【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年3月21日(2008.3.21)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】  軟骨性疾患の治療のためのインスリンの使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】  有効量のインスリン又はインスリン変異体を含有してなる、軟骨疾患によりダメージを受けた軟骨を治療するための医薬。
【請求項２】  有効量のインスリン又はインスリン変異体を含有してなる、軟骨疾患による軟骨の初期の又は連続したダメージを予防するための医薬。
【請求項３】  軟骨が、関節軟骨である請求項１又は２の医薬。
【請求項４】  軟骨が哺乳動物内にあり、投与される量が治療的有効量である請求項１又は２の医薬。
【請求項５】  軟骨疾患が、変性軟骨疾患である請求項１又は２の医薬。
【請求項６】  変性軟骨疾患が、リウマチ様関節炎である請求項５の医薬。
【請求項７】  変性軟骨疾患が、骨関節炎である請求項５の医薬。
【請求項８】  軟骨疾患が、外傷によるものである請求項１又は２の医薬。
【請求項９】  外傷の型が、微細損傷又は鈍的外傷、軟骨破壊、骨軟骨破壊、又は腱、半月板又は靱帯の損傷である、請求項８の医薬。
【請求項１０】  外傷が、スポーツ外傷又は肥満から生じる過度の力学的ストレス又は他の生体力学的不安定性によるものである、請求項８の医薬。
【請求項１１】  担体、賦形剤又は安定化剤を更に含んでなる、請求項１又は２の医薬。
【請求項１２】  軟骨が哺乳動物内にあり、投与される量が治療的有効量である請求項１１の医薬。
【請求項１３】  医薬が、作用させる軟骨領域又は関節に直接注入されることにより投与される、請求項１２の医薬。
【請求項１４】  医薬が、徐放性又は持続放出性製剤である請求項１２の医薬。
【請求項１５】  ＰＬＧＡを更に含む請求項１４の医薬。
【請求項１６】  多価金属塩を更に含む請求項１４の医薬。
【請求項１７】  多価金属塩が、酢酸亜鉛である請求項１６の医薬。
【請求項１８】  治療が、有効量の軟骨剤を更に含んでなる、請求項１又は２の医薬。
【請求項１９】  軟骨が哺乳動物内にあり、インスリン又はインスリン変異体及び軟骨剤の投与される量が治療的有効量である、請求項１８の医薬。
【請求項２０】  軟骨剤が、ペプチド成長因子、異化アンタゴニスト、骨-因子、滑膜-因子及び抗炎症因子からなる群から選択される、請求項１９の医薬。
【請求項２１】  ペプチド成長因子が、ＩＧＦ（１，２）、ＰＤＧＦ（ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）、ＢＭＰｓ、ＦＧＦ（１−２０）、ＴＧＦ-β（１−３）及びＥＧＦからなる群から選択される、請求項２０の医薬。
【請求項２２】  異化アンタゴニストが、ＩＬ-１ｒａ、ＮＯ阻害剤、ＩＣＥ阻害剤、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＬＩＦ、ＩＦＮ-γの活性、ＴＮＦα活性を阻害する物質、テトラサイクリン及びその変異体、アポトーシスの阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、アグリカナーゼ阻害剤及びセリン及びシステインプロテイナーゼ（例えばカテプシン及びウロキナーゼ又は組織プラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ及びｔＰＡ））の阻害剤からなる群から選択される、請求項２０の医薬。
【請求項２３】  骨-因子が、二リン酸エステル、オステオプロテグリンからなる群から選択される、請求項２０の医薬。
【請求項２４】  抗炎症因子が、抗ＴＮＦα、可溶性ＴＮＦレセプター、ＩＬ１ｒａ、可溶性ＩＬ１レセプター、ＩＬ-４、ＩＬ-１０及びＩＬ-１３からなる群から選択される、請求項２０の医薬。
【請求項２５】  治療が、標準的な外科的技術を更に含む請求項１又は２の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に軟骨の修復及び軟骨疾患の治療に関する。
【０００２】
（発明の背景）
軟骨疾患は、痛みにより認識される結合組織の変性又は代謝系の異常、患部の硬化又は運動能力減退により特徴づけられる疾患の群を広く表す。これらの疾患の原因は、病理的又は外傷や怪我によるものであり得る。
骨関節炎（ＯＡ）は、骨関節症又は変形性関節疾患としても知られ、関節構造に影響する局所的な変性過程の繰り返しによるものであり、又は痛みや機能の減退を生じる。ＯＡの発生率は年齢と共に増加し、ＯＡの兆候は、６５歳の人口の過半数の少なくとも１カ所の関節で見られる。ＯＡはしばしば関節の破壊を加速しうる局所的な炎症因子を伴う。
ＯＡは、プロテオグリカン（ＰＧ）及びコラーゲンの早期喪失を伴った、軟骨の滑らかな関節表面の破壊、次に裂け目の形成又はフィブリル化、最後に軟骨の全層喪失により特徴づけられる。軟骨の変化と同時に、特に骨の変化がある。嚢胞性の(subchondral)骨が肥厚し、次第に露わになる。また、骨の小結節又は骨増殖体が軟骨表面の周辺に形成され、時にはむしばまれた隣接領域まで発達する。ＯＡの症状は、罹患した関節の、特に使用後の局部的な痛みを伴う。病気の進行に従って、症状は、断続的な痛みの感覚、局所的な不快、及び罹患した関節の奇形等の外観的な変化へと進行する。
【０００３】
ＯＡの局部的な性質に対して、リウマチ様関節炎（ＲＡ）は滑膜、関節の間隙周辺の組織に発症するような全身性炎症疾患である。ＲＡの罹患率は、合衆国の一般住民においてＯＡの約１／６である。ＲＡは、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる慢性自己免疫疾患であり、典型的には、小及び大可動関節に影響を及ぼし、進行性の破壊を引き起こす。疾病が進行すると、ＲＡの症状は、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節の形成、さらに早期死亡を含む。ＲＡ及びＯＡの原因は明らかに異なるが、軟骨破壊に関連するサイトカイン及び酵素は同様のようである。
成熟した軟骨細胞は複製の可能性が殆ど無く、他の細胞型の補充が軟骨の無血管性の性質により制限されるので、成熟した軟骨はそれ自体の修復能力に限りがあった。このため、軟骨組織又は単離された軟骨細胞の欠陥関節への移植は、治療的には利用されていない。しかしながら提供者からの組織移植は、移植片拒絶、並びに感染症の伝染の可能性の危険を冒す。これらの危険は、患者自身の組織又は細胞を用いることにより最小限に抑えることができるが、この方法は更なる手術、患者の軟骨での新たな障害の創造、及び患者に特異的な細胞の高価な培養と増殖を必要とする。嚢胞性の骨が貫入している場合には、脈管構造への貫入は罹患した修復を行う未分化細胞の補充及び増殖が成されるので、外傷／疾患により又は外科的に、良好な治癒が達成される。しかしながら、生化学的及び機構的なこの特性は正常硝子軟骨のものと異なる繊維軟骨を新たに形成し、欠陥のある又は異常な機能となる。繊維軟骨は周辺の硝子軟骨と同様の耐久性を有さず、正しく支持しない。このため、新しい合成繊維軟骨はもとの関節硝子軟骨組織におとり、壊れやすい。
【０００４】
ペプチド成長因子は、軟骨成長及び軟骨細胞挙動（即ち、分化、移動、分裂、又はマトリクス合成又は分解）F.S.Chen等、Am J. Orthop. 26:396-406 (1997)の非常に重要な制御因子である。軟骨修復を刺激することが既に提唱されていた成長因子には、インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１）、Osborn, J. Orthop. Res. 7:35-42 (1989)；Florini & Roberts, J. Gerontol. 35:23-30 (1980)；塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Toolan等、J. Biomec. Mat. Res. 41:244-50 (1998)；Sah等、Arch. Biochem. Biophys. 308:137-47 (1994)；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、Sato & Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183:180-87 (1984)；Chin等、Arthritis Rheum. 34:314-24 (1991)及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）、Hill & Logan, Prog. Growth Fac. Res. 4:45-68 (1992)；Guerne等、J. Cell Physiol. 158:476-84 (1994)；Van der Kraan等、Ann. Rheum. Dis. 51:643-47 (1992)が含まれる。ペプチド成長因子のみでの、又は移植の技術的な手段の一部としての治療は、理論上では障害のある軟骨の生体内修復の促進又は移植前の細胞生体外増殖の促進に使用することができる。しかしながら、比較的少量であるために、成長因子は素早く消耗及び／又は低下し、従って生体内で十分な量及び十分な持続のある細胞を入手可能にしようとする優れた治療の挑戦が成されている。
【０００５】
本発明は、媒体を用いて及び／又はゆっくりとした放出形態として、成長因子を送達することによりこの制限を克服することを提唱する。理想的な送達媒体は、生体適合性があり、吸収可能であって、適切な機能特性を有し、有害な分解産物を生じないものである。
他の軟骨修復を促進する方法は、軟骨破壊を促進及び／又はマトリックス合成を阻害する分子の活性を抑制することである。このような分子の１つには、関節内にあるいくつかの組織に不利に作用しないサイトカインＩＬ-１αがある。V. Baragi等、J. Clin. Invest. 96:2454-60 (1995)；V.M. Baragi等、Osteoarthritis Cartilage 5:275-82 (1997)；C.H. Evans等、J. Leukoc. Biol. 64:55-61 (1998)；C.H. Evans等、J. Rheumatol. 24:2061-63 (1997)；R. Kang等、Biochem. Soc. Trans. 25:533-37 (1997)；R. Kang等、Osteoarthritis Cartilage 5:139-43 (1997)。ＩＬ-１αに拮抗する手段の一つは、可溶性ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、ＩＬ-１のそのレセプターへの結合を抑制する天然発生タンパク質での処理によって、軟骨のＩＬ-１の直接的及び間接的な作用を妨げるものである。他のサイトカイン、例えばＩＬ-１β、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ-α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ-γ）、ＩＬ-６及びＩＬ-８は、滑膜繊維芽細胞様細胞、軟骨細胞及び／又はマクロファージの活性の増加に関連している。これらのサイトカインの抑制は炎症及び軟骨破壊を防止するのに有益な処理となりうる。実際に、ＴＮＦ-α活性を抑制する分子は、リウマチ様関節炎を有する患者の関節で有益に作用することが示されている。
酸化窒素もまた、軟骨破壊に重要な役割を果たしているようである。[Ashok等、Curr. Opin. Rheum. 10:263-268 (1998)]。ＮＯを生成しない正常な関節組織と異なり、ＩＬ-１のようなサイトカインで促進しても、関節から得られる滑膜又は軟骨は関節から移動して３日後までに大量の酸化窒素を自然に生成する。更に、亜硝酸塩の濃度上昇が、関節炎の患者の滑液に見られる。その軟骨異化の直接の促進に加えて、炎症を起こした関節に存在する酸化窒素は血管拡張及び透過性の増大、更にはＴＮＦ-α及びＩＬ-１の様なサイトカインの白血球からの放出、及び脈管形成の促進を引き起こすと考えられる。関節におけるＮＯが原因となる役割の証拠としては、ＮＯの抑制によりＩＬ-１媒介軟骨破壊及び軟骨細胞の死並びに骨関節炎の進行を防止することが示された動物モデルによるものである。最後に、いくつかの薬剤（例えばオーラノフィン、糖質コルチコイド、サイクロスポリン、テトラサイクリン、及び少なくともいくつかある、アスピリンを含む非ステロイド抗炎症薬剤）が現在、ヒトのリウマチ様疾患の治療に使用され、ＮＯ生成及び／又は活性減少させることが示されている。
【０００６】
糖尿病（変化した血清インスリンレベルを有する）又は異常（下垂体切除した）動物は、結合組織の２つの主要成分、硫酸化したムコ多糖及びコラーゲンの最適生成にインスリンを必要とすることが示唆される。早くも１９５７年には、糖尿病ラットの皮膚への標識した硫酸塩の異常に少ない取り込みがインスリンにより増加することが示された Schiller及びDorfman, J. Biol. Chem. 227:625-632(1957)。同様に、インスリンが糖尿病ラットの大動脈において、それ以外の低レベルの硝酸塩取り込みを増加した。Cohen M.P.及びFoglia, V.G. Proc.Soc.Exp.Biol. Med. 312:376-378(1969); Proc. Soc. Exp. Biol. Med.133:1275-1278(1970); Proc. Soc. Exp. Biol. Med.135: 113-115(1970)。続いて、インスリンが、軟骨への硝酸塩の取り込みを促進するが、硫酸塩が取り込まれた分子の同一性は決定されなかった。さらに、インスリンの内因性マトリックス代謝回転率（つまり、マトリックス内でのタンパク質分解又は持続性）も判断されなかった。Salmon, W.D., Jr., 及びDoughaday, WH. Endocrinol. 82:493-499(1957); J. Posever等, J. Orthopaedic Res. 13: 832-827(1995)。インスリンは結合組織に直接影響がありうるが、少なくともいくつかのデータで、インスリンの全身性投与により少なくとも部分的には逆転させることのできる糖尿病動物に見られる結合組織代謝の不足が、結合組織における循環因子に依存しうるが、インスリンの直接的な影響には依存していないことをを示唆している(Spanheimer, P. G., Matrix 12: 101-107(1992))。
【０００７】
インスリンはまた、マウスの繊維芽細胞培地、Paul及びPerson, J. Endocrinol. 21: 287-294(1960)、下垂体摘出ラット由来の軟骨細胞(Salmon, W.D., Jr., J. Lab. Clin. Med. 56:673-681(1960))、骨の細胞培地(Prasad, G.C.及びRajan, K.T., Acta Orthop. Scand. 41:44-56(1970))、並びに多くの多の細胞系(Gey, G.O.及びThalhimer, W., J. Amer. Med. Assoc. 82: 1609(1924); Lieberman, L., 及びOve, P.O., J. Biol. Chem. 234: 2754-2758(1959); Younger, L. R., King, J.及びSteiner, O.F., Cancer Res. 26: 1408-1413(1966); Schwartz, A.G.及びAmos, H., Nature 219:1366-1367(1968))の生育を促進することが分かっている。これらの初期の研究の殆どが、動物、器官、又は組織で実施された。Hajec及びSolursh, Gene Comp. Endocrin. 25: 432-446(1975)において、無血清培地のニワトリの胚の胸骨部軟骨から誘導された、軟骨のインスリンの直接影響が示されたのが最初であった。インスリンホルモンがアミノ酸の吸収を増加させ、窒素の潜在的なバランスを促進し、全タンパク質合成を助けることから、これらの培地のインスリンによる生育及びムコ多糖の合成の促進は、驚く程のものではないであろう。同様にスウォームラット軟骨肉腫から誘導されたラット腫瘍細胞のインスリンによって促進されたプロテオグリカン合成の増加は、全タンパク質への放射性同位体の組み込みの増加が伴うことから、タンパク質合成の一般的な増加に反映しうる(Stevens, R.L.及びHascall, V.C., JBC256:2053-2058(1981))。最後に、高レベルのインスリン(ニワトリ培地(chick culture)に10μg/ml, Hajec 及びSolursh, 上掲)が多くのこれらの研究に使用されることが理解される。このような高い濃度のインスリンはインスリン様成長因子(ＩＧＦ)-１レセプターに結合して活性化し、従ってＩＧＦ-１自体の効果を模倣する。従って得られた生理学的効果は、ＩＧＦ-１レセプター情報伝達によるはずであって、単なるインスリンの情報伝達の結果にすぎない。最後に、インスリンの全身投与は、多くのはれた関節のみが監視されるラットの炎症性及び多発関節炎モデルには効果がない。Roszkowski-Sliz, W., Acta Physiol. Pol. XXIV, 371-376(1973)。炎症は軟骨の欠損及び骨の破壊を引き起こし、動物モデルにおいては逆もまた同じであり、Joosten等, J. Immunol. 163:5049-5055(1999)、この研究ではどのようなインスリンが関節組織に効果があるのか明らかでない。
【０００８】
３０年以上前、高容量のインスリンを、そのうち７人がリウマチ様関節炎を有している１０人の患者に、低血糖性症を誘導し、コルチコステロイドレベルを増加させ、従って副腎活性を変化させることを目的として皮下注射した（M. Ippolito等, Reumatismo 20(5):561-64(1967)）。コルチゾンと結合させるインスリン処理は、食欲の回復、体重の増加、及び痛みの改善を含む、患者にとって全体として良い効果をもたらした。これらの効果は、インスリンの間接的な活性、例えば血漿コルチコステロイドレベル増加のためのインスリンの活性に依存しうる。著者は「間脳下垂体性機能」における全体的インスリンの効果に最も興味をよせていたので、軟骨におけるインスリンの蛋白同化の効果は調査又は考慮されなかった。更に、軟骨の無血管性と生体内でのインスリンの素早いクリアランスを確認したことによって、任意の皮下送達インスリンがインスリン処理個体の関節内の軟骨細胞に利用できるのか、ということに考えは至っていない。
ＯＡとは異なり、骨の減少はＲＡの一般的特性である。１９８４年１１月７日出願の日本国特許出願JP59-234,826はまた、骨芽（骨）細胞株、ＭＣ３Ｔ３-Ｅ１における、骨のマーカーの誘導に基づいたリウマチ様関節炎治療のためのインスリンの潜在的用途、つまりアルカリホスファターゼ活性を推測した。しかしながら、軟骨組織自体でのインスリンの効果は調査も考慮もされなかった。
人口の高齢化に伴い、関節炎の発症率が増加し、怪我及び／又は病気により損傷した軟骨を含む軟骨の修復を促進するための効果的な治療が必要に迫られている。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は病気及び／又は外傷によるものを含む、軟骨疾患によりダメージを受けた軟骨の治療、修復及び保護の方法に関する。特に、本発明は有効量のインスリン又はインスリン変異体投与を含む、軟骨の治療、修復及び保護の方法に関する。さらに具体的には、持続性又は徐放性形態のインスリン又はインスリン変異体の投与のための方法が提供される。
更なる実施態様では、本発明は軟骨疾患によりダメージを受けた軟骨治療のための、有効量のインスリン及び／又はインスリン変異体を該軟骨に接触させることを含む方法に関する。任意には、軟骨は関節軟骨であり、哺乳動物内にあり、投与量は治療的有効量である。任意には、軟骨疾患は骨関節炎、リウマチ様関節炎又は外傷である。
更なる実施態様では、本発明は、外傷により損傷した軟骨の治療、又は最初の又は連続した損傷の予防のための、有効量のインスリン又はインスリン変異体と該軟骨を接触させること含む方法に関する。より具体的には、治療される外傷は微細損傷又は鈍的外傷、軟骨破壊、骨軟骨破壊、又は腱、半月板又は靱帯の損傷である。更に具体的には、軟骨はヒトを含む哺乳動物内にあり、投与量は治療的有効量である。特定の態様では、外傷はスポーツ外傷又は肥満から生じる過度の力学的ストレス又は他の生体力学的不安定性によるものでありうる。あるいは、本発明は、有効量のインスリン又はインスリン変異体と骨外傷の領域を接触させることを含む、骨破壊の治療又は修復を促進する方法に関する。
【００１０】
更なる実施態様では、本発明は、軟骨疾患及び／又は外傷によりダメージを受けた軟骨の治療、又は初回の又は連続したダメージの予防のための、インスリン又はインスリン変異体を更に含む有効量の組成物と該軟骨を接触させることを含む方法に関する。あるいは、組成物は担体、賦形剤又は安定化剤を更に含む。あるいは、軟骨は哺乳動物内にあり、投与量は治療的有効量である。あるいは、組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、関節内又は局所投与による哺乳動物への注射又は注入によって投与してもよく、投与量は治療的有効量である。あるいは、組成物は作用させる軟骨領域又は関節に直接注入してもよい。
更なる実施態様では、本発明は、軟骨疾患及び／又は外傷によりダメージを受けた軟骨の治療又は初回の又は連続したダメージを予防するための、インスリン又はインスリン変異体の治療的有効量の持続性又は徐放性組成物を投与することを含む方法に関する。あるいは、軟骨は哺乳動物内にあり、投与量は治療的有効量である。特に、徐放性又は持続放出性組成物はマイクロカプセル、個体疎水性ポリマーの半透膜、生物分解性ポリマー、又は分散体（例えば、懸濁液又は乳化液）の形態にしたインスリン又はインスリン変異体を含む。より具体的には、個体疎水性ポリマーの半透膜は、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）であり、生物分解性ポリマーは、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）である。あるいは、徐放性又は持続放出性インスリン又はインスリン変異体組成物は、さらに水溶性多価金属塩を含む。更に具体的には、多価金属塩は、金属陽イオンと無機又は有機の酸から形成される塩を含む。
【００１１】
更なる実施態様では、本発明は、有効量の軟骨剤と組み合わせて有効量のインスリン又はインスリン変異体を軟骨に接触させることを含む、軟骨疾患又は外傷によりダメージを受けた軟骨の治療、又は初回の又は連続したダメージの予防のための方法に関する。任意には、軟骨は哺乳動物内にあり、投与量は治療的有効量である。
他の実施態様では、本発明は、有効量のインスリン又はインスリン変異体と軟骨細胞を接触させることによって、無血清培地の軟骨細胞の生育を維持、向上又は促進させるための方法に関する。あるいは、本方法は、持続性又は徐放性形態のインスリン又はインスリン変異体の有効量と軟骨細胞との接触に関する。あるいは、本発明は、有効量のインスリン又はインスリン変異体で前処理した有効量の軟骨細胞の移植によって、外傷又は軟骨疾患に生じる軟骨の破壊防止又は再生促進をする方法に関する。
更なる実施態様では、本発明は、あらゆる標準的な軟骨の外科的技術と組み合わせて有効量のインスリン及び／又はインスリン変異体と該軟骨を接触させることを含む、外傷又は軟骨疾患によりダメージを受けた軟骨の治療又は初回の又は連続したダメージの予防のための方法に関する。本発明は、標準的な軟骨の外科的技術の前、後及び／又は同時に投与されうる。特定の態様では、本発明は標準的な外科的技術は、次の方法：軟骨シェービング、摩耗性軟骨形成、レーザー修復、壊死組織切除、軟骨形成、軟骨下骨に及ぶ又は及ばない微細破壊、モザイク形成、軟骨細胞同種移植、幹細胞自家移植、助軟骨移植、化学刺激、電気刺激、軟骨外自家移植、骨膜自家移植、軟骨骨格再生(scaffolds)、シェル（骨関節）自家移植又は同種移植から選択されうる。
【００１２】
更なる実施態様では、本発明はインスリン及び／又はインスリン変異体をコードする核酸、該核酸を含むベクター及び組み換え宿主細胞に関する。
他の実施態様では、本発明は、適切に包装されたインスリン及びインスリン変異体及び担体、賦形剤及び／又は安定化剤（例えば、緩衝液）を含んでなる治療用のキットに関する。該キットは、好ましくは、ダメージを受けた軟骨の治療のための又は軟骨疾患による軟骨の初回又は連続ダメージを防止するためにインスリンを使用するための使用説明書を含む。あるいは、キットは軟骨疾患を治療するためのインスリンの使用についての使用説明書を含んでもよい。
さらなる実施態様において、本発明は：
容器；
容器上の使用説明書；及び
容器内に収納される活性薬剤を含む組成物；
を含んでなり、組成物が軟骨疾患を治療するために有効であり、容器上の使用説明書は組成物が軟骨疾患を治療するために使用され得ることを示し、組成物中の活性剤は軟骨の破壊防止及び／又は修復促進する薬剤である製造品に関する。好ましい態様において、活性薬剤はインスリン又はインスリン変異体である。
【００１３】
（本発明の詳細な説明）
骨関節炎とリウマチ様関節炎：
リウマチ様関節炎は（ＲＡ）、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる全身性、慢性、自己免疫疾患で、典型的には、小及び大可動関節などに影響を及ぼす。ＲＡが進行すると、その症状には、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節、さらに早期死亡が含まれる。ＯＡとは対照的に、ＲＡの症状はしばしば、青年期に現れ、関節外症状はあらゆる臓器に影響があり、関節破壊が左右対称で、大及び小関節の両方に同様に生じる。関節外の症状は、関節脈管炎、皮膚及び筋肉の萎縮、皮下小結節、リンパ節症、脾腫、白血球減少症及び慢性貧血が含まれる。更に、ＲＡは、様々な疾患の発症と本質的に異質であり、患者の９０％において病気の経過中の血漿リウマチ因子の形成に関与する。
興味深いことには、ＲＡを有する患者はまた、異常に活発な免疫系を持つ。ＲＡに罹っているかなり多くのヒトは、単球及びマクロファージ上のクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の増大された活性化に関連した遺伝的感受性を有する。これらの組織適合性複合体分子は、これらのクラスＩＩ分子のレセプターを担持する活性化Ｔ細胞に対する抗原の存在に関わる。ＲＡに対する遺伝的素因は、非常に重篤な症状を持つヒト患者における高度に保存された白血球抗原ＤＲのサブタイプＤｗ４、Ｄｗ１４及びＤｗ１５の罹患率によって支持される。
活性化された単球及びマクロファージは、適切なＴ細胞と相互作用しながら、より多くの単球及びマクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び内皮細胞の更なる活性化に至らしめるカスケード又は免疫現象を刺激する。接着分子の促進制御によって、更なる単核細胞及び多形核細胞が炎症性関節を招く。この流れは、更なる走化性サイトカインの分泌を促進し、それによって滑膜及び滑液中に炎症性細胞の浸潤を増加させる。
【００１４】
骨関節炎（ＯＡ）は、関節構造に影響を及ぼし、その結果痛み及び機能欠損を引き起こす局所的変成疾病である。ＯＡは２のタイプ：原発性及び二次性に分類される。原発性ＯＡとは、潜在的な因果関係が決定されない変成関節疾病の範囲を意味する。典型的に、原発性ＯＡによって影響を受ける関節は、手の指節間関節、第一腕掌骨関節、股関節、膝、脊椎及びミッドフット（midfoot）の幾つかの関節である。興味深いことに、足首、肘、及び肩などの大関節は容赦される傾向にある。これに対して、二次性ＯＡは決まった怪我又は外傷の結果として生じる。二次性ＯＡは、しばしば、血色素症、アルカプトン尿症などの代謝病、発育性臼蓋形成不全（先天性股関節脱臼）、肢長不一致などの発育異常と関連し、リウマチ様関節炎、痛風、敗血性関節炎及び神経障害性関節炎などの外傷性及び炎症性関節炎を含む。
ＯＡは進行性の変性疾患である。ＯＡに関する最初の変性は、プロテオグリカンがマトリックスから失われるので、関節軟骨表面の擦り切れ及び線維化として現れる。連続した関節の使用で、表面の線維化が進行し、欠損が軟骨に更に深く入り込み、軟骨組織の一部が失われる。さらに、軟骨の下にある骨（軟骨下骨）が薄くなり、軟骨が失われるので、徐々に骨が露わになる。非対称な軟骨破壊によって醜い傷跡が生じうる。骨増殖体と呼ばれる骨小結節がしばしば軟骨表面の周辺に形成され、場合によっては隣接した浸食領域にまで広がる。これらの骨増殖体の表面が広がると、血管の増殖が生じ、繊維軟骨を含む組織栓の形成を生じる。
【００１５】
軟骨は無血管であるため、軟骨層に生じる損傷は軟骨下骨にまで進入ないが、僅かな内在する複製の潜在力を有する常在性の軟骨細胞の修復作業はなされなくなる。しかしながら、軟骨下骨に浸透した場合、その血管供給は３つの修復過程を生じさせる。この型の損傷に応答して合成される最適以下の軟骨は、その線維マトリックスのためにここで「繊維軟骨」と称されるが、これは、最適以下の生化学及び機能特性を有し、よって更に摩耗及び破壊されやすくなる。罹患又は損傷した関節では、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えばコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、アグリカナーゼ、及び他のプロテアーゼの増加した放出は、更なる軟骨の薄化及び欠損を引き起こす。インビトロ研究では、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＰＤＧＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＦＮ-γ、ＴＧＦ-β、ＬＩＦ、ＩＬ-２及びＩＬ-６、ＩＬ-８等のサイトカインが滑膜繊維芽細胞様細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、及び／又は破骨細胞の活性の代わりをすることができることが示され、これらのサイトカインが生体内でのマトリックスの代謝回転を調節しうることが示唆された。このように、これらのサイトカインの任意のものは、生体内での関節退化の破壊サイクルを拡大し、永続化させうる。実際に、関節炎の動物及びヒトにおけるＩＬ-１又はＴＮＦ-α活性の抑制は、関節炎の進行を少なくとも遅らせる効果的な方法であることが示されている。ＲＡ及びＯＡの発生段階ではっきりとした違いがあるが、これら２つの変性疾患における軟骨及び骨の損失は同じサイトカイン及びプロテアーゼが多く関与するようである。
軟骨の機能特性はその生化学的組成により決定される。軟骨構造は軟骨の引張強度及び硬度に寄与するが、圧縮性（又は弾性）はそのプロテオグリカン成分による。健康な関節軟骨では、ＩＩ型コラーゲンが優性である（約９０−９５％含む）が、少量のＶ、ＶＩ、ＩＸ及びＸＩ型コラーゲンもまた存在する。軟骨プロテオグリカン（ＰＧ）は、架橋結合した硫酸化グリコサミノグリカンを有する、水力学的に大きい集合性ＰＧ、並びにデコリン、ビグリカン及びルミカン等の水力学的により小さい非集合性のＰＧを含む。
【００１６】
軟骨障害のタイプ
軟骨に対する傷害は、３つのカテゴリーに分けられる：（１）微細損傷又は鈍的外傷、（２）軟骨骨折、及び（３）骨軟骨骨折である。
軟骨細胞及び軟骨マトリクスに対する微細損傷は、単一の衝撃により、連続した鈍的外傷により、又は生体力学的に不安定な関節の連続使用によって引き起こされ得る。実際に、変性関節の初期段階に見られるような代謝性又は生化学的変化は、関節軟骨の反復した負荷に関わる動物モデルに複製されうる。Radin等, Clin. Orthop. Relat. Res. 131: 288-93(1978)。このような実施例は、関節炎の関節に見られる軟骨損失の明確なパターンに加えて、疾患における関節軟骨の整合性及び恒常性の欠損に生化学的負荷が関与する役割をはっきりさせる。Radine等, J Orthop Res. 2: 221-234(1984); Radin等, Semin Arthritis Rheum(補足2)21: 12-21(1991); Wei等, Acta Orthop Scand 69:351-357(1998)。軟骨細胞は、基礎的な割合ではプロテオグリカンによって軟骨マトリックスを補充することができるが、コラーゲン網への同時損傷は損失率を増加させ、不可逆性の変性を生じる。Buckwalter等, J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:192-201(1994)。
軟骨骨折は軟骨下板を破らずに関節表面が破壊されることに特徴づけられる。外傷部位で軟骨細胞壊死が生じると、続いて外傷に隣接する生軟骨細胞の分裂及び代謝活性が増加して線維組織による関節表面の壊裂のライニングを引き起こす。軟骨細胞活性の増加は一時的であり、新しいマトリックス成分の不十分な質と量で修復反応が起こる。
３つのタイプのうち最も重篤である骨軟骨骨折は、潮標（tidemark）又は下の軟骨下プレートをクロスリンクする傷害である。このタイプの傷害において、軟骨下脈管構造の存在により、血管組織で典型的に遭遇する３相の反応が引き起こされる：（１）壊死；（２）炎症；（３）修復である。最初、傷害は血液又は血の固まりで埋められる。生じたフィブリンの固まりは炎症反応を活性化し、血管形成修復組織となり、種々の細胞成分がトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質、及びインスリン様成長因子を含む、成長因子及びサイトカインを放出する。Buckwalter等、J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:191-201 (1994)。
【００１７】
骨軟骨骨折に関連する最初の修復反応は、前駆体の軟骨細胞への補充、増殖及び分化に特徴付けられる。間葉幹細胞はフィブリン網に堆積し、最終的には線維軟骨領域となる。F. Shapiro等, J. Bone. Joint Surg. 75: 532-53(1993); N. Mitchell及びN. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58:230-33(1976)。これらの幹細胞は、隣接した関節表面よりむしろ下にある骨髄からのものであると考えられ、軟骨細胞へと分化が進む。外傷の後６〜８週で、修復した組織はいくつかのＩ型コラーゲンと共に大部分がＩＩ型であるコラーゲン及びプロテオグリカンのマトリックスに軟骨細胞様細胞を含む。T. Furukawa等, J. Bone Joint Surg. 62: 79-89(1980); J. Cheung等, Arthritis Rheum. 23:211-19(1980); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72(1971)。しかしながら、この新しく堆積したマトリックスは退化し、軟骨組織はより多くの線維組織及び線維軟骨に置き換わり、コラーゲンの合成はＩＩ型からＩ型に変化する。H.S. Cheung等, J. Bone Joint Surg. 60: 1076-81(1978); D.Hamerman, 「Prospects for medical intervention in cartilage repair」, Joint cartilage degradation: Basic and clinical aspects, Eds. Woessner JF等, (1993); Shapiro等, J. Bone Joint Surg. 75: 532-53(1993); N. Mitchell & N. Shepard, J. Bone joint Surg. 58: 230-33(1976); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72(1971)。初期の変性の変化は、表面の線維化、プロテオグリカンの枯渇、軟骨細胞のクローニングと死、及び表面から深層への縦割れを含む。外傷の一年後には、修復した組織は繊維軟骨と硝子軟骨が混在し、大量のＩ型コラーゲンを有し、これは正常な関節軟骨で大した量で見られることはないものである。T. Furukawa等, J. Bone Joint Surg. 62: 79-89(1980)。
