【手続補正書】
【提出日】平成20年5月12日(2008.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
【表１】
2008509670.tif 000001
2008509670.tif 000002
本発明の特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、内因性ｍｉＲＮＡなどの、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。第２のヌクレオチド配列に実質的に同一であるオリゴヌクレオチド配列は、その第２のヌクレオチド配列と７０％、８０％、９０％、またはそれ以上同一である。好ましくは、薬剤は内因性ｍｉＲＮＡと配列が同じである。ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に同一であるオリゴヌクレオチド剤は、ｍｉＲＮＡ欠乏が疾病または障害に連関している場合などに細胞またはヒトに送達され、内因性ｍｉＲＮＡの活性を置き換えるか、または補完することができる。一実施形態では、本発明で特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、特定の癌においてダウンレギュレーションされるか、または失われることが知られているｍｉＲＮＡと実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、および前立腺癌の多くの場合にダウンレギュレーションされるか、失われることが知られているｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１５（例えば、ｍｉＲ−１５ａまたはｍｉＲ−１５ｂ）またはｍｉＲ−１６と実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる（カリンら（Ｃａｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９９：１５５２４〜１５５２９頁、２００２年）。他の実施例では、オリゴヌクレオチド剤は、結腸直腸新生物の腺腫様および癌段階の多くの場合にダウンレギュレーションされることが知られているｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５と実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる（マイケルら（Ｍｉｃｈｅａｌ  ｅｔ  ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：８８２〜８９１頁、２００３年）。さらに他の実施例では、オリゴヌクレオチド剤は、肺癌組織中でダウンレギュレーションされることが知られているｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７と実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる（ジョンソンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｃｅｌｌ  １２０：６３５〜６４７頁、２００５年）。上述のようなｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同一であるオリゴヌクレオチド剤を対象に投与して、ｍｉＲＮＡ発現のダウンレギュレーションに関連する疾病または障害を治療することができる。他の好適なオリゴヌクレオチド剤は、例えば、ジョンら（Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ）、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１８６２〜１８７９頁、２００４年（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＬｏＳ  ３：１３２８頁、２００５年）、およびＴｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（グリフィス−ジョーンズＳ．（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．）、ＮＡＲ  ３２：Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁、２００４年）で説明されているｍｉＲＮＡと実質的に同一である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６８】
実施例１４
５’コレステロール−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号２４）
化合物１４−ａを用いて、コレステロールがＲＮＡ分子の５’末端に複合されたオリゴヌクレオチド複合体を合成した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５７４】
【化９２】
2008509670.tif 000003
ＡＬ−ＤＵＰ−１０００を血清安定性検定に供して、その固有のヌクレアーゼ耐性を評価し、その分解パターンを画定した（図１８）。ヒト血清安定性検定において、変性ゲル電気泳動を用いてＡＬ−ＤＵＰ−１０００を分析した。５’末端標識センスＲＮＡ（＊ｓ／ａｓ）を含んだｓｉＲＮＡ２本鎖Ａおよび５’末端標識アンチセンスＲＮＡ（ａｓ／ｓ＊）を含んだ２本鎖を各々９０％ヒト血清中でインキュベートし、時間ポイントを１０秒、５分、１５分、３０分、１時間、２時間および４時間で検定した。ＰＢＳ緩衝液のみでインキュベートしたｓｉＲＮＡ２本鎖に関し、対照は４時間の時間ポイントとし、ＯＨ−をアルカリ加水分解マーカーとした。３’−５’エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの両方によってこの非修飾２本鎖が分解されるのが観察された（図１８）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５７７】
