(57)【要約】【課題】骨の正常な代謝を維持・賦活化することのできる、骨代謝改善剤，骨・関節疾患の予防又は治療剤，Cthrc1を用いた骨・関節疾患診断キット，骨・関節疾患診断方法，Cthrc1を用いた骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング用キット，スクリーニング方法，骨・関節疾患の予防又は治療方法を提供すること。【解決手段】Cthrc1，Cthrc1類縁化合物又はこれらをコードする遺伝子，そのmRNA，Cthrc1に対する抗体，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする、骨代謝改善剤及び、これよりなる骨・関節疾患予防又は治療剤である。【選択図】なし
2007123010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Cthrc1，Cthrc1類縁化合物，又はこれらをコードする遺伝子，そのmRNA，Cthrc1に対する抗体，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする、骨代謝改善剤。
【請求項２】
Cthrc1，Cthrc1類縁化合物，又はこれらをコードする遺伝子，そのmRNA，Cthrc1に対する抗体，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする、骨・関節疾患の予防又は治療剤。
【請求項３】
下記(1)又は(2)を含むことを特徴とする、骨・関節疾患診断キット。
(1)Cthrc1に対する抗体
(2)Cthrc1をコードする遺伝子のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチド
【請求項４】
生体から採取した検体中の、Cthrc1あるいはそのmRNAを指標とすることを特徴とする、骨・関節疾患の診断方法。
【請求項５】
破骨細胞，Cthrc1，Cthrc1をコードする遺伝子，又はそのmRNAからなる群から選択される少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする、骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング用キット。
【請求項６】
Cthrc1，Cthrc1をコードする遺伝子，又はそのmRNAを指標とすることを特徴とする、骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
Cthrc1，Cthrc1類縁化合物，又はこれらをコードする遺伝子，又はそのmRNA，Cthrc1に対する抗体，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つ以上を用いることを特徴とする、骨・関節疾患の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨代謝改善剤，骨・関節疾患の予防又は治療剤，骨・関節疾患診断キット，骨・関節疾患の診断方法，骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング用キット，骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング方法，或いは骨・関節疾患の予防又は治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症，癌に合併する骨・カルシウム代謝異常，関節リウマチ，パジェット病等の骨・関節疾患は、高齢化社会において大きな問題となってきているが、これら疾病には、破骨細胞や骨芽細胞等からなる骨代謝異常が関与していると考えられている。【０００３】
例えば骨粗鬆症は、いきすぎた骨吸収と、相対的に追いつかない骨形成との間のアンバランスによって起こる。
これまで骨粗鬆症の治療には、破骨細胞の抑制剤が用いられてきた。即ち、現行の治療は、大部分、ビスフォスフォネート薬による骨吸収の抑制が中心である。
ビスフォスフォネート薬は、骨の石灰化（２次石灰化）過程を遷延させることで、骨密度の維持には有効である。
しかし、骨代謝は、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞（造骨細胞）による骨形成を繰り返す代謝回転の維持によって成立している。
従って、破骨細胞の働きを抑制することは、一時的な治療にはなっても、結果的に、吸収に引き続く骨形成も抑制され、骨の代謝回転が止まってしまうために、長期間の投与による骨質の悪化、骨強度の低下が懸念されている。【０００４】
骨吸収の抑制とは別のアプローチとして、骨形成を促進する薬物である副甲状腺ホルモン（PTH）の皮下への自己注射が、一昨年米国で認可され、有用性も証明されている。しかし、これはきわめて高価であり、重症の患者でかつ２年以内の投与に限定されている。しかもわが国では、市販されていない。【０００５】
また、期待されていたビスフォスフォネート薬とPTH注射の併用，つまり骨吸収防止と骨形成促進の両方を用いる治療は、臨床試験の結果、併用投与により互いの薬理効果が打ち消されることが明らかになった（非特許文献１）。すなわち、骨形成を促進するためには、先行する骨吸収が必須であり、ビスフォスフォネート薬によって吸収を抑制してしまうと、PTHを注射しても骨形成を促進することはできないということが判明した。【０００６】
一方、吸収過程と形成を結びつける共役現象（カップリング）の存在が、以前より概念的にも生理的にも知られていたが、これを担う共役因子（カップリング因子）の本体は未知であった。【０００７】
我々は、このカップリング因子が、骨粗鬆症に代表される骨・関節疾患の診断や予防、治療に有効であるとの考えのもと、破骨細胞が正常に機能している状況下、破骨細胞から分泌されている物質の中から、骨芽細胞の働きを促進する物質を鋭意探索した結果、Cthrc1を見出した。【０００８】
これは、破骨細胞と骨芽細胞間の連携反応を骨・関節疾患の診断や治療に応用しようとする新しい試みであり、これら細胞の各々単独を標的としてきた従来の考え方とは全く異なる治療アプローチである。
カップリング因子、あるいは、その産生あるいは機能を高めるような物質は、生理的な骨代謝の営みを賦活化することで、良質の骨を維持することが期待される。
また、ビスフォスフォネート薬によって破骨細胞が不活化されている場合にも、破骨細胞におけるCthrc1の発現が低下していることが本件発明者等によって明らかとなった（試験例４参照）。従って、カップリング因子の併用により、骨吸収の抑制下でも、骨形成を高い状態に維持することも可能となる。【０００９】
