【手続補正書】
【提出日】平成19年4月12日(2007.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された二本鎖ＲＮＡ分子であって、各ＲＮＡ鎖が１９〜２５塩基長を有し、少なくとも１つの鎖が１〜３塩基からなる３’突出部を有するものであり、該ＲＮＡ分子は標的特異的なＲＮＡ干渉が可能なものであり、かつ、３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して少なくとも７０％かつ１００％未満の同一性を有する配列からなる、上記ＲＮＡ分子。
【請求項２】
各鎖が、１９〜２３塩基長を有する、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】
３’突出部が分解に対して安定化されている、請求項１または２に記載のＲＮＡ分子。
【請求項４】
少なくとも１つの修飾されたリボヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項５】
修飾リボヌクレオチドが、糖、骨格鎖または核酸塩基修飾リボヌクレオチドから選択される、請求項４に記載のＲＮＡ分子。
【請求項６】
修飾リボヌクレオチドが、糖修飾リボヌクレオチドであり、２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ１、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮから選択される基で置換され、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、請求項４または５に記載のＲＮＡ分子。
【請求項７】
修飾リボヌクレオチドが、ホスホチオエート基を含む骨格鎖修飾リボヌクレオチドである、請求項４または５に記載のＲＮＡ分子。
【請求項８】
３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して少なくとも８５％かつ１００％未満の同一性を有する配列からなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項９】
下記のステップを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子の作製方法：
（ａ）各々が１９〜２５塩基長を有する２本のＲＮＡ鎖を合成するステップであって、このＲＮＡ鎖は二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができるものである、上記ステップ、
（ｂ）二本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で合成ＲＮＡ鎖を結合させるステップであって、得られる二本鎖ＲＮＡ分子は標的特異的なＲＮＡ干渉が可能なものである、上記ステップ。
【請求項１０】
ＲＮＡ鎖が化学的に合成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡ鎖が酵素により合成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
下記のステップを含む、細胞または生物（ヒトを除く。）において標的特異的なＲＮＡ干渉を媒介する方法：
（ａ）標的特異的なＲＮＡ干渉が起こりうる条件下で、上記細胞または生物を請求項１〜８のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップ、
（ｂ）上記二本鎖ＲＮＡと実質的に対応する配列部分を有する標的核酸に対する、上記二本鎖ＲＮＡにより引き起こされる標的特異的なＲＮＡ干渉を媒介するステップ。
【請求項１３】
接触ステップが、二本鎖ＲＮＡ分子を標的細胞に導入し、そこで標的特異的なＲＮＡ干渉を起こさせうるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
導入ステップが、キャリア媒介による送達または注射を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞または生物（ヒトを除く。）における遺伝子の機能を決定するための、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１６】
細胞または生物（ヒトを除く。）における遺伝子の機能を調節するための、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１７】
遺伝子が病理的状態と関連する、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
遺伝子が病原体関連遺伝子である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
遺伝子が自己免疫疾患関連遺伝子である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２２】
標的遺伝子特異的ノックアウト表現型を示す真核細胞またはヒト以外の真核生物であって、この細胞または生物が、内因性標的遺伝子の発現を阻害しうる少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子、または少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を阻害しうる少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡでトランスフェクトされているものであり、該二本鎖ＲＮＡ分子は、各ＲＮＡ鎖が１９〜２５塩基長を有し、少なくとも１つの鎖が１〜３塩基からなる３’突出部を有するものであり、かつ、３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して少なくとも７０％かつ１００％未満の同一性を有する配列からなる、上記細胞または生物。
【請求項２３】
哺乳動物細胞である、請求項２２に記載の細胞または生物。
【請求項２４】
ヒト細胞である、請求項２３に記載の細胞または生物。
【請求項２５】
３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して少なくとも８５％かつ１００％未満の同一性を有する配列からなる、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の細胞または生物。
【請求項２６】
標的タンパク質、または該標的タンパク質の変異体もしくは突然変異形態をコードする少なくとも１つの外因性標的核酸でさらにトランスフェクトされた、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の細胞または生物であって、この外因性標的核酸は、二本鎖ＲＮＡ分子による該外因性標的核酸の発現の阻害が、内因性標的遺伝子の発現より実質的に低いという点で、該内因性標的遺伝子とは核酸レベルで異なるものである、上記細胞または生物。
