【手続補正書】
【提出日】平成20年9月2日(2008.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列又はその免疫原性断片に特異的に結合する単離された抗体。
【請求項２】
配列番号２０に示すアミノ酸配列又はその免疫原性断片に特異的に結合するが、ER-α４６又はER-α６６には特異的に結合しない、単離された抗体。
【請求項３】
抗体断片である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項５】
ポリクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項６】
ヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項７】
化合物に共有結合している、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項８】
前記化合物が化学療法剤である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記化合物が検出可能なマーカーである、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記検出可能なマーカーが蛍光マーカーである、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸１３〜２７に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の抗体を含む組成物。
【請求項１３】
さらに医薬として許容可能な担体を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
抗体の作製方法であって、以下のステップ：
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその免疫原性断片をヒト以外の動物に投与し；そして、
上記動物から抗体を単離すること
を含み、ここで、上記単離された抗体が上記アミノ酸配列に特異的に結合する、前記方法。
【請求項１５】
上記ポリペプチド又はその免疫原性サブユニットが、担体ポリペプチドに共有結合している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記単離が前記動物から前記抗体を産生する細胞を得ることを含む、請求項１４に記載の方法であって、さらに、該細胞を用いてモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製することを含む、前記方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法によって作製されるポリクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法によって作製されるモノクローナル抗体。
【請求項１９】
外来性のコード領域を含む細胞であって、ここで、該コード領域が配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド又は配列番号２０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第二のポリペプチドをコードし、ここで、該第二のポリペプチドがＥＲ−α３６活性を有する、前記細胞。
【請求項２０】
前記コード領域が恒常的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
真核細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２２】
原核細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２３】
外来性のポリペプチドを発現する細胞であって、ここで、該ポリペプチドが配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み且つＥＲ−α３６活性を有する、前記細胞。
【請求項２４】
前記コード領域が恒常的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
真核細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
原核細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２７】
ポリペプチドに結合する剤を同定するための方法であって、以下のステップ：
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと剤を併合し；そして、
上記剤と上記ポリペプチドの間の複合体の形成を検出する；
を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記剤の前記ポリペプチドへの前記結合が、以下の：上記剤の上記ポリペプチドへの上記結合を直接的に検出すること、及び上記剤の上記ポリペプチドへの上記結合を競合結合アッセイを用いて検出すること、からなる群から選ばれる方法によって、検出される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、前記剤が配列番号１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合するか否かを決定することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、前記剤が前記ポリペプチドのＥＲ−α３６活性を阻害するか否かを決定することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドのインビトロの検出方法であって、以下のステップ：
