(57)【要約】  ＦＵＴ８の遺伝子の発現量の抑制、ＦＵＴ８タンパク質発現量の抑制、および／またはＦＵＴ８の作用産物の発現量の抑制のための手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡまたは前記ＲＮＡに相補的な配列を有する、細胞内においてα１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡ。
【請求項２】
配列番号５〜８いずれか記載の塩基配列を含有する請求項１記載のＲＮＡ。
【請求項３】
ＲＮＡが３’末端に２〜４残基の連続するデオキシチミジン残基を有することを特徴とする請求項１記載のＲＮＡ。
【請求項４】
請求項１記載のＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなり、かつ、細胞内においてα１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡ。
【請求項５】
請求項１記載のＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡからなる、細胞内においてα１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうる二本鎖ＲＮＡ。
【請求項６】
（１）プロモーターの下流に配置された配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）プロモーターの下流に配置された前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を含有し、かつ細胞内で前記の両核酸にコードされるＲＮＡが転写されうるように構築された核酸構築物。
【請求項７】
（１）配列番号５〜８いずれか記載の塩基配列を含有するＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）前記ＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡをコードする核酸を含有する請求項６記載の核酸構築物、
【請求項８】
プロモーターの下流に配置された、配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有し、かつ、細胞内で前記のＲＮＡが転写されうるように構築されていることを特徴とする核酸構築物。
【請求項９】
配列番号５〜８いずれか記載の塩基配列を含有するＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有する請求項８記載の核酸構築物。
【請求項１０】
プラスミドベクター、ウイルスベクターから選択されるベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項６または８記載の核酸構築物。
【請求項１１】
請求項１記載のＲＮＡ、請求項４または５記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項６または８記載の核酸構築物のいずれかを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１２】
α１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡ、もしくは前記ＲＮＡを細胞内で発現しうる核酸構築物を含有してなるがんの治療に使用される医薬組成物。
【請求項１３】
α１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡが、
（Ａ）配列番号９記載の塩基配列のうちの連続する１３〜２９ヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するＲＮＡ、
（Ｂ）（Ａ）記載のＲＮＡと、当該ＲＮＡに相補的なＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、または
（Ｃ）（Ａ）記載のＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡ、
のいずれかである請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
α１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡが、
（Ａ）配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するＲＮＡ、
（Ｂ）（Ａ）記載のＲＮＡと、当該ＲＮＡに相補的なＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、または
（Ｃ）（Ａ）記載のＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡ、
のいずれかである請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
３’末端に２〜４残基の連続するデオキシチミジン残基を有するＲＮＡを含有してなる請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１６】
核酸構築物が、（１）プロモーターの下流に配置された配列番号９記載の塩基配列のうちの連続する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）プロモーターの下流に配置された前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を含有し、かつ細胞内で前記の両核酸にコードされるＲＮＡが転写されうるように構築された核酸構築物である請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１７】
核酸構築物が、（１）プロモーターの下流に配置された配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）プロモーターの下流に配置された前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を含有する核酸構築物である請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
核酸構築物が、プロモーターの下流に配置された配列番号９記載の塩基配列のうちの連続する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有し、かつ、細胞内で前記のＲＮＡが転写されうるように構築されている請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１９】
核酸構築物が、プロモーターの下流に配置された、配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有する核酸構築物である請求項１８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の発現を抑制するための組成物、該組成物を用いたがん細胞増殖抑制方法、該方法のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの遺伝子治療は、長年にわたって研究されており、現実に臨床研究も開始されている。さらに、アンチセンス技術やリボザイム技術を用いたＲＮＡベースの治療技術も開発されつつある。【０００３】