また逆に、過剰な骨代謝に起因する疾病を予防又は治療する場合には、このカップリング因子を阻害することが有効であると考えられる。【００１０】
このCthrc1は、主に血管平滑筋，肺，脳で発現している公知のタンパク質であるが、骨組織中でも発現しており、骨の成長に何らかの形で関与していることが、例えば下記特許文献１に示されている。
【特許文献１】US2005/0147602A1（2005.7.7）
【非特許文献１】N Engl J Med 349:1207-15, 2003
【００１１】
しかし、上記特許文献１においては、Cthrc1の過剰発現が骨の形成を阻害し、骨強度，骨密度を減少させるとの立場をとっており、骨粗鬆症の治療における、Cthrc1に対する抗体等のCthrc1阻害剤適用の可能性を示唆するものである（［０７０５］等参照）。
これは、Cthrc1が破骨細胞から発生するにも拘わらず、骨芽細胞に作用し、骨形成に寄与する、「カップリング因子」として機能すると言う本発明の知見とは、むしろ逆の理論であり、本件を示唆するものでは無い。
本発明者等の知見によれば、Cthrc1は骨吸収から形成へのカップリングを促進することで、骨の再生を促し破壊や脆弱性を防止する方向に働くことを示唆し、また、Cthrc1の過剰発現によって、破骨細胞への分化は抑制され、骨の吸収はむしろ阻害される方向に働くことも明らかとなっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明者等は、上記特許文献１とは全く異なるアプローチから鋭意研究を行った結果、骨に接着して吸収を行っている最中の活性型破骨細胞がCthrc1を強く発現しており、このCthrc1が、骨芽細胞の分化を促進することにより骨形成に対して促進的に働いていることを初めて見出し、本発明に到達したものであって、その目的とするところは、骨の正常な代謝を維持・賦活化することのできる、骨代謝改善剤，骨・関節疾患の予防又は治療剤，Cthrc1を用いた骨・関節疾患診断キット，骨・関節疾患診断方法，Cthrc1を用いた骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング用キット，スクリーニング方法，骨・関節疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述の目的は、下記の発明によって達成される。【００１４】
（第一の発明）
Cthrc1，Cthrc1類縁化合物，又はこれらをコードする遺伝子，そのmRNA，Cthrc1に対する抗体，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする、骨代謝改善剤。【００１５】
（第二の発明）
Cthrc1，Cthrc1類縁化合物，又はこれらをコードする遺伝子，そのmRNA，Cthrc1に対する抗体，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする、骨・関節疾患の予防又は治療剤。【００１６】
（第三の発明）
下記(1)又は(2)を含むことを特徴とする、骨・関節疾患診断キット。
(1)Cthrc1に対する抗体
(2)Cthrc1をコードする遺伝子のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチド【００１７】
（第四の発明）
生体から採取した検体中の、Cthrc1あるいはそのmRNAを指標とすることを特徴とする、骨・関節疾患の診断方法。【００１８】
（第五の発明）
破骨細胞，Cthrc1，Cthrc1をコードする遺伝子，又はそのmRNAからなる群から選択される少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする、骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング用キット。【００１９】
（第六の発明）
Cthrc1，Cthrc1をコードする遺伝子，又はそのmRNAを指標とすることを特徴とする、骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング方法。【００２０】
（第七の発明）
Cthrc1，Cthrc1類縁化合物，又はこれらをコードする遺伝子，又はそのmRNA，Cthrc1に対する抗体，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つ以上を用いることを特徴とする、骨・関節疾患の予防又は治療方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、骨吸収から骨形成へのカップリングを促進することで、骨の生理的な再生を促し、骨の正常な代謝を維持・賦活化することのできる、骨代謝改善剤，骨・関節疾患の予防又は治療剤，Cthrc1を用いた骨・関節疾患診断キット，骨・関節疾患診断方法，Cthrc1を用いた骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング用キット，スクリーニング方法，骨・関節疾患の予防又は治療方法を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。【００２３】
〈本発明の骨代謝改善剤，骨・関節疾患の予防又は治療剤，及び骨・関節疾患の予防又は治療方法〉
本発明の骨代謝改善剤，及び骨・関節疾患の予防又は治療剤には、Cthrc1の増加を促し、骨代謝を促進するもの（Cthrc1，Cthrc1類縁化合物，又はこれらをコードする遺伝子，そのmRNA，等）と、Cthrc1を抑制し過剰な骨代謝を抑制するもの（Cthrc1に対する抗体，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチド等）がある。【００２４】
本発明において用いられるCthrc1（collagen triple helix repeat containing 1）は公知の蛋白質であり、US2005/0147602A1（2005.7.7）等にも記載されている。ヒトのCthrc1の配列は、配列番号１で示され、ヒトのCthrc1をコードする遺伝子配列は、配列番号２で示される（Accession No. NM_138455等参照）。また、マウスのCthrc1は、配列番号３，マウスのCthrc1をコードする遺伝子配列は、配列番号４で示される（Accession No.AK_003674等参照）。但し、ヒトの予防又は治療の際には、ヒトのCthrc1やCthrc1をコードする遺伝子等を用いることが、副作用が起こる可能性が少ない等の点で好ましい。【００２５】
