(57)【要約】本発明は、分子イメージ剤を提供することを課題とする。本発明により、リポソームと、糖鎖基と、リンカータンパク質基と、親水性化合物基とを含み、該リンカータンパク質基は該リポソームの外表面に結合し、該リンカータンパク質基の少なくとも一部に該糖鎖基が結合し、該リポソームの外表面または該リンカータンパク質基の一部に該親水性化合物基が結合している、糖鎖修飾リポソームが提供される。本発明の１つの局面により、糖鎖修飾リポソームと医薬活性成分をさらに含む薬学的組成物が提供される。本発明の１つの局面により、分子イメージング剤として使用される糖鎖修飾リポソームが提供される。本発明の１つの局面により、標識された糖鎖を含むリポソームを生産する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖修飾リポソームであって、該糖鎖修飾リポソームは、
リポソームと
糖鎖基と
リンカータンパク質基と
親水性化合物基とを含み、
該リンカータンパク質基は該リポソームの外表面に結合し、該リンカータンパク質基の少なくとも一部に該糖鎖基が結合し、該リポソームの外表面または該リンカータンパク質基の一部に該親水性化合物基が結合している、糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２】
前記糖鎖修飾リポソームは、構造Ｉと構造ＩＩとを含み、
該構造Ｉは、
Ｘ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ３で表され、
Ｘは、前記リポソームに含まれる前記リンカータンパク質とＣＨ２−ＮＨ結合可能な官能基ａを含む構成単位から、該官能基ａがとれた基であり、
Ｒ１は、前記リンカータンパク質基であり、
Ｒ２は、リンカータンパク質架橋基であり、
Ｒ３は、前記糖鎖基であり；および
該構造ＩＩは、
Ｙ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ４−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ５で表され、
Ｙは、前記リポソームに含まれる親水性化合物架橋基とペプチド結合可能な官能基ｂを含む構成単位から該官能基ｂがとれた基であり、
Ｒ４は、該親水性化合物架橋基であり、
Ｒ５は、前記親水性化合物基である、請求項１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３】
前記リポソームが蛍光性を有する、請求項１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項４】
前記蛍光性が、前記リポソームと適合性の蛍光色素によって付与される、請求項３に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項５】
前記蛍光色素が、
【化１】
2007091661.tif 000033
【化２】
2007091661.tif 000034
ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０およびフルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項６】
前記蛍光色素が、
【化３】
2007091661.tif 000035
である、請求項５に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項７】
前記蛍光色素が、リポソームに内包されている、請求項４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項８】
前記Ｒ１が、哺乳動物由来タンパク質基である、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項９】
前記Ｒ１が、ヒト由来タンパク質基である、請求項８に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１０】
前記Ｒ１が、ヒト由来血清タンパク質基である、請求項９に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１１】
前記Ｒ１が、血清アルブミン基である請求項８に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１２】
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基、ビススルホスクシンイミジルスベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基からなる群より選択される、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１３】
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基である、請求項１２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１４】
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１５】
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、請求項１４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１６】
前記Ｒ３が、Ｎ−アセチルラクトサミン基であり、該Ｎ−アセチルラクトサミン基が、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、請求項１４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１７】
前記Ｒ３が、α１−６マンノビオース基であり、該α１−６マンノビオース基が、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、請求項１４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１８】
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基から選択される、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１９】
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である、請求項１８に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２０】
前記Ｒ５が、トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基である、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２１】
前記トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基が、ヒドロキシアルキルがＣ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキルであり、アルキルアミノがＣ１〜Ｃ６アルキルアミノである、請求項２０に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２２】
前記トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基が、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基である、請求項２１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２３】
前記官能基ａが、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−基を有する、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２４】
前記Ｘが、ガングリオシドである、請求項２３に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２５】
前記官能基ｂが、アミノ基である、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２６】
前記Ｙが、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項２５に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２７】
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２８】
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で含む、請求項２７に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２９】
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基であり、かつ
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３０】
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３１】
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基であり、
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３２】
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含み、
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基であり、
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３３】
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含み、
前記Ｒ１が血清アルブミン基であり、
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基であり、前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基であり、かつ
前記Ｒ５が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン基である、請求項２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３４】
前記糖鎖修飾リポソームが、
【化４】
2007091661.tif 000036
によって標識されている、請求項３３に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３５】
前記リポソームにおいて、脂質に対するタンパク質の割合が、約０．１から約０．５である、請求項１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３６】
前記糖鎖修飾リポソームが、該リポソームの粒度分布の最大域において、約８０ｎｍ〜約１６５ｎｍの粒子径を有する、請求項１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３７】
前記糖鎖修飾リポソームが、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍの平均粒子径を有する、請求項１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３８】
請求項１に記載の糖鎖修飾リポソームを含む、イメージング剤。
【請求項３９】
請求項１に記載の糖鎖修飾リポソームと送達が所望される物質とを含む、該物質を所望の部位に送達するための組成物。
【請求項４０】
前記所望される物質が、診断薬または研究試薬である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記診断薬が、ＤＮＡプローブ診断薬、腫瘍診断薬、血液学的検査用試薬および微生物検査用試薬からなる群より選択される、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
分子イメージングまたはインビボイメージングにおいて使用するための、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
前記物質が該生物学的因子を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項１に記載の糖鎖修飾リポソームと医薬活性成分をさらに含む、薬学的組成物。
【請求項４５】
前記医薬活性成分が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓もしくは心臓における疾患を処置するための薬剤、または炎症もしくは腫瘍を処置するための薬剤である、請求項４４に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
所望の部位を標識するための組成物の製造のための、請求項１に記載の糖鎖修飾リポソームの使用。
【請求項４７】
前記所望の部位が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓、心臓、炎症部位および腫瘍部位からなる群より選択される、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
所望の部位を標識するための方法であって、
該被験体に、該所望の部位を標識するための組成物を投与する工程を包含し、該組成物は請求項１に記載の糖鎖修飾リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含み、該所望の部位が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓、心臓、炎症部位および腫瘍部位からなる群より選択される、方法。
【請求項４９】
糖鎖修飾リポソームを製造する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）脂質を、メタノール／クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；
（ｂ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程；
（ｃ）該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合して、蛍光標識されたリポソームを提供する工程；
（ｄ）該リポソームをトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンにより親水性化処理する工程；
（ｅ）該親水性化処理されたリポソームにリンカータンパク質を結合させて、リンカータンパク質結合リポソームを生成する工程；および
（ｆ）該リポソームに、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項５０】
前記（ｃ）工程の蛍光標識溶液が、
【化５】
2007091661.tif 000037
を含む、請求項４９に記載の糖鎖修飾リポソームを製造する方法。
【請求項５１】
前記（ｅ）工程のリンカータンパク質が、ヒト血清アルブミンである、請求項４９に記載の製造方法。
【請求項５２】
目的の送達部位に薬物を送達するための糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、該製造方法は、以下：
（ａ）種々の糖鎖密度を有する、該目的の送達部位への送達を達成する蛍光標識された糖鎖修飾リポソームを提供する工程であって、以下：
（ｉ）脂質を、メタノール／クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；
（ｉｉ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程；
（ｉｉｉ）該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合する工程を包含する、工程；
（ｂ）該糖鎖修飾リポソーム上の糖鎖密度について、該送達部位への最適な送達を達成する密度を決定する工程；および
（ｃ）該薬物を決定された最適な糖鎖修飾リポソームに組み込んで薬物含有リポソームを生成する工程
を包含する、製造方法。
【請求項５３】
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
Ａ）蛍光色素をリポソームに内包したか、または結合させたリポソームを形成させる工程；
Ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
Ｃ）該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程、および
Ｄ）該リポソームへ糖鎖を結合させる工程
を包含する、製造方法。
【請求項５４】
前記Ｄ）工程に引き続きフィルター濾過をする工程を包含する、請求項５３に記載の製造方法。
【請求項５５】
前記Ａ）工程が、以下：
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、前記蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程、
を包含する、請求項５３に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法。
【請求項５６】
前記（Ａ４）工程における前記蛍光色素溶液が、蛍光色素で標識された蛍光色素標識タンパク質を含む溶液であり、以下：
（１）蛍光標識が結合し得るタンパク質／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、室温〜約３７℃で撹拌する工程；および
（２）（１）工程の混合溶液を、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程、
を包含する工程により調製される、請求項５５に記載の製造方法。
【請求項５７】
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２）該（Ｂ１）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；
（Ｂ３）該（Ｂ２）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程；
を包含する、請求項５３に記載の製造方法。
【請求項５８】
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ、６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２’）該（Ｂ１’）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ、６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；
（Ｂ３’）該（Ｂ２’）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程；
を包含する、請求項５３に記載の製造方法。
【請求項５９】
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２）（Ｃ１）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３）（Ｃ２）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４）さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該シアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程
を包含する、請求項５３に記載の製造方法。
【請求項６０】
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２）（Ｃ１）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３）（Ｃ２）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４）さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程
を包含する、請求項５３に記載の製造方法。
【請求項６１】
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２’）（Ｃ１’）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３’）（Ｃ２’）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４’）さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程
を包含する、請求項５３に記載の製造方法。
【請求項６２】
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２’）（Ｃ１’）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３’）（Ｃ２’）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４’）さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程
を包含する、請求項５３に記載の製造方法。
【請求項６３】
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）前記糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程、
を包含する、請求項５３に記載の製造方法。
【請求項６４】
前記Ｄ）工程に引き続き前記糖鎖が結合したリポソームを親水性化する工程を包含する、請求項５３に記載の製造方法。
【請求項６５】
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、該製造方法が、
Ａ）蛍光色素をリポソームに内包させたリポソームを形成させる工程；
Ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
Ｃ）該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程；
Ｄ）該リポソームへ糖鎖を結合させる工程；
Ｅ）該糖鎖が結合したリポソームを親水性化する工程；ならびに
Ｆ）該親水性化したリポソームを含む溶液をフィルター濾過する工程
を包含する、製造方法。
【請求項６６】
前記Ａ）工程が、以下：
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、３７℃で撹拌し、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１）該蛍光色素を内包したか、または結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２）該（Ｂ１）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；および
（Ｂ３）該（Ｂ２）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵下で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２）（Ｃ１）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３）（Ｃ２）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；および
（Ｃ４）該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該シアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程を包含し、
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；および
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程を包含する、
請求項６５に記載の製造方法。
【請求項６７】
前記Ａ）工程が、以下：
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、３７℃で撹拌し、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１）該蛍光色素を内包したか、または結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２）該（Ｂ１）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；および
（Ｂ３）該（Ｂ２）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵下で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２）（Ｃ１）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３）（Ｃ２）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；および
（Ｃ４）さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程を包含し、
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；および
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程を包含する、
請求項６５に記載の製造方法。
【請求項６８】
前記Ａ）工程が、以下：
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、減圧乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、３７℃で撹拌し、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１’）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２’）該（Ｂ１’）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；
（Ｂ３’）該（Ｂ２’）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２’）（Ｃ１’）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３’）（Ｃ２’）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４’）さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程を包含し、
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；および
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程を包含する、
請求項６５に記載の製造方法。
【請求項６９】
前記Ａ）工程が、以下：
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、減圧乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、３７℃で撹拌し、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１’）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２’）該（Ｂ１’）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；
（Ｂ３’）該（Ｂ２’）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２’）（Ｃ１’）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３’）（Ｃ２’）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４’）さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程を包含し、
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；および
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程を包含する、
請求項６５に記載の製造方法。
【請求項７０】
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
Ａ）リポソームを形成させる工程；
Ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
Ｃ）該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程であって、該リンカータンパク質が蛍光色素により標識されている工程、および
Ｄ）該リポソームへ糖鎖を結合させる工程
を包含する、方法。
【請求項７１】
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で含まれる、請求項３８に記載のイメージング剤。
【請求項７２】
炎症部位または癌組織をイメージングするための、請求項７１に記載のイメージング剤。
【請求項７３】
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、請求項７２に記載のイメージング剤。
【請求項７４】
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で含まれる、請求項３９に記載の組成物。
【請求項７５】
前記物質を、炎症部位または癌組織に送達するための、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
分子イメージングまたはインビボイメージングにおいて使用するためのキャリアであって、該キャリアは、請求項１に記載の糖鎖修飾リポソームを含む、キャリア。
【請求項７８】
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で含まれ、前記キャリアは炎症部位または癌組織に標識物質を送達するための、請求項７７に記載のキャリア。
【請求項７９】
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、請求項７７に記載のキャリア。
【請求項８０】
前記標識物質が蛍光性である、請求項７９に記載のキャリア。
【請求項８１】
目的の部位を分子イメージングまたはインビボイメージングするためのシステムであって、該システムは：
Ａ）該目的の部位に特異的な糖鎖修飾リポソーム；
Ｂ）標識；および
Ｃ）該標識の有無を調べる手段；
を備え、ここで、
該標識が目的の部位に集積するのに十分な時間たった後、該生体における該標識の有無を調べ、該標識により該生体の機能または構造を画像化することを特徴とする、
システム。
【請求項８２】
前記標識が蛍光物質である、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８３】
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で含まれる、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８４】
炎症部位または癌組織をイメージングするための、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８５】
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、請求項８４に記載のシステム。
【請求項８６】
前記標識の有無を調べる手段が、走査型顕微鏡を含む、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８７】
前記標識の有無を調べる手段が、さらにスティック対物レンズを備える、請求項８６に記載のシステム。
【請求項８８】
前記標識の有無を調べる手段が、蛍光を検出する手段である、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８９】
請求項５３に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、以下：
ａ）リンカータンパク質が結合した蛍光を内包したリポソームを提供する工程；
ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
ｃ）３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）を該リポソームに結合させる工程；および
ｄ）該リポソームにおける該リンカータンパク質へ糖鎖を結合させて、該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程
を包含し、
該ｂ）〜ｃ）工程は任意の順で実施される、製造方法。
【請求項９０】
請求項５３に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、以下：
ａ）リンカータンパク質が結合した蛍光を内包したリポソームを提供する工程；
ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
ｃ）３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）を該リポソームに結合させる工程；および
ｄ）該リポソームにおける該リンカータンパク質へ糖鎖を結合させて、該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程
ｅ）該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを親水性化する工程；および
ｆ）該親水性化した該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液をフィルター濾過する工程
を包含し、
該ｂ）〜ｃ）工程は任意の順で実施される、製造方法。
【請求項９１】
前記ａ）工程の次に順に前記ｃ）工程および前記ｂ）工程を行い、
該ｃ）工程が、以下：
（ｃ１）３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）を含む粉体Ａに、炭酸緩衝液を含む溶液Ａを添加して溶解し、混合溶液を調製する工程；および
（ｃ２）リポソームを含む溶液に、該混合溶液を添加し、室温で、１６〜２０時間攪拌し、分画分子量３０，０００で限外濾過し、脱塩して、３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）の結合した蛍光内包型リポソームを含む溶液を調製する工程を包含し、
該ｂ）工程が、以下：
（ｂ１）該蛍光内包型リポソームを含む溶液を濃縮し、濃縮された該蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該溶液Ａを添加する工程；および
（ｂ２）該溶液Ａが添加された該蛍光内包型リポソームを含む混合溶液を、分画分子量３００，０００で遠心分離にかけて限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた混合溶液に該溶液Ａを添加して、親水性化された該蛍光内包型リポソームを調製する工程を包含し、
前記ｄ）工程が、以下：
（ｄ１）所望の糖鎖を精製水に完全に溶解し、１〜１０ｍＭ濃度の糖鎖溶液を調製する工程；
（ｄ２）必要に応じて、該糖鎖水溶液に、炭酸水素アンモニウム（ｐＨ  ７〜１４）を約０．２〜１．０ｇ／ｍＬ濃度で添加し、２０〜４０℃で３〜７日間攪拌させて、２〜８℃下で２０〜６０分間インキュベートし、濾過フィルターで濾過して、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（ｄ３）該親水性化された蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、混合した後、室温下で２〜６時間反応させて反応溶液工程；および
（ｄ４）該（ｄ３）工程によって得られた該反応溶液に、トリス緩衝液を含む溶液Ｂを添加し、室温下で２〜６時間攪拌し、さらに、冷蔵下で１６〜４８時間攪拌し、分画分子量３０，０００で限外濾過し、脱塩させて、前記蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程を包含し、
前記ｅ）工程が、
（ｅ１）該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液を濃縮し、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液を含む溶液Ｃを添加し、分画分子量３０，０００で限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液に該Ｃ溶液を添加して、該糖鎖が結合した蛍光内包型リポソームを親水性化する工程を包含する、
請求項９０に記載の製造方法。
【請求項９２】
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットであって、
i）蛍光色素をリポソームに内包させるか、または結合させる手段；
ii）該リポソームの親水性化剤；
iii）該リポソームのリンカータンパク質、および
iv）糖鎖；
v）該糖鎖を該リポソームに結合させる手段
を備える、キット。
【請求項９３】
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットであって、以下：
Ａ）リンカータンパク質を結合した蛍光を内包したリポソームを含む溶液；
Ｂ）３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）を含む粉体Ａと
Ｃ）炭酸緩衝液を含む溶液Ａと
Ｄ）トリス緩衝液を含む溶液Ｂと
Ｅ）２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液を含む溶液Ｃとを備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームに関する。詳細には、本発明のリポソームは、バイオテクノロジー、特に分子イメージングにおいて応用し得る、癌などの標的細胞・組織を認識し局所的に薬剤や遺伝子を患部に送り込むためのドラッグデリバリーシステムや診断用の細胞・組織センシングプローブとして利用できる。
【背景技術】
【０００２】
米国の国家ナノテク戦略（ＮＮＩ）によって実現を目指す具体的目標の一例として、「癌細胞や標的組織を狙い撃ちする薬物や遺伝子送達システム（ＤＤＳ：ドラッグデリバリーシステム）」を掲げた。日本の総合科学技術会議のナノテクノロジー・材料分野推進戦略でも、重点領域として「医療用極小システム・材料、生物のメカニズムを活用し制御するナノバイオロジー」があり、その５年間の研究開発目標の１つとして「健康寿命延伸のための生体機能材料・ピンポイント治療等技術の基本シーズ確立」が掲げられている。一方、高齢化社会となるに伴い癌の発症率・死亡率は年々増えており、新規な治療材料である標的指向ＤＤＳの開発が待望されている。その他の病気においても副作用のない標的指向ＤＤＳナノ材料の重要性が注目されており、その市場規模は近い将来に１０兆円を超えると予測されている。また、これらの材料は治療とともに診断への利用においても期待されている。【０００３】
医薬品の治療効果は、薬物が特定の標的部位に到達し、そこで作用することにより発現される。その一方で、医薬品による副作用とは、薬物が不必要な部位に作用してしまうことである。従って、薬物を有効かつ安全に使用するためにもドラッグデリバリーシステムの開発が求められている。その中でも特に標的指向（ターゲティング）ＤＤＳとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。そのための代表的な材料としての微粒子性キャリアであるリポソームが注目されている。この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法が試みられているが、いまだ本法は不十分であり更なる改良が求められている。【０００４】
