【手続補正書】
【提出日】平成20年9月22日(2008.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体と；
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、及びアゾベンジル−Ｐｈｅから構成される群から選択される１種以上のアミノ酸を直交ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体に優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、又はＯ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体にｏ−メチルチロシンを優先的に負荷する配列番号９〜１２の配列を含むＯ−ＲＳもしくはその修飾変異体を含む翻訳系。
【請求項２】
翻訳系が細胞を含むか又は翻訳系が真正細菌細胞を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
Ｏ−ｔＲＮＡが修飾ロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡであるか又はＯ−ｔＲＮＡが修飾チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
Ｏ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体、Ｏ−ＲＳ、又はＯ−ｔＲＮＡとその修飾変異体の両者が大腸菌から誘導されるか又はＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
Ｏ−ＲＳが配列番号３のアミノ酸配列をもつ野生型大腸菌ｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるか；
Ｏ−ＲＳが配列番号４のアミノ酸配列をもつ野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるか；
Ｏ−ＲＳが配列番号３のアミノ酸配列をもつ野生型大腸菌ｔＲＮＡシンテターゼから誘導され、Ｏ−ＲＳが、（ａ）アミノ酸４０位にＡｌａ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、又はＴｒｐ、（ｂ）アミノ酸４１位にＡｌａ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ、（ｃ）アミノ酸４９９位にＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、又はＴｒｐ、（ｄ）アミノ酸５２７位にＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、又はＴｈｒ、及び（ｅ）アミノ酸５３７位にＧｌｙを含むアミノ酸配列をもつか；
Ｏ−ＲＳが配列番号４のアミノ酸配列をもつ野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡシンテターゼから誘導され、Ｏ−ＲＳが、（ａ）アミノ酸３２位にＧｌｙ、（ｂ）アミノ酸６５位にＧｌｕ、（ｃ）アミノ酸１０８位にＡｌａ、（ｄ）アミノ酸１０９位にＧｌｕ、（ｅ）アミノ酸１５８位にＧｌｙ、及び（ｆ）アミノ酸１６２位にＨｉｓを含むアミノ酸配列をもつか；
Ｏ−ＲＳが配列番号５〜１７、及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むか；
系がＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含み、Ｏ−ＲＳが配列番号５〜１７、及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含み、且つ／又はポリヌクレオチドが配列番号２０〜３２のヌクレオチド配列から選択されるか；又は
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号１〜２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
第１のＯ−ＲＳと少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含み、前記セレクターコドンが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識され、更に第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを含み、第２のＯ−ＲＳが第１のアミノ酸と異なる第２のアミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
Ｏ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体がアンバーコドンの認識配列を含み、且つ／又は翻訳系がアンバーコドンを含むターゲット核酸を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項８】
ターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含み、蛋白質が光調節型アミノ酸を含み、且つ／又は蛋白質がアゾベンジル−Ｐｈｅもしくはｏ−ニトロベンジルシステインを含む請求項７に記載の翻訳系。
【請求項９】
請求項１に記載の翻訳系により生産された蛋白質であって、蛋白質が非天然アミノ酸を含み、且つ／又は非天然アミノ酸がα−アミノカプリル酸、Ｏ−メチルチロシン、ｏ−ニトロベンジルシステイン、もしくはアゾベンジル−Ｐｈｅである蛋白質。
【請求項１０】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳがα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、もしくはアゾベンジル−ＰｈｅでＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するか、又は前記Ｏ−ＲＳが配列番号９〜１２の配列を含み、Ｏ−ｔＲＮＡをｏ−メチルチロシンで優先的にアミノアシル化する組成物。
【請求項１１】
Ｏ−ｔＲＮＡがロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡであるか；Ｏ−ｔＲＮＡがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡであるか；又はＯ−ｔＲＮＡがアンバーセレクターコドンを認識する請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｏ−ＲＳが配列番号５〜１７のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むか；
Ｏ−ＲＳが配列番号５〜８及び１３〜１７のいずれか１種の効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するか；
Ｏ−ＲＳが大腸菌から誘導されるか；
Ｏ−ＲＳがＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉから誘導されるか；
前記組成物が細胞を含み、前記細胞が該細胞で１種以上の核酸によりコードされるＯ−ＲＳを有し、前記核酸が配列番号２０〜３２又はその保存変異体から選択されるか；又は
前記組成物が酵母細胞を含み、前記酵母細胞が該酵母細胞で１種以上の核酸によりコードされるＯ−ＲＳを有し、前記核酸が配列番号２０〜３２又はその保存変異体から選択される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
翻訳系を含む請求項１０に記載の組成物であって、
前記組成物が細胞を含み、Ｏ−ＲＳが前記細胞で１種以上の核酸によりコードされ、前記細胞が更に、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、α−アミノカプリル酸、Ｏ−メチルチロシン、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅの１種以上を含み、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳがα−アミノカプリル酸、Ｏ−メチルチロシン、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅの１種でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し；且つ／又は
細胞が該当ポリペプチドをコードするターゲット核酸を含み、ターゲット核酸がＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む組成物。
【請求項１４】
配列番号５〜１７のいずれか１種、又はその保存変異体をコードする核酸、且つ／又は配列番号２０〜３２から選択される核酸。
【請求項１５】
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、もしくはアゾベンジル−Ｐｈｅの１種以上を含む蛋白質、又は前記蛋白質を含む組成物。
【請求項１６】
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅを直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）に負荷する活性直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の選択方法であって、
Ｏ−ｔＲＮＡを含む細胞集団のメンバーに対して直交性のＯ−ｔＲＮＡと；
集団の１個以上の細胞においてα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−ＰｈｅをＯ−ｔＲＮＡに負荷する１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーを含む複数のＯ−ＲＳと；
選択マーカーをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドと；
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅを併有する細胞の集団に選択を実施し、複数のＲＳを含まず且つＯ−ｔＲＮＡを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により、活性Ｏ−ＲＳを含むターゲット細胞を集団から同定する段階と；