図５は、マウス(m)とヒト(h)のCthrc1アミノ酸配列を比較したものである。矢印は分泌時に分解を受ける場所で、それよりＮ末端側は、疎水性のシグナル配列を示す。シグナル配列とは、タンパク質の局在化に関与する配列である。この疎水性シグナル配列が分離した後の残りの配列が、成熟型Cthrc1として機能する。
従って、本発明においてCthrc1と言う用語には、成熟型Cthrc1も含まれるものであり、本発明の骨代謝改善剤，骨・関節疾患の予防又は治療剤として用いられるCthrc1としても、成熟型のCthrc1が含まれる。【００２６】
尚、図５において、四角で囲った箇所は成熟型（矢印からＣ末端まで）のなかでマウスとヒトでアミノ酸が異なる箇所を示す。下線はコラーゲン領域を示し、その中の点線部分（GEKGEC）は、糖鎖の修飾を受けると予想される領域を示す。逆三角印は、システイン残基を示す。全体では93.9％，成熟型では97.7％の相同性を示す。【００２７】
本発明において用いられるCthrc1類縁化合物としては、Cthrc1のアミノ酸配列の一部が置換・欠失・付加・挿入等されたタンパク質であって、Cthrc1と同様の活性（骨芽細胞に作用し、その分化もしくは増殖機能を高めることで骨形成を促進する機能）を有するCthrc1改変タンパク質のほか、Cthrc1やCthrc1改変タンパク質の薬学的に許容される塩（有機酸塩，無機酸塩，金属塩等）や、そのエーテル体，エステル体等が挙げられる。
アミノ酸配列の置換・欠失・付加・挿入等が可能な位置としては、例えば、シグナル配列領域が考えられる。シグナル配列では、ヒトとマウスとで１０箇所異なっているにも拘わらず、共にCthrc1として機能しているからである。また、成熟型Cthrc1のアミノ酸配列において、ヒトのCthrc1とマウスのCthrc1とで配列の異なる箇所も、同様の理由で、置換・欠失・付加・挿入等が可能と考えられる。更には、コラーゲン領域は、Cthrc1タンパク質においても、重要な役割を担っている可能性があるため、置換・欠失・付加・挿入等には、その領域を除くアミノ酸配列領域等が、より適していると考えられるが、コラーゲン領域の改変体を除くものでは無い。
また、置換・欠失・付加・挿入等の数は、１又は複数個が考えられるが、１又は数個以内であることが、Cthrc1と同様の機能を発揮する可能性が高い点で好ましい。
さらに、置換においては、１つ以上のアミノ酸残基を、該アミノ酸と化学的性状または構造的に類似のアミノ酸と置換することがCthrc1の機能を発揮する可能性が高い点で好ましい。このような化学的性状または構造的に類似したアミノ酸の置換、すなわち保存性の高いアミノ酸の置換の具体的な態様は、当業者によって広く知られている。たとえば、グリシン（Gly）はプロリン（Pro）、アラニン（Ala）およびバリン（Val）と、ロイシン（Leu）はイソロイシン（Ile）と、グルタミン酸（Glu）はグルタミン（Gln）と、アスパラギン酸（Asp）はアスパラギン（Asn）と、システイン（Cys）はスレオニン（Thr）と、Thrはセリン（Ser）およびAlaと、リジン（Lys）はアルギニン（Arg）と、化学的性状または構造が類似するものとして例示できるが、必ずしもこれに限定されるものではない。【００２８】
これらのCthrc1やCthrc1類縁化合物は、Cthrc1の不足等に起因する骨代謝異常（骨形成阻害）の改善剤や、骨代謝異常（骨形成阻害）が関与する骨・関節疾患の予防又は治療剤として用いることができる。【００２９】
本発明において用いられるCthrc1に対する抗体としては、モノクロナール，ポリクロナール，もしくはキメラ抗体やヒト化抗体のいずれであっても良い。具体的には、例えばウサギに抗原分子としてCthrc1を免疫し、そのウサギから得た血清から取得することができる、ポリクローナル抗体の一種である抗Cthrc1抗体等が挙げられるが、ヒトの疾病を予防又は治療するためには、ヒト由来のCthrc1抗原を免疫した抗体を使って、キメラ抗体やヒト化抗体にしたものが好ましい。また、Cthrc1そのものに対する抗体の他、Cthrc1が分解されたサブユニットや、二量体等の多量体に対する抗体も含まれる。サブユニットとしては、例えば特許文献１に、配列番号１１や１３で挙げられたようなものが例示される。【００３０】
これらのCthrc1に対する抗体は、Cthrc1過剰の場合の代謝改善剤や、Cthrc1過剰に起因する骨・関節疾患の予防又は治療剤として用いることができる。【００３１】
本発明において用いられるCthrc1又はCthrc1類縁化合物をコードする遺伝子とは、Cthrc1やCthrc1改変タンパク質をコードする遺伝子である。
尚、本発明において遺伝子と言う場合には、DNAの他、mRNAから逆転写酵素を用いて作製したcDNAも含むものとする。
これらの遺伝子やそのmRNAを、本発明の薬剤として投与した場合、生体内においてCthrc1或いはCthrc1類縁化合物が産生され、これらがCthrc1の不足等に起因する骨代謝異常（骨形成阻害）の改善剤や、骨代謝異常（骨形成阻害）が関与する骨・関節疾患の予防又は治療剤として機能する。【００３２】
またCthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドとしては、Cthrc1の発現が抑制できる程度までCthrc1のDNAやmRNAと相補対を形成できるポリヌクレオチドを意味し、具体的には下記のようなものが挙げられる。【００３３】
例えば、Cthrc1をコードする遺伝子（DNA，cDNA）又はそのmRNAの全長又はその一部と、相補対を形成し得るポリヌクレオチドが、いわゆるアンチセンス薬として使用可能であるが、その場合、ヌクレオチドの約７０％以上がターゲットとなるCthrc1をコードする遺伝子等の全長又はその一部と同一であるポリヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上，特に好ましくは９５％以上であるが、確実にCthrc1の発現を阻害するためには、置換塩基数が１乃至数個であることが理想的である。【００３４】
また、Cthrc1のmRNAの一部と相補対を形成し得る１５〜３０塩基のRNAが、いわゆるRNA干渉薬（RNAi薬）として使用可能である。１５塩基程度であれば、完全に相補的であることが好ましいが、３０塩基程度であれば、７０％以上が相補的であれば使用可能であり、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である。【００３５】
