(57)【要約】  短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を有効成分とする徐放性マイクロスフェア製剤において、その徐放性を改善し、長期にわたって有効な製剤を提供する。短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸が安定に封入され、疾患に関与するような特定のタンパク質の発現を長期間にわたって抑制できる、注射可能、または経粘膜投与可能な微細粒子製剤およびその製造法を提供する。  短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸、特にsiRNAを有効成分とする徐放性マイクロスフェア製剤、特にw1/o/w2型エマルションを経て調製される徐放性マイクロスフェアにおいて、生体内分解性ポリマー中にアルギニン、ポリエチレンイミン、細胞透過性ペプチド、ポリ-L−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン等の正電荷を持つ塩基性物質を含有させることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としての短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸と１重量％〜１０重量％の静電気的に相互作用してこれら核酸と複合体を形成し得る正電荷とを有する塩基性物質とを含んでなる徐放性マイクロスフェア。
【請求項２】
短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が、一本鎖または二本鎖構造を有し、長さが10〜85塩基である請求項１に記載の徐放性マイクロスフェア。
【請求項３】
短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が、一本鎖または二本鎖構造を有し、長さが15〜30塩基である請求項１に記載の徐放性マイクロスフェア。
【請求項４】
短鎖リボ核酸が、長さが15〜30塩基のsiRNAである請求項１〜３のいずれか１項に記載の徐放性マイクロスフェア。
【請求項５】
正電荷を有する塩基性物質が、カチオン性ポリマーである請求項１〜４のいずれか１項に記載の徐放性マイクロスフェア。
【請求項６】
正電荷を有する塩基性物質が、アルギニン、ポリエチレンイミン（PEI）、細胞透過性ペプチド、ポリ-L‐リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン又はsiLentFect（登録商標）からなる群から選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の徐放性マイクロスフェア。
【請求項７】
正電荷を有する塩基性物質が、ポリエチレンイミン（PEI）、細胞透過性ペプチド、ポリ-L‐リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン又はsiLentFect（登録商標）からなる群から選択される請求項６に記載の徐放性マイクロスフェア。
【請求項８】
さらに、生体内分解性ポリマーを含んでなる請求項１〜７のいずれか１項に記載の徐放性マイクロスフェア。
【請求項９】
生体内分解性ポリマーが、ポリ乳酸とポリグリコール酸又は乳酸とグリコール酸の共重合体である請求項８に記載の徐放性マイクロスフェア。
【請求項１０】
皮内、皮下、筋肉内、眼球、関節、臓器組織または腫瘍組織に注射可能な、有効成分として短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の徐放性マイクロスフェア。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の徐放性マイクロスフェアを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１２】
短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が腫瘍細胞の増殖を抑制し得る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の徐放性マイクロスフェアを有効成分として含む抗がん剤。
【請求項１３】
正電荷を持つ塩基性物質の存在下に、siRNAを溶解して調製した内水相を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒に溶解してなる油相に高速撹拌することによってW1/0エマルションとなし、これを外水相溶液に攪拌しながら添加してw1/o/w2となし、さらに乾燥することを特徴とするw1/o/w2液中乾燥法による請求項１〜１０に記載の徐放性マイクロスフェアの製造方法。
【請求項１４】
w1/o/w2又はs/o/wエマルションを経て、w/o、o/w又はs/oエマルションを超臨界流体中で脱溶媒又はスプレードライすることを特徴とする請求項１〜１０に記載の徐放性マイクロスフェアの製造方法。
【請求項１５】
w/oエマルション又はs/oサスペンションを経て、外油相に油相連続相とは相溶性があるが生体内分解性ポリマーを溶解しない有機溶媒を徐々に添加して当該短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を内封させることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
生体内分解性ポリマーが、ポリ乳酸とポリグリコール酸又は乳酸とグリコール酸の共重合体である請求項１５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のタンパク質、特に疾患に関係するタンパク質の発現を抑制する短鎖リボ核酸（siRNA；small interfering RNA）を生体内分解性ポリマーに内包させた、長期間にわたって必要量のsiRNAを安定にかつ持続的に放出する徐放性マイクロスフェア及びその製造方法に関する。本徐放性マイクロスフェアは、特に注射剤として有用であり、また、鼻、気管支、肺等の粘膜に対する投与も可能である。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムの塩基配列が解読され、ヒト遺伝子情報の全貌が明らかとなった。また、それに引続いて機能ゲノミクスの研究が精力的に行われ、各種ヒト遺伝子の詳細が明らかにされつつある。それにともなって、細胞シグナル伝達機構、細胞の増殖・分化機構等が解明され、また、タンパク質発現の促進・抑制による生体機能の変化、あるいは遺伝子異常と各種疾患の関係等が明らかにされつつあるとともに、それらヒト遺伝子を医療へ応用するための研究が引き続き活発に行われている。【０００３】
特に、疾病に関与する特定遺伝子と対合する配列を持ち、その遺伝子の発現を抑制する技術として所謂アンチセンス技術が知られている。実際には、合成したオリゴＲＮＡやオリゴＤＮＡ、最近ではその誘導体やＲＮＡ／ＤＮＡキメラ分子などがデザインされている。アンチセンス医薬開発の最大の関門は、細胞内に如何に医薬を取り込ませるかである。【０００４】
特に最近、短い一本鎖のアンチセンスDNA、RNAを用いたアンチセンス療法や、短鎖の二本鎖RNA（dsRNA；double stranded RNA）を用いてRNAi（RNA interference、RNA干渉）によって細胞内で配列特異的にmRNAを分解して特定の遺伝子の発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）技術が、難治性疾患治療のための新しい薬物治療方法として注目されている。【０００５】
また、近年に至り、特に後者のsiRNAは、従来のアンチセンス法に比べ、より少量で有効であることから注目されており、特に21〜29塩基対（bp)のsiRNAが効果的に目的遺伝子をノックダウンすることが報告されている。【０００６】
例えば、特開2005-192556号公報は、標的とする部位によらず、効果的に遺伝子発現が抑制され、しかも細胞毒性が低く、インターフェロン応答が軽減されたRNAi用の長鎖dsRNA(干渉用二本鎖RNA)について報告している。（特許文献１）
特表2005-508306号公報は、RNAiによる哺乳類における遺伝子発現の阻害方法およびそのための組成物の学術的および治療領域への応用について報告している。（特許文献２）
