【手続補正書】
【提出日】令和1年7月5日(2019.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
圃場内のトウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させるための方法であって、
前記圃場内の前記トウモロコシ植物を複数の操作されたジアゾ栄養細菌に曝露するステップであって、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含み、それにより、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌と同種である同量の複数の操作されていないジアゾ栄養細菌に曝露されたトウモロコシ植物と比較して、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌に曝露された前記トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる、ステップを含み、
前記窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ＮｉｆＡの発現もしくは活性の増加、またはＮｉｆＬの発現もしくは活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす変異を含み；
前記窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異が、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌の属の細菌のゲノム内に見出される異種性配列の挿入を含み；
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌の遺伝物質が、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌の属の細菌からの遺伝物質から本質的になり；かつ
非窒素制限条件における前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌の窒素固定活性が、類似の非窒素制限条件における、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌と同種である同量の前記複数の操作されていないジアゾ栄養細菌の窒素固定活性より高い、
方法。
【請求項２】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、前記トウモロコシ植物の種子が植栽される畝間内に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、前記トウモロコシ植物の種子にコーティングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が前記トウモロコシ植物の少なくとも根にコロニーを形成し、これにより、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が前記トウモロコシ植物中に、組織の生重量１グラム当たり少なくとも１０５のコロニー形成ユニットの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、植物内で、窒素固定の窒素含有産物を排出する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、植物内で、前記トウモロコシ植物中の固定窒素の少なくとも１％を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌により産生された、前記トウモロコシ中の前記固定窒素が、１．２％の１５Ｎを含む肥料を用いて処理された圃場内で栽培されたトウモロコシ植物中での１５Ｎの希釈により測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、植物内で、前記トウモロコシ植物中の固定窒素の５％またはそれよりも多くを産生する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、指定突然変異誘発およびランダム突然変異誘発からなる群から選択される少なくとも１つのタイプの操作を用いて操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
非窒素制限条件における前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌の窒素固定活性が、同一の非窒素制限条件における、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌と同種である同量の複数の操作されていないジアゾ栄養細菌の窒素固定活性より高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、着生性ジアゾ栄養細菌、内部寄生性ジアゾ栄養細菌、および根圏性ジアゾ栄養細菌からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種性配列が異種性調節配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
圃場内のトウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させるための方法であって、前記方法が：
圃場内のトウモロコシ植物を、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ／アデニリル除去酵素（ＧｌｎＥ）についての遺伝子変異を含む複数の操作されたジアゾ栄養生物に曝露するステップを含み、
ＧｌｎＥにおける前記遺伝子変異が、二機能性グルタミン合成酵素の活性の減少、アデニリルトランスフェラーゼ活性の減少、またはアデニリル除去酵素活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらし、
それにより、前記複数の操作されたジアゾ栄養生物と同量の操作されていないジアゾ栄養生物に曝露されたトウモロコシ植物と比較して、前記複数の操作されたジアゾ栄養生物に曝露された前記トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させ、
前記操作されていないジアゾ栄養生物が、前記複数の操作されたジアゾ栄養生物と同種である、
方法。
【請求項１５】