これらのターゲットと相補対を形成し得るポリヌクレオチドは、Cthrc1過剰の場合の代謝改善剤や、Cthrc1過剰に起因する骨・関節疾患の予防又は治療剤として用いることができる。【００３６】
尚、本発明において、遺伝子やポリヌクレオチドと言う時は、アデニン（A），グアニン（G）等のプリン塩基や、チミン（T），ウラシル（U），シトシン（C）等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むものであり、一本鎖又は二本鎖のDNA，一本鎖又はヘアピン構造を含む二本鎖のRNA，一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体，RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体をも含むものである。【００３７】
Cthrc1又はCthrc1類縁化合物をコードする遺伝子，或いはCthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドを、骨代謝改善剤や骨・関節疾患予防又は治療剤として用いる場合の遺伝子形態としては、DNAの他、RNA，プラスミド，ウイルスベクター等が使用可能であり、一本鎖であっても二本鎖であっても良い。【００３８】
本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患の予防又は治療剤を投与することで、骨質を改善，又は骨・関節疾患を予防又は治療することができる。【００３９】
骨代謝改善とは、Cthrc1又はCthrc1類縁化合物，これらをコードする遺伝子，又はそのmRNAが奏する、下記（i）の機能を通じて，或いはCthrc1に対する抗体，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドが奏する（ii）の機能を通じて、（i）骨吸収と骨形成からなる骨の代謝を、正常なレベルまで回復（増加），維持，又は賦活化すること，或いは逆に（ii）亢進し過ぎた骨代謝を抑制し、正常なレベルまで戻すことを意味する。【００４０】
（i）破骨細胞から分泌されたあと骨芽細胞に作用し、その分化もしくは増殖機能を高めることで骨形成を促進する機能
（ii）骨代謝回転が異常に高まった病態において、破骨細胞への分化や、破骨細胞から骨芽細胞へのカップリング機能を抑制する機能【００４１】
本発明の予防・治療対象である骨・関節疾患としては、骨粗鬆症，パジェット病，癌に合併する骨・カルシウム代謝異常，関節リウマチ等が挙げられる。【００４２】
骨粗鬆症とは、過剰な骨吸収により、骨形成が追いつかないことによって起こる疾病である。【００４３】
癌に合併する骨・カルシウム代謝異常では、破骨細胞の骨吸収によって、(1)骨中の細胞増殖因子が放出され、癌細胞を増殖させてしまうこと、及び(2)骨の破壊によって癌細胞が骨に定着するためのスペースをつくりだしてしまうこと等が原因で起こると考えられている。また、多くの場合、骨芽細胞による骨形成が抑制されている。【００４４】
また、関節リウマチでは、TNFα等の作用で、破骨細胞による骨吸収が関節内で起こり、軟骨や骨の破壊をもたらす。関節リウマチにおいても、骨芽細胞による骨形成が抑制されている場合が多い。【００４５】
パジェット病（Paget disease of bone）とは、骨の代謝が亢進している病気で（J Clin Invest 115:200-208, 2005）あるため、この疾病においても、Cthrc1作用の過剰によってもたらされている可能性があり、Cthrc1に対する抗体や、Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチド等を有効成分とする本願発明の予防又は治療剤が有効であると考えられる。【００４６】
本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患予防又は治療剤は、他の骨代謝改善剤や骨・関節疾患予防又は治療剤と併用することができる。具体的には、骨粗鬆症の予防又は治療薬として用いられるビスフォスフォネート薬，ホルモン補充療法に用いるエストロゲン薬等，ラロキシフェンに代表されるSERM（Selective Estrogen Receptor Modulator: 選択的エスロトゲン受容体修飾薬），現在治験中のヒト型RANKL（Receptor Activator of NF-κB Ligand）抗体などの骨吸収抑制薬等が挙げられる。【００４７】
また、本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患の予防又は治療剤には、その改善効果や予防又は治療効果を阻害しない範囲で、他の成分を含有させることができ、例えば薬学的に許容される担体として、賦形剤，滑沢剤，結合剤，崩壊剤，安定剤，矯味矯臭剤，希釈剤，界面活性剤，乳化剤，可溶化剤，吸収促進剤，保湿剤，吸着剤，充填剤，増量剤，付湿剤，防腐剤等の添加剤を用いて周知の方法で製剤化することができる。
ここに、賦形剤としては、有機系賦形剤及び無機系賦形剤等が挙げられる。【００４８】
本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患予防又は治療剤がCthrc1，その類縁化合物，又はCthrc1に対する抗体の場合には、投与経路としては、経口投与，静注等の静脈投与，筋肉内投与，経皮投与，経鼻投与，皮内投与，皮下投与，腹腔内投与，直腸内投与，粘膜投与，吸入，関節腔内投与，骨内への投与等が挙げられるが、静注等の静脈投与が安全かつ血中濃度を一定に保つという点で好ましい。【００４９】
本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患予防又は治療剤がCthrc1又はその類縁化合物をコードする遺伝子，そのmRNA ，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドの場合には、下記の様にして投与することができる。【００５０】
プラスミドを用いる場合、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（DNAワクチン法），リポソーム法，リポフェクチン法，マイクロインジェクション法，リン酸カルシウム法，エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法，リポソーム法が好ましい。【００５１】
