(57)【要約】  アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシスに代表されるコンフォメーション病に対して予防、治療効果を示す医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、一般式（１）〔式中、少なくとも１つのＲはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＯＭから選ばれ、他のＲはＨであり、ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａから選ばれる。〕で表される構造単位を有するセルロースエーテル、セルロースエーテルのアルカリ金属塩、セルロースエーテルの脂肪族酸エステル、及びこれらの混合物から選ばれる一種以上のセルロースエーテル類を有効成分として含有する。2007123187.tif 000011
2007123187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）〔式中、少なくとも１つのＲはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＯＭから選ばれ、他のＲはＨであり、ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａから選ばれる。〕で表される構造単位を有するセルロースエーテル、前記セルロースエーテルのアルカリ金属塩、前記セルロースエーテルの脂肪族酸エステル、およびこれらの混合物から選ばれる一種以上のセルロースエーテル類を有効成分として含有することを特徴とするコンフォメーション病医薬組成物。
2007123187.tif 000010
【請求項２】
前記セルロースエーテル類が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびメチルセルロースから選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項１記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物がヒトを含む哺乳動物に投与可能に製剤化されたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項４】
前記医薬組成物が、注射剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、酒精剤、エリキシル剤、リモナーデ剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、チンキ剤、ローション剤、リニメント剤、エアゾール剤、坐剤から選ばれた剤型に製剤化されたものであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項５】
コンフォメーション病予防薬であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項６】
コンフォメーション病治療薬であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項７】
前記コンフォメーション病が、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＪＤ）ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、致死性家族性不眠症（Ｆａｔａｌ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｉｎｓｏｍｎｉａ）、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ；ＢＳＥ）、ヒツジにおけるスクレイピー（ｓｃｒａｐｉｅ）、シカにおける慢性消耗性疾患のいずれかのプリオン病であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項８】
前記コンフォメーション病が、アルツハイマー病であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項９】
前記コンフォメーション病が、アミロイドーシスであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、コンフォメーション病医薬組成物、特に、コンフォメーション病の予防、治療効果のある医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンフォメーション病とは、特定の宿主蛋白質についてその立体構造（コンフォメーション）が変化されて難溶性となって細胞や組織に蓄積し病的状態をもたらす疾患群であり、各種疾患例が報告されている〔非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照〕。これには、アルツハイマー病、プリオン病、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症に代表される神経難病が含まれる。【０００３】
コンフォメーション病では、特定の蛋白質が本来のコンフォメーションとは異なるβシート構造と呼ばれる構造成分に富むコンフォメーションをとって難分解性となる。コンフォメーション病のうちこのような異常なコンフォメーションをとった蛋白質が細胞外の組織に蓄積して難溶性物質（「アミロイド」と呼ばれる）を形成する疾患群はアミロイドーシスと呼ばれる。一方、このような異常なコンフォメーションをとった蛋白質が細胞内に蓄積して難溶性物質（「インクルージョン・ボディ（封入体）」と呼ばれる）を形成する疾患群もある。前者には各種アミロイドーシスの疾患が含まれ、後者にはポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、ハンチントン病、ピック病、進行性核上性麻痺、前頭側頭型痴呆などが含まれる。また、どちらも見られるものとしてはアルツハイマー病やプリオン病などがある。これらのコンフォメーション病の原因蛋白質は疾患によって異なり、蛋白質の一次構造上の共通点はないものの、コンフォメーションの異常化のメカニズムや異常化蛋白質の沈着を促進するメカニズムには共通の因子が関与していると考えられており、コンフォメーション病全般あるいは複数のコンフォメーション病に共通した治療化合物の開発が可能である〔非特許文献４、非特許文献５参照〕。実際に、これまでにアルツハイマー病、アミロイドーシス全般、プリオン病に共通する薬効を示すことが期待される薬物開発の報告が多数ある〔例えば、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９参照〕。【０００４】
しかし、これらコンフォメーション病については、原因及びその作用機構が徐々に解明されつつあるが、現在まで予防および治療に決定的に有効な医薬品は見出されていない。  
これまで、プリオン病を対象として予防、治療効果のある医薬品として、例えば、ラミニン結合部位を構成するアミノ酸配列からの６個の連続するアミノ酸残基から成る人為的に設計されたペプチド〔特許文献１参照〕、キノリン環やナフチリジン環などの含窒素複素環に、キノリン環、キニクリジン環、ピリジン環などの含窒素複素環式基、または芳香族アミン、ヒドラゾンなどの含窒素側鎖を有する化合物〔特許文献２参照〕などが、アルツハイマー病を対象として、例えばコオウレン属植物、バシクルモン属植物、ニチニチソウ、アヤメ属植物など特定の植物およびその抽出液〔特許文献３参照〕、ミリセチン、モリン、カテキン、エピカテキンなどのポリフェノール類〔特許文献４参照〕などが、また、アルツハイマー病を含むアミロイドーシスを対象として、グルコース・ペンタスルフェートのようなアニオン置換基を含有する糖〔特許文献５参照〕、アミロイドーシスを含む疾病を対象として、熱ショック蛋白質を誘導するゲラニルゲラニオール〔特許文献６参照〕、コンフォメーション病を対象として、例えば特定のアミノ酸配列を有する蛋白質〔特許文献７参照〕、神経保護作用を有する神経ペプチド〔特許文献８参照〕、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド、血管作動性腸管ペプチドなど血流促進、血圧低下作用をもつ生理活性ペプチド〔特許文献９参照〕などが提案されている。【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１９２４１５号公報
【特許文献２】特開２００４−０９９５５３号公報
【特許文献３】特開２００５−３５０３９１号公報
【特許文献４】特開２００５−１０４８５０号公報
【特許文献５】特表２００１−５１３５６９号公報
【特許文献６】特開２００１−１７２１７１号公報
【特許文献７】特開２００１−２７５６８７号公報
【特許文献８】国際公開２００３／０５１３８７号パンフレット
【特許文献９】国際公開２００４／０４８４０１号パンフレット
【非特許文献１】Ｒｏｂｉｎ  Ｗ  Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ａ  Ｌｏｍａｓ，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，１９９７年、３５０号、１３４−１３８頁
【非特許文献２】石原得博（監修）、池田修一（編集）、「アミロイドーシスの基礎と臨床」２００５年３月金原出版（株）発行、第８頁〜１３頁
【非特許文献３】岩坪威、細胞工学、２００１年、２０巻１１号、１４７４−１４７７頁
【非特許文献４】Ｊａｒｒｅｔｔ  ＪＴ，Ｌａｎｓｂｕｒｙ  ＰＴ  Ｊｒ，Ｃｅｌｌ，１９９３年、７３巻、１０５５−１０５８頁
【非特許文献５】Ｇｅｒｖａｉｓ  Ｆ，  Ｍｏｒｉｓｓｅｔｔｅ  Ｃ，  Ｋｏｎｇ  Ｘ，  Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．−Ｉｍｍｕｎ．，Ｅｎｄｏｃ．＆  Ｍｅｔａｂ．Ａｇｅｎｔｓ，２００３年、３巻、３６１−３７０頁
【非特許文献６】Ｗａｔｓｏｎ  ＪＤ，Ｌａｎｄｅｒ  ＤＡ，  Ｓｅｌｋｏｅ  ＪＤ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年、５０巻、３１６１７−３１６２４頁
【非特許文献７】Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ  Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９５年、１巻、１４３−１４８頁
【非特許文献８】Ｚｈｕ  Ｈ，Ｙｕ  Ｊ，Ｋｉｎｄｙ  ＭＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１年、７巻、５１７−５２２頁
【非特許文献９】堂浦克美、ファルマシア、２００２年、７巻、６３５−６３９頁
【発明の開示】
【０００６】
かかる状況を鑑み、本発明の目的は、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシスに代表されるコンフォメーション病に対して予防、治療効果を示す医薬品を提供することにある。
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明のコンフォメーション病医薬組成物は、一般式（１）〔式中、少なくとも１つのＲはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＯＭから選ばれ、他のＲはＨであり、ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａから選ばれる。〕で表される構造単位を有するセルロースエーテル、前記セルロースエーテルのアルカリ金属塩、前記セルロースエーテルの脂肪族酸エステル、およびこれらの混合物から選ばれる一種以上のセルロースエーテル類を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００８】
2007123187.tif 000003
【０００９】
このような、コンフォメーション病医薬組成物において、セルロースエーテル類が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびメチルセルロースから選ばれる一種以上であることが好ましく、また、医薬組成物がヒトを含む哺乳動物に投与可能に製剤化されたものであることが好適であり、特に、医薬組成物が、注射剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、酒精剤、エリキシル剤、リモナーデ剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、チンキ剤、ローション剤、リニメント剤、エアゾール剤、坐剤から選ばれた剤型に製剤化されたものであることが好ましい。そして、以上のような医薬組成物は、コンフォメーション病予防薬、又はコンフォメーション病治療薬であることが好適であり、また、コンフォメーション病が、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、致死性家族性不眠症（Ｆａｔａｌ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｉｎｓｏｍｎｉａ）、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ；ＢＳＥ）、ヒツジにおけるスクレイピー（ｓｃｒａｐｉｅ）、シカにおける慢性消耗性疾患のいずれかのプリオン病であることが好ましく、また、コンフォメーション病がアルツハイマー病であることが好適であり、さらには、コンフォメーション病が、アミロイドーシスであることが好ましい。
【００１０】
本発明によるセルロースエーテル類は、プリオン病、アルツハイマー病、アミロイドーシス等の代表的なコンフォメーション病において、徐放性の顕著な治療、予防効果を発揮するものであり、かつこれらの化合物は、工業的には広く使用され、また食料品の添加物や医薬品の製剤成分としても日常的に使われており、安全性が高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】プリオン病の原因蛋白質であるプリオンに対するＨＰＭＣのプリオン形成抑制効果についてインビトロ評価を行った結果を示すウェスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である（実施例１）。
【図２】ＨＰＭＣの投与時期と、プリオン病に対する治療効果の関連をインビボで検討した結果を示すグラフである（実施例２）。
【図３】ＨＰＭＣの投与回数と、プリオン病に対する治療効果の関連をインビボで検討した結果を示すグラフである（実施例３）。
【図４】ＨＰＭＣの投与量と、プリオン病に対する治療効果の関連をインビボで検討した結果を示すグラフである（実施例４）。
【図５】感染前のＨＰＭＣ単回投与によるプリオン病に対する治療予防効果をインビボで検討した結果の一例を示すグラフである（実施例５）。
【図６】感染前の各種セルロースエーテル類単回投与によるプリオン病に対する治療予防効果をインビボで検討した結果を示すグラフである（実施例６）。
【図７】感染前のＨＰＭＣ複数回投与によるプリオン病に対する治療予防効果に加乗効果がみられるかどうかをインビボで検討した結果のグラフである（実施例７）。
【図８】各種セルロースエーテル類について、プリオン病に対する治療効果をインビボで比較検討した結果を示すグラフである（実施例８）。
【図９】ＨＰＭＣの末梢静脈内投与におけるプリオン病に対する治療効果を検討した結果を示すグラフである（実施例９）。
【図１０】ＨＰＭＣを脳室内に直接投与してプリオン病に対する治療効果を検討した結果を示すグラフである（実施例１０）。
【図１１】図１０とは別のＨＰＭＣ、あるいはペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）を脳室内に直接投与してプリオン病に対する治療効果を検討した結果を示すグラフである（実施例１１）。
【図１２】ＨＰＭＣを皮下投与と腹腔内投与の組み合わせで同時に投与した際のプリオン病に対する治療効果について検討した結果を示すグラフである（実施例１２）。
【図１３】ＨＰＭＣを皮下投与と脳室内投与の組み合わせで同時に投与した際のプリオン病に対する治療効果について検討した結果を示すグラフである（実施例１３）。
【図１４】末梢からのプリオン感染に対しての、ＨＰＭＣのプリオン病の予防効果を検討した結果の一例を示すグラフである（実施例１４）。
【図１５】シリアンハムスターに対してのＨＰＭＣ投与量と、プリオン病に対する治療効果の関連を検討した結果を示すグラフである（実施例１５）。
【図１６】シリアンハムスターに対してのＨＰＭＣ投与時期と、プリオン病に対する治療効果の関連を検討した結果を示すグラフである（実施例１５）。
【図１７】ＲＭＬ株（マウスで継代されているスクレイピーのプリオン株）に対するセルロースエーテル類のプリオン病に対する治療効果をインビボで検討した結果を示すグラフである（実施例１６）。
【図１８】福岡１株（マウスで継代されているヒトのプリオン病のプリオン株）に対するセルロースエーテル類のプリオン病に対する治療効果を検討した結果を示すグラフである（実施例１７）。
【図１９】マウスで継代されている別のスクレイピーのプリオン株である２２Ｌ株に対してのセルロースエーテル類のプリオン病に対する治療効果を検討した結果を示すグラフである（実施例１８）。
【図２０】セルロースエーテル類におけるメトキシル基とヒドロキシプロポキシル基の含量、およびセルロースエーテル類分子量についてのプリオン病に対する治療効果を検討した結果を示すグラフである（実施例１９）。
【図２１】セルロースエーテル類分子量のプリオン病に対する治療効果に及ぼす影響についてさらに詳細に検討した結果を示すグラフである（実施例２０）。
【図２２】低分子量である６糖セルロースエーテル類のプリオン病に対する治療効果を調べた結果を示すグラフである（実施例２１）。
【図２３】加水分解により低分子化したＨＰＭＣのプリオン病に対する治療効果への影響を検討した結果を示すグラフである（実施例２２）。
【図２４】セルロースエーテル類と近似するその他化合物について、プリオン病に対する治療効果を検討した結果を示すグラフである（実施例２３）。
【図２５】マウスの脳における海馬近傍を説明する断面図である（実施例２４）。
【図２６】海馬近傍での異常プリオン蛋白の蓄積を示す弱拡大顕微鏡写真である（実施例２４）。
【図２７】図２６のうち海馬と大脳皮質に挟まれた白質領域の強拡大顕微鏡写真である（実施例２４）。
【図２８】図２６で観察したのと同じ部位のＧＦＡＰ免疫染色の顕微鏡写真である（実施例２４）。
【図２９】図２８のうち海馬の錐体細胞層を含む視野の強拡大顕微鏡写真である（実施例２４）。
【図３０】マウスの脳における下丘を説明する断面図である（実施例２４）。
【図３１】下丘の異常プリオン蛋白の蓄積を示す弱拡大顕微鏡写真である（実施例２４）。
【図３２】下丘の異常プリオン蛋白の蓄積を示す強拡大顕微鏡写真である（実施例２４）。
【図３３】図３１で観察したのと同じ部位のＧＦＡＰ免疫染色の強拡大顕微鏡写真である（実施例２４）。
【図３４】ＨＰＭＣを皮下投与して血管内（血清）の抗プリオン活性を測定した結果の一例を示すウェスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である（実施例２５）。
【図３５】血清中の抗プリオン活性因子（アルブミンを除去していない）について温度に対する感受性を検討した結果を示すウェスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である（実施例２６）。
【図３６】血清中の抗プリオン活性因子（アルブミン除去）について温度に対する感受性を検討した結果を示すウェスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である（実施例２６）。
【図３７】限外濾過膜を用いてＨＰＭＣ投与ハムスター血清中の抗プリオン活性因子の分子サイズを推定した結果の一例を示すウェスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である（実施例２７）。
【図３８】ＨＰＭＣ投与ハムスター血清中の抗プリオン活性因子について分解酵素処理に対する感受性を検討した結果の一例を示すウェスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である（実施例２８）。
【図３９】標識化ＨＰＭＣをマウス尾静脈内に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例２９）。
【図４０】標識化ＨＰＭＣをマウス尾静脈内に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例２９）。
【図４１】標識化ＨＰＭＣをマウス尾静脈内に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例２９）。
【図４２】標識化ＨＰＭＣをマウス尾静脈内に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例２９）。
