(57)【要約】細胞（特に、動物細胞および植物細胞）における、改変核酸と細胞内の核酸との間の相同性組換え効率を向上させる方法および組成物を開発することを、本発明の課題とする。また、そのような方法を用いて形質転換細胞を得ることもまた、本発明の課題である。さらに、外因性核酸の宿主細胞への形質転換効率を向上させることもまた、本発明の課題である。改変核酸および／または細胞内の核酸と相同的なキャリア核酸を、改変核酸とともに宿主細胞に導入することによって、相同性組換え効率を向上させて、相同性組換え効率の向上という上記課題を解決した。また、外因性核酸とキャリア核酸とを宿主細胞に導入することによって、形質転換効率の向上という、上記課題を解決した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変核酸と、細胞内の核酸との間で相同性組換えを行う方法であって、以下：
（ａ）該細胞内に該改変核酸とキャリア核酸とを導入する工程、および
（ｂ）前記改変核酸およびキャリア核酸が導入された細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに
（ｃ）前記改変核酸と前記細胞内の核酸との間で相同性組換えが生じた細胞を選択する工程；
を包含する、方法。
【請求項３】
前記細胞が、動物細胞および植物細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞内の核酸が、前記細胞のゲノム中の核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キャリア核酸が、少なくとも２種類である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キャリア核酸が、前記改変核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記キャリア核酸が、前記細胞内の核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記少なくとも２種類のキャリア核酸が、第１のキャリア核酸および第２のキャリア核酸を含み、そして、前記改変核酸が、前記細胞内の核酸に対する第１の相同的部位および第２の相同的部位を含み、そして、該第１のキャリア核酸が該第１の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、該第２のキャリア核酸が該第２の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、方法。
【請求項１０】
前記キャリア核酸が、内向きキャリア核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記キャリア核酸が、外向きキャリア核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
改変核酸と、細胞内の核酸との間の相同性組換え効率を向上させるための組成物であって、少なくとも１種のキャリア核酸を含む、組成物。
【請求項１３】
少なくとも２種のキャリア核酸を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記キャリア核酸が、前記改変核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記キャリア核酸が、前記細胞内の核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１３に記載の組成物であって、ここで、前記組成物が、少なくとも第１のキャリア核酸および第２のキャリア核酸を含み、そして、前記改変核酸が、前記細胞内の核酸に対する第１の相同的部位および第２の相同的部位を含み、そして、該第１のキャリア核酸が該第１の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、該第２のキャリア核酸が該第２の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法によって調製された、細胞。
【請求項１９】
外因性核酸を細胞のゲノム内に挿入する方法であって、以下：
（ａ）該細胞内に該外因性核酸とキャリア核酸とを導入する工程、および
（ｂ）前記外因性核酸およびキャリア核酸が導入された細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
外因性核酸を細胞のゲノム内に挿入する効率を向上させるための組成物であって、キャリア核酸を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の形質転換法の分野に関する。より詳細には、本発明は、核酸またはその誘導体を用いる、改善された形質転換法、および相同性組換え法に関する。
【背景技術】
【０００２】
相同性組換えに依存する遺伝子ターゲッティングは、人工的に細胞内のＤＮＡを除去、および／または改変することを可能にする技術である。この技術は、特定の細胞・個体の遺伝子の改変を可能とするため、所望の遺伝情報を有する動物個体の作成のための強力なツールであるばかりではなく、種々の疾患の治療への応用も可能である。例えば、そのような治療の例としては、疾患原因遺伝子（例えば、癌遺伝子）を正常遺伝子に置き換える遺伝子置換型遺伝子治療が挙げられる。また、この技術は、白血病原因遺伝子の改変を可能とすることにより、患者自身の罹患細胞を改変して健常な細胞として、患者自身に戻すことによる、ドナーを必要としない白血病治療を可能にする。【０００３】
以上のような高い有用性が認識されている一方で、多くの細胞において、相同性組換え頻度が低いことに起因して、相同性組換え技術の多種多様な細胞・個体への適用は、妨げられてきた。一般に、細菌細胞および酵母細胞では、相同性組換えの頻度が高いが、動物細胞および植物細胞では、相同性組換えの頻度は、非常に低い。動物細胞の場合、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）に比べると体細胞での相同性組換えは、非常に低い。そのため、体細胞での相同性組換え技術が求められている。ターゲッティングを行う際のベクター（ターゲッティングベクター）を改変することによって、相同性組換え頻度を向上させる試みが行われている（例えば、ポジティブ−ネガティブ選択ベクターの使用、または、プロモーターレスベクターの使用（非特許文献１））。【０００４】
また、植物においても、相同性組換えの頻度が低いことが公知であり、そのため、強力なネガティブ−ポジティブ選択が用いられている。（非特許文献２）。【０００５】
例えば、疾患の治療のために、ヒト細胞内において相同性組換えを行う際に、目的とするゲノム部位での組換え（相同性組換え）に付随して生じる、望まれない部位での組換え（非相同性組換え）は、結果として、正常に機能している遺伝子の機能を損なうことになリ得る。正常に機能している遺伝子の機能を損なうことなく、所望の位置における相同性組換えを生じるためには、相同性組換えの効率を可能な限り高め、そして非相同性組換えの確立を可能な限り低くする必要がある。しかしながら、現在知られている、改変されたターゲッティングベクター用いる技術においては、相同性組換え効率は、十分なものとはいえない。
【非特許文献１】ＳｅｄｉｖｙおよびＤｕｔｒｉａｕｘ，ＴＩＧ，ｖｏｌ  １５，Ｎｏ．３，１９９９年3月
【非特許文献２】Ｔｅｒａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  ２０，２００２年１０月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、細胞（例えば、動物細胞および植物細胞）における、相同性組換え効率を上昇させることが、本発明の解決しようとする課題である。【０００７】
また、細胞の形質転換の効率を高めることによっても、所望の遺伝情報を保持する細胞を得ることが容易になるため、細胞の形質転換の効率を高めることもまた、本発明の解決しようとする課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、相同性組換えを生じる改変核酸を標的細胞内に導入するのと同時に、キャリア核酸を標的細胞内に導入することによって、相同性組換えの効率が上昇し、そして形質転換効率が上昇することを見出して、上記課題を解決して、本発明を完成させた。【０００９】
従って、本発明は、以下を提供する。
（項目１）  改変核酸と、細胞内の核酸との間で相同性組換えを行う方法であって、以下：
（ａ）該細胞内に該改変核酸とキャリア核酸とを導入する工程、
を包含する、方法。
（項目２）  項目１に記載の方法であって、さらに
（ｂ）前記改変核酸およびキャリア核酸が導入された細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
（項目３）  項目１に記載の方法であって、さらに
（ｃ）前記改変核酸と前記細胞内の核酸との間で相同性組換えが生じた細胞を選択する工程；
を包含する、方法。
（項目４）  前記細胞が、動物細胞および植物細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）  前記動物細胞が、ヒト細胞である、項目４に記載の方法。
（項目６）  前記細胞内の核酸が、前記細胞のゲノム中の核酸である、項目１に記載の方法。
（項目７）  前記細胞内の核酸が、癌遺伝子およびヒト白血球抗原遺伝子からなる群から選択される遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）  前記癌遺伝子が、ｒａｓ遺伝子、ｅｒｂＢ２遺伝子、およびｅｇｆ受容体遺伝子からなる群から選択される遺伝子を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）  前記改変核酸が、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目１０）  前記改変核酸が、二本鎖ＤＮＡである、項目９に記載の方法。
（項目１１）  前記改変核酸が、選択マーカー遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）  選択マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子、細胞毒素をコードする遺伝子、グリーン蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）  薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、およびブレオマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）  前記キャリア核酸が、少なくとも２種類である、項目１に記載の方法。
（項目１５）  前記キャリア核酸が、少なくとも４種類である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）  前記キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）  前記キャリア核酸が、１５〜１００ヌクレオチド長である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  前記キャリア核酸が、少なくとも２０ヌクレオチド長である、項目１４に記載の方法。
（項目１９）  前記キャリア核酸が、少なくとも２５ヌクレオチド長である、項目１４に記載の方法。
（項目２０）  前記キャリア核酸が、前記改変核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、項目１に記載の方法。
（項目２１）  前記キャリア核酸が、前記細胞内の核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、項目１に記載の方法。
