(57)【要約】【課題】質の変動が少ないフィーダー細胞を提供すること。【解決手段】組織幹及び／又は前駆細胞に由来するフィーダー細胞。フィーダー細胞の作製方法、フィーダー細胞を用いて培養細胞を調製する方法、細胞培養キットも提供される。
2007091409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織幹及び／又は前駆細胞に由来するフィーダー細胞。
【請求項２】
組織幹及び／又は前駆細胞が哺乳動物のものである請求項１記載のフィーダー細胞。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである請求項２記載のフィーダー細胞。
【請求項４】
組織幹及び／又は前駆細胞が角膜実質、皮膚又は骨髄間葉由来である請求項１〜３のいずれかに記載のフィーダー細胞。
【請求項５】
組織幹及び／又は前駆細胞を必要により線維芽細胞に誘導し、増殖能を低下させる処理を施すことを含む、フィーダー細胞の作製方法。
【請求項６】
組織幹及び／又は前駆細胞が哺乳動物のものである請求項５記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物がヒトである請求項６記載の方法。
【請求項８】
組織幹及び／又は前駆細胞が角膜実質、皮膚又は骨髄間葉由来である請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞を請求項１〜４のいずれかに記載のフィーダー細胞と共培養することを含む、培養細胞を調製する方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のフィーダー細胞と共培養する細胞が哺乳動物のものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒトである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のフィーダー細胞と共培養する細胞が、角膜細胞、皮膚細胞、歯肉細胞、心臓細胞、消化管細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞及び口腔粘膜細胞からなる群より選択される請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のフィーダー細胞と共培養する細胞が、角膜上皮細胞又は皮膚細胞である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
培養細胞が重層化される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
培養細胞が移植に用いられる請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに記載のフィーダー細胞を含む、細胞培養キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織幹細胞由来フィーダー細胞及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養上皮移植は角膜輪部幹細胞疲弊症の治療に用いられる。角膜輪部幹細胞疲弊症とはアルカリ外傷等により角膜上皮の幹細胞が死滅するもので、不透明な結膜が進入することにより視力が著しく損なわれる（非特許文献1）。
上皮細胞の培養法には、フィーダー細胞を使わない方法と使う方法があるが、使う方法の方が上皮細胞の維持能力に優れている（非特許文献2）。フィーダー細胞は、薬剤処理などで増殖を停止させた線維芽細胞で、上皮細胞の増殖を促し、また混入してきた線維芽細胞の増殖を抑制する働きがある(非特許文献3)。フィーダーに3T3を用いた培養上皮は臨床において20年以上の実績を持つ。【０００３】
しかし、3T3はマウス由来のため異種感染の危険性を完全に排除できず、厚生労働省の指針では異種移植として分類されている(非特許文献4)。
この問題の回避にはヒト細胞をフィーダーとすればよいわけで、実際ヒト線維芽細胞をフィーダーとして表皮細胞（皮膚の上皮細胞）を培養維持できることが報告されている（非特許文献５）。【０００４】
