(57)【要約】本発明は、生体内の活性酸素及び／又はフリーラジカル濃度を効果的に低下させ、この活性酸素及び／又はフリーラジカル濃度の低下によって老化の進行抑制、老年病あるいは生活習慣病の予防、健康増進、酸化ストレス抑制等、所定の効果を奏することが生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を提供することを目的とする。本発明の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、少なくとも水素分子を含む液体又は気体からなる。この媒体中には酸素分子を含んでいてもよい。さらにこの媒体は、水又は水溶液からなるものであっても、あるいは気体であってもよい。該活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも水素分子を含む液体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項２】
少なくとも水素分子を含む液体が水溶液からなる、請求項１に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項３】
水素分子が過飽和状態で含まれる、請求項２に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項４】
更に酸素分子を含む、請求項２又は３に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項５】
少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項６】
少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと酸素ガスの混合ガスからなる、請求項５に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項７】
少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと酸素ガスと不活性ガスの混合ガスからなる、請求項５に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項８】
少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと空気の混合ガスからなる、請求項５に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項９】
少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと麻酔ガスの混合ガスからなる、請求項５に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項１０】
水素ガスを１〜４％（ｖ／ｖ）の濃度で含む請求項５〜９のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項１１】
水素ガスを１．０〜４．５％（ｖ／ｖ）の濃度で含む請求項５〜９のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項１２】
活性酸素及び／又はフリーラジカルがヒドロキシルラジカル、ペルオキシナイトライト、アルコキシラジカル及び脂質ペルオキシルラジカルからなる群から選択される活性酸素及び／又はフリーラジカルである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項１３】
活性酸素及び／又はフリーラジカルがヒドロキシルラジカルである、請求項１２記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防剤。
【請求項１６】
活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が酸化ストレス、酸化ストレスによる細胞死及び酸化ストレスによるミトコンドリア機能障害からなる群から選択される請求項１５に記載の治療又は予防剤。
【請求項１７】
活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化、虚血再還流障害、人工透析時障害、臓器移植時障害、未熟児の網膜変性、急性肺症、炎症及び脂質代謝障害からなる群から選択される、請求項１５記載の治療又は予防剤。
【請求項１８】
活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が、急激な運動後の筋障害又は運動後の高濃度の酸素ガスを吸引する際に生じる酸素障害である、請求項１５記載の治療又は予防剤。
【請求項１９】
活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ等の神経変性疾患からなる群から選択される、請求項１５記載の治療又は予防剤。
【請求項２０】
活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が癌である、請求項１５記載の治療又は予防剤。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の軽減又は予防に適した飲料品。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、生体内の活性酸素及び／又はフリーラジカルの除去又は低下のために用いられるものである旨の表示を付した飲料品。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の軽減又は予防のために用いられるものである旨の表示を付した飲料品。
【請求項２４】
飲料品が、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント又は特定健康食品である請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の飲料品。
【請求項２５】
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器。
【請求項２６】
水素ガスボンベである請求項２５に記載の容器。
【請求項２７】
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器、ガス吸引用手段並びに前記容器中の気体を吸引用手段に供給する供給配管を備えている、活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項２８】
さらに、酸素ガス、不活性ガス及び空気からなる群から選択される少なくとも１種のガスを含む容器を備え、少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤と酸素ガス、不活性ガス及び空気からなる群から選択される少なくとも１種のガスを別々に或いは混合した後にガス吸引用手段に供給する、請求項２７に記載の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項２９】
さらに、麻酔ガスを含む容器を備え、少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤と麻酔ガスを別々に或いは混合した後にガス吸引用手段に供給する、請求項２７又は２８に記載の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項３０】
少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器中に水素ガスが１〜４％含まれる請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項３１】
少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器がガスボンベである請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項３２】
ガス吸引用手段がガス吸引用マスクである請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項３３】
ガス吸引用手段が密閉室であり、該密閉室中に少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を供給することにより、密閉室内の被験体に前記活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を供給する、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル濃度を低下させる活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤に関し、特に、生体内の活性酸素及び／又はフリーラジカル濃度を効果的に低下させ、老化の進行抑制、老年病あるいは生活習慣病の予防、健康増進、酸化ストレス抑制等の効果を奏することができる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に活性酸素種又はフリーラジカルと呼ばれる反応性分子の存在が、老化、がん、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、発作、ウイルス感染、肺の異常、腸の病気及び神経退行疾病を含む多くの人間の健康上の異常の原因の少なくともひとつとなっており、老化と健康の悪化につながることが現在では広く認められている。これらの分子は生理的な反応での通常の副産物であり、酸素の代謝、たとえば、細胞呼吸、あるいは免疫系機能（外的異物の殺害）及び代謝に不可欠な非常に多くの酵素反応によって生産される。
特に細胞内小器官であるミトコンドリアは電子伝達系において電子の受け渡しを行うが、常に電子の漏れを生じ、呼吸に用いる酸素分子の２％〜０．２％が還元されて活性酸素種となる。更に、このような活性酸素種は一般環境中にも普通に発生する。例えば、活性酸素種の周囲の発生源には煙、電離性放射線、大気汚染、化学薬品（発がん物質、多くの石油化学製品、生物致死剤、色素、溶媒、細胞分裂阻害剤、その他）、毒性重金属、及び酸化あるいは酸敗脂肪が含まれる。最も一般的な活性酸素種の中にはスーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素、過酸化水素があげられ、広義の意味では、一酸化窒素、ペルオキシナイトライト、及びアルコキシルラジカルや脂質ペルオキシルラジカルなどの脂質ラジカルが含まれる。スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、一酸化窒素、脂質ペルオキシルラジカル、アルコキシルラジカルなどの脂質ラジカルなどはフリーラジカル分子種である。
フリーラジカル分子は生命有機体に対し、核酸、蛋白質、脂質などのすべての生物分子の構造的損傷の原因となる酸化毒性を持つ。分子の損傷は遺伝子コードの変更、酵素反応の異常、脂質膜の変性といった細胞の異常を誘起し、細胞を傷害する。このように、フリーラジカル分子は酸化力が強く、この酸化力による障害は一般的に酸化ストレスと呼ばれる。こうした酸化ストレスの蓄積により、個体レベルでは神経学的障害、内分泌不安定、アレルギーの増加、血管内皮破壊、及び関節破壊と炎症の原因となることがある。
酸化ストレスは、細胞における過剰な活性酸素種又はフリーラジカルの持つ強力な酸化能によって引き起こされる。スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−・）の大半はミトコンドリアにおいてクレブスサイクルから電子伝達系に至る過程での電子のリークによって発生する。また、Ｏ２−・はＮＡＤＰＨオキシダーゼやキサンチンオキシダーゼなどのオキシダーゼによっても生じる。Ｏ２−・はスーパーオキシドジスムターゼによって過酸化水素へと変換され、さらに過酸化水素はグルタチオンペルオキシダーゼやカタラーゼによって水へと変換されることで無毒化される。過剰なＯ２−・は遷移金属である鉄や銅を還元し、これらが過酸化水素とフェントン反応することでヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が生じる。・ＯＨは最も強力な活性酸素種で核酸、脂質及び蛋白と無差別に反応する。この・ＯＨを解毒する機構は知られておらず、従って、・ＯＨを除去することが最も重要な抗酸化プロセスとなる。
フリーラジカル分子による有毒な影響からの防護は抗酸化剤と呼ばれる多様な領域の分子において見いだされる。生体内におけるフリーラジカル分子及びそれらが関連した副産物は、酸化防止剤により中和され、害の少ない生産物に変換されることがある。このような酸化防止剤は酵素（スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシターゼ等々）、必須栄養素（ベータカロチン、ビタミンＣ及びＥ、セレンなど）、非常に多くの内生物質（グルタチオンなど）又は食品化合物（ビオフラボノイドなど）であることもある。従って、人間の生体内にはフリーラジカル分子に対するいくつかの天然の抑制物が保持されている。
しかしながら、生体内にフリーラジカル抑制物が存在するにも関わらず、個体はフリーラジカル分子によって多くの障害を受ける。従って、フリーラジカル分子による酸化防止のための栄養的補充を含む作用がヒトにおいて老化の進行を遅らせ、健康の増進、疾病の予防に大きな利点を持つことが明らかである。
ところで、水素分子の酸化還元電位は−０．４２Ｖであり、酸素分子の酸化還元電位は＋０．８２Ｖである。従って、水素分子は酸素分子を還元する内在的能力をもつ。しかし、酸化還元電位は酸化又は還元ができる指標であり、平衡状態における酸化還元の反応最終状態を示すにすぎず、実際に生体内で酸化還元反応が進行するか否かとは別問題である。一般に速やかに反応が進行するには触媒などが必要であり、あるいは高温にして反応を進行させる必要がある。複雑な構造をもつ細胞内では、酸化還元反応を進行させるにはそれぞれの特有な酵素が必要であることが多く、水素が生体内で実際に還元力を発揮するかどうかは予測することはできない。
例えば、酸化還元電位からすると水素と酸素は反応して水になるはずであるが、水に溶けた水素分子と酸素分子が反応して水になることはない。同様に、水素分子が前述のように活性酸素種あるいはフリーラジカルを還元できるかどうかは、実際に実験によって確かめなくては全く確認できない。酸化還元電位から判断するとすれば、水素分子は平衡状態では、スーパーオキシド、一酸化窒素、過酸化水素を還元してしまうはずである。一方、スーパーオキシド、過酸化水素、一酸化窒素は、生体によって必要不可欠の役割を果たしていることも明らかにされている。侵入した細菌の殺傷作用、免疫機能、癌に対する防御機構、血管の新生、血管の拡張、精子形成、神経伝達などである。従って、もし、水素分子が生体内で速やかにこれらのフリーラジカル、あるいは活性酸素を還元して消去してしまうなら、時には水素分子は有害となるはずである。
