【手続補正書】
【提出日】平成31年1月8日(2019.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
[本発明1001]
細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムであって、
(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチドであって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド;
(b) 該受容体修飾に応答して該受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド;
(c) 切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む遺伝子調整ポリペプチド(GMP)であって、該切断認識部位の切断の際に該アクチュエータモエティが活性化されて標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、GMP; および
(d) 該切断認識部位に近接している場合に該切断認識部位を切断する、切断モエティ
を含み、
ここで: 
(i) 該GMPが該キメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成し、かつ該切断モエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する;
(ii) 該GMPが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ該切断モエティが該キメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成する; または
(iii) 該切断モエティが、該受容体修飾に応答して該キメラ受容体ポリペプチドに結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつ該GMPが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する、
前記システム。
[本発明1002]
受容体がSEQ ID NO: 39を含まない、本発明1001のシステム。
[本発明1003]
標的ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、本発明1001のシステム。
[本発明1004]
標的ポリヌクレオチドがRNAである、本発明1001のシステム。
[本発明1005]
修飾がリン酸化である、本発明1001のシステム。
[本発明1006]
アクチュエータモエティがCasタンパク質であり、かつ前記システムが、Casタンパク質と複合体を形成するために活性なガイドRNAをさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1007]
(i) アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)であり、かつ (ii) 前記システムが、該ガイドRNAと複合体を形成することができるCasタンパク質をさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1008]
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、本発明1006または1007のシステム。
[本発明1009]
(i) GMPがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、(ii) 切断認識部位の切断が、キメラアダプターポリペプチドを受容体から放出するのに有効であり、かつ (iii) 前記システムが、修飾された受容体に結合するGMPを含むさらなるキメラアダプターポリペプチドを含む、本発明1001のシステム。
[本発明1010]
受容体修飾が複数の修飾部位での修飾を含み、各修飾部位が、アダプターポリペプチドに結合するのに有効である、本発明1001のシステム。
[本発明1011]
切断認識部位がポリペプチド配列を含み、かつ切断モエティがプロテアーゼ活性を含む、本発明1001のシステム。
[本発明1012]
切断認識部位がジスルフィド結合を含み、かつ切断モエティが酸化還元酵素活性を含む、本発明1001のシステム。
[本発明1013]
切断認識部位が、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、該インテイン配列の第1部分を含む、本発明1001のシステム。
[本発明1014]
受容体が膜貫通受容体である、本発明1001のシステム。
[本発明1015]
受容体が核内受容体である、本発明1001のシステム。
[本発明1016]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、本発明1001のシステム。
[本発明1017]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、本発明1001のシステム。
[本発明1018]
アクチュエータモエティが、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される、本発明1001のシステム。
[本発明1019]
キメラ受容体ポリペプチドが、細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、本発明1001のシステム。
[本発明1020]
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へ受容体を輸送させる、本発明1019のシステム。
[本発明1021]
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、本発明1019のシステム。
[本発明1022]
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、本発明1019のシステム。
[本発明1023]
キメラアダプターポリペプチドが、細胞の特定の領域へアダプターを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、本発明1001のシステム。
[本発明1024]
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へキメラアダプターポリペプチドを輸送させる、本発明1023のシステム。
[本発明1025]
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、本発明1023のシステム。
[本発明1026]
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、本発明1023のシステム。
[本発明1027]
受容体がポリペプチド折畳みドメインに連結される、本発明1001のシステム。
[本発明1028]
キメラアダプターポリペプチドが、ポリペプチド折畳みドメインに連結される、本発明1001のシステム。
[本発明1029]
細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、
(a) キメラ受容体ポリペプチドを抗原に曝露する段階であって、ここで (i) 抗原への曝露の際に受容体が修飾され、かつ (ii) 受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、段階;
(b) 該受容体修飾に応答してキメラアダプターポリペプチドを該キメラ受容体ポリペプチドに結合させて、遺伝子調整ポリペプチド(GMP)と切断モエティとの間で複合体を形成させる段階であって、ここで該GMPは切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む、段階; および
(c) 該切断認識部位を該切断モエティによって切断する段階であって、ここで該切断認識部位の切断の際に該アクチュエータモエティが活性化されて標的ポリヌクレオチドと複合体形成し、それにより細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、段階
を含み;
ここで: 
(i) 該GMPが該キメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成し、かつ該切断モエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する;
(ii) 該切断モエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ該GMPが該キメラ受容体の細胞内領域の一部分を形成する; または
