(57)【要約】  本発明は、豊富な塩基配列バリエーションをもち、大量生産可能で安価な優れたアンチセンス特性をもつアンチセンス核酸を簡単な方法で製造する方法、及びそれらの化粧用組成物または医薬用組成物を提供することを目的とする。  生物由来の核酸原料から、ターゲット遺伝子の少なくとも１部の塩基配列を有するプローブ核酸を使用することにより、アンチセンス特性を示す低分子核酸を高収率で得る方法が見出された。すなわち、本発明は、生物由来の核酸を原料とすることを特徴とするアンチセンス核酸及びその製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来の核酸原料を処理することを特徴とするアンチセンス核酸の製造方法。
【請求項２】
由来となる生物が、微生物又は動植物である請求項１記載のアンチセンス核酸の製造方法。
【請求項３】
生物由来の核酸を細断して１本鎖化したものを、ターゲット遺伝子の少なくとも一部の塩基配列を有するプローブ核酸と接着させ、該接着核酸を未接着核酸と分離した後、プローブ核酸より接着した１本鎖核酸をはがして回収することを特徴とする請求項１又は２記載のアンチセンス核酸の製造方法。
【請求項４】
少なくとも上記接着核酸を分離する工程において、プローブ核酸が担体に固定化されていることを特徴とする請求項３記載のアンチセンス核酸の製造方法。
【請求項５】
上記接着核酸を分離および／または回収する工程において、限外ろ過膜を使用することを特徴とする請求項３記載のアンチセンス核酸の製造方法。
【請求項６】
下記の（ａ）〜（ｄ）の工程からなる請求項５記載のアンチセンス核酸の製造方法：
（ａ）生物由来の核酸を細断して、分画する工程、
（ｂ）分画核酸断片を、１本鎖化してプローブ核酸と接着させる工程、
（ｃ）限外ろ過膜を用いて未接着核酸を分離除去する工程、
（ｄ）プローブ核酸より１本鎖核酸断片をはがし、限外ろ過膜を用いて回収する工程。
【請求項７】
分離および回収する工程において使用する限外ろ過膜の排除分子量より大きな分子量を有するプローブ核酸を利用して、工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し実施することを特徴とする請求項６記載のアンチセンス核酸の製造方法。
【請求項８】
生物由来であることを特徴とするアンチセンス核酸。
【請求項９】
由来となる生物が、微生物または動植物である請求項８記載のアンチセンス核酸。
【請求項１０】
核酸の種類に分布幅を有するアンチセンス核酸。
【請求項１１】
請求項３記載の製造方法によって得られるアンチセンス核酸。
【請求項１２】
アンチセンス核酸が、メラニン合成経路関連遺伝子、皺形成関連遺伝子、加齢関連遺伝子、育毛関連遺伝子、又はガン関連遺伝子にハイブリダイズする核酸である請求項８〜１１いずれか１項記載のアンチセンス核酸。
【請求項１３】
ヒトチロシナーゼ遺伝子又はヒトＭＭＰ−１遺伝子にハイブリダイズする核酸である請求項１２記載のアンチセンス核酸。
【請求項１４】
請求項８〜１３いずれか１項記載のアンチセンス核酸を有効成分として含有する化粧用組成物又は皮膚外用剤。
【請求項１５】
請求項８〜１３いずれか１項記載のアンチセンス核酸を有効成分として含有する医薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来の核酸を原料とするアンチセンス核酸とその製造方法に関する。また本発明は、これらの生物由来のアンチセンス核酸を含有する化粧用組成物、皮膚外用剤または医薬用組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトにより、ヒトゲノムＤＮＡを構成する塩基配列が明らかにされた現在、遺伝子の効果的なノックアウト法の開発は多くの難治性疾患の治療、健康や美容などのより身近な分野での利用につながることが期待される。その中、アンチセンス核酸は、遺伝子の働きを阻害する物質として、生物学や医学の分野でその有用性が注目されている。【０００３】
その技術は、ある特定のターゲット遺伝子に対し、その遺伝子の塩基配列情報を基にアンチセンス核酸を設計、人工的に合成し、そしてこれを生体内に入れ、その遺伝子の作用のみを抑えるものである。それ故、ある遺伝子の機能を調べたり、病気の原因となる特定タンパク質の生産を阻害するのに利用できる。いうまでもなく、この技術は生化学や分子生物学の研究に利用され、後者では医薬開発などへとつながっていく。【０００４】
特にアンチセンス核酸医薬は遺伝子治療薬などとともに、２１世紀の新しいタイプの医薬として期待されており、近年では、このアンチセンス核酸を美白化粧品に利用する動きがある（特許文献１）。しかしながら、このように医薬、化粧品に利用するためには、その有効成分であるアンチセンス核酸を核酸合成機で多量に化学合成せねばならず、製品に添加する量を得るためには膨大なコストを要するものである。また得られた合成アンチセンス核酸は、化学合成であるため安全性についての知見が少ないことがヒトに利用する場合の障害となっていた。【０００５】
また、このアンチセンス核酸においては、目的の遺伝子またはその転写RNAにハイブリダイズしてその遺伝子の発現を阻害する効果（アンチセンス効果）を有することがまず必要であるが、そのようなアンチセンス効果を有する核酸を調製するための手法としては、数多くの合成したアンチセンス核酸を用いて実験的により効果の高いものを選択するか（非特許文献１，２）、もしくはある一定のアルゴリズムに従い、実験を行わずにアンチセンス効果のある塩基配列を予測し合成する方法が挙げられる（非特許文献３）。【０００６】
しかし、前者では、対象となる遺伝子に相補的な部分配列を調製し、その配列がアンチセンス効果を有するか否かを、目的の遺伝子について実際に実験を行って調べなければならず、時間、費用および手間がかかり、また後者ではあらゆる場面に見合った万能型の法則が発見されていないのが事実である。そこで、安全、安価、より確実に遺伝子発現を抑えることのできるアンチセンス核酸を生産する方法が求められていた。
【特許文献１】特表２００３−５２１９２９
【非特許文献１】K. R. Blake等, Biochemistry 24 巻 6132-6138頁 1985 年
【非特許文献２】E. Uhlmann, A. Peyman, Chemical Reviews 90巻 543-584頁 1990 年
【非特許文献３】R. A. Stull等, Nucleic Acids Research 20 巻 3501-3508 1992 年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、豊富な塩基配列バリエーションをもち、大量生産可能で安価な優れたアンチセンス効果（アンチセンス特性）をもつアンチセンス核酸を簡単な方法で製造する方法、及びそれらを含有する化粧用組成物、皮膚外用剤または医薬用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、大量生産可能で安価な、優れたアンチセンス特性をもつアンチセンス核酸を簡単な方法で製造する方法を可能にすべく鋭意研究を重ねた結果、生物由来の核酸原料から、簡便な操作で、アンチセンス特性を示す低分子核酸を高収率で得る方法を見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］  生物由来の核酸原料を処理することを特徴とするアンチセンス核酸の製造方法。
［２］  由来となる生物が、微生物又は動植物である［１］のアンチセンス核酸の製造方法。
［３］  生物由来の核酸を細断して１本鎖化したものを、ターゲット遺伝子の少なくとも一部の塩基配列を有するプローブ核酸と接着させ、該接着核酸を未接着核酸と分離した後、プローブ核酸より接着した１本鎖核酸をはがして回収することを特徴とする［１］又は［２］のアンチセンス核酸の製造方法。
［４］  少なくとも上記接着核酸を分離する工程において、プローブ核酸が担体に固定化されていることを特徴とする［３］のアンチセンス核酸の製造方法。
［５］  分離および／または回収する工程において、限外ろ過膜を使用することを特徴とする［３］のアンチセンス核酸の製造方法。
［６］  下記の（ａ）〜（ｄ）の工程からなる[５]のアンチセンス核酸の製造方法：
（ａ）生物由来の核酸を細断して、分画する工程、
（ｂ）分画核酸断片を、１本鎖化してプローブ核酸と接着させる工程、
（ｃ）限外ろ過膜を用いて未接着核酸を分離除去する工程、
（ｄ）プローブ核酸より１本鎖核酸断片をはがし、限外ろ過膜を用いて回収する工程。
［７］  分離および回収する工程において使用する限外ろ過膜の排除分子量より大きな分子量を有するプローブ核酸を利用して、工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し実施することを特徴とする［６］のアンチセンス核酸の製造方法。
［８］  生物由来であることを特徴とするアンチセンス核酸。
［９］  由来となる生物が、微生物または動植物である［８］のアンチセンス核酸。
［１０］  核酸の種類に分布幅を有するアンチセンス核酸。
［１１］  ［３］の製造方法によって得られるアンチセンス核酸。
［１２］  アンチセンス核酸が、メラニン合成経路関連遺伝子、皺形成関連遺伝子、加齢関連遺伝子、育毛関連遺伝子、又はガン関連遺伝子にハイブリダイズする核酸である［８］〜［１１］いずれかのアンチセンス核酸。
［１３］  ヒトチロシナーゼ遺伝子又はヒトＭＭＰ−１遺伝子にハイブリダイズする核酸である［１２］のアンチセンス核酸。
［１４］  ［８］〜［１３］いずれかのアンチセンス核酸を有効成分として含有する化粧用組成物又は皮膚外用剤。
［１５］  ［８］〜［１３］いずれかのアンチセンス核酸を有効成分として含有する医薬用組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、豊富な塩基配列バリエーションをもち、大量生産可能で安価な生物由来の核酸を用いて、優れたアンチセンス特性をもつアンチセンス核酸を簡単な方法で製造することができ、得られた生物由来のアンチセンス核酸の化粧用組成物または医薬用組成物としての利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のアンチセンス核酸のＭＭＰ-１阻害効果（ウエスタンブロッティング結果）
【図２】本発明のアンチセンス核酸のＨＰＬＣクロマトパターン
【符号の説明】
【００１２】
１：陰性コントロール
２：h-MMP1-antiDNA
３：h-MMP1-oligo