従来から、酸化還元電位の低い水は、電気分解により（下記特許文献１〜３参照）又は加圧下において水素を溶解させること（下記特許文献４参照）により作成されていた。このうち、電気分解法によって酸化還元電位の低い水性飲料をつくる場合は、ＯＨ−イオンによりアルカリ性を示すだけであり、飽和濃度以上に水素ガスを含んでいるわけではない。アルカリ性であればＯＨ−イオンによって還元力が生じるので見かけ上還元性を示すが、中性に戻すと酸化還元電位は高くなってしまう。つまり見せかけの還元性を示すだけのものである。また、アルカリ性溶液を多量に飲用すると、健康上の問題が生じる。特に腎臓の負担が大きくなるので、腎障害のある人にとっては有害である。一方、胃酸過多の人にとっては適量であれば少しは効果が認められるが、この効果はアルカリ性溶液による胃酸の中和による効果であって、水素ガス又は還元力による効果ではない。
また、金属マグネシウムを水性飲料の中に混入することによって還元性水を得る方法も知られているが、この場合においては、水素ガスと同時にマグネシウムイオン及びＯＨ−イオンが発生されるため、アルカリ性となる。マグネシウムイオンは、便秘薬などに取り入れられているから、適量であれば人体に対する健康維持効果を期待できるが、既に上述したように、アルカリ性の水性飲料を多量に摂取することは身体が絶えず中性であろうとする機能を阻害する方向に働くため、危険である。水素ガスを単に溶解させる方がアルカリ性を示さないので安全性は高いと考えられる。
【特許文献１】特開２００１−１４５８８０号公報
【特許文献２】特開２００１−１３７８５２号公報
【特許文献３】特開２００２−２５４０７８号公報
【特許文献４】特開２００４−２３０３７０号公報
【発明の開示】
【０００３】
上述のようにフリーラジカル分子は酸化力が強く、生体に対して酸化ストレスを与えることが知られており、従来から酸化ストレスの防止にはポリフェノール類、ビタミン類などが有効であると提唱されてきた。この酸化ストレスの防止用として最も広範に認められ、摂取されているビタミンＣとビタミンＥはそれぞれ安全性が高く、安価である。しかしながら、ビタミンＣは水溶性であり、一方のビタミンＥは脂溶性であることから、両者とも細胞の内部まで容易に到達することはできない。従って、細胞内外に広く浸透することが可能な抗酸化物質が求められている。
一方、フリーラジカルは有害であるだけでなく、生体によって必要不可欠の役割を果たしていることも明らかにされている。侵入した細菌の殺傷作用、免疫機能、癌に対する防御機構、血管の新生、血管の拡張、精子形成、神経伝達などである。それらは、スーパーオキシド、過酸化水素、一酸化窒素によるものである。従って、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシナイトライト、脂質ペルオキシルラジカルといった反応性が高く、細胞障害性の高いフリーラジカル種等のみを選択的に除去できる物質を見出すことができれば、酸化ストレスの防御には安全に用いることができ、望ましいことである。
上述のように、従来からフリーラジカルや活性酸素を消去するための薬剤として抗酸化ビタミンをはじめとする抗酸化物質が健康増進に利用されているが、これらの薬剤は必ずしも細胞の内部まで容易に到達することができるわけではない。また、上記特許文献１〜４に開示されているような還元性水を引用するにしても、その水は還元性が維持されたまま細胞内外へ広く浸透し得ないことは明らかであるし、しかも生体の構造と成分は複雑であり、均一系ではないので、容易にその作用効果を予測することはできない。
本願の発明者等は、気体状態の水素分子であれば、生体内に取り込まれ、細胞内に速やかに分布し、フリーラジカルが発生した時点で消去することが期待し得るものと考察し、種々実験を重ねた結果、水素分子は、細胞内でフリーラジカルの害を軽減できること、実際に人間を含む動物の生体内に取り込まれること、動物の生体内で水素が実際に酸化ストレスを軽減することを確認して本発明を完成するに至ったのである。
すなわち、本発明は、生体内のフリーラジカル濃度を効果的に低下させ、このフリーラジカル濃度の低下によって老化の進行抑制、老年病あるいは生活習慣病の予防、健康増進、酸化ストレス抑制等、所定の効果を奏するフリーラジカル除去剤及びこのフリーラジカル除去剤を吸引させるための装置を提供することを目的とする。
細胞毒性の一方で、低濃度のＯ２−・や過酸化水素は数多くのシグナル伝達カスケードにおいてこれらを制御するシグナル分子として機能し、アポトーシス、細胞増殖及び細胞分化などの生理的プロセスを制御するなど、生理的に重要な機能を持つ。高濃度の過酸化水素はミエロペルオキシダーゼによって次亜塩素酸へと変換され抗菌作用を示す。さらにラジカルである一酸化窒素は神経伝達物質であり、血管拡張において重要な機能を果たす。これに対して、・ＯＨのように一方的な細胞毒性を持つラジカルについては、前述のような活性酸素種が有する基本的な生理活性を阻害するようなことなく、これを中和することができる。本発明者は、水素分子が他の活性酸素種に影響を与えることなく・ＯＨによって誘導される細胞毒性を緩和することができること、水素分子には抗酸化物質として医療に応用できるポテンシャルが有ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  少なくとも水素分子を含む液体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［２］  少なくとも水素分子を含む液体が水溶液からなる、［１］の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［３］  水素分子が過飽和状態で含まれる、［２］の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［４］  更に酸素分子を含む、［２］又は［３］の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［５］  少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［６］  少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと酸素ガスの混合ガスからなる、［５］の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［７］  少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと酸素ガスと不活性ガスの混合ガスからなる、［５］の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［８］  少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと空気の混合ガスからなる、［５］の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［９］  少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと麻酔ガスの混合ガスからなる［５］の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［１０］  水素ガスを１〜４％（ｖ／ｖ）の濃度で含む［５］〜［９］のいずれかの生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［１１］  水素ガスを１．０〜４．５％（ｖ／ｖ）の濃度で含む［５］〜［９］のいずれかの生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［１２］  活性酸素及び／又はフリーラジカルがヒドロキシルラジカル、ペルオキシナイトライト、アルコキシラジカル及び脂質ペルオキシルラジカルからなる群から選択される活性酸素及び／又はフリーラジカルである、［１］〜［１１］のいずれかの生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［１３］  活性酸素及び／又はフリーラジカルがヒドロキシルラジカルである、［１２］の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤。
［１４］  ［１］〜［１３］のいずれかの生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、医薬組成物。
［１５］  ［１］〜［１３］のいずれかの生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防剤。
［１６］  活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が酸化ストレス、酸化ストレスによる細胞死及び酸化ストレスによるミトコンドリア機能障害からなる群から選択される［１５］の治療又は予防剤。
［１７］  活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化、虚血再還流障害、臓器移植時障害、未熟児の網膜変性、急性肺症、人工透析障害、炎症及び脂質代謝障害からなる群から選択される、［１５］の治療又は予防剤。
［１８］  活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が、急激な運動後の筋障害又は運動後の高濃度の酸素ガスを吸引する際に生じる酸素障害である、［１５］の治療又は予防剤。
［１９］  活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ等の神経変性疾患からなる群から選択される、［１５］の治療又は予防剤。
［２０］  活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害が癌である、［１５］の治療又は予防剤。
［２１］  ［１］〜［４］のいずれかの少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の軽減又は予防に適した飲料品。
［２２］  ［１］〜［４］のいずれかの少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、生体内の活性酸素及び／又はフリーラジカルの除去又は低下のために用いられるものである旨の表示を付した飲料品。
［２３］  ［１］〜［４］のいずれかの少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の軽減又は予防のために用いられるものである旨の表示を付した飲料品。
［２４］  飲料品が、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント又は特定健康食品である［２１］〜［２３］のいずれかの飲料品。
［２５］  ［５］〜［１０］のいずれかの生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器。
［２６］  水素ガスボンベである［２５］の容器。
［２７］  ［５］〜［１０］のいずれかの少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器、ガス吸引用手段並びに前記容器中の気体を吸引用手段に供給する供給配管を備えている、活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
［２８］  さらに、酸素ガス、不活性ガス及び空気からなる群から選択される少なくとも１種のガスを含む容器を備え、少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤と酸素ガス、不活性ガス及び空気からなる群から選択される少なくとも１種のガスを別々に或いは混合した後にガス吸引用手段に供給する、［２７］の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
［２９］  さらに、麻酔ガスを含む容器を備え、少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤と麻酔ガスを別々に或いは混合した後にガス吸引用手段に供給する、［２７］又は［２８］の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
［３０］  少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器中に水素ガスが１〜４％含まれる［２７］〜［２９］のいずれかの活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
［３１］  少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器が水素ガスボンベである［２７］〜［３０］のいずれかの活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
［３２］  ガス吸引用手段がガス吸引用マスクである［２７］〜［３１］のいずれかの活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
［３３］  ガス吸引用手段が密閉室であり、該密閉室中に少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を供給することにより、密閉室内の被験体に前記活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を供給する、［２７］〜［３１］のいずれかの活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−２３８５７２５号及び２００６−１５７８２７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、水素含有培地におけるアンチマイシンＡ処理したＰＣ１２細胞の位相差顕微鏡像である。
図２は、アンチマイシンＡ処理後の水素含有培地と水素未充填培地におけるＰＣ１２細胞生存数の比較したグラフである。
図３は、メナジオン処理後の水素含有培地と水素未充填培地におけるＰＣ１２細胞生存数の比較したグラフである。
図４は、アンチマイシンＡ又はメナジオン処理後の水素含有培地と水素未充填培地におけるＰＣ１２細胞生存数経時変化を示すグラフである。
図５は、アンチマイシンＡ又はメナジオン処理後の水素含有培地とビタミンＥ添加水素未充填培地におけるＰＣ１２細胞生存数の比較したグラフである。
図６は、アンチマイシンＡ処理後、水素含有培地に置き換えた場合のＰＣ１２細胞生存数の比較したグラフである。
図７は、溶存水素濃度の変化がアンチマイシンＡ処理後のＰＣ１２細胞生存数に及ぼす影響を示すグラフである。
図８は、水素含有培地におけるアンチマイシンＡ処理したＰＣ１２細胞のミトコンドリア像である。
図９は、酸化ストレス亢進モデル動物における水素水の４−ＨＮＥ蓄積抑制効果を示すグラフである。
図１０は、水素水を投与した酸化ストレス亢進モデル動物における血中４−ＨＮＥ蓄積量の経時変化を示すグラフである。
図１１は、水素ガス吸入による虚血・再灌流障害軽減効果を示す肝臓のヘマトキシリン・エオジン染色像である。
図１２は、水素水を飲用することによる４人の呼気の水素濃度の時間変化を示すグラフである。
図１３は、室温、中性下での溶存水素分子によるヒドロキシルラジカルの除去を示す図である。
図１４は、ＰＣ１２細胞における水素分子によるヒドロキシルラジカル除去を示す図であり、ＨＰＦの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す図である。