(iii) 該切断モエティが、該受容体修飾に応答して該受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつ該GMPが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する、
前記方法。
[本発明1030]
受容体がSEQ ID NO: 39を含まない、本発明1029の方法。
[本発明1031]
標的ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、本発明1029の方法。
[本発明1032]
標的ポリヌクレオチドがRNAである、本発明1029の方法。
[本発明1033]
修飾がリン酸化である、本発明1029の方法。
[本発明1034]
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、本発明1029の方法。
[本発明1035]
アクチュエータモエティが、Casタンパク質と複合体を形成するガイドRNAと複合体形成したRNA結合タンパク質(RBP)である、本発明1029の方法。
[本発明1036]
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、本発明1034または1035の方法。
[本発明1037]
(i) GMPがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、(ii) 該キメラアダプターポリペプチドが、切断認識部位の切断後に受容体から放出され、かつ (iii) GMPを含むさらなるキメラアダプターポリペプチドが、修飾された受容体に結合する、本発明1029の方法。
[本発明1038]
受容体修飾が複数の修飾部位での修飾を含み、各修飾部位が、キメラアダプターポリペプチドに結合するのに有効である、本発明1029の方法。
[本発明1039]
切断認識部位がポリペプチド配列を含み、かつ切断モエティがプロテアーゼ活性を含む、本発明1029の方法。
[本発明1040]
切断認識部位がジスルフィド結合を含み、かつ切断モエティが酸化還元酵素活性を含む、本発明1029の方法。
[本発明1041]
切断認識部位が、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、該インテイン配列の第1部分を含む、本発明1029の方法。
[本発明1042]
受容体が膜貫通受容体である、本発明1029の方法。
[本発明1043]
受容体が核内受容体である、本発明1029の方法。
[本発明1044]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、本発明1029の方法。
[本発明1045]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、本発明1029の方法。
[本発明1046]
キメラ細胞内受容体であって、
(a) 抗原に特異的に結合する抗原相互作用ドメイン; および
(b) 抗原相互作用ドメインに連結されたアクチュエータモエティ
を含み、
ここで: 
(i) キメラ細胞内受容体が抗原結合に応答して修飾され; 
(ii) キメラ受容体ポリペプチドが、修飾に応答して細胞の核に移動し; かつ
(iii) アクチュエータモエティが、核内の標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、
前記受容体。
[本発明1047]
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、本発明1046のシステム。
[本発明1048]
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、本発明1047のキメラ細胞内受容体。
[本発明1049]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、本発明1046のキメラ細胞内受容体。
[本発明1050]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、本発明1046のキメラ細胞内受容体。
[本発明1051]
抗原がホルモンである、本発明1046のキメラ細胞内受容体。
[本発明1052]
アクチュエータモエティが、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される、本発明1046のキメラ細胞内受容体。
[本発明1053]
細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、本発明1046のキメラ細胞内受容体。
[本発明1054]
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、またはペルオキシソームへ受容体を輸送させる、本発明1053のキメラ細胞内受容体。
[本発明1055]
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、本発明1053のキメラ細胞内受容体。
[本発明1056]
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、本発明1053のキメラ細胞内受容体。
[本発明1057]
受容体がポリペプチド折畳みドメインに連結される、本発明1046のキメラ細胞内受容体。
[本発明1058]
核を含む細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、
(a) キメラ細胞内受容体を抗原に曝露する段階であって、ここで (i) 該受容体が抗原相互作用ドメインおよびアクチュエータモエティを含み、かつ (ii) 該抗原への曝露の際に該受容体が修飾される、段階;
(b) 該修飾された受容体を核に移動させる段階; ならびに
(c) アクチュエータモエティと標的ポリヌクレオチドとの間で複合体を形成する段階
を含む、前記方法。
[本発明1059]
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、本発明1058の方法。
[本発明1060]
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、本発明1058の方法。
[本発明1061]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、本発明1058の方法。
[本発明1062]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、本発明1058の方法。
[本発明1063]
抗原がホルモンである、本発明1058の方法。
[本発明1064]
(a) 抗原相互作用ドメイン; および
(b) 切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む遺伝子調整ポリペプチド(GMP)
を含み、
ここで: 
(i) キメラ受容体ポリペプチドが抗原結合に応答して修飾され; 
(ii) 切断認識部位が、キメラ受容体ポリペプチドの修飾に応答して切断モエティにより切断され; 
(iii) アクチュエータモエティが切断認識部位でキメラ受容体ポリペプチドから切断された後に、標的ポリヌクレオチドと複合体形成し; かつ
(iv) キメラ受容体ポリペプチドが、SEQ ID NO: 39を含まない、
キメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1065]
切断認識部位が、抗原相互作用ドメインとアクチュエータモエティとに挟まれている、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1066]
抗原相互作用ドメインが、キメラ受容体ポリペプチドの細胞外領域の一部分を形成し、かつGMPが、該キメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成する、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1067]
アクチュエータモエティが、切断認識配列の切断後に細胞核に移動する、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1068]
抗原結合に応答して細胞核に移動する核内受容体である、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1069]
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1070]
