のサブユニットを有するオリゴマーをいう。キメラオリゴマーの場合、塩基類似体は、そのキメラのどの部分（即ち、ＤＮＡ部分、ＲＮＡ部分及び／又はＰＮＡ部分）にも含まれることが可能である。
【００３５】
ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡオリゴマーの合成方法は公知である。例えば、米国特許第５，４１９，９６６号、ゲート(Gait)前出、Eckstein (編集)"Oligonucleodies and Analogues: A Practical Approach,"1991, IRL Press, Oxford; オジリブ(Ogilive)等、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5746-5748;ニールセン(Nielsen)等、(1991)前出、ウールマン(Uhlmann)等(1998)前出、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、第５，７７３，５７１号、第５，７３６，３３６号及び第５，７６６，８５５号を参照。その他の修飾ＤＮＡ及び／又はＲＮＡオリゴマーを使用することも可能である。例えば、２´−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドの合成方法が記載されている。スプロート(Sproate)等,(1989) Nucleic Acids Res. 17:3373-3386。
【００３６】
一般に、オリゴマー合成の方法は、オプションとして、固体支持体に付着された成長オリゴマー鎖に、モノマーを添加する段階的サイクルを有し、前記成長オリゴマー鎖は、オプションとして、保護基と、ブロックされた成長端部とを含む。通常、モノマー添加の各サイクルにおいて、前記支持体結合成長鎖は、先ず、前記成長端部をブロック解除する条件下に曝され、次に、オプションとして縮合の為に活性化されるモノマーと縮合する。ブロック解除条件及び試薬、更に、活性化条件及び試薬は、公知である。前記モノマー添加工程は、必要回数繰り返され、各工程において追加されるモノマーは、オリゴマーの所望の配列に対応する。所望の配列が得られると、発生期のオリゴマーは、官能基をブロック解除し、及び／又は、完成したオリゴマーを前記支持体から切り離す条件に曝され、その後、必要ならば、精製する。
【００３７】
ＰＮＡオリゴマーは、しばしば、種々のハイブリダイゼーション及びその他の技術におけるＤＮＡオリゴヌクレオチドの代用物として使用される。しかしながら、ＰＡＮオリゴマー、特にＧリッチＰＮＡは、凝集しやすく、多くの場合、水性溶媒中の溶解性の低下を示す。一好適実施例において、ＰＮＡオリゴマーは、プリン塩基がピラゾロピリミジン又はピロロピリミジン塩基類似体によって置換されている、例えば、ＧがＰＰＧ又は７−デアザグアニンによって置換され、ＡがＰＰＡ又は７−デアザアデニンによって置換され、そしてＧ又はＡがＰＰＩ又は７−デアザヒポキサンチンによって置換された、単数又は複数の残基を有する。このようにして、前記塩基類似体は、それが置換された前記塩基の塩基対合特異性を保持する。より好適な実施例において、単数又は複数のＧ残基がＰＰＧによって置換されたＰＮＡオリゴマーが提供される。そのようなＰＰＧ置換ＰＮＡは、Ｇを含有するオリゴマーと比較して、分子間及び分子内自己会合の低下を示す。これによって、これらオリゴマーの精製と取り扱いが容易になり、特に、三つ以上の連続Ｇ残基を含むプローブ配列に対して、ハイブリダイゼーション特性の改善（例えば、感度の増大）が提供される。
【００３８】
塩基類似体は、それが置換する塩基の塩基対合特異性を保持するので、本発明のオリゴマーは、相補的配列に対して配列特異的結合することが可能であり、一本鎖及び二本鎖標的に対して、それぞれ、より高い二倍体及び三倍体係合性を示すことができる。
【００３９】
いかなる理論によっても限定されることを望むものではないが、本出願人は、自然発生プリン塩基と比較した場合、ピラゾロピリミジン及びピロロピリミジン塩基類似体は、非正規塩基対(Ｇ−Ｔ及びＧ−Ｇ塩基対）を形成しにくいものでありながら、それらが置換するプリンの特徴である正規の塩基対（即ち、ＰＰＧ−Ｃ，７ＰＧ−Ｃ，ＰＰＡ−Ｔ及び７ＰＡ−Ｔ塩基対）を形成する能力を保持するものである、ことを銘記するものである。
【００４０】
塩基類似体とそれらの合成
オリゴマー及びオリゴマー合成用の中間体における塩基類似体が提供される。これらの塩基類似体は、式１に示される構造を有し、ここで、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立的に、−Ｈ，−ＯＨ，−ＳＨ又は−ＮＨ2であり、Ｒ3は、−Ｈ，−ＣＮ，ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ又はＩ）又は−Ｒ12−Ｙであり、Ｒ12は、Ｃ1−Ｃ12アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、Ｙは−Ｈ，−ＯＨ，−ＮＨ2又は−ＳＨであり、Ｘは、＝ＣＨ−又は＝Ｎ−であり、Ｌは、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ又はそれらのキメラ等のオリゴマー骨格鎖に対するリンクである。
【００４１】
【化４】
2003527579.tif 000004
【００４２】
Ｘが＝Ｎ−である場合、前記塩基類似体はピラゾロピリミジンであり、Ｘが＝ＣＨ−である場合、前記塩基類似体はピロロピリミジンである（７−デアザプリンとしても知られる）。例えば、Ｘが＝Ｎ−，Ｒ1が−ＯＨ、Ｒ2が−ＮＨ2、Ｒ3が−Ｈであれば、前記塩基類似体は、ピラゾロピリミジニルグアニン（ＰＰＧ）である。Ｘが＝Ｎ−，Ｒ1が−ＮＨ2、Ｒ2及びＲ3が−Ｈであれば、前記塩基類似体は、ピラゾロピリミジニルアデニン（ＰＰＡ）である。Ｘが＝Ｎ−，Ｒ1が−ＯＨ、Ｒ2及びＲ3が−Ｈであれば、前記塩基類似体は、ピラゾロピリミジニルヒポキサンチン（ＰＰＩ）である。
【００４３】
Ｘが＝Ｃ−，Ｒ1が−ＯＨ、Ｒ2が−ＮＨ2、Ｒ3が−Ｈであれば、前記塩基類似体は、７−デアザグアニン（７ＰＧ）である。Ｘが＝Ｃ−，Ｒ1が−ＮＨ2、Ｒ2及びＲ3が−Ｈであれば、前記塩基類似体は、７−デアザアデニン（７ＰＡ）である。Ｘが＝Ｃ−，Ｒ1が−ＯＨ、Ｒ2及びＲ3が−Ｈであれば、前記塩基類似体は、７−デアザヒポキサンチン（７ＰＩ）である。
【００４４】
ＰＰＧと７−デアザグアニンとは、グアニンと同じ塩基対合特性（即ちＣとの塩基対合）を有し、これに対してＰＰＡと７−デアザアデニンとは、アデニンと同じ塩基対合特性（即ちＴとＵとの塩基対合）を有する。ＰＰＩと７−デアザヒポキサンチンとは、ＧとＡとの両方に対して均等の塩基対合特性を有するので、従って、Ｃ，Ｔ及びＵと対合する。
【００４５】
前記塩基類似体を有するオリゴヌクレオチドは、式３による、前駆体（「ＰＮＡモノマー」）を使用して、周知の自動方法によって合成される。前記モノマーは、式２に示される構造を有する中間体を使用して作られる。
【００４６】
【化５】
2003527579.tif 000005
【００４７】
【化６】
2003527579.tif 000006
【００４８】
式１及び式２における許容される官能基は次の通りである。
【００４９】
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立的に、−Ｈ，−ＯＨ，−ＯＲ6，−ＳＨ，−ＮＨ2又は−ＮＨＲ7、
Ｒ3は、−Ｈ，−ＣＮ，ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ又はＩ）又は−Ｒ12−Ｙ、Ｒ12は、Ｃ1−Ｃ12アルキル、アルケニル、又はアルキニル、そしてＹは、−Ｈ，−ＯＨ，−ＮＨ2又は−ＳＨ，
