(57)【要約】  二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定方法であって、水性媒体中、（ｉ）試料中の該二種以上の糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させ該二種以上の糖化タンパク質を糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに分解する工程、（ii）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去する工程、（iii）測定すべき糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程を含む糖化タンパク質の測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定方法であって、水性媒体中、（ｉ）試料中の該二種以上の糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させ該二種以上の糖化タンパク質を分解する工程、（ii）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去する工程、（iii）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程を含む糖化タンパク質の測定方法。
【請求項２】
さらに、(iv)試料中の測定すべき糖化タンパク質を構成するタンパク質（以下、対象タンパク質という）の濃度を測定する工程、及び、(v)工程(iii)で測定した試料中の測定すべき糖化タンパク質の濃度と、工程(iv)で測定した試料中の対象タンパク質の濃度とから、試料中の測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合を決定する工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（i）が、一種又は二種以上の界面活性剤の存在下に行われる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
工程（ii）が、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼを該生成した糖化アミノ酸に作用させ、生成する過酸化水素を除去する工程であり、かつ、工程（iii）が、糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼを該生成した糖化オリゴペプチドに作用させ、生成する過酸化水素を測定することにより行われる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程(ii)での生成物の除去が、カタラーゼを用いる過酸化水素の除去であり、工程(iii)での生成物の測定が、パーオキシダーゼと酸化発色型色原体とを用いる過酸化水素の測定である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
測定すべき糖化タンパク質が、ヘモグロビンＡ１ｃである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
対象タンパク質が、ヘモグロビンである請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定用試薬であって、タンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含むことを特徴とする試薬。
【請求項９】
さらに、対象タンパク質を測定するための試薬を含む請求項８記載の試薬。
【請求項１０】
さらに、一種又は二種以上の界面活性剤を含む請求項８又は９記載の試薬。
【請求項１１】
測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼであり、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼである請求項８〜１０のいずれかに記載の試薬。
【請求項１２】
測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラーゼを含む試薬であり、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬が、パーオキシダーゼ及び酸化発色型色原体を含む試薬である請求項８〜１１のいずれかに記載の試薬。
【請求項１３】
測定すべき糖化タンパク質が、ヘモグロビンＡ１ｃである請求項８〜１２のいずれかに記載の試薬。
【請求項１４】
対象タンパク質が、ヘモグロビンである請求項９〜１３のいずれかに記載の試薬。
【請求項１５】
二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定用キットであって、（Ａ）タンパク質分解酵素を含む第一試薬と、（Ｂ）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬を含む第二試薬と、（Ｃ）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、及び、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む第三試薬と、を含むことを特徴とするキット。
【請求項１６】
さらに、対象タンパク質を測定するための第四試薬を含む請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
タンパク質分解酵素を含む第一試薬が、一種又は二種以上の界面活性剤を含む試薬である請求項１５又は１６記載のキット。
【請求項１８】
測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼであり、かつ、測定すべき糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼである請求項１５〜１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラーゼを含む試薬であり、かつ、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬が、パーオキシダーゼ及び酸化発色型色原体を含む試薬である請求項１５〜１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
測定すべき糖化タンパク質が、ヘモグロビンＡ１ｃである請求項１５〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
対象タンパク質が、ヘモグロビンである請求項１６〜２０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化タンパク質の測定方法、測定用試薬及び測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料、食品等には、タンパク質のアミノ基がグルコース等の還元糖と非酵素的に結合して生成する多種類の糖化タンパク質が含有されている。特に血中のタンパク質であるヘモグロビン、アルブミン等は、血中のグルコース濃度に依存して、それぞれ糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等を生成し、また、各タンパク質は生体中で一定の半減期を持つことから、これら糖化タンパク質は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、糖尿病患者の血糖の指標として臨床の現場で日常的に測定されている。【０００３】
糖化タンパク質の測定方法としては、ＨＰＬＣ法等のクロマトグラフィ法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法など抗体を利用する免疫測定方法、糖化タンパク質及び／又は糖化オリゴペプチド及び／又は糖化アミノ酸に作用する酵素を用いる酵素測定方法などが知られている。酵素測定方法は操作が比較的簡便であり、安価であるという利点を有する。
糖化タンパク質の酵素測定方法としては、例えば糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特許文献１）、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（特許文献２〜７）、フルクトシルアミノ酸キナーゼ（特許文献８）を用いる方法等が知られている。【０００４】
二種以上の糖化タンパク質を含む生体試料中の測定すべき構造の糖化タンパク質を分別測定する方法としては、測定すべき構造の糖化タンパク質を選択的に加水分解させることにより生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを測定する方法が知られている。例えばヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端が糖化されている糖化タンパク質、即ちヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略記する）のみを選択的に測定するために、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを生じる作用よりもβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを用いる方法（特許文献９）が知られている。【０００５】
また、検体中に元々存在する、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化化合物である、例えば測定値の誤差のもととなる遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチド等の影響を除去するため、この遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを除いた検体中に存在する糖化タンパク質を測定する方法(特許文献１０及び１１)が知られている。
また、試料中の糖化タンパク質に、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより糖化タンパク質を測定する方法であって、前記試料中に糖化タンパク質とは別に存在する糖化アミノ酸を除去することを目的として、前記酸化還元反応に先立ち、前記糖化アミノ酸にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて分解し、テトラゾリウム化合物及びアジ化ナトリウムの存在下で、前記酸化還元反応を行う糖化タンパク質の測定方法（特許文献１２）が知られている。【０００６】
また、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、ｐＨ４．０〜７．０でフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させ、得られる生成物をｐＨ４．０〜７．０にて測定することを特徴とする、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法（特許文献１３）が知られている。さらに、カタラーゼを共存させたプロテア−ゼ含有試薬を用いた糖化タンパク質の定量方法（特許文献１４）が知られている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９７／１３８７２号パンフレット
【特許文献２】特開２００１−９５５９８公報
【特許文献３】特開２００３−２３５５８５公報
【特許文献４】特開２００５−１１０６５７公報
【特許文献５】国際公開第ＷＯ０４／０３８０３３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第ＷＯ０４／０３８０３４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０４／２７５０１３号パンフレット
【特許文献８】特開２００５−５８１５７公報
【特許文献９】特開２００４−３４４０５２公報
【特許文献１０】特開２００４−１１３０１４公報
【特許文献１１】国際公開第ＷＯ０３／０３３７２９号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第ＷＯ０３／０６４６８３号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第ＷＯ０５／０４９８５７号パンフレット
【特許文献１４】特開２００４−４９０６３公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質を正確に測定する方法、試薬及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、二種以上の糖化タンパク質を含む試料にタンパク質分解酵素を作用させて、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを生成させ、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質由来の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを予め除去した後、測定すべき糖化タンパク質由来の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを測定することを特徴とする、試料中の測定すべき糖化タンパク質を選択的に測定する方法を提供するものである。【０００９】
本発明は、以下の［１］〜［２１］に関する。
