(57)【要約】スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性およびスルホンアミド化合物の抗腫瘍効果は、腫瘍細胞のＥＧＦＲ１の発現量を測定し、ＥＧＦＲ１の発現量の変化を指標とすることにより検査することができる。これにより、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法およびスルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査する方法ならびにこれらの方法において使用するための検査用キットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルホンアミド化合物またはその類縁体に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が、
一般式（Ｉ）
2007123274.tif 000028
［式中、
Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環を、
Ｂ環は、置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環を、
Ｗは、単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ１）−または酸素原子を、
Ｙは、炭素原子または窒素原子を、
Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）−または窒素原子を意味し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して同一または異なって水素原子または低級アルキル基を意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩ）
2007123274.tif 000029
［式中、Ｅは、−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−を、Ｄは、−ＣＨ２−または−Ｏ−を、Ｒ１ａは、水素原子またはハロゲン原子を、Ｒ２ａは、ハロゲン原子またはトリフルオロメチル基をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩＩ）
2007123274.tif 000030
［式中、Ｊは、−Ｏ−または−ＮＨ−を、Ｒ１ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルキルチオ基、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アジド基、−Ｏ（ＳＯ２）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、水酸基、フェニル基、置換基を有するフェニル基、ピリジニル基、チエニル基、フリル基、キノリニル基またはトリアゾール基を、Ｒ２ｂは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、−ＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、Ｒ３ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基を、Ｒ４ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂの少なくとも一つは、水素原子である）を、Ｒ５ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、−ＣＦ３またはニトロ基を、Ｒ６ｂは、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ６ｂが置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基のとき、Ｒ５ｂは水素原子であり、Ｒ７ｂはハロゲン原子である）を、Ｒ７ｂは、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基または−ＣＦ３（但し、Ｒ５ｂまたはＲ７ｂのいずれか一方が、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ７ｂが、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基である場合には、Ｒ５ｂまたはＲ６ｂのいずれか一方が、水素原子である）をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
式（ＩＶ）
2007123274.tif 000031
で表わされる化合物および
式（Ｖ）
2007123274.tif 000032
で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物であり、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
スルホンアミド化合物またはその類縁体に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が、
一般式（Ｉ）
2007123274.tif 000033
［式中、
Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環を、
Ｂ環は、置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環を、
Ｗは、単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ１）−または酸素原子を、
Ｙは、炭素原子または窒素原子を、
Ｚは−Ｎ（Ｒ２）−または窒素原子を意味し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して同一または異なって水素原子または低級アルキル基を意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩ）
2007123274.tif 000034
［式中、Ｅは、−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−を、Ｄは、−ＣＨ２−または−Ｏ−を、Ｒ１ａは、水素原子またはハロゲン原子を、Ｒ２ａは、ハロゲン原子またはトリフルオロメチル基をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩＩ）
2007123274.tif 000035
［式中、Ｊは、−Ｏ−または−ＮＨ−を、Ｒ１ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルキルチオ基、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アジド基、−Ｏ（ＳＯ２）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、水酸基、フェニル基、置換基を有するフェニル基、ピリジニル基、チエニル基、フリル基、キノリニル基またはトリアゾール基を、Ｒ２ｂは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、−ＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、Ｒ３ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基を、Ｒ４ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂの少なくとも一つは、水素原子である）を、Ｒ５ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、−ＣＦ３またはニトロ基を、Ｒ６ｂは、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ６ｂが置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基のとき、Ｒ５ｂは水素原子であり、Ｒ７ｂはハロゲン原子である）を、Ｒ７ｂは、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基または−ＣＦ３（但し、Ｒ５ｂまたはＲ７ｂのいずれか一方が、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ７ｂが、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基である場合には、Ｒ５ｂまたはＲ６ｂのいずれか一方が、水素原子である）をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
式（ＩＶ）
2007123274.tif 000036
で表わされる化合物および
式（Ｖ）
2007123274.tif 000037
で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物であり、
（ａ）癌患者より取り出された腫瘍細胞を、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体で処理する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で処理した腫瘍細胞および無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｃ）工程（ａ）で処理した腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項３】
スルホンアミド化合物またはその類縁体に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が、
一般式（Ｉ）
2007123274.tif 000038
［式中、
Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環を、
Ｂ環は、置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環を、
Ｗは、単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ１）−または酸素原子を、
Ｙは、炭素原子または窒素原子を、
Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）−または窒素原子を意味し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して同一または異なって水素原子または低級アルキル基を意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩ）
2007123274.tif 000039
［式中、Ｅは、−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−を、Ｄは、−ＣＨ２−または−Ｏ−を、Ｒ１ａは、水素原子またはハロゲン原子を、Ｒ２ａは、ハロゲン原子またはトリフルオロメチル基をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩＩ）
2007123274.tif 000040
［式中、Ｊは、−Ｏ−または−ＮＨ−を、Ｒ１ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルキルチオ基、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アジド基、−Ｏ（ＳＯ２）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、水酸基、フェニル基、置換基を有するフェニル基、ピリジニル基、チエニル基、フリル基、キノリニル基またはトリアゾール基を、Ｒ２ｂは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、−ＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、Ｒ３ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基を、Ｒ４ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂの少なくとも一つは、水素原子である）を、Ｒ５ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、−ＣＦ３またはニトロ基を、Ｒ６ｂは、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ６ｂが置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基のとき、Ｒ５ｂは水素原子であり、Ｒ７ｂはハロゲン原子である）を、Ｒ７ｂは、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基または−ＣＦ３（但し、Ｒ５ｂまたはＲ７ｂのいずれか一方が、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ７ｂが、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基である場合には、Ｒ５ｂまたはＲ６ｂのいずれか一方が、水素原子である）をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
式（ＩＶ）
2007123274.tif 000041
で表わされる化合物および
式（Ｖ）
2007123274.tif 000042
で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物であり、
（ａ）癌患者に対し、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項４】
スルホンアミド化合物またはその類縁体に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が、
一般式（Ｉ）
2007123274.tif 000043
［式中、
Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環を、
Ｂ環は、置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環を、
Ｗは、単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ１）−または酸素原子を、
Ｙは、炭素原子または窒素原子を、
Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）−または窒素原子を意味し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して同一または異なって水素原子または低級アルキル基を意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩ）
2007123274.tif 000044
［式中、Ｅは、−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−を、Ｄは、−ＣＨ２−または−Ｏ−を、Ｒ１ａは、水素原子またはハロゲン原子を、Ｒ２ａは、ハロゲン原子またはトリフルオロメチル基をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩＩ）
2007123274.tif 000045
［式中、Ｊは、−Ｏ−または−ＮＨ−を、Ｒ１ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルキルチオ基、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アジド基、−Ｏ（ＳＯ２）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、水酸基、フェニル基、置換基を有するフェニル基、ピリジニル基、チエニル基、フリル基、キノリニル基またはトリアゾール基を、Ｒ２ｂは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、−ＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、Ｒ３ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基を、Ｒ４ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂの少なくとも一つは、水素原子である）を、Ｒ５ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、−ＣＦ３またはニトロ基を、Ｒ６ｂは、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ６ｂが置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基のとき、Ｒ５ｂは水素原子であり、Ｒ７ｂはハロゲン原子である）を、Ｒ７ｂは、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基または−ＣＦ３（但し、Ｒ５ｂまたはＲ７ｂのいずれか一方が、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ７ｂが、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基である場合には、Ｒ５ｂまたはＲ６ｂのいずれか一方が、水素原子である）をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
式（ＩＶ）
2007123274.tif 000046
で表わされる化合物および
式（Ｖ）
2007123274.tif 000047
で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物であり、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項５】
スルホンアミド化合物またはその類縁体の抗腫瘍効果を検査する方法であって、
前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が、
