(57)【要約】  本発明はミリセチンの体内吸収性および体内抗酸化能を向上させる方法を提供する。これらの方法は、いずれもミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１又は複数個結合させることによって実施することができる。また本発明は、体内吸収性に優れ、体内において抗酸化作用を有効に発揮する体内抗酸化剤、ならびに当該体内抗酸化剤を有効成分とする経口組成物を提供する。当該体内抗酸化剤は、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１又は複数個結合してなるグルコシルミリセチンを有効成分として含有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミリセチンをグルコシル化することを特徴とする、ミリセチンの体内吸収性の向上方法。
【請求項２】
上記ミリセチンのグルコシル化が、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１またはそれ以上結合させるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ミリセチンをグルコシル化して、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１個以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物とする、請求項１に記載する方法。
【請求項４】
ミリセチンをグルコシル化して、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１個以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物とする、請求項１に記載する方法。
【請求項５】
ミリセチンをグルコシル化することを特徴とする、ミリセチンの体内抗酸化能の向上方法。
【請求項６】
上記ミリセチンのグルコシル化が、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１またはそれ以上結合させるものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ミリセチンをグルコシル化して、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１個以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物とする、請求項５に記載する方法。
【請求項８】
ミリセチンをグルコシル化して、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１個以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物とする、請求項５に記載する方法。
【請求項９】
ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１またはそれ以上結合してなるグルコシルミリセチンを有効成分とする体内抗酸化剤。
【請求項１０】
グルコシルミリセチンが、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１またはそれ以上に結合してなるものである、請求項９に記載する体内抗酸化剤。
【請求項１１】
グルコシルミリセチンが、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１個以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物である、請求項９に記載する体内抗酸化剤。
【請求項１２】
グルコシルミリセチンが、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１個以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物である、請求項９に記載する体内抗酸化剤。
【請求項１３】
グルコシルミリセチンの混合物が、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１個以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物に含まれるモノグルコシド体、ジグルコシド体及びトリグルコシド体の合計重量割合が３０重量％以上である、請求項１１に記載する体内抗酸化剤。
【請求項１４】
請求項９乃至１３のいずれかに記載する体内抗酸化剤を、体内で抗酸化作用を発揮する有効量含有する経口組成物。
【請求項１５】
飲食物、経口医薬品、飼料または餌料である請求項１４に記載する経口組成物。
【請求項１６】
ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１またはそれ以上結合してなるグルコシルミリセチンの、体内抗酸化剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミリセチンの体内吸収性を向上させる方法に関する。また本発明は、ミリセチンの体内吸収性を向上させることによって、その体内での抗酸化能を向上させる方法に関する。さらに本発明は、体内吸収性を高めたミリセチン配糖体の体内抗酸化剤としての用途、特に経口組成物としての用途に関する。本発明の方法によって体内吸収性が高められたミリセチン配糖体は体内で有効な抗酸化作用を発揮するため、体内抗酸化剤として、特に食品や医薬品などの経口組成物の成分として有用である。
【背景技術】
【０００２】
酸化は生命活動において重要である一方、酸化反応、それも生体による制御が効かない酸化反応は生体に大きなダメージを与える。特に、脂質などが酸化されて生じる過酸化物は生体に大きな傷害をもたらすこと、また過酸化物は光老化の大きな要因でなることが指摘されている。また、酸化は炎症にも大きく関わっており、慢性的な炎症は発ガンの重要な因子となると考えられていることから、酸化は発ガンとも深い関係にあるといえる。さらに、近年、生活習慣病に分類されている血栓症や脳循環関連の病気にも、酸化ストレス、とりわけ血管内皮細胞の酸化ストレスが関与していることも指摘されている。このように、生体において酸化反応を適切に制御することは、生体の維持と健康の維持に大変有用なことであり、このためにも酸化ストレスを軽減する方法が求められている。【０００３】
この目的で、従来より種々の抗酸化剤が使用されている。例えばルチン、ケルセチン、モリン、カテキン、ヘスペリジン、イソフラボン類及びミリセチンなどの各種のフラボノイド；ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＥ（トコフェロール）などのビタミン類；β-カロテン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、リコピン、ルテインなどのカロテノイド；セレンなどのミネラル；コエンザイムＱ１０、α-リポ酸などの補酵素；クルクミン、クロロゲン酸、タンニンなどのポリフェノール類などは、抗酸化作用を有していることが知られている。【０００４】
なかでもミリセチンについては、上述した生体内脂質の酸化防止作用（抗酸化作用）の他、発癌抑制作用、抗ウィルス作用、抗血栓作用、抗動脈硬化作用、および抗糖尿病作用などを有しているとの報告がある（非特許文献１参照）。【０００５】
しかしながら、ミリセチンなどのフラボノイドは常温の水に難溶であるため、食品等の特に水溶性組成物に対して使用しにくいという問題がある。また、これらは体内吸収性が低く、このため体内において抗酸化作用を有効に発揮することできないという問題がある。【０００６】
水難溶性のフラボノイドを易溶化する方法としては、ルチンにナリンギナーゼ処理させて得たケルセチン３−Ｏ−モノグルコシドに澱粉質とシクロデキストリン−グルカノトランスフェラーゼを作用させることによって水易溶性のフラボノイド配糖体を調製する方法（特許文献１参照）；水難溶性フラボノイドをケルセチン−３−Ｏ−配糖体と共存させることによって当該水難溶性フラボノイドを溶解する方法（特許文献２参照）；水難溶性フラボノイドにケルセチン−３−Ｏ−配糖体を配合した水溶液を乾燥させることによって、水難溶性フラボノイドを改質する方法（特許文献３参照）；並びに、ヤマモモ科植物抽出物にガラクトースを転移させることによって、ヤマモモ科植物抽出物を水易溶化する方法（特許文献４参照）が知られている。【０００７】
しかし、これらのフラボノイド、とくにミリセチンについて体内吸収性を向上させる方法については知られていない。また、水への溶解性を向上させることによって直ちに体内吸収性が向上するというわけではない（例えば、後述する実験例４と６参照）。
【非特許文献１】「Biological Effects of Myricetin」Kian C.Ong, Hoon-Eng Khoo. Gen. Phamac. Vol.29, No.2, 121-126, 1997
【特許文献１】特開平０１−２１３２９３号公報
【特許文献２】特開平０３−０７７８８０号公報
【特許文献３】特開平０７−０１０８９８号公報
【特許文献４】特開平０９−０９５６７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ミリセチンについて体内吸収性を高める方法を提供することを目的とする。特に本発明は、ミリセチンについて水溶性を高めると同時に、経口による体内吸収性を向上する方法を提供することを目的とする。また本発明は、ミリセチンについて体内吸収性を高め、体内での抗酸化能を向上させる方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、これらの方法によって体内吸収性および体内抗酸化能が向上したミリセチン配糖体について、体内抗酸化剤としての用途、特に体内で優れた抗酸化作用を発揮する食品や医薬品などの経口組成物の成分としての用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題の解決を目指して、日夜検討を重ねていたところ、ミリセチンをグルコシル化、具体的にはミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１個以上結合させることにより、経口投与した場合の体内吸収性が、ミリセチンをそのまま経口投与した場合に比して顕著に向上することを見出した。しかも、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１個以上結合させることにより、生体内での抗酸化作用も、ミリセチンをそのまま経口投与する場合に比して向上することを確認した。さらに、当該ミリセチンのグルコシル化体は、ミリセチンに比して水溶性も格段に向上しており、水中での安定性も向上していることを確認した。【００１０】
