(57)【要約】  本発明者らは、HM-1に対して中和活性を有するnmAb-KTをマウスに免疫することにより、HM-1の抗イディオタイプ抗体（ScFv）を作製することに成功した。該nmAb-KTを免疫原（抗原）として用いることにより、実際にキラートキシン活性を有する抗体分子を効率的に作製することが可能であることを見出した。  さらに本発明者らは、該nmAb-KTによって認識されるHM-1のエピトープ（アミノ酸領域）を決定することに成功した。該領域をエピトープとする抗体は、抗イディオタイプ抗体の製造において免疫原として非常に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および／または（ｂ）の活性を有するキラートキシン様タンパク質に対する抗体であって、該活性を阻害する機能を有することを特徴とする抗体。
（ａ）βグルカン合成酵素を有する真菌に対する抗菌活性
（ｂ）真菌のβグルカン合成酵素を阻害する活性
【請求項２】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記キラートキシン様タンパク質が酵母Williopsis saturnus属由来のタンパク質である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記キラートキシン様タンパク質がHM-1である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号：１で示されるHM-1タンパク質の39位〜48位内にエピトープを有することを特徴とする、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号：２に記載のペプチドと反応させることにより前記機能が低下する、請求項３〜５のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
配列番号：５〜８のいずれかに記載のペプチドと結合親和性を有する、請求項３〜５のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
3.0x107M-1以上の親和定数(Ka)を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号：５〜８のいずれかに記載のペプチドと結合し、該ペプチドが有するβグルカン合成酵素阻害活性を抑制し得る抗体である、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記キラートキシン様タンパク質がHYIである、請求項３に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号：３で示されるHYIタンパク質の39位〜47位内にエピトープを有することを特徴とする、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号：４に記載のペプチドと反応させることにより前記機能が低下する、請求項１０または１１に記載の抗体。
【請求項１３】
以下の（ａ）または（ｂ）の抗体を有効成分として含む、抗イディオタイプ抗体作製用抗原。
（ａ）nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体
【請求項１４】
前記抗イディオタイプ抗体が、βグルカン合成酵素阻害活性および／または抗真菌活性を有することを特徴とする抗体である、請求項１３に記載の抗イディオタイプ抗体作製用抗原。
【請求項１５】
以下の（ａ）または（ｂ）の抗体を抗原として用いることを特徴とする、βグルカン合成酵素阻害活性および／または抗真菌活性を有する抗体の作製方法。
（ａ）nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体
【請求項１６】
以下の（ａ）または（ｂ）の抗体を免疫原として抗体を作製する工程、を含む抗真菌剤の製造方法。
（ａ）nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
（ｂ）請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体
【請求項１７】
HM-1タンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号：１に記載のHM-1タンパク質において39位〜48位のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１８】
HYIタンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号：３に記載のHYIタンパク質において39位〜47位のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、中和抗体を誘導し得る免疫原組成物。
【請求項２０】
前記中和抗体がβグルカン合成酵素阻害活性を阻害する機能を有することを特徴とする、請求項１９に記載の免疫原組成物。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の免疫原組成物を抗原として用いることを特徴とする、HM-1タンパク質の中和抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キラートキシン様タンパク質に対する中和抗体、および該中和抗体の作製方法、並びに、該中和抗体を抗原として利用した抗体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の酵母は、他の種の酵母に対して抗酵母（キラー）活性を示すタンパク質（キラートキシン）を分泌する。HM-1キラートキシンは、ハンゼヌラ・ムラキ（Hansenula mrakii）と以前に呼ばれていた酵母ウィリオプシス・サチュルヌス（Williopsis saturnus）Var.mrakii IFO 0895により産生される強力な抗酵母ポリペプチドであり、K9型キラートキシン群に属している。HM-1は88アミノ酸からなり、約9500ダルトンの分子量を有する（非特許文献１参照）。HM-1タンパク質の三次元構造はNMRスペクトルを用いて解明されている（非特許文献２参照）。HM-1は、キラートキシンの中では熱処理および広範囲のpH値にわたって非常に安定である。【０００３】
また、HM-1キラートキシンに関しては、以下のような種々の知見が報告されている。
サッカロマイセス・セレビジエ（Saccaromyces cerevisiae）のハンゼヌラ・ムラキIF O0895由来のHM-1キラートキシンに対する感受性には、N-グリコシレーションが関与している（非特許文献３参照）。また、HM-1キラートキシンは、サッカロマイセス・セレビジエの酵母スフェロプラストにおける、丸い形状の維持に関与している（非特許文献４参照）。【０００４】
このHM-1と相同性を有する、ハンゼヌラ・サチュルヌス（Hansenula saturnus）によって産生されるHYIキラートキシンも知られている（非特許文献５参照）。ウィリオプシス・サチュルヌスvar.saturnus由来のHYIキラートキシンも、細胞壁合成を阻害し、感受性酵母細胞の出芽に細胞破壊効果を及ぼす。このメカニズムはウィリオプシス・サチュルヌスvar.mrakiiのHM-1トキシンと類似している（非特許文献６参照）。【０００５】
HM-1は、感受性サッカロマイセス・セレビジエの細胞壁合成を選択的に阻害し（非特許文献７参照）、細胞壁ベータグルカンと相互作用することが報告されている（非特許文献８参照）。また、HM-1は、グルカン合成酵素を低濃度で阻害する（非特許文献９参照）。サッカロマイセス・セレビジエ由来のβグルカン合成酵素（1,3-ベータ-D-グルカン合成酵素）については、精製と遺伝子のクローニングが行われている。（非特許文献１０参照）。HM-1自体については、モノクローナル抗体とサンドウィッチELISAによって定量が可能である（非特許文献１１参照）。【０００６】
また、サッカロマイセス・セレビジエのGSC1 (glucan synthase of S. cerevisiae 1; FKS1とも呼ばれている）に対するカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）の相同体がクローニングされ、カンジダ・アルビカンスGSC1については、ベータ-1,3-グルカン合成酵素のサブユニットに対する遺伝子であることが知られている（非特許文献１２参照）。
また酵母遺伝子であるRHK1は、HM-1キラートキシンに対する細胞壁受容体の合成に関与している（非特許文献１３参照）。
HM-1は広いスペクトルのキラートキシン菌活性を有し、治療に広く使用することができる。しかし、毒性および抗原性があるので、用途が限られている。【０００７】
また、過剰発現することによって、サッカロマイセス・セレビジエ細胞にHM-1キラートキシン耐性を与えることができる遺伝子（HKR1）がサッカロマイセス・セレビジエのゲノムライブラリーからクローニングされている（非特許文献１４参照）。このHKR1は、酵母サッカロマイセス・セレビジエにおける細胞壁ベータグルカン合成および出芽パターンを調節する細胞表面のタンパク質をコードしている（非特許文献１５参照）。【０００８】
これらの結果から、キラー活性を有するHM-1キラートキシン誘導体を新たな治療法に用いることが期待される。HM-1キラートキシンのキラー活性は、真菌類の細胞壁ベータグルカン合成するグルカン合成酵素を阻害することに起因する。しかし、その詳細な分子機構は十分に理解されておらず、これらキラー分子の標的は、恐らくは細胞膜を貫通して存在するグルカン合成酵素本体の外部領域であったり、あるいはまた、新生グルカン鎖を持つ「グルカン合成酵素―新生グルカン鎖複合体」の細胞外領域であると予想されるが、この他、グルカン合成酵素と結合して存在し、グルカン合成のために必須な働きをする補助的分子を標的にしている可能性も否めない。いずれにしろ、HM-1キラートキシンは真菌の細胞膜の外側からグルカン合成機能を抑制することによりキラー活性を発揮する（図７ＡおよびＢ参照）。【０００９】
Neils Jerneは、免疫調節のネットワークにおけるイディオタイプ決定基の生物学的重要性について提唱した。イディオタイプは、抗体に特有のエピトープで、抗体の重鎖または軽鎖に関連し、通常、活性には可変領域の関与が必要とされる。抗イディオタイプ抗体ネットワークは、Neils Jerneが提唱したように、元の抗原と接触するイディオタイプ抗体結合部位の一部と重なる抗原決定基を認識できる。従って、抗イディオタイプ抗体の結合部位は、元の抗原の「内部イメージ（internal image）」を有する可能性がある。この考えによって更に、抗イディオタイプ抗体の抗原模倣性を、酵母キラートキシンの生物学的特徴を有する抗体の誘発に使用できるという仮説が導かれた。抗原決定基の内部イメージに相当する抗イディオタイプ抗体は、代用ワクチン、あるいは癌免疫療法では毒素と結合するものとして提案されている。ある場合には、タンパク質抗原と抗イディオタイプ抗体可変領域とのアミノ酸配列相同性は明らかにされており、該配列を適宜改変することにより、該抗体の機能をさらに強化することが可能である。抗イディオタイプ抗体による生物学的受容体のリガンドの機能的模倣性に関しては広く研究がされている。【００１０】
最近、Polonelliらは、ポリクローナル、モノクローナル、および単鎖組換え抗体の形をした、抗菌活性を有する抗イディオタイプ抗体を作製した（非特許文献１６参照）。これらの抗体は、広く研究されているピチア-アノマラ（Pichia anomala）により産生される酵母キラートキシンの活性を有する。キラー株はこれらの共通の表現型を有するが、各キラートキシンは種間または株間で異なり、構造遺伝子、分子量、成熟構造および免疫、ならびに感受性細胞を認識および殺傷する機構の点で異なる特徴を示す。実際、Polonelliらが用いたピチア-アノマラ（Pichia anomala）により産生される酵母キラートキシンは、グルカナーゼ活性を持つとキラートキシンとされ、本発明者らが研究の末に明らかにした"グルカン合成酵素を阻害する酵母キラートキシンHM−1やHYI"とは異なっている。このように、各キラートキシンには独特の特性および用途があり、これらは種および株によって大きく異なる。【００１１】
さらに、微生物の抗生物質耐性の広がりは大きな公衆衛生問題になっている。抗生物質耐性株が感染の原因になることが多く、結果として死亡率、罹患率、および医療費が増加する。これらの感染の予防および管理には新たな抗菌剤が必要である。真菌感染の発生は世界中で増加しており、AIDS患者、癌患者、または臓器移植を受けた免疫無防備状態の患者や老齢者人口の増加が原因とされている。総合的に、新規な抗菌剤のための新しい戦略の開発が緊急に必要とされている。【００１２】
【非特許文献１】Yamamoto T.外３名著、「Application of monoclonal antibodies to the isolation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii.」、FEBS Lett.、1986年Jan 20、Vol.195(1-2)、p.253-257
【非特許文献２】Antuch W.外２名著、「Ancestral beta gamma-crystallin precursor structure in a yeast killer toxin. 」、Nat.Struct.Biol.、1996年、p.662-665
【非特許文献３】Kimura T.外６名著、「N-glycosylation is involved in the sensitivity of Saccharomyces cerevisiae to HM-1 killer toxin secreted from Hansenula mrakii IFO 0895.」、Appl.Microbiol.Biotechnol.、1999年Feb、Vol.51(2)、p.176-84
【非特許文献４】Komiyama T.外２名著、「Round shape enlargement of the yeast spheroplast of Saccaromyces cerevisiae by HM-1 toxin」、Biol.Pharm.Bull.、2002年Aug、Vol.25(8)、p.959-65
【非特許文献５】Komiyama T.外４名著、「Structure and activity of HYI killer toxin from Hansenula saturnus」、Biol.Pharm.Bull.、1995年Aug、Vol.18(8)、p.1057-9
【非特許文献６】Komiyama T.外６名著、「Action properties of HYI killer toxin from Williopsis saturnus var. saturnus, and antibiotics, aculeacin A and papulacandin B.」、Biol.Pharm.Bull.、1998年Oct、Vol.21(10)、p.1013-9
【非特許文献７】Yamamoto T.外４名著、「Killer toxin from Hansenula mrakii selectively inhibits cell wall synthesis in a sensitive yeast.」、FEBS Lett.、1986年、Mar.3、Vol.197(1-2)、p.50-54
【非特許文献８】Kasahara S.外８名著、「Involvement of cell wall beta-glucan in the action of HM-1 killer toxin」、FEBS Lett.、1994年Jul 4、348(1)、p.27-32
