【手続補正書】
【提出日】令和1年11月7日(2019.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量すること、
総Ｈ３レベルを定量すること、および
個々の細胞集団の免疫表現型を解析することを含むフローサイトメトリー法。
【請求項２】
前記個々の細胞集団が、被検体から得られる細胞の集団を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法。
【請求項４】
前記細胞の集団が、前記被検体から得られる末梢血からまたは末梢血単核細胞の集団から単離される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞の集団が、リンパ系細胞を含む、から本質的になる、またはからなるか、
前記細胞の集団が、骨髄系細胞を含む、から本質的になる、またはからなるか、
前記細胞の集団が、骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞、赤芽球、巨核球、骨髄芽球、血小板、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、前単球、単球、マクロファージ、骨髄系樹状細胞、ＭＤＣ１ｃ細胞、ＭＤＣ２細胞、肥満細胞、リンパ系幹細胞もしくは前駆細胞、胸腺細胞、Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ／Ｔ）細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、形質細胞、ナチュラルキラーＢ（ＮＫ／Ｂ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞様樹状細胞、またはその任意の組み合わせを含む、から本質的になる、またはからなるか、
前記細胞の集団が、細胞表面抗原または細胞表面抗原の組み合わせの発現によって特徴付けられるか、
前記細胞表面抗原が、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＣＤ２７１、ＣＤ３４７、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、もしくはＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせであるか、
前記細胞表面抗原または前記その組み合わせが、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせであるか、
前記細胞の集団が、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１＋、および／もしくはＣＤ３４７＋である骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ７１＋である赤芽球；ＣＤ６１＋である巨核球；ＣＤ６１＋である血小板；ＨＬＡ−ＤＲ＋およびＣＤ１４−である顆粒球；ＣＤ１２３＋である好塩基球；ＣＤ４４＋である好酸球；ＣＤ１５＋および／もしくはＣＤ１６＋である好中球；ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１６−、および／もしくはＨＬＡ−ＤＲ＋である単球；ＣＤ１ｃ＋であるＭＤＣ１ｃ細胞；ＣＤ１４１＋であるＭＤＣ２細胞；ＣＤ１１７＋である肥満細胞；ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１７＋であるリンパ系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ２＋および／もしくはＣＤ３＋であるＴリンパ球（Ｔ細胞）；ＣＤ８＋である細胞障害性Ｔ細胞；ＣＤ４＋であるＴヘルパー細胞；ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋である調節性Ｔ細胞；ＣＤ３＋およびＣＤ５６＋であるＮＫ／Ｔ細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＴ細胞；ＣＤ２５＋およびＣＤ３０＋である活性化Ｔ細胞；ＣＤ１９＋および／もしくはＣＤ２０＋であるＢ細胞；ＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋、および／もしくはＣＤ３０＋である活性化Ｂ細胞；ＣＤ１３８＋である形質細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＢ細胞；ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＨＬＡ−ＤＲ＋、およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ＣＤ３０４＋である形質細胞様樹状細胞；またはその任意の組み合わせを含む、本質的にからなる、またはからなるか、
前記細胞の集団が、Ｂ細胞を含む、から本質的になる、またはからなるか、
前記細胞の集団が、Ｔ細胞を含む、から本質的になる、またはからなるか、
前記細胞の集団が、単球を含む、から本質的になる、またはからなるか、
前記単球が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６−；ＣＤ１４ｌｏｗおよびＣＤ１６＋；もしくはＣＤ１４ｈｉｇｈおよびＣＤ１６ｌｏｗ単球またはその任意の組み合わせであるか、
前記細胞の集団が、顆粒球を含む、から本質的になる、またはからなるか、
任意に、前記顆粒球が、好中球、好酸球、もしくは肥満細胞またはその任意の組み合わせである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒストン３のリシン２７のトリメチル化の定量が、前記細胞の集団におけるヒストン３におけるトリメチル化リシン２７のレベルを測定すること、前記細胞の集団におけるヒストン３の総レベルを測定すること、および前記細胞の集団における総ヒストン３レベルに対するヒストン３におけるトリメチル化リシン２７レベルの比率を計算することを含む請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記被検体から血液サンプルまたは血球のサンプルを得ることをさらに含む請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞の集団を単離することをさらに含む請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記単離が、フローサイトメトリーによって行なわれる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記フローサイトメトリーが、１つ以上の細胞表面抗原の発現に基づく請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記被検体が、