一方、１９９８年に報告された線虫におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡによって配列特異的なｍＲＮＡ分解が生じることによる遺伝子発現の抑制現象として注目されている（例えば、非特許文献１参照）。前記ＲＮＡ干渉は、長鎖２本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩタイプの活性によりｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる２１〜２５ヌクレオチドの短鎖ＲＮＡに分解され、続いて、該ｓｉＲＮＡが、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるリボ核酸タンパク質複合体に組み込まれ、標的ＲＮＡにＡＴＰ依存的に結合し、標的ＲＮＡを分解するというメカニズムにより起こると考えられている（例えば、非特許文献２〜７参照）。その後、哺乳動物細胞でもＲＮＡ干渉を応用して遺伝子発現を抑制することが可能であることが報告されている（例えば、非特許文献８、９参照）。ＲＮＡ干渉による遺伝子発現制御（ノックダウン）は、外部から導入した遺伝子の発現を制御した報告は多く見られるが、定常状態で発現している内在性の遺伝子発現のノックダウンの報告は少ない。【０００４】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＧＤＰ−Ｌ−Ｆｕｃ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ  α１，６−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＦＵＴ８）は糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖の生合成に関与する糖転移酵素であり、Ｎ−結合型複合型糖鎖中の、アスパラギンに結合したＮ−アセチルグルコサミン残基の６位にフコースを付加する反応を触媒する。すでにマウス、ヒトのＦＵＴ８をコードする遺伝子が単離され、その塩基配列が明らかにされている（非特許文献１０、１１）。抗体の糖鎖修飾を改変するためにＦＵＴ８遺伝子がノックアウトされた細胞が作成されている（特許文献１）。また、同様の目的でＦＵＴ８遺伝子のノックダウンに関する報告があるが（非特許文献１２）、ＦＵＴ８の発現抑制効率は低い（５６−６５％）。【０００５】
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、肝臓で産生される糖タンパク質で胎児期には血清中に分泌されるが、健常な成人の血清中にはほとんど検出されない。ところが、成人でも肝炎や肝がんなどの肝疾患になると血清中のＡＦＰ量は上昇する。肝細胞がん患者の場合、ＦＵＴ８の作用によるフコース結合ＡＦＰ（ＡＦＰ  Ｌ３分画と称される）の量が上昇することが知られており肝細胞がんのマーカーとなっている。しかし、ＦＵＴ８と肝がんの関係は単純ではなく、肝がん患者の血清中のＦＵＴ８の活性は必ずしも健常人より高いとは限らず、肝がん患者で増加することが知られている血清中フコース結合糖タンパク質の生産には、ＦＵＴ８だけでなく別の酵素等との協調作用が必要であると考えられている（非特許文献１３）。また、これまでのところＦＵＴ８の発現制御が疾病の治療に有効であるとの知見は得られていない。【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２２４２４０号公報
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ（ネイチャー）、第３９１巻、第８０６〜８１１頁（１９９８年）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ、第４０９巻、第３６３〜３６６頁（２００１年）
【非特許文献３】Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ジーンズ・アンド・デベロプメント）、第１３巻、第３１９１〜３１９７頁（１９９９年）
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ（セル）、第１０１巻、第２５〜３３頁（２０００年）
【非特許文献５】Ｃｅｌｌ、第１０７巻、第３０９〜３２１頁（２００１年）
【非特許文献６】Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１５巻、第１８８〜２００頁（２００１年）
【非特許文献７】Ｃｅｌｌ、第１０７巻、第２９７〜３０７頁（２００１年）
【非特許文献８】Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、第４９４〜４９８頁（２００１年）
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（プロシ−ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ）、第９８巻、第９７４２〜９７４７頁（２００１年）
【非特許文献１０】ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＮＡシークエンス）、第１１巻、第９０〜９６頁（２０００年）
【非特許文献１１】Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー）、第１２１巻、第６２６〜６３２頁（１９９７年）
【非特許文献１２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．（バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング）、第８８巻、第９０１〜９０８頁（２００４年）
【非特許文献１３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（キャンサー・リサーチ）、第６３巻、第６２８２〜６２８９頁（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＦＵＴ８の遺伝子の発現量を抑制すること、ＦＵＴ８タンパク質発現量を抑制すること、ＦＵＴ８の作用産物の発現量を抑制すること等の少なくとも１つを達成しうる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究を行い、細胞内においてＦＵＴ８の発現を抑制することのできるＲＮＡを明らかにし、さらに、前記ＲＮＡを細胞内において転写する核酸構築物を開発した。さらに、前記のＲＮＡや核酸構築物を利用したＦＵＴ８の機能の抑制によってがん細胞の増殖を抑制できることを明らかにし、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］  配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡまたは前記ＲＮＡに相補的な配列を有する、細胞内においてα１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡ、
［２］  配列番号５〜８いずれか記載の塩基配列を含有する［１］のＲＮＡ、
［３］  ＲＮＡが３’末端に２〜４残基の連続するデオキシチミジン残基を有することを特徴とする［１］または［２］のＲＮＡ、
［４］  ［１］〜［３］いずれかのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなり、かつ、細胞内においてα１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡ、
［５］  ［１］〜［３］いずれかのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡからなる、細胞内においてα１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうる二本鎖ＲＮＡ、
［６］  （１）プロモーターの下流に配置された配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）プロモーターの下流に配置された前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を含有し、かつ細胞内で前記の両核酸にコードされるＲＮＡが転写されうるように構築された核酸構築物、
［７］  （１）配列番号５〜８いずれか記載の塩基配列を含有するＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）前記ＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡをコードする核酸を含有する［６］の核酸構築物、
［８］  プロモーターの下流に配置された、配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有し、かつ、細胞内で前記のＲＮＡが転写されうるように構築されていることを特徴とする核酸構築物、
［９］  配列番号５〜８いずれか記載の塩基配列を含有するＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有する［８］の核酸構築物、
［１０］  プラスミドベクター、ウイルスベクターから選択されるベクターに組み込まれていることを特徴とする［６］〜［９］いずれかの核酸構築物、
［１１］  ［１］〜［３］のＲＮＡ、［４］および［５］の二本鎖ＲＮＡ、［６］〜［１０］の核酸構築物のいずれかを有効成分として含有する医薬組成物、