一般式（Ｉ）
2007123274.tif 000048
［式中、
Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環を、
Ｂ環は、置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環を、
Ｗは、単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ１）−または酸素原子を、
Ｙは、炭素原子または窒素原子を、
Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）−または窒素原子を意味し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して同一または異なって水素原子または低級アルキル基を意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩ）
2007123274.tif 000049
［式中、Ｅは、−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−を、Ｄは、−ＣＨ２−または−Ｏ−を、Ｒ１ａは、水素原子またはハロゲン原子を、Ｒ２ａは、ハロゲン原子またはトリフルオロメチル基をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩＩ）
2007123274.tif 000050
［式中、Ｊは、−Ｏ−または−ＮＨ−を、Ｒ１ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルキルチオ基、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アジド基、−Ｏ（ＳＯ２）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、水酸基、フェニル基、置換基を有するフェニル基、ピリジニル基、チエニル基、フリル基、キノリニル基またはトリアゾール基を、Ｒ２ｂは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、−ＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、Ｒ３ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基を、Ｒ４ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂの少なくとも一つは、水素原子である）を、Ｒ５ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、−ＣＦ３またはニトロ基を、Ｒ６ｂは、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ６ｂが置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基のとき、Ｒ５ｂは水素原子であり、Ｒ７ｂはハロゲン原子である）を、Ｒ７ｂは、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基または−ＣＦ３（但し、Ｒ５ｂまたはＲ７ｂのいずれか一方が、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ７ｂが、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基である場合には、Ｒ５ｂまたはＲ６ｂのいずれか一方が、水素原子である）をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
式（ＩＶ）
2007123274.tif 000051
で表わされる化合物および
式（Ｖ）
2007123274.tif 000052
で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物であり、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が抗腫瘍効果を発揮していると判定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項６】
スルホンアミド化合物またはその類縁体の抗腫瘍効果を検査する方法であって、
前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が、
一般式（Ｉ）
2007123274.tif 000053
［式中、
Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環を、
Ｂ環は、置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環を、
Ｗは、単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ１）−または酸素原子を、
Ｙは、炭素原子または窒素原子を、
Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）−または窒素原子を意味し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して同一または異なって水素原子または低級アルキル基を意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩ）
2007123274.tif 000054
［式中、Ｅは、−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−を、Ｄは、−ＣＨ２−または−Ｏ−を、Ｒ１ａは、水素原子またはハロゲン原子を、Ｒ２ａは、ハロゲン原子またはトリフルオロメチル基をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩＩ）
2007123274.tif 000055
［式中、Ｊは、−Ｏ−または−ＮＨ−を、Ｒ１ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルキルチオ基、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アジド基、−Ｏ（ＳＯ２）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、水酸基、フェニル基、置換基を有するフェニル基、ピリジニル基、チエニル基、フリル基、キノリニル基またはトリアゾール基を、Ｒ２ｂは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、−ＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、Ｒ３ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基を、Ｒ４ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂの少なくとも一つは、水素原子である）を、Ｒ５ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、−ＣＦ３またはニトロ基を、Ｒ６ｂは、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ６ｂが置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基のとき、Ｒ５ｂは水素原子であり、Ｒ７ｂはハロゲン原子である）を、Ｒ７ｂは、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基または−ＣＦ３（但し、Ｒ５ｂまたはＲ７ｂのいずれか一方が、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ７ｂが、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基である場合には、Ｒ５ｂまたはＲ６ｂのいずれか一方が、水素原子である）をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
式（ＩＶ）
2007123274.tif 000056
で表わされる化合物および
式（Ｖ）
2007123274.tif 000057
で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物であり、
（ａ）癌患者に対し、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が抗腫瘍効果を発揮していると判定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項７】
スルホンアミド化合物またはその類縁体の抗腫瘍効果を検査する方法であって、
前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が、
一般式（Ｉ）
2007123274.tif 000058
［式中、
Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環を、
Ｂ環は、置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環を、
Ｗは、単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ１）−または酸素原子を、
Ｙは、炭素原子または窒素原子を、
Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）−または窒素原子を意味し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して同一または異なって水素原子または低級アルキル基を意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩ）
2007123274.tif 000059
［式中、Ｅは、−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−を、Ｄは、−ＣＨ２−または−Ｏ−を、Ｒ１ａは、水素原子またはハロゲン原子を、Ｒ２ａは、ハロゲン原子またはトリフルオロメチル基をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩＩ）
2007123274.tif 000060
［式中、Ｊは、−Ｏ−または−ＮＨ−を、Ｒ１ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルキルチオ基、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アジド基、−Ｏ（ＳＯ２）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、水酸基、フェニル基、置換基を有するフェニル基、ピリジニル基、チエニル基、フリル基、キノリニル基またはトリアゾール基を、Ｒ２ｂは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、−ＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、Ｒ３ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基を、Ｒ４ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂの少なくとも一つは、水素原子である）を、Ｒ５ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、−ＣＦ３またはニトロ基を、Ｒ６ｂは、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ６ｂが置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基のとき、Ｒ５ｂは水素原子であり、Ｒ７ｂはハロゲン原子である）を、Ｒ７ｂは、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基または−ＣＦ３（但し、Ｒ５ｂまたはＲ７ｂのいずれか一方が、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ７ｂが、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基である場合には、Ｒ５ｂまたはＲ６ｂのいずれか一方が、水素原子である）をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
式（ＩＶ）
2007123274.tif 000061
で表わされる化合物および
式（Ｖ）
2007123274.tif 000062
で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくは
その薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物であり、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が抗腫瘍効果を発揮していると判定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項８】
スルホンアミド化合物が、
Ｎ−（３−クロロ−１Ｈ−インドール−７−イル）−１，４−ベンゼンジスルホンアミド、
Ｎ−（３−シアノ−４−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）−３−シアノベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−［［（４−クロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−スルホンアミド、
Ｎ−［［（３，４−ジクロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホンアミド、
Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−４−クロロフェニルスルホンアミド、
Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−５−ブロモチオフェン−２−スルホンアミド
および
２−スルファニルアミド−５−クロロキノキサリン
からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
スルホンアミド化合物が、Ｎ−（３−クロロ−１Ｈ−インドール−７−イル）−１，４−ベンゼンジスルホンアミド、もしくはその薬理学的に許容される塩、たはそれらの溶媒和物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
スルホンアミド化合物が、Ｎ−（３−シアノ−４−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）−３−シアノベンゼンスルホンアミド、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
スルホンアミド化合物が、Ｎ−［［（３，４−ジクロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホンアミドおよびＮ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−５−ブロモチオフェン−２−スルホンアミドからなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
スルホンアミド化合物が、Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−５−ブロモチオフェン−２−スルホンアミドのナトリウム塩である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＧＦＲ１の発現量の測定が、ＥＧＦＲ１のタンパク質を定量することにより行うものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質の定量が、免疫化学的方法、質量分析、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴからなる群から選択される少なくとも一つにより行うものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
免疫化学的方法が、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットからなる群から選択される少なくとも一つの方法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法において使用するための検査用キットであって、ＥＧＦＲ１に親和性を有する抗体を含む、前記検査用キット。
【請求項１７】
ＥＧＦＲ１の発現量の測定が、ＥＧＦＲ１のリン酸化量を定量することにより行うものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＧＦＲ１のリン酸化量の定量が、免疫化学的方法、質量分析、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴからなる群から選択される少なくとも一つにより行うものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
