(57)【要約】  本発明において、RB1CC1はmTORおよびRB1経路のクロストークに必要であり、特に神経、筋細胞において細胞周期の進行を伴わない大型サイズの細胞表現型に貢献していることを見出した。この知見に基づき、RB1CC1の発現量を制御することを特徴とする、細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期を調節する方法、RB1CC1の細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期の調節機能を促進または抑制する化合物、RB1CC1の発現量を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。これらの方法および化合物は、各種動物由来の神経、筋、骨、等組織の構築維持、改善にも適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
RB1CC1の発現量を減少または増加させることにより細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期を調節する方法。
【請求項２】
細胞、組織の大きさの調節がRB1CC1とTSCとの相互作用の抑制または促進によるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
細胞、組織の大きさの調節がRB1CC1によるTSCのユビキチン化分解の抑制または促進による請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
RB1CC1による細胞周期の調節がRB1CC1により誘導されるRB1機能の抑制または促進によるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
RB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳に干渉する分子にRB1CC1を発現している細胞を曝露させ、該細胞におけるRB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳に干渉することにより、RB1CC1蛋白質の発現量を減少もしくは促進させることによる請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項６】
RB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳に干渉する分子が、RNAi物質である請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
RB1CC1を発現している細胞、組織と試験化合物を用いることを特徴とする、RB1CC1による細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期の調節機能を促進もしくは抑制する化合物のスクリーニング方法。
【請求項８】
RB1CC1を発現している細胞、組織と試験化合物を用いることを特徴とする、RB1CC1蛋白質の発現を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法。
【請求項９】
RB1CC1を発現している細胞、組織と試験化合物を用いることを特徴とする、RB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１０】
細胞、組織が神経および／または筋肉、骨細胞及び組織である請求の範囲第１〜８項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
請求の範囲第７項に記載の方法により得られるRB1CC1による細胞周期または細胞、組織の大きさの調節機能を促進もしくは抑制する化合物、請求の範囲第８項に記載の方法により得られるRB1CC1蛋白質の発現を促進または抑制する化合物、および／または請求の範囲第９項に記載の方法により得られるRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物を含有してなる医薬。
【請求項１２】
神経、筋、骨疾患および／または癌の予防・治療剤である請求の範囲第１１項に記載の医薬。
【請求項１３】
請求の範囲第７項に記載の方法により得られるRB1CC1による細胞周期または細胞、組織の大きさの調節機能を促進もしくは抑制する化合物、請求の範囲第８項に記載の方法により得られるRB1CC1蛋白質の発現を促進または抑制する化合物、および／または請求の範囲第９項に記載の方法により得られるRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物を含有してなる神経、筋、骨疾患および／または癌の診断剤。
【請求項１４】
細胞、組織が神経および／または筋肉、骨由来である請求の範囲第１３項に記載の診断剤。
【請求項１５】
細胞、組織が培養細胞、または非脊椎もしくは脊椎動物内の細胞、組織である請求の範囲第１１〜１４項のいずれか１項に記載の医薬または診断剤。
【請求項１６】
脊椎動物が、ヒト、ニワトリ、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジまたは霊長類である請求の範囲第１５項に記載の医薬または診断剤。
【請求項１７】
神経、筋および／または骨の組織構築の維持および／または改善に用いるための請求の範囲第１１〜１６項のいずれか１項に記載の医薬または診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RB1-inducible coiled-coil 1（以下、RB1CC1）の発現量を制御することを特徴とする、細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期を調節する方法に関する。また、さらに、RB1CC1の細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期の調節機能を促進または抑制する化合物、RB1CC1の発現量を促進または抑制する化合物、RB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法などに関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２００５−３６８３１１号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
本発明者らは、網膜芽腫の腫瘍抑制因子（RB1）の機能調節に関与している新規の因子、RB1CC1（Human Gene Nomenclature Committee-approved gene symbol）を同定した。RB1CC1をヒト白血病細胞に導入すると、RB1の発現が促進され、細胞周期の進行が遅くなる（非特許文献１および２）。RB1CC1およびRB1はともに同調して発現しており（非特許文献１）、いくつかの細胞株においてRB1CC1を特異的にノックダウンするとRB1の発現が抑制される（非特許文献３）。このように、RB1CC1はRB1経路を介して細胞増殖活性を調節することが可能である。さらに、10-20%の原発性乳癌は、古典的な腫瘍抑制因子の特徴を有するRB1CC1の機能不全に関与している（非特許文献４および５）。RB1CC1およびRB1は共に胎生筋骨格細胞において選択的に発現し、その成熟に関与している（非特許文献６および７）。【０００４】
本発明者らはまた、RB1CC1は新規の筋分化仲介因子であることを明らかにした（非特許文献３）。マウス筋芽由来C2C12細胞の分化および胚発生において、RB1CC1およびRB1の同調発現によりミオシン重鎖の発現が誘導された。RNA干渉（RNAi：RNA interference）によりRB1CC1をノックダウンすると、RB1の減少が生じ、C2C12細胞は分化しない（非特許文献３）。これらの実験結果から、RB1CC1は横紋筋原細胞の増殖抑制および分化誘導において重要な役割を果たしていることが示された。【０００５】
結節性硬化症分子複合体−哺乳動物ラパマイシン標的分子(TSC-mTOR)経路は、細胞の大きさ調節に関与しており、最もよく研究されている分子経路である（非特許文献８）。様々の動物種において、TSC機能が変異および低下すると、mTOR、S6キナーゼ（S6K）が活性化され、翻訳が亢進制御され細胞の大きさが肥大化する（非特許文献９〜１５）。【０００６】
TSC1およびTSC2は細胞の大きさの調節だけでなく、ハマルチン（Hamartin）およびチュベリン（tuberin）を各々コードしており、これらの遺伝子の変異は結節性硬化症、過誤腫症候群を生じ、各分子は腫瘍抑制因子と考えられている。TSC1およびTSC2遺伝子はともにコイルドコイル領域を持ち、ヘテロダイマーを形成する。またTSC1およびTSC2遺伝子は細胞の大きさの調節に加えて、細胞周期の進行、細胞生存およびアポトーシス過程の調節において機能していると考えられているが、その詳細は不明な点も多い（非特許文献８）。本研究者らは、RB1CC1がインビトロだけでなくインビボの神経、筋細胞においてもTSC-mTOR経路、及びRB1経路を介して細胞周期の休止および細胞、組織の肥大に関して重要な役割を果たしていることの証拠を示す。【０００７】
【非特許文献１】Chano et al., 2002, Oncogene 21: 1295-1298.
【非特許文献２】Kontani et al., 2003, Int. J. Mol. Med. 12: 767-769.
【非特許文献３】Watanabe et al. 2005, Virchows Arch. 447: 643-648.
【非特許文献４】Chano et al., 2002, Nat. Genet. 31: 285-288.
【非特許文献５】Teramoto et al., 2003, Cancer Therapy 1: 103-107.
【非特許文献６】Chano et al., 2002, Am. J. Pathol. 161:359-364.
【非特許文献７】Bamba et al., 2004, Int. J. Mol. Med. 14: 583-587.
【非特許文献８】Inoki et al., 2005, Nat. Genet. 37: 19-24.
【非特許文献９】Kobayashi et al., 1999, Cancer Res. 59: 1206-1211.
【非特許文献１０】Kobayashi et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8762-8767.
【非特許文献１１】Potter et al., 2001, Cell 105: 357-368.
【非特許文献１２】Tapon et al., 2001, Cell 105: 345-355.
【非特許文献１３】Gao et al., 2002, Nat. Cell Biol. 4: 699-704.
【非特許文献１４】Inoki et al., 2002, Nat. Cell Biol. 4: 648-657.
