(57)【要約】本発明は、ヒト染色体１３ｑ３１．３に存在するＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３の３’側半分又はその一部の配列を有する核酸、該染色体に存在するｍｉＲ−１７−５ｐ及び／又はｍｉＲ２０のｍｉＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸を有効成分として含み、これらの核酸が、ｍｉＲ−１７−５ｐ及び／又はｍｉＲ２０が過剰発現している癌の増殖を抑制しかつ細胞しを誘導する活性を有する、癌を治療するための医薬組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の核酸：
（ａ）配列番号１又は１２の配列からなるｍｉＲ−１７−５ｐアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号７又は１３の配列からなるｍｉＲ−２０ａアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１又は１２或いは配列番号７又は１３の配列と８５％以上、９０％以上又は９５％以上の同一性を有する１８〜２５ヌクレオチドの配列からなり、かつｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａの生物活性を抑制することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｄ）ｍｉＲ−１７−５ｐ前駆体のアンチセンス配列において配列番号１又は１２の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｅ）ｍｉＲ−２０前駆体のアンチセンス配列において配列番号７又は１３の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｆ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾体であって、ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−メチル基又は２’−Ｏ−メトキシエチル基を少なくとも１つ有する修飾体、並びに、
（ｇ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列、それに対応するＲＮＡ配列、又は該ＤＮＡ配列を含む発現ベクターＤＮＡ、
からなる群から選択される１又は複数の核酸を有効成分として含み、かつ該核酸がｍｉＲ−１７−５ｐ及び／又はｍｉＲ２０が過剰発現している癌の増殖を抑制する及び／又は細胞死を誘導する活性を有する、癌の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
前記核酸が、配列番号１２の配列（ここで、塩基Ｇ及びＣがＬＮＡによって置換されている）からなるｍｉＲ−１７−５ｐアンチセンスオリゴヌクレオチド修飾体、配列番号１３の配列（ここで、塩基Ｇ及びＣがＬＮＡによって置換されている）からなるｍｉＲ−２０ａアンチセンスオリゴヌクレオチド修飾体、又はそれらの混合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記癌が、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ヒト染色体１３ｑ３１．３に存在するＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３の３’側半分又はその一部のＤＮＡ、それに対応するＲＮＡ、又は該ＤＮＡを含むベクターＤＮＡ、からなる群から選択される核酸を有効成分として含み、かつ該核酸が癌の増殖抑制活性及び／又は細胞死誘導活性を有する、癌の治療のための医薬組成物。
【請求項５】
前記イントロン３の３’側半分のＤＮＡの塩基配列が、配列番号１４によって示される配列、又はその配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記イントロン３の３’側半分の一部のＤＮＡの塩基配列が、配列番号１５によって示される配列、又は配列番号１５によって示される配列の１５塩基以上の部分配列、又は配列番号１４によって示される配列において少なくとも配列番号１５によって示される配列を含む配列、或いはそれらの配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記癌が、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の医薬組成物を、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される癌をもつ患者に投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項９】
請求項４に記載の医薬組成物を、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される癌をもつ患者に投与することを含む、癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡであるｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａ対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３部分等の核酸を含む癌の治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」と称する）は、２２塩基程度の極く小さなＲＮＡ分子として機能する種を超えてよく保存された遺伝子である。ｍｉＲＮＡはしばしばクラスターを成してゲノム上に存在し、ＲＮＡポリメレースＩＩによって転写され、さらにＤｒｏｓｈａとＤｉｃｅｒによって成熟型（ｍａｔｕｒｅ  ｆｏｒｍ）へとプロセッシングされ、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合し標的遺伝子のｍＲＮＡから蛋白への翻訳を阻害すると考えられている（Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．，“ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｆｌｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｏｒｍｓ：ｇｒｏｗｔｈ，ｄｅａｔｈ，ｆａｔ，ｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄ  ｔｉｍｉｎｇ，”Ｃｅｌｌ  ２００３；１１３：６７３−６７６）。
これまでに、極めて僅かな数のマイクロＲＮＡに関して、癌の発症や進展に関与している可能性が示唆されている。本発明者らが報告した代表的なｍｉＲＮＡの一つであるｌｅｔ−７の発現低下と肺癌の臨床病態への関わり及びその細胞生物学的役割（Ｔａｋａｍｉｚａｗａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｔ−７  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；６４：３７５３−３７５６）は、その後米国の研究者らによって追認されるとともにｌｅｔ−７の標的がＲＡＳ遺伝子であることが報告されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＡＳ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｅｔ−７  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｆａｍｉｌｙ，”Ｃｅｌｌ  ２００５；１２０：６３５−６４７）。また、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１  ｍｉＲＮＡの慢性リンパ性白血病における発現低下が報告されている（Ｃａｌｉｎ，ＧＡ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ｍｉＲ１５  ａｎｄ  ｍｉＲ１６  ａｔ  １３ｑ１４  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００２；９９：１５５２４−１５５２９）。