免疫化学的方法が、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットからなる群から選択される少なくとも一つの方法である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法において使用するための検査用キットであって、リン酸化されたＥＧＦＲ１に親和性を有する抗体を含む、前記検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルホンアミド化合物またはその類縁体を作用させた時に腫瘍細胞に起こるＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（「ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １」および「ＥＧＦＲ１」と称する場合がある）の発現量の変化を評価することによる、当該スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法およびスルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査する方法ならびにこれらの方法において使用するための検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗癌剤の臨床治験においては、まず、第一相試験で毒性のプロフィールと最大推奨用量が決められ、次いで第二相試験で腫瘍縮小率を効果判定基準とするｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅにより薬剤としての評価がなされてきた。一方、近年の癌生物学の進展に伴い、細胞内情報伝達系や血管新生などを阻害する新しい作用機序を有する薬剤（新規抗癌剤）が、活発な研究開発の途にある。これら新規抗癌剤においては、必ずしも毒性用量に近い最大推奨用量が投与される必要性がない可能性が考えられる。さらに、腫瘍の縮小よりもむしろ腫瘍の増殖抑制に伴うＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）の改善や延命を指標にした方が薬剤の効果を適正に判定できるものと推測される。この場合、より論理的かつ具体的に薬剤の効果を確かめるためには、腫瘍の増殖抑制作用に密接に関連する生物学的マーカーの変化を、代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）マーカーとして利用することが望まれる。
一般的に、抗癌療法において、抗癌剤を投与した際の生体の反応性は、薬剤の標的となる腫瘍細胞の、その薬剤に対する感受性に大きく依存する。この腫瘍細胞の薬剤に対する感受性は、腫瘍細胞毎に大きく異なるものである。このような感受性の差は、その薬剤の標的分子あるいはそれに関連する因子の量的あるいは質的な差異、あるいは薬剤耐性の獲得等に起因する。このような背景を踏まえると、標的となる腫瘍細胞が薬剤に対して感受性を示す際に特異的に引き起こされる腫瘍細胞の変化を、バイオプシー等により取得した腫瘍組織等を用いて測定することができれば、これを代理マーカーとして、早期に薬剤の効果判定、治療法の確立、新たな治療法の選択等が可能となり、非常に有益である。また、治療に先立ってバイオプシー等により取得した腫瘍組織より、常法に従い腫瘍細胞を分離した後薬剤処理を行い、この腫瘍細胞が薬剤感受性であるか否かを上記生物学的マーカーの変化により測定すれば、予めその薬剤による治療が奏効するか否かを予測することが可能となり、臨床上極めて有用である。この代理マーカーは、その変化が抗腫瘍効果に特異的であることが重要であり、かつ高感度に測定可能であればよい。具体的には、薬剤の抗腫瘍効果に特異的な遺伝子発現変動の定量、それら遺伝子発現の変化に伴うタンパク質の量的変動の解析、さらにはその変化に伴う機能変化の解析等何れもがこの代理マーカーと成り得る。
近年、有用な抗腫瘍剤として、スルホンアミド化合物が報告されている（文献１−５）。特に、Ｎ−（３−クロロ−１Ｈ−インドール−７−イル）−１，４−ベンゼンジスルホンアミド（以下、「Ｅ７０７０」と称する場合がある）、Ｎ−（３−シアノ−４−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）−３−シアノベンゼンスルホンアミド（以下、Ｅ７８２０と称する場合がある）、Ｎ−［［（４−クロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−スルホンアミド（以下、ＬＹ１８６６４１と称する場合がある）、Ｎ−［［（３，４−ジクロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホンアミド（以下、ＬＹ２９５５０１と称する場合がある）、Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−４−クロロフェニルスルホンアミド（以下、ＬＹ−ＡＳＡＰと称する場合がある）、Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−５−ブロモチオフェン−２−スルホンアミド（以下、ＬＹ５７３６３６と称する場合がある）、２−スルファニルアミド−５−クロロキノキサリン（以下、ＣＱＳと称する場合がある）などは、種々のタイプの腫瘍に活性を示し非常に有用である。
また、前記スルホンアミド化合物は、いずれも同一または類似の作用および効果を示すことが報告されている（文献６−８）。
前記の有用な抗腫瘍剤の臨床開発を速やかに進行させて臨床治療法を早期に確立するために、さらには確立された治療法に基づき効率よく治療を進め、患者のＱＯＬ向上に貢献するために、抗腫瘍剤の投与時に特異的に使用できる代理マーカーを発見し、応用することが望まれる。
近年、前記スルホンアミド化合物に関する代理マーカーが報告されている（文献８、９）。すなわち、ＷＯ０２／４２４９３およびＷＯ２００６／０３６０２５に記載された遺伝子の発現の変化は、前記スルホンアミド化合物の抗腫瘍効果に関する代理マーカーとして有用であることが報告されている。
参照文献
（１）特開平７−１６５７０８号公報
（２）国際公開第００／５０３９５号パンフレット
（３）欧州特許出願公開第０２２２４７５号明細書
（４）国際公開第０２／０９８８４８号パンフレット
（５）国際公開第０３／０３５６２９号パンフレット
（６）国際公開第２００６／０３０９４１号パンフレット
（７）国際公開第２００６／０３０９４７号パンフレット
（８）国際公開第２００６／０３６０２５号パンフレット
（９）国際公開第０２／０４２４９３号パンフレット
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、腫瘍細胞に、抗腫瘍活性を有するスルホンアミド化合物を作用させた際に発現量が変化するタンパク質を見出し、このタンパク質を前記スルホンアミド化合物の抗腫瘍効果の代理マーカーとして用いることにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、Ｅ７８２０高感受性癌細胞株（ＰＣ９およびＨＣＴ１１６）、Ｅ７８２０低感受性癌細胞株（Ａ５４９およびＷｉＤｒ）について、Ｅ７８２０を処理した場合のＥＧＦＲ１の発現量の変化を調べたところ、Ｅ７８２０に対して高感受性の癌細胞株ではＥＧＦＲ１の発現量およびＥＧＦＲ１のリン酸化量が減少したのに対し、Ｅ７８２０に対して低感受性の癌細胞株ではＥＧＦＲ１の発現量がほとんど変化しないことを見出した。そして、これらの結果から、ＥＧＦＲ１の発現量は、Ｅ７８２０の作用の代理マーカーとなることが明らかになった。
また、Ｅ７０７０高感受性癌細胞株（ＨＣＴ１１６−Ｃ９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００２，１，２７５−２８６））について、Ｅ７０７０を処理した場合のＥＧＦＲ１の発現量の変化を調べたところ、Ｅ７０７０によりＥＧＦＲ１の発現量が減少した。
さらに、ＤＮＡマイクロアレイおよび癌細胞株パネルの実験において、Ｅ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳまたはこれらの組み合わせによる遺伝子変動パターンおよび細胞増殖抑制活性が、高い相関を示すことが報告されている（ＷＯ２００６／０３０９４１、ＷＯ２００６／０３０９４７、ＷＯ２００６／０３６０２５）。また、細胞増殖抑制活性を測定するアッセイにおいて、Ｅ７０７０に耐性を示す癌細胞株が、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳに交叉耐性を示すことが報告されている（ＷＯ２００６／０３０９４１、ＷＯ２００６／０３０９４７）。そして、Ｅ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳまたはこれらの組み合わせは、同一または類似の作用機序を有し、同一または類似の作用および効果をもたらすことが報告されている（ＷＯ２００６／０３０９４１、ＷＯ２００６／０３０９４７、ＷＯ２００６／０３６０２５）。
よって、スルホンアミド化合物、好ましくはＥ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳまたはこれらの組み合わせに対する腫瘍細胞の感受性は、スルホンアミド化合物の投与後に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、スルホンアミド化合物の投与前に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合、および／または癌患者より取り出された腫瘍細胞にスルホンアミド化合物を作用させた場合におけるＥＧＦＲ１の発現量を、無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該癌患者がスルホンアミド化合物に対して高感受性であると判断することができることを見出した。
また、スルホンアミド化合物、好ましくはＥ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳまたはこれらの組み合わせの抗腫瘍効果は、スルホンアミド化合物の投与後に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、スルホンアミド化合物の投与前に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、抗腫瘍効果を発揮していると判断することができることを見出した。
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）スルホンアミド化合物またはその類縁体に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法。
（２）スルホンアミド化合物またはその類縁体に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
（ａ）癌患者より取り出された腫瘍細胞を、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体で処理する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で処理した腫瘍細胞および無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｃ）工程（ａ）で処理した腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法。
（３）スルホンアミド化合物またはその類縁体に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
（ａ）癌患者に対し、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法。
（４）スルホンアミド化合物またはその類縁体に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法。
（５）スルホンアミド化合物またはその類縁体の抗腫瘍効果を検査する方法であって、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が抗腫瘍効果を発揮していると判定する工程と、
を含む、前記方法。
（６）スルホンアミド化合物またはその類縁体の抗腫瘍効果を検査する方法であって、
（ａ）癌患者に対し、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が抗腫瘍効果を発揮していると判定する工程と、
を含む、前記方法。
（７）スルホンアミド化合物またはその類縁体の抗腫瘍効果を検査する方法であって、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が抗腫瘍効果を発揮していると判定する工程と、
を含む、前記方法。
上記（１）〜（７）において、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体は、
一般式（Ｉ）
2007123274.tif 000002
［式中、
Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環を、
Ｂ環は、置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環を、
Ｗは、単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ１）−または酸素原子を、
Ｙは、炭素原子または窒素原子を、
Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）−または窒素原子を意味し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して同一または異なって水素原子または低級アルキル基を意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩ）
2007123274.tif 000003
［式中、Ｅは、−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−を、Ｄは、−ＣＨ２−または−Ｏ−を、Ｒ１ａは、水素原子またはハロゲン原子を、Ｒ２ａは、ハロゲン原子またはトリフルオロメチル基をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
一般式（ＩＩＩ）
2007123274.tif 000004
［式中、Ｊは、−Ｏ−または−ＮＨ−を、Ｒ１ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルキルチオ基、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アジド基、−Ｏ（ＳＯ２）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、水酸基、フェニル基、置換基を有するフェニル基、ピリジニル基、チエニル基、フリル基、キノリニル基またはトリアゾール基を、Ｒ２ｂは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、−ＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、Ｒ３ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基を、Ｒ４ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂの少なくとも一つは、水素原子である）を、Ｒ５ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、−ＣＦ３またはニトロ基を、Ｒ６ｂは、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ６ｂが置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基のとき、Ｒ５ｂは水素原子であり、Ｒ７ｂはハロゲン原子である）を、Ｒ７ｂは、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基または−ＣＦ３（但し、Ｒ５ｂまたはＲ７ｂのいずれか一方が、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ７ｂが、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基である場合には、Ｒ５ｂまたはＲ６ｂのいずれか一方が、水素原子である）をそれぞれ意味する。］
で表わされる化合物、
式（ＩＶ）
2007123274.tif 000005
で表わされる化合物および
式（Ｖ）
2007123274.tif 000006
で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物を挙げることができる。
また、本発明は、以下に関する。
（８）スルホンアミド化合物が、
Ｎ−（３−クロロ−１Ｈ−インドール−７−イル）−１，４−ベンゼンジスルホンアミド、
Ｎ−（３−シアノ−４−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）−３−シアノベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−［［（４−クロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−スルホンアミド、
Ｎ−［［（３，４−ジクロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホンアミド、
Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−４−クロロフェニルスルホンアミド、
Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−５−ブロモチオフェン−２−スルホンアミド
および
２−スルファニルアミド−５−クロロキノキサリン
からなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（９）スルホンアミド化合物が、Ｎ−（３−クロロ−１Ｈ−インドール−７−イル）−１，４−ベンゼンジスルホンアミド、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（１０）スルホンアミド化合物が、Ｎ−（３−シアノ−４−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）−３−シアノベンゼンスルホンアミド、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（１１）スルホンアミド化合物が、Ｎ−［［（３，４−ジクロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホンアミドおよびＮ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−５−ブロモチオフェン−２−スルホンアミドからなる群から選択される少なくとも一つの化合物、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（１２）スルホンアミド化合物が、Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−５−ブロモチオフェン−２−スルホンアミドのナトリウム塩である、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（１３）ＥＧＦＲ１の発現量の測定が、ＥＧＦＲ１のタンパク質を定量することにより行うものである、（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）タンパク質の定量が、免疫化学的方法、質量分析、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴからなる群から選択される少なくとも一つにより行うものである、（１３）に記載の方法。
