【手続補正書】
【提出日】平成20年3月27日(2008.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメイン内に組み込まれた非ヒト高頻度可変領域残基を含むＶＨドメインを含んでなり、該可変ドメインが配列番号６の４８、４９、６８、７０、７２、７４及び７９からなる群から選択した位置にフレームワーク領域（ＦＲ）置換を含有する、ＴＧＦ-βに結合するヒト化抗体。
【請求項２】
位置４９、６８及び７２にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置６８のフェニルアラニンがアラニンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化される、請求項２に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
位置４８、４９及び７２にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
位置４８のバリンがイソロイシンに変化され、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化される、請求項４に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
位置４９、７０及び７２にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７０のイソロイシンがロイシンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化される、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
付加的なＦＲ置換が位置７４にある、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
位置７４のアスパラギンがリシンに変化される、請求項８に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
位置４９、７２及び７４にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化され、位置７４のアスパラギンがリシンに変化される、請求項１０に記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
位置４９、７２及び７９にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項１３】
位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化され、位置７９のロイシンがアラニンに変化される、請求項１２に記載のヒト化抗体。
【請求項１４】
可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：１８）又はＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号：７）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：１９）又はＹＡＳＳＬＱＳ（配列番号：８）；及びＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：２０）を含んでなる、請求項１ないし１３の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１５】
可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：１８）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：１９）；及びＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：２０）を含んでなる、請求項１ないし１４の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１６】
配列番号：３のＶＬドメインアミノ酸配列を含んでなる、請求項１ないし１５の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１７】
ＶＨドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：２１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：２２）又はＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：２３）を含んでなる、請求項１ないし１６の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１８】
ＶＨドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：２１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：２２）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：２３）を含んでなる、請求項１ないし１７の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１９】
ＶＨドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：２１）；ＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：２３）を含んでなる、請求項１ないし１７の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２０】
配列番号：４のＶＨドメインアミノ酸配列を含んでなる、請求項１ないし３又は１４ないし１８の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
完全なＩｇＧ１抗体である、請求項１ないし２０の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
抗体断片である、請求項１ないし２０の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
Ｆａｂ断片である、請求項２２に記載のヒト化抗体。
【請求項２４】
細胞障害性剤と接合されていない、請求項１ないし２３の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２５】
