【手続補正書】
【提出日】令和1年6月19日(2019.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）免疫抑制性マクロファージ集団を得るために、ヒト単球集団をインターロイキン−３４（ＩＬ−３４）ポリペプチドの存在下で培養するステップと；（ｂ）ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）集団およびステップ（ａ）で得られた免疫抑制性マクロファージ集団を共培養するステップと；（ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）で得られたヒトＴｒｅｇ細胞集団を単離するステップと、を含む、ヒトＴｒｅｇ細胞集団を得る方法。
【請求項２】
免疫抑制性マクロファージ集団が、ヒトＰＢＭＣ集団と同種異系である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法により得ることができる単離ヒトＴｒｅｇ細胞集団。
【請求項４】
前記Ｔｒｅｇ細胞が、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞および／またはＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞である、請求項３に記載の単離ヒトＴｒｅｇ細胞集団。
【請求項５】
前記Ｔｒｅｇ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞および／またはＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞である、請求項３に記載の単離ヒトＴｒｅｇ細胞集団。
【請求項６】
薬物としての使用のための、請求項３に記載の単離ヒトＴｒｅｇ細胞集団。
【請求項７】
免疫および／または炎症性の疾患または状態の予防または処置における使用のための、請求項３に記載の単離ヒトＴｒｅｇ細胞集団。
【請求項８】
前記免疫／炎症性疾患または状態が、移植片拒絶およびＧＶＨＤを含む群から選択される、請求項７に記載の使用のための単離ヒトＴｒｅｇ細胞集団。
【請求項９】
ＰＢＭＣ集団から濃縮Ｔｒｅｇ集団を得るため、または免疫抑制性マクロファージ集団を得るための、ＩＬ−３４の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法のステップ（ａ）で得られた免疫抑制性マクロファージ集団。
【請求項１１】
薬物としての使用のための、請求項１０に記載の免疫抑制性マクロファージ集団。
【請求項１２】
免疫および／または炎症性の疾患または状態の予防または処置における使用のための、請求項１０に記載の免疫抑制性マクロファージ集団。
【請求項１３】
前記免疫／炎症性疾患または状態が、移植片拒絶およびＧＶＨＤを含む群から選択される、請求項１２に記載の使用のための免疫抑制性マクロファージ集団。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】制御性Ｔ細胞を得る方法およびその使用
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫療法の分野のものである。より詳細には本発明は、制御性Ｔ細胞の集団を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ細胞およびＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを包含する制御性Ｔ細胞または「Ｔｒｅｇ」は、Ｔｒｅｇが他の免疫細胞の活性を急速に抑制し得るという点において、様々な免疫応答の制御に不可欠である。特にＴｒｅｇは、自己および非自己抗原に対する望ましくない免疫応答をダウンレギュレートすることによって寛容を維持するのに必須である。例えばＴｒｅｇ欠損は、多発性硬化症（ＭＳ）、Ｉ型糖尿病（ＴＩＤ）、乾癬、重力筋無力症（ＭＧ）および他の自己免疫疾患の患者で発見されている。類似の関係が、アトピー性およびアレルギー性疾患でも存在し得る。これらの疾患全てで、患者のＴｒｅｇ細胞のインビトロ免疫抑制の低減を指摘する報告が存在する。これにより、自己免疫疾患、アレルギー、および移植関連合併症、例えば移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を処置または予防するための免疫療法においてＴｒｅｇを使用する可能性への関心が高まった。
【０００３】
例えば臓器移植により、急性拒絶の予防および処置の両方において非常に顕著な改善が認められるが、不顕性エピソードおよび慢性移植片機能障害は、依然として中期および長期移植片生着に重大な影響を及ぼす（１）。新規の治療戦略、中でもドナー抗原に対する寛容誘導は、数年の実験モデル研究を経た後臨床段階に移行している（２、３）。天然のメカニズムおよび寛容誘導戦略のうち、異なるタイプのＣＤ４＋Ｔｒｅｇなどの異なるタイプの制御性細胞の使用は、中でも最も有望なものとされる（４）。ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ）の使用は、近年になりそれ自体が、そしてそれ以外では、移植分野と他の病理学的状況でも脚光を浴びるようになった（５〜８）。
【０００４】
したがって、自己免疫、アレルギー、移植、治療タンパク質による処置および遺伝子療法の分野で特に関心の高いＴｒｅｇ細胞のそのような精製集団を得て、免疫系による自己または治療分子／組織の分解を回避するために、Ｔｒｅｇ細胞を高純度で、そしてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇを同時に、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を含まずに作製および増大（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）するのに有用な方法が、特に必要とされている。
【０００５】
インターロイキン−３４（ＩＬ３４）は、２００８年に同定された（９）。研究によって、ＩＬ３４がＭ−ＣＳＦと相同性を共有し、それらが単球の細胞表面で発現されるＣＳＦ−１Ｒとも呼ばれる共通の受容体ＣＤ１１５を通して（９）、そして脳では新たに記載された受容体である受容体型タンパク質−チロシンホスファターゼζ（ＰＴＰ−ζ）を通して（１０）作用することが示された。しかし、研究によって、ＩＬ３４およびＭ−ＣＳＦが、空間的および時間的発現の違いを一部の理由として（１２）、別個の生物活性およびシグナル活性化（１１）を示すことが実証されている。現在までＩＬ３４の機能は、単球およびマクロファージ（破骨細胞、ミクログリア）の生存および機能に主として関連づけられている（１２）。休止期の細胞におけるＩＬ３４タンパク質発現は、ケラチノサイト、毛包、ニューロン、近位尿細管細胞および精細管生殖細胞（１２）において、ならびに心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、前立腺、結腸、小腸、脾臓赤色髄および破骨細胞（９）においても観察されている。これまでＩＬ３４は、ＤＣまたはＴ細胞の免疫機能に及ぼす影響には関連づけられていない（１２）。
【０００６】
より近年になり、ＩＬ３４は、ＩＬ３４分化マクロファージがＴＣＲ依存性Ｔ細胞増殖（１３）を抑制することから、ヒト単球の免疫抑制性マクロファージ（ＩＬ３４−Ｍφとも称される）への分化を誘導すること、移植の寛容を誘導すること（１３）、およびＴｈ１７細胞と呼ばれるＩＬ−１７産生エフェクターＴヘルパー細胞を誘導すること（１４）も示された。しかし、ＩＬ３４分化マクロファージが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＴｒｅｇを作製および増大させるのに有用であることは、これまで示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明は、制御性Ｔ細胞集団を得る方法に関する。特に本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、血液試料などの患者から得られた生体試料中に含まれるＴｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇの場合通常５％）を単離する予備ステップを行わずに、ＰＢＭＣからＴｒｅｇを作製および増大させるための新規の効率的方法についての結果に基づく。本発明者らは実際に、ヒトＩＬ３４分化マクロファージが、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（６０％超）と、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ（ほぼ１００％）と、を含むヒトＴｒｅｇを増大および増強することを示した。その上、本発明者らは、本発明の方法により得られたＩＬ３４増大Ｔｒｅｇが、非刺激およびポリクローナル刺激のＴｒｅｇと比較して、最大１６：１のエフェクター：サプレッサー比で非常に強力な抑制能を示すことを実証した。
【０００９】
ヒト制御性Ｔ細胞集団を得る方法
したがって本発明の一態様は、ａ）免疫抑制性マクロファージ（「ＩＬ３４分化マクロファージ」とも称される）集団を得るために、ヒト単球集団を一定量のインターロイキン−３４（ＩＬ−３４）ポリペプチドを含む培地で培養するステップと、ｂ）ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）集団およびステップ（ａ）で得られた免疫抑制性マクロファージ集団を共培養するステップと、を含む、ヒトＴｒｅｇ細胞集団を得るためのインビトロ／エクスビボ方法に関する。
【００１０】
幾つかの実施形態において、方法は、ａ）免疫抑制性マクロファージ集団を得るために、ヒト単球集団を一定量のインターロイキン−３４（ＩＬ−３４）ポリペプチドを含む培地で培養するステップと、ｂ）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団およびステップａ）で得られた免疫抑制性マクロファージ集団を、ＰＢＭＣ集団に含まれるヒトＴｒｅｇ細胞集団を増大させるのに適した培地で共培養するステップと、ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）で得られたヒトＴｒｅｇ細胞集団を単離するステップと、を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、ステップ（ｂ）の前にＰＢＭＣ集団からヒトＴｒｅｇ細胞集団を単離するステップを含む。それゆえこの実施形態によれば、ステップ（ｂ）は、ＰＢＭＣ集団から単離されたヒトＴｒｅｇ細胞集団およびステップ（ａ）で得られた免疫抑制マクロファージ集団を共培養することを含む。
【００１２】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、ステップ（ｂ）の共培養の後に、ヒトＴｒｅｇ細胞集団を単離するステップを含む。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「制御性Ｔ細胞」は、異常または過剰な免疫反応を抑制し、免疫寛容において役割を担うＴ細胞を指す。制御性Ｔ細胞は典型的には、「フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３＋）制御性Ｔ細胞」および「ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ細胞」である。本明細書で用いられる用語「フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３＋）制御性Ｔ細胞」または「Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞」は、その特徴的マーカーが転写因子Ｆｏｘｐ３である、ヒトおよびげっ歯類（ラットまたはマウス）におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の２〜１０％を指す。
【００１４】