【００１８】
臨床的な観点から、繊維軟骨修復組織はかなり長期間、十分に機能しうる。しかしながら、繊維軟骨は正常硝子軟骨のものと比較して生化学的特性に劣る。軟骨繊維は、正常硝子軟骨よりも繊維軟骨でより低い弾性率を有するランダムな並びである。J. Colletti等, J. Bone Joint Surg. 54: 147-60(1972)。修復組織の透過性もまた上昇するため、組織の流体圧力耐荷重は減少する。H. Mankin等, "Form and Function of Articular Cartilage", Orthopaedic BacicScience, Ed: Simon & Schuster, American Academy of Orthopeadic Surgeons, Rosemont, IL(1994)。これらの変化は粘弾性の変形の増大を生じ、修復組織は正常関節軟骨よりも連続した荷重に耐える能力に劣ることになる。骨軟骨欠陥部付近の軟骨におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルは正常値の４２％にまで減少することが報告されており、外傷は初期の欠陥をこえて変性を引き起こすことが示唆されている。Osteoarthritis Cartilage 3:61-70(1995)。
【００１９】
軟骨細胞の移植と生存
また、軟骨細胞、軟骨マトリックスの分泌を担う細胞の移植は、効果的な軟骨修復のための方法として提案されている。しかしながら、同種移植の不都合な点、例えばホストの免疫原性反応、並びにウィルスや他の感染性の病気の伝染の可能性により、事実上、同種間軟骨細胞移植の範囲に限りがある。これらのリスクは、患者自身の組織又は細胞を用いることにより最小限に抑えることができるが、この方法は更なる手術を必要とし、患者の軟骨の新たな損傷を創り、さらに患者に特異的な細胞の高度な培養と増殖が必要となる。
細胞培養皿に単層で培養した場合、単離された軟骨細胞は脱分化し、培養時間と共に繊維芽細胞に類似してくる。例えば、コラーゲン生成は優性であるＩＩ型からＩ型に換わり、細胞はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）総含量に対して増大した率のヒアルロン酸を合成する。W. Green, clin. Orthop. Relat. Res. 124: 237-50(1977)。しかしながら、コラーゲンゲル又はアグリゲート培地での軟骨細胞の増殖は、正常な形態、プロテオグリカン及びＩＩ型コラーゲンの合成を維持し、並びにインビトロでの異染性マトリックスを蓄積する能力を保持しうる。従って、これらの条件下で軟骨細胞は、数週までの間、比較的分化及び表現型の安定性を維持しうる。T. Kimura等, Clin. Orthop. Relat. Res. 186:231-39(1984)。
【００２０】
組織工学
軟骨細胞培養に関する困難と費用のために、関節軟骨修復のための軟骨細胞播種又は無細胞移植が、脱塩し、酵素的に処理した骨、L. Dahlberg.等J. Orthop. Res. 9: 11-19(1991); B.C. Toolan等, J. Biomed. Mat. Res. 41:244-50(1998); ポリ乳酸C.R., Chu等, J. Biomed. Mat. Res. 29:1147-54(1995); ポリグリコール酸C.A. Vacanti等, Mat. Res. Soc. Symp. Proc 252: 367-74(1992); ヒドロキシアパタイト／ダクロン複合体、K. Messner & J. Gillquist, Biomaterials 14: 513-21(1993); フィブリン、D.A. Hendrickson等, J. Orthop. Res. 12: 485-97(1994); コラーゲンゲル、D. Grande等, J. Orthop. Res. 7: 208-18(1989), S. Wakitani等, J. Bone Joint Surg. 71: 74-80(1989), S. Wakitani等, J. Bone Joint Surg 76: 579-92(1994); 及びコラーゲン線維、J.M. Pachence等,「Development of a tissue analog for cartilage repair」, Tissue inducing biomaterials, Eds, L. Cima & E. Ron, Materials Reserch Soc. Press., Pittsburgh, PA(1992); B.C. Toolan等, J. Biomed. Mat. Res. 31: 273-80(1996)を含む、様々な医用材料を用いてなされる。使用される代わりの組織としては、滑膜組織、A.G. Rothwell, Orthopedics 13:433-42(1990); 又は間葉幹細胞（例えば骨髄又は骨膜組織）、K. Messner & J. Gillquist, Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 252:367-74(1992)を含む。
【００２１】
標準軟骨外科的技術：
本方法はまた、あらゆる標準的な軟骨の外科的技術と組み合わせて行われうる。標準的な外科的技術は、軟骨シェービング、摩耗性軟骨形成術、レーザー修復、壊死組織切除、軟骨下骨侵入のある又はない微小破壊、自家骨軟骨移植、軟骨細胞同種移植、幹細胞自家移植、助軟骨移植、化学刺激、電気刺激、軟骨外自家移植、骨膜自家移植、軟骨足場再生(scaffollds)、シェル（骨関節）自家移植又は同種移植、又は骨切り術を含む、軟骨の治療的な操作に通常用いられる外科的手術である。これらの技術はFrenkel等, Front. Bioscience 4: d671-685(1999)により詳細に記載され、検討されている。
【００２２】
軟骨剤：
組織構築と組み合わせて、又はそれに代えて、軟骨剤（例えば、ペプチド成長因子）の投与は軟骨修復を補強する方法とみなされてきた。軟骨剤は、軟骨の分化、移動、接着、及び代謝の非常に重要な制御因子である。F.S.Chen等、Am J. Orthop. 26:396-406 (1997)。軟骨剤は、比較的分子量の小さい溶解性タンパク質であり、すぐに吸収及び／又は分解されるので、十分な質と十分な持続時間のある細胞を入手するために大変な努力があった。従って分泌したタンパク質は、最大の効果を得るための工学的な移植可能な手段の導入を必要としうる。理想的な送達媒体は、生体適合性、吸収性があり、適切な機能特性を有し、非毒性の副産物に分解する。
いくつかの分泌タンパク質は、細胞の移植をしなくてもホストの軟骨修復を促進する潜在性がある。インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１）は、培養におけるマトリックス合成と細胞増殖の両方を促進し、K. Osborn. J. Orthop. Res. 7: 35-42(1989)、ＩＧＦ-１の不適切な部分は骨関節炎の進行の病因的役割を有しうることである。R.D. Coutts,等, Instructional Course Lect. 47: 487-94, Amer. Acad. Orthop. Surg. Rosemont, IL(1997)。変形関節炎の患者の血清のＩＧＦ-１濃度がコントロールグループよりも低いことが示唆された研究もあるが、他に違いの見られなかった研究もある。にもかかわらず、血清のＩＧＦ-１レベルとＩＧＦ-１に対する軟骨細胞の反応性はともに、年齢に従い減少する。J. R. Florini & S.B. Roberts, J. Gerontrol. 35:23-30(1980)。従って、ＩＧＦ-１の低下した利用性並びにＩＧＦ-１に対する減少した軟骨細胞反応性は、軟骨の恒常性を助長し、年齢の上昇と共に退化させうる。
【００２３】
ＩＧＦ-１は、変形関節炎の抑制治療に提案されている。実際に、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（軟骨細胞分解活性阻害剤）と組み合わせたＩＧＦ-１の関節内投与は、組織学的状態の改善をもたらし、分解酵素（中性メタロプロテイナーゼ及びコラゲナーゼ）を正常レベルに近づけ、メタロプロテイナーゼ及びマトリックスコラーゲンの組織阻害剤となる。R.A. Rogachefsky, 等, Ann. NY Acad. Sci. 732: 889-95(1994)。単独で又は軟骨再生を促進する他の成長因子をアジュバンドとしたＩＧＦ-１の使用は、WO91/19510、WO92/13565、US5,444,047、EP434,652に記載されている。
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、成長因子の大きな形質転換成長因子β（ＴＧＦ-β）ファミリーのメンバーである。インビトロ及びインビボの研究において、ＢＭＰが間葉細胞の軟骨細胞への分化を促進することが示されている。K. Sato & M. Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183:180-87 (1984)。さらに骨格成長因子及び軟骨誘導成長因子はＢＭＰと相乗効果があり、これらの成長因子とＢＭＰ及び成長ホルモンの組み合わせは間葉細胞の分化を開始させる。分化した細胞の後の増殖は他の因子により促進される。D.J. Hill & A Logan, Prog. Growth fac. Res. 4: 45-68(1992)。
【００２４】
形質転換成長因子β（ＴＧＦ-β）は、骨芽細胞、軟骨細胞、血小板、活性化リンパ球、及び他の細胞により産生される。R.D. Coutts等, 上掲。ＴＧＦ-βは、標的細胞、用量及び細胞培養条件によって、マトリックス合成及び細胞増殖の促進及び抑制の両方の特性を有す。P. Guerne等, J. Cell Physiol. 158:476-84(1994); H. Van Beuningen等, Ann. Rheum. Dis. 52: 185-91(1993); P. Van der Kraan等, Ann. Rheum. dis. 51:643-47(1992)。さらに、ＩＧＦ-１と同様に、ＴＧＦ-βの反応性は年齢と共に減少する。P.Guerne等, J. Cell Physiol. 158: 476-84(1994)。しかしながら、ＴＧＦ-βは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ-１を含む他の成長因子よりも軟骨細胞増殖をより効果的に促進し（Guerne等, 上掲）、軟骨細胞によるプロテオグリカン産生を促進する。ＴＧＦ-βはまた、軟骨細胞の異化作用を促進するサイトカインの影響を抑制調節するVan der Kraan等, 上掲。生体内で、ＴＧＦ-βは、間葉細胞の軟骨細胞への分化と増殖を誘発し、ウサギの関節軟骨で部分的肥厚の欠陥の修復を促進する。E.B. Hunziker & L.Rosenberg, Trans. Osthopaed. Res Soc.19:236(1994)。
【００２５】
軟骨異化作用のアンタゴニスト
軟骨マトリックスの分解は、プロテアーゼによるマトリックス分子（プロテオグリカン及びコラーゲン）の切断によると考えられている（Woessner JF Jr.,「Proteases of the extacellular matrix」, in Mow, V., Ratcliffe, A. (eds): Structure and Function of Articular Cartilage. Boca Raton, FL, CRC Press, 1994 及びSmith R.L., Front. In Biosci. 4:d704-712参照）。マトリックス分解に関係する重要な酵素は、まだはっきりと分かっていないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び「アグリカナーゼ」は関節破壊に重要な役割を有するようである。さらに、プロテイナーゼのセリン及びシステインファイリーのメンバー（例えば、カテプシン及びウロキナーゼ又はプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ及びｔＰＡ））もまた関与しているようである。プラスミン、ウロキナーゼ プラスミノーゲン活性因子（ｕＰＡ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、メタロプロテイナーゼの活性化の経緯において重要な役割を果たしうる。カテプシンＢ、Ｌ及びＳに近い関係にあるグループはマトリックス分解に関係することが証明され、これらのカテプシンはＯＡにおいて若干増加する。ＩＬ-１、ＴＮＦ-ａ及びＬＩＦを含む多くのサイトカインは、軟骨細胞でのＭＭＰ発現を誘発する。ＭＭＰの誘発は、ＴＧＦ-β及びＩＬ-４により、少なくともウサギにおいてはＦＧＦ及びＰＤＧＦにより拮抗することができる。動物研究で示されるように、これらのプロテアーゼ（ＭＭＰ及びアグリカナーゼ）の阻害剤は、生体内で障害から関節組織を少なくとも部分的に保護しうる。
【００２６】
軟骨修復を促進する他の方法は、軟骨破壊に関連する分子の影響の阻害を含む。例えばＩＬ-１（α及びβ）及び酸化窒素は軟骨における異化作用が知られている物質である。サイトカインＩＬ-１は、滑膜の炎症の発生及びマトリックスメタロプロテイナーゼ及びアグリカナーゼの促進制御を含む、軟骨破壊を引き起こす。V. Baragi, 等, J. Clin. Invest. 96:2454-60 (1995)；V.M. Baragi等、Osteoarthritis Cartilage 5:275-82 (1997)；C.H. Evans等、J. Leukoc. Biol. 64:55-61 (1998)；C.H. Evans Robbins等、J. Rheumatol. 24:2061-63 (1997)；R. Kang等、Biochem. Soc. Trans. 25:533-37 (1997)；R. Kang等、Osteoarthritis Cartilage 5:139-43 (1997)。高レベルのＩＬ-１が病気の関節で見られ、ＩＬ-１が関節炎の発生と進行に極めて重要な役割を有すると考えられるため、ＩＬ-１活性の抑制は治療を成功させうる。哺乳動物においては、インターロイキン１β転換酵素（ＩＣＥ）と称される１つのプロテアーゼのみが特に、成熟した活性ＩＬ-１βを生成することができる。ＩＣＥの阻害はＩＬ-１βの生成を阻害することが証明され、関節変性を遅らせうる（Martel-Pelletier J. 等 Front. Biosci. 4: d694-703参照）。また、可溶性ＩＬ-１レセプターアゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、ＩＬ-１の軟骨細胞との相互作用を防ぐことによりＩＬ-１の影響を抑制する天然発生のタンパク質が、関節炎の動物モデルにおける効果が示され、最近、関節炎の発生と進行を予防する能力をヒトにおいて試験されている。
【００２７】
酸化窒素（ＮＯ）は関節破壊において重要な役割を果たす。Ashok等、Curr. Opin. Rheum. 10:263-268 (1998)。ＩＬ-１α等のサイトカインで刺激された場合以外にＮＯを生成しない正常な軟骨と異なり、骨関節炎関節から得られる軟骨は、更なる刺激がないにもかかわらず培地において３日間にわたって大量の酸化窒素を生成する。さらに、ＮＯ生成の抑制は、ＩＬ-１α媒介軟骨破壊及び軟骨細胞の死、並びに動物モデルにおいて骨関節炎の進行を防ぐことが証明されている。従って、ＮＯの抑制は軟骨破壊を防止する１つの方法でありうる。
ＩＬ１α及びβと同様に、ＴＮＦ-αは軟骨細胞により合成され、マトリックス分解を誘発し、マトリックス合成を抑制し、関節炎の関節において高いレベルで見られる。ＴＮＦ-αはまた、軟骨破壊に関してＩＬ-１と相乗的に作用する。ＴＮＦ-α活性の抑制は、関節炎の動物及びヒトにおいて、関節炎の進行を抑制することが証明されている。
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は軟骨及び滑膜の両方で合成され、ヒトの滑液中に存在する。ＬＩＦは軟骨細胞によるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の合成を抑制するので、軟骨マトリックスの破壊に関与しうる。
インターフェロンγ（ＩＦＮ-γ）は、ヒト軟骨細胞によるプロテオグリカン合成を、その分解を促進せずに抑制する。実際に、ＩＦＮ-γはＭＭＰの誘発を抑制することによりプロテオグリカンの減少を抑えうる。
【００２８】
インターロイキン８、多形核好中球（ＰＭＮ）に対して有効な走化性サイトカインは、単球／マクロファージ、軟骨細胞及び繊維芽細胞を含む様々な細胞により合成され、ＴＮＦ-αにより誘発される。ＯＡ患者において、ＩＬ-β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-α及びＩＬ-８は全て滑液中に見られる。ＩＬ-８、は炎症反応をさらに調節しうるＩＬ-１β、ＩＬ-６及びＴＮＦ-αのものを含むヒト単核細胞の炎症性サイトカインの放出を促進する（Martel-Pelletier J. 等, Front. Biosci. 4:d694-703参照）。
ＩＬ-６はまた、滑膜組織の炎症性細胞の増加により及び軟骨細胞の増殖を促進することによりＯＡ病理学的過程に寄与するものとして提供されている。更に、ＩＬ-６は、ＭＭＰ合成及びプロテオグリカン生成の抑制におけるＩＬ-１の効果を増幅させることができる（Martel-Pelletier J. 等, Front. Biosci. 4:d694-703参照）。
インターロイキン１７はＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６及びＭＭＰの生成を促進調節する。ＩＬ-１７はまた、軟骨細胞でのＮＯ生成を誘発し、正常な関節以外の関節炎で発現する（Martel-Pelletier J. 等, Front. Biosci. 4:d694-703参照）。
【００２９】
軟骨細胞により合成される塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、関節軟骨細胞の複製を誘発しうる。B.C. Toolan等、J. Biomec. Mat. Res. 41:244-50 (1998)。若い動物から得られる外植片では、少量（例えば3ng/ml）のｂＦＧＦがプロテオグリカンの合成を促進し、分解を抑制するが、高いレベル（例えば、30-300ng/ml）では、全く逆の作用をする。成体の組織では、より高い用量のＦＧＦが、細胞増殖しないでプロテオグリカン、タンパク質及びコラーゲンのの合成を促進した。R.L. Sah等, Arch. Biochem. Biophys. 308:137-47(1994)。ｂＦＧＦはまた、インターロイキン１（ＩＬ-１）、軟骨異化作用の強力な刺激物質の軟骨細胞からの自己分泌放出を誘発することにより軟骨の恒常性を調節する。ｂＦＧＦはさらに、おそらく軟骨細胞でのＩＬ-１レセプターを情報制御する能力のある、ＩＬ-１介在プロテアーゼ放出を促進する。J.E. Chin等, Arthritis Rheum. 34:314-24(1991)。同様に、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、ＩＬ-１の及びおそらくはＴＮＦ-αの異化作用を増強することができる。しかしながら、ヒトの軟骨においてｂＦＧＦ及びＰＤＧＦが抗異化作用を有しうることがいくつか証明されている；この現象は種特異的であるのか、あるいは年齢の影響であるのかは未だ分かっていない。
炎症は骨関節炎の初期現象ではないようだが、炎症が骨関節炎関節に生じる。外傷の後及び炎症の間に滑膜ライニングに浸潤する炎症細胞（例えば、単球、マクロファージ、及び好中球）はメタロプロテイナーゼ、並びに分解酵素の更なる放出を助長する能力のある異化サイトカインを産生する。炎症と関節破壊は関節炎の動物モデルの全てにおいて完全な相関は示さないが、炎症を抑制するＩＬ-４、ＩＬ-１０及びＩＬ-１３等の物質は関節炎の動物において軟骨及び骨の病状も減少させる（Martel-Pelletier J.等 Front. Biosci.4:d694-703）。炎症性サイトカインを抑制する物質の使用は、ＯＡ患者に発生する局所性滑膜炎に対抗することによりＯＡの進行を遅らせうる。
【００３０】
多くの研究において、抗生剤のテトラサイクリンファミリーのメンバーがコラゲナーゼ及びゼラチナーゼの活性の抑制に影響することを示している。これらのうち一つ、ドキシサイクリンの経口投与により、末期の変形性股関節炎からの軟骨においてコラゲナーゼ及びゼラチナーゼの両方を減少させることを証明した。これらのデータは、ドキシサイクリンの効果的な経口投与が骨関節炎の進行を遅延させることを示唆する。Smith R. L. Front. Biosci. 4: d704-712。
ＯＡは、骨の象牙質化を引き起こす関節軟骨の分解のみならず、この組織のいわゆる硬化を生じる軟骨下骨の広範な再造形も伴う。これらの骨の変化は、しばしば局所的な吸収の結果としての軟骨下嚢胞の形成を伴う。骨吸収を抑制する物質、即ちオステオプロテグリン又はビスホスホネートは、関節炎の動物モデルにおいて有望な結果を示した。Kong等, Nature 402:304-308。
【００３１】
Ｉ．定義
用語「軟骨疾患」は、疾病又は外傷に因るものを含む、影響した体の部分の痛みの症状、硬直及び／又は動作の制限により更に明らかになる疾患の総称を意味する。「軟骨疾患」の範囲に含まれるのは、「変性軟骨疾患」−少なくとも部分的な、体の結合組織の変性又は代謝異常に特徴づけられ、関節又は筋肉、滑液包（滑膜）、腱及び繊維組織を含む関連構造のみならず、成長板も含む疾患の総称である。一実施態様では、該用語は、滑らかな関節軟骨表面の破壊及び軟骨マトリックスの変性により特徴づけられる「関節軟骨疾患」を含む。更なる病態には、酸化窒素の生成、マトリックス合成の抑制又は減少を含む。
「関節軟骨疾患」の範囲内には、骨関節炎（ＯＡ）及びリウマチ様関節炎（ＲＡ）が含まれる。ＯＡは単一疾患ではなく、複数の過程から生じる関節破壊の最終的共通経路を定義する。ＯＡは、関節マージンにおける明白な骨拡張に比例した局在化した軟骨の非対称性破壊によって特徴付けられる。典型的に、ＯＡは、手の指節間関節、第一腕掌骨関節、股関節、膝、脊椎及びミッドフット（midfoot）の幾つかの関節に影響を及ぼすが、足首、肘、及び肩などの大関節は容赦される傾向にある。ＯＡは、しばしば、血色素症、アルカプトン尿症などの代謝病、発育性臼蓋形成不全（先天性股関節脱臼）、肢長不一致などの発育異常とも関連し、痛風、敗血性関節炎及び神経障害性関節炎などの外傷性及び炎症性関節炎を含む。また、ＯＡはスポーツ外傷又は肥満により生じるような広範な生体力学不安定の後に現れうる。
【００３２】
リウマチ様関節炎は（ＲＡ）、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる全身性、慢性、自己免疫疾患で、典型的には、小及び大可動関節などに影響を及ぼす。ＲＡが進行すると、その症状には、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節、さらに早期死亡が含まれる。ＲＡの症状はしばしば、青年期に現れ、脈管炎、皮膚及び筋肉の萎縮、皮下小結節、リンパ節症、脾腫、白血球減少症及び慢性貧血が含まれる。
さらに、「変性軟骨疾患」という用語は、全身性紅斑性狼瘡及び痛風、アミロイドーシス又はフェルティ症候群を含み得る。さらに、該用語は、乾癬性関節炎、急性炎症（例えば、エルシニア関節炎、ピロリン酸関節炎、痛風関節炎（arthritis urica）、敗血性関節炎）、外傷関連関節炎、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、限局性腸炎、末梢回腸炎、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎、末端性回腸炎)、多発性硬化症、糖尿病（例えば、インスリン依存性及びインスリン非依存性）、肥満症、巨細胞関節炎及びシェーグレン症候群を網羅する。
【００３３】
本発明の方法によって治療されるものの少なくとも幾つかの他の免疫性及び炎症性疾患の例には、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症誘発性筋疾患、（皮膚筋炎、多発性筋炎）、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少症（特発的血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、自己免疫炎症性疾患（例えば、アレルギー性筋痛性脳脊髄炎、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、甲状腺中毒症、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血）及び同種移植の拒絶反応、真性糖尿病、免疫性腎臓疾患（糸状体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び抹消神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症 、特発性脱髄性多発神経障害又はGuillain-Barre症候群、及び慢性炎症誘発性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、グルテン感受性腸疾患、及びフィップル疾患、水泡性皮膚疾患を含む自己免疫性又は免疫媒介性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びジンマシン、肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び高感受性間質性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主の疾患を含む、移植関連疾患を含む考案に従って治療することができる。感染性疾患には、ウイルス性疾患、例えばエイズ（ＨＩＶ感染）、ヘルペス等、細菌性感染症、真菌性感染症、原生動物感染症、寄生虫感染症、及び呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等、及びアレルギー疾患、例えばアナフィラキシー性過敏症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季カタル、湿疹、じんま疹及び食物アレルギー等が含まれる。
【００３４】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変化の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指し、標的である病理学的状態又は疾患を予防、又は抑制（減少）することが目的である。治療が必要なものは、既に疾患に罹患しているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。免疫関連疾患の治療では、治療薬は直接的に疾患の病理成分の応答の大きさを低下又は増加させうるし、或いは疾患を他の治療剤による治療、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等に対してより敏感にしうる。
用語「有効量」とは、損傷した軟骨の検出可能な改善又は修復あるいは軟骨マトリックスの単離した試料における持続した又は誘発された軟骨変性からの測定可能な保護の何れかを引き起こす、誘発する又は結果的に生じる（例えば、マトリックス内プロテオグリカンの保持、マトリクスからのプロテオグリカン放出の抑制、プロテオグリカン合成の促進）、インスリン及び／又はその変異体の最小濃度である。更に、「治療的有効量」とは、少なくとも外傷又は軟骨疾患から生じる症状を和らげる（例えば、損傷した関節軟骨の検出可能な改善又は修復の何れかを引き起こす、誘発する又は結果的に生じる、あるいは軟骨変性の持続又は発生からの測定可能な保護を引き起こす、誘発する又は結果的に生じること、関節可動域の改善、痛みの減少）のに有効な、哺乳動物に投与するインスリン及び／又はその変異体の最小濃度（量）である。
【００３５】
「軟骨剤」は、成長因子、サイトカイン、小分子、抗体、ＲＮＡ片又はＤＮＡ片、ウィルス粒子、ペプチド、又は化学物質であってもよく、軟骨に有利な効果をもたらし、ペプチド成長因子、異化アンタゴニスト及び骨-、滑膜-又は抗炎症因子を含みうる。あるいは、「軟骨剤」はペプチド成長因子-例えば線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ-１、ＦＧＦ-２、．．．ＦＧＦ-２１、等々）、ＩＧＦ'ｓ（Ｉ及びＩＩ）、ＴＧＦ-βｓ（１-３）、ＢＭＰｓ（１-７）、又は例えば増殖、分化、移動、付着、又は軟骨細胞によるマトリックス産生を変化させることによって軟骨の本質的な修復反応を促進することができる、ＥＧＦ、ＨＢ-ＥＧＦ、ＴＧＦ-α等の上皮成長因子ファミリーのメンバーの任意のものであり得る。あるいは、「軟骨剤」は軟骨の異化作用に拮抗する因子（例えば、ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、ＮＯ阻害剤、ＩＬ１-β転換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＬＩＦ、ＩＦＮγの活性、ＴＮＦ-α活性を阻害する因子、テトラサイクリン及びその変異体、アポトーシスの阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、アグリカナーゼ阻害剤、カテプシン及びウロキナーゼ又は組織プラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ及びｔＰＡ）等のセリン及びシステインプロテイナーゼの阻害剤）であり得る。あるいはまた、軟骨剤は下にある骨（即ち、骨因子、例えば、二リン酸エステル又はオステオプロテグリン）又は周囲の滑膜（即ち、滑膜因子）に影響することにより軟骨に直接作用する因子又は抗炎症因子（例えば、抗ＴＮＦ-α、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ-４、ＩＬ-１０、ＩＬ-１３、ＮＳＡＩＤｓ）を含む。軟骨剤の概説としては、例えばMartel-Pelletier等, Front. Biosci. 4: d694-703(1999); Hering , T.M., Front. Biosci. 4: d743-761(1999)を参照のこと。
【００３６】
「標準的な外科的技術」は、軟骨の治療的処置に一般に用いられる外科的手段であり、軟骨シェービング、摩耗軟骨形成、レーザー修復、壊死組織切除、軟骨形成、軟骨下骨に及ぶ又は及ばない微小破壊、モザイク形成、軟骨細胞同種移植、幹細胞自家移植、助軟骨移植、化学刺激、電気刺激、軟骨膜自家移植、骨膜自家移植、軟骨足場再生(scaffollds)、シェル（骨関節）自家移植又は同種移植、又は骨切り術を含む。これらの技術は、Frenkel等, Front. Bioscience 4: d671-685(1999)に検討され、より詳細に説明されている。
“ＩＧＦＢＰ”又は“ＩＧＦ結合タンパク質”は、循環性であろうとなかろうと（例えば、血清又は組織）、ＩＧＦ-１又はＩＧＦ-２と会合、又は結合する、或いは複合体となるタンパク質又はポリペプチドに相当する。このような結合タンパク質には、受容体は含まれない。この定義には、ＩＧＦＢＰ-１、ＩＧＦＢＰ-２、ＩＧＦＢＰ-３、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＧＦＢＰ-５、ＩＧＦＢＰ-６、Ｍａｃ２５（ＩＧＦＢＰ-７）、及びＩＧＦＢＰと高い相同性を有する他のタンパク質と同様にプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）又は内皮細胞特異性細胞（ＥＳＭ-１）が含まれる。Ｍａｃ２５は、例えば、Swisshelm等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:4472-4476(1995)及び Oh等., J. Biol. Chem. 271: 30322-30325(1996)に記載されている。ＰＳＦは、Yamauchi等., Biochemical Journal, 303: 591-598(1994)に記載されている。ＥＳＭ-１は、Lassalle等., J.Biol.Chem. 271: 20458-20464(1996)に記載されている。他の同定されたＩＧＦＢＰについては、例えば、1990年6月27日に公開されたEP 375,438；1990年5月23日に公開さたEP369,943；1989年10月5日に公開されたWO89/09268；Wood等., Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185(1988)；Brinkman等., The EMBO J., 2417-2423(1988)；Lee等., Mol. Endocrinol., 2:1176-1185(1988)；Brewer等., BBRC,152:1289-1297(1988)；1988年12月7日に公開されたEP294,021；Baxter等.,BBRC,147:408-415(1987)；Leung等., Nature, 330: 537-543(1987)；Martin等., J. Biol. Chem., 261: 8754-8760(1986)；Baxter等., Comp.Biochem.Physiol., 91B:229-235(1988)；1989年9月21日に公開されたWO89/08667；1989年10月19日に公開されたWO89/09792；及びBrinkert等., EMBO J., 8:2497-2502(1989)を参照のこと。
【００３７】
「慢性」投与とは、急性の様式とは異なり、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持するために連続的な様式で薬剤を投与することを指す。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
変性軟骨疾患の「症状」は、患者の健康を損なう全ての生理学的現象を含む。限定はしないが、これには、軟骨破壊、減少した軟骨修復、異常な又は制御できない細胞成長、抗体産生、自己抗体産生、補体産生及び活性化、隣接細胞の正常機能への干渉、サイトカイン又は他の分泌物質の異常レベルでの放出、炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球）の組織間隙への浸潤などが含まれる。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ用、又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ハムスターなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組合わせた」投与には、いずれかの順番による同時的（併用の）及び継続的な投与が含まれる。
【００３８】
ここで用いられる「担体」は、製薬上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、使用用量及び濃度でそこに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性のものである。しばしば、生理学的に許容される担体の例は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容される担体は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICSTM(登録商標)、ヒアルロン酸（ＨＡ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