ただし、マウスの株細胞(不死化した細胞)である3T3とは異なり、正常なヒト線維芽細胞は継代を重ねると次第に老化することが知られている。このことは、1つのロットの細胞をいつまでも使用できないことを意味する。このため、継代やロット差によりフィーダーの質が変動する可能性があり、これは培養上皮の質のコントロールに悪影響を及ぼすものと予想される。【０００５】
最近、脳や皮膚の幹細胞を培養、維持する方法が開発された。この方法で培養される幹細胞は上皮には分化しないものの、線維芽細胞には分化することが出来る。この方法を用いて、マウスだけでなくヒトの皮膚幹細胞も長期維持できることが報告されている（非特許文献6）。また、本発明者のグループも、この方法を用いてマウス角膜の実質から幹細胞を分離培養することに成功した(非特許文献7)。【０００６】
【非特許文献１】Ann Acad Med Singapore 2004; 33: 576-80
【非特許文献２】CANCER RESEARCH 63, 7815-7824, November 15, 2003
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 76, No. 11, pp. 5665-5668, November 1979
【非特許文献４】「異種移植の実施に伴う公衆衛生上の感染症問題に関する指針」に基づく３Ｔ３Ｊ２株及び３Ｔ３ＮＩＨ株をフィーダー細胞として利用する上皮系の再生医療への指針  平成15年度厚生労働科学研究費補助金厚生労働科学特別研究事業主任研究者  吉倉廣（国立感染症研究所長）
【非特許文献５】STEM CELLS 2003;21:481-494
【非特許文献６】STEM CELLS 2005;23:727-737
【非特許文献７】Investigative Ophthalmology & Visual Science, May 2005, Vol. 46, No.5, 1653-1658
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、質の変動が少ないフィーダー細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
もし自己自身を複製できる能力を持つ、つまり質の変動がない、幹細胞をフィーダー細胞の細胞源に用いることができれば、良質な１ロットの細胞を理論上は無限に使用することが出来ると予想できる。そこで、本発明者は、マウス角膜実質幹細胞から作成したフィーダー細胞を用いることにより、移植用ヒト上皮の培養に成功し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）組織幹及び／又は前駆細胞に由来するフィーダー細胞。
（２）組織幹及び／又は前駆細胞が哺乳動物のものである（１）記載のフィーダー細胞。
（３）哺乳動物がヒトである（２）記載のフィーダー細胞。
（４）組織幹及び／又は前駆細胞が角膜実質、皮膚又は骨髄間葉由来である（１）〜（３）のいずれかに記載のフィーダー細胞。
（５）組織幹及び／又は前駆細胞を必要により線維芽細胞に誘導し、増殖能を低下させる処理を施すことを含む、フィーダー細胞の作製方法。
（６）組織幹及び／又は前駆細胞が哺乳動物のものである（５）記載の方法。
（７）哺乳動物がヒトである（６）記載の方法。
（８）組織幹及び／又は前駆細胞が角膜実質、皮膚又は骨髄間葉由来である（５）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）細胞を（１）〜（４）のいずれかに記載のフィーダー細胞と共培養することを含む、培養細胞を調製する方法。
（１０）（１）〜（４）のいずれかに記載のフィーダー細胞と共培養する細胞が哺乳動物のものである（９）記載の方法。
（１１）哺乳動物がヒトである（１０）記載の方法。
（１２）（１）〜（４）のいずれかに記載のフィーダー細胞と共培養する細胞が、角膜細胞、皮膚細胞、歯肉細胞、心臓細胞、消化管細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞及び口腔粘膜細胞からなる群より選択される（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）（１）〜（４）のいずれかに記載のフィーダー細胞と共培養する細胞が、角膜上皮細胞又は皮膚細胞である（１２）記載の方法。
（１４）培養細胞が重層化される（１３）記載の方法。