（項目２２）  項目１４に記載の方法であって、ここで、前記少なくとも２種類のキャリア核酸が、第１のキャリア核酸および第２のキャリア核酸を含み、そして、前記改変核酸が、前記細胞内の核酸に対する第１の相同的部位および第２の相同的部位を含み、そして、該第１のキャリア核酸が該第１の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、該第２のキャリア核酸が該第２の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、方法。
（項目２３）  前記キャリア核酸が、内向きキャリア核酸である、項目１４に記載の方法。
（項目２４）  前記キャリア核酸が、外向きキャリア核酸である、項目１４に記載の方法。
（項目２５）  前記キャリア核酸が、内向きキャリア核酸および外向きキャリア核酸を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２６）  改変核酸と、細胞内の核酸との間の相同性組換え効率を向上させるための組成物であって、少なくとも１種のキャリア核酸を含む、組成物。
（項目２７）  少なくとも２種のキャリア核酸を含む、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）  少なくとも４種のキャリア核酸を含む、項目２６に記載の組成物。
（項目２９）  前記キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、項目２６に記載の組成物。
（項目３０）  前記キャリア核酸が、１５〜１００ヌクレオチド長である、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）  前記キャリア核酸が、少なくとも２０ヌクレオチド長である、項目２６に記載の組成物。
（項目３２）  前記キャリア核酸が、少なくとも２５ヌクレオチド長である、項目２６に記載の組成物。
（項目３３）  前記キャリア核酸が、前記改変核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、項目２６に記載の組成物。
（項目３４）  前記キャリア核酸が、前記細胞内の核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、項目２６に記載の組成物。
（項目３５）  項目２７に記載の組成物であって、ここで、前記組成物が、少なくとも第１のキャリア核酸および第２のキャリア核酸を含み、そして、前記改変核酸が、前記細胞内の核酸に対する第１の相同的部位および第２の相同的部位を含み、そして、該第１のキャリア核酸が該第１の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、該第２のキャリア核酸が該第２の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、組成物。
（項目３６）  前記キャリア核酸が、内向きキャリア核酸である、項目２６に記載の組成物。
（項目３７）  前記キャリア核酸が、外向きキャリア核酸である、項目２６に記載の組成物。
（項目３８）  所望のゲノム情報を有する細胞を調製する方法であって、項目３に記載の相同性組換えを行う方法を実行する工程を包含する、方法。
（項目３９）  項目３８に記載の方法によって調製された、細胞。
（項目４０）  項目３８に記載の方法によって調製された、胚性幹細胞。
（項目４１）  項目４０に記載の方法によって調製された胚性幹細胞を用いて調製された、トランスジェニック動物。
（項目４２）  外因性核酸を細胞のゲノム内に挿入する方法であって、以下：
（ａ）該細胞内に該外因性核酸とキャリア核酸とを導入する工程、
を包含する、方法。
（項目４３）  項目４２に記載の方法であって、さらに
（ｂ）前記外因性核酸およびキャリア核酸が導入された細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
（項目４４）  前記キャリア核酸が、少なくとも２種類である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）  前記キャリア核酸が、少なくとも４種類である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）  前記キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、項目４４に記載の方法。
（項目４７）  前記キャリア核酸が、１５〜１００ヌクレオチド長である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）  前記キャリア核酸が、少なくとも２０ヌクレオチド長である、項目４４に記載の方法。
（項目４９）  前記キャリア核酸が、少なくとも２５ヌクレオチド長である、項目４４に記載の方法。
（項目５０）  前記キャリア核酸が、前記外因性核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、項目４４に記載の方法。
（項目５１）  前記外因性核酸が、前記細胞内の核酸に対する第１の相同的部位および第２の相同的部位を含み、そして、前記少なくとも２種類のキャリア核酸が第１のキャリア核酸および第２のキャリア核酸を含み、該第１のキャリア核酸が該第１の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、該第２のキャリア核酸が該第２の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、項目４４に記載の方法。
（項目５２）  外因性核酸を細胞のゲノム内に挿入する効率を向上させるための組成物であって、キャリア核酸を含む、組成物。
（項目５３）  前記組成物が、少なくとも１種の内向きキャリア核酸を含む、項目５２に記載の組成物。
（項目５４）  前記組成物が、少なくとも２種の内向きキャリア核酸を含む、項目５２に記載の組成物。
（項目５５）  前記キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、項目５２に記載の組成物。
（項目５６）  前記キャリア核酸が、１５〜１００ヌクレオチド長である、項目５５に記載の組成物。
（項目５７）  前記キャリア核酸が、少なくとも２０ヌクレオチド長である、項目５２に記載の組成物。
（項目５８）  前記キャリア核酸が、少なくとも２５ヌクレオチド長である、項目５２に記載の組成物。
（項目５９）  前記キャリア核酸が、前記外因性核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、項目５２に記載の組成物。
（項目６０）  前記外因性核酸が、前記細胞内の核酸に対する第１の相同的部位および第２の相同的部位を含み、そして、前記少なくとも２種類のキャリア核酸が第１のキャリア核酸および第２のキャリア核酸を含み、該第１のキャリア核酸が該第１の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、該第２のキャリア核酸が該第２の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、項目５４に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、細胞（特に、動物細胞および植物細胞）における、相同性組換え効率を上昇させる方法が、提供される。また、本発明によって、形質転換効率を上昇させる方法もまた、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の相同組換えの機構を模式的に示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ｐｋａＣ遺伝子の形質転換の結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｇｂｆＡ遺伝子の形質転換の結果を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ｐｋａＣ遺伝子の相同組換えの結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｇｂｆＡ遺伝子の相同組換えの結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００１２】
配列番号１：Ｈ−ｒａｓ標的領域の配列
配列番号２：Ｈ−ｒａｓ標的領域用内向きキャリア核酸１
配列番号３：Ｈ−ｒａｓ標的領域用内向きキャリア核酸２
配列番号４：Ｈ−ｒａｓ標的領域用外向きキャリア核酸１
配列番号５：Ｈ−ｒａｓ標的領域用外向きキャリア核酸２
配列番号６：ｅｒｂＢ２標的領域の配列１
配列番号７：ｅｒｂＢ２標的領域用内向きキャリア核酸１
配列番号８：ｅｒｂＢ２標的領域用内向きキャリア核酸２
配列番号９：ｅｒｂＢ２標的領域用外向きキャリア核酸１
配列番号１０：ｅｒｂＢ２標的領域用外向きキャリア核酸２
配列番号１１：ｅｇｆｒ標的領域の配列１
配列番号１２：ｅｇｆｒ標的領域用内向きキャリア核酸１
配列番号１３：ｅｇｆｒ標的領域用内向きキャリア核酸２
配列番号１４：ｅｇｆｒ標的領域用外向きキャリア核酸１
配列番号１５：ｅｇｆｒ標的領域用外向きキャリア核酸２
配列番号１６：Ｈ−ｒａｓ標的領域用内向きキャリア核酸３
配列番号１７：Ｈ−ｒａｓ標的領域用内向きキャリア核酸４
配列番号１８：Ｈ−ｒａｓ標的領域用外向きキャリア核酸３
配列番号１９：Ｈ−ｒａｓ標的領域用外向きキャリア核酸４
配列番号２０：ｅｒｂＢ２標的領域の配列２
配列番号２１：ｅｒｂＢ２標的領域用内向きキャリア核酸３
配列番号２２：ｅｒｂＢ２標的領域用内向きキャリア核酸４
配列番号２３：ｅｒｂＢ２標的領域用外向きキャリア核酸３
配列番号２４：ｅｒｂＢ２標的領域用外向きキャリア核酸４
配列番号２５：ｅｇｆｒ標的領域の配列２
配列番号２６：ｅｇｆｒ標的領域用内向きキャリア核酸３
配列番号２７：ｅｇｆｒ標的領域用内向きキャリア核酸４
配列番号２８：ｅｇｆｒ標的領域用外向きキャリア核酸３
配列番号２９：ｅｇｆｒ標的領域用外向きキャリア核酸４
配列番号３０：ｐｋａＣ標的領域用内向きキャリア核酸ｐｋａＳ
配列番号３１：ｐｋａＣ標的領域用外向きキャリア核酸ｐｋａＳ’
配列番号３２：ｐｋａＣ標的領域用内向きキャリア核酸ｐｋａＡ
配列番号３３：ｐｋａＣ標的領域用外向きキャリア核酸ｐｋａＡ’
配列番号３４：ｐｋａＣ増幅用プライマーｐｋａＥｘＡ
配列番号３５：ｇｂｆＡ標的領域用内向きキャリア核酸ｇｂｆＡＳ
配列番号３６：ｇｂｆＡ標的領域用外向きキャリア核酸ｇｂｆＡＳ’
配列番号３７：ｇｂｆＡ標的領域用内向きキャリア核酸ｇｂｆＡＡ
配列番号３８：ｇｂｆＡ標的領域用外向きキャリア核酸ｇｂｆＡＡ’
配列番号３９：ｇｂｆＡ増幅用プライマーｇｂｆＡＥｘＳ
配列番号４０：ｐｋａＣの５’隣接領域増幅用オリゴヌクレオチド
配列番号４１：ｐｋａＣの３’隣接領域増幅用オリゴヌクレオチド
配列番号４２：ｇｂｆＡの５’隣接領域増幅用オリゴヌクレオチド
配列番号４３：ｇｂｆＡの３’隣接領域増幅用オリゴヌクレオチド
配列番号４４：ｂｓｒカセットの増幅用オリゴヌクレオチド
配列番号４５：ｂｓｒカセットの増幅用オリゴヌクレオチド
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００１４】
本明細書において使用する場合、用語「相同性組換え」とは、「相同的組換え」と互換可能に用いられ、一対の二本鎖ＤＮＡの相同的な塩基配列を持つ部分に起こる組換えをいう。【００１５】
