【手続補正書】
【提出日】平成31年4月25日(2019.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、（ｉ）前記細胞におけるコレステロール生合成を回復するタンパク質をコードする核酸と、（ｉｉ）前記細胞におけるグルタミン生合成を回復するタンパク質をコードする核酸と、（ｉｉｉ）アミノグリコシド抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸と、（ｉｖ）治療用タンパク質をコードする核酸と、でトランスフェクトする工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、第１、第２及び第３ベクターの少なくとも１つでトランスフェクトする工程を含み、前記第１ベクターが、コレステロール生合成を回復するタンパク質をコードする核酸を含み、前記第２ベクターが、グルタミン生合成を回復するタンパク質をコードする核酸と、前記治療用タンパク質をコードする核酸とを含み、そして、前記第３ベクターが、前記アミノグリコシド抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、前記コレステロール生合成を回復するタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトする間又はその後に、外来的に導入したコレステロールの不在下で、培養することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、前記グルタミン生合成を回復するタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトする間又はその後に、外来的に導入したグルタミンの不在下で、培養することを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、前記グルタミン生合成を回復するタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトした後、グルタミン濃度を徐々に低下することによって培養することを更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、前記コレステロール生合成を回復するタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトする間又はその後に、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、培養することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、前記グルタミン生合成を回復するタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトする間又はその後、グルタミンシンセターゼ阻害剤の存在下で、培養することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、前記アミノグリコシド抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸でトランスフェクトする間又はその後に、アミノグリコシド抗生物質の存在下で、培養することを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、１００μｇ／ｍｌ又は２００μｇ／ｍｌの濃度で、前記アミノグリコシド抗生物質の存在下で、培養することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノグリコシド抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子を含み、前記方法が、前記細胞を、前記ネオマイシン耐性遺伝子をコードする核酸でトランスフェクトすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞から前記治療用タンパク質を回収し及び前記回収の後に、前記細胞の生存率を測定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記コレステロール生合成を回復するタンパク質が、３−ケトステロイドレダクターゼを含み、前記方法が、前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を、３−ケトステロイドレダクターゼをコードするする核酸でトランスフェクトすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グルタミン生合成を回復するタンパク質が、グルタミンシンセターゼを含み、前記方法が、前記細胞を、グルタミンシンセターゼをコードする核酸でトランスフェクトすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療用タンパク質が、抗体、融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、組み換えタンパク質スキャフォールド、酵素、増殖因子、ホルモン、ホルモン放出因子、インターフェロン、インターロイキン、又は血栓溶解剤を含み、前記方法が、前記細胞を、抗体、融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、組み換えタンパク質スキャフォールド、酵素、増殖因子、ホルモン、ホルモン放出因子、インターフェロン、インターロイキン、又は血栓溶解剤をコードする核酸で、トランスフェクトすることを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞が、ＮＳ０細胞である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
ＮＳ０細胞選択をまず、単一ネオマイシン選択（図９）及び単一ＧＳ選択（図１０）の両方を用いて最適化した。ネオマイシン最適化に関しては、細胞に、標準的なやり方で、ネオマイシン耐性遺伝子をコードする核酸ベクターをトランスフェクトした。次に、選択のために、ネオマイシンを細胞培地に（１００μｇ／ｍｌ又は２００μｇ／ｍｌ）で添加した。細胞生存率を回収からの記載の日数で測定した。ＧＳベースの選択の場合は、細胞にＧＳをコードする核酸ベクターをトランスフェクトし、グルタミン非含有細胞培地中で維持した。細胞生存率を、回収からの記載の日数で測定した。３−ＫＳＲベースの三重選択法をネオマイシン、３−ＫＳＲ及びＧＳ選択を用いて最適化することで、３−ＫＳＲ選択に関わる予期せぬ低生産性を克服した（図８）。細胞に、標準的なやり方で、３−ＫＳＲ、ＧＳ及びネオマイシン耐性遺伝子をコードする１種以上の核酸ベクターをトランスフェクトした。選択のために、細胞を、グルタミン及びコレステロールの不在下及びネオマイシンの存在下で維持した。図１１に示すように、三重選択は回収後、十分な細胞生存率を維持した。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、前記細胞におけるグルタミン生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び／又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔２〕前記治療用タンパク質が、抗体である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕核酸（ｉ）が、３−ケトステロイドレダクターゼをコードする、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼをコードする、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕第１発現ベクターが、核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターが、核酸（ｉｉ）を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔７〕第１発現ベクターが、核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターが、核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕前記第１発現ベクターのトランスフェクションが、前記第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記第１発現ベクターのトランスフェクションが、前記第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる、前記〔７〕に記載の方法。
〔１０〕前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後に培養する、前記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後に培養する前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１２〕前記細胞を、グルタミンシンセターゼ阻害剤、例えば、メチオニンスルホキシイミンの存在下で、例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後に培養する、前記〔１〕に記載の方法。
〔１３〕前記細胞を、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクションの間及び／又はトランスフェクションの後に、培養する、前記〔１〕に記載の方法。
〔１４〕前記細胞が、ＮＳ０細胞である、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１５〕前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１６〕治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、１種以上の選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び／又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔１７〕前記治療用タンパク質が、抗体である、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１９〕核酸（ｉ）が、３−ケトステロイドレダクターゼをコードする、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２０〕核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又は１種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２１〕第１発現ベクターが、核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターが核酸（ｉｉ）を含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２２〕第１発現ベクターが、核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターが核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２３〕前記第１発現ベクターのトランスフェクションが、前記第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕前記第１発現ベクターのトランスフェクションが、前記第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２５〕前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後に培養する、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２６〕前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後に培養する、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２７〕前記細胞を、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクションの間及び／又はトランスフェクションの後に培養する、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２８〕前記細胞が、ＮＳ０細胞である、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２９〕前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、前記〔１６〕に記載の方法。
〔３０〕治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、
第１選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸（ｉｉ）と、
第２選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）と、
治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｖ）と、
をトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び／又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔３１〕前記治療用タンパク質が、抗体である、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｖ）をトランスフェクトする、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３３〕核酸（ｉ）が、３−ケトステロイドレダクターゼをコードする、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３４〕核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又は１種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３５〕核酸（ｉｉｉ）が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又は１種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３６〕前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後で培養する、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３７〕前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後で培養する、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３８〕前記細胞を、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後で培養する、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３９〕前記細胞が、ＮＳ０細胞である、前記〔３０〕に記載の方法。
〔４０〕前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、前記〔３０〕に記載の方法。
〔４１〕核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼをコードし、核酸（ｉｉｉ）が、１種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、前記〔３０〕に記載の方法。
〔４２〕核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼをコードし、核酸（ｉｉｉ）が、ネオマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードする、前記〔３０〕に記載の方法。