特開2005-73573号公報は、難治性疾患のひとつである狂牛病の原因因子とされているプリオンタンパク質の産生抑制方法およびその応用としてのRNAi技術の適用について報告している。（特許文献３）
特表2004-535813号公報は、siRNAを用いた哺乳類動物細胞におけるウイルス起源の外因性遺伝子の発現の選択的な転写後サイレンシング方法について報告している。（特許文献４）
一方、遺伝子を用いた製剤においても、副作用を抑制し、より効果的にその遺伝子製剤の治療効果を発揮させるために、通常の薬剤の服用や投与と同様に、生体内の標的部位に確実に、あるいはターゲットとする特定組織に特異的に目的遺伝子を取り込ませるための所謂ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が利用されている。しかし、このドラッグデリバリーシステムは、遺伝子を単独で使用した場合では難しく、遺伝子キャリアーと併用することで達成することが試みられている。例えば、細胞表面に存在するレセプターを標的とし、レセプターに対するリガンドを遺伝子キャリアーに修飾することが試みられている。例えば、J. Control Release, 74,341(2001)は、VEGFを遺伝子キャリアーに修飾することを報告している。（非特許文献１）
また、J Drug Target, 12, 393-404 (2004)は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、siRNAなどのリボ核酸、コレステロールなどの脂溶性物質を結合したオリゴヌクレオチドを生体内分解性ポリマーであるポリ乳酸/グリコール酸に含有させた徐放性粒子の調製について報告しており、さらにこれら徐放性粒子の放出特性や生体内での遺伝子発現抑制効果について報告している。（非特許文献２）
しかし、これら遺伝子製剤を実用化しようとするとき、これら短鎖リボ核酸やリボ核酸は、極性が著しく高いために生体膜透過性が低く、また、生体内へ投与した場合、体内の酵素によって極めて速やかに代謝されてしまうため、消化管や血液中に投与しても十分な効果が期待できず、また、局所投与においても作用が持続しないなどの問題があった。【０００７】
徐放性製剤技術については、従来、薬物が一定の速度で徐々に放出される剤形を製造するために、生分解性高分子、薬物、添加剤、溶媒などが適切に調製された一つの混合液を用いて噴霧乾燥法又は他の製造法によって１つの組成のマイクロスフェアを製造する方法を使用してきた。マイクロスフェア製剤の製法として、生理活性ペプチド等の水溶液を内水相とし、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を油相とするW/Oエマルションを水等に加え、W/O/Wエマルションから徐放性マイクロスフェアを製造する方法がよく知られている。徐放性マイクロスフェアの剤形が生体内で一定の期間最適の薬理学的効果を示すためには、薬物の初期放出量と以後の放出期間の放出速度が適切に調節されなければならない。これまでは、前述したパラメータ、すなわち生分解性高分子の種類、濃度、薬物の含量、放出速度を調節するための添加剤の量、溶媒の量などを変えながらマイクロスフェアを製造することにより、薬物の初期放出量と放出速度を調節した。【０００８】
また、徐放性製剤については、徐放性薬物送達システム(DDS; Drug Delivery System)製剤の一般的な製造方法としては、コアセルベーション法(coacervation)、乳濁液相分離法又は噴霧乾燥によるカプセル化及び有機又は水相中の溶媒蒸発法などが知られている。このような方法のなかでも水相中溶媒蒸発法が最も多く使用されており、これは大きく乳化蒸発法(W/O/W; Water/Oil/Water)と単一乳化蒸発法(O/W; Oil/Water)とに分類される。【０００９】
このうちペプチド又は蛋白質のような水溶性薬物の封入に主として使用されるW/O/W法は、水溶液に薬物を溶解して製造した薬物含有水溶液を生分解性高分子を含有する有機溶媒に分散させて１次エマルジョンを形成(water in oil)した後、これを水相に分散させる方法である。また、脂溶性薬物の封入に主として使用されるO/W法は、有機溶媒又は有機溶媒の混合物に薬物と生分解性高分子を共に溶解(oil)させた後、これを水相に分散させる方法である。両方法は共に、有機溶媒相の高分子が水相に分散される過程で、有機溶媒が抽出又は蒸発などにより除去されて、高分子の溶解度が減少することにより、固形化され、その結果、微粒球を形成することになる。一般に、W/O/W法により製造された微粒球は、O/W法により製造された微粒球に比べて多孔性が増加するので、表面積が大きくなって、薬物の初期放出速度が相対的に高いという特徴がある。
【特許文献１】特開2005-192556号公報
【特許文献２】特表2005-508306号公報
【特許文献３】特開2005-73573号公報
【特許文献４】特表2004-535813号公報
【非特許文献１】E. K Gaidamakova.J. Control Release, 74,341(2001)
【非特許文献２】Alim Khan, Mustapha Beenboubetra. J Drug Target, 12, 393-404 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸が安定に封入され、特定のタンパク質、特に疾患に関係するタンパク質の発現を長期間にわたって抑制し得る徐放性マイクロスフェア、特にこれら核酸と複合体を形成し得る塩基性物質とを含んでいる徐放性マイクロスフェア及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一般に、核酸、ペプチド、タンパク質等からなる医薬製剤を経口あるいは非経口投与した場合、生体内の多くの酵素によって分解されるため、これら医薬製剤の効果は速やかに消失してしまう。これを改善するため様々な工夫がなされている。そのうちの１つの方法が、長期徐放性注射剤とすることである。【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため、核酸を含有する徐放性マイクロスフェア製剤について鋭意研究を重ねた結果、マイクロカプセル化において、正電荷を持つ塩基性物質が、短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を高い封入率で、マイクロスフェア特にw1/o/w2型エマルションを経て調製した徐放性マイクロスフェアに含有させることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
即ち、本発明は、短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸と正電荷を持つ塩基性物質を含有した生体内分解性ポリマーによる徐放性マイクロスフェア製剤を提供するものである。【００１４】
本発明によれば、短鎖デオキシリボ核酸および短鎖リボ核酸を、安定にかつ持続的に標的細胞に送達させるため、w1/o/w2液中乾燥法などのマイクロカプセルの製造法により、短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を、生体分解性および生体適合性を持つ所謂生体内分解性ポリマー中に封入することにより目的とする徐放性マイクロスフェア製剤を得ることができる。【００１５】
より具体的には以下の通りである。【００１６】
１．有効成分としての短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸と１重量％〜１０重量％の静電気的に相互作用してこれら核酸と複合体を形成し得る正電荷とを有する塩基性物質とを含んでなる徐放性マイクロスフェア。【００１７】
２．短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が、一本鎖または二本鎖構造を有し、長さが15〜85塩基である上記１に記載の徐放性マイクロスフェア。【００１８】
３．短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が、一本鎖または二本鎖構造を有し、長さが15〜30塩基である上記１に記載の徐放性マイクロスフェア。【００１９】
４．短鎖リボ核酸が、長さが15〜30塩基のsiRNAである上記１〜３のいずれかに記載の徐放性マイクロスフェア。【００２０】
５．正電荷を有する塩基性物質が、カチオン性ポリマーである上記１〜４のいずれかに記載の徐放性マイクロスフェア。【００２１】
