【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年12月19日(2007.12.19)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  デンプン分枝酵素
【特許請求の範囲】
【請求項１】  コムギデンプン分枝酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】  前記核酸がゲノムＤＮＡ分子である、請求項１または２に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】  請求項２に記載の単離された核酸分子であって、該核酸が、クローンＧ１、Ｇ２、Ｇ７〜Ｇ９、またはＨ１〜Ｈ１０のうちいずれか１つに存在する、核酸分子。
【請求項４】  前記核酸がｃＤＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】  請求項４に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下：
（ａ）図８（配列番号５）、図９（配列番号６）、または配列番号１０のうちいずれか１つにおいて示される配列を有する核酸分子；
（ｂ）少なくとも低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）における配列の少なくとも１つにハイブリダイズ可能な核酸分子；または
（ｃ）（ａ）における配列の少なくとも１つに対し、少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸分子
を含む、核酸分子。
【請求項６】  請求項５に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下：
（ａ）配列番号１０に示される配列を有する核酸分子；
（ｂ）少なくとも低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１０にハイブリダイズ可能な核酸分子；または
（ｃ）配列番号１０に対し、少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸分子
を含む、核酸分子。
【請求項７】  請求項５または６に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、高ストリンジェンシーな条件下で、（ａ）における配列の少なくとも１つに、ハイブリダイズ可能であるか、または該配列に対し、少なくとも８０％の配列同一性を有する、核酸分子。
【請求項８】  コムギデンプン分枝酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）をコードする核酸分子に相補的なヌクレオチドの配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項９】  請求項１または２に記載のゲノムＤＮＡ分子の、プロモーター配列。
【請求項１０】  請求項１〜７のいずれか１つに記載の核酸配列、これらの生物学的に活性なフラグメント、またはＢＥＩＩｂの生物学的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメントを含む、遺伝子構築物であって、該配列またはフラグメントが、植物内でＢＥＩＩｂの発現を容易にし得る１つ以上の核酸配列に作動可能に連結されている、構築物。
【請求項１１】  穀類植物の内胚乳へ所望の遺伝子を標的化するため、および／または穀類植物の内胚乳での所望の遺伝子の発現時間を調節するための遺伝子構築物であって、コムギデンプン分枝酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）プロモーターを含み、該プロモーターが、所望のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結され、そして必要に応じて、１つ以上のさらなる標的化配列および／または１つ以上の３’非翻訳配列にもまた作動可能に連結されている、構築物。
【請求項１２】  請求項１１に記載の遺伝子構築物であって、前記核酸配列が、センス方向にある、構築物。
【請求項１３】  請求項１１に記載の遺伝子構築物であって、前記所望のタンパク質が、細菌イソアミラーゼ、細菌グリコーゲンシンターゼ、およびコムギ高分子量グルテニンＢｘ１７からなる群より選択される、構築物。
【請求項１４】  請求項１１に記載の遺伝子構築物であって、前記核酸配列はアンチセンス方向にある、構築物。
【請求項１５】  請求項１４に記載の遺伝子構築物であって、前記所望のタンパク質は、ＧＢＳＳ、デンプン脱分枝酵素、ＳＢＥＩＩ、低分子量グルテニン、および穀粒軟化タンパク質Ｉからなる群より選択される、構築物。
【請求項１６】  二重鎖遺伝子構築物であって、
（ａ）センス方向において所望のタンパク質をコードする核酸配列の部分であって、アンチセンス方向において該核酸の部分にスペーサー配列により作動可能に連結された、核酸の部分；および
（ｂ）プロモーター配列、
を含み、ここで該所望のタンパク質は、コムギデンプン分枝酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）である、二重鎖遺伝子構築物。
【請求項１７】  請求項１６に記載の二重鎖遺伝子構築物であって、センス方向およびアンチセンス方向の両方において、前記核酸の部分が、該構築物においてイントロン配列によって形成される「スペーサー」ループのいずれかの端に同時局在する、二重鎖遺伝子構築物。
【請求項１８】  請求項８に記載のアンチセンス分子を含む、遺伝子構築物。
【請求項１９】  請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有しかつＢＥＩＩｂの生物学手活性を有するポリペプチドを含む、組換えコムギＢＥＩＩｂポリペプチド。
【請求項２０】  請求項１９に記載のＢＥＩＩｂポリペプチドに対する、抗体。
【請求項２１】  請求項２０に記載の抗体であって、配列番号７、配列番号８、または配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して惹起される、抗体。
【請求項２２】  請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項８に記載のアンチセンス核酸分子、または請求項１０〜１８のいずれか１つに記載の遺伝子構築物によって形質転換された、植物細胞。
【請求項２３】  請求項３１に記載の植物細胞であって、ＧＢＳＳ、ＢＥＩＩａ、およびＳＳＩＩからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子についてのヌル対立遺伝子もまた含む、請求項２２に記載の植物細胞。
【請求項２４】  請求項２２または２３に記載の細胞を含む、植物。
【請求項２５】  １つ以上のＢＥＩＩｂヌル対立遺伝子を、ＢＥＩＩａ、ＧＢＳＳ、ＳＳＩＩ、およびＢＥＩからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子についての１つ以上の他のヌル対立遺伝子と組み合せて含む組換え植物であって、そしてセンス方向またはアンチセンス方向のいずれかにおいて発現されるＢＥＩＩａをコードする遺伝子またはＢＥＩＩｂをコードする遺伝子もまた必要に応じて含む、組換え植物。
【請求項２６】  穀類植物である、請求項２４または請求項２５に記載の植物。
【請求項２７】  請求項２４〜２６のいずれか１つに記載の植物から生産された、産物。
【請求項２８】  植物によって産生されるデンプンの特徴を改変する方法であって、以下の工程：
ａ）該植物におけるコムギデンプン分枝酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）の発現レベルを増大する工程、または
ｂ）該植物におけるＢＥＩＩｂの発現レベルを減少する工程
を含む、方法。
【請求項２９】  請求項２８に記載の方法であって、デンプンのアミロペクチン成分の分枝が、改変される、方法。
【請求項３０】  請求項２８または請求項２９に記載の方法であって、高いアミロース含量を有する植物が生成される、方法。
【請求項３１】  請求項２８または請求項２９に記載の方法であって、低いアミロペクチン含量を有する植物が生成される、方法。
【請求項３２】  コムギデンプン分枝酵素ＩＩｂ（ＢＥＩＩｂ）をコードするヌル対立遺伝子または改変対立遺伝子を同定する方法であって、このような対立遺伝子を有すると疑われる植物由来のＤＮＡを、請求項１〜７のいずれか１つに記載の核酸分子またはそのフラグメントを含む少なくとも１つのＤＮＡプローブを利用したＤＮＡフィンガープリントアッセイまたはＤＮＡ増幅アッセイに供する工程を含む、方法。
【請求項３３】  所望の遺伝子発現を穀類植物の内胚乳に標的化する方法であって、請求項１０〜１５のいずれか１つに記載の遺伝子構築物を用いて該植物を形質転換する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新しいデンプン分枝酵素に関し、そして、この酵素をコードする遺伝子に関する。詳細には、本発明は、コムギ由来の新しいＩＩ型デンプン分枝酵素に関する。本発明はまた、このようなＩＩ型分枝酵素タンパク質の同定のための新規の方法に関し、この方法は、コムギ分枝酵素ＩＩｂのヌル対立遺伝子または変更された対立遺伝子についてコムギ生殖質をスクリーニングするために有用である。本発明の新規の遺伝子、タンパク質および方法は、食品および工業的適用のための新規の性質を有する穀物（例えば、高アミロースまたは低アミロペクチンデンプンを含むコムギ穀物）を生産するコムギ植物の生産において有用である。
【０００２】
（発明の背景）
植物において、２つのクラスの遺伝子が、デンプン分枝酵素（ＢＥＩおよびＢＥＩＩとしてそれぞれ知られている）をコードする。単子葉穀類において、ＢＥＩＩクラスが２つの独立型の遺伝子（トウモロコシにおいてＢＥＩＩａおよびＢＥＩＩｂとして知られている）を含むことを実証する強力な証拠が存在する（Ｇａｏら、１９９６；Ｆｉｓｈｅｒら、１９９６）。オオムギにおいて、２つの型の遺伝子が報告され、そして、差次的に発現されることが示されている（Ｓｕｎら、１９９８）。オオムギ由来の分枝酵素（５０／５１ｋＤ）のさらなるクラスがまた記載されている（Ｓｕｎら、１９９６）。
【０００３】
双子葉植物において、変異（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａら、１９９０）または遺伝子抑制技術のいずれかを介するＢＥＩＩ活性の喪失は、高アミロースレベルを含むデンプンを生じる（Ｓａｆｆｏｒｄ，１９９８，Ｊｏｂｌｉｎｇ  １９９９）。
【０００４】
単子葉植物において、高アミロース含有量を生じる変異が、トウモロコシ、イネおよびオオムギにおいて公知である。イネ（Ｍｉｚｕｎｏら、１９９３）またはオオムギ（Ｓｃｈｏｎｄｅｌｍａｉｅｒら、１９９２）のいずれにおいても、公知の高アミロース表現型は、それぞれＢＥＩＩａまたはＢＥＩＩｂ変異に関連していない。しかし、トウモロコシにおいて、高アミロース表現型が、ＢＥＩＩｂ遺伝子のダウンレギュレーションと関連していることが固く証明されている（Ｂｏｙｅｒら、１９８０；ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ，１９８１；Ｆｉｓｈｅｒら、１９９６）。
【０００５】
ＢＥＩのダウンレギュレーションの影響は、ジャガイモ塊茎におけるアンチセンス阻害を通して調査されてきた；このダウンレギュレーションは、その全体の構造的特徴（例えば、アミロース含有量）ではなく、デンプンの性質を変更することが見出されてきた（Ｆｉｌｐｓｅら、１９９６）。コムギにおいて、ＢＥＩ活性のアンチセンスダウンレギュレーションは、デンプン構造に対して、小さいが有意な効果をもたらした（Ｂａｇａら、１９９９）。トウモロコシ由来の分枝酵素Ｉ遺伝子はクローニングされているが（Ｋｉｍら、１９９８）、トウモロコシの分枝酵素Ｉ活性に影響する変異は、知られていない。