［１２］  α１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡ、もしくは前記ＲＮＡを細胞内で発現しうる核酸構築物を含有してなるがんの治療に使用される医薬組成物、
［１３］  α１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡが、
（Ａ）配列番号９記載の塩基配列のうちの連続する１３〜２９ヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するＲＮＡ、
（Ｂ）（Ａ）記載のＲＮＡと、当該ＲＮＡに相補的なＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、または
（Ｃ）（Ａ）記載のＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡ、
のいずれかである［１２］の医薬組成物、
［１４］  α１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡが、
（Ａ）配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するＲＮＡ、
（Ｂ）（Ａ）記載のＲＮＡと、当該ＲＮＡに相補的なＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、または
（Ｃ）（Ａ）記載のＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡ、
のいずれかである［１３］の医薬組成物、
［１５］  ３’末端に２〜４残基の連続するデオキシチミジン残基を有するＲＮＡを含有してなる［１３］または［１４］の医薬組成物、
［１６］  核酸構築物が、（１）プロモーターの下流に配置された配列番号９記載の塩基配列のうちの連続する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）プロモーターの下流に配置された前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を含有し、かつ細胞内で前記の両核酸にコードされるＲＮＡが転写されうるように構築された核酸構築物である［１２］の医薬組成物、
［１７］  核酸構築物が、（１）プロモーターの下流に配置された配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）プロモーターの下流に配置された前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を含有する核酸構築物である［１６］の医薬組成物、
［１８］  核酸構築物が、プロモーターの下流に配置された配列番号９記載の塩基配列のうちの連続する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有し、かつ、細胞内で前記のＲＮＡが転写されうるように構築されている［１２］の医薬組成物、
［１９］  核酸構築物が、プロモーターの下流に配置された、配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有する核酸構築物である［１８］の医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞内におけるＦＵＴ８の発現抑制に使用できるＲＮＡ、ならびに前記のＲＮＡを細胞内で発現させることのできる核酸構築物が提供される。前記のＲＮＡ、核酸構築物によれば、ＦＵＴ８の発現の抑制を通じて細胞における糖タンパク質の糖鎖を改変することが可能となること、もしくは糖タンパク質の生成および機能を制御することが可能となる。さらに、ＦＵＴ８発現がん細胞の増殖を優先的に抑制させることができることから、本発明はがんの治療に利用できるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の核酸構築物を導入された細胞の増殖を示す図である。
【図２】本発明の核酸構築物を導入された細胞の増殖を示す図である。
【図３】本発明の核酸構築物を導入された細胞の増殖を示す図である。
【図４】本発明の核酸構築物を導入された細胞の増殖を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明を具体的に説明する。
（１）本発明のＲＮＡ
本発明の１つの側面は、α１、６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の発現を抑制しうるＲＮＡに関する。本発明は特定の原理に基づくものに限定されるものではないが、前記のＲＮＡはＦＵＴ８のｍＲＮＡを標的とし、当該ｍＲＮＡの分解、もしくは当該ＲＮＡからのポリペプチドの翻訳の阻害により、ＦＵＴ８の機能を抑制することができる。【００１３】
本明細書において、「フコシルトランスフェラーゼ遺伝子」とは、α１、６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするものであれば特に限定はない。例えば、ヒトのＦＵＴ８をコードする遺伝子のエキソン１〜１１の領域が例示される。前記領域は配列表の配列番号９に示す塩基配列のｍＲＮＡをコードしており、本発明のＲＮＡ（すなわち、ＦＵＴ８の発現を抑制しうるＲＮＡ）の標的として好適である。さらに、前記配列番号９において塩基の付加、置換、欠失、挿入等を有する配列の領域も本発明のＲＮＡの標的となりうる。なお、ＦＵＴ８のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｄ８９２８９（ヒトＦＵＴ８）、ＡＢ０２５１９８（マウスＦＵＴ８）等として開示されている。【００１４】
本明細書において、「ＦＵＴ８の発現を抑制しうる」とは、特に限定されないが、ＦＵＴ８遺伝子の発現、ＦＵＴ８由来の細胞増殖シグナルあるいはＦＵＴ８タンパク質の発現を抑制しうることをいう。いいかえれば、例えば、かかる概念には、ＦＵＴ８遺伝子からのｍＲＮＡの転写を抑制しうること、転写後のｍＲＮＡを不安定化しうること、ＦＵＴ８ｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を抑制しうること、あるいは翻訳後のポリペプチドの機能を抑制しうることも含まれる。【００１５】
本発明のＲＮＡは、ＦＵＴ８の発現を抑制するためのＲＮＡを含有するものであって、ＦＵＴ８遺伝子にコードされているｍＲＮＡの塩基配列に相同なもしくは相補的なＲＮＡ分子、または前記ｍＲＮＡの塩基配列に相同な配列の鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子である。ここで、「ＦＵＴ８遺伝子にコードされているｍＲＮＡの塩基配列に相同もしくは相補的である」とは、前記のｍＲＮＡの塩基配列に完全に相同もしくは相補的であることを指すのみではなく、所望の機能が発揮される範囲で実質的に相同もしくは相補的であることを包含する。このようなＲＮＡ分子としては、特に限定されないが、ＲＮＡ干渉を起こす二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡが例示される。ｓｉＲＮＡの鎖長としては、哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答抑制の観点から、例えば１３〜２９塩基の鎖長を有するもの、好ましくは１５〜２５塩基対の鎖長を有するもの、さらに好ましくは、２０〜２５塩基対の鎖長を有するものが例示される。また、前記鎖長の塩基配列の全てがＦＵＴ８のｍＲＮＡの塩基配列に由来するものであってもよく、その一部が前記の塩基配列に由来するものであってもよい。さらに、本発明のＲＮＡは、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉の有効性の観点から、例えば、３’末端側に２〜４塩基突出した一本鎖領域を有する二本鎖ＲＮＡの形状のもの、さらに好ましくは３’末端側に２塩基突出した一本鎖領域を有する二本鎖ＲＮＡの形状のものであっても良い。前記の突出した一本鎖領域として、２〜４塩基の連続するデオキシチミジン残基（ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ）が例示される。【００１６】
本発明のＲＮＡは、主にリボヌクレオチドによって構成されるが、その一部にデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドの誘導体及び／又はリボヌクレオチドの誘導体を含んでいてもよい。本発明のＲＮＡは、特に限定されないが、公知の化学合成法により合成することができる。また、適切な鋳型核酸を使用して酵素的に（例えばＲＮＡポリメラーゼを用いて）調製してもよい。【００１７】
