【手続補正書】
【提出日】平成20年2月7日(2008.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ａ）コンピューター処理的に生成させた骨格タンパク質の一次変異体配列の一次ライブラリーを含む、一次ライブラリーを用意すること；
ｂ）該一次ライブラリーにおける一次変異位置のリストを生成させること；
ｃ）複数の該一次変異位置をコンピューター処理的に組合せて、二次配列の二次ライブラリーを生成させること；
ｄ）該二次配列のライブラリーを再び組み合わせることにより、複数の三次ライブラリー変異体タンパク質配列を合成すること、但し、該三次変異体の少なくとも１つは該一次および二次変異体と異なるものである；および
ｅ）該三次ライブラリータンパク質配列を、所望のタンパク質の特性について実験的にスクリーニングすること、
を含む、骨格タンパク質変異体の三次ライブラリーの生成方法。
【請求項２】  該一次変異位置を生成させることが、確率分布表の使用によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  該一次変異位置を組み合わせることが、確率分布表の使用によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  該リストがランク順リストである、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】  該再び組み合わせることがコンピューター処理的に行われる、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】  該再び組み合わせることが実験的に行われる、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】  該再び組み合わせることが遺伝子シャフリングにより行われる、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】  該再び組み合わせることが、プールしたオリゴヌクレオチドを用いる複数ＰＣＲによって行われる、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】  該プールしたオリゴヌクレオチドを等モル量加える、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】  該プールしたオリゴヌクレオチドを、変異の頻度に対応した量で加える、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】  該再び組み合わせることが、誤りがちなＰＣＲによって行われる、請求項６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
（発明の背景）
定方向分子進化を用いることにより、新規機能および特性を有するタンパク質および酵素が生成され得る。既知天然タンパク質から出発し、数ラウンドの変異誘発、機能的スクリーニングおよび好結果の配列の増殖が遂行される。この方法の利点は、それを用いることにより構造が判明していないタンパク質でも急速に進化させ得ることである。いくつかの異なる変異誘発方法が存在し、例えば誤りがちな（error prone) ＰＣＲによる点変異誘発、カセット変異誘発およびＤＮＡシャフリングが含まれる。これらの技術は多くの成果をあげてきた。しかしながら、それらは全て、潜在的変化を有する小さなフラクションしか生成できないという不利な条件を抱えている。例えば、約５００アミノ酸長を有する平均的タンパク質の場合２０５００の可能なアミノ酸変化が存在する。明らかに、非常に多くの変異体の変異誘発および機能スクリーニングは不可能である。定方向進化により提供される可能な配列のサンプリングは非常に散在したものであるため、改良された可能性のあるタンパク質のごく一部、典型的には点変異または既存配列の組換えしか調べられない。莫大な数の可能な配列から無作為にサンプリングすることにより、定方向進化は不偏であって、広く適用可能であるが、タンパク質の構造および生物物理学的情報をすべて無視しているため本質的には非効率的である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
別の態様において、本発明は、骨格タンパク質変異体の二次ライブラリーの作成方法であって、骨格タンパク質一次変異配列のランク順リストを含む一次ライブラリーを提供することを含む方法、および複数の変異位置におけるアミノ酸残基の確率分布を作成する方法を提供する。複数のアミノ酸残基を合わせることにより、二次配列の二次ライブラリーを作成する。次いで、これらの配列は、プールしたオリゴヌクレオチドによる多重ＰＣＲ、誤りがちなＰＣＲ、遺伝子シャフリングなどを含む様々な方法で所望により合成および試験され得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