本発明者らは、ヒト染色体１３ｑ３１．３に存在する７個のｍｉＲＮＡを含むｍｉＲ−１７−９２  ｍｉＲＮＡクラスターの遺伝子増幅と過剰発現が肺癌に検出されること、また肺癌細胞株の増殖を促進する作用があることを最近報告した（Ｈａｙａｓｈｉｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｍｉＲＮＡ  ｃｌｕｓｔｅｒ，ｍｉＲ−１７−９２，ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；６５：９６２８−９６３２）。時を同じくして、ＨｅらによりＢ細胞リンパ腫において同様の知見が報告された（Ｈｅ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｈｕｍａｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３５：８２８−８３３）。また、このｍｉＲＮＡクラスターに存在するｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａによって制御されている標的遺伝子として、転写因子であるＥ２Ｆ１遺伝子が同定されている（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．，“ｃ−Ｍｙｃ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  Ｅ２Ｆ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３５：８３９−４３）。具体的には、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌらは、Ｅ２Ｆ１はｃ−Ｍｙｃの標的であること、Ｅ２Ｆ１の発現がＨｅＬａ細胞株（子宮頸癌細胞株）においてｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａによって負に制御され、それゆえこれらのｃ−ｍｙｃによって調節されるｍｉＲＮＡが腫瘍抑制活性をもつ可能性があること、これに対してリンパ腫ではこれらのｍｉＲＮＡが発癌活性をもつ可能性があること、などを記載している。
この関連で、Ａｍｂｉｏｎ社（ＵＳＡ）は、ｍｉＲ−１７−９２  ｍｉＲＮＡ関連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを「Ａｎｔｉ−ｍｉＲＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」を販売している（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５；３３：１２９０−１２９７）。ここでＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓは、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−９２のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ＨｅＬａ（子宮頸癌細胞株）とＡ５４９（肺癌細胞株）で細胞増殖に対する効果を調べているが、ＨｅＬａでは無効であり、Ａ５４９ではｍｉＲ−１９ａのアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ増殖抑制という結果を得ている一方、ｍｉＲ−１８，２０，１０６，９２のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは効果がなかったと報告されている。
【発明の開示】
【０００３】
これまで、上で述べたように、ｍｉＲ−１７−９２クラスターがｃ−ｍｙｃによって調節されており、一方、ｃ−ｍｙｃの下流標的である転写因子Ｅ２Ｆ１が該クラスターのｍｉＲ−１７−５ａ及びｍｉＲ−２０ａによって負に制御されていることまでは知られていた。しかし、ヒト由来の癌腫においてｍｉＲ−１７−９２クラスターがどのようにして癌の発生に機能するかが理解されていなかった。また、上記の報告からｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ２０ａが癌の発生に何らかの関わりがあるかもしれないことは推測されるが、それらの発現又は活性の抑制が、実際に、癌細胞の増殖抑制や細胞死の誘導を引き起こすかどうかを調べた報告はない。さらにまた、ｍｉＲ−１７−９２クラスターの下流に存在するＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５の一部が癌の調節に関わることについては全く報告がなかった。
このような状況において、本発明者らは、ｍｉＲ−１７−９２ｍｉＲＮＡクラスターに含まれる各種のｍｉＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレチドを用いてそれぞれのｍｉＲＮＡを抑制して検討を加えた結果、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ２０ａの抑制が低濃度で特定の癌の増殖抑制と細胞死誘導を引き起こすこと、また、ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５の一部、特にイントロン３部分、が癌の増殖を阻害する活性をもつことを初めて見出した。このような新規な知見により、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド及びＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３部分が癌治療のために有用であることが判明した。
発明の概要
本発明は、以下のように要約される。
本発明は、その一の態様により、下記の核酸：
（ａ）配列番号１又は１２の配列からなるｍｉＲ−１７−５ｐアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号７又は１３の配列からなるｍｉＲ−２０ａアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１又は１２或いは配列番号７又は１３の配列と８５％以上、９０％以上又は９５％以上の同一性を有する１８〜２５ヌクレオチドの配列からなり、かつｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａの生物活性を抑制することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｄ）ｍｉＲ−１７−５ｐ前駆体のアンチセンス配列において配列番号１又は１２の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｅ）ｍｉＲ−２０前駆体のアンチセンス配列において配列番号７又は１３の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｆ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾体であって、ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−メチル基又は２’−Ｏ−メトキシエチル基を少なくとも１つ有する修飾体、並びに、
（ｇ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列、それに対応するＲＮＡ配列、又は該ＤＮＡ配列を含む発現ベクターＤＮＡ、
からなる群から選択される１又は複数の核酸を有効成分として含み、かつ該核酸がｍｉＲ−１７−５ｐ及び／又はｍｉＲ２０が過剰発現している癌の増殖を抑制する及び／又は細胞死を誘導する活性を有する、癌の治療のための医薬組成物を提供する。
本発明の実施形態において、前記核酸が、配列番号１２の配列（ここで、塩基Ｇ及びＣがＬＮＡによって置換されている）からなるｍｉＲ−１７−５ｐアンチセンスオリゴヌクレオチド、配列番号１３の配列（ここで、塩基Ｇ及びＣがＬＮＡによって置換されている）からなるｍｉＲ−２０ａアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの混合物である。
本発明の実施形態において、前記癌が、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される。
本発明はまた、別の態様により、ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３の３’側半分又はその一部のＤＮＡ、それに対応するＲＮＡ、又は該ＤＮＡを含むベクターＤＮＡ、からなる群から選択される核酸を有効成分として含み、かつ該核酸が癌の増殖抑制活性及び／又は細胞死誘導活性を有する、癌の治療のための医薬組成物を提供する。
本発明の実施形態において、前記癌は、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される。
本発明の実施形態において、前記イントロン３の３’側半分のＤＮＡの塩基配列が、配列番号１４によって示される配列、又はその配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列である。
本発明の別の実施形態において、前記イントロン３の３’側半分の一部のＤＮＡの塩基配列が、配列番号１５によって示される配列、又は配列番号１５によって示される配列の１５塩基以上の部分配列、又は配列番号１４によって示される配列において少なくとも配列番号１５によって示される配列を含む配列、或いはそれらの配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列である。