【０００６】
ＢＥＩＩａ活性を特異的に減少する変異は、報告されておらず、そして、植物における遺伝子抑制実験は、ＢＥＩＩａ活性を減少することに成功していないが、トウモロコシにおけるｄｕｌ変異が、ＢＥＩＩａおよびデンプン合成酵素ＩＩＩの両方の発現を減少することが知られている。しかし、ｄｕｌ変異は、現在、デンプン合成酵素ＩＩＩについての構造遺伝子の変異に起因することが公知である（Ｇａｏ  １９９８、Ｃａｏ  １９９９）。
【０００７】
発明者らの以前の特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ９８／００７４３（ＷＯ９９／１４３１４）において、コムギ由来のＢＥＩＩ遺伝子の構造を記載した。これを、その後、ＢＥＩＩａ遺伝子と命名した。
【０００８】
本願において、コムギ由来の第２のＢＥＩＩ遺伝子（これをＢＥＩＩｂ遺伝子と命名する）の単離を記載し、そして、この遺伝子配列が適用され得る用途を考察する。驚くべきことに、コムギにおいて、種々の分枝酵素の発現レベルが、トウモロコシおよびオオムギにおける発現レベルと非常に異なっていることを見出した。この明細書中で、コムギにおけるＢＥＩＩｂは、コムギ内乳の可溶性画分において低いレベルで発現され、そして、デンプン顆粒内に主に見出されることを示す。これは、他の穀類と比較して、コムギにおける遺伝子発現の調節において重要な差異が存在することを示し、コムギにおけるアミロース  対  アミロペクチン比率の操作が、ＢＥＩＩｂ遺伝子のみではなくそれ以上の操作を含むことを示唆する。
【０００９】
驚くべきことに、ＢＥＩＩａおよびＢＥＩＩｂ遺伝子構造は、エキソンの大きさおよび位置に関して高度に保存されていることをまた見出し、ＢＥＩＩａおよびＢＥＩＩｂクラスの遺伝子だけでなく、コムギのＡ、ＢおよびＤゲノムにコードされたこれらの遺伝子の形態もまた区別し得かつコムギＡ、ＢおよびＤゲノムによって発現されるＢＥＩＩｂタンパク質を同定し得るＤＮＡベースの診断薬を調製することを可能にし、コムギ分枝酵素ＩＩａのヌル対立遺伝子または変更された対立遺伝子についてのコムギ生殖質のスクリーニングのための必須の道具を提供する。
【００１０】
（発明の要旨）
第１の局面において、本発明は、コムギデンプン分枝酵素ＩＩｂ（ＢＲＩＩｂ）をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１１】
好ましくは、この核酸配列はＤＮＡ配列であり、そして、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【００１２】
好ましくは、この核酸分子は、図８（配列番号５）、図９（配列番号６）、または配列番号１０において示される配列を有する。本発明はまた、少なくとも低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、これらの配列にハイブリダイズし得る核酸分子、またはこれらの配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸分子を含むことが明確に理解される。ハイブリダイズする能力および％配列同一性を評価するための方法は、当該分野で周知である。なおより好ましくは、核酸分子は、高ストリンジェンシー条件下でそこにハイブリダイズし得るか、または、少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する。これらの配列の１つ以上に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子はまた、本発明の範囲内である。
【００１３】
ゲノムＤＮＡの生物学的に活性な非翻訳制御配列もまた、本発明の範囲内である。従って、本発明はまた、ＢＢＥＩＩｂのプロモーターを提供する。
【００１４】
本発明の第２の局面において、本発明の核酸配列、その生物学的に活性なフラグメント、または、植物、好ましくは、穀類植物中で、ＢＥＩＩｂの発現を容易にし得る１つ以上の核酸配列に作動可能に連結されたＢＥＩＩｂの生物学的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメント、を含む遺伝子構築物が提供される。この構築物は、プラスミドまたはベクター、好ましくは、植物の形質転換における使用のために適した構築物であり得る。このような適切なベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌、好ましくは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓである。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用して穀類植物を形質転換する方法は、公知である；例えば、オーストラリア国特許番号第６６７９３９号（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｉｎｃ．による）；オーストラリア国特許番号第６８７８６３号（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｉｎｃ．による）；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０６２１（Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏｍｐａｎｙによる）；およびＴｉｎｇａｙら（１９９７）を参照のこと。
【００１５】
第３の局面において、本発明は、穀類植物の内乳に所望の遺伝子を標的化するためのおよび／または穀類植物の内乳において所望の遺伝子の発現時間を調節するための遺伝子構築物を提供し、この構築物は、所望のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結され、そして、必要に応じて、１つ以上のさらなる標的化配列および／または１つ以上の３’非翻訳配列にもまた作動可能に連結された、ＢＥＩＩｂプロモーターを含む。
【００１６】
所望のタンパク質をコードする核酸は、センス方向かまたはアンチセンス方向のいずれかであり得る。あるいは二重鎖構築物であり得、センスとアンチセンスの両方の方向で、スペーサー配列により作動可能に連結された所望のタンパク質をコードする核酸の一部を含み得る。穀物植物の内乳で発現し得る遺伝子によりコードされる任意の所望のタンパク質は、本発明における使用に適切であると考えられる。好ましくは、所望のタンパク質は、デンプン生合成経路の酵素である。例えば、ＧＢＳＳのアンチセンス配列、デンプン脱分枝酵素、ＳＢＥ  ＩＩ、低分子量グルテニン、または穀物軟化タンパク質Ｉ（ｇｒａｉｎ  ｓｏｆｔｎｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ）が、用いられ得る。センス方向での使用のための好ましい配列として、細菌イソアミラーゼ、細菌グリコーゲンシンターゼ、またはコムギ高分子量グルテニンＢｘ１７の配列が挙げられる。
【００１７】
４番目の局面において、本発明は、本発明に基づく核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むコムギＢＥＩＩｂポリペプチド、またはそれに少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％のアミノ酸配列の同一性を有し、かつＢＥＩＩｂの生物学的活性を有するポリペプチドを提供する。
【００１８】
このポリペプチドは、本発明の核酸配列から推定されるアミノ酸配列に基づいて設計されるか、または異種系におけるコムギＢＥＩＩｂ核酸分子の発現により生成され得る。適切な異種系は、当該分野で非常に周知であり、当業者は、所望される特定の目的のために適切な系を容易に選択し得る。
【００１９】
５番目の局面において、本発明は、ＢＥＩＩポリペプチドに対する抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル抗体かまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明がまた生物学的に活性な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、およびＳｃＦｖ）を含むことが、はっきりと理解される。抗体およびそのフラグメントを生成するための方法は、当該分野で非常に周知である。
【００２０】
本発明の抗体は、例えばアフィニティー電気泳動により、ＢＥＩＩｂタンパク質の同定および分離のために用いられ得る。これは、生殖質の分析を介して、ＢＥＩＩｂの変化した形態の同定および組み合わせを大いに容易し、そして植物の繁殖を大いに補助する。本発明の抗体は、任意の親和性ベースの分離系、好ましくはアミラーゼによる干渉を克服する方法を用いる分離系における使用に適する。適切な方法は、当該分野において公知である。
【００２１】
６番目の局面において、本発明は、本発明に基づく遺伝子構築物により形質転換された植物細胞、またはこのような細胞に由来する植物を提供する。さらに、形質転換された植物細胞はまた、ＧＢＳＳ、ＢＥＩＩａ、およびＳＳＩＩからなる群より選択される遺伝子について、１つ以上のヌル対立遺伝子（ｎｕｌｌ  ａｌｌｅｌｅ）を含む。好ましくは、この植物は、穀物植物であり、より好ましくはコムギまたはオオムギである。
【００２２】
７番目の局面において、本発明は、植物により産生されるデンプンの性質を改変する方法を提供し、この方法は：
ａ）植物におけるＢＥＩＩｂの発現レベルを増加させる工程（例えば、ＢＥＩＩｂをコードする核酸分子を宿主植物に導入することによる）、または
ｂ）植物におけるＢＥＩＩｂの発現レベルを減少させる工程（例えば、ＢＥＩＩｂをコードする核酸分子に対するアンチセンス核酸配列を宿主植物に導入することによる）
の工程を包含する。
【００２３】
当該分野で周知のように、遺伝子の過剰発現は、この遺伝子のさらなるコピーの導入により達成され得、そしてアンチセンス配列は、このアンチセンス配列が相補的であるタンパク質の発現を抑制するために用いられ得る。遺伝子の発現を抑制する他の方法は、当該分野で公知であり、例えば、同時抑制、ＲＮＡ二重鎖形成、または相同組換えである。センス配列およびアンチセンス配列が、植物により産生されるデンプンの性質の種々の異なる改変をもたらすために、宿主植物に依存して選択され得ることは、当業者に明らかである。
【００２４】
好ましくは、この植物は穀物植物であり、より好ましくはコムギまたはオオムギである。
【００２５】
好ましくはデンプンのアミロペクチン成分の分枝化は、これらの手順のいずれかにより改変される。より好ましくは、高アミロース含有量を有する植物が生産される。
【００２６】
８番目の局面において、本発明は、所望の遺伝子の発現を穀物植物の内乳へ標的化する方法を提供する。この方法は、この植物を本発明に基づく構築物で形質転換する工程を包含する。
【００２７】
９番目の局面において、本発明は、デンプン生合成経路の酵素をコードするヌル対立遺伝子または変化した対立遺伝子を同定する方法を提供する。この方法は、このような対立遺伝子を有すると考えられる植物由来のＤＮＡをＤＮＡフィンガープリントアッセイまたはＤＮＡ増幅アッセイに供する工程を包含し、この工程は、１つ以上の本発明の核酸分子を含む、少なくとも１つのＤＮＡプローブを使用する。この核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得、そして全長コード配列かまたはそのフラグメントを含み得る。ＢＥＩＩｂ配列の同定のための任意の適切な方法が用いられ得、その方法としてＰＣＲ、回転円増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＦＬＰ、およびＡＦＬＰが挙げられるがこれらに限定されない。このような方法は、当該分野で周知であり、そして任意の適切な技術が用いられ得る。
