(57)【要約】リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールに、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液を、基板上に配置し、乾燥させる。これにより、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を用いながらも、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、基板上に固定できる。混合溶液は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液にリンゴ酸塩を添加して調製することが好ましい。リンゴ酸塩は、リンゴ酸カリウムおよびリンゴ酸ナトリウムから選ばれる少なくとも１種が好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールにリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液を、基板上に配置し、乾燥させることによって、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼを前記基板上に固定する、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法。
【請求項２】
前記リンゴ酸塩が、リンゴ酸カリウムおよびリンゴ酸ナトリウムから選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合溶液を、前記グリセロールに前記リンゴ酸塩を添加することにより得る、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法に関し、特には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液を用いて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  免疫測定法は、抗原と抗体の結合性、すなわち抗原抗体反応、を利用することにより、標的物質の量を測定する方法である。抗原抗体反応は、これまでに知られている生物現象の中で最も種類が多く、かつ標的物質の識別性が最も高い。このため、免疫測定法は、膨大な種類の生体分子が混在する生体試料に含有された標的物質の量を、当該標的物質の単離精製作業を必要とせずに、生体試料から直接測定できる方法として注目されている。【０００３】  図１は、免疫測定法の一例について説明するための工程図である。この例では、まず、標的物質４を含む試料溶液５を、抗体２が固定された槽１内に添加する（Ａ１）。抗体２は、標的物質４に対する抗原結合部位を有している。このため、当該添加により、標的物質４と抗体２との間で抗原抗体反応が進行する。次に、バッファー溶液などを用いて槽１内を洗浄する（Ａ２）。これにより、試料溶液に含有され得る夾雑物質３が、槽１内から除去される。その後、第２の抗体７を槽１内に添加する（Ａ３）。第２の抗体７は、抗体２とは異なる抗原結合部位を含む。このため、当該添加により、抗体２に結合した状態にある標的物質４と第２の抗体７との間で、抗原抗体反応が進行する。第２の抗体７は、蛍光物質、放射性物質、酵素などの公知の標識体６により標識された状態にある。続いて、再度、バッファー溶液などを用いて槽１内を洗浄する（Ａ４）。これにより、標的物質４に結合していない第２の抗体７が、槽１内から除去される。その後、槽１内に残存した、抗体２、標識物質４および第２の抗体７の複合体の量、より具体的には当該複合体における第２の抗体７を標識した状態にある標識体６の量、を測定することにより、標的物質４の量を算出する（Ａ５）。【０００４】  図２は、免疫測定法の別例について説明するための工程図である。この例では、標的物質４ａを含む試料溶液とともに、標識化標的物質を所定濃度で含有するように調製された溶液を、槽１内に添加する（Ｂ１）。標識化標的物質は、標的物質４ａと共通する抗原部位を有し、標識体６によって標識された状態にある、擬似的な標的物質４ｂである。当該添加により、槽１内において、抗体２、標的物質４ａおよび標識化標的物質の三者間で競合的な抗原抗体反応が進行する。次に、バッファー溶液などを用いて槽１内を洗浄する（Ｂ２）。これにより、試料溶液に含有され得る夾雑物質３および未反応の標識化標的物質などが、槽１内から除去される。その後、槽１内に残存した、抗体２および標識化標的物質の複合体の量、より具体的には当該複合体における標識化標的物質を標識した状態にある標識体６の量、を測定し、標識化標的物質の添加量に基づいて、標的物質４ａの量を算出する（Ｂ３）。【０００５】  免疫測定法には、上述の二例以外にも様々なパターンが存在する。しかし、いずれのパターンにおいても、試料溶液中の標的物質の量は、当該量を反映した標識体の量に基づいて算出される。標識体の量を測定する方法として、光学的な測定手段を用いる方法がある。当該方法は、Ｔａｄａｙｕｋｉ  Ｔｓｕｋａｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｋｉｙｏｓｈｉ  Ｍａｔｕｍｏｔｏ，″Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−Ｔａｒｔｒａｔｅ  ｉｎ  Ｗｉｎｅ  ｂ���  Ｓｔｏｐｐｅｄ−Ｆｌｏｗ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｄ−Ｍａｌｅｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ″，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｃｈ  ２０００，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．２６５−２６８、に記載されているように、光源および輝度検出器を必要とするため、測定装置を小型化および低コスト化することが難しい。【０００６】  測定装置を小型化および低コスト化するとともに、測定を、安全かつ容易に、また、高い精度で実施する観点から、電気化学的な測定手段を用いる方法が注目されている。例えば、特開平２−０６２９５２号公報および特開平９−２９７１２１号公報は、アルカリホスファターゼを標識体とし、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）を電子メディエータとして用いる酵素サイクリング反応系を利用して、試料中の標的物質の量を電気化学的に測定するバイオセンサを開示する。【０００７】  図３は、特開平２−０６２９５２号公報および特開平９−２９７１２１号公報に記載のバイオセンサにおいて利用される、酵素サイクリング反応系について説明するための図である。この酵素サイクリング反応系は、アルカリホスファターゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ＮＡＤＰ）、エタノール、アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、およびジアホラーゼの基質となるフェリシアン化カリウムを含有する反応溶液において誘導される、第１〜第３の反応によって構成されている。第１の反応は、ＮＡＤＰが、アルカリホスファターゼにより脱リン酸化され、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）へと変換される反応である。第２の反応は、第１の反応によって生成したＮＡＤが、エタノールとともに、アルコールデヒドロゲナーゼの触媒作用による酸化還元反応を受けて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）へと還元される反応である。第３の反応は、第２の反応によって生成したＮＡＤＨが、ジアホラーゼの触媒作用によってフェリシアン化カリウムと反応し、ＮＡＤへと酸化されるとともに、フェリシアン化カリウムがヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム（フェロシアン化カリウム）へと変換される反応である。なお、ＮＡＤＰは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）であってもよい。フェロシアン化カリウムは、反応溶液中に電圧を印加することにより、フェリシアン化カリウムに変換される。反応溶液中のアルカリホスファターゼの量は、上記の第１〜３の反応を経ることにより、第３の反応において生成したフェロシアン化カリウムの量に反映される。これにより、フェロシアン化カリウムからフェリシアン化カリウムへの変換に伴って生じる酸化電流量を測定することで、アルカリホスファターゼの量を測定できる。【０００８】  バイオセンサをチップ化するためには、酵素サイクリング反応に必要な試薬をチップ内に長期的に保持させることが重要である。アルコールデヒドロゲナーゼを利用する酵素サイクリング反応系では、上記のとおりエタノールを用いる必要がある。エタノールは、高い揮発性を有するため���、チップ内に長期的に保持させることが難しい。このため、アルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素サイクリング反応系を利用して、バイオセンサをチップ化することは容易ではない。