【非特許文献１５】Manning et al., 2002, Mol. Cell 10: 151-162.
【非特許文献１６】Evangelopoulos et al., 2005, Oncogene, 24: 3309-3318.
【非特許文献１７】Kobayashi et al., 2001, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 98:8762-8767.
【非特許文献１８】Akagi et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 7290-7295.
【非特許文献１９】Sarbassov, D. D. et al., 2005, Science 307: 1098-1101.
【非特許文献２０】Rosner et al., 2003, Oncogene, 22: 4786-4798.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
細胞増殖、細胞成長、細胞分化および細胞死は組織の体系化に必須であり、協調的に調節される必要がある。当該過程の各要素については研究されているが、これらの要素の協調的な関連性はあまり知られていない。これらの要素の協調的な関連性を解析することは、細胞増殖、細胞成長、細胞分化および細胞死における協調した分子機構の解明に役立つとともに、当該分子機構の異常調節によって生じる各種疾患の治療に結びつくと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、網膜芽腫の腫瘍抑制因子（RB1）の発現調節に寄与している新規の因子RB1CC1がmTORおよびRB1両経路のクロストークに必要であり、特に神経及び筋細胞において細胞周期の進行を伴わない大型の細胞表現型に寄与していることを見出した。神経、筋細胞において豊富なRB1CC1の発現は、TSC1の分解作用を介してmTOR経路の活性化に寄与し、大型の細胞形質の維持に貢献していた。また、RB1CC1はRB1機能の亢進制御を介して細胞周期の進行を抑制していることもわかった。本発明者らはこれらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち本発明は以下の構成からなる。
１． RB1CC1の発現量を減少または増加させることにより細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期を調節する方法。
２．細胞、組織の大きさの調節がRB1CC1とTSCとの相互作用の抑制または促進によるものである前項１に記載の方法。
３．細胞、組織の大きさの調節がRB1CC1によるTSCのユビキチン化分解の抑制または促進による前項２に記載の方法。
４． RB1CC1による細胞周期の調節がRB1CC1により誘導されるRB1機能の抑制または促進によるものである前項１に記載の方法。
５． RB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳に干渉する分子にRB1CC1を発現している細胞を曝露させ、該細胞におけるRB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳に干渉することにより、RB1CC1蛋白質の発現量を減少もしくは促進させることによる前項１に記載の方法。
６． RB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳に干渉する分子が、RNAi物質である前項５に記載の方法。
７． RB1CC1を発現している細胞、組織と試験化合物を用いることを特徴とする、RB1CC1による細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期の調節機能を促進もしくは抑制する化合物のスクリーニング方法。
８． RB1CC1を発現している細胞、組織と試験化合物を用いることを特徴とする、RB1CC1蛋白質の発現を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法。
９． RB1CC1を発現している細胞、組織と試験化合物を用いることを特徴とする、RB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法。
１０．細胞、組織が神経および／または筋肉、骨細胞及び組織である前項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
１１．前項７に記載の方法により得られるRB1CC1による細胞周期または細胞、組織の大きさの調節機能を促進もしくは抑制する化合物、前項８に記載の方法により得られるRB1CC1蛋白質の発現を促進または抑制する化合物、および／または前項９に記載の方法により得られるRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物を含有してなる医薬。
１２．神経、筋、骨疾患および／または癌の予防・治療剤である前項１１に記載の医薬。
１３．前項７に記載の方法により得られるRB1CC1による細胞周期または細胞、組織の大きさの調節機能を促進もしくは抑制する化合物、前項８に記載の方法により得られるRB1CC1蛋白質の発現を促進または抑制する化合物、および／または前項９に記載の方法により得られるRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物を含有してなる神経、筋、骨疾患および／または癌の診断剤。
１４．細胞、組織が神経および／または筋肉、骨由来である前項１３に記載の診断剤。
１５．細胞、組織が培養細胞、または非脊椎もしくは脊椎動物内の細胞、組織である前項１１〜１４のいずれか１項に記載の医薬または診断剤。
１６．脊椎動物が、ヒト、ニワトリ、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジまたは霊長類である請求項１５に記載の医薬または診断剤。
１７．神経、筋および／または骨の組織構築の維持および／または改善に用いるための前項１１〜１６のいずれか１項に記載の医薬または診断剤。
【発明の効果】
【００１１】
RB1CC1による細胞周期または細胞、組織の大きさの調節機能を促進もしくは抑制する化合物、RB1CC1のポリペプチドまたは蛋白質の発現を促進または抑制する化合物、RB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物を含んでなる医薬は、神経、筋疾患（例として、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、炎症性筋疾患、内分泌障害に伴うミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、甲状腺中毒性周期性四肢麻痺、甲状腺機能低下性ミオパチー、ステロイドミオパチー、周期性四肢麻痺、糖原病、重症筋無力症、筋無力症候群、ミトコンドリア病、ミオグロビン尿症、遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィーおよびダノン病などの筋原性疾患、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症、及び、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症などの神経原性疾患等）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）などの予防・治療剤、診断剤に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒト胎生脊髄神経、骨格筋においてRB1CC1のin situ hybridization法を行なった結果（図１Ａ）、および抗RB1CC1抗血清で免疫組織染色を行なった結果（図１Ｂ−Ｄ）を示す。（Ａ）矢印は成熟および肥大した神経を示す。RB1CC1のmRNAは増殖性または移動性神経よりも、より成熟および拡大した神経に豊富に発現していた。（Ｂ）増殖性神経芽細胞におけるRB1CC1の発現量は低かった。（Ｃ）拡大した神経細胞においてRB1CC1の含有量は増加した。（Ｄ）RB1CC1は、ヒトの胎生筋肉分化において、小さい筋芽細胞よりも大きいおよび融合した筋細胞で検出された。（実施例１）
