(57)【要約】本発明はポリエチレングリコール結合アルブミンを含む医薬組成物、およびポリエチレングリコール結合アルブミンを患者に静脈内投与することを含む、ヒトの抗血栓治療またはヒト虚血性疾患の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール結合アルブミンを含む医薬組成物。
【請求項２】
抗血栓薬または虚血性疾患治療薬である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記アルブミンがヒトアルブミンである、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記アルブミンが組換え型ヒト血清アルブミンである、請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
ポリエチレングリコール結合アルブミンを血管内投与することを含む、抗血栓治療または虚血性疾患の治療方法。
【請求項６】
ヒトを治療する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記血管内投与が、静脈内投与である、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
前記アルブミンがヒトアルブミンである、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記アルブミンが組換え型ヒト血清アルブミンである、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
虚血性疾患を治療するために使用する医薬組成物を製造するためのポリエチレングリコール結合アルブミンの使用。
【請求項１１】
抗血栓医薬組成物を製造するためのポリエチレングリコール結合アルブミンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血栓薬および心筋梗塞、脳梗塞、閉塞性動脈疾患などの虚血性疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗血栓薬として、これまで多くの薬剤が使用されてきた。抗血栓薬は主に２つのカテゴリーに分けられる。すなわち、血小板に作用する薬剤と、血液凝固因子の作用を調節する薬剤である。血小板に作用する薬剤としては、シクロオキシゲナーゼを阻害するもの（アスピリン）、ホスホジエステラーゼを阻害するもの（シロスタゾール）、および細胞膜上のプリン受容体を抑制するもの（チアゾリジン誘導体）等が挙げられる。一方、血液凝固因子の作用を調節する薬剤としては、トロンビンを阻害するもの（アンチトロンビンＩＩＩ）、他の凝固因子を阻害するもの（ワルファリン）、および繊維素溶解活性を活性化するもの（組織プラスミノーゲン活性化因子；ｔＰＡおよびウロキナーゼ）等が挙げられる。これらの薬剤は、急性冠動脈不全、脳卒中、および脳虚血の患者を治療するために、臨床分野において広く使用されてきた。
しかしながら、これらの抗血栓薬には課題も多く、虚血性疾患に対し新たな作用機序を有する抗血栓薬が必要とされている。
【発明の開示】
【０００３】
このような状況の下、抗血栓治療または虚血性疾患の治療等に用いることのできる新たな医薬組成物が求められている。
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合アルブミンが、血管損傷部位において血液凝固および／または血小板凝集を調節する機能を有すること、および抗血栓効果を示すこと等を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）  ポリエチレングリコール結合アルブミンを含む医薬組成物。
（２）  抗血栓薬または虚血性疾患治療薬である、上記（１）記載の組成物。
（３）  前記アルブミンがヒトアルブミンである、上記（１）または（２）記載の組成物。
（４）  前記アルブミンが組換え型ヒト血清アルブミンである、上記（１）または（２）記載の組成物。
（５）  ポリエチレングリコール結合アルブミンを血管内投与することを含む、抗血栓治療または虚血性疾患の治療方法。
（６）  ヒトを治療する、上記（５）記載の方法。
（７）  前記血管内投与が、静脈内投与である、上記（５）または（６）記載の方法
（８）  前記アルブミンがヒトアルブミンである、上記（５）〜（７）のいずれか１つに記載の方法。
（９）  前記アルブミンが組換え型ヒト血清アルブミンである、上記（５）〜（７）のいずれか１つに記載の方法。
（１０）  虚血性疾患を治療するために使用する医薬組成物を製造するためのポリエチレングリコール結合アルブミンの使用。
（１１）  抗血栓医薬組成物を製造するためのポリエチレングリコール結合アルブミンの使用。