前記操作されたジアゾ栄養生物が、窒素固定遺伝子調節経路内に改変をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記操作されたジアゾ栄養生物が、着生菌を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記操作されたジアゾ栄養生物が、内部寄生菌を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記操作されたジアゾ栄養生物が、根圏菌を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の操作されたジアゾ栄養生物の遺伝物質が、前記操作されたジアゾ栄養生物と同属のジアゾ栄養生物に由来する遺伝物質から本質的になる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記トウモロコシ植物を前記複数の操作されたジアゾ栄養生物に曝露するステップが、前記複数の操作されたジアゾ栄養生物を、前記トウモロコシ植物の種子が植栽される畝間内に適用することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記トウモロコシ植物を前記複数の操作されたジアゾ栄養生物に曝露するステップが、前記複数の操作されたジアゾ栄養生物を、前記トウモロコシ植物の種子をコーティングすることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の操作されたジアゾ栄養生物が前記トウモロコシ植物の少なくとも根にコロニーを形成し、これにより、前記複数の操作されたジアゾ栄養生物が前記トウモロコシ植物中に、組織の生重量１グラム当たり少なくとも１０５のコロニー形成ユニットの量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の操作されたジアゾ栄養生物が、前記トウモロコシ植物中の固定窒素の少なくとも１％を産生する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の操作されたジアゾ栄養生物により産生された、前記トウモロコシ植物中の前記固定窒素が、１．２％の１５Ｎを含む肥料を用いて処理された土壌内で栽培されたトウモロコシ植物中での１５Ｎの希釈により測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の操作されたジアゾ栄養生物が、前記トウモロコシ植物中の固定窒素の５％またはそれよりも多くを産生する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数の操作されたジアゾ栄養生物が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属からなる群から選択される属である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の操作されたジアゾ栄養生物が、単一の種である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数の操作されたジアゾ栄養生物が、ＮｉｆＡの発現もしくは活性の増加、またはＮｉｆＬの発現もしくは活性の減少：のうちの１つまたは複数をもたらす変異をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示される。本発明の特徴および利点は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を示す以下の詳細な記載および添付の図面を参照すればより良好に理解されると予想される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
非マメ科植物中での窒素固定を増加させるための方法であって、
前記植物を複数の細菌に曝露するステップを含み、前記複数の各メンバーが、前記細菌が外来性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、前記細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含み、前記細菌が、属間微生物ではなく、前記細菌が、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する、方法。
(項目２)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの前記１つまたは複数の遺伝子と作動可能に連結した導入された制御配列を含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記制御配列が、プロモーターである、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、項目３に記載の方法。
(項目５)
前記細菌が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目１に記載の方法。
(項目６)
前記細菌が、ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目１に記載の方法。
(項目７)
前記細菌が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、項目１に記載の方法。
(項目８)
前記植物に曝露された前記複数の細菌が、外来性非大気窒素の取り込み増加を刺激しない、項目１に記載の方法。
(項目９)
前記植物が、１エーカー当たり少なくとも５０ｌｂの窒素含有肥料を与えた圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも５重量％の窒素を含む、項目１に記載の方法。
(項目１０)
前記窒素含有肥料が、アンモニウムまたはアンモニウム含有分子を含む、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記複数の細菌が、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、項目１に記載の方法。
(項目１２)
前記複数の細菌が、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、項目１に記載の方法。
(項目１３)
前記外来性窒素が、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子のうちの１つまたは複数を含む肥料から選択される、項目１に記載の方法。
(項目１４)
前記細菌が、前記植物における前記固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、項目１に記載の方法。
(項目１５)
前記細菌が、前記植物における前記固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、項目１に記載の方法。
(項目１６)
前記細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの前記１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
(項目１７)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、項目１に記載の方法。
(項目１８)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種性調節配列の挿入を含む、項目１に記載の方法。
(項目１９)
前記複数の細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属を含む属である、項目１に記載の方法。
(項目２０)
前記複数の細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目１に記載の方法。
(項目２１)
前記複数の細菌が、少なくとも前記植物の根でコロニー化し、前記細菌が、組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１０５ｃｆｕの量で前記植物中に存在する、項目１に記載の方法。
(項目２２)
前記植物が、農業作物植物である、項目１に記載の方法。
(項目２３)
前記農業作物植物が、ソルガム、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、および小麦から選択される、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記植物が、遺伝子改変生物である、項目２２に記載の方法。
(項目２５)
