【手続補正書】
【提出日】平成19年11月12日(2007.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i) 試験すべき生成物を、(a)適当なマーカーをエンコードする配列の少なくとも1つと同じ位相で融合した、野生型又は突然変異形態のMet4タンパク質をエンコードする配列を含むハイブリッド配列であって、酵母で活性なプロモーターの制御下で発現されるハイブリッド配列、及び任意に(b)適当なオペレーター配列又は適当な酵母プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子からなるレポーター転写系を含む改変酵母株と接触させ、
(ii)  0.03 mM〜20 mMの抑制濃度、又は非抑制濃度でメチオニンを加え、
(iii) 視覚化及び/又は定量、又はレポーター遺伝子の活性測定のいずれかにより、ハイブリッド配列から発現されるタンパク質の発現及び安定性のレベルを測定する
工程を含むことを特徴とする、ヒトにおけるユビキチン−プロテアソームカスケードの機能障害に関連した病状に作用し得る化合物の細胞スクリーニングの方法。
【請求項２】
同時に、
(iv)  試験すべき生成物を、適当なマーカーをエンコードする配列の少なくとも1つと同じ位相で融合した、野生型又は突然変異形態のMet30タンパク質をエンコードする配列を含むハイブリッド配列であって、酵母で活性なプロモーターの制御下で発現されるハイブリッド配列を含む改変酵母株と接触させ、
(v) 0.03 mM〜20 mMの抑制濃度、又は非抑制濃度でメチオニンを加え、
(vi) 視覚化及び/又は定量、又はレポーター遺伝子の活性測定のいずれかにより、ハイブリッド配列から発現されるタンパク質の発現及び安定性のレベルを測定する
工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コントロールの細胞系を用いる別手段をさらに含み、その手段が、
(vii) 試験すべき生成物を、適当なマーカーをエンコードする配列の少なくとも1つと同じ位相で融合した、野生型又は突然変異形態のMet28タンパク質をエンコードする配列を含むハイブリッド配列であって、酵母で活性なプロモーターの制御下で発現されるハイブリッド配列を含む改変酵母株と接触させ、
(viii) 0.03 mM〜20 mMの抑制濃度、又は非抑制濃度でメチオニンを加え、
(ix) 視覚化及び/又は定量、又はレポーター遺伝子の活性測定のいずれかにより、ハイブリッド配列から発現されるタンパク質の発現及び安定性のレベルを測定する
工程を含むことを特徴とする請求項１及び２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ハイブリッド配列及び代謝遺伝子MET16 及び MET25の転写レベル測定に基づくコントロールの無細胞系を用いる別手段をさらに含み、その手段が、
(x) 工程(i)、又は工程(iv)、又は工程(vii)のいずれかで用いた改変株の全RNAを抽出し、
(xi) ハイブリッド配列の転写レベルと代謝遺伝子MET16ならびにMET25の転写レベルを測定する
工程を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
(xii) 試験すべき生成物を、適当な酵母プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子からなるレポーター転写系を含む改変酵母株と接触させ、
(xiii) 0.03 mM〜20 mMの抑制濃度、又は非抑制濃度でメチオニンを加え、
(xiv) レポーター遺伝子の活性を測定する
工程を含むことを特徴とする、ヒトにおけるユビキチン−プロテアソームカスケードの機能障害に関連した病状に作用し得る化合物の細胞スクリーニングの方法。
【請求項６】
ハイブリッド配列の構築に用いられるマーカーが、抗原性ペプチド、固有の蛍光タンパク質、測定可能な酵素活性を有するタンパク質及びDNA-結合因子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
ハイブリッドタンパク質を発現し得るプロモーターが、エス・セレビシェで活性な誘導性プロモーター及び構成プロモーターからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
転写レポーター系に存在するレポーター遺伝子が、活性が比色法により視覚化できるレポーター遺伝子、及び活性が成長試験により測定できる代謝性遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
レポーター遺伝子が、MET遺伝子のプロモーター又はLexAオペレーターいずれかの制御下にあることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
MET遺伝子が、MET 3、MET 10、MET 16、MET 25又はMET 28であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
SCF複合体又はユビキチン-プロテアソーム経路の活性の異常に関連した疾病治療用薬剤を製造するための、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法により選択される化合物の使用。
【請求項１２】
固有の蛍光タンパク質をエンコードする少なくとも1つの配列と同じ位相で融合した、野生型又は突然変異型のMet4 タンパク質をエンコードする配列を含むハイブリッド配列であって、構成又は誘導性のプロモーターの制御下で酵母中で発現可能なハイブリッド配列を含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項１３】
固有の蛍光タンパク質をエンコードする少なくとも1つの配列と同じ位相で融合した、野生型又は突然変異型のMet28 タンパク質をエンコードする配列を含むハイブリッド配列であって、構成又は誘導性のプロモーターの制御下で酵母中で発現可能なハイブリッド配列を含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項１４】
固有の蛍光タンパク質をエンコードする少なくとも1つの配列と同じ位相で融合した、野生型又は突然変異型のMet30 タンパク質をエンコードする配列を含むハイブリッド配列であって、構成又は誘導性のプロモーターの制御下で酵母中で発現可能なハイブリッド配列を含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項１５】
固有の蛍光タンパク質がGFPタンパク質であり、プロモーターがMET 4、MET 28及びMET 30から選択される構成プロモーターであることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１つに記載のプラスミド。
【請求項１６】
固有の蛍光タンパク質がGFPタンパク質であり、プロモーターがGAL1誘導性プロモーターであることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１つに記載のプラスミド。
【請求項１７】
固有の蛍光タンパク質が3つの赤血球凝集素抗原性単位を含むペプチドと融合したGFPタンパク質であり、プロモーターがGAL1誘導性プロモーターであることを特徴とする請求項１４に記載のプラスミド。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか１つに記載の少なくとも1つのプラスミドで安定的に改変されたことを特徴とする酵母株。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
この発明による方法の別の有利な具体例では、方法は、
(x) 工程(i)、又は工程(iv)、又は工程(vii)のいずれかで用いた改変株の全RNAを抽出し、及び
(xi) ハイブリッド配列の転写レベルと代謝遺伝子MET16及びMET25の転写レベルを測定する工程
を含む、ハイブリッド配列及び代謝遺伝子MET16 ならびに MET25の転写レベル測定に基づくコントロールの無細胞系を用いる別手段をさらに含んでいてもよい。