【手続補正書】
【提出日】平成20年7月31日(2008.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
齧歯類ＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することができ、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を阻害することができる合成抗体又はそのＦａｂ断片。
【請求項２】
齧歯類ＶＥＧＦがマウスＶＥＧＦである請求項１に記載の合成抗体。
【請求項３】
少なくとも一の溶媒と接触しうる非常に多様化したアミノ酸位置に変異型アミノ酸を有する少なくとも一の変異型ＣＤＲを含み、該変異型アミノ酸が非ランダムコドンセットによってコードされており、非ランダムセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％が既知の抗体可変ドメイン内の位置の標的アミノ酸である、請求項１に記載の合成抗体。
【請求項４】
ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３からなる群から選択される少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含んでなる重鎖可変ドメインを有する、請求項３に記載の合成抗体。
【請求項５】
重鎖可変ドメインが変異型ＣＤＲ  Ｈ３を含んでなる、請求項４に記載の合成抗体。  
【請求項６】
ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３からなる群から選択される少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含んでなる軽鎖可変ドメインを有する、請求項３に記載の合成抗体。
【請求項７】
ＶＥＧＦレセプターがＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）である、請求項１に記載の合成抗体。
【請求項８】
ＶＥＧＦレセプターがＶＥＧＦレセプター１（Ｆｌｔ−１）である、請求項１に記載の合成抗体。
【請求項９】
ＶＥＧＦレセプター１及びＶＥＧＦレセプター２へのＶＥＧＦの結合を阻害することができる、請求項１に記載の合成抗体。
【請求項１０】
１０ｎＭ以下のＫｄ値でマウス及びヒトＶＥＧＦに結合する、請求項２に記載の合成抗体。
【請求項１１】
２ｎＭ以下のＫｄ値でマウス及びヒトＶＥＧＦに結合する、請求項１０に記載の合成抗体。
【請求項１２】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１及びＹ２５を含むエピトープに結合する、請求項１に記載の合成抗体。
【請求項１３】
図２、７、２４から２９及び３４から４３の何れか一に記載の抗体のＣＤＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項１に記載の合成抗体。
【請求項１４】
図２、７、２４から２９及び３４から４３の何れか一に記載の抗体の配列を含有する重鎖又は軽鎖可変領域又は両方を含んでなる、請求項１に記載の合成抗体。
【請求項１５】
齧歯類ＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することができ、ヒトＶＥＧＦのＧ８８の表面積の８０％のみに接触し、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を阻害することができる抗体又はそのＦａｂ断片。
【請求項１６】
非変異のヒトＶＥＧＦのＫｄ値の１０倍以内のＫｄ値でヒトＶＥＧＦのＧ８８Ａ変異体に結合することができる、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
１０ｎＭ以下のＫｄ値でヒトＶＥＧＦのＧ８８Ａ変異体に結合することができる、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
ＶＥＧＦレセプターがＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１９】
ＶＥＧＦレセプターがＶＥＧＦレセプター１（Ｆｌｔ−１）である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項２０】
ＶＥＧＦレセプター１及びＶＥＧＦレセプター２へのＶＥＧＦの結合を阻害することができる、請求項１５に記載の抗体。
【請求項２１】
齧歯類ＶＥＧＦがマウスＶＥＧＦである請求項１５に記載の合成抗体。
【請求項２２】
１０ｎＭ以下のＫｄ値でマウス及びヒトＶＥＧＦに結合する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
２ｎＭ以下のＫｄ値でマウス及びヒトＶＥＧＦに結合する、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
１．０以上（１０Ｍ−１Ｓ−１）の結合速度（Ｋｏｎ）でヒトＶＥＧＦに結合する、請求項１５に記載の抗体。
【請求項２５】
ＶＥＧＦの２０ｓヘリックスに結合する、請求項１５に記載の抗体。
【請求項２６】
ＶＥＧＦの８０ｓループに結合する、請求項１５に記載の抗体。
【請求項２７】
ＶＥＧＦの２０ｓヘリックス及び８０ｓループに結合する、請求項１５に記載の抗体。
【請求項２８】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７を含む機能的エピトープを有する、請求項１５から２７の何れか一に記載の抗体。
【請求項２９】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＩ８３を含む機能的エピトープを有する、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｉ８３及びＱ８９を含む機能的エピトープを有する、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＭ１８を含む機能的エピトープを有する、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３２】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８及びＱ８９を含む機能的エピトープを有する、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１及びＹ２５を含む機能的エピトープを有する、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３４】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３及びＩ８３を含む機能的エピトープを有する、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３５】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｙ２５及びＱ８９を含む機能的エピトープを有する、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３６】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３及びＣ１０４を含む機能的エピトープを有する、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３及びＱ８９を含む機能的エピトープを有する、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３８】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｋ４８、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｍ８１、Ｉ８３、Ｈ８６、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｃ１０４及びＰ１０６からなる群から選択した残基の何れかの組み合わせを含む機能的エピトープを有する、請求項１５から２７の何れか一に記載の抗体。