ステップ（ａ）では、出発原料として働くヒト単球集団は、当該技術分野で公知の任意技術により単離され得る。例えばヒト単球集団は、ＰＢＭＣを含有する様々な生体試料から得ることができる。典型的にはそれらは、末梢血から単離される。それらは、異なるリガンド（例えば、ＣＤ１４）で標識されたビーズを用いた正の選択により単離され得る。そのような標識細胞は、その後、以下に記載される通り細胞選別などの様々な技術により分離され得る。
【００１５】
幾つかの実施形態において、ヒト単球集団は、したがってＣＤ１４＋ヒト単球集団である。幾つかの実施形態において、ヒト単球集団は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋ヒト単球集団である。幾つかの実施形態において、ヒト単球集団、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−ヒト単球集団である。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「培地」は、細胞の生存率を維持して増殖を支援する栄養素を含有する、細胞集団を維持するため、または細胞集団を培養するための媒体（例えば、培養培地）を指す。
【００１７】
培地は、以下の適当な組み合わせのいずれかを含有し得る：塩、緩衝剤、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または代替血清、および他の成分、例えば増殖因子、サイトカインなど。特定の細胞タイプで通常用いられる培地は、当業者に公知である。本発明の培地は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＲＰＭＩ１６４０などの市販の培地を基本とし得る。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「インターロイキン−３４ポリペプチド」または「ＩＬ−３４ポリペプチド」（Ｉｌ−３４）は、当該技術分野で周知であり、単球およびマクロファージの増殖、生存および分化を促進するサイトカインを指す。用語は、天然由来ＩＬ−３４アイソフォーム（例えば、Ｑ８１を含む、および含まないＱ６ＺＭＪ４およびＱ６ＺＭＪ４−２）、変異体、およびその修飾形態を包含する。天然由来ヒトＩＬ−３４タンパク質は、受託番号Ｑ６ＺＭＪ４としてＵｎｉＰｒｏｔデータベースに提供された２４２アミノ酸のアミノ酸配列を有し、以下の通り示される（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）か、または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
ＭＰＲＧＦＴＷＬＲＹＬＧＩＦＬＧＶＡＬＧＮＥＰＬＥＭＷＰＬＴＱＮＥＥＣＴＶＴＧＦＬＲＤＫＬＱＹＲＳＲＬＱＹＭＫＨＹＦＰＩＮＹＫＩＳＶＰＹＥＧＶＦＲＩＡＮＶＴＲＬＱＲＡＱＶＳＥＲＥＬＲＹＬＷＶＬＶＳＬＳＡＴＥＳＶＱＤＶＬＬＥＧＨＰＳＷＫＹＬＱＥＶＥＴＬＬＬＮＶＱＱＧＬＴＤＶＥＶＳＰＫＶＥＳＶＬＳＬＬＮＡＰＧＰＮＬＫＬＶＲＰＫＡＬＬＤＮＣＦＲＶＭＥＬＬＹＣＳＣＣＫＱＳＳＶＬＮＷＱＤＣＥＶＰＳＰＱＳＣＳＰＥＰＳＬＱＹＡＡＴＱＬＹＰＰＰＰＷＳＰＳＳＰＰＨＳＴＧＳＶＲＰＶＲＡＱＧＥＧＬＬＰ、
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列を有するポリペプチドである。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、天然または合成のいずれで生成されるかにかかわらず、長さが明白に示されていない、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。用語「ポリペプチド」は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化などを含むがこれらに限定されない翻訳後修飾を除外しない。用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然由来アミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然由来アミノ酸ポリマーおよび非天然由来アミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「ＩＬ−３４ポリペプチド」は、天然由来ヒトポリペプチドＩＬ−３４およびポリペプチドの天然由来対立遺伝子変異体（例えば、変異体ｒｓ８０４６４２４およびｒｓ７２０６５０９）を含むものと定義される。対立遺伝子変異体は、ポリペプチドまたはタンパク質においてアミノ酸変化をもたらし得る、またはもたらし得ない、種の集団における天然由来の塩基変化である。加えて、本発明によるＩＬ−３４ポリペプチドは、全長のＩＬ−３４およびその変異体を含む、またはそれからなるポリペプチドを包含するだけでなく、該断片に生物活性があることを条件としてその断片からなるポリペプチドも包含する。加えて、ポリペプチドおよびそのＤＮＡ配列内で誘導された修飾を含み得る、ポリペプチドＩＬ−３４の組換え体および合成変異体の両方が、この定義に含まれる。したがって用語ＩＬ−３４ポリペプチドは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によりコードされたＩＬ−３４ポリペプチドの機能的均等物を包含するものとする。
【００２１】
本明細書で用いられる「機能的均等物」は、親ポリペプチドの生物活性および特異性を保持する分子（例えば、組換えポリペプチド）を指す。それゆえ用語「ＩＬ−３４ポリペプチドの機能的均等物」は、該機能的均等物が、以下に記載される参照ポリペプチドの生物活性の少なくとも１つ、好ましくは全てを示すことを条件として、参照するポリペプチド（即ち、ＩＬ−３４ポリペプチド）の変異体および断片を包含する。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド変異体」は、ネイティブ配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物活性ポリペプチドを指す。そのような変異体としては、例えば１つまたは複数のアミノ酸残基がポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で付加または欠失されたポリペプチドが挙げられる。通常、変異体は、ネイティブ配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２３】
本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、サブジェクトポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり最大５個のアミノ酸改変を含み得ることを除き、サブジェクトポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であることを意図する。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、サブジェクト配列中のアミノ酸残基の最大５％（１００個中の５個）が、挿入、欠失、または別のアミノ酸で置換され得る。本出願の枠組みにおいて、同一性の百分率は、グローバルアライメントを用いて計算される（即ち、２つの配列が全長で比較される）。２つまたはそれ超の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ニードルマン−ブンシュ・グローバルアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３）を用いて、その全長を考慮して２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を見出す「ニードル」プログラムを、用いることができる。ニードルプログラムは、例えばｅｂｉ．ａｃ．ｕｋワールドワイドウェブサイトで入手できる。本発明による同一性の百分率は、好ましくは「Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ」パラメータ１０、「Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ」パラメータ０．５、およびＢｌｏｓｕｍ６２行列と共にＥＭＢＯＳＳ：：ニードル（グローバル）プログラムを用いて計算される。参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の」アミノ酸配列からなるポリペプチドは、参照配列と比較して、欠失、挿入および／または置換などの突然変異を含み得る。参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、参照配列の対立遺伝子変異体に対応し得る。例えばそれは、参照配列と比較して置換のみを含み得る。置換は、好ましくは以下の表に示される保存的置換に対応する。
【表１】
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【００２４】
本明細書で用いられる、ポリペプチド「断片」は、参照ポリペプチドよりも短い生物活性ポリペプチド（即ち、ＩＬ−３４ポリペプチドの断片）を指す。したがって、本発明によるポリペプチドは、断片に生物活性があることを条件として、ＩＬ−３４の断片を含む、またはそれからなるポリペプチドを包含する。
【００２５】
本発明の枠組みにおいて、生物活性断片は、例えばＩＬ−３４ポリペプチドの少なくとも１７５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０連続アミノ酸を含み得る。
【００２６】
ＩＬ−３４またはその機能的均等物の「生物活性」は、免疫抑制性マクロファージを誘導する能力を意味する（実施例の節に記載）。当業者は、ＩＬ−３４ポリペプチドの機能的均等物に生物活性があるか否かを容易に決定することができる。新たに作製されたポリペプチドが、免疫抑制性マクロファージを誘導するか否かをチェックするために、ＦＡＣＳ分析または単細胞の遺伝子発現プロファイリング（実施例の節を参照）が、各ポリペプチドで実施され得る。
【００２７】
幾つかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、タグを含み得る。タグは、該ポリペプチドの精製に有用であり得るエピトープ含有配列である。タグは、免疫標識技術を用いた細胞または組織試料内の前記ポリペプチドの位置特定、イムノブロッティングによる前記ポリペプチドの検出などのために、アフィニティークロマトグラフィーなどの種々の技術によって結合される。当該技術分野で一般に用いられるタグの例は、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）−タグ、ＦＬＡＧ（商標）タグ、Ｓｔｒｅｐタグ（商標）、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ（典型的には６ヒスチジン残基からなる）などである。
【００２８】
幾つかの実施形態において、本発明の方法のステップ（ａ）で用いられたＩＬ−３４ポリペプチドは、近年記載された通りヘテロダイマーＩＬ−３４／ＭＣＳＦである（１５）。
【００２９】
幾つかの実施形態において、本発明の方法のステップ（ａ）において、ヒト単球集団は、ＩＬ−３４および別のサイトカイン、例えばＩＬ−４またはＩＬ−１０などの存在下で培養される。幾つかの実施形態において、本発明の方法のステップ（ａ）において、ヒト単球集団は、ＩＬ−３４および増殖因子、例えばＭＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）の存在下で培養される。
【００３０】
幾つかの実施形態において、ＩＬ−３４は、ヒトインターロイキン−３４（ｈＩＬ−３４）、好ましくは組換えヒトインターロイキン−３４（ｒｈＩＬ−３４）である。
【００３１】
典型的にはＩＬ−３４は、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に添加される。
【００３２】
典型的にはＩＬ−４は、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に添加される。
