【手続補正書】
【提出日】平成18年11月29日(2006.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】抗菌剤及びその製造方法
【技術分野】
【０００１】
この発明は、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５（Trichoderma hurzianum ＳＫ−５５）菌の培地から得られる糸状菌及び細菌に抗菌性を有する抗菌剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリコデルマ菌は、微生物農薬として病害防除に実用化されている糸状菌であり、Trichoderuma lignourum がタバコの白絹病の防除用農薬として登録されている（農薬登録 No.7023）。また英国、フランスでもTrichoderuma hurzianumを有効成分とする野菜の立枯病、苗腐病に有効な微生物農薬（F-ｓtop）が登録されている。
【０００３】
近来減農薬・生態系保全型の病害防除の必要性が強く唱えられ、特に生物防除方法は環境負荷への影響が少ないと考えられるので、精力的に研究が進められている。
【０００４】
植物の根や根圏から分離される細菌や、菌類の中には植物の生育を促進するものがあり、それぞれ植物生育促進根圏（plant growth-promoting rhizobacteria：ＰＧＰＲ)、植物生育促進菌類（plant growth-promoting fungi：ＰＧＰＦ)と呼ばれている。
【０００５】
前記有用根圏微生物であるＰＧＰＲ、ＰＧＰＦは植物の生育を促進するのみならず、各種の土壌病害を抑制することも知られている。また最近では、土壌病害のみならず、地上病害も抑制する事実も明らかにされ、前記ＰＧＰＲ、ＰＧＰＦは、植物の全身抵抗性の誘導が関わっていることが見出されたと紹介されている（１９９９年６月号、「今月の農業」誌）。
【０００６】
またコウライシバから分離選抜したPhoma，Trichoderma, Fusarium，Penicillium，Sterileなどの菌が、キュウリにおける炭そ病に対し、誘導抵抗性を示すことが報告されている（１９９９年６月号、「今月の農業」誌）。
【特許文献１】特開平６−１９２０２８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この発明は、植物病原菌に抗菌性を有する物質を得ることを課題として研究しており、北海道十勝地方の土壌からTrichoderuma hurzianum ＳＫ−５５(トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５)菌を分離した。この菌は、植物病原菌の８０％を占めるとされる土壌伝染性病原糸状菌に対して広く拮抗性を示す菌であり、現在芝のブラウンバッチ、ラージバッチなどの Rhizoctonia類に微生物農薬（生菌製剤）として開発中のものである。前記トリコデルマ ハルジアナムＳＫ−５５菌の拮抗作用は、相手菌糸に接触し、コイリングをする事により、細胞質凝集を促し死滅させるものである。その外観的観察経過より見てペニシリアム（Penicillium sp）等が生産する抗生物質のような培地上で阻止円を示すほど活性が高いものではなく、菌糸同志の接触により発現するものと推定される。
【０００８】
前記細胞質凝集作用が、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５菌の生産する何らかの物質によってもたらされると考えられ、これを究明することを第一の課題としたものである。
【０００９】
なお、この発明で用いるトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５菌は、日本国内工業技術院微生物工業研究所に受託番号「微工研菌寄第１３３２７号」として寄託されている（受注の日：１９９２年１２月９日、寄託者：株式会社北海道グリーン興産、代表者  佐々木進）。微工研は、当該原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託への移管請求を１９９２年１２月９日付で行ない、受託番号ＢＰ−４３４６が付与されている。
【００１０】
前記従来のＰＧＰＲ、ＰＧＰＦは、特定植物（例えばキュウリ）に対し、炭そ病についての有効性を示すもので、今後研究の結果、その使用方法の改善などにより、他の植物、病原菌に対して有効なことが判明する可能性はあるとしても、未だ具体的植物、病原菌に対しては今後の課題とされている。
【００１１】
然し乍ら単に病原菌を殺菌するという従来の生物農薬の思考形態が、植物の根茎に亘り抗菌性を付与する方向に変りつつあることは、今後の植物栽培上重要な示唆を含むものである。
【００１２】
この発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５菌について、各種実験を重ねている間に、前記生物農薬の将来性と合致することに想到し、更に使用方法、対象植物等を選定、研究の結果、この発明を完成したのである。将来の植物栽培に多大の影響を与えるものとして、この発明はきわめて有望であり、将来の農業等を支える重要な手段の１つとなることに疑はない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この発明は、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５菌の生産する物質により、細胞凝集作用（抗菌性）がもたらされるものと推定し、前記菌を培養、精製、同定した所、糸状菌又は細菌に抗菌性を有する物質を得たのである。
