【手続補正書】
【提出日】平成31年3月20日(2019.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；またはそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；ならびに
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
【請求項２】
ａ）配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；及び
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
【請求項３】
ａ）配列番号１４に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；及び
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
【請求項４】
ａ）配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；及び
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
【請求項５】
前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、標的細胞への高い感染性を付与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項６】
前記標的細胞が筋細胞またはグリア細胞である、請求項５に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項７】
野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の標的細胞感染性に比べて少なくとも５倍高い標的細胞感染性を示す、請求項５及び６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項８】
前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質が付与する標的細胞受容体依存性に比べて変化した標的細胞受容体依存性を付与する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項９】
感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子に比べて低いシアル酸またはヘパリン硫酸プロテオグリカン依存性を有する、請求項８に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１０】
前記遺伝子産物がポリペプチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、請求項１０に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１２】
前記分泌ポリペプチドが、リポタンパク質リパーゼ、第ＩＸ因子、α１アンチトリプシン、フォリスタチン、可溶性ミオスタチン受容体、アペリン、グルカゴン様ペプチド１、インスリン様増殖因子１、αガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、αグルコシダーゼ、及びＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼからなる群から選択される、請求項１１に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、トロポニン、ラミニン、コラーゲン、ラミン、セレノプロテインＮ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、フクチン、ＬＡＲＧＥ、Ｏ結合型マンノースβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びイソプレノイドシンターゼドメイン含有タンパク質からなる群から選択される、請求項１０に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１４】
前記遺伝子産物がゲノム編集遺伝子産物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１５】
前記ゲノム編集遺伝子産物が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣａｓ９／ガイドＲＮＡシステムまたはその成分からなる群から選択される、請求項１４に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１６】
前記遺伝子産物が核酸遺伝子産物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１７】
前記核酸遺伝子産物が、干渉ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、またはアプタマーである、請求項１６に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１８】
ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子；及び
ｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤
を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
個体における標的細胞への遺伝子産物の送達方法に用いるための医薬組成物であって、
ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子；及び
ｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤
を含み、
個体に投与される、
医薬組成物。
【請求項２０】
前記標的細胞が筋細胞またはグリア細胞である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記遺伝子産物がポリペプチドである、請求項１９及び２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記分泌ポリペプチドが、リポタンパク質リパーゼ、第ＩＸ因子、及びα１アンチトリプシン、フォリスタチン、可溶性ミオスタチン受容体、アペリン、グルカゴン様ペプチド１、インスリン様増殖因子１、αガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、αグルコシダーゼ、及びＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼからなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、トロポニン、ラミニン、コラーゲン、ラミン、セレノプロテインＮ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、フクチン、ＬＡＲＧＥ、Ｏ結合型マンノースβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びイソプレノイドシンターゼドメイン含有タンパク質からなる群から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記遺伝子産物が、ゲノム編集遺伝子産物である、請求項１９及び２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ゲノム編集遺伝子産物が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びＣａｓ９／ガイドＲＮＡシステムまたはその成分からなる群から選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記遺伝子産物が核酸遺伝子産物である、請求項１９及び２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記核酸遺伝子産物が、干渉ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、またはアプタマーである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；または、それぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、単離された核酸。
【請求項３０】
前記変異型キャプシドタンパク質が、ＡＡＶウイルス粒子中に存在する場合、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性に比べて高いＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性を提供する、請求項２９に記載の単離された核酸。
【請求項３１】
請求項２９及び３０のいずれか一項に記載の核酸を含む、単離された遺伝子改変宿主細胞。
【請求項３２】
配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；またはそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３３】
野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性に比べてそれぞれ高い筋細胞またはグリア細胞感染性を付与する、請求項３２に記載の変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３４】