［１］  二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定方法であって、水性媒体中、（ｉ）試料中の該二種以上の糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させ該二種以上の糖化タンパク質を分解する工程、（ii）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去する工程、（iii）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程を含む糖化タンパク質の測定方法。【００１０】
［２］  さらに、(iv)試料中の測定すべき糖化タンパク質を構成するタンパク質（以下、対象タンパク質という）の濃度を測定する工程、及び、(v)工程(iii)で測定した試料中の測定すべき糖化タンパク質の濃度と、工程(iv)で測定した試料中の対象タンパク質の濃度とから、試料中の測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合を決定する工程を含む［１］記載の方法。【００１１】
［３］  工程（i）が、一種又は二種以上の界面活性剤の存在下に行われる［１］又は[２]記載の方法。
［４］  工程（ii）が、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼを該生成した糖化アミノ酸に作用させ、生成する過酸化水素を除去する工程であり、かつ、工程（iii）が、糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼを該生成した糖化オリゴペプチドに作用させ、生成する過酸化水素を測定することにより行われる［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。【００１２】
［５］  工程(ii)での生成物の除去が、カタラーゼを用いる過酸化水素の除去であり、工程(iii)での生成物の測定が、パーオキシダーゼと酸化発色型色原体とを用いる過酸化水素の測定である［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  測定すべき糖化タンパク質が、ヘモグロビンＡ１ｃである［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。【００１３】
［７］  対象タンパク質が、ヘモグロビンである［２］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］  二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定用試薬であって、タンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含むことを特徴とする試薬。【００１４】
［９］  さらに、対象タンパク質を測定するための試薬を含む［８］記載の試薬。
［１０］  さらに、一種又は二種以上の界面活性剤を含む［８］又は［９］記載の試薬。
［１１］  測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼであり、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼである［８］〜［１０］のいずれかに記載の試薬。
［１２］  測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラーゼを含む試薬であり、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬が、パーオキシダーゼ及び酸化発色型色原体を含む試薬である［８］〜［１１］のいずれかに記載の試薬。【００１５】
［１３］  測定すべき糖化タンパク質が、ヘモグロビンＡ１ｃである［８］〜［１２］のいずれかに記載の試薬。
［１４］  対象タンパク質が、ヘモグロビンである［９］〜［１３］のいずれかに記載の試薬。
［１５］  二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定用キットであって、（Ａ）タンパク質分解酵素を含む第一試薬と、（Ｂ）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬を含む第二試薬と、（Ｃ）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、及び、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む第三試薬と、を含むことを特徴とするキット。【００１６】
［１６］  さらに、対象タンパク質を測定するための第四試薬を含む［１５］記載のキット。
［１７］  タンパク質分解酵素を含む第一試薬が、一種又は二種以上の界面活性剤を含む試薬である［１５］又は［１６］記載のキット。
［１８］  測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼであり、測定すべき糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼである［１５］〜［１７］のいずれかに記載のキット。【００１７】
［１９］  測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラーゼを含む試薬であり、かつ、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬が、パーオキシダーゼ及び酸化発色型色原体を含む試薬である［１５］〜［１８］のいずれかに記載のキット。【００１８】
［２０］  測定すべき糖化タンパク質が、ヘモグロビンＡ１ｃである［１５］〜［１９］のいずれかに記載のキット。
［２１］  対象タンパク質が、ヘモグロビンである［１６］〜［２０］のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質を正確に測定する方法、試薬及びキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットを用いた測定と、免疫法による測定との間の相関を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（試料及び測定対象物）
本発明の測定方法に用いられる試料としては、二種以上の糖化タンパク質を含む試料であれば特に制限はなく、例えば全血液、血漿、血清、血球、細胞試料、尿、髄液、汗、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料、及び食品等が挙げられる。試料としては、全血液、血漿、血清、血球等が好ましい。これらの試料は、溶血、分離、希釈、濃縮、精製等の前処理を施したものを用いてもよい。【００２２】
本発明において、測定すべき糖化タンパク質を構成するタンパク質を対象タンパク質という。例えばＨｂＡ１ｃなどの糖化ヘモグロビンに対してヘモグロビンを、糖化アルブミンに対してアルブミンを対象タンパク質という。
本発明において種類の異なる糖化タンパク質としては、糖化タンパク質を構成するタンパク質、即ち対象タンパク質の種類が異なる場合だけでなく、糖化タンパク質を構成する対象タンパク質の種類が同一であっても、該糖化タンパク質がそれぞれ異なる構造として区別される場合も挙げられる。【００２３】
例えばヘモグロビンβ鎖のＮ末アミノ酸が糖化されたタンパク質、即ちＨｂＡ１ｃを特異的に測定する場合、対象タンパク質であるヘモグロビンは、α鎖とβ鎖とからなる複合体であり、α鎖が糖化されたタンパク質とβ鎖が糖化されたタンパク質の二種の糖化タンパク質を含みうるので、タンパク質としてヘモグロビンのみを含む試料も、本発明の二種以上の糖化タンパク質を含む試料に含まれる。【００２４】
さらには、同一種の対象タンパク質分子内の異なるアミノ酸位置に糖が結合している糖化タンパク質の混合物から、測定すべき特定のアミノ酸位置に糖が結合した糖化タンパク質を測定する場合、該糖化タンパク質の混合物も二種以上の糖化タンパク質に包含される。
例えばＨｂＡ１ｃを測定する場合、対象タンパク質であるヘモグロビンβ鎖は、ヘモグロビンのβ鎖のＮ末のバリン残基のα−アミノ基と、ヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列中のリジン残基のε−アミノ基とが糖化されているヘモグロビンβ鎖の二種類の糖化タンパク質を含みうるので、タンパク質としてヘモグロビンβ鎖のみを含む試料も、本発明の二種以上の糖化タンパク質を含む試料に含まれる。【００２５】
測定すべき糖化タンパク質としては、糖化を受けるタンパク質であれば特に制限はないが、測定すべき糖化タンパク質濃度及び／又は測定すべきタンパク質濃度に対する対象タンパク質濃度の割合を測定する意味があるタンパク質であることが好ましい。
生体内に存在する糖化を受けるタンパク質としては、例えばマトリックスタンパク質、細胞内タンパク質、酵素、血漿タンパク質、ホルモン等が挙げられる。【００２６】
マトリックスタンパク質としては、例えばコラーゲン、ミエリン、フィブロネクチン、フィブリン等が挙げられる。膜タンパク質としては、例えば赤血球グルコース輸送タンパク質、赤血球スペクトクリン、赤血球膜タンパク質、内皮細胞膜タンパク質等が挙げられる。細胞内タンパク質としては、例えばヘモグロビンA、水晶体クリスタリン、チューブリン、カルモジュリン等が挙げられる。酵素としては、例えばカテプシンB、リゾチーム、膵リボアーゼ、銅／亜鉛スーパーオキサイドジムスターゼ、炭酸デヒドラターゼ、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルドースレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Na＋／K＋−ATPアーゼ等が挙げられる。血漿タンパク質としては、例えばアルブミン、免疫グロブリン、アポA−I、アポA−II、アポB、アポC−I、アポE、ハプトグロビン、フェリチン、トランスフェリン、α１−アンチトリプシン、プラスミノーゲン、プラスミノーゲンアクチベータ、フィブリノーゲン、フィブリン、アンチトロンビンIII、β２−ミクログロビン、セルロプラスミン等が挙げられる。ホルモンとしては、例えば甲状腺ホルモン、インスリン等が挙げられる。【００２７】
ヘモグロビンは、α 鎖及びβ鎖の２本のポリペプチドからなる分子量６４，５００の４量体である。ヘモグロビンのα鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ロイシン−セリンであり、β鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ヒスチジン−ロイシンである。ＨｂＡ１ｃは、β鎖のＮ末端バリンが糖化されたものと定義されている。また、ヘモグロビンは分子内に複数の糖化部位を有することが知られている（The Journal of Biological Chemistry  (1980),  256,  3120-3127）。【００２８】
血清アルブミンは、分子量６９，０００で、分子内の４カ所のリジン残基が糖化されることが知られている（The Journal of Biological Chemistry (1986), 261, 13542-13545）。
本発明では、糖化ヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ、糖化アルブミン等が測定すべき糖化タンパク質として好ましく例示される。【００２９】
（糖化アミノ酸及び糖化オリゴペプチド）
本発明において、「糖化アミノ酸」とは、グルコース等の還元糖とアミノ酸１分子が結合しているものであり、「糖化オリゴペプチド」とは、グルコース等の還元糖とオリゴペプチドが結合しているものである。本発明において糖化オリゴペプチドのペプチドとは、アミノ酸残基数が２〜１０の範囲のものをいい、２〜６の範囲のものが好ましい。【００３０】
特に、本発明において、後述するオキシダーゼを用いる場合は、糖化オリゴペプチドのペプチドとは該酵素が作用する長さのペプチドとして定義され、通常アミノ酸残基数が２〜６の範囲のものをいう。オキシダーゼが作用しないアミノ酸残基が１１以上の長さのペプチド及びタンパク質が糖化されているものを併せて「糖化タンパク質」という。【００３１】
（タンパク質分解酵素）
本発明に使用しうるタンパク質分解酵素は、試料中に含まれる測定すべき糖化タンパク質に作用するものであればいかなるものを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。【００３２】
動物由来のプロテアーゼとしては、例えばエラスターゼ（Elastase）、トリプシン（Trypsin)、キモトリプシン（Chymotrypsin）、ペプシン（Pepsin）、牛膵臓プロテアーゼ、ブタ肝由来ロイシンアミノペプチダーゼ、カテプシン（Cathepsin）、カルパイン（Calpain)、プロテアーゼタイプ−I 、プロテアーゼタイプ−XX（以上、シグマ社製）、アミノペプチダーゼＭ（Aminopeptidase Ｍ）、カルボキシペプチダーゼＡ（Carboxypeptidase Ａ）（以上、ベーリンガー・マンハイム社製）、パンクレアチン（Pancreatin：和光純薬工業社製、シグマ社製）等が挙げられる。【００３３】
植物由来のプロテアーゼとしては、例えばカリクレイン（Kallikrein）、フィシン（Ficin)、パパイン（Papain）、キモパパイン（Chymopapain)、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼＷ（以上、シグマ社製）、パパインW-40、ブロメラインF （以上、天野エンザイム社製）等が挙げられる。
微生物由来のプロテアーゼとしては、例えば下記(1) 〜(14)が挙げられる。【００３４】
