【手続補正書】
【提出日】令和1年10月23日(2019.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｃａｓ９ドメイン、（ｉｉ）シチジンデアミナーゼドメインおよび（ｉｉｉ）ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む、融合蛋白質。
【請求項２】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号６７４によって提供されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号１０〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
Ｃａｓ９ドメインが、ヌクレオチド二本鎖のヌクレオチド標的鎖を切るＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメインであり、ヌクレオチド標的鎖が、Ｃａｓ９ニッカーゼドメインのｇＲＮＡに結合する鎖である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列におけるＤ１０Ａ変異、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含むＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列におけるＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、またはＱ９２６Ａ変異の１つ以上、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける１つ以上の対応する変異を含むＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメインである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合蛋白質であって、シチジンデアミナーゼドメインが、
（ｉ）アポリポ蛋白質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼからのデアミナーゼである；
（ｉｉ）配列番号２６６〜２８４、６０７〜６１０、５７２４〜５７３６、または５７３８〜５７４１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）配列番号２６６〜２８４、６０７〜６１０、５７２４〜５７３６、または５７３８〜５７４１のアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）配列番号２８４のＷ９０Ｙ、Ｒ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）デアミナーゼである；
（ｖ）配列番号５７２４のＷ９０Ｙ、Ｑ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むヒトＡＰＯＢＥＣ１（ｈＡＰＯＢＥＣ１）デアミナーゼである；
（ｖｉ）配列番号２７５のＷ２８５Ｙ、Ｒ３２０Ｅ、およびＲ３２６Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）デアミナーゼである；
（ｖｉｉ）活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である；または
（ｖｉｉｉ）Petromyzon marinusからのシチジンデアミナーゼ１（ｐｍＣＤＡ１）である、
前記融合蛋白質。
【請求項８】
ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、およびＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
ＵＧＩドメインが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）活性を阻害することができるドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
ＵＧＩドメインが、配列番号６００と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
ＵＧＩドメインが、配列番号６００によって提供されるアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合蛋白質であって、構造：
（ａ）ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼドメイン］−［Ｃａｓ９ドメイン］−［ＵＧＩドメイン］−ＣＯＯＨ、およびここで、「］−［」のそれぞれが任意のリンカーを含む；
（ｂ）ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼドメイン］−［Ｃａｓ９ドメイン］−［ＵＧＩドメイン］−［第２のＣａｓ９ドメイン］−ＣＯＯＨ、およびここで、「］−［」のそれぞれが任意のリンカーを含む；または
（ｃ）ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼドメイン］−［Ｃａｓ９ドメイン］−［第２のＣａｓ９ドメイン］−［ＵＧＩドメイン］−ＣＯＯＨ、およびここで、「］−［」のそれぞれが任意のリンカーを含む、
を含む、前記融合蛋白質。
【請求項１３】
（ｉｉ）のシチジンデアミナーゼドメインおよび（ｉ）のＣａｓ９ドメインが、アミノ酸配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２６５）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４２８８）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはその組み合わせを含むリンカーによってリンクされ、ｎが独立して端を含めて１および３０の間の整数であり、および、Ｘがいずれかのアミノ酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
核局在配列（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
ＮＬＳが、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７４１）またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号７４２）を含む、請求項１４に記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
構造：ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼドメイン］−［ｎＣａｓ９ドメイン］−［ＵＧＩドメイン］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨを含み、およびここで、「］−［」のそれぞれが任意のリンカーを含む、請求項１５に記載の融合蛋白質。
【請求項１７】
ＵＧＩドメインおよびＮＬＳが、アミノ酸配列ＳＧＧＳ（配列番号４２８８）を含むリンカーによってリンクされる、または、Ｃａｓ９ドメインおよびＵＧＩドメインが、アミノ酸配列ＳＧＧＳ（配列番号４２８８）を含むリンカーによってリンクされる、請求項１５または１６に記載の融合蛋白質。
【請求項１８】
配列番号５９１〜５９４、６１１、６１２、６１５、６５７、６５８、５７３７、５７４３、５７４５、および５７４６のいずれか１つによって提供されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１９】
ｄＣａｓ９ドメインが、Staphylococcus aureus（ＳａＣａｓ９）を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２０】
ＳａＣａｓ９が、配列番号４２７３によって提供されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の融合蛋白質。
【請求項２１】
ＳａＣａｓ９ドメインが、配列番号４２７３のＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、またはＲ１０１４Ｈ変異の１つ以上、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける１つ以上の対応する変異を含む、請求項１９に記載の融合蛋白質。
【請求項２２】
核酸分子を請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合蛋白質およびガイドＲＮＡと接触させることを含む、核酸を編集するための方法であって、ガイドＲＮＡが、生物のゲノム中の標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含み、および、標的塩基対を含み、ここで接触させるステップが、インビトロまたはエクスビボで行われる、前記方法。
【請求項２３】
（ｉ）標的塩基対が、疾患または異常に関連するＴからＣへの点変異を含み、およびここで、変異体Ｃ塩基の脱アミノ化が、疾患または異常に関連しない配列をもたらす、