本発明のＲＮＡは、安定化や標識化のために、化学修飾基等により修飾してもよい。修飾方法には特に限定は無く、例えば、蛍光物質の付加、ビオチン付加、５’−リン酸化、２’−Ｏ−メチル化、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）化、アミノ化、等が挙げられる。当該修飾は、目的とする遺伝子の発現を抑制する作用を阻害しない限り、５’末端、３’末端あるいは内部ヌクレオチドのいずれに対して実施してもよい。【００１８】
前記ＲＮＡ分子の塩基配列は、ＦＵＴ８遺伝子にコードされているｍＲＮＡに相同的もしくは相補的な塩基配列を有していれば特に限定はないが、その設計方法について、ＲＮＡ干渉用のｓｉＲＮＡを例として説明する。ｓｉＲＮＡの場合、（Ｉ）２次構造予測のステップ、及び（ＩＩ）ｓｉＲＮＡ配列選定のステップにより設計されうる。【００１９】
（Ｉ）のステップの２次構造予測は、抑制すべき遺伝子の塩基配列の２次構造をプログラム等によって予測することにより行なわれうる。ＲＮＡ干渉を効率よく生じさせる観点から、強い２次構造をとる箇所は避けることが好ましい。前記２次構造予測プログラムとしては、特に限定は無いが、ＭＦＯＬＤプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓｅｑａｎａｌ／ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ／ｍｆｏｌｄ−ｓｉｍｐｌｅ．ｈｔｍｌ）が使用できる。【００２０】
（ＩＩ）のステップでは、抑制すべき遺伝子に由来するｍＲＮＡの任意の領域の塩基配列に基づいてｓｉＲＮＡ配列を選定することができ、例えば、構造遺伝子領域、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域及び開始コドンあるいは終止コドン周辺領域の塩基配列のいずれもが好適に使用できる。例えば、前記の塩基配列のうちの、２つの連続したアデニル酸残基、又は２つのアデニル酸残基と１つのグアニル酸残基とを含む領域をセンス鎖ＲＮＡとして設計することができる。また、２つの連続したアデニル酸残基以降の任意の１３〜２９ヌクレオチド残基からなる配列、１つのグアニル酸残基と任意の２０ヌクレオチド残基とからなる配列又は１つのシチジル酸残基と任意の２０ヌクレオチド残基とからなる配列を選択してもよい。なお、本発明は前記の特徴を有するＲＮＡ分子を使用するものに限定されるものではない。センス鎖のＧＣ含量は、特に限定されないが、３０〜７０％、より好ましくは４０〜６０％とすることができる。非特異的作用を防ぐため、好ましくは、設計段階で塩基配列相同性検索を行ない、抑制すべき遺伝子に特異的な塩基配列であること、すなわち、前記遺伝子の由来する細胞または生物種に関する既知の塩基配列のデータベース中の配列に対する配列同一性が低いことを確認することが望ましい。【００２１】
本発明の核酸は、特に限定されないが、配列表の配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡまたは前記ＲＮＡに相補的な配列を有する、細胞内においてα１、６−フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制しうるＲＮＡが好適である。前記の核酸としては、例えば配列番号５〜８いずれか記載の塩基配列を含有するＲＮＡが例示される。これらのＲＮＡは、前記のとおり３’末端側に２〜４塩基の連続するデオキシチミジン残基を付加して使用してもよい。なお、配列番号２〜８の塩基配列は、マウス、ヒトのＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡに共通して存在する配列である。
さらに、前記のＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡも本発明の核酸に包含される。その具体例として、下記実施例にｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｓｉＲＮＡ３、ｓｉＲＮＡ４として記載された二本鎖ＲＮＡが例示される。前記の４種の二本鎖ＲＮＡは、マウス細胞におけるＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡの転写を抑制できることが確認されている。本発明の核酸は分子内で二本鎖を形成し得る一本鎖ＲＮＡであってもよく、例えば、配列表の配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなる一本鎖ＲＮＡが例示される。前記の、任意の配列のＲＮＡを有する一本鎖ＲＮＡは、前記の任意の配列部分をループとしたステム−ループ構造の二本鎖ＲＮＡを形成する。前記の任意の配列としては１〜３０ヌクレオチドの配列が例示されるが、好ましくは１〜２５ヌクレオチド、さらに好ましくは５〜２２ヌクレオチドの配列が使用される。【００２２】
本発明のＲＮＡによるＦＵＴ８の発現の抑制は、ＦＵＴ８酵素活性の測定、ＦＵＴ８酵素タンパク質の定量（ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法等）の他、遺伝子増幅法（ＲＴ−ＰＣＲ法等）、核酸ハイブリダイゼーション法（ノーザンブロット法等）等によりＦＵＴ８のｍＲＮＡ量を定量して確認することができる。【００２３】
（２）本発明の核酸構築物
本発明の組成物の別の側面としては、上記（１）のＲＮＡを細胞内で発現しうる核酸構築物が挙げられる。当該構築物は、細胞内における継続的なＦＵＴ８の機能の抑制に有用である。【００２４】
本発明の核酸構築物では、特に本発明を限定するものではないが、哺乳動物細胞内で機能を発揮しうるプロモーターの下流に上記（１）に記載されたＲＮＡをコードする核酸が前記ＲＮＡが転写されうる状態で、すなわち機能的に接続されている。好適な態様として、ＦＵＴ８の発現を抑制しうる二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡ鎖をコードする核酸がそれぞれプロモーターの下流に配置されている構築物が例示される。
本発明の核酸構築物に使用されるプロモーターとしては、哺乳動物細胞内で機能しうるものであれば特に限定はなく、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、テトラサイクリンで調節可能なプロモーター等が挙げられる。また、組織特異的プロモーターを用いることは、所望の細胞、部位、臓器等において特異的にＦＵＴ８の機能の抑制が可能となる点で有利である。特に限定は無いが、例えば、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。また、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ系プロモーターとしては、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒストンＨ１プロモーター等が挙げられる。前記テトラサイクリンで調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリン調節型Ｕ６プロモーター、ＴＲプロモーター等が挙げられる。また、上記プロモーターをＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムと組み合わせることにより、より厳密にＲＮＡの転写を制御することもできる。【００２５】
さらに本発明の好適な態様としては、（１）プロモーターの下流に配置された配列表の配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）プロモーターの下流に配置された前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を含有し、かつ細胞内で前記の両核酸にコードされるＲＮＡが転写されうるように構築された核酸構築物、が挙げられる。さらに具体的には、（１）配列番号５〜８いずれか記載の塩基配列を含有するＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）前記核酸に相補的な配列を有するＲＮＡをコードする核酸を含有する核酸構築物、が例示される。【００２６】
さらに、配列表の配列番号１〜４いずれか記載の塩基配列またはその一部を含有する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有する核酸構築物も本発明に包含される。前記の核酸構築物からは、ステム−ループ（もしくはヘアピン）構造を形成しうる一本鎖ＲＮＡが転写される。ここで、前記の任意の配列（一本鎖ＲＮＡにおけるループ部分をコードする）には特に限定はなく、例えば、１〜３０ヌクレオチドの配列、好ましくは１〜２５ヌクレオチド、さらに好ましくは５〜２２ヌクレオチドの配列が例示される。【００２７】
