【手続補正書】
【提出日】平成20年2月27日(2008.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種類のインターナリゼーションした、ラクトース、シアル酸、α−ガラクトシドおよびβ−ガラクトシドからなる群から選択される外来前駆体から出発する遺伝子修飾した細胞による、ラクトースを含んでなるオリゴ糖の製造方法であって、
(i)    上記外来前駆体、または上記前駆体から上記オリゴ糖の合成に必要な上記外来前駆体から上記オリゴ糖の生合成経路における中間体の一つを修飾することができる酵素をコードする少なくとも一種類の組換え遺伝子と、該遺伝子を細胞で発現するための成分をも含んでなり、
上記オリゴ糖、上記前駆体および上記中間体を分解する傾向にある酵素活性を欠いている
大腸菌細胞を得て、
(ii)    少なくとも一種類の上記外来前駆体の存在下にて、上記細胞による上記外来前駆体の能動輸送の機構に従ってインターナリゼーションおよび上記細胞による上記オリゴ糖の産生を生じさせる条件下で、上記細胞を培養する段階を含んでなる、上記方法。
【請求項２】
上記細胞が、外来前駆体を修飾することができる酵素をコードする少なくとも一種類の組換え遺伝子と、該遺伝子を上記細胞で発現するための成分とを含んでなり、上記細胞が上記外来前駆体を分解する傾向にある酵素活性を欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記修飾がグリコシル化、硫酸化(sulfatation)、 アセチル化、リン酸化、スクシニル化、メチル化、およびエノールピルベート基の付加から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記酵素が、グリコシル化を行うことができるグリコシルトランスフェラーゼから選択された酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記酵素が、β−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−グルクロノシル−トランスフェラーゼ、β−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼ、α−２，６−シアリル−トランスフェ
ラーゼ、α−２，８−シアリル−トランスフェラーゼ、α−１，２−フコシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−フコシル−トランスフェラーゼ、およびα−１，４−フコシル−トランスフェラーゼから選択されるグリコシルトランスフェラーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記細胞培養を炭素を基剤とする基質で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記の炭素を基剤とする基質がグリセロールおよびグルコースから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記培養を高細胞密度の培養物を産生する条件下で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上記培養段階が、
a)  上記の炭素を基剤とする基質によって確保される指数細胞増殖の第一相、  b)  連続的に添加される上記の炭素を基剤とする基質によって制限される細胞増殖の第二相、
c)  段階b)で添加される基質の量より少ない量の基質を培養物に連続的に加えることによって得られ、高細胞密度培養物で産生されるオリゴ糖の含量を増加させる遅い細胞増殖の第三相
を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記c)相中に細胞培養物に連続的に加えられる基質の量が、上記b)相中に連続的に加えられる基質の量より少なくとも３０％少ない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記前駆体をb)相中に添加する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
上記前駆体がラクトースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記前駆体が、天然または合成のβ−ガラクトシドおよびα−ガラクトシドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記前駆体の輸送がラクトース透過酵素によって行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記細胞が、LacZ−および／またはNanA−遺伝子型を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項１６】
インデューサーを上記培地に添加して、上記輸送に関与している上記酵素および／またはタンパク質の上記細胞中での発現を誘発することをも含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項１７】
上記インデューサーがイソプロピル＝β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、上記タンパク質がラクトース透過酵素である、請求項２７に記載の方法。
【請求項１８】
上記細胞が、LacZ−, LacY＋の遺伝子型の細菌であり、
上記酵素がβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼであり、
・上記インデューサーがイソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）であり、
・上記前駆体がラクトースであり、
インデューサーを上記培地に添加して、上記輸送に関与している上記酵素および／またはタンパク質の上記細胞中での発現を誘発することをさらに含んでなる、
ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオースおよびポリラクトースアミン（ラクト−Ｎ−ネオ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオ−オクタオース、ラクト−Ｎ−ネオ−デカオース）の製造のための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子修飾した細胞を用いた、ラクトース、シアル酸、α−ガラクトシドおよびβ−ガラクトシドからなる群から選択される、オリゴ糖の合成に有用な外来前駆体の修飾方法であって、
(i)   大腸菌であって、(a)前記外来前駆体を修飾することが出来る酵素をコードする少なくとも一種類の組換え遺伝子と、(b)該遺伝子を該細胞内で発現するための成分とを少なくとも含んでなり、かつ上記オリゴ糖、上記前駆体および上記中間体を分解する傾向にある酵素活性を欠いているものを得て、
(ii)  少なくとも一種類の上記外来前駆体の存在下にて、上記組換え遺伝子の発現を生じさせるのに十分な条件下で、上記細胞を培養し、
(iii)  上記細胞を、該細胞により上記外来前駆体のインターナリゼーションを行わせるのに十分な条件下で、ラクトース透過酵素と接触させることを含んでなり、
ここで、上記酵素が、β−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−グルクロノシル−トランスフェラーゼ、β−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼ、α−２，６−シアリル−トランスフェラーゼ、α−２，８−シアリル−トランスフェラーゼ、α−１，２−フコシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−フコシル−トランスフェラーゼ、およびα−１，４−フコシル−トランスフェラーゼから選択されるグリコシルトランスフェラーゼであることを特徴とする、方法。
【請求項２０】
少なくとも一種類のインターナリゼーションした、ラクトース、シアル酸、α−ガラクトシドおよびβ−ガラクトシドからなる群から選択される外来前駆体から出発する遺伝子修飾した細胞による、ラクトースを含んでなるオリゴ糖の製造方法であって、
(i)   大腸菌であって、(a)前記外来前駆体を修飾することが出来る酵素をコードする少なくとも一種類の組換え遺伝子と、(b)該遺伝子を該細胞内で発現するための成分とを少なくとも含んでなり、かつ上記オリゴ糖、上記前駆体および上記中間体を分解する傾向にある酵素活性を欠いているものを得て、
(ii)    少なくとも一種類の上記外来前駆体の存在下にて、上記細胞による上記外来前駆体の能動輸送の機構に従ってインターナリゼーションおよび上記細胞による上記オリゴ糖の産生を生じさせる条件下で、上記細胞を培養する段階を含んでなり、
ここで、上記酵素が、β−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，３−グルクロノシル−トランスフェラーゼ、β−１，３−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ、β−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−１，４−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、α−２，３−シアリル−トランスフェラーゼ、α−２，６−シアリル−トランスフェラーゼ、α−２，８−シアリル−トランスフェラーゼ、α−１，２−フコシル−トランスフェラーゼ、α−１，３−フコシル−トランスフェラーゼ、およびα−１，４−フコシル−トランスフェラーゼから選択されるグリコシルトランスフェラーゼであることを特徴とする、方法。