(57)【要約】【課題】  T前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法の提供。移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法およびその評価キットの提供。【解決手段】  stromal cell lineと単核球とを共培養することで、T前駆細胞またはB前駆細胞が検出できる。この検出方法を用いることで、T前駆細胞またはB前駆細胞を定量し、移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価できる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストローマ株（stromal cell line）と単核球とを共培養し、T細胞またはB細胞へ分化誘導することを含むT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法。
【請求項２】
stromal cell lineと単核球に含まれるCD34＋Lineage marker negative−（Lin−）細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞とを共培養し、T細胞またはB細胞へ分化誘導することを含むT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法。
【請求項３】
単核球、CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞を限界希釈法によって培養することを含む請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
分化誘導によって得られた細胞をフローサイトメーターによって解析することを含む請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
CD5＋CD7＋CD3−の未成熟T細胞またはCD19＋sIgM−の未成熟B細胞をフローサイトメーターによって解析することを含む請求項１〜４のいずれかに記載のT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法。
【請求項６】
stromal cell lineがhuman Delta-like 1（DLL1）またはmouse delta-like 1（Dll1）を強制発現させたstromal cell line TSt-4である請求項１〜５のいずれかに記載のT前駆細胞の検出方法。
【請求項７】
stromal cell lineがstromal cell line TSt-4である請求項１〜６のいずれかに記載のB前駆細胞の検出方法。
【請求項８】
単核球、CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞が移植ソース由来である請求項1〜７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
移植ソースが臍帯血、末梢血、骨髄のいずれかより選ばれた少なくとも１つである請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかの検出方法において限界希釈法で培養され、その培養中で増殖した細胞をフローサイトメーターで解析し、T前駆細胞またはB前駆細胞の出現が認められない細胞の割合を調べることを含むT前駆細胞またはB前駆細胞の定量方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかの検出方法において検出されたT前駆細胞またはB前駆細胞を定量し、移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法。
【請求項１２】
単核球あたりのT前駆細胞またはB前駆細胞の頻度を調べる請求項１１に記載の移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法。
【請求項１３】
さらにインビトロ（in vitro）コロニー形成法によって赤血球および顆粒球系列前駆細胞を定量することを含む請求項１１または１２に記載の移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法によって、造血前駆細胞の性質を評価した後、治療対象となる疾病に応じて分類された移植ソース。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法によって、造血前駆細胞の性質を評価した後、治療対象となる疾病に応じて分類する移植ソースの選別方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかに記載の検出方法を用いる、移植ソースの評価キット。
【請求項１７】
stromal cell lineを含む請求項１６に記載の移植ソースの評価キット。
【請求項１８】
stromal cell lineが、DLL1またはDll1を強制発現させたstromal cell line TSt-4である請求項１７に記載の移植ソースの評価キット。
【請求項１９】
DLL1を強制発現させたstromal cell line TSt-4。
【請求項２０】
遺伝子導入により、DLL1を強制発現させたstromal cell line TSt-4。
【請求項２１】
導入した遺伝子がDLL1遺伝子である請求項２０に記載のDLL1を強制発現させたstromal cell line TSt-4。
【請求項２２】
受託番号がFERM BP-10375である請求項２１に記載のDLL1を強制発現させたstromal cell line TSt-4。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
難治性白血病や重症再生不良性貧血などの血液疾患、先天性免疫不全症、Hurler病などの先天代謝異常症の治療には、造血幹/前駆細胞の移植が最も有効な手段である。
また悪性腫瘍に対する大量化学療法後の造血および免疫機能の再構築にも、造血幹/前駆細胞の移植は重要である。造血幹/前駆細胞のソースとしては、骨髄、臍帯血（以下CBとする。）、顆粒球コロニー刺激因子（以下、G-CSFとする。）で動員された末梢血などが用いられている。中でもCBは、骨髄やG-CSFで動員する末梢血に比較して、提供者に対する痛みや危険性を伴わないという利点があり、近年移植治療に盛んに使用されている。【０００２】
これらの移植ソースの中に含まれている造血幹/前駆細胞の分化能を評価することは、移植の成否にかかわる重要な問題である。現在は、メチルセルロースの半固形培地を用いたコロニー形成細胞培養の解析（in vitroコロニー形成法；以下、CFU-C(colony-forming unit culture)とする。）のみが行なわれている。しかし、この方法で検出できるのは、造血幹/前駆細胞の赤血球、顆粒球・マクロファージおよび巨核球系列への分化能に限定され、リンパ球系列への分化能を検出することはできない。造血幹/前駆細胞移植では赤血球、白血球および血小板だけでなく、免疫機能の再構築も重要である。免疫機能の再構築には、T細胞、B細胞への分化能を持つ前駆細胞を十分な数移植することが重要である。しかし、現在ではヒト造血幹/前駆細胞のT細胞系列およびB細胞系列への分化能を調べる効果的で簡便な方法が確立されていない。そのため、移植ソースに含まれるT前駆細胞、B前駆細胞の検出および定量は行われていない。そこで、実用化が可能で簡便なT前駆細胞およびB前駆細胞の検出方法および定量方法の開発が望まれている。【０００３】
ヒト造血幹/前駆細胞のT細胞への分化能はマウス胎仔胸腺との共培養によって検出することが原理的には可能である。SCIDマウスの胎児胸腺を用いれば、検出効率が高くなることも報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、マウス胎仔胸腺の培養系は定量的ではなく、また煩雑であるため、臨床の場で検査に利用することは、事実上不可能である。
T細胞の初期分化にはノッチーデルタ（Notch-Delta）相互作用が重要であることが明らかにされている。最近、ヒトCB由来のCD34＋CD38−Lineage marker negative−（Lin−）細胞をmouse delta-like 1(Dll1)を強制発現させたストローマ株（stromaｌ cell line）OP9上で培養することにより、CD4＋CD8＋細胞へ分化を誘導できることが報告された（例えば、非特許文献２参照）。しかし、この方法では、造血幹/前駆細胞とされているCD34＋CD38−Lin−細胞分画をセルソーターにより採取したものが使われており、検査法として実用的とは言えない。CFU-Cの解析と同様に、移植ソースの中に含まれている有核細胞をそれ以上細分画することなく、そのままで培養して、T前駆細胞を検出し、定量できる培養方法を確立することが必要である。そのためには、造血幹/前駆細胞から培養により作られるT細胞と、培養前から含まれているT細胞が区別できることが不可欠である。【０００４】
また、ヒト造血幹/前駆細胞のB細胞への分化は、マウス骨髄由来stromal cell lineとの共培養法を用いて行うことができる。これまでに、CD34highLin−細胞、CD34＋CD38−細胞、CD34＋CD38−CD7＋細胞など、造血幹/前駆細胞を濃縮した細胞分画をマウス骨髄由来stromal cell lineと共培養し、B細胞系列へ分化を誘導できることが報告されている（例えば、非特許文献3、4、5、6参照）。しかし、移植ソースに含まれるB細胞へ分化しうる造血幹/前駆細胞を簡単に定量するには、CFU-Cの解析と同様に、移植ソースの中に含まれている有核細胞をそれ以上細分画することなく、そのままで培養して、B前駆細胞を計算できる培養方法を確立することが必要である。そのためには、有核細胞層に含まれるB細胞は生存できず、しかも造血幹/前駆細胞からB細胞系列への分化を支持できるような培養条件を得る必要がある。
【非特許文献１】Yeoman H, Gress RE, Bare CV, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Nov 15; 90(22):10778-82.
