【手続補正書】
【提出日】平成20年8月8日(2008.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列の複数のコピーを合成する方法であって、該方法は、
（Ａ）ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸を、以下の（１）および（２）で処理する工程：
（１）該標的配列の３’末端からプライマー伸長反応が開始され得るように、該標的配列の３’末端にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドであって、ここで、以下の条件（ａ）および（ｂ）のうちの一方または両方が満たされる、プライミングオリゴヌクレオチド：
（ａ）該プライミングオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含まない；および
（ｂ）該プライミングオリゴヌクレオチドが、該標的配列にハイブリダイズするｓ前に該標的配列の３’末端にハイブリダイズされたキャップを有し、該キャップは、該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にある少なくとも３個のヌクレオチドに相補的な塩基領域を含み、該キャップの５’末端の塩基は、該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の塩基に相補的であり、かつ、該キャップは、該キャップからのＤＮＡ合成の開始を防ぐように改変される；
（２）該標的配列の５’末端に隣接するかもしくは該５’末端に近い該標的核酸に結合する結合分子；
（Ｂ）プライマー伸長反応において該プライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで伸長させて該標的配列に相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を得る工程であって、該ＤＮＡプライマー伸長産物は、該結合分子によって決定されかつ該標的配列の５’末端に相補的である３’末端を有する、工程；
（Ｃ）該ＤＮＡプライマー伸長産物を、該標的配列を選択的に分解する酵素を用いて、該標的配列から分離する工程；
（Ｄ）該ＤＮＡプライマー伸長産物を、第一の領域および第二の領域を含むプロモーターオリゴヌクレオチドで処理する工程であって、該第一の領域は、該ＤＮＡプライマー伸長産物の３’領域にハイブリダイズしてプロモーターオリゴヌクレオチド：ＤＮＡプライマー伸長産物ハイブリッドを形成し、該第二の領域は、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターでありかつ該第一の領域に対して５’側に位置し、ここで、該プロモーターオリゴヌクレオチドは、該プロモーターオリゴヌクレオチドからのＤＮＡ合成の開始を防ぐように改変される、工程；
（Ｅ）該プロモーターオリゴヌクレオチド：ＤＮＡプライマー伸長産物ハイブリッドにおいて、該ＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端を伸長させて、該プロモーターオリゴヌクレオチドの該第二の領域に対する配列相補性を付加する工程；ならびに
（Ｆ）該プロモーターオリゴヌクレオチド：ＤＮＡプライマー伸長産物ハイブリッドから、該プロモーターを認識し該プロモーターから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて、該ＤＮＡプライマー伸長産物に相補的な複数のＲＮＡ産物を転写する工程であって、ここで、該ＲＮＡ産物の塩基配列は、該標的配列の塩基配列と実質的に同一である、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記プライミングオリゴヌクレオチドが、前記標的配列にハイブリダイズする前に、該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズされるキャップを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャップが、前記プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にある８個以下のヌクレオチドに相補的である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記キャップが前記プライミングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるとき、該キャップが、該プライミングオリゴヌクレオチドと前記プロモーターオリゴヌクレオチドとの間の非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐ、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記キャップが、その３’末端にブロッキング部分を含むように改変されたキャッピングオリゴヌクレオチドである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記キャップの３’末端が、前記プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合され、該キャップは、ループを形成することにより、該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記キャップが、リンカー領域を介して前記プライミングオリゴヌクレオチドに結合される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカー領域が少なくとも５個のヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカー領域が少なくとも５個の無塩基ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記プライミングオリゴヌクレオチドがＲＮＡを含まない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライミングオリゴヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドおよび／またはそのアナログから構成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライミングオリゴヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドから構成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライミングオリゴヌクレオチドが、前記標的配列にハイブリダイズする前記塩基領域の５’側に、非ハイブリダイズ塩基領域を含まない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライミングオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素を用いて伸長される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記逆転写酵素がＭａｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスに由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素が、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を持ち、該酵素が、逆転写酵素以外の酵素である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合分子が、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防ぐために、その３’末端にブロッキング部分を持つオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合分子の前記オリゴヌクレオチドの５’末端が、前記プロモーターオリゴヌクレオチドの前記第一の領域の５’末端と重複し、該第一の領域の５’末端が、該結合分子の該オリゴヌクレオチドの５’末端と十分な数のミスマッチを有し、該プロモーターオリゴヌクレオチドが、該結合分子にハイブリダイズすることを防ぐ、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合分子が終結オリゴヌクレオチドである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記終結オリゴヌクレオチドの５’末端が、前記プロモーターオリゴヌクレオチドの前記第一の領域の５’末端にある少なくとも２個のヌクレオチドに相補的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記終結オリゴヌクレオチドの５’末端が、前記プロモーターオリゴヌクレオチドの前記第一の領域の５’末端にある、少なくとも３個、かつ１０個以下のヌクレオチドに相補的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合分子が改変オリゴヌクレオチドである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変オリゴヌクレオチドが消化オリゴヌクレオチドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、工程（Ｄ）において、前記ＤＮＡプライマー伸長産物をエクステンダーオリゴヌクレオチドで処理する工程をさらに包含し、該エクステンダーオリゴヌクレオチドは、前記プロモーターオリゴヌクレオチド：ＤＮＡプライマー伸長産物ハイブリッドの前記プロモーターオリゴヌクレオチドの３’側にある前記ＤＮＡプライマー伸長産物の一領域にハイブリダイズし、それにより、エクステンダーオリゴヌクレオチド：ＤＮＡプライマー伸長産物ハイブリッドが形成される、方法。
