(57)【要約】  本発明は、標的分子の存在を検出するための新規アプタマー・プローブ複合体、該アプタマー・プローブ複合体を用いた標的分子の存在の検出方法及び検出試薬を提供するものであり、本発明は、標的分子の存在を検出するためのアプタマー・プローブ複合体であって、指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分を少なくとも２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの２種類のオリゴヌクレオチド分子からなるアプタマー・プローブ複合体、該複合体を用いた標的分子の存在の検出方法及び検出試薬に関する。本発明により、ほとんど全ての標的分子に結合するアプタマーを応用できる新規標的分子検出技術を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子の存在を検出するための分離型アプタマー・プローブ複合体であって、指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができるアプタマーを少なくとも２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの少なくとも２種類のオリゴヌクレオチド分子の混合物からなることを特徴とするアプタマー・プローブ複合体。
【請求項２】
標的分子が、核酸、タンパク質、又は小分子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
指示タンパク質が、酵素である、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
指示タンパク質が、トロンビンである、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
標的分子に結合したアプタマーの安定性と、標的分子結合アプタマーとその相補的塩基配列が形成する２本鎖構造の安定性が近く、かつ標的分子に結合したアプタマーの安定性が、上記２本鎖構造の安定性より大きくなるように相補的塩基配列の長さを設計した、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
酵素と結合してその酵素活性を阻害するアプタマーを２つに切断して分割し、分割した部分の一端に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加し、もう一端に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加した、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
アプタマーをアプタマーのループ（一本鎖部分）の任意のサイトで切断して分割した、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のアプタマー・プローブ複合体を有効成分として含むことを特徴とする標的分子の検出試薬。
【請求項９】
請求項８に記載の検出試薬と、指示タンパク質、及び指示タンパク質の特性を測定するための試薬を組み合わせたことを特徴とする標的分子検出試薬キット。
【請求項１０】
被検試料中の標的分子の存在を検出する方法であって、請求項８に記載のアプタマー・プローブ複合体を有効成分とする検出試薬と被検試料とを接触させ、指示タンパク質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検出することを特徴とする標的分子の検出方法。
【請求項１１】
指示タンパク質が、酵素であり、指示タンパク質の酵素活性の変化を分光学的手法又は電気化学的手法により測定する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規アプタマー・プローブ複合体を用いた標的分子の検出技術に関するものであり、更に詳しくは、アプタマー・プローブ複合体の原理に基づき、ほとんど全ての標的分子に結合するアプタマーに対して設計、及び適用が可能な汎用性が高い新規アプタマー・プローブ複合体、該アプタマー・プローブ複合体を用いた標的分子の検出方法及び検出試薬・検出試薬キットに関するものである。【０００２】
本発明は、例えば、酵素活性を阻害するアプタマーを少なくとも２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの２種類のオリゴヌクレオチド分子からなるアプタマー・プローブ複合体を用いて、標的分子を高感度にかつ高精度に検出することが可能な、新規アプタマー・プローブ複合体、及び該アプタマー・プローブ複合体を利用した標的分子の検出手法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
アプタマーは、特定の分子に結合する核酸リガンドとして、１９９０年に、Ｇｏｌｄらによって初めてその基本概念が提示されたものであり、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponentia1 Enrichment）法と呼ばれる手法を用いてアプタマーを取得する方法が報告されている（非特許文献１）。【０００４】
従来、アプタマーが得られているターゲットとして、先行文献には、例えば、各種タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、レセプター、ホルモン、アミノ酸、抗生物質、その他の種々の化合物等が報告されている（非特許文献２）。また、他の先行文献には、アプタマーの選択及び応用に関する事例が詳細に報告されている（非特許文献３）。【０００５】
標的分子に特異的に結合する核酸リガンドであるアプタマーを用いて、標的分子を均一系で検出する方法として、アプタマービーコン法（非特許文献４）と、アプタマー・プローブ複合体法が提案されている。アプタマービーコン法とは、蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）を利用して、標的分子に結合するアプタマーに標的分子が結合することによって起こる構造変化を検出することにより標的分子を検出する手法である。【０００６】