前記植物が、遺伝子改変生物ではない、項目２２に記載の方法。
(項目２６)
前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、項目２２に記載の方法。
(項目２７)
細菌が外来性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、前記細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌を含む細菌集団であって、前記細菌が属間微生物ではなく、前記細菌が、前記細菌の集団の存在下で栽培される植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する、細菌集団。
(項目２８)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの前記１つまたは複数の遺伝子と作動可能に連結した導入された制御配列を含む、項目２７に記載の細菌集団。
(項目２９)
前記制御配列が、プロモーターである、項目２８に記載の細菌集団。
(項目３０)
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、項目２９に記載の細菌集団。
(項目３１)
前記細菌が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３２)
前記細菌が、前記ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３３)
前記細菌が、窒素固定の前記窒素含有産物を植物内で排出する、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３４)
前記植物に曝露された前記細菌が、外来性非大気窒素の取り込み増加を刺激しない、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３５)
少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３６)
同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３７)
前記外来性窒素が、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子のうちの１つまたは複数を含む肥料から選択される、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３８)
前記細菌が、前記植物における前記固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３９)
前記細菌が、前記植物における前記固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４０)
前記細菌の窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４１)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４２)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種性調節配列の挿入を含む、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４３)
前記複数の細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属を含む属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４４)
前記複数の細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４５)
前記植物が、農業作物植物である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４６)
前記農業作物植物が、ソルガム、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、および小麦から選択される、項目４５に記載の細菌集団。
(項目４７)
前記植物が、遺伝子改変生物である、項目４５に記載の細菌集団。
(項目４８)
前記植物が、遺伝子改変生物ではない、項目４５に記載の細菌集団。
(項目４９)
前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、項目４５に記載の細菌集団。
(項目５０)
前記複数の細菌が、前記植物でコロニー化し、前記細菌が、前記植物の生重量１グラム当たり少なくとも約１０５ｃｆｕの量で前記植物中に存在する、項目２７に記載の細菌集団。
(項目５１)
項目２７から５０のいずれか１項に記載の細菌集団を含む組成物。
(項目５２)
種子の表面にコーティングされた前記細菌集団を含む、項目５１に記載の組成物。
(項目５３)
液剤または粉末として製剤化されている、項目５１に記載の組成物。
(項目５４)
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２２９３またはＰＴＡ−１２２２９４として寄託されている単離された細菌。
(項目５５)
細菌が外来性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、前記細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む、非属間細菌。
(項目５６)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの前記１つまたは複数の遺伝子と作動可能に連結した導入された制御配列を含む、項目５５に記載の細菌。
(項目５７)
前記制御配列が、プロモーターである、項目５６に記載の細菌。
(項目５８)
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、項目５７に記載の細菌。
(項目５９)
前記細菌が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目５５に記載の細菌。
(項目６０)
前記細菌が、前記ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目５５に記載の細菌。
(項目６１)
前記細菌の窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される、項目５５に記載の細菌。
(項目６２)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、項目５５に記載の細菌。
(項目６３)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種性調節配列の挿入を含む、項目５５に記載の細菌。
(項目６４)
前記細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属を含む属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目６５)
前記細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目５５に記載の細菌。
(項目６６)
１つまたは複数の細菌を産生するための方法であって、
（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を単離するステップ、
（ｂ）前記細菌のうちの１つまたは複数に遺伝子変異を導入して、１つまたは複数の変異細菌を産生するステップ、