本明細書において使用する場合、塩基配列が「相同的」であるとは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェント（高度にストリンジェントまたは中程度にストリンジェント）な条件下でのハイブリダイゼーション法によって決定され得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同的である。【００１６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のキャリア核酸をプローブとして、改変核酸および／または細胞内の核酸の配列を有する核酸に対してサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、改変核酸および／または細胞内の核酸の配列を有する核酸由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、標識したキャリア核酸をプローブとして用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより、ポジティブのシグナルを与えるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。【００１７】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そして許容される以上のミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。【００１８】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。【００１９】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。【００２０】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。【００２１】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。【００２２】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列(他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失(すなわちギャップ)が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。【００２３】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。【００２４】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリー配列または核酸のクエリー配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。【００２５】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。【００２６】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。【００２７】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。【００２８】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能（例えば、同様の条件、同一の標的を用いた場合、同一のハイブリダイゼーションの結果を生じる）を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリン、および、架橋化核酸（bridged nucleic acid; BNA、例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ  ＢＮＡ）などが挙げられるがそれらに限定されない。非天然のヌクレオチドとしては、ＰＮＡおよびＢＮＡが好ましい。【００２９】
本明細書において、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価（例えば、同様の条件、同一の標的を用いた場合、同一のハイブリダイゼーションの結果を生じる）であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。【００３０】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。【００３１】
本明細書において使用する場合、用語「改変核酸」とは、遺伝情報を改変することが意図される細胞内に導入されて、相同性組換えによってその細胞ゲノム内の標的領域に挿入される配列をいう。代表的には、改変配列は、ジーンターゲッティングベクターとして機能する核酸である。【００３２】
本明細書中、相同性組換えの文脈において使用する場合、用語「ネガティブ選択配列」とは、改変核酸が標的領域以外のゲノム領域に挿入された細胞の増殖を阻害および／または抑制することによって、改変核酸が標的領域に挿入された細胞の選択を容易にする配列である。代表的には、「ネガティブ選択配列」は、改変核酸の付加配列として存在し、２つの相同領域での相同性組換えによらずに改変核酸がゲノム中に挿入された場合、２つの相同領域および挿入配列とともに、ゲノム中に挿入され、その結果、ネガティブ選択配列から、宿主細胞の増殖を阻害および／または促成する遺伝子産物（ＲＮＡおよび／またはタンパク質）が発現されて、その結果、改変核酸が標的領域以外のゲノム領域に挿入された細胞の増殖が阻害および／または抑制される。これに対して、改変核酸が相同性組換えによって標的領域に挿入される場合は、２つの相同領域の外にある付加配列としての「ネガティブ選択配列」は、ゲノム中に挿入されることがなく、そのため、改変核酸を挿入した宿主細胞の増殖が、阻害・抑制されない。本明細書において使用する場合、「ネガティブ選択配列」による選択を「ネガティブ選択」という。「ネガティブ選択配列」としては、細胞毒素（例えば、破傷風毒、およびチミジンキナーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。【００３３】
本明細書中、相同性組換えの文脈において使用する場合、用語「ポジティブ選択配列」とは、改変核酸がゲノム領域に挿入された細胞の増殖の増殖に必須であるか、および／または増殖を促進する配列である。本明細書において使用する場合、「ポジティブ選択配列」による選択を「ポジティブ選択」という。【００３４】
本明細書において使用する場合、用語「キャリア核酸」とは、（１）改変核酸と細胞内の標的領域との相同性組換え効率を向上させる機能、および（２）外因性核酸の細胞内への形質転換効率を向上させる機能、の少なくとも１つの機能を有する核酸をいう。本明細書において使用する場合、「外因性核酸」とは、形質転換される細胞中には、存在しない核酸をいう。従って、改変核酸は、外因性核酸でもある。本発明において、キャリア核酸は、改変核酸と細胞内の標的領域との相同性組換え効率を向上させる機能と、改変核酸の細胞内への形質転換効率を向上させる機能の両方を有してもよい。【００３５】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。【００３６】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【００３７】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。【００３８】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。【００３９】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。【００４０】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。【００４１】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。【００４２】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。  そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。【００４３】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。【００４４】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、真菌、粘菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。【００４５】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。【００４６】
本発明においては、任意の真菌を用いることも可能である。本明細書において使用される場合、代表的な真菌としては、例えば、細胞性粘菌であるＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍが挙げられるが、これに限定されない。【００４７】
本発明においては、任意の動物細胞および植物細胞を用いることが可能である。本明細書において使用される場合、代表的な動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。【００４８】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。【００４９】
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。【００５０】
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。【００５１】
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。【００５２】
本明細書において「塩基対の」および「Ｗａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対の」という表現は、本明細書では同義に用いられ、二重らせん状のＤＮＡにおいて見られるものと同様に、アデニン残基が２つの水素結合によってチミン残基またはウラシル残基と結合し、3つの水素結合によってシトシン残基とグアニン残基とが結合するという配列の正体に基づいて互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照）。このような塩基対は、相互作用を考慮する際に重要である。【００５３】
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。【００５４】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、疾患に関連する遺伝子に異常が存在する場合、その異常な遺伝子を除去および／または正常な遺伝子に置換するために、本発明の方法が遺伝子治療の一部として用いられる。遺伝子治療とは、所望の形質を宿主に付与する核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、宿主細胞内の異常な遺伝子配列を除去および／または別の配列（例えば、正常な遺伝子配列）と置換することによって、治療効果を媒介する。【００５５】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に適用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。【００５６】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。【００５７】
（治療活性または予防活性の証明）
本発明の方法または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、方法または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する本発明の方法の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する方法または組成物の効果は、対象となる疾患に関連して当業者に公知である技術を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の組成物の投与が効果を有するか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルを培養物において増殖し、そして本発明の組成物に曝されるか、または、本発明の方法を実施し、そして、組織サンプルに対するそのような組成物・方法の効果が観察される。【００５８】