(1) バチルス（Bacillus）属由来プロテアーゼ；ズブチリシン(Subtilisin)、プロテアーゼ−タイプ-VIII 、プロテアーゼ−タイプ-IX 、プロテアーゼ−タイプ-X、プロテアーゼ−タイプ-XV 、プロテアーゼ−タイプ-XXIV 、プロテアーゼ−タイプ-XXVII、プロテアーゼ−タイプ-XXXI、プロテイナーゼTypeVII、バチルスリケニフォルミス由来プロテアーゼ(以上、シグマ社製)、サーモリシン(以上、和光純薬社製)、オリエンターゼ-90N、オリエンターゼ-10NL、オリエンターゼ-22BF 、オリエンターゼ-Y、オリエンターゼ-5BL、ヌクレイシン（以上、エイチビィアイ株式会社製）、プロレザーFG-F、プロテアーゼNL「アマノ」、プロテアーゼS「アマノ」G、プロテアーゼN「アマノ」G（以上、天野エンザイム社製）、GODO-BNP、GODO-BAP、GODO高純度プロテアーゼ（以上、合同酒清社精製）、プロチン-AC10F、プロチン-NL10、プロチン-NC25、プロチン-NY10、プロチン-PC10F、プロチン−PS10、デスキン、デピレイス、ビオソーク、サモアーゼ-PC10F、サーモリシン（以上、大和化成社製）、トヨチームNEP、中性プロテアーゼ（以上、東洋紡績社製）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、NUE 、ピラーゼ、クリアーレンズプロ、エバラーゼ、ノボザイム-FM 、ボラン（以上、ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、エンチロン-NBS、エンチロン-SA(以上、洛東化成工業社製)、ナガーゼ（Nagarse）、ビオプラーゼAPL-30、ビオプラーゼSP-4FG、ビオプラーゼXL-416F 、ビオプラーゼAL-15FG、ペクチナーゼXP-534  (以上、ナガセケムテックス社製)、アロアーゼAP-10 、プロテアーゼYB、（以上、ヤクルト薬品工業社製）、コロラーゼ-N、コロラーゼ-7089 、ベロンW （以上、樋口商会社製）、キラザイム  P-1、ディスパーゼ(以上、ロシュ社製)、サチライシン（ベーリンガー・マンハイム社製）、プロテイナーゼＮ、プロテイナーゼBacterial Subtilisin（以上、フルカ社製）、プロナーゼＥ（科研製薬社製）等。【００３５】
(2) アスペルギルス（Aspergillus)由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ-XIII 、-XIX、-XXIII（以上、シグマ社製）、スミチーム -MP、スミチーム-AP 、スミチーム-LP L、スミチーム-LP20、スミチーム-FP、エンザイム P-3（以上、新日本化学工業株式会社製）、オリエンターゼ-20A、オリエンターゼ-ONS、オリエンターゼ-ON5、テトラーゼS （以上、エイチビィアイ株式会社製）、ウマミザイムG、ニューラーゼA、ニューラーゼF3G、プロテアーゼA「アマノ」G、プロテアーゼK「アマノ」、プロテアーゼM「アマノ」G、プロテアーゼP「アマノ」3G（以上、天野エンザイム社製）、アルカリプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、モルシン 、AOプロテアーゼ、ペプチダーゼ（以上、キッコーマン社製）、プロチン-F、プロチン-FN 、プロチン-FA(以上、大和化成社製）、デナプシン2P、デナチーム-SA-7、デナチーム-AP 、デナザイムAP (以上、ナガセケムテックス社製）、プロテアーゼYP-SS 、パンチダーゼ-NP-2 、パンチダーゼ-P (以上、ヤクルト薬品工業社製）、サカナーゼ（科研製薬社製）、フレーバーザイム (ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、ベロンPS（樋口商会社製）、プロテイナーゼ６（フルカ社製）、プロテアーゼA5（協和化成社製）等。【００３６】
(3) リゾパス（Rhizopus）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXVIII(シグマ社製）、ペプチダーゼR 、ニューラーゼF（以上、天野エンザイム社製）、XP-415（ナガセケムテックス社製）等。
(4) ペニシリウム（Penicillium）由来プロテアーゼ；PD酵素（キッコーマン社製）、プロテアーゼＢ「アマノ」（天野エンザイム社製）、デオキシン１（ナガセケムテックス社製）等。【００３７】
(5) ストレプトマイセス（Streptomyces）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXIV（別称Pronase） 、プロテアーゼ-XXI（以上、シグマ社製）、アクチナーゼ-AS 、アクチナーゼ-AF 、アクチナーゼ-E（以上、科研製薬社製）、Alkalofilic  Proteinase （東洋紡社製）、プロナーゼE（ロシュ社製、カルビオケム−ノバイオケム社製、シグマ社製）、プロナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）等。【００３８】
(6) スタフィロコッカス（Staphylococcus）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXVII（シグマ社製）、エンドプロテイナーゼGlu-C（ベーリンガー・マンハイム社製）、V8プロテアーゼ（タカラ社製、和光純薬社製）等。
(7) クロストリジウム（Clostridium)由来プロテアーゼ；クロストリパイン、ノンスペシフィックニュートラルプロテアーゼ、コラゲナーゼType1A(以上、シグマ社製）等。【００３９】
(8) リソバクター（Lysobacter）由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼLys-C （シグマ社製）等。
(9) グリフォラ（Grifola)由来プロテアーゼ；メタロエンドペプチダーゼ（Metalloendopeptidase ；シグマ社製）等。
(10)酵母（Yeast)由来プロテアーゼ；プロテイナーゼA （Proteinase A ；シグマ社製）、カルボキシペプチダーゼY （Carboxypeptidase Y；ベーリンガー・マンハイム社製）等。【００４０】
(11)トリチラチウム（Tritirachium）由来プロテアーゼ；プロテイナーゼK (Proteinase K；シグマ社製、ロシュ社製、和光純薬社製）等。
(12)サーマス（Thermus)由来プロテアーゼ；アミノペプチダーゼＴ(AminopeptidaseT ；ベーリンガー・マンハイム社製）等。
(13)シュードモナス（Pseudomonas)由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼAsp-N  (Endoproteinase Asp-N；和光純薬社製)等。【００４１】
(14)アクロモバクター（Achromobacter）由来プロテアーゼ；リジルエンドペプチダーゼ（Lysylendopeptidase）、アクロモペプチダーゼ（以上、和光純薬社製）、AP-1(タカラ社製)等。【００４２】
本発明の測定方法においては、対象タンパク質がヘモグロビンである場合には、バチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビンに対する作用が大きいので好ましく、特にバチルス属由来のプロテアーゼが好ましい。また対象タンパク質がアルブミンである場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミンに対する作用が大きいので好ましい。【００４３】
タンパク分解酵素の濃度としては、反応液中で０．０１〜１００，０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．１〜１０，０００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。
また本発明に使用するタンパク質分解酵素は着色していないものが好ましく、例えば該タンパク質分解酵素の１，０００Ｕ／ｍＬの水溶液において波長３００〜８００ｎｍの吸光度が１００ｍＡｂｓ以下であるものが好ましく０〜１０ｍＡｂｓがより好ましい。タンパク質分解酵素は各種クロマトグラム、塩析、透析、活性炭処理等で精製し上述の吸光度を減少させたものを使用するのが好ましい。【００４４】
（糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素）
本発明に使用しうる糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素としては、前記タンパク質分解酵素の作用により、試料中の糖化タンパク質から生成される糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するものであれば如何なるものを用いてもよい。【００４５】
糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素としては、例えば糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼ、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ等があげられる。
糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、α-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が好ましい。糖化アルブミンを測定対象とする場合には、ε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が好ましい。【００４６】
(オキシダーゼ)
本発明におけるオキシダーゼとしては、糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させて生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと酸素とに作用し、過酸化水素及びアミノ酸若しくはオリゴペプチド等が生成するオキシダーゼであれば特に制限はないが、例えばフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。【００４７】
該オキシダーゼとしては、ε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼ、α-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼなどが挙げられる。
ε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼとしては、例えばギベレラ（Gibberella）属（例えばIFO-6356等）又はアスペルギルス（Aspergillus)属（例えばIFO-6365、-4242 、-5710 、FERM BP-5684等）由来フルクトサミンオキシダーゼ、カンジダ（Candida)属由来フルクトシルアミンデグリカーゼ、ペニシリウム(Penicillium)属（例えばIFO-4651、-6581、-7905、-5748、-7994、-4897、-5337、FERM BP-5475等）由来、トリコスポロン(Trichosporon)属（例えばFERM P-17134）由来、フサリウム（Fusarium）属（例えばIFO-4468、-4471、-6384、-7706、-9964、-9971、-31180、-9972、FERM BP-5010等）由来フルクトシルアミノ酸分解酵素、アクレモニウム（Acremonium）属由来又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来ケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。【００４８】
α-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼとしては、例えばコリネバクテリウム（Corynebacterium）属由来、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属(例えばNBRC-7590等)由来、コニオケチジウム（Coniochaetidium）属（例えば ATCC36547等）由来、アルスリニウム属由来、ピレノケータ属由来、レプトスフェリア（例えばNBRC7480等）属由来、オフィオボラス属由来、カーブラリア属由来、フォーマ属由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ（特開2004-275013）、ユウペニシリウム属（例えばATCC 18547等）由来、コニオカエタ属（例えばNISL 9330等）由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（特開2003−235585）等が挙げられる。なお、α-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼとしては、前述のε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼも挙げられる。【００４９】
この他、例えばフルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-EE、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOX-TE、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOD-E（以上、キッコーマン社製）、ショウガ科に属する植物由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（WO04/038034）、バラ科、ブドウ科又はセリ科に属する植物由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（WO04/038033）等が挙げられる。【００５０】