また、アプタマー・プローブ複合体法とは、特定のタンパク質に結合してその特性を変化させることができるアプタマーと、標的分子と結合するアプタマーを組み合わせた複合体を用いることにより、タンパク質の特性の変化を指標として標的分子を検出する手法である。【０００７】
これらのうち、前者のアプタマービーコン法においては、標的分子を検出する方法として、ＦＲＥＴを利用しているため、蛍光光度計などの高価な大型機器が必要とされること、また、蛍光強度を測定しているため、標的分子の定量が困難であること、等の問題点がある。【０００８】
一方、後者のアプタマー・プローブ複合体法においては、タンパク質の特性の変化を指標とする方法であるため、例えば、酵素活性を阻害するアプタマーを用いれば、酵素活性を測定することにより、簡便な操作手段で標的分子を高感度に検出することができる。酵素活性の測定は、分光学的手法や電気化学的手法を用いて測定し、標的分子を検出できる可能性があるため、この方法は、検出に高価な大型機器を必要としないこと、また、酵素活性を指標としているため、高感度な検出系が構築できる可能性があること、等の利点を有している。【０００９】
これまでに開発され、報告されているアプタマー・プローブ複合体では、標的分子が、標的分子に結合するアプタマー部位に結合することによって、アプタマーの構造が安定化し、その結果、酵素活性を阻害するアプタマーの構造が安定化し、酵素活性の阻害能が上昇することを特徴とする検出系を用いる方法が代表的な事例として例示される。【００１０】
このアプタマー・プローブ複合体法の従来技術として、先行文献には、例えば、特定のタンパク質に結合するアプタマーと、標的分子と結合するプローブとを一体的に組み合わせたアプタマー・プローブ複合体と、該アプタマー・プローブ複合体を用いて標的分子を検出する方法が提案されている（特許文献１）。また、アプタマーを分離して、利用する事例として、先行文献には、アプタマーをコカインアプタマーとアデノシンアプタマーの２つに分離し、標的分子を検出する方法が提案されている（非特許文献５）。更に、他の先行文献には、Ｔａｔアプタマーを２つに分離し、標的分子を検出する方法が提案されている（非特許文献６）。【００１１】
しかし、これらの方法においては、アプタマー・プローブ複合体を構築するためには、標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を設計し、標的分子が存在しない場合は、アプタマー・プローブ複合体の構造が不安定な構造を形成し、標的分子が結合することにより安定な構造へと変化するように設計しなければならない。そのため、これらの方法では、全ての標的分子に結合するアプタマーを応用することができない可能性があり、従来のアプタマー・プローブ複合体は、全ての標的分子に結合するアプタマーに対して、アプタマーの設計が応用できないという点で、汎用性に欠けるという問題点があった。【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０４９８２６  Ａ１
【非特許文献１】Tuerk, C. and Go1d L.,Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands tobacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249, 505‐510 (1990)
【非特許文献２】Hermann, et al., Adaptiverecognition by nucleic acid aptamers, Science, 287,820‐825 (2000)
【非特許文献３】Osborne SE, Ellington AD.,Nucleic Acid Se1ection and the Challenge of Combinatoria1 Chemistry, Chem. Rev.Apr1.; 97(2), 349‐370 (1997)
【非特許文献４】Hamaguchi N. et al., Anal. Biochem.,294, 126‐131 (2001)
【非特許文献５】Stojanovic et al., J. Am.Chem. Soc., 122, 11547-11548 (2000)
【非特許文献６】Yamamoto et al., Genes Cells,5, 389-396 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、ほとんど全ての標的分子に結合するアプタマーを応用可能な新しいアプタマー・プローブ複合体を用いた標的分子の検出技術を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、特定のタンパク質と結合してその特性を変化させるアプタマーを少なくとも２つに切断して分割し、一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの少なくとも２種類のオリゴヌクレオチド分子との混合物からなるアプタマー・プローブ複合体を構築することにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成させるに至った。【００１４】
本発明は、アプタマー・プローブ複合体の原理に基づき、例えば、酵素活性を阻害するアプタマーを少なくとも２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの２種類のオリゴヌクレオチド分子からなる新規アプタマー・プローブ複合体を提供することを目的とするものである。また、本発明は、該アプタマー・プローブ複合体を用いて標的分子を酵素活性を測定することによって検出する標的分子の検出方法及びその検出試薬・検出試薬キットを提供することを目的とするものである。更に、本発明は、これらの手法を用いて、ほとんど全ての標的分子に結合するアプタマーに応用可能な汎用性が高い新規アプタマー・プローブ複合体を用いた標的分子の検出手法に関する新技術・新製品を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）標的分子の存在を検出するための分離型アプタマー・プローブ複合体であって、指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができるアプタマーを少なくとも２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの少なくとも２種類のオリゴヌクレオチド分子の混合物からなることを特徴とするアプタマー・プローブ複合体。