アクチュエータモエティが、Casタンパク質と複合体を形成することができるガイドRNAと複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)である、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1071]
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、本発明1069または1070のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1072]
切断認識部位が、プロテアーゼの認識配列であるポリペプチド配列を含む、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1073]
切断認識部位が、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、該インテイン配列の第1部分を含む、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1074]
切断認識部位がジスルフィド結合を含む、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1075]
膜貫通受容体である、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1076]
核内受容体である、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1077]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1078]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1079]
アクチュエータモエティが、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1080]
細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1081]
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へ受容体を輸送させる、本発明1080のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1082]
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、本発明1080のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1083]
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、本発明1080のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1084]
ポリペプチド折畳みドメインに連結される、本発明1064のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1085]
(a) 抗原に結合する際に修飾を受けた受容体に結合する受容体結合モエティ; および
(b) 該受容体結合モエティに連結された遺伝子調整ポリペプチド(GMP)であり、切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む、GMP
を含み、
ここで: 
(i) 該切断認識部位が、受容体結合に応答して切断モエティにより切断可能であり; かつ
(ii) 該アクチュエータモエティが、該切断認識部位の切断に応答して標的ポリヌクレオチドと複合体形成するように作動可能である、
キメラアダプターポリペプチド。
[本発明1086]
アクチュエータモエティが、切断認識配列の切断後に細胞核に移動するように作動可能である、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1087]
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1088]
アクチュエータモエティが、Casタンパク質と複合体を形成することができるガイドRNAと複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)である、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1089]
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、本発明1087または1088のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1090]
切断認識部位が、プロテアーゼの認識配列であるポリペプチド配列を含む、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1091]
切断認識部位が、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、該インテイン配列の第1部分を含む、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1092]
切断認識部位がジスルフィド結合を含む、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1093]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1094]
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1095]
アクチュエータモエティが、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1096]
アダプターポリペプチドが、細胞の特定の領域へアダプターを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、本発明1085のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1097]
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へアダプターを輸送させる、本発明1096のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1098]
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、本発明1096のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1099]
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、本発明1096のキメラアダプターポリペプチド。
[本発明1100]
細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムであって、
(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチドであって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド;
(b) 該受容体修飾に応答して該受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド;
(c) ペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティであって、該ペプチド切断ドメインの切断の際にアクチュエータモエティが活性化されて該標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、アクチュエータモエティ; および
(d) 該ペプチド切断ドメインに近接している場合に該ペプチド切断ドメインを切断する切断モエティ
を含み、
ここで: 
(i) 該切断モエティが該受容体の細胞内部分を形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; 
(ii) 該切断モエティが、該受容体修飾に応答して該受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; または
(iii) 該切断モエティが該アダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該受容体の細胞内部分を形成する、
前記システム。
[本発明1101]
細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムであって、