一方、高機能のターゲティングを可能にするために、能動的ターゲティング法も試みられている。これは「ミサイルドラッグ」ともよばれ理想的なターゲティング法であるが、国内外においていまだ完成されたものはなく今後の発展が大いに期待されているものである。本法は、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法である。この能動的ターゲティング法での標的となる細胞膜面上に存在するレセプターのリガンドとしては、抗原、抗体、ペプチド、糖脂質や糖タンパク質などが考えられる。これらのうち、糖脂質や糖タンパク質の糖鎖は、生体組織の発生や形態形成、細胞の増殖や分化、生体防御や受精機構、癌化とその転移機構などの様々な細胞間コミュニケーションにおいて情報分子としての重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。【０００５】
また、その標的となる各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、シグレック、ガレクチンなどの各種のレクチン（糖鎖認識タンパク質）についての研究も進んできたことから、各種の分子構造を有する糖鎖は新しいＤＤＳリガンドとして注目されてきている（非特許文献１および非特許文献２を参照のこと）。【０００６】
外膜表面にリガンドを結合したリポソームについては、癌などの標的部位に選択的に薬物や遺伝子などを送達するためのＤＤＳ材料として多くの研究がなされてきた。しかしながら、それらは、生体外では標的細胞に結合するが、生体内では期待される標的細胞や組織にターゲティングされないものがほとんどである（非特許文献３を参照のこと）。糖鎖の分子認識機能を利用したＤＤＳ材料の研究開発においても、糖鎖を有する糖脂質を導入したリポソームについて若干の研究が知られているが、それらの機能評価は生体外（インビトロ）によるもののみであり、糖鎖を有する糖タンパク質を導入したリポソームの研究はほとんど進んでいない（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６および非特許文献７）を参照のこと）。したがって、糖脂質や糖タンパク質の多種多様な糖鎖を結合したリポソームについての調製法と生体内動態（ｉｎ  ｖｉｖｏ）解析を含めた体系的な研究は、これまで未開発で今後の進展が期待される重要課題である。さらに新しいタイプのＤＤＳ材料研究として、投与が最も簡便・安価に行える経口投与で使用可能なＤＤＳ材料開発も重要課題である。例えば、ペプチド性医薬品などは一般的に水溶性で高分子量であり消化管の小腸粘膜透過性が低いため酵素分解を受けるなどにより経口投与してもほとんど腸管吸収されない。そこでこれらの高分子量の医薬品や遺伝子などを腸管から血液中へ送達するためのＤＤＳ材料としてリガンド結合リポソームの研究が注目されつつある（非特許文献８を参照のこと）。【０００７】
特許文献１は、医薬として許容される担体と、セレクチンレセプターに選択的に結合する成分を含む化合物とを有する医薬組成物を開示している。しかし、この医薬組成物は、炎症性疾患および細胞の付着により媒介される他の病気を阻害するための医薬自体として、経口投与を目的とした糖鎖が用いられており、糖鎖修飾リポソームとは異なる。【０００８】
本発明者らは、糖鎖をリンカータンパク質を介してリポソームに結合させた糖鎖修飾リポソームを開発した（特許文献２）。さらに、糖鎖の種類および糖鎖結合量が各標的細胞または標的組織への指向性に関連するようであることを見出した（特許文献３〜４ならびに非特許文献９および１０）。しかし、現在までに、分子イメージングに最適な糖鎖修飾リポソームは開発されていない。また、分子イメージングにおいて有用な糖鎖について体系的な研究はなされておらず、具体的にどのような糖鎖を用いればよいかは不明のままであった。【０００９】
従って、分子イメージングに最適な糖鎖修飾リポソームを効率よく設計し、提供することに対して需要がある。
【特許文献１】特表平５−５０７５１９公報
【特許文献２】特開２００３−２２６６３８公報
【特許文献３】特開２００３−２２６６４７公報
【特許文献４】国際公開第２００５／０１１６３２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０１１６３３号パンフレット
【非特許文献１】Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．，Ｂｏｖｉｎ，Ｎ．Ｖ．，Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｓ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（２０００）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４３，２２５−２４４．
【非特許文献２】Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｊｉｇａｍｉ，Ｙ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，３１９−３２９．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｋ．ｃｏ．ｊｐ／ＴＩＧＧ／７１ＰＤＦ／ｙａｍａｚａｋｉ．ｐｄｆ
【非特許文献３】Ｆｏｒｓｓｅｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉｓ，Ｍ．（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２９，２４９−２７１．
【非特許文献４】ＤｅＦｒｅｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｌ．，Ｇｕｏ，Ｌ．ａｎｄ  Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，６１０１−６１０４．
【非特許文献５】Ｓｐｅｖａｋ，Ｗ．，Ｆｏｘａｌｌ，Ｃ．，Ｃｈａｒｙｃｈ，Ｄ．Ｈ．，Ｄａｓｑｕｐｔａ，Ｆ．ａｎｄ  Ｎａｇｙ，Ｊ．Ｏ．（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，１０１８−１０２０．
【非特許文献６】Ｓｔａｈｎ，Ｒ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｈ．，Ｋｅｒｎｃｈｅｎ，Ｆ．ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｊ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，３１１−３１９．
【非特許文献７】Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｊｉｇａｍｉ，Ｙ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，３１９−３２９．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｋ．ｃｏ．ｊｐ／ＴＩＧＧ／７１ＰＤＦ／ｙａｍａｚａｋｉ．ｐｄｆ
【非特許文献８】Ｌｅｈｒ，Ｃ．−Ｍ．（２０００）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６５，１９−２９
【非特許文献９】山嵜登（２００５）、アクティブ・ターゲティングＤＤＳナノ粒子の開発、ナノ学会会報、３，９７−１０２
【非特許文献１０】山嵜登（２００６）、ファルマシア、第４２巻、２号、２−６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明の課題は、分子イメージングに有用な糖鎖修飾リポソーム、および糖鎖修飾リポソームに薬剤や遺伝子を封入した薬物送達媒体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究の結果、リポソーム表面が特定の糖鎖で修飾されたリポソームが、分子イメージングにおいて有用な製剤となることを見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。【００１２】
本発明はまた、分子イメージングに有用な糖鎖修飾リポソームの製造法およびその利用法を提供する。【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。【００１４】
（項目１）
糖鎖修飾リポソームであって、該糖鎖修飾リポソームは、
リポソームと
糖鎖基と
リンカータンパク質基と
親水性化合物基とを含み、
該リンカータンパク質基は該リポソームの外表面に結合し、該リンカータンパク質基の少なくとも一部に該糖鎖基が結合し、該リポソームの外表面または該リンカータンパク質基の一部に該親水性化合物基が結合している、糖鎖修飾リポソーム。
（項目２）
前記糖鎖修飾リポソームは、構造Ｉと構造ＩＩとを含み、
該構造Ｉは、
Ｘ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ３で表され、
Ｘは、前記リポソームに含まれる前記リンカータンパク質とＣＨ２−ＮＨ結合可能な官能基ａを含む構成単位から、該官能基ａがとれた基であり、
Ｒ１は、前記リンカータンパク質基であり、
Ｒ２は、リンカータンパク質架橋基であり、
Ｒ３は、前記糖鎖基であり；および
該構造ＩＩは、
Ｙ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ４−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ５で表され、
Ｙは、前記リポソームに含まれる親水性化合物架橋基とペプチド結合可能な官能基ｂを含む構成単位から該官能基ｂがとれた基であり、
Ｒ４は、該親水性化合物架橋基であり、
Ｒ５は、前記親水性化合物基である、項目１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３）
前記リポソームが蛍光性を有する、項目１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目４）
前記蛍光性が、前記リポソームと適合性の蛍光色素によって付与される、項目３に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目５）
前記蛍光色素が、【００１５】
【化１０−１】
2007091661.tif 000002
【００１６】
【化１０−２】
2007091661.tif 000003
ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０およびフルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目６）
前記蛍光色素が、【００１７】
【化１０−３】
2007091661.tif 000004
である、項目５に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目７）
前記蛍光色素が、リポソームに内包されている、項目４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目８）
前記Ｒ１が、哺乳動物由来タンパク質基である、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目９）
前記Ｒ１が、ヒト由来タンパク質基である、項目８に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１０）
前記Ｒ１が、ヒト由来血清タンパク質基である、項目９に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１１）
前記Ｒ１が、血清アルブミン基である項目８に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１２）
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基、ビススルホスクシンイミジルスベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基からなる群より選択される、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１３）
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基である、項目１２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１４）
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１５）
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、項目１４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１６）
前記Ｒ３が、Ｎ−アセチルラクトサミン基であり、該Ｎ−アセチルラクトサミン基が、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、項目１４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１７）
前記Ｒ３が、α１−６マンノビオース基であり、該α１−６マンノビオース基が、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、項目１４に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１８）
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基から選択される、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目１９）
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である、項目１８に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２０）
前記Ｒ５が、トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基である、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２１）
前記トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基が、ヒドロキシアルキルがＣ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキルであり、アルキルアミノがＣ１〜Ｃ６アルキルアミノである、項目２０に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２２）
前記トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基が、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基である、項目２１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２３）
前記官能基ａが、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−基を有する、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２４）
前記Ｘが、ガングリオシドである、項目２３に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２５）
前記官能基ｂが、アミノ基である、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２６）
前記Ｙが、ホスファチジルエタノールアミンである、項目２５に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２７）
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含む、項目１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２８）
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で含む、項目２７に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目２９）
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基であり、かつ
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３０）
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３１）
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基であり、
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３２）
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含み、
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基であり、
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３３）
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含み、
前記Ｒ１が血清アルブミン基であり、
前記Ｒ２が、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基であり、
前記Ｒ３が、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、
前記Ｒ４が、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基であり、かつ
前記Ｒ５が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン基である、項目２に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３４）
前記糖鎖修飾リポソームが、【００１８】
【化１０−４】
2007091661.tif 000005
によって標識されている、項目３３に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３５）
前記リポソームにおいて、脂質に対するタンパク質の割合が、約０．１から約０．５である、項目１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３６）
前記糖鎖修飾リポソームが、該リポソームの粒度分布の最大域において、約８０ｎｍ〜約１６５ｎｍの粒子径を有する、項目１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３７）
前記糖鎖修飾リポソームが、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍの平均粒子径を有する、項目１に記載の糖鎖修飾リポソーム。
（項目３８）
項目１〜３７のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソームを含む、イメージング剤。
（項目３９）
項目１〜３７のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソームと送達が所望される物質とを含む、該物質を所望の部位に送達するための組成物。
（項目４０）
前記所望される物質が、診断薬または研究試薬である、項目３９に記載の組成物。
（項目４１）
前記診断薬が、ＤＮＡプローブ診断薬、腫瘍診断薬、血液学的検査用試薬および微生物検査用試薬からなる群より選択される、項目４０に記載の組成物。
（項目４２）
分子イメージングまたはインビボイメージングにおいて使用するための、項目３９に記載の組成物。
（項目４３）
前記物質が該生物学的因子を含む、項目３９に記載の組成物。
（項目４４）
項目１〜３７のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソームと医薬活性成分をさらに含む、薬学的組成物。
（項目４５）
前記医薬活性成分が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓もしくは心臓における疾患を処置するための薬剤、または炎症もしくは腫瘍を処置するための薬剤である、項目４４に記載の薬学的組成物。
（項目４６）
所望の部位を標識するための組成物の製造のための、項目１〜３７のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソームの使用。
（項目４７）
前記所望の部位が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓、心臓、炎症部位および腫瘍部位からなる群より選択される、項目４６に記載の使用。
（項目４８）
所望の部位を標識するための方法であって、
該被験体に、該所望の部位を標識するための組成物を投与する工程を包含し、該組成物は項目１〜３７のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含み、該所望の部位が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓、心臓、炎症部位および腫瘍部位からなる群より選択される、方法。
（項目４９）
糖鎖修飾リポソームを製造する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）脂質を、メタノール／クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；
（ｂ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程；
（ｃ）該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合して、蛍光標識されたリポソームを提供する工程；
（ｄ）該リポソームをトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンにより親水性化処理する工程；
（ｅ）該親水性化処理されたリポソームにリンカータンパク質を結合させて、リンカータンパク質結合リポソームを生成する工程；および
（ｆ）該リポソームに、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程
を包含する、方法。
（項目５０）
前記（ｃ）工程の蛍光標識溶液が、【００１９】
【化１０−５】
2007091661.tif 000006
を含む、項目４９に記載の糖鎖修飾リポソームを製造する方法。
（項目５１）
前記（ｅ）工程のリンカータンパク質が、ヒト血清アルブミンである、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
目的の送達部位に薬物を送達するための糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、該方法は、以下：
（ａ）種々の糖鎖密度を有する、該目的の送達部位への送達を達成する蛍光標識された糖鎖修飾リポソームを提供する工程であって、以下：
（ｉ）脂質を、メタノール／クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；
（ｉｉ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程；
（ｉｉｉ）該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合する工程を包含する、工程；
（ｂ）該糖鎖修飾リポソーム上の糖鎖密度について、該送達部位への最適な送達を達成する密度を決定する工程；および
（ｃ）該薬物を決定された最適な糖鎖修飾リポソームに組み込んで薬物含有リポソームを生成する工程
を包含する、方法。
（項目５３）
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
Ａ）蛍光色素をリポソームに内包したか、または結合させたリポソームを形成させる工程；
Ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
Ｃ）該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程、および
Ｄ）該リポソームへ糖鎖を結合させる工程
を包含する、方法。
（項目５４）
前記Ｄ）工程に引き続きフィルター濾過をする工程を包含する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記Ａ）工程が、
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、前記蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程、
を包含する、項目５３または５４に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法。
（項目５６）
前記（Ａ４）工程における前記蛍光色素溶液が、蛍光色素で標識された蛍光色素標識タンパク質を含む溶液であり、以下：
（１）蛍光標識が結合し得るタンパク質／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、室温〜約３７℃で撹拌する工程；および
（２）（１）工程の混合溶液を、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程、
を包含する工程により調製される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２）該（Ｂ１）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；
（Ｂ３）該（Ｂ２）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程；
を包含する、項目５３〜５６のいずれか１項に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法。
（項目５８）
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ、６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２’）該（Ｂ１’）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ、６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；
（Ｂ３’）該（Ｂ２’）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程；
を包含する、項目５３〜５７に記載の製造方法。
（項目５９）
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２）（Ｃ１）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３）（Ｃ２）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４）さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該シアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程
を包含する、項目５３〜５８に記載の製造方法。
（項目６０）
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２）（Ｃ１）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３）（Ｃ２）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４）さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程
を包含する、項目５３〜５９に記載の製造方法。
（項目６１）
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２’）（Ｃ１’）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３’）（Ｃ２’）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４’）さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程
を包含する、項目５３〜５９に記載の製造方法。
（項目６２）
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２’）（Ｃ１’）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３’）（Ｃ２’）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４’）さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程
を包含する、項目５３〜５９に記載の製造方法。
（項目６３）
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）前記糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程、
を包含する、項目５３〜６２に記載の製造方法。
（項目６４）
前記Ｄ）工程に引き続き前記糖鎖が結合したリポソームを親水性化する工程を包含する、項目５３〜６３に記載の製造方法。
（項目６５）
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、該製造方法が、
Ａ）蛍光色素をリポソームに内包させたリポソームを形成させる工程；
Ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
Ｃ）該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程；
Ｄ）該リポソームへ糖鎖を結合させる工程；
Ｅ）該糖鎖が結合したリポソームを親水性化する工程；ならびに
Ｆ）該親水性化したリポソームを含む溶液をフィルター濾過する工程
を包含する、製造方法。
（項目６６）
前記Ａ）工程が、以下：
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、３７℃で撹拌し、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１）該蛍光色素を内包したか、または結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２）該（Ｂ１）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；および
（Ｂ３）該（Ｂ２）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵下で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２）（Ｃ１）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３）（Ｃ２）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；および
（Ｃ４）該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該シアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程を包含し、
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；および
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程を包含する、
項目６５に記載の製造方法。
（項目６７）
前記Ａ）工程が、以下：
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、３７℃で撹拌し、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１）該蛍光色素を内包したか、または結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２）該（Ｂ１）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；および
（Ｂ３）該（Ｂ２）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵下で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２）（Ｃ１）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３）（Ｃ２）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；および
（Ｃ４）さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程を包含し、
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；および
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程を包含する、
項目６５に記載の製造方法。
（項目６８）
前記Ａ）工程が、以下：
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、減圧乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、３７℃で撹拌し、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１’）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２’）該（Ｂ１’）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；
（Ｂ３’）該（Ｂ２’）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２’）（Ｃ１’）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３’）（Ｃ２’）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４’）さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程を包含し、
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；および
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程を包含する、
項目６５に記載の製造方法。
（項目６９）
前記Ａ）工程が、以下：
（Ａ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁させる工程；
（Ａ２）該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、減圧乾燥させ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程；
（Ａ３）該再懸濁液を３０〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
（Ａ４）（Ａ３）工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に蛍光色素／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、３７℃で撹拌し、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記Ｂ）工程が、以下：
（Ｂ１’）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程；
（Ｂ２’）該（Ｂ１’）工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去する工程；
（Ｂ３’）該（Ｂ２’）工程において、該遊離の該ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを除去した溶液に、３３０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記Ｃ）工程が、以下：
（Ｃ１’）前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程；
（Ｃ２’）（Ｃ１’）工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換する工程；
（Ｃ３’）（Ｃ２’）工程において、該緩衝液が該ＰＢＳ緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程；
（Ｃ４’）さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量１００，０００、２０００×ｇ  ６０分間の条件で２回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換する工程を包含し、
前記Ｄ）工程が、以下：
（Ｄ１）該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約３７℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（Ｄ２）該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を添加して、冷蔵〜約３７℃で攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去する工程；および
（Ｄ３）（Ｄ２）工程において、該遊離の該３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約３７℃で反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵〜３７℃で一晩撹拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する工程；および
（Ｄ４）（Ｄ３）工程において、遊離の該糖鎖と該トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に交換する工程を包含する、
項目６５に記載の製造方法。
（項目７０）
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
Ａ）リポソームを形成させる工程；
Ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
Ｃ）該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程であって、該リンカータンパク質が蛍光色素により標識されている工程、および
Ｄ）該リポソームへ糖鎖を結合させる工程
を包含する、方法。
（項目７１）
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で含まれる、項目３８に記載のイメージング剤。
（項目７２）
炎症部位または癌組織をイメージングするための、項目７１に記載のイメージング剤。
（項目７３）
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、項目７２に記載のイメージング剤。
（項目７４）
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で含まれる、項目３９に記載の組成物。
（項目７５）
前記物質を、炎症部位または癌組織に送達するための、項目７４に記載の組成物。
（項目７６）
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、項目７５に記載の組成物。
