(57)【要約】本発明は、新規な作用メカニズムにより腸管の機能異常の改善を可能とする薬剤を提供することを目的とする。また、当該薬剤のスクリーニングをはじめとする化合物の評価方法を提供することを目的とする。  腸管の機能異常を伴う疾患に治療剤としてＮＰＹ  Ｙ４アゴニストを使用することにより、当該疾患の改善、治療が可能となる。また、ＮＰＹ  Ｙ４受容体を標的とした化合物の評価を行うことにより、腸管の機能異常を伴う疾患の改善、治療を可能とする化合物の評価、スクリーニングが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、
ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該ＮＰＹ  Ｙ４に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項２】
腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、
ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項３】
腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、
ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該ＮＰＹ  Ｙ４又はＮＰＹ  Ｙ４を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、
被検化合物を接触させていない場合と比較して、該ＮＰＹ  Ｙ４又は該細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項４】
腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、
被検化合物を、ＮＰＹ  Ｙ４に接触させる工程と、
該接触によるＮＰＹ  Ｙ４の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項５】
ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子欠損非ヒト哺乳動物又は該哺乳動物に由来する組織若しくは細胞を用いることを特徴とする、腸管の機能異常を伴う疾患の予防又は治療に有効な化合物の評価方法。
【請求項６】
前記化合物がＮＰＹ  Ｙ４アゴニストである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
【請求項７】
前記腸管の機能異常によって生じる疾患が便秘である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
【請求項８】
有効成分としてＮＰＹ  Ｙ４アゴニストを含む、腸管の機能異常によって生じる疾患の治療剤。
【請求項９】
前記ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストがパンクレアティック・ポリペプタイドである、請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
ＮＰＹ  Ｙ４又はその部分ペプチドを含む、腸管の機能異常を伴う疾患の治療剤のスクリーニング用キット。
【請求項１１】
ＮＰＹ  Ｙ４と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分ペプチドを発現する細胞を含む、腸管の機能異常に伴う疾患の治療剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストを標的とする、腸管の機能異常を伴う疾患の診断又は治療に有効な化合物の評価方法に関する。また、本発明は、腸管の機能異常を伴う疾患の診断又は治療を目的としたＮＰＹ  Ｙ４アゴニストの新規用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＰＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ）は３６アミノ酸からなるペプチドであり、１９８２年、立元らにより豚脳より単離された（非特許文献１）。ＮＰＹは中枢神経系及び末梢神経系に広く分布し、神経系における最も多量に存在するペプチドの一つとして、生体において多様な機能を司っている。
すなわち、ＮＰＹは中枢において食欲促進物質として働くとともに、各種ホルモンの分泌又は神経系の作用を介して脂肪蓄積を顕著に促進する。例えば、ＮＰＹの脳室内連続投与はこれらの作用に基づき、肥満及びインスリン抵抗性を誘発することが知られている。また、ＮＰＹは、うつ病、不安、精神分裂、痛み、痴呆及び概日リズムの調節などの中枢作用を持つことが知られている。さらに、ＮＰＹは、末梢において、交感神経終末にノルエピネフリンと共存し、交感神経系の緊張性と関係している。ＮＰＹの末梢投与は血管収縮を引き起こし、またノルエピネフリンを初めとする他の血管収縮物質の作用を増強することが知られている。
ＮＰＹは、その類縁体であるペプタイドＹＹ（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＹＹ：以下、ＰＹＹと称する）及びパンクレアティック・ポリペプタイド（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：以下、ＰＰと称する）と一部共通の受容体を介して、多種多様な薬理作用を有する。これらＮＰＹによる薬理作用はＮＰＹ  Ｙ１からＹ５といった、少なくとも５種類の受容体の単独あるいは相互作用を介して惹起されることが知られている（非特許文献２）。
一方、ＮＰＹ  Ｙ４受容体に関して、既にヒトＮＰＹ  Ｙ４受容体遺伝子が単離されている（非特許文献３、４及び特許文献１：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ３５２３２（配列番号１及び２））。ヒトＮＰＹ  Ｙ４受容体は、ヒトゲノムライブラリーをＮＰＹ  Ｙ１受容体ｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングすることにより単離されたものであり、７回膜貫通型構造を有し、Ｙ１受容体とはアミノ酸レベルで４２％の相同性を有することが明らかにされている。また、ＮＰＹの他、ＰＰにも親和性を持ち、ＮＰＹ  Ｙ１受容体やＹ２受容体と同じく、細胞内カルシウム濃度を上昇させ、ｃＡＭＰ産生に対して抑制的な効果を示すことが明らかにされている。また、ＮＰＹ  Ｙ４受容体は主に前立腺、結腸、膵臓及び小腸に発現していることが知られている。
ＮＰＹ  Ｙ４受容体のノックアウトマウスでは体重及び白色脂肪組織の総量が減少し、血漿中のＰＰ量が増加することが報告されている（非特許文献５）。
【特許文献１】ＷＯ９５／１７９０６号公報
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻、６５９頁、１９８２年
【非特許文献２】Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０巻、２９４頁、１９９７年
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７０巻、２６７６２頁、１９９５年
【非特許文献４】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７０巻、２９１２３頁、１９９５年
【非特許文献５】Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１６巻、１０７７頁、２００２年
