(57)【要約】関節リウマチ患者の重病度の判断を基に関節リウマチの予後を判定し患者個々に対する治療方法を選択すること、関節リウマチ患者で治療薬剤の投与前後でHSC71蛋白レベルを測定し患者個々での各種薬剤の有効性を判定すること、また関節リウマチの発症や進行を予防する治療薬として使用することを提供する。熱ショックタンパク質７０ファミリーの一員であるＨＳＣ７１ （ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｃｏｇｎａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ７１）が、関節リウマチ患者と健常人でHSC71蛋白の発現に差が見られるかを明らかにした。即ち、関節リウマチ患者でHSC71蛋白の発現が亢進している場合には、患者の血清、関節液、脳脊髄液、尿、唾液、痰中のHSC71蛋白の濃度を測定し関節リウマチの重症度を調べる。それを基に関節リウマチの予後を判定し患者個々に対する治療方法を選択すること、関節リウマチ患者で治療薬剤の投与前後でHSC71蛋白レベルを測定し患者個々での各種薬剤の有効性を判定すること、また関節リウマチの発症や進行を予防する治療薬として使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HSC71抗体を使用して、生体から採取した試料中のHSC71蛋白の濃度を測定し関節リウマチの重傷度を調べる関節リウマチ検査方法。
【請求項２】
患者個々でHSC71の蛋白レベルを測定して関節リウマチ予後判定を行い、患者個々に応じた治療方法を決定することを特徴とする関節リウマチ治療方法。
【請求項３】
関節リウマチ患者で治療薬剤の投与前後でHSC71蛋白レベルを測定し患者個々での各種薬剤の有効性を判定することを特徴とする関節リウマチ治療方法。
【請求項４】
関節リウマチ患者でHSC71蛋白に対する抗体を用いて機能発現を抑制し関節リウマチの病気の進行を防止することを特徴とする関節リウマチ治療方法。
【請求項５】
関節リウマチに発症する可能性がある人でHSC71蛋白に対する抗体を用いて機能発現を抑制して、関節リウマチの発症を防止することを特徴とする関節リウマチ治療方法。
【請求項６】
関節リウマチ患者でHSC71蛋白の発現をDNA及びRNAレベルで抑制して関節リウマチの病気の進行を防止することを特徴とする関節リウマチ治療方法。
【請求項７】
関節リウマチに発症する可能性がある人でHSC71蛋白の発現をDNA及びRNAレベルで抑制して関節リウマチの発症を防止することを特徴とする関節リウマチ治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱ショックタンパク質７０ファミリーの一員であるHSC71 （ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ   ｃｏｇｎａｔｅ   ｐｒｏｔｅｉｎ ７１）抗体を用いて関節リウマチの血清、関節液、脳脊髄液、尿、唾液、痰中などのHSC71蛋白の濃度を測定し関節リウマチの重症度を調べること、それを基に関節リウマチの予後を判定し患者個々に対する治療方法を選択すること、関節リウマチ患者やで治療薬剤の投与前後でHSC71蛋白レベルを測定し患者個々での各種薬剤の有効性を判定すること、また関節リウマチの発症や進行を予防する治療薬として使用することである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチは、慢性関節リウマチ、悪性関節リウマチ等があり、我が国では高い罹患率であるといわれる。その診断は、例えば、アメリカリウマチ学会の診断基準が使用されており、朝のこわばり、多発性対称性関節炎、皮下結節、手の関節Ｘ線所見などで判定する。疾患の患者数は毎年、増加しているにも拘わらず、今なお、有効な治療薬や予防方法は見出されておらず、新規なリウマチ予防・治療用薬剤が提案されている。（特許文献１）【０００３】
一方、本発明者らは、独創的な研究により、重症筋無力症（以下ＭＧという。）では、HSC71に対する血清中の抗体濃度が、ＭＧ患者では、健常人や他の自己免疫疾患患者に比べて有意に高いことを見出して、特許出願している。（特許文献２）しかし、関節リウマチ患者でHSC71蛋白の発現は検討されておらず、その有用性は全く不明であった。
【特許文献１】特開２００３−０２６５９８号公報
【特許文献２】特開２００４−２５７８６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記課題を解決するため、本発明は、関節リウマチ患者の重病度の判断を基に、関節リウマチの予後を判定し患者個々に対する治療方法を選択すること、関節リウマチ患者で治療薬剤の投与前後でHSC71蛋白レベルを測定し患者個々での各種薬剤の有効性を判定すること、また関節リウマチの発症や進行を予防する治療薬として使用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本願発明者らは、鋭意研究の結果、関節リウマチ患者と健常人でHSC71蛋白の発現に差が見られるかを明らかにした。【０００６】
