【手続補正書】
【提出日】平成19年1月31日(2007.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
（Ａ）（ｉ）酸無水物単位を有する熱可塑性共重合体で構成されるバイオチップ用基板であって、該基板には選択結合性物質が固定化される凹凸部が設けられていることを特徴とするバイオチップ用基板。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
すなわち本発明は、
［１］（Ａ）（ｉ）酸無水物単位を有する熱可塑性共重合体で構成されるバイオチップ用基板であって、該基板には選択結合性物質が固定化される凹凸部が設けられていることを特徴とするバイオチップ用基板、
［２］（Ａ）熱可塑性共重合体が、（ii）不飽和カルボン酸単位を有することを特徴とする上記［１］記載のバイオチップ用基板、
［３］（Ａ）熱可塑性共重合体が、（iii）不飽和カルボン酸アルキルエステル単位を有することを特徴とする上記［１］〜［２］記載のバイオチップ用基板、
［４］（Ａ）熱可塑性共重合体が、芳香族環含有単位を有しないことを特徴とする、上記［１］〜［３］いずれか記載のバイオチップ用基板、
［５］（Ａ）熱可塑性共重合体中の（ｉ）酸無水物単位が下記一般式（１）で表されるグルタル酸無水物単位であることを特徴とする上記［１］〜［４］いずれか記載のバイオチップ用基板、
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
ところで、上記のような共重合体にてバイオチップ用基板を作製する場合、ガラス、セラミック、金属などに比較し、射出成形方法やホットエンボス法などを用いることにより、微細な形状を設けた基材（バイオチップ）をより簡単に大量生産することが可能である。そこで、選択結合性物質が固定化されるバイオチップ用基板の形状について述べる。本発明の選択結合性物質が固定化されるバイオチップ用基板には凹凸部があり、凸部上面に選択性適合物質が固定化される。このような構造を取ることにより、検出の際、後述のように非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な選択結合性物質物質が固定化されたバイオチップを提供することができる。そして、凹凸部の複数の凸部の高さに関しては、凸部の上面の高さが略同一であるであることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した被検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が１００μｍより小さいことをいう。さらに本発明のバイオチップには、平坦部が設けられていることが好ましい。具体例を図１、図２に示す。１が平坦部であり、かつ、２で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。そして、該凹凸部の凸部分の上面が実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面が実質的に平坦とは、５０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。さらに、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さが略同一であることが好ましい。ここで、平坦部と凹凸部との高さが略同一とは、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの低下具合が問題とならない高さをいう。具体的に高さの差が略同一とは、凹凸部凸部上面の高さと、平坦部の高さとの差が１００μｍより小さいことをいう。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
参考例１〜３
厚さ１．２ｍｍ、直径１２７ｍｍの合成石英ガラス上に、スパッタリングによりエッチングマスクとして厚さ１５０ｎｍのＳｉ膜を作製した。この上にフォトレジスト（東京応化社製ＯＦＰＲ５０００）をスピナーで３μｍの厚みに塗布した。その後、マスクを介してＵＶ光をフォトレジストに照射した。そして現像し、露光した部分のフォトレジストを除去した。次に、現像まで行ったガラス基板を真空容器内にいれ、ＳＦ６ガスを導入しリアクティブイオンエッチングを行った。こうして、露光した部分のＳｉ膜（エッチングマスク）を除去した。続いてパーターニングされたフォトレジストとエッチングマスクの両方をマスクとして、４５％フッ酸水溶液にて室温にてエッチングした。次に酸素雰囲気下でプラズマエッチングを行い、フォトレジストを灰化してフォトレジストを除去した。さらにＳＦ６雰囲気下でリアクティブイオンエッチングを行い、エッチングマスクを除去した。このようにして、合成石英製の母基板をえた。この母基板に刻まれた溝のディメンジョンは、断面が半円状であり、もっとも幅の広い部分、すなわち溝の一番上の部分は、幅５０μｍであった。深さは２０μｍであった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
比較例１
参考例１〜３と同様に作成したＮｉ板を母基板から剥離し金属板に裏打ちした。これを７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのキャビティーをもつ金型にセットし、ペレット状の（Ｃ−１）ＰＣである帝人化成社製“パンライト”ＡＤ５５０３を、住友プロマット４０／２５（２５ｔ）射出成形機に供し、シリンダー温度２８０℃、金型温度８０℃とし、厚さ１ｍｍの平板を成形した。得られた平板には、表面に母基板と同じ幅５０μｍ、深さ２０μｍの溝が形成されていた。この成形片を使用し、下記方法により評価した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
比較例２
参考例１〜３と同様に作成したＮｉ板を母基板から剥離し金属板に裏打ちした。これを７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのキャビティーをもつ金型にセットし、ペレット状の（Ｃ−２）ＰＭＭＡである住友化学社製“スミペックス”ＭＧを、住友プロマット４０／２５（２５ｔ）射出成形機に供し、シリンダー温度２３０℃、金型温度８０℃とし、厚さ１ｍｍの平板を成形した。得られた平板には、表面に母基板と同じ幅５０μｍ、深さ２０μｍの溝が形成されていた。この成形片を使用し、下記方法により評価した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
比較例３
参考例１〜３と同様に作成したＮｉ板を母基板から剥離し金属板に裏打ちした。これを７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのキャビティーをもつ金型にセットし、ペレット状の（Ｃ−３）５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物を、住友プロマット４０／２５（２５ｔ）射出成形機に供し、シリンダー温度２７０℃、金型温度８０℃とし、厚さ１ｍｍの平板を成形した。得られた平板には、表面に母基板と同じ幅５０μｍ、深さ２０μｍの溝が形成されていた。この成形片を使用し、下記方法により評価した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
【表１】
2005049329.tif 000001
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