（１５）免疫化学的方法が、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットからなる群から選択される少なくとも一つの方法である、（１４）に記載の方法。
（１６）（１３）に記載の方法において使用するための検査用キットであって、ＥＧＦＲ１に親和性を有する抗体を含む、前記検査用キット。
（１７）ＥＧＦＲ１の発現量の測定が、ＥＧＦＲ１のリン酸化量を定量することにより行うものである、（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）ＥＧＦＲ１のリン酸化量の定量が、免疫化学的方法、質量分析、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴからなる群から選択される少なくとも一つにより行うものである、（１７）に記載の方法。
（１９）免疫化学的方法が、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットからなる群から選択される少なくとも一つの方法である、（１８）に記載の方法。
（２０）（１７）に記載の方法において使用するための検査用キットであって、リン酸化されたＥＧＦＲ１に親和性を有する抗体を含む、前記検査用キット。
なお、スルホンアミド化合物を投与された癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量の変化を調べることにより、腫瘍細胞のスルホンアミド化合物に対する感受性を検査することができることについては、国際公開第０２／４２４９３号パンフレット（ＷＯ０２／４２４９３）および国際公開第２００６／０３６０２５号パンフレット（ＷＯ２００６／０３６０２５）には記載されていない。また、ＤＮＡマイクロアレイを使用して、腫瘍細胞においてスルホンアミド化合物により発現量が変化する遺伝子を網羅的に調べたにもかかわらず、スルホンアミド化合物によるＥＧＦＲ１の発現量の減少については見出せなかったものであり、当業者にとって極めて予測困難であると考えられる。
本発明により、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査することが可能となった。
より詳細には、本発明により、スルホンアミド化合物、好ましくはＥ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳまたはこれらの組み合わせに対する腫瘍細胞の感受性は、スルホンアミド化合物の投与後に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、スルホンアミド化合物の投与前に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量の変化を指標とすることにより、および／または癌患者より取り出された腫瘍細胞にスルホンアミド化合物を作用させた場合におけるＥＧＦＲ１の発現量を、無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量の変化を指標とすることにより、検査することが可能となった。
スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査することは、臨床において、より抗腫瘍効果を期待できる癌患者を選択することができるため、非常に有用である。
また、本発明により、スルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査することが可能となった。
より詳細には、本発明により、スルホンアミド化合物、好ましくはＥ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳまたはこれらの組み合わせの抗腫瘍効果は、スルホンアミド化合物の投与後に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、スルホンアミド化合物の投与前に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量の変化を指標とすることにより、検査することが可能となった。
スルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査することは、臨床において、適切な投与量等を決定する上で非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ヒト非小細胞肺癌細胞株（ＰＣ９）皮下移植モデルにおけるＥ７８２０の抗腫瘍効果を示す。
図２は、ヒト非小細胞肺癌細胞株（Ａ５４９）皮下移植モデルにおけるＥ７８２０の抗腫瘍効果を示す。
図３は、ヒト大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）皮下移植モデルにおけるＥ７８２０の抗腫瘍効果を示す。
図４は、ヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）皮下移植モデルにおけるＥ７８２０の抗腫瘍効果を示す。
図５は、ヒト非小細胞肺癌細胞株（ＰＣ９）皮下移植モデルにおけるＥ７８２０の抗腫瘍効果を免疫組織染色により示した写真である。（ａ）はｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧで染色したもの（ネガティブコントロール）であり、（ｂ）はＥ７８２０未投与群、（ｃ）はＥ７８２０投与群（２５ｍｇ／ｋｇ）、（ｄ）はＥ７８２０投与群（５０ｍｇ／ｋｇ）、（ｅ）はＥ７８２０投与群（１００ｍｇ／ｋｇ）、（ｆ）はＥ７８２０投与群（２００ｍｇ／ｋｇ）を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明する
ための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる日本出願特願２００６−１１７１８３号の開示内容を包含する。
１．スルホンアミド化合物
本発明において、スルホンアミド化合物またはその類縁体（以下、本明細書中では単に「スルホンアミド化合物」と記載する。）は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物を含む。
2007123274.tif 000007
上記一般式（Ｉ）において、
Ａ環は、置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環を、
Ｂ環は、置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環を、
Ｃ環は、置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環を、
Ｗは、単結合または−ＣＨ＝ＣＨ−を、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ１）−または酸素原子を、
Ｙは、炭素原子または窒素原子を、
Ｚは、−Ｎ（Ｒ２）−または窒素原子をそれぞれ意味する。
ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して同一または異なって水素原子または低級アルキル基をそれぞれ意味する。
本明細書において、「スルホンアミド化合物の類縁体」は、一般式（Ｉ）の化合物において、Ｘが酸素原子のときの化合物を意味する。
上記一般式（Ｉ）において、Ａ環の意味する「置換基を有していてもよい、単環式または二環式芳香環」とは、芳香族炭化水素、または窒素原子、酸素原子および硫黄原子のうち少なくとも１個を含む芳香族ヘテロ環であり、当該環上には置換基１〜３個があってもよいものを示す。Ａ環に含まれる主な芳香環を例示すると、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、チオフェン、フラン、チアゾール、オキサゾール、ベンゼン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、ナフタレン、キノリン、イソキノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、インドール、イソインドール、インドリジン、インダゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンズオキサゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾピラゾール、ベンゾチアゾールなどがあるが、Ａ環に含まれる芳香環はこれらに限定されるものではない。上記芳香環は置換基１〜３個を有していてもよく、置換基が複数個ある場合には、同一または異なっていてもよい。置換基としては、例えば、低級アルキル基または低級シクロアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、メルカプト基、シアノ基、低級アルキルチオ基、ハロゲン原子、式−ａ−ｂ［式中、ａは単結合、−（ＣＨ２）ｋ−、−Ｏ−（ＣＨ２）ｋ−、−Ｓ−（ＣＨ２）ｋ−または−Ｎ（Ｒ３）−（ＣＨ２）ｋ−を、ｋは１〜５の整数を、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基を、ｂは−ＣＨ２−ｄ（式中、ｄは低級アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、ハロゲン原子、水酸基、低級アルキルチオ基、シアノ基または低級アルコキシ基を意味する）を意味する］で示される基、式−ａ−ｅ−ｆ［式中、ａは前記と同じ意味であり、ｅは−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−を、ｆは低級アルキル基または低級アルコキシ基で置換されていてもよいアミノ基、低級アルキル基、トリフルオロメチル基、−（ＣＨ２）ｍ−ｂまたは−Ｎ（Ｒ４）−（ＣＨ２）ｍ−ｂ（式中、ｂは前記と同じ意味であり、Ｒ４は水素原子または低級アルキル基を、ｍは１〜５の整数を意味する）を意味する］で示される基、式−ａ−ｇ−ｈ［式中、ａは前記と同じ意味であり、ｇは−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｓ）−を、ｈは低級アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、水酸基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、−（ＣＨ２）ｎ−ｂまたは−Ｎ（Ｒ５）−（ＣＨ２）ｎ−ｂ（式中、ｂは前記と同じ意味であり、Ｒ５は水素原子または低級アルキル基を、ｎは１〜５の整数を意味する）を意味する］で示される基、式−ａ−Ｎ（Ｒ６）−ｇ−ｉ［式中、ａおよびｇは前記と同じ意味であり、Ｒ６は水素原子または低級アルキル基を、ｉは水素原子、低級アルコキシ基またはｆ（ｆは前記と同じ意味である）を意味する］で示される基、式−ａ−Ｎ（Ｒ７）−ｅ−ｆ（式中、ａ、ｅおよびｆは前記と同じ意味であり、Ｒ７は水素原子または低級アルキル基を意味する）で示される基、または式−（ＣＨ２）ｐ−ｊ−（ＣＨ２）ｑ−ｂ（式中、ｊは酸素原子または硫黄原子を意味し、ｂは前記と同じ意味であり、ｐおよびｑは同一または異なって１〜５の整数を意味する）で示される基などを挙げることができる。
上記置換基例において、アミノ基が２個のアルキル基で置換されている場合には、これらのアルキル基が結合して５または６員環を形成していてもよい。また、Ａ環が水酸基またはメルカプト基を有する含窒素ヘテロ環である場合には、これらの基が共鳴構造をとることにより、オキソ基またはチオキソ基の形になっていてもよい。
一般式（Ｉ）において、Ｂ環の意味する「置換基を有していてもよい、６員環式不飽和炭化水素またはヘテロ原子として窒素原子を１個含む不飽和６員ヘテロ環」は、例えば、不飽和結合の一部が水素化されていてもよい、ベンゼンまたはピリジンであり、当該環上に置換基を１または２個以上有していてもよく、置換基が２個以上ある場合には同一または異なっていてもよいものを示す。
Ｃ環の意味する「置換基を有していてもよい、窒素原子を１または２個含む５員ヘテロ環」とは、不飽和結合の一部が水素化されていてもよい、ピロール、ピラゾール、イミダゾールであり、当該環上に置換基１または２個を有していてもよく、置換基が２個ある場合には同一または異なっていてもよいものを示す。
Ｂ環およびＣ環が有していてもよい置換基としては、例えば、ハロゲン原子、シアノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、オキソ基、式−Ｃ（Ｏ）−ｒ（式中、ｒは水素原子、低級アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基または水酸基を意味する）、低級アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、トリフルオロメチル基などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２並びにＡ環、Ｂ環およびＣ環が有していてもよい置換基の定義中の「低級アルキル基」は、炭素数が１〜６の直鎖もしくは分枝状のアルキル基を意味し、例えば、これらに限定されるわけではないが、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基（アミル基）、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、１−エチルプロピル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１，２，２−トリメチルプロピル基、１−エチル−１−メチルプロピル基、１−エチル−２−メチルプロピル基などを意味する。これらのうち好ましい基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などを挙げることができ、これらのうち、より好ましい基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基を挙げることができ、最も好ましい基としてはメチル基を挙げることができる。
Ａ環が有していてもよい置換基の定義中の「低級シクロアルキル基」は、炭素数３〜８のシクロアルキル基を意味し、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。また、「低級アルキルチオ基」は、上記の低級アルキル基から誘導されるアルキルチオ基を意味し、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ−ブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
Ａ環、Ｂ環およびＣ環が有していてもよい置換基の定義中の「低級アルコキシ基」とは、これらに限定されるわけではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基など上記の低級アルキル基から誘導される低級アルコキシ基を意味するが、これらのうち最も好ましい基としてはメトキシ基、エトキシ基を挙げることができる。また、「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが挙げられる。
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、公知の方法で製造でき、例えば、国際公開第９５／０７２７６号パンフレット（ＷＯ９５／０７２７６）および／または特開平７−１６５７０８号公報（ＪＰ７−１６５７０８）に記載された方法によって製造することができる。
一般式（Ｉ）において、好ましい化合物は、Ｅ７０７０またはＥ７８２０である。
Ｅ７０７０とは、Ｎ−（３−クロロ−１Ｈ−インドール−７−イル）−１，４−ベンゼンジスルホンアミドをいい、その構造式を以下の式（ＶＩ）に示す。
2007123274.tif 000008
Ｅ７０７０は、公知の方法で製造でき、例えば、国際公開第９５／０７２７６号パンフレット（ＷＯ９５／０７２７６）および／または特開平７−１６５７０８号公報（ＪＰ７−１６５７０８）における実施例１９に記載された方法によって製造することができる。
なお、Ｅ７０７０は、Ｎ−（３−クロロ−１Ｈ−インドール−７−イル）−４−スルファモイルベンゼンスルホンアミドということもできる。
Ｅ７８２０とは、Ｎ−（３−シアノ−４−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）−３−シアノベンゼンスルホンアミドをいい、その構造式を以下の式（ＶＩＩ）に示す。
2007123274.tif 000009
Ｅ７８２０は、公知の方法で製造でき、例えば、国際公開第００／５０３９５号パンフレット（ＷＯ００／５０３９５）に記載された方法によって製造することができる。なお、Ｅ７８２０は、３‐シアノ‐Ｎ‐（３‐シアノ‐４‐メチル‐１Ｈ‐インドール‐７‐イル）ベンゼンスルホンアミドということもできる。
本発明において、スルホンアミド化合物は、下記の一般式（ＩＩ）で表される化合物を含む。
2007123274.tif 000010
上記一般式（ＩＩ）において、式中、Ｅは、−Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−を、Ｄは、−ＣＨ２−または−Ｏ−を、Ｒ１ａは、水素原子またはハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）を、Ｒ２ａは、ハロゲン原子またはトリフルオロメチル基をそれぞれ意味する。
本発明の一般式（ＩＩ）で表される化合物は、公知の方法により製造でき、例えば、欧州特許出願公開第０２２２４７５Ａ１号明細書（ＥＰ０２２２４７５Ａ１）に記載の方法によって製造することができる。
一般式（ＩＩ）において、好ましい化合物は、ＬＹ１８６６４１またはＬＹ２９５５０１である。