【請求項３９】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｋ４８、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｍ８１、Ｉ８３、Ｈ８６、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｃ１０４及びＰ１０６を含む機能的エピトープを有する、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
Ｘ１がＹ又はＦであり；
Ｘ２がＶ又はＡであり；
Ｘ４がＦ又はＹであり；
Ｘ５がＬ又はＡであり；
Ｘ６がＰ又はＡであり；
Ｘ７がＹ又はＦである
連続したアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７を有するＣＤＲ-Ｈ３を含んでなり、齧歯類ＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することができ、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を阻害することができる抗体又はそのＦａｂ断片。
【請求項４１】
Ｘ２がＩ又はＶ又は他の疎水性アミノ酸であり、
Ｘ５が任意のアミノ酸残基である
連続したアミノ酸配列ＧＸ２ＴＰＸ５Ｇを含むＣＤＲ-Ｈ２を更に含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ２がＹ又はＦであり、
Ｘ３がＷ又はＬである
連続したアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＩＨを含むＣＤＲ-Ｈ１を更に含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４３】
齧歯類ＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することができ、図２、７、２４から２９及び３４から４３の何れか一に記載の抗体のＣＤＲ-Ｈ３配列を含んでなる抗体又はそのＦａｂ断片。
【請求項４４】
齧歯類ＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦにに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することが可能であり、図２、７、２４から２９及び３４から４３の何れか一に記載の抗体の配列を有する重鎖又は軽鎖可変領域又は両方を含んでなる抗体又はそのＦａｂ断片。
【請求項４５】
図２、７、２４から２９及び３４から４３の何れか一に記載の抗体のＣＤＲ-Ｈ１配列、ＣＤＲ-Ｈ２配列及びＣＤＲ-Ｈ３配列を含んでなる請求項４３に記載の抗体。
【請求項４６】
Ｇ６抗体のフレームワーク領域を含んでなる、請求項４０から４５の何れか一に記載の抗体。
【請求項４７】
Ｂ２０−４．１抗体のフレームワーク領域を含んでなる、請求項４０から４５の何れか一に記載の抗体。
【請求項４８】
（ａ）Ｘ１及びＸ２が任意のアミノ酸であり、
Ｘ３又はＸ４の何れか、又はＸ３とＸ４の両方がＲであり、
Ｘ５がＳ又はＡである
連続したアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｌを有するＣＤＲ-Ｌ１と、
（ｂ）Ｘ１がＳ又はＡ又はＧであり；
Ｘ２及びＸ３が任意のアミノ酸残基である
連続したアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有するＣＤＲ-Ｌ２と、
（ｃ）Ｘ１及びＸ２が任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ３がＳ又はＡである
連続したアミノ酸配列ＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＬを有するＣＤＲ-Ｌ３、
を含んでなり、齧歯類ＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することができる抗体又はそのＦａｂ断片。
【請求項４９】
Ｂ２０−４．１抗体のフレームワーク領域を含んでなる、請求項４８に記載の抗体。
【請求項５０】
モノクローナル抗体である、請求項１５から４９の何れか一に記載の抗体。
【請求項５１】
二特異性抗体である、請求項１５から４９の何れか一に記載の抗体。
【請求項５２】
合成抗体である、請求項１５から４９の何れか一に記載の抗体。
【請求項５３】
わずか約２ｎＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合することができる、請求項１５から４９の何れか一に記載の抗体。
【請求項５４】
わずか約１ｎＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合することができる、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
わずか約５００ｐＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合することができる、請求項５４に記載の抗体。
【請求項５６】
以下のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH（配列番号２９）
を重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第一重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）として含んでなる、請求項４４に記載の抗体。
【請求項５７】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号２８）
を軽鎖としてさらに含んでなる、請求項４４又は５６に記載の抗体。
【請求項５８】
以下のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTINASWIHWVRQAPGKGLEWVGAIYPYSGYTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGHSTSPWAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH（配列番号３８）