細胞を、ＥＲ−α３６活性及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動後に測定した３６kDaの分子量を有するポリペプチドについて分析し；そして
上記細胞が上記ポリペプチドを発現するか否かを決定する；
を含む、前記方法。
【請求項３２】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍が乳房腫瘍である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記分析が、前記細胞を、配列番号１に示すアミノ酸配列又はその免疫原性断片に特異的に結合する抗体と接触させることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が検出可能なマーカーに共有結合される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出可能なマーカーが蛍光マーカーである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記分析が、ｍRNAポリヌクレオチドを増幅して、増幅されたポリヌクレオチドを形成することを含み、ここで、上記増幅が上記細胞から得られたポリヌクレオチドと、配列番号２２又は配列番号２５に示すヌクレオチド配列或いはその組み合わせを含むｍRNAポリヌクレオチドを増幅するプライマー対を接触させることを含み、ここで、増幅されたポリヌクレオチドの存在が上記細胞が上記ポリペプチドを発現することを示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記プライマー対のうちの1つのプライマーが配列番号２２のヌクレオチド、配列番号２５のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、又はその組み合わせから選ばれ、ここで、各プライマーが少なくとも１５のヌクレオチドを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞のＥＲ−α３６活性を阻害するインビトロの方法であって、配列番号１のアミノ酸１３〜２７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を、ＥＲ−α３６活性を阻害する化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４０】
前記化合物が、配列番号１のアミノ酸１３〜２７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞がＥＲ−α６６陰性である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞がＥＲ−α４６陰性である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物が抗エストロゲン剤でない、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
配列番号１のアミノ酸１３〜２７に示すアミノ酸配列、或いは１つ以上の連続的又は非連続的なアミノ酸の置換、又は除去によって修飾されたそのアナログを含む単離されたポリペプチドであって、ここで前記アナログがＥＲ−α３６（配列番号２０）に結合する抗体の産生を刺激することができる、前記ポリペプチド。
【請求項４５】
さらに、配列番号１のアミノ酸１〜２７に示すアミノ酸配列、或いは１つ以上の連続的又は非連続的なアミノ酸の置換、又は除去によって修飾されたそのアナログを含む単離されたポリペプチドであって、ここで前記アナログがＥＲ−α３６（配列番号２０）に結合する抗体の産生を刺激することができる、前記ポリペプチド。
【請求項４６】
さらに、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４７】
配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドがＥＲ−α３６活性を有する、前記ポリペプチド。
【請求項４８】
配列番号１に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドの免疫原性断片。
【請求項４９】
配列番号１に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体及び包装材料を含む、キット。
【請求項５０】
細胞中でのER-α３６の検出における使用のための請求項１又は２に記載の抗体であって、ここで、前記細胞が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する、前記抗体。
【請求項５１】
対象の細胞中でのER-α３６の検出のための診断剤の製造における、請求項１又は２に記載の抗体の使用であって、ここで、前記細胞が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する、前記使用。
【請求項５２】
さらに担体ポリペプチドを含む、請求項４４又は４５に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４４又は４５に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４４又は４５に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
配列番号２０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４４又は４５に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４４又は４５に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