ここで用いられる場合の「インスリン」及び／又は「インスリン変異体」なる用語は、（１）天然配列インスリンと（２）インスリン変異体（ここで更に定義される）の両方を包含する。インスリン分子は、様々な供給源から、例えばヒト組織型から、又は他の供給源から単離され、あるいは組み換え及び／又は合成手段により調製されうる。
【００３９】
「天然配列インスリン」は、天然由来のインスリンと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列インスリンは、天然のものから単離することもできるし、組み換え及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列インスリン」という用語には、特に、インスリンの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ヒトインスリンは、配列番号：１のアミノ酸１〜２１のアルファ（α）又はＡ鎖及び配列番号：２のアミノ酸１〜３０のベータ又はＢ（β）鎖を含む成熟又は全長天然配列インスリンである。
「インスリン変異体ポリペプチド」とは、下記に定義されるように、（ａ）図１８Ａ（配列番号：１）に示されるヒトインスリンポリペプチドのＡ鎖の残基１〜２１と図１８Ｂ（配列番号：２）に示されるヒトインスリンポリペプチドのＢ鎖の残基１〜３０の組み合わせ、又は（ｂ）図１８Ａ及び１８Ｂ（配列番号：１−２）に示されるアミノ酸配列の他の特定の誘導断片のアミノ酸配列と、又はここに記載されるようなものと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性インスリンポリペプチドを意味する。さらに図１８Ａ及び１８Ｂに記載される二次構造、つまりシステイン残基Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７及びＡ２０−Ｂ１９の間のジスルフィド結合も活性に必要であると考えられるので、この定義に入る変異体の範囲もまたできるだけこの二次構造を保持するようにあるべきである。
【００４０】
例えば、インスリン変異体ポリペプチドは、図１８Ａ及び１８Ｂ（配列番号：１−２）に示される配列のＮ及び／又はＣ末端、並びに一又は複数の内部のドメインで一又は複数のアミノ酸残基が付加、又は欠失したポリペプチドを含む。通常、インスリン変異体ポリペプチドは、（ａ）図１８Ａ（配列番号：１）に示されるヒトインスリンポリペプチドのＡ鎖の残基１〜２１と図１８Ｂ（配列番号：２）に示されるヒトインスリンポリペプチドのＢ鎖の残基１〜３０の組み合わせ、又は（ｂ）図１８Ａ及び１８Ｂ（配列番号：１−２）に示されるアミノ酸配列の他の特定の誘導断片のアミノ酸配列と、又はここに記載されるようなものと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。
【００４１】
インスリン変異体ポリペプチドは、少なくとも約１５残基、あるいは少なくとも約１６残基、あるいは少なくとも約１７残基、あるいは少なくとも約１８残基、あるいは少なくとも約１９残基、あるいは少なくとも約２０残基、あるいは少なくとも約２１残基、あるいは少なくとも約２２残基、あるいは少なくとも約２３残基、あるいは少なくとも約２４残基、あるいは少なくとも約２５残基、あるいは少なくとも約２６残基、あるいは少なくとも約２７残基、あるいは少なくとも約２８残基、あるいは少なくとも約２９残基、あるいは少なくとも約３０残基、あるいは少なくとも約３１残基、あるいは少なくとも約３２残基、あるいは少なくとも約３３残基、あるいは少なくとも約３４残基、あるいは少なくとも約３５残基、又はそれ以上の長さのＡ鎖を有する。インスリン変異体ポリペプチドは、少なくとも約２５残基、あるいは少なくとも約２６残基、あるいは少なくとも約２７残基、あるいは少なくとも約２８残基、あるいは少なくとも約２９残基、あるいは少なくとも約３０残基、あるいは少なくとも約３１残基、あるいは少なくとも約３２残基、あるいは少なくとも約３３残基、あるいは少なくとも約３４残基、あるいは少なくとも約３５残基、あるいは少なくとも約３６残基、あるいは少なくとも約３７残基、あるいは少なくとも約３８残基、あるいは少なくとも約３９残基、あるいは少なくとも約４０残基、あるいは少なくとも約４１残基、あるいは少なくとも約４２残基、あるいは少なくとも約４３残基、あるいは少なくとも約４４残基、あるいは少なくとも約４５残基、あるいは少なくとも約４６残基、あるいは少なくとも約４７残基、あるいは少なくとも約４８残基、あるいは少なくとも約４９残基、あるいは少なくとも約５０残基の長さのＢ鎖を有する。
ここで用いられる場合の「プロインスリン」及び／又は「プロインスリン変異体」は天然配列とプロインスリン変異体（ここで更に説明される）の両方を包含する。プロインスリン分子は様々な供給源から、例えば、ヒト組織型から又は他の供給源から単離され、あるいは組み換え及び／又は合成手段により調製されうる。
【００４２】
「天然配列プロインスリン」は天然由来のプロインスリンと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列インスリンポリペプチドは、天然のものから単離することもできるし、組み換え及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列プロインスリン」という用語には、特に、インスリンの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ヒトプロインスリンは、図１８Ｃ（配列番号：３）のアミノ酸１〜８４を含む成熟又は全長天然配列インスリンである。配列番号：３は、３つの別々の断片：（１）残基１〜３０（配列番号：２）のＢ鎖；（２）残基３１−６３（配列番号：４）のＣ鎖（ペプチドに結合している）及びアミノ酸６４〜８４（Ｎ末端側から数えて）（配列番号：１）のＡ鎖を含む。
「プロインスリン変異体」とは、下記に定義されるように、成熟したインスリンにまで処理される能力のあるインスリンポリペプチドを意味し、隣接する残基の少なくとも２つの識別可能な領域含み；ここで１つの識別可能な領域は図１８Ａ（配列番号：１）に示されるヒトインスリンポリペプチドのＡ鎖のアミノ酸残基１〜２１と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、他の識別可能な領域は図１８Ｂ（配列番号：２）に示されるヒトインスリンポリペプチドのＢ鎖のアミノ酸残基１〜３０と結合したアミノと、又は（ｂ）図１８Ａ及び１８Ｂ（配列番号：１−２）に示されるアミノ酸配列の他の特定の誘導断片のアミノ酸配列、又はここに記載されるようなものと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。あるいは、プロインスリン変異体は、図１８Ｃ（配列番号：３）の残基１〜１１０、又は図１８Ｃ（配列番号：３）に示されるアミノ酸配列の他の特定の誘導断片と少なくとも８０％、あるいは少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有しうる。更なる領域としては、Ｎ末端及びＣ末端方向に延長又は短縮したｃペプチド及び／又は付加的な配列５'-又は３'-を含み、それらは各々、成熟した活性型に適切に折り畳むことを伝達及び／又は促進するために提供される。
【００４３】
さらに図１８Ａ及び１８Ｂに記載される二次構造、つまりシステイン残基Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７及びＡ２０−Ｂ１９の間のジスルフィド結合も活性に必要であると考えられるので、この定義に入る変異体の範囲もまたできるだけこの二次構造を保持するようにあるべきである。
プロインスリンの長さは、３つの主要な構成部分、つまりＡ、Ｂ及びＣペプチドの長さに依る。Ｃペプチドの長さは、非常に幅広く、残基にならない（つまり、完全な欠失）程の数個からあるいは５０ペプチド程の多数にまでなりうる。Ａ及びＢ鎖の長さは、全長分子として前記したものと非常に等しいプロインスリン変異体を構成する。さらに、付加Ｎ末端配列は、シグナルの目的で（例えば、宿主の分泌経路に対して翻訳生成物に直接）又は発現を促進又は制御するために（例えば、プロモーター、オペロン等）加えられる。このようなＮ末端領域の長さは、範囲内に含まれるあらゆる整数（即ち、１、２、３．．．９７、９８、９９等）を含む、１〜１００残基で構成されうる。
【００４４】
ここに同定されるポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のインスリンポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下の表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的において、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００４５】
特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムWU-BLAST-2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードするか、又は国立衛生研究所, Bethesda, MD.から得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全てはデフォルト値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。
【００４６】
また、用語「インスリン変異体」に含まれるのは、上述したように実施されるアミノ酸配列同一性比較の中で、比較した配列のアミノ酸残基において同一ではないが類似した特徴を有するアミノ酸残基を含むポリペプチドである。これらのポリペプチドは、「ポジティブ」と称される。 関心あるアミノ酸残基に対して陽性とされたアミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基の好ましい置換(下記の表６に定義)であるものである。ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する陽性の％値(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2又はNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって陽性であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％陽性は、ＢのＡに対する％陽性とは異なると評価されるであろう。
【００４７】
「インスリン変異体ポリヌクレオチド」又は「インスリン変異体核酸配列」は、以下に定義するような活性なインスリンポリペプチドをコードする核酸分子を意味し、（ａ）図１８Ａ（配列番号：１）に示されるヒトインスリンポリペプチドのＡ鎖のアミノ酸残基１〜２１と図１８Ｂ（配列番号：２）に（ヒト残基Ｂ３０Thrの置換を有して）示されるヒトインスリンポリペプチドのＢ鎖の残基１〜３０の組み合わせをコードする核酸配列、又は（ｂ）図１８Ａ及びＢ（配列番号：１−２）に示されるアミノ酸配列の他の特定の誘導断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。通常は、インスリン変異体ポリヌクレオチドは、（ａ）図１８Ａ（配列番号：１）に示されるヒトインスリンポリペプチドのＡ鎖のアミノ酸残基１〜２１と図１８Ｂ（配列番号：２）に（ヒト残基Ｂ３０Thrの置換を有して）示されるヒトインスリンポリペプチドのＢ鎖の残基１〜３０の組み合わせをコードする核酸配列、又は（ｂ）図１８Ａ及びＢ（配列番号：１−２）に示されるアミノ酸配列の他の特定の誘導断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しうる。
通常は、インスリン変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約４５ヌクレオチド、又は少なくとも約４８ヌクレオチド、又は少なくとも約５１ヌクレオチド、又は少なくとも約５４ヌクレオチド、又は少なくとも約５７ヌクレオチド、又は少なくとも約６０ヌクレオチド、又は少なくとも約６３ヌクレオチド、又は少なくとも約６６ヌクレオチド、又は少なくとも約６９ヌクレオチド、又は少なくとも約７２ヌクレオチド、又は少なくとも約７５ヌクレオチド、又は少なくとも約７８ヌクレオチド、又は少なくとも約８１ヌクレオチド、又は少なくとも約８４ヌクレオチド、又は少なくとも約８７ヌクレオチド、又は少なくとも約９０ヌクレオチド、又は少なくとも約１０５ヌクレオチドのインスリンのＡ鎖をコードする核酸を含む。インスリン変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約７５ヌクレオチド、又は少なくとも約７８ヌクレオチド、又は少なくとも約８１ヌクレオチド、又は少なくとも約８４ヌクレオチド、又は少なくとも約８７ヌクレオチド、又は少なくとも約９０ヌクレオチド、又は少なくとも約９３ヌクレオチド、又は少なくとも約９６ヌクレオチド、又は少なくとも約９９ヌクレオチド、又は少なくとも約１０２ヌクレオチド、又は少なくとも約１０５ヌクレオチド、又は少なくとも約１０８ヌクレオチド、又は少なくとも約１１１ヌクレオチド、又は少なくとも約１１４ヌクレオチド、又は少なくとも約１１７ヌクレオチド、又は少なくとも約１２０ヌクレオチド、又は少なくとも約１２３ヌクレオチド、又は少なくとも約１２６ヌクレオチド、又は少なくとも約１２９ヌクレオチド、又は少なくとも約１３２ヌクレオチド、又は少なくとも約１３５ヌクレオチド、又は少なくとも約１５０ヌクレオチドのインスリンのＡ鎖をコードする核酸を含む。
【００４８】
ここに同定されるインスリンポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、関心あるインスリンポリペプチドコード化配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００４９】
核酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ｃと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４及び５は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示している。
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードするか、又は国立衛生研究所, Bethesda, MD. USA 20892から得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全てはデフォルト値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００５０】
配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性(与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。
他の実施態様では、本発明の変異体ポリペプチドヌクレオチドは、本発明の活性ポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長の本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子である。本発明の変異体ポリペプチドは、本発明の変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００５１】
「陽性(ポジティブ)」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基を含む。関心あるアミノ酸残基に対して陽性とされたアミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基の好ましい置換(下記の表６に定義)であるものである。
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する陽性の％値(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2又はNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって陽性であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％陽性は、ＢのＡに対する％陽性とは異なると評価されるであろう。
【００５２】
インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、同定され、インスリン又はインスリン変異体コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸分子は、それが天然では付随しているすべての成分を含まないものである。単離されたインスリン又はインスリン変異体コード化核酸分子は、天然に見出される形態や設定と異なるものである。従って、このような単離された核酸分子は、天然の細胞に存在するようなインスリン又はインスリン変異体コード化核酸とは区別される。しかしながら、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、インスリン又はインスリン変異体コード化核酸分子を含み、例えば核酸分子がそれぞれ天然の細胞のものとは異なる染色体位置にあるこのような分子を通常発現する細胞を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００５３】  
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において0.015Mの塩化ナトリウム／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン／0.1%フィコール／0.1%のポリビニルピロリドン／50mMのｐＨ６．５のリン酸ナトリウム緩衝液、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における50%ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、0.075Mのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、0.1%のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（50μg/ml）、0.1%ＳＤＳ、及び10%のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での50%ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び20μg/mLの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００５４】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とする融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
本発明のポリペプチドの変異体の意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生インスリンポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性特性を保持する本発明のタンパク質の形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生インスリンによって生ずる（阻害性又は刺激性の）機能であって、本発明の天然又は天然発生ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成を誘発する能力を除く。同様に、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成を誘発する能力を意味する。
ここに開示する抗体又はスクリーニングアッセイで同定できる他の分子（例えば、有機又は無機小分子、ペプチドなど）における「生物学的活性」は、軟骨の再生及び／又は破壊防止を促進するこのような分子の能力に関して使用される。場合によっては、軟骨は関節軟骨であり、軟骨の再生及び／又は破壊は外傷又は軟骨疾患に関する。例えば、生物学的活性は、関節軟骨からのプロテオグリカン（ＰＧ）放出の抑制、関節軟骨でのＰＧ合成の増加、ＮＯの生成の抑制等により定量されうる。
「小分子」とは、ここで、約６００ダルトン未満の分子量を持つと定義され、一般に有機化合物である。
本発明の様々なポリペプチドに関して言う場合の「単離された」とは、その自然環境の成分から同定、分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００５５】
ここで使用される「標識」という語は、化合物、例えば抗体又はポリペプチドに直接的又は間接的に結合して「標識された」化合物を生成する、検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。それに対し「使用説明書」という語は、ここで使用されるように必要とする方法に応じて使用を指示した容器の包装に添付される言葉を意味する。
「固相」とは、当該発明の化合物が付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。ある実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬剤（例えばここで開示されるインスリン及びインスリン変異体）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
この出願で用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」、例えばレセプター、リガンド、又は酵素）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリン、並びにその任意のサブクラス又はアイソタイプから得ることができる。
【００５６】
「徐放性の」又は「持続性の」製剤という用語は、最も広く可能な意味において、持続した又は延長した時間−即ち少なくともポリペプチドが天然のもしくは製剤化されない状態でインビボで役立つように調製された場合よりも長い期間、活性ポリペプチドの放出又は活性化を生じる、活性なインスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの製剤を意味する。場合によっては、徐放性の製剤は、一定の割合で存在し、及び／又は結果的に、持続した及び／又は活性ポリペプチドの持続した濃度を生じさせる。適切な徐放性製剤は、微小カプセル化、固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクス、生物分解性ポリマー、生物分解性ヒドロゲル、懸濁液又は乳濁液（例えば、水中油型又は油中水型）を含んでもよい。場合によっては、徐放性製剤は、乳酸−グリコール酸共重合ポリマー（ＰＬＧＡ）を含み、Lewis による「Controlled Release of Bioactive Agents form Lactide/Glycolide polymer,」in Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems M. Chasin & R. Langeer, Ed.(Marcel Dekker, New York), pp.1-41中に記載されるようにして調製される。選択により、徐放性製剤は安定で、インスリン又はインスリン変異体の活性は保存期間中ほとんど減少しない。さらに特別には、このような安定性は、水溶性多価金属塩などの安定化剤の存在を通して増強され得る。
ALIGN-2配列比較コンピュータプログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供される。このソースコードは、通常ALIGN-2配列比較プログラムを提供するUNIX（登録商標）オペレーティングシステムのためにコンパイルされる。
下記の表２−５には、下記の方法を用いて、ALINE-2配列比較コンピュータプログラムを用いた％アミノ酸配列同一性（表２−３）及び％核酸同一性（表４−５）を決定した仮定される例示であり、ここで「ＰＲＯ」は対象とする本発明の仮説的ペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は本発明の「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」は対象となる仮説的「ＰＲＯ」コード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は対象となる「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸分子の核酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」はそれぞれ異なる仮説的アミノ酸残基を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」はそれぞれ異なった仮説的核酸残基を表す。
【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
ＩＩ．本発明の実施の方法
Ａ．関節軟骨外植片アッセイ
本アッセイにおいて、無傷の軟骨におけるテスト化合物の合成的及び予防的可能性について記述する。このために、プロテオグリカン（ＰＧ）の合成及び分解、並びに一酸化窒素の放出が処理関節軟骨移植片において測定される。プロテオグリカンは、関節軟骨中二番目に大きな有機材料成分である（Kuettner, K.E.等、Articular  Cartilage  Biochemistry. Raven  Press,  New York, USA (1986), p.456；Muir, H., Biochem. Soc. Tran. 11:613-622 (1983)；Hardingham, T. E., Biochem . Soc. Trans. 9;489-497 (1981)）。プロテオグリカンは軟骨の物理的及び化学的性質を決定するのに役立つため、関節の分解の間に生じる軟骨ＰＧｓの減少は、圧縮されたこわばり及び弾性の喪失、水力の透過性の増大、増加した水分含量（膨張）、及びコラーゲンなど他の細胞外組織の変化を導く。従って、ＰＧの喪失は、変性軟骨性疾患の進行の初期段階であり、さらに関節の生体力学的及び生化学的安定性を混乱させる。関節軟骨のＰＧｓは、骨格成長及び疾病における有望な役割により、広く研究されてきた。Mow, V.C., & Ratcliffe, A.Biomaterials 13:67-97 (1992)。病気に罹った関節で増大するプロテオグリカンの分解は、ここで記述されるアッセイにおいて比色定量ＤＭＭＢアッセイを用いて外植片培地中でＰＧｓを定量することにより測定される。Farndale及びButtle, Biochem. Biophys. Acta 883:173-177 (1985)。プロテオグリカンへの３５Ｓ-硫酸塩の取り込みは、プロテオグリカン合成の指標として使用される。
ＩＬ-１αと変成軟骨性疾病が連関するという証拠は事実である。例えば、高レベルのインターロイキン-１α（ＩＬ-１α）（Pelletier JP等、”Cytokines and inflammation in cartilage degradation” in Osteoarthritic Edition of Rheumatic Disease Clinics of North America, Eds. RW Moskowitz, Philadelphia. W.D., Saunders Company, 1993, p.545-568)及びＩＬ-１レセプター(Martel-Pelletier等、Arthritis Rheum. 35:530-540 (1992)が病気に罹った関節において見いだされており、ＩＬ-１αが軟骨マトリクスの分解を誘導し、新たなマトリクス分子の合成を阻害する。Baragi等、J. Clin. Invest. 96:2454-60 (1995)；Baragi等、Osteoarthritis Cartilage 5:275-82 (1997)；Evans等、J. Leukoc. Biol. 64:55-61 (1998)；Evans等、J. Rheumatol. 24:2061-63 (1997)；Kang等、Biochem. Soc. Trans. 25:533-37 (1997)；Kang等、Osteoarthritis Cartilage 5:139-43 (1997)。ＩＬ-１αと疾患との関連性のために、ＩＬ-１αの存在下においてもテスト化合物をアッセイする。軟骨にポジティブな影響を持つだけでなく、ＩＬ-１αの異化作用を妨害するテスト化合物の能力は、テスト化合物によって示される保護的効果の強力な証拠である。さらに、ＩＬ-１α機能の拮抗作用が変成軟骨関節炎の進行を抑えることが示されているため、このような活性はテスト化合物が関節炎の状態で生じる分解を阻害し得ることを示唆する。Arend, W.P.等、Ann. Rev. Immunol. 16：27-55（1998）。
【００７９】
一酸化窒素（ＮＯ）の生産は、ＩＬ-１などの異化作用的サイトカインにより軟骨中で誘発され得る。Palmer, RMJ等、Biochem. Biophys. Res. Commun. 193:398-405 (1993)。また、ＮＯは関節炎の状態で生じる関節破壊にも関与してきた。Ashok等、Curr. Opin. Rheum. 10:263-268 (1998)。正常な（病気ではない又は負傷していない）軟骨とは異なり、インターロイキン-１又はリポ多糖類（ＬＰＳ）などの付加刺激の非存在下でも、骨関節炎の軟骨はエクスヴィボにおいて有意な量の一酸化窒素を生産する。インビボ動物モデルにより、酸化窒素生成の阻害は関節炎の進行を和らげることが示唆された。Pelletier, JP等, Arthritis Rheum. 7: 1275-86(1998)。インヴィトロにおいて、一酸化窒素は軟骨細胞の機能に対し、コラーゲン及びプロテオグリカンの合成阻害、亢進されたアポトーシス及び細胞外マトリクスへの接着阻害を含む有害な影響を及ぼす。亜硝酸の濃度は、リウマチ様関節炎の患者の液よりも変成軟骨関節炎の患者の関節液中において高いことが示されている。Renoux等、Osteoarthritis Cartilage 4:175-179 (1996)。さらに、動物モデルは、一酸化窒素の生産の阻害は、関節炎の進行を抑えることを示唆する。Pelletier, J.P.等、Arthritis Rheum 7:1275-86 (1998)；van de Loo等、Arthritis Rheum. 41:634-46 (1998)；Stichtenoth, D.O.及びFrolich J.C. Br. J. Rheumatol. 37:246-57 (1998)。また、ＮＯは他の細胞にも影響を及ぼすため、関節中のＮＯの存在は、血管拡張及び透過率を増大させ、白血球によるサイトカインの放出を強化し、血管形成活性を刺激する。従って、軟骨によるＮＯの生産は、疾病の状態と相関し、ＮＯは、関節疾病の腐食性及び炎症性の成分の両方において役割を演じるようであるため、一酸化窒素の生産を減少させる因子は、変成軟骨疾患の治療に対して有益であると思われる。
ここで記述されるアッセイは、２,３-ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）が、定量可能な蛍光産物である１-(Ｈ)-ナフトトリアゾールを形成する酸性条件下で亜硝酸塩と反応する原理に基づいている。ＮＯは亜硝酸塩（ＮＯ２-1）及び硝酸塩（ＮＯ３-1）へと代謝されるため、亜硝酸塩の検出は軟骨組織で（たとえカウント値以下であっても）実際に生産されたＮＯを検出する手段の一つである。
用いられる方法は、実施例のより詳細に記載される。
【００８０】
Ｂ．無血清培地での軟骨細胞の維持
この方法において、血清又は他の成長因子無しの培地で軟骨細胞の生存を促進、助長又は維持するための試験化合物の能力が試験される。関節軟骨細胞は、まず細胞外マトリックスの除去により作成され、単層で培養され、マトリックスが枯渇した時に軟骨疾患の後期ステージに近似すると思われる。
アッセイは、黄テトラゾリウム塩ＭＴＴを切断して紫のホルマザン結晶を形成する生細胞の能力に基づいて培養される細胞の代謝活性を測定する比色分析アッセイである。この細胞性還元反応は、ピリジンヌクレオチド補助因子ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに関係する。Berridge, M.V. & Tan, A.S., Arch. Biochem. Biophys. 303: 474(1993)。可溶化した生成物は、ＥＬＩＳＡリーダーで分光光度的に定量される。方法は実施例により詳細に説明される。
【００８１】
Ｃ．マウス膝蓋骨アッセイ
本実験はマウスの膝蓋骨（膝頭）におけるプロテオグリカンの合成に対するテスト化合物の影響を調べる。本アッセイは無傷の軟骨（骨の下の存在するものも含める）、従って、インヴィボの軟骨環境に近い条件下のテスト因子を用いる。化合物は、インヴィトロにおいて膝蓋骨に添加されるか、又はエクスヴィボでの膝蓋骨におけるプロテオグリカンの合成を分析する前にインヴィボにて膝関節へインジェクトされるかのいずれかである。以前示されたように、インヴィボで処理された膝蓋骨はエクスヴィボでのＰＧ合成において明らかな変化を示す。（Van den Berg等、Rheum. Int. 1:165-9 (1982)；Vershure. P.J.等、Ann. Rheum. Dis. 53:455-460 (1994)；及びVan de Loo等、Arthrit. Rheum. 38:164-172 (1995)。本モデルにおいて、各動物の対側の関節はコントロールとして使用できる。方法は、実施例において極めて詳細に記述している。
【００８２】
Ｄ．モルモットモデル
これらの試験は、膝の骨関節炎（ＯＡ）を自然に生じるモルモットの系統、Dunkin Hartley (DH)からの関節軟骨移植片においてＰＧ合成の促進及びＰＧ放出の抑制の両方に対するテスト化合物の影響を測定する。関節破壊の急速な進行を引き起こす多くの他の動物モデルは、徐々に進行するヒト１次ＯＡよりも２次ＯＡに類似している。対照的にＤＨモルモットは、自然発生的なゆっくりとした進行の非炎症性ＯＡ様変化を有する。これらモルモットの軟骨破壊の高い再現性のあるパターンは、ヒトの疾患に見られるものと似ているので、ＤＨモルモットは骨関節炎のためのよく知られた動物モデルである。Young等、”Osteoarthrits”, Spontaneous animal models of human disease vol.2, pp.257-261, Acad. Press. Ney York. (1979)；Bendele等、Arthritis Rheum. 34:1180-1184；Bendele等、Arthritis Rheum. 31:561-565 (1988)；Jimenez等、Laboratory Animal Science vol.47(6):598-601 (1997)。初めに、これらの動物モデルは最小の組織学的変化の存在により検出可能な軽いＯＡを発症する。しかしながら、疾病は進行し、16-18月齢までに関節での中程度から重篤な軟骨変成が観察される（図８）。
結果として、ＤＨモルモットの軟骨マトリックスでの病気の進行を超える試験化合物の効果は、関節破壊の異なるステージでＯＡの治療に化合物が治療的効果を有することの示唆となった。
方法は実施例により詳細に説明される。
【００８３】
Ｅ．糖尿病マウスモデル
糖尿病に関係する代謝の変化は、罹患した生物の他の多くの器官及び筋骨格システムに影響する。例えば、ヒトにおいて、筋骨格の損傷及び疾患の発生は、糖尿病になると増加し、糖尿病は関節炎進行の危険要因であるとされる。