以上説明したように、本発明により、新たな医薬組成物が提供される。本発明の好ましい態様においては、医薬組成物は抗血栓薬または虚血性疾患治療薬として使用でき、血管損傷部位等において血液凝固および／または血小板凝集を調節する機能を有し、抗血栓効果等を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１（Ａ）は、ＰＥＧ（１０，０００）を測定するための較正線を示し、（Ｂ）は、ＰＥＧ−ｒＨＳＡおよび遊離ＰＥＧを表す代表的なチャートを示す図である。
図２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＥＧ−ｒＨＳＡおよび遊離ｒＨＳＡの粘度とせん断速度との関係を示す図である。○はラット血液（絶食ラット由来の全血サンプル）、□はｒＨＳＡ、●はＰＥＧ−ｒＨＳＡ結合体、△は遊離ＰＥＧ＋ｒＨＳＡ混合物を示す。
図３は、ラットにおいて３０％等容量の血液交換を行った前後における平均動脈圧（ＭＡＰ）に対するＰＥＧ−ｒＨＳＡおよびｒＨＳＡの投与効果を示す図である。尾への切り込み（テイルカット）による出血時間を測定するためのラットの状態を最適にするため、体位変換を行った。
図４（Ａ）は、ｒＨＳＡ、ＰＥＧ−ｒＨＳＡ、およびＰＥＧ＋ｒＨＳＡを処置したことによるラットの出血時間の差を示す図である。＊Ｐ＜０．０５（対照群とＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したグループとの比較）。（Ｂ）は、ヘマトクリット値の差を示し、（Ｃ）は、血小板数の差を示す。＊Ｐ＜０．０５（対照群との比較。）
図５は、レーザーアブレーション技術により引き起こした損傷部位における微小血管中の血小板の接着および凝集の形態差を示す図である。（Ａ）は、対照の静脈を示し、（Ｂ）は、ＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したラットの静脈を示す。図５中のデジタル数字はレーザーアブレーションの開始後の時間（秒）を示す。いずれの場合も、腸間膜微小循環における分析を行うため、後毛細管細静脈（直径３０−５０ミクロン）を選択した。マジェンタ色は、レーザーにより生じた損傷部位へのローダミン標識リポソームの集積を示し、標識の強さは、対照とＰＥＧ−ｒＨＳＡ処置グループとの間で同等であった。注目すべきことは、対照の静脈（上パネル）では、損傷部位にＣＦＳＥ染色血小板の集積が認められるのに対し、ＰＥＧ−ｒＨＳＡで処置したラットの静脈では、顕著な血小板の集積は全く認められず、ＰＥＧ−ｒＨＳＡの抗血栓効果を示していることである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は以下の説明に限定されるものではなく、また、本明細書に開示した実施形態は、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて適宜変更されうる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国特許仮出願６０／７７８，４８９号明細書の全体を包含する。また、本明細書に記載した全ての文献および刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
１．  本発明の概要
本発明者は、鋭意研究を行った結果、抗血栓治療または虚血性疾患治療等のための新たな医薬組成物を開発した。本発明の好ましい態様では、医薬組成物は、前述したカテゴリーのものとは異なる新たな抗血栓薬となり得る。
本発明の医薬組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合したアルブミン（ＰＥＧ結合アルブミン）を含むものである。ＰＥＧ結合アルブミンとしては、例えば、「ＰＥＧ結合ヒト血清アルブミン」（ＰＥＧ−ＨＳＡ）、特には、「ＰＥＧ結合組換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）」（ＰＥＧ−ｒＨＳＡ）がある。
ＰＥＧ−ＨＳＡ、ＰＥＧ−ｒＨＳＡ等のＰＥＧ結合アルブミンは、血中に投与した場合に血液の粘度を上昇させる。血液の粘度の上昇は、壁せん断速度を上昇させ、それによりｉｎ  ｖｉｖｏで一酸化窒素（ＮＯ）を二次的に誘導することが知られている。このことから、本発明の好ましい態様においては、医薬組成物は抗血栓薬または虚血性疾患治療薬として使用でき、血管損傷部位等において血液凝固および／または血小板凝集を調節する機能を有し、抗血栓効果等を示す。
尚、過去の研究ではＰＥＧ−ｒＨＳＡを出血性ショックの制御に応用することが試みられている（参照文献１および２）。しかしながら、ＰＥＧ−ｒＨＳＡ等のＰＥＧ結合アルブミンが、ｉｎ  ｖｉｖｏの流動条件下で、循環血小板の再分布および集積に関するメカニズムにより、血管損傷部位等において血液凝固および／または血小板凝集を調節する機能を有することは、知られていなかった。
さらに、本発明は、ポリエチレングリコール結合アルブミンの血管内投与を含む、抗血栓治療または虚血性疾患の治療方法、また、虚血性疾患を治療するために使用する医薬組成物を製造するためのポリエチレングリコール結合アルブミンの使用、さらには、抗血栓医薬組成物を製造するためのポリエチレングリコール結合アルブミンの使用を包含する。