を重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として含んでなる、請求項４４に記載の抗体。
【請求項５９】
以下のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSINGSWIFWVRQAPGKGLEWVGAIWPFGGYTHYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGHSTSPWAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH（配列番号４１）
を重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として含んでなる、請求項４４に記載の抗体。
【請求項６０】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号３２）
を軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として含んでなる、請求項４４又は５６に記載の抗体。
【請求項６１】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVIRRSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNTSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４０）
を軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として含んでなる、請求項４４又は５９に記載の抗体。
【請求項６２】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQGYANPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （配列番号３０）
を軽鎖として含んでなる、請求項４４に記載の抗体。
【請求項６３】
以下のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGVTPAGGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (配列番号３５)
を重鎖可変ドメインとして含んでなる、請求項４４に記載の抗体。
【請求項６４】
以下のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGVTPAGGYTAYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (配列番号３６)
を重鎖可変ドメインとして含んでなる、請求項４４に記載の抗体。
【請求項６５】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGAGSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号３３)
を軽鎖として含んでなる、請求項４４又は５６に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項６６】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQGFANPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号３４)
を軽鎖として含んでなる、請求項４４又は６３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項６７】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号３７)
を軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として含んでなる、請求項４４又は５８に記載の抗体。
【請求項６８】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVIRRSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNTSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号３９)
を軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として含んでなる、請求項４４又は５９に記載の抗体。
【請求項６９】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVIRRSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNTSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号４０)
を軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として含んでなる、請求項４４又は５９に記載の抗体。
【請求項７０】
ＣＤＲ-Ｈ３配列がＦＶＦＦＬＰＹ（配列番号９２９）を含む、請求項４３に記載の抗体。
【請求項７１】
ＣＤＲ-Ｈ３配列がＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号９３０）を含む、請求項４３に記載の抗体。
【請求項７２】
ＣＤＲ-Ｈ３配列がＷＧＨＳＴＳＰＷ（配列番号９３１）を含む、請求項４３に記載の抗体。
【請求項７３】
ＣＤＲ-Ｈ３配列がＷＧＨＳＴＳＰＷＡＭＤＹ（配列番号９３２）を含む、請求項４３に記載の抗体。
【請求項７４】
ＣＤＲ-Ｈ３配列がＡＬＷＡＦＶＡ（配列番号９３３）を含む、請求項４３に記載の抗体。
【請求項７５】
ＣＤＲ-Ｈ３配列がＹＦＲＷＹＭＡ（配列番号９３４）を含む、請求項４３に記載の抗体。
【請求項７６】
齧歯類ＶＥＧＦがマウスＶＥＧＦである請求項４０から７５の何れか一に記載の抗体。
【請求項７７】
Ｇ６系列又はＢ２０系列抗体又はそのＦａｂ抗体である請求項４３に記載の抗体。
【請求項７８】
Ｇ６系列抗体がＧ６-２３である請求項７７に記載の抗体。
【請求項７９】
Ｇ６系列抗体がＧ６-３１である請求項７７に記載の抗体。
【請求項８０】
Ｂ２０系列抗体がＢ２０-４．１である請求項７７に記載の抗体。
【請求項８１】
請求項１から８０の何れか一に記載の抗体又はそのＦａｂ断片をコードする単離された核酸。
【請求項８２】
請求項８１に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項８３】
請求項８２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８４】
ａ）少なくとも一のＣＤＲ内に所望の多様性を有する合成抗体のライブラリを生成し；
ｂ）該ライブラリにｈＶＥＧＦを接触させて、結合体を形成させ；