ｒＡＡＶウイルス粒子の初期ライブラリを標的細胞における第１選択ラウンドに供することであって、前記初期ライブラリ中の前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、それぞれ、ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を有する初期ＡＡＶキャプシドタンパク質を含み、かつ前記ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列は、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の１つまたは複数の可変残基が互いに異なる祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を含み、それにより、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の第２のライブラリを生成する、前記供すること
を含む、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の生成方法。
【請求項３５】
ｉ）複数の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の系統樹を再構築すること；
ｉｉ）前記系統樹のノードを選択すること；及び
ｉｉｉ）前記ノードにおいて最も有望なアミノ酸配列を決定すること
によって、前記祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を決定することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、前記系統樹の各ノードにおける信頼値を推定することをさらに含み、かつ前記選択する段階が、前記ノードにおける推定された信頼値に基づいて前記系統樹のノードを選択することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記初期ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号７に記載の配列と少なくとも９４％同一のアミノ酸配列を有する、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ｒＡＡＶウイルス粒子の前記第２のライブラリを第２選択ラウンドに供することを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２選択ラウンドが、前記第１選択ラウンドで使用した前記標的細胞と同じ標的細胞型で実施される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２選択ラウンドが、前記第１選択ラウンドに比べて高い厳密性を有する、請求項３８及び３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的細胞が、筋細胞、上皮細胞、皮膚細胞、グリア細胞、及びヒト胎児由来腎臓細胞からなる群から選択される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記供する段階が、
ａ）標的細胞に前記ｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリを感染させること；
ｂ）感染した細胞にヘルパーウイルスを重感染させること；及び
ｃ）重感染した細胞から放出されたｒＡＡＶウイルス粒子を回収すること
を含む、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルス粒子を単離することを含み、単離されたｒＡＡＶウイルス粒子が、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子に比べて、高い感染性、増強された指向性、またはその両方を有する、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明のｒＡＡＶウイルス粒子またはｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリを含み、本方法の実施において使用するキットも、本明細書において提供する。
[本発明1001]
ａ）配列番号16に記載の配列に対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、264位、448位、459位、470位、495位、533位、547位、555位、557位、561位、563位、593位、596位、661位、662位、664位、718位及び723位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；またはそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；ならびに
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
[本発明1002]
ａ）配列番号13に記載の配列に対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；及び
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
[本発明1003]
ａ）配列番号14に記載の配列に対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；及び
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
[本発明1004]
ａ）配列番号15に記載の配列に対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；及び
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
[本発明1005]
前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、標的細胞への高い感染性を付与する、本発明1001〜1004のいずれかのｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1006]
前記標的細胞が筋細胞またはグリア細胞である、本発明1005のｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1007]
野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の標的細胞感染性に比べて少なくとも5倍高い標的細胞感染性を示す、本発明1005及び1006のいずれかのｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1008]
前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質が付与する標的細胞受容体依存性に比べて変化した標的細胞受容体依存性を付与する、本発明1001〜1007のいずれかのｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1009]
感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子に比べて低いシアル酸またはヘパリン硫酸プロテオグリカン依存性を有する、本発明1008のｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1010]
前記遺伝子産物がポリペプチドである、本発明1001〜1009のいずれかのｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1011]
前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、本発明1010のｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1012]
前記分泌ポリペプチドが、リポタンパク質リパーゼ、第ＩＸ因子、α1アンチトリプシン、フォリスタチン、可溶性ミオスタチン受容体、アペリン、グルカゴン様ペプチド1、インスリン様増殖因子1、αガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、イズロン酸−2−スルファターゼ、αグルコシダーゼ、及びＮ−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼからなる群から選択される、本発明1011のｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1013]
前記ポリペプチドが、トロポニン、ラミニン、コラーゲン、ラミン、セレノプロテインＮ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、フクチン、ＬＡＲＧＥ、Ｏ結合型マンノースβ1，2−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びイソプレノイドシンターゼドメイン含有タンパク質からなる群から選択される、本発明1010のｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1014]
前記遺伝子産物がゲノム編集遺伝子産物である、本発明1001〜1009のいずれかのｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1015]
前記ゲノム編集遺伝子産物が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣａｓ9／ガイドＲＮＡシステムまたはその成分からなる群から選択される、本発明1014のｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1016]