【請求項２７】
外因性標的核酸が、検出可能なペプチドまたはポリペプチドをコードするさらに別の核酸配列と融合される、請求項２６に記載の細胞または生物。
【請求項２８】
分析手法のための、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の細胞または生物の使用。
【請求項２９】
遺伝子発現プロフィールを分析するための、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
プロテオーム分析のための、請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
外因性標的核酸によってコードされる標識タンパク質の変異体または突然変異形態の分析が実施される、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
標的タンパク質の機能ドメインを同定するための、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
下記のものから選択される少なくとも２つの細胞または生物（ヒトを除く。）の比較を実施する、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の使用：
（ｉ）標的遺伝子阻害を含まない対照細胞または対照生物、
（ｉｉ）標的遺伝子阻害を含む細胞または生物、および
（ｉｉｉ）標的遺伝子阻害と、外因性標的核酸による標的遺伝子の相補を含む細胞または生物。
【請求項３４】
分析が、機能および／または表現型の分析を含む、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
調製手法のための、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の細胞または生物の使用。
【請求項３６】
真核細胞からタンパク質またはタンパク質複合体を単離するための、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
高分子量タンパク質複合体を単離するための、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
高分子量タンパク質複合体が核酸を含む、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
薬理学的物質を同定および／または特性決定する手法における、請求項２８〜３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
下記の（ａ）〜（ｃ）を含む、少なくとも１つの標的タンパク質に作用する薬理学的物質の同定および／または特性決定システム：
（ａ）少なくとも１つの標的タンパク質をコードする少なくとも１つの標的遺伝子を発現することができる、真核細胞またはヒト以外の真核生物、
（ｂ）上記少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を阻害することができる、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子であって、該二本鎖ＲＮＡ分子は、各ＲＮＡ鎖が１９〜２５塩基長を有し、少なくとも１つの鎖は１〜３塩基からなる３’突出部を有するものであり、かつ、３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して少なくとも７０％かつ１００％未満の同一性を有する配列からなる、上記ＲＮＡ分子、および
（ｃ）薬理学的特性を同定および／または特性決定しようとする、試験物質または試験物質のコレクション。
【請求項４１】
さらに下記の（ｄ）を含む、請求項４０に記載のシステム：
（ｄ）上記標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体もしくは突然変異形態をコードする少なくとも１つの外因性標的核酸であって、この外因性標的核酸は、二本鎖ＲＮＡ分子による発現の阻害が、上記内因性標的遺伝子の発現より実質的に低いという点で、該内因性標的遺伝子とは核酸レベルで異なるものである、上記外因性標的核酸。
【請求項４２】
３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して少なくとも８５％かつ１００％未満の同一性を有する配列からなる、請求項４０または４１に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本発明には、さらに、以下の態様が含まれる。
（１）単離された二本鎖ＲＮＡ分子であって、各ＲＮＡ鎖が１９〜２５塩基長を有し、該ＲＮＡ分子は標的特異的な核酸改変が可能なものである、上記ＲＮＡ分子。
（２）少なくとも１つの鎖が、１〜５塩基からなる３’突出部を有する、上記（１）に記載のＲＮＡ分子。
（３）標的特異的ＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化が可能である、上記（１）または（２）に記載のＲＮＡ分子。
（４）各鎖が、１９〜２３、特に２０〜２２塩基長を有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
（５）３’突出部が１〜３塩基からなる、上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
（６）３’突出部が分解に対して安定化されている、上記（２）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
（７）少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド類似体を含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
（８）修飾ヌクレオチド類似体が、糖または骨格鎖修飾リボヌクレオチドから選択される、上記（７）に記載のＲＮＡ分子。
（９）ヌクレオチド類似体が、糖修飾リボヌクレオチドであり、２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ１、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮから選択される基で置換され、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、上記（７）または（８）に記載のＲＮＡ分子。
（１０）ヌクレオチド類似体が、ホスホチオエート基を含む骨格鎖修飾リボヌクレオチドである、上記（７）または（８）に記載のＲＮＡ分子。
（１１）予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して、少なくとも５０％の同一性を有する配列を有する、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
（１２）同一性が少なくとも７０％である、上記（１１）に記載のＲＮＡ分子。
