【手続補正書】
【提出日】平成19年11月27日(2007.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に結合する多量体を同定するための方法であって、
単量体ドメインのライブラリーを提供する工程；
第1の標的分子への親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする工程；
少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの単量体ドメインを同定する工程；
同定された単量体ドメインを連結して、多量体のライブラリーを形成する工程、ここで各多量体が少なくとも2つの単量体ドメインを含む；
第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする工程；ならびに
第1の標的分子に結合する多量体を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
選択された多量体の各単量体ドメインが同じ標的分子に結合する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
選択された多量体が少なくとも3つの単量体ドメインを含有する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
単量体ドメインのライブラリーのスクリーニングおよび単量体ドメインの同定を同時に行う、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
請求項1に記載の方法であって、単量体ドメインが、EGF様ドメイン、クリングルドメイン、I型フィブロネクチンドメイン、II型フィブロネクチンドメイン、III型フィブロネクチンドメイン、PANドメイン、Glaドメイン、SRCRドメイン、クニッツ/ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、カザル型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル（P型）ドメイン、C型フォンウィルブランド因子ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、CUBドメイン、I型サイログロブリン反復、LDL受容体クラスAドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、I型トロンボスポンジンドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、C型レクチンドメイン、MAMドメイン、A型フォンウィルブランド因子ドメイン、ソマトメジンBドメイン、WAP型4ジスルフィドコアドメイン、C型F5/8ドメイン、ヘモペキシンドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、ラミニン型EGF様ドメイン、およびC2ドメインからなる群より選択される、方法。
【請求項６】
少なくとも1つの単量体ドメインを変異させ、それによって変異した単量体ドメインを含有するライブラリーを提供する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
変異工程が方向付けられた進化を包含する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
請求項1に記載の方法であって、
第2の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする工程；
第2の標的分子に結合する、単量体ドメインを同定する工程；
第1の標的分子についての親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインを、第2の標的分子についての親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインと連結して、それによって多量体のライブラリーを形成する工程；
第1の標的分子および第2の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする工程；ならびに
第1の標的分子および第2の標的分子に結合する多量体を同定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項９】
請求項1に記載の方法であって、
単量体ドメインの第2のライブラリーを提供する工程；
少なくとも第2の標的分子に対する親和性について単量体ドメインの第2のライブラリーをスクリーニングする工程；
第2の標的分子に結合する第2の単量体ドメインを同定する工程；
第1の標的分子または第2の標的分子に結合する選択された単量体ドメインを連結し、それによって多量体のライブラリーを形成する工程；
第1の標的分子および第2の標的分子に結合する能力について、多量体のライブラリーをスクリーニングする工程；ならびに
第1の標的分子および第2の標的分子に結合する多量体を同定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１０】
請求項1に記載の方法であって、標的分子が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、酵素、酵素基質、細胞表面タンパク質、酵素阻害剤、レポーター分子、および受容体からなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
多量体のライブラリーがファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、または細胞表面ディスプレイとして発現される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