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明でいうアンチセンス核酸とは、５〜１００塩基程度の長さの１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸の集団のことで、美容、病気等に関係するある特定遺伝子の発現を、選択的に、その転写段階のＲＮＡにアニ−ル（接着）するなどして、タンパク質の翻訳段階を阻害することを目的とする核酸のことである。従来、アンチセンス核酸は、人工的に合成したものが使用されていたが、本発明では、生物由来の核酸を原料として、目的とするアンチセンス核酸を製造することを主眼とする。本発明において、得られる生物由来のアンチセンス核酸は、５〜１００塩基、好ましくは１０〜５０塩基の長さである。【００１４】
本発明において、アンチセンス核酸は生物由来の核酸を原料として得られるものであればその製造方法は特に限定されないが、好ましくは以下の段階を経て製造される：
（１）生物由来の核酸原料を細断し、必要に応じて１本鎖化する工程、
（２）１本鎖化核酸断片とプローブ核酸とを接着させる工程、
（３）プローブ核酸と接着した１本鎖核酸断片を分離する工程、
（４）分離したアンチセンス核酸を回収する工程。【００１５】
以下それらの工程について詳細に説明するが、本発明は下記方法に限定されるものではない。【００１６】
（１）生物由来の核酸原料の細断し、必要に応じて１本鎖化する工程
本発明のアンチセンス核酸は、生物由来の核酸を原料とする。生物としては、微生物又は動植物が例示される。微生物のうち、真核生物としては、例えば、鞭毛菌類、接合菌類、不完全菌類（例えばカビ類）、担子菌類（例えばキノコ類）、酵母などが、原核生物としては、例えば、好気性細菌、嫌気性細菌などの細菌類、放線菌、古細菌類、ラン藻類などが挙げられる。動植物としては、例えば、動物としては哺乳類、爬虫類、両性類、鳥類、魚類が挙げられ、植物としては、例えば、変形菌植物、真菌植物、紅藻植物、褐藻植物、コケ植物、シダ植物、裸子植物、被子植物が挙げられる。【００１７】
これら由来となる生物は、例えば人工的に遺伝子組み換えされたものであっても構わないが、安全性の観点から天然生物であるのが好ましく、中でも比較的大量に入手でき、食経験があるなど人体にやさしいものがより好まれる。そのようなものとして、特に限定はないが、魚類のサケ白子由来の核酸（ＤＮＡ）が相当する。【００１８】
また生物由来のプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡなど核外ＤＮＡも核酸原料として利用可能である。プラスミドＤＮＡとしては、特に限定はないが、大腸菌で複製可能なpUC系、pBR系などが挙げられ、ファージＤＮＡとしては、特に限定はないが、ラムダファージ、φＸ１７４などが挙げられる。また、これら原料となる核酸は１本鎖であっても、２本鎖であっても構わない。さらには、データベース上の核酸配列情報を利用し、目的のアンチセンス効果を示すと思われる配列が多く含まれる生物種を選び出すことも可能である。【００１９】
本発明においては、上述したような生物由来の核酸を、アンチセンスとしての効果の点から、好ましくは２〜２００塩基、より好ましくは５〜１００塩基、さらに好ましくは１０〜５０塩基前後の長さの核酸集団が多く含まれるように細断する。切断は物理的切断でも、酵素による切断でも、化学的切断でも構わない。物理的切断としては、特に制限はないが、水、空気、摩擦など物理的な圧力によるもの、氷、超音波によるものなどが挙げられる。酵素による切断としては、核酸を切断できる酵素であれば、特に制限はないが、大腸菌など様々な生物由来のDeoxyribonucleas I（DNase I）や制限酵素などが挙げられる。また、これらの物理的、酵素学的、化学的切断を組み合わせて細断することも可能である。【００２０】
さらに、上記細断した核酸を分画することによって、核酸断片の大きさをそろえてもよい。分画方法は特に制限されないが、操作性や処理量の観点から、限外ろ過膜等で処理する方法が好ましい。排除分子量２０００程度の限外ろ過膜で処理することによって、５塩基未満の短い核酸を除去し、また、排除分子量１５０００〜３００００程度の限外ろ過膜を使用することで、数１００塩基以上の長い不要な核酸を除去することができる。これらを組み合わせることで、例えば、分子量が、２０００〜１５０００、２０００〜２００００、または２０００〜３００００などといった、長さのある程度揃った、好ましい核酸集団に分画することができる。なお本明細書でいう限外ろ過膜としては、通常の限外ろ過用フィルターだけでなく、いわゆる透析膜のようなものも含まれる。【００２１】
次に、原料である生物由来核酸が２本鎖の場合、これら細断した核酸を、熱やアルカリ処理などの公知の方法を用いて１本鎖に解離させる。限外ろ過膜で核酸断片の大きさを揃える場合、１本鎖への解離工程は、限外ろ過による分画の前でも後でも、また分画と同時に行ってもよい。あるいは、後述するプローブ核酸との接着工程において、１本鎖に解離させると同時に接着を行ってもよい。その場合、２本鎖の核酸断片集団をプローブ核酸と接触／混合させ、その反応系で、１本鎖への解離と接着を引き続いて実施することになるが、それも本発明の製造方法の好ましい一態様である。【００２２】
（２）１本鎖化核酸断片とプローブ核酸とを接着させる工程
本発明においては、上記得られた核酸断片の集団より、プローブ核酸を利用することで、目的となるアンチセンス核酸を配列特異的に分離するのが好ましい。本発明における「プローブ核酸」とは、ターゲットとなる遺伝子（作用を阻害したい遺伝子）のセンス鎖の少なくとも一部の塩基配列を有する１本鎖核酸である。該プローブ核酸を用いることで、目的のアンチセンス核酸だけがプローブ核酸とアニーリング（接着）するという性質を利用して、（１）で得られた核酸断片の集団からターゲットとなる遺伝子の作用を抑えるためのアンチセンス核酸を分離できる。【００２３】
本発明のアンチセンス核酸のターゲットとなる遺伝子（ターゲット遺伝子）は、美容、病気等に関するものであれば、特に制限されず、その目的に応じて適宜選択することができる。具体例としては、メラニン合成・輸送関連遺伝子群（メラニン合成経路関連遺伝子群）、皺形成関連遺伝子群、加齢関連遺伝子群、育毛・脱毛関連遺伝子群、ガン関連遺伝子群等やその他後述するような遺伝子が挙げられる。またターゲット遺伝子として上述したような遺伝子のうち２種以上の遺伝子を組み合わせて選択することも可能である。【００２４】
メラニン合成経路関連遺伝子群としては、例えば、チロシナーゼ、trp-1、trp-2やメラノサイトの発生や分化に関わる遺伝子、例えば、神経堤細胞からメラノサイトに分化する際のマスター遺伝子であるpax3、sox10、MITFなどもターゲットとなりうる。またターゲットとしては、それらの遺伝子を直接ターゲットとしても、それらの遺伝子の発現を制御している遺伝子をターゲットとしても、さらにはそれらの遺伝子産物の成熟、例えば糖鎖の付加や切断に関与する遺伝子をターゲットとしてもよい。【００２５】
例えば、チロシナーゼ遺伝子、trp-1遺伝子、trp-2遺伝子の発現調節には、MITF-Mが上流のM-boxに結合して亢進することが知られているが、MITF-Mの配列に特異的なアンチセンス核酸を利用することでこれら３つの遺伝子の発現を制御できることが予想される。また個々の遺伝子発現を制御する調節因子の発現系を阻害することも考えられる。例えば、チロシナーゼの発現調節にはメタロチオネインが関与（維持することがプラス）していることが知られているが、この発現阻害または分解に関与しているタンパク質の発現を制御することにより、効果を得ることも可能である。【００２６】
また、メラニン生産に関与するシグナル伝達経路を遮断することも考えられる。例えば、メラノサイト表面のMC1Rレセプターにシグナルα-MSHが結合することでユーメラニン合成が亢進すること、さらにはETRAレセプターにET-1シグナル、c-kitレセプターにSCFシグナルが結合することが知られており、例えば、このα-MSH、ET-1の発現系をアンチセンス核酸で制限することも可能であると考えられる。更に、メラニン輸送に関与する遺伝子群もターゲットとなりうる。メラニンはメラノサイトで産生され、ケラチノサイトへ移行し皮膚へ分配されるが、例えば、この輸送に関与しているPAR2を阻害することにより、メラニンの皮膚表面での沈着が抑制されることが期待できる。【００２７】
皺形成関連遺伝子群としては、例えば、皮膚を支え、はりと弾力性を保つ役割を担っている真皮を構成するコラーゲン、ヒアルロン酸、又はエラスチンを分解するタンパク質をコードする遺伝子、具体的には、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）などのコラゲナーゼ、ヒアルロニターゼ、及びエラスターゼなどの遺伝子が挙げられる。特に膠原線維を形成しているコラーゲンは真皮の約90％を占め、皮膚を支える屋台骨としての機能を果たしており、コラーゲンは加齢とともに減少することが知られていることから、抗皺のターゲットとしては有望であると思われる。【００２８】
加齢関連遺伝子群としては、例えば、テロメラーゼ制御遺伝子群が挙げられる。染色体の末端から延びている一連の核酸をテロメアといい、これは染色体を保護する役目を果たすと同時に、細胞が分裂を繰り返すたびに短くなることから、細胞の寿命を決定していると考えられている。この短くなっていくテロメアを修復してくれるのが再生酵素であるテロメラーゼで、この活性を正常なレベルに保つことができれば、細胞の老化を根本的に防ぐことが予想される。つまりテロメラーゼの活性を制御しているテロメラーゼ制御遺伝子群の発現を、アンチセンス核酸で阻害することで加齢を制御することが期待できる。またガン病巣においては、このテロメラーゼ活性が異常に亢進していることが知られており、テロメラーゼ酵素活性を本発明のアンチセンス核酸で阻害することができれば、ガン治療に役立つことも予想される。【００２９】
育毛・脱毛関連遺伝子群としては、例えば、毛幹の調節タンパク質および／または構造タンパク質をコードするものが挙げられる。毛幹の調節タンパク質又は構造タンパク質の具体的例としては、細胞周期に関与するタンパク質；IGF受容体、T4甲状腺受容体などの抗成長に関係するタンパク質；IL1、IL6、TNFα、MCP1などのサイトカイン類、MMP、ウロキナーゼ、リポキシゲナーゼなど抗損傷に関係するタンパク質；PGF2α、5α還元酵素の分解に関与するタンパク質など再成長に関係するタンパク質；α３β１インテグリン、ベータカテニン、ラミニン10、LEF-1など形態形成に着目した関係するタンパク質；毛幹の形成(カーリングまたはアンカーリングなど)、毛幹の分化に関与するタンパク質(酸性または塩基性毛角質など)；毛幹タンパク質のクロスリンクに関連する酵素（チオール酸化還元酵素、トランスグルタミナーゼ3、トランスグルタミナーゼ5など）などの毛幹の形成に関係するタンパク質；などが挙げられる。【００３０】