【００１４】
また他の発明は、植物栽培に際し、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５菌の分生胞子を覆土中に共存させて増殖させることにより、その生成物質により、各種植物の根茎活性を付与し、耐菌性を向上させることが判明し、前記従来の問題点を発展的に改善させて、実用性を確立したものである。
【００１５】
即ち抗菌剤の発明は、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌を固体培地で培養して得た病原微生物に抗菌性を有する物質であって、下記成分を含むことを特徴とした抗菌剤であり、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌を液体培地で培養して得た病原微生物に抗菌性を有する物質であって、下記成分を含むことを特徴とした抗菌剤である。
【００１６】
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-...であってその分子量１９３３
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-...であってその分子量１９４９または１９６４
Ｃ成分：
【化３】
2007008960.tif 000001
【００１７】
...であってその分子量１６８（Ｃ８Ｈ8Ｏ４）
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-... であってその分子量１８１０
【００１８】
また、病原微生物は、Rhizoctonia solani(AG-1IA), Bacillus subtilis ATCC6633, Micrococcus luters ATCC6633, Staphylococcus aureus 209Pとしたものであり、病原微生物は、Bacillus subtilis ATCC6633, Micrococcus luters ATCC6633, Staphylococcus aureus 209P, Escherichia coli NIHJとしたものである。
【００１９】
更に、固体培地は、米を主材料とし、これに少量の大豆かす、滅菌水を添加するものであり、液体培地はグルコースを主材とし、これに少量のポリペプトン、Nacl、酵母エキス及び炭酸カルシウムと、適量の滅菌水を加えたものである。
【００２０】
次に製造方法の発明は、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌を固定培地に植菌し、２５℃〜３０℃で７日〜１５日間静置培養した後、請求項１記載の抗菌剤を得ることを特徴とした抗菌剤の製造方法であり、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌を液体培地に植菌し、２５℃〜３０℃で４日〜１０日間振盪培養した後、請求項２記載の抗菌剤を得ることを特徴とした抗菌剤の製造方法である。
【００２１】
この発明において、使用する固体培地として、米培地を用いた。米培地は、米に対し、大豆かす３％、滅菌水１０％よりなる固定培地であって、培養中に培地の表面が乾燥しないよう、滅菌水を添加した。
【００２２】
この発明において、使用する液体培地は、グルコース３．０％〜５．０％、ポリペプトン０．５％、Ｎａｃｌ０．８％、酵母エキス０．２％、炭酸カルシウム１．０％である。
【００２３】
前記のように固定培地と、液体培地によれば、夫々の特性により、異なる物質を生成することが明らかとなった。このような結果についてのメカニズムは明らかでないが、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５菌に対する刺激その他の作用の相違、かつ培地構成物質に関する特性により、異なる物質を生成するものであって、前記米培地及び液体培地以外の成分の培地であっても同様の物質を生成することは十分考えられ、かつ生成効率向上等今後の研究課題は多大である。
【００２４】
前記におけるトリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５菌の分生胞子を培養し、その単離精製物を検討した所、ＵＶ吸収スペクトラム、質量分析及びＮＭＲ測定結果より、Aib（α-Aminoisobutyric acid）を含むPolypeptideの、Peptibols系と判断した。Peptibols系抗 生物質はアミノ酸配列の中に α-Aminoisobutyric acid（Aib）を含んでおり、 Ｎ末端がAcetyl基で、Ｃ末端が Amino alcohol結合であることが特徴である（多くは Phenylalaniol基でおわる）。なお今回の精製物、Ａ成分、Ｂ成分、Ｄ成分は質量分析より一部のアミノ酸配列を下記のように推定し、その部分構造を既存のPeptibols のアミノ酸配列と検索した結果、一致する物が無く、新規 Peptibols系であると推定した。Ｅはアミノ酸配列の推定が困難であるため判断できなかった。
【００２５】
ＵＶ吸収波長：４成分とも末端吸収
Ａ成分の分子量＝１９３３
Ｂ成分の分子量＝１９４９または１９６４
Ｄ成分の分子量＝１８１０
Ｅ成分の分子量＝１８２９
推定構造：Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-......