前記の核酸構築物は、１種の標的領域に対応するＲＮＡ分子を転写するものの他、複数の標的領域のそれぞれに対応する複数のＲＮＡ分子を転写しうるものであってもよい。【００２８】
本発明の核酸構築物の構築には特に限定はない。例えば、目的遺伝子の機能を抑制しうる二本鎖ＲＮＡのセンス、アンチセンス鎖が下記のようなシステムで転写されるように構築することができる：（Ａ）異なる２つのプロモーターの下流にセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ接続し、この2つの転写ユニットを順方向に配置した、別個にセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを転写するタンデムタイプ、（Ｂ）１つのプロモーターの下流にセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ順方向に配置した、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが直接またはループで連結されたステム−ループタイプ（又はヘアピンタイプ）のＲＮＡを転写するタイプ、あるいは、（Ｃ）センス鎖およびアンチセンス鎖を（それぞれ両ストランド）でコードする核酸の両端側のそれぞれにプロモーターを配置して、別個のプロモーターで両ＲＮＡ鎖を転写する対向タイプ。本発明では、使用条件、例えば、哺乳動物細胞の種類、センス配列とアンチセンス配列の種類等に応じ、タンデムタイプ、ステム−ループタイプ、対向タイプを使い分けることができる。【００２９】
なお、本発明の核酸構築物にコードされている、ＦＵＴ８の発現を抑制しうるＲＮＡの塩基配列は、ＦＵＴ８特異的にその発現を抑制する作用を示す配列であれば特に限定されないが、ＲＮＡの転写にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いる場合、好ましくは、以下の２つの条件：
−  転写開始点は、プリン残基〔グアニル酸残基（Ｇ）又はアデニル酸残基（Ａ）〕とすること、及び
−  アンチセンス鎖の３’末端に連続した４個のウラシル残基が付加されるため、転写開始点の前２塩基はＡＡとすること、
を満たすことが望ましい。
また、ＲＮＡの転写にＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを用いる場合、好ましくは、
−  ステム−ループタイプにすること、及び
−  短いポリ（Ａ）配列を付加すること
の条件を満たす構築物とすることが望ましい。【００３０】
本発明の核酸構築物は、より安定的に細胞内で効果を発揮しうるように、適切なベクター、例えばプラスミドベクターやウイルスベクターに組み込まれていてもよい。さらに、細胞の染色体ＤＮＡ上に本発明の核酸構築物を組み込んでもよい。【００３１】
本発明に使用されるベクターは、本発明の核酸構築物を細胞内で保持できるものであれば特に限定はない。前記プラスミドベクターとしては、特に限定されないが、例えばＲＮＡ干渉用の核酸を発現させるｐｉＧＥＮＥ  ｔＲＮＡプラスミド（商品名、ｉＧＥＮＥ社製）、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＳＥＣ  Ｈｙｇｒｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＢＡｓｉベクター（タカラバイオ社製）等が例示される。ウイルスベクターとしてはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。市販されているアデノウイルスベクターの例としてＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）が、市販されているレトロウイルスベクターの例としてｐＳＩＮｓｉベクター（タカラバイオ社製）、ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）が、それぞれ例示される。【００３２】
本発明の核酸構築物が組み込まれたベクターは、前記のようにｓｉＲＮＡ配列を選択し、該ｓｉＲＮＡが転写されるようにプロモーター、ｓｉＲＮＡをコードする核酸、さらに、必要に応じてその他の要素をベクターに組み込むことにより作製することができる。ベクターに組み込まれる種々の要素はＰＣＲ法により酵素的に合成する、あるいは化学的に合成するなど、公知の手段により調製することができる。【００３３】
作製されたベクターは、当該ベクターに適した適切な方法、例えば、プラスミドベクターの場合はエレクトロポレーション法やリポフェクション法等によって、また、ウイルスベクターの場合には当該ウイルスの細胞への感染能を利用して、目的の細胞に導入することができる。【００３４】
本発明の核酸構築物によるＦＵＴ８の発現の抑制も前記のとおり各種の方法で確認することができる。【００３５】
前記の、本発明のＲＮＡ、本発明の核酸構築物ならびに該構築物が組み込まれたベクターは、これらを有効成分としたＦＵＴ８遺伝子の抑制のための組成物の作製に有用である。当該組成物は、前記の有効成分と適切な担体、例えば前記有効成分の安定化や細胞への導入に有効な担体（緩衝成分、塩類、糖類、タンパク質、界面活性剤、トランスフェクション用試薬等）を前記の有効成分と組み合わせて作製することができる。前記の組成物はその治療にＦＵＴ８の機能の抑制が望まれる疾病の治療用の医薬組成物として使用することができ、この場合は医薬的に許容される担体を使用して前記の組成物を作製することが好ましい。【００３６】
（３）本発明の医薬組成物
下記の実施例に示されるように、ＦＵＴ８の発現が抑制された細胞は細胞増殖能が抑制される。したがって、本発明に開示された、ＦＵＴ８の発現を抑制しうるＲＮＡ、前記ＲＮＡを細胞内で発現しうる核酸構築物、これらを有効成分として含有する組成物は細胞増殖の抑制のために使用することができる。前記の医薬組成物、ならびに該組成物を使用する細胞増殖の抑制方法も本発明の態様の一つである。前記の医薬組成物はその治療、予防に細胞増殖の抑制が望まれる疾患、本発明を特に限定するものではないが、例えばがんの治療、特に好ましくはＦＵＴ８発現がん細胞を含有するがん（例えば、肝がんや子宮がんなど）の治療に有用である。なお、患者に対する前記の医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び投与される患者の年齢、体重、症状に応じて適宜設定される。【００３７】
本発明の医薬組成物は、ＦＵＴ８の発現を抑制しうるＲＮＡ、もしくは前記ＲＮＡを細胞内で転写することができる核酸構築物を有効成分とする。具体的には
（Ａ）配列番号９記載の塩基配列のうちの連続する１３〜２９ヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するＲＮＡ、
（Ｂ）（Ａ）記載のＲＮＡと、当該ＲＮＡに相補的なＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、
（Ｃ）（Ａ）記載のＲＮＡと、前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡ、
（Ｄ）（１）プロモーターの下流に配置された配列番号９記載の塩基配列のうちの連続する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡをコードする核酸、ならびに（２）プロモーターの下流に配置された前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を含有する核酸構築物、
（Ｅ）プロモーターの下流に配置された配列番号９記載の塩基配列のうちの連続する１３〜２９ヌクレオチドのＲＮＡと前記ＲＮＡに相補的なＲＮＡとが直接または任意の配列のＲＮＡを介して接続されてなるＲＮＡをコードする核酸を含有する核酸構築物、
が例示される。【００３８】
前記（１）、（２）に記載された、本発明のＲＮＡ、核酸構築物が本発明の医薬組成物として特に好適である。【００３９】
また、本発明によりがん細胞の増殖を抑制する際には、公知の薬剤を用いる方法をさらに組み合わせてもよい。既存の薬剤としては、特に限定されないが、例えば、５ＦＵやタキソール等の抗がん剤が挙げられる。すなわち、抗がん剤と本発明の医薬組成物を（単一の組成物として、もしくはそれぞれに投与される独立した医薬組成物として）組み合わせたものも本発明の医薬組成物に包含される。【００４０】