Ｒ4は、−Ｈ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）、４−メトキシフェニルジフェニルメチル（ＭＭＴｒ）、イソブチリル（ｉＢｕ）及び９−フルオロニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から成るグループから選択される保護基、
Ｒ5は、−Ｈ又は−Ｃ6Ｆ4Ｈ（ＴＦＰ）、
Ｒ6は、−Ｈ，−Ｃ6Ｈ5（ベンジル）又はジフェニルカルバモイル（ＤＰＣ）基、
Ｒ7は、２−Ｎ−ジメチルビニル（Ｄｍｖ），ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ），モノメトキシトリチル（ＭＭｔｒ）、ベンゾイル（ｂｚ）、イソブチリル（ｉＢｕ）、イソブタノイル、アセチル、及びアニソイル（Ａｎ）基から成るグループから選択される保護基、そして
Ｘは、＝ＣＨ−又は＝Ｎ−である。
【００５０】
これらの式は、これらによって示された分子のすべての異性体と互変異性体とを含む。ＰＮＡ合成用の前駆体と、これら前駆体の合成に使用する中間体の好適実施例は、次の通りである。式２において、Ｒ1が−ＯＨ，Ｒ2が−ＮＨ2，Ｒ3が−ＨそしてＸが＝Ｎ−である場合、その結果得られる構造は、２−（６−アミノ−４−ヒドロキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）酢酸（ＰＰＧＡ）である。式２において、Ｒ1が−ＮＨ2，Ｒ2が−Ｈ，Ｒ3が−ＨそしてＸが＝Ｎ−である場合、その結果得られる構造は、２−（４−アミノピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）酢酸（ＰＰＡＡ）である。Ｒ4及びＲ5が−Ｈである式３の対応する誘導体は、それぞれ、ＭＰＰＧＡ、ＭＰＰＡＡと略称する。後述するように、これらの化合物のブロック誘導体も提供される。
【００５１】
ここで使用する名称「ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン」は、以前の共有公報、特許及び特許出願においてピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンと称されていたものと同じ構造を指す。例えば、米国特許第５，８２４，７９６号，ＰＣＴ  ＷＯ９９／５１６２１及びＰＣＴ  ＷＯ９９／５１７７５を参照。命名法におけるこの変化の理由は、その構造が同定される名称を、それらの構造に対してChemInnovation Software, San Diego, CAによって提供される命名法プログラムNamExpert及びNomenclatorによって割り当てられたものと一致させるためである。
【００５２】
ピラゾロピリミジン及びピロロピリミジン塩基の合成は、当該技術において公知の方法によって達成される。シーラ(Seela)等(1985)前出、シーラ(Seela)等(1986a)前出、シーラ(Seela)等(1986b)前出及びシーラ(Seela)等(1987)前出を参照。２−置換プリン酢酸誘導体の合成に関してウールマン(Uhlmann)等(1998)前出によって記載された反応を使用して、適当に保護された４−アミノピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン（ＰＰＡ）と６−アミノ−４−ヒドロキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン（ＰＰＧ）とを、アルキル２−ブロモアセテートと反応させて式２の生成物を得ることができる。アルキル化は、ピラゾロピリミジンの１と２の窒素原子の両方で起こるので、異性体の分離と１−置換異性体の精製が必要である。７−デアザプリン及び関連ピロロピリミジンの場合、アルキル２−ブロモアセテートとの反応によってＮ1−置換生成物のみが生成する。
【００５３】
従って、ＰＰＧＡ（３）は、前記異性体の分離後に、水素化ナトリウムの存在下におけるエチル２−クロロアセテートとのアルキル化によって、４−メトキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−６−イルアミン（４）（シーラ(Seela)等(1985) Heterocycles 23: 2521-2524)から合成することができる（反応式１）。
【００５４】
【化７】
2003527579.tif 000007
【００５５】
ＰＰＧＡの合成に対する別の方法が反応式２に図示されている。この場合、２−アミノ−４−６−ジクロロピリミジン−５−カルボキシアルデヒド（１）を、エチル２−（ヒドラジノル）アセティックアセテートと反応させて、エチル２−（６−アミノ−４−｛２−［（エトキシカルボニル）メチル］ヒドラジノ｝ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）アセテート（２）を得る。（２）を水酸化ナトリウム、その後、過酸化水素と反応させて、所望の生成物ＰＰＧＡ（３）が得られる。この合成法の利点は、それによってＮ1−置換異性体のみが生成することにある。後述する例１を参照。
【００５６】
【化８】
2003527579.tif 000008
【００５７】
オリゴマーの自動化学合成に使用するために、アミノ基等の塩基類似体の反応基は保護されなければならない。一実施例において、ＰＰＧＡのブロック誘導体が、反応式３に記載されているように合成される。ＰＰＧＡ（３）は、ジメチルホルムアミドとトリエチルアミンとの中で塩化イソブタノイルと反応して、イソブチリル−ブロック・アミノ基を有するＰＰＧＡ誘導体（１４）が得られる。後述する例２を参照。
【００５８】
【化９】
2003527579.tif 000009
【００５９】
自動オリゴマー合成におけるモノマーとしての、ＰＰＧＡ，ＰＰＡＡ，２−（２−アミノ−４−ヒドロキシピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）酢酸（７ＰＧＡ）及び２−（４−アミノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）酢酸（７ＰＡＡ）のアミノエチルグリシル誘導体の合成方法が知られている。ウールマン(Uhlmann)等、前出。これらの方法では、反応式４に図示されているように、（Ｏ−７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ），（ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）又は、Ｏ−［（シアノ（エトキシカルボニル）メチレン）アミノ］−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロボレート（ＴＯＴＵ）等の縮合試薬の存在下で、適当に保護されたアミノエチルグリシン、例えば、メチル２−［（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）アミノ］アセテート（ＭＭＴｒＡｅｇ、ウィル(Will)等(1995) Tetrahedron 51: 12069-12082）が、ＰＰＧＡ，ＰＰＡＡ，７ＰＧＡ又は７ＰＡＡ（これも、必要な場合、保護される）と縮合される。前記Ｒ5保護基はそれが選択的に除去されて（即ち、他のブロック基を除去することなく）、Ｒ5が−Ｈで、そして、例えば、Ｒ1が−ＮＨＣｂｚ、Ｒ2及びＲ3が−Ｈ、そしてＲ4が−ＭＭＴｒである、化合物７が得られるように選択される。ＭＰＰＡＡのこの保護誘導体は、ＰＮＡオリゴマー又はＰＮＡ／ＤＮＡキメラの合成に使用される。
【００６０】
【化１０】
2003527579.tif 000010
【００６１】
