【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年12月10日(2007.12.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  インビボ胆汁排泄感受性の候補化合物をインビトロでスクリーニングする方法であって、
(ａ)肝細胞の培養物を提供すること、この場合、肝細胞の培養物は少なくとも１個の毛細胆管を含み、
(ｂ)当該培養物に対し候補化合物をさらすこと、および
(ｃ)少なくとも１個の毛細胆管中の候補化合物の量を決定すること(ここで、少なくとも１個の毛細胆管中の候補化合物の量が、培養物の胆汁クリアランス値を計算することによって決定され、該胆汁クリアランス計算値が候補化合物の胆汁排泄感受性を示す)、
のステップを含む方法。
【請求項２】  肝細胞が、ラット、ヒト、サル、ヒトニザル、ネコ、イヌ、ブタ、食用ブタ、蓄牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、シチメンチョウ、ニワトリ、カモおよびガンからなる群から選択される起源から分離される、請求項１の方法。
【請求項３】  肝細胞の培養物が、肝臓の長期培養物を更に含む、請求項１の方法。
【請求項４】  肝細胞の培養物が、細管ネットワークを更に含む、請求項１の方法。
【請求項５】  肝細胞の培養物が、肝細胞のクラスター、肝細胞の集合体、肝細胞の少なくとも１層、およびその組合せからなる群から選択される配置を有するとして更に特徴付けられる、請求項１の方法。
【請求項６】  肝細胞が、マトリクス中に植え込まれた、請求項５の方法。
【請求項７】  肝細胞の培養物が、肝細胞のサンドイッチ培養物を更に含み、当該サンドイッチ培養物は肝細胞の少なくとも１層および肝細胞の少なくとも１層を伴う少なくとも１個の毛細胆管を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】  肝細胞のサンドイッチ培養物が、肝細胞の長期サンドイッチ培養物を更に含む、請求項７の方法。
【請求項９】  肝細胞の少なくとも１層がマトリクスの２層の間にサンドイッチされる、請求項７の方法。
【請求項１０】  当該マトリクスが、生物学的マトリクス培地、合成マトリクス培地、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】  当該生物学的マトリクス培地が、コラーゲン、ラミニン、基底膜由来複合体、それらの誘導物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０の方法。
【請求項１２】  インビボ胆汁排泄感受性の、多数の候補化合物を同時にインビトロでスクリーニングする方法であって、
(ａ)複数の肝細胞の培養物を提供すること、この場合、肝細胞の各培養物は、少なくとも１個の毛細胆管を含み、
(ｂ)複数の培養物内の各培養物に対し複数の候補化合物の異なる候補化合物をさらすこと、および
(ｃ)各培養物内の少なくとも１個の毛細胆管中の候補化合物の量を決定すること(ここで、場合、少なくとも１個の毛細胆管中の候補化合物の量が、培養物の胆汁クリアランス値を計算することによって決定され、該胆汁クリアランス計算値が候補化合物の胆汁排泄感受性を示す)、
のステップを含む方法。
【請求項１３】  肝細胞が、ラット、ヒト、サル、ヒトニザル、ネコ、イヌ、ブタ、食用ブタ、蓄牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、シチメンチョウ、ニワトリ、カモおよびガンからなる群から選択される起源から分離される、請求項１２の方法。
【請求項１４】  肝細胞の培養物が、肝細胞の長期培養物を更に含む、請求項１２の方法。
【請求項１５】  肝細胞の培養物が、細管ネットワークを更に含む、請求項１２の方法。
【請求項１６】  肝細胞の培養物が、肝細胞のクラスター、肝細胞の集合体、肝細胞の少なくとも１層、およびその組合せからなる群から選択される配置を有するとして更に特徴付けられる、請求項１２の方法。
【請求項１７】  肝細胞が、マトリクス中に植え込まれた、請求項１６の方法。
【請求項１８】  肝細胞の培養物が、肝細胞のサンドイッチ培養物を更に含み、当該サンドイッチ培養物は肝細胞の少なくとも１層および肝細胞の少なくとも１層を伴う少なくとも１個の毛細胆管を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】  肝細胞の各サンドイッチ培養物が、肝細胞の長期サンドイッチ培養物を更に含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】  肝細胞の少なくとも１層がマトリクスの２層の間にサンドイッチされる、請求項１８の方法。
【請求項２１】  当該マトリクスが、生物学的マトリクス培地、合成マトリクス培地、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０の方法。