糖尿病に類似した病理現象はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与により動物に誘発させることができる。Portha B. 等, Diabete Metab. 15: 61-75(1989)。インスリンを産生する膵臓細胞の死滅によって、ＳＴＺは処置した動物の血清インスリンの量を減少させる。ＳＴＺ誘発性糖尿病は、皮膚、骨及び軟骨を含む結合組織の萎縮に関連し、コラーゲン含量を低下させる。Craig, R.G.等, Biochim. Biophys. Acta 1402: 250-260(1998)。
この方法において、処置したＳＴＺ処理マウスの膝蓋骨を試験化合物の存在下でインキュベートし、結果的なマトリックス合成を分析する。未処理コントロールに対して、ＰＧ合成のレベルを増加又は回復する試験化合物の能力は、治療的潜在性を示唆する。方法は実施例でより詳細に説明する。
【００８４】
Ｆ．高分子微粒子のような徐放性処方
間欠注射は、通常患者によく許容され、現在治療学的に１回／週の注入が臨床的に試験されているが、理想的な薬剤は限られた投与回数が要求されるものでありうる。しかしながら、活性な化合物が不安定である、あるいは物理学的な条件で素早く低下してしまう場合には、安定して徐々に放出される処方が非常に望まれる。
実施例６−８により詳細に記載されるようなこれらの実験は、（１）大きさ、タンパク質負荷及び物理的完全性；（２）徐放性マトリックスからの試験化合物の放出特性；及び（３）徐放性マトリックスからの放出後の試験化合物の生物学的活性によって示されるような試験化合物の徐放性処方の有効性を試験する。
これらの方法は異化の実施例でより詳細に説明される。
【００８５】
１．物理学的特性
いくつかの環境下で、第１に徐放性型への組み込みの前に、試験化合物を他の複合した又は安定した薬剤で安定化することを必要とされ、あるいは所望されうる。例えば、本発明のヒトインスリン（ＨＩ）の粒状化合物は軟骨疾患の治療において非常に効果的であることが明らかであるが、中性の条件において低濃度で長期間保存された場合に不安定である。J. Brenge及びL. Langkjoer, Insulin Formulation and Deliverry in Protein Delivery, Eds, L.M. Sanders及びW. Hendren, Plenum Press, 1997。更にＨＩは体内で素早く消失し、ヒトの体においてたった５分の半減期を有する。Hadley, ME, Endocrinology, Prentice-Hall, Inc. 1988。
ＨＩを処方したものの短命及び不安定であるという問題の１つの可能性のある解決策としては、亜鉛と共に処方することである。やや溶けにくい酢酸亜鉛：ＨＩ処方は、インスリンが亜鉛との複合物において膵臓で貯蔵されるということ示唆する組織化学的証拠に基づき、他で試みている。Eli Lilly, Indianapolis, IN; J. Brenge 及びL. Langkjoir, 上掲; Hadley, 上掲。他の証拠としては、亜鉛と複合したＨＩが、複合していない物質に比較して凝結に対する耐性が高まり、活性の開始が遅れ、長時間持続することが示されている。J. Brenge & L. Langkjoir, 上掲。
この方法に記載される徐放性処方は、Gombotz等, U.S.5,019,400及びJohnson等, Nature Med., 2: 795-799 (1996)に記載されるような方法を用いたポリ乳酸コグリコール酸（ＰＬＧＡ）マトリックスへの噴霧凍結乾燥化合物のマイクロカプセル化を含む。
この方法では、徐放性組成物の試験化合物の量を化学分析により測定し、組成物から回収可能な試験物質の物理的及び生物学的完全性をサイズ排除（ＳＥＣ）及び逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）により測定する。
２．放出特性
この方法では、インスリンを詰めたＰＬＧＡミクロスフェアを３つの異なる条件でインキュベートし、回収したタンパク質をいくつかの時点で活性を分析した。この徐放性システムでは、試験化合物は水酸化ナトリウム及び／又はヒスチジン緩衝液で処理することによりミクロスフェアから放出される。また、より適した物理学的条件において、ミクロスフェアを滑液又は関節軟骨外植片の何れかでインキュベートした。
ミクロスフェアからの試験化合物の放出は、試験化合物の存在及び／又は活性の分析に使用される任意の方法で測定される。例えば、ＨＩでの適した技術は、インスリンレセプターを発現する細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のインスリンレセプターキナーゼアッセイ（ＫＩＲＡ）の使用である。
３．生物学的活性
この方法において、微小カプセルから放出される試験化合物の生物学的活性が測定される。最終章の方法は一般常識における試験化合物の生物学的活性の測定法であるが、放出した試験化合物には関節軟骨で特定の所望される生物学的活性（例えば、マトリックス合成の促進及びマトリックス分解の抑制）も残っていることを確認することが重要である。
【００８６】
Ｇ．ヒト関節軟骨外植片アッセイ
上記と同様の方法において、組織供給源がヒトであること以外は、関節軟骨外植片アッセイ下で、この方法が試験分子の同化作用効果を測定する。方法は実施例９により詳細に説明する。
【００８７】
ＩＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．全長インスリン及び／又はその変異体
本発明は、軟骨の再生及び／又は破壊の予防を含む、軟骨疾患を治療するインスリン及びインスリン変異体ポリぺプチドを用いた新規な方法の一部を提供する。特に、インスリン及びインスリン変異体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定、単離し軟骨疾患の治療におけるそれらの使用をここに開示する。インスリンは、よく知られた分子であり、組み換えヒトインスリンはLilly、Novo-Nordisk、及びSigmaを含む多くの企業から速やかに入手可能である。あるいは、本発明での使用のためのインスリン及びインスリン変異体分子は、配列番号：１及び２（図１８Ａ及び１８Ｂ）として同定されたポリペプチドの配列から既知の技術で得られうる。
天然ヒトインスリンは２つのペプチド鎖、２１のアミノ酸を含むＡ鎖（配列番号：１）及び３０のアミノ酸残基を含むＢ鎖（配列番号：２）を有する。２つの鎖は、２つのシステイニル残基から形成される３つのジスルフィド結合を含む。２つのブリッジは、残基Ａ７−Ｂ７及びＡ-２０−Ｂ-１９の間の鎖間ブリッジであり、他は、残基Ａ-６−Ａ-１１（図１７Ａ-Ｂ）の間の鎖内ブリッジである。
【００８８】
インスリンは、Ａ及びＢ鎖の個々の発現の後、ジスルフィド結合を形成する折り畳み反応を生じうる。Chance等, Diabetes Care 4:147-154(1982)。これらの鎖はβガラクトシダーゼ融合タンパク質として大腸菌で発現されうる。Williams等, Science 215(5):687-689(1982)。離れた鎖（Ｓ-スルホン化型）をメルカプタンの存在下で組み合わせて活性分子を得ることができる。Goeddel等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76(1): 106-110(1979)。大きいβ-ｇａｌ融合タンパク質（即ち、１０００アミノ酸を超える）のために、リボソームからの早すぎる分離がしばしば生じ、その結果不完全なインスリン翻訳となる。Burnett, Experimental Manipulation of Gene Expression, Inoue, Ed. Academic Press, New York, pp 259-277(1983)。この方法の改善点は、β-ｇａｌ発現システムのｌａｃオペロンの部分におけるトリプトファン（Trp）オペロンの使用にある。Hall, Invisible Frontiers -- The Race to Synthesize a Huan Gene, Atlantic Monthly Press, New York, (1987)。Trpオペロンはトリプトファン同化に対する反応能力のある酵素を連続的に合成する５つの細菌性遺伝子の並びである。Trpオペロンは、いくつかの利点を提供する；（１）TrpＥは、β-ｇａｌ酵素（１０００）に比較してたった約１９０のアミノ酸残基しか持たず、従って早すぎる鎖終結の確率が飛躍的に減少し；（２）TrpＥ遺伝子は、融合タンパク質の発現を増加して、ｌａｃ（即ち、β-ｇａｌ）システムに比較して１０倍優れた発現を生じ；（３）Trpオペロンは、発酵媒体のトリプトファンが不足している場合に活性化され、従って、発現は宿主細胞集団を最大限の発酵媒体のトリプトファン不足にした場合に開始される。発酵が完全である場合、タンパク質は細胞壁の崩壊と封入体の復元により回収され、続いてＡ又はＢ鎖放出のためのＣＮＢｒ切断を行い、更にイオン交換、サイズ排除及び逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製して、純粋な組み換え産物を得る。Frank及びChase, Munch Med. Wschr. 125(補足1); 514-520(1983)。
【００８９】
インスリンを生成する一般的な他の方法は、プロインスリンの生成に関する。天然配列プロインスリン（配列番号：３）（図１８Ｃ）は、インスリンＡ鎖のＮ末端がインスリンＢ鎖のＣ末端と結合しているペプチドを通して繋がっている１本鎖ポリペプチドであり、適したシステイニル残基がジスルフィド結合で結ばれている。ヒト天然配列プロインスリンは８６のアミノ酸残基を有し、その３５が結合ペプチドをなし、それは時にＣぺプチドとして知られている（配列番号：４）（図１８Ｄ）。Yanaihara等, Diabetes 27(補足1):149-160(1978)。Ｃペプチドの第１に重要なことは、２つの隣接した塩基性アミノ酸の部位での適切なジスルフィド結合の形成及び／又はトリプシン様プロセッシングを促進する。Bell等, Nature 284:26-32(1980); Thim等, PNAS 83: 6766-6770(1986)。この結合ペプチドは酵素性の消化に依って除去される。W. Kemmler等, J. Biol. Chem.246:6786(1971)。
プロインスリンの生成はKroeff等, J. Chromatogr. 481:45-61(1989)に記載されている。発現は、導入されるプラスミドベクターの細菌性遺伝子にメチオニン遺伝子及びプロインスリン遺伝子に結合することにより大腸菌で行われる。次いでプロインスリンをメチオニンリンカーの破壊により細菌性タンパク質から離して、折り畳み、Ｃペプチドを取り除いて活性インスリンを回収する。
【００９０】
Ｃペプチドの修飾を有する多くのプロインスリン変異体の作成が試みられている。例えば、EP704,527は、少なくとも１つのＮグリコシル化部位、好ましくは-Asn-Ｘ-Ser-を含む任意のペプチドの使用を記載している。付加したＣペプチド変異体は２〜３５アミノ酸（DK-A-5284/87）、又は単なる-Lys-Arg-のジペプチド（EP-A-195-691）を含む。他のＣペプチド変異体は、少なくとも１つのタンパク質分解性切断部位、好ましくは-ＫＲ-Ｘ-ＫＲ-（配列番号：５）、-ＫＲ-Ｘ-Ｍ-（配列番号：６）又は-Ｎ-Ｘ-ＫＲ-（配列番号：７）での含有のみが記載され、ここで、Ｘは、宿主酵母細胞による切断及びプロセッシングを促進する残基の任意の鎖である。宿主プロセッシングの利点は、成熟形態に達するために消化及び精製の段階を通してプロインスリンをプロセッシングする必要が排除又は減少されることである。他のＣペプチド修飾は、残基Arg３２からGlu３５、Arg３２からAsp３６、Arg３２からGlu３５又はArg３２からGly６０の欠失を含み、突然変異体Pseudomonas Fragi（WO86/01540）から産生される部位特異的プロテアーゼにに感受性のある前駆体が与えられる。他の方法は、結合した分子-Ｘ-Ｙ-を含み、ここで、ＸはＡ１のαアミノ基に、及びＢ-２９のεアミノ基又はＢ-３０のカルボキシル基の何れかに対して一部結合し、Ａ又はＢ何れかのインスリン鎖の破壊なしに酵素的又は化学的に切断可能であり、ＹはLys-Ｂ３０であり、Ｂ３０はAla、Thr又はSerである。（U.S. 4,430,266）。
他の発現方法は、Ｃペプチドを完全に欠失し、短くしたＢ鎖（Ｂ１-２９−カルボキシルAla残基欠失）を含み、Ｃ末端で完全なＡ鎖（Ａ１-２１）のＮ末端で結合しているペプチドとして変異体「プロインスリン」を発現する。あるいは、Ｃペプチドは、２つの隣接した塩基性アミノ酸、例えば-Ser-Lys-又は-Ala-Ala-Lys-（EP-A-427-296）、あるいは-Arg-Arg-Gly-Ser-Lys-Arg-（配列番号：８）又は-Arg-Arg-（EP055,945）、あるいは-Arg-又は-Lys-Arg-（WO96/20724）がない限り１-３０の残基でありうる。
様々な他の方法は、メチオニンとコード配列の間にアミノ酸残基（例えば、Ala、Arg、Gln、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Try又はVal）の挿入を含む原核宿主での発現レベルの増加を用いたものである（EP0534705）。酵母でのｇａｓ-１の非活性化に比例するＧＰＩ融合タンパク質の生成を含む生成のスキームがWO95/22614、EP324,274、EP557,976に記載されている。
【００９１】
最後に、抗糖尿病活性を有する多くの成熟インスリン変異体による多くの技術がある。例えば、E.P.0544466はAla、Arg、Asn、Cys、Gly、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr又はValからそれぞれ選択される残基Ｂ３及びＡ２１とHis、Asp又はGluであるＢ１０の組み合わせを有する変異体を記載している。例えば、Ａ２１は  Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Cys、Gly、Thr又はSerから選択され；Ｂ１０はHis又はAsnであり；Ｂ２８は任意の天然に生じるアミノ酸であり；Ｂ２９はPro、ヒドロキシプロであり；Ｂ３０はAla、Thr又は欠失であり；及びＸ-Ｙ-Ｚは、Ｚが-ＯＨ、メトキシ又はエトキシであり、ＸがArg、Arg-Arg、Lys、Lys-Lys、Arg-Lys、Lys-Arg又は欠失であり、及びＹはＸが存在している場合にのみ存在し、Glu又は配列 -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser -Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Gly-Gly-Ser-Leu-（配列番号：９）の任意の断片である。WO95/07931は残基Ａ２１及びＢ３がそれぞれLys、Arg及びCys以外の任意の天然アミノ酸であり、Ｂ１がPhe又は欠失であり、Ｂ３０は欠失又はＢ２９のεアミノ基に親油性の置換を有するLys、Arg又はCys以外の任意の天然アミノ酸である変異体が記載されている。Ｂ３０はまた、Ｂ２９のεアミノ基に結合した５つまでの炭素原子を有するアシル基を有する１０〜２４の炭素原子を有するコードできない親油性アミノ酸により置換されうる。EP0214826は、次の１−７が同じ又は異なる残基で置換されて成熟分子を中性でヒトインスリンのもの：Ａ９-１０、Ａ１３、Ａ２１、Ｂ１-２、Ｂ５、Ｂ９-１０、Ｂ１２、Ｂ１４、Ｂ１６-１８、Ｂ２０、Ｂ２６-２８と同じ電荷又はより負電荷にしたインスリン変異体を記載している。RD365030（調査開示、１９９４年９月）は、トリプシン活性化切断せずにAchromobacter lyticus由来のリシル特異的エンドペプチダーゼによってプロインスリンを活性型に転換させるために、残基２８でのAspからProへの置換、及びＢ３０の欠失を開示している。WO89/10937は、一又は複数のAsp又はGln残基（例えば、Ａ５、Ａ１５、Ｂ４）が他の天然発生アミノ酸によって置換された変異体が開示されている。EP0375437には、正電荷のアミノ酸（即ち、Lys又はArg）がＢ２８の位置で置換され、あるいは残基Ｂ２４、Ｂ２５、Ｂ２６、Ｂ２７又はＢ２８の欠失により新しいＢ２８残基が正電荷になったインスリン変異体を開示している。U.S.5,656,722は、残基Ａ２１がGly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Asp、Glu、Cys、Met、Arg、Lys、His、Tyr、Phe、Trp、Proであり；Ｂ１が無いか又はPheであり、Ｂ１０が任意の天然に生じるアミノ酸（好ましくはAsn又はGln）であり；Ｂ３０が中性のアミノ酸（例えば、Ala、Ser、Thr）であり；Ｂ３１が１−３の塩基性αアミノ酸（例えばArg、Lys、Hyl、Orn、Cit、His）からなる５０までの炭素原子を有する塩基性有機基である、長い活性を有するインスリン変異体を開示している。遅延した開始は、塩基性基により引き起こされる等電点での不足した溶解度に依ると考えられる。これらの分子は、塩基性基の酵素切断（例えば、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、エステラーゼ）により活性になる。これらの分子の更なる変形としては、U.S.P.5,506,302に塩基性残基アルギニンをＡ１グリシン残基のＮ末端に置くことが記載されている。E.P.0519750は、残基Ｂ１０でのAsp置換とＢ２７−３０又はＢ２���−３０の欠失の組み合わせを有すし、場合によっては残基Ａ２１のAsn、Asp、Glu、Gln、Ala、Gly又はSerでの、残基Ｂ１のPhe又はAspでの、又は残基Ｂ３のAsn又はAspでの置換を含んでいてもよいインスリン変異体が開示されている。
【００９２】
最後に、次の分子が抗糖尿病活性を有するとして記載されている：
（１）  GIVEQ(C)1(C)2TSI(C)1SLYQLENY(C)3N（配列番号：１０）
FVNQHL(C)2GSHLVEALTLV(C)3GERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLX（配列番号：１１）、ここで下付はジスルフィド結合の場所を示し、Ｘは存在又は不存在であり、存在している場合にはALEGSLQ（配列番号：１２）又はALEGSLQKR（配列番号：１３）である（EP0171886）；
（２）  EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR-GIVEQ(C)1(C)2TSICSLYQLENY(C)3N（配列番号：１４）
FVNQHL(C)2GSHLVEALYLV(C)3GE-RGFFYTPKT-(RR)n、ここでｎは１（配列番号：１５）又は０（配列番号：１６）（E.P171,147）、ここで下付はジスルフィド結合の場所を表し；又は
（３）  ALEGSLQKRGIVEQ(C)1(C)2TSI(C)1SLYQLENY(C)3N（配列番号：１７）FVNQHL(C)2GSHLVEALYLV(C)3GERGFFYTPKTX、ここで下付はジスルフィド結合の場所を表し（EP171,887）、及びXは存在又は不存在（配列番号：１８）であり、存在する場合には、-R-R又は-RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPL（配列番号：１９）である。
亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）の存在下では、天然ヒトインスリンは、モノマー及び３つの水分子のそれぞれのＨＢ１０に８面的に配位した２つのＺｎ原子を有する六量体に結合している。Blundell等, Adv. Protein Chem.26:279-402(1972)、Baker等, Philos. Trans. R. Soc. London B319, 369-456(1988)。従って結合するＺｎ２＋はアロステリックな高次構造上の変化を引き起こす。
【００９３】
フェノールリガンド又は特定の分子は高次構造上の変化を含む可能性があり、Ｂ鎖のＮ末端の８つのアミノ酸においてαヘリクッスから変化し、構造が伸びた状態になる。この高次構造上の変化は、小さい陰イオン性リガンド、つまりＣｌ１−イオンにより占められていた第４の溶解性の近接可能な部位及びモノマーのそれぞれのＨＢ１０に２つのＺｎ原子を８面的に配位させる、Brader＆Dunn, TIBS 16:341-345(1991)。フェノールリガンドに誘導される高次構造状態はＲステート、高次構造になる前の形態をＴステートと称される。Monod等, J. Mol. Biol. 12:88-118(1965)。Ｒステートは、Ｔステートと比較してよりコンパクトでより低い柔軟性を有し、Ｚｎがより緊密に結合している。Derewenda等, Nature 338:594-596(1989)。Ｔ及びＲアロステリック高次構造の間のインスリンの変化は３０Åを超える距離、アロステリック形質転換には非常に大きい距離のＢ(１)α炭素の移動に関係する。
フェノールリガンドの存在による高次構造上の変化は、保存安定性の増大に影響する。Brange等, Pharm. Res. 9:715-726(1992); Brange等, Pharm. Res. 9:727-734(1992); Brange＆Langkjaer, Acta Pharm. Nord. 4:149-158(1992)。なぜ保存安定性が増大するのかのを説明した１つの説は、熱力学モデルを通して変性の平衡定数Ｋｅｑによりインスリン分解を説明している。Brems等, Protein Engineering 5:519-525(1992)。この[U]/[N]の平衡定数は反応Ｎ←→Ｕから決定され、ここでＮは天然でありＵは変性した高次構造のインスリンである。Ｒステートはより詰まっていて柔軟性の無い高次構造であり、Ｚｎがより緊密に結合し、Ｒステートはまた、最も分解から保護されることが予測される。
インスリンの吸収率は、自己会合の解離定数に直接関係する。Brange等, Diabetes Care 13:923-954(1990)。実際に吸収されるインスリンの形態は単量体であると考えられ、解離率は律速段階である。Binder, C., Artifitial Systems for Insulin Delivery, Bunetti等, Eds, Raven Press, N.Y., 53-57(1983)。更に、単量体インスリンは素早く吸収され、急速な時間活性特徴を示す。Brange等, Curr. Opin. Struct. Biol.1:934-940(1991); DiMarchi等, Peptides: Chemistry and Biology, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium, ESCOM, Leiden, pp. 26-28(1992)。従って、Ｚｎ及び／又は他のフェノール類の存在は、Ｚｎインスリン六量体の解離を延期させ、有効期間が増加する。しかしながら、インスリンは、GluＢ１３をGlnＢ１３に置換することにより亜鉛の存在しない六量体中に誘導させることができる。Gentley等, Mol. Biol.228:1163-1176。更に、六量体はまた、インスリンを欠く場合には、Ｂ鎖の１位にあるアスパラギン酸、場合によってはＢ１３位にあるグルタミンの置換により誘導される（WO96/04307）。
【００９４】
Ｂ．インスリン変異体
ここに記載した全長天然配列インスリンポリペプチドに加えて、インスリン変異体も調製できると考えられる。構成比の変化は活性の直接的な変化に影響しないが、用語「インスリン変異体」はポリペプチド配列の変化及び／又は修飾を包含することを明確に意図する。構成比の修飾の検討は、下記の章「Ｅ．製薬組成物及び投与量」に示す。インスリンの他の構成比又は配列変化は、理論上ではインスリン変異体のプロセッシング及び／又は細胞内輸送を変化させ、レセプターへの結合及び／又はタンパク質の安定性を改善する等がある。従って、このような変化は、天然の分子に対してインスリン変異体の生物活性を究極的に改善することができる。
インスリンのアミノ酸配列又はここに記載したインスリンポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列インスリンポリペプチドと比較してポリペプチドのアミノ酸配列が変化するインスリンポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のインスリンポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、インスリンポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。
【００９５】
インスリンポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
インスリンの断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるインスリン断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ポリペプチド断片は、図１８Ａ及び１８Ｂ（配列番号：１−２）に示すインスリンＡ鎖及びＢ鎖ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表Ｉに示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００９６】
表６
元の残基             例示的置換              好ましい置換
Ala(A)               val; Leu; ile                val
Arg(R)               lys; gln; asn                lys
Asn(N)               gln; his; lys; arg           gln
Asp(D)               glu                          glu
Cys(C)               ser                          ser
Gln(Q)               asn                          asn
Glu(E)               asp                          asp
Gly(G)               pro; ala                     ala
His(H)               asn; gln; lys; arg           arg
Ile(I)               leu; val; met; ala; phe;
ノルロイシン                 leu
Leu(L)               ノルロイシン; ile; val;
met; ala; phe                ile
Lys(K)               arg; gln; asn                arg
Met(M)               leu; phe; ile                leu
Phe(F)               leu; val; ile; ala; tyr      leu
Pro(P)               ala                          ala
Ser(S)               thr                          thr
Thr(T)               ser                          ser
Trp(W)               tyr; phe                     tyr
Tyr(Y)               trp; phe; thr; ser           phe
Val(V)               ile; leu; met; phe;
ala; ノルロイシン            leu
【００９７】
本発明ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発、Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)、カセット突然変異誘発、Wells等, Gene, 34: 315 (1985)、制限的選択突然変異誘発、Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である。Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085(1989)。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い。Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソステリック(isosteric)アミノ酸を用いることができる。
【００９８】
Ｃ．インスリン及びインスリン変異体の修飾
インスリン及び／又はインスリン変異体ポリペプチドの共有結合的修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、分子の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えば分子を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗インスリン又は抗インスリン変異体抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman及びCo., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００９９】
本発明のポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列に見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ポリペプチド（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【０１００】
共有結合的修飾の他の型は、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうち一つに、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で本発明ポリペプチドを結合することを含む。
また、本発明で使用されるインスリン及び／又はインスリン変異体ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した本発明のポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような本発明のポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって本発明のポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体、Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体、Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド、Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)；ＫＴ３エピトープペプチド、Martin等, Science, 255:192-194 (1992)；α-チューブリンエピトープペプチド、Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ、Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子は免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域と本発明のポリペプチドとの融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【０１０１】
Ｄ．インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、インスリン又はインスリン変異体核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりインスリン及びインスリン変異体ポリペプチドを生産する方法に関する。また、当該分野においてよく知られている他の方法は、このようなポリペプチドの調製に使用することができる。例えば、配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい（例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照）。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドを生産してもよい。
【０１０２】
１．本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
インスリン又はインスリン変異体をコードするＤＮＡは、インスリン又はインスリン変異体ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトインスリン又はインスリン変異体ＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またインスリン又はインスリン変異体-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のインスリン及び／又はインスリン変異体ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである。Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)。
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリスクリーニング法において同定された配列は、GenBank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、相同性を測定するための様々なアルゴリズムを使用するＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いて配列アラインメントにより決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【０１０３】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、インスリン又はインスリン変異体生産のためのここに記載した発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法は、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションを含む。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換がなされる。一般的に上掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は頑丈な細胞壁を有する他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、ポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合、又は組み換えウィルスベクターの使用もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１０４】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の適した原核動物宿主細胞は、大腸菌等の腸内細菌科、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、組み換えＤＮＡ生成発酵の一般的な宿主株であるため、一種の特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最少量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株。のインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１０５】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、インスリン又はインスリン変異体コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383）；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 154(2): 737 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wicheramii)（ATCC 24,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケーテモトレランス(K. thermotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