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-......
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-.....
【００２６】
前記発明においては、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５を固体培地又は液体培地で培養し、その生成物質中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ成分について単離精製したが、活性物質は、新規アミノ酸配列をもつ新規物質で、その分子量は、Ａ成分の分子量＝１９３３，Ｂ成分の分子量＝１９４９または１９６４，Ｄ成分の分子量＝１８１０，Ｅ成分の分子量＝１８２９であって、当該アミノ酸又はその周辺物が植物の活性化に有効であろうと推定される。
【００２７】
そこで前記トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５菌を従来法によって多量培養し、その生成物質を抽出精製して植物の活性付与剤を得ることができる。前記生成物質は、前記Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分、Ｄ成分及びＥ成分が判明している。
【発明の効果】
【００２８】
この発明によれば、トリコデルマ ハルジアナム ＳＫ−５５菌を固形培地に培養した場合には、表２のように、糸状菌について抗菌性を示すことが認められた。
【００２９】
またこの発明の製造方法によれば、糸状菌及び細菌に有効な抗菌剤を容易に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
この発明は、トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５菌を固定培地又は液体培地に植菌し、２５℃〜３０℃で４日〜１５日間静置培養又は振盪培養した後、抗菌性を有する下記Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分及びＤ成分を含む物質を分離してこの発明の抗菌剤を得た。
【００３１】
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-...であってその分子量１９３３
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-...であってその分子量１９４９または１９６４
Ｃ成分：
【化４】
2007008960.tif 000002
【００３２】
...であってその分子量１６８（Ｃ８Ｈ３Ｏ４）
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-... であってその分子量１８１０
【００３３】
前記において、固定培地による培養には、７日〜１５日を要し、一液体培地による培養には４日〜１０日を要した。
【実施例１】
【００３４】
（供試菌名称）
Trichoderuma hurzianum ＳＫ−５５（トリコデルマ  ハルジアナム  ＳＫ−５５）
供試菌は97年1月北海道グリーン興産より寒天培地のスラント1本を受領した。供試菌は下記の斜面培地に植菌し、２８℃で５日間培養後、冷蔵にて保存した。
【００３５】
寒天斜面培地組成
オートミール ５．０％
シュクロース ５．０％
寒天 １．０％
２８℃、５日間培養後冷蔵保存
【００３６】
（培養）
培養は５００ｍｌ三角フラスコを用い、米培地（Ａ培地）と液体培地（Ｂ培地Ｉ）の２種類で行った。Ａ培地の条件は、２８℃で静置培養（培養途中に滅菌水１０ｍｌを添加）とし、Ｂ培地Ｉの培養は、２８℃で270rpmの振盪培養をした。
【００３７】
培地組成：Ａ培地
米        １００％
大豆かす      ３％
滅菌水      １０％
培地組成：Ｂ培地Ｉ
グルコース    ５．０％
ポリペプトン  ０．５％
ＮａＣｌ      ０．８％
酵母エキス    ０．２％
炭酸カルシウム  １．０％
【００３８】
（検定法）
検定は、すべてペーパーディスク平板法によるin vitroで行い、供試菌には下記の菌を用いた。
【００３９】
（１）Rhizoctonia solani（AG-1IA）