前記の医薬組成物を患者に投与するに際しては、公知の遺伝子導入方法を用いることができる。特に限定するものではないが、例えば、ＲＮＡ、核酸構築物、プラスミドの形態の有効成分にはエレクトロポレーション法、組織内注射、ハイドロダイナミクス法、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション法、金粒子を用いたボンバードメント法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル粒子を用いる方法、逆ミセル粒子を用いる方法、膜透過性ペプチドを用いる方法、膜融合性ペプチドを用いる方法、低密度リポタンパク質を用いる方法、トランスフェリンを用いる方法、アテロコラーゲンを用いる方法等を利用することができる。ウイルスベクターを使用したものは、当該ウイルスベクターに応じた方法で細胞等への感染を実施すればよい。【００４１】
本発明の医薬組成物は、複数の構成成分が含有されたキットの形態をとってもよい。前記のキットは、本発明を特に含有するものではないが、例えば、ＦＵＴ８の発現を抑制しうるＲＮＡと前記ＲＮＡを細胞に導入するための試薬とを含有するキット、ＦＵＴ８の発現を抑制しうるＲＮＡをコードするプラスミドと前記プラスミドを細胞に導入するための試薬とを含有するキット、ＦＵＴ８の発現を抑制しうるＲＮＡを試験管内で調製するための試薬（鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼ等）と前記ＲＮＡを細胞に導入するための試薬とを含有するキット、ＦＵＴ８の発現を抑制しうるＲＮＡをコードするウイルスベクターと前記ウイルスベクターの細胞への感染に使用される試薬とを含有するキット、等が例示される。前記のキットは、例えば有効成分とその投与のための成分が組み合わされているために即時に患者への投与が実施可能であるなど、特にその取り扱いの面で有利な効果を奏する。【００４２】
ＦＵＴ８発現がん細胞の増殖の抑制は、公知の方法を用いて評価することができる。特に限定するものではないが、例えば、ＭＴＴ法、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、等により行われうる。【００４３】
さらに、本発明のがん細胞の増殖の抑制方法は、ＦＵＴ８発現がん細胞の増殖を選択的に抑制させることができ、上記ＦＵＴ８遺伝子が関与するがんの治療方法としても利用できる。本発明によるがんの治療効果は、公知の方法を用いて評価することができる。特に限定するものではないが、例えば、実験動物（担がん動物等）を用いた延命効果の確認、腫瘍増殖抑制効果の確認や、ＲＴ−ＰＣＲ法による確認、免疫染色による確認、ＥＬＩＳＡによる確認等により評価されうる。
前記のとおり、ＦＵＴ８は糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖の生合成に関与する糖転移酵素であり、Ｎ−結合型複合型糖鎖中の、アスパラギンに結合したＮ−アセチルグルコサミン残基の６位にフコースを付加する反応を触媒する。本発明のＲＮＡや核酸構築物を使用して細胞内のＦＵＴ８の機能を抑制することにより、細胞内におけるフコース含有Ｎ−結合型複合型糖鎖を有する糖タンパク質の糖鎖構造が変化する。ＦＵＴ８により付加されるフコース残基が当該糖タンパク質の生理活性や安定性に重要である場合には、本発明により前記糖タンパク質の機能を調節もしくは改変することも可能である。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。【００４５】
実施例１
化学的に合成した二本鎖ＲＮＡによるＦＵＴ８の発現の抑制をＴＧＰ４９細胞〔マウス膵がん細胞〕を用いて検討した。【００４６】
（１）二本鎖ＲＮＡの作製
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０２５１９８に開示されたマウスＦＵＴ８遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を参照し、配列番号１〜４のそれぞれの塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡを作製した。すなわち、配列番号１〜４の塩基配列のＲＮＡの３’末端に２残基のデオキシチミジンを付加したオリゴヌクレオチドを合成し、さらに、配列番号１〜４に完全に相補的な塩基配列のＲＮＡの３’末端に２残基のデオキシチミジンを付加したオリゴヌクレオチドを合成した。相補性のあるオリゴヌクレオチド同士を組み合わせて二本鎖ＲＮＡとし、配列番号１、２、３、４に対応するものをそれぞれｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｓｉＲＮＡ３、ｓｉＲＮＡ４と命名した。【００４７】
（２）細胞へのＲＮＡ導入
ＴＧＰ４９細胞〔マウス膵がん細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１３６〕を、１０体積％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  グルタミン，５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培地（シグマ社製）中で、５体積％のＣＯ２存在下、３７℃で培養した。【００４８】
得られたＴＧＰ４９細胞を５×１０４細胞／ｍｌとなるよう前記の培地で希釈し、６ウェルプレートの１ウェルあたりにその１ｍｌを添加して上記の条件で９０％コンフルエントになるまで培養した。次いで培地中に終濃度２００ｐｍｏｌとなるように合成ｓｉＲＮＡを添加してトランスフェクションを行なった。トランスフェクションにはＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商品名、Ｍｉｒｕｓ社製、タカラバイオ社販売）を商品に添付のプロトコールに従って使用した。同様にＡｌｅｘａ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ（商品名、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いたトランスフェクションを実施し、トランスフェクションの効率を調べた。【００４９】
（３）ＴＧＰ４９細胞に対するＲＮＡ干渉の確認
ＦＵＴ８遺伝子のＲＮＡ干渉の確認は、以下のように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡの発現量の変化を測定することによって行なった。【００５０】
実施例１−（２）でトランスフェクションされたＴＧＰ４９細胞を２４時間培養した後、ＴＲＩｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、得られた細胞から全ＲＮＡを抽出し、得られた抽出物をＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）により処理した。なお、全ＲＮＡの抽出及びＤＮａｓｅＩによる処理は用いた試薬の製造者のプロトコールに従って行なった。【００５１】
得られたＲＮＡ  １００ｎｇを鋳型とし、配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマー（各２０ｐｍｏｌ）とし、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行なった。反応にはＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を使用し、９５℃で１０秒のインキュベーションの後、９５℃で５秒と６０℃で２０秒を１サイクルとする４０サイクルの反応条件で試料中のＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡ量を定量した。また、それぞれ配列番号１２及び１３に塩基配列を示すプライマーを用いてグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子由来のｍＲＮＡを同様に測定し、相対ｍＲＮＡ量（ＦＵＴ８  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）を算出してｍＲＮＡ量を標準化した。【００５２】
各ｓｉＲＮＡによるＦＵＴ８  ｍＲＮＡ干渉の結果を以下の表１に示す。なお、表１中の数値は、合成ｓｉＲＮＡを添加せずにトランスフェクション操作のみを行なった細胞での相対ｍＲＮＡ量を１００％とした場合の、合成ｓｉＲＮＡを添加した細胞における相対ｍＲＮＡ量の抑制の割合（％）である。【００５３】
【表１】
2007100091.tif 000002
【００５４】