グリコシル化インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９及びｈｉｇｈ-ｆｉｖｅの昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【０１０６】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
インスリン又はインスリン変異体をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、ファージミド又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドは、直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるインスリン又はインスリン変異体-コード化ＤＮＡの一部でありうる。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１０７】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、本発明のポリペプチドをコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。
【０１０８】
発現及びクローニングベクターは、通常、インスリン-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系；Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776；及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター、deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)を含む。細菌系で使用するプロモータもまた、本発明のインスリン又はインスリン変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ、Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)又は他の糖分解酵素、Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【０１０９】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの発現は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による本発明で使用されるポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、インスリン又はインスリン変異体コード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養での本発明のポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【０１１０】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法、Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はインスリン又はインスリン変異体ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１１１】
５．ポリペプチドの精製
本発明で使用されるポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン(登録商標)-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。本発明で使用されるポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
インスリン又はインスリンは生成するのが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：即ち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び本発明のポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のインスリン又はインスリン変異体の性質に依存する。
【０１１２】
６．組織分布
本発明で利用できるポリペプチドを発現させる組織の位置は、種々のヒト組織におけるｍＲＮＡ発現を測定することにより特定可能である。このようなデータにより、本発明のポリペプチドの刺激及び阻害活性の影響を最も受けていると思われる組織の決定に役立ちうる。理論上、インスリンを発現し、インスリンに応答する組織は、以下で検討される活性阻止アッセイに使用することができる。
上記したように、種々の組織における遺伝子発現は、従来のノーザンブロット、ＲＴ-ＰＣＲ（Taqman）、Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]、ドットブロット、又はインサイツハイブリッド形成により、ここに提供する配列に基づき適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、遺伝子発現は、４．遺伝子増幅／発現の検出に上記されるように、組織断片の免疫組織学的染色、及び細胞培養物又は体液のアッセイ等の免疫学的方法によっても測定できる。
【０１１３】
Ｅ．製薬組成物及び投与量
本発明の方法で使用できるインスリン及びインスリン変異体ポリペプチドは、軟骨疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。さらに、また、リポフェクション又はリポソームも細胞及び標的領域へインスリン又はインスリン変異体の供給を行うために使用できる。
本発明で使用され得る活性分子の治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ活性分子を、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。このような治療的製剤は、凍結乾燥又は水溶性形態で在り得る。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンズアルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリン、又はヒアルロナンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はTWEEN（商標登録）、PLURONICS（商標登録）、及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
インビボでの投与に使用される製剤の目的には、それらは滅菌的でなくてはならない。製剤化は、凍結乾燥又は再構成に先立ち又はその後に、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。通常は無菌のアクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液袋又は皮下用注射針で貫通可能なストッパを有するバイアル等の中に設ける。
【０１１４】
また、ここで使用される製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに有害な効果を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。このような分子は、意図する目的に有効な組み合わせ及び量で存在する。
投与の経路は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内経路による注射又は注入、局所的投与、持続放出性又は徐放放出性の手段等の周知の方法に従う。任意には、活性化合物又は製剤を罹患した軟骨領域又は関節に直接注射する。
また、インスリン又はインスリン変異体分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中にカプセル化することにより調製される。このような調製物は、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中にて投与され得る。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版 (又はさらに新しい版), Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
このようなポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でインスリン又はインスリン変異体の持続性又は徐放性投与が望まれる場合、マイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン-α、-β、-γ（ｒｈＩＦＮ-α、-β、-γ）、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman. eds. , (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及びU.S. Pat No. 5,654,010。
持続性放出製剤の好適な例には、活性分子を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが含まれ、該マトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセルの成形物の形態である。徐放性マトリクスの例は、一又は複数のポリアンヒドリド（例えば、U.S.P.4,891,225；4,767,628）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸及び乳酸−グリコール酸の共重合体等のポリエステル（米国特許出願第3,773,919号; 同第4,767,628号; 同第4,530,840号；Kulkarni等、Arch. Surg. 93:839 (1966)）、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシドアクリル酸、ポリアクリル酸、エチレン-ビニルアセテート、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリアセチルニトリル、ポリフォスファゼン、及びポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリル酸)、又はポリ(ビニルアルコール)）のポリマー及びコポリマー、セルロース、アシル置換セルロースアセテート、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、塩化ポリビニル、フッ化ポリビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタミン酸共重合ポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。さらに、使用される非生物分解性ポリマーは、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、エチレンビニル酢酸、ポリエチレングリコール、セルロースアセテートブチレート、及びセルロースアセテートプロピオネートである。
【０１１５】
あるいは、持続性放出製剤は、分解性生物材料で構成される。生物分解性ポリマーは、その生物適合性、特異的な分解に対する高い反応性、及び生物学的マトリクス中への活性薬物の取込み容易性により、魅力的な薬物剤形である。例えば、ヒアルロン酸（ＨＡ）は生物学的材料に対する膨潤性の重合性送達媒体としてクロスリンクされ、使用される。U.S.P. 4,957,744；Valle等、Polym. Mater. Sci Eng. 62:731-735 (1991)。また、ポリエチレングリコールで移植されたＨＡポリマーは、生物学的状態における長期間の保存に関連する望ましくない薬物漏出及び変性の両方を低下させる改善された送達マトリクスとしても調製されている。Kazuteru. M., J.Controlled Release 59:77-86 (1999)。使用される更なる生物分解性ポリマーは、ポリ（カプロラクトン）、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホジエステル）、ポリエステルアミド、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、分解性及び非毒性ポリウレタン、ポリヒドロキシブチル酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリアルキレンオキサル酸、ポリアルキレンコハク酸、ポリ（リンゴ酸）、キチン及びキトサンである。
あるいは、生物分解性ヒドロゲルは、生物学的材料及び薬物に対してコントロールされた放出送達媒体として使用される。マクロマーの適当な選択を通じて、膜は、広範囲の生物分子に適する透過性、孔サイズ及び分解速度の範囲を有して生産され得る。
あるいは、生物材料及び薬物に対する持続性放出送達系は、分散により構成される。分散は、懸濁液又はエマルジョンのいずれかにさらに分類される。生物学的材料に対する送達媒体という点において、懸濁液は液体培地中に分散（多少不均一に）された極微小固体粒子の混合物である。懸濁液の固体粒子は、数ナノメーターから数百ミクロンのサイズにおよび、微粒子、マイクロカプセル及びナノスフェアーを含む。一方、エマルジョンは、少量の乳化剤による懸濁液中に保持される２又は複数の混合できない液体の混合物である。乳化剤は、混合できない液体間に界面状のフィルムを形成し、また、表面活性物質又は界面活性剤としても知られている。エマルジョン形成は、水は連続相で油又は脂肪が分散されている水中油（ｏ／ｗ）、並びに油は連続相で水が分散されている油中水（ｗ／ｏ）の両方であり得る。適切な持続性放出の製剤化の一例は、WO97/25563中に開示される。さらに、生物学的材料と共に使用するためのエマルジョンには、複合エマルジョン、マイクロエマルジョン、ミクロドロプレット及びリポソームが含まれる。ミクロドロプレットは、内部に油層も持つ微粒子性脂質層から構成される単層のリン脂質媒体である。例えば、U.S.P. 4,622,219及びU.S.P. 4,725,442。リポソームは、水溶液と水に不溶な極性脂質とを混合することにより調製されるリン脂質媒体である。
【０１１６】    
あるいは、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの持続性製剤は、乳酸-グリコール酸共重合ポリマー（ＰＬＧＡ）など、非常に高い生物適合性及び広範囲の生物分解性特性を発揮するポリマーを用いて開発される。ＰＬＧＡの分解産物である乳酸及びグリコール酸は、ヒトの身体から速やかにクリアにされる。さらに、該ポリマーの分解性はその分子量及び組成に依存して、月から年の範囲で調整することができる。さらなる情報については、Lewisによる「Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide polymer,」 in Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems M, Chasin and R. Langeer, editors(Marcel Dekker:New York, 1990), pp.1-41を参照のこと。
カプセル化されたポリペプチドが長期間体内に残存する場合、３７℃における水分への暴露の結果、変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の損失及び免疫原性に起こりえる変化が生じる。合理的な計画が、関連するメカニズムに依存する安定化の為に工夫され得る。例えば、凝集のメカニズムが、チオジスルフィド交換を介した分子間のＳ−Ｓ結合形成であることが明らかとなる場合、安定化はスルフィド基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量をコントロールし、適切な添加剤を用いて、特異的なポリマーマトリクス組成物を開発することにより達成される。
カプセル化されたポリペプチド又は徐放性製剤中のポリペプチドは、放出濃度及び温度において非毒性である「水溶性多価金属塩」と共にポリペプチドを製剤化することで得られる。「多価金属」の例には、アルカリ土類金属（例えば、Ｃａ2+，Ｍｇ2+，Ｚｎ2+，Ｆｅ2+，Ｆｅ3+，Ｃｕ2+，Ｓｎ2+，Ｓｎ4+，Ａｌ2+，及びＡｌ3+）が含まれる。上記多価金属カチオンと共に水溶性塩を形成するアニオンの例には、無機酸及び／又は有機酸によって形成されるものが含まれる。このような水溶性塩は水（２０℃）に少なくとも20 mg/ml、或いは100 mg/ml、或いは200 mg/mlの溶解度を持つ。
「水溶性多価金属塩」を形成するために用いられる適切な無機酸には、疎水性酸、硫酸、硝酸、チオシアン酸、及びリン酸が含まれる。用いられる適切な有機酸には、脂肪族カルボン酸及び芳香族が含まれる。ここでの定義において脂肪酸とは、飽和又は不飽和Ｃ２−９のカルボン酸（例えば、脂肪族モノ-、ジ-、及びトリ-カルボン酸）として定義されてもよい。例えば、ここでの定義におけるモノカルボン酸の例には、酢酸、プロピオン酸、ブチル酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸及びカプリオン酸などの飽和Ｃ２−９のモノカルボン酸、及びアクリリル酸、プロプリオリル酸、メタクリル酸、クロトン酸及びイソクロトン酸などの不飽和Ｃ２−９のモノカルボン酸が含まれる。ジカルボン酸の例には、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸及びピメリン酸などの飽和Ｃ２−９のジカルボン酸、さらに、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸及びメサコン酸などの不飽和Ｃ２−９のジカルボン酸が含まれる。トリカルボン酸の例には、トリカルバリル酸及び１,２,３-ブタントリカルボン酸などの飽和Ｃ２−９のトリカルボン酸が含まれる。さらに、また、ここでの定義におけるカルボン酸には、水酸化カルボン酸を形成するための１又は２の水酸基を含む。水酸化カルボン酸の例には、グリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトン酸、リンゴ酸、酒石酸及びクエン酸が含まれる。ここでの定義における芳香族酸には、安息香酸及びサリチル酸が含まれる。
一般に、本発明のカプセル化されたポリペプチドの安定化を補助するために用いられる水溶性多価金属塩には、例えば、：（１）無機酸のハロゲン金属塩（例えば、塩化亜鉛、塩化カルシウム）、硫酸鉛、硝酸塩、リン酸塩、チオシアン酸塩；（２）脂肪族カルボン酸の金属塩、酢酸カルシウム、酢酸亜鉛、プロピオン酸カルシウム、グリコール酸亜鉛、乳酸カルシウム、乳酸亜鉛及び酒石酸亜鉛：及び（３）安息香酸塩の芳香族カルボン酸金属塩、（例えば、安息香酸亜鉛）及びサリチル酸塩などが含まれる。
【０１１７】
本発明で利用できる製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
インスリン又はインスリン変異体のインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約10ng/kgから100mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10mg/kg/日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
【０１１８】
Ｆ．治療方法
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性物質は、様々な軟骨疾患を治療するために使用できると考えられる。本発明のポリペプチドで治療される病状又は疾患の例には、限定するものではないが、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節症、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症(systemic vasculitis)、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性(non-hepatotropic)ウィルス)、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎；クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
全身性紅斑性狼瘡において、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産出であり、続いて、免疫媒介炎症が生じ、抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。しかし、Ｔリンパ球は組織ダメージに直接関与しないことが示されており、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発育に必要である。よって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的な影響を受ける。
【０１１９】
リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、複数の関節の滑膜に関係する慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、内在タンパク質に対する自己抗体の産生に関係し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。これらの複合体は、滑液区画へのリンパ球、単球及び好中球による浸潤を誘発しうる。影響を受けている組織は、多くの場合対照的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態では、典型的な障害は、肺線維症、血管炎、及び皮膚潰瘍である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節(pauciarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性のものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【０１２０】
脊椎関節症は、一般的にＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７(血清学的には、クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞の反応が誘発されると仮定されている。
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり；これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的であり：血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ＩＣＡＭ-１は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するＴ細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動／運動性となっている平滑筋：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【０１２１】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に係る成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されてその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、bilary硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎、及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、単離したＣＮＳ血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(いくつかのケースにおいは、血小板を含む他の血液細胞)表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【０１２２】
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデルラット(ＢＵＦ及びＢＢラット)及びチキン(肥満チキン種)；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。
糖尿病は、インスリン分泌の相対的又は絶対的な不足及び様々なインスリン抵抗度と関係がある。その完全に進行した臨床的発現では、それは空腹時低血糖により、大多数の長期疾患においてはアテローム硬化型及び微小血管障害性の血管疾患及び神経障害により特徴づけられる。種々の型の疾病間の違いは、原因及び病因、自然史、及び処置に対する反応の点において示される。従って、糖尿病は、単なる病気ではなく症候群である。
Ｉ型、又はインスシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は西洋における全ての糖尿病患者の約１０パーセントに発症する。Ｉ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は、膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン-非-反応性の表現型を産出することができる。
【０１２３】
典型的に、この型の疾病が幼児期及び青年期に最も一般的に生じるが；あらゆる年齢に見られ、及び徴候がある。ＩＤＤＭの最も一般的な型（ＩＡ型）において、遺伝的な要因に加えて、環境的（後天的）要因、例えば特定のウィルス感染、あるいは化学物質がβ細胞の細胞媒介性自己免疫崩壊を引き起こしうることが必要条件とされうる。従って、細胞媒介性の体液性自己免疫により特徴づけられる一般的に測定される異常な免疫応答（ＨＬＡ会合に関連する）は、環境的因子による誘起後の病原的役割を果たすと考えられる。ＩＤＤＭの第２の型（ＩＢ型）は主に自己免疫によると考えられている。これらの患者は、ハシモト甲状腺炎、グレーブス疾患、アジソン病、一次性腺機能不全、及び関連した比内分泌性自己免疫疾患、例えば、悪性貧血、結合組織疾患、セリアック病及び重症筋無力症等の自己免疫内分泌疾患に関連している。インスリン依存は、インスリンの投与が突発性のケトン症、昏睡、死の予防に必須であることを意味する。しかしながら、インスリン治療をしていてもなお、糖尿病患者は糖尿病に関連した更なる多くの問題、即ち結合組織疾患、神経障害等を有しうる。
糖尿病の第２の型、ＩＩ型又は非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は全糖尿病の約９０％を占め、遺伝的な原因を有する。ＩＩ型糖尿病を有する患者は、普通から過剰の範囲の体重を有しうる。肥満及び病理的インスリン抵抗性は、ＮＩＤＤＭの進行において決して必須ではない。ＮＩＤＤＭを有する患者の大部分が、中年で糖尿病になる。ＮＩＤＤＭを有する患者は、ケトン症予防のための非インスリン依存であるが、これらが食事又は経口薬の使用で達成される場合には、彼らは症候性又は非症候性の持続的な空腹時性低血糖を正すためにインスリンを必要としうる。従って、インスリンの治療的投与は、ＩＤＤＭ及びＮＩＤＤＭの間に違いは無い。ＮＩＤＤＭのいくつかのファミリーでは、グルコースに対するインスリン分泌反応が非常に遅いので、あらゆる時に初期のＩ型糖尿病と共通点を有しうる。その自然史の初期、インスリン分泌不足及びインスリン抵抗性は、グルコース許容度の正常化での治療（即ち、体重減少）により可逆的でありうる。糖尿病の典型的な慢性の合併症、つまり大血管障害、微小血管障害、神経障害、及びＩＤＤＭに見られる白内障が、ＮＩＤＤＭによく見られる。
【０１２４】
他の型の糖尿病は、特定の他の状態又は症候群の派生的な又はそれと関連したものを含む。糖尿病は、膵臓疾患又は膵臓組織の切除；内分泌疾患、例えば、末端巨大症、クッシング症候群、クロム親和細腫、グルカゴン産生腫瘍、ソマトスタチン産生腫瘍、又は原発性アルドステロン症；高血糖を引き起こすホルモンの投与；及びある種の薬剤（即ち、降圧剤、チアジド系利尿薬、エストロゲンを含む製剤、精神賦活剤、交感神経模倣薬）の投与から２次的に生じうる。糖尿病は、多数の遺伝的症候群に関連しうる。最後に、糖尿病は、インスリンレセプターの遺伝的欠陥に関連しているか、又は関連免疫疾患を伴う又は伴わないインスリンレセプターに対する抗体に依るものである。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出／誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。ＭＳにおいて、疾患の誘発及び進行はＴリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はＴ細胞媒介小膠細胞の優先的湿潤、及びマイクロファージの浸潤を含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は障害において優先的な細胞型であった。オリゴデンドロサイトの細胞死及び続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球の駆動によると思われる。
【０１２５】
好酸球肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。反応を阻害することは治療的に有益なことであり、本発明の範囲内である。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はＴリンパ球依存性である。
乾癬は、Ｔリンパ球媒介炎症疾患である。傷害にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(ＧＶＨＤ)を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及びヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(ＭＬＲを刺激する分子(又は誘導体／アゴニスト)を治療に利用して感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)を含む感染疾患であり、ＭＬＲを刺激する免疫不全疾患（分子／誘導体／アゴニスト)は、遺伝性の、後天性の、感染誘発された(例えばＨＩＶ感染)、又は医原性の(即ち、化学療法からのもの)免疫欠損、及び異常増殖の状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることができる。
さらに、炎症誘発性特性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害；脳卒中；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化；急性肺傷害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血症ショック；急性尿細管壊死；子宮内膜症；変性関節疾患及び膵炎(pancreatis)の治療に有益である。
【０１２６】
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入(鼻孔内、肺内)経路などにより投与される。ポリペプチド及び抗体の静脈内又は吸入投与が好ましい。
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、本発明のポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明のポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤と本発明のポリペプチドとの組み合わせ(相乗)効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ(例えば、０．１-２０ｍｇ／ｋｇ)のポリペプチド又は抗体が、例えば、一又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０１２７】
Ｇ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、例えば、軟骨疾患を治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性薬剤は、典型的にはインスリン又はインスリン変異体ポリペプチドである。組成物は、ここで開示されるいずれの又は複数の成分をも含み得る。容器上の又は添付された説明書は、組成物が選択の状態を治療するために使用されることを示す。例えば、説明書は、組成物が変成軟骨関節炎、リウマチ様関節炎又は他の任意の軟骨疾患の治療に有効であることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容される緩衝液を含む第２の容器を具備してもよい。あるいは、組成物は、セクションＥ．製薬的組成物及び投与量において言及された任意の担体、賦形剤及び／又は安定化剤を含んでもよい。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１２８】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
（実施例）
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して同定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。特記しない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いる：Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y., 1990; Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
【０１２９】
実施例１
初代関節軟骨細胞におけるインスリンの効果
導入