本発明は係る知見に基づいて完成されたものであり、下記の態様を包含するものである：
Ｉ．ミリセチンの体内吸収性の向上方法
（I-1）ミリセチンをグルコシル化することを特徴とする、ミリセチンの体内吸収性の向上方法。【００１１】
（I-2）ミリセチンのグルコシル化が、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１またはそれ以上、好ましくは１または２以上５以下結合させることからなるものである、（I-1）記載の方法。【００１２】
（I-3）ミリセチンをグルコシル化して、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上、好ましくは１以上５以下結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物とする、（I-1）または（I-2）に記載する方法。【００１３】
（I-4）ミリセチンをグルコシル化して、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上、好ましくは１以上５以下結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物とする、（I-1）または（I-2）に記載する方法。【００１４】
（I-5）グルコシルミリセチンの混合物が、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物１００重量％中のモノグルコシド体、ジグルコシド体およびトリグルコシド体の総量が３０重量％以上である、（I-3）または（I-4）に記載する方法。【００１５】
（I-6）モノグルコシド体、ジグルコシド体およびトリグルコシド体の総量が３０〜８０重量％である、（I-5）に記載する方法。【００１６】
II．ミリセチンの体内抗酸化能の向上方法
（II-1）ミリセチンをグルコシル化することを特徴とする、ミリセチンの体内抗酸化能の向上方法。【００１７】
（II-2）ミリセチンのグルコシル化が、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１またはそれ以上、好ましくは１または２以上５以下結合させることからなるものである、（II-1）記載の方法。【００１８】
（II-3）ミリセチンをグルコシル化して、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上、好ましくは１以上５以下結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物とする、（II-1）または（II-2）に記載する方法。【００１９】
（II-4）ミリセチンをグルコシル化して、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上、好ましくは１以上５以下結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物とする、（II-1）または（II-2）に記載する方法。【００２０】
（II-5）グルコシルミリセチンの混合物が、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物１００重量％中のモノグルコシド体、ジグルコシド体およびトリグルコシド体の総量が３０重量％以上である、（II-3）または（II-4）に記載する方法。【００２１】
（II-6）モノグルコシド体、ジグルコシド体およびトリグルコシド体の総量が３０〜８０重量％である、（II-5）に記載する方法。【００２２】
III．体内抗酸化剤
（III-1）ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１またはそれ以上、好ましくは１または２以上５以下結合してなるグルコシルミリセチンを有効成分とする、体内抗酸化剤。【００２３】
（III-2）グルコシルミリセチンが、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１またはそれ以上、好ましくは１または２以上５以下結合してなるものである、（III-1）に記載する体内抗酸化剤。【００２４】
（III-3）グルコシルミリセチンが、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上、好ましくは１以上５以下結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物である、（III-1）または（III-2）に記載する体内抗酸化剤。【００２５】
（III-4）グルコシルミリセチンが、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上、好ましくは１以上５以下結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物である、（III-1）または（III-2）に記載する体内抗酸化剤。【００２６】
（III-5）グルコシルミリセチンの混合物が、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物１００重量％中のモノグルコシド体、ジグルコシド体およびトリグルコシド体の総量が３０重量％以上である、（III-3）または（III-4）に記載する体内抗酸化剤。【００２７】
（III-6）モノグルコシド体、ジグルコシド体およびトリグルコシド体の総量が３０〜８０重量％である、（III-5）に記載する体内抗酸化剤。【００２８】
IV．経口組成物
（IV-1）（III-1）〜（III-6）のいずれかに記載する体内抗酸化剤を、体内で抗酸化作用を発揮する有効量含有する経口組成物。【００２９】
（IV-2）飲食物、経口医薬品、飼料または餌料である（IV-1）に記載する経口組成物。【００３０】
V．使用
（V-1）ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１またはそれ以上、好ましくは１または２以上５以下結合してなるグルコシルミリセチンの、体内抗酸化剤の製造のための使用。【００３１】
（V-2）グルコシルミリセチンが、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１またはそれ以上、好ましくは１または２以上５以下結合してなるものである、（V-1）に記載する使用。【００３２】
（V-3）グルコシルミリセチンが、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上、好ましくは１以上５以下結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物である、（V-1）または（V-2）に記載する使用。【００３３】
（V-4）グルコシルミリセチンが、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上、好ましくは１以上５以下結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物である、（V-1）または（V-2）に記載する使用。【００３４】
（V-5）グルコシルミリセチンの混合物が、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基が１以上結合してなる複数のグルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物１００重量％中のモノグルコシド体、ジグルコシド体およびトリグルコシド体の総量が３０重量％以上である、（V-3）または（V-4）に記載する使用。【００３５】
（V-6）モノグルコシド体、ジグルコシド体およびトリグルコシド体の総量が３０〜８０重量％である、（V-5）に記載する使用。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、ミリセチンをグルコシル化することによって、ミリセチンの体内吸収性を向上させることができる。斯くして当該グルコシルミリセチンは、ミリセチンの体内吸収性が向上することによって、体内においてミリセチンの抗酸化能をより有効に発揮することができる。またグルコシルミリセチンは、上記特徴に加えて、水に対する溶解性および水中での安定性が高いという特徴を有している。このためグルコシルミリセチンは水相溶性に優れており、食品、経口用医薬品、飼料または餌料などの素材として有効に利用することができる。【００３７】
これらのことから、本発明が提供するグルコシルミリセチンは、生体に対する酸化防止剤（体内抗酸化剤）として、また体内の抗酸化を効果とする食品、経口用医薬品、飼料または餌料などの有効成分として、有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
（Ｉ）ミリセチンの体内吸収性の向上方法
本発明の方法は、ミリセチンの体内吸収性を高める方法、具体的には経口投与によるミリセチンの体内吸収性を向上する方法である。【００３９】
当該方法はミリセチンをグルコシル化することによって実施することができる。【００４０】
グルコシル化するミリセチンの部位は特に制限されないが、具体的にはミリセチンの３位または３’位の酸素原子いずれか少なくとも一方である。好ましくはミリセチンの３位または３’位の酸素原子いずれか一方であり、より好ましくはミリセチンの３’位の酸素原子である。結合させるグルコシル基の数は、１またはそれ以上であれば特に制限されない。好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３である。【００４１】
ミリセチンをグルコシル化する方法は、特に制限されない。例えばミリセチンの３位の酸素原子にグルコシル基が一つ結合してなるミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドを調製する方法としては、まずミリセチンの７位と４’位の水酸基をベンジル基などの保護基で修飾した後、アセトブロモグルコース（テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド）を作用させる方法を挙げることができる（実施例１参照）。また、ミリセチンの３位の酸素原子にグルコシル基が複数個結合してなるミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシドを調製する方法としては、例えば上記の方法で得られるミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドに、糖転移酵素を作用させる方法を挙げることができる（実施例２参照）。【００４２】
