(57)【要約】【課題】アルツハイマー病の予防又は治療に有用な物質を提供すること。【解決手段】２以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸（ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸など）を少なくとも含有するアルツハイマー病予防又は治療剤、並びにその化合物を少なくとも含有するアルツハイマー病予防用又は治療用の飲食物を提供する。これらのカフェオイルキナ酸は、βアミロイドによる細胞障害を抑制する作用を有する。従って、この化合物を少なくとも含有する薬剤及び飲食物は、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な可能性が高い。その他、本発明に係る薬剤及び飲食物には、長期間、連続的に適用できる可能性が高い、副作用の少ない可能性が高いなどの利点がある。  【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸を少なくとも含有するアルツハイマー病予防又は治療剤。
【請求項２】
「化１」から「化３」のいずれかの化学構造式で示されたジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を少なくとも含有することを特徴とする請求項１記載のアルツハイマー病予防又は治療剤。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【請求項３】
βアミロイドによる細胞傷害を抑制することを特徴とする請求項１記載のアルツハイマー病予防又は治療剤。
【請求項４】
ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）の発現増加を誘導することを特徴とする請求項１記載のアルツハイマー病予防又は治療剤。
【請求項５】
２個以上のカフェ酸とエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸を少なくとも含有するアルツハイマー病予防用又は治療用の飲食物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病予防又は治療剤、並びに飲食物などに関する。より詳細には、２個以上のカフェ酸とエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸（ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸など）を少なくとも含有するアルツハイマー病予防又は治療剤、並びに飲食物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症）は、進行性の記憶障害・認知障害などを主症状とする進行性神経変性疾患である。近年、その罹患数は増加の一途をたどっている。【０００３】
アルツハイマー病の肉眼病理学的な特徴として、中等度から高度の脳萎縮がみられる。また、顕微鏡レベルの病理学的変化として、老人斑及び神経原線維変化がみられる。老人斑はβアミロイドが細胞外に沈着したものであり、神経原線維変化は主として神経細胞内にみられる変化である。【０００４】
アルツハイマー病の発症メカニズムとして、「アミロイド仮説」が有力であると考えられている。βアミロイドは、ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク）の段階的分解により生成され、恒常的に細胞外へ放出される。それに対し、βアミロイドが何らかの条件により不溶化すると、細胞外でβアミロイドが集積・凝集して沈着する。それにより、神経細胞を傷害する過程が進行し、アルツハイマー病が発症する（以上、例えば、非特許文献１参照）。【０００５】
なお、本発明に関連のある先行文献として、例えば、特許文献１から特許文献３が開示されている。特許文献１には、クロロゲン酸類からなる血糖値上昇抑制剤が、特許文献２には、ウンカリア属植物材料から単離した化合物を含むアミロイド疾患を処置するための医薬が、特許文献３には、ぶどう科ヤブガラシから単離して得られた化合物を有効成分とするアルツハイマー病治療薬または予防薬が、それぞれ記載されている。
【特許文献１】特開２００３−３４６３６号公報
【特許文献２】特表２００４−５１４６７９号公報
【特許文献３】特開平１０−２２６６６８号公報
【非特許文献１】松仁会医学誌４２（２）：９７〜１０９，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アルツハイマー病の有効な予防法・治療法はまだほとんど確立されていない。一方、βアミロイドによる細胞障害を抑制する物質は、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な可能性がある。【０００７】
そこで、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な物質を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、２個以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸が、βアミロイドによる細胞障害を抑制することを新規に見出した。【０００９】
そこで、本発明では、２個以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸を少なくとも含有するアルツハイマー病予防又は治療剤、並びにその化合物を少なくとも含有するアルツハイマー病予防用又は治療用の飲食物を提供する。【００１０】
前記の通り、２個以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸は、βアミロイドによる細胞障害を抑制する作用を有する。また、２個以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸は、  神経細胞保護に関わるタンパク質であるホスホグリセリン酸キナーゼの発現増加を誘導する作用を有する。従って、この化合物を少なくとも含有する薬剤及び飲食物は、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な可能性が高い。【００１１】
加えて、本発明に係る薬剤及び飲食物には、次のような有利性がある。【００１２】
本発明に係る化合物は、植物由来成分であるため、長期間、連続的に適用できる可能性が高い。また、長期間、連続的に適用しても、副作用は少ない可能性が高い。従って、例えば、本発明に係る化合物を、健常者（アルツハイマー病発症前の予備軍を含む）がサプリメント・健康飲食物などとして長期間、連続的に適用することにより、アルツハイマー病の発症を予防できる可能性がある。また、既にアルツハイマー病を発症している場合でも、長期間、連続的な適用が可能であるため、アルツハイマー病の進行を抑制できる可能性があり、また、アルツハイマー病の根本治療にもつながる可能性がある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る薬剤及び飲食物は、アルツハイマー病の予防又は治療に有用な可能性が高い。その他、本発明に係る薬剤及び飲食物には、長期間、連続的に適用できる可能性が高い、副作用の少ない可能性が高いなどの利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
＜本発明に係る化合物について＞
本発明に係る化合物は、２個以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸を全て包含する。【００１５】