（項目７７）
分子イメージングまたはインビボイメージングにおいて使用するためのキャリアであって、該キャリアは、項目１〜３７に記載の糖鎖修飾リポソームを含む、キャリア。
（項目７８）
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で含まれ、前記キャリアは炎症部位または癌組織に標識物質を送達するための、項目７７に記載のキャリア。
（項目７９）
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、項目７７に記載のキャリア。
（項目８０）
前記標識物質が蛍光性である、項目７９に記載のキャリア。
（項目８１）
目的の部位を分子イメージングまたはインビボイメージングするためのシステムであって、該システムは：
Ａ）該目的の部位に特異的な糖鎖修飾リポソーム；
Ｂ）標識；および
Ｃ）該標識の有無を調べる手段；
を備え、ここで、
該標識が目的の部位に集積するのに十分な時間たった後、該生体における該標識の有無を調べ、該標識により該生体の機能または構造を画像化することを特徴とする、
システム。
（項目８２）
前記標識が蛍光物質である、項目８１に記載のシステム。
（項目８３）
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスＸ基であり、該シアリルルイスＸ基が、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で含まれる、項目８２に記載のシステム。
（項目８４）
炎症部位または癌組織をイメージングするための、項目８１に記載のシステム。
（項目８５）
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、項目８４に記載のシステム。
（項目８６）
前記標識の有無を調べる手段が、走査型顕微鏡を含む、項目８１に記載のシステム。
（項目８７）
前記標識の有無を調べる手段が、さらにスティック対物レンズを備える、項目８６に記載のシステム。
（項目８８）
前記標識の有無を調べる手段が、蛍光を検出する手段である、項目８１に記載のシステム。
（項目８９）
項目５３に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、以下：
ａ）リンカータンパク質が結合した蛍光を内包したリポソームを提供する工程；
ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
ｃ）３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）を該リポソームに結合させる工程；および
ｄ）該リポソームにおける該リンカータンパク質へ糖鎖を結合させて、該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程
を包含し、
該ｂ）〜ｃ）工程は任意の順で実施される、製造方法。
（項目９０）
項目５３に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、以下：
ａ）リンカータンパク質が結合した蛍光を内包したリポソームを提供する工程；
ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；
ｃ）３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）を該リポソームに結合させる工程；および
ｄ）該リポソームにおける該リンカータンパク質へ糖鎖を結合させて、該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程
ｅ）該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを親水性化する工程；および
ｆ）該親水性化した該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液をフィルター濾過する工程
を包含し、
該ｂ）〜ｃ）工程は任意の順で実施される、製造方法。
（項目９１）
前記ａ）工程の次に順に前記ｃ）工程および前記ｂ）工程を行い、
該ｃ）工程が、以下：
（ｃ１）３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）を含む粉体Ａに、炭酸緩衝液を含む溶液Ａを添加して溶解し、混合溶液を調製する工程；および
（ｃ２）リポソームを含む溶液に、該混合溶液を添加し、室温で、１６〜２０時間攪拌し、分画分子量３０，０００で限外濾過し、脱塩して、３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）の結合した蛍光内包型リポソームを含む溶液を調製する工程を包含し、
該ｂ）工程が、以下：
（ｂ１）該蛍光内包型リポソームを含む溶液を濃縮し、濃縮された該蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該溶液Ａを添加する工程；および
（ｂ２）該溶液Ａが添加された該蛍光内包型リポソームを含む混合溶液を、分画分子量３００，０００で遠心分離にかけて限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた混合溶液に該溶液Ａを添加して、親水性化された該蛍光内包型リポソームを調製する工程を包含し、
前記ｄ）工程が、以下：
（ｄ１）所望の糖鎖を精製水に完全に溶解し、１〜１０ｍＭ濃度の糖鎖溶液を調製する工程；
（ｄ２）必要に応じて、該糖鎖水溶液に、炭酸水素アンモニウム（ｐＨ  ７〜１４）を約０．２〜１．０ｇ／ｍＬ濃度で添加し、２０〜４０℃で３〜７日間攪拌させて、２〜８℃下で２０〜６０分間インキュベートし、濾過フィルターで濾過して、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；
（ｄ３）該親水性化された蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、混合した後、室温下で２〜６時間反応させて反応溶液工程；および
（ｄ４）該（ｄ３）工程によって得られた該反応溶液に、トリス緩衝液を含む溶液Ｂを添加し、室温下で２〜６時間攪拌し、さらに、冷蔵下で１６〜４８時間攪拌し、分画分子量３０，０００で限外濾過し、脱塩させて、前記蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程を包含し、
前記ｅ）工程が、
（ｅ１）該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液を濃縮し、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液を含む溶液Ｃを添加し、分画分子量３０，０００で限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液に該Ｃ溶液を添加して、該糖鎖が結合した蛍光内包型リポソームを親水性化する工程を包含する、
項目９０に記載の製造方法。
（項目９２）
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットであって、
i）蛍光色素をリポソームに内包させるか、または結合させる手段；
ii）該リポソームの親水性化剤；
iii）該リポソームのリンカータンパク質、および
iv）糖鎖；
v）該糖鎖を該リポソームに結合させる手段
を備える、キット。
（項目９３）
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットであって、以下：
Ａ）リンカータンパク質を結合したリポソームを含む溶液；
Ｂ）３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）を含む粉体Ａと
Ｃ）炭酸緩衝液を含む溶液Ａと
Ｄ）トリス緩衝液を含む溶液Ｂと
Ｅ）２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液を含む溶液Ｃとを備える、キット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によって、分子イメージングに有用な糖鎖修飾リポソームならびにその製造法およびその利用法が提供される。本発明の糖鎖修飾リポソームは、目的送達部位に所望の薬物を提供することが可能なＤＤＳ製剤開発の幅を大いに広げるものである。本発明により、癌治療、遺伝子治療、再生医療などの各分野での新しい治療を実現させるために必要なデリバリーシステムの開発・実用化が可能となる。このような分子イメージングに有用な種々の糖鎖修飾リポソームは、本発明によって初めて提供されるものである。本発明により、標識された糖鎖を含むリポソームを生産する方法が提供される。この方法により、所望の糖鎖を標識し、糖鎖分子の体内分布および局在性を調べることが可能となる。さらに、疾患モデル用いて、病態組織に特異的に発現するレクチンに対する糖鎖のスクリーニングをすることも可能となる。
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた担癌マウスでの画像データを示す。最上段：リポソーム投与前、左および中央２段目：Ｋ１−３リポソーム投与直後、左および中央３段目：Ｋ１−３リポソーム投与１日後、左および中央４段目：Ｋ１−３リポソーム投与２日後、右２段目：糖鎖なしリポソーム投与直後、右３段目：糖鎖なしリポソーム投与１日後、右４段目：糖鎖なしリポソーム投与２日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図２】図２は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた担癌マウスでの画像データを示す。最上段：リポソーム投与前、左２段目：Ｋ１−３リポソーム投与直後、左３段目：Ｋ１−３リポソーム投与８時間後、左４段目：Ｋ１−３リポソーム投与１日後、右２段目：糖鎖なしリポソーム投与直後、右３段目：糖鎖なしリポソーム投与８時間後、右４段目：糖鎖なしリポソーム投与１日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図３】図３は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた担癌マウスでの画像データを示す。最上段：リポソーム投与前、左２段目：Ｋ１−３リポソーム投与直後、左３段目：Ｋ１−３リポソーム投与１日後、左４段目：Ｋ１−３リポソーム投与２日後、左５段目：Ｋ１−３リポソーム投与３日後、左６段目：Ｋ１−３リポソーム投与４日後、右２段目：糖鎖なしリポソーム投与直後、右３段目：糖鎖なしリポソーム投与１日後、右４段目糖鎖なしリポソーム投与２日後、右５段目：糖鎖なしリポソーム投与３日後、右６段目：糖鎖なしリポソーム投与４日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図４】図４は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた担癌マウスでの画像データを示す。最上段：リポソーム投与前、左２段目：Ｋ３−３リポソーム投与直後、左３段目：Ｋ３−３リポソーム投与１日後、左４段目：Ｋ３−３リポソーム投与２日後、左５段目：Ｋ３−３リポソーム投与３日後、右２段目：糖鎖なしリポソーム投与直後、右３段目：糖鎖なしリポソーム投与１日後、右４段目糖鎖なしリポソーム投与２日後、右５段目：糖鎖なしリポソーム投与３日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図５】図５は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた関節炎マウスでの画像データを示す。最上段：リポソーム投与前、左２段目：Ｋ１−３リポソーム投与直後、左３段目：Ｋ１−３リポソーム投与１日後、左４段目：Ｋ１−３リポソーム投与２日後、左５段目：Ｋ１−３リポソーム投与３日後、右２段目：糖鎖なしリポソーム投与直後、右３段目：糖鎖なしリポソーム投与１日後、右４段目糖鎖なしリポソーム投与２日後、右５段目：糖鎖なしリポソーム投与３日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図６】図６は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた関節炎マウスでの画像データを示す。最上段：リポソーム投与前、左２段目：Ｋ１−３リポソーム投与直後、左３段目：Ｋ１−３リポソーム投与１日後、左４段目：Ｋ１−３リポソーム投与２日後、右２段目：糖鎖なしリポソーム投与直後、右３段目：糖鎖なしリポソーム投与１日後、右４段目糖鎖なしリポソーム投与２日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図７】図７は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた関節炎マウスでの画像データを示す。左から、糖鎖なしリポソーム群、Ｋ１−３リポソーム投与群、Ｋ１−４リポソーム投与群、Ｋ１−５リポソーム投与群、Ｋ１−６リポソーム投与群を示す。各々の群は、上段はリポソーム投与前、中段はリポソーム投与直後、下段はリポソーム投与１日後を示す。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図８】図８は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた関節炎マウスでの画像データを示す。左から、糖鎖なしリポソーム群、Ｋ３−３リポソーム投与群、Ｋ３−４リポソーム投与群、Ｋ３−５リポソーム投与群、Ｋ３−６リポソーム投与群を示す。各々の群は、上段はリポソーム投与前、中段はリポソーム投与直後、下段はリポソーム投与１日後を示す。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図９】図９は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた関節炎マウスでの画像データを示す。左から、糖鎖なしリポソーム群、Ｋ２−３リポソーム投与群、Ｋ２−４リポソーム投与群、Ｋ２−５リポソーム投与群、Ｋ２−６リポソーム投与群を示す。各々の群は、上段はリポソーム投与前、中段はリポソーム投与直後、下段はリポソーム投与１日後を示す。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１０】図１０は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた関節炎マウスでの画像データを示す。左から、関節炎マウス／糖鎖なしリポソーム群、関節炎マウス／Ｋ１−３リポソーム投与群、関節炎マウス／Ｋ１−４リポソーム投与群、正常マウス／糖鎖なしリポソーム投与群、正常マウス／Ｋ１−４リポソーム投与群を示す。各々の群は、上段はリポソーム投与前、２段目はリポソーム投与直後、３段目はリポソーム投与１日後、４段目はリポソーム投与２日後を示す。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１１】図１１は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた関節炎マウスでの画像データを示す。最上段：リポソーム投与前、左２段目：Ｋ１−３リポソーム投与直後、左３段目：Ｋ１−３リポソーム投与１日後、右２段目：糖鎖なしリポソーム投与直後、右３段目：糖鎖なしリポソーム投与１日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１２】図１２は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた関節炎マウスでの画像データを示す。最上段：リポソーム投与前、左２段目：Ｋ１−２リポソーム投与直後、左３段目：Ｋ１−２リポソーム投与１日後、右２段目：糖鎖なしリポソーム投与直後、右３段目：糖鎖なしリポソーム投与１日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１３】図１３は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた関節炎マウスでの画像データを示す。最上段：リポソーム投与前、左２段目：Ｋ３−２リポソーム投与直後、左３段目：Ｋ３−２リポソーム投与１日後、中央２段目：Ｋ３−４リポソーム投与直後、中央３段目：Ｋ３−４リポソーム投与１日後、右２段目：糖鎖なしリポソーム投与直後、右３段目：糖鎖なしリポソーム投与１日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１４】図１４は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの脳の画像データを示す。左上段：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、未投与、中央上段：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、未投与、右上段：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、未投与、左下段：Ｋ１リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、未投与、中央下段：Ｋ２リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、未投与、右下段：Ｋ３リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、未投与。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１５】図１５は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの肝臓の画像データを示す。左最上段：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、未投与、中央最上段：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、未投与、右最上段：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、未投与、左２段目：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央２段目：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右２段目：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、左３段目：Ｋ１リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、未投与、中央３段目：Ｋ２リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、未投与、右３段目：Ｋ３リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、未投与、左４段目：Ｋ１リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央４段目：Ｋ２リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右４段目：Ｋ３リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１６】図１６は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの腎臓の画像データを示す。左最上段：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、未投与、中央最上段：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、未投与、右最上段：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、未投与、左２段目：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央２段目：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右２段目：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、左３段目：Ｋ１リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、未投与、中央３段目：Ｋ２リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、未投与、右３段目：Ｋ３リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、未投与、左４段目：Ｋ１リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央４段目：Ｋ２リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右４段目：Ｋ３リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１７】図１７は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの脾臓の画像データを示す。左最上段：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、未投与、中央最上段：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、未投与、右最上段：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、未投与、左２段目：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央２段目：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右２段目：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、左３段目：Ｋ１リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、未投与、中央３段目：Ｋ２リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、未投与、右３段目：Ｋ３リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、未投与、左４段目：Ｋ１リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央４段目：Ｋ２リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右４段目：Ｋ３リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１８】図１８は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの肺の画像データを示す。左最上段：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、未投与、中央最上段：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、未投与、右最上段：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、未投与、左２段目：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央２段目：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右２段目：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、左３段目：Ｋ１リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、未投与、中央３段目：Ｋ２リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、未投与、右３段目：Ｋ３リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、未投与、左４段目：Ｋ１リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央４段目：Ｋ２リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右４段目：Ｋ３リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図１９】図１９は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの膵臓の画像データを示す。左最上段：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、未投与、中央最上段：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、未投与、右最上段：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、未投与、左２段目：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央２段目：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右２段目：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、左３段目：Ｋ１リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、未投与、中央３段目：Ｋ２リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、未投与、右３段目：Ｋ３リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、未投与、左４段目：Ｋ１リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央４段目：Ｋ２リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右４段目：Ｋ３リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２０】図２０は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの心臓の画像データを示す。左最上段：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、未投与、中央最上段：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、未投与、右最上段：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、未投与、左２段目：Ｋ１リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央２段目：Ｋ２リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右２段目：Ｋ３リポソーム投与１時間後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、左３段目：Ｋ１リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、未投与、中央３段目：Ｋ２リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、未投与、右３段目：Ｋ３リポソーム投与１日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与、未投与、左４段目：Ｋ１リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ１−３リポソーム投与、Ｋ１−４リポソーム投与、Ｋ１−６リポソーム投与、中央４段目：Ｋ２リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ２−３リポソーム投与、Ｋ２−４リポソーム投与、Ｋ２−６リポソーム投与、右４段目：Ｋ３リポソーム投与２日後、左側から糖鎖なしリポソーム投与、Ｋ３−３リポソーム投与、Ｋ３−４リポソーム投与、Ｋ３−６リポソーム投与。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２１】図２１は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。上段：糖鎖なしリポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後、下段：Ｋ１−３リポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２２】図２２は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。最上段：糖鎖なしリポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後、２段目：Ｋ１−４リポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後。３段目：Ｋ１−６リポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２３】図２３は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。上段：糖鎖なしリポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後、下段：Ｋ２−３リポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２４】図２４は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。最上段：糖鎖なしリポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後、２段目：Ｋ２−４リポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後。３段目：Ｋ２−６リポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２５】図２５は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。上段：糖鎖なしリポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後、下段：Ｋ３−３リポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２６】図２６は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームまたはｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。最上段：糖鎖なしリポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後、２段目：Ｋ３−４リポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後。３段目：Ｋ３−６リポソーム投与、左側から投与前、投与直後、投与５分後、投与１０分後、投与１５分後、投与２０分後、投与２５分後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２７】図２７は、ｃｙ５．５内包リポソームを用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。左側から投与前、投与直後、３０分後、１日後、２日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２８】図２８は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１−３）を用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。左側から投与前、投与直後、３０分後、１日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図２９】図２９は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１−４）を用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。左側から投与前、投与直後、３０分後、１日後、２日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図３０】図３０は、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１−６）を用いた正常マウスでの頭部以外の全身の画像データを示す。左側から投与前、投与直後、３０分後、１日後、２日後。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。カラーイメージング図では、バーの上方赤色が最もシグナルが強く、下方の色になるほど、蛍光シグナルが弱いことを示す。白黒イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数を表す。
【図３１】図３１は、蛍光物質を内包した糖鎖修飾リポソームの模式図を示す。
【図３２】図３２は、リポソームのタンパク質量を測定するための検量線の一例を示す。
【図３３】図３３は、リポソームの脂質量を測定するための検量線の一例を示す。
【図３４】図３４は、リポソームの粒子径分布の一例を示す。
【図３５】図３５は、蛍光物質の一例を示す。
【図３６】図３６は、蛍光物質の一例を示す。
【図３７】図３７は、蛍光物質の一例を示す。
【図３８】図３８は、蛍光物質の一例を示す。
【図３９】図３９は、蛍光物質の一例を示す。
【図４０】図４０は、糖鎖修飾リポソームの調製についての模式図を示す。ＨＳＡ、ＢＳ３、Ｔｒｉｓ、ＤＴＳＳＰおよびＳＬＸは、それぞれ以下の略号である。ＨＳＡ；ヒト血清アルブミン、ＢＳ３；ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基、Ｔｒｉｓ；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン基、ＤＴＳＳＰ；３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、ＳＬＸ；シアリルルイスＸ基。
【図４１】図４１は、ＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５およびＬｉｐｏ−Ｃｙ５．５の粒子サイズ分布を示す。リポソーム溶液を、蒸留水で５０倍に希釈した。縦軸：動的光散乱の相対強度（％）、横軸：粒子サイズ（対数：直径（ｎｍ））。実線：ＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５、破線：Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５。粒子サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓ９０により測定した。
【図４２】図４２は、４℃で６時間保存した後のＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５の安定性を示す。リポソーム溶液を、蒸留水で５０倍に希釈した。縦軸：動的光散乱の相対強度（％）、横軸：粒子サイズ（対数：直径（ｎｍ））。実線：調製の直後、破線：４℃で６時間保存した後。粒子サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓ９０により測定した。
【図４３】図４３は、慢性関節リウマチマウスにおける炎症領域へのリポソームの集積を示す。ＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５またはＬｉｐｏ−Ｃｙ５．５を尾静脈から投与した（５０μｌ／マウス）。同一マウスの炎症領域（後ろ足の裏側）を、投与前、注射０時間後、注射２４時間後に観察した。ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（Ｅｘ：６８０ｎｍ、Ｅｍ：７００ｎｍ）により測定した。データは正規化した。
【図４４】図４４は、炎症領域における種々の糖鎖修飾リポソームの集積を示す。Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５、ＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５およびＧ４ＧＮ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５を尾静脈から投与した（５０μｌ／マウス）。炎症領域（後ろ足の裏側）を、注射２４時間後に観察した。ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（Ｅｘ：６８０ｎｍ、Ｅｍ：７００ｎｍ）により測定した。データは正規化した。Ｇ４ＧＮ：Ｎ−アセチルラクトサミン。
【図４５】図４５は、リポソーム表面の糖鎖密度と炎症領域への集積との関係を示す。Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５またはＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５（Ｄ１〜Ｄ５）を、尾静脈から投与した（５０μｌ／マウス）。炎症領域（後ろ足の裏側）を、注射２４時間後に観察した。ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（Ｅｘ：６８０ｎｍ、Ｅｍ：７００ｎｍ）により測定した。各糖鎖密度は、糖鎖がリポソーム表面へ結合される際の反応混合物の濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。（Ｄ１：１０μｇ／ｍｌ、Ｄ２：５０μｇ／ｍｌ、Ｄ３：１００μｇ／ｍｌ、Ｄ４：２００μｇ／ｍｌ、Ｄ５：５００μｇ／ｍｌ）。データは正規化した。
【図４６】図４６は、炎症領域における血管および周囲の組織へのリポソームの集積を示す。ＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５またはＬｉｐｏ−Ｃｙ５．５（１００μｌ／マウス）を、尾静脈から投与した。同じマウスの炎症領域（後ろ足の裏側）を、注射の１０分後、３０分後、６時間後、２４時間後および４８時間後に観察した。血流内の白血球および血管内皮細胞を染色するために、観察の直前に、ＡＯ（０．５％，ｗ／ｖ％）（１５０μｌ）を尾静脈から投与した。ＩＶ−１００により測定した。Ｃｙ５．５は赤色で示され（Ｅｘ：６３３ｎｍ、Ｅｍ：６９３ｎｍ）、アクリジンオレンジは緑色で示される（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５２６ｎｍ）。バー：２０μｍ。矢印：血管。
【図４７】図４７は、担癌マウスの腫瘍領域へのＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５の集積を示す。ＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５またはＬｉｐｏ−Ｃｙ５．５を、尾静脈から投与し（２００μｌ／マウス）した。同一マウスの腫瘍領域（右大腿領域）を、投与前、投与の０時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後に観察した。ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（Ｅｘ：６８０ｎｍ、Ｅｍ：７００ｎｍ）により測定した。データを正規化した。
【図４８】図４８は、注射の９６時間後における体内の蛍光分布を示す。ＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５を、尾静脈から投与した（２００μｌ／マウス）。注射の９６時間後に全身を観察した。ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（Ｅｘ：６８０ｎｍ、Ｅｍ：７００ｎｍ）により測定した。
