【手続補正書】
【提出日】平成18年12月22日(2006.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素原子数３０〜１２０の炭素原子から本質的になる閉殻構造の炭素化合物がポリマー鎖により被覆された微小粒子の複合体であって、
該微小粒子が、第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントおよびポリ（エチレングリコール）鎖セグメントを含んでなるブロックコポリマーに由来し、かつ、前者のセグメントをコアとし、後者のセグメントをシェルとする構造物内に該炭素化合物が封入されたものであることを特徴とする微小粒子の複合体。
【請求項２】
２５℃の蒸留水における溶解度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上である、請求項１記載の微小粒子の複合体。
【請求項３】
第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントが、一般式（Ａ）：
【化１】
2005225772.tif 000001
［式中、Ｒ1aは水素原子またはＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ2aおよびＲ3aは独立してＣ1-6アルキル基を表すか、またはＲ2aおよびＲ3aは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、さらなる窒素原子１もしくは２個、酸素または硫黄原子１個を含んでいてもよい５もしくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｘは−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、そして
ｐは２〜６の整数である。］で表されるモノマーに由来し、そして２５℃の蒸留水における溶解度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上である、請求項１に記載の微小粒子の複合体。
【請求項４】
ブロックコポリマーが、一般式（Ａ−１）：
【化２】
2005225772.tif 000002
［式中、Ｒ1は水素原子またはＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1-6アルキル基を表すか、またはＲ2およびＲ3は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、さらなる窒素原子１もしくは２個、酸素または硫黄原子１個を含んでいてもよい５もしくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｘ′は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、そして
ｐ′は２〜６の整数であり；
ＬはＣ1-6アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｙは水素原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アセタール化ホルミル基またはホルミル（もしくはアルデヒド）基を表し、
ｍは１〜１０，０００の整数であり、
ｎは１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である］で表される請求項１〜３のいずれか１項に記載の微小粒子の複合体。
【請求項５】
炭素化合物が炭素原子のみからなるＣ30-120フラーレンである請求項１〜４のいずれか１項に記載の微小粒子の複合体。
【請求項６】
炭素原子数３０〜１２０の炭素原子から本質的になる閉殻構造の炭素化合物および第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントおよびポリ（エチレングリコール）鎖セグメントを含んでなるブロックコポリマーを双極性非プロトン性溶媒に溶解、混合し、次いで分画分子量が１２０００〜１４０００である透析膜を介して水性溶媒に対して透析することにより、形成された該炭素化合物がブロックコポリマー由来の構造物内に封入された微小粒子を取得すること、を特徴とする請求項１に記載の微小粒子の複合体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかの１項に記載の微小粒子の複合体を有効成分とする活性酸素消去剤。
【請求項８】
食品、医療または皮膚科学的もしくは化粧品の分野で使用するものである請求項７記載の活性酸素消去剤。
【請求項９】
炭素原子数３０〜１２０の炭素原子から本質的になる閉殻構造の炭素化合物がポリマー鎖により被覆された微小粒子の複合体であって、
該微小粒子が、第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントおよびポリ（エチレングリコール）鎖セグメントを含んでなるブロックコポリマーに由来し、かつ、前者のセグメントをコアとし、後者のセグメントをシェルとする構造物内に該炭素化合物が封入されており、かつ該炭素化合物の閉殻構造内に金属元素もしくはそのイオン形態にある金属の超微小粒子が内包されたものであることを特徴とする微小粒子の複合体。
【請求項１０】
金属元素もしくはそのイオン形態にある金属が常磁性金属である請求項９に記載の微小粒子の複合体。
【請求項１１】
常磁性金属が、ガドリニウム、ユウロピウム、テルビウムおよびエルビウムからなる群より選ばれる元素に由来するものである請求項１０に記載の微小粒子の複合体。
【請求項１２】
第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントが、一般式（Ａ）：
【化３】
2005225772.tif 000003