そのようなカフェオイルキナ酸として、例えば、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（略号「３，４−ｄｉ−ＣＡ」）、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（略号「３，５−ｄｉ−ＣＡ」）、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（略号「４，５−ｄｉ−ＣＡ」）、３，４，５−トリ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（略号「３，４，５−ｔｒｉ−ＣＡ」）などが挙げられる。【００１６】
３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸の化学構造式を「化１」に、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸の化学構造式を「化２」に、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸の化学構造式を「化３」に、それぞれ示す。なお、ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸の分子式はＣ２５Ｈ２４Ｏ１２、分子量（ＭＷ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）は約５１６である。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【００１７】
本発明に係る化合物は、例えば、所定の植物から成分を抽出し、分離・精製することにより得ることができる。この化合物を含有する植物としては、例えば、アメリカネナシカズラ、コーヒー、リンゴ、ブドウ、レモン、大根、玉ねぎ、マツ、ウコン、ヒマワリ、トウモロコシ、大麦、小麦、米、モロヘイヤなどが挙げられる。【００１８】
本発明に係る化合物は、例えば、各種溶媒を用いてこれらの植物から有効成分を抽出したり、各種クロマトグラフィーにより抽出成分から所定の有効成分を分離・精製したりすることにより、得ることができる。【００１９】
＜本発明に係る薬剤について＞
本発明に係る薬剤は、２個以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸を、アルツハイマー病予防又は治療の有効成分として少なくとも含有していればよい。【００２０】
本発明に係る薬剤の剤型は特に限定されない。例えば、経口剤（散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、丸剤など）、外用剤（軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、外用液剤、点眼液剤、点鼻液剤、吸入剤、坐剤、スプレーなど）、注射剤などとして用いることができる。【００２１】
経口剤の場合、例えば、本発明に係る化合物に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤などを適宜含有させてもよい。【００２２】
外用剤の場合、例えば、本発明に係る化合物に、基材、保存剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、酸化防止剤などを適宜含有させてもよい。【００２３】
注射剤の場合、例えば、本発明に係る化合物に、溶剤、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、保存剤、等張化剤などを適宜含有させてもよい。【００２４】
＜本発明に係る飲食物について＞
本発明に係る飲食物は、２個以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸を、アルツハイマー病予防又は治療の有効成分として少なくとも含有していればよい。【００２５】
例えば、保健機能食品（特定保健機能食品、栄養機能食品など）、いわゆる健康飲食物、その他の各種飲食物などに含有させたり、各種調味料などに配合したりすることができる。また、口中に一時的に含むもの、例えば、歯磨剤、染口剤、チューインガム、うがい剤などに含有させてもよい。
【実施例１】
【００２６】
実施例１では、アメリカネナシカズラ（学名「Ｃｕｓｃｕｔａ  ｐｅｎｔａｇｏｎａ」、以下同じ）から生理活性成分を抽出した。そして、抽出した成分を分離・精製し、化合物を同定した。なお、本実施例で用いた各試薬は、和光純薬株式会社より購入した。【００２７】
はじめに、以下の手順で、アメリカネナシカズラから生理活性成分を抽出した（図１参照）。【００２８】
まず、茨城県結城郡千代川村で採取したアメリカネナシカズラ２．０ｋｇについて、メタノール１１Ｌを用いて抽出を行った。抽出は、同じメタノールを用いて２回行った。次に、そのメタノール抽出溶液をロータリーエバポレーターで減圧下溶媒留去し、アメリカネナシカズラの粗抽出物（２５０ｇ）を得た。【００２９】
次に、その粗抽出物１３３ｇにヘキサンと９０％メタノールを加え、撹拌後静置し、２層（ヘキサン抽出溶液層及び９０％メタノール抽出溶液層）に分離させた。次に、両層をそれぞれ分取した後、前記と同様、ロータリーエバポレーターで減圧下溶媒留去し、ヘキサン抽出成分の粉末（２．５５ｇ）及び９０％メタノール抽出成分の粉末（１１５ｇ）を得た。【００３０】
次に、９０％メタノール抽出成分の粉末１１５ｇにクロロホルムと水を加え、撹拌後静置し、２層（クロロホルム抽出溶液層及び水抽出溶液層）に分離させた。次に、両層をそれぞれ分取した後、前記と同様、ロータリーエバポレーターで減圧下溶媒留去し、クロロホルム抽出成分の粉末（３．１０ｇ）を得た。【００３１】
次に、前記手順で分取した水抽出溶液に酢酸エチルと水を加え、撹拌後静置し、２層（酢酸エチル抽出溶液層及び水抽出溶液層）に分離させた。次に、両層をそれぞれ分取した後、前記と同様、ロータリーエバポレーターで減圧下溶媒留去し、酢酸エチル抽出成分の粉末（１１．７ｇ）を得た。【００３２】
次に、前記手順で分取した水抽出溶液にｎ−ブタノールと水を加え、撹拌後静置し、２層（ｎ−ブタノール抽出溶液層及び水抽出溶液層）に分離させた。次に、両層をそれぞれ分取した後、前記と同様、ロータリーエバポレーターで減圧下溶媒留去し、ｎ−ブタノール抽出成分の粉末（４０．０ｇ）及び水抽出成分の粉末（３６．４ｇ）を得た。【００３３】
以上の手順により、アメリカネナシカズラから、酢酸エチル可溶成分（酢酸エチル抽出成分の粉末１１．７ｇ）、及び、ｎ−ブタノール可溶成分（ｎ−ブタノール抽出成分の粉末４０．０ｇ）を得た。【００３４】
続いて、酢酸エチル可溶成分、及び、ｎ−ブタノール可溶成分について、クロマトグラフィーにより、分離・精製を行った。【００３５】
酢酸エチル可溶成分の分離・精製は、以下の手順で行った（図２参照）。【００３６】
まず、酢酸エチル抽出成分の粉末３．０４ｇを、メタノール／水混合溶液（混合比３０：７０）で溶解した。次に、その溶解液について、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより、メタノール／水混合溶媒を用いて、混合比３０：７０〜１００：０のグラジエント溶出を行い、ＣＰ−ＥＡ−１〜ＣＰ−ＥＡ−９の９画分に分画した。カラムにはカラム径２２ｍｍ、カラム長３００ｍｍのものを、その充填剤には「ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ７５Ｃ１８−ＰＲＥＰ（「ＣＯＳＭＯＳＩＬ」は登録商標、ナカライテスク株式会社製）」を用いた。そして、各画分について、減圧下で溶媒留去を行った。【００３７】