６．正電荷を有する塩基性物質が、アルギニン、ポリエチレンイミン（PEI）、細胞透過性ペプチド、ポリ-L‐リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン又はsiLentFect（登録商標）である上記１〜４のいずれかに記載の徐放性マイクロスフェア。【００２２】
７．正電荷を有する塩基性物質が、ポリエチレンイミン（PEI）、細胞透過性ペプチド、ポリ-L‐リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン又はsiLentFect（登録商標）からなる群から選択される上記６に記載の徐放性マイクロスフェア。【００２３】
８．さらに、生体内分解性ポリマーを含んでなる上記１〜７のいずれかに記載の徐放性マイクロスフェア。【００２４】
９．生体内分解性ポリマーが、ポリ乳酸とポリグリコール酸又は乳酸とグリコール酸の共重合体である上記８に記載の徐放性マイクロスフェア。【００２５】
１０．皮内、皮下あるいは筋肉内、眼球、関節、臓器組織、腫瘍組織に注射可能な、有効成分として短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を有する上記１〜９に記載の徐放性マイクロスフェア。【００２６】
１１．上記１〜１０のいずれかに記載の徐放性マイクロスフェアを有効成分として含む医薬組成物。【００２７】
１２．短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸が腫瘍細胞の増殖を抑制し得る、上記１〜１０のいずれかに記載の徐放性マイクロスフェアを有効成分として含む抗がん剤。【００２８】
１３．正電荷を持つ塩基性物質の存在下に、siRNAを溶解して調製した内水相を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒に溶解してなる油相に高速撹拌することによってW1/0エマルションとなし、これを外水相溶液に攪拌しながら添加してw1/o/w2となし、さらに乾燥することを特徴とするw1/o/w2液中乾燥法による上記１〜１０に記載の徐放性マイクロスフェアの製造方法。【００２９】
１４．w1/o/w2又はs/o/wエマルションを経て、w/o、o/w又はs/oエマルションを超臨界流体中で脱溶媒又はスプレードライすることを特徴とする上記１〜１０に記載の徐放性マイクロスフェアの製造方法。【００３０】
１５．w/oエマルション又はs/oサスペンションを経て、外油相に油相連続相とは相溶性があるが生体内分解性ポリマーを溶解しない有機溶媒を徐々に添加して当該短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を内封させることを特徴とする上記１４に記載の製造方法。【００３１】
１６．生体内分解性ポリマーが、ポリ乳酸とポリグリコール酸又は乳酸とグリール酸の共重合体である上記１５に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、正電荷を持つ物質を用いることで、短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を高封入率で徐放性マイクロスフェアに含有させることができ、かつ、短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸の細胞や組織外での安定性を向上させるばかりでなく、細胞への取り込みも促進する。【００３３】
また、本発明の徐放性マイクロスフェア製剤、特にw1/o/w2型エマルションを経て調製された徐放性マイクロスフェアは、通常なら血中又は細胞中の酵素で容易に分解される短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を、酵素分解から保護し、また、安定かつ持続的に有効成分としての短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を徐放する。【００３４】
また、本発明によれば、極めて少量の短鎖リボ核酸で高いRNAi効果が得られる。【００３５】
本発明の徐放性マイクロスフェアは、医薬としての核酸を1週間から6ヶ月にわたって徐放することができ、特定の遺伝子発現を一過性ではなく持続的に抑制することができる。【００３６】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-254966号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】血管新生抑制因子であるVEGFの産生を抑制する作用を持つホスホロチオエート型アンチセンスオリゴDNAを、異なる添加量のアルギニンと共に生体分解性・生体適合性高分子（PLGA）に封入して調製したマイクロスフェア中のアンチセンスオリゴDNAの封入率（％）を示した図である。（実施例３）
【図２】血管新生抑制因子であるVEGFのmRNAを遺伝子レベルで分解し、VEGF産生を抑制する作用を持つ短鎖リボ核酸（siRNA）と、ホスホロチオエート型アンチセンスオリゴDNAを、マウス由来癌細胞（S-180）にトランスフェクション（形質導入）した後の、細胞からのVEGF産生抑制率を示す図である。（実施例５）  黒い丸印はsiRNA、白い丸印はアンチセンスオリゴDNAをトランスフェクションした場合を示す。（平均値±S.D., n=3）
【図３】正電荷を持つ塩基性物質および市販遺伝子導入試薬をキャリアーとしてsiRNAをS-180細胞にトランスフェクションした際の、VEGF産生抑制率を示す図である。（実施例６）
【図４】siRNA含有PLGAマイクロスフェアからのsiRNA放出特性を示す図である。白い丸印はsiRNAのみを含有するマイクロスフェア、黒い丸印はアルギニンとともにsiRNAを封入したマイクロスフェア、黒い三角印はPEIとともにsiRNAを封入したマイクロスフェアを示す。（平均値±S.D., n=3）（実施例８）
【図５】担癌マウスの腫瘍内に異なる濃度のsiRNAを投与した後の、経時的な腫瘍体積変化を示す図である。ＸはsiRNA未投与のコントロール、黒い丸印はsiRNA 1μM、白い丸印はsiRNA 2μM、黒い三角印はsiRNA 5μM、白い三角印はsiRNA 10μM、白い四角印はsiRNA 15μMを投与した図である。（平均値±S.E., n=4）（実施例１０）
【図６】siRNA含有PLGAマイクロスフェアを担癌マウスの腫瘍内に投与した後の、経時的な腫瘍体積変化を示す図である。白い丸印はPBSのみを投与、白い三角印はsiRNAを含有しないPLGAマイクロスフェア、黒い丸印はsiRNAのみを含有するマイクロスフェア（siRNA投与量：1.3μ/マウス）、黒い三角印はアルギニンとともにsiRNAを封入したマイクロスフェア（siRNA投与量：1.7μg/マウス）、黒い四角印はPEIとともにsiRNAを封入したマイクロスフェア（siRNA投与量：2.1μg/マウス）を示す。（平均値±S.E., n=5）（実施例１１）
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本明細書、本発明において用いられる用語の意味は次のとおりである。【００３９】
「核酸」とは、デオキシリボ核酸（DNA）及び／またはリボ核酸（RNA）を意味する。【００４０】