ε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しないオキシダーゼとしては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ（FODVII；旭化成社製；WO02/061119）が挙げられる。
さらに、α−アミノ基及びε−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用し、タンパク質分解酵素と共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（FODII；旭化成社製）が挙げられる。【００５１】
該酵素の濃度としては、反応液中で０．０１〜１，０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。【００５２】
（キナーゼ）
本発明に使用しうる糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するキナーゼとしては、ATPの存在下、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用し、ADPとリン酸化された糖化アミノ酸及び／又はリン酸化された糖化オリゴペプチドとを生成するキナーゼであれば特に制限はないが、例えばε−フルクトシルリジンに作用する酵素としては、フルクトシルリジン−６−キナーゼ（The Journal of Biological Chemistry (2002)，277，42523-42529）等が挙げられる。また、α−フルクトシルバリン及びα-フルクトシルバリルロイシンに作用するキナーゼとしてはアブラナ科植物由来フルクシルアミノ酸キナーゼ（特開2005-58157）等が挙げられる。【００５３】
該酵素の濃度としては、反応液中で０．００１〜１，０００Ｕ／ｍＬ以上の濃度であることが好ましく、１〜１００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。【００５４】
（界面活性剤）
本発明においてタンパク質分解酵素を作用させる際に界面活性剤を共存させるのが好ましい。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤を共存させることが好ましく、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が特に好ましい。【００５５】
非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。【００５６】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等が挙げられる。【００５７】
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンジベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（ジスチレン化）フェニルエーテル、ポリオキシエチレン（トリスチレン化）フェニルエーテル等が挙げられる。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物としては、例えばポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンランダム重合体等が挙げられる。【００５８】
ポリオキシエチレンアルキルアミンとしては、例えばポリオキシエチレンドデシルアミン等が挙げられる。
アルキレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物としては、例えばエチレンジアミンテトラポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン・ブロックポリマー等が挙げられる。【００５９】
ポリオキシエチレン脂肪酸エステルとしては、例えばポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレエート等が挙げられる。
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられる。【００６０】
ソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げられる。
ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルとしては、例えばテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等が挙げられる。【００６１】
ポリオキシエチレンアルキルアミンとしては、例えばポリオキシエチレンドデシルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルとしては、例えばステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等が挙げられる。
脂肪酸アルカノールアミドとしては、例えばラウリン酸ジエタノールアミド等が挙げられる。【００６２】
ショ糖脂肪酸エステルとしては、例えばショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。
これら非イオン性界面活性剤の中でも、特にポリオキシエチレン鎖を有するものが好ましく、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルアミン等が挙げられる。【００６３】
陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族アミン塩、脂肪族４級アンモニウム塩等が挙げられる。
脂肪族アミン塩としては、例えばモノドデシルアミン、モノステアリルアミン、ジステアリルアミン、トリステアリルアミン等の高級脂肪族アミン等と、塩酸、硫酸等の無機酸或いは酢酸、乳酸、クエン酸等の低級カルボン酸等との塩等が挙げられる。具体的には、例えばドデシルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩等が挙げられる。【００６４】
脂肪族４級アンモニウム塩としては、例えばドデシルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、アルキルジメチルベンジルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム等の高級脂肪族アンモニウム等と塩素、臭素等との塩等が挙げられる。具体的には、例えばドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド等が挙げられる。【００６５】
陰イオン性界面活性剤としては、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩、コール酸塩等が挙げられる。
カルボン酸塩としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ。具体的には、例えばオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。【００６６】
スルホン酸塩としては、例えばドデシルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等のナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等のスルホコハク酸等と、ナトリウム等との塩等が挙げられる。具体的には、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられる。【００６７】
硫酸エステル塩としては、例えば高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。高級アルコール硫酸エステル塩の具体例としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸アンモニウム等が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩の具体例としては、例えばポリオキシエチレンドデシルエーテル硫酸ナトリウム等が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩の具体例としては、例えばポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸ナトリウム等が挙げられる。【００６８】
リン酸エステル塩としては、例えばモノアルキルリン酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。モノアルキルリン酸エステル塩の具体例としては、例えばモノステアリルリン酸ナトリウム、モノドデシルリン酸ナトリウム等が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩の具体例としては、例えばポリオキシエチレンドデシルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。【００６９】
コール酸塩としては、例えばコール酸ナトリウム等が挙げられる。
陰イオン性界面活性剤の中でも、ポリオキシエチレン鎖を有するものが特に好ましく、具体例としては、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。
両性界面活性剤としては、例えばベタイン類、グリシン類、アラニン類、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類、アミンオキサイド類、アルキルアミノ塩類等が挙げられる。ベタイン類としては、例えばアルキルベタイン類、カルボキシベタイン類、スルホベタイン類等が挙げられる。【００７０】
アルキルベタイン類としては、例えばＮ−ドデシルベタイン等が挙げられる。
カルボキシベタイン類としては、例えばラウリン酸アミドプロピルベタイン、ドデシルジメチルアミノ酢酸ベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ ’−カルボキシメチル−Ｎ ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。
スルホベタイン類としては、例えばラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等が挙げられる。【００７１】
グリシン類としては、例えばドデシルジアミノエチルグリシンナトリウム等が挙げられる。
アラニン類としては、例えばＮ−オクトデシル−β−アラニンナトリウム、Ｎ−ミスチリル−β−アラニンナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等が挙げられる。
２−アルキルイミダゾリンの誘導体類としては、例えば２−ラウロイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ −ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。【００７２】
アミンオキサイド類としては、例えばドデシルジメチルアミンオキサイド、ジヒドロキシエチルドデシルアミンオキサイド、ポリオキシエチレンヤシ油アルキルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。
アルキルアミノ塩類としては、例えばドデシルアミノジ酢酸ナトリウム等が挙げられる。【００７３】
両性界面活性剤の中でも、特にアミンオキサイド類、ベタイン類が特に好ましく、アミンオキサイド類が最も好ましい。アミンオキサイド類としては、例えばドデシルジメチルアミンオキサイド、ジヒドロキシエチルドデシルアミンオキサイド、ポリオキシエチレンヤシ油アルキルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。ベタイン類としては、例えばドデシルジメチルアミノ酢酸ベタイン等が挙げられる。【００７４】
尚、これら界面活性剤の使用濃度は、反応液中の濃度として、０．０００１〜２０％が好ましく、０．００１〜１０％がより好ましい。また界面活性剤は、複数の界面活性剤を併用して用いることができる。【００７５】
（水性媒体）
本発明において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（トリス緩衝剤）、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。【００７６】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。【００７７】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。【００７８】
（測定方法）
本発明の二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定は、水性媒体中、下記（ｉ）〜（iii）の工程を順次行うことによって行うことができる。
（ｉ）試料中の二種以上の糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させ該糖化タンパク質を糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに分解する工程、
（ii）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去する工程、
（iii）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程。【００７９】
各工程の反応の反応温度としては、例えば１０〜５０℃で、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間としては、１秒間〜６０分間、好ましくは１〜１０分間である。工程（ｉ）と工程（ii）は、同時に行うこともできる。
