(57)【要約】間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を促進するための薬剤であって、ラミニン５を有効成分として含有する前記薬剤。間葉系幹細胞を培養する方法、間葉系幹細胞の単離方法、間葉系幹細胞を培養するための培地、容器及びシートも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を促進するための薬剤であって、ラミニン５を有効成分として含有する前記薬剤。
【請求項２】
ラミニン５の存在下で間葉系幹細胞を培養する方法。
【請求項３】
無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する請求項２記載の方法。
【請求項４】
無血清培地が繊維芽細胞増殖因子を含有する請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の方法で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の単離方法。
【請求項６】
間葉系幹細胞を培養するための培地であって、濃度が０．０１μｇ／ｍｌ以上のラミニン５を含有する前記培地。
【請求項７】
無血清培地である請求項６記載の培地。
【請求項８】
さらに繊維芽細胞増殖因子を含有する請求項７記載の培地。
【請求項９】
間葉系幹細胞を培養するための容器又はシートであって、濃度が０．０５μｇ／ｍｌ以上のラミニン５溶液で処理することにより、あるいはラミニン５産生細胞に沈着させることにより、ラミニン５が５ｎｇ／ｃｍ２以上の濃度で塗布又は固定されている前記容器又はシート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ラミニン５を利用して、間葉系幹細胞を増殖させる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】  骨髄の間葉系幹細胞は骨、軟骨、脂肪、筋肉などの細胞へ分化する能力をもっており、骨損傷、変形性関節症、骨粗しょう症、筋障害などの再生医療への応用が期待されている。また、間葉系幹細胞が骨髄移植の副作用（移植片対宿主病）の防止に有効であることも明らかになっている。このように、間葉系幹細胞は造血系幹細胞と並んで、最も応用に近い幹細胞であり、既に一部臨床応用されている（非特許文献１）。【０００３】  このため、この細胞を効率よく調製し、増殖させる技術の開発が試みられている（特許文献１及び２）。
これまで間葉系幹細胞の増殖因子としてＦＧＦ−２（非特許文献２）、ＨＢ−ＥＧＦ（非特許文献３）、ＣＹＲ６１／ＣＣＮ１（非特許文献４）が見出されているが、他の有効な因子は知られていない。【０００４】
【特許文献１】特開２００４−０８９０９５号公報
【特許文献２】特開２００４−２４２６１９号公報
【非特許文献１】日経バイオビジネス  日経ＢＰ社  ２００４年７月号第１６頁〜第１７頁
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２８８，４１３−４１９（２００１）
【非特許文献３】Ｂｌｏｏｄ  １０６，５９−６６（２００５）
【非特許文献４】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４２，２１９−２２５（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明は、間葉系幹細胞を効率よく増殖させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者らは、基底膜型細胞接着分子の一つであるラミニン５を利用することにより、間葉系幹細胞を分化能を維持したままで増殖を促進できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】  本発明の要旨は以下の通りである。
（１）間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を促進するための薬剤であって、ラミニン５を有効成分として含有する前記薬剤。
（２）ラミニン５の存在下で間葉系幹細胞を培養する方法。
（３）無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する（２）記載の方法。
（４）無血清培地が繊維芽細胞増殖因子を含有する（３）記載の方法。【０００８】（５）（２）〜（４）のいずれかに記載の方法で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の単離方法。
（６）間葉系幹細胞を培養するための培地であって、濃度が０．０１μｇ／ｍｌ以上のラミニン５を含有する前記培地。
（７）無血清培地である（６）記載の培地。
（８）さらに繊維芽細胞増殖因子を含有する（７）記載の培地。
（９）間葉系幹細胞を培養するための容器又はシートであって、濃度が０．０５μｇ／ｍｌ以上のラミニン５溶液で処理することにより、あるいはラミニン５産生細胞に沈着させることにより、ラミニン５が５ｎｇ／ｃｍ２以上の濃度で塗布又は固定されている前記容器又はシート。
【発明の効果】
【０００９】  本発明により、間葉系幹細胞を効率よく増殖できるようになった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００５−２４０８１４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ラミニンの基本構造を示す。
【図２】精製したラミニン５Ａおよびラミニン５Ｂの電気泳動パターンを示す。左パネル：ＬＮ５Ａ−ＨＥＫ細胞およびＬＮ５Ｂ−ＨＥＫ細胞の培養液上清から精製したラミニン５Ａとラミニン５Ｂを、非還元条件下（−ＭＥ）又は還元条件下（＋ＭＢ）、４．０−７．５％勾配ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、色素（ＣＢＢ）で染色した。左の２レーンは各ラミニン５の３量体とその分子サイズ（ｋＤａ）を、右２レーンは各サブユニット（鎖）と分子サイズを示す。右パネル：精製したラミニン５Ａとラミニン５Ｂのα３鎖、β３鎖、γ２鎖をイムノブロッティングで分析した。各サブユニットと分子サイズを示す。１４５ｋＤａのα３Ａ／Ｂ鎖及び１０５ｋＤａのγ２鎖はプロテアーゼにより切断された型である。
【図３】間葉系幹細胞に対する増殖活性のアッセイの結果を示す。
【図４】５％Ｐａｎｅｘｉｎ含有無血清培地中で培養した間葉系幹細胞に対する増殖活性のアッセイの結果（Ａ）及び細胞形態（Ｂ）を示す。
【図５】間葉系幹細胞をラミニン５非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）あるいは存在下（ＬＮ５）の軟骨分化培地にて３週間培養した時のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積の様子（Ａ）及びＩＩ型コラーゲンの蓄積の様子（Ｂ）を示す。
