【手続補正書】
【提出日】平成31年2月28日(2019.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の核酸種のバリアントの存在または非存在を検出するマルチプレックス方法であって、
（ａ）それぞれの標的核酸種が、低存在量バリアントと高存在量バリアントとを含む、複数の標的核酸種またはその一部に由来する複数のアンプリコンを調製するステップと、
（ｂ）単一の反応において前記アンプリコンを複数のオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズさせるステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、標的核酸種のアンプリコンに特異的に対応し、（ｉ）オリゴヌクレオチド種は、標的核酸種の前記低存在量バリアントと前記高存在量バリアントの間で異なる単一塩基位置に対して５’の位置で、前記標的核酸種の前記低存在量バリアントおよび前記高存在量バリアントに由来するアンプリコンにハイブリダイズし、（ｉｉ）前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドは、前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントのそれぞれに関して同じであるかまたは異なり、（ｉｉｉ）前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドは、前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントのそれぞれに関して同じであり、ならびに（ｉｖ）前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントの前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドのいずれも、前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントの前記単一塩基位置のヌクレオチドと同じではなく、それによってハイブリダイズオリゴヌクレオチドを生成するステップと、
（ｃ）前記ハイブリダイズオリゴヌクレオチドに、前記低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドと、前記高存在量バリアントの１つまたは複数に対して特異的な１、２、または３つの停止ヌクレオチドとを含む伸長組成物を、伸長条件で接触させるステップであって、（ｉ）前記停止ヌクレオチドが捕捉剤を含み、（ｉｉ）１つまたは複数の高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドの濃度がそれぞれ、前記低存在量バリアントに対して特異的な前記停止ヌクレオチドの濃度と比較して０．１％から３０％の濃度であり、（ｉｉｉ）前記伸長条件が、多数の熱サイクルを含み、それによって前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドと、前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドとを生成するステップと、
（ｄ）前記伸長オリゴヌクレオチドに、前記捕捉剤が固相と相互作用する条件で固相を接触させ、それによって前記固相上で前記伸長オリゴヌクレオチドを捕捉するステップであって、前記固相が、（ｃ）における前記捕捉剤の結合パートナーを含むステップと、
（ｅ）上昇した温度条件で前記固相に競合剤を接触させることによって（ｄ）における前記伸長オリゴヌクレオチドを放出するステップであって、前記競合剤が、（ｄ）における前記固相と相互作用する前記捕捉剤の遊離形態を含むステップと、
（ｆ）（ｅ）において放出された前記伸長オリゴヌクレオチドを検出し、それによって前記複数の核酸種の前記バリアントの存在または非存在を検出するステップと、
を含むマルチプレックス方法。
【請求項２】
前記バリアントが単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）バリアントであり、前記低存在量バリアントが低存在量対立遺伝子であり、前記高存在量バリアントが高存在量対立遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記低存在量バリアントが変異体対立遺伝子であり、前記高存在量バリアントが前記対立遺伝子の野生型の対立遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記低存在量バリアントが、１つまたは複数の挿入または欠失を有し、前記高存在量バリアントが、１つまたは複数の挿入または欠失を有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記低存在量バリアントが、前記高存在量バリアントのコピー数の２％またはそれ未満であるコピー数で存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１つまたは複数の停止ヌクレオチドが、１つの停止ヌクレオチド、２つの異なる停止ヌクレオチドもしくは３つの異なる停止ヌクレオチドからなる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記停止ヌクレオチドが、独立してｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記停止ヌクレオチドが１つまたは複数の非環式停止剤を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドのそれぞれの濃度が、前記低存在量バリアントの前記特異的停止ヌクレオチドの濃度と比較して０．５％から１０％の濃度である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドのそれぞれの濃度が、前記低存在量バリアントの前記特異的停止ヌクレオチドの濃度と比較して１％から２％の濃度である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）において産生された前記アンプリコンを、前記アンプリコンに組み込まれていない任意のヌクレオチドから末端のホスフェートを除去する作用剤に接触させる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の標的核酸種が、１０個またはそれ超の標的核酸種である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の標的核酸種が、２０個またはそれ超の標的核酸種である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記捕捉剤がビオチンを含み、前記固相がストレプトアビジンを含み、および前記競合剤が遊離のビオチンを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記上昇温度条件が約８０℃から約１００℃である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記上昇温度条件が約１分間から約１０分間の処置を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記競合剤が、約１０μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの濃度である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドの検出の非存在下において、高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドの検出が、偽陰性結果に対する陽性対照を提供する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
それぞれの伸長オリゴヌクレオチドが蛍光標識を含み、停止ヌクレオチドが蛍光標識を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