ＰＮＡ合成のためのブロックＰＰＧモノマーの合成例は、反応式５によって達成される。ＰＰＧ（１５）が塩化イソブタノイルと反応してアミノ−ブロックＰＰＧ（１６）が得られ、これが水素化ナトリウムによって処理され、その後、アルキルブロモアセテートと反応して、例えば、メチルアセテート誘導体（１７）が得られる。メチルエステル１７のアルカリ加水分解によって、酢酸誘導体１８が得られる。この１８を更にメチル２−［（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）アミノ］アセテート（ＭＭＴｒＡｅｇ）と反応させて、ＭＭＴｒで保護されたアミノ基を備えた、ＭＭＴｒブロックアミノエチルグリシル誘導体（１９）のアルキルエステル（この場合は、メチルエステル）が得られ、これは、前記エステルのアルカリ加水分解後、ＭＭＴｒで保護されたアミノエチルグリシン誘導体２０を生成する。後述する例３を参照。
【００６２】
【化１１】
2003527579.tif 000011
【００６３】
前記塩基類似体ＰＰＡを有するＰＮＡモノマーの合成方法の例が反応式６に図示されている。４−アミノピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン（ＰＰＡ，化合物８）が、ピリジン中で４−メトキシベンゾイル塩化物と反応して前記アミノ保護ＰＰＡ誘導体（９）が生成する。これが、水素化ナトリウムと反応し、その後、２−ブロモアセテートメチルエステルと反応し、Ｎ1−置換メチルアセテート誘導体（１０）が単離される。誘導体１０の水酸化ナトリウムでの処理によって、前記メチルエステルは、ＰＰＡＡのＮ−Ｂｚ保護アセテート誘導体（化合物１１）に変換される。詳細については例４を参照。
【００６４】
【化１２】
2003527579.tif 000012
【００６５】
反応式６について引き続き、Ｎ−ＢｚＰＰＡＡ（１１）のＰＮＡ合成のための反応性モノマーへの変換は、化合物１１とモノメトキシトリチルアミノエチルアミノアセテート（ＭＭＴｒＡｅｇ＝モノメトキシトリチルアミノエチルグリシン）とが縮合することによって１２が形成し、その後、この１２がアルカリによって処理されて、ＭＭＴｒ保護アミノエチルグリシン誘導体１３が生成することによって行われる。詳細については例５を参照。
【００６６】
好適なＰＰＧモノマーは、２−Ｎ−ジメチルビニルで保護されたＭＭＴｒ−アミノエチルグリシン誘導体（２４）であり、その合成は反応式７に図示されている。４−メトキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−６−イルアミン（２１）を、先ず、乾燥メタノール中でＫＯＨと反応させ、その後、メチルブロモアセテートと反応させて、前記メチルアセテート誘導体（２２）が得られた。前記酢酸誘導体２３を生成するアルカリ加水分解の後、（ジメトキシメチル）ジメチルアミンとの反応を行って（２４）を得た。ＭＭＴｒＡｅｇとの（２４）の反応によって保護されたＰＰＧモノマー２５が得られた。
【００６７】
【化１３】
2003527579.tif 000013
【００６８】
好適なＰＰＡモノマーは、２−Ｎ−ジメチルビニルで保護されたＭＭＴｒ−アミノエチルグリシン誘導体（２９）であり、その合成を反応式８に図示する。ピラゾロ［５，４］ピリミジン−４−イルアミン（８）を、先ず、乾燥メタノール中でＫＯＨと反応させ、その後、メチルブロモアセテートと反応させて、メチルアセテート誘導体（２６）を得た。これを、（ジメトキシメチル）ジメチルアミンと反応させて（２７）を得て、これをＮａＯＨによって処理して（２８）を生成した。（２８）とＭＭＴｒＡｅｇとの反応によってＰＰＡモノマー（２９）が生成した。
【００６９】
【化１４】
2003527579.tif 000014
【００７０】
ＰＰＩの反応性誘導体の合成も類似の手順で行われる。ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４−オール（ＰＰＩ，トミナガ(Tominaga)等(1990) J. Heterocycl. Chem. 27: 775-783）をメチルブロモアセテートによって直接にアルキル化し、その後、アルカリ加水分解して、２−（４−ヒドロキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）酢酸を得て、これを、記載されているように（ウールマン(Uhlmann)等、(1998)前出）ＭＭＴｒ−ブロックアミノエチルグリシン誘導体に変換することができる。或いは、メチルブロモアセティックアセテートとの反応の前に、ＰＰＩのヒドロキシル基を、ジフェニルカルバモイル基によってブロックすることができる。
【００７１】
ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジンの反応性誘導体を合成するために使用するのと同じ合成法を、ＰＮＡ含有オリゴマーの合成用の７−デアザプリンの反応性誘導体を合成するために使用することができる。これら二種類の化合物の合成間の基本的相違点は、後者の場合、メチルブロモアセテートとのアルキル化後に、一つの異性体のみが生成することにある。
【００７２】
ＰＮＡ含有オリゴマーの合成
前述したモノマー及び前駆体に加えて、本発明は、オプションとして、単数又は複数のリガンド、尾部分、又はペンダント基に共有結合された、少なくとも一つの式４のモノマー単位を有する、ＰＮＡオリゴマー、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、及び／又はＰＮＡ／ＤＮＡキメラを含む。ＰＮＡオリゴマーは、式４に示されているように、ペプチド結合によって共有結合されている二つ以上のＰＮＡモノマーを有し、ここでＢは、塩基（即ち、核酸又はその修飾誘導体に一般的に見られるように、複素環塩基Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ又はＵ）又は塩基類似体、ｋは、０〜５０、好ましくは０〜４０、より好ましくは０〜３０、更に好ましくは０〜２０であり、Ｒ21は、独立的に、−Ｈ，−ＯＨ，−ＮＨ2，−ＮＨＲ22，−Ｎ（Ｒ22）2，保護基、反応基、又はオリゴマー、Ｒ22は、−Ｈ又はＣ1-6アルキル、アルケニル又はアルキニルである。
【００７３】
【化１５】
2003527579.tif 000015
【００７４】
モノマー前駆体からのＰＮＡオリゴマーの合成は、公知である。例えば、ウールマン(Uhlmann)等、前出。合成は、接合アミノ基を含むＣＰＧ樹脂又はその他の固体支持体から始められる。適当にブロックされたモノマー（所望のオリゴマーの末端モノマーに対応）を、カップリング剤の補助によって、前記アミノ基に共有結合させる。前記第１モノマーのブロックされた成長端部の脱保護後、第２のモノマーを接続する。このプロセスを、所望の長さと配列のオリゴマーが得られるまで繰り返し、その時、オリゴマーは前記固体支持体から切り離され、塩基保護基があればそれらを除去する。
【００７５】
一実施例において、ＰＮＡオリゴマーは、前記固体支持体から切り離された末端に−ＮＨ2基を有し、反対側端部に−ＣＯＯＨ又は−ＯＨ基を有する。前記末端官能基は、ＰＮＡ含有オリゴマーに対する、追加の分子及びペンダント基の付着部位を提供する。
【００７６】
ＰＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴマーの合成方法は、周知である。例えば、ウールマン(Uhlmann)等、前出を参照。ＰＮＡ／ＤＮＡキメラの合成の為の二つの主要な方法は、溶液中での前合成ＰＮＡ及びＤＮＡオリゴマーのブロック縮合と、適当に保護されたＰＮＡ及びＤＮＡモノマー前駆体との段階的固相合成である。当業者は、その合成法に応じて、ＰＮＡ部とＤＮＡ部との間に異なる接続基が可能であることを理解するであろう。結合の具体例としては、非限定的に、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）グリシン及び５´−アミノ−２´，５´−ジデオキシヌクレオシドホスホルアミダイト結合がある。ウールマン(Uhlmann)等、前出。
【００７７】