【図６】ラミニン５非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）あるいは存在下（ＬＮ５）で８日間培養された間葉系幹細胞を軟骨分化培地にて３週間培養した時のグリコサミノグリカンの蓄積の様子（Ａ）及びＩＩ型コラーゲンの蓄積の様子（Ｂ）を示す。また、それぞれの細胞を骨芽細胞分化培地中で３週間培養した時のアルカリフォスファターゼの発現（Ｃ）とオステオポンチンの発現（Ｄ；ＯＰＮ）を示す。
【図７Ａ】間葉系幹細胞に対する接着活性のアッセイの結果を示す。
【図７Ｂ】間葉系幹細胞に対する伸展活性のアッセイの結果を示す。
【図８】抗インテグリン阻害抗体が間葉系幹細胞に対する接着活性のアッセイに及ぼす影響を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を促進するための薬剤であって、ラミニン５を有効成分として含有する前記薬剤を提供する。【００１２】  間葉系幹細胞は、哺乳類の骨髄などに存在し、様々な細胞に分化する能力を持った幹細胞である。骨、軟骨、脂肪細胞などの他、心筋細胞や神経細胞にも分化することが知られている。間葉系幹細胞の由来は特に限定されず、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物、鳥類、爬虫類などに由来するものを挙げることができる。再生医療に用いるためには、ヒト由来のものが好ましい。間葉系幹細胞は、公知の方法により骨髄又は骨膜から採取することができるが、大腿骨、頚骨、骨盤（腸骨）から採取してもよい。また、ヒト間葉系幹細胞は市販されている（ＰＴ−２５０１（Ｃａｍｂｒｅｘ社））。【００１３】  ラミニンは基底膜の重要な成分であり、細胞表面レセプターと相互作用することによって細胞機能を調節している。ラミニン分子は、α、β、γの３つの鎖がジスルフィド結合で会合したヘテロ三量体蛋白質であり、特徴的な十字架構造をとっている。現在までに、５種類のα鎖、３種類のβ鎖、３種類のγ鎖の異なる組み合わせによって１５種類のアイソフォームが同定されている（図１）。各アイソフォームは異なる組織分布を示し、それぞれ異なる役割分担を果たすと考えられるが、その詳細は明らかではない。【００１４】  ラミニン分子は、３本鎖のアミノ（Ｎ）末端部分（短腕）で互いに会合したり、他のマトリクス分子と会合して、基底膜を構築する。一方、α鎖のカルボキシル（Ｃ）末端には５つの相同な球状ドメイン（Ｇ１−Ｇ５ドメインまたはＬＧ１−ＬＧ５）が存在し、主にこの部分でインテグリンやその他のレセプターと結合する。【００１５】  ラミニン５は、α３鎖、β３鎖、γ２鎖からなるラミニン分子であり、表皮細胞や癌細胞が産生する細胞外マトリクス分子（ラドシン、カリニン、エピリグリン、ナイセインとも称される）として見いだされた。この分子は、表皮の真皮への結合に中心的な役割を果たしており、ほとんどの細胞においてインテグリンα３β１に優先的に結合するが、細胞によってはインテグリンα６β１、α６β４にも結合する。ラミニン５におけるα３鎖Ｇ２ドメインのα３Ｇ２Ａ配列（ＲＥＲＦＮＩＳＴＰＡＦＲＧＣＭＫＮＬＫＫＴＳ）やＧ３ドメインのＫＲＤ配列がインテグリンに対する主要な結合部位であることが解明されている。また、α３鎖のＣ末端に存在するＧ４およびＧ５ドメインはラミニン５が分泌された直後にプロテアーゼによって切断除去されることが知られている（図１）。通常の方法で単離されるラミニン５にはＧ４、Ｇ５ドメインが存在しない。このようなα３鎖切断型ラミニン５は非切断型ラミニン５に比べて高い細胞接着促進活性、運動促進活性、および神経再生促進活性を有することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（２００５），１４３７０−１４３７７）。また、γ２鎖（１５０ｋＤａ）は短腕部分で切断され、１０５ｋＤａのサイズになる（図１）。切断の程度は細胞により異なるが、後述の実施例で使用したγ２鎖は大部分が切断型になっている��図２）。γ２鎖の切断によってラミニン５の細胞接着活性は低下し、逆に運動活性が増加することが知られている（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９２（２００４），７０１−７０４）。β３鎖は切断されにくいが、表皮細胞などでは短腕部分で切断されることがある（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（２００５），ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。後述の実施例で使用したβ３鎖は切断されていない（図２，１３５ｋＤａ）。【００１６】ラミニン５に含まれるα３鎖には短鎖型（α３Ａ）と長鎖型（α３Ｂ）が存在し、それらの各組織における発現パターンが異なることが報告されていた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１９９５），２１８２０−２１８２６）。α３Ａ鎖はα３Ｂ鎖のＮ末端側が欠失した構造を有する（図１）。最近、ヒトα３Ｂ鎖の全長ｃＤＮＡがクローニングされ、このα３Ｂ鎖と、β３鎖およびγ２鎖からなる新規ラミニン５の性質が明らかにされた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（２００４），２４７７４−２４７８４）。ラミニン５に含まれるα３鎖が短鎖型（α３Ａ）であるものはラミニン５（またはラミニン５Ａ）と呼ばれており、α３鎖が長鎖型（α３Ｂ）であるものはラミニン５Ｂと呼ばれている（図１）。ここで、α３Ａ鎖は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、α３Ｂ鎖は、配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、β３鎖は、配列番号４で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、γ２鎖は、配列番号６で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有する。【００１７】  本発明で用いるラミニン５は、分泌された直後に蛋白質分解酵素によってＧ４およびＧ５ドメインが切断されたものであってもよい。α３Ａ鎖からＧ４およびＧ５ドメインが切断されたものをα３Ａ＃３鎖と呼び、α３Ｂ鎖からＧ４およびＧ５ドメインが切断されたものをα３Ｂ＃３鎖と呼ぶことにする。本発明で用いるラミニン５は、α３Ａ＃３鎖、β３鎖及びγ２鎖の各サブユニットから構成されるラミニン５Ａ蛋白質、α３Ｂ＃３鎖、β３鎖及びγ２鎖の各サブユニットから構成されるラミニン５Ｂ蛋白質であってもよい。