各画分の取得量は、それぞれ、ＣＰ−ＥＡ−１画分（１７９ｍｇ）、ＣＰ−ＥＡ−２画分（２１２ｍｇ）、ＣＰ−ＥＡ−３画分（１４８ｍｇ）、ＣＰ−ＥＡ−４画分（１２９５ｍｇ）、ＣＰ−ＥＡ−５画分（３９９ｍｇ）、ＣＰ−ＥＡ−６画分（３１４ｍｇ）、ＣＰ−ＥＡ−７画分（２０２ｍｇ）、ＣＰ−ＥＡ−８画分（４３１ｍｇ）、ＣＰ−ＥＡ−９画分（１０１ｍｇ）であった。【００３８】
ｎ−ブタノール可溶成分の分離・精製は、以下の手順で行った（図３参照）。【００３９】
まず、ｎ−ブタノール抽出成分の粉末３．３３ｇをメタノール／水混合溶液（混合比１０：９０）で溶解した。次に、その溶解液について、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより、メタノール／水混合溶媒を用いて、混合比１０：９０〜１００：０のグラジエント溶出を行い、ＣＰ−ＢＵ−１〜ＣＰ−ＢＵ−１０の１０画分に分画した。カラムにはカラム径２２ｍｍ、カラム長３００ｍｍのものを、その充填剤には「ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ７５Ｃ１８−ＰＲＥＰ（「ＣＯＳＭＯＳＩＬ」は登録商標、ナカライテスク株式会社製）」を用いた。そして、各画分について、減圧下で溶媒留去を行った。【００４０】
各画分の取得量は、ＣＰ−ＢＵ−１画分（３８４ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−２画分（２７０ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−３画分（２７８ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−４画分（１９５ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−５画分（５６６ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−６画分（１３５ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−７画分（３９５ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−８画分（２１５ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−９画分（４１ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−１０画分（１８５ｍｇ）であった。【００４１】
次に、ＣＰ−ＢＵ−４画分１７０ｍｇをメタノール／水混合溶液（混合比２０：８０）で溶解し、その溶解液をＯＤＳカラムにアプライして、ＣＰ−ＢＵ−４−１画分及びＣＰ−ＢＵ−４−２画分を得た。カラムにはカラム径１１ｍｍ、カラム長３００ｍｍのものを、その充填剤には「ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ７５Ｃ１８−ＰＲＥＰ（「ＣＯＳＭＯＳＩＬ」は登録商標、ナカライテスク株式会社製）」を用いた。そして、各画分について、減圧下で溶媒留去を行った。【００４２】
各画分の取得量は、ＣＰ−ＢＵ−４−１画分（６２ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−４−２画分（７０ｍｇ）であった。【００４３】
次に、ＣＰ−ＢＵ−４−２画分７０ｍｇをメタノール／水／酢酸混合溶液（混合比５０：５０：１）で溶解した後、逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー、以下同じ）により、溶媒に前記混合溶液を用いてその溶解液を分画し、フラクションコレクターにより各画分を得た（図４参照）。そして、各画分のうち、分光検出器によりピークを検出した３つの画分（Ｐｅａｋ１：ＣＰ−ＢＵ−４−２−２、Ｐｅａｋ２：ＣＰ−ＢＵ−４−２−４、Ｐｅａｋ３：ＣＰ−ＢＵ−４−２−６）について、減圧下で溶媒留去を行った。【００４４】
ＨＰＬＣには、ＳＤ−８０２０型デガッサー、ＤＰ−８０２０型送液システム、ＰＤ−８０２０型又はＵＶ−８０２０型分光検出器（いずれも東ソー株式会社製）を組み合わせて用いた。フラクションコレクターには、ＦＲＡＣＴＩＯＮ  ＣＯＬＬＥＣＴＯＲ  ＳＦ−１６０（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いた。逆相カラムには、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５（カラム径１０．０ｍｍ、カラム長２５０ｍｍ、野村化学株式会社製）を用いた。流速は２．５ｍＬ／ｍｉｎに設定した。【００４５】
各画分の取得量は、ＣＰ−ＢＵ−４−２−２画分（５．７ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−４−２−４画分（１８．４ｍｇ）、ＣＰ−ＢＵ−２−６画分（１４．２ｍｇ）であった。【００４６】
続いて、得られた各画分の化合物の同定を行った。【００４７】
各画分について、ＥＳＩＭＳ（エレクトロスプレーイオン化法による質量分析）、１Ｈ−ＮＭＲ（１Ｈ核磁気共鳴分光による測定）、１３Ｃ−ＮＭＲ（１３Ｃ核磁気共鳴による測定）を行い、それらの測定値の解析を行った。【００４８】
ＥＳＩＭＳ装置には、Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＬＣ型（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた。【００４９】
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲの測定には、ＡＶＡＮＣＥ型（５００ＭＨｚ／６００ＭＨｚ）のＮＭＲスペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用いた。ＮＭＲ測定において、重水素化溶媒として、重水（Ｄ２Ｏ）、重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）、重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を用いた。各重水素化溶媒はＩＳＯＴＥＣ社より購入した。重水は重水の残留溶媒ピーク（δＨ４．８ｐｐｍ）及び重メタノールの残留溶媒ピーク（δＨ３．３５ｐｐｍ）を、重メタノールは重メタノールの残留溶媒ピーク（δＨ３．３５ｐｐｍ、δＣ４９．８ｐｐｍ）を、重クロロホルムは重クロロホルムの残留溶媒ピーク（δＨ７．２６ｐｐｍ）を、それぞれ内部標準とした。【００５０】
その結果、ｎ−ブタノール可溶成分中のＣＰ−ＢＵ−４−２−６画分から３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を、酢酸エチル可溶成分中のＣＰ−ＥＡ−４画分、ｎ−ブタノール可溶成分中のＣＰ−ＢＵ−５画分、同じくｎ−ブタノール可溶成分中のＣＰ−ＢＵ−４−２−４画分から３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を、ｎ−ブタノール可溶成分中のＣＰ−ＢＵ−４−２−４画分から４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を、それぞれ同定した。【００５１】
３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分（ＣＰ−ＢＵ−４−２−６）についての測定結果を図５から図７に、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分（ＣＰ−ＥＡ−４、ＣＰ−ＢＵ−５、及び、ＣＰ−ＢＵ−４−２−４）についての測定結果（代表例）を図８から図１０に、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分（ＣＰ−ＢＵ−４−２−４）についての測定結果を図１１及び図１２に、それぞれ示す。【００５２】