【図２】RB1CC1特異的ノックダウンによるmTOR-S6K活性、RB1発現、および細胞の大きさ、細胞周期への影響を解析した結果を示す。（Ａ）RB1CC1-RNAiにより、活性型mTOR、S6Kおよび4EBP1、すなわち、それぞれのリン酸化型Ser2448、Thr389およびThr37/46が減少した。RB1CC1のノックダウンによりRB1の発現も減少した。（Ｂ）FSC-HのヒストグラムではRNAiにより左方へシフトする所見がみられ、細胞サイズの縮小が示唆された。FL2-Aヒストグラムによる核内DNA量の評価、細胞周期の評価ではRB1CC1-RNAi処理によって、G1期分画のヒト胎児腎由来HEK293細胞数の減少を示した。（Ｃ）mTOR経路各リン酸化型活性化蛋白質の量は段階的に減少し、RB1CC1のノックダウン効果は濃度依存的であることがわかった。（実施例２）
【図３】RB1CC1のノックダウンによるC2C12筋細胞、神経芽由来Neuro2a神経細胞の大きさ、数および細胞周期への影響を解析した。増殖、分化各条件下のC2C12細胞を同時に培養し、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットの両方により解析した。増殖または分化は、各々10%FBSまたは2%ウマ血清を含む培地において誘導した。Neuro2a細胞における分化誘導は血清除去により行った。（Ａ）フローサイトメトリーによる解析の結果を示す。RB1CC1のノックダウンによる細胞の大きさの減少は、分化誘導したC2C12筋細胞において顕著であったが、指数関数的に増殖しているC2C12細胞では顕著ではなかった。また、細胞周期への影響も、分化状態のC2C12筋細胞ではG1期分画細胞数の著明な減少が見られたが、増殖状態の細胞ではその影響は顕著でなかった。（Ｂ）ウェスタンブロットによる解析の結果を示す。RNAi処理した、増殖および分化細胞において活性化型S6（Ser240/244）およびRB1の発現量が減少した。上記、RB1CC1ノックダウンの影響はNeuro2a神経細胞におけるフローサイトメトリーおよびウェスタンブロットにおいても同様の結果であった。（実施例３）
【図４】飢餓条件で培養した細胞に対する外来性RB1CC1による影響を解析した結果を示す。 （Ａ）ウェスタンブロット法により、外来性RB1CC1によるS6K活性、TSC1量への影響を解析した結果を示す。完全アミノ酸（aminoacid ++）とともに25mM グルコース（glucose ++）、2.5 mM グルコース（+）を含むまたはグルコースを含まない（-）培地、あるいはメチオニンおよびシステインを除去した培地（aminoacid +）に外来性RB1CC1を添加した。2.5mM グルコースまたはグルコースなし、または一部のアミノ酸飢餓条件下ではリン酸化型S6K（Thr389）の量が減少したが、外来性RB1CC1の発現量依存的に回復した。また、RB1CC1発現量の上昇はTSC1/ハマルチン発現の減少およびRB1発現の増加と相関していた。（Ｂ）フローサイトメトリーにより外来性RB1CC1による細胞の大きさおよび細胞周期を解析した結果を示す。外来性RB1CC１発現により細胞周期は有意な影響を受けなかったが、細胞の大きさは回復した。（実施例４）
【図５】RB1CC1 およびTSC間の相互作用を解析した結果を示す。（Ａ）RB1CC1を過剰発現した細胞において活性化したThr389-S6K（レーン１）は、TSC1-2発現ベクターの導入により濃度依存的に減少した（レーン１−４）。これに対し、TSC1-2を過剰発現した細胞において、RB1CC1の導入はS6Kを活性化しなかった（レーン6-9）。中央のレーン（レーン5）はコントロールHEK293の状態を示す。（Ｂ）免疫沈降およびウェスタンブロット法による解析の結果、RB1CC1およびTSCは結合することがわかった。（Ｃ）HEK293MSR細胞において、内在性TSC1およびRB1CC1は免疫細胞化学的にその一部が共局在化していた。（実施例５）
【図６】RB1CC1によるTSC1分解がユビキチン−プロテアソーム経路を介しているか否かについて解析した結果を示す。（Ａ）RB1CC1がTSC1のユビキチン化に作用しているか否かを調べるため、TSC1、ユビキチンおよびRB1CC1の発現ベクターをHEK293細胞に外来的に導入し、免疫沈降および免疫ブロット法により解析した結果を示す。TSC1のユビキチン化はRB1CC1の過剰発現により促進され、RB1CC1のRNAiにより抑制された。（Ｂ）変異型RB1CC1がTSC1のユビキチン化に作用しているか否かを調べるため、TSC1、ユビキチンおよび、野生型もしくは変異型RB1CC1（wt、dLZ、dCC、dNおよびFCC）の発現ベクターをHEK293細胞に外来的に導入し、免疫沈降および免疫ブロット法により解析した。野生型RB1CC1(wt) はTSC1のユビキチン化を促進するのに対し、変異型RB1CC1（dLZ、dCC、dNおよびFCC）はこれを促進しなかった。（Ｃ）RB1CC1がTSC1の安定性に影響を与えるか否かを解析するため、コントロールおよび過剰のRB1CC1の存在下で、細胞をシクロヘキシミドに暴露させ、蛋白合成を停止させた後に、TSC1蛋白質量の減少をウェスタンブロット法により評価した。更にプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンを添加もしくは非添加した状態で、同様にTSC1の蛋白質量の減少を評価した。シグナルの測定値は0時間の値を100とし、これに対して各時間でのシグナル値を測定しグラフにプロットした。RB1CC1が豊富な場合にTSC1はより急速に分解された。過剰発現させたRB1CC1の存在下またはコントロール条件下、どちらの場合もラクタシスチンによりTSC1の分解が阻害された。また、RB1CC1特異的RNAiによりTSC1の分解は阻害された。スクランブルRNAiおよび変異型RB1CC1（dCC）をトランスフェクションした場合は、コントロールと同様の速度でTSC1が分解された。（Ｄ）RB1CC1による細胞の大きさおよび細胞周期の調節におけるTSC1の役割を、TSC1ヌルおよびレスキュー細胞を用いてフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。RB1CC1ノックダウンによる細胞サイズの縮小にはTSC1が必須であることがわかった。細胞周期に関しては、いずれの細胞株においてもRB1CC1ノックダウンにより、G1期細胞数の減少およびS期への異常な細胞周期の進行が生じたが、TSC1の有無による著明な差は見られなかった。（実施例６）
【図７】インビボ、マウス後肢、腓腹筋においてRB1CC1をノックダウンさせた結果を示す。（Ａ）レンチウイルスRB1CC1-RNAiの導入されたマウス筋線維はGFPで標識されるが、これらを免疫組織化学的にDABで茶褐色に発色させた（矢印）。（Ｂ）連続切片においてRB1CC1はGFP陽性線維では豊富でなかった（矢印）。（Ｃ）抗GFP抗体で免疫染色し、その後PAS染色を加えたマウス腓腹筋の代表的な切片における、スクランブルRNAi、RB1CC1 RNAi-1-およびRNAi-2で処理した筋線維を示す。（Ｄ）筋原線維CSAはRB1CC1ノックダウンにより減少した。（Ｅ）筋線維切片当たりの筋核数はRNAiによって有意に影響を受けなかった。データは、RNAi処理した3マウス由来の100線維以上のmeans±s.e.で示した。統計学的に有意な差異（p<0.01;Student's-t test）は*で示した。スケールバーは100mmを示す。（実施例７）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
RB1CC1の発現は、神経、筋、骨等の細胞周期停止に連動して、細胞の大きさの調節にも関与していることが示唆される。このことを確かめるため、本発明者らは、有糸分裂後胎生脊髄神経および筋細胞におけるRB1CC1の発現状態をin situ hybridization、及び、免疫組織化学的プレパレーションにより観察した。その結果、これらの組織において、細胞の大きさとRB1CC1の発現状態の間に正の相関関係があることがわかった。これらの知見に基づき、本発明者らは結節性硬化症分子複合体−哺乳動物ラパマイシン標的分子（以下、TSC-mTOR）経路に対するRB1CC1の機能的関与についてを探索した。【００１４】
本発明では２つの重要な知見を提供する。RB1CC1はRB1機能を増強し、細胞周期の進行を抑制する。また、生涯を通じてRB1CC1が有糸分裂後、成熟神経、筋細胞に豊富に発現しており、このことでmTOR経路に正に影響し、細胞、組織の大きさを維持している。これらの知見から、RB1CC1は細胞周期を進行させることのない細胞の大きさの維持において重要な役割を果たしており、組織構築のための調和の取れた機構に寄与していることがわかった。【００１５】
RB1CC1はmTOR-S6Kの活性化を介して細胞の大きさを拡大させるが、RB1の亢進制御により細胞周期の進行を抑制した。細胞の大きさおよび細胞周期に対するRB1CC1の二相効果は、C2C12筋芽細胞、Neuro2a神経芽細胞において、増殖状態よりも特に分化状態の細胞において顕著であった。また、RB1CC1の発現抑制は、インビボにおいても筋線維の萎縮をもたらした。さらに、RB1CC1は細胞周期および細胞サイズについて独立に機能しており、RB1CC1による細胞の大きさの制御にはTSC1が必須因子であった。また、RB1CC1は、ユビキチン−プロテアソーム経路を介するTSC1の分解を介してmTOR経路を正に制御しており、野生型RB1CC1は、TSC1と結合することにより、TSC1のユビキチネーションを促進していることがわかった。【００１６】