ここで、α３Ａ＃３鎖は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、α３Ｂ＃３鎖は、配列番号８で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、β３鎖は、配列番号４で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、γ２鎖は、配列番号６で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有する。【０��１８】  図１に、ラミニン５Ａ（ＬＮ５Ａ）蛋白質及びラミニン５Ｂ（ＬＮ５Ｂ）蛋白質の構造を示す。ラミニン５Ａはα３Ａ鎖、β３鎖、およびγ２鎖からなり、ラミニン５Ｂはα３Ｂ鎖、β３鎖、およびγ２鎖からなる。α３Ｂ鎖はα３Ａ鎖の約２倍の大きさをもち、α３Ｂ鎖のＣ末端側約半分の構造はα３Ａ鎖と共通である。α３Ｂ鎖とα３Ａ鎖のＣ末端部分には球状（Ｇ）ドメインが存在し、それは５つのサブドメイン（またはモジュール）（Ｇ１〜Ｇ５）に分かれている。ラミニン５Ａやラミニン５Ｂが細胞から分泌されると殆どの分子が直ちに内在性のプロテアーゼによりＧ３とＧ４の間で切断される。従って、培養液中にはＧ４とＧ５を欠損するラミニン５Ａまたはラミニン５Ｂが分泌される。また、α３Ｂ鎖、α３Ａ鎖、およびγ２鎖のＮ末端部分でも部分的な切断が起こる。【００１９】  本発明で使用するラミニン５（ラミニン５Ａ及び５Ｂを含む）蛋白質は、これらラミニン５を分泌するヒト或いは動物細胞の培養液上清、あるいはそこから精製した天然型ラミニン５であってもよい。しかし、これらラミニン５は、当該技術分野において知られる組換えＤＮＡ技術を用いて各サブユニットを発現させることにより遺伝子組換え蛋白質として大量かつ効果的に製造することができる。【００２０】  ラミニン５Ａの各サブユニットをコードするｃＤＮＡは、配列番号９、３または５に記載される塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適当なｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅することにより製造することができる。同様に、ラミニン５Ｂの各サブユニットをコードするｃＤＮＡは、配列番号１、３または５に記載される塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適当なｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅することにより製造することができる。このようなＰＣＲ手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０に記載されている。【００２１】  ラミニン５Ａ又は５Ｂの各鎖遺伝子をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して、それぞれの鎖を発現させることにより所望の蛋白質を得ることができる。本発明の蛋白質を発現させるために用いることができる宿主細胞の例としては、限定されないが、大腸菌、枯草菌等の原核生物宿主、および酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。宿主として有用な哺乳動物細胞には、ＨｅＬａ細胞、線維芽細胞由来の細胞、例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１、またはリンパ球由来の細胞、およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ、ならびに神経芽細胞腫細胞株、例えばＩＭＲ３３２が含まれる。さらに、植物細胞および昆虫細胞、例えばショウジョウバエの細胞もまた宿主として利用可能である。【００２２】  ベクターとは、細胞にトランスフェクトすることができ、細胞ゲノム中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の核酸分子を表す。発現ベクターは、ＤＮＡの発現を駆動するプロモーター領域を含み、さらに転写および翻訳の制御配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、３’非コード領域、エンハンサー等を含んでいてもよい。プロモーターの例としては、原核生物宿主中で用いる場合には、ｂｌａプロモーター、ｃａｔプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、真核生物宿主中で用いる場合には、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母解糖系酵素遺伝子配列プロモーター等が挙げられる。ベクターの例には、限定されないが、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ、ｐＫＲＣ、ＢＰＶ、ワクチニア、ＳＶ４０、２−ミクロン等が含まれる。【００２３】  発現ベクターは、これを含有する宿主細胞を選択することができるように、１またはそれ以上のマーカーを有することが好ましい。マーカーとしては、栄養要求性宿主に対する栄養、抗生物質耐性（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン等）、または重金属耐性（例えば銅）を与えるものを用いることができる。【００２４】  さらに、シグナル配列を用いて本発明の蛋白質を分泌発現させるように、あるいは、本発明の蛋白質を別の蛋白質との融合蛋白質の形で発現させるように、ベクターを構築することができる。融合蛋白質を用いることにより、蛋白質の安定性を改良し、または精製を容易にすることができる。そのような発現ベクターの構築は当該技術分野においてよく知られている。【００２５】  ラミニン５Ａ又は５Ｂの各鎖をコードするＤＮＡは、一つの発現ベクター内に組み込んで発現させてもよく、または別個の発現ベクターに組み込んで、これらのベクターを同じ細胞にトランスフェクトして発現させてもよい。α３鎖、β３鎖およびγ２鎖の各サブユニットはいずれも非常に大きなポリペプチドであるため、好ましくは後者の方法を用いる。【００２６】  ラミニン５Ａ又は５Ｂを発現するよう構築したベクターは、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクション等により、適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて本発明の蛋白質を産生させ、細胞または培地から所望の組換え蛋白質を回収し、精製することにより、ラミニン５Ａ又はラミニン５Ｂ蛋白質を得ることができる。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。