【手続補正書】
【提出日】平成20年8月8日(2008.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Ｃ18/20エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなるアラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞。
【請求項２】
ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞。
【請求項３】
ｅ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｆ）Ｃ18/20エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｇ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｈ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなるアラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。
【請求項４】
ｆ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｇ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｈ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｉ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｊ）Ｃ16/18エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
サッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。
【請求項５】
ａ）（１）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびＣ18/20エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
（２）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
よりなる群から選択される少なくとも一組の遺伝子
ｂ）（１）Δ１２デサチュラーゼ、
（２）Δ９デサチュラーゼ、
（３）Ｃ14/16エロンガーゼ、
（４）Ｃ16/18エロンガーゼ
よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）ｉ．）ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＰＤＡＴよりなる群から選択されるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、
ｉｉ．）アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、
ｉｉｉ．）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｉｖ．）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、
ｖ．）ホスホリパーゼＣ、および
ｖｉ．）ホスホリパーゼＡ2
よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
（１）背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするあらゆる天然遺伝子を欠いており、
（２）背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、リパーゼ１（Ｌｉｐ１−）、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼＡＣＯ３（Ｐｏｘ３−）、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ２（Ｐｏｘ２−）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（Ｕｒａ３−）、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５−）、リパーゼ２（Ｌｉｐ２−）、およびイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２−）よりなる群から選択される酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている、組換え生産宿主細胞。
【請求項６】
ａ）請求項１または２のいずれかに記載の生産宿主を培養して、アラキドン酸を含んでなる微生物油が生成され、そして、
ｂ）場合によりステップ（ａ）の微生物油を回収すること
を含んでなるアラキドン酸を含んでなる微生物油の生成方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって生成される微生物油。
【請求項８】
請求項６に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる食品。
【請求項９】
請求項６に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる、メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品。
【請求項１０】
請求項６に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる動物飼料。
【請求項１１】
有効量の微生物油を含んでなり、場合により請求項１または２のいずれか一項に記載の組換え宿主を含んでなる、酵母バイオマスを含んでなる動物飼料。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６８５】
本明細書で報告された結果に基づいて、天然ＤＧＡＴ２および／またはＤＧＡＴ１および／またはＰＤＡＴの中断は、ＡＲＡをはじめとする高濃度のＰＵＦＡを生成するように遺伝子操作されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株において（例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７、Ｙ２２１４株）、％ＰＵＦＡを実質的に増大させる有用な手段であることが考察される。事実、Ｙ２２１４株中の天然ＤＧＡＴ２遺伝子の中断は、パーセントＡＲＡの１．７倍の増大をもたらす（データ示さず）。本発明の主な特徴または態様を以下に記載する。
態様１．  ａ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Ｃ18/20エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなるアラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞。
態様２．  ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞。
態様３．  遺伝子プールが、場合によりΔ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる態様１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
態様４．  背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている態様３に記載の組換え生産宿主。
態様５．  前記ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１５８〜１６８および３６４よりなる群から選択される核酸配列を有するプロモーター配列の制御下にある態様１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
態様６．  前記Δ１２デサチュラーゼが、配列番号２４、２６、２８、３０、３１、３２、３４、３６、３８、３５８、３５９、３６１、３６２および３６３よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する態様３に記載の組換え生産宿主。
態様７．  前記Δ６デサチュラーゼが配列番号２および５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Ｃ18/20エロンガーゼが配列番号１８および２１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する態様１に記載の組換え生産宿主細胞。
態様８．
前記Δ９エロンガーゼが配列番号４０および１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Δ８デサチュラーゼが配列番号４５、４７、および４９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する態様２に記載の組換え生産宿主細胞。
態様９．  前記Δ５デサチュラーゼが、配列番号７、９、および１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する態様１または２のいずれかに記載の組換え生産宿主細胞。
態様１０．  遺伝子プールが、場合により
ａ）Δ９デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Ｃ16/18エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Ｃ14/16エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
よりなる群から選択されるω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる態様１または２のいずれかに記載の組換え生産宿主。
態様１１．  前記Ｃ16/18エロンガーゼが配列番号５１、５４および６２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Ｃ14/16エロンガーゼが配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有する態様１０に記載の組換え生産宿主。
態様１２．  遺伝子プールが、場合により
ａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）、
ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、
ｃ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、
ｄ）アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、
ｅ）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、および
ｆ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
よりなる群から選択されるアシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる態様１または２のいずれかに記載の組換え生産宿主。
態様１３．  前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）が配列番号８２および８４〜８８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）が配列番号９０、９２、９４、および９６よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）が配列番号７７に記載のアミノ酸配列を有し、前記グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）が配列番号９８に記載のアミノ酸配列を有し、前記リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）が配列番号６８、７０、７２、および７５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）が配列番号８０に記載のアミノ酸配列を有する態様１２に記載の組換え生産宿主。
態様１４．  ｅ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｆ）Ｃ18/20エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｇ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｈ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなるアラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。
態様１５．  ｆ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｇ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｈ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｉ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｊ）Ｃ16/18エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
サッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。
態様１６．  ａ）（１）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびＣ18/20エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
（２）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
よりなる群から選択される少なくとも一組の遺伝子
ｂ）（１）Δ１２デサチュラーゼ、
（２）Δ９デサチュラーゼ、
（３）Ｃ14/16エロンガーゼ、
（４）Ｃ16/18エロンガーゼ
よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）ｉ．）ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＰＤＡＴよりなる群から選択されるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、
ｉｉ．）アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、
ｉｉｉ．）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｉｖ．）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、
ｖ．）ホスホリパーゼＣ、および
ｖｉ．）ホスホリパーゼＡ2
よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
（１）背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするあらゆる天然遺伝子を欠いており、
（２）背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、リパーゼ１（Ｌｉｐ１−）、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼＡＣＯ３（Ｐｏｘ３−）、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ２（Ｐｏｘ２−）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（Ｕｒａ３−）、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５−）、リパーゼ２（Ｌｉｐ２−）、およびイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２−）よりなる群から選択される酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている、組換え生産宿主細胞。
態様１７．  宿主が全脂肪酸の％として少なくとも約５％のアラキドン酸を含んでなる微生物油を生成する態様１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
態様１８．  宿主がアラキドン酸を含んでなる微生物油を生成し、微生物油があらゆるγ−リノール酸を欠いている態様１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
態様１９．  ａ）請求項１または２のいずれかに記載の生産宿主を培養して、アラキドン酸を含んでなる微生物油が生成され、そして、
ｂ）場合によりステップ（ａ）の微生物油を回収すること
を含んでなるアラキドン酸を含んでなる微生物油の生成方法。
態様２０．  態様１９に記載の方法によって生成される微生物油。
態様２１．  油が少なくとも約５％のアラキドン酸を含有する態様２０に記載の微生物油。
態様２２．  油がリノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノール酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選択される脂肪酸を含んでなる態様２０に記載の混合油。
態様２３．  態様１９に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる食品。
態様２４．  類似食品、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品、および乳製品よりなる群から選択される態様２３に記載の食品。
態様２５．  態様１９に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる、メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品。
態様２６．  態様１９に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる動物飼料。
態様２７．  ペットフード、反芻動物飼料、家禽飼料、および水産養殖飼料よりなる群から選択される態様２６に記載の動物飼料。
態様２８．  有効量の微生物油を含んでなり、場合により請求項１または２のいずれか一項に記載の組換え宿主を含んでなる、酵母バイオマスを含んでなる動物飼料。
態様２９．  酵母バイオマスが、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、および核酸よりなる群から選択される飼料栄養素を含んでなる態様２８に記載の動物飼料。
態様３０．  態様１９に記載の方法によって生成される微生物油と食品とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で栄養強化された食品の製造方法。
態様３１．  メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品の製造方法であって、態様１９に記載の方法によって生成される微生物油と製品とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で製品が栄養強化される方法。
態様３１．  態様１９に記載の方法によって生成される微生物油と動物飼料とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で栄養強化された動物飼料の製造方法。
態様３３．  態様２６に記載の動物飼料と飼料栄養素を含んでなる酵母バイオマスとを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸を含んでなる動物飼料を飼料栄養素で栄養強化する方法。
態様３４．  飼料栄養素が、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、および核酸よりなる群から選択される態様３３に記載の方法。
態様３５．  ヒトまたは動物によって消費可能または使用可能な形態でアラキドン酸を含有する態様１９に記載の方法によって生成される微生物油を提供することを含んでなる、アラキドン酸で強化された栄養補助食品をヒト、動物または水産養殖生物に提供する方法。
態様３６．  ＡＴＣＣ名称ＡＴＣＣ      を有する、アラキドン酸生成に有用な組換え生産宿主ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７。