それぞれの伸長オリゴヌクレオチドが質量標識を含み、前記質量標識が、アンプリコンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド種の領域の５’に位置する質量識別可能なタグであるか、または前記停止ヌクレオチドが前記質量識別可能なタグを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
検出が、質量分析によって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドの濃度と、高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドの濃度の比率に基づく標準化を含む、それぞれの標的核酸種の高存在量バリアントの量と比較した、低存在量バリアントの量を決定するステップをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
複数の核酸種のバリアントの存在または非存在および量を検出するマルチプレックス方法であって、
（ａ）それぞれの標的核酸種が、低存在量バリアントと高存在量バリアントとを含む、複数の標的核酸種またはその一部に由来する複数のアンプリコンを調製するステップと、
（ｂ）単一の反応において前記アンプリコンを複数のオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズさせるステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、標的核酸種のアンプリコンに特異的に対応し、（ｉ）オリゴヌクレオチド種は、標的核酸種の前記低存在量バリアントと前記高存在量バリアントの間で異なる単一塩基位置に対して５’の位置で、標的核酸種の前記低存在量バリアントおよび前記高存在量バリアントに由来するアンプリコンにハイブリダイズし、（ｉｉ）前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドは、前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントのそれぞれに関して同じであるかまたは異なり、（ｉｉｉ）前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドは、前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントのそれぞれに関して同じであり、および（ｉｖ）前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントの前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドのいずれも、前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントの前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドと同じではなく、それによってハイブリダイズオリゴヌクレオチドを生成するステップと、
（ｃ）前記ハイブリダイズオリゴヌクレオチドに、前記低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドと、前記高存在量バリアントの１つまたは複数に対して特異的な１、２、または３つの停止ヌクレオチドとを含む伸長組成物を、伸長条件で接触させるステップであって、（ｉ）前記停止ヌクレオチドが捕捉剤を含み、（ｉｉ）１つまたは複数の高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドの濃度がそれぞれ、前記低存在量バリアントに対して特異的な前記停止ヌクレオチドの濃度と比較して０．１％から３０％の濃度であり、（ｉｉｉ）前記伸長条件が、多数の熱サイクルを含み、それによって前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドと、前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドとを生成するステップと、
（ｄ）前記伸長オリゴヌクレオチドに、前記捕捉剤が固相と相互作用する条件で固相を接触させ、それによって前記固相上で前記伸長オリゴヌクレオチドを捕捉するステップであって、前記固相が、（ｃ）における前記捕捉剤の結合パートナーを含むステップと、
（ｅ）上昇した温度条件で前記固相に競合剤を接触させることによって、（ｄ）における前記伸長オリゴヌクレオチドを放出するステップであって、前記競合剤が、（ｄ）における前記固相と相互作用する前記捕捉剤の遊離型を含むステップと、
（ｆ）（ｅ）において放出された前記伸長オリゴヌクレオチドを検出し、それによって前記複数の核酸種の前記バリアントの存在または非存在を検出するステップと、
（ｇ）（ｆ）において存在すると検出された前記複数の核酸種のバリアントに関して、それぞれの標的核酸種の前記高存在量バリアントの量と比較して、前記低存在量バリアントの量を決定するステップと、
を含むマルチプレックス方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
同様に、ある特定の態様において、低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドの濃度と、高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドの濃度との比率に基づく標準化を含む、それぞれの標的核酸種に関して、高存在量バリアントの量と比較して低存在量バリアントの量を決定する方法が提供される。
特定の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
複数の核酸種のバリアントの存在または非存在を検出するマルチプレックス方法であって、
（ａ）それぞれの標的核酸種が、低存在量バリアントと高存在量バリアントとを含む、複数の標的核酸種またはその一部に由来する複数のアンプリコンを調製するステップと、
（ｂ）単一の反応において前記アンプリコンを複数のオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズさせるステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、標的核酸種のアンプリコンに特異的に対応し、（ｉ）オリゴヌクレオチド種は、標的核酸種の前記低存在量バリアントと前記高存在量バリアントの間で異なる単一塩基位置に対して５’の位置で、前記標的核酸種の前記低存在量バリアントおよび前記高存在量バリアントに由来するアンプリコンにハイブリダイズし、（ｉｉ）前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドは、前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントのそれぞれに関して同じであるかまたは異なり、（ｉｉｉ）前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドは、前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントのそれぞれに関して同じであり、ならびに（ｉｖ）前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントの前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドのいずれも、前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントの前記単一塩基位置のヌクレオチドと同じではなく、それによってハイブリダイズオリゴヌクレオチドを生成するステップと、