【００２７】  ラミニン５Ａの生産方法は、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２（２００２），６０７−６１２に記載されている。【００２８】  ラミニン５Ｂの生産方法は、ＷＯ００／６６７３１及びＫａｒｉｙａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（２００４）２４７７４−２４７８４に記載されている。【００２９】  ラミニン５Ａ���は５Ｂの各鎖は、対応する配列番号で示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような天然の蛋白質と相同の蛋白質も本発明において使用可能である。【００３０】  アミノ酸の保存的変更を行って、元の機能を保持している蛋白質またはポリペプチドを得ることができることは、当該技術分野においてよく知られている。そのような置換には、アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること、例えば、１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ）を別のもので、または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間で置き換えることが含まれる。【００３１】  また、本発明で用いるラミニン５は、配列番号２、４、６または８に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、かつ間葉系幹細胞の細胞増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を促進することができる蛋白質であってもよい。同一性は、同一である残基の数を、既知の配列または既知の配列のドメイン中の残基の総数で割り、１００を乗ずることにより計算する。標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム、例えば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が利用可能である。好ましくは、これらのプログラムのデフォルト設定を用いるが、所望によりこれらの設定を変更してもよい。【００３２】  また、ラミニン５Ａ又は５Ｂを構成する各鎖の一部が欠失している蛋白質を用いてもよい。例えば、ラミニン５Ａのα３Ａ鎖及びラミニン５Ｂのα３Ｂ鎖は、プロテアーゼによってＧ４およびＧ５が切断除去されるが、それぞれ、ラミニン５Ａ及び５Ｂとしての活性を有する限り、切断型または非切断型を問わず本発明において用いることができる。【００３３】  さらに、ヒト以外の種の生物に由来する、ヒトラミニン５Ａ又は５Ｂと同様の活性を有する蛋白質を用いてもよい。このような蛋白質をコードする遺伝子は、配列番号１（ラミニン５Ｂと同様の活性を有する蛋白質の場合）若しくは配列番号９（ラミニン５Ａと同様の活性を有する蛋白質の場合）、３、５または７に示される配列を有するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをプローブまたはプライマーとして用いて、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ等の手法を用いて容易に単離することができる。このようにして得られる相同遺伝子は、配列番号１若しくは９、３、５または７に記載の塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは６０％���上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。あるいは、相同遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１若しくは９、３、５または７に記載の塩基配列を有する遺伝子とハイブリダイズすることができる。【００３４】  ハイブリダイズという用語は、ＤＮＡまたはこれに対応するＲＮＡが、溶液中でまたは固体支持体上で、別のＤＮＡまたはＲＮＡ分子と水素結合相互作用により結合することを意味する。このような相互作用の強さは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性によって、種々のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、ストリンジェンシーは、塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節することができる。そのようなストリンジェンシーの調節方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″，第２版．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８９）に記載されている。【００３５】  ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、５０％ホルムアミドの存在下で、７００ｍＭのＮａＣｌ中４２℃、またはこれと同等の条件をいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄である。【００３６】  ラミニン５は、間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を促進することができる。ラミニン５の細胞増殖促進活性は、細胞を培養する培養液中にラミニン５を添加して、対照（ラミニン５無添加）と比較した細胞増殖速度を測定することによりアッセイすることができる。対照と比較して、細胞増殖速度が上昇していれば、ラミニン５が細胞増殖活性を促進すると判定することができる。細胞接着促進活性は、プレートにラミニン５をコーティングし、このプレートに細胞を播種し、所定時間インキュベートした後に接着した細胞の数を測定することによりアッセイすることができる。対照（ラミニン５無添加）と比較して、接着した細胞の数が増加していれば、ラミニン５が細胞接着活性を促進すると判定することができる。細胞伸展促進活性は、プレートにラミニン５をコーティングし、このプレートに細胞を播種し、所定時間インキュベートした後に接着した細胞の形態を観察することによりアッセイすることができる。細胞の扁平化が起きていれば、細胞伸展活性を促進すると判定することができる。【００３７】  ラミニン５を用いて、間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を促進するため��は、ラミニン５を間葉系幹細胞の培養液中に添加するか、または培養プレートなどの培養容器もしくは培養シート上に塗布または固定化するとよい。