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の薬学的組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、改変核酸およびキャリア核酸は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。【００５９】
本明細書において「診断、予防、処置または予後上有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができる。【００６０】
本発明の核酸分子またはその誘導体が医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。【００６１】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、ポリヌクレオチド、またはその改変体もしくは誘導体、あるいはそれらの調節因子を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。【００６２】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。【００６３】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。【００６４】
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。【００６５】
本発明の改変核酸およびキャリア核酸などは、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。【００６６】
固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。【００６７】
固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。【００６８】
固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。【００６９】
固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。【００７０】
固形製剤における崩壊阻害剤の好適な例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。【００７１】
固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。【００７２】
固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。【００７３】
固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。【００７４】
固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。【００７５】
固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。【００７６】
固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。【００７７】
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。【００７８】
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。【００７９】
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。【００８０】
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。【００８１】
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。【００８２】
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。【００８３】
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。【００８４】
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。【００８５】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、バクテリア保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。【００８６】
さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。【００８７】
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。【００８８】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版、その追補またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。【００８９】
様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。【００９０】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を、処置の必要な領域（例えば、中枢神経、脳など）に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯と組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。【００９１】
別の実施形態において、核酸または組成物は、小胞、特に、リポソーム中に封入された状態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。【００９２】
さらに別の実施形態において、核酸または組成物は、制御された徐放系中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。【００９３】
さらに別の実施形態において、制御された徐放系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。【００９４】
他の制御された徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。【００９５】
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間〜１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。【００９６】
本発明のポリヌクレオチドまたはその誘導体などの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人１日あたり、経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１０ｇであり、好ましくは、０．１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。非経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１ｇであり、好ましくは、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。【００９７】
本明細書中、「投与する」とは、本発明の改変核酸およびキャリア核酸などまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、生物の細胞、組織または生体に取り込むことを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。【００９８】
異常な状態はまた、生物へのシグナル伝達経路に異常を有する細胞の群に化合物を投与することによって予防または処置され得る。次いで、化合物を投与することの生物機能に対する効果が、モニターされ得る。この生物は、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはヤギ、より好ましくは、サル（ｍｏｎｋｅｙまたはａｐｅ）、および最も好ましくは、ヒトである。これらの非ヒト動物の特定の因子に関するモニターにより、ヒトにおけるその因子の効果を蓋然性を持って推定することができる。【００９９】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール、ＳＭＳ、ボイスメール、インスタントメッセージ）のような形態でも提供され得る。【０１００】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。【０１０１】
血漿、腫瘍および主要器官中での薬物および代謝産物の血漿半減期および体内分布はまた、障害を阻害するのに最も適切な薬物の選択を容易にするように決定され得る。このような測定が行われ得る。例えば、ＨＰＬＣ分析は、薬物で処置された動物の血漿において行われ得、放射線標識された核酸の位置が、Ｘ線、ＣＡＴスキャンおよびＭＲＩのような検出方法を用いて決定され得る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが、薬物動態学的特徴が不十分な化合物は、化学構造の変更や再試験によって最適化され得る。この点について、良好な薬物動態学的特徴を示す核酸が、モデルとして使用され得る。【０１０２】
毒性研究はまた、血液細胞組成物を測定することによって行われ得る。例えば、毒性研究は、以下のような適切な動物モデルにおいて行われ得る：（１）核酸またはそのアナログがマウスに投与される（未処置のコントロールマウスもまた、使用されるべきである）；（２）各々の処置群中の１匹のマウスから尾静脈を介して血液サンプルを周期的に得る；そして（３）上記サンプルを、赤血球および白血球の数、血液細胞組成物ならびにリンパ球と多形核細胞との割合について分析する。各々の投薬レジメンについての結果とコントロールとの比較は、毒性が存在するか否かを示す。【０１０３】
各々の毒性研究の終了の際に、動物を屠殺することによって、さらなる研究を行い得る（好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ，（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０２：２２９−２４９に従う）。次いで、各処置群からの代表的な動物が、転移、異常な病気または毒性の直接的な証拠のために全体的な検屍によって試験され得る。組織における全体の異常が記載され、組織が組織学的に試験される。体重の減少または血液成分の減少を引き起こす化合物は、主要な器官に対する有害作用を有する化合物と同様に好ましくない。一般的に、有害作用が大きいほど、その化合物は好ましくない。【０１０４】
（詳細な説明）
（１．相同性組換え効率を向上する方法および組成物）
本発明の、改変核酸と細胞内の核酸との間で相同性組換えを行う方法は、該細胞内に該改変核酸とキャリア核酸とを導入する工程を包含する。【０１０５】
ここで用いられる宿主は特に限定されることはなく、動物細胞または植物細胞が挙げられる。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、マウス細胞、ラット細胞のような哺乳動物細胞であっても、非哺乳動物細胞であってもよい。本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、葉緑体、硬い細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。植物の種類は、例えば、「原色牧野植物大図鑑」（北隆館（１９８２））などにおいて広範に分類されており、そこに記載されるすべての種類の植物が、本発明において使用され得る。代表的には、植物は、細胞壁の形成・葉緑体による同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。【０１０６】
