(57)【要約】  フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部を重複して有する改変型組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下にリンパ球を培養する工程を包含することを特徴とするリンパ球の製造方法。本発明の方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用されることから、医療分野への多大な貢献が期待される。また、本発明により、新規な改変型組換えフィブロネクチンフラグメントが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の存在下での培養工程を包含することを特徴とするリンパ球の製造方法。
ポリペプチド（Ｘ）：アミノ酸配列（ｍ）を２個以上配列中に含有し、かつアミノ酸配列（ｎ）を１個以上配列中に含有するポリペプチド
ここでアミノ酸配列（ｍ）は、配列表の配列番号１〜３から選択される１個のアミノ酸配列、もしくは配列表の配列番号１〜３から選択される数個のアミノ酸配列が直接又は間接的に連結したアミノ酸配列からなり、
アミノ酸配列（ｎ）は、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、
ただし、アミノ酸配列（ｍ）は配列表の配列番号１〜３で表される配列のうち、同じ配列を２個以上含まず、またポリペプチド（Ｘ）中の２個以上のアミノ酸配列（ｍ）のそれぞれは同じである、
ポリペプチド（Ｙ）：前記ポリペプチド（Ｘ）において、前記ポリペプチド（Ｘ）に含まれる配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列及び配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の少なくとも１つに、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチド（Ｘ）と同等な機能を有するポリペプチド
【請求項２】
ポリペプチド（Ｘ）が、アミノ酸配列（ｍ）を２もしくは３個含んでなる請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ポリペプチド（Ｘ）が、アミノ酸配列（ｎ）を２もしくは３個含んでなる請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
ポリペプチド（Ｘ）が、配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７又は４９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
リンパ球が抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球又はリンフォカイン活性化細胞である請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含する請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
外来遺伝子をレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターを用いて導入する請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか１項に記載の方法により得られるリンパ球。
【請求項９】
請求項１〜７いずれか１項に記載の方法により得られるリンパ球を有効成分として含有する医薬。
【請求項１０】
下記（ａ）および（ｂ）から選択されるポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記（ａ）のポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリペプチド
【請求項１１】
下記（ｃ）〜（ｇ）から選択される核酸。
（ｃ）配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸
（ｄ）配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９からなる群より選択されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸
（ｅ）配列表の配列番号６、１７、２０、２３、２６、２８、３０、３３、３７、４０、４２、４８及び５０から選択される塩基配列からなる核酸
（ｆ）前記（ｅ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（ｅ）の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有する核酸
（ｇ）前記（ｅ）の核酸の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じた核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（ｅ）の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有する核酸
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用なリンパ球を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。【０００３】
Ｔ細胞は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有し、主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞（以下、ＴＨと記載する）、ＣＤ８マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞〔ＴＣ；細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、キラーＴ細胞とも呼ばれる。以下、ＣＴＬと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウイルス感染細胞等を認識して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしているＣＴＬは、Ｂ細胞のように抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなく、標的細胞膜表面上に存在する主要組織適合複合体〔ＭＨＣ：ヒトにおいてはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称することもある〕クラスＩ分子に会合した標的細胞由来の抗原（抗原ペプチド）を直接認識して作用する。この時、ＣＴＬ膜表面のＴ細胞レセプター（以下、ＴＣＲと称す）が前述した抗原ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識して、抗原ペプチドが自己由来のものなのか、あるいは、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己由来と判断された標的細胞はＣＴＬによって特異的に破壊、除去される。【０００４】
近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特にヒト由来のリンパ球から目的とする抗原に対して特異的に反応するＣＴＬを生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で誘導した後、もしくは誘導を行わず、リンパ球を拡大培養し、患者へ移入する養子免疫療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデルにおいて養子免疫療法がウイルス感染および腫瘍に対して有効な治療法であることが示唆されている（例えば、非特許文献１および２）。この治療法ではＣＴＬの抗原特異的細胞傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持あるいは増加させることが重要である。【０００５】
上記のような養子免疫療法において、治療効果を得るためには一定量以上の細胞数の細胞傷害性リンパ球を投与する必要がある。すなわち、ｅｘ  ｖｉｖｏでこれらの細胞数を短時間に得ることが最大の問題であるといえる。【０００６】
ＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持および増強するためには、ＣＴＬについて抗原に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一般的である。しかし、通常、この方法では最終的に得られるＣＴＬ数が減少し、十分な細胞数が得られない。【０００７】
次に、抗原特異的なＣＴＬの調製に関しては、自己ＣＭＶ感染線維芽細胞とＩＬ−２（例えば、非特許文献３）、あるいは抗ＣＤ３モノクローナル抗体（抗ＣＤ３ｍＡｂ）とＩＬ−２を用いて、それぞれＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを単離ならびに大量培養する方法（例えば、非特許文献４）が報告されている。【０００８】
さらに、特許文献１にはＲＥＭ法（ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）が開示されている。このＲＥＭ法は、抗原特異的ＣＴＬおよびＴＨを含むＴ細胞の初期集団を短期間で増殖（Ｅｘｐａｎｄ）させる方法である。つまり、個々のＴ細胞クローンを増殖させて大量のＴ細胞を提供可能であり、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、並びに放射線照射により増殖性をなくしたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、末梢血単核細胞）とエプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢＶと略す）感染細胞とを用いて抗原特異的ＣＴＬ数を増加させることが特徴である。【０００９】
また、特許文献２には改変ＲＥＭ法が開示されており、当該方法はＰＢＭＣとは区別されるＴ細胞刺激成分を発現する分裂していない哺乳動物細胞株をフィーダ細胞として使用し、ＰＢＭＣの使用量を低減させる方法である。【００１０】
ＣＴＬ以外の疾病の治療に有効なリンパ球としては、例えば、リンフォカイン活性化細胞（例えば、非特許文献５、６）、高濃度のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いて誘導した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（例えば、非特許文献７）が知られている。【００１１】
リンフォカイン活性化細胞は、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集団である。リンフォカイン活性化細胞の培養工程において、抗ＣＤ３抗体を加えることにより、さらにリンフォカイン活性化細胞の増殖は加速する。このようにして得られたリンフォカイン活性化細胞は非特異的にさまざまながん細胞やその他のターゲットに対して傷害活性を有する。【００１２】
フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており（以下、第１図参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型はアミノ酸残基７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ＩＩＩ−１０にはＶＬＡ（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）−５結合領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤＳである。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する（例えば、非特許文献８〜１０）。【００１３】
リンフォカイン活性化細胞や細胞傷害性リンパ球の製造において、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することで、細胞増殖率の向上作用、細胞傷害活性の維持作用することについては、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献３、４および５）。しかしながら、養子免疫療法への適用を考えた場合、上記文献の方法では決して満足できるものではなく、さらなる細胞増殖率の向上や、安全性の観点からフィーダ細胞を使用しない拡大培養方法が求められていた。
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  Ｐ．  Ｄ．著，１９９２年発行，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
【非特許文献２】Ｒｅｕｓｓｅｒ  Ｐ．  他３名，Ｂｌｏｏｄ，１９９１年，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．５，Ｐ１３７３〜１３８０
【非特許文献３】Ｒｉｄｄｅｌｌ  Ｓ．  Ｒ．  他４名，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１４６，Ｎｏ．８，Ｐ２７９５〜２８０４
【非特許文献４】Ｒｉｄｄｅｌｌ  Ｓ．  Ｒ．  他１名，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９０年，Ｖｏｌ．１２８，Ｎｏ．２，Ｐ１８９〜２０１
【非特許文献５】Ｈｏ  Ｍ．  他９名，Ｂｌｏｏｄ，１９９３年，Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ．８，Ｐ２０９３〜２１０１
【非特許文献６】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．  Ａ．他，Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．１９８７年，Ｖｏｌ．３１６，Ｎｏ．１５，Ｐ８８９〜８９７
【非特許文献７】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．  Ａ．他，Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．１９８８年，Ｖｏｌ．３１９，Ｎｏ．２５，Ｐ１６７６〜１６８０
【非特許文献８】Ｄｅａｎｅ  Ｆ．  Ｍｏｍｅｒ著，１９８８年発行，ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ，  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ  ＩＮＣ．，Ｐ１〜８
【非特許文献９】Ｋｉｍｉｚｕｋａ  Ｆ．  他８名，Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．２，ｐ２８４−２９１
【非特許文献１０】Ｈａｎｅｎｂｅｒｇ  Ｈ．  他５名，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９７年，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１８，ｐ２１９３−２２０６
【特許文献１】国際公開第９６／０６９２９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／３２９７０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
【発明の要約】
【００１４】
本発明の第１の発明は、後述するポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の存在下での培養工程を包含することを特徴とする、リンパ球の製造方法に関する。前記ポリペプチド（Ｘ）は配列中にアミノ酸配列（ｍ）を２個以上、かつアミノ酸配列（ｎ）を１個以上含有し、該アミノ酸配列（ｍ）は、配列表の配列番号１〜３から選択される１個のアミノ酸配列、もしくは配列表の配列番号１〜３から選択される数個のアミノ酸配列が直接又は間接的に連結したアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列（ｎ）は、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるものである。ただし、前記アミノ酸配列（ｍ）は配列表の配列番号１〜３で表される配列のうち、同じ配列を２個以上含まず、またポリペプチド（Ｘ）中の２個以上のアミノ酸配列（ｍ）のそれぞれは同じである。また、前記ポリペプチド（Ｙ）は、前記ポリペプチド（Ｘ）において、前記ポリペプチド（Ｘ）に含まれる配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列及び配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の少なくとも１つに、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチド（Ｘ）と同等な機能を有するものである。本発明の第１の発明において、ポリペプチド（Ｘ）としては、アミノ酸配列（ｍ）を２もしくは３個含む配列を有するポリペプチド、及びアミノ酸配列（ｎ）を２もしくは３個含む配列を有するポリペプチドが例示される。かかる具体的な例としては、配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。また、本発明の第１の発明において、リンパ球としては、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球、リンフォカイン活性化細胞が例示される。
【００１５】
また、本発明の第１の発明においては、リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含する、リンパ球の製造方法も提供される。外来遺伝子の導入方法としてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターを用いて導入する方法が例示される。
本発明の第１の発明において、ＣＤ３リガンドとは抗ＣＤ３抗体が、ＣＤ２８リガンドとは抗ＣＤ２８抗体が例示される。
【００１６】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明により得られるリンパ球に関する。また、本発明の第３の発明は本発明の第２の発明を有効成分として含有する医薬に関する。
【００１７】
本発明の第４の発明は、後述の（ａ）および（ｂ）から選択されるポリペプチドに関する。（ａ）で表されるポリペプチドは、配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、（ｂ）で表されるポリペプチドは、前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を有するものである。
【００１８】
本発明の第５の発明は、後述の（ｃ）〜（ｇ）から選択される核酸に関する。（ｃ）で表される核酸は、配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、（ｄ）で表される核酸は、配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９からなる群より選択されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードし、（ｅ）で表される核酸は、配列表の配列番号６、１７、２０、２３、２６、２８、３０、３３、３７、４０、４２、４８及び５０から選択される塩基配列からなり、（ｆ）で表される核酸は、前記（ｅ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（ｅ）の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有し、（ｇ）で表される核酸は、前記（ｅ）の核酸の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じた核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（ｅ）の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。
【図２】Ｈ２９６−Ｈ２９６の作製法を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
本発明は、医療への使用に適した、効率的なリンパ球の製造方法に関する。
【００２１】
本発明は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部を重複して有する改変型組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下にリンパ球を培養することにより、拡大培養率が高く、細胞傷害活性も高いリンパ球が得られることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００２２】
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。また、本発明により、新規な改変型組換えフィブロネクチンフラグメントが提供される。
【００２３】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２４】
（１）本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）またはポリペプチド（Ｙ）
本願明細書中に記載のポリペプチド（Ｘ）は、２個以上のアミノ酸配列（ｍ）、１個以上のアミノ酸配列（ｎ）を必須領域として含むポリペプチドである。
【００２５】
アミノ酸配列（ｍ）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部である配列番号１〜３から選択される１もしくは複数個のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列である。ただし、アミノ酸配列（ｍ）は配列表の配列番号１〜３で表されるそれぞれの同じ配列を２個以上含まないアミノ酸配列であり、配列表の配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列の組み合わせで構成されるアミノ酸配列である。例えば、アミノ酸配列（ｍ）は、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を２個以上含まず、また配列表の配列番号２もしくは３で表されるアミノ酸配列についても同様である。また、ポリペプチド（Ｘ）に存在する２個以上のアミノ酸配列（ｍ）はそれぞれ同一のアミノ酸配列を示す。なお、配列表の配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列はフィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの部分アミノ酸配列を示し、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４のアミノ酸配列である（第１図参照）。
【００２６】
当該アミノ酸配列（ｍ）としては、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドがヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。ヘパリン結合活性は、アミノ酸配列（ｍ）からなるポリペプチドとヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、ウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法〔Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕の細胞接着活性の測定法を利用し、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することによりアミノ酸配列（ｍ）からなるポリペプチドとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
【００２７】
アミノ酸配列（ｍ）はポリペプチド（Ｘ）中に、例えば２〜５個、好適には２〜４個、より好適には２〜３個含有されていることが好ましい。
【００２８】
アミノ酸配列（ｎ）は、フィブロネクチンのＣＳ−１ドメインである配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列である。アミノ酸配列（ｎ）はポリペプチド（Ｘ）中に、例えば１〜５個、好適には１〜４個、より好適には１〜３個含有されていることが好ましく、好適にはポリペプチド（Ｘ）中に含まれるアミノ酸配列（ｍ）と同じ個数含有されていることが好ましい。
【００２９】
前述したように、ポリペプチド（Ｘ）は２個以上のアミノ酸配列（ｍ）、１個以上のアミノ酸配列（ｎ）を含有し、かつポリペプチド（Ｘ）中の２個以上のアミノ酸配列（ｍ）はいずれも同じ配列であるポリペプチドであるが、本発明の所望の効果が得られるものであれば、その他のアミノ酸残基を含んでいてもよい。例えば、メチオニンやＨｉｓタグ配列、リンカー等に由来するアミノ酸残基が含まれていても良い。
【００３０】
ポリペプチド（Ｘ）中の２個以上のアミノ酸配列（ｍ）と１個以上のアミノ酸配列（ｎ）の位置関係については、本発明の所望の効果が得られるものであれば、特に限定はないが、例えば少なくとも１つのアミノ酸配列（ｍ）に対してＣ末端側にアミノ酸配列（ｎ）が連結されているものが好ましい。また、ポリペプチド（Ｘ）中のＮ末端側にはアミノ酸配列（ｍ）が位置しており、Ｃ末端側にはアミノ酸配列（ｎ）が位置していることが好ましい。より好適には、ポリペプチド（Ｘ）中において、アミノ酸配列（ｍ）とアミノ酸配列（ｎ）が交互に位置していることが好ましい。
【００３１】
本発明において、ポリペプチド（Ｘ）としては、例えば配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６）、配列表の配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）、配列表の配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ）、配列表の配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）、配列表の配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）、配列表の配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）、配列表の配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５）、配列表の配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２７１−Ｈ２９６）、配列表の配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２７１）、配列表の配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）、配列表の配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）、配列表の配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ）、配列表の配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ）が例示される。
【００３２】
Ｈ２９６−Ｈ２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３３】
Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３４】
ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、アスパラギン酸、リジン、プロリン、セリン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、アスパラギン酸、リジン、プロリン、セリン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３５】
Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３６】
Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３７】
Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６は、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる
【００３８】
Ｈ１０５−Ｈ１０５は、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる。
【００３９】
Ｈ２７１−Ｈ２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００４０】
Ｈ２９６−Ｈ２７１は、Ｎ末端側から順に、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４で構成されるポリペプチドである。
【００４１】
１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１３のＣ末端側の１５アミノ酸、ＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、アラニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００４２】
１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５は、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる。
【００４３】
Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、アラニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。なお、当該ポリペプチドは、前述のＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴと比較して、ＣＳ−１とＩＩＩ−１４の間に含まれるリンカー部分の２アミノ酸が異なるのみである。
【００４４】
Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃは、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる。なお、当該ポリペプチドは、前述のＨ１０５−Ｈ１０５と比較して、ＣＳ−１とＩＩＩ−１４の間に含まれるリンカー部分の２アミノ酸が異なるのみである。
【００４５】
なお、これらのポリペプチドは本発明において初めて製造された新規なポリペプチドである。これらのポリペプチドの製造方法等、詳細については、後述の「（４）改変型フィブロネクチンポリペプチド」に記載する。
【００４６】
ポリペプチド（Ｘ）の調製に関する有用な情報として、フィブロネクチンに関する情報は、キミヅカ  Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｄｕｋａ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット  Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｒｉｈｔｔ  Ａ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ  Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等を参照することができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
【００４７】
本明細書中に記載のポリペプチド（Ｙ）は、前記ポリペプチド（Ｘ）において、前記ポリペプチド（Ｘ）に含まれる配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列及び配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の少なくとも１つに、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｙ）であって、前記ポリペプチド（Ｘ）と同等な機能を有するポリペプチドである。すなわち、ポリペプチド（Ｙ）は、前記ポリペプチド（Ｘ）の必須成分であるアミノ酸配列（ｍ）もしくはアミノ酸配列（ｎ）中にアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するポリペプチドであり、これらのアミノ酸配列（ｍ）および（ｎ）以外の任意のアミノ酸配列にアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するものではない。当該置換、欠失、挿入もしくは付加としては、例えば１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加のいずれか１つ以上が生じたものが例示される。
【００４８】
アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチド（Ｘ）の機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチド（Ｘ）の物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであるのが好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチド（Ｘ）の持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。具体的には、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチド（Ｘ）におけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。
【００４９】
アミノ酸の置換等は種間や個体差に起因して天然に生ずるものであってもよく、また、人工的に誘発されたものであってもよい。人工的な誘発は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、前述のポリペプチド（Ｘ）をコードする核酸において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された所定の核酸を作製し、当該ポリペプチド（Ｘ）のアミノ酸配列に置換等を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（Ｙ）を製造することができる。また、前述のポリペプチド（Ｘ）を遺伝子工学的に取得する場合、例えば大腸菌などを宿主として製造する場合は、大腸菌由来のメチオニンペプチダーゼ等の影響により、Ｎ末端側のメチオニンが存在しない場合があるが、このようなポリペプチドも本発明のポリペプチド（Ｙ）の好適な例として示される。
