【手続補正書】
【提出日】令和1年10月4日(2019.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト体細胞核移入（hSCNT）の効率を増加させるための方法であって、
ハイブリッド卵母細胞を、KDM4ファミリーのヒストンデメチラーゼのメンバーの発現を増加させる活性物質と接触させる段階を含み、
該ハイブリッド卵母細胞が、ヒト体細胞の遺伝物質を含む除核したヒト卵母細胞である、
方法。
【請求項２】
接触させる段階が、ハイブリッド卵母細胞の活性化または融合の後であるがヒト接合体ゲノム活性化（ZGA）が開始する前に起こる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ヒト体細胞核移入（SCNT）の効率を増加させるための方法であって、以下の少なくとも1つの段階：
（i）ドナーヒト体細胞もしくはレシピエントヒト卵母細胞を、該ドナーヒト体細胞もしくは該レシピエントヒト卵母細胞におけるH3K9me3メチル化を減少させる少なくとも1つの活性物質と接触させる段階であって、該レシピエントヒト卵母細胞が、有核もしくは除核卵母細胞である、段階；該レシピエントヒト卵母細胞が有核ならば、除核する段階；該ドナーヒト体細胞由来の核を該除核卵母細胞に移植してハイブリッド卵母細胞を形成させる段階；および該ハイブリッド卵母細胞を活性化させてヒトSCNT胚を形成させる段階；または
（ii）ハイブリッド卵母細胞を、該ハイブリッド卵母細胞におけるH3K9me3メチル化を減少させる少なくとも1つの活性物質と接触させる段階であって、該ハイブリッド卵母細胞が、ヒト体細胞の遺伝物質を含む除核したヒト卵母細胞である、段階；および該ハイブリッド卵母細胞を活性化させてヒトSCNT胚を形成させる段階；または
（iii）活性化後のヒトSCNT胚を、該ヒトSCNT胚におけるH3K9me3メチル化を減少させる少なくとも1つの活性物質と接触させる段階であって、該SCNT胚が、除核したヒト卵母細胞とヒト体細胞の遺伝物質との融合から作製される、段階
を含み、
該ドナーヒト体細胞、該レシピエントヒト卵母細胞、該ハイブリッド卵母細胞または該ヒトSCNT胚のうちのいずれか1つにおけるH3K9me3メチル化の減少が、該SCNTの効率を増加させる、
方法。
【請求項４】
ヒト核移入胚性幹細胞（hNT-ESC）を産生するための方法であって、
a.  以下の少なくとも1つの段階：
（i）ドナーヒト体細胞もしくはレシピエントヒト卵母細胞を、該ドナーヒト体細胞もしくは該レシピエントヒト卵母細胞におけるH3K9me3メチル化を減少させる少なくとも1つの活性物質と接触させる段階であって、該レシピエントヒト卵母細胞が、有核もしくは除核卵母細胞である、段階；該レシピエントヒト卵母細胞が有核ならば、除核する段階；該ドナーヒト体細胞由来の核を該除核卵母細胞に移植してハイブリッド卵母細胞を形成させる段階；および該ハイブリッド卵母細胞を活性化させてヒトSCNT胚を形成させる段階；または
（ii）ハイブリッド卵母細胞を、該ハイブリッド卵母細胞におけるH3K9me3メチル化を減少させる少なくとも1つの活性物質と接触させる段階であって、該ハイブリッド卵母細胞が、ヒト体細胞の遺伝物質を含む除核したヒト卵母細胞である、段階；および該ハイブリッド卵母細胞を活性化させてヒトSCNT胚を形成させる段階；または
（iii）活性化後のヒトSCNT胚を、該SCNT胚におけるH3K9me3メチル化を減少させる少なくとも1つの活性物質と接触させる段階であって、該SCNT胚が、除核したヒト卵母細胞とヒト体細胞の遺伝物質との融合から作製される、段階、
b.  胚盤胞を形成させるために十分な時間、該SCNT胚をインキュベートする段階；および該胚盤胞から少なくとも1つの割球を収集し、該少なくとも1つの割球を培養して少なくとも1つのヒトNT-ESCを形成させる段階
を含む、方法。
【請求項５】
ヒト体細胞核移入（SCNT）胚を産生するための方法であって、
ドナーヒト体細胞、レシピエントヒト卵母細胞またはヒト体細胞核移入（SCNT）胚の少なくとも1つを、該ドナーヒト体細胞、該レシピエントヒト卵母細胞または該ヒトSCNT胚におけるH3K9me3メチル化を減少させる少なくとも1つの活性物質と接触させる段階であって、該レシピエントヒト卵母細胞が、有核または除核卵母細胞である、段階；
