(57)【要約】  本発明は、タンパク質などの被測定物質を測定する化学発光酵素免疫測定法に関する。本発明の化学発光酵素免疫測定法は、化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体と被測定物質とを含む免疫複合体を溶液層のない支持体上に捕捉するステップと、捕捉された免疫複合体の上に化学発光基質を含む支持膜を重ねるステップと、酵素標識抗体と化学発光基質との反応により生ずる発光量を検出することにより、被測定物質の量を測定するステップとを含む。本発明の化学発光酵素免疫測定法は、高感度な化学発光酵素免疫測定法を非液相型の反応系を用いて行うので、微量の検体で多項目の測定が出来る他、試薬の分注などの煩雑な手順を踏むことなく被測定物質を高感度に測定することができる。
2007052613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体および被測定物質を含む免疫複合体を溶液層のない支持体上に捕捉するステップと、
前記免疫複合体の上に、前記化学発光基質を含む支持膜を重ねるステップと、
前記酵素標識抗体と前記化学発光基質との反応により生ずる発光量を検出することにより、被測定物質の量を測定するステップと、
を含む、非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項２】
前記支持膜は透明または半透明である、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項３】
前記支持膜は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルまたはセルロースアセテート膜のいずれかである、請求項２記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項４】
前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項５】
前記免疫複合体の上に、化学発光増強剤を含む支持膜を重ねるステップをさらに含む、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項６】
前記化学発光増強剤を含む支持膜は、前記免疫複合体と前記化学発光基質を含む支持膜との間に置かれる、請求項５記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項７】
前記被測定物質はタンパク質または化学物質を含む、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項８】
前記測定するステップは、前記検出された発光量およびあらかじめ作成した検量線から、前記被測定物質の濃度を定量するステップを含む、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項９】
被測定物質を含む検体を注入される検体注入部、化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体を含む標識抗体保持部、前記被測定物質および前記酵素標識抗体を含む免疫複合体を捕捉する測定部、ならびに前記検体注入部、前記標識抗体保持部および前記測定部を配置される支持体を有する試験片と、
前記化学発光基質を含む支持膜と、
を有する、非液相型化学発光酵素免疫測定法を用いる測定キット。
【請求項１０】
前記試験片は、前記酵素標識抗体または前記免疫複合体を捕捉する第二の測定部を前記支持体上にさらに有する、請求項９記載の測定キット。
【請求項１１】
前記支持膜は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルまたはセルロースアセテート膜のいずれかである、請求項９記載の測定キット。
【請求項１２】
前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、請求項９記載の測定キット。
【請求項１３】
化学発光増強剤を含む支持膜をさらに有する、請求項９記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光酵素免疫測定法および測定キットに関し、特に、タンパク質などの生体成分を測定する非液相型化学発光酵素免疫測定法およびそれを用いる測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法（immunoassay）は、抗体が被測定物質（抗原）に対して特異的に結合する性質を利用した測定法である。代表的な免疫測定法として、酵素免疫測定法（enzyme immunoassay：ＥＩＡ）が一般的に知られている。酵素免疫測定法は、測定感度が数ｎｇ／ｍＬと高感度であり、がん関連タンパク質やウイルスなどの検査法として研究や臨床検査などに幅広く使用されている。また、最近では、１ｎｇ／ｍＬ以下の測定感度を必要とする項目があることや使用する検体量の微量化などによりさらなる高感度測定法が注目を浴び、化学発光酵素免疫測定法（chemiluminescent enzyme immunoassay：ＣＬＥＩＡ）が普及し始めている（例えば、特許文献１および特許文献２を参照）。【０００３】
従来の酵素免疫測定法および化学発光酵素免疫測定法では、タンパク質などの被測定物質に選択的に結合する特異抗体を、試験管や合成樹脂製の９６穴マイクロプレートなどの容器、合成樹脂製ビーズまたはフェライトなどの磁気性担体や磁気担体に固定して、被測定物質を液層中から選択的に取り出す方法が採られている。このような試験管やマイクロプレートなどの中で反応を行ない液層中に現れた色調または蛍光物質、発光物質を測定するものを液相型の測定法といい、試薬類の注入や排水などの測定手順が煩雑であり、測定機器が大型になるという問題点を有している。【０００４】