（２）標的分子が、核酸、タンパク質、又は小分子である、前記（１）に記載の複合体。
（３）指示タンパク質が、酵素である、前記（１）に記載の複合体。
（４）指示タンパク質が、トロンビンである、前記（１）に記載の複合体。
（５）標的分子に結合したアプタマーの安定性と、標的分子結合アプタマーとその相補的塩基配列が形成する２本鎖構造の安定性が近く、かつ標的分子に結合したアプタマーの安定性が、上記２本鎖構造の安定性より大きくなるように相補的塩基配列の長さを設計した、前記（１）に記載の複合体。
（６）酵素と結合してその酵素活性を阻害するアプタマーを２つに切断して分割し、分割した部分の一端に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加し、もう一端に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加した、前記（１）に記載の複合体。
（７）アプタマーをアプタマーのループ（一本鎖部分）の任意のサイトで切断して分割した、前記（１）に記載の複合体。
（８）前記（１）から（７）のいずれかに記載のアプタマー・プローブ複合体を有効成分として含むことを特徴とする標的分子の検出試薬。
（９）前記（８）に記載の検出試薬と、指示タンパク質、及び指示タンパク質の特性を測定するための試薬を組み合わせたことを特徴とする標的分子検出試薬キット。
（１０）被検試料中の標的分子の存在を検出する方法であって、前記（８）に記載のアプタマー・プローブ複合体を有効成分とする検出試薬と被検試料とを接触させ、指示タンパク質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検出することを特徴とする標的分子の検出方法。
（１１）指示タンパク質が、酵素であり、指示タンパク質の酵素活性の変化を分光学的手法又は電気化学的手法により測定する、前記（１０）に記載の方法。【００１６】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明のアプタマー・プローブ複合体は、指示タンパク質と結合してそのタンパク質の特性を変化させることができるアプタマー部分を少なくとも２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの少なくとも２種類のオリゴヌクレオチド分子からなることを特徴とするものである。【００１７】
本発明においては、例えば、酵素活性を阻害するアプタマーを選択し、これを少なくとも２つに切断して分割する。この場合、アプタマーの分割の個数については、好適には、アプタマーを２分割することが例示される。しかし、アプタマーの分割の個数は、アプタマーの種類、特にその立体構造に大きく依存することから、基本的には、使用するアプタマーの種類に依存する。したがって、本発明では、アプタマーの分割の個数は、特に制限されるものではなく、使用するアプタマーの種類に応じて３分割以上の任意の個数に分割することも適宜可能である。【００１８】
本発明では、例えば、２つに切断して分割したアプタマー部分にプローブを付加してアプタマー・プローブ複合体が作製されるが、この場合、２つに分割されたアプタマーのうち、標的分子に結合するアプタマー部分の方を３’−アプタマー・プローブ複合体、他方の上記アプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したアプタマー部分の方を、５’−アプタマー・プローブ複合体と各々定義することとする。また、本明細書において、「プローブ」とは、標的分子に結合するものを意味するものとして定義される。したがって、本発明において、例えば、標的分子がＤＮＡの場合は、プローブはその相補鎖ＤＮＡを意味し、また、標的分子がタンパク質の場合は、プローブは標的分子に結合するアプタマーを意味する。【００１９】
本発明では、２つに切断して分割された一方のアプタマー部分に、標的分子に結合するアプタマー部分の一部の相補的塩基配列が付加されるが、付加するプローブの相補的塩基配列の長さや相補的塩基配列の領域は、任意に設計することができる。その場合、特に、付加するプローブの長さは、標的分子に結合したアプタマーの安定性と、標的分子結合アプタマーとその相補的ＤＮＡが形成する２本鎖ＤＮＡ構造の安定性を考慮して任意に決定することができる。【００２０】
本発明の方法においては、上記標的分子に結合したアプタマーの安定性と、標的分子結合アプタマーとその相補的ＤＮＡが形成する２本鎖構造の安定性の差を見ることが重要であり、これらの安定性をなるべく近くすることで高感度かつ高精度の標的分子の検出が可能となる。上記２本鎖構造の安定性は、単純に、相補的ＤＮＡ鎖の長さに依存することから、付加するプローブの長さは、上記標的分子に結合したアプタマーの安定性と上記２本鎖構造の安定性が近く、かつ標的分子に結合したアプタマーの安定性が、標的分子結合アプタマーとその相補的ＤＮＡが形成する２本鎖構造の安定性より大きくなるような長さに設計することが好ましい。【００２１】
本発明では、付加するプローブの相補的塩基配列の長さは、特に、標的分子に結合するアプタマーの結合後の安定性と、標的分子結合アプタマーとその相補的塩基配列が形成する２本鎖構造の安定性を考慮して、その好適な範囲で任意に設計することができる。そして、それにより、これらの２つの構造の競合を見ることで高感度かつ高精度に標的分子を検出することが可能になる。【００２２】