請求項４４、４５、５２及び５６のいずか１項に記載のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項５８】
さらに、以下の：
前記ポリペプチドを、該ポリペプチドに結合することが知られているリガンドと併合し；そして
前記リガンドに比較した、前記剤の前記ポリペプチドに結合する能力を判定する；
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項５９】
対象中の細胞のER-α３６活性を阻害するための医薬の製造における、ER-α３６活性を阻害する化合物の使用であって、ここで、上記細胞が、配列番号１のアミノ酸１３〜２７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する、前記使用。
【請求項６０】
前記化合物が、配列番号１のアミノ酸１３〜２７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、請求項５９に記載の使用。
【請求項６１】
前記細胞が、ＥＲ−α６６陰性である、請求項５９に記載の使用。
【請求項６２】
前記細胞が、ＥＲ−α４６陰性である、請求項５９に記載の使用。
【請求項６３】
前記化合物が、抗エストロゲン剤でない、請求項５９に記載の使用。
【請求項６４】
対象中の細胞のER-α３６活性の阻害における使用のための、ＥＲ−α３６活性を阻害する化合物であって、ここで、上記細胞が、配列番号１のアミノ酸１３〜２７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する、前記化合物。
【請求項６５】
前記化合物が、配列番号１のアミノ酸１３〜２７に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、請求項６４に記載の化合物。
【請求項６６】
前記細胞が、ＥＲ−α６６陰性である、請求項６４に記載の化合物。
【請求項６７】
前記細胞が、ＥＲ−α４６陰性である、請求項６４に記載の化合物。
【請求項６８】
前記化合物が、抗エストロゲン剤でない、請求項６４に記載の化合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
【図１】図１は、ヒトエストロゲン受容体−アルファ（ER-α）アイソフォームのドメイン構造を表したものを図示する。（A〜Fで標識された）ドメイン、アミノ酸配列番号付け、AF-1及びAF-2、DNA結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、及び二量体化ドメインが示される。各ドメインのリン酸化部位及び機能も示される。
【図２】図２は、ER-αの膜及びゲノムのシグナル伝達経路間の可能なクロストークを模式的に示す。Cav-1はカベオリンー１を表し、ER-αはエストロゲン受容体−アルファを表し；RTKは受容体チロシンキナーゼを表し；RasはRas癌遺伝子を表し；Mekは、MAP/ERKキナーゼを表し；MAPKはマイトゲン活性化プロテインキナーゼを表し；PI3Kは、ホスホイノシトール−トリホスフェートキナーゼを表し；AKTはプロテインキナーゼ１３を表し；PDK1は、ホスホイノシトール依存性プロテインキナーゼを表し；RSKは、p90リボソームS6キナーゼを表す。
【図３】図３は、pRET感染したMCF10A細胞がエストラジオール（E2）存在下のソフト寒天中で大きなコロニーに増殖することを示す写真である。ST1クローンは、E2含有ソフト寒天中で増殖の促進を示した。MCF7及びMCF10A細胞は、それぞれ、陽性及び陰性対照として含まれる。
【図４】図４は、pRET感染したMCF10A細胞におけるカベオリンー１（Cav-1）発現の下方制御を示すウエスタンブロットである。様々な細胞株からの等量の全細胞抽出物を、抗−Cav-1ウサギ抗体（N20）を用いるウエスタンブロットによって分析した。Cav-1の位置を矢印で示し、各レーンにおける分析された細胞抽出物を各レーンの上部に示した。
【図５】図５は、pRET感染したMCF10A細胞におけるER-αの発現の上方制御を示すウエスタンブロットである。様々な細胞株からの等量の全細胞抽出物を、ER-α（H２２２）及びER-βに対する抗体を用いるウエスタンブロットによって分析した。ER-α及びER-βの位置を矢印で示し、各レーンにおける分析された細胞抽出物を各レーンの上部に示した。
【図６】図６は、pRET感染したMCF10A細胞におけるERK1/2リン酸化の活性化を示すウエスタンブロットである。上記細胞株からの等量の全細胞抽出物を、ERK1/2及びリン酸化ERK1/2に対する抗体を用いるウエスタンブロットによって分析した。
【図７】図７は、Cav-1ハプロ不全細胞、ST1及びST3並びにMCF7乳癌細胞における３つのER-αタンパク質の存在を示すウエスタンブロットである。上記細胞株からの等量の全細胞抽出物を、ER-αに対するH222抗体を用いるウエスタンブロットによって分析した。ER-α６６、ER-α４６及びER-α３６の位置を矢印で示し、各レーンにおける分析された細胞抽出物を各レーンの上部に示した。
【図８】図８は、ヒトER-α遺伝子のゲノム構造を示す。複数のプロモーターの位置を矢印で示す。翻訳開始及び停止部位をAUG及びUGAで示す。エキソンを番号のついた四角で示す。イントロン１もエキソン１’とともに四角中に示す。下のパネルは、ER-αアイソフォームのmRNA構造を示す。ポリA部位はAAAで示す。
【図９】図９は、ER-α３６のオープンリーディングフレームをコードするcDNAのPCRによる単離を示すアガロースゲルの写真である。ゲル中のcDNAの位置を矢印で示す。
【図１０】図１０は、ER-α３６オープンリーディングフレームの予測されたアミノ酸配列を示す。アミノ酸位置を、アミノ酸配列（配列番号２０）の左側上の数字によって示す。ER-α３６に特有の最後の２７アミノ酸（配列番号１）に下線を引く。