（ａ）治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することが予定されていたもしくは予定されている、または
（ｂ）コントロールもしくは参照値と比較してＨ３Ｋ２７ｍｅ３量の増加が同定される請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化の定量が、被検体が、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与される前におよびその後に実行される請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
被検体由来のサンプルにおけるヒストンのエピジェネティックな修飾を定量するための方法であって、
（ａ）透過処理サンプルを得るために透過処理組成物と前記サンプルにおける少なくとも１つの細胞を接触させること、
（ｂ）Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３内のエピトープに特異的に結合する第１の蛍光複合抗体と前記透過処理サンプルを接触させること、
（ｃ）Ｈ３内のエピトープに特異的に結合する第２の蛍光複合抗体と前記透過処理サンプルを接触させること、
（ｄ）前記第１の蛍光複合抗体からの第１の蛍光シグナルを検出すること、
（ｅ）前記第２の蛍光複合抗体からの第２の蛍光シグナルを検出することおよび
（ｄ）前記第１の蛍光シグナルの値を前記第２の蛍光シグナルの値によって割ること、それによって、前記サンプルにおける前記ヒストンの前記エピジェネティックな修飾を定量することを含む、エピジェネティック修飾されたＨ３の量を決定することを含む方法。
【請求項１５】
前記第１の蛍光複合抗体または前記第２の蛍光複合抗体のいずれかと前記透過処理サンプルを接触させる前に、細胞のサイズによって前記サンプルにおける少なくとも１つの細胞をソートすることをさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルにおける少なくとも１つの細胞の免疫表現型を解析することをさらに含み、
細胞型特有のマーカー上の第３のエピトープに特異的に結合する第３の蛍光複合抗体と前記サンプルを接触させること、および
前記第３の蛍光複合抗体からの第３の蛍光シグナルを検出することを含む請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
その必要がある被検体由来のサンプルにおけるヒストンのエピジェネティックな修飾のステータスをモニターするための方法であって、
（ａ）事象の前に、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って、ヒストンのエピジェネティックな修飾の第１の量を決定すること、
（ｂ）前記事象後に、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って、前記ヒストンの前記エピジェネティックな修飾の第２の量を決定することおよび
（ｃ）前記第１の量を前記第２の量と比較することを含み、
増加は、前記事象後のエピジェネティックな修飾の増加を示し、減少は、前記事象後のエピジェネティックな修飾の低下を示す方法。
【請求項１８】
前記事象が、前記被検体へのＥＺＨ２阻害剤の投与を含む治療である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法に従って、Ｈ３の量と比較してＨ３Ｋ２７ｍｅ３の量が増加しているとして同定された癌を有する被検体を治療するための医薬品の製造におけるＥＺＨ２阻害剤の使用。
【請求項２０】
前記透過処理組成物が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、Ｔｗｅｅｎ−２０、サポニン、ジギトニンおよびｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドか、
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）か、
約０．２５ｗｔ／ｖｏｌ％〜約５ｗｔ／ｖｏｌ％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）を含む請求項１４から１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記第１の蛍光シグナルが、フローサイトメトリーによって検出される請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記第２の蛍光シグナルが、フローサイトメトリーによって検出される請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記第３の蛍光シグナルが、フローサイトメトリーによって検出される請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
第１の蛍光結合抗体または第２の蛍光結合抗体と固定サンプルを接触させる前に、前記固定サンプルを得るために固定組成物と前記サンプルにおける少なくとも１つの細胞を接触させることをさらに含む請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
前記固定組成物が、メタノールフリー組成物であるか、
約１％〜約１０％の濃度のホルムアルデヒドを含むメタノールフリー組成物であるか、
ホルムアルデヒドを含む前記メタノールフリー組成物が約４％の濃度である請求項４に記載の使用。
【請求項２６】
前記ＥＺＨ２阻害剤が、以下の化合物またはその薬学的に許容される塩である請求項１３〜２５に記載の使用。
【化１】
2019500623.tif 000001
【請求項２７】
前記被検体が癌を有するヒトである請求項２〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記癌が、リンパ腫であるか、
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、胚中心由来リンパ腫、非胚中心由来リンパ腫、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、バーキットリンパ腫、および他の非ホジキンリンパ腫亜型から選択される前記リンパ腫である請求項２７に記載の使用。