【手続補正書】
【提出日】平成20年5月14日(2008.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、試料中の標的核酸を検出する方法：
ａ）前記試料を、核酸ポリメラーゼ；前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー；第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程、
ｂ）前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて標識化リポーターの存在下で前記標的核酸を増幅して増幅産物を生成する工程であって、標識化リポーターが、増幅産物中に、第２オリゴヌクレオチドプライマーの第２領域に存在する非天然塩基の向かい側に組み込まれている非天然塩基を含む工程；ならびに
ｃ）増幅の間の標識化リポーターからのシグナルを観察して、リポーターの取り込みを、試料中の標的核酸の存在と関連づける工程。
【請求項２】
標的化リポーターが、実質的に非天然塩基のヌクレオチド三リン酸及び標識からなる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、さらに標識を含み、かつ前記リポーター及び該第２オリゴヌクレオチドプライマーの該第２領域の標識が、１対の発蛍光団を含み、該発蛍光団の一方の放射が、他方の発蛍光団の放射を刺激する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）が標的核酸増幅の間の増幅の蛍光をモニターする工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
以下の工程を含む、試料中の標的核酸を検出する方法：
ａ）前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記標的核酸を増幅して増幅産物を提供する工程であって、前記標的核酸を増幅するために用いる少なくとも１つのプライマーが第１の非天然塩基を含む、工程；
ｂ）増幅の間に、リポーターを増幅産物へと組み込む工程であって、リポーターが、標識及び第１の非天然塩基と塩基対を形成する第２の非天然塩基を含む、工程；
ｃ）増幅の間の標識からのシグナルを観察し、それによって前記標的核酸を検出および定量する工程。
【請求項６】
以下の工程を含む、試料中の標的核酸を検出する方法：
ａ）以下を含む混合物を反応させる工程；
（i）試料；
（ii）標的核酸と相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー；
（iii）標的核酸と相補的な配列及び第１の非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマー；及び
（iv）標識及び第１の非天然塩基と塩基対を形成する第２の非天然塩基を含むリポーター；
ｂ）試料中に標的核酸が存在する場合、該標的核酸を増幅して増幅産物を生成する工程であって、リポーターが増幅産物中に組み込まれる工程；ならびに
ｃ）増幅の間の標識からのシグナルを観察し、それによって標的核酸を検出および定量する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
2004500850.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
１Ａ〜１Ｅは、本発明の一実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図２】
２Ａ〜２Ｅは、本発明の第２実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図３】
多数の非天然塩基の化学構造を示し、式中、Ａは高分子バックボーンへの付着点であり、ＸはＮ又はＣ−Ｚであり、ＹはＮ又はＣ−Ｈであり、かつＺはＨ、置換若しくは無置換アルキル基、又はハロゲンである。
【図４】
４Ａ〜４Ｄは、本発明の第３実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図５】
５Ａ〜５Ｅは、本発明の第４実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図６】
６Ａ〜６Ｅは、本発明の第５実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図７】
７Ａ〜７Ｅは、本発明の第６実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図８】
８Ａ〜８Ｅは、本発明の第７実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図９】
９Ａ〜９Ｅは、本発明の第８実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１０】
１０Ａ〜１０Ｅは、本発明の第９実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１１】
１１Ａ〜１１Ｅは、本発明の第１０実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１２】
１２Ａ〜１２Ｅは、本発明の第１１実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１３】
ＰＣＲ混合物に特異的な対立遺伝子と鋳型試料を含有する分析プレートを調製するための一般的な手順を概略的に図解する。
【図１４】
ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによるＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングを示すグラフであり、Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図１５】
方法Ａによる標識化非天然塩基の調製の合成スキームを概略的に図解する。
【図１６】
方法Ｂによる標識化非天然塩基の調製の合成スキームを概略的に図解する。
【図１７Ａ】
ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによるＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングの“リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図１７Ｂ】
図１７ＡのＰＣＲ増幅産物の融解曲線解析を示すグラフであり；Ｘ軸に融解温度が示される。
【図１８Ａ】
ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによるＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングの“リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図１８Ｂ】
図１８ＡのＰＣＲ増幅産物の融解曲線解析を示すグラフであり；Ｘ軸に融解温度が示される。
【図１９】
ゲノムＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応における蛍光の増加の “リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図２０】
種々の量の逆転写ＲＮＡを増幅するＰＣＲ反応における蛍光の増加の “リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図２１】
ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによる種々の量の逆転写ＲＮＡを増幅するＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングの “リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図２２】
野生型、突然変異体、及び異型接合性因子Ｖ ＤＮＡ標的の多重ＰＣＲ解析による総合結果を示すグラフであり；Ｙ軸にＨＥＸ蛍光ＲＦＵｓが示され、Ｘ軸にＦＡＭ蛍光ＲＦＵｓが示される。
【図２３Ａ】
種々のマウス株由来ゲノムＤＮＡのマウスＳＴＳ配列２７．ＭＭＨＡＰ２５ＦＬＡ６における多型性の多重ＰＣＲ解析による総合結果を示すグラフであり；Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示され、Ｙ軸にＨＥＸ蛍光ＲＦＵｓが示される。
【図２３Ｂ】
種々のマウス株由来ゲノムＤＮＡのマウスＳＴＳ配列２７．ＭＭＨＡＰ２５ＦＬＡ６における多型性の多重ＰＣＲ解析による総合結果を示すグラフであり；Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示され、Ｙ軸にＦＡＭ蛍光ＲＦＵｓが示される。
【図２４】
クエンチング化合物の部位特異的組込みによる種々の量の逆転写ＲＮＡを増幅する反応によるＰＣＲ産物の融解曲線解析であり；Ｙ軸に経時的な蛍光の変化が示され、Ｘ軸に融解温度が示される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  EraGen Biosciences, Inc.
<120>  Materials and Methods for Detection of Nucleic Acids
<130>  X1J1932
<140>  PCT/US01/16359
<141>  2001-05-18
<150>  US 60/205,712
<151>  2000-05-19
<150>  US 60/240,398
<151>  2000-10-14
<150>  US 60/282,831
<151>  2001-04-10
<160>  41    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  12
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
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<220>
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<220>
<221>  modified_base
<222>  (3)..(3)
<223>  n represents 