一方、ミリセチンの３’位の酸素原子をグルコシル化する場合は、ミリセチンとα-グルコシル糖化合物を含有する溶液に糖転移酵素を作用させる方法を挙げることができる（実施例３参照）。ここで、α−グルコシル糖化合物としては、例えば、マルトース、アミロース、アミロペクチン、デキストリン、でんぷん、でんぷん液化物、シクロデキストリンなどを挙げることができる。また糖転移酵素としては、α−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.20）、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19）またはα−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）を挙げることができる。【００４３】
なお、ミリセチンをグルコシル化すると、単一組成からなるグルコシルミリセチンのほか、異なる組成を有する２種以上のグルコシルミリセチンの混合物を得ることもできる。本発明でいうグルコシルミリセチンは、特に言及しないかぎり、単一組成からなるグルコシルミリセチンならびに異なる組成を有する２種以上のグルコシルミリセチンの混合物を区別なく意味するものとする。【００４４】
例えば、グルコシルミリセチンの混合物には、下式（１）に示す、ミリセチンの３位の酸素原子に１以上、好ましくは１〜５のグルコシル基を有するミリセチン−３−Ｏ−グルコシド、具体的にはミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド、ミリセチン−３−Ｏ−ジグルコシド、ミリセチン−３−Ｏ−トリグルコシド、ミリセチン−３−Ｏ−テトラグルコシドおよびミリセチン−３−Ｏ−ペンタグルコシドからなる群から選択される２種以上のグルコシルミリセチンの混合物が含まれる。【００４５】
【化１】
2007105547.tif 000002
【００４６】
制限されないものの、かかるグルコシルミリセチン混合物として好ましくは、混合物１００重量％中にモノグルコシド体、ジグルコシド体及びトリグルコシド体を合計３０重量％以上の割合、好ましくは４０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、さらに好ましくは６０重量％以上の割合で含むものである。なお、上限は１００重量％であるが、好ましくは８０重量％である。この限りにおいてグルコシルミリセチン混合物中に含まれるモノグルコシド体、ジグルコシド体、トリグルコシド体、テトラグルコシド体、およびペンタグルコシド体の割合は制限されないが、実施例２の結果から、例えば下記の割合を例示することができる；(1)モノグルコシド体：２７〜３７重量部、好ましくは２９〜３５重量部、(2)ジグルコシド体：１５〜２１重量部、好ましくは１７〜２３重量部、(3)トリグルコシド体：１０〜２０重量部、好ましくは１２〜１８重量部、(4)テトラグルコシド体：６〜１６重量部、好ましくは８〜１４重量部、(5)ペンタグルコシド体：４〜１０重量部、好ましくは６〜１２重量部。【００４７】
なお、前述する方法（ミリセチンにアセトブロモグルコースを作用させる方法にてミリセチン−３−モノグルコシドを得た後、糖転移酵素を作用させる方法）によって調製されるミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシドは、ミリセチンの３位の酸素原子にグルコシル基が１、２、３、４および５個それぞれ結合した複数のグルコシルミリセチンの混合物である（実施例２）。単一組成からなるミリセチン−３−Ｏ−グルコシドは、上記混合物から、ゲルろ過または逆相クロマトグラフィーなどの各種方法により単離取得することができる。【００４８】
また、本発明が対象とするグルコシルミリセチンの混合物には、下式（２）に示す、ミリセチンの３’位の酸素原子に１以上、好ましくは１〜５のグルコシル基を有するミリセチン−３’−Ｏ−グルコシド、具体的にはミリセチン−３’−Ｏ−モノグルコシド、ミリセチン−３’−Ｏ−ジグルコシド、ミリセチン−３’−Ｏ−トリグルコシド、ミリセチン−３’−Ｏ−テトラグルコシドおよびミリセチン−３’−Ｏ−ペンタグルコシドからなる群から選択される２種以上のグルコシルミリセチンの混合物が含まれる。【００４９】
【化２】
2007105547.tif 000003
【００５０】
制限されないものの、かかるグルコシルミリセチン混合物として好ましくは、混合物１００重量％中にモノグルコシド体、ジグルコシド体及びトリグルコシド体を合計３０重量％以上の割合、好ましくは４０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、さらに好ましくは６０重量％以上の割合で含むものである。なお、上限は１００重量％であるが、好ましくは８０重量％である。この限りにおいてグルコシルミリセチン混合物中に含まれるモノグルコシド体、ジグルコシド体、トリグルコシド体、テトラグルコシド体、およびペンタグルコシド体の割合は制限されないが、実施例３の結果から、例えば下記の割合を例示することができる；(a)モノグルコシド体：１０〜１６重量部、好ましくは１２〜１８重量部、(b)ジグルコシド体：２９〜３５重量部、好ましくは３１〜３７重量部、(c)トリグルコシド体：１６〜２２重量部、好ましくは１８〜２４重量部、(d)テトラグルコシド体：３〜９重量部、好ましくは５〜１１重量部、(e)ペンタグルコシド体：０〜９重量部、好ましくは１〜７重量部。【００５１】
前述する方法（ミリセチンとα-グルコシル糖化合物を含有する溶液に糖転移酵素を作用させる方法）によって調製されるグルコシルミリセチンは、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１、２、３、４および５個それぞれ結合した複数のグルコシルミリセチンの混合物である（実施例３）。単一組成からなるミリセチン−３’−Ｏ−グルコシドは、上記混合物から、ゲルろ過または逆相クロマトグラフィーなどの各種方法により単離取得することができる。【００５２】
ミリセチンをグルコシル化することによって得られるグルコシルミリセチンは、後記実験例３および６に示すように、ミリセチンそのものを経口投与した場合よりも体内吸収性が高く、さらに加えて水溶性および水中での安定性が高いという特徴を備えている（実験例４および５）。中でも、上記式（１）で示されるミリセチンの３位の酸素原子に１、または１〜５のグルコシル基を有するミリセチン−３−Ｏ−グルコシド、ならびに上記式（２）で示されるミリセチンの３’位に１、または１〜５のグルコシル基を有するミリセチン−３’−Ｏ−グルコシドは、かかる特徴を顕著に備えている。特に好ましくは、ミリセチンの３’位に１、または１〜５のグルコシル基を有するミリセチン−３’−Ｏ−グルコシドである（実験例６参照）。【００５３】
（II）ミリセチンの体内抗酸化能の向上方法
本発明の方法は、ミリセチンの体内における抗酸化能を高める方法である。【００５４】
当該方法は、前述する体内吸収性の向上方法と同様に、ミリセチンをグルコシル化することによって実施することができる。【００５５】
ここでグルコシル化するミリセチンの部位は、前述する体内吸収性の向上方法と同様に、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子いずれか少なくとも一方を挙げることができる。好ましくはミリセチンの３位または３’位の酸素原子いずれか一方であり、より好ましくはミリセチンの３’位の酸素原子である。結合させるグルコシル基の数は、１またはそれ以上であれば特に制限されない。好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３である。また、本発明が対象とするグルコシルミリセチンもまた、前述するように、単一組成からなるグルコシルミリセチンであってもよいし、また異なる組成を有する２種以上のグルコシルミリセチンの混合物であってもよい。具体的には、前述の（Ｉ）体内吸収性の向上方法に記載するグルコシルミリセチンを同様に用いることができる。【００５６】
ミリセチンをグルコシル化することによって得られるグルコシルミリセチンは、後記実験例に示すように、ミリセチンそのものよりも体内での抗酸化能が高く（実験例２）、中でも、上記式（１）で示されるミリセチンの３位の酸素原子に１のグルコシル基を有するミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド、ならびに上記式（２）で示されるミリセチンの３’位に１〜５のグルコシル基を有するミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシドは、かかる特徴を有意に備えている。さらに前述するように、ミリセチンをグルコシル化することによって、ミリセチンそのものを経口投与する場合よりも、ミリセチンの体内吸収性が顕著に増加する（実験例３および６）。このことから、グルコシルミリセチンを経口的に用いることによって、体内でのミリセチンの抗酸化作用をより有効に発揮させることが可能になることがわかる。【００５７】
（III）体内抗酸化剤
本発明が提供する体内抗酸化剤は、上記方法によってミリセチンの体内吸収性が高められ、その結果、体内において有効に抗酸化能を発揮するグルコシルミリセチンを有効成分とするものである。【００５８】
ここでグルコシルミリセチンは、前述する（１）体内吸収性の向上方法、および（２）体内抗酸化能の向上方法に記載するグルコシルミリセチンを同様に用いることができる。【００５９】
かかるグルコシルミリセチンは、ミリセチンそのものを経口投与する場合に比べて体内吸収性に優れ、またミリセチンに比して体内における抗酸化能、特に体内における脂質の酸化を抑制する効果に優れている。このため、グルコシルミリセチンは、体内抗酸化剤、特に体内における脂質の酸化を予防する抗酸化剤として有効に用いることができる。【００６０】
この目的のため、グルコシルミリセチンは、水、アルコール（例えば、エタノール）、その他の溶媒に溶解または分散した液体状態（乳液、溶液、懸濁液、シロップ）、または公知の方法により調製、成形した固体状態（散剤状、粉末状、顆粒状、錠剤状、丸剤状、カプセル剤状）を有する経口的に服用または摂取される各種の製剤形態とすることができる。【００６１】
これらの製剤は、前述するグルコシルミリセチンに加えて、その製剤形態に応じて、薬学的または食品として許容される担体や添加剤が配合されていてもよい。例えば、固体状態の製剤を調製する場合の賦形剤としては、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ゼラチン、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、合成ならびに天然のケイ酸アルミニウム、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母が例示される。また、液体状態の製剤を調製する場合の賦形剤としては、水、グリセリン、プロピレングリコール、単シロップ、エタノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール等が例示される。また、これらの製剤は、所望によりクエン酸、リン酸、リンゴ酸又はその塩類などの安定化剤；スクラロース、アセスルファムカリウムなどの高甘味度甘味料やショ糖、果糖などの甘味剤；アルコール類、グリセリンなどの防腐剤；粘滑剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤及び着色剤のような通常の添加剤と混合されていてもよく、常法又はその他の適切な方法で、散剤、粉剤、錠剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、チュアブル、液剤、シロップ剤等の経口投与用形態に製造することができる。【００６２】