（１５）培養細胞が移植に用いられる（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）（１）〜（４）のいずれかに記載のフィーダー細胞を含む、細胞培養キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の利点は、幹細胞を細胞源に用いるため、均質なフィーダー細胞を安定的に供給することが出来る点にある。さらに、フィーダー細胞にヒト細胞を用いれば、異種感染の危険性を減少させることができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2006‐030997の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】A:培養中のマウス実質幹細胞、B:Aを薬剤処理によりフィーダー細胞としたもの、C:上皮培養の実際、D:培養中の上皮細胞。
【図２】培養した上皮細胞の組織標本。HE：ヘマトキシリン/エオシン染色像。K3：角膜上皮分化マーカーであるケラチン3の免疫染色像、Cx43：上皮細胞分化マーカーであるコネキシン43の免疫染色像、Int b1：未分化上皮の指標であるインテグリンβ1の免疫染色像、p63：未分化上皮細胞のマーカーであるp63の免疫染色像。
【図３】1000個の上皮細胞をそれぞれのフィーダー細胞と2週間共培養した後のローダミンＢ染色像。左下図：上皮コロニーの形成率（ＣＦＥ）、右下図：上皮コロニーの平均サイズ。
【図４】上皮細胞とヒト骨髄間葉系幹細胞由来のフィーダー細胞(MASCf)を用いて作成した培養上皮シート。Contact coculture：カルチャーインサート内に上皮細胞とフィーダー細胞を共に播種することで、フィーダー細胞と接触させながら培養した上皮シート。Duplex coculture：カルチャーインサート内およびインサート下のウェル双方にフィーダー細胞を播種することで、接触かつ液性因子の持続的供給を受けながら培養した培養上皮シート。Separated coculture：カルチャーインサート下のウェルにのみフィーダー細胞を播種することで、フィーダー細胞と接触させずに共培養した培養上皮シート。HE：ヘマトキシリン/エオシン染色像。K3：角膜上皮分化マーカーであるケラチン3の免疫染色像、K15：角膜輪部上皮マーカーであるケラチン15の免疫染色像。
【図５】上皮細胞とヒト骨髄間葉系幹細胞由来のフィーダー細胞(MASCf)を用いて作成した培養上皮シート。K12：角膜上皮分化マーカーであるケラチン12の免疫染色像、K15：角膜輪部上皮マーカーであるケラチン15の免疫染色像、K12+K15：ケラチン3とケラチン15の二重染色像。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、組織幹及び／又は前駆細胞に由来するフィーダー細胞を提供する。
組織幹及び／又は前駆細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス）のものであるとよく、このうち、哺乳動物のものであることが好ましく、特に、ヒトものであることが好ましい。
組織幹及び／又は前駆細胞は、成人のものであっても、胎児のものであってもよい。
組織幹及び／又は前駆細胞は、いかなる組織由来のものであってもよいが、骨髄、筋肉、神経、皮膚、角膜、肝臓、膵臓、小腸、口腔粘膜、脂肪などの組織由来のものを挙げることができ、このうち、角膜（特に、角膜実質）、皮膚又は骨髄（特に、骨髄間葉）由来のものが好ましい。【００１３】
組織幹及び／又は前駆細胞は、以下のようにして調製することができる。目的の組織を採取後、必要ない部分をできるだけ除去する．４℃で終夜のディスパーゼ処理後、上皮を除去し、さらに３７℃で１時間〜２時間コラゲナーゼ処理を行うことによって組織を融解する。遠心分離操作によって細胞を回収後、組織幹及び／又は前駆細胞培養用の無血清培地で培養し、２〜３週間毎に継代を行う。【００１４】
本発明のフィーダー細胞は、組織幹及び／又は前駆細胞を必要により線維芽細胞に誘導し、増殖能を低下させる処理を施すことにより作製することができる。