２．  医薬組成物
２．１  ポリエチレングリコール結合アルブミン
本発明で用いる「ポリエチレングリコール結合アルブミン」は、アルブミンにポリエチレングリコールが結合したものである。１分子のアルブミンに結合させるポリエチレングリコールの数は、例えば、１〜２０個、好ましくは、８〜１５個である。
本発明に使用されるポリエチレングリコールは、特に限定されないが、水溶性で生体適合性の液体であることが好ましい。その分子量は１００〜２０，０００ダルトン（Ｄａ）の範囲内であるのが好ましく、より好ましくは、１，０００〜１０，０００ダルトン（Ｄａ）の範囲内である。このようなポリエチレングリコールは、公知の技術に従って容易に作製することもできるし、あるいは市販のものを入手することができる。
また、本発明に使用されるアルブミンとしては、例えば、卵アルブミン、血清アルブミン、乳アルブミン、筋アルブミンなどの動物性アルブミンや、ロイコシン、レグメリン、リシンなどの植物性アルブミンなどが挙げられる。本発明では、特に、ヒト血清アルブミンを用いることが好ましい。また、組換え型ヒト血清アルブミンであってもよい。組換え型ヒト血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンと同一のアミノ酸配列を有していてもよいし、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加している変異型アルブミンであってもよい。このようなアルブミンは、公知の技術に従って容易に作製することができるし、あるいは市販のものを入手することができる。
本発明の医薬組成物中のポリエチレングリコール結合アルブミンの含有量は、特に限定されず、当業者が適宜選択することができる。
ここで、本発明は、抗血栓医薬組成物を製造するためにポリエチレングリコール結合アルブミンを使用することを含む。
２．２  添加物
さらに、本発明の組成物は、（ｉ）高分子組成物中の薬物の安定性を向上させること、（ｉｉ）この組成物における水素イオン濃度をコントロールすること、あるいは（ｉｉｉ）薬物の放出速度および高分子の分解速度を制御すること等を目的として、薬学的に許容される添加物を含有しうる。これらの添加物は、好ましくは、界面活性剤、無機塩類、糖類、天然高分子、およびその混合物からなる群から選択される。イオン性または非イオン性界面活性剤は、いずれも本発明の組成物において使用されうる。代表的なイオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウムが挙げられ、また、代表的な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート、ポリビニルピロリドン、ポロキサマー、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびその混合物が挙げられる。
本発明で添加物として使用されうる糖類としては、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、フルクトース、ラクトース、およびその混合物が挙げられる。
本発明の組成物への添加物として使用されうる無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩化マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、酢酸亜鉛、乳酸亜鉛、水酸化マグネシウム、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、酸化亜鉛、およびその混合物が挙げられる。
本発明の組成物への添加物として使用されうる天然高分子としては、例えば、シクロデキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キトサン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびその混合物が挙げられる。
本発明における組成物中の添加物の含有量は、好ましくは、０．０１〜１０重量％の範囲内であり、より好ましくは、０．１〜１重量％の範囲内である。
２．３  医薬組成物の投与
本発明の好ましい態様では、医薬組成物を生体内に投与することにより、血管損傷部位等において血液凝固および／または血小板凝集を調節し、血栓ができるのを効果的に防ぐことができる。このため、抗血栓治療または虚血性疾患の治療に有用である。
本発明の医薬組成物は、特に限定されないが、例えば非経口投与とするのが好ましい。非経口投与とする場合は、好ましくは、液剤、例えば注射剤等の形で投与する。特に、本発明では、注射剤は、点滴注射剤であるのが好ましい。注射剤とする場合は、例えば、静脈注射のほか、皮下注射、皮内注射、筋肉注射などにより投与する。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なり、特に限定されず、適宜選択することができる。例えば、投与量は臨床医によって適宜選択される。
