【手続補正書】
【提出日】平成20年2月1日(2008.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節ＲＮＡ−リガンド相互作用を調整するオリゴヌクレオチドの同定および選択のための方法であって、
(ａ)リガンド、例えばタンパク質による認識に必要なＲＮＡ分子の二次構造要素を規定することおよび選択すること、
(ｂ)当該ＲＮＡの二次構造の集合において工程(ａ)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(ｃ)少なくとも部分的に逆相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる当該ＲＮＡの二次構造の集合において工程(ａ)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(ｄ)規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化させるオリゴヌクレオチドを同定および選択し、そして任意にオリゴヌクレオチドを以下の工程(ｅ)、(ｆ)および(ｇ)に定義の通り実験的にバリデートすること、
(ｅ)工程(ｄ)で決定したオリゴヌクレオチドを提供すること、ならびに任意に、
(ｆ)工程(ａ)の当該二次構造要素を含むＲＮＡを工程(ｅ)のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすること、そして
(ｇ)当該二次構造要素の熱力学的確率への当該ハイブリダイゼーションの作用を決定し、さらに該ＲＮＡとハイブリダイズすることにより調節ＲＮＡ−リガンド相互作用を調節できるオリゴヌクレオチドを選択すること
を含む、方法。
【請求項２】
標的遺伝子発現を増強するかまたは沈黙できるオリゴヌクレオチドを同定するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該リガンドがＨｕＲであり、ＨｕＲによる認識に必要な二次構造を含む該ＲＮＡ分子がｍＲＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該ｍＲＮＡがＩＬ−２である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該ｍＲＮＡがＴＮＦαである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
工程(ｄ)で選択されたオリゴヌクレオチドが
配列番号１：  ＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＧ、
配列番号２：  ＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴ、
配列番号３：  ＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＡＣＡ、
配列番号４：  ＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣＣＣ、
配列番号５：  ＡＡＧＧＣＣＵＧＡＵＡＵＧＵＵＵＵＡＡＧ、
配列番号６：  ＡＡＵＡＵＡＡＡＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵ、
配列番号７：  ＵＡＧＡＧＣＣＣＣＵＡＧＧＧＣＵＵＡＣＡ、
配列番号８：  ＵＧＡＡＡＣＣＡＵＵＵＵＡＧＡＧＣＣＣＣ
からなる群より選択される配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
工程(ｄ)で選択されたオリゴヌクレオチドが
配列番号９：  ＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＣＣＧ、
配列番号１０：  ＴＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧ、
配列番号１１：  ＡＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＧＧＴ、
配列番号１２：  ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡ、
配列番号１３：  ＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡ、および
配列番号１４：  ＡＴＣＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡ
からなる群より選択される配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
請求項１の方法により同定できるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ分子へのハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定するアッセイ法であって、