ウイルスベクターを用いる場合、（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁，月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４），実験医学増刊，１２（１５），（１９９４），およびこれらの引用文献等）等に記載されているように、ウイルスに、目的とする遺伝子を組み込むことによって行うことができる。
ウイルスベクターに用いるウイルスとしては、例えばレトロウイルス，アデノウイルス，アデノ関連ウイルス，ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，ポックスウイルス，ポリオウイルス，シンビスウイルス等のDNAウイルス又はRNAウイルスが挙げられる。
ウイルスの中では、レトロウイルス，アデノウイルス，アデノ関連ウイルス，ワクシニアウイルス等が好ましく、特にアデノウイルスが好ましい。【００５２】
遺伝子を実際に医薬として作用させるには、当該遺伝子を直接体内に導入する「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」の他、ヒトかから採集した細胞に当該遺伝子を導入し、その後、遺伝子導入細胞を体内に戻すという、「ｅｘ  ｖｉｖｏ法」等がある［日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁，月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４），実験医学増刊，１２（１５），（１９９４），およびこれらの引用文献等］が、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」法は費用や手間が少なく、簡便である点で好ましく、「ｅｘ  ｖｉｖｏ法」は、遺伝子の細胞内への導入効率が良いという点で好ましい。【００５３】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択することができる。投与経路としては、例えば、静脈，動脈，皮下，皮内，筋肉内，骨内等が挙げられる。【００５４】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」によって投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとることができる。一般的には遺伝子を含有する注射剤等の形態が好ましく、必要に応じて、注射剤等に常用されている各種の成分等を加えることもできる。【００５５】
また、骨の再生医療（細胞と担体を骨に移植する場合など）において、Cthrc1又はその類縁化合物等を、担体（ハイドロキシアパタイトやポリマーなど）に浸潤させて用いる方法もある。【００５６】
また、遺伝子を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤，凍結剤，遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態として用いることができる。【００５７】
本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患予防又は治療剤の剤形は、例えば錠剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，丸剤，トローチ，もしくはシロップ剤，注射剤等の形態が挙げられる。注射剤には、リポソーム製剤等が含まれる。【００５８】
本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患の予防又は治療剤中の、有効成分の含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、投与量との関係で適宜選択すれば良い。【００５９】
例えば本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患の予防又は治療剤が、Cthrc1，Cthrc1類縁化合物，或いはCthrc1に対する抗体を含む液剤の場合、０．０００１〜１０（ｗ／ｖ％），好ましくは０．００１〜５（ｗ／ｖ％），特に注射剤の場合、０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％），好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％），固形剤の場合、０．０１〜５０（ｗ／ｗ％），好ましくは０．０２〜２０（ｗ／ｗ％）等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものでは無い。【００６０】
また、本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患の予防又は治療剤が、Cthrc1，Cthrc1類縁化合物をコードする遺伝子，そのmRNA，Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドの場合、例えば０．０００１〜５０（ｗ／ｗ％）等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものでは無い。【００６１】
本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患の予防又は治療剤の投与量は、疾患の種類，投与経路，症状，年齢，体重，予防又は治療剤の形態等によって異なるが、例えば、骨代謝改善剤や骨・関節疾患の予防又は治療剤が、Cthrc1，Cthrc1類縁化合物，或いはCthrc1に対する抗体の場合は、治療剤中の有効成分の量が、処置を必要としている対象体重１ｋｇ当たり０．００５〜５００ｍｇ，好ましくは、０．１〜１００ｍｇ，但し、成人に対して１日あたり、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ），上限として、２０ｇ（好ましくは２０００ｍｇ，より好ましくは５００ｍｇ，更に好ましくは１００ｍｇ）となるように、１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。【００６２】
また、本発明の骨代謝改善剤や骨・関節疾患の予防又は治療剤が、Cthrc1，Cthrc1類縁化合物をコードする遺伝子，そのmRNA，或いはCthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチドの場合、疾患の種類，投与経路，症状，年齢，体重，投与形態等によって異なるが、例えば遺伝子やポリヌクレオチドの量として、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ，好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇを、数日乃至数ヶ月に一度投与することが好ましい。【００６３】
