【手続補正書】
【提出日】平成20年3月17日(2008.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖核酸であって、前記第１のオリゴクレオチド鎖は少なくとも２５ヌクレオチドを含み、かつ、生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができ、並びに、前記第２のオリゴクレオチドは２５〜３０ヌクレオチドからなり、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１及び／又は２は前記第１のオリゴクレオチド鎖の対になったヌクレオチド残基とミスマッチを形成し、並びに、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、前記の鎖の少なくとも１及び好ましくは共に５’−リン酸基を含み、並びに、好ましくは、前記第１の鎖の５’末端及び前記第２の鎖の３’末端は平滑末端を形成している、前記二本鎖核酸。
【請求項２】
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖核酸であって、前記第１のオリゴクレオチド鎖は２５〜３０ヌクレオチドからなり、かつ、生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができ、並びに、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１及び／又は２は前記第２のオリゴクレオチド鎖の対になったヌクレオチド残基とミスマッチを形成し、並びに、前記第２のオリゴクレオチド鎖は少なくとも２５ヌクレオチドを含み、かつ、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、前記の鎖の少なくとも１又は好ましくは共に５’−リン酸基を含み、並びに、好ましくは、前記第１の鎖の５’末端及び前記第２の鎖の３’末端は平滑末端を形成している、前記二本鎖核酸。
【請求項３】
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖核酸であって、前記第１及び第２のヌクレオチド鎖が各々リボヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴクレオチド鎖は少なくとも２５ヌクレオチドを含み、かつ、生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができ、並びに、前記第２のオリゴクレオチドは２５〜３０ヌクレオチドからなり、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１、２及び／又は３は第１のオリゴヌクレオチド鎖の修飾ヌクレオチド残基と塩基対を形成し、前記第２鎖の３’末端は、前記第１鎖よりも１〜４個のヌクレオチド長く、前記の鎖の少なくとも１又は好ましくは共に５’−リン酸基を含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させる、前記二本鎖核酸。
【請求項４】
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖核酸であって、前記第１及び第２のヌクレオチド鎖が各々リボヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴクレオチド鎖は２５〜３０ヌクレオチドからなり、かつ、生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができ、並びに、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１、２及び／又は３は修飾オリゴヌクレオチドと置換され、並びに、前記第２のオリゴクレオチド鎖は少なくとも２５ヌクレオチドを含み、かつ、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖よりも１〜４個のヌクレオチド長く、好ましくは、第２のオリゴヌクレオチド鎖は２５〜３０のヌクレオチドからなり、前記の鎖の少なくとも１又は好ましくは共に５’−リン酸基を含む、前記二本鎖核酸。
【請求項５】
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖核酸であって、前記第１及び第２のヌクレオチド鎖は各々同数のヌクレオチド残基からなり、その長さは２５〜３０ヌクレオチドからなり、前記第１の鎖の３’末端の最後及び最後から２番目の残基及び前記第２の鎖の５’末端の最後及び最後から２番目の残基が１又は２のミスマッチした塩基対を形成し、前記第１の鎖の５’末端及び前記第２の鎖の３’末端が平滑末端を形成し、並びに、第２のオリゴクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、好ましくは少なくとも１又はより好ましくは共に５’−リン酸基を含み、並びに、好ましくは前記第１及び第２の鎖は各々２７ヌクレオチドからなる、前記二本鎖核酸。
【請求項６】