【発明の開示】
【０００９】  本発明者は、これまでに、揮発性の高い試薬を必要としない新規な酵素サイクリング反応系の確立を進めてきた。図４は、この新規な酵素サイクリング反応系について説明するための図である。基本的な反応メカニズムは図３に示す酵素サイクリング反応系と同様であるが、本発明者が提案する酵素サイクリング反応系は、図４に示すように、アルコールデヒドロゲナーゼに代えてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを、また、エタノールに代えてリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を用いる。この酵素サイクリング反応系は、エタノールのような揮発性の高い試薬を含まない。
【００１０】  バイオセンサのチップ化を実現するためには、酵素サイクリング反応系を構成する試薬を、チップの保管中に多少の衝撃が加わっても定位置からずれない程度の強固さで、チップ内に保持できるようにすることが重要である。
【００１１】  リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、グリセロール溶液に溶解された状態にある保存溶液を使用して、チップ内に固定することが好ましい。リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液は、例えば３．２Ｍの硫酸アンモニウム溶液中に添加された状態にあるその他の保存溶液と比べて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの失活が少ないことが知られている。
【００１２】  ところが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液は、乾燥させることが難しく、所定の乾燥操作によっても流動性の高い状態が維持されるという問題がある。このため、当該溶液を用いて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをチップ内に固定することは容易ではない。
【００１３】  本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を用いながらも、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定できる方法の提供を目的とする。
【００１４】  本発明者は、図４に示す酵素サイクリング反応系を利用したチップ型のバイオセンサの開発を進める過程において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液に、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより、グリセロール溶液が乾燥しやすくなることを見出し、本発明の方法を完成させた。すなわち、本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールにリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液を、基板上に配置し、乾燥させることによって、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼを前記基板上に固定する、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、免疫測定法の一例を説明するための工程図である。
【図２】図２は、免疫測定法の別例を説明するための工程図である。
【図３】図３は、アルコールデヒドロゲナーゼを利用する酵素サイクリング反応系について説明するための図である。
【図４】図４は、新規な酵素サイクリング反応系について説明するための図である。
【図５】図５は、免疫測定法を実施するためのチップの一例を示す図である。
【図６】図６は、免疫測定法を実施するためのチップの別例を示す図である。
【図７】図７は、実施例１における定電位測定の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  上記のとおり、本発明者は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液について、そのままの状態では基板上で乾燥固定させることが難しいものの、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより、乾燥固定できることを見出した。詳しくは後述するが、種々の実験結果によれば、図４に示す酵素サイクリング反応系を構成するその他の試薬、すなわちフェリシアン化カリウム、ジアホラーゼおよびＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨなどでは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液に添加しても、当該グリセロール溶液を、乾燥しやすい状態に変化させることはできないようである。【００１７】  リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液には、リンゴ酸塩を添加することが好ましい。後述する実施例で示すように、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、その活性の低下をより確実に回避しつつ、基板上に固定することができるからである。リンゴ酸塩としては、リンゴ酸ナトリウムおよびリンゴ酸カリウムから選ばれる少なくとも１種を例示できる。なお、本発明の方法は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を基板上に乾燥固定できる限り、当該溶液に、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種に加えて、図４に示す酵素サイクリング反応系を構成するその他の試薬に代表される添加物を、さらに添加することを排除しない。【００１８】  基板の材料としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が例示できる。基板の材料は、ポリカーボネート、ポリイミドおよびポリプロピレンなどに代表されるＰＥＴ以外の樹脂材料であっても、また、ガラスであっても構わない。【００１９】  リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールにリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液は、滴下、塗布および噴射などに代表される、液体を基板上に配置するための公知の方法を用いて、基板上に配置すればよい。【００２０】  上記の混合溶液を、基板上で乾燥させるための乾燥操作としては、後述する実施例において示すように、当該混合溶液が配置された状態にある基板を、常温（２５℃）で、約２時間、真空乾燥させる操作が例示できる。乾燥操作の条件は、基板上にリンゴ酸デヒドロゲナーゼを固定できる限り、適宜変更して構わない。