図１５は、ＰＣ１２細胞における水素分子によるヒドロキシルラジカル除去を示す図であり、ＨＰＦ蛍光強度を定量した結果を示す図である。
図１６は、水素分子によりグアニンの酸化が抑制されたＰＣ１２細胞を示す図である。
図１７は、水素分子によるＰＣ１２細胞のグアニンの酸化の抑制を示す図である。
図１８は、水素分子によりＨＮＥ産生が抑制されたＰＣ１２細胞を示す図である。
図１９は、水素分子によるＰＣ１２細胞のＨＮＥ産生の抑制を示す図である。
図２０は、水素分子によるインビトロの虚血からの神経細胞保護効果を示す図であり、再還流１０分後に細胞をＨＰＦで染色した結果を示す図である。
図２１は、水素分子によるインビトロの虚血からの神経細胞保護効果を示す図であり、ＨＰＦ蛍光強度を１００個の細胞についてＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて計測した結果を示す図である。
図２２は、水素分子による生存神経細胞数の増加効果を示す図である。
図２３は、水素分子による生存神経細胞のバイアビリティーの増加を細胞数により示す図である。
図２４は、水素分子による生存神経細胞のバイアビリティーの増加を活性により示す図である。
図２５は、吸引水素ガスの酸化ストレス抑制による虚血再還流傷害の保護効果を示す図であり、ＴＴＣで染色した結果を示す図である。
図２６は、吸引水素ガスの酸化ストレス抑制による虚血再還流傷害の保護効果を示す図であり、脳の梗塞体積を示す図である。
図２７は、種々の水素ガス吸引時間での虚血再還流傷害保護効果を示す図である。
図２８は、吸引水素ガスの酸化ストレス抑制による虚血再還流傷害の保護効果を示す図であり、一週間後に脳を冠状切断して得たスライスをヘマトキシリン・エオジン染色した結果を示す図である。
図２９は、吸引水素ガスの酸化ストレス抑制による虚血再還流傷害の保護効果を示す図であり、一週間後の梗塞体積をヘマトキシリン・エオジン染色で薄ピンク色に見える領域を梗塞領域として算出した結果を示す図である。
図３０は、水素処置及び未処置ラットの体温又は体重の変化を示す図である。
図３１は、水素ガス存在下及び非存在下における虚血再還流傷害後の脳の抗８−ＯＨ−Ｇ抗体による免疫染色の結果を示す図である。
図３２は、水素ガス存在下及び非存在下における虚血再還流傷害後の脳の抗ＨＮＥ抗体による免疫染色の結果を示す図である。
図３３は、水素ガス存在下及び非存在下における虚血再還流傷害後の脳の抗ＧＦＡＰ抗体による免疫染色の結果を示す図である。
図３４は、水素ガス存在下及び非存在下における虚血再還流傷害後の脳をミクログリア特異的抗Ｉｂａ−Ｉ抗体染色した結果を示す図である。
図３５は、水素ガス存在下及び非存在下における虚血再還流傷害後の脳をミクログリア特異的抗Ｉｂａ−Ｉ抗体染色したときに陽性となった細胞数を示す図である。
図３６は、本発明の装置を示す図である。
図３７は、ＳＯＤ（＋／−）マウス同士の交配で生まれるマウスの遺伝子型を示す図である。
図３８は、ＳＯＤ（＋／−）マウス同士の交配で生まれるマウスの遺伝子型に対する水素水の効果を示す図である。
図３９は、水素水の発癌抑制効果を評価する実験方法を示す図である。
図４０は、水素水を投与したマウスと投与しなかったマウスの肝臓のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の数（図４０ａ）及び陽性巣の面積（図４０ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
水素は生体内の活性酸素及び／又はフリーラジカルを還元することにより、これらを除去することができる。
活性酸素とは、酸素よりも酸化力が強く他の物質を酸化する能力が高い分子をいい、一重項酸素、過酸化水素、オゾン、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシナイトライト等をいう。フリーラジカルは、活性酸素であるスーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル等のほか、一酸化窒素、アルコキシルラジカル（脂質ラジカル。Ｌ・）、脂質ペルオキシルラジカル（アルキルペルオキシルラジカル、ＬＯＯ・）等を含む。本発明において、フリーラジカルという場合、活性酸素種も含む広義のフリーラジカル分子を意味する場合がある。
これらのうち、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシナイトライト、アルコキシラジカル及び脂質ペルオキシルラジカルは、細胞毒性を有し、生体に有害な作用をもたらし、種々の障害の原因の一つになり得る悪玉活性酸素又はフリーラジカルである。本発明において、水素はもっぱらこれらの有害な活性酸素及び／又はフリーラジカルを短時間で還元して除去する。一方、前記の悪玉活性酸素及び／又はフリーラジカル以外の活性酸素及び／又はフリーラジカルは、生体内でシグナル伝達等に関与し、有用な機能を有しており、善玉活性酸素及び／又はフリーラジカルという。善玉活性酸素及び／又はフリーラジカルは、水素によっても容易に除去されることはない。本発明の少なくとも水素分子を含む液体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、専ら生体に有害な悪玉活性酸素及び／又はフリーラジカルのみを除去する。ここで、酸化ストレスとは活性酸素及び／又はフリーラジカルの酸化力によりもたらされる生体の障害をいう。
水素分子は細胞膜をも透過し得るので、細胞内に進入し、細胞内の活性酸素及び／又はフリーラジカルを除去する。また、水素分子は核内とミトコンドリア内にも入ることができ、遺伝子を活性酸素及び／又はフリーラジカルから保護することができ癌を抑制することができる。また、水素は血液脳関門を通過し得るので、脳を酸化ストレスから保護することもできる。
少なくとも水素分子を含む液体は、水溶液からなることを特徴とする。この水溶液を形成する媒体としては、純水、イオン交換水、蒸留水、生理食塩水等を使用し得る。さらに、前記媒体として純水、イオン交換水あるいは蒸留水を使用し、得られた生体内の有害なフリーラジカル除去剤を一般的な水性飲料品、例えば、ミネラルウォーター、ジュース、コーヒー、お茶等に添加して飲用するようにしてもよい。ここで、飲料品は、飲料用の健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメント等を含む。ここで、特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする食品をいう。これらの飲料品には、生体内の活性酸素及び／又はフリーラジカルの除去又は低下のために用いられるものである旨の表示やフリーラジカルに起因する障害の軽減又は予防のために用いられるものである旨の表示が付されていてもよい。さらに、具体的に活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害を定義して、それらの障害の軽減又は予防のために用いられるものである旨の表示が付されてもよいし、また抗老化や抗酸化に有用である旨の表示が付されていてもよい。さらに、同様の目的で水素を含む液体は化粧水にも用いられてもよい。
水素分子は過飽和状態であっても水又は水溶液中にある程度の時間溶けていることができる。このような水素分子が過飽和状態の水又は水溶液は、加圧下において水素ガスを水又は水溶液に溶解させた後に圧力を取り除くことにより製造し得る。例えば、水溶液を０．４ＭＰａ以上の水素ガス圧下に数時間、好ましくは１〜３時間おけばよい。水溶液形態の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、飲用として用いることもでき、酸素を共存させた生理食塩水の形で静注用として用いることもできる。この場合、投与はカテーテルを用いた投与や注射による投与が可能である。注入後は生体内に摂取された水素は生体にほとんど吸収され、血液を介して全身に行き渡り、効果を発揮し、その後呼気と一緒に排出される。
水素１気圧、室温条件で水素は水１Ｌ当たり約１７．５ｍＬ溶存し得る（約１．６ｐｐｍ、約０．８ｍＭ）。本発明の水溶液形態の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、水溶液１Ｌ当たり、１０ｍＬ以上、好ましくは１５ｍＬ以上、特に好ましくは１７．５ｍＬ以上の水素分子を含む。また、本発明の水溶液形態の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、１ｐｐｍ以上、好ましくは１．５ｐｐｍ以上の水素分子を含む。また、本発明の水溶液形態の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、０．１ｍＭ以上、好ましくは０．４ｍＭ以上、さらに好ましくは０．６ｍＭ、特に好ましくは０．８ｍＭ以上の水素を含む。
また、本発明の水溶液形態の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、酸素分子を含んでいてもよい。水溶液中に水素分子と酸素分子とが共存することとなるが、水素分子と酸素分子とが混合状態であっても、ただちに反応することはなく、両者とも安定に共存し得る。ただし、気体が多量の酸素分子を含む場合においては安全性を確保するために水素含有量は全気体の４．７％（ｖ／ｖ）未満となるようにすることが好ましい。安全性に問題がない使用環境下においては、水素含有量は可能な限り高濃度であることが好ましい。酸素を含む活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤も、飲用又は生理食塩水の形で静注用として使用し得るが、注射による投与の場合には、酸素分子がない場合に比すると、生体内が局部的に酸素不足の状態となることがないため、生体組織に損傷を与えることが少なくなる。
本発明の飲料品は、好ましくはアルミニウム等の水素を透過できない素材でできた容器中に保存するのが好ましい。このような容器として例えばアルミパウチが挙げられる。また、低温である程、より多くの水素が溶存するので、低温で保存するのが好ましい。
本発明の少なくとも水素分子を含む生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、気体状の形態であってもよい。この場合、水素の濃度は、１〜４．７％、好ましくは１〜４．５％、さらに好ましくは１〜４％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは１．５〜２．５％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは約２％である。水素ガス含有量は安全性確保のために約４．７％（ｖ／ｖ）未満であることが望ましいが、密閉条件下で静電気が発生しないように配慮された安全な条件下であれば水素ガス含有量をより高くすることもできる。本発明の少なくとも水素分子を含む生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、さらに酸素ガス及び／又は他の不活性ガスを含んでいてもよい。酸素ガスを含む場合、水素ガスと酸素ガスの混合ガスからなる。酸素ガスは呼吸のために消費される。不活性ガスとしては、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス等を使用し得るが、安価な窒素ガスが望ましい。この不活性ガスの含有量は、多すぎない範囲で当業者が任意に設定できるが、呼吸用の酸素ガス濃度を考慮すると８０％（ｖ／ｖ）以下が好ましい。さらに、本発明の少なくとも水素分子を含む生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、水素ガスと空気の混合ガスであってもよい。このような混合ガスは、空気に水素ガスを適宜混合することにより簡単に製造し得る。さらに、本発明は水素分子を含む生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、麻酔用ガスを含んでいてもよい。この場合、生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、水素ガスと麻酔ガスの混合ガスからなる。麻酔ガスとしては、笑気ガス等が挙げられる。
本発明の気体状の少なくとも水素分子を含む生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、例えばガスボンベ等の耐圧性の容器中に入れられる。本発明は、気体状の少なくとも水素分子を含む生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器をも包含する。
本発明の気体状の少なくとも水素分子を含む生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、被験体に吸引させることができる。吸引は吸引手段を用いて行うことができ、前記の生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器から配管を通して吸引手段を介して吸引させればよい。吸引手段は限定されないが、例えば、吸引マスクが挙げられ該マスクは好ましくは被験体の口及び鼻を同時に覆うことができる。さらに、吸引手段として密閉された小密閉室がある、該小室は被験体がその中に入り込める程度の大きさを有し、該小室に被験体が入った状態で、消失内に本発明の気体状の少なくとも水素分子を含む生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を供給することにより、被験体に吸引させることができる。このような小室の一例として、密閉されたベッドが挙げられる。被験体はベッドに横臥した状態で本発明の気体状の少なくとも水素分子を含む生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を吸引することができる。
本発明は、少なくとも水素分子を含む液体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を有効成分として含む、医薬組成物等の組成物も包含する。この場合、活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は液体状であっても、気体状であってもよい。これらの組成物は、活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害を予防又は治療するために用いることができる。
