【手続補正書】
【提出日】平成31年2月5日(2019.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
6. 一度所望の配列が達成されたら、DNA生産物に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して直接該生産物を「抽出し」、かつ増幅させる。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
(構成１)
核酸合成方法における：
(a) 配列番号：1〜5及び8のいずれか1つ、又は該アミノ酸配列との少なくとも20％の配列相同性を有するその機能的等価物若しくは断片；あるいは
(b) 配列番号：6の修飾誘導体、のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）酵素の使用。
(構成２)
前記ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）酵素が配列番号：1〜5及び8のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列との少なくとも20％の配列相同性を有するその機能的等価物若しくは断片を含む、構成1記載の使用。
(構成３)
前記ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）酵素が配列番号：1、2、若しくは8から選択されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列との少なくとも20％の配列相同性を有するその機能的等価物若しくは断片を含む、構成1又は2記載の使用。
(構成４)
(a) イニシエーター配列を提供する工程；
(b) 構成1〜3のいずれか1項記載のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）の存在下、3'-ブロックヌクレオチド三リン酸を該イニシエーター配列に付加する工程；
(c) 該イニシエーター配列からの全ての試薬の除去工程；
(d) 切断剤の存在下で該3'-ブロックヌクレオチド三リン酸からブロック基を切断する工程；
(e) 該切断剤の除去工程、を含む、核酸合成方法。
(構成５)
1を超えるヌクレオチドが工程(b)〜(e)を繰り返すことにより付加される、構成4記載の方法。
(構成６)
前記3'-ブロックヌクレオチド三リン酸が、3'-O-アジドメチル基、3'-アミノキシ基、又は3'-O-アリル基のいずれかによりブロックされる、構成4又は5記載の方法。
(構成７)
前記ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）が、トリス又はカコジル酸塩のような1以上の緩衝液、1以上の塩、及び出芽酵母由来の精製組換え無機ピロホスファターゼのような無機ピロホスファターゼを含む伸長溶液の存在下で追加される、構成4〜6のいずれか1項記載の方法。
(構成８)
工程(b)が、5〜10のpH範囲で実施される、構成4〜7のいずれか1項記載の方法。
(構成９)
前記切断剤が、化学的切断剤である、構成4〜8のいずれか1項記載の方法。
(構成１０)
前記切断剤が、酵素的切断剤である、構成4〜9のいずれか1項記載の方法。
(構成１１)
前記切断剤が、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）、パラジウム錯体、又は亜硝酸ナトリウムから選択される、構成4〜10のいずれか1項記載の方法。
(構成１２)
前記切断剤が、尿素、塩化グアニジニウム、ホルムアミド、又はベタインのような変性試薬、及び1以上の緩衝液を含む切断溶液の存在下で追加される、構成4〜11のいずれか1項記載の方法。
(構成１３)
工程(d)が、99℃未満の温度で実施される、構成4〜12のいずれか1項記載の方法。
(構成１４)
工程(c)及び(e)が、洗浄溶液を適用することにより実施される、構成4〜13のいずれか1項記載の方法。
(構成１５)
前記方法が、微量流体フロー装置又はカラムベースフロー装置のようなフロー装置内で実施される、構成4〜14のいずれか1項記載の方法。
(構成１６)
前記方法が、プレート又はマイクロアレイ構成内で実施される、構成4〜14のいずれか1項記載の方法。
(構成１７)
前記イニシエーター配列が、5〜50ヌクレオチド長、例えば10〜30ヌクレオチド長、特に約20ヌクレオチド長である、構成4〜16のいずれか1項記載の方法。
(構成１８)
前記イニシエーター配列が、一本鎖又は二本鎖である、構成4〜17のいずれか1項記載の方法。
(構成１９)
前記イニシエーター配列が、固体支持体上に固定化されている、構成4〜18のいずれか1項記載の方法。
(構成２０)
前記イニシエーター配列が、可逆的相互作用部分を介して固定化されている、構成19記載の方法。
(構成２１)
前記可逆的相互作用部分を除去することにより、結果として生じる核酸を抽出することをさらに含む、構成20記載の方法。
(構成２２)
前記可逆的相互作用部分が、化学的に切断可能なリンカー、例えばジスルフィド、アリル、又はアジドでマスクされたヘミアミナールエーテルである、構成20記載の方法。
(構成２３)
前記化学的に切断可能なリンカーを切断することにより、例えばトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）、ジチオスレイトール（DTT）、又はパラジウム錯体を追加することにより、結果として生じる核酸を抽出することをさらに含む、構成22記載の方法。
(構成２４)
前記イニシエーター配列が、少なくとも1つの制限酵素部位を含む、構成4〜19のいずれか1項記載の方法。
(構成２５)
制限酵素を用いることにより、結果として生じる核酸を抽出することをさらに含む、構成24記載の方法。
(構成２６)
前記イニシエーター配列が、少なくとも1つのウリジンを含む、構成4〜25のいずれか1項記載の方法。
(構成２７)
前記結果として生じる核酸を、例えばPCRによって、増幅することをさらに含む、構成4〜26のいずれか1項記載の方法。
(構成２８)
核酸合成方法におけるキットの使用であって、該キットが、任意にイニシエーター配列、1以上の3'-ブロックヌクレオチド三リン酸、出芽酵母由来の精製組換え無機ピロホスファターゼのような無機ピロホスファターゼ、及び切断剤から選択される1以上の構成要素と組合わせて；
さらに任意に構成4〜27のいずれか1項記載の方法に従う該キットの取扱説明書とともに、構成1〜3のいずれか1項記載のTdTを含む、前記使用。
(構成２９)
伸長溶液、洗浄溶液、及び/又は切断溶液の群から選択される1以上の構成要素をさらに含む、構成28記載の使用。
(構成３０)
鋳型非依存的核酸合成方法における3'-ブロックヌクレオチド三リン酸の使用であって、該3'-ブロックヌクレオチド三リン酸が式（I）、（II）、（III）、又は（IV）の化合物から選択される、前記使用：
（化１)
2018509177.tif 000001
（式中、
R1は、NRaRbを表し（式中、Ra及びRbは独立に、水素又はC1-6アルキルを表す）、
R2は、水素、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、COH、又はCOOHを表し、
Xは、C1-6アルキル、NH2、N3、又は-OR3を表し、
R3は、C1-6アルキル、CH2N3、NH2、又はアリルを表し、
Yは、水素、ハロゲン、又はヒドロキシルを表し、かつ
Zは、CR4又はNを表す（式中、R4は、水素、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、COH、又はCOOHを表す））。
(構成３１)
Ra及びRbの両方が水素を表すか、又はRaが水素を表し、かつRbがメチルを表す、構成30記載の使用。
(構成３２)
R2が、水素、メチル、又はメトキシを表す、構成30又は31記載の使用。
(構成３３)
Xが、-OR3を表し、かつR3が、C1-6アルキル、CH2N3、NH2、又はアリルを表す、構成30〜32のいずれか1項記載の使用。
(構成３４)
Yが、水素を表す、構成30〜33のいずれか1項記載の使用。
(構成３５)
Zが、CR4を表し、かつR4が、メトキシ、COH、又はCOOHを表す、構成30〜34のいずれか1項記載の使用。
(構成３６)
前記3'-ブロックヌクレオチド三リン酸が、E1〜E11から選択される、構成30〜35のいずれか1項記載の使用。
(構成３７)
核酸合成方法における、無機ピロホスファターゼの使用。
(構成３８)
前記無機ピロホスファターゼが、出芽酵母由来の精製組換え無機ピロホスファターゼである、構成37記載の使用。