細胞障害性剤と接合される、請求項１ないし２３の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２６】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体と担体を含んでなる組成物。
【請求項２７】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２９】
請求項２７に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項３０】
核酸が発現されて抗体が産生されるように、請求項２９に記載の宿主細胞を培養することを含んでなるヒト化抗体の産生方法。
【請求項３１】
さらに宿主細胞培養物から抗体を回収することを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗体が宿主細胞培養液から回収される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
培養する前に、可変重鎖ドメインをコードする核酸を含有するベクターと、可変軽鎖ドメインをコードする核酸を含有するベクターとが宿主細胞に同時形質移入される、請求項３０ないし３２の何れか一に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物のＴＧＦ-β疾患の治療方法。
【請求項３５】
哺乳動物が霊長類である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物がヒトである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
疾患が線維形成、動脈損傷、感染、関節リウマチ又は癌である、請求項３４ないし３６の何れか一に記載の方法。
【請求項３８】
癌が大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌又は悪性黒色腫である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、有効量のヒト化抗体以外の治療的薬剤を哺乳動物に投与することを含む、請求項３４ないし３８の何れか一に記載の方法。
【請求項４０】
治療的薬剤が化学療法剤、細胞障害性剤、サイトカイン、成長阻害性剤、抗血管形成剤又は抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
治療的薬剤が抗血管形成剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
治療的薬剤が抗体である、請求項３９ないし４１の何れか一に記載の方法。
【請求項４３】
抗体が血管内皮性成長因子と結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
抗体がＨｅｒ-２抗原と結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
抗体が完全な抗体である、請求項４２ないし４４の何れか一に記載の方法。
【請求項４６】
抗体が抗体断片である、請求項４２ないし４４の何れか一に記載の方法。
【請求項４７】
抗体断片がＦａｂ断片である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗体が細胞障害性剤と接合される、請求項４２ないし４７の何れか一に記載の方法。
【請求項４９】
抗体が細胞障害性剤と接合されていない、請求項４２ないし４７の何れか一に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体を生体試料と接触することと、ＴＧＦ-βへの抗体結合が起こっているかどうかを検出することとを含む、生体試料中のＴＧＦ-βを検出する方法。
【請求項５１】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体を含有している容器と、有効量の抗体で哺乳動物のＴＧＦ-β疾患を治療することを使用者に示す指示書とを含んでなる製造品。
【請求項５２】
さらに、ヒト化抗体以外の治療的薬剤を含有している容器を含んでなり、該指示書が有効量の薬剤と抗体とを組み合わせて疾患を治療することを使用者に示す、請求項５１に記載の製造品。
【請求項５３】
哺乳動物がヒトである、請求項５１又は５２の製造品。
【請求項５４】
有効量のＴＧＦ-β抗体と血管内皮性成長因子と結合する抗体とを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の癌の治療方法。
【請求項５５】
哺乳動物がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＴＧＦ-β抗体が以下の一又は一以上と結合する請求項５４又は５５の方法：ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３。
【請求項５７】
抗体がＴＧＦ-β１と結合する、請求項５４ないし５６の何れか一に記載の方法。
【請求項５８】
抗体がＴＧＦ-β１とＴＧＦ-β２の両方と結合する、請求項５４ないし５７の何れか一に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】（発明の概要）  第一の態様では、本発明は、ヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメイン内に組み込まれた非ヒト高頻度可変領域残基を含むＶＨドメインを含んでなり、該可変ドメインがKabat等., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)による番号付けに従った配列番号６の４８、４９、６８、７０、７２、７４及び７９からなる群から選択した位置にフレームワーク領域（ＦＲ）置換を含有する、ＴＧＦ-βに結合するヒト化抗体を提供する。抗体は完全なＩｇＧ１抗体又はＦａｂなどの抗体断片を含有してなる。  好ましくは、ヒト化抗体は位置４９、６８及び７２にＦＲ置換を含有し、さらに、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置６８のフェニルアラニンがアラニンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化されるのが好ましい。  他の好ましい実施態様では、ヒト化抗体は位置４８、４９及び７２にＦＲ置換を含有し、さらに、位置４８のバリンがイソロイシンに変化され、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化されるのが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】  また好ましくは、ヒト化抗体は位置４９、７０及び７２にＦＲ置換を含有しており、さらに、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７０のイソロイシンがロイシンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化されるのが好ましい。