【００２８】
１０番目の局面において、本発明は、ＢＥＩＩａ、ＧＢＳＳ、ＳＳＩＩ、およびＢＥＩからなる群より選択される１つ以上の他のヌル対立遺伝子と組み合わせて、１つ以上のＢＥＩＩｂヌル対立遺伝子を含む植物を提供する。必要に応じて、この植物はまた、センスまたはアンチセンスのいずれかの方向で発現されるＢＥＩＩａまたはＢＥＩＩｂ遺伝子を含み得る。ＢＥＩＩａ、ＧＢＳＳ、ＳＳＩＩ、およびＢＥＩについてのヌル対立遺伝子は、ＰＣＴ／ＡＵ９７／００７４３に記載される方法を用いて同定され得る。
【００２９】
本発明はまた、本発明に基づく植物から生産される産物（全穀物、部分穀物、フラワーまたはデンプンを含むがこれらに限定されない）を含むことがはっきりと理解される。
【００３０】
ＰＣＴ／ＡＵ９７／００７４３に記載されるように、Ａｅｇｉｌｏｐｓ  ｔａｕｓｃｈｉｉ（公式にはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｔａｕｓｃｈｉｉとして知られている）とコムギとの間には非常に近い関係があるので、Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉを用いて得られる結果は、いくらかの改変があるとしてもほとんど改変せずに、コムギに直接的に適用され得る。必要とされ得るこのような改変は、慣用的な試行および誤った実験を表わす。これらの遺伝子由来の配列は、プローブとして用いられて、コムギにおけるヌル対立遺伝子または変化した対立遺伝子を同定し得、次いで、植物繁殖のプログラムに用いられて、デンプンの性質の改変を提供し得る。本発明の新規の配列は、植物により産生されるデンプンの性質を改変するために、遺伝子操作ストラテジーにおいてか、または所望の遺伝子を宿主植物に導入するためにか、あるいは宿主植物におけるＢＥＩＩｂ遺伝子の発現の抑制のためのアンチセンス配列を提供するために用いられ得る。
【００３１】
本発明は、コムギに関して詳細に記載されているが、イネ科の他の穀物植物（例えば、トウモロコシ、オオムギまたはイネ）にもまた適用可能であることが、明らかに理解される。
【００３２】
単子葉植物（例えば、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、およびイネ）を形質転換するための方法、およびプロトプラストまたは未成熟な植物胚から植物を再生するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｌａｚｚｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９１；Ｊａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９１およびオオムギについてのＷａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｍａｕｘ，１９９４；Ｗｉｒｔｚｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９７；Ｔｉｎｇａｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９７；Ｎｅｈｒａによるカナダ国特許出願第２０９２５８８号；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａによるオーストラリア国特許出願第６１７８１／９４号、ならびにＪａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｃｏ．によるオーストラリア国特許第６６７９３９号および同第６８７８６３号を参照のこと。
【００３３】
オオムギ由来のＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの配列（オーストラリア国特許出願第６５３９２／９４号）、イネ由来のデンプン脱分枝酵素およびそのプロモーター（日本国特許公開番号第６２６１７８７号および同第５３１７０５７号）、ならびにホウレンソウおよびジャガイモ由来のデンプン脱分枝酵素（オーストラリア国特許出願第４４３３３／９６号）は、すべて公知である。
【００３４】
（実施例１．Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉゲノムライブラリー由来のＢＥＩＩ遺伝子
の単離およびそのＰＣＲによる特徴づけ）
（植物材料）
Ａｅｇｉｌｏｐｓ  ｔａｕｓｃｈｉｉ、ＣＰＩ  １１０７９９を、ゲノムライブラリーの構築のために使用した。以前、この受託が、遺伝マーカーの順序の保存に基づいて、コムギの祖先のＤゲノムドナーに最も似ていることが示された（Ｌａｇｕｄａｈら、１９９１）。このＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ培養変種であるＲｏｓｅｌｌａ、ＷｙｕｎａおよびＣｈｉｎｅｓｅ  Ｓｐｒｉｎｇを、異なるｃＤＮＡライブラリーの構築のために使用した。
【００３５】
（ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリー）
この実施例において使用されるｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築は、Ｒａｈｍａｎら、（１９９７、１９９９）およびＬｉら（１９９９）に記載される通りである。ライブラリースクリーニングのための条件は、２５％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、１０×デンハルト液、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡで４２℃にて１６時間のハイブリダイゼーション、続く２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃にて１時間の３回の洗浄であった。
【００３６】
（コムギｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
内乳（成長の中期段階）から調製されたコムギｃｖ  Ｒｏｓｅｌｌａ  ｃＤＮＡライブラリーの、トウモロコシＳＢＥ  Ｉクローン（Ｂａｂａら、１９９１）との、低いハイブリダイゼーションストリンジェンシーでのスクリーニングが、２つのクラスの陽性プラークの単離を導いた。１つのクラスはプローブを強くハイブリダイズし、そしてコムギＳＢＥ  Ｉ（Ｒａｈｍａｎら、１９９７、１９９９）をコードしていた。第２のクラスは弱くハイブリダイズした。この第２のクラス由来のもっとも長いインサートを有するクローンをＳＢＥ９と呼び、そしてその配列はＳＢＥ  Ｉ型配列よりもＳＢＥ  ＩＩ型配列とより高い同一性を示した。これを、ＳＢＥ  ＩＩａと命名した。ＳＢＥ９の配列（配列番号１）を、図１に示す。
【００３７】
（Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉゲノムライブラリーのスクリーニング）
Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ由来の構築されたゲノムライブラリーを、ＳＢＥ９とのＤＮＡハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、そして４つの陽性クローンを精製した。これらをＦ１〜Ｆ４と命名した。ＳＢＥ９の５３７位から８９０位までの配列をＰＣＲによって増幅し、そして再びＡ．ｔａｕｓｃｈｉｉライブラリーをスクリーニングするために使用した。このスクリーニングから単離されたクローンを、Ｇ１およびＧ２ならびにＨ１〜Ｈ８とした。
【００３８】
（（１）コムギにおけるＢＥＩＩ型遺伝子の数）
Ｆ２と命名されたＡｅｇｉｌｏｐｓ  ｔａｕｓｃｈｉｉ由来の分枝酵素遺伝子の配列は、ＷＯ９９／１４３１４に記載され、そして図２に示される（配列番号２）。Ｆ２．２と命名されたＦ２から生成されたプローブは、配列番号２の２７０４ｂｐ〜４４５６ｂｐの配列を含み、そしてエキソン４〜９、イントロン４〜８、およびイントロン３〜９の一部を含んだ。Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ  ＤＮＡ（４つの異なる制限酵素で切断された）のＦ２．２とのハイブリダイゼーションによって、ただ１つの強くハイブリダイズしたバンドおよびいくつかの非常に弱いバンドを明らかにし（図３、パネルＢ）、このことは、Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉゲノムにおけるただ１つのＢＥＩＩ型遺伝子の存在と矛盾しなかった。このｃＤＮＡクローン、ＳＢＥ９（配列番号１）は、Ｆ２分枝酵素遺伝子のエキソン領域に対して＞９５％の同一性を有する。エキソン５〜９を含むヌクレオチド５３７〜８９０由来のＳＥＢ９領域を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用し、そしてより多くの複合パターン（図３、パネルＡ）を得て、Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉゲノムにおいて１つよりも多くのＢＥＩＩ遺伝子型が存在することを強く示した。
【００３９】
（実施例２．ＢＥＩＩａ−イントロン５のＰＣＲ分析）
ＰＣＲプライマーであるｓｒ９１３Ｆ（５’  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  Ｇ  ３’、配列番号３）およびＷＢＥ２Ｅ６Ｒ（５’  ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＴＧ  ３’、配列番号４）を、それぞれコムギＦ２遺伝子のエキソン５およびエキソン６とアニールするように設計し、これらのエキソンの間のイントロン領域（イントロン５）を増幅した。これらのプライマーを使用したＰＣＲ反応の産物の分析は、このプライマーが、コムギのＡゲノム由来の２２８ｂｐのフラグメント、Ｄゲノム由来の２２６ｂｐおよびＢゲノム由来の２１７ｂｐを増幅することを示す。これらのフラグメントは、コムギの零染色体性／四染色体性の染色体操作株の分析によって、それぞれコムギの２Ａ、２Ｄおよび２Ｂ染色体から増幅されることを示した。これらのフラグメントに加えて、２６２ｂｐフラグメントを増幅し、そしてこのフラグメント（２６２ｂｐのユニバーサルフラグメントと命名された）は、試験される染色体操作株の間の多型ではなかった。この２６２ｂｐユニバーサルフラグメントおよび、Ｆ２遺伝子由来のＡ、Ｂ、およびＤ領域をクローン化し、そして配列決定し、そして配列の比較を図４に示す。
【００４０】
（実施例３．Ｇ１〜Ｇ２遺伝子およびＨ１〜Ｈ１０遺伝子のクラス分け）
ＰＣＲプライマーであるｓｒ９１３Ｆ（５’  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  Ｇ  ３’）およびＷＢＥ２Ｅ６Ｒ（５’  ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＴＧ  ３’）を使用したＰＣＲ分析は、Ｈ１〜Ｈ１０λクローンがおよそ２００ｂｐフラグメントを産生し、そしてＧ１およびＧ２クローンがおよそ２６０ｂｐフラグメントを産生することを示した（図５）。Ｇ１およびＧ２の部分的な配列は、分析されたこの配列のこの部分がｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＡ１のエキソン４およびエキソン５と８０％の同一性を有することを示したが、しかし、この間に存在するイントロンは、Ｆ２中に含まれるいずれの配列とも相同性を示さない配列を含んでいた。