【００５０】
本発明のポリペプチド（Ｙ）としては、好適には、前述のＨ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５、Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、又はＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃに含まれる配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列及び配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列の少なくとも１つに、１もしくは複数個のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、前記Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５、Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、又はＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃと同等な機能を有するポリペプチドが例示され、好適には、１〜２０個、さらに好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。
【００５１】
また、本明細書において「同等な機能を有する」とは、比較対照であるポリペプチド（Ｘ）を使用して後述のリンパ球の製造を実施した場合、同等の細胞増殖率が得られること、又は同等の細胞傷害活性が維持されていることをいう。すなわち、後述のリンパ球の製造方法、特に後述の実施例２〜２１、２５〜３３、４２〜４４、４７〜５１、５４〜６０、６４〜６６に記載の方法に沿って実施することにより、その機能を適宜確認することができる。また、ポリペプチド（Ｙ）としては、ヘパリン結合活性を有するものが好適である。ヘパリン結合活性は、前記活性測定方法に準じて評価することができる。当該ポリペプチド（Ｘ）及び当該ポリペプチド（Ｙ）は、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して後述のリンパ球の製造方法に使用することができる。
【００５２】
本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）および（Ｙ）は、後述の実施例９〜１５、３６〜３８にも記載のとおり、後述の本発明のリンパ球の製造方法において、公知のフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）やＨ−２９６（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）と比較しても、明らかに細胞増殖率が高いこと、本発明の抗原特異的ＣＴＬの製造に使用した場合、細胞傷害活性を高く維持できることから、これらのポリペプチドを用いた場合、公知のフィブロネクチンフラグメントを使用するのと比較してきわめて有用な利点がある。なお、本発明に使用されるポリペプチドが、これらの極めて有用な効果を発揮する要因の１つとしては、後述の実施例３５や実施例６１に示すとおり、これらのポリペプチドは細胞培養器材等の固相への固定化効率が極めて高いことが挙げられる。しかしながら、後述の実施例３６〜３８にも示すとおり、細胞培養器材への固定化量を合わせた場合でも、本発明に使用されるポリペプチドは、公知のフィブロネクチンフラグメントと比較して、きわめて高い効果を発揮する。例えば、Ｈ２９６−Ｈ２９６と、モル換算でその２倍量のＨ−２９６を用いて本発明の方法でリンパ球を製造した場合でも、Ｈ２９６−Ｈ２９６の方が明らかに高い効果を発揮する。このことから、本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）又は（Ｙ）のリンパ球の製造に及ぼす効果は、固定化効率が高いことやフィブロネクチンフラグメントのドメインが重複することによる単純な相加効果だけでないことが示される。さらに、後述の（２）−１−３でも示すようにポリペプチド（Ｘ）又は（Ｙ）を抗原特異的ＣＴＬの拡大培養に使用することにより、フィーダ細胞を使用しなくとも高い細胞増殖率、細胞傷害活性の維持が実現できる。抗原特異的ＣＴＬの拡大培養にフィーダ細胞を使用しないことは、安全面、細胞培養の操作やそのコスト、フィーダ細胞の提供者もしくは患者への負担の面において、極めて有意義であるにもかかわらず、従来の抗原特異的ＣＴＬの拡大培養では実現できなかったことである。この点においても、本発明の製造方法は、従来のフィブロネクチンフラグメントを使用したリンパ球の製造からは予想することができない、極めて有用な方法である。
【００５３】
これらのポリペプチド（Ｘ）又は（Ｙ）を構成するアミノ酸数としては、特に限定はないが、好適には１００〜３０００アミノ酸、より好適には１５０〜２８００アミノ酸、さらに好適には２００〜２６００アミノ酸である。
【００５４】
（２）リンパ球の製造方法
以下、本発明のリンパ球の製造方法について具体的に説明する。本発明の方法は、前述のポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の存在下での培養工程（以下、本発明の培養工程と称することがある）を包含することを特徴とする、リンパ球の製造方法である。なお、本願明細書において、ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）を本発明の有効成分と称することがある。
【００５５】
本発明のリンパ球の製造方法は、リンパ球製造における培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において本発明の培養工程を実施することにより行われる。すなわち、リンパ球の製造工程の一部に前記培養工程を含むものであれば本発明に包含される。リンパ球の製造工程の一部に前記培養工程を含む場合、好適には培養初期に前記培養工程を含むことが好ましく、より好適には培養開始時に前記培養工程を含むことが好ましい。
【００５６】
本発明の製造方法により得られるリンパ球としては、特に限定するものではないが、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞、リンフォカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、これらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団等が挙げられる。これらのうち、本発明は、抗原特異的ＣＴＬおよびリンフォカイン活性化細胞の製造により適している。これらの製造方法については後述の（２）−１および（２）−２において具体的に説明する。なお、本明細書においてリンフォカイン活性化細胞とは、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間培養することにより得られる機能的細胞集団を示す。このような細胞集団のことを一般的にリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）と称することがあるが、当該細胞集団には細胞傷害性を有さない細胞（例えば、ナイーブ細胞等）も含まれていることから、本願明細書においては当該細胞集団をリンフォカイン活性化細胞と称することとする。
【００５７】
なお、本発明の製造方法により得られるリンパ球の細胞傷害活性を評価する場合は公知の方法により評価でき、例えば、放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に対する細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を、細胞傷害性リンパ球により破壊された標的細胞に由来する放射活性や蛍光強度を測定することによって評価できる。また、細胞傷害性リンパ球や標的細胞より特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン量を測定することにより検出することもできる。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えば細胞傷害性リンパ球を細胞傷害性リンパ球特異性抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させた後に第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をフローサイトメーターで分析することにより細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を評価することができる
【００５８】
本発明の培養工程は、ＣＴＬになり得る細胞からの抗原特異的ＣＴＬへの誘導、抗原特異的ＣＴＬの維持、もしくは抗原特異的ＣＴＬやナイーブ細胞等の上記のリンパ球の拡大培養を目的とするものである。本発明のリンパ球の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適宜調整してリンパ球の培養を行うことにより、養子免疫療法等に有用なリンパ球を製造することができる。なお、本明細書においてリンパ球とはリンパ球を含有する細胞群をも包含し、ＣＴＬとはＣＴＬを含有する細胞群をも包含するものとする。培養に使用される細胞は製造するリンパ球の種類に応じて適宜設定できるが、当該細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。
【００５９】
本発明の培養工程において使用される細胞培養器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られるリンパ球の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００６０】
本発明において前記有効成分の存在下とは、リンパ球の培養を行なう際に、前記有効成分がその機能を発揮し得る状態で存在することをいい、その存在状態は特に限定されるものではない。例えば、有効成分を使用する培地に溶解させる場合、培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定するものではないが、例えば、好ましくは０．０００１〜１００００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．００１〜１００００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．００５〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０１〜１０００μｇ／ｍＬである。
【００６１】
本発明の有効成分を含め、培地中に使用される成分（例えば後述の抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、インターロイキン−２等）は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００６２】
例えば、ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の固定化は、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載のフィブロネクチンのフラグメントの固定化と同様の方法により実施することができる。前記の種々の成分や、本発明の有効成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法によりリンパ球を得た後、該リンパ球と固相とを分離するのみで、該リンパ球と本発明の有効成分とを容易に分離することができ、該リンパ球への有効成分等の混入を防ぐことができる。
【００６３】
培養条件は、リンパ球の公知の培養条件で行なえばよく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、細胞培養器材を交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は後述のとおり、製造するリンパ球の種類によって、適宜設定することができる。
【００６４】
また、国際公開第０３／０８０８１７号パンフレットに記載されたフィブロネクチンや公知のフィブロネクチンのフラグメントを前記成分と共に用いて培養してもよい。ここで公知のフィブロネクチンのフラグメントとして、好適には、後述の調製例１及び２に記載されているＨ−２９６およびＣＨ−２９６を使用することができる。
【００６５】
さらに、国際公開第０２／１４４８１号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に有効な酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖およびそれらの塩からなる群より選択される化合物や、国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択される物質を前記成分と共に用いて培養してもよい。
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
【００６６】
前記ＣＤ４４に結合活性を有する物質としては、例えばＣＤ４４リガンドおよび／または抗ＣＤ４４抗体が例示される。ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質としては、例えば成長因子に結合活性を有し、成長因子と複合体を形成することにより成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質、もしくは成長因子レセプターに結合活性を有し、成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質が挙げられる。さらに、成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。これらの成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。また、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、前記のような適切な固相に固定化して使用してもよい。なお、上記の各種物質は単独で、もしくは２種以上混合して用いることができる。
【００６７】
本発明のリンパ球の培養工程に使用される培地としては、細胞培養に使用される公知の培地を使用すればよく、さらに後述するとおり製造するリンパ球の種類に応じて各種サイトカイン等を添加すれば良い。
【００６８】
本発明のリンパ球の培養工程においては、培地中に血清や血漿を添加することもできる。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０〜２０容量％、特に自己由来の血清または血漿を用いる場合、患者への負担を考慮して、０〜５容量％とするのが好ましい。また、リンパ球の培養工程において、培地中の血清や血漿濃度は段階的に低減させることができる。例えば、リンパ球の培養工程において培地の交換や添加を行う際に、新たな培地中の血清や血漿濃度を低く調整することにより、使用する血漿や血漿を低減させてリンパ球の培養を実施することができる。このように、培地中の血清や血漿の添加量を低減させることができることは、本発明の有効な効果の１つである。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養するリンパ球と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養するリンパ球と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用できる。
【００６９】
例えば、本発明の方法において、リンパ球の拡大培養を行う場合、本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００７０】
（２）−１  抗原特異的ＣＴＬの製造方法
以下、本発明の製造方法により抗原特異的ＣＴＬを製造する例（以下、本発明の抗原特異的ＣＴＬの製造方法と称することがある）について詳細に記載する。
【００７１】
本発明の製造方法によって抗原特異的ＣＴＬを製造する場合は、ＣＴＬになり得る能力を有する細胞を抗原特異的ＣＴＬに誘導するための培養（本発明の抗原特異的ＣＴＬの誘導方法）、抗原特異的ＣＴＬを維持するための培養（本発明の抗原特異的ＣＴＬの維持方法）、又は抗原特異的ＣＴＬを拡大培養するための培養（本発明の抗原特異的ＣＴＬの拡大培養方法）において、本発明の培養工程を実施することができる。
【００７２】
（２）−１−１  本発明の抗原特異的ＣＴＬの誘導方法
抗原特異的ＣＴＬの誘導のために本発明のリンパ球の培養工程を実施することについて説明する。抗原特異的ＣＴＬの誘導はＣＴＬになり得る細胞に所望の抗原に対する認識能力を付与するために、適切な抗原提示細胞や抗原とともにＣＴＬになり得る細胞を培養することにより実施される。
【００７３】
ＣＴＬになり得る能力を有する細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナイーブ細胞、メモリー細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞、もしくはリンフォカイン活性化細胞等が例示される。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に対して認識すべき抗原を提示する能力を有する細胞であれば特に限定はなく、例えば単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞等に所望の抗原を提示させ、必要に応じてＸ線照射等を施すことにより増殖性を喪失させて本発明に使用することができる。抗原としては、特に限定されるものではなく、例えば、細菌、ウイルス等の外来性抗原や腫瘍関連抗原（癌抗原）等の内在性抗原等が挙げられる。また、抗原提示細胞による刺激は、培養期間中、数回に分けて実施することができる。
【００７４】
また、抗原特異的ＣＴＬの誘導においては、好適には培地に本発明の有効成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、インターロイキン−２（以下、ＩＬ−２と称することがある）を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、より好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。
【００７５】
その他、抗原特異的ＣＴＬの誘導の一般的な条件としては、公知の条件（Ｂｅｄｎａｒｅｋ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４７，Ｎｏ．１２，Ｐ４０４７−４０５３，１９９１）に従えば良い。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施される。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養器材を交換する工程を行っても良い。
【００７６】
このように本発明の培養工程を実施して抗原特異的ＣＴＬの誘導を行なうことにより、抗原特異的ＣＴＬ誘導後の細胞増殖率が高く、さらに誘導された抗原特異的ＣＴＬを拡大培養に供した際に極めて高い細胞増殖率を実現することができる。さらに、このようにして誘導された抗原特異的ＣＴＬは、長期間にわたって維持培養、あるいは拡大培養させても、誘導直後に観察されたような高い細胞傷害活性を維持されているという特徴を有している。この維持培養や拡大培養については、好ましくは後述する抗原特異的ＣＴＬの維持培養方法や拡大培養方法により行うことができるが、それ以外の公知の方法、すなわち前述のポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の非存在下に抗原特異的ＣＴＬの維持培養や拡大培養が実施されても、得られた細胞は前述のような細胞傷害活性を高く維持し、かつ高い細胞増殖率が認められる。これらの効果については、例えばフィブロネクチンの既知のフラグメントであるＨ−２９６（後述の実施例９〜１４参照）の存在下に抗原特異的ＣＴＬの誘導を行なった結果と比較しても有意に高い効果を発揮する。さらに本発明の抗原特異的ＣＴＬの誘導方法により得られた抗原特異的ＣＴＬを用いて拡大培養を実施した場合、フィーダ細胞を用いなくとも、高い細胞増殖率を実現できる。また、例えば誘導された抗原特異的ＣＴＬをクローン化することにより、安定した抗原特異的ＣＴＬを維持することもできる。
【００７７】
（２）−１−２  本発明の抗原特異的ＣＴＬの維持方法
本発明の抗原特異的ＣＴＬの維持方法は、抗原特異的ＣＴＬの細胞傷害活性を保ったままで維持する方法である。該方法は前述の本発明の培養工程を抗原特異的ＣＴＬの維持培養の際に実施することを特徴としており、これにより抗原特異的ＣＴＬの細胞傷害活性を維持させることができる。
【００７８】
該方法を適用可能な抗原特異的ＣＴＬは特に限定はなく、公知の方法により得られた抗原特異的ＣＴＬや、前述の本発明の抗原特異的ＣＴＬの誘導方法により得られた抗原特異的ＣＴＬ、もしくは後述の抗原特異的ＣＴＬの拡大培養方法により得られた抗原特異的ＣＴＬの維持に使用される。また、ここで抗原特異的ＣＴＬとは抗原特異的ＣＴＬを含む細胞集団を意味する。
【００７９】
使用される培地については特に限定はなく、公知の培地を使用することができ、また前述の抗原特異的ＣＴＬの誘導と同様に適当なタンパク質、サイトカイン類（例えば、ＩＬ−２）、その他の成分を含んでいてもよい。
【００８０】
抗原特異的ＣＴＬの維持培養の一般的な条件については公知の方法（例えばＣａｒｔｅｒ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．５７，  Ｎｏ．１，  Ｐ１２３−１２９，１９９６）に従えば良い。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養日数については、特に限定はない。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養器材を交換する工程を行っても良い。
【００８１】
（２）−１−３  本発明の抗原特異的ＣＴＬの拡大培養方法
本発明の抗原特異的ＣＴＬの拡大培養方法は、抗原特異的ＣＴＬの細胞傷害活性を保ったままで細胞数を急速に拡大培養させる方法である。該方法は前述の本発明の培養工程を抗原特異的ＣＴＬの拡大培養の際に実施することを特徴とする。ここで本発明の培養工程の実施は、拡大培養の全期間であっても一部の期間であってもよく、好適には培養開始時に本発明の培養工程を実施することが好ましい。本発明の培養工程の培養期間については、例えば１〜８日、好適には２〜７日、より好適には３〜７日が好ましく、より高い拡大培養率を実現する観点からは３日以上が好ましい。
【００８２】
該方法を適用可能な抗原特異的ＣＴＬは、特に限定はなく、例えば公知の方法で得られた抗原特異的ＣＴＬや、前述の本発明の抗原特異的ＣＴＬの誘導方法により得られた抗原特異的ＣＴＬ、もしくは前述の抗原特異的ＣＴＬの維持方法により維持培養された抗原特異的ＣＴＬが使用される。
【００８３】
使用される培地については特に限定はなく、公知の培地を使用することができ、また前述の抗原特異的ＣＴＬの誘導と同様に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分、例えばＩＬ−２等を含んでいてもよい。
【００８４】
抗原特異的ＣＴＬの拡大培養の一般的な条件については公知の方法（例えばＣａｒｔｅｒ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．５７，  Ｎｏ．１，  Ｐ１２３−１２９，１９９６）に従えば良い。
【００８５】
本発明の抗原特異的ＣＴＬの拡大培養方法においては、高い拡大培養率を実現する観点から、前記有効成分に加え、抗ＣＤ３抗体、好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体、より好適にはＯＫＴ３と共培養することが好ましい。抗ＣＤ３抗体の培養中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、０．０１〜１００μｇ／ｍＬがより好適である。また、さらに副刺激として抗ＣＤ２８抗体、より好適には抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体と共培養することもできる。また、レクチン等のリンパ球刺激因子を共培養することもできる。また、これらの成分は前述のとおり、適当な固相に固定化して使用することもできる。
【００８６】
また、本発明の抗原特異的ＣＴＬの拡大培養方法においては、必要に応じて適当なフィーダ細胞と共培養することもできる。抗原特異的ＣＴＬの拡大培養方法において、フィーダ細胞は前記抗ＣＤ３抗体と共同してＣＴＬを刺激し、Ｔ細胞レセプター又は各刺激受容体を活性化するものであれば特に限定はない。本発明においてフィーダ細胞としては、特に限定はないが、例えば自己もしくは非自己由来のＰＢＭＣやＥＢＶ−Ｂ細胞が使用されるが、安全性の観点からはＥＢＶ−Ｂ以外の細胞を使用することが好ましい。通常、フィーダ細胞はＸ線等の放射線照射またはマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）等の薬剤による処理を行うことにより増殖能を奪ったうえで使用される。なお、フィーダ細胞の培地中における含有量は、公知の方法に従って決定すればよく、特に限定はないが、例えば１〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好適である。
【００８７】
しかしながら、前述したように、養子免疫療法においてフィーダ細胞は、安全性の観点、コスト、フィーダ細胞の患者または患者への負担の観点からは使用しないことが好ましい。本発明の抗原特異的ＣＴＬの拡大培養方法は、フィーダ細胞を使用しない場合でも高い拡大培養率を実現することも一つの大きな特徴である。すなわち、本発明により、フィーダ細胞を使用しない抗原特異的ＣＴＬの拡大培養方法が提供される。なお、フィーダ細胞を使用せずに抗原特異的ＣＴＬの製造を行なう場合、本発明の拡大培養方法に供する抗原特異的ＣＴＬは、高い拡大培養率を実現するという観点から、前述の本発明の抗原特異的ＣＴＬの誘導方法により得られた抗原特異的ＣＴＬを使用することが望ましい。
【００８８】
（２）−２  リンフォカイン活性化細胞の製造方法
以下、本発明の製造方法によりリンフォカイン活性化細胞を製造する例（以下、本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法と称することがある）について詳細に記載する。
【００８９】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法は、リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞を用いて、ＩＬ−２の存在下で本発明の培養工程を実施することを特徴とする。ここで本発明の培養工程の実施は、培養の全期間であっても一部の期間であってもよく、好適には培養開始時に本発明の培養工程を実施することが好ましい。本発明の培養工程の培養期間については、例えば１〜８日、好適には２〜７日、より好適には３〜７日が好ましく、より高い拡大培養率を実現する観点からは３日以上が好ましい。
【００９０】
リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞、これらの細胞を含有する血液成分等が挙げられ、血球系細胞であれば使用できる。また、前記細胞を含有する材料、例えば末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。
【００９１】
また、リンフォカイン活性化細胞を培養するための一般的な条件は、公知の条件〔例えば、細胞工学、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．２、ｐ２２３〜２２７、（１９９５年）；細胞培養、１７、（６）、ｐ１９２〜１９５、（１９９１年）；ＴＨＥ  ＬＡＮＣＥＴ、Ｖｏｌ．３５６、ｐ８０２〜８０７、（２０００）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １７，  ＵＮＩＴ７．７を参照〕に従えばよい。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施され、培養初期に本発明の培養工程を実施することが好ましいことは前述のとおりである。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養器材を交換する工程を行っても良い。
【００９２】
使用される培地については特に限定はなく、公知の培地を使用することができ、また前述の抗原特異的ＣＴＬの誘導や拡大培養と同様に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。
【００９３】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法においては、高い拡大培養率を実現する観点から、前記有効成分に加え、抗ＣＤ３抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体、より好適にはＯＫＴ３と共培養することが好ましい。抗ＣＤ３抗体の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。また、さらに副刺激として抗ＣＤ２８抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体と共培養することもできる。また、レクチン等のリンパ球刺激因子と共培養することもできる。また、これらの成分は前述のとおり、適当な固相に固定化して使用することもできる。
【００９４】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法により得られた細胞は、実施例３３、４３、４４、４７、５４〜５６に記載のとおり、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞や、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ２７陽性細胞、ＣＤ２８陽性細胞の比率が高い。すなわち、当該方法により得られるリンフォカイン活性化細胞はナイーブＴ様細胞を高比率に含んでいる細胞であり、養子免疫療法への利用に極めて適している。
【００９５】
（２）−３  外来遺伝子の導入工程を包含する本発明のリンパ球の製造方法
本発明は、前述したリンパ球の製造方法において、さらに外来遺伝子を導入する工程を包含するリンパ球の製造方法も提供する。すなわち、本発明は、その一態様として、リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含むリンパ球の製造方法を提供する。なお、「外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
【００９６】
本発明のリンパ球の製造方法、なかでもリンパ球の拡大培養方法を行うことにより、培養されるリンパ球の増殖能が増強される。よって、本発明のリンパ球の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わせることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。
【００９７】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、リンパ球の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記本発明のＣＴＬの拡大培養方法やリンフォカイン活性化細胞の製造方法中の細胞増殖時に実施するのが好適である。
【００９８】
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
【００９９】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際に導入効率を向上させる物質を使用してもよく、例えばレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）やその他のフィブロネクチンフラグメントを使用することもできる。
【０１００】
レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における、リンパ球の製造工程、例えば、拡大培養の工程において遺伝子導入を行なうのに好適である。
【０１０１】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡや直鎖状ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
【０１０２】
本発明においてリンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
【０１０３】
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
【０１０４】
本発明の方法によれば、例えば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をリンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのようなリンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）が例示される。
【０１０５】
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をリンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
【０１０６】
その他、導入する遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子や、標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位を有し、かつＴＣＲの細胞内領域（ＣＤ３等）を含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。
【０１０７】
（３）本発明の製造方法により得られるリンパ球、当該リンパ球を含有する医薬、当該医薬を用いた疾患の治療方法、本発明の有効成分を含有するリンパ球培養用培地