【請求項２２】  当該生物学的マトリクス培地が、コラーゲン、ラミニン、基底膜由来複合体、それらの誘導物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】  インビボ胆汁排泄感受性の候補化合物をインビトロでスクリーニングする方法であって、
(ａ)肝細胞の培養物を提供すること、この場合、当該培養物は少なくとも１個の毛細胆管を含み、
(ｂ)取り込むことができる十分な時間、ステップ(ａ)で提供された培養物に対し候補化合物および事前に選択した量のマーカー化合物の両方を同時にさらすこと、
(ｃ)培養物を洗浄すること、
(ｄ)候補化合物とマーカー化合物の間の取り込みおよび排泄競合を比較するために培養物中の少なくとも１個の毛細胆管に存在するマーカー化合物の量を決定すること、この場合、事前に選択した量のマーカー化合物との比較として低減した量のマーカー化合物の存在または非存在が候補化合物の胆汁排泄感受性を示す、
のステップを含む方法。
【請求項２４】  肝細胞が、ラット、ヒト、サル、ヒトニザル、ネコ、イヌ、ブタ、食用ブタ、蓄牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、シチメンチョウ、ニワトリ、カモおよびガンからなる群から選択される起源から分離される、請求項２３の方法。
【請求項２５】  肝細胞の培養物が、肝細胞の長期培養物を更に含む、請求項２３の方法。
【請求項２６】  肝細胞の培養物が、細管ネットワークを更に含む、請求項２３の方法。
【請求項２７】  肝細胞の培養物が、肝細胞のクラスター、肝細胞の集合体、肝細胞の少なくとも１層、およびその組合せからなる群から選択される配置を有するとして更に特徴付けられる、請求項２３の方法。
【請求項２８】  肝細胞が、マトリクス中に植え込まれた、請求項２７の方法。
【請求項２９】  肝細胞の培養物が、肝細胞のサンドイッチ培養物を更に含み、当該サンドイッチ培養物は肝細胞の少なくとも１層および肝細胞の少なくとも１層を伴う少なくとも１個の毛細胆管を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】  肝細胞のサンドイッチ培養物が、肝細胞の長期サンドイッチ培養物を更に含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】  肝細胞の少なくとも１層がマトリクスの２層の間にサンドイッチされる、請求項３０の方法。
【請求項３２】  当該マトリクスが、生物学的マトリクス培地、合成マトリクス培地、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３１の方法。
【請求項３３】  当該生物学的マトリクス培地が、コラーゲン、ラミニン、基底膜由来複合体、それらの誘導物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２の方法。
【請求項３４】  マーカー化合物が、蛍光源化合物、蛍光性化合物、ケミルミネセンス化合物、比色分析用化合物、放射標識化合物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２４の方法。
【請求項３５】  ステップ(ａ)から(ｄ)をマルチウェルプレートの少なくとも１個のウェルにおいて行う、請求項２４の方法。
【請求項３６】  胆汁排泄感受性の、多数の候補化合物を同時にスクリーニングすることを更に含む、請求項２４の方法。
【請求項３７】  インビボ胆汁排泄感受性の候補化合物をインビトロでスクリーニングする方法であって、
(ａ)肝細胞の第１および第２の培養物を確立すること、この場合、各培養物は、少なくとも１個の毛細胆管を含み、第１の培養物は未処置毛細胆管を含み、そして第２の培養物は、破壊された毛細胆管を含み、
(ｂ)候補化合物を取り込むことができる十分な時間(Ｔ)、第１の培養物および第２の培養物に対し候補化合物をさらすこと、
(ｃ)第１および第２の培養物を洗浄し、次いで細胞溶解させること、
(ｄ)ステップ(ｃ)の各培養物から得られた溶解物中に存在する候補化合物の量を測定すること、
(ｅ)未処置毛細胆管を有する第１の培養物および破壊された毛細胆管を有する第２の培養物から溶解物に存在する候補化合物の量の差異として毛細胆管の量をすること、そして
(ｆ)胆汁クリアランス値をステップ(ｅ)の量と培養培地の曲線下面積(ＡＵＣ)の比率として計算し（ここで、ＡＵＣは時間０から時間Ｔまでの候補化合物濃度の積分を意味する）、それにより候補化合物の胆汁排泄に対する感受性をスクリーニングすること
のステップを含む方法。
【請求項３８】  肝細胞が、ラット、ヒト、サル、ヒトニザル、ネコ、イヌ、ブタ、食用ブタ、蓄牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、シチメンチョウ、ニワトリ、カモおよびガンからなる群から選択される起源から分離される、請求項３７の方法。
【請求項３９】  肝細胞の第１および第２の培養物が、それぞれ更に、肝細胞の長期培養物を含む、請求項３７の方法。
【請求項４０】  肝細胞の第１および第２の培養物が、細管ネットワークを更に含む、請求項３７の方法。