【００３３】
典型的にはＩＬ−１０は、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に添加される。
【００３４】
典型的にはＭＣＳＦは、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは２５ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に添加される。
【００３５】
一定量のＩＬ−３４を含む培地中でヒト単球集団を培養するステップ（ａ）は、免疫抑制性マクロファージ（またはＩＬ３４分化マクロファージ）集団の獲得に要する所要時間の間、実施される。
【００３６】
典型的には、目的の培地でのヒト単球の培養は、少なくとも３または４日から８日を超えない期間、好ましくは６日間実施される。幾つかの実施形態において、目的の培地でのヒト単球の培養は、３、４、５、６、７もしくは８日間、またはより長く実施される。
【００３７】
ステップ（ｂ）では、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）集団は、当業者に周知の方法により（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）密度勾配遠心分離などの密度勾配遠心により）単離され得る。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「増大させること」は、所定の細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞）集団を変換および／または増幅する工程を指す。Ｔ細胞の増大は、好ましくは抗原特異的刺激剤、例えば抗原、細胞、抗体、レクチンなどの存在下でＴ細胞を含む細胞集団を培養することにより実施される。増大はまた、サイトカインの存在下でのＴ細胞の培養を必要とし得る。
【００３９】
幾つかの実施形態において、Ｔｒｅｇを増大させるのに適した培地は、一定量の少なくとも１種のサイトカインを含む。Ｔｒｅｇを増大させるのに適した培地に存在し得るサイトカインの例としては、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−３４および炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１（特にＩＬ−１β）、ＩＬ−６およびＴＮＦαなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
幾つかの実施形態において、Ｔｒｅｇを増大させるのに適した培地は、一定量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）および／または一定量のインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含む。
【００４１】
幾つかの実施形態において、Ｔｒｅｇを増大させるのに適した培地は、一定量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）および一定量のインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含む。
【００４２】
幾つかの実施形態において、ＩＬ−２は、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）、好ましくは組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）である。ｒｈＩＬ−２は、医薬的用途のために市販されている。適切な商品としては、例えばＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）の組換えヒトＩＬ−２組成物が挙げられる。
【００４３】
幾つかの実施形態において、ＩＬ−１５は、ヒトインターロイキン−１５（ｈＩＬ−１５）、好ましくは組換えヒトインターロイキン−１５（ｒｈＩＬ−１５）である。
【００４４】
典型的にはＩＬ−２は、１〜２５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは２５ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。幾つかの実施形態において、ＩＬ−２は、１〜１０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１０〜５００Ｕ／ｍｌの範囲内、より好ましくは２５Ｕ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００４５】
典型的にはＩＬ−１５は、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２．５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００４６】
典型的にはＩＬ−１２は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００４７】
典型的にはＩＬ−４は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００４８】
典型的にはＩＬ−７は、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２．５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００４９】
典型的にはＩＮＦγは、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００５０】
典型的にはＩＬ−３４は、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００５１】
典型的にはＩＬ−１は、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２．５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００５２】
典型的にはＩＬ−６は、１〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００５３】
典型的にはＴＮＦは、１〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００５４】
典型的にはＴＧＦβは、０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００５５】
ＰＢＭＣ集団に含まれるヒトＴｒｅｇ細胞集団を増大させるのに適した培地中で、免疫抑制性マクロファージ（ＩＬ３４分化マクロファージとも呼ばれる）およびＰＢＭＣを共培養するステップ（ｂ）は、Ｔｒｅｇ細胞の増大に要する所要時間の間、実施される。
【００５６】
幾つかの実施形態において、ＰＢＭＣは、免疫抑制性マクロファージと同種異系である。本明細書で用いられる用語「同種異系」は、同じ種であるが、遺伝的に異なる２つの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプを有する異なる個体を指す。したがってＰＢＭＣは、移植ドナーから単離され、免疫抑制性マクロファージは、レシピエントから単離され得る。あるいはＰＢＭＣは、自己免疫疾患もしくはアレルギーに罹患した患者から、または臓器移植の必要があるもしくは臓器移植を待機中の患者から、または骨髄ドナーから（例えば、ＧＶＨＤを処置するための）、または健常個体から単離され得る。
【００５７】
幾つかの実施形態において、ＰＢＭＣは、免疫抑制性マクロファージと同系である。本明細書で用いられる用語「同系」は、同じ種の遺伝子的に同一のメンバーを指す。
【００５８】
典型的には、ＰＢＭＣと目的の培地との培養は、少なくとも１２日間、例えば少なくとも１２日から２０日を超えない期間、または少なくとも１２日から６〜８週間を超えない期間、好ましくは１５日間実施される。幾つかの実施形態において、ＰＢＭＣと目的の培地との培養は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１日間実施される。幾つかの実施形態において、ＰＢＭＣと目的の培地との培養は、１週間、２週間、３、４、５、６、７、８、９または１０週間、またはそれより長く実施される。
【００５９】
幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５は、ＰＢＭＣの培養の０日目に、本発明の培養培地に添加される。幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５はさらに、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０日目に、本発明の培養培地に１回、２回、または３回、または４回、またはそれより多く添加される。幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５は、ＰＢＭＣの培養の０日目と、５、６、７、８または９日目に、好ましくは０および７日目に本発明の培養培地に添加される。幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５は、好ましくは０日目に３回、そしてさらに２回、本発明の培養培地に添加される。幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５は、好ましくは０日目に４回、そしてさらに３回、本発明の培養培地に添加される。幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５は、好ましくは０日目に５回、そして例えば０、６、１３、１６および１８日目などにさらに４回、本発明の培養培地に添加される。幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５は、０日目と、培養終了時まで２、３または４日ごとに添加される。
【００６０】
幾つかの実施形態において、濃縮Ｔｒｅｇ集団は、濃縮前のＰＢＭＳ集団内のヒトＴｒｅｇ細胞の百分率の少なくとも２倍であるヒトＴｒｅｇ細胞の百分率を含む。幾つかの実施形態において、濃縮Ｔｒｅｇ集団は、濃縮前のＰＢＭＳ集団内のヒトＴｒｅｇ細胞の百分率の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍であるヒトＴｒｅｇ細胞の百分率を含む。
【００６１】
幾つかの実施形態において、本発明は、ａ）免疫抑制性マクロファージ集団を得るために、ヒト単球集団を一定量のＩＬ−３４を含む培地で培養するステップと、ｂ）ステップ（ａ）で得られた免疫抑制性マクロファージ集団および同種異系ＰＢＭＣ集団を、好ましくは一定量のＩＬ１５および一定量のＩＬ２を含む培地で共培養するステップと、ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）で得られたヒトＴｒｅｇ細胞集団を単離するステップと、を含む、ヒトＴｒｅｇ細胞集団を得る方法に関する。
【００６２】
幾つかの実施形態において、本発明は、ａ）免疫抑制性マクロファージ集団を得るために、ヒト単球集団を一定量のＩＬ−３４を含む培地で培養するステップと、ｂ）ステップ（ａ）で得られた免疫抑制性マクロファージ集団および同系ＰＢＭＣ集団を、好ましくは一定量のＩＬ１５および一定量のＩＬ２を含む培地で共培養するステップと、ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）で得られたヒトＴｒｅｇ細胞集団を単離するステップと、を含む、ヒトＴｒｅｇ細胞集団を得る方法に関する。
【００６３】
幾つかの実施形態において、マクロファージおよびＰＢＭＣ集団は、同系であり、マクロファージは、同種異系抗原を提示する。
【００６４】