【非特許文献９】Takasuka T.外３名著、「Cell wall synthesis specific cytocidal effect of Hansenula mrakii toxin-1 on Saccharomyces cerevisiae.」、Cell Mol.Biol.Res.、1995年、Vol.41(6)、p.575-581
【非特許文献１０】Inoue SB.外９名著、「Characterization and gene cloning of 1,3-beta-glican synthase from Saccharomycec cerevisiae」、Eur.J.Biochem.、1995年Aug、Vol.231(3)、p.845-54
【非特許文献１１】Komiyama T.外４名著、「Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quantitation of HM-1 killer toxin.」、Biol.Pharm.Bull.、2004年May、Vol.27(5)、p691-3
【非特許文献１２】Mio T.外９名著、「Cloning of the Candida albicans homolog of Saccharomyces cerevisiae GSC1/FKS1 and its involvement in beta-1,3-glucan synthesis」、J.Bacteriol.、1997年Jul、Vol.179(13)、p.4096-105
【非特許文献１３】Kimura T.外８名著、「A novel yeast gene, RHK1, is involved in the synthesis of the cell wall receptor for the HM-1 killer toxin that inhibits beta-1,3-glucan synthesis」、1997年Mar26、Vol.254(2)、p.139-47
【非特許文献１４】Kasahara S.外８名著、「Cloning of the Saccharomyces cerevisiae gene whose overexpression overcomes the effects of HM-1 killer toxin, which inhibits beta-glucan synthesis.」、J.Bacteriol.、1994年Mar、176(5)、p.1488-99
【非特許文献１５】Yabe T.外７名著、「HKR1 encodes a cell surface protein that regulates both cell wall beta-glucan synthesis and budding pattern in the yeast Saccharomyces cerevisiae.」、J.Bacteriol.、1996年Jan、Vol.178(2)、p.477-83
【非特許文献１６】L.Polonelli, ら著、「Therapeutic potential of antiidiotypic single chain antibodies with yeast killer toxin activity」、Nature Biotech.、1997年、 Vol.15、p.155-158
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、βグルカン合成酵素を阻害することにより抗真菌活性を発揮するＨＭ−１キラートキシンと同様の活性を有する抗イディオタイプ抗体の作製に利用可能な免疫原の提供を課題とする。より詳しくは、キラートキシン様タンパク質に対して中和活性を有する抗体、および該抗体の作製方法、並びに、該抗体を抗原として用いた抗体の作製方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究を行った。まず本発明者らは、実際にHM-1キラートキシン活性を有する抗イディオタイプ抗体の作製を試みた。該抗体の作製のための抗原として、本発明者らはnmAb-KTと称する抗体を選択した。このnmAb-KTは、HM-1に結合し、HM-1のキラー活性を中和する活性を有するHM-1に対するモノクローナル抗体（nmAb-KT）である。(Yamamoto et al.によって調製された（Yamamoto, T., Imai, M., Tachibana, K., and Mayumi, M. (1986) Application of monoclonal antibodies to the isolation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii. FEBS Lett. 195, 253-257.）)。【００１５】
本発明者らは、上記nmAb-KTをマウスに免疫して、組換えDNA技術によりHM-1の可溶性抗イディオタイプ一本鎖可変領域断片抗体（ScFv）を作製することに成功した。そして、精製された該ScFvは、グルカン合成酵素を低濃度で阻害し、HM-1よりも広い抗真菌活性スペクトルを有する強力なHM-1様活性を示すことを明らかにした。【００１６】
即ち、該nmAb-KTを免疫原（抗原）として用いることにより、実際にβグルカン合成酵素を阻害することにより抗真菌活性を表す抗体分子を効率的に作製することが可能であることを見出した。【００１７】
該nmAb-KTは、βグルカン合成酵素阻害活性を持つ抗真菌性の抗体分子の作製のために大いに有用であることが本発明者らによって初めて見出された。【００１８】
つまり、該nmAb-KT抗体を用いることによって有効な抗イディオタイプ抗体が作製できたことから、HM-1のキラートキシン活性を中和し得る抗体（nmAb-KT）は実際に抗イディオタイプ抗体を作製するための免疫原として利用可能であることが初めて実証された。【００１９】
さらに本発明者らは、該nmAb-KTによって認識されるHM-1のエピトープの同定を試みた。その結果、HM-1キラートキシンおよびHYIキラートキシン由来の種々の合成ペプチドを用いることにより、mAB-KTによって認識され得るHM-1のエピトープ領域を決定することに成功した。【００２０】
即ち、該領域をエピトープとする抗体は、キラートキシン活性を中和し得る抗体であることが期待され、該中和抗体はキラートキシン活性を有する抗イディオタイプ抗体の免疫原として非常に有用である。【００２１】
また、該中和抗体が結合し得るキラートキシン上のエピトープ領域が決定されたことにより、該エピトープを含むポリペプチドを利用して効率的に中和抗体を作製することが可能となった。【００２２】
さらに、エピトープを同定することに成功したことにより、nmAb-KT抗体はもちろん、nmAb-KT以外の抗体であっても、HM-1の該領域をエピトープとする抗体は、抗イディオタイプ抗体の作製のための免疫原として利用可能であることが期待される。【００２３】
該抗体は、キラートキシンタンパク質のキラートキシン活性を担う領域に対して高い結合親和性を有し、該抗体を抗原とする抗イディオタイプ抗体は、キラートキシンの内部イメージを有し、HM-1の活性を担う領域と極めて模倣性の高いアミノ酸配列を有する抗体であるものと考えられる。【００２４】
本発明者らによって見出された知見に基づいて、抗真菌剤として有用な抗体イディオタイプ抗体を効率的に作製することが可能となった。
上記nmAb-KTを免疫原として作製される抗体は、顕著なβグルカン合成酵素阻害作用を有することを見出した。さらに該抗体は、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して実際に抗真菌活性を有することが確認された。本発明の中和抗体を利用して作製される抗体は、既存の抗真菌剤では効きめが弱いカンジダ-アルビカンス株やアスペルギルス-フミガトス（Aspergillus fumigatos）株に対しても、有効な抗真菌作用を発揮することが分かった。即ち、本発明の抗体を免疫原として用いることにより、現在、医療上の重要な課題となっている深在性真菌症を引き起こすカンジダ-アルビカンス株やアスペルギルス-フミガトス株までも殺傷し得る強力な抗真菌活性を有する抗体を作製可能なことが実証された。【００２５】
これまでの本発明者らによる独自の研究から、HM-1の抗菌メカニズムについては、HM-1が、酵母細胞の細胞膜表面に存在するβグルカン合成酵素を阻害し、増殖中の酵母細胞の出芽領域に働き、そのβグルカン合成を抑えることにより穴を開けて、細胞物質を漏出させることにより細胞死を招いていることが明らかとなった。（Komiyama T.７名著、「Pore formation on proliferating yeast Saccharomyces cerevisiae cell buds by HM-1 killer toxin」、J.Biochem.、1996年Apr、Vol.119(4)、p.731-6）。このHM-1キラートキシンのキラー活性については、HM-1トキシンのC末領域にある２つの特異的なアルギニン残基が関与している（Shirai T.外３名著、「The involvement of two specific arginine residues in the action of HM-1 killer toxin was deduced from site-directed mutagenesis」、Biol.Pharm.Bull.、2000年Aug、Vol.23(8)、p.998-1000）。【００２６】
従って、本発明の中和抗体を免疫原として作製される抗イディオタイプ抗体は、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して、βグルカン合成酵素を阻害することにより、上述のメカニズムによって該真菌細胞を殺傷するものと考えられる。【００２７】
本発明者らによって得られた知見により、カンジダ・アルビカンス菌を含む、これまで感染により人類を苦しめてきたβグルカン合成酵素を持つ多くの真菌に対して、βグルカン合成酵素阻害活性をもつ抗体を効率的に作成することによって対抗し得る道が拓かれたといえる。
また、これまであまり明らかとなっていなかったHM-1キラートキシンの機能の解明にも、本発明者らによって見出された知見は大いに有用である。【００２８】
本発明は、キラートキシン活性を有する抗イディオタイプ抗体の作製に利用可能な免疫原となる抗体を提供するものであり、詳しくは、キラートキシン様タンパク質に対して中和活性を有する抗体、および該抗体の作製方法、並びに、該抗体を抗原として用いた抗体の作製方法に関する。より具体的には、
〔１〕  以下の（ａ）および／または（ｂ）の活性を有するキラートキシン様タンパク質に対する抗体であって、該活性を阻害する機能を有することを特徴とする抗体、
（ａ）βグルカン合成酵素を有する真菌に対する抗菌活性
（ｂ）真菌のβグルカン合成酵素を阻害する活性
〔２〕  モノクローナル抗体である、〔１〕に記載の抗体、
〔３〕  前記キラートキシン様タンパク質が酵母Williopsis saturnus属由来のタンパク質である、〔１〕または〔２〕に記載の抗体、
〔４〕  前記キラートキシン様タンパク質がHM-1である、〔３〕に記載の抗体、
〔５〕  配列番号：１で示されるHM-1タンパク質の39位〜48位内にエピトープを有することを特徴とする、〔４〕に記載の抗体、
〔６〕  配列番号：２に記載のペプチドと反応させることにより前記機能が低下する、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の抗体、
〔７〕  配列番号：５〜８のいずれかに記載のペプチドと結合親和性を有する、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の抗体、
〔８〕  3.0x107M-1以上の親和定数(Ka)を有する、〔７〕に記載の抗体、
〔９〕  配列番号：５〜８のいずれかに記載のペプチドと結合し、該ペプチドが有するβグルカン合成酵素阻害活性を抑制し得る抗体である、〔７〕または〔８〕に記載の抗体、
〔１０〕  前記キラートキシン様タンパク質がHYIである、〔３〕に記載の抗体、
〔１１〕  配列番号：３で示されるHYIタンパク質の39位〜47位内にエピトープを有することを特徴とする、〔１０〕に記載の抗体、
〔１２〕  配列番号：４に記載のペプチドと反応させることにより前記機能が低下する、〔１０〕または〔１１〕に記載の抗体、
〔１３〕  以下の（ａ）または（ｂ）の抗体を有効成分として含む、抗イディオタイプ抗体作製用抗原、
（ａ）nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
（ｂ）〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗体
〔１４〕  前記抗イディオタイプ抗体が、βグルカン合成酵素阻害活性および／または抗真菌活性を有することを特徴とする抗体である、〔１３〕に記載の抗イディオタイプ抗体作製用抗原、
〔１５〕  以下の（ａ）または（ｂ）の抗体を抗原として用いることを特徴とする、βグルカン合成酵素阻害活性および／または抗真菌活性を有する抗体の作製方法、
（ａ）nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
（ｂ）〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗体
〔１６〕  以下の（ａ）または（ｂ）の抗体を免疫原として抗体を作製する工程、を含む抗真菌剤の製造方法、
（ａ）nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
（ｂ）〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗体
〔１７〕  HM-1タンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号：１に記載のHM-1タンパク質において39位〜48位のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
〔１８〕  HYIタンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号：３に記載のHYIタンパク質において39位〜47位のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
〔１９〕  〔１７〕または〔１８〕に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、中和抗体を誘導し得る免疫原組成物、
〔２０〕  前記中和抗体がβグルカン合成酵素阻害活性を阻害する機能を有することを特徴とする、〔１９〕に記載の免疫原組成物、
〔２１〕  〔１９〕または〔２０〕に記載の免疫原組成物を抗原として用いることを特徴とする、HM-1タンパク質の中和抗体の作製方法、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によって、HM-1キラートキシン活性並びにβグルカン合成酵素阻害活性を有する抗イディオタイプ抗体を作製するために利用可能な免疫原（抗原）が提供された。キラートキシンの生物学的な機能を模倣する抗イディオタイプ抗体は、キラートキシンに対して感受性を有する日和見病原体等に対して抗真菌活性を発揮し、新規な抗真菌剤としてその利用が期待される。【００３０】
さらに本発明者らは、HM-1キラートキシン活性を中和する抗体が結合し得るエピトープ領域を具体的に同定することに成功した。
