(57)【要約】  本発明は新たな糖尿病治療薬の提供に関する。本発明に従って、ペプチド側鎖を糖鎖で修飾することにより、酵素分解に対して抵抗性のあるグルカゴン様ペプチド−１誘導体を合成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分解酵素に対する耐性を付与したGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項２】
下式（Ｉ）で示されるＧＬＰ−１(7-36)アミド、若しくは下式（ＩＩ）で示されるエキセンディン-4
【化１】
2007063907.tif 000052
または該アミノ酸配列において１個から１１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドにおいて、
１）式（Ｉ）で表されるペプチドのアミノ酸配列中、７位のHis、８位のAla、９位のGlu、１１位のThr、１４位のSer、１６位のVal、１７位のSer、１８位のSer、１９位のTyr、２０位のLeu、２１位のGlu、２２位のGly、２３位のGln、２４位のAla、２５位のAla、２６位のLys、２７位のGlu、３０位のAla、３１位のTrp、３２位のLeu、３３位のVal、３４位のLys、３５位のGlyおよび３６位のArgから選択される１個若しくはそれ以上のアミノ酸が、いずれも側鎖に糖鎖が付加したセリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、およびシステインからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換された；または、
ペプチド（ＩＩ）のアミノ酸配列中、１位のHis、２位のGly、３位のGlu、５位のThr、８位のSer、１０位のLeu、１１位のSer、１２位のLys、１７位のGln、１４位のMet、１５位のGlu、１６位のGlu、１７位のGlu、１８位のAla、１９位のVal、２０位のArg、２１位のLeu、２４位のGlu、２５位のTrp、２６位のLeu、２７位のLys、２８位のAsn、２９位のGly、３０位のGly、３１位のPro、３２位のSer、３３位のSer、３４位のGly、３５位のAla、３６位のPro、３７位のPro、３８位のProおよび３９位のSerから選択される１個若しくはそれ以上のアミノ酸が、いずれも側鎖が糖鎖修飾されたセリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、およびシステインからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換された；および／または
２）該付加されたアミノ酸において、１もしくはそれ以上のアミノ酸が、いずれも側鎖に糖鎖が付加したセリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、およびシステインからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換された；
ＧＬＰ−１関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項３】
下式（ＩＩＩ）：
【化２】
2007063907.tif 000053
［式中、Xaaは、Hisまたは式：
【化３】
2007063907.tif 000054
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アリールで置換されていてもよい低級アルキル、低級アルキルカルボニルアミノ、ヒドロキシ、低級アルキルオキシ、ハロゲン原子、低級アルキルスルホニル、もしくはトリフルオロメチル、またはＲ１とＲ２は一緒になって単結合、ここでアリールは、アミノ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルキルオキシ、ハロゲン原子、低級アルキルスルホニル、低級アルキルカルボニルアミノおよびトリフルオロメチルから選択される置換基で置換されていてもよい；Ａは、式：
【化４】
2007063907.tif 000055
（式中、Ｑは窒素原子、酸素原子または硫黄原子）で表される環式基であり、該環式基は、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルキルオキシ、ハロゲン原子、トリフルオロメチル及びアリールからなる群から選択される置換基で１または複数の官能基で置換されていてもよい］で表される基；
Xbbは、Ala、D-Ala、Gly、Asp、Glu、Phe、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Val、Tyr、または式：
【化５】
2007063907.tif 000056
【化６】
2007063907.tif 000057
【化７】
2007063907.tif 000058
【化８】
2007063907.tif 000059
【化９】
2007063907.tif 000060
（式中、Ｒはそれぞれ独立して糖鎖、Ｘ、ＹおよびＺはリンカー、ｍ、ｎ、ｐ、ｗ、ｘ、ｙ、ｚはそれぞれ１〜１０の整数を表す）
で表される糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xccは、Gluまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xddは、Thr、Ala、Gly、Ile、Leu、Ser、Val、Aspまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xeeは、Ser、Ala、Gly、Ile、Leu、Thr、Valまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xffは、Val、Leu、Ala、Gly、Ile、Ser、Thr、Tyrまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xggは、Ser、Ala、Gly、Ile、Leu、Thr、Valまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xhhは、Ser、Lys、Ala、Gly、Ile、Leu、Thr、Valまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xiiは、Tyr、Gln、Phe、Trp、または糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xjjは、Leu、Met、Ala、Gly、Ile、Leu、Ser、Thr、Valまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xkkは、Glu、Ala、Gly、Gln、Ser、Thr、Aspまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xllは、Gly、Glu、Ala、Ile、Leu、Ser、Thr、Val、Aspまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xmmは、Gln、Glu、Asn、Arg、Aspまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xnnは、Ala、Gly、Ile、Leu、Arg、Ser、Thr、Valまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xooは、Ala、Val、Gly、Ile、Leu、Ser、Thrまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xppは、Lys、Arg、His、Gln、または糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xqqは、Glu、Leu、Ala、Gly、Gln、Ser、Thr、Aspまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xrrは、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Ser、Thr、Val、Aspまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xssは、Trp、Phe、Tyrまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xttは、Leu、Ala、Gly、Ile、Ser、Thr、Valまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xuuは、Val、Lys、Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Argまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xvvは、Lys、Asn、His、Gln、Argまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xwwは、Gly、Ala、Ile、Leu、Ser、Thr、Valまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xxxは、Arg、Gly、His、Lysまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xyyは、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Ser、Thr、Valまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基；
Xzzは、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、または非存在；
Yaaは、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、または非存在；
Ybbは、Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、または非存在；