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、ＮＰＹ  Ｙ４受容体と腸管運動との関係については知見がないのが現状であった。また、腸管の機能異常（例えば、便秘）を改善する薬剤として、より副作用が少なく、新たなメカニズムの薬剤が望まれているのが現状であった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、新規な作用メカニズムにより腸管の機能異常の改善を可能とする薬剤を提供することを目的とする。また、当該薬剤のスクリーニングをはじめとする化合物の評価方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストが腸管に作用し、かかる作用によって腸管の機能異常を改善することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の化合物の評価方法は、腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ  Ｙ４に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。かかる評価方法により、ＮＰＹ  Ｙ４受容体に作用して腸管の機能異常を治療・改善する化合物の評価やスクリーニングが可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法は、腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。かかる評価方法により、ＮＰＹ  Ｙ４受容体に作用してＮＰＹ  Ｙ４受容体を介した細胞内情報伝達の制御を行う機能を有し、腸管の機能異常を治療・改善する化合物の評価やスクリーニングが可能となる。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ  Ｙ４又はＮＰＹ  Ｙ４を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、被検化合物を接触させていない場合と比較して、当該ＮＰＹ  Ｙ４又は該細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする。かかる評価方法により、ＮＰＹ  Ｙ４受容体に作用してＮＰＹ  Ｙ４受容体を介した細胞内情報伝達の制御を行う機能を有し、腸管の機能異常を治療・改善する化合物の評価やスクリーニングが可能となる。
また、本発明の評価方法は、腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、被検化合物を、ＮＰＹ  Ｙ４に接触させる工程と、当該接触によるＮＰＹ  Ｙ４の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。かかる評価方法により、ＮＰＹ  Ｙ４タンパク質と相互作用することによりＮＰＹ  Ｙ４の機能を制御する機能を有し、腸管の機能異常を治療・改善する化合物の評価やスクリーニングが可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法は、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子改変非ヒト哺乳動物又は該哺乳動物に由来する組織若しくは細胞を用いることを特徴とする。当該動物を用いて被検化合物を評価することにより、ＮＰＹ  Ｙ４特異的に結合する化合物についてｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能や挙動を観察することが可能となり、より的確な化合物の評価は可能となる。
また、上述した５つの態様の化合物の評価方法においては、前記化合物がＮＰＹ  Ｙ４アゴニストであることが好ましい。
さらに、本発明の腸管の機能異常によって生じる疾患の治療剤は、有効成分としてＮＰＹ  Ｙ４アゴニストを含むことを特徴とする。ここで、前記ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストがパンクレアティック・ポリペプタイドであることが好ましい。
また、本発明の腸管の機能異常を伴う疾患の治療剤のスクリーニング用キットは、ＮＰＹ  Ｙ４又はその部分ペプチドを含むことを特徴とする。当該キットを使用することにより、腸管の機能異常を伴う疾患の治療剤のスクリーニングや評価を簡便且つ迅速に行うことが可能となる。
さらに、本発明の腸管の機能異常に伴う疾患の治療剤のスクリーニング用キットは、ＮＰＹ  Ｙ４と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分ペプチドを発現する細胞を含むことを特徴とする。当該キットを使用することにより、化合物のスクリーニングや評価に用いる細胞の調製をすることなしに、腸管の機能異常を伴う疾患の治療剤のスクリーニングや評価を簡便且つ迅速に行うことが可能となる。
すなわち、本発明によれば、新規な作用メカニズムによる腸管の機能異常（例えば、便秘）の改善を可能とする薬剤を提供することが可能となる。また、このような薬剤のスクリーニングをはじめとする、腸管の機能異常の改善作用を有する化合物の評価方法や当該評価を簡便且つ迅速に行うことができるキットを提供することが可能となる。また、本発明の化合物の評価方法によれば、小腸に対する作用は小さく、大腸（特に回腸）に対して選択性が高い治療剤を得ることが可能となる。従って、著明な便秘改善効果を示すばかりでなく、他の臓器・器官に対する副作用の少ない治療剤を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＰの投与量と排糞量との関係を経時的に示す図である。
図２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＰの投与量と、投与後４時間の排糞量の総量との関係を示す図である。
図３は、回腸（ｉｌｅｕｍ）、近位結腸（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｃｏｌｏｎ）又は遠位結腸（ｄｉｓｔａｌ  ｃｏｌｏｎ）におけるＰＰの投与量と腸の張力との関係を示す図である。
図４は、回腸、近位結腸又は遠位結腸におけるＰＰの投与と腸の振幅数との関係を示す図である。
図５は、便秘モデルマウスにＰＰ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した際の投与後４時間における排糞量を示す図である。
図６は、ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウスにＰＰを投与した際の投与後２時間における排糞量を示す図である。
図７は、ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウス及び野生型マウスより摘出した回腸、近位結腸又は遠位結腸におけるＰＰの投与の際の腸の張力の相違を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明にかかる「ＮＰＹ  Ｙ４」受容体とは、上述したように、ＮＰＹの受容体として機能する７回膜貫通構造の分子をいう。また、由来となる生物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ又はウサギが挙げられる。中でも、本発明のＮＰＹ  Ｙ４アゴニストの投与対象や、化合物の評価における評価対象がヒトであることから、ヒトＮＰＹ  Ｙ４であることが好ましい。
また、本発明に係るＮＰＹ  Ｙ４遺伝子には、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子と同等の生理機能を有し、ＮＰＹ受容体としての機能するタンパク質をコードするものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
また、本発明に係るＮＰＹ  Ｙ４遺伝子には、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０ｘＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで上昇させることができる。
また、本発明に係る腸管の機能異常によって生じる疾患としては特に制限はなく、例えば、便秘、急性虫垂炎、便秘型の過敏性腸症候群、虚血性大腸炎を挙げることができる。また、かかる便秘の具体例としては、一過性の単純性便秘、症候群性便秘、けいれん性便秘、弛緩性便秘、直腸性便秘及び薬剤性便秘を挙げることができる。
（１）化合物の評価
ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子又はタンパク質を用いて、ＮＰＹ  Ｙ４に作用する化合物の評価をすることができる。ＮＰＹ  Ｙ４に対する作用を検出する方法として、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じたＮＰＹ  Ｙ４を介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。
先ず、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出することにより、被検化合物を評価する方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法の第一の態様は、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ  Ｙ４に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