他の態様では、さらにＦＲ置換が位置７４にあり、位置７４のアスパラギンがリシンに変化されるのがより好ましい。  さらに他の好ましい実施態様では、ヒト化抗体は位置４９、７２及び７４にＦＲ置換を含有しており、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化され、位置７４のアスパラギンがリシンに変化されるのがより好ましい。  さらに他の好ましい実施態様では、ヒト化抗体は位置４９、７２及び７９にＦＲ置換を含有しており、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７２のアルギニンがアラニンに変化され、位置７９のロイシンがアラニンに変化されるのがより好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】  他の好ましい実施態様では、上記の何れかの抗体は可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：１８）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：１９）；及びＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：２０）を含有しているか、第一ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１）がヒト生殖系κ遺伝子座Ｌ８／Ｌ９の配列：ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号：７）に変換され、及び／または、第二ＣＤＲ（ＣＤＲＬ２）がヒト生殖系κ遺伝子座Ｌ８／Ｌ９／Ｌ１４／Ｌ１５の配列：ＹＡＳＳＬＱＳ（配列番号：８）に変換されているＶＬドメインＣＤＲ残基を含有している。他の好ましい実施態様では、上記の何れかの抗体はＶＨドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：２１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：２２）又はＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：２３）を含んでなる。  また、本発明は細胞障害性剤と接合されているか、接合されていない。さらに、本発明はそのような抗体と担体を含んでなる組成物を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】  以下の実施例２には、ＴＧＦ-βに結合する例示的なヒト化抗-ＴＧＦ-β抗体の作製が記載される。本明細書中のヒト化抗体は、ヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメイン内に組み込まれた非ヒト高頻度可変領域残基を含んでなり、更に上掲のKabat等, による番号付けに従った可変ドメインの４８、４９、６８、７０、７２、７４及び７９からなる群から選択した位置にフレームワーク領域（ＦＲ）置換を含有する。一実施態様では、ヒト化抗体は２以上の位置４８、４９、６８、７０、７２、７４及び７９にＦＲ置換を含有する；他の実施態様では、それらの位置のうちの３又は４あるいはそれ以上にＦＲ置換を含有する。好ましい実施態様では、前記抗体は位置４９、６８及び７２、あるいは位置４８、４９及び７２、あるいは位置４９、７０及び７２、あるいは位置４９、７０、７２及び７４に、あるいは位置４９、７２及び７４、あるいは位置４９、７２及び７９にＦＲ置換を含有する。免疫原性を小さくするためによりフレームワーク置換よりも少ないが、最も重要なものとして効果を考慮する。実際に置換されたアミノ酸は免疫原性や効果を変えないように保存されていることが好ましい。位置４８のバリンがイソロイシンに変化されるのが好ましく、位置４９のアラニンがグリシンに変わっている、位置６８のフェニルアラニンがアラニンに変化され、位置７０のフェニルアラニンがアラニンに変異するのが好ましく、位置７２のアルギニンがアラニンに変化されるのが好ましく、位置７４のアスパラギンをリジンに変えるのが好ましく、そして位置７９のロイシンをアラニンに変えるのが好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】  本明細書中で対象とする例示的ヒト化抗体は、可変重鎖ドメイン相補性決定残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：２１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：２２）又はＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及び／又はＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：２３）、場合によってはこれらＣＤＲ残基のアミノ酸修飾、例えば抗体の親和性を基本的に維持する又は改良する修飾を含んでなる。例えば、対象とする抗体変異形は上記の可変重鎖ドメインＣＤＲ配列内におよそ１からおよそ７つ又はおよそ５つのアミノ酸修飾を含んでもよい。そのような抗体変異形は例えば以下に示すような親和性成熟によって調整されうる。好ましくは、残基は、ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：２１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：２２）又はＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）の２つ又はそれ以上、最も好ましくは３つすべて；及び／又はＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：２３）である。最も好適なヒト化抗体は、ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：２１）；ＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：２３）を有するもの又は配列番号：４の可変重鎖ドメインアミノ酸配列を含んでなる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】  ヒト化抗体は、例えば前段落の可変重鎖ドメインＣＤＲ残基に加えて、可変軽鎖ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：１８）又はＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号：７）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：１９）又はＹＡＳＳＬＱＳ（配列番号：８）；及び／又はＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：２０）を含んでなる。