【図４３】標識化ＨＰＭＣをマウス尾静脈内に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例２９）。
【図４４】標識化ＨＰＭＣをマウス尾静脈内に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例２９）。
【図４５】標識化ＨＰＭＣをマウス背部皮下に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例３０）。
【図４６】標識化ＨＰＭＣをマウス背部皮下に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例３０）。
【図４７】標識化ＨＰＭＣをマウス背部皮下に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例３０）。
【図４８】標識化ＨＰＭＣをマウス背部皮下に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例３０）。
【図４９】標識化ＨＰＭＣをマウス背部皮下に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例３０）。
【図５０】標識化ＨＰＭＣをマウス背部皮下に単回投与後における、各組織内放射能濃度の経時的変化を示すグラフである（実施例３０）。
【図５１】標識化ＨＰＭＣをマウス尾静脈内に単回投与後における、右側矢状断面（ｒｉｇｈｔ  ａｘｉｓ  ａｓｐｅｃｔ）凍結乾燥切片（上段）の各組織内放射能濃度を示すラジオルミノグラム（下段）である（実施例３１）。
【図５２】標識化ＨＰＭＣをマウス尾静脈内に単回投与後における、正中矢状断面（ｃｅｎｔｒａｌ  ａｘｉｓ  ａｓｐｅｃｔ）凍結乾燥切片（上段）の各組織内放射能濃度を示すラジオルミノグラム（下段）である（実施例３１）。
【図５３】標識化ＨＰＭＣをマウス尾静脈内に単回投与後における、左側矢状断面（ｌｅｆｔ  ａｘｉｓ  ａｓｐｅｃｔ）凍結乾燥切片（上段）の各組織内放射能濃度を示すラジオルミノグラム（下段）である（実施例３１）。
【図５４】セルロースエーテル類（ＨＰＣＬ）のＡβ蛋白凝集阻害活性の検討結果を示すグラフである（実施例３２）。
【図５５】セルロースエーテル類（ＭＣ）のＡβ蛋白凝集阻害活性の検討結果を示すグラフである（実施例３２）。
【図５６】セルロースエーテル類（ＨＰＭＣ）のＡβ蛋白凝集阻害活性の検討結果を示すグラフである（実施例３２）。
【図５７】セルロースエーテル類（０．３％塩酸加水分解ＨＰＭＣ）のＡβ蛋白凝集阻害活性の検討結果の一例を示すグラフである（実施例３２）。
【図５８】セルロースエーテル類（４０％塩酸加水分解ＨＰＭＣ）のＡβ蛋白凝集阻害活性の検討結果を示すグラフである（実施例３２）。
【図５９】セルロースエーテル類〔ＨＰＣＬ〕の凝集Ａβに対する神経細胞保護効果の検討結果を示すグラフである（実施例３３）。
【図６０】セルロースエーテル類〔ＭＣ（ＳＭ−４）〕の凝集Ａβに対する神経細胞保護効果の検討結果を示すグラフである（実施例３３）。
【図６１】セルロースエーテル類〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕の凝集Ａβに対する神経細胞保護効果の検討結果を示すグラフである（実施例３３）。
【図６２】セルロースエーテル類〔０．３％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ〕の凝集Ａβに対する神経細胞保護効果の検討結果を示すグラフである（実施例３３）。
【図６３】セルロースエーテル類〔４０％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ〕の凝集Ａβに対する神経細胞保護効果の検討結果を示すグラフである（実施例３３）。
【図６４】アルツハイマー病疾患マウスに対するセルロースエーテル類の治療効果を検討するブロウイング試験の結果である（実施例３４）。
【図６５】アルツハイマー病疾患マウスに対するセルロースエーテル類の治療効果を検討するブドウ糖液消費試験の結果である（実施例３４）。
【図６６】ＡＡアミロイドを末梢緒臓器に蓄積する動物疾患モデルを用いて、ＨＰＭＣのアミロイドーシスに対する発病抑制効果を検討した結果であり、肝臓のＨＥ染色標本の図面代用写真である（実施例３５）。
【図６７】図６６と同じく動物疾患モデルを用いて、ＨＰＭＣのアミロイドーシスに対する発病抑制効果を検討した結果であり、肝臓のコンゴー赤染色標本の図面代用写真である（実施例３５）。
【図６８】同じく動物疾患モデルを用いて、ＨＰＭＣのアミロイドーシスに対する発病抑制効果を検討した結果であり、肝臓の抗ＳＡＡ抗体による免疫染色標本の図面代用写真である（実施例３５）。
【図６９】同じく動物疾患モデルを用いて、ＨＰＭＣのアミロイドーシスに対する発病抑制効果を検討した結果であり、脾臓のＨＥ染色標本の図面代用写真である（実施例３５）。
【図７０】同じく動物疾患モデルを用いて、ＨＰＭＣのアミロイドーシスに対する発病抑制効果を検討した結果であり、脾臓のコンゴー赤染色標本の図面代用写真である（実施例３５）。
【図７１】同じく動物疾患モデルを用いて、ＨＰＭＣのアミロイドーシスに対する発病抑制効果を検討した結果であり、脾臓の抗ＳＡＡ抗体による免疫染色標本の図面代用写真である（実施例３５）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明においてコンフォメーション病は、特定の宿主蛋白質のコンフォメーション（立体構造）に変化が生じて細胞や組織に蓄積してもたらされるプリオン病、アルツハイマー病や、ＡＡアミロイドーシスに代表されるアミロイドーシス疾患群の全般を包括している。さらに詳しくは、プリオン病は、プリオン蛋白質に起因すると考えられる疾患群であり、クロイツフェルト−ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＪＤ）、牛海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ；ＢＳＥ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症、クールー（Ｋｕｒｕ）、羊スクレイピー（ｓｃｒａｐｉｅ）、伝達性ミンク脳症（ＴＭＥ）、シカ慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）などがある。このようなプリオン病に罹患する可能性のある哺乳動物として、ヒト以外には例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコなどが挙げられる。【００１３】
アミロイドーシスは、アミロイド線維が緒臓器の細胞外に沈着することにより機能障害を引き起こすと考えられる疾患であり、全身性アミロイドーシス〔免疫グロブリン性アミロイドーシス、反応性ＡＡアミロイドーシス、家族性アミロイドーシス、透析（Ａβ２Ｍ）アミロイドーシス、老人性アミロイドーシスなど〕、限局性アミロイドーシス〔脳アミロイドーシス、内分泌アミロイドーシス、皮膚アミロイドーシス、角膜アミロイドーシス、限局性結節性アミロイドーシスなど〕の病型がある。その他、アミロイド類似の繊維状蛋白質の凝集からなる細胞内異常構造物（インクルージョン・ボディ）に起因すると考えられる疾患群があり、アルツハイマー病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、ハンチントン病、前頭側頭葉型痴呆、筋萎縮性側索硬化症などがある（非特許文献２および３）。【００１４】
本発明のコンフォメーション病治療薬は、式（１）で表される構造単位を有するセルロースエーテル類、このセルロースエーテル類のアルカリ金属塩、このセルロースエーテル類の脂肪族酸エステル、およびこれらの混合物を有効成分として含有している。式１において、少なくとも１つのＲはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＯＭから選ばれ、他のＲはＨである。また、ＣＨ２ＣＯＯＭにおけるＭは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａから選ばれる。【００１５】
2007123187.tif 000004
【００１６】
式（１）で表される構造単位を有するセルロースエーテル類を具体的に挙げれば、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、メチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロースである。このうち、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースは特に顕著な効果を示しており、好ましい選択である。【００１７】
セルロースエーテル類のアルカリ金属塩は、上記のセルロースエーテル類における水酸基（ＯＨ基）がアルカリ金属塩となったものであり、具体的にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩が挙げられる。アルカリ金属は、塩一種単独でもよく、二種以上の混合であってもよい。【００１８】
セルロースエーテル類の脂肪族酸エステルは、上記のセルロースエーテル類における水酸基（ＯＨ基）が脂肪族酸によりエステル化されたものであり、脂肪族酸は好ましくは炭素数が１８以下の脂肪酸であり具体的には酢酸、プロピオン酸、コハク酸、オレイン酸、ステアリン酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸が挙げられる。脂肪酸は、一種単独でもよく、二種以上の混合であってもよい。【００１９】
また、セルロースエーテル類は、鉱酸、アルカリ金属水酸化物、酵素による分解物であってもよい。ここで分解物は、水中において分解処理されたそのまま、さらにｐＨ調製された分解処理液、分解処理液よりの分画処理液、分解処理液または分画処理液から単離された固形分などいずれの形体でもよい。ここで、鉱酸は代表的には塩酸、硫酸であり、アルカリ金属水酸化物は代表的には水酸化ナトリウム、水酸化カリウムであり、酵素は代表的にはエンド型又はエキソ型のセルラーゼである。【００２０】
本発明の医薬組成物とするには、セルロースエーテル類を有効成分として含有するものであり、セルロースエーテル類は一種単独でもよく、または二種以上の混合であってもよい。【００２１】
医薬組成物は式（１）で示されるセルロースエーテル類を有効成分として含むが、本発明の効果が損なわれない範囲でこれ以外の成分を配合、または同時に投与されてもよい。また、本発明の医薬組成物は製剤学的に許容される如何なる剤型に製剤化し、薬学的に許容される如何なる投与経路によっても投与可能である。製剤化する剤型としては、例えば、注射剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、酒精剤、エリキシル剤、リモナーデ剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、チンキ剤、ローション剤、リニメント剤、エアゾール剤、坐剤などを挙げることができる。有効成分として用いるセルロースエーテル類の種類によっては消化管を介しての吸収率が低いことがあり、この場合には錠剤、散剤、顆粒剤、内用の液剤、シロップ剤、リモナーデ剤、エリキシル剤、懸濁剤や乳剤、及びこれらいずれかを充填したカプセル剤などの経口剤以外の非経口用に製剤化して経口以外の投与経路により投与することが好ましい。また、本発明の医薬組成物は、消化管と同様に皮膚、口腔、咽頭、鼻や肺等の粘膜などを介しての吸収率も概して高くないことが多く、この場合には液剤、チンキ、ローション剤、軟膏剤、硬膏剤などの外用塗布用剤、リニメント剤、パップ剤、エアゾール剤、坐剤などの経皮、経粘膜以外の投与経路により投与することが好ましい。以上のように有効成分として含有させるセルロースエーテル類が消化管、皮膚や粘膜を介して吸収され難い場合には、本発明のコンフォメーション病医薬組成物は水性溶剤又は非水溶剤の溶液状、懸濁液状、乳濁液状の注射剤、或いは用時溶解用の注射剤として、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、鞘内、髄腔内、脳室内、皮内などに注射投与、或いは輸液として又は輸液とともに静脈内に点滴投与することが好ましく、また、浸透圧ポンプなどを用いて持続的に注射投与したり、体内埋入徐放型に製剤化して皮下投与することもできる。本発明のコンフォメーション病医薬組成物には、製剤化する剤型に応じて本発明の効果が損なわれない範囲で安定化剤、緩衝剤、保存剤、賦形剤などの添加剤を加えることができる。例えば注射剤の場合には、安定化剤として、クエン酸塩や酢酸塩などのｐＨ調整緩衝剤、ピロ亜硫酸ナトリウム、アセトン、アスコルビン酸などの抗酸化剤、皮下、筋肉内用では無痛化剤として、ベンジルアルコールやフェノール、塩酸プロカイン、ブドウ糖などから適宜選定して添加することができ、用時溶解用とする場合にはエタノールやプロピレングリコールなどの溶解補助剤、賦形剤を添加しても良い。【００２２】
セルロースエーテル類の体内への投与量は、コンフォメーション病の種類、投与対象の動物種、投与経路、予防目的か治療目的か、症状などにより異なり一律に限定されず、使用するセルロースエーテル類の種類、投与頻度（間隔）や各耐容量に応じて適宜設定することができる。本発明の医薬組成物は、コンフォメーション病の原因に暴露される前、又は兆候が現れる前に予防薬として投与されれば、コンフォメーション病の発病を抑えることができ、コンフォメーション病の原因に暴露された後又は発病後に投与開始した場合にも、治療薬としてコンフォメーション病の発症を抑えたり発症後の進行を遅らせることができる。
【実施例１】
【００２３】
代表的なコンフォメーション病の一つであるプリオン病において、その原因蛋白質であるプリオン（異常型プリオン蛋白）に対するヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）の効果についてインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）評価を行った。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ−ＴＣ５ＲＷ）；信越化学工業（株）製、「ＴＣ−５ＲＷ」（商品名）（メトキシル基含量２９．２重量％、ヒドロキシプロポキシル基含量８．９重量％、２０℃における２重量％水溶液の粘度５．８１ｍｍ２／ｓ、１重量％水溶液のｐＨ６．８）を用いた。【００２４】
〔評価方法〕
プリオン持続感染細胞を用いるイシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）、ドウウラ（Ｄｏｈ−ｕｒａ）らの検定評価法〔Ｋ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．Ｄｏｈ−ｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年、８５巻、１７８５−１７９０頁〕に準じ、抗プリオン効果のインビトロ評価を行った。ここでは神経芽細胞種細胞Ｎ２ａに、スクレイピープリオンであるＲＭＬ株を持続感染させたＳｃＮ２ａ細胞を用い、これを６穴の培養用シャーレにコンフルエントの１０％に相当する細胞数をまき、培養液中のＨＰＭＣ濃度が０．１、または１ｍｇ／ｍＬとなるようにＨＰＭＣ水溶液を加えた。対照（０ｍｇ／ｍＬ）として滅菌蒸留水を培養液に加えた。細胞培養条件としては、終濃度１０％の胎児ウシ血清を加えたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を培養液として用いて、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃に調整した炭酸ガスインキュベータ内に培養用シャーレを３日間静置することにより行なった。コンフルエントとなった細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、細胞溶解バッファー［０．５％ポリオキシエチレン−ｐ−オクチルフェノール（和光純薬工業（株）、「ＮＰ−４０」（商品名）を使用した）及び０．５％デオキシコール酸ナトリウム添加ＰＢＳ］で細胞を溶解し、溶解液を軽遠心（５，０００×ｇ、５分間）して得られた上清にプロテイナーゼＫ（ＰＫ）（メルク社製）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように加え３７℃で３０分反応（蛋白質分解）させた後、フェニルメタンスルホニルフロライド（ＰＭＳＦ）を終濃度１ｍＭとなるように加えて反応をとめた。その後、超遠心（１００，０００×ｇ、４℃、３０分間）して異常型プリオン蛋白を沈査として回収し、ウエスタンブロット法にてプリオン蛋白を解析した。ウェスタンブロット法の条件としては、１５％トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、電気泳動した蛋白質をナイロンメンブラン（ミリポア社製、ＰＶＤＦメンブレイン）にブロッティングし、プリオン蛋白に対するマウスモノクローナル抗体（ＳＰＩ−ＢＩＯ  社製、ＳＡＦ８３  （５，０００倍希釈））、及びアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（プロメガ社製（２０，０００倍希釈）、化学発光検出試薬（アマーシャム社製、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）を使用してプリオン蛋白の検出を行った。【００２５】
〔結果〕
結果を図１に示す。この結果から、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）は濃度依存的にプリオン持続感染細胞中の異常型プリオン蛋白（すなわちプリオン）の形成を阻害していることがわかる。
【実施例２】
【００２６】
投与時期とプリオン病に対する治療効果の関連をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で検討した。
〔評価方法〕
ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を用いて、Ｔｇ７マウス（ハムスター型プリオン蛋白を過剰発現した遺伝子改変マウス）と２６３Ｋ（ハムスターで継代されているスクレイピーのプリオン株）脳ホモジネートを用いるドウウラ（Ｄｏｈ−ｕｒａ）らの検定評価法〔Ｋａｔｓｕｍｉ  Ｄｏｈ−ｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年、７８巻、４９９９−５００６頁〕に準じ、抗プリオン効果のインビボ評価を行った。ここでは、生理食塩水で１％（Ｗ／Ｖ）濃度とした２６３Ｋ脳ホモジネートの２０μＬをマウスの脳内に接種し、プリオンに感染させた。接種後１４日、２１日、２８日、３５日経過後それぞれについてマウスの背部皮下にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）７５ｍｇを投与した。投与方法としては、粉末状のＨＰＭＣをオブラート（旭光社製、三角型フクロ（商品名））１包に包み、皮下に埋入することにより行なった。
１４日経過後に投与を開始した群では一週毎に計４回、２１日経過後に投与を開始した群では一週毎に計３回、２８日経過後に投与を開始した群では一週後の計２回、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）７５ｍｇを皮下に投与した。対照はＨＰＭＣ非投与群（オブラートのみ投与）である。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹（体重２０〜２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びターキイ−クレイマー法（Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法）による多重比較検定で解析した。【００２７】
〔結果〕
結果を図２に示す。
プリオン脳内感染から１４日経過後にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）の投与を開始した群の潜伏期間は８３．３±１４．５日であり、２１日経過後に投与を開始した群では７２．０±７．０日、２８日日経過後に投与を開始した群では６５．３±６．３日、３５日経過後に投与を開始した群では６３．２±６．２日であり、対照群の４７．６±２．７日よりＨＰＭＣ投与により有意（いずれもｐ＜０．０１）な潜伏期間延長が見られた。さらに、１４日目投与開始群は２８日目投与開始群や３５日目投与開始群に比して有意（ともにｐ＜０．０５）に潜伏期間が長く、脳内感染後の投与時期が早いほどプリオン病に対する治療効果は優れていた。
【実施例３】
【００２８】
投与回数とプリオン病に対する治療効果の関連をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で検討した。
〔評価方法〕
ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を、単回の皮下投与と複数回の皮下投与の比較を行った。
