【手続補正書】
【提出日】平成20年5月13日(2008.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅する方法であって、
（ａ）単一ストランド核酸の一つ又はそれ以上の鋳型ストランドを、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの一部に相補的な一つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップと、
（ｂ）前記一つ又はそれ以上のプライマーのうちの少なくとも１つのプライマを前記プライマーが相補的である前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの一部にアニーリングさせるステップと、
（ｃ）前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドを核酸重合酵素及び少なくとも４種類の異なるヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
（ｄ）前記核酸重合酵素によって前記少なくとも一つのアニーリングされたプライマーを延長し、これにより、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに結合された一つ又はそれ以上の延長生成物を形成するステップと、
（ｅ）前記一つ又はそれ以上の延長生成物を前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドから分離させるステップと、
（ｆ）前記核酸を増幅するために前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を反復するステップと、を有し、
前記ステップ（ａ）〜（ｅ）の各サイクルにおける前記（ｅ）の前記一つ又はそれ以上の延長生成物の少なくとも一つは、ステップ（ａ）〜（ｅ）の次のサイクルにおける鋳型ストランドとして使用され、最後のサイクルに対してステップ（ｅ）はオプションであり、
前記ステップ（ｂ）または（ｄ）のうちの少なくとも一つは前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
更に、前記ステップ（ｅ）は前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を応力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに制御された量の張力を適用するステップは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに機械的張力、水力学的応力、または電場のエネルギーを適用するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに制御された量の機械的張力を直接適用するステップは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドが付着された表面を移動するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに流体流れによって引き起こされる水力学的張力を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドは、流体流れに露出された表面に固定される、流体流れに露出された表面に固定されたＤＮＡ重合酵素に結合される、または、逆伝搬性の流体流れによって維持されかつ延長される、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの少なくとも一つのストランドの一側または両側の末端に連結された一つ又はそれ以上の粒子に力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｅ）で、張力を適用するステップは、前記ステップ（ｄ）で適用されるのと同じ種類の張力の増加された量を適用するステップを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｂ）は、約０〜約６５ｐＮ、約１０〜約６５ｐＮ、および０ｐＮより大きく〜約４５ｐＮの中から選択された範囲内で、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｄ）は、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用し、前記核酸上の複製することが難しい序列が複製される時期に対応する時点で前記張力を増大させるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸は、５０％を超えるＧＣ含量を有する数個の残分の一つ又はそれ以上のセグメントを含み、前記核酸は、９０％より高い効率で増幅されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸は、８個又はそれ以上の塩基対の反復単位を含む一つ又はそれ以上のセグメントを含み、前記核酸は、９０％より高い効率で増幅されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、約６５℃未満で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、少なくとも約５０回反復されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
約１０００塩基より多くの塩基で構成された鋳型ストランドが増幅されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、約１時間又はそれ未満に完了することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸は、ｐＨ４−７またはｐＨ８−１０を有する溶液中で増幅されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
約１μｌ未満の容量を有する反応チャンバで行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ａ）の最初の前に、
ＲＮＡ試料を取得するステップと、
相補的なＤＮＡストランドの生成を可能にするのに十分な組成物の存在下で、前記ＲＮＡを逆転写酵素と接触させるステップと、
前記単一ストランド核酸を形成するために、前記ＤＮＡを前記ＲＮＡから分離するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ（ａ）の最初の前に、
ＤＮＡ試料を取得するステップと、
前記ＤＮＡを変性させるステップと、
前記変性したＤＮＡストランドを反応チャンバ内で基板に結合させるステップと、
前記反応チャンバをフラッシングして前記試料から汚染物を除去するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップ（ａ）の前記最初に、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドは、一つのＤＮＡ分子から取得されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ（ａ）の少なくとも前記最初に、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドは、精製されていない試料物質内に含まれていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸を増幅する方法であって、
