【手続補正書】
【提出日】平成20年8月6日(2008.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
式Ｉの化合物は、スクシノイル−Ｔｙｒ−もしくは−Ａｓｐ−Ｔｙｒモチーフに加えて、いかなるアミノ酸、優先的に天然由来のアミノ酸、を含んでもよい。オリゴペプチジル残基もしくはオリゴペプチドは好ましくは２〜７アミノ酸残基の長さであり得る。さらに好ましい数のアミノ酸は５〜７アミノ酸残基の長さであり得る。式Ｉの化合物は、遊離でもよくもしくは固体支持体、例えば、ポリスチレン(例えばポリ−リシン被膜ポリスチレンのマイクロタイタープレート)、ポリアミド(例えばポリアクリルアミドのピンもしくはビーズまたはセルロース、例えば紙)；標識基、例えばビオチン、特にＬ(＋)−ビオチン(また他の、例えばオリゴ−リシンもしくはアルギニン(Ｌｙｓおよび／もしくはＡｒｇ)ｎ，ｎ＝２〜６）、発色性もしくは蛍光性基(例えば２,４−ジニトロフェニル)；または高分子担体、例えばもう一つのペプチド、例えばペネトラチンもしくはリポペプチドのような膜透過性ペプチドまたはタンパク質(例えばウシ血清アルブミン)のいずれかに結合してもよい。結合は、スクシノイル−Ｔｙｒ−中のチロシンのもしくは−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−モチーフ中のアスパラギン酸もしくはチロシンのを除いて、式Ｉの化合物に含まれるアミノ酸の側鎖のいずれか一つを経由するか、または、直接もしくはリンカー、例えばアミノヘキサノイルもしくはスクシニル、を経由して、末端のアミノもしくはカルボキシ基を経由してもよい。式Ｉの化合物のアミノ基は遊離でもよくまたはペプチド化学における当業者に公知の保護基のいずれかにより、例えば、アシル、ウレタンもしくは尿素基、さらに好ましくはアセチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルもしくは９−フルオレニルメトキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)により保護されてもよい。末端カルボキシ基は、官能性誘導体、例えばエステル、例えばアルキルもしくはアラルキル、例えばメチルもしくはベンジルエステル、非置換アミドまたはモノ−もしくはジ−置換アミド、例えばＮ−メチル、Ｎ,Ｎ−ジエチルもしくはＮ−フェニル、Ｎ−エチルアミド、により置換されてもよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
７．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤の有効量を対象に投与することを含む、そのような阻害を必要とする該対象においてＴ細胞の機能およびＴ細胞の増殖を阻害する方法。
８．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤の有効量を対象に投与することを含む、そのような阻害を必要とする該対象においてＮＫ細胞の機能およびＮＫ細胞の増殖を阻害する方法。
９．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤の有効量を対象に投与することを含む、そのような阻害を必要とする該対象においてＢ細胞の機能およびＢ細胞の増殖を阻害する方法。
１０．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤を、そのための一つもしくはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤もしくは担体と共に含む、医薬組成物。
１１．式Ｉの化合物をＬＡＴの基質として使用。
１２．例えば少なくとも一つのＴｙｒ残基においてリン酸化される、式Ｉの化合物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
実施例Ａ１：Ｌ(＋)−ビオチニル−アミノヘキサノイル−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ(配列番号１２)の調製
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−オキシメチル−４−フェノキシメチル−コ(ポリスチレン−１％−ジビニルベンゼン)、Ａｓｎの含量は約０.５ｍｍｏｌ／ｇ、のＮ−α  Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて切断する。側鎖で保護されたＦｍｏｃ−アミノ酸[Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)、Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)、Ａｓｎ(Ｔｒｔ)、Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)およびＴｙｒ(ｔＢｕ)］についてアミノ基当り４当量をＤＩＰＣＤＩおよびＨＯＢｔをＤＭＦ中で用いてカップリングさせる。ペプチド鎖の完全な組み立て後に、末端のＦｍｏｃ−保護基を、上述のように、ＤＭＦ中ピペリジンで除去する。それから、Ｌ(＋)−ビオチニル−アミノヘキサン酸を４当量の試薬を用いてＤＭＦ中でＤＩＰＣＤＩおよびＨＯＢｔを用いて末端アミノ基へＲＴで４日間カップリングさせる。ペプチドを樹脂支持体から切断し、そして全ての側鎖の保護基を、ＴＦＡ中で５％ドデシルメチルスルフィドおよび５％水からなる試薬をＲＴで２時間用いて同時に除去する。樹脂粒子をろ過し、ＴＦＡで洗浄し、そして、１０〜２０容量のジエチルエーテルの添加により、合併したろ液から生成物を沈澱させ、エーテルで洗浄しそして乾燥する。２％リン酸水溶液中でアセトニトリルの勾配を用いるＣ−１８広−孔シリカカラム上のクロマトグラフィーにより、生成物を精製する。純粋な化合物を含有するフラクションを集め、陰イオン交換樹脂(Biorad、ＡＧ４−Ｘ４酢酸塩形)を通してろ過しそして凍結乾燥して、タイトル化合物を得る。ＭＳ：１９５８.０(Ｍ−Ｈ)−１
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
実施例Ａ１で記した手順を用いるが、適切なアミノ酸誘導体および樹脂支持体に取り替えることにより、表１の配列を持つ化合物を調製する：