(ａ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡを候補化合物の存在下および不在下に規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化させるオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(ｂ)当該候補化合物の存在下および不在下に当該ＲＮＡの当該オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を決定すること
(ｃ)ハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
【請求項９】
ＲＮＡ分子の、請求項１の方法により同定できるオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定するアッセイ法であって、
(ａ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡを規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化させるオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(ｂ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡを、請求項１の方法により同定できるオリゴヌクレオチドと同様な作用を有すると期待される候補化合物へハイブリダイズすること、
(ｃ)ハイブリダイゼーションの作用を工程(ａ)および(ｂ)について決定すること、そして
(ｄ)候補化合物の中から工程(ａ)のハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
【請求項１０】
ハイブリダイゼーションの作用をハイブリダイゼーションの作用に関連するシグナルを測定することにより決定して、その作用はＲＮＡ二次構造、ＲＮＡ三次構造、ＲＮＡ−リガンドの親和性、ＲＮＡのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドの立体配座変化、ＲＮＡ−リガンド認識の下流作用の効率、ＲＮＡのスプライシング、共有ＲＮＡ修飾、ＲＮＡの局在化、ＲＮＡの安定性、ＲＮＡの翻訳およびタンパク質の発現プロフィルにおける変化からなる群より選択される、請求項８または９に記載のアッセイ法。
【請求項１１】
ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求８〜１０のいずれか１項に記載のアッセイ法。
【請求項１２】
ＲＮＡ、リガンドおよびオリゴヌクレオチドが請求項３〜７のいずれかに記載されているものである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のアッセイ法。
【請求項１３】
高処理能力スクリーニングのための請求項８〜１２のいずれか１項に記載のアッセイ法の使用。
【請求項１４】
医薬品としての使用のための請求項８〜１３のいずれか１項に記載のアッセイ法により同定される薬剤。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法により同定される規定の確率閾値を超えて二次構造要素の熱力学的確率を変化させる、オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号１：  ＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＧ、
配列番号２：  ＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴ、
配列番号３：  ＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＡＣＡ、
配列番号４：  ＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣＣＣ、
配列番号５：  ＡＡＧＧＣＣＵＧＡＵＡＵＧＵＵＵＵＡＡＧ、
配列番号６：  ＡＡＵＡＵＡＡＡＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵ、
配列番号７：  ＵＡＧＡＧＣＣＣＣＵＡＧＧＧＣＵＵＡＣＡ、
配列番号８：  ＵＧＡＡＡＣＣＡＵＵＵＵＡＧＡＧＣＣＣＣ、
配列番号９：  ＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＣＣＧ、
配列番号１０：  ＴＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧ、
配列番号１１：  ＡＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＧＧＴ、
配列番号１２：  ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡ、
配列番号１３：  ＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡ、および
配列番号１４：  ＡＴＣＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡ
からなる群より選択される配列を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