【非特許文献２】Ross N.La Motte-Nohs, Elaine Herer, and Juan Carlos Zuniga-Pflucker., BLOOD, vol. 105, Num. 4, 15, February, 2005.
【非特許文献３】DiGiusto DL, Lee R, Moon J, et al., Blood 1996; 87(4):1261-71.
【非特許文献４】Hao QL, Smogorzewska EM, Barsky LW, et al., Blood 1998; 91(11):4145-51.
【非特許文献５】Crooks GM, Hao QL, Petersen D, et al., J Immunol 2000; 165(5):2382-9.
【非特許文献６】Hao QL, Zhu J, Price MA, et al., Blood 2001; 97(12):3683-90.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法の提供を課題とする。さらにこの検出方法を用いる、移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法の提供や、その評価キットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、stromal cell lineと単核球（以下、MNCとする。）とを共培養することで、T細胞またはB細胞へ分化誘導することにより、CD5＋CD7＋CD３−の未成熟T細胞やCD19＋sIgM−の未成熟B細胞を得た。そして、得られた細胞を解析することで、T前駆細胞またはB前駆細胞が検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明者らはstromal cell line TSt-4（以下、TSt-4とする。）にhuman Delta-like 1(DLL1)を強制発現させた細胞を樹立した。このDLL1を強制発現させた細胞またはD111を強制発現させた細胞を用いることで移植ソース等に含まれるT前駆細胞の検出を可能とした。また、TSt-4を用いることでB前駆細胞の検出を可能とした。さらに、これらの検出方法を用いることにより、T前駆細胞またはB前駆細胞を定量し、移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法を確立するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１６）に関する。
（１）  stromal cell lineと単核球とを共培養し、T細胞またはB細胞へ分化誘導することを含むT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法。
（２）  stromal cell lineと単核球に含まれるCD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin
−細胞とを共培養し、T細胞またはB細胞へ分化誘導することを含むT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法。
（３）  単核球、CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞を限界希釈法によって培養することを含む上記（１）または（２）に記載の検出方法。
（４）  分化誘導によって得られた細胞をフローサイトメーターによって解析することを
含む上記（１）〜（３）のいずれかに記載の検出方法。
（５）  CD5＋CD7＋CD3−の未成熟T細胞またはCD19＋sIgM−の未成熟B細胞をフローサイトメーターによって解析することを含む上記（１）〜（４）のいずれかに記載のT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法。
（６）  stromal cell lineが DLL1またはDll1を強制発現させたstromal cell line TSt-
4である上記（１）〜（５）のいずれかに記載のT前駆細胞の検出方法。
（７）  stromal cell lineがstromal cell line TSt-4である上記（１）〜（６）のいずれかに記載のB前駆細胞の検出方法。
（８）  単核球、CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞が移植ソース由来である上記（1）〜（７）のいずれかに記載の検出方法。
（９）  移植ソースが臍帯血、末梢血、骨髄のいずれかより選ばれた少なくとも１つである上記（８）に記載の検出方法。
（１０）  上記（１）〜（９）のいずれかの検出方法において限界希釈法で培養され、その培養中で増殖した細胞をフローサイトメーターで解析し、T前駆細胞またはB前駆細胞の出現が認められない細胞の割合を調べることを含むT前駆細胞またはB前駆細胞の定量方法。
（１１）  上記（１）〜（９）のいずれかの検出方法において検出されたT前駆細胞またはB前駆細胞を定量し、移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法。
（１２）  単核球あたりのT前駆細胞またはB前駆細胞の頻度を調べる上記（１１）に記載の移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法。
（１３）  さらにin vitro コロニー形成法によって赤血球および顆粒球系列前駆細胞を定量することを含む上記（１１）または（１２）に記載の移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法。
（１４）  上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法によって、造血前駆細胞の性質を評価した後、治療対象となる疾病に応じて分類された移植ソース。
（１５）  上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法によって、造血前駆細胞の性質を評価した後、治療対象となる疾病に応じて分類する移植ソースの選別方法。
（１６）  上記（１）〜（９）のいずれかに記載の検出方法を用いる、移植ソースの評価キット。
（１７）  stromal cell lineを含む上記（１６）に記載の移植ソースの評価キット。
（１８）  stromal cell lineが、DLL1またはDll1を強制発現させたstromal cell line TSt-4である上記（１７）に記載の移植ソースの評価キット。
（１９）  DLL1を強制発現させたstromal cell line TSt-4。
（２０）  遺伝子導入により、DLL1を強制発現させたstromal cell line TSt-4。
（２１）  導入した遺伝子がDLL1遺伝子である上記（２０）に記載のDLL1を強制発現させたstromal cell line TSt-4。
（２２）  受託番号がFERM BP-10375である上記（２１）に記載のDLL1を強制発現させたstromal cell line TSt-4。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法により、T前駆細胞またはB前駆細胞を定量することで、移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価することができる。これにより、移植の成否にかかわる移植ソースの有用性を事前に調べることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】TSt-4にDLL1を導入し、TSt-4/hDLL1を作成した図である（実施例1）。