したがって、本発明の一態様は、RB1CC1蛋白質の発現量を減少または増加させることによる、細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期を調節する方法である。【００１７】
RB1CC1による細胞の大きさの調節は、RB1CC1とTSCが相互作用し、TSC1のユビキチン化分解が促進されることによると考えられる。したがって、本発明の細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期を調節する方法に関し、細胞、組織の大きさの調節はRB1CC1とTSC1との相互作用の抑制または促進によることが好ましく、RB1CC1によるTSCのユビキチン化分解の抑制または促進によることがさらに好ましい。【００１８】
また、RB1CC1による細胞周期の調節はRB1CC1によりRB1の発現が誘導、機能増強されることによるものであった。したがって、前記方法において、細胞周期の調節はRB1CC1により誘導されるRB1機能の抑制または促進であることが好ましい。【００１９】
本発明の方法におけるRB1CC1蛋白質の発現量を減少させることは、RB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳に干渉する分子にRB1CC1を発現している細胞を曝露させ、該細胞におけるRB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳に干渉することにより可能である。【００２０】
RB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳に干渉する分子として、アンチセンスヌクレオチド、RNAi物質、例えば、干渉リボ核酸（siRNA(small interferring RNA)やshRNA(short hairpin RNA)等）またはその転写鋳型、例えばshRNAをコードするDNAなどが好適に挙げられ、RNAi物質が好ましい。RB1CC1をコードするDNA又はRNAポリヌクレオチド分子、及びこの転写又は翻訳に干渉する分子の有効量は、所望の様式で標的遺伝子の発現を調節するために、例えば標的細胞遺伝子発現の所望の増加、及び、減少を得るために、宿主生物に投与される。【００２１】
RNAi物質とは、RNA干渉機構によって標的遺伝子の発現を調節する物質を意味する。本発明の一つの態様において用いられるRNAi物質は、小さいリボ核酸分子（本明細書において干渉リボ核酸とも呼ぶ）、すなわち二本鎖構造で存在するオリゴヌクレオチド、例えば互いにハイブリダイズする二つの異なるオリゴリボヌクレオチド、または二本鎖構造を生成するために小さいヘアピン形態をとる単一のリボオリゴヌクレオチドである。オリゴリボヌクレオチドとは、長さが約100ヌクレオチドを超えず、典型的には長さが約75ヌクレオチドを超えず、特定の態様において長さが約70ヌクレオチド未満であるリボ核酸を意味する。RNA物質が、互いにハイブリダイズする二つの異なるリボ核酸の二本鎖構造、例えばsiRNAである場合、二本鎖構造の長さは典型的には約15〜30bp、通常約15〜29bpの範囲であり、長さが約20〜29bpの場合、例えば21bp、22bpは特定の態様において特に重要である。RNA物質がヘアピン形態で存在する単一のリボ核酸の二本鎖構造、すなわちshRNAである場合、ヘアピンのハイブリダイズ部分の長さは典型的にsiRNA型の物質に関して先に提供した長さと同じであるか、または4〜8ヌクレオチド長い。この態様のRNAi物質の重量は典型的に、約5,000ダルトンから約35,000ダルトンの範囲であり、多くの態様において少なくとも約10,000ダルトンであり、かつ約27,500ダルトン未満、しばしば約25,000ダルトン未満である。【００２２】
RNAi物質が干渉リボ核酸、例えば上記のsiRNAまたはshRNAである代わりに、RNAi物質は上記のような干渉リボ核酸、例えばshRNAをコードしてもよい。言い換えれば、RNAi物質は、干渉リボ核酸の転写鋳型であってもよい。これらの態様において、転写鋳型は典型的に干渉リボ核酸をコードするDNAまたはRNAである。DNAは、ベクター（多様な異なるベクターが当技術分野で既知であり、例えばプラスミドベクター、ウイルスベクター等）に存在してもよい。【００２３】
RNAi物質は、プロトコールとして典型的な核酸投与プロトコールを用いることができ、自体公知のプロトコールを用いて胚以外の哺乳類宿主に投与することができる。核酸は、ウイルス感染、マイクロインジェクション、または小胞の融合を含む任意の数の経路によって組織または宿主細胞に導入してもよい。発現ベクターを用いて核酸を細胞に導入してもよい。そのようなベクターは一般的に、核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近傍に存在する都合のよい制限部位を有する。転写開始領域、標的遺伝子またはその断片、および転写終了領域を含む転写カセットを調製してもよい。転写カセットは、多様なベクター、例えばプラスミド；レトロウイルス、例えばレンチウイルス；アデノウイルス等に導入してもよく、この場合、ベクターは細胞において一過性または安定に、通常少なくとも約1日、より通常は少なくとも約数日から数週間の期間、状況によってはそれ以上に維持することができる。【００２４】
例えば、RNAi物質は、標的遺伝子を含む宿主生物に直接摂取させるか、または注射することができる。物質は細胞（すなわち、細胞内）に直接導入してもよく、または腔、間質腔、生物の体循環へ細胞外に導入してもよく、経口等で導入してもよい。経口導入方法には、RNAを生物の食物と直接混合することが含まれる。核酸を導入する物理的方法には、細胞への直接注入、またはRNA溶液の生物への細胞外注入が含まれる。物質は、細胞あたり少なくとも1コピーを輸送することができる量で導入してもよい。物質のより高用量（例えば、細胞あたり少なくとも5、10、100、500、または1000コピー）は、より有効な阻害を生じる可能性があり、より低用量もまた特定の態様にとって有用となる可能性がある。【００２５】
本発明の方法におけるRB1CC1蛋白質の発現量の増加は、RB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現ベクター及び発現ウイルスベクターを細胞にトランスフェクションすることによる発現亢進、RB1CC1蛋白質の発現を促進する化合物、および／またはRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進する化合物によっても可能である。【００２６】
本発明の別の一態様は、「RB1CC1蛋白質を発現している細胞、組織」と「試験化合物」を用いることを特徴とする、RB1CC1による細胞、組織の大きさおよび／または細胞周期の調節機能を促進もしくは抑制する化合物、RB1CC1の蛋白質の発現を促進または抑制する化合物、あるいはRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法である。より具体的には、例えば、（i）RB1CC1蛋白質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ii）RB1CC1蛋白質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。【００２７】
前記スクリーニング方法において、例えば、（i）と（ii）の場合における、RB1CC1蛋白質の発現量（具体的にはRB1CC1蛋白質をコードするmRNA量、蛋白量）、mTOR経路における活性化された蛋白質（具体的にはmTOR、S6Kおよび4EBP1）の量、TSCのユビキチネーションの程度、RB1蛋白質の発現量を測定して、比較する。RB1CC1蛋白質の発現量において変化があった場合は、試験化合物はRB1CC1蛋白質の発現、またはRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物であることがわかる。また、mTOR経路における活性化された蛋白質量、TSCのユビキチネーションの程度における変化があった場合は、試験化合物はRB1CC1による細胞の大きさの調節を促進または抑制する化合物であることがわかる。さらに、RB1蛋白質の機能、及び、発現量に変化あった場合は、試験化合物はRB1CC1による細胞周期の調節を促進または抑制する化合物であることがわかる。【００２８】