(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチド受容体であって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド;
(b) 該受容体修飾に応答して該受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド;
(c) ペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティであって、該ペプチド切断ドメインの切断の際にアクチュエータモエティが活性化されて該標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、アクチュエータモエティ; および
(d) 該ペプチド切断ドメインに近接している場合に該ペプチド切断ドメインを切断する組換えプロテアーゼドメイン
を含み、
ここで: 
(i) 該組換えプロテアーゼドメインが該受容体の細胞内部分を形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; 
(ii) 該組換えプロテアーゼドメインが、該受容体修飾に応答して該受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し; または
(iii) 該組換えプロテアーゼドメインが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該受容体の細胞内部分を形成する、
前記システム。
[本発明1102]
(a) 抗原に結合する細胞外抗原相互作用ドメイン;
(b) 膜貫通ドメイン; および
(c) Casタンパク質を含む細胞内遺伝子調整ドメイン
を含み、
ここで、ペプチド切断ドメインが該遺伝子調整ドメインのアミノ末端に位置し;
ここで、該抗原に該細胞外抗原相互作用ドメインが結合する際に、該遺伝子調整ドメインが、該ペプチド切断ドメインの切断によってキメラ受容体ポリペプチドから放出される、
前記キメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1103]
抗原に結合する際に受容体修飾を受ける、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1104]
膜貫通ドメインがNotch受容体タンパク質の一部分、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1105]
膜貫通ドメインが、SEQ ID NO: 39またはそのフラグメントに対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1104のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1106]
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1107]
Casタンパク質がCas9タンパク質である、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1108]
遺伝子調整ドメインが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータドメインをさらに含む、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1109]
遺伝子調整ドメインが、標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるのに有効なリプレッサドメインをさらに含む、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1110]
遺伝子調整ドメインが、該遺伝子調整ドメインが受容体から放出された後に細胞の特定の領域へ該遺伝子調整ドメインを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列をさらに含む、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1111]
少なくとも1つの標的指向配列が、核局在化配列(NLS)を含む、本発明1110のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1112]
細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1113]
ポリペプチド折畳みドメインに連結される、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
[本発明1114]
ペプチド切断ドメインが、プロテアーゼの認識配列を含む、本発明1102のキメラ受容体ポリペプチド。
参照による組み入れ
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み入れられるものと具体的かつ個別的に示されているのと同じ程度まで参照により本明細書に組み入れられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【図１】抗原相互作用ドメインおよび遺伝子調整ポリペプチド(GMP)を含む例示的なキメラ受容体ポリペプチドを示す。
【図２】例示的なキメラ膜貫通受容体ポリペプチドを示す。
【図３】図3Aは、ガイド核酸(例えば、sgRNA)と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質を含むアクチュエータモエティを含む例示的なキメラ受容体ポリペプチドを示す。図3Bは、キメラ受容体ポリペプチドおよび切断モエティを含むキメラアダプターポリペプチドを含む例示的なシステムを示す。
【図４】図4A〜Dは、リン酸化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す; 図4E〜H: コンフォメーション変化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す。
【図５】少なくとも1つの標的指向配列を含む例示的なキメラ受容体ポリペプチドを示す。
【図６】図6Aは、受容体結合モエティおよび遺伝子調整ポリペプチド(GMP)を含む例示的なキメラアダプターポリペプチドを示す。図6Bは、ガイド核酸(例えば、sgRNA)と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質を含むアクチュエータモエティを含む例示的なキメラアダプターポリペプチドを示す。
【図７】切断モエティを含むキメラ受容体ポリペプチドおよびGMPを含むキメラアダプターポリペプチドを含む例示的なシステムを示す。
【図８】図8A〜Dは、リン酸化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す; 図8E〜Hは、コンフォメーション変化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す。
【図９】キメラ受容体ポリペプチド、GMPを含むキメラアダプターポリペプチド、および切断モエティを含む第2アダプターポリペプチドを含む例示的なシステムを示す。
【図１０】図10A〜Dは、少なくとも2つのアダプターポリペプチドおよびリン酸化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す; 図10E〜Hは、少なくとも2つのアダプターポリペプチドおよびコンフォメーション変化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す。
【図１１】少なくとも1つの標的指向配列を含む例示的なキメラアダプターポリペプチドを示す。
【図１２】図12A〜Cは、例示的な細胞内受容体を含むシステムを模式的に示す。
【図１３】図13A〜Dは、切断認識部位がインテイン配列を含むシステムを模式的に示す; 図13E〜Hは、切断認識部位がインテイン配列を含むシステムの代替的配置を示す。
【図１４】図14A〜Dは、切断認識部位がジスルフィド結合を含むシステムを模式的に示す; 図14E〜Hは、切断認識部位がジスルフィド結合を含むシステムの代替的配置を示す。
【図１５】CRISPR-Casシステムのサブタイプのためのゲノム遺伝子座の構造を提供する、Makarova, K.S. et al, 「An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems」, Nat Rev Microbiol (2015) 13:722-736の図2から適応された実例を示す。
【図１６】図16A〜Dは、少なくとも2つのアダプターポリペプチドを含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す。