場合によってはこのようなヒト化抗体は、上記のＣＤＲ残基のアミノ酸修飾、例えば抗体の親和性を基本的に維持する又は改良する修飾を含んでなる。例えば、対象とする抗体変異形は上記の可変軽鎖ドメインＣＤＲ配列内におよそ１からおよそ７つ又はおよそ５つのアミノ酸修飾を含んでもよい。そのような抗体変異形は例えば以下に示すような親和性成熟によって調整されうる。好ましくは、残基は、ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：１８）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：１９）；及び／又はＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：２０）の２つ又はそれ以上、最も好ましくは３つすべてである。最も好適なヒト化抗体は、配列番号：３の可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を含んでなる。  また、本出願はＴＧＦ-βに結合する親和性成熟抗体も包含する。親抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、例えば配列番号：３及び４の重鎖配列及び／又は可変軽鎖をそれぞれ含んでなるもの（すなわちバージョン５）であってもよい。親和性成熟抗体はマウス２Ｇ７又は変異形５よりも優れた親和性をもってＴＧＦ-βに結合するのが好ましい（例えばＴＧＦ-β細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＥＬＩＳＡによる評価などで、およそ２倍ないしはおよそ４倍〜およそ１００倍ないしはおよそ１０００倍の親和性の改善）。  ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の様々な形態が、考えられる。例えば、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、場合によっては免疫コンジュゲートを作成するために１又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は、親和性成熟抗体は、完全な抗体、例えば完全なＩｇＧ１抗体であってもよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】（ｉｖ）プロモーター成分  発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗ＴＧＦ-β抗体コード化核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗ＴＧＦ-β抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。  真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ（配列番号：４６）領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ（配列番号：４７）配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】表２  ヒト化２Ｇ７ ＦＲ突然変異体の設定2008505610.tif 000001
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】  バージョン３及び４は、より後の数を有するヒト化Ｆａｂバージョンを得るための中間体として用いた。変異ＡｌａＨ４９Ｇｌｙ、ＰｈｅＨ６８Ａｌａ及びＡｒｇＨ７２Ａｌａを有するバージョン５は、バージョン７０９及び１１のように、元のキメラ２Ｇ７  Ｆａｂ断片のものに回復した結合を有するようである（図５）。バージョン７１０及び７１２はキメラ断片と同様の結合を有すると思われるが、バージョン７１２は免疫原性増加の可能性にとって望ましくない付加的なフレームワーク突然変異を有する。付加的なＦＲ又はＣＤＲ残基、例えばＬ３、Ｌ２４、Ｌ５４及び／又はＨ３５は変更してもよい（例えば以下の通りに置換される：ＧｌｎＬ３Ｍｅｔ、ＡｒｇＬ２４Ｌｙｓ、ＡｒｇＬ５４Ｌｅｕ、ＧｌｕＨ３５Ｓｅｒ）。安定性を改良するために望ましいかもしれない置換は、酸化を減少させるためのメチオニンからロイシン又はイソロイシンへの置換、又はアミド分解の可能性を減少させるためのＣＤＲ内のアスパラギンから他の残基への変異である。あるいは又はさらに、ヒト化抗体は、更にその親和性及び／又は他の生物学的活性を改良するかまたは精製するために、親和性成熟（上記参照）してもよい。  キメラ２Ｇ７ＦａｂのＶＬ及びＶＨドメイン並びにヒト化Ｆａｂバージョン５、７０９及び１１を、哺乳類細胞発現(Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech., 2:3-10 (1990))のために既に記載のｐＲＫベクターにサブクローニングすることによって、完全長ＩｇＧの発現用プラスミドを構築した。簡潔には、各々のＦａｂコンストラクトをＶＬ断片を切り取るためにＥｃｏＲＶ及びＢｌｐＩによって消化し、それを完全な軽鎖（ＶＬ-ＣＬドメイン）の発現用のプラスミドｐＤＲ１（図６を参照）のＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ部位にクローニングした。さらに、各々のＦａｂコンストラクトをＶＨ断片を切り取るためにＰｖｕＩＩ及びＡｐａＩによって消化し、それを完全な重鎖（ＶＨ-ＣＨ１-ＣＨ２-ＣＨ３ドメイン）の発現用のプラスミドｐＤＲ２（図７を参照）のＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩ部位にクローニングした。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】表３  ヒト化２Ｇ７ＣＤＲ変異形の設定2008505610.tif 000002
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