培養液中に添加されるラミニン５は、遺伝子組換え型、天然型のいずれでも、また精製したものでも未精製のものでもよい。ラミニン５分泌細胞の培養液上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）をラミニン５溶液として使用することもできる。ラミニン５の固定化はこれら各種ラミニン５含有液を培養容器もしくは培養シートに直接処理することによって行うことができる。また、ラミニン５産生細胞を培養容器もしくは培養シート上に沈着させたもの（ラミニン５マトリックス）を使用してもよい。殆どの動物細胞は生存条件として基質（足場）に接着することが必須であり、さらに増殖因子の刺激を受けて分裂する。下記の実施例２の結果から分かるように、正常細胞は一般に増殖速度が低い。ラミニン５は細胞接着活性と、増殖因子としての増殖促進活性の両方をもつことから、間葉系幹細胞の増殖促進剤として有効である。従って、間葉系幹細胞の培養に使用できる。【００３８】  ラミニン５を培養液中に添加する場合、培養液中におけるラミニン５の濃度は特に限定されないが、通常、０．０１μｇ／ｍｌ以上の濃度が適当であり、０．１〜１μｇ／ｍｌの濃度で最適な増殖効果が得られる。培養液中の他の成分は、間葉系幹細胞の培養に適するものであれば、特に限定されない。また、固定化ラミニン５は、ラミニン５産生細胞（例、ＬＮ５−ＨＥＫ細胞、ＬＮ５Ｂ−ＨＢＫ細胞、表皮細胞、扁平上皮癌細胞、胃癌細胞など）を適当な培養容器もしくは培養シート上で飽和状態で数時間以上（好ましくは２日以上）培養した後、細胞をＥＤＴＡ処理などにより除いて作製することもできる。培養液としてはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などの基本培地を用いることができる。さらに、グルコース、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ヒト血清、ウマ血清、抗生物質（例えば、ペニシン、ストレプトマイシンなど）、増殖因子（例えば、ＦＧＦ−２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＣＹＲ６１／ＣＣＮ１）などを添加してもよい。【００３９】  ラミニン５を利用することにより、血清含有培地又は無血清培地で間葉系幹細胞を増殖させることができる。間葉系幹細胞をラミニン５添加増殖培地に５，０００〜６，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養するとき、通常５〜６日間で飽和する。【００４０】  一般に、細胞培養法は、単層静止培養法、ローラーボトル培養法、撹拌培養法、坦体培養法などに分類されるが、本発明においては、いずれの培養法を用いてもよい。【００４１】  ラミニン５を塗布又は固定した培養プレートなどの培養容器又は培養シート上で間葉系幹細胞を培養する場合、ラミニン５の量は特に限定されず、培養容器又は培養シートの大きさによって適宜調整するとよい。通常、０．０５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．５〜３μｇ／ｍｌのラミニン５溶液で処理された場合、良好な増殖が得られる。ラミニン５は、５ｎｇ／ｃｍ２以上の濃度で培養容器又は培養シートに塗布又は固定されているとよく、好ましくは５０〜３００ｎｇ／ｃｍ２の濃度で培養容器又は培養シートに塗布又は固定される。��葉系幹細胞を培養するための培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などの基本培地を用いることができる。さらに、グルコース、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ヒト血清、ウマ血清、抗生物質（例えば、ペニシン、ストレプトマイシンなど）、増殖因子（例えば、ＦＧＦ−２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＣＹＲ６１／ＣＣＮ１）などを添加してもよい。【００４２】  いずれかの方法で固定化されたラミニン５を利用することにより、血清含有培地又は無血清培地で間葉系幹細胞を増殖させることができる。ラミニン５をコートしたプレート上に間葉系幹細胞を５，０００〜６，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養するとき、通常５〜６日間で飽和する。【００４３】  また、ラミニン５は間葉系幹細胞を効果的に接着させることから、骨髄などからの間葉系幹細胞の単離・調製にも利用できる。例えば、ラミニン５をコート（固定化）した培養容器又は培養シート上に、骨髄などの、間葉系幹細胞を含む細胞混合物を播種し、５分〜２時間インキュベートする。まだ接着していない細胞を除き、プレートに接着した間葉系幹細胞を他の細胞から分離する。このプレート上で増殖させた間葉系幹細胞は通常のトリプシン処理によって回収することができる。
【実施例】
【００４４】  以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４５】〔実施例１〕遺伝子組換えヒトラミニン５Ａ及び５Ｂの調製
ラミニン５Ａは既に報告した方法（Ｋａｒｉｙａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２（２００２），６０７−６１２）により調製した。α３Ａ、β３、γ２鎖のｃＤＮＡを導入したヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（ＬＮ５−ＨＥＫ）から回収した無血清培養液上清の含有タンパク質を硫安沈殿により濃縮後、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いるゲルろ過により分画した。このラミニン５Ａ含有画分をゼラチンカラムに通してフィブロネクチンを除去し、さらに抗ラミニンα３鎖モノクローナル抗体（ＬＳα３）を固定化したアフィニティーカラムに通してラミニン５Ａを吸着、次いで溶出した。精製されたラミニン５Ａは６％ゲルを用いる還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティングによってほぼ純粋であることを確認した（図２）。イムノブロッティングはα３鎖抗体（ＬＳα３、自作）、β３鎖抗体（Ｋａｌｉｎｉｎ  Ｂ１，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、γ２鎖抗体（Ｄ４Ｂ５、自作）を用いて行った。なお、培養液上清を直接ゼラチンカラムと抗体カラムで分画しても、上記に近い精製標品が得られた。以上のように調製及び精製されたラミニン５Ａのα３鎖は完全に切断して１６０ｋＤａになっており、γ２鎖は大部分が１０５ｋＤａの切断型（配列番号６のアミノ酸配列中のＡｓｐ（４３５）とＧｌｕ（４３６）の間で切断）になっていた。