【図１７】ゲノム編集および遺伝子調節のような遺伝子調整のための本発明の工学的に操作されたキメラ抗原受容体の模式図を示す。
【図１８】本開示の工学的に操作されたキメラ抗原受容体の膜貫通ドメインと遺伝子調整ドメインとの間に位置するリンカーのバリアントを示す。
【図１９】図19A〜19Fは、遺伝子調整ドメインおよびいくつかの場合には、その関連したアダプタープロテアーゼを有する工学的に操作されたキメラ抗原受容体を示す。図19Aは、細胞表面抗原に結合するそのような組換え受容体を示す。図19Bは、可溶性抗原に結合することができる遺伝子調整のための組換え受容体を描く。図19Cは、細胞外マトリックス(ECM)シグナルに結合することができる遺伝子調整性の、工学的に操作された受容体を示す。図19Dは、二量体化受容体を示す。受容体の一方は、細胞外ドメイン(ECD)、膜貫通ドメイン(TM)、細胞内ドメイン(ICD)、ペプチド切断配列、および遺伝子調整エフェクタードメインを含む。二量体の他方の受容体は、ECD、TM、ICD、およびプロテアーゼを含む。図19Eは、遺伝子発現を調整しまたは遺伝子を編集しうる二量体化受容体の別の例を示す。二量体化受容体の一方は、ECD、TM、ICD、ペプチド切断配列、および遺伝子調整エフェクタードメインを含むことができる。二量体の他方の受容体は、プロテアーゼではなく、ECD、TMおよびICDを含むことができる。この二量体化受容体を切断するプロテアーゼは、活性化された二量体化受容体に会合するアダプタータンパク質に融合することができる。図19Fは、遺伝子調整ドメインに融合した工学的に操作されたキメラ抗原受容体を含むオリゴマー化受容体の例を示す。
【図２０】図20Aおよび20Bは、異なるキメラ抗原受容体を提供し、sgRNAによって標的遺伝子にガイドされるdCas9-アクチベータドメインの結合を示す。図20Aは、組換えキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびいくつかの場合には、Notchおよびプレセニリン-プロテアーゼ、GPCRおよびβ2-アレスチン-プロテアーゼ、インテグリンおよびパキシリン-プロテアーゼ、カドヘリンおよびβ-カテニン-プロテアーゼ、デスレセプターおよびFADD-プロテアーゼのようなその関連したアダプタープロテアーゼポリペプチド、ならびにキメラ抗原受容体を示す。
【図２１Ａ】dCas9-アクチベータにカップリングしたキメラ抗原GPCRの使用を示す。
【図２１Ｂ】プロテアーゼモエティがGPCRにカップリングされ、かつdCas9-アクチベータドメインが活性化GPCRに動員されたアダプタータンパク質にカップリングされる代替的な構成を示す。
【図２２−１】図22Aおよび22Bは、インテグリン-dCas9遺伝子調整ポリペプチドおよびフィブロネクチンのようなインテグリンリガンドに対するそれらの応答を示す。図22Aは、キメラ抗原インテグリン-dCas9アクチベータの模式図を描く。図22Bは、フィブロネクチンに応答するインテグリン-dCas9複合体を示す。レポーター遺伝子に特異的なsgRNAに結合すると、組換え複合体はレポーター(H2B-GFP)の転写を活性化した。
【図２２−２】図22Cは、浮遊細胞と比較した接着細胞におけるインテグリン-dCas9複合体の活性を示す。図22Dおよび22Eは、インテグリンのβサブユニットに対するパキシリン-TEVの結合特異性をαサブユニットと比べて示す。
【図２３−１】図23Aおよび23Bは、キメラGPCR遺伝子調整ドメインポリペプチドの例示的な態様を提供する。図23Aは、GPCRに基づくキメラ抗原受容体-dCas9アクチベータによる標的遺伝子調節のスキームを示す。
【図２３−２】図23Aおよび23Bは、キメラGPCR遺伝子調整ドメインポリペプチドの例示的な態様を提供する。図23Bは、CXCR4-dCas9ポリペプチドがCXCL12に対して応答性であり、発光レポーターを活性化したことを示す。
【図２３−３】図23Cおよび23Dは、LPAR1、CXCR4およびhM3Dを含むキメラGPCR受容体を示し、リガンド、β-アレスチン-プロテアーゼおよびsgRNAの存在下での蛍光レポーター(GFP)の対応する活性化を示す。
【図２３−４】図23Eおよび23Fは、キメラ受容体からの放出後のsgRNAによって標的とされたdCas9-VPRおよびレポーター遺伝子のプロモーターに直接結合するTetR-VPRから生じるレポーター遺伝子の転写調節のレベルを比較する。
【図２４】図24A〜24Gは、本発明のモジュールキメラ人工Notch受容体の例示的な態様を示す。図24Aは、そのリガンドデルタ(Delta)に結合した野生型Notchを示す。受容体がDeltaに結合することにより活性化された後、ICDはプロテアーゼにより切断され、核に移動して標的遺伝子を調節する。図24Bは、Notch ICDがdCas9融合タンパク質で置換されているキメラ人工Notch受容体を示す。dCas9融合タンパク質は、アクチベータドメイン、例えば、VP64ドメインまたはリプレッサドメイン、例えば、KRABドメインのようなエフェクタードメインを含むことができる。図24Cは、Notch ECDがCD47結合scFvで置換されたdCas9融合タンパク質を含む別のキメラ人工Notch受容体を示す。図24Dは、免疫細胞のような細胞の表面上に発現された例示的なモジュールキメラ人工Notch受容体およびアダプター-プロテアーゼ融合タンパク質(プレシニリン-TEVプロテアーゼ)を示す。モジュールキメラ人工Notch受容体は、dCas9融合ポリペプチド、リンカーおよびエフェクタードメインを含むことができる。Delta-Notch結合に際して、プレシニリンはキメラ人工Notch受容体と会合することができる。次にTEVプロテアーゼは、キメラ人工Notch受容体のペプチド切断ドメインを切断することができる。Notch-dCas9-アクチベータを発現する細胞における蛍光レポーターの活性化は、HEK293細胞については図24Eに、Jurkat細胞については図24Fに、およびTHP-1マクロファージでは図24Gに示されている。
【図２５】図25A〜25Cは、本明細書において記述されるキメラ抗原Notch受容体を用いたNotch受容体の内因性応答を再形成するための理論モデルを示す。図25Aは、シグナル伝達細胞上に発現したDeltaに結合する際の内因性Notchを発現する受容細胞の内因性食細胞応答の抑制を示す。図25Bは、工学的に操作されたcaN受容体が、外的Deltaシグナルに対する内因性食細胞応答を再配線するために作製されうることを示す。図25Cは、細胞の内因性食細胞応答の抑制をDelta結合時の活性化にシフトさせるために工学的に操作されたcaN受容体を産生できることを示す。
【図２６−１】図26A〜26Dは、Notch-dCas9アクチベータがDelta結合に際して、細胞アポトーシスまたは細胞周期を制御するものなどの標的遺伝子を活性化できることを示す。Notch-dCas9ポリペプチドを発現する細胞は、Deltaの存在下での場合に標的遺伝子を活性化した(図26Bおよび26D)。Notchキメラ抗原受容体は、Deltaの非存在下で標的遺伝子の転写を活性化しなかった(図26Aおよび26C)。
【図２６−２】図26-1の説明を参照のこと。
【図２７】図27Aおよび27Bは、Notch-dCas9アクチベータがsgUAS (SEQ ID NO:1; gtactccgacctctagtgt)によりUASプロモーターにガイドされ、レポーター遺伝子(H2B-シトリン)の転写を活性化することを示す。図27Aは、プロセスの模式図を提供する。図27Bは、Notch-dCas9アクチベータがDeltaに応答することを示す。
【図２８】図28Aおよび28Bは、CXCR4-dCas9-VPRポリペプチドがCXCL12リガンドに応答し、レポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)の転写を活性化することを示す。図28A: sgRNA (sgTET; SEQ ID NO:2; gtacgttctctatcactgata)と複合体形成したCXCR4-dCas9-VPRポリペプチドのリガンド結合の模式図を提供する。図28Aは、工学的に操作されたキメラ抗原受容体に関連しうるβ2-アレスチン-プロテアーゼ融合タンパク質も示す。この図はまた、(1) 遊離dCas9-VPRの核への移動、(2) sgTET-dCas9-VPR複合体のルシフェラーゼ遺伝子の転写を調節するTetOプロモーターへの結合、および(3) レポーターの転写を示す。図28Bは、ルシフェラーゼ遺伝子の転写が、CXCR4-dCas9-VPRポリペプチドへのCXCL2結合によって調節されることを示す。
【図２９】図29Aおよび29Bは、インテグリン-dCas9-VPRポリペプチドが細胞外マトリックスリガンドに応答し、レポーター遺伝子(H2B-シトリン)の転写を活性化することを示す。図29Aは、インテグリン-dCas9-VPRポリペプチドへのリガンド結合の際のレポーターの転写活性化の模式図を示す。図29Bは、ECMからのシグナルに応答してインテグリンに基づく工学的に操作されたキメラ抗原受容体-dCas9複合体がレポーター発現を誘導したことを示す。