さらに本発明は、上記の本発明の製造方法で得られたリンパ球を提供する。また、本発明は当該リンパ球を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。なかでも、当該リンパ球を含有する前記治療剤は養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適したリンパ球が、例えば静脈への投与によって患者に投与される。当該治療剤は前述の疾患やドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該リンパ球を有効成分として、たとえば、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜、決定でき、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０５〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０６〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、さらに好ましくは１×１０６〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。通常、リンパ球は注射や点滴により静脈、動脈、皮下、腹腔内等へ投与される。本発明の医薬の投与においては、特に限定はないが、例えば、治療しようとするがんに対してワクチンとして機能しうる成分、すなわちがんワクチンを投与することもできる。例えば、腫瘍抗原、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、人為的操作により増殖能を失った腫瘍組織由来の細胞や、腫瘍組織からの抽出物などを投与することもできる。また、当該医薬の投与においては、リンパ球刺激因子、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ，ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β等）、ケモカイン等を適宜投与することもできる。なお、本願明細書において、リンパ球刺激因子とはリンパ球増殖因子を包含するものである。
【０１０８】
本発明の方法により製造されるリンパ球を投与される疾患としては、特に限定はないが、例えば、癌、白血病、悪性腫瘍、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶ等のウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。また、前述のようにさらに外来遺伝子を導入した場合は、各種遺伝子疾患に対しても効果が期待される。また、本発明の方法により製造されるリンパ球は骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。
【０１０９】
また、本発明の別の態様として、前記医薬を用いた疾患の治療方法が提供される。当該疾患の治療方法は、前述のリンパ球の製造方法により製造されたリンパ球を用いることを特徴とし、当該医薬の投与の諸条件については、公知の養子免疫療法や前述の医薬の投与の開示に従って実施できる。
【０１１０】
本発明の別の態様として、本発明の有効成分を含有する培地が提供される。当該培地は、さらにその他の任意の成分、たとえば、公知の細胞培養に用いられる培地成分、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。当該培地中の本発明の有効成分等の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法に使用される前記培地中の有効成分等の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができる。本発明の培地の一態様としては、本発明の有効成分が固定化された細胞培養用担体を含有する培地、本発明の有効成分が固定化された細胞培養器材に封入して提供される培地が包含される。
【０１１１】
（４）改変型フィブロネクチンポリペプチド
本発明においては、前述のリンパ球の製造方法においての使用に非常に有用な、下記（ａ）および（ｂ）から選択される新規なポリペプチドも提供される。
（ａ）配列表の配列番号５（Ｈ２９６−Ｈ２９６）、配列番号１６（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）、配列番号１９（ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ）、配列番号２２（Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）、配列番号２５（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）、配列番号２７（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）配列番号２９（Ｈ１０５−Ｈ１０５）、配列番号３２（Ｈ２７１−Ｈ２９６）、配列番号３６（Ｈ２９６−Ｈ２７１）、配列番号３９（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）、配列番号４１（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）、配列番号４７（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ）及び配列番号４９（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する新規なポリペプチド、
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記（ａ）のポリペプチドと同等な機能を有する新規なポリペプチド。
【０１１２】
また、本発明においては、下記（ｃ）〜（ｇ）から選択される新規な核酸も提供される。
（ｃ）配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９から選択されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ）配列表の配列番号６（Ｈ２９６−Ｈ２９６をコードする核酸の塩基配列）、配列番号１７（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号２０（ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号２３（Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号２６（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号２８（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６をコードする核酸の塩基配列）、配列番号３０（Ｈ１０５−Ｈ１０５をコードする核酸の塩基配列）、配列番号３３（Ｈ２７１−Ｈ２９６をコードする核酸）、配列番号３７（Ｈ２９６−Ｈ２７１をコードする核酸）、配列番号４０（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴをコードする核酸）、配列番号４２（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５をコードする核酸）、配列番号４８（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴをコードする核酸）及び配列番号５０（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃをコードする核酸）からなる群より選択される塩基配列からなる核酸、
（ｆ）前記（ｅ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが前記（ｅ）によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有する核酸、
（ｇ）前記（ｅ）の核酸の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じた核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（ｅ）の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有する核酸。
なお、上記（ｃ）の核酸は、前記（ａ）のポリペプチドをコードする核酸であり、前記（ｄ）の核酸は、前記（ｂ）のポリペプチドをコードする核酸である。また、前記（ａ）のポリペプチドは、上記（ｃ）の核酸を用いてタンパク発現に供する場合、Ｎ末端のメチオニン残基が消化されている場合がある。
【０１１３】
なお、本明細書において、前記新規なポリペプチドを本発明のポリペプチドと称し、前記新規な核酸を本発明の核酸と称することがある。
【０１１４】
以下、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、該ポリペプチドおよび該核酸の製造方法について説明する。
【０１１５】
本発明の前記（ｂ）のポリペプチドとしては、好適には配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３２、３６、３９、４１、４７及び４９からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。また、配列番号１６、１９、２２、２５、３９又は４７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドから、Ｈｉｓタグ配列（配列表の配列番号１６における１〜１５番目のアミノ酸配列、配列表の配列番号１９における１〜１５番目のアミノ酸配列、配列表の配列番号２２における１〜１５番目のアミノ酸配列、配列表の配列番号２５における１〜１５番目のアミノ酸配列、配列表の配列番号３９における１〜１５番目のアミノ酸配列、配列表の配列番号４７における１〜１５番目のアミノ酸配列）を欠失させたポリペプチドや、配列番号５記載のアミノ酸配列にＨｉｓタグ配列を付加したポリペプチドも、本発明の前記（ｂ）のポリペプチドに包含される。また、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドはそのＮ末端のメチオニン残基は除去されており、発現の際にメチオニンアミノペプチダーゼにより除去されたことが予想される。本発明において、（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸の欠失、挿入としては、このようなＮ末端のメチオニン残基の挿入、欠失を包含するものである。なお、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その際のアミノ酸の置換等は、好適には「（１）本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）またはポリペプチド（Ｙ）」の記載と同様に行なうことができる。
【０１１６】
本発明のポリペプチドをコードする配列表の配列番号６、１７、２０、２３、２６、２８、３０、３３、３７、４０、４２、４８及び５０からなる群より選択される核酸は、天然型のフィブロネクチンをコードする核酸、もしくは組み替え型のフィブロネクチンフラグメント、例えば前述のＣＨ−２９６やＨ−２９６等をコードする核酸を用いて、本発明のポリペプチドを構成する各ドメインをコードする核酸を取得し、公知の方法によりこれらをつなぎ合わせることにより取得することができる。例えば、後述の実施例１、２２〜２４、３９〜４１、４５、４６、５２、５３に記載のとおり、ＣＨ−２９６をコードする核酸からヘパリン結合ドメインの一部もしくは全部、およびＣＳ−１ドメインをコードする核酸を取得し、これを重複してつなぎ合わせることにより取得することができる。
【０１１７】
配列番号６、１７、２０、２３、２６、２８、３０、３３、３７、４０、４２、４８及び５０からなる群より選択される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、本発明のポリペプチドと同等な機能、すなわち前述のリンパ球の製造において所望の効果を有するポリペプチドをコードする核酸も本発明の核酸に含まれる。上記「ストリンジェントな条件」とは特に限定されず、例えば、これらの塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイズさせるＤＮＡに応じて、ハイブリダイゼーション時の、好ましくはさらに洗浄時の温度および塩濃度を適宜決定することにより設定し得るが、ストリンジェントな条件としては、例えば、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第３版〔サンブルーク（ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）社発行〕等の文献に記載の条件が挙げられる。
【０１１８】
具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、５０℃、好ましくは６５℃で保温する条件が例示される。前記の温度は用いるＤＮＡのＴｍ値が既知である場合は、その値より５〜１２℃低い温度としてもよい。さらに、非特異的にハイブリダイズしたＤＮＡを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件および／またはより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上等の条件下で洗浄を行なう、という条件等を追加してもよい。
【０１１９】
より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた本発明に包含される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生じる）、塩濃度、または温度の操作によって行われる。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍＬサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩インキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行うことができる。
【０１２０】
上記の条件は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬を添加および／または置換することによって改変することができる。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の製品処方物が挙げられる。また、この改変に応じて、上記のハイブリダイゼーション条件の他の要素の改変が必要な場合もある。
【０１２１】
また、本発明の核酸としては、配列表の配列番号６、１７、２０、２３、２６、２８、３０、３３、３７、４０、４２、４８及び５０からなる群より選択される核酸の塩基配列において、１ないし複数個の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものも含まれる。例えば配列表の配列番号６、１７、２０、２３、２６、２８、３０、３３、３７、４０、４２、４８又は５０に記載の塩基配列から１〜６０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜３０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜１５塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。なお、塩基の置換等は、核酸にコードされるポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その詳細、塩基の置換等の方法については前記のアミノ酸の置換等に関する記載に準ずる。
【０１２２】
一方、このようにして得られた核酸を用いて、本発明のポリペプチド、特に配列表の配列番号５、１６、１９、２２、２５、２７、２９、３３、３７、４０、４２、４７及び４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを遺伝子工学的に取得することができる。すなわち、当該核酸を適切な発現用ベクター、特に限定はないが、例えばｐＥＴベクターやｐＣｏｌｄベクター等に挿入し、公知の方法により、当該ポリペプチドを、例えば、大腸菌等で発現させることにより取得することができる。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。【０１２４】
調製例１  Ｈ−２９６の調製
Ｈ−２９６（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２０）を用い、これを米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて調製した。【０１２５】
調製例２  ＣＨ−２９６の調製
ＣＨ−２９６（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００）を用い、これを米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて調製した。【０１２６】
実施例１  Ｈ２９６−Ｈ２９６の作製
本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。【０１２７】
（１）発現ベクターの構築
（ｉ）Ｈ−２９６発現ベクターの構築
配列表の配列番号７記載のＣＨ−２９６のアミノ酸配列のＮ末端側よりアミノ酸２７８〜５７４（塩基番号８３５〜１７２５）よりなるポリペプチドをＨ−２９６とし、このＨ−２９６が２つ連結した改変型フィブロネクチンフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。以下、図２を参照。【０１２８】
まず、配列表の配列番号８記載のＣＨ−２９６の塩基配列（国際公開第０３／０８０８１７パンフレット参照）より、配列表の配列番号９及び１０に記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ及びＨ２９６−ＨｉｎｄＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号２７８〜２８３に相当する塩基配列を塩基番号１３〜３０にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号５７０〜５７４に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３４にもつ合成ＤＮＡである。【０１２９】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μＬのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【０１３０】
反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０１３１】
次に国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従い、ｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターを調製した（これ以降、このｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターをｐＣｏｌｄ１４ベクターとする）。【０１３２】
次に上記ｐＣｏｌｄ１４ベクターを上記ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０１３３】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６とした。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８〜５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。【０１３４】
（ｉｉ）Ｈ２９６−Ｈ２９６発現ベクターの構築
次に、国際公開第０３／０８０８１７パンフレットで公開されている塩基配列より、配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号５７４〜５６９に相当する塩基配列を塩基番号１７〜３４にもつ合成ＤＮＡである。上記合成プライマーと配列表の配列番号１２記載のｐＣｏｌｄ１４ベクターの５’ＵＴＲ部分にアニ−リングするプライマーＮＣ２−５’ＵＴＲを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。【０１３５】
すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（タカラバイオ社製）、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＮＣ２−５’ＵＴＲ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲ、５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９６℃  １分、６８℃  ４分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【０１３６】
反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液をＢｉｏ−Ｒａｄカラムにより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを３９μＬの滅菌水に懸濁、全量５０μＬとした反応液を制限酵素ＮｃｏＩで消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＮｃｏＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０１３７】
次に、（ｉ）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６を制限酵素ＮｃｏＩで消化し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０１３８】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６とした。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８〜５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が、間にアミノ酸“Ａ”を挟んで２つ連結した形で含むプラスミドである。当該プラスミドにより発現されるタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、塩基配列を配列表の配列番号６に示す。【０１３９】
（２）発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いて大腸菌ＢＬ２1を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。生育したコロニーを３０ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を３Ｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。なお、この培養の際には、５Ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製）を使用し、１２０ｒ／ｍｉｎ、Ａｉｒ＝１．０Ｌ／ｍｉｎの条件で行なった。前記培養後、１５℃まで冷却した後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、約４０ｍＬの細胞破砕溶液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒ／ｍｉｎ、２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。得られた上清の抽出液を２ＬのｂｕｆｆｅｒＡ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌ］で透析を行い、その約４０ｍＬを用いてさらにイオン交換クロマトによる精製を以下のように行なった。【０１４０】
すなわち、樹脂容積にして１００ｍＬ分のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡで飽和させたカラム（Φ４ｃｍ×２０ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＢ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１Ｍ  ＮａＣｌ］で５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行なった。５ｍＬずつ分画を行い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量約６５ｋＤａの目的タンパク質を多く含む画分、約１００ｍＬを回収し、２ＬのｂｕｆｆｅｒＡで透析を行なった。【０１４１】
次に、樹脂容積にして５０ｍＬ分のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡで飽和させたカラム（Φ３ｃｍ×１６ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＢで５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行なった。５ｍＬずつ分画を行い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量約６５ｋＤａの目的タンパク質を多く含む画分、約１００ｍＬを回収し、２Ｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｄ［５０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）］で透析を行なった。【０１４２】
その後、セントリコン−１０（ミリポア社製）で約２０倍の５ｍＬまで濃縮を行い、さらに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約６５ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＨ２９６−Ｈ２９６とした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキット（ピアース社製）を使用して、タンパク質濃度を測定したところ、２．１６ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約３３μＭ）。また、Ｎ末端解析を行なったところ、メチオニンは消化されており、Ｎ末端はＡｌａであった。【０１４３】
実施例２  Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
ＨＬＡ−Ａ２．１保有ヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ〔アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕上に重層後、６００×ｇで２０分間遠心した。遠心後、中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０培地〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕に懸濁した後、ＣＰ−１（極東製薬工業社製）と２５％ヒト血清アルブミン〔ブミネート：バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）社製〕を１７：８の割合で混合した保存液を等量加えて懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＣＴＬ誘導時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ〔カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕を含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。【０１４４】
（２）Ｈ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６（終濃度２５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを２４穴細胞培養プレート〔ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）社製〕に１ｍＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。【０１４５】
（３）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導は、ベドナレク（Ｂｅｄｎａｒｅｋ）らの方法〔Ｂｅｄｎａｒｅｋ  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、第１４７巻、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）〕を一部改変して実施した。すなわち、５％ヒトＡＢ型血清、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ  Ｍｉｘｔｕｒｅ〔全てキャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）社製〕、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下５ＨＲＰＭＩと略す）に４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例２−（２）で作製した２４穴細胞培養プレートに１ｍＬ／ウェルずつ添加し、５％ＣＯ２湿式インキュベーター内にて、３７℃で１．５時間インキュベートし、プラスチック接着性の単球を分離した（対照にはＨ２９６−Ｈ２９６固定化処理を行っていないプレートを使用）。その後、非接着性の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地を用いて回収し、レスポンダー細胞として氷上保存した。分離した単球には、抗原ペプチドとして５μｇ／ｍＬのインフルエンザウイルスタンパク質由来エピトープペプチド（配列表の配列番号１３に記載のマトリックスプロテイン由来−ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチド）および１μｇ／ｍＬのβ２マイクログロブリン〔スクリプス（Ｓｃｒｉｐｓ）社製〕を含む５ＨＲＰＭＩを０．５ｍＬずつ添加し、２時間室温にてインキュベート後、Ｘ線照射（１．４２Ｃ／ｋｇ）して抗原提示細胞とした。各ウェルからペプチド液を吸引除去し、ウェルをＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄後、氷上保存しておいたレスポンダー細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５ＨＲＰＭＩに懸濁し、１ｍＬ／ウェルずつ抗原提示細胞上に添加したのち、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。培養開始後１日目に、６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（プロロイキン：ＣＨＩＲＯＮ社製）を含む５ＨＲＰＭＩ  １ｍＬを各ウェルに添加、また５日目には培養上清を半分除去後、同様のＩＬ−２含有培地を１ｍＬずつ添加した。７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製したあと、１週間培養したレスポンダー細胞を回収し、４４０×ｇで１０分間遠心した。遠心後、レスポンダー細胞を１ｍＬの５ＨＲＰＭＩに懸濁し、調製した抗原提示細胞上に１ｍＬ／ウェルずつ添加し、再刺激した。このとき、プレートはＨ２９６−Ｈ２９６を固定化したものを使用した（対照には固定化していないプレートを使用）。再刺激後１日目に、６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ  １ｍＬを各ウェルに添加、また４日目あるいは５日目には培養上清を半分除去後、除去前と同じ内容の培地を１ｍＬずつ添加し、さらに培養を続け、ＣＴＬを誘導した。１４日間培養後の細胞増殖率を表１に示す。細胞増殖率はＣＴＬ誘導開始時のレスポンダー細胞数に対する誘導終了時点での細胞数の比を増殖率として求めた。【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
その結果、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群では固定化していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。【０１４８】
実施例３  実施例２のＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６（終濃度２５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１２．５ｃｍ２フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を立てて２．７ｍＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のフラスコは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。【０１４９】
（２）実施例２のＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
実施例２−（３）で調製したＨ２９６−Ｈ２９６存在下で誘導したＣＴＬ（対照はＨ２９６−Ｈ２９６非存在下で誘導したＣＴＬ）を３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。一方、実施例２−（１）と同様の方法により採取したＨＬＡ−Ａ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＰＢＭＣを２ドナー混合したのちＸ線照射（０．８５１Ｃ／ｋｇ）し、培地で洗浄後、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した（フィーダ細胞とする）。これら３×１０４ｃｅｌｌｓのＣＴＬおよび４×１０６ｃｅｌｌｓのフィーダ細胞を５ｍＬの１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩと略す）に懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）：ヤンセンファーマ社製）を加えて１２．５ｃｍ２のフラスコを立てたものに入れ、３７℃  湿式ＣＯ２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、実施例３−（１）のＨ２９６−Ｈ２９６固定化フラスコを使用した（対照については非固定化フラスコを使用）。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩ  ５ｍＬと終濃度１２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後５日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩ  ５ｍＬを各フラスコに添加し、１４日間拡大培養を行った。結果を表２に示す。拡大培養時の増殖率は拡大培養開始時の細胞数に対する拡大培養終了時点の細胞数の比を増殖率として求め、誘導からの増殖率は誘導開始時のレスポンダー細胞数に対する拡大培養終了時点の細胞数の比として求めた。【０１５０】
