【手続補正書】
【提出日】平成19年8月22日(2007.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有する単離ポリペプチドであって、
以下の（ａ）、又は（ｂ）のアミノ酸配列；
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列のフラグメントであって、配列番号５のアミノ酸配列のＮ−末端とＣ−末端が欠損してアミノ酸９３〜２０１となり、かつ前記活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（ｂ）少なくとも１のアミノ酸の欠失、又は置換を有する前記（ａ）のバリアントであって、前記活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号５のアミノ酸配列のＮ−末端とＣ−末端が欠損してアミノ酸９３〜２０１となる、配列番号５のアミノ酸配列のフラグメントを含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸１０１〜１９６を含む請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸９３〜２０１を含む請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記少なくとも１のアミノ酸の置換が保存的置換であり、かつ前記少なくとも１のアミノ酸の欠損、又は置換が、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＰｌＧＦとの間で保存されたアミノ酸以外のアミノ酸に限定される、前記（ｂ）のバリアントである請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有する単離ポリペプチドであって、
以下の（ａ）〜（ｃ）からなるグループから選択されるアミノ酸配列； 
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列、
（ｂ）少なくとも１のアミノ酸の欠失、又は置換を有する前記（ａ）のバリアントであって、前記活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、
（ｃ）アフィニティータグが取り付けられた前記（ａ）、又は（ｂ）のアミノ酸配列、からなる単離ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸１０１〜１９６を含む請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
少なくとも配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸６４〜１７２を含む請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＶＥＧＦＲ−２に結合する請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＶＥＧＦＲ−２を活性化する請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＶＥＧＦＲ−３に結合する請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＶＥＧＦＲ−３を活性化する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
内皮細胞増殖を刺激する請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
血管透過性を刺激する請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
血管新生を刺激する請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
内皮細胞の遊走を刺激する請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸９３〜２０１からなる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
アフィニティータグを含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記タグが、ＦＬＡＧタグである請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
シグナルペプチドのアミノ酸配列を含む請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項２２】
ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
ゲノムＤＮＡ配列を含む請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列からなるコード配列を有する単離核酸分子。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子が、少なくとも１のプロモーターと作動するように結合する位置において、前記核酸分子をベクターに挿入する工程、を含むベクターを作る方法。
【請求項２６】
請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
前記核酸分子の発現を促進するため、前記核酸分子に作動可能に関連するプロモーターを含む請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２６、又は２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターでトランスフォーム、又はトランスフェクトされた昆虫宿主細胞であって、前記核酸分子が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなるグループから選択されるアミノ酸配列；
（ａ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のフラグメントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（ｃ）少なくとも１のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を有する前記（ａ）、又は（ｂ）のバリアントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を含む昆虫宿主細胞。