【図３０】図30Aおよび30Bは、「Split ANDゲート」または「Cascade ANDゲート」論理に基づいた本明細書において記述されるキメラ抗原受容体-エフェクターポリペプチドの例示的な態様を示す。図30Aは、工学的に操作された受容体を分離するために繋がれたスプリットdCas9エフェクターの模式図を示す。図30Bは、リガンドに結合すると、TetO駆動キメラ受容体-dCas9ポリペプチドの発現を誘導するキメラ受容体-tTaポリペプチドの模式図を提供する。
【図３１Ａ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。Cas9誘導体の発現を促進するために置換または工学的に操作されうる、Notch細胞内ドメインの切断および核移行を伴うNotch1受容体の活性化を示す。Cas9に対するエフェクタードメインの融合およびユーザ定義の単一ガイドRNA (sgRNA)配列は、標的指向性の遺伝子調節を可能にする。
【図３１Ｂ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。細胞局在およびDelta依存性レポーター活性化について最初に試験されたmCherryタグ付キメラ受容体コンストラクトの模式的デザインを示す。Notch1細胞外ドメイン(hNECD)および膜貫通ドメインの直後に、ヒトコドン最適化ヌクレアーゼデッドCas9 (dCas9)および三要素(tripartite)アクチベータドメイン(VP64、p65およびRta; VPR)が融合される。コンストラクトNC5は、既知のER搬出シグナルから導出された成熟シグナルを含む。
【図３１Ｃ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。表面固定化されたDelta有りまたは無しで培養された場合のキメラ受容体の遺伝子活性化効率を確認するために用いられる、上流活性化配列(Upstream Activating Sequence: UAS)またはヒストン2B (H2B)-シトリンレポーター遺伝子を駆動するCSL結合(示されていない)プロモーターおよび安定に組み込まれたプロモーターを標的とするsgRNA (例えば、それぞれsgUASまたはsasgCSL)を組み込まれたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株の模式図を示す。固定化されたDeltaリガンドによるNC5受容体の活性化は、dCas9-VPRの切断および核移行をもたらす。配列特異的sgRNA (例えば、sgUASまたはsasgCSL)と複合体形成したdCas9-VPRは、プロモーターへの複合体の結合およびH2B-シトリン遺伝子の活性化を可能にする。
【図３１Ｄ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。固定化されたDeltaに4日間曝露した場合にH2B発現を生じるNC5キメラでトランスフェクトされたCHO細胞の実例の顕微鏡画像を示す。スケールバー, 20 μm。
【図３１Ｅ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。NC5 (化膿連鎖球菌(S. pyogenes) dCas9およびsgUAS)について安定に選択されたCHO UAS-H2Bクローンでのまたは野生型ヒトNotch1もしくはNC5 (黄色ブドウ球菌(S. aureus) dCas9およびsasgCSL)を有するCHO CSL-H2Bクローンでの、ならびに露出表面またはDeltaが固定化された表面上で4日間培養での相対的H2Bレベル(正規化された発現)を示す(n = 3)。平均 ± SEM。
【図３１Ｆ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。NC5 (化膿連鎖球菌dCas9およびsgUAS)について安定に選択されたCHO UAS-H2Bクローンでのまたは野生型ヒトNotch1もしくはNC5 (黄色ブドウ球菌dCas9およびsasgCSL)を有するCHO 12xCSL-H2Bクローンでの、ならびに露出表面またはDeltaが固定化された表面上で4日間培養でのH2B-シトリンを活性化する細胞の割合を示す(n = 3)。平均 ± SEM, ＊＊(-Delta)対照と比較して、p < 0.01。
【図３１Ｇ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。dCas9-VPRの切断および核移行をもたらす固定化されたDeltaリガンドによるNC5受容体の活性化を示す。
【図３１Ｈ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。dCas9-VPR、NC5 + Delta + DAPT、NC5 + Delta、NC5 - Deltaの存在下での、およびコンストラクトなしでのtet-誘導性EGFP遺伝子および標的指向sgRNA (sgTET)を安定に発現するHEK293Tレポーター細胞からのEGFPレポーター強度ヒストグラムを示す。
【図３１Ｉ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。NC5受容体をトランスフェクトし、3日間さまざまな濃度の固定化されたDelta上で培養したHEK293Tレポーター細胞のEGFP活性化の等高線図(同数の細胞が等高線の各対の間に入る)を示す。
【図３２Ａ】本明細書において記述される態様による合成Cas9受容体システムの模式図を示す。標的内因性遺伝子の調整は、Deltaのような、細胞外シグナルに応答する。システムのデザインに依存して、種々の下流細胞挙動が天然の細胞外インプットから誘発されうる。
【図３２Ｂ】左は、hNECD-dCas9-VPR (コンストラクトNC5)を介するCDKN1B活性化がG0/G1期にDelta依存性細胞周期停止を誘導することを示す。右は、一態様による高CDKN1BおよびG0/G1停止の細胞(2n DNAを有する)をもたらすNC5からのdCas9-VPRのDelta依存性切断の略図を示す。
【図３２Ｃ】異なる培養条件下での高CDKN1BおよびG0/G1停止の細胞の実例のフローサイトメトリープロットおよび定量% (陰影領域)を示す: sgRNAのみ、sgRNA + Delta、sgRNA + NC5、またはsgRNA + NC5 + Deltaを有するHEK293細胞。NC5をsgCDKN1B-組み込み細胞に一過的にトランスフェクトし、これを次いで、Delta被覆表面または露出表面上で4日間培養した。n = 3, 平均 ± SEM。G0/G1停止細胞は、プロットの左上の陰影付きの角部に対応し、棒グラフ中の各ペアの上バーに対応する。G2停止細胞は、プロットの右上の陰影付きの角部に対応し、棒グラフ中の各ペアの下バーに対応する。
【図３３】左パネルは、コンストラクトNC1 (赤色)およびsgUAS (青色)でトランスフェクトしたCHO細胞の実例の共焦点蛍光顕微鏡写真を示す。H2B (緑色、核)の早期活性化が観察される。右パネルは、Notch-Cas9キメラのDelta依存性切断における核局在化シグナルと膜成熟シグナルの強度間のバランスの略図を示す。
【図３４】コンストラクトNC1〜NC4 (上、図31B参照)でトランスフェクトし、Deltaの非存在下でのH2B発現(下)を有するCHO細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。スケールバー, 20 μm。
【図３５−１】図35Aは、アミノ酸残基番号647〜670に見出された化膿連鎖球菌(S. py.) Cas9における天然NLS配列を示す。図は、この「内因性」NLS (iNLS)が、表面接近可能なヘリックス・リンカー・へリックス構造(PDB ID: 4UN3)を形成しうることを示している。図35Aは、SEQ ID NO: 31を開示している。図35Bは、dCas9-VPR(上)または変異iNLS dCas9-VPR (中央)でトランスフェクトされた、pTET-EGFPレポーターおよび標的指向sgRNA (sgTET)を安定に組み込まれたHEK293細胞の実例の結果を示す。コンストラクトの存在下または非存在下(下)におけるEGFP活性化およびEGFP活性化(非トランスフェクション細胞に対して正規化)の定量化の代表的ヒストグラムを示す。図35Bは、出現順にそれぞれSEQ ID NO: 31〜32を開示している。
【図３５−２】図35Cは、iNLSモチーフが破壊された場合のHEK293T細胞における損なわれた核局在化およびEGFPレポーター活性化を顕微鏡使用により示す。図35Cは、出現順にそれぞれSEQ ID NO: 31、32、32、および17を開示している。図35Cおよび35Dは、iNLS-変異dCas9-VPRのN末に合成NLSを付加すると、EGFP活性化が部分的に回復することを、顕微鏡使用により視覚的におよび定量的に示す。
