(57)【要約】  保存性及び取り扱い性に優れるとともに、使用時に高い柔軟性を有する羊膜を含むシート状組成物を提供する。トレハロースを付加した羊膜を用いる。トレハロースの付加によって羊膜の柔軟性が向上し、凍結乾燥処理に伴う基底膜及び緻密層の損傷を防止できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロースを付加した羊膜を備えてなるシート状組成物。
【請求項２】
凍結状態又は乾燥状態である、請求項１に記載のシート状組成物。
【請求項３】
凍結乾燥状態である、請求項２に記載のシート状組成物。
【請求項４】
前記羊膜が、上皮細胞層が除去された羊膜である、請求項１〜３のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項５】
前記羊膜が、基底膜成分であるコラーゲンIV、コラーゲンVII、及びラミニン5が未処理の羊膜と同等の強度で検出される羊膜である、請求項１〜４のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項６】
前記羊膜がヒト羊膜である、請求項１〜５のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項７】
生体由来細胞からなる細胞層が前記羊膜上に形成されている、請求項１〜６のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項８】
前記細胞層において前記生体由来細胞が重層化している、請求項７に記載のシート状組成物。
【請求項９】
前記生体由来細胞が、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜上皮、虹彩色素上皮、網膜色素上皮、気道粘膜上皮又は腸管粘膜由来の細胞である、請求項７に記載のシート状組成物
【請求項１０】
前記細胞層が、約５〜７層に重層化した細胞から構築され、角膜上皮に類似した性質を備える、請求項７に記載のシート状組成物。
【請求項１１】
癒着防止用材料、又は手術侵襲による臓器ないし器官の表面組織障害の再建用材料として使用される、請求項１〜６のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項１２】
前記羊膜の絨毛膜側の表面に接着成分が付着している、請求項１〜１１のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項１３】
前記接着成分がフィブリノーゲン及びトロンビンである、請求項１２に記載のシート状組成物。
【請求項１４】
前記接着成分がフィブリノーゲン、トロンビン及びアプロチニンである、請求項１２に記載のシート状組成物。
【請求項１５】
前記羊膜の絨毛膜側の表面が生体吸収性材料で被覆されている、請求項１〜１４のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかのシート状組成物を移植材料として使用する移植方法。
【請求項１７】
以下のステップを含んでなる、シート状組成物の作製方法：
(a)羊膜を調製するステップ；
(b)前記羊膜にトレハロースを付加するステップ。
【請求項１８】
以下のステップを更に含む、請求項１７に記載の作製方法：
(c)ステップbよりも後に凍結処理又は乾燥処理するステップ。
【請求項１９】
以下のステップを更に含む、請求項１８に記載の作製方法：
(d)ステップcよりも後に滅菌処理するステップ。
【請求項２０】
前記ステップaが以下のステップを含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の作製方法：
(a1)羊膜から上皮を除去するステップ。
【請求項２１】
前記ステップa1が以下のステップを含む、請求項２０に記載の作製方法：
(1)生体より分離された羊膜を用意するステップ、
(2)前記羊膜に凍結融解処理を施すステップ、
(3)凍結融解処理後の羊膜にトリプシン処理を施すステップ、
(4)トリプシン処理後の羊膜を洗浄するステップ。
【請求項２２】
前記凍結融解処理において、凍結温度が約−20℃〜約−80℃であり、融解温度が約4℃〜約50℃であることを特徴とする、請求項２１に記載の作製方法。
【請求項２３】
前記凍結融解処理を二回以上繰り返し実施することを特徴とする、請求項２１又は２２に記載の作製方法。
【請求項２４】
トリプシン濃度が約0.01%(w/v)〜約0.05%(w/v)のトリプシン溶液を使用して前記トリプシン処理を実施することを特徴とする、請求項２０〜２３のいずれかに記載の作製方法。
【請求項２５】
前記トリプシン溶液が、EDTA、NTA、DTPA、HEDTA、GLDA及びこれらの任意の組合せからなる群より選択されるキレート剤を約0.1mM〜約0.6mM含有することを特徴とする、請求項２４に記載の作製方法。
【請求項２６】
羊膜上皮側のみにトリプシン溶液が接触する条件下で前記トリプシン処理を実施することを特徴とする、請求項２０〜２５のいずれかに記載の作製方法。
【請求項２７】
ステップbよりも後に、以下のステップが実施される、請求項２０〜２６のいずれかに記載の作製方法：
(A)生体由来細胞からなる細胞層を前記羊膜上に形成するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羊膜を用いたシート状組成物及びその作製方法に関する。本発明のシート状組成物は例えば、人工組織（角膜上皮シートなど）を作製するための培養基質、眼表面や皮膚等の再建用の移植材料、又は癒着防止剤として利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
生体適合性が高いことや柔軟性に富むことなど、移植材料として好ましい特性を羊膜は備えており、角膜上皮の再建をはじめとして様々な組織の再建への利用が図られている（例えば特許文献１〜４を参照）。羊膜の利用方法は二つに大別される。即ち、羊膜を直接患部に適用して組織の再建を図る方法と、羊膜を細胞培養用の基質として用いる方法である。これらいずれの利用方法においても羊膜の柔軟性は重要な特性である。高い柔軟性を有するが故に羊膜は患部を隙間無く被覆でき、また患部への良好な接着及び生着も可能となり、良好な治療効果を発揮する。一方、細胞培養用の基質として羊膜が用いられる場合においては、高い柔軟性を有することによってその上での良好な細胞増殖及び正常な組織化（分化）を可能とする。【０００３】
【特許文献１】特開平５−５６９８７号公報
【特許文献２】国際公開第０３／０４３５４２  Ａ１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０９２７６２  Ａ１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０７８２２５  Ａ１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
羊膜は哺乳動物において子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって分娩時に得られる。従って、新鮮な状態の羊膜を常に入手することができるわけではなく、今後の臨床応用を視野にいれれば、長期間の保存が可能であり、取り扱い性も優れた羊膜を提供することが望まれる。そこで、採取された羊膜を乾燥状態にして保存性及び取り扱い性を向上させることが行われている。乾燥処理を施すことによって羊膜の保存性などが格段に向上するものの、構成蛋白質の変性などが生ずる結果、湿潤状態に戻したときの柔軟性は大きく低下する。柔軟性が低くなれば、隙間無く患部を被覆することができない場合も生じ、患部への接着性や生着性も低下する。一方、乾燥処理を経た羊膜ではその上での細胞増殖率が低く、重層化も阻害され、正常な組織化（分化）が生じない。これは、柔軟性の低下に伴い、羊膜表面の平坦性が大幅に低下することによると考えられる。
本発明は以上の課題に鑑みてなされたものであってその主たる目的は、保存性及び取り扱い性に優れるとともに、使用時に高い柔軟性を有する羊膜を含むシート状組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために本発明者らは羊膜に修飾を施すことによって柔軟性を向上させることを試みた。その結果、二糖の一つであるトレハロースで処理した羊膜では、後に乾燥処理を施したとしても湿潤状態に戻せば柔軟性を回復し、その柔軟性は未処理の羊膜（生羊膜）と同等のレベルであることを見出した。つまり、羊膜の柔軟性を向上させることにトレハロース処理が有効であることが明らかとなった。
また、トレハロース処理を経ることによって羊膜の透明度が向上するという驚くべき現象も認められた。このことから、可能な限り高い透明性が要求される用途（例えば角膜再建）に使用する際、羊膜をトレハロース処理することが極めて有効であることが判明した。
一方、トレハロース処理によって羊膜の引張強度も高まり、生羊膜よりも強靱な羊膜を得ることができた。このことから、羊膜の取り扱い性の向上や移植後の形態保持にもトレハロース処理が有効であることが明らかとなった。
さらに、トレハロース処理後の羊膜の生体適合性を検証したところ生羊膜同様の高い生体適合性を認めた。これによって、トレハロース処理が生体適合性に影響を与えないことが確認された。
以上の知見を得た後、羊膜の細胞培養基質としての機能に及ぼすトレハロースの影響を調べた。具体的には、トレハロース処理後の羊膜上で角膜上皮細胞を培養し、細胞増殖率、重層化の程度を調べた。その結果、良好な細胞増殖が認められるとともに５〜７層の重層化が生じた。これは、トレハロース処理を施さない羊膜での重層化（１〜２層）の程度と比して大幅に向上したことになる。このように、羊膜を細胞培養基質として用いる場合においてもトレハロース処理が有効であることが判明した。
続いて、羊膜上に細胞層が形成されたシートを動物へ眼表面に移植し、その再建効果を検証した。その結果、良好な接着性及び生着性を示し、欠損なく眼表面を再建することができ、高い透明性も維持した。
本発明は主として以上の知見に基づくものであり、本発明は以下のシート状組成物を提供する。
［１］  トレハロースを付加した羊膜を備えてなるシート状組成物。
［２］  凍結状態又は乾燥状態である、［１］に記載のシート状組成物。
［３］  凍結乾燥状態である、［２］に記載のシート状組成物。
［４］  前記羊膜が、上皮細胞層が除去された羊膜である、［１］〜［３］のいずれかに記載のシート状組成物。
［５］  前記羊膜が、基底膜成分であるコラーゲンIV、コラーゲンVII、及びラミニン5が未処理の羊膜と同等の強度で検出される羊膜である、［１］〜［４］のいずれかに記載のシート状組成物。
［６］  前記羊膜がヒト羊膜である、［１］〜［５］のいずれかに記載のシート状組成物。
［７］  生体由来細胞からなる細胞層が前記羊膜上に形成されている、［１］〜［６］のいずれかに記載のシート状組成物。
［８］  前記細胞層において前記生体由来細胞が重層化している、［７］に記載のシート状組成物。
［９］  前記生体由来細胞が、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜上皮、虹彩色素上皮、網膜色素上皮、気道粘膜上皮又は腸管粘膜由来の細胞である、［７］に記載のシート状組成物
［１０］  前記細胞層が、約５〜７層に重層化した細胞から構築され、角膜上皮に類似した性質を備える、［７］に記載のシート状組成物。
［１１］  癒着防止用材料、又は手術侵襲による臓器ないし器官の表面組織障害の再建用材料として使用される、［１］〜［６］のいずれかに記載のシート状組成物。
［１２］  前記羊膜の絨毛膜側の表面に接着成分が付着している、［１］〜［１１］のいずれかに記載のシート状組成物。
［１３］  前記接着成分がフィブリノーゲン及びトロンビンである、［１２］に記載のシート状組成物。
［１４］  前記接着成分がフィブリノーゲン、トロンビン及びアプロチニンである、［１２］に記載のシート状組成物。
［１５］  前記羊膜の絨毛膜側の表面が生体吸収性材料で被覆されている、［１］〜［１４］のいずれかに記載のシート状組成物。【０００６】
本発明は他の局面として以下の移植方法を提供する。
［１６］  ［１］〜［１５］のいずれかのシート状組成物を移植材料として使用する移植方法。【０００７】
本発明はさらに他の局面として以下の作製方法を提供する。
［１７］  以下のステップを含んでなる、シート状組成物の作製方法：
(a)羊膜を調製するステップ；
(b)前記羊膜にトレハロースを付加するステップ。
［１８］  以下のステップを更に含む、［１７］に記載の作製方法：
(c)ステップbよりも後に凍結処理又は乾燥処理するステップ。
［１９］  以下のステップを更に含む、［１８］に記載の作製方法：
(d)ステップcよりも後に滅菌処理するステップ。
［２０］  前記ステップaが以下のステップを含む、［１７］〜［１９］いずれかに記載の作製方法：
(a1)羊膜から上皮を除去するステップ。
［２１］
前記ステップa1が以下のステップを含む、［２０］に記載の作製方法：
(1)生体より分離された羊膜を用意するステップ、
(2)前記羊膜に凍結融解処理を施すステップ、
(3)凍結融解処理後の羊膜にトリプシン処理を施すステップ、
(4)トリプシン処理後の羊膜を洗浄するステップ。
［２２］  前記凍結融解処理において、凍結温度が約−20℃〜約−80℃であり、融解温度が約4℃〜約50℃であることを特徴とする、［２１］に記載の作製方法。
［２３］
前記凍結融解処理を二回以上繰り返し実施することを特徴とする、［２１］又は［２２］に記載の作製方法。
［２４］  トリプシン濃度が約0.01%(w/v)〜約0.05%(w/v)のトリプシン溶液を使用して前記トリプシン処理を実施することを特徴とする、［２０］〜［２３］のいずれかに記載の作製方法。
［２５］  前記トリプシン溶液が、EDTA、NTA、DTPA、HEDTA、GLDA及びこれらの任意の組合せからなる群より選択されるキレート剤を約0.1mM〜約0.6mM含有することを特徴とする、［２４］に記載の作製方法。
［２６］  羊膜上皮側のみにトリプシン溶液が接触する条件下で前記トリプシン処理を実施することを特徴とする、［２０］〜［２５］のいずれかに記載の作製方法。
［２７］  ステップbよりも後に、以下のステップが実施される、［２０］〜［２６］のいずれかに記載の作製方法：
(A)生体由来細胞からなる細胞層を前記羊膜上に形成するステップ。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】組織再建用材料としてのシート状組成物の用途（主な適用部位、適用方法の例、好ましい羊膜の形態、主な目的）をまとめた表である。
【図２】羊膜の固定法を説明する図である。（ａ）では一対の枠で羊膜を挟み、(b)では枠と平板状部材で羊膜を挟む。
【図３】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の物性評価試験（厚さ）の結果を示すグラフである。
【図４】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の物性評価試験（透明度）の結果を示すグラフである。
【図５】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の物性評価試験（引張強度）の結果を示すグラフである。
【図６】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の物性評価試験（柔軟性）の結果を示すグラフである。
【図７】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の生体適合性評価試験の結果を示す図である。トレハロース処理・凍結乾燥羊膜を家兎の角膜実質層間に移植し、眼表面の状態を観察した。左は移植直後の眼表面の状態、右は移植後一ヶ月の眼表面の状態である。
【図８】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の生体適合性評価試験の結果を示す図である。トレハロース処理・凍結乾燥羊膜を家兎の角膜実質層間に移植し、移植後一ヶ月の時点で、移植部を含む角膜の一部を摘出してHE染色に供した。
【図９】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜上に角膜上皮細胞を培養する際の器具等の状態を模式的に示した断面図である。カルチャー・ディッシュ１１内にカルチャー・インサート１２が静置され、カルチャー・ディッシュ１１底面には3T3細胞層１５が形成される。また、カルチャー・インサート１２の底面上に羊膜１３が静置され、その上に角膜上皮細胞１４が培養される状態が示される。符号１６は培地である。
【図１０】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜上に形成された細胞層を示す図（HE染色像）である。トレハロース処理を行わずに凍結乾燥を行って得られた羊膜（未処理凍結乾燥羊膜）を使用した場合に形成される細胞層の状態を比較対照として示す。
【図１１】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜上に細胞層が形成されたシート（培養角膜上皮シート）のHE染色像及び免疫染色像である。免疫染色像において各抗体のシグナルは緑である。細胞核は赤で表示される。角膜型ケラチン３は発現（＋）、皮膚角化型ケラチン１０（−）、結膜型ケラチン１３（−）。
【図１２】トレハロース処理・凍結乾燥羊膜を使用して作製した培養角膜上皮シートの再建効果を示す図である。培養角膜上皮シート移植後２日目及び１４日目の眼表面の状態（上段）及びフルオレセイン染色像（下段）を示す。
【図１３】移植後２週目の培養角膜上皮シートのHE染色像（上段左）、及び各種ケラチンに関する免疫染色像（上段右、下段）である。記号＊＊はトレハロース処理・凍結乾燥羊膜（TH-AM）を示す。
【図１４】基底膜特異的成分に対する抗体、及び緻密層特異的成分に対する抗体を使用してトレハロース処理・凍結乾燥羊膜を免疫染色した結果である。トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の免疫染色像（Ｃ）を、生羊膜（Ａ）の免疫染色像とトレハロース処理をせずに凍結乾燥させた羊膜の免疫染色像（Ｂ）と比較して示す。１：コラーゲンIの染色像、２：コラーゲンIIIの染色像、３：コラーゲンIVの染色像、４：コラーゲンVの染色像、５：コラーゲンVIIの染色像、６：ラミニン5の染色像、７：フィブロネクチンの染色像。
【図１５】羊膜上皮の除去手順を示すフローチャートである。
【図１６】トリプシン処理の方法を示す図である。（ａ）では枠固定された羊膜の上皮側を下にしてトリプシン溶液への浸漬を行う。（ｂ）では枠内にトリプシン溶液を入れることで羊膜の上皮側にトリプシンを作用させる。
【図１７】トリプシン処理羊膜、生羊膜（上皮有）、用手的処理羊膜のHE染色像である。
【図１８】トリプシン処理羊膜の免疫染色像である。
【図１９】同じくトリプシン処理羊膜の免疫染色像である。
【図２０】生羊膜（上皮有）の免疫染色像である。
【図２１】用手的処理羊膜の免疫染色像である。
【図２２】HE染色実験及び免疫実験の結果をまとめた表である。
【符号の説明】
【０００９】
１、２、３  枠
４  板状部材
５  トリプシン溶液
１０  羊膜
１１  カルチャー・ディッシュ（培養皿）
１２  カルチャー・インサート（培養挿入容器）
１３  羊膜
１４  角膜上皮細胞
１５  3T3細胞層
１６  培地
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の第１の局面はシート状組成物に関する。本発明のシート状組成物ではその主要構成成分として羊膜が使用される。羊膜が有する高い透明性及び強靱性によって、透明性及び強度に優れたシート状組成物を構成できる。また、羊膜の高い生体親和性及び低免疫原性によって、生体親和性に一層優れ且つ免疫原性の低いシート状組成物を構成できる。羊膜を使用することによってさらに、抗炎症作用、痕跡形成の抑制、血管新生の阻害といった作用を期待できる。羊膜を使用することは、本発明のシート状組成物が細胞層を含む場合において、当該細胞層を良好に形成させる点でも好ましい。即ち、後述のように、細胞層を備えるシート状組成物は、羊膜を基質（支持体）としてその上に所定の細胞を播種、培養することによって形成されるところ、羊膜はその上に細胞が良好に接着及び増殖するという特性を備えることから、羊膜を使用すれば良好な細胞の接着、増殖、そして細胞層の形成が可能となる。【００１１】
（羊膜の由来）
「羊膜」とは、哺乳動物において子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲンに富む実質組織上に基底膜、上皮層が形成されて構成される。ヒト、サル、チンパンジー、ブタ、ウマ、ウシ等の羊膜を用いることができる。中でもヒト羊膜を用いることが好ましい。免疫原性やウイルス感染を含め、安全性の面で有利だからである。【００１２】
（トレハロースの付加）
本発明のシート状組成物では、トレハロースを付加した羊膜が使用される。本発明者らの検討の結果、トレハロースの付加によって羊膜の柔軟性が向上し、特に凍結乾燥状態としたときの柔軟性が大幅に改善されることが判明した。また、後述の実施例に示すように、トレハロースを付加した羊膜は細胞培養用の基質として良好に機能することが判明した。このような知見に基づいて構成された本発明のシート状組成物は、高い柔軟性を有し、一方で細胞培養用の基質として使用される場合には良好な細胞増殖及び重層化を可能とする。
ここで、羊膜内部のマトリックス蛋白が弱体化すると羊膜の強度が低下し、障害を受けやすくなる。また、水分を内部に堅固に保持できず、脆弱となり弾力も失われる。トレハロースはマトリックス蛋白内の結合の緩んだ部分に作用して蛋白質間の結合を強め、これによって羊膜内部の水分保持機能が正常になり、羊膜本来の潤い、まとまり、弾力が維持されるものと予想される。トレハロースを付加しておくことによって、凍結乾燥処理に伴い羊膜内部のマトリックス蛋白が柔らかくなり、特に水中で膨潤し弱体化することを有効に防止できると考えられる。
トレハロース（物質名、一般名）はα-D-Glucopyranosyl (1,1)-α-D-Glucopyranosideで表される化合物である。
羊膜へのトレハロースの付加は例えば、トレハロース溶液で羊膜を処理することによっておこなうことができる。尚、トレハロースの付加方法の詳細については後述する。
尚、本発明の一形態は、トレハロースが付加された羊膜のみから実質的に構成される。【００１３】
（羊膜の状態）
本発明の一形態では、上皮細胞層が除去された羊膜が使用される。上皮細胞層が除去された羊膜では上皮細胞に起因する免疫拒絶等の問題が全くなく、極めて安全性が高くなる。また、上皮が除去された羊膜ではその上に細胞が一層良好に接着及び増殖することから、より短時間で高い品質の細胞シートを構築することができるという、作製上の利点も得られる。
上皮層を除去した羊膜であることは、本発明のシート状組成物に羊膜上皮層の細胞が含まれていないことを調べることによって確認できる。
一方、上皮層を残存させた羊膜を用いて本発明のシート状組成物を構築してもよい。羊膜の上皮層を残存させておくことによって、作製段階でγ線処理など十分な滅菌処理を行うことができ、安全性の向上を図ることができる。【００１４】
（再構築した羊膜の使用）
再構築した羊膜を用いて本発明のシート状組成物を構成することもできる。具体的には例えば、ホモジナイザ、超音波、酵素処理により一旦分解し、再び膜状の形状に再構築した羊膜を用いることができる。処理の方法はホモジナイザを用いることが好ましい。基底膜の微小な構造体を比較的高く保持することが期待されるからである。ホモジナイズ処理の条件（回転数）は例えば３０００ｒｐｍ〜５００００ｒｐｍ、好ましくは１００００ｒｐｍ〜４００００ｒｐｍ、更に好ましくは約３００００ｒｐｍである。【００１５】
（厚さ）
羊膜を使用することによって本発明のシート状組成物は非常に薄いシート状に構成され得る。本発明のシート状組成物は例えば10μm〜500μmの厚さに調製される。このように非常に薄いシート状であることによって汎用性が増す。絨毛膜側の緻密層の一部（例えば、10μm〜30μm程度）を除去した羊膜を用いて本発明のシート状組成物が構築されていてもよいし、生体吸収性の素材をコートすることによって例えば100μm〜500μm程度の厚さにしてもよい。【００１６】
（接着成分の使用）
本発明の一形態では、羊膜の表面にフィブリノーゲン及びトロンビン（以下、これらをまとめて「接着成分」ともいう）が付着している。これによって、本発明のシート状組成物を移植した際、まずトロンビンによってフィブリノーゲンが特異的に加水分解されてフィブリンが生成し、続いてフィブリンが重合して安定なフィブリン塊となり接着作用を発揮する。このようにして接着性を高めれば、シート状組成物を患部に適用した際、縫合することなく十分な接着力を得ることも可能となり、これによって術式の簡便化が図られる。尚、本明細書において、上皮を有し且つ接着成分が付着した羊膜を「接着成分付着・上皮有り羊膜」ともいい、上皮を有さず且つ接着成分が付着した羊膜を「接着成分付着・上皮無し羊膜」ともいう。【００１７】
フィブリノーゲン及びトロンビンは、本発明のシート状組成物の用途に合わせて羊膜の片面又は両面に付着している。片面付着の場合には、羊膜における上皮の有無に拘わらず、羊膜の絨毛膜側表面（即ち、上皮側と反対側の表面）が付着面となる。従って、このような構成のシート状組成物を使用する場合には、羊膜の上皮が存在していた側を上にして適用部位に移植されることになる。尚、癒着防止を目的としたシート状組成物の場合においても、羊膜の片面に接着成分を付着させることとなる。生体接着剤を目的として生体内に移植される場合は、羊膜の両面に接着成分を付着させることが適当である。【００１８】
後述のようにこの形態のシート状組成物は、使用目的などを考慮して適切な状態（例えば乾燥状態又は湿潤状態）へと、羊膜表面にフィブリノーゲン及びトロンビンを付着させる工程を経て調製される。従って、その作製過程において及び／又はその最終状態の如何によっては、使用されるまでの間に一部のフィブリノーゲンからフィブリンが生成することが予想される。従って、本発明のシート状組成物には、このような原因によって生じたフィブリン又はフィブリン塊が付着しているものも含まれる。【００１９】
フィブリノーゲン及びトロンビンの由来は特に限定されない。例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等の血液を材料としてフィブリノーゲン及びトロンビンを調製することができる。また、フィブリノーゲン及びトロンビンとして、培養細胞（例えばＣＨＯ細胞やＣＯＳ細胞）を利用して得られた組み換え体（リコンビナント）を使用してもよい。ヒト由来（特にヒト由来の組換え体）のフィブリノーゲン及びトロンビンを使用することが好ましい。免疫原性を含め、安全性の面で有利だからである。また、安定した品質のものを使用できる点及び感染の問題を考慮すれば、組み換え体を用いることが特に好ましい。
本発明のシート状組成物の移植を受ける患者（レシピエント）の血液に由来するフィブリノーゲン及びトロンビンを使用することが特に好ましい。これら接着成分に起因する免疫拒絶反応を惹起するおそれがなくなるからである。
尚、フィブリノーゲン及びトロンビンの由来は必ずしも同一でなくて良い。一例を挙げれば、ヒト血液由来のフィブリノーゲンと、ウシ血液由来のトロンビンを組み合わせて使用することができる。【００２０】
フィブリノーゲン及びトロンビンの付着量は特に限定されない。例えば、フィブリノーゲンの付着量を、羊膜1cm2あたり0.1mg〜50mgの範囲で設定することができる。同様に、トロンビンの付着量を、羊膜1cm2あたり0.5μmg〜10mgの範囲で設定することができる。
フィブリノーゲン及びトロンビンの付着量の設定にあたっては第一に接着力が考慮される。即ち、期待される接着量が得られるように、これらの成分の付着量を設定する必要がある。一方、フィブリノーゲンやトロンビンの付着量が多すぎる場合には、使用するフィブリノーゲンの由来にもよるが、免疫反応や血管新生を惹起し易くなる点が問題となる。
ここで、例えば眼表面の再建に適用されるシート状組成物とする場合など、移植後にこれらの成分による血管新生が問題となる場合には、血管新生の惹起をできるだけ抑えるために、これらの成分の付着量を少なくすることが好ましい。これらの成分の付着量を可能な範囲で少なく設定することによって、移植後の血管新生が抑えされ、高い治療効果が期待できる。本発明者らの検討の結果、羊膜との組合せにおいて使用する場合、フィブリノーゲンの付着量が羊膜1cm2あたり約0.5mg以上の場合に、眼表面に対する良好な接着力が得られることが判明している。トロンビンについてはその付着量を羊膜1cm2あたり約1μgとした場合であっても眼表面に対する良好な接着力が得られることが判明している。これらの知見に基づいて、フィブリノーゲンの付着量の好ましい範囲として羊膜1cm2あたり0.5〜20mg、さらに好ましい範囲として羊膜1cm2あたり0.5mg〜10mg、より一層好ましい範囲として羊膜1cm2あたり0.5mg〜6mg（具体的には例えば約0.5mg、約1mg、約2mg）を挙げることができる。同様にトロンビンの付着量の好ましい範囲として羊膜1cm2あたり1μg〜1mg、さらに好ましい範囲として羊膜1cm2あたり5μg〜200μg、より一層好ましい範囲として羊膜1cm2あたり10μg〜100μg（具体的には例えば約10μg、約20μg、約30μg）を挙げることができる。【００２１】
本発明の一形態では、フィブリノーゲン及びトロンビンに加えてアプロチニンが羊膜表面に付着している。アプロチニンは、トロンビンの作用によって形成されたフィブリン塊がプラスミンにより溶解されるのを阻害する。従って、アプロチニンを併用することでフィブリン塊の分解を抑え、接着力の維持ないし増強を図れる。
アプロチニンの由来は特に限定されない。例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、チンパンジー等の膵臓由来のアプロチニンを使用することができる。また、培養細胞（例えばＣＨＯ細胞やＣＯＳ細胞）を利用して得られた組み換え体（リコンビナント）のアプロチニンを使用してもよい。安定した品質のものを使用できる点及び感染の問題を考慮すれば、組み換え体を用いることが好ましい。
アプロチニンを使用する場合、その付着量は特に限定されない。例えば、アプロチニンの付着量を、羊膜1cm2あたり0.1 KIU〜200 KIUの範囲で設定することができる。上述したフィブリノーゲンの付着量の検討に合わせて、アプロチニンについての付着量も変化させて接着力への影響を調べたところ、羊膜との組合せにおいて使用する場合、アプロチニン量を1 KIU〜2 KIUの範囲で設定した場合であっても眼表面に対する十分な接着力が得られることが判明している。この知見に基づいて、アプロチニンの付着量の好ましい範囲として羊膜1cm2あたり1 KIU〜100 KIU、さらに好ましい範囲として羊膜1cm2あたり1 KIU〜20 KIU、より一層好ましい範囲として羊膜1cm2あたり1 KIU〜10 KIU（具体的には例えば約1 KIU、約2 KIU、約3 KIU）を挙げることができる。アプロチニン量が多すぎると、製造コストの上昇を引き起こすことは勿論のこと、アプロチニン自体の免疫原性などに起因する副作用のおそれが大きくなる。一方でアプロチニン量が少なすぎる場合には、フィブリン塊の分解抑制という、アプロチニンの作用が十分に発揮されないおそれがある。
尚、様々な用途においてフィブリン塊が接着剤として利用されているが、そのような用途ではアプロチニンを併用することが一般的である。本発明者らの検討の結果、羊膜との組合せにおいては、アプロチニンを使用しなくとも生体に対する十分な接着力が得られることが判明した。アプロチニンを使用しなくても良いことは、構成が簡略化されて作製上及びコスト面で有利となるばかりか、アプロチニン自体の免疫原性などに起因する副作用を考慮する必要がなくなることを意味する。【００２２】
（生体吸収性材料による補強）
羊膜の絨毛膜側を生体吸収性材料で被覆することによって本発明のシート状組成物の強度を高めることができる。このような目的で使用される生体吸収性材料として、羊膜に比較して早期に分解・吸収される材料を採用することが好ましい。例えばポリグラクチン９１０、ゼラチン、コラーゲン、ポリ乳酸等をここでの生体吸収性材料として好適に使用することができる。補強に使われる生体吸収性材料の形態は特に限定されない。例えばメッシュ状やシート状に成形した生体吸収性材料で羊膜絨毛膜側を被覆することで羊膜を補強する。羊膜の状態は、補強を行う過程では湿潤状態、乾燥状態のいずれでも構わない。但し、製品の最終形態では羊膜が乾燥状態である方が好ましい。乾燥状態とすれば操作性及び保存性に優れるからである。尚、本明細書において、補強を施した羊膜を「ハイブリッド羊膜」ともいう。【００２３】
（細胞層）
本発明のシート状組成物の一形態では、羊膜上に細胞層が備えられる。この形態において接着成分を併用する場合には、細胞層が形成されない側の羊膜表面に接着成分（フィブリノーゲン等）が付着されることになる。
この形態では通常、上皮が除去された羊膜が使用される。そして、上皮が存在していた側に細胞層が形成される。ここでの細胞層は生体由来細胞から構成される。細胞層を構成する細胞の由来は特に限定されない。例えば、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜上皮、虹彩色素上皮、網膜色素上皮、気道粘膜上皮又は腸管粘膜上皮由来の細胞によって細胞層が構成される。互いに異なる二種以上の細胞によって細胞層が構成されていてもよい。このように由来の異なる二種以上の細胞を含んで構成されていることを、本明細書では「ハイブリッド化」ともいう。ハイブリッド化された細胞層における細胞の含有形態（ハイブリッド化の状態）は特に限定されず例えば、各細胞が散在していてもよいし、いずれかの細胞（又は複数種類の細胞）が一定のまとまりをもって存在していてもよい。また、各細胞の含有率が細胞層全体に亘って均一でなくてもよい。細胞層は単層であっても多層（重層化した状態）であってもよい。【００２４】
ハイブリッド化された細胞層が備えられる場合における、細胞層を構成する細胞の種類を、角膜上皮の再建用として本発明のシート状組成物が構築される場合を例にとり、以下に詳述する。
ハイブリッド化された細胞層には二種類以上の細胞が含有される。そこで、説明の便宜上、細胞層に含まれる細胞種の一つを第１細胞とし、これと種類が異なる細胞種を第２細胞とする。まず、第１細胞として自己細胞を用いる。本明細書において「自己」とは、本発明のシート状組成物を適用する対象、即ち移植を受ける者（レシピエント）をいう。一方、このような「自己」以外の者を「他人」という。後述の第２細胞とハイブリッド化させた場合に角膜上皮様の粘膜上皮層を形成可能である限り、第１細胞の種類は特に限定されない。第１細胞の例としては、口腔粘膜上皮、結膜上皮、鼻腔粘膜上皮等の粘膜上皮に由来する細胞、或いはこのような粘膜上皮を構築可能な未分化細胞（即ち粘膜上皮の幹細胞）に由来する細胞を挙げることができる。ここで「由来する又は由来の」とは、出発材料を特定する目的で使用される。従って例えば、口腔粘膜上皮に由来する（又は由来の）細胞といえば、口腔粘膜上皮細胞を出発材料として得られた細胞を意味する。また、本発明において「粘膜上皮を構築可能な未分化細胞」とは、当該粘膜上皮を構成する細胞への分化能を有する細胞をいう。例えば、口腔粘膜上皮を構築可能な未分化細胞といえば、口腔粘膜上皮細胞へと分化し得る細胞をいう。未分化細胞の具体例としては、口腔粘膜上皮や結膜上皮など、特定の組織を構成する細胞の前駆又は幹細胞、或いはさらに分化度の低い上皮系幹細胞などが挙げられる。【００２５】
ハイブリッド化された細胞層が、異なる二種以上の第１細胞を含んでいてもよい。例えば、口腔粘膜上皮に由来する細胞と、結膜上皮に由来する細胞とを含んだ状態で細胞層が構築されていてもよい。【００２６】
本発明における「口腔粘膜上皮」には、口腔内縁粘膜上皮部、口唇部、口蓋部、頬部などが含まれる。それが口腔粘膜上皮に由来する細胞であることは、口腔粘膜上皮特異的なケラチン４、又はケラチン１３が発現していることを指標として確認することができる。又は、ケラチン３を発現していることを指標とすることもできる。このケラチン３は、角膜特異的ケラチンの一つと知られているが、口腔粘膜上皮においても発現していることが確認されている。尚、この角膜特異的ケラチンであるケラチン３を発現している点において、口腔粘膜上皮細胞を角膜上皮移植用の組成物を作製する材料として用いることは好ましいといえる。
一方、口腔粘膜上皮細胞特異的な遺伝子の発現を調べることによっても、それが口腔粘膜上皮由来であることを確認することができる。
尚、口腔粘膜上皮以外の組織に由来する細胞の場合も同様に、当該組織に特異的なマーカー或いは遺伝子の発現を調べることによってその由来を確認することができる。【００２７】
第２細胞の具体例としては、角膜上皮、結膜上皮、又は羊膜上皮に由来する細胞を挙げることができる。中でも、第２細胞が角膜上皮又は結膜上皮に由来する細胞であることが好ましい。眼表面組織に由来する細胞によって構築された細胞層では、角膜上皮により近い特性を備えることができるからである。第２細胞が角膜上皮に由来する細胞であることが特に好ましい。角膜上皮に一層近似した特性の細胞層となるからである。
第２細胞は自己細胞又は他人の細胞のいずれであってもよい。自己細胞によって構築された細胞層であれば免疫拒絶の問題のない又は少ない細胞層となる。他人の細胞によって構築された細胞層であれば原材料となる細胞の入手が容易となることから、その作製の観点から有利な細胞層となる。本発明における細胞層が、異なる二種以上の第２細胞を含んでいてもよい。例えば、角膜上皮に由来する細胞と、結膜上皮に由来する細胞とを含んだ状態で細胞層が構築されていてもよい。【００２８】
本発明のシート状組成物における細胞層が角膜上皮に由来する細胞を含むことは例えば、角膜上皮特異的なケラチン３又はケラチン１２が発現していることを指標として確認することができる。または、ケラチン４を発現していることを指標とすることもできる。
尚、角膜上皮以外の組織に由来する細胞の場合も同様に、当該組織に特異的なマーカー或いは遺伝子の発現を調べることによってその由来を確認することができる。【００２９】
本発明のシート状組成物は、支持体として羊膜を使用することから、非常に薄い状態に構築できる。本発明のシート状組成物を、細胞層を含まない場合には例えば10μm〜100μmの厚さ、細胞層を含む場合には例えば20μm〜200μmの厚さに調製することができる。このように非常に薄いことも本発明の大きな特徴の一つである。この特徴を備えることによって、様々な用途への適用が可能となる。特に、高い透明性を利用して眼表面の再建などへの適用が図れる。【００３０】
（シート状組成物の状態）
本発明のシート状組成物の状態は特に限定されず、湿潤状態（例えば溶液に浸析された状態）、凍結状態、又は乾燥状態（半乾燥状態を含む）で提供される。凍結状態又は乾燥状態とすれば、取り扱いが容易で保存性にも優れる。乾燥状態とすれば、常温（例えば約１０℃〜約３５℃）などでも保存することが可能となる。即ち、使用前において冷凍ないし冷蔵環境下で管理する必要がなくなりその取り扱い（保存、運搬など）が容易となる。但し、乾燥状態であっても、必要に応じて冷凍ないし冷蔵保存に供してもよい。
特に、凍結乾燥状態とすれば取り扱いの点で優れることに加えて、適用した際に患部に良好に接着する（患部表面において浸潤し接着力を発揮する）ことから適用後の縫合が基本的に不要となる（但し、患部への接着を一層確実にするために、縫合処理を行ってもよい）。縫合不要となれば患者及び医師の負担が大幅に軽減する。
好ましくは、上皮層を有する凍結状態、上皮層を有する乾燥状態（凍結乾燥状態）、上皮層を有さない湿潤状態、上皮層を有さない凍結状態、又は上皮層を有さない乾燥状態（凍結乾燥状態）の羊膜を用いて本発明のシート状組成物が構築される。尚、本明細書において、上皮層を有する凍結状態の羊膜を「凍結保存・上皮有り羊膜」ともいい、上皮層を有する凍結乾燥状態の羊膜を「凍乾・上皮有り羊膜」ともいい、上皮層を有さない凍結状態の羊膜を「凍結保存・上皮無し羊膜」といい、上皮層を有さない凍結乾燥状態の羊膜を「凍乾・上皮無し羊膜」ともいう。【００３１】
乾燥状態のシート状組成物ではその取り扱いが容易となり、具体的には常温（例えば約１０℃〜約３５℃）などでも保存することが可能となる。即ち、使用前において冷凍ないし冷蔵環境下で管理する必要がなくなりその取り扱い（保存、運搬など）が容易となる。
一方、乾燥状態であることにより、その使用に影響を与えることなく効果的な滅菌処理を行うことが可能となる。また、乾燥状態であるため経時的な劣化は極めて少なく、長期間に亘ってその品質を高い状態に維持できる。【００３２】
本発明のシート状組成物が期待される機能（例えば細胞層を形成するための基質としての機能や、組織再建材としての機能など）を発揮するためには基底膜の構造の保持が重要であると考えられる。そこで本発明の好ましい一態様では、基底膜成分（コラーゲンIV（α１、α２、及びα５）、コラーゲンVII、ラミニン５）が残存した羊膜が使用されることを特徴とする。基底膜成分が残存しているか否かは、当該成分を検出対象とした免疫染色を実施することによって検定できる。本発明の一態様ではこれらの成分の少なくとも一つ、好ましくは複数、更には全てが検出される。また、未処理の羊膜（即ち、生体より分離した後、凍結などの処理を行っていない羊膜）を対象として検出した場合の強度と大差ない強度（好ましくはほぼ等しい強度）でこれらの成分が検出されることが好ましい。
一方、緻密層成分（コラーゲンI、III、V、フィブロネクチン）も残存している羊膜が使用されることが好ましい。緻密層成分の残存状態は、上記の基底膜成分の場合と同様に免疫染色によって検定することができる。
羊膜にトレハロースを付加することによって、凍結乾燥処理を施したとしても基底膜及び緻密層の構造が高度に維持される。【００３３】
（提供形態）
本発明のシート状組成物は例えば、ガラスやプラスチックなどの容器に収納された状態、或いは透明フィルムや遮光シートなどを用いて包装された状態で提供される。
好ましくは、本発明のシート状組成物は実施的に酸素との接触がない状態に包装されて提供される。かかる形態では酸素による品質の劣化がなく、長期間に亘って高い品質を維持することができる。「実質的に酸素との接触がない状態」としては例えば、容器内を真空にした状態や容器内に窒素を充填した（窒素置換した）状態、或いはフィルムやシートなどで密封包装した状態を挙げることができる。尚、本発明のシート状組成物は通常、事前に滅菌処理が施されている。【００３４】
（用途）
本発明のシート状組成物は、組織の再建用の移植材料、癒着防止剤等として使用される。本発明のシート状組成物の適用領域として眼科領域、消化器外科領域、婦人科領域、皮膚科領域を挙げることができる。
本発明のシート状組成物の適用例（適用部位、適用方法など）を、本発明のシート状組成物が細胞層を備えない場合（Ａ）と、細胞層を備える場合（Ｂ）に分けて記載する。【００３５】
Ａ．細胞層を備えないシート状組成物の適用例
細胞層を備えないシート状組成物は、強膜や角膜の再建（翼状片や角膜上皮欠損などに対する治療）、皮膚（表皮）潰瘍や熱傷時の被覆などに適用され得る。また、組織再建用材料としても利用される。ここでの「組織再建用材料」とは、生体組織の再建（再生）に使用される材料をいう。細胞層を備えないシート状組成物は、手術侵襲による臓器ないし器官の表面組織障害の再建を目的とした治療において好適に使用される。本発明のシート状組成物は、通常の治癒過程において癒着が生ずる表面組織を再建するための材料として特に好適である。ここでの用語「組織再建」は、典型的には表面組織の損傷部を正常な状態に向けて回復させることを意味するが、ある臓器又は器官などの表面組織の再癒着を防止することで当該臓器などを正常な状態に向けて回復させること（例えば卵管の癒着剥離後の再癒着を防止し、正常な状態へと回復させること）も含む用語として使用される。【００３６】
本発明の再建対象となる組織の好適な例は、腹部、胸部、若しくは骨盤内の臓器若しくは器官（胃、大腸、小腸、盲腸、十二指腸、心臓、肺臓、卵管、直腸、肝臓、卵巣、子宮等）の表面組織、又は腹腔、胸腔、骨盤腔、口腔、鼻腔、耳腔、若しくは咽喉腔の表面組織、或いは眼組織である。従って、本発明のシート状組成物は消化器外科、産婦人科、胸部外科、口腔外科、耳鼻咽喉外科、及び眼外科の分野において利用され得る。本発明のシート状組成物は特に腹部、胸部、若しくは骨盤内の臓器若しくは器官の表面組織、又は腹腔、胸腔、若しくは表面組織を再建するための材料として好適である。但し、これらの領域以外であっても、外科的手術が伴う領域において本発明は幅広く適用され得る。以下、本発明のシート状組成物の適用部位、適用方法等の詳細を記載する。
組織再建用材料として使用する場合、本発明のシート状組成物の用途は、適用方法と適用目的を基準に以下の３種類に大別することができる。
（１）組織再建用材料を被覆（適用方法）・組織再建（適用目的）型
臓器表面、腹膜表面などに組織再建用材料を貼布し、傷害された組織表面を再建することを狙った使い方（使用方法）である。当該用途の具体例は下記の１−１，１−４，１−５，１−６である。
（２）組織再建用材料を被覆（適用方法）・癒着防止（適用目的）型
臓器表面、腹膜表面などに羊膜を貼布し、周辺組織との癒着形成を抑制することを狙った使い方（使用方法）である。当該用途の具体例は下記の２−１，３−１，３−２，３−３である。
（３）組織再建用材料を留置（適用方法）・癒着防止（適用目的）型
癒着が高度に形成される部位に羊膜を留置することにより癒着の形成を抑える使い方（使用方法）である。当該用途の具体例は下記の１−２、１−３、２−２である。従来の癒着防止剤の多くはこの使用形態をとる。例えば癒着防止剤として現在使用されているセプラフィルムは下記の１−２と同様の使用形態である。但し、下記の１−３，２−２の使用形態ではセプラフィルムは使用できない。【００３７】
以下、組織再建用材料としてのシート状組成物の用途の具体例を示す（図１を参照）。
１．消化器外科領域での適用
１−１．障害臓器の再建，癒着防止用途への適用法
各種の外科手術を行った場合には操作の過程で臓器が微小に傷害される。傷害領域は漿膜構造を失い術後早期にこの構造が再建されなければ、臓器間で癒着が形成される原因ともなり、根本的な機能を損なう場合もあり不都合である。羊膜の組織再建能、癒着防止能を活かしてこのような問題を解決することができる。具体的には組織再建用材料で傷害臓器表面を覆い組織再建及び癒着防止を図る。このような目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、接着成分付着・上皮無し羊膜などで構築された組織再建用材料を好適に使用できる。取り扱いが簡便であるため乾燥状態の羊膜（例えば凍乾・上皮有り羊膜、凍乾・上皮無し羊膜）で構築された組織再建用材料が好ましいが、心臓など担体に柔軟性が必要な領域では凍結保存状態の羊膜（例えば凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜）で構築された組織再建用材料を選択することもできる。適用方法は外科手術が終了した段階にて臓器の傷害領域に羊膜基底膜が腹腔側向きになるように組織再建用材料で直接被覆を行う。その後、必要に応じて固定する。固定にはバイクリルなどの縫合糸を用いることができる。乾燥状態の羊膜で構築された組織再建用材料を使用する場合、高い結合力が期待できるため、縫合などの固定処理を省略することができる。接着成分を使用して構築した組織再建用材料を使用する場合も同様に高い結合力が期待できる。このように、縫合等の固定処理を別途行うことなく、適用部位への組織再建用材料の固定が達成されることが好ましい。縫合等を行った場合は操作が煩雑になるし、炎症が惹起され癒着形成が促進される可能性があるからである。特に、凍結保存・上皮有り羊膜で構築された組織再建用材料を用いれば、適用部位に対して高い結合力を発揮できるとともに、接着成分による異物反応の惹起の問題がなく、特に好ましいといえる。
以上の操作によって、術後早期での漿膜構造の再建が期待でき、障害臓器の再建・癒着防止が達成される。【００３８】
１−２．傷害臓器−創間の癒着防止用途への適用法
各種の外科手術を行った後には腹腔内臓器と創間で癒着が形成されることがある。腹腔内臓器が創と癒着を起こすと臓器が物理的に固定されてしまい、臓器の運動性が弱まり内腔が閉塞し麻痺性腸閉塞の原因となる。羊膜の癒着防止能を活かしてこのような問題を解決することができる。このような目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、補強を行ったハイブリッド羊膜などで構築された組織再建用材料を使用することができる。皺にならない十分な強度が求められるため、乾燥状態の羊膜で構築された組織再建用材料を使用することが好ましく、乾燥状態の羊膜であり且つ補強を行ったハイブリッド羊膜で構築された組織再建用材料を使用することが更に好ましい。適用方法は例えば次ぎの通りとする。外科手術が終了した段階にて創直下に組織再建用材料を挿入し、そのまま留置する。この際、羊膜の基底膜側が腹腔側、絨毛膜側が腹壁側となるように組織再建用材料を適用する。適用後、縫合等により固定してもよいが、固定せずに留置するだけの方が好ましい。
以上の操作によって術後の臓器と創間での癒着防止を達成できる。【００３９】
１−３．骨盤底癒着防止への適用
骨盤内には直腸、子宮など、臓器表面の一部が腹膜に覆われていない腹腔外臓器が存在する。このような腹腔外臓器を手術した際には、骨盤内に腹膜が存在しない領域が生じ、骨盤底に小腸が落ち込んでしまい骨盤壁と小腸が癒着を形成することがある。一度癒着が形成されると剥離は困難であることが多い。そのため予防的な措置が重要である。羊膜の漿膜再建能を用いて骨盤底の癒着を予防することができる。このような目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、補強を行ったハイブリッド羊膜などで構築された組織再建用材料を好適に使用できる。組織再建用材料に求められる性質は１−２．と同様である。適用方法は例えば次ぎの通りとする。外科手術が終了した段階にて骨盤底に組織再建用材料を挿入し、軽く腹膜に押し付けて被覆させる。この際、羊膜の基底膜側が腹腔側、絨毛膜側が腹膜側となるように組織再建用材料を適用する。適用後、縫合等により固定してもよいが、固定せずに被覆するだけの方が好ましい。
以上の操作によって術後の骨盤底での癒着防止を達成できる。【００４０】
１−４．壁側腹膜の再建用途への適用法
壁側腹膜は複数回の手術を行った場合や腹壁瘢痕ヘルニアなどの腹膜疾患により欠損される。欠損腹壁の補填用の担体として羊膜を使用することができる。この目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、接着成分付着・上皮無し羊膜などで構築された組織再建用材料を好適に使用できる。腹膜の欠損が広範、重度の場合は強度の面から、凍結保存・上皮有り羊膜で構築された組織再建用材料を使用することが好ましい。適用は外科手術が終了した段階に行われる。まず腹壁欠損領域に組織再建用材料をのせて覆い隠す。羊膜の基底膜側が腹腔側になるように組織再建用材料で腹壁欠損領域を被覆する。その後、縫合糸などを用いて組織再建用材料を固定してもよい。接着成分が付着した羊膜で構築された組織再建用材料を用いた場合、接着成分によって固定が達成されても良い。以上の操作によって腹壁の再建が期待できる。【００４１】
１−５．腹膜播種性転移抑制への適用
腹膜播種とは、胃癌、大腸癌、卵巣癌が進行し、癌細胞が組織から遊離して胸水や腹水を通じて体腔に転移を起こす症例のことである。腹膜播種を伴う癌の予後はきわめて悪く、転移を抑制する方法が好まれるが、現在のところ有効な方法は知られていない。羊膜の性質を活かして、転移を抑制できる可能性がある。癌細胞が高頻度で転移を起こす部位として大網、横隔膜、腸間膜などが知られている。これらのミルキースポットをあらかじめ組織再建用材料で被覆してバリアを形成することにより転移抑制を達成することができる。この目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、接着成分付着・上皮無し羊膜などで構築された組織再建用材料を使用できるが、取り扱いが簡便であることから、凍乾・上皮有り羊膜で構築された組織再建用材料を使用することが好ましい。適用方法としては例えば、組織を包み込むよう組織再建用材料で適用部位を被覆する。また、一部分につぎあてを当てて縫合することや、羊膜に付着させた接着成分によって組織再建用材料を適用部位に固定してもよい。組織再建用材料の適用時期は、癌が進行し転移が起こった後であってもよいし、播種が起こっていない段階であってもよい（予備的な使用）。【００４２】
１−６．再発癒着防止への適用
開腹手術を行った後に腸同士あるいは腸と腹壁が癒着を起こして折れ曲がり、通過障害をきたし機能不全に陥ることにより腸閉塞が起こる。癒着解除術を施行しても癒着組織特に高度に炎症を起こし瘢痕化した組織においては漿膜欠損が起こっているため術後に再癒着をきたすことが多い。羊膜を用いて術後の癒着再発を防止し、漿膜欠損部の修復、補強を図ることができる。この目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、接着成分付着・上皮無し羊膜などで構築された組織再建用材料を使用できる。取り扱いが簡便であることから、凍乾・上皮有り羊膜で構築された組織再建用材料を使用することが好ましい。適用方法としては例えば、開腹後に癒着を物理的に剥離した段階にて組織再建用材料で腸を筒状に包み込む。この際、羊膜の基底膜側が腹腔側となるように組織再建用材料を適用する。この後、通常は固定を行うが、バイクリルなどの縫合糸を用いて臓器と羊膜とを縫合することにしても良いし、羊膜同士を縫合することにしてもよいし（羊膜が管状となる）、又は縫合を行わずに留置してもよい。接着成分を付着した羊膜で構築された組織再建用材料を使用した場合、当該接着成分により固定が達成されても良い。縫合等の固定処理を別途行うことなく、適用部位への組織再建用材料の固定が達成されることが好ましい。縫合等を行った場合は操作が煩雑になるし、炎症が惹起され癒着形成が促進される可能性があるからである。特に、乾燥状態の羊膜で構築された組織再建用材料を用いれば、適用部位に対して高い結合力を発揮できるとともに、接着成分による異物反応の惹起の問題がなく、特に好ましいといえる。
以上の操作によって癒着の再発を予防でき、術後早期での漿膜構造の再建が期待できる。【００４３】
２．産婦人科領域での適用
２−１．卵管閉塞への適用
卵管が腹膜などに癒着を起こすと卵管が塞がり卵の通過ができなくなり、不妊の原因となる。羊膜を用いて卵管の癒着を防止することができる。この目的における組織再建用材料の適用方法は例えば次ぎの通りとする。癒着している部分を剥離し、通常の卵管采形成術を行う。術後閉腹前に卵管の領域を組織再建用材料で被覆する。この目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、接着成分付着・上皮無し羊膜などで構築された組織再建用材料を使用できるが、取り扱いが簡便であることから、凍乾・上皮有り羊膜で構築された組織再建用材料を使用することが好ましい。適用方法としては例えば、組織を包み込むよう組織再建用材料で適用部位を被覆する。また、一部分につぎあてを当てて縫合することや、羊膜に付着させた接着成分によって組織再建用材料を適用部位に固定してもよい。【００４４】
２−２．骨盤底癒着防止への適用
骨盤内の子宮は腹腔外臓器であり、臓器表面の約50％は腹膜に覆われていない。そのため子宮摘出手術を行うと腹膜欠損部位が生じ、骨盤底と小腸との癒着形成が起こる原因となる。羊膜を用いて骨盤底の癒着を防止することができる。この目的においては使用される組織再建用材料の形態、適用方法は１−３．と同様である。【００４５】
３．眼科領域での適用
３−１．緑内障手術への適用
緑内障は、視神経が障害され視野が狭くなり視力が落ちる疾患である。緑内障の治療では線維柱帯切除によって新しい房水排出系を形成する手術が行われるが、術後に強膜と結膜が癒着を起こし治療効果が望めない事があった。この問題に対して羊膜の使用が有効であると考えられる。具体的には、通常の線維柱帯切除を行った後、結膜下に組織再建用材料を挿入する。この目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、接着成分付着・上皮無し羊膜などで構築された羊膜を使用できるが、取り扱いが簡便であることから、凍乾・上皮有り羊膜で構築された組織再建用材料を使用することが好ましい。適用後、組織再建用材料を適用部位に縫合などで固定してもよい。【００４６】
３−２．瞼球癒着への適用
瞼球癒着とは、眼瞼結膜から眼球にかけて瘢痕化し、瞼と眼球が癒着を起こす疾患である。瞼球癒着が起こる場合は眼表面が広範囲に障害を受けていることが多く、癒着した組織を剥離した後に再発することが多い。羊膜を利用して瞼球癒着を抑制することができると考えられる。具体的な適用方法としては例えば、瞼と眼球間の癒着を剥離した後に瘢痕化した結膜組織を剥離し、強膜を露出させ、組織再建用材料で被覆する。この目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、接着成分付着・上皮無し羊膜などで構築された組織再建用材料を使用できるが、取り扱いが簡便であること等の理由から、接着成分付着・上皮無し羊膜で構築された組織再建用材料を使用することが好ましい。当該組織再建用材料を使用した場合、適用部位への固定は主に接着成分により達成される。組織再建用材料で被覆する部位は瞼側でもよいし、強膜でもよい。【００４７】
３−３．再発翼状片への適用
翼状片とは、結膜組織が異常増殖を起こし、増殖組織が角膜に癒着し乱視や視力低下を起こす疾患である。当該疾患に対して羊膜が有効であると考えられる。具体的な適用方法としては例えば、翼状片組織を剥離して強膜を露出後に組織再建用材料で被覆する。この目的においては、凍結保存・上皮有り羊膜、凍結保存・上皮無し羊膜、凍乾・上皮有り羊膜、接着成分付着・上皮無し羊膜などで構築された組織再建用材料を使用することができるが、取り扱いが簡便であること等の理由から、接着成分付着・上皮無し羊膜で構築された組織再建用材料を使用することが好ましい。当該組織再建用材料を使用した場合、適用部位への固定は主に接着成分により達成される。【００４８】
Ｂ．細胞層を備えるシート状組成物の適用例
細胞層を備えるシート状組成物は、角膜や網膜の再建（スティーブンジョンソン症候群、熱化学外傷、眼類天疱瘡、網膜剥離、加齢性黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症などに対する治療）、表皮−糖尿病性潰瘍（表皮）、表皮水疱症、又は熱傷の治療などに適用され得る。【００４９】
（シート状組成物の作製方法）
本発明の他の局面はシート状組成物の作製方法に関する。本発明の作製方法は次のステップを含む。即ち、(a)羊膜を調製するステップと、(b)前記羊膜にトレハロースを付加するステップである。【００５０】
１．羊膜の調製：ステップ(a)
「羊膜」とは、哺乳動物において子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲンに富む実質組織上に基底膜、上皮層が形成されて構成される。羊膜としてヒト羊膜を使用することが好ましい。ヒト羊膜は、例えば分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜、胎盤などから採取することができる。具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、胎盤及び臍帯からなる一体物を処理、精製することによりヒト羊膜を調製することができる。処理、精製方法は、特開平５−５６９８７号に記載される方法などの公知の方法を採用できる。すなわち、分娩時に得られる胎仔膜より羊膜を剥離し、超音波洗浄等の物理的処理及び酵素処理などにより残存組織を除去し、適宜洗浄工程を経てヒト羊膜を調製することができる。
このように調製したヒト羊膜は、使用時まで凍結して保存しておくことができる。ヒト羊膜の凍結は、例えば-80℃、DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とグリセロールとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。凍結保存することにより操作性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。【００５１】
羊膜をそのまま利用することもできるが、羊膜から掻爬処理などによって上皮を除去したものを利用することが好ましい。上皮の除去によって、抗原性が低下する。例えば、上記のように凍結保存したヒト羊膜を解凍した後、EDTAやタンパク分解酵素で処理して細胞間の接着を緩め、そしてセルスクレイパーなどを用いて上皮を掻爬することにより、上皮が除去されたヒト羊膜を調製することができる。【００５２】
好ましくは、以下のステップを含む方法で羊膜の上皮を除去する。
(1)生体より分離された羊膜を用意するステップ。
(2)前記羊膜に凍結融解処理を施すステップ。
(3)凍結融解処理後の羊膜にトリプシン処理を施すステップ。
(4)トリプシン処理後の羊膜を洗浄するステップ。【００５３】
当該上皮除去法によれば、従来の用手的な上皮除去法と同程度に、基底膜の損傷を抑えつつ上皮を完全に除去することが可能である。即ち、当該上皮除去法によれば、上皮が完全に除去され、しかも本来の構造を良好に保持した基底膜を備える羊膜が得られる。かかる羊膜は例えば、細胞培養用の基質（基材）として良好に機能する。一方で以下の上皮除去法は、従来の用手的方法に比較して操作が非常に簡便であり、操作時間も短くてすむ。また、同時に多数の羊膜を処理することも容易である。さらには、熟練した技術が特に要求されないことから、自動化することも容易である。
以下、上皮除去法の各ステップを詳細に説明する。【００５４】
（羊膜の用意：ステップ1）
ステップ(1)では羊膜を用意する。ここでの羊膜は好ましくはヒト羊膜である。ヒト羊膜は例えば、分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜、胎盤などから採取することができる。具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、胎盤及び臍帯からなる一体物を処理・精製することによりヒト羊膜を調製することができる。このようなヒト羊膜の調製方法は、特開平５−５６９８７号に記載される方法などの公知の方法を採用できる。典型的には以下の手順でこのステップを実施する。
(1-1)羊膜の採取
分娩時に胎盤組織の一部を採取し、続いて胎盤組織より羊膜組織を用手的に剥離する。この段階で一旦凍結してもよい。
(1-2)血球成分等の除去
羊膜に付着した血球成分を生理食塩水などで洗浄・除去する。また、絨毛膜を用手的に剥離し、除去する。このように、この段階において血球成分及び絨毛膜を除去した羊膜にすることが好ましいが、後述の凍結融解処理（ステップ2）の後に、血球成分の除去及び／又は絨毛膜の剥離を行うこともできる。
このように調製したヒト羊膜は、次の処理まで凍結して保存しておくことができる。ヒト羊膜の凍結は、例えば-80℃、DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とグリセロールとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。凍結保存することにより操作性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。【００５５】
（枠固定）
以上の手順で調製した羊膜を枠に固定した後、以降の処理に供することが好ましい。羊膜を枠で固定することによって取り扱いやすくなる。
羊膜の固定方法の具体例を図２に示す。図２ａの例では同形状の二つの枠（１、２）が使用される。これら二つの枠にその縁部を狭持されて羊膜１０が固定される。尚、羊膜を拡げた状態で固定する。図２ｂの例では、枠３と板状部材４とを用いて羊膜１０を固定する。まず、板状部材４の上に羊膜１０を拡げた状態で載せる。このとき羊膜１０の上皮側を上にする。続いて羊膜１０の上から枠３を載せ、羊膜１０の縁部を板状部材４と枠３で挟む。その結果、羊膜１０の上皮側のみが露出することになる。従って、後述のトリプシン処理を実施するときに、トリプシン溶液を羊膜の上皮側のみに接触させることができる（例えば、枠３の内側にトリプシン溶液を添加する）。これによって、上皮以外の部分（羊膜緻密層及び基底膜）に影響を与えることなくトリプシン処理を行うことができる。即ち、羊膜の上皮に対してトリプシンを作用させつつ、羊膜緻密等をトリプシンの作用から保護することができる。【００５６】
（凍結融解処理：ステップ2）
このステップでは羊膜を一旦凍結させ、その後融解させる。この凍結融解処理によって、後のトリプシン処理の際に羊膜上皮層が剥離し易くなる。これは、羊膜上皮層と基底膜との間の接着状態（結合状態）が緩められることによると考えられる。
凍結温度として約−20℃〜約−80℃を採用することができる。十分な凍結状態を得ることができる点、汎用的なフリーザーを利用できる点などを考慮し、約−80℃で凍結させることが好ましい。一方、融解温度として約4℃〜約50℃を採用することができる。好ましくは融解温度を約37℃とする。
凍結融解処理を繰り返し実施することが好ましい。繰り返し実施することによって、後のトリプシン処理において上皮が剥離しやすくなるという凍結融解処理の効果が増強される。但し、必要以上に繰り返し行えば上皮以外の部分に悪影響を与えることも予想される。従って例えば凍結融解処理を２〜４回の範囲で繰り返し実施することが好ましい。本発明者らの検討した結果、凍結温度-80℃、融解温度37℃の凍結融解処理を２回実施することによって必要十分な効果が得られることが判明した。この知見より、凍結温度-80℃、融解温度37℃の条件下では凍結融解処理を２回実施することが好ましいと言える。
凍結融解処理を繰り返し実施する場合の各回の条件（凍結温度、融解温度）は全てが同一であっても、一部が異なっていても、又は相互に異なっていてもよい。但し操作性の点から、各回の条件を同一とすることが好ましい。【００５７】
（トリプシン処理：ステップ3）
このステップでは凍結融解処理後の羊膜をトリプシンで処理する。トリプシン処理は、トリプシン溶液を羊膜に接触させることによって実施される。トリプシン溶液として例えば、トリプシン濃度が約 0.01%(w/v)〜約0.05%(w/v)のトリプシン溶液を使用することができる。好ましくはトリプシン濃度が約0.02%(w/v)のトリプシン溶液を使用する。トリプシン溶液のトリプシン濃度が低すぎればトリプシンの作用が十分に発揮されない。一方、トリプシン濃度が高すぎれば羊膜上皮に対してトリプシンを良好に作用させることができる反面、羊膜緻密層及び基底膜にもトリプシンが作用し、当該部分が損傷することになる。
トリプシンはウシ由来、ブタ由来、ヒト由来のもの等、数多く市販されている。例えば、Trypsin-EDTA（Invitrogen社）、トリプシン1:250（Sigma社）を好適に使用することができる。【００５８】
トリプシン溶液には通常キレート剤を添加しておくが、キレート剤は必須ではない。キレート剤としてはEDTA、NTA、DTPA、HEDTA、GLDA等を用いることができる。これらを任意に組み合わせて使用してもよい。キレート剤は例えば約0.1mM〜約0.6mMの濃度となるように添加される。【００５９】
羊膜上皮側のみがトリプシン溶液に接触する条件下でトリプシン処理を実施することが好ましい。羊膜上皮以外の部分をトリプシンの作用から保護するためである。例えば、羊膜上皮側のみをトリプシン溶液に浸漬させること、羊膜上皮側にトリプシン溶液を添加ないし塗布すること、羊膜絨毛膜側をブロックして溶液に接しないように加工を行った後にトリプシン液に全浸漬する等によって、羊膜上皮側のみをトリプシン溶液に接触させることが可能である。上述のように、図２ｂに示すような枠に予め固定した羊膜（枠固定羊膜）を使用すれば羊膜の上皮側のみが露出した状態になっているため、例えば枠固定羊膜をトリプシン溶液に浸漬させることによっても羊膜上皮側のみをトリプシン溶液に接触させることが可能である。この方法では、枠固定した羊膜を浸漬するという簡便な操作でトリプシン処理を実施できるという利点もある。尚、このように枠に固定された羊膜を使用する場合においても、枠ごとトリプシ溶液に浸漬するという方法ではなく、羊膜の上皮側部分のみをトリプシン溶液に浸漬すること（例えば羊膜の上皮側を下にしてトリプシン溶液に漬ける）、枠内へのトリプシン溶液の添加、又は羊膜上皮側へのトリプシン溶液の塗布によって羊膜の上皮側のみをトリプシン溶液に接触させることにしてもよい。【００６０】
トリプシン処理時間（トリプシン溶液の接触時間）は例えば約5分〜約60分とする。好ましくは約10分〜約20分、更に好ましくは約15分とする。処理時間が短すぎればトリプシンを十分に作用させることができず、結果として羊膜上皮の除去が不十分となる。一方、処理時間が長すぎれば羊膜の基底膜、緻密層に対してもトリプシンが作用して当該部分を損傷させるおそれがある。
トリプシン処理の温度条件はトリプシンが良好に作用するように例えば約25℃〜約42℃とする。
トリプシン溶液を接触させる間、羊膜を静置した状態に維持することが好ましい。トリプシン溶液が基底膜、緻密層により浸透しにくくなると考えられるからである。
トリプシン処理を複数回に分けて実施することもできる。【００６１】
（洗浄：ステップ4）
以上の方法でトリプシン溶液を接触させた後、羊膜を洗浄する。この洗浄によって付着しているトリプシン溶液が除去され、同時に羊膜上皮（上皮細胞）が除去される。例えば適当な流れをもった液体中（例えば流水中）に放置すること、適当な液体に浸けた状態で振盪（例えば上下振盪）させること、又は適当な液体に浸けた状態で超音波等を加えることによって、トリプシン処理後の羊膜を洗浄する。洗浄に使用する液体として、生理食塩水、リン酸系緩衝液、純水、DMEMを例示できる。【００６２】
洗浄後の羊膜を使用時まで冷蔵又は冷凍保存しておいてもよい。例えば、グリセロールを含む保存液（例えば50%グリセロール含有DMEM (Dulbecco’S Modofied Eagle Medium: GIBCOBRL社)）に浸漬させた状態で保存することができる。【００６３】
２．トレハロースの付加：ステップ(b)
羊膜へのトレハロースの付加は例えば、トレハロース溶液に羊膜を浸漬することによって行うことができる。例えば、５％（w/v）〜２０％（w/v）となるようにトレハロースを蒸留水やリン酸緩衝化生理食塩水（PBS(-)）に溶解して得られる溶液に羊膜を浸漬する。浸漬時の温度は例えば４℃〜３７℃の範囲内とする。浸漬時間は例えば１時間〜１日の範囲内とする。尚、トレハロースは例えば株式会社林原商事が提供するトレハ（登録商標）や株式会社エイチプラスビィ・ライフサイエンスが提供する、とれはのいのち等を利用することができる。
羊膜へのトレハロースの付加方法として、トレハロース溶液を羊膜表面に塗布する方法、トレハロース溶液を羊膜表面に吹き付ける方法、トレハロースを直接羊膜表面に添加する方法等を採用してもよい。
尚、羊膜から上皮を除去するステップ（例えば上記ステップ２〜４）の前にトレハロースを付加するステップを実施してもよい。【００６４】
３．凍結処理又は乾燥処理：ステップ(c)
本発明の一態様では、トレハロース付加後の羊膜を凍結又は乾燥させる。この処理によって保存性が向上し、取り扱いも容易となる。特に、乾燥処理によれば、保存性の面及び取り扱いの面で極めて優れたシート状組成物となる。また、乾燥に伴う表面形態の変化によって羊膜の生体組織に対する親和性（接着性）が向上することを期待できる。羊膜の乾燥は凍結乾燥処理で実施することが好ましい。羊膜の柔軟性の低下が抑えられるからである。また凍結乾燥処理は、羊膜の基底膜成分の構造を保持するという観点からも好ましい。凍結乾燥処理では一般に、沸点が約-20℃（107 Pa、0.8 Torr）〜約-50℃（4 Pa、0.03 Torr）となるような低い気圧環境（真空）において、凍結固化状態の試料（例えば約-40℃で凍結させたもの）から昇華によって水分が除去される。凍結乾燥処理によれば内部からも均一に脱水でき、また高い乾燥度が実現されることから本来の機能及び形態を高度に保持したままで乾燥させることができる。また、凍結乾燥処理は、1．処理中の劣化が少ない、２．無菌化が容易にできる、３．復元性に優れた乾燥体が得られる、４．保存性に優れた乾燥体が得られる、などの特徴を有する。【００６５】
凍結乾燥処理は、真空室、冷却・加熱装置、排気装置（コールドトラップ及び真空ポンプ）を備えた凍結乾燥機によって行うことができる。数多くの凍結乾燥装置が市販されており、これらの中から任意に選択したものを用いて乾燥処理を実施することができる。尚、処理条件は、使用する装置に添付の使用説明書に基づいて設定することができる。その際には乾燥処理に供する試料の大きさ、乾燥度などを考慮することができる。乾燥度は例えば水分活性（AW）が0.5より小さくなるように設定できる。【００６６】
凍結乾燥された羊膜を切断したり、切り抜いたりすることで、所望の大きさ及び形状の乾燥羊膜を得ることができる。得られた乾燥羊膜を支持体や枠に固定することにしてもよい。【００６７】
本発明の一態様では、乾燥処理によって得られた乾燥羊膜を、実質的に酸素との接触がない状態となるように適当な容器に収納する。酸素から実質的に遮断された状態にパッケージされることによって、極めて保存性に優れた上皮非含有乾燥羊膜となる。
例えば、乾燥処理後の羊膜を適当な容器内に収納した後、容器内の空気を吸引除去して真空状態を形成することや容器内を窒素置換すること等によって、羊膜を酸素から実施的に遮断した状態でパッケージすることができる。或いは、容器内に脱酸素剤を同封することで、残存する酸素を除去することにしてもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて用いても良い。容器としては例えば、可塑性の合成樹脂からなる袋状又はチューブ状のもの（二枚のシートを重ね合わせて周縁部をシーリングさせたものであってもよい）、或はガラスなどの無機材料からなるビン状のものなどを使用することができる。【００６８】
凍結処理又は乾燥処理を実施する前又は後に、羊膜の絨毛膜側を生体吸収性材料で被覆するステップを実施してもよい。この処理によって羊膜の強度を高めることができる。生体吸収性材料としてはポリグラクチン９１０、ゼラチン、コラーゲン、ポリ乳酸等を例示することができる。【００６９】
４．滅菌処理ステップ：ステップ(d)
滅菌処理を実施することにより菌の混入のリスクを最小化できる。EOG（エチレンオキサイドガス）、UV（紫外線）、γ線処理などにより羊膜を滅菌することができる。この中でもγ線滅菌を採用することが好ましい。羊膜の物性の低下が少ないからである。γ線滅菌における線量は例えば2kGy〜50kGy、好ましくは10kGy〜30kGy、さらに好ましくは15kGy〜25kGyである。
一連の処理を施した後の羊膜を容器に収納した状態、又はフィルムやシート等で包装した状態で滅菌処理を実施することが好ましい。従って、滅菌処理に先行して、羊膜を容器等に収納等するステップを実施することが好ましい。尚、実質的に酸素との接触がない状態で羊膜を収納又は包装することが好ましい。品質の劣化が抑えられ、長期の保存が可能となるからである。【００７０】
５．接着成分の付着：ステップ(e)
本発明の一態様では、羊膜の表面へフィブリノーゲン及びトロンビンを付着する。これらの成分の付着は例えば、上記乾燥処理の後に実施することができる。乾燥状態の羊膜を使用することにより、フィブリノーゲン等の接着成分をより良好に付着させることができる。【００７１】
羊膜の表面へのフィブリノーゲン及びトロンビンの付着は、それぞれ単独に又は同時に行われる。付着方法は特に限定しない。付着方法の例として、付着させる成分の溶解液を羊膜表面に塗布、滴下、又は噴霧する方法、或いは付着させる成分の溶解液に羊膜を浸漬する方法を挙げることができる。また、フィブリノーゲン自体（又はトロンビン自体）を、又はフィブリノーゲン（又はトロンビン）を適当な溶媒に溶解した後析出させた成分を羊膜表面に添加する（まぶす）ことによってフィブリノーゲン（又はトロンビン）を羊膜表面に付着させることもできる。
好ましくはこれら２成分の混合液を調製し、当該混合液を用いた塗布、滴下などによってフィブリノーゲン及びトロンビンを同時に羊膜表面に付着させる。このような２成分を同時に付着させる方法の具体例を以下に説明する。【００７２】
まず、フィブリノーゲン溶解液を調製する。具体的にはフィブリノーゲンを、所望の濃度となるようにエタノール（例えば94%エタノール）などの溶剤（溶媒）に溶解する。エタノールの他、無水エタノール、イソプロパノール、メタノールなどのアルコール類やアセトンなどを溶剤として用いることができる。一方、同様の手順でトロンビン溶解液を別途調製する。この場合の溶剤としては例えばエタノール（例えば99.5%エタノール）、無水エタノール、イソプロパノール、メタノール等のアルコール類やアセトンなどを用いることができる。
次に、以上の手順で用意したフィブリノーゲン溶解液及びトロンビン溶解液を混合する。このようにして得られた混合液を用いて、上記の通り、羊膜上への塗布、滴下などを実施する。以上のようにフィブリノーゲン溶解液とトロンビン溶解液を混合し、混合液を用いて付着操作を実施する場合には、混合液中の水分量が多くならないよう留意することが好ましい。仮に混合液中の水分量が多くなれば、付着操作前にフィブリノーゲン、トロンビン間の反応が起こり、付着操作に支障を来す。また、移植後に良好な接着力を得るためには、フィブリノーゲンとトロンビンが事前に作用しない状態で羊膜上に付着していることが好ましい。以上の点を考慮すれば、フィブリノーゲンの溶剤及びトロンビンの溶剤としてそれぞれ、水溶性で且つ水分量が少なく揮発性であるものを採用することが好ましい。【００７３】
フィブリノーゲン溶解液及びトロンビン溶解液、又はフィブリノーゲンとトロンビンの混合液の塗布、滴下などは、典型的には羊膜表面の全領域に対して均一に実施されるが、例えば一部領域にのみ実施したり（例えば、スポット的に間隔をおいて複数領域に実施したり、周辺部のみに実施する）、付着量に濃淡をつけて実施したりすることもできる。【００７４】
上記方法では、フィブリノーゲン及びトロンビンの付着が同時に行われるが、それぞれの成分を別個の工程で付着させてもよい。即ち、フィブリノーゲンの付着と、トロンビンの付着を２段階のステップとして実施してもよい。但し、操作を簡略化できる点、及びフィブリノーゲンとトロンビンをより均一な分散状態で付着できる点において、フィブリノーゲンとトロンビンの混合液を用いて１ステップで付着操作を行うことが好ましい。
尚、フィブリノーゲン及びトロンビンは、常法に従って血液より調製することができる。リコンビナント体のフィブリノーゲン等を使用することもでき、この場合には適当な培養細胞の培養液又は細胞破砕液より常法で調製することができる。また、市販のフィブリノーゲン等を使用することにしても良い。例えば、ヒト由来のフィブリノーゲンはバクスター社より購入することができる。同様にヒト由来のトロンビンはバクスター社より購入することができる。【００７５】
フィブリノーゲン及びトロンビンに加えて、アプロチニンを羊膜表面に付着させることにしてもよい。即ち、当該態様では、アプロチニンを付着させるステップ（ステップb-1）を更に実施する。アプロチニンの付着は、フィブリノーゲン等と同様の手段及び手順で実施できる。即ち、アプロチニン溶解液を用いた塗布、滴下、噴霧、浸漬などによって羊膜表面にアプロチニンを付着させることができる。アプロチニン溶解液は、塩化ナトリウム溶液（例えば0.85%溶液）、塩化カリウム溶液、塩化カルシウム溶液、塩化マグネシウム溶液などにアプロチニンを溶解することによって調製することができる。
尚、アプロチニンは、常法に従ってウシの膵臓より調製することができる。リコンビナント体のアプロチニンを使用することもでき、この場合には適当な培養細胞の培養液又は細胞破砕液より常法で調製することができる。また、市販のアプロチニンを使用することにしても良い。例えば、ウシ由来のアプロチニンはバイエル薬品より購入することができる。
アプロチニンを付着させるステップを単独で実施することも可能であるが、フィブリノーゲン及びトロンビンを付着させるステップと同時に実施することが好ましい。接着成分の付着操作が全体として簡略化されるからである。また、フィブリノーゲン、トロンビン、及びアプロチニンをより均一に分散した状態で羊膜表面に付着できるからである。例えば、フィブリノーゲン、トロンビン、及びアプロチニンの混合液を調製し、これを塗布することなどによって、これら３成分の羊膜への同時付着を実施できる。これら３成分の混合順序は特に限定されない。【００７６】
フィブリノーゲン等の付着は、羊膜の片面又は両面に対して実施される。前者の場合には原則として、羊膜における上皮の有無に拘わらず、上皮側（上皮が存在していた側）と反対側の表面（即ち絨毛膜側）にフィブリノーゲン等の付着が行われる。【００７７】
フィブリノーゲン及びトロンビン（場合によっては更にアプロチニン）を付着させた後、必要に応じて乾燥処理を施す。これによって、保存安定性に優れたシート状組成物となる。また、取り扱い（輸送、移植操作など）の面でも好ましい形態となる。
乾燥処理として、風乾、真空乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥など、一般的な乾燥処理方法を採用できる。【００７８】
（細胞層を含むシート状組成物の作製方法）
本発明の一態様では、羊膜上に生体由来細胞を用いた細胞層が形成される。細胞層を形成するステップは次の手順で実施することができる。まず、適切な生体由来細胞を用意する（生体由来細胞を調製するステップ）。生体由来細胞としては、最終的に得られるシート状組成物の用途に適合した細胞を使用する。例えば皮膚表皮組織の再生用のシートを作製する場合には、皮膚表皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）や毛包上皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）などが好適に使用される。同様に、角膜上皮組織の再生を目的とする場合には角膜上皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）が好適に使用され、粘膜上皮組織の再生を目的とする場合には粘膜上皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）が好適に使用される。粘膜上皮細胞の例としては口腔粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞などを挙げることができる。
生体由来細胞の調製方法について、皮膚表皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞及び気道粘膜上皮細胞を例に採り説明する。【００７９】
（皮膚表皮細胞）
まず、皮膚の採取にあたっては、あらかじめ採取部位を予防的にポビドンヨードなどの消毒薬にて消毒し、抗真菌剤の外用塗布を行った後、小皮膚片を皮膚生検に準じて採取する。表皮角化細胞の培養にあたってはハサミで皮膚片から脂肪組織と真皮をできる限り取り除き、ダルベッコリン酸緩衝液（PBS）にて数回洗浄する。70％エタノールに１分間浸し滅菌する。短冊状に切り、ディスパーゼ液に浸し、4℃で一晩静置する。ついで表皮を真皮から剥離する。剥離した表皮を、洗浄後、表皮片をほぐし、表皮角化細胞浮遊液を調整する。細胞を無血清培地に懸濁し、コラーゲンコートシャーレに播種し、継代培養を行う。【００８０】
（角膜上皮細胞）
角膜上皮細胞は角膜輪部組織から得ることができる。例えば角膜輪部組織から内皮細胞を剥離除去し、結膜を切除し単一細胞懸濁液を作製する。そしてこれを窒素タンクで保存し、その後急速に37℃で融解して角膜上皮細胞浮遊液を調整する。必要に応じて継代培養する。継代培養には、例えば無血清培地であるEpiLifeTM（カスケード社）、MCDB153培地（日水製薬株式会社）やこれらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地などを使用することができる。【００８１】
（口腔粘膜上皮細胞）
口腔粘膜上皮細胞としては歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口唇部の細胞、口蓋部の細胞、頬部の細胞などが用いられる。中でも口腔内縁粘膜上皮細胞はその増殖能が高く、また抗原性が低いことから、これを用いることが特に好ましい。口腔粘膜上皮細胞は、目的とする細胞が存在する場所をメスなどで切除したり、掻爬したりすることにより採取することができる。口腔内縁粘膜上皮細胞にあっては、抜歯に付着している口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離し、これより採取することができる。尚、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。【００８２】
（腸管粘膜上皮細胞）
腸管粘膜上皮細胞は大腸内視鏡下腸管上皮生検組織より採取、または開腹手術時に通常の手法で採取される。また、組織よりlazer capture microdissectionにより上皮細胞を切除することもできる。食道、胃、十二指腸、小腸、大腸のヒトの全ての消化管上皮細胞を用いて作製されるシート状組成物についても本発明の技術は適用される。潰瘍や炎症などでヒトの消化管上皮が傷害を受けた時、骨髄由来細胞が緊急事態に対応するレスキュー的な役割を果たし、上皮が修復される。消化管上皮細胞も一部とはいえ骨髄から作られる。この意味で本発明の意義は角膜上皮細胞を用いるものと同等とみなすことができる。通常はわずか1000個に数個程度しかない骨髄からできる上皮細胞が、胃潰瘍、大腸炎などでできた消化管内面の潰瘍(傷口)が治っていく過程では50倍から100倍にも増え、概ね10個に1個の消化管上皮細胞が骨髄由来であることが判明している。ここで作製される消化管粘膜上皮細胞由来シート状組成物は難病に指定されている重症腸管感染症、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病などの腸疾患の治りにくい潰瘍、炎症に対して、腸管上皮の再生を促す意味でもすこぶる有意義と考えられる。腸管アレルギーに対しての有用性も期待される。【００８３】
（気道粘膜上皮細胞）
気道粘膜上皮細胞は気道粘膜の生検組織より容易に得られ、前述の組織同様に結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。気道粘膜上皮細胞はβデフェンシンの生合成、放出などを介し、各種感染症の病態進展に重要な働きを担う。また、喘息やアレルギー疾患においても気道粘膜上皮の果たす役割は高い。組織障害を受けた気道粘膜に本発明になる気道粘膜上皮細胞から作製されるシート状組成物を提供することは、緊急時対応を超え、人口気道の提供にも繋がるものである。特に羊膜上に作製されたシートの持つ免疫抑制作用は有益である。【００８４】
口腔粘膜上皮細胞や腸管粘膜上皮細胞などは特に、組織の採取後、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。【００８５】
生体由来細胞は、シート状組成物の移植を受ける者（レシピエント）から調製することが好ましい。即ち、生体由来細胞のドナーと、生体移植シートのレシピエントが同一人であることが好ましい。このような自家細胞を用いることにより、免疫拒絶の問題が解消される。【００８６】
調製された生体由来細胞は、羊膜上に播種され（生体由来細胞を羊膜上に播種するステップ）、その後培養に供される（播種した生体由来細胞を培養して増殖させるステップ）。
この態様においては特に、上皮が除去された羊膜を用いることが好ましい。上皮の除去によって抗原性の低下を期待でき、また不要な細胞を事前に除くことで良好に目的の細胞層を形成することが可能となる。上皮が除去された羊膜を用いる場合、上皮を除去して表出した面側（即ち、基底膜側）に生体由来細胞を播種することが好ましい。この面側には、IV型コラーゲンがリッチに含まれており、播種された生体由来細胞の増殖、重層化が良好に進行すると考えられるからである。【００８７】
ここで、二種以上の細胞を用いることでハイブリッド化された細胞層を形成することにしてもよい。このような場合の細胞層の具体的な形成方法を、角膜上皮の再建用のシート状組成物を作製する場合を例にとり、以下に詳述する。
まず、細胞層の形成に使用する細胞種の一つ（第１細胞）として口腔粘膜上皮細胞、結膜上皮細胞、鼻腔粘膜上皮細胞、又はその他の粘膜上皮細胞、或いはこれらいずれかの粘膜上皮を構築可能な未分化細胞が好適に用いられる。他方、第１細胞とともに細胞層の形成に使用される細胞種（第２細胞）としては、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、又は羊膜上皮細胞が好適に用いられる。これらの細胞は、それが存在する生体組織より採取される。具体的には例えば、目的の細胞が存在する組織の一部をメスなどで採取した後、結合組織の除去、細胞の分離等の処理を経て細胞浮遊液（懸濁液）の形態に調製する。尚、第１細胞として異なる二種以上の細胞を用いてもよい。第２細胞についても同様に、異なる二種以上の細胞を用いてもよい。【００８８】
第１細胞の採取源として好適な口腔粘膜上皮には幹細胞の存在が示唆されており、上皮様細胞層を形成する細胞へと分化誘導を行い易いと考えられる。また、口腔粘膜上皮細胞を用いることは、採取が容易なこと、多量の細胞を採取可能なこと、更には両眼性の患者を処置する場合においても自己の細胞を用いて移植材料を調製できること等の利点を有する。特に、角膜上皮細胞を採取不可能な患者に対して、自己の細胞由来の移植材料を適用できるという利点は、臨床上極めて重要な拒絶反応の問題を大幅に解消するものと期待される。
口腔粘膜上皮細胞としては歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口唇部の細胞、口蓋部の細胞、頬部の細胞などが用いられる。中でも口腔内縁粘膜上皮細胞はその増殖能が高く、また抗原性が低いことから、これを用いることが特に好ましい。口腔粘膜上皮細胞は、目的とする細胞が存在する場所をメスなどで切除したり、掻爬したりすることにより採取することができる。口腔内縁粘膜上皮細胞にあっては、抜歯に付着している口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離し、これより採取することができる。尚、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。
本発明によって作製されるシート状組成物を移植する予定の患者以外の口腔より採取した口腔粘膜上皮細胞を用いることもできるが、免疫拒絶反応を考慮すれば、患者自身の口腔より口腔粘膜上皮細胞を採取し、培養に供することが好ましい。
口腔粘膜は増殖能が高く、通常、術後数日間の抗生剤内服、イソジン消毒等で創傷治癒するため、粘膜採取による患者自身の侵襲は軽度であると思われる。【００８９】
一方、第２細胞としては、他人（アロ）の角膜上皮細胞を好適に利用できる。このような角膜上皮細胞は例えば、感染症フリーのドナー眼球をアイバンク（Northwest lions eye bank等）より入手することができる。第２細胞として使用可能な細胞は角膜上皮細胞に限られず、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞等を用いてもよい。但し、生体における角膜上皮を構成する細胞である角膜上皮細胞、又はその近隣に存在する結膜上皮細胞を採用すれば、角膜上皮の特性をより良好に再現するシート状組成物を構築できると考えられる。本発明者らの検討の結果、第２細胞として角膜上皮細胞を使用した場合には、角膜上皮に近似した細胞層を構築できることが確認された。この事実は、上記の予想を支持するものであるとともに、第２細胞として角膜上皮細胞が特に好適であることを裏付けるものである。一方、第２細胞として羊膜上皮細胞を用いた場合にも、角膜として求められる特性を良好に再現した細胞層を形成できることが確認された。この事実は、第２細胞として羊膜上皮細胞も好適に使用できることを示すものである。【００９０】
第２細胞として自己の細胞を用いることもできるが、他人の細胞を用いることにすれば細胞をより容易に入手することができる。例えば、両眼性の患者の治療用にシート状組成物を作製する場合においても、第２細胞としての角膜上皮細胞を入手可能となる。【００９１】
それぞれ調製された第１細胞と第２細胞（以下、これらをまとめて「第１細胞等」ともいう）は羊膜上に播種され、培養に供される。通常、細胞浮遊液の形態に調製された第１細胞と第２細胞とをそれぞれ羊膜上に滴下し、培養を実施する。
典型的には、第１細胞の播種と第２細胞の播種とを同時（ここでの「同時」は、文字通りの同時は勿論のこと、片方の播種の後に実質的な時間的間隔を置かずに他方を播種する場合を含む）に実施するが、例えば、第１細胞の播種後、数分〜数時間経過した時点で第２細胞を播種する等、両者を異なるタイミングで播種してもよい。このように播種の時期をずらすことによって例えば、第１細胞に由来する細胞に富む領域が局在している細胞層を構築するなど、均質でない細胞層を構築することも可能である。【００９２】
播種される第１細胞等の比率は特に限定されないが、典型的には、およそ同数の第１細胞と第２細胞が播種されるようにする。尚、第１細胞として口腔粘膜上皮細胞を、第２細胞として角膜上皮細胞を用いた実験において、第１細胞の数：第２細胞の数が３：７の場合、５：５の場合、及び７：３の場合を比較したところ、細胞の増殖の点及び重層化の点についてこれらの間に明確な差異は認められなかった（データ示さず）。【００９３】
羊膜上で第１細胞及び第２細胞を培養することによって、これらの細胞が増殖して細胞層を形成する（この過程において少なくとも一部の細胞が分化すると考えられる）。細胞層が形成された後、当該細胞層の表層を空気に接触させるステップを実施する。尚、このステップを本明細書においてエアーリフティング（Air-lifting）とも呼ぶ。このステップは、細胞層を形成する細胞の分化、及びバリア機能の誘導のために行われる。
このステップは、培養液の一部をスポイト、ピペットなどを用いて一時的に除去することにより培養液表面を低下させ、これにより細胞層の最表層を一時的に培養液外に露出させることによって行うことができる。又は、細胞層を羊膜ごと持ち上げて、最表層を培養液表面から一時的に露出させることにより行うこともできる。更には、チューブなどを用いて空気を培養液中に送り込み、細胞層の最上層に空気を接触させてもよい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて細胞層の最表層を露出させる方法により行うことが好ましい。
このステップを行う時間、即ち重層化した細胞層の最表層を空気に接触させる時間は、細胞の状態や培養条件などによって変動するが、例えば３日〜２週間程度であり、好ましくは１週間以内、更に好ましくは３日以内である。
以上の本発明の方法により、羊膜上において、第１細胞等が重層化した角膜上皮様の細胞層が形成される。このようにして得られたシート状組成物は、第１細胞等の培養基質として用いられる羊膜とともに、角膜を損傷、欠損等した患者に対する移植材料（角膜上皮の代替）として用いることができる。この場合、羊膜が眼球側となるように角膜上皮欠損部に移植される。【００９４】
本発明の一態様では、生体由来細胞の培養を支持細胞の存在下で行う。支持細胞とは、feeder細胞とも呼ばれ培養液中に成長因子等などを供給する。支持細胞との共存下で培養することにより、細胞の増殖効率が向上する。支持細胞には、例えば3T3細胞（スイスマウス3T3細胞、マウスNIH3T3細胞、3T3J2細胞など）などを用いることができる。中でも、増殖効率、取り扱いの容易さなどの観点からマウスNIH3T3細胞を支持細胞として用いることが好ましい。
支持細胞を予めマイトマイシンCなどを用いて不活性化しておくことが好ましい。支持細胞自体が増殖することによって生体由来細胞の増殖が阻害されることを防止し、生体由来細胞の増殖効率を上昇させるためである。このような不活性化は、放射線処理などによっても行うことができる。【００９５】
支持細胞の細胞密度は、例えば約1×102個／cm2以上、好ましくは約1×102個／cm2〜約1×107個／cm2、更に好ましくは約1×103個／cm2〜約1×105個／cm2とすることができる。第１細胞等との対比でいえば、使用する支持細胞数を、例えば生体由来細胞の総数に対して1／103倍〜1×102倍、好ましくは1／102〜１倍となるような条件で培養を行うことができる。支持細胞数が少ないと生体由来細胞の増殖率が低下し、少なすぎる場合には良好な生体由来細胞の増殖及び重層化が得られない。一方、支持細胞数が多すぎる場合には、かえって生体由来細胞の増殖率を低下させることとなり好ましくない。【００９６】
生体由来細胞の培養を支持細胞の共存下で行う場合には、支持細胞と羊膜との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜を存在させることが好ましい。この隔離膜の利用によって、培養時に羊膜側（即ち、生体細胞側）に支持細胞が侵入することを防止できる。その結果、最終的に得られるシート状組成物内に支持細胞が混在するおそれが無くなる。このことは、支持細胞による免疫拒絶の問題のないシート状組成物の作製が可能になることを意味し、臨床上極めて有意義である。
隔離膜としては、支持細胞が通過できないポアサイズを有する公知のものを適宜選択して使用することができる。例えば、ポリカーボネート製、ポアサイズが約0.4μｍ〜3.0μｍの膜を用いることができる。隔離膜の材質は特に限定されず、ポリカーボネートの他、ポリエステルなどであってもよい。このような隔離膜は市販されており、容易に入手することができる。
隔離膜を用いた場合の培養方法の例として以下の方法を挙げることができる。まず、シャーレ等の容器（第１の容器）に不活性化した支持細胞を播種して培養することにより、容器表面に支持細胞層を形成させる。次に、隔離膜で底面を形成した第２の容器を、第１の容器内に設置する。この際、第２の容器の底面が培養液中となるように第２の容器の位置を調整する。続いて、第２の容器の底面、即ち隔離膜上に羊膜を載置又は付着させる。そして、羊膜上に生体由来細胞を播種し、培養する。
第２の容器の底面に予め羊膜を載置又は付着させておき（例えば、第２の容器の底面に上皮を除去した羊膜を載せ、この状態で一旦乾燥処理を行う）、この第２の容器を、支持細胞を播種した第１の容器内に設置し、そして羊膜上に生体由来細胞を播種し、培養を行ってもよい。【００９７】
生体由来細胞を培養する際に用いられる培養液は、当該細胞を増殖させ、重層化できるものであれば特に限定されない。例えば、上皮細胞の成長に通常用いられるDMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とハムF12培地（Ham's F12 medium）とを所定割合で混ぜ、FBS、成長因子、抗生物質等を添加した培地を使用することができる。具体例としては、FBS（10%）、インシュリン（5 mg/ml）、コレラトキシン（0.1 nM）、上皮細胞増殖因子（EGF）（10 ng/ml）、及びペニシリン−ストレプトマイシン（50 IU/ml）を添加した、DMEMとハムF12培地の混合培地（混合体積比１：１）が挙げられる。また、トリヨードサイロニン（例えば、2 nM）、グルタミン（例えば、4 mM）、トランスフェリン（例えば、5 mg/ml）、アデニン（例えば、0.18 mM）、及び／又はハイドロコルチゾン（例えば、0.4 mg/ml）を更に添加したDMEM／ハムF12混合培地を用いることもできる。【００９８】
生体由来細胞の培養を、異種動物細胞非存在下で行うことにしてもよい。本発明において「異種動物細胞非存在下」とは、生体由来細胞を培養する際の条件として、当該生体由来細胞に対して異種である動物の細胞が使用されないことをいう。具体的には生体由来細胞としてヒト細胞（例えばヒト皮膚表皮細胞やヒト角膜上皮細胞）を使用する場合に、マウスやラット等、ヒト以外の動物種の細胞が培養液中に存在（併存）しない条件のことをいう。このような条件で培養を実施することによって、最終的に得られる移植材料（即ちシート状組成物）に異種由来の成分（異種細胞自体を含む）が混入するおそれがなくなる。
生体由来細胞を培養する際に用いられる培地は、当該細胞を増殖させるものであれば特に限定されない。例えば、MCDB153培地（日水製薬株式会社）や、EpiLifeTM（カスケード社）、これらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地、上皮細胞の成長に通常用いられるDMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とハムF12培地（Ham's F12 medium）とを所定割合で混ぜた培地などを使用することができる。特に、本発明では無血清で且つ異種動物由来のタンパク質を含まない培地を用いることが好ましい。一方、成長因子や抗生物質等が添加された培地を使用してもよい。但し、血清を含まない培地を使用することが好ましい。即ち、本発明における培養方法として無血清培養法を採用することが好ましい。血清由来の成分の混入による免疫拒絶等の問題を回避することができるからである。尚、血清を含む培地中で培養することにしてもよいが、その場合には同種由来の血清（ヒトの生体由来細胞を培養する際にはヒト由来の血清）を使用するか、自家血清を使用することが好ましい。勿論、可能であれば、免疫拒絶反応の惹起のおそれがなくなる自家血清を使用することが好ましい。
生体由来細胞の良好な増殖を目的として培養ステップの途中で培養条件を変更することもできる。【００９９】
培養ステップの結果、羊膜上で生体由来細胞が増殖する。このようにして得られた細胞層の表層を角化する必要がある場合（例えば皮膚表皮細胞を用いて皮膚表皮シートを作製する場合や、角膜上皮細胞を用いて角膜上皮シートを作製する場合）には、上述したエアーリフティング（Air-lifting）を実施することができる。【０１００】
生体由来細胞は、例えば細胞密度が約1×103個／cm2以上、好ましくは約1×103個／cm2〜約1×107個／cm2、更に好ましくは約1×104個／cm2〜約1×106個／cm2となるように羊膜上に播種される。【０１０１】
好適な一態様では、予め調製したヒト線維芽細胞含有コラーゲンマトリクス上に羊膜を載置し、その後、羊膜上に生体由来細胞を播種し、培養する。即ち、この態様では、コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ（ステップB）、及び前記コラーゲンゲル上に羊膜を載置した後、前記生体由来細胞を該羊膜上に播種ないし載置するステップ（ステップC）が実施される。このような手順で作製されたシート状組成物は、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で増殖させた生体由来細胞を含有することとなる。この態様のシート状組成物は、コラーゲンマトリクスを除去した後に移植材料として用いることもできる。また、コラーゲンマトリクスごと移植材料として用いることもできる。
「コラーゲンゲル」はヒト線維芽細胞の培養基質として機能する。コラーゲンゲルの原材料となるコラーゲンの種類は特に限定されず、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲンなどを用いることができる。複数の種類のコラーゲンが混在するものを用いることもできる。これらのコラーゲンは、ブタ、ウシ、ヒツジなどの動物の皮膚、軟骨などの結合組織から、酸可溶化法、アルカリ可溶化法、酵素可溶化法などにより抽出、精製することができる。尚、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシンなどの分解酵素で処理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるアテロコラーゲンとしたものを用いることが好ましい。コラーゲンゲルの材料として羊膜由来、特にヒト羊膜由来のコラーゲンを用いてもよい。ここで、羊膜由来とは、広く羊膜を出発原料として得られたものであることを意味する。【０１０２】
コラーゲンゲルが含有するヒト線維芽細胞の由来は特に限定されず、コラーゲンを産生するものであればいずれの組織由来のものでもよく、例えば、皮膚組織、口腔粘膜組織などから調製したヒト線維芽細胞を使用することができる。【０１０３】
コラーゲンマトリクスの作製方法の具体例を示す。まず、以下の手順でヒト線維芽細胞を調製する。皮膚を採取し、続いて皮膚から真皮を剥離する。真皮を細切し、I型コラーゲンコートディッシュに密着させる。静置培養し、真皮片から遊走するヒト線維芽細胞を継代する。細胞がディッシュ底面から剥離させ、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。適宜細胞を凍結保存（例えば液体窒素中で保存）する。
一方、Ｉ型コラーゲンを用いて中和コラーゲン液を調製する（後述の実施例を参照）。これを培養容器（例えばカルチャーインサート）に添加し、室温で10分間程度静置させてゲル化させる。次に、上述の方法によって予め培養しておいた対数増殖期のヒト線維芽細胞をこのゲルに混和し、再度ゲル化させる。その後、静置培養する。以上の手順によってヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンマトリクスが得られる。この創意工夫により、必要な強度を有し、羊膜層や生体由来細胞を載置できるコラーゲンマトリクスとなったもので、本発明の根幹をなす。コラーゲンマトリクスの上には、別途用意した羊膜が載置（密着）される。その後、上述の手順で細胞の播種、培養が実施される。【０１０４】
尚、羊膜表面に接着成分（フィブリノーゲン等）を付着させる操作を伴う場合は、接着成分の付着操作に先行して細胞層を形成する。即ち、この態様では、羊膜上に細胞層を形成した後、フィブリノーゲン等の接着成分を羊膜表面（細胞層が形成されない側の表面）に付着させる。
【実施例１】
【０１０５】
１．トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の調製
１−１．羊膜の採取
全身的合併症のない帝王切開予定の妊婦に対して事前に産婦人科医とともに十分なインフォームドコンセントを行った後、手術室で帝王切開時に羊膜を採取した。操作は清潔に気をつけ、手術操作に準じて手洗いの後に専用ガウンを装用した。分娩前に清潔な羊膜採取用のバットと洗浄用の生理食塩水を準備した。分娩後に胎盤組織をバットに移し、用手的に羊膜組織を胎盤より剥離した。羊膜と胎盤との癒着が強い部分はハサミで切除した。【０１０６】
１−２．羊膜の処理
羊膜処理の過程は（１）洗浄、（２）トリミング、（３）保存の順で行った。すべての過程において、操作は清潔なドラフト内で行うのが望ましく、使用する容器や器具もすべて滅菌されたものを使用し、シャーレ等は滅菌された使い捨て（ディスポーザブル）タイプのものを使用した。採取した羊膜に付着した血液成分を生理食塩水にて洗浄しながら除去し、さらに十分量の生理食塩水（0.005% ofloxacin添加）にて洗浄した。続いて、ペニシリン−ストレプトマイシン（50IU）を添加したリン酸緩衝液（PBS）で合計３回洗浄した。次に、羊膜をシャーレ内に移し、ハサミを用いて約4×3 cm程度のサイズに分割した。分割後、形状や厚さなどを基準に状態のよい羊膜を選別した。【０１０７】
１−３．羊膜の保存
2ccの滅菌クライオチューブに1ccずつ保存液を入れ、そこに採取、洗浄して選別された羊膜を1枚ずついれラベルした後、−80℃のディープフリーザーに保存した。保存液には50％滅菌済みグリセロール in DMEM (Dulbecco’S Modofied Eagle Medium: GIBCOBRL社)を使用した。保存された羊膜の使用期限は3ヶ月とし、期限が過ぎれば焼却処分した。尚、このような保存処理を行わずに、以下の上皮処理を実施してもよい。【０１０８】
１−４．羊膜上皮の処理
−80℃で保存していた羊膜を室温で解凍した後、ペニシリン−ストレプトマイシン（50IU）を添加したリン酸緩衝液（PBS）で2回洗浄した。洗浄後の羊膜を0.02％EDTA溶液 (Nacalai tesque社)に浸し（100mm培養皿）、CO2インキュベーター内で37℃、1時間反応させた。反応後、羊膜を十分量のPBSで2回洗浄し、実体顕微鏡下、cell scraper (Nunc社 USA)を用いて用手的に上皮を掻爬（除去）した。尚、この処理方法によって一層の羊膜上皮が完全に除去掻爬されたことを光学的及び電子顕微鏡的操作（走査型電子顕微鏡）で確認した。【０１０９】
１−５．トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の作製
上皮を除去した羊膜を、１０％（ｗ／ｖ）トレハロース溶液に３７℃で２時間浸漬した。トレハロース溶液は、トレハロース（とれはのいのち、株式会社エイチプラスビィ・ライフサイエンス、林原製）を蒸留水で希釈して作製した。溶液のpHは７〜１０の範囲に保った。羊膜を一組の滅菌済みプラスチックフレームで挟持した後、クリップで固定した。フレームごと−80℃のディープフリーザー内に移し、羊膜が凍結したのを確認した後、真空凍結乾燥機（Yamato, NEOCOOL）を用いて凍結乾燥処理（-110℃、約1時間）を行った。使用説明書に従い、十分な乾燥体が得られるように条件設定した。凍結乾燥処理後の羊膜をフレームから外し、外側がポリアミドナイロン、内側がポリエチレンからなる二層構造の袋に移し、家庭用真空パック器（フレームノバ、マジックパック）を用いて真空包装した。このようにして得られた真空パック状態の羊膜にγ線を照射して（約25kGy）滅菌した。滅菌処理後の羊膜を真空パック状態のまま使用直前まで常温保存した。尚、保存開始から12ヶ月経過した時点においても凍結乾燥直後の状態を維持していた。以降の実験は1ヶ月常温保存した乾燥羊膜を使用して行った。【０１１０】
２．トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の物性評価
上記の手順で調製したトレハロース処理・凍結乾燥羊膜（トレハロース処理FD-AMともいう）を充分に復元するまで室温でPBSに浸漬した後、その物性を評価した。試験項目、試験方法は次の通りとした。尚、別々に調製した５枚のトレハロース処理・凍結乾燥羊膜を各試験に供し、得られた測定値の平均を評価に用いた。また、上皮処理、トレハロース処理及び凍結乾燥処理を施さない羊膜（生羊膜）と、トレハロース処理を施さないこと以外は同様の手順で調製した凍結乾燥羊膜とを用意し、物性評価の基準（比較対照）とした。
(1)厚さ
厚さの測定はキーエンス製ダブルスキャン高精度レーザー測定器（LT-9010M）で行った。
(2)透明度
日本電色社製  濁度計（NDH2000）を用いて濁度を測定し、透明度の評価に用いた。濁度は以下の式で算出される。Haze（濁度）＝拡散透過率（DF）/全光線透過率（TT）
(3)引張強度
引っ張り強度の測定にはA&D社製  引張強度計（テンシロン RTC-1210A)）を用いた。
(4)柔軟性
柔軟性の測定のために、カールツァイス製、マイクロサージェリー用顕微鏡を用いて肉眼的にしわの存在を検出した。眼球全面の範囲におけるしわの数を３人でそれぞれ測定し、その平均によって柔軟性を評価した。【０１１１】
試験結果を図３〜図６に示す。まず、図３に示されるようにトレハロース処理・凍結乾燥羊膜は凍結乾燥羊膜よりも厚いことがわかる。これはトレハロース処理によって水分保持能が高まったためと考えられる。尚、上皮層が除去されていることを反映して、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜は生羊膜（AM）よりも大幅に薄い。
次に、図４に示されるようにトレハロース処理・凍結乾燥羊膜は凍結乾燥羊膜よりも透明度が高い。このように、トレハロース処理によって透明性が向上するという、驚くべき事実が明らかとなった。トレハロース処理・凍結乾燥羊膜に比較して生羊膜の透明度が劣るのは上皮層の存在による。
一方、図５に示されるようにトレハロース処理・凍結乾燥羊膜は凍結乾燥羊膜よりも引張強度が高い。驚くべきことに、上皮を備える羊膜（生羊膜）と比較してもトレハロース処理・凍結乾燥羊膜の強度の方が高い。このように、トレハロース処理は羊膜の強度を高めるために非常に有効であることが明らかとなった。
また、図６に示されるようにトレハロース処理・凍結乾燥羊膜の柔軟性は、凍結乾燥羊膜とは大きく異なり、生羊膜と同等である。このように、トレハロース処理は羊膜の柔軟性を高めるために非常に有効であることが明らかとなった。【０１１２】
３．トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の生体適合性評価
生体に移植される材料には生体適合性が高いことが要求される。そこで、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の生体適合性を以下の手順で評価した。
６週齢日本家兎の眼表面よりメスで角膜実質層に切り込みを入れた。続いて、適当な大きさに整形したトレハロース処理・凍結乾燥羊膜を実質層の切れ込み内に挿入した。以上の移植術後、眼表面の状態を経時的に観察した。移植直後及び移植後一ヶ月の眼表面の状態を図７に示す。移植後一ヶ月において周囲からの血管新生はなく、炎症反応も認められない。また、眼表面の透明性も移植直後と比較して格段に向上している。この結果から、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の生体適合性は、未処理の羊膜と同等であると判断された。【０１１３】
生体適合性をさらに詳細に調べるため、移植後一ヶ月の時点で、移植部を含む角膜の一部を摘出してHE染色に供した。HE染色像を図８に示す。移植片（即ちトレハロース処理・凍結乾燥羊膜）を矢印で示した。図８から明らかなように、上皮の分化異常、角膜内血管新生、上皮浮腫、及び細胞浸潤はいずれも認められない。この結果より、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜は抗原性が極めて低く、生体適合性に優れることが確認された。【０１１４】
４．トレハロース処理・凍結乾燥羊膜を用いた培養角膜上皮シートの作製
４−１．角膜上皮細胞の回収
６週齢日本白色家兎より採取した角膜を、10％ウシ胎児血清(FBS)を含有するDMEMに浸漬し、結膜、角膜内皮等不要な組織を切除した。その後、組織をリン酸緩衝液（PBS）で洗浄し、1.2U/mlディスパーゼ(Nacalai tesque社)を含有するリン酸緩衝液（PBS）に37℃で１時間浸漬した。処理後の組織を取り出し、0.02％EDTAに室温で2分間、続いてリン酸緩衝液に室温で2分間浸漬してディスパーゼ活性を停止させた。10％ウシ胎児血清(FBS)を含有するDMEM中で角膜上皮細胞を掻爬した後、遠心処理により角膜上皮細胞を濃縮、回収した。【０１１５】
４−２．共培養細胞の調製
共培養の細胞（支持細胞）として、NIH-3T3細胞（以下、「3T3細胞」と略称する）を使用した。事前に培養して75Fフラスコ(BD Falcon社)でコンフルエントになった3T3細胞を0.05％マイトマイシンＣ溶液に２時間浸漬させ、3T3の増殖活性を抑えた。続いてリン酸緩衝液（PBS）で数回洗浄してマイトマイシンＣを除去した。細胞を0.05%トリプシンーEDTA溶液で処理した後、ピペッティングして細胞懸濁液（3T3細胞懸濁液）とした。【０１１６】
４−３．細胞層の形成
１．で得られたトレハロース処理・凍結乾燥羊膜を、充分に復元するまで室温でPBSに浸漬した。このようにして調製した羊膜を基質として、角膜上皮細胞と3T3細胞とを以下の手順で共培養した。培養器具としては6wellのカルチャー・ディッシュ（培養皿）（Corning社, NY）とカルチャー・インサート（培養挿入容器）（ポリカーボネート製、平均ポアサイズ3.0μm、Corning社, NY）を用いた。
まず、カルチャー・ディッシュ上に約1×104個／cm2の細胞密度となるように3T3細胞懸濁液を播種し、37℃、5％CO2の条件下で培養した。また、カルチャー・インサート上に基底膜側（上皮が存在していた側）を上にして羊膜を貼り付け、室温で10分間乾燥させた。その後、羊膜を貼り付けたカルチャー・インサート上に約1×105個／cm2の細胞密度となるように角膜上皮細胞懸濁液を播種した。【０１１７】
以上の操作後、図９に示すように、カルチャー・インサートをカルチャー・ディッシュ内に設置し、3T3細胞と角膜上皮細胞を同じ培地中で培養した。尚、図９は培養中の状態を示した模式断面図である。カルチャー・ディッシュ１１内にカルチャー・インサート１２が静置され、カルチャー・ディッシュ１１底面には3T3細胞層１５が形成される。また、カルチャー・インサート１２の底面上に羊膜１３が静置され、その上に角膜上皮細胞１４が培養される状態が示される。符号１６は培地である。
培地には、DMEM/ハムF12混合培地（混合体積比１：１）に、10％ＦＢＳ, インシュリン(5 mg/ml)、コレラトキシン(0.1nM)、ペニシリンストレプトマイシン(50 IU/ml)、ヒトリコンビナント上皮細胞増殖因子(EGF)(10 ng/ml)を添加したものを使用した。【０１１８】
上記の培地中で３週間培養した(Submerge)。その後、粘膜上皮を分化誘導すべく、いわゆるエアーリフティング（Air-lifting）法を用いて１週間培養した。エアーリフティング法とは、培地の液面を、羊膜上に形成された角膜上皮細胞由来の細胞層面までにし、当該細胞層の表面を空気中に暴露する方法である。Submerge中は隔日で培地を交換し、エアーリフティング後は毎日培地交換して培養を行った。その結果、羊膜上に細胞層が形成された。【０１１９】
５．培養角膜上皮シートの組織学的特性の検証
エアーリフティング後、２日間培養した時点で、角膜上皮に類似した細胞層が形成された（図１０右欄）。細胞層では、正常角膜上皮と同様に５〜７層に細胞が重層化していることがわかる。この細胞層の羊膜側には比較的円柱形をした基底細胞類似の細胞群が存在していた。また、最表層の細胞は扁平型を呈していたが核を有しており、皮膚とは異なりその表面は角化していなかった。このように、羊膜上に角膜上皮類似の細胞層（角膜上皮様層）が形成されていることが確認された。尚、トレハロース処理を行わずに凍結乾燥させた羊膜（凍結乾燥羊膜）を基質として同様に角膜上皮細胞を培養した場合、細胞層は形成されるものの、１〜２層の重層化しか認められない（図１０左欄）。このことから、トレハロース処理を施した凍結乾燥羊膜は、角膜の正常分化を促す機能を発揮するといえる。【０１２０】
次に、細胞層の組織学的特性をさらに検討するために免疫染色を行った。まず、得られた細胞層を羊膜とともに適切な大きさに切除してOCT compoundに凍結包埋した。その後クライオスタットにて薄切りし、スライド切片を作製した。免疫染色にあたっては、代表的な細胞骨格蛋白であるケラチン関連の検討を行った。すなわち、角膜特異的なケラチン３、表皮特異的なケラチン１０、及び結膜特異的なケラチン１３の発現を調べた。方法は以下のとおりである。スライド切片をリン酸緩衝液（PBS）で洗浄した後、1％ウシ胎仔血清（FBS）でブロッキングを行い非特異的な抗体反応を抑制した。その後、各ケラチンに対する抗体（１次抗体）を室温で1時間反応させた。反応後triton-X含有のPBSにて15分、3回の条件で洗浄し、続いて蛍光標識化抗体（２次抗体）を室温で1時間反応させた。反応後、リン酸緩衝液（PBS）にて15分、3回の条件で洗浄し、封入した後コンフォーカルマイクロスコープにて組織を観察した。【０１２１】
細胞層に対する各種ケラチンの抗体反応は以下の通りである。まず、表皮特異的ケラチン１０、及び結膜特異的ケラチン１３に対する染色性はいずれも認められなかった（図１１下段）。一方、角膜特異的ケラチン３に対する染色性が広範囲に亘って認められた（図１１上段右）。ケラチン３に対する染色性は細胞層の上部において強い。以上の結果から、正常角膜上皮に近似した上皮細胞層が形成されていることが確認できた。【０１２２】
６．培養角膜上皮シートを用いた移植実験
４．で作製された、羊膜上に角膜上皮様の細胞層が形成されたシート（培養角膜上皮シート）を用いて以下の移植実験を行った。
まず、角膜上皮細胞の採取を行った家兎に対し、輪部より4mm外側からクレセントナイフを用いて角膜および結膜上皮を100μmの厚さですべて除去した。この操作により角膜上皮幹細胞を含む上皮細胞が存在しなくなるため、人為的な眼表面幹細胞疲弊症が再現されると考えることができる。
次に、培養角膜上皮シートを輪部よりやや内側の領域に移植した。移植の際には１０−０ナイロン糸を用いて周囲の組織に縫合した。移植後、移植片の上に治療用ソフトコンタクトレンズを縫着した。術後、抗生剤およびステロイド眼軟膏を２回／日塗布した。移植後の時点で眼表面は、移植前の培養角膜上皮シートと同様の透明度を示していた。【０１２３】
移植術を施した眼表面を移植後２日及び１４日に観察した。併せて、フルオレセイン染色試験を実施した。尚、フルオレセイン染色試験は、フルオレセイン試験紙に抗生剤の点眼などの水分を含ませて直接眼表面に塗布し、２、３度瞬目をさせた後、眼表面のフルオレセイン染色性を観察することにより行った。角膜上皮が残存していると、そのタイトな細胞間接着構造によってフルオレセイン色素は浸潤せず、フルオレセインによる染色が見られない。
移植後２日において、眼表面は透明性を維持していた（図１２上段左）。またフルオレセイン染色によって、培養角膜シートが眼表面に欠損なく残存していることが確認された（図１２下段左）。一方、移植した培養角膜上皮シートがフルオレセイン染色性を示さないことにより、培養角膜上皮シートが角膜上皮同様のバリア機能を備えていることが確認された。さらに、移植した培養角膜上皮シートの周囲では全周に渡ってフルオレセインの染色性が認められ、移植部に存在する組織が周囲の残存結膜上皮のコンタミネーションではないことが確認された。
尚、通常の角膜上皮では細胞同士がタイトな接着構造で結合しているため、その表面よりフルオレセインの色素が浸潤しない。即ち、フルオレセイン染色試験において染色性を示さない。一方、細胞間の接着が緩んだり、細胞自体が剥離してバリア機能が障害されたときには、フルオレセイン色素の浸潤が生じて組織を染色する。したがって、フルオレセイン染色による染色性を調べることにより、移植した培養角膜上皮シートが角膜上皮同様のバリア機能を備えるか否かを確認できる。【０１２４】
一方、移植後１４日においても培養角膜上皮シートは眼表面に残存しており、しかも移植後２日の状態と比較して周囲へ伸展し、眼表面全体を被覆していることが確認された（図１２上段右）。また、眼表面はフルオレセイン染色性を示さず、培養角膜上皮シートがバリア機能を維持していることが確認された（図１２下段右）。透明性についても移植後２日の時点と変わらず、依然として高い透明性が維持されていた（図１２上段右）。【０１２５】
以上の結果から、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜を基質として得られる培養角膜上皮シートは、眼表面への良好な生着性を備え、それは長期に亘って維持されることが実証された。また、移植後に周囲に伸展するとともに、角膜上皮として必要なバリア機能を長期間に亘って発揮し、併せて高い透明性を維持することも確認された。即ち、上記方法で得られる培養角膜上皮シートは角膜上皮の代替として良好に機能するものであり、角膜の損傷、欠損などの場合に眼表面を再建するための移植材料として好適に利用できるものであることが確認された。【０１２６】
７．移植後の培養角膜上皮シートの組織学的特性評価
次に、移植後２週の培養角膜上皮シートを摘出し、その組織学的特性を検討した。図１３の上段左に培養角膜上皮シートのHE染色像を示す。トレハロース処理・凍結乾燥羊膜（TH-AM、記号＊＊）の上に、正常角膜上皮と同様、細胞が規則正しく整列して構成された細胞層を確認できる。この細胞層は上層ほど扁平形状の細胞が多く、角膜上皮に極めて近似した構造を維持している。
図１３の上段右及び下段に、各種ケラチンに対する染色試験の結果を示す。概ね、移植前の培養角膜上皮シートと同様の染色性を示した。即ち、表皮特異的ケラチン１０、及び結膜特異的ケラチン１３に対する染色性はいずれも認められず（図１３下段）、角膜特異的ケラチン３に対する染色性が細胞層全体に認められた（図１３上段右）。以上のように、培養角膜上皮シートは移植後においても、角膜特異的なケラチンを維持していることが確認された。この結果は、培養角膜上皮シートが角膜上皮と同様の機能を長期に亘って発揮するであろうことを組織学的見地から強く支持するものである。【０１２７】
８．基底膜成分及び緻密層成分に対する免疫染色
細胞培養用の基質として羊膜が良好に作用するためには、基底膜及び緻密層がその本来の構造を保持していることが好ましいと考えられる。基底膜及び緻密層がその本来の構造を保持しているか否かは、それぞれについて特徴的な成分の有無（残存しているかどうか）を調べることによって評価できる。そこで、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜において基底膜成分及び緻密層成分が残存しているか否かを以下に示す免疫染色法で調べた。尚、上皮処理、トレハロース処理、及び凍結乾燥処理を行っていない羊膜（生羊膜）と、トレハロース処理を行わないこと以外はトレハロース処理・凍結乾燥羊膜と同様の方法で調製した羊膜（凍結乾燥羊膜）を比較対象とした。
まず、各羊膜を各々1.5×1.5cmの大きさに切り、OCTコンパウンドにて包埋を行い、−80℃で凍結して凍結標本とした。この標本を凍結状態のままクリオスタット(CM1900 Leica社製)を使って厚さ8μmで羊膜面に対して垂直方向で切り、スライドガラス上にマウントして凍結切片を作製した。この切片を用いて以下の手順で免疫染色を行った。
1.アセトン固定 5分、2.PBS洗浄 30分、3.PBS/3%BSAによるブロッキング 15分、4.一次抗体 1時間、5.PBS洗浄 30分、6. PBS/3%BSAによるブロッキング 15分、7.二次抗体 1時間、8.PBS洗浄 30分、9.封入。
封入後のサンプルを蛍光顕微鏡(Leica DMIRB)下で観察した。
尚、使用した抗体は以下の通りであり、適用量は各メーカーのマニュアルに従った。
コラーゲンI（Collagen I）:LSL LB-1190、コラーゲンIII（Collagen III）:LSL LB1300、コラーゲンIV（Collagen IV）:LSL LB-1407、コラーゲンV（Collagen V）:LSL LB1581、コラーゲンVII（Collagen VII）:Chemicon MAB1345、ラミニン5（Laminin-5）:Chemicon MAB19562、フィブロネクチン（Fibronectin）:LSL LB-1021。
羊膜基底膜層にはコラーゲンIV、VII、ラミニン5、緻密層にはコラーゲンI、III、V、フィブロネクチンが発現している。そのため各抗体での免疫染色を行うことによって羊膜基底膜と緻密層の残存が観察できる。合わせて本実験ではPI染色も行っているため、羊膜上皮細胞の有無についても同時に判別ができる。
免疫染色の結果を図１４に示す。Ａの列が生羊膜の染色像、Ｂの列が凍結乾燥羊膜の染色像、Ｃの列がトレハロース処理・凍結乾燥羊膜の染色像である。各列において上か順に（１）コラーゲンIの染色像、（２）コラーゲンIIIの染色像、（３）コラーゲンIVの染色像、（４）コラーゲンVの染色像、（５）コラーゲンVIIの染色像、（６）ラミニン5の染色像、（７）フィブロネクチンの染色像である。【０１２８】
染色結果から次の事項が明らかとなった。まず、凍結乾燥羊膜に比較して、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜では基底膜成分（コラーゲンIV、コラーゲンVII、ラミニン5）のシグナルが強く、即ち基底膜成分に関する染色性が生羊膜のそれに近似する。このことは、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜では基底膜が本来の構造を高度に保持していることを示唆する。
一部の染色結果（コラーゲンIV、フィブロネクチン）において、凍結乾燥羊膜では全体に亘って染色性が認められるが、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜では、生羊膜と同様に、染色される部位と染色されない部位の境界が比較的明確である。このことは、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜では、基底膜と緻密層がそれぞれ本来の構造を高度に保持していることを示唆する。
緻密層に関する染色結果から明らかなように、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜の緻密層は凍結乾燥羊膜のそれに比較して厚い。このことから、トレハロース処理を施したことによって、湿潤状態に戻した際、緻密層が良好に膨潤し、生羊膜に近い厚さに回復したことが分かる。
以上のように、トレハロース処理・凍結乾燥羊膜では基底膜及び緻密層の構造が生羊膜のそれに近似していることが明らかとなった。即ち、トレハロース処理を施すことによって、凍結乾燥の際に基底膜及び緻密層の構造が損傷することを防止でき、生羊膜に近い構造の基底膜及び緻密層を備えた羊膜が得られることが確認された。【０１２９】
９．上皮除去法の検討
図１５に示す手順で羊膜を処理し、上皮が除去された羊膜（上皮非含有羊膜）を調製した。以下、各工程の操作方法（処理方法）、操作条件（処理条件）などを詳細に説明する。
９−１．羊膜の採取
羊膜は、全身的合併症のない帝王切開予定の妊婦に対して事前に産婦人科医とともに十分なインフォームドコンセントを行った後、手術室で帝王切開時に採取した。操作は清潔に気をつけ、手術操作に準じて手洗いの後に専用ガウンを装用した。分娩前に清潔な羊膜採取用のバットと洗浄用の生理食塩水を準備した。分娩後に胎盤組織をバットに移し、用手的に羊膜組織を胎盤より剥離した。羊膜と胎盤との癒着が強い部分はハサミで切除した。【０１３０】
９−２．血液成分の除去、絨毛膜の剥離
まず、採取した羊膜に付着した血液成分を生理食塩水にて洗浄しながら除去し、さらに十分量の生理食塩水（0.005% ofloxacin添加）にて洗浄した。次に羊膜に接着している絨毛膜を用手的に取り除いた。【０１３１】
９−３．羊膜の固定
図２ｂに示す方法で羊膜を固定した。まず、上皮側が上になるように羊膜を滅菌済みフッ素樹脂シートに載せた。その後、しわ、たるみがなくなるように羊膜を伸ばし、滅菌済みフッ素樹脂シートフレームを羊膜に載せた。クリップ等を用いてフッ素樹脂シートとフッ素樹脂シートフレームを固定した。これによって羊膜は、フッ素樹脂シートとフッ素樹脂シートフレームで狭持された状態となる（枠固定）。外側にはみ出した余分な羊膜を切り落とした。実態顕微鏡下で観察し、上皮側が上になっていることを確認した。【０１３２】
９−４．凍結融解処理
枠固定された羊膜を-80℃のディープフリーザー内に移し、約30分放置した（凍結）。ディープフリーザーから取り出した後、37℃のインキュベーター内に移し、約30分放置した（融解）。以上の操作をもう一度行った。【０１３３】
９−５．トリプシン処理
凍結融解処理後、トリプシン溶液（0.02%トリプシン、0.2mM EDTA含有のリン酸緩衝液）に羊膜の上皮側を浸漬させ、約15分間放置した（37℃）。浸漬方法は図１６ａに示す方法を採用した。即ち、枠固定された羊膜１０をフッ素樹脂シート４が下になるように保持した状態で、トリプシン溶液５をフッ素樹脂シートフレーム３内に加えた。これによって、羊膜１０の上皮部分のみがトリプシン溶液５に浸漬する。尚、図１６ｂに示すように、枠固定された羊膜１０を、その上皮側が下になるように容器６内に入れることでトリプシン溶液５への浸漬を実施することもできる。この例では容器６の内側に設けた突起７にフッ素樹脂シートフレーム３が係り止めされるようにすることで、トリプシン溶液５の液面５ａと羊膜１０について所望の位置関係を実現している。【０１３４】
９−６．洗浄
トリプシン処理後の羊膜をフッ素樹脂シート及びフッ素樹脂シートフレームから外してＰＢＳ中に移し、振盪させることで洗浄した（140rpm 15分を2回）。この操作によってトリプシン溶液及び羊膜上皮細胞が除去される。【０１３５】
９−７．凍結乾燥
洗浄後の羊膜を一組の滅菌済みプラスチックフレームで挟持した後、クリップで固定した。フレームごと−80℃のディープフリーザー内に移し、羊膜が凍結したのを確認した後、真空凍結乾燥機（Yamato, NEOCOOL）を用いて凍結乾燥処理（-110℃、約1時間）を行った。使用説明書に従い、十分な乾燥体が得られるように条件設定した。凍結乾燥処理後の羊膜をプラスチックフレームから外し、外側がポリアミドナイロン、内側がポリエチレンからなる二層構造の袋に移し、家庭用真空パック器（フレームノバ、マジックパック）を用いて真空包装した。このようにして得られた真空パック状態の羊膜にγ線を照射して（約25kGy）滅菌した。滅菌処理後の羊膜を真空パック状態のまま使用直前まで常温保存した。【０１３６】
９−８．凍結融解処理及びトリプシン処理による上皮除去法の評価
上記の羊膜上皮除去法を以下の手法で評価した。評価実験には、トリプシン処理後、洗浄して得られる上皮非含有羊膜（トリプシン処理羊膜）を使用した。
（１）HE染色
上皮非含有羊膜（トリプシン処理羊膜）を次の手順でHE染色した。尚、上皮を除去していない羊膜（生羊膜）と用手的に上皮を除去した羊膜（用手的処理羊膜）を比較対象とした。
まず、上皮非含有羊膜（トリプシン処理羊膜）、生羊膜、用手的に上皮を除去した羊膜（用手的処理羊膜）を各々1.5×1.5cmの大きさに切り、OCTコンパウンドにて包埋を行い、−80℃で凍結して凍結標本とした。この標本を凍結状態のままクリオスタット(CM1900 Leica社製)を使って厚さ8μmで羊膜面に対して垂直方向で切り、スライドガラス上にマウントして凍結切片を作製した。
HE染色の手順、及び条件は次の通りとした。1.10%ホルマリン液 5分、2.流水洗浄15分、3.ヘマトキシン液10秒、4.流水洗浄15分、5.エオジン液10秒、6.流水洗浄15分、7.70%エタノール 10秒、8.90%エタノール 10秒、9.95%エタノール 10秒、10.100%エタノール 10秒、11.100%キシレン 10秒、12.100%キシレン 30分、13.封入。
封入後のサンプルを光学顕微鏡(Olympus BX50)下で観察した。
羊膜を用いてヘマトキシンで染色を行った場合、羊膜上皮細胞と緻密層有核細胞が染色される。一方エオジンで染色すると緻密層が染色される。従ってHE染色によれば、上皮細胞の剥離の有無、緻密層へのダメージの有無を判別できる。【０１３７】
HE染色結果を図１７に示す。生羊膜では細胞層（上皮）を確認できる。トリプシン処理羊膜では用手的処理羊膜と同様に細胞層（上皮）は観察されない。この結果から、上記方法によれば上皮を完全に、しかもムラ無く除去できることが確認された。また、緻密層の損傷は認められなかった。【０１３８】
（２）基底膜成分及び緻密層成分に対する免疫染色
細胞培養用の基質として良好に作用するためには、上皮層が完全に除去されていることに加えて、基底膜及び緻密層がその本来の構造を保持していることが好ましいと考えられる。基底膜及び緻密層が構造を維持しているか否かは、それぞれについて特徴的な成分の有無（残存しているかどうか）を調べることによって評価できる。そこで、トリプシン処理羊膜において基底膜成分及び緻密層成分が残存しているか否かを以下に示す免疫染色法で調べた。尚、HE染色の場合と同様に、上皮を除去していない羊膜（生羊膜）と用手的に上皮を除去した羊膜（用手的処理羊膜）を比較対象とした。
羊膜の凍結切片の作製方法はHE染色の場合と同様である。この切片を用いて以下の手順によって免疫染色を行った。
1.アセトン固定 5分、2.PBS洗浄 30分、3.PBS/3%BSAによるブロッキング 15分、4.一次抗体 1時間、5.PBS洗浄 30分、6. PBS/3%BSAによるブロッキング 15分、7.二次抗体 1時間、8.PBS洗浄 30分、9.封入。
封入後のサンプルを蛍光顕微鏡(Leica DMIRB)下で観察した。
尚、使用した抗体は以下の通りであり、適用量は各メーカーのマニュアルに従った。
コラーゲンI（Collagen I）:LSL LB-1190、コラーゲンIII（Collagen III）:LSL LB1300、コラーゲンIV（Collagen IV）:LSL LB-1407、コラーゲンV（Collagen V）:LSL LB1581、コラーゲンVII（Collagen VII）:Chemicon MAB1345、ラミニン5（Laminin-5）:Chemicon MAB19562、フィブロネクチン（Fibronectin）:LSL LB-1021。
羊膜基底膜層にはコラーゲンIV、VII、ラミニン5、緻密層にはコラーゲンI、III、V、フィブロネクチンが発現している。そのため各抗体での免疫染色を行うことによって羊膜基底膜と緻密層の残存が観察できる。合わせて本実験ではPI染色も行っているため、羊膜上皮細胞の有無についても同時に判別ができる。
免疫染色の結果を図１８〜図２１に示す。図１８及び１９はトリプシン処理羊膜の免疫染色像、図２０は生羊膜（上皮有）の免疫染色像、図２１は用手的処理羊膜の免疫染色像である。免疫染色の結果をまとめた表を図２２に示す。これらの結果から明らかなようにトリプシン処理羊膜では、基底膜成分、緻密層成分とも、用手的処理羊膜と同程度に残存している。つまり上記の処理方法によれば、従来の用手的処理方法と同等に基底膜成分及び緻密層成分を残存させることができる。【０１３９】
９−９．まとめ
以上の実験結果から、凍結融解処理とトリプシン処理を組み合わせた方法で羊膜を処理すれば、羊膜の基底膜及び緻密層を実質的に損傷させることなく（即ち本来の構造を良好に保持させたままで）、上皮を完全に除去することが可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明のシート状組成物は、組織の再建用の移植材料、癒着防止剤等として、広範な領域で利用され得る。本発明のシート状組成物の適用領域として眼科領域、消化器外科領域、婦人科領域、皮膚科領域を例示することができる。【０１４１】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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