(57)【要約】  水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分（例えばＢＣＧ−ＣＷ）を、界面活性剤を用いることなく、生体に適用可能な形態（水系溶媒に分散可能であり、かつサイズが制御された形態）に製剤化することができるリポソームを提供する。  水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分（例えばＢＣＧ−ＣＷ）を含む脂質膜を有するリポソームを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を含む脂質膜を有するリポソーム。
【請求項２】
前記細菌菌体成分が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌又はロドコッカス属細菌の細胞壁画分又は細胞壁骨格画分である請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
前記ミコバクテリウム属細菌がＢＣＧである請求項２記載のリポソーム。
【請求項４】
リポソーム表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを有する請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項５】
前記ペプチドが、連続した４〜２０個のアルギニン残基を含む４〜３５個のアミノ酸残基からなるペプチドである請求項４記載のリポソーム。
【請求項６】
前記ペプチドがアルギニン残基のみからなる請求項４又は５記載のリポソーム。
【請求項７】
前記ペプチドの量が、前記リポソームを構成する総脂質に対して２％（モル比）以上である請求項４〜６のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項８】
前記ペプチドが疎水性基又は疎水性化合物で修飾されており、前記疎水性基又は前記疎水性化合物が前記リポソームの表面を形成する脂質膜に挿入され、前記ペプチドが前記リポソームの表面を形成する脂質膜から露出している請求項４〜７のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のリポソームを含有する医薬組成物。
【請求項１０】
前記細菌菌体成分が免疫活性化作用を有し、前記医薬組成物が免疫活性化剤である請求項９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を含む脂質膜を有するリポソーム、並びに該リポソームを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等を標的部位に確実に送達するためのベクターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療においては、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等のウイルスベクターが開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少ないリポソームベクターやペプチドキャリアーが注目を集めている。リポソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有している。【０００３】
最近、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの表面をステアリル化オクタアルギニンで修飾することにより、凝縮化ＤＮＡの細胞導入効率が１０００倍、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの細胞への導入効率が１００倍向上したことが報告されている（特許文献１，非特許文献１及び２）。また、表面をステアリル化オクタアルギニンで修飾したリポソームは、原形を保ったまま（インタクト（intact）な状態で）細胞内に導入できることが報告されている（特許文献１，非特許文献１及び２）。【０００４】
ＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、弱毒牛型結核菌）は、結核に対するワクチン作用の他に、腫瘍退縮効果を有することが知られている。この腫瘍退縮効果は、ＢＣＧの持つ強力なアジュバント（免疫賦活化）作用によって細胞性免疫が活性化される、いわゆる腫瘍免疫治療効果が発揮されることによるものと考えられている。【０００５】
しかしながら、生きた結核菌をヒトに投与することで生じる副作用が、ＢＣＧの腫瘍治療への臨床応用への妨げとなっていた。この副作用の問題に対して、細菌菌体成分、例えばＢＣＧの細胞壁画分であるＢＣＧ−ＣＷをアジュバントとする方法が着目されている。しかしながら、ＢＣＧ−ＣＷ等の細菌菌体成分は、特殊な構造及び物理化学的性質を有しているため、水及び有機溶媒に不溶である。また、負電荷を有するため、同じ負電荷を有する細胞膜との親和性が低く、細胞への取込効率が低いという問題を有している。さらに、ＢＣＧ−ＣＷ等の細菌菌体成分は界面活性剤により可溶化する必要があるが、界面活性剤による刺激等の副作用が問題となり得る他、界面活性剤により可溶化された細菌菌体成分は、粒子径が大きく（約３００ｎｍ以上）、負電荷を帯びているため、細胞への取込効率が依然として低いという問題は依然として解消されない。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレット
【非特許文献１】Kogure等, 「Journal of Controlled Release」, 2004年, 98巻, 317-323頁