（ｃ）前記ハイブリダイズオリゴヌクレオチドに、前記低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドと、前記高存在量バリアントの１つまたは複数に対して特異的な１、２、または３つの停止ヌクレオチドとを含む伸長組成物を、伸長条件で接触させるステップであって、（ｉ）前記停止ヌクレオチドが捕捉剤を含み、（ｉｉ）１つまたは複数の高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドの濃度がそれぞれ、前記低存在量バリアントに対して特異的な前記停止ヌクレオチドの濃度と比較して０．１％から３０％の濃度であり、（ｉｉｉ）前記伸長条件が、多数の熱サイクルを含み、それによって前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドと、前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドとを生成するステップと、
（ｄ）前記伸長オリゴヌクレオチドに、前記捕捉剤が固相と相互作用する条件で固相を接触させ、それによって前記固相上で前記伸長オリゴヌクレオチドを捕捉するステップであって、前記固相が、（ｃ）における前記捕捉剤の結合パートナーを含むステップと、
（ｅ）上昇した温度条件で前記固相に競合剤を接触させることによって（ｄ）における前記伸長オリゴヌクレオチドを放出するステップであって、前記競合剤が、（ｄ）における前記固相と相互作用する前記捕捉剤の遊離形態を含むステップと、
（ｆ）（ｅ）において放出された前記伸長オリゴヌクレオチドを検出し、それによって前記複数の核酸種の前記バリアントの存在または非存在を検出するステップと、
を含むマルチプレックス方法。
（項目２）
前記バリアントが単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）バリアントであり、前記低存在量バリアントが低存在量対立遺伝子であり、前記高存在量バリアントが高存在量対立遺伝子である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記低存在量バリアントが変異体対立遺伝子であり、前記高存在量バリアントが前記対立遺伝子の野生型の対立遺伝子である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記低存在量バリアントが、１つまたは複数の挿入または欠失を有し、前記高存在量バリアントが、１つまたは複数の挿入または欠失を有しない、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記低存在量バリアントが、前記高存在量バリアントのコピー数の２％またはそれ未満であるコピー数で存在する、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１つまたは複数の停止ヌクレオチドが、１つの停止ヌクレオチドからなる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１つまたは複数の停止ヌクレオチドが、２つの異なる停止ヌクレオチドからなる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１つまたは複数の停止ヌクレオチドが、３つの異なる停止ヌクレオチドからなる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記停止ヌクレオチドが、独立してｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから選択される、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記停止ヌクレオチドが１つまたは複数の非環式停止剤を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドのそれぞれの濃度が、前記低存在量バリアントの前記特異的停止ヌクレオチドの濃度と比較して０．５％から１０％の濃度である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドのそれぞれの濃度が、前記低存在量バリアントの前記特異的停止ヌクレオチドの濃度と比較して１％から２％の濃度である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
それぞれの核酸種に関して、前記低存在量バリアントおよび前記高存在量バリアントの総コピー数が、少なくとも約１０００コピーであり、前記低存在量バリアントが前記総コピー数の０．１％に相当する、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
（ａ）において産生された前記アンプリコンを、前記アンプリコンに組み込まれていない任意のヌクレオチドから末端のホスフェートを除去する作用剤に接触させる、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記末端のホスフェートが溶液にホスファターゼを接触させることによって除去される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ホスファターゼがアルカリホスファターゼである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記アルカリホスファターゼが、エビのアルカリホスファターゼである、実施形態Ａ１３に記載の方法。
（項目１８）
前記複数の標的核酸種が、１０個またはそれ超の標的核酸種である、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記複数の標的核酸種が、２０個またはそれ超の標的核酸種である、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
（ａ）における前記伸長条件が、３０から４５回のサイクリングを含む、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
（ｃ）における前記伸長条件が、２０から３００回のサイクリングを含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
（ｃ）における前記伸長条件が、少なくとも５０回のサイクリングを含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記捕捉剤が、アビジン、アビジンの類似体、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンの類似体、ビオチン、またはビオチンの類似体を含む、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記結合パートナーが、アビジン、アビジンの類似体、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンの類似体、ビオチン、またはビオチンの類似体からなる群から選択される、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記捕捉剤がビオチンを含み、前記固相がストレプトアビジンを含み、および前記競合剤が遊離のビオチンを含む、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記上昇温度条件が約８０℃から約１００℃である、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記上昇温度条件が約１分間から約１０分間の処置を含む、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記上昇温度条件が約９０℃で約５分間の処置を含む、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記競合剤が、約１０μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの濃度である、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記競合剤が、濃度約２５μｇ／ｍｌの遊離のビオチンまたは遊離のビオチン類似体である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドの検出の非存在下において、高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドの検出が、偽陰性結果に対する陽性対照を提供する、項目１から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