一方、非液相型の免疫測定法も開発されており、その代表例としてイムノクロマト法（immunochromatography）がある。イムノクロマト法は、被測定物質と標識抗体（金コロイド粒子やカラーラテックスなどの可視的な物質で標識されている）との免疫複合体を、試験片上の線状に抗体を配置した部分で集中的に捕捉し、捕捉された免疫複合体（色付きのラインとして出現する）を目視または光学的に読み取ることで被測定物質を測定する方法である（例えば、特許文献３を参照）。イムノクロマト法によれば、尿や血液などの検体を検体注入部に入れて、出現したラインを観察するだけで被測定物質のおおよその濃度を知ることができるので、操作が簡便である。イムノクロマト法の必要検体量は１００μＬ前後と比較的多いが、その測定感度は１ｎｇ／ｍＬ前後である。
【特許文献１】特開平３−５３８９７号公報
【特許文献２】特開２００１−２４９０７９号公報
【特許文献３】特許第３４８１８９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述の通り、化学発光酵素免疫測定法は、非常に高感度であり、微量タンパク質などの測定に使用されている。しかしながら、従来の化学発光酵素免疫測定法には、自動測定装置に適用すると、測定装置が大型かつ高価になってしまうという問題があった。すなわち、従来の化学発光酵素免疫測定法は、液相型の測定法のため、自動測定装置に適用しようとすると、検体および試薬の分注機構やＢ／Ｆ分離のための洗浄機構などの煩雑な機構が必要となる。その結果、従来の化学発光酵素免疫測定法を適用した測定装置は、大型かつ高価になってしまうのである。【０００６】
そこで、本発明者は、液相型の化学発光酵素免疫測定法の特徴（例えば、外部光の影響をほとんど受けないことや高感度であること）と、非液相型のイムノクロマト法の特徴（例えば、Ｂ／Ｆ分離のための洗浄工程が不要であること）とを併せ持つ免疫測定法の開発を検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、非液相型のイムノクロマト法に化学発光の原理を応用することを検討した。化学発光（chemiluminescence）は、酵素の触媒作用などにより励起された分子が、安定状態に戻るときにエネルギーとして光を放出する現象である。化学発光を利用した測定法では、一般的に、酵素、化学発光基質および化学発光増強剤を溶液中で混和して、溶液全体を発光させ、その発光量を測定する。特許文献１や特許文献２などに記載されている化学発光酵素免疫測定法は、この液相型の化学発光反応系を利用した免疫測定法である。【０００８】
本発明者は、イムノクロマト法における抗体の標識物質を可視的な金コロイドでなく化学発光基質に作用する酵素とすることで、非液相型の化学発光酵素免疫測定法を開発することを検討した。研究の結果、試験片上で捕捉された免疫複合体（酵素標識抗体を含む）を化学発光により測定するために、化学発光基質の溶液や化学発光増強剤の溶液を試験片上にアプライしても、生成した発光生成物は、免疫複合体周辺に固定されずに拡散してしまうため、安定した測定対象物にならないことがわかった。【０００９】
本発明者は、化学発光基質の溶液を試験片上に直接アプライするのではなく、化学発光基質を含む支持膜を試験片上に重ね合わせることで、支持膜上に安定して発光生成物を残せることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
また、本発明者は、化学発光増強剤を含む支持膜を試験片上に重ね合わせ、さらに化学発光基質を含む支持膜をその化学発光増強剤を含む支持膜の上に重ね合わせることで、化学発光増強剤を必要とする反応系においても化学発光増強剤がない場合と同様支持膜上に安定して発光生成物を残せることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明の第一は、以下に示される化学発光酵素免疫測定法に関する。
［１］化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体および被測定物質を含む免疫複合体を支持体上に捕捉するステップと、前記免疫複合体の上に、前記化学発光基質を含む支持膜を重ねるステップと、前記酵素標識抗体と前記化学発光基質との反応により生ずる発光量を検出して、被測定物質の量を測定するステップとを含む、非液相型化学発光酵素免疫測定法。
［２］前記支持膜は透明または半透明である［１］に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
［３］前記支持膜は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルまたはセルロースアセテート膜のいずれかである、［２］に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
［４］前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、［１］〜［３］に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
［５］前記免疫複合体の上に、化学発光増強剤を含む支持膜を重ねるステップをさらに含む、［１］〜［３］に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
［６］前記化学発光増強剤を含む支持膜は、前記免疫複合体と前記化学発光基質を含む支持膜との間に置かれる、［５］に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
［７］前記被測定物質はタンパク質または化学物質を含む、［１］〜［６］に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
［８］前記測定するステップは、前記検出された発光量およびあらかじめ作成した検量線から、前記被測定物質の濃度を定量するステップを含む、［１］〜［７］に記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。【００１２】