【図１−２】TSt-4/mDll1と共培養したmFT由来のコロニーを写真で示した図である（実施例1）。
【図１−３】細胞のCD4/8 profilesを示した図である（実施例１）。
【図２−１】TSt-4/hDLL1とCBMNCの共培養における成熟T細胞（CD3＋細胞）の増殖を示した図である（実施例２）。
【図２−２】TSt-4/hDLL1とCBMNCの共培養におけるT前駆細胞の分化を示した図である（実施例２）。
【図３】CD34＋CD38−Lin−細胞とTSt-4またはTSt-4/hDLL1との共培養後の細胞のFACS解析を示した図である（実施例３、実施例７）。
【図４】CD34＋CD38−Lin−細胞とTSt-4またはTSt-4/hDLL1との共培養における細胞のDJ再構成を示した図である（実施例３）。
【図５−１】CD34＋CD38−Lin−細胞からのCD5＋CD7＋T細胞の出現が検出されないwellの割合を培養細胞数ごとにプロットした図である（実施例３）。
【図５−２】MNCからのCD3−CD5＋T細胞の出現が検出されないwellの割合を培養細胞数ごとにプロットした図である（実施例４)。
【図６】TSt-4/hDLL1の継代による頻度安定性を示した図である（実施例５）。
【図７】TSt-4とCBMNCとの共培養におけるMNC中のCD19＋のB細胞の消失を示した図である（実施例６）。
【図８】CD34＋CD38−Lin−細胞およびCD34＋Lin−細胞の分取を示した図である(実施例2、実施例６)。
【図９−１】CD34＋Lin−細胞からB細胞へ分化しなかったwellの比率(％)を培養細胞数ごとにプロットした図である（実施例７）。
【図９−２】CD34＋CD38−Lin−細胞からB細胞へ分化しなかったwellの比率(％)を培養細胞数ごとにプロットした図である（実施例７）。
【図１０】MNCからのCD19＋B細胞の出現が検出されないwellの割合を培養細胞数ごとにプロットした図である(実施例８)。
【図１１】TSt-4の継代による頻度安定性を示した図である（実施例９）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の「stromal cell line」は、MNCと共培養することにより、MNCに含まれるT前駆細胞を未成熟T細胞まで分化誘導できる細胞か、あるいはB前駆細胞を未成熟B細胞まで分化誘導できる細胞であれば、いずれも用いることができる。さらに、この分化誘導によって、未成熟T細胞または未成熟B細胞まで分化誘導することにより、MNC中に含まれるT前駆細胞またはB前駆細胞を検出できる細胞であることが好ましい。
T前駆細胞を検出する場合では、「DLL1またはDll1を強制発現させたstromal cell line TSt-4」を用いることが特に好ましい。また、B前駆細胞を検出する場合では、「stromal cell line TSt-4」を用いることが特に好ましい。これらのstromal cell lineの由来となる動物種は特に問わない。【００１１】
本発明の「DLL1またはDll1を強制発現させたstromal cell line TSt-4」とは、マウス胸腺より樹立された「stromal cell line TSt-4」にノッチリガンド（Notch ｌigand）のDLL1またはDll1の遺伝子を導入することで、DLL1またはDll1を強制発現させた細胞のことをいう。
導入する遺伝子は、DLL1またはDll1の機能を有すれば、DLL1遺伝子またはDll1の全部または一部のいずれも用いることができる。また、この遺伝子の由来となる動物種は特に問わない。例えば、Dll1を強制発現させたマウス遺伝子導入stromal cell line（以下、TSt-4/mDll1とする。）、DLL1を強制発現させたヒト遺伝子導入stromal cell line（受託番号：FERM BP-10375, 以下、TSt-4/hDLL1とする。）等を挙げることができる。
T前駆細胞の検出方法において、このTSt-4/mDll1またはTSt-4/hDLL1とMNCまたはMNCに含まれるCD34＋CD38−Lin−細胞を共培養することで、MNCに含まれるT前駆細胞をCD5＋CD7＋CD3−の未成熟T細胞まで分化誘導できる。また、B前駆細胞の検出方法として、「stromal cell line TSt-4」とMNC、MNCに含まれるCD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞を共培養することで、MNCに含まれるB前駆細胞をCD19＋のB細胞まで分化誘導できる。【００１２】
本発明のT前駆細胞の検出方法は、stromal cell lineとMNCまたはMNCに含まれるCD34＋CD38−Lin−細胞とを共培養することでMNCに含まれるT前駆細胞を検出することによって行う。具体的には、TSt-4/mDll1またはTSt-4/hDLL1とMNCを共培養することで、MNCに含まれるT前駆細胞またはMNCに含まれるCD34＋CD38−Lin−細胞がCD5＋CD7＋CD3−の未成熟T細胞まで分化誘導される。次にこの分化誘導によって得られたCD5＋CD7＋CD3−の未成熟T細胞をフローサイトメーター等で解析する。そしてこの解析において、分化誘導によってCD5＋CD7＋CD3−の未成熟T細胞が得られたことから、MNCまたはMNCに含まれるCD34＋CD38−Lin−細胞中にT前駆細胞が含まれていることが確認できる。これによって、T前駆細胞を検出することができる。また、T前駆細胞を検出し、定量する場合には、単核球を限界希釈法によって培養することが好ましい。
本発明の共培養では、MNCに含まれるT前駆細胞はCD4/CD8を発現する成熟T細胞までは分化しないため、元から存在する成熟したT細胞や、それが培養中に増殖したものと区別することができる。よって造血幹/前駆細胞といわれているCD34＋CD38−Lin−細胞を分画することなく、MNCをTSt-4/hDLL1と共培養することでT前駆細胞を定量的に検出できる。【００１３】
本発明のB前駆細胞の検出方法は、stromal cell lineとMNC 、MNCに含まれるCD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞とを共培養することでMNCに含まれるB前駆細胞を検出することによって行う。具体的には、TSt-4とMNC 、MNCに含まれるCD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞を共培養することで、MNCに含まれるB前駆細胞がCD19＋のB細胞まで分化誘導される。次にこの分化誘導によって得られたCD19＋のB細胞をフローサイトメーター等で解析する。この解析において、分化誘導によってCD19＋のB細胞が得られたことから、MNC 、MNCに含まれるCD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞中にB前駆細胞が含まれていることが確認できる。また、B前駆細胞の検出には、定量する場合には、単核球を限界希釈法によって培養することが好ましい。
本発明の共培養では、MNC中に元から存在するCD19＋のB細胞は消失するため、新たに分化誘導されたCD19＋細胞はすべてB前駆細胞由来である。よって造血幹/前駆細胞といわれているMNC、CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞を分画することなく、MNCをTSt-4と共培養することでB前駆細胞を定量的に検出できる。なお、MNC中に元から存在するCD19＋のB細胞はすべてsIgM＋であるのに対し、新たに分化誘導されたCD19＋細胞はすべてsIgM−の未成熟B細胞であり、このことによっても、新たに分化誘導されたCD19＋細胞はすべてB前駆細胞由来であるといえる。【００１４】