表１に示されるように、どのｓｉＲＮＡを使用した場合もＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量の低下が認められた。特にｓｉＲＮＡ３、ｓｉＲＮＡ４を用いた場合、ＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量はｓｉＲＮＡを用いない場合に比べてそれぞれ４８％、２９％低下した。【００５５】
なお、ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２を用いた場合、ＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量の低下は、ｓｉＲＮＡを用いない場合の１５％前後であった。以上のことから、本発明の組成物ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ４は、ＦＵＴ８の発現を効率よく抑制することができることを確認した。【００５６】
実施例２
（１）ｓｉＲＮＡ発現レトロウイルスの作製
ＦＵＴ８の機能が定常的に抑制された細胞株を得るために、配列番号３または配列番号４記載の塩基配列を有するｓｉＲＮＡを発現しうるユニットが組み込まれたレトロウイルスベクターを作製した。【００５７】
骨格となるベクターとして、ｐＳＩＮｓｉ−ｍＵ６  ＤＮＡ（商品名、タカラバイオ社製）を使用し、化学的に合成した配列番号１４、１５記載の塩基配列のＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを前記のベクターのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩサイトに組み込んだ。挿入配列は配列番号３に示す塩基配列のＲＮＡと該配列に相補的なＲＮＡをコードしており、さらに両ＲＮＡをコードする配列の間にＴＴＣＡＡＧＡＧＡの９塩基が挿入されている。こうして構築されたプラスミドをｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃１６と命名した。同様に、配列番号４に示す塩基配列のＲＮＡと該配列に相補的なＲＮＡをコードする、配列番号１６、１７記載の塩基配列のＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを用いてプラスミドｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃５を構築した。レトロウイルス作製にはＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（商品名、タカラバイオ社製）を用いた。このキットに含まれる２種のプラスミド、ｐＧＰ  ＶｅｃｔｏｒとｐＥ−ｅｃｏ  Ｖｅｃｔｏｒと共に、前記のｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃１６またはｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃５をＨＥＫ２９３細胞〔ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３〕に同時に導入した。こうして形質転換された細胞の培養上清中にはｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃１６レトロウイルスまたはｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃５レトロウイルスが産生され、これらの培養上清を以下の遺伝子導入に使用した。同様にして、前記のＤＮＡを組み込んでいないｐＳＩＮｓｉ−ｍＵ６ベクター（ｍｏｃｋ  コントロール用）をｐＧＰ  ＶｅｃｔｏｒおよびｐＥ−ｅｃｏ  Ｖｅｃｔｏｒと共にＨＥＫ２９３細胞に同時に導入し、ｍｏｃｋ  コントロール用のウイルスを作製した。【００５８】
ｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃１６レトロウイルスとｍｏｃｋ  コントロール用のレトロウイルスをそれぞれＴＧＰ４９細胞に感染させ、Ｇ４１８耐性を指標に遺伝子導入株をスクリーニングし、定常的にＦＵＴ８の発現がノックダウンされた２株（ＫＤ１、ＫＤ２）とｍｏｃｋ  コントロール１株（ＷＴ）を得た。【００５９】
得られたノックダウン株のＦＵＴ８  ｍＲＮＡ発現量を実施例１−（３）と同様の方法にて調べた。ＷＴ株と比較したＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量は、ＫＤ１株では９５％、ＫＤ２株では９８％抑制されていた。また、ＦＵＴ８の酵素活性を魚住らの方法〔Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１２０巻、３８５〜３９２頁（１９９６年）〕にて調べたところ、測定限界以下であった。すなわち、ＫＤ１株およびＫＤ２株は、ほぼ完全にＦＵＴ８の発現が抑制された株であることが分かった。【００６０】
（２）ＦＵＴ８ノックダウン細胞株の細胞増殖能の評価
実施例２−（１）で得られたＫＤ１、ＫＤ２およびＷＴのそれぞれ２×１０４細胞を９６ウェルプレートの１ウェルあたりに入れ、２体積％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍＭ  グルタミン，５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培地（シグマ社製）中で、５体積％のＣＯ２存在下、３７℃で培養した。培養開始後１〜４日後の細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（商品名、和光純薬社製）を用いて測定した。なお、実験は各々ｎ＝３で実施し、その平均値を求めた。【００６１】
図１に細胞増殖の経時変化を示す。図中、縦軸は前記キットによる測定で細胞数の指標となる４９０ｎｍでの吸光度、横軸は培養日数であり、菱形がＷＴ、四角、三角がそれぞれＫＤ１、ＫＤ２での吸光度を示す。図１に示したごとく、ＷＴの細胞数に比較してＫＤ１およびＫＤ２は細胞の増殖速度が遅く、また、最終的な細胞数も有意に少ないことが分かる。つまり、ＫＤ１、ＫＤ２はＷＴに比して細胞の増殖が抑制されている。【００６２】
実施例３
ヒト肝がん細胞であるＨｅｐＧ２細胞に対するＦＵＴ８の機能抑制の影響を調べた。【００６３】
ＨｅｐＧ２細胞〔ヒト肝がん細胞、ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５〕を１０体積％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（シグマ社製）中で、５体積％のＣＯ２存在下、３７℃で培養した。一方、ＨＥＫ２９３細胞への導入にＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（商品名、タカラバイオ社製）に含まれるｐＧＰ  Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥ−ａｍｐｈｏ  Ｖｅｃｔｏｒを使用した他は実施例２−（１）と同様にレトロウイルスを作製した。【００６４】
ｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃１６由来レトロウイルスをＨｅｐＧ２細胞に感染させてＧ４１８耐性を指標に遺伝子導入株をスクリーニングし、定常的にＦＵＴ８の発現がノックダウンされた株を２株得た。これらの株におけるヒトＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量の定量は、配列番号１８、１９に示す塩基配列のプライマーを使用した、実施例１−（３）と同様のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で実施した。また、前記のｍＲＮＡ量を標準化するためのヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの測定には配列番号２０、２１に示す塩基配列のプライマーを使用した。【００６５】
得られたノックダウン細胞および親株であるＨｅｐＧ２細胞のそれぞれ２×１０４細胞を９６ウェルプレートの１ウェルあたりに入れ、１０体積％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（シグマ社製）中で、５体積％のＣＯ２存在下、３７℃で培養した。培養開始後１日、２日、４日および６日後の細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を用いて測定した。なお、実験は各々ｎ＝３で実施し、その平均値を求めた。【００６６】