３．医薬組成物の製造方法
本発明の組成物の製造方法は、特に限定されず、公知の製造方法を用いることができる。例えば、注射剤とする場合は、ポリエチレングリコール結合アルブミンを、無菌の水性液もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、アンプルに充填される。
また、本発明で用いるポリエチレングリコール結合アルブミンは、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）や組換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ））とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを反応させることにより得られる。具体的には、本発明のポリエチレングリコール結合アルブミン溶液は、水溶性かつ生体適合性の液体ポリエチレングリコールと生理活性物質であるアルブミン（例えば、ＨＳＡ、ｒＨＳＡ）とを、有機溶媒中または有機溶媒と水との混合物中で、混合および溶解させて高分子溶液を得る工程を含む方法により製造することができる。さらに、この高分子溶液を膜に通して濾過することにより滅菌し、濾過後の高分子溶液を減圧下で凍結乾燥または蒸発させることにより有機溶媒を除去しても良い。
より具体的には、本発明におけるポリエチレングリコール結合アルブミンの溶液は、液体ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ＨＳＡ、ｒＨＳＡ）および任意の添加物を、有機溶媒中、または有機溶媒と水との混合液中で共に溶解することにより、製造できる。溶液の調製に適切な有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、アセトン、酢酸、ジメチルアセトアミド、エタノール、イソプロパノール、ジオキサンなどが挙げられる。
４．  治療方法
また、本発明は、ポリエチレングリコール結合アルブミンを血管内投与することを含む、抗血栓治療または虚血性疾患の治療方法を提供する。治療対象としては、特に限定されないが、例えば、ヒトや、ヒト以外の生物、例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ウマなどの非ヒト哺乳動物等が挙げられる。
ここで、本発明の治療方法は、虚血性（低酸素）イベントにおけるアルブミン分子の作用を利用することにより機能していると考えられる。尚、本明細書において、用語「虚血性イベント」とは、臓器への血流が不十分（血液循環の部分的または全体的障害）であるために、患者が局所的および／または一時的な虚血を経験することを意味する。また、「抗血栓治療」とは、血栓の形成を抑制するために行う治療のことを意味する。
そして「虚血性疾患」とは、そのような虚血性イベントが生じる疾患のことを意味し、例えば、外傷、移植時の拒絶反応、虚血性脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞など）、虚血性腎疾患、虚血性肺疾患、感染症に関連する虚血性疾患、四肢の虚血性疾患（例えば、閉塞性動脈硬化症など）、虚血性心疾患（例えば、虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全など）などが挙げられる。また、脳水腫、急性冠動脈不全等の虚血性イベントが生じる疾患もあげられる。
好ましくは、ポリエチレングリコール結合アルブミンは、液剤、例えば注射剤等として、血管内投与する。また、本発明の好ましい態様では、ポリエチレングリコール結合アルブミンを静脈内投与する。
また、本発明は、ヒトの虚血性疾患を治療するために使用する医薬組成物を製造するためにポリエチレングリコール結合アルブミンを使用することを含む。
以下、本発明を下記の実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。
【実施例１】
【０００６】
１  材料および方法
１．１  動物
２３０〜２９０ｇのＷｉｓｔｅｒ系雄ラットを、水を自由に得られる状態で終夜絶食させ、公知の方法（参照文献３）に従いイソフルラン吸入により麻酔した。出血時間は公知の方法（参照文献４）を用いて測定した。麻酔したラットの尾に、テンプレートに従って２．５ｍｍの長さ、１ｍｍの深さで、尾の先端部から１ｃｍの位置に背部静脈から４５度の角度で切り込みを入れた。尾は通常の生理食塩水（４５ｍｌ）に浸し、出血が止まるまでに要した時間をストップウォッチで測定した。
１．２  ＰＥＧ−ｒＨＳＡの調製