【００４１】
しかし、Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ由来のＧ１およびＧ２クローンは、６倍体コムギから増幅されてクローン化された２６２ｂｐユニバーサルフラグメントの配列と、９２．７％の同一性を示し、そしてこれらの配列の整列を、図６に示す。図７は、オオムギＢＥＩＩｂについてのｃＤＮＡ（Ｓｕｎら、１９９５、Ｓｕｎら、１９９８）由来のＳＢＥ９クローンの５３７ｂｐ〜８９０ｂｐ領域に対応する領域と、ＳＢＥ９と、コムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡと、クローンＧ１由来の配列とのアラインメントを示す。Ｇ１のさらなる配列は、図８（配列番号５）に示した配列の単離を誘導し、この配列は、オオムギＩＩｂ  ｃＤＮＡの５’末端についてＳｕｎら（１９９８）によって報告された配列、およびこの同族遺伝子についての部分配列と、高い同一性を示した。従ってＧ１およびＧ２は、Ｆ２とは異なり、かつオオムギＢＥＩＩｂと高い相同性を有する遺伝子を含む。本発明者らは、この遺伝子をｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＢ１と命名した。
【００４２】
（実施例４．コムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡおよびさらなるゲノムフラグメントの単離）
オオムギｃＤＮＡライブラリーを、５μｇのポリＡ＋ｍＲＮＡを使用して構築した（１０、１２、および１５ＤＰＡ内胚乳組織由来の１．６７μｇのポリＡ＋ｍＲＮＡを貯蔵した）。ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ−（ｄＴ）１８プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してｃＤＮＡの最初の鎖を合成したことを除き、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって市販されるｃＤＮＡ合成システムを使用して合成した。第２鎖合成の後に、Ｐｆｕポリメラーゼをこの反応物に添加し、ｃＤＮＡの末端をそろえた（ｆｌｕｓｈ）。次いで、ＳａｌＩ−ＸｈｏＩアダプター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をこのｃＤＮＡに添加した。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡのＮｏｔＩでの消化の後にλＺｉｐＬｏｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ）のＳａｌＩ−ＮｏｔＩアームに連結し、続いてサイズ分画（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈのＳｉｚｅＳｅｐ  ４００スパンカラム）を行った。この全体の連結反応物（５μｌ）を、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してパッケージングした。このライブラリーの力価を、Ｅ．ｃｏｌｉのＹ１０９０（ＺＬ）系統またはＬＥ３９２系統のいずれかのトランスフェクトによって試験した。
【００４３】
プライマー１およびプライマー２（Ｓｕｎら、１９９８）を、Ｓｕｎら（１９９８）に記載される条件を使用したオオムギｃＤＮＡライブラリー（Ａｌｉら、２０００）由来のフラグメントのＰＣＲ増幅のために使用した。このフラグメントの同一性を配列決定分析によって確認し、そしてこのフラグメントを、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｐｒｉｎｇ（Ｌｉら、１９９９）から構築したｃＤＮＡライブラリーからのハイブリダイゼーションによってｃＤＮＡを単離するためのプローブとして使用した。
【００４４】
このｃＤＮＡを、ｗＢＥＩＩｂと命名し、そしてこの配列を図９（配列番号６）に示す。このプローブをまた使用して、上記に参照されるＡ．ｔａｕｓｃｈｉｉ由来のゲノムライブラリーをリプローブし、そしてＧ５と命名されたクローンをこのスクリーニングから回収した。分析によって、すでにＧ１およびＧ２から回収された配列に対して、ｗＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡ配列が９８．５％の同一性を示し、そしてＧ５配列が１００％の同一性を示すことを示した。それゆえＧ５は、同じｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＢ１遺伝子を表し、そしてｗＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡは、６倍体コムギにおけるオルソログ遺伝子の産物である。
【００４５】
（実施例５  ＢＥＩＩ配列間の関係）
様々な穀物由来の分枝酵素についての推定されるアミノ酸配列を、プログラムのＧＣＧスイートからＰＩＬＥＵＰプログラムを用いて分析し（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  １９８４）、そしてこれらの配列のアライメントを図１０に示す。ＰＩＬＥＵＰ解析では、ギャップの挿入に対してのペナルティーを１２とし、そして残基当たりのギャップ伸長に対してペナルティを０．１として用いた。この解析のために使用したｃＤＮＡ配列は、ＳＢＥ９（配列番号１；図１）、コムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡ（配列番号６；図９）、Ｙ１１２８２、コムギ分枝酵素配列（Ｎａｉｒら  １９９７）、オオムギＢＥＩＩａ（Ｓｕｎら、１９９８）、オオムギＢＥＩＩｂ（Ｓｕｎら、１９９８）；イネＢＥＩＩＩ（Ｍｉｚｕｎｏら  １９９３）、イネＢＥＩＶ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  Ｅ１４７２３）、トウモロコシＢＥＩＩａ（Ｇｏａら  １９９７）およびトウモロコシＢＥＩＩｂ（Ｆｉｓｈｅｒら、１９９３）である。コムギの観察されたＮ末端（Ｍｏｒｅｌｌら、１９９７；Ｙ１１２８２）を太字体している。
【００４６】
分枝酵素配列間の関係は、ＰＩＬＥＵＰプログラムにより生成した系統樹を用いて図１１に説明した。解析された配列は、コムギＹ１１２８２（Ｎａｉｒら、１９９７）、ＳＢＥ９（図１）、コムギＢＥＩＩｂ（図９）、オオムギＩＩａおよびオオムギＩＩｂ（Ｓｕｎら、１９９８）、トウモロコシＢＥＩ（Ｋｉｍら、１９９８）、トウモロコシＩＩａ（Ｇｏａら、１９９７）、トウモロコシＩＩｂ（Ｆｉｓｈｅｒら、１９９３）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＢＥ  ＩＩ（Ｕ２２４２８、Ｆｉｓｈｅｒら、１９９６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＢＥ  ＩＩ（Ｕ１８８１７、Ｆｉｓｈｅｒら、１９９６）、イネＩ（Ｋａｗａｓａｋｉら、１９９３）、イネＩＩＩ（Ｍｉｚｕｎｏら、１９９３）、イネＩＶ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  Ｅ１４７２３）、ジャガイモＢＥＩ（Ｋｈｏｓｈｎｏｏｄｉら、１９９７）、ジャガイモＢＥＩＩ（Ｃａｎｇｉａｎｏら，１９９３）、エンドウマメＢＥＩおよびＢＥＩＩ（Ｂｕｒｔｏｎら、１９９５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＥ（Ｂａｅｃｋｅｒら  １９８６）ならびにバシラス属（Ｋｉｅｌら  １９９２）であった。エンドウマメＢＥ  Ｉ配列およびエンドマメＢＥ  ＩＩ配列は、トウモロコシＢＥＩＩおよびトウモロコシＢＥＩにそれぞれ対応することに留意すべきである。これは、命名法の慣例における相違に起因する。
【００４７】
この比較に基いて、このクローンＦ２に含まれる分枝酵素遺伝子を、ＢＥＩＩａ型遺伝子として分類し、ｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＡ１と命名した。
【００４８】
（実施例６：ｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＡ１遺伝子およびｗＳＢＥＩＩ−ＤＢ１遺伝子の構造）
図１２は、コムギｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＡ１遺伝子およびｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＢ１遺伝子のエキソン／イントロン構造の比較を示す。ｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＢ１遺伝子の構造を、コムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡのはじまりからエキソン５までを示す。ハイブリダイゼーションの結果は、コムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡの３’末端にある領域が、クローンＧ１、Ｇ２、およびＧ５のいずれかにも含まれないことを示唆する。このことは、驚くべきことではなく、なぜならばトウモロコシＳＢＥ  ＩＩ  ｂ遺伝子は、１６．５ｋｂを超えて伸長し、そして２つのゲノムクローンの単離が求められるからである（Ｋｉｍら  １９９８）。コムギのＢＥＩＩａ遺伝子およびＢＥＩＩｂ遺伝子の最初の５つのイントロンについてのイントロン／エキソン境界の位置は、表１に示されるように、保存されている。ｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＢ１における、この最初の５つのイントロンの大きさは、ｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＡ１における最初の５のイントロンのサイズから、大きさの点で著しく異なっている。
【００４９】
【表１】
2003523773.tif 000001
（実施例７：ｍＲＮＡレベルにおける発現解析）
異なった発生段階の内乳由来のＲＮＡを、Ｌｉら（１９９９）によって記載されたように温室で育てたコムギから得た。ＲＮＡを、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９７）の方法によって抽出し、本質的にはＭａｎｉａｔｉｓら（１９９２）らによって記載されたように、変性ホルムアミドゲル上で分離し、そしてＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋紙上にブロットした。プローブを、ＳＢＥ９の最端の３’の末端（配列番号１の塩基２４５０〜２６４０）およびｗＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡの最端の３’の末端（配列番号６の塩基２７００〜２８９０）から、以下のスキームを用いたＰＣＲによって調製した：９４℃、２分、１サイクル、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、３０秒、３６サイクル、７２℃  ５分  １サイクル、２５℃、１分、１サイクル。プローブは、３’非翻訳領域に由来し、そしてこのプローブはｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＡ１型配列またはｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＢ１型配列のいずれかに対して特異的である。約２．９ｋｂのＲＮＡ種（図１３パネルＢ）が、各プローブに対してハイブリダイズした。しかし、デンシトメトリーにより決定され、そしてＲＮＡのロードにおける差異について標準化したハイブリダイゼーションの強度は、ｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＢ１遺伝子に対してハイブリダイズしているＲＮＡが、ｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＡ１遺伝子に対してハイブリダイズしているＲＮＡよりも、２．５〜３倍低い濃度で存在することを示した。