本発明の「移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法」は、評価の対象となる移植ソースに含まれるMNCについて、本発明のT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法を用いることで行うことができる。
具体的にはそれぞれの移植ソースについて、本発明の検出方法で未成熟T細胞や未成熟B細胞を検出することで、移植ソースに含まれるT前駆細胞、B前駆細胞の数を測定する。これにより、各移植ソースにおける造血前駆細胞の数等を把握し、その移植ソースの性質を評価することができる。
移植ソースの性質の評価には、単核球あたりのT前駆細胞またはB前駆細胞の頻度を用いることができる。例えば、ポワソン（Poisson）分布などを用いて、限界希釈法により、培養した単核球から分化誘導された未成熟T細胞を解析しT前駆細胞を検出することで行うことができる。そして検出されたT前駆細胞の数を調べることにより、T前駆細胞の頻度を決定することができる。
本発明の「移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価する方法」は、さらにin vitro コロニー形成法によって赤血球および顆粒球系列前駆細胞を定量することを含むことができる。これにより、移植ソースの赤血球および顆粒球系列への分化能およびT前駆細胞またはB前駆細胞の分化能を調べることができ、移植ソースの性質を包括的に把握することができる。【００１５】
本発明の「移植ソース」には、移植に用いられるいずれのものも含むことができるが、例えば、CB、末梢血、骨髄等を挙げることができる。また、「治療対象となる疾病に応じて分類された移植ソース」とは、本発明の検出方法において性質が評価された移植ソースであって、例えば、T前駆細胞を多く含む移植ソース、B前駆細胞を多く含む移植ソースまたはT前駆細胞およびB前駆細胞を多く含む移植ソースというように、その性質からどのような疾病の治療に適しているのかを分類したもののことをいう。例えば、T前駆細胞およびB前駆細胞を多く含む移植ソースは、T細胞およびB細胞両者の障害を来たす免疫不全症である重症複合型免疫不全症やWiskott-Aldrich症候群等を「治療対象となる疾病」として分類することができる。【００１６】
本発明の「移植ソースの評価キット」とは、移植ソースにおける造血前駆細胞の性質を評価するための試薬、細胞等を少なくとも2つ以上組み合わせたもののことをいう。例えば、共培養用のプレートと培地を組み合わせたものや、共培養用のプレートにstromal cell lineとして、それぞれTSt-4、TSt-4/mDll1またはTSt-4/hDLL1を培養した状態のもの等を挙げることができる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
＜stromal cell lineの樹立＞
Watanabeら（参考文献）により樹立されたマウス胸腺由来のTSt-4を使用した。TSt-4の培養には5％ウシ胎仔血清（Fetal Bovine Serum（FBS; Lot. 511042；BioSource International, Camarillo, CA)）、1mM ピルビン酸ナトリウム（Sodium pyruvate (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)）、1mM 非必須アミノ酸溶液（Non-essential amino acid solution(Invitrogen)）、5×10-5M ２−メルカプトエタノール（2-Mercartoethanol(2-ME; NACARAI TESQUE, Osaka, Japan)）、100μg/mL ストレプトマイシン（Streptomycin）、 100U/mLペニシリン（Penicillin）を添加したRPMI1640(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を完全培地（complete medium）として使用した。
このTSt-4にレトロウイルスベクターpMSCV-IRES-EGFP（MIEベクター）（京都大学湊長博先生から供与）を用いてDll1を導入(pMSCV-Dll-1-IRES-EGFP)し、TSt-4/mDll1を作成した。導入したDll1遺伝子の配列を配列表配列番号1に記載した。また、同様にDLL1を導入(pMSCV-DLL1-IRES-EGFP)し、TSt-4/hDLL1を作成した。導入したDLL1遺伝子の配列を配列表配列番号2に記載した。【００１８】
TSt-4へのDLL1(Dll1)を導入したMIEベクター（以下MIEとする。）の導入は次のように行った。すなわち、10％FCS添加DMEM（Sigma D5796）を培地として用い、パッケージング細胞であるPhoenix（フェニックス）細胞（京都大学生田宏一先生から供与：東京大学北村俊雄先生作製）を8×105cells/2mLとなるように調製し、collagen-coated plate(IWAKI #4810-010)に2mL/well播種した。これを37℃、5％CO2の条件下で１晩培養した。
遺伝子導入にあたり、25μM chloroqine（クロロキン）添加培地を調製し、37℃に温め、Phoenix細胞の培地交換に用いた。次にDNA溶液を表１に記載の組成で調製した。このDNA溶液を別のFACSチューブに用意した2×HEPＥS Buffer Saline（HBS）250μLに泡立てながら加え、500μLの溶液とした。これをPhoenix細胞の培養plateに1滴ずつまんべんなく落とした。再度、Phoenix細胞を37℃、5％CO2の条件下で培養し、5時間後培養細胞中に小細胞集団があることを確認した。培養8時間後に培地2ｍLを交換し、この後さらに24時間経過後に培地1ｍLを交換した。これらの培地交換後、一晩培養した後、培養上清を回収し、0.22μmフィルター（MILLIPORE）で濾過滅菌後polygrene (ポリグレン)10pgを加えた。あらかじめ、12well plate(Costar)にコンフルエントにさせておいたTSt-4細胞の上清とpolygrene添加後の培養上清を交換した。32℃、1,750Gで1時間遠心分離し、その後完全培地を1mL加え37℃、5％CO2の条件下で培養しTSt-4細胞を増殖させた。【００１９】
【表１】
2007040123.tif 000002
【００２０】
遺伝子導入を行った各細胞について、488nmのレーザーによるグリーン蛍光（GFP）の励起を検出することで、遺伝子が導入されたことを確認した。図1-1に示すように、グラフの左側は遺伝子が導入されなかった陰性の細胞を示し、右側は遺伝子が導入された陽性の細胞を示す。右端の細胞が大多数であることから、高い確立で遺伝子が導入された細胞が得られたことが確認された。導入された細胞のみをセルソーターを用いて分取し培養した。このうち、TSt-4/hDLL1（受託番号；FERM BP-10375）は、産業技術総合研究所微生物寄託センターに寄託した。
参考文献：Watanabe Y, Mazda O, Aiba Y, Iwai K, Gyotoku J, Ideyama S, Miyazaki J, Katsura Y., Cell Immunol., 142(2), 385-97, Jul., 1992.【００２１】