多量体のライブラリーがマイクロアレイ上に提示される、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
連結工程が、単量体ドメインを異なる長さおよび組成の種々のリンカーと連結させることを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
単量体ドメインが、ジスルフィド結合の形成により二次構造を形成する、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
多量体がLDL受容体クラスAドメインを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも1つの標的分子に結合する多量体を同定するための方法であって、
多量体のライブラリーを提供する工程であって、各多量体が少なくとも2つの単量体ドメインを含み、単量体ドメインが、EGF様ドメイン、クリングルドメイン、I型フィブロネクチンドメイン、II型フィブロネクチンドメイン、III型フィブロネクチンドメイン、PANドメイン、Glaドメイン、SRCRドメイン、クニッツ/ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、カザル型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル（P型）ドメイン、C型フォンウィルブランド因子ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、CUBドメイン、I型サイログロブリン反復、LDL受容体クラスAドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、I型トロンボスポンジンドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、C型レクチンドメイン、MAMドメイン、A型フォンウィルブランド因子ドメイン、ソマトメジンBドメイン、WAP型4ジスルフィドコアドメイン、C型F5/8ドメイン、ヘモペキシンドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、ラミニン型EGF様ドメイン、およびC2ドメインからなる群より選択される、工程；および
標的分子結合多量体についての多量体のライブラリーをスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
標的分子についての単一の単量体ドメインの結合活性よりも大きい、標的分子についての結合活性を有する標的分子結合多量体を同定する工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
1つまたはそれ以上の多量体が、第2の標的分子に特異的に結合する単量体ドメインを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
多量体のライブラリーであって、
各多量体が、リンカーによって連結された少なくとも2つの単量体ドメインを含み；かつ
単量体ドメインが、EGF様ドメイン、クリングルドメイン、I型フィブロネクチンドメイン、II型フィブロネクチンドメイン、III型フィブロネクチンドメイン、PANドメイン、Glaドメイン、SRCRドメイン、クニッツ/ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、カザル型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル（P型）ドメイン、C型フォンウィルブランド因子ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、CUBドメイン、I型サイログロブリン反復、LDL受容体クラスAドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、I型トロンボスポンジンドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、C型レクチンドメイン、MAMドメイン、A型フォンウィルブランド因子ドメイン、ソマトメジンBドメイン、WAP型4ジスルフィドコアドメイン、C型F5/8ドメイン、ヘモペキシンドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、ラミニン型EGF様ドメイン、およびC2ドメインからなる群より選択される、
ライブラリー。
【請求項２０】
多量体の各単量体ドメインが天然には存在しない単量体ドメインである、請求項19に記載のライブラリー。
【請求項２１】
単量体ドメインが、ジスルフィド結合の形成により二次構造を形成する、請求項19に記載のライブラリー。
【請求項２２】
多量体がLDL受容体クラスAドメインを含有する、請求項21に記載のライブラリー。
【請求項２３】
異種リンカーによって分離された少なくとも2つの単量体ドメインを含むポリペプチドであって、各単量体ドメインが標的分子に特異的に結合する、ポリペプチド。
【請求項２４】
各単量体ドメインが天然には存在しないタンパク質単量体ドメインである、請求項23に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
ポリペプチドが、第1の標的分子を結合する第1の単量体ドメインおよび第2の標的分子を結合する第2の単量体ドメインを含む、請求項23に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドが2つの単量体ドメインを含み、各単量体ドメインが第1の標的分子上の異なる部位について特異的な結合を有する、請求項23に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
単量体ドメインが少なくとも70％同一である、請求項23に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
