【手続補正書】
【提出日】令和1年11月1日(2019.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼをコードする核酸配列又はヌクレアーゼを細胞に導入すること、
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の一部に相補的な配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記細胞に導入すること、及び
前記少なくとも１つのガイドＲＮＡと前記ヌクレアーゼとが複数のＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子と共局在複合体を形成し、前記ヌクレアーゼが前記複数のＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の２０％以上を切断する条件下で、前記細胞を維持すること
を含む、細胞内のブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）ｐｏｌ遺伝子を改変する方法。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子のうち９７％以上が切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の全てのコピーが切断される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、第２の細胞へのＰＥＲＶ感染が、野生型コントロール細胞と比較して１／１０００倍以下に減少している、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の細胞がヒト細胞であり、前記ヒト細胞はＨＥＫ２９３細胞であってもなくてもよい、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の切断の結果、インデル又は変異が生じている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子のうち５０％以上がゲノムインデルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子のうち８０％以上がゲノムインデルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、胚由来の細胞、幹細胞、接合子、生殖系列細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞  体細胞、真核細胞、動物細胞、哺乳類細胞、及びブタ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の２０％以上に存在する前記切断が配列決定により求められる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が無傷のＰＥＲＶ ｇａｇ及び／又はｅｎｖ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ブタ細胞中のＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の９７％以上に１又は複数の数の遺伝的に操作されたゲノムインデルを挿入し、それによってＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の９７％以上を不活性化することを含む、
ブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）を実質的に含まないブタ細胞を作製する方法。
【請求項１６】
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の一部に相補的な配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記ブタ細胞に導入することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレアーゼをコードする核酸又はヌクレアーゼを前記ブタ細胞に導入することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の方法により作成された遺伝的に操作されたＰＥＲＶ非含有ブタ細胞に由来する、子孫細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の子孫細胞を複数含む組成物。
【請求項２３】
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の９７％以上が遺伝的に操作されたゲノムインデルを含む、遺伝的に操作されたブタ細胞。
【請求項２４】
ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の１００％が遺伝的に操作されたゲノムインデルを含む、請求項２３に記載の遺伝的に操作されたブタ細胞。
【請求項２５】
前記遺伝的に操作されたブタ細胞は、ＰＥＲＶの感染が１／１０００倍以下に減少していて、該減少は、第２の細胞を前記遺伝的に操作されたブタ細胞と共培養した場合を、第２の細胞を野生型ブタ細胞と共培養した場合と比較することによって示される、請求項２３に記載の遺伝的に操作されたブタ細胞。
【請求項２６】
前記第２の細胞はヒト細胞であり、前記ヒト細胞はＨＥＫ２９３であってもなくてもよい、請求項２５に記載の遺伝的に操作されたブタ細胞。
【請求項２７】
前記遺伝的に操作されたゲノムインデルは配列決定によって観察される、請求項２３に記載の遺伝的に操作されたブタ細胞。
【請求項２８】
遺伝的に操作されたブタ細胞は無傷のＰＥＲＶ ｇａｇ及び／又はｅｎｖ遺伝子を含む、請求項２３に記載の遺伝的に操作されたブタ細胞。
【請求項２９】
前記遺伝的に操作されたブタ細胞が、胚由来の細胞、幹細胞、接合子、生殖系列細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞  及び体細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の遺伝的に操作されたブタ細胞。
【請求項３０】
請求項２３に記載の遺伝的に操作されたブタ細胞に由来する子孫細胞。
【請求項３１】
請求項３０に記載の子孫細胞を複数含む組成物。
【請求項３２】
遺伝的に操作されたブタ細胞を複数含み、前記複数の遺伝的に操作されたブタ細胞のそれぞれは、ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の９７％以上が遺伝的に操作されたゲノムインデルを含むことを特徴とする、単離されたブタ臓器。
【請求項３３】
ヌクレアーゼをコードする核酸配列又はヌクレアーゼと、１又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含み、ｇＲＮＡのそれぞれはブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子の一部に相補的な配列を含む、改変されたブタ細胞。
【請求項３４】
前記ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼである、請求項３３に記載の改変されたブタ細胞。
【請求項３５】
