(57)【要約】  安全性に優れ、かつ食品等に広く適用することが可能なＭＣＰ−１の発現抑制剤を提供する。本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤は、オーラプテンを含むことを特徴とする。オーラプテンは、八朔、甘夏、夏みかんおよびグレープフルーツ等の柑橘類に含まれており、これらは従来から食されているため、本発明は安全性に問題がない。また、オーラプテンは、ほぼ無味無臭であるため、食品等に添加しても、その風味を損なうことがない。オーラプテンは、カロリーが低いため、肥満者や糖尿病患者等であっても長期間摂取することが可能である。オーラプテンは、ＭＣＰ−１の発現を遺伝子レベル（図１参照）およびタンパク質レベルで抑制する。
2007132893.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＣＰ−１の発現抑制剤であって、
オーラプテンを含む、ＭＣＰ−１の発現抑制剤。
【請求項２】
前記ＭＣＰ−１の発現抑制が、遺伝子レベルでの発現抑制およびタンパク質レベルでの発現抑制の少なくとも一方である、請求の範囲１記載のＭＣＰ−１の発現抑制剤。
【請求項３】
前記オーラプテンが、柑橘類由来オーラプテンである、請求の範囲１記載のＭＣＰ−１の発現抑制剤。
【請求項４】
前記柑橘類が、甘夏、八朔、夏みかんおよびグレープフルーツからなる群から選択される少なくとも一つである、請求の範囲３記載のＭＣＰ−１の発現抑制剤。
【請求項５】
炎症性疾患の改善剤であって、
請求の範囲１記載のＭＣＰ−１の発現抑制剤を含有する、炎症性疾患の改善剤。
【請求項６】
前記炎症性疾患が、メタボリックシンドローム、アレルギー、腎疾患、感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、移植臓器の拒絶反応および癌転移からなる群から選択される少なくとも一つである、請求の範囲５記載の炎症性疾患の改善剤。
【請求項７】
前記メタボリックシンドロームが、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満からなる群から選択される少なくとも一つである、請求の範囲６記載の改善剤。
【請求項８】
炎症性疾患の予防もしくは治療のための医薬品であって、
請求の範囲５記載の炎症性疾患の改善剤を含む、医薬品。
【請求項９】
炎症性疾患の予防若しくは改善のためのサプリメントであって、
請求の範囲５記載の炎症性疾患の改善剤を含む、サプリメント。
【請求項１０】
炎症性疾患の予防若しくは改善のための食品であって、
請求の範囲５記載の炎症性疾患の改善剤を含む、食品。
【請求項１１】
炎症性疾患の予防若しくは改善のための飲料であって、
請求の範囲５記載の炎症性疾患の改善剤を含む、飲料。
【請求項１２】
炎症性疾患の予防若しくは改善のための食品添加剤であって、
請求の範囲５記載の炎症性疾患の改善剤を含む、食品添加剤。
【請求項１３】
ＭＣＰ−１の発現を抑制する方法であって、
オーラプテンを投与する工程を含む、ＭＣＰ−１の抑制方法。
【請求項１４】
前記投与が、経口投与、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与および静脈内投与からなる群から選択された少なくとも一つの投与方法である、請求の範囲１３記載のＭＣＰ−１の抑制方法。
【請求項１５】
炎症性疾患を予防もしくは治療する方法であって、
オーラプテンを投与する工程を含む、予防もしくは治療方法。
【請求項１６】
前記投与が、経口投与、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与および静脈内投与からなる群から選択された少なくとも一つの投与方法である、請求の範囲１５記載の予防もしくは治療方法。
【請求項１７】
ＭＣＰ−１の発現を抑制するための、オーラプテンの使用。
【請求項１８】
炎症性疾患を予防もしくは治療するための、オーラプテンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＣＰ−１の発現抑制剤、それを用いた炎症性疾患の改善剤、医薬品、サプリメント、食品、飲料および食品添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）は、ケモカイン（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）の一種である。これは、主に、単球、マクロファージ、繊維芽細胞、血管内皮細胞等から分泌され、単球やＴ細胞の遊走活性、サイトカイン産生誘導、接着分子の発現等の機能を持つ。また、ＭＣＰ−１の受容体は、ＣＣＲ２である。最近の研究により、脂肪組織がＭＣＰ−１を分泌する臓器であり、肥満者の脂肪組織では、ＭＣＰ−１の分泌量が増えることが分かっている。この他にも、ＭＣＰ−１が、感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、移植臓器の拒絶反応、アテローム性動脈硬化症および癌転移等の炎症性疾患や、インスリン抵抗性等に関与していることが分かっている（非特許文献１）。このため、ＭＣＰ−１をターゲットとした医薬品の開発が進められている（特許文献１）。