Yccは、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、または非存在；
Yddは、Pro、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、または非存在；
Yeeは、Pro、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、または非存在；
Yffは、Pro、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、または非存在；
Yggは、Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、Tyr、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、または非存在；
ただし、Xaa〜Yggの１個〜６個が糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基で置換され、かつ、Xaa〜Yggのアミノ酸配列と、式（Ｉ）若しくは式（ＩＩ）のペプチドアミノ酸配列のいずれかとを対比した場合、非存在および異なるアミノ酸の総数は最大で１１残基であるものとする］
で表されるペプチド誘導体、またはそのエステル、アミド、アルキルアミド、もしくはジアルキルアミド；および／またはその薬理学的に許容される塩、であるGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項４】
XaaがHis、XbbがAla、XccがGlu、XddがThr、XeeがSer、XffがVal、XggがSer、XhhがSer、XiiがTyr、XjjがLeuまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XkkがGluまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XllがGlyまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XmmがGlnまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XnnがAlaまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XooがAlaまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XppがLysまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XqqがGluまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XrrがAlaまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XssがTrpまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XttがLeuまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XuuがValまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XvvがLysまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XwwがGlyまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XxxがArgまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XyyがGlyまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基である請求項３記載のGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項５】
XaaがHis、XbbがAla、XccがGlu、XddがThr、XeeがSer、XffがVal、XggがSer、XhhがSer、XiiがTyr、XjjがLeuまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XkkがGluまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XllがGlyまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XmmがGlnまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XnnがAlaまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XooがAlaまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XppがLysまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XqqがGluまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XrrがAlaまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XssがTrpまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XttがLeuまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XuuがValまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XvvがLysまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XwwがGlyまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XxxがArgまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XyyがGlyまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、およびXzz〜Yggが非存在である、請求項３記載のGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項６】
Xpp、Xvv、および／またはXyyのみが、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基で置換された、請求項４記載のGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項７】
Xpp、Xvv、および／またはXyyのみが、糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基で置換された、請求項５記載のGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項８】
XaaがHis、XbbがGly、XccがGlu、XddがThr、XeeがSer、XffがLeu、XggがSer、XhhがLys、XiiがGln、XjjがMetまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XkkがGluまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XllがGluまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XmmがGluまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XnnがAlaまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XooがValまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XppがArgまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XqqがLeuまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XrrがGluまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XssがTrpまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XttがLeuまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XuuがLysまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XvvがAsnまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XwwがGlyまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XxxがGlyまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XyyがProまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、XzzがSerまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、YaaがSerまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、YbbがGlyまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、YccがAlaまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、YddがProまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、YeeがProまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、YffがProまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基、YggがSerまたは糖鎖付加アミノ酸残基群Ａから選択される糖鎖付加アミノ酸残基である請求項３記載のGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項９】