中和抗体のnmAb-KTは、IgG1(κ)として分類され、関連酵母Williopsis saturnus var. saturnus IFO 0117の産生するHYIトキシンは、その構造およびキラートキシン作用の様式がHM-1と非常に類似しているものの、nmAb-KTはHYIトキシンには無効であることが示された。nmAb-KTのエピトープを決定するため、HM-1のアミノ酸配列に基づいて12のペプチド配列を合成した。これらのうち、nmAb-KTは、HM-1分子の中央部分を示す3つのペプチドP6（33NVHWMVTGGST43、配列番号：１４）、P7（44DGKQGCATIWEGS56、配列番号：１５）、およびP9（44DGKQGCATIWEGSGCV59、配列番号：１７）と反応した。さらに、本発明者らは、P6、P7、およびP9ペプチドと重複するHM-1デカペプチドP10（39TGGSTDGKQG48、配列番号：２）が、nmAb-KTと最も強く反応することを見出した。ウェスタンブロッティング、サンドイッチELISA、および酵母増殖阻害アッセイを用いて併せて解析した結果、nmAb-KTは、HYIの相当する領域内に存在しない、HM-1のP10内の特異的エピトープを認識することが明らかになった。nmAb-KTのHM-1に対する、しかしHYIに対しては示さない強い結合活性は、SPR解析によっても確認された。これらの結果から、nmAb-KTが、同じ位置のHYI配列とは異なる配列41GSTDGK46（配列番号：２１）において、HM-1と結合する可能性が最も高いことが強く示唆された。【００３１】
本発明者らによって見出されたキラートキシン様タンパク質の上記アミノ酸領域をエピトープとする抗体を作製し、該抗体を免疫原とすることにより、キラートキシン活性を有する種々の抗体分子を新たに作出することが可能である。また、該領域を適宜改変することにより、より強力な、あるいはより特異性の高い有用な抗体分子を作出することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】酵母の増殖およびHM-1およびHYIのキラートキシン活性に及ぼすnmAb-KTの効果を示す図である。アッセイ法および条件は実施例に記載する。活性は、nmAb-KTおよびHM-1およびHYIを含まない対照試料を100%として表した。各実験は三つ組で行い、結果は平均値として算出した。
【図２】HM-1およびHYIのウェスタンブロット解析を示す写真である。精製HM-1およびHYIを電気泳動し、その後免疫ブロッティングし、実施例に記載したようにnmAb-KTを一次抗体として用いて検出した。M：標準マーカー（レーン1および4）、HM-1（レーン2）、およびHYI（レーン3）。
【図３】サンドイッチELISAによるHM-1およびHYIの定量を示す図である。実施例に記載した通りにELISA法により検量線を得た。四角（黒）、HM-1;丸（黒）、HYI。
【図４】HM-1およびHYIのSPR解析を示す図である。CM5センサーチップ上の固定化nmAb-KTの調製および分析手法は、実施例に記載する。(A) 100 nMでのHM-1およびHYIの結合および解離。(B) 種々の濃度でのHM-1シグナル。
【図５Ａ】図５Ａ‐Ｃは、nmAb-KTのペプチド解析を示す図である。増殖阻害アッセイおよび酵母増殖に及ぼすHM-1のキラートキシン活性は、実施例に記載した。活性は、ペプチドおよびnmAb-KTを含まない対照試料を100%として表した。各実験は三つ組で行い、結果は平均値として算出した。図５Ａは、S. セレビシエA451の増殖に及ぼすペプチドの影響を示す。
【図５Ｂ】nmAb-KTとプレインキュベートしたペプチドの、HM-1のキラートキシン活性に及ぼす効果を示す図である。
【図５Ｃ】HM-1のキラートキシン活性に及ぼすHM-1デカペプチドおよびHYIナノペプチドの効果を示す図である。
【図６】HM-1ペプチド上のエピトープに対するnmAB-KTの特異的結合を示す写真である。ドットブロッティングおよび一次抗体としてnmAb-KTを用いた検出は、実施例に記載した。図６Ａは、メンブレン上に吸着した12のペプチド、図６（Ｂ）は、メンブレン上に吸着したHM-1デカペプチドおよびHYIナノペプチド。
【図７】Ａは酵母グルカン合成酵素、Ｂはグルカン合成酵素に対するHM-1トキシンの働きを模式的に示す図である。
【図８】HM-1およびHYIの全長アミノ酸配列を比較した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、キラートキシン様タンパク質に対する抗体であって、該キラートキシン様タンパク質の活性を阻害する機能を有することを特徴とする抗体を提供する。
上記キラートキシン様タンパク質は、以下の（ａ）および／または（ｂ）の活性を有するタンパク質であることが好ましい。
（ａ）βグルカン合成酵素を有する真菌に対する抗菌活性
（ｂ）真菌のβグルカン合成酵素を阻害する活性（βグルカン合成酵素阻害活性）【００３４】
上記（ａ）の抗菌活性としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）株に対する抗真菌活性を挙げることができる。該活性は、例えば、CFUアッセイによって、適宜評価することができる。【００３５】
上記（ｂ）のβグルカン合成酵素阻害活性は、公知の種々の方法（例えば、放射性物質によって標識されたβグルカンを検出する方法等）によって、適宜測定することが可能であり、当業者であれば、βグルカン合成酵素阻害活性について適宜評価することができる。一例を示せば、Takasukaらの文献(Takasuka T. et al., Cell Mol. Biol. Res. 1995; 41: 575-581)に記載の方法によって、βグルカン合成酵素阻害活性を評価することが可能である。【００３６】
本発明の上記抗体は、キラートキシン様タンパク質の活性（例えば、上記（ａ）または（ｂ））を中和する機能を有する（本発明の上記抗体を「本発明の中和抗体」と記載する場合あり）。【００３７】
本発明の中和抗体は、例えば、キラートキシン様タンパク質の活性を有する抗イディオタイプ抗体を作製する際の免疫原（抗原）として好適に利用される。該抗イディオタイプ抗体は、キラートキシン活性、あるいはβグルカン合成酵素阻害活性を有し、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して顕著な抗真菌活性を有することが期待される。また、本発明の中和抗体を利用して作製される抗イディオタイプ抗体は、キラートキシン様タンパク質と同等、もしくはより広い抗菌スペクトルを有することが期待される。【００３８】
一般的に抗イディオタイプ抗体とは、抗体可変部のイディオタイプ決定基（イディオトープ）を認識する抗体を言う。抗体分子は通常、重鎖(H鎖)と軽鎖(L鎖)から構成され、その抗原特異性は、抗原結合部位であるH鎖およびL鎖の可変領域(V領域)の構造により決定される。この部分の構造は抗体分子の固有のものであり、イディオタイプと呼ばれる。このイディオタイプ自体も抗原性を有し、このイディオタイプを免疫原として、抗イディオタイプ抗体を作製することができる。【００３９】
本発明の中和抗体を免疫原として作製される抗体は、好ましくは、キラートキシン様タンパク質に対する本発明の中和抗体（抗キラートキシン様タンパク質抗体）のイディオタイプ決定基と結合する（親和性を有する）抗イディオタイプ抗体である。【００４０】
該抗イディオタイプ抗体は、キラートキシン様タンパク質の内部像（イメージ）を有し、該キラートキシン様タンパク質と同様の機能（活性）を有することを特徴とする抗体である。【００４１】
本発明の中和抗体は、通常、抗キラートキシン様タンパク質抗体であり、好ましくは、該キラートキシン様タンパク質（例えば、HM-1等）の有する活性（例えば、βグルカン合成酵素阻害活性、抗真菌活性等）を中和する抗体である。該抗キラートキシン様タンパク質抗体は、好ましくは、モノクローナル中和抗体である。本発明の中和抗体の具体例としては、nmAb-KTと称するHM-1に対して中和活性を有する抗体（Yamamoto T.外３名著、「Application of monoclonal antibodies to the isolation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii.」、FEBS Lett.、1986年Jan 20、Vol.195(1-2)、p.253-257）を好適に示すことができる。【００４２】
該nmAb-KTは、酵母(Williopsis saturnus) Var. mrakiiから産生されるキラートキシンの活性をインビトロで中和するモノクローナル抗体であり、標準的なハイブリドーマ技術によって作製されたものであり、抗原特異性が高く、βグルカン合成酵素阻害活性を中和する活性も高い。このnmAb-KTは、当業者においては、本明細書に記載された文献等を参考に、一般的な抗体作製技術を用いて適宜作製することが可能である。【００４３】
本発明においてキラートキシン様タンパク質とは、真菌が生成するタンパク質性抗菌物質を指し、上述の（ａ）および／または（ｂ）の活性を有するタンパク質であれば特に制限されないが、例えば、酵母Williopsis saturnus属由来のタンパク質であることが好ましい。具体的には、本発明のキラートキシン様タンパク質として、HM-1キラートキシン、またはHYIタンパク質を例示することができる。【００４４】
HM-1キラートキシンは、ハンゼヌラ・ムラキ（Hansenula mrakii）とも呼ばれている酵母ウィリオプシス・サチュルヌス（Williopsis saturnus）により産生される強力な抗真菌活性を有するポリペプチドである。HM-1キラートキシンを産生する好ましいハンゼヌラ・ムラキ株としては、例えば、IFO 0895またはIFO 8075等をあげることができる。また、HM-1キラートキシンのアミノ酸配列は既に公知である(FEBS LETT.,195,253-257,1986)。【００４５】
本発明の中和抗体の好ましい態様としては、HM-1に対する中和抗体であって、HM-1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１）における33〜59位内、より好ましくは39〜48位内のアミノ酸領域をエピトープとすることを特徴とする抗体である。【００４６】
即ち、本発明の中和抗体の好ましい態様としては、HM-1タンパク質の部分断片ポリペプチドであって、通常、配列番号：１における30〜60位、好ましくは33〜59位、より好ましくは39〜48位に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体である。HM-1タンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において39〜48位に相当するアミノ酸領域からなるHM-1デカペプチド（「TGGSTDDGKQG」）の配列を、配列番号：２に示す。【００４７】
また本発明の中和抗体は、例えば、HYIに対する中和抗体であって、HYIタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：３）における30〜60位内、より好ましくは39〜47位内のアミノ酸領域をエピトープとすることを特徴とする抗体である。【００４８】
即ち、本発明の中和抗体の好ましい態様としては、HYIタンパク質の部分断片ポリペプチドであって、通常、配列番号：３における30〜60位、より好ましくは39〜47位に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体である。HYIタンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において39〜47位に相当するアミノ酸領域からなるHYIナノポリペプチド（「TGESNGQQG」）の配列を、配列番号：４に示す。【００４９】
本発明の中和抗体は、上述のように配列番号：２もしくは配列番号：４に記載のペプチドをエピトープとして認識し得ることから、該ペプチドと強固な結合親和性を有することが好ましい。従って、本発明の中和抗体は、必ずしも必須ではないが、上記の配列番号：２もしくは配列番号：４に記載のペプチドと結合親和性を有する抗体であると特徴づけることができる。【００５０】
また、これらの配列番号：２もしくは４に記載のペプチドと結合した中和抗体は、キラートキシン様タンパク質（例えば、HM-1、HYI等）の有する上記（ａ）または（ｂ）の活性を中和する機能が低下もしくは喪失しているものと考えられる。従って、本発明の抗体は、例えば、配列番号：２もしくは４に記載のペプチドと反応させることにより、キラートキシン様タンパク質の有する前記機能を低下もしくは喪失させ得る抗体であると特徴づけることが可能である。【００５１】
また本発明者らは、中和抗体のnmAb-KTを免疫原として利用することにより、実際に抗真菌活性を有する抗イディオタイプ抗体を作製することに成功した。（後述の実施例参照）該抗体は、所謂ScFvと呼ばれる一本鎖ポリペプチド抗体である。【００５２】
本発明者らによって作製された一本鎖ポリペプチド抗体のアミノ酸配列を、配列番号：５〜８に示す。（ScFv-A1（配列番号：５）、ScFv-A2（配列番号：６）、ScFv-A3（配列番号：７）、ScFv-A4（配列番号：８））【００５３】
上記ポリペプチドは、HM-1キラートキシン活性を有し、βグルカン合成酵素を有する真菌に対して抗真菌活性を有する抗イディオタイプ抗体の可変領域を含むポリペプチドである。該ポリペプチドは、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)に相当する領域を有し、これらのVHおよびVLがアミノ酸からなるリンカーによって連結された構造を有する。【００５４】
これらのポリペプチドは、中和抗体のnmAb-KTと結合親和性を有することから、本発明の抗体の好ましい態様としては、例えば、上記ポリペプチド（配列番号：５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド）と結合親和性を有する抗体であると特徴づけることができる。【００５５】
この結合親和性とは、本発明の中和抗体と上記ポリペプチドが実質的に結合し得る程度の親和性を示すものであればよいが、一例を示せば、通常、親和定数が1.0 x106M-1以上であり、好ましくは、親和定数Kaが1.0 x106M-1以上であり、好ましくは3.0 x106M-1以上であり、より好ましくは4.0 x106M-1以上であり、さらに好ましくは4.4 x106M-1以上である。【００５６】
また本発明の中和抗体の好ましい態様においては、上記ポリペプチドと結合することにより、該ポリペプチドの有する活性を阻害する機能を有する抗体であることが好ましい。例えば、本発明の中和抗体は、上記ポリペプチドと結合することによって、該ポリペプチドが有するβグルカン合成酵素阻害活性を抑制（阻害）する機能を有するものと特徴付けられる。【００５７】
また、当業者においては一般的な免疫工学技術を用いて、本発明の中和抗体を免疫原（抗原）とする抗体を、適宜作製することが可能である。例えば、キラートキシン様タンパク質、もしくは本発明者らによって見出されたエピトープ領域を含むポリペプチドを免疫原として用いて、一般的な抗体作製技術により、本発明の中和抗体を取得することが可能である。該技術により、種々の抗体が作製された場合であっても、上述のポリペプチド（例えば、配列番号：５〜８に記載のペプチド）を利用して、上述のように結合親和性もしくはキラートキシン様タンパク質の有する活性の有無を指標として、当業者においては過度の試行を伴うことなく、適宜、本発明の中和抗体を選択することが可能である。【００５８】
本発明の中和抗体を免疫原（抗原）として作製される抗体は、キラートキシン様タンパク質と同等の機能を有することが期待される。例えば、該抗体は、βグルカン合成酵素を有する真菌に対する抗真菌活性、および／または、βグルカン合成酵素阻害活性を有することが期待される。【００５９】
本発明において「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体（キメラ抗体、ヒト化抗体、低分子化抗体（抗体断片も含む）、多特異性抗体等）が含まれる。また、本発明において「抗体」は、ポリペプチドあるいは異種多量体（例えば、IgG型抗体）のいずれであってもよい。好ましい抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、並びに、抗体断片等の低分子化抗体（一本鎖Fvポリペプチド等）である。【００６０】