中でも５α還元酵素はテストステロンを還元し、その生成産物が毛母細胞の細胞分裂を抑制するということが知られており、この酵素の遺伝子の発現をアンチセンス核酸で阻害することにより育毛効果が狙える。また、アンチセンス核酸により特定の遺伝子発現を阻害することで毛包細胞、毛母細胞、毛乳頭細胞などの毛の生成に関連する細胞の細胞活性を上昇させたり、その細胞周期を調整すること、例えば、休止期を短くする、細胞の自殺（アポトーシス）を防ぐ（自殺酵素カスパーゼの働きを阻害する）などの効果をもたらす場合にも利用することが可能である。また脱毛に関しても、例えば、細胞増殖や分化調節に関与するBone Morphogenetic Protein (BMP)のレセプター遺伝子を不活性化することにより抑制できる可能性がある。【００３１】
ガン関連遺伝子群としては、特に限定はないが、ras等のオンコジーンと呼ばれる癌遺伝子やガン活性化にはたらくとされるc-fos、c-myc等の遺伝子が挙げられる。またウイルスの感染、複製等に関与する遺伝子をターゲットとしたアンチセンス核酸は、抗ウイルス剤としても利用可能である。【００３２】
また、細胞分化または増殖現象に関与している遺伝子も、本発明のアンチセンス核酸のターゲットとして考えられ、具体的には、以下のタンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる：
EGF、TNF-α、TGF、エンドセリン、NGF、HGF、IGF、VEGFなどの成長因子；
IL1、IL6、IL8などの型のサイトカイン；EGFr、TGFr、PAR、PPAR、FXR、RXR、CB1R、CB2R、VR1、CRAB2、u−PAなどの型の受容体；
カルモジュリン、CLPまたはCLSP型のカルシウム結合タンパク質；
S100A8、Sl00A9、S100A7などS100タンパク質ファミリーのカルシウム結合タンパク質；
トランスグルタミナーゼ1、3または5などのトランスグルタミナーゼ；
オクルディン、ラミニン、カベオリン、デスモグレイン、デスモコリン、コルネオデスモシン、プラコグロビン、デスモプラキンなどの細胞間合着／結合を確実にするタンパク質；
ホスファターゼまたはプロテインホスファターゼなどタンパク質の翻訳後修飾に関与する酵素；
カルシニュリン、ホスホリラーゼ、プロテインキナーゼ（例えば、PKC）、グルコシルトランスフェラーゼ、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ；
MMP、1-、2-、3-または9-エラスターゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンEおよびカテプシンDなど）、カテプシンL、BまたはH型のシステインプロテアーゼ、カテプシンL2、SCCL、キモトリプシン等価物、SCCE（カリクレイン7）型のトリプシン様プロテアーゼ、SCTE（カリクレイン5）型のウロキナーゼ、SASPアーゼ、カスパーゼ（特にカスパーゼ14）、カルパイン、フィラグリンの加水分解に関与するサブチリシン様プロタンパク質コンバターゼ型のプロテアーゼ（フューリン、PACE4、PC5/6およびPC7/8など）、膜内外型セリンプロテアーゼファミリーのプロテアーゼ（マトリプターゼなど）などのプロテアーゼ；
へパラナーゼ型ヒアルロニダーゼ、コンドロイチン分解酵素、アスパルチルグルコサミニダーゼ、Bグリコシダーゼ、グリコシダーゼなどの、エキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼ；
HMG-CoA還元酵素、コレステロールスルファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼなどの脂質代謝酵素；
シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ホスホリパーゼ、15-PGDHなどのエイコサノイド代謝酵素；
Ｉ型またはII型5α還元酵素などのホルモン代謝酵素；
エラスチン、コラーゲンなどの型のマトリックスタンパク質；
サイトケラチン型のケラチノサイト分化タンパク質、フィラグリン、水チャネルなどの皮膚の水分補給に関与するタンパク質；
hBD2、hBD3、ダームシディン、リボヌクレアーゼ７などの皮膚の抗菌防御に関与するタンパク質；
リジルオキシダーゼ、リジルヒドロキシラーゼなどの真皮の成熟に関与するタンパク質。【００３３】
その他、ウロキナーゼなどセリンプロテアーゼ遺伝子をターゲットとし、これを本発明のアンチセンス核酸で抑制することができれば、美容的な治療、ならびに乾燥や炎症をおこした皮膚の外見改善に有効であると考えられる。【００３４】
また本発明のアンチセンス核酸では、下記タンパク質の遺伝子をターゲットとすることも可能である。例えば、肌質改善領域における適用として皮脂の合成に関与するタンパク質(HMG-CoA還元酵素、およびスクアレンシンターゼなど)；フケ形成の抑制を目的とする適用として細菌性リパーゼ；毛の喪失を抑制することを目的とする適用としてlox12および/またはcox2および/またはIL1および/またはTGFβ1；発現抑制目的として、異常タンパク質および/またはオリゴペプチド（特にHPVなどのウイルス活性または癌細胞に関係するもの、またはある種の疾患において過剰発現されるもの）；ある種のサイトカイン（例えば、ILl、TNFα-308およびTNFβ+252)、受容体タンパク質(例えば、Toll様受容体、TLR）、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ、細胞接着分子(例えばCDw60)などの増殖に関係するタンパク質；プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼ（角質層キモトリプシン酵素、SCCE）もしくはメタロプロテアーゼ（特に、乾癬に関与するMMP-9およびMMP-19）；カルシウム結合タンパク質（カルモジュリン様セリンプロテアーゼ、CLSP）などである。【００３５】
本発明においては、上述したような遺伝子群のなかから、目的とする用途に応じて、活性を阻害したい対象に関連するターゲット遺伝子を決定し、その塩基配列情報をもとにしてターゲット遺伝子の塩基配列のすべてまたは一部を有するプローブ核酸を作製する。ターゲット遺伝子の一部の配列を利用する場合、通常、ターゲット遺伝子の翻訳開始点上流やその周辺のセンス鎖配列が用いられる。プローブ核酸は、ＤＮＡ合成機などにより人工的に作製される。また、生体よりターゲット遺伝子を分離し、必要に応じて、必要箇所のみ切り出す、増幅するなどの処理を行い、1本鎖化したものを使用してもよい。【００３６】
ターゲット遺伝子の一部の塩基配列を利用する場合のその塩基配列の長さは特に限定されないが、好ましくは２〜３００塩基、より好ましくは５〜２００塩基、さらに好ましくは１０〜１００塩基である。プローブ核酸を合成する場合の調製方法は、例えば、ＡＢＩ(Applied Biosystems Inc.)社製のＤＮＡ合成機もしくはＤＮＡ／ＲＮＡ合成機、又はパーセプティブ社製核酸自動合成機などを用いて、ホスホロアミダイト法（ABI社の手順書又はF. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press, 1991年参照）により行うことができる。またこれらの合成DNAをプライマーとして用いてPCR（polymerase chain reaction）により所望の長さの核酸を合成することも可能である。またこのプローブ核酸は、１本鎖ＤＮＡ分解酵素による劣化を防ぐための処理を施したものを使うことも可能である。例えば、リン酸結合部位をチオエステル化したものも利用することもできる。【００３７】
得られたプローブ核酸の粗製物は、通常の精製方法、例えば、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーの原理に基づく高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、超臨界クロマトグラフィー等種々のクロマトグラフィー、エタノール沈澱法及び電気泳動法などを用いて精製される。このほか、逆相クロマトグラフィーの原理に基づいて製造されたカートリッジ（例えば、tC18を充填剤とするセップパックプラス（ロングボディ/ENV）；パーセプティブ社製）等を用いても精製される。なお、その純度は、HPLCやキャピラリー電気泳動法による分析により調べることができる。【００３８】
次に上記プローブ核酸と、（１）で得られた核酸断片の集団に含まれる目的の１本鎖核酸（アンチセンス核酸）とをアニール（接着）させる。プローブ核酸と１本鎖核酸断片とをアニールさせる方法としては、特に制限はなく公知の物理的方法又は化学的方法を用いることができる。【００３９】
例えば、物理的方法として、プローブ核酸と１本鎖核酸断片とを混合した上で、プローブ核酸のＴｍ値付近又はそれ以下の温度条件でアニーリングする方法が一般的である。またこのアニーリングの際の温度を調整することにより、得られるアンチセンス核酸の配列特異性の度合いを調整することも可能である。例えば、より高い温度、つまりプローブ核酸のＴｍ値付近の温度でアニーリングさせた場合は、よりプローブ核酸の塩基配列に準じた相同性の高い塩基配列のアンチセンス核酸がアニールしやすく、また、より低い温度、つまりプローブ核酸のＴｍ値よりも低い温度でアニーリングさせた場合は、よりプローブ核酸の塩基配列と相同性の低い塩基配列のものもアニールしやすい。その場合、得られるアンチセンス核酸の、アンチセンス効果が低い可能性が考えられるが、アニールする断片が多くなるため収量が得やすくなる。また、同一反応系でアニールする温度を段階的に変化させることで、特異性と収量を共に得やすくすることも可能である。【００４０】
また、前述の通り、（１）で２本鎖の核酸断片集団を調製しておき、本工程の反応系中で１本鎖への解離とプローブ核酸とのアニーリングを連続して行うことが好ましい。具体的には、加熱処理（例えば９０℃以上、好ましくは９４℃以上、より好ましくは１００℃以上）することで２本鎖を１本鎖に解離させ、その後、プローブ核酸のＴｍ値以下の温度でプローブ核酸と反応させることでアニーリングを実施する。その場合、核酸断片とプローブ核酸との混合は、核酸断片の１本鎖への解離工程の前で後でもかまわない。【００４１】
また、化学的方法として、（１）において２本鎖の核酸断片を0.01Ｎ〜1Ｎ程度の水酸化ナトリウム溶液などのアルカリで処理することで１本鎖にした場合には、プローブ核酸との混合後、中性または酸性条件にすることでプローブ核酸と目的のアンチセンス核酸とをアニーリングすることが可能である。【００４２】
また、あるプローブ核酸にアニールしない核酸断片については、他のプローブ核酸での分離の際に再度用いることも可能である。【００４３】
（３）プローブ核酸と接着した１本鎖核酸断片を分離する工程
次にアニーリング反応後の核酸集団より、プローブ核酸とそれに接着した目的のアンチセンス核酸を分離する。本発明においては、その方法として、（Ａ）担体固定化法と（Ｂ）限外ろ過膜法の２通りの方法がある。以下、これらそれぞれの方法について詳細に説明する。【００４４】