［式中、Ｒ1aは水素原子またはＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ2aおよびＲ3aは独立してＣ1-6アルキル基を表すか、またはＲ2aおよびＲ3aは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、さらなる窒素原子１もしくは２個、酸素または硫黄原子１個を含んでいてもよい５もしくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｘは−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、そして
ｐは２〜６の整数である。］で表されるモノマーに由来する請求項９〜１１のいずれかの１項に記載の微小粒子の複合体。
【請求項１３】
ブロックコポリマーが、一般式（Ａ−１）：
【化４】
2005225772.tif 000004
［式中、Ｒ1は水素原子またはＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1-6アルキル基を表すか、またはＲ2およびＲ3は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、さらなる窒素原子１もしくは２個、酸素または硫黄原子１個を含んでいてもよい５もしくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｘ′は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、そして
ｐ′は２〜６の整数であり；
ＬはＣ1-6アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｙは水素原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アセタール化ホルミル基またはホルミル（もしくはアルデヒド）基を表し、
ｍは１〜１０，０００の整数であり、
ｎは１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である］で表される請求項１２に記載の微小粒子の複合体。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載の微小粒子の複合体を有効成分とする造影剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、黒鉛やダイヤモンドを除く、炭素原子数３０〜１２０からなる閉殻構造の炭素化合物がブロックコポリマーに由来する構造物（またはポリマーミセル）内に封入された微小粒子の複合体、該微小粒子にさらに金属の超微小粒子が内包されている微小粒子の複合体、並びにこれらの複合体の使用に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
さらに、フルオロアルキル鎖が末端に付加されたアクリロイルモルホリンオリゴマーまたはＮ、Ｎ−ジメチルアクリルアミドオリゴマー等の水溶液中にフラーレンを加えて十分に攪拌すると、可溶化されたフラーレンの量が約１００μｇ／ｍｌとなる自己組織化物（自己アセンブリー）が得られることが報告されている（非特許文献１参照）。また、本発明者らはＣ60フラーレンを、親水性ポリマー鎖セグメントとしポリ（エチレングリコール）鎖を有し、かつ、機能性ポリマー鎖として第三級アミノ基を側鎖に担持する特定のブロックコポリマーの水溶液中に加え、十分に攪拌することにより、Ｃ60フラーレンを水に対して可溶化できることを報告した（非特許文献２参照。）。
【特許文献１】特開平７−０４８３０２号公報
【特許文献２】特開平８−１４３４７８号公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，（２００３），１−３
【非特許文献２】第５２回（２００３年）高分子討論会 高分子学会予稿集  １１２頁
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
他方、かような炭素化合物を封入した構造物（またはポリマーミセル）を形成しうるブロックコポリマーは、親水性ポリマー鎖セグメントとして、ポリ（エチレングリコール）に由来するセグメントを含み、そして第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントとを含み、本発明の目的、例えば、Ｃ30〜Ｃ120フラーレンを効率よく水に対して可溶化しうるものであれば如何なる分子種であってもよい。しかし、好ましくは、一般式（Ａ）：
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
［式中、Ｒ1は水素原子またはＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1-6アルキル基を表すか、またはＲ2およびＲ3は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、さらなる窒素原子１もしくは２個、酸素または硫黄原子１個を含んでいてもよい５もしくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｘ′は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、そして
ｐ′は２〜６の整数であり；
ＬはＣ1-6アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｙは水素原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アセタール化ホルミル基またはホルミル（もしくはアルデヒド）基を表し、
ｍは１〜１０，０００の整数であり、