図５は、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についてのＥＳＩＭＳ測定結果を示すスペクトルである。このスペクトルの横軸は質量電化比（ｍ／ｚ）を、縦軸はイオンの相対強度を、それぞれ表す。【００５３】
図５に示す通り、ｍ／ｚ５３９に［Ｍ＋Ｎａ］＋の擬似分子イオンピークが観察された。この結果より、その画分に含有する化合物の分子量は５１６であると推定された。この分子量の値は、この化合物がジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸であることを示唆する。【００５４】
図６は、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトルである。このスペクトルの横軸は化学シフト値（単位：ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ））を、縦軸はシグナル強度を、それぞれ表す。【００５５】
図６のスペクトルデータを以下に示す。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）δ：２．１〜２．３（４Ｈ，ｍ，Ｈ−２，６）、４．３７（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−５）、５．１２（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｈ−４）、５．６４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、６．１９及び６．２８（１Ｈ，  ｅａｃｈ，ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，  Ｈ−８’，８”）、６．７４及び６．７５（１Ｈ  ｅａｃｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−５’，５”）、６．９０及び６．９２（１Ｈ  ｅａｃｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．９Ｈｚ，Ｈ−６’，６”）、７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−２’，２”）、７．５２及び７．５８（１Ｈ  ｅａｃｈ，ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，Ｈ−７’，７”）。【００５６】
図６のスペクトル中、４．３７ｐｐｍの「ｂｒｓ（ｂｒｏａｄ  ｓｉｎｇｌｅｔ、幅の広い一重線）」のピークは、キナ酸構造の５位の水素であると推定した。５．１２ｐｐｍの「ｂｒｄ（ｂｒｏａｄ  ｄｏｕｂｌｅｔ、幅の広い二重線）」のピークでは結合定数Ｊが３．２Ｈｚであったことから、キナ酸構造の３位のアキシアル位の水素と４位のアキシアル位の水素が相互作用（カップリング）していると推定した。５．６４ｐｐｍの「ｍ（ｍｕｌｔｉｌｅｔ、多重線）」のピークは、キナ酸構造の３位の水素であると推定した。【００５７】
６．１９及び６．２８の「ｄ（二重線）」のピーク、及び、７．５２及び７．５８の「ｄ（二重線）」のピークでは結合定数Ｊがともに１５．８Ｈｚであったことから、カフェ酸構造部分の７’位及び７”位の二重結合はトランス型に帰属した。６．７４、６．７５、６．９０及び６．９２の「ｄ（二重線）」のピークでは結合定数Ｊが８．２Ｈｚ（７．８Ｈｚ）であったことから、カフェ酸構造部分の５’位の水素と６’位の水素、及び、同じく５”位の水素と６”位の水素が、それぞれ相互作用（カップリング）していると推定した。６．９０、６．９２及び７．０１の「ｄ（二重線）」のピークでは結合定数Ｊが１．９Ｈｚであったことから、カフェ酸構造部分の２’位の水素と６’位の水素、及び、同じく２”位の水素と６”位の水素が、それぞれカップリングしていると推定した。【００５８】
図７は、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１３Ｃ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトルである。このスペクトルの横軸は化学シフト値（単位：ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ））を、縦軸はシグナル強度を、それぞれ表す。【００５９】
図７のスペクトルデータを以下に示す。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）δ：６９．７（Ｃ−５）、１１５．３及び１１５．４（Ｃ−８’，８”）、１１５．８（Ｃ−２’，２”）、１１７．１（Ｃ−５’，５”）、１２３．８（Ｃ−６’，６”）、１２８．３（Ｃ−１’，１”）、１４７．４（Ｃ−３’，３”）、１４８．２及び１４８．３（Ｃ−７’，７”）、１５０．３（Ｃ−４’，４”）、１６８．９及び１６９．２（Ｃ−９’，９”）、１７５．８（Ｃ−７）。【００６０】
図７のスペクトル中、４０ｐｐｍ付近にメチレン鎖、７０〜８０ｐｐｍにオキシメチン、１１０〜１５５ｐｐｍ付近に芳香環、１６９ｐｐｍ付近にエステル、１７６ｐｐｍにカルボン酸のシグナルがそれぞれ観察された。【００６１】
以上の解析及び文献値との比較検討に基づき、この化合物は、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（前記「化１」の化学式に示す化合物）であると推定した。【００６２】
図８は、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についてのＥＳＩＭＳ測定結果を示すスペクトル（代表例）である。前記と同様、このスペクトルの横軸は質量電化比（ｍ／ｚ）を、縦軸はイオンの相対強度を、それぞれ表す。【００６３】
図８に示す通り、ｍ／ｚ５３９に［Ｍ＋Ｎａ］＋の擬似分子イオンピークが観察された。この結果より、その画分に含有する化合物の分子量は５１６であると推定された。この分子量の値は、前記と同様、この化合物がジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸であることを示唆する。【００６４】
図９は、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトル（代表例）である。前記と同様、このスペクトルの横軸は化学シフト値（単位：ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ））を、縦軸はシグナル強度を、それぞれ表す。【００６５】