検定用培地にはＰＤＡ（Nissui）1.3%、Chloramphenicol 0.002%の組成からなる培地を用いた。Rhizoctonia の菌糸の先端をコルクボーラーで抜いたものを平板培地の中央にのせ、ブロスを染み込ませたペーパーディスクを置き菌糸の伸長の様子を観察した。
【００４０】
（２）Botrytis cinerea検定用培地にはPotato-extract 20.0%、Sucrose 2.0%、寒天1.5%の組成からなる培地を用いた。検定はペーパーディスクに試料をのせ風乾後シャーレにのせた。シャーレをインキュベーターに入れて培養し、ペーパーディスクの周りに阻止円が形成されているか否かを観察した。
【００４１】
（３）抗菌スペクトラム検定菌
抗菌スペクトラムを下記の検定菌を用いて測定した。
【００４２】
Bacillus subtilis ATCC6633
Micrococcus luters ATCC6633
Staphylococcus aureus 209P
Escherichia coli NIHJ
Saccharomyces cerevisiae SHY3
Candida albicans M9001
Candida pseudotropicalis M9035
Cryptococcus neoformans M9010
Debaryomyces hansenii M9011
Trigonopsis variabilis M9031
Schizosaccharomyces pombe M9025
Hansenula schneggi IAM4269
【００４３】
（培養法）
（１）Ａ培地培養法
Rhizoctonia solani（AG-1IA） 活性成物
糸状菌Rhizoctonia solani（AG-1IA）に対するＡ培地の培養抽出液活性物の単離精製。
【００４４】
Ａ培地（米培地１kg）５００ｍｌの三角フラスコ１本に米１００ｇと大豆かす３ｇを加え、同じ条件のもの１０本分の培地を調製した。滅菌後エーゼで植菌して、２８℃１０日間（菌がよく増殖するように途中何度かフラスコを振る。また培地の表面が乾いてきたら滅菌水を添加する。）静置培養後、５０％アセトン水を２リットル加え抽出をした。ここで培養物５０％アセトン抽出液２リットルを得た。
【００４５】
（２）Ｂ培地培養法
Staphylococcus aureus 209P 活性成物
細菌Staphylococcus aureus 209Pに対するＢ培地培養抽出液中活性物の単離精製。
【表１】
2007008960.tif 000003
【００４６】
液体培地であるＢ培地Ｉの抗細菌活性成分をより多く生産する目的で培地組成の窒素源と炭素源の割合が異なるＩ〜ＩＶの４種を比較検討した。各培地５００ｍｌ三角フラスコ２本を用い、培養５日間後培養液を５倍濃縮に調製し、検定に用いた。
【００４７】
（３）Ｂ培地Ｉ培養法
培地検討の結果よりＢ培地Ｉで精製用培養を行った。
【００４８】
Ｂ培地（グルコース ５．０％、ポリペプトン ０．５％、ＮａＣｌ ０．８％、酵母エキス ０．２％、炭酸カルシウム １．０％）５００ｍｌ三角フラスコに、１００ｍｌの培地を調製した。滅菌後植菌し、２８℃、５日間、振盪培養を行った。計１．５リットルの培養液と等量のアセトンを加え、５０％アセトン抽出液３リットルを得た。
【００４９】
（精製法）
（１）Ａ培地培養抽出物精製法
Ａ培地培養５０％アセトン抽出液２リットルのアセトン留去後、１リットルをＨＰ−２０−Sephadex カラム（60.0cm×4.5cm φ）に全量を通過吸着させた。等量の水で洗浄後、等量の５０％アセトン、次いで等量の１００％アセトンで溶離させた。それぞれの分画を検定菌Rhizoctonia solani（AG-1IA）で検定後、活性物質が１００％アセトン溶離部に溶離されていることを確認した。続いて１００％アセトン溶離部１リットルを濃縮し、1098mgの粗精製物を得て、その中の１００ｍｇを展開溶媒メタノール系のＬＨ−２０カラムにかけた（100.0cm×2.0cmφ）。分画をアッセイし、活性分画を確認した。これら活性分画を回収後シリカゲルＴＬＣ（酢酸エチル：酢酸：水＝５：１：１）で展開し、モリブデン硫酸呈色反応をしたところ、Ｒｆ＝０．３付近にスポットが検出された。同時に不活性分画の展開部にはこれらのスポットは検出されなかった。このことから活性物はＲｆ＝０．３付近に検出されるスポットと推定し、さらに精製を進めた。シリカゲルＰＴＬＣ展開（酢酸エチル：酢酸：水＝５：１：１）、かき取りメタノール抽出後、ＨＰＬＣを用いて単離精製をした。単離精製物は器機分析を実施し同定をした（図３１）。