【図１Ａ】マウスモノクローナル抗体２Ｇ７の可変軽鎖（ＶＬ）（図１Ａ）及び可変重鎖（ＶＨ）（図１Ｂ）ドメインのアミノ酸配列（それぞれ配列番号：１及び２）；ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢバージョン（Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ）のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号：３及び４）、及びヒトＶＬ及びＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１、軽鎖κサブグループI；ｈｕｍIII、重鎖サブグループIII)（それぞれ配列番号：５及び６）を表す。アスタリスクは、ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢとマウスモノクローナル抗体２Ｇ７との間の、又は、ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢとヒトコンセンサスフレームワーク領域との間の相違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）を下線で示し、実際のヒト生殖細胞系配列のＣＤＲを比較のためにコンセンサスフレームワーク領域の下に示す（配列番号７ないし１０）。
【図１Ｂ】マウスモノクローナル抗体２Ｇ７の可変軽鎖（ＶＬ）（図１Ａ）及び可変重鎖（ＶＨ）（図１Ｂ）ドメインのアミノ酸配列（それぞれ配列番号：１及び２）；ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢバージョン（Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ）のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号：３及び４）、及びヒトＶＬ及びＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１、軽鎖κサブグループI；ｈｕｍIII、重鎖サブグループIII)（それぞれ配列番号：５及び６）を表す。アスタリスクは、ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢとマウスモノクローナル抗体２Ｇ７との間の、又は、ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢとヒトコンセンサスフレームワーク領域との間の相違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）を下線で示し、実際のヒト生殖細胞系配列のＣＤＲを比較のためにコンセンサスフレームワーク領域の下に示す（配列番号７ないし１０）。
【図２】多様なＣＤＲ領域（配列番号：１８ないし２４）をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１１ないし１７）。
【図３Ａ】７０９.ｌａｎｄＨ.ＩｇＧ１（配列番号：２５）；Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ（配列番号：２６）；Ｖ１１Ｈ.Ｖ１１Ｌ（配列番号：２７）；Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ（配列番号：２８）；ｃｈｉｍＬ.ｃｈｉｍＨ（配列番号：２９）；及びＶ５Ｈ.ｇ１Ｌ２（配列番号：３０）のアミノ酸配列。
【図３Ｂ】７０９.ｌａｎｄＨ.ＩｇＧ１（配列番号：２５）；Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ（配列番号：２６）；Ｖ１１Ｈ.Ｖ１１Ｌ（配列番号：２７）；Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ（配列番号：２８）；ｃｈｉｍＬ.ｃｈｉｍＨ（配列番号：２９）；及びＶ５Ｈ.ｇ１Ｌ２（配列番号：３０）のアミノ酸配列。
【図４Ａ】図３の配列をコードするシグナル配列を持つ及び持たない核酸配列（配列番号３１ないし４２）。
【図４Ｂ】図３の配列をコードするシグナル配列を持つ及び持たない核酸配列（配列番号３１ないし４２）。
【図４Ｃ】図３の配列をコードするシグナル配列を持つ及び持たない核酸配列（配列番号３１ないし４２）。
【図４Ｄ】図３の配列をコードするシグナル配列を持つ及び持たない核酸配列（配列番号３１ないし４２）。
【図５】ＴＧＦ-βに対する２Ｇ７ ＩｇＧ変異形ヒト化抗体の結合曲線。
【図６Ａ】実施例２に記載の免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１の配列（配列番号：４４；５３９１ｂｐ）。ｐＤＲ１は無関係な抗体、すなわちヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖をコードする配列を含むものであり(Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992))、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図６Ｂ】実施例２に記載の免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１の配列（配列番号：４４；５３９１ｂｐ）。ｐＤＲ１は無関係な抗体、すなわちヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖をコードする配列を含むものであり(Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992))、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図７Ａ】実施例２に記載の免疫グロブリン重鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ２の配列（配列番号：４５；６１３５ｂｐ）。ｐＤＲ２は無関係な抗体、すなわちヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖をコードする配列を含むものであり(上掲のShalaby等)、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図７Ｂ】実施例２に記載の免疫グロブリン重鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ２の配列（配列番号：４５；６１３５ｂｐ）。ｐＤＲ２は無関係な抗体、すなわちヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖をコードする配列を含むものであり(上掲のShalaby等)、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図８】ＴＧＦ-βに対する２Ｇ７生殖系復帰変異体ヒト化抗体の結合曲線。