本発明の体内抗酸化剤中に含まれるグルコシルミリセチンの量は、当該抗酸化剤を摂取した場合に、生体内において抗酸化作用を発揮する有効量であればよく、特に制限されるものではない。具体的には、体内抗酸化剤の１日投与用量中に含まれるグルコシルミリセチンの量として、ミリセチンの量に換算して１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１ｇ、より好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇの割合を挙げることができる。この範囲で使用されるものであれば、体内抗酸化剤１００重量％中に含まれるグルコシルミリセチンの割合は特に制限されず、０．０５〜１００重量％、好ましくは０．５〜８０重量％の範囲から、適宜選択することができる。【００６３】
本発明の体内抗酸化剤は、有効成分とするグルコシルミリセチンによって得られる、ミリセチンの高い体内吸収性に基づいて、生体内で抗酸化作用を有効に発揮することができる。このため本発明の体内抗酸化剤は、体内における酸化、特に脂質の酸化を防止し、酸化によって生じる種々の疾患や不都合な生理現象を予防または改善することが可能となる。具体的には、本発明の体内抗酸化剤は、その経口摂取により生体内で有効に抗酸化作用を発揮するため、例えば細胞の老化、炎症および発癌等の原因となる過酸化物から生体を防御する効果を得ることができる。【００６４】
（IV）経口組成物
本発明が提供する経口組成物は、前述する体内抗酸化剤を有効成分として含有するものである。【００６５】
本発明の経口組成物は、前述する体内抗酸化剤に含まれるグルコシルミリセチンが備える、ミリセチンの高い体内吸収性に基づいて、生体内で抗酸化作用を有効に発揮することができる。このため本発明の経口組成物は、生体の酸化、特に体内における脂質の酸化を防止し、酸化によって生じる種々の疾患や不都合な生体現象を予防または改善することが可能となる。具体的には、本発明の経口組成物は、その経口摂取により、生体内で有効に抗酸化作用を発揮するため、例えば細胞の老化、炎症および発癌等の原因となる過酸化物から生体を防御する効果を奏することができる。【００６６】
かかる目的で使用される経口組成物としては、経口用の医薬品（錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤、エキス剤等）、飲食物、飼料、および餌料（ドッグフードやキャットフード等の各種ペットフードを含む）を挙げることができる。【００６７】
なお、本発明で対象とする飲食物には、体内における酸化を予防し、過酸化物によって生じる不都合な状態、例えば細胞の老化、炎症または発癌等を予防または解消することを目的とした食品、特に健康食品が含まれる。【００６８】
ここで健康食品とは、通常の食品より積極的な意味での保健、健康維持・増進等の目的をもった食品をいう。本発明の経口組成物は、食品として許容される担体や添加剤を用いて前述するような製剤形態〔散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、乳剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤、シロップ剤等の経口投与用形態〕に調製して、体内酸化の予防を目的とするサプリメントとして提供することができる。また、一般の食品に添加することにより（言い換えれば、食品の原材料の一つとして使用することにより）、体内酸化の予防を目的・機能とする食品、特に健康食品（例えば、機能性食品、特定保健用食品）の調製に用いることができる。なお、特定保健用食品（条件付き特定保健用食品を含む）は、その包装容器などに、例えば体内酸化を予防または解消することを意味する表示を付するなど、食品の機能・効果を示すことが可能な食品であり、他の食品との差別化を図ることができる点で好適な態様である。【００６９】
食品の種類としては、特に制限されないが、(1)乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜・果実飲料、粉末飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、茶飲料、乳飲料、豆乳飲料、ココア、スポーツ飲料、サプリメント飲料、青汁などの飲料；(2)カスタードプリン、ミルクプリン、スフレプリン、果汁入りプリン等のプリン類、ゼリー、及びババロア等のデザート類；(3)アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、ミルクアイスクリーム、果汁入りアイスクリーム及びソフトクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、氷菓等の冷菓類；(4)チューインガムや風船ガム等のガム類（板ガム、糖衣状粒ガム）；(5)板チョコ、マーブルチョコレート等のコーティングチョコレートの他、イチゴチョコレート、ブルーベリーチョコレート及びメロンチョコレート等の風味を付加したチョコレート等のチョコレート類；（6）ハードキャンディー（ボンボン、バターボール、マーブル等を含む）、ソフトキャンディー（キャラメル、ヌガー、グミキャンディー、マシュマロ等を含む）、ドロップ、タフィ等の飴類；(7)ハードビスケット、クッキー、おかき、煎餅等の焼き菓子類（以上、(2)〜(7)を総合して菓子という）；（8）ケチャップ、ソース、醤油、ドレッシング、みそ、砂糖、塩、マヨネーズ、酢、黒酢等の調味料；（9）ハム、ソーセージ、ベーコン、冷凍ハンバーグ等の畜肉製品類；（10）マウススプレー等の口内薬剤、トローチ、嚥下補助食品、ドリンク剤、顆粒剤、散剤、錠剤等の医薬部外品、健康補助食品類；（11）マーマレード、ジャム、マーガリン、バター、フラワーペースト、ピーナツペーストなどのペースト類；（12）魚肉ハム、魚肉ソーセージ、蒲鉾、ちくわ、はんぺん、てんぷら等の魚介類練り製品類；（13）レトルトカレー、レトルトスープ、レトルトシチュー等のレトルト製品類；（14）うどん、そば、中華そば、スパゲッティ、マカロニ、乾麺、そうめん、インスタントラーメン等の各種麺類；(15)赤ワイン等の果実酒、リキュール、チュウハイ、炭酸アルコール飲料等のアルコール類；（16）豆腐、油揚げ等の大豆加工食品；（17）漬物、チーズ、ヨーグルト、テンペ、納豆等の各種発酵食品；を挙げることができる。【００７０】
中でも、継続的に服用するという観点から、各種の製剤形態を有するサプリメント；清涼飲料や栄養飲料などの飲料を好適に例示することができる。【００７１】
本発明の経口組成物に含まれる体内抗酸化剤の配合量は、当該経口組成物を摂取した場合に生体内において抗酸化作用を発揮する有効量であればよく、特に制限されるものではない。具体的には、経口組成物の１日投与用量中に、ミリセチンの量に換算して１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１ｇ、より好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇを挙げることができる。この範囲で使用されるものであれば、経口組成物中に含まれるグルコシルミリセチンの割合は特に制限されず、０．０５〜１００重量％、好ましくは０．５〜８０重量％の範囲から、適宜選択することができる。【００７２】
本発明の経口組成物は、上記グルコシルミリセチンに加えて、他の抗酸化剤、例えばトコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、ＢＨＡ、ＢＨＴなどを含んでいてもよい。また、ミリセチングルコシル化物に加えて、他の生体抗酸化剤、例えばルチン、ケルセチン、酵素処理イソクエルシトリン、モリン、ミリセチンなどのフラボノイド；ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＥ（トコフェロール）などのビタミン類；β-カロテン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、リコピン、ルテインなどのカロテノイド；セレンなどのミネラル；コエンザイムＱ１０、α-リポ酸などの補酵素；クルクミン、クロロゲン酸、タンニンなどのポリフェノール類；ローズマリー抽出物、ラフマ抽出物などの天然抽出物などを含んでいてもよい。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に記載のない限り「部」とは「重量部」を、「％」とは「重量％」を意味するものとする。【００７４】
実施例１  ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドの合成
図１に示すスキームに従って、ミリセチンの３位の酸素原子にグルコシル基が１個結合したミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド（化合物５）を合成した。【００７５】
（１）アセトブロモグルコースの合成
ピリジン７ｍＬ中で、グルコース１.５ｇと無水酢酸５ｍＬを反応させ、全ての水酸基をアセチル化した。次いで再結晶により精製した主生成物３.１ｇのうち４００ｍｇを、ジクロロメタン４ｍＬ中で３０％臭化水素／酢酸４ｍＬと反応させ、グルコース１位をブロム化し、アセトブロモグルコース（２,３,４,６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド）（化合物１）を４４３ｍｇ得た。なお、当該化合物１は、例えばワコーケミカル社から市販の試薬として購入も可能である。【００７６】
（２）ミリセチン−３−モノグルコシド（化合物５）の合成
ピリジン２０ｍＬ中で、ミリセチン（化合物２）３.１ｇと無水酢酸１０ｍＬを反応させ、全ての水酸基をアセチル化した。晶出した結晶（乾燥物として４.２ｇ）を濾取し、アセトン１００ｍＬ中にてベンジルクロライド６.６ｍＬ、炭酸カリウム１６.５ｇ、ヨウ化カリウム６８０ｍｇと還流し、７位と４'位にベンジル化した。シリカゲルカラムにて精製した主生成物２.０ｇを、テトラヒドロフラン２５ｍＬ／メタノール２５ｍＬ中で、１０％苛性ソーダ水溶液１８.６ｍＬを加えて反応させ、脱アセチル化した（化合物３）。【００７７】
シリカゲルカラムにて精製した主生成物（化合物３）１.２ｇのうち３６１.５ｍｇを、０.１５Ｍ炭酸カリウム５０ｍＬ／クロロホルム５０ｍＬ中にてＴＢＡＢ(テトラブチルアンモニウムブロマイド)３６１.５ｍｇ存在下で、４４３.０ｍｇの化合物１と５０℃にて反応させ、グルコシル化した（化合物４）。これをシリカゲルカラムにて精製し、主生成物（化合物４）１８１.９ｍｇを得た。【００７８】