「短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」とは、短鎖のDNA又はRNAのアンチセンスおよびその活性誘導体、リボザイム、さらには短鎖の二本鎖RNA（dsRNA；double stranded RNA）を意する。例えば、small interfering RNA（siRNA）と称される15〜30塩基対（bp）、好ましくは21〜29bpのリボ核酸を意味する。siRNAは、合成することによって得られるが、DNAあるいはRNAによって細胞を用いて産生することもできるし、市販のものを入手することもできる。また、ステムループ構造を有するmiRNA（micro RNA)も含まれる。miRNAは、１本鎖RNAとして含まれていてもよく、また70塩基前後の２本鎖RNA（miRNA前駆体）として含まれていてもよい。70塩基前後の２本鎖RNA（miRNA前駆体）として含まれている場合、ダイサーの作用により１本鎖RNAが生じる。さらに、「短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」には、核酸アプタマーおよびデコイ核酸（おとり型核酸）が含まれる。核酸アプタマーとは、標的たんぱく質に特異的に結合する10〜85塩基、好ましくは20〜60塩基のオリゴヌクレオチド（RNA/DNA）で、たんぱく質のポケットに入り込み、安定な3次元構造を形成、機能阻害する能力を有し、抗体より高い親和性と特異性を持ち、抗体とは異なる機能阻害を示す。実際に、成長因子（VEGF、PDGF、bFGF）、ホルモン（Neuropeptide Y, LHRH, Vasopressin)、酵素（キナーゼ、タンパク質分解酵素）、シグナル伝達因子、受容体（Neurotensin受容体１）、膜タンパク質（PSMA）、転写因子（NF-κB、B2F)、ウイルスタンパク質などさまざまなタンパク質に結合するアプタマーが挙げられるがこれに限定されない。デコイ核酸は、アプタマーの１種であり、標的遺伝子と結合し目的の遺伝子の発現を阻止することができる。デコイ型核酸としては、2本鎖型および血清中での核酸分解酵素に対する抵抗性が向上したリボン型デコイ核酸が挙げられる。たとえば、NF-κBタンパク質、HIV転写増殖因子（Tatタンパク質）、C型肝炎ウイルスのNS 3プロテアーゼなどを認識するデコイ核酸が挙げられる。さらに、短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」にはCpGオリゴ核酸も含まれる。CpGオリゴ核酸は、通常、GACGTTなどのシトシン（C）、グアニン（G)が並ぶCpGモチーフを含む20〜30塩基程度のオリゴ核酸で、自然免疫の賦活作用、および抗原と同時投与することによって抗原特異的な免疫反応の賦活作用を持っている。また、配列によっては、免疫反応の抑制作用を持っている。また、CpGモチーフ以外にも、一本鎖または二本鎖のRNAが免疫を制御することも知られており、これらRNAも「短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」に含まれる。これらは、単独または抗原とともにマイクロスフェアに封入して、CpGオリゴ核酸、一本鎖RNA、または二本鎖RNAを強力なアジュバントとしたシングルショットのワクチンとして有効であり、また、免疫抑制剤や自己免疫疾患治療剤として有効である。【００４１】
また、本発明の「短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」は、体内安定性や親和性を高めるために、一部化学構造を修飾したものも含む。たとえば、核酸分子の修飾塩基の導入、リン酸結合部の改変、五炭糖2'位の誘導体、リボース環にフルオロ基の導入、五炭糖中の酸素原子を硫黄原子に置換した4’-チオ核酸などを含むがこれに限定されない。【００４２】
本発明において、塩基の長さを表現するとき、１本鎖核酸の場合は、塩基であらわし、２本鎖核酸の場合、塩基または塩基対(bp)であらわす。２本鎖核酸において、例えば、30塩基という場合も、30塩基対という場合も同じ長さを表す。本発明の「短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」の長さは、10〜85塩基、好ましくは15〜60塩基、さらに好ましくは15〜30塩基である。【００４３】
siRNAは、細胞内において極めて少量で配列特異的にｍRNAを分解し、特定の遺伝子発現を抑制することにより、目的タンパク質の合成を阻害するRNA干渉（RNA  interfering; RNAi）を引き起こす特徴を有する。前記RNAiは、siRNAによる目的遺伝子のノックダウン技術のひとつであり、細胞の機能や分化を誘導する新規遺伝子の探索、細胞内シグナル伝達経路の決定、ノックダウン細胞株・動物の作製など幅広い研究領域での利用も期待されている。また、siRNAは、疾病に関連する遺伝子の発現を一過的に直接的かつ特異的に抑制できるため、副作用の少ない遺伝子治療薬としても期待されている。【００４４】
当該siRNAの具体例としては、例えば、血管内皮増殖因子およびこの受容体の産生、細胞の癌化に関与すると言われているBcl-2タンパク質の産生、human immunodeficiency virus（HIV）やC型・B型肝炎ウイルス、トリインフルエンザ、SARS、ウェストナイル熱の伝染性疾患を引き起こすウイルスの複製、免疫性疾患や炎症性疾患に関与する腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor、TNF-α、TNF-β）やモノカイン、インターロイキン（IL）、ケモカイン、コロニー刺激因子（CSF）、血管内皮増殖因子（VEGF)などのサイトカインおよびその受容体の産生、ウイルス感染や肝移植時に生じる肝障害の要因のひとつである細胞のアポトーシスを誘導するFas遺伝子の発現、ｃFLIP等のアポトーシス阻害因子の産生など、様々な疾患の原因因子および関連因子の産生を抑制する作用を示す短鎖の核酸を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。例えば、腫瘍部位において血管内皮増殖因子の発現をサンレンシングさせることにより、腫瘍部位における血管新生を阻止することにより腫瘍を治療することができる、さらに腫瘍部位においてアポトーシス阻害因子の発現をサイレンシングさせることにより、腫瘍細胞にアポトーシスを起こさせ腫瘍を治療することができる。また、腫瘍部位において血管内皮増殖因子とアポトーシス阻害因子の両方の発現をサイレンシングさせることにより相乗的な効果が得られる。【００４５】
「遺伝子導入キャリアー」とは、短鎖リボ核酸（dsRNA、siRNAなど）をはじめプラスミド、DNAなどの核酸を標的細胞に特異的に導入するための、siRNAと静電気的に相互作用して複合体を形成することが可能な、正電荷を有する塩基性のキャリアーを意味する。【００４６】
「正電荷を持つ塩基性物質」とは、機能的に言うならば遺伝子導入キャリアーであり、正電荷を持ち、siRNAと静電気的に相互作用して複合体を形成できるものであればよく、遺伝子導入キャリアーとして知られている物質を用いることができる。具体的には、正電荷を持つ脂質やこれからなるリポソーム、高分子、デンドリマーなどである。【００４７】
短鎖リボ核酸（dsRNA、siRNAなど）をはじめプラスミドDNAなどの核酸を標的細胞に特異的に導入するためには、運び手となる遺伝子導入キャリアーが必要不可欠となる。本発明における微粒子製剤の製造法は、負の電荷を帯びた短鎖デオキシリボ核酸及び短鎖リボ核酸と正電荷の遺伝子キャリアーを静電気的に相互作用させることにより、短鎖デオキシリボ核酸及び短鎖リボ核酸を高い割合で高分子物質内に封じ込め、かつ、短鎖デオキシリボ核酸及び短鎖リボ核酸と遺伝子キャリアーとの複合体が生体内で微粒子製剤から放出され、効果的に標的細胞内に短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を導入できる。遺伝子導入キャリアーは特に限定しないが、正電荷を持ち、siRNAと静電気的に相互作用して複合体を形成できるものであり、正電荷を持つ脂質やこれからなるリポソーム、高分子、デンドリマーなどである。【００４８】
さらに具体的には、前記「正電荷を持つ脂質」としては、例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、トリメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N-1-2,3-ジオレオイルオキシプロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、N-2,3-ジオレオイルオキシ-1-プロピルトリメチルアンモニウムメチルサルファイト（DOTAP methosulfate）、コレステリル3β-N-ジメチルアミノエチルカルバメートハイドロクロリド（DC-Chol）、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアミンモニウムブロミド（DMRIE）、2,3-ジオレイルオキシ-N-2スペルミンカルボキシアミドエチル-N,N-ジメチルアンモニウムトリフルオロアデテート（DOSPA）、O,O’-ジテトラデカノイル-N-α-トリメチルアンモニオアセチルジエタノールアミンクロライドなどを挙げることができる。【００４９】