前記試験化合物として、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。【００２９】
RB1CC1を産生する能力を有する細胞としては、RB1CC1蛋白質をコードするDNAを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）あるいは、RB1CC1を内生的に発現しているHEK293細胞、C2C12細胞、Neuro2a細胞等が挙げられる。【００３０】
前記スクリーニング方法における、RB1CC1の蛋白質量、mTOR経路における活性化された蛋白質量、TSCのユビキチネーションの程度の測定は、公知の方法で測定することができる。例えば、RB1CC1の蛋白質量は、RB1CC1を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在するRB1CC1を、ウェスタン解析、ELISA法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。【００３１】
また、前記スクリーニング方法における、RB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやReverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）、リアルタイムPCR解析システム（ABI社製、TaqMan polymerase chain reaction）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。【００３２】
RNA物質によるRB1CC1遺伝子発現阻害の場合、遺伝子発現は、そのRB1CC1蛋白質が容易にアッセイされるレポーターまたは薬物耐性遺伝子を用いることによって簡便にアッセイされる。そのようなレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）、アルカリホスファターゼ（AP）、b-ガラクトシダーゼ（LacZ）、b-グルクロニダーゼ（GUS）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、ルシフェラーゼ（Luc）、ノパリンシンターゼ（NOS）、オクトピンシンターゼ（OCS）、およびその誘導体が含まれ、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メソトレキセート、ホスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対して抵抗性を付与する多数の選択マーカーが利用可能である。【００３３】
前記スクリーニング方法において、例えば、上記（ii）の場合におけるRB1CC1蛋白質またはRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現量を、上記（i）の場合に比べて、約20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは約50％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物として選択することができる。【００３４】
本発明の方法は、神経および／または筋肉細胞に作用することができ、未分化および分化したこれらの細胞をともに用いることができる。これらの細胞は培養細胞であっても、非脊椎、脊椎動物内の細胞であってもよく、具体的な脊椎動物の例としてニワトリ、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、霊長類、ヒトなどが挙げられる。【００３５】
RB1CC1は神経、筋、骨細胞等の増殖、成長、分化、および死において重要な役割を果たしており、協調された組織構築、生体の分子機構に新規な見解を提供するものである。RB1CC1の欠損はこれらの機構の異常調節をもたらし、癌や神経筋疾患などの様々な病的状態となる。【００３６】
したがって、本発明の一態様は、本発明の方法により得られるRB1CC1による細胞周期または細胞、組織の大きさの調節機能を促進もしくは抑制する化合物、RB1CC1蛋白質の発現を促進または抑制する化合物、および／またはRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物を含有してなる医薬である。該医薬は、例えば、神経筋疾患（例、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、炎症性筋疾患、内分泌障害に伴うミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、甲状腺中毒性周期性四肢麻痺、甲状腺機能低下性ミオパチー、ステロイドミオパチー、周期性四肢麻痺、糖原病、重症筋無力症、筋無力症候群、ミトコンドリア病、ミオグロビン尿症、遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィーおよびダノン病などの筋原性疾患、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症硬化症、及び、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症などの神経原性疾患等）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）の予防・治療剤として使用することができる。【００３７】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより適宜調整することができる。【００３８】
また、本発明のさらなる一態様は、本発明の方法により得られるRB1CC1による細胞周期または細胞、組織の大きさの調節機能を促進もしくは抑制する化合物、RB1CC1蛋白質の発現を促進または抑制する化合物、および／またはRB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物を含有してなる神経筋疾患（例として、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、炎症性筋疾患、内分泌障害に伴うミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、甲状腺中毒性周期性四肢麻痺、甲状腺機能低下性ミオパチー、ステロイドミオパチー、周期性四肢麻痺、糖原病、重症筋無力症、筋無力症候群、ミトコンドリア病、ミオグロビン尿症、遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィーおよびダノン病などの筋原性疾患、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症硬化症、及び、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症などの神経原性疾患等）および／または癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）の診断剤である。
【実施例】
【００３９】
（抗体および試薬）
RB1CC1に対するラビット抗血清は、RB1CC1のN末端内の第1〜253番目のアミノ酸を含むGST融合蛋白質をエピトープとして得た。また、他の抗RB1CC1抗血清はGuan J.L.（コーネル大学、NY14853）より得た。次を除く全ての抗体はCellSignaling社より得た：抗TSC2抗体（C-20）、抗S6K抗体（C-18）および抗Myc抗体（9E10）（SantaCruzBiotechnology社製）；抗HA抗体（12CA5）（Roche社製）；抗Flag抗体（M2）および抗Tubulina抗体（DM1A）（Sigma社製）；抗RB1抗体（G3-245、BDPharmingen社製）および抗GFP抗体（Clontech社製）。シクロヘキシミド（cycloheximide）およびラクタマイシン（ラクタシスチン）はCalbiochem社製のものを用いた。【００４０】
（細胞培養）
HEK293、293TおよびC2C12、Neuro2a細胞は10%のウシ胎仔血清（FBS）を含むDulbecco's modified Eagle'smedium（DMEM）中で5%のCO2存在下、37℃にて培養した。C2C12細胞の筋分化にはウマ血清（2%）を導入した（非特許文献３）。Neuro2a細胞の神経分化には血清除去による分化誘導をおこなった（非特許文献１６）。各細胞を25mM HEPESおよび10% 透析FBS（Invitrogen社製）を含有する貧栄養培地で培養し、mTOR-S6K活性を評価した。TSC1-/-細胞はTSC1knockoutマウス由来の腎細胞癌株を用いた（非特許文献１７）。TSC1を安定発現している細胞は、TSC1-/-細胞にヒトTSC1 cDNA（GenBank accession No. NM_000368）をレトロウイルスベクターを用いて導入、作製した。クローン化したTSC1レスキュー細胞はブラスチシジン（blasticidin）の存在下で選択した。C2C12細胞、Neuro2a細胞、TSC1ヌル細胞およびレスキュー細胞について、RB1CC1遺伝子の付加的修飾はレンチウイルス遺伝子導入系（Invitrogen社製）を用いて行なった。【００４１】