次に、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃が挙げられる。
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被検化合物に代えて、これらの被検化合物を複数種混合した混合物を使用してもよい。
また、本発明において「接触」は、ＮＰＹ  Ｙ４の状態に応じて行う。例えば、ＮＰＹ  Ｙ４が細胞表面に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液又は細胞抽出液に被検化合物を添加することにより接触させることができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＮＰＹ  Ｙ４が発現している細胞へ導入する、又は当該ベクターをＮＰＹ  Ｙ４が発現している細胞抽出液に添加することにより接触させることができる。また、例えば、酵母又は動物細胞等を用いたツーハイブリッド法を用いることも可能である。
具体的には、被検化合物とＮＰＹ  Ｙ４との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、ＮＰＹ  Ｙ４を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（好ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドと受容体との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの当該溶液に、一定量（例えば、５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識した被検化合物を添加し、同時に１０−１０〜１０−４Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量を知るために大過剰の未標識の本発明のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃〜５０℃、好ましくは４℃〜３７℃で２０分〜２４時間、好ましくは３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター又はγ−カウンターで計測する。
第一の態様では、次いで、ＮＰＹ  Ｙ４と被検化合物の結合を検出する。検出方法としては、特に制限はない。細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、上述したような、結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度による検出）のほか、細胞表面上の受容体へ被検化合物が結合することによって生じた細胞内へのシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の活性化、ｃＡＭＰ、またはＣａ２＋の濃度変化（ＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）等が使用できる）、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、受容体のインターナリゼーション）を指標に検出することができる。
具体的には、ＮＰＹ  Ｙ４を介する細胞内へのシグナル伝達（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸（ＩＰ）産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、微小管結合蛋白質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性または抑制する活性など）を、公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＮＰＹ  Ｙ４を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては予め新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、被検化合物を添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、イノシトール３リン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、当該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
第一の態様では、次いで、ＮＰＹ  Ｙ４と結合する被検化合物を選択する。選択された化合物には、ＮＰＹ  Ｙ４の活性を促進又は抑制する化合物若しくは、ＮＰＹ  Ｙ４の発現を増加又は減少させる化合物が含まれ、それらの化合物は腸管のぜん動等の運動を促進又は抑制する作用を有する。これらの化合物からＮＰＹ  Ｙ４に対するアゴニストとして働くものを選択すれば、当該化合物は腸管の異常に伴う疾患の予防又は治療に有効な薬剤として利用することができる。
また、本発明の化合物の評価方法の第二の態様は、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
第二の態様においては、まず、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞に被検化合物を接触させる。
ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞は以下のようにして調製することができる。すなわち、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４タンパク質を発現する細胞の調製は、当業者に公知の方法で行うことができるが、例えば、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
次に、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、例えば、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１、ＣＣＤ−１８Ｃｏ、ＣＣＤ−８４１ＣｏＮ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法又はリポフェクション法が挙げられる。
また、第二の態様において用いる被検化合物は第一の態様において使用したものと同様のものを用いることができる。
次に、このようにして調製したＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、ＮＰＹ  Ｙ４が細胞内（細胞膜上を含む）に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または当該細胞抽出液に被検試料を添加することにより行うことができる。被検試料がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＮＰＹ  Ｙ４が発現している細胞へ導入する、または当該ベクターをＮＰＹ  Ｙ４が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
次に、ＮＰＹ  Ｙ４と被検化合物との接触によって生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する。具体的には、例えば、フォスホリパーゼリパーゼＣ（ＰＬＣ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）のようにＮＰＹ  Ｙ４を介した細胞内情報伝達を司る分子の活性を測定する。