該レシピエントヒト卵母細胞が有核ならば、除核する段階；
該ドナーヒト体細胞由来の核を該除核卵母細胞に移植してハイブリッド卵母細胞を形成させる段階；
該ハイブリッド卵母細胞を活性化させる段階；および
該ヒトSCNT胚を形成させるために十分な時間、該ハイブリッド卵母細胞をインキュベートする段階
を含む、方法。
【請求項６】
ヒトSCNT胚をインビトロ培養してヒト胚盤胞を形成させる段階、または
ヒトSCNT胚をインビトロ培養してヒト胚盤胞を形成させる段階であって、（i）ヒトSCNT胚が少なくとも4細胞期ヒトSCNT胚である、もしくは（ii）ヒトSCNT胚が少なくとも4細胞期SCNT胚である、もしくは（iii）ヒト胚盤胞由来の内細胞塊から細胞を単離する段階と、未分化状態の内細胞塊からの細胞を培養してヒト胚性幹（ES）細胞を形成させる段階とをさらに含む、段階
をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
活性物質が、ヒトKDM4ファミリーのヒストンデメチラーゼのメンバーの発現または活性を増加させる、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
活性物質が、KDM4A（JMJD2A）、KDM4B（JMJD2B）、KDM4C（JMJD2C）、KDM4D（JMJD4D）もしくはKDM4E（JMJD2E）の少なくとも1つの発現もしくは活性を増加させる；かつ／または
活性物質が、SEQ ID NO:1〜4もしくはSEQ ID NO:45に対応する核酸配列、もしくはSEQ ID NO:1〜4もしくはSEQ ID NO:45の対応する配列と比較してSCNTの効率を同程度もしくはより大きな程度増加させるその生物学的に活性なフラグメントを含む；かつ／または
活性物質が、H3K9メチルトランスフェラーゼの阻害剤である；かつ／または
活性物質が、H3K9メチルトランスフェラーゼの阻害剤であり、(i)H3K9メチルトランスフェラーゼが、SUV39h1、SUV39h2、もしくはSETDB1であるかもしくは、(ii)SUV39h1、SUV39h2およびSETDB1の2つ以上が阻害される；かつ／または
活性物質が、H3K9メチルトランスフェラーゼの阻害剤であり、H3K9メチルトランスフェラーゼを阻害する活性物質が、RNAi剤、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1オリゴヌクレオチド、中和抗体もしくは抗体フラグメント、アプタマー、小分子、ペプチド阻害剤、タンパク質阻害剤、アビジミル（avidimir）、およびその機能的フラグメントもしくは誘導体からなる群より選択される；かつ／または
活性物質が、H3K9メチルトランスフェラーゼの阻害剤であり、H3K9メチルトランスフェラーゼを阻害する活性物質が、siRNAもしくはshRNA分子であるRNAi剤である；かつ／または
活性物質が、SEQ ID NO:14〜16、47、49、51、52もしくは53のいずれかの発現を阻害する核酸阻害剤を含む；かつ／または
活性物質が、H3K9メチルトランスフェラーゼの阻害剤であり、H3K9メチルトランスフェラーゼを阻害する活性物質がRNAi剤であり、RNAi剤が、(i)SEQ ID NO:14〜16、47、49、51、52もしくは53の少なくとも一部とハイブリダイズする、もしくは(ii)SEQ ID NO:7、8もしくはSEQ ID NO:18もしくは19の核酸、もしくはその少なくとも10個の核酸が連続するフラグメント、もしくはSEQ ID NO:7、8もしくはSEQ ID NO:18もしくは19と少なくとも80％同一の配列を有するホモログの、任意の1つもしくは組み合わせを含む、
請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
レシピエントヒト卵母細胞が、除核したヒト卵母細胞である；または
ヒトSCNT胚が、1細胞期SCNT胚、活性化の5時間後（5hpa）のSCNT胚、活性化の10〜12時間後（10〜12hpa）のSCNT胚、活性化の20〜28時間後（20〜28hpa）のSCNT胚、2細胞期SCNT胚のいずれかより選択される；かつ／または