【表１３】
2008509670.tif 000004
糖修飾によるヌクレアーゼ耐性の増強：エンドヌクレアーゼ切断の部位のほかｓｉＲＮＡ２本鎖の３’末端において２’ＯＨを２’ＯＭｅで置換することの効果を評価した。ヒト血清安定性検定において試験した２本鎖を表１２に示す。２つの修飾の組合せがヌクレアーゼ耐性をより有意に増強するか否かを評価するために、これらの２本鎖の一部もホスホロチオエート結合を含んだ。末端ｄＴ残基を２’ＯＭｅ−Ｕ（ＡＬ−ＤＵＰ−１０２７）で置換したところ、３’−５’エキソヌクレアーゼ分解は、非修飾親２本鎖にわたって僅かに低減された（データ示さず）。しかし、２’ＯＭｅ−Ｕによるエキソヌクレアーゼ保護の程度は、２つの末端ｄＴ残基の間にホスホロチオエートを配置することによって得られる程度よりもはるかに小さかった（図１９Ａ参照）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５７８】
【表１４】
2008509670.tif 000005
２つの末端２’ＯＭｅ−ウリジン残基の間にホスホロチオエートを１つ付加したところ、２本鎖ＡＬ−ＤＵＰ−１０３６、ＡＬ−ＤＵＰ−１３ｆｆおよびＡＬ−ＤＵＰ−１３６３について図２０に見られるように、３’−５’エキソヌクレクアーゼ切断が効果的に阻害された。それ自身に２’ＯＭｅ置換することは、内部切断部位に配置されるときにエンドヌクレアーゼ切断から保護する際にさらにより効果的であった。親２本鎖は２本鎖の２つのＵｐＡ部位のＵの３’で切断された。両鎖はこのジヌクレオチド・リピートの対称性に起因して切断され、マッピング・データを用いて切断の部位を確認した（データ示さず）。強力なエンドヌクレアーゼ部位（（図２０、ｓ／＊ａｓゲルの星印、ＡＬ−ＤＵＰ−１３ｆｆ）に２’ＯＭｅを配置したところ、この部位の切断が阻害された。しかし、強力な部位を２’ＯＭｅで保護したとき、第２の弱いエンドヌクレアーゼ部位（図２０、＊ｓ／ａｓの黒い星）が僅かに増強された（図２０、ＡＬ−ＤＵＰ−３ｆｆをＡＬ−ＤＵＰ−１０３６と比較）。２’ＯＭｅ（ＡＬ−ＤＵＰ−１３６３）で両部位を保護したところ、両部位のエンドヌクレアーゼ切断が低減された（図２０）。２’ＯＭｅ置換による阻害作用は、切断反応における求核試薬として２’ＯＨを必要とするエンドヌクレアーゼ切断の機構と一致する。２’ＯＭｅ修飾は３’オーバーハングがリボヌクレオチドで構成された単一のオーバーハングｓｉＲＮＡ２本鎖の３’オーバーハングを保護するのにも有効な手段となる。この場合、２’ＯＭｅ置換を用いて、エンドヌクレアーゼ切断によって生じ得る末端２つのヌクレオチドの損失をブロックすることができ、ホスホロチオエートを用いてエキソヌクレアーゼ分解から保護することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５８１】
【表１５】
2008509670.tif 000006
ヒト血清安定性検定で検定した２本鎖の配列を表１３に示す。アルキルアミノ−ｄＴおよびカチオン性非塩基性ピロリジン修飾の両方を３’末端オーバーハングに配置して、３’−５’エキソヌクレアーゼ分解に対するその効果を評価した。アリルアミノ−ウリジンを内部エンドヌクレアーゼ切断部位に配置して、それがエンドヌクレアーゼ切断を阻害する能力を評価した。図２１に示すように、３’末端ｄＴ残基を単一のアルキルアミノ−ｄＴで置換したところ、３’−５’エキソヌクレクアーゼ分解が効果的に阻害された（図２１、ＡＬ−ＤＵＰ−１０ａａ、左のゲル像）。オーバーハング部分の両ｄＴ残基をアルキルアミノ−ｄＴで置換したところ、同程度の阻害がもたらされた（データ示さず）。各鎖の３’末端にカチオン性非塩基ピロリジン修飾を付加したところ、エキソヌクレクアーゼ分解からも保護した（図２１、真中のゲル像）。アルキルアミノ−ｄＴおよび非塩基ピロリジン修飾の両方が、最長２３時間、３’−５’エキソヌクレクアーゼ切断から保護された（データ示さず）。アリルアミノ−Ｕを内部切断部位に配置したところ、２本鎖ＡＬ−ＤＵＰ−１４０３について図２１に示すようにエンドヌクレアーゼ切断を阻害した。異なる２つの切断事象を分離するために、２’ＯＭｅ−Ｕおよびホスホロチオエート置換によって、エキソヌクレクアーゼ分解からこの２本鎖の末端を安定化した。エンドヌクレアーゼ切断はＡＬ−ＤＵＰ−１４０６のアリルアミノ−Ｕ置換によって、両方の内部切断部位において阻害された（データ示さず）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５８４】
【表１６】
2008509670.tif 000007
モノマー合成および複合戦略の付加的な例を別紙Ｉに記載し、これを本願の開示の一部として明示的に包含する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５８６】
【表１７】
2008509670.tif 000008