本発明はまた、別の態様により、本発明の上記医薬組成物の各々を、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌なる群から選択される癌をもつ患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。
本明細書で使用する「ｍｉＲ−１７−５ｐ」及び「ｍｉＲ−２０ａ」という用語は、ヒト染色体１３ｑ３１．３上のｍｉＲ−１７−９２クラスターに存在するｍｉＲＮＡを指す。このクラスターには、上記ｍｉＲＮＡ以外に１７−３ｐ、１８、１９ａ、１９ｂ−１及び９２−１として表されるｍｉＲＮＡも存在している。
本明細書で使用する「同一性」という用語は、「ｍｉＲ−１７−５ｐ」又は「ｍｉＲ−２０ａ」の各アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号１又は１２或いは配列番号７又は１３）との％同一性を表すときに使用される。同一性は、配列間にギャップを導入して或いはギャップを導入しないで塩基の同一性を比較することによって決定され、全塩基数に対する同一塩基数の百分率で表わすことができる。
ｍｉＲＮＡについては種を超えてその保存性が高いことも知られていることから、ヒト以外の哺乳動物（例えばマウス、ブタ、サルなど）由来のｍｉＲＮＡホモログについて、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＵｎｉＧｅｎｅなどの配列データベースを利用するか、或いはＢＬＡＳＴプログラムを使用してホモロジー検索を行うことによって、同一性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を見出すことも可能であろう。
本発明によれば、配列番号１又は１２或いは配列番号７又は１３の配列との同一性は少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であり、また、配列番号１４又は配列番号１５の配列との同一性は少なくとも９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上であり、これらの場合、配列は１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入又は付加を含むことができる。ここで、数個とは１〜１０の整数を指す。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数が２２とするとき、８５％同一性であれば約３個の塩基の置換が可能である。
本明細書で使用する「過剰発現」という用語は、「ｍｉＲ−１７−５ｐ」又は「ｍｉＲ−２０ａ」が、癌組織若しくは癌細胞において、正常又は非癌の組織若しくは細胞（対照）と比べて統計学的に有意に発現又は存在していることを意味する。ここで、「統計学的に有意」とは、ｍｉＲＮＡの発現レベルが対照と比べて１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、又は５倍以上高いことをいう。ｍｉＲＮＡの発現レベルは、例えばＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析によって決定することができる。
本明細書で使用する「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、「ｍｉＲ−１７−５ｐ」又は「ｍｉＲ−２０ａ」の配列、或いはそれらと相同性の高い配列、に結合することができる完全に又は部分的に相補的な配列（すなわち、アンチセンス配列）を有するオリゴヌクレオチドを意味する。該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよいし、又はＲＮＡであってもよいし、又は塩基が化学修飾された誘導体であってもよい。
本明細書で使用する「ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＮＡ）」という用語は、Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）、Ｅｘｉｑｏｎ社（デンマーク）などから入手可能なコンホメーションが制限された核酸類似体を指す。ＬＮＡは、下記のＤＮＡ及びＲＮＡの構造と対比されるように、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している下記の２つの環状構造をもつ核酸である（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．２００４，７：１８８−９４；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００３，３１：３１８５−９３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２００５，３３：４３９−４７）。下記の構造中、Ｂは塩基を表わす。
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本明細書で使用する「ｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａの生物活性」という用語は、癌の発生及び癌細胞の増殖に関わる活性を指す、
本明細書で使用する「ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５」という用語は、ヒト染色体１３ｑ３１．３に存在しｍｉＲ−１７−９２  ｍＲＮＡクラスターを含む図１Ａに示す構造を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１８又はｍｉＲ−１９ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ；ここで、Ｇ及びＣは全てＬＮＡで置換されている）の単独或いは併用によるヒト癌細胞株Ｃａｌｕ６株及びＨｅＬａ株の生存又は増殖に及ぼす影響（図１Ａ〜１Ｂ）、ＦＡＣＳ解析の結果（図１Ｃ〜１Ｄ）、ならびに、ヒト癌細胞株（Ｃａｌｕ６）に対して、図に示したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ここで、Ｇ及びＣは全てＬＮＡで置換されている）を作用したときの、ｍｉＲＮＡの発現の程度をＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ法で解析した結果を示し、ここでＳＣは、Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ、すなわち同一のＧ、Ａ、Ｔ、Ｃ比で配列を無作為にゲノム上の他の遺伝子と相同性がないものに変更したものを表す（図１Ｅ〜１Ｆ）。図１Ａ及び１Ｂにおいて、白丸は、Ｓｃｒａｍｂｌｅｄオリゴヌクレオチドを表し、黒丸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを表わす。また、図１Ｆにおいて、ｌｅｔ７は、対照として、無関係のｍｉＲＮＡであるｌｅｔ７の発現を表わし、５Ｓは、検体量の比較の目的で、５Ｓリボゾームの発現を表わす。
図２は、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａの更なる標的であるＲＢＬ２／ｐ１３０の同定を示す（図２Ａ〜２Ｄ）。具体的には、図２Ａは、ＲＢＬ２（ｐ１３０）・ＲＢ１・ＲＢＬ１（ｐ１０７）・Ｅ２Ｆ１に対する各々の抗体を用いたウェスタンブロット解析結果を示し、図２Ｂは、ＲＢＬ２（ｐ１３０）の３’非翻訳領域に検出される２箇所のｍｉＲ−１７−５ｐ／ｍｉＲ−２０ａ推定標的部位を示し、図２Ｃは、図２Ｂの推定標的部位を下流に挿入したシフェラーゼレポーターと、表記のオリゴヌクレオチドとを共導入したときのシフェラーゼ活性を示し、図２Ｄは、ｍｉＲ−１７−９２を高発現していないヒト癌細胞株Ａ５４９細胞における、表記のオリゴヌクレオチドの生存又は増殖に及ぼす影響を示す。図２Ｃにおいて、白色バーはｐＣＭＶ＿Ｌｕｃを表し、黒色バーはｐＲＢＬ２＿Ｔ１＋Ｔ２を表す。図２Ｄにおいて、白丸はＳｃｒａｍｂｌｅｄオリゴヌクレオチドを表し、黒丸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを表わす。また、ＡＳ及びＳＣは上記の意味を有する。
図３は、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−９２−１、並びにそれらに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）の各ヌクレオチド配列（ここで、Ｇ及びＣは全てＬＮＡで置換されている）を示す。