ステップ（ｂ）の後、ヒトＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（６０％を超える）およびヒトＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ（ほぼ１００％）を含むヒトＴｒｅｇは、増大されている。しかし、ヒトＴｒｅｇ細胞集団、または前記ヒトＴｒｅｇ細胞の亜集団、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇまたはＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを高度に精製および単離することは、有用であり得る。
【００６５】
ステップ（ｃ）では、ヒトＴｒｅｇ細胞集団の単離は、免疫選択技術、例えばフローサイトメトリー法を利用したハイスループット細胞選別、磁気ビーズ、生分解性ビーズ、非生分解性ビーズに標識された抗体によるアフィニティー法、ＩＬ３４およびＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７またはＣＤ４５ＲＣ、ＰＤ１、ＧＩＴＲなど）に特異的な二重特異性抗体の使用、ＩＬ３４、ＩＦＮγ、ＴＧＦβおよびＩＬ１０に特異的な二重特異性抗体の使用、三重特異性抗体の使用、ならびにそのような方法の組み合わせなど、当業者に利用可能な特定の免疫細胞集団を検出する種々の方法により実施され得る。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「フローサイトメトリー法」は、目的の細胞を流体の流れに浮遊させて電子検出装置の中に通すことによる、目的の細胞を計数するための技術を指す。フローサイトメトリー法は、蛍光パラメータなどの、１秒あたり最大数千粒子の物理的および／または化学的パラメータの同時マルチパラメータ分析を可能にする。近年のフローサイトメトリー機器は通常、複数のレーザーおよび蛍光検出器を有する。フローサイトメトリー技術の一般的な改良型は、「蛍光活性化細胞選別」を利用して目的の集団を精製または検出するために、それらの特性に基づいて粒子を物理的に選別する。本明細書で用いられる「蛍光活性化細胞選別」（ＦＡＣＳ）は、各細胞の特異的光散乱および蛍光特性に基づいて、生体試料からの不均一な混合物を一度に一細胞ずつ、２つまたはそれ超の容器に選別するためのフローサイトメトリー法を指し、個々の細胞からの蛍光シグナルの迅速で客観的かつ定量的な記録と、特定の目的の細胞の物理的分離を提供する。したがってＦＡＣＳは、ＣＤ４＋ＴｒｅｇおよびＣＤ８＋Ｔｒｅｇを単離するために本明細書に記載された方法で用いられ得る。
【００６７】
あるいは、免疫細胞集団（例えば、ヒトＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇおよびヒトＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ）の単離は、磁気ビーズなどのビーズに基づく選別法を利用して実施され得る。そのような方法を利用して、細胞を特定の細胞表面マーカーに関して正または負に分離および単離し得る。
【００６８】
本明細書に定義される「正の選択」は、特定の細胞表面マーカーを発現する細胞の単離および検出をもたらす技術を指すが、「負の選択」は、特異的細胞表面マーカーを発現しない細胞の単離および検出をもたらす技術を指す。幾つかの実施形態において、ビーズは、市販のビーズコンジュゲーションキットなど、当該技術分野で公知の標準的技術を利用して当業者により抗体でコーティングされ得る。幾つかの実施形態において、負の選択ステップは、１つまたは複数の系列マーカーを発現する細胞を除去した後、蛍光活性化細胞選別を行って、Ｔｒｅｇ（即ち、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＴ細胞）を正に選択するために実施される。
【００６９】
幾つかの実施形態において、ヒトＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を単離するステップは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＣおよびＣＤ１２７からなる群から選択される細胞表面マーカー、ならびに／または少なくとも１つのサイトカイン発現、例えばＩＬ１０またはＩＬ３４のうちの少なくとも１つに基づく正および負の選択により実施され得る。この単離ステップは、一価または多価抗体、例えば二重特異性または三重特異性抗体などの抗体を利用して実施され得る。
【００７０】
本発明はさらに、ａ）免疫抑制性マクロファージ（ＩＬ３４分化マクロファージとも呼ばれる）集団を得るために、ヒト単球集団を一定量のインターロイキン−３４（ＩＬ−３４）ポリペプチドを含む培地で培養するステップと、ｂ）Ｔｒｅｇ集団およびステップ（ａ）で得られた免疫抑制性マクロファージ集団を、前記ヒトＴｒｅｇ細胞集団を増大させるのに適した培地で共培養するステップと、ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）で得られたヒトＴｒｅｇ細胞集団を単離するステップと、を含む、ヒトＴｒｅｇ細胞を増大させる方法に関する。
【００７１】
幾つかの実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞または単球は、ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）から得ることができる。
【００７２】
幾つかの実施形態において、Ｔｒｅｇ集団は、免疫抑制性マクロファージと同種異系である。したがってＴｒｅｇは、移植ドナーから単離され、免疫抑制性マクロファージは、レシピエントから単離され得る。あるいはＴｒｅｇは、自己免疫疾患もしくはアレルギーに罹患した患者から、または臓器移植の必要があるもしくは臓器移植を待機中の患者から、または骨髄ドナーから（例えば、ＧＶＨＤを処置するための）、または健常個体から単離され得る。幾つかの実施形態において、Ｔｒｅｇは、免疫抑制性マクロファージと同系である。
【００７３】
幾つかの実施形態において、Ｔｒｅｇ集団は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇおよび／またはＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団である。幾つかの実施形態において、Ｔｒｅｇ集団は、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよび／またはＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ集団である。
【００７４】
典型的には、Ｔｒｅｇの培養は、少なくとも１２日間、例えば少なくとも１２日から６〜８週間を超えない期間、好ましくは１５日間実施される。幾つかの実施形態において、ＰＢＭＣと目的の培地との培養は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１日間実施される。幾つかの実施形態において、ＰＢＭＣと目的の培地との培養は、１週間、２週間、３、４、５、６、７、８、９または１０週間、またはそれより長く実施される。
【００７５】
幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５は、Ｔｒｅｇの培養の０日目に培養培地に添加される。幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５はさらに、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０日目に、培養培地に１回、２回、または３回、またはより多く添加される。幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５は、Ｔｒｅｇの培養の０日目と、５、６、７、または８日目に培養培地に添加される。幾つかの実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５は、０日目と、培養の終了時まで２、３または４日ごとに培養培地に添加される。
【００７６】
本発明の方法の幾つかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ８抗体は、ＰＢＭＣまたはＴｒｅｇの培養の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０日目に、好ましくは０日目および／または１１、１２、１３、１４および／または１５日目に、培養培地に添加される。
【００７７】
幾つかの実施形態において、０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜４μｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および／または０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜４μｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体が、培養培地に添加される。
【００７８】
本発明によるＩＬ３４の使用
先に記載された本発明の方法により得られたＩＬ３４増大Ｔｒｅｇは、非刺激およびポリクローナル刺激のＴｒｅｇと比較して、最大１６：１のエフェクター：サプレッサー比で非常に強力な抑制能を示す。
【００７９】
したがって本発明の第二の態様は、Ｔｒｅｇ集団の抑制能を上昇させるためのＩＬ３４の使用に関する。
【００８０】
本発明はまた、ＰＢＭＣ集団から濃縮Ｔｒｅｇ集団を得るためのＩＬ３４の使用に関する。本発明は、Ｔｒｅｇ集団を作製および増大させるためのＩＬ３４の使用に関する。
【００８１】
本発明はさらに、免疫抑制性マクロファージ（ＩＬ３４分化マクロファージとも呼ばれる）集団を得るためのＩＬ３４の使用に関する。
【００８２】
本発明はまた、ＰＢＭＣ集団から濃縮Ｔｒｅｇ集団を得るための免疫抑制性マクロファージ（ＩＬ３４分化マクロファージとも呼ばれる）に関する。本発明は、Ｔｒｅｇ集団を作製および増大させるための免疫抑制性マクロファージの使用に関する。
【００８３】
本発明の方法によるＴｒｅｇ細胞集団およびそれを含む医薬組成物
本発明の第三の態様は、先に定義された方法により得ることができる単離／濃縮Ｔｒｅｇ細胞集団に関する。
【００８４】
幾つかの実施形態において、前記単離Ｔｒｅｇ細胞（ＩＬ３４増大Ｔｒｅｇ）集団は、以下の実施例の節に詳述される通り、非常に強力な抑制能を示す。
【００８５】
幾つかの実施形態において、前記単離Ｔｒｅｇ細胞集団は、単離Ｆｏｘｐ３＋およびＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞集団である。
【００８６】
幾つかの実施形態において、前記単離ヒトＴｒｅｇ細胞集団は、単離ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞および／またはＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞集団である。
【００８７】
幾つかの実施形態において、前記単離ヒトＴｒｅｇ細胞集団は、単離ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞および／またはＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞集団である。
【００８８】
本発明の状況において、単離／濃縮Ｔｒｅｇ細胞集団はその後、抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞集団を実現するために目的の抗原でパルスすることができ、前記抗原は、単離Ｔｒｅｇ細胞集団を「プライミング」し、それにより前記抗原に特異的なＴｒｅｇ細胞集団を得るのに有効な量で提供される。
【００８９】
事実、そのようなプライミングされたＴｒｅｇ細胞は、自己免疫障害、治療タンパク質に対する免疫反応、移植片拒絶、ＧＶＨＤおよび／またはアレルギーに関係する反応などの、望まない免疫応答の予防または処置に有用である。
【００９０】