本発明における「抗体」には、上述の抗体に対してさらにアミノ酸の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入、またはキメラ化やヒト化等により、そのアミノ酸配列が改変されたものが含まれる。アミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入、並びにヒト化、キメラ化などのアミノ酸配列の改変は、当業者が公知の方法により行うことが可能である。同様に、本発明における抗体を組換え抗体として作製する際に利用する抗体の可変領域もしくは定常領域も、アミノ酸の置換、欠失、付加および／もしくは挿入、またはキメラ化やヒト化等によりそのアミノ酸配列を改変してもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、中でもヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体等でもよい。【００６１】
「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組合わせて作製される抗体である。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変（V）領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常（C）領域からなる抗体を例示することができる。キメラ抗体の作製は公知であり、例えば、抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによりキメラ抗体を得ることができる。【００６２】
「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）をヒト抗体のCDRへ移植したものが公知である。また、一般的な遺伝子組換え手法により、例えば、マウス抗体のCDRを決定し、該CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とが連結された抗体をコードするDNAを取得し、ヒト化抗体を通常の発現ベクターを用いた系により産生することができる。このようなDNAは、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成することができる。【００６３】
本発明における抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体のC領域は，好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を必要に応じ修飾してもよい。ヒト抗体由来の定常領域は、通常、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、IgA、IgDおよびIgE等のアイソタイプごとに固有のアミノ酸配列を有する。本発明におけるヒト化抗体に用いられる定常領域は、どのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトIgGの定常領域が用いられるが、これに限定されず、上述のように定常領域を全く有さない場合であってもよい。【００６４】
本発明におけるキメラ抗体またはヒト化抗体の可変領域および定常領域は、元の抗体の機能（活性）を示す限り、欠失、置換、挿入および/または付加等により改変されていてもよい。【００６５】
ヒト由来の配列を利用したキメラ抗体およびヒト化抗体は、体内において抗体産生能力が低下している患者に対して、体外で作製し治療目的に投与することが有用である。【００６６】
また、低分子化抗体は、体内動態の性質の面からも、大腸菌、植物細胞等を用いて低コストで製造することが可能であり、経済的にも優れている。【００６７】
本発明の中和抗体を利用して、適宜、低分子抗体（例えば、ScFv、ダイアボディ等）を作製することができる。【００６８】
ScFv等の抗体断片（ポリペプチド）を局所投与以外の方法、例えば、静脈投与にて体内へ注入した場合、体内の免疫反応により該ポリペプチドに対する中和抗体が産生され、該ポリペプチドの活性が低下することが考えられる。一方、通常の抗体（完全抗体）であれば、中和抗体の産生が起こりにくいことから、局所投与以外の方法にて体内へ投与する場合には、抗体断片よりも、完全抗体であることが好ましい。【００６９】
抗体断片は低分子化抗体の一種である。また、低分子化抗体には、抗体の断片をその構造の一部とする抗体も含む。本発明の中和抗体を利用して作製される低分子化抗体は、特にその構造、製造法等は限定されない。低分子化抗体は、通常、全長抗体と比較して、高い比活性を有することが多い。【００７０】
本発明の中和抗体を免疫原として作製可能な抗体断片としては、例えば、Fab、F(ab')2、Fab'、Fvなどを挙げることができる。抗体断片中の、VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加および／または挿入により改変されていてもよい。【００７１】
例えば、前述の抗体断片のうち「Fv」は、完全な抗原認識部位と結合部位を含む最小の抗体断片である。「Fv」は、1つのVHおよび1つのVLが共有結合により強く結合したダイマー（VH-VLダイマー）である。各可変領域の3つの相補鎖決定領域（complementarity determining region；CDR）が立体的に相互作用し、VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。6つのCDRが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、1つの可変領域（または、抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。従って、このようなFvより小さい分子も本発明における抗体断片に含まれる。又、抗体断片の可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。【００７２】
低分子化抗体は、VHとVLの両方を含んでいることが好ましい。低分子化抗体の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2およびFv等の抗体断片、並びに、抗体断片を利用して作製され得るScFv（シングルチェインFv）等を挙げることができる。抗体断片は、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼにより処理して取得することも可能である。【００７３】
抗体断片を改変した構造を有する低分子化抗体は、酵素処理若しくは遺伝子組換えにより得られた抗体断片を利用して構築することができる。あるいは、低分子化抗体全体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることもできる。【００７４】
また、本発明の中和抗体を用いて作製される上記「ScFv」は、2つの可変領域を、必要に応じリンカー等を介して、結合させた一本鎖ポリペプチドであってもよい。ScFvに含まれる2つの可変領域は、通常、1つのVHと1つのVLであるが、2つのVHまたは2つのVLであってもよい。一般にScFvポリペプチドは、VHおよびVLドメインの間にリンカーを含み、それにより抗原結合のために必要なVHおよびVLの対部分が形成される。通常、同じ分子内でVHおよびVLの間で対部分を形成させるために、一般に、VHおよびVLを連結するリンカーを10アミノ酸以上の長さのぺプチドリンカーとする。しかしながら、本発明におけるScFvのリンカーは、ScFvの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカーに限定されるものではない。【００７５】
また、抗体の２つの可変領域を連結させるリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー等を用いることができる。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。【００７６】
また、「ダイアボディ(diabody; Db)」は、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を言う。ダイアボディは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で軽鎖可変領域(VL)および重鎖可変領域(VH)が、互いに結合できない位に短い、例えば、5アミノ酸残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、その間のリンカーが短いため単鎖V領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイアボディは2つの抗原結合部位を有することとなる。【００７７】
ダイアボディは、2分子のScFvを含むことから、4つの可変領域を含み、その結果、2つの抗原結合部位を持つこととなる。ダイマーを形成させないScFvの場合と異なり、ダイアボディの形成を目的とする場合、通常、各ScFv分子内のVHおよびVL間を結ぶリンカーは、ペプチドリンカーとする場合には、5〜20アミノ酸程度のものとする。しかしながら、ダイアボディを形成するScFvのリンカーは、ダイアボディの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカーに限定されない。【００７８】
また、抗体の可変領域を一本鎖抗体(ScFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するScFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を基に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。【００７９】
本発明の中和抗体を免疫原として用いて、ハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用して実施することができる。一例を示せば、本発明の中和抗体（例えば、nmAb-KT）を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域(V領域)のcDNAを合成し、これを所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAと連結することにより得ることができる。【００８０】
抗体工学における最近の進歩は、細菌およびファージディスプレイシステムにおける抗体フラグメントの発現に向けられてきた。そして、生物医学および製薬（特に、臨床での治療および診断）の分野における様々な出願の増加を導いた。ファージディスプレイシステムが抗体フラグメントを発現する能力は、ハイブリドーマ技術より優れたいくつかの重要な利点をもたらす。従って、本発明の抗体を免疫原として用いて作製する場合、ファージディスプレイ技術を利用することが好ましい。第一に、ファージディスプレイ技術は、望ましい特性を有する試薬の迅速で簡単な選択を可能にする強力な濃縮手順を含み、また、安定した遺伝子供給源を提供する。第二に、ScFvフラグメントを細菌内で大量に産生することができる。第三に、抗体試薬の結合特性を高める変異を導入するように、ScFv遺伝子を操作することができる。ファージディスプレイ法は、機能的な免疫グロブリン遺伝子をクローニングするための信頼性の高い技法である（ファルマシア Vol.40, No.8, 2004）。【００８１】
本発明の中和抗体を用いた抗イディオタイプ抗体作製の一例として、中和モノクローナル抗体のnmAb-KTを用いて、ファージディスプレイ法により作製する手順を以下に示す。ただし、以下に示す手順は、本発明の抗体を免疫原として利用して抗体を作製するための一例を簡潔に示すものであり、この方法に特に制限されるものではない。
（１）マウスHM-1中和モノクローン抗体（nmAb-KT）→
（２）マウスへ注射→
（３）脾臓細胞から、抗体H&L鎖mRNAを抽出、cDNA化（H鎖DNA-リンカーL鎖DNAライブラリーを構築）→
（４）cDNAをファージDNAへ組み込んだファージライブラリーを構築→
（５）大腸菌中でファージタンパクを発現→
（６）HM-1中和モノクローン抗体（nmAb-KT）を指標にしたパンニング・スクリーニングを繰り返し、中和抗体と強く結合するファージクローンを選別→
（７）個別クローンによるタンパク発現と、目的とするファージの選別→
（８）選ばれたファージのDNAの塩基配列・アミノ酸配列を解析し、H鎖、L鎖の確認→
（９）抗体（ペプチド）タンパクの発現並びに精製→
（１０）Sc酵母あるいは病原真菌を用いての抗菌力の測定【００８２】
また本発明の中和抗体を免疫原として利用し抗体産生細胞を作製することにより、所望の抗体を取得することも可能である。【００８３】
抗体産生細胞は感作抗原（本発明の中和抗体）を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をin vitroで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる。このようなトランスジェニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球をin vitroで本発明の中和抗体（抗原）または該抗体を発現する細胞で感作（免疫）し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させることにより、該抗原への結合活性を有するヒト抗体を得ることもできる。【００８４】
動物の免疫化は、例えば、本発明の中和抗体（感作抗原）をPhosphate-Buffered Saline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行うことができる。【００８５】
ハイブリドーマは、本発明の中和抗体（抗原）で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用してミエローマ細胞と融合して作製することができる。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸着分析(ELISA)等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。【００８６】
続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞(感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブを用いてクローニングすることができる。また、mRNAからRT-PCRによりクローニングすることも可能である。【００８７】
また、H鎖およびL鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ハムスター抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体のH鎖、L鎖の可変領域とヒト抗体のH鎖、L鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域(CDR; complementary determining region) を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる。CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域(FR)は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい。【００８８】