そして、関節リウマチ患者でHSC71蛋白の発現が亢進している場合には、患者の血清、関節液、脳脊髄液、尿、唾液、痰中などのHSC71蛋白の濃度を測定し関節リウマチの重症度を調べる。【０００７】
それを基に関節リウマチの予後を判定し患者個々に対する治療方法を選択すること、関節リウマチ患者で治療薬剤の投与前後でHSC71蛋白レベルを測定し患者個々での各種薬剤の有効性を判定すること、また関節リウマチの発症や進行を予防する治療薬として使用する。以下のように、本発明を構成する。【０００８】
請求項１の本発明は、HSC71抗体を使用して、生体から採取した試料中のHSC71蛋白の濃度を測定し関節リウマチの重傷度を調べる関節リウマチ診断方法である。【０００９】
請求項２の本発明は、患者個々でHSC71の蛋白レベルを測定して関節リウマチ予後判定を行い、患者個々に応じた治療方法を決定することを特徴とする関節リウマチ治療方法である。【００１０】
請求項３の本発明は、関節リウマチ患者で治療薬剤の投与前後でHSC71蛋白レベルを測定し患者個々での各種薬剤の有効性を判定することを特徴とする関節リウマチ治療方法である。                                                                                          【００１１】
請求項４の本発明は、関節リウマチ患者でHSC71蛋白に対する抗体を用いて機能発現を抑制し関節リウマチの病気の進行を防止することを特徴とする関節リウマチ治療方法である。                                                                                        【００１２】
請求項５の本発明は、関節リウマチに発症する可能性がある人でHSC71蛋白に対する抗体を用いて機能発現を抑制して、関節リウマチの発症を防止することを特徴とする関節リウマチ治療方法である。【００１３】
請求項６の本発明は、関節リウマチ患者でHSC71蛋白の発現をDNA及びRNAレベルで抑制して関節リウマチの病気の進行を防止することを特徴とする関節リウマチ治療方法である。【００１４】
請求項７の本発明は、関節リウマチに発症する可能性がある人でHSC71蛋白の発現をDNA及びRNAレベルで抑制して関節リウマチの発症を防止することを特徴とする関節リウマチ治療方法である。
【発明の効果】
【００１５】
発明者の１人である青才はrecombinant human HSC71 とFreund adjuvantをBALB/c マウスの腹腔に注射し、脾臓細胞を摘出培養することでHSC71に対する抗体を作製した。この抗体を用いて、人の血清、関節液、脳脊髄液、尿、唾液、痰中でHSC71蛋白を測定できるELISA法の利用が可能となった。このシステムを用いて、関節リウマチ患者と健常人で蛋白発現に有意差があることを確認でき、HSC71と関節リウマチ患者の重症度の関係が判明した。
これにより、HSC71を利用して関節リウマチの重症度を調べること、それを基に関節リウマチの予後を判定し患者個々に対する治療方法を選択すること、関節リウマチ患者で治療薬剤の投与前後でHSC71蛋白レベルを測定し患者個々での各種薬剤の有効性を判定すること、また関節リウマチの発症や進行を予防する治療薬として使用することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、実施例を挙げて、本発明の実施態様（以下本発明という）をより詳細に説明する。本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の方法では、生体から採取した体液中の抗ＨＳＣ７１抗体を測定する。ＨＳＣ７１は、ヒトを含む広範囲の生物に存在する熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）の一員であり、そのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列が公知である。例えば、ヒトＨＳＣ７１のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｙ００３７１に記載されている。【００１７】
本発明の検査方法は、通常、ヒトに対して適用され、下記実施例においてもヒト血清が用いられているが、ＨＳＣ７１のアミノ酸配列は、広範囲の生物においてよく保存されていることから、ヒト以外の動物にも適用可能である。体液としては、血液並びにその成分である血清及び血漿を好ましい例として挙げることができる。【００１８】