ポリペプチドが少なくとも3つの単量体ドメインを含む、請求項23に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
請求項23に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドドメインが、EGF様ドメイン、クリングルドメイン、I型フィブロネクチンドメイン、II型フィブロネクチンドメイン、III型フィブロネクチンドメイン、PANドメイン、Glaドメイン、SRCRドメイン、クニッツ/ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、カザル型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル（P型）ドメイン、C型フォンウィルブランド因子ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、CUBドメイン、I型サイログロブリン反復、LDL受容体クラスAドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、I型トロンボスポンジンドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、C型レクチンドメイン、MAMドメイン、A型フォンウィルブランド因子ドメイン、ソマトメジンBドメイン、WAP型4ジスルフィドコアドメイン、C型F5/8ドメイン、ヘモペキシンドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、ラミニン型EGF様ドメイン、およびC2ドメインからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項３０】
請求項23に記載のポリペプチドであって、標的分子が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、酵素、細胞表面タンパク質、酵素阻害剤、レポーター分子、および受容体からなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項３１】
ドメインが、ジスルフィド結合の形成により二次構造を形成する、請求項23に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
多量体がLDL受容体クラスAドメインを含む、請求項23に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
標的分子に結合する多量体を同定するための方法であって、
免疫ドメインのライブラリーを提供する工程；
第1の標的分子に対する親和性について免疫ドメインのライブラリーをスクリーニングする工程；
少なくとも1つの標的分子に結合する1つまたはそれ以上（例えば、2つまたはそれ以上）の免疫ドメインを同定する工程；
同定した単量体ドメインを連結して多量体のライブラリーを形成する工程、ここで各多量体が、少なくとも3つの免疫ドメイン（例えば、4つまたはそれ以上、5つまたはそれ以上、6つまたはそれ以上など）を含む；
第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする工程；および
第1の標的分子に結合する多量体を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
標的分子に結合するヘテロ免疫多量体を同定するための方法であって、
免疫ドメインのライブラリーを提供する工程；
第1の標的分子に対する親和性について免疫ドメインのライブラリーをスクリーニングする工程；
単量体ドメインのライブラリーを提供する工程；
第1の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする工程；
少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの免疫ドメインを同定する工程；
少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの単量体ドメインを同定する工程；
同定した免疫ドメインと同定した単量体ドメインを連結して多量体のライブラリーを形成する工程、ここで各多量体が、少なくとも2つのドメインを含む；
第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする工程；および
第1の標的分子に結合する多量体を同定する工程、
を包含する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
他の出願の相互参照
本願は、以下の特許出願を参照することによって優先権の恩恵を主張し、かつ以下の特許出願は明白に本願に組み入れられる：2002年4月18日に出願された米国仮特許出願第60/374,107号（代理人整理番号18097A-034410US）、2001年4月26日に出願された米国仮特許出願第60/286,823号、2001年11月19日に出願された米国仮特許出願第60/337,209号、および2001年11月26日に出願された米国仮特許出願第60/333,359号。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