ＰＮＡオリゴマーを形成するためのＰＮＡモノマーの前記縮合に使用されるカップリング剤（又は活性化剤）は、非限定的に、ベンゾトリアゾリル−１−オキシ−トリスピロロジノフォスフォニウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＰｙＢＯＰ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ），Ｎ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ），ブロモ  トリス（ピロリジノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＢｙＢｒｏｐ）、及び、Ｏ−［（シアノ（エトキシカルボニル）メチレン）アミノ］−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロボレート（ＴＯＴＵ）を含む。これら及びその他の活性化及び縮合剤は、当業者に周知である。例えばウールマン(Uhlmann)等、前出を参照。
【００７８】
オリゴマーに共有結合可能な追加の分子は、非限定的に、インターカレータ、脂肪好性基、小溝バインダ、大溝バインダ、レポータ基（蛍光、化学発光及び放射性レポーターを含む）、タンパク質、酵素、抗体、キレート試薬、及び／又は架橋剤を含む。これらの分子は、オリゴマーの内部、又はその一方又は両方の端部に付着させることができる。それらの分子のオリゴヌクレオチドに対する性質及び付着は現在周知であり、例えば、米国特許第５，５１２，６６７号及び第５，４１９，９６６号、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／３２４９６号に記載されており、ここにこれらを参考文献として合体させる。
【００７９】
本発明の前記オリゴマーは、その一方又は両方の端部に、比較的低分子量の尾部分を備えることができる。例えば、尾分子は、燐酸塩、燐酸塩エステル、アルキル基、アミノアルキル基、親水性基、又は脂肪好性基とすることができる。この尾部分は、又、インターカレータ、脂肪好性基、小溝バインダ、レポータ基、キレート試薬、及び／又は架橋機能を、本発明のオリゴマーに結合させることができる。尾部分及び種々の尾部分を備えたオリゴヌクレオチドを得るための方法も、上述した米国特許第５，５１２，６６７号及び第５，４１９，９６６号に記載されている。
【００８０】
その水性溶媒中における溶解性を変化させるために、本発明のオリゴマーに分子を付着させることができる。そのような分子は、非限定的に、糖類、アミノ酸、荷電小溝バインダ等の荷電分子等を含む。
【００８１】
一好適実施例において、グアニンに置換したＰＰＧ及び／又はアデニンに置換したＰＰＡを含有する本発明のオリゴマーは、更に、接合した小溝バインダ（ＭＧＢ）を含む。最適な単一ヌクレオチドミスマッチ識別は、共有ＰＣＴ公報ＷＯ９９／５１７７５に開示されているように、グアニンの代りにＰＰＧを含有するＭＧＢ接合オリゴヌクレオチドを使用することによって得られる。極性ＭＧＢが好ましく、より好適なＭＧＢ部分は、カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロロ−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）である。本発明の実施に使用されるその他のＭＧＢ部分は、共有米国特許第５，８０１，１５５号及び共有ＰＣＴ公報ＷＯ９９／５１６２１号とに開示されており、それらの開示をここに参考文献として合体させる。
【００８２】
オリゴマーは、ここに開示されているプリン類似体の他に、例えば、修飾ピリミジンやピリミジン類似体等の、塩基類似体を含むことができる。
【００８３】
更に、本発明の前記オリゴマーは、ペプチド骨格鎖以外の骨格鎖を有することができ、或いは、混合したペプチド及び非ペプチド結合から成るヘテロ骨格鎖を備えることができる。例えば、グリシンメチルエステル、オルニチン、プロリン、ジアミノシクロヘキサン、及び２−アミノプロパンジオールのホスホルアミダイトに基く骨格鎖を備えたオリゴマーを使用することができる。ウールマン(Uhlmann)等、前出。更に、Ｎ−（２−アミノエチル）ホスホノグリシンやＮ−（２−ヒドロキシエチル）ホスホノグリシン等の、ペプチド結合がホスホン酸ブリッジによって置換されたＰＮＡを使用することができる。ペイマン(Peyman)等(1997) Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 36: 2809-2812;エフィモフ(Efimov)等(1998) Nucl. Acids. Res. 26:566-577。その他のオリゴマー結合は当業者に明らかであろう。
【００８４】
三倍体形成オリゴマー
ＰＮＡ含有オリゴマーは、一本鎖及び二本鎖核酸標的の両方の検出に有用である。二本鎖核酸の検出の為には、当該技術において知られているように、オリゴマーは、フーグスティーン型塩基対、逆フーグスティーン型塩基対、その他均等の塩基対を介して二本鎖標的の大溝バインダに結合する。例えば、フレスコ(Fresco)米国特許第５，４２２，２５１号、ホーガン(Hogan)米国特許第５，１７６，９９６号、及びランペ(Lampe)(1997) Nucleic Acids Res. 25: 4123-4131を参照。ここに開示されているようにＰＮＡ含有オリゴマーにおいてプリンを塩基類似体によって置換することによって、三倍体形成が容易になる。三倍体形成オリゴヌクレオチドは、オプションとして、フルオロホア、蛍光クエンチャー、及び、上述した追加分子のすべて等の結合基を含む。一好適実施例において、単数又は複数のプリンが塩基類似体によって置換された三倍体形成ＰＮＡ含有オリゴマーは、結合小溝バインダを有する。本発明のオリゴマーにおいて有用な小溝バインダの開示については上記内容を参照。
【００８５】
フルオロホア及び蛍光クエンチャー
一実施例において、付着レポーター基は、蛍光標識又は、フルオロホア／蛍光クエンチャー対である。一好適実施例において、蛍光標識を含有するプローブにおける、単数又は複数のプリン残基の、ピラゾロピリミジン及び／又はピロロピリミジン塩基類似体による置換により、その標的の消光が減少する。更に、単数又は複数のブリン類似体と、オプションとして蛍光クエンチャーとを有する蛍光標識プローブが提供される。
【００８６】
蛍光標識は、非限定的に、フルオレセイン、ローダミン、ナフチラミン、クーマリン、キサンテン、アクリジン、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、シアニン、フィコエリトリン、緑色蛍光タンパク質、等を含む。追加的蛍光標識、及び、それらを核酸及びＰＮＡプローブに結合する方法は、当業者に知られている。例えば、ホーグランド(Hauglan) (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 第６版、Molecular Probes, Inc., Eugene, OR及びＰＣＴ公報ＷＯ９９／４０２２６を参照。一般に、蛍光標識及び／又は蛍光クエンチャーをＰＮＡオリゴマー又はキメラオリゴマーのＰＮＡ部分に付着させる方法は、フルオロホア及び／又は蛍光クエンチャーをＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合させるために使用される方法と類似している。前記フルオロホア又はクエンチャーは、例えば、−ＯＨ又は−ＮＨ2等の反応基を有する尾部分に付着するか、若しくは、例えば、ピリミジンの５位置、プリンの７位置、又は、ピラゾロピリミジン或いはピロロピリミジンの３位置において、塩基に付着する。
【００８７】