任意の化学修飾を持つＲＮＡのもしくはＤＮＡ分子である、請求項１に記載の方法により同定されるオリゴヌクレオチドまたは請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ペプチド核酸もしくはロックド核酸分子である、請求項１に記載の方法により同定されるオリゴヌクレオチドまたは請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
調節ＲＮＡ−リガンド相互作用を操作するための請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２０】
遺伝子の発現を操作する、例えば遺伝子発現を増強するかまたは沈黙するための、請求項１５から１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
ＲＮＡ分子の安定性に影響するための請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
ＴＮＦα  ｍＲＮＡ安定性を増加させるための、請求項５に記載の方法により同定したオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２３】
ＴＮＦα発現を増加させるための、請求項５に記載の方法により同定したオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２４】
ＩＬ−２  ｍＲＮＡ安定性および／またはＩＬ−２遺伝子発現を増加させるための、配列番号１、２、３および４から選択されるオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２５】
ＴＮＦα  ｍＲＮＡ安定性および／またはＴＮＦα遺伝子発現を増加させるための、配列番号１４のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２６】
少なくとも一つの薬学的賦形剤に加えて、請求項８に記載のアッセイにより同定される薬剤もしくは請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
他の巨大分子のように、等しい配列ｓのＲＮＡ分子は、セットΣ(ｓ)により表示される、多くの異なる構造を形成し得る。Σ(ｓ)の中でそれぞれの二次構造ψについて、積重ね塩基対、ヘアピンループ、内部ループ、隆起および多分枝ループに対するエネルギーの寄与を合計することにより自由エネルギーＦ(ψ)(ランダムコイル構造に比べて)を計算することができる。これらの寄与は、実験的に決定されてきている(Mathews D. H. et al., J. Mol. Biol. 1999, 288 (5): 911-40)。構造は、構造の熱力学的平衡の集合の中で均等に分布されていないが、構造の頻度はその安定性(即ちその自由エネルギー)に依存して、次の式のように計算され得る:
【数１】
2007521813.tif 000001
(式中、
【数２】
2007521813.tif 000002
は、ＲＮＡ分子の分配関数であり、Ｔは温度であって、Ｒは一般気体定数である)。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
一つの態様において、本発明は、
(ａ)リガンド、例えばタンパク質、による認識に要求されるＲＮＡ分子の二次構造要素を規定することおよび選択すること、
(ｂ)当該ＲＮＡ二次構造の集合において工程(ａ)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(ｃ)少なくとも部分的に逆相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる当該ＲＮＡ二次構造の集合において工程(ａ)の二次構造要素の熱力学的確率を計算すること、
(ｄ)規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化するオリゴヌクレオチドを決定すること、
(ｅ)工程(ｄ)で決定したオリゴヌクレオチドを提供すること、ならびに任意に、
(ｆ)工程(ａ)の当該二次構造要素を含むＲＮＡを工程(e)のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、そして該二次構造要素の熱力学的確率への当該ハイブリダイゼーションの作用を決定すること
を含む調節ＲＮＡ−リガンド相互作用を調整する方法を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
さらなる態様では、本発明は以下のアッセイ法を提供する：
(Ｉ)ＲＮＡ分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定するアッセイであって、
(ａ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡを候補化合物の存在下においておよび不在下において規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化オリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(ｂ)当該候補化合物の存在下においておよび不在下において当該ＲＮＡの当該オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を決定すること、ならびに
