【手続補正書】
【提出日】平成30年12月5日(2018.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することと、
（ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを、前記細胞に導入することであって、
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが少なくとも１００ｋｂであり、
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の重複配列が少なくとも１ｋｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的化効率性が少なくとも１．６％である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の核酸挿入物及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それが、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって改質される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の核酸挿入物及び／又は前記第２の核酸挿入物がゲノムＤＮＡを含み、
任意選択的に、前記第１の核酸挿入物及び／又は前記第２の核酸挿入物が、条件付き対立遺伝子、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、レポーター遺伝子、１つ以上の発現カセット、又は部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸を含み、
任意選択的に、前記ゲノムＤＮＡが、前記ゲノム標的遺伝子座における欠失のために標的化される配列に相同であるか、又はオルソロガスであり、
任意選択的に、前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の挿入が相同又はオルソロガスヒト核酸配列での非ヒト核酸配列の置き換えをもたらす、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（Ｉ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、若しくは両方が前記細胞の種とは異なる種由来であり、及び／又は
（ＩＩ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、若しくは両方がヒト核酸である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（Ｉ）前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、若しくは約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂであるか、
（ＩＩ）前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが少なくとも２００ｋｂであり、任意選択的に、前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約３００ｋｂであるか、又は
（ＩＩＩ）前記標的化された細胞が、前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが１００ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（Ｉ）前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と同一であり、及び／又は
（ＩＩ）前記第１の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂであり、及び／又は
（ＩＩＩ）前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂであり、任意選択的に、前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも２０ｋｂである、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方の前記標的ゲノム遺伝子座への組み込みが、
（Ｉ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
（ＩＩ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失であって、任意選択的に、前記欠失が約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである、欠失及び
（ＩＩＩ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（Ｉ）前記第１のＬＴＶＥＣ又は前記第２のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、及び／又は
（ＩＩ）前記第１のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、かつ前記第２のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、任意選択的に、前記第１のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂであり、かつ前記第２のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂである、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
インビトロで細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することと、
（ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣと、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第３の５’ホモロジーアーム及び第３の３’ホモロジーアームが隣接した第３の核酸挿入物を含む、第３のＬＴＶＥＣとを、前記細胞に導入することであって、
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが少なくとも１００ｋｂであり、
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の５’ホモロジーアームに相同の第２の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記第１の重複配列が少なくとも１ｋｂであり、前記第２の重複配列が少なくとも１ｋｂである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的化効率性が少なくとも０．４％である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の核挿入及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、前記第２の核挿入及び前記第２の３’ホモロジーアーム、並びに前記第３の核酸挿入物及び第３の５’ホモロジーアームが、前記隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって改質される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の核酸挿入物及び／又は前記第２の核酸挿入物及び／又は前記第３の核酸挿入物がゲノムＤＮＡを含み、
任意選択的に、前記第１の核酸挿入物及び／又は前記第２の核酸挿入物及び／又は前記第３の核酸挿入物が、条件付き対立遺伝子、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、レポーター遺伝子、１つ以上の発現カセット、又は部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸を含み、
任意選択的に、前記ゲノムＤＮＡが、前記ゲノム標的遺伝子座における欠失のために標的化される配列に相同であるか、又はオルソロガスであり、
任意選択的に、前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物及び前記第３の核酸挿入物の挿入が相同又はオルソロガスヒト核酸配列での非ヒト核酸配列の置き換えをもたらす、
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（Ｉ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上が前記細胞の種とは異なる種由来であり、及び／又は
（ＩＩ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上がヒト核酸である、
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（Ｉ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、又は約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂであるか、
（ＩＩ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが少なくとも２００ｋｂであり、任意選択的に、前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約４００ｋｂであるか、又は
（ＩＩＩ）前記標的化された細胞が、前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが１００ｋｂ〜約７００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（Ｉ）前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と同一であり、かつ／若しくは前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列が前記第３のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列と同一であり、及び／又は
（ＩＩ）前記第１の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂであり、かつ／若しくは前記第２の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂであり、及び／又は
（ＩＩＩ）前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂであり、かつ／若しくは、前記第２の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂであり、任意選択的に、前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも２０ｋｂであり、かつ／若しくは、前記第２の重複配列の前記サイズが少なくとも２０ｋｂである、
請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みが、
（Ｉ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
（ＩＩ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失であって、任意選択的に、前記欠失が約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである、欠失あるいは、
（ＩＩＩ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（Ｉ）前記第１のＬＴＶＥＣ、前記第２のＬＴＶＥＣ、又は前記第３のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、及び／又は
（ＩＩ）前記第１のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、前記第２のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、かつ前記第３のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、任意選択的に、前記第１のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂであり、前記第２のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂであり、かつ前記第３のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂである、
請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はメガヌクレアーゼである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とであり、任意選択的に、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が
（Ｉ）ヒト細胞；
（ＩＩ）非ヒト細胞；
（ＩＩＩ）哺乳類細胞であって、任意選択的に、前記哺乳類細胞がげっ歯類細胞であり、任意選択的に、前記げっ歯類がマウス若しくはラットである、哺乳類細胞；
（ＩＶ）多能性細胞であって、任意選択的に、前記多能性細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞若しくは人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、多能性細胞；
（Ｖ）造血幹細胞；
（ＶＩ）神経幹細胞；又は
（ＶＩＩ）線維芽細胞