本発明のいくつかの実施例において蛍光標識（フルオロホア）と蛍光クエンチャーとの両方を有するオリゴマーが使用される。蛍光クエンチャーは、プローブ又はポリマーのクエンチャー部分とも称される。蛍光クエンチャーは、その吸収スペクトルが特定のフルオロホアの蛍光放出スペクトルと重なり、フルオロホアによって放出されるエネルギを吸収して、それによって、放出された蛍光の量を減少させる（即ち、蛍光標識の放出を消光する）分子を含む。様々なフルオロホアが様々な消光剤によって消光される。一般に、特定のフルオロホア／クエンチャー対のスペクトル特性は、そのクエンチャーの単数又は複数の吸収波長がフルオロホアの単数又は複数の放出波長と重なるものである。
【００８８】
フルオロホアによる放出がクエンチャーによって吸収される適当なフルオロホア／クエンチャー対は公知である。例えば、ホーグランド(Hauglan)前出を参照。本発明の実施に使用可能な、蛍光クエンチャー／フルオロホア対の具体例は次の通りである。好適なフルオロホア／クエンチャー対は、フルオレセインとテトラメチルローダミンである。ニトロチアゾールブルーは、６種類の染料、即ち、６−ＦＡＭ，ｄＲ１１０，ｄＲ６Ｇ，ｄＴＭＲ，ｄＲＯＸ及びＪＡＺの蛍光放出を消光する。リー(Lee)等、(1999) Biotechniques 27: 342-349。６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）は、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及び６−カルボキシ−４，７，２´，７´−フルオレセイン（ＴＥＴ）からの放出を消光する。リー(Lee)等(1993) Nucl. Acid Res. 21: 3671-3766。６−（Ｎ−［７−ニトロベンズ−２−オクサ−１，３−ジアゾール−４−イル］アミノ）ヘキサン酸は、７−ジメチルアミノクーマリン−４−アセテートによる蛍光を消光する。ビケット(Bicket)等(1994) Ann. NY Acad. Sci. (９月６日)732: 351-355。６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）とエリスロマイシンＢとは、ＦＡＭ放出を消光する。リ(Li)等、(1999) Bioconj. Chem. 10: 241-245。２，４−ジニトロフェニル基は、（Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−３−（７−メトキシ−４−クーマリル）プロパン酸を消光する。ホーソン(Hawthorne)等(1997) Anal. Chem. 253:13-17。ダブシル(dabcyl)は、化学センサにおけるダンシルスルホンアミドのクエンチャーとして、そして、蛍光発生プローブにおいて、フルオロホアＥＤＡＮＳ用のクエンチャーとして使用される。ロスマン(Rothman)等、(1999) Biorg. Med. Chem. Lett. 22: 509-512及びマタヨシ(Matayosh)等(1990) Science 247: 954-958。ＱＳＹ−７は、テトラメチルローダミンのクエンチャーである。ホーグランド(Hauglan)前出。その他のフルオロホア／クエンチャー対は、上述した特性に応じて、放出及び吸収波長を比較することによって、当業者により選択可能である。
【００８９】
すべての蛍光標識が本発明の実施において有効ではあるが、好適なフルオロホアは、４００〜８００ｎｍの放出最大量を有する。同様に、すべての蛍光クエンチャーが使用可能であるが、好適な蛍光クエンチャーは、４００〜８００ｎｍの吸収最大量を有する。
【００９０】
別実施例において、オリゴマーは、蛍光共鳴エネルギ転移（ＦＲＥＴ）が可能な一対のフルオロホアを有する。この場合、二つのフルオロホアがＦＲＥＴシリーズ中に使用される。第１のフルオロホア（蛍光供与体）は、第２フルオロホア（蛍光受容体）の励起スペクトルに重なる放出スペクトルを有する。従って、蛍光供与体の励起波長における放射によって、受容体の放出波長での蛍光が発生する。それらの放出及び励起波長の適切な重なりを有する任意の数のフルオロホアによって、ＦＲＥＴシリーズ、又は、３つ、４つ又はそれ以上のフルオロホアを形成することが可能であることは明らかである。
【００９１】
一実施例において、フルオロホアは、「核酸ハイブリダイゼーションによって誘発される蛍光検出」と題する（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  ｄｏｃｋｅｔＮｏ．３４４６９−２０００６．００）、１９９９年１０月２６日出願の共有米国特許出願第０９／ ， ，号に開示されているように、潜在フルオロホアである。
【００９２】
利点例
オリゴマーがプローブ又はプライマとして使用される場合、プリンを塩基類似体で置換することにより、置換されたオリゴマーと、それ自身、及びその他のオリゴマー分子との凝集が減少する。凝集の減少は、後述する例６に記載されているＧリッチプローブについて示された。その結果、ここに開示されたオリゴマーを使用することによって、オリゴマーをプローブとして使用する、ハイブリダイゼーションによる標的配列の検出のための改善された方法が得られる。標的配列はＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、すべてのオリゴ−又はポリヌクレオチドを有することができる。
【００９３】
蛍光標識プローブにおけるプリンの塩基類似体による置換は、置換されないプローブにおいて発生する標識の消光を減少させる。後述する例７及び８を参照。特に、本発明者等は、蛍光標識に隣接する３つ以上の連続Ｇ残基を含有するプローブを使用した増幅生成物の検出が非効率的であること、そして、蛍光標識に隣接する５つ以上の連続するＧ残基を有するプローブの場合、生成物の検出は観察されないということを証明した。本発明者等は、又、ＧをＰＰＧによって置換すると、蛍光標識に隣接する９つ以下の連続ＰＰＧ残基を含有する蛍光プローブは、増幅生成物の極めて効率的な検出を提供するということも測定した。従って、ポリマー部分（通常、オリゴマー、好ましくは、ＰＮＡオリゴマー、又はＰＮＡ／ＤＮＡキメラ、より好ましくはＤＮＡオリゴマー）と、蛍光部分とを有するプローブを利用した、標的配列を検出するための改良方法が、ここに開示されている組成物を使用することによって得られる。
【００９４】
従って、ここに開示されている、ピラゾロピリミジン及びピロロピリミジン塩基類似体を有する、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ及びキメラオリゴマーは、非限定的に、ハイブリダイゼーション、プライマ伸長、加水分解可能プローブアッセイ、増幅方法（例えば、ＰＣＲ，ＳＳＳＲ，ＮＡＳＢＡ）、単一ヌクレオチドミスマッチ識別、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ヌクレオチド配列分析、オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション及びそれらに関連する技術を含む技術において有用である。ここに開示されるオリゴマーは、例えば、米国特許第５，４９２，８０６号、第５，５２５，４６４号、第５，５５６，７５２号及びＰＣＴ公報ＷＯ９２／１０５８８及びＷＯ９６／１７９５７に開示されいるもののような、オリゴマーアレイ中の固定オリゴマーとして使用することができる。溶解度の増加、凝集傾向の低下、結合蛍光発光標識の消光の減少、及び／又は、これら及びその他の要因のなんらかの組み合わせにより、恐らく特異性が改善され、感度が改善される。
【００９５】
リアルタイム加水分解可能プローブアッセイにおけるＰＰＧ置換プローブの優れた性能は、後述する例９に示される。
【００９６】
本発明の別実施例において、単数又は複数のプリンが塩基類似体によって置換されたＰＮＡ含有オリゴマーが、例えば、薬用、アンチセンス又は抗遺伝子試薬、リボザイムの成分として、或いは遺伝子療法用に、使用される。治療用途には、イン・ヴィヴォ又はエクス・ヴィヴォのＤループ形成が含まれる。
【００９７】
以下の例は、本発明を限定するのではなく、例示するために提供される。