後記する実施例では、例えば、相補的塩基配列の長さが１１、８、及び４ｍｅｒの塩基配列を付加した５’トロンビン・アデノシンアプタマーの作製例、及び相補的塩基配列の長さが１５ｍｅｒの塩基配列を付加した５’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマーの作製例を示したが、これらは、相補的塩基配列を付加したアプタマー作製の一例を具体的に説明したものである。本発明では、これらの手法に準じて、任意の種類及び長さの塩基配列及び相補的塩基配列を任意のアプタマーに付加してアプタマー・プローブ複合体を作製することができる。【００２３】
次に、アプタマーの切断位置について説明すると、基本的に、アプタマーは、ステム（２本鎖部分）とループ（一本鎖部分）から構成されているが、アプタマーの切断位置としては、アプタマーのループ部分が好ましく、また、アプタマーと標的分子の結合部分を除いた領域の部分が好ましい。例えば、後記する実施例で使用するトロンビンアプタマーには、ループ部分として、ｔ−ｔループが２箇所、ＴＧＴループが一箇所存在するが、これらのうち、標的分子のトロンビンとの結合に関与しないｔ−ｔループ部分を切断位置として選択することが好ましい。これと同様にして、使用するアプタマーの種類に応じて、アプタマーの切断位置を適宜選択することができる。【００２４】
アプタマーを所定の切断位置で切断する方法としては、例えば、制限酵素による方法、化学的手法による方法等が例示される。制限酵素は、アプタマーの切断サイトの塩基配列に応じて公知の制限酵素を適宜選択して使用することができる。また、制限酵素による処理工程及び処理条件についても特に制限されるものではなく、基質と制限酵素の種類に応じて任意の処理工程及び処理条件を採用することができる。【００２５】
本発明では、上述のように、標的分子に結合するアプタマーの結合後の安定性が重要であり、本発明の方法は、標的分子に結合したアプタマーの安定性と、標的分子結合アプタマーとその相補的塩基配列が形成する２本鎖ＤＮＡ構造の安定性との差により標的分子を検出することを基本とする手法であると言える。したがって、本発明では、これらの２つの構造の安定性を制御できるように、付加するアプタマーの塩基配列及び相補的塩基配列を設計することが重要になる。【００２６】
本発明の方法は、上述のアプタマー・プローブ複合体を利用することで、試料中の標的分子の存在を高感度かつ高精度に検出することが可能である。この方法では、例えば、被検試料と、本発明のアプタマー・プローブ複合体を接触させ、指示タンパク質の特性の変化を測定し、これを指標として試料中の標的分子の存在を検出することができる。本発明では、指示タンパク質として、酵素を用いることが好ましく、その場合、酵素活性の変化を、分光学的手法又は電気化学的手法により測定することが可能である。本発明では、標的分子として、例えば、核酸、タンパク質、分子量１０００以下の有機化合物を含む小分子が例示されるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等ないし類似のものであれば対象とされる。【００２７】
本発明では、アプタマー・プローブ複合体の原理に基づき、アプタマーを少なくとも２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドを作製し、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドを作製し、これらの２種類のオリゴヌクレオチド分子を用いてアプタマー・プローブ複合体が構築される。この場合、これらのオリゴヌクレオチド分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸類似体である核酸ホモログを例示することができる。また、これらのヌクレオチド分子は、それらの活性を有する範囲で、塩基を付加、欠失及び／又は置換することが可能であり、また、糖、及び／又はヌクレオチド間結合に任意の修飾を付加することも可能である。それらの操作は、通常の手法を用いて行うことが可能であり、特に制限されるものではない。【００２８】
本発明のアプタマー・プローブ複合体を構築する場合、例えば、アプタマー部分の３’側に標的分子結合アプタマー部分が連結され、標的分子結合アプタマー部分と標的分子とがハイブリダイズしたときにアプタマー部分と指示タンパク質との結合が阻害されるように設計することができる。また、例えば、標的分子の非存在下において、標的分子結合アプタマー部分がアプタマー部分と指示タンパク質との結合を阻害し、標的分子結合アプタマー部分と標的分子がハイブリダイズしたときに、標的分子結合アプタマー部分による阻害作用が軽減され、アプタマー部分と指示タンパク質との結合が強まるように設計することができる。【００２９】
本発明では、指示タンパク質として、例えば、酵素、蛍光タンパク質、レセプター、特定のレセプターと結合するリガンド等を用いることができる。好適には、指示タンパク質としては、トロンビン等の酵素が例示される。更に、ＳＥＬＥＸ法により、所望の酵素に対して、それに結合するアプタマーを取得することが可能であるため、任意の酵素について、その活性を阻害するアプタマーを取得し、その配列に基づいて、本発明のアプタマー・プローブ複合体を設計することができる。【００３０】
本発明においては、指示タンパク質として、酵素を用いた場合には、例えば、標的分子結合アプタマーが標的分子に結合することにより、アプタマー部分と酵素との結合が強まることにより、アプタマー部分による酵素活性の阻害が増加し、その結果、酵素活性が低下する。また、標的分子結合アプタマー部分が標的分子に結合することにより、アプタマー部分と酵素との結合が弱まることにより、アプタマー部分による酵素活性の阻害が軽減され、その結果、酵素活性が高まる。これらのいずれの方法においても、指示タンパク質である酵素の活性を測定することによって、標的分子の存在を容易に検出することができる。【００３１】
次に、本発明では、上述のアプタマー・プローブ複合体を用いて、被検試料中の標的分子の存在を検出することができる。この方法では、被検試料と、本発明のアプタマー・プローブ複合体とを接触させ、指示タンパク質の特性の変化を測定し、これを指標として、試料中の標的分子の存在を検出することができる。指示タンパク質として酵素を用いた場合には、指示タンパク質の特性の変化を酵素活性の変化として容易に測定することができる。【００３２】