【非特許文献２】カリル・イクラミ等, 「YAKUGAKU ZASSHI」, 2004年, 124巻, Suppl.4, 113-116頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分（例えばＢＣＧ−ＣＷ）を、界面活性剤を用いることなく、生体に適用可能な形態（水系溶媒に分散可能であり、かつサイズが制御された形態）に製剤化することができるリポソーム、並びに該リポソームを含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明は、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を含む脂質膜を有するリポソーム、及び該リポソームを含有する医薬組成物を提供する。本発明のリポソームによれば、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を、界面活性剤を用いることなく、生体に適用可能な形態（水系溶媒に分散可能であり、かつサイズが制御された形態）に製剤化することができる。【０００８】
本発明のリポソームにおいて、前記細菌菌体成分が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌又はロドコッカス属細菌の細胞壁画分又は細胞壁骨格画分であることが好ましく、前記ミコバクテリウム属細菌がＢＣＧであることが好ましい。【０００９】
本発明のリポソームは、リポソーム表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを有することが好ましい。これにより、本発明のリポソームは、主としてマクロピノサイトーシスを介して細胞内に移行することができるので、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を細胞内に効率よく導入することができる。【００１０】
本発明のリポソームにおいて、前記ペプチドが、連続した４〜２０個のアルギニン残基を含む４〜３５個のアミノ酸残基からなるペプチドであることが好ましい。【００１１】
本発明のリポソームにおいて、前記ペプチドがアルギニン残基のみからなることが好ましい。【００１２】
本発明のリポソームにおいて、前記ペプチドの量が、前記リポソームを構成する総脂質に対して２％（モル比）以上であることが好ましい。【００１３】
本発明のリポソームにおいて、前記ペプチドが疎水性基又は疎水性化合物で修飾されており、前記疎水性基又は前記疎水性化合物が前記リポソームの表面を形成する脂質膜に挿入され、前記ペプチドが前記リポソームの表面を形成する脂質膜から露出していることが好ましい。【００１４】
本発明の医薬組成物において、前記細菌菌体成分が免疫活性化作用を有し、前記医薬組成物が免疫活性化剤であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分（例えばＢＣＧ−ＣＷ）を、界面活性剤を用いることなく、生体に適用可能な形態（水系溶媒に分散可能であり、かつサイズが制御された形態）に製剤化することができるリポソーム、並びに該リポソームを含有する医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＢＣＧ−ＣＷに含まれる機能ドメインの構造を示す図である。
【図２】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図３】共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図４】Ｒ８修飾ＢＣＧリポソームを取り込んだ膀胱癌細胞株ＭＢＴ−２のフローサイトメトリーを用いた細胞内蛍光量の解析結果を示す。
【図５】ＭＢＴ−２に取り込まれたＲ８修飾ＢＣＧリポソームの細胞内局在性を示す。左上の青色はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ＴＭによる発光を、右上の緑色はＲ８修飾ＢＣＧリポソームによる発光を、左下の赤色はＬｙｏｓｏｔｒａｃｋｅｒＲｅｄＴＭによる発光を、右下は３種類の発光の重ね合わせをそれぞれ示す。
【図６】ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＭＨＣＩＩを指標とした樹状細胞の活性化の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のリポソームは、脂質膜（脂質二重膜）を有する閉鎖小胞であり、本発明のリポソームが有する脂質膜の数は特に限定されるものではない。本発明のリポソームは、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（small unilamellar vesicle）、ＬＵＶ（large unilamellar vesicle）、ＧＵＶ（giant unilamellar vesicle）等の１枚膜リポソームであってもよい。本発明のリポソームのサイズは特に限定されるものではないが、直径５０〜３００ｎｍであることが好ましく、直径１００〜２００ｎｍであることがさらに好ましい。【００１８】
脂質膜の構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。【００１９】
脂質は脂質膜の必須の構成成分であり、脂質膜に含有される脂質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常７０％（モル比）以上、好ましくは７５％（モル比）以上、さらに好ましくは８０％（モル比）以上である。なお、脂質膜に含有される脂質量の上限値は、脂質膜を構成する総物質量の１００％である。【００２０】
脂質としては、例えば、以下に例示するリン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。【００２１】
[リン脂質]
ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１,２−ジミリストイル−１,２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等。【００２２】
[糖脂質]
グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等。【００２３】
[ステロール]
動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、コレスタノール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等。【００２４】
[飽和又は不飽和の脂肪酸]
パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸等。【００２５】
膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される膜安定化剤量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、膜安定化剤の含有量の下限値は０である。【００２６】
膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。【００２７】
抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される抗酸化剤量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、抗酸化剤の含有量の下限値は０である。【００２８】
抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。【００２９】
荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される荷電物質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、荷電物質の含有量の下限値は０である。【００３０】
正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。【００３１】
膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される膜タンパク質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常１０％（モル比）以下、好ましくは５％（モル比）以下、さらに好ましくは２％（モル比）以下である。なお、膜タンパク質の含有量の下限値は０である。【００３２】
膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。【００３３】
脂質膜を構成する脂質として、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、ｐＨ感受性機能等を有する脂質誘導体を使用してもよい。これにより、上記機能のうち１種又は２種以上の機能をリポソームに付与することができる。リポソームに血中滞留性機能を付与することにより、リポソームの血液中での滞留性を向上させ、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織による捕捉率を低下させることができる。リポソームに温度変化感受性機能及び／又はｐＨ感受性機能を付与することにより、リポソームに封入された目的物質の放出性を高めることができる。【００３４】
血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、Ｎ−{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール−２０００}−１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール−５０００}−１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−{カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０}−１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−{カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００}−１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−{カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００}−１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン等のポリエチレングリコール誘導体等が挙げられる。【００３５】
温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられ、ｐＨ感受性機能を付与することができるｐＨ感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。【００３６】
本発明のリポソームは、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を含む脂質膜を有する。リポソームが１枚膜リポソームである場合、リポソームが有する１枚の脂質膜に細菌菌体成分が含まれ、リポソームが多重膜リポソームである場合、リポソームが有する複数の脂質膜のうち、１又は２以上の脂質膜に細菌菌体成分が含まれる。脂質膜に含有される細菌菌体成分量は、脂質膜を構成する総物質量の通常１〜１５％（重量比）、好ましくは２〜１０％（重量比）、さらに好ましくは３〜７％（重量比）である。【００３７】