糖鎖が下式
【化１０】
2007063907.tif 000061
【化１１】
2007063907.tif 000062
【化１２】
2007063907.tif 000063
【化１３】
2007063907.tif 000064
【化１４】
2007063907.tif 000065
【化１５】
2007063907.tif 000066
Glc
Gal
Lac
NeuAcα2-3Galβ1-4Glc
NeuAcα2-6Galβ1-4Glc
NeuAcα2-6(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc
NeuAcα2-6(NeuAca2-3)Galβ1-4GlcNAc
Gen、および
(Mal)n
から選択される糖鎖である請求項３記載のGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項１０】
糖鎖が、下式
【化１６】
2007063907.tif 000067
【化１７】
2007063907.tif 000068
NeuAcα2-6(NeuAca2-3)Galβ1-4GlcNAc、および
Gen
で示される糖鎖であり、糖鎖付加アミノ酸残基が次式（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）、（ｇ’）、（ｊ）
【化１８】
2007063907.tif 000069
【化１９】
2007063907.tif 000070
【化２０】
2007063907.tif 000071
（ｎは１〜１０の整数を表す）
で示されるいずれかの糖鎖付加アミノ酸残基より選択される、請求項３記載のGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体。
【請求項１１】
請求項３記載のGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項３記載のGLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体を有効成分とする、糖尿病の治療または予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な糖鎖付加ペプチドおよびそれを有効成分とする医薬に関する。より詳細には、インスリンの分泌を促進し糖尿病治療薬として有用なグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）に関連するペプチド糖鎖付加体に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルガゴン様ペプチド−１(GLP-1)は小腸のL細胞から血中に分泌される30アミノ酸残基からなるペプチドホルモンである (後記非特許文献１参照)。GLP-1は糖濃度依存的にインスリン分泌を促進し、グルカゴンの分泌を抑制すること、食欲抑制、胃内容排泄の抑制などの作用がある(後記非特許文献２参照)ことから糖尿病治療薬として期待されている。しかし、天然型のGLP-1は生体内でジペプチジルペプチダーゼ IV (DPP-IV)による分解をうけ、N末端側の2つのアミノ酸残基が切断された不活性体になること（後記非特許文献３、４参照）さらには血中半減期が数分であること(後記非特許文献５参照)から臨床応用が困難であった。これまでに、DPP-IV作用部位周辺のアミノ酸置換や修飾によるDPP-IV耐性を付与した誘導体は、N末端のHis7の修飾(後記非特許文献６、７、８参照)、Ala8のアミノ酸置換（後記非特許文献９、１０、１１参照）Glu9のアミノ酸置換（後記非特許文献１２参照）など数多く報告されている。【０００３】
【非特許文献１】Lancet. 1987 2 1300-4
【非特許文献２】Regul Pept 2005; 128: 135-48
【非特許文献３】Eur J Biochem 1993; 214: 829-35
【非特許文献４】J Biol Chem 1997; 272: 21201-6
【非特許文献５】Diabetologia 1998; 41: 271-278
【非特許文献６】Regul Pept 2001; 96: 95-104
【非特許文献７】Regul Pept 2000; 86: 103-111
【非特許文献８】Regul Pept 1999; 79: 93-102
【非特許文献９】JBC 2004; 279: 3998-4006
【非特許文献１０】J Endocrinol 1998; 159: 93-102
【非特許文献１１】Metabolism 1999; 48: 252-258
【非特許文献１２】Biol Chem 2003; 384: 1543-1551
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は血中半減期が長く、インスリン分泌促進剤として有用なGLP-1関連ペプチドの誘導体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、GLP-1関連ペプチドを糖鎖で修飾することにより、インスリン分泌促進作用を保持しつつ、DPP-IVに対する抵抗性を与え得ることを見出して本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００６】
GLP-1関連ペプチドの糖鎖付加体は血中半減期が長く、持続性のあるインスリン分泌促進作用を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
合成した糖鎖付加体のMSスペクトル分析結果を示した図である。
【図１】GL34Nの糖修飾体のMSスペクトル測定結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明により提供される糖鎖付加体はGLP-1関連ペプチドの側鎖に以下で説明する糖鎖が結合した糖ペプチドである。ここで、GLP-1関連ペプチドとは、下式（I）で示されるGLP-1(7-36)アミドまたは下式(II)で示されるエキセンディン-4
【化１】
2007063907.tif 000002
を意味し、これらアミノ酸配列から１個から１１個、好ましくは１個〜６個、さらに好ましくは１個〜３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したペプチドも包含される。【０００９】
GLP-1関連ペプチドはインスリン分泌促進作用を有するが、上記ペプチド（I）において、7位のHis、10位のGly、12位のPhe、13位のThr、15位のAsp、28位のPhe、および29位のIle、さらに上記ペプチド（II）において、1位のHis、4位のGly、6位のPhe、7位のThr、9位のAsp、22位のPhe、および23位のIleがその活性発現に重要であるため、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加はこれらの存在に影響しないものが好ましい。【００１０】
また、7位のHisについてはヘテロ環を側鎖に有するアミノ酸類似体で置換することができる。具体的には、下式
【化２】
2007063907.tif 000003
【００１１】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アリールで置換されていてもよい低級アルキル、低級アルキルカルボニルアミノ、ヒドロキシ、低級アルキルオキシ、ハロゲン原子、低級アルキルスルホニル、もしくはトリフルオロメチル、またはＲ１とＲ２は一緒になって単結合、ここでアリールは、アミノ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルキルオキシ、ハロゲン原子、低級アルキルスルホニル、低級アルキルカルボニルアミノおよびトリフルオロメチルから選択される置換基で置換されていてもよい；【００１２】
Ａは、式：
【化３】
2007063907.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｑは窒素原子、酸素原子または硫黄原子）で表される環式基であり、該環式基は、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルキルオキシ、ハロゲン原子、トリフルオロメチル及びアリールからなる群から選択される置換基で１または複数の官能基で置換されていてもよい］
で表される残基で置換することが可能である。
次に糖鎖付加の形態につき説明する。糖鎖はアミノ酸の側鎖官能基に直接、またはリンカーを介して結合することができる。具体的には、下式【００１４】
【化４】
2007063907.tif 000005
【化５】
2007063907.tif 000006
【化６】
2007063907.tif 000007
【化７】
2007063907.tif 000008
【化８】
2007063907.tif 000009
【００１５】
（式中、Ｒはそれぞれ独立して糖鎖、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれリンカー、ｍ、ｎ、ｐ、ｗ、ｘ、ｙ、ｚはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示されるように、Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、および／またはCysの側鎖に糖鎖が付加することができる。「側鎖に糖鎖が付加したセリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、およびシステイン」は、上記式で表される基を包含する。【００１６】