ここで、活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害とは、活性酸素及び／又はフリーラジカルが原因の１つになっている障害、疾患、機能異常等をいう。具体的には、酸化ストレス、酸化ストレスによる細胞死及び酸化ストレスによるミトコンドリア機能障害が挙げられる。また、脳梗塞、心筋梗塞、手術時等の虚血再還流障害、臓器移植時の障害、未熟児の網膜変性、急性肺症、人工透析時障害及び炎症が挙げられる。さらに、急激な運動後の筋障害又は運動後の高濃度の酸素ガスを吸引する際に牛じる酸素障害が挙げられる。さらに、アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ等の神経変性疾患が挙げられる。さらに、核のＤＮＡの酸化を防止することにより癌の予防又は治療にも用いることができる。さらに、老化の進行には活性酸素及び／又はフリーラジカルが関与しており、本発明の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、老化に伴う種々の障害を治療又は予防することにより、抗老化（アンチエイジング、抗加齢）作用を発揮し得る。すなわち、本発明の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤は、抗老化に有用な組成物として使用することもできる。これらの障害のうち、脳梗塞及び心筋梗塞においては、酸素欠乏状態から血流が流れることにより活性酸素及び／又はフリーラジカルが生起し障害が生じる。また、手術時の虚血再還流障害は、手術時に血流をとめて手術が終了した時点で血流が流れることにより活性酸素及び／又はフリーラジカルが生起し障害が生じる。また、臓器移植においては、移植する臓器は酸素欠乏状態にあり、移植後血流が流れることにより、活性酸素及び／又はフリーラジカルが生起し障害が生じる。未熟児の網膜変性は未熟児の高濃度酸素治療のため活性酸素が生じやすくなりそのため網膜に障害を受ける。急性肺症においては、高濃度酸素治療により活性酸素及び／又はフリーラジカルが生起し障害が生じる。さらに、急激な運動直後には、酸欠状態から運動停止により酸素が供給されることにより活性酸素及び／又はフリーラジカルが生起し障害が生じる。
本発明における予防又は治療とは、実際に障害を有している被験体へ活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を投与して、該障害を治癒させること、障害を起こす危険のある被験体へ活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を投与して、該障害が生じる危険を低下させること、該障害の程度を軽減すること、該障害を抑制すること等を含む。
これら組成物の投与又は摂取の時期は限定されないが、現実に障害が生じているときに投与又は摂取してもよい。また、活性酸素及び／又はフリーラジカルが生体内で生起し得る直前又は直後に投与又は摂取してもよい。例えば、激しい運動後、激しい運動後の酸素摂取時、精神的ストレス、肉体的ストレスを受けた後等が好ましい。さらに、タバコの煙中には、スーパーオキシドラジカルが多量に含まれており、生体内でヒドロキシルラジカルに転換し、該ヒドロキシルラジカルが遺伝子に損傷を与えることが肺がんの原因の１つと言われている。したがって、喫煙者の肺がんの予防に用いることもできる。
投与は、液体状の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤の場合、経口投与、静脈注射により行うことができる。また、癌等の局所的な疾患の場合は、癌部位に直接投与してもよく、例えば内臓の癌の場合、腹腔内に注射により投与してもよい。また、気体状の活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤の場合は、吸引により投与すればよい。
さらに、本発明は少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器、ガス吸引用手段並びに前記容器中の気体を吸引用手段に供給する供給配管を備えている、活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置を包含する。容器は例えば、水素ガスボンベである。また、ガス吸引手段として前述のように、吸引マスク、密閉した小室が挙げられる。該装置は、さらに、酸素ガス、不活性ガス、空気及び麻酔ガスからなる群から選択される少なくとも１種のガスを含む容器を備えていてもよく、この場合、少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤と酸素ガス、不活性ガス及び空気からなる群から選択される少なくとも１種のガスを別々に或いは混合した後にガス吸引用手段に供給すればよい。図３６に本発明の装置の概略図を示す。該図は、ガス吸引用手段１、水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器２、酸素ガス、不活性ガス、空気及び麻酔ガスからなる群から選択される少なくとも１種のガスを含む容器３並びに配管４を備え、ガスが配管を通してガス吸引用手段に供給され、被験体に投与される。
以下、本発明の具体例を実施例を用いて詳細に説明するが、以下の実施例は本発明をこれに限定することを意図するものではなく、本発明は特許請求の範囲に示した技術思想を逸脱することなく種々の変更を行ったものにも均しく適用し得るものである。
以下の実施例において、水素と酸素の測定、培養細胞の水素処理及び培養細胞の染色は、特に断りのない限り以下の手法で行った。また、詳細な条件を各実施例中に示す。
水素と酸素の測定
溶液中の水素と酸素の濃度はそれぞれ水素電極（ＡＢＬＥ  Ｉｎｃ．）と酸素電極（Ｓｔｒａｔｈｋｅｌｖｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）で測定した。水素ガス濃度はガス・クロマトグラフィー（テラメックス社、京都）で測定した。蛍光強度の測定にはＲＦ−５３００ＰＣ（島津製作所製）を用いた。溶液条件での実験には、水素ガス０．４ＭＰａ圧下で２時間放置することで、水素を溶存させた。水素によるヒドロキシルラジカル消去測定実験では、水素溶存水にはリン酸バッファー（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）、水酸化第一鉄（０．１ｍＭ）、ＨＰＦ（０．４μＭ、第一化薬）を加えて、水素電極で濃度を測定した。次いで、フェントン反応の開始には過酸化水素（５μＭ）を加え、２３℃で緩やかに攪拌した。
培養細胞の水素処理
水素ガス０．４ＭＰａ圧下でＤＭＥＭ培地を２時間放置することで、水素を溶存させた。酸素ガスを通気することで酸素飽和培地を別途用意し、水素溶存培地と混合、２５℃での溶存酸素濃度を８．５ｍｇ／Ｌとした。また、水素電極で水素濃度を測定した。Ｏ２−・を介した・ＯＨの発生には、細胞にアンチマイシンＡを添加した。ＰＣ１２細胞は、溶存水素と溶存酸素の濃度が適切になるように調整した水素と酸素を含む気体を封入した密閉容器に入れ、３７℃で培養した。
培養細胞の染色
・ＯＨの検出には、細胞培地にＨＰＦ（０．４μＭ）を加え、その蛍光イメージを共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製  ＦＶ３００）を用いて励起波長４８８ｎｍ吸収波長５１０ｎｍで観察した。ミトコンドリアの染色にはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（１μＭ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）とＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（１００ｎＭ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を用いた。抗ＨＮＥ及び抗８−ＯＨ−Ｇ抗体は日研ザイルより買い求めた。また、抗ＴＵＪ−１及び抗ＧＦＡＰ抗体は、それぞれＢａｂｃｏとＩｍｍｕｎｏｎから買い求めた。
【実施例１】
【０００６】
水素分子には還元力があることは知られているが、前記のように生物学的に重要な酸化還元に関与する分子種、及びフリーラジカル分子種を短時間に還元できるかどうかは予測できない。そこで、実施例１においては、水素水を用いて各分子種に対する作用を測定した。
水素水の調製
まず、水１リットルを容量５リットルの耐圧ボトル（ユニコントロールズ社製）に注入後、水素ガスを０．４メガ・パスカルの圧力となるように充填した。２時間後にボトルから水素を添加した水を減圧しながら回収した。水素含有量は溶存水素測定器（エイブル社製）を用いて解析した。この方法により、０．８ｍＭ程度の過飽和水素を含有する水（水素水）が得られた。
水素水の活性酸素種消去作用の測定
次いで、一酸化窒素ＮＯに対しては、リン酸０．０１ＭでｐＨ７．４に調製した水素水にＮＯドナーである１−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏ−３−（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｏｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｔｒｉａｚｅｎｅ（ＮＯＣ７、同仁化学研究所社製）０．１ｍＭ又は１ｍＭを加えて室温で３０分反応させ、次いで１μＭの５−（ａｎｄ−６）−ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＤＨ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製、米国）を加え、蛍光分析装置（ＴＥＣＡＮ社製、オーストリア）にて４８５ｎｍの励起波長で測定することにより、ＮＯ残量を測定した。
ペルオキシナイトライト（Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ  ＯＮＯＯ−）に対しては、リン酸０．０１ＭでｐＨ７．４に調製した水素水にペルオキシナイトライト溶液（同仁化学研究所社製）を終濃度６２．３ｍＭとなるように加えて室温で１０分反応、次いで３００ｎｍの吸光度を分光高度計（ＢＥＣＫＭＡＮ社製）を用いて測定した。
過酸化水素Ｈ２Ｏ２に対しては、水素水に終濃度１００μＭから１μＭとなるように過酸化水素水（和光純薬社製）を加えて室温で３０分反応、次いで等量の２０μＭ  ＤＣＦＤＡを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．２）を加えて１０分間反応後に蛍光分析装置にて４８５ｎｍの励起波長で測定することにより、Ｈ２Ｏ２残量を測定した。
ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）に対しては、水素水に終濃度１００μＭのｆｅｒｒｏｕｓ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及び過酸化水素１ｍＭ及び１ｐＭの２−［６−（４’−ｈｙｄｒｏｘｙ）ｐｈｅｎｏｘｙ−３Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−３−ｏｎ−９−ｙｌ］ｂｅｎｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＰＦ、同仁化学研究所社製）を加えて１０分間反応後に蛍光分析装置にて４８５ｎｍの励起波長で測定した。ＨＰＦは過酸化水素に対する反応性が低く、ヒドロキシルラジカルに対しては高い反応性を示して蛍光を発する。これにより、ヒドロキシルラジカル残量を測定した。
脂質ラジカルの指標として脂質ペルオキシルラジカル（ａｌｋｙｌｐｅｒｏｘｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ）（ＬＯＯ・）を発生する２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ａｍｉｄｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬社製）０．１ｍＭを水素水に加えて室温で１時間反応、次いで等量の２０μＭ  ＤＣＦＤＡを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．２）を加えて１０分間反応後に蛍光分析装置にて４８５ｎｍの励起波長で測定することにより、ＬＯＯ・残量を測定した。
スーパーオキシド（Ｏ２−・）に対しては、水素水にＴＲＥＶＩＧＥＮ社のＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅアッセイキットに含まれる２５ｘ反応液、Ｘａｎｔｈｉｎｅ溶液、及びＮＢＴ溶液を製造者のマニュアルに従って混和した後、Ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ溶液を加えることでＯ２−・を発生させ、分光光度計で５５０ｎｍにてＮＢＴ−ｄｉｆｏｒｍａｚａｎの蓄積を経時的に測定した。
シトクロムｃ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）については、１０μＭシトクロムｃ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ  ＦＡＤ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ  ＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ社製）となるように水素水に溶解し、３０分間室温で反応後にそれぞれ４１５、４００、３４０ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。結果を表１に示す。なお、表１における消去量は水素未充填の水で反応を行ったときの各分子種残量を１００％として、水素水で反応を行ったときの各分子種残量を引いた値を示す。
表１に示した測定結果から以下のことが分かる。すなわち、水素水は最も反応性の高く毒性の高いヒドロキシルラジカル、ペルオキシナイトライトラジカル及び脂質ペルオキシルラジカルを還元して消去することが確認できた。一方、生体内でシグナル伝達などに使われることが知られるＮＯ、スーパーオキシド、過酸化水素などの消去は認められなかった。同様に酸化還元反応によって生体内のエネルギー代謝において中心的な役割を果たすシトクロムｃ、ＦＡＤ、ＮＡＤ＋に対してもなんら影響を与えなかった。
【表１】
2007021034.tif 000002
2007021034.tif 000003
＊消去量は水素未充填の水で反応を行ったときの各分子種残量を１００％として、水素水で反応を行ったときの各分子種残量を引いた値
【実施例２】
【０００７】
アンチマイシンＡはミトコンドリアの呼吸鎖複合体ＩＩＩの阻害剤で、細胞における活性酸素の産生を促進し、その結果として酸化ストレスによる細胞死を誘導する。そこで、実施例２においては、アンチマイシンＡ存在下における水素による酸化ストレス防御効果を測定した。
水素含有培地の調製
細胞培養液には酸素が含まれ、ほぼ中性で、高濃度の金属イオンが含まれないことが必要である。酸素分子と水素分子を共存させる培養液を作製するには、ヘンリーの法則に従って、それぞれを加圧して溶解させることが予測できる。前記の水素加圧装置の空間に酸素を満たしてから、水素ガスを５気圧に加圧する。酸素ガスの分圧は１気圧を維持できるので培養に必要な酸素濃度を確保できる。細胞培養用培地であるＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、インビトロジェン社製）１リットルに終濃度１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリンＧ（インビトロジェン社製）と１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（インビトロジェン社製）を含有せしめ、これを容量５リットルの耐圧ボトルに注入後、水素ガスを０．４メガ・パスカルの圧力となるように充填した。２時間後にボトルから水素を添加したＤＭＥＭを減圧しながら回収した。
