【手続補正書】
【提出日】平成20年6月20日(2008.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  モノネガウイルス目のウイルスのプロモーターから遠位に位置する遺伝子の発現量を増大させる方法であって、
前記プロモーターから遠位に位置する前記遺伝子を野性型ウイルスの３’末端側のプロモーターの近位の部位に近づく方向に移動させることによって前記モノネガウイルス目のウイルスの前記遺伝子の順序を再編成する工程を含む方法。
【請求項２】  前記遠位遺伝子は表面糖タンパク質の遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記モノネガウイルス目のウイルスはラブドウイルスもしくはパラミクソウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項４】  前記ラブドウイルスは、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択され、前記パラミクソウイルスは、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、及び呼吸系発疹ウイルスからなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】  プロモーターから遠位の遺伝子を野性型ウイルスの３’末端側のプロモーターの近位の部位に近づく方向に移動させることによってゲノムが再編成されたモノネガウイルス目の組換えウイルス。
【請求項６】  前記プロモーターの遠位の遺伝子は表面糖タンパク質の遺伝子である請求項５に記載の方法。
【請求項７】  前記モノネガウイルス目のウイルスはラブドウイルスもしくはパラミクソウイルスである請求項５に記載の組換えウイルス。
【請求項８】  前記ラブドウイルスは、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択され、前記パラミクソウイルスは、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、及び呼吸系発疹ウイルスからなる群から選択される請求項７に記載の組換えウイルス。
【請求項９】  請求項５に記載の組換えウイルスを含有する、防御的免疫応答を促進かつ増強させるための組成物。
【請求項１０】  モノネガウイルス目のウイルスを弱毒化する方法であって、
遺伝子を野性型ウイルスにおける位置から遠くに移動させることによって前記モノネガウイルス目のウイルスの遺伝子の順序を再編成する工程を含む方法。
【請求項１１】  モノネガウイルス目のウイルスを弱毒化する方法であって、
野性型ウイルスにおける３’末端側のプロモーターの近位の部位から遠ざかる方向に遺伝子を移動させることによって前記モノネガウイルス目のウイルスの遺伝子順序を再編成する工程であって、前記遺伝子はゲノムの複製に必須の制限因子である工程を含む方法。
【請求項１２】  前記必須の制限因子の遺伝子はヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】  前記必須の制限因子の遺伝子は前記ウイルスの遺伝子順序において最後から２番目の位置に配される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】  請求項１１の方法に基づいて弱毒化されたウイルス。
【請求項１５】  ワクチンとして有用なモノネガウイルス目の弱毒化ウイルスを構築する方法であって、
野性型ウイルスにおける３’末端側のプロモーターの近位の部位から遠ざかる方向に遺伝子を移動させることによって前記ウイルスの遺伝子順序を再編成する工程であって、前記遺伝子はゲノムの複製に必須の制限因子である工程と、
免疫応答誘導抗原をコードした遺伝子を前記ウイルスの遺伝子順序の３’末端に最も近い位置に配することによりワクチン用の弱毒化ウイルスを構築する工程とを含む方法。
【請求項１６】  前記必須の制限因子の遺伝子はヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】  前記必須の制限因子の遺伝子は前記ウイルスの遺伝子順序において最後から２番目の位置に配される請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】  免疫応答誘導抗原をコードした前記遺伝子は、付着用糖タンパク質（Ｇ）遺伝子、融合遺伝子、またはヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ遺伝子からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】  請求項１５の方法に基づいて弱毒化されたウイルス。