細菌菌体成分は、水及び有機溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロ酢酸、メタノール、エタノール、エーテル、ジエチルエーテル、ヘキサン、テトラヒドロフラン等）に不溶性である限り特に限定されるものではなく、例えば、ミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌等の細胞壁画分又は細胞壁骨格画分が挙げられる。【００３８】
ミコバクテリウム属細菌の細胞壁は、ミコール酸（脂肪酸）、アラビノガラクタン（多糖）及びペプチドグリカンからなる高分子を含んでおり、この高分子により細胞壁の基本構造が構成されている。この基本構造は「細胞壁骨格（Ｃｅｌｌ−Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ；ＣＷＳ）」と呼ばれる。ミコバクテリウム属細菌と分類上関連するノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌等も、ミコバクテリウム属細菌と同様の細胞壁骨格を有する。【００３９】
細胞壁画分は、細胞壁骨格を主成分とする限り、その組成、調製方法等は特に限定されるものではないが、例えば、次の方法により調製することができる。加熱死菌体を１０倍容の精製水に懸濁し、フレンチプレス処理により菌体を破砕する。次いで、菌体破砕液を６７６０×ｇで遠心することにより未破砕菌体を除去し、遠心上清をさらに１８０００×ｇで遠心することにより細胞壁画分を沈渣として得ることができる。細胞壁画分（例えばＢＣＧ−ＣＷ）を水、緩衝液等に懸濁することにより形成されるミセルのメジアン径は、通常１２０〜３２０ｎｍ、好ましくは１７０〜２７０ｎｍ、さらに好ましくは２２０ｎｍである。なお、メジアン径は例えば粒度分布計で測定する。【００４０】
細胞壁骨格画分は、細胞壁画分から細胞壁骨格を精製して得られる画分であり、例えば、次の方法により調製することができる。細胞壁画分をリン酸緩衝液に懸濁し、ＤＮａｓｅ処理により細胞壁結合核酸（例えばオリゴＤＮＡ）を分解除去するとともに、プロナーゼ（pronase）及びトリプシン（trypsin）処理により細胞壁結合タンパク質を分解除去する。次いで、有機溶媒（例えばテトラヒドロフラン）抽出処理により脂質を抽出除去する。これにより、細胞壁骨格画分を、上記処理後の水及び有機溶媒に不溶性の残渣として得ることができる。細胞壁骨格画分（例えばＢＣＧ−ＣＷＳ）を水、緩衝液等に懸濁することにより形成されるミセルのメジアン径は、通常８０〜１８０ｎｍ、好ましくは１００〜１５０ｎｍ、さらに好ましくは１３０ｎｍである。なお、メジアン径は例えば粒度分布計で測定する。【００４１】
ミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌等の細胞壁画分又は細胞壁骨格画分は、水及び有機溶媒に不溶性であるとともに、免疫活性化作用（アジュバンド活性、免疫賦活作用）を有する。細胞壁骨格のうち、ペプチドグリカン部分及びミコール酸部分が免疫活性化作用に関して重要である。細胞壁画分に含まれる細胞壁骨格以外の成分（例えば、リポマンナン、トレハロースミコレート）も免疫活性化作用に寄与している。【００４２】
ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌としては、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉｉ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ等の結核菌群が挙げられる。【００４３】
ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）細菌としては、例えば、Ｎ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｎ．ｒｕｂｒａ等が挙げられる。【００４４】
コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌としては、例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｕｌｃｅｒａｎｓ等が挙げられる。【００４５】
細菌菌体成分としては、ＢＣＧの細胞壁画分（ＢＣＧ−ＣＷ）又は細胞壁骨格画分（ＢＣＧ−ＣＷＳ）を使用することが好ましい。ＢＣＧは、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）の実験室培養を繰り返して作製した弱毒性の細菌であり、ヒトに対してほとんど病原性を示さない。ＢＣＧ−ＣＷ又はＢＣＧ−ＣＷＳに含まれる機能ドメインは図１に示される構造物の他、リポマンナン（ＬＭ）、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）、ジホスファチジルイノシトール（ＰＩＭ２）又はヘキサマンノシド（ＰＩＭ６）及びコードファクター（ＴＤＭ）を含有する。【００４６】