本発明の第二は、以下に示される測定キットに関する。
［９］被測定物質を含む検体を注入する検体注入部、化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体を含む標識抗体保持部、前記被測定物質および前記酵素標識抗体を含む免疫複合体を捕捉する測定部、ならびに前記検体注入部、前記標識抗体保持部および前記測定部を配置される支持体を有する試験片と、前記化学発光基質を含む支持膜とを有する、非液相型化学発光酵素免疫測定法を用いる測定キット。
［１０］前記試験片は、前記抗体または前記免疫複合体を捕捉する第二の測定部を前記支持体上にさらに有する、［９］に記載の測定キット。
［１１］前記支持体は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルまたはセルロースアセテート膜のいずれかである、［９］または［１０］に記載の測定キット。
［１２］前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、［９］〜［１１］に記載の測定キット。
［１３］化学発光増強剤を含む支持膜をさらに有する、［９］〜［１２］に記載の測定キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、非液相型の化学発光酵素免疫測定法を用いるので、試薬の分注や洗浄および攪拌などの煩雑な手順を踏むことなく被測定物質を高感度に測定することができる。また、本発明によれば、上記煩雑な手順を必要としないので、小型で低価格の測定装置を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施の形態１に係る測定キットの構成を示す模式図である。
【図２】本発明の実施の形態１に係る非液相型化学発光酵素免疫測定法の原理を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態２に係る測定キットの構成を示す模式図である。
【図４】本発明の実施の形態２に係る非液相型化学発光酵素免疫測定法の原理を示す図である。
【図５】本発明の非液相型化学発光酵素免疫測定法により、多項目同時測定を行う測定装置の例を示す図である。
【図６】実施例１の結果を示すグラフである。
【図７】実施例２の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の非液相型化学発光酵素免疫測定法では、化学発光基質を触媒する酵素で標識された抗体を用い、その酵素標識抗体と化学発光基質とを支持膜上で反応させることを特徴とする。これにより、反応生成物を支持膜上に留めおくことができる。
本明細書において、容器内で試薬溶液を反応させて化学発光を発生させる反応系を「液相型の反応系」といい、液相型の反応系を用いる従来の化学発光酵素免疫測定法を「液相型化学発光酵素免疫測定法」という。また、本発明者は、溶液層のない支持体上の酵素標識抗体の上に化学発光基質を含む支持膜を重ね、支持膜上で化学発光を発生させる反応系を「非液相型の反応系」と規定し、非液相型の反応系を用いる本発明の化学発光酵素免疫測定法を「非液相型化学発光酵素免疫測定法」と規定した。本発明の化学発光酵素免疫測定法（すなわち、非液相型化学発光酵素免疫測定法）は、試験管やマイクロプレートなどの容器を使用しなくても化学発光を発生させ安定してそれを保持することができる。【００１６】
本発明の化学発光酵素免疫測定法は、非液相型の反応系を用いてタンパク質や化学物質などの被測定物質を測定する。本明細書において「測定する」とは、被測定物質の濃度（量）を測定するだけではなく、被測定物質の有無を検出することを含む。【００１７】
本発明の化学発光酵素免疫測定法は、反応生成物を支持体上に拡散させずに支持膜上にとどめることができるため、被測定物質を安定して測定することができる。また、本発明の化学発光酵素免疫測定法は、液相型の化学発光酵素免疫測定法のように洗浄工程を必要としないので、緩衝溶液などの溶液を交換する手順が不要であり、簡便な手順で行うことができる。【００１８】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。【００１９】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係る測定キットの構成を示す図である。【００２０】
図１において、測定キット１００は、試験片２００、化学発光基質支持膜３００および化学発光増強剤支持膜４００を有する。【００２１】
試験片２００は、支持体２１０、検体注入部２２０、標識抗体保持部２３０、第一の測定部２４０、第二の測定部２５０および吸収部２６０を有する。検体注入部２２０、標識抗体保持部２３０、第一の測定部２４０、第二の測定部２５０および吸収部２６０は、支持体２１０上に形成されており、この順番に配置されることが好ましい。【００２２】
支持体２１０は、被検検体を毛細管現象により展開するための膜２１０−１を含み、膜２１０−１の例には、ニトロセルロース膜もしくはナイロン膜が挙げられる。支持体２１０は、強度を確保するため、膜２１０−１を貼り付けたサポート板２１０−２をさらに有していることが好ましい。サポート板２１０−２の例には、板ガラスまたは合成樹脂板などが挙げられる。支持体２１０に、溶液層がある必要はない。したがって、支持体に槽が形成されている必要もない。【００２３】
検体注入部２２０は、被検検体をアプライする箇所であり、例えばレーヨンの不織布や濾紙、綿布（脱脂綿）などで構成される。検体注入部２２０は、標識抗体保持部２３０に接触していることが好ましい。【００２４】