ＩＰ３の場合、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストにより細胞内イノシトール三リン酸濃度は上昇する。この現象を利用し、標識したイノシトールの存在下、被検化合物をＮＰＹ  Ｙ４受容体を発現した細胞に接触させた場合と、接触させていない場合とのイノシトール三リン酸の濃度を測定し、濃度が上昇した場合には、当該被検化合物にはＮＰＹ  Ｙ４アゴニストとしての活性があると判断することができる。ここで、イノシトール三リン酸の濃度の測定は公知の方法により行うことができる。より具体的には、例えば、ＮＰＹ  Ｙ４を発現した細胞を９６穴プレートに播き、１日間培養する。その後、ｍｙｏ−［３Ｈ］ｉｎｏｓｉｔｏｌを添加した培地で１日間培養した後、標識されたイノシトールを含まない培地で細胞を洗浄する。これに被検化合物を添加した後、１０％過塩素酸を加え、反応を止める。１．５Ｍ  水酸化カリウム及び６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液で中和し、０．５ｍｌのＡＧ１ｘ８樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を詰めたカラムに通し、５ｍＭ  四ホウ酸ナトリウム及び６０ｍＭ  ギ酸アンモニウムで洗浄した後、１Ｍ  ギ酸アンモニウム及び０．１Ｍ  ギ酸で溶出した放射活性を、液体シンチレーションカウンターで測定することにより、ＩＰ３の濃度を測定・算出することができる。
また、被検化合物とＮＰＹ  Ｙ４の結合活性を指標にして活性の測定とすることもできる。このような方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ＮＰＹ  Ｙ４が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる被検化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、放射性同位体で標識したリガンドと競合してＮＰＹ  Ｙ４へ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、かかる方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である。
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るＮＰＹ  Ｙ４とリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）及び当該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）等が含まれる。アゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明に係るＮＰＹ  Ｙ４を介したシグナル伝達の進行を制御する機能を有し、このようなシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法の第三の態様は、腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＮＰＹ  Ｙ４又はＮＰＹ  Ｙ４を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、被検化合物を接触させていない場合と比較して、当該ＮＰＹ  Ｙ４又は該細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする。
第三の態様では、まず、ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞に被検化合物を接触させる。
ＮＰＹ  Ｙ４を発現する細胞は以下のようにして調製することができる。すなわち、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子を導入し、ＮＰＹ  Ｙ４タンパク質を発現する細胞の調製は、当業者に公知の方法で行うことができるが、例えば、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
次に、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、例えば、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１、ＣＣＤ−１８Ｃｏ、ＣＣＤ−８４１ＣｏＮ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法又はリポフェクション法が挙げられる。
また、第三の態様において用いる被検化合物は第一の態様において使用したものと同様のものを用いることができる。
本発明において「接触」は、以下のように行うことできる。細胞内に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液又は細胞抽出液に被検化合物を添加することにより接触させることができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＮＰＹ  Ｙ４が発現している細胞へ導入する、又は当該ベクターをＮＰＹ  Ｙ４が発現している細胞抽出液に添加することにより接触させることができる。また、例えば、酵母又は動物細胞等を用いたツーハイブリッド法を用いることも可能である。
第三の態様では、次いで、ＮＰＹ  Ｙ４の発現レベルを測定する。ここで、本発明における「発現レベル」とは、ＮＰＹ  Ｙ４を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子にはＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれもが含まれる。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ＮＰＹ  Ｙ４を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
ＮＰＹ  Ｙ４の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによってＮＰＹ  Ｙ４遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
また、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子にコードされるＮＰＹ  Ｙ４を含む画分を定法に従って回収し、ＮＰＹ  Ｙ４の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法により検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＮＰＹ  Ｙ４に対する抗体を用いてウエスタンブロッティング法を実施し、ＮＰＹ  Ｙ４の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルでの測定を行うことも可能である。ここで、ＮＰＹ  Ｙ４の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、モノクローナル抗体であってもよくポリクローナル抗体であってもよい。当該抗体は、当業者に公知の方法により調製することができる。具体的には、例えば、ポリクローナル抗体であれば、以下のようにして調製することができる。すなわち、ＮＰＹ  Ｙ４又はＮＰＹ  Ｙ４とＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質又はその部分ペプチドをウサギ等に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、イオン交換クロマトグラフィー、ＮＰＹ  Ｙ４をカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製できる。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、ＮＰＹ  Ｙ４又はその部分ペプチドをマウス等の小動物に対して免疫し、同マウスより脾臓を取り出し、これをすりつぶして細胞を分離し、当該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これにより得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ＮＰＹ  Ｙ４に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマを、マウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、イオン交換クロマトグラフィー、ＮＰＹ  Ｙ４をカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製できる。
第三の態様では、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、当該ＮＰＹ  Ｙ４の発現レベルを減少又は増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、ＮＰＹ  Ｙ４の発現を減少又は増加させる化合物が含まれ、発現を減少させる化合物はＮＰＹ  Ｙ４アンタゴニストとして、発現を増強する化合物はＮＰＹ  Ｙ４アゴニストとして作用する。これらの化合物からＮＰＹ  Ｙ４に対するアゴニストとして働くものを選択すれば、当該化合物は腸管の機能異常を伴う疾患の予防又は治療に有効な薬剤として使用することができる。