【表２】
2007142300.tif 000003
【０１５１】
その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群のＣＴＬは、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化しなかった対照群より高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。【０１５２】
実施例４  実施例３のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例３で調製した拡大培養開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ  Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。一晩エピトープペプチド存在下、もしくは非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名  ２２１Ａ２．１）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、  ウシ胎児血清、Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞は、３０倍量のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）と混合し、細胞傷害活性測定用細胞とした。なお、Ｋ５６２細胞はレスポンダー細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的傷害活性を排除するために用いた。【０１５３】
実施例３で調製した抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬをエフェクター細胞として１×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩで段階希釈後、９６穴細胞培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）の各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらにＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞濃度が１×１０５／ｍＬとなるように調整した細胞傷害活性測定用細胞を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比をＥ／Ｔ比として示し、Ｅ／Ｔ比３０、１０、３、１について測定を行った。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、３７℃の湿式ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした。４時間後、各ウェルから培養上清  １００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー〔ベルトールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕（励起４８５ｎｍ／測定５３８ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「特異的細胞傷害活性（％）」は以下の式１にしたがって算出した。
式１：特異的細胞傷害活性（％）＝
｛（各ウェルの測定値−最小放出量）／（最大放出量−最小放出量）｝×１００
上式において最小放出量は細胞傷害活性測定用細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は細胞傷害活性測定用細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。また、Ｅ／Ｔ比３において、拡大培養前の細胞傷害活性をどれだけ維持しているかを「細胞傷害活性維持（％）」として以下の式２にしたがって算出した。
式２：細胞傷害活性維持（％）＝
〔拡大培養後の細胞傷害活性（％）／拡大培養前の細胞傷害活性（％）〕×１００
測定結果を表３に示す。【０１５４】
【表３】
2007142300.tif 000004
【０１５５】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性において、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６フラグメントを固定化した群については、１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもＨ２９６−Ｈ２９６を固定化しなかった対照群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。【０１５６】
実施例５  実施例３のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
今回、ＣＴＬ誘導に用いたＨＬＡ−Ａ２．１結合性インフルエンザウイルスタンパク質由来ペプチドはＴＣＲ  Ｖβ１７陽性Ｔ細胞により認識されることがＬｅｈｎｅｒらによって示されている〔Ｌｅｈｎｅｒ  Ｐ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、第１８１巻、第７９〜９１頁（１９９５）〕。したがって、ＴＣＲ  Ｖβ１７の陽性細胞含有比率を測定することにより、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの指標となり得る。【０１５７】
実施例３で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬをＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ社製）を含む１５μＬのＰＢＳ中に懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１もしくはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＴＣＲ  Ｖβ１７抗体〔ともにベックマンコールター（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）社製〕を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに懸濁した。この細胞をＣｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞の含有率を測定した。測定結果を表４に示す。【０１５８】
【表４】
2007142300.tif 000005
【０１５９】
ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群のＣＴＬは、固定化しなかった対照群と比較して明らかに高い陽性細胞含有率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有率は、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については７８．０％、固定化していない対照群については７３．０％であった。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの含有率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。【０１６０】
実施例６  実施例２のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養器材にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）とＨ２９６−Ｈ２９６（終濃度２５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。【０１６１】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例２−（３）で調製したＨ２９６−Ｈ２９６存在下で誘導したＣＴＬ（対照はＨ２９６−Ｈ２９６非存在下で誘導したＣＴＬ）を５ＨＲＰＭＩで洗浄したのち、１×１０５ｃｅｌｌｓを５ＨＲＰＭＩ  ３００μＬに懸濁し、実施例６−（１）で作製した９６穴培養プレートを用いて３７℃  湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加、さらに培養開始後５日目以降は２〜３日ごとに固定化を行っていないプレートに継代を行い、終濃度１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、１３日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表５に示す。【０１６２】
【表５】
2007142300.tif 000006
【０１６３】
誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については、固定化していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となった。【０１６４】
実施例７  実施例６のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例６−（２）で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表６に示す。【０１６５】
【表６】
2007142300.tif 000007
【０１６６】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を添加した群のＣＴＬは、対照群と比較して、１３日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能になることが明らかになった。【０１６７】
実施例８  実施例６のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例６−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。なお、Ｈ２９６−Ｈ２９６の非存在下で拡大培養したＣＴＬを用いた対照群については拡大培養後に得られた細胞数が少なかったため、試験を実施しなかった。結果を表７に示す。【０１６８】
【表７】
2007142300.tif 000008
【０１６９】
Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用した群において、高い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有率は、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については７８．０％であった。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用することにより、フィーダ細胞を用いない系で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬ含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。【０１７０】
実施例９  Ｈ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材にＨ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６を固定化した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍＬ）それぞれを含むＰＢＳを２４穴細胞培養プレートに１ｍＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。【０１７１】
（２）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例２−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例２−（３）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき使用した培養プレートは、実施例９−（１）で作製したものを用いた（対照にはＨ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６を固定化していないプレートを使用）。誘導開始後１４日目の細胞増殖率を表８に示す。【０１７２】
【表８】
2007142300.tif 000009
【０１７３】
この結果、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群が最も高い増殖率を示し、ついでＨ−２９６を固定化した群で、固定化していない対照群はこれらと比較して低い増殖率であった。つまり、ＣＴＬ誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を使用した方がより高い効果が得られた。【０１７４】
実施例１０  実施例９のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例９で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表９に示す。【０１７５】
【表９】
2007142300.tif 000010
【０１７６】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性において、誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を固定化した群のＣＴＬは、対照群のＣＴＬに比べて特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６をＣＴＬ誘導時に使用することにより、高い細胞傷害活性を持ったＣＴＬを誘導することが可能となった。【０１７７】
実施例１１  実施例９のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例９で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１０に示す。なお、ＣＴＬ誘導前のレスポンダー細胞のＶβ１７陽性細胞含有率は２．５％であった。【０１７８】
【表１０】
2007142300.tif 000011
【０１７９】
Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を誘導時に使用した群において、使用していない対照群に比べて高い陽性細胞含有比率を示した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を誘導時に使用することにより、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬを効率よく誘導出来ることが明らかとなった。【０１８０】
実施例１２  実施例９のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６の固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養器材にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）と、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。【０１８１】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例９で調製したＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６の存在下で誘導したＣＴＬ（対照は非存在下で誘導したＣＴＬ）を５ＨＲＰＭＩで洗浄したのち、１×１０５ｃｅｌｌｓを５ＨＲＰＭＩ  ３００μＬに懸濁し、実施例１２−（１）で作製した９６穴培養プレートを用いて３７℃  湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。培養開始１日目に終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加、５日目以降は５ＨＲＰＭＩを用いて固定化を行っていないプレートに継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。すなわち、培養開始後５日目には１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、８日目には１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１２日目には３．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで継代を行った。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、１５日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表１１に示す。【０１８２】
【表１１】
2007142300.tif 000012
【０１８３】
誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群が最も高い増殖率を示し、ついで誘導時および拡大培養時にＨ−２９６を固定化した群で、固定化していない対照群は最も低い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となり、その効果はＨ２９６−Ｈ２９６を使用した方が高いことが示された。【０１８４】
実施例１３  実施例１２のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例１２−（２）で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表１２に示す。なお、Ｅ／Ｔ比３０については、試験を行わなかった。【０１８５】
【表１２】
2007142300.tif 000013
【０１８６】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を添加した群のＣＴＬは、１５日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。また、誘導時および拡大培養時にＨ−２９６を添加した群のＣＴＬは、Ｈ２９６−Ｈ２９６を添加した群より低いが、特異的な細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的な細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能になることが明らかになり、Ｈ２９６−Ｈ２９６の方が高い効果が得られた。【０１８７】
実施例１４  実施例１２のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例１２−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１３に示す。【０１８８】
【表１３】
2007142300.tif 000014
【０１８９】
Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用した群が最も高い陽性細胞含有比率を示し、次いでＨ−２９６を誘導時および拡大培養時に使用した群が高く、固定化していない対照群は最も低い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有率は、対照群については５０．６％、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については７３．５％、Ｈ−２９６を固定化した群については７３．２％であった。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用することにより、フィーダ細胞を用いない系で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬ含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。【０１９０】
実施例１５  ３０ｍＬ採血を想定した実施例９のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６フラグメントの固定化
以下のフィーダを用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養器材にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）と、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみ固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。【０１９１】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例９でＨ２９６−Ｈ２９６を用いて誘導したＣＴＬを３％ヒトＡＢ型血清、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下３ＨＲＰＭＩと略す）で洗浄したのち、１×１０５ｃｅｌｌｓを３００μＬの３ＨＲＰＭＩに懸濁し、実施例１５−（１）で作製した９６穴培養プレートに入れ、３７℃  湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。この際、３０ｍＬ採血から得られると予想されるＰＢＭＣ  ３×１０７ｃｅｌｌｓを用いた培養スケールにおいて、誘導から拡大培養までのヒトＡＢ型血清の使用量を最大１５ｍＬ、ＲＰＭＩ培地使用量を最大１０Ｌに制限して拡大培養をおこなった。培養開始１日目に終濃度５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加、５日目には１％ヒトＡＢ型血清ＲＰＭＩ培地を用いて固定化を行っていないプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。培養開始後８日目には０．２％ヒトＡＢ型血清ＲＰＭＩ培地を用いて固定化を行っていないプレートに１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加し、１２日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２のみ添加した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せずに１５日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表１４に示す。【０１９２】
【表１４】
2007142300.tif 000015
【０１９３】
拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を固定化した群のＣＴＬは、拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を固定化しなかった群より高い増殖率を示した。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時に用いて得られたＣＴＬについて、拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を使用することにより高い細胞増殖効果が見られた。【０１９４】
実施例１６  Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導（自己血漿）
実施例２−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例２−（３）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、５％自己血漿、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ培地（以下５ＰｌａｓｍａＲＰＭＩと略す）を用いた。こうして調製した誘導開始後１４日目の細胞増殖率を表１５に示す。【０１９５】
【表１５】
2007142300.tif 000016
【０１９６】
誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群において、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化していない対照群よりも高い増殖率が得られた。つまり、自己血漿を含む培地において、ＣＴＬ誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。【０１９７】
実施例１７  実施例１６のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例１６で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１６に示す。なお、ＣＴＬ誘導前のレスポンダー細胞のＶβ１７陽性細胞含有率は２．５％であった。【０１９８】
【表１６】
2007142300.tif 000017
【０１９９】
誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群について、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化していない対照群と比較して高い陽性細胞含有比率を示した。すなわち、誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を用いることで、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬを効率よく誘導できることが明らかとなった。【０２００】
実施例１８  実施例１６のＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
実施例１６で調製したＨ２９６−Ｈ２９６存在下で誘導したＣＴＬ（対照はＨ２９６−Ｈ２９６非存在下で誘導したＣＴＬ）を用い、実施例３と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、５ＰｌａｓｍａＲＰＭＩ培地を用いて培養し、１４日間拡大培養を行った。１４日後の細胞増殖率を表１７に示す。【０２０１】
【表１７】
2007142300.tif 000018
【０２０２】
誘導時及び拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化しなかった群より高い増殖率を示した。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時あるいは拡大培養時に使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。【０２０３】
実施例１９  実施例１８のＣＴＬ細胞傷害活性の測定
実施例１８で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表１８に示す。【０２０４】
【表１８】
2007142300.tif 000019
【０２０５】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群は１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化しない対照群については、その活性は明らかに低下していた。つまり、自己血漿を用いた拡大培養で、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。【０２０６】
実施例２０  実施例１８のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例１８で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１９に示す。【０２０７】
【表１９】
2007142300.tif 000020
【０２０８】
誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群について、固定化していない対照群と比較して、明らかに高い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後すなわち拡大培養前のＣＴＬについてのＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有率は、表１６に示したように、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については８０．１％であり、固定化していない群については７２．１％であった。つまり、自己血漿を用いた拡大培養で、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することで、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが明らかとなった。【０２０９】
実施例２１  Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）の拡大培養
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ上に重層して５００×ｇで２０分間遠心した。中間層の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社製）からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。リンパ球拡大培養時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。【０２１０】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６フラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｍｐａｎｙ社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１．９ｍＬ／ウェルずつ添加した。この時、Ｈ２９６−Ｈ２９６添加群には実施例１で調製したＨ２９６−Ｈ２９６を終濃度（２５μｇ／ｍＬ）となるように添加した。【０２１１】
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃に保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。【０２１２】
（３）リンパ球の拡大培養
３％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下３％ＡＩＭ−Ｖと略す）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例２１−（２）で作製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６固定化プレートに３％ＡＩＭ−Ｖを  ２ｍＬ／ウェルで添加しておき、細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群とも０．０７５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、培養液を何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。血清濃度は、３０ｍＬ採血より得られたＰＢＭＣを培地１０Ｌで培養することを想定して決定した。培養を継続し、７日目には各群とも０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、対照群（Ｈ２９６−Ｈ２９６非固定化）では０．１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて、およびＨ２９６−Ｈ２９６固定化群では０．０９％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて希釈した培養液（液量１２．６ｍＬ）を何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１０日目には、７日目と同じ血清濃度のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて０．４１３×１０６／ｍＬとなるように細胞液を希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各群において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２０に示す。【０２１３】
【表２０】
2007142300.tif 000021
【０２１４】
表２０に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してリンパ球の拡大培養率が高かった。このことから、Ｈ２９６−Ｈ２９６はリンパ球拡大培養時に好適に使用されることが明らかとなった。【０２１５】
実施例２２  Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴの作成
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｈ−２９６が３つ連結した改変型フィブロネクチンフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２１６】
（ｉ）Ｈ２９６−ＨＴ発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６の塩基配列（配列表の配列番号８）より、配列表の配列番号１４に記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列のアミノ酸番号２７８〜２８５に相当する塩基配列を塩基番号１２〜３５にもつ合成ＤＮＡである。【０２１７】
上記合成プライマーと、合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２１８】
次にｐＣｏｌｄＩベクター（タカラバイオ社製）をＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したものを調製し、上記ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組み換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６とした。【０２１９】
（ｉｉ）Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ発現ベクターの構築