実施例２と同様の実験を行い、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）１００ｍｇを脳内感染から１週間経過後に皮下に１回投与した群（単回）と、脳内感染から１週間経過後、２週間経過後、３週間経過後の３回投与した群とで比較を行った。同様にして、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）１００ｍｇを脳内感染から３週間経過後に皮下に１回投与した群（単回）と、脳内感染から３週間経過後、４週間経過後、５週間経過後の３回投与した群での比較も行った。なお対照群としてＨＰＭＣ非投与群（オブラートのみ投与）を準備した。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹（体重２０〜２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータは、実施例２と同様に解析した。【００２９】
〔結果〕
結果を図３に示す。
脳内感染から１週間経過後にＨＰＭＣを単回投与した群の潜伏期間は８６．０±４．４日で、脳内感染から１週間経過後より１週毎に３回投与した群の潜伏期間は９７．８±５．６日であり、複数回投与で有意（ｐ＜０．０１）な潜伏期間延長が見られ、その差は約１２日であった。しかし、脳内感染から３週間経過後にＨＰＭＣを単回投与した群の潜伏期間８４．２±１０．４日と、脳内感染から３週間経過後より１週毎に３回投与した群の潜伏期間８５．２±６．９日では、有意差はみられなかった。従って、感染早期からの投与では複数回投与は有効であるものの、その効果は大きくはなかった。
【実施例４】
【００３０】
投与量とプリオン病に対する治療効果の関係をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で検討した。
〔評価方法〕
実施例２と同様の実験を行い、脳内感染から５日経過後にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）１５、２５、５０、１００、１５０、２００ｍｇのそれぞれを背部皮下に単回投与した。なお対照群としてＨＰＭＣ非投与群（オブラートのみ投与）を準備した。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹（体重２０〜２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータは、実施例２と同様に解析した。【００３１】
〔結果〕
結果を図４に示す。
ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）は１００ｍｇまでは用量依存的に潜伏期間の延長が見られ、１００ｍｇ投与では潜伏期間９３．０±１２．５日、１５０ｍｇ投与では１１７±１８．６日、２００ｍｇ投与では１１０．７±３０．９日で有意差が認められず、１００ｍｇの投与でほぼ飽和状態となった。なお、２００ｍｇ投与群では２匹がこの量のＨＰＭＣ投与に耐えられずに投与２日目に死亡した。
【実施例５】
【００３２】
実施例３の実験より、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）は単回投与でも長期間にわたりプリオン病に対する治療効果を発揮することが推定されたため、感染以前の単回投与でも発症を予防する効果があるかどうかをインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で検討した。
〔評価方法〕
実施例２と同様の実験を行い、脳内感染の７４日前、同１８日前、同９日前、脳内感染時、および脳内感染から２２日経過後のそれぞれのマウス群にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）７５ｍｇを背部皮下に単回投与した。なお対照群としてＨＰＭＣ非投与群を準備した。マウスは８週齢以上で、各群内で雄雌を各３匹（体重２０〜２５ｇ）使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００３３】
〔結果〕
結果を図５に示す。
対照群であるＨＰＭＣ非投与では潜伏期間が４５．３±１．９日であり、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を脳内感染前７４日に投与した群では潜伏期間が７６．７±９．７日、同１８日に投与した群では８０．８±８．３日、同９日に投与した群では８６．８±６．２日、脳内感染時の投与では８５．３±８．９日、脳内感染から２２日経過後では７５．１±７．８日であり、対照群とは有意（いずれもｐ＜０．０１）に潜伏期間の延長がみられた。特筆すべきデータとして、脳内感染７４日前、同１８日前、同９日前、脳内感染時のそれぞれの群の間ではプリオン病に対する治療予防効果に有意差が認められなかった。脳内感染以前（実施例５の実験では２ヶ月以上前であっても）の単回投与で、脳内感染時に投与した場合と同等のプリオン病に対する治療予防効果が見られたことより、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）は極めて優れた予防的効果を発揮することが明らかとなった。
【実施例６】
【００３４】
実施例５より、感染の２．５ヶ月前にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を単回投与しても、発症を遅らせる効果があったため、その他各種セルロースエーテル類を含めてさらにそれより以前の単回投与の効果をインビボで検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）〕；信越化学工業（株）製、「６０ＳＨ−５０」（商品名）（メトキシル基含量２８．８％、ヒドロキシプロポキシル基含量８．９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度５０．４ｍｍ２／ｓ（ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）の約９倍の分子量）、１重量％水溶液のｐＨ６．３、）を使用した。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）〕；信越化学工業（株）製、「６０ＳＨ−４０００」（商品名）（メトキシル基含量２９．４％、ヒドロキシプロポキシル基含量８．９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度３８６０ｍｍ２／ｓ（ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）の約７００倍の分子量）、１重量％水溶液のｐＨ６．７）を使用した。
〔評価方法〕
実施例２と同様の実験を行い、脳内感染の６．５ヶ月前にマウスに各種セルロースエーテル類１００ｍｇを背部皮下に単回投与した。なお対照群としてＨＰＭＣ非投与群を準備した。マウスは８週齢以上で、各群内で雄雌を各７匹（体重２０〜２５ｇ）使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００３５】
〔結果〕
結果を図６に示す。
対照であるＨＰＭＣ非投与群では脳内感染から６７日以内に全例が発症死亡したのに対して、脳内感染後１０２日を経過してＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与群およびＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）投与群では約４割が生存しており、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）投与群では９割以上が発症死亡を逃れている。対照群に比較してセルロースエーテル類投与群では有意（いずれもｐ＜０．０１）な潜伏期間の延長がみられた。特にＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）投与は、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与やＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）投与よりも有意（Ｐ＜０．０１）に発症遅延効果が高かった。以上の結果よりＨＰＭＣ、特にＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）は半年以上前の投与であっても極めて優れた予防効果を発揮することが明らかとなった。
【実施例７】
【００３６】
実施例５および実施例６より、感染前の単回投与でプリオン病に対する予防的効果がセルロースエーテル類に認められたため、感染前の複数回投与に加乗効果がみられるかどうかをインビボで検討した。
〔評価方法〕
実施例２と同様の実験を行い、脳内感染の１週間前、５週間前、あるいは１週間前および５週間前にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）の２５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＢＳ溶液をマウス腹腔内に０．６ｍＬあるいは１．２ｍＬ投与した。なお対照群として脳内感染１週間前に腹腔内にＰＢＳ１．２ｍＬを投与した。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹（体重２０〜２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００３７】
〔結果〕
結果を図７に示す。
脳内感染の１週間前と５週間前に２回投与を行っても、１週間前あるいは５週間前に２回分の投与量を１回投与したものと発症遅延効果に差がなく、複数回投与による加乗効果は見られなかった。このことは抗体を介する獲得免疫のような生体防御機構が作用機序に関与しているとは考え難いことを示している。
【実施例８】
【００３８】
各種セルロースエーテル類について、プリオン病に対する治療効果をインビボ（腹腔内投与）で比較検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）〕；信越化学工業（株）製、「ＴＣ−５ＥＷ」（商品名）（メトキシル基含量２８．９％、ヒドロキシプロポキシル基含量９．０％、２０℃における２重量％水溶液の粘度２．９ｍｍ２／ｓ（ＴＣ−５ＲＷの約２分の１の分子量）、１重量％水溶液のｐＨ６．８）を用いた。
・メチルセルロース〔ＭＣ（ＳＭ−４）〕；信越化学工業（株）製、「ＳＭ−４」（商品名）（メトキシル基含量２９．５％、２０℃における２重量％水溶液の粘度３．９３ｍｍ２／ｓ、１重量％水溶液のｐＨ６．９）を用いた。
・ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣＬ）；日本曹達（株）製、「ＨＰＣ−ＳＳＬ」（商品名）（ヒドロキシプロポキシル基含量６２．４％、２０℃における２重量％水溶液の粘度２．７ｍｍ２／ｓ、１重量％水溶液のｐＨ５．５）を用いた。【００３９】
〔評価方法〕
実施例２と同様の実験を行い、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）、ＭＣ、ＨＰＣＬのそれぞれを２５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＢＳ溶液とし、脳内感染から５日経過後のマウス腹腔内に１ｍＬ単回投与した。なお対照群として同様に腹腔内にＰＢＳ１ｍＬを単回投与した。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹（体重２０〜２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００４０】
〔結果〕
結果を図８に示す。図中、［ＴＣ−５ＥＷ］、［ＴＣ−５ＲＷ］、［ＳＭ−４］、［ＨＰＣＬ］、［ＰＢＳ］は、それぞれＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、ＭＣ（ＳＭ−４）、ＨＰＣＬ、ＰＢＳを示している。  
ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）の潜伏期間が７５．４±１０．６日、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）が７４．０±５．０日、ＭＣ（ＳＭ−４）が７９．３±８．５日で、これらの群間ではプリオン病に対する治療効果に有意差はみられなかった。一方、ＨＰＣＬの潜伏期間は５６．３±３．２日であり、前の３つの群とは有意（ｐ＜０．０１）に治療効果が低かった。しかし、ＨＰＣＬ群は、対照群であるＰＢＳの潜伏期間４８．０±３．５日と比較して約８日程度の延長ではあるが、ＰＢＳとは有意（ｐ＜０．０１）な差があった。【００４１】
なお、同一実験で検討していないが、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）では、投与量が同じ（２５ｍｇ）であれば、腹腔内投与で潜伏期間が７５．４±１０．６日（対照群では４８．０±３．５日）、皮下投与で潜伏期間が７２．４±３．１日（対照群では４６．０±１．７日、図４のデータ参照）と、同程度の治療効果が観察されている。また、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）とＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）で治療効果に差がないことより、ＨＰＭＣでは分子量が２分の１程度に小さくなってもプリオン病に対する治療効果に影響しないことが判明した。さらに、メチルセルロースはＨＰＭＣと同程度の効果であり、ヒドロキシプロピルセルロースに比較して効果が高いことがわかった。
【実施例９】
【００４２】
末梢静脈内投与でのプリオン病に対する治療効果について検討した。
〔評価方法〕
実施例８と同様にして実験を行った。ただし、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）の２５ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液を、脳内感染の６時間前に尾静脈内に３００μＬ単回投与した。対照群は、同様に尾静脈内にＰＢＳを３００μＬ単回投与した。マウスは、８週齢以上の雄各６匹（体重約２５ｇ）を一群として、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。【００４３】
〔結果〕
結果を図９に示す。対照群の潜伏期間４９．８±２．６日に対し、ＨＰＭＣ投与群では６４．２±４．５日であり、ＨＰＭＣ投与群で有意な（Ｐ＜０．０１）発症遅延効果を示した。この結果は、末梢静脈内への単回投与でもＨＰＭＣが有効であることを示している。
【実施例１０】
【００４４】
プリオンが標的とする主要な臓器である脳に、ＨＰＭＣの直接投与を行い、その治療効果を検討した。
〔評価方法〕
実施例８と同様にして実験を行った。ただし、４週間連続注入が可能なアルゼット（Ａｌｚｅｔ）浸透圧ポンプ〔デュレクト社（ＤＵＲＥＣＴ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製、「Ｍｏｄｅｌ  ２００４」（型番）〕を用い、ポンプをカニューレに接続し、カニューレの先端をマウスの大脳の第３脳室に挿入してマウス脳室内に４週間連続的に注入した。浸透圧ポンプをマウス背部皮下に留置し、ここでは、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）の０．２５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ濃度の各ＰＢＳ溶液、およびＰＢＳのみ（対照群）をそれぞれ充填したポンプから、脳内感染から８日経過したマウスの脳室内に送り込み、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を１日あたり１．５μｇ、１５μｇ、１５０μｇ、および０μｇ（対照群）投与した。マウスは８週齢以上の雄各６匹（体重約２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００４５】
〔結果〕
結果を図１０に示す。
対照群の潜伏期間が５４．０±５．７日に対し、ＨＰＭＣ投与群では、１．５μｇ／日の投与で６８．６±９．７日、１５μｇ／日の投与で８０．８±４．４日、１５０μｇ／日の投与で１２８．８±１７．０日となり、有意（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１）な治療効果を示し、かつ投与濃度依存的に効果が増大した。検討した限りの投与濃度では、マウスに障害を起こさず効果の飽和状態は観察されなかったが、１５０μｇ／日投与群の治療効果は、ＨＰＭＣ皮下投与で得られた効果の飽和状態〔図４における１００ｍｇ（潜伏期間：９３．０±１２．５日）、２００ｍｇ（潜伏期間：１１０．７±３０．９日）に近いと考えられる。
【実施例１１】
【００４６】
実施例１０の結果を踏まえ、脳室内投与においてＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）と他のＨＰＭＣとの比較や、これまでに顕著な治療効果が報告されているペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）との比較を行った。
〔評価に用いたセルロースエーテル類および比較の薬剤〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロースＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４００）；信越化学工業（株）製、「６０ＳＨ−４００」（商品名）（メトキシル基含量２９．１重量％、ヒドロキシプロポキシル基含量９．０重量％、２０℃における２重量％水溶液の粘度４５０ｍｍ２／ｓ（ＴＣ−５ＲＷの約８０倍の分子量）、１重量％水溶液のｐＨ６．８）を使用した。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロースＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ６０２）；信越化学工業（株）製、「ＨＰＭＣ６０２」（商品名）（メトキシル基含量２９．１％、ヒドロキシプロポキシル基含量９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度１．６８ｍｍ２／ｓ（ＴＣ−５ＲＷの約３．５分の１の分子量）、１重量％水溶液のｐＨ６．８）を使用した。
・ペントサンポリサルフェート（ＰＰＳ）；ペントサンポリサルフェートナトリウム〔オーストラリア・バイオファーム社（Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．）製、「Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ  Ｖｅｔ」（商品名）〕を使用した。
〔評価方法〕
実施例１０と同様にして実験を行った。用いたＨＰＭＣはＨＰＭＣ類は、ＰＢＳ液で２５ｍｇ／ｍＬ濃度に調製し、ＰＰＳは、ＰＰＳナトリウム注射液から乾固してアルコール性防腐剤を除いた後にＰＢＳ液で１．２５ｍｇ／ｍＬ濃度に溶解し、それぞれポンプに充填した。０．１％（Ｗ／Ｖ）濃度の２６３Ｋ脳ホモジネートの２０μＬをマウスの脳内に接種した後、３日目より試料溶液を脳室内への投与を開始した。マウスは８週齢以上の雄各７匹（体重約２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００４７】
〔結果〕
結果を図１１に示す。
対照群の潜伏期間が６２．０±３．２日、ＰＰＳ投与群の潜伏期間は１０９．０±７．２日であった。それに対してＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ６０２）投与群が１３８．３±６．５日、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４００）投与群およびＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与群がそれ以上の潜伏期間を示し、２２４日を経過しても各々１４％、２０％が発症死亡を逃れており、ＨＰＭＣ類はＰＰＳよりも有意（それぞれｐ＜０．０１）に有効である。用いたＰＰＳの製品、調製の仕方は報告例〔Ｋａｔｓｕｍｉ  Ｄｏｈ−ｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４年、７８巻、４９９９−５００６頁〕と全く同じであり、最も治療効果が発揮されたと報告のある濃度にほぼ近い濃度を用いて比較検討した結果であり、ＨＰＭＣが極めて安全で優れた治療効果を発揮することを示している。
【実施例１２】
【００４８】
これまでの実施例でセルロースエーテル類が皮下、腹腔、静脈内、脳室内のいずれの投与経路でもプリオン病に対する治療効果を発揮することが明らかになっている。そこで、複数の投与経路から同時に投与した際の治療効果について検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・メチルセルロース〔ＭＣ（ＳＭ−４）〕；実施例８に記載。