リンカーとしては、Ｘは置換されていてもよいメチレン鎖を包含する。【００１７】
天然型GLP-1(7-36)アミドはそのＮ末端側の２つのアミノ酸残基がDPP-IVにより酵素的に切断され不活性体になることが知られている。従って、その活性に影響しない限り、糖鎖付加部位は酵素切断される部位に近い位置が好ましい。
式（I）で示される天然型GLP-1(7-36)アミドの活性を保持しながら、DPP-IVによる切断を防ぐためには、20位以降に上記糖鎖付加アミノ酸を１〜３箇所導入することが好ましい。２６位、３４位、および／または３７位に糖鎖付加アミノ酸を導入することが好ましい。すなわち、式（I）において、7位のHis、10位のGly、12位のPhe、13位のThr、15位のAsp、28位のPhe、および29位のIleは欠失または置換させず、20位以降に上記糖鎖付加アミノ酸を１〜３箇所導入することが好ましい。特に、２６位、３４位、および／または３７位に糖鎖付加アミノ酸を導入することが好ましい。
式（III）においては、XaaがHisであり、Xjj〜Xyyに上記糖鎖付加アミノ酸を１〜３箇所導入、特にXpp、Xvv、および／またはXyyに糖鎖付加アミノ酸を導入したペプチドが好ましい（この場合、Xzz〜Yggは不存在であり、Xaa〜Ygg以外のアミノ酸は欠失または置換されない。）。変異をおこしていないアミノ酸については、式（I）で表されたアミノ酸であることが好ましい。
式(II)で示されるエキセンディン-4の活性を保持しながら、薬効持続性を向上するためには、１７位以降に上記糖鎖付加アミノ酸を１〜4箇所導入することが好ましい。２１位、２８位、３５位、および／または４０位に糖鎖付加アミノ酸を導入することが好ましい。すなわち、式（II）において、1位のHis、4位のGly、6位のPhe、7位のThr、9位のAsp、22位のPhe、および23位のIleは変異させず、１７位以降に上記糖鎖付加アミノ酸を１〜4箇所導入することが好ましい。特に、２１位、２８位、３５位、および／または４０位に糖鎖付加アミノ酸を導入することが好ましい。
式（III）においては、XaaがHisであり、Xｍｍ〜46位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を１〜4箇所導入、特にXqq、Xvv、Ycc、および／または46位に糖鎖付加アミノ酸を導入したペプチドが好ましい。変異を起こしていないアミノ酸については、式（II）で表されたアミノ酸であることが好ましい（この場合、Xaa〜Ygg以外のアミノ酸は欠失または置換されない。）。【００１８】
ペプチドの修飾に用いる糖鎖の種類は特に限定されない。本発明で使用される糖鎖を以下に例示する（式中、ｎは０〜１０の整数、ｍは０〜１０の整数）。
【化９】
2007063907.tif 000010
【００１９】
【化１０】
2007063907.tif 000011
【００２０】
【化１１】
2007063907.tif 000012
【００２１】
【化１２】
2007063907.tif 000013
【００２２】
【化１３】
2007063907.tif 000014
【００２３】
【化１４】
2007063907.tif 000015
【００２４】
【化１５】
2007063907.tif 000016
【００２５】
【化１６】
2007063907.tif 000017
【００２６】
【化１７】
2007063907.tif 000018
【００２７】
【化１８】
2007063907.tif 000019
【００２８】
【化１９】
2007063907.tif 000020
【００２９】
【化２０】
2007063907.tif 000021
【００３０】
【化２１】
2007063907.tif 000022
式中の略号は次のとおりである；
Fuc            D-フコース
Gal            D-ガラクトース
GalNAc         N-アセチル-D-ガラクトサミン
Glc            D-グルコース
GlcNAc         N-アセチル-D-グルコサミン
Man            D-マンノース
NeuAc          N-アセチル-D-ノイラミン酸
Lac            ラクトース
Gen            ゲンチオビオース
特に好ましい糖鎖としては
【化２２】
2007063907.tif 000023
【化２３】
2007063907.tif 000024
NeuAcα2-6(NeuAca2-3)Galβ1-4GlcNAc、および
Gen
が挙げられる。【００３１】
で示した、式（I）、（II）、および（III）の好ましいペプチドに、上記の糖鎖、特に好ましい糖鎖として挙げた糖鎖が付加したペプチドの糖鎖付加体が特に好ましい。
本明細書中、「分解酵素」とは、DPP-IV，neutral endopeptidase などのGLP-1関連ペプチドの代謝に関わる分解酵素を意味する。【００３２】
GLP-1関連ペプチドのペプチド鎖はBoc法またはFmoc法によるペプチド固相合成により好適に合成することができる。糖鎖による修飾は、例えば、Asn(GlcNAc)のような単糖付加体を用いてペプチド固相合成を行い、必要に応じその後に糖鎖をさらに修飾して実施することができる。糖鎖伸長には糖転移酵素等を用いることができる。【００３３】
具体的には、当該ペプチド鎖におけるアスパラギン残基の側鎖に糖が結合した修飾体（Asn型）は以下の方法により合成される。
【化２４】
2007063907.tif 000025
【００３４】
また、システイン残基の側鎖に糖が結合した修飾体（Cys型）は、固相合成によって調製したシステイン置換ペプチドと、化学合成したヨードアセチル誘導体を下記の一般式に従って結合することによって合成される。
【化２５】
2007063907.tif 000026
ただし、点線方向にGLP-1関連ペプチドのペプチド鎖が存在し、Ｒは糖鎖を示す。
２分岐Ｎ型糖鎖(E1)修飾体は、エンド-Ｍ酵素を用いた方法、または後記参考例の化合物3とシステイン置換ペプチドとの反応によって得られる。
２分岐Ｎ型糖鎖集積体(E2)修飾体は、後記参考例の化合物7とシステイン置換ペプチドとの反応によって得られる。
Gal集積体(J3Gal)修飾体は、後記参考例の化合物21とシステイン置換ペプチドとの反応によって得られる。【００３５】
試験例
本発明の糖鎖付加体のインスリン分泌促進作用を受容体に対するアゴニスト活性（cAMP産生）とレセプター結合試験により評価した。さらに、GLP-1誘導体では、DPP−IVによる酵素分解速度パラメータを測定し、また、DPP−IVに対して抵抗性を有するエキセンディン−４関連誘導体では血糖降下試験を行って各付加体の作用持続性を評価した。
１．cAMP産生試験
GLP-1レセプター強制発現CHO細胞を384-ウェルプレートに4000 cells/wellで播種し、48時間培養した。アッセイバッファー (Hanks/20mM HEPES、 pH 7.4、 0.1 % BSA) で細胞を3回洗浄後、アッセイバッファー20μLを加え、更に0.1mM IBMX、 0.2 mM RO20-1724を含むアッセイバッファーで調製したGLP-1誘導体溶液 (終濃度10-12-10-6M) 10μLを添加した。室温下1時間反応後、Triton X-100 (終濃度1 %) を添加して細胞を溶解した。cAMPの定量はcAMP フェントモラーキット(シスビオ・インタナショナル社) を用いて行った。即ち、新たな384-ウェルプレートに反応液1μLを移し、キットの希釈液を9μL加えて10倍に希釈した。次いで、キットのcAMP-XL665溶液と抗cAMP-クリプテート溶液を各5μL添加し室温の下1時間インキュベートした後、RUBYstar (BMG ラブテック社) で時間分解蛍光を測定した。産生cAMP量はcAMPの検量線に基づき算出した。GLP-1による最大cAMP産生量を100 %とし、50 %活性を与える濃度を被検物質のEC50値とした。【００３６】
２．レセプター結合試験
GLP-1レセプター強制発現CHO細胞から定法により調製した膜画分5μg、放射性リガンド[125I]GLP-1(7-36) (パーキンエルマー社) (終濃度62 pM)，アッセイバッファー (25 mM HEPES、pH 7.4、5 mM MgCl、1 mM CaCl2、0.25 mg/mL バシトラシン, 0.1 % BSA)で調製したGLP-1誘導体(終濃度10-11-10-6M) を含む反応溶液(25mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.25 mg/mL バシトラシン、0.1 % BSA) 100μLを調製した。室温下2時間インキュベートした後，0.5 % BSAを含む1 %ポリエチレンイミンで前処理したユニフィルター 96 GF/Cプレート (パーキンエルマー社) に移して吸引濾過し，0.5 % BSAを含む25 mM HEPES緩衝溶液 (pH7.4) で洗浄後、フィルター上に残った放射能をガンマーカウンター (トップカウンター；パーキンエルマー社) で測定した。非特異的結合は1μM GLP-1存在下の結合量とした。GLP-1誘導体質非存在下の特異的結合に相当するカウントを100％とし，50%のカウントを与える濃度を各GLP-1誘導体のIC50値とした。【００３７】
３．分解速度試験
0.05 % Tween 80，1 mM EDTA および 0.7 mg/L ヒト由来組換えジペプチジルペプチダーゼ-IV (DPP-IV, カタログ番号 1180-SE, R&Dシステム社) を含む 100 mM HEPES バッファー (pH 7.5) に，基質である各 GLP-1 誘導体の終濃度が 20-500μM，反応溶液の体積が 60μL となるように GLP-1 誘導体溶液を添加し，分解反応を開始した．反応は37℃の恒温槽に反応溶液を含む 1 mL 容ポリプロピレンチューブを静置して行なった．反応開始後 25 分まで 5 分毎に反応溶液を 7.0 μL サンプリングし，GLP-1 誘導体の DPP-IV による分解生成物の C 末端側断片の濃度を HPLC により 定量した．カラムは C30 (2.0×100 mm, Develosil RPAQUEOUS-AR-3, 野村化学) を用い，210 nm における吸光値によって濃度を評価した．分解生成物濃度の経時変化をプロットし，その直線範囲の傾きから分解反応の初速度を決定した．各 GLP-1誘導体について，初速度と GLP-1 誘導体濃度を式 (1) で表されるミカエリス-メンテン式に適応し，動力学的パラメータ kcat および KM を求めた．【００３８】