次に、ＣＨ−２９６の塩基配列（配列表の配列番号８）より、配列表の配列番号１５に記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＲは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号４〜９に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列表の配列番号７）のアミノ酸番号５７４〜５６９に相当する塩基配列を塩基番号１０〜２７にもつ合成ＤＮＡである。【０２２０】
上記合成プライマーと、合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩで消化し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した後、得られた１．８ｋｂｐ以上のＤＮＡ断片を１．０％アガロースゲル電気泳動により抽出精製した。【０２２１】
次に、上記ｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６をＮｄｅＩ消化し、末端を脱リン酸化処理したものを調製し、上記ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０２２２】
目的のＨ−２９６が３つ連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６−３とした。このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６−３は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が、間にアミノ酸“Ｈ”を挟んで３つ連結しそのＮ末端にＨｉｓタグ配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号１６に、塩基配列を配列表の配列番号１７に示す。【０２２３】
（２）Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６−３を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。生育したコロニーを２００ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）に植菌し、ＯＤ＝０．４〜０．６になるまで（約５〜８時間）３７℃で培養した。その後、１５℃まで冷却した後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、約１０ｍＬのＢｉｎｉｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２］に懸濁した後、超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒ／ｍｉｎ  ２０分）により上清の抽出液を得た。得られた上清の抽出液を、２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂に添加し、４℃、１時間攪拌した後、樹脂をＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０ｍＬ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］１０ｍＬ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］１０ｍＬ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＡ  １０ｍＬで順次処理した後、樹脂に結合していた目的タンパク質を３ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で溶出した。得られた溶出液を、Ｖｉｖａカラム（ザルトリウス社製）を用いて０．３ｍＬに濃縮した。得られた濃縮液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、分子量約９９ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出された。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキットを使用して、タンパク質濃度を測定したところ、２．５ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約２５μＭ）。【０２２４】
実施例２３  ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴの作成
ＣＨ−２９６が２つ連結した改変型フィブロネクチンフラグメント（ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２２５】
（１）ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ発現ベクターの構築
（ｉ）ＣＨ２９６−ＨＴ発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号１８記載の塩基配列を有する合成プライマーＣＨ２９６−ＮｄｅＦをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＣＨ２９６−ＮｄｅＦは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜６に相当する塩基配列を塩基番号１５〜３２にもつ合成ＤＮＡである。【０２２６】
上記合成プライマーと合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＨ２９６−ＮｄｅＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約１．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２２７】
次にｐＣｏｌｄＩベクターをＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組み換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ２９６とした。【０２２８】
（ｉｉ）ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ発現ベクターの構築
合成プライマーＣＨ２９６−ＮｄｅＦ、合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＲを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＨ２９６−ＮｄｅＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【０２２９】
反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約１．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩで消化し、目的の１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を１．０％アガロースゲル電気泳動により抽出精製した。【０２３０】
次に、ｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ２９６をＮｄｅＩ消化し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０２３１】
目的のＣＨ−２９６が２つ連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ２９６−２とした。このｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ２９６−２は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号１〜５７４のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンを付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列が、間にアミノ酸“Ｈ”を挟んで２つ連結しそのＮ末端にＨｉｓタグ配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号１９に、塩基配列を配列表の配列番号２０に示す。【０２３２】
（２）ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴの発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ２９６−２を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例２２−（２）と同様にＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴの発現、精製を行なった。得られた濃縮液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、分子量約１２８ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出された。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキットを使用して、タンパク質濃度を測定したところ、３．１ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約２４μＭ）。【０２３３】
実施例２４  Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴの作成
（１）Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６のアミノ酸配列のＮ末端側よりアミノ酸４６０〜５７４（塩基番号１３８１〜１７２５）よりなるポリペプチドをＨ−１０５とし、このＨ−１０５が２つ連結した改変型フィブロネクチンフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２３４】
（ｉ）Ｈ１０５−ＨＴ発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号２１記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ１０５−ＮｄｅＦをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ１０５−ＮｄｅＦは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列のアミノ酸番号４６０〜４６６に相当する塩基配列を塩基番号１５〜３５にもつ合成ＤＮＡである。【０２３５】
上記合成プライマーとＨ２９６−ＨｉｎｄＲを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μＬのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ１０５−ＮｄｅＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．３５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２３６】
次にｐＣｏｌｄＩベクター（タカラバイオ社製）をＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組み換えプラスミドは、シークエンシングにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５とした。このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号４６０〜５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列のＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。【０２３７】
（ｉｉ）Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｈ１０５−ＮｄｅＦ、Ｈ２９６−ＮｄｅＲを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μＬのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ１０５−ＮｄｅＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【０２３８】
反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．３５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）で消化し、目的の０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を１．０％アガロースゲル電気泳動により抽出精製した。【０２３９】
次に、ｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５をＮｄｅＩ消化し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。【０２４０】
目的のＨ−１０５が２つ重複したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−２とした。このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−２は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号４６０〜５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が、間にアミノ酸“ＨＭ”を挟んで２つ連結しそのＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号２２に、塩基配列を配列表の配列番号２３に示す。【０２４１】
（２）Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴの発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−２を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例２２−（２）と同様にＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴの発現、精製を行なった。なお、培養液、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＡ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、分子量約２８ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出された。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキットを使用して、タンパク質濃度を測定したところ、５．１ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約１８０μＭ）。【０２４２】
実施例２５  ＦＮフラグメントを用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）各ＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に３種類のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ）をそれぞれ固定化した。すなわち、終濃度４〜２５μｇ／ｍＬのＦＮフラグメントを含むＰＢＳを２４穴細胞培養プレートに１ｍＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定に合わせるために使用するＦＮフラグメントの濃度を調整した。培養器材は使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。【０２４３】
（２）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例２−（１）に記載した方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例２−（３）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行なった。その際、プレートは実施例２５−（１）で作製したものを使用した。Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴについては、対照と同様に調製したウェルに終濃度０．４μｇ／ｍＬになるように添加し、培養した（対照にはＦＮフラグメントを固定化していないプレートを使用）。１４日間培養後の細胞増殖率を表２１に示す。【０２４４】
【表２１】
2007142300.tif 000022
【０２４５】
細胞増殖率はＣＴＬ誘導開始時のレスポンダー細胞数に対する誘導終了時点での細胞数の比を増殖率として求めた。その結果、ＦＮフラグメントを使用した群では使用していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時にＦＮフラグメントを使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。【０２４６】
実施例２６  実施例２５で得られたＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
（１）  各ＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に３種類のＦＮフラグメントを固定化した。すなわち、終濃度４〜２５μｇ／ｍＬのＦＮフラグメントを含むＰＢＳを１２．５ｃｍ２フラスコを立てたものに２．７ｍＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定に合わせるために使用するＦＮフラグメントの濃度を調整した。また、上記のフラスコは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。【０２４７】
（２）実施例２５で得られたＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
実施例２５−（２）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）に記載の方法で拡大培養を行なった。その際、５ＨＲＰＭＩ培地で培養し、フィーダ細胞には３ドナーを混合したものを用いた。また、培養器材は実施例２６−（１）の各ＦＮフラグメント固定化フラスコを使用し、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴについては対照と同様に調製したフラスコに終濃度０．４μｇ／ｍＬとなるように添加し、培養した（対照については非固定化フラスコを使用）。結果を表２２に示す。【０２４８】
【表２２】
2007142300.tif 000023
【０２４９】
拡大培養時の増殖率は拡大培養開始時の細胞数に対する拡大培養終了時点の細胞数の比を増殖率として求め、誘導からの増殖率は誘導開始時のレスポンダー細胞数に対する拡大培養終了時点の細胞数の比として求めた。その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを固定化あるいは溶液添加した群のＣＴＬは、ＦＮフラグメントを使用しなかった対照群より高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。【０２５０】
実施例２７  実施例２６で得られたＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例２６−（２）で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その際、ＨＬＡ−Ａ２保持Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ（細胞名  Ｔ２：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９２）を用いてＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を調製した。ＣＴＬ拡大培養後細胞傷害活性結果を表２３、活性維持効果を表２４に示す。なお、細胞傷害活性維持効果については、Ｅ／Ｔ比３および１の２点について算出した。【０２５１】
【表２３】
2007142300.tif 000024
【０２５２】
【表２４】
2007142300.tif 000025
【０２５３】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性において、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用した群については、１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもＦＮフラグメントを使用しなかった対照群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、ＦＮフラグメントをＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。【０２５４】
実施例２８  実施例２６で得られたＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例２６−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬをＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡを含む１５μＬのＰＢＳ中に懸濁し、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１あるいはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＴＣＲ  Ｖβ１７抗体とＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ８（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳに懸濁した。この細胞をＣｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００を用いたフローサイトメトリーに供し、ＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。測定結果を表２５に示す。【０２５５】
【表２５】
2007142300.tif 000026
【０２５６】
ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用したＣＴＬは、使用しなかった対照群と比較して高い陽性細胞含有率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞含有率は、ＦＮフラグメントを使用した群については４７．９％〜６３．８％、使用していない対照群については６７．８％であった。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用することで、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの含有率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。【０２５７】
実施例２９  ６０ｍＬ採血を想定した実施例２５で得られたＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体と各ＦＮフラグメントの固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体と３種類のＦＮフラグメントを固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）と、終濃度４〜２５μｇ／ｍＬのＦＮフラグメントを含むＰＢＳを４８穴細胞培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）に３７５μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定に合わせるために使用するＦＮフラグメントの濃度を調整した。【０２５８】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例２５−（２）で調製したＣＴＬ１×１０５ｃｅｌｌｓを５ＨＲＰＭＩ  ６００μＬに懸濁し、実施例２９−（１）で作製した４８穴培養プレートに入れ、３７℃  湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。なお、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴについては対照と同様に調製したウェルに終濃度０．４μｇ／ｍＬとなるように添加し、培養を開始した。この際、６０ｍＬ採血から得られると予想されるＰＢＭＣ５×１０７ｃｅｌｌｓを用いた培養スケールにおいて、誘導から拡大培養までのヒトＡＢ型血清の使用量を最大３０ｍＬ、ＲＰＭＩ培地使用量を最大１２Ｌに制限して拡大培養を行なった。培養開始１日目に終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加、５日目以降は５ＨＲＰＭＩを０ＨＲＰＭＩ（０％ヒトＡＢ型血清、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）で適宜希釈した血清濃度の培地を用いて固定化を行っていないプレートに継代し、終濃度５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。すなわち、培養開始後５日目には１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、８日目には１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１２日目には３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで継代を行った。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、１５日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表２６に示す。【０２５９】
【表２６】
2007142300.tif 000027
【０２６０】
誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用した群については、使用していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となり、その効果が最も高いＦＮフラグメントはＨ２９６−Ｈ２９６であることが示された。【０２６１】
実施例３０  実施例２９のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例２９−（２）で得られたＣＴＬを実施例２７と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。ＣＴＬ拡大培養後細胞傷害活性結果を表２７、活性維持効果を表２８に示す。なお、細胞傷害活性結果についてはＥ／Ｔ比３０について試験を行わず、細胞傷害活性維持効果については、Ｅ／Ｔ比３および１の２点について算出した。【０２６２】
【表２７】
2007142300.tif 000028
【０２６３】
【表２８】
2007142300.tif 000029
【０２６４】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用した群のＣＴＬは、対照群と比較して、１５日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、ＦＮフラグメントをＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能であり、その効果が高いＦＮフラグメントはＨ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴであることが明らかになった。【０２６５】
実施例３１  実施例２９で得られたＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例２９−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例２８と同様の方法にてＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表２９に示す。【０２６６】
【表２９】
2007142300.tif 000030
【０２６７】
ＦＮフラグメントを誘導時および拡大培養時に使用した群において、高い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞含有率は、ＦＮフラグメントを使用した群については４７．９％〜６３．８％、使用していない対照群については６７．８％であった。つまり、ＦＮフラグメントを誘導時および拡大培養時に使用することにより、フィーダ細胞を用いない系で、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬ含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められ、特にＨ２９６−Ｈ２９６とＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴが有効であることが示された。【０２６８】
実施例３２  各ＦＮフラグメントを用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体および３種のＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体および３種類のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ）をそれぞれ固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレートに抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）と終濃度２〜４μｇ／ｍＬのＦＮフラグメントを含むＰＢＳを１．９ｍＬ／ウェルずつ添加した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定に合わせるために使用するＦＮフラグメントの濃度を調整した。これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃に保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮフラグメントを含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。【０２６９】
（２）リンパ球の拡大培養
０．５％ｈｕｍａｎＡＢ血清と０．２％ヒト血清アルブミンを含むＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ社製、以下０．５％ＧＴ−Ｔ５０３と略す）に０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例３２−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化プレートに０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を  ０．５ｍＬ／ウェルで添加しておき、細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴは、対照と同様に調製したウェルに終濃度０．６７μｇ／ｍＬになるように直接添加した。続いて終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて８倍希釈し、希釈液６ｍＬを何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、７日目には各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて４．２倍希釈し、希釈液１２．６ｍＬを何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移し、いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１１日目には、０．２％ヒト血清アルブミンを含む無血清ＧＴ−Ｔ５０３を用いて、各群の細胞培養液を２倍希釈し、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに希釈量１２．６ｍＬをそれぞれ移した。各群において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表３０に示す。【０２７０】
【表３０】
2007142300.tif 000031
【０２７１】
表３０に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメントを固定化した培養器材を使用した群、もしくは培養液に直接溶液添加した群は、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。つまり、４種のＦＮフラグメントはリンパ球拡大培養時に好適に使用されることが明らかとなった。【０２７２】
実施例３３  ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ２７陽性細胞、ＣＤ２８陽性細胞の解析
実施例３２−（２）で調製した細胞をＰＢＳ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に細胞を懸濁し、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加した。同様に、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加した細胞、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ２７抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加した細胞を用意した。各々の抗体を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を洗浄し、再度ＰＢＳに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ２７陽性細胞、ＣＤ２８陽性細胞の割合を算出した。結果を表３１、表３２、表３３に示す。【０２７３】
【表３１】
2007142300.tif 000032
【０２７４】
【表３２】
2007142300.tif 000033