なお、α３鎖の切断はＧ４ドメインとＧ５ドメインの間のＧｌｎ（１３３７）とＡｓｐ（１３３８）の間で起こる（Ｔｓｕｂｏｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７８（２０００），６１４−６２０）。【００４６】  ラミニン５Ｂの調製及び精製は、α３Ｂ、β３、γ２鎖のｃＤＮＡを導入したヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（ＬＮ５Ｂ−ＨＥＫ）から回収した培養液上清を用いて上記と同様に調製及び精製した（Ｋａｒｉｙａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（２００４），２４７７４−２４７８４）。精製されたラミニン５Ｂのγ２鎖は約半分が切断型γ２鎖であった（図２）。α３Ｂ鎖はＧ４−Ｇ５領域を予め除いたｃＤＮＡを導入しているため３３５ｋＤａの切断型（但し、このα３Ｂ鎖＃３のＣ末端配列はプロテアーゼによって切断されて生じるＣ末端配列（Ｇｌｎ２９５７）よりも短いＰｈｅ２９４４となっている）が主要成分であるが、さらにＮ末端部分で切断された１４５ｋＤａα３Ｂ鎖も見られる。この切断はＬｙｓ（１８１１）とＡｓｐ（１８１２）の間で起こる（Ｋａｒｉｙａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（２００４），２４７７４−２４７８４）。【００４７】  以下の実施例において、ラミニン５とは、特に断りのない限り、本実施例で調製したラミニン５Ａを指す。【００４８】〔実施例２〕間葉系幹細胞に対する増殖活性のアッセイ
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ（Ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ））（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を５×１０３細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、維持培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）にて１２日間培養した。その際、以下のように細胞を処理した。細胞数は、４日ごとにカウントした。【００４９】（Ａ）ラミニン５を２４ウェルプレートに次のようにコートした。１ウェル当たり１．０μｇ／ｍｌのラミニン５溶液（生理食塩水ＰＢＳで希釈）０．５ｍｌ（０．５μｇラミニン５／ウェル）を加え、一晩４℃で放置した。溶液を除いた後、１２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液０．５ｍｌを加え、室温で２時間処理した（ＢＳＡブロッキング）。各ウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を播種した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）はＰＢＳで処理した。なお、ＢＳＡブロッキングはラミニン５の実際の利用にあたっては必ずしも必要ではない。【００５０】（Ｂ）０．５、１．０、２．０μｇ／ｍｌのラミニン５溶液を上記のようにコートした（それぞれ、０．２５，０．５，１．０μｇ／ウェル）。【００５１】（Ｃ）１．０μｇ／ｍｌのラミニン５溶液の０．５ｍｌ（０．５μｇ／ウェル）を上記のようにコートしたプレート上で細胞を培養するか（Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）、もしくは培地に０．５μｇ／ｍｌになるようにラミニン５を添加して培養した（Ｓｏｌｕｂｌｅ）。【００５２】（Ｄ）１．０μｇ／ｍｌのラミニン５（ＬＮ５）溶液（０．５μｇ／ウェル）、もしくは２．０μｇ／ｍｌ（１．０μｇ／ウェル）のラミニン１（ＬＮ１）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、ラミニン２／４（ＬＮ２／４）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、ラミニン１０／１１（ＬＮ１０／１１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をコートしたプレート上で細胞を培養した。【００５３】（Ｅ）１．０μｇ／ｍｌのラミニン５溶液及び１．５μｇ／ｍｌのラミニン５Ｂ溶液の０．５ｍｌ（それぞれ０．５μｇ／ウェルと０．７５μｇ／ウェル）を上記のようにコートし、そのプレート上で細胞を培養した（Ｓｏｌｕｂｌｅ）。【００５４】  （Ａ）〜（Ｅ）を通し、Ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）はラミニン溶液の代わりにＰＢＳのみで処理した。図３Ａより、Ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ラミニン５をコートしたプレート上でｈＭＳＣ細胞は増殖速度が高くなっていることが明らかとなった。さらに、図３Ｂより、その効果が濃度依存的であることが示された。この増殖促進効果はラミニン５を培地中に直接添加した場合にも同様に観察された（図３Ｃ）。ラミニン５の増殖促進活性は他のラミニンと比較しても高いことが示された（図３Ｄ）。また、ラミニン５Ｂをラミニン５（ラミニン５Ａ）と同じモル濃度で処理したとき、両者はほぼ同等の増殖促進活性を示した（図３Ｅ）。【００５５】  次に、無血清培地におけるラミニン５の増殖促進活性を明らかにするために、市販の幹細胞用無血清添加物Ｐａｎｅｘｉｎ（ＰＡＮ−ｂｉｏｔｅｃｈ社）を添加した培地を用いた。ｈＭＳＣ細胞を無血清ＭＳＣＢＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社）で１度洗った後、５％Ｐａｎｅｘｉｎ含有無血清ＭＳＣＢＭ培地中に懸濁して無処理またはラミニン５（０．５μｇ／ｍｌ）（ＬＮ５）でコートしたプレート上に播種し、８日間培���した。またそれぞれにつき、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を最終濃度１ｎｇ／ｍｌで培地に添加し、その効果も調べた（図４Ａ，Ｂ）。また比較のため、無血清培地で１度洗浄したｈＭＳＣ細胞を、５％血清を含有する維持培地（ＭＳＣＢＭ＋ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ社）に同様に播種し、８日間培養した（Ｓｅｒｕｍ）。その結果、無血清ＭＳＣＢＭ培地単独（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べてラミニン５添加は一定の増殖促進を示したが、ｂＦＧＦの増殖促進活性がより顕著であった。