＜stromal cell lineの分化誘導能の確認＞
マウス胎仔胸腺細胞（以下、mFTとする。）と、TSt-4/mDll1またはTSt-4/hDLL1とを共培養した後、培養後の細胞を解析することでstromal cell lineの分化誘導能を調べた。コントロールとしてTSt-4との共培養も行った。
10％FCS、1mM Sodium pyruvate、1mM Non-essential amino acid solution、5×10-5M 2-ME、100μg/mL Streptomycin、100U/mL Penicillinを添加したRPMI1640をcomplete mediumとして用いた。培養開始4日前に、12ウェル（well）プレートの各wellにcomplete mediumを用いTSt-4、TSt-4/mDll1またはTSt-4/hDLL1を播種した。これらの単層の細胞上に、mFTのCD4/CD8のいずれも発現していないダブルネガティブ（DN（double negative））細胞300個を播種し共培養を行った。図1-2にTSt-4/mDll1とDN細胞との共培養によって形成された敷石（cobble stone）様のコロニーを示した。
妊娠13日目のC57BL/6マウス(CLEA Japan)胎仔より胸腺をとりだし、mFTを分離し、コンフルエント（confluent）となった各stromal cell line上に播種した。37℃、5％CO２存在下に共培養し、7日後、トリプシン-EDTA(Trypsin-EDTA(Invitrogen)）を用いて培養した細胞を分離した。
FcRブロッキング（FcR blocking）の後、FITC(PE)標識抗マウスCD8 (clone 53-6.7;Pharmingen)、FITC(PE)標識抗マウスCD4(clone H129.19;Pharmingen)を用いて染色し、フローサイトメーターFACSCalibur(Nippon Becton Dickinson, Japan)を用いて細胞表面マーカーを解析した。【００２２】
回収した細胞のCD4/8 profileは図1-3に示した。TSt-4/mDll1と7日間共培養したmFTのDN細胞300個はCD4/CD8のいずれも発現しているDP（double positive）細胞だけでなく、CD4のみが発現しているCD4 SP(single positive)細胞が多数出現した。この系では、CD8のみが発現しているCD8 SP細胞はあまり出現しなかった。同様にTSt-4/hDLL1と7日間共培養したmFTのDN細胞300個は、TSt-4/mD111と同様に、DP細胞およびCD4 SP細胞が誘導された。一方、コントロールであるTSt-4との共培養では、DP細胞もSP細胞のいずれもほとんど出現しなかった。
この結果より、本発明のTSt-4/mDll1およびTSt-4/hDLL1はT前駆細胞の分化誘導に有用であることが示された。
【実施例２】
【００２３】
ヒトT前駆細胞の検出法
＜原理＞
ミエロイド、エリスロイド系列へ分化可能な前駆細胞はCFU-Cによって臍帯血単核球（以下、CBMNCとする。）そのままで、clonal assayが可能であり、その数を知ることができる。T細胞系列への分化能を持つ造血幹/前駆細胞もCBMNCを用いて検出し、定量することができれば、用いるCBのT細胞生産能をあらかじめ知ることが可能となる。
そこで、本発明では、移植ソースとして例えばCBに含まれるT前駆細胞を検出する場合に、本発明で樹立したTSt-4/hDLL1とCBMNCとを共培養することで、CBMNC中に含まれているT前駆細胞をT細胞へ分化誘導することにより、T前駆細胞を検出することを可能とした。
この共培養において、TSt-4/hDLL1はヒト造血前駆細胞からCD19＋のB細胞を出現させず、T前駆細胞をCD3−CD5＋またはCD3−CD5＋CD７＋の未成熟なT細胞までしか分化させない。培養後に出現する細胞は、CD19−CD3−CD5＋CD19−）であるためB細胞ではない。また、CD3−CD5＋CD19−の未成熟なT細胞は、培養前のMNC中にはほぼ存在しない(図2-2)ので、抗CD3およびCD5抗体を用いて簡単に区別することができる。この共培養ではCBMNC中に含まれている成熟T細胞（CD3＋細胞）も増殖する(図2-1)が、T前駆細胞はCD3−CD5＋CD19−の未成熟な細胞までしか増殖しないため、既に含まれている成熟T細胞と、新たに前駆細胞から分化・増殖するT細胞とを区別することができる。
従って、このTSt-4/hDLL1との共培養法を用いて、培養後にCD3−CD5＋細胞が出現する頻度を解析することにより、CBあたりのT前駆細胞を計測することができる。【００２４】
＜試料の調製＞
CBに含まれるMNCあたりのT前駆細胞を検出するために試料を調製した。
１．CBMNCの調製
東京臍帯血バンクより研究用に供与された、採取後24時間以内のCBを使用した。Lymphoprep(1.077g/cm3)(AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Norway)を用いて比重遠心法により、MNCを分離した。3回洗浄後、これを1.5×107個ずつ分注し、凍結保存液セルバンカー（Cell Banker(Juji Field（十慈フィールド）, Tokyo, Japan)）を用いてCBMNCとして凍結保存した。【００２５】
２．CD34＋細胞およびCBCD34＋CD38−Lin−細胞の調製
１）CD34＋細胞の調製
CBMNCに含まれるCD34＋CD38−Lin−細胞を共培養に用いる場合において、CD34＋CD38−Lin−細胞のセルソーターでの分取において、その前段階として、ソーティングをより効率よく行うために、CD34＋細胞だけを調製した。調製方法としては、上記で分離したCBMNCの一部に、MiniMACS、MACS MS Separation ColumnsおよびMACS Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit (all Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を用いることで、MNCからCD34＋細胞とした。Cell Bankerを用いて得られたCD34＋細胞を凍結保存した。【００２６】
２）CD34＋CD38−Lin−細胞の調製
上記で保存したCBのCD34＋細胞を速やかに解凍し、洗浄した後、FcR blockingを行った。Fluorescein isothiocyanate (FITC)-anti-lineage markers (Lin)[CD3(clone HIT3a)、CD4(clone RPA-T4)、CD5(clone UCHT2)、CD7(clone M-T701)、CD8(clone HIT8a)、CD14(clone M5E2)、CD19(clone HIB19)、CD56(clone B159)、Glycophorin A(clone Ga-R2(HIR2))]、PE (APC)標識抗ヒトCD34(clone 581)、 PE (APC)標識抗ヒトCD38 (clone HIT2)(all Pharmingen)を用いて染色し、フローサイトメーターFACSVantage (Nippon Becton Dickinson, Japan)を用いてCD34＋CD38−Lin−細胞を分取した（図8）。
【実施例３】
【００２７】
＜CD34＋CD38−Lin−細胞に含まれるT前駆細胞の検出および定量＞
１．CD34＋CD38−Lin−細胞とTSt-4/hDLL1との共培養