【０２７５】
【表３３】
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【０２７６】
表３１、表３２、表３３に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメントを固定化した培養器材を使用した群、もしくは培養液に直接溶液添加した群においては、対照群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞集団、ＣＤ２７＋細胞集団、ＣＤ２８＋細胞集団が高い結果が得られた。これらは、いずれもナイーブＴ細胞でみられる表現型であり、拡大培養後のリンパ球を体内に戻したときの効果が期待できる。当該実施例より、４種のＦＮフラグメントを用いることにより、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０２７７】
実施例３４  Ｈ−２９６の固定化緩衝液の検討
ｐＨ３．８から０．６毎にｐＨ８．０までの０．２Ｍ  リン酸緩衝液または０．２Ｍ  酢酸緩衝液を２５および５０μｇ／ｍＬに調製したＨ−２９６を９６穴細胞培養プレートの各ウェルにそれぞれ添加し、５時間室温で固定化した。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢＳを用いて４倍希釈したＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ（大日本製薬社製）を各ウェルに添加し、１時間室温で静置した。ＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ標識したＦＮＨ３−８抗体（タカラバイオ社製）を各ウェルに添加して、１時間室温で静置したのち、ＰＢＳで３回洗浄した。このプレートをＡＢＴＳ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて発色し、４０５ｎｍの吸光度を測定することで固定化率を評価した。なお、ＦＮＨ３−８抗体はフィブロネクチンの部分領域であるＩＩＩ−１２を特異的に認識する抗体である（図１参照）。結果を表３４に示す。【０２７８】
【表３４】
2007142300.tif 000035
【０２７９】
表３４より、Ｈ−２９６はリン酸緩衝液よりもｐＨの低い酢酸緩衝液を使用した方が培養プレートへの固定化効率が高く、ｐＨ５．６酢酸緩衝液を用いて固定化した場合に高い固定化率を示すことが明らかとなった。【０２８０】
実施例３５  Ｈ−２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６の固定化量の比較
０．２Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）（以下、ｐＨ５．６酢酸緩衝液と記載）を用いて段階希釈したＨ−２９６と、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて段階希釈したＨ２９６−Ｈ２９６を９６穴細胞培養プレートにそれぞれ固定化し、５時間静置した。このプレートのＦＮフラグメント固定化量を実施例３４と同様の方法で測定した。結果を表３５に示す。【０２８１】
【表３５】
2007142300.tif 000036
【０２８２】
その結果、Ｈ２９６−Ｈ２９６はＨ−２９６と比べて培養プレートへの固定化効率が極めて高く、また、ｐＨ５．６酢酸緩衝液を用いたＨ−２９６  ２００μｇ/ｍＬの固定化量と、ＰＢＳを用いたＨ２９６−Ｈ２９６  約３μｇ/ｍＬの固定化量は、重量比でほぼ一致することが示された。【０２８３】
実施例３６  培養器材への固定化量を合わせたＨ−２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）各ＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に２種類のＦＮフラグメント（Ｈ−２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６）をそれぞれ固定化した。すなわち、表３６に示した終濃度のＦＮフラグメントを含むｐＨ５．６酢酸緩衝液あるいはＰＢＳを２４穴細胞培養プレートに１ｍＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。培養器材は使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。【０２８４】
【表３６】
2007142300.tif 000037
【０２８５】
なお、前述の実施例３５より、上記の終濃度２００μｇ／ｍＬ  Ｈ−２９６を用いた培養プレートへの固定化量は、終濃度３μｇ／ｍＬ  Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いたものと同等である。【０２８６】
（２）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例２−（１）に記載した方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例２−（３）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、プレートは実施例３６−（１）で作製したものを使用した（対照にはＦＮフラグメントを固定化していないプレートを使用）。１４日間培養後の細胞増殖率を表３７に示す。【０２８７】
【表３７】
2007142300.tif 000038
【０２８８】
細胞増殖率はＣＴＬ誘導開始時のレスポンダー細胞数に対する誘導終了時点での細胞数の比を増殖率として求めた。その結果、ＦＮフラグメントを使用した群では使用していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時にＦＮフラグメントを使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。また、Ｈ−２９６（２００μｇ／ｍＬ）とＨ２９６−Ｈ２９６（３μｇ／ｍＬ）では、プレートへの固定化量は同量であるにもかかわらず、Ｈ２９６−Ｈ２９６（３μｇ／ｍＬ）の方が細胞増殖率が高かった。【０２８９】
実施例３７  ３０ｍＬ採血を想定した実施例３６のＣＴＬのフィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体と各ＦＮフラグメントの固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体と２種類のＦＮフラグメントを固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）と表３６に示した濃度のＦＮフラグメントを含むｐＨ５．６酢酸緩衝液またはＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。【０２９０】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例３６−（２）で調製したＣＴＬ  １×１０５ｃｅｌｌｓを実施例１５−（２）と同様の方法で拡大培養を行なった。この際、実施例３７−（１）で作製した９６穴培養プレートを使用し、５ＨＲＰＭＩを用いて培養を開始した。培養開始１日目に終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加、５日目以降は５ＨＲＰＭＩを０ＨＲＰＭＩで適宜希釈した血清濃度の培地を用いて固定化を行っていないプレートに継代し、終濃度５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。すなわち、培養開始後５日目には０．７５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、８日目には１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１２日目には３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで継代を行った。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、１５日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表３８に示す。【０２９１】
【表３８】
2007142300.tif 000039
【０２９２】
誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用した群については、使用していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となった。また、Ｈ−２９６（２００μｇ／ｍＬ）とＨ２９６−Ｈ２９６（３μｇ／ｍＬ）では、プレートへの固定化量は同量であるにもかかわらず、Ｈ２９６−Ｈ２９６（３μｇ／ｍＬ）の方が極めて高い細胞増殖率を示した。【０２９３】
実施例３８  実施例３７のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例３７−（２）で得られたＣＴＬを実施例２７と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。ＣＴＬ拡大培養後細胞傷害活性結果を表３９、活性維持効果を表４０に示す。なお、細胞傷害活性結果のＥ／Ｔ比３０については試験を行わず、細胞傷害活性維持効果については、Ｅ／Ｔ比３および１の２点について算出した。【０２９４】
【表３９】
2007142300.tif 000040
【０２９５】
【表４０】
2007142300.tif 000041
【０２９６】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用した群のＣＴＬは、対照群と比較して、１５日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、ＦＮフラグメントをＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能であり、その効果が高いＦＮフラグメントはＨ２９６−Ｈ２９６であることが明らかになった。【０２９７】
実施例３９  Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴの作成
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｈ−２９６が２つ連結した改変型フィブロネクチンフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２９８】
（ｉ）ｐＴ７−Ｈ２９６ベクターの構築
ＣＨ−２９６の塩基配列（配列表の配列番号８）より、配列表の配列番号２４記載の塩基配列を有する合成プライマーＣＳ１−ＮｄｅＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。合成プライマーＣＳ１−ＮｄｅＲは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号４〜９に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列表の配列番号７）のアミノ酸番号５７４〜５６９に相当する塩基配列を塩基番号１０〜２７にもつ合成ＤＮＡである。【０２９９】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例２２−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−ＮｄｅＲ、１ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製した。【０３００】
次にｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ（メルク社）、タカラバイオ社製）と、上記ＤＮＡ断片を混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組み換えプラスミドを、ｐＴ７−Ｈ２９６とした。【０３０１】
（ｉｉ）Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ発現ベクターの構築
ｐＴ７−Ｈ２９６をＮｄｅＩ消化して、約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを１．０％アガロースゲル電気泳動により回収、精製した。次に、実施例２２−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６をＮｄｅＩ消化し、末端を脱リン酸化処理したものを調製し、上記約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントと混合、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０３０２】
目的のＨ−２９６が２つ連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６−２とした。このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６−２は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が、間にアミノ酸“Ｈ”を挟んで２つ連結しそのＮ末端にＨｉｓタグ配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ２９６−Ｈ２９６−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号２５に、塩基配列を配列表の配列番号２６に示す。【０３０３】
（２）Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ発現、精製
実施例３９−（１）−（ｉｉ）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６−２を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例２２−（２）と同様にＨ２９６−Ｈ２９６−ＨＴの発現、精製を行なった。なお、培養液、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＡ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＢ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレントテクノロジー社製）で解析したところ、分子量約６７ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、１．３ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約１９μＭ）。【０３０４】
実施例４０  Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６の作成
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ発現、精製
実施例２２−（１）−（ｉｉ）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６−３を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例２２−（２）と同様にＨ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴの発現、精製を行なった。なお、培養液、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＡ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＢ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約９９ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、３．７ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約３７μＭ）。【０３０５】
（２）Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６の精製
次に、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（メルク社製）を用いて、実施例４０−（１）で精製したＨ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ精製タンパク質３ｍｇ分のＨｉｓタグ配列の切断を４℃にて一晩行った後、Ｈｉｓタグなしの目的タンパク質の精製を行った。Ｈｉｓタグの切断および目的タンパク質の精製は上記Ｋｉｔに付属の操作書に従って行った。切断後の溶液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約９７ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．６５ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約６．７μＭ）。Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６のアミノ酸配列を配列表の配列番号２７に、また当該タンパク質をコードすると予想される塩基配列を配列表の配列番号２８に示す。【０３０６】
実施例４１  Ｈ１０５−Ｈ１０５の作成
（１）Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴの発現、精製
実施例２４−（２）と同様の方法でＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴの発現、精製を行なった。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約２８ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、１．２５ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約４５μＭ）。【０３０７】
（２）Ｈ１０５−Ｈ１０５の精製
Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて、実施例４０−（２）と同様に上記のＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ精製タンパク質３ｍｇ分のＨｉｓタグ配列の切断を４℃にて一晩行った後、Ｈｉｓタグなしの目的タンパク質の精製を行った。Ｈｉｓタグの切断および目的タンパク質の精製は上記Ｋｉｔに付属の操作書に従って行った。切断後の溶液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約２６ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．４２ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約１６μＭ）。Ｈ１０５−Ｈ１０５のアミノ酸配列を配列表の配列番号２９に、また当該タンパク質をコードすると予想される塩基配列を配列表の配列番号３０に示す。【０３０８】
実施例４２  抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体およびＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５）を用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体、および６種のＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体および６種のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５）を固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレート（コーニング社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）抗ヒトＣＤ２８抗体（ダコ・ジャパン社製、終濃度５μｇ／ｍＬ）および終濃度１〜２５μｇ／ｍＬのＦＮフラグメントを含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を０．４５ｍＬ／ウェルずつ添加した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定に合わせるために調整した。この時、ＦＮフラグメントとして実施例３９で調製したＨ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、実施例２２で調製したＨ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、実施例２４で調製したＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ、実施例１で調製したＨ２９６−Ｈ２９６、実施例４０で調製したＨ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６、実施例４１で調製したＨ１０５−Ｈ１０５を使用した。これらの培養器材を室温で５時間インキュベートした。使用直前にはこれらの培養器材から抗体およびＦＮフラグメントを含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。【０３０９】
（２）リンパ球の拡大培養
０．５％ＧＴ−Ｔ５０３に０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例４２−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体・抗ヒトＣＤ２８抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体・抗ヒトＣＤ２８抗体およびＦＮフラグメント固定化プレートに０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を  １．０ｍＬ／ウェルで添加しておき、細胞液を０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。続いて終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて１４．３倍希釈し、希釈液１０ｍＬを何も固定化していない２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、８日目には各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて２倍希釈し、希釈液１０ｍＬを何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移し、いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１１日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表４１に示す。【０３１０】
【表４１】
2007142300.tif 000042
【０３１１】
表４１に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメントを固定化した培養器材を使用した群は、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。つまり、６種のＦＮフラグメントは抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体刺激と組み合わせたリンパ球拡大培養時においても好適に使用されることが明らかとなった。【０３１２】
実施例４３  各ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を用いて培養したリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
（１）抗ヒトＣＤ３抗体および２種のＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に実施例４２−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体および２種のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を固定化した。この際、抗ヒトＣＤ２８抗体は添加しなかった。ただし、ＦＮフラグメントは終濃度１〜３μｇ／ｍＬとなるようにＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）に添加した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定にあわせるために調整した。この時、ＦＮフラグメントとして実施例３９で調製したＨ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、実施例１で調製したＨ２９６−Ｈ２９６を使用した。【０３１３】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例４２−（２）と同様の方法で、リンパ球の拡大培養を行った。培養開始０日目には、実施例４３−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート又は抗ヒトＣＤ３抗体・ＦＮフラグメント固定化プレートを使用し、ただし、培養開始１１日目には０．２％ヒト血清アルブミンを含む無血清ＧＴ−Ｔ５０３を用いて、各群の細胞培養液を２倍希釈後、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表４２に示す。【０３１４】
【表４２】
2007142300.tif 000043
【０３１５】
表４２に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を固定化した培養器材を使用した群は、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。【０３１６】
（３）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例４３−（２）で調製した細胞について実施例３３と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析を行った。ただし、解析時にはＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体／ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の割合を算出した。結果を表４３に示す。【０３１７】
【表４３】
2007142300.tif 000044
【０３１８】
表４３に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。当該実施例より、２種のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を用いることにより、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０３１９】
実施例４４  抗ＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）を用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体および４種のＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体および４種のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）を実施例４３-（１）と同様の方法で固定化した。ただし、固定化の際の緩衝液はＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を使用し、ＦＮフラグメントは終濃度１〜２５μｇ／ｍＬとなるように添加した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定にあわせるために調整した。この時、ＦＮフラグメントとして実施例３９で調製したＨ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、実施例１で調製したＨ２９６−Ｈ２９６、実施例２２で調製したＨ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、実施例４０で調製したＨ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６を使用した。【０３２０】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例４３−（２）と同様の方法で、リンパ球の拡大培養を行った。ただし、培養開始０日目には、実施例４４−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート又は抗ヒトＣＤ３抗体・ＦＮフラグメント固定化プレートを使用し、Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６については、対照と同様に調製したウェルに終濃度０．６７μｇ／ｍＬとなるように直接添加する群も設定した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表４４に示す。【０３２１】
【表４４】
2007142300.tif 000045
【０３２２】
表４４に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）を固定化した培養器材を使用した群は、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。またＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を培地中に直接添加した群においても対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。つまり、４種のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）はリンパ球拡大培養時において好適に使用されることが明らかとなった。【０３２３】
（３）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例４４−（２）で調製した細胞について実施例４３−（３）と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析を行った。結果を表４５に示す。【０３２４】
【表４５】
2007142300.tif 000046
【０３２５】
表４５に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。またＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を培地中に直接添加した群においても同様に高い比率が得られた。当該実施例より、４種のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）を用いることにより、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０３２６】
実施例４５  Ｈ２７１−Ｈ２９６の作成
（１）Ｈ２７１−Ｈ２９６発現ベクターの構築
Ｈ−２７１とＨ−２９６が連結した改変型フィブロネクチンフラグメント（Ｈ２７１−Ｈ２９６）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０３２７】
（ｉ）ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１−Ｈ２９６ベクターの構築
ＣＨ−２９６の塩基配列（配列表の配列番号８）より、配列表の配列番号３１記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２７１−ＮｃｏＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２７１−ＮｃｏＲは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号５４９〜５４４に相当する塩基配列を塩基番号１７〜３４にもつ合成ＤＮＡである。上記合成プライマーと配列表の配列番号１２記載の合成プライマーＮＣ２−５’ＵＴＲを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。【０３２８】
すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＮＣ２−５’ＵＴＲ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２７１−ＮｃｏＲ、５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９６℃  １分、６８℃  ４分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【０３２９】
反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁、全量５０μＬとした反応液で制限酵素ＮｃｏＩ消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＮｃｏＩ消化物を抽出精製し、約０．８ｋｂｐのＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０３３０】
次に、ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６をＮｃｏＩ消化し、末端を脱リン酸化処理したものを調製し、上記約０．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントと混合、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０３３１】
目的のＨ−２７１と、Ｈ−２９６が連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１−Ｈ２９６とした。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８−５４９のアミノ酸配列をコードする塩基配列とＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が間にアミノ酸“Ａ”を挟んで連結したプラスミドである。当該タンパク質をＨ２７１−Ｈ２９６と命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号３２に、塩基配列を配列表の配列番号３３に示す。【０３３２】