【００９８】
例
例１：２−（６−アミノ−４−ヒドロキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）酢酸（ＰＰＧＡ，化合物３）の合成
エチル−２−（６−アミノ−４−｛２−［エトキシカルボニル］メチル｝ヒドラジノ）ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）アセテート（化合物２）
２−アミノ−４−６−ジクロロピリミジン−５−カルボキシアルデヒド（化合物１）（１０ｇ；５２ｍｍｏｌｅ）を、１００ｍｌの水中のエチル２−（ヒドラジノール）アセティックアセテート  ヒドロクロライド１０．１ｇ（６４．８ｍｍｏｌ）によって処理する。トリエチルアミン（１５ｍｌ；１０７ｍｍｏｌｅ）を添加し、その混合物を１０分間６０℃に加熱し、次に、室温で３日間攪拌した。エチル２−（ヒドラジノール）アセティックアセテート  ヒドロクロライドは、完全には溶解しなかったが、ＳｉＯ2（ＣＨ2Ｃｌ2：ＣＨ3ＯＨ  １０：１）上のＴＬＣは、新規な生成物の形成を示した。この混合物を、乾燥状態にまで蒸発させ、トルエン（１００ｍｌ）中に採り、乾燥状態まで蒸発させた。固体を約３００ｍｌのＣＨ3ＣＮ中で懸濁させ、ＳｉＯ2カラム（４９ｘ６ｃｍ）を通して濾過し、０．７１のＣＨ3ＣＮと約３００ｍｌのＣＨＣｌ3で洗浄した。濾液を乾燥状態まで蒸発させ、１２０ｍｌの高温ＣＨ3ＯＨ中に溶解させ、一晩４℃で結晶化させた。その生成物、無色固体（３．２ｇ）を収集し、乾燥させた。ＴＬＣと逆相ＨＰＬＣは、純粋化合物を示し、ＮＭＲ分析は構造２を裏付けた。
【００９９】
２−（６−アミノ−４−ヒドロキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）酢酸（化合物２）
化合物２（３．１６ｇ；９．４ｍｍｏｌｅ）を、１００ｍｌの高温メタノール中に溶解させ、次に、１００ｍｌの２Ｎ  ＮａＯＨ溶液を添加し、その混合物を、６時間還流し、その時、ＴＬＣによる分析は、エステルの加水分解を示した。前記反応混合物に対する２ｍｌの３０％Ｈ2Ｏ2（０．５ｍｌの部分）の添加、その後の、過剰Ｈ2Ｏ2分解によるＯ2発生が完了するまで、８０℃まで加熱することによって、生成物３（ＰＰＧＡ）が形成された。１００−１２０℃で加熱することによってエタノールを除去し、その後、室温まで冷却し、１７ｍｌの濃縮ＨＣｌを添加して、約４のｐＨを得た。前記生成物の沈殿はこの時点から始まり、これは、氷の添加によって促進された。生成物を濾過し、冷水で洗浄し、ＮａＯＨ及びＰ2０5上で乾燥させた（収量  ３．９ｇ）。ＮＭＲによって、その構造が確認され、生成物１分子当たり約４−８分子のＨ2Ｏの存在が示された。
【０１００】
例２：２−［４−ヒドロキシ−６−（２−メチルプロパノイルアミノ）ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル］酢酸（１４）の合成
ＰＰＧＡ（化合物３，５．５８ｇ；２０ｍｍｏｌｅ）を、無水ＤＭＦ（４０ｍｌ）及びトリエチルアミン（４．２９ｍｌ；３０．８ｍｍｏｌｅ）中に懸濁する。塩化イソブタノイル（２．１２ｇ；１９．９ｍｍｏｌｅ）を、シリンジによって滴状添加する。その混合物を１００℃で３時間攪拌し、その後、メタノールで処理し、乾燥状態まで蒸発させる。残渣を２０ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌで処理し、次に、メタノールで処理し、乾燥状態まで蒸発させる。残渣を、高温イソプロパノールで処理し、沈殿生成物を濾過し、真空乾燥させる。生成物（１４）をＴＬＣ及びＨＰＬＣによって分析し、必要ならば、更にクロマトグラフィによって精製する。
【０１０１】
例３：５−［４−ヒドロキシ−６−（２−メチルプロパノイルアミノ）ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル］−３−（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）−４−オキソペンタン酸（２０）
Ｎ−（４−ヒドロキシピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−６−イル）−２−メチルプロパンアミド（１６）
化合物１５（ＰＰＧ，３．０２ｇ；２０ｍｍｏｌｅ）を、無水ＤＭＦ（４０ｍｌ）及びトリエチルアミン（１．４５ｍｌ；１０．４ｍｍｏｌｅ）中に懸濁し、塩化イソブタノイル（２．１２ｇ；１９．９ｍｍｏｌｅ）を、シリンジによって滴状添加する。その混合物を１００℃で３時間攪拌する。次に、その反応混合物を、メタノールで処理し、乾燥状態まで蒸発させる。残渣をメタノールで処理し、乾燥状態まで蒸発させる。次に、残渣を、高温イソプロパノールで処理し、析出生成物（１６）を濾過し、真空乾燥させる。生成物をＴＬＣ及びＨＰＬＣによって分析し、必要ならば、更にクロマトグラフィによって精製する。
【０１０２】
メチル２−［４−ヒドロキシ−６−（２−メチルプロパノイルアミノ）ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル］アセテート（１７）
化合物１６（４．４２ｇ；２０ｍｍｏｌｅ）を乾燥ＤＭＦ（４０ｍｌ）中で懸濁させ、水素化ナトリウム（０．５ｇ；２０．８ｍｍｏｌｅ）を分与で添加し、その混合物を室温で６０分間攪拌する。次に、メチルブロモアセテート（１．９ｍｌ；２０．６ｍｍｏｌｅ）をシリンジを用いて室温で添加し、室温で攪拌を続ける。反応の終了時（ＴＬＣによってモニター）、反応混合物をメタノール中の少量の二酸化炭素で処理する。次に、溶剤を蒸発させ、残渣をＣＨ2Ｃｌ2中に溶解させ、水で１回洗浄し、乾燥状態にまで蒸発させた。生成物をクロマトグラフィによって精製し、所望の異性体（１７）を得た。
【０１０３】
２−［４−ヒドロキシ−６−（２−メチルプロパノイルアミノ）ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル］酢酸（１８）
化合物１７（４．４１ｇ：１５ｍｍｏｌｅ）を、２５ｍｌの水中に懸濁し、メチルエステルが完全に加水分解されるまで、ｐＨを１１に維持しながら、２Ｎの水酸化ナトリウムの水溶液を０℃で滴状添加する。次に、反応溶液を濾過し、濾液を２Ｍ  ＫＨＳＯ4溶液を使用してｐＨ３にし、次に、エチルアセテートで抽出する。水相を蒸発させ、生成物（１８）をクロマトグラフィによって精製する。
【０１０４】
メチル  ５−［４−ヒドロキシ−６−（２−メチルプロパノイルアミノ）ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル］−３−（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）−４−オキソペンタノエート（１９）
メチル  ２−［（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）アミノ］アセテート（ＭＭＴｒＡｅｇ、１．２６ｇ；３．１ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（８ｍｌ）中に溶解させる。この溶液に、Ｎ−エチルモルホリン（１．０７ｇ；６．２８ｍｍｏｌｅ），３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒロ−１，２，３−ベンゾトラジン（ＨＯＯｂｔ）（０．５０５ｇ；３．１ｍｍｏｌｅ）、化合物１８（０．９１ｇ；３．１ｍｍｏｌｅ）とジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）（０．５９ｇ；３．７２ｍｍｏｌｅ）を添加する。反応混合物を４８時間４℃で攪拌し、その時、溶剤を蒸発させ、残渣をエチルアセテート中に溶解する。このエチルアセテート溶液を水で洗浄し、飽和ＫＣｌ溶液で一回洗浄する。次に、有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。残渣を、少量のエチルアセテート中に溶解させ、氷上で冷却し、ジイソプロピルウレアの結晶化を誘導し、水相中に生成物１９を残す。或いは、ジイソプロピルウレアを、化合物１９からシリカゲルクロマトグラフィによって分離する。
