【手続補正書】
【提出日】平成31年2月8日(2019.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2018510904.tif 000001
（式中、
Ｒ１は、水素原子および（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択され、
Ｒ２は、メタ置換フェニル基およびパラ置換フェニル基から選択され、ここで、前記ベンジル基またはフェニル基上の置換基は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ハロゲン基、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基およびシアノ基から選択され、または
Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している窒素原子と共に、場合により置換および／または縮合されることがある複素環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立して、水素原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基、および、アミン基または飽和窒素複素環で置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基から選択され、
Ｃｙは、アダマンチル基、場合により置換されることがある単環式アリール基、および場合により置換されることがある単環式ヘテロアリール基から選択される。）の化合物を含む、リソソーム蓄積障害の治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記障害が、スフィンゴリピドーシスおよびムコ多糖症から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記障害が、ニーマン・ピックＣ、ニーマン・ピックＡ／Ｂ、ファブリー病、ファーバー病、ウォルマン病、ゴーシェ病、クラッベ病、ＭＰＳ  ＶＩＩ（ムコ多糖症ＶＩＩ）、神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ  ２）および糖原病ＩＩ型（ポンペ病）から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
Ｃｙが、置換ピロール基、オルト置換フェニル基、メタ置換フェニル基、および場合により置換されることがあるピリジン基またはイミダゾール基から選択される環であり、ここで、前記環上の前記置換基が、（Ｃ１−Ｃ７）炭化水素基、（Ｃ１−Ｃ６）アシル基、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ１０）オキサアルキル基およびハロゲン基から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｒ２が、メタおよびパラ置換フェニル基から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｒ１およびＲ２が、これらが結合している窒素原子と共に、場合により置換されることがある単環式複素環を形成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記場合により置換されることがある複素環が、ピロリジン、ピペリジン、アゼピン、モルホリンおよびピペラジンから選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
Ｒ１およびＲ２が、これらが結合している窒素原子と共に、場合により置換されることがある縮合複素環を形成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記場合により置換されることがある縮合複素環が、テトラヒドロベンゾアゼピン、テトラヒドロキノリン、テトラヒドロイソキノリン、インドリンおよびイソインドリンから選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｒ３が、水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基、ジメチルアミノプロポキシ基およびヒドロキシ基から選択され、Ｒ４およびＲ６が水素原子であり、かつＲ５が水素原子またはフッ素原子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
式：
【化２】
2018510904.tif 000002
（式中、Ｃｙはメチル置換ピリジン環、イミダゾール、又は置換イミダゾールである。）の化合物。
【請求項１２】
Ｃｙの置換基が（Ｃ１−Ｃ７）炭化水素基、（Ｃ１−Ｃ６）アシル基、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ１０）オキサアルキル基およびハロゲン基から選択される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｃｙが、４−メチルピリジン−３−イル、イミダゾール−４−イルおよび２−フェニルイミダゾール−４−イルから選択される、請求項１１又は１２に記載の化合物。
【請求項１４】
医薬として許容される担体、および式：
【化３】
2018510904.tif 000003
（式中、Ｃｙは、メチル置換ピリジン環、イミダゾール基または置換イミダゾール基である。）の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１５】
Ｃｙが、４−メチルピリジン−３−イル、イミダゾール−４−イルおよび２−フェニルイミダゾール−４−イルから選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
式Ｉ
【化４】
2018510904.tif 000004
（式中、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している窒素原子と共に、場合により置換および／または縮合されることがある複素環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立して、水素原子、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基、および、アミン基または飽和窒素複素環で置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基から選択され、
Ｃｙは、場合により置換されることがあるピリジン基またはイミダゾール基である）
で表される化合物。
【請求項１７】