（２）Ｈ２７１−Ｈ２９６発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１−Ｈ２９６を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例１−（２）と同様にＨ２７１−Ｈ２９６の発現、精製を行なった。なお、培養液、細胞破砕溶液、樹脂容積、ｂｕｆｆｅｒＡ、ｂｕｆｆｅｒＢ、ｂｕｆｆｅｒＤ、分画液、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約６２ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＨ２７１−Ｈ２９６とした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキットを使用して、タンパク質濃度を測定したところ、１．６ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約２５．８μＭ）。なお、Ｎ末端はメチオニン消化されてＡｌａとなることが予想される。【０３３３】
実施例４６  Ｈ２９６−Ｈ２７１の作成
（１）Ｈ２９６−Ｈ２７１発現ベクターの構築
Ｈ−２９６とＨ−２７１が連結した改変型フィブロネクチンフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２７１）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０３３４】
（ｉ）ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１ベクターの構築
ＣＨ−２９６の塩基配列（配列表の配列番号８）より、配列表の配列番号３４及び３５記載の塩基配列を有する合成プライマー１２−Ｎｃｏ−Ｆ２及びＨ２７１−ＢａｍＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー１２−Ｎｃｏ−Ｆ２は、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号７〜１２に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列のアミノ酸番号２７９〜２８５に相当する塩基配列を塩基番号１２〜３２にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＨ２７１−ＢａｍＲは、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号８〜１３に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列表の配列番号７）のアミノ酸番号５４９〜５４４に相当する塩基配列を塩基番号１９〜３６にもつ合成ＤＮＡである。【０３３５】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１２−Ｎｃｏ−Ｆ２、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２７１−ＢａｍＲ、２．５Ｕの  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９８℃  １０秒、６８℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液をエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ―ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０３３６】
次にｐＣｏｌｄ１４ベクターをＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組み換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１とした。【０３３７】
（ｉｉ）Ｈ２９６−Ｈ２７１発現ベクターの構築
次に、配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲと配列表の配列番号１２記載の合成プライマーＮＣ２−５’ＵＴＲを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。【０３３８】
すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＮＣ２−５’ＵＴＲ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲ、５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９６℃  １分、６８℃  ４分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【０３３９】
反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を回収し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁、全量５０μＬとした反応液で制限酵素ＮｃｏＩ消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＮｃｏＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０３４０】
次に、実施例４６−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１をＮｃｏＩ消化し、末端を脱リン酸化処理したものを調製し、上記約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントと混合、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０３４１】
Ｈ−２９６とＨ−２７１が連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２７１とした。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２７１は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列とＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８−５４９のアミノ酸配列をコードする塩基配列の間にアミノ酸“Ａ”を挟んで連結したプラスミドである。当該タンパク質をＨ２９６−Ｈ２７１と命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号３６に、塩基配列を配列表の配列番号３７に示す。【０３４２】
（２）Ｈ２９６−Ｈ２７１発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２７１を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例１−（２）と同様にＨ２９６−Ｈ２７１の発現、精製を行なった。なお、培養液、細胞破砕溶液、樹脂容積、ｂｕｆｆｅｒＡ、ｂｕｆｆｅｒＢ、ｂｕｆｆｅｒＤ、分画液、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約６２ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＨ２９６−Ｈ２７１とした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキットを使用して、タンパク質濃度を測定したところ、１．１ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約１７．７μＭ）。なお、Ｎ末端はメチオニン消化されてＡｌａとなることが予想される。【０３４３】
実施例４７  抗ＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント（Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１）を用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体および２種のＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体および２種のＦＮフラグメント（Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１）を実施例４３−（１）と同様の方法で固定化した。ただし、固定化の際の緩衝液はＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）またはＰＢＳを使用し、ＦＮフラグメントは終濃度１１〜１６μｇ／ｍＬとなるように添加した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定にあわせるために調整した。この時、ＦＮフラグメントとして実施例４５で調製したＨ２７１−Ｈ２９６、実施例４６で調製したＨ２９６−Ｈ２７１を使用した。【０３４４】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例４３−（２）と同様の方法で、リンパ球の拡大培養を行った。ただし、培養開始０日目には、実施例４７−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート又は抗ヒトＣＤ３抗体・ＦＮフラグメント固定化プレートを使用し、培養は１５日間とした。培養開始後１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表４６に示す。【０３４５】
【表４６】
2007142300.tif 000047
【０３４６】
表４６に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１）を固定化した培養器材を使用した群は、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。つまり、２種のＦＮフラグメント（Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１）はリンパ球拡大培養時において好適に使用されることが明らかとなった。【０３４７】
（３）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例４７−（２）で調製した細胞について実施例４３−（３）と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析を行った。結果を表４７に示す。【０３４８】
【表４７】
2007142300.tif 000048
【０３４９】
表４７に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１）を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。当該実施例より、２種のＦＮフラグメント（Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１）を用いることにより、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０３５０】
実施例４８  ＦＮフラグメントを用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）  各ＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に３種類のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１）を固定化した。すなわち、終濃度５〜１０μｇ／ｍＬのＦＮフラグメントを含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を２４穴細胞培養プレートには０．２４ｍＬ／ウェルずつ、４８穴細胞培養プレートには０．０９ｍＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。培養器材は使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定に合わせるために使用するＦＮフラグメントの濃度を調整した。このとき、ＦＮフラグメントとして実施例１で調製したＨ２９６−Ｈ２９６、実施例４５で調製したＨ２７１−Ｈ２９６、実施例４６で調製したＨ２９６−Ｈ２７１を使用した。【０３５１】
（２）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例２−（１）に記載した方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例２−（３）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行なった。その際、培養開始時は実施例４８−（１）で作製した４８穴細胞培養プレートを用い（対照にはＦＮフラグメントを固定化していないプレートを使用）、レスポンダー細胞は０．４ｍＬ／ウェルずつ添加した。培養７日目には実施例４８−（１）で作製した２４穴細胞培養プレートを使用した（対照にはＦＮフラグメントを固定化していないプレートを使用）。１４日間培養後の細胞増殖率を表４８に示す。【０３５２】
【表４８】
2007142300.tif 000049
【０３５３】
表４８に示されるように、ＦＮフラグメントを使用した群では使用していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時にＦＮフラグメントを使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。【０３５４】
実施例４９  ６０ｍＬ採血を想定した実施例４８のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体と各ＦＮフラグメントの固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体と３種類のＦＮフラグメントを固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）と実施例４８−（１）と同濃度のＦＮフラグメントを含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を４８穴細胞培養プレートに０．０９ｍＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。【０３５５】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例４８−（２）で調製したＣＴＬ  １×１０５ｃｅｌｌｓを実施例２９−（２）と同様の方法で拡大培養を行なった。この際、実施例４９−（１）で作製した４８穴培養プレートを使用した。１５日間培養後の細胞増殖率を表４９に示す。【０３５６】
【表４９】
2007142300.tif 000050
【０３５７】
表４９に示されるように、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用した群については、使用していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となった。【０３５８】
実施例５０  実施例４９のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例４９−（２）で得られたＣＴＬを実施例２７と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。ＣＴＬ拡大培養後の細胞傷害活性の結果を表５０、活性維持効果を表５１に示す。なお、細胞傷害活性効果のＥ／Ｔ比３０については試験を行わず、細胞傷害活性維持効果については、Ｅ／Ｔ比３および１の２点について算出した。【０３５９】
【表５０】
2007142300.tif 000051
【０３６０】
【表５１】
2007142300.tif 000052
【０３６１】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用した群のＣＴＬは、対照群と比較して、１５日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、ＦＮフラグメントをＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能であることが明らかになった。【０３６２】
実施例５１  実施例４９のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例４９−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例２８と同様の方法にてＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。測定結果を表５２に示す。【０３６３】
【表５２】
2007142300.tif 000053
【０３６４】
表５２に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用したＣＴＬは、使用しなかった対照群と比較して高い陽性細胞含有率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞含有率は、ＦＮフラグメントを使用した群については６７．５％〜７１．８％、使用していない対照群については６８．０％であった。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用することで、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの含有率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。【０３６５】
実施例５２  Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ及びＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃの作成
（１）Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｈ−１０５が２つ連結した改変型フィブロネクチンフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０３６６】
（ｉ）ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５ベクターの構築
配列表の配列番号４５及び４６記載の塩基配列を有する合成プライマーＡＩＤ−Ｆ−Ｎｃｏ及びＣＳ１−Ｒ−ＸｂａをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＡＩＤ−Ｆ−Ｎｃｏは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号４６０〜４６６に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３８にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａは、制限酵素ＸｂａＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号５７４〜５６９に相当する塩基配列を塩基番号１９〜３６にもつ合成ＤＮＡである。【０３６７】
上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＡＩＤ−Ｆ−Ｎｃｏ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５Ｕの  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９８℃  １０秒、６８℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．３５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液をエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素ＸｂａＩで２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０３６８】
次にｐＣｏｌｄ１４ベクターをＮｃｏＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組み換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５とした。【０３６９】
（ｉｉ）ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５−２ベクターの構築
配列表の配列番号４５及び１１記載の塩基配列を有する合成プライマーＡＩＤ−Ｆ−Ｎｃｏ及びＨ２９６−ＮｃｏＲを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＡＩＤ−Ｆ−Ｎｃｏ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲ、２．５Ｕの  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９８℃  １０秒、６８℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．３５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液をエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｃｏＩ消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＮｃｏＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ―ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０３７０】
次に、実施例５２−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５をＮｃｏＩ消化し、末端を脱リン酸化処理したものを調製し、上記約０．３５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントと混合、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組み換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５−２とした。【０３７１】
（ｉｉｉ）ｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−２Ｎｃベクターの構築
配列表の配列番号２１記載の合成プライマーＨ１０５−ＮｄｅＦと配列表の配列番号１０記載の合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例５２−（１）−（ｉｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５−２  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ１０５−ＮｄｅＦ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、２．５Ｕの  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９８℃  １０秒、６８℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液をエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ―ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０３７２】
次に、ｐＣｏｌｄＩベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで２重消化したものを調製し、上記約０．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントと混合、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０３７３】
Ｈ−１０５が２つ連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−２Ｎｃとした。このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−２Ｎｃは、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号４６０−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列がアミノ酸“ＡＭＡ”を挟んで２つ連結しそのＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号４７に、塩基配列を配列表の配列番号４８に示す。【０３７４】
（２）Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴの発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−２Ｎｃを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例２２−（２）と同様にＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴの発現、精製を行なった。なお、培養液、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＡ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、分子量約２８ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出された。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキットを使用して、タンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、１．２５ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約４４μＭ）。【０３７５】
（３）Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃの精製
Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて、実施例４０−（２）と同様に上記のＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ精製タンパク質３ｍｇ分のＨｉｓタグ配列の切断を４℃にて一晩行った後、Ｈｉｓタグなしの目的タンパク質の精製を行った。Ｈｉｓタグの切断および目的タンパク質の精製は上記Ｋｉｔに付属の操作書に従って行った。切断後の溶液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約２６ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出された。Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃのアミノ酸配列を配列表の配列番号４９に、また当該タンパク質をコードすると予想される塩基配列を配列表の配列番号５０に示す。【０３７６】
実施例５３  １５ａａＨ１０５−Ｈ１０５及び１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴの作成
（１）１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６のアミノ酸配列番号４４５〜４５９にＨ−１０５が２つ連結した改変型フィブロネクチンフラグメント（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０３７７】
（ｉ）ｐＣｏｌｄI−１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５ベクターの構築
配列表の配列番号３８記載の塩基配列を有する合成プライマーＮｄｅ−１５ａａ―ＦをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＮｄｅ−１５ａａ―Ｆは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号７〜１２に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号４４５〜４５１に相当する塩基配列を塩基番号１３〜３３にもつ合成ＤＮＡである。上記合成プライマーと配列表の配列番号１１記載のＨ２９６−ＮｃｏＲを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。【０３７８】
すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例２２−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６  約０．１μｇ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＮｄｅ−１５ａａ―Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬ（タカラバイオ社製）にセットし、ＮＯＲＭモードで９６℃  １０秒、５８℃  １５秒、７２℃  ３０秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【０３７９】
反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を回収し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁、全量１２０μＬとした反応液で制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＮｃｏＩで二重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＮｃｏＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０３８０】
次に、実施例５２−（１）−（ｉｉｉ）で構築したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−２Ｎｃを制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＮｃｏＩで二重消化し、上記約０．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントと混合、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０３８１】
目的のＣＨ−２９６のアミノ酸配列番号４４５〜４５９にＨ−１０５が２つ連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５とした。このｐＣｏｌｄＩ−１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５は、ＣＨ−２９６の塩基配列４４５〜４５９のアミノ酸配列をコードする塩基配列にＣＨ−２９６のアミノ酸番号４６０−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が間にアミノ酸“ＡＭＡ”を挟んで２つ連結しそのＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質を１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号３９に、塩基配列を配列表の配列番号４０に示す。【０３８２】
（２）１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例２２−（２）と同様に１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴの発現、精製を行なった。なお、培養液、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＡ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＢ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約２９ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、１．５ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約５１．７μＭ）。【０３８３】
（３）１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５精製
次に、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて、実施例４０−（２）と同様に上記の１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ精製タンパク質３ｍｇ分のＨｉｓタグ配列の切断を４℃にて一晩行った後、Ｈｉｓタグなしの目的タンパク質の精製を行った。Ｈｉｓタグの切断および目的タンパク質の精製は上記Ｋｉｔに付属の操作書に従って行った。切断後の溶液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約２７ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約３７μＭ）。１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５のアミノ酸配列を配列表の配列番号４１に、また当該タンパク質をコードすると予想される塩基配列を配列表の配列番号４２に示す。【０３８４】
実施例５４  各ＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を用いて培養したリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）のＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＣＲ７陽性細胞ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析（ＦＮフラグメントの直接添加）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体の固定化