体液中の抗ＨＳＣ７１抗体の測定自体は、周知の免疫測定方法により行うことができる。免疫測定方法において抗ＨＳＣ７１抗体と抗原抗体反応する物質としては、天然のＨＳＣ７１でもよいが、取得の容易性から、遺伝子工学的に作製した組換えＨＳＣ７１が好ましい。抗ＨＳＣ７１抗体との抗原抗体反応が可能である限り、組換えＨＳＣ７１の一部分であってもよいし、ＨＳＣ７１以外の他の部分を含むものであってもよい。また、ＨＳＣ７１のアミノ酸配列中、少数、好ましくは数個以下のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されたものであっても、抗ＨＳＣ７１抗体との抗原抗体反応が可能である限り許容することができる。なお、言うまでもなく、抗原として用いるＨＳＣ７１は、検査の対象となる動物のＨＳＣ７１を用いる（例えば、検査対象がヒトならば、ヒトＨＳＣ７１を用いる）ことが好ましい。上記の通り、アミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列が公知であるので、組換えＨＳＣ７１は常法により容易に調製することができる。下記実施例にも、大腸菌を宿主として用いた遺伝子工学的手法によりヒトＨＳＣ７１を生産する方法が具体的に記載されている。【００１９】
免疫測定方法自体は、周知であり、周知の免疫測定方法のいずれをも用いることができる。すなわち、反応形式に基づき分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法等があり、標識に基づき分類すると、酵素免疫分析、放射免疫分析、蛍光免疫分析等があるがこれらのいずれをも用いることができる。これらのうち、操作が簡便で、正確な測定が可能であるサンドイッチ法が好ましく、とりわけ、安全で特殊な装置が不要である酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）が好ましいが、これに限定されるものではない。【００２０】
本発明は、さらに、抗ＨＳＣ７１抗体と抗原抗体反応する物質を含む、関節リウマチの検査薬をも提供する。抗ＨＳＣ７１抗体と抗原抗体反応する物質は、上記の通りであり、その使用方法は、上記した免疫測定方法において、抗ＨＳＣ７１抗体と抗原抗体反応する抗原又はハプテンとして用いられる。
材料及び方法
１９８７年のアメリカリウマチ学会の判定基準をみたした関節リウマチ患者１５６名の血清と健常人３６例の血清を用いた。すべての血清は−３０℃で保存した。
ヒトＨＳＣ７１のクローニングＰ３６細胞（ヒトメラノーマセルライン）の全ＲＮＡを、単一工程グアニジウムイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法（ＴＲＩｚｏｌ（商品名）、米国メリーランド州ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇのＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）により調製した。オリゴヌ102030405クレオチドプライマーは、ゲノミックヒトＨＳＣ７１ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｙ００３７１）及び隣接する部分にクローニングのための制限酵素部位（制限酵素名：ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ）を付加して設計した。ｃＤＮＡの調製及びヒトＨＳＣ７１を増幅するためのＰＣＲは、Ｔａｋａｒａ  ＲＮＡ  ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ（宝酒造）を用いて行った。用いたＰＣＲプライマーは次の通りであった。センスプライマー：５’−ｇｇｇｃｔｃｇａｇａｔｇｔｃｃａａｇｇｇａｃｃｔｇｃａ−３’アンチセンスプライマー：５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｇｇｃｔｔａａｔｃａａｃｃｔｃｔｔｃａａｔ−３’ＰＣＲは、９４℃、１分間の変性工程；５５℃、２分間のアニーリング工程：及び７２℃、２分間の伸長工程から成るサイクルを３６回繰り返すことにより行った。得られたＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（商品名）ファジミドベクターのクローニング部位に挿入してクローニングした。得られた組換えベクター中の挿入物の塩基配列を、ＡＢＩ  ＤＮＡシーケンサー（米国カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒのＡＢＩ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用い、二本鎖ジデオキシシーケンシング法により決定した。【００２１】
組換えヒトＨＳＣ７１の発現組換えヒトＨＳＣ７１の合成のために、ＨＳＣ７１  ｃＤＮＡを組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（商品名）から制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにより切り出し、発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ（米国Ｎｏｖａｇｅｎ社）のクローニング部位にもう１箇所のＸｈｏＩ切断部位を導入してＮ末端にＸｈｏＩ部位をもちＣ末端にＢａｍＨＩ部位をもつインサートＤＮＡの挿入を可能となる様に修飾したベクターに挿入した。