【００５０】
（実施例８：ＢＥＩＩａのみが可溶性分画において顕著であることを実証するアフィニティ電気泳動による分枝酵素の分析）
Ｍｏｒｅｌｌら（１９９７）によって、本発明者らは、分枝酵素ＩＩのただ１つの形態のみが、コムギの発生中の内胚乳の可溶性分画において同定され得る。しかし、これは、陰イオン交換クロマトグラフィーに基づくものであり、そして、この技術によって分離されなかったとしても、依然として複数の形態が存在し得る。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏは、分枝酵素の多糖類基質との相互作用を測定するためのアフィニティ電気泳動方法を開発し（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、１９９０）、そして、本発明者らは、この技術を開発し、特に、３つのコムギゲノムの各々にコードされる分枝酵素ＩＩａ形態の分離を可能にした。図１４は、ゲルマトリックスが、トウモロコシアミロペクチン単独のβリミットデキストリンを含む非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験の免疫ブロットを示し（図１４、レーン１および２）、これは分枝酵素ＩＩａの３つの形態の分離を示している。分離能は、α−アミラーゼインヒビターアルカボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）（図１４、レーン３、４、および５）を添加することにより幾分増強され、α−シクロデキストリンを添加することにより十分に増強される（図１４、レーン６、７、および８）。
【００５１】
０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）、６％アクリルアミド、０．０６％過硫酸アンモニウムおよび０．１％ＴＥＭＥＤからなる濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ）を含む非変性ゲルを調製した。分離ゲルは、３つのパネルからなる。塩基性非変性ゲル混合物は、０．３４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）、ＣＨＡＰＳ（０．０５％）、グリセロール（１０．３％）、アクリルアミド（６．２％）、０．０６％過硫酸アンモニウム、０．１％ＴＥＭＥＤ、およびトウモロコシアミロペクチンのβリミットデキストリン（０．１５５％）。パネルＡ（レーン１および２）は、塩基性非変性ゲル試薬のみを含んだ。パネルＢ（レーン３、４、および５）は、塩基性非変性ゲル試薬および０．０６６ｍＭアカルボースを含んだ。パネルＣ（レーン６、７および８）は、塩基性非変性ゲル試薬および０．０６７ｍＭのα−シクロデキストリンを含む。
【００５２】
１００Ｖで４℃にて１６時間電気泳動した後に、Ｍｏｒｅｌｌら（１９９７）に従って、分離ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜へ移し、そして３ＫＬＨ抗体（キーホールリンペットヘモシニアンに、ヘテロ二官能性試薬であるｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを介して結合させた以下の合成ペプチドに対して惹起された：ＡＡＳＰＧＫＶＬＶＰＤＥＳＤＤＬＧＣ（配列番号７））の１：５０００希釈液を用いて免疫反応を行った。
【００５３】
βリミットデキストリンの使用は、コムギ内乳組織内の内在性β−アミラーゼによる分離の干渉を妨げるので、より優れた分離を提供し、そしてアッセイにおけるα−シクロデキストリンの使用は、さらにこの分離を増大する。任意の提案される機構によって本発明を制限することが望まれない限り、発明者らは、この増大が内在性コムギ内乳α−アミラーゼの阻害に起因し得ると考える。
【００５４】
この分析は、３つの分枝酵素ＩＩタンパク質が存在すること、そしてこれらのタンパク質のそれぞれが、コムギＢＥＩＩｂタンパク質との相同性を共有しない領域におけるＢＥＩＩａタンパク質のＮ末端領域から設計される合成オリゴヌクレオチドに対する抗体と交差反応することを示す。
【００５５】
コムギ内乳の可溶性画分は、コムギＢＥＩＩａ  ｃＤＮＡの配列（図１２参照のこと）またはコムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡの配列に基づいて設計されたペプチドに対して惹起される種々の抗体と反応した。図１５は、ＢＥＩＩａのＮ末端に対して惹起した３ＫＬＨのみが、アミロペクチンのβリミットデキストリンおよびα−シクロデキストリンの存在下で移動度において特定のシフトを示す可溶画分中のタンパク質（矢印によって示される）と交差反応をしたことを示す。ゲルを、パネルＡに使用されるゲルがトウモロコシアミロペクチンのβ−リミットデキストリンを含まない非変性ゲル混合物を含むことを除いて、図１４に記載されるように調製した。パネルＢは、非変性ゲル混合物プラスα−シクロデキストリンを含んだ。発生中のコムギ内乳の抽出液を、組織１ｇあたり３倍容積の抽出緩衝液を使用して調製し、そして１つのゲルあたりに１４０μｌのサンプルをアプライした。４℃、１００Ｖで１６時間の電気泳動の後、分離ゲルにおけるタンパク質を、１ｃｍ片に切ったＭｏｒｅｌｌら（１９９７）に従うニトロセルロース膜へ移した。調製された抗体は、３ＫＬＨ（図１１を参照のこと）、Ｒ６（ヘテロ二官能性試薬ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニイミドエステルを介してキーホールリムペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に結合する合成ペプチドＡＧＧＰＳＧＥＶＭＩＧＣ（配列番号８）に対してウサギにおいて惹起する）；Ｒ６ウサギ由来の免疫前血清；Ｒ７（ヘテロ二官能性試薬ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニイミドエステルを介してキーホールリムペットヘモシアニンに結合する合成ペプチドＧＧＴＰＰＳＩＤＧＰＶＱＤＳＤＧＣ（配列番号９）に対してウサギにおいて惹起する）およびＲ７ウサギ由来の免疫前血清である。
【００５６】
図１４のように、ＢＥ  ＩＩａタンパク質を、β−リミットデキストランの存在下におけるアフィニティー電気泳動によって３つの形態に分離される（図１５、パネルＢにおいてアローによって示される）。オオムギ（Ｓｕｎら、１９９７）およびトウモロコシ（ＢａｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ、１９８１）において、分枝酵素ＩＩａおよびＩＩｂの両方は、可溶性画分に存在する。いくつかの後の実験において、発明者らは、可溶性画分において低レベルのＢＥＩＩｂを検出した。
【００５７】
各コムギゲノムによってコードされるＢＥＩＩａの形態の分離を、図１６に示す。パネルＡにおいて、二倍体Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ（レーン２、３および４）ならびにオオムギ株（レーン１１）は、単一のバンドを生じる。しかし、三倍体Ｔ．ｄｕｒｕｍ株（パネルＡレーン１、パネルＢ、レーン１、１６および１７）および六倍体Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ株（パネルＡレーン５〜１０、パネルＢレーン２〜１５、１８〜１９）は、少なくとも２つのバンドを生じる。いくつかの六倍体株（パネルＡ、レーン７および９、パネルＢレーン２〜６、レーン８〜９、レーン１３）は、２つのバンドを生じる（このことは、これらのバンドが１つのゲノムについてヌルであることか、または２つのゲノムの産物がゲル系において同一の移動度で移動したことかのいずれかを示す）。
【００５８】
分枝酵素ＩＩａの改変対立遺伝子またはヌル対立遺伝子を有するコムギゲノムに対するスクリーニングの手段としての分離系の使用を、図１４（パネルＢ）に示す。ここで、異なる株は、分枝酵素ＩＩａタンパク質の異なる数および移動度を有することを示す。
【００５９】
（実施例９）
（デンプン顆粒中の２つのクラスのタンパク質の８８ｋＤａにおける存在およびこれらの異なる抗体結合）
コムギデンプン顆粒は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｒａｈｍａｎら、１９９５、Ｄｅｎｙｅｒら、１９９５、Ｔａｋａｏｋａら、１９９９ａ、Ｌｉら、１９９９ｂ）および２次元ゲル電気泳動（ＹａｍａｍｏｒｉおよびＥｎｄｏ、１９９６）によって分析された多くのタンパク質を含む。以下のバンドが同定されている：６０ｋＤａ、ＧＢＳＳ；７５ｋＤａ、ＳＳＩ；１００ｋＤａ、１０８ｋＤａおよび１１５ｋＤａ、ＳＳＩＩ。８８ｋＤａのバンドもまた観察し、そして分枝酵素活性に関連すること（Ｄｅｎｙｅｒら、１９９５）そしてトウモロコシＢＥＩＩに対する抗体に反応すること（Ｒａｈｍａｎら、１９９５）を示した。このタンパク質のバンドが少なくとも２つのタンパク質成分を含むことを示した。
【００６０】
この分析は、個々の顆粒タンパク質の精製および分析によって拡張される。この顆粒タンパク質を、Ｒａｈｍａｎら、（１９９５）によって記載されるように、２４ｍｌのＳＤＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）、１０％  ＳＤＳおよび６．２５％  ２−メルカプトエタノール）中で沸騰させることによって４．７ｇのコムギデンプン顆粒から単離された。残渣の顆粒デンプンを遠心分離によって除去し、そして顆粒タンパク質を、Ｂｉｏｒａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ４９１  Ｐｒｅｐ  Ｃｅｌｌ装置において調製した９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに上清をアプライすることによって分離した。このＳＤＳゲルは、０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）、０．２５％  ＳＤＳ、６％  アクリルアミド、０．０６％  過硫酸アンモニウムおよび０．１％  ＴＥＭＥＤからなる濃縮ゲルならびに０．３４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）、０．２５％  ＳＤＳ、アクリルアミド（９％）、０．０６％  過硫酸アンモニウムおよび０．１％  ＴＥＭＥＤからなる分離用ゲルを含む。サンプルを、６０ｍＡｍｐの定電流で１６時間電気泳動し、そし反応物（５ｍｌ）の画分を、０．５ｍｌ／分にてポンプ操作（ｐｕｍｐ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ）によって回収した。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、８８ｋＤａバンドを含む画分を、３倍容積のアセトンの添加によって沈殿させた。５ｍｌの各画分からの沈殿物を遠心分離によって回収し、このサンプルを、ＳＤＳ緩衝液に溶解し、そして標準の８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを介して電気泳動した。このレーンをゲルから切除し、そして０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓで２時間再生した。２次元分離物を生成するために、次いで、このゲルを、第２の非変性ＰＡＧＥゲルの上部に横たえ、そして電気泳動をした。タンパク質を、クーマシーブルー（２．５％  クーマシーブルーＲ２５０とクーマシーブルーＧ２５０溶液の５０：５０混合物）で染色することによって同定した。