図９のスペクトルデータを以下に示す。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）δ：２．１８−２．３８（４Ｈ，ｍ，Ｈ−２，６）、４．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，７．４Ｈｚ，Ｈ−４）、４．４７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５）、５．４３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、６．３１及び６．４０（１Ｈ  ｅａｃｈ，ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，Ｈ−８’，８”）、６．７４及び６．７５（１Ｈ  ｅａｃｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，  Ｈ−５’，５”）、７．０１及び７．０２（１Ｈ  ｅａｃｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７，８．１Ｈｚ，Ｈ−６’，６”）、７．１１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，Ｈ−２’，２”）、７．６２及び７．６６（１Ｈ  ｅａｃｈ，ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，Ｈ−７’，７”）。【００６６】
図９のスペクトル中、４．０２ｐｐｍの「ｄｄ（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｏｕｂｌｅｔ、二つの二重線）」のピークでは結合定数Ｊが７．４Ｈｚであったことから、キナ酸構造の５位のアキシアル位の水素と４位のアキシアル位の水素が相互作用（カップリング）していると推定した。同じく、４．０２ｐｐｍのピークでは、もう一方の結合定数Ｊが３．３Ｈｚであったことから、キナ酸構造の３位のエクアトリアル位の水素と４位のエクアトリアル位の水素が相互作用（カップリング）していると推定した。４．４７ｐｐｍの「ｍ（ｍｕｌｔｉｌｅｔ、多重線）」のピークは、キナ酸構造の５位の水素であると推定した。５．４３ｐｐｍの「ｍ（ｍｕｌｔｉｌｅｔ、多重線）」のピークは、キナ酸構造の３位の水素であると推定した。【００６７】
カフェ酸構造部分については、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸におけるスペクトルとほぼ同様であった。【００６８】
図１０は、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１３Ｃ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトルである。前記と同様、このスペクトルの横軸は化学シフト値（単位：ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ））を、縦軸はシグナル強度を、それぞれ表す。【００６９】
図１０のスペクトルデータを以下に示す。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）δ：３６．７（Ｃ−２）、３８．４（Ｃ−６）、７１．４（Ｃ−４）、７２．８（Ｃ−３）、７３．３（Ｃ−５）、７５．５（Ｃ−１）、１１５．８及び１１５．９（Ｃ−８’，８”）、１１６．０及び１１６．３（Ｃ−２’，２”）、１１７．２（Ｃ−５’，５”）、１２３．８及び１２３．９（Ｃ−６’，６”）、１２８．５及び１２８．６（Ｃ−１’，１”）、１４７．４（Ｃ−３’，３”）、１４７．８及び１４８．０（Ｃ−７’，７”）、１５０．１及び１５０．２（Ｃ−４’，４”）、１６９．１及び１６９．７（Ｃ−９’，９”）、１７８．１（Ｃ−７）。【００７０】
図１０のスペクトル中、３５〜４０ｐｐｍ付近にメチレン鎖、７１〜７６ｐｐｍにオキシメチン、１１０〜１５５ｐｐｍ付近に芳香環、１６９ｐｐｍ付近にエステル、１７８ｐｐｍにカルボン酸のシグナルがそれぞれ観察された。【００７１】
以上の解析及び文献値との比較検討に基づき、この化合物は、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（前記「化２」の化学式に示す化合物）であると推定した。【００７２】
図１１は、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についてのＥＳＩＭＳ測定結果を示すスペクトルである。前記と同様、このスペクトルの横軸は質量電化比（ｍ／ｚ）を、縦軸はイオンの相対強度を、それぞれ表す。【００７３】
図１１に示す通り、ｍ／ｚ５３９に［Ｍ＋Ｎａ］＋の擬似分子イオンピークが観察された。この結果より、その画分に含有する化合物の分子量は５１６であると推定された。この分子量の値は、前記と同様、この化合物がジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸であることを示唆する。【００７４】
図１２は、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトルである。前記と同様、このスペクトルの横軸は化学シフト値（単位：ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ））を、縦軸はシグナル強度を、それぞれ表す。【００７５】
図１２のスペクトルデータを以下に示す。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）δ：４．３７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０，８．６Ｈｚ，Ｈ−４）、５．６４（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−５）。【００７６】
図１２のスペクトル中、４．３７ｐｐｍの「ｍ（ｍｕｌｔｉｌｅｔ、多重線）」のピークは、キナ酸構造の３位の水素であると推定した。５．０１ｐｐｍの「ｄｄ（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｏｕｂｌｅｔ、２つの二重線）」のピークでは結合定数Ｊが３．０Ｈｚであったことから、キナ酸構造の４位のアキシアル位の水素と３位のエクアトリアル位の水素が相互作用（カップリング）していると推定した。同じく、５．０１ｐｐｍのピークでは、もう一方の結合定数Ｊが８．６Ｈｚであったことから、キナ酸構造の４位のアキシアル位の水素と５位のアキシアル位の水素が相互作用（カップリング）していると推定した。５．６４ｐｐｍの「ｂｒｓ（ｂｒｏａｄ  ｓｉｎｇｌｅｔ、幅の広い一重線）」のピークは、キナ酸構造の５位の水素であると推定した。【００７７】
カフェ酸構造部分については、図１２では明瞭な化学シフトが観察されなかった。しかし、カフェ酸構造部分を有する化合物に関する本発明者らが蓄積したスペクトルデータと、図１２に示すスペクトルとは、高度に類似していた。従って、この化合物は、カフェ酸構造部分を有する物質であると推定する。【００７８】
以上の解析及び文献値との比較検討に基づき、この化合物は、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（前記「化３」の化学式に示す化合物）であると推定した。【００７９】
以上のように、この実施例では、アメリカネナシカズラに含有する生理活性物質として、３種類のジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した。
【実施例２】
【００８０】
実施例２では、ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸に、βアミロイドによる細胞傷害を抑制する作用があるかどうかを、ＭＴＴアッセイにより検討した。【００８１】
ＭＴＴアッセイは、相対的な生存細胞数を測定する方法である。ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）は、生細胞中のミトコンドリア内脱水素酵素（フタル酸脱水素酵素）により、ＭＴＴホルマザンに還元される。産生されたＭＴＴホルマザン量と生存細胞数は比例する。そこで、培養細胞中にＭＴＴ試薬を添加した後、５５０〜６００ｎｍにおける吸光度を測定してＭＴＴホルマザン産生量（相対値）を取得することにより、相対的な生存細胞数を測定できる。【００８２】