「正電荷を持つ高分子（カチオン性ポリマー）」としては、ポリエチエレンイミン（PEI、直鎖型もしくは分岐型）、ポリエチレングリコールとポリ-L-リジンからなるブロック共重合体などが、また、市販の遺伝子導入試薬として、Lipofectamine（登録商標）、Lipofectamine plus（登録商標）、jet PEI（登録商標）、Oligofectamine（登録商標）、siLentFect（登録商標）、DMRIE-C（登録商標）、Transfectin-Lipid（登録商標）、Effectene（登録商標）などを挙げることができる。このうち、ポリエチレンイミン（PEI)には、直鎖PEIと1級、2級、3級アミンを含む分岐PEIとが存在するがいずれも用いることができる。また、PEIの分子量も限定されない。さらに脱アシル化等の化学修飾されたPEIも用いることができる。【００５０】
その他、アルギニン、ポリアルギニン、ポリ-L-リジン、ポリオルニチン、スペルミン、プロタミン、キトサンなどの塩基性物質を挙げることができる。【００５１】
また、「デンドリマー」としては、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミドアミンスターバーストデンドリマー、デンドリリックポリリジン、サイクロデキストリン・デンドリマー結合体、スターバーストデンドリマーなどを挙げる事ができる。【００５２】
さらに、Tatなどの細胞透過性ペプチドおよびその誘導体や、NF-κβなどの核移行シグナルを挙げることができる。【００５３】
また、微粒子の製造において、正電荷の物質として、たとえば、アルギニン、ポリエチレンイミン、ポリ-L‐リジン、-L-オルニチン、ポリsiLentFect（登録商標）が挙げられる。【００５４】
好ましい「正電荷を持つ塩基性物質」としては、例えば、アルギニン、特にL(+)-アルギニン、ポリエチレンイミン、特に分岐型ポリエチレンイミン（PEI）、細胞透過性ペプチド、ポリ-L‐リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、siLentFect（登録商標）を例示することができる。ポリ-L-リジンは好ましくは３つ以上のリジン残基、さらに好ましくは４つ以上のリジン残基、特に好ましくは10個以上のリジン残基からなる。さらに、ポリエチレンイミン、細胞透過性ペプチド、ポリ-L‐リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、siLentFect（登録商標）等のポリマー性の正電荷を持つ塩基性物質（カチオン性ポリマー）が好ましい。しかし、これらに限定されるものではない。【００５５】
また、上記の正電荷を持つ塩基性物質の複数を組み合わせて用いてもよい。【００５６】
これらの正電荷を持つ塩基性物質は、核酸と会合し、核酸をマイクロスフェアに取り込む機能を有する。さらに、ポリエチレンイミン、細胞透過性ペプチド、ポリ-L‐リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、siLentFect（登録商標）等のポリマーを用いた場合、マイクロスフェアの細胞への導入効率を高くすることが可能である。【００５７】
本発明で用いられる「生体内分解性ポリマー」とは、生体分解性および生体適合性の高分子を意味し、特に限定されるものではないが、長期にわたり徐々に分解され、siRNAなどの薬物を持続的に放出できるものであればよく、脂肪族高分子（ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシラクサンなど）、ポリ-α-シアノアクリル酸エステル、ポリエステルなどのホモポリマーおよびこれらの構成モノマーからなるコポリマーなどを挙げることができる。【００５８】
本発明においては、製剤を構成する特に好ましい高分子物質としては、ポリ乳酸もしくは乳酸とポリグリコール酸もしくはグリコール酸のモル比が50/50〜90/10の共重合体であるポリ乳酸グリコール酸を挙げることができるが、これに限定されるものではない。【００５９】
本発明において、「短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸」および「正電荷を持つ塩基性物質」は生体内分解性ポリマー中に封入されるが、「封入」とはカプセル状あるいはマトリックス状の生体内分解性ポリマー中に短鎖デオキシリボ核酸もしくは短鎖リボ核酸および正電荷を持つ塩基性物質が含まれる状態も、短鎖デオキシリボ核酸もしくは短鎖リボ核酸、正電荷を持つ塩基性物質ならびに生体内分解性ポリマーが会合した状態で存在し、容易には分解しな状態もさす。本発明において、「封入」を「内封」あるいは「内包」ということもある。【００６０】
本発明において、「徐放性マイクロスフェア」とは、短鎖デオキシリボ核酸またはリボ核酸の放出もしくは溶出を制御することで特定遺伝子の発現を抑制する効果を持続できる作用を有する徐放性微粒子製剤をいい、徐放性を有するものであれば注射剤用、粘膜投与剤用等とくに限定されない。これらの持続放出性微粒子製剤は、薬学的に許容しうる公知の添加物を含むことができる。なお、本記載において、「マイクロスフェア」を便宜上、「持続放出性微粒子製剤」、「マイクロカプセル」もしくは「マイクロ粒子」という場合もある。本発明のマイクロスフェアはW1/O/W2、S/O/W、W/O、O/W、S/W等のエマルションを公知の方法、例えば凍結乾燥を適用することによって製造することができる。エマルションの形態は好ましくは、w1/o/w2型である。【００６１】
本発明のw1/o/w2に基づく徐放性マイクロスフェア製剤は、カプセル化技術、例えば、それ自体公知のw1/o/w2液中乾燥法により、正電荷を持つ塩基性物質の存在下に、siRNAを溶解して調製した内水相を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒に溶解してなる油相に高速撹拌することによってW1/Oエマルションとなし、これを外水相溶液に攪拌しながら添加してw1/o/w2となし、さらに乾燥することにより製造することができる。即ち、低分子化合物、リボ核酸、ペプチドなどの水溶性薬物、好ましくは短鎖リボ核酸又は短鎖デオキシリボ核酸の水溶性薬物ならびに必要に応じて薬物封入化剤を、正電荷を持つ塩基性物質の存在下に、水、リン酸などの無機物で調製される緩衝液、もしくはポリビニルアルコールなどの界面活性作用を持つ高分子からなる溶液に溶解して調製した内水相を、生体分解性および生体適合性を持つポリ乳酸・グリコール酸等の生体内分解性ポリマーをジクロロメタンなどの有機溶媒に溶解してなる油相に高速撹拌することによってW1/Oエマルジョンを調製し、これをポリビニルアルコール溶液等の外水相溶液に攪拌しながら添加し、攪拌してw1/o/w2となし、ジクロルメタン等の有機溶媒を除去して凍結乾燥することによって薬物を内封した微粒子を製造するものである。微粒子の平均径は、数μm〜数100μm、好ましくは10μm〜150μm、さらに好ましくは20μm〜45μm、特に好ましくは20μm〜30μmである。微粒子の径がこれより小さくナノオーダーであると細胞に貪食され、細胞内で微粒子中の核酸が分解されてしまい、また微粒子中に核酸を導入するのが困難になる。また、これより大きいと微粒子を含む液は懸濁液となり注射による投与が困難になってしまう。本発明のマイクロスフェアは、皮下投与した場合、血管中に入ることなく皮下に留まり核酸を徐々に放出し得る。【００６２】
これらマイクロスフェアの製造方法は、特に限定されるものではなく、w1/o/w2又はs/o/wエマルションを経て、w/o、o/w又はs/oエマルションを超臨界流体中で脱溶媒又はスプレードライすることによって達成される。【００６３】
siRNAを内封させるにあたって、w/oエマルションおよびs/oサスペンションを経て、外油相に油相連続相とは相溶性があるが生体内分解性ポリマーを溶解しない有機溶媒、例えばヘキサンを徐々に添加することが推奨される。【００６４】
正電荷を持つ塩基性物質の添加量は、内水相に対し、重量比で１％以上、好ましくは２％以上、より好ましくは５％以上であり、良好な製剤特性を維持するためには15％以下、好ましくは10％以下である。なお、ここで用いられる水とは、精製水、蒸留水、超純水、滅菌水をいう。【００６５】
エマルションの脱溶媒方法は、通常は常温、常圧で軽く撹拌しながら溶媒を留去させるが、減圧にしたり気体を溶液の表面乃至中部に吹き付けてもよい。また、超臨界流体中での脱溶媒あるいはスプレードライ法等を採用することができる。また、エマルジョンは、w1/o/w2のほか、s/o/w、w/o、o/w、s/oであってもよい。【００６６】
本発明の短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を含む徐放性マイクロスフェアは、医薬組成物、すなわち徐放性マイクロスフェア製剤として、種々の形態で被験体に投与することができる。【００６７】