それぞれの伸長オリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記停止ヌクレオチドが前記検出可能な標識を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記検出可能な標識が蛍光標識である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
停止ヌクレオチドが前記蛍光標識を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記検出可能な標識が質量標識である、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記質量標識が、アンプリコンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド種の領域の５’に位置する質量識別可能なタグであるか、または前記停止ヌクレオチドが前記質量識別可能なタグを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記伸長オリゴヌクレオチドの捕捉後に前記固相を洗浄するステップを含む、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記洗浄するステップが、質量分析による分析において妨害性の付加物を産生する塩を除去する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
伸長オリゴヌクレオチドがイオン交換樹脂に接触されない、項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
検出が、質量分析によって行われる、項目１から３３および３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドの濃度と、高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドの濃度の比率に基づく標準化を含む、それぞれの標的核酸種の高存在量バリアントの量と比較した、低存在量バリアントの量を決定するステップをさらに含む、項目１から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
複数の核酸種のバリアントの存在または非存在および量を検出するマルチプレックス方法であって、
（ａ）それぞれの標的核酸種が、低存在量バリアントと高存在量バリアントとを含む、複数の標的核酸種またはその一部に由来する複数のアンプリコンを調製するステップと、
（ｂ）単一の反応において前記アンプリコンを複数のオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズさせるステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、標的核酸種のアンプリコンに特異的に対応し、（ｉ）オリゴヌクレオチド種は、標的核酸種の前記低存在量バリアントと前記高存在量バリアントの間で異なる単一塩基位置に対して５’の位置で、標的核酸種の前記低存在量バリアントおよび前記高存在量バリアントに由来するアンプリコンにハイブリダイズし、（ｉｉ）前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドは、前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントのそれぞれに関して同じであるかまたは異なり、（ｉｉｉ）前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドは、前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントのそれぞれに関して同じであり、および（ｉｖ）前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントの前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドのいずれも、前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントの前記単一塩基位置の前記ヌクレオチドと同じではなく、それによってハイブリダイズオリゴヌクレオチドを生成するステップと、
（ｃ）前記ハイブリダイズオリゴヌクレオチドに、前記低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドと、前記高存在量バリアントの１つまたは複数に対して特異的な１、２、または３つの停止ヌクレオチドとを含む伸長組成物を、伸長条件で接触させるステップであって、（ｉ）前記停止ヌクレオチドが捕捉剤を含み、（ｉｉ）１つまたは複数の高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドの濃度がそれぞれ、前記低存在量バリアントに対して特異的な前記停止ヌクレオチドの濃度と比較して０．１％から３０％の濃度であり、（ｉｉｉ）前記伸長条件が、多数の熱サイクルを含み、それによって前記複数の標的核酸種の前記低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドと、前記複数の標的核酸種の前記高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドとを生成するステップと、
（ｄ）前記伸長オリゴヌクレオチドに、前記捕捉剤が固相と相互作用する条件で固相を接触させ、それによって前記固相上で前記伸長オリゴヌクレオチドを捕捉するステップであって、前記固相が、（ｃ）における前記捕捉剤の結合パートナーを含むステップと、
（ｅ）上昇した温度条件で前記固相に競合剤を接触させることによって、（ｄ）における前記伸長オリゴヌクレオチドを放出するステップであって、前記競合剤が、（ｄ）における前記固相と相互作用する前記捕捉剤の遊離型を含むステップと、
（ｆ）（ｅ）において放出された前記伸長オリゴヌクレオチドを検出し、それによって前記複数の核酸種の前記バリアントの存在または非存在を検出するステップと、
（ｇ）（ｆ）において存在すると検出された前記複数の核酸種のバリアントに関して、それぞれの標的核酸種の前記高存在量バリアントの量と比較して、前記低存在量バリアントの量を決定するステップと、
を含むマルチプレックス方法。
（項目４４）
前記バリアントが単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）バリアントであり、前記低存在量バリアントが低存在量対立遺伝子であり、前記高存在量バリアントが高存在量対立遺伝子である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記低存在量バリアントが変異体対立遺伝子であり、前記高存在量バリアントが対立遺伝子の野生型である、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記低存在量バリアントが、１つまたは複数の挿入または欠失を有し、前記高存在量バリアントが、１つまたは複数の挿入または欠失を有しない、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記低存在量バリアントが、前記高存在量バリアントのコピー数の２％またはそれ未満であるコピー数で存在する、項目４３から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１つまたは複数の停止ヌクレオチドが、１つの停止ヌクレオチドからなる、項目４３から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１つまたは複数の停止ヌクレオチドが、２つの異なる停止ヌクレオチドからなる、項目４３から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１つまたは複数の停止ヌクレオチドが、３つの異なる停止ヌクレオチドからなる、項目４３から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記停止ヌクレオチドが、独立してｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから選択される、項目４３から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記停止ヌクレオチドが１つまたは複数の非環式停止剤を含む、項目４３から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドのそれぞれの濃度が、前記低存在量バリアントの前記特異的停止ヌクレオチドの濃度と比較して０．５％から１０％の濃度である、項目４３から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記高存在量バリアントに対して特異的な前記１、２、または３つの停止ヌクレオチドのそれぞれの濃度が、前記低存在量バリアントの前記特異的停止ヌクレオチドの濃度と比較して１％から２％の濃度である、項目４３から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