標識抗体保持部２３０は、酵素標識抗体２３２ならびに第一の測定部２４０および第二の測定部２５０に結合する物質で標識された抗体（以下「測定部結合物質標識抗体」という）２３４を移動可能な状態で含む部材であり、例えばグラスファイバーの不織布などである。標識抗体保持部２３０に含まれる酵素標識抗体２３２および測定部結合物質標識抗体２３４は、試験片の保存を容易にするため、乾燥していることが好ましい。【００２５】
酵素標識抗体２３２は、化学発光反応を触媒する酵素で標識されている、被測定物質に結合する抗体である。酵素標識抗体２３２は、被測定物質に直接結合する一次抗体でもよいし、他の抗体を介して被測定物質に結合する二次抗体や三次抗体などでもよい。【００２６】
酵素標識抗体２３２を標識する酵素は、化学発光基質支持膜３００に含まれる化学発光基質に応じて適宜選択すればよく、例えば、アルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase：以下「ＡＬＰ」と略記する）や、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase：以下「ＨＲＰ」と略記する）などである。【００２７】
測定部結合物質標識抗体２３４は、第一の測定部２４０および第二の測定部２５０に結合する物質で標識されている、被測定物質に結合する抗体である。例えば、第一の測定部２４０および第二の測定部２５０にビオチン特異的結合タンパク質であるアビジンまたはストレプトアビジンが固定されている場合、測定部結合物質標識抗体２３４は、ビオチンで標識された、被測定物質に結合する抗体である。【００２８】
標識抗体保持部２３０では、検体注入部２２０から移動してきた被検検体に含まれる被測定物質、酵素標識抗体２３２および測定部結合物質標識抗体２３４が結合し、免疫複合体が形成される。【００２９】
第一の測定部２４０は、標識抗体保持部２３０で形成された免疫複合体を捕捉する、バンド状またはドット状の部位である。第一の測定部２４０には、測定部結合物質標識抗体２３４に結合できる物質２４２が固定されていることが好ましい。例えば、測定部結合物質標識抗体がビオチンで標識された抗体の場合、第一の測定部２４０にはアビジンまたはストレプトアビジンが固定されていることが好ましい。第一の測定部２４０は、被測定物質に結合した測定部結合物質標識抗体２３４に結合して、免疫複合体を捕捉する。【００３０】
第二の測定部２５０は、第一の測定部２４０で捕捉されなかった免疫複合体を捕捉する、バンド状またはドット状の部位である。第二の測定部２５０は、第一の測定部２４０と同様に、測定部結合物質標識抗体に結合できる物質２５２が固定されており、被測定物質に結合した測定部結合物質標識抗体２３４に結合して、免疫複合体を捕捉する。【００３１】
吸収部２６０は、被検検体に含まれる液体（通常は水）を吸収する箇所であり、例えば濾紙などで構成される。【００３２】
化学発光基質支持膜３００は、化学発光基質を含む、乾式または湿式の支持膜である。化学発光基質支持膜３００は、酵素標識抗体２３２を標識する酵素と化学発光基質との反応による発光を測定する観点から、透明または半透明のものであることが好ましく、例えばアガロースゲルやポリアクリルアミドゲル、セルロースアセテート膜などである。アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどのゲルを用いる場合、これらのゲルは、ゲルサポート用の透明なポリエステルフィルムやポリエチレンフィルムなどに固定されることが好ましい。例えば、アガロースゲルについてはGel Bond Film（Cambrex社）、ポリアクリルアミドゲルについてはGel Bond PAG  Film（Cambrex社）などがある。【００３３】
化学発光基質支持膜３００に含まれる化学発光基質は、酵素標識抗体２３２を標識する酵素に応じて適宜選択すればよい。例えば、酵素標識抗体２３２を標識する酵素がＡＬＰの場合には、ＣＤＰ−ＳｔａｒやＣＳＰＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）などのジオキセタン系化合物などを化学発光基質として選択すればよい。また、酵素標識抗体２３２を標識する酵素がルシフェラーゼの場合には、ルシフェリン（同仁化学研究所など）などを化学発光基質として選択すればよい。また、酵素標識抗体２３２を標識する酵素がＨＲＰの場合には、ルミノール（ピアス社など）などを化学発光基質として選択すればよい。【００３４】
化学発光基質支持膜３００に化学発光基質を含ませるには、例えばアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどの場合、ゲルを製造するための組成物に化学発光基質を加えて、前記組成物を固化もしくは重合させればよい。また、セルロースアセテート膜の場合、セルロースアセテート膜に化学発光基質を含浸させた後、余分な化学発光基質を除去すればよい。【００３５】
化学発光増強剤支持膜４００は、化学発光増強剤を含む、乾式または湿式の支持膜である。化学発光増強剤支持膜４００は、例えばアガロースゲルやポリアクリルアミドゲル、セルロースアセテート膜、濾紙などである。【００３６】
化学発光増強剤支持膜４００に含まれる化学発光増強剤は、化学発光の反応系に応じて適宜選択すればよい。例えば、酵素標識抗体２３２を標識する酵素がＡＬＰの場合には、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロマイドやセチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロライド、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロライドなどの４級アンモニウム基を含む水溶性ポリマーまたはニトロブロック（トロピックス社）などを化学発光増強剤として選択すればよい。また、酵素標識抗体２３２を標識する酵素がルシフェラーゼの場合には、ＡＴＰなどを化学発光増強剤として選択すればよい。また、酵素標識抗体２３２を標識する酵素がＨＲＰの場合には、フェノールなどを化学発光増強剤として選択すればよい。【００３７】