図２に細胞数の経時変化を示す。図中、縦軸は前記キットによる測定で細胞数の指標となる４９０ｎｍでの吸光度、横軸は培養日数であり、菱形がＨｅｐＧ２細胞、四角、三角がそれぞれノックダウン株での吸光度を示す。図２に示したごとく、ＨｅｐＧ２細胞と比較してノックダウン株の細胞増殖速度は顕著に遅く、６日の培養後でも親株の１／２程度の細胞数にしか達しないことが分かる。つまり、ＦＵＴ８の発現をノックダウンさせたＨｅｐＧ２細胞は親株であるＨｅｐＧ２細胞に比して細胞の増殖が著しく抑制されている。
実施例４
ヒト子宮頸がん細胞であるＨｅＬａ細胞に対するＦＵＴ８に機能抑制の影響を調べた。【００６７】
ＨｅＬａ細胞〔ヒト子宮頸がん細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２〕を２体積％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（シグマ社製）中で、５体積％のＣＯ２存在下、３７℃で培養した。一方、プラスミドｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃１６、プラスミドｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃５およびｐＳＩＮｓｉ−ｍＵ６ベクターを使用した他は実施例３と同様の方法によりレトロウイルスを作製した。【００６８】
ｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃１６、ｍＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ＃５またはｐＳＩＮｓｉ−ｍＵ６ベクター（ｍｏｃｋ  コントロール用）由来レトロウイルスをＨｅＬａ細胞に感染させてＧ４１８耐性を指標に遺伝子導入株をスクリーニングし、それぞれ３株（ｓｉ１６−１、ｓｉ１６−３およびｓｉ１６−４）、１株（ｓｉ５−３）並びに２株（ｂＧ２およびｂＧ３）のクローンを得た。ｓｉ１６−３およびｓｉ５−３におけるヒトＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量を、実施例３と同様のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により定量し、ｂＧ３細胞におけるヒトＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量と比較した。その結果、ｓｉ１６−３において８４％、ｓｉ５-３において８０％のヒトＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量の減少が見られた。【００６９】
また、ノックダウン細胞であるｓｉ１６-４およびｍｏｃｋ  コントロールＨｅＬａ細胞であるｂＧ２のそれぞれ２×１０４細胞を９６ウェルプレートの１ウェルあたりに入れ、２体積％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（シグマ社製）中で、５体積％のＣＯ２存在下、３７℃で培養した。培養開始後１日、２日、３日および４日後の細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を用いて測定した。なお、実験は各々ｎ＝３で実施し、その平均値を求めた。
図３に細胞数の経時変化を示す。図中、縦軸は前記キットによる測定で細胞数の指標となる４９０ｎｍでの吸光度、横軸は培養日数であり、■がｓｉ１６-４、◇がｂＧ２での吸光度を示す。図３よりコントロール細胞と比較してノックダウン株であるｓｉ１６-４の細胞増殖速度は顕著に遅いことが分かる。【００７０】
さらに、ｓｉ１６-１、ｓｉ１６-３、ｂＧ３を使用して同様の試験を実施した。この結果を図４に示す。図中、▲がｓｉ１６-１、●がｓｉ１６-３、□がｂＧ３の細胞数の経時変化を示している。本実験でもｍｏｃｋ  コントロール細胞に比較してＦＵＴ８遺伝子ノックダウン細胞株の細胞増殖速度は低下していた。
以上のとおり、ＦＵＴ８の発現をノックダウンさせたＨｅＬａ細胞はｍｏｃｋ  コントロール細胞に比して細胞の増殖が著しく抑制されていた。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明により、ＦＵＴ８の発現を抑制しうるＲＮＡ、ならびに該ＲＮＡを細胞内で転写しうる核酸構築物が提供される。これらのＲＮＡ、核酸構築物はＦＵＴ８発現細胞における前記遺伝子の産物の機能を選択的に抑制するために有用である。さらに、本発明によりＦＵＴ８発現細胞の増殖を選択的に抑制する方法が提供される。前記の方法は、例えばがんの治療に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
SEQ ID NO:1 ; RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:2 ; RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:3 ; RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:4 ; RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:5 ; RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:6 ; RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:7 ; RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:8 ; RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:10 ; Primer to amplify a DNA fragment derived from mouse FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:11 ; Primer to amplify a DNA fragment derived from mouse FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:12 ; Primer to amplify a DNA fragment derived from mouse GAPDH mRNA.
SEQ ID NO:13 ; Primer to amplify a DNA fragment derived from mouse GAPDH mRNA.
SEQ ID NO:14 ; DNA encoding stem-loop RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:15 ; DNA encoding stem-loop RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:16 ; DNA encoding stem-loop RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:17 ; DNA encoding stem-loop RNA which represses the function of FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:18 ; Primer to amplify a DNA fragment derived from human FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:19 ; Primer to amplify a DNA fragment derived from human FUT8 mRNA.
SEQ ID NO:20 ; Primer to amplify a DNA fragment derived from human GAPDH mRNA.
SEQ ID NO:21 ; Primer to amplify a DNA fragment derived from human GAPDH mRNA.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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