【図４９】図４９は、腫瘍領域における、血管から周辺組織への蛍光の移動を示す。ＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５またはＬｉｐｏ−Ｃｙ５．５を、尾静脈から投与した（１００μｌ／マウス）。注射の４８時間後に、腫瘍領域（右大腿領域）の血管および周辺組織を観察した。血流内の白血球および血管内皮細胞を染色するために、観察の直前に、ＡＯ（０．５％，ｗ／ｖ％）（１５０μｌ）を尾静脈から投与した。ＩＶ−１００により測定した。Ｃｙ５．５は赤色で示され（Ｅｘ：６３３ｎｍ、Ｅｍ：６９３ｎｍ）、アクリジンオレンジは緑色で示される（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５２６ｎｍ）。バー：２０μｍ。無地矢印：血管。縞矢印：腫瘍組織（腫瘍細胞）。三角：白血球。
【図５０】図５０は、Ｃｙ７内包型糖鎖修飾リポソーム（Ｋ−１）を投与した担癌マウスを、蛍光イメージング装置  ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて経時的に撮影した画像である。投与６時間後、Ｃｙ７内包型糖鎖修飾リポソーム（Ｋ−１）を投与した担癌マウスは、コントロールに比べて腫瘍部位において蛍光強度が高かった。投与２４時間後においては、ほとんどシグナルが検出されなかった。
【図５１】図５１は、Ｃｙ３内包型糖鎖修飾リポソーム（Ｋ−１）を投与した担癌マウスの腫瘍部位を、蛍光顕微鏡ＣＫＸ４１（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて撮影した写真である。投与６時間後、Ｃｙ３内包型糖鎖修飾リポソーム（Ｋ−１）を投与した担癌マウスは、コントロールに比べて腫瘍組織における蛍光強度が高いことが判明した。
【図５２】図５２は、従来法および遠心法により製造したリポソームについての粒子径分布を示す。Ａ：従来法、Ｂ：遠心法。
【図５３】図５３は、従来法および遠心法により製造したリポソームについての吸収スペクトルを示す。太線：従来法、細線：遠心法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００２３】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。【００２４】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明する。【００２５】
本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約２０種類の単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体など）が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外のタンパク質や脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子・細胞認識機能などタンパク質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られているが、そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、タンパク質に次ぐ第３の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド（情報分子）としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。【００２６】
本明細書において「糖鎖基」とは、糖鎖が別の基と結合したときに付される名称である。糖鎖基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、糖鎖基としては、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基が挙げられる。【００２７】
本明細書において「糖」または「単糖」とは、少なくとも１つの水酸基および少なくとも１つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンをいい、糖鎖の基本単位を構成する。本明細書において、糖はまた、炭水化物ともいい、両者は互換的に用いられる。本明細書において、特に言及するときは、糖鎖は、１つ以上糖が連なった鎖または配列をいい、糖または単糖というときは、糖鎖を構成する１つの単位をいう。
ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。本発明では、いずれの形式のものでも使用され得る。【００２８】
本発明において糖を記載するために使用する命名法および略称は、通常の命名法に従う。例えば、β−Ｄ−ガラクトース【００２９】
【化１１】
2007091661.tif 000007
は、Ｇａｌ；
Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン【００３０】
【化１２】
2007091661.tif 000008
は、ＧａｌＮＡｃ；
α−Ｄ−マンノース【００３１】
【化１３】
2007091661.tif 000009
は、Ｍａｎ；
β−Ｄ−グルコース【００３２】
【化１４】
2007091661.tif 000010
は、Ｇｌｃ；
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン【００３３】
【化１５】
2007091661.tif 000011
は、ＧｌｃＮＡｃ；
α−Ｌ−フコース【００３４】
【化１６】
2007091661.tif 000012
は、Ｆｕｃ；
α−Ｎ−アセチルノイラミン酸【００３５】
【化１７】
2007091661.tif 000013
は、Ｎｅｕ５Ａｃ；
セラミド【００３６】
【化１８】
2007091661.tif 000014
は、Ｃｅｒ；
Ｌ−セリン
ＣＨ２（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ２
は、Ｓｅｒにより表す。なお、Ｃｅｒは通常脂質に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。また、Ｓｅｒは通常アミノ酸に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。環状の２つのアノマーは、αおよびβにより表す。表示上の理由により、ａまたはｂと表すことがある。従って、本明細書において、αとａ、βとｂは、アノマー表記については交換可能に使用される。【００３７】
本明細書において、ガラクトースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ−Ｄ−ガラクトースであり、特に言及しないときには、β−Ｄ−ガラクトースを指すものとして使用される。【００３８】
本明細書において、アセチルガラクトサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはＮ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミンであり、特に言及しないときには、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミンを指すものとして使用される。【００３９】
本明細書において、マンノースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−Ｄ−マンノースであり、特に言及しないときには、α−Ｄ−マンノースを指すものとして使用される。【００４０】
本明細書において、グルコースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ−Ｄ−グルコースであり、特に言及しないときには、β−Ｄ−グルコースを指すものとして使用される。【００４１】
本明細書において、アセチルグルコサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンであり、特に言及しないときには、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンを指すものとして使用される。【００４２】
本明細書において、フコースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−Ｌ−フコースであり、特に言及しないときには、α−Ｌ−フコースを指すものとして使用される。【００４３】
本明細書において、アセチルノイラミン酸とは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、特に言及しないときにはα−Ｎ−アセチルノイラミン酸を指すものとして使用される。【００４４】
本明細書において、セリンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはＬ−セリンであり、特に言及しないときにはＬ−セリンを指すものとして使用される。【００４５】
本明細書において、糖の表示記号、呼称、略称（Ｇｌｃなど）などは、単糖を表すときと、糖鎖中で使用されるときとは、異なることに留意する。糖鎖中、単位糖は、結合先の別の単位糖との間に脱水縮合があるので、相方から水素または水酸基を除いた形で存在することになる。従って、これらの糖の略号は、単糖を表すときに使用されるときは、すべての水酸基が存在するが、糖鎖中で使用されるときは、水酸基が結合先の糖の水酸基とが脱水縮合されて酸素のみが残存した状態を示していることが理解される。【００４６】
糖が、アルブミンと共有結合されるときには、糖の還元末端がアミノ化され、そのアミン基を介してアルブミンなどの他の成分に結合することができるが、その場合は還元末端の水酸基がアミン基に置換されたものを指すことに留意する。【００４７】
単糖は一般に、グリコシド結合により結合されて二糖および多糖を形成する。環の平面に関する結合の向きは、αおよびβにより示す。２つの炭素の間の結合を形成する特定の炭素原子も記載する。【００４８】
本明細書において糖鎖は、【００４９】
【化１９】
2007091661.tif 000015
により表される。従って、例えば、ガラクトースのＣ−１とグルコースのＣ−４との間のβグリコシド結合は、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃにより表される。従って、例えば、シアリルルイスＸ（ＳＬＸ）は、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃと表される。Ｎ-アセチルラクトサミン（Ｇ４ＧＮ）は、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃと表される。α1-6マンノビオース（Ａ６）は、Ｍａｎα１，６Ｍａｎと表される。【００５０】
糖鎖の分岐は、括弧により表し、結合する単位糖のすぐ左に配置して表記する。例えば、【００５１】
【化２０】
2007091661.tif 000016
と表され、括弧の中は、【００５２】
【化２１】
2007091661.tif 000017
と表記される。従って、例えば、ガラクトースのＣ−１とグルコースのＣ−４との間がβグリコシド結合し、さらにこのグルコースのＣ−３がフコースのＣ−１とαグリコシド結合している場合、Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）Ｇｌｃと表される。単糖は、（潜在）カルボニル原子団になるだけ小さい番号を付けることを基本にして表される。有機化学命名法の一般基準では（潜在）カルボニル原子団より優位な原子団が分子中に導入されたときでも、通常上記の番号付けで表される。【００５３】
【化２２】
2007091661.tif 000018
【００５４】
【化２３】
2007091661.tif 000019
【００５５】
本明細書において使用される糖鎖としては、例えば、シアリルルイスＸ、Ｎ−アセチルラクトサミン、α１−６マンノビオースならびにそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される糖鎖が挙げられるが、これらに限定されない。２つ以上の組み合わせが使用可能な理由としては、理論に束縛されないが、上記糖鎖の各々が目的の送達部位の組織または細胞に局在するレクチンに対して特異性を有しており、混在してもその特異性を発揮すると考えられるからである。【００５６】
（リポソーム）
本明細書において「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リポソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリポソームによって、細胞膜を通過しえない薬物や遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いのでＤＤＳ用のナノ粒子性キャリアー材料としての期待が大きい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）を有し得る。【００５７】
リポソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、その中でもコール酸透析法による方法が挙げられる。コール酸透析法では、ａ）脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、およびｂ）混合ミセルの透析により製造を実施する。次に本発明の糖鎖リポソームにおいて好ましい実施形態では、リンカーとしてタンパク質を使用することが好ましく、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質のリポソームへのカップリングは、以下の２段階反応によって行うことができる。ａ）リポソーム膜上のガングリオシド部分の過ヨウ素酸酸化、およびｂ）還元的アミノ化反応による酸化リポソームへの糖タンパク質のカップリングである。その反応フローの一例を図３１に示す。このような手法によって望ましい糖鎖を含む糖タンパク質をリポソームに結合することができ、所望の糖鎖を有する多種多様な糖タンパク質・リポソームコンジュゲートを得ることができる。リポソームの純度や安定性を見るために粒子径サイズ分布を調べることが非常に重要である。その方法として、ゲル濾過クロマト法（ＧＰＣ）および走査型電顕（ＳＥＭ）や動的光散乱法（ＤＬＳ）などを使うことができる。ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドのモル比  ３５：４５：５：１５のタイプのリポソームを製造することができる。なお、このリポソームは４℃で数ヶ月保存しても安定である。リポソームのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性は、マウスを使って調べることができる。リポソームをマウスに静注し、３時間後に採血して血清を調製し、孔径０．０３μｍの膜を用いて限外濾過を行いリポソームを精製し回収する。そのＳＥＭ観察の結果、このリポソームの形態はｉｎ  ｖｉｖｏでの３時間処理・回収前後においても変化がないことを確認することができる。【００５８】
本発明の糖鎖修飾リポソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類（ガングリオシド類など）、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられる。【００５９】
ホスファチジルコリン類としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。【００６０】
ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。【００６１】
ホスファチジン酸類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸が挙げられる。長鎖アルキルリン酸塩類としてはジセチルホスフェート等が挙げられる。【００６２】
糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボシド、ガングリオシド類等が挙げられる。ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤｌａ、ガングリオシドＧＴｌｂ等が挙げられる。【００６３】
ホスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロ−ル、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が好ましい。【００６４】
このうち、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類、およびコレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。例えば、本発明のリポソームを構成する脂質として、ホスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、ホスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含むものが挙げられる。ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含むことが好ましい。アルブミンのようなリンカーの結合が容易になるからである。【００６５】
好ましい実施形態において、本発明におけるリポソームは、ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含ませてそれにペプチドなどのリンカーを結合させ、糖鎖を結合させることが可能である。【００６６】
リポソームを作製するときにガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを合わせることによって、この糖脂質中に含まれる糖鎖を構成成分として含む、本発明の糖鎖修飾リポソームを作製することができる。【００６７】
別の好ましい実施形態では、本発明におけるリポソームは、ホスファチジルエタノールアミンを含むことが好ましい。ホスファチジルエタノールアミンを含むことによって、親水性付与基（トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンなど）との結合が容易になるからである。【００６８】
（糖鎖修飾リポソーム）
１つの局面において、本発明は、糖鎖修飾リポソームを提供する。従来、生体内では所望の標的細胞または組織に十分にターゲティングするものは提供されてこなかった。本発明は、生体内の所望の標的細胞または組織に指向性有する糖鎖修飾リポソームを提供することにより、従来ＤＤＳ材料では不可能であったターゲティングが可能になるという効果を有する。具体的な実施形態では、このような糖鎖修飾リポソームは、シアリルルイスＸ、Ｎ−アセチルラクトサミン、α１−６マンノビオースおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの構造を有する糖鎖が結合されている。【００６９】
本明細書において「糖鎖修飾リポソーム」とは、糖鎖とリポソームとを含む物質をいい、好ましくは、糖鎖が直接または間接的に結合することによって修飾されたリポソームをいう。糖鎖がリポソームに結合した形態を具体的に表すと、
構造Ｉ  Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３
Ｘ：前記リポソームに含まれる前記リンカータンパク質とＣＨ２−ＮＨ結合可能な官能基ａを含む構成単位から、該官能基ａがとれた基
Ｒ１：リンカータンパク質基
Ｒ２：リンカータンパク質架橋基
Ｒ３：糖鎖
であり、ＸとＲ１とはＣＨ２−ＮＨ結合し、Ｒ１とＲ２とはペプチド結合し、Ｒ２とＲ３とはペプチド結合している。
従って、より詳細には、構造Ｉは、
Ｘ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ３
という構造式で表すことができる。【００７０】
本発明の糖鎖修飾リポソームは、以下の構造により親水性化されている：
構造ＩＩ  Ｙ−Ｒ４−Ｒ５
Ｙ：前記リポソームに含まれる親水性化合物架橋基とペプチド結合可能な官能基ｂを含む構成単位から該官能基ｂがとれた基
Ｒ４：親水性化合物架橋基
Ｒ５：親水性化合物基
ＹとＲ４はペプチド結合し、Ｒ４とＲ５はペプチド結合している。
従って、より詳細には、構造ＩＩは、
Ｙ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ４−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ５
という構造式で表すことができる。【００７１】
１つの実施形態では、本発明のリポソームは、上述の構造Ｉおよび構造ＩＩを有し、さらに、蛍光性である。【００７２】
本発明において、蛍光性は、本発明の糖鎖修飾リポソームの構成要素の少なくとも１つが蛍光性を有すること、または本発明の糖鎖修飾リポソームが新たに蛍光性を有する要素（例えば、蛍光色素）をさらに有することによって付与される。【００７３】
蛍光性を有する要素としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光色素としては、例えば、ｃｙ５．５（例えば、【００７４】
【化２４】
2007091661.tif 000020
、１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３‘−テトラメチル−３Ｈ−ベンズインドジカルボシアニン−５，５’，７，７’−テトラスルホネート三カリウム塩−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）、
ｃｙ３（例えば、【００７５】
【化２５】
2007091661.tif 000021
、１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートカリウム塩−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｃｙ３）など）、ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、ＦＩＴＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。【００７６】
本明細書において使用する場合、リポソームと「適合性（である）」とは、ある物質をリポソームに含めた場合、またはリポソームに結合させた場合に、リポソームの安定性を損なわない、その物質の性質をいう。リポソームとの適合性は、例えば、ゼータ電位、電気移動度、粒子径、脂質量、タンパク質量などを測定することによって判断され得る。例えば、ゼータ電位により、リポソーム粒子の凝集性を判断することができる。粒子径、粒度分布により、平均粒子径、最大域、最大域におけるリポソームの数などを分析し、その分析結果によりリポソームの均一性を確認することができる。タンパク質量：脂質量：脂質あたりのタンパク質量の割合を測定することにより、リポソームが適切な組成を有しているかどうかを確認することができる。【００７７】
本明細書において使用される糖鎖修飾リポソームは、目的の送達部位への送達のために適切な密度で含まれ得る。【００７８】
本明細書において使用する場合、「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リポソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質１ｍｇあたりに結合した糖鎖の密度（ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）として表される。本発明の糖鎖修飾リポソームの結合密度は、理論に束縛されることを望まないが、経験的に、調製するときに使用した糖鎖の量は、リポソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることが分かっている。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって結合密度が確定される。インビトロにおいて、例えば、Ｅ−セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、リポソームに結合される糖鎖の種類と結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下、表１にリポソーム番号、糖鎖の構造、および修飾結合密度を示す。【００７９】
【表１】
2007091661.tif 000022
【００８０】
上記の表に記載されるような本発明の好ましい糖鎖修飾リポソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、（ａ）脂質を、メタノール／クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；（ｂ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程；（ｃ）該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合して、蛍光標識されたリポソームを提供する工程；（ｄ）該リポソームをトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンにより親水性化処理する工程；（ｅ）該親水性化処理されたリポソームにリンカータンパク質を結合させて、リンカータンパク質結合リポソームを生成する工程；および（ｆ）該リポソームに、上記表に記載される糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程を包含する。【００８１】
好ましくは、この方法において、工程（ｃ）の蛍光標識溶液は、１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートカリウム塩，ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｃｙ５．５）を含み、工程（ｅ）のリンカータンパク質は、ヒト血清アルブミンであり、工程（ｆ）において、糖鎖とリポソームを、目的の送達部位への送達に適切な条件で結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する。【００８２】
リポソームとリンカー、リンカーと糖鎖とは、二官能性架橋基（例えば、３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ））などを利用して結合されることが好ましい。【００８３】
本発明の糖鎖修飾リポソームは、薬剤または遺伝子を封入または結合し得る。薬剤としては、例えば、アルキル化系抗癌剤、代謝拮抗剤、植物由来抗癌剤、抗癌性抗生物質、生物学的応答調節剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ：ＢＲＭ）・サイトカイン類、白金錯体系抗癌剤、免疫療法剤、ホルモン系抗癌剤、モノクローナル抗体等の腫瘍用薬剤、中枢神経用薬剤、末梢神経系・感覚器官用薬剤、呼吸器疾患治療薬剤、循環器用薬剤、消化器官用薬剤、ホルモン系用薬剤、泌尿器・生殖器用薬剤、ビタミン・滋養強壮剤、代謝性医薬品、抗生物質・化学療法薬剤、検査用薬剤、抗炎症剤、眼疾患薬剤、中枢神経系薬剤、自己免疫系薬剤、循環器系薬剤、糖尿病、高脂血症のような生活習慣病薬剤、副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、抗サイトカイン抗体、抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＯＤＮ）またはＤＮＡのような遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子、抗体医薬、分子標的薬、骨粗鬆症・骨代謝改善薬、神経ペプチド、生理活性ペプチド・タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。【００８４】
本明細書において使用される場合、「リンカー」とは、糖鎖とリポソーム表面との結合を介在する分子である。本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、糖鎖はリンカーを介してリポソーム表面に結合してもよい。リンカーは、当業者が適宜選択することができるが、生体適合性であるものが好ましく、より好ましくは、薬学的に受容可能である。本明細書において「リンカータンパク質」とは、リンカー分子のうち、タンパク質、ペプチド、アミノ酸のポリマーをいう。本明細書において使用されるリンカータンパク質としては、例えば、生体由来タンパク質、好ましくは、ヒト由来タンパク質、より好ましくは、ヒト由来血清タンパク質、さらにより好ましくは、血清アルブミンであり得る。特に、ヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。【００８５】
本明細書において「リンカー（タンパク質）基」とは、リンカー（タンパク質）が別の基と結合したときに付される名称である。リンカー（タンパク質）基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、哺乳動物由来タンパク質基、ヒト由来タンパク質基、ヒト血清タンパク質基、血清アルブミン基が挙げられる。リンカー（タンパク質）基は「ヒト」由来が好ましい。ヒト投与において適合性が高いと考えられるからである。また、免疫原性がないタンパク質が好ましい。【００８６】
本明細書において「架橋基」とは、橋をかけるように，鎖式高分子の分子間で化学結合を形成させる基をいう。代表的には、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの高分子と他の分子（例えば、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖）との間に作用し、分子内または分子間で、共有結合のなかったところを結ぶ共有結合を形成させる基をいう。本明細書において架橋基は、架橋を目的とする標的によって変動し、例えば、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、カルボジイミド類、イミドエステル類など挙げることができるがそれらに限定されない。アミノ基含有物質を架橋する場合、アルデヒド含有基、例えば、グルタルアルデヒドを用いることができる。【００８７】
本明細書において、「リンカータンパク質架橋基」とは、リポソームと糖鎖との間にペプチド結合を形成させる基をいう。リンカータンパク質架橋基は、架橋を目的とする標的によって変動し、例えば、ビススルホスクシンイミジルスベラート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスベラート、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート、エチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート等の２価試薬などを使用することができる。本明細書において使用され得るリンカータンパク質架橋基としては、例えば、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基、ビススルホスクシンイミジルスベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基などが挙げられ得る。【００８８】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。【００８９】
本明細書では、特に言及するときは、「タンパク質」は、比較的大きな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指し、「ペプチド」というときは、比較的小さな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指すことがあることが理解されるべきである。そのような分子量としては、例えば、約３０ｋＤａ、好ましくは約２０ｋＤａ、より好ましくは約１０ｋＤａなどを挙げることができるがそれらに限定されない。【００９０】
本明細書中で使用される場合、「生体由来タンパク質」とは、生物に由来するタンパク質をいい、どの生物（例えば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（例えば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（例えば、単子葉植物、双子葉植物など）など））由来のタンパク質でもよい。好ましくは、脊椎動物（例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来のタンパク質、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来のタンパク質が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来のタンパク質が用いられる。最も好ましくは投与を目的とする生体由来のタンパク質が用いられる。本明細書において、生体由来タンパク質が別の物質と結合した状態を示す場合、生体由来タンパク質基と称される。【００９１】
本明細書で使用される場合「ヒト由来血清タンパク質」は、ヒトの血液が自然に凝固したときに残る液体部分に含まれるタンパク質をいう。本明細書において、ヒト由来タンパク質が別の物質と結合した状態を示す場合、ヒト由来タンパク質基と称される。【００９２】
本明細書で使用される場合、「血清アルブミン」は、血清中に含まれるアルブミンをいう。本明細書において、血清アルブミンが別の物質と結合した状態を示す場合、血清アルブミン基と称される。【００９３】
本発明における糖鎖修飾リポソームは、リポソーム膜またはリンカーの少なくとも一方が親水性化合物、好ましくは、トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンを結合させることにより親水性化されていてもよい。【００９４】
本明細書中で使用される場合、「親水性化」は、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることをいう。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも１つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも２つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも１つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも１つのＯＨ基と少なくとも１つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。親水性化合物は、低分子なので、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げることはない。また、親水性化合物には、本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、レクチン等の特定の標的を指向するために用いられるレクチンが結合し得る糖鎖は含まれない。このような親水性化合物として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどを含むトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス（ヒドロキシメチノレ）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパン等が挙げられる。【００９５】
本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（本明細書において「アルカン」という）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１１アルキルまたはＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルキルであり得る。アルカンについては、これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルカン、Ｃ１〜Ｃ３アルカン、Ｃ１〜Ｃ４アルカン、Ｃ１〜Ｃ５アルカン、Ｃ１〜Ｃ６アルカン、Ｃ１〜Ｃ７アルカン、Ｃ１〜Ｃ８アルカン、Ｃ１〜Ｃ９アルカン、Ｃ１〜Ｃ１０アルカン、Ｃ１〜Ｃ１１アルカンまたはＣ１〜Ｃ１２アルカン、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルカンまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルカンであり得る。ここで、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（ＣＨ３−）、エチル（Ｃ２Ｈ５−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。Ｒとしては、Ｃ１〜Ｃ６アルキルが好ましく、特にＣ１〜Ｃ６アルキルが好ましい。【００９６】
本発明の物質または上で定義した官能基が置換基Ｒによって置換されている場合、そのような置換基Ｒは、単数または複数存在し、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオ−ル、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、アシル、チオカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される。【００９７】
さらに、ＯＨ基を有する低分子化合物にアミノ基を導入した化合物も本発明の親水性化合物として用いることができる。該化合物は限定されないが、例えば、セロビオース等のレクチンが結合しない糖鎖にアミノ基を導入した化合物が挙げられる。例えば、リポソーム膜の脂質ホスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。親水性化合物の一般式は、下記式（１）、式（２）、式（３）等で示される。【００９８】
Ｚ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ  式（１）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ  式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ  式（３）
ここで、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、Ｃ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Ｚはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、ＣＯＯＨ、ＮＨ、ＮＨ２、ＣＨＯ、ＳＨ、ＮＨＳ−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、ＥＤＣ、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。ｎは自然数を示す。このような親水性化合物で親水性化を行ったリポソームの表面は、薄く親水性化合物で覆われている。但し、その親水性化合物の覆いの厚みは小さいので、リポソームに糖鎖を結合させた場合であっても、糖鎖等の反応性を抑制することはない。【００９９】
本明細書において「親水性化合物基」とは、上記のような親水性化合物が他の基と結合したときの呼称である。親水性化合物基は場合に応じて一価または二価であり得る。【０１００】
本明細書において、「親水性化合物架橋基」とは、一端がリンカータンパク質とペプチド結合し、他の一端が糖鎖とペプチド結合する基であり、親水性化合物基とリポソームまたはリンカータンパク質との間にペプチド結合を形成させる基をいう。親水性化合物架橋基としては、例えば、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基などを挙げることができる。好ましくは、親水性化合物架橋基は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である。【０１０１】
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作成する方法（特開２０００−３０２６８５号（例えば、ＣＮＤＡＣ含有リポソーム製剤ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール；スフィンゴミエリン；コレステロール；ポリエチレングリコール部分の分子量が約２０００であるＮ−モノメトキシポリエチレングリコールサクシニル−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥとする。）；ＣＮＤＡＣ塩酸塩、グルコース水溶液およびトレハロース水溶液を使用し、Ｂａｎｇｈａｍら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８、６６０−６６８（１９６４）参照。）の方法により、多重層リポソームの粗分散液を得た。」と記載されている。））等の方法を採用することによっても行うことができる。このうち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。本発明のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンは低分子量物質であるので従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン（糖鎖認識タンパク質）による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。【０１０２】