【０１０５】
５−［４−ヒドロキシ−６−（２−メチルプロパノイルアミノ）ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル］−３−（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）−４−オキソペンタノエート（２０）
化合物（１９）（１．３３ｇ；２ｍｍｏｌｅ）を１０ｍｌのジオキサン中に溶解させる。この溶液を、０℃まで冷却し、１Ｍの水性ＮａＯＨ（８．６６ｍｌ）を２．５時間に渡って、５つのアリコートで滴状添加する。更に室温中で２時間後、溶液を２Ｍ  ＫＨＳＯ4の滴状添加によってｐＨ５に調節する。析出塩を濾過し、ジオキサンによって洗浄し、これらの合体した濾液を蒸発させる。残渣を、エタノールとメタノール／ＣＨ2Ｃｌ2とで同時蒸発させ、次に、シリカゲルクロマトグラフィによって精製し、（２０）を得る。
【０１０６】
例４：２−｛４−［４−メトキシフェニル）カルボニルアミノ］ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル｝酢酸（化合物１１，反応式６）の合成
４−（メトキシフェニル）−Ｎ−ピラゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−４−イルカルボキシアミド（９）
ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（８）（１３．５ｇ；０．１０ｍｏｌｅ）を乾燥ピリミジン（２５０ｍｌ）中に懸濁させ、４−メトキシベンゾイル塩化物（１７．１ｇ；０．１ｍｏｌｅ）をシリンジを使用して滴状添加する。ＴＬＣによって反応が完了していることが示されるまで（約１〜３時間）、混合物を、１００℃で加熱する。次に、冷却された反応物を、メタノールによって処理し、溶剤を蒸発させる。この残渣を、２回、トルエンと同時蒸発させ、この後、高温イソプロパノールと共に攪拌する。この混合物をゆっくりと冷却し、析出生成物（９）を濾過し、ＴＬＣとＨＰＬＣとによって純度を評価する。必要であれば、生成物を更にクロマトグラフィによって精製する。
【０１０７】
メチル  ２−｛４−［（４−メトキシフェニル）カルボニルアミノ］ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル｝アセテート（１０）
化合物（９）（６．７ｇ；２５ｍｍｏｌｅ）を７５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中に懸濁させる。水素化ナトリウム（０．６５ｇ；２５ｍｍｏｌｅ）を分与で添加し、室温で３０分間攪拌する。メチルブロモアセテート（２．４４ｍｌ；２６．５ｍｍｏｌｅ）をシリンジを使用して室温で添加する。ＴＬＣによって反応の完了が示されるまで、室温で攪拌を続け、反応混合物を、少量の、メタノール中の二酸化炭素で処理する。次に、溶剤を蒸発させ、残渣をＣＨ2Ｃｌ2中に溶解させ、水で洗浄し、乾燥状態にまで蒸発させる。生成物をクロマトグラフィによって精製し、所望の異性体（１０）を得る。
【０１０８】
２−｛４−［４−メトキシフェニル］カルボニルアミノ｝ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル｝酢酸（１１）
化合物１０（５．１３ｇ：１５ｍｍｏｌｅ）を、１２０ｍｌの水中に懸濁し、メチルエステルが完全に加水分解されるまで、ｐＨを１１に維持するべく２Ｎの水酸化ナトリウムの水溶液を０℃で滴状添加する。次に、反応溶液を濾過し、濾液を２Ｍ  ＫＨＳＯ4溶液を使用してｐＨ３にし、生成物（１１）を析出させる。析出物を少量の水で洗浄し、真空乾燥し、純度を分析する。必要であれば、生成物（１１）をクロマトグラフィによって更に精製する。
【０１０９】
例５：  ２−［Ｎ−（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）−２−｛４−［（４−メトキシフェニル）カルボニルアミノ］ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル｝アセチルアミノ］酢酸の合成（化合物１３，反応式６）
メチル  ２−［Ｎ−（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）−２−｛４−［（４−メトキシフェニル）カルボニルアミノ］ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル｝アセチルアミノ］アセテート（１２）
メチル  ２−［（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）アミノ］アセテート（ＭＭＴｒＡｅｇ．１．２６ｇ；３．１ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（８ｍｌ）中に溶解させる。この溶液に、Ｎ−エチルモルホリン（１．０７ｇ；６．２８ｍｍｏｌｅ），３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒロ−１，２，３−ベンゾトラジン（ＨＯＯｂｔ）（０．５０５ｇ；３．１ｍｍｏｌｅ）、化合物１１（０．０１ｇ；３．１ｍｍｏｌｅ）とジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）（０．５９ｇ；３．７２ｍｍｏｌｅ）を添加する。反応混合物を４８時間４℃で攪拌し、次に、溶剤を真空乾燥させ、残渣をエチルアセテート中に溶解する。この溶液を水で洗浄し、飽和ＫＣｌ溶液で一回洗浄する。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。残渣を、少量のエチルアセテート中に溶解させ、氷上で冷却し、ジイソプロピルウレアの結晶化を誘導し、水相中に生成物（１２）を残す。或いは、ジイソプロピルウレアを、化合物（１２）からシリカゲルクロマトグラフィによって分離する。
【０１１０】
２−［Ｎ−（２−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝エチル）−２−｛４−［（４−メトキシフェニル）カルボニルアミノ］ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル｝アセチルアミノ］酢酸（１３）
化合物（１２）（１．４３ｇ；２ｍｍｏｌｅ）を１０ｍｌのジオキサン中に溶解させる。この溶液を、０℃まで冷却し、１Ｍの水性ＮａＯＨ（８．６６ｍｌ）を２．５時間に渡って、５つのアリコートで滴状添加する。更に室温中で２時間後、溶液を２Ｍ  ＨＫＳＯ4の滴状添加によってｐＨ５に調節する。析出塩を濾過し、ジオキサンで洗浄し、これらの合体した濾液を真空蒸発させる。残渣（１３）を、エタノールとメタノール／ＣＨ2Ｃｌ2とで同時蒸発させ、次に、シリカゲルクロマトグラフィによって精製し、（２０）を得る。
【０１１１】
例６：  ＰＰＧ−含有オリゴヌクレオチドの自己会合の減少
この例において、２〜９のＧ残基を含有する、１３量体及び１４量体の接合体を、非変性ゲル電気泳動によって分析し、すべてのＧ残基がＰＰＧによって置換された以外は同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較した。これらオリゴヌクレオチドの長さと配列を表１に示す。電気泳動は、１Ｘ  ＴＢＥ緩衝液中の８％ポリアクリルアミドゲルのランで４５分間、４０℃で行われた。ゲルを、Daiichi 2D Silver Stein  ＩＩ（登録商標）によって染色し、染色されたオリゴヌクレオチドバンドのＲｆ値を、二つの対照オリゴヌクレオチドを標準として使用して測定した。対照オリゴヌクレオチドＡは、配列５´−ＡＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＴＧＣＣ−３´（配列識別番号２２）を有し、オリゴヌクレオチドＢは、配列５´−ＺＴＡＣＡＺＣＡＡＡＴＺＺＡＡ−３´（配列識別番号２３）を有していた。ここでＺはＰＰＧを表わす。