上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異(例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、PCR変異、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は、基となった抗体の可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号：５〜８に記載のアミノ酸配列）に対して、70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上(例えば、95％以上、97％、98％、99％等)のアミノ酸配列相同性および/または類似性を有する。本明細書において、配列の相同性および/または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、およびギャップ導入した後、基となった抗体残基と相同(同じ残基)または類似(一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基づき同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸残基の割合として定義される。【００８９】
通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づいて(1)疎水性：アラニン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニンおよびロイシン；(2)中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニンおよびセリン；(3)酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸；(4)塩基性：アルギニン、ヒスチジンおよびリシン；(5)鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン；ならびに(6)芳香族性：チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンのグループに分類される。従って、本発明においてアミノ酸の改変を行う場合には、特に制限されないが、上述のように同様の性質を有するアミノ酸へ改変することが好ましい。【００９０】
また、本発明の中和抗体を免疫原として用いて、例えば、ヒト染色体導入マウス（元木一宏、医学のあゆみ、Vol.211、No.7、p.733-740、2004年）を利用して所望のヒト抗体を作製することも可能である。【００９１】
本発明の中和抗体をコードする核酸もまた、本発明に含まれる。当業者においては、アミノ酸の縮重を考慮して、該アミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を容易に知ることができる。【００９２】
また、本発明における核酸は、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明の抗体を生産する目的としてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などを例示することができる。ベクターへの本発明の核酸の挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。【００９３】
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。【００９４】
宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。【００９５】
上記製造方法におけるポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。【００９６】
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。【００９７】
また本発明は、本発明の中和抗体（例えば、nmAb-KT等）を有効成分として含有する抗イディオタイプ抗体作製用抗原（免疫原）を提供する。（本明細書において「本発明の抗原」と記載する場合あり）【００９８】
なお、本発明の抗原は、薬学的に許容される溶媒もしくは担体等が添加された組成物（免疫原組成物）であってもよい。また、本発明の上記抗原を、例えば、「免疫誘導剤」、または、「抗イディオタイプ抗体作製用免疫誘導剤」等と表現することもできる。【００９９】
本発明において上記抗原として利用可能な抗体としては、具体的には、nmAb-KT等を挙げることができる。該nmAb-KTが効果的な抗イディオタイプ抗体の作製のための免疫原として有用であることは、本発明者らによって初めて見出された知見である。【０１００】
本発明の上記抗原を利用して作製される抗体は、抗真菌剤として有用である。該抗真菌剤が有効と考えられる真菌は、通常、βグルカン合成酵素を有する真菌であるが、一例を示せば、サッカロミセス（酵母）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、Cryptococcus neoformans、Aspergillus fumigatos等を例示することができるが、必ずしもこれらに限定されない。【０１０１】
また、本発明の抗原を用いて、上述のように抗イディオタイプ抗体を好適に作製することができる。該抗イディオタイプ抗体は、例えば、βグルカン合成酵素阻害活性、および／または抗真菌活性を有することを特徴とする抗体である。【０１０２】
なお、任意の真菌について、βグルカン合成酵素を有するか否かについては、当業者であれば、公知の種々の文献等によって、適宜知ることができる。公知の文献等によって、βグルカン合成酵素を有するか否かについて不明な場合であっても、上述のようにβグルカン合成酵素活性を検出する方法は既に知られていることから、当業者においては公知の一般的な手法を用いて、任意の真菌について、βグルカン合成酵素を有するか否かを適宜調べることが可能である。【０１０３】
本発明の中和抗体（例えば、nmAb-KT）を免疫原として利用する抗体作製方法もまた、本発明に含まれる。上記方法は、例えば、本発明の中和抗体（例えば、nmAb-KT）を、動物へ投与する工程を含む方法である。【０１０４】
さらに、本発明の中和抗体を免疫原として利用して作製される抗体自体もまた、本発明に含まれる。【０１０５】
また、上述のように本発明者らによって、本発明の中和抗体が認識し得る、キラートキシン様タンパク質上のエピトープ領域が決定された。【０１０６】
該エピトープ領域を含むポリペプチドは、本発明の中和抗体を作製するための抗原として有用である。従って本発明は、以下のポリペプチドに関する。
（１）HM-1タンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号：１に記載のHM-1タンパク質において39位〜48位のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（２）HYIタンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号：３に記載のHYIタンパク質において39位〜47位のアミノ酸配列を含むポリペプチド。【０１０７】
本発明の上記ポリペプチドの一例として、配列番号：１に記載のHM-1タンパク質において39位〜48位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、配列番号：３に記載のHYIタンパク質において39位〜47位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。【０１０８】
また、上記ポリペプチドは、キラートキシン様タンパク質の活性を中和する抗体の作製のための免疫原（抗原）として好適に用いることができる。即ち、上記ポリペプチドは、キラートキシン様タンパク質の活性を中和する抗体を誘導するための薬剤として利用可能である。【０１０９】
従って本発明は、本発明の上記ポリペプチドを有効成分として含有する、中和抗体を誘導し得る免疫原組成物（中和抗体誘導剤）を提供する。【０１１０】
本発明の上記ポリペプチドをエピトープとする抗体は、例えば、βグルカン合成酵素阻害活性を阻害する機能を有することを特徴とする抗体である。【０１１１】
さらに本発明は、本発明の免疫原組成物（例えば、上記エピトープを有するポリペプチド等）を抗原として用いることを特徴とする、本発明の中和抗体の作製方法に関する。該方法には、本発明の免疫原組成物を抗原とする一般的な抗体作成技術を用いた各種方法（工程）が含まれる。【０１１２】
一例を示せば、本発明の上記作製方法として、以下の工程を含む方法を挙げることができるが、必ずしもこの方法に限定されない。
（ａ）本発明の免疫原組成物（例えば、上記エピトープを有するポリペプチド等）で免疫した動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間にハイブリドーマを形成させる工程
（ｂ）該ハイブリドーマをクローン化して、該免疫原に対する抗体を産生するクローンを選択する工程
（ｃ）該クローンから所望の中和抗体を調製する工程【０１１３】
また、上述のようにハイブリドーマからモノクローナル抗体を作製する方法以外にも、例えば、ファージディスプレイヒト型1本鎖抗体ライブラリーを用いた方法（伊藤文昭、ファルマシア、Vol.40、No.8、p.709-713、2004年）により、本発明の中和抗体を作製することが可能である。この方法においては、動物に免疫する必要がなく、ファージを用いてin vitroでスクリーニングを行うため、操作は容易かつ迅速である。また、目的とする抗体が発現しているファージが得られると、抗体タンパク質と併せて抗体遺伝子も単離することができるため、大腸菌や酵母において大量に抗体を発現させたり、抗体遺伝子を操作することにより所望の改変を実施することが可能である。【０１１４】
本発明の中和抗体を用いて作製される抗真菌剤は、真菌症の治療もしくは予防に有効である。例えば、真菌症に対する外用・内用治療薬として有用である。真菌症としては、例えば、皮膚真菌症（白癬菌症(水虫、たむし、しらくも)等）、皮下真菌症（菌腫、放線菌症等）、粘膜真菌症（カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール菌症等）、肺真菌症（クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症等）等が挙げられる。本発明の中和抗体を用いて作製される抗真菌剤の対象となる真菌症としては、特に制限されないが、好ましくは、カンジダ属もしくはアスペルギルス属の真菌を原因とする真菌症である。より具体的には、カンジダ属もしくはアスペルギルス属の真菌を原因とする深在性真菌症を挙げることができる。深在性真菌症の多くは重篤であり致命率も高く、深在性真菌症の治療は医療上の重要な課題となっている。上記薬剤は、例えば、深在性真菌症に対して有効な治療効果が期待される。【０１１５】
また本発明は、本発明の中和抗体を抗原として用いる抗体作製法により、カビ等の病原性真菌に対するタンパク質性抗生物質を作製することも可能である。該物質は、カビの除去もしくは付着の防止を目的とする洗剤、防カビ剤・防カビ素材として利用することも可能である。【０１１６】
さらに本発明は、本発明の中和抗体と医薬的に許容される担体とを含む組成物に関する。【０１１７】
また、本発明の薬剤もしくは組成物、または、本発明の中和抗体を用いて作製される抗体は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。【０１１８】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）を併用してもよい。【０１１９】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジルおよび／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコールおよびフェノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。【０１２０】
本発明の薬剤、もしくは本発明の中和抗体を用いて作製される抗体を含有する薬剤（組成物）は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。【０１２１】
投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり0.001〜100000 mgの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量および投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量および投与方法を設定することが可能である。
また、必要に応じ本発明の薬剤を、その他の薬効成分と組み合わせて製剤化することもできる。【０１２２】
また本発明は、本発明の中和抗体をコードする核酸を提供する。さらに該核酸を担持するベクターもまた、本発明に含まれる。【０１２３】
さらに本発明は、上記核酸を有する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、特に制限されず、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを挙げることができる。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体もしくはポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系には、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系および原核細胞を使用する産生系が挙げられる。【０１２４】
宿主細胞として使用できる真核細胞として、例えば、動物細胞、植物細胞等が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108: 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero等、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340）、および昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が例示される。本発明の抗体の発現においては、CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7細胞、BHK細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。【０１２５】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、この細胞をカルス培養する方法により本発明の抗体を産生させることができる。【０１２６】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、上述の大腸菌（E. coli）に加えて、枯草菌を用いた産生系が知られており、本発明の抗体産生に利用できる。【０１２７】
本発明の宿主細胞を用いて抗体を産生する場合、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞の培養を行い、ポリヌクレオチドを発現させればよい。培養は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、動物細胞を宿主とした場合、培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、FBS、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用しても、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8とするのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。【０１２８】