【請求項４１】  肝細胞の第１および第２の培養物が、肝細胞のクラスター、肝細胞の集合体、肝細胞の少なくとも１層、およびその組合せからなる群から選択される配置を有するとして更に特徴付けられる、請求項３７の方法。
【請求項４２】  肝細胞が、マトリクス中に植え込まれた、請求項３７の方法。
【請求項４３】  第１および第２の肝細胞の培養物は、肝細胞のサンドイッチ培養物を更に含み、当該サンドイッチ培養物は肝細胞の少なくとも１層および肝細胞の少なくとも１層を伴う少なくとも１個の毛細胆管を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】  肝細胞の少なくとも１層がマトリクスの２層の間にサンドイッチされる、請求項４３の方法。
【請求項４５】  肝細胞の第１および第２の培養物が、それぞれ更に、肝細胞の長期培養物を含む、請求項４３の方法。
【請求項４６】  当該マトリクスが、生物学的マトリクス培地、合成マトリクス培地、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４４の方法。
【請求項４７】  当該生物学的マトリクス培地が、コラーゲン、ラミニン、基底膜由来複合体、それらの誘導物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】  ステップ(ａ)から(ｄ)をマルチウェルプレートの少なくとも１個のウェルにおいて行う、請求項３７の方法。
【請求項４９】  胆汁排泄感受性の、多数の候補化合物を同時にスクリーニングすることを更に含む、請求項３７の方法。
【請求項５０】  インビボ胆汁排泄感受性の候補親化合物の代謝産物をインビトロでスクリーニングする方法であって、
(ａ)肝細胞の第１セットおよび第２セットの２つの培養物を確立すること、この場合、各培養物は、少なくとも１個の毛細胆管を含み、各セット内の第１の培養物は未処置毛細胆管を含み、そして各セット内の第２の培養物は、破壊された毛細胆管を含み、
(ｂ)候補化合物を取り込むことができる十分な時間(Ｔ)、各セットの第１の培養物および第２の培養物に対し候補親化合物をさらすこと、
(ｃ)第１セットの培養物の肝細胞において代謝酵素活性を誘導すること、
(ｄ)各セットの第１および第２の培養物を洗浄し、次いで細胞溶解させること、
(ｅ)ステップ(ｄ)の各培養物から得られた溶解物中に存在する候補親化合物の量を測定すること、
(ｆ)ステップ(ｄ)における各培養物から得られた溶解物中に存在する候補親化合物の代謝産物の量を測定すること、
(ｇ)ステップ(ｅ)で測定した未処置毛細胆管を有する第１の培養物および破壊された毛細胆管を有する第２の培養物に存在する候補親化合物の量の差異として、毛細胆管における候補親化合物の量を計算して、候補親化合物の胆汁排泄感受性を決定し、
(ｈ)ステップ(ｆ)で測定した未処置毛細胆管を有する第１の培養物および破壊された毛細胆管を有する第２の培養物に存在する候補親化合物の代謝産物の量の差異として、毛細胆管における候補親化合物の代謝産物の量を計算して、それにより候補親化合物の代謝産物の胆汁排泄感受性をスクリーニングすること、
のステップを含む方法。
【請求項５１】  肝細胞が、ラット、ヒト、サル、ヒトニザル、ネコ、イヌ、ブタ、食用ブタ、蓄牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、シチメンチョウ、ニワトリ、カモおよびガンからなる群から選択される起源から分離される、請求項５０の方法。
【請求項５２】  肝細胞の第１および第２セットの培養物が、それぞれ更に、肝細胞の長期培養物を含む、請求項５０の方法。
【請求項５３】  肝細胞の第１および第２セットの培養物が、細管ネットワークを更に含む、請求項５０の方法。
【請求項５４】  肝細胞の培養物が、肝細胞のクラスター、肝細胞の集合体、肝細胞の少なくとも１層、およびその組合せからなる群から選択される配置を有するとして更に特徴付けられる、請求項５０の方法。
【請求項５５】  肝細胞が、マトリクス中に植え込まれた、請求項５４の方法。
【請求項５６】  肝細胞の各培養物が、肝細胞のサンドイッチ培養物を更に含み、当該サンドイッチ培養物が肝細胞の少なくとも１層および肝細胞の少なくとも１層を伴う少なくとも１個の毛細胆管を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】  肝細胞の少なくとも１層がマトリクスの２層の間にサンドイッチされる、請求項５６の方法。
【請求項５８】  肝細胞の培養物が、それぞれ更に、肝細胞の長期培養物を含む、請求項５６の方法。
【請求項５９】  当該マトリクスが、生物学的マトリクス培地、合成マトリクス培地、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５７の方法。
【請求項６０】  当該生物学的マトリクス培地が、コラーゲン、ラミニン、基底膜由来複合体、それらの誘導物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５９の方法。