（３−Ａ）担体固定化法による１本鎖核酸断片の分離
担体固定化法においては、（２）の１本鎖核酸断片とプローブ核酸との接着工程の前かそのあとに、プローブ核酸を、それを固定化しうる担体に固定する。プローブ核酸を担体に固定する方法としては、特に制限はないが、プローブ核酸の合成段階であらかじめ５’もしくは３’末端に特殊なラベルを入れておき、それを介して担体に付着させる方法が可能である。例えば、プローブ核酸の５’末端をビオチンでラベルしておき、これを担体上のストレプトアビジンに結合させる方法が挙げられる。また、担体をエポキシ化、カルボキシル化、シアノジェンブロマイド化して、プローブ核酸が結合できる形としてもよい。もしくは合成段階で特定の担体上にプローブ核酸を直接合成してもよい。【００４５】
ここで用いられる担体としては、核酸を固定できる一般的に使用されている担体であれば、特に限定はないが、例えば、磁性を帯びた磁性担体、ガラス担体、トーヨーパール（東ソー社製）やシリカゲルなどの化学合成担体が挙げられ、好ましくは磁性担体や陰イオン吸着性を持った担体が使用される。【００４６】
担体として磁性担体を用いた場合、磁性担体に固定化したプローブ核酸とそれに接着した１本鎖核酸断片は、磁力を利用することで、容易に未接着の核酸断片より分離できる。また、担体として磁性担体以外のその他の担体を使用した場合は、例えば、ろ過やカラムなどを用いて、担体とそれに固定化したプローブ核酸及び接着した１本鎖核酸断片と、未接着の核酸断片とを分離できる。これら分離工程においては、適宜、洗浄操作を繰り返すことで、未接着の核酸断片を完全に取り除くことが可能である。【００４７】
（３−Ｂ）限外ろ過膜法による１本鎖核酸断片の分離
限外ろ過膜法では、分子量の違いによって分離が可能な限外ろ過膜の性質を利用して、プローブ核酸およびそれに接着した目的の１本鎖核酸と、未接着の１本鎖核酸断片とを分離する。その詳細な方法としては例えば以下に説明する方法が挙げられる。【００４８】
まず、（１）の工程において核酸断片の集団を得るが、ここで、上述したように限外ろ過膜を使用して、その核酸断片の分子量、特にその上限を揃えておく。例えば、排除分子量がＸの限外ろ過膜を使用して、それを通過する、すなわち分子量の上限がＸの核酸集団を調製しておく。次にプローブ核酸を準備するが、ここでプローブ核酸としては、ターゲット遺伝子中の切り出す塩基配列の長さを調整するか、特定の塩基配列を繰り返すなどして、その分子量がＸよりも大きくなるようにしておく。このプローブ核酸と、核酸断片の集団とをアニーリングさせると、プローブ核酸とそれに接着した１本鎖核酸断片の分子量はかならずＸ以上となるため、先の排除分子量がＸの限外ろ過膜を使用することで、分子量がＸ以下の非接着核酸断片と分離できる。ここで選択する限外ろ過膜の排除分子量Ｘは、得たいアンチセンス核酸の長さに応じて適宜選択しうるが、好ましくは１５０００〜３００００の範囲で設定しうる。【００４９】
もちろん上記方法に限定されず、限外ろ過膜法においては、プローブ核酸やそれに接着した核酸断片と、未接着の核酸断片との分子量の違いを応用した他の方法であっても構わない。【００５０】
上記担体固定化法と限外ろ過膜法とは、その目的に応じてどちらをも適宜選択しうる。例えば、工程数や作業時間という点では担体固定化法の方が少なくてすむが（核酸断片の分子量を揃える必要がない、磁性担体を使用すれば分離操作は５分程度）、回収率の点や工業的に安価に生産できるという点では限外ろ過膜法の方が優位である。【００５１】
（４）分離したアンチセンス核酸を回収する工程
非接着核酸と分離したアンチセンス核酸を、プローブ核酸よりはがして回収するためには、公知の物理的方法や化学的方法を用いることができる。物理的方法については、例えば熱処理、化学的方法については、水酸化ナトリウム溶液を用いるなどしてｐＨを変化させることなどが挙げられるが、これらに限定されない。【００５２】
担体固定化法の場合、上記プローブ核酸よりはがれた（解離した）１本鎖核酸は、上述の担体と未接着核酸断片との分離方法と同様の方法で回収できる。例えば、磁性担体を使用した場合は、磁性担体とそれに固定化したプローブ核酸は磁力により分離除去でき、目的のアンチセンス核酸のみを回収することができる。非磁性担体の場合は、ろ過やカラムを用いることで分離可能である。ここでカラムを使用する場合、例えば、（３）の分離工程で非接着核酸断片を洗浄除去した後、カラム中で上記物理的または化学的処理を行うことで、アンチセンス核酸を担体に固定化されたプローブ核酸よりはがし、カラムより流出させることで目的のアンチセンス核酸のみを回収することもできる。【００５３】
一方、限外ろ過膜法の場合、プローブ核酸とそれに接着した１本鎖核酸断片に、上記物理的または化学的処理を行い、その後解離した目的のアンチセンス核酸を公知の方法で回収することができる。例えば、該回収工程においても限外ろ過膜を使用してもよい。好ましくは、（３）において分子量がＸより大きいプローブ核酸を使用した場合、プローブ核酸と目的のアンチセンス核酸とは、限外排除分子量がＸの限外ろ過膜を使用することで分離回収が可能である。より好ましくは、（３）で非接着核酸を洗浄後、限外ろ過膜の装置中のプローブ核酸とそれに接着した１本鎖核酸断片を、そのまま、物理的処理または化学的処理を行って、プローブ核酸よりアンチセンス核酸をはがすと、解離したアンチセンス核酸は限外ろ過膜の外部に流出するためそのまま回収することができる。【００５４】
ここで、アンチセンス核酸をはがして回収した後のプローブ核酸は、そのまま繰り返し（２）〜（４）において利用することが可能である。つまりは、化学合成して得られる高価な少量のプローブ核酸を繰り返し利用することで、生物由来の大量の核酸を処理し、多くのアンチセンス核酸を安価に得ることも可能である。【００５５】
このようにして得られるアンチセンス核酸は、プローブ核酸に使用した塩基配列を有するターゲット遺伝子の転写段階のＲＮＡのみならず、該遺伝子自体ともハイブリダイズする性質を有する。その場合のハイブリダイズ条件としては特に限定されず、上記プローブ核酸に使用する塩基配列の選定や、接着工程の条件等によってアンチセンス核酸とターゲット遺伝子との最適ハイブリダイズ条件は変わってくる。但し、ターゲット遺伝子とストリンジェントな条件においてもハイブリダイズするアンチセンス核酸が、アンチセンス能力に優れているのはいうまでもない。【００５６】
生物由来の核酸を原料とする本発明のアンチセンス核酸は、化学合成して得られるアンチセンス核酸と異なり、多種多様の塩基配列からなる核酸断片からなり、本発明のアンチセンス核酸を、イオン交換カラム、ゲルろ過カラムなどを用いてそのイオン強度や分子量などの諸性質で分画できる条件で分析すると、複数の連続する大きさの核酸の存在を表すバンドパターンを示し、核酸の種類に分布幅を有することがわかる。【００５７】
このときのイオン交換カラムとしては、例えば、陰イオン交換カラムならジエチルアミノエチル（DEAE）、クオータナリーアミノエチル（QAE）、クオータナリーアンモニウム（Q）などが、陽イオン交換カラムならカルボキシメチル（CM）、スルホプロピル（SP）、メチルスルホネート（S）などが、ゲルろ過カラムとしては、セファデックス、セファクリル、スーパーロースなどの担体によるものなどが挙げられる。また、本発明のアンチセンス核酸は、全ての画分において、多かれ少なかれ所望の阻害効果を発揮することができるが、上述したようなカラムを使用して、より効果の高いアンチセンス核酸分画を分取して純度を上げることも可能である。【００５８】
以上のようにして調製された本発明のアンチセンス核酸は、そのままでも遺伝子阻害剤として利用できるが、水、エタノール等の極性溶媒に溶解又は懸濁したり、乳剤、クリーム、ゲル、軟膏等の基剤に分散して遺伝子阻害剤とすることもできる。【００５９】
さらに上述した遺伝子阻害剤には、活性酸素消去剤、抗炎症剤、抗がん剤、美白剤、皮膚細胞賦活剤、殺菌剤等の生理活性成分の他、油類、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、粉体、香料、防腐剤等の一般的な医薬品及び化粧料用原料をも含有させることができる。【００６０】
なお、本発明のアンチセンス核酸は、核酸より構成されるため、それ単独でも核酸がもともと有する紫外線吸収、保湿効果も期待される。【００６１】
また本発明においては、上記のようにして得たアンチセンス核酸を外用剤基剤に含有させて皮膚外用剤や化粧用組成物とすることもできる。皮膚外用剤や化粧用組成物としては、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、スプレー剤等の剤型で提供することができ、る。さらに化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、乳液状、クリーム状或いは軟膏型のファンデーション、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧料やその他皮膚外用剤などとしても提供することができる。また、油類、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、顔料、香料、防腐剤等の一般的な医薬品及び化粧料用原料や、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤、しわ改善剤、皮膚細胞賦活剤等の生理活性成分も含有させることができる。【００６２】
本発明のアンチセンス核酸は、それを主成分として含有する医薬組成物としても使用できる。その場合、主薬が患部の細胞または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような製剤であれば特に限定されるものではなく、アンチセンス核酸単独で、もしくは慣用の担体と混合して、上述したような皮膚外用剤などの外用の形やその他非経口投与、あるいは経口投与の形で投与される。【００６３】
本発明の手法を用いて、特に食経験のある天然の核酸源からアンチセンス核酸を製造した場合、経口で摂取する場合にも安全性が高く好ましい。経口摂取した場合、口腔内、のど、胃、腸（小腸、大腸など）、肛門の上皮粘膜、もしくはその下部組織での作用が考えられる。【００６４】
これらの医薬組成物は、溶液、懸濁液、シロップ、リポソーム製剤、乳剤等の液体の投与形態であってもよいし、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤などの固形の投与形態であってもよい。必要に応じ、上記製剤には各種の担体、助剤、安定剤、潤滑剤、その他一般に使用される添加剤、例えば乳糖、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白陶土、蔗糖、コーンスターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、落下生油、オリーブ油、カカオバター、エチレングリコールなどを添加することができる。【００６５】