【数１】
2007063907.tif 000027
【００３９】
４．急性血糖降下試験
12-17週齢の雄性BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdbマウス (日本クレア) に天然型エキセンディン−４およびその各種糖鎖修飾体を1または100 nmol/kgの用量で皮下投与し，薬物投与後の血糖値をグルコカード (アークレイ) を用いて経時的に測定した．対照群には溶媒のみを投与した．動物は自由摂食 (100 nmol/kg投与試験) または実験開始1.5時間前から実験終了まで絶食 (1 nmol/kg投与試験) とし，血液サンプルは尾静脈より採取した．各時間の血糖値が対照群と比較して危険率P < 0.05 (Tukey検定) の場合を有意であるとし，有意な血糖降下作用の持続時間が，同用量の天然型エキセンディン−４よりも長い化合物を「○」，同等の化合物を「△」で表した．ただし，EX(1-28)NGおよびEX(1-28)NS6に関しては，EX(1-28)を比較対象とした．
表１には、GLP-1(7-36)アミド修飾体について、cAMP産生試験とレセプター結合試験の結果、および酵素分解に対する抵抗性を評価するために求めた分解速度パラメータの値を示す。【００４０】
【表１】
2007063907.tif 000028
また、表２−１および表２−２には、エキセンディン−４修飾体について、cAMP産生試験とレセプター結合試験の結果、およびin vivoの活性持続性を評価するために行った血糖降下試験の結果をあわせて示した。
【表２−１】
2007063907.tif 000029
【表２−２】
2007063907.tif 000030
【００４１】
結果から、20位以降に糖鎖を導入した糖鎖付加体が好ましいことが分かる。【００４２】
本発明は、ＧＬＰ−１関連ペプチドの糖鎖付加体および医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤からなる医薬組成物を提供する。このような医薬組成物を、通常の製剤手段を用いて製造し、非経口投与することが好ましい。特に好ましい投与経路としては、筋肉内投与および皮下投与が挙げられる。非経口の一日投与量は、約１pg/kg体重〜約１０００μg/kg体重の範囲であるが、それ以下またはそれ以上の用量を用いることもできる。必要とされる投与量は、患者の容体の重篤度ならびに患者の身長、体重、性別、年齢および既往歴などの判断基準によって左右される。
本発明の医薬組成物は、例えばレミントン(Remington) Pharmacentical Science, 1985又はレミントン(Remington): The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995に記載されるように、慣用的な技術により調製することができる。
例えば、本発明のＧＬＰ−１誘導体の注入用組成物は、要求される最終製品を供するために、適切なら、成分を溶解し及び混合することに関する医薬産業の慣用的技術を用いて調製することができる。【００４３】
本発明組成物を製造する場合、有効成分(少なくとも１種のＧＬＰ−１関連ペプチドの糖鎖付加体を含む)を、通常、賦形剤と混合するかまたは賦形剤で希釈する。製造する際には、他の成分と混合する前に、ＧＬＰ−１関連ペプチドの糖鎖付加体を粉砕して適当な粒子径にしてもよい。
賦形剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アラビアゴム、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース等が挙げられる。さらに、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油などの潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、メチルおよびプロピルヒドロキシ安息香酸などの保存剤、甘味剤または香味剤を含んでいてもよい。【００４４】
医薬組成物は、通常、１投与量毎に約５０μg〜１００mg、より好ましくは約１mg〜約１０mgの有効成分を含む単位投与剤形になるように製剤するのが好ましい。
１つの手順によれば、ＧＬＰ−１誘導体は、調製すべき組成物の最終容量よりいくらか少ない量の水に溶かされる。必要に応じて等張剤、防腐剤及び緩衝液が添加され、その溶液のpH値は、必要に応じて、酸、例えば塩酸、又は塩基、例えば水酸化ナトリウム水溶液を用いて調節される。最後に、その溶液の容量は水で調和されて要求される成分の濃度を供する。特定のペプチドの鼻への投与のための組成物は、例えば、欧州特許第２７２０９７（ノボ・ノルディスク A/S) 又はＷＯ９３／１８７８５に記載されるように調製することができる。【００４５】
本発明のひとつの側面においては、医薬組成物、特に糖尿病の治療のための医薬組成物の製造における上記ＧＬＰ−１誘導体の使用が提供される。
また、別の側面では、上記ＧＬＰ−１誘導体を用いて糖尿病を治療する方法が提供される。
【実施例】
【００４６】
本明細書ではペプチドおよびその糖鎖付加体を略号で表す場合がある。下記の例１および例２によりその命名法を説明する。
【化２６】
2007063907.tif 000031
上記例１において略号「ＧＬ３４ＮＳ６」中、（１）から（３）の部分はそれぞれ次の意味を表す。【００４７】
（１）は以下の通り、ペプチドの種類を表す。
ＧＬ：GLP-1(7-36)アミド
ＧＬＳＧＳＧＳＧ：上記ＧＬのＣ末端にＳＧＳＧＳＧ（アミド）が追加されたペプチド
ＥＸ：エキセンディン−４
ＥＸ(1-28)：エキセンディン−４(1-28)アミド【００４８】
（２）は、アミノ酸変異を示す。
３４Ｎ：34番目のアミノ酸がAsnに置換されたことを示す。
２８Ｃ：28番目のアミノ酸がCysに置換されたことを示す。
０１Ｎ：1番目のアミノ酸がAsnに置換されたことを示す。
３４３７Ｎ：34番目と37番目のアミノ酸がそれぞれAsnに置換されたことを示す。
−１Ｎ：Ｎ末端にAsnが追加されたことを示す。【００４９】
（３）は以下の通り、糖の種類を表す。
Ｇ：GlcNAc
Ｌ：LacNAc
Ｓ３：シアリルα2,3 LacNAc
Ｓ６：シアリルα2,6 LacNAc
Ｓ３６：ジシアリル LacNAc
Ｅ１：２分岐Ｎ型糖鎖
Ｅ２：２分岐Ｎ型糖鎖集積体
７Ｍ：マルトヘプタオース
ＳＬａｃ３：シアリルα2,3 Lac
ＳＬａｃ６：シアリルα2,6 Lac
Ｊ３Ｇａｌ：Gal集積体【００５０】
例２：ＧＬ３４３７ＮＳ３
2007063907.tif 000032
GLP-1(7-36)アミドの34位および37位の二ケ所にAsn シアリルα2,3 LacNAcを導入した糖鎖付加体を示す。【００５１】
実施例１：GLP-1の３４位糖鎖付加体の合成
（１）GL34N、GL34NGの合成
Boc法あるいはFmoc法によるペプチド固相合成法にてGL34NGおよびGL34Nを合成し、ODSカラムによりHPLC精製後、凍結乾燥した。
（２）GL34NLの調製
2 mM GL34NG、5mM UDP-Galactose、0.2U/ml β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ (東洋紡)を含む反応液(10mM MnCl2、12.5mM HEPES buffer pH 7.5)にて25℃、2時間反応後、凍結乾燥により濃縮し、25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてODSカラムInertsil ODS-3 10×250mm (GLサイエンス)にて分取精製した。【００５２】
（３）GL34NS6の調製
2 mM GL34NG、5mM UDP-Galactose、0.2U/ml β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ (東洋紡)を含む反応液(10mM MnCl2、12.5mM HEPES buffer pH 7.5、500μｌ)にて25℃、2時間反応後、凍結乾燥した。終濃度10mM CMP-シアル酸、50mU/ml α2,6-シアリルトランスフェラーゼ (東洋紡)、0.01% Triton X-100となるように添加した。反応容量は400μlとなるように水を添加後、37℃、23時間反応した。反応途中40μlの100mM CMP-シアル酸を添加した。25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてODSカラムInertsil ODS-3 10×250mm (GLサイエンス)にて分取精製した。【００５３】
（４）GL34NE1の調製
【化２７】
2007063907.tif 000033
【００５４】
次いで、150mg(58.6μmol)の化合物１(大塚化学)をメタノール60mlに溶解し、1.8mlの1N水酸化ナトリウム水溶液を添加した。室温で10時間攪拌して反応を行い、その後3.6mlの1N酢酸水溶液を添加することによって反応を停止させた。反応終了後、メタノールを揮発留去し、残渣に水およびジエチルエーテルを加え、水層をジエチルエーテルで２回洗浄した。得られた水層を凍結乾燥することによって化合物２の粗精製物を得た。その後、粗精製物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー(Sephadex  G-50、移動層:H2O)によって精製し、化合物２を118mg(50.5μmol)得た。得られた化合物はMALDI-TOF-MSによって同定した。
MALDI-TOF-MS：[M(average)+Na]+＝2360.0、(理論値：[M（average）+Na]+=2361.1)。
10 mM GL34NL、75mM化合物２ 、60mU/ml エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(東京化成)を含む反応液(60mM リン酸カリウムbuffer pH6.25)にて37℃、2時間反応後、等量の8M塩酸グアニジン溶液を添加し反応を停止した。その後、逆相HPLCにて分離精製した。【００５５】