【図１１】図１１は、ER-α６６、ER-α４６及びER-α３６のウエスタンブロット分析を示す。ER-α６６、ER-α４６及びER-α３６とマークしたレーンは、示したエストロゲン受容体アイソフォームをコードする発現プラスミドでトランスフェクトしたHEK２９３細胞の別々の培養であり、トランスフェクトした２日後に溶解させた。各トランスフェクタントのライセートを抗−ER-α抗体（H222）で免疫検出した。MCF7細胞からの細胞抽出物を陽性対照として使用した。ER-α６６、ER-α４６及びER-α３６の位置は矢印で示した。
【図１２】図１２は、（ａ）ER-α３６プロモーターを含む、ER-α３６をコードする遺伝子の５’フランキング配列（配列番号２２）のDNA配列及び（ｂ）エキソン９によりコードされるヌクレオチドを含む、ER-α３６をコードする３’フランキング配列（配列番号２５）のDNA配列を示す。５’フランキング配列においては、仮定の転写結合部位に下線をひき、核酸配列に結合するタンパク質もまた示す。cDNAの開始部位もまた矢印で示す。
【図１３】図１３は、異なる乳癌細胞、MCF10A、T47D、MCF7、及びMDA-MB-231中のER-α３６のノーザンブロット分析を示す。ER-α３６及びアクチンの位置を矢印で示す。
【図１４】図１４は、ER-α６６及びER-βのAF-1及びAF-2ドメインによって仲介される転写トランス活性化活性のER-α３６による阻害を示す。（+E２）、E2処理した細胞；（−E2）、E２処理しない細胞。
【図１５ａ】図１５は、ER-α３６が、E2によって刺激された膜性のMAPKキナーゼ経路を仲介することを示す。（ａ）ウエスタンブロットは、エストラジオール-１７β（Ｅ２β）によるＥＲ３６−２９３細胞の処理がMek1/2及びERK1/2それぞれの急速なリン酸化を誘導することを示す。P-Mek1/2及びP-ERK1/2、それぞれ、Mek1/2及びERK1/2のリン酸化形態。
【図１５ｂ】図１５は、ER-α３６が、E2によって刺激された膜性のMAPKキナーゼ経路を仲介することを示す。（ｂ）E2βではなく、血清が対照ベクター-２９３細胞におけるERK1/2のリン酸化を誘導する。P-ERK1/2、ERK1/2のリン酸化形態。
【図１５ｃ】図１５は、ER-α３６が、E2によって刺激された膜性のMAPKキナーゼ経路を仲介することを示す。（ｃ）異なるエストロゲン及び抗エストロゲン剤が、ER36-293細胞におけるERK1/2の急速なリン酸化を誘導する。P-ERK1/2、ERK1/2のリン酸化形態。
【図１５ｄ】図１５は、ER-α３６が、E2によって刺激された膜を介するMAPKキナーゼ経路を仲介することを示す。（ｄ）タモキシフェン処理が、ER36-293細胞におけるERK1/2のリン酸化を恒常的に刺激する。P-ERK1/2、ERK1/2のリン酸化形態。
【図１６ａ】図１６は、ER-α３６が、E2βにより誘導されたMAPKキナーゼ核シグナル伝達を仲介し、そして細胞増殖を刺激することを示す。（ａ）E2βのMAPKキナーゼ核シグナル伝達に対する効果。ER36-293及び対照ベクター-２９３細胞を一過性に５X Gal4-LUC,5つのGal4 DNA結合部位を含むルシフェラーゼレポータープラスミド及びGal4 DNA結合ドメインと融合されたELK転写活性化ドメインを含むGal-ELK発現ベクターでトランスフェクトした（上のパネル）。トランスフェクト後、培養細胞をエストロゲンを含まない培地中で３６時間、１２時間E2β（１nM又は１０nM）を加える前に保持した。標準偏差を伴うルシフェラーゼ活性は、二連で実施した３つを超える実験を代表する。
【図１６ｂ】図１６は、ER-α３６が、E2βにより誘導されたMAPKキナーゼ核シグナル伝達を仲介し、そして細胞増殖を刺激することを示す。（ｂ）E2β及び抗エストロゲン剤がER36-293細胞の増殖を刺激する。４９０nmにおける吸収データを示す。５つ以上の独立した実験の結果を平均し；平均及びSEMを示す。これらの結果の統計学的有意性も対のｔ−検定によって評価した。ER36-293及びベクター-２９３細胞についてのP値は０．００１未満であった。
【図１７ａ】図１７は、ER-α３６が主に膜に基づくエストロゲン受容体であることを示す。（ａ）異なる確立された乳癌細胞株におけるER-α３６の発現のウエスタンブロット分析。同じブロットをはがし、抗-アクチン抗体でプローブして等しい負荷であることを確認した。
【図１７ｂ】図１７は、ER-α３６が主に膜に基づくエストロゲン受容体であることを示す。（ｂ）ER-α３６でトランスフェクトした２９３細胞におけるER-α３６の細胞内位置。異なる細胞内分画中のER-α３６のER-α３６特異的抗体によるイムノブロット。W、全細胞ライセート；PM、細胞膜；C、サイトソル；N、核。細胞内分画の純度を、細胞膜、サイトソル、核及びゴルジ体のための多様なタンパク質マーカーでイムノブロットすることによって試験した。5'NT、５’ヌクレオチダーゼ；D4-GDI、GDP解離阻害剤；ｍSin3A、ヒストンリモデリング複合体の成分；COPB、βコートタンパク質。
【図１８】図１８は、E2βがER-α６６陰性乳癌細胞、MDA-MB-231のソフト寒天中での増殖を促進することを示す。MDA-MB-231細胞をE2βの非存在下（０）、及び１０nMのE2β（E2）、１０nMのE2β及び１０nMタモキシフェン（E2+TAM）並びに１０nMのタモキシフェンのみ（TAM）の存在下で３週間増殖させた。
【図１９】図１９は、E2βが、ER-α６６陰性乳癌細胞MDA-MB-231における膜性のエストロゲンシグナル伝達を誘導することを示す。MDA-MB-231のエストラジオール17β（E2β）による処理は、ERK1/2の急速なリン酸化を誘導した。細胞をE2β（１０nM）で異なる時間の間処理し、溶解し、そして、リン酸化依存性及び非依存性の抗体を用いてウエスタンブロットで分析した。