(ｃ)ハイブリダイゼーションの作用を調整する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
(ＩＩ)ＲＮＡ分子のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定するアッセイ法であって、
(ａ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡを規定の確率閾値を超えて当該二次構造要素の熱力学的確率を変化するオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすること、
(ｂ)リガンドによる認識に必要な二次構造要素を含むＲＮＡをオリゴヌクレオチドのように同様な作用を有すると期待される候補化合物へハイブリダイズすること、
(ｃ)ハイブリダイゼーションの作用を工程(ａ)および(ｂ)について決定すること、ならびに
(ｄ)工程(ａ)のハイブリダイゼーションの作用を模倣する薬剤を同定すること
を含む、アッセイ法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
好ましい態様では、本発明のアッセイでのハイブリダイゼーションの作用を、ハイブリダイゼーションの作用に関連するシグナルを測定することにより決定して、その作用は、二次のＲＮＡ構造、三次のＲＮＡ構造、ＲＮＡ−リガンド親和性、ＲＮＡのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドのオリゴマー化もしくは多量体化、リガンドの立体配座変化、ＲＮＡ−リガンド認識の下流作用の効率、ＲＮＡのスプライシング、共有ＲＮＡ修飾、ＲＮＡの局在化、ＲＮＡの安定性、ＲＮＡの翻訳およびタンパク質の発現プロフィルにおける変化からなる群より選択される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
そのようなアッセイは、本発明のオリゴヌクレオチドを候補化合物の存在下もしくは不在下において興味のあるＲＮＡにハイブリダイズすることおよび当該作用を調整するかもしくは模倣する薬剤を同定するために当該ハイブリダイゼーションの作用に関連する表現型読み出しを測定することにより実現され得る。当該ハイブリダイゼーションの作用は、上記に説明されるように表現型読み出しに関連するシグナルを測定することにより例えば決定される。例えば、ｍＲＮＡ調節のレベルにおいてＡＲＥ制御遺伝子を薬物可能にするために、当該アッセイを使用することができる。本発明のオープナーもしくはクローザーに強く関連するかもしくは似ているｍＲＮＡ構造の変化を誘発するために、細胞が小分子のＲＮＡ類またはタンパク質のようなモジュレーターを使用することを想定して、本発明のオープナーもしくはクローザーを使用して、標的特異性ｍＲＮＡの安定性アッセイをデザインし得る。本発明のオープナーを用いる例示的アッセイ原理を図１１および１２に図示している。オープナーは、蛍光強度、寿命もしくは蛍光共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)の測定のような、標準的な蛍光分光方法により例えば検出される、構造の転位に至る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
図４：ＩＬ−２オープナーはＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのインビトロのＨｕＲ親和性を増加する
組換えＨｕＲのＩＬ−２  ３'ＵＴＲへの見かけの親和性をオープナーの存在下および不在下において１Ｄ−ＦＩＤＡ検出で決定する。全ての４個の試験されたＩＬ−２特異的オープナーは、見かけの解離定数Ｋｄａｐｐ(Ｏｐ１有りで：Ｋｄａｐｐ＝１１.８０±１.４８ｎＭ；Ｏｐ２有りで：Ｋｄａｐｐ＝１８.９１±１.９１ｎＭ；Ｏｐ３有りで：Ｋｄａｐｐ＝８.３８±１.１８ｎＭ；Ｏｐ４有りで：Ｋｄａｐｐ＝１９.５２＋／−２.２０ｎＭ；オープナー無しで：Ｋｄａｐｐ＝３２.７７±４.４８ｎＭ；０.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ；それぞれ、２５、２５、５および１ｎＭでのオープナー)の減少により反映された、ＩＬ−２  ３'ＵＴＲとのＨｕＲの会合を強化する。負の対照オリゴヌクレオチドのＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのハイブリダイゼーションは、ＨｕＲとの相互作用を影響を受けないままにする(Ｎ１有りで：Ｋｄａｐｐ＝３２.９１±６.３４ｎＭ；Ｎ２有りで：Ｋｄａｐｐ＝３２.７７±３.７２ｎＭ、２５ｎＭ濃度でのＮ１およびＮ２)(Ａ)。オープナーのハイブリダイゼーションにより誘発される親和性の増加は、０.３８ｎＭのオープナー濃度で最大半減飽和を持つ飽和カーブを示している(Ｏｐ３ハイブリダイゼーションの見かけの親和性＝１３４(±５４)ｐＭ)。開かれたＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのＨｕＲ結合の見かけの親和性は、両方が１.５６ｎＭで、８.５７±１.３３ｎＭのＫｄａｐｐにおいて最大値に近づいている(全ての実験において０.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ)(Ｂ)。Ｏｐ１の存在下においては、解離定数は、オープナーの濃度が増加するにつれて１.５６ｎＭのＯｐ１濃度において、Ｋｄａｐｐ＝１１.８０±１.４８ｎＭの最小値に減少している(全ての実験において２.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ)。Ｏｐ１については、この最適値を超えて濃度を増加させることは、作用を逆戻りさせて、解離定数が再び増加する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