一方、in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物または植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。【０１２９】
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ハムスター、ウマ、ウシ等を用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。【０１３０】
例えば、本発明の中和抗体をコードするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに投与してもよい。【０１３１】
また、本発明の中和抗体を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる。【０１３２】
さらに、植物を本発明の中和抗体の産生に使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる。【０１３３】
このようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地、乳汁など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて抗体を分離、精製することができる。【０１３４】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia製)等が挙げられる。【０１３５】
必要に応じ、抗体の精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１３６】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。
なお、本実施例において用いられた材料および各種実験手法を以下に示す。【０１３７】
＜材料＞
アフィニティー精製した中和モノクローナル抗体（nmAb-KT）およびHM-1に対するポリクローナルウサギ抗血清は、それぞれTechnology Incubation & Transfer Ltd.（日本、埼玉）および株式会社日本バイオテスト研究所（日本、東京）の調製による。精製HM-1およびHYIキラートキシンタンパク質は、文献（Ohta, Y., Tsukada, Y., and Sugimori, T. (1984) Production, purification and characterization of HYI, an anti-yeast substance, produced by Hansenula saturnus. Agric. Biol. Chem. 48, 903-908.；  Komiyama, T., Ohta, T., Furuichi, Y., Ohta, Y., and Tsukada, Y. (1995) Structure and activity of HYI killer toxin from Hansenula saturnus. Biol. Pharm. Bull. 18, 1057-1059.；  Kasahara, S., Yamada, H., Mio, T., Shiratori, Y., Miyamoto, C., Yabe, T., Nakajima, T., Ichishima, E., and Furuichi, Y. (1994) Cloning of the Saccharomyces cerevisiae gene whose overexpression overcomes the effects of HM-1 killer toxin, which inhibits beta-glucan synthesis. J. Bacteriol. 176, 1488-1499.）に記載の手法によって調製した。マウスモノクローナルアイソタイピングキットは、アマシャムバイオサイエンス株式会社（日本、東京）から購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギヤギIgGおよび抗マウスヤギIgG、ならびにアルカリホスファターゼ結合抗マウスヤギIgGは、Sigma（米国、ミズーリ州、セントルイス）から購入した。Biocore Xシステム、CM5チップ、およびアミノカップリングキットは、Biocore AB（スウェーデン、ウプサラ）の製品である。ペプチドはシグマジェノシス株式会社の合成による。YPD培地は、1%酵母エキス、ならびそれぞれ2%のペプトンおよびグルコースからなる。【０１３８】
＜抗体のアイソタイプ決定＞
抗体アイソタイピングキット（アマシャムファルマシアバイオテック社）を使用し、製造業者の提供する手順に従って、中和モノクローナル抗体のサブクラスを決定した。具体的には、アイソタイピングスティックをTBSに溶解した3 μg/ml nmAbと共に、適度に撹拌しながら室温で15分間インキュベートした。スティックを500倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスヤギIgGの溶液中に、適度に振盪しながら室温で15分間浸した。冷メタノールに溶解した4-クロロ-1-ナフトールおよび0.1%過酸化水素を添加して、nmAb-KTのサブクラスを規定した。【０１３９】
＜SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング＞
HM-1およびHYIタンパク質0.1 μgを、15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。タンパク質をゲルからProBlottメンブレン（Applied Biosystems）に転写した。TBS-T緩衝液に溶解した4%ローファットドライミルクでメンブレンをブロッキングした。メンブレンを、ブロッキング溶液に溶解した3 μg/ml nmAb-KT中に2時間浸した。TBS-Tで3回洗浄した後、メンブレンをアルカリホスファターゼ結合抗マウスヤギIgG溶液中でさらに1時間インキュベートした。洗浄した後、基質としてウェスタンブルー(Western blue)（Promega）を添加して、メンブレン上のタンパク質を可視化した。着色広域標準物質5 μlを標準マーカーとして使用した。【０１４０】
＜サンドイッチELISAによるHM-1およびHYIの定量＞
HM-1およびHYIを検出するため、以前に報告されている通りにサンドイッチELISA法を確立した（Komiyama, T., Zhang, Q.Z., Miyamoto, M., Selvakumar, D., and Furuichi, Y. (2004) Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quantitation of HM-1 killer toxin. Biol. Pharm. Bull. 27, 691-693.）。マイクロタイタープレートのウェルを、50 mM重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)に溶解した10 μg/ml nmAb-KT 50 μlで4℃で一晩コーティングし、TBに溶解した1% BSAで室温で1時間ブロッキングし、TBS-Tで洗浄した。キラートキシンタンパク質をブロッキング緩衝液で希釈し、HM-1およびHYI溶液50 μlを各ウェルに添加して室温で2時間インキュベートし、その後TBS-Tで3回洗浄した。次いで、ブロッキング緩衝液で1:1000希釈したポリクローナル抗HM-1ウサギ血清100 μlをウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。TBS-Tでウェルを洗浄した後、1:1000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギヤギIgG溶液と共に30℃で30分間インキュベートし、次いでTBS-Tで洗浄することにより、結合したタンパク質を検出した。0.1%過酸化水素を含む10% o-フェニレンジアミン溶液を各ウェルに添加し、発色のため30℃で10分間インキュベートした。1N HCl 100 μlを添加して反応を停止し、最終的にマイクロプレートリーダーを用いて490 nmの吸光度を測定した。【０１４１】
＜SPR解析＞
nmAB-KTとHM-1またはHYIとの間の相互作用のリアルタイム測定は、25℃でBIAcore Xバイオセンサーを用いて行った。固定化実験において、HBS-EP緩衝液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.005%ポリソルベート20 (pH 7.4）)を溶出緩衝液として、流束10 μl/minで使用した。CM5センサーチップへのnmAb-KTの固定化は、活性化を除いて、アミンカップリング法の標準的な手順に従って行った。具体的には、200 mM N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩と50 mM N-ヒドロキシスクシニミドの1:1混合物120 μlで活性化したバイオセンサー表面に、前濃縮緩衝液（10 mM酢酸ナトリウム(pH 5.0)）に希釈した35 μg/ml nmAb-KTを注入し、次いで1Mエタノールアミン(pH 8.5) 120 μlを注入して未反応の試薬を不活化した。約3,000レゾナンスユニット(RU)のnmAb-KTが固定化された。1つのチャネルは、10 mM酢酸ナトリウム(pH 5.0)の注入によって活性化し、その後エタノールアミンで不活化した各センサーチップに使用した。このチャネルは、カルボキシルメチル化デキストラン表面に対するHM-1またはHYIの非特異的結合の対照として用いた。それぞれ測定した後、1 mM HCl 20 μlを用いてチップ表面を再生した。【０１４２】
精製HM-1およびHYIタンパク質は、6.25 nM〜100 nMの濃度で解析した。精製タンパク質の各注入試料(30 μl)を抗原と接触させた。BIAevaluation 3.0を用いて動力学的センサーグラム曲線を評価して、結合速度定数konおよび解離速度定数koffを決定した。解離定数Kdは、式Kd = koff/kon用いて計算した。【０１４３】
＜nmAb-KTを用いた場合のHM-1およびHYIのキラートキシン活性＞
HM-1およびHYIタンパク質のキラートキシン活性は、S. セレビシエA451を用いて、液体培養法によって測定した（Komiyama, T., Ohta, T., Urakami, H., Shiratori, Y., Takasuka, T., Satoh, M., Watanabe, T., and Furuichi, Y. (1996) Pore formation on proliferating yeast Saccharomyces cerevisiae cell buds by HM-1 killer toxin. J. Biochem. (Tokyo). 119, 731-736.）。約4 x 106 細胞/mlのS. セレビシエA451を、15 μg/ml nmAb-KTまたは40 ng/ml HM-1もしくはHYIを含むYPD培地中、30℃で8時間インキュベートした。600 nmの吸光度により酵母の増殖を測定した。【０１４４】
＜nmAb-KTのペプチド解析＞
nmAb-KTのエピトープを決定するため、nmAb-KTの中和活性に対するHM-1またはHYI由来ペプチドの阻害効果を測定した。nmAb-KTのエピトープの配列を同定するため、HM-1のアミノ酸配列に基づいて、N末端からC末端まで12のペプチド（P1〜P12）を調製した（表1）。約4 x 106 細胞/mlのS. セレビシエA451を含むYPD培地中、nmAb-KTを、10 μMペプチドおよび40 ng/ml HM-1と供に4℃で一晩インキュベートする方法で、実験を行った。30℃で8時間インキュベートした後、600 nmの吸光度をモニタリングすることによって酵母の増殖を測定した。
nmAb-KTのエピトープ解析に使用したペプチドを表１に示す。【０１４５】
【表１】
2007023782.tif 000002
【０１４６】
ペプチド名の番号はHM-1アミノ酸配列に基づく。アミノ酸位置の番号は、N末端のアミノ酸から数えたものである。【０１４７】
＜ドットブロッティング解析によるペプチド結合アッセイ＞
12のペプチドに加えて、HM-1の39〜48位のアミノ酸配列を示すHM-1デカペプチド、およびHYIの39〜47位のHYIナノペプチド（表1）を合成し、HM-1のエピトープ部位を同定した。ProBlottメンブレンをドットブロット装置（Bio-Craft Inc）に設置し、所定の区域を12のHM-1ペプチドまたはHM-1デカペプチドまたはHYIナノペプチドそれぞれ0.1 μgでコーティングした。TBSに溶解した2%ローファットドライミルクで、メンブレンを室温で1時間ブロッキングした。洗浄した後、メンブレンを一次モノクローナル抗体としてのnmAb-KTと共に室温で2時間インキュベートし、その後TBS-T溶液で3回洗浄した。1:5,000希釈したアルカリホスファターゼ結合抗マウスヤギIgG溶液と室温で1時間インキュベートして、結合したペプチドを検出した。ウェスタンブルー色素を添加して、検出を完了した。【０１４８】
〔実施例１〕nmAb-KTを免疫原として用いる抗イディオタイプ抗体の作製
（１）  免疫化
抗イディオタイプ抗体は、マウスをイディオタイプ免疫原（nmAb-KT）で免疫化することによって作製した。nmAb-KTは、酵母ウィリオプシス・サチュルヌスvar.mrakiiから産生されるキラートキシンの活性をインビトロで中和するモノクローナル抗体であり、標準的なハイブリドーマ技術によって作製した（Yamamotoら,1986,FEBS letter）。雌Balb/cマウス（3週齢、概算体重10グラム）を、0日目および14日目に、nmAb-KT 50 μgと完全フロイントアジュバント（CFA）（1/1:v/v）で皮下に免疫化し、その後に、28日目、42日目、および56日目に、nmAb-KTと不完全フロイントアジュバント（IFA）を腹腔内に追加免疫注射した。最後の追加免疫注射の3日後に、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。【０１４９】
（２）  mRNA単離
RNA抽出キットを使用し、製造業者（ファルマシア（Pharmacia））により提供されたプロトコールに従って、総RNAを過免疫マウスから単離し、エタノール沈殿によって精製した。ポリ（AT）トラクトシステム（poly（AT） tract system）（プロメガ（Promega））を用いて、総RNAからmRNAを単離した。【０１５０】
（３）  抗体可変領域遺伝子のクローニング
組換えファージ抗体システム-ScFvモジュール（recombinant phage antibody system-ScFv module）（ファルマシア）を使用し、製造業者により提供されたプロトコールを用いて、抗体可変領域遺伝子を構築した。【０１５１】
（４）  ScFvライブラリーの構築
ScFv遺伝子のcDNAは、上記nmAb-KTで免疫化された過免疫マウスの脾臓から単離されたmRNAからの逆転写によって作製した。
ScFv遺伝子を、VHフラグメントおよびVLフラグメントをテンプレートとしたオーバーラップPCR（overlap PCR）によって構築し、等量のVH、VL、および（Gly4Ser）3リンカー配列（配列番号：２２）を融合した。【０１５２】