（プラスミドDNAおよび遺伝子導入）
RB1CC1（GenBank accession no. NM_014781）の外部および内部欠失変異型は、以下に示した適当な位置のプライマーを用いたPCRに基づく操作と制限酵素での消化を組み合わせて作製した。全てのコンストラクトのヌクレオチドはDNAシークエンシングにより確認した。RB1CC1変異型のdLZ、dCC、dNおよびFCCはそれぞれ第1〜1363番目（dLZ）、第1〜823番目（dCC）、第1〜555番目（dN）および第864〜1594番目（FCC）のアミノ酸を含む。トランスフェクションはLipofectamine2000（Invitrogen社製）またはFuGENE6（Roche社製）を用いて製造元のプロトコールにしたがって行った。【００４２】
RB1CC1についてのRNAiのプラスミドベクターは文献（非特許文献３）の方法にしたがって調製した。RB1CC1発現コントロールのためのスクランブルRNAi配列は5'-CAACTACCAAGAGCTTGCCTA-3'（配列番号１）である。RB1CC1を標的とするRB1CC1-RNAiの標的部位配列はRNAi-1:5'-TGGGCTGGTGCTTTAGTCAAA-3'（配列番号２）、 RNAi-2: 5'-CGGGATAAAGATTTGATAGAG-3'（配列番号３）、RNAi-3:5'-GGGAGATTTGGTACTCATCATC-3' （配列番号４）［マウスの場合、5'-GGGAGATTTGGTTCTCATCATC-3'（配列番号５）］である（RNAi-3以外はヒト、マウス共通の部位を標的としている）。レンチウイルスRNAiベクターも非特許文献３に同様の配列にて調製した。選択マーカーはGFPを用いた。ウイルス導入RNAiは製造元のプロトコールにしたがって調製した（Invitrogen社製）。ヒトTSC1cDNAをpCX-bsrベクターにクローニングし、pCX-bsrおよびpCL-Amphoの組み合わせによりレトロウイルスベクターを調製し、遺伝子導入を行った（非特許文献１８）。【００４３】
（ウェスタンブロット法および免疫沈降法）
ウェスタンブロット法に用いる細胞溶解液は文献（非特許文献１９）の方法に従って溶解した。免疫沈降に用いる細胞は1xTNEバッファー（150mM NaCl、5mM EDTA、1% NP-40および1mM Na3VO4を含有する20mM Tris-HCl 、ならびにプロテアーゼインヒビターの混合物）中で溶解した。溶解した材料を15,000xgにて10分間遠心した後、上清を抗HA（Roche社製）、抗Mycまたは抗Flag（Sigma社製）抗体で免疫化したビーズとともに、4℃にて3時間回転させながらインキュベートした。ビーズを5回1xTNEバッファーで洗浄し、SDSサンプルバッファー中で煮沸し、共免疫沈降してきた蛋白分子複合体を溶解した。蛋白分子複合体をSDS-PAGEで泳動分離し、ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜にトランスファーし、前記の各抗体で蛋白分子複合体の解析を行った。【００４４】
（細胞の大きさおよび細胞周期解析）
細胞の大きさおよび細胞周期を解析するために、FSCの分布およびDNA量をBecton Dickinson FACS Caliburを用いてGFP陽性の遺伝子導入細胞についてフローサイトメトリーにより解析した。フローサイトメトリーは文献（非特許文献２０）の如くCELLQUESTソフトウェア（BectonDickinson社）を用いて解析した。【００４５】
（インビボにおけるRB1CC1のレンチウイルスノックダウン）
RB1CC1-RNAiを含むレンチウイルスをC57BL6マウスの左右の後肢腓腹筋に導入した。スクランブルRNAiおよびRB1CC1-RNAiを含むレンチウイルス1x104TU(Titer Units; Hela細胞換算)を脚の左右にそれぞれ導入し、4週間後に筋肉を組織学的に評価した。【００４６】
（組織学および免疫組織化学）
胎芽内で発達中の神経、筋細胞におけるRB1CC1を評価するために、妊娠4〜8週間のヒト胎児流産組織、及び、胎生11-18日のマウス胎芽組織を用い、組織学的および免疫組織化学標本を作製した（非特許文献３、６および７）。【００４７】
in situ hybridization法は文献６，７に記載の方法により行なった。また、免疫組織染色は文献３，６，７に記載の方法により行なった。【００４８】
マウス骨格筋におけるRB1CC1ノックダウンの効果は、GFPで免疫染色し、RNAi導入筋線維を標識した後にノックダウンおよびコントロール筋繊維の平均断面積（CSA）を比較することにより評価した。GFPを発現している筋線維におけるCSAの大きさは、NIHImage1.63ソフトウェアを用いて画像解析を行い評価した。断面筋繊維当たりの平均核数もまた比較した。各筋繊維における核数を正確に算出するため、筋肉基底膜をGFPで免疫染色した後、過ヨウ素酸／シッフ（PAS）染色を行い可視化した。【００４９】
［実施例１］
脊髄神経におけるRB1CC1の発現をin situ hybridization法および免疫組織学的染色法により解析した。【００５０】
In situ hybridization法
脊髄神経におけるRB1CC1 mRNAの存在量をRB1CC1-antisense probeを用いたin situ hybridization法により解析した結果を図１Ａに示す。図１Ａにおいて矢印は成熟および肥大した神経を示す。RB1CC1のmRNAは増殖性または移動性神経よりも、より成熟および拡大した神経に豊富に発現していた。【００５１】
免疫組織学的染色法
抗RB1CC1抗血清により胎芽内の発達中脊髄神経及び骨格筋の免疫組織染色を行なった。図１Ｂに示すように、増殖性神経芽細胞におけるRB1CC1の発現量は低かったが、図１Ｃに示す如く、拡大、より成熟した神経細胞においてRB1CC1の含有量は増加した。ここでデータは示していないが成獣脊髄神経標本においても、同様の結果が得られた。これらの結果から、成獣および胎生脊髄神経におけるRB1CC1の発現量は、非増殖性の成熟した大型の神経、筋細胞においてより顕著であり、成熟により誘導される細胞の肥大に付随して上昇することがわかった。また、骨格筋では図１Ｄに示すようにRB1CC1発現量は、筋管形成の後に肥大する骨格筋細胞において著明に増加していた。【００５２】
これらの結果、更にRB1CC1は筋骨格の分化に重要であるという前記した知見から、RB1CC1は神経筋組織の分化に関連する細胞の肥大に関与していることが示唆された。【００５３】
［実施例２］
RB1CC1特異的ノックダウンによるmTOR−S6K活性、RB1発現、および細胞の大きさ、細胞周期への影響を解析した。【００５４】
HEK293細胞における、mTOR経路蛋白質活性へのRB1CC1特異的ノックダウンのよる影響
各々、RB1CC1に対する標的部位の独立した3タイプのRNAi（RNA-1、2および3）を用いてRB1CC1のknockdownを行った。各RNAiが標的とするRB1CC1配列はRNAi-1:5'-TGGGCTGGTGCTTTAGTCAAA-3'（配列番号２）, RNAi-2: 5'-CGGGATAAAGATTTGATAGAG-3'（配列番号３）, RNAi-3:5'-GGGAGATTTGGTACTCATCATC-3'（配列番号４） である。これらによりRB1CC1を特異的にノックダウンし、mTOR経路における蛋白質の活性への影響を解析した。蛋白質の活性は、活性型mTOR、S6Kおよび4EBP1、すなわち、それぞれのリン酸化型をウエスタン・ブロット法により定量して解析した。1x106個のHEK293細胞に4mgの各RNAiプラスミドベクターをトランスフェクションし、5%CO2存在下37℃にて48時間培養後細胞を溶解した。その後、以下に示す活性型の各リン酸化蛋白に特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングを行うことによりmTOR経路分子の活性度評価を行った。その結果、図２Ａに示すようにRB1CC1のノックダウンにより、活性型mTOR、S6Kおよび4EBP1、すなわち、それぞれのリン酸化型Ser2448（mTOR）、Thr389（S6K）およびThr37/46（4EBP1）の各分子の量が減少した。さらに、RB1CC1のノックダウンにより、RB1の発現が減少した。空ベクターまたはスクランブル・ベクターをHEK293細胞にトランスフェクションしても影響はなかった。【００５５】