当該条件の変更は、乾燥固定後に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が低下しない程度の範囲に収めることが好ましい。【００２１】  本発明の方法によれば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、基板に多少の衝撃が加わっても固定した位置からずれない程度の強固さで基板上に固定できる。なお、こうして基板上に固定されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、強固に固定されるものの、後述する実施例で示すように、試料溶液に代表される溶媒に対して容易に溶解する。【００２２】  図５および図６は、図４に示す酵素サイクリング反応系を利用して試料溶液中の標的物質の量を測定するチップの一例について説明するための図である。【００２３】  チップ１００は、図５に示すように、試料溶液をチップ内に導入するための試料導入口８、試料溶液中の標的物質の量を反映した量のアルカリホスファターゼ標識化物質を含む溶液を得るための反��槽９、試薬固定槽１０、および定電位測定が可能な電極が保持された電極槽１１を有している。試薬固定槽１０と電極槽１１は流路１２ａにより連通されている。反応層９と試薬固定槽１０は流路１２ｂにより連通されている。試料導入口８と反応層９は流路１２ｃにより連通されている。チップ２００は、図６に示すように、試料導入口８、試薬固定槽１０および電極槽１１を有している。試薬固定槽１０と電極槽１１は流路１２ａにより、また、試料導入口８と試薬固定槽１０は流路１２ｄにより連通されている。【００２４】  試薬固定槽１０には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種、ＮＡＤＰおよび／またはＮＡＤＰＨ、フェリシアン化カリウム、ジアホラーゼが固定されている。上記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼからジアホラーゼまでの試薬は、試薬固定槽１０に導入される試料溶液に溶解する状態にある。リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、上記のとおり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールに、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液を、チップの基板上に配置し、これを乾燥させることにより、基板上に固定すればよい。ＮＡＤＰおよび／またはＮＡＤＰＨ、フェリシアン化カリウムおよびジアホラーゼは、チップの基板上に配置し、これを乾燥させることにより、基板上に容易に固定できる。【００２５】  チップ１００では、試料導入口８から導入された試料溶液が、流路１２ｃを通じて反応槽９に送られる。反応槽９では、試料溶液中の標的物質の量を反映する、アルカリホスファターゼ標識された物質を含有する溶液が調製される。その後、当該溶液は、流路１２ｂを通じて試薬固定槽１０に送られる。当該溶液を得るための反応は、図１および２の工程図に代表されるように種々のパターンが存在する。このため、反応槽９は、反応のパターンに応じ、槽ならびに流路の数および配置パターンを適宜調整してよい。【００２６】  チップ２００では、試料溶液中の標的物質の量を反映する、アルカリホスファターゼ標識された物質を含有する溶液を、流路１２ｄを通じて試料導入口８から試薬固定槽１０に導入する。当該溶液は、チップの使用者が、チップ内に導入する前に調製する。【００２７】  チップ１００および２００のいずれにおいても、アルカリホスファターゼ標識された物質を含有する溶液が試薬固定槽１０に導入されると、当該溶液に、上記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼからジアホラーゼまでの試薬群が溶解する。これにより、試薬固定槽１０において、当該試薬群と、溶液中のアルカリホスファターゼとの間で、図４に示すサイクリング反応が進行する。サイクリング反応後の溶液は、流路１２ａを通じて電極槽１１に送られる。電極槽１１では、当該電極槽１１に導入された溶液に電圧が印加される。これにより、サイクリング反応によって得られたフェロシアン化カリウムがフェリシアン化カリウムに変換されるとともに、当該変換の際に流れる電流値が測定される（定電位測定）。そして、上記のとおり、定電位測定により得た電流値に基づいて、試料溶液中の標的物質の量が算出される。【００２８】  上記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼからジアホラーゼまでの試薬���は、試薬固定槽１０に代えて、流路１２ａ、１２ｂ、１２ｄや電極槽１１において、試料溶液に代表される溶液に溶解可能な状態で固定されていてもよい。電極槽１１における電極の構成は、作用極および対極からなる二極式としてもよいし、作用極、対極および参照極からなる三極式としてもよい。各槽間の送液は、例えば遠心力を利用することにより行ってもよいし、また例えばポンプなどを利用して流路内に圧力をかけることにより行ってもよい。【００２９】  以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。【００３０】  （比較例１）
図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬、すなわちフェリシアン化カリウム、ジアホラーゼ、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸カリウム、ＮＡＤＰおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、の基板上への固定性について、次のようにして調べた。基板は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基板を使用した。【００３１】  フェリシアン化カリウム（和光純薬工業株式会社製）を純水に溶解させて得た１Ｍのフェリシアン化カリウム水溶液を１μＬ、ジアホラーゼ（ユニチカ株式会社製）を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解させて得た１０００Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ溶液６．７μＬ、リンゴ酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を純水に溶解させて得た４Ｍのリンゴ酸ナトリウム水溶液７．８μＬ、リンゴ酸（和光純薬工業株式会社製）を純水に溶解させて得た４Ｍのリンゴ酸水溶液７．８μＬ、リンゴ酸カリウム（関東化学株式会社製）を純水に溶解させて得た４Ｍのリンゴ酸カリウム水溶液７．８μＬ、ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母工業株式会社製）を純水に溶解させて得た５ｍＭのＮＡＤＰ水溶液１μＬ、および、リンゴ酸デヒドロゲナーゼが５０％グリセロールに溶解した状態にある２５０００Ｕ／ｍＬのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液（ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）１μＬ、をそれぞれ用意した。【００３２】  各溶液をＰＥＴ基板上に滴下し、常温で２時間、真空乾燥させた。乾燥操作後の各溶液の状態、および各溶液に含有されたフェリシアン化カリウムからリンゴ酸デヒドロゲナーゼまでの上記の成分の固定状態を、表１に示す。【００３３】
【表１】
2007132628.tif 000002