それゆえ、上記短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を含有する本発明の徐放性マイクロスフェア製剤は、癌、ウイルスによる感染性疾患、免疫性疾患、炎症性疾患、肝移植時に生じる肝障害、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑症などの難治性疾患から生活習慣病など様々な疾病を治療するのに有用である。【００６８】
本発明のマイクロスフェアを含む医薬組成物の投与形態としては、注射剤、埋め込み剤などによる非経口投与を挙げることができ、皮内、皮下、筋肉内、眼球、関節、臓器組織、腫瘍組織に投与することができる。医薬組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ゲル化剤、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、マイクロスフェアを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、ポリエチレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などを使用することができる。【００６９】
投与量は、疾患の重篤度等により適宜決定できるが、本発明の組成物の医薬的に有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、各種疾患を治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することをいう。本発明の医薬組成物の投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。例えば、体重１kg当り、マイクロスフェアに含ませる短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸の量で0.0001〜1000mg、好ましくは0.0001〜10mg、さらに好ましくは0.0001〜0.1mgでよい。また、マイクロスフェアの量で、体重１kg当たり0.1mg〜100mg、好ましくは0.2mg〜50mgである。【００７０】
本発明の短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を含むマイクロスフェアを被験体に投与した場合、少なくとも１週間〜６ヶ月以上、好ましくは１ヶ月〜４ヶ月以上にわたって短鎖デオキシリボ核酸または短鎖リボ核酸を放出することが可能である。従って、本発明のマイクロスフェアを有効成分として含む医薬組成物は、例えば、１週間〜６ヶ月、好ましくは１ヶ月〜４ヶ月に１度投与すればよい。【００７１】
さらに、本発明は本発明の徐放性マイクロスフェアを治療を必要とする被験体に医学上有効量を投与して、癌、ウイルスによる感染性疾患、免疫性疾患、炎症性疾患、肝移植時に生じる肝障害、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑症などの難治性疾患から生活習慣病など様々な疾病を治療する方法を包含する。【００７２】
さらに、本発明は、本発明の徐放性マイクロスフェアの癌、ウイルスによる感染性疾患、免疫性疾患、炎症性疾患、肝移植時に生じる肝障害、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑症などの難治性疾患から生活習慣病など様々な疾病を治療する医薬組成物の製造への使用を包含する。
【実施例】
【００７３】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００７４】
実施例１  アンチセンス含有マイクロスフェアの調製法；
血管内皮増殖因子（VEGF）の産生に関与するメッセンジャーRNA（mRNA）と相補的に結合し、遺伝子発現過程における翻訳段階を阻害することによってVEGFの産生を抑制する効果を持つ抗マウスVEGFアンチセンスオリゴDNAを、生分解性で生体適合性の高分子に封入した徐放性マイクロスフェアの調製法を確立することを目的として実験を行った。【００７５】
2 mMアンチセンスオリゴDNA（21 base、分子量6360.2、ホスホロチオエート型） 20μLおよび内水相液量に対して0.1〜10%量のL(+)-アルギニン（Sigma製）を、100μLの0.4％ポリビニルアルコール溶液に溶解して内水相とし、生体分解性・生体適合性のポリ乳酸/グリコール酸（PLGA、乳酸/グリコール酸＝75/25、Wako製） 0.5 gをジクロロメタン2 mLに溶解して油相とした。内水相と油相を混合し、10,000 rpmで3分間高速撹拌を行いw1/oエマルションを調製した。次に、調製したw1/oエマルションを500 mLの0.25％ポリビニルアルコール溶液に撹拌しながら添加し、3,000 rpmで15分間撹拌してw1/o/w2エマルションを得た。さらに、250 rpmで3時間撹拌することでジクロロメタンを留去し、遠心分離後、上清を除去した。蒸留水で3回洗浄した後、回収した粒子を凍結乾燥し、アンチセンス含有マイクロスフェアを得た。【００７６】
実施例２  siRNA含有長期徐放性マイクロスフェアの調製法；
VEGFの産生に関与するmRNAを分解してVEGFの合成を阻害する作用を持つ短鎖リボ核酸siRNAを、PLGAに封入した長期持続放出性微粒子の調製法を確立することを目的として実験を行った。【００７７】
350 nM 濃度の抗マウスVEGF siRNA（21bp、分子量13345.4） 25μLとL(+)-アルギニン7.5μgあるいは分岐型ポリエチレンイミン（PEI、分子量25 kDa、Sigma製） 5μgを、100μLの0.4％ポリビニルアルコール溶液に溶解して内水相とした。実施例1で用いたPLGA 0.5 gを3 mLジクロロメタンに溶解して油相とした。内水相と油相を混合し、10,000 rpmで2分間高速撹拌を行いw1/oエマルションを調製した。次に、調製したw1/oエマルションを500 mLの0.25％ポリビニルアルコール溶液に撹拌しながら添加し、3,000 rpmで3分間撹拌してw1/o / w2エマルションを得た。さらに、250 rpmで3時間撹拌することでジクロロメタンを留去し、遠心分離後、上清を除去した。蒸留水で3回洗浄した後、回収した粒子を凍結乾燥し、siRNA含有マイクロスフェアを得た。【００７８】
実施例３  アンチセンスオリゴDNAの封入率（％）；
実施例１で調製したアンチセンスオリゴDNA含有マイクロスフェアを電子顕微鏡で観察し、さらに顕微鏡写真からフェレー水平径を測定して平均粒子径を算出した。また、マイクロスフェア25 mgを試験管にとり、アセトニトリル0.5 mLを加えてPLGA成分を溶解し、これに、pH6.0リン酸緩衝液0.5 mLを加えて2時間振とうした後、5,000 rpmで20分間遠心分離し、上清についてHPLC測定を行い、マイクロスフェアに封入されたアンチセンスオリゴDNA量を求めた。粒子調製時の固形成分の処方量の総質量を100％とし、これに対する測定されたアンチセンスオリゴDNA量の割合をマイクロスフェアへのアンチセンスオリゴDNAの封入率（％）として算出した。HPLCの分析条件は以下のとおりである。【００７９】
装置：
SHIMADZU製HPLCシステム（SCL-10Avpシステムコントローラー、LC10ADvpポンプ、DGU-12Aデガッサー、SPD-10Avp UV検出器、SIL-10Avpオートインジェクター、CTO-10ASvpカラムオーブン、C-R8Aプリンター）
カラム：
TSKgel Oligo DNA RP、4.6 mm×15 cm 、TOSOH
移動相：
A；0.1 M triethylamine acid (TEAA)
B；アセトニトリル
Ａ/Ｂ（90/10）→Ａ/Ｂ（70/30）
リニアグラジエント（45分）
流  速：１mL/min
検  出；UV（260 nm）
注入量：10μL
（結果）
調製されたアンチセンスオリゴDNA含有マイクロスフェアは、球形の粒子であることが顕微鏡により観察され、また、マイクロスフェアの平均粒子径は、いずれも30〜45μmで注射針を容易に通過し得る粒子径であり、注射剤として応用可能な大きさの粒子であることが確認された。【００８０】