【請求項２０】  前記モノネガウイルス目のウイルスはラブドウイルスもしくはパラミクソウイルスである請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】  前記ラブドウイルスは狂犬病ウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスであり、前記パラミクソウイルスは、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、及び呼吸系発疹ウイルスからなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】  ワクチンとして有用な前記弱毒化ウイルスは、該ウイルスの致死量と防御反応誘導量が約１０００倍異なるように弱毒化されている請求項１５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の別の一実施形態では、ゲノムが再編成されたモノネガウイルス目の組換えウイルスであって、ウイルスのプロモーターの遠位の遺伝子を野性型ウイルスの３’末端側のプロモーターの近位の部位に近づく方向に移動させることによってゲノムが再編成される組換えウイルスが提供される。こうした組換えウイルスを利用して防御的免疫応答を促進かつ増強することが可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の更に別の一実施形態では、所定の遺伝子をその野性型ウイルスにおける位置から遠ざかる方向に移動させることによってウイルスの遺伝子順序を再編成するか、もしくは、必須の制限因子の遺伝子を野性型ウイルスにおける３’末端側のプロモーターの近位の部位から遠ざかる方向に移動させることによってウイルスの遺伝子順序を再編成することによりモノネガウイルス目のウイルスを弱毒化する方法が提供される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の更に別の一実施形態では、ワクチンとして有用な弱毒化ウイルスを構築するための方法であって、野性型ウイルスにおける３’末端側のプロモーターの近位の部位から遠ざかる方向に所定の遺伝子を移動させることによって当該ウイルスの遺伝子順序を再編成する工程であって、当該所定の遺伝子はゲノムの複製に必須の制限因子である工程と、免疫応答誘導抗原をコードした遺伝子をウイルスの遺伝子順序の３’末端に最も近い位置に配する工程とを含む方法が提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の更なる別の一実施形態では、モノネガウイルス目のウイルスを弱毒化するための方法であって、所定の遺伝子をその野性型における位置から遠ざかる方向に移動させることによってウイルスの遺伝子の順序を再編成するか、または、必須の制限因子の遺伝子をその野性型における３’末端側のプロモーターに最も近い部位から遠ざかる方向に移動させることによってウイルスの遺伝子の順序を再編成することによってモノネガウイルス目のウイルスを弱毒化する方法が提供される。好ましくは当該遺伝子はウイルスの遺伝子の順序において最後から２番目の位置に配される。更に、ゲノム複製に必須の制限因子としての前記遺伝子はヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子であることが好ましい。モノネガウイルス目に属するウイルスの代表例としては、狂犬病ウイルスや水疱性口内炎ウイルスなどのラブドウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザウイルスや呼吸器系発疹ウイルス（ヒト及びウシの）などのパラミクソウイルス、及びエボラウイルスやマールブルグウイルスなどのフィロウイルスが挙げられる。本発明は本方法に基づいて弱毒化されたウイルスをも含むものである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明の更なる別の一実施形態では、ワクチンとして有用な弱毒化ウイルスを構築するための方法であって、ゲノム複製に必須の制限因子である所定の遺伝子をその野性型における３’末端側のプロモーターに最も近い部位から遠ざかる方向に移動させることによって当該ウイルスの遺伝子の順序を再編成する工程と、免疫応答誘導抗原をコードする遺伝子をウイルスの遺伝子順序の３’末端に最も近い位置に配する工程とからなる方法が提供される。好ましくは、必須の制限因子の遺伝子はヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子であり、該遺伝子は当該ウイルスの遺伝子の順序において最後から２番目に配される。更に好ましくは、免疫応答誘導抗原をコードする遺伝子は付着用糖タンパク質（Ｇ）遺伝子、融合遺伝子またはヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ遺伝子である。当業者であれば適当な免疫応答誘導抗原に容易に置換することが可能である。本発明は本方法に基づいて弱毒化されたウイルスをも含むものである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
実施例１４
Ｎ遺伝子を再編成したウイルスによるＲＮＡ合成
