【誤訳訂正書】
【提出日】令和1年6月20日(2019.6.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む、ボツリヌス毒素の製造方法。
（ａ）ボツリヌス毒素の生産菌株培養液を酸で処理してボツリヌス毒素を含む沈殿を生成させるステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）におけるボツリヌス毒素を含む沈殿物に緩衝液を添加した後、深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、およびメンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）からなる群から選択される１つ以上の方法により浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）における浄化されたボツリヌス毒素を含む溶液に対して、塩酸沈殿を行った後、塩酸沈殿の沈殿物を緩衝液に溶解させるステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）における塩酸沈殿物の溶解物に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＥＸ）を用いてボツリヌス毒素を精製するステップ。
【請求項２】
前記ボツリヌス毒素の生産菌株は、クロストリジウムボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）またはその変異体であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項３】
前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧで構成された群から選択されるボツリヌス毒素であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項４】
精製されたボツリヌス毒素は、純度９８％以上のボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項５】
前記ステップ（ａ）での酸処理は、前記ボツリヌス毒素の生産菌株培養液に、硫酸または塩酸を添加し、培養液のｐＨが３．０〜４．５となるようにすることによって行われることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項６】
前記ステップ（ａ）での酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｂ）での深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）は、蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｐｕｍｐ）を用いることを特徴とし、深層濾過に使用されるフィルタは、０．０１〜２０μｍの公称孔径（ｎｏｍｉｎａｌ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）を有することを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｃ）での塩酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行うことを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｃ）での塩酸沈殿は、ｐＨ２〜５となるように塩酸を添加して行われることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）及び（ｃ）での緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｂ）でのリン酸ナトリウム緩衝液は、ｐＨ４．５〜６．５であり、前記ステップ（ｃ）でのリン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ６〜７であることを特徴とする請求項１０に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｄ）における陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ｄ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）の、ボツリヌス毒素が含まれた分画として得られることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１４】
精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓまたは１９Ｓの構成形態を有することを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１５】
前記ステップ（ｄ）の後に、次のステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法：
（ｅ）ボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨを上向き調節するステップと、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）でｐＨが調節された陰イオン交換クロマトグラフィー分画を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するステップと、
（ｈ）前記ステップ（ｆ）で希釈されたボツリヌス毒素を、陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＣＥＸ）を用いて精製するステップ。
【請求項１６】
前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１７】
前記ステップ（ｆ）とステップ（ｈ）との間に、
（ｇ）精製された陰イオン交換クロマトグラフィー分画に緩衝液を添加してボツリヌス毒素を希釈するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１８】
前記ステップ（ｅ）でのｐＨの上向き調節では、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ｐＨ滴定（ｐＨ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、透析、および緩衝液交換カラムクロマトグラフィー（ｂｕｆｆｅｒ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）からなる群から選択される１つ以上の技法を用いることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ｇ）での緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする請求項１７に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２０】
前記ステップ（ｇ）でのリン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ６．５〜７．５であることを特徴とする請求項１９に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２１】
前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて行われことを特徴とする請求項１８に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２２】
前記ステップ（ｅ）でのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液は、ｐＨ７．３〜８．３であることを特徴とする請求項２１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｆ）での陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ｆ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）のボツリヌス毒素を含む分画、または、陰イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に結合されたボツリヌス毒素を含む分画として得られることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ｈ）での陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ｈ）でのボツリヌス毒素は、陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に結合されたボツリヌス毒素を含む分画として得られることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２７】
最終的に精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓの構成形態を有することを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０７】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
一態様において、本発明は以下を提供する。
[項目１]
次のステップを含む、ボツリヌス毒素の製造方法。