〈本発明のCthrc1を用いた骨・関節疾患診断キット〉
本発明の骨・関節疾患診断キットは、下記(1)又は(2)を含むことを特徴とする。
(1)Cthrc1に対する抗体
(2)Cthrc1をコードする遺伝子のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチド【００６４】
(1)には、抗体の他、一般にウェスタンブロッティングや、後述する本発明の診断方法において記載するELISA等に用いられる試薬が含まれる。
例えば、Cthrc1に対する一次抗体，二次抗体，西洋わさびパーオキシダーゼ（HRP），アルカリフォスファターゼ（AP），等の二次抗体用の標識，あるいは予め標識化した二次抗体，標識が作用する基質，Tween20等の緩衝剤，牛血清アルブミン(BSA)等の、非特異的吸着を防止するためのブロッキング剤等があり、適宜選択することができる。
使用に際しては、これらに加えてアクリルアミドゲル，ニトロセルロース膜等が用いられ、これらを併せてキットとすることもできる。【００６５】
(1)の、Cthrc1に対する抗体としては、Cthrc1そのものに対する抗体の他、Cthrc1が分解されたサブユニットや、二量体等の多量体に対する抗体も含まれる。サブユニットとしては、例えば特許文献１に、配列番号１１や１３で挙げられたようなものが例示される。【００６６】
(2)の「Cthrc1をコードする遺伝子のmRNAと相補対を形成し得るポリヌクレオチド」とは、Cthrc1をコードする遺伝子のmRNAと、完全に相補的なポリヌクレオチド又はその一部配列（オリゴヌクレオチドを含む）が挙げられ、好ましくは１５塩基以上，更に好ましくは２０塩基以上あれば、プローブとして使用可能である。
また、プローブとして釣り上げ可能なほど結合可能である限り、これらのヌクレオチド配列の一部が置換，欠失，付加，又は挿入等されているものも含まれるが、プローブとなるヌクレオチド配列が短い場合程、Cthrc1のmRNAとの相同性が高い方が好ましく、例えば２０塩基の場合、ヌクレオチドの約７０％以上がCthrc1をコードする遺伝子と同一であることが好ましく、より好ましくは８０％以上，更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは置換塩基数が１乃至数個であり、１５塩基の場合にはほぼ１００％同一であることが好ましい。
尚、これらのポリヌクレオチドは、Cthrc1をコードする遺伝子に先天的あるいは後天的に異常が生じている場合でも相補対を形成し得ると考えられるため、診断時においても、有る程度の変異体までは、検出することが可能である。【００６７】
通常、遺伝子プローブとしては、核酸分子の安定性の点等から、DNAが適しているが、上記のポリヌクレオチドをリアルタイムPCR法のうちの一種であるサイクリングプローブ法に用いる場合には、キメラプローブが用いられる。【００６８】
また、上記のポリヌクレオチドは、常法に従い、DNA合成装置等を用いて人工的に合成する方法，天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する方法，天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失，置換，付加，挿入等する方法，目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やDNAポリメラーゼ，RNAポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる方法等によって製造することができる。【００６９】
抗体や遺伝子プローブ等には、必要に応じて蛍光物質等の標識を結合させることが好ましい。【００７０】
標識としては、蛋白質や遺伝子の検出に一般に用いられているものであれば良いが、抗体に結合させる蛍光蛋白質としては、例えばGFP（Green Fluorescence Protein：オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク），YFP（Yellow Fluorescence Protein：黄色タンパク質），CFP（Cyan Fluorescence Protein：シアン色タンパク質）の他、珊瑚由来の赤色蛍光タンパク等が挙げられ、遺伝子プローブに結合させる標識としては、FAM（６−カルボキシフルオレセイン）のようなフルオレセイン系蛍光色素等の、蛍光色素，ビオチンやジゴキシゲニン（DIG），HRP（西洋わさびパーオキシダーゼ），あるいはAP（アルカリフォスファターゼ）等が挙げられる。【００７１】
これらの標識を抗体や遺伝子プローブに結合させるには常法を用いることができる。【００７２】
尚、測定対象が遺伝子の場合には、予め検体中の遺伝子を、核酸増幅法等により増幅させて測定する方法がある。【００７３】
遺伝子検出に先だって行われる核酸増幅法としては、例えば、PCR法（ポリ核酸増幅法メラーゼ連鎖反応法，Polymerase Chain Reaction，EP200362等参照）やNASBA法（EP329822等参照），TAS法（WO88/10315等参照）のほか、等温遺伝子増幅法（ICAN法：Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，タカラバイオ社）等が挙げられる。【００７４】
これらのうち、主にPCR法が用いられているが、PCR法にも、色々な種類が開発されている。（A）遺伝子の量的な変化を追跡可能なリアルタイム−PCR法，（B）遺伝子を、一旦PCRで増幅した後に、更に別のプライマー対によってPCRを行う、nested-PCR法，（C）nested-PCR法とリアルタイムPCR法を組み合わせたnested-リアルタイムPCR法（二度目のPCRをリアルタイムPCR法で行う方法），及び、これらに、PCR法の実施前にRNAを逆転写する逆転写工程（Reverse Transcription : RT）を組み合わせた方法等が開発されている。
nested-PCR法は、２段階のPCRに基づく増幅により、より特異的に標的遺伝子内の特異配列DNAのみを増幅する事が可能である点で好ましい。【００７５】