（ｃ）複数の植物を前記変異細菌に曝露するステップ、
（ｄ）前記複数の植物のうち１つの組織または土壌から細菌を単離するステップであって、前記細菌を単離した前記植物が、前記複数の植物中の他の植物と比較して向上された形質を有する、ステップ、および
（ｅ）ステップ（ｄ）で単離された細菌を用いてステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返すステップ
を含む方法。
(項目６７)
前記向上された形質が、細菌を単離した前記植物における窒素固定増強である、項目６６に記載の方法。
(項目６８)
前記遺伝子変異が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子の変異である、項目６６に記載の方法。
(項目６９)
前記遺伝子変異が、グルタミン合成酵素、グルタミナーゼ、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、抗転写活性化因子、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、フラボドキシン、またはＮＡＤ＋二窒素レダクターゼＡＤＰ−Ｄ−リボシルトランスフェラーゼからなる群から選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異である、項目６６に記載の方法。
(項目７０)
前記遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、項目６６に記載の方法。
(項目７１)
前記遺伝子変異が、ノックアウト突然変異である、項目６６に記載の方法。
(項目７２)
前記遺伝子変異が、タンパク質ドメインの活性の排除または消失をもたらす、項目６６に記載の方法。
(項目７３)
前記遺伝子変異が、標的遺伝子の調節配列を変更または消失させる、項目６６に記載の方法。
(項目７４)
前記遺伝子変異が、異種性調節配列の挿入を含む、項目６６に記載の方法。
(項目７５)
前記遺伝子変異が、前記遺伝子変異が導入されている前記細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列の挿入を含む、項目６６に記載の方法。
(項目７６)
前記調節配列が、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択される、項目７５に記載の方法。
(項目７７)
前記遺伝子変異が、化学的突然変異誘発により生成される、項目６６に記載の方法。
(項目７８)
ステップ（ｃ）が、前記植物を、生物ストレス因子または非生物ストレス因子に曝露することをさらに含む、項目６６に記載の方法。
(項目７９)
ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、前記第１の植物と同じタイプの第２の植物における窒素の１％またはそれよりも多くを産生する、項目６７に記載の方法。
(項目８０)
ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、前記第１の植物から単離された細菌と比較して、少なくとも２倍増の窒素固定を示す、項目６７に記載の方法。
(項目８１)
前記第２の植物が、グルタミン、アンモニア、または窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で栽培される、項目８０に記載の方法。
(項目８２)
前記第１の植物が、農業作物植物である、項目６６に記載の方法。
(項目８３)
前記農業作物植物が、大麦、米、トウモロコシ、小麦、ソルガム、スイートコーン、サトウキビ、タマネギ、トマト、イチゴ、またはアスパラガスから選択される、項目８２に記載の方法。
(項目８４)
前記複数の植物における前記第１の植物が、モデル植物である、項目６６に記載の方法。
(項目８５)
前記モデル植物が、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ属、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属から選択される、項目８４に記載の方法。
(項目８６)
前記遺伝子変異が、標的部位に特異的に導入された所定の遺伝子変異である、項目６６に記載の方法。
(項目８７)
前記遺伝子変異が、前記標的部位内のランダム突然変異である、項目６６に記載の方法。
(項目８８)
ステップ（ａ）が、単離された細菌の遺伝子分析を実施することをさらに含む、項目６６に記載の方法。
(項目８９)
ステップ（ｂ）が、前記遺伝子変異を含む細菌を富化するように選択圧を加えることをさらに含む、項目６６に記載の方法。
(項目９０)
前記選択圧が、標的部位に導入された前記遺伝子変異が欠如したゲノムを切断し、切断が、前記標的部位の１００ヌクレオチド内で生じることを含む、項目８９に記載の方法。
(項目９１)
前記選択圧を生き残った細菌を単離することをさらに含む、項目８９に記載の方法。
(項目９２)
切断が、対抗選択可能なマーカー、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼにより指示される、項目９１に記載の方法。
(項目９３)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、項目９２に記載の方法。
(項目９４)
前記遺伝子変異が、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失である、項目６６に記載の方法。
(項目９５)
ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目６６に記載の方法。
(項目９６)
ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、複数の異なる細菌分類群を含む、項目６６に記載の方法。
(項目９７)
前記細菌が、植物組織から単離される、項目６６に記載の方法。
(項目９８)
ステップ（ａ）での細菌単離が、前記第１の植物の種子から細菌を単離することを含む、項目６６に記載の方法。
(項目９９)
細菌種の細胞のゲノムを改変するための方法であって、
（ａ）前記細菌種に由来する配列からなる部分配列を含むポリヌクレオチドを提供するステップであって、前記部分配列が、５’から３’の方向で、第１の相同配列、プロモーター、および第２の相同配列を含む、ステップ；ならびに
（ｂ）前記ゲノムの標的遺伝子座と前記ポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導して組換え配列を産出するステップであって、（ｉ）前記標的遺伝子座が、前記第１および第２の相同配列を端部に有する標的配列を含み、（ｉｉ）前記標的遺伝子座に隣接する１つまたは複数の第２の遺伝子の発現を増強する、ステップ
を含む方法。
(項目１００)
（ｂ）（ｉｉｉ）相同組換えが、前記標的配列を含む第１の遺伝子の発現を妨害することをさらに含む、項目９９に記載の方法。
(項目１０１)
（ｃ）前記組換え配列を含む細菌細胞を単離するステップをさらに含む、項目９９に記載の方法。
(項目１０２)
前記プロモーターが、環境条件下において閾値レベルを超える発現活性に基づいて選択される、項目９９に記載の方法。
(項目１０３)
前記環境条件が、栄養素利用能、栄養欠乏、窒素ストレス、窒素への曝露の増加、熱、寒さ、浸透圧ストレス、乾燥、洪水、塩分、種間シグナル伝達化合物の有無、病原体の有無、および殺虫剤、除草剤、殺昆虫剤、殺線虫剤、殺真菌剤、または殺細菌剤の有無からなる群から選択され、曝露の増加または減少が、基準状態に対するものである、項目１０２に記載の方法。
(項目１０４)