本発明のアンチセンス核酸を用いる場合、その好ましい製剤の一態様として、一般の遺伝子導入法で用いられる形態、例えばセンダイウイルス等を用いた膜融合リポソーム製剤やエンドサイトーシスを利用するリポソーム製剤等のリポソーム製剤、リポフェクトアミン（ライフテックオリエンタル社製）等のカチオン性脂質を含有する製剤、リン酸カルシウムとポリエチレングリコールを組み合わせた製剤またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等を用いるウイルス製剤を用いるのが有利であり、特に膜融合リポソーム製剤の形で用いることができる。【００６６】
また通常のドラッグデリバリーシステム（DDS）に利用されている製剤技術も、本発明のアンチセンス核酸に応用可能である。その場合、例えば、PLA（乳酸重合体）、PLGA（乳酸・グリコール酸共重合体）などをその製剤基材として使用できる。このDDS技術を使ったターゲティング、徐放の技術も使用可能である。【００６７】
リポソーム製剤の場合、そのリポソームの構造体が、大きな１枚膜リポソーム（ＬＵＶ）、多重層リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）のいずれであってもよい。その大きさも、ＬＵＶでは２００から１０００ｎｍ、ＭＬＶでは４００から３５００ｎｍ、ＳＵＶでは２０から５０ｎｍ程度の粒子系をとり得るが、センダイウイルス等を用いる膜融合リポソーム製剤の場合は粒子系２００から１０００ｎｍのＭＬＶを用いるのが好ましい。【００６８】
リポソームの製造方法は、本発明のアンチセンス核酸が保持されるものであれば特に限定されるものではなく、慣用の方法、例えば逆相蒸発法（Szoka, F.ら：Biochim. Biophys. Acta, Vol.601, 559 (1980)）、エーテル注入法（Deamer, D. W.：Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol.308, 250 (1978)）、界面活性剤法（Brunner, J.ら：Biochim. Biophys. Acta, Vol.455, 322 (1976)）等を用いて製造することができる。【００６９】
リポソーム構造を形成するための脂質としてはリン脂質、コレステロール類や窒素脂質等が用いられるが、一般的にはリン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを常法によって水素添加したものの他、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質等を使用することができる。【００７０】
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることもできるが、２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内に持つものを用いることにより、電気的に陰性なアンチセンス核酸の結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に、一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。【００７１】
このようにして得られるリポソームは患部の細胞または目的とする組織の細胞内に取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えばセンダイウイルス、不活化センダイウイルス、センダイウイルスより精製された膜融合促進蛋白質、ポリエチレングリコール等を加えることができる。【００７２】
リポソーム製剤の製造法の例を具体的に説明すると、たとえば前記したリポソーム形成物質を、コレステロール等と共に、テトラヒドロフラン、クロロホルム、エタノール等の有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリポソーム形成物質の膜を形成する。これにアンチセンス核酸を含有する緩衝液を加えて撹拌し、得られたリポソームにさらに所望により前記した膜融合促進物質を加えた後、リポソームを単離する。このようにして得られるアンチセンス核酸を含有するリポソームは適当な溶媒中に懸濁させるか、或いはいったん凍結乾燥したものを適当な溶媒に再分散させて治療に用いることができる。膜融合促進物質はリポソーム単離後、使用までの間に加えてもよい。【００７３】
さらに本発明のアンチセンス核酸は、通常の化学合成アンチセンス核酸と同様に、微生物や植物、動物などの研究の材料として使用することも可能である。【００７４】
上記説明においては、アンチセンス核酸としてアンチセンスＤＮＡの場合を中心に説明したが、生物由来のＲＮＡを核酸材料として用いれば、アンチセンスＲＮＡも同様に製造することができる。【００７５】
また本発明のアンチセンス核酸の製造方法を応用することで、１本鎖であるアンチセンス核酸のみならず、２本鎖ＤＮＡであるデコイ核酸や２本鎖ＲＮＡであるsiRNAも生産することができる。デコイ核酸とは、転写因子が標的遺伝子に結合することを防ぎ、転写段階での阻害を目的とする核酸のことである。上述したようにして生物由来の核酸からアンチセンス側の１本鎖ＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ：本発明のアンチセンス核酸）を製造し、さらにセンス側の１本鎖ＤＮＡ（センスＤＮＡ）を本発明の製造方法を応用して（プローブ核酸としてターゲット遺伝子のアンチセンス側の塩基配列を持つ核酸を使用する）製造し、それらをアニール（接着）させることでデコイ核酸が製造できる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００７７】
（実施例１）プローブ核酸（マウスメラノーマ評価用）の合成
本実施例で用いた全ての合成核酸は、シグマジェノシス社により合成されたものを使用した。【００７８】
マウスのメラニン合成経路を構成する遺伝子であるチロシナーゼ遺伝子、ｔｒｐ−１遺伝子に対するアンチセンス核酸を調製するために、それぞれ下記のプローブ核酸を合成した。配列番号１は、マウス由来のチロシナーゼのｍＲＮＡ配列（Genbank登録番号：NM#011661）のセンス配列の翻訳開始点の５１塩基上流から４塩基上流までの４８塩基であり、これの５'末端にビオチンを付加して合成したプローブ核酸をbio-m-Tyrと命名した。また、配列番号２は、マウス由来のＴｒｐ−１のｍＲＮＡ配列（Genbank登録番号：NM#031202）のセンス配列の５０塩基上流から３塩基上流までの４８塩基であり、これの５'末端にビオチンを付加して合成したプローブ核酸をbio-m-Trpと命名した。また、ネガティブコントロールとして、配列番号１の塩基配列をA、T、G、C含量を同じにしてランダムに並び替えた塩基配列の核酸（配列番号３）の５'末端をビオチン化したプローブ核酸も合成し、Sh-bio-m-Tyrと命名した。また、コントロールとして、マウスのチロシナーゼ遺伝子、及びtrp-1遺伝子に対するアンチセンス作用を示すと推測される合成１本鎖核酸（化学合成アンチセンス核酸）を作製し、これらをm-Tyr-oligo（配列番号４）、m-Trp-oligo（配列番号５）と命名した。なお、これらはそれぞれの遺伝子の翻訳開始点から４７塩基上流から２８塩基上流まで、３８塩基上流から１９塩基上流までの２０塩基の長さのものである。【００７９】
（実施例２）アンチセンス核酸の取得
（１）サケ白子由来ＤＮＡの切断
サケ白子由来のＤＮＡ−Ｎａ（ニチロ社製）５％（ｗ／ｖ）溶液２．８ｍｌに、０．２ｍｇ／ｍｌのDNaseＩ（アマシャム・バイオサイエンス社製）０．４ｍｌ、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ2を０．４ｍｌ、１０×DNaseＩ緩衝液（１００ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、１ｍＭＣａＣｌ2）を０．４ｍｌ添加後、３７℃で１０分間保温した。その後、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール溶液（ナカライ社製）を約４ｍｌ添加して、１７，８００×ｇ、１０分間遠心して、約４ｍｌの上清を回収した。これにあらかじめ冷やしておいた１００％エタノールを８ｍｌ、２．５Ｍ酢酸アンモニウムを２ｍｌ加え、−２０℃で約２時間放置した。１７，８００×ｇ、１０分間遠心し、得られた沈殿に対して７０％エタノールを加えて、さらに１７，８００×ｇ、５分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿を遠心エバポレーターで乾燥させ、１．８ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液pH８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で沈殿を溶解し、これを核酸断片溶液とした。【００８０】
（２）ＤＮＡの分画
（１）で調製した核酸断片溶液を１ｍＭになるように調製したものを１００μｌ分と、実施例１で合成した３つのプローブ核酸（bio-m-Tyr、bio-m-Trp、Sh-bio-m-Tyr）とを、それぞれ０．５ｍｌのＰＣＲ用チューブにいれ、ＰＣＲ用サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステムズ社製）にセットし、９５℃、５分間→８５℃、２分間→７５℃、１分間→６５℃、１分間→５５℃、１分間→４５℃、１分間、その後４℃で保持して、核酸断片の１本鎖への解離を行うと同時に、プローブ核酸とハイブリダイズさせた。【００８１】
５００μｌ分の磁性担体（Megacell-Streptavidin、CORTEX BIOSYSTEM社製）を１ＸＢ／Ｗ緩衝液５００μlで洗浄し、磁性担体のみを回収用磁石（プロメガ社製）で回収した（これを洗浄操作とする）。この洗浄操作を3回繰り返した後、５００μｌの１ＸＢ／Ｗ緩衝液に懸濁し、これに前述の１１０μｌのハイブリダイズさせたＤＮＡ溶液を添加し、室温で１０分間、攪拌（１０ｒｐｍ）しながらプローブ核酸を磁性担体に結合させた。その後、プローブ核酸（とそれに接着した１本鎖核酸）が結合した磁性担体を磁石で回収し、洗浄操作を3回繰り返し、非接着核酸断片を除去した。回収したプローブ核酸（とそれに接着した１本鎖核酸）が結合した磁性担体に、１００μｌの０．１Ｎ水酸化ナトリウムを添加し、穏やかに混和させた後、約５分間静置し、プローブ核酸が結合した磁性担体を磁石で回収・廃棄し、その約１００μｌの上清をアンチセンス画分として回収した。【００８２】