個々のタンパク質は1つまたはそれ以上の個別の単量体ドメインを有し得る。これらのタンパク質は、しばしばモザイクタンパク質と呼ばれる。例えば、LDL受容体ファミリーのメンバーは、4つの主要な構造的ドメインを含む：システインリッチAドメイン反復、上皮成長因子前駆体様反復、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。LDL受容体ファミリーは、1）細胞表面受容体であるメンバー；2）細胞外リガンドを認識するメンバー；および3）リソソームによる分解のためにそれらを内在化するメンバーを含む。Hussainら、The Mammalian Low-Density Lipoprotein Receptor Family、(1999) Annu. Rev. Nutr. 19:141-72を参照されたい。例えば、いくつかのメンバーには、超低密度リポタンパク質受容体（VLDL-R）、アポリポタンパク質E受容体2、LDLR関連タンパク質（LRP）、およびメガリンが含まれる。ファミリーのメンバーは以下の特徴を有する：1）細胞表面での発現；2）Aドメイン反復からなる細胞外リガンド結合；3）リガンド結合に対するカルシウムの要求性；4）受容体結合タンパク質およびアポリポタンパク質（apo）Eの認識；5）YWTD（配列番号：215）反復を含む上皮成長因子（EGF）前駆体相同性ドメイン；6）単一の膜貫通領域；ならびに7）種々のリガンドの受容体媒介エンドサイトーシス。Hussain、前記を参照されたい。さらに、これらのメンバーは、構造的に異なるいくつかのリガンドを結合する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
多量体に関連して使用される場合、「異種リンカー」という用語とは、自然状態では互いに同じ関連性が見いだされないリンカーおよび単量体を含む多量体を示す（例えば、それらは融合タンパク質を形成する）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
上記に記載のように、単量体ドメインは選択的にシステインリッチである。適切なシステインリッチ単量体ドメインは、例えば、LDL受容体クラスAドメイン（Aドメイン）またはEGF様ドメインを含む。単量体ドメインはまた、負に荷電した残基のクラスターを有し得る。選択的に、単量体ドメインは、反復配列（例えば、βプロペラドメインにおいて見い出されるようなYWTD（配列番号：215））を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
例示的なAドメイン配列および共通配列は、図2、3、および8に示される。図9は、引き続くシステイン間の間隔を有するAドメインにおける残基の位置および存在を示す。さらに、図10は、多数のAドメインを示し、保存性アミノ酸のリストを提供する。Aドメインを同定するために有用な1つの代表的な共通配列は以下である：
2005519579.tif 000001
ここで角括弧［］内の残基は、1つの位置で可能な残基を示す。「X（＃）」は残基の数を示す。これらの残基は、任意のアミノ酸残基であり得る。2つの数字を含む丸括弧（）は、その位置を占め得るアミノ酸の範囲をいう（例えば、「［DE］-X（1，5）―C」は、アミノ酸DEの後に1個、2個、3個、4個、または5個の残基が続き、その後にCが続くことを意味する）。この共通配列は、第3のシステインで開始するAドメインの部分のみを表す。第2の一致は以下である：
2005519579.tif 000002
第2の一致は、6つすべてのシステイン残基にわたるアミノ酸残基を示す。いくつかの態様において、Aドメイン改変体は、上記の配列のいずれかと実質的に同一な配列を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
本発明の実施における使用のために適切な別の例示的な単量体ドメインはC2ドメインである。C2単量体ドメインは、2つ、4つの鎖のβシートからなるコンパクトなβサンドイッチを含むポリペプチドである。ここで、このドメインの「トップ」のループおよびこのドメインの「ボトム」のループは、8つのβ鎖を連結している。C2単量体ドメインは2つのサブクラス、すなわち、トポロジーI（シナプトタグミン様トポロジー）、およびトポロジーII（サイトゾルホスホリパーゼA2様トポロジー）を、それぞれ有するC2単量体ドメインに分けられ得る。トポロジーIを有するC2単量体ドメインは、分子の「トップ」に3つのループ（それらのすべてがCa2＋結合ループである）を含むが、トポロジーIIを有するC2単量体ドメインは、分子の「トップ」に4つのループ（それらの内で3つのみがCa2＋結合ループである）を含む。C2単量体ドメインの構造は、RizoおよびSudhof、J.Biol.Chem.273; 15879-15882 (1998)ならびにCho、J.Biol.Chem.276; 32407-32410 (2001)によって概説されている。「ループ領域1」、「ループ領域2」、および「ループ領域3」という用語とは、分子の「トップ」に位置するCa2＋結合ループ領域をいう。この命名法（これは、分子の「トップ」に位置する3つのCa2＋結合ループをCa2＋結合ループでないループ（主として分子の「ボトム」に位置する）と区別するために使用される）は、広範に使用され、文献中で認知されている。RizoおよびSudhof、J.Biol.Chem. 273; 15879-15882 (1998) を参照されたい。ループ領域1、2、および3は標的結合領域を示し、従って、結合特異性および親和性を調節するために変化させ得る。C2ドメインの残りの部分は、所望の場合、変更することなしに維持され得る。いくつかの例示的なC2ドメインは以下の配列（配列番号：218）と実質的に同一である：
2005519579.tif 000003
残基1〜16、29〜48、54〜77、および86〜123はループ領域1、2、および3の外側に局在する位置を、残基17〜28、49〜53、および78〜85はループ領域1、2、および3を、それぞれ構成する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