この実施例は、無血清培地の軟骨細胞のマトリックス（プロテオグリカン）合成及び生存能力における、様々な濃度（0.1-100nM）のインスリンの効果を示す。軟骨細胞を培養するために、関節軟骨を細胞外マトリックスを取り除く酵素で消化する。従って、この培養系の細胞環境はマトリックスが枯渇した軟骨疾患の後期段階に見られるものと同様でありうる。本質的に単層で培養された軟骨細胞により合成された全てのマトリックスが培地に放出されるので、このような細胞の培地のプロテオグリカンの量は、マトリックス合成を示す。Farndale及びButtle,  Biochem. Biophys. Acta 883：173-177(1986)の１,９-ジメチル-メチレンブルー(ＤＭＭＢ)比色アッセイを用いて、プロテオグリカンを測定する。このアッセイにおいて、プロテオグリカンと結合することによって生じるＤＭＭＢ染色の色の変化は、分光測定で定量される。軟骨細胞の生存能力は、黄色のテトラゾリウム塩ＭＴＴを分解して紫色のホルマザン結晶を形成する生存細胞の能力に基づいて培養した細胞の対処活性を測定する比色アッセイを用いて測定されたBerridge, M. V. & Tan, A. S., Arch. Biochem. Biophys. 303:474 (1993)。形成されたホルマザン結晶を溶解し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて分光光度的に定量した。
【０１３０】
材料と方法
軟骨細胞の作成：
４−６月齢の雌のブタの中手指節関節を無菌で解剖し、下の骨を避けるように注意して関節軟骨をフリーハンドのスライシングによって取り出した。次に、これらの軟骨切片を３７℃で２５分間、無血清ハムＦ１２中の0.05%のトリプシンで消化した。培地を流し捨て、軟骨を３７℃で３０分間、無血清ハムＦ１２培地中の0.3%のコラゲナーゼＢで消化した。培地を流し捨て、軟骨をハムＦ１２中の0.06%のコラゲナーゼＢ＋10%のウシ胎児血清中で一晩消化した。次いで、細胞を７０ミクロンのナイロンフィルターで濾過し、無血清のハムＦ１２培地に蒔いた。
軟骨細胞の培養：
軟骨細胞（上記のようにして作成）を、抗生物質（10μg/mlのゲンタマイシン、250ng/mlのアンホテリシンＢ、100μg/mlのペニシリン/ストレプトマイシン）を入れたハムＦ１２を含む培地中、ウェルにつき80,000細胞の密度にしたマイクロタイタープレート（ファルコンマイクロテスト９６、平底）で、最終容量250μl/ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で６日間、生育した。培地を取り除き、３日目と６日目にプロテオグリカンを測定するために使用した。
プロテオグリカンの測定：
ＤＭＭＢは、プロテオグリカンの側鎖である硫酸化グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）との結合により異染色性（色の変化、この場合は青から紫へ）を起こす染色剤である。ＤＭＭＢへの硫酸化プロテオグリカンの添加は、590と660nmでのピーク値の減少と530nmの吸光度の増加を引き起こす。こうして培地中のプロテオグリカンの量は、ＤＭＭＢ色素を９６穴プレート形式へ添加することにより定量され、色の変化は分光光度計（Spectramax 250）を用いて定量化される。ＤＭＭＢアッセイは軟骨培養物中のプロテオグリカンの量を測定するために十分認められたものである。本アッセイについて、標準曲線は0.0から5.0μgの範囲のコンドロイチン硫酸を用いて作成される。
ＭＴＴアッセイ：
処理の６日後、10μlのテトラゾリウム塩、ＭＴＴ（5mg/ml保存）、（Boehringer Mannheim, cat. No.1465007）を各ウェルの残り100μlの培地に添加する。更に３７℃、５％ＣＯ２での４時間のインキュベーションの後、100μlの可溶化溶液（Boehringer Mannheimのアッセイキット中の試薬）を添加し、プレートは３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。次いで吸光度を584nmで（更にバックグラウンド吸光度を決定するために690nmで）測定した。
【０１３１】
結果と考察
図１に示すように、インスリンは用量依存法においてプロテオグリカンの合成を増加した。更に、インスリンは（0.1nM程度の低い濃度で）ＩＬ-１αにより誘導されるＰＧ合成の抑制制御を抑制した（図１の右のグラフ）。従って、インスリン（Intergen, Purchase, New York, cat. no. 450100）は非常に潜在性のあるプロテオグリカンの刺激剤であり、プロテオグリカン合成におけるＩＬ-１α（R&D Systems, cat.no. 200LA002）の抑制効果を超えることが可能であった。
最も初期の細胞と異なり、軟骨細胞は、少なくとも１週間、無血清培地で更なる成長因子が何もない状態で生存することができる。しかしながら、インスリンの添加（100nMと10nMで）は、この方法で６日間培養した軟骨細胞の代謝活性を増加した（図２）。また、インスリンは、軟骨細胞の代謝活性を抑制するインターロイキン１-αの能力も阻害した（グラフ右半分）。このような活性は、特に軟骨細胞の代謝活性の障害がおきる関節炎、関節傷害、又は老化等の症状に、治療的に非常に役立ちうる。
ＩＬ-１αの有害な影響を防止するインスリンの能力は、インスリンを、高レベルのＩＬ-１が病気の進行に関係している関節炎のような症状の治療に非常に好ましい候補にする。
【０１３２】
実施例２
関節軟骨移植アッセイ
導入
この実施例の実験は、軟骨マトリックス代謝回転における試験化合物の合成及び予防可能性の両方を試験する。この可能性は、関節軟骨におけるマトリックス（即ち、プロテオグリカン）合成と分解、並びに酸化窒素の合成を測定することにより決定される。これらのパラメータは、インターロイキン１α、ＩＬ-１αの存在及び不存在で評価される。関節軟骨外植片は培養において初代細胞の間、いくつかの利点を有する。第１に、恐らく最も重要であるが、外植片中の細胞は生体内での組織構造に組み込まれたままである。第２に、これらの外植片は、生体外で組織向上性を保持できる間の数週間、表現型的に安定である。最後に、初代細胞と異なり、外植片はマトリックス分解の測定に使用できる。軟骨外植片を準備するために、関節軟骨を解剖し、細かく刻んで、コラーゲン網を破壊し、培地中にプロテオグリカンを放出させなければならない。従って、このシステムは、マトリックスが次第に消耗した関節炎等の変性状態を模倣する。このシステムを用いて、我々は、試験化合物が：（１）プロテオグリカン（ＰＧ）の合成を促進し；（２）ＰＧ放出を阻害し；（３）ＩＬ-１α誘発性ＰＧ分解を阻害し；（４）ＰＧ合成におけるＩＬ-１α誘発の減少を阻害し；及び（５）基礎的及びＩＬ-１α誘発性の両方の酸化窒素産生を減少させることができることを見出した。
ＩＬ-１αは、マトリックス破壊を誘発する酵素の促進制御（マトリックスメタロプロテイナーゼ及びアグリカナーゼ）、並びに新しいマトリックス分子の合成阻害（プロテオグリカン及びコラーゲン）を含む軟骨における異化作用を有する。従って、軟骨にポジティブな影響を持つだけでなく、ＩＬ-１αの異化作用を妨害する試験化合物の能力は、試験化合物によって示される保護的効果の強力な証拠である。さらに、このような活性によって、高レベルのＩＬ-１αが関節塩の関節に見られ、ＩＬ-１α機能の拮抗作用が変成軟骨関節炎の進行を抑えることが示されているため、このような活性はテスト化合物が関節炎の状態で生じる分解を阻害し得ることを示唆する。Arend, W.P.等、Ann. Rev. Immunol. 16：27-55（1998）。
【０１３３】
関節軟骨の破壊、特に骨関節炎に関与する破壊における酸化窒素（ＮＯ）の役割が記載されている（Ashok等、Curr. Opin. Rheum. 10:263-268 (1998)）。酸化窒素生成の抑制は関節炎の進行を減少させることを、インビボ動物モデルは示唆している（Pelletier, JP等、Arthritis Rheum 7:1275-86 (1998)；van de Loo等、Arthritis Rheum. 41:634-46 (1998)；Stichtenoth, DO及びFrolich J.C. Br. J. Rheumatol. 37:246-57 (1998)）。ヒトにおいては、リウマチ様関節炎の治療に使用される多くの薬剤が酸化窒素の生成又は活性を減少させうる。また、ＮＯは軟骨細胞に加えて他の細胞にも影響を及ぼすため、関節中のＮＯの存在は、血管拡張及び透過率を増大させ、白血球によるサイトカインの放出を強化し、血管形成活性を刺激する。軟骨によるＮＯの生産は、疾病の状態と相関し、ＮＯは、関節疾病の腐食性及び炎症性の成分の両方において役割を演じるようであるため、一酸化窒素の生産を減少させる因子は、変成軟骨疾患の治療に対して有益であると思われる。
ここで記述される酸化窒素のアッセイは、２,３-ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）が、定量可能な蛍光産物である１-(Ｈ)-ナフトトリアゾールを形成する酸性条件下で亜硝酸塩と反応する原理に基づいている。ＮＯは亜硝酸塩（ＮＯ２-1）及び硝酸塩（ＮＯ３-1）へと代謝されるため、亜硝酸塩の検出は軟骨組織で（たとえカウント値以下であっても）実際に生産されたＮＯを検出する手段の一つである。
【０１３４】
材料と方法
関節軟骨外植片：
４−６月齢の雌ブタの中手指節関節が上記のようにして無菌的に開かれる。軟骨は、細かく刻まれ、洗浄され、バルクで少なくとも２４時間３７℃で外植片培地、即ち0.1%ＢＳＡ、100U/ml  ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、2mMのＬ-グルタミン、0.1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、20μg/mlのゲンタマイシン（Gibco）、1.25mg/LのアムホテリシンＢを含有する無血清（ＳＦ）ＬＧ ＤＭＥＭ/Ｆ１２培地において５％のＣＯ２で培養される。関節軟骨をマイクロチューブに等分（１チューブにつき約55mg）し、少なくとも２４時間上記培地中でインキュベートする。培地を回収し、種々の時点（例えば、０，２４，４８，７２時間）で新しい培地（培地のみ又は新しいインスリンと共に）を加えた。
【０１３５】
プロテオグリカンの放出：
種々の時点で収集された培地を、Farndale及びButtle. Biochem. Biophys. Acta 883:173-177(1985)の１,９-ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）比色定量アッセイを用いてプロテオグリカン含量についてアッセイした。時間０におけるＰＧ放出を基準測定値として使用し、特に高い又は低いＰＧ放出を有する任意の試料をインスリン処置前に捨てた。全ての処理の間、結果は５つの各試料の平均を示す。
最初の処理の４８時間後、３５Ｓ-硫酸塩を新しい培地（試験化合物を含有又は無し）とともに10μＣｉ/mlの最終濃度で軟骨外植片に添加した。３７℃での更なる１２−１７時間のインキュベーションの後、培地を取り除き、次のＰＧ及び酸化窒素（ＮＯ）分析に備えた。軟骨片を外植片用培地を用いて２回洗浄し、900mLの反応容積の10mMのＥＤＴＡ、0.1Mのリン酸ナトリウム及び1mg/mlのプロテイナーゼＫ（Gibco BRL）中、５０℃で一晩消化した。消化反応物を10%Ｗ／Ｖ塩化セチルピリジニウム（Sigma）と混合して（２：１）プロテオグリカンを沈殿させ、1000ｘ gで１５分間遠心した。上清を除去し、沈殿物を溶解させるためにギ酸（500mL、Sigma）を添加した。次いで試料を10mlのシンチレーション液（ＩＣＮ）を含むバイアルに移し、シンチレーションカウンターで読み取った。
軟骨組織の残留プロテオグリカン：
７２時間後、残りの関節軟骨外植片を上記のプロテオグリカン合成のようにして消化し、ＤＭＭＢ比色アッセイ（プロテオグリカン放出に上記されている）を用いてプロテオグリカン含量を検定した。
酸化窒素アッセイ：
様々な時間（２４、４８、及び７２時間）に軟骨外植片から採って保存した軟骨外植片培地を、0.62Mの ＨＣｌ中10μlの0.05mg/ml２,３-ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）と混合し、室温、暗所で１０−２０分間インキュベートした。反応は5μLの2.8N ＮａＯＨで停止した。２,３-ジアミノナフトトリアゾールの蛍光量を、Cytoflor蛍光プレートリーダーを用いて365nmの励起波長、409nmの発光波長で測定した。
【０１３６】
結果と考察
初代関節軟骨細胞におけるその効果（図１）と同様に、インスリン（Intergen, Purchase, New York, cat. no. #450100）は、関節軟骨外植片のプロテオグリカン合成を誘導し、ＩＬ-１α（R&D Systems, cat. no. 200LA002）の抑制効果を少なくとも部分的に阻害することができる（図３）。さらに、インスリンはＩＬ-１αの存在下又は不存在下において引き起こされるマトリックスの破壊を減少させた（図３）。マトリックス破壊は、関節の最も早期の最も有害な特徴の１つであり、この過程の抑制及び新しいマトリックス分子の促進は、組織及び関節の修復を助長した。最も重要なことには、マトリックス破壊の減少及びインスリンにより誘発される合成の増加によって、関節軟骨のプロテオグリカン総量が未処理の組織のものと比較して増加する結果となった（図４）。軟骨に保持されるマトリックス量の増加により、インビボでのインスリン治療は、関節軟骨マトリックスの保持を引き起こし、従って次の関節破壊及び変形を抑制する。
マトリックス破壊の減少及びマトリックス合成の増加の能力に加えて、インスリンもまた、処理していない又はＩＬ-１α-処理した関節軟骨外植片の何れかによる酸化窒素（ＮＯ）産生を阻害した（図５）。この影響は1nM程度の低さの濃度で見られ、またＩＧＦ処理した外植片でも見られた。上記したように、酸化窒素は、軟骨細胞並びに関節内の他の細胞型において有害な影響を有する。  酸化窒素の阻害は動物の関節炎の進行を抑制することが示されているので、ＮＯにおけるインスリンの影響は更に、インビボでの関節組織を保護しうることが示唆される。
【０１３７】
実施例３
マウス膝蓋骨アッセイ
導入
本アッセイはマウス膝蓋骨中のプロテオグリカン合成における試験化合物のインビトロ及びインビボの影響を決定する。膝蓋骨は、下の骨から取り除かれていない軟骨に対するテスト化合物の影響の評価を可能にするため、非常に有用なモデルである。さらに、各動物は各脚に１つの膝蓋骨を持つため、実験は反対側の関節をコントロールとして用いて実施することができる。このアッセイは、（マウス）膝関節の関節内にタンパク質を注入し、続いてマトリックス合成の測定のために膝蓋骨（膝の皿）を（注入後数日で）採取することを含む（図６）。個々で実施される方法は、図６に概略が示され、インビトロ又はインビボでのサイトカインの影響を測定するために以前から使用されている（Van den Berg等、Rheum. Int. 1:165-9 (1982)；Vershure P.J.等、Ann. Rheum. Dis. 53:455-460 (1994)；及びVan de Loo等、Arthit. Rheum. 38:164-172 (1995)）。
【０１３８】
材料と方法
膝蓋骨のインビトロ処理
２月齢のＣ５７Ｂｌ-６Ｊマウス（Jackson Laboratories）の膝蓋骨を周辺軟組織から切り離し、外植片培地（上記、実施例２参照）で、更なる因子無しに、又は100ng/mlのＩＬ１α又は100nMのインスリンと共に一晩インキュベートした。膝蓋骨を３５Ｓ-硫黄（30μＣｉ/ml）で１８時間のインキュベーションの終わりの３時間に標識し、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。試料を10%のホルマリンで一晩固定したのち、5%のギ酸で下にある骨を脱灰した。軟骨を下にある骨から切り離し、500μlの組織及びゲル溶解剤（Solvable, Packard Instrument Company）中に置き、６０℃で１．５時間インキュベートする。濃縮したアルカリ及び塩溶液用のシンチレーション液（HIONIC-fluor, Packard Instrument Company）を各試験管に加えて（10mL）完全に撹拌した。次いで３５Ｓの取り込みをシンチレーションカウンターで測定した。ＰＧ合成のレベルがｃｐｍとして記録され、４の個々のマウス/グループからの膝蓋骨の平均を示す。
膝蓋骨のインビボ処理
マウスを２つのサブグループに分けて注射し、試験化合物（例えば、10mg/mlのインスリン）の高投与量（6μl）又は低投与量（3μl）の何れかを３日間連続して毎日右膝に関節内注射した。次いで膝蓋骨を採取し、何の添加因子もなしに外植片培地で３時間標識して、上記のような工程を行った。図７Ｂは、未処理の膝に対する処理した膝への取り込み率としてデータを示す。１よりも高い（線の上）処理／未処理率を表すデータの点は、試験化合物の処理がプロテオグリカンの合成を増加させたことを示唆する。高投与量（6μl）の適用によるＰＧ合成は左側のデータの点に示唆され、低投与量（3μl）は右側のテータの点に示唆されている。各点は個々のマウスからの結果を示す。
【０１３９】
結果と考察
解体した軟骨外植片（実施例２）におけるインビトロでのプロテオグリカン（ＰＧ）合成の誘発と同様に、インスリンは、無傷の軟骨においてインビトロ（図７Ａ）及びインビボ（図７Ｂ）の両方でＰＧ合成を促進した。更に特には、インスリン（Intergen, Purchase, New York, cat. no. 450100）正常マウス膝関節への注入は、３日間で約２５％増のＰＧ合成となった（図７Ｂ）。このような増加は、軟骨マトリックスを劣化により失い、元に戻すことのできない罹患した組織に有利な効果を有することが見込まれる。更に、軟骨破壊を減少させるインスリンの能力（実施例２参照）がこのアッセイにより検出されず、従ってこの予測に当てはまらないために、この増加割合は、生体内での軟骨マトリックスにおけるインスリンの有利な影響を過小評価しうる。インスリンにより誘導される破壊の減少は、インスリン処理膝関節に残されたマトリックス量を更に増加させる。最後にこれらの実施例は動物モデルでの安定性を確認するという最初の試みを意味する。かなり驚くべきことには、３日間の１回／１日のインスリンの非常に高い投与量（30μg）の関節内注入によって不利な影響は無いようであった。
従って、試験化合物インスリンは関節領域内で軟骨においてポジティブな影響を有し、精製したインスリンタンパク質の膝関節への関節内注入は持続する治療方法となることを示す。
【０１４０】
実施例４
モルモットモデル
導入
これらの実施例は、プロテオグリカン（ＰＧ）合成及び骨関節炎の動物モデルとして認められているDunkin Hartley (ＤＨ)モルモットの軟骨の破壊における試験化合物の効果を測定するのに有用である（Young等, 「Osteoarthrits」, Spontaneous animal models of human disease vol. 2, pp. 257-261, Acad. Press, New York. (1979); Bendele等, Arthritis Rheum. 34:1180-1184; Bendele等, Arthritis Rheum. 31:561-565(1988); Jimenez等, Laboratory Animal Sciences vol47(6):598-601(1997)）。関節の急速に進行した組織破壊を有する多くの他の動物モデルと異なり、ＤＨモルモットは、それらの関節に自然発生の遅い進行の非炎症性ＯＡ様変化を有する。
これらのモルモットの軟骨破壊の高再現性パターンは、ヒト疾患に見られるものと同様である（図８）。関節は、２月齢のＤＨモルモットでは正常に見えるが、動物が老化するにつれて、病気の原因及び重度はヒトＯＡのものと同様に進行する。従って、初期の組織学的変化には、局所性軟骨細胞の変性及び死及び関節軟骨表層マトリックスの損失を含む。低細胞性フィブリル化領域に隣接した生軟骨細胞はプロテオグリカンを合成しうるが、これらの細胞は正常なマトリックス含量と構造を維持できない。これらの軟骨細胞は、低細胞性の領域に移動して、それ自体をそこに正常に配することはなく、代わりにそれらはプロテオグリカンに囲まれたクラスターにとどまる。その結果、正常に配された軟骨細胞を欠くこの軟骨マトリックスは更なる劣化を被り、最終的には関節表面の破壊を引き起こす（Bendele及びHulman, Arthritis Rheum. 31: 561-565(1988)）。従って、時間が経つと、軟骨細胞とマトリックスの喪失はより広範囲となる。軟骨細胞増殖の一過性の増加は、周辺軟骨棘の形成を引き起こし、続いて骨棘を形成する軟骨内骨化を起こす。その後、中程度から重度の軟骨破壊は、広範で深部に及ぶ軟骨変性、骨棘形成、軟骨下骨肥厚及び滑膜肥厚及び繊維症を生じる。従って、１歳を過ぎたＤＨモルモットの関節は、脛骨及び大腿骨の周辺骨棘、脛骨プラトーの軟骨下骨の硬化、大腿骨顆嚢腫、及び側副靱帯の石灰化に重大な影響がある（Jimenez等, 上掲）。
【０１４１】
材料と方法
オスのDunkin Hartley モルモットはCharles River Laboratories(Wilmington, MA)から入手し、１−２、６及び１１月齢での屠殺のための治療グループに分けた。屠殺時に、中手指節関節が無菌的に開かれ、関節軟骨は下の骨を避けるように注意しながらフリーハンドで切除することにより除去された。軟骨は細かく刻まれ、洗浄され、バルクで少なくとも２４時間95%の空気と5%のＣＯ２で加湿された環境中、0.1%のＢＡＳ、100U/mlのペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、2mMのＬ-グルタミン、0.1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、20μg/mlのゲンタマイシン（Gibco）及び1.25mg/LのアムホテリシンＢを含む無血清（ＳＦ）ＬＧ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。関節軟骨をMicrobicsチューブに等分（チューブあたり約35mg）し、少なくとも２４時間上記培地中でインキュベートした。種々の時点（例えば、０，２４，４８及び７２時間）で培地を回収し、新しい培地のみを、又はインスリンと共に加えた。
プロテオグリカン放出：
種々の時点で回収された培地は、上記（実施例２、関節軟骨外植片アッセイ）のようにFarndale及びButtle. Biochem. Biophys. Acta 883:173-177(1985)の１,９-ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）比色定量アッセイを用いてプロテオグリカン含量についてアッセイした。時間０でのＰＧ放出を基準値として使用し、特に高い又は低いＰＧ放出の任意の試料は処置の前に処分した。
プロテオグリカン合成：
４８時間での培地交換後、３５Ｓ-硫酸塩（最終濃度10μＣｉ/ml）が軟骨外植片に添加され、組織を実施例２（関節軟骨外植片アッセイ）に上記するように処理した。
軟骨組織の残留プロテオグリカン：
７２時間後、残った関節軟骨外植片を、上記のプロテオグリカン合成に記載されるようにして消化し、ＤＭＭＢ比色アッセイ（上記のプロテオグリカン放出に示される）でプロテオグリカン含量を分析した。
【０１４２】
結果と考察
軟骨マトリックス異化に影響することが知られる因子の１つは年齢である。年齢と共に減少するのは生合成率及び組織修復能力のみならず、インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１）を含む成長因子に対する応答性も同様に落ちる（Schafer等, Arch. Biochem and Biophys. 302:431-438(1993)）。疾患はまた、ＩＧＦ-１に対する関節炎軟骨の応答性が年齢に対応した制御にかなり率直な関係があることが分かっていることから証明されるように、成長因子感受性の減少にも関係する（Chevalier及びTyler 1996, Br. J. Rheum 35: 515-522; J. Posever等, J. Orthopaedic Res. 13: 832-827(1995)）。この理由のために、我々は様々な齢のモルモットからの組織、つまり様々な退化段階でインスリンの影響を試験した。図９に示されるように、インスリンは１−２、６又は１１月齢のＤＨモルモットからの関節軟骨でほぼ同じ程度（２倍）にプロテオグリカン（ＰＧ）合成が増加した。従って、ＤＨモルモット軟骨は様々な齢及び病気の段階でインスリンに応答する。ＰＧ合成の増加に加えて、インスリンはまた、インスリン処理した外植片の培地におけるＰＧ量の減少に示されるように（図１０、左側、「培地」）、マトリックス破壊を減少させた。更に重要なことには、インスリンの誘発する破壊の減少及び合成の増加は、ほんの３日間処理した１１月齢の動物からの組織（図１０、右側、「組織」）でさえも、インスリン処理した軟骨に残るプロテオグリカン量において有意な純益となる。インスリン処理軟骨のマトリックスに保持されるＰＧ量の増加を示すこのデータは、マトリックス喪失が初期に及び病気の間中連続して起こるので、インスリンが軟骨修復の有効及び強力な刺激剤でありうることを強く示唆する。
【０１４３】
実施例５
糖尿病マウスモデル
糖尿病（ＤＭ）を有する患者の代謝の変化は、多くの器官系に影響する。例えば、糖尿病を有する患者は、糖尿病のない患者に比較して増加した数の筋骨格の傷害及び疾患を有する。実際に糖尿病は関節炎を進行させるとして知られる危険因子の１つである。プロテオグリカンの変化は、糖尿病患者の椎間板で見られており、糖尿病を有する患者からの関節軟骨試料は構造的健全性を落としている（Robinson等, Spine 23:849-55(1998); Athanasiou等, Clin Orthop 368, 182-9(1999)）。糖尿病患者の関節軟骨のこれらの変化にあるメカニズムはまだ分かっていない。
ヒト糖尿病に共通している症候群は、多くの動物に自然発生し、あるいは膵臓の除去により外科的に又は薬剤、ウィルス、又は特殊な食事での処理により誘発することができる。これらのモデルの中で、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与により誘発した糖尿病は、様々な意味でヒト非インスリン依存性糖尿病に見られるものと類似するインスリン分泌又は活性の欠陥を伴う（Portha, B等Diabetes Metab. 15:61-75,1989）。動物モデルでのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病は、退化した及び低下した皮膚、骨、及び軟骨を含む結合組織のコラーゲン成分と関連する（Craig, R.G.等 Biochem. Biophys. Acta 1402:250-260. 1998）。重要なことには、ＳＴＺ誘導ラットからの軟骨は、インビトロでの３５ＳＯ４取り込みにより測定されるように、ＩＧＦ-Ｉの同化活性に耐性があることが分かっている（Kelley, K.M.等1993. Diabetes 42:463-469）。軟骨マトリックス代謝における糖尿病の影響をより理解するために及び罹患した潜在的に成長因子に耐性のある軟骨の他のモデルにおけるインスリンの影響を試験するために、我々は単独で又はインスリン存在下で生育したＳＴＺ誘導糖尿病マウスからの関節軟骨におけるマトリックス合成を測定した。
【０１４４】
材料と方法
糖尿病の誘発：
８週齢の雌ＣＤ-１マウスに40mg/kgのＳＴＺを５日間連続して注射した。処理の２、３、又は５月後に膝蓋骨を採取した。これらと同じ時に尾部から血液も採取し、血液グルコースレベルをグルコース測定器を用いて測定した（One-Touch, Lifescan）。
膝蓋骨アッセイ：
膝蓋骨をインスリン（100nM, Intergen, Purchase, New York, cat. no. 450100）及び３５Ｓ-硫酸塩（最終濃度15μＣｉ/ml）存在又は不存在で１８時間インキュベートした。膝蓋骨を上記と同様の方法で解剖した（実施例３）。
【０１４５】
結果と考察
試験した全ての時点で（２、３及び５月）、ＳＴＺ誘導マウスからの関節軟骨はプロテオグリカン合成の低い基準のレベルを有した（図１１）。この合成の減少は、ＳＴＺ処理がインスリンを産生する膵細胞の破壊に依存して低血清インスリンレベルを生じるという事実に依るものであり得る（Portha, B等Diabetes Metab. 15:61-75,1989; Craig, R.G.等Biochem. Biophys. Acta 1402:250-260. 1998; Kelley, K.M.等Diabetes 42:463-469(1993)）。最も重要なことには、インスリンは、ＳＴＺ処理マウスからの軟骨のマトリックス合成を正常なマウスからの軟骨と同様の規模にまで誘発する。実際に、インスリンは、ＳＴＺ処理マウスの軟骨におけるマトリックス合成を未処理の正常マウスのものに匹敵する程のレベルまで回復することができる。対照的に、ＩＧＦ-１はＳＴＺ処理マウスからの軟骨におけるプロテオグリカン合成を増加させることはできない（Kelley, K.M.等, Diabetes 42:463-469(1993)）。従って、罹患した組織は、同様に同化因子にも反応せず、インスリンは糖尿病動物のＩＧＦ-１よりも効果的であることを証明しうる。
我々のデータは、ＳＴＺ処理マウスのインスリン欠乏が軟骨のマトリックス合成を減少させるという仮説を支持するものである。さらに、合成がＳＴＺ処理マウスで低下する場合のメカニズムに関係なく、インスリン処理は、正常なレベルにまで合成を回復させることができる。これらの結果は、インスリンが、軟骨組織がマトリックス合成及び／又は破壊において欠陥を有する疾患（原発性関節炎以外）の効果的な治療となりうることを示唆する。
【０１４６】
実施例６
組み換えヒトインスリンを含む高分子ミクロスフェアの作成及び分析
導入
関節内注入は一般に患者によく許容され、現在では１回／週の注入の治療が臨床的に試験されているが、理想的な薬剤は制限された投与回数が必要なものでありうる。残念ながら、ヒトインスリン（ＨＩ）は長時間の低濃度の中性溶液中で保存した場合に不安定である。J. Brenge及びL. Langkjoer, Insulin Formulation and Delivery in Protein Delivery Eds. L.M. Sanders及びHendren。更にインスリンは、ヒトの体内で約５分の半減期を有する。Hadley, M.E. Endocrinology, Prentice-Hall, Inc. 1988。従って、安定した徐放性形態のＨＩが高く望まれる。ヒトインスリン（Eli Lilly, Indianapolis, IN）はまた、難溶解性のＺｎ：Ｈ１複合体を生成するために酢酸亜鉛と共に処方されている。Ｚｎ：Ｈ１複合体はインスリンの長期活性形態を生じると考えられている。実際に、組織化学的証拠はＨＩが亜鉛複合体として膵臓に保存されることを示す。J. Brenge及びL. Langkjoer, Insulin Formulation and Delivery in Protein Delivery Eds. L.M. Sanders及びW. Hendren, Pleum Press, 1997; Hadley, M.E. Endocrinology, Prentice-Hall, Inc. 1988。更に、亜鉛と複合したＨＩは、複合していないＨＩよりも凝集に対してより耐性があることが知られている。J. Brenge及びL. Langkjoer, 上掲。最後に、亜鉛と複合したインスリンは、普通のインスリンに比較してヒトにおいて、より遅い開始とより長い持続時間の活性（２４時間以上）を有することが示されている。J. Brenge及びL. Langkjoer, 上掲。
ミクロスフェアの製剤は、大きさ、タンパク質負荷、物理的及び生物学的完全性の決定が検討される。カプセル化されるヒトインスリン（ＨＩ）の量（ｗ／ｗ）は、Cleland, J.C. 及びJones, A.J.S., Pharm. Res. 13(10):1464-1475(1996)に従う化学分析により決定された。ＨＩの物理学的及び生物学的完全性は、サイズ排除（ＳＥＣ）及び逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）により分析された。ＳＥＣ及びＲＰＣはそれぞれ凝集した及び脱アミドしたＨＩを検出するのに使用された。
【０１４７】
材料と方法
ミクロスフェア製剤：
調製されたミクロスフェア製剤において、タンパク質負荷の間のＺｎ：ＨＩ六量体の比率（例えば、処方Ｉ−２：１及び処方ＩＩ−４：１）は一定（約5.0%）のままである。全てのポリマーのラクチドとグリコリドのモル比は５０：５０で一定に保たれた。全てのミクロスフェア製剤はBoehringer Ingelheimから入手したＤ,Ｌ-ＰＬＧＡ（Ingelheim, 独; RG502H; 0.2dL/g, 8kD）を用いて調製した。組み換えヒトインスリン（ＨＩ）は、Gombotz等, １９９１年５月２８日公開の米国特許出願第5,019,400号及びJohnson等, Nature Med 2(7):795-799(1996)に記載の低温、非水の方法を用いてＰＬＧＡミクロスフェアにカプセル化された。
ミクロスフェアに挿入する調製物において、前記のＨＩ製剤をまずスプレー凍結乾燥した。この方法は、液体窒素中に超音波ノズル（Sono-Tek, Milton NY）を通して上記製剤を霧状にし、続いて上記されるように（Johnson等、上掲）凍結乾燥することによりなされた。例えば、乾燥したＺｎ-ＨＩパウダー（100mg）を、0.17mg/mlの上記Ｄ,Ｌ-ＰＬＧＡのエチルアセテート溶液、5.8mlに添加し、Ｚｎ-ＨＩ及びポリマーの均一な懸濁液を形成するために剪断ホモジナイザー（Vitrius Inc. Giandiner, NY）を用いて8000rpmで２分間ホモジナイズした。ポリマー及びＺｎ-ＨＩ懸濁液を300mlの凍結したエタノールの入った容器に超音波処理ノズル（Sono-Tek, Milton NY）を通してスプレーした。次いで、凍結エタノールが融解するとすぐ、容器を−７０℃の冷凍庫（−７０℃まで温度を上げるために）に置き、エチルアセテート溶液としてゆっくりと固めたミクロスフェアをエタノールにより抽出する。３日後、固められたミクロスフェアを20μmのスクリーンで濾過することにより回収し、次いで４日間窒素ガス下で乾燥し、最後に60μmのスクリーンを通してふるいにかけた。
【０１４８】
クロマトグラフィー：
サイズ排除（ＳＥＣ）及び逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）法は、公表された方法（Pietta, P.G.等, J. Chromatogr. 549:367:373(1991); Klyushnichenko V.E.等, J. Chromatogr. 661:83-92(1994)）に従って実施した。概略を説明すると、ＳＥＣはＺｏｒｂａｘ(登録商標)カラムで溶離液としてリン酸緩衝液を用いて実施された。ＨＩは214nmのＵＶ吸収により検出した。逆相クロマトグラフィーは溶離液としてアセトニトリルを有する硫酸緩衝液を用いてＣ-１８逆相カラムにより４０℃で実施された（Pietta. P. G. 等, J. Chromatogr. 549:367-373(1991); Klyushnichenko, V.E.等, J. Chromatogr. 661:83-92(1994)）。
タンパク質分析：
カプセル化したＨＩの形態を、1.0Nの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）にそれらを溶解することによりミクロスフェアに戻し、溶解したタンパク質を実験的に決定した吸光度Ａ（1mg/ml、291nm、1cm）＝１．９４を用いたＵＶ吸光度により分析した。
【０１４９】
結果と検討
ミクロスフェアの平均粒径分布は、Malvern Masterisizer Xで測定され、約30ミクロンであることが分かった（表Ｉ）。処方Ｉと処方ＩＩのタンパク質負荷は、それぞれ5.56%と5.59%であることが分かった（表Ｉ）。ＨＩ完全性の分析は、インスリンレセプターキナーゼアッセイＫＩＲＡによって測定されるようにカプセル化の前と後でタンパク質に大した違いはないことを示唆した（以下の実施例７の方法参照）。
表Ｉ．ＰＬＧＡインスリンミクロスフェア処方の物理的特徴
処方        負荷（% w/w）  直径（nm）  インスリンＺｎ比率ａ
処方Ｉ        5.56          30.2±12        1:2