あるいは、高濃度の水素を必要としない場合は、酸素飽和ＤＭＥＭを適量加えることで、水素添加前のＤＭＥＭと同程度の溶存酸素を有する水素含有培地を調製した。溶存酸素は、Ｍｉｔｏｃｅｌｌ  ＭＴ２００（シィー・ティー  アンド  シィー社製）を用いて、培養液のＤＭＥＭの溶存酸素濃度を測定し、一定に保つようにした。水素含有量は前記の溶存水素測定器をもちいて解析した。水素含有ＤＭＥＭ調製時の溶存酸素、及び溶存水素濃度の測定結果一例を表２に示す。この培地に終濃度１％となるように馬血清（ＰＡＡ社製、オーストリア）を添加し、溶存水素濃度が０．６〜０．８ｍＭ、溶存酸素濃度が８．６〜９．３ｍｇ／Ｌとした水素含有培地を以降の実験に用いた。
【表２】
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ラット副腎由来褐色細胞腫株ＰＣ１２の培養
ラット副腎由来褐色細胞腫株ＰＣ１２を１０％牛胎児血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製、米国）と５％馬血清を含有するＤＭＥＭに懸濁し、コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュに１×１０４／ｃｍ２の細胞密度となるよう植え込んだ。細胞は５％ＣＯ２下、３７℃のインキュベーターで培養した。水素含有培地の効果を確認するためには、一晩培養後に培地を吸引して１％馬血清を含有するＤＭＥＭで細胞を一回洗浄して以降の実験に用いた。
水素含有培地で細胞培養する時には、開放系の培養用ディシュを用いたが、水素が培養液より放出しないようにするため、以下のような工夫をした。すなわち、容量３リッターのタッパーに適当な濃度の水素水を２リッター入れ、水面上に台をおいて、その上に水素含有培地で培養中のディッシュを静置し、密封状態において３７℃で培養した。以後、水素水を用いるときは、この方法を踏襲した。水素を充填していない培地で培養中のディッシュは、調製済み水素水に代えて未処理の水を入れたタッパーの台上に静置して３７℃で培養した。
アンチマイシンＡによって誘導される細胞死の水素による抑制効果の調査
水素による酸化ストレス防御効果を測定するため、ＰＣ１２細胞をコラーゲンコートされた２４ウェル細胞培養用ディッシュ（旭テクノグラス社製）で培養し、これにアンチマイシンＡ（シグマ社製）添加又は未添加水素含有培地を各ウェル２ｍＬずつ加えて、２４時間後に位相差顕微鏡下でピラミッド型の細胞形態を有する生細胞を計数した。このときに比較対照として水素を充填していない１％馬血清含有ＤＭＥＭ（以下、水素未充填培地という。）を用いた。２４時間後の位相差顕微鏡像を図１に示す。
この時、水素未充填培地に１０μｇ／ｍＬのアンチマイシンＡを添加した培地で培養した細胞では、丸く小さくなった死細胞が多数観察され、ピラミッド型の生細胞が減少している。これに対し、水素含有培地に１０μｇ／ｍＬのアンチマイシンＡを添加した場合は、死細胞が減少し、生細胞の比率が水素不含培地に比して顕著に増加した。アンチマイシンＡの濃度を変えて、水素含有培地と水素未充填培地での生細胞数を計数した結果を図２に示す。棒グラフは少なくとも４ウェルの平均を示し、誤差線は標準偏差を示す。アンチマイシンＡの濃度が１０μｇ／ｍＬ及び３０μｇ／ｍＬのいずれの場合でも水素含有培地の生存細胞数が有意に増加し、水素添加による細胞死抑制効果が示された。
【実施例３】
【０００８】
メナジオンによって誘導される細胞死の水素による抑制効果の調査
メナジオンはミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉの阻害剤で、細胞における活性酸素の産生を促進し、その結果として酸化ストレスによる細胞死を誘導する。そこで実施例２に示したアンチマイシンＡによる細胞死の実験と同様に水素による酸化ストレス防御効果を測定するため、ＰＣ１２細胞をコラーゲンコートされた２４ウェル細胞培養用ディッシュで培養し、これに濃度の異なるメナジオン（シグマ社製）を添加又は添加していない水素含有培地を各ウェル２ｍＬずつ加えて、２４時間後に位相差顕微鏡下でピラミッド型の細胞形態を有する生細胞を計数した。このとき、比較対照として水素未充填培地を用いた。結果を図３に示す。棒グラフは少なくとも４ウェルの平均を示し、誤差線は標準偏差を示す。１０μＭのメナジオンを添加した場合に水素含有培地の生存細胞数が有意に増加し、水素添加による細胞死抑制効果が示された。
【実施例４】
【０００９】
アンチマイシンＡ及びメナジオンによって誘導される細胞死の、水素による抑制効果の経時的測定
実施例２及び３と同様の方法でアンチマイシンＡ及びメナジオンによって細胞死を誘導したときの水素による酸化ストレス防御効果を経時的に測定することで、水素による防御効果の持続性を調べた。ＰＣ１２細胞をコラーゲンコートされた２４ウェル細胞培養用ディッシュ（旭テクノグラス社製）で培養し、１０μＭのメナジオン又は３０μｇ／ｍＬのアンチマイシンＡを添加又は添加していない水素含有培地を各ウェル２ｍＬずつ加えて、０、１、２、３日後に位相差顕微鏡下でピラミッド型の細胞形態を有する生細胞を計数した。その結果を図４に示す。各点は少なくとも４ウェルの平均を示す。水素添加による細胞死抑制効果は２日目以降も確認でき、水素添加による細胞死抑制効果が２４時間目以降も継続されていることが示された。
【実施例５】
【００１０】
水素による細胞死抑制効果のビタミンＥとの比較測定
実施例５においては、抗酸化効果を示す物質としてよく知られ、広範に用いられているビタミンＥと水素を比較した。実施例２及び３と同様の方法でアンチマイシンＡ又はメナジオンによって細胞死を誘導し、水素含有培地とα−トコフェノール（ビタミンＥ）を含有する水素不含培地での生存細胞数を比較した。まず、ＰＣ１２細胞をコラーゲンコートされた２４ウェル細胞培養用ディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）で培養し、３μＭのメナジオン又は１０μｇ／ｍＬのアンチマイシンＡを添加又は添加していない水素含有培地又は１００μＭのα−トコフェノール（シグマ社製）を含有する水素未充填培地を各ウェル２ｍＬずつ加えて、２４時間後に位相差顕微鏡下でピラミッド型の細胞形態を有する生細胞を計数した。比較対照として水素未充填培地を用いた。結果を図５に示す。
棒グラフは少なくとも４ウェルの平均を示し、誤差線は標準偏差を示している。水素含有培地での生存細胞数は水素不含培地に比して有意に増加したが、α−トコフェノールを含有する水素不含培地では、アンチマイシンＡによって誘導された細胞死の阻害効果は水素よりも弱いながらも認められたが、メナジオンに対しては有意な効果は認められなかった。以上の結果は、細胞レベルにおいて水素がビタミンＥよりも優れた抗酸化ストレス物質であることを示している。
【実施例６】
【００１１】
水素含有培地後添加によるアンチマイシンＡ誘導細胞死の抑制効果の測定
水素含有培地によるアンチマイシンＡ誘導細胞死の抑制効果が、アンチマイシンＡの水素による変性のためではなくアンチマイシンＡよって惹起される酸化ストレスの抑制であることを示すために、アンチマイシンＡを含有する水素未充填培地で細胞を処理して一定時間後に水素含有培地と入れ替え、細胞死抑制の有無を調べた。実施例５に示したアンチマイシンＡによる細胞死の実験と同様にＰＣ１２細胞をコラーゲンコートされた２４ウェル細胞培養用ディッシュで培養し、これに３０μｇ／ｍＬのアンチマイシンＡを添加した水素未充填培地を各ウェル２ｍＬずつ加えて、その後１、３及び６時間の時点で各２ｍＬの水素含有培地又は水素未充填培地に置換した。アンチマイシンＡ添加時から数えて２４時間後に位相差顕微鏡下でピラミッド型の細胞形態を有する生細胞を計数した。結果を図６に示す。
棒グラフは少なくとも４ウェルの平均を示し、誤差線は標準偏差を示している。１及び３時間後に水素含有培地へ置換した場合の生存細胞数は水素不含培地に比して有意に増加した。アンチマイシンＡ添加後に水素を与えても細胞死を抑制できることから、水素はアンチマイシン添加によって二次的に生じる酸化ストレスを抑制していることを示している。また、６時間後では効果が認められなかったのは、この時点ですでに不可逆的細胞死が進行しており、そのために水素添加の有無に関係なく細胞が一定の割合で死滅したものと推測される。
【実施例７】
【００１２】
溶存水素濃度の細胞死抑制効果に対する影響の測定
細胞における酸化ストレス防御に必要な水素濃度を検討した。実施例２に示したアンチマイシンＡによる細胞死の実験と同様にＰＣ１２細胞をコラーゲンコートされた２４ウェル細胞培養用ディッシュで培養し、これに３０μｇ／ｍＬのアンチマイシンＡを添加した濃度の異なる水素を含有した培地を各ウェル２ｍＬずつ加えて、２４時間後に位相差顕微鏡下でピラミッド型の細胞形態を有する生細胞を計数した。結果を図７に示す。細胞死の抑制が水素濃度に依存することから、抑制効果が水素によるものであることが確認された。更に水素濃度が飽和水素濃度の約１／１６にあたる５０μＭという低濃度であっても細胞死を有意に抑制することができた。
【実施例８】
【００１３】
酸化ストレスによって生じるミトコンドリア機能障害の水素による抑制効果の測定
アンチマイシンＡなどにより酸化ストレスが亢進されると、ミトコンドリアの機能が障害される。そこで、実施例２に示したアンチマイシンＡによる細胞死の実験と同様に、ＰＣ１２細胞をコラーゲンコートされた３５ｍｍガラスボトムディッシュで培養し、これに１０μｇ／ｍＬのアンチマイシンＡを含む水素含有培地を加えた。比較対照として水素未充填培地を用いた。５０分後にミトコンドリア特異的色素Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（終濃度１μＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製、米国）とミトコンドリア膜電位感受性色素Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（終濃度１０ｎＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製、米国）を添加し、更に１０分間培養した。これを４８８ｎｍと５４３ｎｍの励起波長で発する蛍光像を共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製）で観察した。結果を図８に示す。
図８に示す実験において、０．６ｍＭ水素存在下又は非存在下でアンチマイシンＡ（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、３０分後に１μＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＭＴＧｒｅｅｎ）と１００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（ＭＴＲｅｄ）を添加、さらに１０分間培養した。次いで、細胞の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。スケールバーは５０μｍである。水素非存在下でのＭＴＲｅｄ染色強度の減少はミトコンドリア膜電位の低下を示し、重ね合わせた画像では水素存在下と比べてより緑色が濃くなる。従って、水素分子はミトコンドリア膜を透過したものと考えられる。
水素未充填培地でアンチマイシンＡ処理した細胞は、未処理の細胞では編み目様の構造をとっていたミトコンドリアの形態が丸く千切れた形態をとっている。また、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄの蛍光強度も低下している。これらはミトコンドリアの機能低下を示すものであるが、水素含有培地でアンチマイシンＡ処理した細胞は形態及びＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄの蛍光強度共にアンチマイシンＡ未処理の細胞に近く、ミトコンドリア機能低下が抑制されていることが分かる。すなわち、水素分子はミトコンドリアを保護した。
【実施例９】
【００１４】
酸化ストレス亢進モデル動物に対する水素水の効果の測定
アルデヒド脱水素酵素２の不活性型遺伝子が導入されたトランスジェニック・マウスは酸化ストレスが亢進され、老化関連疾患を示す（Ｃ２マウス、特開ＷＯ２００５／０２０６８１，Ａ１）。このＣ２マウス（５週齢、雌、各群４匹）に水素水を自由摂取させた。開放系では水素水から水素が遊離して消失してしまうので、水素が長時間にわたって水に溶解している状態を維持するために、摂水口にベアリングボールを２個いれて、水が漏れ出ず、水が空気と接しないようにした。マウスはベアリングボールをつついて水を摂水口から水を飲むことができる。この方法でマウスの飲水量は開放系とくらべて低下することはなかった。この方法では２４時間後にも水素は半分以上残存した。実施例１に準じた方法で調製した水素水を容量１００ｍＬのガラス給水瓶に満水となるまで充填し、２４時間に一度水素水を交換した。対照の水は、水素水から水素を脱気した水を用いて、水素溶存以外は完全に同一の水を用いた。
Ｃ２マウスに水素水あるいは対照水を自由摂取させ、過酸化脂質から生じる有害なアルデヒドであり生体内酸化ストレス蓄積の指標となる４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ＨＮＥ）の血液及び大腿筋における濃度変化を測定した。４週後、全血は眼底から採取した。また、大腿筋は即座に液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。凍結した臓器は、ハンマーを用いて破砕した後に臓器１００ｍｇに対して氷冷した１ｍＬのバッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸、ｐＨ７．２）を添加した。次いで、これをＰＯＬＹＴＲＯＮ（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ  ＡＧ社製、スイス）で細断し、１／４量の１０％ＳＤＳを加えてから１分間氷上にて超音波処理後、４℃にて３０００ｒｐｍで遠心、その上清を回収して、抽出タンパク量が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにバッファーで希釈することで筋抽出液を調製した。全血６０μＬと筋抽出液２００μＬを用いて、ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ  ＨＡＥ−５８６  ＡＳＳＡＹキット（ＯＸＩＳ社製、米国）を用いて４−ＨＮＥ濃度を製造者によるマニュアル記載の方法で測定した。結果を図９に示す。血液及び大腿筋のいずれの場合においても水素水摂取群の４−ＨＮＥ量が有意に減少していた。この結果は、飲料とともに摂取した水素が血液内及び組織内の生体内酸化ストレスを抑制できることを示している。
【実施例１０】
【００１５】
異なった溶存水素濃度の水による酸化ストレス抑制効果の経時的測定