CD34＋CD38−Lin−細胞とTSt-4/hDLL1との共培養を限界希釈法によって行った。比較としてTSt-4との共培養も行った。培養開始4日前に、48wellプレートの各wellに、complete mediumを用いてTSt-4またはTSt-4/hDLL1を播種した。CD34＋CD38−Lin−細胞を速やかに解凍し洗浄した後、限界希釈して、confluentとなった各stromal cell line上に播種した。37℃、5％CO２にて約33日間培養し、その間1週間ごとに培地（medium）を交換した。【００２８】
２．培養後の細胞の解析
培養後、得られた細胞をフローサイトメトリーで解析した。
共培養によって分化誘導された細胞をstromal cell lineとともにプレートから剥離し、FcR blocking後、FITC-anti-CD3、FITC-anti-CD7、FITC-anti-CD8 、FITC-anti-CD19、PE-anti-CD4 (clone RPA-T4(Pharmingen))、PE-anti-CD5(clone UCHT2(Pharmingen))、PE-anti -CD11b(clone Bear1 (IOTest))、APC-anti human-CD45(clone J33 (IOTest))を用いて染色し、フローサイトメーターFACSCaliberを用いて細胞表面抗原を解析した。解析時には、GFP＋であるストローマを除去するため、APC−anti human-CD45を使用した。
フローサイトメトリーの結果を図3に示した。CD34＋CD38−Lin−細胞とTSt-4との共培養中ではミエロイド系細胞、B細胞が出現するが、T系列の細胞は作られなかった。一方、CD34＋CD38−Lin−細胞とTSt-4/hDLL1との共培養では、B系列細胞への分化は起こらず、CD5＋細胞の出現がみられた。この細胞はCD7＋CD19−であり、T系列細胞であると考えられるが、CD3、CD4、CD8などは発現していなかった。【００２９】
３．TCR 遺伝子再構成の解析
ゲノムDNAアッセイ（genomic DNA assay）法を用いて、TCRβ鎖のDJ領域の再構成が起こっているか否かについて解析した。培養後の1×105の細胞を20μLのPCR バッファー（buffer）に溶解し、55℃で1時間、その後95℃で10分インキュベート（incubete）し、PCR テンプレート（templeate）として用いた。
配列表配列番号3、配列番号4に記載のプライマー（Primer）を用いた。反応液は20μLとし、templeateを4μL、10×PCR bufferを1.6μL、2.5ｍM dNTPsを1.6μL、各primerを4pmol、および0.6Uのタックポリメラーゼ（Taq polymerase）を使用した。サーモサイクル（Thermocycling）は94℃ 5分ののち、94℃ 1分、60℃ 1分、72℃ 1分を40サイクル行い、最後に72℃ 10分とした。PCR産物を電気泳動により、1.2％アガロースゲルに展開した。【００３０】
TSt-4/hDLL1との共培養で出現したCD5＋細胞がT系列細胞であるならば、TCRβ鎖のDJ領域の再構成がおこっていると考えられる。Genomic DNAを配列表配列番号3および配列番号4に記載のTCRβ鎖のDJ領域のprimerを用いてPCR解析したところ、TSt-4/hDLL1との共培養で出現した細胞では、germ lineは消失し、DJ再構成がおきたときにあらわれる160bpのバンドが認められた(図4)。TSt-4との共培養で出現した細胞ではこのバンドは認められず、germ lineのみが認められた。TSt-4/hDLL1との共培養により、CD34＋CD38−Lin−細胞から出現したCD5＋細胞は未熟なT細胞であると考えられた。【００３１】
４．CD34＋CD38−Lin−細胞中のT前駆細胞数の測定
限界希釈したCD34＋CD38− Lin−細胞のTSt-4/hDLL1との共培養法により、CD34＋CD38−Lin−細胞中の CD3−CD5＋のT細胞の出現頻度を調べた。CD5＋CD7＋細胞が検出されないwellの割合をCD5＋CD7＋細胞が検出されない細胞の割合として培養細胞数ごとにプロットし、Poisson分布を用いて解析した（図5-1）。その結果、T細胞へ分化する能力を持った前駆細胞は、CD34＋CD38−Lin−細胞中に、1.9個に1個含まれていると推定された。
【実施例４】
【００３２】
＜CBMNCに含まれるT前駆細胞の検出および定量＞
１．CBMNCとTSt-4/hDLL1との共培養
CBMNCとTSt-4/hDLL1との共培養を限界規釈法によって行った。培養開始4日前に、48wellプレートの各wellにcomplete mediumを用いTSt-4/hDLL1を播種した。CBMNCを速やかに解凍し、洗浄した後限界希釈して、confluentとなったTSt-4/hDLL1上に播種した。37℃、5％CO２にて約33日間培養し、その間1週間ごとにmediumを交換した。【００３３】
２．培養後の細胞の解析
培養後、得られた細胞をフローサイトメトリーで解析した。
共培養によって分化誘導された細胞をstromal cell lineとともにプレートから剥離し、FcR blocking後、FITC-anti-CD3、PE-anti-CD5(clone UCHT2(Pharmingen))、APC-anti human-CD45(clone J33 (IOTest))を用いて染色し、フローサイトメーターFACSCaliberを用いて細胞表面抗原を解析した。解析時には、GFP＋であるストローマを除去するため、APC−anti human-CD45を使用した。【００３４】
３．CBMNC中のT前駆細胞数の測定
限界希釈したCBMNC のTSt-4/hDLL1との共培養法により、CBMNC中のCD5＋CD3−T細胞の出現頻度を調べた。前述のように、CD5＋CD3−の未成熟なT細胞は、培養前のMNC中にはほぼ存在しないため、抗CD3およびCD5抗体を用いて簡単に区別することができる。CD5＋CD3−細胞が検出されないwellの割合をCD5＋CD3−細胞が検出されない細胞の割合として培養細胞数ごとにプロットし、Poisson分布を用いて解析した(図5-2)。その結果、T細胞へ分化する能力を持った前駆細胞は、用いたCBMNC中に、1205個に1個含まれていることが確認された。
上記で用いたCBMNCにはCD34＋CD38−Lin−細胞は、0.18％含まれており、これを上記実施例３で測定されたCD34＋CD38−Lin−細胞中に含まれるT前駆細胞の割合（1.9個に1個）を用いて計算すると、T前駆細胞はMNC1056個に1個含まれるという計算になり、MNCで培養した際の値とほぼ同じになった。
【実施例５】
【００３５】
１．T前駆細胞の検出方法の確認
本共培養系の細胞分化誘導能の安定性を確認するために、5つのCBMNCサンプルを用い、各3回の培養を行い、T前駆細胞の頻度を検討した。頻度はほぼ一定であり、安定した培養系であるといえた(図6)。 また、CBによるT前駆細胞の頻度の違いについてさらに検討した。異なる児由来のCBMNC 10サンプルについて検討したところ、T前駆細胞の頻度は1/861から1/4803までばらつきがあり、平均は1/2803であった（表２）。【００３６】
２．CFU-C assayによるミエロイド系前駆細胞の測定
MethoCult GFH4434V（Stem Cell Technology, Vancouver, BC; Lot.3H079061）にCBMNC2×104/mLまたはCD34＋CD38−Lin−細胞100/mLを播種し、培養14日目にコロニーをカウントした。CBMNCの培養において、CFU-GMは平均697個に1個の割合で認められた。また、CD34＋CD38−Lin−細胞の培養において、CFU-GMは平均3.6個に1個の割合で認められた。