得られた主生成物（化合物４）１８１.９ｍｇを、メタノール６.０ｍＬ中にて０.５Ｍナトリウムメトキシドと反応させ、脱アセチル化した。シリカゲルカラムにて精製した主生成物１８１.８ｍｇを、エタノール１８ｍＬ中にて１０％パラジウムカーボン（ミクロスパーテル４杯分）を触媒として水素接触還元し、脱ベンジル化した。パラジウムカーボンをろ過除去し、ろ液を減圧濃縮後、濃縮液をゲル濾過にて精製し、首題のミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド（化合物５）７２.１ｍｇを取得した。【００７９】
（３）同定
化合物４の二次元ＮＭＲを測定したところ、ＨＭＢＣスペクトルにおいてグルコースのアノマープロトンよりアグリコン部の３位炭素へ相関があることが確認された。また1H-NMRにおけるアノマープロトンのスピン結合定数が７.６Ｈｚであることから糖はβ体であることがわかった。さらに脱保護を行なって得られた化合物５は、ＮＭＲにおいてアセチル基およびベンジル基由来のシグナルの消失が確認された。化合物５について、さらに各種二次元ＮＭＲスペクトルを測定して1H, 13C-NMRの帰属を行なったところ（Methanol-d4使用）、表１に示す結果を得た。この結果は、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド（myricetin 3-O-monoglucoside）の文献値とほぼ一致していた。斯くして上記化合物５がミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドであることを確認した。【００８０】
【表１】
2007105547.tif 000004
【００８１】
実施例２    ミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシド（ｎ＝１〜５の混合物）の製造
・  製造
実施例１で調製したミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドを原料として、ミリセチンの３位の酸素原子にグルコシル基が１〜５個結合してなる、下式のミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシドを製造した。【００８２】
【化３】
2007105547.tif 000005
【００８３】
具体的には、まずデキストリン（ＤＥ６〜８）２０ｇを５５℃の水６００ｍＬに溶解後、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド１００ｍｇを添加した。ＮａＯＨにてｐＨ９とし、溶解後すぐに硫酸水溶液にてｐＨ７とした。糖転移酵素であるシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（コンチザイム（天野エンザイム株式会社製））８０００Ｕｎｉｔ相当を加え、５５℃にて６時間攪拌反応した。反応液を加熱して酵素を失活させ、ろ過した。ろ液を、合成吸着樹脂ＳＰ２０７（三菱化学株式会社製）を充填したカラムに通液して溶液中のグルコシルミリセチンを吸着させ、次いで水洗浄して糖類、酵素、塩類などを除去した。次いで、エタノール水溶液を通液し、グルコシルミリセチン画分を採取し、減圧濃縮し、ミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシドの乾燥物約１ｇを得た。上記反応を何回か繰り返して得られた乾燥物約１.５ｇ（原料ミリセチン−３−モノグルコシド１５０ｍｇ由来）をSephadex LH-20を充填したカラムによってゲルろ過することにより、除去しきれていなかった糖類などを除き、ミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシドの乾燥物８０.７ｍｇを得た。【００８４】
（２）ＬＣ／ＭＳ分析
上記で得られた乾燥物について、下記ＬＣ条件にてＬＣ/ＭＳ分析を行なった。
＜ＬＣ／ＭＳ分析時のＬＣ条件＞
カラム  ：XBridge  ShieldRP18 2.1×150mm
移動相  ：1%ギ酸／アセトニトリル／水（10／12／78）
UV測定波長  ：351nm
流速  ：0.2mL／min。【００８５】
その結果得られたピーク（低極性側からＧ２、Ｇ１、Ｇ３〜５とした）について、ＥＳＩ−ＭＳ（イオン化モードはポジティブ）により検出された分子量関連イオンピークを以下に示す。
＜分子量関連イオンピーク＞
Ｇ１  ｍ／ｚ   481.4 [M+H]+
Ｇ２  ｍ／ｚ   643.5 [M+H]+
Ｇ３  ｍ／ｚ   805.6 [M+H]+
Ｇ４  ｍ／ｚ   967.9 [M+H]+
Ｇ５  ｍ／ｚ  1129.9 [M+H]+。【００８６】
（３）ＨＰＬＣ分析
また得られたミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシドの乾燥物を、下記条件のＨＰＬＣに供した。そのクロマトグラムを、図２に示す。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム  ：YMC-Pack ODS-AQ (4.6×250mm)
移動相  ：0.1％リン酸水溶液／アセトニトリル（85／15）
UV測定波長  ：351nm
流速  ：1.0mL／min
カラムオーブン  ：30℃。【００８７】
得られた分子量関連イオンピーク及びＨＰＬＣの結果（図２）から、上記で得られたミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシドは、表２に示すように、ミリセチンの３位の酸素原子にグルコシル基が脱水縮合により１〜５分子付加したＧ１〜Ｇ５の混合物であることが確認された。表２に、ミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシドに含まれるＧ１〜Ｇ５の組成比（重量％）を併せて示す。【００８８】
【表２】
2007105547.tif 000006
【００８９】
なお、上記Ｇ１〜Ｇ５として示される個々のミリセチン−３−Ｏ−グルコシドは、前記で得られたミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）を、例えば上記条件のＨＰＬＣに供し、該当するピーク画分を分取することによって、単離取得することができる。ただし、この方法に限らず、各ミリセチン−３−Ｏ−グルコシドは、各種クロマトグラフィーにより分取することが可能である。【００９０】
実施例３  ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（ｎ＝１〜５の混合物）の製造
ミリセチンを原料として、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が１〜５個結合してなる、下式のミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（ｎ＝１〜５）を製造した。【００９１】
【化４】
2007105547.tif 000007
【００９２】
（１）ミリセチンとグルコシルミリセチン混合物の製造
まず、デキストリン（ＤＥ６〜８）３０ｇを６０℃の水９００ｍＬに溶解後、１％ミリセチン／メタノール溶液１００ｍＬを滴下した。直ちに糖転移酵素であるα−アミラーゼ製剤〔アミラーゼＡＤ「アマノ」１（天野エンザイム株式会社製）〕５０００Ｕｎｉｔ加え、６０℃を維持し攪拌しつつ嫌気下で１５時間反応させた。反応液を加熱して酵素を失活させ、ろ過した。ろ液を、合成吸着樹脂ＳＰ２０７（三菱化学株式会社製）を充填したカラムに通液して溶液中のグルコシルミリセチンと未反応ミリセチンとを吸着させ、次いで水洗浄して糖類、酵素、塩類などを除去した。次いで、エタノール水溶液を通液し、未反応ミリセチンとグルコシルミリセチンの混合画分を採取し、減圧濃縮し、ミリセチンとグルコシルミリセチンの混合物（乾燥物）１.５ｇを得た（乾燥物１とする）。【００９３】
（２）ＬＣ/ＭＳ分析
この乾燥物１について、下記ＬＣ条件にてＬＣ/ＭＳ分析を行なった。【００９４】
＜ＬＣ／ＭＳ分析時のＬＣ条件＞
カラム  ：L−column ODS-L 2.1×150mm
移動相  ：0.05％TFA／アセトニトリル（85／15）
UV測定波長  ：351nm
流速  ：0.15mL／min。【００９５】
その結果、ミリセチン以外のピーク（低極性側からＧ１〜５とした）において、ＥＳＩ−ＭＳ（イオン化モードはポジティブ）により検出された分子量関連イオンピークは以下の通りであった。【００９６】
＜分子量関連イオンピーク＞
Ｇ１  ｍ／ｚ 480.9 [M+H]+
Ｇ２  ｍ／ｚ 642.9 [M+H]+
Ｇ３  ｍ／ｚ 804.9 [M+H]+
Ｇ４  ｍ／ｚ 967.2 [M+H]+
Ｇ５  ｍ／ｚ 1128.8 [M+H]+。【００９７】
（３）ＨＰＬＣ分析
上記で得られたミリセチンとグルコシルミリセチンの混合物（乾燥物１）を下記条件のＨＰＬＣ分析に供した。そのクロマトグラムを、図３に示す。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム  ：YMC-Pack ODS-AQ (4.6×250mm)
移動相  ：0.1％リン酸水溶液／アセトニトリル（80／20）
UV測定波長  ：368nm
流速  ：1.0mL／min
カラムオーブン  ：30℃。【００９８】
これらの結果から、（１）で得られた乾燥物１は、ミリセチンとミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基が脱水縮合により１〜５分子付加したミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５）の混合物であることが確認された。【００９９】
（４）ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）の製造と同定
この乾燥物１（１.５ｇ）をSephadex LH20を充填したオープンカラムを用いてゲルろ過することによりミリセチンを除去し、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）の画分を減圧濃縮し、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）の乾燥物０.５ｇを得た（これを「乾燥物２」とする）。この乾燥物２についてさらにゲルろ過を繰り返し、５成分（Ｇ１〜Ｇ５）のミリセチン−３’−Ｏ−グルコシドをおのおの単離した。【０１００】