しかしながら、化学的に合成された医薬品は、その効果が顕著な場合であっても、例えば、副作用を伴う可能性があり、安全性の面で問題がある。また、肥満を含む炎症性疾患やインスリン抵抗性等は、生活習慣と密接に関連しているため、運動や食生活の改善が必要である。したがって、食事等の日常生活において、ＭＣＰ−１の発現を抑制することが、炎症性疾患等の予防若しくは治療につながると考えられる。しかしながら、化学的に合成された医薬品では、前述のように、副作用の問題があるため、長期に摂取することが困難である。また、化学的に合成された医薬品は、独特の風味を持つことが多いため、食品とともに摂取する場合、例えば、食品本来の風味を損なうという問題もある。したがって、化学的に合成された医薬品は、例えば、医師の指導下での治療においては有用かもしれないが、安全性に問題があり、また、食品、飲料ないしサプリメント等に適用することができず、適用範囲が狭いという問題がある。
【非特許文献１】「肥満研究」Ｖｏｌ．１１  Ｎｏ．３  ２００５  ２７（２６７）−３２（２７２）
【特許文献１】特開２００５−１８７４５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明は、安全性に優れ、且つ、食品等に広く適用することが可能なＭＣＰ−１の発現抑制剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記目的を達成するために、本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤は、オーラプテンを含む。【０００５】
本発明の炎症性疾患の改善剤は、本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤を含有する。【０００６】
また、本発は、炎症性疾患の予防もしくは治療のための医薬品であって、本発明の炎症性疾患の改善剤を含む。【０００７】
本発明は、炎症性疾患の予防若しくは改善のためのサプリメント、食品、飲料、または、食品添加剤であって、本発明の炎症性疾患の改善剤を含む。【０００８】
本発明は、ＭＣＰ−１の発現を抑制する方法であって、オーラプテンを投与する工程を含む。また、本発明は、炎症性疾患を予防もしくは治療する方法であって、オーラプテンを投与する工程を含む。【０００９】
本発明は、ＭＣＰ−１の発現を抑制するための、または、炎症性疾患を予防もしくは治療するための、オーラプテンの使用である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者は、前記目的を達成するために、天然物を中心に、ＭＣＰ−１の発現を抑制する物質について一連の研究を重ねた。その結果、柑橘類に含まれているオーラプテンが、ＭＣＰ−１の発現を抑制することを見出し、本発明に至った。オーラプテンを含む柑橘類は、長年、食品として使用されており、その安全性に問題はない。また、オーラプテンは、独特の風味が無いか、若しくはあっても少ないため、食品や飲料等に適用しても、それらの風味を損ねることがない。また、オーラプテンは、カロリーが低いため、この点で、肥満者や糖尿病患者等のようにカロリー制限が必要な人が長期間摂取しても問題がない。したがって、本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤は、安全性に優れ、かつ食品等に広く適用可能であり、しかも長期間摂取することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の一実施例において、遺伝子レベルでのＭＣＰ−１の発現抑制効果を示すグラフである。
【図２】図２は、前記実施例において、タンパク質レベルでのＭＣＰ−１の発現抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、前記ＭＣＰ−１の発現抑制は、遺伝子レベルでの発現抑制およびタンパク質レベルでの発現抑制の少なくとも一方である。前記遺伝子レベルでの発現抑制は、ｍＲＮＡへの転写抑制を含む。また、前記タンパク質レベルでの発現抑制とは、例えば、翻訳における抑制を含み、翻訳後に修飾される場合は、前記修飾の抑制を含む。【００１３】
本発明において、前記オーラプテンは、柑橘類由来であることが好ましい。柑橘類由来のオーラプテンは、前記柑橘類のどの部分に由来してもよく、例えば、果汁由来のもの、果肉由来のもの、果皮由来のものがある。前記柑橘類は、特に制限されないが、例えば、甘夏（学術名Ｃｉｔｒｕｓ  ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉ  ＨＡＹＡＴＡ）、八朔（学術名Ｃｉｔｒｕｓ  ｈａｓｓａｋｕ  Ｈｏｒｔ．ｅｘ  ＴＡＮＡＫＡ）、夏みかん（学術名Ｃｉｔｒｕｓ  ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉ  ＨＡＹＡＴＡ  変異種）、グレープフルーツ（学術名Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ）等がある。また、前記オーラプテンは、例えば、柑橘類から単離精製したものを使用してもよいし、柑橘類の全部もしくは一部を含んだクルードな状態で使用してもよい。また、オーラプテンは、合成物や市販品を使用してもよい。【００１４】