一般的に、これらの方法において、各々のファージ粒子または細胞は、天然のファージまたは細胞のタンパク質配列に加えて、ディスプレイされたポリペプチドの単一の種をディスプレイする個々のライブラリーメンバーとして機能する。複数の核酸が、融合タンパク質の転写を生じる部位でファージDNAにクローニングされ、融合タンパク質の一部が複数の核酸によってコードされる。核酸分子を含むファージは、細胞中で複製および転写を受ける。融合タンパク質のリーダー配列は、ファージ粒子の先端への融合タンパク質の輸送を方向付ける。従って、この核酸によって部分的にコードされる融合タンパク質は、上記または下記に記載した方法による検出および選択のために、ファージ粒子上でディスプレイされる。例えば、ファージライブラリーは、所定の（所望の）リガンドとインキュベートされ得、その結果、リガンドに結合する融合タンパク質配列を提供するファージ粒子は、所定のリガンドに結合するポリペプチド配列を提供しないファージ粒子から、差次的に分配される。例えば、この分離は、所定のリガンドを固定化することによって提供され得る。次いで、固定化されたリガンドに結合するファージ粒子（すなわち、ライブラリーメンバー）は回収され、親和性富化およびファージ複製の引き続くラウンドのために、選択されたファージの亜集団を増幅するために複製される。親和性富化およびファージ複製の数回のラウンドの後で、このように選択されたファージライブラリーメンバーは単離され、ディスプレイされたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が決定され、それによって、所定のリガンドに結合するポリペプチドの配列を同定する。このような方法は、PCT特許公報第91/17271号、第91/18980号、第91/19818号、および第93/08278号にさらに記載されている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
ペプチドリンカーの使用が広範囲に及んでいる1つの例は、単鎖抗体（軽鎖（VL）および重鎖（VH）の可変領域が人工のリンカーを介して連結されている）の産生についてであり、この特定の分野において膨大な刊行物が存在する。広範に使用されるペプチドリンカーは、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：219）アミノ酸配列の3反復（（Gly4Ser）3）（配列番号：220）からなる15merである。他のリンカーは使用されてきており、ファージディスプレイ技術ならびに選択的感染性ファージ技術が適切なリンカー配列を多様化および選択するために使用されてきた（Tangら、(1996) J.Biol.Chem、271、15682-15686；Henneckeら、(1998)、Protein Eng. 11、405-410）。ペプチドリンカーは、ヘテロ二量体タンパク質およびホモ二量体タンパク質（例えば、T細胞受容体、λCroリプレッサー、P22ファージArcリプレッサー、IL-12、TSH、FSH、IL-5、およびインターフェロン-γ）中の個々の鎖を接続するために使用されてきた。ペプチドリンカーはまた、融合ポリペプチドを作製するために使用されてきた。種々のリンカーが使用されてきており、Arcリプレッサーファージディスプレイの場合には、単鎖タンパク質の安定性の増加のために、ファージディスプレイがリンカーの長さおよび組成を最適化するために使用されてきた（RobinsonおよびSauer (1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95、5929-5934）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
適切なリンカーを得るためのさらに別の方法は、単純なリンカー（例えば、（Gly4Ser）n）（配列番号：221）を、ランダム変異誘発を通して最適化することによる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
上記に言及したように、ペプチドリンカーは、少なくともある程度の柔軟性を有することが一般的に好ましい。従って、いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、1〜25のグリシン残基（配列番号：222）、5〜20のグリシン残基（配列番号：223）、5〜15のグリシン残基（配列番号：224）、または8〜12のグリシン残基（配列番号：225）を含む。ペプチドリンカーは、代表的には、少なくとも50％のグリシン残基（例えば、少なくとも75％のグリシン残基）を含む。本発明のいくつかの態様において、ペプチドリンカーは、グリシン残基のみを含む。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
ペプチドリンカーは、グリシン残基に加えて、他の残基、特に、Ser、Ala、およびThrからなる群より選択される残基、特にSerを含む。従って、特定のペプチドリンカーの1つの例には、アミノ酸配列Glyx-Xaa-Glyy-Xaa-Glyzを有するペプチドリンカーが含まれ、ここで各Xaaは、独立して、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、およびGluからなる群より選択され、かつx、y、zは、各々、1〜5の範囲の整数である（配列番号：226）。いくつかの態様において、各Xaaは、独立して、Ser、Ala、およびThrからなる群（配列番号：227）、特にSer（配列番号：228）より選択される。より詳細には、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Glyを有し、ここでXaaは、独立して、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、およびGluからなる群より選択される（配列番号：229）。いくつかの態様において、各Xaaは、独立して、Ser、Ala、およびThrからなる群（配列番号：230）、特にSer（配列番号：231）より選択される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