このように構築した遺伝子産物をゲル精製し、分光光度計で定量した。エタノール沈殿の後、構築した遺伝子をSfiIおよびNotI制限酵素で消化した。消化されたScFvフラグメントをゲル精製し、同じ制限酵素で切断されているファージミド発現ベクターpCANTAB 5E（ファルマシア）に連結した。次いで、連結された産物は、プラスミド1 ngにつき1×109形質転換体の効率で、エレクトロポレーションによってサプレッサー大腸菌TG1細胞（ファルマシア）に導入した。エレクトロポレーションの後、細胞を、2％グルコースおよび100 μg/mlの濃度のアンピシリンを含むSOBAG培地へ移し、30℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、コロニーをこそぎ取って、10％グリセロールを含む2×YT培地5 mlに入れ、その後-80℃で保存した。【０１５３】
（５）  ファージレスキュー
nmAb-KTと結合するScFvをファージ粒子の表面に発現するファージ（以下ScFvファージと略す）をレスキューするために、ファージ培養液50 μlを、2％グルコースおよび100 μg/mlアンピシリンを含む2×YT-AG培地50 ml中へ加え、OD600が0.5〜0.7の値に達するまで37℃で振盪した。M13 KO7（ファルマシア）ヘルパーファージを20:1（ファージ粒子:細菌細胞数）のMOIで添加し、振盪せずに37℃で1時間放置した。細胞を遠心分離で収集し、100 μg/mlアンピシリンおよび50 μg/mlカナマイシンを含む新鮮な2×YT-AK培地に懸濁し、振盪しながら30℃で一晩インキュベートした。細菌細胞を遠心分離によって除去し、1/5体積のPEG-NaCl（20％PEG8000,2.5 M NaCl）を添加し上清中のファージ粒子を精製および濃縮し、氷上で30分間インキュベートし、4℃で30分間、10,000 gで遠心分離した。上清を捨て、ペレットをPBS 5 mlに再懸濁した。ファージ懸濁液を再度、PEG-NaClで氷上で30分間処理し、前記のように遠心分離した。このあと、上清を捨て、ペレットを10％グリセロールを含むPBS 2 mlに再懸濁し、その後、4℃で保存した。【０１５４】
（６）  nmAb-KTと結合するScFvファージのパンニングによるスクリーニング
nmAb-KTに特異的に結合するScFvを産生するファージ（ScFvファージ）を選択的に捕獲するために、以下に述べるパンニングスクリーニングを数回繰り返して実施した。ScFvポリペプチドライブラリーを表面上に発現する組換えファージを、ヘルパーファージを用いるレスキューによって産生し、固定化したnmAb-KTに対する結合を利用してスクリーニングし、濃縮した。【０１５５】
（７）  ELISA-ScFvファージ抗体
以上のようにして得られた組換えScFvファージを、これを含む大腸菌の個々のクローンからヘルパーファージを用いる方法によりレスキューし、更に、下記のようにELISA法によってnmAb-KTと結合する能力差を指標にして、選抜スクリーニングを行った。マイクロタイターウェルを前記のようにnmAB-KTでコーティングし、PBSに溶解した3％ドライミルク液を用いて37℃1時間ブロックした。洗浄後、組換えScFvファージをウェル内へ入れ37℃で2時間インキュベートし、次いで、PBS-Tで6回洗浄した。ウェル内でnmAB-KT と結合しているScFvファージは、HRP結合抗M13ファージ抗体（ファルマシア）（1:1000）と37℃で1時間インキュベートすることによって検出した。その際、ウェルを徹底的に洗浄した後、クエン酸に溶解したABTSを基質として添加することによって発色結合したウイルスを発色させ、吸光度をA405nmで測定した。【０１５６】
この結果、パンニングスクリーニング以前には、nmAb-KTと結合するScFvファージはライブラリープール中ごく僅かであったが、4回のパンニングスクリーニングによる選抜・増殖の後ではnmAb-KTと特異的に結合するウイルスは著しく増加した。ScFvファージとnmAb-KTが、真に特異的に結合していることは、nmAb-KTに替えてBSA（Bovine serum albumine）を用いたコントロール実験から証明されている。【０１５７】
4回のパンニング後に選抜されたScFvファージプールを大腸菌（TG1）細胞に感染させた後、アンピシリン含有寒天培地に移し、ファージを含む大腸菌コロニーを増殖させた。このように単一種化された各ファージクローンを得ることが出来た。このようにして得られたScFvが特異的にnmAb-KTに結合することは、ELISA法により確認している。【０１５８】
（８）  可溶性ScFv抗体の作製
可溶性ScFv抗体を作製するために、4回のパンニングスクリーニング後に選抜されたファージを、ScFvコーディング領域とM13遺伝子IIIフラグメント領域との間にあるアンバー停止コドンを認識する非サプレッサー大腸菌HB2151（アマシャムファルマシアバイオサイエンス）に感染させた。大腸菌は、OD600が0.5〜0.9に達するまで、30℃で振盪培養した。ファージミドを含む増殖期大腸菌を1 mMイソプロピルβ,-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）とインキュベートし、さらに22℃で16時間インキュベートすることによりScFv抗体フラグメントのタンパク合成を行い、これにより、ペリプラズムに分泌される可溶型ScFv抗体フラグメントを産生させることが出来た。【０１５９】
細胞を遠心分離によってペレット化し、一方、細胞外へ分泌した可溶性ScFvを含む上清は、0.45 μmフィルターに通して濾過し、それぞれ、-20℃で保存した。細胞のペリプラズムからScFv抗体フラグメントを調製するために、細胞を、氷冷した1×TES（0.2 M Tris-HCl（pH8.0）、0.5 mM EDTA、および0.4Mスクロース）20 mlに懸濁して遠心洗浄し、次に、氷冷1/5×TES緩衝液30 mlに再懸濁し、1時間氷上でインキュベートし、10,800gで30分間遠心分離した。可溶化したScFv抗体フラグメントは上清中に存在する。このようにして得られた可溶性ScFv抗体フラグメントは滅菌チューブに移し、-20℃で保存した。【０１６０】
（９）  ScFv抗体のELISA法による解析
マイクロタイターウェルを、前記のように10 μg/mlのnmAb-KTまたは1F1 mAbまたは4A2 mAbおよびBSA（負の対照）でコーティングし、それぞれPBSに溶解した3％ドライミルク液により室温で1時間ブロックした。洗浄後、可溶性ScFv抗体をウェル内に入れ、室温で2時間インキュベートし、この後、ウェルは、PBS-Tで3回洗浄した。ScFvのカルボキシ末端には小さなペプチドエピトープ（E-Tag）が組み込まれているので、結合したScFv抗体は、HRP結合抗E-Tag抗体（ファルマシア）（1:1000）と室温で1時間インキュベートした後、先に述べたELISA法により検出することができる。この結果、ScFv抗体を可溶化した形で大腸菌から抽出した事を確認した。【０１６１】
（１０）  ScFv抗体の精製
ScFv抗体をコードするファージ遺伝子を含む大腸菌HB2151を、1 mM イソプロピルβ,-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を含む2×YT培地中で22℃で16時間増殖させることによって、可溶性ScFv抗体の産生を誘導した。ScFv抗体は、先に述べた方法により大腸菌HB2151細胞のペリプラズムから抽出し、抗E-Tag N-ヒドロキシスクシンイミドで活性化したセファロースカラム（ハイトラップ抗E-Tag（Hi trap anti-E-Tag）ファルマシア）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製することが出来た。精製されたScFv抗体の収率は1.0〜3.0 mg/lであった。【０１６２】
（１１）  ゲル電気泳動およびイムノブロッティングによるScFvの検証
アフィニティクロマトグラフィーによって得られた精製ScFv抗体の純度を確かめるために、クロマトグラフィーの溶出画分についてウェスタンブロッティング分析を行った。ScFv抗体タンパク質の確認は15％SDS-PAGEで分離した後に、クマシーブリリアントブルーもしくは硝酸銀による染色により行った。ウェスタンブロット分析の際は、ScFv抗体をゲル電気泳動後、イムノトランスファー緩衝液を含むセミドライ装置（1時間,0.8 mA/cm2）を用いて、ニトロセルロースフィルター（プロブロット（ProBlott）膜、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems））に転写した。膜は、PBSに溶解した3％ドライミルク液により室温で1時間ブロックし、その後、HRP結合抗E-Tag抗体（ファルマシア）と1時間インキュベートし、膜上のScFvタンパク質を明らかにした。ゲル電気泳動の際の分子量マーカーとしては、予め着色された広範囲標準（broad range standard）（バイオラド（BIO-RAD））4 μlを使用して、ScFvの分子量を測定した。また、ScFv抗体のタンパク質濃度はBCA-ペプチド結合法を用いて測定した。【０１６３】
この結果、大腸菌HB2151細胞のペリプラズムから得られるScFv抗体のタンパク質は約30 Kdaの分子量をもつことがわかった。一方、ほぼ同じサイズのScFv抗体が培養液内にも観察され、このことから、抽出・精製の行程で、ScFvの一部は大腸菌ペリプラズム部分から漏出することも分かった。【０１６４】
（１２）  ScFv-DNA配列決定
ELISAによりnmAb-KTと強い結合反応性を示す9個のクローンについて、VH鎖およびVL鎖をコードするヌクレオチド配列を決定した。CEQ 2000ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing kit）（ベックマンコールター（BECKMAN COULTER））を用いて、選択されたクローンの核酸配列決定を行い、産物をCEQTM 2000XL DNA分析システムによって分析した。プライマーは、pCANTAB 5EベクターのR1、S3、S4、およびS6配列決定用プライマー（ファルマシア）を用いた。配列アラインメントおよび操作はDNASISおよびGenetyxソフトウェアによって行った。【０１６５】
その結果、これらのクローンのうち4個は、VH遺伝子については共通したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を持ち、VL遺伝子については、それぞれ異なる配列を持つことが判明した。この結果、これらの4種類のクローンはそれぞれ独立したクローンから由来していることが判り、ScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4と名付けた。【０１６６】
（１３）  nmAb-KTとの結合特異性
4種類のScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4について、先に述べた方法により精製し、生化学的特徴について調べた。その結果、4種類のScFv抗体はすべて分子量29〜30 Kdaであり、nmAb-KTと特異的に結合する活性を持つことがわかった。【０１６７】
1F1および4A2モノクローナル抗体はHM-1に対して産生され、HM-1と結合することが出来るが、HM-1の抗菌活性を中和する事は出来ない。更なる生化学的実験により、今回得られた4種類の精製ScFvは、この2種類のモノクローン抗体、1F1 mAbと4A2 mAb、に結合しないことが分かり、これらの実験事実から総合して、4種類のScFvはHM-1の活性部位と相同の機能を持つことが推定された。【０１６８】
（１４）  βグルカン合成酵素阻害活性の検出
精製した4種類のScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4について、これらのScFvは、酵母サッカロミセスのβグルカン合成酵素を阻害することがわかった。βグルカン合成酵素は増殖期の酵母細胞から抽出し（Yamamoto T. et al., FEBS Lett. 1986; 197: 50-54）、基質であるUDPG (Uridine diphosphate glucose)を含む反応液中におけるβグルカンの合成量を山本らの報告に従い（Yamamoto T. et al., FEBS Lett. 1986; 197: 50-54）、発色反応によって測定した。その際、精製したHM-1をポジティブコントロール（陽性対称）として、また、BSA（牛アルブミンタンパク）をネガテェブコントロール（陰性対称）として用いて比較した。この測定条件下において、ScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4は、HM-1と同等のβグルカン合成酵素阻害活性を示した。【０１６９】
（１５）  表面プラズモン共鳴（SPR）分析
表面プラズモン共鳴（SPR）分析を用いて、精製ScFv抗体の結合特異性および速度論パラメータを測定した。
ビアコア（BIAcore）X（ビアコア,Uppasala,Sweden）を使用し、製造業者の説明書に従って、表面プラズモン共鳴（SPR）分析により、固定化抗原に対するScFvの結合速度を測定した。抗原を、35 μg/ml nmAb-KTまたは1F1 mAbまたは4A2 mAbの濃度で、10 mM酢酸ナトリウム（pH5.0）の前濃縮（preconcentration）緩衝液で希釈し、製造業者により供給されたアミン結合キットを接触時間7分および流速10 μl/分で用いてCM5センサーチップに固定化し、表面上の反応しなかった部分をエタノールアミンでブロックした。この結果、以下のレゾナンスユニット（1000レゾナンスユニットは1 ng/mm2の表面濃度に相当する）を測定することができた。それらは、固定化nmAb-KTの場合、3000、1F1 mAbの場合、2854、4A2 mAbの場合、1825という値である。【０１７０】
それぞれのセンサーチップの1個のチャンネルを、活性化後に、10 mM酢酸ナトリウム（pH5.0）を注入するのに使用し、その後に、エタノールアミンで非活性化した。このチャンネルは、ScFvとカルボキシメチル化デキストラン表面との非特異的結合を制御するのに使用した。表面プラズモン共鳴分析の全ての場合において、測定は、流速10 μl/分、25℃、HBS-EP中で行った。それぞれの測定の後、チップ表面を1 mM HCl 10 μlで再生した。【０１７１】
単量体ScFv抗体の分析は15.75 nM〜250 nMの濃度で行った。組換え抗体フラグメントのそれぞれの注入試料（30 μl）と抗原を5分間接触させた。続いて解離が10分間生じた。速度定数konおよびKoffを求めるために、速度論センサーグラム曲線をビアエバリュエーション（BIAevaluation）3.0で評価した。速度論親和定数（ka）はKa=kon/ Koffの式を用いて計算した。
様々な濃度のScFv-A1、ScFv-A2、ScFv-A3、およびScFv-A4と固定化nmAb-KTとの相互作用に関するビアコアセンサーグラムを解析した。【０１７２】
この結果、ScFvは固定化nmAb-KTに結合することが分かった。速度論データの分析から、ScFvのアミノ酸配列は異なるが、これらの抗体はmAb-KTに対して同様の親和性、あるいは結合力を示すことが明らかになった。対照的に、これらの抗体はnmAb-KTには結合するが、1F1 mAbや4A2 mAbやBSA（負の対照）とは測定可能な結合を示さない。会合速度定数（kon）および解離速度定数（Koff）ならびに親和定数（Ka）の計算値を表２に示す。Ka＝Kon／Koff【０１７３】
【表２】
2007023782.tif 000003
【０１７４】
ScFv-A2の親和定数（Ka）（6.65×107M-1）は、ScFv-A3の親和定数（3.04×107M-1）、またはScFv-A1の親和定数（4.8×107M-1）、またはScFv-A4の親和定数（4.48×107M-1）の約2倍または1.2倍であった。これらの選択された抗体の速度論親和定数（Ka）によって、抗体がnmAb-KTに高親和性で結合すると結論付けられる。【０１７５】
（１６）  ScFvの抗カンジダ活性測定