図４は、ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３の３’半分（３’ｉｎｔｒｏｎ３）が、癌の増殖抑制領域であることを示し（図４Ａ及び４Ｂ）、図４Ｃは、前記増殖抑制が主に３’ｉｎｔｒｏｎ３の保存領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）２（Ｃ２）に存在することを示し、図４Ｄ、４Ｅ及び４Ｆは、二本鎖ＲＮＡ依存的プロテインキナーゼＰＫＲ及びカスパーゼ７のタンパク分解酵素活性の活性化と部分的に関与するＣ２の同定を示す。具体的には、図４Ｄは、ＰＫＲのリン酸化を検出する抗体を用いたウェスタンブロット解析を示し、図４Ｅは、ＲＮＡ構造解析ソフトＭｆｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，３４０６−１５，２００３）による、Ｃ２の推定二次構造（ここで、４つの領域をＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４と表示した）を示し、図４Ｆは、活性化カスパーゼ７特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析を示す。また、図４中、ＶＣはインサートを持たない対照の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のｎｅｏｍｙｃｉｎ抵抗遺伝子をｐｕｒｏｍｙｃｉｎ抵抗遺伝子に置換した改変発現ベクター）を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明における癌治療用の医薬組成物は、特定の癌に対して有効であるという特徴を有している。このような癌には、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌が含まれる。いずれの癌でも、正常又は非癌（組織若しくは細胞）と比べてｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａが過剰発現している。一方、上記ｍｉＲＮＡを全く又は実質的に発現していない癌細胞に対しては、本発明の有効成分は効果を示さない。
上記癌に対し効能を示す有効成分としての核酸は、ヒト１３番染色体ｑ３１．３（「１３ｑ３１．３」と称する）に存在するｍｉＲ−１７−９２クラスター上のｍｉｃｒｏＲＮＡ（５’側から３’側に向かって配置される１７−５ｐ，１７−３ｐ，１８，１９ａ，２０ａ，１９ｂ−１及び９２−１  ｍｉＲＮＡ）のうちｍｉＲ−１７−５ｐ及び／又はｍｉＲ−２０ａのみを選択的に発現抑制又は活性（若しくは機能、例えば癌細胞の増殖促進作用）抑制することができる。本発明によれば、そのような核酸の例は、ｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（それぞれ、配列番号１又は１２、或いは配列番号７又は１３）、或いはその混合物である。これらのオリゴヌクレオチドは、３つの塩基のみが相違するだけであり、したがって高い同一性を有しているため、ｍｉＲ−１７−５ａアンチセンスオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａの双方の生物活性を抑制することができるし、またｍｉＲ−２０ａアンチセンスオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−１７−５ｐの生物活性をともに抑制することができる。
ｍｉＲＮＡの発現の程度は、癌細胞から全ＲＮＡを抽出し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ法にて、具体的には、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて小ＲＮＡを分離し、核酸用ブロッティング膜に転写し、ｍｉＲＮＡ特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションを含む手段によって判定することができる。
全ＲＮＡの抽出は、例えばｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ及びｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌを使用する方法、ｇｕａｎｉｄｉｕｍ／ＣｓＣｌ法などによって行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。
ｍｉＲＮＡ等の小ＲＮＡを分離するための変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、約７〜８Ｍ尿素とホルムアミドを含む約１５〜２０％のアクリルアミドゲルを用いて行うのがよい（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。
核酸ブロッティングは、泳動ゲルからブロッティング膜への電気的移動によって行う。このとき、膜として、例えばＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ  ＧＴ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ＵＳＡ）、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋  ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ＵＳＡ）などを使用することができる。
ハイブリダイゼーションは、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを用いて末端放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブと、ブロッティング膜上のｍｉＲＮＡとのハイブリダイゼーションを、７％  ＳＤＳ及び０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ＰＰＩを含む０．２５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２）溶液を用いて行ったのち、０．２〜２×ＳＳＣ及び０．１〜１％  ＳＤＳにて３７〜６８℃で洗浄を行う。検出は、オートラジオグラフィーによって行い、Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅにて露光しシグナルを得る。
ｍｉＲＮＡの生物活性は、５％血清添加ＲＰＭＩ１６４０培養液を含むｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに約８×１０４個の癌細胞を撒き、翌日とそのさらに２日後にｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法にて０〜１００ｎＭの範囲の種々の濃度の上記ｍｉＲＮＡを細胞に導入し３７℃で培養したのち、約４日後に細胞の生存率を比色法にて測定することによって求めることができる。ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎのために、例えばｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＳＡ）、正電荷コレステロール誘導体（Ｏｋａｙａｍａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７；４０８：２３２−２３４）、他のカチオン性リポソーム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９；５９：４３２５−４３３３）などを使用することができる。ｍｉＲＮＡ等の核酸をリポソーム内に封入し、この複合体を細胞と接触させてエンドサイトーシスを利用して細胞内に複合体を導入することができる。
核酸の細胞内導入の他の例は、ウイルスベクターによる感染を利用する方法（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微量注入法などを含むが、これらに限定されない。
本発明の核酸にはさらに、ｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１又は１２、或いは配列番号７又は１３）と８５％以上、９０％以上又は９５％以上の同一性を有する１８〜２５、好ましくは２１〜２３、ヌクレオチドの配列からなり、かつｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａの生物活性（例えば癌細胞の増殖促進作用）を抑制することができる、ＤＮＡ又はＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドも含まれる。