【００３４】  表１に示すように、フェリシアン化カリウム水溶液、ジアホラーゼ溶液およびＮＡＤＰ水溶液は、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態になった。また、リンゴ酸ナトリウム水溶液およびリンゴ酸カリウム水溶液は、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態にはならなかったものの粘性が非常に高い状態になった。また、リンゴ酸水溶液は、乾燥操作後にほぼ完全に乾燥した状態になった。そして、各溶液に含有されたフェリシアン化カリウムからリンゴ酸カリウムまでの上記の成分が、基板上に強固に固定された状態が得られた。これに対し、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの溶液は乾燥操作後にほとんど乾燥せず、当該溶液中のリンゴ酸デヒドロゲナーゼは基板上に固定されなかった。なお、本明細書において「基板上に強固に固定された」状態とは、各溶液を滴下し乾燥させた状態にあるＰＥＴ基板を１０００ｒｐｍで５秒間遠心させても、乾燥状態の試薬が、基板上に付いたままになる状態にあることを意味し、「基板上に固定されなかった」状態とは、乾燥状態の試薬が、当該遠心により基板上からとれてしまう状態にあることを意味する。【００３５】  このように、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有した状態にあるグリセロール溶液を、そのままの状態で基板上に滴下し乾燥させることによっては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定することは難しい。【００３６】  （比較例２）
下記の混合溶液Ａ〜Ｃによる、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基板上への固定性について調べた。【００３７】  混合溶液Ａは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびフェリシアン化カリウム水溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液Ｂは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびジアホラーゼ溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液Ｃは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびＮＡＤＰ水溶液を、混合して得た溶液である。【００３８】  混合溶液Ａ〜ＣをそれぞれＰＥＴ基板上に滴下し、常温で２時間、真空乾燥させた。乾燥操作後の各溶液の状態、および各溶液に含有されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼの固定状態を表２に示す。表２には、後述する混合溶液Ｄ〜Ｆについての状態もあわせて示す。【００３９】
【表２】
2007132628.tif 000003
【００４０】  表２に示すように、混合溶液Ａ〜Ｃは、いずれも、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態にはならず、また、粘性が高い状態にもならなかった。これにより、混合溶液Ａ〜Ｃを基板上に滴下し乾燥させることによっても、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定することは難しいことがわかった。【００４１】  （実施例１）
下記の混合溶液Ｄ〜Ｆによる、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基板上への固定性について調べた。【００４２】  混合溶液Ｄは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびリンゴ酸ナトリウム水溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液Ｅは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびリンゴ酸水溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液Ｆは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびリンゴ酸カリウム水溶液を、混合して得た溶液である。【００４３】  混合溶液Ｄ〜ＦをそれぞれＰＥＴ基板上に滴下し、常温で２時間、真空乾燥させた。表２に示すように、混合溶液ＤおよびＦは、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態にはならなかったものの粘性が非常に高い状態になった。また、混合溶液Ｅは、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態になった。これにより、混合溶液Ｄ〜Ｆを基板上に滴下し乾燥させることによって、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に強固に固定できることがわかった。基板上に固定された状態にあるリンゴ酸デヒドロゲナーゼが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液に由来することは、公知のバイオセンサ（例えば、王子計測機器株式会社製バイオフロー（ＢＦ−４））を用いて特定できる。【００４４】  次に、混合溶液Ｄ〜Ｆに対する乾燥操作によって基板上に固定されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼにおける、酵素活性について調べた。ＰＥＴ基板上で固定された状態にある混合溶液Ｄ〜Ｆに対し、比較例１において用意したフェリシアン化カリウム水溶液、ジアホラーゼ溶液およびＮＡＤＰ水溶液を、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）５μＬに混合して得た溶液１３．７μＬを添加し、さらにアルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体溶液１００μＬを添加することにより反応溶液を調製した。反応溶液は、アルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体の濃度が、０Ｍ、０．０８３ｎＭ、０．４１５ｎＭ、０．８３０ｎＭとなるように複数種を調製した。【００４５】  反応溶液を３０℃で１０分間インキュベートした後、４００ｍＶの定電圧を反応溶液に印加する、定電位測定を実施した。図７は、反応溶液中のアルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体濃度と、電圧印加直後にそれぞれの反応溶液において流れた電流値との関係を示すグラフである。図７に示すように、基板上に固定された混合溶液ＤおよびＦを用いて調製した反応溶液では、アルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体濃度と電流値との間には高い相関関係が認められ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が維持されていた。基板上に固定された混合溶液Ｅを用いて調製した反応溶液では、基板上に固定された混合溶液ＤおよびＦを用いた場合と比べると、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が低下していた。【００４６】  以上のとおり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液に、リンゴ酸カリウムおよびリンゴ酸ナトリウムに代表されるリンゴ酸塩を添加した混合溶液を用いることにより、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、失活を防止しつつ基板上に強固に固定できる。また、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液にリンゴ酸を添加した混合溶液を用いることによっても、酵素活性が低下する場合はあるものの、リ��ゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に強固に固定できる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】  本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を用いながらも、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法を提供するものとして、チップ型のバイオセンサによる免疫測定法の実施が要求される各分野において多大な利用価値を有する。