本発明のリポソームは、その表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを有することが好ましい。連続したアルギニン残基の個数は複数個である限り特に限定されるものではないが、通常４〜２０個、好ましくは６〜１２個、さらに好ましくは７〜１０個である。ペプチドを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるものではないが、通常４〜３５個、好ましくは６〜３０個、さらに好ましくは７〜２３個である。ペプチドは、連続した複数個のアルギニン残基のＣ末端及び／又はＮ末端に任意のアミノ酸配列を含むことができるが、アルギニン残基のみからなることが好ましい。連続した複数個のアルギニン残基のＣ末端又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列は、剛直性を有するアミノ酸配列（例えば、ポリプロリン）であることが好ましい。ポリプロリンは、柔らかくて不規則な形をとっているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と異なり、直線的で、ある程度の堅さを保持している。また、連続した複数個のアルギニン残基のＣ末端又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は、酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基であることが好ましい。負電荷を有する酸性アミノ酸残基が、正電荷を有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、アルギニン残基の効果を減弱させる可能性があるためである。【００４７】
リポソーム表面に存在するペプチドの量は、リポソームを構成する総脂質に対して通常０．１〜３０％（モル比）、好ましくは０．２〜２５％（モル比）、さらに好ましくは０．５〜２０％（モル比）である。【００４８】
リポソーム表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドが存在する場合、本発明のリポソームは、その表面に存在するペプチドを介して細胞内へ移行することができる（ＷＯ２００５／０３２５９３号参照）。リポソーム表面に存在するペプチドの量が、リポソームを構成する総脂質に対して２％（モル比）未満、好ましくは１．５％（モル比）未満、さらに好ましくは１％（モル比）未満であると、リポソームは、主にエンドサイトーシスを介して細胞内へ移行することができる（ＷＯ２００５／０３２５９３号参照）。このときのペプチド量の下限値は、リポソームを構成する総脂質に対して通常０．１％（モル比）、好ましくは０．５％（モル比）、さらに好ましくは０．７％（モル比）である。一方、リポソーム表面に存在するペプチド量が、リポソームを構成する総脂質に対して２％（モル比）以上、好ましくは３％（モル比）以上、さらに好ましくは４％（モル比）以上であると、リポソームは、主にマクロピノサイトーシスを介して細胞内へ移行することができる（ＷＯ２００５／０３２５９３号参照）。このときのペプチド量の上限値は、リポソームを構成する総脂質に対して通常３０％（モル比）、好ましくは２５％（モル比）、さらに好ましくは２０％（モル比）である。【００４９】
マクロピノサイトーシスでは、細胞外物質がマクロピノソームという画分として細胞内に取り込まれ、マクロピノソームはエンドソームと異なりリソソームと融合しないため、マクロピノソーム内封物はリソソームによる分解を回避することができる。したがって、リポソームがマクロピノサイトーシスを介して細胞内に移行する場合、リポソームは効率よく細胞内に移行することができる。【００５０】
リポソームの細胞内移行経路がエンドサイトーシスに依存する場合、脂質膜はその主要成分としてカチオン性脂質を含む必要があるが、リポソームの細胞内移行経路が、エンドサイトーシスに依存しない場合には、脂質膜にカチオン性脂質が含まれている必要はなく、カチオン性脂質による細胞毒性を低減させることができる。リポソームを構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合は０〜４０％（モル比）であることが好ましく、０〜２０％（モル比）であることがさらに好ましい。【００５１】
カチオン性脂質としては、例えば、ＤＯＤＡＣ（dioctadecyldimethylammonium chloride）、ＤＯＴＭＡ（N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium）、ＤＤＡＢ（didodecylammonium bromide）、ＤＯＴＡＰ（1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（3β-N-(N',N',-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol）、ＤＭＲＩＥ（1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium）、ＤＯＳＰＡ（2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate）等が挙げられ、非カチオン性脂質（中性脂質又はアニオン性脂質）としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド等の中性脂質；カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等のアニオン性脂質が挙げられる。【００５２】
連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドは、疎水性基又は疎水性化合物で修飾されており、疎水性基又は疎水性化合物がリポソームの表面を形成する脂質膜に挿入され、ペプチドがリポソームの表面を形成する脂質膜から露出することにより、リポソーム表面に存在することが好ましい。連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドが一定の配向性を保持してリポソーム表面に存在することにより、リポソームはマクロピノサイトーシスを介して効率よく細胞内に移行することができる。【００５３】