【００５０】
（２）Ｂ培地Ｉ培養抽出物精製法
Ｂ培地培養５０％アセトン抽出液３リットルのアセトン留去後（１．５リットル）、活性炭吸着カラム（60.0cm×2.0cm φ）に全量１．５リットルを通過、吸着させた。等量の水で洗浄後、等量の５０％アセトン、続いて等量の１００％アセトンで溶離させた。各分画を検定菌Staphylococcus aureus 209Pを用いて検定した結果、１００％アセトン溶離部に活性物質が溶離されていることが確認された。１００％アセトン溶離部１．５リットルを濃縮し、酢酸エチルで分配抽出を行い、次いでメタノールを展開溶媒とするＬＨ−２０を実施し、ＨＰＬＣで単離精製を行った。単離精製物は機器分析を実施し同定をした（図３２）。
【００５１】
（単離精製物生物活性法）
（１）Ａ培地単離精製物評価法
４成分の生物評価法
検定用培地にはＰＤＡ（Nissui） 1.3%、Choloramphenicol 0.002%の組成からなる培地を用いた。Rhizoctonia solani（AG-1IA）の菌糸の先端をコルクボーラーで抜いたものを平板培地の中央に乗せ、サイドに調製した単離物質を染み込ませたペーパーディスクを置き菌糸の伸長の様子を観察した。
【００５２】
（２）Ｂ培地Ｉ単離精製物評価物
Ｃ成分の生物評価（ＭＷ１６８）
単離精製したＣ成分（MW:168）は新規物であり、きわめて単純な構造を保持している。母核としての興味が持たれた為生物評価を拡大して実施した。
【００５３】
（３）バクテリア属の評価
Bioassay
試験菌を加えた寒天培地をシャーレに入れ固める。その上に試料を含むペーパーディスクをのせ、37℃で18時間培養した後、発育阻止円の形成を確認する。
【００５４】
（ａ）使用菌株
Staphylococcus aureus 209P、Pseudomonas syringal（タバコ野火病菌）、Xanthomonoas Campestris pv.citri（カンキツかいよう病）、Erwinia sp（ウメかいよう病）の４菌株を用いた。
【００５５】
（ｂ）使用培地
前培養にはブイヨン培地 （DIFCO）を用い、一晩培養後、×102に希釈し、これを上層の培地０．５％に混ぜ、菌測定培地には MYCIN AGAR （ミクニ化学）を用いた。
【００５６】
上層 − MYCIN AGAR 1.5%（ミクニ化学）＋ブイヨン２％培地 （DIFCO）にて一晩培養した培養液×102に希釈したものを０．５％加える。
【００５７】
下層 − MYCIN AGAR 2.0%（ミクニ化学）
【００５８】
（ｃ）抗菌測定
ペーパーディスクに1000ppm,500ppm,250ppmに調製した単離精製物を染み込ませ、風乾後シャーレに乗せ、37℃で18時間培養し、発育阻止円の形成の有無を観察した。
【００５９】
（４）黄色ブドウ球菌に対する抗菌力（ＭＩＣ）の測定
（ａ）使用菌株
S.aureusu 209P JC−1，第１Ｇ保存の臨床分離黄色ブドウ球菌２０株（ＭＳＳＡ，ＭＲＳＡ 各１０株）及び基準菌株である E.coli NIHJ JC−2の計２２株を用いた。
【００６０】
（ｂ）使用抗菌薬
MW:168、methicllin（DMPPC，注射用スタフシリン、Lot.No.FSB 19,900μg/mg、萬有製薬）、vancomycin （VCM,Lot.No.41H0457,10750SIGMA）
（ｃ）使用培地
抗菌力測定にはMueller-Hinton agar （MIA:Difco）を用い前培養には、Mueller Hinton broth（MHB:Difco）を用いた。
【００６１】
（ｄ）抗菌力測定
使用菌株に対する各薬剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は日本化学療法学会標準法に準拠し、寒天平板希釈法にて測定した。菌株はＭＨＡに塗抹し、３７℃で一晩培養して生育したコロニーをＭＨＢにて３７℃で一晩培養し、その菌液を１００倍希釈（E.Coliのみ１０００倍希釈）したものを接種菌液とした。
【００６２】
（結果）
（１）検定菌の結果
Ａ培地とＢ培地Ｉの培養液活性は表２の通りである。  
抗菌スペクトラムを下記の検定菌を用いて測定した。
【表２】
2007008960.tif 000004