本明細書で用いられる用語「処置」は、治療的処置と、目的が標的病理状態または障害を予防または緩徐化（低減）することである、防護的または予防的手段の両方を指す。処置を必要とするものとは、既に障害を有するもの、および障害を有する傾向があるものまたは障害を予防すべきものなどである。対象または哺乳動物は、本発明によりＴｒｅｇ細胞の治療量を投与された後に、患者が以下の１つまたは複数の観察可能および／もしくは測定可能な低下または非存在を示す場合には、望まない免疫応答に関して「処置」に成功している：病原細胞の数の減少；病原性である細胞総数に対する割合の低下；および／または特定の疾患もしくは状態に関連する症状の１つもしくは複数のある程度の軽減；疾病率および死亡率の低下、ならびに生活の質問題の改善。処置の成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師に熟知された日常的手順によって容易に測定可能である。
【００９１】
したがって本発明はさらに、単離／濃縮Ｔｒｅｇ細胞集団を、それを必要とする対象へ投与することを含む、望まない免疫応答を処置または予防する方法に関する。好ましくは本発明のＴｒｅｇ細胞の治療有効量が、対象へ投与される。
【００９２】
本明細書で用いられる用語「治療有効量」は、標的に対して顕著な負の影響または有害副作用を引き起こさずに、（１）望まない免疫応答の開始を遅延または予防すること；（２）望まない免疫応答の１つもしくは複数の症状の進行、深刻化もしくは悪化を緩徐化もしくは停止すること；（３）望まない免疫応答の症状の改善をもたらすこと；（４）望まない免疫応答の重症度もしくは発生率を低減すること；または（５）望まない免疫応答を治癒すること、を目指すＴｒｅｇのレベルまたは量を意味する。治療有効量は、防護的または予防的作用のために、望まない免疫応答の開始前に投与され得る。あるいはまたはさらに、治療有効量は、治療的作用のために、望まない免疫応答の開始後に投与され得る。
【００９３】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、免疫および／または炎症性疾患または状態を処置または予防するためのものである。免疫および／または炎症性の疾患または状態の例としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、食物アレルギー（例えば、乳タンパク質アレルギー、鶏卵アレルギーまたはピーナッツアレルギー）または不耐性に関連する腸炎、セリアック病に関連する腸炎、関節リウマチ、多発性軟骨炎、敗血症性関節炎、脊椎関節症または強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、乾癬性関節炎および全身エリテマトーデスなどの関節炎に関連する疾患、シェーグレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、多発筋炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、サルコイドーシス、または血管炎、Ｉ型糖尿病または自己免疫性インスリン炎、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デビック病またはＮＭＯ（視神経脊髄炎）、脱髄性疾患、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、灰白髄炎、運動ニューロン疾患（ＮＭＤ）、視神経炎、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチー、甲状腺炎、胃炎、ブドウ膜炎（前部ブドウ膜炎（虹彩炎、虹彩毛様体炎、および前部毛様体炎を含む））、中間部ブドウ膜炎（毛様体扁平部炎、後部毛様体炎および硝子体炎を含む）、後部ブドウ膜炎（脈絡膜炎、脈絡網膜炎、網脈絡膜炎、網膜炎、および視神経網膜炎を含む）、汎ブドウ膜炎、急性ブドウ膜炎、再発性ブドウ膜炎および慢性ブドウ膜炎）、網膜ブドウ膜炎、強膜炎、網膜血管炎、広汎性片眼性亜急性視神経網膜炎、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、サルコイドーシス関連網膜炎、ベーチェット病関連網膜炎、急性網膜色素上皮炎、睾丸炎、卵巣炎、乾癬、前立腺炎、脳脊髄炎、白斑、移植片拒絶およびＧＶＨＤが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
したがって、処置される疾患に関連する抗原（病原性抗原）に対して特異的な、または移植片に特異的なＴｒｅｇ細胞集団を、得ることができる。それゆえ、目的の抗原は、自己抗原、同種異系抗原およびアレルゲンからなる群から選択される。
【００９５】
本発明はまた、本発明によるＴｒｅｇ細胞集団と、少なくとも１種の医薬的に許容し得る賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【００９６】
本明細書で用いられる用語「医薬的に許容し得る賦形剤」は、動物、好ましくはヒトへ投与される場合に有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない賦形剤を指す。この用語は、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを包含する。ヒトへの投与の場合、調製物は、たとえばＦＤＡ局またはＥＭＡなどの規制当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性および純度規準に適合しなければならない。
【００９７】
本発明はさらに、本発明によるＴｒｅｇ細胞集団を含む薬剤を提供する。
【００９８】
本発明の第四の態様は、先に定義された方法のステップ（ａ）により得ることができる免疫抑制性マクロファージ（ＩＬ３４分化マクロファージとも呼ばれる）集団に関する。
【００９９】
幾つかの実施形態において、前記免疫抑制性マクロファージは、以下の実施例の節に詳述される通り、非常に強力なＴｒｅｇ細胞誘導能を示す。
【０１００】
それゆえ本発明の幾つかの実施形態において、前記免疫抑制性マクロファージは、自己免疫障害、治療タンパク質に対する免疫反応、移植片拒絶、ＧＶＨＤおよび／またはアレルギーに関係する反応などの、望まない免疫応答の予防または処置に有用である。理論に拘束されるのを望むものではないが、本出願者は、前記免疫抑制性マクロファージを患者へ投与することで、Ｔｒｅｇ細胞の増大を誘導し、それにより望まない免疫応答を予防または処置し得ることを示唆する。
【０１０１】
したがって本発明はさらに、免疫抑制性マクロファージ集団を、それを必要とする対象へ投与することを含む、望まない免疫応答を処置または予防する方法に関する。好ましくは免疫抑制性マクロファージの治療有効量が、対象へ投与される。
【０１０２】
本発明はまた、本発明による免疫抑制性マクロファージ集団と、少なくとも１種の医薬的に許容し得る賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【０１０３】
本発明はまた、本発明による免疫抑制性マクロファージ集団を含む薬剤も提供する。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、本発明の医薬組成物または薬剤は、免疫抑制性マクロファージおよびＴｒｅｇ細胞を含む。それゆえ幾つかの実施形態において、治療的使用のために、本発明の方法の任意選択のステップ（ｃ）（単離ステップ）は、実施されない。
【０１０５】
本発明を、以下の図および実施例によりさらに例示する。しかしこれらの実施例および図は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ＩＬ３４分化マクロファージの表現型。健常個体からのＣＤ１４＋単球の表現型を、精製してＩＬ３４による分化後６日目に、または分化させずに評価した。細胞を回収して、ＬＰＳで２４時間刺激して、または刺激せずに、複数のマーカーの発現について染色した。３回の独立した実験から得られた１つの代表的ヒストグラム。
【図２】ＩＬ３４マクロファージ分化後の効率的なヒトＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ増大および増強。ＣＤ１４＋単球を、ＩＬ３４によって６日間分化させ、または分化させずに、全同種異系ＰＢＭＣに１５日間添加した。Ｆｏｘｐ３陽性細胞の百分率を、ＰＢＭＣ中で、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ細胞において評価した。代表的なプロット（Ａ）およびグラフ（Ｂ）を、健常個体３名に関して培養前後で示す。（Ｃ）増大倍率を、Ｆｏｘｐ３＋ ＣＤ１４＋またはＣＤ８＋Ｔｒｅｇについて評価した。（Ｄ）ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞において評価されたＣＤ４５ＲＣｌｏｗの百分率を、健常個体２または３名に関して培養前後で示す。（Ｅ）増大倍率を、ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＣＤ１４＋またはＣＤ８＋Ｔｒｅｇについて、健常個体３名に関して培養前後で評価した。（Ｆ〜Ｇ）非刺激、刺激、またはＩＬ３４増大ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗおよびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを、同種異系Ｔ枯渇ＰＢＭＣに応答したＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖の抑制に関して試験して、培養の５日後のＣＦＳＥ希釈液についてフローサイトメトリーにより分析した。ｎ＝３。同種異系Ｔ枯渇ＰＢＭＣのみの対照増殖条件における分裂中のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の割合は、５日目に細胞のおよそ６０％となり、各実験で１００の値を与えた。結果を、分裂中のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の相対的割合の平均±ＳＥＭとして表す。代表的なＣＦＳＥ未加工プロファイルを示す。二元配置繰り返し測定のある分散分析。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１
【図３】Ｉｌ−３４分化マクロファージによるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの増大。Ａ．ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＬ３４分化マクロファージの存在下でおよそ１１５倍に増大した。Ｂ〜Ｃ．ＴｒｅｇとＩＬ３４分化マクロファージとの共培養により、抑制性サイトカインＩＬ３４およびＴＧＦｂを分泌してＴｒｅｇ関連マーカーＦｏｘｐ３、ＧＩＴＲ、ＰＤ１およびＨＬＡＤＲを発現する細胞が濃縮された。Ｂ．ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ細胞のうちのＴｒｅｇ関連マーカーを発現する細胞の平均値＋／−ＳＥＭ。
【図４】ヒト化マウスにおけるＧＶＨＤに及ぼす本発明のＴｒｅｇの影響。Ａ．Ｔｒｅｇの同時移入は、ＧＶＨＤ発症により誘発されたマウスの体重減少を用量依存的に遅延させた。Ｂ．Ｔｒｅｇの同時移入は、１以上：１のＰＢＭＣ：Ｔｒｅｇ比でマウスの生存を改善した。
【図５】ヒト化マウスにおける同種異系皮膚移植片拒絶に及ぼす本発明のＴｒｅｇの影響。Ａ．Ｔｒｅｇの同時移入は、ヒト化マウスにおける同種異系ヒト皮膚移植片の拒絶を遅延させた。Ｂ．移植片生着は、１：２のＰＢＭＣ：Ｔｒｅｇ比でＴｒｅｇを移入されたヒト化マウスにおいて延長した。
【図６】ＩＬ３４分化マクロファージとＭＣＳＦ分化マクロファージの比較。Ｆｏｘｐ３およびＣＤ４５ＲＣ陽性細胞の百分率を、健常個体の未分化、ＩＬ３４分化、またはＭＣＳＦ分化マクロファージで増大させた後のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞において評価した。健常個体の代表的プロットを示す。