〔評価方法〕
皮下投与は実施例２と同様に、脳室内投与は実施例８と同様にして実験を行った。ただし、１％（Ｗ／Ｖ）濃度の２６３Ｋ脳ホモジネートの２０μＬをマウスの脳内に接種した後に、ＭＣ（ＳＭ−４）の５０ｍｇ／ｍＬ水溶液を０．５ｍＬまたは１．０ｍＬ腹腔内投与、あるいは２５ｍｇまたは５０ｍｇを皮下投与した。重複投与群には、０．５ｍＬの腹腔内投与と２５ｍｇの皮下投与を行った。対照群には蒸留水０．５ｍＬの腹腔内投与とオブラートのみの皮下投与を行った。マウスは８週齢以上の雄各４匹（体重約２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００４９】
〔結果〕
結果を図１２に示す。図中の〔ｉｐ〕は腹腔内投与、〔ｓｃ〕は皮下投与を示している。２５ｍｇ腹腔内投与群、５０ｍｇ腹腔内投与群、２５ｍｇ皮下投与群、５０ｍｇ皮下投与群のそれぞれの潜伏期間は７７．５±５．８日、８３．０±３．９日、８２．４±３．１日、８９．０±３．２日であるのに対して、２５ｍｇ腹腔内投与＋２５ｍｇ皮下投与の重複投与群の潜伏期間は１２９．０±２２．６日であった。このことは、異なる投与経路からの重複投与がプリオン病に対する治療効果を顕著に高めることを示している。
【実施例１３】
【００５０】
実施例１２の異なる投与経路からの重複投与による治療効果を、さらに皮下投与と脳室内投与の組み合わせで検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
〔評価方法〕
皮下投与は実施例２と同様に、脳室内投与は実施例１０と同様に行った。０．１％（Ｗ／Ｖ）濃度の２６３Ｋ脳ホモジネートの２０μＬをマウスの脳内に接種した後、３日目にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）５０ｍｇを皮下投与あるいはＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）２５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＢＳ溶解液をポンプに充填して脳室内投与を開始した。重複投与群には、５０ｍｇを皮下投与し、同時に２５ｍｇ／ｍＬ濃度液をポンプに充填して脳室内投与を行った。対照群にはオブラートのみの皮下投与またはＰＢＳ液のみをポンプに充填して脳室内投与を行った。マウスは８週齢以上の雄各７匹（体重約２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００５１】
〔結果〕
結果を図１３に示す。図中の〔ｉｃｖ〕は脳室内投与、〔ｓｃ〕は皮下投与を示している。
５０ｍｇ皮下投与群の潜伏期間は１１１．５±１４．１日であった。２５ｍｇ／ｍＬ脳室内投与群や２５ｍｇ／ｍＬ脳室内投与＋５０ｍｇ皮下投与の重複投与群では脳内感染後２２４日を経過しても各々１４％、７１％のマウスが発症死亡を逃れている。従って、皮下と脳室内への重複投与が皮下あるいは脳室内への単一経路投与よりも明らかに発症遅延効果に優れており、皮下投与と脳室内投与の組み合わせでも重複投与が治療効果を顕著に高めることが確認された。
【実施例１４】
【００５２】
プリオン病の中でも動物のウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、スクレイピー、シカ慢性消耗性疾患や、ヒトの変異型クロイツフェルト・ヤコブ病などは末梢、特に経口、からプリオン汚染物を摂取する事により感染することが知られている。そこで、末梢からのプリオン感染に対してセルロースエーテル類の治療予防効果を検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
〔評価方法〕
実施例２と同様にＴｇ７マウスと２６３Ｋ株プリオンを用い、プリオンを腹腔内接種して末梢感染させた。生理食塩水を用い１％（Ｗ／Ｖ）濃度とした２６３Ｋ脳ホモジネートを調製し、この１００μＬをマウスの腹腔内に接種してプリオン感染させた。なお、試験は腹腔内感染直前にマウスの背部皮下にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）１００ｍｇを投与しておき、対照群はＨＰＭＣ非投与群（オブラートのみ）とした。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹（体重２０〜２５ｇ）を一群として使用し、腹腔内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。  【００５３】
〔結果〕
結果を図１４に示す。
ＨＰＭＣ非投与群（対照群）の潜伏期間が９３．０±７．４日であったのに対し、ＨＰＭＣ投与群では６１０日を過ぎてもプリオン病の発病が全く観察されなかった。ＨＰＭＣは、プリオンの標的臓器である脳に直接感染した際にも、末梢からの投与（皮下投与や末梢血管内投与や腹腔内投与）で優れた発症遅延効果を発揮したが、プリオンの末梢感染においてはその効果がより一層顕著であった。
【実施例１５】
【００５４】
動物種を変えて、シリアンハムスターに対してセルロースエーテル類のプリオン病に対する治療効果を検討した。
〔評価方法〕
スクレイピープリオン株である２６３Ｋは、ハムスターでも感染によりプリオン病を起こす。５〜６週齢の雌のシリアンハムスター（３匹／群）（日本エスエルシーより入手、体重９０ｇ前後／匹）の脳内に、生理食塩水で１％（Ｗ／Ｖ）濃度とした２６３Ｋ脳ホモジネート４０μＬを接種してプリオン感染させた。脳内感染させて８日経過後、シリアンハムスターの背部皮下にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を１５０ｍｇ、３００ｍｇ、４５０ｍｇ、６００ｍｇのそれぞれを投与した。また、脳内感染させて８日経過後、１６日経過後、５６日経過後（発病による明らかな神経症状（失調症状）の出現が既に見られる時期）にシリアンハムスターの背部皮下にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を３００ｍｇ投与した（投与方法は実施例２の場合と同様オブラートに包み皮下に埋入）。対照群としてはＨＰＭＣ非投与群（オブラートのみ）を準備した。脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定し、得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００５５】
〔結果〕
投与量に関する検討結果を図１５に、投与時期に関する検討結果を図１６に示す。
投与量との関係をみると、ＨＰＭＣ非投与群（対照群）の潜伏期間が８０．０±２．１日であるのに対し、ＨＰＭＣ投与群では１５０ｍｇ投与の群で潜伏期間が１３２．０±５．６日、３００ｍｇ投与の群で１５５．０±１２．７日、４５０ｍｇ投与の群で１５４．５±２．１日、６００ｍｇ投与の群で１５７．５±２．１日でありいずれも顕著な潜伏期間の延長がみられた（いずれもｐ＜０．０１）。３００ｍｇ以上では効果は飽和しており、１５０ｍｇの効果は３００ｍｇの効果よりも少し劣っていた（ｐ＜０．０１）。
投与時期との関係をみると、ＨＰＭＣ非投与群（対照群）の潜伏期間が８０．０±２．１日に対して、ＨＰＭＣ投与群では、脳内感染８日経過後投与で潜伏期間が１５５．０±１２．７日、１６日経過後投与で１２３．２±４．３日、５６日経過後投与で８５．０±０．３日となり、感染後の投与時期が早いほど潜伏期間が長くなった（いずれもｐ＜０．０１）。発病後（脳内感染後５６日目）の単回投与においても程度は小さいものの明らかな生命予後改善効果が観察されたことは特筆すべきことである。
以上の結果は、マウス以外の動物種でもセルロースエーテル類によるプリオン病に対する治療予防効果がみられることを示している。
【実施例１６】
【００５６】
マウスで継代されているスクレイピーのプリオン株であるＲＭＬ株に対してのセルロースエーテル類のプリオン病に対する治療効果をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）〕；実施例８に記載。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）〕；実施例６に記載。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）〕；実施例６に記載。
・メチルセルロース〔ＭＣ（ＳＭ−４）〕；実施例８に記載。
・ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣＬ）；実施例８に記載。
・カルメロースカルシウム（カルボキシメチルセルロースカルシウム）〔ＣＭＣ（ＥＣＧ−５０５）〕；五徳薬品（株）製、「ＥＣＧ−５０５」（商品名）を使用した。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート〔ＨＰＭＣＡＳ（ＡＳ−ＭＧ）〕；信越化学工業（株）製、信越ＡＱＯＡＴ「ＡＳ−ＭＧ」（商品名）（メトキシル基含量２３．３％、ヒドロキシプロポキシル基含量７．３％、アセチル基含量８．８％、サクシノイル基含量１０．９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度２．７４ｍｍ２／ｓ）を使用した。【００５７】
〔評価方法〕
生理食塩水で１％（Ｗ／Ｖ）濃度とした脳ホモジネートを調製した。このホモジネート２０μＬを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本エスエルシーより入手）の脳内にＲＭＬ株を接種してプリオンに感染させた後、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）、ＭＣ（ＳＭ−４）、ＨＰＣＬ、ＣＭＣ（ＥＣＧ−５０５）、ＨＰＭＣＡＳ（ＡＳ−ＭＧ）のそれぞれ１００ｍｇを、脳内感染直前にマウス背部皮下に単回投与した（投与方法は実施例２の場合と同様オブラートに包み皮下に埋入）。なお対照群として化合物非投与群（オブラートのみ）を準備した。マウスは８週齢以上の雌５匹（体重約２０ｇ／匹）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００５８】
〔結果〕
結果を図１７に示す。図中、［ＴＣ−５ＥＷ］、［ＴＣ−５ＲＷ］、［６０ＳＨ−５０］、［６０ＳＨ−４Ｋ］、［ＳＭ−４］、［ＨＰＣ］、［ＥＣＧ−５０５］、［ＡＳ−ＭＧ］は、それぞれＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）、ＭＣ（ＳＭ−４）、ＨＰＣＬ、ＣＭＣ（ＥＣＧ−５０５）、ＨＰＭＣＡＳ（ＡＳ−ＭＧ）を示している。
対照群の潜伏期間が１４９．３±８．５日であるのに対し、ここに用いたセルロースエーテル類では、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）が１７４．３±５．９日、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）が２０２．５±１３．４日、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）が１８９．６±４．２日、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）が１９１．０±９．９日、ＭＣ（ＳＭ−４）が１７５．７±９．８日、ＨＰＣＬが１８１．０±４．２日、ＣＭＣ（ＥＣＧ−５０５）が１６７．５±３．５日、ＨＰＭＣＡＳ（ＡＳ−ＭＧ）が１６４±０日となり、潜伏期間が長くなりプリオン病に対する治療効果を示した（いずれもｐ＜０．０１）。ただし、ＨＰＭＣＡＳ（ＡＳ−ＭＧ）では、３匹が１００ｍｇの投与量に耐えられずに投与２日以内に死亡した。【００５９】
ＨＰＭＣ間の比較では、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）の間では治療効果に有意差はみられなかったが、これらに比べてＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）はやや効果が低かった（ｐ＜０．０１）。ＭＣ（ＳＭ−４）とＨＰＣＬは、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）と同程度で有意差はなかった。ＣＭＣ（ＥＣＧ−５０５）とＨＰＭＣＡＳ（ＡＳ−ＭＧ）は、やや効果が劣る傾向にありＨＰＣＬとの間に有意差（ｐ＜０．０１）が見られたが、対照群よりも１８日あるいは１５日の潜伏期間延長があり有意な（ｐ＜０．０１）効果を示した。
この実験系では、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）の分子量が２分の１程度〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）〕になると効果が落ちることが示された。また、メチルセルロースがＨＰＣＬと同程度の効果を持ち、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）より効果が劣る点は２６３Ｋプリオン株を用いた結果とは異なる点であった。
【実施例１７】
【００６０】
マウスで継代されているヒトのプリオン病のプリオン株である福岡１株について調べた。
〔評価方法〕
生理食塩水で１％（Ｗ／Ｖ）濃度とした福岡１株脳ホモジネート２０μＬを脳内に接種してプリオンに感染させたＣ５７ＢＬ／６マウスにて、実施例１６と同様にして実験を行った。【００６１】
〔結果〕
結果を図１８に示す。
ＨＰＣＬ群の潜伏期間１８３．０±５．７日とＣＭＣ（ＥＣＧ−５０５）群の潜伏期間１６９．０±３．６日）は、対照群の潜伏期間１７１．３±１０．７日と有意差がなかったが、他のセルロースエーテル類では、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）群の潜伏期間が２０４．３±２２．５日、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）群が２１８．０±８．４日、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）群が２３５．５±７．８日、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）群が２２０．５±１４．１日、ＭＣ（ＳＭ−４）群が１９１．７±１１．０日、ＨＰＭＣＡＳ（ＡＳ−ＭＧ）群が２００±０日であり有意な治療効果を示した（ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）、ＭＣ（ＳＭ−４）はｐ＜０．０５、それ以外はｐ＜０．０１）。ただし、ＨＰＭＣＡＳ（ＡＳ−ＭＧ）では、３匹が１００ｍｇの投与量に耐えられずに投与２日以内に死亡した。【００６２】
ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）が最も治療効果が高く、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）も同程度であった。また、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）（ｐ＜０．０１）やＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）（ｐ＜０．０５）は、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）よりもやや効果が劣った。ＭＣ（ＳＭ−４）とＨＰＭＣＡＳ（ＡＳ−ＭＧ）では有意差はなく、これらはＨＰＭＣよりも効果は低かった（ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）とはｐ＜０．０１、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）とは有意差がなかった）。
以上の結果は、ＲＭＬプリオンと同様に福岡１株プリオンに対しても、ＨＰＭＣが最も有効なセルロースエーテル類であることを示している。
【実施例１８】
【００６３】
マウスで継代されている別のスクレイピーのプリオン株である２２Ｌ株に対してのセルロースエーテル類のプリオン病に対する治療効果を検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
〔評価方法〕
生理食塩水で１％（Ｗ／Ｖ）濃度とした２２Ｌ株脳ホモジネート２０μＬを脳内に接種してプリオンに感染させたＣ５７ＢＬ／６マウスにて、実施例１６と同様にして行った。【００６４】
〔結果〕
結果を図１９に示す。
対照群の潜伏期間１５０．３±６．２日に対して、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与群の潜伏期間は２２０．３±１５．１日であり有意な治療効果を示した（ｐ＜０．０１）。以上の実施例より、セルロースエーテル類は特定のプリオン株に限定されることなく広い範囲のプリオン株に対して効果を示すことが明らかとなった。
【実施例１９】
【００６５】
セルロースエーテル類におけるメトキシル基とヒドロキシプロポキシル基の含量、およびセルロースエーテル類分子量について、プリオン病に対する治療効果に及ぼす影響を検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）〕；実施例６に記載。（メトキシル基含量２９．４％、ヒドロキシプロポキシル基含量８．９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度３８６０ｍｍ２／ｓ、１重量％水溶液のｐＨ６．７。）
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（９０ＳＨ−４Ｋ）〕；信越化学工業（株）製、「９０ＳＨ−４０００」（商品名）（メトキシル基含量２３．１％、ヒドロキシプロポキシル基含量９．３％、２０℃における２重量％水溶液の粘度４４５０ｍｍ２／ｓ（６０ＳＨ−４Ｋと同程度の分子量）、１重量％水溶液のｐＨ６．８）を用いた。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ６０２）〕；実施例１１に記載。（メトキシル基含量２９．１％、ヒドロキシプロポキシル基含量９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度１．６８ｍｍ２／ｓ、１重量％水溶液のｐＨ６．８。）
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ９０２）〕；信越化学工業（株）製、「ＨＰＭＣ９０２」（商品名）（メトキシル基含量２２．６％、ヒドロキシプロポキシル基含量６．７％、２０℃における２重量％水溶液の粘度１．８７ｍｍ２／ｓ（ＨＰＭＣ６０２と同程度の分子量）、１重量％水溶液のｐＨ６．８）を用いた。
〔評価方法〕
１％（Ｗ／Ｖ）濃度の２６３Ｋ株脳ホモジネート２０μＬを脳内に接種してプリオンに感染させたＴｇ７マウスにて、感染の３日前に各セルロースエーテル類５０ｍｇを皮下に投与した。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹（体重約２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００６６】
〔結果〕
結果を図２０に示す。
ここでは、水溶液粘度が相対的に高い（高分子量）グループ〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）とＨＰＭＣ（９０ＳＨ−４Ｋ）〕と、水溶液粘度が相対的に低い（低分子量）グループ〔ＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ６０２）とＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ９０２）〕について、プリオン病に対する治療効果を比較した。水溶液粘度の高いグループでは、ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）投与群の潜伏期間９９．２±１１．５日に対しＨＰＭＣ（９０ＳＨ−４Ｋ）投与群の潜伏期間９９．７±９．５日であり、それぞれメトキシル基とヒドロキシプロポキシル基含量の相違があってもこの範囲では効果に有意差が見られなかった。水溶液粘度の低いグループにおいては、ＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ６０２）投与群の潜伏期間５９．８±１．６日とＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ９０２）投与群の潜伏期間６３．３±８．１日で、それぞれのメトキシル基とヒドロキシプロポキシル基含量の範囲では治療効果に有意差が見られなかった。一方、水溶液粘度の高いグループと低いグループでは、潜伏期間に有意差が見られ、効果に差が認められ、プリオン病に対する治療効果に対してはセルロースエーテル類の分子量がむしろ大きく影響していることがわかる。
【実施例２０】
【００６７】