Ｃ２マウス（４週齢、雄、各群４から５匹）に溶存水素濃度の異なる水を実施例９に準じて自由摂取させ、１、２及び３週後に眼底から６０μＬの血液を採取して、実施例９に示した方法に準じて、４−ＨＮＥ量を測定した。与えた水の水素含有量は、高濃度（Ｈ：１．６〜１．２ｍＭ）、中濃度（Ｍ：０．７〜０．９ｍＭ）、低濃度（Ｌ：０．３〜０．５ｍＭ）、対照コントロール（Ｃ：０ｍＭ）である。一匹あたりの飲料は、それぞれの群間で差が認められなかった。結果を図１０に示す。高濃度及び中濃度の水素水を摂取させた群では２週目で４−ＨＮＥ量の減少が認められた。しかし、低濃度では減少が認められなかったことから、飽和濃度以上の水素水が酸化ストレスの抑制に効果的であることが示された。また、２週間程度の連続的飲用が酸化ストレスの抑制には効果的であることが示された。
【実施例１１】
【００１６】
水素ガス吸入による虚血・再灌流障害軽減効果の測定
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６種，５週齢、雄）に小動物全身麻酔器Ｓｏｆｔ  Ｌａｎｄｅｒ（株式会社ニュロサイエンス）を用いて混合麻酔ガス（酸素：０．３Ｌ／ｍｉｎ，笑気ガス：０．７Ｌ／ｍｉｎ，セボフレン（丸石製薬株式会社）：３％）を供給して全身麻酔を導入した。麻酔導入後、セボフレンを１．５％に減少させた混合麻酔ガス（酸素：０．３Ｌ／ｍｉｎ，笑気ガス：０．７Ｌ／ｍｉｎ，セボフレン：１．５％）を供給して麻酔を長時間維持し、以下に示す外科的手技（参考文献：Ｙａｄａｖ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６５，１４３３−１４３６（１９９８））を用いて肝臓の局所的虚血・再灌流傷害モデル動物を作製し、虚血・再灌流障害による虚血肝の組織変性と肝実質細胞の細胞死をヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）で評価した。
腹部中央を開腹して、肝臓左葉に通じる門脈、肝動脈、胆管の三管を一緒にミクロクランプ（ＦＤ５６２，Ａｅｓｃｕｌａｐ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で閉塞し（虚血開始）、腹を絹糸で縫合した。９０分後に縫合した絹糸を取り除いて再び開腹し、ミクロクランプを取り除いた（再灌流開始）。再び腹を絹糸で縫合し、麻酔下に肝臓左葉を３時間再灌流した。水素ガス供給群では、指定の期間に指定の水素ガス流量で上記の混合麻酔ガスと混合して供給したが、全混合ガスの流量を一定にするために水素ガス流量分だけ笑気ガスの流量を減じた。３時間の再灌流後、肝臓左葉（虚血肝）を摘出し、短冊状に細片して１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業株式会社）に浸漬して固定した。
固定された虚血肝片はエチルアルコールによる脱水、キシレンによる脱水剤除去、及びパラフィン浸透を自動包埋装置（ＳＡＫＵＲＡ，Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＶＩＰ５）で行った。パラフィンに包埋した虚血肝を滑走型ミクロトームで３μｍ〜５μｍの厚さに薄切し、切片をスライドガラスに貼布した。キシレン、続いてエチルアルコール処理してパラフィンを除き、流水水洗した。マイヤーヘマトキシリン溶液（和光純薬工業株式会社）でヘマトキシリン染色後、水洗し続いて１％エオシンＹ溶液（和光純薬工業株式会社）でエオシン染色した。エチルアルコールで完全に脱水した後、キシレンで透徹し、封入剤マリノール（武藤化学薬品株式会社）をつけたカバーガラスで封入して永久標本を作製した。
結果を図１１及び表３に示す。
【表３】
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図１１では、水素ガス未処理の肝組織は多くの細胞で細胞質の変性（エオシンで赤く染色されず、白くぬけている）が起き、更に核（ヘマトキシリンで紫に染色）も脱落している細胞も多い。水素ガス（０．２Ｌ／ｍｉｎ）を再灌流開始５分前から再灌流開始後５分までの１０分間吸入させたマウスの肝組織では核も細胞質も変性が少なく、組織が良好に保たれている。表４のデータは、切片全体のデジタル写真から画像処理ソフトＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを使って、肝組織変性領域（白くぬけた領域）の面積を計測し、切片全体の面積を１００％として変性領域が占める割合を示した。水素ガスを吸引させたことにより、いずれのケースでも肝組織の変性が軽減されていた。虚血・再灌流による障害はフリーラジカルによる効果であることが明らかにされているので、水素ガスの吸引によってフリーラジカルが消去されたことを示した。虚血・再灌流だけでなく、水素ガスを吸引することにより一般にフリーラジカルを消去することが類推できる。なお、水素４％の条件では水素に火がつくことはなく、安全に利用できる。
【実施例１２】
【００１７】
水素を摂取することによる運動後のフリーラジカルの消去効果の測定
急激な運動と急激な運動停止によってフリーラジカルが発生し、筋肉をはじめとする様々な組織に障害を与えることが知られている。水素水の摂取及び水素ガスの吸引によって運動後のフリーラジカルの消去効果を示した。ラット（Ｗｉｓｔｅｒ  Ｒａｔ８週齢雄）を４０ｍ毎分で２０分間走らせ、直後に１０％水素ガスを含む空気を３０分間吸引させた。あるいは、過飽和水素を含む生理的食塩水を腹腔注射し３０分間休ませた。３０分後に屠殺し、骨格筋をとりだし、Ｈ＆Ｅ染色によって、水素摂取により筋組織の損傷が軽減していることを確認した。更に、ミトコンドリアＤＮＡの欠失変異をＰＣＲ法によって検出し、水素摂取ラットでは、ミトコンドリアＤＮＡの欠失が減少していることが示された。以上の結果から、水素の摂取は急激な運動後の筋組織を維持することが示された。方法は、Ｓａｋａｉ，Ｙ．，Ｉｗａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｊ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｏｈｋｏｓｈｉ，Ｎ．，Ｎａｇａｔａ，Ｈ．Ａｃｕｔｅ  ｅｘｅｒｓｉｓｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  Ｎｅｒｖｅ  ２２：２５６−２６１，１９９９に従った。
【実施例１３】
【００１８】
水素水を飲用すること、水素ガスを吸引することにより水素分子が生体内に取り込まれたことの証明
水素が溶解した水を摂取あるいは、水素ガスを吸引することによって、実際に水素分子が生体内に取り込まれたかどうかを、ヒトの呼気の水素濃度を調べることにより調べた。呼気の水素濃度は個人差があるので、呼気水素濃度１０ｐｐｍ以下の４人を対象とした。水素水を摂取する前の呼気の水素濃度をＢｒｅａｔｈ  Ｇａｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（呼気中水素分析装置）ＴＧＡ−２０００（テラメックス株式会社、京都）により測定した後に、水素水を体重ｋｇあたり１０ｍＬ飲用摂取させた。その後、口腔内を水素不含水で漱いで完全に水素水を除去し、時間を追って呼気中の水素濃度を測定した。個人差があるが、水素水摂取後２０分以内に呼気水素濃度は３０ｐｐｍ以上上昇し、その後、減少した。一時間後にも水素水摂取以前に比べて高値が続いたことから、生体内に水素はとりこまれ、血液中に溶解し、肺から呼気として排出されたことを示した。以上のことより、水素水を摂取すると２０分程度で水素は生体内に取り込まれ、血液中に溶解することが示された。結果を図１２に示した。
なお、ここでは水素水を飲用することにより水素分子を生体内にとりこませたが、被検者に水素ガスを吸引させる場合は、被検者の口及び鼻を覆うガス吸引用マスク内に空気及び水素ガスを別々に或いは予め混合して供給して吸引させたり、あるいは、被検者を密閉容器内のベッドに横たわらせて密閉容器内に空気及び水素ガスを別々に或いは予め混合して供給して吸引させる方法等を採用し得る。この場合、水素ガス濃度が約４ｖｏｌ％以下であれば発火及び爆発の危険性はない。
【実施例１４】
【００１９】
シンプルな溶液状態において水素分子が生理物質を還元するか調べた。室温において水素分子で飽和した中性溶液ではＮＡＤ＋，ＦＡＤ，Ｆｅ３＋，Ｃｕ２＋及び三価のヘム鉄、酸化型シトクロームｃを還元しない（データ未掲載）。すなわち、水素分子は溶液において酸化還元反応を攪乱することなく安定である。またこの条件下で、水素分子は過酸化水素、一酸化窒素あるいはＯ２−・を還元しない（データ未掲載）。この結果は、水素分子はシグナル伝達において主要な機能を有するこうした活性酸素種を中和しないことを示す。これに対して、図１３に示すように、同一条件下で水素分子は触媒がなくとも・ＯＨを減少させる。図１３は、室温、中性下での溶存水素分子によるヒドロキシルラジカルの除去を示す。ヒドロキシルラジカルは蛍光分光光度計でモニターした。図１３ａは、各水素分子濃度におけるＨＰＦ蛍光強度の代表的な経時変化を示す。ベースライン１と２は、０．８ｍＭの水素濃度で過酸化水素不含（１）及び過塩素酸第一鉄不含（２）のＨＰＦ蛍光強度変化を示している。図１３ｂは、反応初期速度の平均値と標準偏差は独立した４回の実験の実験から求めた結果を示す。フェントン反応で発生させた・ＯＨは２−［６−（４’−ｈｙｄｒｏｘｙ）ｐｈｅｎｏｘｙ−３Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−３−ｏｎ−９−ｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＰＦ）の蛍光でモニターした。ＨＰＦは過酸化水素やＯ２−・を検出することなく、・ＯＨを特異的に検出できる。
【実施例１５】
【００２０】
水素分子が培養細胞における・ＯＨを中和できるか調べた。自発的な・ＯＨの発生は細胞毒性を示す量には至らず、また検出が困難なため、異なる二つの方法で・ＯＨを誘導した。なお、・ＯＨはＨＰＦをマーカー色素として共焦点レーザー顕微鏡で検出した。最初に、水素及び酸素でそれぞれ飽和した培地を用意し、水素及び酸素電極でモニターしながらそれぞれの濃度が適量となるように混合した。次いでＰＣ１２細胞の培地をこれに置き換え、さらに水素及び酸素が適量濃度になるように調製した気体で満たされた容器に細胞を入れた。ＰＣ１２細胞ではミトコンドリア呼吸鎖阻害剤であるアンチマイシンＡを添加することでＯ２−・を発生させ、フェントン反応を経て・ＯＨを増加させた。図１４及び図１５に示すように、これを水素分子で処理すると・ＯＨは減少した。図１４は、０．６ｍＭ水素存在下又は非存在下でアンチマイシンＡを添加し、３０分後にＨＰＦの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果である。矢印と矢尻はそれぞれ核においてＨＰＦの蛍光が陽性と陰性の細胞を示している。スケールバーは５０μｍである。図１５は、０．６ｍＭ水素存在下又は非存在下でアンチマイシンＡを添加した時のＨＰＦ蛍光強度を定量した結果を示す。それぞれ独立した実験で１００個の細胞についてＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて計測した。細胞は初期の水素濃度を保つために適量の気体濃度とした密閉容器で培養した。興味深いことに水素分子は核の・ＯＨを減少させた（図１４の右のパネルで矢尻で示す）。
さらに、０．６ｍＭ水素存在下又は非存在下でアンチマイシンＡを添加して、培養２４時間後に抗８−ＯＨ−Ｇ抗体及び抗ＨＮＥ抗体で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。図１６〜１９に結果を示す。図１６及び１８のスケールバーは１００μｍである。抗８−ＯＨ−Ｇ抗体（図１７）及び抗ＨＮＥ抗体（図１９）による免疫染色強度はＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて定量化した。図１４〜１９に結果を示す実験において、アンチマイシンＡ（＋）、水素（＋）及びビタミンＥ（＋）の各濃度は１０μｇ／ｍｌ、０．６ｍＭ及び０．１ｍＭであった。平均値と標準偏差は独立した４回の実験から求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図１６及び１７において酸化グアニン（８−ＯＨ−Ｇ）の減少に示されるように、水素分子は核ＤＮＡを酸化から保護した。また、図２２に示すように、水素分子が過酸化脂質の最終産物である４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）の蓄積を抑制したことは、脂質の過酸化も抑制していることを示している。
【実施例１６】
【００２１】
ラット大脳皮質初代培養細胞を用いて、より生理的な条件で酸化ストレスを誘導した。虚血状態から再還流への急激な移行は酸化ストレスによる障害を引き起こすことが知られている。そこで虚血を模倣して、細胞を窒素又は水素雰囲気下で６０分間、酸素グルコース欠乏状態に曝した。
ラット大脳皮質初代培養神経細胞は、１６日齢の胎児より調製した。大脳皮質は髄膜を除去し、裁断、プロテアーゼ混合液（ＳＵＭＩＬＯＮ）で消化した。ピペットを用いて機械的に解離した後、細胞を神経細胞培養培地（ＳＵＭＩＬＯＮ）に分散して、ポリ−Ｌ−リジンでコートしたプレートに１ｃｍ２あたり５ｘ１０４個となるように蒔いた。培地はＢ−２７（Ｇｉｂｃｏ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）で３日毎に交換し、１１日培養した細胞を実験に使用した。酸素グルコース欠乏状態とする１日前に培地はＢ−２７ｍｉｎｕｓ  ＡＯ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）に交換した。神経細胞の品質管理は神経細胞特異的抗ＴＵＪ−１抗体とアストロサイト特異的抗ＧＦＡＰ抗体で染色することで確認した。９０％以上の細胞が神経細胞であった。
酸素グルコース欠乏状態の開始には、９５％窒素／５％二酸化炭素又は９５％水素／５％二酸化炭素で通気したグルコースを含まないＤＭＥＭ培地で、細胞培地を交換した。これを９５％窒素／５％二酸化炭素又は９５％水素／５％二酸化炭素雰囲気下で３０℃、１時間放置した。酸素グルコース欠乏状態の終了は、交換前の培地と再交換することで行い、さらに９５％空気／５％二酸化炭素雰囲気下で３７℃にて培養を続けた。
酸素グルコース欠乏状態終了１０分後に・ＯＨ量をＨＰＦの蛍光で測定したところ、図２０及び２１に示すように、水素非存在下では・ＯＨの顕著な増加が認められたが、水素存在下では認められなかった。図２０は、再還流１０分後に細胞をＨＰＦで染色した（左は蛍光イメージ、右は蛍光イメージとノマルスキー微分干渉像との重ね合わせ）結果を示す。コントロールは酸素グルコース欠乏状態に曝す替わりに細胞をグルコースと酸素を含むＤＭＥＭ培地で処理した。スケールバーは１００μｍである。図２１は、ＨＰＦ蛍光強度を１００個の細胞についてＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて計測した結果を示す。平均値と標準偏差は独立した４回の実験から求めた。＊＊Ｐ＜０．０１。
さらに、酸素グルコース欠乏１日後に生存神経細胞を神経細胞特異的な抗ＴＵＪ−１抗体で染色することにより検出したところ、図２２に示すように、水素分子は生存神経細胞数を増加させた。また、図２３及び２４に示すように、そのバイアビリティーも増加させた。図２３は、酸素グルコース欠乏状態から１日後に生存神経細胞数を位相差顕微鏡下で一定視野についてカウントした結果を示す。図２４は細胞のバイアビリティーをＭＴＴ変法で測定した結果を示す。図２３及び図２４に示す平均値と標準偏差は独立した４回の実験から求めた。＃Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＜０．０５。これらの結果は、水素分子は酸化ストレスによる細胞死を抑制することを示す。