【請求項３０】
ポリペプチドを作る方法であって、前記方法が以下の（ａ）、及び（ｂ）の工程；
（ａ）請求項２６、又は２７に記載のベクターを含む宿主細胞を、前記核酸によってコードされるポリペプチドが発現するような条件下で培養する工程、
（ｂ）前記宿主細胞、又は前記宿主細胞を培養した増殖培地から前記ポリペプチドを単離する工程、を含む方法。
【請求項３１】
前記単離工程が、（ｉ）前記細胞からの前記ポリペプチドの遊離を促進するため前記細胞をヘパリンに曝する工程と、（ii）遊離したポリペプチドを精製する工程を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項３０、又は３１に記載の方法により単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
ポリペプチドを作る方法であって、前記方法が以下の（ａ）、及び（ｂ）の工程；
（ａ）前記ポリペプチドが発現するような条件下で、前記ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程、ここで、コードされる前記アミノ酸配列が、以下の（ｉ）〜（iii）のグループから選択されるアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列、
（ii）前記（ｉ）のフラグメントのアミノ酸配列、
（iii）少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する前記（ｉ）、又は（ii）のバリアントであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含み、
ここで、前記細胞が前記核酸分子によってコードされるポリペプチドを分泌し、
分泌されたポリペプチドがＶＥＧＦＲ−２に結合するか、又は血管透過性を刺激するものである、
（ｂ）前記宿主細胞が培養される増殖培地から分泌された前記ポリペプチドを単離する工程、を有するポリペプチドを作る方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞が哺乳動物のものであり、かつベクターが哺乳動物発現ベクターである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＶＥＧＦＲ−３に結合する、請求項３３、又は３４に記載の方法によって作られる単離ポリペプチド。
【請求項３６】
ポリペプチドを作る方法であって、前記方法が以下の（ａ）、及び（ｂ）の工程；
（ａ）核酸分子によってコードされる前記ポリペプチドが発現するような条件下で、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸分子でトランスフォーム、又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、ここで、発現される前記ポリペプチドが、以下の（ｉ）〜（iii）のグループから選択されるアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列、
（ii）前記（ｉ）のフラグメントであって、前記フラグメントは内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（iii）少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する前記（ｉ）又は（ii）のバリアントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含むものであり、
（ｂ）前記宿主細胞、又は前記宿主細胞が培養される増殖培地から前記ポリペプチドを単離する工程、ここで、前記単離工程が、以下の（ｉ）、及び（ii）の工程；
（ｉ）前記宿主細胞からの前記ポリペプチドの遊離を促進するため前記宿主細胞をヘパリンに曝す工程、
（ii）遊離した前記ポリペプチドを精製する工程、を含む方法。
【請求項３７】
コードされるアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸１０１〜１９６を含む請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
コードされるアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸９３〜２０１を含む請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜２０、３２、及び３５のいずれか一項に記載のポリペプチドである第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドを含む単離タンパク質ダイマー。
【請求項４０】
ホモダイマーであって、前記第二のポリペプチドと前記第一のポリペプチドが同じである請求項３９に記載のタンパク質ダイマー。
【請求項４１】
ヘテロダイマーであって、前記第二のポリペプチドが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰｌＧＦ、及びＰＤＧＦからなるグループから選択される請求項３９に記載のタンパク質ダイマー。
【請求項４２】
第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドを含む単離タンパク質ダイマーであって、ここで、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドが、それぞれ請求項１〜２０、３２、及び３５のいずれか一項に記載のポリペプチドであるタンパク質ダイマー。
【請求項４３】
第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドを含む単離タンパク質ダイマーであって、ここで、少なくとも１の前記ポリペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）のグループから選択されるアミノ酸配列；
（ａ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列
（ｂ）前記（ａ）のフラグメントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（ｃ）少なくとも１のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する前記（ａ）、又は（ｂ）のバリアントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含む単離タンパク質ダイマー。