図９：ＴＮＦ−αオープナーはＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへのインビトロのＨｕＲ親和性を増加する
組換えＨｕＲのＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへの見かけの親和性をオープナー、クローザーもしくは負の対照オリゴヌクレオチドの存在下においておよび不在下において１Ｄ−ＦＩＤＡアッセイで決定する。ＴＮＦ−αのクローザーＣｌＴは、見かけの解離定数Ｋｄａｐｐの増加により反映された、ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲとのＨｕＲの会合を明らかに低減する。作用は、クローザーの濃度と相関している。作用は、最高のクローザーの濃度で２.５倍までのＫｄの増加(ＣｌＴ有りで：Ｋｄａｐｐ＝１３.８０±２.４１ｎＭ、クローザー無しで：Ｋｄａｐｐ＝５.６３±０.８７ｎＭ)をもって最高値に近づいている(Ａ)。オープナーのＯｐＴは、ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへのＨｕＲの親和性を２倍まで増加して(Ｂ)、それは計算で予測された作用と良好な整合性にある(図８)。しかしながら、０.５ｎＭ以上のオープナーの濃度では、作用は、増加した解離定数に向かって再び逆戻りする。負の対照オリゴヌクレオチドＮＴとのハイブリダイゼーションは、実験の全体の濃度範囲に亘ってＨｕＲ−ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの親和性に影響を及ぼさない(Ｃ)。ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの濃度は、全ての実験において１ｎＭである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
図１２：オープナーをベースにするインビトロアッセイのデザインＩＩ：ＨｕＲ結合
これに代えて、アッセイ戦略をｍＲＮＡ上でおよびＨｕＲ上で二つの蛍光体の間のエネルギー転移を測定することによりＨｕＲ結合事象の検出へシフトし得る。ｍＲＮＡのラベルは、(Ａ)３'末端に共役的に付着させる(例えば、Qin P. Z. et al., Methods, 1999, 18 (1): 60-70の中に記載されているように)もしくは(Ｂ)オープナーのオリゴヌクレオチドを介して導入されるかのいずれかであり得る。この設定では、オープナーにより誘発される立体配座の転位を、引き続く工程である、ＨｕＲ  ｍＲＮＡ会合の測定により間接的に決定する。それ故に、ＨｕＲ阻害剤は、ｍＲＮＡの立体配座に作用する化合物と同一のシグナルを生成して、適切な対向スクリーニングにおいて選別される必要があるであろう。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
(実施例)
実施例Ａ―実験プロトコル
ａ)蛍光的に標識したＲＮＡの作製。公表された手順[例えば、Chaix C. et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 1989, (21): 45-6; Scaringe S. A. et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18 (18): 5433-41、を参照]および製造業者のプロトコルを採用して、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−Ｏ−トリイソプロピルオキシメチルで保護されたβ'−シアノエチル−(Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−)ヌクレオチド  ホスホラミダイト(Glen Research)を用いる394A合成機(Applied Biosystems)の上で、５'−アミノ−Ｃ６で修飾されたＲＮＡを合成する。ＯＲＮを支持体から開裂し、塩基で、ホスフェートでおよび２'で脱保護して、標準的プロトコルに従って変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。参考文献(Gray D. M. et al., Methods in Enzymology 1995, 246: 19-34)にしたがって決定して、２６０ｎｍにおける正確な分子吸光係数を用いて、ブーゲ−ランベルト−ベーアの法則にしたがって２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収から、ＲＮＡの濃度を計算する。解析ＲＰ−ＨＰＬＣ分析(VYDAC  Ｃ１８カラム、５μｍ、３００Å、４.