（ａ）単一ストランド核酸の一つ又はそれ以上の鋳型ストランドを、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの一部に相補的な一つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、前記一つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つのプライマが基板に結合された一つ又はそれ以上の分子を結合できる複合体化基を含む、ステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つのプライマを前記プライマーが相補的である前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの一部に前記一つ又はそれ以上の複合体化基とアニーリングさせるステップと、
（ｃ）前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドを核酸重合酵素及び少なくとも４種類の異なるヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
（ｄ）前記核酸重合酵素によって前記一つ又はそれ以上のプライマーを延長し、これにより、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに結合された一つ又はそれ以上の延長生成物を形成するステップと、
（ｅ）前記一つ又はそれ以上の延長生成物を前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドから分離させるステップと、
（ｆ）前記核酸を増幅するために前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を反復するステップと、を有し、最後のサイクルに対してステップ（ｅ）はオプションであり、
前記ステップ（ａ）〜（ｅ）の各サイクルにおける前記（ｅ）の前記一つ又はそれ以上の延長生成物の少なくとも一つは、ステップ（ａ）〜（ｅ）の次のサイクルにおける鋳型ストランドとして使用され、
前記ステップ（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも一つは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記一つ又はそれ以上の複合体化基は、活性化可能であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記基板に結合された前記一つ又はそれ以上の複合体化基及び前記一つ又はそれ以上の分子は、ビオチン及びストレプトアビジンであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記一つ又はそれ以上の複合体化基は、光活性化可能な束縛されたビオチンを含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
病原菌を検出する方法であって、
請求項１に記載の方法を含み、
前記病原菌と特異的に関連したヌクレオチド序列の存在如何に対して増幅された核酸を探索するステップをさらに含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項２８】
核酸を増幅する方法であって、
（ａ）二重ストランド核酸分子を二つの単一ストランド核酸分子に分離させるのに十分な張力を前記二重ストランド核酸分子の一つ又は２つのストランドに適用することによって、二重ストランド核酸分子を変性させるステップであって、前記張力が適用された一つまたは二つの前記単一ストランド核酸分子が鋳型核酸ストランドとなるステップと、
（ｂ）一つ又は２つの前記鋳型核酸ストランドを前記鋳型核酸ストランドの一部に相補的な一つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、核酸重合酵素及び少なくとも４種類の異なるヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
（ｃ）前記ステップ（ａ）で前記一つ又は２つの鋳型核酸ストランドに適用された張力を減少させて、前記一つ又はそれ以上のプライマーを前記一つ又はそれ以上のプライマーが相補的である前記各鋳型ストランドの対応する部分にアニーリングさせるステップと、
（ｄ）前記一つ又は２つの鋳型ストランドに適用された張力を制御して前記核酸重合酵素によって前記一つ又はそれ以上のプライマーを延長させ、これにより、一つ又はそれ以上の延長生成物が一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに結合されて前記一つ又はそれ以上の二重ストランドの核酸分子を形成するステップと、
（ｅ）前記核酸を増幅するために前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を反復するステップと、を有し、
前記ステップ（ａ）〜（ｄ）の各サイクルにおける前記（ｄ）で形成された前記一つ又はそれ以上の二重ストランドの核酸分子の少なくとも一つは、ステップ（ａ）〜（ｄ）の次のサイクルにおけるステップ（ａ）で二重ストランドの核酸分子として使用されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
前記張力を適用する、前記張力を減少させる、および前記張力を制御するステップのうちの少なくとも１つは、前記張力が適用される前記核酸分子を基板または一つ又はそれ以上の粒子または両者に結合させるステップ及び前記基板または一つ以上の粒子の運動を制御するステップを含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記張力を適用する、前記張力を減少させる、および前記張力を制御するステップのうちの少なくとも１つは、前記張力が適用される前記核酸分子を一つ又はそれ以上の粒子に結合させるステップ及び光学的な操作または磁気的な操作によって前記一つ又はそれ以上の粒子の運動を制御するステップを含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記張力を適用する、前記張力を減少させる、および前記張力を制御するステップのうちの少なくとも一つは、前記張力が適用される前記核酸分子に対する流体流れを調整するステップを含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸分子のうちの少なくとも一つは、前記基板に結合された重合酵素によって結合され、流体が前記基板上を流れていることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸分子のうちの少なくとも一つは、基板に結合されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸分子のうちの少なくとも一つは、流体流れの速度勾配で、又は逆伝搬性の流体流れによって伸びることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記ステップ（ｄ）は、複製することが難しい前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの序列が複製される時期に対応する時点で前記張力を増大させるステップを含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記の全体プロセスは、周囲の温度で行われることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記の全体プロセスは、約２０℃より高く、約６０℃より低い温度で行われることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記の全体プロセスは、室温で行われ、前記ステップ（ｂ）で、前記張力は、約６５ｐＮより大きく、前記ステップ（ｃ）で、前記張力は、約０ｐＮ〜約６０ｐＮの範囲に減少し、前記ステップ（ｄ）で、前記張力は、約０ｐＮ〜約４５ｐＮの範囲に調整されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