組織幹及び／又は前駆細胞を線維芽細胞に誘導するには、以下のような手順で行うとよい。無血清培地中で培養した組織幹及び／又は前駆細胞を遠心操作によって回収し、３７℃で酵素処理 (AccumaxTM, Innovative Cell Technologies, Inc.) を行って分散させる。分散させた細胞を１０％血清を含む培地中で培養することによって線維芽細胞へと分化誘導を行う。組織幹及び／又は前駆細胞を線維芽細胞に誘導するのは随意の工程である。組織幹／前駆細胞のうち、骨髄間葉系幹細胞などもともと線維芽細胞としての性質を持つ細胞は、特別な分化誘導を必要とせず増殖能低下処理に進むことができる。【００１５】
組織幹及び／又は前駆細胞から誘導された線維芽細胞には、放射線照射、マイトマイシン処理などの増殖能を低下させる処理が施される。例えば、セミコンフルエントに達した線維芽細胞をマイトマイシンC添加培地で37℃、2時間培養する、あるいは致死量の放射線を照射する、といった処理を行う。
本発明のフィーダー細胞と共培養することにより、培養細胞の増殖や分化を調節することができる。
本発明のフィーダー細胞と共培養する細胞は、ヒトのものであることが好ましい。【００１６】
本発明のフィーダー細胞と共培養する細胞の種類は特に限定されるものではないが、角膜細胞（例えば、角膜上皮細胞）、皮膚細胞（例えば、表皮細胞）、心臓細胞（例えば、心筋細胞）、消化管細胞（例えば、胃粘膜上皮細胞、小腸粘膜上皮細胞、大腸粘膜上皮細胞）、骨髄細胞、胚性幹細胞、口腔粘膜細胞などを挙げることができる。培養する細胞中に幹及び／又は前駆細胞が存在すれば、本発明のフィーダー細胞と共培養することにより、細胞の生存を維持するだけでなく、細胞を増殖したり、分化させることができる。培養する細胞が組織細胞である場合には、組織が再生されることもある。再生された組織は移植することができる。【００１７】
本発明のフィーダー細胞と共培養する細胞が角膜上皮細胞又は皮膚細胞である場合には、培養細胞は増殖して、重層化しうる。
本発明のフィーダー細胞と共培養する細胞が骨髄細胞又は胚性幹細胞である場合には、培養細胞は増殖するが、重層化しないであろう。
本発明のフィーダー細胞との共培養は、以下のようにして行うことができる。まずフィーダー細胞を培養皿に70％〜90％コンフルエントになるように播種し、翌日共培養する細胞を播種する。細胞はフィーダー細胞と接触させて培養しても良いし、またカルチャーインサート等を用いて接触させずに培養しても良い。【００１８】
角膜上皮細胞、皮膚表皮細胞、口腔粘膜上皮細胞などを重層させる場合は、まず血清添加培地を用いてカルチャーインサート上で細胞をコンフルエントになるまで培養する。次に培地量を細胞が気相と液相の境界に接するまで減らし、1週間程度培養する。【００１９】
本発明のフィーダー細胞と共培養することにより、移植に用いるための培養細胞を調製することができる。限られた組織で広い範囲を被覆するために、あらかじめ羊膜上に上皮を培養した移植片を上記方法で用意する。培養シャーレ内に羊膜を一層敷き、ドナー角膜、あるいは患者より採取した少量の細胞を培養する。培養上皮移植は、羊膜単独の移植に比べて早期より創傷治癒が得られるメリットがあり、炎症を抑える効果がある。また、増殖した細胞の中には未分化な細胞も含まれていることが示唆されており、少量の幹細胞から角膜上皮を再生できる可能性を秘めている。手術は、角膜を覆っている異常上皮を全て切除し、止血をする。次に、培養細胞シートを眼表面に展開をして、縫合糸にて固定をする。培養細胞が脱落しないために、保護用コンタクトレンズを装用して手術は終了する。【００２０】
さらに、本発明は、上記のフィーダー細胞を含む、細胞培養キットを提供する。
本発明のキットには、フィーダー細胞の他、培地（例えば、F12/DMEM、DMEM、）、増殖因子類（例えばEGF、インスリン、コレラトキシン、ハイドロコルチゾン、トランスフェリン、イソプロテレノール、トリヨードチロニン、アデニン）などを含んでもよい。本発明のキットを用いることにより、細胞を培養することができ、培養された細胞は移植に用いてもよい。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されることはない。【００２２】
〔実施例１〕
実験方法及び材料