好ましい態様において、一次ライブラリー作成に使用するコンピューター処理方法は、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／０６１０９７、６０／０４３４６４、６０／０５４６７８、０９／１２７９２６およびＰＣＴ ＵＳ９８／０７２５４（これらは全て出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている、タンパク質設計オートメーション（ＰＤＡ）である。簡単に述べると、ＰＤＡは次の要領で説明し得る。既知タンパク質構造を出発点として使用する。次いで、最適化される残基を同定するが、それらは全配列またはそのサブセットであり得る。次いで、可変位置の側鎖を除去する。生成したタンパク質骨格および残りの側鎖から成る構造は鋳型と呼ばれる。次いで、各可変残基位置を、好ましくはコア残基、表面残基または境界残基として分類する。各分類により、位置に関して可能性のあるアミノ酸残基のサブセットが特定される（例えば、コア残基は一般に一連の疎水性残基から選択され、表面残基は一般に親水性残基から選択され、そして境界残基はどちらでもあり得る）。各アミノ酸は、回転異性体と呼ばれる、各側鎖の許容された全配座異性体の独立した一群により代表され得る。即ち、骨格に最適な配列に到達するため、回転異性体の可能性のある配列を全てスクリーニングしなければならず、その場合各骨格位置は、全てその可能な回転異性体状態である各アミノ酸、またはアミノ酸のサブセット、即ち回転異性体のサブセットにより占められ得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
好ましい実施態様において、スコアリング関数を変更し得る。好ましい実施態様において、上記に概説のスコアリング関数は、種々の方法において偏らされ、または加重され得る。例えば、参照配列または配列のファミリーに向かうかまたはそこから離れる偏りを成すことができる；例えば、野生型またはホモログ残基に向かう偏りを使用し得る。同様に、全タンパク質またはそのフラグメントを偏らせ得る；例えば、活性部位を野生型残基に向けて偏らせ得、または特定の物理的特性に向けたドメイン残基を成し得る。更に、エネルギーの増加に向かうまたは対する偏りを創生し得る。更なるスコアリング関数の偏りは、静電ポテンシャル勾配または疎水性勾配の適用、計算への基質または結合パートナーの加入、または所望の電荷または疎水性に向けた偏りを含むが、これらに限定されない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
好ましい実施態様では、二次ライブラリーの異なるタンパク質構成員を化学的に合成できる。これは、設計したタンパク質が短いものである場合、好ましくは１５０アミノ酸長以下のものである場合、より好ましくは１００アミノ酸長以下である場合、特に好ましくは５０アミノ酸長以下である場合に特に有用である（しかし、当業界で知られているように、化学的にまたは酵素的により長いタンパク質も調製し得る）。例えば、参照して本明細書の一部とすることを明記する Wilken et al, Curr. Opin. Biotevhnol. 9: 412-26 (1998) 参照。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
好ましい実施態様では、二次ライブラリーは、ファミリー（例えば、変異体のセット）をシャフリングすることにより実施される；つまり、（ランク順リストを使用する場合、）いくつかのトップ配列のセットを、誤りがちなＰＣＲを用いて、または用いずに、シャフリングすることができる。この文脈での「シャフリング」は、一般にランダムに行われる、関連配列の組換えを意味する。それには、５，８３０，７２１；５，８１１，２３８；５，６０５，７９３; ５，８３７， ４５８ および ＰＣＴ ＵＳ／１９２５６（すべて、これらの全部分を出典明示により本明細書の一部とする）に定義および例示されているような「シャフリング」が包含される。この配列のセットは、人工のセットであってもよい；例えば、確率分布表（例えばＳＣＭＦを使用して生成されるもの）やモンテカルロのセットからのものである。同様に、「ファミリー」は、上位の１０配列と下位の１０配列、上位１００配列、などであり得る。また、このことは誤りがちなＰＣＲによっても実施し得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
従って、好ましい実施態様では、本明細書に記載のコンピューター処理方法を使用して、インシリコ（in silico）シャフリングを実施する。つまり、２つのライブラリーまたは２つの配列のどちらかで出発し、ランダムな配列の組換えを生成させ、評価することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