（ｉｉ）接触させるステップが、塩基編集によって２０％未満のindel形成をもたらす、および／または
（ｉｉｉ）接触させるステップが、塩基編集によって少なくとも２：１の意図される産物対意図されない産物をもたらす、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
疾患または異常が、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角質増殖症（ＥＨＫ）、シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型、神経芽腫（ＮＢ）、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、先天性ミオトニー、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、ＨＩＶ、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、デスミン関連ミオパチー（ＤＲＭ）、変異体PI3KCA蛋白質、変異体CTNNB1蛋白質、変異体HRAS蛋白質、または変異体p53蛋白質に関連する新生物疾患である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合蛋白質、および融合蛋白質のＣａｓ９ドメインに結合したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、複合体。
【請求項２６】
ガイドＲＮＡが、１５〜１００ヌクレオチドの長さであり、および標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２７】
標的配列がＤＮＡ配列である、請求項２５または２６に記載の複合体。
【請求項２８】
標的配列が原核生物のゲノム中にある、または真核生物のゲノム中にある、例えば哺乳動物のゲノム中にある、および／またはここで哺乳動物がヒトである、請求項２７に記載の複合体。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載のポリヌクレオチドおよび融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、ベクター。
【請求項３１】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合蛋白質、または請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の複合体、または請求項３０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３２】
医薬としての使用のための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３３】
二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を核酸塩基編集因子およびガイド核酸を含む複合体と接触させることを含む、二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法であって、標的領域が標的核酸塩基対を含み、当該標的核酸塩基対の第１の核酸塩基が第２の核酸塩基に変換され、およびさらに、第１の核酸塩基に対して相補的な第３の核酸塩基が第２の核酸塩基に対して相補的な第４の核酸塩基によって置き換わる、前記方法。
【請求項３４】
接触させるステップが、二本鎖ＤＮＡ配列における２０％未満のindel形成をもたらす、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
２０％、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、または１％未満のindel形成をもたらす、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
意図される編集された核酸塩基対を生成する効率が、少なくとも５％であり、および／または、効率が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％である、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
標的ヌクレオチドにおける意図される産物対意図されない産物の比が、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、または２００：１である、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
意図される点変異対indel形成の比が、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、または１０００：１超である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
接触させるステップが、当該標的領域の１つの鎖だけを切ることをもたらし、および、切られた鎖が、ガイド核酸にハイブリダイゼーションする、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
切られた単一鎖が、第１の核酸塩基を含む鎖の反対である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
当該第１の核酸塩基がシトシンである、および／または、第２の核酸塩基がウラシルである、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
核酸塩基編集因子がＵＧＩ活性を含む、および／または、核酸塩基編集因子がニッカーゼ活性を含む、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
意図される編集された核酸塩基対が、ＰＡＭ部位の上流である、および／または、意図される編集された核酸塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
意図される編集された核酸塩基対が、ＰＡＭ部位の下流である、および／または、意図される編集された核酸塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
古典的ＰＡＭ部位を要求しない、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
標的領域が標的ウインドウを含み、さらにここで標的ウインドウが標的核酸塩基対を含む、請求項３３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
標的ウインドウが、１〜１０個のヌクレオチド、例えば、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１個のヌクレオチドの長さを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
核酸塩基編集因子が、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含む、請求項３３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合蛋白質および（ｂ）二本鎖ＤＮＡ分子中の標的核酸塩基対に対して（ａ）の融合蛋白質をターゲティングするガイドＲＮＡの、ＤＮＡを編集するためのキットの製造における使用であって、ＤＮＡを編集することが、当該標的核酸塩基対の第１の核酸塩基の第２の核酸塩基への変換に好適な条件下、ＤＮＡ分子を（ａ）および（ｂ）と接触させることを含む、前記使用。
【請求項５０】
接触させるステップが、標的領域において二本鎖ＤＮＡの分離を誘導する、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
（ａ）請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合蛋白質および（ｂ）二本鎖ＤＮＡ分子中の標的核酸塩基対に対して（ａ）の融合蛋白質をターゲティングするガイドＲＮＡの、医薬の製造における使用。
【請求項５２】
接触させるステップがインビトロまたはエクスビボで行われる、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法であって、
（ａ）二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を核酸誘導型デアミナーゼと接触させること、ここで標的領域が標的核酸塩基対を含む；および
（ｂ）標的領域をウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）と接触させること；
ここで、当該標的核酸塩基対の第１の核酸塩基が第２の核酸塩基に変換される、
を含む、前記方法。
【請求項５４】
核酸誘導型デアミナーゼが、核酸誘導型シチジンデアミナーゼである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
塩基除去修復の阻害剤にカップリングされた、核酸誘導型デアミナーゼ。
【請求項５６】
ミスマッチ修復の開始因子をさらに含む、請求項５５に記載の核酸誘導型デアミナーゼ。
【請求項５７】
ニッカーゼを含む、請求項５６に記載の核酸誘導型デアミナーゼ。