得られた組換えベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）を形質転換し、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（片山化学）を添加して組換えタンパク質の合成を誘導した。組換え６  Ｘ  Ｈｉｓ−ＨＳＣ７１タンパク質（Ｎ末端に発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ由来のアミノ酸配列であるＭｅｔ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒに引き続き６個のヒスチジンが続き、更にＳｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ    Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔが続き、その後に引き続いてＨＳＣ７１のアミノ酸配列が続く）は、Ｎｏｖａｇｅｎ社の指示書に従い、ニッケルキレート親和性クロマトグラフィー（６個のヒスチジンがニッケルに結合する性質を利用）により、細胞抽出物から精製した。ニッケルキレート親和性クロマトグラフィーにより精製した組換えＨＳＣ７１をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、分子量は７１ｋＤａであった。【００２２】
ＥＬＩＳＡによる抗ＨＳＣ７１抗体の測定１０μｇ／ｍｌの組換えヒトＨＳＣ７１溶液（ＰＢＳ中）で、平底マイクロタイタープレートを被覆した。一夜インキュベートした後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  ＢＳＡ及び０．０５％  ＮａＮ３を含むＰＢＳで非特異結合部位をブロッキングした。各ウェルに患者血清又は対照血清の１：２００希釈物を入れ、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の１：１０００希釈物を加え、室温で２時間インキュベートした。発色のために、ウェルを洗浄し、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート基質溶液を加え、波長４０５  ｎｍの吸光度を測定した。
【実施例】
【００２３】
関節リウマチ患者１５６名と健常人３６名の血清を使用してHSC71−IgG抗体価（図１）、HSC71−IgM抗体価（図２）を測定した。関節リウマチ患者は１９８７年のアメリカリウマチ学会の判定基準をみたしていた。関節リウマチ患者では有意に抗体価が高かった。以下にさらに、本発明を説明する。【００２４】
２７名の関節リウマチ患者について、メソトレキセートやサラゾスルファピリジンやブシラミンなどの抗リウマチ薬、ステロイド剤、生物学的製剤等で治療した。治療開始前と治療開始後３ヶ月以上の血清を用いてHSC71−IgG抗体価（図３）、HSC71−IgM抗体価（図４）を測定した。これらの症例では、治療後、臨床症状の改善とともにHSC71−IgG抗体価とHSC71−IgM抗体価の全般的な減少が得られ、統計学的に有意であった。治療開始前のCRPは平均2.56mg/dlであり、治療後のCRPは平均0.36mg/dlであった。抗体価の減少がみられないか、あるいは上昇した症例も数例見られた。【００２５】
（結果）
以上説明したように本発明によれば、HSC71抗体を用いて関節リウマチ患者の血清、関節液、脳脊髄液、尿、唾液、痰中のHSC71蛋白の濃度を測定し関節リウマチの重症度を調べることができ、それを基に関節リウマチの予後を判定し患者個々に対する治療方法を選択することができる。【００２６】
また、この発明を用いることで、関節リウマチ患者で治療薬剤の投与前後でHSC71蛋白レベルを測定し患者個々での各種薬剤の治療判定が可能となる。【００２７】
さらにまた、本発明を用いることで、関節リウマチの発症や進行を予防する治療薬として使用することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
これまで困難だった関節リウマチの診断、治療、予防方法に極めて有効である。                                                                        
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】関節リウマチ患者１５６名と健常人３６名の血清を使用したHSC71−IgG抗体価を示す図
【図２】HSC71−IgM抗体価を示す図
【図３】HSC71−IgG抗体価の治療前後における変化
【図４】HSC71−IgM抗体価の治療前後の変化
【図１】
2007100058.tif 000002
【図２】
2007100058.tif 000003
【図３】
2007100058.tif 000004
【図４】
2007100058.tif 000005
【配列表】
2007100058000001.app
【国際調査報告】
2007100058.tif 000006
2007100058.tif 000007
2007100058.tif 000008
2007100058.tif 000009
2007100058.tif 000010