【請求項４４】
前記第一のポリペプチド、及び第二のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号３、又は配列番号５、若しくは前記活性を有する配列番号３又は配列番号５のフラグメントのアミノ酸配列を含む請求項４３に記載のタンパク質ダイマー。
【請求項４５】
ホモダイマーである請求項４３、又は請求項４４に記載のタンパク質ダイマー。
【請求項４６】
ジスルフィド結合されている請求項３９〜４５のいずれか一項に記載のタンパク質ダイマー。
【請求項４７】
請求項２〜４、及び１７のいずれか一項に記載のポリペプチドに対して特異的な免疫反応性を有する抗体。
【請求項４８】
ヒト化抗体である請求項４７に記載の抗体。
【請求項４９】
検出可能なラベルで標識されている請求項４７、又は４８に記載の抗体。
【請求項５０】
前記抗体と前記ポリペプチドとの結合が、前記ポリペプチドのＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５１】
前記抗体と前記ポリペプチドとの結合が、前記ポリペプチドのＶＥＧＦＲ−３との結合を阻害する請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５２】
アンチセンスヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記アンチセンスヌクレオチド配列が、請求項１７に記載のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ｃＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的であり、かつ前記ポリペプチドの少なくとも１の活性を阻害する、ベクター。
【請求項５３】
内皮細胞の増殖を生体外において刺激する方法であって、内皮細胞を増殖するのに有効な量の請求項１〜２０、３２、及び３５のいずれか一項に記載のポリペプチドに接触させる工程、を含む方法。
【請求項５４】
前記内皮細胞が、血管内皮細胞、又はリンパ内皮細胞である請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１〜２０、３２、及び３５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び薬用的に許容されるキャリア、又はアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項５６】
ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、及びヘパリンからなるグループから選択される少なくとも１の物質を含む請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の抗体、及び薬用的に許容されるキャリア、又はアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項５８】
生物試料中における請求項１〜２０、３２、及び３５のいずれか一項に記載のポリペプチドを検出する方法であって、
前記試料を、前記ポリペプチドに結合する能力のある抗体に接触させる工程と、
前記抗体の結合の発生を検出する工程、とを含む方法。
【請求項５９】
生体外におけるＶＥＧＦＲ−２の活性化方法であって、前記ＶＥＧＦＲ−２を有する細胞を、前記ＶＥＧＦＲ−２を活性化するのに有効な用量の請求項１〜２０、３２、及び３５のいずれか一項に記載のポリペプチドに接触させる工程を含む方法。
【請求項６０】
生体外におけるＶＥＧＦＲ−３の活性化方法であって、前記ＶＥＧＦＲ−３を有する細胞を、前記ＶＥＧＦＲ−３を活性化するのに有効な用量の請求項１〜２０、３２、及び３５のいずれか一項に記載のポリペプチドに接触させる工程を含む方法。
【請求項６１】
請求項１〜２０、３２、及び３５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む内皮細胞増殖刺激用の医薬組成物。
【請求項６２】
請求項１〜２０、３２、及び３５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む血管新生刺激用の医薬組成物。
【請求項６３】
請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子を含むか、又は請求項２６若しくは２７に記載のベクターを含む内皮細胞増殖刺激用の医薬組成物。
【請求項６４】
請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子を含むか、又は請求項２６若しくは２７に記載のベクターを含む血管新生刺激用の医薬品組成物。
【請求項６５】
請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の抗体を含む内皮細胞増殖阻害用の医薬組成物。
【請求項６６】
請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の抗体を含む血管新生刺激用の医薬組成物。
【請求項６７】
リンパ内皮細胞の増殖、又は分化刺激用の医薬組成物であって、ＶＥＧＦ−Ｄ核酸分子、又はＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを含み、前記ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドは、以下（ａ）〜（ｃ）のグループから選択されるアミノ酸配列；
（ａ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のフラグメントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（ｃ）少なくとも１のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する前記（ａ）、又は（ｂ）のバリアントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含み、そして、
前記ＶＥＧＦ−Ｄ核酸分子が、前記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）をコードするヌクレオチド配列を含む、医薬組成物。
【請求項６８】