異なる児由来の臍帯血間で比較する際、CFU-GM数とT前駆細胞数の比率は一定ではなく、ばらつきがある。CFU-C assayによる測定結果とT前駆細胞の測定結果とを合わせることで、新たな移植源の評価方法として使用することができる。【００３７】
【表２】
2007040123.tif 000003
【実施例６】
【００３８】
ヒトB前駆細胞の検出法
＜原理＞
本発明では、移植ソースとして例えばCBに含まれるB前駆細胞を検出する場合に、TSt-4とCBMNCとを共培養することで、CBMNC中に含まれているB前駆細胞を分化誘導することにより、B前駆細胞を検出することを可能とした。
造血幹/前駆細胞移植ソースのB細胞生産能を簡単に評価するには、MNCをそのままで用いて、B細胞系列への分化能を持つ造血幹/前駆細胞を検出できる方法をつくることが重要である。本発明では、この共培養を33日間続けた。この共培養によってMNC中に含まれているCD19＋B細胞が死滅することより(図7)、TSt-4との共培養後に出現するCD19＋B細胞はすべて造血前駆細胞由来であることが確認できた。このことによってCBMNC中にB細胞が含まれていてもB前駆細胞から分化・増殖したB細胞のみを検出することができる。
従って、TSt-4との共培養法を用いて、培養後に出現するCD19＋B細胞が出現する頻度を解析することにより、CBに含まれるMNCあたりの前駆細胞を計測することができる。【００３９】
＜stromal cell line および試料の調製＞
CBに含まれるMNCあたりのB前駆細胞を検出するために試料を調製した。
１．stromal cell lineの調製  TSt-4を使用した。TSt-4の培養には、5％Fetal Bovine Serum（FBS; Lot. 511042；BioSource International, Camarillo, CA)、1mM Sodium pyruvate (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)、1mM Non-essential amino acid solution(Invitrogen)、5×10-5M 2-Mercartoethanol(2-ME; NACARAI TESQUE, Osaka, Japan)、100μg/mL Streptomycin、 100U/mL Penicillin Gを添加したRPMI1640(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を使用した。【００４０】
２．試料の調製
東京臍帯血バンクより研究用に供与された、採取後24時間以内のCBを使用した。Lymphoprep (1.077g/cm3) (AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Norway)を用いて、比重遠心法によりMNCを分離した。3回洗浄後、これを1.5×107個ずつ分注し、凍結保存液セルバンカー（Cell Banker(Juji Field（十慈フィールド）, Tokyo, Japan)）を用いてCBMNCとして凍結保存した。【００４１】
３．CD34＋細胞の調製
CBMNCに含まれるCD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞を共培養に用いる場合には、CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞のセルソーターでの分取において、ソーティングをより効率よく行うために、あらかじめ簡便法を用いてCD34＋細胞を調製、保存した。すなわち、調製方法としては、上記で分離したCBMNCの一部に、MiniMACS、MACS MS Separation ColumnsおよびMACS Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit  (all Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) を用いることで、MNCからCD34＋細胞とし、Cell Banker(Juji Field, Tokyo, Japan)を用いてCD34＋細胞を凍結保存した。【００４２】
４．CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞の調製
上記で保存した、CD34＋細胞を速やかに解凍し、洗浄した後、FcR blockingを行った。Fluorescein isothiocyanate (FITC)-anti-lineage markers (Lin) [CD3 (clone HIT3a)、CD4 (clone RPA-T4)、CD5 (clone UCHT2)、CD7 (clone M-T701)、CD8 (clone HIT8a)、CD14 (clone M5E2)、CD19 (clone HIB19)、CD56 (clone B159)、Glycophorin A (clone Ga-R2 (HIR2))]、R-phycoerythrin (PE)-anti-CD34 (clone 581)、Allophycocyanin (APC)-anti-CD38-allophycocyanin (clone HIT2) (all Pharmingen)を用いて染色し、フローサイトメーターFACSVantage (Nippon Becton Dickinson, Japan)を用いてCD34＋CD38−Lin−細胞およびCD34＋Lin−細胞を分取した (図8)。
【実施例７】
【００４３】
＜CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞に含まれるB前駆細胞の検出および定量＞
１．CBMNC、CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞とTSt-4との共培養
CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞とTSt-4との共培養を行った。共培養開始4日前に、48wellプレートの各wellにcomplete mediumを用いTSt-4細胞 を播種した。CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞をconfluentとなったTSt-4細胞上に限界希釈法を用いて播種した。37℃、5％CO２にて約33日間培養し、その間1週間ごとにmediumを交換した。【００４４】
２．培養後の細胞の解析
培養後、得られた細胞をフローサイトメトリーで解析した。
共培養によって分化誘導された細胞をstromal cell lineと共にプレートから物理的に剥離し、FcR blocking後、FITC-anti-CD3、FITC-anti-CD7、FITC-anti-CD8、FITC-anti-CD19、PE-anti-CD4(clone RPA-T4 (Pharmingen))、PE-anti-CD5(clone UCHT2 (Pharmingen))、PE-anti-CD11b (clone Bear1 (IOTest))、APC-anti-CD45(clone J33 (IOTest))を用いて染色し、フローサイトメーターFACSCaliber (Becton Dickinson)を用いて細胞表面抗原を解析した。解析にはCELLQuest (BD Biosciences)を使用した。