【図３６Ａ】Delta依存性遺伝子編集を示す。NC5バリアント: 野生型化膿連鎖球菌ヌクレアーゼ活性Cas9に融合されたhNECD (hNECD-Cas9)でのDelta依存性DNA切断を模式的に示す。
【図３６Ｂ】Delta依存性遺伝子編集を示す。安定に組み込まれたEGFPおよび標的指向sgRNA (sgEGFP)を有するCHO細胞におけるhNECD-Cas9による遺伝子編集/切断の有効性を示す。
【図３６Ｃ】Delta依存性遺伝子編集を示す。HEK293T細胞中で安定に発現され、CXCR4の5'非翻訳領域(UTR)およびイントロン1を標的とするようにデザインされた2つのsgRNA (「sgCXCR4」の左右の短いバー)の実例図を示す。スケールバー, 1000 bp。
【図３６Ｄ】Delta依存性遺伝子編集を示す。上パネルは、SDS-PAGEゲル中でT7E1によって切断された産物の量によって検出される、HEK293T細胞におけるCXCR4遺伝子のDelta誘導hNECD-Cas9媒介性修飾の程度をアッセイするためのT7E1エンドヌクレアーゼの実例の結果を示す。下パネルは、CXCR4 indel変異の頻度の実例の結果を示す。
【図３６Ｅ】Delta依存性遺伝子編集を示す。HEK293T細胞におけるCXCR4タンパク質発現のフローサイトメトリーに基づく免疫蛍光染色の定量化のための実例の結果を示す。
【図３７Ａ】ヒト、アフリカツメガエル(Xenopus)、ゼブラフィッシュ(Zebrafish)、およびショウジョウバエ(Drosophila)相同体のEGF-11およびEGF-12リピートのアライメントを示す(SEQ ID NO: 57〜60)。同一の残基は灰色の四角で示される。星印(＊)は保存されたシステインおよびCa2+結合コンセンサス残基に印を付けている。
【図３７Ｂ】(レポーターアッセイによって評価したときの)さまざまなEGF欠失バリアントの可変活性化レベルを示す。
【図３８】遺伝子特異的sgRNA (1遺伝子あたり2つ)によって標的とされるCXCR4およびCD95遺伝子の同時活性化を示す。4日間培養物における示された条件下でのCXCR4およびCD95の相対活性化レベルを示す(a.u., 任意単位)。データは平均蛍光強度 ± SEMとして表示される(n = 3の独立した実験)。陰性対照dCas9-VPR + sgNT (非標的指向)においてそれぞれ、CXCR4およびCD95レベルと比較して、#、## p < 0.01、0.001、＊、＊＊ p < 0.01、0.001。
【図３９Ａ】Deltaシグナルの細胞周期相特異的停止への変換を示す。細胞周期のDelta依存性停止を誘発するための最小NC5受容体バリアントの使用を模式的に示す。
【図３９Ｂ】Deltaシグナルの細胞周期相特異的停止への変換を示す。CDKN1B過剰発現に起因するG0/G1期での細胞停止を描く。
【図３９Ｃ】Deltaシグナルの細胞周期相特異的停止への変換を示す。dCas9-VPRおよびsgCDKN1Bを有する細胞において、CDKN1B上方制御がG0/G1富化と同時であったこと、ならびにdCas9-VPRおよび非標的指向gsRNAを有する細胞において、CDKN1Bの最小限の増加が観察されたことを示す。
【図３９Ｄ】図39Cの説明を参照のこと。
【図３９Ｅ】Deltaシグナルの細胞周期相特異的停止への変換を示す。DAPTを有する細胞におけるDelta誘導性CDKN1B上方制御およびG0/G1停止の無効化を示す。
【図３９Ｆ】図39Eの説明を参照のこと。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
（表１）例示的プロテアーゼおよび関連認識配列
2019500887.tif 000001
2019500887.tif 000002
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
いくつかの態様において、標的指向配列は膜を標的とするペプチドを含み、ポリペプチドを形質膜または細胞小器官の膜に向かわせる。膜を標的とする配列は、細胞表面膜または他の細胞膜へのキメラ膜貫通受容体ポリペプチドの輸送をもたらしうる。細胞膜と会合している分子は膜会合を容易にする一定の領域を含有し、そのような領域を膜を標的とする配列に組み入れることができる。例えばいくつかのタンパク質はN末またはC末にアシル化された配列を含有し、これらのアシルモエティは膜会合を容易にする。そのような配列はアシルトランスフェラーゼによって認識されることが可能であり、特定の配列モチーフに従うことが多い。一定のアシル化モチーフは単一のアシルモエティによる修飾を受けることができ（多くの場合、アニオン性脂質ヘッドグループとの会合を改善するために、いくつかの正荷電残基が続いている（例えばヒトc-Src））、他のアシル化モチーフは複数のアシルモエティによる修飾を受けることができる。例えばタンパク質チロシンキナーゼSrcのN末配列は単一のミリストイルモエティを含むことができる。Srcファミリーメンバーのサブセット（例えばYes、Fyn、Lck）およびGタンパク質アルファサブユニットなどといった一定のプロテインキナーゼのN末領域には、二重アシル化領域がある。そのような二重アシル化領域は、多くの場合、そのようなタンパク質の最初の18アミノ酸内に位置して、配列モチーフMet-Gly-Cys-Xaa-Cys（SEQ ID NO:86）に合致し、ここでは、Metが切断され、GlyがNアシル化され、Cys残基がSアシル化される。Glyはミリストイル化されることが多く、Cysはパルミトイル化されうる。Gタンパク質ガンマサブユニットおよび他のタンパク質のC末に由来する、C15またはC10イソプレニルモエティで修飾されうる配列モチーフCys-Ala-Ala-Xaa（いわゆる「CAAXボックス」）に合致するアシル化領域も利用することができる。これらのアシル化モチーフおよび他のアシル化モチーフには、Gauthier-Campbell et al., Molecular Biology of the Cell 15: 2205-2217（2004）、Glabati et al., Biochem. J. 303: 697-700（1994）およびZlakine et al., J. Cell Science 110: 673-679（1997）において議論されているものが含まれ、膜局在化を誘導するために標的指向配列中に組み入れることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１０】
修飾は、「タンパク質形質導入ドメイン」（Protein Transduction Domain）、すなわちPTD（つまり細胞透過性ペプチド（CPP））を含みうる。PTDは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、または小胞膜を横切ることを容易にする、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機化合物を指すことができる。PTDは、小さな極性分子から大きな高分子および/またはナノ粒子まで多岐にわたりうる別の分子に取り付けることができ、その分子が膜を横切るのを、例えば細胞外間隙から細胞内スペースに、またはサイトゾルから細胞小器官内に移動するのを、容易にすることができる。PTDはポリペプチドのアミノ末端に共有結合で連結することができる。PTDはポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合で連結することができる。PTDは核酸に共有結合で連結することができる。例示的なPTDとしては、最小ペプチドタンパク質導入ドメイン（minimal peptide protein transduction domain）;細胞への進入を支持するのに十分ないくつかのアルギニン（例えば3、4、5、6、7、8、9、10、または10〜50個のアルギニン）を含むポリアルギニン配列、VP22ドメイン、ショウジョウバエ（Drosophila）アンテナペディアタンパク質導入ドメイン、トランケート型ヒトカルシトニンペプチド、ポリリジン、およびトランスポータン、3アルギニン残基〜50アルギニン残基のアルギニンホモポリマー(SEQ ID NO: 87)を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。PTDは活性化可能な（activatable）CPP（ACPP）であることができる。ACPPとしては、正味の電荷をほとんどゼロまで低減することができそれによって細胞への接着と取り込みを阻害する対応ポリアニオン（例えばGlu9、すなわち「E9」(SEQ ID NO: 89)）に切断可能なリンカーを介して接続された、ポリカチオン性CPP（例えばArg9、すなわち「R9」(SEQ ID NO: 88)）を挙げることができる。リンカーが切断されると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニンおよびその固有の接着性が局所的に露わになり、よってACPPは膜を横切るように「活性化」される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４０】