ＬＹ１８６６４１とは、Ｎ−［［（４−クロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−スルホンアミドをいい、その構造式を以下の式（ＶＩＩＩ）に示す。
2007123274.tif 000011
ＬＹ１８６６４１は、公知の方法で製造でき、例えば、欧州特許出願公開第０２２２４７５Ａ１号明細書（ＥＰ０２２２４７５Ａ１）に記載の方法で製造することができる。
本発明において、ＬＹ２９５５０１とは、Ｎ−［［（３，４−ジクロロフェニル）アミノ］カルボニル］−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホンアミドをいい、その構造式を以下の式（ＩＸ）に示す。
2007123274.tif 000012
ＬＹ２９５５０１は、公知の方法で製造でき、例えば、欧州特許出願公開第０２２２４７５Ａ１号明細書（ＥＰ０２２２４７５Ａ１）および／または欧州特許出願公開第０５５５０３６Ａ２号明細書（ＥＰ０５５５０３６Ａ２）に記載の方法で製造することができる。
また、本発明において、スルホンアミド化合物は、下記の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物を含む。
2007123274.tif 000013
一般式（ＩＩＩ）において、式中、Ｊは、−Ｏ−または−ＮＨ−を、Ｒ１ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルキルチオ基、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アジド基、−Ｏ（ＳＯ２）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、水酸基、フェニル基、置換基を有するフェニル基、ピリジニル基、チエニル基、フリル基、キノリニル基またはトリアゾール基を、Ｒ２ｂは、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、−ＣＦ３、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基、置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいキノリニル基を、Ｒ３ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ４アルコキシ基を、Ｒ４ｂは、水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂの少なくとも一つは、水素原子である）を、Ｒ５ｂは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、−ＣＦ３またはニトロ基を、Ｒ６ｂは、水素原子、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（但し、Ｒ６ｂが置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基のとき、Ｒ５ｂは水素原子であり、Ｒ７ｂはハロゲン原子である）を、Ｒ７ｂは、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基または−ＣＦ３（但し、Ｒ５ｂまたはＲ７ｂのいずれか一方が、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ７ｂが、ハロゲン原子または置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基である場合には、Ｒ５ｂまたはＲ６ｂのいずれか一方が、水素原子である）をそれぞれ意味する。
一般式（ＩＩＩ）において、「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であることが好ましい。
一般式（ＩＩＩ）において、「Ｃ１−Ｃ６アルキル基」は、前述の「低級アルキル基」と同じ意味であり、特に限定されるわけではないが、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等を挙げることができる。
一般式（ＩＩＩ）において、「Ｃ１−Ｃ４アルコキシ基」は、前述の「低級アルコキシ基」の中、炭素数が１〜４のアルコキシ基を意味し、特に限定されるわけではないが、好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等が挙げられる。
一般式（ＩＩＩ）において、「Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基」において、アルキル基は特に限定されるわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等を挙げることができる。
一般式（ＩＩＩ）において、「Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基」の例としては、特に限定されるわけではないが、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等を挙げることができる。
一般式（ＩＩＩ）において、導入される置換基としては、特に限定されるわけではないが、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等）、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等）、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）またはシリル基などの置換基を挙げることができる。
本発明の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物は、公知の方法により製造でき、例えば、国際公開第０２／０９８８４８号パンフレット（ＷＯ０２／０９８８４８）に記載の方法によって製造することができる。
一般式（ＩＩＩ）において、好ましい化合物はＬＹ−ＡＳＡＰである。
ＬＹ−ＡＳＡＰとは、Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−４−クロロフェニルスルホンアミドをいい、その構造式を以下の式（Ｘ）に示す。
2007123274.tif 000014
ＬＹ−ＡＳＡＰは、公知の方法で製造でき、例えば、国際公開第０２／０９８８４８号パンフレット（ＷＯ０２／０９８８４８）に記載の方法で製造することができる。
さらに、本発明において、スルホンアミド化合物には、ＬＹ５７３６３６を挙げることができる。本発明において、ＬＹ５７３６３６とは、Ｎ−（２，４−ジクロロベンゾイル）−５−ブロモチオフェン−２−スルホンアミドをいい、その構造式を以下の式（ＩＶ）に示す。
2007123274.tif 000015
ＬＹ５７３６３６は、ナトリウム塩であることが好ましい。
ＬＹ５７３６３６は、公知の方法で製造でき、例えば、国際公開第０２／０９８８４８号パンフレット（ＷＯ０２／０９８８４８）に記載の方法と同様にして、市販の５−ブロモチオフェン−２−スルフォニルクロライドと２，４−ジクロロ安息香酸より製造することができる。
また、ＬＹ５７３６３６は、国際公開第２００３／０３５６２９号パンフレット（ＷＯ２００３／０３５６２９）における実施例６３に記載の方法で製造することができる。
本発明において、スルホンアミド化合物には、ＣＱＳを挙げることができる。本発明において、ＣＱＳとは、２−スルファニルアミド−５−クロロキノキサリンをいい、その構造式を以下の式（Ｖ）に示す。
2007123274.tif 000016
ＣＱＳは、公知の方法で製造でき、例えば、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４７，７１，６−１０）の方法で製造することができる。
スルホンアミド化合物は、酸または塩基と薬理学的に許容される塩を形成する場合もある。本発明におけるスルホンアミド化合物は、これらの薬理学的に許容される塩をも包含する。酸との塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸塩や蟻酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸との塩を挙げることができる。また、塩基との塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、アルギニン、リジン等の有機塩基との塩（有機アミン塩）、アンモニウム塩を挙げることができる。
また、スルホンアミド化合物は、無水物であってもよく、水和物などの溶媒和物を形成していてもよい。溶媒和物は水和物または非水和物のいずれであってもよいが、水和物が好ましい。溶媒は水、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール）、ジメチルホルムアミドなどを使用することができる。
また、これら化合物の溶媒和物および／または光学異性体が存在する場合には、本発明におけるスルホンアミド化合物は、それらの溶媒和物および／または光学異性体が含まれる。また、本発明におけるスルホンアミド化合物は、生体内で酸化、還元、加水分解、抱合などの代謝を受けるスルホンアミド化合物をも包含する。またさらに、本発明におけるスルホンアミド化合物は、生体内で酸化、還元、加水分解などの代謝を受けてスルホンアミド化合物を生成する化合物をも包含する。
本発明において、スルホンアミド化合物は、一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）からなる群から選択されるいずれかの化合物であり、好ましくはＥ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６およびＣＱＳからなる群から選択される少なくとも一つの化合物であり、より好ましくはＥ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ２９５５０１およびＬＹ５７３６３６からなる群から選択される少なくとも一つの化合物であり、特に好ましくはＥ７８２０である。
２．感受性を検査する方法
本発明により、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法が提供される。
本発明の第一の態様は、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物の投与前後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物の投与後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法である。
本発明において、スルホンアミド化合物は、そのまま用いてもよく、医薬組成物としてもよい。医薬組成物は、前記スルホンアミド化合物を含有する医薬組成物であれば、特に限定されない。
前記医薬組成物としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤等の経口剤、坐剤、軟膏剤、眼軟膏剤、テープ剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の外用剤および注射剤などを挙げることができる。
癌患者よりスルホンアミド化合物の投与前後に取り出された腫瘍細胞は、スルホンアミド化合物を、腫瘍細胞の感受性が測定可能となる量で投与された癌患者から、その投与の前後において取り出された腫瘍細胞であればよい。
スルホンアミド化合物の投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類、有効成分の種類等によって異なり、特に限定されないが、例えば、通常成人（体重６０Ｋｇ）１日あたり１０〜６０００ｍｇ、好ましくは３０〜４０００ｍｇ、さらに好ましくは５０〜２０００ｍｇであり、これを通常１日１〜３回に分けて投与することができる。
腫瘍細胞は、例えば、癌患者より外科的処置（例えば、バイオプシーなど）あるいは、採血にて得ることができる。
また、腫瘍細胞には、血液中の腫瘍細胞も含まれる。
なお、癌患者から採取される腫瘍細胞の量は、ＥＧＦＲ１の発現量を測定できる量であればよい。
腫瘍の種類は、例えば、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸または十二指腸の癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫など）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ）など）及びメラノーマなどを挙げることができ、好ましくは大腸癌、非小細胞肺癌および膵癌である。
ここで、「ＥＧＦＲ１」とはＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １であり（「ｅｒｂＢ１」または「ＨＥＲ１」ともいう。）、１７０ｋＤａの膜一回貫通型チロシンキナーゼの一つとして、当業者にとって周知のものである（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．，１１，１８４−１８９，１９９９．）。
ＥＧＦＲ１は、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることができる（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号：ＮＭ＿００５２２８）。また、ＥＧＦＲ１には、多くの変異が報告されている（Ｎｅｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．，３７，１３１５−１３１６，２００５．，Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．，３６，１１２７−１１３４，２００５．）。そのため、本発明において、ＥＧＦＲ１には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１または複数個（例えば、１個または数個）のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１または複数個（例えば、１個または数個）のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、例えば、
（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列、
などが挙げられる。
ここで、アミノ酸の「欠失」は、配列中のアミノ酸残基の一つ以上が欠失した変異を意味し、欠失には、アミノ酸配列の端からアミノ酸残基が欠失したものおよびアミノ酸配列の途中のアミノ酸残基が欠失したものが含まれる。
ここで、アミノ酸の「付加」は、配列中にアミノ酸残基の一つ以上が付加された変異を意味し、付加には、アミノ酸配列の端にアミノ酸残基が付加されたものおよびアミノ酸配列の途中にアミノ酸残基を付加されたものが含まれる。なお途中に付加されたものは、「挿入」ということもできる。
ここで、アミノ酸の「置換」は、配列中のアミノ酸残基の一つ以上が、異なる種類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。
ＥＧＦＲ１の発現量の測定方法は、公知の方法で行うことができ、例えば、免疫化学的方法（例えば、免疫組織化学的方法、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡなど）、質量分析による方法などがあげられ、好ましくは免疫化学的方法であり、より好ましくは免疫組織化学的方法、ウエスタンブロット、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡであり、特に好ましくは免疫組織化学的方法、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットである。これらの方法は、常法に従い行うことができる。
ＥＧＦＲ１の発現量は、例えば、腫瘍中の単位体積あたりのＥＧＦＲ１量、単位重量あたりのＥＧＦＲ１量および腫瘍細胞あたりのＥＧＦＲ１量などとして算出することができる。
また、細胞に恒常的に発現するタンパク質の発現量を指標としてＥＧＦＲ１の発現量を算出することができる。細胞に恒常的に発現するタンパク質は、例えば、β−ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨなどを挙げることができる。細胞に恒常的に発現するタンパク質の発現量は、ＥＧＦＲ１の発現量の測定方法と同様にして算出することができる。
この場合には、ＥＧＦＲ１の発現量は、細胞に恒常的に発現するタンパク質の発現量あたりのＥＧＦＲ１量として算出することができる。
以下、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量の測定方法の一例について記載する。
腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量は、ウエスタンブロットにより測定することができる。
ウエスタンブロットは、常法に従い行うことができる（細胞工学別冊  目で見る実験ノートシリーズ  バイオ実験イラストレイテッド  ５巻  タンパクなんてこわくない  第１章  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｐ１３−ｐ６２、第４章  ウエスタンブロッティングｐ１０５−ｐ１２６、秀潤社、１９９７）。
初めに、癌患者より取り出された腫瘍細胞の細胞溶解液を作成する。腫瘍細胞の細胞溶解液は、常法に従い調製することができる。腫瘍細胞の細胞溶解液は、腫瘍細胞に対し、例えば、各種プロテアーゼ阻害剤（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，ｐ−ＡＰＭＳＦ，ＥＤＴＡ，ｏ−ＮａＶＯ４）及び１０％グリセロール含有の細胞溶解液などを加えることにより得ることができる。
次に、腫瘍細胞の細胞溶解液について、ウエスタンブロットを行うことができる。
その一例として、まず、腫瘍細胞の細胞溶解液に、例えば、ＳＤＳサンプルバッファーなどに添加する。そして、当該試料を常法に従い電気泳動を行う。電気泳動は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、２次元電気泳動などがあげられ、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥである。電気泳動後、常法に従いメンブレンに転写することができる。メンブレンは、例えば、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレンなどがあげられ、好ましくはＰＶＤＦメンブレンである。
