【手続補正書】
【提出日】令和1年7月1日(2019.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製する方法であって、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程であって、前記熱ブレンドが９０〜１００℃で行われる、工程と；
結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程であって、添加した前記アリコートと前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ０．５：１とおよそ１．５：１との間である、工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも３回の希釈ステップを行う工程であって、各希釈ステップが：
前記試料に前記機能性タンパク質の前記溶液の追加量を添加することと；
前記ＰＥＧ／ポリマー配合物中の前記機能性タンパク質の、結果として生成する分散液を混合することと；
前記結果として生成する分散液を少なくとも３０分間超音波処理することと
を含む、工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも３回の希釈ステップを行う工程が、順次的な様式で、第１、第２、および第３の希釈ステップを行うことを含み、
前記第１のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第１の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ１：１であるように、前記第１の量を添加することを含み；
前記第２のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第２の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ２：１であるように、前記第２の量を添加することを含み；
前記第３のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第３の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、前記第３の量を添加することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも３回の希釈ステップを行う工程が、第４の希釈ステップを行うことをさらに含み、前記第４のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第４の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、前記第４の量を添加することを含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも３回の希釈ステップの後、タンパク質分解を使用して、前記ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の前記懸濁液中のポリマーソームから表面会合タンパク質を除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質分解を使用することが：
ＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を０．４ｗｔ％プロナーゼ溶液で室温で少なくとも１８時間処理すること；および
混合した前記ＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を４℃で少なくとも１２時間透析すること
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記機能性タンパク質の前記溶液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のオキシミオグロビン１５０ｍｇ／ｍＬ溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リン酸緩衝食塩水中の１５０ｍｇ／ｍＬメトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ）溶液を１ｗｔ％亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）の十分量と合わせて、前記ｍｅｔＭｂをオキシミオグロビン（ｏｘｙＭｂ）に還元することにより、前記機能性タンパク質の前記溶液を調製する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ブロックコポリマーが、両親媒性ジブロックコポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記両親媒性ジブロックコポリマーが、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ブロックコポリマーの前記ある分量を前記低分子量ＰＥＧの前記ある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程が、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）５〜１５ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）５〜１５ｍｇと少なくとも１時間熱ブレンドすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記熱ブレンドする工程が、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）１０ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）１０ｍｇと１時間熱ブレンドすることを含み；
前記機能性タンパク質の前記溶液の前記アリコートを添加する工程が、オキシミオグロビン溶液１０μＬを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物の前記試料に添加することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記熱ブレンドが、およそ９５℃で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を含む組成物であって、前記懸濁液が、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と熱ブレンドする工程と；
結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程であって、前記機能性タンパク質の前記溶液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のオキシミオグロビンまたはメトミオグロビンを含む、工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも１回の希釈ステップを行う工程と
によって調製される、組成物。
【請求項１４】
被験体を処置する方法において使用するための、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製する方法であって、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と熱ブレンドする工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも１回の希釈ステップを行う工程と
を含む、方法。
【請求項１６】
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製することが、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程であって、前記熱ブレンドが９０〜１００℃で行われる、工程と；
結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程であって、添加した前記アリコートと前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ０．５：１とおよそ１．５：１との間である、工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも３回の希釈ステップを行う工程であって、各希釈ステップが：
前記試料に前記機能性タンパク質の前記溶液の追加量を添加することと；
前記ＰＥＧ／ポリマー配合物中の前記機能性タンパク質の、結果として生成する分散液を混合することと；
前記結果として生成する分散液を少なくとも３０分間超音波処理することと
を含む、工程と
を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも３回の希釈ステップを行う工程が、順次的な様式で、第１、第２、および第３の希釈ステップを行うことを含み、
前記第１のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第１の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ１：１であるように、前記第１の量を添加することを含み；
前記第２のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第２の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ２：１であるように、前記第２の量を添加することを含み；
前記第３のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第３の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、前記第３の量を添加することを含む、
請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも３回の希釈ステップを行う工程が、第４の希釈ステップを行うことをさらに含み、前記第４のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第４の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、前記第４の量を添加することを含む、
請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製することが、前記少なくとも３回の希釈ステップの後、タンパク質分解を使用して、前記ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の前記懸濁液中のポリマーソームから表面会合タンパク質を除去する工程をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
タンパク質分解を使用することが：
ＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を０．４ｗｔ％プロナーゼ溶液で室温で少なくとも１８時間処理すること；および
混合した前記ＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を４℃で少なくとも１２時間透析すること