Inventigative Ophthalmology & Visual Science, May 2005, Vol.46, No.5, p.1653-1658に記載の方法に従って、トリプシン、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼで処理したマウス角膜実質前駆細胞を機械的に分散させた後、10％ウシ胎児血清（FBS）添加DMEM/F12に懸濁し、75 cm2フラスコに3x106個の細胞が存在するよう播種、4日間37℃で培養することで線維芽細胞に誘導した。誘導後の細胞を4μg/mlのマイトマイシンＣ（Sigma）を用いて37℃で2時間処理したのち、0.05%トリプシンＥＤＴＡ処理（Invitrogen）により細胞を分散させ、3x106個/ｍｌになるようセルバンカー（十善フィールド）で希釈してディープフリーザーで凍結保存した。上皮細胞を播種する前日にこの細胞を解凍し、10%FBS添加DMEM/F12で希釈して６ウェルプレート（Falcon）に2.5x104/cm2の密度で播種した。
翌日、米国アイバンク由来の強角膜切片を角膜移植に用いた残りから輪部を分離し、外科的に虹彩、毛様体、デスメ膜、内皮、結膜を取り除いた。ディスパーゼ（Invitrogen, 10 mg/ml）Ｄ-ソルビトール（Wako, 9 mg/ml）を添加した血清添加培地を用いて4度で一晩処理したのち、上皮を実質から剥離させ、引き続いて0.05%トリプシンＥＤＴＡによる37℃、30分処理にて上皮細胞を分散させた。上皮細胞をフィブリンゲル（ボルヒール、化血研,2 mg/cm2）塗布したカルチャーインサート（Cornig, Transwell（登録商標）, cat no 3450）に播種し、前日用意したフィーダー細胞と約2週間培養した。培地にはF12/DMEMにFBS（10％）、human recombinant epidermal growth factor (Invitrogen, 10 ng/ml), human recombinant insulin (Wako, 5μg/ml)、transferrin human cell culture tested (Sigma, 5μg/ml), hydrocortisone water soluble (Sigma, 0.5μg/ml), DL-isoproterenol hydrochloride (Sigma 0.25μg/ml)、ストレプトマイシン／ペニシリンを添加したSupplement hormonal epithelial medium (SHEM)に、さらにアプロチニン(Wako, 666 KIU/ml)を添加したものを用い、1週間に3回交換した。細胞がコンフルエントに達した後に培地量を減らして空気に曝露させ、毎日培地を交換して引き続いて6日間培養した。
培養後はホルマリン固定後パラフィン切片にしてHE染色するか、あるいは4％ CMC溶液（Sakura finetek）に包埋して液体窒素で凍結し、凍結切片を作成した。凍結切片はアセトン固定後、10％血清添加PBSでブロッキングし、マウスモノクロナールの抗ケラチン3抗体（AE5, Progen Biotechnik GmbH）、抗コネキシン43抗体（Chemicon international Inc）、抗インテグリンβ1抗体（Chemicon）、抗p63抗体（Oncogene Research Products）を用いて染色した後、Cy3標識抗マウス抗体と反応させ、蛍光顕微鏡を用いて検出した。
コロニー形成率の測定では、100ミリディッシュにフィーダー細胞を播種し、翌日1000個の上皮細胞を播種した。これを2週間培養した後、10％ホルマリンで固定し、ローダミンBで染色した。【００２３】
結果
結果を図１に示す。図１Aは、培養中のマウス実質幹細胞である。図１Bは、図１Aのマウス実質幹細胞を薬剤処理によりフィーダー細胞としたものである。図１Cは、上皮培養の様子を示している。培養皿底部にフィーダー細胞を、その上に置いたカルチャーインサート内で上皮を培養する。図１Dは、培養中の上皮細胞である。
このフィーダー細胞を用いて作製した培養上皮シート（図2、列中央）は、従来の3T3を用いて作製した培養上皮シート(左列)と同様に重層しており、またほぼ同様の分化マーカー、未分化マーカーの遺伝子発現パターンを示す。すなわち、K3陽性細胞は最表層に、Cx43は基底細胞を含む上皮全体に、integerinβ1及びp63の発現は最表層を除く上皮全体に認められた。このことは、マウス角膜実質幹細胞を細胞源とするフィーダー細胞を用いても3T3を用いても、培養上皮シートの質に差がないことを示唆している。