【００６３】
Ａ培地の培養抽出液中の検定の結果、Rhizoctonia solani（AG-1IA）の菌糸がＡ培地培養抽出物のペーパーディスクを避けている様子が観察された。本菌が生産するＡ培地培養液中の活性物が、菌糸の成長を妨げる物質を生産していると推察した。このためＡ培地培養液中より、Rhizoctonia solani（AG-1IA）に阻害活性を示す物質を指標に単離精製を試みた。
【００６４】
またＢ培地Ｉの培養抽出液中の検定の結果、Botrytis cinerea、Rhizoctoniasolaniに活性は確認されず、バクテリアにのみ発育阻止円の形成が確認された。このことは、本菌は拮抗作用以外の抗菌力があると見られ、抗生物質を生産している可能性が考えられた。特にStaphylococcus aureus 209Pに形成された発育阻止円はクリアーであった為、Ｂ培地ＩではバクテリアStaphylococcus aureus 209Pに対する活性物質を指標に単離精製を実施することにした。Ａ培地培養物とＢ培地Ｉ培養物の抗菌スペクトラムは異なっており、それぞれ系統の異なるものを生産していると思われた。それぞれの活性物を単離精製することとした。
【００６５】
（２）培養の結果
（ａ）Ａ培地培養結果
Ａ培地（米培地 １kg）５００ｍｌの三角フラスコ１０本分を２８℃で１０日間、静置培養し、培養物５０％アセトン抽出液２リットルを得た。
【００６６】
（ｂ）Ｂ培地検討と培養結果
表１に表したＢ培地ＩとＢ培地ＩＩに活性が認められ、Ｂ培地Ｉにより強い活性が認められた本菌は、窒素源が少ない条件で活性物を生産することが確認された。この結果よりＢ培地Ｉを用いて２８℃で５日間、振盪培養をした。
【００６７】
（３）精製結果
（ａ）Ａ培地培養精製結果
シリカゲルＰＴＬＣ処理後の活性分画を粗精製物として、ＨＰＬＣ（0.05%TFA含 MeOH/H2O）で純度の確認を行った。分析では０分から３０分にかけてメタノール０％から１００％のグラジエントをかけ、さらに３０分から１００％メタノールで流速１ml/minで分析したところ、ＲＴ（リテションタイム）32.5分（Fr65）で検出された（図１）。一見、単一物質のピークが検出されたかのように思われたが、拡大することにより複数ピークの存在が明らかとなった（図２）。ＲＴの速い方からＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅと称し（図２）、そのうちの４成分を単離精製した。単離精製物の成分と量は、Ａ成分 7.2mg，Ｂ成分12.1mg，Ｄ成分 3.5mg，Ｅ成分 4.5mgであった。ピークＣは量が少量であり、精製は断念した。
【００６８】
（ｂ）Ｂ培地Ｉ培養精製結果
それぞれの分画のアッセイより活性Fr41〜54に活性があることを確認し回収した。ＨＰＬＣ（0.05%TFA含 MeOH/H2O）分取、分析を行い検出されたピークのＲＴの速い方からＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅと数え、５成分の存在を確認した。このうちＣ成分 8.1mg単離精製することが出来た。
【００６９】
（４）機器分析の結果
（ａ）Ａ培地単離精製物
ＵＶ吸収スペクトラム、質量分析及びＮＭＲ測定結果（図３〜１４）より、Aib（α-Aminoisobutyric acid）を含むPolypeptideの、Peptibols系と判断した。Peptibols系抗生物質はアミノ酸配列の中に α-Aminoisobutyric acid（Aib）を含んでおり、Ｎ末端がAcetyl基で、Ｃ末端が Amino alcohol結合であることが特徴である（多くは Phenylalaniol基でおわる）。なお今回の精製物、Ａ成分、Ｂ成分、Ｄ成分は質量分析より一部のアミノ酸配列を下記のように推定し、その部分構造を既存のPeptibols のアミノ酸配列と検索した結果、一致する物が無く、新規 Peptibols系であると推定した。Ｅはアミノ酸配列の推定が困難であるため判断できなかった。
【００７０】
ＵＶ吸収波長：４成分とも末端吸収（図３、図６、図９、図１２）
Ａ成分＝１９３３（図５）
Ｂ成分＝１９４９または１９６４（図８）
Ｄ成分＝１８１０（図１１）
Ｅ成分＝１８２９（図１４）
推定構造
Ａ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-...