ｃ）非結合体から結合体を分離して、標的ｈＶＥＧＦから結合体を溶出して、約０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の少なくした量の標的ｈＶＥＧＦとともに溶液中で結合体をインキュベートし；
ｄ）最も低い濃度の標的ＶＥＧＦに結合することができ、約５００ｐＭから２ｎＭの親和性を有する結合体を選別する、
合成抗体のライブラリから、齧歯類ＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することができる抗体又はそのＦａｂ断片を選別する方法。
【請求項８５】
請求項８３に記載の宿主細胞を培養して核酸を発現させることを含む、抗体を産生する方法。
【請求項８６】
宿主細胞培養物から抗体を回収することをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
抗体が宿主細胞培養培地から回収される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
請求項１から８０の何れか一に記載の抗体を含有してなる、治療を必要とする哺乳動物の病的な血管新生関連疾患を治療するための医薬。
【請求項８９】
疾患が癌、眼球血管再生に起因する疾患、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症又は子宮筋腫である、請求項８８に記載の医薬。
【請求項９０】
癌が、乳癌、大腸癌、膵癌、非小細胞性肺癌、非ホジキン性リンパ腫（ＮＨＬ）、腎臓癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択したものである、請求項８９に記載の医薬。
【請求項９１】
同時に又は連続して前記抗体と投与するための第二治療薬をさらに含んでなる、請求項９０に記載の医薬。
【請求項９２】
第二治療薬が、抗血管形成剤、抗腫瘍性組成物、化学療法剤及び細胞障害性剤からなる群から選択される薬剤である、請求項９１に記載の医薬。
【請求項９３】
抗血管形成剤が、抗体Ａ４．６．１と同じＶＥＧＦエピトープに結合することができる抗ｈＶＥＧＦ抗体である、請求項９２に記載の医薬。
【請求項９４】
眼球血管再生に起因する疾患が、糖尿病性盲目、網膜症、原発性糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症又はルベオーシスである、請求項８９に記載の医薬。
【請求項９５】
請求項１から８０の何れか一に記載のＦａｂ抗体を含有してなる、炎症性疾患又は免疫系疾患に罹患している又はその発症のリスクがある哺乳動物を治療するための医薬。
【請求項９６】
炎症性疾患又は免疫系疾患が慢性関節リウマチ、乾癬又は乾癬性関節炎である、請求項９５に記載の医薬。
【請求項９７】
Ｆａｂ抗体がＧ６系列抗体である、請求項９５に記載の医薬。
【請求項９８】
Ｆａｂ抗体がＢ２０系列抗体である、請求項９５に記載の医薬。
【請求項９９】
請求項１から８０の何れか一に記載の抗体を含有してなる、浮腫に罹患している又はその発症のリスクがある哺乳動物を治療するための医薬。
【請求項１００】
浮腫が、大脳浮腫、脳腫瘍と関係している浮腫又は脳卒中と関係している浮腫である、請求項９９に記載の医薬。
【請求項１０１】
ａ）生体試料を請求項１から８０の何れか一に記載の抗体と接触させて；
ｂ）該試料への該抗体の結合を検出する
ことを含む、生体試料中のＶＥＧＦの検出方法。
【請求項１０２】
生体試料が、組織、血液、血清又は脊髄液である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
容器；
請求項１から８０何れか一に記載の抗体
を具備する診断用キット。
【請求項１０４】
さらに、試料中のＶＥＧＦの検出のための抗体の使用についての指示書を更に具備する、請求項１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
生体試料が、組織、血液、血清又は脊髄液である、請求項１０３に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
他の実施態様では、本発明の抗体は１．０以上（１０Ｍ−１Ｓ−１）のヒト及び／又はマウスＶＥＧＦへの結合速度（ｋｏｎ）を有する。他の実施態様では、速度は５．０以上（１０Ｍ−１Ｓ−１）である。更に他の実施態様では、速度は１０．０以上（１０Ｍ−１Ｓ−１）である。
他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＧ８８の全表面積（Å２）の８０％未満に接触する。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＧ８８の全表面積（Å２）の７０％未満に接触する。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＧ８８の全表面積（Å２）の６０％未満に接触する。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＧ８８の全表面積（Å２）の１％未満に接触する。このような抗体は一般にマウスＶＥＧＦに結合可能である。
ＶＥＧＦへの結合が阻害されるＶＥＧＦレセプターはＶＥＧＦレセプター１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）又は双方のレセプターでありうる。
一実施態様では、本発明の抗体はＶＥＧＦの２０ｓヘリックスに接触する。他の実施態様では、本発明の抗体はＶＥＧＦの８０ｓループに接触する。更に他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦの２０ｓヘリックス及び８０ｓループに接触する。
一実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｃ１０４及びＰ１０６の何れか一つに対して相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＦ１７、Ｍ１８、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｃ１０４及びＰ１０６に対して相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＹ２１に対して相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はＶＥＧＦのＹ２５に対して更なる相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はＭ１８及びＱ８９ヒトＶＥＧＦに対して相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＭ１８、Ｙ２１及びＹ２５に対して相対親和性を有するか又は接触可能である。好適な実施態様では、本発明の抗体は上述の実施態様の任意のものの三又はそれ以上の組み合わせを有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