前記エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項３４に記載の改変されたブタ細胞。
【請求項３６】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である、請求項３５に記載の改変されたブタ細胞。
【請求項３７】
前記１又は複数のｇＲＮＡの少なくとも一部とヌクレアーゼとは共局在複合体を形成する、請求項３６に記載の改変されたブタ細胞。
【請求項３８】
１又は複数の標的核酸配列の各々の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数のリボ核酸（ＲＮＡ）配列及びＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入すること；並びに
前記細胞内で前記Ｃａｓタンパク質が発現され、かつ前記Ｃａｓタンパク質が前記１又は複数の標的核酸配列に結合して前記１又は複数の標的核酸配列を不活性化する条件下で前記細胞を維持すること
を含む、細胞内の１又は複数の標的核酸配列の発現を不活性化する方法。
【請求項３９】
前記導入工程が、前記１又は複数のＲＮＡ配列及び前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を前記細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１又は複数のＲＮＡ配列、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、又はそれらの組合せが前記細胞のゲノムに導入される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｃａｓタンパク質の発現が誘導される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が、胚由来の細胞、幹細胞、接合子、生殖系列細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞  体細胞、真核細胞、動物細胞、及びブタ細胞からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記１又は複数の標的核酸配列がブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＰＥＲＶ遺伝子がｐｏｌ遺伝子を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記１又は複数のＲＮＡ配列が約１０から約１０００ヌクレオチドであり、前記１又は複数のＲＮＡ配列が約１５から約２００ヌクレオチドであってもなくてもよい、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
細胞内の標的核酸配列の全体又は一部に相補的なＲＮＡをコードする核酸配列を前記細胞に導入すること；
前記ＲＮＡと相互作用し且つ前記標的核酸配列を部位特異的に切断する酵素をコードする核酸配列を前記細胞に導入すること；及び
相補的標的核酸配列に前記ＲＮＡが結合して複合体を形成する条件下で前記細胞を維持することを含み、
前記酵素が前記複合体上の結合部位に結合して、１又は複数の標的核酸配列を変化させる、
細胞内の１又は複数の標的核酸配列を変化させる方法。
【請求項５０】
導入工程のそれぞれが、前記細胞に前記核酸配列をトランスフェクトすることを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＲＮＡをコードする核酸配列、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、又はそれらの組合せが前記細胞のゲノムに導入される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記酵素をコードする核酸配列を誘導によって発現させる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞は、胚由来の細胞、幹細胞、接合子、生殖系列細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞  体細胞、真核細胞、動物細胞、及びブタ細胞からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記１又は複数の標的核酸配列がブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＰＥＲＶ遺伝子がｐｏｌ遺伝子を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記酵素はＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質であり、前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９であってもなくてもよい、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＲＮＡをコードする核酸配列は約１０から約１０００ヌクレオチドであり、前記ＲＮＡをコードする核酸配列は約１５から約２００ヌクレオチドであってもなくてもよい、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
１又は複数の内在性ウイルス遺伝子；及び
前記１又は複数の内在性ウイルス遺伝子の１又は複数の標的核酸配列の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数の外来性核酸配列
を含み、
細胞の１又は複数の内在性ウイルス遺伝子の各々が変化されている、操作された細胞。
【請求項６１】
複数の内在性レトロウイルス遺伝子；及び
前記複数の内在性ウイルス遺伝子の１又は複数の標的核酸配列の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数の外来性核酸配列
を含み、
細胞の複数の内在性ウイルス遺伝子の各々が変化されている、操作された細胞。
【請求項６２】
前記レトロウイルス遺伝子がブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含む、請求項６１に記載の操作された細胞。
【請求項６３】
前記ＰＥＲＶ遺伝子がｐｏｌ遺伝子を含む、請求項６２に記載の操作された細胞。
【請求項６４】
前記ｐｏｌ遺伝子の変化により前記ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化されている、請求項６３に記載の操作された細胞。
【請求項６５】
前記細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化されている、請求項６４に記載の操作された細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
本発明を、その例示的な実施形態を参照して具体的に示し、説明したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく形態及び詳細の様々な変更を行い得ることは当業者に理解される。
本開示に係る態様は以下の態様も含む。
＜１＞  細胞内の１又は複数の標的核酸配列の発現を不活性化する方法であって、