ターゲット細胞を選択することにより、活性Ｏ−ＲＳを選択する段階を含む前記方法。
【請求項１７】
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅ以外のアミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する非ターゲットＯ−ＲＳを含む細胞を排除するように細胞を更に選択する請求項１６に記載の方法であって、選択がポジティブ選択を含み、選択マーカーがポジティブ選択マーカーを含み；Ｏ−ｔＲＮＡがロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡ又はチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡである方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項１９】
１種以上のα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸を１個以上の特定位置に組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と；
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸を提供する段階を含み；
前記細胞が更に、
セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み；
更に、セレクターコドンに応答してα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸を特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項２０】
Ｏ−ＲＳが配列番号５〜１７に対応するアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞で機能する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の同定に有用なポリヌクレオチドメンバーのライブラリーであって、前記ポリヌクレオチドメンバーが、
（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列（その場合、前記ポリヌクレオチドメンバーは配列番号４のＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含む）；又は
（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列以外の古細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸配列（その場合、前記ポリヌクレオチドメンバーは対応するアミノ酸が配列番号４のＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２に空間的に対応するコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含む）から選択されるアミノ酸配列の変異体をコードする前記ライブラリー。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターを含むか；前記Ｏ−ＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するか；前記Ｏ−ＲＳが（ｉ）配列番号４の３２、６５、１０８、１０９、１５８及び１６２位、又は（ｉｉ）配列番号４のＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２に空間的に対応する位置以外の位置に１個以上の保存アミノ酸置換を含むか；又は前記宿主細胞が大腸菌細胞である請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項２３】
請求項２１に記載の複数のライブラリーポリヌクレオチドメンバーを含む複数の細胞、又は前記古細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼであるか若しくは前記Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼである請求項２１に記載の複数のライブラリーポリヌクレオチドメンバーを含む複数の細胞。
【請求項２４】
ａ）（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の変異体をコードし、配列番号４のＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含むポリヌクレオチドメンバーのライブラリーと；
（ｉｉ）宿主細胞を提供する段階と；
ｂ）前記宿主細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドメンバーを前記ライブラリーから検出することにより、所望Ｏ−ＲＳを同定する段階を含む所望直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の同定方法。
【請求項２５】
前記検出段階がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ蛋白質を発現させ、クロラムフェニコールの存在下で細胞生存を検出することにより実施されるポジティブ選択を含むか、又は前記検出段階がバルナーゼ蛋白質を発現させることにより実施されるネガティブ選択を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞で機能する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の同定に有用なポリヌクレオチドメンバーのライブラリーであって、前記ポリヌクレオチドメンバーが、
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列（その場合、前記ポリヌクレオチドメンバーは配列番号３のＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含む）；又は
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列以外の真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸配列（その場合、前記ポリヌクレオチドメンバーは対応するアミノ酸が配列番号３のＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７に空間的に対応するコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含む）から選択されるアミノ酸配列の変異体をコードする前記ライブラリー。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターを含むか；前記Ｏ−ＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するか；前記Ｏ−ＲＳが（ｉ）配列番号３の４０、４１、４９９、５２７、及び５３７位、又は（ｉｉ）配列番号３のＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７に空間的に対応する位置以外の位置に１個以上の保存アミノ酸を含むか；前記宿主細胞がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であるか；前記真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼであるか；又は前記大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼである請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項２８】
請求項２６に記載の複数のライブラリーポリヌクレオチドメンバーを含む複数の細胞。
【請求項２９】
ａ）（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の変異体をコードし、配列番号３のＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含むポリヌクレオチドメンバーのライブラリーと；
（ｉｉ）宿主細胞を提供する段階と；
ｂ）前記宿主細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドメンバーを前記ライブラリーから検出することにより、所望Ｏ−ＲＳを同定する段階を含む所望直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の同定方法。
【請求項３０】
前記検出段階がｇａｌ４蛋白質を発現させ、ウラシルの不在下又はヒスチジンの不在下で且つアミノトリアゾールの存在下に細胞生存を検出することにより実施されるポジティブ選択を含み；又は前記検出段階がフルオロオロチン酸の存在下でｕｒａ３蛋白質を発現させることにより実施されるネガティブ選択を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ａ）アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインに特異的なＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの対を介してアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを蛋白質に組込む段階と；
ｂ）アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを光調節する光エネルギーの波長に蛋白質を暴露することにより、アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを含む蛋白質の活性を調節する段階を含む蛋白質の活性の調節方法。
【請求項３２】
ａ）アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを組込んだ蛋白質と；
ｂ）蛋白質のアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを光調節することにより、蛋白質の活性を調節する光源を含む蛋白質の活性の調節システム。