実施例１９の結果に基づき、セルロースエーテル類の分子量がプリオン病に対する治療効果に及ぼす影響についてさらに詳細に検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
ここでは、粘度の異なる各種ＨＰＭＣを用いた。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ６０２）〕；実施例１１に記載。（メトキシル基含量２９．１％、ヒドロキシプロポキシル基含量９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度１．６８ｍｍ２／ｓ）
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＥＷ）〕；実施例８に記載。（メトキシル基含量２８．９％、ヒドロキシプロポキシル基含量９．０％、２０℃における２重量％水溶液の粘度２．９ｍｍ２／ｓ）
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
（メトキシル基含量２９．２重量％、ヒドロキシプロポキシル基含量８．９重量％、２０℃における２重量％水溶液の粘度５．８１ｍｍ２／ｓ）
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）〕；実施例６に記載。
（メトキシル基含量２８．８％、ヒドロキシプロポキシル基含量８．９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度５０．４ｍｍ２／ｓ）
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＨＰＭＣ１６５７）〕；信越化学工業（株）製、「ＨＰＭＣ１６５７」（商品名）を用いた。（メトキシル基含量３２．２％、ヒドロキシプロポキシル基含量８．５％、２０℃における２重量％水溶液の粘度２１０ｍｍ２／ｓ）
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４Ｋ）〕；実施例６に記載。
（メトキシル基含量２９．４％、ヒドロキシプロポキシル基含量８．９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度３８６０ｍｍ２／ｓ）
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−１０Ｋ）〕；信越化学工業（株）製、「６０ＳＨ−１００００」（商品名）を用いた。（メトキシル基含量２９．３％、ヒドロキシプロポキシル基含量９％、２０℃における２重量％水溶液の粘度９７３０ｍｍ２／ｓ）
〔評価方法〕
１％（Ｗ／Ｖ）濃度の２６３Ｋ株脳ホモジネート２０μＬを脳内に接種してプリオンに感染させたＴｇ７マウスにて、感染の３日前に各セルロースエーテル類５０ｍｇを皮下に投与した。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹（体重約２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００６８】
〔結果〕
結果を図２１に示す。
セルロースエーテル類の粘度と治療効果の関係はベル型の曲線になり、粘度が増すに従って治療効果が上昇し、１００ｍｍ２／ｓ付近で最大の効果となり、さらに粘度が増すと逆に治療効果の減少が観察された。試料であるセルロースエーテル類の供給会社の情報に依れば、２０℃における２重量％水溶液の粘度１００ｍｍ２／ｓは、分子サイズ（分子量）はおよそ９０ｋＤａである。
【実施例２１】
【００６９】
実施例２０の結果を踏まえ、低分子量である６糖セルロースエーテル類についてその治療効果を調べた。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・メチルヘキサオース（Ｍ−６Ｃ）；生化学工業（株）製、６糖セルロースエーテル「セロヘキサオース」（カタログ番号、４００４０６）を用い、これにメチル基を付加させてメチル化６糖セルロースエーテル（メトキシル基含量３０％）とした。
・ヒドロキシプロピルメチルヘキサオース（ＨＰＭ−６Ｃ）；生化学工業（株）製、６糖セルロースエーテル「セロヘキサオース」（カタログ番号、４００４０６）を用い、これにヒドロキシプロピル基とメチル基を付加させてヒドロキシプロピルメチル化６糖セルロースエーテル（メトキシル基含量３０％、ヒドロキシプロポキシル基含量１３％）とした。
〔評価方法〕
実施例１０と同様にして脳室内投与によりプリオン病に対する治療効果判定実験を行った。
各６糖セルロースエーテル類をＰＢＳ液で２５ｍｇ／ｍＬ濃度に調製しポンプに充填してマウスの第３脳室内に投与を行った。対照群はＰＢＳ液のみをポンプに充填して同様に脳室内投与を行った。なお、０．１％（Ｗ／Ｖ）濃度の２６３Ｋ脳ホモジネートの２０μＬをＴｇ７マウスの脳内に接種した後、２日目より脳室内への投与を開始した。マウスは８週齢以上の雄各８匹（体重約２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００７０】
〔結果〕
結果を図２２に示す。
対照群、Ｍ−６Ｃ投与群、ＨＰＭ−６Ｃ投与群の潜伏期間は、それぞれ５８．２±１．３日、７６．５±３．５日、８３．４±４．７日であった。ＨＰＭ−６Ｃ群は、Ｍ−６Ｃ群及び対照群より有意に（各々ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）治療効果が見られた。また、Ｍ−６Ｃ群は対照群より有意に（ｐ＜０．０１）治療効果が見られた。この結果は、セルロースエーテル類の分子サイズとしては６糖でプリオン病に対して治療効果を発揮できることを示している。
【実施例２２】
【００７１】
ＨＰＭＣを末梢に投与した場合には、徐々に吸収され持続的なプリオン形成抑制効果を発現しているものと考えられることより、ＨＰＭＣを低分子化することで投与部位から血管内への移行や血管内から各組織への移行の効率を上げて治療効果を高めることができる可能性がある。そこで、加水分解によりＨＰＭＣの低分子化を行い、ＨＰＭＣの治療効果への影響をインビボで検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・加水分解ＨＰＭＣ：ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕（実施例１に記載）を使用し、この２５ｍｇ／ｍＬ水溶液に、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）に対して塩酸０．３重量％、４重量％、４０重量％をそれぞれ加え、撹拌しながら９０℃で６時間反応させた。重炭酸ソーダで中和した後に８０℃以上に加熱して析出したＨＰＭＣを３ＭＭ濾紙〔ワットマン社（Ｗｈａｔｍａｎ）製〕で濾過して回収した。濾紙上のＨＰＭＣを８０℃以上に加熱した滅菌水で３回洗浄した後に凍結乾燥した。
〔評価方法〕
実施例２と同様に、脳内感染から１０日経過後に、加水分解ＨＰＭＣ１５ｍｇを皮下に単回投与した。比較のため加水分解を行っていないＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）１５ｍｇ投与群、および化合物非投与群（オブラートのみ）を準備した。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹（体重２０〜２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００７２】
〔結果〕
結果を図２３に示す。加水分解していないＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与群での潜伏期間が５６．７±４．０日に対し、０．３％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ投与群の潜伏期間が７０．０±２．６日で有意（ｐ＜０．０１）に治療効果が向上したが、４％塩酸による場合には６０．３±３．４日、４０％塩酸による場合には５２．３±０．６日であり、有意差は見られなかった。０．３％塩酸での加水分解物が最も効果が高く、塩酸濃度が高くなるに従って効果は明らかに低下した（いずれもｐ＜０．０１）が、非投与群（対照）の潜伏期間４７．０±１．６日と比べると治療効果は明らかに見られた（いずれもｐ＜０．０１）。この結果は、加水分解による低分子化がプリオン病に対する治療効果を高めることを示唆しているが、過度に加水分解すると、逆に抗プリオン活性を発揮する構造が損なわれる可能性があることを示唆している。
【実施例２３】
【００７３】
これまでの実施例で用いたセルロースエーテル類と近似する化合物について、同様なプリオン病に対する治療効果があるかどうかについて検討した。
〔評価に用いた化合物〕
・２糖類；Ｄ（＋）−セロビオース〔ナカライテスク（株）製、カタログ番号０７５１１−４２〕、ラクトース一水和物〔ナカライテスク（株）製、カタログ番号２００１４−５２〕、マルトース一水和物〔ナカライテスク（株）製、カタログ番号２１１１７−８２〕、シュクロース〔和光純薬工業（株）製、カタログ番号１９８−１３５２５〕、Ｄ（＋）−トレハロース二水和物〔和光純薬工業（株）製、カタログ番号２０３−０２２５２〕、メチルセロビオース〔焼津水産工業（株）製〕をそれぞれ使用した。
・６糖類；セロヘキサオース〔生化学工業（株）製、カタログ番号４００４０６〕、イソマルトヘキサオース〔生化学工業（株）製、カタログ番号４００４８１〕、マルトヘキサオース〔生化学工業（株）製、カタログ番号４００５１６〕、ラミナリヘキサオース〔生化学工業（株）製、カタログ番号４００４９３〕、ヘキサ−Ｎ−アセチルキトヘキサオース〔生化学工業（株）製、カタログ番号４００４２７〕、キトサンヘキサマー〔生化学工業（株）製、カタログ番号４００４３６〕をそれぞれ使用した。
・シクロデキストリン類；アルファーシクロデキストリン〔純正化学（株）製、カタログ番号３３７３０−０４１０〕、ベータシクロデキストリン〔純正化学（株）製、カタログ番号３３７３５−０４１０〕、ガンマーシクロデキストリン〔純正化学（株）製、カタログ番号３３７４０−０４１０〕、モノアセチルベータシクロデキストリン〔純正化学（株）製、カタログ番号７７０１６−１６１０〕、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル）ベータシクロデキストリン〔ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ｔ３１９６〕、ヘプタキス（２，３，６−トリ−アセチル）ベータシクロデキストリン〔ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ｔ３４４６〕をそれぞれ使用した。
・メチル基あるいはヒドロキシプロピル基を有するシクロデキストリン類；メチルベータシクロデキストリン〔ＡＬＤＲＩＣＨ社製（カタログ番号３３２６１５）〕、２−ヒドロキシプロピルアルファシクロデキストリン〔ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号３９０６９０〕、２−ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン〔ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号３８９１４５、置換度１．０モル〕、２−ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン〔ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号３３２６０７、置換度０．８モル〕、２−ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン〔ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号３３２５９３、置換度０．６モル〕、２−ヒドロキシプロピルガンマーシクロデキストリン〔ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ｈ１２５〕、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）ベータシクロデキストリン〔ＳＩＧＭＡ社製（カタログ番号Ｈ４６４５）〕、ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−メチル）ベータシクロデキストリン〔ＳＩＧＭＡ社製（カタログ番号Ｈ０５１３）〕をそれぞれ使用した。
・キチンあるいはキトサン；キトサン−１０〔和光純薬工業（株）、カタログ番号０３９−１６１２２〕、キトサン−１００〔和光純薬工業（株）、カタログ番号０３２−１６０９２〕、キトサン−１０００〔和光純薬工業（株）、カタログ番号０３９−１４４２２〕、キチン〔和光純薬工業（株）、カタログ番号０３４−１３６３２〕をそれぞれ使用した。
・セルロース；セルロース〔ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ｓ３５０４〕を使用した。
・ヒドロキシプロピル基を有するキチンあるいはキトサン；ヒドロキシプロピルキトサン−１００〔焼津水産工業（株）製）〕、ヒドロキシプロピルキチン〔焼津水産工業（株）製〕をそれぞれ使用した。
・メチル基およびヒドロキシプロピル基を有する長鎖アルキル基含有セルロース類；長鎖アルキル基含有ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＳＧ−６０Ｍ）〔大同化成工業（株）製、「サンジェロース−６０Ｍ」（商品名）〕、長鎖アルキル基含有ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＳＧ−６０Ｌ）〔大同化成工業（株）製、「サンジェロース−６０Ｌ」（商品名）〕をそれぞれ使用した。
・メチル基を有するセルロース類；実施例８に記載メチルセルロース〔ＭＣ（ＳＭ−４）〕を使用した。
・ヒドロキシプロピル基を有するセルロース；不溶性低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（Ｌ−ＨＰＣ）〔信越化学工業（株）製、「Ｌ−ＨＰＣ（ＬＨ−３１）」（商品名）、ヒドロキシプロポキシル基含量１１％〕を使用した。
・カルボキシル基およびメチル基を有するセルロース類；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）〔ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ｃ５６７８〕、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ（ＮＳ３００））〕〔五徳薬品（株）製、「ＮＳ−３００」（商品名）〕、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）〔五徳薬品（株）製、「Ｔ．Ｐ．Ｔ」（商品名）〕をそれぞれ使用した。
・メチル基およびヒドロキシエチル基を有するセルロース類；ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＭＨＥＣ）〔ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号４３５０１５〕を使用した。
・ヒドロキシエチル基を有するセルロース類；ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）〔ＦＬＵＫＡ社製、カタログ番号５４２９０〕、ヒドロキシエチルスターチ〔ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ｈ６３８２〕、ヒドロキシエチルスターチ７００００含有輸液剤〔杏林製薬（株）製、「ヘスパンダー」（商品名）〕をそれぞれ使用した。
・免疫賦活作用を有する医薬多糖類；レンチナン（商品名）〔味の素（株）製〕、ピシバニール（商品名〕〔中外製薬（株）製〕、ベスタチン（商品名）〔日本化薬（株）製〕、ソニフィラン（商品名）〔科研製薬（株）製〕をそれぞれ使用した。
〔評価方法〕
１％（Ｗ／Ｖ）濃度の２６３Ｋ株脳ホモジネート２０μＬを脳内に接種してプリオンに感染させたＴｇ７マウスにて、感染後５日以内に各化合物を１００ｍｇ以下で毒性が出ない量を皮下あるいは腹腔内に投与した。皮下投与の際には粉末を、腹腔内投与の際には水溶液の形で投与した。マウスは８週齢以上の雄雌各３匹以上（体重約２５ｇ）を一群として使用し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。得られたデータを実施例２と同様に解析した。【００７４】
〔結果〕
脳内感染４日目に各化合物５０ｍｇをマウス背部皮下に投与した代表的な結果を図２４に示す。図中のＨＰＭＣ（ＡＳ−ＭＧ）群およびＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）群は陽性対照として、オブラートのみの投与群を陰性対照として載せている。ヒドロキシプロピルメチルセルロース修飾体である長鎖アルキル基を有するＨＰＭＣ（ＳＧ−６０Ｍ，ＳＧ−６０Ｌ）やヒドロキシエチルメチルセルロース（ＭＨＥＣ）は有効であるが、カルボキチメチルセルロース類（ＣＭＣ−Ｎａ、ＣＭＣ（ＮＳ３００）、ＣＭＣ）やヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、不溶性の低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（Ｌ−ＨＰＣ）は無効であった。
各種化合物を２６３Ｋプリオン脳内感染マウスにおける皮下投与あるいは腹腔内投与による方法にて検定し、プリオン病に対する治療効果を×；無効、○；有効、◎；極めて有効の３段階で評価し、結果を表１にまとめた。
【００７５】
【表１】
2007123187.tif 000005
【００７６】
プリオン病に対する治療効果を発揮するのはメチル基を有するセルロース、メチル基およびヒドロキシプロピル基を有するセルロース、メチル基およびヒドロキシエチル基を有するセルロース、ヒドロキシプロピル基を有するセルロースである。
【実施例２４】
【００７７】
これまでの実施例で、セルロースエーテル類がプリオン病感染個体で治療効果を発揮して発症予防や発症遅延をもたらすことを明らかにしてきた。そこで、治療効果がプリオン病の病変の主座である脳における所見を反映しているかどうかを組織病理学的に検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
〔評価方法〕
実施例１５と同様にして行った。５〜６週齢の雌のシリアンハムスター（６匹）（日本エスエルシーより入手、体重９０ｇ前後／匹）の脳内に、１％（Ｗ／Ｖ）２６３Ｋ脳ホモジネート４０μＬを接種してプリオン感染させた。脳内感染させて８日経過後、シリアンハムスターの背部皮下にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を１５０ｍｇ投与した。対照群（４匹）としてはＨＰＭＣ非投与群（オブラートのみ）を準備した。脳内感染から６４日目、８０日目（対照群は病末期状態）にＨＰＭＣ投与群および対照群のハムスターを各２匹安楽死させた。また脳内感染から１３６日目（ＨＰＭＣ投与群は病末期状態）に残りのＨＰＭＣ投与群のハムスター２匹を安楽死させた。各ハムスターより脳を取り出し正中で矢状断に切りバッファー化ホルマリンに浸けて１ヶ月以上固定した。固定した脳を９０％以上の蟻酸液に室温で１時間浸漬して感染性を除去した後にパラフィン包埋し、薄切して０．４μｍの組織切片を作製した。その組織切片を異常プリオン蛋白の蓄積を検出するためプリオン蛋白に対する抗体で免疫染色を行った。さらに連続する組織切片を神経変性部位で増生するアストログリアを検出するためグリア線維性酸性蛋白（ＧＦＡＰ）に対する抗体で免疫染色を行った。免疫染色はドウウラ（Ｄｏｈ−ｕｒａ）らの方法〔Ｋａｔｓｕｍｉ  Ｄｏｈ−ｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年、７８巻、４９９９−５００６頁〕に従い、以下のように実施した。
内因性ペルオキシダーゼのブロック処理を行った組織切片を、プリオン蛋白免疫染色では１ｍＭ塩酸に浸漬して１２１℃で１０分間処理した。ＧＦＡＰ免疫染色ではこの処理を行はない。組織切片を蒸留水で３回、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で２回、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）で１回洗浄した後に抗プリオン蛋白抗体（免疫生物研究所（株）製、１８６３１（商品番号）、５％正常ヤギ血清加ＰＢＳで２００倍稀釈）あるいは抗ＧＦＡＰ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製、Ｍ０７６１（商品番号）、０．１％ウシ血清アルブミン加ＰＢＳで５０００倍希釈）を４℃で一晩反応させた。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で２回、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）で１回洗浄した後に、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ液（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製、Ｋ４００２あるいはＫ４００６（商品番号））を組織切片上に滴下し室温３０分反応させた。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で２回、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）で１回洗浄した後に、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を用いてペルオキシダーゼ反応で抗原抗体複合体を可視化した。【００７８】