を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記機能性タンパク質の前記溶液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のオキシミオグロビン１５０ｍｇ／ｍＬ溶液を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製することが、リン酸緩衝食塩水中の１５０ｍｇ／ｍＬメトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ）溶液を１ｗｔ％亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）の十分量と合わせて、前記ｍｅｔＭｂをオキシミオグロビン（ｏｘｙＭｂ）に還元することにより、前記機能性タンパク質の前記溶液を調製する工程をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ブロックコポリマーが、両親媒性ジブロックコポリマーを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
前記両親媒性ジブロックコポリマーが、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ブロックコポリマーの前記ある分量を前記低分子量ＰＥＧの前記ある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程が、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）５〜１５ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）５〜１５ｍｇと少なくとも１時間熱ブレンドすることを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記熱ブレンドする工程が、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）１０ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）１０ｍｇと１時間熱ブレンドすることを含み；
前記機能性タンパク質の前記溶液の前記アリコートを添加する工程が、オキシミオグロビン溶液１０μＬを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物の前記試料に添加することを含む、
請求項１３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記熱ブレンドが、およそ９５℃で行われる、請求項１３に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
平均±平均の標準偏差（ＳＤ）としてデータが提示されている。各条件に対して、最低でも３回の実験の繰り返しを使用した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用して一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。＜０．０５のｐ値は統計的に有意であるとした。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製する方法であって、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程であって、前記熱ブレンドが９０〜１００℃で行われる、工程と；
結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程であって、添加した前記アリコートと前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ０．５：１とおよそ１．５：１との間である、工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも３回の希釈ステップを行う工程であって、各希釈ステップが：
前記試料に前記機能性タンパク質の前記溶液の追加量を添加することと；
前記ＰＥＧ／ポリマー配合物中の前記機能性タンパク質の、結果として生成する分散液を混合することと；  
前記結果として生成する分散液を少なくとも３０分間超音波処理することと
を含む、工程と
を含む、方法。
（項目２）
前記少なくとも３回の希釈ステップを行う工程が、順次的な様式で、第１、第２、および第３の希釈ステップを行う工程を含み、
前記第１のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第１の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ１：１であるように、前記第１の量を添加することを含み；
前記第２のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第２の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ２：１であるように、前記第２の量を添加することを含み；
前記第３のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第３の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、前記第３の量を添加することを含む、
項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも３回の希釈ステップを行う工程が、第４の希釈ステップを行う工程をさらに含み、前記第４のステップにおいて前記溶液の前記追加量を添加することが、前記機能性タンパク質の前記溶液の第４の量と前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ５：１であるように、前記第４の量を添加することを含む、
項目２に記載の方法。
（項目４）
前記少なくとも３回の希釈ステップの後、タンパク質分解を使用して、前記ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の前記懸濁液中のポリマーソームから表面会合タンパク質を除去する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
タンパク質分解を使用することが：
ＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を０．４ｗｔ％プロナーゼ溶液で室温で少なくとも１８時間処理すること；および
混合した前記ＰＥＧ／ポリマー／タンパク質試料を４℃で少なくとも１２時間透析する
こと
を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記機能性タンパク質の前記溶液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のオキシミオグロビン１５０ｍｇ／ｍＬ溶液を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
リン酸緩衝食塩水中の１５０ｍｇ／ｍＬメトミオグロビン（ｍｅｔＭｂ）溶液を１ｗｔ％亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）の十分量と合わせて、前記ｍｅｔＭｂをオキシミオグロビン（ｏｘｙＭｂ）に還元することにより、前記機能性タンパク質の前記溶液を調製する工程をさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ブロックコポリマーが、両親媒性ジブロックコポリマーを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記両親媒性ジブロックコポリマーが、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ブロックコポリマーの前記ある分量を前記低分子量ＰＥＧの前記ある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程が、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）５〜１５ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）５〜１５ｍｇと少なくとも１時間熱ブレンドする工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記両親媒性ジブロックコポリマーを前記低分子量ＰＥＧと少なくとも３０分間熱ブレンドする工程が、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）１０ｍｇを５００ｋＤａ  ＰＥＧ（ＰＥＧ５００）１０ｍｇと１時間熱ブレンドする工程を含み；
前記機能性タンパク質の前記溶液の前記アリコートを添加する工程が、オキシミオグロビン溶液１０μＬを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物の前記試料に添加する工程を含む、
項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記熱ブレンドが、およそ９５℃で行われる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を含む組成物であって、前記懸濁液が、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程であって、前記熱ブレンドが９０〜１００℃で行われる、工程と；
結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程であって、添加した前記アリコートと前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ０．５：１とおよそ１．５：１との間である、工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも３回の希釈ステップを行う工程であって、各希釈ステップが：
前記試料に前記機能性タンパク質の前記溶液の追加量を添加することと；
前記ＰＥＧ／ポリマー配合物中の前記機能性タンパク質の、結果として生成する分散液を混合することと；
前記結果として生成する分散液を少なくとも３０分間超音波処理することと
を含む、工程と
によって調製される、組成物。
（項目１４）
被験体を処置する方法であって、前記方法が：
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製する工程を含み、前記懸濁液を調製する工程が：
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と少なくとも３０分間熱ブレンドする工程であって、前記熱ブレンドが９０〜１００℃で行われる、工程と；
結果として生成するＰＥＧ／ポリマー配合物を混合し室温に冷却する工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程であって、添加した前記アリコートと前記ＰＥＧ／ポリマー配合物との比が容積でおよそ０．５：１とおよそ１．５：１との間である、工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも３回の希釈ステップを行う工程であって、各希釈ステップが、
前記試料に前記機能性タンパク質の前記溶液の追加量を添加することと；
前記ＰＥＧ／ポリマー配合物中の前記機能性タンパク質の、結果として生成する分散液を混合することと；
前記結果として生成する分散液を少なくとも３０分間超音波処理することと
を含む、工程と；
前記被験体にポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を投与する工程であって、前記懸濁液が：によって調製される、工程と
を含む、方法。
（項目１５）
ポリマーソームカプセル化機能性タンパク質の懸濁液を調製する方法であって、
ブロックコポリマーのある分量を低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある分量と熱ブレンドする工程と；
前記機能性タンパク質の溶液のアリコートを前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加する工程と；
生成するポリマーソームが前記機能性タンパク質で逐次飽和されるように少なくとも１回の希釈ステップを行う工程と
を含む、方法。