（ａ）ボツリヌス毒素の生産菌株培養液を酸で処理してボツリヌス毒素を含む沈殿を生成させるステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）におけるボツリヌス毒素を含む沈殿物に緩衝液を添加した後、深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）、および遠心分離からなる群から選択される１つ以上の方法により浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）における浄化されたボツリヌス毒素を含む溶液に対して、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿を行った後、前記ＵＦダイアフィルトレーションの透析残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を緩衝液に希釈するか、硫酸アンモニウム沈殿または塩酸沈殿の沈殿物を緩衝液に溶解させるステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）における希釈された透析残留物、硫酸アンモニウム沈殿物の溶解物、または塩酸沈殿物の溶解物に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＥＸ）を用いてボツリヌス毒素を精製するステップ。
[項目２]
前記ボツリヌス毒素の生産菌株は、クロストリジウムボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）またはその変異体であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目３]
前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧで構成された群から選択されるボツリヌス毒素であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目４]
精製されたボツリヌス毒素は、純度９８％以上のボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目５]
前記ステップ（ａ）での酸処理は、前記ボツリヌス毒素の生産菌株培養液に、硫酸または塩酸を添加し、培養液のｐＨが３．０〜４．５となるようにすることによって行われることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目６]
前記ステップ（ａ）での酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目７]
前記ステップ（ｂ）での深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）は、蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｐｕｍｐ）を用いることを特徴とし、深層濾過に使用されるフィルタは、０．０１〜２０μｍの公称孔径（ｎｏｍｉｎａｌ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）を有することを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目８]
前記ステップ（ｃ）でのＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行うことを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目９]
前記ステップ（ｃ）における硫酸アンモニウム沈殿での硫酸アンモニウムは、１０〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度となるように、ボツリヌス毒素含有溶液に添加することを特徴と
する項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１０]
前記ステップ（ｃ）での塩酸沈殿は、ｐＨ２〜５となるように塩酸を添加して行われることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１１]
前記ステップ（ｂ）及び（ｃ）での緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１２]
前記ステップ（ｂ）でのリン酸ナトリウム緩衝液は、ｐＨ４．５〜６．５であり、前記ステップ（ｃ）でのリン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ６〜７であることを特徴とする項目１１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１３]
前記ステップ（ｄ）における陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１４]
前記ステップ（ｄ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）の、ボツリヌス毒素が含まれた分画として得られることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１５]
精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓまたは１９Ｓの構成形態を有することを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１６]
前記ステップ（ｄ）の後に、次のステップをさらに含むことを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法：
（ｅ）ボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨを上向き調節するステップと、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）でｐＨが調節された陰イオン交換クロマトグラフィー分画を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するステップと、
（ｈ）前記ステップ（ｆ）で希釈されたボツリヌス毒素を、陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＣＥＸ）を用いて精製するステップ。
[項目１７]
前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１８]
前記ステップ（ｆ）とステップ（ｈ）との間に、
（ｇ）精製された陰イオン交換クロマトグラフィー分画に緩衝液を添加してボツリヌス毒素を希釈するステップをさらに含むことを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１９]
前記ステップ（ｅ）でのｐＨの上向き調節では、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ｐＨ滴定（ｐＨ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、透析、および緩衝液交換カラムクロマトグラフィー（ｂｕｆｆｅｒ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）からなる群から選択される１つ以上の技法を用いることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２０]
前記ステップ（ｇ）での緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする項目１８に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２１]
前記ステップ（ｇ）でのリン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ６．５〜７．５であることを特徴とする項目２０に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２２]
前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて行われことを特徴とする項目１９に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２３]
前記ステップ（ｅ）でのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液は、ｐＨ７．３〜８．３であることを特徴とする項目２２に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２４]
前記ステップ（ｆ）での陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２５]
前記ステップ（ｆ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）のボツリヌス毒素を含む分画、または、陰イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に結合されたボツリヌス毒素を含む分画として得られることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２６]
前記ステップ（ｈ）での陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２７]
前記ステップ（ｈ）でのボツリヌス毒素は、陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に結合されたボツリヌス毒素を含む分画として得られることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２８]
最終的に精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓの構成形態を有することを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。