ｎは１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である］
で表されるブロックコポリマーを、本発明で都合よく使用できる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
炭素化合物を封入した構造物（またはポリマーミセル）は、上記のようなブロックコポリマーにより該炭素化合物の表面が充分に被覆され、そして該炭素化合物を水に対して可溶化するように構成されている物体を意味する。限定されるものでないが、このような構造物は、炭素化合物をコアとして封入しうるようにブロックコポリマーの第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントで内部もしくは中心部を構成し、そしてポリ（エチレングリコール）鎖セグメントが外部を覆うように、水性媒体中でブロックコポリマー分子が会合した分子集合体であることが好ましい（なお、このような分子集合体を、本明細書では、ポリマーミセルとも称することもある。）。上記および本明細書において使用する、水性媒体は、水、水と混和しうる有機溶媒（例えば、エタノール、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、等）と水の混合溶液、水または該混合溶液に、さらに、緩衝剤および／または浸透圧調整剤を含んでいてもよい、溶液を意味することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
かかる製造方法において使用できる、双極性非プロトン性溶媒としては、上記のように高い溶解度を提供できるものであれば、種類を問うことなく使用できるが、好ましくは、ＤＭＦおよびＤＭＳＯを挙げることができる。まず、このような溶媒中にフラーレンを初めとする炭素化合物とブロックコポリマーと溶解させる。溶解させる順序は、炭素化合物、次いでブロックコポリマーを、その逆に、ブロックコポリマー、次いで炭素化合物を、それぞれ順に溶解させるか、あるいは両者を同時に溶解させてもよい。溶解に際し、必要に応じて溶媒の沸点まで加温してもよいが、室温で処理してもよい。また、溶解および混合する際に、溶液を超音波処理してもよい。こうして得られる溶液は必要に応じて、不溶物を濾過により除去した後、室温で一定時間（数時間ないし一晩）静置する。その後、所望の分画分子量の透析膜を介して、水、好ましくは蒸留水に対して透析する。透析は、通常、非処理溶液に対して約１０倍以上の水に対して２時間、３回以上行い、最後は終夜で透析する。また、分画分子量１２０００−１４０００の透析膜を使用するのが好ましく、さらに、透析膜は、使用前に蒸留水を用いて十分に膨潤させておくのがよい。上記の操作は、いずれも室温で実施できるが、必要により、冷却下（例えば、０〜５℃）、または加温下（４０〜８０℃）で行うこともできる。こうして、炭素化合物がポリマーミセル内に封入された微小粒子の複合体であって、室温、例えば２５℃の蒸留水に対する溶解度が、５００μｇ／ｍｌ以上の複合体が、効率よく得られる。炭素化合物およびブロックコポリマーの混合液中での濃度は、使用溶媒に溶解できる限り、限定されないが、通常、溶液の体積当り、炭素化合物は、０．００１ｗｔ％〜１０ｗｔ％  の範囲ないで、ブロックコポリマーは、０．００１ｗｔ％〜２ｗｔ％の範囲内で使用するのが好都合である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
したがって、上述した、該炭素化合物の閉殻構造内に金属元素もしくはそのイオン形態にある金属の超微小粒子が内包されていることも特徴とする微小粒子の複合体、も別の態様の本発明として提供される。かような金属は、水性媒体に対して可溶化できることにより有用性が高まる技術分野、例えば、医療、診断、食品、の技術分野で使用されているものであれば、如何なるものであってもよい．したがって、疾病もしくは生体の何らかの器官の傷害の検診または診断において使用する造影剤として使用されている金属、例えば、ガドリニウム（Ｇｄ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）およびエルビウム（Ｅｒ）からなる群より選ばれる元素に由来する常磁性金属、その他、亜鉛、銅、マグネシウム、鉄、白金、等の酸化物を提供しうる元素に由来する金属、等が本発明にいう金属として使用される。これらの金属は、イオンの形態であることもできる。また、これらの金属は超微小粒子に状態で炭素化合物に内包されることができるが、超微小粒子とは、典型的には、上記のフラーレンに内包されうるサイズのものをいう。このような、金属が内包されたフラーレンは、一部は市販されており、それらをそのまま使用できるが、それ自体公知の方法、上記特許文献２に記載されているように、例えば、目的とする金属の酸化物を、グラファイトとともに、高温高圧下でレーザー蒸発させること等により得ることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
精製したポリマーの分子量はＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝４，５００／５，５００であった。
＜複合体の製造例１＞  透析法による水中でのフラーレンの分散安定化
Ｃ60フラーレン：アセタール−ＰＥＧ−ＰＡＭＡブロックコポリマー（ＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝４，５００／５，５００）の混合比（Ｆ：Ｐ）が１：０、１：０．５、１：１となるように溶媒ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２５ｍＬ中にフラーレン１ｍｇ、ブロックコポリマー１３．８ｍｇを加え（Ｆ：Ｐ＝１：１の場合）、６時間超音波処理を行った後、一晩静置した。その後、蒸留水で一晩膨潤させた分画分子量１２０００−１４０００の透析膜中に溶液を入れ、透析を行った（水交換３回）。こうして得られた３０ｍＬのフラーレン内包微小粒子の溶液の溶媒を凍結乾燥により除去し、その後蒸留水５ｍＬ加え、再分散させた。その後、再度ＤＬＳ測定を行った。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