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖核酸であって、前記第１及び第２の鎖は各々３５又はそれ以下からなり、前記第１の鎖の３’末端の最後及び最後から２番目の残基及び前記第２の鎖の５’末端の最後及び最後から２番目の残基が１又は２のミスマッチした塩基対を形成し、前記第１の鎖の５’末端及び前記第２の鎖の３’末端が平滑末端を形成し、並びに、第２のオリゴクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、好ましくは少なくとも１又はより好ましくは共に５’−リン酸基を含む、前記二本鎖核酸。
【請求項７】
二本鎖核酸がインビトロで哺乳類細胞中の標的遺伝子の発現を、少なくとも１０％、少なくとも５０％及び少なくとも８０〜９０％からなる群から選択される発現量（％）を低下させる、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項８】
二本鎖核酸が哺乳類細胞中で内因的に切断されて、長さが１９〜２３の範囲のヌクレオチドである二本鎖核酸を産生し、この二本鎖核酸は標的核酸発現を低下させ、好ましくは前記切断がダイサーにより行われる、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項９】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１、２及び／又は３は、修飾ヌクレオチド、好ましくはデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド又は蛍光ヌクレオチド、より好ましくは前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の位置１がデオキシリボヌクレオチド又はアシクロヌクレオチドで、並びに、最も好ましくは前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の位置１がデオキシリボヌクレオチドで、置換される、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項１０】
前記第１の鎖の３’末端及び前記第２の鎖の５’末端は平滑末端を形成している、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項１１】
前記第１及び第２の鎖の長さが、少なくとも２６及び最大で３０である、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項１２】
前記第２の鎖が標的ｍＲＮＡと完全に相補的である、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項１３】
二本鎖核酸が化学修飾を含み、前記化学修飾が場合によっては：好ましくは２’−デオキシ又は非環基である糖修飾であり；好ましくはホスホン酸、ホスホロチオエート又はホスホトリエステルであるリン酸骨格の修飾であり；塩基の修飾であり、修飾された塩基は、好ましくは、２’-Ｏ-アルキル修飾ピリジン、２’-フルオロ修飾ピリジン又は脱塩基糖である；請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項１４】
デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’-デオキシアデノシン（コーディセピン）、３’-アジド-３’-デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’-ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’-ジデオキシ-３’-チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’-ジデヒドロ-２’，３’-ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’-アジド-３’-デオキシチミジン（ＡＺＴ）及び２’，３’-ジデオキシ-３’-チアシチジン（３ＴＣ）のヌクレオチド１リン酸、２’，３’-ジデヒドロ-２’，３’-ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド１リン酸、４-チオウラシル、５-ブロモウラシル、５-ヨードウラシル、５-（３-アミノアリル）-ウラシル、２’-Ｏ-アルキルリボヌクレオチド、２’-Ｏ-メチルリボヌクレオチド、２’-アミノリボヌクレオチド、２’-フルオロリボヌクレオチド及びロックされた核酸からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項１５】
第１及び第２の鎖が化学結合で連結された、好ましくは、第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が化学結合で連結された、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項１６】
第２の鎖又は第１の鎖のヌクレオチドがダイサー切断に配向性がある修飾ヌクレオチドで置換された、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項１７】