化学発光増強剤支持膜４００に化学発光増強剤を含ませるには、例えばアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどの場合、ゲルを製造するための組成物に化学発光増強剤を加えて、前記組成物を固化もしくは重合させればよい。また、セルロースアセテート膜や濾紙などの場合、セルロースアセテート膜または濾紙に化学発光増強剤を含浸させた後、余分な化学発光増強剤を除去すればよい。【００３８】
なお、化学発光の反応系によっては、化学発光増強剤を必要としない場合がある。この場合、化学発光増強剤支持膜４００は不要である。また、化学発光基質を含む支持膜（化学発光基質支持膜３００）と化学発光増強剤を含む支持膜（化学発光増強剤支持膜４００）とを別個のものとして説明したが、一つの支持膜に化学発光基質および化学発光増強剤を含むようにしてもよい。この場合、化学発光基質および化学発光増強剤を含む支持膜は、例えばアガロースゲルやポリアクリルアミドゲル、セルロースアセテート膜、濾紙などである。化学発光基質と化学発光増強剤との比率は適宜調整すればよく、例えば化学発光基質：化学発光増強剤＝１：１０とすればよい。【００３９】
次に、図２の模式図を参照しながら、実施の形態１の測定キットで被測定物質を測定する原理を説明する。図２では、被検検体の溶媒を、説明の便宜上図示しない。【００４０】
被測定物質５００を含む被検検体を検体注入部２２０にアプライすると（図２Ａ）、被検検体は、毛細管現象により標識抗体保持部２３０および膜２１０−１表面を通り、吸収部２６０まで移動する。このとき、標識抗体保持部２３０では、被検検体に含まれる被測定物質５００、酵素標識抗体２３２および測定部結合物質標識抗体２３４が結合し、免疫複合体５１０が形成される。【００４１】
形成された免疫複合体５１０は、膜２１０−１表面を吸収部２６０に向けて移動する。免疫複合体５１０に含まれる測定部結合物質標識抗体２３４は第一の測定部２４０に結合するため、免疫複合体５１０の多くは第一の測定部２４０で捕捉される（図２Ｂ）。残りの免疫複合体５１０は、膜２１０−１表面を吸収部２６０に向けてさらに移動し、第二の測定部２５０で捕捉される（図２Ｂ）。【００４２】
第一の測定部２４０および第二の測定部２５０の上に化学発光増強剤支持膜４００を重ね合わせ、さらにその上に化学発光基質支持膜３００を重ね合わせると、酵素標識抗体２３２を標識する酵素が化学発光基質支持膜３００に含まれる基質に作用して、第一の測定部２４０および第二の測定部２５０で化学発光が生じる（図２Ｃ）。これらの化学発光を冷却ＣＣＤカメラや光電子倍増管などの光学的手段で検出することで、被検検体に含まれる被測定物質５００を測定することができる。このとき、第一の測定部２４０の発光量と第二の測定部２５０の発光量とを比較することにより、反応系の状態（例えば、プロゾーン現象の有無）を調べることができる。また、第一の測定部２４０の発光量をあらかじめ作成した検量線に当てはめることにより、被検検体中の被測定物質５００の濃度（量）を測定することができる。【００４３】
以上説明したように、本実施の形態に係る化学発光酵素免疫測定法および測定キットでは、化学発光基質および化学発光増強剤を溶液ではなく支持膜に含ませた状態で、酵素標識抗体を含む免疫複合体を捕捉した第一の測定部および第二の測定部の上に供給する。これにより、本実施の形態に係る化学発光酵素免疫測定法および測定キットは、高感度な化学発光酵素免疫測定法を簡便な非液相型の反応系を用いて実現することができる。【００４４】
（実施の形態２）
実施の形態１では、標識抗体保持部で被測定物質に測定部結合物質標識抗体を結合させて、第一の測定部および第二の測定部で免疫複合体を捕捉する例を示した。実施の形態２では、第一の測定部および第二の測定部に被測定物質に結合する抗体をあらかじめ固定して、第一の測定部および第二の測定部で免疫複合体を捕捉する例を示す。【００４５】
図３は、本発明の実施の形態２に係る測定キットの構成を示す図である。実施の形態１に係る測定キットと同じ構成要素については同一の符号を付し、重複箇所の説明を省略する。【００４６】
図３において、測定キット１１０は、試験片２０２、化学発光基質支持膜３００および化学発光増強剤支持膜４００を有する。化学発光基質支持膜３００および化学発光増強剤支持膜４００は、実施の形態１と同様のものである。【００４７】
試験片２０２は、支持体２１０、検体注入部２２０、標識抗体保持部２３６、第一の測定部２４４、第二の測定部２５４および吸収部２６０を有する。支持体２１０、検体注入部２２０および吸収部２６０は、実施の形態１と同様のものである。【００４８】
標識抗体保持部２３６は、酵素標識抗体２３２を移動可能な状態で含む部材である。標識抗体保持部２３６に含まれる酵素標識抗体２３２は、実施の形態１の酵素標識抗体と同様のものであり、乾燥していることが好ましい。標識抗体保持部２３６では、被検検体に含まれる被測定物質および酵素標識抗体２３２が結合し、免疫複合体が形成される。【００４９】
第一の測定部２４４は、実施の形態１の第一の測定部と同様に、標識抗体保持部２３６で形成された免疫複合体を捕捉する、バンド状またはドット状の部位である。第一の測定部２４０には、被測定物質に結合する捕捉抗体２４６が固定されている。第一の測定部２４４は、免疫複合体に含まれる被測定物質に結合して、免疫複合体を捕捉する。【００５０】
第二の測定部２５４は、実施の形態１の第二の測定部と同様に、第一の測定部２４４で捕捉されなかった免疫複合体を捕捉する、バンド状またはドット状の部位である。第二の測定部２５４には、第一の測定部２４４と同様に、被測定物質に結合する捕捉抗体２５６が固定されており、免疫複合体に含まれる被測定物質に結合して、免疫複合体を捕捉する【００５１】
次に、図４の模式図を参照しながら、実施の形態２の測定キットで被測定物質を測定する原理を説明する。図４では、被検検体の溶媒を、説明の便宜上図示しない。【００５２】