尚、(2)を用いたキットには、更に、予め核酸増幅を行うための材料として、耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素や、緩衝液等、PCRキットの基本物質や、RT-PCR等に用いられる逆転写酵素をキット材料として含ませることもできる。【００７６】
キット中の(1)や(2)の量は、常法に準じて適宜選択すれば良いが、プローブとして用いる(2)のポリヌクレオチドは、正常人の有するCthrc1mRNAの平均的な量乃至はその数倍程度としておくことが好ましい。【００７７】
〈本発明のCthrc1又はCthrc1のmRNAを用いた骨・関節疾患の診断方法〉【００７８】
本発明において、骨・関節疾患の診断は、被験者の生体から採取した検体中の、Cthrc1やCthrc1のmRNAを指標として行う。「Cthrc1又はCthrc1のmRNAを指標とする」とは、Cthrc1やCthrc1のmRNAの、量や活性を、直接又は間接的に測定することを意味する。
間接的に測定する方法としては、Cthrc1のサブユニット，二量体その他の多量体，Cthrc1のmRNAを逆転写させたcDNA等をターゲットとする場合等が挙げられる。【００７９】
本発明の診断には、上述の診断キットを用いることができる。【００８０】
検体としては、尿や血漿，血清，全血，脳脊髄液，精液等の体液等が挙げられるが、被験者からの抽出が容易である点や、全身の骨の状態が反映され、全身性の骨代謝疾患である骨・関節疾患の評価が可能であると言う点から、血清が好ましい。【００８１】
蛋白質の測定方法としては、（１）ウェスタンブロット分析や（２）ELISA法等の酵素免疫測定法，（３）放射免疫測定法のほか、（４）蛋白質に結合している糖鎖を検出する方法等、蛋白質の検出・定量に用いられている一般的な方法を用いることができるが、測定精度の点では、ELISA法が好ましい。【００８２】
ELISA法とはenzyme-linked immunosorbent assayの頭文字をとったもので、EIA法 ( Enzyme Immune Assay：酵素抗体法，酵素免疫測定法)とも言われるものである。【００８３】
測定は、目的とするCthrc1蛋白質に対する抗体や、当該目的蛋白質の遺伝子に対する遺伝子プローブを用いて、常法に従って行うことができる。【００８４】
抗体としては、ポリクローナル抗体，モノクローナル抗体が挙げられる。【００８５】
また、抗体は、哺乳動物由来の抗体、キメラ抗体または擬人化抗体，ヒト化抗体のいずれであっても良い。ヒトのタンパク質に対する抗体であれば何でもよく、検出用抗体自体はヒト化である必要はない。【００８６】
Cthrc1のmRNAを測定する際には、ノザンブロット分析や後述する核酸増幅法が挙げられるが、同時に定量できることから核酸増幅法が好ましい。【００８７】
ただし、mRNAは酵素分解を受けやすく不安定であることから、逆転写酵素を用いてmRNAをcDNAに変換した後にPCR分析を行うRT-PCR法を用いると、壊れやすいRNAに変わって安定したcDNAで測定できるので好ましい。【００８８】
尚、mRNAの発現量は標識した遺伝子プローブを用いることによって定量することができる。【００８９】
本発明の骨・関節疾患の診断方法においては、Cthrc1タンパク質量やCthrc1のmRNA量が正常時よりも少ないと、骨代謝回転が衰えており、骨粗鬆症や癌に合併する骨・カルシウム代謝異常，関節リウマチ等に罹患する，あるいはしている可能性が高く、逆にCthrc1タンパク質量やCthrc1のmRNA量が正常時よりも多いと、骨代謝亢進により、パジェット病に罹患するあるいはしている可能性が高いとの診断をすることができる。【００９０】
〈本発明の骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング用キット〉
本発明の骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング用キットは、破骨細胞，Cthrc1，Cthrc1をコードする遺伝子，又はそのmRNAからなる群から選択される少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする。例えば破骨細胞の培養液や、Cthrc1をコードする遺伝子又はそのmRNAを含む溶液等に、候補物質を添加することによって、Cthrc1の産生量を増加又は減少させるものを適宜選択することができる。また、Cthrc1に候補物質を添加することによって、Cthrc1自体の骨形成機能を高めるもの又は阻害するものを適宜選択することができる。【００９１】
このスクリーニング用キットを用いれば、Cthrc1を増加させるか、あるいはCthrc1自体の骨形成機能を高めるものを、骨粗鬆症，癌に合併する骨・カルシウム代謝異常，関節リウマチ等の骨代謝が衰えている骨・関節疾患に対する予防又は治療剤として選択することができる。【００９２】
逆に、Cthrc1又はCthrc1のmRNAを減少させるか、あるいは骨形成機能等のCthrc1の機能を阻害するものを、パジェット病等の骨代謝が亢進している骨・関節疾患に対する予防又は治療剤として選択することができる。【００９３】
選択した物質の、Cthrc1増加又は減少機能，あるいはCthrc1機能増強又は阻害効果は、当該物質を骨芽細胞に添加すること等によって確認することができる。
このキットの使用方法は下記の骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング方法に記載する。【００９４】
〈本発明の骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング方法〉
本発明のCthrc1，Cthrc1をコードする遺伝子，又はそのmRNAを指標とするスクリーニング方法は、下記の（１）や（２）によって実施することができる。「指標とする」とは、Cthrc1やCthrc1をコードする遺伝子，又はそのmRNAの、量や活性を、直接又は間接的に測定することを意味する。【００９５】
（１）候補物質の投与前後の破骨細胞のCthrc1産生量や、Cthrc1の機能を測定し、Cthrc1の発現量を増加又は減少させる，或いはCthrc1の、骨芽細胞に作用し、その分化もしくは増殖機能を高める機能自体を増強又は阻害する物質を選抜する方法。【００９６】
（２）Cthrc1の有する、「骨芽細胞に作用し、その分化もしくは増殖機能を高める機能」と同等の機能を有する物質，又はそれと逆の機能を有する物質を選抜する方法。【００９７】
「骨芽細胞に作用し、その分化もしくは増殖機能を高める機能」は、例えば下記の方法等によって、測定することができる。【００９８】
