【手続補正書】
【提出日】平成20年4月22日(2008.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
具体的には、以下のsiRNA分子（SEQ ID NO：86〜97）を使用した。
1. βGal siRNA(免疫賦活性配列)
2008504827.tif 000001
2. βGal Mod-1(U→C置換)
2008504827.tif 000002
3. βGal Mod-2(U→C；U→C置換)
2008504827.tif 000003
4. BP1 siRNA(低免疫賦活性)
2008504827.tif 000004
5. BP1 Mod-1(G→U置換)
2008504827.tif 000005
6. BP1 Mod-2(G→U、C→G置換)
2008504827.tif 000006
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】SNALP封入siRNAが血液循環時間の延長を示すことを実証するデータを例証する。
【図２】SNALP封入siRNAが特定の疾患部位を標的するように設計され得ることを実証するデータを例証する。図2Aは肝臓へのSNALPの標的化を実証するデータを例証し、図2Bは腫瘍へのSNALPの標的化を実証するデータを例証する。
【図３】siRNA二重鎖が、インビトロおよびインビボでI型インターフェロンおよび炎症性サイトカインの産生を刺激することを実証するデータを例証する。図3Aは、脂質封入siRNAがヒトPBMCにおいてIFN-α産生を誘導し、脂質複合化siRNAがヒトPBMCにおいてIL-6およびTNF-α産生を誘導することを実証するデータを例証する。図3Bは、脂質封入siRNAがマウスにおいてIFN-α産生を誘導することを実証するデータを例証する。図3Cは、脂質封入siRNAがマウスにおいてIL-6およびTNF-α産生を誘導することを実証するデータを例証する。図3Dは、マウスにおけるINF-α産生が用量依存的であることを実証するデータを例証する。図3Eは、ヒトPBMCにおけるIFN-α産生が用量依存的であることを実証するデータを例証する。
【図４】siRNAの免疫賦活特性がtoll様受容体媒介性免疫応答に特有であること、および樹状細胞が脂質封入siRNAへのIFN-α応答に関与する1つの細胞種であることを実証するデータを例証する。図4Aは、脂質封入siRNAに対するIFN-α応答がクロロキンによって阻害されることを実証するデータを例証する。図4Bは、脂質封入siRNAに対するIL-6応答がクロロキンによって阻害されることを実証するデータを例証する。図4Cは、樹状細胞が、脂質封入siRNAへのIFN-α応答に関与する主な細胞種であることを実証するデータを例証する
【図５】siRNA二重鎖による免疫刺激が、GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'および5'-UGUGU-3'モチーフ)によって誘導されることを実証するデータを例証する。
【図６】siRNA二重鎖による免疫刺激が、GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'および5'-UGUGU-3'モチーフ)によって誘導されることを実証するデータを例証する。
【図７】siRNA二重鎖による免疫刺激が、GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'および5'-UGUGU-3'モチーフ)によって誘導されることを実証するデータを例証する。
【図８】siRNA二重鎖による免疫刺激が、GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'および5'-UGUGU-3'モチーフ)によって誘導されることを実証するデータを例証する。
【図９】血漿由来因子がインビトロにおいてsiRNAの免疫賦活効果を増強すること、およびsiRNAによるヒトPBMCの刺激もまたヌクレオチド配列に依存することを実証するデータを例証する。図9Aはβgal siRNA二重鎖の免疫賦活効果を示す。図9BはBP1 siRNA二重鎖の免疫賦活効果を示す。
【図１０】選択されたsiRNA分子（SEQ ID NO：1〜69）の免疫賦活効果を測定するインビトロおよびインビボ実験によるデータを要約する表1である。
