【手続補正書】
【提出日】令和1年6月14日(2019.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作製する方法であって、Ｔ細胞前駆細胞の集団に、
ａ．前記Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイド（ｇＲＮＡ）と、
ｂ．超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、前記ｇＲＮＡの前記第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、前記組換え部位特異的ヌクレアーゼと、
ｃ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列と、前記標的ＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第４のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸配列とを含む複合体を導入することを含み、
前記複合体は、相同組換え型修復（ＨＤＲ）及び前記第３のヌクレオチド配列の前記標的ＤＮＡへの組込みを許容する条件下で前記Ｔ細胞前駆細胞に導入されて、前記ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞を形成する、前記方法。
【請求項２】
前記細胞は、造血幹細胞及び多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記超荷電タンパク質は、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結されている、請求項１〜請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記超荷電タンパク質に機能的に連結されている前記組換え部位特異的ヌクレアーゼは、さらに、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結されているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドを含んでいる、請求項１〜請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記超荷電タンパク質は、その対応する未修飾タンパク質よりも大きい全体的に正の電荷を有している、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記全体的に正の電荷は、約＋５〜約＋４０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項１〜請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する＋３６ＧＦＰである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼはＣａｓ９である、請求項１〜請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ｇＲＮＡと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：１〜約１．５：１：１である、請求項１〜請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞前駆細胞集団における相同組換え型修復の非相同末端結合に対する割合は、少なくとも約０．５である、請求項１〜請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体は、ヌクレオポレーションにより前記細胞に導入される、請求項１〜請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞前駆細胞集団の少なくとも５％がＨＤＲにより修飾されて、前記ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞を形成する、請求項１〜請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞を単離することを含んでいる、請求項１〜請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
さらに、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞を培養することを含んでいる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾済みＴ細胞前駆細胞は、増殖条件下で培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞を、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞が前記ＣＡＲを発現するＴ細胞へと分化するのを促進するような条件下で培養することを含んでいる、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象の癌を治療するための組成物であって、請求項１〜請求項１８のいずれかに記載の方法により入手した細胞を含み、前記組成物が前記対象へと移植されることを特徴とする、前記組成物。
【請求項２０】
前記組成物が自家移植により移植されることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作製するための複合体であって、
ａ．前記Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイド（ｇＲＮＡ）と、
ｂ．超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、前記ｇＲＮＡの前記第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、前記組換え部位特異的ヌクレアーゼと、
ｃ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列と、前記標的ＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第４のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸配列とを含んでいる、前記複合体。
【請求項２２】
前記超荷電タンパク質は、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結されている、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記超荷電タンパク質に機能的に連結されている前記組換え部位特異的ヌクレアーゼは、さらに、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結されているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドを含んでいる、請求項２１または請求項２２のいずれかに記載の複合体。
【請求項２４】
前記超荷電タンパク質は、その対応する未修飾タンパク質よりも大きい全体的に正の電荷を有している、請求項２１〜請求項２３のいずれかに記載の複合体。
【請求項２５】
前記全体的に正の電荷は、約＋５〜約＋４０である、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項２１〜請求項２５のいずれかに記載の複合体。
【請求項２７】
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する＋３６ＧＦＰである、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】
前記ヌクレアーゼはＣａｓ９である、請求項２１〜請求項２７のいずれかに記載の複合体。
【請求項２９】
ｇＲＮＡと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：１〜約１．５：１：１である、請求項２１〜請求項２８のいずれかに記載の複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