請求項４に記載の単離された二本鎖核酸であって、好ましくは、前記第２の鎖及び第１の鎖のヌクレオチドの相対的な長さが：第２鎖の長さが２６〜２９ヌクレオチド残基のときに第１鎖の長さが２５ヌクレオチド残基、第２鎖の長さが２７〜３０ヌクレオチド残基のときに第１鎖の長さが２６ヌクレオチド残基、第２鎖の長さが２８〜３０ヌクレオチド残基のときに第１鎖の長さが２７ヌクレオチド残基、第２鎖の長さが２９〜３０ヌクレオチド残基のときに第１鎖の長さが２８ヌクレオチド残基、第２鎖の長さが３０ヌクレオチド残基のときに第１鎖の長さが２９ヌクレオチド残基からなる群から選択され、より好ましくは前記第１の鎖の長さが２５ヌクレオチド残基であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１、２及び／又は３はデオキシリボヌクレオチドで置換され、前記第２の鎖の長さは２７ヌクレオチド残基で、かつ、第１の鎖よりも３’末端が２ヌクレオチド長く、より好ましくは前記第１の鎖の長さは２５ヌクレオチド残基であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１はデオキシリボヌクレオチドで置換され、かつ、前記第２の鎖の長さは２７ヌクレオチド残基で第１の鎖よりも３’末端が２ヌクレオチド長い、前記二本鎖核酸。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸を包含する哺乳類細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸を含む製剤であって、前記二本鎖核酸がインビトロで哺乳類細胞に導入される場合に標的遺伝子の発現を、少なくとも１０％、少なくとも５０％及び少なくとも８０〜９０％からなる群から選択される発現量（％）を低下させるのに有効な量で存在し、好ましくは前記二本鎖核酸は、１ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的ＲＮＡの少なくとも１９が同一のヌクレオチドに向けられた単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有し、より好ましくは前記二本鎖核酸は、２００ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的ＲＮＡの少なくとも１９が同一のヌクレオチドに向けられた単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有し、最も好ましくは前記二本鎖核酸は、５０ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的ＲＮＡの少なくとも１９が同一のヌクレオチドに向けられた単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の単離された二本鎖核酸を含む製剤であって、前記二本鎖核酸が哺乳類の対象の細胞に導入される場合に標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも５０％及び少なくとも８０〜９０％からなる群から選択される発現量（％）を低下させるのに有効な量で存在し、前記二本鎖核酸は、１ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的ＲＮＡの少なくとも１９が同一のヌクレオチドに向けられた２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有し、より好ましくは、前記有効な量は、１マイクログラム〜５ミリグラム／前記対象のｋｇ／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／ｋｇ、０.００１〜０．２５ミリグラム／ｋｇ、０.０１〜２０マイクログラム／ｋｇ、０.０１〜１０マイクログラム／ｋｇ、０.０１〜５マイクログラム／ｋｇ及び０.１０〜２.５マイクログラム／ｋｇからなる群から選択される用量である、前記製剤。
【請求項２２】
リボヌクレオチドを含み５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴクレオチド鎖及びリボヌクレオチドを含み５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴクレオチド鎖を含む単離された二本鎖核酸を含む製剤であって、前記第１及び第２の鎖の長さは各々少なくとも２５及び最大で３０ヌクレオチドであり、前記第２のオリゴクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させ、前記二本鎖核酸は前記製剤中に、前記二本鎖核酸が哺乳細胞中に導入される場合に標的遺伝子の発現を低下させるのに有効な量で存在し、かつ、１ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的ＲＮＡの少なくとも１９が同一のヌクレオチドに向けられた単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有し、好ましくは前記二本鎖核酸は、２００ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的ＲＮＡの少なくとも１９が同一のヌクレオチドに向けられた単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有し、並びにより好ましくは前記二本鎖核酸は、５０ピコモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的ＲＮＡの少なくとも１９が同一のヌクレオチドに向けられた単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、前記製剤。