である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞がマウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞であり、任意選択的に、宿主胚に前記マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞を導入することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
代理母において前記宿主胚を懐胎させることをさらに含み、前記代理母が前記修飾された標的ゲノム遺伝子座を含むＦ０世代非ヒト動物を生産する、請求項２４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
本発明はまた、Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法を提供し、（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、非ヒトＥＳ細胞は、上記の方法によって生産されたものである、導入することと、（ｂ）代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、修飾を含むＦ０世代非ヒト動物を生産する、懐胎させることと、を含む。任意に、非ヒト動物は、マウス又はラットである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することと、
（ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを、前記細胞に導入することであって、
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む、方法。
（項目２）
前記第１の核酸挿入物及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それが、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって改質される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方が前記細胞の種とは異なる種由来である、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方がヒト核酸である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、又は約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂである、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約１００ｋｂ〜約５００ｋｂである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約３００ｋｂである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記標的化された細胞が、前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記第１の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂである、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂ又は少なくとも２０ｋｂである、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方の前記標的ゲノム遺伝子座への組み込みが、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、及び
（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第１のＬＴＶＥＣ及び前記第２のＬＴＶＥＣの組み合わせた使用が、単一ＬＴＶＥＣの使用と比較して標的化効率性の増大をもたらす、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記標的化効率性の増大が少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記第１のＬＴＶＥＣ又は前記第２のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することと、
（ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣと、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第３の５’ホモロジーアーム及び第３の３’ホモロジーアームが隣接した第３の核酸挿入物を含む、第３のＬＴＶＥＣとを、前記細胞に導入することであって、
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の５’ホモロジーアームに相同の第２の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む、方法。
（項目１７）
前記第１の核挿入及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、前記第２の核挿入及び前記第２の３’ホモロジーアーム、並びに前記第３の核酸挿入物及び第３の５’ホモロジーアームが、前記隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって改質される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上が前記細胞の種とは異なる種由来である、項目１６又は１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上がヒト核酸である、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、又は約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂである、項目１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約１００ｋｂ〜約７００ｋｂである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約４００ｋｂである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記標的化された細胞が、前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが約５ｋｂ〜約７００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、項目１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％同一であり、かつ／又は前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列が前記第３のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％同一である、項目１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂであり、かつ／又は前記第２の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂである、項目１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも２０ｋｂであり、かつ／又は前記第２の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも２０ｋｂである、項目１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みが、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは、
（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす、項目１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記第１のＬＴＶＥＣ、前記第２のＬＴＶＥＣ、又は前記第３のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記標的ゲノム遺伝子座における前記内因性配列の前記欠失が約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである、項目１２又は２７に記載の方法。
（項目３０）
細胞中の標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法であって、第１の標的化ベクターと第２の標的化ベクターとを細胞に導入することを含み、前記第１の標的化ベクターが、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含み、前記第２の標的化ベクターが、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含み、
前記第１の３’ホモロジーアーム及び前記第２の５’ホモロジーアームが、重複ヌクレオチド配列を含み、
前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第２の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するセグメントに相同である、方法。
（項目３１）
相同組み換えが、ヌクレアーゼ剤の使用なしで前記標的ゲノム遺伝子座において強化される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記標的ゲノム遺伝子座において、又はその付近で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することを更に含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はメガヌクレアーゼである、項目１〜２９及び３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、項目１〜２９及び３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記方法が、前記標的ゲノム遺伝子座における前記第１の標的化ベクター、前記第２の標的化ベクター、又は両方の前記相同組み換えを強化する、項目３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記相同組み換えの前記強化が少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記第１の標的化ベクターの前記重複配列が、前記第２の標的化ベクターの前記重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記重複配列が約１ｋｂ〜約７０ｋｂである、項目３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記重複配列が少なくとも２０ｋｂである、項目３０〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記第１の標的化ベクターが、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である、項目３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記第２の標的化ベクターが、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第２の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である、項目３０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記第１のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が１０ｋｂ〜約２００ｋｂである、項目４１又は４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第２のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が１０ｋｂ〜約２００ｋｂである、項目４２又は４３に記載の方法。
（項目４５）
前記重複ヌクレオチド配列が、前記標的ゲノム遺伝子座への組み換え機構の誘引を促進する、項目３０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞がヒト細胞である、項目１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記細胞が非ヒト細胞である、項目１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞が多能性細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、又は線維芽細胞である、項目１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記多能性細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が哺乳類細胞である、項目４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記哺乳類細胞がげっ歯類細胞である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法であって、
（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、前記非ヒトＥＳ細胞が、項目１〜４５及び４７〜５２のいずれか一項に記載の方法によって生産されたものである、導入することと、
（Ｂ）代理母において前記非ヒト宿主胚を懐胎させることと、を含み、
前記代理母が、修飾を含む前記Ｆ０世代非ヒト動物を生産する、方法。
（項目５４）
前記非ヒト動物がマウス又はラットである、項目５３に記載の方法。