前記遺伝子産物が核酸遺伝子産物である、本発明1001〜1009のいずれかのｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1017]
前記核酸遺伝子産物が、干渉ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、またはアプタマーである、本発明1016のｒＡＡＶウイルス粒子。
[本発明1018]
ａ）本発明1001〜1016のいずれかの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子；及び
ｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤
を含む、医薬組成物。
[本発明1019]
本発明1001〜1017のいずれかの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を個体に投与することを含む、個体における標的細胞への遺伝子産物の送達方法。
[本発明1020]
前記標的細胞が筋細胞またはグリア細胞である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記遺伝子産物がポリペプチドである、本発明1019及び1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記分泌ポリペプチドが、リポタンパク質リパーゼ、第ＩＸ因子、及びα1アンチトリプシン、フォリスタチン、可溶性ミオスタチン受容体、アペリン、グルカゴン様ペプチド1、インスリン様増殖因子1、αガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、イズロン酸−2−スルファターゼ、αグルコシダーゼ、及びＮ−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼからなる群から選択される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記ポリペプチドが、トロポニン、ラミニン、コラーゲン、ラミン、セレノプロテインＮ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、フクチン、ＬＡＲＧＥ、Ｏ結合型マンノースβ1，2−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びイソプレノイドシンターゼドメイン含有タンパク質からなる群から選択される、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記遺伝子産物が、ゲノム編集遺伝子産物である、本発明1019及び1020のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記ゲノム編集遺伝子産物が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びＣａｓ9／ガイドＲＮＡシステムまたはその成分からなる群から選択される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記遺伝子産物が核酸遺伝子産物である、本発明1019及び1020のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記核酸遺伝子産物が、干渉ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、またはアプタマーである、本発明1027の方法。
[本発明1029]
変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号16に記載の配列に対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、264位、448位、459位、470位、495位、533位、547位、555位、557位、561位、563位、593位、596位、661位、662位、664位、718位及び723位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；または、それぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、単離された核酸。
[本発明1030]
前記変異型キャプシドタンパク質が、ＡＡＶウイルス粒子中に存在する場合、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性に比べて高いＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性を提供する、本発明1029の単離された核酸。
[本発明1031]
本発明1029及び1030のいずれかの核酸を含む、単離された遺伝子改変宿主細胞。
[本発明1032]
配列番号16に記載の配列に対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、264位、448位、459位、470位、495位、533位、547位、555位、557位、561位、563位、593位、596位、661位、662位、664位、718位及び723位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；またはそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質。
[本発明1033]
野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性に比べてそれぞれ高い筋細胞またはグリア細胞感染性を付与する、本発明1032の変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質。
[本発明1034]
ｒＡＡＶウイルス粒子の初期ライブラリを標的細胞における第1選択ラウンドに供することであって、前記初期ライブラリ中の前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、それぞれ、ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を有する初期ＡＡＶキャプシドタンパク質を含み、かつ前記ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列は、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の1つまたは複数の可変残基が互いに異なる祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を含み、それにより、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の第2のライブラリを生成する、前記供すること
を含む、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の生成方法。
[本発明1035]
ｉ）複数の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の系統樹を再構築すること；
ｉｉ）前記系統樹のノードを選択すること；及び
ｉｉｉ）前記ノードにおいて最も有望なアミノ酸配列を決定すること
によって、前記祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を決定することを含む、本発明1033の方法。
[本発明1036]
前記方法が、前記系統樹の各ノードにおける信頼値を推定することをさらに含み、かつ前記選択する段階が、前記ノードにおける推定された信頼値に基づいて前記系統樹のノードを選択することを含む、本発明1034の方法。
[本発明1037]
前記初期ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号7に記載の配列と少なくとも94％同一のアミノ酸配列を有する、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
ｒＡＡＶウイルス粒子の前記第2のライブラリを第2選択ラウンドに供することを含む、本発明1034〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記第2選択ラウンドが、前記第1選択ラウンドで使用した前記標的細胞と同じ標的細胞型で実施される、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記第2選択ラウンドが、前記第1選択ラウンドに比べて高い厳密性を有する、本発明1038及び1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記標的細胞が、筋細胞、上皮細胞、皮膚細胞、グリア細胞、及びヒト胎児由来腎臓細胞からなる群から選択される、本発明1034〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記供する段階が、
ａ）標的細胞に前記ｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリを感染させること；
ｂ）感染した細胞にヘルパーウイルスを重感染させること；及び
ｃ）重感染した細胞から放出されたｒＡＡＶウイルス粒子を回収すること
を含む、本発明1034〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記方法が、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルス粒子を単離することを含み、単離されたｒＡＡＶウイルス粒子が、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子に比べて、高い感染性、増強された指向性、またはその両方を有する、本発明1034〜1042のいずれかの方法。