次に、メンブレンは、例えば、ＢＳＡ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ｔｗｅｅｎ２０、スキムミルク（Ｓｋｉｍｍｉｌｋ）、カゼインなどを含む溶液により前処理することができる。前処理の方法は、特に限定されず、使用する抗体に応じて適宜選択することができる。
次に、前処理したメンブレンに、ＥＧＦＲ１に親和性を有する抗体（以下、「抗ＥＧＦＲ１抗体」と称する場合がある）を接触させる。抗ＥＧＦＲ１抗体は、市販のもの（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社など）を使用してもよく、作成してもよい。また、抗ＥＧＦＲ１抗体は、標識物質により標識されていてもよく、標識されていなくてもよい。抗ＥＧＦＲ１抗体が標識されていない場合には、当該抗ＥＧＦＲ１抗体を認識する抗体（以下、「二次抗体」と称する場合がある）を接触させることができる。二次抗体は、標識物質により標識されていることが好ましい。標識物質は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰｈａｒＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなどの蛍光物質およびビオチンなどがあげられる。標識物質がビオチンである場合には、さらに、アビジン、ストレプトアビジンなどを接触させることができる。当該アビジン、ストレプトアビジンなどは、標識物質により標識されていることが好ましい。標識物質は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰｈａｒＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなどの蛍光物質があげられる。反応の諸条件（例えば、反応溶液、抗体濃度、反応時間、反応温度、洗浄操作など）は、使用する抗体に応じて適宜選択することができる。
標識物質が酵素である場合には、基質および／または発色試薬をメンブレンに接触させて発色させ、当該発色を観察することにより、ＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
酵素がペルオキシダーゼの場合は、例えば、基質としてＨ２Ｏ２などを、発色試薬としてジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＢ）などを組織切片に接触させることができる。
酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、例えば、基質として５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅなどを、発色試薬としてニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ）などを組織切片に接触させることができる。また、酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、例えば、発色基質としてＣＳＰＤ（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ［１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３．７］ｄｅｃａｎ］−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などを組織切片に接触させることにより化学発光反応を行うこともできる。
また、標識物質が蛍光物質の場合には、励起光を組織切片に照射して発光させ、当該蛍光を観察することにより、ＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
このようにして、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
また、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する方法の別の一例を以下に記載する。
腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量は、抗ＥＧＦＲ１抗体を用いて免疫組織化学的方法により測定することができる。
免疫組織化学的方法は、常法に従い行うことができる（細胞工学別冊  目で見る実験ノートシリーズ  バイオ実験イラストレイテッド  ５巻  タンパクなんてこわくない  第５章  免疫染色  ｐ１２７−ｐ１６３、秀潤社、１９９７）。
初めに、癌患者より取り出された腫瘍の組織切片を作成する。組織切片は、例えば、凍結切片、パラフィン切片などがあげられる。
癌患者より取り出された腫瘍は、例えば、未処理でもよく、固定化処理を行ってもよい。また、当該腫瘍は、例えば、ＯＣＴコンパウンドなどにより包埋することができる。
固定化処理は、ホルムアルデヒド、好ましくは４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）で固定化処理することができ、その後、２０％ショ糖／リン酸緩衝液等で置換することができる。
これらの諸条件は、使用する抗体等に応じて適宜選択することができる。
組織切片は、スライドガラスに保持し、染色が可能な状態に前処理することができる。
前処理の方法は、特に限定されず、使用する抗体に応じて適宜選択すればよい。組織切片は、例えば、キシレン、ホルムアルデヒド、アセトン、メタノールなどを含む溶液により前処理することができる。また、組織切片は、例えば、ＢＳＡ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ｔｗｅｅｎ２０、スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）、カゼインなどを含む溶液により前処理することも可能である。
次に、前処理した組織切片に抗ＥＧＦＲ１抗体を接触させる。抗ＥＧＦＲ１抗体は、市販のものを使用してもよく、作成してもよい。また、抗ＥＧＦＲ１抗体は、標識物質により標識されていてもよく、標識されていなくてもよい。抗ＥＧＦＲ１抗体が標識されていない場合には、当該抗ＥＧＦＲ１抗体を認識する抗体（以下、「二次抗体」と称する場合がある）を接触させることができる。二次抗体は、標識物質により標識されていることが好ましい。標識物質は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰｈａｒＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなどの蛍光物質およびビオチンなどがあげられる。標識物質がビオチンである場合には、さらに、アビジン、ストレプトアビジンなどを接触させることができる。当該アビジン、ストレプトアビジンなどは、標識物質により標識されていることが好ましい。標識物質は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰｈａｒＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなどの蛍光物質があげられる。反応の諸条件（例えば、反応溶液、抗体濃度、反応時間、反応温度、洗浄操作など）は、使用する抗体等に応じて適宜選択することができる。
標識物質が酵素である場合には、基質および／または発色試薬を組織切片に接触させて発色させ、当該発色を観察することにより、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
酵素がペルオキシダーゼの場合は、例えば、基質としてＨ２Ｏ２などを、発色試薬としてジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＢ）などを組織切片に接触させることができる。
酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、例えば、基質として５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅなどを、発色試薬としてニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ）などを組織切片に接触させることができる。また、酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、例えば、発色基質としてＣＳＰＤ（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ［１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３．７］ｄｅｃａｎ］−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などを組織切片に接触させることにより化学発光反応を行うこともできる。
また、標識物質が蛍光物質の場合には、励起光を組織切片に照射して発光させ、当該蛍光を観察することにより、ＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
このようにして、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
また、前記処理をした組織切片は、ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて核染色を行うことができる。
さらに、前記処理をした組織切片は、水溶性封入剤で封入することができる。
また、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する方法の別の一例を以下に記載する。
腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量は、抗ＥＧＦＲ１抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定することができる。
フローサイトメトリーは、常法に従い行うことができる。
癌患者よりバイオプシー等で得られた癌組織から、常法に従い腫瘍細胞を分離することができる。例えば、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，３８，３４３８−３４４３，１９７８）に従い、得られた組織を無菌的に細切し、その後ステンレスメッシュ、注射針、さらにはナイロンメッシュ等を用いて細胞の懸濁液を調製することができる。
次に、得られた腫瘍細胞に抗ＥＧＦＲ１抗体を接触させる。抗ＥＧＦＲ１抗体は、市販のものを使用してもよく、作成してもよい。また、抗ＥＧＦＲ１抗体は、標識物質により標識されていてもよく、標識されていなくてもよい。抗ＥＧＦＲ１抗体が標識されていない場合には、当該抗ＥＧＦＲ１抗体を認識する抗体（以下、「二次抗体」と称する場合がある）を接触させることができる。二次抗体は、標識物質により標識されていることが好ましい。標識物質は、例えば、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰｈａｒＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなどの蛍光物質およびビオチンなどがあげられる。標識物質がビオチンである場合には、さらに、アビジン、ストレプトアビジンなどを接触させることができる。当該アビジン、ストレプトアビジンなどは、標識物質により標識されていることが好ましい。標識物質は、例えば、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰｈａｒＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなどの蛍光物質があげられる。また、細胞は、未処理でもよく、固定化処理を行ってもよい。固定化処理は、例えば、メタノール、アセトン、ホルムアルデヒド、好ましくは４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）などにより行うことができる。反応の諸条件（例えば、反応溶液、抗体濃度、反応時間、反応温度、洗浄操作、固定化処理など）は、使用する抗体等に応じて適宜選択することができる。
そして、フローサイトメトリーにて、腫瘍細胞における蛍光強度を測定することにより、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
また、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する方法の別の一例を以下に記載する。
腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量は、抗ＥＧＦＲ１抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定することができる。
ＥＬＩＳＡは、常法に従い行うことができる。また、市販の測定キットを使用することができる（例えば、ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社など）。
初めに、癌患者より取り出された腫瘍細胞の細胞溶解液を作成する。腫瘍細胞の細胞溶解液は、常法に従い調製することができる。腫瘍細胞の細胞溶解液は、腫瘍細胞に対し、例えば、各種プロテアーゼ阻害剤（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，ｐ−ＡＰＭＳＦ，ＥＤＴＡ，ｏ−ＮａＶＯ４）及び１０％グリセロール含有の細胞溶解液などを加えることにより得ることができる。
次に、腫瘍細胞の細胞溶解液について、ＥＬＩＳＡを行うことができる。
まず、細胞溶解液をプレート（例えば、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ、３８４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅなど）へ添加する。プレートは、特に限定されないが、好ましくは抗ＥＧＦＲ１抗体が固相化されたプレートである。また、細胞溶解液と別のウェルにＥＧＦＲ１の標準品を加えておくことが好ましい。次に、抗ＥＧＦＲ１抗体を各ウェルに添加する。抗ＥＧＦＲ１抗体は、市販のものを使用してもよく、作成してもよい。また、抗ＥＧＦＲ１抗体は、標識物質により標識されていてもよく、標識されていなくてもよい。抗ＥＧＦＲ１抗体が標識されていない場合には、当該抗ＥＧＦＲ１抗体を認識する抗体（以下、「二次抗体」と称する場合がある）を接触させることができる。二次抗体は、標識物質により標識されていることが好ましい。標識物質は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰｈａｒＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなどの蛍光物質およびビオチンなどがあげられる。標識物質がビオチンである場合には、さらに、アビジン、ストレプトアビジンなどを接触させることができる。当該アビジン、ストレプトアビジンなどは、標識物質により標識されていることが好ましい。標識物質は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰｈａｒＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなどの蛍光物質があげられる。反応の諸条件（例えば、反応溶液、抗体濃度、反応時間、反応温度、洗浄操作など）は、使用する抗体に応じて適宜選択することができる。
標識物質が酵素である場合には、基質および／または発色試薬をメンブレンに接触させて発色させ、当該発色を観察することにより、ＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
酵素がペルオキシダーゼの場合は、例えば、基質としてＨ２Ｏ２などを、発色試薬としてジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＲ）などを組織切片に接触させることができる。
酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、例えば、基質として５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅなどを、発色試薬としてニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ）などを組織切片に接触させることができる。また、酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、例えば、発色基質としてＣＳＰＤ（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ［１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３．７］ｄｅｃａｎ］−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などを組織切片に接触させることにより化学発光反応を行うこともできる。
また、標識物質が蛍光物質の場合には、励起光を組織切片に照射して発光させ、当該蛍光を観察することにより、ＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
このようにして、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
なお、本明細書において、ＥＧＦＲ１の発現量を測定するために抗ＥＧＦＲ１抗体を使用する方法について説明したが、本発明では、抗ＥＧＦＲ１抗体の代わりにリン酸化されたＥＧＦＲ１に親和性を有する抗体（以下、「抗リン酸化ＥＧＦＲ１抗体」と称する場合がある）を使用してＥＧＦＲ１のリン酸化量を定量することによりＥＧＦＲ１の発現量を測定することもできる。抗リン酸化ＥＧＦＲ１抗体は、市販のもの（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社など）を使用してもよく、作成してもよい。
さらに、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量は、質量分析（例えば、ＷＯ２００５／０５０１８８に記載の方法）によっても測定することができる。この場合、抗ＥＧＦＲ１抗体や抗リン酸化ＥＧＦＲ１抗体を用いて、定法に従って操作することによりＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