このような改変体は、ｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａと部分的に相補的な配列を有しており、ｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａの生物活性（例えば癌細胞の増殖促進作用）を抑制できる限り、上記の％同一性の範囲内で配列番号１又は配列番号７の配列においてヌクレオチドの欠失、置換、挿入又は付加を含むことができる。
本発明において有効成分としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ｍｉＲ−１７−５ｐ前駆体のアンチセンス配列において配列番号１又は１２の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはｍｉＲ−２０前駆体のアンチセンス配列において配列番号７又は１３の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０はいずれも、マイクロＲＮＡに関する既知の知見から、前駆体が存在し、核内のそれらの５００ｂ〜１ｋｂの前駆体ＲＮＡからＲＮＡ分解酵素の作用によって約３００ｂの前駆体ＲＮＡに分解され、さらにＲＮＡ分解酵素によって約７０ｂの前駆体ＲＮＡに分解され、その後、核外に移行し細胞質にて約２０ｂのｍｉＲＮＡとなると考えられる（Ｈ．Ｏｓａｄａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００７，２８：２−１２）。したがって、約２０ｂ〜約１ｋｂの間のサイズのｍｉＲ−１７−５ｐ前駆体及びｍｉＲ−２０前駆体、又はそれに対応するＤＮＡ、のアンチセンス配列において、配列番号１又は１２、或いは配列番号７又は１３、の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内である。
本発明の上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して合成することができる。このような装置は市販されており、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（ＵＳＡ）の３４００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ｂｉｏｓｓｅｔ社（ＵＳＡ）のＡＳＭ−８００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒなどが挙げられる。
本発明の上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの核酸修飾基によって化学修飾されていてもよい。そのような修飾基としては、例えばｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−メチル基及び２’−Ｏ−メトキシエチル基が挙げられる。これらの修飾は、塩基、好ましくは全ての又は一部のＧ及びＣ、をＬＮＡで置換するか、或いは塩基を２’−Ｏ−メチル基及び２’−Ｏ−メトキシエチル基で修飾することを含む。修飾によって、オリゴヌクレオチドの安定性が高まるとともに、ＬＮＡを含む核酸の場合、その構造がＲＮＡ様になり標的ＲＮＡに対する親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を高めることができる。また、ＲＮａｓｅ−Ｈによる標的ＲＮＡ切断を妨げないように５’−ｅｎｄ及び３’−ｅｎｄのみを例えば２’−Ｏ−メチル基で修飾した「ｇａｐｍｅｒ」構造の有用性も報告されている（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３８：６８５−６８９）。しかし、本発明では、上記の修飾は、効果の強弱には幾分影響する可能性はあるが、非修飾体と比べて本質的な差異はないと考えられる。
本発明の核酸はさらに、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターＤＮＡを含むことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列又はその改変配列は、それぞれ配列番号１２、配列番号１３に示される以下の配列：
2007126150.tif 000004
或いは、上記の配列と８５％以上、９０％以上又は９５％以上の同一性を有する配列である。
本発明のベクターは、適するプロモーター、ターミネーター、ポリアデニル化部位、選択マーカーなどとともに上記のＤＮＡ配列を含む。ベクターとしては、例えばプラスミド、コスミド、ウイルスベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなど）などを挙げることができ、哺乳動物細胞内での使用に適する任意のベクター、プロモーター、ターミネーター、ポリアデニル化部位、選択マーカーが好ましい。
本発明はまた、別の態様により、ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３の３’側半分又はその一部のＤＮＡ、それに対応するＲＮＡ、又は該ＤＮＡを含むベクターＤＮＡ、からなる群から選択される核酸を有効成分として含み、かつ該核酸が癌の増殖抑制活性及び／又は細胞死誘導活性を有する、癌、以下のものに限定されないが、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される癌、の治療のための医薬組成物を提供する。ここで前記イントロン３の３’側半分は、図４Ａにおいて「３’ｉｎｔｒｏｎ３」として示されている領域である。
本発明の実施形態によれば、前記イントロン３の３’側半分のＤＮＡ配列が配列番号１４によって示される配列、又はその配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列である。
さらにまた、前記イントロン３の３’側半分の一部のＤＮＡ配列が、図４Ａに示される保存領域２（Ｃ２）の配列、すなわち配列番号１５によって示される配列、又は配列番号１５によって示される配列の１５塩基以上の部分配列、又は配列番号１４によって示される配列において少なくとも配列番号１５によって示される配列を含む配列、或いはそれらの配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有する配列であるが、癌増殖抑制活性及び／又は細胞死誘導活性を有する配列である。ここで、部分配列は、配列番号１５によって示される配列において、連続する１５以上、１８〜２５又はそれ以上、１８〜３０又はそれ以上、１８〜４０又はそれ以上、１８〜５０又はそれ以上、１８〜７０又はそれ以上、１８〜１００又はそれ以上、１８〜１５０又はそれ以上、１８〜２００又はそれ以上、１８〜２５０又はそれ以上、１８〜３００又はそれ以上、１８〜３５０又はそれ以上、１８〜４００又はそれ以上、１８〜４５０又はそれ以上、１８〜５００又はそれ以上、１８〜５５０又はそれ以上、１８〜６００又はそれ以上、１８〜６５０又はそれ以上、の塩基からなる配列である。
本発明のＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３に由来する領域が、癌の増殖抑制作用及び／又は細胞死誘導作用という極めて重要な制御機能をもつことが今回判明した。このような制御機能は、イントロン３の３’側半分の領域に存在し、特にＣ２領域に存在することが分かった（図４Ｂ及び４Ｃ）。このような領域をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ核酸は、本発明の癌の治療のために有効に使用することができる。核酸をベクターとして使用するときには、前記ＤＮＡをベクターに組み込む。
改変体及びベクターについては、上記の説明をここにも適用でき、また、遺伝子組換え技術については、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．），２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されている慣用技術を使用することができる。
本発明の上記核酸は、単独で又は組み合わせて、特定の癌の治療のために使用することができる。癌は、ｍｉＲ−１７−５ｐ及び／又はｍｉＲ２０が過剰発現している癌であり、例えば肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢・胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される。本発明の核酸は、このような癌の増殖を抑制しかつ細胞死を誘導することが可能である。
したがって、本発明は、上記の核酸の１又は複数を含む癌の治療用の医薬組成物を提供する。
医薬組成物には、有効成分としての上記の核酸とともに、担体を含むことができる。担体は、液体又は固体製剤を処方するための任意の剤であり、例えば生理食塩液、滅菌水、緩衝液などが含まれる。組成物にはさらに、保存剤、安定剤などを含むことができる。好ましい製剤は、例えば注射剤、特に癌組織に直接注入可能な製剤である。そのような製剤として好適な例、有効性成分がカチオン性リポソームに封入された製剤である。或いは、凍結乾燥製剤であり、使用時に生理食塩水などで希釈するような形態である。