こうして濃縮後の溶液はフラーレン特有の黒褐色を呈した。ブロックコポリマー非存在下では濃縮によって濁度を生ずるものの、本発明に従う複合体では凍結乾燥後にも極めて容易に水中に分散溶解した。混合比がＦ：Ｐ＝１：１、１：０．５のものを再度ＤＬＳ測定を行ってみたところ、濃縮再分散を行う前よりはフォトンカウントが増加したが、以前測定した値に比べて十分なフォトンカウントを得ることができなかった。このようにこの条件で調製したフラーレン粒子は光散乱で検出できる粒径（およそ３ｎｍ）以下のほぼ分子状分散に近い形で分散している。
＜複合体の製造例２＞  バブリング蒸発法による水中でのＣ60フラーレンの分散安定化  フラーレン１ｍｇを塩化メチレン溶媒２５ｍＬに混ぜ、超音波をかけることで塩化メチレン中に溶解させた。その後、アセタール−ＰＥＧ−ＰＡＭＡブロックコポリマー（ＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝４，５００／５，５００）１３９ｍｇを溶媒に入れ、超音波を２時間かけた後、一晩静置した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
このようにして調製した塩化メチレン溶液をアルゴンバブリングをしている蒸留水４０ｍＬに滴下していった。こうして調製した溶液は、実施例１に記載のものと同様に、淡黄色の透明溶液を与える微小粒子の複合体を提供した。得られた水中分散安定化フラーレン複合体の溶液のＤＬＳ測定を行った結果、粒径１７０ｎｍ程度のナノ粒子が形成されていることが確認できた。
＜複合体の製造例＞  高濃度フラーレン水溶液の製造例
Ｃ60フラーレン１００ｍｇを１５０ｍＬのＤＭＦ溶液に室温下で混合し、超音波処理を３時間施した。その後、溶液を０．４５μｍ（ミリポア社製）の疎水性フィルターで溶媒に不溶な物質を除去し、次いで溶媒に対してポリマー濃度が５ｍｇ／ｍｌになるようにアセタール−ＰＥＧ−ＰＡＭＡブロックコポリマー（ＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝５，０００／５，９００）を加えて一晩静置した。その後、蒸留水に一晩膨潤させた分画分子量１２０００−１４０００の透析膜製のバッグに溶液を入れ、ＤＭＦ：蒸留水（１５０：２０００）２リットルに対して透析を行った（水交換：５回、２、４、６、８、１０時間目に交換、２４時間後に回収）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
その後、透析処理済の溶液を凍結乾燥し、粉末にした後、そのサンプルを４００μＬの蒸留水を用いて再溶解させ、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトル測定を行い、フラーレンの吸光度から溶解度を算出したところ、２．９ｍｇ／ｍＬという高濃度でフラーレンを水中に可溶化することができた。
＜フラーレン封入微小粒子の複合体の活性酸素の消去作用の確認＞
スピントラップ剤である５，５−ジメチルー１−ピロリン  Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）をＭｉｌｌｉＱで２倍希釈したものを３０μＬ、ＭｉｌｌｉＱで調製した１００ｍＭ  リン酸緩衝化溶液（ＰＢＳ）で調製した５ｍＭ  ヒポキサンチン（ＨＰＸ）を５０μＬ、９．６２５ｍＭ  ジエチレントリアミンーＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ"，Ｎ"−五酢酸（ＤＴＰＡ）を２０μＬサンプル（１．ＰＢＳ，２．フラーレン溶液）各５０μＬ，０．４Ｕ／ｍＬ  キサンチンオキシシダーゼ（ＸＯＤ）の５０ｍＬを順に容器に入れ、ＸＯＤ添加９０秒後にＥＳＲを用いてスペクトル測定を行った。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
緩和時間測定（Ｔ1測定）は、まず、Ｎｕｌｌ法を用いてＴ1  ｎｕｌｌポイントを求め、その値によってＴ1を推測し、測定条件をそれぞれ設定して測定した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
緩和時間短縮効果を表す指標が緩和度（または緩和能、ｒｅｌａｘｉｖｉｌｉｔｙ（Ｒ））であり、造影剤濃度をＣ（ｍ  ｍｏｌ／Ｌ）、造影前の縦緩和時間（つまり、溶媒の縦緩和時間）をＴ10、造影剤投与後の緩和時間（サンプル存在下での緩和時間）をＴ1Ρと
すると、Ｒは次式で定義される。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
ここで、緩和時間の逆数である１／Ｔ1は緩和速度（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）と呼ばれ、その名のとおり緩和の速さを示す指標である。また、緩和度（Ｒ）は造影剤が組織に分布して単位濃度になった場合にどれだけ緩和速度が速くなるかを示している。すなわち、Ｒが大きければ大きいほど造影剤の緩和速度促進効果（緩和時間短縮効果）が大きいことを意味する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
それぞれのサンプルの濃度およびＴ1、使用溶媒の緩和時間を基に緩和度Ｒを算出し、比較検討を行った。結果を表１に示す。表１からＧｄ＠Ｃ82／ポリマーの複合体は有意にＲ値が高く、ＭＲＩ用造影剤として有望である。