【手続補正書】
【提出日】令和1年6月19日(2019.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること；
前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する）；ならびに
前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。
【請求項２】
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する）；ならびに
前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。
【請求項３】
前記二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件が、有機溶媒の添加および／または耐熱性ＤＳＮと組み合わせた温度の上昇を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する）
；
前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；
前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること；ならびに
前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。
【請求項５】
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍〜１０億倍モル過剰である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
各プローブが、ロックド核酸、ペプチド核酸、異種核酸（ＸＮＡ）、任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはＲＮＡを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に対する１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各標的突然変異体核酸およびプローブペアについて、前記プローブの一方が前記標的突然変異体核酸の前記野生型核酸対応物のトップ鎖に相補的であり、他方が前記標的突然変異体核酸の前記野生型核酸対応物のボトム鎖に相補的である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸サンプルが、尿、血漿または他の体液中のゲノムＤＮＡまたは循環ＤＮＡを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸サンプルと、トップ鎖およびボトム鎖上の目的の異なる核酸に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させること、前記トップ鎖およびボトム鎖上の目的の核酸への前記ベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にすること、ならびにそれに結合した前記目的の核酸を有するベイトオリゴヌクレオチドを残りの核酸から単離することによって、目的の領域について前記核酸を最初に濃縮することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベイトオリゴヌクレオチドが一方の末端においてビオチン化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベイトオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
最初に前記核酸サンプルを増幅条件に供することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅条件が、ＰＣＲ、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性ＰＣＲまたはＣＯＬＤ−ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲおよび等温増幅からなる群より選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように３’末端で改変されている、請求項１３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、前記ＤＳＮ切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるＤＮＡ分解条件に供することであって、前記切断位置で分解を開始させることによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング（ＭＰＳ）、パイロシーケンシング、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、ＣＣＭ、デジタルＰＣＲおよび定量ＰＣＲからなる群より選択される方法の１つまたはそれよりも多くを使用して、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を分析することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用され、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで最初に処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブは、前記目的のメチル化核酸に相補的である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
その後に濃縮するための目的のメチル化標的核酸を調製するために使用され、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで最初に処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が亜硫酸水素塩変換した前記目的の非メチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが亜硫酸水素塩変換した前記目的の非メチル化核酸のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブが亜硫酸水素塩変換した前記目的の非メチル化核酸に相補的である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸および目的のメチル化標的核酸の両方を調製するために使用され、前記核酸サンプルを、亜硫酸水素ナトリウムで最初に処理し、
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブが、前記非メチル化核酸を含む鎖に結合するオリゴヌクレオチドプローブペア、
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブが、非メチル化核酸を含む鎖に結合するオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む２つのオリゴヌクレオチドプローブペアを用いる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用され、
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、一つのプローブが、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他のプローブが、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、一つのプローブが、目的の各メチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む複数のオリゴヌクレオチドプローブペアを用いる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する）；
（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；ならびに
（ｃ）前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。
【請求項２４】
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍〜１０億倍モル過剰である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）および（ｃ）を２サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記変性温度が６５〜８５℃である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的ＤＮＡ上のそれらの対応する配列への、異なるＴｍを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度間の漸減温度勾配を適用することによって、前記温度を低下させる工程（ｃ）を実施する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＤＳＮ消化中に６７℃〜６４℃の漸減温度勾配を適用して、６４〜６７℃の異なるＴｍを有するプローブがそれらの個々の標的にハイブリダイズすることを可能にする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記温度勾配が２〜２０℃の範囲である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、
（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペア（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する）と、ＰＣＲ増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製すること；
（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；
（ｃ）前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記ＤＳＮは、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する）；ならびに
（ｄ）前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮すること
を含む、方法。
【請求項３５】
工程（ｄ）を行う前に、工程（ｂ）および（ｃ）を２サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を２サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記変性温度が６５〜８５℃である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように３’末端で改変されている、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーが、工程（ｃ）において適用された温度未満の融解温度を有する、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
野生型核酸と比べて２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を濃縮するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記増幅条件がＣＯＬＤ−ＰＣＲである、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、メチル化核酸と比べて亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸の優先的変性を可能にする温度に供すること；
（ｄ）前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記ＤＳＮが、亜硫酸水素塩変換した前記非メチル化一本鎖核酸と比べて前記メチル化二本鎖核酸を優先的に切断する、方法。
【請求項４５】
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること；
（ｄ）前記温度を低下させることであって、亜硫酸水素塩変換した非メチル化二重鎖と比べてメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること；ならびに
（ｅ）前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記ＤＳＮが、前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化一本鎖核酸と比べて前記メチル化二重鎖を優先的に切断する、方法。
【請求項４６】
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程；ならびに
（ｄ）前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記メチル化二本鎖核酸と比べて前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断する、方法。
【請求項４７】
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること；
（ｄ）前記温度を低下させることであって、亜硫酸水素塩変換した非メチル化二重鎖と比べてメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること；ならびに
（ｅ）前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記メチル化二重鎖と比べて前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断する、方法。
【請求項４８】
