【手続補正書】
【提出日】令和1年8月2日(2019.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体をコードする核酸であって、
リーダー配列をコードする配列を含む第１の核酸、
B細胞特異的細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子に特異的な抗体もしくはその結合断片またはscFvをコードする配列を含む第２の核酸、
非免疫原性細胞外スペーサーをコードする配列を含む第３の核酸、
膜貫通ドメインをコードする配列を含む第４の核酸、
4-1BBドメインおよび／またはCD3ζドメインを含むシグナル伝達ドメインをコードする配列を含む第５の核酸、
リンカーをコードする配列を含む第６の核酸、ならびに
マーカードメインをコードする配列を含む第７の核酸
を含み、
第２の核酸が第１の核酸の３’末端に共有結合によって結合しており、第３の核酸が第２の核酸の３’末端に共有結合によって結合しており、第４の核酸が第３の核酸の３’末端に共有結合によって結合しており、第５の核酸が第４の核酸の３’末端に共有結合によって結合しており、第６の核酸が第５の核酸の３’末端に共有結合によって結合しており、第７の核酸が第６の核酸の３’末端に共有結合によって結合していること、
第１の核酸が、薬物によって誘導可能な第１のプロモーターをコードする配列を含むこと、および
前記リーダー配列の５’末端領域が第１のプロモーターであること
を特徴とする核酸。
【請求項２】
前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、B細胞特異的細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子に特異的であり、
前記B細胞特異的細胞表面分子が、CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 R α、CD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40（TNFRSF5）、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54（ICAM-1）、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B細胞受容体（BCR）、IgM、IgD、B220/CD45R、C1q R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148またはEMMPRIN/CD147などであり、
前記腫瘍特異的細胞表面分子が、EGFR、HER2、メソテリン、癌精巣抗原、L1CAM、O-アセチル化GD2、GD2、ネオアンチゲン、Var2、グリピカン−２（GPC2）、HPV抗原、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、rasもしくはp53の異常生成物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、アディポフィリン、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン−３、G250、HLA-DOB、ヘプシン、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α−フェトプロテイン、カリクレイン４、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、ミッドカイン、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、サバイビン、テロメラーゼ、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1またはROR1などのがん抗原などであり、
該がん抗原が、好ましくはL1CAMおよびROR1から選択される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項３】
第２の核酸が、B細胞特異的細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子に特異的な抗体もしくはその結合断片またはscFvをコードする配列と、B細胞特異的細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子に特異的な抗体もしくはその結合断片またはscFvをコードする配列とを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項４】
前記リンカーが、リボソームスキップ配列および／またはIRES配列であり、該リボソームスキップ配列が、P2A配列、T2A配列、E2A配列またはF2A配列などであり、好ましくはT2A配列であり、より好ましくは配列番号３３に示すアミノ酸配列をコードするT2A配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
第１のプロモーターが、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物などの薬物によって誘導可能である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムなどの自殺遺伝子システムをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７】
前記スペーサーが、IgG4ヒンジスペーサー、および配列番号１、配列番号３または配列番号３９に示すアミノ酸配列を含むスペーサーから選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
前記CD28ζドメインが、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、配列番号６に示す核酸配列によってコードされる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
前記4-1BBドメインが、配列番号７に示すアミノ酸配列を含み、配列番号８に示す核酸配列によってコードされる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記CD3ζドメインが、配列番号９に示すアミノ酸配列を含み、配列番号１０に示す核酸配列によってコードされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１】
前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、CD19、CD20、L1CAM、ROR1、EGFR 806、Her2、GD2、EphA2（2H4）およびEphA2（4H5）から選択される抗原に特異的であり、CD19に特異的な前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、好ましくは配列番号１１に示すアミノ配列を含み、CD20に特異的な前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、好ましくは配列番号１３に示すアミノ配列を含み、前記L1CAMが好ましくはL1CAM上のCE7エピトープであり、より好ましくは、L1CAMに特異的な前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含み、ROR1に特異的な前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、好ましくは配列番号１７に示すアミノ酸配列を含み、EGFR 806に特異的な前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、好ましくは配列番号１９に示すアミノ酸配列を含み、Her2に特異的な前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、好ましくは配列番号２１に示すアミノ酸配列を含み、GD2に特異的な前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、好ましくは配列番号２３に示すアミノ酸配列を含み、EphA2（2H4）に特異的な前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、好ましくは配列番号２５に示すアミノ酸配列を含み、EphA2（4H5）に特異的な前記抗体もしくはその結合断片またはscFvが、好ましくは配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２】
前記リーダー配列が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のシグナル配列から選択される配列を含み、該顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のシグナル配列が、好ましくは配列番号２９に示すアミノ酸配列または配列番号３１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１３】
前記マーカードメインが、Her2tGドメインおよびEGFRtドメインから選択されるドメインを含み、該Her2tGが、好ましくは配列番号３５に示すアミノ酸配列を含み、該EGFRtが、好ましくは配列番号３７に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸を含む、キメラ抗原受容体を発現させるためのベクターであって、該ベクターが、ウイルスベクター、トランスポゾンベクター、インテグラーゼベクターシステムおよびmRNAベクターから選択され、該ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクターおよびフォーミーウイルスベクターから選択されるウイルスベクターなどである、ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸または請求項１４に記載のベクターによってコードされるキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