【０１１２】
【表１】
2003527579.tif 000016
【０１１３】
前記分析の結果を表２に示す。Ｒｆ値は、Ｇ含有オリゴヌクレオチドとＰＰＧ含有オリゴヌクレオチドとについて、別々に、対照オリゴヌクレオチドＡ及びＢに対して、それぞれ測定された。しかしながら、対照オリゴヌクレオチドＡ及びＢによって移動された距離は実質的に同一であった。三つ以上のＧ残基を有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１−６）は、２つ以下のＧ残基を有するサイズの類似するオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド７及び８及び対照オリゴヌクレオチドＡ）と比較して、Ｒｆの低下を示し、これは、Ｇリッチオリゴヌクレオチドの凝集を示している。これに対して、２〜９のＰＰＧ残基を含有するオリゴヌクレオチドは、互いに対して、そして二つのＰＰＧ残基を含有する対照オリゴヌクレオチドに対して類似のＲｆを有している。又、Ｇ含有オリゴヌクレオチドは、電気泳動時に拡散バンド（これらのオリゴヌクレオチドのＲｆ値は、バンドの中心からの測定によって測定された）を示すことも銘記された。更に、Ｇ含有オリゴヌクレオチドと、ＧがＰＰＧによって置換されてはいるがそれと同じサイズと配列のオリゴヌクレオチドとの比較は、３つ以上のＧ残基を含有するオリゴヌクレオチドの低下したＲｆ特性が、ＰＰＧ含有オリゴヌクレオチドにおいては観察されないことを示しており、これは、９以下の連続ＰＰＧ残基を含有するオリゴヌクレオチドの凝集がほとんど無いか、全く無いということを示唆している。
【０１１４】
【表２】
2003527579.tif 000017
【０１１５】
例７：ＧをＰＰＧに置換した場合における蛍光標識ヌクレオチドの蛍光消光の減少
フルオレセインをＧＭＰとＰＰＧＭＰ（即ち、Ｇ及びＰＰＧのモノホスフェイト誘導体）に結合させ、これらの接合体の２００ｍＭ溶液の蛍光発光を測定した。励起は４９４ｎｍで行い、蛍光放出は５２２ｎｍで測定した。ＧＭＰ結合物の蛍光放出は１５，４４７単位であったのに対して、ＰＰＧＭＰ結合物の蛍光放出は３２，７６７単位であった。従って、ＰＰＧでグアニンを置換した時に、グアニンによるフルオロホアの消光は軽減され、Ｇ結合物と比較して、ＰＰＧＭＰ結合物の蛍光収量は２倍以上増加した。
【０１１６】
例８：ＧをＰＰＧに置換した場合における蛍光標識ヌクレオチドプローブの蛍光消光の減少
ＧをＰＰＧに置換置換することによる、フルオレセイン−オリゴヌクレオチド結合体の蛍光収量に対する影響を調べた。前記結合体のオリゴヌクレオチド部分は、５´末端Ｇ又はＰＰＧ残基を含み、そこにフルオレセイン分子が結合していた。これら結合体は、オプションとして、それらの３´末端にＣＤＰＩ3を共有結合していた。配列は表３に示す。２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７，４０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中における、２００ｎＭの前記結合体の溶液の蛍光発光を、４９４ｎｍでの励起で、５２２ｎｍでの放出検出で、室温で測定した。その結果を表３に示す。
【０１１７】
【表３】
2003527579.tif 000018
【０１１８】
これらの結果は、ＰＰＧによるＧの置換が、ＭＧＢ結合オリゴヌクレオチドと、非ＭＧＢ結合オリゴヌクレオチドとに対して、それぞれ、２４％と３８％、蛍光発光を増加させた（即ち、消光を減少させた）ということを示した。
【０１１９】
例９：ＧがＰＰＧによって置換された場合の、加水分解可能プローブアッセイにおける複数連続Ｇ残基を含有するプローブの性能の改善
その配列を表１に示すオリゴヌクレオチド接合体を加水分解可能プローブアッセイにおける蛍光プローブとして使用した。米国特許第５，２１０，０１５号、リバック(Livak)等、(1995) PCR Meth App. 4:357-362;ウィットワー(Wittwer)等(1997a) Biotechniques 22: 130-138;及びウィットワー(Wittwer)等(1997b) Biotechniques 22: 176-181。Ｇ含有プローブの性能を、ＰＰＧ含有プローブの性能と比較した。プローブは、共有ＰＣＴ公報ＷＯ９９／５１７７５に記載されているように、そのプローブの３´末端に接合されたクエンチャーと小溝バインダと共に、それらの５´末端に接合フルオロホアを有していた。標的配列は、５´−ＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＴＴＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＴＴＴＧＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＴＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴ−３´（配列識別番号１７）であった。標的配列の下線部は、プライマ配列に対応する。
【０１２０】
増幅を、リアルタイム蛍光発光モニタで、Idaho Technologies LC-24 Light Cycler（登録商標）で行った。増幅反応物は、標的７６量体（前述）の１０5のコピー／μｌ，１００ｎＭの各プライマ、１０ｎＭの蛍光プライマ（前述），２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７，４０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，０．０５％ウシ血清アルブミン、０．５ｍＭ各ｄＮＴＰ，０．０３８単位／μｌのＴａｑポリメラーゼ及び０．０１単位／μｌウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含有していた。サイクルのプログラムは、５０℃で３分間を１サイクル、次に９５℃で２分間、その後、９５℃で２秒間、次に、６０℃で３０秒間を５０サイクルであった。
【０１２１】
その結果を図１に示す。この方法において、増幅生成物の生成は、蛍光発光の経時的増大によって示され、これは、増幅生成物にハイブリダイズされたプローブの加水分解によるものである。ここに得られた結果は、３つ以上の連続するＧ残基を含有するプローブを使用した増幅生成物の検出は不十分であり、事実、５以上の連続するＧ残基を含有するプローブについては、生成物の検出は観察されなかった。これに対して、蛍光プローブにおいてＧがＰＰＧによって置換された場合には、９つ以下の連続ＰＰＧ残基を含有するプローブが増幅生成物の極めて効率的なリアルタイム検出を提供した。
【０１２２】
以上の発明は理解の目的のために例示的に幾分詳細に記載されたものであるが、当業者には、本発明の精神から逸脱することなく、様々な改造及び改変を実行可能であることが明らかであろう。従って、上記説明及び例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべぎではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、２〜９のヌクレオチドのＧランを含むプローブ（配列識別番号１−８）が蛍光プローブとして使用され、Ｇ残基がＰＰＧによって置換されたプローブ（配列識別番号９−１６）と比較した、一連の加水分解可能プローブアッセイのリアルタイム蛍光分析を図示している