更なる実施態様では、本発明の抗体はここに記載した機能的エピトープを有する。一実施態様では、本発明に係る抗体の機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７を含む。他の実施態様では、本発明に係る抗体の機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＩ８３を含む。更なる実施態様では、その機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｉ８３及びＱ８９を含む。一実施態様では、本発明に係る抗体の機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＭ１８を含む。更なる実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８及びＩ８９を含む。一実施態様では、本発明に係る抗体の機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１及びＹ２５を含む。更なる実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３及びＩ８３を含む。他の実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｙ２５及びＱ８９を含む。更なる実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３、及びＣ１０４を含む。更に他の実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３及びＱ８９を含む。本発明に係る抗体の機能的エピトープは、ヒトＶＥＧＦのＦ１７、Ｍ１８、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｋ４８、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｍ８１、Ｉ８３、Ｈ８６、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｃ１０４及びＰ１０６からなる群から選択される残基の何れかの組み合わせを含みうる。他の実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｋ４８、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｍ８１、Ｉ８３、Ｈ８６、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｃ１０４及びＰ１０６を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
好適な実施態様では、抗体はＢ２０−４．１抗体又はＢ２０−４抗体のフレームワーク領域を含む。他の実施態様では、抗体はＢ２０重鎖可変領域のＣＤＲｓ又は可変領域を含む。他の実施態様では、ＣＤＲ-Ｌ２のＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号９１７）はＸ１ＡＳＸ４ＬＸ６（配列番号９１９）によってコードされており、ここでＸ４とＸ６は任意のアミノ酸である。他の実施態様では、ＣＤＲ-Ｌ１はおよそ残基２８−３３に位置し、ＣＤＲ-Ｌ２はおよそ残基５０−５５に位置しており；ＣＤＲ-Ｌ３はおよそ残基９１−９６に位置している。他の実施態様では、ＣＤＲ-Ｈ１はおよそ残基３０−３３に位置し、ＣＤＲ-Ｈ２はおよそ残基５０−５８に位置しており；ＣＤＲ-Ｌ３はおよそ残基９４−１００ａに位置している。
また考えられるものは、図２、７、２４−２９及び３４−４３の抗体の何れか一のＣＤＲ-Ｈ３配列を含み、場合によっては図２、７、２４−２９及び３４−４３の同じ抗体のＣＤＲ-Ｈ２及び／又はＣＤＲ-Ｈ１を更に含む抗体である。また考えられるものは、Ｇ６列抗体、Ｂ２０列抗体、ＹＡＤＳ列抗体及びＹＳ列抗体からなる群から選択される抗体である。更に、本発明の他の抗体は図２、７、２４−２９及び３４−４３の抗体の何れか一の可変領域を含む抗体である。
好適な一実施態様では、本発明の抗体はハイブリドーマから直接産生するかハイブリドーマ由来の抗体配列から誘導するよりもむしろ組換え法によって合成される。好適な一実施態様では、抗体は約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、又は約５００ｐＭ以下のＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合する。一実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体は多重特異性抗体（二重特異性抗体）である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
「抗体」なる用語は、は最も広義に用いられ、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体フラグメントを特に包含する。本発明の「Ｇ6系列ポリペプチド」は、図２、７、２４−２６および３４−３５の任意の一つのＧ6抗体又はＧ6由来抗体の配列に由来し、本発明の所望の親和性（例えば、２５℃で抗体のＦａｂ型に対して１０ｎＭの以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下）でヒトＶＥＧＦに結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「Ｂ20系列ポリペプチド」は、図２７−２９の任意の一つのＢ20抗体又はＢ20由来抗体の配列由来であり、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦと結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「ＹＡＤＳ系列ポリペプチド」又は「ＹＡＤＳポリペプチド」は、図３６−４０の任意の一つのＹＡＤＳ抗体の配列由来であり、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦと結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「ＹＡＤＳ-２系列ポリペプチド」又は「ＹＡＤＳ2ポリペプチド」は、図３６又は図３９のＹＡＤＳ２抗体の配列に由来し、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦに結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「ＹＡＤＳ-３系列ポリペプチド」又は「ＹＡＤＳ3ポリペプチド」は、図３６又は図３９のＹＡＤＳ3抗体の配列に由来し、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦと結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「ＹＳ系列ポリペプチド」又は「ＹＳポリペプチド」は、図４１−４３のＹＳ抗体の配列に由来し、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦと結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。一好ましい実施態様によれば、Ｇ系列ポリペプチド、Ｂ20系列ポリペプチド、ＹＡＤＳ系列ポリペプチド、ＹＡＤＳ2系列ポリペプチド、ＹＡＤＳ3系列ポリペプチド又はＹＳ系列ポリペプチドは、互いの１０倍以内のＫｄ値でヒト及び非ヒト哺乳動物ＶＥＧＦに結合する。一実施態様によれば、ヒトＶＥＧＦおよびマウスＶＥＧＦに対する抗体結合のｋＤ値は、１０ｎＭ以下である。他の実施態様では、抗体は、２ｎＭ以下のＫｄ値でヒトＶＥＧＦおよびマウスＶＥＧＦと結合する。他の実施態様では、抗体は、1ｎＭ以下のＫｄ値でヒトＶＥＧＦと結合する。このようなＧ6系列、Ｂ20系列、ＹＡＤＳおよびＹＳ系列ポリペプチドのＶＥＧＦに対する親和性は、例えば、本願明細書において教示されるファージディスプレイ技術などの方法によって改良することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