疎水性基又は疎水性化合物は、脂質膜に挿入され得る限り特に限定されるものでない。脂質膜は親水性部分と疎水性部分とからなるが、疎水性基又は疎水性化合物は、脂質膜の疎水性部分と疎水結合した状態で脂質膜に挿入される。疎水性基としては、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基、コレステロール基又はその誘導体等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数１０〜２０の脂肪酸基（例えば、パルミトイル基、オレイル基、ステアリル基、アラキドイル基等）が好ましい。また、疎水性化合物としては、例えば、上記に例示したリン脂質、糖脂質又はステロール、長鎖脂肪族アルコール（例えば、フォスファチジルエタノールアミン、コレステロール等）、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。【００５４】
水和法によるリポソームの製造例を以下に示す。
有機溶媒中で、脂質膜の構成成分である脂質と、所定の細菌菌体成分と、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された所定のペプチドとを混合し、有機溶媒を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、所定の細菌菌体成分を含む脂質膜を備え、所定のペプチドを表面に有するリポソームを製造することができる。【００５５】
水和法による別の製造例を以下に示す。
有機溶媒中で、脂質膜の構成成分である脂質と、所定の細菌菌体成分とを混合し、有機溶媒を蒸発除去することにより脂質膜を得、この脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、所定の細菌菌体成分を含む脂質膜を備えたリポソームを製造する。次いで、このリポソームの外液に、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された所定のペプチドを添加し、リポソーム表面に所定のペプチドを導入する。【００５６】
リポソームを所定のポアサイズのフィルターで通過させることにより、一定の粒度分布を持ったリポソームを得ることができる。また、公知の方法に従って、多重膜リポソームから一枚膜リポソームへの転換、一枚膜リポソームから多重膜リポソームへの転換を行うことができる。【００５７】
水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を含む脂質膜を備えたリポソームによれば、界面活性剤を用いることなく、細菌菌体成分を生体に適用可能な形態（水系溶媒に分散可能であり、かつサイズが制御された形態）に製剤化することができる。また、リポソーム表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを有するリポソームによれば、細菌菌体成分を細胞内に効率よく導入することができる。細菌菌体成分を導入すべき細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、樹状細胞、マクロファージ（大喰細胞）、Ｔリンパ球、単核球、多型核白血球、腫瘍細胞等が挙げられる。【００５８】
本発明のリポソームを含有する医薬組成物は、細菌菌体成分の作用に応じた医薬用途に使用することができる。例えば、細菌菌体成分が免疫活性化作用を有する場合、本発明のリポソームを含有する医薬組成物を免疫活性化剤（アジュバンド）として使用することができる。免疫活性化剤は、樹状細胞（抗原提示細胞）等の免疫細胞を活性化することにより、体液性免疫（抗体産生）及び細胞性免疫を活性化することができる。免疫活性化剤は、免疫細胞に取り込まれることにより当該免疫細胞を活性化してもよいし、免疫細胞の外部から作用することにより当該免疫細胞を活性化してもよい。【００５９】
医薬組成物の剤形としては、例えば、リポソームの分散液又はその乾燥物（例えば、凍結乾燥物、噴霧乾燥物等）が挙げられる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。【００６０】
医薬組成物は、in vivo及びin vitroのいずれにおいても使用することもできる。医薬組成物をin vivoにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、細菌菌体成分の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
【実施例】
【００６１】
〔実施例１〕
脂質（卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）／コレステロール（Ｃｈｏｌ）＝７:３（モル比））のクロロホルム溶液（脂質量：１０μモル）と、クロロホルム／エタノール（２:１）に懸濁したＦＴＳＣ（Fluorescein-5-thiosemicarbazide，緑色）標識化ＢＣＧ−ＣＷ（ＢＣＧ−ＣＷ量：０．４ｍｇ）と、ステアリルオクタアルギニン（ＳＴＲ−Ｒ８）水溶液（ＳＴＲ−Ｒ８量：脂質量の０．８モル％）とを混合し、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、ＢＣＧ−ＣＷ及びＳＴＲ−Ｒ８を含有する脂質薄膜を調製した。得られた脂質薄膜に緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）１ｍＬを加えて水和させた後、さらにガラスビーズを添加し、６５℃で２０分間、通常の空気圧（減圧なし）でロータリーエバポレーターを回転させることによりリポソーム懸濁液を調製した。なお、リポソームの水相マーカーとして、脂質薄膜を水和する緩衝液に１ｍＭローダミン（赤色）を溶解させておいた。得られたリポソーム懸濁液を、０．８μｍ、０．４μｍ、０．１μｍの膜を複数回透過させること（エクストリューダー処理）により、粒子径の小さな（約１２０ｎｍ）リポソームを調製した。このリポソームは、ＢＣＧ−ＣＷを含む脂質膜を有し、ＳＴＲ−Ｒ８を表面に有する（以下「Ｒ８修飾ＢＣＧリポソーム」という）。【００６２】
