【手続補正書】
【提出日】平成20年4月2日(2008.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
該標的核酸分子は、第１のＤＮＡ鎖および第２のＤＮＡ鎖を含み、
該方法は、
（ａ）リコンビナーゼ因子を核酸プライマーと接触させて核タンパク質プライマーを形成する工程であって、該核タンパク質プライマーは単鎖領域をその３’末端に含む、工程；
（ｂ）該核タンパク質プライマーを該標的核酸分子と接触させ、それにより該標的核酸分子の一部において二本鎖構造を形成する工程；
（ｃ）該核酸プライマーの３’末端を、１種類以上のポリメラーゼとｄＮＴＰとを用いて伸長させて、二本鎖核酸と、核酸被置換鎖とを生成する工程；ならびに
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）を、所望の増幅度に達するまで反復することを介して、該反応を継続する工程
を含み、ここで、
該方法は、工程（ｂ）および（ｃ）において、クラウディング剤の存在下において、該クラウディング剤が増幅を刺激するように、実施される、方法。
【請求項２】
前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、デキストラン、フィコール、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ化合物、ならびにそれらの誘導体およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）および（ｃ）がアクセサリー因子の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アクセサリー因子が、単鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、リゾルベースおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アクセサリー因子が、単鎖結合タンパク質、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、ＤｎａＸクランプ負荷体、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼ、スライディングクランプおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸プライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ主鎖核酸、ホスホロチオレート主鎖核酸、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメント安定化因子の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記安定化因子が、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＦおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｇｐ３２、大腸菌ＳＳＢタンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２タンパク質、およびそれらの誘導体からなる群より選択される単鎖安定化因子の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ４  ｇｐ３２タンパク質の誘導体が、Ｎ末端にさらなるアミノ酸を有するＴ４  ｇｐ３２、Ｃ末端にさらなるアミノ酸を有するＴ４  ｇｐ３２、リシンではないアミノ酸によるリシン３の置換を有するｇｐ３２  Ｔ４、およびアルギニンではないアミノ酸によるアルギニン４の置換を有する  Ｔ４ｇｐ３２、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔ４  ｇｐ３２誘導体が、Ｔ４  ｇｐ３２（Ｎ）、Ｔ４  ｇｐ３２（Ｃ）、Ｔ４  ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、Ｔ４  ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｑ、Ｔ４  ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔ、Ｔ４  ｇｐ３２Ｋ３Ａ、Ｔ４  ｇｐ３２Ｒ４Ｑ、Ｔ４  ｇｐ３２Ｒ４Ｔおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
リコンビナーゼ負荷タンパク質の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リコンビナーゼ負荷タンパク質が、Ｔ４  ｕｖｓＹ、大腸菌ｒｅｃＯ、大腸菌ｒｅｃＲならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＴＰ、ＡＴＰアナログ、およびその組合せからなる群より選択されるリコンビナーゼ因子の補因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＤＰをＡＴＰに変換するためのＡＴＰ再生系をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＴＰ再生系が、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ピロリン酸塩をリン酸塩に変換するためのピロホスファターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記１種類以上のＤＮＡポリメラーゼが、原核生物のポリメラーゼ、真核生物のポリメラーゼおよびファージにコードされたポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記真核生物のポリメラーゼが、ｐｏｌ−α、ｐｏｌ−β、ｐｏｌ−δ、ｐｏｌ−εならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記原核生物のポリメラーゼが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片、バクテリオファージＴ４  ｇｐ４３  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ポリメラーゼＩラージフラグメント、φ−２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｐｏｌ  Ｉラージフラグメント（Ｂｓｕポリメラーゼ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＶならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記リコンビナーゼ因子が温度感受性であり、該温度感受性リコンビナーゼ因子は、許容温度で鎖侵入活性を有するが、非許容温度では鎖侵入活性を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ネステッドリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）請求項１に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法を用い、第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いてＤＮＡの一領域を増幅し、第１の増幅産物を生成させる工程；