工程（i）のタンパク質分解酵素を作用させる反応は、前述の界面活性剤の存在下に行うのが好ましい。なお、タンパク質分解酵素は、工程(ii)及び/又は工程(iii)の反応に影響を及ぼさなければ、工程（i）を行った後に、特に失活させなくともよいが、加熱、冷却、遠心分離、膜濾過、阻害剤の添加等によって該酵素が工程(ii)及び/又は工程(iii)で作用することがないようにすることもできる。【００８０】
工程（ii）における、反応液中に生成する生成物（以下、生成物Ａという）を除去する工程とは、該生成物を工程（iii）で反応液中に生成する生成物（以下、生成物Ｂという
）の測定に関与しない物質に酵素変換することを意味する。
なお、工程（iii）における生成物Ｂの測定方法との組み合わせで、工程（ii）の生成物Ａの除去方法は、当業者が適宜選択できる。【００８１】
即ち、工程（ii）及び工程（iii）に使用する酵素反応の組み合わせは特に制限はない。
工程（ii）及び／又は工程（iii）において、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼを作用させて生成する生成物としては、過酸化水素、アミノ酸、オリゴペプチド等が挙げられる。【００８２】
工程（ii）及び／又は工程（iii）において、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するキナーゼをＡＴＰ存在下で作用させて生成する生成物としては、リン酸化糖化アミノ酸、リン酸化糖化オリゴペプチド、ＡＤＰ等が挙げられる。さらに生成物にリン酸化糖化アミノ酸に作用するデグリカーゼを作用させて生成する生成物としては、グルコース−６−リン酸、アミノ酸等が挙げられる。リン酸化糖化アミノ酸に作用するデグリカーゼとしては、例えばフルクトシルリジン−6−リン酸に作用する大腸菌由来デグリカーゼ（The Journal of Biological Chemistry（2002），277,  42523-42529）等が例示される。【００８３】
工程（ii）及び／又は工程（iii）において、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するデヒドロゲナーゼを酸化型補酵素の存在下で作用させて生成する生成物としては、例えば酸化型補酵素としてＮＡＤＰを用いた場合、生成物としては還元型補酵素ＮＡＤＰＨと脱水素化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチド、例えば補酵素としてピロロキノリンキノンを用いた場合、生成物としては、還元型ピロロキノリンキノンと脱水素化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドが挙げられる。【００８４】
以下、工程（ii）及び工程（iii）に基質特異性の異なる２種類のオキシダーゼを使用し、測定する場合について詳細に説明する。
工程（ii）の生成物の除去方法としては、オキシダーゼの作用により生成する過酸化水素を除去する方法、アミノ酸もしくはオリゴペプチドを除去する方法等が挙げられるが、過酸化水素を除去する方法が好ましい。【００８５】
過酸化水素を除去する方法としては、パーオキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素を作用させる方法、各種金属等の還元性物質を作用させる方法等が挙げられる。
工程（ii）でパーオキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素を作用させる場合、工程（iii）の測定反応に影響を及ぼさなければ酵素反応を停止しなくてもよいが、工程（iii）の測定反応に影響を及ぼす場合、加熱、冷却、遠心分離、膜ろ過、阻害剤の添加などの方法によって該酵素が工程（iii）で作用することがないように調整するのが好ましい。また酵素反応を失活させる操作を必要としない点で、担体、カラム等に固定化した酵素を用いて除去反応を行うのが好ましい。カタラーゼは、例えばアジ化ナトリウム等の阻害剤を添加して失活させることができる。【００８６】
また、工程（ii）で生成する過酸化水素を還元性物質を用いて除去する場合、該過酸化水素と反応後の反応液中に残存する還元性物質は、工程（iii）の測定反応に影響を及ぼさないようにするのが好ましい。還元性物質を用いて、工程（ii）で生成する過酸化水素除去する方法としては、還元性物質を固定化して反応液に接触させる方法が好ましい。
生成物Ａの除去を、例えば測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼの作用により生成する過酸化水素を除去することにより行い、生成物Ｂの測定を、測定すべき糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する前記オキシダーゼとは基質特異性の異なる他のオキシダーゼにより生成する過酸化水素を測定することにより行う場合に好適な方法を以下に記載する。【００８７】
工程（ii）の過酸化水素の除去は、例えば過酸化水素除去試薬により除去することができる。該過酸化水除去試薬としては、例えばカタラーゼ以外に、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と後述の酸化カップリング型色原体の片方（即ち、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物又は４−アミノアンチピリン等のカプラー）との組み合わせ等が挙げられる。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は、工程（ii）においてカタラーゼを該過酸化水素に作用させて該過酸化水素を水と酸素に変換することにより除去することができる。【００８８】
過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と後述の酸化カップリング型色原体の片方（即ち、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物又は４−アミノアンチピリン等のカプラー）との組み合わせを用いる場合は、該過酸化水素を過酸化活性物質の存在下、該酸化カップリング型色原体と反応させて、無色の物質を生成させることによって除去することができる。【００８９】
過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のカタラーゼの濃度としては、工程（ii）で生成する過酸化水素を除去可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．１〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、１０〜２，０００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化カップリング型色原体の片方との組み合わせを使用する場合、過酸化活性物質の濃度としては、該過酸化活性物質と過酸化水素との反応により、無色の物質が生成し得る濃度であれば特に制限はない。過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合、パーオキシダーゼの濃度としては、反応液中で１〜１００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、２〜５０Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。【００９０】
過酸化水素除去試薬として使用される酸化カップリング型色原体は、過酸化水素測定用試薬として使用される酸化カップリング型色原体の組み合わせ、即ち、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と４−アミノアンチピリン等のカプラーとの組み合わせにおける１つの構成成分である。フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と４−アミノアンチピリン等のカプラーとは、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する。【００９１】
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
フェノール系水素供与体化合物としては、例えばフェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、２，４，６−トリクロロフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、２，４−ジブロモフェノール、２，４，６−トリブロモフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。【００９２】
アニリン系水素供与体化合物としては、例えばＮ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ） 、Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン（ＣＥＭＢ） 、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ）−３−ホスホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＨＳＰＴ） 、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−ｍ−トルイジン（ＥＳＥＴ）等が挙げられる。【００９３】
過酸化水素除去試薬としてカプラー又はフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物を使用する場合、該カプラー、該フェノール系水素供与体化合物、該アニリン系水素供与体化合物の濃度としては、生成した過酸化水素を除去可能とする濃度であれば特に限定はされないが、好ましくは０．０５〜４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌである。【００９４】
本発明の工程（ii）において、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は、工程（iii）においてカタラーゼ阻害剤を共存させることが好ましい。カタラーゼ阻害剤としては、例えばアジ化ナトリウム、Ｈ2Ｓ、ＨＣＮ、ＮＨ2ＯＨ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール等が挙げられ、使用する濃度としてはカタラーゼ活性を阻害し、工程（iii）で生成する過酸化水素の測定に影響を及ぼさない濃度であればとくに限定はされないが、好ましくは０．５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。【００９５】
本発明の工程（iii）において生成する過酸化水素は、例えば光学的手法又は電気化学的手法を用いて測定することができる。光学的手法としては、例えば吸光度法、発光法等が挙げられる。具体的には、過酸化水素測定試薬を用いた光学的測定法、過酸化水素電極を用いた電気化学的測定法等が挙げられる。
過酸化水素測定試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば発色物質、発光物質等が挙げられるが、発色物質が好ましい。【００９６】
検出可能な物質が発色物質の場合には、過酸化水素測定試薬は、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む。酸化発色型色原体としては、例えば前述の酸化カップリング型色原体や後述のロイコ型色原体が挙げられる。
検出可能な物質が発光物質の場合には、過酸化水素測定試薬は、化学発光物質を含む。化学発光物質としては、生物発光物質も含まれ、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル、シュウ酸エステル等が挙げられる。【００９７】
過酸化水素測定試薬として、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む試薬を用いる場合には、過酸化水素を、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応させ色素を生成し、生成した色素を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。また、化学発光物質を含む過酸化水素測定試薬を用いる場合には、過酸化水素を、化学発光物質と反応させフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、過酸化水素を測定することができる。【００９８】
前述のように、酸化カップリング型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する色原体である。前述のように、４−ＡＡ等のカプラーとフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物とが酸化カップリング反応により色素を生成する。
ロイコ型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、単独で色素を生成する色原体である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’,Ｎ’,Ｎ’’,Ｎ’’−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミン等が挙げられる。【００９９】