【実施例１７】
【００２２】
抗酸化物質としての水素分子を医療へ応用できるか調べるためにラットの虚血モデルを用いた検討を行った。
大脳虚血においては多様なメカニズムで活性酸素種が発生し、虚血再還流後に・ＯＨが検出される。ラットを軽度大脳動脈閉塞によって９０分間局所的に虚血し、次いで３０分間再還流した。特に指定のないかぎり、この間、水素を吸引させ続けた。ＦＫ５０６（１ｍｇ／ｋｇ体重）は再還流直前に１度、エダラボン（３ｍｇ／ｋｇ体重）は再還流直前と再還流直後に２度、血中投与した。麻酔後、ラットは通常空気下２０℃で維持した。水素分子は特に示さないかぎり全１２０分間吸引させた。ラットには笑気（麻酔のため）、酸素及び水素を６６〜７０％、３０％、０〜４％（体積／体積）の比率で混合したガスを吸引させた。軽度大脳動脈閉塞１日後に脳をスライスし、ミトコンドリアにおける呼吸過程で基質となりうる２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩（ＴＴＣ）で染色した。１週間後の動物については麻酔後、脳を速やかに取り出して１０％ホルマリンで固定した。パラフィンに包埋した脳は６−μｍの厚さにスライスし、ヘマトキシリン・エオジン染色した。また、抗体による染色にはＶＥＣＳＴＡＩＮ  ＡＢＣキットを用いた。抗ＩｂａＩ抗体は和光純薬から買い求めた。スライドの解析には、画像解析ソフト（Ｍａｃ  Ｓｃｏｐｅ  ｖｅｒ．２．５５、Ｍｉｔｓｕｙａ商事）を用いた。なお、全ての動物実験は日本医科大学動物委員会の指針に従った。
梗塞体積は脳の白く見える領域を測定することで推算した。結果を図２５及び２６に示す。図２５は、軽度大脳動脈閉塞１日後に脳を６枚に冠状切断し、ＴＴＣで染色した結果を示す。さらに、比較のため、二つの化合物をテストした。一つはエダラボンで日本では脳梗塞の処置に使用することが推奨されている。もう一つはＦＫ５０６でアメリカにおいて脳梗塞に対するクリニカル・トライアルが進行中である。水素分子はいずれの化合物よりも酸化障害の軽減に効果的であった。図２６は、脳の梗塞体積を示し、脳の梗塞体積は各スライスの梗塞面積ｘ厚さの合計として算出した。図２６中のＥとＦはエダラボン（６ｍｇ／ｋｇ体重）とＦＫ５０６（１ｍｇ／ｋｇ体重）を最適条件で投与した場合の梗塞体積を示す。梗塞体積の平均値と標準偏差は各グループ６匹の動物の値から求めた。水素ガス濃度０％と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。水素ガス濃度２％と比較して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃＜０．００１。
図２５及び２６に示すように、梗塞体積の水素濃度依存的減少が明らかに認められ、２％の水素濃度が最も効果的であった（図２６）。
図２７は、水素を虚血時のみ吸引させ、再還流時には吸引させない場合の結果を示す。ラットを軽度大脳動脈閉塞によって９０分間局所的に虚血し、次いで３０分間再還流した。２％水素ガスをＡ、Ｂ、Ｃで示す３種の異なった期間、吸引させた。図２７ａはその模式図を示す。図２７ｂは、上記３種の異なった期間、水素ガスを吸引させた場合の梗塞体積を示す。軽度大脳動脈閉塞１日後に脳を６枚に冠状切断、ＴＴＣで染色し、脳の梗塞体積は各スライスの梗塞面積ｘ厚さの合計として算出した。水素ガス濃度０％と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ａと比較して＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１。図２７に示すように、水素を虚血時のみ吸引させ、再還流時には吸引させない場合は、梗塞体積は減少しない。この結果は、水素分子が保護効果を示すには再還流時に水素分子が存在しなければならないことを示す。
また、図２８及び２９に示すように、軽度大脳動脈閉塞１週間後、水素処置群と未処置群での梗塞体積の違いはより顕著になった。図２８は、軽度大脳動脈閉塞１週間後、脳を冠状切断して得たスライスをヘマトキシリン・エオジン染色した結果を示し、図２８の写真はそのうち３枚の異なるスライスの染色像である。図２９は、梗塞体積をヘマトキシリン・エオジン染色で薄ピンク色に見える領域を梗塞領域として、上記と同様に算出した結果を示す。梗塞体積の平均値と標準偏差は各グループ６匹の動物の値から求めた。水素ガス濃度０％と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。水素ガス濃度２％と比較して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１。
図３０に示すように、水素処置ラットは体重及び体温でも未処置に比して改善が見られた。図３０ａ及び３０ｂは、それぞれ体温と体重の変化を２％水素ガス吸引（実線）、未吸引（破線）で示す。平均値と標準偏差は各グループ６匹の動物の値から求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。これらの結果が示すように、水素分子は初期の脳障害を改善したのみならず障害の進行も抑制した。
閉塞１週間後の脳を用いて、水素分子による保護効果により生じた分子レベルでの変化を核酸の酸化を表す抗８−ＯＨ−Ｇ抗体、脂質の過酸化を表す抗ＨＮＥ抗体、及び抗ＧＦＡＰ抗体で脳スライスを染色して調べた結果を図３１〜３３に示す。図３１は抗８−ＯＨ−Ｇ抗体を用いた場合を、図３２は抗ＨＮＥ抗体を用いた場合を、図３３はアストロサイト特異的抗ＧＦＡＰ抗体を用いた場合を示す。軽度大脳動脈閉塞３日及び７日後に脳を固定しパラフィンに包埋した。６μｍ厚の冠状切片を抗８−ＯＨ−Ｇ抗体、抗ＨＮＥ抗体及び抗ＧＦＡＰ抗体で染色した。図３１〜３３の左の写真は大脳側頭部の同一の閉塞周辺領域を示す。スケールバーは１００μｍである。図３１〜３３の右のグラフは一定視野下（０．２５ｍｍ２）の各抗体陽性細胞数の平均値と標準偏差を各グループ６匹の動物の値から求めた結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。水素処置ラットではいずれの酸化マーカーの染色についても有意に減少していた。
図３４は、脳の同一領域をミクログリア特異的抗Ｉｂａ−Ｉ抗体で染色した結果を示す。染色実験において、軽度大脳動脈閉塞３日及び７日後に脳を固定しパラフィンに包埋した。冠状切片をそれぞれの抗体で染色した。写真は大脳側頭部の閉塞中心領域を示す。図３４のスケールバーは２００μｍであり、図３４の挿入写真のスケールバーは１００μｍである。図３５は一定視野下のＩｂａ−Ｉ陽性細胞数の平均値と標準偏差は各グループ６匹の動物の値から求めた。＊Ｐ＜０．０５。図３４及び３５に示すように、脳の同一領域をミクログリア特異的抗Ｉｂａ−Ｉ抗体で染色したところ、抗Ｉｂａ−Ｉ抗体による染色は水素処置によって顕著に減少していた。ミクログリアの集積は脳障害の指標であり、こうした結果は水素分子が酸化ストレスと、さらには脳障害を顕著に抑制することを強く示唆している。
【実施例１８】
【００２３】
水素水の効果
ＳＯＤ遺伝子破壊マウスを用いたＳＯＤ−／ＳＯＤ−ホモマウスの出産上昇
ミトコンドリアに存在するＭｎＳＯＤ（マンガンスーパーオキシドジスムターゼ）は、ミトコンドリア内で発せられるスーパーオキシド（Ｏ２−・）を過酸化水素に変換する酵素で遺伝子は核に存在する。ＭｎＳＯＤが欠損するとＯ２−・が蓄積し、ＮＯと反応する頻度が高まり、有害なＯＮＯＯ−（ペロオキシナイトライト）が増加し、細胞毒性を生じる。あるいは、Ｏ２−・は遷移金属を還元し、Ｃｕ２＋，Ｆｅ２＋を増加させるために、フェントン反応を加速し、有害なヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）を生じさせる。そのため、ＭｎＳＯＤを欠損した動物は、死産により生まれる頻度が少なくなり、あるいは生まれても１週間内に死亡する。ＭｎＳＯＤ欠損遺伝子をヘテロにもつマウス（ＳＯＤ２（＋／−）））どうしを交配させると、ＭｎＳＯＤが正常なマウス（ＳＯＤ２（＋／＋）））、ＭｎＳＯＤをヘテロにもつマウス（ＳＯＤ２（＋／−））、ＭｎＳＯＤが完全に欠損したマウス（ＳＯＤ（−／−））が生じ、メンデルの法則に従えば、１：２：１の比率で生まれるはずである。実際には、ＭｎＳＯＤ欠損マウスは上記の有害な活性酸素、フリーラジカルによって死産となり生まれてくる頻度は少なくなる（図３７）。
ＭｎＳＯＤメスヘテロマウス１６匹を２群にわけ、一群には水素水を８日飲ませ、交配した。その後、出産まで水素水を飲ませ続けた。妊娠したのはそれぞれ５匹、６匹で４２匹と４５匹生まれた。その生まれた仔マウスの尾からＤＮＡを抽出し、常法にしたがって遺伝子型を決定した。
対照水をのませた場合の生まれた仔マウス４５匹でＭｎＳＯＤ（＋／＋）：ＭｎＳＯＤ（＋／−）：ＭｎＳＤＯ（−／−）は１４：２９：２であった。一方、水素水を飲ませた母親から生まれた仔は４２匹で、その比率は１４：２０：８で、ＭｎＳＤＯ（−／−）マウスは８倍も多く、統計的にも有意であった（図３８）。
以上の結果から、水素水はＯ２−・に起因する酸化ストレスを軽減することが示された。
【実施例１９】
【００２４】
水素水の飲用と腹腔内投与による発癌抑制効果
発癌性を予測するための検索法として、近年、種々の中期発がん性試験法が開発されている。げっ歯類を用いた二段階発癌モデルは、まずイニシエーション処置として既知の発癌物質を発がんしない程度の少量で投与し、その後、被験物質を投与しプロモーション作用の有無を検索する試験法で、発癌性を検出する際に、特にプロモーション作用に注目して被験物質の発癌性を評価するものである。
中期肝発癌性試験法（伊東法）は、プロモーション期の初期に部分肝切除術を施行し、再生増殖期に肝細胞の細胞分裂を促すことによって短期間に変異細胞巣を誘発する方法で、現在までに、最も多くのデータが集積されているとされる（Ｉｔｏ  Ｎ，Ｔａｍａｎｏ  Ｓ，Ｓｈｉｒａｉ  Ｔ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２００３  Ｊａｎ；９４（１）：３−８．Ｒｅｖｉｅｗ．）。ラット肝臓を標的とし、これまで３１３の化学物質について検索され、肝発癌性物質（プロモーターを含む）とされる化学物質では６０／６５（９２％）に陽性結果が報告されており、本試験法は肝を標的とする発癌物質を検索する上で、信頼性の高い有用な検索法とされている。さらに、本試験法で肝発癌物質を種々の投与用量で検索した結果では、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の発生の定量値について、長期の発癌性試験による肝細胞癌の発生頻度と相関した結果であること、また、用量相関性についても報告されている（Ｏｇｉｓｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３，２５７−２６５，１９８５）。
本実施例では、ヘテロサイクリックアミンの１種で、肝発癌性が報告されているＭｅＩＱｘと被験物質を中期肝発癌性試験法のプロモーション段階で同時投与する検出法を用いた。この検出法は被験物質の肝発癌に対する抑制作用を検索しようと開発されたもので、これまでに広瀬ら（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６，３０４９−３０５５，１９９５）はこのモデルを用いていくつかの肝発癌抑制物質を見いだしている。
本実施例において、被験物質として水素を含む生理食塩水（Ｈ２生理食塩水）および水素を含む水（Ｈ２水）を用いた。本実施例では上記のモデルを用い、被験物質である水素を含む生理食塩水を腹腔内投与し、さらに水素を含む水を飲水投与することによる肝発癌に対する抑制作用について検索した。
水素を含む生理食塩水および水素を含む水の併用投与による肝発癌に対する抑制効果の有無を調べる目的で、胎盤型Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ−Ｐ）陽性細胞巣を指標とした中期肝発癌性試験法を用いて定量的に検討した。
肝発がんに対するイニシエーション処置のため、６週齢のＦ３３４系雄ラットにＤｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ（ＤＥＮ）をイニシエーターとして２００ｍｇ／ｋｇの用量で１回腹腔内に投与し、その２週間後から、被験物質である水素を含む生理食塩水を１０ｍｌ／ｋｇの投与量で１日２回、または７回／週の頻度で６週間腹腔内投与し、さらに水素を含む水を飲水投与した。対照群には生理食塩水および水道水をそれぞれ腹腔内および飲水投与した。また、ＤＥＮ無処置の対照群および被験物質投与群も設けた。さらに、ＤＥＮ処置群、無処置群それぞれについて、肝発がん物質である２−ａｍｉｎｏ−３，８−ｄｅｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｆ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ（ＭｅＩＱｘ）をプロモーターとして飼料中濃度０．０２％で被験物質と６週間併用投与する群についても設けた。実験第３週経過時（被験物質投与開始１週後）に全動物について部分肝切除術の施行し、実験開始８週間経過後（被験物質投与期間終了後）に屠殺剖検した後、肝臓におけるＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の定量的解析を実施した。図３９に実験方法を示す。
投与期間中、被験物質投与に起因する一般状態の変化、死亡動物および体重変化を認めなかった。摂水量では、被験物質投与全群において投与期間の一時期に高値傾向を示したことから被験物質投与の影響と考えられた。
肝臓重量および肉眼的病理学検査では、被験物質投与の影響を認めず、血液生化学的検査においても被験物質投与による毒性を示唆する変動は認められなかった。今回用いた被験物質は、過酸化脂質の生成を抑制することが推察されたことから、血清過酸化脂質についても測定を実施したが、今回の実験では抑制は認められなかった。
図４０に肝臓のＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の数（図４０ａ））及び面積（図４０ｂ）の計測結果を示す。水素を含む生理食塩水（腹腔内投与）および水素を含む水（飲水投与）の組み合わせ投与はＤＥＮ処置群におけるＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の発生を軽度ながら抑制し、その抑制率は個数で２８．０％、面積で２５．２％であった。また、ＤＥＮに加えＭｅＩＱｘを投与した群においても水素を含む生理食塩水および水素を含む水はＧＳＴ−Ｐ陽性細胞巣の発生を軽度ながら抑制し、その抑制率は個数で２１．０％、面積で２０．９％であった。