ショットガンスキャニングライブラリのための突然変異原性オリゴヌクレオチド
Ｇ６及びＧ６−２３抗体のＣＤＲ残基をランダム化するためのショットガンアラニン（Ａ）及びホモログ（Ｈ）スキャンライブラリの構築の以下の突然変異原性オリゴヌクレオチドは、既に記載したショットガンコドンを用いて設定した(Vajdosら. (2002) J. Mol Biol 320:415-428)。等モルＤＮＡ縮重をＩＵＢコードで表し（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）、縮重コドンを太字で表す。以下のすべてのオリゴヌクレオチドはGenentech DNA synthesis Groupによって生成した。
2007526756.tif 000001
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
【図１】ファージディスプレイに有用な様々なタイプの抗体断片を概略的に示す。
【図２】鋳型抗体ｈ４Ｄ５及び４つの選択した新規の合成抗体（配列番号９２１−９２８）の重鎖ＣＤＲ内の残基変異を比較する。また、４つの抗体のＶＥＧＦ結合を比較する。
【図３】新規の抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦ結合をブロックするＶＥＧＦレセプター（Ｆｌｔ１−ｄ２及びＫＤＲ）の能力を表す。抗ＶＥＧＦ変異体であるＹ０９５９Ａを対照として用いた。
【図４】Ｇ６抗体がｈＶＥＧＦ及びｍＶＥＧＦの両方には特異的に結合するが、ＶＥＧＦ関連抗原には結合しないことを示す。
【図５】Ｇ６がＫＤＲレセプターに対するｈＶＥＧＦとｍＶＥＧＦ両方の結合を効率的にブロックすることができることを示す。Ｆａｂ−１２及びＹ０３１７を対照として用いた。
【図６】ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖についてのＧ６の効果を示す。
【図７】高親和性抗ＶＥＧＦ抗体の生成工程と、様々な親和性を改良したＧ６変異体（配列番号４４−８４）に関する残基と結合親和性の表を示す。
【図８】Ｇ６、Ｇ６−２３及びＦａｂ−１２のＶＥＧＦ結合を比較する。ｈＶＥＧＦ及びｍＶＥＧＦに対する会合速度（結合速度）を時間の経過につれて測定した；算出したＫｏｎ、Ｋｏｆｆ及びＫｄを表に示す。
【図９】Ｇ６とさらに改良したＧ６−２３の変異体のＶＥＧＦ結合速度を比較した。
【図１０】新生仔マウスの体重と生存率に対するＶＥＧＦアンタゴニスト（Ｇ６−２３及びＦｌｔ１−３Ｆｃ）の効果を示す。
【図１１】異種移植したヒト腫瘍細胞（ＫＭ１２細胞及びＳＷ４８０細胞）によるヌードマウスでの腫瘍の成長に対するＧ６−２３の効果を示す。処置日数に対する腫瘍容積として測定した。
【図１２】Ｇ６−２３の有無の下でのＫＭ１２異種移植性マウスでのＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦとｍＶＥＧＦの両方）発現を示す。
【図１３】異種移植したマウス腫瘍（ＬＬ２）によるヌードマウスでの腫瘍の成長に対するＶＥＧＦアンタゴニスト（Ｇ６−２３及びＦｌｔ１−３Ｆｃ）の効果を示す。処置日数に対する腫瘍容積として測定した。
【図１４Ａ】Ｇ６及びＧ６−２３のショットガンスキャニングコドンのために設定したコドンを示す。各スキャンについて、Ｇ６及びＧ６−２３Ｆａｂのアラニンスキャンでは野生型アミノ酸及びアラニン（ｍ１）を、又はホモログスキャンでは類似のアミノ酸（ｍ４）をコードするように重鎖の縮重ショットガンコドンを設定した。ショットガンコドンをＩＵＢコードで表す（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。天然の遺伝子コードのためにいくつかの残基でより多くの置換（ｍ２、ｍ３及びｍ５）が起こった。野生型アラニンの場合、アラニンとグリシンをコードするようにショットガンコドンを設定した。ＣＤＲの各残基をアミノ酸の一文字表記で表し、その後ろにKabatら, 1987の図式に従ってその位置を示す数字を示した。Ｇ６とＧ６−２３の配列が異なる位置を二文字で示した。例えば、Ｑ８９ＫはＧ６ではＧｌｎをＧ６−２３ではＬｙｓである位置８９であることを表す。星印（＊）はアラニンスキャンとホモログスキャンのコドンが共通の置換をコードしていることを表す。
【図１４Ｂ】Ｇ６及びＧ６−２３のショットガンスキャニングコドンのために設定したコドンを示す。各スキャンについて、Ｇ６及びＧ６−２３Ｆａｂのアラニンスキャンでは野生型アミノ酸及びアラニン（ｍ１）を、又はホモログスキャンでは類似のアミノ酸（ｍ４）をコードするように軽鎖の縮重ショットガンコドンを設定した。ショットガンコドンをＩＵＢコードで表す（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。天然の遺伝子コードのためにいくつかの残基でより多くの置換（ｍ２、ｍ３及びｍ５）が起こった。野生型アラニンの場合、アラニンとグリシンをコードするようにショットガンコドンを設定した。ＣＤＲの各残基をアミノ酸の一文字表記で表し、その後ろにKabatら, 1987の図式に従ってその位置を示す数字を示した。Ｇ６とＧ６−２３の配列が異なる位置を二文字で示した。例えば、Ｑ８９ＫはＧ６ではＧｌｎをＧ６−２３ではＬｙｓである位置８９であることを表す。星印（＊）はアラニンスキャンとホモログスキャンのコドンが共通の置換をコードしていることを表す。
【図１５】Ｇ６及びＧ６−２３のショットガンスキャニングライブラリの構築に関する情報を示す。ショットガンスキャニングライブラリによって、Ｇ６及びＧ６−２３の重鎖（ｈｃ）又は軽鎖（ｌｃ）上の示す残基のコドンをアラニン又はホモログの何れかのスキャンショットガンコドンに変異させた（図１４Ａ及びＢ）。実施例１に示すように突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いて全部で８個のライブラリを構築した。各ライブラリの理論上の多様性、突然変異原性オリゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸組み合わせの計数は実際に構築したライブラリの多様性の少なくとも１００倍を超えていた。