フローサイトメトリーの結果を図3に示した。CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞とTSt-4との共培養中では、骨髄球系細胞(CD11b＋)およびB系細胞(CD19＋)への分化が認められた。しかし、T細胞系列の細胞は全く検出されなかった。すなわち、TSt-4はヒトCB中の最も初期の造血幹/前駆細胞であるCD34＋CD38−Lin−細胞からミエロイド系細胞およびB細胞への分化を支持することが示された。【００４５】
３．CD34＋Lin−細胞またはCD34＋CD38−Lin−細胞に含まれるB前駆細胞数の測定
限界希釈したCD34＋CD38−Lin−細胞またはCD34＋Lin−細胞のTSt-4との共培養法により、CD34＋Lin−細胞およびCD34＋CD38−Lin−細胞中のB細胞の出現頻度を調べた。各培養細胞数においてCD19＋のB細胞が検出されないwellの割合を培養細胞ごとにプロットし（図9-1および図9-2）、Poisson分布を用いて解析した。その結果、B細胞へ分化する能力を持った前駆細胞は、CD34＋Lin−細胞では25.0個に1個、CD34＋CD38−Lin−細胞では14.6個に1個含まれていることが推定された。
【実施例８】
【００４６】
＜CBMNCに含まれるB前駆細胞の検出および定量＞
１．CBMNCとTSt-4との共培養
CBMNCとTSt-4との共培養を限界規釈法によって行った。共培養開始4日前に、48wellプレートの各wellにcomplete mediumを用いTSt-4細胞 を播種した。CBMNCを速やかに解凍し、洗浄した後限界希釈して、confluentとなったTSt-4細胞上に播種した。37℃、5％CO２にて約33日間培養し、その間1週間ごとにmediumを交換した。【００４７】
２．培養後の細胞の解析
培養後、得られた細胞をフローサイトメトリーで解析した。共培養によって分化誘導された細胞をstromal cell lineとともにプレートから物理的に剥離し、FcR blocking後、FITC-anti-CD19、PE-anti-CD11b (clone Bear1 (IOTest))、APC-anti-CD45 (clone J33 (IOTest))を用いて染色し、フローサイトメーターFACSCaliber (Becton Dickinson)を用いて細胞表面抗原を解析した。解析にはCELLQuest (BD Biosciences)を使用した。【００４８】
３.CBMNC中のB前駆細胞数の定量
限界希釈したCBMNCとTSt-4との共培養により、CBMNC中のCD19＋のB細胞の出現頻度を調べた。培養前のMNCに含まれているCD19＋細胞は、培養中に消失する。このことによって、MNCのままで培養しても新たに前駆細胞から作られたB細胞のみを検出でき、CBMNCに含まれているB前駆細胞を検出することができる。CD19＋B細胞が検出されないwellの割合を培養細胞数ごとにプロットし、Poisson分布を用いて解析した(図10)。その結果、B細胞へ分化する能力を持った前駆細胞は、用いたMNC中に、3809個に1個含まれていることが確認された。
上記で用いたCBMNCにはCD34＋Lin−細胞は、0.79％含まれており、これを実施例７で測定されたCD34＋Lin−細胞中に含まれるB前駆細胞の割合（25.04個に1個）を用いて計算すると、B前駆細胞はCBMNC3175個に1個含まれるという計算になり、MNCで培養した際の値とほぼ同じになった。
【実施例９】
【００４９】
１．B前駆細胞の検出方法の確認
本共培養系の細胞分化誘導能の安定性を確認するために、4つのCBMNCサンプルを用い、各2回の培養を行い、B前駆細胞の頻度を検討した。頻度は各試料においてほぼ一定であり、安定した培養系であるといえた(図11)。また、CBによるB前駆細胞の頻度の違いについてさらに検討した。異なる児由来のCBMNC 10サンプルについて検討したところ、B前駆細胞の頻度は1/765から1/12585までばらつきがあり、平均は1/889であった(表３)。
【表３】
2007040123.tif 000004
【００５０】
２．CFU-C assayによるミエロイド系前駆細胞の測定
MethoCult GFH4434V（Stem Cell Technology, Vancouver, BC; Lot.3H079061）にCBMNC 2×104/mL、CD34＋100 cells/mLまたはCD34＋CD38−Lin−細胞100 cells /mLを播種し、培養14日目にコロニーをカウントした。CBMNCの培養において、CFU-GMは平均697個に1個の割合で認められた。また、CD34＋Lin−細胞の培養において、CFU-GMは平均4.8個に1個、CD34＋CD38−Lin−細胞の培養において、CFU-GMは平均3.7個に1個の割合で認められた(表４)。
この測定方法は、主に顆粒球系列およびマクロファージの前駆細胞を測定できるものである。異なる児由来の臍帯血間で比較する際、CFU-GM数とB前駆細胞数の比率は一定ではなくばらつきがある。従って、CFU-C assayによる測定の結果とB前駆細胞数の測定結果とを合わせることで、新たな移植源の評価方法として使用することができる。
【表４】
2007040123.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のT前駆細胞またはB前駆細胞の検出方法移植ソースにおける造血前駆細胞の性質の評価を可能とする。この方法は安定かつ簡便であるので、移植ソースの有用性を事前に調べることができる。また、移植ソースの品質管理にも利用することができる。
【寄託された生物材料への言及】
【００５２】
イ．当該生物材料を寄託した寄託機関の名称およびあて先
名称：独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６
ロ．イの機関に寄託した日付
平成１７年７月１５日（ブタペスト条約に基く寄託日）
ハ．イの機関が寄託について付した寄託番号
FERM BP-10375
【図１−１】
2007040123.tif 000006
【図１−２】
2007040123.tif 000007
【図１−３】
2007040123.tif 000008
【図２−１】
2007040123.tif 000009
【図２−２】
2007040123.tif 000010
【図３】
2007040123.tif 000011
【図４】
2007040123.tif 000012
【図５−１】
2007040123.tif 000013
【図５−２】
2007040123.tif 000014
【図６】
2007040123.tif 000015
【図７】
2007040123.tif 000016
【図８】
2007040123.tif 000017
【図９−１】
2007040123.tif 000018
【図９−２】
2007040123.tif 000019
【図１０】
2007040123.tif 000020
【図１１】
2007040123.tif 000021
【配列表】
2007040123000001.app
【国際調査報告】
2007040123.tif 000022
2007040123.tif 000023
2007040123.tif 000024
2007040123.tif 000025
2007040123.tif 000026
2007040123.tif 000027
2007040123.tif 000028
2007040123.tif 000029
2007040123.tif 000030