以上のように、水素を含む生理食塩水及び水素を含む水は発癌の抑制に効果があった。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明によれば、上記の構成を備えることにより以下の実施例によって詳細に説明するように、生体内の有害な活性酸素及び／又はフリーラジカルを消去することができるため、この活性酸素及び／又はフリーラジカルの存在に起因する各種悪影響を抑制することができる。従って、人体の老化進行の抑制、健康増進と疾病の予防に貢献できるという優れた効果を奏する。後述の実施例の結果は水素分子には有力な抗酸化物質として多くの利点があることを示している。すなわち、水素分子は代謝過程での酸化還元反応や細胞シグナルにおける活性酸素種に影響を与えることの無い適度な強度で・ＯＨを効果的に中和する。既知の多くの抗酸化物質が標的とするオルガネラや組織に容易に到達することができないのに対して、水素分子には容易に生体膜を透過して細胞質に拡散することにより、効果的に分布することができる特質がある。炎症や虚血再還流によって生じる酸化ストレスは他の様々な状況からも生じてくる。これには過度の運動、心筋梗塞、出血による手術中断、臓器移植などが挙げられる。水素分子のように効果的でありながら他にダメージを与えない抗酸化物質は、その利便性から多くの医療分野での応用が可能である。すでに水素ガスの吸引は減圧による潜水病からダイバーを保護するために用いられ、その安全性が広く確認されている。また、本発明において治療に用いる水素濃度では引火や爆発の危険性が無い。さらに、吸引した水素ガスは液体に溶解し容易に血管を通して運ばれる。このように、最もよく知られた分子の一つである水素が、副作用が小さく安全で効果的な抗酸化物質として広く医療分野で応用される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図１】
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【図８】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２８】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月28日(2006.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
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【請求項３】
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【請求項４】
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【請求項５】
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【請求項６】
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【請求項７】
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【請求項８】
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【請求項９】
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【請求項１０】
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【請求項１１】
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【請求項１２】
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【請求項１３】
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【請求項１４】
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【請求項１５】
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【請求項１６】
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【請求項１７】
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【請求項１８】
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【請求項１９】
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【請求項２０】
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【請求項２２】
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【請求項２４】
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【請求項２５】
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【請求項２６】
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【請求項２７】
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【請求項２８】
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【請求項２９】
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【請求項３０】
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【請求項３１】
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【請求項３２】
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【請求項３３】
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【請求項３４】
生体内の有害な活性酸素種でありかつフリーラジカルであるヒドロキシルラジカルを除去する、少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項３５】
生体内の有害な活性酸素種であるペルオキシナイトライトを除去する、少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項３６】
少なくとも水素分子を含む液体が水溶液からなる、請求項３４又は３５に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項３７】
水素分子が過飽和状態で含まれる、請求項３６に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項３８】
更に酸素分子を含む、請求項３６又は３７に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項３９】
生体内の有害な活性酸素種でありかつフリーラジカルであるヒドロキシルラジカルを除去する、少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項４０】
生体内の有害な活性酸素種であるペルオキシナイトライトを除去する、少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項４１】
少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと酸素ガスの混合ガスからなる、請求項３９又は４０に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項４２】
少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと酸素ガスと不活性ガスの混合ガスからなる、請求項３９又は４０に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項４３】
少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと空気の混合ガスからなる、請求項３９又は４０に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項４４】
少なくとも水素分子を含む気体が水素ガスと麻酔ガスの混合ガスからなる、請求項３９又は４０に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項４５】
水素ガスを１〜４％（ｖ／ｖ）の濃度で含む請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項４６】
水素ガスを１．０〜４．５％（ｖ／ｖ）の濃度で含む請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤。
【請求項４７】
請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、医薬組成物。
【請求項４８】
請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防剤。
【請求項４９】
活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害が酸化ストレス、酸化ストレスによる細胞死及び酸化ストレスによるミトコンドリア機能障害からなる群から選択される請求項４８に記載の治療又は予防剤。
【請求項５０】
活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害が、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化、虚血再還流障害、人工透析時障害、臓器移植時障害、未熟児の網膜変性、急性肺症、炎症及び脂質代謝障害からなる群から選択される、請求項４８記載の治療又は予防剤。
【請求項５１】
活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害が、急激な運動後の筋障害又は運動後の高濃度の酸素ガスを吸引する際に生じる酸素障害である、請求項４８記載の治療又は予防剤。
【請求項５２】
活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ等の神経変性疾患からなる群から選択される、請求項４８記載の治療又は予防剤。
【請求項５３】
活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害が癌である、請求項４８記載の治療又は予防剤。
【請求項５４】
請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の軽減又は予防に適した飲料品。
【請求項５５】
請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、生体内の活性酸素種及び／又はフリーラジカルの除去又は低下のために用いられるものである旨の表示を付した飲料品。
【請求項５６】
請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の少なくとも水素分子を含む液体からなる活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を含む、活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の軽減又は予防のために用いられるものである旨の表示を付した飲料品。
【請求項５７】
飲料品が、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント又は特定健康食品である請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の飲料品。
【請求項５８】
請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器。
【請求項５９】
水素ガスボンベである請求項５８に記載の容器。
【請求項６０】
請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器、ガス吸引用手段並びに前記容器中の気体を吸引用手段に供給する供給配管を備えている、活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項６１】
さらに、酸素ガス、不活性ガス及び空気からなる群から選択される少なくとも１種のガスを含む容器を備え、少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤と酸素ガス、不活性ガス及び空気からなる群から選択される少なくとも１種のガスを別々に或いは混合した後にガス吸引用手段に供給する、請求項６０に記載の活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項６２】
さらに、麻酔ガスを含む容器を備え、少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤と麻酔ガスを別々に或いは混合した後にガス吸引用手段に供給する、請求項６６又は６７に記載の活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項６３】
少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器中に水素ガスが１〜４％含まれる請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項６４】
少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を含む容器がガスボンベである請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項６５】
ガス吸引用手段がガス吸引用マスクである請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【請求項６６】
ガス吸引用手段が密閉室であり、該密閉室中に少なくとも水素分子を含む気体からなる生体内の有害な活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を供給することにより、密閉室内の被験体に前記活性酸素腫及び／又はフリーラジカル除去剤を供給する、請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の活性酸素種及び／又はフリーラジカル除去剤を活性酸素種及び／又はフリーラジカルに起因する障害の治療又は予防を必要とする被験体に供給するための装置。
【国際調査報告】
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2007021034.tif 000048
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