【図７】単球の異なる亜集団に及ぼすＩＬ−３４の影響。Ａ．単球をＦＡＣＳ  ＡｒｉａによりＣＤ１４およびＣＤ１６マーカー発現について選別した。Ｂ．単球は、健常志願者の血中では主としてＣＤ１４＋ＣＤ１６−である。ＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４−ＣＤ１６＋、およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋はそれぞれ、ＰＢＭＣの２０％、８％および２．５％を表す。Ｃ．ＩＬ３４の存在下での細胞生存率は、単球集団に依存する。６日目に、播種されたＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４−ＣＤ１６＋およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋の１２％、３７％および２２％が回収された。Ｄ．ＣＤ１４＋ＣＤ１６−およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋両単球のＩＬ３４による分化は、ＣＤ１４−単球（ＣＤ１４−ＣＤ１６＋）のＩＬ３４による分化よりも多数の、Ｍ１関連マーカー発現が低いＭ２様マクロファージを生成した。
【図８】マクロファージに及ぼす３日間ＩＬ−３４処置の影響。Ａ．ＩＬ−３４と共に３日間の培養後に、播種されたＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４−ＣＤ１６＋、およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球のそれぞれ１０７％、１５７％、および９１％が回収された。ＩＬ−３４と共に４日間の培養後に、播種されたＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４−ＣＤ１６＋、およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球のそれぞれ５９％、２６４％、および２７５％が回収された。Ｂ．ＣＤ１４＋ＣＤ１６−およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋両単球のＩＬ３４による分化は、６日間培養において観察された通り、３日および４日間の培養後に、ＣＤ１４−単球（ＣＤ１４−ＣＤ１６＋）のＩＬ３４による分化と比較して、Ｍ２関連マーカーの高い発現およびＭ１関連マーカーの低い発現を生じた。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
実施例：
材料と方法
健常志願者の採血およびＰＢＭＣ分離：Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ（フランスのナント所在）にて、健常ドナーから、インフォームドコンセントを受取った後に、血液を採取した。血液をＰＢＳで２倍希釈した後、室温で３０分間の、２０００ｒｐｍでブレーキを用いないＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（Ｅｕｒｏｂｉｏ）により、ＰＢＭＣを単離した。回収されたＰＢＭＣを、５０ｍＬ  ＰＢＳにより１８００ｒｐｍで１０分間洗浄した。
【０１０８】
移植片対宿主病および皮膚移植拒絶
健常志願者（ＨＶ）ドナーからのＰＢＭＣまたはＦＡＣＳ−Ａｒｉａ選別後のＣＤ４５ＲＣ−ＰＢＭＣ  １．５×１０７を、１．５Ｇｙの全身亜致死照射で１６時間前に処置した１０〜１３週齢ＮＳＧ  ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。増大させたＴｒｅｇを、１：１または１：２のＰＢＭＣ：Ｔｒｅｇ比で同系ＰＢＭＣと共にマウスに同時注射した。ＧＶＨＤをマウス体重減少により特徴づけ、初期体重の２０％減少時点でマウスを殺処分した。
【０１０９】
９〜１１週齢ＮＳＧマウスに、ヒトの皮膚を移植した。６週後、マウスに、皮膚に対して同種異系のＰＢＭＣ  １．５×１０７をｉ．ｖ．注射して、同種異系移植片拒絶を誘導した（０日目）。ＰＢＭＣと同系のＴｒｅｇを、過去に記載された通りＩＬ３４分化マクロファージで増大させて、１：１または１：２のＰＢＭＣ：Ｔｒｅｇ比でＰＢＭＣと同時注射した。同種異系移植片拒絶を、組織学的評定により１〜３でスコア付けする。
【０１１０】
レシピエントの体重を毎日測定し、体重減少率％が初期体重の２０％以上になれば殺処分した。経過観察は、可能な限り盲検の条件で実施した。１群あたり動物３〜６匹を処置した。マウスの性別、週齢および初期体重を一致させて、無作為に処置した、または処置しなかった。
【０１１１】
Ｔｒｅｇおよび単球分化プロトコル：健常志願者（ＨＶ）血液からのＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配により単離して、単球をＦＳＣおよびＳＳＣ形態学的パラメータに従ってエルトリエートした（ｅｌｕｔｒｉａｔｅｄ）。その後、ＣＤ１４＋単球をＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより選別し、洗浄して、５０ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ３４（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充した培地（ＲＰＭＩ  １６４０、グルタミン２ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、ＡＢ血清１０％）中の１×１０６／ｍｌで播種した。６日目に、細胞を回収し、表現型分析のために１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで２４時間刺激するか、またはイスコフ培地（ＩＭＤＭ、グルタミン２ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、ＡＢ血清５％）中の１〜５の同種異系ＰＢＭＣと共に４×１０５／ｍｌで播種した。ＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を、１０、１３および１６日目に新たに添加した。１９および２１日目にそれぞれ４８時間および２時間、浮遊細胞を新しいプレートへ連続移入することにより、マクロファージを取り出した。２１日目に、細胞を表現型分析のためにブレフェルジンＡの存在下でＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激するか、またはＴ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ細胞、およびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＴ細胞を抑制アッセイのためにＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより選別した。新しい同系ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、ＣＤ１４＋細胞と同じドナーから単離された同種異系ＡＰＣで刺激されたレスポンダーＴ細胞として用いた。ＤＡＰＩ標識死細胞およびＣＰＤ４０５標識ＣＤ４＋Ｔｒｅｇの除外後に、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞でゲーティングすることにより、増殖をＣＦＳＥ希釈により５日後に評価した。
【０１１２】
モノクローナル抗体およびフローサイトメトリー：ＣＤ３−ＰｅＣｙ７（ＳＫＹ７）、ＣＤ４−ＰｅｒｃＰＣｙ５．５（Ｌ２００）、ＣＤ２５−ＡＰＣＣｙ７（Ｍ−Ａ２５１）、ＣＤ１２７−ＰＥ（ＨＩＬ７−Ｒ  Ｍ２１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５ＲＣ−ＦＩＴＣ（ＭＴ２、ＩＱ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）、Ｆｏｘｐ３−ＡＰＣ（２３６Ａ／Ｅ７、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＩＬ３４−ＰＥ（５７８４１６、Ｒ＆Ｄ）に対する抗体を用いて、ヒト細胞の表現型を特徴づけた。蛍光をＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州マウントビュー所在）で測定して、ＦＬＯＷＪＯソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，  Ｉｎｃ．米国所在）を用いてデータを解析した。最初に、形態学的検査により細胞をゲーティングして、ＤＡＰＩ生存細胞を選択することにより死亡細胞を除外した。
【０１１３】
健常志願者からのＣＤ１４＋単球を細胞選別し、ＩＬ３４の存在下で６日間分化させて、表現型をＣＤ１６３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８０の発現について分析した。
【０１１４】
結果
ＩＬ３４分化マクロファージはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを効率的に誘導し、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを増強する
健常志願者からのＣＤ１４＋単球を細胞選別して、ＩＬ３４の存在下で６日間分化させて、表現型を分析した（図１）。本発明者らは、ＩＬ３４分化マクロファージが新しい単球よりも高レベルのＣＤ１６３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８０を発現することを観察した。分化マクロファージをその後、同種異系ＰＢＭＣへ１５日間添加し、その後、Ｔｒｅｇの割合、数および抑制能を分析した（図２）。興味深いこととして、本発明者らは、ＩＬ３４分化マクロファージとの培養後に、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴＣＤ４＋およびＦｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴＣＤ８＋Ｔ細胞が、それぞれＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率として５倍および８．２倍増加することを観察した（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｄ）。百分率のこの増加は、増大倍率で認められる通り、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴＣＤ４＋およびＦｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴＣＤ８＋Ｔ細胞数のそれぞれ８３．４倍および１００．６倍増加も伴った（図２Ｂおよび２Ｃ）。したがって、本発明者らは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗおよびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの百分率および数の有意な増加を観察した（図２Ｄおよび２Ｅ）。最も重要なこととして、本発明者らは、ＩＬ３４増大ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇおよびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇが非刺激およびポリクローナル刺激のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇおよびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと比較して最大１６：１のエフェクター：サプレッサー比で非常に強力な抑制能を示し、およそ５０％の抑制率であること観察した（図２Ｆおよび２Ｇ）。
【０１１５】
総括すると、これらの結果から、ＩＬ３４分化単球がＦｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを選択的に増大させ、その抑制能を維持するだけでなく、増強能を有することが実証される。