少なくとも１種のキメラ抗原受容体を含む細胞であって、
該少なくとも１種のキメラ抗原受容体が、
B細胞上のリガンドに特異的であり、かつインビボにおけるエフェクター細胞の増殖および活性化を促進する第１のキメラ抗原受容体と、腫瘍上のリガンドに特異的である第２のキメラ抗原受容体またはTcRとの組み合わせ；ならびに
B細胞上のリガンドに特異的であり、かつインビボにおけるB細胞の増殖および活性化を促進する第１の結合ドメインと、腫瘍上のリガンドに特異的である第２の結合ドメインからなる２つの結合ドメインを含む二重特異性キメラ抗原受容体
から選択されることを特徴とする細胞。
【請求項１７】
B細胞上の前記リガンドが、CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 R α、CD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40（TNFRSF5）、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54（ICAM-1）、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B細胞受容体（BCR）、IgM、IgD、B220/CD45R、C1q R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148またはEMMPRIN/CD147であり、腫瘍上の前記リガンドが、EGFR、HER2、メソテリン、癌精巣抗原、L1CAM、O-アセチル化GD2、GD2、ネオアンチゲン、Var2、グリピカン−２（GPC2）、HPV抗原、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、rasもしくはp53の異常生成物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、アディポフィリン、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン−３、G250、HLA-DOB、ヘプシン、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、腸カルボキシルエステラーゼ、α−フェトプロテイン、カリクレイン４、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、ミッドカイン、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、サバイビン、テロメラーゼ、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1またはROR1などのがん抗原であり、該がん抗原が、好ましくはL1CAMおよびROR1から選択される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のキメラ抗原受容体が前記細胞において誘導発現されており、該少なくとも１種のキメラ抗原受容体が、抗体もしくはその結合断片またはscFv、受容体のリガンドもしくはその変異体、ペプチド、および／またはポリペプチド性親和性分子もしくはポリペプチド性結合パートナーを含み、前記少なくとも１種のキメラ抗原受容体がマーカータンパク質と共発現されており、該マーカータンパク質が好ましくはEGFRtまたはHer2tgである、請求項１６または１７に記載の細胞。
【請求項１９】
自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含み、該自殺遺伝子システムが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムなどであり、前記細胞が、恒常性サイトカインなどの治療用可溶性タンパク質を発現し、該恒常性サイトカインがIL2、IL7、IL12またはIL15である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、細胞傷害性CD8+Tリンパ球およびCD4+Tヘルパーリンパ球から選択され、該細胞傷害性CD8+Tリンパ球が、ナイーブCD8+T細胞、CD8+メモリーT細胞、セントラルメモリーCD8+T細胞、制御性CD8+T細胞、IPS細胞由来のCD8+T細胞、エフェクターメモリーCD8+T細胞およびバルクCD8+T細胞からなる群から選択され、該CD4+Tヘルパーリンパ球が、ナイーブCD4+T細胞、CD4+メモリーT細胞、セントラルメモリーCD4+T細胞、制御性CD4+T細胞、IPS細胞由来のCD4+T細胞、エフェクターメモリーCD4+T細胞およびバルクCD4+T細胞からなる群から選択され、B細胞上の前記リガンドがCD19であり、前記少なくとも１種のキメラ抗原受容体がL1CAMまたはROR1に特異的であり、前記キメラ抗原受容体が、4-1BBおよびCD3ζからなるシグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２１】
少なくとも１種のキメラ抗原受容体を有する細胞を製造する方法であって、
B細胞上のリガンドに特異的であり、かつインビボにおけるB細胞の増殖および活性化を促進する結合ドメインを含む第１のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、固形腫瘍上のリガンドに特異的な結合ドメインを含む第２のキメラ抗原受容体またはTcRをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸；または
B細胞上のリガンドに特異的であり、かつインビボにおけるB細胞の増殖および活性化を促進する第１の結合ドメインと、固形腫瘍上のリガンドに特異的な第２の結合ドメインとを含む二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む第３の核酸
を細胞に導入すること；
前記細胞を増殖させること；ならびに
前記細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項２２】
第１の核酸、第２の核酸または第３の核酸が、ベクターに含まれており、該ベクターが、ウイルスベクター、プラスミドおよび／またはミニサークルトランスポゾン、トランスポゾン、インテグラーゼベクターシステムならびにmRNAベクターから選択され、前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターおよび／またはレンチウイルスベクターなどであり、第１の核酸および第２の核酸または第３の核酸が、好ましくは第１の逆方向末端反復遺伝子配列と第２の逆方向末端反復遺伝子配列との間に位置し、前記逆方向末端反復遺伝子配列が、Sleeping Beautyトランスポゾンの逆方向反復配列またはPiggyBacトランスポゾンの逆方向反復配列である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種のキメラ抗原受容体が発現することによってEGFRtまたはHer2tgの共発現が誘導される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
可溶性タンパク質をコードする配列を含むベクターを前記細胞に導入することをさらに含み、該可溶性タンパク質が、IL2、IL7、IL12またはIL15などの恒常性サイトカインである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスベクターが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムなどの自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
対象におけるB細胞に関連しない疾患の治療に使用するための、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の細胞の集団または請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法によって製造された細胞であって、
前記疾患が、感染症およびがんから選択され、該感染症が細菌性感染症またはウイルス性感染症などであり、該がんが、好ましくは、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌などの固形腫瘍であり、好ましくは不応性再発神経芽腫であり、前記対象が、哺乳動物、好ましくはヒト、より好ましくは２５歳未満のヒトである、細胞集団または細胞。
【請求項２７】
CD4+Tヘルパーリンパ球とCD8+Tリンパ球を１：１０〜１０：１、好ましくは１：１の比率で含む、請求項２６に記載の細胞集団または細胞。
【請求項２８】
化学療法剤、抗ウイルス剤もしくは抗菌剤などのさらなる治療剤、もしくは放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法；タモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物などの、キメラ抗原受容体の発現を誘導する薬物；またはアービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506もしくは二量体化誘導化学物質などのプロドラッグと組み合わせる、請求項２６または２７に記載の細胞集団または細胞。
【請求項２９】
養子細胞移入によって前記対象に投与される、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の細胞集団または細胞。