【図１】
2007132628.tif 000004
【図２】
2007132628.tif 000005
【図３】
2007132628.tif 000006
【図４】
2007132628.tif 000007
【図５】
2007132628.tif 000008
【図６】
2007132628.tif 000009
【図７】
2007132628.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月25日(2007.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールにリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液を、基板上に配置し、乾燥させることによって、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼを前記基板上に固定する、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法。
【請求項２】
前記リンゴ酸塩が、リンゴ酸カリウムおよびリンゴ酸ナトリウムから選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合溶液を、前記グリセロールに前記リンゴ酸塩を添加することにより得る、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法に関し、特には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液を用いて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法は、抗原と抗体の結合性、すなわち抗原抗体反応、を利用することにより、標的物質の量を測定する方法である。抗原抗体反応は、これまでに知られている生物現象の中で最も種類が多く、かつ標的物質の識別性が最も高い。このため、免疫測定法は、膨大な種類の生体分子が混在する生体試料に含有された標的物質の量を、当該標的物質の単離精製作業を必要とせずに、生体試料から直接測定できる方法として注目されている。
【０００３】
図１は、免疫測定法の一例について説明するための工程図である。この例では、まず、標的物質４を含む試料溶液５を、抗体２が固定された槽１内に添加する（Ａ１）。抗体２は、標的物質４に対する抗原結合部位を有している。このため、当該添加により、標的物質４と抗体２との間で抗原抗体反応が進行する。次に、バッファー溶液などを用いて槽１内を洗浄する（Ａ２）。これにより、試料溶液に含有され得る夾雑物質３が、槽１内から除去される。その後、第２の抗体７を槽１内に添加する（Ａ３）。第２の抗体７は、抗体２とは異なる抗原結合部位を含む。このため、当該添加により、抗体２に結合した状態にある標的物質４と第２の抗体７との間で、抗原抗体反応が進行する。第２の抗体７は、蛍光物質、放射性物質、酵素などの公知の標識体６により標識された状態にある。続いて、再度、バッファー溶液などを用いて槽１内を洗浄する（Ａ４）。これにより、標的物質４に結合していない第２の抗体７が、槽１内から除去される。その後、槽１内に残存した、抗体２、標識物質４および第２の抗体７の複合体の量、より具体的には当該複合体における第２の抗体７を標識した状態にある標識体６の量、を測定することにより、標的物質４の量を算出する（Ａ５）。
【０００４】
図２は、免疫測定法の別例について説明するための工程図である。この例では、標的物質４ａを含む試料溶液とともに、標識化標的物質を所定濃度で含有するように調製された溶液を、槽１内に添加する（Ｂ１）。標識化標的物質は、標的物質４ａと共通する抗原部位を有し、標識体６によって標識された状態にある、擬似的な標的物質４ｂである。当該添加により、槽１内において、抗体２、標的物質４ａおよび標識化標的物質の三者間で競合的な抗原抗体反応が進行する。次に、バッファー溶液などを用いて槽１内を洗浄する（Ｂ２）。これにより、試料溶液に含有され得る夾雑物質３および未反応の標識化標的物質などが、槽１内から除去される。その後、槽１内に残存した、抗体２および標識化標的物質の複合体の量、より具体的には当該複合体における標識化標的物質を標識した状態にある標識体６の量、を測定し、標識化標的物質の添加量に基づいて、標的物質４ａの量を算出する（Ｂ３）。
【０００５】
免疫測定法には、上述の二例以外にも様々なパターンが存在する。しかし、いずれのパターンにおいても、試料溶液中の標的物質の量は、当該量を反映した標識体の量に基づいて算出される。標識体の量を測定する方法として、光学的な測定手段を用いる方法がある。当該方法は、Tadayuki Tsukatani and Kiyoshi Matsumoto，"Quantification of L-Tartrate in Wine by Stopped-Flow Injection Analysis Using Immobilized D-Malete Dehydrogenase and Fluorescence Detection"，Analytical Sciences，March 2000, vol. 16, pp.265-268、に記載されているように、光源および輝度検出器を必要とするため、測定装置を小型化および低コスト化することが難しい。
【０００６】
測定装置を小型化および低コスト化するとともに、測定を、安全かつ容易に、また、高い精度で実施する観点から、電気化学的な測定手段を用いる方法が注目されている。例えば、特開平２−０６２９５２号公報および特開平９−２９７１２１号公報は、アルカリホスファターゼを標識体とし、ヘキサシアノ鉄（III）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）を電子メディエータとして用いる酵素サイクリング反応系を利用して、試料中の標的物質の量を電気化学的に測定するバイオセンサを開示する。
【０００７】
図３は、特開平２−０６２９５２号公報および特開平９−２９７１２１号公報に記載のバイオセンサにおいて利用される、酵素サイクリング反応系について説明するための図である。この酵素サイクリング反応系は、アルカリホスファターゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ＮＡＤＰ）、エタノール、アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、およびジアホラーゼの基質となるフェリシアン化カリウムを含有する反応溶液において誘導される、第１〜第３の反応によって構成されている。第１の反応は、ＮＡＤＰが、アルカリホスファターゼにより脱リン酸化され、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）へと変換される反応である。第２の反応は、第１の反応によって生成したＮＡＤが、エタノールとともに、アルコールデヒドロゲナーゼの触媒作用による酸化還元反応を受けて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）へと還元される反応である。第３の反応は、第２の反応によって生成したＮＡＤＨが、ジアホラーゼの触媒作用によってフェリシアン化カリウムと反応し、ＮＡＤへと酸化されるとともに、フェリシアン化カリウムがヘキサシアノ鉄（II）酸カリウム（フェロシアン化カリウム）へと変換される反応である。なお、ＮＡＤＰは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）であってもよい。フェロシアン化カリウムは、反応溶液中に電圧を印加することにより、フェリシアン化カリウムに変換される。反応溶液中のアルカリホスファターゼの量は、上記の第１〜３の反応を経ることにより、第３の反応において生成したフェロシアン化カリウムの量に反映される。これにより、フェロシアン化カリウムからフェリシアン化カリウムへの変換に伴って生じる酸化電流量を測定することで、アルカリホスファターゼの量を測定できる。
【０００８】