また、本発明の化合物の評価方法の第四の態様は、腸管の機能異常によって生じる疾患の診断又は治療に用いる化合物の評価方法であって、被検化合物を、ＮＰＹ  Ｙ４に接触させる工程と、当該接触によるＮＰＹ  Ｙ４の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
ＮＰＹ  Ｙ４の精製は公知の方法により行うことができる。また、ＮＰＹ  Ｙ４を発現している細胞としては、内在性のＮＰＹ  Ｙ４を発現している細胞又は外来性のＮＰＹ  Ｙ４を発現している細胞を挙げることができる。内在性のＮＰＹ  Ｙ４を発現している細胞としては、培養細胞等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。当該培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることができる。また、内在性のＮＰＹ  Ｙ４を発現している細胞が由来する生物種としては特に制限はなく、ヒト、マウス、ラット、サル、モルモット、フェレット等を挙げることができる。また、前記外来性のＮＰＹ  Ｙ４を発現している細胞は、例えば、ＮＰＹ  Ｙ４をコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法によって実施することができる。
また、ＮＰＹ  Ｙ４が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＮＰＹ  Ｙ４をコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。このような試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キット等を使用することができる。
また、第四の態様において用いる被検化合物は第一の態様において使用したものと同様のものを用いることができる。
第四の態様において、接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、ＮＰＹ  Ｙ４タンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
次に、接触によって生じたＮＰＹ  Ｙ４の活性の変化を検出する。
タンパク質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよく、具体的には、例えば、ＮＰＹ  Ｙ４に対するリガンドの結合活性を指標にする方法が挙げられる。
前記のリガンドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ＮＰＹ  Ｙ４が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる被検化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、放射性同位体で標識したリガンドと競合してＮＰＹ  Ｙ４へ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、かかる方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である。
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るＮＰＹ  Ｙ４とリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）及び当該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）等が含まれる。アゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明に係るＮＰＹ  Ｙ４を介したシグナル伝達の進行を制御する機能を融資、このようなシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。なかでも、ＮＰＹ  Ｙ４に対するアゴニストとして働くものを選択すれば、当該化合物は腸管の機能異常を伴う疾患の予防又は治療に有効な薬剤として使用することができる。
本発明の化合物の評価方法の第五の態様は、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子改変非ヒト哺乳動物又は該哺乳動物に由来する組織若しくは細胞を用いることを特徴とする。
当該評価方法において用いられる遺伝子改変非ヒト哺乳動物としては、そのＮＰＹ  Ｙ４の抑制方法について特に制限はなく、公知の方法に従って作製することができるが、例えば、以下のようにして遺伝子改変マウスを作製することができる。まず、マウスからＮＰＹ  Ｙ４遺伝子のエクソン部分を含むＤＮＡを単離し、遺伝子工学的手法によりＮＰＹ  Ｙ４遺伝子配列の一部又は全部を削除、若しくは他遺伝子を挿入又は置換する。一般に、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子配列の一部又は全部に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲティングベクターを構築する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子；β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）、ルシフェラーゼ遺伝子又はＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子のようなレポーター遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、レポーター遺伝子を挿入してエクソンの機能を破壊する場合、当該レポーター遺伝子は、ＮＰＹ  Ｙ４のプロモーターの制御下で発現するように挿入することが好ましい。また、ターゲティングベクターの調製に用いるベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＢ１１０、ｐＴＢ５、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ｐＫＯを挙げることができる。
こうして得られたターゲティングベクターをエレクトロポーレーション法等によりマウス等のＥＳ細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。具体的には、ターゲティングベクターを非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞又は非ヒト動物卵細胞に公知の方法（エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、パーティクルガン法等）によって導入し、ターゲティングベクターに含まれる不活性化されたＮＰＹ  Ｙ４遺伝子配列を相同組換えにより、非ヒト動物ＥＳ細胞又は非ヒト動物卵細胞の染色体上のＮＰＹ  Ｙ４遺伝子と入れ替えることにより選抜することができる。
ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子がノックアウトされた細胞は、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子上又はその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析又はターゲティングベクター上のＤＮＡ配列とＮＰＹ  Ｙ４遺伝子近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。
非ヒト動物ＥＳ細胞を用いた場合は、相同組換えにより、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子が不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を胚形成の初期の適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト動物胚または胚盤胞に注入し、又はＮＰＹ  Ｙ４遺伝子が不活性化されたＥＳ細胞塊を２個の８細胞期胚ではさみ込むことにより作製したキメラ胚を偽妊娠させた非ヒト動物の子宮に移植する。