請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の抗体と、前記抗体の結合を検出するための手段を含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
本発明の核酸およびポリペプチドは、合成的手段または組換え手段によって調製することができ、または、天然のソースから精製することができる、ということが明らかに理解されるであろう。
具体的には、本発明は以下の〔１〕〜〔６８〕に係る発明に関する。
〔１〕内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有する単離ポリペプチドであって、
以下の（ａ）、又は（ｂ）のアミノ酸配列；
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列のフラグメントであって、配列番号５のアミノ酸配列のＮ−末端とＣ−末端が欠損してアミノ酸９３〜２０１となり、かつ前記活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（ｂ）少なくとも１のアミノ酸の欠失、又は置換を有する前記（ａ）のバリアントであって、前記活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含む単離ポリペプチド。
〔２〕配列番号５のアミノ酸配列のＮ−末端とＣ−末端が欠損してアミノ酸９３〜２０１となる、配列番号５のアミノ酸配列のフラグメントを含む上記〔１〕のポリペプチド。
〔３〕少なくとも配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸１０１〜１９６を含む上記〔２〕のポリペプチド。
〔４〕配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸９３〜２０１を含む上記〔３〕のポリペプチド。
〔５〕前記少なくとも１のアミノ酸の置換が保存的置換であり、かつ前記少なくとも１のアミノ酸の欠損、又は置換が、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＰｌＧＦとの間で保存されたアミノ酸以外のアミノ酸に限定される、前記（ｂ）のバリアントである上記〔１〕のポリペプチド。
〔６〕内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有する単離ポリペプチドであって、
以下の（ａ）〜（ｃ）からなるグループから選択されるアミノ酸配列； 
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列、
（ｂ）少なくとも１のアミノ酸の欠失、又は置換を有する前記（ａ）のバリアントであって、前記活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、
（ｃ）アフィニティータグが取り付けられた前記（ａ）、又は（ｂ）のアミノ酸配列、からなる単離ポリペプチド。
〔７〕配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸１０１〜１９６を含む上記〔６〕のポリペプチド。
〔８〕少なくとも配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸６４〜１７２を含む上記〔６〕のポリペプチド。
〔９〕ＶＥＧＦＲ−２に結合する上記〔１〕〜〔８〕のいずれかのポリペプチド。
〔１０〕ＶＥＧＦＲ−２を活性化する上記〔９〕のポリペプチド。
〔１１〕ＶＥＧＦＲ−３に結合する上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかのポリペプチド。
〔１２〕ＶＥＧＦＲ−３を活性化する上記〔１１〕のポリペプチド。
〔１３〕内皮細胞増殖を刺激する上記〔１〕〜〔１２〕のポリペプチド。
〔１４〕血管透過性を刺激する上記〔１〕〜〔１３〕のポリペプチド。
〔１５〕血管新生を刺激する上記〔１〕〜〔１４〕のポリペプチド。
〔１６〕内皮細胞の遊走を刺激する上記〔１〕〜〔１５〕のポリペプチド。
〔１７〕配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸９３〜２０１からなる上記〔１〕のポリペプチド。
〔１８〕アフィニティータグを含む上記〔１〕〜〔１７〕のいずれかのポリペプチド。
〔１９〕前記タグが、ＦＬＡＧタグである上記〔１８〕のポリペプチド。
〔２０〕シグナルペプチドのアミノ酸配列を含む上記〔１〕〜〔１９〕のポリペプチド。
〔２１〕上記〔１〕〜〔２０〕のいずれかの単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
〔２２〕ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む上記〔２１〕の核酸分子。
〔２３〕ゲノムＤＮＡ配列を含む上記〔２１〕の核酸分子。
〔２４〕上記〔１〕〜〔２０〕のいずれかのポリペプチドをコードする配列からなるコード配列を有する単離核酸分子。
〔２５〕上記〔２１〕〜〔２４〕のいずれかの核酸分子が、少なくとも１のプロモーターと作動するように結合する位置において、前記核酸分子をベクターに挿入する工程、を含むベクターを作る方法。
〔２６〕上記〔２１〕〜〔２４〕のいずれかの核酸分子を含むベクター。
〔２７〕前記核酸分子の発現を促進するため、前記核酸分子に作動可能に関連するプロモーターを含む上記〔２６〕のベクター。
〔２８〕上記〔２６〕、又は〔２７〕のベクターを含む宿主細胞。
〔２９〕核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターでトランスフォーム、又はトランスフェクトされた昆虫宿主細胞であって、前記核酸分子が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなるグループから選択されるアミノ酸配列；
（ａ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のフラグメントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（ｃ）少なくとも１のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を有する前記（ａ）、又は（ｂ）のバリアントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を含む昆虫宿主細胞。