６ｍｍ×２５０ｍｍ、４５分で０〜５０％ＣＨ３ＣＮの勾配溶出でもってＴＥＡＡｃ(０.１Ｍ、ｐＨ７.０)の中で、２６０ｎｍにおけるＵＶ検出)にしたがって、全てのＯＲＮ類は＞９９％純粋である。第一級アミンのサクシニミジルエステルで活性化した蛍光体との標準的反応で、ＴＭＲ(Molecular Probes)を５'アミノリンカーに付着して、安定なカルボキサミドを形成する。未反応の染料を、ヒドロキシルアミン塩酸塩の添加により加水分解する。標識ＲＮＡをゲルろ過により遊離の染料から分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより未標識ＲＮＡから精製して、上で説明されるように、ＵＶ吸収分光法によるが、２６０ｎｍにおける染料の吸収を補正して、濃度を決定する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ(T7 MEGASCRIPTインビトロ転写キット、Ambion)を持つｄｓＤＮＡテンプレートからの流出転写により、３'ＵＴＲ類を作製する。ＩＬ−２およびＴＮＦ−α(ＩＬ−２：ｎｔ  ７０７−１０３５、ＴＮＦ−α：ｎｔ  ８７２−１５６８、それぞれ、GenBank受け入れ番号ＮＭ＿０００５８９およびＮＭ＿０００５９４)の３'ＵＴＲ類を包含しているプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅の間に転写テンプレートの中に、Ｔ７プロモーターを組み込む。本質的に参考文献(Qin P. Z. et al., Methods 1999, 18 (1): 60-70)に記載されているように、転写物をＮa(ｍ−)ＩＯ４で３'末端で酸化して、ヒドラジドで活性化されたＣｙ３(AP Biotech)に結合する。生成物を合成ＯＲＮ類について説明したように、ＲＰ−ＨＰＬＣにより引き続いて精製し、脱塩して、ゲルろ過により水溶液の中に移す。２６０ｎｍにおける染料の吸収を補正するＵＶ／ＶＩＳ吸収分光法によるＣｙ３のおよびＲＮＡの濃度の決定により、１：１の標識付け化学量論を制御する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
組換えヒトＨｕＲの作製。全長ＨｕＲ(アミノ酸１〜３２６、RefSeq受け入れ：ＮＰ＿００１４１０)のためのコード化配列を、活性化ヒトリンパ球から作製されるｃＤＮＡから増幅する。ベクターｐＴＸＢ１(IMPACT[登録商標]−CNシステム、New England Biolabs)のＮｄｅｌおよびＳａｐｌ部位の中に、生成物を指向性にクローン化して、さらに別のアミノ酸の挿入無しでインテイン−キチン結合ドメインタグとのＣ末端融合を許容する。ＩＰＴＧ(１ｍＭ、２８°で６時間)との誘導時に大腸菌のER2566(New England Biolabs)の中で融合タンパク質を発現する。Ｔｒｉｓ／Ｃｌの緩衝液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、２０ｍＭ、ｐＨ８.０)、ＮａＣｌ(８００ｍＭ)、ＥＤＴＡ(１ｍＭ)およびPluronic F−127(０.２％ｗ／ｖ、Molecular Probes)の中の連続的凍結／解凍により、細菌の細胞を溶菌する。ＤＮＡ消化の後で、溶菌液を超遠心分離により透明にして、融合タンパク質をキチンアガロースビーズ(New England Biolabs)の上に捕獲する。溶菌緩衝液での大量の洗浄の後で、１２時間４°で２−メルカプトエタンスルホン酸でのインテインタグのチオールで誘発するカラム上の自己スプライシング[例えば、Cantor E. J. et al., Protein Expr. Purif. 2001, 22 (1): 135-40、を参照]により、組換えタンパク質を回収する。いかなる共溶出されたインテインタグおよび未開裂の融合タンパク質を、第二の減法親和性工程で溶出液から除去する。タンパク質を、ゲルろ過(ＤＧ−１０カラム、Bio−Rad)により保存緩衝液(Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４(２５ｍＭ)ｐＨ７.２、ＮａＣｌ(８００ｍＭ)、Pluronic F−127(０.２％ｗ／ｖ))の中に移し、液体窒素の中で小アリコートにショック凍結をして、−８０°で保存する。これらの条件下では、全長ＨｕＲは、更に高度の凝集状態の存在無しで可溶性であって(分析用サイズ排除クロマトマトグラフィー)、ＲＲＭドメインについての特徴的なＣＤスペクトル(Manival X. et al., Nucleic Acids Res. 2001, 29 (11): 2223-30)を示している。タンパク質は、ＬＣ／ＥＩ−ＭＳの、ＲＰ−ＨＰＬＣのおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析にしたがって＞９９％純粋である。Ｎ末端シークエンシングは、定量的にＭｅｔ１が欠落している正確なＮ末端を明らかにしている。濃度の正確な決定のために、精製されたＨｕＲを凍結乾燥し、塩酸グアニジニウム(６Ｍ)中に溶解して、濃度を参考文献(Gill S. C. et al., Anal. Biochem. 1989, 182 (2): 319-26を参照)にしたがってＵＶ分光法により測定する。この溶液を、ＲＰ−ＨＰＬＣの定量化によるＨｕＲ濃度の測定のための外部標準として使用する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
