【手続補正書】
【提出日】平成20年4月30日(2008.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞輸送タンパク質による胆汁中排泄への感受性に対する候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）複数の肝実質細胞、及び少なくとも１つの毛細胆管を含む細胞培養物を提供すること、ここで、該肝実質細胞の少なくとも１つは、輸送タンパク質を含み；
（ｂ）該培養物に候補化合物を曝露すること；及び
（ｃ）該少なくとも１つの毛細胆管中の該候補化合物の量を決定し、それによって、該肝実質細胞輸送タンパク質による胆汁中排泄への感受性に対する該候補化合物をスクリーニングすることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記肝実質細胞が、ラット、ヒト、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ブタ、雄ブタ、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ウマ、シチメンチョウ、ニワトリ、カモ、及びガンからなる群から選択された供給源から単離されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記肝実質細胞の培養物が、肝実質細胞の長時間培養物をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記肝実質細胞の培養物が、小管網をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記肝実質細胞の培養物が、肝実質細胞のクラスター、肝実質細胞の凝集体、肝実質細胞の少なくとも１つの層、及びそれらの組合せからなる群から選択された形態を有するものとして、さらに特徴付けられる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記肝実質細胞が、マトリックス内に埋め込まれている、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記肝実質細胞の培養物が、肝実質細胞のサンドイッチ培養物をさらに含み、該サンドイッチ培養物は、肝実質細胞の少なくとも１つの層、及び該肝実質細胞の少なくとも１つの層とともに少なくとも１つの毛細胆管を含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記肝実質細胞のサンドイッチ培養物が、肝実質細胞の長時間サンドイッチ培養物を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記肝実質細胞の少なくとも１つの層が、マトリックスの２つの層間に挟まれている、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記マトリックスが、生物学的マトリックス培地、合成マトリックス培地、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的マトリックス培地が、コラーゲン、ラミニン、基底膜誘導化複合体、それらの誘導体、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記輸送タンパク質が、NTCP、OATP1A1、OATP1A2、OATP1A4、OATPB2、OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、OAT2、OAT3、OAT4、OCT1、OCT3、OCTN1、OCTN2、BSEP、MRP1、MRP2、MRP3、MRP4、MRP5、MRP6、MRP7、MRP8、MRP9、MDR1、MDR1A/B、MDR2、MDR3、BCRP、ABCG5、ABCG8、FIC-1、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
複数の候補化合物を同時にスクリーニングすることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの毛細胆管中の前記候補化合物の量を決定することが：
（ａ）取り込み、該候補化合物、及び予め選択された量のラベル化基質を可能にするのに十分な時間、該培養液に同時に曝露すること；
（ｂ）該培養物を洗浄すること；及び
（ｃ）少なくとも１つの毛細胆管中に存在する該ラベル化基質の量を決定して、該肝実質細胞輸送タンパク質による胆汁中排泄に対する該候補化合物と該ラベル化基質との間の競合を評価することを含み、該予め選択された量のラベル化基質と比較して、該少なくとも１つの毛細胆管中のラベル化基質の減少量の存在が、該輸送タンパク質による胆汁中排泄への該候補化合物の感受性を示す、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記ラベル化基質が、蛍光発生化合物、蛍光化合物、化学発光化合物、比色定量用化合物、放射標識化合物、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの毛細胆管中の該候補化合物の量を決定することが：該肝実質細胞輸送タンパク質の発現を阻害し、かつ少なくとも１つの毛細胆管中に存在する該候補化合物の量を検出することを含み、該肝実質細胞輸送タンパク質の発現が、阻害されない場合、該少なくとも１つの毛細胆管中の該候補化合物と比較して、該少なくとも１つの毛細胆管中の該ラベル化基質の減少量の存在が、該肝実質細胞輸送タンパク質による胆汁中排泄への該候補化合物の感受性を示す、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記肝実質細胞輸送タンパク質の発現を阻害することが、リボ核酸（RNA）を、該肝実質細胞輸送タンパク質の発現阻害に十分な量で、複数の肝実質細胞の少なくとも１つに導入することを含み、ここで、該RNAは、該輸送タンパク質をコード化している遺伝子のコード鎖に相当するリボヌクレオチド配列を含んでいる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子が、NTCP、OATP1A1、OATP1A2、OATP1A4、OATPB2、OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、OAT2、OAT3、OAT4、OCT1、OCT3、OCTN1、OCTN2、BSEP、MRP1、MRP2、MRP3、MRP4、MRP5、MRP6、MRP7、MRP8、MRP9、MDR1、MDR1A/B、MDR2、MDR3、BCRP、ABCG5、ABCG8、及びFIC-1からなる群から選択されたポリペプチドをコード化している、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子が、配列番号：１、及び２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記RNAが、前記肝実質細胞輸送タンパク質をコード化している遺伝子のコード鎖に相当するリボヌクレオチド配列を含む第一鎖と、該第一鎖に相補的なリボヌクレオチド配列を含む第二鎖とを含有した二本鎖領域を含み、かつ該第一鎖と該第二鎖とが、互いにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記二本鎖領域が、少なくとも１５塩基対長さである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記二本鎖領域が、１５〜５０塩基対長さである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記二本鎖領域が、１５〜３０塩基対長さである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記RNAが、分子内自己ハイブリダイゼーションにより二本鎖領域を形成している一本鎖を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
前記二本鎖領域が、少なくとも１９塩基にわたって相補的である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記RNAが、分子間ハイブリダイゼーションにより二本鎖領域を形成している２つの別個の鎖を含み、該二本鎖領域は、少なくとも１９塩基にわたって相補的である、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記RNAが、配列番号：３、４、及び５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２８】
前記輸送タンパク質をコード化している遺伝子の発現が、少なくとも１０％阻害される、請求項１７記載の方法。
【請求項２９】
前記RNAをコード化しているベクターを、前記複数の肝実質細胞の少なくとも１つの中に導入することをさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３０】
前記RNAを、前記複数の肝実質細胞の少なくとも１つの中に導入することは、前記RNAを、前記複数の肝実質細胞の少なくとも１つの中にトランスフェクトすることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３１】
前記RNAを、前記複数の肝実質細胞の少なくとも１つの中に導入することは、前記複数の肝実質細胞の少なくとも１つを、前記RNAをコード化している組換えウイルスで感染させることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの毛細胆管中の前記候補化合物の量が、該培養物中の胆汁クリアランス値を計算することにより決定される、請求項１又は３３記載の方法。