好ましい実施態様では、偏りのあるオリゴヌクレオチド群の存在下に、誤りがちなＰＣＲによる遺伝子のシャフリングを遺伝子上で最適配列に対して実施し、二次ライブラリー中に見出される各変異の割合を反映しているＤＮＡ配列ライブラリーを創り出すことができる。偏りのあるオリゴヌクレオチド群の選択は、各種の方法で実施できる；それらは、それらの頻度に基づいて選択できる、即ち、高い変異頻度の位置群をコードしているオリゴヌクレオチド群を使用でき；あるいは、最も変異しやすい位置群を含有するオリゴヌクレオチド群を使用でき、そのようにして多様性を増加でき；もし二次ライブラリーがランクされたなら、トップスコアの位置群の一部を、偏りのあるオリゴヌクレオチド群の生成に使用でき；ランダムな位置群を選択することもでき；僅かのトップスコア群および僅かの低スコア群も選択し得る；等である。重要なことは、好ましい変異位置および配列に基づいて新規な配列を生成させることである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
好ましい実施態様では、１またはそれ以上の二次ライブラリーに対して、様々な付加的な工程を実施することができる；例えば、さらなるコンピューター処理を施すことができ、二次ライブラリーを組換えることができ、あるいは異なる二次ライブラリーからのカットオフを組合せることができる。好ましい実施態様では、二次ライブラリーをコンピューター処理により巧みに再操作して別の二次ライブラリー（本明細書で三次ライブラリーと呼ぶときがある）を形成させることができる。例えば、任意の二次ライブラリー配列を、第１二次ライブラリー中の変化位置の一部または全てを凍結または固定することにより、ＰＤＡの第２ラウンド用に選択できる。あるいは、最後の確率分布表中にみられる変化のみを可能とする。あるいは、確率表のストリンジェンシイを、加入に対するカットオフを増加させるかまたは減少させるかの何れかにより変更することができる。同様にして、二次ライブラリーを第１ラウンド後に実験的に組換えることもできる；例えば、最良遺伝子／第１スクリーン由来の遺伝子群、を採取し、遺伝子組み立てを再実施する（以下に概説する技術、複数ＰＣＲ、誤りがちなＰＣＲ、シャフリング、等を使用して）。あるいは、一部の位置における確率を変更するための、１種またはそれ以上の良好遺伝子由来のフラグメント。これは、第１ラウンドのコンピューター処理的および実験的スクリーニングにおいて見出された配列スペースの領域についての探索を偏らせる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
本明細書中で概説しているように、これらの方法において、酵素活性、安定性、溶解性、凝集性、結合親和性、結合特異性、基質特異性、構造的完全性、免疫原性、毒性、ペプチドおよび擬ペプチドライブラリーの生成、新規抗体ＣＤＲの創出、新規ＤＮＡの生成、ＲＮＡ結合、等を含む、がそれらに限定されない、任意の数のタンパク質属性を改変できる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
従って、一般に、既知ペプチドリガンド類を、一次ライブラリーを生成させるための出発骨格として使用できる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
ある位置においてアミノ酸の異なるサブセットをコードしている多数のＤＮＡライブラリーを合成し、コドンを完全にはランダム化せずに所望の多様なアミノ酸の生成を可能とし、その結果、ライブラリー中の終止コドン、フレームシフト、不要アミノ酸などのある無駄な配列をなくす。これは、ランダム化しようとする各位置で、トリプレットのうちの１つまたは２つの位置のみでランダム化されるライブラリーを創作することによって行なうことができ、ここで、変わらず残った位置は、この位置において考慮されるアミノ酸が共有しているものである。多数のＤＮＡライブラリーを、各位置において所望の全アミノ酸が、集積したライブラリー中に存在することが保証されるように調製する。あるいは、当分野で一般的に知られている「シャフリング」を、多数のライブラリーで実施できる。加えて、インシリコ・シャフリングも実施できる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
あるいは、頻度作表、および多重ＰＣＲ、シャフリング等を含む実験的生成方法を使用して、ランダム・ペプチドライブラリーを行ってもよい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