参考例１〜２、比較例１〜３の比較により、本発明の参考例となるバイオチップ用基板に使用される特定の共重合体は、高い耐熱性を有し、さらに基板への核酸の固定化およびハイブリダイゼーションも容易である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
また、参考例３より、バイオチップ基板を黒色化することにより、スキャナーによる観察において、ノイズが大幅に減少することが分かる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
本参考例では、基板の平坦な部分にＤＮＡを固定化したが、本発明の参考例となるバイオチップ用基材を用い、本参考例で示した同じ方法で、平坦部分のみならず微細な溝にもＤＮＡやタンパク質を容易に固定化できる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
比較例４
参考例１のように基板が本発明の樹脂ではなく、ガラスの場合の実験を行った。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
ついで、５．５ｇの無水コハク酸を１−メチル−２−ピロリドン３３５ｍｌに溶解させた。１Ｍの５０ｍｌのホウ酸ナトリウム（ホウ酸３．０９ｇとｐＨ調整用の水酸化ナトリウムを加えて、純水で５０ｍｌにメスアップしたもの。ｐＨ８．０）に上記コハク酸溶液に加えた。この混合液に上記のガラス基板を２０分間浸漬した。浸漬後、純水で洗浄および乾燥した。このようにして、ガラス基板の表面のアミノ基と無水コハク酸を反応させて、ガラス表面にカルボン酸を導入した。これをＤＮＡ固定化用基板として用いた。さらに、塩基配列１のＤＮＡを参考例１と同様の手順で上記ガラス基板に固定化した。さらに定量的な議論を行うためにこれらの基板における発光強度をスキャナーにより測定した。その結果を表２に示す。表２の結果からガラス基板では蛍光が微弱であり、Ｓ／Ｎ比が劣っていることがわかる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
また、その他の市販のアミノ基が導入されたスライドガラスを用い、上記と同様なスキームでＤＮＡの固定化、ハイブリダイゼーションまで行った。用いたスライドガラスは、ＤＮＡマイクロアレイ用コートスライド硝子 高密度アミノ基導入タイプ（松浪硝子工業（株）製；製品番号ＳＤ０００１１）とＭＡＳコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製；製品番号Ｓ０８１１１０）を用いた。同様に測定した結果、これらのスライドガラスを用いても、参考例１よりもＳ／Ｎ比が劣っていた。その結果を表２に示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
実施例１
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるLIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有する（Ａ−３）からなる基板を得た。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
（検体ＤＮＡの調製）
参考例１と同様に行った。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
（ハイブリダイゼーション）
前述の（検体ＤＮＡの調製）で調製したＤＮＡ溶液を１０μｌ取りだし、これに３０μｌの、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液を加え、トータルで４０μｌとした（すなわち、参考例１や２と比較すると、検体の濃度は１／４であるが、トータルの検体量は参考例１や２と同じとなる）。そして、これを前述したＤＮＡが固定化された担体の凹凸部分に滴下して、注意深くカバーガラスをかぶせた。そして、カバーガラスの周りをペーパボンドでシーリングして、ハイブリダイゼーション溶液が乾かないようにした。すなわち、検体ＤＮＡの分子量を参考例１や比較例１と同じにした。これをプラスチック容器に入れて、湿度１００％、温度６５℃の状態で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離して、洗浄・乾燥した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
（測定）
参考例１と同じ条件にて、スキャナーにより蛍光測定を行った。その結果を表３に示す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
【表３】
2005049329.tif 000002
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
これから、蛍光強度については参考例３とほぼ同一であるが、ノイズについては参考例３よりもさらに低下した。すなわち、よりＳ／Ｎ比が向上した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
実施例２
次いで、凸部の高さがばらついた場合について実験を行った。実施例１で用いた射出成形品の凸部をラッピングペーパーで削り、凸部上面の高さに差を設けた。すなわち、他の凸部上面（基準となる凸部）よりも、３０μｍ低い凸部（４箇所）がある基材（基材ア）、他の凸部上面よりも、５０μｍ低い凸部（４箇所）がある基材（基材イ）をそれぞれ作製した。なお、これら基材の低い部分以外の凸部（基準となる凸部）上面の高さと、平坦部分の高さの差は３μｍ以下であった。実施例１と同様に、点着するプローブＤＮＡの調製を行った。ついで、基準となる凸部上面に４箇所、低い凸部上面に４箇所にプローブＤＮＡ溶液の点着を実施例１と同様に行った。さらに、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーションの操作、測定を実施例１と同様に行った。基準となる凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズ、高さが低い凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズを表４に示す。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
【表４】
2005049329.tif 000003
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
このように、凸部の高さにばらつき（５０μｍ以下）があっても、比較例と比べると十分に大きなＳ／Ｎが得られていることがわかる。
実施例３
さらに、凸部上面と平坦部の差がある場合について検討した。実施例１で用いた射出成形品の平坦部をラッピングペーパーで削り、平坦部上面と凸部上面の高さの差が３０μｍ（基材ウ）、５０μｍ（基材エ）の２種類の基材を作製した。すなわち、基材ウは凸部の高さが平坦部の高さより３０μｍ高いことになる。実施例１と同様に、点着するプローブＤＮＡの調製、凸部上面へのプローブＤＮＡ溶液の点着、ハイブリダイゼーション用ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーションの操作を行い、実施例１と同様に測定を行った。その結果を表５に示す。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
【表５】
2005049329.tif 000004