また、本発明によるリポソームは該親水化処理後においても粒子径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体内安定性も優れているのでリポソーム製剤化して利用するために好ましい。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルホスクシンイミジルスベラート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスベラート、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート、エチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート等の２価試薬を加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン等の脂質に２価試薬を結合させ、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、該２価試薬の−方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを結合せしめる。【０１０３】
このように、リポソームを親水性化処理したリポソームは、生体内で極めて安定であり、後述のように標的指向性を有する糖鎖を結合しなくても、生体内での半減期が長いためドラッグデリバリーシステムにおけるドラッグ担体として好適に用いることができる。本発明は、表面を低分子化合物で親水性化したリポソームをも包含する。【０１０４】
本明細書において「送達媒体」は、所望の物質の送達を媒介する担体（ビヒクル）をいう。送達される物質が薬物であれば、「薬物送達媒体」という。薬物送達システム（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＤＳ）とは、ドラッグデリバリーシステムとも呼ばれ、吸収制御型ＤＤＳ、放出制御型ＤＤＳ、標的指向型ＤＤＳに分類することもある。理想的なＤＤＳは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むシステムである。ターゲティングＤＤＳ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＤＤＳと書き、和訳は標的指向性ＤＤＳである。）は、パッシブ・ターゲティング（受動的・標的指向性）ＤＤＳとアクティブ・ターゲティング（能動的・標的指向性）ＤＤＳとに分類される。前者はキャリアー（薬物運搬体）の粒子径や親水性など物理化学的性質を利用して体内挙動を制御する方法である。後者はこれらに特殊な仕組みを付け加えて積極的に標的組織への指向性を制御しようとする方法であり、例えば標的組織を構成する特定細胞の標的分子への特異的分子認識機能を有する抗体や糖鎖などを結合したキャリアーを利用する方法があり“ミサイルドラッグ”と呼ばれることもある。【０１０５】
本明細書において「薬物送達媒体」は、所望の薬物を送達するためのビヒクルをいう。【０１０６】
別の局面において、本発明は、分子イメージング剤に関する。この分子イメージング剤は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の分子イメージング剤は、糖鎖修飾リポソームを、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得る。【０１０７】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性である。そのような非毒性および不活性のキャリアとしては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。【０１０８】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤またはｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。【０１０９】
１つの局面において、本発明は、糖鎖修飾リポソームを含む分子イメージング剤を提供する。本発明の薬物送達媒体は、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＦｕｃおよびＮｅｕ５Ａｃからなる群より選択される少なくとも１つの構造を有する糖鎖、好ましくは、上記表１に示される糖鎖を結合した糖鎖修飾リポソームを含む。この糖鎖修飾リポソームは、薬剤または遺伝子を封入していても、結合していてもよい。【０１１０】
本明細書において「分子イメージング剤」とは、生体の機能または構造を画像化するために用いられる薬剤または因子をいう。例えば、生体内の癌組織および炎症部位を画像化するために用いられるものが挙げられる。【０１１１】
本発明の分子イメージング剤は、生物学的因子を必要とする被験体へ生物学的因子を投与するため、および呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿器・生殖器系、中枢神経系または末梢神経系の障害を有する哺乳動物を処置するためにも使用され得る。【０１１２】
本発明の分子イメージング剤は、糖鎖修飾リポソームの糖鎖の種類と結合密度を調節することによって、腸管での吸収制御性を高めることもできる。腸管吸収制御性を高める糖鎖と特定の組織または器官への指向性を有する糖鎖の両方をリポソームに結合させることにより、特定組織または器官への指向性と腸管吸収制御性の両方の特性を併せ持ったリポソームを作製することも可能である。【０１１３】
本発明のイメージング剤に含まれる糖鎖修飾リポソームは、糖鎖がシアリルルイスＸ基であり得る。このシアリルルイスＸ基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。炎症をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。癌組織をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１１４】
本発明のイメージング剤に含まれる糖鎖修飾リポソームは、糖鎖がＮ−アセチルラクトサミン基であり得る。このＮ−アセチルラクトサミン基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。脳血管をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。肝臓をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１１５】
本発明のイメージング剤に含まれる糖鎖修飾リポソームは、糖鎖がα１−６マンノビオース基であり得る。このα１−６マンノビオース基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。癌組織をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１１６】
本発明のイメージング剤は、炎症部位、癌組織、脳血管または肝臓等をイメージングするために使用され得る。これらの組織は実質を含んでいてもよい。【０１１７】
本発明の分子イメージング剤の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本発明の分子イメージング剤は、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤等の固形製剤、シロップ剤、懸濁剤、溶液剤等の液状製剤として経口的に投与することができる。【０１１８】
本発明の分子イメージング剤は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。【０１１９】
本発明の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームは、従来のイメージング剤よりも高感度なイメージングを可能にする。なぜなら、励起および蛍光検出波長が、長波長５００〜７００ｎｍの蛍光色素を選択することにより、生体成分由来の自家蛍光と区別することができるため、生体外からの高感度なイメージングを実現することが可能となるからである。【０１２０】
本発明の処置方法において使用される分子イメージング剤の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。【０１２１】
分子イメージング剤は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬物送達媒体が患者による摂取に適した液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。【０１２２】
一つの局面において、本発明は、分子イメージングまたはインビボイメージングにおいて使用するためのキャリアを提供する。このキャリアは、糖鎖修飾リポソーム含み得る。【０１２３】
本発明のキャリアに含まれる糖鎖修飾リポソームは、糖鎖がシアリルルイスＸ基であり得る。このシアリルルイスＸ基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。炎症をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。癌組織をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１２４】
本発明のキャリアに含まれる糖鎖修飾リポソームは、糖鎖がＮ−アセチルラクトサミン基であり得る。このＮ−アセチルラクトサミン基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。脳血管をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。肝臓をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１２５】
本発明のキャリアに含まれる糖鎖修飾リポソームは、糖鎖がα１−６マンノビオース基であり得る。このα１−６マンノビオース基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。癌組織をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１２６】
本発明のイメージング剤は、炎症部位、癌組織、脳血管または肝臓等をイメージングするために使用され得る。これらの組織は実質を含んでいてもよい。【０１２７】
本発明の媒体または組成物は、蛍光色素、薬剤または生物学的因子が意図される目的を達成するのに有効な量で、糖鎖修飾リポソーム中に含有される組成物を含む。「処置するのに有効な量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果（例えば、予防、治療、再発防止など）を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、処置有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、処置有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。【０１２８】
治療有効量、予防有効量などおよび毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。大きな治療係数を呈する薬物送達媒体が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用する細胞の種類等により適宜選択される。【０１２９】
本発明の組成物、分子イメージング剤、媒体などは、当該分野で公知の様式と同様の様式（例えば、混合、溶解など）で製造され得る。【０１３０】
本発明の、物質を所望の部位に送達するための組成物は、糖鎖で修飾された糖鎖修飾リポソームを含み得る。本発明の組成物に含まれる糖鎖修飾リポソームは、糖鎖がシアリルルイスＸ基であり得る。このシアリルルイスＸ基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。炎症をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。癌組織をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１３１】
本発明の組成物に含まれる糖鎖修飾リポソームは、糖鎖がＮ−アセチルラクトサミン基であり得る。このＮ−アセチルラクトサミン基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。脳血管をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。肝臓をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１３２】
本発明の組成物に含まれる糖鎖修飾リポソームは、糖鎖がα１−６マンノビオース基であり得る。このα１−６マンノビオース基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。癌組織をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１３３】
本発明のイメージング剤は、炎症部位、癌組織、脳血管または肝臓等をイメージングするために使用され得る。これらの組織は実質を含んでいてもよい。【０１３４】
本明細書において「指示書」は、本発明の糖鎖修飾リポソームまたは分子イメージング剤などを投与する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の糖鎖修飾リポソームまたは分子イメージング剤などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。【０１３５】
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。【０１３６】
（糖鎖修飾リポソームの医薬としての使用）
他の局面において、本発明は、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿器・生殖器系、中枢神経系、または末梢神経系の障害を処置するための医薬の製造のための、糖鎖修飾リポソームの使用を提供する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１３７】
別の局面において、本発明は、医薬としても用いられ得る。このような場合、本発明の糖鎖修飾リポソームに、封入または結合される薬剤としては、例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルキル化系抗癌剤、代謝拮抗剤、植物由来抗癌剤、抗癌性抗生物質、ＢＲＭ・サイトカイン類、白金錯体系抗癌剤、免疫療法剤、ホルモン系抗癌剤、モノクローナル抗体等の腫瘍用薬剤、中枢神経用薬剤、末梢神経系・感覚器官用薬剤、呼吸器疾患治療薬剤、循環器用薬剤、消化器官用薬剤、ホルモン系用薬剤、泌尿器・生殖器用薬剤、ビタミン・滋養強壮剤、代謝性医薬品、抗生物質・化学療法薬剤、検査用薬剤、抗炎症剤、眼疾患薬剤、中枢神経系薬剤、自己免疫系薬剤、循環器系薬剤、糖尿病、高脂血症のような生活習慣病薬剤、副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、抗サイトカイン抗体、抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、アンチセンスＯＤＮまたはＤＮＡのような遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子、抗体医薬、分子標的薬、骨粗鬆症・骨代謝改善薬、神経ペプチド、生理活性ペプチド・タンパク質のような薬剤。【０１３８】
（画像化方法）
別の局面において、本発明は、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿器・生殖器系、中枢神経系、または末梢神経系を画像化するための方法を提供する。この方法は、被験体に、分子イメージング剤を投与する工程を包含し、該分子イメージング剤は糖鎖修飾リポソームおよび蛍光色素を含み、該糖鎖修飾リポソームは検出に十分な量の蛍光色素を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１３９】
別の局面において、本発明は、炎症またはがんを画像化するための方法を提供する。この方法は、被験体に、分子イメージング剤を投与する工程を包含し、該分子イメージング剤は糖鎖修飾リポソームおよび蛍光色素を含み、該糖鎖修飾リポソームは検出に十分な量の蛍光色素を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１４０】
（イメージングシステム）
別の局面において、本発明は、目的の部位を分子イメージングまたはインビボイメージングするためのシステムを提供する。本明細書において、「分子イメージング」または「インビボイメージング」とは、生体の機能または構造を画像化するこという。本発明の分子イメージングまたはインビボイメージングするためのシステムは、
Ａ）該目的の部位に特異的な糖鎖修飾リポソーム；
Ｂ）標識；および
Ｃ）該標識の有無を調べる手段；
を備え、ここで、
該標識が目的の部位に集積するのに十分な時間たった後、該生体における該標識の有無を調べ、該標識により該生体の機能または構造を画像化することができる。標識としては、蛍光物質、放射性物質、発色物質（例えば、βｇａｌ）、発行物質（例えば、ルシフェラーゼ）などが挙げられるが、これらに限定されない。【０１４１】
本発明のシステムにおいて使用され得る糖鎖修飾リポソームの糖鎖は、シアリルルイスＸ基であり得る。このシアリルルイスＸ基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。炎症をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。癌組織をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１４２】
本発明のシステムにおいて使用され得る糖鎖修飾リポソームの糖鎖は、Ｎ−アセチルラクトサミン基であり得る。このＮ−アセチルラクトサミン基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。脳血管をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。肝臓をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１４３】
本発明のシステムにおいて使用され得る糖鎖修飾リポソームの糖鎖は、α１−６マンノビオース基であり得る。このα１−６マンノビオース基は、０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。癌組織をイメージングする場合、好ましくは、０．００２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質（好ましくは、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）の修飾結合密度で糖鎖修飾リポソームに含まれ得る。【０１４４】
本発明のシステムにより、炎症部位、癌組織、脳血管または肝臓等をイメージングすることができる。これらの組織は実質を含んでいてもよい。本発明のシステムにおいて使用される、標識の有無を調べる手段は、走査型顕微鏡であり得る。好ましくは、この標識の有無を調べる手段は、さらにスティック対物レンズを備える。標識の有無を調べる手段は、標識を検出可能であれば、どのような物質（例えば、蛍光、放射線、発色物質（例えば、βｇａｌ）、発行物質（例えば、ルシフェラーゼ）など）を検出する手段など）であってもよい。なぜなら、標識を検出することにより、生体の機能または構造を画像化することが可能であるからである。【０１４５】
（処置方法）
別の局面において、本発明は、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿器・生殖器系、中枢神経系、または末梢神経系の障害を有する被験体を処置するための方法を提供する。この方法は、被験体に、障害を処置するための分子イメージング剤を投与する工程を包含し、該分子イメージング剤は糖鎖修飾リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含み、該糖鎖修飾リポソームは該障害を処置するのに有効な量の薬剤を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１４６】
別の局面において、本発明は、炎症またはがんを有する被験体を処置するための方法を提供する。この方法は、被験体に、障害を処置するための分子イメージング剤を投与する工程を包含し、該分子イメージング剤は糖鎖修飾リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含み、該糖鎖修飾リポソームは該障害を処置するのに有効な量の薬剤を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１４７】
（送達方法）
別の局面において、本発明は、生物学的因子を必要とする被験体において、標的部位に該生物学的因子を送達するための方法を提供する。この方法は、本発明の糖鎖修飾リポソームを投与する工程を包含し、該糖鎖修飾リポソームは該生物学的因子の有効量を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１４８】
（製造方法）
一つの局面において、本発明は、蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法を提供する。この製造方法は、Ａ）蛍光色素をリポソームに内包したか、または結合させたリポソームを形成させる工程；Ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；Ｃ）該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程、およびＤ）該リポソームへ糖鎖を結合させる工程を包含する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１４９】
別の局面において、本発明は、糖鎖修飾リポソームを製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）脂質を、メタノール／クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；（ｂ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程；（ｃ）該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合して、蛍光標識されたリポソームを提供する工程；（ｄ）該リポソームをトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンにより親水性化処理する工程；（ｅ）該親水性化処理されたリポソームにリンカータンパク質を結合させて、リンカータンパク質結合リポソームを生成する工程；および（ｆ）該リポソームに、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程を包含する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１５０】
別の局面において、本発明は、目的の送達部位に物質（たとえば、蛍光色素、医薬）を送達するための糖鎖修飾リポソームの製造方法を提供する。この方法は、（ａ）種々の糖鎖密度を有する、該目的の送達部位への送達を達成する蛍光標識された糖鎖修飾リポソームを提供する工程であって、以下：（ｉ）脂質を、メタノール／クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；（ｉｉ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程；（ｉｉｉ）該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合する工程を包含する、工程；（ｂ）該糖鎖修飾リポソーム上の糖鎖密度について、該送達部位への最適な送達を達成する密度を決定する工程；および（ｃ）該物質（たとえば、蛍光色素、医薬）を決定された最適な糖鎖修飾リポソームに組み込んで薬物含有リポソームを生成する工程を包含する。物質（たとえば、蛍光色素、医薬）の組み込みは、例えば、封入、外表面への結合などを挙げることができる。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１５１】
（蛍光色素の結合または封入）
蛍光色素の結合または封入は、薬物をリポソーム中に結合または封入するために用いられる任意のものが使用される。例えば、（１）ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルフォスフェート（ＤＣＰ）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、コール酸ナトリウムを秤量し、メタノール・クロロホルム溶液（１：１）に懸濁させ、３７℃、１時間撹拌し；（２）クロロホルム・メタノールをロータリーエバポレーターで蒸発させ、真空乾燥させる。Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁させ、３７℃、１時間撹拌後、窒素置換し超音波処理をし、（３）超音波処理溶液と蛍光色素（例えば、ｃｙ５．５、ｃｙ３、ｃｙ７）標識ヒト血清アルブミン溶液（蛍光色素標識ＨＳＡ溶液）を混合して、限外濾過（分画分子量：１０，０００）をすることによって、蛍光色素（例えば、ｃｙ５．５、ｃｙ３、ｃｙ７）標識ＨＳＡを内包したリポソーム粒子が得られる。【０１５２】
（リポソームの製造）
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。【０１５３】
また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。本発明のリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、ホスファチジルコリン類、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはホスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。とりわけ、ホスファチジン酸類もしくはジセチルホスフェート等の長鎖アルキルリン酸塩類の配合は、リポソームを負に荷電させるために必須であり、ホスファチジルエタノールアミン類の配合は親水性化反応部位として、ガングリオシド類または糖脂質類またはホスファチジルグリセロール類の配合はリンカーの結合部位として必須のものである。ガングリオシド類、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質はリポソーム中で集合し、リンカーを結合させる足場（ラフト）として機能する。本発明のリポソームは、このようなタンパク質を結合させうるラフトが形成されることによりさらに安定化される。すなわち、本発明のリポソームは、リンカーを結合させるためのガングリオシド、糖脂質、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも、１種の脂質のラフトが形成されたリポソームを含む。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製する。本発明において使用するリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。上述のようにしてリポソームを作製した後にリポソーム表面を親水性化する。【０１５４】
本発明は、上記の親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームそのものをも包含する。このような親水性化したリポソームは、リポソーム自体の安定性が高まり、また糖鎖を結合したときに糖鎖の認識性が高まるという利点がある。本発明のリポソームは、例えば、リポソームの構成脂質が、ホスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、ホスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩およびジセチルホスフェート類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、リポソームである。【０１５５】
本発明は、さらにリポソームに上記に親水性化化合物を結合させて、リポソームを親水性化する方法をも包含する。また、糖鎖の結合していない親水性化したリポソームをも包含する。糖鎖の結合していないリポソームに糖鎖を結合することにより、本発明の標的指向性リポソームまたは腸管吸収性リポソームを製造することができる。【０１５６】
好ましくは、親水性化は以下のようにして行うことができる。（１）炭酸緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１５７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）にバッファー交換する為、限外濾過（分画分子量：３００，０００）をする。（２）架橋剤ＢＳ３（ＰＩＥＲＣＥ）を添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌する。（３）遊離のＢＳ３を除去するため、限外濾過（分画分子量：３００，０００）をする。（４）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌する。（５）遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）にバッファー交換する為に限外濾過（分画分子量：３００，０００）をする。【０１５７】
より好ましくは、親水性化は以下のようにして行うことができる。（１）炭酸緩衝液（ＣＢＳ緩衝液：５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１５７ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５））にバッファー交換する為、限外濾過（分画分子量：１００，０００、２０００×ｇで６０分間）を２回実施する。（２）架橋剤ＢＳ３（ＰＩＥＲＣＥ）を添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌する。（３）遊離のＢＳ３を除去するため、限外濾過（分画分子量：１００，０００、２０００×ｇで６０分間）を２回実施する。（４）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌する。（５）遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）にバッファー交換する為に限外濾過（分画分子量：１００，０００、２０００×ｇで６０分間）を２回実施する。【０１５８】
１つの実施形態において、本発明の製造方法は、ａ）リンカータンパク質が結合した蛍光を内包したリポソームを提供する工程；ｂ）該リポソームを親水性化処理する工程；ｃ）３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）を該リポソームに結合させる工程；およびｄ）該リポソームにおける該リンカータンパク質へ糖鎖を結合させて、該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程を包含し、該ｂ）〜ｃ）工程は任意の順で実施され得る。この実施形態は、ｅ）該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを親水性化する工程；ｆ）該親水性化した該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液をフィルター濾過する工程をさらに包含し得る。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１５９】
好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、前記ａ）工程の次に順に前記ｃ）工程および前記ｂ）工程を行うことによって実施され得る。【０１６０】
１つの実施形態において、本発明の製造方法は、該ｃ）工程が、（ｃ１）架橋剤（例えば、３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート））を含む粉体Ａに、炭酸緩衝液を含む溶液Ａを添加して溶解し、混合溶液を調製する工程；および（ｃ２）リポソームを含む溶液に、該混合溶液を添加し、室温で、１６〜２０時間攪拌し、分画分子量３０，０００で限外濾過し、脱塩して、３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）の結合した蛍光内包型リポソームを含む溶液を調製する工程を包含し、該ｂ）工程が、（ｂ１）該蛍光内包型リポソームを含む溶液を濃縮し、濃縮された該蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該溶液Ａを添加する工程；および（ｂ２）該溶液Ａが添加された該蛍光内包型リポソームを含む混合溶液を、分画分子量３００，０００で遠心分離にかけて限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた混合溶液に該溶液Ａを添加して、親水性化された該蛍光内包型リポソームを調製する工程を包含し、前記ｄ）工程が、（ｄ１）所望の糖鎖を精製水に完全に溶解し、１〜１０ｍＭ濃度（好ましくは、５ｍＭ濃度）の糖鎖溶液を調製する工程；（ｄ２）必要に応じて、該糖鎖水溶液に、炭酸水素アンモニウム（ｐＨ  ７〜１４）を約０．２〜１．０ｇ／ｍＬ濃度（好ましくは、０．６ｇ／ｍＬ濃度）で添加し、２０〜４０℃（好ましくは、３７℃）で３〜７日間（好ましくは、３日間）攪拌させて、冷蔵（例えば、約２〜８℃）下で、２０〜６０分間（好ましくは、３０分間）インキュベートし、濾過フィルターで濾過して、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程；（ｄ３）該親水性化された蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、混合した後、室温（例えば、約１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の範囲）で２〜６時間（好ましくは、２  時間）反応させて反応溶液工程；および（ｄ４）該（ｄ３）工程によって得られた該反応溶液に、トリス緩衝液を含む溶液Ｂを添加し、室温（例えば、約１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の範囲）下で、２〜６時間（好ましくは、２時間）攪拌し、さらに、冷蔵（例えば、１〜１０℃、好ましくは２〜８℃）下で、１６〜４８時間（好ましくは、１６〜２０時間）攪拌し、分画分子量３０，０００で限外濾過し、脱塩させて、前記蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程を包含し、前記ｅ）工程が、（ｅ１）該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液を濃縮し、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液を含む溶液Ｃを添加し、分画分子量３０，０００で限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液に該Ｃ溶液を添加して、該糖鎖が結合した蛍光内包型リポソームを親水性化する工程を包含し得る。糖鎖に既に一級アミノ基が存在する場合には、該（ｄ２）のアミノ化糖鎖溶液を調製する工程は省略され得る。アミノ化反応を行う場合、糖鎖を溶解させる緩衝液は、一級アミノ基を有しさえしなければ、どのような緩衝液であってもよい。一級アミノ基を含む緩衝液に糖鎖を溶解すると、リポソームに対する糖鎖の結合が妨げられるからである「冷蔵」とは約１〜１２℃、好ましくは約２〜８℃の範囲の温��をいう。【０１６１】
本方法において使用されるトリス緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアンモニウム（Ｔｒｉｓ−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）を塩基成分に用いた緩衝液であり、例えば、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液等が使用され得る。【０１６２】
本方法において使用され得る糖鎖は、例えば、シアリルルイスＸ、Ｎ−アセチルラクトサミン、α１−６マンノビオースなどが挙げられるが、これらに限定されない。糖鎖は、好ましくは、シアリルルイスＸであり得る。【０１６３】
別の実施形態において、本発明の方法により使用され得る糖鎖は、グリコシルアミノ化反応の可能な糖鎖であり得る。【０１６４】
糖鎖の添加量は、リポソーム溶液１ｍＬあたり約１〜２５０μＬの範囲であり得る。好ましくは、リポソーム溶液１ｍＬあたり約２．５〜１２５μＬであり得る。炎症系に特異的な糖鎖を用いる場合、好ましくは、糖鎖は、終濃度５ｍＭで添加され得る。【０１６５】
（蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキット）
一つの局面において、本発明は、蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットを提供する。このキットは、i）蛍光色素（例えば、ｃｙ５．５、ｃｙ３、ｃｙ７等）をリポソームに内包させるか、または結合させる手段；ii）該リポソームの親水性化剤；iii）該リポソームのリンカータンパク質、およびiv）糖鎖；v）該糖鎖を該リポソームに結合させる手段を備える。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。【０１６６】
別の局面において、本発明は、蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットを提供する。このキットは、（Ａ）リンカータンパク質を結合したリポソームを含む溶液；（Ｂ）架橋剤（例えば、３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）等）を含む粉体Ａと；（Ｃ）炭酸緩衝液を含む溶液Ａと；（Ｄ）トリス緩衝液を含む溶液Ｂと；（Ｅ）ＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液Ｃとを備える。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の（糖鎖修飾リポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。本キットにおいて使用されるトリス緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアンモニウム（Ｔｒｉｓ−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）を塩基成分に用いた緩衝液であり、例えば、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液等が使用され得る。【０１６７】
本発明において使用される場合、「冷蔵（下）」とは、約１℃〜約１２℃、好ましくは約２℃〜約８℃の範囲の温度をいう。本発明において使用される場合、「室温」とは、約１５℃〜約３０℃、好ましくは約２０℃〜約２５℃の範囲の温度をいう。【０１６８】
（糖鎖の合成）
本発明の糖鎖修飾リポソームに使用され得る糖鎖は、一般的な糖鎖合成方法によって合成され得る。これらの方法としては、（１）化学合成による方法、（２）遺伝子組換え細胞あるいは微生物による発酵法、（３）糖加水分解酵素（グリコシダーゼ）を用いて合成する方法、（４）糖転移酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）を用いて合成する方法が挙げられる。（ＷＯ２００２／０８１７２３、特開平９−３１０９５公報、特開平１１−４２０９６公報、特開２００４−１８０６７６公報、畑中研一、西村紳一郎、大内辰郎および小林一清（１９９７）糖質の科学と工業、講談社、東京などを参照のこと）。【０１６９】