Ｃｙの置換基が（Ｃ１−Ｃ７）炭化水素基、（Ｃ１−Ｃ６）アシル基、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１−Ｃ１０）オキサアルキル基およびハロゲン基から選択される、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記場合により置換されることがある縮合複素環が、テトラヒドロベンゾアゼピン、テトラヒドロキノリン、テトラヒドロイソキノリン、インドリンおよびイソインドリンから選択される、請求項１６又は１７に記載の化合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本明細書に記載の化合物の多くは文献において既知であり、商業的供給元から購入されてもよい。市販されていない化合物は、以下の経路で合成されてもよい：
【化３】
2018510904.tif 000005
上に示した試薬は例示であり、同じ変換を達成するために当技術分野において周知の類似の試薬で置き換えることができることを当業者は理解されよう。例えば、ＣｙＣＯＯＨは、アミドおよびペプチド合成において使用される一般的な試薬のいずれかによってアニリンと縮合させることができる。同様に、ニトロ基は、水素原子および触媒または別の金属／酸の組み合わせを用いて還元することができる。例示的な合成は以下の通りである。
Ｎ−（３−（Ｎ−（４−ブロモフェニル）スルファモイル）−４−メトキシフェニル）−４−メチルニコチンアミドの調製：
ステップ１  ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ（５ｍＬ）中の１−メトキシ−４−ニトロベンゼンＡ（６．２ｇ、４１ｍｍｏｌ）の溶液を０℃まで冷却し、クロロスルホン酸（４ｍＬ、６ｍｍｏｌ）を滴加して処理した。反応物を室温まで加温し、２時間還流し、次いで冷却した。水を注意深く加えて過剰のクロロスルホン酸を失活させた。固体の沈殿が観察され、これは、クロロホルムを加えて混合物を撹拌すると再び溶解した。有機層を分離して乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、濾過して濃縮し、２−メトキシ−５−ニトロベンゼン−１−スルホニルクロリドＢ（１．７８ｇ、７．０７ｍｍｏｌ、収率１７．５％）を得た。
ステップ２  Ｂ（１．７ｇ、６．８ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍＬ）中の４−ブロモアニリン（１．７ｇ、１０ｍｍｏｌ）で処理した。反応物に還流冷却器を取り付け、９０℃で１６時間撹拌した。ピリジンの大部分を回転蒸発により除去した。残留物をＥｔＯＡｃで希釈して、水、次いで塩水で洗った。有機層を分離して（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、濾過して濃縮し、精製して１．７ｇ（６５％）のＣを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔシステム）保持時間ｔ１（ショート）＝３．５０ｍｉｎ、Ｃ２６Ｈ２２Ｂｒ２Ｎ４ＮａＯ１０Ｓ２［２Ｍ＋Ｎａ］＋のＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値７９６．９、測定値７９６．８。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）８ｐｐｍ  １０．５４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），８．４９（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３８−７．４３（ｍ，３Ｈ），７．０９−７．０２（ｍ，２Ｈ），４．０１（ｓ，３Ｈ）。
ステップ３  Ｃ（０．９０ｇ、２．３０ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（２４ｍＬ）に溶解し、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（２．１ｇ、９．３ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を１時間還流して冷却し、約ｐＨ６まで１Ｎ  ＮａＯＨで処理した。おそらくスズ塩からなる白色懸濁液が観察された。ＥｔＯＡｃを加え、混合物を一晩激しく撹拌した。水層は依然として白色懸濁液であった。混合物をセライトに通して濾過し、有機層を分離して乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、濾過して濃縮した。アイソクラティック３５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン溶媒系を用いたフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーによる精製により、接近して溶出する非極性化合物を分離し、純粋なアニリンＤ（０．５６ｇ、１．５７ｍｍｏｌ、収率６７％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔシステム）保持時間ｔ１（ショート）＝２．７８ｍｉｎ、Ｃ１３Ｈ１４ＢｒＮ２０３Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋のＭＳ（ＥＳ１）ｍ／ｚ計算値３５７．０、測定値  ３５６．９。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）６  ９．９６（ｓ，４Ｈ），７．４４−７．３３（ｍ，８Ｈ），７．０９−６．９７（ｍ，１２Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ），６．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．８Ｈｚ，４Ｈ），５．０２（ｓ，１０Ｈ），４．０３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｓ，１２Ｈ），１．９９（ｓ，１Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）６  ９．９６（ｓ，１Ｈ），７．４２−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．０７−６．９８（ｍ，３Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．８Ｈｚ，１Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３１１）。