被測定物質５００を含む被検検体を検体注入部２２０にアプライすると（図４Ａ）、被検検体は、毛細管現象により標識抗体保持部２３６および膜２１０−１表面を通り、吸収部２６０まで移動する。このとき、標識抗体保持部２３６では、被検検体に含まれる被測定物質５００および酵素標識抗体２３２が結合し、免疫複合体５１０が形成される。【００５３】
形成された免疫複合体５１０は、膜２１０−１表面を吸収部２６０に向けて移動する。第一の測定部２４４に固定された捕捉抗体２４６は免疫複合体５１０に結合するため、免疫複合体５１０の多くは第一の測定部２４４で捕捉される（図４Ｂ）。残りの免疫複合体５１０は、膜２１０−１表面を吸収部２６０に向けてさらに移動し、第二の測定部２５４で捕捉される（図４Ｂ）。【００５４】
第一の測定部２４４および第二の測定部２５４の上に化学発光増強剤支持膜４００を重ね合わせ、さらにその上に化学発光基質支持膜３００を重ね合わせると、酵素標識抗体２３２を標識する酵素が化学発光基質支持膜３００に含まれる基質に作用して、第一の測定部２４４および第二の測定部２５４で化学発光が生じる（図４Ｃ）。これらの化学発光を冷却ＣＣＤカメラや光電子倍増管などの光学的手段で検出することで、被検検体に含まれる被測定物質５００を測定することができる。このとき、第一の測定部２４４の発光量と第二の測定部２５４の発光量とを比較することにより、反応系の状態（例えば、プロゾーン現象の有無）を調べることができる。また、第一の測定部２４４の発光量をあらかじめ作成した検量線に当てはめることにより、被検検体中の被測定物質５００の濃度（量）を測定することができる。【００５５】
以上説明したように、本実施の形態に係る測定キットは、第一の測定部および第二の測定部にあらかじめ捕捉抗体を固定して、第一の測定部および第二の測定部で免疫複合体を捕捉する。本実施の形態によれば、実施の形態１と同様の効果を得ることができる。【００５６】
なお、実施の形態１および実施の形態２では、第一の測定部および第二の測定部を設ける態様を示したが、測定部の数はこれに限定されず、１つまたは３つ以上であってもよい。【００５７】
また、実施の形態２では、第二の測定部に固定される捕捉抗体を被測定物質に結合する抗体としたが、第二の測定部に固定される捕捉抗体を酵素標識抗体に結合する抗体としてもよい。この場合、第一の測定部の上で化学発光が生じれば、被検検体に被測定物質が含まれていることがわかる。ただし、第一の測定部の上で化学発光が生じても、第二の測定部の上で化学発光が生じなければ、反応系が正常に動いていない可能性がある。また、第一の測定部の上で化学発光が生じなければ、被検検体に被測定物質が含まれていないことがわかる。ただし、第一の測定部だけでなく第二の測定部の上でも化学発光が生じなければ、反応系が正常に動いていない可能性があるので、被検検体に被測定物質が含まれていないと判断するべきではないことがわかる。【００５８】
（実施の形態３）
実施の形態１および実施の形態２では、一の試験片を使用して一種類の被測定物質を測定する例を示した。実施の形態３では、複数種の試験片を同時に使用して、複数種の被測定物質を１回のサンプリングで測定する例を示す。【００５９】
図５は、本発明の実施の形態３に係る測定装置の構成を示す模式図である。【００６０】
図５において、測定装置６００は、複数の試験片６１０ａ〜６１０ｄ、中心検体注入部６２０、化学発光増強剤支持膜格納部６３０、化学発光基質支持膜格納部６４０、支持台６５０および検出部６６０を有する。【００６１】
試験片６１０ａ〜６１０ｄは、実施の形態１または実施の形態２の試験片と同様のものである。各試験片は、それぞれ異なる試験項目に対応しており、それぞれ異なる被測定物質を測定する。例えば、試験片６１０ａをミオグロビンに対応するものとし、試験片６１０ｂをトロポニンＴに対応するものとし、試験片６１０ｃをトロポニンＩに対応するものとし、試験片６１０ｄをＣＫ−ＭＢに対応するものとすることで、１回の少ないサンプリングで心筋梗塞マーカーと呼ばれる４項目を一度に測定することができる。このため心筋梗塞の病態解析をより早くすることができるため、治療法の選択、予後の判定に欠かせないものとなる。【００６２】
中心検体注入部６２０は、被検検体をアプライする箇所であり、例えばレーヨンの不織布や濾紙、綿布（脱脂綿）などで構成される。中心検体注入部６２０は、各試験片６１０ａ〜６１０ｄの共通の検体注入部である。【００６３】
化学発光増強剤支持膜格納部６３０は、各試験片６１０ａ〜６１０ｄに重ね合わせる化学発光増強剤支持膜を格納している容器である。【００６４】
化学発光基質支持膜格納部６４０は、各試験片６１０ａ〜６１０ｄに重ね合わせる化学発光基質支持膜を格納している容器である。【００６５】
支持台６５０は、各試験片６１０ａ〜６１０ｄを同一平面状に放射状に配置する円板状の部材である。支持台６５０は、回転可能に設けられている。【００６６】
検出部６６０は、各試験片６１０ａ〜６１０ｄ上で生じる化学発光の発光量を検出する。検出部６６０は、例えば冷却ＣＣＤカメラである。【００６７】
次に、上記測定装置が、一の被検検体から複数種の被測定物質を測定する動作を説明する。【００６８】
支持台６５０上に各試験片６１０ａ〜６１０ｄを配置して、中心検体注入部６２０に被検検体をアプライすると、各試験片６１０ａ〜６１０ｄ上で免疫複合体が形成され、形成された免疫複合体は第一の測定部および第二の測定部で捕捉される。化学発光増強剤支持膜格納部６３０および化学発光基質支持膜格納部６４０が、化学発光増強剤支持膜および化学発光基質支持膜を各試験片６１０ａ〜６１０ｄ上に重ね合わせた後、検出部６６０は、支持台６５０を回転させながら、経時的に各試験片６１０ａ〜６１０ｄの発光量を検出する。検出結果は、出力部（図示せず）によりプリントアウトされる。このとき、出力部は、発光量の検出結果ではなく、検出結果から算出した各被測定物質の濃度をプリントアウトしてもよい。【００６９】