【図１１】全身投与したsiRNAによる、サイトカインの配列依存的誘導を実証するデータを例証する。図11Aは、ルシフェラーゼ(Luc)、β-ガラクトシダーゼ(β-gal)、BP1を標的する封入siRNA、または封入されたそれぞれの非標的化配列対照 siRNA 50μg(約2 mg/kg)をICRマウスに投与してから6時間後の血清IFN-αレベルを示す。空のリポソームまたは裸のβ-gal siRNAのみの注射では、検出可能なIFN-αは誘導されなかった。図11Bは、6時間の時点で血清IFN-αを測定する、封入β-gal 728 siRNAに対する用量反応を示す。図11Dは、脂質二重層中にDLinDMAを含むリポソーム中に封入されたβ-gal 728、β-gal 481、TetR 57、またはTetR対照siRNA 50μgを静脈内投与してから6時間後の血清IFN-αレベルを実証するデータを例証する。図11Dは、TNF-α、IL-6、およびIFN-γもまた刺激性siRNAによって誘導されることを実証するデータを例証する。
【図１２】siRNAの免疫刺激活性がGUリッチモチーフによって制御されることを実証するデータを例証する。図12Aは、この実験系列で使用した修飾siRNA配列（SEQ ID NO：70〜75）を記載する表2である。系列1；β-gal対照(高刺激性)、β-gal Mod1(一塩基置換)、およびβ-gal Mod2(二塩基置換)。系列2；BP1対照(低刺激性)、BP1 Mod1(一塩基置換)、およびBP1 Mod2(二塩基置換)。塩基置換を下線で示す。図12Bは、それぞれ5'-UGUGU-3'モチーフの導入および破壊により、siRNAの刺激性をより高くまたはより低くできることを実証するデータを例証する。図12Cは、GUリッチモチーフを取り込むように修飾したBP-1 siRNAが、増強された免疫刺激活性を有することを実証するデータを例証する。図12Dは、GUリッチモチーフを除去するように修飾したβ-gal siRNAが、減少した免疫刺激活性を有することを実証するデータを例証する。図12Eは、免疫賦活性siRNAの投与に伴って末梢白血球数および血小板数が減少し、これがRNA配列の修飾によって軽減されることを実証するデータを例証する。図12Fは、免疫賦活性修飾BP-1 siRNAの投与に伴って末梢白血球数および血小板数が減少することを実証するデータを例証する。
【図１３】脂質封入siRNAがインビトロでのRNAiの媒介において効果的であることを実証するデータを例証する。
【図１４】新たに単離された単球が脂質複合化siRNAまたはポリカチオン複合化siRNAにより刺激を受けて、炎症性サイトカインを産生し得ることを実証するデータを例証する。図14Aは、脂質-siRNA複合体に応答して産生されたTNF-αのレベルを示すデータを例証する。図14Bは、脂質-siRNA複合体に応答して産生されたIL-6のレベルを示すデータを例証する。図14Cは、ポリカチオン-siRNA複合体に応答して産生されたIFN-α、IL-6、およびTNF-αのレベルを示すデータを例証する
【図１５】siRNA二重鎖の免疫賦活活性が、ssRNAなどの混入物に起因しないことを実証するデータを例証する。図15Aは、siRNA二重鎖のPAGE精製がその免疫賦活活性に影響しないことを実証するデータを例証する。図15Bは、GUリッチセンスssRNAが、RNase A処理後に検出可能なIFN-αを誘導しないこと、およびRNase A処理が、siRNA二重鎖によるIFN-αの誘導に対して、未処理試料と比較して最小限の効果しか及ぼさないことを実証するデータを例証する。
【図１６】本明細書に記載した実験で使用した特定のsiRNA配列（SEQ ID NO：76〜81）を記載する表3である。
【図１７】RNAiの媒介において活性があり、かつ先天性免疫応答を活性化する能力が最低限であるsiRNAを設計できることを実証するデータを例証する。図17Aは、推定免疫賦活性モチーフを欠く、β-galを標的化するように設計されたsiRNA配列（SEQ ID NO：82〜85）(コドン開始部位、478、728、924、および2891)を示す表4である。図17Bは、ヒトPBMCにおける、新規β-gal siRNAの免疫賦活活性を示すデータを例証する。図17Cは、Neuro 2A細胞における、新規β-gal標的化siRNAによるβ-gal活性の阻害を示すデータを例証する。図17Dは、Neuro 2A細胞における、GUリッチβ-gal標的化siRNAによるβ-gal活性の阻害を示すデータを例証する。
【図１８】インビボでのsiRNAに対するサイトカイン応答がpDC細胞に限定されないことを実証するデータを例証する。