【００６１】
図１７、パネル（Ａ）は、２つのタンパク質が染色後に可視化され、そしてこれらを８８ｋＤ（Ｕ）および８８ｋＤ（Ｌ）（矢印によって示す）と命名したことを示す。ＢＥＩＩａ（３ＫＬＨ）のＮ−末端およびコムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡ配列のＮ末端（Ｒ６；図１２および１３を参照のこと、抗体の詳細については実施例８に示す）に対するペプチド抗体を使用する２次元ゲルの免疫ブロッティングは、８８ｋＤ（Ｕ）に対するＲ６抗体の優先的な結合および８８ｋＤ（Ｌ）に対する３ＫＬＨとの優先的な結合を示した（図１７、パネルＢ）、それぞれＢＥＩＩｂおよびＢＥＩＩａとしてこれらタンパク質の一時的な割り当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を提供する。
【００６２】
このタンパク質は、トリプシンで消化することによってさらに分析され、そして解離されたペプチドは、Ａｕｓｔｒａｌｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｍａｃｑｕａｒｉｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｙｄｎｅｙにて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって同定された。この分析の結果（表２に示す）は、８８ｋＤ（Ｕ）が、コムギＢＥＩＩｂ遺伝子の産物であること、そして一方で、８８ｋＤ（Ｌ）の割り当てが、結論に達しないことを示し、この結果は、ＳＢＥ９かまたはコムギＢＥＩＩｂｃＤＮＡかのいずれかによってコードされる分枝酵素であるタンパク質と矛盾しない。
【００６３】
（表２）
（ａ）８８ｋＤ（Ｕ）ならびにコムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡによってコードされる予測タンパク質との比較。
適合：６
ＭＯＷＳＥスコア：４．９７ｅ＋００１
範囲：８．８５％
適合するペプチド：
【００６４】
【表２】
2003523773.tif 000002
（ｂ）８８ｋＤ（Ｌ）ならびにコムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡおよびＳＢＥ９  ｃＤＮＡによってコードされる予測タンパク質との比較。
コムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡに対する適合
適合：８
ＭＯＷＳＥスコア：１．３２ｅ＋００３
可能性：２．０５３＋００３
範囲：１１．７２％
適合するペプチド：
【００６５】
【表３】
2003523773.tif 000003
コムギＳＢＥ９に対する適合
適合：６
ＭＯＷＳＥスコア：１．０４ｅ＋００１
範囲：８．６３％
適合ペプチド：
【００６６】
【表４】
2003523773.tif 000004
（実施例１０：ＳＢＥ  ＩＩｂ遺伝子の配列決定）
実施例４に記載のクローンＧ５を使用して、ＳＢＥＩＩｂ遺伝子の部分的なゲノム配列を得た。これまでのところ配列の約８．４ｋｂを得た。これは、開始コドンの上流約５００ｂｐを含み、おそらくプロモーター領域およびエキソン１〜１４を完全に含む。この部分配列を、配列番号１０に示す。対応するトウモロコシおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＢＥＩＩ遺伝子の配列から、本発明者らは、この遺伝子が２２のエキソンを含むことを予想した。種々のＢＥＩＩｂ遺伝子およびコムギＢＥＩＩ遺伝子のエキソン／イントロン構造の間の比較を、図１８に示す。そして種々のＳＢＥＩＩ遺伝子におけるエキソンの大きさを表３において比較する。この表において、「Ａｒａｂ」は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを示す。
【００６７】
（表３）
【００６８】
【表５】
2003523773.tif 000005
ＳＢＥ  ＩＩｂの３’末端に特異的なプローブを用いて、それぞれＧ７、Ｇ８およびＧ９と称される３つのクローンを、ここでＴ．ｔａｕｓｃｈｉｉゲノムライブラリーから単離し、そしてこれらの遺伝子の３’領域を提供するための配列分析に供する。
【００６９】
（実施例１１）
（各ゲノムからのＢＥＩＩｂ遺伝子の識別のためのＰＣＲプライマーセットの開発）
ＳＢＥ  ＩＩａ遺伝子とＳＢＥ  ＩＩｂ遺伝子との間の比較に基づいて設計した複数のプライマーセットを、コムギゲノムＤＮＡに対して試験した。これらのプライマー配列を以下に示す。
【００７０】
【化１】
2003523773.tif 000006
プライマーＡＲＡ  １２ＦおよびＡＲＡ  １３Ｒを用いたＳＢＥ  ＩＩｂのプロモーター領域の標的化によって、Ｄゲノム遺伝子のみの特異的な増幅を得た。このプライマー対を用いた異数性分析によって、図１９に示されるように、ＳＢＥ  ＩＩｂがコムギの第２染色体の長いアーム上に位置したことが示された。
【００７１】
ＳＢＥ  ＩＩｂのエキソン１−イントロン１−エキソン２領域を増幅するプライマーＡＲＡ６ＦおよびＡＲＡ８Ｒは、図２０に示されるように、ＤゲノムをＡゲノムおよびＢゲノムと識別し得た。これらの領域の配列分析は、ＡゲノムおよびＢゲノム由来の遺伝子が完全にイントロン１を欠くことを示した。これを図２１に示す。
【００７２】
（実施例１２）
（ゲノムＡ、ゲノムＢおよびゲノムＤにおけるＳＥＢ  ＩＩｂの同定）
プライマーＡＲＡ  １９ＦおよびＡＲＡ  １５Ｒを用いたＰＣＲによって増幅し、続いて制限酵素Ｒｓａ１を用いて消化したＳＢＥ  ＩＩｂのイントロン３領域の配列分析によって、３つのゲノム間の有意な多型が明らかになった。図２２に示す配列アラインメントに示すこの多型を使用して、Ａ、ＢおよびＤゲノム間を識別し得るゲノム特異的マーカーを開発した。
【００７３】
ＳＢＥ  ＩＩｂ遺伝子のＰＣＲ増幅を、プライマーＡＲＡ  １９ＦおよびＡＲＡ  １５Ｒを用いて実行し、続いて、Ｒｓａ１を用いて制限消化した。図２３に示すＰＣＲ分析の結果は、これらのプライマーが３つのゲノム間を識別し得ることを示す。
【００７４】
ゲノム特異的プライマー対（ＡＲＡ  １９ＦおよびＡＲＡ  ２３Ｒ、これらは、ＡＲＡ  １９ＦおよびＡＲＡ  １５Ｒと同じ領域を増幅する）を用いた約６００のコムギ株のスクリーニングによって、コムギゲノムの１つの零変異体を同定した。増幅を、図２３に記載されるように実行し、そして結果を図２４に示す。
【００７５】
（実施例１３）
（ＢＥ  ＩＩ遺伝子の発現のための構築物）
組換えＤＮＡ技術を使用して、ＢＥ  ＩＩａおよびＢＥ  ＩＩｂのいずれかまたはこれらの両方の発現を阻害または消滅し得た。３つの一般的なアプローチを使用し、以下の型の構築物のうちの１つを有する標的植物細胞の形質転換を使用した：
ａ）ＳＢＥ  ＩＩａおよびＳＢＥ  ＩＩｂの「アンチセンス」構築物（ここで、所望の核酸配列を機能遺伝子に対して反対の方向で構築物に挿入する）；
ｂ）ＳＢＥ  ＩＩａおよびＳＢＥ  ＩＩｂの「センス」構築物（ここで、所望の核酸を機能遺伝子と同じ方向で挿入する）；これは、標的遺伝子の発現を阻害するために同時の抑制事象を利用する；
ｃ）ＳＢＥ  ＩＩａおよびＳＢＥ  ＩＩｂの二重鎖構築物（ここで、センス方向およびアンチセンス方向の両方の所望の核酸を、この構築物においてイントロン配列によって形成される「スペーサー」ループのいずれかの端に同時局在させる）。
【００７６】
これらの全ての場合において、所望の核酸を構築物中のプロモーター配列に作動可能に連結する。
【００７７】
センスおよびアンチセンス構築物は、植物における遺伝子発現を調節するために広範に使用される。より最近、二重鎖を形成する可能性を有するＲＮＡの送達が、トランスジェニック植物における転写後の遺伝子サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を起こすのに特に有効な戦略であることが示された（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８；Ｓｍｉｔｈら、２０００）。
【００７８】
これらの構築物を用いた標的コムギ細胞または他の植物細胞の形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いた形質転換のような当該分野で公知の方法を用いてもたらされる。一旦トランスジェニック植物を得ると、これらを、ＢＥ  ＩＩａおよびＢＥ  ＩＩｂ発現に対するトランスジーンの影響に関して評価する。例えば、トウモロコシおよびジャガイモの両方において、ＢＥ
ＩＩ変異またはＢＥ  ＩＩ導入遺伝子のＢＥ  Ｉ欠損バックグラウンドへの交雑が、アミロース含量を大きく増加することが示された。ＷＯ９９／１４３１４に記載される方法を用いて同定されたコムギＢＥ  Ｉヌル株は、生成され得るデンプンの範囲をさらに拡大するために、ＢＥ  ＩＩａおよびＢＥ  ＩＩｂトランスジェニックが交雑され得るＢＥ  Ｉ欠損遺伝材料の容易な供給源を提供する。
【００７９】
ＳＢＥ  ＩＩａおよびＳＢＥ  ＩＩｂのセンス構築物、アンチセンス構築物および二重鎖構築物を、ベクターｐＤＶ０３０００（Ｂｉｏｇｅｍｍａ  Ｌｔｄ，ＵＫ）（これは、高分子量グルテンプロモーター（ｐＨＭＷＧ）およびノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）ターミネーターを保有する）に作製した。これらの構築物を、図２５、２６、および２７に概略的に示す。Ｂｉｏｇｅｍｍａベクターは、周知プラスミドｐＢＲ３２２に基づき、そして図２５および２６に示されるように、所望のＤＮＡ配列の組み込みのための複数の制限部位を含む。次いで、全体の所望のＤＮＡ、および上記で言及されるプロモーター配列およびターミネーター配列を、Ｘｈｏフラグメントとして切り出し、そして適切なベクター（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）にクローニングし得る。当業者は、使用され得る他の適切なベクターを認識する。
【００８０】
（ＳＢＥ  ＩＩａ構築物）
ＳＢ  ＩＩａのセンス構築物を、ＳＢＥ  ＩＩａコード配列の２１４３ｂｐフラグメントをセンス方向でｐＤＶ０３０００のＥｃｏＲ１／Ｓｍａ１部位に挿入することによって調製した。ＳＢＥ  ＩＩａアンチセンス構築物を、ＳＢＥ  ＩＩａコード配列の１９１３ｂｐをアンチセンス方向でｐＤＶ０３０００のＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１部位に挿入することによって調製した。これをまた、図２５に例示する。
【００８１】
（ＳＢＥ  ＩＩｂ構築物）
ＳＢＥ  ＩＩｂのセンス構築物を、ＳＢＥ  ＩＩｂコード配列の１００８ｂｐフラグメントをセンス方向でｐＤＶ０３０００のＥｃｏＲ１／Ｓｍａ１部位に挿入することによって調製した。アンチセンスＳＢＥ  ＩＩｂ構築物を、ＳＢＥ  ＩＩｂのコード配列の９５５ｂｐ配列をアンチセンス方向でｐＤＶ０３０００のＢａｍＨ１／Ｐｓｔ１部位に挿入することによって調製した。これを、図２６に例示する。
【００８２】
（二重鎖構築物）
二重鎖構築物の概略モデルを、図２７に示す。二重鎖構築物を、以下のプロトコールを用いて調製した。ここで、全ての増幅工程を従来の条件下のＰＣＲを用いて実行した。