本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて使用される糖鎖は、上記の方法により合成された糖鎖であっても、市販の糖鎖であってもよい。【０１７０】
（リポソームへの糖鎖の結合）
本発明においては、上記のようにして作製したリポソームに、上記の糖鎖のいずれかを直接結合させてもよいし、さらに、リンカーを介して糖鎖を結合させてもよい。この際、リポソームに結合させる糖鎖の種類は１種類に限らず、複数の糖鎖を結合させてもよい。この場合の複数の糖鎖は同じ組織または器官の細胞表面に共通して存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する複数の糖鎖であってもよいし、異なる組織または器官の細胞表面に存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する糖鎖であってもよい。前者のような複数の糖鎖を選択することにより、特定の標的組織または器官を確実に指向することができ、後者のような複数の糖鎖を選択することにより、１種類のリポソームに複数の標的を指向させることができ、マルチパーパスな標的指向性リポソームを得ることができる。【０１７１】
なお、糖鎖をリポソームに結合させるには、リポソームの製造時にリンカーおよび／または糖鎖を混合し、リポソームを製造させつつ糖鎖をその表面に結合させることも可能であるが、あらかじめリポソーム、リンカーおよび糖鎖を別途準備し、製造が完了したリポソームにリンカーおよび／または糖鎖を結合させたほうが望ましい。これは、リポソームにリンカーおよび／または糖鎖を結合させることにより、結合させる糖鎖の密度を制御できるからである。糖鎖のリポソームヘの直接結合は、以下に述べるような方法で行うことができる。【０１７２】
糖鎖を糖脂質として混合してリポソームを製造するか、製造後のリポソームのリン脂質に糖鎖を結合するとともに糖鎖密度を制御する。リンカーを用いて糖鎖を結合させる場合、リンカーとしては、生体由来のタンパク質、特にヒト由来タンパク質を用いるのが好ましい。生体由来のタンパク質は限定されないが、アルブミン等の血液中に存在するタンパク質、その他生体に存在する生理活性物質等が挙げられる。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。本発明のリポソームは、非常に安定であり、リポソームを形成した後にタンパク質を結合させたり、リンカーを結合させたり、糖鎖を結合させるという後処理が可能である。従って、リポソームを大量に製造した後に、目的に応じてそれぞれ異なるタンパク質を結合させたり、リンカーや糖鎖を結合させることにより、目的に応じた種々のリポソームを製造することが可能である。【０１７３】
本発明のリポソームには、糖鎖がリンカーを介して、あるいはリポソームを構成する脂質に直接結合している。本発明のリポソームは、糖脂質や糖タンパク質等の複合糖質型リガンドを有し、低分子化合物で親水化処理されているリポソームである。【０１７４】
また、後述のように、本発明の標的指向性リポソームを医薬として用いる場合、該リポソームは医薬効果を有する化合物を含んでいる必要がある。該医薬効果を有する化合物は、リポソーム中に封入させるか、あるいはリポソーム表面に結合させればよいが、リンカーとして、医薬効果を有するタンパク質を用いてもよい。この場合、タンパク質がリポソームと糖鎖を結合させるためのリンカーおよび医薬効果を有するタンパク質を兼ねることもある。薬効を有するタンパク質としては、生理活性タンパク質等が挙げられる。【０１７５】
本発明の糖鎖修飾リポソームの作製において、リポソームとリンカーとを結合させる際には、架橋基が使用され得る。【０１７６】
リンカーを介して糖鎖をリポソームへ結合させるには以下に述べる方法で行えばよい。【０１７７】
まずリポソーム表面にタンパク質を結合させる。リポソームを、ＮａＩＯ４、Ｐｂ（Ｏ２ＣＣＨ３）４、ＮａＢｉＯ３等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ４等の試乗を用いて、リンカーとリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカーも、親水性化するのが好ましく、これにはリンガータンパク質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルホスクシンイミジルスベラート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスベラート、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート、エチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート等の２価試薬を用いて、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物をリポソーム上のリンカーと結合させればよい。【０１７８】
これを具体的に述べると、まず、リンカーのすべてのアミノ基に架橋用２価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋２価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。糖鎖および／または親水性化合物とリポソームとの共有結合、または糖鎖および／または親水性化合物とリンカーとの共有結合は、リポソームが細胞内に取り込まれたときに切断することも可能である。例えば、リンカーと糖鎖がジスルフィド結合を介して共有結合されている場合、細胞内で還元されて糖鎖が切断される。糖鎖が切断されることによりリポソーム表面が疎水性になり、生体膜と結合し膜安定性が乱れリポソーム中に含まれる薬剤が放出される。【０１７９】
次に、このようにして得られる糖鎖修飾リポソーム膜面上タンパク質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の２価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上タンパク質に結合している２価試薬の未反応末端とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物との結合反応を行い、リポソーム表面全体を親水性化する。リポソーム表面およびリンカーの親水性化は、各種組織への移行性、および血中における滞留性および各種組織への移行性を向上させる。これは、リポソーム表面およびリンカー表面が親水性化されることによって、糖鎖以外の部分が、各組織等においてはあたかも生体内水分であるかのようにみえ、これにより、標的以外の組織等に認識されず、糖鎖のみがその標的組織のレクチン（糖鎖認識タンパク質）により認識されることに起因するものと思われる。【０１８０】
好ましくは、リンカーは以下のようにしてリポソームに結合させる。（１）メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を添加し、冷蔵下、一晩撹拌し、リポソーム粒子表面を酸化する。（２）遊離のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）にバッファー交換する為に、限外濾過（分画分子量：３００，０００）をする。（３）ＨＳＡ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して室温で２時間反応させた溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌する。（４）遊離のシアノホウ素酸ナトリウム、ＨＳＡを除去し、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）にバッファー交換する目的で、限外濾過（分画分子量：３００，０００）をする。これにより、リンカーをリポソーム結合させることができる。【０１８１】
好ましくは、リンカーは以下のようにしてリポソームに結合させる。（１）メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を添加し、冷蔵下、一晩撹拌し、リポソーム粒子表面を酸化する。（２）遊離のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）にバッファー交換する為に、限外濾過（分画分子量：３００，０００）をする。（３）ＨＳＡ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して室温で２時間反応させた後、冷蔵下、一晩撹拌する。（４）遊離のＨＳＡを除去し、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）にバッファー交換する目的で、限外濾過（分画分子量：３００，０００）をする。これにより、リンカーをリポソーム結合させることができる。【０１８２】
より好ましくは、リンカーは以下のようにしてリポソームに結合させる。（１）メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を添加し、冷蔵下、一晩撹拌し、リポソーム粒子表面を酸化する。（２）遊離のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）にバッファー交換する為に、限外濾過により１／５〜１／１０倍量まで濃縮し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え元の容量に合わせる。この操作を２回繰り返す。（３）ＨＳＡ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して室温で２時間反応させた後、シアノホウ素酸ナトリウム／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して、室温で２時間の後、さらに冷蔵下で、一晩撹拌する。（４）遊離のシアノホウ素酸ナトリウム、ＨＳＡを除去し、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）にバッファー交換する目的で、限外濾過により１／５〜１／１０倍量まで濃縮し、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加え元の容量に合わせる。この操作を２回繰り返す。これにより、リンカーをリポソーム結合させることができる。【０１８３】
より好ましくは、リンカーは以下のようにしてリポソームに結合させる。（１）メタ過ヨウ素酸ナトリウム／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を添加し、冷蔵下、一晩撹拌し、リポソーム粒子表面を酸化する。（２）遊離のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）にバッファー交換する為に、限外濾過により１／５〜１／１０倍量まで濃縮し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え元の容量に合わせる。この操作を２回繰り返す。（３）ＨＳＡ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して室温で２時間反応させ、さらに冷蔵下で、一晩撹拌する。（４）炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）にバッファー交換する目的で、限外濾過により１／５〜１／１０倍量まで濃縮し、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加え元の容量に合わせる。この操作を２回繰り返す。これにより、リンカーをリポソーム結合させることができる。【０１８４】
次いで、糖鎖をリポソーム上のリンカーに結合させる。これには、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＮＨ２ＣＯＯＮＨ４等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルホスクシンイミジルスベラート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスベラート、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート、エチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート等の２価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカーと、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させてリポソームを得る。なお、これらの糖鎖は市販されている。【０１８５】
好ましくは、糖鎖のリポソーム上のリンカーへの結合は以下のように行うことができる。（１）糖鎖を精製水に溶解し、炭酸水素アンモニウム飽和下で３７℃、３日間反応させる。（アミノ化糖鎖溶液）。（２）リポソーム溶液に架橋剤  ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）を添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌する。（３）遊離のＤＴＳＳＰを除去するため、限外濾過（分画分子量：３００，０００）をする。（４）アミノ化糖鎖溶液を添加して、室温で２時間反応させた後、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、冷蔵下、一晩撹拌する。（５）遊離の糖鎖とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）にバッファー交換するため、限外濾過（分画分子量：３００，０００）をする。これにより、糖鎖のリポソーム上のリンカーへの結合が達成され得る。【０１８６】
リポソーム形成と蛍光（例えば、ｃｙ５．５、Ｃｙ３、Ｃｙ７など）標識ＨＳＡの内包（工程Ａ）；リポソームの親水性化処理（工程Ｂ）；リポソームとＨＳＡの結合（工程Ｃ）およびリポソームへの糖鎖の結合（工程Ｄ）に引き続いて０．４５μｍフィルター濾過をすることによって、仕上げることができる。【０１８７】
本発明のリポソーム、糖鎖修飾リポソームのタンパク質量は、例えば、リポソームに内包されたＨＳＡ量とリポソーム表面にカップリングしたＨＳＡの総タンパク質量をＢＣＡ法により測定することができる。【０１８８】
【化２６】
2007091661.tif 000023
【０１８９】
タンパク質量の測定は、例えば、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（カタログ番号２３２３５ＢＮ）（ＰＩＥＲＣＥ  Ｃｏ．ＬＴＤ）などを用いることができる。標準物質として、２ｍｇ／ｍｌアルブミン（ＢＳＡ）を使用し得る。（１）スタンダード溶液として、標準物質（２ｍｇ／ｍｌ：アルブミン）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．２５、０．５、１、２、３、４、５μｇ／５０μｌ溶液を調製する。（２）Ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームをＰＢＳ緩衝液で２０倍希釈し、検体溶液を調製する。（３）スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に５０μｌ分注する。（４）各試験管に３％ラウリル硫酸ナトリウム溶液（ＳＤＳ溶液）を１００μｌ添加する。（５）キットに添付された試薬Ａ、Ｂ、Ｃを、試薬Ａ：試薬Ｂ：試薬Ｃ＝４８：２：５０となるように混合し、各試験管に１５０μｌ添加する。（６）この試験管を、６０℃で１時間、静置する。（７）室温に戻ってから、吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのタンパク質量を測定する。検量線の一例を図３２に示す。【０１９０】
本発明の糖鎖修飾リポソームのタンパク質量は、例えば、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。Ｃｙ３により標識された糖鎖修飾リポソームのタンパク質量は、例えば、０．２４ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。Ｃｙ５．５により標識された糖鎖修飾リポソームのタンパク質量は、例えば、０．４５ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。Ｃｙ７により標識された糖鎖修飾リポソームのタンパク質量は、例えば、０．２０ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。【０１９１】
本発明のリポソーム、糖鎖修飾リポソームの構成脂質量は、例えば、コレステロール量を定量することにより算出することができる。【０１９２】
＜脂質定量の原理＞【０１９３】
【化２７】
2007091661.tif 000024
【０１９４】
脂質の定量には、例えば、デタミナーＴＣ５５５キット（カタログ番号ＵＣＣ／ＥＡＮ１２８）（ＫＹＯＷＡ  Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いることができる。標準物質として、キットに添付されている５０ｍｇ／ｍｌ  コレステロールを使用する。（１）スタンダード溶液として、標準物質（５０ｍｇ／ｍｌ：コレステロール）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０μｇ／２０μｌ溶液を調製する。（２）Ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームをＰＢＳ緩衝液で５倍希釈し、検体溶液を調製する。（３）スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に２０μｌ分注する。（４）各試験管に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１０％溶液）を１７μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、４０分間、静置する。（５）デタミナーＴＣ５５５キットの酵素試薬を３００μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、２０分間、静置する。（６）吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線（検定線の一例を図３３に示す。）を作成して、リポソームのコレステロール量を測定し、脂質量を求める。【０１９５】
コレステロール量から脂質量を求める換算式は、例えば、以下のように表される。
脂質量（μｇ／５０μｌ）＝コレステロール量（μｇ／５０μｌ）×４．５１（換算係数）
リポソーム中の脂質に対するタンパク質の割合は、例えば、上述のタンパク質定量および脂質定量の結果から導くことができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、好ましくは、脂質に対するタンパク質の割合が、約０．１から約０．５である。【０１９６】
本発明の糖鎖修飾リポソームの脂質量は、例えば、１〜４ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。Ｃｙ３により標識された糖鎖修飾リポソームの脂質量は、例えば、１．２ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。Ｃｙ５．５により標識された糖鎖修飾リポソームの脂質量は、例えば、１．４ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。Ｃｙ７により標識された糖鎖修飾リポソームの脂質量は、例えば、２．１ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。【０１９７】
本発明のリポソーム、糖鎖修飾リポソームの粒子径分布および粒子径は、例えば、リポソーム粒子を精製水で５０倍に希釈して、ゼータサイザーナノ（Ｎａｎ−ＺＳ：ＭＡＬＶＥＲＮ  Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いて測定することができる。粒子径分布の一例を図３４に示す。【０１９８】
本発明のリポソーム、糖鎖修飾リポソームは、粒度分布の最大域において、約８０ｎｍ〜約１６５ｎｍの粒子径を有することが好ましい。なぜなら、約８０ｎｍ〜約１６５ｎｍの粒子径は、マクロファージなどの免疫系細胞の認識を回避でき、そして肝臓や脾臓の内皮細網系（ＲＥＳ）からの取り込みをある程度回避することができるからである。約８０ｎｍ〜約１６５ｎｍの粒子径の糖鎖修飾リポソームは、薬物を内包させ、その薬物を標的臓器、疾患部分に送達させるのに適している。【０１９９】
本発明のリポソーム、糖鎖修飾リポソームは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍの平均粒子径を有し、好ましくは、約６５ｎｍ〜約１６５ｎｍ、より好ましくは、約１００ｎｍの粒子径を有する。なぜなら、リポソームの粒子径が小さすぎると、肝臓・脾臓の細胞内皮系に非特異的に入り、粒子径が大きすぎると、マクロファージなどの免疫系細胞に貪食されやすくなるからである。また、本発明のリポソームは、負に荷電していることが望ましい。負に荷電していることにより、生体中の負に荷電している細胞との相互作用を防ぐことができる。本発明のリポソーム表面のゼ−タ電位は、生理食塩水中において、３７℃で、−５０〜１０ｍＶ、好ましくは−４０〜０ｍＶ、さらに好ましくは−３０〜−１０ｍＶである。リポソーム表面のゼータ電位は、２５℃で、−１２０ｍＶ〜−３０ｍＶであり得るが、これらに限定されない。好ましくは、２５℃で、−３０ｍＶ未満である。リポソーム表面のゼータ電位は、−１２０ｍＶ（２５℃）未満であっても、−３０ｍＶ以上であってもよい。なぜなら、リポソーム間の凝集が生じさえしなければよいからである。【０２００】
本発明の糖鎖修飾リポソームに含ませる薬剤としては、アルキル化系抗癌剤、代謝拮抗剤、植物由来抗癌剤、抗癌性抗生物質、ＢＲＭ・サイトカイン類、白金錯体系抗癌剤、免疫療法剤、ホルモン系抗癌剤、モノクローナル抗体等の腫瘍用薬剤、中枢神経用薬剤、末梢神経系・感覚器官用薬剤、呼吸器疾患治療薬剤、循環器用薬剤、消化器官用薬剤、ホルモン系用薬剤、泌尿器・生殖器用薬剤、ビタミン・滋養強壮剤、代謝性医薬品、抗生物質・化学療法薬剤、検査用薬剤、抗炎症剤、眼疾患薬剤、中枢神経系薬剤、自己免疫系薬剤、循環器系薬剤、糖尿病、高脂血症のような生活習慣病薬剤、副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、抗サイトカイン抗体、抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、アンチセンスＯＤＮまたはＤＮＡのような遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子、抗体医薬、分子標的薬、骨粗鬆症・骨代謝改善薬、神経ペプチド、生理活性ペプチド・タンパク質等が挙げられる。例えば、腫瘍用薬剤として、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、プルスファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニートール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウムなどのアルキル化剤、メルカプトプリン、チオイノシン（メルカプトプリンリボシド）、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、塩酸アンシタビン（塩酸サイクロシチジン）、フルオロウラシル、５−ＦＵ、テガフール、ドキシフルリジン、カルモフールなどの代謝拮抗剤、エトポシド、硫酸ビンプラスチン、硫酸ピンクリスチン、硫酸ビンデシン、パクリタキセル、タキソール、塩酸イリノテカン、塩酸ノギテカンなどのアルカロイド等の植物由来抗癌剤、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン（アクラシノマイシンＡ）、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチンなどの抗癌性抗生物質、その他、塩酸ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトン、塩酸プロカルバジン、クエン酸タモキシフェン、ウベニメクス、レンチナン、シゾフィラン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ホスフェストロール、メピチオスタン、エピチオスタノール等がある。本発明において、上述の薬剤にはその誘導体も包含される。【０２０１】
上述のような薬剤を含ませることにより、本発明のリポソームを、癌、炎症等の疾患の治療に用いることができる。ここで、癌は、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。本発明の糖鎖修飾リポソームにこれらの薬剤を含ませて投与した場合、薬剤を単独で投与した場合に比較し、薬剤が癌、炎症部位に集積する。単独投与の場合に比べ、２倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、特に好ましくは５０倍以上集積し得る。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを結合させたリポソーム（基準リポソーム）を投与した場合と比較すると、３〜４倍、好ましくは４〜６倍集積し得る。【０２０２】
本発明の糖鎖修飾リポソームは、上述のように薬剤を封入することにより様々な疾患の治療に用いることができる。薬剤封入糖鎖修飾リポソームは、静脈注射によっても、経口投与によっても投与することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、経口投与した場合の臓器への送達についても、経口投与により血中に移行した媒体は静脈注射と同様の傾向を示す。【０２０３】
なお、医薬効果を有する化合物は、リポソームの中に封入させてもよいし、リポソーム表面に結合させてもよい。例えば、タンパク質は上記のリンカーの結合方法と同じ方法で表面に結合させることが可能であり、他の化合物もその化合物が有する官能基を利用することにより、公知の方法で、結合させることができる。また、リポソーム内部への封入は、以下の方法により行う。リポソームへ薬剤等を封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、薬剤等の含有溶液とホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはホスファチジルグリセロール類およびコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。【０２０４】
したがって、本発明のリポソームに、治療あるいは診断に供しうる薬剤あるいは遺伝子を封入することによって得られるリポソーム製剤は、ガン組織、炎症組織、各種組織への移行性が選択的に制御されたものであり、治療薬剤あるいは診断剤の標的細胞、組織への集中による効力の増強あるいは他の細胞、組織に対する薬剤の取り込みの減少による副作用の軽減化等を図れるものである。【０２０５】
また、本発明の分子イメージング剤を診断用に用いる場合は、リポソームに蛍光色素、放射性化合物等の標識化合物を結合させる。該標識化合物結合リポソームが患部に結合し、標識化合物が患部細胞に取り込まれ、該標識化合物の存在を指標に疾患を検出・診断することができる。【０２０６】
（保健・食品）
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。好ましくは、本発明の糖鎖修飾リポソームに機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品を封入または結合させたものを食品組成物として用いることができる。本発明で用い得る機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品に限定はなく、摂取されて食品機能を有効に発現するように設計され、加工変換された食品ならばいずれのものも含まれる。【０２０７】
例えば、イチョウ葉、エキナシア、ノコギリヤシ、セントジョーンズワート、バレリアン、ブラックコホッシュ、ミルクシスル、月見草、ブドウ種子エキス、ビルペリー、ナツシロギク、当帰、大豆、フランス海岸松、ガーリック、高麗ニンジン、茶、ショウガ、アガリクス、メシマコブ、紫イペ、アクティブヘミセルロースコンパウンド（Ａｃｔｉｖｅ−Ｈｅｍｉ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−Ｃｏｍｐｏｕｎｄ：ＡＨＣＣ）、酵母ベータグルカン、マイタケ、プロポリス、ビール酵母、穀類、梅、クロレラ、大麦若葉、青汁、ビタミン類、コラーゲン、グルコサミン、桑葉、ルイボス茶、アミノ酸、ローヤルゼリー、シイタケ菌糸体エキス、スピルリナ、田七ニンジン、クレソン、植物発酵食品、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサぺンタエン酸（ＥＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、昆布、キャベツ、アロエ、メグスリノ木、ホップ、カキ肉エキス、ピクジエノール、ゴマ等が本発明に用い得る機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品として例示できる。これらは、そのままリポソームに含ませてもよいし、抽出物等の処理物を含ませてもよい。リポソームを含む食品組成物は、経口摂取される。用いるリポソームは、糖鎖が結合していなくてもよく、また腸管吸収を高める糖鎖または特定の組織もしくは器官を標的とした糖鎖が結合していてもよい。本発明のリポソームを食品組成物として投与する場合は、液体飲料、ゲル状食品、固形食品等の食品に加工すればよい。また、錠剤、顆粒等に加工してもよい。本発明の食品組成物は、リポソームが含む食品の種類に応じた機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品として用いることができる。【０２０８】
例えば、ＤＨＡを含むリポソームは、軽度老人性痴呆症や記憶改善に効果のある機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品として用いることができる。【０２０９】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。【０２１０】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。【０２１１】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。
【実施例】
【０２１２】
（実施例１．リポソームの調製）
リポソームは既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、クロロホルム／メタノール（１：１）溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ  ８．４）３ｍｌに再懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ  ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ均一リポソーム（平均粒子径１００ｎｍ）１０ｍｌを調製した。【０２１３】
（実施例２．リポソーム脂質膜面上の親水性化処理）
実施例１で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。その後、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけた。次に、炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）１ｍｌに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えた。次いで、この溶液を、室温で２時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。【０２１４】
（実施例３．リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合は、既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、はじめに、実施例２で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ  ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加え、冷蔵下で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換して、酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を加えて室温で２時間反応させ、次に２Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）１００μｌを加えて室温で２時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換して、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。【０２１５】
（実施例４．糖鎖の調製）
以下の表２Ｂに示される糖鎖を使用した。【０２１６】
各糖鎖の質量を計測し、以下の実施例５において使用するための前処理をした。２つ以上の糖鎖の組み合せを使用する場合、各糖鎖を混合する。【０２１７】
【表２】
2007091661.tif 000025
【０２１８】
2007091661.tif 000026
【０２１９】
（実施例５．リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への糖鎖の結合）
実施例４において調製した各糖鎖２ｍｇを精製水に溶解し、０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物４ｍｇ／ｍｌ（アミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１０ｍｌに架橋試薬３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物（アミノ化糖鎖溶液）１２．５、３７．５、１２５、２５０、５００、１２５０、２５００μｌを加えて、室温で２時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した。その結果、表２Ｂに示される糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各１０ｍｌ（総脂質量２６ｍｇ、総蛋白量１．５ｍｇ、平均粒子径１００ｎｍ）が得られた。
（調製例１．リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの結合）
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例３で得たリポソーム液の一部分１０ｍｌに架橋試薬３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム液にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｗａｋｏ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）２６．４ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌し、その後冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの結合を行った。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）した。この工程で既に大過剰である２６．４ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが存在するのでリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理も同時に完結した。０．４５μｍのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム（略称：ＴＲＩＳ）１０ｍｌ（総脂質量２６ｍｇ、総蛋白量１．５ｍｇ、平均粒子径１００ｎｍ）が得られた。【０２２０】
（実施例６．リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理）
実施例５の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のＨＳＡタンパク質表面の親水性化処理を行った。糖鎖修飾リポソーム１０ｍｌに、別々に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２６．４ｍｇを加えて、室温で２時間、その後冷蔵下で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）し未反応物を除去した。０．４５μｍのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖修飾リポソーム複合体各１０ｍｌ（総脂質量２６ｍｇ、総蛋白量１．５μｇ、平均粒子径１００ｎｍ）を得た。【０２２１】
（実施例７．蛍光色素を内包するリポソームの調製）
（ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミン溶液の調製）
ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）、（２ｍｌ）にｃｙ５．５／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液（２ｍｇ／ｍｌ）、（２．５ｍｌ）を混合して、３７℃で３時間撹拌した。この混合溶液を、分画分子量１０，０００、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液で限外濾過し、遊離のｃｙ５．５を除去し、ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミン溶液を調製した。【０２２２】
リポソームは既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、クロロホルム／メタノール（１：１）溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝生理食塩液（ｐＨ８．４）３ｍｌに再懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液３ｍｌを得た。この超音波処理したミセル懸濁液にＨＳＡ緩衝液（ｐＨ８．４）で０．２ｍｇ／１ｍｌになるよう完全に溶解したｃｙ５．５標識ＨＳＡ溶液を撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、この蛍光色素入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＴＡＰＳ緩衝生理食塩液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ均一な蛍光色素を内包するリポソーム粒子懸濁液１０ｍｌを調製した。【０２２３】
得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の蛍光色素を内包するリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は約６５ｎｍ〜約１２５ｎｍ、ゼータ電位は−４０〜−７０ｍＶであった。【０２２４】
（実施例８．蛍光色素を内包するリポソーム脂質膜面上の親水性化処理）
実施例７で調製した蛍光色素を内包するリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。その後、さらに７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけた。次に、炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）１ｍｌに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えた。次いで、この溶液を、室温で２時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。【０２２５】