以上説明したように、実施の形態３に係る測定装置は、複数種の試験片を使用して複数種の被測定物質を測定する。本実施の形態によれば、実施の形態１の効果に加えて、１回のサンプリングで複数項目について同時に測定することができる。例えば、本実施の形態によれば、５０μＬの被検検体で５〜１０項目について同時に測定することができる。【００７０】
以下、本発明を実施例を参照してさらに説明する。なお、本発明の範囲は、本実施例により限定して解釈されない。
【実施例１】
【００７１】
実施例１では、実施の形態１の態様の測定キットを用いて、前立腺特異抗原（prostate-specific antigen：以下「ＰＳＡ」と略記する）を測定した例を示す。【００７２】
（１）測定キット
本実施例では、支持体としてニトロセルロース膜（縦２５ｍｍ×横５ｍｍ×厚さ０.２ｍｍ）を使用し、検体注入部として濾紙（縦２０ｍｍ×横５ｍｍ×厚さ１ｍｍ）を使用し、標識抗体保持部としてグラスファイバー（縦７ｍｍ×横５ｍｍ×厚さ０.８ｍｍ）を使用し、吸収部として濾紙（縦１８ｍｍ×横５ｍｍ×厚さ１ｍｍ）を使用した。検体注入部と標識抗体保持部は接触させ、標識抗体保持部と第一の測定部との間隔を６ｍｍとし、第一の測定部と第二の測定部との間隔を４ｍｍとし、第二の測定部と吸収部との間隔を８ｍｍとした。第一の測定部および第二の測定部には、ストレプトアビジン（和光純薬工業社）を固定した。酵素標識抗体としてＡＬＰ標識抗ヒトＰＳＡマウスモノクローナル抗体（シバヤギ社）を使用し、測定部結合物質標識抗体としてビオチン標識抗ヒトＰＳＡマウスモノクローナル抗体（自社製）を使用した。化学発光基質支持膜としてＣＤＰ−Ｓｔａｒ（０.２５ｍＭ：ロシュ・ダイアグノスティックス社）を含浸させたセルロースアセテート膜（縦２ｍｍ×横７ｍｍ×厚さ０.１ｍｍ）を使用し、化学発光増強剤支持膜としてニトロブロックII（１０％（ｖ/ｖ）：トロピックス社）を含浸させたセルロースアセテート膜（縦１.５ｍｍ×横７ｍｍ×厚さ０.１ｍｍ）を使用した。【００７３】
（２）被検検体
本実施例では、ＰＳＡを測定対象とした。ＰＢＳでＰＳＡ（International Immunology Corporation（ＩＩＣ社））の希釈系列（０，０.００１，０.１００ｎｇ／ｍＬ）を作製して、被検検体とした。【００７４】
（３）測定
（２）で用意した各濃度の被検検体（２０μＬ）をそれぞれ異なる試験片の検体注入部に滴下した。滴下して５分後に、試験片の第一の測定部および第二の測定部の上に、化学発光増強剤支持膜を重ね合わせ、さらに化学発光基質支持膜を重ね合わせた。その後、冷却ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社：Ｃ４７４２−９５）を用いて、第一の測定部および第二の測定部における発光量を１０秒ごとに２時間測定した。【００７５】
（４）結果
図６は、測定した発光量の経時変化を示すグラフである。ＰＳＡの濃度が０ｎｇ／ｍＬの場合、発光量の変化はほとんど観察されなかった。一方、ＰＳＡが存在する場合（０.００１，０.１００ｎｇ／ｍＬ）、発光量は時間の経過と共に上昇し、ある程度時間が経過すると飽和して一定値に達した。また、ＰＳＡの濃度が高いほど、より強い発光量が観察された。この結果から、任意の時間における発光量の変化率を算出して、ＰＳＡの濃度と発光量の関係を示す検量線を作成することができる。このように、本発明の化学発光酵素免疫測定法は、少量の被検検体で高感度（０.００１ｎｇ／ｍＬ以下）に被測定物質を測定できることがわかる。
【実施例２】
【００７６】
実施例２では、実施の形態２の態様の測定キットを用いて、肝がんマーカーであるアルファフェトプロテイン（alpha-fetoprotein：以下「ＡＦＰ」と略記する）を測定した例を示す。【００７７】
（１）測定キット
本実施例では、支持体としてニトロセルロース膜（縦２５ｍｍ×横５ｍｍ×厚さ０.２ｍｍ）を使用し、検体注入部として濾紙（縦２０ｍｍ×横５ｍｍ×厚さ１ｍｍ）を使用し、標識抗体保持部としてグラスファイバー（縦７ｍｍ×横５ｍｍ×厚さ０.８ｍｍ）を使用し、吸収部として濾紙（縦１８ｍｍ×横５ｍｍ×厚さ１ｍｍ）を使用した。検体注入部と標識抗体保持部は接触させ、標識抗体保持部と第一の測定部との間隔を６ｍｍとし、第一の測定部と第二の測定部との間隔を４ｍｍとし、第二の測定部と吸収部との間隔を８ｍｍとした。第一の測定部および第二の測定部には、抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体（ＩＩＣ社）を固定した。酵素標識抗体としてＡＬＰ標識抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体（シバヤギ社）を使用した。化学発光基質支持膜としてＣＤＰ−Ｓｔａｒ（０.２５ｍＭ：ロシュ・ダイアグノスティックス社）を含浸させたセルロースアセテート膜（縦２ｍｍ×横７ｍｍ×厚さ０.１ｍｍ）を使用し、化学発光増強剤支持膜としてニトロブロックII（１０％（ｖ/ｖ）：トロピックス社）を含浸させたセルロースアセテート膜（縦１.５ｍｍ×横７ｍｍ×厚さ０.１ｍｍ）を使用した。【００７８】
（２）被検検体
本実施例では、ＡＦＰを測定対象とした。ＰＢＳでＡＦＰ（ＩＩＣ社）の希釈系列（０，０.０１０，０.１００，１.０００ｎｇ／ｍＬ）を作製して、被検検体とした。【００７９】
（３）測定
（２）で用意した各濃度の被検検体（２０μＬ）をそれぞれ異なる試験片の検体注入部に滴下した。滴下して５分後に、試験片の第一の測定部および第二の測定部の上に、化学発光増強剤支持膜を重ね合わせ、さらに化学発光基質支持膜を重ね合わせた。その後、冷却ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社：Ｃ４７４２−９５）を用いて、第一の測定部および第二の測定部における発光量を１０秒ごとに２時間測定した。【００８０】
（４）結果