また、本発明の第二の態様は、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
（ａ）癌患者より取り出された腫瘍細胞を、前記スルホンアミド化合物で処理する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で処理した腫瘍細胞および無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｃ）工程（ａ）で処理した腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物に対して高感受性であると判定する工程と、を含む、前記方法である。
本態様において、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する際に用いる、癌患者より取り出された腫瘍細胞は、採取後に培養して前記スルホンアミド化合物で処理する腫瘍細胞と、無処理の腫瘍細胞を用意することができる。腫瘍細胞をスルホンアミド化合物で処理する場合は、例えば、細胞１×１０６個に対して、０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭ、さらに好ましくは０．３〜３μＭの前記化合物を接触させる。無処理の腫瘍細胞は、当該化合物で処理していない細胞である。スルホンアミド化合物で当該腫瘍細胞を処理する場合の条件として、処理時間は、例えば、３〜７２時間、好ましくは６〜４８時間、より好ましくは１２〜２４時間であり、温度は、例えば、２５〜３８℃、好ましくは３７℃である。
本態様において、癌患者より取り出された腫瘍細胞は、癌患者よりバイオプシー等で得られた癌組織から、常法に従い分離することができる。例えば、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，３８，３４３８−３４４３，１９７８）に従い、得られた組織を無菌的に細切し、その後ステンレスメッシュ、注射針、さらにはナイロンメッシュ等を用いて細胞の懸濁液を調製する。こうして得られた細胞を適当な培地（例えば、１０〜１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０、ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ培地等）に培養することができる。なお、使用するバイオプシー等で得られた組織中から軟寒天培養法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７，４６１−４６３，１９７７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．，６０，８４６−８５４，１９７７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ．Ａｍｅｒｉｃａｎ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，２０，５１，１９７９）を用いて、腫瘍細胞のみを特異的に分離して用いることも可能である。
ＥＧＦＲ１の発現量の測定方法は、公知の方法で行うことができ、例えば、免疫化学的方法（例えば、免疫組織化学的方法、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡなど）、質量分析による方法などがあげられ、好ましくは免疫化学的方法であり、より好ましくはフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡであり、特に好ましくはフローサイトメトリーである。これらの方法は、常法に従い行うことができる。
ＥＧＦＲ１の発現量は、例えば、腫瘍中の単位体積あたりのＥＧＦＲ１量、単位重量あたりのＥＧＦＲ１量および腫瘍細胞あたりのＥＧＦＲ１量などとして算出することができる。
本発明において、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物に対して高感受性であると判定することができる。
詳しくは、本発明において、スルホンアミド化合物の投与後に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、スルホンアミド化合物の投与前に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合、および／または癌患者より取り出された腫瘍細胞にスルホンアミド化合物を作用させた場合におけるＥＧＦＲ１の発現量を、無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該癌患者がスルホンアミド化合物に対して高感受性であると判断することができる。
ＥＧＦＲ１の発現量は、１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．８倍以上、特に好ましくは２．０倍以上減少した場合に、ＥＧＦＲ１の発現量が「減少」したと判断することができる。当該減少の程度は上記のほか、例えば２．５倍以上、３．０倍以上、３．５倍以上、４．０倍以上であってもよい。
本発明において、腫瘍細胞がスルホンアミド化合物に対して高感受性であると判断されたときは、スルホンアミド化合物は、当該腫瘍細胞を有する癌患者に対して、より抗腫瘍効果を有すると判断することができる。より抗腫瘍効果を有する場合として、例えば、同様の症状の患者における平均的な抗腫瘍効果よりも高い抗腫瘍効果を期待できる場合、同一の癌種に罹患した他の患者よりも高い抗腫瘍効果を期待できる場合、または他の癌種に罹患した患者よりも高い抗腫瘍効果を期待できる場合などをあげることができる。このように、より抗腫瘍効果を有するか否かを判断することは、臨床において、より抗腫瘍効果を期待できる癌患者を選択することができるため、非常に有用である。
また、本発明の第三の態様は、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
（ａ）癌患者に対し、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法である。
本態様では、癌患者から組織細胞を取り出すことなく、スルホンアミド化合物に対する感受性を測定することができる。具体的には、ＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程において、患者にスルホンアミド化合物を投与する前後において、陽電子放出核種または放射性物質が標識された抗ＥＧＦＲ１抗体を投与し、標識された抗ＥＧＦＲ１抗体の発現量をＰＥＴ（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）装置やＳＰＥＣＴ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）装置などの核医学検査装置を用いて検出することで、スルホンアミド化合物を投与する前後の患者の体内におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
また、本発明の第四の態様は、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法であって、
（ａ）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、当該腫瘍細胞が前記スルホンアミド化合物またはその類縁体に対して高感受性であると判定する工程と、
を含む、前記方法である。
ここで、ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１とは、血液中に存在するＥＧＦＲ１のアイソフォームであり、ＥＧＦＲ１を構成する膜外領域部分のタンパク質である。
本態様はＡ．Ｔ．Ｂａｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１９：２３−４３，１９９８らにより報告された血液中にｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１が存在するという事実に基づき、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と同様に、血液中に存在するｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を算出することによっても、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査可能にしたものである。
なお、血液中に存在するｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量は、癌患者から採取された血液に対してｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を本発明の第一の態様において用いたＥＧＦＲ１の発現量の測定方法と同様の手法を用いて測定することで算出可能であり、好ましくはＥＬＩＳＡである。
血液中に存在するｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１は、例えば、血液の単位体積あたりのｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１量、単位重量あたりのｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１量などとして算出することができる。
ＥＬＩＳＡにより血液中に存在するｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を測定する場合には、血液から血清を分離した後、必要に応じてこれを適当に希釈する。この希釈液に対し、市販の測定キットを使用することができる（例えば、ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社など）。また、常法に従い、本発明の第一の態様と同様に酵素反応による発色や励起光照射による蛍光を観察することで血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を測定することができる。
また、本発明の第一、第三および第四の態様において、腫瘍細胞がスルホンアミド化合物に対して高感受性であると判断されたときは、スルホンアミド化合物は、当該腫瘍細胞を有する癌患者に対して抗腫瘍効果を有していると判断することができる。そのため、本発明は、スルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査する方法をも提供する。
すなわち、本発明の第五の態様は、スルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査する方法であって、
（ａ−１）癌患者より前記スルホンアミド化合物の投与前後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ−１）前記スルホンアミド化合物の投与後に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、前記スルホンアミド化合物が抗腫瘍効果を発揮していると判定する工程と、
を含む、前記方法、
（ａ−２）癌患者に対し、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ−２）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が抗腫瘍効果を発揮していると判定する工程と、
を含む、前記方法、または、
（ａ−３）癌患者より前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与前後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を測定する工程と、
（ｂ−３）前記スルホンアミド化合物またはその類縁体の投与後に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量を、前記化合物の投与前に取り出された血液におけるｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍのＥＧＦＲ１の発現量が減少した場合に、前記スルホンアミド化合物またはその類縁体が抗腫瘍効果を発揮していると判定する工程と、
を含む、前記方法である。
このように、短期に抗腫瘍効果を有しているか否かを判断することは、臨床において、適切な投与量等を決定する上で非常に有用である。
３．検査用キット
本発明は、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法および／またはスルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査する方法において使用するための、ＥＧＦＲ１に親和性を有する抗体（「抗ＥＧＦＲ１抗体」ともいう）および／またはリン酸化されたＥＧＦＲ１に親和性を有する抗体（「抗リン酸化ＥＧＦＲ１抗体」ともいう）を含む、検査用キットを提供する。抗体は、常法に従い作製することができる。また、市販の抗ＥＧＦＲ１抗体（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社など）および／または抗リン酸化ＥＧＦＲ１抗体（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社など）を購入してもよい。本発明の検査用キットは、上記抗体に加えて、一般の測定において慣用的な成分を含んでいてもよい。また、本発明の検査用キットは、上記抗体に加えて、抗ＥＧＦＲ１抗体および／または抗リン酸化ＥＧＦＲ１抗体をスルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査する方法および／またはスルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査する方法に使用することを記載した取扱説明書、添付文書等を含んでいてもよい。
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ヒト癌細胞株皮下移植モデル（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるＥ７８２０の抗腫瘍効果
ヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９（免疫生物研究所より入手）、ヒト非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９（大日本製薬より入手）、ヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒ（大日本製薬より入手）またはヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣより入手）を３７℃下、５％炭酸ガスインキュベーター内においてＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ含）で約８０％コンフルレントとなるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡにより、各細胞を回収した。ＰＣ９、ＷｉＤｒまたはＨＣＴ１１６についてはリン酸緩衝液で、Ａ５４９については５０％マトリゲル含有リン酸緩衝液で、それぞれ５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ懸濁液を調製した。そして、得られた細胞懸濁液を０．１ｍｌずつヌードマウス体側皮下に移植した。
次に、ＰＣ９については、移植８日目より、Ｅ７８２０を５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ、１日２回、１４日間のスケジュールで経口投与した。また、Ａ５４９については、移植２４日目より、Ｅ７８２０を５０ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ、１日２回、７日間のスケジュールで経口投与した。さらに、ＷｉＤｒについては、移植１１日目より、Ｅ７８２０を５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ、１日２回、１４日間のスケジュールで経口投与した。また、ＨＣＴ１１６については、移植２３日目より、Ｅ７８２０を６．２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ、１日２回、１４日間のスケジュールで経口投与した。
腫瘍長径および短径をデジマチックキャリパ（Ｍｉｔｓｕｔｏｙｏ）で測定し、以下の式で腫瘍体積、比腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ＴＶ）＝腫瘍長径（ｍｍ）×腫瘍短径２（ｍｍ２）／２
比腫瘍体積（ＲＴＶ）＝測定日の腫瘍体積／投与開始日の腫瘍体積
その結果、Ｅ７８２０は、いずれのヒト癌細胞株に対しても抗腫瘍効果を示したものの、その効果の程度については差異が認められた（図１−４）。すなわち、Ｅ７８２０は、Ａ５４９およびＷｉＤｒに比べて、ＰＣ９およびＨＣＴ１１６に対して、より強力な抗腫瘍効果を示した。
【実施例２】
【０００７】
ヒト癌細胞株培養下（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるＥＧＦＲ１の発現量に対するＥ７８２０の効果（フローサイトメトリー）
ＰＣ９またはＡ５４９をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ含）に懸濁し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。次に、本懸濁液１ｍｌを６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに加え、３７℃下５％炭酸ガスインキュベーター内にて培養した。翌日、当該細胞に各濃度（０−２０μＭ）のＥ７８２０希釈培養液１ｍｌを各ｗｅｌｌに加えて培養を続けた。培養２日後に、常法に従いトリプシン−ＥＤＴＡにより細胞を回収し、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳに懸濁した。その後、当該懸濁液に抗ＥＧＦＲ１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、４℃、３０分間インキュベートした。そして、常法に従いＰＢＳによる遠心および洗浄により過剰な抗体を除去した。その後、当該懸濁液にＲＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、４℃、３０分間インキュベートした。そして、常法に従いＰＢＳによる遠心および洗浄により過剰な抗体を除去した。そして、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（日本ベクトン・ディッキンソン）にて、ＰＣ９およびＡ５４９におけるＥＧＦＲ１の発現量を測定した。