（実施例９．蛍光色素を内包するリポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合は、既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、はじめに、実施例２で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ  ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム１０．８ｍｇを加え、７℃で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換して、酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を加えて室温で２時間反応させ、次に２Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）１００μｌを加えて室温で２時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換して、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。【０２２６】
（実施例１０．糖鎖の調製）
実施例４と同様の手順により糖鎖を調製した。【０２２７】
（実施例１１．蛍光色素を内包するリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への糖鎖の結合とリンカータンパク質（ＨＳＡ）の親水性化処理）
実施例１０において調製した各糖鎖２ｍｇを精製水に溶解し、０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物４ｍｇ／ｍｌ（アミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、実施例９で得たリポソーム液の一部分１０ｍｌに架橋試薬３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物（アミノ化糖鎖溶液）１２．５、３７．５、１２５、２５０、５００、１２５０、２５００μｌを加えて、室温で２時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した。その結果、表２Ｂに示される糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各１０ｍｌ（総脂質量３８ｍｇ、総蛋白量１５ｍｇ、平均粒子径１００ｎｍ）が得られた。【０２２８】
得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の蛍光色素を内包するリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定した結果、粒子径は約６５ｎｍ〜約１２５ｎｍ、ゼータ電位は−４０〜−７０ｍＶであった。【０２２９】
（実施例１２．リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理）
実施例１１の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、以下の手順によりリポソーム上のＨＳＡタンパク質表面の親水性化処理を行った。糖鎖修飾リポソーム１０ｍｌに、別々に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２６．４ｍｇを加えて、室温で２時間、その後冷蔵下で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、未反応物を除去した。０．４５μｍのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖修飾リポソーム複合体各１０ｍｌ（総脂質量３８ｍｇ、総蛋白量１５ｍｇ、平均粒子径１００ｎｍ）を得た。【０２３０】
（実施例１３．担癌マウスでのインビボイメージング）
（担癌マウスの作製）
マウス（ｄｄｙＹ、雄性、７週齢）の右大腿部皮下に、Ｅｈｒｌｉｃｈ  ａｓｃｉｔｅ
ｔｕｍｏｒ（ＥＡＴ）細胞を５×１０６細胞移植し、７〜１０日後に実験に使用した。【０２３１】
（評価方法）
１／１０  ネンブタール溶液を担癌マウスの腹腔内に３００μｌ投与して麻酔をかけた。蛍光イメージング装置  ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により投与前の画像データを取った。尾静脈より、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）（２００μｌ：脂質量７５０μｇ相当）を投与して、投与直後の画像データを取った。【０２３２】
コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソーム粒子を同量投与した。経時的に画像データをとった。画像データは、すべて腹側より撮影した。【０２３３】
（結果）
図１に示されるように、リポソーム投与直後では糖鎖のあるなしの差は見られないが、１日後には糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）が糖鎖なしよりも強く腫瘍部位に集積した。２日後では、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は有意に腫瘍部位に集積することが確認できた。この結果から、Ｋ１−３リポソームによる腫瘍部位のイメージングが可能であることがわかった。リポソーム投与量を２００μｌから５０μｌと１／４にすると、バックグラウンドが下がり８時間後でも糖鎖結合リポソ−ムは腫瘍部位に集積しているのが確認できた。１日後ではさらに明確に腫瘍部位での糖鎖なしとの差が見られた。この結果から、Ｋ１−３リポソームによる腫瘍部位のイメージングが少量で、しかも短時間に可能であることがわかった（図２）。リポソーム投与量２００μｌの場合、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）の集積は投与２日後が最大となり、その後徐々にシグナルが弱くなっていくのが確認できた。一方、糖鎖なしリポソームでは大きな変化は見られなかった。この結果から、Ｋ１−３リポソームが腫瘍部位において代謝されている様子をイメージングによりリアルタイムで見ることができることがわかった（図３）。【０２３４】
図４に示すように、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ３）は腫瘍部位に集積するが、糖鎖なしよりも腫瘍部位が弱いシグナルとなった。また、１日後までは腫瘍部位に徐々に集積しているが、２日後、３日後と増減なく変化がなかった。この結果は、腫瘍部位のイメージングにはＫ３−３リポソームではなくＫ１−３リポソームが最適であり、また糖鎖の特異性を示した。【０２３５】
（実施例１４．慢性関節リウマチモデルマウスを用いた実験）
（ヒト慢性関節リウマチモデルマウスの作製）
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ，雌性、８週齢）に関節炎惹起用モノクロナール抗体（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）を２００μｌ（２ｍｇ）、尾静脈投与した。投与２〜５日後、ＬＰＳ（リポポリサッカリド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ））を１００μｌ（５０μｌ）をマウス腹腔内に投与した。マウスは、投与３〜４日後に関節炎を発症した。【０２３６】
（評価方法）
１／１０  ネンブタール溶液を関節炎マウスの腹腔内に２００μｌ投与して麻酔をかけた。蛍光イメージング装置  ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により投与前の画像データを取った。尾静脈より、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１，Ｋ２）（５０μｌ：脂質量１９０μｇ）を投与して、投与直後の画像データを取った。コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した。経時的に画像データをとった。画像データは、すべて背中側より後ろ足を撮影した。【０２３７】
（結果）
図５に示すように、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）投与１日後に炎症部位に集積していることが確認できた。その後、２日後、３日後と徐々にシグナルは弱くなっていった。この結果から、Ｋ１−３リポソームによる炎症部位のイメージングが可能であることがわかった。また、炎症部位に集積したＫ１−３リポソームの代謝される様子が、イメージングによりリアルタイムで見ることができることがわかった。  図６に示すように、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）投与１日後に炎症部位に集積していることが確認できた。その後、図５と同様に、２日後とシグナルは弱くなっていった。この結果は、Ｋ１−３リポソームによる炎症部位のイメージングと特異性の再現性を示した。【０２３８】
図７に示すように、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）において、リポソームの表面に結合している糖鎖の密度を変え炎症部位への集積量を比較したところ、Ｋ１−３が最も集積していた。Ｋ１−４もＫ１−３ほど顕著ではないが炎症部位に集積した。Ｋ１−５、Ｋ１−６と密度を高めると糖鎖なしリポソーム以上に炎症部位のシグナルが弱かった。この結果から、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）による炎症部位のイメージングには、Ｋ１−３、Ｋ１−４などリポソーム表面に結合している糖鎖の密度が低い方が適していることがわかった。また、リポソーム表面の糖鎖の修飾結合密度による特異性を示した。糖鎖修飾リポソーム（Ｋ３）は、１日後ではどの糖鎖密度のリポソームも糖鎖なしリポソームとの差が見られなかった。この結果は、図７の結果をふまえて糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）と糖鎖修飾リポソーム（Ｋ３）とでは炎症部位へのリポソームの集積性が異なり、糖鎖Ｋ１リポソームが炎症部位へ特異的に集積することを示した（図８）。【０２３９】
糖鎖修飾リポソーム（Ｋ２）は、１日後ではＫ２−３が炎症部位に集積しているのが確認できた。この結果から、Ｋ２−３リポソームでの炎症部位のイメージングが可能であることがわかった。また、図７〜９の結果をふまえると、炎症部位への集積具合により糖鎖の特異性が示され、かつ、炎症部位のイメージングにはリポソーム表面に結合している糖鎖の密度が低い方が良いことを示した（図９）。糖鎖Ｋ１は糖鎖量レベル３（Ｋ１−３）および糖鎖量レベル４（Ｋ１−４）で有意な差を認めた。正常マウスでは集積なし。この結果から、糖鎖の修飾結合密度が低い糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は、炎症部位に特異的に集積することがわかった（図１０）。別ロットサンプルでのＫ１−３も炎症部位に集積した。この結果は、Ｋ１−３リポソームによる炎症部位のイメージングと特異性の再現性を示した（図１１）。糖鎖Ｋ１についてはＫ１−２と糖鎖密度が低くても炎症部位に集積した。この結果から、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）については糖鎖の修飾結合密度が高いリポソームより低いリポソームの方が炎症部位のイメージングに適していることがわかった（図１２）。【０２４０】
糖鎖Ｋ３については糖鎖密度を変えても炎症部位には集積しなかった。この結果と図８、図１２をふまえると糖鎖修飾リポソーム（Ｋ３）はリポソーム表面に結合している糖鎖の密度を変えても炎症部位に集積せず、リポソームの表面に結合している糖鎖の種類による炎症部位への特異性がわかった（図１３）。【０２４１】
（実施例１５．正常マウスを用いた実験）
（ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームの正常マウスにおける体内動態の確認）
正常マウスとして、Ｂａｌｂ／ｃ，雌性、７〜８週齢を用いた。【０２４２】
（評価方法）
１／１０  ネンブタール溶液を正常マウスの腹腔内に１００μｌ投与して麻酔をかけた。蛍光イメージング装置  ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により投与前の画像データを取った。尾静脈より、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（２００μｌ：脂質量７５０μｇ）を投与して、投与直後の画像データを取った。経時的に画像データをとった。画像データは、すべて腹側より撮影した。【０２４３】
（結果）
図１４は、脳のデータを示す。投与後１時間でＫ１−３、Ｋ２−３が脳に集積しているのが確認できた。また、投与後１日ではＫ１−３は脳にかなりの量残っているが、Ｋ２−３では明らかに減少していた。この結果から、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ；  ＢＢＢ）を通過し組織へ浸透していることがわかった。また、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ２）は、１日後で減少していたことより、脳の血管には入るが、ＢＢＢを通過できず、組織へは浸透しないことがわかった。このことより、糖鎖の種類による脳での特異的な動態があることがわかった。【０２４４】
図１５は、肝臓のデータを示す。１日後のＫ２−６では強いシグナルが確認できた。この結果から、糖鎖の種類・修飾結合密度の違いによる肝臓への集積の特異性をイメージングとして見ることができることがわかった。【０２４５】
図１６は、腎臓のデータを示す。Ｋ１糖鎖、Ｋ３糖鎖と比較して、Ｋ２糖鎖（Ｋ２−３）は投与後１時間で強いシグナルが確認できた。この結果から、Ｋ２−３糖鎖は腎臓への集積の特異性をイメージングができることがわかった。【０２４６】
図１７は、脾臓のデータを示す。Ｋ１−３，４，６とＫ２−４，６が集積していた。この結果から、糖鎖の種類・修飾結合密度の違いによる脾臓への集積の特異性をイメージングとして見ることができることがわかった。【０２４７】
図１８は肺のデータを示す。Ｋ１−３は、投与後１時間と１日後においてシグナルが持続していた。この結果から、糖鎖の種類・修飾結合密度の違いによる肺への集積の特異性をイメージングとして見ることができることがわかった。【０２４８】
図１９は、膵臓のデータを示す。全体的にシグナルが弱いが、部分的（Ｋ２−３、Ｋ２−６など）にシグナルの高い部位が見られた。この結果から、糖鎖の種類・修飾結合密度の違いによる膵臓への集積の特異性をイメージングとして見ることができることがわかった。【０２４９】
図２０は、心臓のデータを示す。糖鎖密度を変えるとシグナル強度に差は見られたが、糖鎖なしの方が強いシグナルを示していた。この結果から、糖鎖の種類・修飾結合密度の違いによる心臓への集積の特異性をイメージングとして見ることができることがわかった。【０２５０】
図２１は、Ｋ１−３の全身スキャンデータ（頭頂部以外）、投与直後を示す。糖鎖なしに比べるとＫ１−３は肝臓のシグナルが弱い。この結果から、投与直後、Ｋ１−３リポソームは糖鎖なしリポソームに比べて肝臓に取り込まれにくいことがわかった。図２２は、Ｋ１−４，６の全身スキャンデータ（頭頂部以外）、投与直後を示す。Ｋ１−３と同様に糖鎖なしに比べると肝臓のシグナルが弱い。この結果から、投与直後、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は糖鎖なしリポソームに比べて肝臓に取り込まれにくいことがわかった。【０２５１】
図２３は、Ｋ２−３の全身スキャンデータ（頭頂部以外）、投与直後を示す。糖鎖なしに比べると肝臓のシグナルが強い。この結果から、投与直後、Ｋ２−３リポソームは糖鎖なしリポソームに比べて肝臓に取り込まれやすいことがわかった。また、この結果は、図１５と同様の結果になった。投与直後において、糖鎖の種類による肝臓への特異性が示された。図２４は、Ｋ２−４，６の全身スキャンデータ（頭頂部以外）、投与直後を示す。糖鎖なしに比べるとＫ２−４，Ｋ２−６は肝臓のシグナルが弱い。この結果から、投与直後、Ｋ２−４、Ｋ２−６リポソームは糖鎖なしリポソームに比べて肝臓に取り込まれにくいことがわかった。投与直後において、修飾結合密度の違いによる肝臓への特異性が示された。【０２５２】
図２５は、Ｋ３−３の全身スキャンデータ（頭頂部以外）、投与直後を示す。糖鎖なしと肝臓でのシグナルが同じである。この結果から、投与直後、Ｋ３−３リポソームは糖鎖なしリポソームに比べて肝臓に取り込まれにくいことがわかった。図２６は、Ｋ３−４，６の全身スキャンデータ（頭頂部以外）、投与直後を示す。糖鎖なしに比べるとＫ３−４，Ｋ３−６は肝臓のシグナルが弱い。この結果から、投与直後、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ３）は糖鎖なしリポソームに比べて肝臓に取り込まれにくいことがわかった。【０２５３】
図２７は、糖鎖なしの全身スキャンデータ（頭頂部以外）、経時変化を示す。１日後には肝臓、および膀胱にシグナルが検出された。この結果から、リポソームが肝臓、膀胱へと代謝・排出されているのが、イメージングにより見ることができることがわかった。図２８は、Ｋ１−３の全身スキャンデータ（頭頂部以外）、経時変化を示す。１日後には膀胱にシグナルが検出された。この結果から、リポソームが肝臓、膀胱へと代謝・排出されているのが、イメージングにより見ることができることがわかった。図２９は、Ｋ１−４の全身スキャンデータ（頭頂部以外）、経時変化を示す。１日後には肝臓および膀胱にシグナルが検出された。２日後には肝臓におけるシグナルが減少した。この結果から、リポソームが肝臓、膀胱へと代謝・排出されているのが、イメージングにより見ることができることがわかった。図３０は、Ｋ１−６の全身スキャンデータ（頭頂部以外）、経時変化を示す。この結果から、リポソームが肝臓、膀胱へと代謝・排出されているのが、イメージングにより見ることができることがわかった。【０２５４】
（実施例１６．リポソームの定量分析）
（Ｉ．タンパク質定量）
リポソームに内包されたＨＳＡ量とリポソーム表面にカップリングしたＨＳＡの総タンパク質量をＢＣＡ法により測定した。【０２５５】
タンパク質量の測定は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（カタログ番号２３２３５ＢＮ）（ＰＩＥＲＣＥ  Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いた。標準物質として、キットに添付された２ｍｇ／ｍｌアルブミン（ＢＳＡ）を使用した。【０２５６】
スタンダード溶液として、標準物質（２ｍｇ／ｍｌ：アルブミン）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．２５、０．５、１、２、３、４、５μｇ／５０μｌ溶液を調製した。Ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームをＰＢＳ緩衝液で２０倍希釈し、検体溶液を調製した。スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に５０μｌ分注した。各試験管に３％ラウリル硫酸ナトリウム溶液（ＳＤＳ溶液）を１００μｌ添加した。キットに添付された試薬Ａ、Ｂ、Ｃを、試薬Ａ：試薬Ｂ：試薬Ｃ＝４８：２：５０となるように混合し、各試験管に１５０μｌ添加した。この試験管を、６０℃で１時間、静置した。室温に戻ってから、吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのタンパク質量を測定した。以下の表に結果を示す。【０２５７】
【表３】
2007091661.tif 000027
【０２５８】
（ＩＩ．脂質定量）
リポソームの構成脂質量を、コレステロール量を定量することにより算出した。脂質の定量にはデタミナーＴＣ５５５キット（カタログ番号ＵＣＣ／ＥＡＮ１２８）（ＫＹＯＷＡ  Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いた。標準物質として、キットに添付されている５０ｍｇ／ｍｌ
コレステロールを使用した。【０２５９】
スタンダード溶液として、標準物質（５０ｍｇ／ｍｌ：コレステロール）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０μｇ／２０μｌ溶液を調製した。Ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームをＰＢＳ緩衝液で５倍希釈し、検体溶液を調製した。スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に２０μｌ分注した。各試験管に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１０％溶液）を１７μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、４０分間、静置した。デタミナーＴＣ５５５キットの酵素試薬を３００μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、２０分間、静置した。吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのコレステロール量を測定し、脂質量を求めた。
コレステロール量から脂質量を求める換算式
脂質量（μｇ／５０μｌ）＝コレステロール量（μｇ／５０μｌ）×４．５１（換算係数）
脂質量の定量結果を以下に示す。【０２６０】
【表４】
2007091661.tif 000028
【０２６１】
【表５】
2007091661.tif 000029
【０２６２】
（ＩＩＩ．粒子径分布および粒子径）
リポソーム粒子を精製水で５０倍に希釈して、ゼータサイザーナノ（Ｎａｎ−ＺＳ：ＭＡＬＶＥＲＮ  Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いて測定した。【０２６３】
【表６】
2007091661.tif 000030
【０２６４】
（実施例１７．蛍光標識物質外付型リポソームの調製Ｉ）
（ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミン溶液の調製）
ヒト血清アルブミン／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）、（２ｍｌ）にｃｙ５．５／Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶液（２ｍｇ／ｍｌ）、（２．５ｍｌ）を混合して、３７℃で３時間撹拌した。この混合溶液を、分画分子量１０，０００で限外濾過し、遊離のｃｙ５．５を除去し、ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミン溶液を調製する。【０２６５】
実施例２で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ  ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加え、冷蔵下で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化する。ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換して、酸化されたリポソーム１０ｍｌを得る。このリポソーム液に、２０ｍｇのｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミン溶液を加えて室温で２時間反応させ、次に２Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）１００μｌを加えて室温で２時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとｃｙ５．５標識ＨＳＡとのカップリング反応でｃｙ５．５標識ＨＳＡを結合させる。次いで、限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換して、ｃｙ５．５標識ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得る。【０２６６】
（糖鎖の調製）
実施例４と同様の方法にて糖鎖を調製する。【０２６７】
（リポソーム膜面結合ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への糖鎖の結合）
実施例４において調製した各糖鎖２ｍｇを精製水に溶解し、０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物４ｍｇ／ｍｌ（アミノ化糖鎖溶液）を得る。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１０ｍｌに架橋試薬３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のｃｙ５．５標識ＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得る。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物（アミノ化糖鎖溶液）１２．５、３７．５、１２５、２５０、５００、１２５０、２５００μｌを加えて、室温で２時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにグリコシル化アミン化合物の結合を行う。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する。その結果、糖鎖とｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソームが得られる。【０２６８】
（リポソーム膜面結合ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理）
上記の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のｃｙ５．５標識ＨＳＡタンパク質表面の親水性化処理を行う。糖鎖修飾リポソーム１０ｍｌに、別々に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２６．４ｍｇを加えて、室温で２時間、その後冷蔵下で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、未反応物を除去する。０．４５μｍのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖修飾リポソーム複合体各１０ｍｌを得る。【０２６９】
（実施例１８．蛍光標識物質外付型リポソームの調製ＩＩ）
実施例６で得られたリポソーム表面のＨＳＡ中のＳ―Ｓ基に対して、蛍光色素ｃｙ３またはｃｙ５を添加して反応させ、標識させる。【０２７０】
実施例６で得られた糖鎖修飾リポソーム１０ｍｌをＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、ｃｙ３またはｃｙ５／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ｐＨ８．４）溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを混合して、室温で２時間攪拌後、冷蔵下一晩攪拌する。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離の蛍光色素を除去する。最終産物である蛍光標識物質外付型リポソームが得られる。【０２７１】
（実施例１９．蛍光色素を内包するリポソームを用いたイメージング）
（Ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）の調製）
糖鎖としてＳＬＸを用いてＣｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）を調製した（図４０を参照のこと。）。リポソームを、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｃｅ
Ｓｃｉ．１９８９，４１，２４９−２６７、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｍａｄａ，Ｍ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ−Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９４，２４２，５６−６５に記載される改良されたコール酸塩透析法を用いて調製した。【０２７２】
ジパルミトイルホスファチジルコリン（１６．８ｍｇ）、コレステロール（１０．１ｍｇ）、ジセチルホスフェート（１．８ｍｇ）、ガングリオシド（１４．６ｍｇ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（２．３ｍｇ）およびコール酸ナトリウム（４６．９ｍｇ）を混合した。この混合物を、３ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）溶液で溶解した。この溶媒を、３０℃にてロータリーエバポレーターを用いて蒸発させ、減圧下で乾燥させた後、脂質フィルムを得た。この脂質フィルムを、３ｍｌのトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液（ＴＡＰＳ、ｐＨ８．４）中に溶解し、そして、超音波処理をした後に、ミセル懸濁液を得た。【０２７３】
以下の標識方法を用いて、Ｃｙ５．５をＨＳＡに結合させた。２０ｍｇのＨＳＡおよび２ｍｇのＣＹ５．５−ＮＨＳエステル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を、３ｍｌのＴＡＰＳ（ｐＨ８．４）中に溶解し、３７℃にて３時間撹拌した。この溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｄｉａｆｌｏ  ＰＭ１０メンブレン（Ａｍｉｃｏｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を取り付けた限外濾過セル（Ｍｏｄｅｌ  ８０１０；Ａｍｉｃｏｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いてＴＡＰＳ（ｐＨ８．４）で限外濾過し、残ったＣｙ５．５−ＮＨＳエステルを除去した。【０２７４】
Ｃｙ５．５を有するＨＳＡの溶液（３ｍｌ）を、上記のミセル懸濁液と混合した。この混合液を、ＰＭ１０（Ａｍｉｃｏｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ）によりＴＡＰＳ（ｐＨ８．４）で限外濾過して、残ったＣｙ５．５を有するＨＳＡを除去し、リポソーム溶液（１０ｍｌ）を得た。１０ｍｇのスベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）（ＢＳ３；ＰＩＥＲＣＥ
ＣＯ．，ＬＴＤ）（架橋剤）を、このリポソーム溶液（１０ｍｌ）に加え、２０〜２５℃にて２時間撹拌し、さらに、４℃にて一晩撹拌した。ＢＳ３を、リポソーム表面に結合させた。次いで、４０ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを加え、２０〜２５℃にて２時間撹拌し、さらに、４℃にて一晩撹拌して、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをＢＳ３に結合させた。これを、ＸＭ３００（Ａｍｉｃｏｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ）により限外濾過して、残ったトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した。ＨＳＡをリポソーム表面に結合させるために、カップリング法を用いた。リポソーム表面を酸化するために、１０．８ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを、リポソーム溶液（１０ｍｌ）に加え、４℃にて一晩撹拌した。これを、ＸＭ３００（Ａｍｉｃｏｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ）により限外濾過し、残った過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。２０ｍｇのＨＳＡをこれに加え、２０〜２５℃にて２時間撹拌した。次いで、３．１２５ｍｇのシアノホウ化水素ナトリウムを加え、２０〜２５℃にて２時間撹拌し、さらに、４℃にて一晩撹拌した。残ったシアノホウ化水素ナトリウムを除去するために、この溶液を、ＸＭ３００（Ａｍｉｃｏｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ）により限外濾過した。【０２７５】
糖鎖を、３，３−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；ＰＩＥＲＣＥ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を介して、リポソーム表面に結合させた。ＤＴＳＳＰを架橋剤として用いた。１０ｍｇのＤＴＳＳＰを、１０ｍｌのリポソーム溶液に加え、２０〜２５℃にて２時間撹拌し、さらに、４℃にて一晩撹拌した。残ったＤＴＳＳＰを除去するために、この溶液を、ＸＭ３００（Ａｍｉｃｏｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ）により限外濾過した。糖鎖の還元基末端のアミノ化を、グリコシルアミノ化反応により行なった。２ｍｇのＳＬＸ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を、０．５ｍＬの蒸留水に溶解させた。０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を加え、そして、３７℃にて３日間撹拌した。アミノ化ＳＬＸを、２５μｇ／ｍｌ（密度Ｄ１：Ｋ１−２）、５０μｇ／ｍｌ（密度Ｄ２：Ｋ１−３）、１００μｇ／ｍｌ（密度Ｄ３：Ｋ１−４）、２００μｇ／ｍｌ（密度Ｄ４：Ｋ１−５）および５００μｇ／ｍｌ（密度Ｄ５：Ｋ１−６）の最終濃度に到達するまで加え、そして、２０〜２５℃にて２時間撹拌した。【０２７６】
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、１３２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に到達するまで加え、４℃にて一晩撹拌して、リポソーム表面を繰返し親水性化した。この溶液を、ＸＭ３００（Ａｍｉｃｏｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ）により限外濾過して、残ったＳＬＸおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した。【０２７７】
（糖鎖なしのリポソームの調製）
糖鎖なしのリポソームの調製を、糖鎖を結合させるプロセスを除いて、糖鎖修飾リポソームの場合と同様に行った。リポソーム表面上へのＮ−アセチルラクトサミン（Ｇ４ＧＮ：  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＣＯ．，ＬＴＤ）の結合もまた、糖鎖修飾リポソームの場合と同様に行なった。【０２７８】
（リポソームの定量分析）
（リポソームの脂質含量の測定）
得られた糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）および糖鎖なしリポソームの脂質含量を、Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒ  ＴＣ５５５キット（ＫＹＯＷＡ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いて、０．５％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下での総コレステロールとして測定した。次いで、脂肪酸の総量を各脂質のモル比から計算した。タンパク質含量を、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｃｅ  Ｓｃｉ．１９８９，４１，２４９−２６７、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｍａｄａ，Ｍ．，Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ−Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９４，２４２，５６−６５に記載されるように、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いて、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で測定した。【０２７９】
糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）の脂質含量およびタンパク質含量は、それぞれ、３．７ｍｇ／ｍｌおよび１．２ｍｇ／ｍｌであった。糖鎖なしリポソームについて、３．８ｍｇ／ｍｌの脂質含量および１ｍｇ／ｍｌのタンパク質含量が得られた。【０２８０】
（リポソームの粒子サイズおよびζ電位の測定）
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いて、粒子サイズおよびζ電位を２５℃にて測定した。このリポソーム溶液を、測定のために、蒸留水で５０倍に希釈した。糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）および糖鎖なしリポソームの両方の粒子サイズは、ほぼ均一な分布を示した。平均粒子サイズは、約１００ｎｍであった（図４１）。リポソーム膜表面の電荷を示すζ電位は、負に帯電しており、両方のリポソームについて、−４０ｍＶであった。４℃にて６ヶ月間保存した後、粒子サイズの分布は、調製直後のものとほぼ同じであり、これらのリポソームの安定特性を示した（図４２）。【０２８１】
（実施例２０．ヒト慢性関節リウマチモデルマウスを用いた実験）
（ヒト慢性関節リウマチモデルマウスの作製およびリポソームの投与）
ヒト慢性関節リウマチモデルマウスを、以下の方法により作製した。ヒト慢性関節リウマチの誘導のために、２００μｌ（２ｍｇ）のモノクローナル抗体（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌性、８週齢）の尾静脈から投与した。４日後、１００μｌ（５０μｇ）のリポ多糖（ＬＰＳ）を、腹腔内に投与した。このマウスを、３〜４日後に実験に使用した。生理食塩水で１０倍希釈した１５０μｌのネンブタール溶液（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を、腹腔内に投与し、モデルマウスを麻酔をかけた。次いで、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与した（マウス１匹あたり５０μｌ）。【０２８２】
（実施例２１．ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘを用いたイメージング）
ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いて、Ｃｙ５．５の蛍光シグナルを、注射前、注射後の０時間および２４時間において、同じマウスの炎症領域（後脚の裏面）においてモニターした（励起：６８０ｎｍ、発光：７００ｎｍ）。【０２８３】
注射の２４時間後の炎症領域への糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）および糖鎖なしリポソームの集積を比較すると、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は、糖鎖なしリポソームよりも多く集積した（図４３）。【０２８４】
（糖鎖の特異性の確認）
この集積がＳＬＸ特異的であることを確認するために、Ｇ４ＧＮがリポソーム表面に結合した糖鎖修飾リポソーム（Ｋ２）を、本実施例の糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）と同様の方法を用いて、Ｄ２の糖鎖密度（Ｋ２−３）で調製する。糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１およびＫ２）を、尾静脈から投与し（５０μｌ／マウス）、注射の２４時間後に、リポソームの集積を調べた。図４４に示すように、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ２）の集積は、糖鎖なしリポソームの場合とほぼ同じレベルであり、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）のみが、炎症領域に特異的に集積した。【０２８５】