ステップ４  ５−アミノ−Ｎ−（４−ブロモフェニル）−２−メトキシベンゼンスルホンアミドＤ（７０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、４−メチルニコチン酸（８１ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）、２，４，６−トリプロピル−１，３，５，２，４，６−トリオキサトリホスフィナン２，４，６−トリオキシド（０．３７ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）（Ｔ３Ｐ（登録商標））およびトリエチルアミン（０．１１ｍＬ、０．７８ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を６０℃で４８時間撹拌した。冷却後、混合物（これはゲルになっていた。）を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離して濃縮し、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーにより精製して、Ｎ−（３−（Ｎ−（４−ブロモフェニルスルファモイル）−４−メトキシフェニル）−４−メチルニコチンアミド：３２ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ、３４％）を得た：ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔシステム）保持時間ｔ１（ロング）＝４．１３ｍｉｎ、Ｃ２０Ｈ１９ＢｒＮ３０４Ｓ［Ｍ＋Ｈｌ］＋のＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値４７６．０  測定値４７６．０；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．５８（ｓ，１Ｈ），１０．１７（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４３−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１０−７．０３（ｍ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），２．４４（ｓ，３１１）；Ｃ２０Ｈ１９ＢｒＮ３０４Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値４７６．０２７４  測定値４７６．０２８４。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
Ｒａｂ９プロモーター−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイのｑＨＴＳ。一次スクリーニングの目的で、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現させるために約１．５ｋｂのＲａｂ９プロモーターを用いてベクターを操作することによりプロモーターアッセイを開発した。したがって、Ｒａｂ９プロモーターの活性化は、ルシフェラーゼ発現をもたらす。このベクターを用いて、Ｒａｂ９ルシフェラーゼベクターを安定して発現させるＨｕｈ７細胞株を作製した。これらの細胞を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ−１６４０を含む培地内で増殖させ、維持した。１０％  ＦＢＳを追加したＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ還元血清培地中のアッセイのために、ＤＭＳＯ溶液中の２３ｎＬ／ウェルの試験化合物を含む１，５３６ウェル白色不透明プレートに、５μＬ中１，５００細胞／ウェルで細胞を播種した。アッセイプレートを３７℃で２４時間インキュベートし、その後、３μＬ／ウェルのＢｒｉｔｅＬｉｔｅおよびルシフェラーゼ検出試薬混合物（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を加えた。室温で１０分間インキュベートした後、ＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で発光シグナルを測定した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
異なるリソソーム蓄積症におけるリソソームの蓄積量を定量化するために、本発明者らは、特定のタイプの脂質に結合するいくつかの毒素を開発した。その受容体、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ３）の検出および定量化のための組換え大腸菌ベロ毒素サブユニットＢ（ＶＴＢ）の使用は上述した。本発明者らは、Ｃ末端にステップタグＩＩ配列を含むようにＶＴＢを再設計し、したがって、これは、さまざまなストレプトアビジン標識プローブと共に使用できる。本発明者らは、異なるレポーター；ＧＦＰ、ＲＦＰ、ルシフェラーゼ、ＳｔｒｅｐＴａｇに融合したオステロリシン（ｏｓｔｅｒｏｌｙｓｉｎ）Ａ（ＯｌｙＡ）の４つの異なるバージョンを設計した。さらに、本発明者らは、ガングリオシドＧＴ１ｂに結合する破傷風毒素断片Ｃ（ＴＴＣ）と、コレステロールを認識するｐｅｒｆｒｉｎｇｏｌｙｓｉｎ  Ｏ（ＰＦＯ）とに基づくプローブを構築した。上述の毒素プローブのそれぞれを大腸菌で発現させ、均一になるまで精製した。各リソソーム蓄積症に適切なプローブの組み合わせを決定するために、本発明者らは、異なるリソソーム蓄積障害の患者の細胞株をいくつか用いて、これらのプローブの評価を実施した。いくつかのリソソーム蓄積症は、特定の染色パターンを共有し、それらのエンドソーム／リソソーム内に類似の脂質が蓄積していることを示唆した。リソソーム蓄積症の大部分について最も強いシグナルを有する毒素は、ＯｌｙＡプローブおよびＶＴＢプローブである。したがって、それらをほとんどの検討で使用した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
それぞれの場合で、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００  Ｐｒｏにおいて、３６０／４６０ｎｍ励起／発光対で蛍光シグナルを読み取った。ファブリー病（突然変異Ｐ２５０Ｔ、Ｎ３４Ｓ、Ｎ２１５Ｓ）の３人の異なる患者由来の細胞において、実施例５０の化合物で処理した細胞におけるリソソームα−ガラクトシダーゼＡはそれぞれ、対照の１２２％、１８０％および１２９％であった。ウォルマン病患者由来の細胞では、実施例５０の化合物で処理した細胞におけるリソソーム酸リパーゼ活性は、対照の１８０％であった。クラッベ病患者由来の細胞では、実施例５０の化合物で処理した細胞におけるβ−ガラクトセレブロシダーゼ活性は、対照の１１４％であった。バッテン病患者由来の細胞では、実施例５０の化合物で処理した細胞におけるペプチダーゼＩＩ活性は、対照の１８５％であった。