さらなる態様において、ペプチドリンカーは、グリシン残基およびシステイン残基（例えば、グリシン残基およびシステイン残基のみ）を含む。代表的には、ペプチドリンカーあたり1つのみのシステイン残基が含まれる。従って、システイン残基を含む特定のペプチドリンカーの1つの例には、アミノ酸配列Glyn-Cys-Glymを有するペプチドリンカーが含まれ、ここでnおよびmは、それぞれ、1〜12の整数（例えば、3〜9、4〜8、または4〜7の整数）である（配列番号：232）。より詳細には、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列GGGGG-C-GGGGG（配列番号：233）を有し得る。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
このアプローチ（すなわち、非ペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基の導入）はまた、より強固なプロリン含有リンカーのために使用され得る。従って、ペプチドリンカーは、プロリンおよびシステイン残基（例えば、プロリン残基およびシステイン残基のみ）を含み得る。システイン残基を含む特定のプロリン含有ペプチドリンカーの1つの例には、アミノ酸配列Pron-Cys-Promを有するペプチドリンカーが含まれ、ここでnおよびmは、それぞれ、1〜12の整数、好ましくは、3〜9（例えば、4〜8、または4〜7）の整数である（配列番号：234）。より詳細には、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列PPPPP-C-PPPPP（配列番号：235）を有し得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
インビボのN-グリコシル化部位を含むペプチドリンカーの特定の例は、アミノ酸配列Glyn-Asn-Xaa-Ser/Thr-Glym、好ましくはGlyn-Asn-Xaa-Thr-Glym（配列番号：236）を有するペプチドリンカーであり、ここでXaaはプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、かつnおよびmは、それぞれ、1〜8の範囲、好ましくは2〜5の範囲の整数である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
単一のリガンドが使用され得、または選択的に、種々のリガンドが単量体ドメイン、免疫ドメイン、および/または多量体を選択するために使用され得る。本発明の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインは、単一のリガンドまたは種々のリガンドを結合し得る。本発明の多量体は、単一のリガンドについての複数の個別の結合部位を有し得るか、または選択的に、種々のリガンドについての複数の結合部位を有し得る。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
単量体性C2ドメインをコードするDNA配列のライブラリーは、Stemmerら、Gene 164、49-53 (1995)に記載されるように、アセンブリーPCRによって作製される。このPCR反応において使用するオリゴヌクレオチドは：
2005519579.tif 000004
（配列番号：237〜249）である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
このPCR反応において使用するオリゴヌクレオチドは、
2005519579.tif 000005
（配列番号：250および251）である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
次いで、PCR断片を、AlwNIで消化し、消化産物を、1.5%アガロースゲルで分離し、C2ドメイン断片をゲルから精製する。続いて、PCR断片を、ストップ断片の存在下でDNAライゲーションによって多量体化する。ストップ断片を以下に列挙する（配列番号：252および253）：
ストップ1：
2005519579.tif 000006
ストップ2：
2005519579.tif 000007
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
多量体を、1％アガロースゲル上で分離し、ストップ1-C2-C2-ストップ2に対応するDNA断片をゲルから精製する。ストップ1-C2-C2-ストップ2断片は、プライマー5'aattcaacgctactaccat3'（配列番号：254）および5'agcttcattacccaaatcaac3'（配列番号：255）を使用してPCR増幅し、引き続いてBamHIとXhoIで消化する。選択的に、多量体をコードするポリヌクレオチドは、アフィニティースクリーニングのさらなるラウンドを行い得る（例えば、上記のFACS解析）。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
単量体性AドメインをコードするDNA配列のライブラリーは、Stemmerら、Gene 164、49-53 (1995)に記載されるように、アセンブリーPCRによって作製される。このPCR反応において使用するオリゴヌクレオチドは：
2005519579.tif 000008
（配列番号：256〜263）である。
ここで、R＝A/G、Y＝C/T、M＝A/C、K＝G/T、S＝C/G、W＝A/T、B＝C/G/T、D＝A/G/T、H＝A/C/T、V＝A/C/G、およびN＝A/C/G/Tである。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
このPCR反応において使用するオリゴヌクレオチドは：
2005519579.tif 000009
（配列番号：264および265）である。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２４】