酵素活性の変化は、分光学的手法又は電気化学的手法により測定することができる。例えば、酵素としてトロンビンを用いる場合、基質としてＮ−ベンゾイル−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドを用い、遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度（４１０ｎｍ）を測定することによって、トロンビンの活性を測定するか、あるいは、血漿に終濃度が一定になるようにフィブリノーゲンとトロンビンを加え、トロンビンによるフィブリノーゲンの切断によって開始される血液凝固を測定することによって、トロンビンの活性を測定することができる。【００３３】
血液凝固の測定は、例えば、分光学的方法による屈折率の変化の測定、血漿に金属球を添加して血液凝固に伴う運動の停止を観察する方法、水晶振動子、表面プラズモン共鳴、干渉増幅反射法
（Interference Enhanced Reflection;IER）等により行うことが可能である。また、酵素としては、好適には、例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等が例示される。【００３４】
酵素反応の検出法としては、例えば、比色法や電気化学的測定法が例示される。指示タンパク質として、レセプターを用いる場合には、分光学的方法で検出することができる。また、指示タンパク質として、蛍光タンパク質を用いる場合には、その蛍光特性で検出することができる。【００３５】
本発明では、標的分子と本発明のアプタマー・プローブ複合体とを混合することにより、標的分子と標的分子結合アプタマーとの結合を観察することができるので、極めて高感度かつ高精度で、簡単な操作手段で標的分子の存在を検出することができる。【００３６】
次に、本発明の標的分子検出用試薬について説明すると、本発明では、上述のアプタマー・プローブ複合体を利用することにより、標的分子の存在を検出するための検出試薬を構築することができる。また、本発明では、本発明のアプタマー・プローブ複合体に加えて、指示タンパク質、及び指示タンパク質の特性を測定するための試薬等からなる検出用試薬キットを構築することができる。これらの検出試薬及び検出試薬キットの製品形態及び使用態様は、特に制限されるものではなく、任意に構成することができる。【００３７】
更に、本発明のアプタマー・プローブ複合体は、例えば、標的分子検出用センサーの認識素子として使用することができる。この場合、標的分子検出用センサーは、指示タンパク質の特性の変化を測定するために、電極や半導体チップに本発明のアプタマー・プローブ複合体を装着して用いることができるが、その具体的構成については、特に制限されるものではなく、任意に構成することができる。【００３８】
従来のアプタマー・プローブ複合体法では、例えば、酵素活性を阻害するアプタマーと、標的分子と結合するプローブを一体的に組み合わせたアプタマー・プローブ複合体が種々設計され、使用されている。そして、これまでに開発され、報告されているアプタマー・プローブ複合体は、標的分子がアプタマー部分に結合することによって、標的分子に結合したアプタマーの構造が安定化し、その結果、酵素活性を阻害するアプタマーの構造が安定化し、阻害能が上昇する検出系が用いられている。【００３９】
しかし、この種の複合体では、酵素活性を阻害するアプタマーと標的分子結合プローブとが一体的に複合化されているため、アプタマー・プローブ複合体を構築するために、標的分子に結合するプローブの塩基配列を設計し、標的分子が存在しない場合には、アプタマー・プローブ複合体の構造が不安定な構造を形成し、標的分子が結合することにより安定な構造へと変化するように設計する必要があり、そのために、特定の標的分子に結合するアプタマーしか使用できないという制約があった。【００４０】
これに対して、本発明のアプタマー・プローブ複合体は、例えば、酵素活性を阻害するアプタマーを少なくとも２つに切断して分割し、その一方に、標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加した２種類のオリゴヌクレオチド分子から構成される混合物としてのアプタマー・プローブ複合体分子であるので、本発明では、アプタマー・プローブ複合体分子の設計思想をほとんど全ての標的分子に結合するアプタマーへ応用の範囲を広げることが可能であり、ほとんど全てのアプタマーに対して、本発明の複合体の設計を適用することが可能であるという、従来のアプタマー・プローブ複合体分子からは全く期待し得ない格別の効果が奏される。【００４１】
以上詳述したように、本発明は、アプタマー・プローブ複合体の原理に基づき、例えば、酵素活性を阻害するアプタマーを少なくとも２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドとを作製し、これらの少なくとも２種類のオリゴヌクレオチド分子を構成要素とするアプタマー・プローブ複合体を構築した点、及びこれらの２種類のオリゴヌクレオチド分子からなるアプタマー・プローブ複合体を用いて標的分子の存在を検出する手法を構築した点に最大の特徴を有するものである。【００４２】
また、本発明の方法において、上記アプタマー・プローブ複合体を使用する場合は、上記２種類のオリゴヌクレオチド分子の混合物を被検試料に混合して使用し、その酵素阻害能を検出するという簡便な操作手段で標的分子の存在を高感度かつ高精度で調べることができるので、本発明のアプタマー・プローブ複合体は、標的分子の存在を高感度かつ高精度に検出するための簡便手法として高い技術的意義を有するものである。
【発明の効果】
【００４３】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）全ての標的分子に結合するアプタマーを応用可能な汎用性が高い新規アプタマー・プローブ複合体を提供することができる。
（２）例えば、酵素活性を阻害するアプタマーを２つに切断して分割し、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの２種類のオリゴヌクレオチド分子を用いて標的分子の存在を酵素活性を測定することによって検出できる新規アプタマー・プローブ複合体を利用した標的分子の存在の検出方法を提供することができる。【００４４】