本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤は、前述のようにオーラプテンを含んでいればよく、その構成や形態は制限されない。すなわち、本発明において、ＭＣＰ−１の発現抑制剤は、オーラプテン単独でもよいし、例えば、その他の成分をさらに含んでも良い。その他の成分は、制限されず、本発明の用途等により適宜決定でき、例えば、下記に例示する各種の成分があげられる。本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤を、例えば、投与または摂取することによって、例えば、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで、ＭＣＰ−１の発現を抑制することができる。本発明の発現抑制剤は、制限されないが、例えば、ヒト、ヒトを除く哺乳類動物に投与または摂取させることが好ましい。【００１５】
つぎに、本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤は、例えば、炎症性疾患の改善剤、医薬品、サプリメント、食品、飲料、食品添加剤等に適用できる。なお、これらも、本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤と同様に、例えば、その構成や形態は制限されない。【００１６】
本発明の炎症性疾患の改善剤は、前記本発明のＭＣＰ−１発現抑制剤を含有する。前記炎症性疾患とは、例えば、メタボリックシンドローム、アレルギー、腎疾患、感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、移植臓器の拒絶反応および癌転移である。前記メタボリックシンドロームとは、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等である。本発明の炎症性疾患の改善剤を投与することによって、このような炎症性疾患の改善が可能である。投与対象は、制限されないが、例えば、ヒト、ヒトを除く哺乳類動物があげられる。【００１７】
本発明において、オーラプテンの投与量または摂取量は、制限されない。また、オーラプテンの投与または摂取は、例えば、１日１回でもよいし、１日に数回に分けて行ってもよい。【００１８】
本発明の医薬品は、炎症性疾患の予防もしくは治療のための医薬品であり、前記本発明の炎症性疾患の改善剤を含む。本発明の医薬品を投与することにより、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等のメタボリックシンドローム、アレルギー、腎疾患、感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、移植臓器拒絶および癌転移等の疾病の予防若しくは治療が可能である。本発明の医薬品を投与する対象は、制限されないが、例えば、ヒト、ヒトを除く哺乳類動物があげられる。【００１９】
本発明の医薬品は、前記本発明の改善剤以外に、例えば、その他のＭＣＰ−１発現抑制成分、薬学的に許容可能な添加物等を含んでいても良い。本発明の医薬品において、具体的な剤形は、例えば、錠剤、細粒剤（散剤を含む）、カプセル、液剤（シロップ剤を含む）等があげられる。これらの各剤形に応じて、例えば、それぞれ適した添加剤や基材等を適宜使用し、日本薬局方等に記載された通常の方法に従って製造できる。また、投与経路は、特に制限されず、例えば、経口投与や非経口投与があげられる。前記非経口投与としては、例えば、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等があげられる。【００２０】
本発明のサプリメントは、炎症性疾患の予防若しくは改善のためのサプリメントであり、本発明の炎症性疾患の改善剤を含む。本発明のサプリメントを摂取することにより、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等のメタボリックシンドローム、アレルギー、腎疾患、感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、移植臓器拒絶および癌転移等の疾病の予防若しくは改善が可能である。本発明のサプリメントは、制限されないが、前述と同様に、ヒトや、ヒトを除く哺乳類動物が摂取することが好ましい。本発明のサプリメントは、前記本発明の改善剤以外に、例えば、各種添加剤、その他のサプリメント等を含んでいても良い。その他の成分としては、例えば、その他のＭＣＰ−１発現抑制成分、ビタミンＣなどの各種ビタミン類、アミノ酸、オリゴ糖等があげられる。本発明のサプリメントの形態は、特に制限されず、例えば、錠剤、細粒剤（散剤を含む）、カプセル、液剤（シロップ剤を含む）等があげられる。【００２１】
