【手続補正書】
【提出日】平成20年10月9日(2008.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１又は２若しくはその相補体の少なくとも２１の連続的ヌクレオチドを含む阻害性核酸を含む、遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項２】
少なくとも２種の異なる線虫種によって引き起こされる線虫性疾患に抵抗性である、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項３】
メロイドジーンインコグニタによって引き起こされる線虫病害に抵抗性である、請求項２記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項４】
また、メロイドジーンジャバニカによって引き起こされる線虫病害に抵抗性である、請求項３記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項５】
また、メロイドジーンアレナリアによって引き起こされる線虫病害に抵抗性である、請求項４記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項６】
また、メロイドジーンハプラ又はメロイドジーンチットウッディによって引き起こされる線虫病害に抵抗性である、請求項５記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項７】
前記阻害性核酸が、コントロールの植物又は植物細胞と比較して、該遺伝子組換え植物又は細胞を常食とする寄生線虫による線虫の食道腺細胞分泌型ポリペプチドの発現を低減、阻害、又は阻止するのに有効な量である、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項８】
前記阻害性核酸が、コントロールの植物又は植物細胞と比較して、遺伝子組換え植物又は植物細胞の線虫病害を低減、阻害、又は阻止するのに有効な量である、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項９】
前記阻害性核酸が、コントロールの植物又は植物細胞と比較して、遺伝子組換え植物又は植物細胞を常食とする少なくとも２種の寄生根瘤線虫種による線虫の食道腺細胞分泌型ポリペプチドの発現を低減、阻害、又は阻止するのに有効な量である、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項１０】
前記阻害性核酸が、コントロールの植物又は植物細胞と比較して、少なくとも２種の異なる根瘤線虫種によって引き起こされる遺伝子組換え植物又は植物細胞の線虫病害を低減、阻害、又は阻止するのに有効な量である、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項１１】
前記線虫がネコブ線虫類のメンバーである、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項１２】
前記遺伝子組換え植物又は植物細胞が、単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項１３】
前記遺伝子組換え植物又は植物細胞が、バラ科、マメ科、トケイソウ科、ウリ科、アオイ科、トウダイグサ科、ブドウ科、ナス科、ヒルガオ科、アカネ科、マメ科植物（Leguminosae）、及びアブラナ科からなる群から選択される系統学的な科のメンバーである、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項１４】
前記植物が、トマト、ナス、ジャガイモ、メロン、キュウリ、ニンジン、レタス、チョウセンアザミ、セロリ、ウリ科植物、オオムギ、トウモロコシ、ピーナッツ、ダイズ、テンサイ、ワタ、ササゲ、マメ類、アルファルファ、タバコ、柑橘類、クローバ、コショウ、ブドウ、コーヒー、オリーブ又は茶である、請求項１３記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項１５】
前記阻害性核酸がＲＮＡである、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は細胞。
【請求項１６】
前記阻害性核酸がミクロＲＮＡである、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項１７】
異なる線虫の食道腺細胞分泌型ポリペプチドに特異的な２以上の阻害性核酸を含む、請求項１記載の遺伝子組換え植物又は植物細胞。
【請求項１８】
線虫に与えた場合、配列番号：１又は２若しくはその相補体或いはその相同体の発現を阻害するのに十分な量で、配列番号：１又は２若しくはその相補体或いはその相同体の少なくとも２１の連続的ヌクレオチドを含む阻害性核酸を含む、組成物。
【請求項１９】
前記線虫がネコブ線虫のメンバーである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
前記遺伝子組換え植物又は植物細胞が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
前記植物又は植物細胞が、バラ科、マメ科、トケイソウ科、ウリ科、アオイ科、トウダイグサ科、ブドウ科、ナス科、ヒルガオ科、アカネ科、マメ科植物、及びアブラナ科からなる群から選択される系統学的な科のメンバーである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２２】