工程（ii）において、過酸化水素除去試薬としてカプラー又はフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物を使用し、工程（iii）において、過酸化水素測定試薬として酸化カップリング型色原体を使用する場合、工程（ii）において使用する該カプラー又は該フェノール系もしくは該アニリン系水素供与体化合物を工程（iii）における過酸化水素測定試薬として使用することができる。過酸化水素除去試薬としてカプラーを用いた場合には、工程（iii）において、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物を添加すればよく、また、過酸化水素除去試薬としてフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物を用いた場合には、工程（iii）において、４−ＡＡ等のカプラーを添加すればよい。【０１００】
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００Ｕ／ｍＬが好ましく、２〜５０Ｕ／ｍＬがより好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜５ｇ／Ｌがより好ましい。【０１０１】
過酸化水素を過酸化水素電極を用いて測定する場合、使用する電極は、過酸化水素との間で電子を授受する材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられる。測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることができる。オキシダーゼ又は基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定することもできる。【０１０２】
電子伝達体としては、電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定することができる。
オキシダーゼを工程（iii）に用いる場合は、過酸化水素とα−ケトアルデヒド体が生成するので、生成するα−ケトアルデヒド体にグルコースオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を併せて測定することにより、高感度に測定することができる。【０１０３】
前述の場合、工程（ii）でα−ケトアルデヒド体が生成する場合は、予め工程（ii）でα−ケトアルデヒド体及びグルコースを除去する。
工程（ii）の反応にキナーゼを使用する場合は、リン酸化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに対して、工程（iii）の測定に用いる酵素が作用しない場合は、反応を停止することなくそのまま使用することができる。【０１０４】
また、工程（ii）の反応に用いる酵素としてキナーゼを使用する場合は、リン酸化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに対して、特異的に作用するデグリカーゼを作用させてリン酸化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを分解することができる。
工程（iii）の反応にキナーゼを使用する場合は、反応系内にＡＴＰを共存させて、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドがキナーゼによってリン酸化される反応に伴うＡＴＰの変化量を公知の方法によって測定することができる。【０１０５】
工程（ii）の反応にデヒドロゲナーゼを使用する場合は、脱水素化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに対して、工程（iii）の測定に用いる酵素が作用しない場合は、反応を停止することなくそのまま使用することができる。
工程（iii）の反応にデヒドロゲナーゼを使用する場合は、反応系内に酸化型補酵素を共存させ、酸化型補酵素の消費量又は還元型補酵素の生成量を測定することにより、測定すべき糖化タンパク質を定量することができる。生成する還元型補酵素の測定は、例えばその極大吸収波長域である３４０ｎｍ付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用いた直接的方法や、生成した還元型補酵素を各種ジアフォラーゼ、又はフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８（以上、同仁化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用いた間接的方法等により行うことができ、またこれ以外の公知の方法により測定することもできる。【０１０６】
また補酵素として例えばピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を用いることができ、例えば反応系に電子メディエータを共存させ、電気化学的手法を用いて補酵素の変化量を測定することもできる。
本発明に基づく糖化タンパク質の測定方法において、ケトアミン構造を認識する酵素を用いる場合には、例えば前述のデヒドロゲナーゼを用いた場合の方法により、測定すべき糖化タンパク質を測定することができる。【０１０７】
（対象タンパク質の測定）
本発明の対象タンパク質の測定方法は、対象タンパク質を正確に測定できる方法であれば如何なる方法を用いてもよい。なお、測定する対象タンパク質は、糖化されていないタンパク質だけであっても、該タンパク質の糖化体を含んでもよい。対象タンパク質の測定方法としては、吸光度法（比色法）や視差屈折法が公知であり、これらの方法は広く用いられている。吸光度法（比色法）は、物質溶液の紫外吸収や、可視吸収、赤外吸収を測定し、溶液濃度を算出する方法である。一方、視差屈折法は屈折率の違いから溶液濃度を導出する方法であり、主に糖類などのように比色法を適用しにくい物質に対して利用されている。また、物質が電解質である場合には、イオン濃度や電気伝導度から溶液濃度の測定が行われている。【０１０８】
例えば対象タンパク質がヘモグロビンである場合には、公知のヘモグロビンを測定する方法であれば如何なる方法も用いることができる。このような方法には、例えばメトへモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、アザイドメトヘモグロビン法、ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＬＳ）法、アルカリヘマチン法、緑色発色団形成法又はオキシヘモグロビン法等が挙げられる。また、試料中のヘモグロビンをテトラゾリウム化合物で変性させ得られた変性ヘモグロビンに特異的な吸収波長で、前記試料の光学的変化量を測定する方法等を用いることができる。【０１０９】
さらにまた、対象タンパク質がアルブミンである場合には、公知のアルブミンを測定する方法であれば如何なる方法も用いることができる。このような方法には、例えばブロムクレゾールグリーン、ブロムクレゾールパープル、ブロモフェノールブルー、メチルオレンジ、又は2-（4'- ヒドロキシベンゼンアゾ）安息香酸等のアルブミン特異的な色素を用いる方法等が挙げられる。【０１１０】
（測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合の算出方法）
本発明において、測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合とは、試料中の測定すべき糖化タンパク質の含量又は濃度に対する同一試料中の対象タンパク質の含量又は濃度の割合を意味する。測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合を算出する方法としては、標準品として既知濃度の対象タンパク質及び既知濃度の測定すべき糖化タンパク質をそれぞれ用いて検量線を作成し、その検量線を用いて試料中の対象タンパク質濃度及び測定すべき糖化タンパク質濃度を決定することができる。両者の濃度から対象タンパク質に対する測定すべき糖化タンパク質の割合を算出することができる。【０１１１】
（試料の調製方法）
測定すべき糖化タンパク質及び対象タンパク質を含む試料は、必要に応じて生体試料から分離することができる。分離方法としては、遠心、濾過、血球分離膜を用いた方法等が挙げられる。例えば遠心による分離方法は、全血を血球、血漿もしくは血清に分離することができる。必要に応じて、該血球を生理食塩水等の等張液で洗浄することで、血漿由来の成分を除去した洗浄血球を得ることもできる。【０１１２】
試料として血球を用いる場合は、全血、血球、洗浄血球等の血球を含む試料を低張液で希釈して溶血することができる。低張液としては、血球を溶血させることができれば如何なる溶液でもよいが、水、緩衝液等が挙げられ、前述の界面活性剤等の添加剤を含むのが好ましい。【０１１３】
洗浄血球の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、２５℃で５分間、遠心分離（３，０００ｒｐｍ）を行う。遠心分離後、上澄みの血漿は除去する。下層部分の血球層１容に対して、４容の生理食塩水を追加し、転倒混和後、２５℃で５分間、遠心分離（３，０００ｒｐｍ）を行う。遠心分離後、上澄みの生理食塩水を除去する。この洗浄操作を３回繰り返した後、洗浄された血球層1容に対して９容の蒸留水を添加し、洗浄血球を得ることができる。【０１１４】
（工程（ii）と工程（iii）で使用する酵素の選択）
工程（ii）と工程（iii）で使用する酵素の選択について試料中のＨｂＡ１ｃを測定する場合を例に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【０１１５】
ＨｂＡ１ｃを含む精製ヘモグロビン試料にタンパク質分解酵素を作用させることにより、β鎖N末端のバリン残基が糖化された糖化ヘモグロビンに由来するフルクトシルバリン（以下、Fru-Valと略記する）及びフルクトシルバリルヒスチジン（以下、Fru-Val-Hisと略記する）、α鎖N末端のバリン残基が糖化された糖化ヘモグロビンに由来するFru-Val及びフルクトシルバリルロイシン（以下、Fru-Val-Leuと略記する）、α鎖及び／又はβ鎖の内部のリジン残基のε−アミノ基の糖化に由来するフルクトシルリジン（以下、Fru-Lysと略記する）等の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドが生成する。【０１１６】
さらに試料が全血の場合、例えば糖化アルブミンなど血液中の測定すべき糖化蛋白質以外の糖化タンパク質からも例えばFru-Lys等の糖化アミノ酸が生成する。
即ち、精製ヘモグロビンを含む試料又は全血を含む試料にタンパク質分解酵素を作用させると、例えばFru-Val-His、Fru-Val、Fru-Lys、Fru-Val-Leu等が生成し、Fru-Val-His及びFru-Val-Leuは糖化ヘモグロビンに由来し、Fru-Val-Hisは、ＨｂＡ１ｃに特異的に由来する。
従って、糖化ヘモグロビンを測定するには、例えばFru-Val-His及びFru-Val-Leuを特異的に測定すればよく、ＨｂＡ１ｃを測定する場合は、Fru-Val-Hisを特異的に測定すればよい。
第１表は、Fru-Val-His、Fru-Val、Fru-Lys、Fru-Val-Leuに対する酵素の理論的な特異性のパターンを示す。○印は、酵素が作用することを、×印は酵素が作用しないことを示す。【０１１７】
【表１】
2007072941.tif 000002
【０１１８】
ここで、糖化アミノ酸即ちFru-Val及び／又はFru-Lysにのみ作用し、糖化オリゴペプチド、即ちFru-Val-HisとFru-Val-Leuとに作用しない酵素としては、タイプ１０、タイプ１２、及びタイプ１４に属する酵素が挙げられる。
糖化オリゴペプチド即ちFru-Val-His及び／又はFru-Val-Leuに作用する酵素としては、タイプ１〜タイプ９、タイプ１１、タイプ１３及びタイプ１５があげられ、Fru-Val-Hisに作用する酵素としてはタイプ１〜タイプ８が挙げられる。【０１１９】
Fru-Val-Hisに作用し、Fru-Val-Leuに作用しない酵素としては、タイプ２、タイプ４、タイプ６、タイプ８が挙げられる。
これらの酵素を工程（ii）及び工程（iii）に組み合わせて使用すれば目的とする糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを測定することができる。
ＨｂＡ１ｃの測定においては、工程(ii)と工程(iii)で使用し得る酵素の組み合わせとして、例えば第２表の例１及び例２に示す酵素の組み合わせが挙げられる。また、Fru-Val又はFru-Lysが生成しないタンパク質分解酵素等を用いることによって、例えば第２表の例３又は例４に示す酵素の組み合わせも使用できる。【０１２０】
【表２】
2007072941.tif 000003
【０１２１】
なお、前述のＨｂＡ１ｃの測定方法に置いては、工程（ii）で、試料中にもともと存在する糖化アミノ酸も除去される。
先行文献等の情報により特定の酵素が第１表に記載したどのタイプに属するか分類することができる。例えばタイプ２に属する酵素として、FPOX-CE（キッコーマン社製）が、タイプ４に属する酵素として、FPOX-EE（キッコーマン社製）が、タイプ１０に属する酵素として、FAOD-E（キッコーマン社製）、タイプ１１に属する酵素として、フルクトシルアミノ酸キナーゼ（特開２００５−５８１５７）が、タイプ１２に属する酵素として、FAOX-TE（キッコーマン社製）が、タイプ１４に属する酵素として、遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼFODVII（旭化成社製；ＷＯ０２／０６１１１９）挙げられる。【０１２２】
ＨｂＡ１ｃ以外の糖化タンパク質について同様に測定系を構築する場合、 (a)タンパク質分解酵素によって生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドの、クロマトグラフィ、質量分析、キャピラリー電気泳動法等の方法による同定、(b)同定された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドには反応せず、当該糖化タンパク質以外の糖化タンパク質に由来する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに反応する酵素、及び、同定された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに反応する酵素の選択、という手順により、測定系を構築することができる。【０１２３】