これらのうち、極性の低い順から２成分（Ｇ１，Ｇ２）についてプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H-NMR)、カーボン核磁気共鳴スペクトル(13C-NMR)、H-H COSY、インバース異種核相関（HMQC、HMBC）を測定して、構造決定を行ったところ、Ｇ１とＧ２の両成分ともに、ＨＭＢＣスペクトルにおいてグルコースのアノマープロトンよりアグリコン部の３'位炭素へ相関があることが確認された。さらにＧ２においては、オリゴグルコシド部の一方のグルコシル基のアノマープロトンより他方のグルコシル基４位炭素へ相関があることが確認された。また1H-NMRにおけるアノマープロトンのスピン結合定数が3.4Hz（Ｇ１）、3.4Ｈｚ（Ｇ２、アグリコン部結合グルコシル基）、4.1Ｈｚ（Ｇ２、末端グルコシル基）であることから糖はα体であった。Ｇ１およびＧ２の1H-NMRと13C-NMRの同定データをそれぞれ表３及び表４に示す。【０１０１】
以上のことから、Ｇ１はミリセチン３’−Ｏ−モノグルコシド（myricetin-3’-O-α-monoglucoside）であり、Ｇ２はミリセチン３’−Ｏ−ジグルコシド（myricetin-3’-O-α-glucosyl-(1→4)-α-glucoside）であることが判明した。【０１０２】
【表３】
2007105547.tif 000008
【０１０３】
【表４】
2007105547.tif 000009
【０１０４】
ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（乾燥物２）に含まれるＧ１〜Ｇ５の組成比（重量％）を表５に示す。【０１０５】
【表５】
2007105547.tif 000010
【０１０６】
なお、上記Ｇ１〜Ｇ５として示される個々のミリセチン−３’−Ｏ−グルコシドは、前記で得られたミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（乾燥物２）を、例えば上記条件のＨＰＬＣに供し、該当するピーク画分を分取することによって、単離取得することができる。ただし、この方法に限られず、各ミリセチン−３’−Ｏ−グルコシドは、その他の各種クロマトグラフィーにより分取することが可能である。【０１０７】
実施例４  ミリセチン−３’− Ｏ−モノグルコシドの製造
実施例３と同様の方法で得たミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（乾燥物２）を、Sephadex LH-20を充填したカラムを用いてゲルろ過することにより、ミリセチン−３’− Ｏ−モノグルコシドを単離した。【０１０８】
比較例１  ミリシトリンの製造
ヤマモモ乾燥葉を原料としてミリシトリンを調製した。なお、ミリシトリンは、下式に示すように、ミリセチンの３位の酸素原子にラムノシル基が結合してなる、ラムノシルミリセチン（ミリセチン−３−Ｏ−ラムノシド）である。【０１０９】
【化５】
2007105547.tif 000011
【０１１０】
具体的には、ヤマモモ乾燥葉（小枝を少し含む）２０００ｇを粉砕し、メタノール1０Ｌを加えて６０℃に維持しながら４時間攪拌して抽出した。この混合物を室温まで冷却後、吸引濾過した。残渣にメタノール１５００ｍＬを加えて洗浄し、濾過液と洗浄液を合わせた。この溶液を、ロータリーエバポレーターを用いて１０００ｍＬまで減圧濃縮した。黒緑色を呈した濃縮液を分液ロートに移し、水１５００ｍＬを加えた後エチルエーテルで３回洗浄した。水層を減圧濃縮し、濃縮物にメタノールを加えて晶析し、黄褐色の析出物を得た。これをメタノールから再結晶を行うことにより、ミリシトリン２５ｇを得た。【０１１１】
比較例２  ミリシトリンガラクトシドの製造
比較例１で調製したミリシトリンを原料として、ミリシトリンガラクトシドを調製した。なお、当該ミリシトリンガラクトシドは、下式に示すように、ミリシトリンとミリシトリンのラムノシル基にさらにガラクトシル基が１〜３個結合してなるガラクトシルミリシトリン（ｎ＝１〜３）の混合物である。【０１１２】
【化６】
2007105547.tif 000012
【０１１３】
具体的には、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）１００ｍＬに乳糖２５０ｇを加えて６０℃に加熱して溶解し、この溶液に、ミリシトリン２０ｇを含有するジメチルスルホキシド液１００ｍＬとバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製）（酵素力価２０，０００Ｕｎｉｔ／ｇ）１ｇを加えて６０℃で４時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、得られた反応液に水１Ｌを添加して希釈し、これをスチレン−ジビニールベンゼン共重合体からなるポーラスポリマー７００ｍＬを充填したカラムに１時間かけて通液し、次いでイオン交換水５Ｌを１.５時間かけて通液した。次いで、４０容量％メタノール水溶液２Ｌを１時間かけて通液してカラム吸着物を溶出した。溶出したメタノール液を回収して濃縮し、黄色の固形物２５ｇを取得した。当該固形物はミリシトリンとガラクトシルミリシトリン（ｎ＝１〜３）を５０：５０（モル比）の割合で含む混合物であることを、下記条件のＨＰＬＣ分析により確認した。【０１１４】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム  ：YMC-Pack  ODS-AQ 4.5×250mm
カラムオーブン温度  ：40℃
移動相  ：0.１％リン酸水溶液／アセトニトリル（85／15）
UV測定波長  ：351nm
流速  ：1.0mL／min。【０１１５】
なお、各ガラクトシルミリシトリン（ｎ＝１〜３）の同定は、下記条件のＬＣ／ＭＳ分析にて行った。【０１１６】
＜ＬＣ／ＭＳ分析時のＬＣ条件＞
カラム  ：L−column ODS-L 2.1×150mm
移動相  ：0.05％TFA／アセトニトリル（85／15）
UV測定波長  ：351nm
流速  ：0.15mL／min。【０１１７】
UV351nmにて検出されたピークの保持時間と、各ピークにおいてESI-MSにより検出された分子量関連イオンピークを以下に示す（イオン化モードはポジティブ）。
（ａ）Ｇ３     9.55min      ｍ／ｚ 951.01 [M+H]+
（ｂ）Ｇ２    10.87min      ｍ／ｚ 788.95 [M+H]+
（ｃ）Ｇ１    11.68min      ｍ／ｚ 626.94 [M+H]+。【０１１８】
比較例３    ミリシトリングルコシドの製造
比較例１で調製したミリシトリンを原料として、ミリシトリングルコシドを調製した。なお、ここでミリシトリングルコシドは、下式に示すように、ミリシトリンとミリシトリンのラムノシル基にさらにグルコシル基が１〜５個結合してなるグルコシルミリシトリン（ｎ＝１〜３）の混合物である。【０１１９】
【化７】
2007105547.tif 000013
【０１２０】
具体的には、水１Ｌ（温度６０℃）にミリシトリン５ｇを分散し、苛性ソーダ水溶液を滴下することにより溶解した後、希硫酸にてｐＨ７とした液に、デキストリン１００ｇを加えて溶解した。これにBacillus属菌株（受託番号FERM P-13199）由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（酵素力価１０００Ｕｎｉｔ相当量）を添加し、６０℃にて２４時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、得られた反応液をスチレン−ジビニールベンゼン共重合体からなるポーラスポリマー１００ｍＬを充填したカラムに２時間かけて通液し、次いで当該カラムにイオン交換水１Ｌを２時間かけて通液した。さらに、このカラムに６０容量％メタノール水溶液２Ｌを１時間かけて通液して、カラム吸着物を溶出した。溶出したメタノール水溶液を回収して濃縮し、黄色の固形物７ｇを得た。次いで、この固形物を少量の水に溶解し、Sephadex LH-20（pharmacia社製）２００ｍＬを充填したカラムに通液した。次いでこのカラムに５０容量％メタノール水溶液を溶出溶媒として用いて通液し、ミリシトリン画分とグルコシルミリシトリン画分とに分画した。比較例２で使用した同一条件のＨＰＬＣ分析により、グルコシルミリシトリン画分は、ミリシトリンとグルコシルミリシトリンを１２：８８（モル比）の割合で含む混合物であることを確認した。得られたグルコシルミリシトリン画分を減圧濃縮し、２.４ｇを得た。【０１２１】
なお、各グルコシルミリシトリンの同定は、比較例２で使用した同一条件のＬＣ／ＭＳ分析にて行った。【０１２２】
UV351nmにて検出されたピークの保持時間と、各ピークにおいてESI-MSにより検出された分子量関連イオンピークを以下に示す（イオン化モードはポジティブ）。
（ａ）Ｇ３     9.38min      ｍ／ｚ 950.99 [M+H]+
（ｂ）Ｇ２    10.75min      ｍ／ｚ 788.96 [M+H]+
（ｃ）Ｇ１    11.80min      ｍ／ｚ 626.91 [M+H]+ 。【０１２３】
実験例１  抗酸化作用の評価
本発明のグルコシルミリセチンについて、下記の方法によりＤＰＰＨラジカル捕捉活性を測定して抗酸化作用を評価した。
＜ＤＰＰＨラジカル捕捉活性の測定＞
ＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）は５１７ｎｍに極大吸収を持つ紫色の安定ラジカルであり、水素を得ることにより無色のヒドラジンになる。この呈色反応を利用して実施例１で調製したミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドおよび実施例２３で調製したミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシドのＤＰＰＨラジカル捕捉活性を測定した。【０１２４】
具体的には、ミリセチン、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド（実施例１）、およびミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（実施例３）のそれぞれについて、各濃度（０μＭ、０.６μＭ、３μＭ、６μＭ、１２μＭ）のメタノール溶液を調製し、試料溶液とした。３００μＭのＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）メタノール溶液２ｍＬに各試料溶液２ｍＬを加え、攪拌混合後、３０分間、３７℃、遮光下にて静置した。ＤＰＰＨラジカルの退色度をラジカル捕捉の指標とし、分光光度計にて波長５１７ｎｍにおける吸光度を測定し、次式によりＤＰＰＨラジカル捕捉活性（％）を求めた。試料濃度０μＭのメタノール溶液とＤＰＰＨメタノール溶液を混合したものをコントロールとした。【０１２５】
【数１】
2007105547.tif 000014
【０１２６】