２Ｄ−ＦＩＤＡ−異方性ＨｕＲ−ＲＮＡ結合アッセイ。蛍光的に標識されたＲＮＡを、アッセイ緩衝液(ＰＢＳ、Pluronic F−127(０.１％ｗ／ｖ)、ＭｇＣｌ２(５ｍＭ))の中で２分間８０°で変性し、室温に冷却することにより(−１.１３℃／秒)再折りたたみ、０.５ｎＭに希釈すると、それは、記述された設定(Ecotec BA, 2001, 2D-FIDA Quick Guide, Hamburg)において共焦点容積の中で＜１の蛍光粒子の平均を保証する。それぞれの試料の中の正確な濃度を、点広がり関数(EVOTEC BioSystems, 2001)に対する調整パラメーターにより与えられるように、平行のＦＣＳ評価から誘導される粒子数および共焦点容積のサイズに基づいて決定する。蛍光的に標識されたＲＮＡを、増加する濃度の組換えＨｕＲに対して滴定する(少なくとも１１個の滴定点)。それぞれの測定に先立って、少なくとも１５分間室温で、ＨｕＲ−ＲＮＡの試料をインキュベートする。
ＰＬＣの定量化によるＨｕＲ濃度の測定のための外部標準として使用する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
２Ｄ−ＦＩＤＡでの蛍光異方性の決定により真の平衡条件下に、ＨｕＲ−ＲＮＡの複合体形成をモニターする。EvotecOAI PickoScreen機器の上で９６穴のガラス底マイクロタイタープレート(Whatman)の中で環境温度(２３.５°で一定)で、測定を実施する。Olympusの倒立顕微鏡IX70をベースにする機器は、二つの蛍光検出器、蛍光発光経路の中で偏光ビームスプリッターおよび励起経路の中でさらに別の直線偏光フィルターを備えている。ＨｅＮＥレーザー(λ＝５４３ｎｍ、レーザー出力＝４９５μＷ)を蛍光励起に使用する。励起レーザー光を、ＯＤ＝５を持つ干渉バリヤーフィルターにより光学検出経路からブロックする。アッセイ緩衝液中のＴＭＲの０.５ｎＭ溶液を、共焦点ピンホール(７０μｍ)の調整のためにおよび機器のＧ因子の決定(Lakowitcz J. R. 「蛍光分光法の原理、第２版」(Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2 ed.)、New York, 1999, Plenum Pubisihers)のために使用する。１０回のＦＩＤＡ測定を、それぞれの穴について１０秒の測定時間および４０μ秒の滞留時間で実施する。分子輝度ｑを、ＦＩＤＡアリゴリズム(Kask P. et al., Biophys.J. 2002, 78 (4): 1703-13)を用いて、それぞれの偏光チャネルについての２Ｄ−ＦＩＤＡの粗データから抽出する。適切なパラメーター：緩衝液の別々の測定で決定されるように、両方のチャネルの中でのバックグランド強度(普通は約０.５ｋＨｚ)、ＴＭＲでの調整測定で決定されるように、共焦点容積パラメーターＡ０およびＡ１(普通はＡ０約−０.４およびＡ１約０.０８)、単一の成分適合。異方性γを、平行のおよび垂直の偏光についての分子輝度から方程式[Ｖ](Lakowicz, 1999、上を参照)により計算して、１０回の連続の測定から平均する。
【数９】
2007521813.tif 000003
式中、ｑＩＩ、ｑ⊥は：平行のおよび垂直の偏光チャネルの中の分子輝度で、Ｇは機器のＧ因子を意味する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
１Ｄ−ＦＩＤＡ  ＨｕＲ  ｍＲＮＡ結合アッセイ。標識されたｍＲＮＡもしくは３'ＵＴＲを、アッセイ緩衝液(ＰＢＳ、Pluronic F−127(０.１％ｗ／ｖ)、ＭｇＣｌ２(５ｍＭ))の中で２分間８０°で熱的に変性して、室温に冷却することにより(−１.１３℃／秒)再折りたたみする。オープナー、クローザーもしくは負の対照のＯＲＮ類(MWG Biotech、配列は表１を参照)を、０.５および１００ｎＭの間の最終濃度に加える。Ｃｙ３で標識されたｍＲＮＡの最終濃度は０.５ｎＭであって、正確な粒子数を、２Ｄ−ＦＩＤＡ異方性測定について説明されているように、決定する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
標識されたｍＲＮＡを、オープナーもしくは負の対照のＯＲＮ類の存在下および不在下において増加する濃度のＨｕＲに対して滴定する。ＲＮＡへのＨｕＲ結合により誘発されるＣｙ３の分子輝度の変化の決定によるＩＤ−ＦＩＤＡで、ＨｕＲ−ｍＲＮＡの複合体形成をモニターする。ＨｅＮｅレーザー(λ＝５４３ｎｍ、レーザー出力＝４９５μＷ)を蛍光励起に使用して、光学的な設定は、光学的経路の中で、一つの検出チャネルのみを使用して、偏光ビームスプリッターを何も使用しない、２Ｄ−ＦＩＤＡ異方性測定についての設定と類似している。ＦＩＤＡアリゴリズムを用いて、１Ｄ−ＦＩＤＡの粗データから、分子輝度ｑを抽出して、２０回の連続の測定(それぞれ１０秒)から平均する。蛍光強度測定に適応される、方程式[ＶＩ]に類似の方程式に基づいて、分子輝度データを適合する。
【数１１】
2007521813.tif 000004
ｑｍｉｎ：遊離ＲＮＡの分子輝度、ｑｍａｘ：ＲＮＡ  ＨｕＲ複合体の分子輝度、ｑ：与えられるＨｕＲ０のおよびＲＮＡ０の濃度での定常状態平衡についての平均分子輝度。全ての提示されたデータは、少なくとも三回の独立した実験からの平均である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