本発明において使用するフルクトシルアミンオキシダーゼ等の酵素の基質特異性は、既知の構造の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを用いて、例えば以下の試薬Ａ及び試料からなる酵素の基質特異性検討用試薬を用いて確認することができる。【０１２４】
試薬Ａ  発色試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                    １００ｍｍｏｌ／Ｌ
西洋わさび由来パーオキシダーゼ                ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６４                                    ０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE      １０Ｕ／ｍＬ
試料
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                    １００ｍｍｏｌ／Ｌ
糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチド（基質）
１μｍｏｌ／Ｌ【０１２５】
上記試料中の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドはいかなる濃度でもよく、例えば一定濃度、例えば１μｍｏｌ／Ｌを調製する。この調製した試料（０．１５ｍＬ）を、３７℃で１分間加温した後に７５０ｎｍにおける吸光度Ａ０基を測定する。続いて、反応開始５分後に試薬Ａ５０μＬを添加して、続けて３７℃で５分間反応させる。反応開始１０分後に７５０ｎｍにおける吸光度Ａ１基を測定する。反応吸光度ΔＡ基を下記式【０１２６】
【数１】
2007072941.tif 000004
【０１２７】
により算出する。同様に、コントロールとして、糖化アミノ酸又は糖化オリゴペプチド水溶液の代わりに精製水を使用して測定を行い、ΔＡコントロールを下記式【０１２８】
【数２】
2007072941.tif 000005
【０１２９】
により算出する。測定の結果の判定は、測定対象とする糖化タンパク質を特異的に測定する目的において、当業者が適宜選択できるが、例えば下記式【０１３０】
【数３】
2007072941.tif 000006
【０１３１】
により算出した反応吸光度ΔＡが１ｍＡｂｓ以上得られた場合、反応性があると判定することができる。また、例えばある基質に対する反応吸光度ΔＡに対し、他の基質に対する反応吸光度が５０％以下の場合、他の基質に対しては反応性がないと判定することもできる。【０１３２】
（測定すべき糖化タンパク質測定用試薬及び測定用キット）
本発明の測定すべき糖化タンパク質測定用試薬及び測定用キットは、本発明の測定すべき糖化タンパク質の測定方法に使用することができる。本発明の測定すべき糖化タンパク質測定用試薬は、保存、運搬、流通に適した形態として、キットの形態をとり得る。キットの形態としては、２試薬系、３試薬系等が挙げられる。【０１３３】
本発明の測定すべき糖化タンパク質測定用試薬は、タンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む。【０１３４】
本発明の測定すべき糖化タンパク質測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられる。【０１３５】
キット１（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット。
（Ａ）タンパク質分解酵素を含む第一試薬；
（Ｂ）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬を含む第二試薬；
（Ｃ）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、及び、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む第三試薬。【０１３６】
キット２（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット。
（Ａ）タンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するため試薬を含むの第一試薬；
（Ｂ）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、及び、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む第二試薬。【０１３７】
タンパク質分解酵素による、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素の分解を抑制する観点から、本発明のキットは３試薬系が好ましい。
本発明の測定用試薬及び測定用キットにおいて使用されるタンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬としては、それぞれ、前述のものが挙げられる。【０１３８】
以下、工程（ii）及び工程（iii）の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素として、特異性の異なるオキシダーゼを使用する場合の試薬構成について詳細に説明する。
工程（ii）の生成物の除去試薬としては、オキシダーゼの作用により生成する過酸化水素を除去する過酸化水素除去剤、グルコースを除去するグルコース除去剤、アミノ酸若しくはオリゴペプチドを除去するアミノ酸もしくはオリゴペプチド除去剤等が挙げられるが、過酸化水素除去剤が好ましい。【０１３９】
本発明の工程（iii）の生成物測定試薬としては、過酸化水素測定試薬が挙げられる。
３試薬系のキットにおいては、過酸化水素除去試薬は、第二試薬に含有される。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合は、第三試薬はカタラーゼ活性阻害剤を含む。該カタラーゼ活性阻害剤としては、前述のカタラーゼ活性阻害剤が挙げられる。過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と１種類の酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合、該過酸化活性物質と該酸化カップリング型色原体は、過酸化水素測定試薬の構成成分も兼ねているので、特に過酸化水素除去試薬を除去又は不活性化する必要はなく、第三試薬に、発色に必要なもう一方の酸化カップリング発色型色原体を含有させればよい。また、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合においても、過酸化水素測定試薬中の一部の構成成分、特に、１種類の酸化カップリング型色原体は第二試薬に含有されてもよい。【０１４０】
本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、標準タンパク質等の測定用標準物質が含有されてもよい。
また本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、対象タンパク質を測定するための試薬が含有されてもよい。対象タンパク質がヘモグロビンの場合は、ヘモグロビン測定試薬としては、メトへモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、アザイドメトヘモグロビン法、ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＬＳ）法、アルカリヘマチン法、緑色発色団形成法又はオキシヘモグロビン法等に用いられる公知のヘモグロビン測定試薬が挙げられる。【０１４１】
本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、それぞれ緩衝剤、安定化剤、防腐剤、影響物質除去剤、非特異反応抑制等が含有されてもよい。緩衝剤としては、例えば前述の緩衝剤等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、アミノ酸類、アルブミン、デキストラン、塩化カルシウム及び酢酸カルシウム等の塩類等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質除去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。非特異反応抑制剤としては、デキストラン硫酸等の高分子化合物等が挙げられる。【０１４２】
本発明の測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、反応液に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、当該キットは前述の水性媒体又は反応液に溶解して使用することができる。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、必要に応じて、該キットに凍結乾燥試薬を溶解するための試薬等が含有されてもよい。
本発明の測定用キットにおけるタンパク質分解酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜１，０００，０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．１〜１００，０００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。【０１４３】
本発明のフルクトシルアミンオキシダーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜１，０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。
本発明のキットにおける界面活性剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜２０％となる含量が好ましく、０．０１〜１０％となる含量がより好ましい。【０１４４】
過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のキットにおけるカタラーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．１〜１０，０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、１０〜２，０００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。また、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のキットにおけるカタラーゼ活性阻害剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が５〜６００ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量が好ましく、１〜９０ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量がより好ましい。【０１４５】
過酸化水素除去試薬剤としてパーオキシダーゼと１種類の酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合のキットにおけるパーオキシダーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が１〜６００Ｕ／ｍＬ、０．０５〜８ｇ／Ｌとなる含量が好ましく、２〜１５０Ｕ／ｍＬ、０．１〜４ｇ／Ｌとなる含量がより好ましい。【０１４６】
過酸化水素測定試薬としてパーオキシダーゼと酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合のキットにおけるパーオキシダーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が１〜６００Ｕ／ｍＬ、０．５〜４０ｇ／Ｌとなる含量が好ましく、２〜１５０Ｕ／ｍＬ、１〜２０ｇ／Ｌとなる含量がより好ましい。【０１４７】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記の試薬を使用した。
トリス緩衝剤（和光純薬工業社製）
フルクトシルバリルヒスチジン(Fru-Val-His)（ペプチド研究所社製）
プロテアーゼN「アマノ」G（天野エンザイム社製）
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE（キッコーマン社製）
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOD-E（キッコーマン社製）
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOX-TE（キッコーマン社製）
西洋わさび由来パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）
カタラーゼ（東洋紡績社製）
ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）
ＭＣＤＰ（協和メデックス社製）
アンヒトール２０Ｎ（ドデシルジメチルアミンオキサイド；花王社製）
ニューコール７２３（ＰＯＥ多環フェニルエーテル；日本乳化剤社製）
Nonidet Ｐ−４０（ＰＯＥオクチルフェニルエーテル；Fluka社製）
【実施例１】
【０１４８】
フルクトシルオリゴペプチドの特異的測定（１）