（３）本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いることにより、特定のタンパク質の特性を指標として、核酸、タンパク質、小分子等のほとんど全ての標的分子に結合するアプタマーを応用でき、しかも、それらの標的分子の存在を高感度かつ高精度で、簡便に検出することが可能な新規標的分子検出技術を提供することができる。
（４）本発明のアプタマー・プローブ複合体は、分割されたアプタマーにプローブを結合して作製しているため、アプタマー・プローブ複合体の分子量を低下させることができる。したがって、複合体の合成の際に、合成が極めて容易になることは勿論、その収率を大幅に向上させることができ、しかも複合体の合成の際の製造コストを大幅に低減させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
酵素活性阻害アプタマーとして、トロンビンアプタマー、また、標的分子に結合する標的分子結合アプタマーとしてアデノシンアプタマーをそれぞれ採択し、分離型アプタマー・プローブ複合体を作製した。【００４７】
（１）分離型アプタマー・プローブ複合体の設計
上記トロンビンアプタマーを構成しているＧ−カルテット内の３’側のＴ−Ｔループ部位を切断部位として２つに分割して考え、その塩基配列を特定し、本発明の分離型アプタマー・プローブ複合体を設計した。すなわち、分割したアプタマーの一端に標的分子アプタマーであるアデノシンアプタマーを付加したアプタマー・プローブ複合体（以下、３’アプタマー・プローブ複合体という。）と、分割したもう一方のアプタマーの一端に標的分子アプタマーであるアデノシンアプタマーの一部の相補的塩基を付加したアプタマー・プローブ複合体（以下、５’アプタマー・プローブ複合体という。）をそれぞれ別個に設計した（図２参照）。【００４８】
（２）分離型アプタマー・プローブ複合体の作製
具体的には、トロンビンアプタマーを構成しているＧ−カルテット内の３’側のＴ−Ｔループ部位を切断部位として、２つに分割した塩基配列を有するアプタマー粉末（インビトロジェン社製）を用い、これを水に溶かし、緩衝水溶液とした。これらの別個のアプタマーの水溶液をそれぞれ３’アプタマー水溶液、５’アプタマー水溶液とした。一方の５’アプタマー水溶液に相補的塩基配列の長さが１１ｍｅｒのアデノシンアプタマー水溶液を混合することにより、５’アプタマーにアデノシンアプタマー（１１ｍｅｒ）を付加させた５’アプタマー・プローブ複合体を作製した【００４９】
このように作製した濃度１μＭの３’アプタマー・プローブ複合体に濃度１μＭの５’アプタマー・プローブ複合体を加え、９５℃で３分間加熱後、３０分かけて２５℃まで冷却し、本発明の分離型アプタマー・プローブ複合体を作製した。配列表に、作製した３’トロンビン・アデノシンアプタマー・プローブ複合体の塩基配列（配列番号１）、及び５’トロンビン・アデノシンアプタマー・プローブ複合体（１１ｍｅｒ）の塩基配列（配列番号２）を示す。【００５０】
（３）酵素活性阻害能の測定
上記分離型アプタマー・プローブ複合体に終濃度５４ｎＭのトロンビン溶液、終濃度１ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン溶液、終濃度５００μＭのアデノシンを混合し、３７℃で５分間インキュベートした。５分後、フィブリノーゲン溶液にトロンビン溶液を混ぜ、酵素活性阻害能を測定した。その結果を図４に示す。また、アデノシンの終濃度を５．０μＭ〜２５００μＭの範囲で変化させて、上記と同様の条件で、酵素活性阻害能を測定した。同様に対照分子であるシチジンを存在させた場合の酵素活性阻害能を測定した。その結果を図５に示す。【００５１】
酵素活性阻害能は、フィブリノーゲン溶液にトロンビン溶液を混合し、その後、溶液が凝固するまでの時間を凝固時間（ｓｅｃ）とし、この値によって酵素活性阻害能を測定した。凝固時間は、自動血液凝固装置（ＫＣ４Ａｍｉｃｒｏ，ＡＭＥＬＵＮＧ）により測定した。バッファーの終濃度は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、ＰＨ＝８．０である。３’トロンビン・アデノシンアプタマー又は５’トロンビン・アデノシンアプタマー単独では、トロンビンの活性を阻害しないのに対し、アデノシンアプタマーとの相補的塩基配列の長さが１１
ｍｅｒの５’トロンビン・アデノシンアプタマーと３’トロンビン・アデノシンアプタマーを混合したアプタマーは、高い阻害能を示した。【００５２】
また、図５のキャリブレーションカーブの結果からも明らかなように、対照標的分子であるシチジンを添加しても凝固時間は、変わらないのに対して、標的分子であるアデノシンを添加すると、終濃度１０００μＭまでは、凝固時間が減少し、それ以上では飽和していた。すなわち、終濃度１μＭの分離型アプタマー・プローブ複合体を用い、トロンビンの酵素活性を測定することにより、５０μＭ以上の標的分子であるアデノシンを検出できることが示された。
【実施例２】
【００５３】
分割したトロンビンアプタマーに付加するアデノシンアプタマーの相補的塩基配列の長さを変化させた以外は実施例１と同様にして、アプタマー・プローブ複合体を作製した。配列表に、作製した５’トロンビン・アデノシンアプタマー・プローブ複合体（８ｍｅｒ）の塩基配列（配列番号３）を示す。また、実施例１と同様にして、酵素活性阻害能を測定した。その結果を図４に示す。
【実施例３】
【００５４】
分割したトロンビンアプタマーに付加するアデノシンアプタマーの相補的塩基配列の長さを変化させた以外は実施例１と同様にして、アプタマー・プローブ複合体を作製した。配列表に、作製した５’トロンビン・アデノシンアプタマー・プローブ複合体（４ｍｅｒ）の塩基配列（配列番号４）を示す。また、実施例１と同様にして、酵素活性阻害能を測定した。その結果を図４に示す。【００５５】