本明細書では、血液系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するための複合体及び方法を提供する。本明細書では、腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作る方法を提供し、該方法は、Ｔ細胞前駆細胞の集団に複合体を導入することを含んでおり、該複合体は、（ａ）Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイド（ｇＲＮＡ）と、（ｂ）超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、ｇＲＮＡの第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、組換え部位特異的ヌクレアーゼと、（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列と、標的ＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第４のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）配列とを含んでおり、該複合体は、相同組換え型修復（ＨＤＲ）及び第３のヌクレオチド配列の標的ＤＮＡへの組込みを許容する条件下でＴ細胞前駆細胞に導入されて、ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞を形成する。該方法はさらに、修飾済みＴ細胞前駆細胞において高細胞生存率を提供する。また、腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作るための複合体も提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作製する方法であって、Ｔ細胞前駆細胞の集団に、
ａ．前記Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイド（ｇＲＮＡ）と、
ｂ．超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、前記ｇＲＮＡの前記第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、前記組換え部位特異的ヌクレアーゼと、
ｃ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列と、前記標的ＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第４のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸配列とを含む複合体を導入することを含み、
前記複合体は、相同組換え型修復（ＨＤＲ）及び前記第３のヌクレオチド配列の前記標的ＤＮＡへの組込みを許容する条件下で前記Ｔ細胞前駆細胞に導入されて、前記ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞を形成する、前記方法。
(項目２)
前記細胞は、造血幹細胞及び多能性幹細胞からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記超荷電タンパク質は、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結されている、項目１〜項目３に記載の方法。
(項目５)
前記超荷電タンパク質に機能的に連結されている前記組換え部位特異的ヌクレアーゼは、さらに、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結されているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドを含んでいる、項目１〜項目４のいずれかに記載の方法。
(項目６)
前記超荷電タンパク質は、その対応する未修飾タンパク質よりも大きい全体的に正の電荷を有している、項目１〜項目５のいずれかに記載の方法。
(項目７)
前記全体的に正の電荷は、約＋５〜約＋４０である、項目６に記載の方法。
(項目８)
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、項目１〜項目７のいずれかに記載の方法。
(項目９)
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する＋３６ＧＦＰである、項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記ヌクレアーゼはＣａｓ９である、項目１〜項目９のいずれかに記載の方法。
(項目１１)
ｇＲＮＡと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：１〜約１．５：１：１である、項目１〜項目１０のいずれかに記載の方法。
(項目１２)
前記Ｔ細胞前駆細胞集団における相同組換え型修復の非相同末端結合に対する割合は、少なくとも約０．５である、項目１〜項目１１のいずれかに記載の方法。
(項目１３)
前記複合体は、ヌクレオポレーションにより前記細胞に導入される、項目１〜項目１２のいずれかに記載の方法。
(項目１４)
前記Ｔ細胞前駆細胞集団の少なくとも５％がＨＤＲにより修飾されて、前記ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞を形成する、項目１〜項目１３のいずれかに記載の方法。
(項目１５)
さらに、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞を単離することを含んでいる、項目１〜項目１４のいずれかに記載の方法。
(項目１６)
さらに、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞を培養することを含んでいる、項目１５に記載の方法。
(項目１７)
前記修飾済みＴ細胞前駆細胞は、増殖条件下で培養される、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
さらに、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞を、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞が前記ＣＡＲを発現するＴ細胞へと分化するのを促進するような条件下で培養することを含んでいる、項目１６または項目１７に記載の方法。
(項目１９)
対象の癌を治療する方法であって、項目１〜項目１８のいずれかに記載の方法により入手した細胞を前記対象に移植することを含んでいる、前記方法。
(項目２０)
前記移植は自家移植である、項目１９に記載の方法。
(項目２１)
腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作製するための複合体であって、
ａ．前記Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイド（ｇＲＮＡ）と、
ｂ．超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、前記ｇＲＮＡの前記第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、前記組換え部位特異的ヌクレアーゼと、
ｃ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列と、前記標的ＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第４のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸配列とを含んでいる、前記複合体。
(項目２２)
前記超荷電タンパク質は、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結されている、項目２１に記載の複合体。
(項目２３)
前記超荷電タンパク質に機能的に連結されている前記組換え部位特異的ヌクレアーゼは、さらに、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結されているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドを含んでいる、項目２１または項目２２のいずれかに記載の複合体。
(項目２４)
前記超荷電タンパク質は、その対応する未修飾タンパク質よりも大きい全体的に正の電荷を有している、項目２１〜項目２３のいずれかに記載の複合体。
(項目２５)
前記全体的に正の電荷は、約＋５〜約＋４０である、項目２４に記載の複合体。
(項目２６)
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、項目２１〜項目２５のいずれかに記載の複合体。
(項目２７)
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する＋３６ＧＦＰである、項目２６に記載の複合体。
(項目２８)
前記ヌクレアーゼはＣａｓ９である、項目２１〜項目２７のいずれかに記載の複合体。
(項目２９)
ｇＲＮＡと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：１〜約１．５：１：１である、項目２１〜項目２８のいずれかに記載の複合体。