そこで、本実施例では、神経細胞由来の培養細胞にβアミロイドとジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を添加した後、ＭＴＴアッセイを行い、生存細胞数を測定した。そして、生存細胞数を測定することにより、ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸に、βアミロイドによる細胞傷害を抑制する作用があるかどうかを調べた。【００８３】
実験手順の概要を以下に示す。【００８４】
本実験では、ヒト神経芽腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２２６６）を用いた。この細胞は、１９７０年にヒトの骨転移がんから確立されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１１）の亜系を３回クローニングした細胞である（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−  ＞ＳＨ−ＳＹ−  ＞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（以下、「ＳＨ細胞」とする。）は細胞接着因子の放出が少なく剥離しやすい性質を有しているため、培養時には、接着因子（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）を添加した。【００８５】
βアミロイドには、スイスＢａｃｈｅｍ社製のβアミロイドを１００％ＤＭＳＯで溶解した後、１％ＤＭＳＯ加ＰＢＳ（リン酸緩衝液、以下同じ）で２００μＭ濃度に希釈したものを用いた。【００８６】
サンプル（ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸）には、実施例１で分離・精製した各粉末をＰＢＳで１０％（ｖ／ｖ）に希釈したもの（３種類）を用いた。以下、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸のサンプルをサンプル１、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸のサンプルをサンプル２、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸のサンプルをサンプル３とする。【００８７】
まず、９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）をＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎでコートし、各ウエルにＳＨ細胞を２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ濃度で１００μＬ／ｗｅｌｌ播種し、１２〜２４時間、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。次に、各ウエルの培地を除去し、細胞の接着を確認し、Ａｓｓａｙ培地（「ＯＰＴＩ−ＭＥＭ」、Ｇｉｂｃｏ社製）で細胞を１回洗浄・除去した後、再度、その培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。【００８８】
次に、各ウエルに、１８０μＭのβアミロイド溶液１０μＬと、サンプル溶液１０μＬを添加し、７２時間培養した。【００８９】
次に、ＭＴＴ試薬（株式会社同仁化学研究所製）をＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈した後、各ウエルに１０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、６時間培養した。次に、１０％ＳＤＳ溶液を各ウエルに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、一晩（１２時間）、ＣＯ２インキュベーター内に放置し、ＭＴＴホルマザンを完全に溶解させた。【００９０】
次に、プレートリーダー（「ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ  ＨＴ」、大日本製薬株式会社製、「ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ」は登録商標）で５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＭＴＴホルマザン産生量（相対値）の値を得た。【００９１】
結果を図１３に示す。【００９２】
図１３は、βアミロイド存在下の培養細胞にジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を添加した場合における細胞生存数を示すグラフである。グラフの縦軸は生存細胞数の相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）を表す。なお、縦軸の数値は、各測定値を、βアミロイドのみを添加した場合における測定値で除して算出した値である。【００９３】
グラフ中、「Ｃｏｎｔ」はコントロール（サンプル及びβアミロイド溶液を添加しなかった場合における生存細胞数の相対値）を、「Ａβ」はβアミロイド溶液を添加した場合における生存細胞数の相対値を、「Ｓ１」はサンプル１（３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸）を添加した場合における生存細胞数の相対値を、「Ｓ１＋Ａβ」はサンプル１（３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸）とβアミロイドを添加した場合における生存細胞数の相対値を、「Ｓ２」はサンプル２（３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸）を添加した場合における生存細胞数の相対値を、「Ｓ２＋Ａβ」はサンプル２（３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸）とβアミロイドを添加した場合における生存細胞数の相対値を、「Ｓ３」はサンプル３（４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸）を添加した場合における生存細胞数の相対値を、「Ｓ３＋Ａβ」はサンプル３（４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸）とβアミロイドを添加した場合における生存細胞数の相対値を、それぞれ表す。【００９４】
図１３に示す通り、サンプル１〜３の各ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸とβアミロイドの両者を添加した場合、βアミロイドを単独で添加した場合と比較して、生存細胞数が増加した（グラフ中、点線で囲んだ部分を参照）。この結果は、ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸が、βアミロイドによる細胞傷害を抑制する作用を有することを示す。
【実施例３】
【００９５】
実施例３では、カフェオイルキナ酸の神経保護作用のメカニズムについて、プロテオミクス解析を行った。【００９６】
プロテオミクス解析は、一般的に、二次元電気泳動法により細胞内のタンパク質を展開し、目的タンパク質を回収し、質量分析等の後、データベース解析を行って、タンパク質を同定する方法である。例えば、目的タンパク質の化学構造、総量、発現時期、翻訳後修飾、スプライシング、集合体形成などの高次情報解析を行うことができる。【００９７】