【請求項２３】
第２の鎖の３’末端の長さがが第１の鎖よりも１〜４ヌクレオチド長い、請求項２２記載の製剤。
【請求項２４】
第１及び第２の鎖のヌクレオチド残基の数が同数である、請求項２２記載の製剤。
【請求項２５】
第１の鎖の３’末端の最後及び最後から２番目の残基及び第２の鎖の５’末端の最後及び最後から２番目の残基が１又は２のミスマッチした塩基対を形成する、請求項２２記載の製剤。
【請求項２６】
標的遺伝子の発現が、場合によっては、インビトロ又はインビボで低下する、哺乳類細胞中の前記標的遺伝子の発現を低下させるための請求項１〜１７のいずれか１項記載の二本鎖核酸を含む医薬組成物。
【請求項２７】
標的遺伝子の発現が、場合によっては、インビトロ又はインビボで低下する、哺乳類細胞中の前記標的遺伝子の発現を低下させるための請求項２０〜２５のいずれか１項記載の製剤。
【請求項２８】
標的遺伝子の発現を低下させるのに十分な単離された二本鎖核酸の量が、前記細胞環境中に１ナノモル又はそれ以下、好ましくは２００ピコモル又はそれ以下、より好ましくは５０ピコモル又はそれ以下である、請求項２６の医薬組成物。
【請求項２９】
標的遺伝子の発現を低下させるのに十分な単離された二本鎖核酸の量が、前記細胞環境中で１ナノモル又はそれ以下、好ましくは２００ピコモル又はそれ以下、より好ましくは５０ピコモル又はそれ以下である、請求項２７記載の製剤。
【請求項３０】
単離された二本鎖核酸が、１ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的ＲＮＡの少なくとも１９が同一のヌクレオチドに向けられた単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、請求項２６の医薬組成物。
【請求項３１】
単離された二本鎖核酸が、１ナノモル又はそれ以下の細胞の環境中で有効な濃度で哺乳類細胞中インビトロでアッセイをする場合に前記標的ＲＮＡの少なくとも１９が同一のヌクレオチドに向けられた単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡより標的遺伝子の発現を低下させることについて優れた効能を有する、請求項２７記載の製剤。
【請求項３２】
単離された二本鎖核酸の用量単位が１マイクログラム〜５ミリグラム／当該哺乳類のｋｇ／日、１００マイクログラム〜０.５ミリグラム／ｋｇ、０.００１〜０.２５ミリグラム／ｋｇ、０.０１〜２０マイクログラム／ｋｇ、０.０１〜１０マイクログラム／ｋｇ、０.１０〜５マイクログラム／ｋｇ及び０.１〜２.５マイクログラム／ｋｇからなる群から選択される用量である、請求項２６の医薬組成物。
【請求項３３】
単離された二本鎖核酸の用量単位が１マイクログラム〜５ミリグラム／当該哺乳類のｋｇ／日、１００マイクログラム〜０.５ミリグラム／ｋｇ、０.００１〜０.２５ミリグラム／ｋｇ、０.０１〜２０マイクログラム／ｋｇ、０.０１〜１０マイクログラム／ｋｇ、０.１０〜５マイクログラム／ｋｇ及び０.１〜２.５マイクログラム／ｋｇからなる群から選択される用量である、請求項２７記載の製剤。
【請求項３４】
医薬組成物が静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、輸液、経皮送達、噴霧、直腸送達、膣内送達、局所送達、経口送達及び吸入送達からなる群から選択される態様により対象に送達するために製剤化される、請求項２６の医薬組成物。
【請求項３５】
製剤が静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、輸液、経皮送達、噴霧、直腸送達、膣内送達、局所送達、経口送達及び吸入送達からなる群から選択される態様により対象に送達するために製剤化される、請求項２７記載の製剤。
【請求項３６】
哺乳類発現系で標的遺伝子の発現を低下させる効能が増大した二本鎖核酸を選択する方法であって、以下の
（ａ）コントロールの形質発現と比較して、５０ナノモル又はそれ以下の第１の二本鎖核酸の形質導入する濃度で哺乳類細胞で標的遺伝子発現の低下の量を決定する工程であって、前記第１の二本鎖核酸が、５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖及び５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含み、前記第１及び第２の鎖の長さが各々少なくとも２５及び最大で３０ヌクレオチドであり、前記第２のオリゴクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させる；
（ｂ）前記工程（ａ）の標的遺伝子発現の低下を、コントロールの形質導入と比較した５０ナノモル又はそれ以下の、５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖及び５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含む第２の二本鎖核酸の形質導入する濃度で哺乳類細胞で標的遺伝子発現を低下させる第２の二本鎖核酸の能力と、比較する工程であって、第１及び第２の鎖は各々２１〜２３ヌクレオチドからなり、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させる；及び
（ｃ）そして、工程（ｂ）の比較により、工程（ａ）において決定された前記第１二本鎖核酸による前記標的遺伝子発現において、低下が少なくとも５０％より高いと特定された場合は、効能が増大した二本鎖核酸の選択が可能となる工程