なお、ＢＣＧ−ＣＷは、次の方法を用いて日本ビーシージー製造株式会社により調製されたものを用いた。ＢＣＧ加熱死菌体を１０倍容の精製水に懸濁し、フレンチプレス処理により菌体を破砕した。次いで、菌体破砕液を６７６０×ｇで遠心することにより未破砕菌体を除き、その上清を１８０００×ｇで遠心することにより得られた沈渣を凍結乾燥してＢＣＧ-ＣＷを得た。こうして得られるＢＣＧ−ＣＷを精製水等に懸濁することにより形成されるミセルのメジアン径は、粒度分布計で測定すると、通常１２０〜３２０ｎｍ、好ましくは１７０〜２７０ｎｍ、さらに好ましくは２２０ｎｍである。【００６３】
脂質（ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ＝７:３（モル比））のクロロホルム溶液（脂質量：１０μモル）と、クロロホルム／エタノール（２:１）に懸濁したＦＴＳＣ標識化ＢＣＧ−ＣＷ（ＢＣＧ−ＣＷ量：０．４ｍｇ）とを混合し、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、ＢＣＧ−ＣＷは含有するがＳＴＲ−Ｒ８は含有しない脂質薄膜を調製した後、上記と同様に処理することにより、ＢＣＧ−ＣＷを含む脂質膜を有し、ＳＴＲ−Ｒ８を表面に有しないリポソームを調製した（以下「Ｒ８非修飾ＢＣＧリポソーム」という）。【００６４】
共焦点レーザー顕微鏡による観察の下、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（２．５×１０５細胞／６０ｍｍディッシュ）を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で一晩インキュベートした。次いで、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、Ｒ８修飾又は非修飾ＢＣＧリポソーム（最終脂質濃度５０μＭ）を含有する血清不含ＤＭＥＭ培養液中でインキュベートした。インキュベーションは、３７℃で１時間行った。インキュベーション終了時に細胞を洗浄し、その後、固定することなく共焦点レーザー顕微鏡により観察した。【００６５】
その結果、図２に示すように、Ｒ８非修飾ＢＣＧリポソームの場合、緑色（リポソームの脂質膜に含まれるＦＴＳＣ標識化ＢＣＧ−ＣＷ）及び赤色（リポソームの水相マーカーであるローダミン）はほとんど細胞内に観察されなかった。このことは、Ｒ８非修飾ＢＣＧリポソームの細胞への取込量が低いことを示す。ＢＣＧ−ＣＷが負に帯電しているため、リポソーム表面も負に帯電しており（ゼータ電位：−２．９４ｍＶ）、負電荷を有する細胞膜表面と反発するため、細胞への取込量が低いと考えられる。【００６６】
一方、図３に示すように、Ｒ８修飾ＢＣＧリポソームの場合、緑色（リポソームの脂質膜に含まれるＦＴＳＣ標識化ＢＣＧ−ＣＷ）及び赤色（リポソームの水相マーカーであるローダミン）が細胞内で観察された。このことは、Ｒ８修飾ＢＣＧリポソームの細胞への取込量が高いことを示す。ＳＴＲ−Ｒ８修飾により、リポソーム表面が正に帯電しているため（ゼータ電位：＋２５．５９ｍＶ）、細胞への取込量が高いと考えられる。なお、Ｒ８非修飾ＢＣＧリポソームによる細胞の形態学的変化は認められなかった。【００６７】
次に、１０％仔牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０メディウム（Ｓｉｇｍａ社）を用いて５％ＣＯ２で培養した膀胱癌細胞株ＭＢＴ−２（理化学研究所）５×１０５個に、Ｒ８非修飾ＢＣＧリポソーム又はＲ８修飾ＢＣＧリポソームを３．３ｍｇ添加して３７℃、１時間培養を行った。フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて細胞内蛍光量を解析したところ、Ｒ８修飾ＢＣＧリポソームにおいて細胞内蛍光量が増加しており、ＳＴＲ−８修飾による細胞内取り込み量の増加が確認された（図４)。また、蛍光の可視化３０分前に７５ｎＭのＬｙｏｓｏｔｒａｃｋｅｒＲｅｄＴＭ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ＴＭを用いてエンドソーム／リソソーム及び核をそれぞれ赤色と青色に発光するように処理したところ、ＭＢＴ−２に取り込まれたＲ８修飾ＢＣＧリポソーム（緑色に発光する）、エンドソーム／リソソーム画分に局在化していた（図５）。【００６８】
〔実施例２〕
脂質（ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ＝７:３（モル比））のクロロホルム溶液（脂質量：１０μモル）と、クロロホルム／エタノール（２:１）に懸濁したＦＴＳＣ標識化ＢＣＧ−ＣＷ（ＢＣＧ−ＣＷ量：０．４ｍｇ）と、ＳＴＲ−Ｒ８水溶液（ＳＴＲ−Ｒ８量：脂質量の０．８又は５モル％）とを混合し、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、ＢＣＧ−ＣＷ及びＳＴＲ−Ｒ８を含有する脂質薄膜を調製し、実施例１と同様に処理することにより、ＢＣＧ−ＣＷを含む脂質膜を有し、ＳＴＲ−Ｒ８を表面に有するリポソームを調製した（ＳＴＲ−Ｒ８量が脂質量の０．８モル％であるものを以下「低密度Ｒ８修飾ＢＣＧリポソーム」といい、５モル％であるものを以下「高密度Ｒ８修飾ＢＣＧリポソーム」という）。【００６９】
脂質（ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ＝７:３（モル比））のクロロホルム溶液（脂質量：１０μモル）と、クロロホルム／エタノール（２:１）に懸濁したＦＴＳＣ標識化ＢＣＧ−ＣＷ（ＢＣＧ−ＣＷ量：０．４ｍｇ）とを混合し、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、ＢＣＧ−ＣＷは含有するがＳＴＲ−Ｒ８は含有しない脂質薄膜を調製した後、実施例１と同様に処理することにより、ＢＣＧ−ＣＷを含む脂質膜を有し、ＳＴＲ−Ｒ８を表面に有しないリポソームを調製した（以下「Ｒ８非修飾ＢＣＧリポソーム」という）。【００７０】