工程（ｂ）の前記核酸増幅反応が、ＰＣＲ；完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲおよび変性時間限定ＣＯＬＤ−ＰＣＲからなる群より選択される、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記切断非メチル化一本鎖核酸および前記非切断メチル化二重鎖を、工程（ａ）においてライゲーションされた前記亜硫酸水素塩耐性アダプターを使用した増幅条件に供する、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記増幅条件が、ＰＣＲ；完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲおよび変性時間限定ＣＯＬＤ−ＰＣＲからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記亜硫酸水素ナトリウム処理の前に、天然にＡＴリッチな配列を除去する、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本出願で特定されるすべての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること；
前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；ならびに
前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
（項目２）
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；ならびに
前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
（項目３）
前記二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件が、有機溶媒の添加および／または耐熱性ＤＳＮと組み合わせた温度の上昇を含む、項目１〜２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）
；
前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；
前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること；ならびに
前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
（項目５）
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍〜１０億倍モル過剰である、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
各プローブが、ロックド核酸、ペプチド核酸、異種核酸（ＸＮＡ）、任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはＲＮＡを含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に対する１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記核酸サンプルが、尿、血漿または他の体液中のゲノムＤＮＡまたは循環ＤＮＡを含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
項目２または４に記載の方法を実行する前に、以下：前記核酸サンプルと、トップ鎖およびボトム鎖上の目的の異なる核酸に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させること、前記トップ鎖およびボトム鎖上の目的の核酸への前記ベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にすること、ならびにそれに結合した前記目的の核酸を有するベイトオリゴヌクレオチドを残りの核酸から単離することによって、目的の領域について前記核酸を濃縮することをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ベイトオリゴヌクレオチドが一方の末端においてビオチン化されている、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ベイトオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着されている、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
項目２または４に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを増幅条件に供する、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記増幅条件が、ＰＣＲ、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性ＰＣＲまたはＣＯＬＤ−ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲおよび等温増幅からなる群より選択される、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように３’末端で改変されている、項目１３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、前記ＤＳＮ切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるＤＮＡ分解条件に供することであって、前記切断位置で分解を開始させることによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング（ＭＰＳ）、パイロシーケンシング、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、ＣＣＭ、デジタルＰＣＲおよび定量ＰＣＲからなる群より選択される方法の１つまたはそれよりも多くを使用して、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を分析することをさらに含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して項目２または４に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
その後に濃縮するための目的のメチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して項目２または４に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的の非メチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的の非メチル化核酸のボトム鎖に相補的である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸および目的のメチル化標的核酸の両方を調製するために使用され、
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含み；ならびに
前記反応混合物に対して項目２または４に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用され、
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；
（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；ならびに
（ｃ）前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
（項目２４）
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍〜１０億倍モル過剰である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
工程（ｂ）および（ｃ）を２サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目２３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、項目２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記変性温度が６５〜８５℃である、項目２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記標的ＤＮＡ上のそれらの対応する配列への、異なるＴｍを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度間の漸減温度勾配を適用することによって、前記温度を低下させる工程（ｃ）を実施する、項目２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
ＤＳＮ消化中に６７℃〜６４℃の漸減温度勾配を適用して、６４〜６７℃の異なるＴｍを有するプローブがそれらの個々の標的にハイブリダイズすることを可能にする、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記温度勾配が２〜２０℃の範囲である、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する、項目２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、
（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペア（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）と、ＰＣＲ増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製すること；
（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；
（ｃ）前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記ＤＳＮは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない）；ならびに
（ｄ）前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮すること
を含む、方法。
（項目３５）
工程（ｄ）を行う前に、工程（ｂ）および（ｃ）を２サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を２サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目３４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、項目３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記変性温度が６５〜８５℃である、項目３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する、項目３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように３’末端で改変されている、項目３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーが、工程（ｃ）において適用された温度未満の融解温度を有する、項目３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
野生型核酸と比べて２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を濃縮するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記増幅条件がＣＯＬＤ−ＰＣＲである、項目３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供すること；
（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記ＤＳＮが、前記メチル化二本鎖核酸を切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
（項目４５）
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること；
（ｄ）前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること；ならびに
（ｅ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記ＤＳＮが、前記メチル化二重鎖を優先的に切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
（項目４６）
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程；ならびに
（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断するが、前記メチル化二本鎖核酸を切断しない、方法。
（項目４７）
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること；
（ｄ）前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること；ならびに
（ｅ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断するが、前記メチル化二重鎖を切断しない、方法。
（項目４８）
工程（ｂ）の前記核酸増幅反応が、ＰＣＲ；完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲおよび変性時間限定ＣＯＬＤ−ＰＣＲからなる群より選択される、項目４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記切断非メチル化一本鎖核酸および前記非切断メチル化二重鎖を、工程（ａ）においてライゲーションされた前記亜硫酸水素塩耐性アダプターを使用した増幅条件に供する、項目４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記増幅条件が、ＰＣＲ；完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲおよび変性時間限定ＣＯＬＤ−ＰＣＲからなる群より選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記亜硫酸水素ナトリウム処理の前に、天然にＡＴリッチな配列を除去する、項目４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。