ドナーヒト体細胞が、遺伝子組換えされたドナーヒト細胞である；かつ／もしくはドナーヒト体細胞、レシピエントヒト卵母細胞もしくはヒトSCNT胚の任意の1つもしくは複数が、凍結および解凍されている、
請求項3〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
核移入前に、活性物質が、レシピエントヒト卵母細胞もしくは除核したヒト卵母細胞と接触し、KDM4ファミリーのヒストンデメチラーゼの発現もしくは活性を増加させる；または
活性化の前もしくは活性化の約5時間後に、もしくはSCNT胚が1細胞期のときに、活性物質が、該ヒトSCNT胚と接触し、KDM4ファミリーのヒストンデメチラーゼの発現もしくは活性を増加させる；または
活性化の5時間後（5hpa）、もしくは活性化の12時間後（12hpa）、もしくは活性化の20時間後（20hpa）に、もしくはSCNT胚が2細胞期のときに、もしくは5hpa〜28hpaの任意の時間に、活性物質が、該ヒトSCNT胚と接触し、KDM4ファミリーのヒストンデメチラーゼの発現もしくは活性を増加させる；または
レシピエントヒト卵母細胞もしくはハイブリッド卵母細胞、もしくはヒトSCNT胚を、活性物質と接触させる段階が、該レシピエントヒト卵母細胞もしくは該ハイブリッド卵母細胞、もしくは該ヒトSCNT胚の核もしくは細胞質に該活性物質を注射することを含む；または
除核したヒト卵母細胞に注射するために核を取り出す前に、活性物質がドナーヒト体細胞の細胞質もしくは核と接触し、除核したヒト卵母細胞にドナーヒト体細胞の核を注射する少なくとも24時間前に、もしくは該注射する前の少なくとも1日間、ドナーヒト体細胞が接触され、（i）活性物質がH3K9メチルトランスフェラーゼを阻害する、もしくは（ii）H3K9メチルトランスフェラーゼが、SUV39h1もしくはSUV39h2、もしくはSUV39h1およびSUV39h2（SUV39h1/2）である；または
除核したヒト卵母細胞にドナーヒト体細胞の核を注射する前に、活性物質がドナーヒト体細胞と少なくとも24時間、もしくは少なくとも48時間、もしくは少なくとも3日間接触し、（i）活性物質がH3K9メチルトランスフェラーゼを阻害する、もしくは（ii）H3K9メチルトランスフェラーゼが、SUV39h1もしくはSUV39h2、もしくはSUV39h1およびSUV39h2（SUV39h1/2）である、
請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
ドナーヒト体細胞が、最終分化した体細胞である；かつ／または
ドナーヒト体細胞が、胚性幹細胞、もしくは人工多能性幹（iPS）細胞、もしくは胎児細胞、もしくは胚細胞ではない；かつ／または
ドナーヒト体細胞が、卵丘細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、角化細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、赤血球、マクロファージ、単球、筋細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、胎児細胞、胎盤細胞、および成熟細胞からなる群より選択される；かつ／または
ドナーヒト体細胞が、線維芽細胞もしくは卵丘細胞である；かつ／または
除核したレシピエントヒト卵母細胞に注射するためにドナーヒト体細胞から核を取り出す前に、活性物質がドナーヒト体細胞の核と接触する、
請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
H3K9me3メチル化を減少させる活性物質の不在下で行われるhSCNTと比較して、胚盤胞期へのhSCNTの効率に少なくとも10%の増加をもたらし、（i）SCNT効率における増加が、ヒトSCNT胚の胚盤胞期への発生における増加である、もしくは（ii）SCNT効率における増加が、ヒトSCNT胚由来胚性幹細胞（hNT-ESC）の派生における増加である；かつ／または
H3K9me3メチル化を減少させる活性物質の不在下で行われるhSCNTと比較して、hSCNTの効率に10〜20%の増加をもたらし、（i）SCNT効率における増加が、ヒトSCNT胚の胚盤胞期への発生における増加である、もしくは（ii）SCNT効率における増加が、ヒトSCNT胚由来胚性幹細胞（hNT-ESC）の派生における増加である；かつ／または