図４において、１はトロンビンのみ、２は、５’トロンビン・アデノシンアプタマー（１１ｍｅｒ）、３は、３’トロンビン・アデノシンアプタマー、４は、５’トロンビン・アデノシンアプタマー（１１ｍｅｒ）＋３’トロンビン・アデノシンアプタマー、５は、５’トロンビン・アデノシンアプタマー（１１ｍｅｒ）＋３’トロンビン・アデノシンアプタマー＋０．５ｍＭアデノシン、６は、５’トロンビン・アデノシンアプタマー（８ｍｅｒ）＋３’トロンビン・アデノシンアプタマー、７は、５’トロンビン・アデノシンアプタマー（４ｍｅｒ）＋３’トロンビン・アデノシンアプタマー、８は、トロンビンアプタマーを示す。【００５６】
終濃度５００ｎＭアデノシン存在下における、相補的塩基配列の長さが１１ ｍｅｒの５’トロンビン・アデノシンアプタマーと３’トロンビン・アデノシンアプタマーを混合したアプタマーの阻害能は、アデノシン非存在下と比べ低下した。３’トロンビン・アデノシンアプタマーに補的塩基配列の長さが８、４
ｍｅｒの５’トロンビン・アデノシンアプタマーを混合した場合は、阻害能が低いことから、アデノシンがアデノシンアプタマー部位に結合することにより、３’トロンビン・アデノシンアプタマーと５’トロンビン・アデノシンアプタマーがハイブリダイゼーションしにくくなり、その結果、アプタマーの阻害能が低下したと考えられた。
【実施例４】
【００５７】
（１）アプタマー複合体の作製
標的分子結合アプタマーとして、アデノシンアプタマーに代えて血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）に結合するＤＮＡアプタマー（５’ＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＧＣＡＣＧＴＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧ
３’）を採択し（Green et al. Biochemistry 1996, 35, 14413‐14424）、相補的塩基配列の長さを１５ｍｅｒとした以外は、実施例１と同様にして、アプタマー・プローブ複合体を作製した。【００５８】
すなわち、トロンビンアプタマーのＧ−カルテット内の３’側のＴ−Ｔループ部位を切断部位として２つに分割して考え、その塩基配列を特定し、本発明の分離型アプタマー・プローブ複合体を設計し、分割したアプタマーの一端に標的分子アプタマーであるＰＤＧＦ−ＡＢアプタマーを付加したアプタマー・プローブ複合体（３’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマー）を、分割したもう一方のアプタマーの一端に標的分子アプタマーであるＰＤＧＦ−ＡＢアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したアプタマー・プローブ複合体（５’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマー）を作製した（図６）。配列表に、３’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマー・プローブ複合体の塩基配列（配列番号５）、５’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマー・プローブ複合体の塩基配列（配列番号６）を示す。【００５９】
（２）酵素活性阻害能の測定
終濃度１００ｎＭの３’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマーに、終濃度１００ｎＭの５’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマーを加え、９５℃で３分間加熱後、３０分かけて２５℃まで冷却し、終濃度１３．５ｎＭトロンビン、終濃度１ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンを用い、終濃度１００ｎＭ
ＰＤＧＦ−ＡＢ存在下において、アプタマーの阻害能を測定した。【００６０】
その結果、３’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマー又は５’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマー単独では、トロンビンの活性を阻害しないのに対し、それらを混合したアプタマーは、トロンビンの酵素活性を阻害した（図７）。終濃度１００ｎＭＰＤＧＦ−ＡＢ存在下における、５’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマーと３’トロンビン・ＰＤＧＦアプタマーを混合したアプタマーの阻害能は、ＰＤＧＦ−ＡＢ非存在下と比較すると低下した。尚、５’アプタマー・プローブ複合体、又は３’アプタマー・プローブ複合体単独では、酵素活性阻害能を有しないことが示された。
【実施例５】
【００６１】
酵素活性阻害アプタマーとして、トロンビンアプタマー、また、標的分子に結合する標的分子結合アプタマーとしてＩｇＥアプタマーをそれぞれ採択し、分離型アプタマー・プローブ複合体を作製した。【００６２】
（１）分離型アプタマー・プローブ複合体の設計
上記トロンビンアプタマーを構成しているＧ−カルテット内の３′側のＴ−Ｔループ部位を切断部位として２つに分割したアプタマーの一端に、標的分子アプタマーであるＩｇＥアプタマーを付加したアプタマー・プローブ複合体（３′アプタマー・プローブ複合体）と、分割したもう一方のアプタマーの一端に、標的分子アプタマーであるＩｇＥアプタマーの一部の相補的塩基を付加したアプタマー・プローブ複合体（５′アプタマー・プローブ複合体）をそれぞれ個別に設計した（図８）。【００６３】
（２）分離型アプタマー・プローブ複合体の作製
上記（１）のように設計された、２つに分割した塩基配列を有するアプタマー粉末（インビトロジェン社製）を用い、これを水に溶かし、緩衝水溶液とした。これらの別個のアプタマーの水溶液をそれぞれ３′−アプタマー水溶液、５′−アプタマー水溶液とした。一方の５′−アプタマー水溶液に相補的塩基配列の長さが６ｍｅｒのＩｇＥアプタマー水溶液を混合することにより、５′アプタマーにＩｇＥアプタマー（６ｍｅｒ）を付加させた５′アプタマー・プローブ複合体を作製した。これと同様にして、５′アプタマーにＩｇＥアプタマー（４ｍｅｒ）又はＩｇＥアプタマー（５ｍｅｒ）を付加させた２種類の５′アプタマー・プローブ複合体を作製した。【００６４】