【０１１６】
ＩＬ３４分化マクロファージによるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの増大はそれらの免疫寛容原性プロファイルを改善した
単球をＦｉｃｏｌｌ勾配により単離し、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋およびＣＤ１６＋を枯渇させて、ＣＤ１４マーカー発現についてＦＡＣＳ  Ａｒｉａで選別した。ＣＤ１４＋単球を、５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ３４タンパク質を補充した完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、１％グルタミン、１０％ＦＢＳ）中で１０６細胞／ｍｌで播種し、６日間培養した。６日目に、Ｆｉｃｏｌｌ勾配により、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇを異なるＨＶ（健常志願者）ドナーの血液から単離して、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋およびＣＤ１６＋を枯渇させ、ならびにＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ４５ＲＣマーカー発現をＦＡＣＳ  Ａｒｉａで選別した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ細胞を、０日目に１：４のＴｒｅｇ：単球比で同種異系ＩＬ３４分化マクロファージ、ならびに１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体と共に完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、１％グルタミン、１０％ＡＢ血清、１％Ｈｅｐｅｓ、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム）中で１０６細胞／ｍｌで播種した。１３日目に、Ｔｒｅｇを再度、１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で刺激した。６、１３、１６および１８日目に、培養培地に１０００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−１５を補充した。２０日目に、Ｔｒｅｇを発現収率について分析して、増大前と比較して、Ｔｒｅｇ関連マーカー発現分析のために１０μｇ／ｍｌブレフェルジンＡの存在下、５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌ  イオノマイシンで４時間刺激した。
【０１１７】
図３に示される通り、ＩＬ−３４分化マクロファージは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの１１５倍増大を誘導する。その上、ＴｒｅｇとＩＬ−３４分化マクロファージとの共培養は、抑制性サイトカインＩＬ３４およびＴＧＦβを分泌し、Ｔｒｅｇ関連マーカーＦｏｘｐ３、ＧＩＴＲ、ＰＤ１およびＨＬＡＤＲを発現する細胞の濃縮を誘導した。それゆえ、ＩＬ３４分化マクロファージは、Ｔｒｅｇ関連マーカーの発現を増加させ、このことはＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇに関する抑制活性の上昇を示唆している。 
【０１１８】
ＩＬ３４分化マクロファージで増大されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはヒト化マウスにおける移植片対宿主病を遅延させた
１０〜１３週齢ＮＳＧマウスに、２Ｇｙを１６時間照射した後、１．５×１０７ＰＢＭＣをｉ．ｖ．注射して、異種間ＧＶＨ反応を誘導した。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを選別して、ＩＬ３４分化ＣＤ１４＋単球の存在下で増大させた。増大したＴｒｅｇを、１：１または１：２のＰＢＭＣ：Ｔｒｅｇ比でマウスに同系ＰＢＭＣと同時注射した。ＧＶＨＤをマウス体重により特徴づけて、初期体重の２０％減少時点でマウスを殺処分した。
【０１１９】
図４Ａに示される通り、本発明のＴｒｅｇの同時移入は、ＧＶＨＤ発症により誘発されたマウスの体重減少を用量依存的に遅延させた。その上、本発明のＴｒｅｇの同時移入は、１以上：１のＰＢＭＣ：Ｔｒｅｇ比でマウスの生存を改善した（図４Ｂ）。
【０１２０】
したがってこの結果から、ＩＬ３４分化マクロファージで増大させたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇがＧＶＨＤを効率的に遅延させ、細胞療法において用いられ得ることが実証される。
【０１２１】
ＩＬ３４分化マクロファージで増大させたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはヒト化マウスにおける同種異系皮膚移植片拒絶を遅延させた
９〜１１週齢ＮＳＧマウスに、ヒト皮膚を移植した。６週後に、マウスに皮膚に対して同種異系のＰＢＭＣ  １．５×１０７個をｉ．ｖ．注射して、同種異系移植片拒絶を誘導した（０日目）。ＰＢＭＣと同系のＴｒｅｇを、過去に記載された通りＩＬ３４分化マクロファージで増大させて、１：１または１：２のＰＢＭＣ：Ｔｒｅｇ比でＰＢＭＣと同時注射した。同種異系移植片拒絶を、組織学的評価により１〜３でスコア付けする。
【０１２２】
図５Ａに示される通り、本発明のＴｒｅｇの同時移入は、ヒト化マウスにおける同種異系ヒト皮膚の拒絶を遅延させた。その上、１：２のＰＢＭＣ：Ｔｒｅｇ比でＴｒｅｇを移入したヒト化マウスでは、移植片の生着が延長した（図５Ｂ）。
【０１２３】
したがってこの結果から、ＩＬ３４分化マクロファージで増大させたＴｒｅｇが、移植片に対する同種異系免疫反応を制御できることが実証される。
【０１２４】
ＩＬ３４分化マクロファージはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの増大においてＭＣＳＦ分化マクロファージよりも効率的である
単球をＦｉｃｏｌｌ勾配により血液から単離し、その後、ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋細胞を枯渇させて、ＣＤ１４マーカー発現についてＦＡＣＳ  Ａｒｉａで選別した。ＣＤ１４＋単球を、５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ３４タンパク質または２５ｎｇ／ｍｌヒトＭＣＳＦタンパク質を補充した完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、１％グルタミン、１０％ＦＢＳ）中で１０６細胞／ｍｌで６日間播種した。６日目に、マクロファージを、５：１  ＰＢＭＣ：マクロファージ比で同種異系ＰＢＭＣを補充した完全培地（ＩＭＤＭ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、５％ＡＢ血清）中の４×１０５細胞／ｍｌで播種した。２５Ｕ／ｍｌヒトＩＬ２および１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ１５を、１０、１３および１６日目に新たに添加した。２１日目に、Ｆｏｘｐ３およびＣＤ４５ＲＣマーカー発現分析のために１０ｎｇ／ｍｌブレフェルジンＡの存在下でＴ細胞を５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌイオノマイシンで４時間刺激した。
【０１２５】
Ｆｏｘｐ３およびＣＤ４５ＲＣ陽性細胞の百分率を、健常個体の未分化、ＩＬ３４分化、またはＭＣＳＦ分化マクロファージで増大させた後のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞において評価した。健常個体の代表的プロットを、図６に示す。
【０１２６】
得られた結果から、ＩＬ３４分化マクロファージが細胞療法のためのＴｒｅｇの増大においてＭＣＳＦ分化マクロファージよりも効率的であることが示される。
【０１２７】
ＣＤ１４−ＣＤ１６＋、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋はインビトロでＩＬ−３４の存在下で異なるように挙動する
単球をＦｉｃｏｌｌ勾配により血液から単離し、ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋細胞を枯渇させて、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａによりＣＤ１４およびＣＤ１６マーカー発現について選別した。ＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋およびＣＤ１４−ＣＤ１６＋単球を、５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ３４タンパク質を補充した完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、１％グルタミン、１０％ＦＢＳ）中で１０６細胞／ｍｌで７日間播種した。７日目に、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦと５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮｇ、または２５ｎｇ／ｍｌ  ＭＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ４と２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ１０で分化させたＭ１およびマクロファージと比較して、マクロファージ関連マーカーの発現について分析した。
【０１２８】
図７に示される通り、ＩＬ３４の存在下での細胞生存は、単球集団に依存する。６日目には、播種されたＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４−ＣＤ１６＋、およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋の１２％、３７％、および２２％が回収された（図７Ｃ参照）。その上、図７Ｄに示される通り、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋両単球のＩＬ３４による分化は、ＣＤ１４−単球（ＣＤ１４−ＣＤ１６＋）のＩＬ３４による分化よりも多数の、Ｍ１関連マーカーの発現が低いＭ２様マクロファージを生成した。
【０１２９】
それゆえＩＬ３４は、ＣＤ１４＋単球をＭ２様細胞へと優先的に分化する。
【０１３０】
３日目のＩＬ３４分化マクロファージの収率および表現型
単球を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配により血液から単離し、ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋細胞を枯渇させて、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａによりＣＤ１４マーカー発現について選別した。ＣＤ１４＋単球を、５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ３４タンパク質を補充した完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、１％グルタミン、１０％ＦＢＳ）中で１０６細胞／ｍｌで播種して、Ｍ１およびＭ２関連マーカー発現について３日後に分析した。
【０１３１】