H3K9me3メチル化を減少させる活性物質の不在下で行われるhSCNTと比較して、hSCNTの効率に20%よりも大きな増加をもたらし、（i）SCNT効率における増加が、ヒトSCNT胚の胚盤胞期への発生における増加である、もしくは（ii）SCNT効率における増加が、ヒトSCNT胚由来胚性幹細胞（hNT-ESC）の派生における増加である；かつ／または
ドナーヒト体細胞が、遺伝子組換えされたドナーヒト細胞である、
請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項記載の方法から産生された、ヒトSCNT胚由来胚性幹細胞（hNT-ESC）集団であって、
hNT-ESCが、遺伝子組換えされたhNT-ESC、もしくは多能性幹細胞もしくは全能幹細胞である、または
hNT-ESCが、培養培地中に存在し、培養培地が、（i）hNT-ESCを多能性もしくは全能状態に維持する、もしくは（ii）hNT-ESCの凍結もしくは凍結保存に適切な培地である、または
hNT-ESC集団が、凍結もしくは凍結保存される、
hNT-ESC集団。
【請求項１４】
請求項1〜12のいずれか一項記載の方法によって産生される、ヒトSCNT胚であって、
遺伝子組換えされており、レシピエントヒト卵母細胞由来ではないミトコンドリアDNA（mtDNA）を含む、または
培養培地中に存在する、または
培養培地中に存在し、培養培地が、ヒトSCNTの凍結もしくは凍結保存に適切な培地である、または
凍結もしくは凍結保存される、
ヒトSCNT胚。
【請求項１５】
ヒトSCNT胚、レシピエントヒト卵母細胞、ヒトハイブリッド卵母細胞または胚盤胞の少なくとも1つと、
a.  KDM4ファミリーのヒストンデメチラーゼの発現もしくは活性を増加させる活性物質、または
b.  H3K9メチルトランスフェラーゼを阻害する活性物質
の少なくとも1つと
を含む、組成物であって、
KDM4（JMJD2）ファミリーのヒストンデメチラーゼの発現もしくは活性を増加させる活性物質が、KDM4A（JMJD2A）、KDM4B（JMJD2B）、KDM4C（JMJD2C）、KDM4D（JMJD2D）もしくはKDM4E（JMJD2E）の少なくとも1つの発現もしくは活性を増加させる、または
KDM4（JMJD2）ファミリーのヒストンデメチラーゼの発現もしくは活性を増加させる活性物質が、KDM4D（JMJD2D）もしくはKDM4A（JMJD2A）の発現もしくは活性を増加させる、または
KDM4（JMJD2）ファミリーのヒストンデメチラーゼの発現もしくは活性を増加させる活性物質が、SEQ ID NO:1〜4もしくはSEQ ID NO:45に対応する核酸、もしくはSEQ ID NO:1〜4もしくはSEQ ID NO:45の対応する配列と比較してヒトSCNTの効率を同程度もしくはより大きな程度増加させるその生物学的に活性なフラグメントを含む、または
KDM4（JMJD2）ファミリーのヒストンデメチラーゼの発現もしくは活性を増加させる活性物質が、SEQ ID NO:1に対応する核酸、もしくはSEQ ID NO:1の核酸配列と比較してSCNTの効率を同程度もしくはより大きな程度増加させるその生物学的に活性なフラグメントを含む、または
H3K9メチルトランスフェラーゼの阻害剤が、SUV39h1、SUV39h2、もしくはSETDB1の少なくとも1つもしくは任意の組み合わせを阻害する、または
ヒトSCNT胚が、1細胞期、2細胞期もしくは4細胞期のヒトSCNT胚である、または
レシピエントヒト卵母細胞が、除核したレシピエントヒト卵母細胞である、または
最終分化したヒト体細胞の核を注射することからヒトSCNT胚が産生されるか；もしくは、除核したヒト卵母細胞に、最終分化したヒト体細胞の核を注射することから産生されるヒトSCNT胚から胚盤胞が発生する、
組成物。
【請求項１６】
（i）ヒトKDM4ファミリーのヒストンデメチラーゼの発現もしくは活性を増加させる活性物質および／またはH3K9メチルトランスフェラーゼを阻害する活性物質、ならびに
（ii）ヒト卵母細胞
を含み、ヒト卵母細胞が除核した卵母細胞である、キット。