【００８３】
（ＳＢＥ  ＩＩａ二重鎖）
１）ＳＢＥ  ＩＩａの４６８ｂｐ配列（これは、いずれかの端にＥｃｏＲ１およびＫｐｎ１制限部位を有する、エキソン１と２の全体およびエキソン３の一部を含む）を、第１のフラグメント（フラグメント１）を得るために増幅した；
２）５１２ｂｐ長の第２のフラグメント（これは、いずれかの端にＫｐｎ１およびＳａｃ１部位を有する、ＳＢＥ  ＩＩａのエキソン３と４の一部、およびイントロン３の全体からなる）を、フラグメント２を得るために増幅した；
３）ＳＢＥ  ＩＩａの完全なエキソン１、２、および３からなる５２８ｂｐのフラグメント（いずれかの端にＢａｍＨ１およびＳａｃ１部位を有する）を、フラグメント３を得るために増幅した；
４）フラグメント１に対してアンチセンスの方向でフラグメント３の配列がフラグメント２に連結されるように、フラグメント１、２および３を連結した。
【００８４】
（ＳＢＥ  ＩＩｂ二重鎖）
１）ＳＢＥ  ＩＩｂのエキソン１および２の全体、ならびにエキソン３の一部からなる４７１ｂｐ配列を、フラグメント１を産生するために、いずれかの端のＥｃｏＲ１およびＫｐｎ１制限部位を用いて増幅した；
２）いずれかの端にＫｐｎ１部位およびＳａｃ１部位を有する、ＳＢＥ  ＩＩｂのエキソン３および４の一部、ならびにイントロン３の全体からなる５８９ｂｐフラグメントを、フラグメント２を提供するために増幅した；
３）いずれかの端にＢａｍＨ１部位およびＳａｃ１部位を有する、完全なエキソン１、２および３からなる５２８ｂｐフラグメントを、フラグメント３を提供するために増幅した；
４）フラグメント１、２および３を連結し、その結果、フラグメント３は、フラグメント２に連結される場合、フラグメント１に対してアンチセンス配向であった。
【００８５】
この構築物を作製するために使用された配列の開始点および終点は、以下のようである：
ａ）ＳＢＥ  ＩＩａセンス構築物
開始：４６１ｂｐのＳｂｅ９（ＳＢＥ  ＩＩａ）ｃＤＮＡ
終止：２６０３ｂｐのＳｂｅ９（ＳＢＥ  ＩＩａ）ｃＤＮＡ
ｂ）ＳＢＥ  ＩＩａアンチセンス構築物
開始：６９１ｂｐのＳｂｅ９（ＳＢＥ  ＩＩａ）ｃＤＮＡ
終止：２６０３ｂｐのＳｂｅ９（ＳＢＥ  ＩＩａ）ｃＤＮＡ
このフラグメントをアンチセンス配向において連結した。
ｃ）ＳＢＥ  ＩＩｂセンス構築物
開始：８５ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂ  ｃＤＮＡ
終止：１０８５ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂ  ｃＤＮＡ
ｄ）ＳＢＥ  ＩＩｂアンチセンス構築物
開始：１５３ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂ  ｃＤＮＡ
終止：１０８５ｂｐのＳＢｅ  ＩＩｂ  ｃＤＮＡ
このフラグメントをアンチセンス配向で連結した。
ｅ）ＳＢＥ  ＩＩａ二重鎖構築物
ｉ）フラグメント１
完全なエキソン１：１１５１ｂｐ〜１３３６ｂｐのＳＢＥ  ＩＩａゲノム配列
完全なエキソン２：１６６４ｂｐ〜１７６１ｂｐのＳＢＥ  ＩＩａゲノム配列
部分エキソン３：２０３８ｂｐ〜２２１９ｂｐのＳＢＥ  ＩＩａゲノム配列
このフラグメントは、エキソン１配列の開始に導入されるＥｃｏＲ１部位（ＧＡＡＴＴＣ）および部分エキソン３配列の終わりに導入されるＫｐｎ１部位（ＧＧＴＡＣＣ）を有した。
ｉｉ）フラグメント２
部分エキソン３：２２２０ｂｐ〜２２７９ｂｐのＳＢＥ  ＩＩａゲノム配列
完全なイントロン３：２２８０ｂｐ〜２６８０ｂｐのＳＢＥ  ＩＩａゲノム配列
部分エキソン４：２６８１ｂｐ〜２７３１ｂｐのＳＢＥ  ＩＩａゲノム配列
このフラグメントは、部分エキソン３の開始に導入されるＫｐｎ１部位（ＧＧＴＡＣＣ）および部分エキソン４配列の終わりに導入されるＳａｃ１部位（ＧＡＧＣＴＣ）を有した。
ｉｉｉ）フラグメント３
完全なエキソン１：１１５１ｂｐ〜１３３６ｂｐのＳＢＥ  ＩＩａゲノム配列
完全なエキソン２：１６６４ｂｐ〜１７６１ｂｐのＳＢＥ  ＩＩａゲノム配列
完全なエキソン３：２０３８ｂｐ〜２２７９ｂｐのＳＢＥ  ＩＩａゲノム配列
このフラグメントは、完全なエキソン１配列の開始に導入されるＢａｍＨ１部位（ＧＧＡＴＣＣ）および完全なエキソン３配列の終わりに導入されるＳａｃ１部位（ＧＡＧＣＴＣ）を有した。
ｆ）ＳＢＥ  ＩＩｂ二重鎖構築物
ｉ）フラグメント１
完全なエキソン１：４８９ｂｐ〜６４０ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂゲノム配列
完全なエキソン２：７８９ｂｐ〜９３４ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂゲノム配列
部分エキソン３：１５９８ｂｐ〜１７７０ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂゲノム配列
このフラグメントは、エキソン１の開始に導入されるＥｃｏＲ１部位（ＧＡＡＴＴＣ）および部分エキソン３配列の終わりに導入されるＫｐｎ１部位（ＧＧＴＡＣＣ）を有した。
ｉｉ）フラグメント２
部分エキソン３：１７７１ｂｐ〜１８２７ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂゲノム配列
完全なイントロン３：１８２８ｂｐ〜２２９２ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂゲノム配列
部分エキソン４：２２９３ｂｐ〜２３５９ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂゲノム配列
このフラグメントは、部分エキソン３配列の開始に導入されるＫｐｎ１部位（ＧＧＴＡＣＣ）および部分エキソン４配列の終わりに導入されるＳａｃ１部位（ＧＡＧＣＴＣ）を有した。
ｉｉｉ）フラグメント３
完全なエキソン１：４８９ｂｐ〜６４０ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂゲノム配列
完全なエキソン２：７８９ｂｐ〜９３４ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂゲノム配列
完全なエキソン３：１５９８ｂｐ〜１８２７ｂｐのＳＢＥ  ＩＩｂゲノム配列
このフラグメントは、エキソン１配列の開始に導入されるＢａｍＨ１部位（ＧＧＡＴＣＣ）およびエキソン３配列の終わりに導入されるＳａｃ１部位（ＧＡＧＣＴＣ）を有した。
【００８６】
従って、形成されたＳＢＥ  ＩＩａおよびＳＢＥ  ＩＩｂ二重鎖をそれぞれ、ｐＤＶ０３０００のＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１部位において挿入した。
【００８７】
λファージクローンＧ５およびＧ９のサンプルを、それぞれ受託番号第ＮＭ０１／１９２５５号および同第ＮＭ０１／１９２５６号の下で、２００１年２月２０日にブダペスト条約に従って国際目録受託局（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）の役目を果たすオーストラリア政府分析研究所（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において寄託した。
【００８８】
本発明は、明瞭さおよび理解の目的のために幾分詳細に記載されているが、本明細書中に記載される実施形態および方法についての種々の改変および変更は、本明細書に開示される発明の概念の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明らかである。
【００８９】
本明細書中で引用される参考文献は、以下の頁に列挙され、これらは本明細書中において参考として援用される。
【００９０】
【表６】
2003523773.tif 000007
2003523773.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、コムギｃｖ  Ｒｏｓｅｌｌａ  ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた、ＳＢＥ  ＩＩａをコードするＳＢＥ９分枝酵素ｃＤＮＡの配列（配列番号１）を示す。
【図２】
図２は、Ａｅｇｉｌｏｐｓ  ｔａｕｓｃｈｉｉゲノムＤＮＡライブラリーから単離されたＦ２λクローン中に含まれる分枝酵素ＢＥＩＩａ遺伝子の配列（配列番号２）を示す。
【図３】
図３は、ｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＡ１型配列由来のプローブとのＡｅｇｉｌｏｐｓ  ｔａｕｓｃｈｉｉ  ＤＮＡのハイブリダイゼーションの結果を示す。Ａ．エキソン５〜９からなるＳＢＥ９由来のプローブとのハイブリダイゼーション。Ｂ．フラグメントＦ２．２（エキソン４〜９およびイントロン４〜８ならびにイントロン３およびイントロン９の一部からなる）とのハイブリダイゼーション。消化のために用いた酵素は、以下である：１．Ｂａｍ  ＨＩ、２．Ｄｒａ  Ｉ、３．ＥｃｏＲ  Ｉ、４．ＥｃｏＲ  Ｖ。分子サイズマーカーを示す。
【図４】
図４は、コムギのＡゲノム、ＢゲノムおよびＤゲノムからのイントロン５フラグメントの配列のアライメントを示す。
【図５】
図５は、イントロンＶ配列を用いたＡ．ｔａｕｓｃｈｉｉゲノムクローンのＰＣＲ分析を示す。
【図６】
図６は、プライマーｓｒ９１３ＦおよびＷＢＥ２Ｅ６Ｒを用いた６倍体コムギから増幅した２６２ｂｐのＰＣＲフラグメントとコムギ（ｗｈｅａｔ）分枝酵素ＩＩｂ遺伝子ｗＳＢＥ  ＩＩ−ＤＢ１由来の領域とのアライメントを示す。
【図７】
図７は、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）分枝酵素ＩＩｂ  ｃＤＮＡ、コムギ分枝酵素ＩＩｂ  ｃＤＮＡ、およびコムギ（Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ）分枝酵素ＩＩｂ遺伝子の配列を有するＳＢＥ９配列のアライメントを示す。
【図８】
図８は、Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ由来の分枝酵素ＩＩｂ遺伝子の部分的なゲノム配列を示す（配列番号５）。
【図９】
図９は、６倍体コムギ由来の分枝酵素ＩＩｂ遺伝子についてのｃＤＮＡ配列を示す（配列番号６）。
【図１０】
図１０は、分枝酵素遺伝子の配列アライメントを示す。この分析に用いたｃＤＮＡ配列は、ＳＢＥ９（配列番号１；図１）、コムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡ（配列番号６；図９）、Ｙ１１２８２（コムギ分枝酵素配列（Ｎａｉｒら、１９９７年））、オオムギＢＥＩＩａ（Ｓｕｎら、１９９８年）、オオムギＢＥＩＩｂ（Ｓｕｎら、１９９８年）、イネＢＥＩＩＩ（Ｍｉｚｕｎｏら、１９９３年）、イネＢＥＩＶ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｅ１４７２３）、トウモロコシＢＥＩＩａ（Ｇａｏら、１９９７年）およびトウモロコシＢＥＩＩｂ（Ｇａｏら、１９９７年）であった。コムギ（Ｍｏｒｅｌｌら、１９９７年；Ｙ１１２８２）の認められたＮ末端を太字で示す。
【図１１】