【図１６Ａ】Ｇ６の重鎖ショットガンスキャンの結果を示す。ｈＶＥＧＦ（標的選別）又は抗ｇＤタグ抗体（ディスプレイ選別）の何れかに対する結合選別の後に単離したアラニンスキャンライブラリ（ｍ１、ｍ２及びｍ３）又はホモログスキャンライブラリ（ｍ４及びｍ５）の何れかからの機能的クローンの配列からｗｔ／ｍｕｔ比を算出することによって、Ｇ６の重鎖ＣＤＲ残基の各変異（図１４Ａ及びＢ）の効果を評価した。ｈＶＥＧＦに対するＧ６の結合親和性に対する各変異の効果を量的に推定するために、各変異部位での機能的割合（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）を標的選別のｗｔ／ｍｕｔ比をディスプレイ選別の比で割ることによって求めた。有害な効果を１．０以上のＦｗｔ／ｍｕｔ値で表し、著しく有害な効果（Ｆｗｔ／ｍｕｔ＞１０）となる変異を太字で示した。標的選別の中であまり変異は見られず、そのｗｔ／ｍｕｔ比についてより低い限定のみを定義することができた；ゆえに、Ｆｗｔ／ｍｕｔ値をより大きな信号として表された。
【図１６Ｂ】Ｇ６−２３の重鎖ショットガンスキャンの結果を示す。ｈＶＥＧＦ（標的選別）又は抗ｇＤタグ抗体（ディスプレイ選別）の何れかに対する結合選別の後に単離したアラニンスキャンライブラリ（ｍ１、ｍ２及びｍ３）又はホモログスキャンライブラリ（ｍ４及びｍ５）の何れかからの機能的クローンの配列からｗｔ／ｍｕｔ比を算出することによって、Ｇ６−２３の重鎖ＣＤＲ残基の各変異（図１４Ａ及びＢ）の効果を評価した。ｈＶＥＧＦに対するＧ６−２３の結合親和性に対する各変異の効果を量的に推定するために、各変異部位での機能的割合（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）を標的選別のｗｔ／ｍｕｔ比をディスプレイ選別の比で割ることによって求めた。有害な効果を１．０以上のＦｗｔ／ｍｕｔ値で表し、著しく有害な効果（Ｆｗｔ／ｍｕｔ＞１０）となる変異を太字で示した。標的選別の中であまり変異は見られず、そのｗｔ／ｍｕｔ比についてより低い限定のみを定義することができた；ゆえに、Ｆｗｔ／ｍｕｔ値をより大きな信号として表された。
【図１７Ａ】Ｇ６の軽鎖ショットガンスキャンの結果を示す。ｈＶＥＧＦ（標的選別）又は抗ｇＤタグ抗体（ディスプレイ選別）の何れかに対する結合選別の後に単離したアラニンスキャンライブラリ（ｍ１、ｍ２及びｍ３）又はホモログスキャンライブラリ（ｍ４及びｍ５）の何れかからの機能的クローンの配列からｗｔ／ｍｕｔ比を算出することによって、Ｇ６の軽鎖ＣＤＲ残基の各変異（図１４Ａ及びＢ）の効果を評価した。ｈＶＥＧＦに対するＧ６の結合親和性に対する各変異の効果を量的に推定するために、各変異部位での機能的割合（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）を標的選別のｗｔ／ｍｕｔ比をディスプレイ選別の比で割ることによって求めた。有害な効果を１．０以上のＦｗｔ／ｍｕｔ値で表し、著しく有害な効果（Ｆｗｔ／ｍｕｔ＞１０）となる変異を太字で示した。
【図１７Ｂ】Ｇ６−２３の軽鎖ショットガンスキャンの結果を示す。ｈＶＥＧＦ（標的選別）又は抗ｇＤタグ抗体（ディスプレイ選別）の何れかに対する結合選別の後に単離したアラニンスキャンライブラリ（ｍ１、ｍ２及びｍ３）又はホモログスキャンライブラリ（ｍ４及びｍ５）の何れかからの機能的クローンの配列からｗｔ／ｍｕｔ比を算出することによって、Ｇ６−２３の軽鎖ＣＤＲ残基の各変異（図１４Ａ及びＢ）の効果を評価した。ｈＶＥＧＦに対するＧ６−２３の結合親和性に対する各変異の効果を量的に推定するために、各変異部位での機能的割合（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）を標的選別のｗｔ／ｍｕｔ比をディスプレイ選別の比で割ることによって求めた。有害な効果を１．０以上のＦｗｔ／ｍｕｔ値で表し、著しく有害な効果（Ｆｗｔ／ｍｕｔ＞１０）となる変異を太字で示した。
【図１８】ショットガンスキャニングの機能的値（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）にてＦａｂＧ６及びＧ６−２３の点突然変異のｈＶＥＧＦへの相対的結合活性の比較である。各変異タンパク質のｈＶＥＧＦへの相対的結合活性を、各点突然変異によるｈＶＥＧＦ結合活性の倍数的減少として測定したＩＣ５０、ｍｕｔ／ＩＣ５０、ｗｔ比にて評価した。Ｇ６及びＧ６−２３のＩＣ５０、ｗｔ値はそれぞれ２．５ｎＭ及び２０ｐＭであった。標準偏差を示していない比は偏差が±５％であると推測される。このアッセイに用いたｈＶＥＧＦの最も高い濃度（Ｇ６及びＧ６−２３に対してそれぞれ１μＭ及び０．１μＭ）では阻害が見られなかったので、顕著な有害変異の比は正確に定量できず、ｈＶＥＧＦ結合での倍数減少についてより低い限定（Ｇ６及びＧ６−２３に対してそれぞれ＞４００及び＞５０００）として示されたのみであった。ショットガンスキャニングの機能的値（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）は図１６及び図１７から求めた。両方の突然変異原性スキャニングのＤＤＧｍｕｔ−ｗｔ値は、図２２Ａ及びＢの説明文に示す式を用いて算出した。
【図１９】異なる型の抗ｈＶＥＧＦ抗体又はｈＶＥＧＦレセプターに結合するファージ由来ｈＶＥＧＦ１−１０９単一アラニン変異体についてのファージＥＬＩＳＡによって測定した相対的結合親和性を示す（それぞれ、Ｇ６、Ｇ６−２３とＢ２０−４Ｆａｂ、モノクローナル抗体Ａ４．６．１とレセプターＦｌｔ−１（１−３）、Ｆｌｔ−１Ｄ２とＫＤＲ−Ｉｇ）。抗ｈＶＥＧＦ抗体及びｈＶＥＧＦレセプターの結合親和性に対するｈＶＥＧＦのファージ由来単一アラニン変異体の効果を、ファージＥＬＩＳＡからＩＣ５０,ａｌａ／ＩＤ５０,ｗｔとして算出した相対的ＩＣ５０値として評価した。結合親和性の減少と１０以上の著しい相対的ＩＣ５０値を有する任意の変異体を現す１．０以上の数は白抜きの太字で示した。Ｇ６及びＧ６−２３のＩＣ５０,ｗｔ値はそれぞれ２．５ｎＭ及び２０ｐＭである。標準偏差を示していない比は偏差が±５％であると推測される。ファージＥＬＩＳＡは測定可能なシグナルを生成するためにそのタンパク質標的への変異型ファジミドの実質的結合を必要とするため、非結合体（ＮＢ）は正確に定量することができなかったが、非常に結合親和性が低減されたことが理解されるであろう（１０００ＩＣ５０値より大きい）。星印（＊）は、Ｆａｂ−１２及びｈＶＥＧＦレセプターに対するｈＶＥＧＦのアラニンスキャニングデータがMuller ら, (1997) PNAS USA 94: 7192-7197及びLiら., (2000) Cancer Res. 57:4593-4599からのものであることを表す。
【図２０】ＦａｂＧ６及びＧ６−２３の重鎖ショットガンスキャンの結果を示す。Ｆｗｔ／ｍｕｔ値は、ｈＶＥＧＦへの結合親和性に対するＦａｂＧ６及びＧ６−２３の重鎖ＣＤＲアラニン置換（黒線）又はホモログ置換（白線）の効果を測定したものである。（Ａ）ＦａｂＧ６重鎖のショットガンスキャンデータは図１６Ａから、（Ｂ）ＦａｂＧ６−２３重鎖のショットガンスキャンデータは図１６Ｂからのものである。
【図２１】ＦａｂＧ６及びＧ６−２３の軽鎖ショットガンスキャンの結果を示す。Ｆｗｔ／ｍｕｔ値は、ｈＶＥＧＦへの結合親和性に対するＦａｂＧ６及びＧ６−２３の軽鎖ＣＤＲアラニン置換（黒線）又はホモログ置換（白線）の効果を測定したものである。（Ａ）ＦａｂＧ６軽鎖のショットガンスキャンデータは図１７Ａから、（Ｂ）ＦａｂＧ６−２３軽鎖のショットガンスキャンデータは図１７Ｂからのものである。