アンチセンス画分に、約１００μｌの０．１Ｎ塩化水素を添加して中和した後、４００μｌの１００％エタノールと１００μｌの２．５Ｍ塩化ナトリウムを加え、−２０℃で一晩インキュベートした。続いて、１４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心してアンチセンス核酸を回収し、７０％エタノールで洗浄した後、減圧下で乾燥させた。その後、１５μｌのＴＥ緩衝液に懸濁し、吸光度計によりその濃度を決定し、それぞれ約８μｇのアンチセンス核酸を得た。なお、プローブ核酸としてbio-m-Tyrを用いて得られたアンチセンス核酸をｍ-Tyr-antiDNA、プローブ核酸としてbio-m-Trpを用いて得られたアンチセンス核酸をm-Trp-antiDNA、またプローブ核酸としてSh-bio-m-Tyrを用いて得られたアンチセンス核酸をSh-m-Tyr-DNAとした。【００８３】
（実施例３）マウスメラノーマ細胞での黒色化阻害効果−培地に添加して効果を確認
マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６）（ＨＳ財団より分譲。分譲株Ｎｏ．JCRB0202）を、ＤＭＥＭ培地（ウシ胎児血清を１０％になるように含むダルベッコ変法イーグル培地、インビトロジェン社製）で増幅させたのち、96穴プレートに１穴当たり１０4個となるように加え、そこに実施例２（２）で調製したm-Tyr-antiDNA、m-Trp-antiDNAを最終濃度１００ｎＭ、１μＭになるように含有するDMEM培地を用いて、３７℃でCO2インキュベーター内で培養した。陰性コントロールとして、2本鎖ＤＮＡである実施例２（１）で調製した核酸断片（未分画核酸）を同じ濃度になるように加え、さらに、比較対照として、実施例１の合成１本鎖核酸のm-Tyr-oligo、m-Trp-oligoを同じ濃度になるように加えた。【００８４】
これら核酸の含有したＤＭＥＭ培地２００μｌで毎日培地交換を行い、7日間培養した。その後、培地を除去し、ＰＢＳで接着した細胞を軽く洗浄し、50μｌのトリトンＸ-１００を0.1％の濃度で含むＰＢＳ溶液を添加し、4℃で１時間インキュベートした。その後、10ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ溶液を50μｌ加え、３７℃で約１時間保温した。【００８５】
上清を回収し、Ｌ−ＤＯＰＡを基質として黒色化の度合いを測定するため、プレートリーダー（マルチスキャンプラスＭＫＩＩ、日本フロウラボラトリー社製）で４９２nmにおける吸光度を測定した。その結果を表１に示す。なお、表の数値は核酸サンプルのかわりにＴＥ緩衝液を加えた場合の活性を１００％とした場合の残存活性を表し、つまりこの数値が低い方が抑制率が高いことを示す。これより明らかなように実施例２の本発明のアンチセンス核酸を添加した細胞において、メラニン生成による黒色化が抑制されていることが明らかとなった。【００８６】
【表１】
2007013411.tif 000002
【００８７】
さらにm-Tyr-antiDNA、Sh-m-Tyr-DNA、m-Tyr-oligo及び実施例２（１）の未分画核酸を終濃度５０ｎＭ、１００ｎＭになるように添加して同様に検討した結果を表２に示す。この場合もＴＥをサンプルのかわりに加えた場合の活性を１００％とした場合の残存活性を示す。【００８８】
【表２】
2007013411.tif 000003
【００８９】
この結果からも特異的な分画によって分離されたアンチセンス核酸により抑制効果が発揮されていることが明らかである。【００９０】
（実施例４）  マウスメラノーマ細胞での黒色化阻害効果−細胞に導入
細胞への導入はＳＡＩＮＴ−ＭＩＸ（タカラバイオ社製）を用いた。実施例２で調製したm-Tyr-antiDNA、Sh-m-Tyr-DNA、および実施例２（１）の未分画核酸の５００μM溶液を２μｌと、１００μｌのＨＢＳをそれぞれ混合し、室温で約５分間放置し、これと２０μｌのＳＡＩＮＴ−ＭＩＸと８０μｌのＨＢＳの混液とを混合した。これに約８００μｌのＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）を添加し、これらの混合液を、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６が１×１０5個／ウェルになるように添加した６穴プレートに添加した。CO2インキュベーター内で３７℃、約３時間インキュベートした後、２ｍｌのＤＭＥＭ培地を添加し、同様に２４時間インキュベートした。その後、培地を破棄し、トリプシン溶液（インビトロジェン社製）を用いて、細胞をプレートよりはがし、遠心（４３０×ｇ、３分間）して細胞を遠沈管に回収し、目視によりその黒色度を判定した。さらには、実施例３と同様にして、トリトンＸ−１００溶液を添加して細胞を溶解し、そこにＬ−ＤＯＰＡ溶液を加えて、黒色化の度合いを評価した（表３）。この場合、１０6個の細胞あたりに換算した、波長４９２nmにおける吸光度の値が低い方が、黒色化が抑制されている。【００９１】
【表３】
2007013411.tif 000004
【００９２】
その結果、本発明のアンチセンス核酸を導入した細胞において、黒色化を優位に抑えていることが判明した。【００９３】
（実施例５）プローブ核酸（ヒトメラノサイト評価用）の合成
ヒトのメラニン合成経路を構成する遺伝子であるチロシナーゼ遺伝子に対するアンチセンス核酸を調製するために、下記のプローブ核酸を合成した。配列番号６は、ヒト由来のＴｙｒ−１のｍＲＮＡ配列（Genbank登録番号：NM#000372）のセンス配列の、翻訳開始点の４８塩基上流から１塩基上流までの４８塩基であり、これの５’末端にビオチンを付加して合成したプローブ核酸をbio-h-Tyrと命名した。【００９４】
またコントロールとして、ヒトのチロシナーゼ遺伝子に対するアンチセンス作用を示すと推測される合成１本鎖核酸を作製し、これらをｈ-Tyr-oligo（配列番号７）と命名した。なお、これらはヒトチロシナーゼ遺伝子の翻訳開始点から６７塩基上流から４８塩基上流までの２０塩基の長さのものである。【００９５】
（実施例６）ヒトメラノサイトでの黒色化阻害効果
実施例２と同様にして、プローブ核酸としてbio-h-Tyrを使用し、担体に結合させることで、サケ白子ＤＮＡ断片よりアンチセンス核酸を分離し、これをh-Tyr-antiDNAと命名した。ヒト正常メラノーマ細胞（クラボウ社製）に、該アンチセンス核酸を与えた場合の黒色化抑制の度合いを検証した。【００９６】
Medium254培地（HMGSを添加したヒトメラノサイト培地、クラボウ社製）で増幅させたヒト正常メラノサイト（クラボウ社製）を96穴プレートに１穴当たり１０4個となるように加え、それを、h-Tyr-antiDNAをそれぞれ最終濃度１００ｎＭ、１μＭになるように含有するMedium254培地中、３７℃、CO2インキュベーター内で培養した。さらに合成アンチセンス核酸のコントロールとして実施例５で合成したh-Tyr-oligoを、陰性コントロールとして実施例２（１）の未分画核酸を、同じ濃度になるように加えたものでも実施した。【００９７】
これら核酸の含有したMedium254培地２００μｌで毎日培地交換を行い、7日間培養した。その後、培地を除去し、ＰＢＳで接着した細胞を軽く洗浄し、50μｌのトリトンＸ-１００を0.1％の濃度で含むＰＢＳ溶液を添加し、4℃で１時間インキュベートした。その後、10ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ溶液を50μｌ加え、３７℃で約１時間保温した。【００９８】
上清を回収し、Ｌ−ＤＯＰＡを基質として黒色化の度合いを測定するため、プレートリーダー（マルチスキャンプラスＭＫＩＩ、日本フロウラボラトリー社製）で４９２nmを測定、その結果を表４に示す。なお、表の数値は核酸サンプルのかわりにＴＥ緩衝液を加えた場合の活性を１００％とした場合の残存活性を表し、つまりこの数値が低いほど抑制率が高いことを示す。これより明らかなように本発明のアンチセンス核酸を添加した細胞において、メラニン生成による黒色化が抑制されていることが明らかとなった。【００９９】
【表４】
2007013411.tif 000005
【０１００】
（実施例７）プローブ核酸（ヒト繊維芽細胞評価用）の合成
ヒトのマトリックスメタロプロテアーゼ１（MMP−１）遺伝子に対するアンチセンス核酸を調製するために、下記のプローブ核酸を合成した。配列番号８は、ヒト由来のMMP−１のｍＲＮＡ配列（Genbank登録番号：NM#002421）のセンス配列の翻訳開始点の４８塩基上流から１塩基上流までの４８塩基であり、これの５'末端にビオチンを付加して合成したプローブ核酸をbio-h-MMP1と命名した。またコントロールとしてヒトのMMP−１遺伝子に対するアンチセンス作用を示すと推測される合成アンチセンス核酸を作製し、これらをｈ-MMP1-oligo（配列番号９）と命名した。なお、これはヒトチロシナーゼ遺伝子の翻訳開始点から２０塩基上流から１塩基上流までの２０塩基の長さのものである。【０１０１】
（実施例８）ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（MMP−１）阻害
（１）ウエスタンブロッティングによる確認
実施例２と同様にして、プローブ核酸としてbio-h-MMP1を使用し、担体を利用して、サケ白子ＤＮＡ断片よりアンチセンス核酸を分離し、これらをh-MMP1-antiDNAと命名した。ヒト正常繊維芽細胞（クラボウ社製）に該アンチセンス核酸を与えた場合のマトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）抑制の度合いを検証した。【０１０２】
２％ＦＢＳを含むＭｅｄｉｕｍ１０６Ｓ培地（クラボウ社製）で増幅させたヒト正常繊維芽細胞（クラボウ社製）を２４穴プレートに１穴当たり５×104個となるように加え、CO2インキュベータ内、３７℃で２４時間培養を行った。その後、ＦＢＳを含まない同培地に交換し、ＵＶ照射装置（クリニカルサプライ社製）で３．７Ｊ／ｃｍ2の条件でＵＶ照射（ピーク波長３５２ｎｍ）を１２分間実施した。そこh-MMP1-antiDNAを最終濃度１μＭになるように含有するＭｅｄｉｕｍ１０６Ｓ培地で３７℃、CO2インキュベーター内で４８時間培養した。コントロールとして、合成アンチセンス核酸のh-MMP1-oligoを同じ濃度になるように加えた（サンプル未添加の場合を陰性コントロールとした）。【０１０３】