結果を図４に示す。図４に示すように、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドはミリセチンと同等の抗酸化作用を有していたが、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（ｎ＝１〜５）はミリセチンよりも抗酸化作用が若干低下する傾向が見られた。しかし、ＤＰＰＨラジカル捕捉活性は、被験試料の単なる抗酸化能を評価するものであり、生体における抗酸化作用を正当に評価するものではない。そこでミリセチンのグルコシル化体の、生体における抗酸化作用を評価するために、実験例２（ＬＤＬの酸化抑制効果の評価）を行った。【０１２７】
実験例２    生体に対する抗酸化作用の評価
実施例１および実施例３でそれぞれ調製したミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドおよびミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）について、チオバルビツール酸法（ＴＢＡ法）に従ってＬＤＬ（低密度リポ蛋白）の酸化抑制効果を評価した。【０１２８】
なお、ＴＢＡ法は生体組織中の過酸化脂質を高感度に測定するのに適した方法であり、酸性条件下で試料をチオバルビツール酸（ＴＢＡ）と加熱することで、試料から遊離するＴＢＡ反応性物質（ＴＢＡＲＳ）とＴＢＡの反応で生じる赤色色素を定量することにより脂質過酸化度を測定するものである。すなわち、ＴＢＡＲＳの数値が高いほど過酸化脂質の生成が多く、逆にＴＢＡＲＳの数値が低いほど過酸化脂質の生成が少ないことを示す。ＴＢＡ法によって測定されるＴＢＡＲＳは、脂質ヒドロペルオキシド、マロンジアルデヒド、アルデヒドとタンパク質などとの反応物であり、ＴＢＡ法はこれらを包括的に測定するものである。【０１２９】
＜ＬＤＬ酸化抑制効果の測定＞
ミリセチン、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド（実施例１）、およびミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（実施例３）を、それぞれ試験管に１０μＭとなるように調製し、ヒト由来ＬＤＬ（ＳＩＧＭＡ社製、終濃度１００μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）を添加してよく混合した。次いで、ＣｕＳＯ４（終濃度１２μＭ）を上記試料液に添加して３７℃で酸化を誘導し、１８０分間インキュベート後の脂質過酸化度（ＴＢＡＲＳ）をＴＢＡ法により測定した。【０１３０】
上記酸化誘導後の反応液を０.５ｍＬ採取し、これに３５％ＴＣＡ（trichloro aceticacid）溶液を０.５ｍＬ、０.５％ＴＢＡ溶液を１.０ｍＬ、０.２％ＢＨＴ（butylated hydroxytoluene）溶液０.０５ｍＬ、０.５％ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）溶液を０.０５ｍＬ加えた後、１００℃で３０分加熱した。冷却後、酢酸０.５ｍＬ、クロロホルム１.０ｍＬを加えて攪拌後、遠心分離（３,０００ｒｐｍ×１０分）を行い、上層の吸光度を５３２ｎｍで測定して、過酸化脂質量を求めた。結果は試料無添加（リン酸緩衝液）のものをＢｌａｎｋと称し、過酸化度（ＴＢＡＲＳ）１００％として表した。【０１３１】
結果を図５に示す。図５に示すように、実施例１で調製したミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド、および実施例３で調製したミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５）はミリセチンよりも高いＬＤＬ酸化抑制作用、すなわち生体抗酸化作用（生体内過酸化脂質に対する抗酸化作用）を有することが確認された。【０１３２】
実験例３    体内吸収性の評価
ミリセチン、並びにミリセチンの各種配糖体、具体的にはミリセチンの各種配糖体として、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド（実施例１）、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（実施例３）、ミリシトリン（ミリセチン−３−Ｏ−ラムノシド）（比較例１）、ミリシトリンガラクトシド（比較例２）、およびミリシトリングルコシド（比較例３）について体内吸収性を対比評価した。なお、ミリセチン配糖体を摂取すると、血中への吸収前後でミリセチンに結合している糖がはずれてミリセチンになる。その後、あるいは同時にミリセチンは硫酸抱合やグルクロン酸抱合などを受けてミリセチン抱合体となる。そこで、ここで体内吸収性の評価は、上記の被験物質を、おのおの日を変えて、同一人に絶食時に経口投与し、一定時間経過後に血液中に存在する各種ミリセチン抱合体の総濃度を測定することにより行った。【０１３３】
＜血漿中のミリセチン抱合体濃度の測定＞
前日の２１時以降絶食とし、翌日朝９時に絶食条件にて上記被験物質をオブラートに包み、水と共に経口摂取した。なお、１回あたり１種類の被験物質を摂取した。摂取量はモル数をそろえ、０.２１ｍｍｏｌとした。ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（実施例３）、ミリシトリンガラクトシド（比較例２）、およびミリシトリングルコシド（比較例３）は、いずれも混合物である。このため、ミリシトリンガラクトシドおよびミリシトリングルコシドは、純度既知のミリシトリンを標準物質とし、ミリシトリンと各ガラクトシドまたは各ガラクトシドの分子量とＨＰＬＣにおける各ピーク面積値と比率から平均分子量を設定した。またミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシドについては、純度既知のミリセチン−３’-モノグルコシドを標準物質とし、各グルコシドの分子量とＨＰＬＣにおける各ピーク面積値と比率から、平均分子量を設定した（モル数は、重量／分子量にて算出した）。【０１３４】
各被験物質について、摂取直前、摂取後１時間および３時間後に、それぞれ血液を採取して、これをＨＰＬＣ分析にかけて各種ミリセチン抱合体の総濃度を測定した。【０１３５】
＜摂取被験物質とその摂取量＞
(1)ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド  １００ｍｇ（０.２１ｍｍｏｌ）
(2)ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５）  １３５ｍｇ（０.２１ｍｍｏｌ）
(3)ミリセチン  ６７ｍｇ（０.２１ｍｍｏｌ）
(4)ミリシトリン  ９７ｍｇ（０.２１ｍｍｏｌ）
(5)ミリシトリンガラクトシド  １２０ｍｇ（０.２１ｍｍｏｌ）
(6)ミリシトリングルコシド  １２２ｍｇ（０.２１ｍｍｏｌ）。【０１３６】
＜血液の前処理＞
採取した血液を４℃、１０００×ｇにて１０分間遠心分離後、上清を回収し、２ｍＭアスコルビン酸／0.5Ｍリン酸溶液を血漿に対し等容量を添加、混合した（血漿希釈液）。【０１３７】
固相(Varian SPEC C8 30mg)をメタノール１ｍＬで洗浄し、０.１％リン酸水溶液１ｍＬを通液した後、上記で調製した血漿希釈液２ｍＬを通液した。次いで、０.５Ｍリン酸水溶液１ｍＬにて共洗いし、イオン交換水１ｍＬにて洗浄後、１ｍＭアスコルビン酸／メタノール溶液１ｍＬ×３にて溶出した。溶出液をエバポレータにて濃縮乾固した後、１ｍＭアスコルビン酸／０.１％リン酸水溶液１ｍＬにて希釈し、ＨＰＬＣ用サンプルとした。【０１３８】
これを下記条件のＨＰＬＣにかけて、血液中のミリセチン抱合体を定量した。【０１３９】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム      ：Cadenza CD-18（4.6×150mm）
カラム温度  ：40℃
流速        ：1.2mL／min
検出        ：UV351nm
移動相      ：A液（0.1％リン酸水溶液）、B液（アセトニトリル）
グラジェント：B液15%→20%(0-10min), B液20%-50%(10-25min), B液100%(25-30min),B液15%(30-45min)
インジェクト量 ：50μL。【０１４０】
検出されたピークがミリセチン抱合体であることの判定は、photodiode arrayによるスペクトルがミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドのスペクトルと一致または相似することを確認することにより行なった。各ミリセチン抱合体の定量は、標準品の代用としてミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドにより検量線を作成し、絶対検量線法により概算値を求めることによって行った。なお、ここでは被験物質に由来する各種ミリセチン抱合体の混合物の総量を、ミリセチン抱合体の含量とした。【０１４１】
結果を図６に示す。図６に示すように、ミリセチンをグルコシル化することによって、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド（―◆―）及びミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（―■―）の体内吸収性が顕著に向上することが確認された。【０１４２】
実験例４  水溶性の評価
ミリセチン、ミリシトリン（比較例１）、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド（実施例１）、およびミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（実施例３）（被験物質）について、下記の方法により、水溶性を評価した。【０１４３】
＜水溶性の評価＞
イオン交換水に過剰量の各被験物質を懸濁し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，１０分間）し、上清に溶解している被験物質の量を、ＨＰＬＣにより測定した。【０１４４】
結果を表６、ならびに図７（Ａ）及び（Ｂ）に示す。【０１４５】
【表６】
2007105547.tif 000015
【０１４６】
これらの結果からわかるように、ミリセチンをグルコシル化することによって水溶性が顕著に向上することが確認された（実施例１と３）。特にミリセチンの３’位の酸素原子をグルコシル化することによって水溶性が顕著に向上した（実施例３）。【０１４７】
実験例５  水溶液中での安定性評価
ミリセチン、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド（実施例１）、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（実施例３）（被験物質）について、下記の方法により、水溶液中での安定性を評価した。【０１４８】
＜水溶液中での安定性評価＞