実施例２：GLP-1の３７位糖鎖付加体の合成
（１）GL37N、GL37NGの調製
Boc法あるいはFmoc法によるペプチド固相合成法にてGL37NGおよびGL37Nを合成し、ODSカラムによりHPLC精製後、凍結乾燥した。
（２）GL37NLの調製
1 mM GL37NG、3mM UDP-ガラクトース、0.2U/ml β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ (東洋紡)を含む反応液(10mM MnCl2、25mM HEPES buffer pH 7.5、2ml)にて25℃、2時間反応後、凍結乾燥により濃縮し、逆相HPLCにて分取精製した。【００５６】
（３）GL37NS6の調製
1 mM GL37NG、3mM UDP-ガラクトース、0.2U/ml β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(東洋紡)を含む反応液(10mM MnCl2、25mM HEPES buffer pH 7.5、1ml)にて25℃、2時間反応した。その後、100mM CMP-シアル酸 50μl、1U/ml α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(東洋紡) 50μl、1% Triton X-100 10μlを添加し、25℃、26h反応した。さらに37℃、39時間反応した。途中、100mM CMP-シアル酸 50μl、1U/ml α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(東洋紡) 25μlを添加した。凍結乾燥により濃縮し、逆相HPLCにて分取精製した。【００５７】
（４）GL37NS3の調製
2 mM GL37NG、5 mM UDP-Galactose、0.2 U/ml β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(東洋紡)を含む反応液(5 mM MnCl2、25mM HEPES buffer pH 7.5、1.4 ml)にて25℃、2時間反応し、逆相HPLCにて分取精製、凍結乾燥を行った。上記操作にて得られたGL37NLを蒸留水で再溶解し、1 mM GL37NL、5 mM CMP-シアル酸、50 mU/ml α2,3-シアリルトランスフェラーゼ (CALBIOCHEM) を含む反応液(50mM HEPES buffer pH 7.5、0.01% Triton X-100、2 ml)を調製し、37℃、0.5時間反応した。その後、凍結乾燥により濃縮し、逆相HPLCにて分取精製した。
（５）GL37NS36の調製
1 mM GL37NS3、5 mM CMP-シアル酸、50 mU/ml α2,6-シアリルトランスフェラーゼ (日本たばこ) を含む反応液(5 mM MnCl2、20 mM カコジル酸 buffer pH 7.0、2.0 ml)にて30 ℃、16時間反応し、逆相HPLCにて分取精製、凍結乾燥を行った。
（６）GL37NE1の調製
10 mM GL37NL、75mM化合物２、60mU/ml endo-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(東京化成)を含む反応液(60mM リン酸カリウムbuffer pH6.25)にて37℃、2時間反応後、等量の8M塩酸グアニジン溶液を添加し反応を停止した。その後、逆相HPLCにて分取精製した。【００５８】
実施例３：その他のGLP-1糖修飾体の合成
上記実施例１および２と同様にして、下記のGLP-1糖修飾体を合成した。
GL08N、GL08NG、GL08NL、GL08NS6、GL08NE1、GL19N、GL19NG、GL19NL、GL19NS6、GL19NE1、GL26N、GL26NG、GL26NL、GL26NS6、GL26NE1、GLSGSGSG43NG、GLSGSGSG43NL、およびGLSGSGSG43NS6。
実施例１から３で得られた化合物のマススペクトルデータを以下に示す。【００５９】
【表３】
2007063907.tif 000034
表中、ＥＳＩはエレクトロスプレイイオン化法、ＭＡＬＤＩはマトリクス支援レーザー脱離イオン化法をそれぞれ示す。【００６０】
実施例４：GLP-1の３４位および３７位糖鎖付加体の合成
（１）GL3437NGの調製
Boc法あるいはFmoc法によるペプチド固相合成法にてGL3437NGを合成し、ODSカラムによりHPLC精製後，凍結乾燥した。
（２）GL3437NLの調製
2 mM GL3437NG、6mM UDP-Galactose、0.2U/ml β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ (東洋紡)、10mM MnCl2を含む反応液(25mM HEPES buffer pH 7.5)にて25℃、16時間反応後、25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてODSカラムInertsil ODS-3 10×250mm (GLサイエンス)にて分取精製した。【００６１】
（３）GL3437NS6の調製
1 mM GL3437NL、10mM CMP-シアル酸、0.1U/ml α2,6-シアリルトランスフェラーゼ (東洋紡)、0.01% Triton X-100を含む反応液(25mM HEPES buffer pH 7.5)にて37℃、14時間反応した。25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてODSカラムInertsil ODS-3 10×250mm (GLサイエンス)にて分取精製した。
（４）GL3437NS3の調製
1 mM GL3437NL、10mM CMP-シアル酸、0.05U/mlα2,3-シアリルトランスフェラーゼ(Calbiochem)、0.01% Triton X-100を含む反応液(50mM HEPES buffer pH 7.5)にて37℃、3.5時間反応後、25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてInertsil ODS-3 10×250mm (GLサイエンス)にて分取精製した。【００６２】
（５）GL3437NS36の調製
1 mM GL3437NS3、10 mM CMP-シアル酸、50 mU/ml α2,6-シアリルトランスフェラーゼ (日本たばこ) を含む反応液(5 mM MnCl2、20 mM カコジル酸 buffer pH 7.0、0.44 ml)にて30 ℃、16時間反応し、逆相HPLCにて分取精製、凍結乾燥を行った。
実施例５：その他の糖修飾GLP-1の合成
上記実施例４と同様にして、下記の糖修飾体を合成した。
GL2634NG、GL2634NL、GL2634NS6、GL2637NG、GL2637NL、GL2637NS6、GL263437NG、GL263437NL、およびGL263437NS6。【００６３】
実施例６：システイン変異GLP-1の側鎖チオール基修飾による糖修飾体の合成
（１）GL34C、GL3437Cの合成
Boc法あるいはFmoc法によるペプチド固相合成にてGL34C、GL3437Cを合成し、ODSカラムによりHPLC精製後、凍結乾燥した。
（２）GL34CE1の合成
0.5mMGL34C、1mM化合物3を含む反応液1.2ml(100mM リン酸緩衝液、pH8.0)を37℃で24時間反応させた。その後0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(GLサイエンス Inertsil ODS-3 10×250mm)にて分離精製を行い、GL34CE1を得た。【００６４】
（３）GL3437CE1の合成
0.5mMGL3437C、1.5mM化合物3を含む反応液0.85ml(100mM リン酸緩衝液、pH8.0)を37℃で反応させた。10時間後、5mMの化合物3水溶液を0.1ml追加し、さらに13時間反応させた。その後0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(GLサイエンス Inertsil ODS-3 10×250mm)にて分離精製を行い、GL3437CE1を得た。
（４）GL34CE2の合成
2mMGL34C、2.5mM化合物7を含む反応液0.2ml(100mM リン酸緩衝液、pH8.0)を37℃で25.5時間反応させた。その後0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(GLサイエンス Inertsil ODS-3 10×250mm)にて分離精製を行い、GL34CE2を得た。
（５）GL3437CE2の合成
0.25mM GL3437C、1mM化合物7を含む反応液30μl(100mM リン酸緩衝液、pH8.0)を37℃で反応させ、MALDI-TOF-MSによってGL3437CE2の生成を確認した。【００６５】
実施例４から６で得られた化合物のマススペクトルデータを以下に示す。
【表４】
2007063907.tif 000035
【００６６】
実施例７：エキセンディン−４の28位糖鎖付加体の合成
（１）EX28NGの合成
Boc法あるいはFmoc法によるペプチド固相合成法にてEX28NGを合成し、ODSカラムによりHPLC精製後、凍結乾燥した。
（２）EX28NLの合成
2 mM EX28NG、5mM UDP-Galactose、0.2U/ml β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(東洋紡)(10mM MnCl2、25mM HEPES buffer pH 7.5)にて25℃、3時間反応後、25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてC30カラムDevelosil RPAQUEOUS AR-5 10×250mm (野村化学)にて分離精製した。【００６７】
（３）EX28NS6の合成
1 mM EX28NG、5mM UDP-Galactose、0.1U/ml β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(東洋紡)、 0.01% Triton X-100を含む反応液(10mM MnCl2、25mM HEPES buffer pH 7.5)にて25℃、2時間反応した。反応液に1/10容の100mM CMP-シアル酸、1/10容の1U/mlα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(東洋紡) にて37℃、19時間反応し、ODSカラムInertsil ODS-3 10×250mm(GLサイエンス)にて分取精製した。