それぞれの核酸種に関して、前記低存在量バリアントおよび前記高存在量バリアントの総コピー数が、少なくとも約１０００コピーであり、前記低存在量バリアントが前記総コピー数の０．１％に相当する、項目４３から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
（ａ）において産生されたアンプリコンを、アンプリコンに組み込まれていない任意のヌクレオチドから末端のホスフェートを除去する作用剤に接触させる、項目４３から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記末端のホスフェートが溶液にホスファターゼを接触させることによって除去される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ホスファターゼがアルカリホスファターゼである、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記アルカリホスファターゼが、エビのアルカリホスファターゼである、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記複数の標的核酸種が、１０個またはそれ超の標的核酸種である、項目４３から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記複数の標的核酸種が、２０個またはそれ超の標的核酸種である、項目４３から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
（ａ）における前記伸長条件が、３０から４５回のサイクリングを含む、項目４３から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
（ｃ）における前記伸長条件が、２０から３００回のサイクリングを含む、項目４３から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
（ｃ）における前記伸長条件が、少なくとも５０回のサイクリングを含む、項目４３から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記捕捉剤が、アビジン、アビジンの類似体、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンの類似体、ビオチン、またはビオチンの類似体を含む、項目４３から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記結合パートナーが、アビジン、アビジンの類似体、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンの類似体、ビオチン、またはビオチンの類似体からなる群から選択される、項目４３から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記捕捉剤がビオチンを含み、前記固相がストレプトアビジンを含み、および前記競合剤が遊離のビオチンを含む、項目４３から６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記上昇温度条件が約８０℃から約１００℃である、項目４３から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記上昇温度条件が約１分間から約１０分間の処置を含む、項目４３から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記上昇温度条件が約９０℃で約５分間の処置を含む、項目４３から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記競合剤が、約１０μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの濃度である、項目４３から７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記競合剤が、濃度約２５μｇ／ｍｌの遊離のビオチンまたは遊離のビオチン類似体である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
低存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドの検出の非存在下において、高存在量バリアントに対して特異的な停止ヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドの検出が、偽陰性結果に対する陽性対照を提供する、項目４３から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
それぞれの伸長オリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、項目４３から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
停止ヌクレオチドが前記検出可能な標識を含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記検出可能な標識が蛍光標識である、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
停止ヌクレオチドが前記蛍光標識を含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記検出可能な標識が質量標識である、項目７４に記載の方法。
（項目７９）
前記質量標識が、アンプリコンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド種の領域の５’に位置する質量識別可能なタグであるか、または前記停止ヌクレオチドが質量識別可能なタグを含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記伸長オリゴヌクレオチドの捕捉後に前記固相を洗浄するステップを含む、項目７８または７９に記載の方法。
（項目８１）
前記洗浄するステップが、質量分析による分析において妨害性の付加物を産生する塩を除去する、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
伸長オリゴヌクレオチドがイオン交換樹脂に接触されない、項目７８から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
検出が、質量分析によって行われる、項目４３から７５および７８から８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
それぞれの標的核酸種の高存在量バリアントの量と比較して低存在量バリアントの量を決定するステップが、前記低存在量バリアントに対して特異的な前記停止ヌクレオチドの濃度と、前記高存在量バリアントに対して特異的な前記停止ヌクレオチドの濃度の比率に基づく標準化を含む、項目４３から８３のいずれか一項に記載の方法。