【請求項６１】  ステップ(ａ)から(ｆ)をマルチウェルプレートの少なくとも１個のウェルにおいて行う、請求項５０の方法。
【請求項６２】  胆汁排泄感受性の、多数の候補親化合物および多数の候補親化合物の代謝産物を同時にスクリーニングすることを更に含む、請求項５０の方法。
【請求項６３】  胆汁中に排泄されない候補化合物、胆汁中に高度に排泄される化合物、ならびに胆汁中に迅速におよび広範囲に排泄される化合物の間を区別するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項６４】  胆汁中に排泄されない候補化合物、胆汁中に高度に排泄される化合物、ならびに胆汁中に迅速におよび広範囲に排泄される化合物の間を区別するステップをさらに含む、請求項１２の方法。
【請求項６５】  胆汁中に排泄されない候補化合物、胆汁中に高度に排泄される化合物、ならびに胆汁中に迅速におよび広範囲に排泄される化合物の間を区別するステップをさらに含む、請求項２３の方法。
【請求項６６】  胆汁中に排泄されない候補化合物、胆汁中に高度に排泄される化合物、ならびに胆汁中に迅速におよび広範囲に排泄される化合物の間を区別するステップをさらに含む、請求項３７の方法。
【請求項６７】  胆汁中に排泄されない候補化合物、胆汁中に高度に排泄される化合物、ならびに胆汁中に迅速におよび広範囲に排泄される化合物の間を区別するステップをさらに含む、請求項５０の方法。
【請求項６８】  誘発される代謝酵素活性がフェーズＩ、フェーズII、輸送代謝酵素活性、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５０の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
略語の表
【表１】
2003502016.tif 000001
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
“候補化合物”または“候補基質”なる語句は、化合物の胆汁排泄感受性の特徴付けが望ましい任意の化合物をいうことを意味する。典型的な候補化合物または基質には、薬物および他の治療剤のような生体異物、発癌物質および環境汚染物質、ならびにステロイド、脂肪酸およびプロスタグランジンのような生体内物質が含まれる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
“胆汁排泄物”なる語句は、基質が、肝細胞(肝臓の細胞)により取り込まれ、毛細胆管を通して胆汁中に排泄されることにより動物循環系から除去される、生物学的過程をいうことを意味する。肝細胞への取り込みは、以下に制限されないが、ＮｔｃｐおよびＯＡＴＰ１を含む肝細胞に内在性の輸送系により仲介される。毛細胆管は、肝細胞からの排泄成分を受け入れ、胆汁を動物から取り除くための胆管に胆汁を輸送する、肝臓組織内の構造である。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４３】
本明細書および請求項中で使用する“候補化合物の量”なる語句および／または“少なくとも１個の毛細胆管中の候補化合物の量を決定する”なる成句により、肝細胞により取り込まれ、本発明のアッセイにより少なくとも１個の毛細胆管中に排泄される任意の候補化合物の量を意味する。例えば、“量”は、本発明により培養物に候補化合物をさらした後、少なくとも１個の毛細胆管中に存在する候補化合物を実質的にいうことができない。他に、“量”は、本発明により培養物に候補化合物をさらした後少なくとも１個の毛細胆管中に存在するすべての候補化合物を実質的にいうことができる。そのため、“少なくとも１個の毛細胆管中の候補化合物の量”を用い、高度に排泄されない、広範囲に排泄されない、および広範囲におよび急速に排泄されない候補化合物が述べられる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
しかし、当業者が容易に認識し得るように、化合物が胆汁排泄に感受性であるという特性が、治療剤としての化合物の更なる開発を必然的に妨げるということはない。実際、治療剤としての特定の候補化合物の開発を続行するかどうかの決定は、以下に限らないが、候補化合物の生物学的活性が含まれる多くの因子に基づく。胆汁排泄感受性は重要な因子である一方、当業者により典型的に考慮される唯一の因子というわけではない。そのため、本発明の方法による胆汁排泄感受性の特徴付けは、治療剤として候補化合物の開発を続行するかどうか評価する当業者による使用に望ましいデータを提供する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４８】
本明細書に述べる胆汁排泄過程を通じて広範囲に取り込まれ排泄される治療組成物は、典型的に、対象に治療効果を供する最小の機会を有する。そのため、評価過程の初期に、治療剤としての更なる評価から望ましくない高感受性を有する化合物を除外することを促進するため、肝細胞の取り込みおよび化合物の胆汁排泄感受性についてのインビトロ試験の確立が非常に望ましい。本発明の胆汁排泄アッセイはその試験を提供する。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６３】