前記１又は複数の標的核酸配列の各々の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数のリボ核酸（ＲＮＡ）配列及びＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入すること；並びに
前記細胞内で前記Ｃａｓタンパク質が発現され、且つ前記Ｃａｓタンパク質が前記１又は複数の標的核酸配列に結合して不活性化する条件下で前記細胞を維持すること
を含む方法。
＜２＞  前記導入工程が、前記１又は複数のＲＮＡ配列及び前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を前記細胞にトランスフェクトすることを含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  前記１又は複数のＲＮＡ配列、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、又はそれらの組合せが前記細胞のゲノムに導入される、＜１＞に記載の方法。
＜４＞  前記Ｃａｓタンパク質の発現が誘導される、＜１＞に記載の方法。
＜５＞  前記細胞が胚由来である、＜１＞に記載の方法。
＜６＞  前記細胞が、幹細胞、接合子、又は生殖系列細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜７＞  前記幹細胞が、胚性幹細胞又は多能性幹細胞である、＜６＞に記載の方法。
＜８＞  前記細胞が体細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜９＞  前記体細胞が真核細胞である、＜８＞に記載の方法。
＜１０＞  前記真核細胞が動物細胞である、＜９＞に記載の方法。
＜１１＞  前記動物細胞がブタ細胞である、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞  前記１又は複数の標的核酸配列がブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含む、＜１＞に記載の方法。
＜１３＞  前記ＰＥＲＶ遺伝子がｐｏｌ遺伝子を含む、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞  前記ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化される、＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞  前記細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化される、＜１４＞に記載の方法。
＜１６＞  前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、＜１＞に記載の方法。
＜１７＞  前記１又は複数のＲＮＡ配列が約１０から約１０００ヌクレオチドである、＜１＞に記載の方法。
＜１８＞  前記１又は複数のＲＮＡ配列が約１５から約２００ヌクレオチドである、＜１＞に記載の方法。
＜１９＞  細胞内の１又は複数の標的核酸配列を変化させる方法であって、
前記細胞内の標的核酸配列の全体又は一部に相補的なＲＮＡをコードする核酸配列を前記細胞に導入すること；
前記ＲＮＡと相互作用し且つ前記標的核酸配列を部位特異的に切断する酵素をコードする核酸配列を前記細胞に導入すること；及び
複合体を形成する相補的標的核酸配列に前記ＲＮＡが結合する条件下で前記細胞を維持することを含み、
前記酵素が前記複合体上の結合部位に結合して、前記１又は複数の標的核酸配列を変化させる方法。
＜２０＞  導入工程のそれぞれが、前記細胞に前記核酸配列をトランスフェクトすることを含む、＜１９＞に記載の方法。
＜２１＞  前記ＲＮＡをコードする核酸配列、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、又はそれらの組合せが前記細胞のゲノムに導入される、＜１９＞に記載の方法。
＜２２＞  前記酵素をコードする核酸配列を誘導によって発現させる、＜１９＞に記載の方法。
＜２３＞  前記細胞が胚由来である、＜１９＞に記載の方法。
＜２４＞  前記細胞が、幹細胞、接合子、又は生殖系列細胞である、＜１９＞に記載の方法。
＜２５＞  前記幹細胞が胚性幹細胞又は多能性幹細胞である、＜２４＞に記載の方法。
＜２６＞  前記細胞が体細胞である、＜１９＞に記載の方法。
＜２７＞  前記体細胞が真核細胞である、＜２６＞に記載の方法。
＜２８＞  前記真核細胞が動物細胞である、＜２７＞に記載の方法。
＜２９＞  前記動物細胞がブタ細胞である、＜２８＞に記載の方法。
＜３０＞  前記１又は複数の標的核酸配列がブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含む、＜１９＞に記載の方法。
＜３１＞  前記ＰＥＲＶ遺伝子がｐｏｌ遺伝子を含む、＜３０＞に記載の方法。
＜３２＞  前記ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化される、＜１９＞に記載の方法。
＜３３＞  前記細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化される、＜３２＞に記載の方法。
＜３４＞  前記酵素がＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質である、＜１９＞に記載の方法。
＜３５＞  前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、＜３４＞に記載の方法。
＜３６＞  前記ＲＮＡをコードする核酸配列が約１０から約１０００ヌクレオチドである、＜１９＞に記載の方法。
＜３７＞  前記ＲＮＡをコードする核酸配列が約１５から約２００ヌクレオチドである、＜１９＞に記載の方法。
＜３８＞  遺伝子操作された細胞であって、
１又は複数の内在性レトロウイルス遺伝子；及び
前記１又は複数の内在性ウイルス遺伝子の１又は複数の標的核酸配列の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数の外来性核酸配列
を含み、
前記細胞の１又は複数の内在性ウイルス遺伝子の各々が変化されている、細胞。
＜３９＞  遺伝子操作された細胞であって、
複数の内在性ウイルス遺伝子；及び
前記複数の内在性ウイルス遺伝子の１又は複数の標的核酸配列の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数の外来性核酸配列
を含み、
前記細胞の複数の内在性ウイルス遺伝子の各々が変化されている、細胞。
＜４０＞  前記レトロウイルス遺伝子がブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含む、＜３９＞に記載の遺伝子操作された細胞。
＜４１＞  前記ＰＥＲＶ遺伝子がｐｏｌ遺伝子を含む、＜４０＞に記載の遺伝子操作された細胞。
＜４２＞  前記ｐｏｌ遺伝子の変化により前記ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化されている、＜４１＞に記載の遺伝子操作された細胞。
＜４３＞  前記細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化されている、＜４２＞に記載の遺伝子操作された細胞。