組換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）は、ＮＩＰＲＯ  Ｉｎｃ．（滋賀、日本）から得た。分子量１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は市販品を購入した。ＰＥＧ結合ｒＨＳＡは、公知の方法（参照文献５）に従い、ｒＨＳＡとスクシンイミド−ＰＥＧ前駆体（タンパク質のリジン残基と反応する能力を有する）とを反応させることにより調製した。ｒＨＳＡ  １分子当たりのＰＥＧの結合数は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ウォーターズ社製２６９５セパレーションモジュールを用いたＴＳＫゲルカラム）を用いて、ＰＥＧ−ｒＨＳＡを調製するための反応混合液中の遊離ＰＥＧを測定することにより計算した。反応混合液中の未結合の遊離ＰＥＧを定量するため、所定の濃度のＰＥＧを調製し、較正線を引いた。ＰＥＧの量は、ＨＰＬＣチャートのピーク領域を計算することにより測定した。図１において、計算データは約１０〜１１分子のＰＥＧが１分子のｒＨＳＡに結合したことを示した。
血液の粘度に対するＰＥＧ−ｒＨＳＡの効果は、回転式液体粘度計を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討した。サンプルの特性に関するパラメーターを表１に示した。図２において、ＰＥＧと非結合ｒＨＳＡとの混合物は、粘度において全血と比較して顕著な減少を示した（△）が、ＰＥＧ−ｒＨＳＡは、全血サンプル単独と同等の粘度を示した（●）。一方、ｒＨＳＡ単独では、粘度において最小値を示した（□）。ＰＥＧ−ｒＨＳＡの別の特徴としては、ｒＨＳＡと比較してＰＥＧ−ｒＨＳＡの膠質浸透圧（ＣＯＰ）の値が高いことが挙げられる（表１）。これらの結果は、ＰＥＧ−ｒＨＳＡが生理学的な血液粘度を維持できることを示す。
１．３  等容量血液希釈（ｉｓｏｖｏｌｅｍｉｃ  ｈｅｍｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）動物モデル
ラットは、ジエチルエーテルで処置後、イソフルランを用いて麻酔した。動脈カテーテルを左大腿動脈に移植し、圧力変換器に結合した。平均動脈圧（ＭＡＰ）を増幅させ、継続的に観測した。データはコンピューターに集めた。右大腿静脈にカニューレを挿入して溶液を注入し、一方で、右大腿動脈にカニューレを挿入して血液を採取し、動脈血を血液ガス分析、ヘマトクリット数および血小板数の測定のためのサンプルとした。サンプルは、血液希釈の前後でＥＤＴＡ入りのチューブに２回（カニューレ挿入時、および測定期間終了時）採取した。直腸の温度を観測し、観測開始時から一定に維持した。
３本のカテーテルを移植した後に、ＭＡＰの安定性を５分間測定した。各溶液（ｒＨＳＡ、ＰＥＧ−ｒＨＳＡ結合体、ＰＥＧ＋ｒＨＳＡ混合物）は、二本のシリンジポンプを用いて右大腿静脈のカテーテルに５分間注入し、同時に右大腿動脈カテーテルから同じ速度で血液を採取した。交換する輸液の容量は、ラットが有する血液容量の３０％として計算し、ラットの体重１ｋｇ当たり５６ｍｌとして概算した。輸液の交換速度は、（交換する輸液の容量）／５［ｍｌ／分］として計算した。
血液交換の開始から１０分後、尾に切り込みを入れる準備のためラットの体位を変えた。血液交換の開始から１５分後、すなわち体位変換から５分後、テンプレート（Ｑｕｉｋｈｅｅｌ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に従って２．５ｍｍの長さで１．０ｍｍの深さの切り込みを尾の先端部から１ｃｍの位置に入れた。尾は生理食塩水入りの５０ｍｌシリンダーに浸し、出血が止まるまでに要した時間を測定した。ＭＡＰの観測は５０分間続け、２回目のサンプルを採取した。
【表１】
2007102562.tif 000002
１．４  レーザーアブレーションを用いたｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板の接着および凝集の生体内観察
公知の方法（参照文献６）に従って微小血管にレーザーアブレーションを行ったｉｎ  ｖｉｖｏモデルを用いて、ＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したグループと遊離ｒＨＳＡを処置したグループとの、血管損傷部位における血小板の接着および凝集についての差を比較した。具体的には、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミドエステル（ＣＳＦＥ）をラットに注入し、ＣＳＦＥの注入後、ローダミンＧで標識したＰＥＧコートリポソーム２００ｍｌを注入した。ＣＳＦＥは、血中に注入した場合に循環血小板および一部の白血球を染色することができる蛍光前駆体である（参照文献７）。また、ＰＥＧコートリポソーム分子は、損傷していない血管壁には集積せず、接着もしないが、損傷した血管内皮細胞の内皮下腔には迅速に集積する。