候補親化合物は、候補親化合物の取り込みが可能な十分な時間、第１および第２のセットの培養物にさらされる。各セットの培養物は、洗浄され、次いで細胞溶解される。不活性化代謝性酵素を有する各セットの培養物中の培養物から得られる溶解物中に存在する候補親化合物の量が決定される。活性代謝性酵素を有する各セットの培養物中の培養物から得られる溶解物中に存在する候補親化合物の代謝産物の量もまた決定される。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６６】
候補化合物とマーカー化合物との間の取り込みおよび排泄の競合が評価される。すなわち、培養物中の毛細胆管内のマーカー化合物(例えば、マーカー化合物からのシグナルを測定または検出する)の量における著しい低下は、候補化合物(マーカー化合物とは逆に)は取り込まれ、広く排泄されることを示し得る。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６８】
典型的なマーカー化合物には、蛍光性ｃＭＯＡＴ／ＭＲＰ２基質、カルボキシジクロロフルオレセインが含まれる。好ましくは、弱い蛍光性のみを示す、カルボキシジクロロフルオレセインジアセテートを、肝細胞原形質膜中への迅速な浸透のために蛍光源前駆体として利用する。カルボキシジクロロフルオレセインジアセテートは、Haugland, Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994), p.134, Molecular Probes, Inc., 1992に記載のように、肝細胞の細胞質中で、細胞内エステラーゼにより、高蛍光性産物カルボキシジクロロフルオレセインに容易に加水分解される。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６９】
カルボキシジクロロフルオレセインの蛍光性は、ｐＨに感受性があり、そのため、カルボキシジクロロ蛍光(carboxydichlorofluorescence)の強度に基づく任意のアッセイがｐＨの効果であると考えられる。しかし、０．３ｐＨ単位未満の相違が肝細胞カプレット中のサイトゾルと毛細胆管との間に見られることが観察される。カルボキシジクロロフルオレセインは、酸性オルガネラ中のｐＨ決定に用いられるが、蛍光強度は、ｐＨ７．１とｐＨ７．４との間では顕著に変らない。ｐＨ７．４のカルボキシジクロロフルオレセインの蛍光は、最大放出波長でｐＨ７．１の場合よりも約１０−２０％のみ高い。カルボキシジクロロフルオレセインをカルボキシジクロロフルオレセイン細胞分布に対する定性プローブとして使用する限り、サイトゾルと細管との間の僅かなｐＨ勾配は、本発明の高処理アッセイの適用に影響しない。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７６】
動物
Charles River Laboratory(Raleigh, North Carolina)のオスWistarラット(250-280g)を肝臓ドナーとして使用した。ラットは、研究を行う前、少なくとも１週間は１２時間の明と暗のサイクルで定期的に変化するステンレススチールのゲージ中で個々に飼育し、使用するまでは任意に餌を与えた。胆管にカニューレを挿入されたラット(200-250g)は、Charles River(Raleigh, North Carolina)から得た。すべての方法は、Institutional Animal CareおよびChapel Hill, Chapel Hill, North CarolinaのUniversity of North CarolinaのUse Committeeより承認を得た。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７７】
培養物ディッシュの調製
プラスチック培養ディッシュ(60mm)を肝細胞培養物の調製前に少なくとも１日、ラット・テイル・コラーゲンで前被覆した。ゲル化コラーゲン基部を得るために、氷冷中和コラーゲン溶液(0.1mg、1.5mg/ml、pH7.4)を各培養物ディッシュ上に広げた。新たに被覆したディッシュを約１時間、加湿インキュベーター中、３７℃に静置すると、マトリクス物質はゲルとなり、その後、３ｍｌ ＤＭＥＭを各ディッシュに加え、加湿インキュベーター中に保存した。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７８】
ラット肝細胞の培養物
肝細胞を２段階潅流法で単離した。端的には、ラットを門脈にカニューレを挿入する前にケタミンおよびキシラジン(xylazine)(それぞれ60および12mg/kg i.p.)で麻酔した。当該肝臓は、コラーゲナーゼタイプＩ(0.5mg/ml)を含む酸素で処理したＣａ２＋のないクレブス・ヘンセレイト重炭酸緩衝液でin situで１０分間潅流した。肝臓カプセルは、鉗子で取り出した。肝細胞は、１００ｍｌ ＤＭＥＭ中でゆっくりと肝臓を振盪することにより放出させた。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８１】