【図９】ＴＧＦ-β１抗体２Ｇ７と多様なヒト化ＴＧＦ-β変異形抗体のマウスメサンギウム細胞増殖アッセイの阻害結果。
【図１０】ＴＧＦ-βに対する３つのヒト化抗体（Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ、Ｈ２ＮＩ.ｇ１Ｌ２及びＶ５Ｈ.ｇｌＬ２）及び２Ｇ７マウス抗体による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおけるそれぞれ３つの異なる濃度のＴＧＦ-β３の中和反応。
【図１１】図１０に示す４つの抗体による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおけるそれぞれ３つの異なる濃度のＴＧＦ-β２の中和反応。
【図１２】図１０に示す４つの抗体による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおけるそれぞれ３つの異なる濃度のＴＧＦ-β１の中和反応。
【図１３】図１０に示す４つの抗体による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおけるそれぞれ２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１、β２及びβ３の中和反応。
【図１４】ヒト化抗体Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ（図１４Ａ）、ヒト化抗体Ｈ２ＮＩ.ｇ１Ｌ２（図１４Ｂ）、２Ｇ７マウス抗体（図１４C）及びヒト化抗体Ｖ５Ｈ.ｇｌＬ２（図１４D）による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおける３つのＴＧＦ-βイソ型の中和反応。
【図１５】正常上皮細胞及び腫瘍上皮細胞によるＴＧＦ-βの産生及び阻害のＥＬＩＳＡ結果。図１５Ａは、正常上皮細胞（ＥｐＣ）（Ｃ５７）及び腫瘍ＥｐＣ（４Ｔ１モデル）によるＴＧＦ−β１のインビトロ産生を示す。図１５Ｂは、正常ＥｐＣ及び腫瘍ＥｐＣにおける腫瘍ＥｐＣの血清ＴＧＦ-β１レベルに対するインビボ抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照抗体（イソ型一致ＩｇＧであり、抗サワギク抗体である）との比較で示す。この同じＩｇＧ対照は残りの図に用いられ、図２８では同じ又は同じでないＩｇＧ対照を用いられる。
【図１６】ＩｇＧ対照と比較したときの二次肺腫瘍に対する抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果。図１６ＡはＩｇＧ対照抗体とＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の両方に関与した肺葉の数とグレードを用いた組織学的スコアを示し、図１６Ｂは同じ対照とＴＧＦ-β抗体２Ｇ７のグラム組織重と割合重量を示す。
【図１７】肺腫瘍の定量化に対する抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較によりｕＣＴ、腫瘍容積及び腫瘍数で示す。
【図１８】４Ｔ１乳癌モデルにおける抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７と化学療法の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。図１８Ａは、生理食塩水対照、ＩｇＧとドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)）対照、及び抗ＴＧＦ-β ２Ｇ７とドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)）をＩｇＧの細胞接種後の時間の関数として、腫瘍容積を示す。図１８Ｂは、２つの対照（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)ドセタキセル有無のＩｇＧ）とドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)）を有する抗ＴＧＦ-βについて脳、肺、脾臓及び腫瘍の組織重量を示す。
【図１９】対照ＩｇＧ（対照）又は抗ＴＧＦ-β（２Ｇ７）で処置した４Ｔ１乳癌腫瘍マウス又は、腫瘍を持たないマウス（正常）における血漿ＶＥＧＦレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図２０】異なる乳癌モデルＰｙｍＴにおけるＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果。図２０ＡはＴＧＦ-β抗体とＩｇＧ対照の腫瘍成長の日数の関数として腫瘍容積を示し、図２０ＢはＴＧＦ-β抗体とＩｇＧ対照の腫瘍重量を示す。
【図２１】マウス黒色腫モデルＢ１６とＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。図２１Ａは対照とＴＧＦ-β抗体についてSurface及びPathologyに肺腫瘍を有するマウスの割合を示し、図２１Ｂは対照とＴＧＦ-β抗体についてのSurface、Cleared、CTの肺腫瘍数を示す。
【図２２】接種後１４日間にわたるＢ１６腫瘍成長（容積）に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果を対照ＩｇＧとの比較で示す。
【図２３】Ｂ１６（Ｅ６）可視的肺転移数に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。
【図２４】接種後１７日間にわたるＢ１６腫瘍成長（容積）に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。
【図２５】Ｂ１６原発性腫瘍重量に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。
【図２６】Ｂ１６（Ｅ７）可視的肺転移数に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。
【図２７】第４２日目までの期間にわたるヒト肺細胞Ｃａｌｕ-６マウス異種移植片における腫瘍容積に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７、マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４６１、及びこの２つの抗体の組み合わせの効果をＩｇＧ対照との比較で示す。様々な薬剤での治療を第２日目に開始した。
【図２８】３つの種類の抗体処置とＩｇＧ対照について行った図２７に示すＣａｌｕ-６実験の最終腫瘍重量を示す。