ｐＨ７.２のリン酸緩衝液に、１００μＭとなるように各被験物質（ミリセチン、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド、またはミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物））を配合し、３７℃で６時間放置した。経時的にリン酸緩衝液中のミリセチン、ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドまたはミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）の各濃度を、実施例３に示すＨＰＬＣ分析法で測定することによって、水中での残存率（％）を求め、その残存率から水溶液中の安定性を評価した。【０１４９】
結果を図８に示す。図８に示すように、ミリセチンをグルコシル化することによって水中での残存率の低下が抑えられており、水中における安定性が顕著に向上することが確認された。【０１５０】
実験例６    ミリセチン配糖体のラットにおける体内動態試験
被験物質として、ミリセチン−３−Ｏ−ポリグリコシド（実施例２）、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（実施例３）、ミリセチン−３’−Ｏ−モノグルコシド（実施例４）、ミリセチン、およびミリシトリン（ミリセチン−３−Ｏ−ラムノシド）（比較例１）を用いて、ラットにおける体内吸収性を対比評価した。なお、前述するように、ミリセチン配糖体を摂取すると、血中でミリセチンに結合している糖が外れ、ミリセチンとなる。その後、ミリセチンは硫酸抱合やグルクロン酸抱合などを受けて、各種のミリセチン抱合体となる。ここでは、血液中に存在する各種ミリセチン抱合体に酵素を作用させてミリセチンとし、そのミリセチン量からミリセチンの体内吸収性を評価した。【０１５１】
＜ラットの体内吸収性試験＞
実験動物として、雄性ラット（系統：Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）、体重２７０〜３６０ｇ、投与時齢：９週齢、各被験物質に対して５匹ずつ使用）を用いた。各被験物質を０.５％メチルセルロース水溶液に懸濁させて投与液を調製した。これをスターラーで充分に攪拌しながら適当な大きさのポリプロピレン製注射筒に吸引し、ラット用ゾンデを用いて速やかに且つ強制的に上記実験動物に経口投与した（投与回数：１回）。【０１５２】
＜投与被験物質及び投与量＞
(1)投与被験物質
(a)ミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（実施例２）、
(b)ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）（実施例３）、
(c)ミリセチン−３’− Ｏ−モノグルコシド（実施例４）、
(d)ミリセチン、
(e)ミリシトリン（比較例１）。【０１５３】
(2)投与量
上記の投与被験物質はいずれも、投与液中の濃度を２５μｍｏｌ／ｋｇ（ミリセチン換算、ラット体重当たり）に調整して投与する。【０１５４】
投与から０.５、１、４、８、１２、１６及び２４時間め（７ポイント）に、頸静脈から血液を採取した（採血量：約０.５ｍＬ／ポイント、血漿として０.２ｍＬ）。採血は、無麻酔下で、ヘパリンナトリウム（ヘパリン１０００単位／ｍＬ、血液１ｍＬに対して１０μＬ）を添加したポリプロピレン製注射筒及び２５ゲージの注射針を用いて行った。なお、コントロールとして上記投与被験物質に代えて０．５％メチルセルロース水溶液を投与した対照群（ｎ＝５）を設定し、当該対照群は投与から１時間後に同様の方法で採血を行った。【０１５５】
＜血液の前処理及び血漿中ミリセチン濃度の測定＞
グルクロン酸抱合化や硫酸抱合化を受けた血漿中のミリセチン代謝物（ミリセチン抱合体）を、酵素で加水分解してミリセチンとし、血漿中のミリセチン濃度を測定した。【０１５６】
具体的には、まず上記で採取した血液を採血容器に入れ、直ちに氷冷下で保存し、採血後３０分以内に遠心分離（約１６００×ｇ、１０分、４℃）して血漿を得た。得られた血漿９０μＬ(1% Ｌ-AsA/0.01%メタリン酸ナトリウムを含む) に、０.５８Ｍ酢酸緩衝液 (pH 4.9) １０μＬとβ-Glucronidase (SIGMA G-0876) ５μＬを加え、３７℃で３０分間反応させた。これに、５０μｇ／ｍＬDiosmetin(内部標準)１０μＬとMeOH／200mM HCl ２５０μＬを加え、よく撹拌し、室温で30分間静置した。１５,０００ｒｐｍ、4℃にて１０分間遠心した。得られた上清１５０μＬに０.１%リン酸水溶液１５０μＬを加えて、ＨＰＬＣ用サンプルとした。【０１５７】
これを下記条件のＨＰＬＣに供し、ミリセチン濃度を測定した。結果を表７及び図９に示す。【０１５８】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Cadenza CD-C18 (φ4.6×150mm)
移動相：0.1%リン酸水溶液／アセトニトリル
グラジェント：アセトニトリル20%→40%(0-10min)、40%(10-13min)、100%(13-18min)、20%(18-25min)
流速：1.0mL/min
温度：30℃
検出：UV 371nm。【０１５９】
【表７】
2007105547.tif 000016
【０１６０】
また、表７の結果からＡＵＣ（血中濃度時間曲線下面積）（μg・hr/mL）を求めた。なお、表７に示すように対照群の血漿中にミリセチンは検出されなかったことから、被験物質投与前の血漿中ミリセチン濃度はゼロ（０）であるとして、ＡＵＣを算出した。結果を表８に示す。【０１６１】
【表８】
2007105547.tif 000017
【０１６２】
表７、表８及び図９に示すように、ミリセチンをグルコシル化することによって、血漿中のミリセチン（正確にはミリセチン抱合体）含量が増加することが確認された。このことから、ミリセチンをグルコシル化することによって、ミリセチンの体内吸収性が格段に向上することが確認された。特に表８の結果から、ミリセチンの３’位の酸素原子にグルコシル基を１個以上結合させることによって、ミリセチンの３位の酸素原子にグルコシル基を結合させる場合に増して、ミリセチンの体内吸収性が顕著に向上することが確認された。【０１６３】
なお、実験例２でミリセチンをグルコシル化することによっても、ミリセチンが有する体内抗酸化作用自体に悪影響を及ぼさないことを示したが、さらに上記の結果から、ミリセチンをグルコシル化してミリセチンの体内吸収性を高めることによって、体内においてミリセチンの抗酸化作用をより有効に発揮させることが可能になることがわかる。一方、ミリセチンの配糖体であるミリシトリン（ラムノシルミリセチン）は、実験例４に示すようにミリセチンよりも高い水溶性を示すにも関わらず、上記表８および図９で示すように、ほとんど体内で吸収されない。この結果から、ミリセチンの配糖化による水溶性向上と体内吸収性との間に相関関係はないこと、すなわちミリセチンの配糖化による水溶性向上がただちに体内吸収性の向上に結びつくわけではないことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドの合成スキームを示す（実施例１）。
【図２】実施例２で調製したミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシド乾燥物（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図中、Ｇ１はミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド、Ｇ２はミリセチン−３−Ｏ−ジグルコシド、Ｇ３はミリセチン−３−Ｏ−トリグルコシド、Ｇ４はミリセチン−３−Ｏ−テトラグルコシド、Ｇ５はミリセチン−３−Ｏ−ペンタグルコシドを意味する。
【図３】ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド乾燥物（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図中、Ｇ１はミリセチン−３’−Ｏ−モノグルコシド、Ｇ２はミリセチン−３’−Ｏ−ジグルコシド、Ｇ３はミリセチン−３’−Ｏ−トリグルコシド、Ｇ４はミリセチン−３’−Ｏ−テトラグルコシド、Ｇ５はミリセチン−３’−Ｏ−ペンタグルコシドを意味する。
【図４】ミリセチン、およびミリセチンのグルコシル化物（ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物））のＤＰＰＨラジカル捕捉活性を示す（実験例１）。
【図５】ミリセチン、およびグルコシルミリセチン（ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物））のＬＤＬ酸化抑制能（％）を示す（実験例２）。
【図６】ミリセチン、およびグルコシドミリセチン（ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物））、ミリシトリン、ミリシトリンガラクトシド、ミリシトリングルコシドを投与した後の、血漿中のミリセチン抱合体の総濃度（μＭ）を示す。
【図７】（Ａ）ミリセチンとミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）の水への溶解度（w/v%）、（Ｂ）ミリセチンとミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシドの水への溶解度（w/v%）を示す（実験例４）。
【図８】ミリセチン、グルコシルミリセチン（ミリセチン−３−Ｏ−モノグルコシド、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物））の水中安定性（37℃、pH7.2）を示す（実験例５）。
【図９】ミリセチン、グルコシルミリセチン（ミリセチン−３’−Ｏ−モノグルコシド、ミリセチン−３’−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物）、ミリセチン−３−Ｏ−ポリグルコシド（Ｇ１〜Ｇ５の混合物））、ミリシトリンを投与した後の、血漿中のミリセチン濃度を示す（平均値±SEM）（実験例６）。なお、ミリセチン濃度は、血漿中に存在するミリセチン抱合体を酵素処理してミリセチンとすることによって求めた。
【図１】
2007105547.tif 000018
【図２】
2007105547.tif 000019
【図３】
2007105547.tif 000020
【図４】
2007105547.tif 000021
【図５】
2007105547.tif 000022
【図６】
2007105547.tif 000023
【図７】
2007105547.tif 000024
【図８】
2007105547.tif 000025
【図９】
2007105547.tif 000026
【国際調査報告】
2007105547.tif 000027
2007105547.tif 000028