実験的に本発明のライブラリーを生成させるのに使用できる、多様な実験技術がある。それには、Rachitt-Enchira (http ://www. enchira. com/geneshuff)ing.htm); 例えば、修飾ヌクレオチドを使用する誤りがちなＰＣＲ; マルチカセットを含む既知の突然変異誘発法; ＤＮＡシャフリング (Crameri, et al., Nature 391 (6664) : 288-291. (1998)) ; 異種ＤＮＡサンプル (US5939250) ; ＩＴＣＨＹ (Ostermeier, et al., Nat Biotechnol 17 (12) : 1205-1209. (1999)) ; ＳｔＥＰ (Zhao, et al., Nat Biotechnol 16 (3) : 258-261. (1998)), ＧＳＳＭ (US6171820, US5965408) ; インビボ相同組替え、リガーゼ補助遺伝子集合（ligase assisted gene assembly）、末端相補的ＰＣＲ（end-complementary PCR）、大量（profusion） (Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci U S A 94 (23) : 12297-12302. (1997)) ; 酵母／細菌表面ディスプレイ (Lu, et al., Biotechnology (N Y) 13 (4) : 366-372. (1995) ; Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci U S A 84 (10) : 3365-3369. (1987) ; Boder and Wittrup, Nat Biotechnol 15 (6) : 553-557. (1997)) が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
外来核酸を哺乳類宿主ならびに他の宿主に導入する方法は、当業界ではよく知られており、使用される宿主により変化する。技術として、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、ウイルス感染、リポソームにおけるポリヌクレオチド封入、および核へのＤＮＡの直接顕微注入がある。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
一旦発現させ、必要であれば精製したライブラリータンパク質および核酸は、様々な用途に有用である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
一般に、二次ライブラリーを、生物活性についてスクリーンする。これらのスクリーンは、当分野で知られているように、選択した骨格タンパク質を基準とする。このようにして、その既知の結合構成員（例えば、酵素であれば、その基質）との結合、活性プロファイル、安定性プロファイル（ｐＨ、温度、緩衝液の条件）、基質特異性、免疫原性、毒性などを含む、多数のタンパク質の活性または特性の全てを試験し得る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
ランダムペプチドが生成する場合、これらを、活性に関するスクリーニングのために様々な方法で使用し得る。好ましい態様では、第一の細胞集団がスクリーニングされる。即ち、ライブラリー構成員の核酸を導入した細胞を、変化表現型に関してスクリーンする。従って、この態様では、ライブラリー構成員の効果は、それが作製されたのと同じ細胞中で見られる；即ちオートクリン効果である。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
本明細書では「細胞集団」により、おおよそ約１０３から１０８または１０９までの細胞を意味し、１０６ないし１０８が好ましい。この細胞集団は、細胞性ライブラリーを含み、その場合、通常ライブラリー内の各細胞には二次ライブラリーの構成員、即ち、別のライブラリー構成員を含むが、当業者には明らかなように、ライブラリー内の一部の細胞はライブラリー構成員を含まないこともあり、一部は１以上のライブラリー構成員を含んでいてもよい。レトロウイルス感染以外の方法を用い、ライブラリー構成員を細胞集団に導入する場合には、細胞性ライブラリーの個々の細胞構成員内のライブラリー構成員の分布は広範囲に変化し得る。それは、エレクトロポレーションなどの間に細胞に入る核酸の数を制御することが困難だからである。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