結果を図８に示す。ＩＬ３４との３日間の培養後に、播種されたＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４−ＣＤ１６＋、およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球のそれぞれ１０７％、１５７％、および９１％が回収された。ＩＬ−３４との４日間の培養後に、播種されたＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４−ＣＤ１６＋、およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球のそれぞれ５９％、２６４％、および２７５％が回収された。ＣＤ１４＋ＣＤ１６−およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋両単球のＩＬ３４による分化は、６日間培養において観察された通り、３日および４日間の培養後に、ＣＤ１４−単球（ＣＤ１４−ＣＤ１６＋）のＩＬ３４による分化と比較して、Ｍ２関連マーカーの高い発現およびＭ１関連マーカーの低い発現を生じた。
【０１３２】
これらの結果から、ＣＤ１４＋単球とＩＬ３４との３日間の培養が、Ｍ２様プロファイルを高い収率で誘導するのに十分であることが実証される。
【０１３３】
参考資料：
本出願全体を通して、様々な参考資料に本発明が関係する当該技術分野の最先端が記載される。これらの参考資料の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
１．  Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｂｏｒｒｏｗｓ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｆｕｎｇ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ｐ．Ｊ．，  Ａｌｌｅｎ，  Ｒ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｃｈａｐｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．  ２００３．  Ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９：２３２６−２３３３．
２．  Ｓｒｉｎｉｖａｓ，  Ｔ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ，  Ｂ．  ２０１２．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ２０１１：  Ｎｅｗ  ａｇｅｎｔｓ，  ｎｅｗ  ｉｄｅａｓ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｈｏｐｅ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ８：７４−７５．
３．  Ｌｏｎｄｏｎｏ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｄａｎｇｅｒ，  Ｒ．，  Ｇｉｒａｌ，  Ｍ．，  Ｓｏｕｌｉｌｌｏｕ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｆｕｅｙｏ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｂｒｏｕａｒｄ，  Ｓ．  ２０１２．  Ａ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １２：１３７０−１３７７．
４．  Ｗｏｏｄ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｂｕｓｈｅｌｌ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｈｅｓｔｅｒ，  Ｊ．  ２０１２．  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：４１７−４３０．
５．  Ｎｉｅｄｅｒｋｏｒｎ，  Ｊ．Ｙ．  ２００８．  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ＣＤ８（＋）  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：３２７−３３１．
６．  Ｐｉｃａｒｄａ，  Ｅ．，  Ａｎｅｇｏｎ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，  Ｃ．  ２０１１．  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＣＤ８（＋）  Ｔｒｅｇｓ  ｉｎ  ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：３５−３７．
７．  Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，  Ｃ．，  Ｐｉｃａｒｄａ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ａｎｅｇｏｎ，  Ｉ．  ２０１０．  ＣＤ８＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５：７５１−７５６．
８．  Ｍｅｎｏｒｅｔ，  Ｓ．，  Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，  Ｃ．，  Ｂｅｚｉｅ，  Ｓ．，  Ｃａｒｏｎ，  Ｌ．，  Ａｎｅｇｏｎ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｌｉ，  Ｘ．Ｌ．  ２０１１．  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８（＋）  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６７７：６３−８３．
９．  Ｗｅｉ，  Ｓ．，  Ｎａｎｄｉ，  Ｓ．，  Ｃｈｉｔｕ，  Ｖ．，  Ｙｅｕｎｇ，  Ｙ．Ｇ．，  Ｙｕ，  Ｗ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｍ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｌ．Ｔ．，  Ｌｉｎ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，  Ｅ．Ｒ．  ２０１０．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｂｕｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＳＦ−１  ａｎｄ  ＩＬ−３４  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ＣＳＦ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８８：４９５−５０５．
１０．  Ｎａｎｄｉ，  Ｓ．，  Ｃｉｏｃｅ，  Ｍ．，  Ｙｅｕｎｇ，  Ｙ．Ｇ．，  Ｎｉｅｖｅｓ，  Ｅ．，  Ｔｅｓｆａ，  Ｌ．，  Ｌｉｎ，  Ｈ．，  Ｈｓｕ，  Ａ．Ｗ．，  Ｈａｌｅｎｂｅｃｋ，  Ｒ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｈ．Ｙ．，  Ｇｏｋｈａｎ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３．  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｙｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｚｅｔａ  ｉｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３４．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：２１９７２−２１９８６．
１１．  Ｃｈｉｈａｒａ，  Ｔ．，  Ｓｕｚｕ，  Ｓ．，  Ｈａｓｓａｎ，  Ｒ．，  Ｃｈｕｔｉｗｉｔｏｏｎｃｈａｉ，  Ｎ．，  Ｈｉｙｏｓｈｉ，  Ｍ．，  Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ，  Ｋ．，  Ｋｉｍｕｒａ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，  Ｓ．  ２０１０．  ＩＬ−３４  ａｎｄ  Ｍ−ＣＳＦ  ｓｈａｒｅ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｍｓ  ｂｕｔ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １７：１９１７−１９２７．
１２．  Ｗａｎｇ，  Ｙ．，  Ｓｚｒｅｔｔｅｒ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｖｅｒｍｉ，  Ｗ．，  Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ，  Ｓ．，  Ｒｏｓｓｉｎｉ，  Ｃ．，  Ｃｅｌｌａ，  Ｍ．，  Ｂａｒｒｏｗ，  Ａ．Ｄ．，  Ｄｉａｍｏｎｄ，  Ｍ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｎｎａ，  Ｍ．  ２０１２．  ＩＬ−３４  ｉｓ  ａ  ｔｉｓｓｕｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ＣＳＦ１Ｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：７５３−７６０．
１３．  Ｂｅｚｉｅ，  Ｓ．，  Ｐｉｃａｒｄａ，  Ｅ．，  Ｏｓｓａｒｔ，  Ｊ．，  Ｔｅｓｓｏｎ，  Ｌ．，  Ｕｓａｌ，  Ｃ．，  Ｒｅｎａｕｄｉｎ，  Ｋ．，  Ａｎｅｇｏｎ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，  Ｃ．  ２０１５．  ＩＬ−３４  ｉｓ  ａ  Ｔｒｅｇ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２５：３９５２−３９６４．
１４．  Ｆｏｕｃｈｅｒ，  Ｅ．Ｄ．，  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，  Ｓ．，  Ｐｒｅｉｓｓｅｒ，  Ｌ．，  Ｄｅｓｃａｍｐｓ，  Ｐ．，  Ｉｆｒａｈ，  Ｎ．，  Ｄｅｌｎｅｓｔｅ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｊｅａｎｎｉｎ，  Ｐ．  ２０１５．  ＩＬ−３４−  ａｎｄ  Ｍ−ＣＳＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｓｗｉｔｃｈ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＩＬ−１ａｌｐｈａ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５：１０９２−１１０２．
１５．  Ｓｅｇａｌｉｎｙ，  Ａ．Ｉ．，  Ｂｒｉｏｎ，  Ｒ．，  Ｂｒｕｌｉｎ，  Ｂ．，  Ｍａｉｌｌａｓｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｃｈａｒｒｉｅｒ，  Ｃ．，  Ｔｅｌｅｔｃｈｅａ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｈｅｙｍａｎｎ，  Ｄ．  ２０１５．  ＩＬ−３４  ａｎｄ  Ｍ−ＣＳＦ  ｆｏｒｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  Ｍ−ＣＳＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．