その結果、Ｅ７８２０は、用量依存的にヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９におけるＥＧＦＲ１の発現量を強力に減少させた（表１）。一方、Ｅ７８２０は、ヒト非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９におけるＥＧＦＲ１の発現量をわずかに減少させた（表１）。すなわち、Ｅ７８２０は、低感受性癌細胞株（Ａ５４９）に比べて、高感受性癌細胞株（ＰＣ９）に対して、より強力にＥＧＦＲ１の発現量を減少させた。
【表１】
2007123274.tif 000017
表１は、ヒト非小細胞肺癌細胞株（ＰＣ９またはＡ５４９）培養下におけるＥＧＦＲ１の発現量に対するＥ７８２０の効果を示す。
以上の結果から、ＥＧＦＲ１の発現量を指標とすることにより、Ｅ７８２０に対する腫瘍細胞の感受性を検査できることが明らかになった。
【実施例３】
【０００８】
ヒト癌細胞株皮下移植モデル（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるＥＧＦＲ１の発現量に対するＥ７８２０の効果（ウエスタンブロット）
ＰＣ９を５％炭酸ガスインキュベーター内においてＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ含）で約８０％コンフルレントとなるまで培養した。そして、常法に従いトリプシン−ＥＤＴＡにより、細胞を回収し、リン酸緩衝液で５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁液を調製した。そして、当該懸濁液を０．１ｍｌずつヌードマウスの体側皮下に移植した。移植後８日目より、Ｅ７８２０を５０ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ、１日２回、１週間のスケジュールで経口投与した。投与開始１週間後、腫瘍を摘出し、各種プロテアーゼ阻害剤及び１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有の細胞溶解液により、氷冷下で腫瘍溶解液を調製した。それぞれの腫瘍溶解液について、同量のタンパク質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画し、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ、アマシャムバイオサイエンス社）にトランスファーした。そして、常法に従い抗ＥＧＦＲ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または抗ＥＧＦＲ１  ｐＹ１０６８抗体（抗リン酸化ＥＧＦＲ１抗体）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用してウエスタンブロットを行った。
各バンドの検出および定量は、次のように行った。まず、各バンドをＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ）で化学発色させ、Ｉｍａｇｅ  ＭａｓｔｅｒＶＤＳ−ＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，東京）にてデジタル画像として取り込んだ。そして、デジタル画像をＴＩＦファイルとして保存し、各バンドをＩｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒｔｏｔａｌ  Ｌａｂ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．００，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，東京）にて数値化した。
その結果、移植腫瘍においても、Ｅ７８２０は、用量依存的にヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９におけるＥＧＦＲ１の発現量を減少させ、ＥＧＦＲ１のリン酸化を抑制した（表２）。
【表２】
2007123274.tif 000018
表２は、ヒト非小細胞肺癌細胞株（ＰＣ９）皮下移植モデルにおけるＥＧＦＲ１の発現量およびＥＧＦＲ１のリン酸化量に対するＥ７８２０の効果を示す。
以上の結果から、ＥＧＦＲ１の発現量および／またはＥＧＦＲ１のリン酸化量を指標とすることにより、Ｅ７８２０に対する腫瘍細胞の感受性および／またはＥ７８２０の抗腫瘍効果を検査できることが明らかになった。
【実施例４】
【０００９】
ヒト癌細胞株皮下移植モデル（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるＥＧＦＲ１の発現量に対するＥ７８２０の効果（ウエスタンブロット）
ＨＣＴ１１６またはＷｉＤｒを５％炭酸ガスインキュベーター内においてＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ含）で約８０％コンフルレントとなるまで培養した。そして、常法に従いトリプシン−ＥＤＴＡにより、細胞を回収し、リン酸緩衝液で５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁液を調製した。そして、当該懸濁液を０．１ｍｌずつヌードマウスの体側皮下に移植した。
次に、ＨＣＴ１１６については、移植後２３日目より、Ｅ７８２０を１２．５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ、１日２回、３日間のスケジュールで経口投与した。一方、ＷｉＤｒについては、移植後１８日目より、Ｅ７８２０を５０ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ、１日２回、７日間のスケジュールで経口投与した。ＨＣＴ１１６については投与開始４日後に、ＷｉＤｒについては投与開始後８日後に、それぞれ腫瘍を摘出し、各種プロテアーゼ阻害剤及び１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有の細胞溶解液により、氷冷下で腫瘍溶解液を調製した。それぞれの腫瘍溶解液について、同量のタンパク質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画し、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ、アマシャムバイオサイエンス社）にトランスファーした。そして、常法に従い抗ＥＧＦＲ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用してウエスタンブロットを行った。
各バンドの検出および定量は、次のように行った。まず、各バンドをＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ）で化学発色させ、Ｉｍａｇｅ  ＭａｓｔｅｒＶＤＳ−ＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，東京）にてデジタル画像としてバンドを取り込んだ。そして、デジタル画像をＴＩＦファイルとして保存し、Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  ｔｏｔａｌＬａｂ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．００，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，東京）にて数値化した。
その結果、Ｅ７８２０は、用量依存的にヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６におけるＥＧＦＲ１の発現量を減少させた（表３）。一方、Ｅ７８２０は、ヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒにおけるＥＧＦＲ１の発現量を変化させなかった（表３）。すなわち、Ｅ７８２０は、低感受性癌細胞株（ＷｉＤｒ）におけるＥＧＦＲ１の発現量を変化させず、高感受性癌細胞株（ＨＣＴ１１６）におけるＥＧＦＲ１の発現量のみを減少させた。
【表３】
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表３は、ヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６またはＷｉＤｒ）皮下移植モデルにおけるＥＧＦＲ１の発現量に対するＥ７８２０の効果を示す。
以上の結果から、ＥＧＦＲ１の発現量を指標とすることにより、Ｅ７８２０に対する腫瘍細胞の感受性および／またはＥ７８２０の抗腫瘍効果を検査できることが明らかになった。
【実施例５】
【００１０】
ヒト癌細胞株皮下移植モデル（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるＥＧＦＲ１の発現量に対するＥ７８２０の効果（免疫組織化学染色）
ＰＣ９を３７℃下、５％炭酸ガスインキュベーター内においてＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ含）で培養した。ヌードマウス（ＫＳＮマウス、ＳＬＣ社より入手）に培養したヒト腫瘍細胞（ＰＣ９）（８×１０６細胞／マウス）の皮下移植を行った。マウスに移植した腫瘍の増殖が観察された時点から、Ｅ７８２０を０ｍｇ／ｋｇ（未投与）、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇ、１日２回、７日間のスケジュールでマウスに経口投与を行った。７日間の投与後にマウスから腫瘍組織を採取して、腫瘍組織のホルマリン固定を行い、腫瘍組織をパラフィンに包埋した。その後、パラフィン包埋腫瘍組織を、６μｍ厚で薄切し、スライドガラスに載せ、キシレン／エタノールで脱パラフィン処理を行った。その後、この切片に対し、プロテインキナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ社製）処理を行い、シンプルステインキット：マウスＭＡＸ−ＰＯ（Ｍ）（ＮＩＣＨＩＲＥＩ社製）のプロトコールに従い、抗ＥＧＦＲ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を用いて免疫染色を行った。その結果を図５に示す。図５中、（ａ）はｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧで染色したもの（ネガティブコントロール）であり、（ｂ）はＥ７８２０未投与群、（ｃ）はＥ７８２０投与群（２５ｍｇ／ｋｇ）、（ｄ）はＥ７８２０投与群（５０ｍｇ／ｋｇ）、（ｅ）はＥ７８２０投与群（１００ｍｇ／ｋｇ）、（ｆ）はＥ７８２０投与群（２００ｍｇ／ｋｇ）を示している。各パネルの倍率は、それぞれ２０倍である。その結果、感受性癌細胞株（ＰＣ９）において、Ｅ７８２０投与群（図５（ｃ）〜（ｆ））ではＥ７８２０未投与群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）（図５（ｂ））に比べてＥＧＦＲ１発現の低下が検出された。このことは、Ｅ７８２０はＥＧＦＲ１の発現を減少させることで組織レベルにおいても抗腫瘍効果を発揮させることを示しており、本実施例は、ＥＧＦＲ１の発現量を指標とすることにより、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性および／またはスルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査できることを強く支持している。
【実施例６】
【００１１】
ヒト癌細胞株培養下（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるＥＧＦＲ１の発現量に対するＥ７０７０の効果  （質量分析）
まず、ＲＰＭＩ−１６４０（１０％ＦＢＳ含）に１３Ｃで標識されたＬ−ロイシン（１３Ｃ−ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ社）を添加したもの、および、同位体標識されていないＬ−ロイシン（１２Ｃ−ｌｅｕｃｉｎｅ）を添加したものを用意した。
次に、それぞれの培地中でヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６−Ｃ９を５継代以上培養した。なお、ＨＣＴ１１６−Ｃ９は、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣより入手）から分離した亜株であり、Ｅ７０７０高感受性癌細胞株として知られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００２，１，２７５−２８６）。その後、それぞれの細胞を１５−ｃｍ径のｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈに１．０×１０７ｃｅｌｌ／５０ｍｌの濃度で蒔き込み直した。
そして、２４時間後に１２Ｃ−ｌｅｕｃｉｎｅを含む培地中で培養しているＨＣＴ１１６−Ｃ９にはＥ７０７０  １μＭを添加し、他方、１３Ｃ−ｌｅｕｃｉｎｅを含む培地中で培養しているＨＣＴ１１６−Ｃ９には何も添加せずに、さらに培養を継続した。
２４時間後に、常法に従い細胞をｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅで２回洗浄し、Ｍ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社）３ｍｌを加えてそれぞれの細胞を可溶化した後にそれぞれ等量を混合した。常法に従い細胞溶解液を透析し、溶液を昇華させ、トリプシンにて消化し、ペプチド試料を得た。そして、得られたペプチド試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで解析した。次に、１２Ｃ−ｌｅｕｃｉｎｅを含むペプチドフラグメントのピーク強度と１３Ｃ−ｌｅｕｃｉｎｅを含むペプチドフラグメントのピーク強度との比（１２Ｃ／１３Ｃ）が１以下のものについて、網羅的にペプチドフラグメントの配列情報をもとにタンパク質の同定を行った。ここで、ピーク強度比（１２Ｃ／１３Ｃ）が１以下のペプチドは、ＨＣＴ１１６−Ｃ９において、１μＭＥ７０７０によって発現量が減少したタンパク質に由来しているということになる。
その結果、ＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲなどのＥＧＦＲ１由来のペプチドフラグメントにおいて、ピーク強度比が０．６−０．８であることが観測された。すなわち、Ｅ７０７０もまた、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６−Ｃ９においてＥＧＦＲ１の発現量を減少させた。
以上の結果から、ＥＧＦＲ１の発現量を指標とすることにより、Ｅ７０７０に対する腫瘍細胞の感受性および／またはＥ７０７０の抗腫瘍効果を検査できることが明らかになった。
また、Ｅ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳまたはこれらの組み合わせは、同一または類似の作用機序を有し、同一または類似の作用および効果をもたらすことが報告されている（ＷＯ２００６／０３０９４１、ＷＯ２００６／０３０９４７、ＷＯ２００６／０３６０２５）。そして、当該事実および前記結果（実施例１−６）から、ＥＧＦＲ１の発現量を指標とすることにより、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性および／またはスルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００１２】
本発明により、スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査することが可能となった。
より詳細には、本発明により、スルホンアミド化合物、好ましくはＥ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳまたはこれらの組み合わせに対する腫瘍細胞の感受性は、スルホンアミド化合物の投与後に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、スルホンアミド化合物の投与前に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量の変化を指標とすることにより、および／または癌患者より取り出された腫瘍細胞にスルホンアミド化合物を作用させた場合におけるＥＧＦＲ１の発現量を、無処理の腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量の変化を指標とすることにより、検査することが可能となった。
スルホンアミド化合物に対する腫瘍細胞の感受性を検査することは、臨床において、より抗腫瘍効果を期待できる癌患者を選択することができるため、非常に有用である。
また、本発明により、スルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査することが可能となった。
より詳細には、本発明により、スルホンアミド化合物、好ましくはＥ７０７０、Ｅ７８２０、ＬＹ１８６６４１、ＬＹ２９５５０１、ＬＹ−ＡＳＡＰ、ＬＹ５７３６３６もしくはＣＱＳまたはこれらの組み合わせの抗腫瘍効果は、スルホンアミド化合物の投与後に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量を、スルホンアミド化合物の投与前に癌患者より取り出された腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ１の発現量と比較して、ＥＧＦＲ１の発現量の変化を指標とすることにより、検査することが可能となった。
スルホンアミド化合物の抗腫瘍効果を検査することは、臨床において、適切な投与量等を決定する上で非常に有用である。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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