微小血管の血栓症を誘導するため、本発明者らは、窒素−色素パルスレーザーシステムを備えたマルチピンホール共焦点レーザー顕微鏡（Ｙｏｋｏｋａｗａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．東京）を用いた。この顕微鏡は、目的の領域に局在する微小血管内皮細胞にピンポイントレーザーアブレーションを実施することができる。レーザーアブレーションのエネルギーは、異なる実験間で一定にした。分析のために選択した微小血管にパルスレーザーを適用した場合、損傷した内皮細胞は、５３０ｎｍの励起波長下で赤色（あるいはマジェンタ色）として可視化できるローダミン標識リポソームの集積により、顕著に認められるようになった。一方、血小板の接着および凝集における変化は、４８８ｎｍの落射照明下で緑色として可視化した。広帯域フィルターを用いて、血管損傷部位における緑色および赤色（あるいはマジェンタ色）双方の蛍光シグナルを、増感ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス株式会社、浜松市）およびデジタルビデオ記録システムを用いて同時に可視化した。
１．５  統計的分析
値は、他に示さない限り平均±Ｓ．Ｅ．を表す。統計学的有意差は、Ｐ＜０．０５により示す。
２  結果および考察
２．１  ３０％等容量血液希釈法におけるＰＥＧ−ｒＨＳＡのＭＡＰおよび心拍数に対する改善効果
図３は、３０％等容量血液希釈を行うための血液交換法における、それぞれのＭＡＰの経時的変化を示す。図３に示すように、ｒＨＳＡのみを処置したグループは、血液交換の過程で血液希釈の処置をしていない対照群と比較してＭＡＰの有意な低下を示した。ＭＡＰの値は、この交換法の完了後に回復を示したが、対照群のレベルにまで十分に回復しなかった。一方、ＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したグループは、一連の測定を通してＭＡＰの顕著な低下を全く示さなかった。また、ｒＨＳＡプラス非結合遊離ＰＥＧを同等の投与量で処置したグループもＭＡＰ値の顕著な低下を全く示さなかったが、その効果はＰＥＧ−ｒＨＳＡで処置したグループにおいて測定されたものより小さいことが示された。
２．２  ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＥＧ−ｒＨＳＡの投与による出血時間の延長
図４は、尾への切り込みにおいて測定された出血時間におけるグループ間の差を示す。図４（Ａ）に示すように、ＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したグループは、ｒＨＳＡのみを処置したグループまたはｒＨＳＡプラス遊離ＰＥＧを処置したグループと比較して、出血時間の有意な延長を示した。これらの結果から、発明者は、循環血小板数およびヘマトクリット値についてグループ間における差を検討することとした。図４（Ｂ）に示すように、ＰＥＧとｒＨＳＡの結合体（ＰＥＧ−ｒＨＳＡ）、ｒＨＳＡ、またはｒＨＳＡと遊離ＰＥＧの混合物（ＰＥＧ＋ｒＨＳＡ）を処置したラットにおいて、ヘマトクリット値は、血液希釈の結果にほぼ相当する２５−３０％減少した。これら３つのグループにおいて、ＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したグループは、ヘマトクリット値において最小値を示した。これは、血管内腔において水分子を保持する機能によるものであると推定される。興味深いことに、これらのグループにおける循環血小板数の減少は、血液希釈により生じるヘマトクリット値の減少と比較して大きいものではなかった（図４（Ｃ））。結論としては、血漿成分に対する血小板数（血小板／１００−Ｈｃｔ％）は、ＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したグループが最小になった。これらの結果から、本発明者は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板の損傷部位への動員の効率性について、以下に示すように、微小血管のレーザーアブレーション技術を用いて検討することとした。
２．３  ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてレーザーにより生じる微小血管の血栓形成のＰＥＧ−ｒＨＳＡ投与による軽減
図４に示した結果に基づき、本発明者は、微小血管内皮およびその周囲に付着する血小板は、等容量血液希釈条件下では、ＰＥＧ−ｒＨＳＡの投与において血管の中心線領域にその分布をシフトし、それにより、見かけの循環血小板数は、血液交換法による細胞の減少にかかわらず上昇したと仮定した。