〔３０〕ポリペプチドを作る方法であって、前記方法が以下の（ａ）、及び（ｂ）の工程；
（ａ）上記〔２６〕、又は〔２７〕のベクターを含む宿主細胞を、前記核酸によってコードされるポリペプチドが発現するような条件下で培養する工程、
（ｂ）前記宿主細胞、又は前記宿主細胞を培養した増殖培地から前記ポリペプチドを単離する工程、を含む方法。
〔３１〕前記単離工程が、（ｉ）前記細胞からの前記ポリペプチドの遊離を促進するため前記細胞をヘパリンに曝する工程と、（ii）遊離したポリペプチドを精製する工程を有する、上記〔３０〕の方法。
〔３２〕上記〔３０〕、又は〔３１〕の方法により単離されたポリペプチド。
〔３３〕ポリペプチドを作る方法であって、前記方法が以下の（ａ）、及び（ｂ）の工程；
（ａ）前記ポリペプチドが発現するような条件下で、前記ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程、ここで、コードされる前記アミノ酸配列が、以下の（ｉ）〜（iii）のグループから選択されるアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列、
（ii）前記（ｉ）のフラグメントのアミノ酸配列、
（iii）少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する前記（ｉ）、又は（ii）のバリアントであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含み、
ここで、前記細胞が前記核酸分子によってコードされるポリペプチドを分泌し、
分泌されたポリペプチドがＶＥＧＦＲ−２に結合するか、又は血管透過性を刺激するものである、
（ｂ）前記宿主細胞が培養される増殖培地から分泌された前記ポリペプチドを単離する工程、を有するポリペプチドを作る方法。
〔３４〕前記宿主細胞が哺乳動物のものであり、かつベクターが哺乳動物発現ベクターである上記〔３３〕の方法。
〔３５〕ＶＥＧＦＲ−３に結合する、上記〔３３〕、又は〔３４〕の方法によって作られる単離ポリペプチド。
〔３６〕ポリペプチドを作る方法であって、前記方法が以下の（ａ）、及び（ｂ）の工程；
（ａ）核酸分子によってコードされる前記ポリペプチドが発現するような条件下で、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸分子でトランスフォーム、又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、ここで、発現される前記ポリペプチドが、以下の（ｉ）〜（iii）のグループから選択されるアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列、
（ii）前記（ｉ）のフラグメントであって、前記フラグメントは内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（iii）少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する前記（ｉ）又は（ii）のバリアントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含むものであり、
（ｂ）前記宿主細胞、又は前記宿主細胞が培養される増殖培地から前記ポリペプチドを単離する工程、ここで、前記単離工程が、以下の（ｉ）、及び（ii）の工程；
（ｉ）前記宿主細胞からの前記ポリペプチドの遊離を促進するため前記宿主細胞をヘパリンに曝す工程、
（ii）遊離した前記ポリペプチドを精製する工程、を含む方法。
〔３７〕コードされるアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸１０１〜１９６を含む上記〔３３〕〜〔３６〕のいずれかの方法。
〔３８〕コードされるアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸配列のアミノ酸９３〜２０１を含む上記〔３３〕〜〔３６〕のいずれかの方法。
〔３９〕上記〔１〕〜〔２０〕、〔３２〕、及び〔３５〕のいずれかのポリペプチドである第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドを含む単離タンパク質ダイマー。
〔４０〕ホモダイマーであって、前記第二のポリペプチドと前記第一のポリペプチドが同じである上記〔３９〕のタンパク質ダイマー。
〔４１〕ヘテロダイマーであって、前記第二のポリペプチドが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰｌＧＦ、及びＰＤＧＦからなるグループから選択される上記〔３９〕のタンパク質ダイマー。
〔４２〕第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドを含む単離タンパク質ダイマーであって、ここで、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドが、それぞれ上記〔１〕〜〔２０〕、〔３２〕、及び〔３５〕のいずれかのポリペプチドであるタンパク質ダイマー。
〔４３〕第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドを含む単離タンパク質ダイマーであって、ここで、少なくとも１の前記ポリペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）のグループから選択されるアミノ酸配列；
（ａ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列
（ｂ）前記（ａ）のフラグメントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（ｃ）少なくとも１のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する前記（ａ）、又は（ｂ）のバリアントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含む単離タンパク質ダイマー。
〔４４〕前記第一のポリペプチド、及び第二のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号３、又は配列番号５、若しくは前記活性を有する配列番号３又は配列番号５のフラグメントのアミノ酸配列を含む上記〔４３〕のタンパク質ダイマー。
〔４５〕ホモダイマーである上記〔４３〕、又は〔４４〕のタンパク質ダイマー。