バイオセンサをチップ化するためには、酵素サイクリング反応に必要な試薬をチップ内に長期的に保持させることが重要である。アルコールデヒドロゲナーゼを利用する酵素サイクリング反応系では、上記のとおりエタノールを用いる必要がある。エタノールは、高い揮発性を有するために、チップ内に長期的に保持させることが難しい。このため、アルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素サイクリング反応系を利用して、バイオセンサをチップ化することは容易ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、これまでに、揮発性の高い試薬を必要としない新規な酵素サイクリング反応系の確立を進めてきた。図４は、この新規な酵素サイクリング反応系について説明するための図である。基本的な反応メカニズムは図３に示す酵素サイクリング反応系と同様であるが、本発明者が提案する酵素サイクリング反応系は、図４に示すように、アルコールデヒドロゲナーゼに代えてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを、また、エタノールに代えてリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を用いる。この酵素サイクリング反応系は、エタノールのような揮発性の高い試薬を含まない。
【００１０】
バイオセンサのチップ化を実現するためには、酵素サイクリング反応系を構成する試薬を、チップの保管中に多少の衝撃が加わっても定位置からずれない程度の強固さで、チップ内に保持できるようにすることが重要である。
【００１１】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、グリセロール溶液に溶解された状態にある保存溶液を使用して、チップ内に固定することが好ましい。リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液は、例えば３．２Ｍの硫酸アンモニウム溶液中に添加された状態にあるその他の保存溶液と比べて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの失活が少ないことが知られている。
【００１２】
ところが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液は、乾燥させることが難しく、所定の乾燥操作によっても流動性の高い状態が維持されるという問題がある。このため、当該溶液を用いて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをチップ内に固定することは容易ではない。
【００１３】
本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を用いながらも、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定できる方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、図４に示す酵素サイクリング反応系を利用したチップ型のバイオセンサの開発を進める過程において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液に、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより、グリセロール溶液が乾燥しやすくなることを見出し、本発明の方法を完成させた。すなわち、本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールにリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液を、基板上に配置し、乾燥させることによって、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼを前記基板上に固定する、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上記のとおり、本発明者は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液について、そのままの状態では基板上で乾燥固定させることが難しいものの、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより、乾燥固定できることを見出した。詳しくは後述するが、種々の実験結果によれば、図４に示す酵素サイクリング反応系を構成するその他の試薬、すなわちフェリシアン化カリウム、ジアホラーゼおよびＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨなどでは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液に添加しても、当該グリセロール溶液を、乾燥しやすい状態に変化させることはできないようである。
【００１６】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液には、リンゴ酸塩を添加することが好ましい。後述する実施例で示すように、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、その活性の低下をより確実に回避しつつ、基板上に固定することができるからである。リンゴ酸塩としては、リンゴ酸ナトリウムおよびリンゴ酸カリウムから選ばれる少なくとも１種を例示できる。なお、本発明の方法は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を基板上に乾燥固定できる限り、当該溶液に、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種に加えて、図４に示す酵素サイクリング反応系を構成するその他の試薬に代表される添加物を、さらに添加することを排除しない。
【００１７】
基板の材料としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が例示できる。基板の材料は、ポリカーボネート、ポリイミドおよびポリプロピレンなどに代表されるＰＥＴ以外の樹脂材料であっても、また、ガラスであっても構わない。
【００１８】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールにリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液は、滴下、塗布および噴射などに代表される、液体を基板上に配置するための公知の方法を用いて、基板上に配置すればよい。
【００１９】
上記の混合溶液を、基板上で乾燥させるための乾燥操作としては、後述する実施例において示すように、当該混合溶液が配置された状態にある基板を、常温（２５℃）で、約２時間、真空乾燥させる操作が例示できる。乾燥操作の条件は、基板上にリンゴ酸デヒドロゲナーゼを固定できる限り、適宜変更して構わない。当該条件の変更は、乾燥固定後に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が低下しない程度の範囲に収めることが好ましい。
【００２０】
本発明の方法によれば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、基板に多少の衝撃が加わっても固定した位置からずれない程度の強固さで基板上に固定できる。なお、こうして基板上に固定されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、強固に固定されるものの、後述する実施例で示すように、試料溶液に代表される溶媒に対して容易に溶解する。
【００２１】
図５および図６は、図４に示す酵素サイクリング反応系を利用して試料溶液中の標的物質の量を測定するチップの一例について説明するための図である。
【００２２】
チップ１００は、図５に示すように、試料溶液をチップ内に導入するための試料導入口８、試料溶液中の標的物質の量を反映した量のアルカリホスファターゼ標識化物質を含む溶液を得るための反応槽９、試薬固定槽１０、および定電位測定が可能な電極が保持された電極槽１１を有している。試薬固定槽１０と電極槽１１は流路１２ａにより連通されている。反応層９と試薬固定槽１０は流路１２ｂにより連通されている。試料導入口８と反応層９は流路１２ｃにより連通されている。チップ２００は、図６に示すように、試料導入口８、試薬固定槽１０および電極槽１１を有している。試薬固定槽１０と電極槽１１は流路１２ａにより、また、試料導入口８と試薬固定槽１０は流路１２ｄにより連通されている。