全身の血圧は、ＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したグループがｒＨＳＡを処置したグループよりもわずかに高いことから、本発明者は、局所の灌流圧がグループ間において同等である後毛細管細静脈を選択した。図５に示すように、マジェンタ色は、レーザーにより生じた損傷部位におけるローダミン標識リポソームの集積を示し、標識の強度は、対照群とＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したグループとの間で同等であった。一方、血小板の接着および凝集の程度は異なることが示された。図５（Ａ）に示すように、対照の細静脈では、損傷部位においてＣＦＳＥ染色血小板の集積が認められたのに対し、図５（Ｂ）に示すＰＥＧ−ｒＨＳＡを処置したラットの細静脈では、血小板の顕著な集積が全く認められなかった。このことは、ＰＥＧ−ｒＨＳＡの抗血栓効果を示す。よって、ポリエチレングリコール結合アルブミンは、例えば、抗血栓治療または虚血性疾患治療に用いることができることが判った。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
ＰＥＧ−ｒＨＳＡは、血管内腔における水分保持を維持する上で注目すべき効果を有し、また、抗血栓能により微小血管の血行動態を改善する。したがって、ＰＥＧ−ｒＨＳＡの投与は、脳微小循環の急性虚血性脳卒中および脳水腫の患者、または急性冠動脈不全の患者を治療する上で有益である可能性が高い。
参照文献
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【図１】
2007102562.tif 000003
【図２】
2007102562.tif 000004
【図３】
2007102562.tif 000005
【図４】
2007102562.tif 000006
【図５】
2007102562.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月7日(2008.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール結合アルブミンを含む、抗血栓または虚血性疾患治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記アルブミンがヒトアルブミンである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記アルブミンが組換え型ヒト血清アルブミンである、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
血管内投与するものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
ヒトを治療するための、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
前記血管内投与が、静脈内投与である、請求項４または５記載の組成物。
【請求項７】
虚血性疾患を治療するために使用する医薬組成物または抗血栓医薬組成物を製造するためのポリエチレングリコール結合アルブミンの使用。
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月13日(2009.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール結合ヒトアルブミンを含む、抗血栓または虚血性疾患治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記アルブミンが組換え型ヒト血清アルブミンである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
血管内投与するものである、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
ヒトを治療するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
前記血管内投与が、静脈内投与である、請求項３または４記載の組成物。
【請求項６】
虚血性疾患を治療するために使用する医薬組成物または抗血栓医薬組成物を製造するためのポリエチレングリコール結合ヒトアルブミンの使用。
【請求項７】
ポリエチレングリコール結合アルブミンを含む、血液粘度上昇剤。
【請求項８】
前記アルブミンがヒトアルブミンである、請求項７記載の血液粘度上昇剤。
【請求項９】
前記アルブミンが組換え型ヒト血清アルブミンである、請求項７記載の血液粘度上昇剤。
【請求項１０】
血管内投与するものである、請求項７〜９のいずれか１項記載の血液粘度上昇剤。
【請求項１１】
ヒトを治療するための、請求項７〜１０のいずれか１項記載の血液粘度上昇剤。
【請求項１２】
前記血管内投与が、静脈内投与である、請求項１０または１１記載の血液粘度上昇剤。
【請求項１３】
血液粘度上昇剤を製造するためのポリエチレングリコール結合アルブミンの使用。
【国際調査報告】
2007102562.tif 000008
2007102562.tif 000009
2007102562.tif 000010
2007102562.tif 000011
2007102562.tif 000012
2007102562.tif 000013