作出された動物は正常なＮＰＹ  Ｙ４遺伝子座を有する細胞と人為的に変異したＮＰＹ  Ｙ４遺伝子座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。当該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異したＮＰＹ  Ｙ４遺伝子座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えたＭＧＡＴ２遺伝子座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＮＰＹ  Ｙ４ヘテロ発現不全個体であり、ＮＰＹ  Ｙ４ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＮＰＹ  Ｙ４ホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法で遺伝子溶液を注入することによりターゲティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト動物を比較することにより、相同組換えによりＮＰＹ  Ｙ４遺伝子座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして作製したＮＰＹ  Ｙ４遺伝子欠損非ヒト哺乳動物は、生体内のＮＰＹ  Ｙ４受容体を欠損している。従って、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストやアンタゴニストを投与した際でも当該アゴニスト又はアンタゴニストによる生理機能を発揮することはない。本発明者らは、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストをマウスに投与すると排糞量が増加し、腸管の張力が上昇することを見出しているが、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子欠損マウスではこの現象は見られない。すなわち、上述の化合物の評価方法の第一から第四の態様によって評価・スクリーニングされた化合物をＮＰＹ  Ｙ４欠損非ヒト哺乳動物に投与したり、当該動物の組織を用いて化合物の評価を行うことにより、当該化合物がＮＰＹ  Ｙ４特異的に結合し、作用していることを確認することが可能となる。
具体的には、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子欠損マウスと野生型マウスを準備し、それぞれに被検化合物を投与する。投与方法は特に限定されないが、経口投与や皮下投与による方法を挙げることができる。投与後、糞を採取し、その重量を測定することにより、被検化合物投与による排糞量を測定する。野生型マウスにおいてＮＰＹ  Ｙ４遺伝子欠損マウスと比較して排糞量が有意に多い場合には、当該被検化合物はＮＰＹ  Ｙ４特異的に作用する化合物であり、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニスト活性を有すると判断することができる。
また、ＮＰＹ  Ｙ４遺伝子欠損マウス及び野生型マウスから摘出した腸管を用いて被検化合物の作用を検討することができる。例えば、マウスから取り出した腸管を適当な長さに切り、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液中で所望の静止張力で懸垂する。懸垂した腸管に被検化合物を適用し、張力の変化を測定することにより、ＮＰＹ  Ｙ４特異的に作用する化合物を選択することができる。ここで、摘出する腸管の部位（例えば、回腸、結腸等）を変えて試験に供することにより、部位特異的に機能する化合物を選択することができる。
また、本発明の化合物の評価方法により、ＮＰＹ  Ｙ４への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンド及びそのアナログを作用させた場合の細胞内シグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、ＮＰＹ  Ｙ４への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、ＮＰＹ  Ｙ４への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、腸管の機能異常を伴う疾患の治療又は症状の緩和に有効であり、中でも、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストとして機能する化合物は、腸管の機能異常を伴う疾患の治療又は症状の緩和に有効である。また、本発明の化合物の評価方法によれば、小腸に対する作用は小さく、大腸（特に回腸）に対して選択性が高い治療剤を得ることが可能となる。従って、著明な便秘改善効果を示すばかりでなく、他の臓器・器官に対する副作用の少ない治療剤を得ることが可能となる。
（２）ＮＰＹ  Ｙ４アゴニスト及び当該アゴニストを有効成分として含む治療剤
本発明における「ＮＰＹ  Ｙ４アゴニスト」とは、ＮＰＹ  Ｙ４受容体を介して細胞内シグナル伝達を引き起こす物質をいい、ＮＰＹ  Ｙ４作動剤ともいう。また、本発明にかかるＮＰＹ  Ｙ４アゴニストは、ＮＰＹ  Ｙ４受容体に親和性を示し、アゴニストとして機能する分子であればその分子種は特に制限されない。このような分子としては、例えば、低分子化合物、タンパク質、ペプチドを挙げることができる。前記低分子化合物としてもその種類は特に制限されず、具体的には、例えば、天然化合物、有機化合物又は無機化合物が挙げられる。また、前記ペプチドとしてもその種類は特に制限されず、具体的には、例えば、ＮＰＹの類縁体であるＰＰが挙げられる。
ここで、ＰＰ（ヒトＰＰ：配列番号３、ウシＰＰ：配列番号４、ラットＰＰ：配列番号５、マウスＰＰ：配列番号６）は、ＮＰＹとアミノ酸で約５０％の相同性を有するペプチドであり、ＰＹＹ（ペプチドＹＹ）と併せてＮＰＹファミリーと称される（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２５０巻、９３６９頁、１９７５年）。ＰＰはＮＰＹと同様３６アミノ酸からなるペプチドであり、主に膵臓に発現する。ＰＹＹをマウスに投与すると摂食量が抑制されることから、生体内において食欲や摂食の調節因子として機能していることが示唆されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．、８８巻、３９８９頁、２００３年）。また、ＰＰの分泌量と下痢との間に何らかの関係を示唆する報告もあるが、これらの間の機能的な観点からの因果関係は明らかではない（Ｇｕｔ、２４巻、６６５頁、１９８３年；Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｔ．Ｃａｎｃｅｒ、３２巻、１５３頁、２００２年；Ｐａｎｃｒｅａｓ、２９巻、８３頁、２００４年）。
本発明に係るＰＰには、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストとしての機能を有し且つ配列番号２〜５のいずれかのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するペプチドも含まれる。かかる置換、欠失、付加又は挿入のアミノ酸数としては、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストとしての機能を有する限り特に制限はないが、１〜１０アミノ酸であることが好ましく、１〜８アミノ酸であることがより好ましく、１〜５アミノ酸であることがさらに好ましく、１〜３アミノ酸であることが特に好ましい。
また、本発明のＮＰＹ  Ｙ４アゴニストは、化合物であれば化合物種に応じた当業者に公知の合成法により合成することができる。また、化合物が天然物由来であれば、当該天然物より所定の抽出方法により精製することができる。さらに、当該アゴニストがペプチドであれば、当業者に公知の方法により合成することができる。
本発明のＮＰＹ  Ｙ４アゴニストをヒトや他の動物の治療剤として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該アゴニストがＤＮＡによりコードされうるものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストの投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
本発明によれば、小腸に対する作用は小さく、大腸（特に回腸）に対して選択性が高い治療剤が提供される。従って、著明な便秘改善効果を示すばかりでなく、他の臓器・器官に対する副作用の少ない治療剤が提供される。
