【手続補正書】
【提出日】平成31年2月22日(2019.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
母集団からの細胞を少なくとも２つの異なる試薬に曝す方法であって、各細胞が、個別に、又は２つ若しくはそれ以上の細胞群毎にこれら試薬に曝す、該方法において、
(a)   母集団からの細胞をマイクロ流体装置における複数個の捕獲部位に分配し、複数個の捕獲部位それぞれが１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   １つ又はそれ以上の第１試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(c)   前記第１試薬とは異なり及び／又は前記第１試薬とは別個に供給する、１つ又はそれ以上の第２試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(d)   前記反応生成物が捕獲部位情報の項目をコード化する反応を行わせる、及び／又は核酸配列が各細胞又は細胞群の反応生成物内に個別に取り込まれる反応を行わせる、及び／又は核酸配列が各細胞又は細胞群の核酸内に個別に取り込まれる反応を行わせて、反応生成物を産生する、ステップと、
(e)   前記反応生成物を回収するステップと、並びに
(f)   前記反応生成物を解析するステップであって、このような解析が、特定捕獲部位における単一細胞又は細胞群に由来するものとして特定反応生成物の同定を可能にするステップと、
を備え、前記方法は、必要に応じて、
核酸配列を前記細胞母集団からの反応生成物内に取り込み、前記核酸配列が、各細胞の前記反応生成物に個別に、又は１０００にも達するまでの細胞群毎の反応生成物内に取り込まれる、及び／又は、
前記方法は、必要に応じて、
核酸配列を細胞母集団の核酸内に取り込み、前記核酸配列が、各細胞の核酸に個別に、又は１０００にも達するまでの細胞群毎の核酸内に取り込まれる、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記分配は、複数個の捕獲部位それぞれが多くて単一の細胞しか有しないよう行う、方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、前記反応は、
（ａ）ヌクレオチドのバーコードを前記反応生成物内に取り込むものであり、前記バーコードは、必要に応じて、捕獲部位情報の項目をコード化する、及び／又は、
（ｂ）核酸配列が取り込まれる分子を一意的に同定するような核酸配列（ＵＭＩ）を取り込むものである、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法において、前記反応は、ＲＮＡの逆転写を含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記第１試薬は、ポリ-ｄＴ配列及び前記ポリ-ｄＴ配列の第１バーコード５′を有する逆転写（ＲＴ）プライマーを含んでおり、
必要に応じて、前記ＲＴプライマーは、さらに（ａ）第１ＵＭＩを含んでおり、必要に応じて、前記第１ＵＭＩは、前記ポリ-ｄＴ配列の５′であり、及び／又は、
（ｂ）第１リンカーを含んでおり、必要に応じて、前記第１リンカーは、前記ＲＴプライマーの５′末端にあり、及び／又は、
（ｃ）ポリ-ｄＴ配列のアンカー配列３′を含んでいる、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記反応は、さらにｃＤＮＡを産生する第２ストランド合成を含む、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記第２試薬は、ポリ-リボＧ配列を有する５′オリゴヌクレオチドを含んでおり、前記５′オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、
（ａ）前記ポリ-リボＧ配列の第２バーコード５′、及び／又は、
（ｂ）第２ＵＭＩであり、必要に応じて、前記第２ＵＭＩはポリ-リボＧ配列の５′である、及び／又は、
（ｃ）第２リンカーであり、必要に応じて、前記第２リンカーは、５′オリゴヌクレオチドの５′末端にあり、
必要に応じて、
前記方法は、ｃＤＮＡを産生するステップであって、一方のストランドが、
（ｉ）リンカー間にバーコードが配置される、５′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列であり、必要に応じて、前記第１バーコードは、前記第１リンカーに隣接して配置され、好ましくは、前記第２バーコードは、前記第２リンカーに隣接して配置される、５′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′；
（ｉｉｉ）３′-第２リンカー-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′；
（ｉｖ）３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
（ｖ）３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
（ｖｉ）３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-ポリｄＣ-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
（ｖｉｉ）３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-ポリｄＣ-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
（ｖｉｉｉ）３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；及び