このように作製した濃度１μＭの３′アプタマー・プローブ複合体に濃度１μＭの５′アプタマー・プローブ複合体を加え、９５℃で３０分間加熱後、３０分かけて２５℃まで冷却し、本発明の分離型アプタマー・プローブ複合体を作製した。表１に、作製した５′トロンビン・ＩｇＥアプタマー・プローブ複合体（６ｍｅｒ）、３′トロンビン・ＩｇＥアプタマー・プローブ複合体（６ｍｅｒ）、５′トロンビン・ＩｇＥアプタマー・プローブ複合体（４ｍｅｒ）、及び３′トロンビン・ＩｇＥアプタマー・プローブ複合体（４ｍｅｒ）の配列を示す。【００６５】
【表１】
2007032359.tif 000002
【００６６】
また、配列表に、５′トロンビン・ＩｇＥアプタマー・プローブ複合体（６ｍｅｒ）の塩基配列（配列番号７）、３′トロンビン・ＩｇＥアプタマー・プローブ複合体（６ｍｅｒ）の塩基配列（配列番号８）、５′トロンビン・ＩｇＥアプタマー・プローブ複合体（４ｍｅｒ）の塩基配列（配列番号９）、及び３′トロンビン・ＩｇＥアプタマー・プローブ複合体（４ｍｅｒ）の塩基配列（配列番号１０）を示す。【００６７】
（３）酵素活性阻害能の測定
酵素活性阻害能の測定は、２５０ｎＭＡＥＳ、２５０ｎＭＩｇＥ、２５０ｎＭＢＳＡ、５４ｎＭトロンビン及び１．７ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンを用いて３７℃で行った。その結果を図９に示す。図９は、６−ｂｐ、５−ｂｐ、又は４−ｂｐリンカーＤＮＡを有するＡＥＳをＩｇＥ又はＢＳＡと一緒に添加したときの凝固時間及び阻害の減少率を示す。【００６８】
図中、レーン１〜１３は、レーン１：トロンビンのみ、レーン２：トロンビンアプタマー、レーン３：トロンビンアプタマーとＢＳＡ、レーン４：トロンビンアプタマーとＩｇＥ、レーン５：トロンビン−阻害アプタマー（Ｌｉｎｋｅｒ  ６−ｍｅｒ）、レーン６：トロンビン−阻害アプタマー（Ｌｉｎｋｅｒ  ６−ｍｅｒ）とＢＳＡ、レーン７：トロンビン−阻害アプタマー（Ｌｉｎｋｅｒ  ６−ｍｅｒ）とＩｇＥ、レーン８：トロンビン−阻害アプタマー（Ｌｉｎｋｅｒ  ５−ｍｅｒ）、
レーン９：トロンビン−阻害アプタマー（Ｌｉｎｋｅｒ  ５−ｍｅｒ）とＢＳＡ、レーン１０：トロンビン−阻害アプタマー（Ｌｉｎｋｅｒ  ５−ｍｅｒ）とＩｇＥ、 レーン１１：トロンビン−阻害アプタマー（Ｌｉｎｋｅｒ  ４−ｍｅｒ）、レーン１２：トロンビン−阻害アプタマー（Ｌｉｎｋｅｒ  ４−ｍｅｒ）とＢＳＡ、レーン１３：トロンビン−阻害アプタマー（Ｌｉｎｋｅｒ  ４−ｍｅｒ）とＩｇＥ、である。凝固時間及び阻害の減少率は、それぞれ、３つの実験の平均であり、誤差を表示した。【００６９】
図１０は、ＩｇＥにＡＥＳを用いたＩｇＥのキャリブレーショングラフを示す。これらの実験は、４−ｂｐリンカーＤＮＡを有する２５０ｎＭＡＥＳ、５４ｎＭトロンビン及び０．３４ｍｇ/ｍｌフィブリノーゲンを用いて３７℃で行った。凝固時間は３つの実験の平均であり、誤差を表示した。図１０の結果から明らかなように、対照標的分子であるＢＳＡを添加しても凝固時間は、変わらないのに対して、標的分子であるＩｇＥを添加すると、５００ｎＭまで凝固時間が減少した。【００７０】
すなわち、２５０ｎＭの分離型アプタマー・プローブ複合体を用い、トロンビンの酵素活性を測定することにより、１００ｎＭ以上の標的分子であるＩｇＥを検出できることが示された。このように、ＩｇＥの濃度に依存してトロンビンの阻害活性が変化することが明らかとなった。つまり、図１０に示されたように、検量線に従い、トロンビンの酵素活性からＩｇＥの濃度を簡易かつ容易に測定できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上詳述したように、本発明は、アプタマー・プローブ複合体及び該アプタマー・プローブ複合体を用いた標的分子の検出方法に係るものであり、本発明により、ほとんど全ての標的分子結合するアプタマーに対して、設計思想を適用できる汎用性が高い新規アプタマー・プローブ複合体を提供することができる。また、本発明により、例えば、酵素活性を阻害するアプタマーを２つに分け、その一方に標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドと、もう一方に標的分子に結合するアプタマーの一部の相補的塩基配列を付加したオリゴヌクレオチドの２種類のオリゴヌクレオチド分子を用いて標的分子を検出できる新規アプタマー・プローブ複合体による標的分子検出方法を提供することができる。更に、本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いることにより、高感度かつ高精度にほとんど全ての標的分子に結合するアプタマーを応用可能で、しかも、それらの標的分子を高感度かつ簡便に検出することができる標的分子の検出手法に関する新技術・新製品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いたアデノシン検出原理を示す。
【図２】本発明のアプタマー・プローブ複合体の一例を示す。
【図３】トロンビン・アデノシンアプタマーの塩基配列を示す。
【図４】本発明の新規アプタマー・プローブ複合体のトロンビンに対する阻害能を示す。
【図５】本発明の新規アプタマー・プローブ複合体を用いたアデノシンの検出結果を示す。
【図６】トロンビン・ＰＤＧＦアプタマーの塩基配列を示す。
【図７】本発明の新規アプタマー・プローブ複合体のトロンビンに対する阻害能を示す。
【図８】本発明のアプタマー・プローブ複合体の他の一例を示す。
【図９】本発明のアプタマー・プローブ複合体のトロンビンに対する阻害能（凝固時間、阻害の減少率）を示す。
【図１０】本発明のアプタマー・プローブ複合体を用いたＩｇＥの検出結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007032359.tif 000014
2007032359.tif 000015
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