ラミニン５とｂＦＧＦの両方の存在下では、相乗的に細胞増殖が促進され、血清含有培地とほぼ同等の増殖促進が見られた（図４Ａ）。形態的にはラミニン５上で細胞が扁平になるのに対して、ラミニン５とｂＦＧＦの共存下ではやや細くて明瞭な細胞形態が得られた（図４Ｂ）。これらの結果からラミニン５とｂＦＧＦおよび他の増殖因子との併用により、ｈＭＳＣ細胞を無血清培地中で増殖できることが明らかになった。【００５６】  さらに、ｈＭＳＣ細胞の軟骨および骨芽細胞への分化に及ぼすラミニン５の効果を調べた。血清含有維持培地（ＭＳＣＢＭ＋ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ社）中で培養したｈＭＳＣ細胞をディッシュから剥がし、ＴＧＦ−β３を添加しない不完全軟骨分化培地（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、ａｓｃｏｒｂａｔｅ、ｉｎｓｕｌｉｎ、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ、ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）（Ｃａｍｂｒｅｘ社）で１回洗った後、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β３を添加した完全軟骨分化培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社）に懸濁した。２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅの濃度でポリプロピレンチューブに移して遠心した後、細胞のペレットを３７℃で２４時間以上インキュベートして球状の細胞塊を形成させた。ラミニン５（１μｇ／ｍｌ）は細胞塊が形成された後に添加し、培養した。２〜３日に一度ラミニン５を添加した完全軟骨分化培地で培地交換を行った。３週間培養した後、切片を作成し、Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅを用いて軟骨特異的なグリコサミノグリカンを、また特異抗体（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ社）を用いてＩＩ型コラーゲンを染色した。その結果、ラミニン５を含まない完全軟骨分化培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、ラミニン５添加培地（ＬＮ５）では、細胞塊の成長が阻害された（図５Ａ，Ｂ）。また、ラミニン５によってグリコサミノグリカン（図５Ａ）と、ＩＩ型コラーゲン（図５Ｂ）の蓄積が顕著に抑制され、ＴＧＦ−β３を添加しない不完全軟骨分化培地（ＴＧＦ−β３（−））の染色度を示した。これらの結果からラミニン５がｈＭＳＣ細胞の軟骨分化を抑制することが示された。【００５７】  次に、ｈＭＳＣ細胞の骨芽細胞分化に及ぼすラミニン５の影響を調べた。細胞を骨芽細胞分化培地（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、ａｓｃｏｒｂａｔｅ、β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｃａｍｂｒｅｘ社）に分散し、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で無処理またはラミニン５（０．５μｇ／ｍｌ）でコートしたプレート上に播種し、３週間培養した。骨芽細胞分化マーカーであるアルカリ���ォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）はｎａｐｈｔｈ  ＡＳＢＩとＦａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲの混合液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で検出し、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）はＩＢＬ社の特異抗体を用いる免疫ブロッティングで検出した。その結果、ラミニン５はこれらの蛋白質の産生、すなわちｈＭＳＣ細胞の骨芽細胞分化に影響を与えないことが示された。【００５８】  ラミニン５が軟骨細胞分化を抑制することから、ラミニン５処理がｈＭＳＣ細胞の分化能に影響を与えるかどうかを調べた。このために、先ずｈＭＳＣ細胞を無処理（Ｃｏｎｔｒｏｌ）あるいはラミニン５（１μｇ／ｍｌ）でコートしたプレート（ＬＮ５）上で、維持培地を用いて８日間培養した。それぞれの細胞をプレート上から剥がし、ラミニン５非存在下でのｈＭＳＣ細胞の軟骨および骨芽細胞への分化を調べた。ラミニン５非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）あるいは存在下（ＬＮ５）で培養されたｈＭＳＣ細胞を完全軟骨分化培地（ＴＧＦ−β３含有）にて３週間培養した時、両者の間でグリコサミノグリカン（図６Ａ）とＩＩ型コラーゲン（図６Ｂ）の蓄積に差は見られなかった。またそれぞれの細胞を骨芽細胞分化培地中で３週間培養した時、アルカリフォスファターゼ（図６Ｃ）とオステオポンチン（図６Ｄ；ＯＰＮ）の発現に差は見られなかった。すなわち、ラミニン５処理はｈＭＳＣ細胞の軟骨と骨芽細胞への分化能に影響を与えなかった。以上の結果から、ラミニン５はｈＭＳＣ細胞の分化能を保った状態で細胞増殖を促進することが示された。【００５９】〔実施例３〕間葉系幹細胞に対する接着活性のアッセイ
濃度が１．６μｇ／ｍｌのラミニン１（ＬＮ１）、ラミニン２／４（ＬＮ２／４）、ラミニン１０／１１（ＬＮ１０／１１）溶液の０．１ｍｌ（０．５μｇ／ｃｍ２）、もしくは０．８μｇ／ｍｌのラミニン５（ＬＮ５）溶液の０．１ｍｌ（０．２５μｇ／ｃｍ２）で９６ウェルプレートをコートし、その後１２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡでブロッキング処理した。各ウェルに、無血清のＤＭＥＭ培地（Ｎｉｓｓｕｉ）で２回洗ったｈＭＳＣを２ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。約５分後、接着していない細胞を軽いボルテックスにより浮遊させ、パーコール処理にてウェル表面から除いた。接着した細胞をホルマリンで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３４３２により染色し、相対細胞数を定量した。ラミニン溶液の代わりにＰＢＳで処理し、その後ＢＳＡでブロッキングしたプレートを対照（Ｎｏｎｅ）とした。【００６０】  結果を図７Ａに示す。他のラミニンと比較して、ラミニン５は著しく接着活性が強いことが明らかとなった。【００６１】〔実施例４〕間葉系幹細胞に対する伸展活性のアッセイ