以下の実験で使用する培養器材に実施例４２−（１）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体を固定化した。ただし、この際抗ヒトＣＤ２８抗体および各種ＦＮフラグメントは固定化しなかった。【０３８５】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例４２−（２）と同様の方法で、リンパ球の拡大培養を行った。ただし、培養開始０日目には実施例５２で作成したＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、実施例３９で作成したＨ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、実施例１で作成したＨ２９６−Ｈ２９６を終濃度０．６７μg／ｍLまたは０．３４μg／ｍＬになるように直接添加した。培養開始１１日目に０．２％ヒト血清アルブミンを含む無血清ＧＴ−Ｔ５０３を用いて、各群の細胞培養液を２倍希釈後、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表５３、５４に示す。【０３８６】
【表５３】
2007142300.tif 000054
【０３８７】
【表５４】
2007142300.tif 000055
【０３８８】
表５３、５４に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を培養液に直接培地に添加した群は、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。【０３８９】
（３）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例５４−（２）で調製した細胞について実施例４３−（３）と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析を行った。結果を表５５、表５６に示す。【０３９０】
【表５５】
2007142300.tif 000056
【０３９１】
【表５６】
2007142300.tif 000057
【０３９２】
表５５、５６に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を培養液に直接溶液添加した群においては、対照群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。当該実施例より、３種のＦＮフラグメントを直接添加で用いても、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０３９３】
実施例５５  抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体およびＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ）を用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体、およびＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体、ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ）を実施例４２−（１）と同様の方法で固定化した。ただし、ＦＮフラグメントは終濃度３〜２５μｇ／ｍＬとなるように添加した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定にあわせるために調整した。この時、ＦＮフラグメントとして実施例１で調製したＨ２９６−Ｈ２９６、実施例４０で調製したＨ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６、実施例５２で調製したＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃを使用した。【０３９４】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例４２−（２）と同様の方法で、リンパ球の拡大培養を行った。ただし、培養開始０日目には、実施例５５−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体・抗ヒトＣＤ２８抗体固定化プレート又は抗ヒトＣＤ３抗体・抗ヒトＣＤ２８抗体・ＦＮフラグメント固定化プレートを使用し、培養開始４日目には各群の細胞濃度を０．０２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて希釈後、希釈液６ｍＬを１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、７日目には０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて希釈後、希釈液６ｍＬを１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１０日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表５７に示す。【０３９５】
【表５７】
2007142300.tif 000058
【０３９６】
表５７に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体およびＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）を固定化した培養器材を使用した群についても、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。つまり、ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）は抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体を用いたリンパ球拡大培養時において好適に使用されることが明らかとなった。【０３９７】
（３）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、 ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例５５−（２）で調製した細胞について実施例４３−（３）と同様の方法で培養開始１０日目にＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析を行った。結果を表５８に示す。【０３９８】
【表５８】
2007142300.tif 000059
【０３９９】
表５８に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体およびＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）を固定化した培養器材を使用した群については、対照群と比較してＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。当該実施例より、ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）を用いることにより、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０４００】
実施例５６  抗ＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）を用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）を実施例４３−（１）と同様の方法で固定化した。ただし、固定化の際の緩衝液はＰＢＳを使用し、ＦＮフラグメントは終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。この時、ＦＮフラグメントとして実施例５３で調製した１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５を使用した。【０４０１】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例４３−（２）と同様の方法で、リンパ球の拡大培養を行った。ただし、培養開始０日目には、実施例５６−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート又は抗ヒトＣＤ３抗体・ＦＮフラグメント固定化プレートを使用し、実施例４３−（２）における培養開始８日目の操作を当該実施例では７日目に行った。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表５９に示す。【０４０２】
【表５９】
2007142300.tif 000060
【０４０３】
表５９に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）を固定化した培養器材を使用した群は、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。つまり、ＦＮフラグメント（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）はリンパ球拡大培養時において好適に使用されることが明らかとなった。【０４０４】
（３）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例５６−（２）で調製した細胞について実施例４３−（３）と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＣＲ７陽性細胞ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析を行った。結果を表６０に示す。【０４０５】
【表６０】
2007142300.tif 000061
【０４０６】
表６０に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。当該実施例より、ＦＮフラグメント（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）を用いることにより、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０４０７】
実施例５７  ＦＮフラグメントを用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）  各ＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に３種類のＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）を固定化した。すなわち、終濃度５〜１０μｇ／ｍＬのＦＮフラグメントを含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）あるいはＰＢＳを２４穴細胞培養プレートに０．２４ｍＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。培養器材は使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。なお、ＦＮフラグメントの濃度と固定化液については、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定に合わせるために使用するＦＮフラグメントの濃度と固定化液を調整した。このとき、ＦＮフラグメントとして実施例１で調製したＨ２９６−Ｈ２９６、実施例５２で調製したＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ、実施例５３で調製した１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５を使用した。【０４０８】
（２）  抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導は、実施例２−（３）の方法を一部改変して実施した。培養開始時に実施例５７−（１）で調製した２４穴細胞培養プレートを使用し、直接添加のＨ２９６−Ｈ２９６については対照と同様に調製したウェルに終濃度１μｇ／ｍＬになるように添加した。また、ＣｐＧ（ＣｐＧ−Ｃ  ＤＮＡ：配列表の配列番号４３記載のＤＮＡ：Ｈｙｃｕｌｔ  ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した試験区も設定した。ＣｐＧは、免疫細胞を活性化する働きを有することが知られる公知のオリゴヌクレオチドである。ＣｐＧについては終濃度１μｇ／ｍＬあるいは５μｇ／ｍＬとなるように添加した。培養７日目にはペプチドパルスした抗原提示細胞による再刺激を行なわず、５日目と同様に培養上清を半分除去後、ＩＬ−２含有培地を１ｍＬずつ添加し、９日間培養を継続した。細胞増殖率を表６１に示す。【０４０９】
【表６１】
2007142300.tif 000062
【０４１０】
表６１に示されるように、ＦＮフラグメントを使用した群では使用していない対照群と比較して高い増殖率を示した。また、ＣｐＧについては、対照と比較して高い増殖率を示したが、ＦＮフラグメントの増殖率には及ばなかった。つまり、ＣＴＬ誘導時にＦＮフラグメントを使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなり、その増殖率はＣｐＧを超えることが示された。【０４１１】
実施例５８  ６０ｍＬ採血を想定した実施例５７のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体と各ＦＮフラグメントの固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体と３種類のＦＮフラグメントを固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度１μｇ／ｍＬ）と実施例５７−（１）と同濃度のＦＮフラグメントを含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）あるいはＰＢＳを４８穴細胞培養プレートに０．１ｍＬ／ウェル添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。【０４１２】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例５７−（２）で調製したＣＴＬ  ２×１０５ｃｅｌｌｓを実施例２９−（２）と同様の方法で拡大培養を行なった。この際、実施例５８−（１）で作製した４８穴培養プレートを使用し、直接添加する群については実施例５７−（２）の濃度に従って添加した。また細胞継代日を４日目、７日目、１０日目に変更し、１４日間培養を継続した。１４日後の細胞増殖率を表６２に示す。【０４１３】
【表６２】
2007142300.tif 000063
【０４１４】
表６２に示されるように、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用した群は、対照群またはＣｐＧを使用した群と比較して高い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となった。【０４１５】
実施例５９  実施例５８のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例５８−（２）で得られたＣＴＬを実施例２７と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。ＣＴＬ拡大培養後細胞傷害活性結果を表６３に示す。なお、Ｅ／Ｔ比３０については、試験を行わなかった。【０４１６】
【表６３】
2007142300.tif 000064
【０４１７】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用した群のＣＴＬは、対照群またはＣｐＧを使用した群と比較して、１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、ＦＮフラグメントをＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能であることが明らかになった。【０４１８】
実施例６０  実施例５８のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例５８−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例２８と同様の方法にてＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。測定結果を表６４に示す。【０４１９】
【表６４】
2007142300.tif 000065
【０４２０】
ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用したＣＴＬは、対照群またはＣｐＧを使用した群と比較して高い陽性細胞含有率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ  Ｖβ１７陽性ＣＤ８陽性細胞含有率は、ＦＮフラグメントを使用した群については５４．０％〜６４．４％、使用していない対照群については４３．７％、ＣｐＧを使用した群については４２．０％〜４５．８％であった。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＦＮフラグメントを使用することで、抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの含有率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。【０４２１】
実施例６１  各種ＦＮフラグメントの固定化率の比較
各種ＦＮフラグメント０〜２５μｇ／ｍＬを含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）またはＰＢＳを９６穴細胞培養プレートの各ウェルに４０μＬずつ添加し、５時間室温で固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢＳを用いて４倍希釈したＢｌｏｃｋ  Ａｃｅを各ウェルに３００μＬずつ添加し、１時間室温で静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、１次抗体として適宜希釈したＨＲＰ標識ＦＮＨ３−８またはマウス抗ヒトフィブロネクチンＣＳ−１抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を各ウェルに４０μＬずつ添加し、１時間室温で静置した後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。１次抗体としてマウス抗ヒトフィブロネクチンＣＳ−１抗体使用時には、さらに２次抗体として適宜希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を各ウェルに４０μＬずつ添加し、１時間室温で静置した後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。抗体反応後、ＡＢＴＳ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに４０μＬずつ添加し、室温で約１０〜２５分静置した後、１５０ｍＭシュウ酸（ナカライテスク社製）２０μＬを加え反応停止後、４０５ｎｍの吸光度を測定することで固定化率を評価した。なお、マウス抗ヒトフィブロネクチンＣＳ−１抗体はフィブロネクチンの部分領域であるＣＳ−１を特異的に認識する抗体である（図１参照）。結果を表６５、表６６、表６７に示す。なお、下記表における「４０５ｎｍ（測定値−ブランク）」とは各ＦＮフラグメント濃度における吸光値から各ＦＮフラグメント濃度０μｇ／ｍＬにおける吸光値を引いた値である。【０４２２】
【表６５】
2007142300.tif 000066
【０４２３】
【表６６】
2007142300.tif 000067
【０４２４】
【表６７】
2007142300.tif 000068
【０４２５】
その結果、Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、Ｈ２７１−Ｈ２９６、Ｈ２９６−Ｈ２７１はＣＨ−２９６と比べて培養プレートへの固定化効率が高いことが明らかとなった。【０４２６】
実施例６２  Ｈ１０５−ＨＴの作成
（１）Ｈ１０５−ＨＴの発現、精製
実施例２４−（１）−（ｉ）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例２２−（２）と同様にＨ１０５−ＨＴの発現、精製を行なった。なお、培養液、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＡ、Ｗａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＢ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約１４．８ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．２３ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約１５．５μＭ）。当該タンパク質をＨ１０５−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号５１に、塩基配列を配列表の配列番号５２に示す。【０４２７】
実施例６３  抗ＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、Ｈ１０５−ＨＴ）を用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体を実施例５４−（１）と同様の方法で固定化した。【０４２８】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例５４−（２）と同様の方法で、リンパ球の拡大培養を行った。ただし、培養開始０日目には、実施例６３−（１）で作成したプレートを使用し、実施例５２で作成したＨ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、実施例６２で作成したＨ１０５−ＨＴを終濃度０．６７または０．７８μｇ／ｍＬになるように培地に直接添加した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は培養液中における各ＦＮフラグメントのモル比を一定にあわせるために調整した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表６８に示す。【０４２９】
【表６８】
2007142300.tif 000069
【０４３０】
表６８に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、Ｈ１０５−ＨＴ）を直接培地に添加した群は、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。さらには、改変型ＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ）を用いた場合、Ｈ１０５−ＨＴよりも高い効果が得られた。このことから、改変型ＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ）はＨ１０５−ＨＴよりも抗ＣＤ３抗体を用いた拡大培養時において好適に使用されることが明らかとなった。【０４３１】
（３）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例６３−（２）で調製した細胞について実施例４３−（３）と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞ＣＣＲ７陽性細胞ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析を行った。結果を表６９に示す。【０４３２】
【表６９】
2007142300.tif 000070
【０４３３】
表６９に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ、Ｈ１０５−ＨＴ）を直接培地に添加した群においては、対照群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。さらには、改変型ＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ）を用いた場合、Ｈ１０５−ＨＴよりも高い効果が得られた。当該実施例より、改変型ＦＮフラグメント（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ）はＨ１０５−ＨＴよりもナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０４３４】
実施例６４  Ｈ２９６−Ｈ２９６フラグメントを用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、終濃度５μｇ／ｍＬのＨ２９６−Ｈ２９６を含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を２４穴細胞培養プレートに０．２４ｍＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し実験に供した【０４３５】
（２）抗サイトメガロウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
抗サイトメガロウイルス  メモリーＣＴＬの誘導は、実施例５７−（２）の方法に従って行なった。ただし、抗原ペプチドには４０μｇ／ｍＬのサイトメガロウイルスタンパク質由来エピトープペプチド（配列表の配列番号４４に記載のマトリクスプロテインｐｐ６５由来−ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチド）のみを用いた。培養９日後の細胞増殖率を表７０に示す。【０４３６】
【表７０】
2007142300.tif 000071
【０４３７】
表７０に示されるように、ＦＮフラグメントを使用した群では使用していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時にＦＮフラグメントを使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。【０４３８】
実施例６５  ６０ｍＬ採血を想定した実施例６４のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体と各ＦＮフラグメントの固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度１μｇ／ｍＬ）とＨ２９６−Ｈ２９６（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を４８穴細胞培養プレートに０．１ｍＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。【０４３９】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例６４−（２）で調製したＣＴＬ  ２×１０５ｃｅｌｌｓを実施例５８−（２）と同様の方法で拡大培養を行なった。１４日後の細胞増殖率を表７１に示す。【０４４０】
【表７１】
2007142300.tif 000072
【０４４１】
表７１に示されるように、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用した群については、使用していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となった。【０４４２】
実施例６６  実施例６５のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例６５−（２）で得られたＣＴＬを実施例２７と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。ＣＴＬ拡大培養後細胞傷害活性結果を表７２、活性維持効果を表７３に示す。なお、細胞傷害活性維持効果については、Ｅ／Ｔ比３および１の２点について算出した。【０４４３】
【表７２】
2007142300.tif 000073
【０４４４】
【表７３】
2007142300.tif 000074
【０４４５】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用した群のＣＴＬは、対照群と比較して、１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能であることが明らかになった。【０４４６】
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０４４７】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:5 ; Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:6 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:7 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:8 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:9 ; Primer H296-NcoF.
SEQ ID NO:10 ; Primer H296-HindR.
SEQ ID NO:11 ; Primer H296-NcoR.
SEQ ID NO:12 ; Primer NC2-5' UTR.
SEQ ID NO:13 ; Designed peptide based on matrix-protein derived from influenza virus.
SEQ ID NO:14 ; Primer H296-NdeF.
SEQ ID NO:15 ; Primer H296-NdeR.
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named H296-H296-H296-HT.
SEQ ID NO:17 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296-H296-H296-HT.
SEQ ID NO:18 ; Primer CH296-NdeF.
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named CH296-CH296-HT.
SEQ ID NO:20 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named CH296-CH296-HT.
SEQ ID NO:21 ; Primer H105-NdeF.
SEQ ID NO:22 ; Fibronectin fragment named H105-H105-HT.
SEQ ID NO:23 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H105-H105-HT.
SEQ ID NO:24 ; Primer CS1-NdeR.
SEQ ID NO:25 ; Fibronectin fragment named H296-H296-HT.
SEQ ID NO:26 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296-H296-HT.
SEQ ID NO:27 ; Fibronectin fragment named H296-H296-H296.
SEQ ID NO:28 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296-H296-H296.
SEQ ID NO:29 ; Fibronectin fragment named H105-H105.
SEQ ID NO:30 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H105-H105.
SEQ ID NO:31 ; Primer H271-NcoR.
SEQ ID NO:32 ; Fibronectin fragment named H271-H296.
SEQ ID NO:33 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H271-H296.
SEQ ID NO:34 ; Primer 12-Nco-F2.
SEQ ID NO:35 ; Primer H271-BamR.
SEQ ID NO:36 ; Fibronectin fragment named H296-H271.
SEQ ID NO:37 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296-H271.
SEQ ID NO:38 ; Primer Nde-15aa-F.
SEQ ID NO:39 ; Fibronectin fragment named 15aaH105-H105-HT.
SEQ ID NO:40 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named 15aaH105-H105-HT.
SEQ ID NO:41 ; Fibronectin fragment named 15aaH105-H105.
SEQ ID NO:42 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named 15aaH105-H105.
SEQ ID NO:43 ; Oligonucleotide CpG-C DNA.
SEQ ID NO:44 ; Designed peptide based on matrix-protein derived from pp65.
SEQ ID NO:45 ; Primer AID-F-Nco
SEQ ID NO:46 ; Primer CS1-R-Xba
SEQ ID NO:47 ; Fibronectin fragment named H105-H105Nc-HT
SEQ ID NO:48 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H105-H105Nc-HT
SEQ ID NO:49 ; Fibronectin fragment named H105-H105Nc
SEQ ID NO:50 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H105-H105Nc
SEQ ID No:51 ; Fibronectin fragment named H105-HT
SEQ ID No:52 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H105-HT 
【図１】
2007142300.tif 000075
【図２】
2007142300.tif 000076
【配列表】
2007142300000001.app
【国際調査報告】
2007142300.tif 000077
2007142300.tif 000078
2007142300.tif 000079
2007142300.tif 000080
2007142300.tif 000081
2007142300.tif 000082
2007142300.tif 000083