本明細書の「変化表現型」もしくは「生理学的に変化した」または他の文法上の同義語は、当該細胞の当該表現型が、いくつかの方法で、好ましくは検出可能および／または測定可能な方法で変化することを意味する。当業者が認識するように、本発明の長所は、本方法を用い試験され得る多様な細胞型および可能性ある表現型変化である。従って、観察され、検出されるか、または測定され得る全ての表現型変化は本明細書のスクリーニング方法の基礎となり得る。適当な表現型変化には、以下に限らないが、細胞の形態学的変化、細胞増殖、細胞生存能力、基質または他の細胞への接着、および細胞性密度のような全体的な物理的変化；１以上のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたは他の分子の発現の変化；１以上のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたは他の分子の平衡状態(即ち、半減期(half-life))の変化；１以上のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたは他の分子の局在化の変化；１以上のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン、レセプターまたは他の分子の生物活性または特異活性（比活性）の変化；イオン、サイトカイン、ホルモン、増殖因子または他の分子の分泌の変化；細胞膜の電位、極性、完全性または輸送性の変化；感染性、伝染力、潜在性、接着性ならびにウイルスおよび細菌性病原体の吸収の変化などが含まれる。本明細書において「表現型を変化させ得る」とは、ライブラリー構成員が、いくつかの検出可能および／または測定可能な方法で細胞の表現型を変化させ得ることを意味する。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
好ましい態様では、ライブラリー構成員は、陽性細胞から単離される。これは、種々の方法で行い得る。好ましい態様では、上記で定義された構築体もしくはレスキュー配列のようなライブラリーの特定要素に共通するＤＮＡ領域に相補的なプライマーを用い、特定のランダム配列を「レスキュー」する。他に、該構成員は、レスキュー配列を用いて単離される。そのため、例えば、エピトープタグまたは精製配列を含むレスキュー配列を用い、免疫沈降または親和性カラムを使用してライブラリー構成員を回収する。ある例では、ライブラリー構成員と標的分子の間に強力な結合相互作用が有意に存在するならば、ライブラリー構成員が結合するもの（例えば第一標的分子）も回収される。あるいは、該ペプチドはマススペクトロメトリーを用いて検出され得る。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
一旦バイオチップを作ったら、それらを、当業者に認識されるように、種々の広範な目的のために、多くの形態で使用し得る。例えば、ライブラリー出発点として働く骨格タンパク質は、酵素であり得る；チップ上に変異体のライブラリーを置くことにより、変異体を、基質の添加による活性の増加に関して、または阻害剤に関してスクリーニングできる。同様に、リガンド骨格の変異体ライブラリーを、結合パートナー、例えば、細胞表面レセプターとの増加したまたは減少した結合親和性に関してスクリーニングできる。したがって、本実施態様において、例えば、レセプターの細胞外部分は、アレイに添加でき、結合親和性を任意の数の条件下で試験する；例えば、結合および／または活性を、異なるｐＨ条件、異なる緩衝液、塩または試薬濃度、異なる温度、競合的結合剤の存在下等で試験し得る。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２１】
他の好ましい実施態様は、そのままのタンパク質に結合するが、修飾タンパク質には結合できない、医薬候補物の同定のためのディファレンシャル・スクリーニングを利用する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５０】
コンピューター処理プレスクリーニング
配列のコンピューター処理プレスクリーニングを、ＰＤＡを使用して行なった。４Å球体を４つの触媒残基(S70, K73, S130, およびE166)の重側鎖原子の周りに設けて、そしてカットオフ距離内の重側鎖原子を有する全てのアミノ酸を選択した。このようにして下記の７つの位置：F72, Y105, N132, N136, L169, N170, およびK234、が得られた。これらの残基の２つ、N132とK234は、数種の異なるβ-ラクタマーゼ中に高度に維持されており、従って、５つの可変位置(F72, Y105, N136, L169, N170)を残して、設計に含めなかった。これらの設計した位置を、２０種の天然型アミノ酸のうちプロリン、システイン、およびグリシンを除いたもの(計１７アミノ酸)の何れかと変更可能とした。プロリンは、プロリンの適切な回転異性体を定義することが難しいため、通常は使用しない。システインは、ジスルフィド結合の形成を防ぐために除外し、そしてグリシンは高次構造上の可動性のため、除外した。