（ｉｘ）３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記反応は、ＤＮＡの増幅を含む、方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法において、前記第１及び／又は第２の試薬は、それぞれ第１及び／又は第２の増幅プライマーを含み、前記第１及び／又は第２の増幅プライマーは、それぞれ第１又は第２のバーコード、すなわち、プライマー配列の５′を有し、
必要に応じて、前記第１及び／又は第２の増幅プライマーは、さらに、
（ａ）それぞれ第１又は第２のＵＭＩを含んでおり、必要に応じて、前記第１又は第２のＵＭＩは、プライマー配列の５′であり、及び／又は、
（ｂ）第１又は第２のリンカーを含んでおり、必要に応じて、前記第１又は第２のリンカーは、前記増幅プライマーの５′末端にあり、
必要に応じて、前記方法は、一方のストランドが、
（ｉ）リンカー間にバーコードを持つ５′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１リンカー-３′；
（ｉｉ）３′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′；
（ｉｉｉ）３′-第２リンカー-第２バーコード-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′；
（ｉｖ）３′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
（ｖ）３′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
（ｖｉ）３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
（ｖｉｉ）３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
（ｖｉｉｉ）３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；及び
（ｉｘ）３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-細胞ＤＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法において、前記マイクロ流体装置は、マトリクス型マイクロ流体装置であって、
Ｒ行及びＣ列のマトリクス状に配列された捕獲部位であり、Ｒ及びＣは１より大きい整数であり、細胞を前記捕獲部位に分配した後には互いに流体的に隔絶することができる、該捕獲部位と、
第１試薬を特定の行における捕獲部位に送給するＲ個の入力ラインのセットと、
第２試薬を特定の列における捕獲部位に送給し、第１試薬の送給とは別個に送給するＣ個の入力ラインのセットと、
を備え、反応後には、個別の行及び列からの反応生成物のプールとして前記マイクロ流体装置から反応生成物を回収する、該マトリクス型マイクロ流体装置を有する、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法において、すべての方法ステップはマイクロ流体装置内で実施する、方法。
【請求項１２】
マトリクス型マイクロ流体装置であって、
Ｒ行及びＣ列のマトリクス状に配列された複数個の捕獲部位であって、Ｒ及びＣは１より大きい整数であり、各捕獲部位は、１個又はそれ以上の細胞を捕獲する捕獲形体を有し、細胞を前記捕獲部位に分配した後には互いに流体的に隔絶され得る、該捕獲部位と、
第１試薬を特定の行における捕獲部位に送給するよう構成されたＲ個の第１入力ラインのセットと、及び
第２試薬を特定の列における捕獲部位に送給するよう構成され、第１試薬の送給とは別個に送給するＣ個の第２入力ラインのセットと、
を備え、前記第１の入力ライン及び前記第２の入力ラインは、前記細胞の捕獲部位への分配の後に、前記第１試薬及び前記第２試薬を別々に各捕獲部位に送給するように構成されており、必要に応じて、
前記捕獲形体は、多くても単一の細胞を捕獲するよう構成されている、及び／又は、
マイクロ流体装置は、細胞を、及び／又は可視化標識を採用するとき細胞又は反応生成物に関連する信号を可視化できるよう、少なくとも一方の表面が十分透明である、装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の装置において、各捕獲部位は、互いに流体的に隔絶することができる４個のチャンバを有し、これらチャンバのうち１つのチャンバは前記捕獲形体を有する、装置。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のマイクロ流体装置を動作させる方法において、
(a)   細胞母集団からの細胞を前記捕獲部位に分配して、複数個の捕獲部位が１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   分配後、前記捕獲部位を互いに流体的に隔絶するステップと、
(c)   １つ又はそれ以上の第１試薬を前記Ｒ個の第１入力ライン経由で流体的に隔絶された各捕獲部位に供給するステップと、
(d)    １つ又はそれ以上の第２試薬を前記Ｃ個の第２入力ライン経由で流体的に隔絶された各捕獲部位に供給し、前記第２試薬は前記第１試薬とは異なるものであるステップであって、前記１つ又はそれ以上の第１試薬及び前記１つ又はそれ以上の第２試薬は、前記細胞を前記捕獲部位に分配した後に、別々に各捕獲部位に供給される、ステップと、
(e)   反応を行わせるステップと、
を備え、必要に応じて、
複数個の捕獲部位は、多くとも単一の細胞を有し、前記方法は、必要に応じて、
各行からの反応生成物プールとして、又は各列からの反応生成物プールとして前記反応生成物を回収するステップを備え、必要に応じて、
好ましくは、前記Ｒ個の第１入力ライン又は前記Ｃ個の第２入力ラインに回収試薬を供給するステップを含む、方法。