5'-5-[N-4'-carboxy-4(dimethylamino)-azobenzene)-aminohexyl-3-acry
limido]-2'-deoxyUridine
<220>
<221>  modified_base
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<223>  n represents deoxycytidylate 3' labeled with BiotinTEG CPG
<400>  1
tnncctgtct gn                                                         12
<210>  2
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<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  2
ggccagcata agccm                                                      15
<210>  3
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
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gcagacagga naccatcagc tgttttcgtt g                                    31
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  4
ggccagcata agccc                                                      15
<210>  5
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  5
ggccagcata agcca                                                      15
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<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  6
tgaatttcca gtcttgcaag caaagtgact agcttgacgt aaggg                     45
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<213>  Artificial
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<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  8
tgaatttcca gtcttgcaag caaattgact agcttgacgt aaggg                     45
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  9
cccttacgtc aagctagtca atttgcttgc aagactggaa attca                     45
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
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cccttacgtc aagctagtca c                                               21
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<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  11
cccttacgtc aagctagtca a                                               21
<210>  12
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  12
tgaatttcca gtcttgcaag ca                                              22
<210>  13
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
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<220>
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<221>  modified_base
<222>  (3)..(3)
<223>  n represents 
(5'-5-[(N-4'-carboxy-4(dimethylamino)-azobenzene)-aminohexyl-3-ac
rylimido]-2'-deoxyUridine
<220>
<221>  modified_base
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nnncctgtct gn                                                         12
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
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ctcatggacc cccatac                                                    17
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<213>  Artificial
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gcagacagga nagctaactg gagcgtgg                                        28
<210>  16
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (11)..(11)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (12)..(12)
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gcagacagga nngctaactg gagcgtgg                                        28
<210>  17
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  17
cctcatggac ccccatacat attgtccacg ctccagttag c                         41
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
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<221>  modified_base
<222>  (6)..(6)
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<220>
<221>  misc_feature
<222>  (11)..(11)
<223>  n represents a n-propylene spacer (c3)
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gtnatntgcg ntcgtgcggt gcgtc                                           25
<210>  19
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  19
tagcctgctg tgctgtgt                                                   18
<210>  20
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (2)..(2)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<400>  20
tngcctgctg tgctgtgt                                                   18
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<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  21
tcgtgcggtg cgtcacacag cacagcaggc                                      30
<210>  22
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (2)..(2)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (3)..(3)
<223>  n represents 
(5'-5-[N-4'-carboxy-4(dimethylamino-azobenzene)-aminohexyl-3-acry
limido]-2'-deoxyUridine
<220>
<221>  modified_base
<222>  (16)..(16)
<223>  n represents deoxythymidylate 3' labeled with BiotinTEG CPG
<400>  22
tnncctgtct gcctgn                                                     16
<210>  23