（３）腸管の機能異常によって生じる疾患の治療剤のスクリーニング用キット
本発明のスクリーニング用キットは、ＮＰＹ  Ｙ４と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分ペプチドを少なくとも含むことを特徴とする。当該タンパク質又は部分ペプチドは標識されていてもよい。
前記部分ペプチドは、ＮＰＹ  Ｙ４の部分配列を有し、且つ、ＮＰＹ  Ｙ４と同様のＧＰＣＲ活性を有していればそのアミノ酸数及びＮＰＹ  Ｙ４上の部位は限定されない。
また、ＮＰＹ  Ｙ４又はその部分ペプチドのほか、反応用緩衝液、反応の停止液、洗浄用緩衝液、反応や洗浄に用いる容器等をさらに含んでいてもよい。
本発明のスクリーニング用キットを用いた被検化合物の評価の方法は以下のとおりである。すなわち、反応容器に反応用緩衝液を加えた後、キットに含まれるＮＰＹ  Ｙ４又はその部分配列を有するペプチド及び被検化合物を添加し、被検化合物とＮＰＹ  Ｙ４との結合反応を進行させる。ここで、被検化合物に代えてコントロール（ネガティブコントロール及び／又はポジティブコントロール）化合物を添加した試料を準備しておくことが望ましい。反応は所望の反応停止液によって停止すればよい。反応停止後、ＮＰＹ  Ｙ４と結合した標識された被検化合物を検出することにより、被検化合物のＮＰＹ  Ｙ４結合活性を測定することができる。
また、本発明のスクリーニング用キットの別の態様は、ＮＰＹ  Ｙ４と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分ペプチドを発現する細胞を少なくとも含むことを特徴とする。ここで、ＮＰＹ  Ｙ４と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質とは、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入はあるが、ＮＰＹ  Ｙ４と同様のＧＰＣＲ活性を有しているタンパク質を指す。例えば、活性に影響を与えない遺伝子多型を有するタンパク質を挙げることができる。また、前記部分ペプチドは、ＮＰＹ  Ｙ４の部分配列を有し、且つ、ＮＰＹ  Ｙ４と同様のキナーゼ活性を有していればそのアミノ酸数及びＮＰＹ  Ｙ４上の部位は限定されない。
当該スクリーニング用キットにおいては、ＮＰＹ  Ｙ４、ＮＰＹ  Ｙ４と実質的に同一なタンパク質又はその部分ペプチドのほか、反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、コントロールとして利用可能なリガンド、反応や洗浄に用いる容器等をさらに含んでいてもよい。
本発明のスクリーニング用キットを用いた被検化合物の評価の方法は以下のとおりである。すなわち、細胞培養容器にキットに含まれる細胞を播種した後、被検化合物を添加し、反応を進行させる。ここで、被検化合物に代えてコントロール（ネガティブコントロール及び／又はポジティブコントロール）化合物を添加した試料を準備しておくことが望ましい。反応は所望の反応停止液によって停止してもよいし、氷上等で反応溶液の温度を下げることにより停止させてもよい。反応停止後、細胞上のＮＰＹ  Ｙ４に結合した標識された被検化合物を検出したり、ＮＰＹ  Ｙ４を介した細胞内シグナル伝達を検出することにより、被検化合物のＮＰＹ  Ｙ４アゴニスト又はアンタゴニスト活性を測定することができる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストであるｍＰＰの消化管運動に対する効果）
神経ペプチドＹの受容体サブタイプのひとつであるＮＰＹ  Ｙ４受容体に対して、腸管ペプチドであるＰＰが高い親和性を示すことが知られている。また、Ｙ４受容体は下部消化管に存在することが知られているため、マウスにｍｏｕｓｅ  ＰＰ（ｍＰＰ）を投与し、マウスの下部消化管運動に与える影響を検討した。すなわち、ｍＰＰ投与によって排糞量がどのような変化をするかを観察し、排糞量の増加が下部消化管の運動亢進を反映しているものとして、消化管運動の変化を考察した。
雄性のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、１５週齢）にｍＰＰ（０．００１、０．０１、０．１又は１ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与し、ｖｅｈｉｃｌｅ群には生理食塩水のみを皮下投与（５ｍＬ／ｋｇ）した。生理食塩水又はｍＰＰの皮下投与と同時に絶食を行い、投与１、２及び４時間後に糞を採取し重量を測定した、分散分析およびＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔを用い群間の有意差を解析した。
図１及び２に示すとおり、ｍＰＰは用量依存的な排便増加作用を示した。ｍＰＰの投与４時間後における累積排糞量は、ｖｅｈｉｃｌｅ群に比して０．１ｍｇ／ｋｇ以上の用量で有意であり、ｖｅｈｉｃｌｅ群、ｍＰＰ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群及びｍＰＰ  １ｍｇ／ｋｇ群において、各々２１１±１８ｍｇ／４ｈ、３２５±２２ｍｇ／４ｈ（Ｐ＜０．０５）及び４０８±３６ｍｇ／４ｈ（Ｐ＜０．０１）であった。なお、図中、＊＊はＰ＜０．０１を、＊はＰ＜０．０５（ｖｅｈｉｃｌｅ群との比較）を表す。
ｍＰＰの皮下投与によりマウスの排便量の増加が示されたことから、ｍＰＰの下部消化管運動促進作用が示された。したがって、ｍＰＰは便秘症および便秘型の過敏性腸症候群（ＩＢＳ：ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの下部消化管運動機能障害を改善する新規かつ有効な治療薬として有用と考えられた。
実施例２
（マウス摘出結腸の自発性収縮に対するＮＰＹ  Ｙ４アゴニストの効果）
実施例１において、マウスにＮＰＹ  Ｙ４アゴニストであるｍＰＰを１ｍｇ／ｋｇ適用することで排糞量の増加が誘発された。そこでｍＰＰの作用点を確認するためにｍＰＰの作用が摘出臓器レベルでも見られるか検討した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８−２０週齢）の回腸、近位結腸及び遠位結腸を摘出した。標本はそれぞれ１ｃｍの長さに切り、９５％  Ｏ２〜５％  ＣＯ２で酸素化した５ｍＬのＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液（組成を表１に示す）中に０．３ｇの静止張力で縦走筋方向に懸垂し、ｂａｔｈ内温度は３７度とした。張力はｉｓｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（ＴＢ−６５１，Ｎｉｈｏｎ  Ｋｏｈｄｅｎ製）で測定し、Ｐｏｗｅｒ  Ｌａｂ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製）に毎秒２０ポイント記録した。
１時間平衡化したのち０．０１μＭ、０．１μＭ及び１μＭのｍＰＰを適用して２０分間計測した。ｍＰＰは０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ及び１ｍＭのＤＭＳＯ溶液になるように調製して、５ｍＬのｏｒｇａｎ  ｂａｔｈ中に５μＬ適用した。ｍＰＰの作用は適用前２０分の平均張力に対する適用後２０分の平均張力の比で示した。統計計算はＰａｉｒｅｄ  ｔ−Ｔｅｓｔで行った。
【表１】
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図３に示すとおり、マウス近位結腸及び遠位結腸においてｍＰＰは用量依存的に張力を上昇させ、その最大作用は適用前のそれぞれ１３１％及び１５２％であった。一方、回腸においては有意な張力の上昇を示さなかった。また、図４に示すとおり、近位結腸及び遠位結腸において、ｍＰＰ適用により張力の上昇だけでなく自動運動の振幅の増大が見られた。なお、図中、＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１（ｐｒｅ値との比較）を表す。
以上より、マウス近位結腸及び遠位結腸においてｍＰＰは張力の上昇及び自動運動の振幅の増大が見られた。結腸は排便に重要な役割を持ち、結腸の運動の亢進は下痢を惹起するとされている。今回の結果はｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍＰＰによる排便亢進といった結果と一致する。摘出組織でもｍＰＰの作用が見られたことよりその作用点は末梢神経または平滑筋であることが考えられた。