【請求項２５】
前記エクステンダーオリゴヌクレオチドがさらに、該エクステンダーオリゴヌクレオチドの３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防ぐために、該エクステンダーオリゴヌクレオチドの３’末端に位置するブロッキング部分を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記エクステンダーオリゴヌクレオチドが、前記ＤＮＡプライマー伸長産物にハイブリダイズし、それにより、該エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端が、前記ＤＮＡプライマー伸長産物に対して、前記プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端の塩基から３ヌクレオチドより多くの間隔をあけない、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記エクステンダーオリゴヌクレオチドが、工程（Ｄ）において、前記プロモーターオリゴヌクレオチドに隣接する前記プライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロモーターオリゴヌクレオチドはさらに、前記第一の領域と前記第二の領域との間、または、該第一の領域および該第二の領域に隣接して位置する挿入配列を含み、該プロモーターオリゴヌクレオチドにおける該挿入配列の存在が、前記ＲＮＡ産物が形成される速度を高める、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロモーターオリゴヌクレオチドが、該プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端に位置するブロッキング部分を含むように改変される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロモーターオリゴヌクレオチドの前記ブロッキング部分が、改変ヌクレオチド、３’から５’の方向性を有するヌクレオチドまたはヌクレオチド配列、３’アルキル基、３’２’−ジデオキシヌクレオチド、３’コルジセピン、３’アルカン−ジオール残基、３’非ヌクレオチド部分、前記標的配列に相補的でないヌクレオチド配列、核酸結合タンパク質、およびこれらの混合物からなる群より選択される置換基を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ブロッキング部分が、３’から５’の方向性を有するヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、または、３’非ヌクレオチド部分を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的配列の存前記複数のコピーの在または量を決定する工程をさらに包含する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的配列の前記複数のコピーの存在または量が、検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて決定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
実質的に一定の温度において実施される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
標的核酸の存在下で、伸長のために利用可能なプライミングオリゴヌクレオチドを作製するための方法であって、該方法は、
（ａ）該標的核酸を含む反応混合物に該プライミングオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、該プライミングオリゴヌクレオチドは、該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の一領域にハイブリダイズされたキャップを有し、該キャップの５’末端の塩基は、該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の塩基に相補的であり、そして、該キャップは、該キャップからのＤＮＡ合成の開始を防ぐように改変される、工程；
（ｂ）該標的核酸内に含まれる標的配列に該プライミングオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、それにより、該プライミングオリゴヌクレオチドから該キャップを解放する、工程；および
（ｃ）プライマー伸長反応において、該プライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで伸長させて、該標的配列に相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を得る、工程
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記キャップが、前記プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にある８個以下のヌクレオチドに相補的である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記キャップが、その３’末端に位置するブロッキング部分を含むように改変されたキャッピングオリゴヌクレオチドである、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記キャップの３’末端が、前記プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合され、該キャップは、ループを形成することにより、該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記キャップが、リンカー領域を介して前記プライミングオリゴヌクレオチドに結合される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記リンカー領域が少なくとも５個のヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記リンカー領域が少なくとも５個の無塩基ヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
容器であって、以下：
プライミングオリゴヌクレオチドであって、該プライミングオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列の３’末端にハイブリダイズして、該標的核酸配列に相補的なＤＮＡプライマー伸長産物の合成を開始する、プライミングオリゴヌクレオチド；および
該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の一領域にハイブリダイズするキャップであって、該キャップの５’末端の塩基は、該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に相補的であり、そして、該キャップは、該キャップからのＤＮＡ合成の開始を防ぐように改変される、キャップ
を含む、容器。
【請求項４３】
前記キャップは、前記プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にある８個以下のヌクレオチドに相補的である、請求項４２に記載の容器。
【請求項４４】
前記キャップは、その３’末端に位置するブロッキング部分を含むように改変されたキャッピングオリゴヌクレオチドである、請求項４２または４３に記載の容器。
【請求項４５】
前記キャップの３’末端が、前記プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合され、該キャップは、ループを形成することにより、該プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする、請求項４２または４３に記載の容器。
【請求項４６】
前記キャップが、リンカー領域を介して前記プライミングオリゴヌクレオチドに結合される、請求項４５に記載の容器。
【請求項４７】
前記リンカー領域が少なくとも５個のヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の容器。
【請求項４８】
前記リンカー領域が少なくとも５個の無塩基ヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の容器。