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  23
gataatcagt agctttgtaa ccctg                                           25
<210>  24
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  24
gtggcacaag attgatggaa t                                               21
<210>  25
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (19)..(19)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (20)..(20)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<400>  25
cacgacaggc agacaggann cccaccaact gtttactgta c                         41
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
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<400>  26
acaggcagac aggannagga ccttgctgca gtaac                                35
<210>  27
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (2)..(2)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (3)..(3)
<223>  n represents 
(5'-5-[(N-4'-carboxy-4(dimethylamino)-azobenzene)-aminohexyl-3-ac
rylimido]-2'-deoxyUridine
<220>
<221>  modified_base
<222>  (16)..(16)
<223>  n represents deoxythymidylate 3' labeled with BiotinTEG CPG
<400>  27
tnncctgtct gcctgn                                                     16
<210>  28
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  28
gcgcggcgat atcatc                                                     16
<210>  29
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (19)..(19)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (20)..(20)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<400>  29
cacgacaggc agacaggann cgccagctca ccatg                                35
<210>  30
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<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (2)..(2)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<400>  30
tncgccagct caccatg                                                    17
<210>  31
<211>  12
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (2)..(2)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (3)..(3)
<223>  n represents 
(5'-5-[(N-4'-carboxy-4(dimethylamino)-azobenzene)-aminohexyl-3-ac
rylimido]-2'-deoxyUridine
<220>
<221>  modified_base
<222>  (12)..(12)
<223>  n represents deoxyguanylate 3' labeled with BiotinTEG CPG
<400>  31
tnnggacaga cn                                                         12
<210>  32
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  32
gagcagtcgg tcagtgac                                                   18
<210>  33
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (11)..(11)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (12)..(12)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<400>  33
cgtctgtcca nngagctagc ggaggcc                                         27
<210>  34
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (11)..(11)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (12)..(12)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<400>  34
gcagacagga nnggagctag cggaggct                                        28
<210>  35
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  35
atttctgaaa ggttacttca aggaca                                          26
<210>  36
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (15)..(15)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (16)..(16)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<400>  36
tgtccgtctg tccannagat ccctggacag gca                                  33
<210>  37
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (15)..(15)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (16)..(16)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<400>  37
acaggcagac agganngatc cctggacagg cg                                   32
<210>  38
<211>  70
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  38
atttctgaaa ggttacttca aggacaaaat acctgtattc ctcgcctgtc cagggatctg     60
ctcttacaga                                                            70
<210>  39
<211>  70
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  39
atttctgaaa ggttacttca aggacaaaat acctgtattc cttgcctgtc cagggatctg     60
ctcttacaga                                                            70
<210>  40
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (15)..(15)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (16)..(16)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<400>  40
tgtccgtctg tccanngagc tagcggaggc c                                    31
<210>  41
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<220>
<221>  modified_base
<222>  (15)..(15)
<223>  n represents deoxy-iso-cytosine (d-isoC)
<220>
<221>  modified_base
<222>  (16)..(16)
<223>  n represents deoxy-iso-guanine (d-isoG)
<400>  41
acaggcagac aggannggag ctagcggagg ct                                   32