〔結果〕
対照群において異常型プリオン蛋白の蓄積や神経変性が目立った部位のうち、顕微鏡写真として結果を示す海馬近傍と下丘の解剖学的局在を各々図２５と図３０（「マウスカラーアトラスと写真で見る脳実験マニュアル」黒川衛編集、羊土社、２００５年の５２頁の矢状断標本拡大図を改変）に示す。なお、図中ａ〜ｙの符号は各符号を付した各引き出し線先端近傍の部位を指しており、各符号の指す部位名は次に示すとおりである。
ａ；第四脳室（Ｆｏｕｒｔｈ  ｖｅｎｔｉｃｌｅ）
ｂ；小脳ＶＩＩＩ小葉（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ＶＩＩＩ  ｌｏｂｕｌａ）
ｃ；小脳ＩＸ小葉（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ＩＸ  ｌｏｂｕｌａ）
ｄ；小脳髄体（Ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｃｏｒｐｕｓ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）
ｅ；小脳ＶＩＩ小葉（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ＶＩＩ  ｌｏｂｕｌａ）
ｆ；小脳ＩＶ・Ｖ小葉（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ＩＶ・Ｖ  ｌｏｂｕｌａ）
ｇ；小脳ＩＩＩ小葉（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ＩＩＩ  ｌｏｂｕｌａ）
ｈ；小脳ＩＩ小葉（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ＩＩ  ｌｏｂｕｌａ）
ｉ；下丘（Ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）
ｊ；上丘（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）
ｋ；歯状回（Ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓ）
ｍ；アンモン角（Ａｍｍｏｎ’ｓ  ｈｏｒｎ）
ｎ；背側第三脳室（Ｄｏｒｓａｕｍ  ｔｈｉｒｄ  ｖｅｎｔｉｃｌｅ）
ｏ；脳梁（Ｃａｌｌｏｓｕｍ）
ｐ；前頭連合野（Ｆｒｏｎｔａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｒｅａ）
ｑ；海馬采（Ｆｉｍｂｒｉａ）
ｒ；外叢状層（Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ  ｌａｙｅｒ）
ｓ；嗅球顆粒細胞層（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｕｌｂ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）
ｔ；前交連（Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｍｍｉｓｓｕｒｅ）
ｕ；乳頭体視床束（Ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ  ｍａｍｉｌｌｏｔｈａｌａｍｉｃｕｓ）
ｖ；視索（Ｏｐｔｉｃ  ｔｒａｃｔ）
ｗ；乳頭体（Ｃｏｒｐｕｓ  ｍａｍｍｉｌｌａｒｅ）
ｘ；視床下部（Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ）
ｙ；橋核（Ｐｏｎｔｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ）
海馬近傍での異常プリオン蛋白の蓄積を示す弱拡大の顕微鏡写真を図２６に、同部位の一部である海馬と大脳皮質に挟まれた白質領域の強拡大の顕微鏡写真を図２７に示す。写真は図２５中の矢印から見た方向で示している。対照群では既に脳内感染６４日目で海馬と大脳皮質に挟まれた白質領域に異常プリオン蛋白の蓄積があり、病末期の脳内感染８０日目には同領域での異常型プリオン蛋白の蓄積が増している。それに対してＴＣ−５ＲＷ投与群では脳内感染６４日目および８０日目に異常プリオン蛋白の蓄積は見られない。そしてＴＣ−５ＲＷ投与群で病末期である脳内感染１３６日目では、異常型プリオン蛋白の蓄積が極軽度に観察された。
ＧＦＡＰ免疫染色で描出されるアストログリア細胞は正常脳でも白質に存在しており、神経変性が起こると変性部位の灰白質や白質でＧＦＡＰ陽性のアストログリア細胞の数が増えるとともに活性化されるため、ＧＦＡＰ免疫染色は神経変性を評価するために使われる簡便な方法である。図２６で観察したのと同じ部位のＧＦＡＰ免疫染色の顕微鏡写真を図２８に示す。また、同部位の一部である海馬の錐体細胞層を含む視野の強拡大の顕微鏡写真を図２９に示す。対照群では既に脳内感染６４日目で海馬と大脳皮質に挟まれた白質領域から海馬にかけて広汎にアストログリア細胞の増生が観察され、病末期の脳内感染８０日目にはその程度は高度に増悪している。それに対してＴＣ−５ＲＷ投与群では脳内感染６４日目および８０日目にアストログリア細胞の増生は見られない。そしてＴＣ−５ＲＷ投与群で病末期である脳内感染１３６日目では、白質領域から海馬にかけてアストログリア細胞の増生が極軽度に観察された。
以上の所見は、下丘においてもほぼ同様であった。下丘の異常プリオン蛋白の蓄積を示す弱拡大の顕微鏡写真を図３１に、強拡大の顕微鏡写真を図３２に示す。写真は図３０中の矢印から見た方向で示している。対照群では既に脳内感染６４日目で下丘に異常プリオン蛋白の蓄積があり、病末期の脳内感染８０日目にはその程度はやや増している。それに対してＴＣ−５ＲＷ投与群では脳内感染６４日目および８０日目に異常プリオン蛋白の蓄積は見られない。そしてＴＣ−５ＲＷ投与群で病末期である脳内感染１３６日目では異常型プリオン蛋白の蓄積が観察されたが、その程度は対照群の病末期に比べてやや軽い。図３１で観察したのと同じ部位のＧＦＡＰ免疫染色の強拡大の顕微鏡写真を図３３に示す。対照群では既に脳内感染６４日目で下丘にアストログリア細胞の増生が観察されている。それに対してＴＣ−５ＲＷ投与群では脳内感染６４日目および８０日目にアストログリア細胞の増生は見られず、ＴＣ−５ＲＷ投与群で病末期である脳内感染１３６日目でアストログリア細胞の増生が観察された。
以上の結果より、ＨＰＭＣはプリオン病の病変の主座である脳において異常プリオン蛋白の蓄積と神経変性を抑えることにより治療効果を発揮していることが確認された。
【実施例２５】
【００７９】
実施例９と実施例１０の結果より、皮下に投与したＨＰＭＣは血管内に吸収され、血管内から脳実質に移行してプリオン病に対する治療効果を発揮する可能性がある。さらに実施例３と実施例５の結果より、ＨＰＭＣは単回投与で十分に治療効果が持続し、分解排泄されるのに時間がかかると考えられる。これらの可能性を検証するため、ＨＰＭＣを皮下投与して血管内の抗プリオン活性を測定した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
〔評価方法〕
５〜６週齢の雌のシリアンハムスター１５匹（体重９０ｇ前後／匹）の背部皮下にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）４００ｍｇを投与した（投与方法は実施例２の場合と同様オブラートに包み皮下に埋入）。対照としてＨＰＭＣ非投与（オブラートのみ）のものを６匹準備した。ＨＰＭＣ投与してから１．５週間経過後、３週間経過後、４．５週間経過後のそれぞれにＨＰＭＣ投与群の５匹、非投与群の２匹より全血液を採取し、血清を分離した。得られた血清中の抗プリオン活性の存在を実施例１のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）評価方法で検定した。２４穴細胞培養シャーレにコンフルエントの１０％に相当する細胞数のＳｃＮ２ａ細胞を撒き、１ｍＬ培養液中に採取したハムスター血清５０μＬを加えて培養を続けた。細胞がコンフルエントとなった時点で、実施例１の方法で細胞溶解液より異常型プリオン蛋白（プリオン）を調製し、ウエスタンブロット法で解析した。【００８０】
〔結果〕
結果を図３４に示す。図中の［ＴＣ−５ＲＷ］はＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与群、［ｃｏｎｔ］は非投与群についてそれぞれ個別のハムスター血清で処理したＳｃＮ２ａ細胞由来の異常型プリオン蛋白シグナルを示している。［ｎｏ］はハムスター血清で処理していない対照群である。
検討した中ではＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与後１．５週間経過したハムスター血清中に最も強い抗プリオン活性が見られた。同３週間経過後では抗プリオン活性は下がるものの、同４．５週間経過後でもほぼ同程度かあるいは若干低い抗プリオン活性が血清中には存在していた。この結果は、単回投与であってもＨＰＭＣに由来する抗プリオン活性が長期間にわたり血清中に存在することを示している。
【実施例２６】
【００８１】
血清中の抗プリオン活性因子について温度に対する感受性を検討した。
〔評価方法〕
実施例２５におけるＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与して１．５週間経過したハムスター血清（図３４の［ＴＣ−５ＲＷ］の１レーン目の検体）と、同じ時期に採取した対照のハムスター血清（図３４の［ｃｏｎｔ］の１レーン目の検体）を用いた。
ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清１０μＬおよびＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）加対照血清（対照ハムスター血清にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を終濃度４．２ｍｇ／ｍＬ加えたもの）１０μＬを３５℃、５０℃、６５℃、８０℃、９５℃で１０分間処理を行い、冷却後に遠心（１３，０００×ｇ、５分間）を行って上清を分取した。２４穴細胞培養シャーレにコンフルエントの１０％に相当する細胞数のＳｃＮ２ａ細胞を撒き、１ｍＬ培養液中に分取した上清を加えて培養を続けた。細胞がコンフルエントとなった時点で、実施例１の方法で細胞溶解液より異常型プリオン蛋白（プリオン）を調製し、ウエスタンブロット法で解析した。
また、モンタージュ・アルブミン・デプリート・キット（Ｍｏｎｔａｇｅ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｄｅｐｌｅｔｅ  Ｋｉｔ）〔ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製〕を用いてハムスター血清からアルブミンを除去した検体について同様に温度処理の影響を検討した。【００８２】
〔結果〕
アルブミンを除去していないときの結果を図３５に示す。［ｃｏｎｔ］は何も添加していないＳｃＮ２ａ細胞の異常型プリオン蛋白を示している。ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清では８０℃以上の温度処理で抗プリオン活性が若干低下していたが、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）加対照ハムスター血清ではもともと加えたＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）の濃度では抗プリオン活性が低いためか同様な変化は明らかではなかった。ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）は８０℃や９５℃で１０分間程度の温度処理では分解・修飾されないため、この結果はＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清中の抗プリオン活性因子はＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）やＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）様のものでない可能性を示すことになる。しかし、血清は８０℃以上の温度処理で血清中に含まれる多量のアルブミン等の蛋白質が熱変性を起こし巨大な沈殿物を形成し、抗プリオン活性因子の一部がこの沈殿物にトラップされて上清中の活性が低下した可能性がある。【００８３】
アルブミンを除去した検体の結果を図３６に示す。図中、［ｃｏｎｔ］は何も添加していないＳｃＮ２ａ細胞の異常型プリオン蛋白であり、［ａｌｂｕｍｉｎ  ＋］はアルブミンを除去していないＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清を用いたもの、［ａｌｂｕｍｉｎ  −］はアルブミンを除去したＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清を用いたものを示している。温度処理をしていないもの（［ｈｅａｔ  −］）、６５℃で処理したもの（［ｈｅａｔ  ６５］）、９５℃で処理したもの（［ｈｅａｔ  ９５］）の間で抗プリオン活性に明らかな差はみられなかった。この結果から、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清中の抗プリオン活性は、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）と同様な熱耐性を有していると解される。
【実施例２７】
【００８４】
次に、分子篩い分け効果を持つフィルター（限外濾過膜）を用いてＴＣ−５ＲＷ投与ハムスター血清中の抗プリオン活性因子の分子サイズ（分子量）を推定した。
〔評価方法〕
ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスターの血清１０μＬ、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）加対照の血清（対照ハムスター血清にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を終濃度２０ｍｇ／ｍＬ加えたもの）１０μＬをそれぞれバイオマックス−３０・フィルター（ＢＩＯＭＡＸ−３０  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ）〔ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製、「ＵＦＣ  ３ＢＴＫ００」（型番）、分子量約３万Ｄａをカット〕、あるいはバイオマックス−１００・フィルター（ＢＩＯＭＡＸ−１００  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ）〔ミリポア社製、「ＵＦＣ  ３ＢＨＫ００」（型番）、分子量約１０万Ｄａをカット〕で濾過処理を行い、濾過液（［ｆｉｌｔｒａｔｅ］）と濾過できなかった残留液（［ｒｅｔｅｎｔａｔｅ］）を分取した。２４穴細胞培養シャーレにコンフルエントの１０％に相当する細胞数のＳｃＮ２ａ細胞を撒き、１ｍＬ培養液中に分取した濾過液あるいは残留液を加えて培養を続けた。細胞がコンフルエントとなった時点で、実施例１の方法で細胞溶解液より異常型プリオン蛋白（プリオン）を調製し、ウエスタンブロット法で解析した。【００８５】
〔結果〕
結果を図３７に示す。図中、［ｃｏｎｔｒｏｌ］は無添加のＳｃＮ２ａ細胞の異常型プリオン蛋白、［ｎｏ  ｆｉｌｔｅｒ］は濾過前のＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスターの血清、あるいはＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）加対照の血清を用いたもの、［３０Ｋ］はバイオマックス−３０・フィルターで処理したもの、［１００Ｋ］はバイオマックス−１００・フィルターで処理したもの、［ｆｉｌｔｒａｔｅ  ＋］は濾過液を用いたもの、［ｒｅｔｅｎｔａｔｅ  ＋］は濾過できなかった残留液を用いたものを示している。ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清中の抗プリオン活性因子は、対照ハムスター血清に加えたＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）と同様の挙動を示し、約１０万Ｄａの分子量のフィルターを透過しなかった。
【実施例２８】
【００８６】
ＨＰＭＣ投与ハムスター血清中の抗プリオン活性因子について、分解酵素処理に対する感受性を検討した。
〔評価方法〕
ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスターの血清１０μＬ、およびＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）加対照の血清（対照ハムスター血清にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を終濃度２０ｍｇ／ｍＬとなるように加えたもの）１０μＬのそれぞれをモンタージュ・アルブミン・デプリート・キット（Ｍｏｎｔａｇｅ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｄｅｐｌｅｔｅ  Ｋｉｔ）〔ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製〕でアルブミンを除いた後に、α−アミラーゼ（α−ａｍｙｌａｓｅ）〔シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製、「Ａ３１７６」（商品番号）〕を終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように、アミログルコシダーゼ（ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）〔シグマ社製、「Ａ９２２８」（商品番号）〕を終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）〔和光純薬工業（株）製、「５４８−００２１２」（商品番号）〕を終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ）〔シグマ社製、「ＤＮ２５」（商品番号）〕を終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように、リボヌクレアーゼＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ）〔シグマ社製、「Ｒ４８７５」（商品番号）〕を終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃、１時間反応させた。その後プロテナーゼＫを終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えて３７℃でさらに１時間反応させた。９５℃で５分間処理した後に冷却し、遠心〔１３，０００×ｇ、５分間〕して上清を分取した。２４穴細胞培養シャーレにコンフルエントの１０％に相当する細胞数のＳｃＮ２ａ細胞を撒き、１ｍＬ培養液中に分取した上清を加えて培養を続けた。細胞がコンフルエントとなった時点で、実施例１の方法で細胞溶解液より異常型プリオン蛋白（プリオン）を調製し、ウエスタンブロット法で解析した。【００８７】
〔結果〕
結果を図３８に示す。図中、［ｃｏｎｔｒｏｌ］は無添加のＳｃＮ２ａ細胞の異常型プリオン蛋白、［ａｌｂｕｍｉｎ  ＋］はアルブミンを除去していないＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清を用いたもの、［ａｌｂｕｍｉｎ  −］はアルブミンを除去したＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清を用いたものを示している。［ｈｅａｔ  ｄｅｎａｔｅ  ＋］は９５℃５分間の処理をしたもの、［ｈｅａｔ  ｄｅｎａｔｅ  −］は９５℃５分間の処理をしていないもの、［ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ＋］は上記６種の酵素で処理をしたもの、［ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ−］は酵素処理していないものを示している。ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清中の抗プリオン活性は、対照ハムスター血清に加えたＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）による抗プリオン活性と同様の挙動を示し、上記６種の酵素処理に対して影響を受けなかった。