培養後の培養上清を回収し、このサンプル中のＭＭＰ−１量をウエスタンブロッティングにより確認を行った。サンプルの蛋白質量はウシ血清アルブミンをスタンダードとしてMicroBCA assay kit（ＰＩＲＣＥ社製）により定量し、アプライするサンプルのタンパク質量が同じになるようにし、電気泳動の際は、ウエスタンブロッティング用、ＣＢＢ染色確認用の２枚のゲルで同溶液量のサンプルをアプライした。具体的には、サンプル５μｇに電気泳動サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間加熱処理し、１０％ポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動を行った。【０１０４】
ウエスタンブロッティング用ゲルは、「セミドライブロッティング実験方法：ＡＴＴＯ社」を参考にし、ポリビニリデンフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜、Hybond P:Amersham Biosciences社製）への転写操作を行った。【０１０５】
転写後のＰＶＤＦ膜はブロッキング溶液（０．３％スキムミルク／ＰＢＳＴ（Phosphate Buffered Saline with 0.1% Tween20））に浸して室温で３時間ブロッキングし、その後、ＰＢＳＴで膜をよく洗浄した。【０１０６】
ブロッキング後の膜は、０．３％ スキムミルク／ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で１０μg ／ｍｌに希釈した抗ＭＭＰ−１（Collagenase-1）抗体（LAB VISION社製）の溶液に浸して４℃、一晩反応させ、反応終了後、ＰＢＳＴでよく洗浄した。【０１０７】
次に、０．３％ スキムミルク／ＰＢＳで１０００倍に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体−ペルオキシダーゼ標識物（ＤＡＫＯ社製）の溶液に膜を浸し、室温で２時間反応させた。反応終了後、膜はＰＢＳＴでよく洗浄した。【０１０８】
洗浄後、膜を基質液（ECL Plus Western Blotting Detection System：Amersham Biosciences社製）に浸し、生じた化学発光をフィルム（Hyperfilm ECL：Amersham Biosciences社製）に感光させることによってシグナルを可視化した。またＣＢＢ染色確認用ゲルは、ＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue）でタンパク質染色を行い、アプライしたタンパク質量がほぼ同じであることを確認した。【０１０９】
感光させたフィルムのＭＭＰ−１検出バンドの結果を図１に示す。図１より、本発明のアンチセンス核酸を添加した細胞において、ＭＭＰ−１のタンパク質発現が阻害されていることが明らかとなった。【０１１０】
（２）ＭＭＰ−１活性での確認
（１）で使用した培養上清を用いてＭＭＰ−１活性を測定し、その阻害の度合いを確認した。培地上清中のＩ型マトリックスメタロプロテアーゼ活性は、最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬのトリプシンを添加して３７℃で１５分間インキュベートした後、最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬの大豆トリプシン阻害用組成物を添加し、これについて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したＩ型コラーゲンを基質として用いて測定した。すなわち、０．２５ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識Ｉ型コラーゲンを含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、０．４Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ塩化カルシウム及び０．０４(w/v)％アジ化ナトリウムを含む）５０μＬを、前記トリプシン処理した培地上清５０μＬに加え、遮光下にて３７℃で２時間反応させた。次いで４０ｍＭのo-フェナントロリン（phenanthroline）５μＬを加え反応を停止した後、３７℃にて３０分間コラーゲンの変性処理を行い、エタノールと０．１７Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５、０．６７Ｍ塩化ナトリウムを含む）との容量比７：３の混合液５０μＬを添加し、変性されたコラーゲンのみを抽出した。２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清の蛍光強度を励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５２０ｎｍで測定した。その結果を表５に示す。陰性コントロールの前記酵素活性を１００として示した相対活性により、評価を行った。【０１１１】
【表５】
2007013411.tif 000006
【０１１２】
その結果、ＭＭＰ−１活性からも本発明のアンチセンス核酸による阻害が確認された。【０１１３】
（実施例９）本発明のアンチセンス核酸の分析と分画
（１）アンチセンス核酸の調製
本実施例では、実施例２（２）で調製したマウスチロシナーゼ阻害用アンチセンス核酸、m-Tyr-antiDNAを使用した。【０１１４】
（２）アンチセンス核酸のクロマト分画
ｍ−Ｔｙｒ−antiDNAを高速液体クロマトグラフィーを用いて分画を行った。すなわち、０．１ｍｌのｍ−Ｔｙｒ−antiDNA溶液（濃度１ｍM）をＨＰＬＣにインジェクションし、陰イオン交換カラム（COSMOSIL  DEAE、ナカライ社製）を用いた分画を実施した。インジェクション後、緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．２）で洗浄した後、塩化ナトリウム濃度勾配（０〜１Ｍ）による溶出操作を実施し、溶出画分を以下の集団になるように１つにまとめた。なお、その際のクロマトパターンを図２に示した（横軸は時間経過、縦軸は２５４ｎｍの吸収を示す）。【０１１５】
図２からも明らかなように、本発明のアンチセンス核酸は分布幅を有する溶出パターンを示し、多種類の連続した大きさの核酸の集合体であることが確認された。【０１１６】
（３）マウスメラノーマ細胞での黒色化阻害効果−培地に添加して効果を確認
（２）のクロマト分画において、勾配をかけていない塩化ナトリウム濃度が０の状態のものをコントロール、塩化ナトリウム勾配が、０より大きく１００ｍＭ以下のフラクション分を（ａ）、１００ｍＭより大きく２００ｍＭ以下のフラクション分を（ｂ）、２００ｍＭより大きく３００ｍＭ以下のフラクションを（ｃ）、３００ｍＭより大きく４００ｍＭ以下のフラクションを（ｄ）、４００ｍＭよりも大きく５００ｍM以下のフラクションを（ｅ）、５００ｍMよりも大きく１M以下のものを（ｆ）としてそれぞれ分取した。これらのフラクションは、それぞれ、エタノール沈殿により、濃縮し、ＴＥ緩衝液に懸濁した。【０１１７】
ＤＭＥＭ培地（ウシ胎児血清を１０％になるように含むダルベッコ変法イーグル培地、インビトロジェン社製）で増幅させたマウスメラノーマ細胞（Ｂ１６）（ＨＳ財団より分譲。分譲株Ｎｏ．JCRB0202）を96穴プレートに１穴当たり１０4個となるように加え、そこに上記（ａ）〜（ｆ）のフラクションの懸濁液を、それぞれ最終濃度が１００ｎＭになるように含有するDMEM培地を加え、３７℃でCO2インキュベーター内で培養した。コントロールとして、m-Tyr-antiDNAを同じ濃度になるように加えた。【０１１８】
これらアンチセンス核酸の含有したＤＭＥＭ培地２００μｌで毎日培地交換を行い、7日間培養した。その後、培地を除去し、ＰＢＳで接着した細胞を軽く洗浄し、50μｌのトリトンＸ-１００を0.1％の濃度で含むＰＢＳ溶液を添加し、4℃で１時間インキュベートした。その後、10ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ溶液を50μｌ加え、３７℃で約１時間保温した。【０１１９】
上清を回収し、Ｌ−ＤＯＰＡを基質として黒色化の度合いを測定するため、プレートリーダー（マルチスキャンプラスＭＫＩＩ、日本フロウラボラトリー社製）で４９２nmにおける吸光度を測定した。その結果を表６に示す。なお、表の数値は核酸サンプルのかわりにＴＥ緩衝液を加えた場合（これを陰性コントロールとする）の活性を１００％とした場合の残存活性を表し、つまりこの数値が低い方が抑制率が高いことを示す。これより明らかなように（ａ）から（ｆ）のどの画分のアンチセンス核酸を添加した細胞においても、メラニン生成による黒色化が抑制されていることが明らかとなった。【０１２０】
【表６】
2007013411.tif 000007
【０１２１】
（実施例１０）長鎖プローブ核酸（マウスメラノーマ評価用）の合成
マウスのメラニン合成経路を構成する遺伝子であるチロシナーゼ遺伝子をターゲットとしたアンチセンス核酸を調製するために、下記の長鎖プローブ核酸をＰＣＲにより合成した。配列番号１０、１１、１２及び１３の核酸は、マウス由来のチロシナーゼの配列（Genbank登録番号：NM#011661）の転写開始点から、その下流７０番目の塩基までをＰＣＲで合成できるようにデザインしたもので、これらをPCR-m-Tyr-1、PCR-m-Tyr-2、PCR-m-Tyr-3及びPCR-m-Tyr-4と命名した。これらの核酸を利用して転写開始点からその下流７０番目までの２本鎖ＤＮＡをＰＣＲにより合成し、これを１本鎖の長鎖プローブ核酸をＰＣＲ合成するための鋳型とした。【０１２２】
次に上記のものを鋳型として用い、配列番号１０の合成核酸をプライマーとしたリニアーＰＣＲを実施し、１本鎖の長鎖プローブ核酸を合成した。ＰＣＲの条件は９４℃、２分間後の変性後に９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、１５秒の反応サイクルを１００回実施した。その後、エタノール沈殿により、増幅された断片を回収し、これを５００μｌの滅菌水に懸濁した。この長鎖プローブ核酸をL-PCR-m-Tyr（分子量約２１，０００）と命名した。【０１２３】
（実施例１１）アンチセンス核酸の取得
（１）サケ白子由来ＤＮＡの切断と分画
サケ白子由来のＤＮＡ−Ｎａ（ニチロ社製）１０％（ｗ／ｖ）溶液２０ｍｌを、超音波破砕機（ＳＭＴ社製）で２０分間処理してＤＮＡを細断し、その溶液を排除分子量２，０００の限外ろ過透析膜（ナカライ社製）に注入し、滅菌水中、室温で一晩放置した。その後、内容物（分子量２，０００以上の核酸）を、今度は排除分子量１５，０００の限外ろ過透析膜（ナカライ社製）に添加し、４０ｍｌの滅菌水中、室温で一晩、振とうを加えながら放置した。その外液である滅菌水中に含まれるＤＮＡ断片（分子量２，０００〜１５，０００）をエタノール沈殿により回収し、４ｍｌの滅菌水に懸濁した。これを分画核酸断片溶液とした。【０１２４】
（２）目的のアンチセンス核酸の分離