実施例３
（Ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ誘発便秘モデルマウスに対するＮＰＹ  Ｙ４アゴニストの効果）
マウスにおいてｍＰＰの腹腔内あるいは皮下投与が排便量を増加させたことから、ＮＰＹ  Ｙ４アゴニストの排便亢進作用がＣｌｏｎｉｄｉｎｅ誘発の便秘モデルにおいて改善作用を示すか否かを検討した。
雄性のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、１８週齢）にＣｌｏｎｉｄｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、ｖｅｈｉｃｌｅ群には生理食塩水のみを腹腔内投与した。Ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ投与１時間後にｓａｌｉｎｅ（対照群）あるいはｍＰＰ（１ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。なお、ｖｅｈｉｃｌｅ群においても生理食塩水の皮下投与を行なった。生理食塩水又はＣｌｏｎｉｄｉｎｅの腹腔内投与と同時に絶食を行い、その投与１、２、３及び４時間後に糞を採取し重量を測定した。分散分析及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔにより群間の有意差を解析した。
図５に示すとおり、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、ｖｅｈｉｃｌｅ群に比して投与４時間後において有意な排便量の減少が観察された（図中、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す）。これに対し、Ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ投与４時間後（ｍＰＰ投与３時間後）においてｍＰＰ  １ｍｇ／ｋｇ投与群では、ｖｅｈｉｃｌｅ群に比して排便量の有意な低下は観察されなかった。
すなわち、マウスＣｌｏｎｉｄｉｎｅ誘発便秘モデルにおいてｍＰＰの後処置は改善作用を示したことから、ｍＰＰの抗便秘作用が示された。従って、ｍＰＰは便秘症及び便秘型過敏性腸症候群（ＩＢＳ）等の下部消化管運動機能障害を改善する新規かつ有効な治療薬として有用と考えられた。
実施例４
（ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウスにおけるｍＰＰの消化管運動に対する効果）
ＰＰの作用するＮＰＹ受容体サブタイプは不明であることから、ＰＰによる下部消化管運動促進効果にＮＰＹ  Ｙ４受容体が関与するかどうかを明らかにするために、ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウス（Ｄｅｌｔａｇｅｎ  Ｉｎｃ．製）におけるＰＰの下部消化管運動に与える影響を検討した。
以下の試験は野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）マウス及びＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウス（雄性、２３−２９週齢、ｎ＝１０〜１６）を用いて行った。ｍＰＰ（１ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水を皮下投与（５ｍＬ／ｋｇ）し、投与と同時に絶食を行った。投与１及び２時間後に糞を採取し重量を測定した。糞重量は２時間の累積量を解析に用い、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより群間の有意差を解析した。
図６に示すとおり、ｍＰＰは野生型マウスにおいて排便増加作用を示した（ｖｅｈｉｃｌｅ群３２２±４１ｍｇ／２時間、ｍＰＰ群６６８±６４ｍｇ／２時間，Ｐ＜０．０１）。一方、ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウスではｍＰＰによる排便増加作用は認められなかった（ｖｅｈｉｃｌｅ群３５８±３１ｍｇ／２時間、ｍＰＰ群４０３±４３ｍｇ／２時間）。なお、図中、＃＃はＰ＜０．０１（ｖｅｈｉｃｌｅ群との比較）を表す。
以上より、ｍＰＰの皮下投与による排便量の増加は野生型マウスのみで認められ、ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウスでは認められなかった。このことはＮＰＹ  Ｙ４受容体の活性化は下部消化管運動を亢進させる事を示している。したがって、ＮＰＹ  Ｙ４受容体アゴニストは便秘症及び便秘型の過敏性腸症候群などの下部消化管運動機能障害を改善する新規かつ有効な治療薬として有用と考えられた。
実施例５
（ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウス摘出結腸の自発性収縮に対するＮＰＹ  Ｙ４アゴニストの効果）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス近位結腸及び遠位結腸においてＮＰＹ  Ｙ４アゴニストであるｍＰＰは張力を上昇させた。そこでｍＰＰの作用がＮＰＹ  Ｙ４受容体を介するか否かを確認するためにＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウスを用いて検討した。
ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウス及び野生型マウス（３２−３７週齢）の回腸、近位結腸及び遠位結腸を摘出した。標本はそれぞれ１ｃｍの長さに切り、９５％  Ｏ２〜５％  ＣＯ２で酸素化した５ｍＬのＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液中に０．３ｇの静止張力で縦走筋方向に懸垂し、ｂａｔｈ内温度は３７度とした。張力はｉｓｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（ＴＢ−６５１，Ｎｉｈｏｎ  Ｋｏｈｄｅｎ製）で測定し、Ｐｏｗｅｒ  Ｌａｂ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に毎秒２０ポイント記録した。
１時間平衡化したのち１μＭのｍＰＰを適用して２０分間計測した。ｍＰＰは１ｍＭのＤＭＳＯ溶液になるように調製して、５ｍＬのｏｒｇａｎ  ｂａｔｈ中に５μＬ適用した。ｍＰＰの作用は適用前２０分の平均張力に対する適用後２０分の平均張力の比で示した。また、統計計算はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ＴｅｓｔまたはＰａｉｒｅｄ  ｔ−Ｔｅｓｔで行った。
図７に示すとおり、近位結腸及び遠位結腸において１μＭ  ｍＰＰ適用後の張力の変化は野生型マウスとＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウスの間で有意な差が見られた。また野生型マウスで見られた張力の上昇はＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウスでは見られなかった。一方、回腸においては両者に差は見られなかった。なお、図中、＃はＰ＜０．０５を、＃＃はＰ＜０．０１を表す（ｐｒｅ値との比較）。なお、図中、＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を表す（ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウスと野生型マウスとの比較）。
以上より、野生型マウス近位結腸及び遠位結腸においてみられたｍＰＰによる張力の上昇は、ＮＰＹ  Ｙ４受容体欠損マウスでは見られなかったことよりマウス近位結腸及び遠位結腸におけるｍＰＰによる張力上昇はＮＰＹ  Ｙ４受容体を介することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
以上説明したよう、本発明のＮＰＹ  Ｙ４アゴニスト及び化合物の評価方法によれば、新規な作用メカニズムによる腸管の機能異常の改善を可能とする薬剤を提供することが可能となる。また、このような薬剤のスクリーニングをはじめとする、腸管の機能異常の改善作用を有する化合物の評価方法を提供することが可能となる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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