（炎症領域への特異的な集積に対する糖鎖密度の影響）
糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）の炎症領域への特異的な集積と、その表面上の糖鎖密度との関係を明らかにするために、種々の密度の糖鎖を有する糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）（Ｄ１〜５）を投与し（５０μｌ／マウス）、リポソームの集積の程度を比較した（図４５）。【０２８６】
興味深いことに、糖鎖密度がＤ２の場合において、炎症領域への最も高い集積を示した。糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）では、糖鎖密度がＤ２よりも高くなると、炎症領域への集積は低下した。リポソームの表面上の糖鎖密度は、集積に著しい影響を及ぼすことがわかった。そして、炎症領域への効率的な集積のための糖鎖の最適な密度が存在することが明らかとなった。従って、糖鎖修飾リポソーム（密度Ｄ２：Ｋ１−３）は、炎症領域へ効率的に集積させるために、顕著に有効な種類の糖鎖であり、かつその最適な結合密度であるといえる。【０２８７】
（実施例２２．走査型顕微鏡によるイメージング）
（オリンパスＩＶ１００による観察）
（方法）
炎症部位へ集積したＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５が血管内にとどまっているのか、或いは血管から周辺の組織へ移行しているのかの確認を走査型蛍光顕微鏡ＩＶ−１００（ＯＬＹＭＰＵＳ．，Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いて行った。観察は、ＩＶ−１００の直径１．３ｍｍの極細径スティック対物レンズ（ＩＶ−ＯＢ３５Ｆ２２Ｗ２０）を観察部位に近づけて行った。１／１０ネンブタール溶液を関節炎マウスの腹腔内に２００μｌ投与して麻酔をかけ、尾静脈より、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１−３）（１００μｌ：脂質量３８０μｇ）を投与した。また、コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した。経時的に画像データをとった。画像データは、すべて後ろ足の裏側を観察した。【０２８８】
また、観察直前にアクリジンオレンジ（１５０μｌ：０．５％，ｗ／ｖ％）をマウスの尾静脈より投与して、血管内の白血球を染めた。Ｅｘ  ４８８ｎｍ、Ｅｍ  ５２６ｎｍでアクリジンオレンジ（緑色）、Ｅｘ  ６３３ｎｍ、Ｅｍ  ６９３ｎｍでＣｙ５．５（オレンジ色）の蛍光を観察した。【０２８９】
（結果）
炎症部位へ集積したＫ１−３リポソームが血管内にとどまっているのか、或いは血管から周辺の組織へ移行しているのかの確認を行った。図４６に示すとおり、投与後１０分および３０分では、リポソームの血管壁への付着や凝集物は認められず、血管内を流れるリポソームが確認できた。投与６ｈ後では、Ｋ１−３リポソームのみ、部分的に血管壁に添った付着が認められた。一方、糖鎖なしリポソームではそのような付着は確認されなかった。投与２４ｈ後では、Ｋ１−３リポソームは、血管周辺組織へ移行しており、血管内壁に６ｈ後に認められた血管に添った付着は認められなかった。４８ｈ後において、Ｋ１−３リポソームの血管周辺組織での集積は、２４ｈ後よりも増加した。【０２９０】
（まとめ）
以前より、ＬＰＳにより誘導されたヒト臍静脈（ＨＵＶＥＣ）上のＥ−セレクチンの発現パターンは均一ではなく、細胞上で部分的かつ高密度の凝集を形成することが報告されている（Ｊｏｓｅｐｈ．Ｋ．Ｗｅｌｐｌｙ．，Ｓ．Ｚａｈｅｅｒ  Ａｂｂａｓ．，Ｐｅｔｅｒ  Ｓｃｕｄｄｅｒ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９４，４，２５９−２６５、Ｍｕｌｉｇａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｐｏｌｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｙｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９２，９０（４），１６００−１６０７、Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｄ．Ｌ．，Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｌ．Ａ．，Ｌａｐｉｅｒｒｅ，Ｌ．Ａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６，１３６（５），１６８０−１６８７）。本実施例において、血管内に存在した糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１−３）リポソームは、血管から血管内壁をローリングし、血管周辺組織へ移行することが確認された。これは、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）が、血管内皮上に不均一に発現するＥ−セレクチンを認識し、部分的に結合しながら移動したことを示している。【０２９１】
（実施例２３．担癌マウスを用いた実験）
（担癌マウスモデルの作製およびリポソームの投与）
糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）および糖鎖なしリポソームの腫瘍領域への集積を、以下の方法により作製した腫瘍を有するマウスを用いて試験した。ＥＡＴ細胞（５×１０６  細胞／マウス）を、ｄｄＹマウス（雄性、７週齢）の右大腿領域に移植し、そして、このマウスを、７〜１０日後に実験に使用した。麻酔をかけるために、生理食塩水で１０倍希釈した３００μｌのネンブタール溶液を、腹腔内に投与した。次いで、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与した（２００μｌ／マウス）。【０２９２】
（実施例２４．ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘによるイメージング）
ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（励起：６８０ｎｍ、発光：７００ｎｍ）を用いて、同じマウスの腫瘍領域（後脚の裏面）を、投与前、投与の０時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後に観察した。図４７に示されるように、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は、腫瘍領域に有意に集積した。この集積は、４８時間まで次第に増加した。一方で、糖鎖なしリポソームの集積は、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）の集積よりも低く、９６時間以降まで一定であった。【０２９３】
体内の蛍光の分布を調べるために、全身を注射の９６時間後にスキャンした。強い蛍光シグナルが、肝臓、膀胱および腫瘍領域において検出された（図４８を参照のこと。）。これらのシグナルを、蛍光の寿命により分析した。腫瘍領域において、ＨＳＡに結合したＣｙ５．５（寿命、１．８ｎｓ）のみが検出された。しかし、肝臓および膀胱においては、遊離型のＣｙ５．５（寿命、１．５ｎｓ）およびＨＳＡに結合したＣｙ５．５（寿命、１．８ｎｓ）の両方が存在することが確認された。【０２９４】
（実施例２５．走査顕微鏡によるイメージング）
（オリンパスＩＶ１００による観察）
（方法）
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌性、８週齢）の右大腿部皮下にＥｈｒｌｉｃｈ  ａｓｃｉｔｅ  ｔｕｍｏｒ  （ＥＡＴ）細胞を２×１０６細胞移植し、７〜１０日後に実験に使用した。【０２９５】
担癌部位へ集積したＫ１−３リポソームが血管内にとどまっているのか、或いは血管から周辺の組織へ移行しているのかの確認を走査型蛍光顕微鏡ＩＶ−１００（ＯＬＹＭＰＵＳ．，Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いて行った。観察は、ＩＶ−１００の直径１．３ｍｍの極細径スティック対物レンズ（ＩＶ−ＯＢ３５Ｆ２２Ｗ２０）を観察部位に近づけて行った。１／１０ネンブタール溶液を担癌マウスの腹腔内に２００μｌ投与して麻酔をかけた。蛍光イメージング装置  ＩＶ−１００（ＯＬＹＭＰＵＳ）により、担癌部位の血管及び血管周辺組織の画像データをとった。尾静脈より、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１−３）（１００μｌ：脂質量３８０μｇ）を投与した。また、コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した。投与４８ｈ後に癌部位（右大腿部）の血管及び血管周辺組織をＩＶ−１００（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて観察した。また、観察直前にアクリジンオレンジ（１５０μｌ：０．５％，ｗ／ｖ％）をマウスの尾静脈より投与して、血管内の白血球を染めた。Ｅｘ  ４８８ｎｍ、Ｅｍ  ５２６ｎｍでアクリジンオレンジ（緑色）、Ｅｘ  ６３３ｎｍ、Ｅｍ  ６９３ｎｍでＣｙ５．５（オレンジ色）の蛍光を観察した。【０２９６】
（結果）
担癌部位へ集積したＫ１−３リポソームが血管内にとどまっているのか、或いは血管から周辺の組織へ移行しているのかの確認を行った。図４９に示すとおり、Ｋ１−３リポソームは、投与４８時間後、血管から血管外組織へ移行して血管外組織の細胞内に集積していた。糖鎖なしリポソームの場合も、投与４８時間でＫ１−３リポソームに比べ集積量は少ないが、血管外組織で蛍光が確認された。このことは、糖鎖なしリポソームの場合も、癌周辺の血管内皮の間隙から受動的に組織へ移行したことによると考えられた。【０２９７】
（まとめ）
血管内のリポソームの保持は、炎症領域および腫瘍領域における集積に有意に影響を与え、この集積は、血管内の保持を延長することによって増加することが報告された（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｄ．Ｃ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｏ．，Ｈｏｎｇ，Ｋ．，Ｋｉｒｐｏｔｉｎ，Ｄ．Ｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｒｅｖ．１９９９，５１，６９１−７４３、Ｋａｗａｋｉｔａ，Ｙ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ．２０００，４９，３３９−３４５、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ．２００３−０１４３２６７）。【０２９８】
血管中のリポソームの保持を延長する対策として、現在までに、「肝臓および脾臓内への細網内皮系（ＲＥＳ）の取り込みの回避」、「マクロファージによる貪食の回避」および「血管内皮細胞および白血球のような細胞による非特異的な吸着の回避」が報告されている（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｄ．Ｃ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｏ．，Ｈｏｎｇ，Ｋ．，Ｋｉｒｐｏｔｉｎ，Ｄ．Ｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｒｅｖ．１９９９，５１，６９１−７４３）。【０２９９】
糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）、ならびに血管内皮細胞、赤血球および白血球のような細胞は、負に帯電している。このことから、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）およびこれらの細胞は、相互に電気的に反発する（ｒｅｐｕｌｓｅ）。従って、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は、このような細胞には非特異的には吸着されない。さらに、リポソーム表面を親水性にすることにより、血漿中のオプソニンタンパク質の吸着、およびマクロファージによる貪食が回避され得、従って、血流中のリポソームの保持が延長される。【０３００】
その結果、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は、Ｅ−セレクチンに対する親和性および血管内での優れた保持を示すので、炎症領域に特異的かつ効率的に集積すると考えられる。それゆえ、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は、インビボ蛍光イメージング試薬として有用である。さらに、適切な糖鎖および密度を選択することによって、糖鎖を有するリポソームは、種々の物質（蛍光物質、化学物質、タンパク質、遺伝子など）を、体内の特定の所望の領域（疾患領域を含む）へと送達し得る。このことは、これらの型のリポソームが、能動的ターゲティングＤＤＳとして有用な道具となり得ることを示す。【０３０１】
（実施例２６．蛍光標識物質外付型リポソームを用いたイメージング）
（蛍光標識物質外付型リポソームの調製）
糖鎖としてＳＬＸを用いて、実施例１７と同様の方法を使用して蛍光標識外付型リポソームを調製する。【０３０２】
（糖鎖なしのリポソームの調製）
糖鎖なしのリポソームの調製を、実施例１９と同様の方法を使用して調製する。【０３０３】
（リポソームの定量分析）
（リポソームの脂質含量の測定）
得られた糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）および糖鎖なしリポソームの脂質含量を、実施例１９と同様の方法を用いて測定する。次いで、脂肪酸の総量を各脂質のモル比から計算する。タンパク質含量を、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で測定する。【０３０４】
（リポソームの粒子サイズおよびζ電位の測定）
実施例１９と同様の方法を用いて、粒子サイズおよびζ電位を測定する。糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）および糖鎖なしリポソームの両方の粒子サイズは、ほぼ均一な分布を示す。リポソーム膜表面の電荷を示すζ電位は、負に帯電しており、両方のリポソームについて、−４０ｍＶである。４℃にて６ヶ月間保存した後、粒子サイズの分布は、調製直後のものとほぼ同じであり、これらのリポソームの安定特性を示す。【０３０５】
（実施例２７．ヒト慢性関節リウマチモデルマウスを用いた実験）
（ヒト慢性関節リウマチモデルマウスの作製およびリポソームの投与）
実施例２０と同様の方法によりヒト慢性関節リウマチモデルを作製する。麻酔をかけるために、生理食塩水で１０倍希釈した１５０μｌのネンブタール溶液（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を、腹腔内に投与する。次いで、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与する（マウス１匹あたり５０μｌ）。【０３０６】
（実施例２８．ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘを用いたイメージング）
実施例２１と同様の方法を用いて、Ｃｙ５．５の蛍光シグナルを、注射前、注射後の０時間および２４時間において、同じマウスの炎症領域（後脚の裏面）においてモニターする（励起：６８０ｎｍ、発光：７００ｎｍ）。【０３０７】
注射の２４時間後の炎症領域への糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）および糖鎖なしリポソームの集積を比較すると、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は、糖鎖なしリポソームよりも多く集積することが確認される。【０３０８】
（糖鎖の特異性の確認）
この集積がＳＬＸ特異的であることを確認するために、実施例２１と同様の方法によりＧ４ＧＮがリポソーム表面に結合した糖鎖修飾リポソーム（Ｋ２）を、Ｄ２の糖鎖密度（Ｋ２−３）で調製する。これらのリポソーム（Ｋ１およびＫ２）を尾静脈から投与し（マウス１匹あたり５０μｌ）、注射の２４時間後にリポソームの集積を調べる。糖鎖修飾リポソーム（Ｋ２）の集積は、糖鎖なしリポソームの場合とほぼ同じレベルであり、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）のみが炎症領域に特異的に集積することが確認される。【０３０９】
（炎症領域への特異的な集積に対する糖鎖密度の影響）
糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）の炎症領域への特異的な集積と、その表面上の糖鎖密度との関係を明らかにするために、種々の密度の糖鎖を有する糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１：Ｄ１〜５）を投与し（マウス１匹あたり５０μｌ）、リポソームの集積の程度を比較する。【０３１０】
その結果、糖鎖修飾リポソームＤ２（Ｋ１−３）が最も高い集積性を示す。この集積性は、糖鎖密度がＤ２（Ｋ１−３）によりも高密度の糖鎖において低くなる。また、糖鎖修飾リポソームＤ２（Ｋ１−３）は、Ｄ１（Ｋ１−２）よりも集積性が高いことが確認される。以上より、炎症への集積において最適の糖鎖密度が存在するといえる。【０３１１】
（実施例２９．走査型顕微鏡によるイメージング）
実施例２２と同様の方法を用いて、炎症部位へ集積したＫ１−３リポソームが血管内にとどまっているのか、或いは血管から周辺の組織へ移行しているのかの確認する。走査型顕微鏡は、ＩＶ−ＯＢ  ３５Ｆ２２Ｗ２０、１．３ｍｍ直径レンズ（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いる。【０３１２】
（オリンパスＩＶ１００による観察）
（方法）
白血球および血管内皮細胞を染色するために、１５０μｌのアクリジンオレンジ（ＡＯ）（０．５％、ｗ／ｖ％）を、観察の直前にマウスの尾静脈から投与する。糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与する（１００μｌ／マウス）。測定条件は以下を使用する：Ｃｙ５．５およびＡＯに対する励起は、それぞれ、ＨｅＮｅ−Ｒレーザ（６３３ｎｍ）およびアルゴンレーザ（４８８ｎｍ）により提供する。発光は、Ｃｙ５．５については、Ｃｙ５．５チャネル（６６０〜７３０ｎｍ  バンドパスフィルタ）で補足し、ＡＯについては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）チャネル（５０５〜５２５ｎｍ  バンドパスフィルタ）で捕捉する。【０３１３】
炎症領域の血管および周囲の組織（後脚の裏面）を、注射の１０分後、３０分後、６時間後、２４時間後、および４８時間後に観察する。注射の１０分後および３０分後には、血管壁へのリポソームの接着もリポソームの凝集も認められず、血管内でのリポソームの流れのみが観察される。血管壁への部分的な接着（注射６時間後）、その後の血管周囲組織への移動（注射２４時間後）が、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）においてのみ観察される。注射の４８時間後において、血管の周囲組織への糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）の集積量は、注射の２４時間後と比較して増加する。【０３１４】
糖鎖なしリポソームは、注射の２４時間後および４８時間後には血管の周囲組織へと移動するが、この集積は、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）よりも低く、このことは、糖鎖なしリポソームが、炎症により生じた血管内皮のギャップを通って受動的に移動したことを示す。【０３１５】
（実施例３０．担癌マウスを用いた実験）
（担癌マウスモデルの作製およびリポソームの投与）
実施例２３と同様の方法により、腫瘍を有するマウスを作製する。糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与する（マウス１匹あたり２００μｌ）。【０３１６】
（実施例３１．ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘによるイメージング）
実施例２４と同様の方法を用いて、ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（励起：６８０ｎｍ、発光：７００ｎｍ）を用いて、同じマウスの腫瘍領域（後脚の裏面）を、投与前、投与の０時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後に観察する。糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は、腫瘍領域に有意に集積し、この集積は、４８時間まで次第に増加する。一方で、糖鎖なしリポソームの集積は、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）の集積よりも低く、９６時間以降まで一定である。【０３１７】
体内の蛍光の分布を調べるために、全身を注射の９６時間後にスキャンする。強い蛍光シグナルが、肝臓、膀胱および腫瘍領域において検出される。これらのシグナルを、蛍光の寿命により分析する。腫瘍領域において、ＨＳＡに結合したＣｙ５．５のみが検出される。しかし、肝臓および膀胱においては、遊離型のＣｙ５．５およびＨＳＡに結合したＣｙ５．５の両方が存在することが確認される。【０３１８】
（実施例３２．走査顕微鏡によるイメージング）
（オリンパスＩＶ１００による観察）
（方法）
実施例２５と同様の方法を使用する。糖鎖修飾リポソームが血管内にとどまっているのか、或いは血管から腫瘍組織へ移行しているのかの確認する。【０３１９】
注射の４８時間後において、蛍光シグナルは血管から周囲組織へと移動し、組織の細胞内においても検出される。さらに、白血球のローリングは、腫瘍領域の血管内皮上で観察される。このことは、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）が、腫瘍増殖と共に発現されるＥ−セレクチンにより認識され、その結果、腫瘍領域に集積したことを示す。【０３２０】
糖鎖なしリポソームもまた、血管の周囲組織に集積するが、この集積量は、糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）よりも少ない。糖鎖なしリポソームは、腫瘍の周りの血管内皮のギャップから組織へと受動的に移動したものと考えられる。【０３２１】
（まとめ）
蛍光標識物質外付型リポソームにおいても、蛍光内包糖鎖修飾リポソームと同様に、ＳＬＸで修飾した糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）は、Ｅ−セレクチンに対する親和性および血管内での優れた保持を示し、炎症領域および腫瘍組織に特異的かつ効率的に集積すると考えられる。それゆえ、蛍光標識物質外付型の糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）も、蛍光内包糖鎖修飾リポソームと同様にインビボ蛍光イメージング試薬として有用である。【０３２２】
（実施例３３．Ｃｙ７を内包した糖鎖修飾リポソーム（Ｃｙ７内包型糖鎖修飾リポソーム）を用いたインビボ実験）
（Ｃｙ７内包型糖鎖修飾リポソームの調製）
蛍光色素としてＣｙ５．５のかわりにＣｙ７を用いること以外、実施例１〜１２と同様の方法を用いてＣｙ７内包型糖鎖修飾リポソームを調製した。糖鎖としては、ＳＬＸ（Ｋ−１）を用いた。【０３２３】
（担癌マウスの作製）
実施例２３と同様の方法を用いて６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスの右大腿部皮下にＥｈｒｌｉｃｈ  ａｓｃｉｔｅ  ｔｕｍｏｒ（ＥＡＴ）細胞を１×１０６個移植した。７〜１０日後にこれらの担癌マウスを実験に使用した。【０３２４】
（評価方法）
１／１０  ネンブタール溶液を担癌マウスの腹腔内に２００μｌ投与して麻酔をかけた。次いで、尾静脈より、ｃｙ７内包型糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１−３（５０μｇ／ｍＬ）５０μｌ）を投与した。蛍光イメージング装置  ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、投与直後から経時的に画像データをとった。画像データはすべて腹側より撮影した。コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した担癌マウスを用いた。【０３２５】
（結果）
投与６時間後、Ｃｙ７内包型糖鎖修飾リポソーム（Ｋ−１）を投与した担癌マウスは、コントロールに比べて腫瘍部位において蛍光強度が高かった。投与２４時間後においては、ほとんどシグナルが検出されなかった（図５０を参照のこと。）。【０３２６】
（実施例３４．Ｃｙ３を用いて蛍光を付与した糖鎖修飾リポソーム（Ｃｙ３内包型糖鎖修飾リポソーム）を用いたインビボ実験）
蛍光色素としてＣｙ５．５のかわりにＣｙ３を用いること以外、実施例１〜１２と同様の方法を用いてＣｙ３内包型糖鎖修飾リポソームを調製した。糖鎖としては、ＳＬＸ（Ｋ−１）を用いた。【０３２７】
（担癌マウスの作製）
実施例２３と同様の方法を用いて６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスの右大腿部皮下にＥｈｒｌｉｃｈ  ａｓｃｉｔｅ  ｔｕｍｏｒ（ＥＡＴ）細胞を１×１０６個移植した。７〜１０日後にこれらの担癌マウスを実験に使用した。【０３２８】
（評価方法）
１／１０  ネンブタール溶液を担癌マウスの腹腔内に２００μｌ投与して麻酔をかけた。次いで、尾静脈より、ｃｙ３内包型糖鎖修飾リポソーム（Ｋ−１）（Ｋ１−３（５０μｇ／ｍＬ）１００μｌ）を投与した。投与４８時間後に腫瘍部位を取り出し、ホルマリン溶液で１２時間以上固定した後、常法によりパラフィン切片を作製し、蛍光顕微鏡ＣＫＸ４１（ＯＬＹＭＰＵＳ）により画像データを得た。コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した担癌マウスを用いた。【０３２９】
（結果）
投与６時間後、Ｃｙ３内包型糖鎖修飾リポソーム（Ｋ−１）を投与した担癌マウスは、コントロールに比べて腫瘍組織における蛍光強度が高いことが判明した（図５１を参照のこと。）。【０３３０】
（実施例３５．蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造）
本実施例では、標識物質として、蛍光色素であるＣｙ３．Ｃｙ５．５およびＣｙ７をそれぞれ用いた。
３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を含む粉体Ａに、炭酸緩衝液を含む溶液Ａを５００μＬ添加して溶解した。この溶液５０μＬを、リポソームを含む溶液１ｍＬに添加して、室温で２時間撹拌した。遠心限外濾過フィルター（ＮＭＷＬ，：３０，０００）を用いて脱塩を行った。１００〜２００μｌに濃縮し、溶液Ａを加え１ｍｌとした。この操作をもう一度繰り返した。【０３３１】
（１．リポソームに結合させる糖鎖溶液の調製）
糖鎖ＳＬＸ、Ｎ-アセチルラクトサミン、α-マンノビオースをそれぞれ密栓のできるガラス製バイアルに秤量し、精製水５００μＬに完全に溶解した。糖鎖水溶液の終濃度が５ｍＭとなるように調製した。【０３３２】
炭酸水素アンモニウム  ０．３ｇを添加して、炭酸水素アンモニウムが溶けきらないように注意しながら、３７℃で３日間撹拌した。炭酸水素ナトリウムが溶けきった場合は、更に、適量の炭酸水素アンモニウムを追加した。この溶液を冷蔵庫に３０分間入れ、０．４５μｍ  濾過フィルターで濾過した。【０３３３】
（２．リポソームへの糖鎖の結合と親水性化処理）
これらのリポソームを含む溶液１ｍＬに糖鎖溶液１２．５μＬを添加し、ボルテックスで混合後、室温で２時間反応させた。トリス緩衝液を含む溶液Ｂを４０μＬ添加し、室温で２時間撹拌し、さらに、冷蔵（２〜１０℃）で１６〜２０時間撹拌した。遠心限外濾過フィルター（ＮＭＷＬ，：３０，０００）を用いて、脱塩を行った。脱塩を行った溶液を１００〜２００μｌに濃縮し、ＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液Ｃを加え１ｍ１にした。この操作をもう一度繰り返した。０．４５μｍ  濾過フィルター（マイレクス−ＨＶ（ミリポア））で濾過し、遮光下で、冷蔵保管した。【０３３４】
（３．脂質濃度、平均粒子径、Ｚ電位、吸光度の測定、安定性の確認）
これらのリポソームについて、タンパク質濃度、脂質濃度、平均粒子径、ゼータ電位を測定した。本実施例により調製されたリポソームの脂質濃度、平均粒子径、Ｚ電位、吸光度、安定性は、実施例７〜１２において調製された糖鎖修飾リポソームの脂質濃度、平均粒子径、Ｚ電位、吸光度、安定性と変わらなかった。本実施例により調製されたリポソームは、表面に結合させる糖鎖の影響も受けなかった。【０３３５】
（３−１．タンパク質濃度）
実施例１６と同様の方法により、これらの糖鎖修飾リポソームについて、タンパク質濃度を測定した。その結果、タンパク質濃度は、Ｃｙ３では０．２４ｍｇ／ｍＬ以上、Ｃｙ５．５では０．４５ｍｇ／ｍＬ以上、Ｃｙ７では０．２０ｍｇ／ｍＬ以上であった（表８を参照のこと。）。【０３３６】
（３−２．脂質濃度）
実施例１６と同様の方法により、これらの糖鎖修飾リポソームについて、脂質濃度を測定した。その結果、脂質濃度は、Ｃｙ３では１．２ｍｇ／ｍＬ以上、Ｃｙ５．５では１．４ｍｇ／ｍＬ以上、Ｃｙ７では２．１ｍｇ／ｍＬ以上であった（表８を参照のこと。）。【０３３７】
（３−３．平均粒子径）
実施例１６と同様の方法により、これらの糖鎖修飾リポソームについて、平均粒子径を測定した。その結果、平均粒子径は、いずれの蛍光を用いた場合も５０ｎｍ〜３００ｎｍであった（表８を参照のこと。）。【０３３８】
（３−４．ゼータ電位）
実施例１６と同様の方法により、これらの糖鎖修飾リポソームについて、ゼータ電位を測定した。その結果、ゼータ電位は、いずれの蛍光を用いた場合も−３０未満であった（表８を参照のこと。）。【０３３９】
（３−５．安定性）
製造した各リポソームを、冷蔵保存した後、安定性を確認した。その結果、Ｃｙ３では少なくとも１年間、Ｃｙ５．５では少なくとも１年間、Ｃｙ７では少なくとも３ケ月間にわたって、粒子サイズの分布は、調製直後のものとほぼ同じであり、これらのリポソームの安定特性を示した。【０３４０】
【表７】
2007091661.tif 000031
【０３４１】
（実施例３６．糖鎖修飾リポソームの製造方法についての改良法（遠心法））
実施例１と同様の方法を使用して、リポソーム（平均粒子径１００ｎｍ）１０ｍｌを調製した。【０３４２】
（１．リポソーム脂質膜面上の親水性化処理）
実施例１と同様の方法で調製したリポソーム溶液１２．５ｍｌをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（分画分子量：１００，０００）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）４本それぞれに４等分して入れ、２０００×ｇで６０分間、室温で遠心分離機にかけることで限外濾過濃縮した。このリポソーム濃縮液に炭酸緩衝液（ＣＢＳ緩衝液：５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１５７ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５））を２ｍｌずつ加え、同条件で遠心機にかけて限外濾過した。濃縮されたリポソーム溶液を回収してまとめ、同緩衝液を加え元の体積にメスアップした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１２．５ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。その後、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。リポソーム溶液１２．５ｍｌをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（分画分子量：１００，０００）４本それぞれに４等分して入れ、２０００×ｇで６０分間、室温で遠心分離機にかけることで限外濾過濃縮した。このリポソーム濃縮液にＣＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．５）を２ｍｌずつ加え、同条件で遠心機にかけて限外濾過した。濃縮されたリポソーム溶液を回収してまとめ、同緩衝液を加え元の体積にメスアップした。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．５）１．２５ｍｌに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５０ｍｇをリポソーム液１２．５ｍｌに加えた。次いで、この溶液を、室温で２時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌しリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの化学結合反応を完結した。このリポソーム溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（分画分子量：１００，０００）４本それぞれに４等分して入れ、２０００×ｇで６０分間、室温で遠心分離機にかけることで限外濾過濃縮した。このリポソーム濃縮液にＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を２ｍｌずつ加え、同条件で遠心機にかけて限外濾過した。濃縮されたリポソーム溶液を回収してまとめ、同緩衝液を加え元の体積にメスアップした。【０３４３】
（２．リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
上記１．で得られた１２．５ｍｌのリポソーム溶液に、０．３ｍｌのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ  ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム１３．４５ｍｇを加え、冷蔵下で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（分画分子量：１００，０００）４本それぞれに４等分して入れ、２０００×ｇで６０分間、室温で遠心分離機にかけることで限外濾過濃縮した。このリポソーム濃縮液にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を２ｍｌずつ加え、同条件で遠心機にかけて限外濾過した。濃縮されたリポソーム溶液を回収してまとめ、同緩衝液を加え元の体積にメスアップした。【０３４４】
このリポソーム液に、２５ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を加えて室温で２時間反応させ、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡを結合した。次いで、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（分画分子量：１００，０００）４本それぞれに４等分して入れ、２０００×ｇで６０分間、室温で遠心分離機にかけることで限外濾過濃縮した。このリポソーム濃縮液にＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を２ｍｌずつ加え、同条件で遠心機にかけて限外濾過した。濃縮されたリポソーム溶液を回収してまとめ、同緩衝液を加え元の体積にメスアップし、ＨＳＡ結合リポソーム液１２．５ｍｌを得た。【０３４５】
蛍光としてＣｙ５．５の変わりにＣｙ７を用いたこと以外、実施例１と同様の方法（従来法）を使用して製造したＣｙ７内包型リポソームおよび本実施例の方法（遠心法）により製造したＣｙ７内包型リポソームの諸性質を比較した。結果を以下の表８、図５２および図５３に示す。本実施例の方法によると、従来法と比較して、収率が約19％向上し、使用する緩衝液の量が節約でき、操作時間の短縮された。また、製造時間も大幅に短縮された。【０３４６】
（表８．脂質濃度、平均粒子径、Ｚ電位、吸光度の比較）
【表８】
2007091661.tif 000032
【０３４７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３４８】
本発明は、目的の送達部位に薬物を経口投与などによって送達することができるという有用性を有する。従って、本発明は、糖鎖修飾リポソームに薬剤や遺伝子を封入した経口投与用薬物送達媒体および関連する有用性を提供する。
【図３１】
2007091661.tif 000038
【図３２】
2007091661.tif 000039
【図３３】
2007091661.tif 000040
【図３４】
2007091661.tif 000041
【図３５】
2007091661.tif 000042
【図３６】
2007091661.tif 000043
【図３７】
2007091661.tif 000044
【図３８】
2007091661.tif 000045
【図３９】
2007091661.tif 000046
【図４１】
2007091661.tif 000047
【図４２】
2007091661.tif 000048
【図５２】
2007091661.tif 000049
【図５３】
2007091661.tif 000050
【図１】
2007091661.tif 000051
【図２】
2007091661.tif 000052
【図３】
2007091661.tif 000053
【図４】
2007091661.tif 000054
【図５】
2007091661.tif 000055
【図６】
2007091661.tif 000056
【図７】
2007091661.tif 000057
【図８】
2007091661.tif 000058
【図９】
2007091661.tif 000059
【図１０】
2007091661.tif 000060
【図１１】
2007091661.tif 000061
【図１２】
2007091661.tif 000062
【図１３】
2007091661.tif 000063
【図１４】
2007091661.tif 000064
【図１５】
2007091661.tif 000065
【図１６】
2007091661.tif 000066
【図１７】
2007091661.tif 000067
【図１８】
2007091661.tif 000068
【図１９】
2007091661.tif 000069
【図２０】
2007091661.tif 000070
【図２１】
2007091661.tif 000071
【図２２】
2007091661.tif 000072
【図２３】
2007091661.tif 000073
【図２４】
2007091661.tif 000074
【図２５】
2007091661.tif 000075
【図２６】
2007091661.tif 000076
【図２７】
2007091661.tif 000077
【図２８】
2007091661.tif 000078
【図２９】
2007091661.tif 000079
【図３０】
2007091661.tif 000080
【図４０】
2007091661.tif 000081
【図４３】
2007091661.tif 000082
【図４４】
2007091661.tif 000083
【図４５】
2007091661.tif 000084
【図４６】
2007091661.tif 000085
【図４７】
2007091661.tif 000086
【図４８】
2007091661.tif 000087
【図４９】
2007091661.tif 000088
【図５０】
2007091661.tif 000089
【図５１】
2007091661.tif 000090
【国際調査報告】
2007091661.tif 000091
2007091661.tif 000092
2007091661.tif 000093
2007091661.tif 000094
2007091661.tif 000095
2007091661.tif 000096
2007091661.tif 000097
2007091661.tif 000098