（４）EX28NS3の合成
1 mM EX28NL、10mM CMP-シアル酸、0.05U/mlα2,3-シアリルトランスフェラーゼ(Calbiochem)、0.01% Triton X-100を含む反応液(50mM HEPES buffer pH 7.5)にて37℃、17時間反応後、25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてC30カラムRPAQUEOUS AR-5 10×250mm(野村化学)にて分取精製した。【００６８】
（５）EX28NS36の合成
1 mM EX28NS3、20mM CMP-シアル酸、0.2U/mlα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(日本たばこ)、0.01% Triton X-100を含む反応液(50mM HEPES buffer pH 7.5)にて30℃、70時間反応後、25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてC30カラムRPAQUEOUS AR-5 10×250mm(野村化学)にて分取精製した。【００６９】
実施例８：その他のエキセンディン−４糖修飾体の合成
実施例７と同様にして、下記の糖修飾体を合成した。
EX-1NG、EX01NG、EX02NG、EX03NG、EX04NG、EX05NG、EX06NG、EX07NG、EX08NG、EX09NG、EX10NG、EX11NG；
EX12NG、EX12NL、EX12NS6；
EX13NG、EX13NL、EX13NS6；
EX14NG、EX15NG、
EX16NG、EX16NL、EX16NS6；
EX17NG、EX17NL、EX17NS6；
EX18NG、EX19NG、【００７０】
EX20NG、EX20NL、EX20NS6；
EX21NG、EX21NL、EX21NS6；
EX22NG、EX23NG、
EX24NG、EX24NL、EX24NS6；
EX25NG、EX25NL、EX25NS6；
EX26NG、
EX27NG、EX27NL、EX27NS6；
EX29NG、EX29NL、EX29NS6；
EX30NG、EX30NL、EX30NS6；
EX31NG、EX31NL、EX31NS6；
EX32NG、EX32NL、EX32NS6；
EX33NG、EX33NL、EX33NS6；
EX34NG、EX34NL、EX34NS6；
EX35NG、EX35NL、EX35NS6；
EX36NG、EX36NL、EX36NS6；
EX37NG、EX37NL、EX37NS6；
EX38NG、EX38NL、EX38NS6；
EX39NG、EX39NL、EX39NS6；
EX40NG、EX40NL、EX40NS6；
EX2840NG、EX2840NL、EX2840NS6；
EX17212840NG、EX17213540NG、EX17283540NG、EX21283540NG；
EX(1-28)、
EX(1-28)28NG、EX(1-28)28NL、EX(1-28)28NS6。【００７１】
実施例９
システイン変異エキセンディン−４の側鎖チオール基修飾による糖鎖修飾体の合成
（１）EX28C、EX21283540Cの合成
Boc法あるいはFmoc法によるペプチド固相合成法にてEX28C、EX21283540Cを合成し、ODSカラムによりHPLC精製後、凍結乾燥した。
（２）EX28CE1の合成
1mM EX28C、2mM化合物3を含む反応液0.5ml(100mM リン酸緩衝液、pH8.0)を37℃で23時間反応させた。その後0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(GLサイエンス Inertsil ODS-3 10×250mm)にて分離精製を行い、EX28CE1を得た。【００７２】
（３）EX28CJ3Galの合成
1mM EX28C、2.7mM化合物21を含む反応液0.36ml(100mM リン酸緩衝液、pH8.0)を37℃で3.5時間反応させた。その後0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(GLサイエンス Inertsil ODS-3 10×250mm)にて分離精製を行い、EX28CJ3Galを得た。
（４）EX21283540CJ3Galの合成
1mM EX21283540C、8mM化合物21を含む反応液0.23ml(100mM リン酸緩衝液、pH8.0)を37℃で反応させた。2時間後、EX28Cを0.5mg追加し、さらに1時間反応させた。その後0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(GLサイエンス Inertsil ODS-3 10×250mm)にて分離精製を行い、EX21283540CJ3Galを得た。
（５）EX28C7Mの合成
1mM EX28C、4mM化合物9を含む反応液0.40ml（100mM リン酸緩衝液、pH8.0）を37℃で3.5時間反応させた。その後C30カラム RPAQUEOUS AR-5 10×250mm（野村化学）HPLCにて分取精製を行い、EX28C7Mを得た。【００７３】
（６）EX21283540C7Mの合成
1mM EX21283540C、8mM化合物9を含む反応液0.37ml（100mM リン酸緩衝液、pH8.0）を37℃で1.5時間反応させた。その後C30カラム RPAQUEOUS AR-5 10×250mm（野村化学）HPLCにて分取精製を行い、EX21283540C7Mを得た。
（７）その他の糖修飾体の合成
上記（５）および（６）と同様にして、以下の化合物を合成した。
EX28CGlc、EX28CGal、EX28CLac、EX28CGen、EX2840C7M；
EX21283540CGlc、EX21283540CGal、EX21283540CLac、EX21283540Cgen。【００７４】
（８）EX28CSLac6の合成
0.5 mM EX28CLac、10mM CMP-シアル酸、0.1U/mlα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(日本たばこ)、0.01% Triton X-100を含む反応液(50mM Tris-HCl buffer pH 7.5)にて30℃、16h反応後、25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてODSカラムInertsil ODS-3 10×250mm（GLサイエンス）にて分取精製した。
（９）EX21283540CSLac6の合成
0.5 mM EX21283540CLac、10mM CMP-シアル酸、0.1U/mlα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(日本たばこ)、0.01% Triton X-100を含む反応液(50mM Tris-HCl buffer pH 7.5)にて30℃、16h反応後、25mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを溶離液としてODSカラムInertsil ODS-3 10×250mm（GLサイエンス）にて分取精製した。
実施例６から９で得られた化合物のマススペクトルデータを以下に示す。【００７５】
【表５】
2007063907.tif 000036
【００７６】
【表６】
2007063907.tif 000037
【００７７】
【表７】
2007063907.tif 000038
【００７８】
以下に、糖鎖修飾に用いられる試薬の製造法を説明する。
参考例１
化合物３の合成
【化２８】
2007063907.tif 000039
【００７９】
2mM化合物2、10mMヨード酢酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、15mM炭酸水素ナトリウム、50% (V/V)アセトンを含む水溶液5mlを室温で1.5時間反応させ、その後100mMアンモニア水溶液を0.5ml加えて反応を停止させた。1N酢酸水溶液で反応液を中和した後、アセトンを減圧留去し、0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(GLサイエンス Inertsil ODS-3 10×250mm)および水を移動相としたゲル濾過カラムクロマトグラフィー(Sephadex G-15)によって分離精製して化合物3を4.1mg得た。化合物の同定はESI-MSによって行った。
ESI-MS：[M+2H]2+＝1252.7、(理論値：[M+2H]2+=1254.0)。【００８０】
参考例２
化合物４の合成
【化２９】
2007063907.tif 000040
【００８１】
Fmoc-Glu-OH 189mg、DSC(N,N’-Disuccinimidyl carbonate) 512mg、ピリジン158mgをアセトニトリルに溶解し、5時間加熱還流した。その後、反応液を室温まで冷却し、アセトニトリルを減圧留去した。得られた残渣に酢酸エチルを加え、1N塩酸および飽和食塩水で水洗し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥した後に溶媒を減圧留去して化合物4を含む混合物を0.36g得た。化合物4は、これ以上精製することなく次工程に用いた。
MALDI-TOF-MS：[M(average)+Na]+=587.3 、(理論値：[M(average)+Na]+= 586.50)；
１H-NMR(CDCl3)：δ7.77(d，2H)、7.61(br，2H)、7.41(t，2H)、7.32(t，7.32)、5.67(d，1H)、4.90(m，1H)、4.50-4.39(m，2H)、4.24(t，1H)、2.84(br，8H)、2.95-2.65(m，2H)、2.47(m，1H)、2.36(m，1H).【００８２】
参考例３
化合物５の合成
【化３０】
2007063907.tif 000041
【００８３】