【図２２】ＦａｂＧ６及びＧ６−２３ショットガンスキャンのＤＤＧＡｌａ−ｗｔ値を示す。ｈＶＥＧＦの結合親和性に対する（Ａ）ＦａｂＧ６及び（Ｂ）ＦａｂＧ６−２３のＣＤＲアラニン置換の効果を測定したＤＤＧＡｌａ−ｗｔ値は、既に記載のように(Weissら., (2000) PNAS USA 97:8950-8954)、生物物理学的な式を用いて算出し(DDGAla-wt = RTln(Ka,wt/Ka,Ala) = RTln(Fwt/Ala))、Ｆｗｔ／Ａｌａ値は図１６及び１７から得た。
【図２３】ＢＩＡコアチップに固定したｈＶＥＧＦに２５℃の１００ｎＭのＦａｂを注入したsensogramの結果を示す。ＣＤＲ−Ｈ２の位置５８でのアラニン置換によるＧ６変異体の結合速度の改善が実証された。また、ＣＤＲ-Ｈ２の位置５１でのバリン置換を有する変異体についても付加的な結合速度の改善が見られた。この図はGraphPad Prism 4.0 バージョンソフトウェア(http://www.graphpad .com)を用いて作成した。
【図２４】Ｇ６Ｆａｂ軽鎖とＧ６Ｆａｂ重鎖それぞれのアミノ酸配列（配列番号２８−２９）を示す。下線は、カバット番号付けに従ったＣＤＲ１−ＬＣ、ＣＤＲ２−ＬＣ及びＣＤＲ３−ＬＣ  又はＣＤＲ１−ＨＣ、ＣＤＲ２−ＨＣ又はＣＤＲ３−ＨＣの残基を示す。
【図２５】Ｇ６−２３Ｆａｂ軽鎖とＧ６−２３Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列、並びにＧ６−３１及びＧ６−８のＦａｂ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３０−３３）を示す。下線は、カバット番号付けに従ったＣＤＲの位置を示す。
【図２６】Ｇ６−２３．１及びＧ６−２３．２のＦａｂ軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号３４−３６）を示す。下線は、カバット番号付けに従ったＣＤＲの位置を示す。
【図２７】Ｂ２０Ｆａｂの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号３７−３８）を示す。下線は、カバット番号付けに従ったＣＤＲの位置を示す。
【図２８】Ｂ２０ベースのライブラリ由来のＶＥＧＦの高親和性結合体の概要を示す（配列番号８５−１４０）。
【図２９】Ｂ２０−４及びＢ２０−４．１のＦａｂ軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号３９−４１）を示す。
【図３０】軽鎖ランダム化による抗ｍＶＥＧＦ Ｆａｂ Ｇ６の親和性改善を示す。（Ａ）ｍＶＥＧＦを固定したＢＩＡコアチップに３７℃の５００ｎＭのＦａｂを注入したセンソグラム(sensogram)により解離速度と結合速度の改良が実証された；（Ｂ）蛍光強度の減少率としてＧ６と変異型ＦａｂとｍＶＥＧＦ間の複合体形成の観察速度（Kobs, s-1）を用いたｍＶＥＧＦ（ｎＭ）の濃度に対してプロットし、pseudo-first-order分析に基づく勾配が結合速度（×１０９  Ｍ−１  ｓ−１）である。
【図３１】Ｇ６がＦｌｔ−１レセプターに対するｈＶＥＧＦ及びｍＶＥＧＦの結合を効果的にブロックすることができることを示す。Ｆａｂ−１２及びＹ０３１７を対照として用いた。
【図３２】ＢＩＡコアを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法又は競合的ＥＬＩＳＡを用いた可溶性結合アッセイ又はＦａｂ−１２及びＹ０３１７を比較として用いた蛍光消光を用いて、２５℃及び３７℃でのＦａｂタンパク質−ヒトＶＥＧＦ又はＦａｂタンパク質−マウスＶＥＧＦの相互作用についての結合速度、解離速度、Ｋｄ値及びＩＣ５０値を示す。「ＮＢ］は非結合体を表す。「ＮＤ」は検出されないことを表す。
【図３３Ａ】０．１ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３３Ｂ】０．２５ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３３Ｃ】０．５ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３３Ｄ】２ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３３Ｅ】５ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３４】配列及びＩＣ５０分析に基づく変異体Ｇ６の（Ａ）軽鎖及び（Ｂ）重鎖の変異体の概要を示す（配列番号３６１−４８８）。野生型のＩＣ５０は異なる実験で得られた値の平均を表す。変異したアミノ酸位置を太字で示す。野生型のＧ６と異なる残基を白抜きで示す。残基は、一文字アミノ酸コードとKabatら, 1987の図式に従った位置を示す数字で示す。
【図３５】配列及びＩＣ５０分析に基づく変異体Ｇ６−２３の（Ａ）軽鎖及び（Ｂ）重鎖の変異体の概要を示す（配列番号１４１−２７２）。野生型のＩＣ５０は異なる実験で得られた値の平均を表す。変異したアミノ酸位置を太字で示す。野生型のＧ６と異なる残基を白抜きで示す。残基は、一文字アミノ酸コードとKabatら, 1987の図式に従った位置を示す数字で示す。
【図３６】ＹＡＤＳ−１、ＹＡＤＳ−２及びＹＡＤＳ−３抗体と他のクローンのアミノ酸配列の一部を示す（配列番号４８９−５６０）。ＹＡＤＳ−ＩＩライブラリから選択した３つのｈＶＥＧＦ結合体の配列を表す。ライブラリ内でランダム化されていない残基を灰色で示す。
【図３７】一群のＹＡＤＳ系列抗体のアミノ酸配列を示す（配列番号２７３−３３２）。ｈＶＥＧＦに対するライブラリＹＡＤＳ−Ａの分類から得た特定のクローンの配列を表す。ライブラリ内でランダム化されていない残基を灰色で示す。
【図３８】一群のＹＡＤＳ系列抗体のアミノ酸配列を示す（配列番号３３３−３６０）。ｈＶＥＧＦに対するライブラリＹＡＤＳ−Ｂの分類から得た特定のクローンの配列を表す。ライブラリ内でランダム化されていない残基を灰色で示す。
【図３９】ＹＡＤＳ２及びＹＡＤＳ３抗体のＦａｂ配列（配列番号２１−２４）を示す。太字の部分は可変領域の残基を表す。下線部分はＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２又はＣＤＲ−Ｈ３のおおよその残基を表す。
【図４０】ＹＡＤＳ２抗体のＮＮＫ変異体（配列番号７２３−７９４）を示す。「ｘ」は停止コドン又は読取り不可能な配列を表す。
【図４１】一群のＹＳ系列抗体のアミノ酸配列を示す（配列番号７９５−９１４）。ライブラリＹＳ−Ａ及びＹＳ−Ｂから得た結合体の配列を表す。
【図４２】ＹＳライブラリの抗ＶＥＧＦ抗体のＣＤＲ配列を示す（配列番号５６１−７２２）。ライブラリＢからクローン１−５２が選別され、ライブラリＡからクローン５３−６３が選別された。左から右へ、カバット番号付けに従って、ＣＤＲ-Ｌ３の段落１−５はそれぞれ位置９１、９２、９３、９４及び９６を表す；ＣＤＲ-Ｈ１の段落１−５は位置２８、３０、３１、３２及び３３を表す；ＣＤＲ-Ｈ２の段落１−６は位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８を表す；ＣＤＲ-Ｈ３の段落１−１５は９５、９６、９７、９８、９９、１００及び１００ａ−ｉを表す。
【図４３】ＹＳ１ Ｆａｂの配列を表す。太字の部分は可変領域の残基を表す（配列番号４２−４３）。