処方ＩＩ      5.59          36.6±11        1:4
ａモルインスリン六量体／亜鉛のモルで定義される比率
【０１５０】
実施例７
ＨＩミクロスフェアからのインスリンの放出
導入
インスリン放出の量を決定するために、インスリン負荷ミクロスフェアを３つの異なる条件下でインキュベートし、回収したタンパク質についていくつかの時点で活性を分析した。初めに、ミクロスフェアを10mMのヒスチジン緩衝液中、ｐＨ７．４、３７℃でインキュベートした。また、関節と同様の条件下での放出を測定するために、ミクロスフェアは滑液中で又は関節軟骨外植片と共にインキュベートした。全ての場合において、試料をいくつかの時点で採り、ヒトインスリンレセプターを発現する細胞でのインスリンレセプターリン酸化の誘導を測定することにより分析した。
【０１５１】
材料と方法
緩衝液中でのインスリンの放出：
ＨＩミクロスフェア製剤のインビトロ放出特性を評価するために、20mgの各ＨＩミクロスフェア製剤を500μLの放出緩衝液（10mMのヒスチジン、10mMのＮａＣｌ、0.02%のポリソルベート２０、0.02%のＮａＮ３、ｐＨ７．２）中におき、３７℃でインキュベートした。全ての放出媒体を各採取間隔で取り替え、得られた放出試料を分析まで５℃で保存した。
滑液中のインスリンの放出：
滑液を７−８週齢のオスのSprague-Dawleyラットから回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：２に希釈した。全ての放出媒体を各採取間隔で取り替え、得られた放出試料を分析まで５℃で保存した。
外植片培地でのインスリンの放出：
インスリン（10nM）又はＰＬＧＡ-インスリンミクロスフェアと共にインキュベートした関節軟骨外植片からの媒体を、様々な時点で回収し、インスリンキナーゼレセプターアッセイでの活性を試験した。ＰＬＧＡ-Ｉｎｓビーズを500ulの外植片媒体に懸濁し、3μlのこの混合物を260ulの外植片媒体の各外植片試料に加えた。
【０１５２】
インスリンキナーゼレセプターアッセイ（ＫＩＲＡ）：
細胞刺激：ヒトインスリンレセプターを形質移入したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、平底の９６穴無菌組織培養プレート（Falcon 1270）の培地（5%のダイアフィルトレーションしたＦＢＳを含むＰＳ／２０及び抗生物質1xグルタミン、1x penn/strep、10μg/mLのプロマイシン）におき（100μlの5x105細胞/mL）、３７℃、95%の空気及び5%のＣＯ２の加湿した雰囲気で一晩インキュベートした。次いで細胞を培地（0.5%ＢＳＡを含むＰＳ／２０）中の試料100μlで処理し３７℃で１５分間インキュベートした。プロテーゼ（ＡＥＢＳＦ、1mM、アプロチニン、ロイペプチン0.05mM）及びホスファターゼ（オルトバニド酸ナトリウム、20mM）阻害剤を含む130μlのLysis Buffer（50mMのＨＥＰＥＳ及び0.5%のTriton-X 100を含む150mMのＮａＣｌ）を各ウェルに添加した。次いで試料をＥＬＩＳＡ分析に使用した。
酵素結合免疫特異性アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：プレート（Nunc Maxisorp immunoplate 4-39454）を４℃で一晩、100μlの１°モノクローナル抗体（ＰＢＳ中最終濃度2μg/ml、ｐＨ７．０）で被覆した。この溶液を取り除いた後、プレートを150μlの阻害緩衝液（0.5%のＢＳＡを含むＰＢＳ）で１時間インキュベートした。次いでプレートを、洗浄緩衝液（0.05%のtween 20 を含むＰＢＳｐＨ７．４）（Skatron Scan Washer 300）で３回洗浄した。80μLの溶解緩衝液（50mMのＨＥＰＥＳ及び0.5%のTriton-X 100を含む150mMのＮａＣｌ）と20μlの試料（上記から）を調製したＥＬＩＳＡプレートに添加した。プレートを穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で６回洗浄した後、試料を100μlのビオチニン化２°抗体（4G10、アッセイ緩衝液中最終濃度0.1μg/ml、0.5%のＢＳＡ、0.05%のtween20及び5mMのＥＤＴＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）（ＵＢＩ）と共に穏やかに撹拌しながら２時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、100μlのストレプトアビジン／ＨＲＰ（アッセイ緩衝液で1:50,000に希釈した）（Amedex）と共に室温で穏やかに撹拌しながら１時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、100μlの基質溶液（１容積のK&P TMB基質＋１容積のTMB中K&P TMBペルオキシド溶液、Kirkegard and Perryの基質キット）と共にインキュベートした。着色の後（１０−１５分）、反応を100μlの1.0N Ｈ３ＰＯ４で止めた。次いで450nmのＯ．Ｄ．で読み取った。
【０１５３】
結果と考察
インスリンキナーゼレセプターアッセイ（ＫＩＲＡ）は、活性インスリンを測定する非常に感度のよいアッセイである。タンパク質放出の初期バースト（１日目）は緩衝液（図１２）及び滑液（図１３Ａ）の両方に見られた。処方ＩＩ（ＰＬＧＡ-Ｚｎ）からのＨＩの放出特性は、全負荷タンパク質の４０％近くが最初の２４時間に放出され、次いで負荷した全タンパク質の89%程度が放出されたその後１５日にわたって誘導期（毎日＜１％の放出）及び第２の放出期（毎日２−５％の放出）の２相性放出を示した（ＦＩｇ．１２）。３日間の滑液中でのインキュベーションの後、処方ＩＩのミクロスフェアは約5μM（全体で1.67mg/ml）の濃度で活性インスリンを放出し続けた。従って、これらの結果は、活性インスリンが負荷したミクロスフェアから放出され、処方の手段はタンパク質の質に不利ではないようであることを示唆した。
生体内で有しうる有利なこのような徐放性システムは、関節軟骨外植片と共にインキュベーションした後インスリン及びインスリン負荷ミクロスフェアを試験する実験により説明される。このシステムにおいて、試料を１回だけ処理し、培地を連日回収し、細胞は実験進行の間代謝活性を有する。このように、生物学的に適切なシステムでのインスリンの安定性を確認することができた。インスリンは組織のない培地で（３７℃で）培養した場合に完全に安定を保つが（図１４Ａ）、関節軟骨の存在下では、活性インスリンの量は劇的に増加した。実際に、軟骨のインキュベーション後２４時間内に、活性インスリンの量は７０％程度まで増加し、培養の４日目までに、少量の活性インスリンが検出された（図１４Ｂ）。対照的に、有意なレベルの活性インスリンが、ＰＬＧＡ-Ｉｎｓでの処理後、３日程後に見られた（１４Ｃ）。さらに、希釈したＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアを組織と共にインキュベートしたときでさえも、３日目のＰＬＧＡ-Ｉｎｓ試料中の活性インスリンの量は３日目のインスリン試料のものよりほぼ１４倍高かった（図１４Ｄ）。
結論として、我々は、ＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアが関節軟骨の存在する間中活性インスリンを放出し続けることを示す。従って、インスリンは、数日間生物学的に適したシステムでインキュベートしたミクロスフェアから放出した後に活性を保ち、明らかに変化はない。まとめて言えば、我々の結果は、ＰＬＧＡ-Ｉｎｓはインスリンの関節への局所的徐放性送達に利用できることを示唆する。
【０１５４】
実施例８
ＰＬＧＡ-Ｉｎｓの生物学的活性
導入
ＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアから放出されるインスリンが関節軟骨で活性であることを立証するために、これらのミクロスフェアを関節軟骨外植片に添加して３日間毎日培地の回収及び交換（更なるＰＬＧＡ-Ｉｎｓは加えずに）をした。活性は上記の関節軟骨外植片（実施例２）に記載されるようにしてプロテオグリカンの分解と合成を測定することにより確認した。コントロールとして、いくつかの外植片試料を各培地交換（即ち、０、２４、及び４８時間の時点）で新しいインスリン（10nM）で処理した。
外植片培地からのデータは、生体内で関節軟骨において特定のタンパク質の影響の予測に使用することができる。しかしながら、関節には軟骨に加えていくつかの組織型がある。更に、タンパク質は滑液から素早く除去されうる。従って、ＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアから放出されたインスリンが生体内で軟骨において硬化を有するか否かを決定するために、マウス膝関節にＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアを注入し、プロテオグリカン合成を測定した。
【０１５５】
材料と方法
プロテオグリカンの放出と合成におけるＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアの影響：
０日目、外植片をＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアで処理し（0.5mlの外植片培地に懸濁された3ulのミクロスフェアの溶液を260ulの培地中の外植片に添加した）、後日、培地を回収及び交換（ミクロスフェア無し）した。プロテオグリカンの分解と合成を上記（実施例２、関節軟骨外植片）のようにして測定した。いくつかの外植片試料を各培地交換時（即ち、０、２４、及び４８時間の時点で）に新しいインスリン（10nM）で処理した。
関節内注入：
ＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアを500μlの緩衝液（0.1%のヒアルロン酸を含有したリン酸緩衝食塩水）に懸濁し、この溶液の3μlをマウスの関節に関節内注入した。コントロールとして、3μlの緩衝液を反対側の膝に注入した。３日後、膝蓋骨を回収し、プロテオグリカン合成を上記のようにして測定した（実施例３、膝蓋骨アッセイ）。
【０１５６】
結果と考察
ＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアで処理した外植片は、減少したマトリックス分解（図１５Ａ）と増加したマトリックス合成（図１５Ｃ）を示した。更に、破壊を誘発し（図１５Ｂ）マトリックス合成を抑制する（図１５Ｄ）ＩＬ-１αの能力をＰＬＧＡ-Ｉｎｓでの同時処理により妨げられた（図１５Ａ-Ｂ）。最後に、ＰＬＧＡ-Ｉｎｓは、基礎的な（図１５Ｅ）及びＩＬ-１α誘発性の（図１５Ｆ）酸化窒素生成の両方を抑制した。これらの結果は、ＰＬＧＡ-Ｉｎｓが関節炎等の軟骨疾患を発症させる軟骨の異化及び損失を抑制することができることを示唆する。
マウス膝関節へのＰＬＧＡ-Ｉｎｓの注射の３日後、マトリックス合成は反対側の緩衝液を注入した関節に比較して著しく（ｐ＜０．０５）促進された（図１６）。従って、インスリンが滑液から除去され及び／又は周辺組織及び細胞により吸収された状況下であっても、関節軟骨はＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアにより放出されるインスリンに対して同化反応を有する。
まとめると、我々の結果は、インスリンがプロテオグリカン等のマトリックス分子の喪失を軽減し、並びにこれらの損失に代わって新しい分子の合成を促進したことをはっきりと示す。純益としては、得られた軟骨組織量中の総プロテオグリカン量が増加したことであった。インスリンのこの効果は、インビトロ及びインビボで示された。最後に、我々は担体としてＰＬＧＡを用いたインスリンの徐放性処方を作成した。これらのＰＬＧＡ-Ｉｎｓミクロスフェアはインスリンのみのものに比較して優れた安定性と活性を有していることが示された。
【０１５７】
実施例９
ヒト軟骨外植片
ＧＨ／ＩＧＨ／ＩＧＦＢＰ系が同化及び代謝恒常性の制御に関与しており、この系の欠如は成長、生理、及び糖血症の制御へ逆作用する（Jones 等., Endocr. Rev., 16: 3-34(1995); Davidson, Endocr. Rev., 8: 115-131(1987); Moses, Curr. Opin. Endo. Diab., 4: 16-25(1997)）。
ＩＧＦ-１は、培養における細胞増殖及びマトリックス合成を促進するその能力のために、骨関節炎の治療又は予防のために提供されている（Osborn, J. Orthop.Res., 7:35-42(1989)）。軟骨の活性中性メタロプロテイナーゼのレベルを下げることにより疾患の重度を減少させる効果のために、ＩＧＦ-１を、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）（軟骨細胞異化活性阻害剤）と共に重傷の骨関節炎の犬に投与した。Rogachefsky, Osteoarthritis and Cartilage, 1: 105-114(1993); Rogachefsky等, Ann. NY Acad. Sci., 732: 889-895(1994)に記載されるように、軽い骨関節炎の犬では、ＩＧＦ-１及びＰＰＳを一緒にした治療的介入は、軟骨構造及び生化学をうまく維持することが示されたが、ＩＧＦ単独では効果が無かった。軟骨再生を促進するための、単独あるいは他の成長因子をアジュバントとしたＩＧＦ-１の使用は、WO91/19510、WO92/13565、US5,444,047、及びEP434,652に記載されている。
また、EP560,723及びEP436,469に記載されるように、ＩＧＦ-１は、骨塩量の減少が見られる哺乳動物の骨粗鬆症、及び骨密度の減少及び潜在的な骨粗鬆症を生じる薬剤又は環境的条件にさらされたものの治療に役立つことが分かっている。
ＩＧＦ-１不足は、骨関節炎の発症の病因的役割を有しうる（Coutts等, 「Effect of growth factors on cartilage repair,」Instructional Course Lect., 47:487-494 (Amer. Acad. Orthop. Surg.: Rosemont, IL 1997)）。血清ＩＧＦ-１濃度は骨関節炎患者においてコントロール集団よりも低いことがいくつかの研究で示されているが、他の研究では、違いはないことが見出されている。にもかかわらず、血清ＩＧＦ-１レベル及び軟骨細胞のＩＧＦ-１に対する応答性の両方が年齢と共に減少し、後者はＩＧＦ-ＢＰｓに依存しているようである（Florini及びRoberts, J. Gerontol., 35:23-30(1980); Martin等, J. Orthop. Res., 15:491-498(1997); Fernihough等, Arthr. Rheum. 39: 1556-1565(1996)）。従って、ＩＧＦ-１の減少した有効性並びに低下した軟骨細胞の応答性／更なるＩＧＦＢＰｓの制御不能は、加齢及び疾患の進行を引き起こす弱った軟骨マトリックス恒常性及び組織変性に寄与しうる。
【０１５８】
ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ）の生物学的機能は分かっていない。ＩＧＦＢＰｓの、ＩＧＦＢＰ-３は、血漿のＩＧＦ-１及びＩＧＦ-２の全体のレベルの調節に最大の原因となるＩＧＦＢＰであることが示される。ＩＧＦＢＰ-３は、ＧＨ依存性タンパク質であり、ＧＨ-欠乏又は抵抗性の場合に減少する（Jones 等.,上掲；Rosenfield 等., The insulin-like growth factors and their regulatory proteins, Eds Baxter RC, Gluckman PD, Rosenfield RG. Excerpta Medica, Amsterdam(1994), pp357-464の「IGF-1 treatment of syndromes of growth hormone insensitivity」; Scharf等, J. Hepatology,25:689-699(1996)）。ＩＧＦＢＰｓは、主にそれらの翻訳後の修飾及び組織分布により、ＩＧＦ活性抑制を促進することができる（Jones及びClemmons, Endocr. Rev. 16:3-34(1995); Collet-Solberg 及びCohen, Endocrinol. Metabol. Clin. North Am. 25:591-614(1996)）。更に、ＩＧＦＢＰ（３、４及び／又は５）の制御不能は、関節炎疾患において重大な役割を果たす（Chevalier及びTyler, Brit. J. Rheum. 35:515-522(1996); Olney等, J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:1096-1103(1996); Martel-Pelletier等, Inflamm. Res., 47:90-100(1998)）。ＩＧＦ-ＢＰｓに対して低い結合親和性を有するＩＧＦ-１類似物は、プロテオグリカン合成の促進において野生型ＩＧＦ-１よりも効果的であった（Morales, Arch Biochem. Biophys. 324, 173-188(1997)）。しかしながら、より最近のデータでは、ＩＧＦＢＰｓはＩＧＦの軟骨組織結合及び介在性輸送に寄与することが示唆され、従ってＩＧＦＢＰｓは関節内のＩＧＦ-１の生物学的利用性を調節しうる（Bhatka等, J. Biol. Chem. 275:5860-5866(2000)）。
WO94/04569は、天然ＩＧＦＢＰ以外の特異的結合分子がＩＧＦ-１に対する結合能力があり、ＩＧＦ-１の生物学的活性を促進することが可能であることを開示する。1998年10月15日公開のWO98/45427; Lowman等, Biochemistry, 37:8870-8878(1998);及びDubaquie及びLowman, Biochemistry, 38: 6386(1999)は、ＩＧＦ-１類似物がファージディスプレイにより同定されることを開示する。また、WO97/39032はＩＧＦＢＰ'ｓのリガンド阻害剤及びそれらの使用方法を開示する。更に、米国特許出願第5,891,722号は、遊離ＩＧＦＢＰ-１に対して結合親和性を有する抗体、及び遊離ＩＧＦＢＰ-１及び膣液中の遊離ＩＧＦＢＰ-１の存在により示唆されるような、膣液中の羊水の存在に基づく胎膜の破裂を検出するための手段及び方法を開示する。
【０１５９】
結果と考察：
ＩＧＦ-１は、関節軟骨のマトリックス恒常性の重要な調節剤である。新しいマトリックス合成を超えるマトリックス分解を支持する骨関節炎の新陳代謝不均衡は、少なくとも部分的な、ＩＧＦ-１促進に対する軟骨細胞の非感受性に依存しうる。このＩＧＦ-１耐性にあるメカニズムは未知であるが、説の何れか１つに限ることなく、多くのＯＡ患者において上昇するＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ）が役割を担うと考えられる。これらの患者において、ＩＧＦＢＰｓに結合せず、従ってそれにより阻害されないＩＧＦ-１様活性を有するタンパク質は、組織において軟骨修復を促進するようであり、それ以外においてはＩＧＦ-１耐性がある。図１９に示されるように、我々は、関節置換を実施した少なくとも20%の患者がＩＧＦ-Ｉに応答性のない関節軟骨を有することを見出した。しかしながら、これらの患者の軟骨は、新しい軟骨マトリックス分子の有意な合成を誘発することによって、ＩＧＦＢＰｓに結合しないインスリンに応答する（図１９Ａ、Ｂ）。ＩＧＦＢＰｓに結合しないＩＧＦ-Ｉ変異体、ｄｅｓＩＧＦがこれらＩＧＦ-Ｉ耐性組織での軟骨マトリックス合成を誘発する（図１９Ａ、Ｂ）という事実は、このシステムにおけるＩＧＦ-１耐性にあるメカニズムが抑制性ＩＧＦ-ＢＰｓの生成を増加させることを示唆する。従って、罹患した軟骨はインスリンの同化効果に対する応答性を残し、このようにインスリンは罹患した関節内の軟骨に有利な影響を有しているようである。さらに、インスリンは関節炎軟骨等の組織において同化作用を有し、そうでなければＩＧＦ-１耐性があることが期待される。
【０１６０】
実施例１０
大腸菌におけるインスリン又はインスリン変異体の発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現によるインスリン又はインスリン変異体の非グリコシル化形態の調製を例示する。
インスリン又はインスリン変異体をコードするＤＮＡ配列を、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivarら, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＮＰＯＲコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
次いで、Sambrookら, 上掲に記載されている方法を用いて、ライゲーション混合物を選択した大腸菌の形質転換に使用する。形質転換体を、ＬＢプレートで成長する能力によって同定し、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡは、制限分析及びＤＮＡ配列分析によって単離され、確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地を、続いて大規模培地の播種に用いてもよい。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
【０１６１】
さらに数時間の培養の後、細胞を遠心分離によって採取できる。この分野で知られた種々の試薬を用いて、遠心分離で得られた細胞ペレットを可溶化することができ、次いで金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で、可溶化インスリン又はインスリン変異体タンパク質を精製できる。
以下の手法を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態でインスリン又はインスリン変異体を発現させてもよい。選択したＰＣＲプライマーを用いて、インスリン又はインスリン変異体をコードするＤＮＡを最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、並びに効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、そしてエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅されたポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に用いる。形質転換体は、最初に、50mg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ中で３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させる。ついで培地をＣＲＡＰ培地（3.57gの(ＮＨ４)２ＳＯ４、0.71gのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、1.07gのＫＣｌ、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのＭｇＳＯ４の混合で調製）中にて５０-１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させる。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって発現を確認するために試料を取り出し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとする。精製及びリフォールディング（再折りたたみ）まで、細胞ペレットを凍結させる。
0.5〜1Lの発酵（6-10gペレット）の大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、ｐＨ８緩衝液中で１０容量（w/v）で再懸濁させる。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、この溶液を４℃で終夜撹拌する。この工程により、亜硫酸によりブロックされたシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされる。溶液をBeckman Ultracentrifugeで40,000rpmで３０分間濃縮した。この上清を金属キレートカラムバッファー（6Mのグアニジン、20mMのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。条件によって、この透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに負荷する。このカラムを、50mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加緩衝液、ｐＨ７．４によって洗浄する。タンパク質は、250mMのイミダゾールを含有する緩衝液によって溶離する。所望のタンパク質を含有する分画をプールし、４℃で保存した。そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて、280nmにおける吸収度からタンパク質濃度を見積もった。
【０１６２】
20mMのトリス、ｐＨ８．６、0.3MのＮａＣｌ、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのＥＤＴＡからなる新たに調製したリフォールディングバッファー中で試料を徐々に希釈することによって、タンパク質をリフォールディングさせた。最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように、リフォールディング容量を選択する。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間に渡ってゆっくりと撹拌する。リフォールディング反応は、最終濃度が0.4%（約ｐＨ３）となるようにＴＦＡを添加することで停止させる。タンパク質の更なる精製の前に、溶液を0.22ミクロンフィルターによって濾過し、アセトニトリルを最終濃度が2-10%となるよう添加した。０．１％ＴＦＡの移動緩衝液と10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いて、リフォールディングしたタンパク質をPoros R1/H逆相カラム上でクロマトグラフにかける。Ａ２８０吸収を持つ分画のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同なリフォールディングしたタンパク質を含有する分画をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しくリフォールディングした種は、最もコンパクトであって、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているために、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。通常、凝集した種は、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤ってリフォールディングした形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望のフォールディングインスリン又はインスリン変異体タンパク質を含有する分画をそれぞれプールし、この溶液に向けた窒素の穏やかな気流を当てることでアセトニトリルを除去する。透析又は調製緩衝液で平衡化したＧ２５  Superfine（Pharmacia）樹脂を用いたゲル濾過又は透析によって、タンパク質を0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に調製する。
【０１６３】
実施例１１
哺乳動物細胞におけるインスリン又はインスリン変異体の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のインスリン又はインスリン変異体の調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターpRK5（1989年3月15日公開のＥＰ 307，247参照）を用いる。場合によっては、インスリン又はインスリン変異体ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてインスリン又はインスリン変異体ＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、例えばｐＲＫ５-ｉｎｓと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化する。約10μgのｐＲＫ５-ｉｎｓＤＮＡを約1μgのＶＡ ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、500μlの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mM ＥＤＴＡ、0.227M ＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に、滴状の、500μlの50mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、280mMのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させる。培地を吸引し、2mlの20%グリセロールを含むＰＢＳを３０秒間添加する。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートする。
形質移入の約２４時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は200μＣｉ/ml ３５Ｓ-システイン及び200uCi/ml３５Ｓ-メチオニンを含む培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの存在を明らかにするために選択された時間、フィルムに暴露する。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
【０１６４】
これに代わる技術において、インスリン又はインスリン変異体は、Somparyracら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入されうる。２９３細胞を、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５-ｉｎｓＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を20%グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインスリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。次いで発現されたインスリン又はインスリン変異体を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製する。
他の実施態様では、インスリン又はインスリン変異体をＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-ｉｎｓは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。インスリン又はインスリン変異体の存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたインスリン又はインスリン変異体を含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０１６５】
また、エピトープタグインスリン又はインスリン変異体は、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。インスリン又はインスリン変異体はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施して、バキュロウイルス発現ベクターにポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠で融合できる。ポリ-ｈｉｓタグインスリン又はインスリン変異体挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングされうる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入されうる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ｈｉｓタグインスリン又はインスリン変異体を含む培地は、次いで濃縮され、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の任意の選択された方法により精製できる。
またインスリン又はインスリン変異体は、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、又は他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施されてもよい。タンパク質は、例えば、（１）それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ定常領域配列に融合した、ＩｇＧ作成物（イムノアドへシン）、及び／又は（２）ポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現され得る。
ＰＣＲ増幅に続いて、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されているような標準的技術を用いて、対応するＤＮＡをＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように構築される。ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
【０１６６】
所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)又はFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）を使用して約一千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上掲のLucasらに記載されているように成長させた。約３ｘ１０−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させる。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合する。内容物を10mLの媒体を含む遠心管にピペットして、1000rpmで５分間遠心分離する。上清を吸引し、そして細胞を10mLの選択培地（5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を含有する0.2μm濾過ＰＳ２０）中に再懸濁させる。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分ける。１−２日後、細胞を150mLの選択成長培地で満された250mLスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを３ｘ１０５細胞/mLで播種する。この細胞培地を遠心分離によって新鮮培地に交換し、そして生産培地に再懸濁させる。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載されている生産培地を使用してもよい。3Lの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞/mLで播種する。０日目に、細胞数とｐＨを測定する。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施する。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、30mLの500g/Lグルコース及び0.6mLの１０％消泡剤（例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）とする。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持する。１０日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過する。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【０１６７】