Ｂ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-...
Ｄ成分：Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-...
【００７１】
（ｂ）Ｂ培地Ｉ（液体培地）活性物
機器分析の結果Ｃ成分は、分子量１６８（C8H8O4）の新規物質であることが推定された。他の成分について単離精製は非常に困難であり、不可能と判断したが、LC/MS を実施した。Ａ成分のＵＶ吸収波長は末端であった（図１５）。ＨＰＬＣの条件はカラムCapcel pac C18 UG120 （2×150mm）を用い、１％酢酸：アセトニトリル＝９８：２、流速0.2ml/min、温室の条件で分析した。Ａ成分は、ＲＴ７．４８分に検出された（図１６）。Ａ成分が検出された分画の質量分析の結果、分子量は１９２であることを推定した（図１７）。同じくＢ成分についても同様の分析をしたところＢ成分もＵＶ吸収波長が末端（図１８）で、ＨＰＬＣのＲＴ １２、４５分に検出された（図１９）。質量分析の結果、分子量は２０６であることを推定した（図２０）。Ｃ成分は単離精製が可能であった分画である。Ｃ成分のＵＶ吸収波長は２７０ｎｍ（図２１）で、ＨＰＬＣのＲＴは１５．９２分に検出された（図２２）。質量分析の結果、分子量は１６８であることを推定した（図２３、２４）。また溶媒CD3ODで溶解し、ＮＭＲを測定（図２５）、解析したところ五員環を含み、共役結合をもつ新規物質であることが推定された。推定構造を図２６に示した。Ｄ成分はＵＶ吸収波長が２３０ｎｍ付近にあり（図２７）、ＨＰＬＣのＲＴは３０．２８分に検出された（図２８）。しかし再度ＨＰＬＣを実施し、ＵＶスペクトラム検出器の波長を末端と２３０ｎｍで分析した結果、ＲＴ０．６分の差で２成分（Ｄ１，Ｄ２）存在していることが確認された（図２９）。それぞれの質量分析の結果、ＲＴの速いＵＶ吸収が２３０ｎｍのものは分子量１５４であった（Ｄ１）。たまＲＴが０．６分遅れて検出される成分の分子量は２２０であることを推定した（Ｄ２）（図３０）。これらの分子量の明らかとなった成分を分子量の少ない順にならべると１５４（Ｄ１），１６８（Ｃ），１９２（Ａ），２０６（Ｂ），２２０（Ｄ２）であることが確認された。
【００７２】
（５）生物評価結果
（ａ）Ａ培地培養単離精製物生物評価結果
４成分の生物評価結果
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ成分について5000ppmから希釈し、5000ppm，2500ppm，1250ppm，625ppmで検定した。結果Ａ成分、Ｅ成分は1250ppmまで Rhizoctonia solaniの菌糸の伸長を阻害しおり、Ｂ成分、Ｄ成分は625ppmまでRhizoctonia solaniの菌糸の伸長を阻害しているのが確認された。
【００７３】
（ｂ）Ｂ培地Ｉ培養単離精製物生物評価結果
（イ）バクテリア属の評価結果
Ｂ培養物（MW168） のバクテリアに対する生物活性は発育阻止円が形成されていなかったことから抗菌力は無いか、弱いものと考えられた。
【００７４】
（ロ）黄色ブドウ球菌に対する抗菌力（ＭＩＣ）の測定結果は表３の通りである。
【００７５】
表３に示したようにＢ培養物（MW168）は今回測定した濃度において抗菌力を示さず、黄色ブドウ球菌に対する抗菌力は極めて弱いものと考えられた。
【表３】
2007008960.tif 000005
【００７６】
考察Ａ培地培養物より単離精製した成分からは、Ａｉｂ（α-Aminoisobutyric acid）を含むPeptibols系のもの４成分を単離することが出来た。Trichodermaが生産する Peptibols系のものは幾つかすでに報告されているが、今回単離精製したものは、それらのものとは一致しなかった。また、それぞれの成分のアミノ酸配列の結果、３成分が新規の配列であることが推定された（Ｅ成分のみ配列を測定するのが不可能だった）。さらにin vitro試験ではRhizoctonia solani（AG-1IA）の菌糸を阻害している様子が観察された。この結果から本菌の米培養抽出物中にRhizoctonia solani（AG-1IA）に対する菌糸伸長阻害物質が生産されていることが明らかとなった。本菌の拮抗作用である相手菌糸との接触により発現する細胞質凝集を促し死滅させる物質そのものであるという断言はまだ出来ないが、本菌の米培養抽出物中に菌糸成長伸長抑制物が生産されていることは明らかである。