下記の試薬からなるキット（コントロールキット、キットＡ、キットＢ）を調製した。尚、基質Fru-Val及びFru-Lysは、ハシバらの方法（Hashiba H, J.Agric.Food.Chem.24:70,1976）を用いて調製した。【０１４９】
コントロールキット
第１試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val-His                                Ｘμｍｏｌ／Ｌ
（Ｘ＝０，１．４，２．８，５．６）
第２試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
第３試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE   １０Ｕ／ｍＬ
西洋わさび由来ペルオキシダーゼ            ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６４                                ０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ【０１５０】
キットＡ
第１試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val                                   ５．６μｍｏｌ／Ｌ
Fru-Lys                                   ５．６μｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val-His                               Ｘμｍｏｌ／Ｌ
（Ｘ＝０，１．４，２．８，５．６）
第２試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
第３試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE   １０Ｕ／ｍＬ
西洋わさび由来ペルオキシダーゼ            ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６４                                ０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ【０１５１】
キットＢ
第１試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val                                   ５．６μｍｏｌ／Ｌ
Fru-Lys                                   ５．６μｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val-His                               Ｘμｍｏｌ／Ｌ
（Ｘ＝０，１．４，２．８，５．６）
第２試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOD-E    １０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ                                ３００Ｕ／ｍＬ
第３試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE   １０Ｕ／ｍＬ
西洋わさび由来ペルオキシダーゼ            ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６４                                ０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ
【実施例２】
【０１５２】
フルクトシルオリゴペプチドの特異的測定（２）
二種以上の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを含む試料中の測定すべきの糖化オリゴペプチドの分別測定を検証するため、実施例１の各キットを用いて、以下の実験を行った。
Fru-Val-Hisの濃度が０，１．４，２．８，５．６μｍｏｌ／Ｌとなるように調製した第１試薬４９０μＬに、第２試薬２１０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。反応液を９５℃で５分間加熱した後、氷冷した。更に、４℃で１０分間遠心分離（５，０００ｒｐｍ）し、得られた上清３５μＬに１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を１１５μＬ添加し、３７℃で１分間加温した後に７５０nmにおける吸光度（Ａ０’）を測定した。続いて、反応開始５分後に第３試薬５０μＬを添加して、続けて３７℃で５分間反応させた。反応開始１０分後に７５０nmにおける吸光度（Ａ１’）を測定した。反応吸光度ΔＡ’を以下の式【０１５３】
【数４】
2007072941.tif 000007
【０１５４】
により算出した。
各キットを用いた測定における測定値を第３表に示す。【０１５５】
【表３】
2007072941.tif 000008
【０１５６】
第３表から明らかなように、キットＡではコントロールキットに対し、反応吸光度が増大した。これは、反応液中に一定濃度で共存させたFru-Lys及びFru-Valを消去しておらず、Fru-Lys及びFru-Val由来の過酸化水素を、Fru-Val-His由来の過酸化水素と同時に測定しているためである。一方、キットＢでは、コントロールキットを用いた場合とほぼ同様の反応吸光度が得られた。これは、第２試薬中に含まれるFAOD−E及びカタラーゼを作用させることにより、反応液中に一定濃度で共存させたFru-Lys及びFru-Valを除去し、共存させたFru-Lys及びFru-Val由来の過酸化水素をほとんど測定することなく、測定対象物であるFru-Val-His由来の過酸化水素を選択的に測定していることを示唆する。【０１５７】
以上より、二種以上の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドが存在する反応液中において、測定すべき糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチド以外の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去することによって、測定すべき糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを選択的に測定できることが示された。
【実施例３】
【０１５８】
ＨｂＡ１ｃ測定用キット
下記の試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第１試薬：タンパク質分解酵素を含む試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
プロテアーゼN「アマノ」Ｇ                 ５，０００Ｕ／ｍＬ
アンヒトール２０Ｎ                        ０．５％
ニューコール７２３                        ０．１％
第２試薬：生成物除去試薬を含む試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOD-E    １０Ｕ／ｍＬ
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOX-TE   １０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ                                ３００Ｕ／ｍＬ
第３試薬：生成物測定試薬を含む試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE  １０Ｕ／ｍＬ
西洋わさび由来ペルオキシダーゼ            ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＭＣＤＰ                                  ０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ
Nonidet Ｐ−４０                          ０．１％
【実施例４】
【０１５９】
試料中のＨｂＡ１ｃの測定
（１）測定用試料の調製〜試料中のＨｂＡ１ｃ濃度の測定
健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、全血1容に対して４容の蒸留水を添加し、標準品を得た。
また、健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、２５℃で５分間遠心分離（３，０００ｒｐｍ）した。遠心分離後、下層部分の血球層を蒸留水で１００倍希釈したもの、及び蒸留水をデタミナーＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）の用法・用量に従ってＨｂＡ１ｃ（％）値を測定し、濃度を測定した。
（２）実施例３のキットを用いた試料中のＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の測定  試料として、（１）で濃度を測定した健常人及び糖尿病患者由来の試料及び蒸留水を、測定用キットとして、実施例３のキットを用いて、各試料中のＨｂＡ１ｃ濃度を次の手順により測定した。【０１６０】
実施例３のキット中の第１試薬５０μＬ及び試料２０μＬを反応容器に分注し２５℃で１分間反応させた後、反応液を９５℃で５分間加熱し氷冷した。４℃で１０分間遠心分離（５，０００ｒｐｍ）し、得られた上清を以下の反応に供した。
上記上清３５μＬに第２試薬１μＬセルに分注し、３７℃で５分間反応させた後、反応液を９５℃で５分間加熱し氷冷した。更に、４℃で１０分間遠心分離（５，０００ｒｐｍ）し、得られた上清３５μＬに１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を１１５μＬ添加し、３７℃で１分間加温した後に、６６０ｎｍにおける吸光度（Ａ０Ｘ）を測定した。続いて、反応開始５分後に第３試薬５０μＬを添加して、続けて３７℃で５分間反応させた。反応開始１０分後に６６０ｎｍにおける吸光度（Ａ１Ｘ）を測定した。反応吸光度ΔＡＸは、下記の式【０１６１】
【数５】
2007072941.tif 000009
【０１６２】
より算出した。
（３）試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）の測定
試料として、（１）で濃度を測定した健常人及び糖尿病患者由来の試料並びに蒸留水を、ヘモグロビン測定用キットとして、ヘモグロビンＢ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて、各試料中のヘモグロビン濃度を、ヘモグロビンＢ−テストワコーの用法・用量に従って測定した。得られたヘモグロビン濃度より、本反応系の反応液総量２００μＬ中のヘモグロビン量（μｇ）を算出した。
（４）試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）に対するＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の割合の算出
（２）で得られた反応吸光度ΔＡＸを、（３）で得られたヘモグロビン量で除して、ヘモグロビン１μｇ当たりの反応吸光度（ΔＡ’Ｘ）を算出し、試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）に対するＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の割合の指標とした。
（５）免疫法を用いた試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）に対するＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の割合の算出
デタミナーＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）の用法・用量に従って、（１）で濃度を測定した各試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）に対するＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の割合（ＨｂＡ１ｃ％）を測定した。
（６）本発明の方法と免疫法との相関
（４）で算出したΔＡ’Ｘと、（５）で算出した割合（ＨｂＡ１ｃ％）との相関関係を図１に示す。縦軸に本発明の測定キットを用いた酵素法による測定で得られたΔＡ’Ｘを、横軸にデタミナーＨｂＡ１ｃ試薬を用いた免疫法による測定で得られたＨｂＡ１ｃ％を取り、各試料についての値をプロットしたところ、図１に示すように、両者の間で、良好な相関関係及び直線性が認められた。従って、本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明によれば、糖尿病等の疾患の診断に有用な、試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定方法、測定用試薬及び測定用キットが提供される。
【図１】
2007072941.tif 000010
【国際調査報告】
2007072941.tif 000011
2007072941.tif 000012
2007072941.tif 000013
2007072941.tif 000014