PCR断片を、AlwNIおよびBglIで消化する。消化産物を3％アガロースゲル上で分離し、Aドメイン断片をゲルから精製する。PCR断片を、以下のストップ断片（配列番号：266および267）の存在下でDNAライゲーションによって多量体化する。
ストップ1：
2005519579.tif 000010
ストップ2：
2005519579.tif 000011
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
多量体を、1％アガロースゲル上で分離し、ストップ1-A-A-A-ストップ2に対応するDNA断片をゲルから精製する。ストップ1-A-A-A-ストップ2断片は、引き続いて、プライマー5'agcttcattacccaaatcaac3'（配列番号：268）および5'aattcaacgctactaccat3'（配列番号：269）を使用してPCR増幅し、引き続いて、XmalおよびSfiIで消化する。次いで、選択したポリヌクレオチドをファージ発現系にクローニングし、標的タンパク質についての親和性について試験する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】LDL受容体ファミリーのメンバーにおいて見い出される単量体ドメインの型、数、および順番を図示する。これらの単量体ドメインには、βプロペラドメイン、EGF様ドメイン、およびLDL受容体クラスAドメインが含まれる。示されたメンバーは、低密度リポタンパク質受容体（LDLR）、ApoE受容体2（ApoER2）、極低密度リポタンパク質受容体（VLDLR）、LDLR関連タンパク質2（LRP2）、およびLDLR関連タンパク質1（LRP1）が含まれる。
【図２】種々のLDL受容体クラスAドメイン（配列番号：1〜13）からの部分アミノ酸配列のアライメントを、保存性システインを例証するために図示する。コンセンサス=配列番号：14。
【図３】図3パネルAは、Aドメインの例を図解的に示す。パネルAは、約40アミノ酸長のAドメイン（配列番号：15）中の保存性アミノ酸を図示する。保存性システイン残基をCによって示し、負に荷電したアミノ酸を、マイナス（「-」）と記した円の記号で示す。「H」と記した円は、疎水性残基を示す。パネルBは、リンカーを介して連結した2つの折り畳まれたAドメインを図示する。パネルBはまた、2つのカルシウム結合部位（Ca2＋と記した黒い円）および、全部で6つのジスルフィド結合について、各々折り畳まれたAドメイン中の3つのジスルフィド結合を示す。
【図４】LDL受容体ファミリーによって認識されたリガンドのいくつか（阻害剤、プロテアーゼ、プロテアーゼ複合体、ビタミン担体複合体、リポタンパク質代謝に関与するタンパク質、非ヒトリガンド、抗生物質、ウイルス、およびその他）を示す。
【図５】リガンドに結合する単量体ドメインを同定すること、選択された単量体ドメインを単離すること、種々の組み合わせの選択された単量体ドメインを連結することによって選択された単量体ドメインの多量体を作製すること、およびその多量体をスクリーニングして、リガンドに結合する1つより多い単量体含む多量体を同定することについての一般的なスキームを図解的に示す。
【図６】別の選択ストラテジーの図解的な表示である（導かれた選択）。適切な結合特性を有する単量体ドメインは、単量体ドメインのライブラリーから同定される。次いで、同定された単量体ドメインは、単量体ドメインの別のライブリー由来の単量体ドメインに連結され、多量体のライブラリーを形成する。多量体ライブラリーは、標的に同時に結合する一対の単量体ドメインを同定するためにスクリーニングされる。次いで、このプロセスは、最適な結合プロセスが多量体中で得られるまで反復され得る。
【図７】単量体ドメインの多量体化プロセスを示す。標的-結合単量体のヒットは、ベクターから増幅される。次いで、標的-結合単量体ドメインおよび/または免疫ドメインのこの混合物は、切断され、リンカーの最適な組み合わせおよびストッパーオリゴヌクレオチドと混合される。次いで、生成した多量体は、標的-結合多量体の同定のための第2の選択工程のための適切なベクターにクローニングされる。
【図８】Aドメイン（配列番号：16）の各部位における共通のアミノ酸を示す。アミノ酸の位置の上のパーセンテージは、示されたシステイン間の間隔を有する天然に存在するAドメインのパーセンテージをいう。各アミノ酸の位置の下に太字で示した潜在的なアミノ酸残基は、その位置における共通の残基を示す。明るい色の円で示した、最終的な6つのアミノ酸は、リンカー配列を表す。リンカーの2位および3位のイタリックで示したアミノ酸残基の2つのカラムは、その位置には存在しないアミノ酸残基を表す。他の任意のアミノ酸（例えば、A、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、およびV）はこれらの位置に含まれ得る。
【図９】以下のシステイン間の間隔：CX6CX4CX6CX5CX8C（配列番号：17）を有するAドメインについて、天然に存在するAドメインにおけるアミノ酸残基の出現の頻度を示す。
【図１０】Aドメイン（配列番号：18〜214）のアライメントを示す。図の一番上および一番下で、小文字（a-q）は保存性残基を示す。これらの位置における優勢なアミノ酸およびネイティブなAドメイン中に観察された回数のパーセントは、図の一番下に示される。
【図１１】免疫ドメインからなる可能な多量体の高次構造を示す。図11Aは、ミニボディーの多量体を図示する。図11Bは、単鎖ドメイン抗体の多量体を図示する。図11Cは、scfvの免疫ドメイン多量体を図示する。図11Dは、Fab断片の多量体を図示する。
【図１２】部分的リンカーを介したドメインの連結を示す。
【図１３】例示的な多量体環形成を図示する。
【図１４】Fvsの重鎖および軽鎖の種々の多量体の高次構造を図示する。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005519579000001.app