前記植物又は植物細胞が、トマト、ナス、ジャガイモ、メロン、キュウリ、ニンジン、レタス、チョウセンアザミ、セロリ、ウリ科植物、オオムギ、トウモロコシ、ピーナッツ、ダイズ、テンサイ、ワタ、ササゲ、マメ類、アルファルファ、タバコ、柑橘類、クローバ、コショウ、ブドウ、コーヒー、オリーブ又は茶である、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
配列番号：１又は２若しくはその相補体の少なくとも２１の連続的ヌクレオチドを含む核酸を含む、細胞。
【請求項２４】
配列番号：１又は２若しくはその相補体の少なくとも２１の連続的ヌクレオチドを含む阻害性核酸をコードする核酸に機能的に連結させたプロモーターを含む、ベクター。
【請求項２５】
植物に線虫抵抗性を付与する方法であって、該植物内で配列番号：１又は２若しくはその相補体の少なくとも２１の連続的ヌクレオチドを含む阻害性核酸を発現させることを含む、前記方法。
【請求項２６】
前記線虫がネコブ線虫類のメンバーである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
植物に線虫抵抗性を付与する方法であって、前記植物を、配列番号：１又は２若しくはその相補体の少なくとも２１の連続的ヌクレオチドを含む１以上の阻害性核酸と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２８】
前記線虫がネコブ線虫類のメンバーである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記植物が、少なくとも２種の異なる根瘤線虫種によって引き起こされる線虫病害に抵抗性である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記植物が、属に属する線虫によって引き起こされる線虫病害に抵抗性である、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
前記阻害性核酸を含む、請求項１に記載の植物由来の種子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
最終産物に必要ではない可能性があるが遺伝子組換え事象の回復における有用な役割を担い得る他の遺伝子は、これらに限定されないが、例えばＧＵＳ（ｂ−グルクロニダーゼ；Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387)、ＧＦＰ (緑色蛍光タンパク質；Chalfieらの論文 (1994) Science 263:802）、ルシフェラーゼ（Riggsらの論文 (1987) Nucleic Acids Research. 15(19):8115及びLuehrsenらの論文 (1992) Methods Enzymol. 216:397-414）、及びアントシアニン産生物をコードするメイズ（maize）遺伝子（Ludwigらの論文 (1990) Science 247:449）などの例を含み得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
「種子優先」プロモーターは、「種子発芽」プロモーター（種子発芽中に活性なプロモーター）に加えて、「種子特異的」プロモーター（種子貯蔵タンパク質プロモーターなどの、種子発達中に活性なプロモーター）の両方を含む。引用によって本明細書に組み込まれるThompsonらの論文 (1989) BioEssays 10:108を参照されたい。そのような種子優先プロモーターは、これらに限定されないが、Cim1（サイトカイニン誘導性伝達）；cZ19B1（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）；mi1ps（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）；及びce1A（セルロースシンターゼ）を含む。ガンマ−ゼインは、好ましい胚乳特異的プロモーターである。Glob-1は、好ましい胚特異的プロモーターである。双子葉植物に関して、種子特異的プロモーターは、これらに限定されないが、マメベータ−ファゼオリン、ナピン（napin）、ベータ−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどを含む。単子葉植物に関して、種子特異的プロモーターは、これらに限定されないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ワクシー（waxy）、シュランケン（shrunken）１、シュランケン２、グロブリン１などを含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
（実施例５）：サザンブロット解析