【図４】ＩＬ−２オープナーはＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのインビトロのＨｕＲ親和性を増加する；組換えＨｕＲのＩＬ−２  ３'ＵＴＲへの見かけの親和性をオープナーの存在下および不在下において１Ｄ−ＦＩＤＡ検出で決定する。全ての４個の試験されたＩＬ−２特異的オープナーは、見かけの解離定数Ｋｄａｐｐ(Ｏｐ１有りで：Ｋｄａｐｐ＝１１.８０±１.４８ｎＭ；Ｏｐ２有りで：Ｋｄａｐｐ＝１８.９１±１.９１ｎＭ；Ｏｐ３有りで：Ｋｄａｐｐ＝８.３８±１.１８ｎＭ；Ｏｐ４有りで：Ｋｄａｐｐ＝１９.５２＋／−２.２０ｎＭ；オープナー無しで：Ｋｄａｐｐ＝３２.７７±４.４８ｎＭ；０.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ；それぞれ、２５、２５、５および１ｎＭでのオープナー)の減少により反映された、ＩＬ−２  ３'ＵＴＲとのＨｕＲの会合を強化する。負の対照オリゴヌクレオチドのＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのハイブリダイゼーションは、ＨｕＲとの相互作用を影響を受けないままにする(Ｎ１有りで：Ｋｄａｐｐ＝３２.９１±６.３４ｎＭ；Ｎ２有りで：Ｋｄａｐｐ＝３２.７７±３.７２ｎＭ、２５ｎＭ濃度でのＮ１およびＮ２)(Ａ)。オープナーのハイブリダイゼーションにより誘発される親和性の増加は、０.３８ｎＭのオープナー濃度で最大半減飽和を持つ飽和カーブを示している(Ｏｐ３ハイブリダイゼーションの見かけの親和性＝１３４(±５４)ｐＭ)。開かれたＩＬ−２  ３'ＵＴＲへのＨｕＲ結合の見かけの親和性は、両方が１.５６ｎＭで、８.５７±１.３３ｎＭのＫｄａｐｐにおいて最大値に近づいている(全ての実験において０.５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ)(Ｂ)。Ｏｐ１の存在下においては、解離定数は、オープナーの濃度が増加するにつれて１.５６ｎＭのＯｐ１濃度において、Ｋｄａｐｐ＝１１.８０±１.４８ｎＭの最小値に減少している(全ての実験において２．５ｎＭでのＩＬ−２  ３'ＵＴＲ)。Ｏｐ１については、この最適値を超えて濃度を増加させることは、作用を逆戻りさせて、解離定数が再び増加する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
【図９】ＴＮＦ−αオープナーはＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへのインビトロのＨｕＲ親和性を増加する；組換えＨｕＲのＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへの見かけの親和性をオープナー、クローザーもしくは負の対照オリゴヌクレオチドの存在下においておよび不在下において１Ｄ−ＦＩＤＡアッセイで決定する。ＴＮＦ−αのクローザーＣｌＴは、見かけの解離定数Ｋｄａｐｐの増加により反映された、ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲとのＨｕＲの会合を明らかに低減する。作用は、クローザーの濃度と相関している。作用は、最高のクローザーの濃度で２.５倍までのＫｄの増加(ＣｌＴ有りで：Ｋｄａｐｐ＝１３.８０±２.４１ｎＭ、クローザー無しで：Ｋｄａｐｐ＝５.６３±０.８７ｎＭ)をもって最高値に近づいている(Ａ)。オープナーのＯｐＴは、ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲへのＨｕＲの親和性を２倍まで増加して(Ｂ)、それは計算で予測された作用と良好な整合性にある(図８)。しかしながら、０.５ｎＭ以上のオープナーの濃度では、作用は、増加した解離定数に向かって再び逆戻りする。負の対照オリゴヌクレオチドＮＴとのハイブリダイゼーションは、実験の全体の濃度範囲に亘ってＨｕＲ−ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの親和性に影響を及ぼさない(Ｃ)。ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲの濃度は、全ての実験において１ｎＭである。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
【図１２】オープナーをベースにするインビトロアッセイのデザインＩＩ：ＨｕＲ結合；これに代えて、アッセイ戦略をｍＲＮＡ上でおよびＨｕＲ上で二つの蛍光体の間のエネルギー転移を測定することによりＨｕＲ結合事象の検出へシフトし得る。ｍＲＮＡのラベルは、(Ａ)３'末端に共役的に付着させる(例えば、Qin P. Z. et al., Methods, 1999, 18 (1): 60-70の中に記載されているように)もしくは(Ｂ)オープナーのオリゴヌクレオチドを介して導入されるかのいずれかであり得る。この設定では、オープナーにより誘発される立体配座の転位を、引き続く工程である、ＨｕＲ  ｍＲＮＡ会合の測定により間接的に決定する。それ故に、ＨｕＲ阻害剤は、ｍＲＮＡの立体配座に作用する化合物と同一のシグナルを生成して、適切な対向スクリーニングにおいて選別される必要があるであろう。