実施例３と同濃度の各ラミニンでコートしたプレートに、ｈＭＳＣを３．１ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、１０分後の細胞形態を観察した。ラミニン溶液の代わりにＰＢＳで処理したプレートを対照（Ｎｏｎｅ）とした。【００６２】  結果を図７Ｂに示す。Ｎｏｎｅ、ラミニン１、ラミニン２／４ではほとんどの細胞が球状を示し、伸展が見られないが、ラミニン５ではほとんどの細胞がプレート上に広がり、伸展している様子が観察できた。ラミニン１０／１１もラミニン５に近い伸展活性を示した。【００６３】〔実施例５〕抗インテグリン阻害抗体の影響
抗インテグリン阻害抗体を用いて、ｈＭＳＣがもつラミニン５受容体を調べた。ラミニン５（ＬＮ５）上に細胞を播種する前に、ｈＭＳＣを抗インテグリン阻害抗体（抗α３インテグリン抗体（Ｐ１Ｂ５）、抗β１インテグリン抗体（６Ｓ６）、抗β４インテグリン抗体（３Ｅ１）、以上Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製；抗α６インテグリン抗体（ＧｏＨ３）、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）と５分ほどプレインキュベートし、実施例３と同様に細胞接着活性を測定した。ラミニン溶液の代わりにＰＢＳで処理したプレートを対照（Ｎｏｎｅ）とした。【００６４】  結果を図８に示す。抗α３インテグリン抗体及び抗β１インテグリン抗体で処理すると、図７Ａで示したようなラミニン５の接着促進活性が著しく阻害された。このことから、ラミニン５による細胞接着促進活性は、インテグリンα３β１との結合に拠ることが明らかとなった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００６５】  ラミニン５を利用することにより、間葉系幹細胞を効率よく培養することができるようになった。間葉系幹細胞は骨、軟骨、脂肪、筋肉などの細胞へ分化する能力をもっており、骨損傷、変形性関節症、骨粗しょう症、筋肉障害などに対する再生医療への応用が期待される。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトラミニンα３Ｂ鎖の全長塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトラミニンα３Ｂ鎖の全長アミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトラミニンβ３鎖の全長塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトラミニンβ３鎖の全長アミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ヒトラミニンγ２鎖の全長塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ヒトラミニンγ２鎖の全長アミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、ヒトラミニンα３Ｂ＃３鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、ヒトラミニンα３Ｂ＃３鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、ヒトラミニンα３Ａ鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、ヒトラミニンα３Ａ鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、ヒトラミニンα３Ａ＃３鎖（ヒトラミニンα３Ａ鎖からＧ３とＧ４が切断されたもの）の塩基配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、ヒトラミニンα３Ａ＃３鎖のアミノ酸配列を示す。
【図１】
2007023875.tif 000002
【図２】
2007023875.tif 000003
【図３】
2007023875.tif 000004
【図４】
2007023875.tif 000005
【図５】
2007023875.tif 000006
【図６】
2007023875.tif 000007
【図７Ａ】
2007023875.tif 000008
【図７Ｂ】
2007023875.tif 000009
【図８】
2007023875.tif 000010
【配列表】
2007023875000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月24日(2007.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の分化能を維持したままで、間葉系幹細胞の増殖活性、接着活性及び伸展活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を促進するための薬剤であって、ラミニン５を有効成分として含有する前記薬剤。
【請求項２】
ラミニン５の存在下で、間葉系幹細胞の分化能を維持したままで、間葉系幹細胞を培養する方法。
【請求項３】
無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する請求項２記載の方法。
【請求項４】
無血清培地が繊維芽細胞増殖因子を含有する請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の方法で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の単離方法。
【請求項６】
間葉系幹細胞の分化能を維持したままで、間葉系幹細胞を培養するための培地であって、濃度が０．０１μｇ／ｍｌ以上のラミニン５を含有する前記培地。
【請求項７】
無血清培地である請求項６記載の培地。
【請求項８】
さらに繊維芽細胞増殖因子を含有する請求項７記載の培地。
【請求項９】
間葉系幹細胞の分化能を維持したままで、間葉系幹細胞を培養するための容器又はシートであって、濃度が０．０５μｇ／ｍｌ以上のラミニン５溶液で処理することにより、あるいはラミニン５産生細胞に沈着させることにより、ラミニン５が５ｎｇ／ｃｍ２以上の濃度で塗布又は固定されている前記容器又はシート。
【国際調査報告】
2007023875.tif 000062
2007023875.tif 000063
2007023875.tif 000064
2007023875.tif 000065
2007023875.tif 000066
2007023875.tif 000067
2007023875.tif 000068