以上実施例２５〜２８のいずれの結果も、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）投与ハムスター血清中の抗プリオン活性因子はＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）と同じ性状を有することを示しており、抗プリオン活性因子はＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）そのもの、あるいはＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）が一部修飾（分解）されたものである可能性がある。
【実施例２９】
【００８８】
実施例２５〜２８の結果を踏まえ、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を動物（マウス）の末梢に投与した際の組織内推移について放射性同位元素（炭素１４）で標識したＨＰＭＣを用いて詳細に検討した。まず、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）をマウス尾静脈より単回投与した際の組織内推移について調べた。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・標識化ＨＰＭＣ；ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）（実施例１に記載）を使用し、これをアルカリ塩とした後、［１４Ｃ］ヨウ化メチル、ヘキサン（溶剤）とともに封管し、４０〜４５℃で２０時間保持した。未反応のヨウ化メチルおよびヘキサンを蒸発除去した後、残渣を水に溶解してイオン交換樹脂（Ｈ＋とＯＨ−の混床型）カラムを通して精製し、溶出液を濃縮、乾燥して炭素１４メチル基を導入した標識化ＨＰＭＣ（比活性；７４ｋＢｑ／ｍｇ）とした。
〔評価方法〕
標識化ＨＰＭＣを、表２に記載の用量で尾静脈より単回投与した動物（Ｔｇ７マウス）を、所定時間にエーテル麻酔下，下大静脈より採血致死させ，所定の組織を摘出し，組織内放射能濃度および分布率を求め，各組織への放射能分布および経時的変化について調べた。【００８９】
＜試験条件＞
【表２】
2007123187.tif 000006
【００９０】
＜評価組織＞
Ｔｇ７マウス（ハムスター型プリオン蛋白を過剰発現した遺伝子改変マウス）の血漿（Ｐｌａｓｍａ）、血液（Ｂｌｏｏｄ）、大脳（Ｃｅｒｅｂｒｕｎ）、小脳（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）＊、下垂体（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｇｌａｎｄ）＊＊、眼球（Ｅｙｅｂａｌｌ）＊、ハーダー腺（Ｈａｒｄｅｒｉａｎ  ｇｌａｎｄ）＊、甲状腺（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｇｌａｎｄ）＊＊、顎下腺（Ｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｇｌａｎｄ）＊、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）＊、心臓（Ｈｅａｒｔ）＊、肺（Ｌｕｎｇ）＊、肝臓（ｌｉｖｅｒ）＊、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）＊、副腎（Ａｄｒｅｎａｌ  ｇｌａｎｄ）＊＊、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）＊、膵臓（Ｐａｎｃｒｅａｓ）＊、白色脂肪（Ｆａｔ）、骨格筋（Ｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｍｕｓｃｌｅ）＊、皮膚（Ｓｋｉｎ）、骨髄（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）＊＊、大動脈（Ａｏｒｔａ）＊＊、精巣（Ｔｅｓｔｉｓ）＊、精巣上体（Ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ）＊、前立腺（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｇｌａｎｄ）＊＊、膀胱（Ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ）＊、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）＊、小腸（Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）＊、大腸（Ｌａｒｇｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ））＊〔＊：分布率を求めた。なお，血液および骨格筋については，血液全量を体重の７．７８％（参考文献；田嶋嘉雄編集，実験動物学各論，東京，朝倉書店，１９７２，１２頁）、骨格筋を体重の４５％（参考文献；Ｇｅｒｌｏｗｓｋｉ  ＬＥ，  Ｊａｉｎ  ＲＫ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９８３年  ７２巻１０号、１１０３−１１２７頁）として計算した。＊＊：３例分を合して測定した。〕のそれぞれから試料を採取した。【００９１】
＜試料採取および調製方法＞
血液および骨格筋以外で分布率を求める組織については、すべて全重量を測定した。肝臓は胆嚢を取り除いた後、その全重量を測定した。骨髄は大腿骨より採取し，その全量を測定した。白色脂肪は腎臓周辺部より、皮膚は腋下部より、骨格筋は大腿部より採取した。膀胱および消化管は秤量に際し、内容物を除去後生理食塩液で充分に洗浄を行い、小腸は十二指腸から回腸までを、大腸は盲腸から結腸までを採取した。
ａ）血液；下大静脈よりヘパリン処理したシリンジを用いて血液を採取した。血液はその１００μＬをバイアルに採取し、組織溶解剤“ＳＯＬＵＥＮＥ−３５０”（商品名）〔Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製〕２ｍＬを加えて溶解後、過酸化ベンゾイル飽和のベンゼン溶液０．４ｍＬを加えて脱色した。
ｂ）血漿；放射能測定分を除く残余の血液を遠心分離（８０００×ｇ、４℃、５分間）し，得られた血漿はその１００μＬをバイアルに採取し、組織溶解剤“ＳＯＬＵＥＮＥ−３５０”（商品名）２ｍＬを加えて溶解した。
ｃ）大脳および腎臓；大脳は２分割して片方をバイアルに採取しその重量を測定した後、組織溶解剤“ＳＯＬＵＥＮＥ−３５０”２ｍＬを加えて加温・溶解した。腎臓は片方をバイアルに採取し、その重量を測定した後、組織溶解剤“ＳＯＬＵＥＮＥ−３５０”（商品名）２ｍＬを加えて加温・溶解した。
ｄ）肝臓；ポリ容器に採取して全重量の約２倍量の生理食塩液を加えて再び重量を測定し、細かく砕片化してからホモジネートを調製した。調製後のホモジネート０．５ｍＬをバイアルに採取してその重量を測定した後、組織溶解剤“ＳＯＬＵＥＮＥ−３５０”（商品名）２ｍＬを加えて加温・溶解した。
ｅ）胃、小腸、大腸；採取した全量に０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を３ｍＬ加えて加温・溶解後水を加えて５ｍＬに希釈し、それぞれその１ｍＬをバイアルに採取した。
ｆ）  白色脂肪；約５０ｍｇをバイアルに移し、組織溶解剤“ＳＯＬＵＥＮＥ−３５０”（商品名）２ｍＬを加えて加温・溶解した。
ｇ）眼球および皮膚；眼球は両眼，皮膚は約１５０ｍｇを燃焼用カップ濾紙に秤取した。
ｈ）その他の組織；約１５０ｍｇ（全量が約１５０ｍｇに満たない場合は全量）をバイアルに移し，組織溶解剤“ＳＯＬＵＥＮＥ−３５０”（商品名）２ｍＬを加えて加温・溶解した。【００９２】
＜放射能測定方法＞
ａ）眼球および皮膚（燃焼法）；燃焼用カップ濾紙に採取した試料は、恒温器を用いて４０℃で２４時間以上乾燥させてから自動燃焼装置で燃焼し、発生した１４ＣＯ２をＣＯ２吸収剤“ＣＡＲＢＯ−ＳＯＲＢ  Ｅ”（商品名）〔Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製〕６ｍＬに吸収させ、さらにシンチレーター“ＰＥＲＭＡＦＬＵＯＲ  Ｅ＋”（商品名）〔Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製〕１２ｍＬを加え、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）〔Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、「２７００ＴＲ」（商品名）〕を用いて放射能の計測を行った。なお，燃焼法による測定値は、サンプルオキシダイザー用１４Ｃ標準試料〔Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、「ＳＰＥＣ−ＣＨＥＣ  １４Ｃ」（商品名）〕０．２ｍＬを用いて次式より求めた燃焼時の回収率で補正した後，組織内放射能濃度及び分布率を算出した。
回収率（％）＝〔標準試料燃焼後に回収された放射能（ｄｐｍ）／〔燃焼に供した標準試料の放射能（ｄｐｍ）〕×１００
ｂ）眼球および皮膚以外の組織（溶解法）；調製後の各試料にはそれぞれシンチレーター“ＨＩＯＮＩＣ−ＦＬＵＯＲ”（商品名）〔Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製〕１０ｍＬを加え、ＬＳＣを用いて放射能の計測を行い、得られた値より組織内放射能濃度および分布率を算出した。【００９３】
〔結果〕
結果を図３９〜４４に示す。組織内放射能濃度は大動脈、精巣および膀胱が投与後２時間に、皮膚は投与後７２時間に、他の組織は最初の測定時間である投与後５分にそれぞれ最高濃度を示した。いずれの測定時間においても大脳および小脳の放射能濃度は低かった。投与後５分では血漿（１４８９０３１ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ）に最も高い放射能濃度が認められ、次に腎臓（１１２１８６９ｎｇ  ｅｑ．／ｇ）および血液（７６３８３２ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ）にそれぞれ血漿の０．７５倍および０．５１倍の放射能濃度が認められた。他の組織内放射能濃度は血漿の０．１３倍以下であった。投与後２４時間では皮膚に最高濃度の７５％が認められた。精巣、白色脂肪、胸腺、脾臓、副腎、眼球、ハーダー腺、甲状腺、精巣上体、胃、顎下腺、骨格筋、骨髄、膵臓、肝臓、前立腺、膀胱および大腸の放射能濃度はそれぞれの最高濃度の４７％〜２２％に、他の組織はそれぞれの最高濃度の２０％以下に減少した。投与後７２時間では皮膚に最高濃度（４２３３８ｎｇ  ｅｑ．／ｇ）が認められた。白色脂肪、精巣、脾臓、副腎、ハーダー腺、大動脈、骨格筋、甲状腺、顎下腺、肝臓、胸腺、膵臓、膀胱、眼球、精巣上体、前立腺、胃、大腸、心臓および骨髄の放射能濃度はそれぞれの最高濃度の４１％〜１１％に、他の組織はそれぞれの最高濃度の９％以下に減少した。大脳および小脳での放射能濃度は測定した組織の中では最も低いものであり、その時間的な推移のパターンはほぼ血液や血漿と一致していた。
【実施例３０】
【００９４】
標識化ＨＰＭＣをマウス背部の皮下に単回投与した際の組織内推移について調べた。
〔評価方法〕
実施例２９と同様にして調製した標識化ＨＰＭＣ（比活性；７４ｋＢｑ／ｍｇ）を、表３の用量で単回投与した動物（Ｔｇ７マウス）を所定時間にエーテル麻酔下、下大静脈より採血致死させ、所定の組織を摘出し、組織内放射能濃度および分布率を求め、各組織への放射能分布および経時的変化について調べた。【００９５】
＜試験条件＞
【表３】
2007123187.tif 000007
【００９６】
〔結果〕
結果を図４５〜５０に示す。標識化ＨＰＭＣを雄性Ｔｇ７マウスに２．５ｍｇ／ｂｏｄｙの用量で単回皮下投与した際の組織内放射能濃度は血漿、血液、大脳、小脳、下垂体、心臓、肺、肝臓、腎臓、白色脂肪、骨格筋、皮膚、骨髄、大動脈、精巣上体、膀胱、胃、小腸および大腸は投与後２４時間に、他の組織は投与後３３６時間に最高濃度を示した。いずれの測定時間においても大脳および小脳の放射能濃度は低かった。投与後２時間では血漿（１７８２２ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ）に最も高い放射能濃度が認められた。次に腎臓（１３１０６ｎｇ  ｅｑ．／ｇ）および血液（９２９４ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ）にそれぞれ血漿の０．７４倍および０．５２倍の放射能濃度が認められた。他の組織内放射能濃度は血漿の０．３９倍以下であった。投与後２４時間では、血漿（１５４０７１ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ）に最も高い放射能濃度が認められ、次に血液（６９７０８ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ）および皮膚（２９９２９１ｎｇ  ｅｑ．／ｇ）にそれぞれ血漿の０．４５倍および０．３９倍の放射能濃度が認められた。他の組織内放射能濃度は血漿の０．１９倍以下であった。投与後３３６時間では眼球、ハーダー腺、甲状腺、顎下腺、胸腺、副腎、脾臓、膵臓、精巣および前立腺の放射能濃度は、この時点で最高濃度を示しており、これらの組織へ標識化ＨＰＭＣ由来の放射能が蓄積していることを示唆する結果が得られた。さらに血液および血漿以外の組織についてもそれぞれ最高濃度の８７％〜３７％を示し，各組織からの消失が遅いことも明らかとなった。これらの結果は、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）が皮下より徐々に血液中に吸収され、各組織に分布して一部の組織では蓄積する傾向にあること、各組織から標識化ＨＰＭＣが消失するまでにかなりな時間を要することを示唆している。
【実施例３１】
【００９７】
さらに、マウスの静脈内に単回投与した際の標識化ＨＰＭＣに由来する放射能の体内での分布を視覚化して、詳細な局在を調べた。
〔評価方法〕
標識化ＨＰＭＣ（比活性；７４ｋＢｑ／ｍｇ）を、表４に示す用量で単回投与した動物（Ｔｇ７マウス）を所定時間にエーテル麻酔死させた後、全身オートラジオグラムを作製し、各組織への放射能分布について検討した。【００９８】
＜試験条件＞
【表４】
2007123187.tif 000008
【００９９】
＜作製方法＞
所定時間に動物をエーテル麻酔死させ，速やかに被毛を刈り取り，鼻腔および肛門を４％ＣＭＣ−Ｎａで塞いだ。ついでドライアイス・アセトン中で凍結し、得られた凍結屍体より前後肢および尾を切り離した後、４％ＣＭＣ−Ｎａで包埋し、ドライアイス・アセトン中で凍結後クライオミクロトームに固定した。作成した凍結ブロックに接着テープ〔住友スリーエム（株）製、「Ｎｏ．８１０」（型番）〕を貼り付け、クライオミクロトームにより、厚さ３０μｍの凍結切片を作製し、凍結乾燥した。乾燥後の切片を保護膜〔三菱ポリエステルフィルム（株）製、「ダイアホイル」（商品名）、厚さ：４μｍ〕で被った後、イメージングプレート〔富士写真フイルム（株）製、「ＴＹＰＥ  ＢＡＳ  ＳＲ２０４０」（商品名）〕と密着させ、室温下で鉛製シールドボックス内で一定期間露出した。露出後、イメージングプレート上の放射能像をＢＡＳ〔Ｂｉｏ−ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、富士写真フィルム（株）製、「ＦＵＦＩＸ−ＢＡＳ２５００」（商品名）〕により読み取り、ラジオルミノグラムを作製した。【０１００】
〔結果〕
結果を図５１〜５３に示す。図中、符号１〜２８は各符号を付した各引き出し線矢印近傍の組織を指しており、各符号の指す組織名は次に示す通りである。
１；副腎（Ａｄｒｅｎａｌ  ｇｌａｎｄ）
２；血液（Ｂｌｏｏｄ）
３；骨髄（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）
４；脳（Ｂｒａｉｎ）
５；褐色脂肪（Ｂｒｏｗｎ  ｆａｔ）
６；精巣上体（Ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ）
７；白色脂肪（Ｆａｔ）
８；胃内容物（Ｇａｓｔｒｉｃ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ）
９；ハーダー腺（Ｈａｒｄｅｒｉａｎ  ｇｌａｎｄ）
１０；心臓（Ｈｅａｒｔ）
１１；腸内容物（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ）
１２；腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）
１３；腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）
１４；肝臓（Ｌｉｖｅｒ）
１５；肺（Ｌｕｎｇ）
１６；顎下腺（Ｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｇｌａｎｄ）
１７；膵臓（Ｐａｎｃｒｅａｓ）
１８；下垂体（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｇｌａｎｄ）
１９；前立腺（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｇｌａｎｄ）
２０；骨格筋（Ｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｍｕｓｃｌｅ）
２１；皮膚（Ｓｋｉｎ）
２２；脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）
２３；胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）
２４；精巣（Ｔｅｓｔｉｓ）
２５；胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）
２６；甲状腺（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｇｌａｎｄ）
２７；膀胱（Ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ）
２８；膀胱中の尿（Ｕｒｉｎｅ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ）
標識化ＨＰＭＣを雄性Ｔｇ７マウスに２．５ｍｇ／ｂｏｄｙの用量で単回静脈内投与後２時間における組織内分布について全身オートラジオグラムにより検討したところ、膀胱内尿に最も高い放射能が認められ、次いで血液に高い放射能が認められた。肺、副腎、肝臓、腎臓、腸、下垂体、甲状腺、精巣上体、顎下腺、膀胱、胃、心臓、褐色脂肪、骨髄、膵臓、ハーダー腺、皮膚、前立腺、腸内容物、脾臓、胸腺、精巣には血液より低い放射能が、胃内容物、骨格筋、脳には更に低い放射能が認められた。白色脂肪の放射能は最も低かった。脳での放射能の分布は均一ではなく、放射能シグナルは脳の血管の局在に一致していることが示唆された。
実施例２９〜３１の結果を考え合わせると、以下の３点が示唆される。
（１）皮下に投与したＨＰＭＣは、そのものあるいはその分解修飾産物が徐々に血液中に吸収され体内の各組織に分布し、同時に主に尿中に排泄される。
（２）各組織中に分布したＨＰＭＣあるいはその分解修飾産物はきわめて徐々に分解あるいは組織外へ放出される。
（３）ＨＰＭＣあるいはその分解修飾産物が脳血液関門を越えて脳実質内に直接移行している可能性はきわめて低い。
【実施例３２】
【０１０１】
代表的コンフォメーション病の一つであるアルツハイマー病においては、その主な病気の原因の一つは脳内でのＡβ蛋白の凝集沈着と凝集Ａβによる神経細胞障害である。そこでセルロースエーテル類のＡβ蛋白の凝集への阻害効果をインビトロで検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
・メチルセルロース〔ＭＣ（ＳＭ−４）〕；実施例８に記載。
・ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣＬ）；実施例８に記載。
・０．３％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ；実施例２２に記載。
・４０％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ；実施例２２に記載。
〔評価方法〕