を含む、前記方法。
【請求項３７】
哺乳類発現系で標的遺伝子の発現を低下させる効能が増大した二本鎖核酸を選択する方法であって、以下の
（ａ）コントロールの形質発現と比較して、５０ナノモル又はそれ以下の第１の二本鎖核酸の形質導入する濃度で哺乳類細胞で標的遺伝子発現の低下の量を決定する工程であって、前記第１の二本鎖核酸が、５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖及び５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含み、前記第１及び第２の鎖の長さが各々少なくとも２５及び最大で３０ヌクレオチドであり、前記第２のオリゴクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させる；
（ｂ）前記工程（ａ）の標的遺伝子発現の低下を、コントロールの形質導入と比較して５０ナノモル又はそれ以下の第２の二本鎖核酸の形質導入する濃度で哺乳類細胞で標的遺伝子発現を低下させる、５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖及び５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含む第２の二本鎖核酸の能力と、比較する工程であって、第１及び第２の鎖は各々２１〜２３ヌクレオチドからなり、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させる；及び
（ｃ）そして、工程（ｂ）の比較により、工程（ａ）において決定された前記第１二本鎖核酸による前記標的遺伝子発現において、低下が少なくとも５０％より高いと特定された場合は、増大した効能のための二本鎖核酸の選択が可能となる工程
を含む、前記方法。
【請求項３８】
形質導入する濃度が１ナノモル又はそれ以下、好ましくは２００ピコモル又はそれ以下、より好ましくは５０ピコモル又はそれ以下である、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｂ）の比較により、前記第１の二本鎖核酸による標的遺伝子発現において低下が少なくとも８０〜９０％よりも高いと特定された場合に二本鎖核酸の選択が可能となる、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項４０】
第１の二本鎖核酸の第１及び第２の鎖が各々２６〜３０ヌクレオチドからなる、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項４１】
第１の二本鎖核酸の第１の鎖及び第１の二本鎖核酸の第２の鎖が同数のヌクレオチド残基を含む、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項４２】
第１の二本鎖核酸の第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端ヌクレオチド残基及び第１の二本鎖核酸の第２のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基が相補的であり、かつ、第２のオリゴヌクレオチド鎖に長さが１〜４ヌクレオチドの３’突出がある、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項４３】
請求項１の単離された二本鎖核酸を調製する方法であって、以下の：
標的遺伝子のＲＮＡの標的配列を選択する工程であって、前記標的配列は少なくとも１９ヌクレオチドを含む；
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させるヌクレオチド配列を有する２５〜３０ヌクレオチドを含む第２のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程；
生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる少なくとも２５ヌクレオチドを含む第１のオリゴクレオチド鎖を合成する工程であって、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１及び／又は２は前記第１のオリゴクレオチド鎖の対になったヌクレオチド残基とミスマッチを形成し、前記の鎖の少なくとも１及び好ましくは共に５’−リン酸基を含み、並びに、好ましくは、前記第１の鎖の５’末端及び前記第２の鎖の３’末端は平滑末端を形成する；及び
それにより請求項１に記載の二本鎖核酸を調製する工程；
を含む、前記方法。
【請求項４４】
請求項２の単離された二本鎖核酸を調製する方法であって、以下の：
標的遺伝子のＲＮＡの標的配列を選択する工程であって、前記標的配列は少なくとも１９ヌクレオチドを含む；
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させるヌクレオチド配列を有する少なくとも２５ヌクレオチドを含む第２のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程；