サンドイッチ培養した肝細胞を調製するため、中和コラーゲン溶液(0.1ml、約1.5から3.0 mg/ml、pH7.4)を細胞のシード後２４時間後に単層に加えた。コラーゲンオーバーレイを有する培養物は、加湿インキュベーター中で４５分間３７℃でインキュベートし、ＤＭＥＭの添加前にコラーゲンをゲルにした。培地は細胞をシードした後の４日間、毎日変えた。これらの肝細胞は、９６時間または長期培養した肝細胞と呼んだ。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８７】
インビボの胆汁クリアランス、ＣｌＢ(ml/min/kg体重)を等式１により計算した：
【数１】
2003502016.tif 000002
[式中、Ａｍｏｕｎｔｂｉｌｅ(０−Ｔ)は、０から殆どの薬物が全身性循環から排泄されるときである時間Ｔまでの胆汁中に回収される親薬物の量を示し、ＡＵＣ０−Ｔは、血漿濃度−時間曲線の下、０から時間Ｔまでの領域を示す。]。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８８】
インビボの内因性の胆汁クリアランス(ＣｌＢｉｎ、ml/min/kg体重)は、胆汁排泄が優勢排泄経路であると見なされる肝臓性質の十分に攪拌されたモデル(Pang et al., J. Pharmacokinet. Biopharm. 5: 625-653, 1977)に基づく等式２に従い評価した。
【数２】
2003502016.tif 000003
[式中、Ｑは、ラットの肝臓血漿流、４０ｍｌ／ｍｉｎ／体重ｋｇ{(血流×(１−ヘマトクリット)}；Pollack et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 18: 197-202, (1989)を示し、ＣｌＢは、当該文献中で報告されているモデル化合物の胆汁クリアランスか等式１から計算した胆汁クリアランスを示す。]
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８９】
単層中の基質の胆汁排泄は、定量的に、等式３に基づくBiliary Excretion Indexにより評価した。
【数３】
2003502016.tif 000004
[式中、ＵｐｔａｋｅｓｔａｎｄａｒｄおよびＵｐｔａｋｅＣａ＋＋−ｆｒｅｅは、標準緩衝液およびＣａ＋＋のない緩衝液それぞれにおいて前インキュベーションした肝細胞単層における１０分間インターバルの基質の蓄積取り込みを示す。]
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９１】
実施例の結果の要約
本発明による長期サンドイッチ培養した肝細胞における５モデル基質の胆汁排泄は、インビボ胆汁排泄性と一致した。胆汁排泄指標計算を用いる培養した肝細胞における胆汁排泄の定量は上記している。端的には、胆汁排泄指標は、毛細胆管中に維持される基質の割合を示す。実験例の結果は、胆汁中に排泄される用量の割合に基づいてインビボでは無視し得る胆汁排泄に付される化合物(例えば、イヌリン、サリチラート)が、低い胆汁排泄指標を有する(ほぼ０)ことを示す。インビボで胆汁中でより広範囲に排泄される化合物(例えば、メトトレキサート、[Ｄ−ｐｅｎ２，５]エンケファリン、およびタウロコール酸)は、高い胆汁排泄指標を有する(およそ５０％)。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９２】
胆汁排泄指標とインビボで胆汁中に排泄される用量の割合との間の関係は、分類別の相関関係を示すのみである。メトトレキサートおよび[Ｄ−ｐｅｎ２，５]エンケファリンは、胆汁中に“高度に”排泄される(静脈注射用量の約６０％および７０％が、それぞれ、胆汁中に１時間で回収された)化合物を示す。対照的に、タウロコール酸は、静脈注射用量の殆どすべてが１時間未満に胆汁中に排泄される点で“迅速におよび広範囲に”排泄される。そのため、胆汁排泄指標は、無視可能または低い胆汁排泄に対し広範囲に胆汁排泄される化合物群の間で区別され得る。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９３】
しかし、胆汁排泄指標は、メトトレキサート(胆汁排泄指標：約５５％)または[Ｄ−ｐｅｎ２，５]エンケファリン(胆汁排泄指標：約４２％)のような高度に胆汁中に排泄される化合物と、タウロコール酸(胆汁排泄指標：約５６％)のような“迅速にそして広範囲に”排泄される化合物を区別することができないと思われる。胆汁排泄指標におけるこの制限が、この指標が主に細管排泄機能により決定されるという事実に起因し得る。インビボで胆汁中に排泄される静脈投与基質の割合は、シヌソイド取り込み活性、細管排泄活性、および他の競合性排泄過程により決定される。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９４】