HEK293細胞における、細胞の大きさへのRB1CC1特異的ノックダウンによる影響
2タイプのRNAi（RNA-1およびRNA-2）によりRBCC1を各々独立してノックダウンし、細胞の大きさへの影響を解析した。4mgの各RNAiプラスミドベクターを1x106個のHEK293細胞にLipofectamine2000を用いてトランスフェクションし、5% CO2存在下37℃にて48時間培養した後、フローサイトメトリーにより解析した。その結果、図２Ｂ上に示すようにRNAiによるRB1CC1のノックダウンにより細胞の大きさが減少した。さらに、図２Ｂ下に示すようにRB1CC1のノックダウンによりG0-G1期の細胞数が減少した。【００５６】
RB1CC1ノックダウン効果の濃度依存性
mTOR経路における蛋白質のリン酸化に対するRNAiの影響が濃度依存的であるか否かを調べた。1x106個のHEK293細胞に0、1、4および7mgのRNAi-1プラスミドベクターをLipofectamine2000を用いてトランスフェクションし、5% CO2存在下37℃にて48時間培養後細胞を溶解した。その後、前記方法によりmTOR経路における蛋白質（mTOR、S6Kおよび4EBP-1）のリン酸化型蛋白質を定量した。その結果、図２Ｃに示すように各リン酸化型蛋白質量は段階的に減少し、RB1CC1のノックダウン効果は濃度依存的であった。【００５７】
これらの結果から、RB1CC1は、mTORおよびRB1経路を各々介して細胞の大きさおよび細胞周期を調節していることが示された。【００５８】
［実施例３］
RB1CC1のノックダウンによるC2C12筋芽細胞、Neuro2a神経芽細胞の大きさ、数および細胞周期への影響を調べた。1x106個のC2C12筋芽細胞にRNAiレンチウイルスベクターをトランスフェクションし、7-10日後RNAi導入細胞を回収、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロット法により解析した。増殖または分化は、C2C12筋芽細胞については、各々10%FBSまたは2%のウマ血清を含む培地において誘導した。Neuro2a神経芽細胞の分化誘導は血清除去によりこれを行った。【００５９】
C2C12筋芽細胞、Neuro2a神経芽細胞における、細胞の大きさへのRB1CC1特異的ノックダウンによる影響
フローサイトメトリーによる解析の結果、図３Ａ左に示すようにRB1CC1のノックダウンによる細胞の大きさの減少は、分化誘導したC2C12筋細胞においてより顕著であったが、指数関数的に増殖する細胞では顕著ではなかった。また、図３Ａ右に示すように、RB1CC1のノックダウンにより、分化した細胞集団において最も豊富であるG1分画の著明な減少がみられた。Neuro2a神経芽細胞においても同様の結果であった。【００６０】
C2C12筋芽細胞における、mTOR経路の蛋白質活性へのRB1CC1特異的ノックダウンによる影響
また、ウェスタンブロットにより実施例２と同様の方法でS6Kの下流ターゲットであるS6蛋白質のリン酸化型、およびRB1蛋白質の発現量を解析した。その結果、図３Ｂに示すように、RB1CC1のノックダウンによりリン酸化型S6蛋白質およびRB1蛋白質の発現量が減少していた。細胞の大きさの減少はリン酸化型S6蛋白質の減少によるものであると考えられる。また、RB1CC1のノックダウンによるRB1蛋白質量の減少は、G1期の分化細胞数の減少に平行している。このことから、RB1の発現の減少により細胞周期が正常に抑制されないことがわかった。【００６１】
［実施例４］
mTOR経路を介する細胞の大きさの調節に対するRB1CC1の寄与を解析した。MetおよびCysを除去した培地における飢餓状態、低濃度（2.5mＭ）グルコースを含むまたは全くグルコースを含まない培地で培養したHEK293細胞において、外来性RB1CC1の過剰発現による影響を、25mM グルコースを含む完全培地で培養した場合と比較した。1x106個のHEK293細胞にRB1CC1をコードするプラスミドDNA（0、0.5、1、3または5mg）をLipofectamine2000を用いて飢餓条件下でトランスフェクションした。その後5% CO2存在下37℃にて24時間培養し、解析に用いた。【００６２】
飢餓条件下で培養した細胞における、RB1CC1のS6K活性への影響
ウェスタンブロットによりリン酸化型S6Kの蛋白質量を定量し、外来性RB1CC1の過剰発現によるS6Kの活性への影響を調べた。その結果、図４Ａに示すように、上記飢餓条件下で培養したHEK293細胞では通常S6Kの活性が抑制されるが、外来性RB1CC1の発現量依存的にS6K活性が亢進されることがわかった。また、RB1CC1発現量の上昇はTSC1（ハマルチン）発現の減少およびRB1発現の増加と平行していた。【００６３】
飢餓条件下で培養した細胞における、RB1CC1の細胞の大きさおよび細胞周期への影響
フローサイトメトリーにより細胞の大きさおよび細胞周期を解析した結果、図４Ｂに示すようにRB1CC1により細胞周期は有意な影響を受けなかったが、低濃度グルコース条件下で縮小した細胞サイズはRB1CC1発現亢進によりその大きさを回復した。【００６４】
これらの結果は、RB1CC1は細胞の大きさおよび細胞周期を各々TSC-mTORおよびRB1経路を介して調節している、という知見を支持していた。【００６５】
［実施例５］
RB1CC1およびTSC-mTOR経路間の分子カスケードを評価するため、RB1CC1およびTSC間の相互作用を解析した。【００６６】
RB1CC1を過剰発現させた細胞における、TSC1-2の導入によるS6K活性への影響
RB1CC1を過剰発現させたHEK293細胞にTSC1-2を段階的に導入し、S6K活性の変化を解析した。1x106個のHEK293細胞に2mgのRB1CC1発現ベクターをトランスフェクションし、RB1CC1の発現亢進によりS6Kを活性化した。このHEK293細胞（1x106個）に0、1、3および5mgのTSC1-2発現ベクターをトランスフェクションし、ウェスタンブロット法によりリン酸化型S6K（Thr389-S6K）を検出した。その結果、図５Ａ（左から1〜4番目のレーン）に示すように、RB1CC1の発現亢進により増加していた活性化型S6K（Thr389-S6K）がTSC1-2濃度依存的に減少した。これに対し、1x106個のHEK293細胞に2mgのTSC1-2発現ベクターをトランスフェクションし、TSCを過剰発現させた後、このHEK293細胞（1x106個）に0、1、3および5mgのRB1CC1発現ベクターをトランスフェクションし、5% CO2存在下37℃にて48時間培養後、ウェスタンブロット法によりリン酸化型S6K（Thr389-S6K）を検出した。その結果、図５Ａ（左から6〜9番目のレーン）に示すように、TSCを過剰発現させた細胞において、RB1CC1の導入によってS6Kは活性化されなかった。これらの結果から、RB1CC1はTSCの上流で機能していることが示された。【００６７】
RB1CC1および TSC間の相互作用
RB1CC1とTSCが相互作用しているか否かを免疫沈降およびウェスタンブロット法により解析した。1x106個のHEK293T細胞に、2mgのFlag-RB1CC1発現ベクター（+）またはコントロールベクター（-）、並びに2mgのMyc-TSC1およびHA-TSC2発現ベクターを、FuGeneを用いてコトランスフェクションし、5% CO2存在下37℃にて48時間培養した細胞を解析に用いた。等分量の溶解液、抗Flag抗体または抗Myc抗体による免疫沈降物をウェスタンブロット法により解析した。その結果、図５Ｂに示すようにRB1CC1はTSC1および2と相互作用していることがわかった。尚、データは示してないが、酵母2ハイブリッドアッセイによってもRB1CC1およびTSC1間の結合が確認された。【００６８】
内在性TSC1およびRB1CC1の局在
内在性のTSC1およびRB1CC1の局在を解析した。HEK293MSR細胞において、抗TSC1抗体および抗RB1CC1抗体を免疫細胞化学的に反応させた。1x104個のHEK293MSR細胞を1%中性緩衝ホルマリンにて固定後、各抗体をそれぞれAlexa-Fluor555（赤）、488（緑）を用いて標識し、標識各抗体を4℃で一晩反応させた。1%中性緩衝ホルマリンによる後固定、グリセロール包埋の後、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM510 META: Carl Zeiss社製）で解析した。その結果、図５Ｃに示すように内在性のTSC1およびRB1CC1の一部は免疫細胞化学的に共局在化していた。【００６９】