図１に示すように、マイクロスフェアへのアンチセンスオリゴDNAの封入率は、粒子調製時の内水相へのアルギニンの添加割合によって変化し、アルギニン添加率の増加に伴い封入率は増大し、特に、内水相に対して7.5重量％以上のアルギニンを添加することで封入率は約80％もの高い値を示し、アルギニンなどの正電荷を持つ塩基性物質を適当量添加することで高い封入率のアンチセンスオリゴDNA含有マイクロスフェアが調製可能であることが示された。【００８１】
実施例４  残存率を指標として、マイクロスフェアからのアンチセンスDNAの放出性を評価
実施例１で調製したマイクロスフェア25 mgを栓付試験管に秤量し、37℃のpH7.4の0.1 Mリン酸緩衝液1.5 mLを加え、回転撹拌装置を用いて37℃下で28日間の放出試験を行った。一定時間後、5,000 rpmで20分間遠心分離した後上清を除去し、得られた沈殿物（マイクロスフェア）にアセトニトリル0.5 mLを加えてPLGA成分を溶解した。これに、pH6.0リン酸緩衝液0.5 mLを加えて強く混合し、2時間振とうした後、5,000 rpmで20分間遠心分離し、上清についてHPLC測定を行い、マイクロスフェアに残存しているアンチセンスDNA量を求めた。試験前のマイクロスフェア中のアンチセンスDNA量を100％とし、これに対する各時間のマイクロスフェア中のアンチセンスDNA量の割合を残存率（％）として算出した。この残存率を指標として、マイクロスフェアからのアンチセンスDNAの放出性を評価した。【００８２】
HPLCの分析条件は、実施例３と同じである。【００８３】
（結果）
内水相にアルギニンを5％以上添加して調製したマイクロスフェアは、2ヶ月間にわたってアンチセンスDNAを持続的に安定に放出することが示された。【００８４】
実施例５  VEGF産生抑制率（％）；
血清を含むDMEM培地に懸濁した培養細胞：マウス腎由来癌細胞Sarcoma180（S-180）を1×105個/穴の密度で24穴培養プレートに播種し、37℃、5％CO2条件下で前培養した。24時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄したのち無血清培地RPMI1640に培地交換し、実施例２で用いたsiRNA 0.13μgまたは実施例１で用いたアンチセンスオリゴDNA 3.25μgを培養プレートの各穴に添加して37℃、5％CO2条件下で12時間トランスフェクション（形質導入）を行った。その後、細胞をPBSで洗浄したのち無血清培地RPMI1640を加え、37℃、5％CO2条件下で静置し、12時間ごとに72時間までの培地中のVEGF量を酵素免疫測定法（ELISA法）で測定した。細胞のみの培地中の単位細胞あたりのVEGF量を100％とし、これに対する各試料培地中の単位あたりのVEGF量の割合をVEGF産生抑制率（％）として算出した。【００８５】
（結果）
図２に示すように、アンチセンスオリゴDNAに比べ、siRNAは高いVEGF産生抑制率を示した。このときのsiRNAの投与量はアンチセンスオリゴDNAの1/25倍であり、極めて少量の短鎖リボ核酸で高いRNAi効果が得られることが判明した。アンチセンスDNAは3日で効果が消失しており、作用時間が短いことが問題である。また、siRNAにおいては実験を行った3日間は抑制が見られたが次第に抑制率が低下しており、効果の持続は通常1週間程度とされている。この実験からも作用の持続には短鎖リボ核酸の長期徐放性製剤の必要性が示唆された。【００８６】
実施例６  VEGF産生抑制率（％）；
VEGF産生抑制効果を示すsiRNAを塩基性物質および市販導入試薬とともに細胞内に導入した際のRNAi効果を評価し、遺伝子キャリアーの必要性を検討することを目的として実験を行った。【００８７】
遺伝子導入キャリアーとして、L(+)-アルギニン（7.5μg）、分岐型ポリエチレンイミン（PEI、Mw2.5 kDa、0.1μg）、jetPEI（0.8 mL、N/P比＝2）、Lipofectamine（2μg）、SiLentfect（1.6μg）用い、これらの物質と実施例２で用いたsiRNA（0.13 μg）をそれぞれ混合し、複合体を調製した。実施例５と同様にS-180細胞を、血清を含むDMEM培地に懸濁したのち、1×105個/穴の密度で24穴培養プレートに播種し、37℃、5％CO2条件下で前培養した。24時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄したのち無血清培地RPMI1640に培地交換し、siRNA単独（0.13μg）もしくは上記調製したsiRNAとキャリアーとの複合体を培養プレートの各穴に添加し、37℃、5％CO2条件下でトランスフェクションした。12時間後、細胞をPBSで洗浄したのち無血清培地RPMI1640を加え、37℃、5％CO2条件下に静置した。12時間後、ELISA法で培地中のVEGF量を測定し、実施例５と同様にVEGF産生抑制率（％）を算出した。【００８８】
（結果）
図３に示すように、正電荷を持つ遺伝子キャリアーと負電荷のsiRNAを静電気的に相互作用させた複合体として投与することで、siRNA単独投与に比べ、VEGF産生抑制率が著しく向上することが明らかとなった。この結果は、siRNAを細胞内に送達させ、高いRNAi効果を誘導するには、遺伝子キャリアーが必要であることを示唆している。【００８９】
実施例７  マイクロスフェアへのsiRNAの封入率（％）；
実施例２で調製されたマイクロスフェアを電子顕微鏡で観察し、さらに顕微鏡写真からフェレー水平径を測定し平均粒子径を算出した。また、マイクロスフェア25 mgを試験管にとり、アセトニトリル0.5 mLを加えてPLGA成分を溶解し、これに、pH6.0リン酸緩衝液0.5 mLを加えて2時間振とうした後、5,000 rpmで2分間遠心分離し、上清についてHPLC測定を行い、マイクロスフェアに封入されたsiRNA量を求めた。粒子調製時の固形成分の処方量の総質量を100％とし、これに対する測定されたsiRNA量の割合をマイクロスフェアへのsiRNAの封入率（％）として算出した。【００９０】
HPLCの分析条件は実施例３と同じである。【００９１】
（結果）
実施例２調製されたマイクロスフェアは、siRNAのみを封入、siRNAとアルギニン封入、siRNAとPEI封入したいずれのマイクロスフェアにおいても、球形の粒子であることが顕微鏡観察により確認された。また、表１に示すように、マイクロスフェアの平均粒子径は、いずれも30〜45μmで通常の注射針を容易に通過し得る粒子径であり、注射剤として使用可能な大きさの粒子であることが確認された。マイクロスフェアへのsiRNA封入率は、siRNAのみを封入した場合には約48％であったのに対し、正電荷の塩基物質であるアルギニンを添加した場合に約64％と大きく、さらにPEIを添加した場合においては約80％の高い封入率を示した。以上のことから、高封入率でsiRNAをマイクロスフェアに封入するためには、正電荷の物質とともにsiRNAを添加することが効果的であり、特に、遺伝子導入剤としても用いられるPEIを添加することで、より封入効率が高まることが示された。
【表１】
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【００９２】
実施例８  マイクロスフェアからのsiRNAの放出挙動；
siRNAをPLGAに内封したマイクロスフェアからのsiRNAの放出挙動を検討することを目的として実験を行った。【００９３】
実施例２で調製されたマイクロスフェア25 mgを栓付試験管に秤量し、37℃のpH7.4の0.1 Mリン酸緩衝液1.5 mLを加え、回転撹拌装置を用いて37℃下で28日間の放出試験を行った。一定時間後、5,000 rpmで20分間遠心分離し、上清を除去後、得られた沈殿物にアセトニトリル0.5 mLを加えてPLGA成分を溶解した。これに、pH6.0リン酸緩衝液0.5 mLを加えて2時間振とうした後、5,000 rpmで2分間遠心分離し、上清についてHPLC測定を行い、マイクロスフェア中のsiRNA残存量を求めた。試験前のマイクロスフェア中のsiRNA量を100％とし、これに対する各時間のマイクロスフェア中のsiRNA残存量の割合を残存率（％）として算出した。この残存率を指標として、マイクロスフェアからのsiRNAの放出性を評価した。【００９４】
HPLCの分析条件は、実施例３と同じである。【００９５】
（結果）
図４に示すように、アルギニンやPEIを添加したマイクロスフェアでは、siRNAのみを封入したマイクロスフェアに比べ、初期バーストが小さく、28日間にわたって持続的にsiRNAが放出されることが認められた。このことからマイクロスフェアの調製段階において内水層にアルギニンやPEIなどの正電荷を持つ塩基性物質を添加することで封入率の向上と初期バーストの改善、放出速度の制御が可能であることが示された。【００９６】