本実施例においては、神経保護に関わるタンパク質として知られているホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）の発現量が、カフェオイルキナ酸により変化するか否かについて、プロテオミクス解析により検討した。【００９８】
実験手順の概要を以下に示す。【００９９】
＜サンプル処理＞ 
培養したＳＨ細胞を、実施例２と同様に、dish（10cm）を用いてβアミロイド溶液と、実施例１で分離・精製した各粉末をＰＢＳで１０％（ｖ／ｖ）に希釈したサンプルとで処理した。【０１００】
＜蛋白質抽出＞ 
処理が終わった細胞から培地を吸い出し、１０ｍＬのTris-Sorbitolで２回洗浄した。次に、表１に示す組成のLysis bufferを２ｍＬ加え、セルスクーパーで掻き取った。細胞液を超遠心用チューブに移し、１５分毎に上下攪拌しながら室温で１時間放置した。そして、１５℃、４６０００ｒｐｍで１時間超遠心後の上澄み液を蛋白質抽出液とした。
【表１】
2007091613.tif 000006
【０１０１】
＜蛋白質濃度測定＞ 
PlusOne2-D Quant Kit（Amershm Biosiences）を用いて、牛血漿アルブミン（BSA）のスタンダードカーブを作成し、被験液の蛋白質量を求めた。【０１０２】
＜二次元電気泳動〜一次元目等電点電気泳動〜＞
本実施例における一次元目電気泳動には，Ettan IPGphorII等電点電気泳動システム（Amershm Biosiences）を使用した。IPGストリップはpHレンジを3-10 とした１８ｃｍのIPGストリップ（Immobiline DryStrip）を使用し、ストリップの膨潤にはストリップホルダーを用いた。【０１０３】
ＣＢＢ（CoomassieBrilliant Blue (PhastGel Blue R-350, Amersham-Pharmacia Biotech)）染色でタンパク質を呈色するため、各タンパク質を３５０μｇ流した。そこでタンパク質濃度測定結果より、表２に示す組成の膨潤バッファーで試料曝露細胞タンパク質抽出液を希釈し、膨潤液とした。ストリップホルダーでIPGストリップを３４０μＬの膨潤液に浸し、表２に示す組成のカバー液２ｍＬで覆いふたをした。ストリップホルダーを前記Ettan IPGphorIIに設置し、１２時間膨潤後、一次元電気泳動を行った。IPGストリップの泳動条件を表３に示す。
【表２】
2007091613.tif 000007
【表３】
2007091613.tif 000008
【０１０４】
＜二次元電気泳動〜二次元目ＳＤＳ−ＰＡＧＥ〜＞
本実施例における二次元目ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、Ｅｔｔａｎ  Ｄａｌｔｓｉｘ電気泳動システム（Ａｍｅｒｓｈｍ  Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）を使用した。一次元電気泳動の終了したＩＰＧストリップをシャーレに移し、表４に示す組成の平衡化溶液１を１０ｍＬ加え、１５分間シェーカーで揺らした。その後、平衡化溶液１を捨て、表４に示す組成の平衡化溶液２を１０ｍＬ加え、同様に１５分間シェーカーで揺らし、ＩＰＧストリップを平衡化した。
【表４】
2007091613.tif 000009
【０１０５】
平衡化したＩＰＧストリップをゲルの陰極側（上部）に設置し、分子量マーカー（Ｓａｍｐｌｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｉｅｃｅに１０μＬの分子量マーカー溶液（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用）を染み込ませ、マーカーの拡散を防ぐために封入用アガロース５０μＬでＳａｍｐｌｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｉｅｃｅをカバーし、封入用アガロースが固まった後、ＩＰＧストリップの横にセットしたしたもの）を添加後、表４に示す組成のアガロース溶液でゲルを封入した。泳動条件を表５に示す。
【表５】
2007091613.tif 000010
【０１０６】
＜タンパク質の検出＞
二次元電気泳動によってゲル上で分離したタンパク質を、表６に示す組成のＣＢＢ染色液で染色し、タンパク質スポットパターンを検出した。泳動後のゲルを表６に示す定着液に浸し二時間揺らし、ＣＢＢ染色液に浸し１５分間染色後、定着液と同一の組成の洗浄液で二時間揺らし、タンパク質スポットを検出した。スポット解析にはＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。
【表６】
2007091613.tif 000011
【０１０７】
＜質量分析（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）＞
二次元電気泳動後のゲルより得られた特異スポットをゲルより切り出し、洗浄後、トリプシン酵素により消化処理を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）を用いて、ＰＭＦ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）解析を行った。得られたペプチド配列情報をタンパク質データベースＢＬＡＳＴ検索により、データベース上のタンパク質と照合し、特異スポットのタンパク質を同定した。その結果、特異スポットのタンパク質は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）であることが分かった。【０１０８】
二次元電気泳動したゲルでのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）の発現パターンを図１４に示す。【０１０９】
図１４中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロール（カフェオイルキナ酸及びβアミロイド溶液を添加しなかった場合におけるＰＧＫ１の発現パターン）を、「Ａβ」はβアミロイド溶液を添加した場合におけるＰＧＫ１の発現パターンを、「ＣＡ」はカフェオイルキナ酸を添加した場合におけるＰＧＫ１の発現パターンを、「ＣＡ＋Ａβ」はカフェオイルキナ酸とβアミロイドを添加した場合におけるＰＧＫ１の発現パターンを、それぞれ示す。【０１１０】
図１４に示す通り、カフェオイルキナ酸とβアミロイドを添加した場合におけるＰＧＫ１の発現量が、明らかに増加していることが分かる。【０１１１】
また、それぞれのＰＧＫ１発現強度を調べた。結果を図１５に示す。【０１１２】
図１５に示す通り、カフェオイルキナ酸とβアミロイドを添加した場合におけるＰＧＫ１の発現強度が、他に比べて明らかに強いことが分かる。【０１１３】
実施例３では、カフェオイルキナ酸は、神経細胞保護に関わるタンパク質ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）の発現増加が深く関わっていることを示唆する。
【実施例４】
【０１１４】
実施例４では、カフェオイルキナ酸のアルツハイマー発症予防効果について、動物レベルで確認した。【０１１５】
本実施例は、モリス水迷路を用いた行動生理的手法により行った。モリス水迷路とは、空間認識の記憶学習を測定することが可能な実験装置であり、円形プールに水を満たし、非難場所として水面下に隠れた台を置いたものである。マウスをモリス水迷路に入れると、最初は、水槽の中を泳ぎ回った結果、台を見つける。これを何回も繰り返すと、マウスは台のある場所を覚え、台に到着するまでの時間が短縮する。マウスの水泳パターン（台付近に滞在する時間）や台に到着するまでの時間を測定することにより学習能力を知ることができる。【０１１６】