ｍｉＲ−１２２は細胞１個当たり５００００以上の高いレベルで肝細胞で発現される（チャン  ジェイら（Ｃｈａｎｇ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ）、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：２、１０６〜１１３頁、２００４年）。ａｎｔａｇｏｍｉｒ処理後のｍｉＲ−１２２のサイレンシングがｍｉＲ−１２２とａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２との間の化学量論的２本鎖形成によって、またはｍｉＲ−１２２の触媒分解によって引き起こされたものかどうかを決定するために、ホルムアミドを含んだストリンジェントな変性条件下で、非複合１本鎖抗−ｍｉＲ−１２２ＲＮＡ（抗−１２２ｆＳ、抗−１２２ｐＳ）またはａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２で処理したマウスの肝からの総ＲＮＡを検証した（図２３Ｃ）。ＰＢＳ肝と非複合抗−ｍｉＲ−１２２ＲＮＡ処理肝との間にｍｉＲ−１２２レベルの差は検出できず、これは非ストリンジェント条件下で観察されたｍｉＲ−１２２レベル低減は分解によるものではないが、その代わりにｍｉＲ−１２２／ＲＮＡ２本鎖の形成によるものであることを示している。対照的に、ｍｉＲ−１２２はａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２で処理したマウスの肝蔵では検出不能のままであった。これらのデータからは、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２で処理したマウスの肝臓におけるｍｉＲＮＡ−１２２のサイレンシングはｍｉＲＮＡの分解、および非複合抗−１２２ＲＮＡではなくａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２の能力に起因するものであり、ｍｉＲ−１２２の分解はａｎｔａｇｏｍｉｒが肝細胞に効果的に送達されることに起因するものであるかもしれないという結果に至ることが示唆される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５９０】
マイクロＲＮＡはｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおいて不完全に相補的な標的部位に結合し、翻訳および恐らくはｍＲＮＡ安定性に干渉すると考えられる。したがって、ｍｉＲＮＡがサイレンシングされると、相応して、標的タンパク質レベルが増加し、恐らくはｍＲＮＡレベルが低減するものと予想される。この予想を試験するために、肝細胞では抑制されてｍｉＲ−１２２の標的となると予想される遺伝子であるアルドラーゼＡの発現を試験した。アルドラーゼ−Ａ  ｍＲＮＡは、オープン・リーディング・フレームの下流のヌクレオチド２９と３６との間に、ｍｉＲ−１２２に対して完全な配列相補性を有する細胞核を保持した。ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２を投与したマウスの肝蔵では、アルドラーゼ−Ａの発現はスクランブルな対照（ｍｍ−ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２）に比して４〜５倍上昇した。この調節は、複数の実験において、投与後の異なる時間ポイントで観察された。ルシフェラーゼ・オープン・リーディング・フレームの下流で３’ＵＴＲアルドラーゼ−Ａをクローニングし、このベクターを、対照ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２４（５’−ＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡ−３（配列番号１０４）；クレックら（Ｋｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：４９５〜５００頁、２００５年およびリムら（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：７６９〜７７３頁、２００５年を参照）およびｍｉＲ−１９２）およびｍｉＲ−１２２と、ｍｉＲ−１２２発現のないＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトすることによっても、この標的を独立して確認した。ｍｉＲ−１２２を共トランスフェクトしたところ、ルシフェラーゼ活性はｍｉＲ−１２４およびｍｉＲ−１９２トランスフェクト細胞に比して有意に低減した。これとともに、これらのデータはアルドラーゼ−ＡがｍｉＲ−１２２の生理学的標的であることを示している。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５９７】
ルシフェラーゼ活性の検定。次のプライマー：５’ｄ−ＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＣＣＡ）−３’ （配列番号１０５）および５’ｄ−（ＣＣＣＣＴＴＡＡＡＴＡＧＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＣＡ）−３’ （配列番号１０６）を用いて、マウス完全長アルドラーゼ−Ａ３’ＵＴＲをＰＣＲ増幅し、ｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）において停止コドンの下流でクローンした。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェル・プレートで培養し、各々ｐＲＬ−ＴＫ（Ｒｒ−ｌｕｃ）５０ｎｇ、ｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｐ−ｌｕｃ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５０ｎｇおよび２本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）２００ｎｇでトランスフェクトした。細胞を収集し、トランスフェクション後２４〜３０時間で検定した。