【００７７】
またＢ培地Ｉ培養より単離精製した成分はMW:168の新規物（3(3-hydroxy-cyclopropene 5-one-2yl)2-propenoic asid）であり、Bioassay を幾つか実施したが活性は無いか、きわめて弱いものと判断した。おそらく活性本体はMW:168周辺化合物であり、MW:168は活性物の副成物であると推測している。またMW:168周辺化合物の分子量はMW:154、MW:192、MW:206、MW:220であり、分子量の差がそれぞれ１４であることがわかる。これはメチル基一個分と同量であり、メチル基の増減による活性の違いも考えられる。またMW:168は新規な構造を保持しているが、構造検索より類似していた化合物が幾つか報告されていた。その中でMW:168に一番近い構造であったもの（図３３）は、鳥取大学のＰＧＲ活性スクリーニングで見出されたものであり、糸状菌Penicillium valiabile SOPPより代謝され単離精製されたと報告され、Ｃ8Ｈ8Ｏ5（MW:198）の組成式で表されている新規物質であるが、活性は弱いものと報告されている。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】この発明の菌のＡ培地培養におけるＨＰＬＣ分析グラフ。
【図２】同じく図１の拡大グラフ。
【図３】同じくＡ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図４】同じくＡ成分の1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）を示すグラフ。
【図５】（ａ）、（ｂ）同じくＡ成分の質量分析測定のグラフ。
【図６】同じくＢ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図７】同じくＢ成分の1Ｈ−ＮＭＲを示すグラフ。
【図８】（ａ）、（ｂ）同じくＢ成分の質量分析測定のグラフ。
【図９】同じくＤ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図１０】同じくＤ成分の1Ｈ−ＮＭＲを示すグラフ。
【図１１】（ａ）、（ｂ）同じくＤ成分の質量分析測定のグラフ。
【図１２】同じくＥ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図１３】同じくＥ成分の1Ｈ−ＮＭＲを示すグラフ。
【図１４】（ａ）、（ｂ）同じくＥ成分の質量分析測定のグラフ。
【図１５】同じくＡ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図１６】同じくＡ成分のＨＰＬＣを示すグラフ。
【図１７】同じく図１６の検出されたＡピークの質量分析のグラフ。
【図１８】同じくＢ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図１９】同じくＢ成分のＨＰＬＣを示すグラフ。
【図２０】同じく図１９の検出されたＡピークの質量分析のグラフ。
【図２１】同じくＣ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図２２】同じくＣ成分のＨＰＬＣを示すグラフ。
【図２３】同じく図２２の検出されたＡピークの質量分析のグラフ。
【図２４】同じくＣ成分の質量分析グラフ。
【図２５】同じくＣ成分のピークの1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）を示すグラフ。
【図２６】同じくＣ成分の構造図。
【図２７】同じくＤ成分のＵＶ吸収波長を示すグラフ。
【図２８】同じくＤ成分のＨＰＬＣを示すグラフ。
【図２９】（ａ）同じくＵＶλ２３０ｎｍで検出されたＤ１成分を示すグラフ、（ｂ）同じくＵＶが末端吸収でＤ１成分とＲＴ０．６差で検出されたＤ２成分を示すグラフ。
【図３０】（ａ）同じく図２９で検出されたＤ１成分の質量分析を示すグラフ、（ｂ）同じく図２９で検出されたＤ２成分の質量分析を示すグラフ。
【図３１】同じく米培地の培養抽出物精製経過の系統図。
【図３２】同じくＢ培地Ｉの培養抽出物精製経過の系統図。
【図３３】同じく新規物質（ＭＷ：１９８）１、２、３の誘導体の構造図。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３５
【補正方法】削除
【補正の内容】