【００２３】
試薬固定槽１０には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種、ＮＡＤＰおよび／またはＮＡＤＰＨ、フェリシアン化カリウム、ジアホラーゼが固定されている。上記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼからジアホラーゼまでの試薬は、試薬固定槽１０に導入される試料溶液に溶解する状態にある。リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、上記のとおり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールに、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液を、チップの基板上に配置し、これを乾燥させることにより、基板上に固定すればよい。ＮＡＤＰおよび／またはＮＡＤＰＨ、フェリシアン化カリウムおよびジアホラーゼは、チップの基板上に配置し、これを乾燥させることにより、基板上に容易に固定できる。
【００２４】
チップ１００では、試料導入口８から導入された試料溶液が、流路１２ｃを通じて反応槽９に送られる。反応槽９では、試料溶液中の標的物質の量を反映する、アルカリホスファターゼ標識された物質を含有する溶液が調製される。その後、当該溶液は、流路１２ｂを通じて試薬固定槽１０に送られる。当該溶液を得るための反応は、図１および２の工程図に代表されるように種々のパターンが存在する。このため、反応槽９は、反応のパターンに応じ、槽ならびに流路の数および配置パターンを適宜調整してよい。
【００２５】
チップ２００では、試料溶液中の標的物質の量を反映する、アルカリホスファターゼ標識された物質を含有する溶液を、流路１２ｄを通じて試料導入口８から試薬固定槽１０に導入する。当該溶液は、チップの使用者が、チップ内に導入する前に調製する。
【００２６】
チップ１００および２００のいずれにおいても、アルカリホスファターゼ標識された物質を含有する溶液が試薬固定槽１０に導入されると、当該溶液に、上記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼからジアホラーゼまでの試薬群が溶解する。これにより、試薬固定槽１０において、当該試薬群と、溶液中のアルカリホスファターゼとの間で、図４に示すサイクリング反応が進行する。サイクリング反応後の溶液は、流路１２ａを通じて電極槽１１に送られる。電極槽１１では、当該電極槽１１に導入された溶液に電圧が印加される。これにより、サイクリング反応によって得られたフェロシアン化カリウムがフェリシアン化カリウムに変換されるとともに、当該変換の際に流れる電流値が測定される（定電位測定）。そして、上記のとおり、定電位測定により得た電流値に基づいて、試料溶液中の標的物質の量が算出される。
【００２７】
上記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼからジアホラーゼまでの試薬群は、試薬固定槽１０に代えて、流路１２ａ、１２ｂ、１２ｄや電極槽１１において、試料溶液に代表される溶液に溶解可能な状態で固定されていてもよい。電極槽１１における電極の構成は、作用極および対極からなる二極式としてもよいし、作用極、対極および参照極からなる三極式としてもよい。各槽間の送液は、例えば遠心力を利用することにより行ってもよいし、また例えばポンプなどを利用して流路内に圧力をかけることにより行ってもよい。
【００２８】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２９】
（比較例１）
図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬、すなわちフェリシアン化カリウム、ジアホラーゼ、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸カリウム、ＮＡＤＰおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、の基板上への固定性について、次のようにして調べた。基板は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基板を使用した。
【００３０】
フェリシアン化カリウム（和光純薬工業株式会社製）を純水に溶解させて得た１Ｍのフェリシアン化カリウム水溶液を１μＬ、ジアホラーゼ（ユニチカ株式会社製）を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解させて得た１０００Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ溶液６．７μＬ、リンゴ酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を純水に溶解させて得た４Ｍのリンゴ酸ナトリウム水溶液７．８μＬ、リンゴ酸（和光純薬工業株式会社製）を純水に溶解させて得た４Ｍのリンゴ酸水溶液７．８μＬ、リンゴ酸カリウム（関東化学株式会社製）を純水に溶解させて得た４Ｍのリンゴ酸カリウム水溶液７．８μＬ、ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母工業株式会社製）を純水に溶解させて得た５ｍＭのＮＡＤＰ水溶液１μＬ、および、リンゴ酸デヒドロゲナーゼが５０％グリセロールに溶解した状態にある２５０００Ｕ／ｍＬのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液（ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）１μＬ、をそれぞれ用意した。
【００３１】
各溶液をＰＥＴ基板上に滴下し、常温で２時間、真空乾燥させた。乾燥操作後の各溶液の状態、および各溶液に含有されたフェリシアン化カリウムからリンゴ酸デヒドロゲナーゼまでの上記の成分の固定状態を、表１に示す。
【００３２】
【表１】
2007132628.tif 000011
【００３３】
表１に示すように、フェリシアン化カリウム水溶液、ジアホラーゼ溶液およびＮＡＤＰ水溶液は、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態になった。また、リンゴ酸ナトリウム水溶液およびリンゴ酸カリウム水溶液は、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態にはならなかったものの粘性が非常に高い状態になった。また、リンゴ酸水溶液は、乾燥操作後にほぼ完全に乾燥した状態になった。そして、各溶液に含有されたフェリシアン化カリウムからリンゴ酸カリウムまでの上記の成分が、基板上に強固に固定された状態が得られた。これに対し、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの溶液は乾燥操作後にほとんど乾燥せず、当該溶液中のリンゴ酸デヒドロゲナーゼは基板上に固定されなかった。なお、本明細書において「基板上に強固に固定された」状態とは、各溶液を滴下し乾燥させた状態にあるＰＥＴ基板を１０００ｒｐｍで５秒間遠心させても、乾燥状態の試薬が、基板上に付いたままになる状態にあることを意味し、「基板上に固定されなかった」状態とは、乾燥状態の試薬が、当該遠心により基板上からとれてしまう状態にあることを意味する。
【００３４】
このように、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有した状態にあるグリセロール溶液を、そのままの状態で基板上に滴下し乾燥させることによっては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定することは難しい。
【００３５】
（比較例２）
下記の混合溶液Ａ〜Ｃによる、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基板上への固定性について調べた。
【００３６】