〔４６〕ジスルフィド結合されている上記〔３９〕〜〔４５〕のいずれかのタンパク質ダイマー。
〔４７〕上記〔２〕〜〔４〕、及び〔１７〕のいずれかのポリペプチドに対して特異的な免疫反応性を有する抗体。
〔４８〕ヒト化抗体である上記〔４７〕の抗体。
〔４９〕検出可能なラベルで標識されている上記〔４７〕、又は〔４８〕の抗体。
〔５０〕前記抗体と前記ポリペプチドとの結合が、前記ポリペプチドのＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する上記〔４７〕〜〔４９〕のいずれかの抗体。
〔５１〕前記抗体と前記ポリペプチドとの結合が、前記ポリペプチドのＶＥＧＦＲ−３との結合を阻害する上記〔４７〕〜〔５０〕のいずれかの抗体。
〔５２〕アンチセンスヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記アンチセンスヌクレオチド配列が、上記〔１７〕のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ｃＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的であり、かつ前記ポリペプチドの少なくとも１の活性を阻害する、ベクター。
〔５３〕内皮細胞の増殖を生体外において刺激する方法であって、内皮細胞を増殖するのに有効な量の上記〔１〕〜〔２０〕、〔３２〕、及び〔３５〕のいずれかのポリペプチドに接触させる工程、を含む方法。
〔５４〕前記内皮細胞が、血管内皮細胞、又はリンパ内皮細胞である上記〔５３〕の方法。
〔５５〕上記〔１〕〜〔２０〕、〔３２〕、及び〔３５〕のいずれかのポリペプチド、及び薬用的に許容されるキャリア、又はアジュバントを含む医薬組成物。
〔５６〕ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、及びヘパリンからなるグループから選択される少なくとも１の物質を含む上記〔５５〕の医薬組成物。
〔５７〕上記〔４７〕〜〔５１〕の抗体、及び薬用的に許容されるキャリア、又はアジュバントを含む医薬組成物。
〔５８〕生物試料中における上記〔１〕〜〔２０〕、〔３２〕、及び〔３５〕のいずれかのポリペプチドを検出する方法であって、
前記試料を、前記ポリペプチドに結合する能力のある抗体に接触させる工程と、
前記抗体の結合の発生を検出する工程、とを含む方法。
〔５９〕生体外におけるＶＥＧＦＲ−２の活性化方法であって、前記ＶＥＧＦＲ−２を有する細胞を、前記ＶＥＧＦＲ−２を活性化するのに有効な用量の上記〔１〕〜〔２０〕、〔３２〕、及び〔３５〕のいずれかのポリペプチドに接触させる工程を含む方法。
〔６０〕生体外におけるＶＥＧＦＲ−３の活性化方法であって、前記ＶＥＧＦＲ−３を有する細胞を、前記ＶＥＧＦＲ−３を活性化するのに有効な用量の上記〔１〕〜〔２０〕、〔３２〕、及び〔３５〕のいずれかのポリペプチドに接触させる工程を含む方法。
〔６１〕上記〔１〕〜〔２０〕、〔３２〕、及び〔３５〕のいずれかのポリペプチドを含む内皮細胞増殖刺激用の医薬組成物。
〔６２〕上記〔１〕〜〔２０〕、〔３２〕、及び〔３５〕のいずれかのポリペプチドを含む血管新生刺激用の医薬組成物。
〔６３〕上記〔２１〕〜〔２４〕、〔２６〕、及び〔２７〕のいずれかの核酸分子、又はベクターを含む内皮細胞増殖刺激用の医薬組成物。
〔６４〕上記〔２１〕〜〔２４〕、〔２６〕、及び〔２７〕のいずれかの核酸分子、又はベクターを含む血管新生刺激用の医薬品組成物。
〔６５〕上記〔４７〕〜〔５１〕の抗体を含む内皮細胞増殖阻害用の医薬組成物。
〔６６〕上記〔４７〕〜〔５１〕の抗体を含む血管新生刺激用の医薬組成物。
〔６７〕リンパ内皮細胞の増殖、又は分化刺激用の医薬組成物であって、ＶＥＧＦ−Ｄ核酸分子、又はＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを含み、前記ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドは、以下（ａ）〜（ｃ）のグループから選択されるアミノ酸配列；
（ａ）配列番号３、及び配列番号５のアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のフラグメントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有するフラグメントのアミノ酸配列、
（ｃ）少なくとも１のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する前記（ａ）、又は（ｂ）のバリアントであって、内皮細胞増殖の刺激、血管透過性の刺激、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインへの結合、及びＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへの結合からなるグループから選択される少なくとも１の活性を有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ中で４２℃での洗浄）下で、配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるバリアントのアミノ酸配列、を含み、そして、
前記ＶＥＧＦ−Ｄ核酸分子が、前記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）をコードするヌクレオチド配列を含む、医薬組成物。
〔６８〕上記〔４７〕〜〔５１〕の抗体と、前記抗体の結合を検出するための手段を含むキット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
例９ 内部ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの生理活性
ＶＥＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列は、他のすべてのＶＥＧＦファミリーのメンバーの配列に類似した中央部分を含んでいる（図１０におけるアラインメントに示すように、ヒトＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸配列のおよそ残基１０１から１９６）。したがってＶＥＧＦ−Ｄの生理活性の部分は、この保存領域に存在するであろうと考えられていた。この仮説についてテストするために、ＶＥＧＦ−Ｄの生合成について研究し、そしてヒトＶＥＧＦ−Ｄの前記保存領域を哺乳動物細胞において発現させ、精製し、そして以下に記載するバイオアッセイにおいてテストした。