本発明の相同性組換えにおいて、改変配列は、標的領域と相同的な配列を有する２つの相同領域、そしてこれら２つの領域に挟まれた挿入配列を有する。改変配列と相同性組換えを起こす標的領域は、宿主細胞のゲノム内であっても、ゲノム以外の場所に存在してもよい。この挿入配列は、標的領域と相同であっても、なくてもよい。２つの相同領域の好ましい長さは、当該分野において周知であり、例えば、５０ｂｐ〜２０ｋｂ、好ましくは１００ｂｐ〜１５ｋｂ、より好ましくは０．５〜１０ｋｂ、さらにより好ましくは４〜５ｋｂであるが、改変核酸が相同領域での相同性組換えによって標的領域に挿入される限り、これらに限定されない。２つの相同領域の間隔は、当該分野において周知であり、例えば、０．５〜２０ｋｂ、好ましくは１〜１０ｋｂであるが、改変核酸が相同領域での相同性組換えによって標的領域に挿入される限り、これらに限定されない。改変核酸は、２つの相同領域の外側（すなわち、挿入配列と反対側）に、付加配列として、さらなる追加の核酸配列を有してもよい。改変核酸が、選択マーカーを含む場合には、挿入領域中にあっても、付加配列として存在してもよい。代表的なポジティブ・ネガティブ選択を行う改変核酸においては、ポジティブ選択配列を挿入領域中に含み、そして、ネガティブ選択配列を付加配列として含む。ポジティブ選択配列は、所望の遺伝子のオープンリーディングフレームおよびリボゾーム結合配列を含むが、プロモーター配列を含んでも、プロモーター配列を含まなくても（すなわち、プロモーターレスであっても）よい。ポジティブ選択配列がプロモーター配列を含まない場合は、改変核酸がゲノム内の標的領域に挿入された場合に、標的領域近傍のプロモーター配列がポジティブ選択配列と作動可能に連結するように、改変核酸が設計される。その結果、改変核酸が所定の標的領域に所定の方向で挿入された場合にのみ、ポジティブ選択配列が機能することになる。【０１０７】
本発明の相同性組換えにおいて、キャリア核酸は、代表的には、改変核酸、および標的領域の少なくとも１つに対して、相同的である。ある局面においては、キャリア核酸は、改変核酸の２つの相同性領域の１つに対して相同である。好ましくは、キャリア核酸が相同的である、改変核酸内の部位および／または標的領域内の部位は、相互に相同的である。より好ましくは、キャリア核酸と、改変核酸内の部位および標的領域内の部位は、相互に相同的である。【０１０８】
理論に拘束されることは、望まないが、本発明のキャリア核酸が相同性組換え効率を向上させる原因の一つは、キャリア核酸が、改変核酸および／または標的領域と細胞内の条件下（例えば、生理条件下）でハイブリダイズし、そのため、相互に相同的である改変核酸内の部位と標的領域内の部位の一方、または双方の構造に変化が生じ、二重鎖が不安定になるか（例えば、二重鎖の一部がほどけて一重鎖の部分が露出する）、および／または三重鎖を形成するために、相互に相同的である改変核酸内の部位と標的領域内の部位での相同性組換えの頻度が上昇するものと考えられる。そのため、本発明の相同性組換えにおいて使用可能なキャリア核酸は、改変核酸、および標的領域の少なくとも１つに対して、高度にストリンジェントな条件または中程度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし得る核酸である。キャリア核酸の長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド長である。キャリア核酸の長さに特に制限はないが、好ましくは１００ヌクレオチド長以下である。キャリア核酸は、改変核酸または外因性核酸に対して、内向き（すなわち、５’末端よりも３’末端が、改変核酸または外因性核酸の中央に近い）であっても、外向き（すなわち、３’末端よりも５’末端が、改変核酸または外因性核酸の中央に近い）であってもよい。【０１０９】
また、本発明の別の局面において、相同性組換えのためのキャリア核酸は、改変核酸および／または標的領域に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の相同性を有する。【０１１０】
改変核酸とキャリア核酸とを細胞に導入する方法としては、任意の周知の遺伝子導入法を用いることが可能である。例えば、動物細胞の場合にの核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。また、核酸の導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。【０１１１】
植物細胞の遺伝子導入法としては、一般に、植物に対して直接的に遺伝子導入を行う方法（直接的遺伝子導入法、例えば、エレクトロポーレーション法）、または植物に対して間接的に遺伝子導入を行う方法（間接的遺伝子導入法）が行われる。現在までに、間接的な遺伝子導入法として、アグロバクテリウムを利用した方法が広く利用されている。例えばイネの完熟種子を培養して３週間後に得られたカルスに対してアグロバクテリウムを感染させる方法（Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６：２７１−２８２，１９９４を参照）あるいは、数日間、前培養した種子に対してアグロバクテリウムを感染させて形質転換体を迅速に得ることができる方法（田中ら、特許第３１４１０８４号を参照）を挙げることができる。【０１１２】
本発明の相同性組換え法の１つの局面においては、少なくとも１つのキャリア核酸が用いられる。別の局面においては、２つの相同領域の各々に相同的な２つのキャリア核酸が用いられる。さらなる局面においては、３つまたは４つ以上のキャリア核酸が用いられる。複数のキャリア核酸を用いる場合、その組合せは、内向きキャリア核酸のみ、外向きキャリア核酸のみ、内向きキャリア核酸と外向きキャリア核酸との混合物のいずれであってもよい。【０１１３】
用いられる改変核酸の量およびキャリア核酸の量に特に制限はない。両者の好ましい比率は、１：１００〜１：２００００、好ましくは１：５００〜１：１００００、より好ましくは１：１０００〜１：７０００、なおより好ましくは１：５０００であるが、これらに限定されない。【０１１４】
本発明の相同性組換えが成功したか否かは、例えば、相同性組換え後の細胞をサザン分析、ＰＣＲ分析、ノザン分析、またはウェスタンブロット分析などの周知の技術を用いることによって、決定することが可能である。【０１１５】
必要に応じて、本発明の相同性組換え後の細胞は、培養される。培養条件は、種々の細胞に応じて、周知の方法が確立されている。【０１１６】
本発明の局面において、相同性組換え後に、相同性組換えが生じた細胞を選択する工程が実行される。相同性組換えが生じた細胞は、改変核酸内に含まれるポジティブ選択配列を用いて、ポジティブ選択される。ポジティブ選択配列としては、薬剤存在下の培養における細胞増殖に必須の薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、およびブレオマイシン耐性遺伝子）、細胞の増殖に必須の成分を供給するために必要とされる遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。【０１１７】
別の局面においては、相同性組換えが生じた細胞は、改変核酸内に含まれるマーカー遺伝子に依存して、選択される。マーカー遺伝子としては、ＧＦＰ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および、ルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。【０１１８】
例えば、癌遺伝子の機能解析、および／または癌の治療を目的とする場合、標的領域としては、癌遺伝子内の配列を用いることが可能である。癌遺伝子としては、例えば、ｒａｓ遺伝子、ｅｒｂＢ２遺伝子、およびｅｇｆ受容体遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。【０１１９】
本発明の相同性組換えにおいて、改変核酸として使用する核酸は、一本鎖核酸であっても、二本鎖核酸であってもよい。【０１２０】
本発明のさらなる局面において、上記本発明の相同性組換え法を実施するための、キャリア核酸を含む組成物が提供される。【０１２１】
本発明の別の局面において、本発明の相同性組換え法によって得られた細胞が提供される。細胞の種類としては、特に限定されることはないが、例えば、正常細胞（体細胞、卵母細胞、および、胚性幹細胞）、ならびに癌細胞（体細胞由来、および、胚性幹細胞由来）が挙げられるが、これに限定されない。【０１２２】
（２．相同性組換え効率を向上する方法および組成物）
本発明の別の局面においては、向上した形質転換効率をもたらす形質転換法およびそのための組成物が提供される。【０１２３】
ここで用いられる宿主は特に限定されることはなく、動物細胞または植物細胞が挙げられる。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、マウス細胞、ラット細胞のような哺乳動物細胞であっても、非哺乳動物細胞であってもよい。本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、葉緑体、硬い細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。植物の種類は、例えば、「原色牧野植物大図鑑」（北隆館（１９８２））などにおいて広範に分類されており、そこに記載されるすべての種類の植物が、本発明において使用され得る。代表的には、植物は、細胞壁の形成・葉緑体による同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。【０１２４】
上記形質転換方法においては、キャリア核酸を用いることによって、外因性核酸を宿主細胞（例えば、宿主細胞ゲノム）に導入する効率が向上する。【０１２５】
外因性核酸は、宿主細胞のゲノム配列と相同性組換えを起こす必要は必ずしもないので、宿主細胞のゲノム配列と相同的な配列を有する必要は、ない。また、外因性核酸の長さは限定されることはないが、５０ｂｐ〜２０ｋｂ、好ましくは１００ｂｐ〜１５ｋｂ、より好ましくは０．５〜１０ｋｂ、さらにより好ましくは４〜５ｋｂである。好ましくは、外因性核酸は、ポジティブ選択配列を含む。【０１２６】
理論に拘束されることは、望まないが、本発明のキャリア核酸が形質転換効率を向上させる原因の一つは、キャリア核酸が、外因性核酸と細胞内の条件下でハイブリダイズし、そして、キャリア核酸をプライマーとして核酸重合が行われることである。本発明のキャリア核酸が形質転換効率を向上させる別の原因は、キャリア核酸が外因性核酸の一部に結合して、外因性核酸内の部位の構造に変化が生じ、二重鎖が不安定になるか、および／または三重鎖を形成し、その結果、形質転換効率が上昇するものと考えられる。そのため、本発明の形質転換において使用可能なキャリア核酸は、外因性核酸に対して、高度にストリンジェントな条件または中程度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし得る核酸である。キャリア核酸の長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド長である。キャリア核酸の長さに特に制限はないが、好ましくは１００ヌクレオチド長以下である。キャリア核酸は、外因性核酸に対して、内向き（すなわち、５’末端よりも３’末端が、外因性核酸の中央に近い）であっても、外向き（すなわち、３’末端よりも５’末端が、外因性核酸の中央に近い）であってもよい。しかし、キャリア核酸をプライマーとする重合による効果を考慮すると、内向きが好ましい。【０１２７】
本発明の形質転換方法において、キャリア核酸は、代表的には、改変核酸に対して、相同的である。【０１２８】
また、本発明の別の局面において、相同性組換えのためのキャリア核酸は、外因性核酸に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の相同性を有する。【０１２９】
外因性核酸とキャリア核酸とを細胞に導入する方法としては、上記の、改変核酸とキャリア核酸とを細胞に導入する方法を用いることができる。【０１３０】