胆汁クリアランスは、インビボとインビトロの胆汁排泄の関係の比較としてより有効なパラメーターを示す。当該インビボ胆汁クリアランスは、時間Ｔの胆汁中に排泄された量および時間０と時間Ｔとの間の血漿ＡＵＣの割合として実験例で計算した。殆どの投与用量が時間Ｔで排泄されたため、胆汁クリアランスは、時間０から時間無限大までを計算する胆汁クリアランスに近づく。この点について計算した胆汁クリアランスは、内因性の胆汁クリアランスおよび肝臓血漿流速の関数である。血漿流の効果を無視するため、内因性の胆汁クリアランスを、Pang and Rollan in J. Pharmacokinet. Biolphrm. 5: 625-653, 1997により述べられた肝臓の性質の“十分に攪拌された”モデルに基づき計算した。同様に、インビトロ胆汁クリアランスは、肝細胞単層における細管ネットワーク中に排泄する量およびインキュベーション培地中のＡＵＣの割合として計算した。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９５】
サンドイッチ培養した肝細胞では、当該インキュベーション培地は、同時にディッシュ中の全肝細胞に利用できた。そのため、計算したインビトロの胆汁クリアランスは、内因性の胆汁クリアランスを示す。しかし、胆汁排泄には、２つの過程、すなわち、シヌソイド膜を通した取り込みおよび細管膜を通した排泄が含まれ、厳密な内因性の胆汁クリアランスは、細管膜を通した輸送により決定され、細胞内基質濃度に基づき計算される。そのため、実験例において計算したインビボおよびインビトロの“内因性の”クリアランス値は、当該過程、すなわちシヌソイド取り込みまたは細管排泄の何れかにおいて最も遅いステップにより制限される割合である、“見かけの”内因性の胆汁クリアランスとして呼ばれ得る。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９６】
インビトロ胆汁クリアランスとインビボ内因性胆汁クリアランスとの間の相関関係は、５モデル基質では高かった(r2=0.9865)。インビボ内因性胆汁クリアランスにより、５モデル基質は、３グループ、すなわち：胆汁中に排泄されない化合物(イヌリンおよびサリチラート；約0ml/min/kg)、胆汁中に高度に排泄される化合物(メトトレキサートおよび[Ｄ−ｐｅｎ２，５]エンケファリン、それぞれ約17.3ml/min/kgおよび約34.4ml/min/kg)；および胆汁中に迅速におよび広範囲に排泄される化合物(タウロコール酸、約116.9ml/min/kg)に分類され得る。推算されたインビトロ胆汁クリアランスは、これら３グループの化合物(それぞれ約0、4-13、および56ml/min/kg)の間では適当に区別された。これらの結果から、胆汁クリアランスは、胆汁排泄指標との比較としてインビボとインビトロとの間の胆汁排泄の関係をより正確に特徴付けることが示唆される。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９８】
実施例２
ラットの胆汁中に排泄される用量の割合と培養した肝細胞中の胆汁排泄指標との関係
胆汁排泄性の異なるスペクトルを示す５モデルの基質を選択し、ラットのインビボでの胆汁中に排泄される用量の割合とサンドイッチ培養した肝細胞中の胆汁排泄指標との関係を試験した。静脈投与後のラット胆汁中に排泄される用量の割合に関する情報は文献から得た。胆汁中へのイヌリンおよびサリチラート排泄の程度は無視できた(Eriksson et al., Acta Physiol. Scand. 95: 1-5, 1975; Laznicekand et al., Eur. J. Drug Met. Pharmacokinet. 19: 21-26, 1994)。約５０−６０％の２２μｍｏｌ／ｋｇメトトレキサート用量(Bremnes et al., Cancer Res. 49: 2460-2464, 1989; Masuda et al., Cancer Res. 57: 3506-10, 1997)および７０％の１４．５μｍｏｌ／ｋｇ[Ｄ−ｐｅｎ２，５]エンケファリン用量(Chen et al., Pharm. Res. 14: 345-350, 1997)は１時間で未変化薬物としてラット胆汁中に排泄された。タウロコール酸胆汁排泄は、メトトレキサートおよび[Ｄ−ｐｅｎ２，５]エンケファリンよりも迅速で広範囲であった。１時間で、事実上、１００％の用量(8.0μmol/kg)がラット胆汁中に回収された(Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta. 833; 211-216, 1985)。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０３】