各サンプルに関して、１０μｇのゲノムＤＮＡを、５０単位のEcoRI又はBamHI（New England Biolabs社, Beverly, MA）を用いて完全に消化し、０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離し、ハイボンド−Ｎ ナイロン膜（Hybond-N Nylon membrane）（Amersham Pharmacia Biotech社, Piscataway, NJ）上に転写し、標準的な手順（Sambrookらの文献, 1989）を使用してブロッティングした。Ｔ７及びＳＰ６プライマーを用いたpGEM-Tイージーベクター中の挿入配列からの対応全長ｃＤＮＡの増幅によって、16D10プローブを作成した。PCR-DIGプローブ合成システム（PCR-DIG probe synthesis system）（Roche Applied Science社, Indianapolis, IN）を用いたＰＣＲによって、ゲル抽出したＰＣＲ産物を標識した。各ハイブリダイゼーションに、１ｍｌ当たり約１５ｎｇのＤＩＧ標識プローブを使用した。DIGイージーハイブ溶液（DIG Easy Hyb solution）（Roche Applied Science社, Indianapolis, IN）中でのハイブリダイゼーションを４０℃で１６時間実施したのに続き、室温の2×SSC/0.1% SDS溶液中で５分間で２回洗浄した。該膜をそれから、６８℃で３０分間、0.5×SSC/0.1% SDSを用いて２回洗浄した。１％ブロッキング試薬中で１時間、該膜をインキュベートした後、該膜を、１／１０，０００希釈したヒツジ抗DIGアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）複合体と３０分間インキュベートした。マレイン酸洗浄緩衝液（100 mM マレイン酸, 150 mM NaCl, pH7.5, 及び0.3% Tween 20）を用いた１５分間の洗浄を２回行うことで、非結合抗体を除去した。ＡＰ検出緩衝液（100 mM トリス-HCl, pH9.5, 100 mM NaCl, 及び50 mM MgCl2）中で１０分間のインキュベートに続いて、２枚の透明フィルムに該膜を封着する前に、１：５０希釈した化学発光基質である３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム（ＣＳＰＤ）（Roche Applied Science社）とインキュベートし、該膜をＸ線フィルムに１．５時間感光させた。16D10ｃＤＮＡとハイブリダイズしたＭ．インコグニタ、Ｍ．ジャバニカ、Ｍ．アレナリア及びＭ．ハプラ由来のゲノムＤＮＡを含むブロットは、16D10が、４種の農業的に重要なメロイドジーン種の各々において、３〜４のコピー又は相同体を有して存在することを示した（図６）。ダイズシスト線虫Ｈ．グリシン（H.glycine）、非寄生性自由生息線虫ケノルハブディティス・エレガンス、及び植物（タバコ及びアラビドプシス）由来のゲノムＤＮＡからは、ハイブリダイゼーション検出されなかった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
（実施例１６）：アラビドプシス花浸漬形質転換
電子穿孔法（Shen及びFordeの論文, 1989）で、プラスミドpBIX(16D10)、pBIX(C3S-16D10)、及びコントロールとしての空ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスC58C1中に導入し、花浸漬法（Clough及びBentの文献, 1998）によって、Ａ．サリアナの野生型Col-0植物体中に形質転換した。カナマイシン耐性の分離、ＧＵＳ−染色（Jefferson et al, 1987）、及び16D10発現をＰＣＲ解析に共役させて、遺伝子組換え相同Ｔ２系統の世代を確認した。逆ＰＣＲ（Inverse PCR）（Doesらの文献, 1991）は、分子的アッセイ及び根の成長アッセイ用のゲノムにおける、単一遺伝子組換えコピーを有する相同系統を同定した。それぞれ３回繰り返した各遺伝子組換え系統由来の３０個の植物体を、１６時間明条件（２４℃）／８時間暗条件（２０℃）サイクルで、３％スクロース含有ＭＳプレート上にインビトロ培養し、該プレートを根の成長アッセイ用に垂直方向に維持した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
（実施例２３）：抵抗性アッセイ
pART27由来構築物の形質転換から生じたＡ．サリアナ遺伝子組換え系統由来の種子を、70% (v/v) エタノールで１分間、及び3% (v/v)ハイポクロライドナトリウムで５分間表面を滅菌し、それから滅菌蒸留水で５回すすいだ。該滅菌済種子を重複させ、ガンボルグのＢ−５培地で３週間成育させた。Ｍ．インコグニタの卵を滅菌し、それから先に記載したように（Sijmonsらの文献, 1991）、約５００個の卵を各植物体の根付近に植えつけた。感染根の瘤の数及びサイズを、植え付け３週間後に解析し、該感染根をHwangらの文献, 2000に記載されているように、酸性フクシンを用いて赤色に染色し、植え付け８週間後に、根１グラム当たりの卵の数をアッセイした。16D10ｄｓＲＮＡを発現する遺伝子組換えアラビドプシス系統は、４種の主要なメロイドジーン種、すなわちＭ．インコグニタ、Ｍ．ジャバニカ、Ｍ．アレナリア及びＭ．ハプラに抵抗性であった。根の瘤形成アッセイは、ベクター形質転換系統に比較して、16D10 ｄｓＲＮＡ遺伝子組換えアラビドプシス系統上の瘤の数（及びサイズ）の６３〜９０％の減少を示した（図１Ａ、１Ｂ、及び表１）。線虫再生産アッセイは、コントロール植物体に比較し場合、16D10 ｄｓＲＮＡ遺伝子組換え系統において、根１グラム当たりのＲＫＮの卵の数の７０〜９７％の減少を示した（図７）。