本発明の相同性組換え法の１つの局面においては、少なくとも１つのキャリア核酸が用いられる。別の局面においては、２つ以上のキャリア核酸が用いられる。キャリア核酸は、内向きであっても、外向きであってもよいが、内向きであることが、好ましい。【０１３１】
用いられる外因性核酸の量およびキャリア核酸の量に特に制限はない。両者の好ましい比率は、１：１００〜１：２００００、好ましくは１：５００〜１：１００００、より好ましくは１：１０００〜１：７０００、なおより好ましくは１：５０００であるが、これらに限定されない。【０１３２】
本発明の相同性組換えが成功したか否かは、例えば、形質転換後の細胞をサザン分析、ＰＣＲ分析、ノザン分析、またはウェスタンブロット分析などの周知の技術を用いることによって、決定することが可能である。【０１３３】
必要に応じて、本発明の形質転換後の細胞は、培養される。培養条件は、種々の細胞に応じて、周知の方法が確立されている。【０１３４】
本発明の局面において、形質転換後に、形質転換が生じた細胞を選択する工程が実行される。形質転換が生じた細胞は、外因性核酸内に含まれるポジティブ選択配列を用いて、ポジティブ選択される。ポジティブ選択配列としては、薬剤存在下の培養における細胞増殖に必須の薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、およびブレオマイシン耐性遺伝子）、細胞の増殖に必須の成分を供給するために必要とされる遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。【０１３５】
別の局面においては、形質転換細胞は、外因性核酸内に含まれるマーカー遺伝子に依存して、選択される。マーカー遺伝子としては、ＧＦＰ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および、ルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。【０１３６】
本発明の相同性組換えにおいて、改変核酸として使用する核酸は、一本鎖核酸であっても、二本鎖核酸であってもよい。【０１３７】
本発明のさらなる局面において、上記本発明の形質転換法を実施するための、キャリア核酸を含む組成物が提供される。【０１３８】
本発明の別の局面において、本発明の形質転換法によって得られた細胞が提供される。細胞の種類としては、特に限定されることはないが、例えば、正常細胞（体細胞、卵母細胞、および、胚性幹細胞）、ならびに癌細胞（体細胞由来、および、胚性幹細胞由来）が挙げられるが、これに限定されない。【０１３９】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
本実施例においては、標的領域としてＨ−ｒａｓ遺伝子を選択した。標的領域の核酸を配列番号１に示す。Ｈ−ｒａｓ遺伝子配列と相同的な２つの相同配列（配列番号１の１〜９１２位の９１２ｂｐ、および、１０４２位〜２２２０位の１１７９ｂｐ）の中に、挿入配列として、ポジティブ選択配列（１８９３塩基対）であるネオマイシン耐性遺伝子を連結した３９８４塩基長の改変核酸を構築した。改変核酸内のネオマイシン耐性遺伝子は、ＳＶ４０プロモーターおよびＨＳＶ−ＴＫのポリＡシグナル（Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）と作動可能に連結している。【０１４１】
内向きキャリア核酸としては、５’−ＣＡＧＴＡＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＡＡＡＴＡＣＴＴＧ−３’（配列番号２）および５’−ＣＣＴＧＧＧＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣ−３’（配列番号３）、を用い、外向きキャリア核酸としては、５’−ＣＡＡＧＴＡＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＧ−３’（配列番号４）および５’−ＧＡＣＧＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＧＧＡＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号５）を用いた。【０１４２】
４×１０７個のＨｅｌａ細胞を、８００μｌのＭＥＭ培地（血清添加せず）に懸濁し、細胞懸濁液を８００μｌのエレクトロポーレーション用キュベット（電極の間隔＝４ｍｍ）に入れた。さらに、（１）４０μｇの改変核酸、（２）４０μｇの改変核酸＋１００μＭの内向きキャリア核酸（配列番号２および３）、または（３）４０μｇの改変核酸＋１００μＭの外向きキャリア核酸（配列番号４および５）を添加し、エレクトロポーレーションを行い（１５０Ｖ／０．４ｃｍ、１０ｍ秒）、細胞懸濁液を９６ウェルプレートの８つのウェルに播種し、培養した。２日後、ネオマイシン（６００μｇ／ｍｌ）を添加した。２〜３週間後に、コロニー数を計数し、そして、さらに一ヵ月後、ゲノムＰＣＲにより相同性組換えの有無を確認した。その結果を、以下の表１に示す。【０１４３】
【表１】
2007052728.tif 000002
表１に示されるように、１組の内向きキャリア核酸を用いた場合であっても、１組の外向きキャリア核酸を用いた場合であっても、形質転換効率がコントロールの約１５０％〜約２００％にまで向上した。また、キャリア核酸を用いなかった場合、体細胞であるＨｅＬａ細胞での相同性組換えは観察されなかったが、１組の内向きキャリア核酸を用いた場合であっても、１組の外向きキャリア核酸を用いた場合であっても、形質転換体の約６％〜約１３％が相同性組換え体であった。【０１４４】
以上の結果より、内向きキャリア核酸または外向きキャリア核酸のいずれであっても、形質転換効率を向上し、かつ相同性組換え効率を向上させるという効果を奏することが実証された。【０１４５】
（実施例２）
本実施例においては、標的領域としてｅｒｂＢ２遺伝子を選択した。標的領域の核酸を配列番号６に示す。ｅｒｂＢ２遺伝子配列と相同的な２つの相同配列（配列番号６の２２２１〜３７３８位の１５１８ｂｐ、および、４３１９〜５８０２位の１７２３ｂｐ）の中に、挿入配列として、ポジティブ選択配列（１８９３塩基対）であるネオマイシン耐性遺伝子を連結した４９８４塩基長の改変核酸を構築した。このネオマイシン耐性遺伝子は、実施例１に用いたものと同一である。【０１４６】
内向きキャリア核酸としては、５’−ＣＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＣＣＴＡＴＴＧ−３’（配列番号７）および５’−ＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧＧＧＧＧＣＡＡＡＡＡＣ−３’（配列番号８）、を用い、外向きキャリア核酸としては、５’−ＣＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号９）および５’−ＧＴＴＴＴＴＧＣＣＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧ−３’（配列番号１０）を用いた。【０１４７】
実施例１と同一の条件にて、ＨｅＬａ細胞を形質転換して、培養した。その結果を、以下の表２に示す。【０１４８】
【表２】
2007052728.tif 000003
表２に示されるように、１組の内向きキャリア核酸を用いた場合には、形質転換効率がコントロールの約約２００％にまで向上した。また、キャリア核酸を用いない場合、相同性組換えは生じなかったが、内向きキャリア核酸および外向きキャリア核酸を用いた場合は、それぞれ、形質転換体の１２．５％および８．９％が相同組換えを起こしていた。以上の結果より、キャリア核酸による形質転換効率の向上および相同性組換え効率の向上は、標的領域の配列やゲノム上での位置に依存しないことが実証された。【０１４９】
（実施例３）
本実施例においては、標的領域としてｅｇｆｒ遺伝子を選択した。標的領域の核酸を配列番号１１に示す。ｅｇｆｒ遺伝子配列と相同的な２つの相同配列（配列番号１１の１〜１０８５位の１０８５ｂｐ、および、１４０４〜２３００位の９００ｂｐ）の中に、挿入配列として、ポジティブ選択配列（１８９３塩基対）であるネオマイシン耐性遺伝子を連結した３８７８塩基長の改変核酸を構築した。このネオマイシン耐性遺伝子は、実施例１に用いたものと同一である。【０１５０】
内向きキャリア核酸としては、５’−ＧＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＡＴＣＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＧＡＴＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＡＧＧＣＡＴＡＧＧ−３’（配列番号１３）、を用い、外向きキャリア核酸としては、５’−ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＣ−３’（配列番号１４）および５’−ＣＣＴＡＴＧＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＣＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１５）を用いた。【０１５１】
実施例１と同一の条件にて、ＨｅＬａ細胞を形質転換して、培養した。その結果を、以下の表３に示す。【０１５２】
【表３】
2007052728.tif 000004
表３に示されるように、１組の内向きキャリア核酸を用いた場合には、形質転換効率がコントロールの約１４０％にまで向上した。また、キャリア核酸を用いない場合、相同性組換えは生じなかったが、内向きキャリア核酸および外向きキャリア核酸を用いた場合は、それぞれ、形質転換体の１２．３％および８．８％が相同組換えを起こしていた。以上の結果より、キャリア核酸による形質転換効率の向上および相同性組換え効率の向上は、標的領域の配列やゲノム上での位置に依存しないことが実証された。【０１５３】
（実施例４）
本実施例においては、標的領域としてＨ−ｒａｓ遺伝子を選択した。標的領域の核酸を配列番号１に示す。Ｈ−ｒａｓ遺伝子配列と相同的な２つの相同配列（配列番号１の１〜９１２位の９１２ｂｐ、および、１０４１〜２２２０位の１１７９ｂｐ）の中に、ポジティブ選択配列（１１９５塩基対）を挿入配列として挿入して、３２８６ｂｐの改変核酸を構築した。改変核酸のポジティブ選択配列（１１９５塩基対）は、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に作動可能にＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を結合し、プロモーター配列を欠く配列である。この改変核酸を用いる場合には、改変核酸が標的領域と相同性組換えを起こしてゲノム中に挿入された場合にのみ、形質転換体が得られる。従って、この改変核酸を用いた場合には、相同性組換えを起こした形質転換体のみが、形質転換体として観察される。【０１５４】
内向きキャリア核酸としては、５’−ＣＡＧＴＡＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＡＡＡＴＡＣ−３’（配列番号１６）および５’−ＣＴＧＧＧＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１７）、を用い、外向きキャリア核酸としては、５’−ＧＴＡＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＧ−３’（配列番号１８）および５’−ＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＧＧＡＣＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１９）を用いた。【０１５５】