図７は、測定した発光量の経時変化を示すグラフである。ＡＦＰの濃度が０ｎｇ／ｍＬの場合、発光量の変化はほとんど観察されなかった。一方、ＡＦＰが存在する場合（０.０１０〜１.０００ｎｇ／ｍＬ）、発光量は時間の経過と共に上昇し、ある程度時間が経過すると飽和して一定値に達した。また、ＡＦＰの濃度が高いほど、より強い発光量が観察された。この結果から、任意の時間における発光量の変化率を算出して、ＡＦＰの濃度と発光量の関係を示す検量線を作成することができる。このように、本発明の化学発光酵素免疫測定法は、少量の被検検体で高感度（０.０１０ｎｇ／ｍＬ以下）に被測定物質を測定できることがわかる。【００８１】
本願は、２００５年１０月３１日出願の特願２００５−３４２７８５に基づく優先権を主張する。当該出願明細書に記載された内容はすべて、本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の化学発光酵素免疫測定法は、高感度な化学発光酵素免疫測定法を簡便な非液相型の反応系を用いて行うので、試薬の分注回数が少なくかつ小型のベッドサイド検査法として有用である。また、本発明の測定キットは、従来のイムノクロマト法に比べて１００〜１０００倍高感度であるため、試験片を超小型に作製することができ、かつ抗体および化学発光基質の使用量を少なくすることができる。また高感度測定の点から使用する検体（抗原）をあらかじめ希釈して使用できるので、結局患者から採血する血液量が例えば１０μＬとしても１０倍希釈することで、同時にいくつかの項目を同時に測定できる。さらに、本発明の化学発光酵素免疫測定法は、煩雑な手順を必要としないので、小型で低価格の測定装置に適用することができる。
【図１】
2007052613.tif 000003
【図２】
2007052613.tif 000004
【図３】
2007052613.tif 000005
【図４】
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【図５】
2007052613.tif 000007
【図６】
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【図７】
2007052613.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月31日(2007.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体および被測定物質を含む免疫複合体を溶液層のない支持体上に捕捉するステップと、
前記免疫複合体の上に、前記化学発光基質を含む支持膜を重ねるステップと、
前記酵素と前記化学発光基質とを反応させて、化学発光を発生させる反応生成物を前記支持膜に生成させるステップと、
前記支持膜に位置する前記反応生成物から生ずる発光量を検出することにより、被測定物質の量を測定するステップと、
を含む、非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項２】
前記支持膜は透明または半透明である、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項３】
前記支持膜は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルまたはセルロースアセテート膜のいずれかである、請求項２記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項４】
前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項５】
前記免疫複合体の上に、化学発光増強剤を含む支持膜を重ねるステップをさらに含む、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項６】
前記化学発光増強剤を含む支持膜は、前記免疫複合体と前記化学発光基質を含む支持膜との間に置かれる、請求項５記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項７】
前記被測定物質はタンパク質または化学物質を含む、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項８】
前記測定するステップは、前記検出された発光量およびあらかじめ作成した検量線から、前記被測定物質の濃度を定量するステップを含む、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【請求項９】
被測定物質を含む検体を注入される検体注入部、化学発光基質に作用する酵素で標識された酵素標識抗体を含む標識抗体保持部、前記被測定物質および前記酵素標識抗体を含む免疫複合体を捕捉する測定部、前記検体に含まれる液体を吸収する吸収部、ならびに前記検体注入部、前記標識抗体保持部、前記測定部および前記吸収部を配置される支持体を有する試験片と、
前記化学発光基質を含み、かつ前記吸収部と別個に用意された支持膜と、
を有する、非液相型化学発光酵素免疫測定法を用いる測定キット。
【請求項１０】
前記試験片は、前記酵素標識抗体または前記免疫複合体を捕捉する第二の測定部を前記支持体上にさらに有する、請求項９記載の測定キット。
【請求項１１】
前記支持膜は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルまたはセルロースアセテート膜のいずれかである、請求項９記載の測定キット。
【請求項１２】
前記支持膜は化学発光増強剤をさらに含む、請求項９記載の測定キット。
【請求項１３】
化学発光増強剤を含む支持膜をさらに有する、請求項９記載の測定キット。
【請求項１４】
前記支持膜は、前記支持体と別個に用意されたものである、請求項１記載の非液相型化学発光酵素免疫測定法。
【国際調査報告】
2007052613.tif 000010
2007052613.tif 000011
2007052613.tif 000012
2007052613.tif 000013