使用直前に蒸留水で溶かしたモノマー型Ａβ（１−４０）〔（株）ペプチド研究所製、「４３７９−ｖ」（カタログ番号）〕１ｍＭ溶液０．６μＬを、セルロースエーテル類のＰＢＳ（ｐＨ７．５）溶液と混合して、全量をＰＢＳで４０μＬに調製し、３７℃で２４時間反応させた。Ａβの終濃度は１５μＭであり、各セルロースエーテル類の終濃度を０．４、２、１０、５０μｇ／ｍＬとした。Ａβのアミロイド化の程度をナイキ（Ｎａｉｋｉ）、ナカクキ（Ｎａｋａｋｕｋｉ）によるチオフラビンＴ（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｔ）法〔Ｎａｉｋｉ  Ｈ、Ｎａｋａｋｕｋｉ  Ｋ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １９９６年、７４巻、２号、３７４−３８３頁〕に基づいて測定した。Ａβと化合物の混合反応液にチオフラビンＴを終濃度が５μＭになるように混合して蛍光・吸光マイクロプレートリーダー〔モレキュラダイナミックス社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）製、「Ｂｉｏｌｕｍｉｎ−９６０」（型番）、励起波長４５０ｎｍ／蛍光強度測定波長４８５ｎｍ〕で蛍光を測定した。なおチオフラビンＴを混合する前に化合物とＡβ蛋白の混合反応液の蛍光を測光しておき、その値をチオフラビンＴを混合後の蛍光測光値から除算した。測定値は対照（化合物なし）群を１００％として相対値（％）に換算した。【０１０２】
〔結果〕
結果を図５４〜５８に示す。図中、［ＨＬ］、［ＳＯ］、［ＴＯ］、［Ｔ１］、［Ｔ３］はそれぞれＨＰＣＬ、ＭＣ（ＳＭ−４）、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、０．３％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、４０％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を示す。ＨＰＣＬ（ＩＣ５０＝５．１μｇ／ｍＬ）とＭＣ（ＳＭ−４）（ＩＣ５０＝５．３μｇ／ｍＬ）は、ほぼ同程度のＡβ蛋白凝集阻害活性を示した。０．３％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）（ＩＣ５０＝１３．８μｇ／ｍＬ）はＨＰＣＬ、ＭＣ（ＳＭ−４）よりは活性はやや低かった。一方、加水分解未処理のＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）や４０％塩酸加水分解ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）はＨＰＣＬ、ＭＣ（ＳＭ−４）より阻害効果がきわめて弱かった。
【実施例３３】
【０１０３】
セルロースエーテル類について、凝集Ａβによる神経細胞障害に対する保護効果を神経細胞・グリア細胞混合培養系で検討した。
〔評価方法〕
１６穴スライドチャンバーで培養を行ったＷｉｓｔａｒラット胎仔由来神経細胞・グリア混合培養系に凝集Ａβ１−４０（３５μＭ）と実施例３２で検討したセルロースエーテル類のＰＢＳ溶液（８、４０、２００μｇ／ｍＬ）を添加して２日間インキュベートを行った（各ｎ＝３）。その後、細胞を固定して神経細胞の細胞体や樹状突起に存在する微小管結合蛋白（ＭＡＰ２）に対する免疫染色を行った。標本は格子を付けた接眼レンズを装着した光顕下（対物レンズＸ２０  接眼レンズＸ１０）でＭＡＰ２陽性細胞数を算定した。算定部位は各ウエルの中心部１箇所を設定した。Ｗｉｓｔａｒラット胎仔由来神経細胞・グリア混合培養は妊娠１８−１９日目の雌Ｗｉｓｔａｒラットの胎児を用いて、「畠中寛、津久井弘子、実験医学別冊  神経生化学マニュアル（１９９０）  ｐ１２９−１３５  中枢諸神経核神経細胞の培養」の方法に基づき神経細胞とアストログリア細胞を調整した。神経細胞１０６／ｍＬの密度に抗生物質混合液（Ｓｉｇｍａ，  カタログ番号  Ａ９９０９）を添加した１０％ＦＢＳ／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号  ２１１０３−０４９）で希釈したものを、アストログリア細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｔに増殖した１６穴スライドチャンバー内に分注し（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）ＣＯ２インキュベーター中で培養を行った。混合培養開始３日後に培地をＢ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号  １７５０４−０４４）添加Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍに交換し実験に供した。Ａβ凝集体は、Ａβ１−４０〔（株）ペプチド研究所製、４３７９−ｖ（カタログ番号）〕を１ｍＭの濃度でＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）〔Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、１１８８５−０８４（商品番号）〕に溶解させ、２週間ＣＯ２インキュベーターでインキュベートさせて作製し、ＤＭＥＭで稀釈して実験に用いた。ＭＡＰ２に対する免疫染色は以下のように行った。
細胞をＰＢＳで洗浄した後に、−３０℃に冷やした５％酢酸添加９５％エタノールに細胞を１０分間浸漬して細胞を固定した。ＰＢＳで十分に洗浄した後に、内因性ペルオキシダーゼのブロック処理を行った。１％ウシ血清アルブミン加ＰＢＳで１５分間反応させた後、ＰＢＳで３回に洗浄を行い、抗ＭＡＰ２抗体〔ＳＩＧＭＡ社製、「Ｍ−１４０６」（商品番号）、１％ウシ血清アルブミン加ＰＢＳで４００倍希釈〕を４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後にホースラディシュペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、「ＮＡ９３ＩＶ」（商品番号）、１％ウシ血清アルブミン加ＰＢＳで１００倍稀釈〕を室温で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄した後に、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を用いてペルオキシダーゼ反応で抗原抗体複合体を可視化した。【０１０４】
〔結果〕
結果を図５９〜６３に示す。図中の［ＨＬ］、［ＳＯ］、［ＴＯ］、［Ｔ１］、［Ｔ３］はそれぞれＨＰＣＬ、ＭＣ（ＳＭ−４）、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、０．３％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、４０％塩酸による加水分解ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）を示す。セルロースエーテル類を８，４０，２００μｇ／ｍＬ濃度で添加した際に、４０μｇ／ｍＬまでの濃度ではいずれのセルロースエーテル類も濃度依存的にＡβに対する神経細胞保護効果を示した。４０％塩酸加水分解ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）はやや効果が低かった。４０μｇ／ｍＬ濃度においては、ＨＰＣＬとＭＣ（ＳＭ−４）とＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）はほぼ同程度の神経細胞保護効果を示した。２００μｇ／ｍＬ濃度ではＭＣ（ＳＭ−４）や加水分解ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）でさらに効果の上昇が見られたのに対して、ＨＰＣＬやＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）では４０μｇ／ｍＬ濃度よりやや効果が下がる傾向があった。この結果はＡβの凝集阻害効果の結果とそれほど矛盾しないものであった。
【実施例３４】
【０１０５】
実施例３２および実施例３３よりアルツハイマー病の治療効果が期待されることより、アルツハイマー病の疾患モデル動物（マウス）を用いてセルロースエーテル類の効果を検討した。
〔評価に用いたセルロースエーテル類〕
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）〕；実施例１に記載。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）〕；実施例６に記載。
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４００）〕；実施例１１に記載。
〔評価方法〕
疾患モデルマウスとして変異型アミロイド前駆体蛋白と変異型タウ蛋白を発現しているＡＰＰ／Ｔａｕトランスジェニックマウス〔Ｔａｃｏｎｉｃ社製、６００９０２（商品番号）〕を用いた。一群は同じ週齢の雌五匹で構成し、セルロースエーテル類は２５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＢＳ溶液とし、対照にはＰＢＳのみを用いた。実施例１０と同様にして浸透圧ポンプに各溶液を充填して第１５週齢時より４週間の脳室内への投与を開始した。第２０週齢時からはセルロースエーテル類２５ｍｇ／ｍＬ濃度の各溶液０．２５ｍＬをそれぞれのマウスの腹腔内に１週おきに投与を行い第３０週齢時まで投与を継続した。第３９週齢時よりブドウ糖液消費試験を開始した。また、第４０週齢時よりブロウイング（ｂｕｒｒｏｗｉｎｇ）試験を開始した。両試験はボーシェ（Ｂｏｃｈｅ）らの方法〔Ｄ．Ｂｏｃｈｅ，Ｃ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ、２００６年、２２巻、６３８−６５０頁〕に準じ、週一回の割合で朝９時より翌日朝９時まで実施した。ブロウイング試験では、パイプ（直径７６ｍｍ、長さ２００ｍｍ、床から入り口の高さ３０ｍｍの塩化ビニールパイプ）にペレット状のエサを１９０ｇ入れ、次の日パイプに残っているエサの重さを測定し、移動させた量を計算した。ブドウ糖液消費試験では５％ブドウ糖液〔Ｄ（＋）ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業（株）製、「０４１−００５９５」（カタログ番号）〕を蒸留水で溶解）を調製し、給水ビンに充填してマウスに自由給水させた。次の日残量を測定し、ブドウ糖液の消費量を計算した。【０１０６】
〔結果〕
ブロウイング試験の結果を図６４に示す。ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）投与群もＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４００）投与群も、対照群に比して有意に（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）成績が良好であった。また、ブドウ糖液消費試験の結果を図６５に示す。ＨＰＭＣ（６０ＳＨ−５０）投与群もＨＰＭＣ（６０ＳＨ−４００）投与群も、対照群に比して有意に（ともにｐ＜０．０５）成績が良好であった。以上の結果は、セルロースエーテル類がインビボにおいてもアルツハイマー病に対して治療効果を発揮し得ることを示している。
【実施例３５】
【０１０７】
アミロイドーシスもコンフォメーション病を代表する疾患群であるが、リュウマチやクーロン病等の慢性炎症性疾患に付随して末梢緒臓器に蓄積するＡＡアミロイドの動物疾患モデルにおいてセルロースエーテル類の発病抑制効果をインビボで検討した。この動物疾患モデルで得られた成果は、ＡＡアミロイドーシスへの適応だけではなく、他のアミロイドーシスやアルツハイマー病などへの適応の応用が可能であることが知られている（非特許文献５、７及び８）。
〔評価方法〕
このモデルではマウスに起炎剤を投与してヒトの病態と同様に炎症反応蛋白である血清アミロイドＡ蛋白（ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＡＡ）の血中濃度を亢進させ、ＳＡＡから切り出されるアミロイド形成蛋白であるアミロイドＡ蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＡ）が凝集して末梢緒臓器（脾臓、肝臓が最も好発）に蓄積する。単に炎症だけ惹起するとマウスにアミロイドが蓄積するまで１ヶ月以上の期間がかかるが、起炎剤の投与と同時またはそれ以前にＡＡアミロイド蓄積組織ホモジネート（ａｍｙｌｏｉｄ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＡＥＦ）を投与するとアミロイドが蓄積するまでの期間を数日に短縮できることが知られている。【０１０８】
６ヶ月齢以上の雌のＩＣＲマウス（日本クレアより入手、近交系Ｊｃｌ：ＩＣＲマウス、体重約３０ｇ／匹）の背部皮下にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）、ＭＣ（ＳＭ−４）、ＨＰＣＬを５０ｍｇあるいは７５ｍｇあるいは１００ｍｇを投与した（投与方法は実施例２の場合と同様にオブラートに包み皮下に埋入）。化合物非投与群（オブラートのみ）を対照とした。各群１匹を用いた。投与してから１．５ヶ月後あるいは４ヵ月後にＡＥＦと起炎剤を投与しアミロイドーシスを発症させた。ＡＥＦは、既にアミロイドが十分に蓄積したＡＡアミロイドマウスの脾臓、肝臓の混合物に重量の３倍のＰＢＳを添加し、ポリトロンホモジナイザーを使ってホモジナイズして調製した。これをＰＢＳでさらに２倍に希釈したもの０．５ｍＬをマウスの腹腔内に投与した。起炎剤は、アゾカゼイン〔シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製〕を滅菌水で溶解して１０％溶液を作製し、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＧＩＦＣＯ社製）を等量添加して冷やしながらポリトロンホモジナイザーでホモジナイズして乳液状とした。これを１匹あたり０．５ｍＬ背部の皮下に投与した。１週間後にマウスより肝臓、脾臓を取り出し、バッファー化ホルマリンに１週間浸けて固定した後にパラフィン包埋し、０．４μｍの組織切片を作製した。その組織切片にコンゴー赤染色を行い、偏光顕微鏡下で緑色複屈折を呈するアミロイドを検出した。また、連続する組織切片をＳＡＡに対する抗体で免疫染色を行いＡＡ（アミロイド）の沈着を検出した。免疫染色は、以下のように実施した。
内因性ペルオキシダーゼのブロック処理を行った組織切片を９８％蟻酸で室温５分間処理した。組織切片をＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）５０ｍＭで２回、蒸留水で１回洗浄した後に０．１％・Ｎ−ドデシルサルコシン酸ナトリウム（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）、２５ｍＭ・ＮａＯＨ、２％・ＮａＣｌ液で室温１０分間処理した。流水、蒸留水、Ｔｒｉｓ塩酸５０ｍＭで十分に洗浄した後に抗ＳＡＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ｓｃ−２０６５１（商品番号）、０．１％ウシ血清アルブミン加ＰＢＳで５００倍希釈）を室温で１時間反応させた。Ｔｒｉｓ塩酸５０ｍＭで十分に洗浄した後に、ＨＩＳＴＯＦＩＮＥ（株式会社ニチレイバイオサイエンス製）液を組織切片上に滴下し室温３０分反応させた。Ｔｒｉｓ塩酸５０ｍＭで十分に洗浄した後に、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を用いてペルオキシダーゼ反応で抗原抗体複合体を可視化した。【０１０９】
〔結果〕
結果を表５および図６６〜７１に示す。表中、［−］はアミロイドあるいはＡＡの蓄積を認めないこと、［±］はごく一部にアミロイドあるいはＡＡの蓄積を認めること、［＋］はアミロイドあるいはＡＡの蓄積を広汎に認めることを示している。【０１１０】
【表５】
2007123187.tif 000009
【０１１１】
図６６〜７１はアミロイド作製４ヶ月前にＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）１００ｍｇを投与したマウスの標本と化合物非投与の対照マウスの標本であり、［ＨＥ］はヘマトキシエオジン染色、［Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄ］はコンゴー赤染色、［ＳＡＡ］は抗ＳＡＡ抗体による免疫染色を示している。ＭＣ（ＳＭ−４）は、アミロイドあるいはＡＡの蓄積をほとんど抑制しなかったが、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）やＨＰＣＬではアミロイドあるいはＡＡの蓄積を顕著に抑制した。このことは、ＨＰＭＣ（ＴＣ−５ＲＷ）やＨＰＣＬがアミロイドーシスの治療予防効果のあることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、身近にあり、かつ安全な化合物を用いて、これまで難病といわれたコンフォメーション病に対する予防、治療薬となるものであり、人に対しては、これらの疾患の発症を予防し、また発症後の生命予後を改善することにより福祉の向上や医療経済の負担軽減に大いに貢献する。また、動物、特に家畜においては、これらの疾患の発症を予防することにより商品価値を失うことなく安全性が確保される。
【図４】
2007123187.tif 000012
【図５】
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【図２１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月5日(2009.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）〔式中、少なくとも１つのＲはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＯＭから選ばれ、他のＲはＨであり、ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａから選ばれる。〕で表される構造単位を有するセルロースエーテル、前記セルロースエーテルのアルカリ金属塩、前記セルロースエーテルの脂肪族酸エステル、およびこれらの混合物から選ばれる一種以上のセルロースエーテル類を有効成分として含有することを特徴とするコンフォメーション病の予防及び治療薬。
2007123187.tif 000083
【請求項２】
前記セルロースエーテル類が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびメチルセルロースから選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項１記載のコンフォメーション病の予防及び治療薬。
【請求項３】
ヒトを含む哺乳動物に投与可能に製剤化されたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病の予防及び治療薬。
【請求項４】
注射剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、酒精剤、エリキシル剤、リモナーデ剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、チンキ剤、ローション剤、リニメント剤、エアゾール剤、坐剤から選ばれた剤型に製剤化されたものであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のコンフォメーション病の予防及び治療薬。
【請求項５】
コンフォメーション病が、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeldt-Jakob disease;CJD）ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Gerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome）、致死性家族性不眠症（Fatal familial insomnia）、ウシにおけるウシ海綿状脳症（bovine spongiform encephalopathy ;BSE）、ヒツジにおけるスクレイピー（scrapie）、シカにおける慢性消耗性疾患のいずれかのプリオン病であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のコンフォメーション病の予防及び治療薬。
【請求項６】
コンフォメーション病が、アルツハイマー病であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のコンフォメーション病の予防及び治療薬。
【請求項７】
コンフォメーション病が、アミロイドーシスであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のコンフォメーション病の予防及び治療薬。
【国際調査報告】
2007123187.tif 000084
2007123187.tif 000085
2007123187.tif 000086
2007123187.tif 000087