本発明の医薬組成物の治療効果は、ＬＤ５０／ＥＣ５０の測定に基づいて決定することができる。ここでＬＤ５０は、毒性を表し集団の５０％の致死量を、ＥＣ５０は、治療指数を表し集団の５０％の治療有効量をそれぞれ表す。組成物の用量は、例えば約１０〜約１００ｎＭである。特に約５０〜１００ｎＭの範囲の用量では癌細胞がほぼ完全に細胞死を起こす。また、ベクター、特にウイルスベクターの場合、その用量は例えば１０５〜１０１２ｐｆｕ／ｍｌである。しかし、実際の投与量は、患者の状態、年齢、性別、重症度などによって医師が決めるべきものである。
本発明の医薬組成物は、上記の特定の癌をもつ患者に投与することによって、癌の増殖及び進行を抑制し、非癌組織に影響せずに癌を選択的に死滅させることが可能である。投与のための有効成分としての上記アンチセンスオリゴヌクレオチド核酸及びＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３の３’半分領域をコードする核酸は、単独で又は組み合わせて使用することができる。好ましい投与形態は、非ベクターの核酸であるが、これは一過的な作用を可能とし副作用を有意に軽減できるからである。また、投与は、外科的手術、局所投与或いは静脈内投与などによって行うことができる。
以下に、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０００６】
実施例１
実験方法
１．ヒト癌細胞株
ヒト肺癌細胞株（Ｃａｌｕ６，ＡＣＣ−ＬＣ−１７６）及びヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）を、５％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて５％ＣＯ２存在下で培養し、以下の実験に使用した。Ｃａｌｕ６及びＨｅＬａ株はそれぞれ愛知県がんセンター研究所（Ｎａｇｏｙａ、Ｊａｐａｎ）から入手した。
２．アンチセンスオリゴヌクレオチド
ｍｉＲ−１７−９２ｍｉＲＮＡクラスターに含まれるｍｉＲＮＡ及びそれと極めて相同性の高い配列をもつｍｉＲＮＡの塩基配列と、実験に用いたそれらのｍｉＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は以下のとおりである（図３）。
2007126150.tif 000005
2007126150.tif 000006
なお、実験に用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのＧ及びＣがＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄによって置換されたオリゴＤＮＡ鎖を用いた。
３．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析
１×１０６個のＣａｌｕ６又はＨｅＬａ細胞を１０ｃｍ  ｄｉｓｈに撒き、翌日のｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎはオリゴヌクレオチドを１０ｎＭの最終濃度でｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＳＡ）を使用して行った。その２日後に前回と同じ条件で再度ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った細胞からａｃｉｄ−ｐｈｅｎｏｌ法にてＲＮＡを抽出した。ｍｉＲＮＡのＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔは５μｇのＲＮＡを使用し、１５％  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌを用いて行い、さらにＲＮＡをＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ  ＧＴ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ＵＳＡ）にｏｖｅｒｎｉｇｈｔで転写した。用いたＰｒｏｂｅは、下記のとおりである。
2007126150.tif 000007
これらのオリゴヌクレオチドを［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを用いてｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇでラベルしてプローブを作製した。０．２５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．２），７％  ＳＤＳ，０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ＰＰＩ溶液を用いて、ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎとｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔのｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ後に、ｗａｓｈを２×ＳＳＣ＋１％  ＳＤＳにて３７℃で行い、Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅにて露光しシグナルを得た。
４．ＭＴＴ解析
５％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を含む６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに８×１０４個の細胞を撒き、翌日にｍｉＲ−１７−５ｐ・ｍｉＲ−２０ａ等として表記のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１，３，５，７，３４）又はスクランブルオリゴヌクレオチド（配列番号１１、１６〜１９）を最終濃度が５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭになるように、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。翌日、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌ分を２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの４ｗｅｌｌ分に撒きなおし、さらにその翌日には、前回と同様な条件で２回目のｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。その２日後にＴｅｔｒａＣｏｌａｒＯｎｅ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ社、Ｊａｐａｎ）を用いてｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙを行った。
５．ＦＡＣＳ解析
５％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を含む６ｃｍ  ｄｉｓｈに２×１０５個の細胞を撒き、ＬＮＡ−オリゴヌクレオチドの最終濃度が１０ｎＭになるようにｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。翌日細胞を２分の１に分け、再度６ｃｍ  ｄｉｓｈに撒きなおした。その翌日に、前回と同じ条件で２度目のｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。さらにその翌々日に細胞をｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５％  ＮＰ−４０を含有する）にて懸濁し、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にて染色したのち、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にてＤＮＡ含量を測定し、付属するＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ及びＭｏｄｉｆｉｔプログラムにて解析した。
なお、上記の実験で使用したスクランブルオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有している。
2007126150.tif 000008
（但し、上記の配列において、ＧとＣは全てＬＮＡで置換されている。）
６．ｍｉＲＮＡ抑制活性のルシフェラーゼアッセイ