（１３）下記のステップを含む、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡ分子の作製方法：
（ａ）各々が１９〜２５塩基長を有する２本のＲＮＡ鎖を合成するステップであって、このＲＮＡ鎖は二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができるものである、上記ステップ、
（ｂ）二本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で合成ＲＮＡ鎖を結合させるステップであって、得られる二本鎖ＲＮＡ分子は標的特異的な核酸改変が可能なものである、上記ステップ。
（１４）ＲＮＡ鎖が化学的に合成される、上記（１３）に記載の方法。
（１５）ＲＮＡ鎖が酵素により合成される、上記（１３）に記載の方法。
（１６）下記のステップを含む、細胞または生物において標的特異的な核酸改変を媒介する方法：
（ａ）標的特異的な核酸改変が起こりうる条件下で、上記細胞または生物を請求項１〜１２のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップ、
（ｂ）上記二本鎖ＲＮＡと実質的に対応する配列部分を有する標的核酸に対する、上記二本鎖ＲＮＡにより引き起こされる標的特異的な核酸改変を媒介するステップ。
（１７）核酸改変がＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化である、上記（１６）に記載の方法。
（１８）接触ステップが、二本鎖ＲＮＡ分子を標的細胞に導入し、そこで標的特異的な核酸改変を起こさせうるステップを含む、上記（１６）または（１７）に記載の方法。
（１９）導入ステップが、キャリア媒介による送達または注射を含む、上記（１８）に記載の方法。
（２０）細胞または生物における遺伝子の機能を決定するための、上記（１６）〜（１９）のいずれかに記載の方法の使用。
（２１）細胞または生物における遺伝子の機能を調節するための、上記（１６）〜（１９）のいずれかに記載の方法の使用。
（２２）遺伝子が病理的状態と関連する、上記（２０）または（２１）に記載の使用。
（２３）遺伝子が病原体関連遺伝子である、上記（２２）に記載の使用。
（２４）遺伝子がウイルス遺伝子である、上記（２３）に記載の使用。
（２５）遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、上記（２２）に記載の使用。
（２６）遺伝子が自己免疫疾患関連遺伝子である、上記（２２）に記載の使用。
（２７）有効物質としての上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子と、薬学的キャリアを含む、医薬組成物。
（２８）診断用途に用いる上記（２７）に記載の組成物。
（２９）治療用途に用いる上記（２７）に記載の組成物。
（３０）標的遺伝子特異的ノックアウト表現型を示す真核細胞またはヒト以外の真核生物であって、この細胞または生物が、内因性標的遺伝子の発現を阻害しうる少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子、または少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を阻害しうる少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡでトランスフェクトされているものである、上記細胞または生物。
（３１）哺乳動物細胞である、上記（３０）に記載の細胞または生物。
（３２）ヒト細胞である、上記（３１）に記載の細胞または生物。
（３３）標的タンパク質、または該標的タンパク質の変異体もしくは突然変異形態をコードする少なくとも１つの外因性標的核酸でさらにトランスフェクトされた、上記（３０）〜（３２）のいずれかに記載の細胞または生物であって、この外因性標的核酸は、二本鎖ＲＮＡ分子による該外因性標的核酸の発現の阻害が、内因性標的遺伝子の発現より実質的に低いという点で、該内因性標的遺伝子とは核酸レベルで異なるものである、上記細胞または生物。
（３４）外因性標的核酸が、検出可能なペプチドまたはポリペプチドをコードするさらに別の核酸配列と融合される、上記（３３）に記載の細胞または生物。
（３５）分析手法のための、上記（３０）〜（３４）のいずれかに記載の細胞または生物の使用。
（３６）遺伝子発現プロフィールを分析するための、上記（３５）に記載の使用。
（３７）プロテオーム分析のための、上記（３５）に記載の使用。
（３８）外因性標的核酸によってコードされる標識タンパク質の変異体または突然変異形態の分析が実施される、上記（３５）〜（３７）のいずれかに記載の使用。
（３９）標的タンパク質の機能ドメインを同定するための、上記（３８）に記載の使用。
（４０）下記のものから選択される少なくとも２つの細胞または生物の比較を実施する、上記（３５）〜（３９）のいずれかに記載の使用：
（ｉ）標的遺伝子阻害を含まない対照細胞または対照生物、
（ｉｉ）標的遺伝子阻害を含む細胞または生物、および
（ｉｉｉ）標的遺伝子阻害と、外因性標的核酸による標的遺伝子の相補を含む細胞または生物。
（４１）分析が、機能および／または表現型の分析を含む、上記（３５）〜（４０）のいずれかに記載の使用。
（４２）調製手法のための、上記（３０）〜（３４）のいずれかに記載の使用。
（４３）真核細胞からタンパク質またはタンパク質複合体を単離するための、上記（４１）に記載の使用。
（４４）場合によっては核酸を含んでいてもよい高分子量タンパク質複合体を単離するための、上記（４３）に記載の使用。
（４５）薬理学的物質を同定および／または特性決定する手法における、上記（３５）〜（４４）のいずれかに記載の使用。
（４６）下記の（ａ）〜（ｃ）を含む、少なくとも１つの標的タンパク質に作用する薬理学的物質の同定および／または特性決定システム：
（ａ）少なくとも１つの標的タンパク質をコードする少なくとも１つの標的遺伝子を発現することができる、真核細胞またはヒト以外の真核生物、
（ｂ）上記少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を阻害することができる、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子、および
（ｃ）薬理学的特性を同定および／または特性決定しようとする、試験物質または試験物質のコレクション。
（４７）さらに下記の（ｄ）を含む、上記（４６）に記載のシステム：
（ｄ）上記標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体もしくは突然変異形態をコードする少なくとも１つの外因性標的核酸であって、この外因性標的核酸は、二本鎖ＲＮＡ分子による発現の阻害が、上記内因性標的遺伝子の発現より実質的に低いという点で、該内因性標的遺伝子とは核酸レベルで異なるものである、上記外因性標的核酸。
以下の図面および実施例を参照にしながら、本発明をさらに詳しく説明する。