【手続補正書】
【提出日】平成20年10月17日(2008.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンから構成される群から選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み；
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する翻訳系。
【請求項２】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７、５９−６３に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は前記第１のＯ−ＲＳが配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１又は５８に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を翻訳系で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｉｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（但し、前記第１のＯ−ＲＳは前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む翻訳系を提供する段階と；
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して前記蛋白質の翻訳中に前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項４】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７、５９−６３に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含むか、又は翻訳系を提供する前記段階が配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１又は５８に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）３−ニトロ−Ｌ−チロシンとｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み；
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、配列番号７−１０から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸でアミノアシル化する翻訳系。
【請求項６】
前記第１のＯ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ、大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及び野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼからなる群から選択されるｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１又は５に記載の翻訳系。
【請求項７】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号７−１０に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる請求項５に記載の翻訳系。
【請求項８】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項１又は５に記載の翻訳系。
【請求項９】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１又は５に記載の翻訳系。
【請求項１０】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項１又は５に記載の翻訳系。
【請求項１１】
第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項１０に記載の翻訳系。
【請求項１２】
前記系が宿主細胞を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含む請求項１又は５に記載の翻訳系。
【請求項１３】
前記宿主細胞が真正細菌細胞、酵母細胞及び大腸菌細胞から選択されるか、又は前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１２に記載の翻訳系。
【請求項１４】
特定位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を宿主細胞で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）３−ニトロ−Ｌ−チロシンとｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
（ｉｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（但し、前記第１のＯ−ＲＳは前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、配列番号７−１０から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む前記宿主細胞で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む宿主細胞を提供する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記蛋白質の翻訳中に前記核酸のセレクターコドンの位置に対応する前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項１５】
翻訳系を提供する前記段階又は宿主細胞を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
翻訳系を提供する前記段階又は宿主細胞を提供する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ、大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及び野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼからなる群から選択されるｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号７−１０に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含むか、又は翻訳系を提供する前記段階が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
翻訳系を提供する前記段階又は宿主細胞を提供する前記段階が部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項３又は１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記Ｏ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
翻訳系を提供する前記段階又は宿主細胞を提供する前記段階が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項３又は１４に記載の方法。
【請求項２１】
翻訳系を提供する前記段階又は宿主細胞を提供する前記段階がアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項３又は１４に記載の方法。
【請求項２２】
翻訳系を提供する前記段階又は宿主細胞を提供する前記段階が配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項３又は１４に記載の方法。
【請求項２３】
翻訳系を提供する前記段階又は宿主細胞を提供する前記段階がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項３又は１４に記載の方法。
【請求項２４】
更に前記蛋白質が第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸を含み、翻訳系又は宿主細胞が第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項３又は１４に記載の方法。
【請求項２５】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項３又は１４に記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞を提供する前記段階が真正細菌宿主細胞、酵母宿主細胞及び大腸菌宿主細胞からなる群から選択される宿主細胞を提供する段階を含むか、又は宿主細胞を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含むか、又は宿主細胞を提供する前記段階が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７、５９−６３に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含むポリペプチドを含む組成物であって、前記保存変異体ポリペプチドが、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と、配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７及び５９−６３から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でコグネイト直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１及び５８から選択される請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記組成物がポリペプチドを含む細胞である請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１又は５８に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３３】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞。