【手続補正書】
【提出日】平成20年5月14日(2008.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物中のニトロレダクターゼ酵素活性を検出する方法であって、当該方法が、
ｉ）ニトロレダクターゼ活性を促進する条件下で組成物を色素分子と混合する段階と、
ｉｉ）ニトロレダクターゼ活性の尺度としての、上記色素分子の光学的性質の変化を測定する段階と
を含み、上記色素分子が、１個以上のＮＯ２基を含むスクアライン色素であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記組成物が１以上の細胞又は細胞抽出物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該方法が、ニトロレダクターゼ酵素活性に対する効果を測定すべき試薬の存在下で実施される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
ｉ）ニトロレダクターゼをコードする配列と作用可能に連結した発現調節配列を含む核酸分子を形質移入した宿主細胞を色素分子と接触させる段階と、
ｉｉ）ニトロレダクターゼ活性の尺度としての、上記色素分子の光学的性質の変化を測定する段階とを含む方法であって、上記色素が、１個以上のＮＯ２基を含むスクアライン色素であることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記光学的性質の変化が色素分子の蛍光強度の増大であり、当該増大がニトロレダクターゼ活性の尺度としての、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記スクアライン色素が次の式（Ｉ）のものである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【化１】
2008500828.tif 000001
式中、
Ｒ３は環構造Ｚ１に結合しており、Ｒ４は環構造Ｚ２に結合しており、
Ｚ１及びＺ２は独立にフェニル又はナフチル環系を表し、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【化２】
2008500828.tif 000002
Ｒ１基及びＲ２基は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ、−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６及びＷ基から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｗは一置換又は二置換ニトロベンジルであり、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基は独立に水素、ＮＯ２、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択され、
Ｒ５はＣ１〜Ｃ６アルキルであって、ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）、ＳＯ３−又はＯＨで適宜置換されていてもよく、
Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基及びＲ４基の少なくとも１つが１個以上のＮＯ２基を含む。
【請求項７】
前記色素が細胞透過性であるか、或いは細胞透過性にされる、請求項４乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記スクアライン色素が、以下の式の色素から選択される化合物である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【化３】
2008500828.tif 000003
式中、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【化４】
2008500828.tif 000004
（式中、Ｒ５は上記で定義した通りである。）、
Ｒ１基及びＲ２基の少なくともいずれかがＷ基（Ｗは上記で定義した通りである。）であり、
残りのＲ１基又はＲ２基があれば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ及び−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基は独立に水素、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択される。
【請求項９】
Ｒ１基及びＲ２基の一方が、以下の基から選択されるＷから選択され、
【化５】
2008500828.tif 000005
残りのＲ１基又はＲ２基がメチル及びエチルから選択されるか、或いは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７ 基（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、好ましくは５又は６である。）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｗが次式の基であり、
【化６】
2008500828.tif 000006
残りのＲ１基又はＲ２基が上記で定義した通りである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記スクアライン色素が以下の式の化合物である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【化７】
2008500828.tif 000007
式中、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【化８】
2008500828.tif 000008
（式中、Ｒ５は上記で定義した通りである。）
Ｒ１基又はＲ２基は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ及び−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基の少なくともいずれかがＮＯ２であり、
残りのＲ３基又はＲ４基があれば、水素、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択される。
【請求項１２】
ニトロレダクターゼ遺伝子発現に対する効果を測定すべき試薬のスクリーニング方法であって、当該方法が、
ａ）請求項４乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法を上記試薬の非存在下及び存在下で実施する段階と、
ｂ）試薬の非存在下及び存在下でのニトロレダクターゼ遺伝子発現量を測定する段階とを含み、
上記試薬の非存在下及び存在下でのニトロレダクターゼ遺伝子発現量の差が、ニトロレダクターゼ遺伝子発現に対する上記試薬の効果の指標となる、方法。
【請求項１３】
ニトロレダクターゼ遺伝子発現に対する効果を測定すべき試薬のスクリーニング方法であって、
ａ）請求項４乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法を上記試薬の存在下で実施する段階と、
ｂ）ニトロレダクターゼ遺伝子発現量を、試薬の非存在下でのニトロレダクターゼ遺伝子発現量についての対照値と比較する段階と
を含む方法。
【請求項１４】
前記対照値がデータベースその他の電子的フォーマットに電子的に記憶される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
以下の式の色素から選択される化合物。
【化９】
2008500828.tif 000009
式中、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【化１０】
2008500828.tif 000010
Ｒ１基及びＲ２基の一方が、以下の基から選択されるＷから選択され、
【化１１】
2008500828.tif 000011
残りのＲ１基又はＲ２基がメチル、エチル及び−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７ 基（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数である。）であり、
Ｒ３基及びＲ４基は独立に水素、ＮＯ２、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択され、
Ｒ５はＣ１〜Ｃ６アルキルであって、ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）、ＳＯ３−又はＯＨで適宜置換されていてもよい。
【請求項１６】
残りのＲ１基又はＲ２基が−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＲ７基及び−（ＣＨ２）６−ＣＯＯＲ７基（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）から選択される、請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
以下のａ）〜ｆ）から選択される化合物。
ａ）２−（１−メチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物１）、
ｂ）２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物２）、
ｃ）２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−ベンズインドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物３）、
ｄ）２−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物５）、
ｅ）２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物６）、及び
ｆ）３−（５−カルボキシペンチル）−１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデンメチル−４−（（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−２−イル）メチレン）−３−オキソシクロブト−１−エン−１−オレート（化合物７）。
【請求項１８】
以下のａ）及びｂ）から選択される化合物。
ａ）２−（３−エチル−６−ニトロ−２−ベンゾチアゾリニリデンメチル）−４−（１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物４）、及び
ｂ）２−（（３，３−ジメチル−５−スルホ−１−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）メチル）−４−（（１−メチル−６−ニトロキノリニウム−２−イル）メチレン）−３−オキソシクロブト−１−エン−１−オレート（化合物８）。
【請求項１９】
ニトロレダクターゼ酵素活性の検出及び／又は測定用の基質としての、請求項１５乃至請求項１８のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２０】
前記化合物をインビボで投与し、光学画像化によってニトロレダクターゼ酵素活性を求める、請求項１９記載の使用。