【表１】
2004505991.tif 000001
【表２】
2004505991.tif 000002
【表３】
2004505991.tif 000003
【表４】
2004505991.tif 000004
Ａ：配列番号
Ｒ：Ｌ(＋)−ビオチニル−アミノヘキサノイル
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
実施例Ｃ１：時間分解蛍光共鳴エネルギー移動により測定されるＺＡＰ−７０による式Ｉの化合物のリン酸化
ＺＡＰ−７０キナーゼアッセイ：１０ｎＭ  ＺＡＰ−７０単独もしくは１０ｎＭ  ＺＡＰ−７０プラス４２ｎＭ  Ｌｃｋ、２５０ｎＭの式Ｉのビオチン化した化合物および１μＭ  ＡＴＰを４０μｌのＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液(２０ｍＭトリス、ｐＨ７.５、１０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０.０１％ウシ血清アルブミン、０.０５％ Tween 20)中でマイクロタイタープレート中ＲＴで５時間インキュベートする。検出緩衝液(２０ｍＭトリス、ｐＨ７.５、０.０１％ウシ血清アルブミン、０.０５％ Tween 20)中の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌでキナーゼ反応を終結させる。
検出緩衝液中へ５０μｌのユウロピウム−標識抗−ホスホチロシン抗体(例えばＥＵ−ＰＴ６６：０.１２５ｎＭの最終濃度；Advant/Wallac)および５０μｌのストレプトアビジン−アロフィコシアニン(ＳＡ−ＡＰＣ；４０ｎＭの最終濃度)の添加により、検出段階を実施する。ＲＴで１時間インキュベーション後に、例えば Victor2 Multilabel Counter (Wallac) 上で６６５ｎｍにおいて蛍光を測定する。
このアッセイにおいては、式Ｉの化合物、特に配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４もしくは配列番号２５で表される化合物、は、ＺＡＰ−７０によりおよびＬｃｋにより活性化されたＺＡＰ−７０によりリン酸化されて、２０,０００〜４６,０００蛍光単位をもたらす。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
実施例Ｃ２：ＺＡＰ−７０および３３Ｐ−ＡＴＰによる式Ｉの化合物のリン酸化
ＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液１５μｌ中Ｌｃｋ(１００ｎＭ)およびＡＴＰ(１０μＭ)で、ＺＡＰ−７０(２０ｎＭ)をインビトロで活性化する。この反応は、シリコン化したマイクロタイタープレート中ＲＴで１時間実施される。５μＭの選択的Ｌｃｋ阻害剤ＰＰ２(４−アミノ−５−(４−クロロフェニル)−７−(ｔ−ブチル)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン；Alexis Biochemicals；１μＭの最終濃度)および３０ｎＭの３３Ｐ−ＡＴＰ(１１０  Ｔｂｑ／ｍｍｏｌ)を含むＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液５μｌの添加後に、混合液をＲＴでさらに１０分間インキュベートする。
それから、ＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液５μｌ中の０.４〜１００μＭの式Ｉの化合物(０.０８〜２０μＭの最終濃度)を加えそしてＲＴで２時間インキュベートする。７.５Ｍ塩酸グアニジン１２.５μｌの添加によりキナーゼ反応を終結させる。
３０μｌを、ウェル当り１００μｌのリン酸−緩衝生理食塩水でインキュベートしている、個々のＳＡＭ２(商標)ビオチン捕獲プレートウェル(Promega)へ移す。１分間のインキュベーション後に、真空マニホールドシステム中で以下のように洗浄を実施する：ウェル当り２００μｌの２Ｍ  ＮａＣｌで５回、ウェル当り２００μｌの２Ｍ  ＮａＣｌ／１％Ｈ３ＰＯ４で６回、ウェル当り２００μｌの脱イオン水で２回およびウェル当り２００μｌの９５％エタノールで２回。プレートを風乾しそしてプレートの底に不透明なシールを敷き、ウェル当り１５μｌのシンチレーション流体(例えば、Microscint, Packard)を加えそしてプレートを透明なトップシールでカバーする。液体シンチレーション分光計(例えば、TopCount, Packard)で放射能を測定する。例えば、配列番号１２、配列番号１３もしくは配列番号１４の化合物がＺＡＰ−７０によりリン酸化される。最高のｃｐｍは１２，０００〜１６,０００の範囲にある。Ｋｍ値は０.４〜２.０μＭの範囲にある。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
実施例Ｃ５：競合アッセイで測定されるＺＡＰ−７０による式Ｉの化合物のリン酸化
ＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液中８０ｎＭ  Ｌｃｋおよび４μＭ  ＡＴＰで、８０ｎＭ  ＺＡＰ−７０(２)をシリコン化したポリプロピレンチューブ中ＲＴで１時間インキュベートする。それから、選択的Ｌｃｋ阻害剤ＰＰ２(実施例Ｃ２を参照)を加え(１.２μＭの最終濃度)、そしてさらに１０分間インキュベートする。この溶液１０μｌを、例えば配列番号１２(１μＭ)のビオチン化した化合物の１０μｌおよび例えば配列番号２１、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７(０.２８〜２００μＭの逐次希釈)、の式Ｉの化合物の非−ビオチン化ペプチドの２０μｌと混合し、そしてＲＴで４時間インキュベートする。キナーゼ反応の終結、検出段階および蛍光の測定を実施例Ｃ１に記載のように実施する。
このアッセイにおいては、式Ｉの化合物、例えば配列番号２１、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３もしくは配列番号２４で表される化合物、は、配列番号１２で表される化合物のＺＡＰ−７０によるリン酸化を阻害する。ＩＣ５０値は０.６〜２１μＭの範囲にある。