４×１０７個のＨｅｌａ細胞を、８００μｌのＭＥＭ培地（血清添加せず）に懸濁し、細胞懸濁液を８００μｌのエレクトロポーレーション用キュベット（電極の間隔＝４ｍｍ）に入れた。さらに、（１）４０μｇの改変核酸、（２）４０μｇの改変核酸＋１００μＭの内向きキャリア核酸（配列番号１６および１７）、または（３）４０μｇの改変核酸＋１００μＭの外向きキャリア核酸（配列番号１８および１９）を添加し、エレクトロポーレーションを行い（１５０Ｖ／０．４ｃｍ、１０ｍ秒）、細胞懸濁液を９６ウェルプレートの８つのウェルに播種し、培養した。２日後、ブラスチシジンＳ（２μｇ／ｍｌ）を添加した。２〜３週間後に、コロニー数を計数した。その結果を、以下の表４に示す。【０１５６】
【表４】
2007052728.tif 000005
表４に示されるように、キャリア核酸を用いない場合には、相同性組換えを生じた形質転換体が得られなかった。これに対して、１組の内向きキャリア核酸を用いた場合であっても、１組の外向きキャリア核酸を用いた場合であっても、相同性組換えを起こした形質転換効率が、各々２４個および１５個得られた。【０１５７】
以上の結果を実施例１の結果とともに検討すると、キャリア核酸は、標的領域中の限られた特定の配列に相同的な場合にのみ形質転換効率や相同性組換え効率を向上させるのではないと結論付けられる。従って、当業者は、任意の標的領域での相同性組換えを促進するためのキャリア核酸を、容易に設計できるといえる。【０１５８】
（実施例５）
本実施例においては、標的領域としてｅｒｂＢ２遺伝子を選択した。標的領域の核酸を配列番号２０に示す。ｅｒｂＢ２遺伝子配列と相同的な２つの相同配列（配列番号２０の１〜１２７３位の１２７３ｂｐ、および、１２８６〜２９８０位の１６９５ｂｐ）の中に、挿入配列として、ポジティブ選択配列であるブラスチシジンＳ耐性遺伝子（１１９５塩基対）を連結した４１６３ｂｐの改変核酸を構築した。このポジティブ選択配列は、実施例４に用いたものと同一である。【０１５９】
内向きキャリア核酸としては、５’−ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＴＧＣＴＧ−３’（配列番号２１）および５’−ＧＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＧＣＴＡＣＡＡＣ−３’（配列番号２２）、を用い、外向きキャリア核酸としては、５’−ＣＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＣＣＴＡＡＧＧ−３’（配列番号２３）および５’−ＧＴＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号２４）を用いた。【０１６０】
実施例４と同一の条件にて、ＨｅＬａ細胞を形質転換して、培養した。その結果を、以下の表５に示す。【０１６１】
【表５】
2007052728.tif 000006
以上の結果を実施例２の結果とともに検討すると、キャリア核酸は、標的領域中の限られた特定の配列に相同的な場合にのみ形質転換効率や相同性組換え効率を向上させるのではないと結論付けられる。従って、当業者は、任意の標的領域での相同性組換えを促進するためのキャリア核酸を、容易に設計できるといえる。【０１６２】
（実施例６）
本実施例においては、相同組換えを行う細胞として細胞性粘菌であるＤｉｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍを選択し、種々のオリゴマーを用いて相同組換えを行った。【０１６３】
（１．実験方法）
（１．１．材料および方法）
ブラストサイジンＳは、フナコシ株式会社（東京、日本）より購入した。表６に記載される種々の配列を有するＤＮＡオリゴマー（塩を含まない、５’リン酸化されていないオリゴマー）は、株式会社ニッポン  イージーティー（富山、日本）より購入した。全てのＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  （ロッシュダイアグノスティックス）によって行った。【０１６４】
【表６】
2007052728.tif 000007
（１．２．細胞培養）
ＡＸ２（一倍体）およびｄＩＲ２（二倍体、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｉｎｓａｌｌ博士（Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｂ１５  ２ＴＴ，  ＵＫ  ）（ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔ．  ２００３  Ｊｕｌ  １０；４：１２．を参照のこと）より入手）をＨＬ５培地（グルコース  １４．３ｇ、ＤＩＦＣＯ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ７．１５ｇ、および、ＤＩＦＣＯ  ペプトン  １４．３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４８５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  １．２８ｇ、ｐＨ  ６．５）（１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンと１００単位／ｍｌのベンズペニシリンカリウムを添加）中で２１℃で培養した。形質転換体の選択の際には、ＨＬ５培地に１０μｇのブラストサイジンを添加した。【０１６５】
（１．３．遺伝子ターゲッティング構築物）
Ｄｉｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットｐｋａＣ（アクセッション番号Ｐ３４０９９）およびＧボックス結合因子ｇｂｆＡ（Ｌ２９０７５）のための２つの遺伝子ターゲッティング構築物を用いた。図１に示すように、両構築物に隣接する５’および３’に、約１ｋｂのブラストサイジンカセット（ｂｓｒカセット）を結合し、相同組換えに用いた（ｐｋａ−ｃａｔ  ＫＯ構築物、ｇｂｆＡ  ＫＯ構築物）。ｐｋａＣの５’隣接領域を、キャリア核酸ｐｋａＳおよびオリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣ−３’；配列番号４０）を用いて増幅し、３’隣接領域を、キャリア核酸ｐｋａＡおよびオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴＡＧＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡ−３’；配列番号４１）を用いて増幅した。ｇｂｆＡの５’隣接領域を、キャリア核酸ｇｂｆＡＳおよびオリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＣＧＡＧ−３’；配列番号４２）を用いて増幅し、ｇｂｆＡの３’隣接領域を、キャリア核酸ｇｂｆＡＡおよびオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’；配列番号４３）を用いて増幅した。ｐＵＣＢｓｒΔＢａｍのマルチクローニングサイト内のｂｓｒカセットを、オリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ−３’；配列番号４４）およびオリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’；配列番号４５）を用いて増幅した。この両オリゴヌクレオチドは、市販のＭ１３正方向配列および逆方向配列を含む。なお、配列番号４０および配列番号４２の最初の２９マーは、配列番号４４と相補的であり、配列番号４１および配列番号４３の最初の２７マーは、配列番号４５と相補的である。増幅したｂｓｒカセットと隣接領域との結合は、融合ＰＣＲ技法を用いて行った。具体的には、５’ＢＳＲカセットおよび３’ＢＳＲカセットを同時に３つ添加し、一番外側のプライマーで増幅した。これにより３つの断片はこの順に融合した（Ｋｕｗａｙａｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００２  Ｊａｎ  １５；３０（２）：Ｅ２．を参照のこと）。遺伝子ターゲッティングのために必要とされる量の核酸を、ｐｋａＳおよびｐｋａＡを用いたＰＣＲ、およびｇｂｆＡＳおよびｇｂｆＡＡを用いたＰＣＲにより増幅し、エタノール沈殿し、乾燥して調製した。【０１６６】
（１．４．形質転換）
ＡＸ２細胞およびｄＩＲ２細胞の形質転換を、エレクトロポーレーションにより行った。エレクトロポーレーションの直前に、１０μｇの沈殿した遺伝子ターゲッティング構築物を溶解した。所定の濃度の遺伝子ターゲッティング構築物と２．０×１０７細胞とを含むエレクトロポーレーション緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５０ｍＭ  スクロース、ｐＨ６．１）を調製した。エレクトロポーレーションと形質転換クローンの単離を、ブラストサイジンＳを含む９６ウェルの平底タイタープレートを用いてＨＬ５培地中で、慣用的方法に従って行った。添加したオリゴヌクレオチドの配列と濃度を、以下の表７に記載する。なお、結果は、三連の実験の平均±標準偏差である。【０１６７】
（１．５．遺伝子ターゲッティング効率の計算）
各クローンを５ＬＰ培地プレート（０．５％  ラクトース、０．５％  ＤＩＦＣＯ  ペプトン、１．５％  アガー）上に、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓとともにプレーティングすることによって、形態形成表現型について分析した。遺伝子ターゲッティング効率を、凝集欠損クローンの数をブラストサイジンＳ耐性クローンの数で割り算することによって計算した。各実験における少なくとも６つの凝集欠損クローンについてゲノムＰＣＲ分析を行った。ゲノムＰＣＲには、ｐｋａＳとｐｋａＡの組合せ、ｇｂｆＡＳとｇｂｆＡＡの組合せ、ｐｋａＳとｐｋａＥｘＡの組合せ、ｇｂｆＡＥｘＳとｇｂｆＡＡの組合せを用いた（図１）。全ての凝集欠損クローンでは、相同組換えによる遺伝子ターゲッティングが確認された。【０１６８】
（２．結果）
（２．１．形質転換効率）
形質転換効率についての結果を表７および図２に示す。図２Ａは、ｐｋａＣについての結果であり、２．０×１０７細胞を用いて１４３個の形質転換体が出現した場合を１００％とした。図２Ｂは、ｇｂｆＡについての結果であり、２．０×１０７細胞を用いて８個の形質転換体が出現した場合を１００％とした。【０１６９】
【表７】
2007052728.tif 000008
短い長さを有するキャリア核酸の、形質転換効率および遺伝子ターゲッティング効率に対する影響を、細胞性粘菌Ｄｉｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの一倍体株および二倍体株を用いて試験した。この粘菌の野生株を飢餓状態に置くと、化学走性による細胞凝集を生じるが、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットｐｋａＣまたはＧボックス結合因子ｇｂｆＡの少なくとも１つを欠損する変異株は、凝集を起こさない。この現象は、これら遺伝子について遺伝子ターゲッティングを行った株を、形質転換の集団から選択することを容易にする。従って、各実験においては、全ての凝集欠損形質転換を、遺伝子ターゲッティングが行われた株として計数した。なお、各実験においては、少なくとも６つのランダムに選択した凝集欠損クローンについて、ゲノムＰＣＲを行い相同組換えが行われたことを確認した（図１）。【０１７０】
２．０×１０７個の一倍体細胞ＡＸ２について、１０μｇの約３．４ｋｂ長のｐｋａＣ遺伝子ターゲッティング構築物をエレクトロポーレーションすることによって、約１４０個のｂｓｒ耐性クローンを得た。一方、２．０×１０７個の一倍体細胞ＡＸ２について、１０μｇの約３．４ｋｂ長のｇｂｆＡ遺伝子ターゲッティング構築物をエレクトロポーレーションすることによって、８個のｂｓｒ耐性クローンを得た。この結果は、従来法によるｐｋａＣの遺伝子ターゲッティング効率がｇｂｆＡの場合よりも高いことを示す。相同組換え効率の平均（すなわち、平均遺伝子ターゲッティング効率）は、ｐｋａＣの場合は約８０％であったが、ｇｂｆＡの場合は、約１３％であった（表７中、キャリア核酸を添加しない場合）。【０１７１】