重合酵素連鎖反応によって核酸を増幅する方法であって、
（ａ）二重ストランド核酸を変性させて単一ストランド鋳型ストランドを生成するステップと、
（ｂ）前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
（ｃ）鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ（ａ）〜（ｃ）の各サイクルにおける前記（ｃ）で生成した前記二重ストランド核酸分子の少なくとも一つは、ステップ（ａ）〜（ｃ）の次のサイクルのステップ（ａ）で変性され、
前記ステップ（ｂ）と（ｃ）のうちの少なくとも一つは、前記核酸に張力を適用するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
前記張力を適用するステップは、機械的張力、水力学的応力、または電場力またはそれらの組み合わせを適用するステップを含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ステップ（ａ）〜（ｄ）は、８０℃以下、３０℃以下および周囲温度から選択された温度で行われることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ステップ（ａ）で適用される張力は、６５ｐＮまたはそれより大きい、または、
前記ステップ（ｂ）で適用される張力は、（ｉ）５０ｐＮまたはそれより小さい、（ｉｉ）３０ｐＮ〜５０ｐＮ、（ｉｉｉ）３５ｐＮ〜４５ｐＮ、または、
前記ステップ（ｃ）で適用される張力は、４５ｐＮまたはそれより小さいことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
核酸増幅を行う方法であって、
（ａ）二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
（ｂ）前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
（ｃ）鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ（ｃ）は等温であり、前記核酸に機械的張力または水力学的張力を適用するステップを含み、
前記ステップ（ａ）〜（ｃ）の各サイクルにおけるステップ（ｃ）で生成された前記二重ストランド核酸分子の少なくとも１つは、前記ステップ（ａ）〜（ｃ）の次のサイクルのステップ（ａ）で変性されることを特徴とする方法。
【請求項４４】
核酸増幅を行う方法であって、
（ａ）二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
（ｂ）前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
（ｃ）鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ（ｃ）は前記核酸に変更可能な張力を適用するステップを有し、
前記変更可能な張力は、前記核酸の重合酵素のプルーフリーディング・エキソヌクレアーゼ活性を調製することを特徴とする方法。
【請求項４５】
核酸増幅を行う方法であって、
（ａ）二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
（ｂ）前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
（ｃ）鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ（ｃ）で使用されたプライマーは、前記ステップ（ｃ）で得られた延長生成物を固定化するための複合体基を含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
核酸増幅を行う方法であって、
（ａ）二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
（ｂ）前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
（ｃ）鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ（ａ）〜（ｃ）の各サイクルにおけるステップ（ｃ）で生成された前記二重ストランド核酸分子の少なくとも１つは、前記ステップ（ａ）〜（ｃ）の次のサイクルのステップ（ａ）で変性され、
前記ステップ（ｂ）と（ｃ）のうちの少なくとも１つは、前記核酸に張力を適用するステップを含み、
前記鋳型ストランドの複製の数は、ステップ（ａ）〜（ｃ）がｎ回繰り返された後で、２ｎ倍に増加し、ここで、ｎは１より大きい整数であることを特徴とする方法。
【請求項４７】
前記ステップ（ａ）は前記核酸に張力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
核酸ストランドにプライマーのアニーリングの緊縮調節を制御する方法であって、
核酸ストランドにプライマーをアニーリングするステップを含み、
張力が前記核酸ストランドまたは前記プライマーに調整可能に適応されることを特徴とする方法。
【請求項４９】
核酸重合酵素によってプライマーを延長するときの誤り率を低下する方法であって、
核酸重合酵素によって核酸鋳型にアニーリングされたプライマーを延長して二重ストランドの核酸分子を生成するステップを含み、
張力が前記核酸鋳型または前記プライマーに調整可能に適応されることを特徴とする方法。
【請求項５０】
核酸重合酵素によってＧＣに富む鋳型でプライマーを延長するときの誤り率を低下する方法であって、
核酸重合酵素によってＧＣに富む核酸鋳型にアニーリングされたプライマーを延長して二重ストランドの核酸分子を生成するステップを含み、
張力が前記ＧＣに富む核酸鋳型または前記プライマーに調整可能に適応されることを特徴とする方法。
【請求項５１】
核酸増幅の忠実度を改善する方法であって、
（ａ）二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
（ｂ）前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
（ｃ）鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ（ａ）〜（ｃ）の各サイクルにおけるステップ（ｃ）で生成された前記二重ストランド核酸分子の少なくとも１つは、前記ステップ（ａ）〜（ｃ）の次のサイクルのステップ（ａ）で変性され、
前記ステップ（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つは、前記核酸に張力を調整可能に適応するステップを含むことを特徴とする方法。