ポリ-Ｈｉｓタグ作成物については、タンパク質をＮｉ-ＮＴＡカラム(Qiagen)を用いて精製する。精製の前に、条件培地へイミダゾールを5mMの濃度にまで添加した。0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, ｐＨ７.４緩衝液で平衡化した6mlのＮｉ-ＮＴＡカラムへ、4-5ml/分の流速で４℃で条件培地をポンプ供給する。充填後、さらに平衡緩衝液でカラムを洗浄し、0.25Mイミダゾールを含む平衡緩衝液でタンパク質を溶離する。続いて、高度に精製されたタンパク質を10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトールを含むｐＨ６の貯蔵緩衝液中に25mlのG25 Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。
以下のようにして条件培地からイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を精製する。ｐＨ６．８の20mMのリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）へ、条件培地をポンプ供給する。充填後、100mMのクエン酸, ｐＨ３．５で溶離する前に、このカラムを平衡緩衝液でしっかりと洗浄する。275μlの1Mトリス緩衝液, ｐＨ９を含む管に1mlの分画を回収することによって、溶離したタンパク質を即座に中性化する。続いて、上記にてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質に関して記した貯蔵緩衝液中に、この高度に精製されたタンパク質を脱塩する。その均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル、及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定によって評価する。
【０１６８】
実施例１２
酵母でのインスリン又はインスリン変異体の発現
以下の方法は、酵母菌中でのインスリン又はインスリン変異体の組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのインスリン又はインスリン変異体の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。インスリン又はインスリン変異体をコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入して挿入物の細胞内発現を指示する。分泌のために、挿入物をコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然シグナルペプチド又は他の異種哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）挿入物の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えインスリン又はインスリン変異体は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。未精製のポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１６９】
実施例１３
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのインスリン又はインスリン変異体の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるインスリン又はインスリン変異体の組換え発現を記載する。
インスリン又はインスリン変異体コードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単に言うと、インスリン又はインスリン変異体又はこのポリペプチドのコード化配列の所望の部分[例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列]が、５' 及び３' 領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択されたそれらの制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施する。
【０１７０】
次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグインスリン又はインスリン変異体は、例えばＮｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーによって、次のように精製される。抽出物は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製する。簡略して言うと、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用緩衝液（25mLのHepes、pH7.9；12.5mMのＭｇＣｌ２;0.1mMＥＤＴＡ;10%グリセロール;0.1%のＮＰ-４０; 0.4MのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理する。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷緩衝液（50mMリン酸塩、300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、ｐＨ７.８）で５０倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過する。Ｎｉ２+-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷緩衝液で平衡にする。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに負荷する。分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで、負荷緩衝液でカラムを洗浄した。次に、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄緩衝液（50mMリン酸塩; 300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、ｐＨ６.０）で、カラムを洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、二次洗浄緩衝液中での０から500mMイミダゾール勾配によって、カラムを展開した。1mLの分画は、回収され、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）と結合したＮｉ２+-ＮＴＡでのウェスタンブロットによって分析される。溶離したＨｉｓ１０-タグインスリン又はインスリン変異体を含む分画をプールし、負荷緩衝液で透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はFcタグ）インスリン又はインスリン変異体の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１７１】
あるいは更に、修飾バキュロウイルス法を用いるＨｉ-５細胞によって、本発明のインスリン又はインスリン変異体分子を発現してもよい。この方法では、所望の配列をコードするＤＮＡは、Ｐｆｕ（Stratagene）等の適当な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピトープタグの上流（５'-）に融合させてもよい。このようなエピトープタグは、ｐｏｌｙ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域等）を含む。ｐＩＥ-１（Novagen）等の市販のプラスミドから誘導されたプラスミドを含む、種々のプラスミドを用いることができる。このｐＩＥ-１及びｐＩＥ-２ベクターは、安定に形質転換された昆虫細胞におけるバキュロウイルスｉｅ１プロモーターからの組換えタンパク質の構成的発現のために設計される。このプラスミドは複数のクローニング部位の方向においてのみ相違し、未感染昆虫細胞におけるｉｅ１媒介遺伝子発現に重要であることが知られた全てのプロモーター配列並びにｈｒ５エンハンサー成分を含む。ｐＩＥ-１及びｐＩＥ-２はｉｅ１翻訳開始部位を含み、融合タンパク質の製造に利用できる。簡単に言うと、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲによって、所望の配列又は配列の所望の部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を増幅する。５'プライマーには、隣接する（選択された）制限酵素部位を導入してもよい。次いで、生成物を選択された制限酵素で消化し、発現ベクターへサブクローニングする。例えば、ｐＩＥ１-１の誘導体は、ヒトＩｇＧ（ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ）のＦｃ領域又は所望の配列の８ヒスチジン（ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ）タグ下流（３'-）を含むことができる。好ましくは、確認のために、構築ベクターの配列を確認する。
２７℃、ＣＯ２無し、pen／strep無しの条件下で、Ｈｉ-５細胞を５０%の培養飽和密度まで成長させる。各々の150mmプレートについて、配列を含む30μgのｐＩＥベースベクターを1mlのＥｘ-細胞培地（培地：Ex-細胞401＋1/100のL-Ｇｌｕ JRH Biosciences #14401-78P（注：この培地は軽感受性））と混合した。別の管において、１００μlのセルフェクチン（CellFECTIN;Gibco BRL +10362-010，ボルテックスで混合）を1mlのＥｘ-細胞培地と混合する。この２つの溶液を混合し、室温で１５分間インキュベーションする。8mlのＥｘ-細胞培地を２ｍｌのＤＮＡ／セルフェクチン混合物に添加し、Ｅｘ-細胞培地で１回洗浄したＨｉ５細胞上に層形成させた。次いでこのプレートを暗中室温で１時間インキュベートする。次いでＤＮＡ／セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をＥｘ-細胞で１回洗浄して過剰のセルフェクチンを除去する。30mlの新鮮なＥｘ-細胞培地を添加し、細胞を２８℃で３日間インキュベートする。その上清を回収し、バキュロウイルス感染ベクターの配列発現を、1mlの上清の25mlのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ-ＮＴＡビーズ（QIAGEN）のためのＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースＣＬ-４Ｂビーズ（Pharmacia）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色によって周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定する。
【０１７２】
形質移入細胞の条件培地（0.5-3L）を、遠心分離によって細胞を除去して回収し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過した。ポリ-Ｈｉｓタグ作成物のために、配列を含むタンパク質をＮｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを４８℃で流速４−５ｍｌ／分とする。負荷後、カラムを更なる平衡緩衝液で洗浄し、タンパク質が０.２５Ｍイミダゾールを含む平衡緩衝液で溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び４%のマンニトールを含む貯蔵緩衝液、ｐＨ６.８中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
また、タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を、以下のようにして条件培地から精製してもよい。20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）へ、条件培地をポンプ供給する。負荷後、カラムを平衡緩衝液でしっかりと洗浄した後、100mMのクエン酸, ｐＨ３.５で溶離した。１ｍｌの画分を275μlの1Mトリス緩衝液、ｐＨ９を含む管に回収することによって、溶離したタンパク質を即座に中性化した。続いてポリ-Hisタグタンパク質のために上記の貯蔵緩衝液中で、高度に精製されたタンパク質を脱塩した。その均一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定よって評価する。    
【０１７３】
実施例１４
インスリン又はインスリン変異体に結合する抗体の調製
この実施例は、インスリン又はインスリン変異体に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、当該分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製インスリン又はインスリン変異体、インスリン又はインスリン変異体を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えインスリン又はインスリン変異体を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなく成すことができる。
完全フロイントアジュバントに乳化したインスリン又はインスリン変異体免疫原でＢａｌｂ/ｃ等のマウスを免疫化し、そして皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入する。あるいは、免疫原をＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。次いで、１０から１２日後に、免疫化したマウスを選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗インスリン又は抗インスリン変異体抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイによる試験のために、レトロオービタル出血によってマウスから血清試料を周期的に採取してもよい。
【０１７４】  
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物へインスリン又はインスリン変異体の最後の静脈内注射を注入をすることができる。３から４日後に、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に脾臓細胞を（３５%ポリエチレングリコールを用いて）融合させた。
次いで、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートへプレートできるハイブリドーマ細胞が、この融合で生成される。
ハイブリドーマ細胞は、インスリン又はインスリン変異体に対する反応性に関してＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。インスリン又はインスリン変異体に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
抗インスリン又は抗インスリン変異体モノクローナル抗体を含む腹水を生成させるために、陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ/ｃマウスに腹腔内注入できる。あるいは、組織培養フラスコ又はローラーボトルで、ハイブリドーマ細胞を成長させることができる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを利用できる。
【０１７５】
実施例１５
特異的抗体を用いたインスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの精製
天然又は組換えインスリン又はインスリン変異体ポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-インスリン又はプロ-インスリン変異体ポリペプチド、成熟インスリン又はインスリン変異体ポリペプチド、又はプレ-インスリン／プレ-インスリン変異体ポリペプチドは、対象とするポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは、抗インスリン又は抗インスリン変異体ポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させることによって作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムによる沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）による精製のいずれかによって、免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡによるクロマトグラフィーによって、マウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロース(商品名)（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂へ共有結合的に付着している。この抗体は樹脂へ結合し、樹脂はブロックされ、そして誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のインスリン又はインスリン変異体ポリペプチドを含有する細胞からの分画を調製することによって、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの精製に利用される。洗浄剤の添加或いはこの分野で公知の他の方法によって、微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分分画の可溶化によって、この調製物は誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドは、成長する培地にその有用量が細胞が分泌される。
可溶化インスリン又はインスリン変異体ポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの好ましい吸着を可能にする条件下でカラムを洗浄する（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度緩衝液）。次いで、抗体／抗原結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ緩衝液、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）でカラムを溶離し、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドを回収する。
【０１７６】
実施例１６
合理的薬剤設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（即ち、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドのより活性で安定な形態薬剤、或いはインビボでこのポリペプチドの機能を促進又は阻害する薬剤の創作に利用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
インスリンは、ジスルフィド結合の対を介して結合するＡ（２１アミノ酸）及びＢ（３０アミノ酸）鎖からなる。異なる脊椎動物種の間に、インスリンの一次構造に僅かな相違がある（図表１、本文からの転載[Hadley, M.E. Endocrinology, Prentice-Hall, Inc.,1988]参照）。哺乳動物におけるこれらの相違は、通常、Ａ鎖の鎖内ジスルフィド結合内の８、９及び１０位及びＢ鎖の３０位にある。これらの相違は、生物学的な効力には影響は見られないが、それらは一部の患者にインスリン抗原性を構築するのに十分であり得る[Hadley, M.E.,上掲]。インスリン変異体は作用時に変化するものを作成できる。例えば、インスリンの即効性形態はインスリンＢ鎖のアミノ酸２８及び２９の反復により作成される（Humalog, Insulin lispro injection, Eli Lilly）。あるいは、遅い開始と活性の長い持続（２４時間以上）を有する中間型のインスリンは、インスリンが非結晶及び亜鉛との結晶性懸濁液として形成されリ場合に生じる。（ヒューマリンＬ, Lente, Eli Lilly）。インスリンの一次アミノ酸配列の豊富な情報、並びに外因性インスリンに対するヒトの免疫反応に関する臨床データはインスリン変異体の構築に役立足せることができる。
【０１７７】
１つの方法において、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチド、又はこのポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、インスリン又はインスリン変異体ポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似インスリン又はインスリン変異体ポリペプチド様分子の設計或いは効果的なインヒビターの同定に利用される。合理的な薬剤設計の有用な例には、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、或いはAthaudaら, J.Biochem.,113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子が含まれる。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離し、その結晶構造を解明することもできる。原理的には、この方法は、後に続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的で、薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することによって、タンパク質結晶学を迂回することができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに、抗-ｉｄを利用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するのに十分な量のインスリン又はインスリン変異体ポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したインスリン又はインスリン変異体ポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わって、又はそれに加えて、コンピュータモデル化技術を用いるものにガイダンスを提供する。
【０１７８】
（刊行物）
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、インスリンが初代関節軟骨細胞（ＡＣｓ）のマトリックス合成において効果があることを示す。様々な濃度（0.-100nM）での無血清媒体中のインスリンはブタ関節軟骨から初代軟骨細胞を誘導して、無処理コントロール試料（−）に関するプロテオグリカン合成を増加し、合成の抑制を誘発するインターロイキン１α（ＩＬ-１α）に勝ることができた。媒体は軟骨ＤＭＭＢアッセイを用いてプロテオグリカン含量を分析した。「＊」は比較コントロール（−又はＩＬ１α）のものとの有意な（ｐ＜０．０５）差異を示す。
【図２】  図２は、無血清培地中様々な濃度（1-100nM）での長期間（６日間）にわたるインスリン処理によって、初代関節軟骨細胞の代謝が増加した結果を示し、代謝は黄テトラゾリウム塩ＭＴＴを分解して紫ホルマザン結晶を形成する生存細胞の能力に基づいて培養細胞の代謝活性を測定する比色分析アッセイによって測定された。
【図３】  図３は、関節軟骨外植片におけるインスリンの同化作用効果を示す。３日間毎日のブタ関節軟骨外植片のインスリン処理は、基礎的な減少及びＩＬ-１α誘発性マトリックス破壊を生じ、これは、ＤＭＭＢアッセイを用いて培地中のプロテオグリカンの量を測定して決定した（上図、図３Ａ）。治療はまた、マトリックス合成を有意の増加し、ＩＬ-１αにより誘発されたマトリックス合成の抑制に部分的に勝った（下図、図３Ｂ）。
【図４】  図４は、軟骨マトリックスタンパク質の保持におけるインスリンの影響を示す。インスリンによるマトリックス破壊の抑制及びマトリックス合成の誘発（図３として上記される）によって、３日間の処理の最後に軟骨組織に残ったマトリックスの量は増加した。インスリンはまた、ＩＬ-１α（＋対Ｉｎｓ＋）により誘発される軟骨マトリックス含量の減少を超えることができた。
【図５】  図５は、インスリン又はＩＧＦ-１がＡＣ外植片による酸化窒素の放出を減少させることを示す。ＩＬ-１αの不存在下（上図、５Ａ（−））又は存在下（下図、５Ｂ（＋））でのインスリン（0.5-100nM）、ＩＧＦ-１（1-100ng/ml）又は培地のみ（−）で処理した関節軟骨外植片から培地を回収した。培地中の窒素量は、窒素と反応する２,３-ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）を用いて１-(Ｈ)-ナフトリアゾール、蛍光産物を形成する酸性条件下で測定した。
【図６】  図６は、膝蓋アッセイの絵図を示す。マウス膝関節に与えられる「タンパク質」の関節内注入後に、膝蓋骨を回収し、Ｓ３５-硫酸で標識し、固定して、脱灰し、下の骨をはずした。軟骨に取り込まれた放射能の量がマトリックス合成の伸びを表す。
【図７】  図７は、マウス膝蓋骨におけるインスリンの影響を示す。マウスから膝蓋骨を回収し、２４時間ＩＬ-１α又はインスリン（Ｉｎｓ）のどちらかと共にインキュベートした。最後の３時間の間に、膝蓋骨を３５Ｓ-硫酸で標識した。次いで、膝蓋骨を図６に示されるようにして処理した。このモデルにおいて、この初期関節軟骨アッセイのマトリックス合成をＩＬ-１αは減少させ、インスリンは増加させた（上図、図７Ａ−インビトロ処理）。インビボ分析において、マウスの一方の膝にインスリンを、他方の膝に緩衝液のみ（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）を３日間毎日注入し、膝蓋骨を回収して、膝蓋アッセイで分析した。２つの別々の実験が示される（下図、図７Ｂ）。第１の実験（左側）では、１０ｍｇ／ｍｌのインスリン保存液を６μｌ毎日注入し、３回目の注入の３時間後に膝蓋骨を回収した。第２には（右側）、マウスに１０ｍｇ／ｍｌの保存液６μｌを毎日注入し、３回目の注入の２４時間後に膝蓋骨を回収した。結果はコントロールに比較した放射能の取り込み量として示され、１．０を超えるものは、インスリンを注入した膝での合成の誘発を示す。
【図８】  図８は、ハートレーモルモットで生じる齢に従う突発性関節変性を示す。雄ハートレーモルモットの大腿脛骨関節の変性は、様々な齢の関節軟骨の組織学的分析によって示されるように、齢に依存した様態で生じる（６、９及び１２ヶ月、図８Ａ左側）。組織病理学的変化は、最小、中程度又は重度と等級付けした（図８Ａ右側）。最小の変化は限局的な軟骨細胞変性、軟骨表層の破損、減少したトルイジンブルーマトリックス染色を包含する。軽度の障害は、同様に限局的な軟骨細胞変性、軟骨表層の破損、減少したトルイジンブルーマトリックス染色である。中程度の変化は表面の殆どにわたっており、中層の殆どを含む。重度の変化は、広範な深層変性、骨増殖体、軟骨細胞複製、軟骨下骨肥厚、滑液過形成及び線維症を有する。各星印（*）は１つの膝関節を示す。（データは、Wei, L等, Arthritis Rheum. 40:2075-2083及びBendele, A., Lab. Anim. Sci.39:115-121(1989)から編集された。）
【図９】  図９は、インスリンが正常及び病変軟骨において同化作用効果を有することを示す。関節軟骨を雄ハートレーモルモットから採取し、100nMでインスリンを含む（Insulin）又は含まない（−）無血清培地で外植片を培養した。３５Ｓ-硫酸の混入を、プロテオグリカン合成の表示に使用した。全ての月齢（１−２ヶ月−図９Ａ、６ヶ月−図９Ｂ、及び１１ヶ月−図９Ｃ）でインスリンによってプロテオグリカン合成が有意に促進された。
【図１０】  図１０は、インスリンがモルモット関節軟骨の異化作用を減少させることを示す。インスリン（Ｉｎｓ）は、１１月齢の雄ハートレーモルモット由来の関節軟骨外植片から放出されるプロテオグリカンの量を測定することにより決定されるマトリックス分解の量を減少させる（左側「培地」）。処理の３日後、軟骨外植片を一晩消化させ、組織に残ったプロテオグリカンの量をＤＭＭＢアッセイを用いて測定した（右側「組織」）。マトリックス破壊の減少（培地）、及びマトリックス合成の増大（図９）により、３日の処理の最後に組織に残ったマトリックスの量に増加が生じた（組織）。
【図１１】  図１１は、糖尿病マウス由来の軟骨におけるインスリンの影響を示す。糖尿病、低インスリンマウス由来の膝蓋骨（ストレプトゾトシン処理）を回収し、マトリックス合成を100nMのインスリンの存在下（＋Ｉｎｓ）又は不存在下（−）で培養（１８時間）した後に測定した（図６）。基礎合成はコントロール（Con-）よりも糖尿病マウス（Diab-）で低かった。しかしながら、インスリンの処理は、糖尿病マウス（Diab +Ins）由来軟骨での合成レベルを未処理（Con -Ins）のものと同等のレベルまで回復させた。更に、コントロールと糖尿病組織の誘発の程度が同じであった。
【図１２】  図１２は、ＰＬＧＡマイクロスフィアからのＨＩの累積放出を示す。ＰＬＧＡのマイクロスフィアにカプセル化された処方ＩＩ（実施例７参照）を、１０ｍＭのＮａＣｌ、0.02%のポリソルベート２０、0.02%のＮａＮ３中でｐＨ７．２にしておき、３７℃でインキュベートした。全ての放出媒体は各試料採取の毎に交換し、放出試料はインスリンキナーゼレセプターアッセイ（ＫＩＲＡ）で生物活性インスリンを分析した。
【図１３】  図１３Ａ−１３Ｂは滑液中でのＰＬＧＡカプセル化からのインスリンの放出を示す。ＰＬＧＡ-Ｉｎｓはラット膝関節から回収された滑液中でインキュベートし、試料を毎日採取し、インスリンキナーゼレセプターアッセイ（ＫＩＲＡ）でインスリン活性を試験した。コントロールとしてＫＩＲＡの直前に500nM（ＳＦ＋Ｉ-５００）のインスリンで滑液をスパイクした。滑液はそれ自体、検出可能なインスリン活性を有さない（データは示されず）。図１３Ａは１−３日目の放出を示し、図１３は２日目及び３日目の放出のＡのデータを拡大したグラフである。結果は活性インスリンの濃度nMで表した。
【図１４】  図１４は３７℃、5%ＣＯ２でインキュベートした試料から毎日回収した試料のインスリン活性（ＫＩＲＡによる）を示す。毎日、培地を回収し、インスリンキナーゼレセプターアッセイ（ＫＩＲＡ）でインスリン活性を試験した。結果は、活性インスリンの濃度nMで表した。図１４Ａにおいて、試料は３７℃、5%ＣＯ２での無血清移植培地でインキュベートしたインスリン由来である。図１４Ｂにおいては、図１４Ａと同様のインスリン培養液をブタ関節軟骨外植片に加えた。図１４Ｃにおいては、外植片にＰＬＧＡマイクロカプセル化インスリン（ＰＬＧＡ-Ｉｎｓ）を加え、図１４Ｄにおいては、このＰＬＧＡ-Ｉｎｓ溶液を１：１０に希釈して外植片に加えた。
【図１５】  図１５Ａ−Ｆは軟骨外植片でのＰＬＧＡ-Ｉｎｓの影響を示す。図１５Ａ−Ｂは、マトリックス分解での影響を検討する。外植片に、ＩＬ-１α（1ng/ml）の不存在下（図１５Ａ−）又は存在下（図１５Ｂ＋）でＰＬＧＡ-Ｉｎｓを１回（時間０で）加え、培地中の（つまり、外植片から放出される）プロテオグリカンの量をＤＭＭＢアッセイを用いて測定した。２４時間、及び４８時間で、更なるＰＬＧＡ-Ｉｎｓを加えずに培地を交換した。対照的に、インスリン（10nM）（Ｉｎｓ１０）で処理した試料には、各時間（０、２４、４８時間）での培地交換と共に新しいインスリンを取り込んだ。２４時間にわたって放出されたプロテオグリカン（μｇ）で結果を示す。ＰＬＧＡ-Ｉｎｓでの単一処理で、基礎的な及びＩＬ-１α誘発性のマトリックス破壊の両方を減少させることができた。図１５Ｃ-Ｄはマトリックス合成におけるＰＬＧＡ-Ｉｎｓの影響を検討する。３日間、ＩＬ-１α（1ng/ml）の不存在下（上）又は存在下（下、＋）で外植片にＰＬＧＡ-Ｉｎｓを加えた。ＰＬＧＡ-Ｉｎｓは時間０の時にのみに加えられ、インスリン（10nM）（Ｉｎｓ１０）は各時点（０、２４時間４８時間）での培地交換と共に加えられた。処理の最後の１５時間で、外植片を３５Ｓ-硫酸で標識し、標識したマトリックスタンパク質を沈殿させ、計量した（ｃｐｍ）。ここに示されるように、ＰＬＧＡ-Ｉｎｓはマトリックス合成を促進し、プロテオグリカン合成のＩＬ-１α誘発性抑制に勝っていた。図１５Ｅ-Ｆは酸化窒素（ＮＯ）生成での影響を試験した。外植片にＩＬ-１α（1ng/ml）の不存在下（上）又は存在下（下、＋）でＰＬＧＡ-Ｉｎｓを加え、培地中の亜硝酸塩（μＭ）の量を測定した。ＰＬＧＡ-Ｉｎｓ  は時間０でのみ加えられ、インスリン（10nM）（Ｉｎｓ１０）は各時点（０、２４時間４８時間）での培地交換と共に加えられた。ＰＬＧＡ-Ｉｎｓでの単一処理で、酸化窒素の基礎生成が減少し、ＩＬ-１αによる酸化窒素合成の誘発を抑制した。
【図１６】  ＰＬＧＡインスリンの生体内での効果を示す。ＰＬＧＡ-Ｉｎｓマウスの後脚の関節領域に注入した。緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）をコントロール（−）として反対側の膝に注入した。結果は放射活性（ｃｐｍ）／膝蓋骨のとして表した。各線は単一のマウスを示す。
【図１７】  図１７Ａ及び１７Ｂはインスリンの一次構造を示す図である。選択された脊椎動物のインスリンの一次構造の比較図（図１７Ａ）、及びブタのプロインスリンの一次構造（図１７Ｂ）を示す。データはHadly, M.E., Endrocrinology, Prentice Hall Inc., 1988から編集した。
【図１８】  図１８は天然配列Ａ鎖のＡ鎖（図１８Ａ）（配列番号：１）、Ｂ鎖（図１８Ｂ）（配列番号：２）、天延配列プロインスリン（図１８Ｃ）（配列番号：３）及びＣ鎖（図１８Ｄ）（配列番号：４）のヒト天然配列を示す。
【図１９】  図１９Ａ及び１９Ｂは、ＩＧＦ、ＩＧＦ ＢＰｓ及びインスリンに結合しないＩＧＦ突然変異体のヒト関節軟骨でのマトリックス合成への影響を示す。ＩＧＦ-１（ＩＧＦ）ではなく、インスリン（Ｉｎｓ）が関節軟骨の軟骨マトリックス合成を誘発することが示される。３５Ｓ-硫酸で軟骨を標識することによりプロテオグリカン合成を測定する際に、表示した薬剤で２４時間、組織を処理した。図１９ＡはＩＧＦ-１（100ng/ml）、ｄｅｓＩＧＦ（100ng/ml）又はインスリン（13.15nM−100ng/mlのＩＧＦと等しいモル濃度）で処理した、変性関節疾患（ＤＪＤ）を有する６３歳の白人男性から採取した組織での結果を示す。図１９Ｂは、ＩＧＦ-１（80ng/ml）、ｄｅｓＩＧＦ（80ng/ml）又はインスリン（10.54nM−80ng/mlのＩＧＦと等しいモル濃度）で処理した、変形関節炎（ＯＡ）を有する７０歳女性から採取した組織での結果を示す。