（１）で調製した分画核酸断片溶液を５ｍＭの濃度になるように調製したものを９００μｌ分と、実施例１０のL-PCR-m-Tyrの１００μｌを、エッペンドルフチューブにいれ、ヒートブロック（タイテック社製）にセットし、１００℃で５分間加熱して分画核酸断片を１本鎖化させた後、３０℃で５分間保持して、長鎖プローブ核酸と分画核酸断片とをハイブリダイズさせた。【０１２５】
これを排除分子量１５，０００の限外ろ過膜（ナカライ社製）に添加し、４Ｌの滅菌水中で一晩放置し、長鎖プローブ核酸にアニールしていない分子量１５，０００以下の分画核酸断片を排除した。その後、目的のアンチセンス核酸が接着したプローブ核酸溶液の入った限外ろ過膜を５ｍｌの滅菌水の入った容器に入れ、１０５℃、１０分間加熱し、長鎖プローブ核酸にアニールした１本鎖核酸をはがし、外液に溶出させることにより、アンチセンス核酸を回収し、これをf-m-Tyr-antiDNAとした。なおその回収は約５ｍｌの外液をエタノール沈殿法で処理し、３００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁することにより実施した。【０１２６】
（３）マウスメラノーマ細胞での黒色化阻害効果
（２）で回収したアンチセンス核酸を実施例３と同様にして、マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６）に対する黒色化阻害によりその効果を検証した。添加したアンチセンス核酸は、（２）のf-m-Tyr-antiDNA、実施例２（２）で調製したm-Tyr-antiDNA、コントロールとして合成アンチセンス核酸m-Tyr-oligoを用い、細胞培養液にアプライする際の最終添加濃度を全て１μＭになるようにした。その結果を表７に示す。なお、表の数値はサンプルのかわりにＴＥ緩衝液を加えた場合の活性を１００％とした場合の残存活性を表し、つまりこの数値が低い方が抑制率が高いことを示す。これより明らかなように、限外ろ過膜を利用して調製したアンチセンスＤＮＡを添加した細胞において、磁性担体を使用した場合の方法と比較してもほぼ同程度の阻害活性を示すことが明らかとなった。【０１２７】
【表７】
2007013411.tif 000008
【０１２８】
続いて、本発明のアンチセンス核酸を使用した、皮膚外用剤についての実施例の処方を示す。なお、下記処方において、アンチセンス核酸は実施例６で得られたアンチセンス核酸を使用した。処方中の配合量はすべて重量部である。【０１２９】
（実施例１２）  皮膚用ローション剤
(1)エタノール    １０．０
(2)ヒドロキシエチルセルロース    １．０
(3)アンチセンス核酸    ０．０１
(4)パラオキシ安息香酸メチル    ０．１
(5)精製水    ８８．８
製法：(1)〜(4)を順次(5)に添加し、均一に溶解する。【０１３０】
（実施例１３）皮膚用乳剤
(1)ステアリン酸    ０．２
(2)セタノール    １．５
(3)ワセリン    ３．０
(4)流動パラフィン    ７．０
(5)ポリオキシエチレン(10E.O.)モノオレイン酸エステル  １．５
(6)酢酸トコフェロール    １．０
(7)グリセリン    ５．０
(8)パラオキシ安息香酸メチル    ０．１
(9)トリエタノールアミン    １．０
(10)精製水    ７９．５
(11)アンチセンス核酸    ０．０１
製法：(1)〜(6)の油相成分を混合，加熱して均一に溶解し、７０℃に保つ。一方、(7)〜(10)の水相成分を混合、加熱して均一とし、７０℃とする。この水相成分に前記油相成分を攪拌しながら徐々に添加して乳化し、冷却した後４０℃にて(11)を添加、混合する。【０１３１】
（実施例１４）皮膚用ゲル剤
(1)ジプロピレングリコール    １０．０
(2)カルボキシビニルポリマー    ０．５
(3)水酸化カリウム    ０．１
(4)パラオキシ安息香酸メチル    ０．１
(5)精製水    ８８．８
(6)アンチセンス核酸    ０．０１
製法：(5)に(2)を均一に溶解した後、(1)に(4)を溶解して添加し、次いで(3)を加えて増粘させ、(6)を添加、混合する。【０１３２】
（実施例１５）皮膚用クリーム
(1)ミツロウ    ６．０
(2)セタノール    ５．０
(3)還元ラノリン    ８．０
(4)スクワラン    ２７．５
(5)グリセリル脂肪酸エステル    ４．０
(6)親油型グリセリルモノステアリン酸エステル    ２．０
(7)ポリオキシエチレン(20E.O.)ソルビタンモノラウリン酸エステル    ５．０
(8)プロピレングリコール ５．０
(9)パラオキシ安息香酸メチル    ０．１
(10)精製水    ３６．４
(11)アンチセンス核酸    ０．０１
製法：(1)〜(7)の油相成分を混合、溶解して７５℃に加熱する。一方、(8)〜(10)の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化し、冷却後４０℃にて(11)を添加、混合する。【０１３３】
（実施例１６）水中油型乳剤性軟膏
(1)白色ワセリン    ２５．０
(2)ステアリルアルコール   ２５．０
(3)グリセリン   １２．０
(4)ラウリル硫酸ナトリウム   １．０
(5)パラオキシ安息香酸メチル   ０．１
(6)精製水   ３６．３
(7)アンチセンス核酸    ０．０１
製法：(1)〜(4)の油相成分を混合，溶解して均一とし、７５℃に加熱する。一方、(5)を(6)に溶解して７５℃に加熱し、これに前記油相成分を添加して乳化し、冷却後４０℃にて(7)を添加，混合する。【０１３４】
（実施例１７）化粧水
(1)エタノール    １０．００
(2)1,3-ブチレングリコール    ５．００
(3)アンチセンス核酸    ０．０１
(4)香料    ０．１０
(5)精製水    ８４．８９
製法：(1)〜(4)を順次(5)に添加して均一に混合、溶解する。【０１３５】
（実施例１８）美容液
(1)グリセリン    ２．００
(2)1,3-ブチレングリコール    ３．００
(3)ポリオキシエチレン(25E.O.)オレイルエーテル    ０．５０
(4)アンチセンス核酸    ０．０１
(5)エタノール    １５．００
(6)パラオキシ安息香酸メチル    ０．１０
(7)香料    ０．１０
(8)精製水 ７９．２５
製法：(6)，(7)を(5)に溶解し、これを(1)〜(4)とともに(8)に添加して均一に混合，溶解する。【０１３６】
（実施例１９）エモリエントクリーム（油中水型）
(1)流動パラフィン    ３０．００
(2)マイクロクリスタリンワックス    ２．００
(3)ワセリン    ５．００
(4)ジグリセリルジオレイン酸エステル    ５．００
(5)L-グルタミン酸ナトリウム    １．６０
(6)L-セリン    ０．４０
(7)プロピレングリコール    ３．００
(8)パラオキシ安息香酸メチル    ０．１０
(9)精製水    ５２．７５
(10)香料    ０．１０
(11)アンチセンス核酸    ０．０１
製法：(5)，(6)を(9)の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した(4)に攪拌しながら徐々に添加する。これをあらかじめ混合し７０℃に加熱溶解した(1)〜(3)に均一に分散し、これに(7)，(8)を(9)の残部に溶解して７０℃に加熱したものを攪拌しながら添加し、ホモミキサーにて乳化する。冷却後、４０℃にて(10)，(11)を添加、混合する。【０１３７】
（実施例２０）メイクアップベースクリーム
(1)ステアリン酸    １２．００
(2)セタノール    ２．００
(3)グリセリルトリ2-エチルヘキサン酸エステル    ２．５０
(4)自己乳化型グリセリルモノステアリン酸エステル    ２．００
(5)プロピレングリコール    １０．００
(6)水酸化カリウム    ０．３０
(7)精製水    ６９．５８
(8)酸化チタン    １．００
(9)ベンガラ    ０．１０
(10)黄酸化鉄    ０．４０
(11)香料    ０．１０
(12)アンチセンス核酸    ０．０１
製法：(1)〜(4)の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とする。一方(5)〜(7)の水相成分を混合し、７５℃に加熱、溶解して均一とし、これに(8)〜(10)の顔料を添加し、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を添加し、ホモミキサーにて乳化した後冷却し、４０℃にて(11)、(12)を添加、混合する。【０１３８】
（実施例２１）乳液状ファンデーション
(1)ステアリン酸    ２．００
(2)スクワラン    ５．００
(3)ミリスチン酸オクチルドデシル    ５．００
(4)セタノール    １．００
(5)デカグリセリルモノイソパルミチン酸エステル    ９．００
(6)1,3-ブチレングリコール    ６．００
(7)水酸化カリウム    ０．１０
(8)パラオキシ安息香酸メチル    ０．１０
(9)精製水    ５３．４０
(10)酸化チタン    ９．００
(11)タルク    ７．４０
(12)ベンガラ    ０．５０
(13)黄酸化鉄    １．１０
(14)黒酸化鉄    ０．１０
(15)香料    ０．１５
(16)アンチセンス核酸    ０．０１
製法：(1)〜(5)の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とする。一方(6)〜(9)の水相成分を混合し、７５℃に加熱、溶解して均一とし、これに(10)〜(14)の顔料を添加し、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を添加し、ホモミキサーにて均一に乳化した後冷却し、４０℃にて(15)、(16)を添加、混合する。【０１３９】
（実施例２２）ハンドクリーム
(1)セタノール    ４．０
(2)ワセリン    ２．０
(3)流動パラフィン    １０．０
(4)グリセリルモノステアリン酸エステル    １．５
(5)ポリオキシエチレン(60E.O.)グリセリルイソステアリン酸エステル    ２．５
(6)酢酸トコフェロール    ０．５
(7)グリセリン    ２０．０
(8)パラオキシ安息香酸メチル    ０．１
(9)精製水    ５９．２
(10)アンチセンス核酸    ０．０１
製法：(1)〜(6)の油相成分を混合、溶解して７５℃に加熱する。一方、(7)〜(9)の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化して冷却し、４０℃にて(10)を添加、混合する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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