ゲノム上でＮ遺伝子を順次下流に移動させると複製及びＮのｍＲＮＡ合成レベルは大きく変化した。ＮのｍＲＮＡの合成レベルは、Ｎ２、Ｎ３及びＮ４ウイルスにおいてＮ遺伝子をプロモーターから遠ざかる方向に順次移動させることにより野性型のレベルから大幅に低下した（それぞれ野性型の３６％、６％及び３％。図１１）。これに符合するように、遺伝子順序の中でＧ遺伝子の位置がプロモーターに１つ近づき、代わりにＮ遺伝子が最後から２番目の位置に配されたＮ４ウイルスではＧのｍＲＮＡの量の増加が観察された（図１１）。Ｎ２、Ｎ３及びＮ４のゲノムＲＮＡの複製量は、野性型に対して減少し（それぞれ５０％、２８％、及び４％。図１１）、これにともなってＮ遺伝子の発現が低下した。これはＮタンパク質の合成が複製を制限している場合に予想されるとおりである。Ｎ遺伝子が段階的にプロモーターから遠ざかるにしたがって更に全体の転写レベルも低下したが、これは恐らくゲノムのテンプレートの数が減少したことの副次的な効果であると考えられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
実施例２５
Ｎ及びＧ遺伝子が再編成されたウイルスの複製
１段増殖条件下での遺伝子再編成ウイルスの複製能を、感染多重度（ＭＯＩ）が３となるようにＢＨＫ−２１培養細胞にウイルスを感染させた後、３７℃にて培養して調べた。異なる時間に上清を回収し、プラークアッセイによってウイルス収量を測定した。プロモーターに最も近い位置から遠ざかる方向にＮ遺伝子を転座させると、第１番目の位置から遠位へと遺伝子が移動させられるにしたがって複製量は段階的に低減した。Ｎ遺伝子の第２番目の位置への移動（Ｇ１Ｎ２）により、複製量は３分の１に減少したのに対し、Ｎ遺伝子を第４番目の位置に移動（Ｇ３Ｎ４）させると複製量は１，０００分の１にまで低下した（図１９）。これに対し、Ｎ遺伝子が第４番目の位置にある２種類のウイルス（Ｇ３Ｎ４とＧ１Ｎ４）では１段増殖条件下での複製量が大きく異なったが、これは最適な複製が行われるうえで重要なＮ：Ｐのモル比がＧ１Ｎ４ではＧ３Ｎ４よりも安定していたことに恐らくよるものと考えられる。感染５時間後に細胞内のタンパク質合成速度を測定したところ、Ｇ１Ｎ４（３’−ＧＰＭＮＬ−５’）に感染した細胞ではＮ：Ｐのモル比は１：１．６であったのに対し、Ｇ３Ｎ４（３’−ＰＭＧＮＬ−５’）に感染した細胞ではＮ：Ｐのモル比は１：１．８であった（図１８Ｃ）。野性型に感染した細胞（Ｎ１Ｇ４）におけるＮ：Ｐの比が１：０．７であり、Ｇ１Ｎ２に感染した細胞では１：０．８であることに示されるように、ウイルスの複製には１：０．５〜１：１のＮ：Ｐのモル比が最適である。野性型ウイルス及びＧ１Ｎ２ではいずれも遺伝子順序においてＮ遺伝子の直後にＰ遺伝子が位置している（図１７）。Ｎに対するＰの量が多すぎても少なすぎても複製量は大幅に低下する。Ｇ３Ｎ４に感染した細胞ではＮが制限因子となっているばかりでなくＮ：Ｐのモル比が最適値の２倍以上となっている。Ｇ３Ｎ４及びＧ１Ｎ４の複製速度は野性型及びＧ１Ｎ２に比較して遅くなっている。Ｎ１Ｇ４及びＧ１Ｎ２では１段増殖は感染１２時間後に完了したのに対し、Ｇ３Ｎ４及びＧ１Ｎ４では感染２４時間後であった。Ｇ１Ｎ２では野性型ウイルスと比較して複製の遅れは見られなかったことから、感染細胞における過剰量のＧの存在が複製のこうした遅れの原因であるとは考えにくい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
実施例２７
再編成されたＮ及びＧ遺伝子を有するウイルスを接種したマウスの血清抗体
Ｇ遺伝子が再編成されたウイルスの接種が体液性免疫応答に与える影響を評価するため、各変異体ウイルスの１０倍毎の連続希釈液をマウスに鼻腔内接種した。毎週尾から採血してＥＬＩＳＡにより血清の抗体レベルを求めた。この実験では接種後のマウスの生存が前提条件であるのでＬＤ５０以下の投与量のみを用いた。Ｇ遺伝子の転座によって抗体の応答反応の反応速度及び程度が変化した（図２２）。野性型ウイルスを接種したマウスでは２１日以内に辛うじて検出可能なレベルの抗体が産生されたのに対して、１００ＰＦＵのＧ１Ｎ２を接種した動物では１４日目までに有意な抗体価の抗体が産生され、Ｇ１Ｎ４を接種した動物では接種７日後までに有意な抗体価の抗体が産生された。このような促進、増強された免疫応答は、１００ＰＦＵのウイルスを接種したマウスを比較することによって最も明らかとなる（図２２）。これらの結果は、Ｇ遺伝子を第１番目の位置から第４番目の位置に転座させることによってＶＳＶに対する体液性免疫応答が増強されることを示すものである。Ｇ１Ｎ４を接種したマウスではＧ３Ｎ４を接種したマウスと比較して早期かつ高レベルの抗体の産生が見られた。このことは更に、Ｇ遺伝子を遺伝子順序の第１番目の位置に配することでＶＳＶの免疫原性が高められるという観察を裏付けるものである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
ゲノムＲＮＡの複製には化学量論的な量のＮタンパク質を必要とすることから、Ｎ遺伝子の位置及びＮタンパク質の発現レベルと複製の効率とは相関していると考えられる。野性型ウイルスＮ１Ｇ４が最も高いウイルス価で複製し、次いでＧ１Ｎ２及びＧ１Ｎ４ウイルスの順でＧ３Ｎ４ウイルスの複製能が最も低かった。Ｇ１Ｎ４ウイルスとＧ３Ｎ４ウイルスではいずれも第４番目の位置にＮ遺伝子があるにも関わらずＧ１Ｎ４ウイルスの複製能はＧ３Ｎ４よりも大幅に高かった。これらのウイルスではいずれも複製速度は遅く、Ｎタンパク質の供給によって子孫ウイルスの生成が制限されると仮定した場合に予想されるとおりであった。