CFUアッセイ(colony forming unit assay)によって、精製ScFvクローンの抗カンジダ活性を測定した。
約5×102細胞/mlのカンジダ・アルビカンスATCC 10231またはカンジダ・アルビカンスIFM 40213またはカンジダ・アルビカンスCAIJ細胞株をPBS 10 μlに懸濁し、精製ScFv KTIdAb（25 μg/ml）およびPBS（対照）100 μlに添加した。対照実験として、nmAb-KTで予め吸着されたScFv KTIdAbにも等量のカンジダ・アルビカンス菌を添加した。それぞれのScFv抗体と37℃で16時間インキュベートした後、カンジダ・アルビカンス菌をサブローデキストロース寒天プレートの表面に分配し、広げ、次いで30℃でインキュベートし、CFUを48時間後に数えた。この実験は、確認のため3回繰り返した。
統計解析を行うために、結果は平均±標準偏差で表した。CFUの数値の差を、スチューデントt検定を用いて評価した。【０１７６】
その結果、CFUアッセイによって、25 μgml-1の4種類のScFv KTIdAbで処理されたカンジダ・アルビカンス菌の増殖は約95％、あるいはそれ以上の阻害をうけることが明らかになった（表３：酵母（サッカロミセス）、およびカンジダ・アルビカンス株に対するScFv抗体の増殖阻害活性）。【０１７７】
【表３】
2007023782.tif 000004
【０１７８】
（上記表中「コロニー数」は残存コロニー数を表す。）
上記実験より、通常の酵母（サッカロミセス）はもちろん、既存の抗真菌剤では効きめが弱いカンジダ・アルビカンス株に対しても、本発明のScFvは、有効な抗真菌作用を発揮することが示された。即ち、本発明の中和抗体を用いて作製される抗イディオタイプ抗体(ScFv)は、カンジダ・アルビカンス株までも殺傷し得る強力な抗真菌活性を有することが実証された。【０１７９】
従って、本発明の中和抗体は、顕著な抗真菌活性を有する抗体の作製のための免疫原として非常に有用であることが示された。【０１８０】
〔実施例２〕nmAb-KTの特徴の解析
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いて、nmAb-KTはIgG1(κ)サブタイプとして分類された。SDS-PAGEによりそれぞれ分子量約57 kDaおよび25 kDaの重鎖および軽鎖のバンドのみが示され、抗体の精度が示唆された。HM-1およびHYIの酵母キラートキシン活性に及ぼすnmAB-KTの効果を図１に示す。nmAb-KTを添加しても酵母の増殖に及ぼす影響は示されなかったが、HM-1およびHYIは強いキラートキシン活性を示した。nmAb-KTはHM-1による酵母細胞の増殖阻止を防いだが、細胞をHYIで処理した場合には、高い濃度(15 μg/ml)においても、nmAb-KTは細胞破壊活性から感受性酵母細胞を防ぐことができなかった。【０１８１】
これらの結果から、nmAb-KTはHM-1のキラートキシン活性を特異的に中和し、HYIのキラートキシン活性は、これら2つのトキシンがアミノ酸配列において高い相同性を共有するものの、nmAb-KTによって妨げられないことが示された。【０１８２】
〔実施例３〕ウェスタンブロット解析によるnmAb-KTの結合特異性
HM-1およびHYIタンパク質を15% SDS-PAGEにより電気泳動し、PVDFメンブレンに転写し、次いでnmAb-KTを一次抗体として使用した。アルカリホスファターゼ結合抗マウスヤギIgGおよびウェスタンブルーを添加して、メンブレン上のタンパク質を可視化した。図２では、HM-1の予想分子量約9500 Daに相当する明らかな単一バンドが示されたが、HYIはメンブレン上にバンドが示されなかった。【０１８３】
これらの結果から、nmAb-KTはM-1のみに結合し、HYIには結合しないことが示された。ドットブロット法によっても同様の結果が得られた。【０１８４】
〔実施例４〕HM-1の定量
0.25〜5 ng（すなわち、5〜100 ng/ml溶液50μl）の範囲の少量のHM-1を測定できるように、HM-1を定量化するサンドイッチELISA法により典型的な検量線を作成した（図３）。一次抗体としてmAB-KTを用いるサンドイッチELISA条件下では、一次構造においてHM-1と高い(87%)相同性を示すにもかかわらず、HYI (5 ng)は検出されなかった。この結果から、nmAb-KTの結合は、HM-1に対して厳密に特異的であることが示された。【０１８５】
〔実施例５〕HM-1およびHYIのSPR解析
SPR解析により、精製HM-1およびHYIの結合特異性および動力学的パラメータを決定した（図４）。Biacoreセンサーグラムから、固定化nmAb-KTとHM-1またはHYIとの相互作用の程度が示された。SPR解析から得られた動力学的データにより、HM-1がnmAb-KTに対して強い親和性を示すのに対して、HYIはnmAb-KTに対する結合を示さないことが明らかになった。konおよびkoffならびにKdの計算値を表４に示す。HM-1のKd値は5.48 x 10-9 M-1である。従って、この場合もやはり、nmb-KTはHM-1に対する強い反応性を示すが、HYIに対する反応性は示さないと結論づけることができる。【０１８６】
SPR解析によって測定したHM-1およびHYIに対するnmAb-KTの結合の動力学的パラメータを表４に示す。【０１８７】
【表４】
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【０１８８】
HM-1およびHYIの動力学的定数は、BIAcoreバイオセンサーを用いて測定した：kon、結合速度定数；koff、解離速度定数；Kd、Kd = koff/konとして算出。ND、シグナルは検出されなかった。【０１８９】
〔実施例６〕nmAb-KTのペプチド解析
酵母増殖阻害アッセイにより、nmAb-KTのペプチド解析を行った。12の合成HM-1ペプチドのうち、P1がHM-1分子を網羅する最初のペプチド（1GDGYLIMCKN10、配列番号：９）であり、P12が最後のペプチド（78GFYIRSYRRVE88、配列番号：２０）である（表１）。酵母増殖に及ぼすペプチドの影響を図５Aに示したが、この結果から、有意な阻害を示すP6および隣接ペプチドを除いて、12のペプチドのほとんどすべてがHM-1に及ぼすnmAb-KTの阻害効果を妨げないことが示された。ペプチドをnmAb-KTに添加することにより、HM-1のキラートキシン活性がある程度回復したことから（図５B）、ペプチドP6（33NVHWMVTGGST43、配列番号：１４）、P7（44DGKQGCATIWEGS56、配列番号：１５）、およびP9（44DGKQGCATIWEGSGCV59、配列番号：１７）がnmAb-KTと反応すると考えられる。一般に、モノクローナル抗体が同じタンパク質中の3つの異なるペプチドに結合することは異例である。したがって、nmAb-KTの特異的結合エピトープを同定するため、P6、P7、およびP9の位置において重複配列を示す新たなデカペプチド（39TGGSTDGKQG48、配列番号：２）を合成した。【０１９０】
HYIにおいてHM-Iの同じ位置に相当するHYIナノペプチド（39TGESNGQQG47、配列番号：４）もまた、対照として合成した（Komiyama, T., Ohta, T., Furuichi, Y., Ohta, Y., and Tsukada, Y. (1995) Structure and activity of HYI killer toxin from Hansenula saturnus. Biol. Pharm. Bull. 18, 1057-1059.）。同じ条件下において、HM-1デカペプチド（39TGGSTDGKQG48、配列番号：２）の添加によりnmAb-KTの中和活性が減少し、このことから、ペプチドによってnmAb-KTのHM-1への結合が妨害されて、遊離のHM-1分子が酵母細胞を死滅させることが示唆される（図５C）。一方、HYIナノペプチド（39TGESNGQQG47、配列番号：４）はnmAb-KTのHM-1中和活性に影響しなかった。これらの結果から、nmAb-KTが39TGGSTDGKQG48（配列番号：２）の位置においてHM-1に特異的に結合し、HM-1のキラートキシン活性を中和することが強く示唆された。【０１９１】
〔実施例７〕nmAb-KTのエピトープの同定
HM-1分子内のnmAb-KTのエピトープを調べるため、ドットブロット解析により、HYIナノペプチドを陰性対照として使用して、12のHM-1ペプチドまたはHM-1デカペプチドに対するnmAb-KTの結合特異性を測定した（図６）。図６Aに示すように、試験した12のペプチドのうち、ペプチドP6およびP7がnmAb-KTに対して強い結合を示したのに対して、P9は弱い結合を示した。ペプチドP6およびP7を網羅するHM-1デカペプチドを用いたドットブロット解析は、すべてのうち最も強い結合を示したが、同じ領域のアミノ酸配列に相当するHYIナノペプチドはnmAb-KTに対する結合を示さなかった（図６B）。これらの結果から、この場合もやはり、nmAb-KTのエピトープがHM-1デカペプチド39TGGSTDGKQG48（配列番号：２）内に位置することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１９２】
キラートキシンは、酵母および菌類の間での増殖競合を制御する興味深い抗菌性タンパク質であることが判明している。キラー現象は1963年に酵母において発見され、それ以来、二本鎖RNAウイルス様粒子の検出、キラー因子の作用機序、およびキラー因子遺伝子の発現における核遺伝子の関与ついて、酵母キラー因子に関する数多くの分子生物学的および微生物学的研究がなされてきた。キラートキシン系によるこれらの研究は、抗真菌薬の開発およびタンパク質-タンパク質相互作用研究を含む種々の目的に利用されている。【０１９３】
キラー活性を中和する抗体のエピトープを同定し特徴づけることは、キラートキシンの構造と機能との関連性を理解するため、ならびに農業および臨床分野においてキラータンパク質または抗体を利用するために必然的に重要である。【０１９４】
キラートキシンは、それ自体、抗真菌剤の候補物質であることが示された（Yamamoto, T., Imai, M., Tachibana, K., and Mayumi, M. (1986) Application of monoclonal antibodies to the isolation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii. FEBS Lett. 195, 253-257.）。しかし、キラートキシンのタンパク質性および免疫原性の性質によって、病原性真菌の全身感染を治療するために直接適用することは困難であった。また、キラートキシンの抗真菌活性が、病原体の増殖を効率的に処理するのに十分強力であるのかどうか、または抗菌スペクトルが種々の病原株に対処するのに十分広いかどうかは不明であった。【０１９５】
本発明者らは、HM-1のキラートキシン活性を中和し得るnmAb-KT、および、HM-1に結合するがHM-1のキラートキシン活性を中和しない他の種類のモノクローナル抗体、1F1および4A2を作製した（Komiyama, T., Zhang, Q.Z., Miyamoto, M., Selvakumar, D., and Furuichi, Y. (2004) Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quantitation of HM-1 killer toxin. Biol. Pharm. Bull. 27, 691-693.）。さらに、本発明者らの以前の研究で、別のキラートキシンHYIが、構造およびグルカン合成酵素阻害活性の点でHM-1に非常に類似しているにもかかわらず、HM-1に対するnmAb-KTによって中和されないことを示した。【０１９６】
本発明者らは、グルカン合成酵素阻害に関与するHM-の活性部位およびnmAb-KTが結合するエピトープ部位を特徴づけることに成功した。
本研究では、nmAb-KTをIgG1(κ)抗体であると特徴づけ、またナノグラム以下の微量のHM-1を定量できるように、nmAb-KTを用いて新たなサンドイッチELISA法を作製した。次に、HM-1のグルカン合成酵素阻害活性およびキラー活性を阻害する（中和する）nmAb-KTによって認識されるHM-1のエピトープを特徴づけた。合成ペプチドスキャン解析から、nmAb-KTのエピトープがHM-1デカペプチド39TGGSTDGKQG48（配列番号：２）内に位置することが認められ、これがHM-1キラー機能の活性部位の一部である可能性があることが示された。これと一致して、nmAb-KTによって中和されないHYIは、相当する領域に、HM-1と約50%の部分的相同性しか示さない、異なるアミノ酸配列39TGESNGQQG47（配列番号：４）を含むことが判明した。HYIは、HM-1との全体的な相同性は87%という高さであるにもかかわらず、39TGESNGQQG47（配列番号：４）領域でのみHM-1と相同でないことは注目に値する。SPR解析から、nmAb-KTはHM-1とKd = 5.48 x 10-9 M-1という高い親和性で結合するが、HYIとは結合しないことが証明された。一方、初めにHM-1に対して作製したモノクローナル抗体、1F1および4A2は、ドットブロット解析によって示されるようにHM-1およびHYIの両方に結合し（図６AおよびB）、HM-1およびHYIは、87%という高いアミノ酸配列相同性によって同じ3D構造を有することが示唆された。nmAb-KTが39TGGSTDGKQG48（配列番号：２）でHM-1のみに結合しキラー活性を中和するという事実から、同じ領域の39TGESNGQQG47（配列番号：４）を認識するHYI抗体は、nmAb-KTのようにHYIのキラートキシン活性およびグルカン合成酵素阻害活性を中和することが示唆された。このような抗体は、HYIと類似の活性を有する抗イディオタイプ抗体を作製するための抗イディオタイプ免疫に用いることが可能である。【０１９７】
また本発明者らは、イディオタイプワクチン接種においてnmAb-KTを使用して、組換えDNA技術またはファージディスプレイ技術により、HM-1キラートキシンの内部像を模倣した抗イディオタイプ抗体を実際に作製した。本発明者らは、臨床的に重要な種々の病原体に対する強力なキラートキシン真菌活性を示すScFv抗イディオタイプ抗体の取得に成功した。【０１９８】
本実施例において、可溶性ペプチドを用いることにより、nmAb-KTのエピトープを決定することができた。HM-1とHYIとの相同性を考慮して、nmAb-KTの最終的エピトープが示唆された。HM-1デカペプチド中のアミノ酸39TG40および47QG48は、HYIと相同である（表1）。従って、nmAb-KTの最終的エピトープは41GSTDGK46（配列番号：２１）の位置であると結論づけることが可能である。【０１９９】
ペプチド結合アッセイから、nmAb-KTがHM-1デカペプチドと最も強く反応するが、HYIナノペプチドとは反応しないことが明らかになった。これらの結果は、HM-1デカペプチドがHM-1のキラートキシン活性を発現する活性部位の1つであることを強く示唆するものである。本実施例で評価したnmAb-KTのエピトープのアミノ酸配列は、HM-1のアスパラギン酸-44およびリジン-46がHM-1のキラートキシン活性に重要な2つの必須なアミノ酸であることが示唆された。HYI配列のこの位置にこれら2つのアミノ酸が存在しないことは、HYIがnmAb-KTに結合できないことの根拠の説明になると考えられる。【０２００】
非常に有用な抗体を理解し設計するためには、エピトープの同定といった基本レベルで抗体を特徴づけることが必要である。本研究で得られ記載した実験結果は、臨床応用に関連した本抗体のさらなる研究をサポートするものである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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