5mM化合物２、2mM化合物４、10mM炭酸水素ナトリウム，50%(V/V)アセトンを含む水溶液1mlを室温で3時間反応させた。20mM化合物２水溶液を125μl追加してさらに1.5時間反応させ、その後100mMアンモニア水溶液を50μl加えて反応を停止させた。1N酢酸水溶液で反応液を中和した後、アセトンを減圧留去し、0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(GLサイエンス Inertsil ODS-3 10×250mm)によって分離精製して化合物5を2.2mg得た。
MALDI-TOF-MS：[M(average)+Na]+=5037.8 、(理論値：[M(average)+Na]+= 5032.5)．【００８４】
参考例４
化合物６の合成
【化３１】
2007063907.tif 000042
【００８５】
化合物５ 2.2mg、22mM水酸化ナトリウム、88%メタノール(V/V)を含む水溶液1.7mlを室温で反応させた。2時間後、1N水酸化ナトリウム水溶液を15μ追加し、さらに2時間時反応させた。その後1N酢酸水溶液で中和して反応を停止させ、メタノールを減圧留去後、水を追加し、得られた水溶液をジエチルエーテルで2回洗浄した。洗浄した水層を、水を移動相としたゲル濾過カラムクロマトグラフィー(Sephadex G-15)によって分離精製して化合物6を含む混合物を2.4mg得た。化合物６は、これ以上精製することなく次反応に用いた。【００８６】
参考例５
化合物７の合成
【化３２】
2007063907.tif 000043
【００８７】
1mM化合物６、5mMヨード酢酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、10mM炭酸水素ナトリウム，50% (V/V)アセトンを含む水溶液0.4mlを室温で2時間反応させ、その後100mMアンモニア水溶液を40μl加えて反応を停止させた。1N酢酸水溶液で反応液を中和した後、アセトンを減圧留去し、0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(GLサイエンス Inertsil ODS-3 10×250mm)によって分離精製して化合物7を1.5mg得た。化合物の同定はMALD-TOF-MSによって行った。
MALDI-TOF-MS：[M(average)+Na]+=4979.7 、(理論値：[M(average)+Na]+= 4978.2).【００８８】
参考例６
化合物９の合成
【化３３】
2007063907.tif 000044
【００８９】
16Mアンモニア水溶液0.1mlに炭酸水素アンモニウム1.6mg、マルトヘプタオース23mgを溶解させ、42℃で36時間反応させた。反応終了後、減圧濃縮、凍結乾燥し化合物8を含む混合物を得た。得られた混合物を1M炭酸水素ナトリウム水溶液0.2mlに溶解し、無水ヨード酢酸35mg を加え室温で一時間反応させた後、1Mアンモニア水溶液0.1mlを加え反応を停止させた。酢酸で中和したのち、C30カラム RPAQUEOUS AR-5 10×250mm(野村化学) にて精製し化合物9を4.5mg得た。
ESI-MS：[M+H]+=1320.1 、（理論値：[M+H]+=1320.3）．【００９０】
参考例７
その他のヨードアセチル化糖の合成
化合物９と同様に、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13を合成した。
【化３４】
2007063907.tif 000045
化合物10 ESI-MS：[M+Na]+=369.8 、（理論値：[M+Na]+=370.0）
化合物11 ESI-MS：[M+Na]+=369.8 、（理論値：[M+Na]+=370.0）
化合物12 ESI-MS：[M+H]+=510.0 、（理論値：[M+H]+=510.1）
化合物13 ESI-MS：[M+Na]+=532.1 、（理論値：[M+Na]+=532.0）【００９１】
参考例８
化合物14の合成
【化３５】
2007063907.tif 000046
【００９２】
水50mlおよびDMF20mlの混合液に炭酸水素ナトリウム3.6g、グルタミン酸2.1ｇを溶解させ、10℃以下に冷却した。そこへFmoc-Glu(OtBu)-OSuのDMF溶液を流入し、さらにDMF20mlを加え，室温まで昇温して2時間反応した。反応終了後、1N塩酸でpHを酸性に調整し、酢酸エチルを加えて抽出した。有機相を水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥した後に溶媒を減圧留去して化合物14を含む混合物を1.6g得た。化合物14はこれ以上精製することなく次工程に用いた。
MALDI-TOF-MS：[M(average)+Na]+=577.35 、(理論値：[M(average)+Na]+=577.58)。【００９３】
参考例９
化合物15の合成
【化３６】
2007063907.tif 000047
化合物14の混合物1.5gを50%TFAジクロロメタン溶液へ溶解し、室温で1時間攪拌した。その後溶媒を減圧留去し、残渣にジエチルエーテルを加えて沈殿を生成させた。得られた沈殿を濾別、乾燥し化合物15を含む混合物を1.2g得た。化合物15はこれ以上精製することなく次工程に用いた。
MALDI-TOF-MS：[M(average)+H]+=499.30 、(理論値：[M(average)+H]+=499.49)。【００９４】
参考例１０
化合物16の合成
【化３７】
2007063907.tif 000048
【００９５】
化合物15 0.71g、DSC（N,N’-ジサクシイミジルカーボネート）2.2g、およびピリジン0.68gをアセトニトリルに溶解し、10時間加熱還流した。その後、反応液を室温まで冷却し、アセトニトリルを減圧留去した。得られた残渣に酢酸エチルを加え、1N塩酸、飽和食塩水で水洗し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥した後に溶媒を減圧留去して化合物16を含む混合物を0.92g得た。化合物16はこれ以上精製することなく次の工程に用いた。
MALDI-TOF-MS：[M(average)+Na]+=812.36 、(理論値：[M(average)+Na]+=812.69)。【００９６】
参考例１１
化合物17の合成
【化３８】
2007063907.tif 000049
【００９７】
1-アミノ-1-デオキシ-β-D-ガラクトース175mg、炭酸水素ナトリウム336mgを50%アセトン水溶液50mlに溶解し、Fmoc-Gly-OSu 788mgのアセトン溶液を添加した。アセトンをさらに20ml追加して室温で3.5時間攪拌した。その後アセトンを減圧留去し、得られた水溶液を0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(YMC-Pack ODS-A 20×250mm)にて分離精製を行い、化合物17を96mg得た。
ESI-MS：[M(average)+H]+=459.3 、(理論値：[M(average)+H]+= 459.5)。【００９８】
参考例１２
化合物18、化合物19の合成
【化３９】
2007063907.tif 000050
化合物17 60mgをメタノール25mlに溶解し、1N水酸化ナトリウム水溶液でpH12〜13に調整して室温で3.5時間反応させた。その後酢酸で反応液を中和し、メタノールを減圧留去後、水を添加し、ジエチルエーテルで洗浄した。得られた水溶液を減圧濃縮することによって残存するジエチルエーテルを留去して化合物18を含む水溶液を約2ml得た。得られた水溶液にアセトンを1ml加え、500mM炭酸水素ナトリウム水溶液でpHを7.0〜7.5に調整し、そこへ化合物16 21mgを含むアセトン溶液を添加した。室温で0.5時間攪拌後、化合物16 8mgのアセトン溶液を追加し、さらに１時間反応させた。反応終了後、酢酸で反応液を中和し、アセトンを減圧留去した。得られた残渣を0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(YMC-Pack ODS-A 20×250mm)にて分離精製を行って化合物19を13mg得た。
ESI-MS：[M(average)+H]+=1153.7 、(理論値：[M(average)+H]+= 1154.1)。【００９９】
参考例１３
化合物20、化合物21の合成
【化４０】
2007063907.tif 000051
【０１００】
化合物19 13mgを50%メタノール水溶液6mlに溶解し、1N水酸化ナトリウム水溶液でpH12〜13に調整して室温で2時間反応させた。その後反応液を酢酸で中和し、メタノールを減圧濃縮後、水を添加し、ジエチルエーテルで洗浄した。得られた水溶液を減圧濃縮することによって残存するジエチルエーテルを留去して化合物20を含む水溶液を約1.5ml得た。得られた水溶液にアセトン1mlを加え、500mM炭酸水素ナトリウム水溶液でpHを7.0〜7.5に調整し、そこへヨード酢酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル4.3mgのアセトン溶液を添加して室温で0.5時間反応させた。その後、500mM酢酸アンモニウムを40μl添加し、さらに酢酸で中和することによって反応を停止させた。アセトンを減圧留去後、残渣を0.1% TFA水溶液と0.1%TFAアセトニトリル溶液を溶離液とした逆相HPLC(Inertsil ODS-3 10×250mm)にて分離精製を行い、化合物21を3mg得た。
ESI-MS：[M(average)+H]+=1099.4 、(理論値：[M(average)+H]+= 1099.8)。
【図１】
2007063907.tif 000072
【配列表】
2007063907000001.app
【国際調査報告】
2007063907.tif 000073
2007063907.tif 000074
2007063907.tif 000075
2007063907.tif 000076
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2007063907.tif 000078
2007063907.tif 000079
2007063907.tif 000080
2007063907.tif 000081
2007063907.tif 000082