【手続補正書】
【提出日】令和1年5月31日(2019.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を分化させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記方法は、
（ａ）複数の多能性幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と接触させるステップと、
（ｂ）前記細胞を、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の少なくとも１種の活性化剤、およびウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１種の活性化剤と接触させるステップを含み、
前記細胞に接触させる、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度を、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤との前記細胞の最初の接触から約２日から約６日の間に増加させ、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）およびＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）を発現する分化細胞の集団を得る、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２】
前記細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤と、約４日間から約１０日間の間接触させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤と、最長約７日間まで、または少なくとも約７日間にわたり接触させる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞を、ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤と、約８日間から約１５日間の間接触させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を、ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤と、最長約１２日間まで、または少なくとも約１２日間にわたり接触させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度を、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤との前記細胞の最初の接触から約４日後に増加させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、前記細胞に接触させた、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の最初の濃度の約４００％〜１４５０％である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、前記細胞に接触させた、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の最初の濃度の約７００％〜１０５０％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、約３から１０μＭの間の濃度までの増加である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、約３μＭの濃度までの増加である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、約７．５μＭの濃度までの増加である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分化細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１（ＥＮ−１）、および核受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）の１種または複数を発現する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記分化細胞が、検出可能なレベルのペアードボックスタンパク質（ＰＡＸ６）および／またはＫｉ６７を発現しない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
分化細胞の集団を、前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい条件に供するステップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい前記条件が、前記細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦβ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）、および／またはＤＡＰＴと接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記多能性細胞が、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の非胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の人工多能性幹細胞、およびヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の組換え多能性細胞からなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤が、ＴＧＦβ受容体の阻害剤を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＴＧＦβ受容体の阻害剤が、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＢＭＰおよびＳＭＡＤシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤が、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン（ＬＤＮ１９３１８９）、ノギン、または上記の組合せを含む、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤が、ＳＨＨタンパク質、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト、または上記の組合せを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＳＨＨタンパク質が、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、または上記の組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えＳＨＨが、ＳＨＨ  Ｃ２５ＩＩを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストが、パルモルファミンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１、または上記の組合せを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを発現する分化細胞が、中脳ドーパミンニューロンである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記多能性幹細胞が、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤との前記多能性幹細胞の最初の接触から約２２〜２７日以内に、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを発現する分化細胞に分化する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記分化細胞が、検出可能なレベルのＣＤ１４２を発現する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＣＤ１４２を発現する細胞を選択するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法に従って分化させた中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
【請求項３１】
前記細胞を、ポリシアリルトランスフェラーゼと接触させる、請求項３０に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
【請求項３２】
前記中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体が、検出可能なマーカーを発現する組換え細胞である、請求項３０または３１に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
【請求項３３】
前記中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体が、生体適合性スキャフォールドに含まれる、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体を含むキット。
【請求項３５】
被験体における神経変性障害の処置における使用のための、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体を含む組成物。
【請求項３６】
前記神経変性障害が、パーキンソン病である、請求項３５に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本開示の主題は、神経変性障害を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載されている分化細胞集団の使用をさらに提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
多能性細胞を分化させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、複数の多能性細胞を、（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤、
（ｂ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の少なくとも１種の活性化剤、および
（ｃ）ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１種の活性化剤
と接触させるステップを含み、
前記複数の多能性細胞に接触させる、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度を、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を前記複数の多能性細胞に最初に接触させてから約２日から約６日の間の後に増加させ、その結果、複数の前記細胞が分化して、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）およびＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）を発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目２）
前記細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と接触させる、項目１に記載の方法。
（項目３）
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を、約４日間から約１０日間の間、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目４）
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を、最長約７日間まで、または少なくとも約７日間にわたり、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目５）
ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を、約８日間から約１５日間の間、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目６）
ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を、約１２日間にわたり、最長約１２日間まで、または少なくとも約１２日間にわたり、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目７）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度を、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を前記複数の多能性細胞に最初に接触させてから約４日後に増加させる、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、前記複数の細胞に接触させた、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の最初の濃度の約４００％〜１４５０％である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、前記複数の細胞に接触させた、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の最初の濃度の約７００％〜１０５０％である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、約３から１０μＭの間の濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、約３μＭの濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、約７．５μＭの濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記複数の細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１（ＥＮ−１）、および核受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）の１種または複数を発現する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記複数の細胞が、検出可能なレベルのペアードボックスタンパク質（ＰＡＸ６）および／またはＫｉ６７を発現しない、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
分化細胞の集団を、前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい条件に供するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい前記条件が、前記細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦβ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）、および／またはＤＡＰＴと接触させることを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記多能性細胞が、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の非胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の人工多能性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の組換え多能性細胞からなる群より選択される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤が、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
ＢＭＰおよびＳＭＡＤシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤が、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン（ＬＤＮ１９３１８９）を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤が、パルモルファミン、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、および／またはＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３Ａ、および／またはＷｎｔ１を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記多能性細胞が、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤、およびＷｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤との接触の開始後、２２〜２７日以内に、中脳ドーパミンニューロンに分化する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記複数の細胞が、検出可能なレベルのＣＤ１４２を発現し、前記方法が、ＣＤ１４２を発現する中脳ドーパミンニューロンの集団を選択するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記項目のいずれかに記載の方法に従って分化させた中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
（項目２５）
前記細胞を、ポリシアリルトランスフェラーゼと接触させる、項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
（項目２６）
項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体を含むキット。
（項目２７）
被験体における神経変性障害を処置する方法であって、項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体をそれを必要とする被験体に投与するステップを含む方法。
（項目２８）
前記神経変性障害が、パーキンソン病であり、前記中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体が、パーキンソン病の１つまたは複数の症状を減少させるのに有効な量で投与される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
検出可能なマーカーを発現する組換え細胞である、項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
（項目３０）
生体適合性スキャホールドに含まれる、項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。