生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる２５〜３０ヌクレオチドを含む第１のオリゴクレオチド鎖を合成する工程であって、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１及び／又は２は前記第２のオリゴクレオチド鎖の対になったヌクレオチド残基とミスマッチを形成し、前記の鎖の少なくとも１及び好ましくは共に５’−リン酸基を含み、並びに、好ましくは、前記第１の鎖の５’末端及び前記第２の鎖の３’末端は平滑末端を形成する；及び
それにより請求項２に記載の二本鎖核酸を調製する工程；
を含む、前記方法。
【請求項４５】
請求項３の単離された二本鎖核酸を調製する方法であって、以下の：
標的遺伝子のＲＮＡの標的配列を選択する工程であって、前記標的配列は少なくとも１９ヌクレオチドを含む；
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させるヌクレオチド配列を有する２５〜３０ヌクレオチドを含む第２のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程；
生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる少なくとも２５ヌクレオチドを含む第１のオリゴクレオチド鎖を合成する工程であって、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１、２及び／又は３は第１のオリゴヌクレオチド鎖の修飾ヌクレオチド残基と塩基対を形成し、前記第２鎖の３’末端は、前記第１鎖よりも１〜４個のヌクレオチド長く、前記の鎖の少なくとも１又は好ましくは共に５’−リン酸基を含む、及び
それにより請求項３に記載の二本鎖核酸を調製する工程；
を含む、前記方法。
【請求項４６】
請求項４の単離された二本鎖核酸を調製する方法であって、以下の：
標的遺伝子のＲＮＡの標的配列を選択する工程であって、前記標的配列は少なくとも１９ヌクレオチドを含む；
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９ヌクレオチド長で標的ＲＮＡと十分に相補的で、前記二本鎖核酸試薬を哺乳類細胞に導入する場合に標的遺伝子の発現を低下させるヌクレオチド配列を有する少なくとも２５ヌクレオチドを含む第２のオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程であって、好ましくは前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は２５〜３０ヌクレオチドからなる；
生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる２５〜３０ヌクレオチドを含む第１のオリゴクレオチド鎖を合成する工程であって、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端で第１のヌクレオチド（位置１）が始まる場合、位置１、２及び／又は３は修飾オリゴヌクレオチドと置換され、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖よりも１〜４個のヌクレオチド長く、前記の鎖の少なくとも１又は好ましくは共に５’−リン酸基を含む；及び
それにより請求項４に記載の二本鎖核酸を調製する工程；
を含む、前記方法。
【請求項４７】
請求項５の単離された二本鎖核酸を調製する方法であって、以下の：
標的遺伝子のＲＮＡの標的配列を選択する工程であって、前記標的配列は少なくとも１９ヌクレオチドを含む；
選択した標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有する２５〜３０ヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド鎖を合成する工程；
生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる２５〜３０ヌクレオチドを含む第１のヌクレオチド鎖を合成する工程であって、前記第１の鎖の３’末端の最後及び最後から２番目の残基及び前記第２の鎖の５’末端の最後及び最後から２番目の残基が１又は２のミスマッチした塩基対を形成し、少なくとも１又は好ましくは共に５’−リン酸基を含み、好ましくは前記第１及び第２の鎖は各々２７ヌクレオチドからなる；
それにより請求項５に記載の二本鎖核酸を調製する工程；
を含む、前記方法。
【請求項４８】
請求項６の単離された二本鎖核酸を調製する方法であって、以下の：
標的遺伝子のＲＮＡの標的配列を選択する工程であって、前記標的配列は少なくとも１９ヌクレオチドを含む；
選択した標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有する３５又はそれ以下のヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド鎖を合成する工程；
生物学的条件で前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とアニーリングすることができる３５又はそれ以下のヌクレオチドを含む第１のヌクレオチド鎖を合成する工程であって、前記第１の鎖の３’末端の最後及び最後から２番目の残基及び前記第２の鎖の５’末端の最後及び最後から２番目の残基が１又は２のミスマッチした塩基対を形成し、少なくとも１又は好ましくは共に５’−リン酸基を含む；
それにより請求項６に記載の二本鎖核酸を調製する工程；
を含む、前記方法。