本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）は、細胞による取り込みを促進するために、ポリペプチド浸透性ドメインに融合することができる。本開示の非組込みポリペプチドには、ペプチド、ペプチドミメティック、および非ペプチド担体を含むいくつかの浸透性ドメインを使用することができる。例えば浸透性ペプチドは、アミノ酸配列
2019500887.tif 000003
(SEQ ID NO: 85)を含む、ペネトラチンと呼ばれるキイロショウジョウバエ転写因子アンテナペディア（Antennapaedia）の第3アルファヘリックスに由来しうる。別の例として、浸透性ペプチドは、例えば天然tatタンパク質のアミノ酸49〜57を含みうるHIV-1 tat塩基性領域アミノ酸配列を含むことができる。他の浸透性ドメインとして、ポリ-アルギニンモチーフ、例えばHIV-1 revタンパク質のアミノ酸34〜56の領域、ノナアルギニン(SEQ ID NO: 88)、オクタアルギニン(SEQ ID NO: 90)などが挙げられる。（例えば、トランスロケーションペプチドおよびペプトイドの教示に関して本明細書に特に組み入れられる、Futaki et al.（2003）Curr Protein Pept Sci. 2003 April; 4（2）: 87-9および446;ならびにWender et al.（2000）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2000 Nov. 21; 97（24）:13003-8;米国特許出願公開第20030220334号、同第20030083256号、同第20030032593号、および同第20030022831号を参照されたい）。ノナアルギニン（R9）配列(SEQ ID NO: 88)を使用することができる。（Wender et al. 2000; Uemura et al. 2002）。融合を行う部位は、ポリペプチドの生物学的活性、分泌または結合特徴が最適化されるように選択することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１４】
実施例5: ヌクレアーゼ欠損Cas9タンパク質に融合した工学的に操作されたキメラインテグリン受容体を用いた遺伝子調節の制御
キメラ人工インテグリン受容体は、完全長β1-インテグリン、プロテアーゼ切断部位、および三要素エフェクタードメイン(VPR)を有するヌクレアーゼ-デッドCas9 (dCas)を含むように産生することができる(図29A)。αβ-インテグリン二量体に結合する細胞外マトリックスは、表面上に固定化され、または別の細胞により提示されることができる。インテグリン活性化は、β-インテグリンのC末へのキメラパキシリン-プロテアーゼの結合、プロテアーゼ切断部位の切断、およびdCas9-VPRの核への移動をもたらす。パキシリンは、β-インテグリンのHDRKモチーフ(SEQ ID NO: 91)を認識する。dCas9および上流活性化配列(UAS)プロモーターを標的とする単一ガイドRNA, sgUAS (SEQ ID NO:1; gtactccgacctctagtgt)は、レポーター遺伝子、例えば蛍光シトリンタグ付きのヒストン2Bをコードする遺伝子の発現を活性化することができる。UAS駆動H2B-シトリン遺伝子およびパキシリン-プロテアーゼコンストラクトの両方を安定に発現するHEK293細胞に、キメラβ1-インテグリン-dCas9-VPRおよびα-インテグリンをコードする発現コンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をECM被覆表面上で培養した。フローサイトメトリーデータは、ECMによって接触されなかった細胞と比較して、ECM表面によって接触された細胞がH2B-シトリンを過剰発現したことを示す(図29B)。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３３】
実験技法
Deltaの表面吸着: 本実施例において記述される実験は、1.5×104細胞/mLにて24ウェルプレートまたは48ウェルプレート(Corning)上にプレーティングした細胞で行われた。8-ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 92)を有するDLL4の親和性増強バリアント(E12)を用いて、2.15 μg/mLの飽和濃度でDeltaをプレート表面に吸着させ、細胞播種の前に37℃で2時間インキュベートした。CHO細胞での実験のために、5 μg/mLのハムスターフィブロネクチン(Innovative Research)もDeltaと一緒に吸着させた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４４】
非公式の配列表
SEQ ID NO:1
sgUAS
2019500887.tif 000004
SEQ ID NO:2
sgTET
2019500887.tif 000005
SEQ ID NO:3
CXCR4-dCas9-VPR-mCherry [CXCR4-V2尾部-TEV切断部位-dCas9-VPR-NLS-mCherry-HAタグ-リンカー]
2019500887.tif 000006
SEQ ID NO:4
CXCR4
2019500887.tif 000007
SEQ ID NO:5
V2尾部
2019500887.tif 000008
SEQ ID NO:6
TEV切断部位
2019500887.tif 000009
SEQ ID NO:7
dCas9
2019500887.tif 000010
SEQ ID NO:8
VPR (太字のNLS, 下線付きのリンカー)
2019500887.tif 000011
SEQ ID NO:9
NLS
2019500887.tif 000012
SEQ ID NO:56
mCherry
2019500887.tif 000013
SEQ ID NO:10
HAタグ
2019500887.tif 000014
SEQ ID NO:11
リンカー
2019500887.tif 000015
SEQ ID NO:12
ITGB1-dCas9-VPR-mCherry [インテグリンβ1-TEV切断部位-dCas9-VPR-NLS-mCherry-HAタグ-リンカー]
2019500887.tif 000016
SEQ ID NO:13
インテグリンβ1
2019500887.tif 000017
SEQ ID NO:14
TEV切断部位
2019500887.tif 000018
SEQ ID NO:15
dCas9
2019500887.tif 000019
SEQ ID NO:16
VPR (太字のNLS、下線付きのリンカー)
2019500887.tif 000020
SEQ ID NO:17
NLS
2019500887.tif 000021
SEQ ID NO:18
mCherry
2019500887.tif 000022
SEQ ID NO:19
HAタグ
2019500887.tif 000023
SEQ ID NO:20
リンカー
2019500887.tif 000024
SEQ ID NO:21
Notch-dCas9-VPR-mCherry [hNECD-TM-hNICD-dCas9-VPR-mCherry-HAタグ-リンカー]
2019500887.tif 000025
2019500887.tif 000026
SEQ ID NO:22
hNECD
2019500887.tif 000027
SEQ ID NO:23
TM
2019500887.tif 000028
SEQ ID NO:24
hNICD
2019500887.tif 000029
SEQ ID NO:25
dCas9
2019500887.tif 000030
SEQ ID NO:26
下線付きのリンカー配列を有するVPR
2019500887.tif 000031
SEQ ID NO:27
mCherry
2019500887.tif 000032
SEQ ID NO:28
HAタグ
2019500887.tif 000033
SEQ ID NO:29
HAタグとVPRとの間のリンカー
2019500887.tif 000034
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019500887000001.app