これらの結果から、RB1CC1はTSC1と相互作用し、TSC1の直接の上流で機能していることがわかった。【００７０】
［実施例６］
過剰なRB1CC1発現状態はTSC1蛋白質量と負に相関しており（実施例４）、またRB1CC1はTSC1と相互作用している（実施例５）という知見から、RB1CC1はユビキチン−プロテアソーム経路を介してTSC1を分解しているという可能性が示唆された。よって、この可能性について検討した。【００７１】
TSC1のユビキチン化に対するRB1CC1の影響
RB1CC1がTSC1のユビキチン化に作用しているか否かを調べるため、TSC1、ユビキチンおよびRB1CC1の発現ベクターをHEK293細胞に外来的に導入し、免疫沈降および免疫ブロット法により解析した。1x106個のHEK293細胞に0または1mgのMyc-TSC1、HA-ユビキチンおよび／またはFlag-RB1CC1の発現ベクターをトランスフェクションし、5% CO2存在下37℃にて48時間培養後解析に用いた。細胞溶解液を抗HA（ユビキチン）抗体で免疫沈降し、沈降蛋白分子をSDSbufferにて再可溶化後、抗Myc（TSC1）抗体で免疫ブロットを行い、評価した。図６Ａに示すように、RB1CC1の過剰発現によりTSC1のユビキチン化が促進された。また、当該促進はRNAiによるRB1CC1のノックダウンによって抑制された。抗Myc（TSC1）抗体により免疫沈降し、坑HA（ユビキチン）抗体で免疫ブロットした場合も同様の結果を示した。【００７２】
TSC1のユビキチン化に対する各種変異型RB1CC1の影響
各種の変異型RB1CC1がTSC1のユビキチン化に作用しているか否かを調べるため、TSC1、ユビキチンおよび野生型、変異型のRB1CC1（wt、dLZ、dCC、dNおよびFCC）の発現ベクターをHEK293細胞に外来的に導入し、免疫沈降および免疫ブロット法により解析した。1x106個のHEK293細胞に0または1mgのTSC1、ユビキチン、野生型または変異型RB1CC1（dLZ、dCC、dNおよびFCC）の発現ベクターをトランスフェクションし、5% CO2存在下37℃にて48時間培養後解析に用いた。細胞溶解液を抗Myc（TSC1）抗体で免疫沈降し、抗HA（ユビキチン）抗体で免疫ブロットした。その結果、図６Ｂに示すように、野生型RB1CC1（wt）はTSC1のユビキチン化を促進するのに対し、変異型RB1CC1（dLZ、dCC、dNおよびFCC）は促進しなかった。【００７３】
TSC1の安定性に対するRB1CC1の影響
RB1CC1がTSC1の安定性に影響を与えるか否かを解析するため、コントロールおよび過剰のRB1CC1の存在下で、細胞をシクロヘキシミドに暴露させ、蛋白合成を停止させた後に、TSC1蛋白質量の減少をウェスタンブロット法により評価した。更にプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンを添加もしくは非添加した状態で、同様にTSC1の蛋白質量の減少を評価した。【００７４】
プロテアソーム阻害剤であるラクタシスチン （10mM）の存在下または非存在下で、1x106個のHEK293細胞に6mgの野生型RB1CC1、変異型RB1CC1（dCC）、RB1CC1特異的RNAiまたはスクランブルRNAiを、Lipofectamine2000を用いて各々トランスフェクションし、10mg/mlのシクロヘキシミドに暴露させた。その後、0、2、5および8時間後にウェスタンブロット法により内在性TSC1の蛋白量を評価した。【００７５】
その結果、図６Ｃに示すように、RB1CC1が豊富な場合にTSC1はより急速に分解された。過剰発現させたRB1CC1の存在下またはコントロール条件下、どちらの場合もラクタシスチン（プロテアソーム阻害剤）によりTSC1の分解は阻害された。また、RB1CC1特異的RNAiによってもTSC1の分解は阻害された。スクランブルRNAiおよび変異型RB1CC1（dCC）をトランスフェクションした場合は、コントロールと同様の速度でTSC1が分解された。これらの結果から、RB1CC1はユビキチン−プロテアソーム経路を介して、TSC1の速い代謝回転を誘導していることが示された。【００７６】
RB1CC1による細胞の大きさの調節におけるTSC1の役割
RB1CC1が細胞の大きさを調節するためには、TSC1が必須か否かを調べた。TSC1ヌルマウス腎細胞癌細胞およびTSC1−レスキュー細胞において、RB1CC1をノックダウンした。レンチウイルスベクターによりRNAiを導入した。RNAi導入に伴いGFP蛍光を示した細胞について、フローサイトメトリーにより解析した。その結果、図６Ｄ左に示すように、RB1CC1による細胞の大きさの調節にはTSC1が必須であることが明らかとなった。【００７７】
RB1CC1による細胞周期の調節におけるTSC1の役割
TSC-mTOR経路がRB1CC1の介在する細胞周期の調節に関与しているか否かを調べた。前記と同じ条件でTSC1ヌルマウス腎細胞癌細胞およびTSC1-レスキュー細胞において、RB1CC1をノックダウンし、RB1CC1のノックダウンが細胞周期に与える影響をフローサイトメトリーにより解析した。その結果、図６Ｄ右に示すように、いずれの細胞株においてもRB1CC1のノックダウンにより、G1期細胞数の減少およびS期への異常な細胞周期の進行が生じたが、TSC1の有無による著明な差は見られなかった。【００７８】
前記解析の結果、RB1CC1による細胞の大きさの調節はTSC1の状態に依存するが、細胞周期の調節はTSC1の状態とは独立していることがわかった。この結果から、RB1CC1は細胞周期および細胞の大きさに対しては各々独立して作用しており、TSC1はRB1CC1による細胞の大きさの調節に必須であることがわかった。【００７９】
［実施例７］
RB1CC1のインビボにおける筋肉細胞および組織への影響
RB1CC1が細胞または組織の大きさを維持しているか否かをインビボで解析した。【００８０】
RB1CC1-RNAiを含むレンチウイルスをC57BL6マウスの左右の後肢腓腹筋に導入した。スクランブルRNAiおよびRB1CC1-RNAiを含むレンチウイルス1x104TU(Titer Units; Hela細胞換算)を脚の左右にそれぞれ導入し、4週間後に筋肉を組織学的に評価した。レンチウイルスRB1CC1-RNAiにより処理したマウス筋線維はGFPを発現するが、連続切片を作成し、これを抗GFP抗体（図７Ａ）および抗RB1CC1抗体（図７Ｂ）でそれぞれ免疫染色し、ノックダウンの効果を確認した。その結果、図７ＡおよびＢに示すように、RB1CC1のノックダウンによりRB1CC1の量が減少した。【００８１】
さらに、スクランブルRNAi、RB1CC1 RNAi-1、RNAi-2を導入した筋原線維（GFPにより標識されており、抗GFP抗体による免疫組織学染色にてDABによる茶褐色で標識される）の大きさを組織学的に測定した。ここで、腓腹筋断面積（CSA）の大きさはNIHImage softwareにより評価した。その結果、図７ＣおよびＤに示すように、GFPを発現しているRNAi導入マウス腓腹筋断面積（CSA）は減少し、筋肉線維の萎縮が生じた。この結果から、筋原繊維CSAはRB1CC1ノックダウンにより減少したことがわかった。また、図７Ｅに示すように、スクランブルRNAiとRB1CC1RNAiの場合において、GFP陽性の筋線維横断面当りの筋核数に有意な違いはなかった。【００８２】
これらの結果から、RB1CC1はインビボでも筋肉細胞および組織の大きさを調節していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
上記に述べたように、本発明の方法により得られるRB1CC1による細胞周期または細胞、組織の大きさの調節機能を促進もしくは抑制する化合物、RB1CC1のポリペプチドまたは蛋白質の発現を促進または抑制する化合物、RB1CC1蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進または抑制する化合物を含んでなる医薬は、神経、筋疾患、癌などの予防・治療剤、診断剤として用いることができる。更には、これら化合物、医薬は、各種動物の神経機能、肉質の維持、改善等にも使用しうる。
【図１】
2007072645.tif 000002
【図２】
2007072645.tif 000003
【図３】
2007072645.tif 000004
【図４】
2007072645.tif 000005
【図５】
2007072645.tif 000006
【図６】
2007072645.tif 000007
【図７】
2007072645.tif 000008
【配列表】
2007072645000001.app
【国際調査報告】
2007072645.tif 000009
2007072645.tif 000010
2007072645.tif 000011
2007072645.tif 000012