実験手順の概要を以下に示す。【０１１７】
本実施例では、老化促進モデルマウス（SAM P8）を用いた。老化促進モデルマウス（SAM P8）とは、近親交配によって老化の進行が早くなり、記憶・学習障害を起こしたマウスである。【０１１８】
老化促進マウス（SAM P8）を、ＰＢＳで希釈したカフェオイルキナ酸を一日目から体重１ｋｇ当たり6.7ｍｇ(200μl)をゾンデにて経口投与したカフェオイルキナ酸投与群、ＰＢＳ200μlをゾンデにて経口投与したＰＢＳ投与群に分けた。なお、コントロール群として、ＰＢＳ200μlをゾンデにて経口投与した正常マウス(SAM R１)を用いた。【０１１９】
図１６に示す直径１２０ｃｍ、深さ２５ｃｍのモリス水迷路を用意し、該モリス水迷路内にカフェオイルキナ酸投与群、ＰＢＳ投与群、コントロール群のマウスを放した。図１７に示すように、マウスが水中を泳いで水面下にある透明の台（フラットホーム）に乗るまでの時間を、１日１回、３０日間測定した。【０１２０】
３０日目のカフェオイルキナ酸投与群とＰＢＳ投与群のマウスがフラットホームに乗るまでの時間を比較した結果、カフェオイルキナ酸投与群のマウスがフラットホームに乗るまでの時間の方が短かった。これは、カフェオイルキナ酸投与群のマウスは記憶学習能に対する老化が抑制されたが、ＰＢＳ投与群のマウスは、記憶学習能の老化が進行していることを示唆する。【０１２１】
以上の結果から、実施例４では、カフェオイルキナ酸が、学習記憶障害に対して改善効果を有することが分かった。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】アメリカネナシカズラから生理活性成分を抽出する手順を示す模式図。
【図２】アメリカネナシカズラ抽出成分中、酢酸エチル可溶成分の分離・精製手順を示す模式図。
【図３】アメリカネナシカズラ抽出成分中、ｎ−ブタノール可溶成分の分離・精製手順を示す模式図。
【図４】ｎ−ブタノール可溶成分中、ＣＰ−ＢＵ−４−２画分について行ったＨＰＬＣクロマトグラム。
【図５】３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についてのＥＳＩＭＳ測定結果を示すスペクトル。
【図６】３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトル。
【図７】３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１３Ｃ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトル。
【図８】３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についてのＥＳＩＭＳ測定結果を示すスペクトル。
【図９】３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトル。
【図１０】３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１３Ｃ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトル。
【図１１】４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についてのＥＳＩＭＳ測定結果を示すスペクトル。
【図１２】４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を同定した画分についての１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示すスペクトル。
【図１３】βアミロイド存在下の培養細胞にジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を添加した場合における細胞生存数を示すグラフ。
【図１４】実施例３において、二次元電気泳動したゲルでのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）の発現パターンを示す図面代用写真。
【図１５】実施例３において、二次元電気泳動したゲルでのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）の発現強度を示す図面代用グラフ。
【図１６】実施例４において用いたモリス水迷路の図面代用写真。
【図１７】実施例４において、マウスがフラットホームに乗った状態を示す図面代用写真。
【図１】
2007091613.tif 000015
【図２】
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【図３】
2007091613.tif 000017
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007091613.tif 000021
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2007091613.tif 000024
【図１１】
2007091613.tif 000025
【図１２】
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【図１３】
2007091613.tif 000027
【図１４】
2007091613.tif 000028
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2007091613.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月26日(2007.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個以上のカフェ酸がエステル結合した構造を有するカフェオイルキナ酸を有効成分として少なくとも含有するホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）発現誘導剤。
【請求項２】
「化１」から「化３」のいずれかの化学構造式で示されたジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸を有効成分として少なくとも含有することを特徴とする請求の範囲第１項記載のホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）発現誘導剤。
【化１】
2007091613.tif 000032
【化２】
2007091613.tif 000033
【化３】
2007091613.tif 000034
【請求項３】
βアミロイドによる細胞障害を抑制することを特徴とする請求の範囲第１項記載のホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）発現誘導剤。
【請求項４】
学習記憶障害を改善することを特徴とする請求の範囲第１項記載のホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）発現誘導剤。
【請求項５】
請求の範囲第１項から請求の範囲第４項のいずれか一項に記載のホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）発現誘導剤を少なくとも含有する学習記憶障害改善用の飲食物。
【国際調査報告】
2007091613.tif 000035
2007091613.tif 000036