本発明の食品は、炎症性疾患の予防若しくは改善のための食品であり、前記本発明の炎症性疾患の改善剤を含む。本発明の食品を摂取することによって、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等のメタボリックシンドローム、アレルギー、腎疾患、感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、移植臓器拒絶および癌転移等の疾病の予防若しくは改善が可能である。本発明の食品は、制限されないが、例えば、ヒトやヒトを除く哺乳類動物が摂取することが好ましい。本発明の食品は、例えば、前記改善剤以外に、各種成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、例えば、その他のＭＣＰ−１発現抑制成分、各種添加剤、サプリメント等があげられる。本発明において、前記食品は、例えば、一般食品および機能性食品の双方を含む。本発明において、食品の形態は、制限されず、例えば、穀類、麺類、菓子類、スープ、肉、魚介類、海草、野菜、果物、豆類、各種加工品、乾燥食品、冷凍食品、燻製品、缶詰、瓶詰、レトルト食品等がある。【００２２】
本発明の飲料は、炎症性疾患の予防若しくは改善のための飲料であり、前記本発明の炎症性疾患の改善剤を含む。本発明の飲料を摂取することにより、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等のメタボリックシンドローム、アレルギー、腎疾患、感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、移植臓器拒絶および癌転移等の疾病の予防若しくは改善が可能である。本発明の飲料は、制限されないが、例えば、ヒトやヒトを除く哺乳類が摂取することが好ましい。本発明の飲料は、例えば、前記改善剤以外に、各種成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、例えば、その他のＭＣＰ−１発現抑制成分、各種添加剤、サプリメント等があげられる。本発明において、前記飲料は、例えば、一般飲料および機能性飲料の双方を含む。本発明において、飲料の形態は、制限されず、例えば、ジュース等の清涼飲料水、炭酸飲料、コーヒー、紅茶、緑茶、ミネラルウオーター等がある。【００２３】
本発明の食品添加剤は、例えば、炎症性疾患の予防若しくは改善のための食品添加剤であり、前記本発明の炎症性疾患の改善剤を含む。本発明の食品添加剤を摂取することにより、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、肥満および内臓脂肪型肥満等のメタボリックシンドローム、アレルギー、腎疾患、感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、移植臓器拒絶および癌転移等の疾病の予防若しくは改善が可能である。本発明の食品添加剤は、制限されないが、例えば、ヒトやヒトを除く哺乳類動物が摂取することが好ましい。本発明の食品添加剤は、例えば、前記改善剤以外に、各種成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、例えば、その他のＭＣＰ−１発現抑制成分、各種添加剤、サプリメント等があげられる。本発明の食品添加剤の形態は、制限されず、例えば、液状、粉末状、フレーク状、顆粒状等があげられる。なお、本発明の食品添加剤は、例えば、食品以外に、飲料用の食品添加剤も含む。【００２４】
つぎに、本発明は、ＭＣＰ−１の発現を抑制する方法であって、前記オーラプテンを投与する工程を含む。オーラプテンの投与によって、細胞におけるＭＣＰ−１の発現を抑制することができる。オーラプテンを投与する対象としては、制限されず、例えば、生体であってもよいし、生体から単離した細胞であってもよい。前記生体としては、制限されないが、例えば、ヒトまたはヒトを含む哺乳類動物等があげられる。投与する前記オーラプテンの形態は、制限されず、例えば、前述の本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤や炎症性改善剤、医薬品、サプリメント、食品、飲料、食品添加剤等と同様の形態があげられる。【００２５】
前記投与方法は、制限されず、例えば、生体の場合は、経口投与や非経口投与があげられる。前記非経口投与としては、例えば、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等があげられる。また、生体から単離した細胞の場合は、例えば、培地にオーラプテンを添加して培養する方法があげられる。【００２６】
つぎに、本発明は、炎症性疾患を予防もしくは治療する方法であって、本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤を投与する工程を含む。前記本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤の形態は、制限されず、前述と同様である。また、前記ＭＣＰ−１の発現抑制剤は、例えば、前述のような、炎症性改善剤、医薬品、サプリメント、食品、飲料、食品添加剤として、投与してもよい。【００２７】
前記投与方法は、制限されず、例えば、経口投与や非経口投与があげられる。前記非経口投与としては、例えば、口腔内投与、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等があげられる。前記本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤を投与する対象は、制限されないが、例えば、ヒトまたはヒトを含む哺乳類動物があげられる。【００２８】