図１１は、ＢＥ配列の系統図を示す。分析された配列は、コムギ（ｗｈｅａｔ）Ｙ１１２８２（Ｎａｒｉら、１９９７年）、ＳＢＥ９（配列番号１；図１）、コムギ（ｗｈｅａｔ）ＢＥＩＩｂ（配列番号９；図９）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）ＩＩａおよびＩＩｂ（Ｓｕｎら、１９９８年）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）ＩＩａ（Ｇａｏら、１９９７年）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）ＩＩｂ（Ｆｉｓｈｅｒら、１９９３年）、イネ（ｒｉｃｅ）ＩＩＩ（Ｍｉｚｕｎｏら、１９９３年）、イネ（ｒｉｃｅ）ＩＶ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｅ１４７２３）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）ＢＥＩ（Ｋｈｏｓｈｎｏｏｄｉら、１９９７年）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）ＢＥ  ＩＩ（Ｃａｎｇｉａｎｏら、１９９３年）、エンドウマメ（ｐｅａ）ＢＥＩおよびＢＥＩＩ（Ｂｕｒｔｏｎら、１９９５年）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＥ（Ｂａｅｃｋｅｒら、１９８６年）ならびにバシラス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｋｉｅｌら、１９９２年）についてであった。ここで留意すべき点は、ｐｅａ  ＢＥＩおよびｐｅａ  ＢＥＩＩ配列が、命名の慣例における相違に起因して、ｍａｉｚｅ  ＢＥ  ＩＩおよびＢＥ  Ｉにそれぞれ対応することである。
【図１２】
図１２は、ＢＥＩＩａおよびＢＥＩＩｂ遺伝子についてエキソン／イントロン構造の比較を示す。（１）コムギ分枝酵素ＩＩａ遺伝子（ｗＳＢＥ  ＩＩ  ＤＡ１）、（２）トウモロコシアミラーゼエキステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）ＢＥＩＩｂ遺伝子、（３）部分的なコムギ分枝酵素ＩＩｂ遺伝子（ｗＳＢＥ  ＩＩ  ＤＢ１）、（４）部分的なオオムギ分枝酵素ＩＩｂ遺伝子。
【図１３】
図１３は、コムギにおけるＢＥＩＩａおよびＢＥＩＩｂ遺伝子についてｍＲＮＡの発現の分析結果を示す。パネル（Ａ）：レーン１〜３にＳＢＥ９プローブのハイブリダイゼーションおよびレーン４〜６にコムギＢＥＩＩｂ  ｃＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション。パネル（Ｂ）各レーンについてロードしたｍＲＮＡ。レーン１およびレーン４は、葉のｍＲＮＡを含み；レーン２およびレーン５は、開花前の小花のｍＲＮＡを含み；レーン３およびレーン６は、開花から１５日後に収集したコムギ内乳由来のｍＲＮＡを含んだ。
【図１４】
図１４は、アフィニティー電気泳動によるコムギ内乳由来分枝酵素ＩＩａの分析の結果を示す。サンプル：レーン１、レーン４およびレーン７は、２０μｇの内乳可溶性タンパク質を含み、レーン２、レーン５およびレーン８は、３０μｇの内乳可溶性タンパク質を含み、そしてレーン３およびレーン６は、１０μｇの内乳可溶性タンパク質を含む。
【図１５】
図１５は、コムギ内乳の可溶性画分における分枝酵素の非変性ゲル電気泳動分析の結果を示す。サンプルは、以下であった：レーン１は、免疫前のＲ６（１：１００）であり；レーン２は、免疫前のＲ６（１：３０００）であり；レーン３は、Ｒ６（１：１００）であり；レーン４は、Ｒ６（１：１０００）であり；レーン５は、Ｒ６（１：３０００）であり；レーン６は、３ＫＬＨ（１：２０００）であり；レーン７は、３ＫＬＨ（１：５０００）であり；レーン８は、免疫前のＲ７（１：１０００）であり；レーン９は、免疫前のＲ７（１：５０００）であり；レーン１０は、Ｒ７（１：１０００）であり；レーン１１は、Ｒ７（１：３０００）であり；レーン１２は、Ｒ７（１：５０００）である。
【図１６】
図１６は、図１１（パネルＣ）に記載されるゲルの条件を用いた多様なコムギ生殖質からの分枝酵素ＩＩａ形態のアフィニティー電気泳動分離の結果を示す。パネルＡ．レーン１は、Ｄｕｒａｔｉ，Ｔ．  ｄｕｒｕｍであり；レーン２は、Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ，登録番号２４２４２であり；レーン３は、Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ，登録番号２４０９５であり；レーン４は、Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ，登録番号２４０９２であり；レーン５は、Ｈａｒｔｏｇ，Ｔｒｉｔｉｕｍ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン６は、Ｒｏｓｅｌｌａ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン７は、Ｃｏｒｒｉｇｉｎ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン８は、Ｂｏｄａｌｌｉｎ、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン９は、Ｂｅｕｌａｈ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１０は、Ｂｉｎｄａｗａｒｒａ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１１は、Ｂａｒｌｅｙ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）である。パネルＢ．レーン１は、Ａｆｇｈａｎｉｓｔａｎ００６，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｕｒｕｍであり；レーン２は、Ｐｅｒｓｉａ２０，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン３は、Ａｆｇｈａｎｉｓｔａｎ８，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン４は、Ｋａｓｈｍｉｒ４，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン５は、Ｇａｎｄｕｍ  Ｓｏｃｋｈａｋ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン６は、Ｗａｒｂｌｅｒ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン７は、Ｂａｙｌｅｓ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン８は、Ｋｏｍｅｔａであり；レーン９は、Ｋａｓｈｉｍｉｒ１４，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１０は、Ｒｏｓｅｌｌａ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１１は、Ｋａｓｈｍｉｒ８，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１２は、Ｂｅｉｊｉｎｇ１０，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１３は、Ｓａｖａｎｎａｈ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１４は、Ａｆｇｈａｎｉｓｔａｎ５５−６２３，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１５は、Ｋａｒｉｚｉｋ，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１６は、Ｉｎｄｏｒｅ  Ｅ９８，Ｔ．ｄｕｒｕｍであり；レーン１７は、Ｉｒａｑ１７，Ｔ．ｄｕｒｕｍであり；レーン１８は、Ｓｅｒｉ８２，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍであり；レーン１９は、Ｉｎｄｏｒｅ１９，Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍである。
【図１７】
図１７は、コムギデンプン顆粒の８８ｋＤａのバンドの成分の２次元的分離の結果を示す。コムギデンプン顆粒の８８ｋＤａのバンドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを介して第１の次元において電気泳動した。レーンを切り出し、再生し、そして非変性ＰＡＧＥゲルの上に配置して、第２の次元に電気泳動した。２つのレーンを、各非変性ＰＡＧＥゲルの上に配置した。図に示されるように、（Ａ）クマシーブルー試薬を用いたタンパク質の染色、（Ｂ）３ＫＬＨまたはＲ６抗体のいずれかを用いたゲルの免疫ブロット法。
【図１８】
図１８は、エキソン／イントロンの構造を示す、種々の種由来のＢＥＩＩ遺伝子の図式による表示である。黒の長方形は、エキソンを示す。
【図１９】
図１９は、プライマーＡＲＡ  １２ＦおよびＡＲＡ  １０Ｒを用いた、ＣＳ零染色体株由来のＳＥＢ  ＩＩｂ遺伝子のＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図２０】
図２０は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．由来のプライマーＡＲＡ  ６ＦおよびＡＲＡ  ８Ｒを用いた、ＳＢＥ  ＩＩｂ遺伝子のＰＣＲ増幅の結果を示す。レーン：１）Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、２）Ｔ．ｄｕｒｕｍ，３）Ｔ．ｕｒａｒｔｕ、４）Ｔ．ｔａｕｓｃｈｉｉ、５）ＣＳＤＴ２ＤＳ、６）ＣＳＤＴ２ＢＬ−９、７）ＣＳＤＴ２ＡＳ、および８）ＣＳ。
【図２１】
図２１は、Ａゲノム、ＢゲノムおよびＤゲノム由来のＳＢＥ  ＩＩｂ遺伝子のエキソン１−イントロン１−エキソン２領域のアライメントを示す。＊は、その配列が、ＡゲノムまたはＢゲノムに特異的にあてがわれ得なかったことを示す。
【図２２】
図２２は、各ゲノム由来のＢＥＩＩｂ配列のアライメントを示す。
【図２３】
図２３は、プライマーＡＲＡ  １９ＦおよびＡＲＡ  １５Ｒを用いて行われたＳＢＥ  ＩＩｂ遺伝子のＰＣＲ増幅、続く、Ｒｓａ１を用いた制限消化の結果を示す。レーン１）ＣＳ、２）Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、３）Ｔ．ｔａｕｓｃｈｉｉ、４）ＣＳＤＴ２ＢＬ−９（これは、染色体２Ｂの長腕の一部を欠損している）、および６）ＣＳＤＴ２ＡＳ（これは、染色体２Ａの長を欠損している）。
【図２４】
図２４は、プライマーＡＲＡ  １９ＦおよびＡＲＡ  ２３Ｒを用いた、コムギ系由来のＳＢＥ  ＩＩｂのイントロン３領域のＰＣＲ増幅、続く、Ｒｓａ１消化の結果を示す。レーン１２は、Ｄゲノムについてのヌル変異体（ｎｕｌｌ  ｍｕｔａｎｔ）である。
【図２５】
図２５は、ＳＢＥ  ＩＩａ構築物の開発を示す概略図である。Ａ）Ｂｉｏｇｅｍｍａベクター、ｐＤＶ０３０００；Ｂ）ＳＢＥ  ＩＩａの全長ｃＤＮＡを保有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ；Ｃ）ｐＤＶ０３０００中のＳＢＥ  ＩＩａ構築物；Ｄ）センスＩＩａ構築物、およびＥ）アンチセンスＩＩａ構築物。
【図２６】
図２６は、ＳＢＥ  ＩＩｂ構築物の開発を表す概略図である。Ａ）Ｂｉｏｇｅｍｍａベクター（ｐＤＶ０３０００）；Ｂ）ＳＢＥ  ＩＩｂの１０４６ｂｐのフラグメントを保有するｐＧＥＭ−Ｔ；Ｃ）ｐＤＶ０３０００中のＳＢＥ  ＩＩｂ構築物；Ｄ）センスＩＩｂ構築物、およびＥ）アンチセンスＩＩｂ構築物。
【図２７】
図２７は、ＳＢＥ  ＩＩ二重鎖構築物を表す概略図である。Ａ）その直鎖形状のプロモーターとターミネーターとの間に挿入されたＳＢＥ配列；Ｂ）トランスジェニック植物内のｍＲＮＡの二重鎖形成。