前記プロモーターの選択が、（ａ）前記細菌種の細胞を、前記環境条件に曝露すること、（ｂ）前記細胞の転写物の発現レベルを測定すること、および（ｃ）閾値レベルを超えるレベルを有する転写物の発現を駆動する前記プロモーターを特定することを含む、項目１０３に記載の方法。
(項目１０５)
前記部分配列が、前記細菌種のタンパク質をコードしない、項目９９に記載の方法。
(項目１０６)
前記部分配列が、選択可能なマーカーをコードしない、項目９９に記載の方法。
(項目１０７)
細菌細胞を単離するステップが、前記組換え配列が欠如した細胞に対してネガティブセレクションを適用することを含む、項目１０１に記載の方法。
(項目１０８)
ネガティブセレクションが、前記組換え配列が欠如したゲノムを切断することを含み、切断が、前記標的配列の１００ヌクレオチド内で生じる、項目１０７に記載の方法。
(項目１０９)
前記切断が、対抗選択可能なマーカー、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼにより指示される、項目１０８に記載の方法。
(項目１１０)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、項目１０９に記載の方法。
(項目１１１)
前記第１の遺伝子が、前記１つまたは複数の第２の遺伝子の負の調節因子である、項目９９に記載の方法。
(項目１１２)
前記第１の遺伝子、前記１つまたは複数の第２の遺伝子、または両方が、窒素固定経路のメンバーである、項目９９に記載の方法。
(項目１１３)
前記第１の遺伝子が、ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、およびＡｍｔＢからなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
(項目１１４)
前記１つまたは複数の第２の遺伝子が、ＮｉｆＡおよびグルタミナーゼからなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
(項目１１５)
前記単離された細菌細胞が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目９９に記載の方法。
(項目１１６)
前記単離された細菌細胞が、宿主植物の細胞中の窒素の５％またはそれよりも多くを産生する、項目１１５に記載の方法。
(項目１１７)
前記単離された細菌が、グルタミン、アンモニア、または補充窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で前記窒素を産生する、項目１１６に記載の方法。
(項目１１８)
細菌種の細胞の標的遺伝子を妨害するための、前記細菌種に由来する配列からなる部分配列を含むポリヌクレオチドであって、
（ａ）前記部分配列が、５’から３’の方向で、第１の相同配列、プロモーター、および第２の相同配列を含み、
（ｂ）前記第１および第２の相同配列が、標的配列の端部にある配列に相当し、前記標的配列が、前記部分配列と前記標的配列を含む標的遺伝子座との間の相同組換え時に欠失され、
（ｃ）前記標的配列は、少なくとも第１の遺伝子の第１のタンパク質をコードする部分を含み、
（ｄ）前記部分配列が、前記細菌種のタンパク質をコードしない、ポリヌクレオチド。
(項目１１９)
前記部分配列が、選択可能なマーカーをコードしない、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２０)
前記プロモーターが、環境条件下において閾値レベルを超える発現活性を有する遺伝子のプロモーターである、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２１)
前記環境条件が、窒素への曝露の増加であり、曝露の増加が、基準条件に対するものある、項目１２０に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２２)
前記標的配列が、１つまたは複数の第２の遺伝子に隣接している、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２３)
前記第１の遺伝子、前記１つまたは複数の第２の遺伝子、または両方が、窒素固定経路のメンバーである、項目１２２に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２４)
前記第１の遺伝子が、ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、およびＡｍｔＢからなる群から選択される、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２５)
前記細胞が、内部寄生性、着生性、または根圏性である細菌である、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２６)
項目１１８から１２５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(項目１２７)
項目１２６に記載の発現を含む細胞。
(項目１２８)
前記複数の細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属である、項目１に記載の方法。
(項目１２９)
前記複数の細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ属である、項目１に記載の方法。
(項目１３０)
前記複数の細菌が、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属である、項目１に記載の方法。(項目１３１)
前記複数の細菌が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属である、項目１に記載の方法。
(項目１３２)
前記複数の細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属である、項目１に記載の方法。
(項目１３３)
前記複数の細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３４)
前記複数の細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３５)
前記複数の細菌が、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３６)
前記複数の細菌が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３７)
前記複数の細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３８)
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１３９)
Ｒａｈｎｅｌｌａ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１４０)
Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１４１)
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１４２)
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１４３)
（ｂ）（ｉｉｉ）相同組換えが、前記標的配列を含む第１の遺伝子の発現を妨害すること、および
（ｃ）前記組換え配列を含む細菌細胞を単離するステップをさらに含む、項目９９に記載の方法。