（ア）マウス頭頂骨由来骨芽細胞にリコンビナントCthrc1タンパク質，又はそれに変わる物質を添加して培養し、アルカリフォスファターゼ活性や石灰化をアリザリン染色で調べる。
（イ）マウス頭頂骨を摘出し、リコンビナントCthrc1タンパク質，又はそれに変わる物質を添加して器官培養し、アリザリン染色やフォンコッサ染色により石灰化の程度を調べることにより、骨形成誘導能を調べる。
（ウ）リコンビナントCthrc1タンパク質，又はそれに変わる物質を直接マウス頭頂骨に注射し、頭頂骨の厚みや石灰化の程度を測定することにより、骨形成誘導能を調べる。【００９９】
本発明で言うスクリーニングには、複数候補の中から、目的の予防又は治療剤等を選択するための、いわゆる一次スクリーニングの他、被験物の予防又は治療効果を確認するための、二次スクリーニング（再評価又は確認試験）も、含まれる。
【実施例】
【０１００】
実施例に先立って、以下に試験例を挙げて、Cthrc1の発現量と骨形成に関連性があることについて説明する。【０１０１】
試験例１
［Cthrc1の破骨細胞特異的発現］
各破骨細胞分化段階の細胞のCthrc1の発現をRT-PCRにより解析した。１〜４は各々下記の細胞を示す。【０１０２】
１：骨髄由来マクロファージ
２：１のマクロファージをRANKLとM-CSFで２日間培養した単核TRAP陽性プレ破骨細胞
３：２のプレ破骨細胞をさらにプレートの上で２日間培養して得られた成熟破骨細胞
４：３と同様に２のプレ破骨細胞を象牙片の上で２日間培養して得られた活性型破骨細胞【０１０３】
それぞれの細胞からRNAを調製し、cDNAにした後に各遺伝子特異的なプライマーを用いてPCRを行い、ゲル電気泳動によりそれらの発現量を解析した。カテプシンK，カルシトニンレセプター，カーボニックアンヒドラーゼII，及びTRAP（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）は全て破骨細胞の分化マーカーであり、GAPDHは１から４までの陽性コントロールであり、全てのRNAが均一に用いられていることを示す。結果を図１に示す。図１から、Cthrc1が活性化破骨細胞に特異的に発現することが分かった。【０１０４】
試験例２
［Cthrc1による骨形成の確認］
Cthrc1を、マウス頭頂骨由来骨芽細胞にレトロウィルスを用いて発現させ、アスコルビン酸とβ−グリセロリン酸を含む骨形成誘導培地で４日間培養し、骨形成のマーカーであるアルカリフォスファターゼ染色（青色の強さは骨形成の分化程度を表す）を行った結果を図２に示す。その結果、Cthrc1は骨形成培地による誘導を行った場合のみならず、通常の培地に於いても骨形成を促進することが分かった。【０１０５】
試験例３
［Cthrc1による骨芽細胞の石灰化］
Cthrc1を、マウス頭頂骨由来骨芽細胞にレトロウィルスを用いて発現させ、アスコルビン酸とβグリセロリン酸を含む骨形成誘導培地で１０日間培養し、石灰化のマーカーであるカルシウムをアリザリンレッドにより染色（赤色の沈着）を行った。結果を図３に示す。図３から、Cthrc1は骨芽細胞の石灰化を促進することが分かった。【０１０６】
上記の試験結果から、Cthrc1自体あるいはその作用を高める物質が、破骨細胞から骨芽細胞へのカップリングを促進することで骨形成機能を高める、逆に骨代謝が異常に高まった病態においては、Cthrc1を阻害する抗体や、Cthrc1をコードする遺伝子やCthrc1のmRNAの発現を阻害するアンチセンス薬やRNAi薬が、Cthrc1の作用過剰（Cthrc1の増殖過剰，Cthrc1自体の機能過剰等），つまり骨の代謝亢進に起因する疾病の、予防又は治療薬となり得ることは明らかである。【０１０７】
試験例４
［ビスフォスフォネート投与による、破骨細胞のCthrc1の発現抑制］
マウス骨髄由来のTRAP陽性単核プレ破骨細胞を、ビスフォスフォネートの溶液で処理した象牙片（＋）と処理していない象牙片（−）上で、RANKL及びM-CSFを含む培地で２日間培養し、成熟破骨細胞を誘導した。それぞれの細胞からRNAを調整し、RT-PCR法によりCthrc1及びコントロールとしてGAPDHの発現を調べた結果を図４に示す。図４から、ビスフォスフォネートは象牙片上で活性化した破骨細胞に於いてCthrc1の発現を抑制することが分かった。【０１０８】
上記の結果から、骨吸収の抑制剤として知られているビスフォスフォネートによって、破骨細胞のCthrc1の産生量が低下していることが分かった。
この結果から、ビスフォスフォネートを用いた予防・治療において、骨の吸収過程と骨形成を結びつけるカップリング因子であるCthrc1タンパク質や、Cthrc1をコードする遺伝子等を併用することで、ビスフォスフォネート単独治療の際の、長期間の投与による骨質の悪化、骨強度の低下等の心配が無くなることが十分に期待される。【０１０９】
実施例１，２（骨代謝改善剤／注射剤）
Cthrc1（1重量部）又はCthrc1抗体（1重量部）を注射用蒸留水（１０００重量部）に溶解し、この水溶液をメンブランフィルターで濾過する。濾液を窒素置換したアンプルに１ｍｌずつ分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理して実施例１又は２の注射剤を得る。【０１１０】
実施例３（骨・関節疾患治療剤／注射剤）
Cthrc1をコードする遺伝子をレトロウイルスに組み込んだウイルスベクターを作製し、水を加えて、注射剤とする。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明によって、骨の正常な代謝を維持・賦活化することのできる、骨代謝改善剤，骨・関節疾患の予防又は治療剤，Cthrc1を用いた骨・関節疾患診断キット，骨・関節疾患診断方法，Cthrc1を用いた骨・関節疾患予防又は治療剤のスクリーニング用キット，スクリーニング方法，骨・関節疾患の予防又は治療方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】各破骨細胞分化段階の細胞における、Cthrc1の発現をRT-PCRにより解析した結果を示す図である。
【図２】Cthrc1による骨形成を示す図である。
【図３】Cthrc1による骨芽細胞の石灰化を示す図である。
【図４】ビスフォスフォネートによる、Cthrc1産生量の低下を示す図である。
【図５】マウスCthrc1とヒトCthrc1のアミノ酸配列の、相同性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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