実施例９  VEGF産生抑制効果を評価；
実施例２で調製されたマイクロスフェアは、実施例７で示されたように緩衝液を用いたin vitro放出性試験による評価では持続的な放出特性を示すことが明らかとなったことから、次に、細胞を用いた実験系で実施例５、６と同様に、siRNA含有マイクロスフェアによるVEGF産生抑制効果を評価することを目的として実験を行った。【００９７】
実施例5と同様にDMEM培地に懸濁させたS-180細胞を1×105個/穴の密度で24穴培養プレートに播種し37℃、5％CO2条件下、24時間、前培養した。細胞をPBSで洗浄した後、無血清培地RPMI1640に培地交換し、実施例２で調製されたPLGAのみからなるマイクロスフェア、siRNAのみを含有したマイクロスフェアならびにアルギニンとsiRNAを含有したマイクスフェアをそれぞれ10 mg入れたメッシュ付きチャンバーを各穴の細胞上部にセットし、37℃、5％CO2条件下で静置した。12時間後に培地を採取し、培地中のVEGF量をELISA法によって測定した。PLGAのみからなるマイクロスフェアを用いた場合の培地中の単位細胞あたりのVEGF量を100％とし、これに対するsiRNA含有マイクロスフェアおよびsiRNA/アルギニン含有マイクロスフェアを用いた場合の単位あたりのVEGF量の割合をVEGF産生抑制率（％）として算出した。ここでは、無血清培地を使用しているため、長期間生細胞を維持するのが困難であったため、48時間ごとにマイクロスフェア入りのチャンバーを外し、このチャンバーを新たに前培養しておいた新鮮な細胞の上部に再セットし、上記同様、12時間後の培地中VEGF量を測定した。上記操作を17日間継続して行い、マイクロスフェアから持続的に放出されるsiRNAの17日間にわたるRNAi効果を評価した。【００９８】
（結果）
表２に示すように、試験開始12時間後は、VEGF産生抑制率はsiRNAのみを封入、siRNAとアルギニンを封入したマイクロスフェア間のVEGF産生抑制効果に大きな差は認められなかった。しかし、siRNAのみを封入したマイクロスフェアにおいては、12時間以降、経時的にVEGF産生抑制率の低下が認められ、持続的なsiRNAによるRNAi効果が得られなかった。これに対し、アルギニンを共に封入したsiRNAマイクロスフェアにおいては、siRNAのみを封入したマイクロスフェアに比べ、顕著なRNAi効果が16.5日まで持続することが示された。
【表２】
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【００９９】
実施例１０  腫瘍体積の変化を指標とした生体内におけるsiRNA効果の評価；
担癌マウスに異なる濃度のsiRNAを投与し、腫瘍体積の変化を指標として、生体内におけるsiRNAの効果を評価することを目的として実験を行った。【０１００】
担癌マウスの作製：実施例５と同様にS-180細胞を血清を含むDMEM培地中で、37℃、5％CO2条件下前培養した。細胞をPBSで洗浄した後無血清培地RPMI1640に懸濁した。このS-180細胞（5×106個/300μL）を、8週令ICR雌性マウスの背部皮下に注射し、移植した。移植６日後、形成される腫瘍の体積が50 mm3以上に到達した時点で担癌マウスが作製されたと判断し、以下の実験に用いた。【０１０１】
前記方法によってS-180移植後6日目の担癌マウスの腫瘍内に、1、2、5、10、15μMの異なる濃度の実施例２で用いたsiRNAを投与し、1、3、5、7、10、14日後に腫瘍の長径と短径を測定し、次式を用いて腫瘍の体積を算出した。【０１０２】
腫瘍体積（mm3）＝（腫瘍の短径）2×腫瘍の長径／2  
（結果）
図５に示すように、siRNA未投与のコントロールにおいては、経時的な腫瘍体積の増大が認められたが、siRNA溶液を腫瘍内に投与したマウスにおいては、いずれの投与濃度においても顕著に腫瘍の増殖が抑制された。また、腫瘍の増殖は、siRNAの濃度依存的に抑制される傾向が認められた。しかし、siRNA投与後7日を過ぎると、腫瘍体積は急激に増大する傾向が認められ、いずれの濃度においてもsiRNA単独を単回投与した場合には、長期間のRNAi効果の持続が得られないことが明らかとなった。【０１０３】
実施例１１  siRNA含有マイクロスフェアを用いた生体内でのRNAi効果の評価；
実施例９において、担癌マウスにsiRNAを単独で単回投与した場合、顕著なRNAi効果が認められたが、その効果は一過性であり、長いものでも効果の持続期間は約7日であった。このことから、実施例２で調製されたsiRNA含有マイクロスフェアを用いて、生体内でのRNAi効果を評価することを目的として実験を行った。【０１０４】
担癌マウスは、実施例９と同様の方法で作製し、腫瘍体積が50 mm3以上の大きさに到達した癌細胞移植6日後に以下の実験を行った。【０１０５】
なお、siRNA含有マイクロスフェアは、実施例２で内水相中に添加するsiRNA量を350 nMを25μLとしたが、これを20μMを25μLとし、実施例２に示したw1/o/w2液中乾燥法により調製した。【０１０６】
PBSおよびsiRNAを含有しないPLGAのみから成るマイクロスフェアをコントロールとして担癌マウスに腫瘍内投与した。また、siRNA含有マイクロスフェア10 mgを懸濁したPBS溶液を担癌マウスの腫瘍内に投与した。投与後2日ごとに腫瘍体積を実施例７と同様の方法で測定した。【０１０７】
（結果）
図６に示すように、コントロールにおいては腫瘍体積の増殖が著しく、これに対し、siRNA含有マイクロスフェアでは、腫瘍増殖は抑制されることが認められた。siRNA含有マイクロスフェアによるRNAi効果は、siRNAのみを封入したマイクロスフェアに比べ、アルギニンやPEIを共に封入したsiRNA含有マイクロスフェアを用いた場合に顕著に抑制され、その効果は約1ヶ月間もの長期にわたって持続することが明らかとなった。以上のことから、siRNAを正電荷の塩基性物質をキャリアーとして生体分解性高分子に封入してマイクロスフェアとすることで、長期間にわたって安定にかつ持続的にsiRNAを放出し、生体内における持続的なRNAi効果を得る長期徐放性マイクロスフェアが調製可能であることが示された。【０１０８】
実施例１２  anti-cFLIP iRNA含有長期徐放性マイクロスフェアの調製 
アポトーシス阻害因子であるcFLIP（cellular FLICE-inhibitory protein）の産生に関与するmRNAを分解してcFLIPの合成を阻害する作用を持つ短鎖リボ核酸siRNAとVEGF産生を抑制するsiRNAを、伴に、PLGAに封入した長期徐放性微粒子を調製法した。【０１０９】
40μMの濃度の抗マウスcFLIP（23 bp、分子量 14544）25μL、40μMの濃度の抗マウスVEGF（21 bp、分子量13345.4）25μLと分岐型ポリエチレンイミン（PEI、分子量25 kDa、Sigma製）500μgを100μLの0.4%ポリビニルアルコール溶液に溶解して内水相とした。実施例1で用いたPLGA 0.5 gを3 mLジクロロメタンに溶解して油相にした。内水相と油相を混合し、10,000 rpmで2分間高速攪拌を行いw1/oエマルションを調製した。次に、調製したw1/oエマルションを500 mLの0.25％ポリビニルアルコール溶液に撹拌しながら添加し、3,000 rpmで3分間撹拌してw1/o/w2エマルションを得た。さらに、250 rpmで3時間攪拌することでジクロロメタンを留去し、遠心分離後、上清を除去した。蒸留水で3回洗浄した後、回収した粒子を凍結乾燥し、siRNA含有マイクロスフェアを得た。【０１１０】
得られたマイクロスフェアの平均粒子径は約23μm、siRNA含有率は約83%であった。【０１１１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の徐放性マイクロスフェア、特にw1/o/w2型徐放性マイクロスフェアによれば、徐放性マイクロスフェアー中に従来に比べてより多量のsiRNA（small interfering RNA）を封入することが可能となり、長期にわたった薬剤放出が可能となる。【０１１３】
したがって、遺伝子治療における遺伝子製剤としての有用性が大いに期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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