ラットへの[１４Ｃ]２６４Ｗ９４（０．２４μmol／kg）の静脈投与後、２６４Ｗ９４も２１６９Ｗ９４の何れも２４時間では胆汁中には検出されなかった。しかし、全投与放射活性の３５．４％(ｎ＝２)は、最初の１時間で胆汁中に回収された。胆汁中から回収された放射活性の約３０．０％が、２１６９Ｗ９４グルクロニドであり、胆汁中に残る放射活性の７０％は、同定されない代謝産物を示した。ラットへの[１４Ｃ]２６４Ｗ９４（２．４μmol／kg）の経口投与後、２１６９Ｗ９４は、２４時間では胆汁中に検出されなかった。しかし、全投与放射活性の６６．４％(ｎ＝２)が８時間で胆汁中から回収された。胆汁中の放射活性の約８８．７％が、２１６９Ｗ９４グルクロニド結合体型であった。これらインビボの結果は、２６４Ｗ９４およびそのＯ−デメチル化物、２１６９Ｗ９４の胆汁排泄は無視できるが、２１６９Ｗ９４のグルクロニド結合体はラットでは広範囲に胆汁排泄をすることを示す。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０５】
１０分における細胞溶解物のＨＰＬＣ分析は、全放射活性の７３．０％が２６４Ｗ９４型であり、３．３％が２１６９Ｗ９４グルクロニド結合体であり、２１６９Ｗ９４は溶解物中には検出されないことを示した。９６時間のサンドイッチ培養した肝細胞では、２１６９Ｗ９４の１０分の蓄積取り込みは、Ｃａ２＋の非存在下よりもＣａ２＋存在下のほうが約７０％高くなった(ｐ＞０．０５)。１０分の細胞溶解物では、約１６．７％の全放射活性が２１６９Ｗ９４型であり、約５８．５％が２１６９Ｗ９４グルクロニド結合体であった。化合物２１６９Ｗ９４は、長期培養した肝細胞における毛細胆管ネットワーク中に排泄されるグルクロニド結合体を形成する。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０６】
薬物代謝産物のインビボ胆汁排泄を予測する本発明のインビトロ胆汁排泄アッセイの利用性を更に特徴付けるため、２６４Ｗ９４およびそのＯ−デメチル化代謝産物２６９Ｗ９４および２１６９Ｗ９４グルクロニドのインビトロおよびインビボの胆汁排泄を調査した。ラットおよびヒト肝臓ミクロソーム、正確にカットした肝臓スライス、およびｃＤＮＡが発現した肝臓のチトクロムｐ４５０イソ酵素で行われた従前のインビトロ研究は、２４６Ｗ９４が８−メトキシの位置でＯ−デメチル化代謝産物を形成することを示す。調査した幾つかのチトクロムｐ４５０イソ酵素の間では、ＣＹＰ３Ａ４は、２６４Ｗ９４の代謝に主として関与するイソ酵素であった(Silver et al., ISSX Proceedings (San Diego, California USA)p.387, 1996)。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０７】
インビボの性質の研究は、２６４Ｗ９４もそのＯ−デメチル化代謝産物、２１６９Ｗ９４の何れも胆汁中に排泄されないことを示した。しかし、他の非同定性代謝産物を一緒に、２１６９Ｗ９４グルクロニド結合体は、広範囲に胆汁中に排泄された。長期サンドイッチ培養した肝細胞では、２６４Ｗ９４の胆汁排泄の欠損が、２６４Ｗ９４の無視し得るインビボ胆汁排泄と一致した。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０８】
インビボで２６４Ｗ９４均等物の約３５％が、２６４Ｗ９４の静脈注射後１時間で代謝産物として胆汁中に排泄された。しかし、培養した肝細胞では、２６４Ｗ９４代謝産物の胆汁排泄は無視できた(図７Ｂ)。２６４Ｗ９４の代謝産物のインビボおよびインビトロの間の見かけの胆汁排泄の不一致は、代謝活性における相違により説明され得る。インビボで、２６４Ｗ９４をＯ−デメチル化し、２１６９Ｗ９４を形成し、その後、２１６９Ｗ９４をウリジン−５'−ジホスホグルクロン酸と結合させ、２１６９Ｗ９４グルクロニドを形成する。このグルクロニド結合体は、胆汁中に排泄される全量の３０％を占める。２６４Ｗ９４と共にインキュベートした長期サンドイッチ培養肝細胞の溶解物では、インキュベートした全量の約３％しか２１６９Ｗ９４グルクロニド結合体として検出されなかった。これらの結果は、長期培養した肝細胞がＯ−デメチル化反応できないことを示した。結果として、無視し得るグルクロニド結合体が形成され、胆汁中に排泄された。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０９】
しかし、２１６９Ｗ９４、すなわち、２６４Ｗ９４のＯ−デメチル化代謝産物を伴う単層のインキュベーション後、２１６９Ｗ９４の５８．５％がグルクロニド結合体に変換され、有意な胆汁排泄が培養した肝細胞で観察された(図８Ｂ)。明らかに、Ｏ−デメチル化のようなフェーズＩ代謝活性が非常に低下し、その一方、グルクロニド結合体のようなフェーズII代謝活性は、本発明により使用された長期サンドイッチ培養した肝細胞において、少なくとも一部維持される。そのため、実験例が、本発明のアッセイを用い親型の基質のインビボ胆汁排泄を予測し得ることをさらに示す。確かに、代謝産物のインビボ胆汁排泄を研究し予測する本インビトロアッセイ法の適用は、単層中の代謝活性の状態を考慮する必要がある。