本実施例において使用するキャリア核酸は、２０〜２４マーの長さであり、遺伝子ターゲッティング構築物の両方の鎖の隣接領域と同一の配列を有するよう設計されている（表６）。ＡＸ２細胞を、内向きキャリア核酸の組合せ（ｐｋａＳとｐｋａＡの組合せ、およびｇｂｆＡＳとｇｂｆＡＡの組合せ）とともに形質転換すると、形質転換効率が上昇した。１００μＭのキャリア核酸を用いると、ｐｋａＣの場合、形質転換効率が１６０％に上昇し、ｇｂｆＡの場合には、６００％に上昇した。これら形質転換効率の増加は、添加したキャリア核酸の量に比例した（表７）。その一方で、ｐｋａＣについての外向きキャリア核酸の組合せ（ｐｋａＳ’とｐｋａＡ’の組合せ）は、形質転換効率に影響を与えなかったが、ｇｂｆＡについての外向きキャリア核酸の組合せ（ｇｂｆＡＳ’とｇｂｆＡＡ’の組合せ）は、形質転換効率を上昇させた（表７）。内向きキャリア核酸の組合せのうちのセンス側の一方のみ（ｐｋａＳまたはｇｂｆＡＳ）を添加した場合、形質転換効率の上昇が観察されたが、アンチセンス側（ｐｋａＡまたはｇｂｆＡＡ）の場合は、形質転換効率の上昇は、観察されなかった。ランダムな配列を有するオリゴヌクレオチドを１００μＭ添加しても、オリゴヌクレオチドを添加しなかった場合と比較して、形質転換効率の上昇は観察されなかった。【０１７２】
（２．２．相同組換え効率）
キャリア核酸による相同組換え効率への影響についての結果を表８および図３に示した。図３Ａは、ｐｋａＣについての結果であり、２．０×１０７細胞を用いて出現した形質転換体に対する相同組換えを生じたクローンの割合を示した。図３Ｂは、ｇｂｆＡについての結果であり、２．０×１０７細胞を用いて出現した形質転換体中で相同組換えを生じたクローンの割合を示した。  
【表８】
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ｐｋａＣの相同組換え効率は、キャリア核酸を用いない場合であっても、約８０％であった（表８および図３Ａ）。キャリア核酸であるｐｋａＳおよびｐｋａＡを添加した場合、約９６％にまで上昇した。キャリア核酸の効果は、ｐｋａＳまたはｐｋａＡのいずれかを用いた場合であっても観察されたが、相同組換え効率を上昇させる効果は、用いたキャリア核酸によって異なっていた。さらに、内向きキャリア核酸のみならず外向きキャリア核酸を用いた場合であっても、相同組換え効率の上昇が確認された。外向きキャリア核酸が形質転換効率に影響を与えなかったことと比較すると、この結果は、興味深いものであった。【０１７３】
ｇｂｆＡ遺伝子の場合、さらに劇的な効果が観察された。キャリア核酸を用いない場合、相同組換え効率は約１０％であり、ｐｋａＣの場合と比較すると非常に低かったが、内向きキャリア核酸の添加によって、相同組換え効率は約８０％を越える程度にまで劇的に上昇した（表８および図３Ｂ）。この効率上昇の効果は、ｇｂｆＡＳ単独またはｇｂｆＡＡ単独の場合でも観察された。外向きキャリア核酸ｇｂｆＡＳ’およびｇｂｆＡＡ’は、形質転換効率を上昇させなかったが、相同組換え効率を有意に上昇させた。【０１７４】
これら両方の遺伝子ターゲッティング構築物に対してランダムな２０マーのキャリア核酸を添加した場合には、形質転換効率の上昇も相同組換え効率の上昇の効果も確認されなかった。【０１７５】
（２．３．二倍体細胞での相同組換えクローンの単離）
一倍体株は、ゲノム中に各遺伝子を一組のみ含むため、遺伝子ターゲッティング技術を適用することが容易である。その一方で、二倍体細胞の相同組換えによる遺伝子ターゲッティングのためには、相同組換えの後に、さらなる遺伝子ターゲッティングまたはヘテロ接合体の交雑を必要とする。そこで、次に、キャリア核酸の使用が二倍体細胞ｄＩＲ２においてホモ接合型相同組換え体の産生をもたらすか否かについて、実験をした。使用した細胞数は、２×１０７細胞であった。上記と同一の遺伝子ターゲッティング構築物とキャリア核酸を用いてｄＩＲ２株を形質転換した。対照実験としては、キャリア核酸を用いずに形質転換を行った。その結果を表８に示す。キャリア核酸を用いなかった場合、および、外向きキャリア核酸を用いた場合には、凝集欠損クローンが単離されなかった。しかしながら、１００μＭの内向きキャリア核酸を用いた場合（ｐｋａＳ＋ｐｋａＡ、または、ｇｂｆＡＳ＋ｇｂｆＡＡ）、凝集欠損クローンが単離された。凝集欠損クローンがホモ接合型の相同組換え体であるか否かを、ＰＣＲ法を用いて確認した。その結果、内向きキャリア核酸（ｐｋａＳ＋ｐｋａＡ、または、ｇｂｆＡＳ＋ｇｂｆＡＡ）を用いた場合、それぞれ、約１２％および約１０％のホモ接合型相同組換え体が得られた。表８に示されるように、内向きキャリア核酸は、形質転換効率および相同組換え効率の両方の上昇をもたらした。その一方で、外向きキャリア核酸は、形質転換効率および相同組換え効率のいずれにも影響を与えなかった。これらの結果は、内向きキャリア核酸を用いることによって、二倍体細胞からホモ接合型相同組換え体を容易に得ることができることを示す。【０１７６】
（考察）
理論に拘束されることは好まないが、内向きキャリア核酸による形質転換効率の上昇は、内向きキャリア核酸が増幅プライマーとして機能して、遺伝子ターゲッティング構築物が細胞内で増幅され、そのコピー数が上昇する結果であるとも考えられる。その一方で、相同組換え効率の上昇は、キャリア核酸が遺伝子ターゲッティング構築物と相同組換え標的領域の両方にアニーリングし、その両方の二重鎖を部分的に巻き戻した状態にするためとも考えられる。二重鎖が巻き戻された状態が維持されると、相同組換えを生じる核酸同士がお互いに接近し易くなり、その結果、相同組換え効率が上昇すると考えられる。従って、オリゴヌクレオチドが本発明におけるキャリア核酸としての機能を発揮するためには、標的となる配列に対して、生理学的条件下でアニーリングする機能を持つことが必要であり、また、その機能で十分であると考えられる。従って、本発明において使用可能なキャリア核酸は、標的核酸（例えば、ゲノムのような外因性核酸）に対して、高度にストリンジェントな条件または中程度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし得る核酸であり、従って、その長さは、好ましくは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド長である。【０１７７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態および実施例を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明に従って、標的遺伝子が破壊された細胞を容易に取得することができる。また、従来は多段階の工程を経て初めて取得することが可能であったホモ接合型遺伝子破壊細胞が、本発明を利用することによって、一段階の形質転換によって容易に取得される。遺伝子抑制法としてＲＮＡｉが周知であるが、本発明においては、ＲＮＡｉでは不可能であった、完全かつ永久的な遺伝子抑制が可能となる。【０１７９】
相同組換え効率を上昇させるための種々の変法が公知である（例えば、Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガータンパク質のＤＮＡ結合部位と融合したヌクレアーゼを用いる方法）。しかし、既存の変法では、毒性や免疫原性の問題が無視できない。【０１８０】
さらに、本発明は、例えば、遺伝子疾患の治療、所望の遺伝子情報を有する細胞の確立を可能にするという有用性を有する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月30日(2007.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変核酸と、細胞内の核酸との間で相同性組換えを行う方法であって、以下：
（ａ）該細胞内に該改変核酸とキャリア核酸とを導入する工程、および
（ｂ）前記改変核酸およびキャリア核酸が導入された細胞を培養する工程、
を包含する、方法であって、ここで、
該キャリア核酸が、少なくとも２種類であり、
該キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、
該キャリア核酸が、該改変核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに
（ｃ）前記改変核酸と前記細胞内の核酸との間で相同性組換えが生じた細胞を選択する工程；
を包含する、方法。
【請求項３】
前記細胞が、動物細胞および植物細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞内の核酸が、前記細胞のゲノム中の核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
前記キャリア核酸が、前記細胞内の核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記少なくとも２種類のキャリア核酸が、第１のキャリア核酸および第２のキャリア核酸を含み、そして、前記改変核酸が、前記細胞内の核酸に対する第１の相同的部位および第２の相同的部位を含み、そして、該第１のキャリア核酸が該第１の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、該第２のキャリア核酸が該第２の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、方法。
【請求項１０】
前記キャリア核酸が、内向きキャリア核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記キャリア核酸が、外向きキャリア核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
改変核酸と、細胞内の核酸との間の相同性組換え効率を向上させるための組成物であって、少なくとも１種のキャリア核酸を含む、組成物であって、ここで、
該キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、
該キャリア核酸が、該改変核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、組成物。
【請求項１３】
少なくとも２種のキャリア核酸を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記キャリア核酸が、前記改変核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記キャリア核酸が、前記細胞内の核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１３に記載の組成物であって、ここで、前記組成物が、少なくとも第１のキャリア核酸および第２のキャリア核酸を含み、そして、前記改変核酸が、前記細胞内の核酸に対する第１の相同的部位および第２の相同的部位を含み、そして、該第１のキャリア核酸が該第１の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、該第２のキャリア核酸が該第２の相同的部位またはその相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法によって調製された、細胞。
【請求項１９】
外因性核酸を細胞のゲノム内に挿入する方法であって、以下：
（ａ）該細胞内に該外因性核酸とキャリア核酸とを導入する工程、および
（ｂ）前記外因性核酸およびキャリア核酸が導入された細胞を培養する工程、
を包含する、方法であって、ここで、
該キャリア核酸が、少なくとも２種類であり、
該キャリア核酸が、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、
該キャリア核酸が、該改変核酸またはその相補鎖に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る、方法。
【請求項２０】
外因性核酸を細胞のゲノム内に挿入する効率を向上させるための組成物であって、キャリア核酸を含む、組成物。
【国際調査報告】
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