混合溶液Ａは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびフェリシアン化カリウム水溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液Ｂは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびジアホラーゼ溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液Ｃは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびＮＡＤＰ水溶液を、混合して得た溶液である。
【００３７】
混合溶液Ａ〜ＣをそれぞれＰＥＴ基板上に滴下し、常温で２時間、真空乾燥させた。乾燥操作後の各溶液の状態、および各溶液に含有されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼの固定状態を表２に示す。表２には、後述する混合溶液Ｄ〜Ｆについての状態もあわせて示す。
【００３８】
【表２】
2007132628.tif 000012
【００３９】
表２に示すように、混合溶液Ａ〜Ｃは、いずれも、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態にはならず、また、粘性が高い状態にもならなかった。これにより、混合溶液Ａ〜Ｃを基板上に滴下し乾燥させることによっても、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定することは難しいことがわかった。
【００４０】
（実施例１）
下記の混合溶液Ｄ〜Ｆによる、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基板上への固定性について調べた。
【００４１】
混合溶液Ｄは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびリンゴ酸ナトリウム水溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液Ｅは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびリンゴ酸水溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液Ｆは、比較例１と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびリンゴ酸カリウム水溶液を、混合して得た溶液である。
【００４２】
混合溶液Ｄ〜ＦをそれぞれＰＥＴ基板上に滴下し、常温で２時間、真空乾燥させた。表２に示すように、混合溶液ＤおよびＦは、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態にはならなかったものの粘性が非常に高い状態になった。また、混合溶液Ｅは、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態になった。これにより、混合溶液Ｄ〜Ｆを基板上に滴下し乾燥させることによって、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に強固に固定できることがわかった。基板上に固定された状態にあるリンゴ酸デヒドロゲナーゼが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液に由来することは、公知のバイオセンサ（例えば、王子計測機器株式会社製バイオフロー（ＢＦ−４））を用いて特定できる。
【００４３】
次に、混合溶液Ｄ〜Ｆに対する乾燥操作によって基板上に固定されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼにおける、酵素活性について調べた。ＰＥＴ基板上で固定された状態にある混合溶液Ｄ〜Ｆに対し、比較例１において用意したフェリシアン化カリウム水溶液、ジアホラーゼ溶液およびＮＡＤＰ水溶液を、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）５μＬに混合して得た溶液１３．７μＬを添加し、さらにアルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体溶液１００μＬを添加することにより反応溶液を調製した。反応溶液は、アルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体の濃度が、０Ｍ、０．０８３ｎＭ、０．４１５ｎＭ、０．８３０ｎＭとなるように複数種を調製した。
【００４４】
反応溶液を３０℃で１０分間インキュベートした後、４００ｍＶの定電圧を反応溶液に印加する、定電位測定を実施した。図７は、反応溶液中のアルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体濃度と、電圧印加直後にそれぞれの反応溶液において流れた電流値との関係を示すグラフである。図７に示すように、基板上に固定された混合溶液ＤおよびＦを用いて調製した反応溶液では、アルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体濃度と電流値との間には高い相関関係が認められ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が維持されていた。基板上に固定された混合溶液Ｅを用いて調製した反応溶液では、基板上に固定された混合溶液ＤおよびＦを用いた場合と比べると、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が低下していた。
【００４５】
以上のとおり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液に、リンゴ酸カリウムおよびリンゴ酸ナトリウムに代表されるリンゴ酸塩を添加した混合溶液を用いることにより、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、失活を防止しつつ基板上に強固に固定できる。また、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液にリンゴ酸を添加した混合溶液を用いることによっても、酵素活性が低下する場合はあるものの、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に強固に固定できる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を用いながらも、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法を提供するものとして、チップ型のバイオセンサによる免疫測定法の実施が要求される各分野において多大な利用価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、免疫測定法の一例を説明するための工程図である。
【図２】図２は、免疫測定法の別例を説明するための工程図である。
【図３】図３は、アルコールデヒドロゲナーゼを利用する酵素サイクリング反応系について説明するための図である。
【図４】図４は、新規な酵素サイクリング反応系について説明するための図である。
【図５】図５は、免疫測定法を実施するためのチップの一例を示す図である。
【図６】図６は、免疫測定法を実施するためのチップの別例を示す図である。
【図７】図７は、実施例１における定電位測定の結果を示すグラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007132628.tif 000013
【図２】
2007132628.tif 000014
【図３】
2007132628.tif 000015
【図４】
2007132628.tif 000016
【図５】
2007132628.tif 000017
【図６】
2007132628.tif 000018
【図７】
2007132628.tif 000019
【国際調査報告】
2007132628.tif 000020
2007132628.tif 000021
2007132628.tif 000022
2007132628.tif 000023