ＲＢＬ２の３’−ＵＴＲ中、２つのｍｉＲ−１７−５ｐ／ｍｉＲ−２０ａが標的とする部位に対応するオリゴヌクレオチドを、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃレポーターのホタルルシフェラーゼ遺伝子の停止コドンの下流にクローン化した。これらのＲＢＬ２レポーター（ＲＢＬ２−Ｔ１＋Ｔ２）を、２度目のＬＮＡトランスフェクションの翌日、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、１／９量のｐＲＬ−ＴＫと共にＣａｌｕ６中にトランスフェクトした。レポーター活性を翌日測定し、ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性で標準化した。
７．ウェスタンブロット解析
ＬＮＡ−オリゴヌクレオチドのトランスフェクション翌日、ＳＤＳサンプル緩衝液を用いて細胞溶解物を回収した。この細胞溶解サンプル中での推定標的遺伝子産物の改変を、マウスモノクローナル抗ＲＢ２抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＲＢ抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ｐ１０７抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗Ｅ２Ｆ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて調べた。内部対照として、マウスモノクローナル抗−α−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、再度厳密に調べた。
解析結果
ｍｉＲ１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる増殖抑制：
ｍｉＲ−１７−９２クラスター内に存在するどのｍｉＲＮＡが癌細胞の増殖を抑制するための治療標的となり得るのか検討を行った。各グアニン及びシトシン残基にＬＮＡを取り込んだアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８、ｍｕｉＲ−１９ａ及びｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−９２−１の発現抑制を行ったところ、ノーザンブロット解析により、ｍｉＲ−１７−５ｐとｍｉＲ−２０ａの間に高度に相同的な性質により起こる顕著な相互抑制が見られる一方、対応するｍｉＲＮＡの特異的抑制が確認された（図１Ｅ及び１Ｆ）。ＭＴＴアッセイにより、Ｃａｌｕ６、ＡＣＣ−ＬＣ−１７６（データ示さず）及びＨｅｌａ細胞においてｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトすることにより細胞増殖が顕著に減少することが明らかとなった（図１Ａ）。一方、それぞれのＧ、Ａ、Ｔ、Ｃ比を保って配列をスクランブルしたオリゴヌクレオチド（ＳＣ）ではそのような増殖抑制効果は見られなかった。
一方、ｍｉＲ−１７−９２クラスターに属するｍｉＲＮＡの中で、ｍｉＲ−１８及びｍｉＲ−１９ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはそのような抑制効果を示さなかった（図１Ｂ）。ｍｉＲ−９２−１を抑制することにより、細胞増殖がわずかに抑制された。この結果は、癌細胞の増殖における役割という点で、ｍｉＲ−１７−９２の複数のｍｉＲＮＡ間での明らかな違いを示した。さらに、ＦＡＣＳ解析により、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを単独でまたは組み合わせてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたＣａｌｕ６では、ｓｕｂＧ１細胞集団の増加が明らかに認められ、アポトーシスが誘導されている事を示唆するものと考えられた（組み合わせによる処理のデータを図１Ｃ及び１Ｄに示す）。
上記の実験により、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、癌細胞に対する優れた増殖抑制と細胞死誘導効果をもつことが明らかとなった。したがって、これらの組成物は癌の新規治療薬として有用であろう。
ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａ用の付加的真性標的としてのＲＢＬ２／ｐ１３０の同定：
次に、本発明者らは、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａに着目し、Ｅ２Ｆ１に加えて標的遺伝子を探索した。コンピューターベースのアルゴリズム（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｃａｎ並びにＰｉｃｔａｒ）により推定した数百個の遺伝子のうち、細胞増殖と癌との明らかな関連に基づいてＲｂファミリーのメンバーを選択した。ウェスタンブロット解析の結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたＣａｌｕ６細胞では、スクランブルオリゴヌクレオチドと比較して、ＲＢＬ２／ｐ１３０の発現に顕著な増加を示した（図２Ａ）。さらに、ＲＢ１でもアンチセンスオリゴヌクレオチドｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎにより、軽度の発現上昇が認められたが、ＲＢＬ１／ｐ１０７では、有意と判断しうる変化は認められなかった。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理に対する最も顕著な反応は、それぞれ１つの結合可能部位を有するＲＢ１及びＲＢＬ１／ｐ１０７ではなく、２つの結合可能部位を有するＲＢＬ２／ｐ１３０で観察された。従って、ＲＢＬ２／ｐ１３０が実際に、これらのｍｉＲＮＡにより直接制御されるのかどうかを調べた。アンチセンスで処理したＣａｌｕ６細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ領域に挿入されたＲＢＬ２／ｐ１３０の２つの結合可能部位のうち、少なくとも一方の部位のみを有するか、またはその両方の部位を共に有する、レポーター構築物を用いて調べた（図２Ａ）。ｍｉＲ−１７−５ｐ及び／又はｍｉＲ−２０ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理に反応してルシフェラーゼ活性の明らかな増加が観察された（図２Ｃ）。さらにまた、ＲＢＬ２（ｐ１３０）の３’非翻訳領域に検出される２箇所のｍｉＲ−１７−５ｐ／ｍｉＲ−２０ａ推定標的部位が決定され（図２Ｂ）、また、ｍｉＲ−１７−９２が高発現していないＡ５４９癌細胞株ではアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞の生存及び増殖に影響しないことを確認した（図２Ｄ）。
実施例２
材料と方法
細胞培養及びＯｎｃｏｍｉＲ−１断片発現用構築物
前述したように、実施例１に記載のヒト癌細胞株はすべてＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＣＳ中、３７℃、５％ＣＯ２の存在下培養した。発現用構築物には、下記のＯｎｃｏｍｉＲ−１遺伝子（ｃｈｒ１３：９０７９８０７４−９０８０４８７のの断片を使用した（ｍｉＲＮＡｓ＋３’イントロン３；９０８００４６５−９０８０４４８０、ｍｉＲＮＡｓ；９０８００６５９−９０８０２３９９（ｍｉＲ−１７−９２クラスターを有するＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片）、３’イントロン３；９０８０２３９９−９０８０４４８０、Ｃ１；９０８０２３２９−９０８０３１７０、Ｃ２；９０８０３１４６−９０８０９６及びＣ３；９０８０３８７６−９０８０４４８０））。これらの断片はＰＣＲにより増幅し、ピューロマイシン耐性遺伝子を担持する改変ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローン化した。
細胞増殖アッセイ
ＯｎｃｏｍｉＲ−１断片の各発現ベクターを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトし、ピューロマイシンにより選択した（２μｇ／ｍＬで２日間、その後は０．５μｇ／ｍＬ）。トランスフェクションの１０日後、テトラカラーワン（生化学工業、東京、日本）を用いて細胞増殖を測定した。ＬＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチドを、リポフェクタミン２０００を用いて細胞株にトランスフェクトし、３日目に再度トランスフェクトし、最初のトランスフェクションから４日後に細胞増殖を測定した。