つぎに、本発明におけるオーラプテンは、前述のように柑橘類を原料として製造することが好ましい。この製造方法の一例（特開平１１−２９５６５号公報）を、以下に示す。【００２９】
まず、柑橘類の果皮を、常温下で、水に浸漬させた後、遠心分離して果皮油を得る。前記果皮に代えて、果実、果肉、果汁を使用してもよいが、オーラプテンの含有量が多いことから、果皮を使用することが好ましい。【００３０】
続いて、前記果皮油を吸着剤に吸着させる。前記吸着剤としては、例えば、電気的に中性で、比表面積が大きい多孔性吸着剤を使用することが好ましい。このような吸着剤としては、例えば、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体を含む樹脂等があげられる。また、吸着量を多くして効率よくオーラプテンを精製するという観点から、前記吸着剤として使用する樹脂は、乾燥状態で使用することが好ましい。【００３１】
前記果皮油を吸着させた吸着剤を、アルコール水溶液を用いて洗浄する。これによって、前記吸着剤に吸着した不純物を除去する。前記アルコール水溶液のアルコール濃度は、例えば、５０％（体積比）未満であり、好ましくは１０％以上４５％以下であり、より好ましくは３５％以上４５％以下である。前記アルコールとしては、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール等があげられる。中でも、精製したオーラプテンを、例えば、サプリメント、食品、飲料もしくは食品添加剤等に用いる場合は、エタノールが好ましく、医薬品に用いる場合は、イソプロピルアルコールが好ましい。また、前記アルコール水溶液の量は、制限されないが、例えば、吸着剤に吸着させたオーラプテン含有液（例えば、果皮油）の約１４倍（体積比）であることが好ましい。【００３２】
そして、前記吸着剤から、アルコール水溶液を用いてオーラプテンを溶出する。この溶出液は、オーラプテンを含んでいるので、そのまま使用してもよいし、濃縮若しくは乾燥させて使用してもよい。このようにして得られたオーラプテンは、ほぼ白色の無味無臭である。溶出用の前記アルコール水溶液のアルコール濃度は、例えば、５０％以上９５％以下であり、好ましくは６０％以上９０％以下であり、より好ましくは７５％以上８５％以下である。前記アルコール水溶液およびその添加量は、例えば、前述と同様である。【００３３】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例に制限されない。
【実施例１】
【００３４】
本実施例は、オーラプテンによる遺伝子レベルおよびタンパク質レベルでのＭＣＰ−１の発現抑制を確認した例である。【００３５】
（前駆脂肪細胞の分化誘導）
まず、以下に示す２種類の培地、すなわち、分化誘導培地および分化促進培地を準備した。【００３６】
分化誘導培地
（組成：０．２５μＭ  ＤＥＸ、０．５ｍＭ  ＭＩＸ、１０μｇ／ｍＬインスリン／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）
ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ製）５００ｍＬに、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ製））を５５ｍＬ加え、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを調製した。これに、１ｍＭ  ＤＥＸ（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）含有ＤＭＳＯ（ナカライ製）を１３８．７５μＬ、および、１０ｍｇ／ｍＬインスリン含有ＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ製）を５５５μＬ加えた。なお、インスリン含有ＰＢＳは、予め、ＰＢＳに１Ｎ  ＨＣｌを加えて、インスリンが溶ける程度に酸性にした後、インスリンを溶解させた。使用する直前に、ＭＩＸ（３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）（ナカライ製）を０．５ｍＭとなるように、必要な量の前記培地に加えて、分化誘導培地を調製した。ＭＩＸは、非常に溶けにくいため、まず、少量の９９．５％エタノールに溶解させた後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに加えた。この際、分化誘導培地において、９９．５％エタノールの最終濃度が、１％を越えないようにした。
分化促進培地
（組成：５ｕｇ／ｍＬ  インスリン／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／オーラプテン）