（ｂ）第３のプライマーおよび第４のプライマーを用い、請求項１に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法を用いて該増幅産物を増幅し、第２の増幅産物を生成させる工程であって、該第２の増幅産物は、該第１の増幅産物内に含まれる、より短い配列である、工程；
を含む、方法。
【請求項２３】
前記ｄＮＴＰのうちの少なくとも一部または少なくとも１つのプライマーが、検出可能なマーカーで標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記標識が、蛍光色素、酵素、蛍光消光剤、酵素阻害剤、放射性標識およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リコンビナーゼ因子が、ｕｖｓＸまたはＴ４  ｕｖｓＸである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）少なくとも１種類のリコンビナーゼ；
（２）少なくとも１種類の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；
（３）少なくとも１種類のＤＮＡポリメラーゼ；
（４）ｄＮＴＰ、またはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物；
（５）クラウディング剤；
（６）バッファー；
（７）還元剤；
（８）ＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；
（９）少なくとも１種類のリコンビナーゼ負荷タンパク質；
（１０）第１のプライマー、および任意選択の第２のプライマー；ならびに
（１１）標的核酸分子
を反応物中で合わせる工程；ならびに
（ｂ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、該クラウディング因子が増幅を刺激する、方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）０．２〜１２μＭの濃度のｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）１〜３０μＭの濃度のｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；
（３）５０〜５０００単位／ｍｌの濃度のＴ４  ｇｐ４３  ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｕポリメラーゼ；
（４）１〜３００μＭの濃度のｄＮＴＰ、またはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物；
（５）１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％の濃度のポリエチレングリコール；
（６）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（７）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＤＴＴ；
（８）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＡＴＰ；
（９）０．２μＭ〜８μＭの濃度のｕｖｓＹ；
（１０）第１のプライマー、および任意選択の第２のプライマーであって、該第１のプライマーおよび第２のプライマーは５０ｎＭ〜１μＭの濃度である、プライマー；ならびに
（１１）少なくとも１コピーの標的核酸分子
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、
該ポリエチレングリコールが増幅を刺激する、方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌ  ｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）６００ｎｇ／μｌ  ｇｐ３２；
（３）２０ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）２００μＭ  ｄＮＴＰ；
（５）１ｍＭ  ＤＴＴ；
（６）３ｍＭのＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌ  ｕｖｓＹ；
（８）３００ｎＭの第１のプライマーおよび３００ｎＭの第２のプライマー；
（９）８０ｍＭ  酢酸カリウム；
（１０）１０ｍＭ  酢酸マグネシウム；
（１１）２０ｍＭ  クレアチンリン酸；
（１２）１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％の濃度のポリエチレングリコール；
（３）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、
該ポリエチレングリコールが増幅を刺激する、方法。
【請求項２９】
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌ  ｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）３００〜１０００ｎｇ／μｌ  ｇｐ３２；
（３）１０〜５０ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）５０〜５００μＭ  ｄＮＴＰ；
（５）０．１〜１０ｍＭ  ＤＴＴ；
（６）３ｍＭのＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌ  ｕｖｓＹ；
（８）５０〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０〜１０００ｎＭの第２のプライマー；
（９）４０〜１６０ｍＭ  酢酸カリウム；
（１０）５〜２０ｍＭ  酢酸マグネシウム；
（１１）１０〜４０ｍＭ  クレアチンリン酸；
（１２）５０〜２００ｎｇ／μｌ  クレアチンキナーゼ；
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％の濃度のポリエチレングリコール；
（３）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、
該ポリエチレングリコールが増幅を刺激する、方法。
【請求項３０】
請求項１に記載のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌ  ｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）３００〜１０００ｎｇ／μｌ  ｇｐ３２；
（３）１０〜５０ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）５０〜５００μＭ  ｄＮＴＰ；
（５）０．１〜１０ｍＭ  ＤＴＴ；
（６）３ｍＭのＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌ  ｕｖｓＹ
（８）５０〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０〜１０００ｎＭの第２のプライマー；
（９）４０〜１６０ｍＭ  酢酸カリウム；
（１０）５〜２０ｍＭ  酢酸マグネシウム；
（１１）１０〜４０ｍＭ  クレアチンリン酸；
（１２）５０〜２００ｎｇ／μｌ  クレアチンキナーゼ；
（１３）１重量％〜１２重量％または１容量％〜１２容量％の濃度のポリエチレングリコール
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含み、
該ポリエチレングリコールが増幅を刺激する、方法。