図３は、ごく少数の上皮細胞を播種した際のコロニー形成率の差を示している。フィーダー細胞なしではまったく上皮細胞のコロニー形成が認められないのに対し、このフィーダー細胞を用いた場合には上皮細胞のコロニー形成が認められた。このことは、このフィーダー細胞が上皮細胞の生存と増殖を支持できる微小環境を提供しうることを示唆している。【００２４】
〔実施例２〕
実験方法及び材料
角膜実質幹細胞（COPs）は吉田らの方法に従って培養し、血清添加培地を用いて線維芽細胞に誘導した（Yoshida. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 May;46(5):1653-8.）。ヒト骨髄間葉系幹細胞（MASC）はSanBio社より供給を受け、同社のプロトコルに従い培養した。コンフルエントに達した細胞をmitomycin C ( 4 ug/ml, 37度、2時間)処理してフィーダー細胞とし、-80℃で使用するまで凍結保存した。
フィーダー細胞の上皮増殖支持能力を検討するため、ヒト輪部上皮細胞を米国アイバンク角膜から酵素処理により調整し、各フィーダー細胞を用意した径100 mmの培養皿上に1000個ずつ播種して2週間培養した。培地にはSHEM（実施例１で使用したものと同じ）を用いた。培養後培養皿をホルマリン固定し、ローダミンBで上皮コロニーを染色した。コロニー数を播種細胞数で除した百分率をコロニー形成率とした。
フィーダー細胞が上皮の分化および重層化を支持できるか否かを検討するため、フィーダー細胞を６ウェルプレートおよびフィブリンコートしたセルカルチャーインサートに用意し、このインサート中でヒト輪部上皮細胞を三次元培養した。セルカルチャーインサートは実施例1と同様、Cornig社Transwell（登録商標）（cat no 3450）にボルヒール（化血研,2 mg/cm2）を塗布したものを用いた。ヒト上皮細胞がコンフルエントに達した後、引き続いて１週間air lift cultureを行い、培養上皮シートを作成した。培養上皮シートはホルマリン固定後パラフィン切片にしてHE染色し、組織学的検定に供するか、あるいは新鮮凍結切片にして免疫組織学的検定に供した。免疫組織学的検定では１次抗体に抗keratin 3, 抗keratin 12, 抗keratin 15, 抗connexin 43, 抗integrin beta1, および抗p63抗体を、２次抗体にAlexa flour 標識抗体(Invitrogen社)、核染色にDAPIを用い、蛍光顕微鏡(Axioplan 2, Carl Zeiss社)を用いて発現の有無を検討した。【００２５】
結果
図2に示されるとおり、角膜実質幹細胞と共培養することでも、従来使用されてきたマウス3Ｔ3と共培養した場合と同等の培養上皮シートを作成することができた。具体的には、角膜実質幹細胞と共培養した培養上皮は重層し、分化マーカーであるK3およびCx43を発現する細胞を含み、かつ未分化マーカーであるInt b1およびp63を発現する細胞を含んでいた。また、図3に示すとおり、角膜実質幹細胞と共培養した培養上皮シートは、コロニー形成できるだけの増殖能を保った細胞を維持していた。一方、フィーダー細胞と共培養しなかった上皮細胞はほとんど重層せず、分化マーカーの発現がほとんど認められず、かつコロニー形成能を持つ細胞も維持していなかった。図4、5に示されるとおり、ヒト間葉系幹細胞由来のフィーダー細胞と共培養した上皮細胞も、重層した上皮シートを形成できた。フィーダーと接触させた場合でも接触させなかった場合でも、これらの上皮シートはＫ3，Ｋ12を発現する分化細胞を含んでいた。また、特に液性因子が持続的に供給された場合において（Duplex coculture, separated coculture）、角膜上皮幹細胞が存在する角膜輪部と同様にＫ15の発現が認められた。【００２６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明により、フィーダー細胞が提供された。本発明のフィーダー細胞を用いることにより、移植用の培養細胞を調製することができる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【国際調査報告】
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