細胞増殖のルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼレポーター活性を、細胞増殖を反映したものとして選択剤を使用せずに測定した。Ａ５４９細胞は、１／１０量のｐＲＬ−ＴＫレポーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に各ｍｉＲＮＡ発現ベクターに三重に共トランスフェクションした。ＣＭＶ駆動型（ホタル）ルシフェラーゼレポーター（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）の使用によっても同様の結果が得られた（データ示さず）。トランスフェクションの翌日、トランスフェクトした培養皿中の培養細胞をそれぞれ４分割し、その後、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３日目まで毎日ルシフェラーゼ活性を測定した。
結果
ｍｉＲ−１７−９２に隣接する増殖抑制領域の同定
ｍｉＲ−１７−９２の機能解析を進めていく過程において、ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３の３’側半分を含有することにより、腫瘍ｍｉＲＮＡクラスターの有無に関らず、ヒト癌細胞株の増殖が著しく抑制されることが判った（図４Ｂ）。イントロン３の３’側半分を厳密に検査することにより、３つの進化的に保存された領域の存在が明らかになった（図４Ａ）。そこで、それら３つの領域のいずれが細胞増殖抑制活性を有するかどうか検討を行った結果、保存領域２（Ｃ２）がその機構に深く関与することが示唆された（図４Ｃ）。更なる検討の結果、このＣ２領域による細胞増殖抑制機構の一部は、二本鎖ＲＮＡ依存的プロテインキナーゼＰＫＲ及びカスパーゼ７のタンパク分解酵素活性を活性化することによるものである可能性が示唆された（図４Ｄ及び図４Ｆ）。しかしながら、Ｃ２の推定二次構造に基づく本発明者らの試みは、Ｃ２領域内の原因部分を究明することにはならなかった（図４Ｅ）。
考察
上記の実験では、アンチセンスオリゴヌクレオチドによりｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａを抑制すると、肺癌細胞に顕著にアポトーシスを誘発することが明らかになった。これは、肺癌などの各種の癌タイプに有効な新規の治療方法となり得ることを示唆している。ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａは、３’側の非翻訳領域の標的部位に結合することによりＥ２Ｆ１を直接抑制することが予め示された。従って、アポトーシスの誘発は、これらのｍｉＲＮＡによる抑制から解除されることによるＥ２Ｆ１の誘発と、それに続く偶発的な細胞周期のＳ期への進行とに、部分的に関連しているということができる。さらに、上記の実験結果から、肺癌細胞の増殖はｍｉＲ−１８又はｍｉＲ−１９に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理により顕著に抑制されなかったことが判った。これは、これらのｍｉＲＮＡがＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５の同一の転写ユニット内で第三者的であり、細胞の増殖及び生存には直接関与せず、腫瘍発症・進展における異なる役割を担う可能性を示唆している。
発癌機構を考慮した上でのｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａの更なる標的分子の探索により、ＲＢＬ２／ｐ１３０が実際にそれらのｍｉＲＮＡの直接的な標的であるという確かな証拠を得ることができた。骨髄間質幹細胞中のＲＢＬ２／ｐ１３０の過剰発現は、アポトーシスの顕著な増加につながることが示されている。しかし、ＢｒｄＵ陽性の細胞周期細胞の割合に対する重要でない作用のみが観察された。これは、過剰発現されたＲＢの効果、すなわち、Ｓ期及びＴＵＮＥＬ陽性細胞の明らかな減少、と明らかに対照的である。この関連で、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａは、各ｍｉＲＮＡ単一の標的部位を有するＲｂファミリーの他の２つのメンバーであるＲＢ１及びＲＢＬ１／ｐ１０７を制御すると考えられる。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理されたＲＢ１及びＲＢＬ１／ｐ１０７のアップレギュレーションは、Ｃａｌｕ６細胞においてはあまり見られなかった。
ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現の複雑な微調整は、目的の細胞内で発現された各種遺伝子の発現プロファイルの関係だけでなく、相同性の度合いや標的部位の数という特異な影響を恐らく受ける。従って、ｍｉＲ−１７−９２の過剰発現を伴う癌細胞の生存はある程度、Ｅ２Ｆ１及びＲＢファミリーのメンバー間、ならびにそれらの未だ同定されていない標的遺伝子間の、微調整されたｍｉＲＮＡ仲介のバランスに依存することは考えられないことではない。更なる研究が必要なのは明らかであるが、新規な癌特異的治療方針を、癌細胞の合成致死性を誘発すると思われる微妙なバランスのアンチセンスオリゴヌクレオチド主体の揺らぎに基づき最終的には確立することができる。しかし、この関連で、これらｍｉＲＮＡを低レベルで発現するＡ５４９細胞において、上記処理による顕著な抑制は見られなかった。これは、「ＯｎｃｏｍｉＲ依存性」の存在の可能性を示唆している。
ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５は、リンパ腫において、遺伝子増幅領域に存在しｍｉＲ−１７−９２を発現する運搬体として作用することが示されている（Ｌ．Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３５：８２８−８３３）。しかし、この報告は、保存された阻害性ゲノム領域がｍｉＲ−１７−９２と共に発現することが、おそらくＰＫＲが仲介するアポトーシス経路の活性化によって、ｍｉＲ−１７−９２の増殖促進効果を相殺する、という本発明者らの観察と矛盾すると思われる。この明らかな矛盾は、２つの悪性腫瘍の細胞起源の差を反映していると言うことができるが、イントロン３の阻害効果は子宮頚癌や膵臓癌のような他のヒト癌細胞株に同様に見られることを、本発明者らは既に確認している（データ示さず）。ｍｉＲＮＡは、ポリシストロン性クラスターとしてしばしばＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写されることが提示されているが、ゲノム構造との関係において詳細に解析された例はほとんどない。従って、上記の実験は、ヒトゲノムにおいてそのように稀な例であるｍｉＲ−１７−９２に関する極めて重要な知見を、さらに提示するものである。本研究において、本発明者らがその存在を明らかとしたヒトゲノム上のｍｉＲ−１７−９２クラスター３’側領域の３つの機能配列は、マウスゲノム上のｍｉＲ−１７−９２クラスターの３’側の領域に同様に保存され存在することから、Ｃ２領域に見られる増殖抑制機能も進化的意味で保存されているものと推定できる。
要約すると、１）ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドがｍｉＲ−１７−９２ｍｉＲＮＡクラスターを過剰発現する癌細胞においてアポトーシス（細胞死）を効果的に誘発する、２）ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３は腫瘍増殖阻害効果を有する、という本発明者らの知見は、新規な癌治療方法を提供する。また、ｍｉＲ−１７−９２クラスターの更なる標的遺伝子の同定は、これらｍｉＲＮＡの過剰発現が癌細胞に対しいかに選択的利点を与えるかを十分に理解するために重要である。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明に係るｍｉＲ−１７−５ｐ及び／又はｍｉＲ−２０ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＯｎｃｏｍｉＲ−１／Ｃ１３ｏｒｆ２５のイントロン３の３’側半分又はその一部の配列を有する核酸などの核酸は、ｍｉＲ−１７−５ｐ又はｍｉＲ−２０ａを過剰発現する癌の細胞増殖を抑制し、細胞死を誘導することから、そのような癌の治療のために有用である。
上で開示した配列番号１４及び１５の配列は、以下のとおりである。
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［配列表］
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【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｆ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図２Ａ−Ｂ】
2007126150.tif 000029
【図４Ｄ−Ｆ】
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【国際調査報告】
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