脂質（ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ＝７:３（モル比））のクロロホルム溶液（脂質量：１０μモル）と、ＳＴＲ−Ｒ８水溶液（ＳＴＲ−Ｒ８量：脂質量の０．８モル％）とを混合し、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、ＳＴＲ−Ｒ８は含有するがＢＣＧ−ＣＷは含有しない脂質薄膜を調製し、実施例１と同様に処理することにより、ＢＣＧ−ＣＷを含まない脂質膜を有し、ＳＴＲ−Ｒ８を表面に有するリポソームを調製した（以下「低密度Ｒ８修飾ＢＣＧ不含リポソーム」という）。【００７１】
脂質（ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ＝７:３（モル比））のクロロホルム溶液（脂質量：１０μモル）を、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、ＢＣＧ−ＣＷもＳＴＲ−Ｒ８も含有しない脂質薄膜を調製し、実施例１と同様に処理することにより、ＢＣＧ−ＣＷを含まない脂質膜を有し、ＳＴＲ−Ｒ８を表面に有しないリポソームを調製した（以下「Ｒ８非修飾ＢＣＧ不含リポソーム」という）。【００７２】
マウス骨髄から単離した樹状細胞（ＤＣ）の血清不含培養液中に各種リポソームを添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、２２時間血清存在下で培養し、ＤＣの活性化の有無を検討した。ＤＣの活性化の指標として、表在マーカータンパク質ＣＤ８６及びＣＤ８０、さらに抗原提示にかかわるＭＨＣＩＩを選定し、各タンパク質に対する蛍光ラベル化抗体を用い、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）によって各処理群におけるマーカータンパク質量を測定した。【００７３】
結果を図６に示す。図６中、「Cultured DC」は無処理の樹状細胞、「EPC/Chol Lip」はＲ８非修飾ＢＣＧ不含リポソームで処理した樹状細胞、「LD-STR-R8 Lip」は低密度Ｒ８修飾ＢＣＧ不含リポソームで処理した樹状細胞、「LPS」は代表的免疫細胞活性化成分（アジュバント）であるリポポリサッカライド（ポジティブコントロール）で処理した樹状細胞、「Lip/BCG-CW」はＲ８非修飾ＢＣＧリポソームで処理した樹状細胞、「LowR8 Lip/BCG-CW」は低密度Ｒ８修飾ＢＣＧリポソームで処理した樹状細胞、「HighR8 Lip/BCG-CW」は高密度Ｒ８修飾ＢＣＧリポソームで処理した樹状細胞の結果を示す。
図５に示されるように、高密度Ｒ８修飾ＢＣＧリポソームは、代表的アジュバントであるＬＰＳと同様に高い免疫細胞活性化能を発揮した。【００７４】
［実施例３］
１０％仔牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０メディウム（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、膀胱癌細胞株ＭＢＴ−２（理化学研究所）を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。７週令のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）をグループＡ〜Ｇに分け、０．７×１０７個のＭＢＴ−２と下記の各試料とを、各グループのマウス背右側に移植した。【００７５】
グループＡ：１００μlのＰＢＳ緩衝液（６匹）
グループＢ：１ｍｇのＢＣＧ（ＢＣＧ株式会社）／１００μlのＰＢＳ緩衝液（６匹）
グループＣ：実施例１で作製した１ｍｇのＢＣＧ−ＣＷ／１００μlのＰＢＳ緩衝液（１８匹）
グループＤ：実施例１で作製した０．１ｍｇのＢＣＧ−ＣＷ／１００μlのＰＢＳ緩衝液（６匹）
グループＥ：実施例１で作製した１ｍｇのＢＣＧ−ＣＷを含む脂質膜を有し、ＳＴＲ−Ｒ８を表面に有するＲ８修飾ＢＣＧ高含有リポソーム／１００μlのＰＢＳ緩衝液（１８匹）
グループＦ：実施例１で作製した０．１ｍｇのＢＣＧ−ＣＷを含む脂質膜を有し、ＳＴＲ−Ｒ８を表面に有するＲ８修飾ＢＣＧ低含有リポソーム／１００μlのＰＢＳ緩衝液（６匹）
グループＧ：ＢＣＧ−ＣＷを含まない脂質膜を有し、ＳＴＲ−Ｒ８を表面に有しないＲ８非修飾ＢＣＧ不含リポソーム／１００μlのＰＢＳ緩衝液（６匹）【００７６】
上記のリポソームは、実施例２に記載された低密度Ｒ８修飾ＢＣＧリポソームの作製方法において、ＢＣＧ−ＣＷの含有量を変化させることによって作製した。またＲ８非修飾ＢＣＧ不含リポソームは、実施例２に記載された方法と同様の方法で行った。【００７７】
各グループのマウスを４週間飼育後、移植した癌細胞に由来する腫瘍組織を摘出してその大きさ（ｍｍ２）を測定して、各試料の腫瘍退縮効果を確認した。その結果を表１に示す。【００７８】
【表１】
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【００７９】
グループＢ（１ｍｇのＢＣＧ）及びグループＣ（１ｍｇのＢＣＧ−ＣＷ）と同様の腫瘍退縮効果がグループＥ（Ｒ８修飾ＢＣＧ高含有リポソーム）で認められた。一方、グループＤ（０．１ｍｇのＢＣＧ−ＣＷ）では腫瘍退縮効果は認められなかったが、同量のＢＣＧ−ＣＷを含むグループＦ（Ｒ８修飾ＢＣＧ低含有リポソーム）では、強い腫瘍退縮効果が認められた。このことから、Ｒ８修飾リポソームにＢＣＧ−ＣＷを含有させることにより、ＢＣＧやＢＣＧ−ＣＷをそのまま投与するよりも高い腫瘍退縮効果が得られることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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