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ５５５ｍＬに、前述の１０ｍｇ／ｍＬインスリン含有ＰＢＳを２７７．５μＬ加えた。この混合液に、さらに、各種濃度のオーラプテン（ＡＵＲ）を加えて、分化促進培地を調製した。なお、オーラプテンに代えてＤＭＳＯを添加した、オーラプテン無添加の分化促進培地を使用した培養細胞を、無処理対照（コントロール）とした。【００３７】
つぎに、凍結させた培養前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を解凍し、培地を入れた１００ｍｍディッシュにまき、３Ｔ３−Ｌ１が、約８０％コンフルエントに達するまで培養した。約８０％コンフルエントに達したディッシュ１枚分の３Ｔ３−Ｌ１を、６ウェルプレート１枚に継代した。そして、前記６ウェルプレートにおいて継代した３Ｔ３−Ｌ１が１００％コンフルエントに達するまでさらに培養した後、培地を分化誘導培地に交換して分化誘導させた。分化誘導培地に交換した４８時間後、続いて、分化促進培地に培地交換した。そして、以降２日おきに分化促進培地の培地交換を行った。分化誘導開始から８日後、培養細胞から、セパゾールＲＮＡＩ  ｓｕｐｅｒ（商品名、ナカライ製）を用いてｍＲＮＡを抽出した。そして、Ｌｉｇｈｔ／Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）を用いて、脂肪細胞分化初期の指標である３６Ｂ４およびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ｍＲＮＡ発現量の測定については、詳細を以下に示す。【００３８】
また、分化誘導開始から８日後の培地を、各ウェルから１ｍＬずつ採取し、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、商品名：ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｓｅｔ  Ｍｏｕｓｅ  ＭＣＰ−１）を用いて、前記キットのマニュアルに従い、培養上清中のＭＣＰ−１量（タンパク質量）を測定した。【００３９】
（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃ１ｅｒ（登録商標）によるｍＲＮＡの定量）
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出と定量
前述のように、前記６ウェルプレートから培地を除去し、各ウェルに１ｍＬずつセパゾールＲＮＡ  Ｉ  ｓｕｐｅｒ（ナカライ製）を加え、ピペッティングを数回繰り返すことによって細胞を分散させた。この細胞分散液を容量１．５ｍＬのチューブに移し、室温で５分間放置した。放置後、前記チューブにクロロホルム２００μＬを加え、Ｖｏｒｔｅｘでよく撹拌し、室温で３分間放置した。そして、前記チューブを４℃に冷却し、１２０００×ｇで１５分間遠心して、フェノール層（下層、黄色）と水層（上層、無色）とに分離させた。前記層間の界面を乱さないように注意しながら、前記水層のみを、容量１．５ｍｌの別のチューブに移した。この際、層と層との間に浮いているタンパク質が混入しないように注意した。前記チューブ内の分取した水層にイソプロパノール５００μＬを加えて混和し、室温で１０分間放置した。前記チューブを４℃に冷却し、１２０００×ｇで１０分間遠心し、上清約１ｍＬを除去した。回収した沈殿に７５％エタノールを１ｍＬ加えて撹拌し、沈殿を十分に懸濁した。そして、前記チューブを４℃に冷却し、１２０００×ｇで１０分間遠心して、上清を除去した。得られた沈殿（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を乾燥させた後、２０μＬの水（ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ）に溶かし、ＮａｎｏＤｒｏｐ（スクラム製）によりｍＲＮＡの濃度を測定した。【００４０】
逆転写反応
前述のように、濃度測定を行ったｍＲＮＡ溶液を、ｍＲＮＡ濃度が１μｇ／μＬになるように調整した。そして、８連チューブ（容量０．２ｍＬ）に、Ｏ１ｉｇｏ  ｄＴプライマー１μＬと前記ＲＮＡ溶液１０μＬとを添加した。このＲＮＡサンプル／プライマー混合液を、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて、７０℃で１０分間インキュベー卜することにより、ＲＮＡの高次構造を破壊し、氷上に移して１分以上放置した。ついで、前記ＲＮＡサンプル／プライマー混合液１１μＬ、５×逆転写緩衝液５μＬ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ５μＬ、および、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ２μＬを、順に加えた（合計２４μＬ）。【００４１】
前記混合液を、前記Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）において、４２℃で５分間プレインキュベ−卜した後、逆転写酵素を１μＬ添加し、チューブの内容物をピベッティングでよく混合した。これを、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて、４２℃で５０分間、さらに、７０℃で１５分間インキュベー卜した。インキュベート後、前記チューブを氷上で冷やし、軽く遠心して、前記チューブ内の反応液を、前記チューブの底に集め、−２０℃で凍結保存した。なお、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）測定に使用する際には、その度に、１０倍希釈して用いた。これを測定用ｃＤＮＡサンプルという。【００４２】
Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）測定
以下の操作は、全てクリーンベンチ内で行った。外部標準として、従来公知の方法により、発現量を測定する目的遺伝子（ＭＣＰ−１遺伝子または３６Ｂ４遺伝子）の断片が入ったプラスミドを準備した。このプラスミド溶液５μＬを容量０．６５ｍＬのチューブに入れ、さらに、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（商品名）に付属されている水４５μＬを添加して、前記プラスミドを１０倍に希釈した。この作業を繰り返し、プラスミドについて、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７および１０８倍の各希釈溶液を作製した。Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ａｄａｐｔｅｒ（商品名）に、ピンセットを用いて専用キャピラリーをセットし、前記キャピラリーに、前記「逆転写反応」で調製した混合液（合計２４μＬ）のうち１８μＬを分注した。そして、さらに、前記７種類のプラスミド希釈溶液２μＬと、前記１０倍希釈した測定用ｃＤＮＡサンプル２μＬとを、前記キャピラリーに添加し、ピンセットを用いて蓋をした。そして、前記キャピラリーを、５０００ｒｐｍ、４℃で１０秒間遠心した後、カルーセルに装填し、チャンバーにセットして、測定を行った。なお、ネガティブコントロールとして、前記測定用ｃＤＮＡサンプルに代えて水を使用し、同様に測定を行った。【００４３】
Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）の定量結果に基づいて、まず、各測定用ｃＤＮＡサンプルについて、３６Ｂ４のｍＲＮＡ発現量（Ａ）と、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量（Ｂ）との比（Ｂ／Ａ）を算出した。そして、オーラプテン無添加の無処理対照（コントロール）についての前記比（Ｂ／Ａ）を１００％として、各サンプルの相対値を算出した。その結果を、下記表１および図１のグラフに示す。下記表１および図１におけるオーラプテン濃度は、分化促進培地における最終濃度である（以下、同様）。図１において、ＡＵＲはオーラプテンを表し、Ｃｔｒｌは無処置対照（コントロール）を表す。また、同図において、横軸には、オーラプテン（ＡＵＲ）の各添加量（μＭ）を記載し、縦軸には、無処置対照（コントロール）に対するｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示す。【００４４】
また、ＥＬＩＳＡによるＭＣＰ−１の分泌量の測定値に対し、無処置対照（コントロール）の測定値を１００として算出した相対比を、下記表２および図２のグラフに示す。下記表２および図２におけるオーラプテン濃度は、分化促進培地における最終濃度である。図２において、ＡＵＲはオーラプテンを表し、Ｃｔｒｌは無処置対照（コントロール）を表す。また、同図において、横軸には、オーラプテン（ＡＵＲ）の各添加量（μＭ）を記載し、縦軸には、無処置対照（コントロール）に対する相対的なＭＣＰ−１のタンパク質量（分泌量）（％）を示す。【００４５】
【表１】
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【００４６】
【表２】
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【００４７】
前記表１および図１のグラフから明らかなように、オーラプテンを添加することにより、オーラプテン用量に依存的に、遺伝子レベルでＭＣＰ−１の発現を抑制できたことが分かる。また、前記表２および図２のグラフに示すように、オーラプテンを添加することにより、オーラプテン用量に依存的に、タンパク質レベルでＭＣＰ−１の発現を抑制できたことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
以上のように、本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤は、オーラプテンを含むことによって、安全性に優れ、長期間摂取しても問題なく、ＭＣＰ−１の発現を抑制できる。また、風味の問題もないため、例えば、食品等に適用しても、風味を損なうことがない。したがって、本発明のＭＣＰ−１の発現抑制剤は、例えば、医薬品、サプリメント、食品、飲料、食品添加剤等の様々なものに適用でき、その用途は制限されず広い。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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