(57)【要約】酵素活性の優れた改変型ＣｕｅＯ、及び、当該酵素を用いたケラチン繊維染色用組成物を提供する。パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性を有し、ＣｕｅＯから、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７からなる群より選択される少なくとも１つを除去してなる組換えタンパク質、並びに、当該組換えタンパク質及び酸化染料を含有するケラチン繊維染色用組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性を有する組換えタンパク質であって、
ＣｕｅＯから、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７からなる群より選択される少なくとも１つを除去してなることを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項２】
ＣｕｅＯから少なくともヘリックス５を除去してなる請求項１記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
ＣｕｅＯから、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７を除去し、かわりにスペーサを挿入してなる請求項１又は２記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む請求項３記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項５記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４３１である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜４いずれか１項に記載の組換えタンパク質を製造する方法であって、
請求項７又は８記載の形質転換体を培養し、産出された組換えタンパク質を採取することを特徴とする製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質、及び、酸化染料を含有することを特徴とするケラチン繊維染色用組成物。
【請求項１１】
さらに、アルカリ性化合物を含有する請求項１０記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項１２】
ケラチン繊維が毛髪である請求項１０又は１１記載のケラチン繊維染色用組成物。
【請求項１３】
酸素含有雰囲気下、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質の存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることを特徴とする、ケラチン繊維の染色方法。
【請求項１４】
上記接触を、アルカリ条件下で行う請求項１３記載の染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣｕｅＯを改変してなる組換えタンパク質、当該組換えタンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、前記組換えタンパク質の製造方法、並びに、前記組換えタンパク質を用いたケラチン繊維染色用組成物及びケラチン繊維染色方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣｕｅＯは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのペリプラズム側の酵素を銅誘導型損傷から保護する働きをするタンパク質である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが産出するＣｕｅＯは５１６残基、分子量５６５５５Ｄａの単量体であるが、Ｎ末端側の２８残基はシグナル配列であり、ペリプラズムに移行する際に切断されて、４８８残基、分子量５３４０９Ｄａの成熟タンパク質となる。【０００３】
ＣｕｅＯは、１分子あたり銅４原子を含んでおり、マルチ銅オキシダーゼファミリーに分類される。ラッカーゼとは異なり、２，６−ジメトキシフェノール、カテコールなどのフェノール化合物を酸化する活性が著しく低い、もしくは全く酸化しない。５番目の銅が結合するサイトを有しており、外因性の銅の存在下ではフェノールオキシダーゼ活性を示す。ＣｕｅＯは、かつてｙａｃＫと呼ばれていた遺伝子がコードするタンパク質であり、そのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列は非特許文献１で報告されており、その基本的特性については非特許文献２及び非特許文献３で報告されている。【０００４】
非特許文献２では、ＣｕｅＯがパラフェニレンジアミンや２，６−ジメトキシフェノール等を酸化する酵素活性は極めて低い、もしくは示さないが、その酵素活性が２価の銅の共存下で向上することが記載されている。しかしながら、銅が存在しない系でのＣｕｅＯの上記酵素活性は、特に染色用途に用いるにあたっては、不十分なものであった。【０００５】
従来、毛髪や種々の繊維を含むケラチン繊維を染色するにあたって、染色効果を持続させるために、酸化染料が用いられている。酸化染料は、酸化反応及び重合反応を経て発色することによって染色を達成するものであり、永久染色剤を構成するものである。【０００６】
酸化染料の酸化反応及び重合反応を進行させるために、従来、過酸化水素等の酸化剤が使用されてきた。これによって、毛髪内に浸透した酸化染料が酸化重合して、高分子体の色素が形成されて毛皮質内に沈着する。しかしながら、過酸化水素は反応性が高いことから取り扱いに十分な注意が必要である。また、アルカリと過酸化水素の併用による頭皮や毛髪へのダメージが問題となっていた。さらに、酸化染料及びアルカリ剤を配合した一剤と、過酸化水素を配合した二剤を使用時に混合するため二剤式となり、使用方法が煩雑であった。【０００７】
そこで、酸化剤ではなく、酵素を用いることによって酸化染料の直接的酸化重合反応を進行させる試みが行われている。このような酵素として、マルチ銅オキシダーゼの使用が提案されている。マルチ銅オキシダーゼは基質を直接酸化し、過酸化水素のような活性酸素種を生じることがないので、極めて安全に基質の酸化による発色、脱色、重合、分解等の多様な化学反応に適するものである。【０００８】
そのような染色用途におけるマルチ銅オキシダーゼとして、具体的には、中性フェノールオキシダーゼ様活性を有するフラムリナ属菌類の培養物（特許文献１を参照）、フラムリナ属に属する担子菌に由来する中性フェノールオキシダーゼ（特許文献２を参照）、マイセリオフトラ・サーモフィラに由来するラッカーゼ（特許文献３を参照）の使用が提案されている。【０００９】
ケラチン繊維の染色を酸性〜中性条件下で行うと、退色がきわめて容易に進行しやすい。ケラチン繊維を膨潤させて酸化染料を毛皮質内に浸透させ、高分子体の色素を毛皮質内に沈着させることによって、染色効果を向上、持続させるには、酸化染料による染色をアルカリ条件下で行うのが好ましい。【００１０】
ところが、特許文献１及び特許文献２に記載された中性フェノールオキシダーゼは、中性付近に至適ｐＨを有しており、アルカリ条件下での使用に適したものではなかった。さらに、至適ｐＨである中性付近での安定性が低いことから実用的な使用において難点があった。加えて、これら中性フェノールオキシダーゼは、直接染料の分解・脱色反応を触媒する性質をも持っており、直接染料による調色を困難とする問題点があった。【００１１】
特許文献３に記載されたマイセリオフトラ・サーモフィラに由来するラッカーゼについても、至適ｐＨが６．５であり、アルカリ条件下での使用に適したものではなかった。
【特許文献１】国際公開第２００４／０２０６１７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０７８９５８号パンフレット
【特許文献３】特表平１０−５０１１３７号公報
【非特許文献１】「サイエンス（ＳＣＩＥＮＣＥ）」、１９９７年、２７７（５３３１）、１４５３−１４７４頁
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ）」、２００１年８月、４８６６−４８７５頁
【非特許文献３】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」、２００３年８月、２７８巻、３４号、３１９５８−３１９６３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記現状に鑑み、以下のことを目的とするものである。
（１）野生型ＣｕｅＯと比較して、パラフェニレンジアミン等を酸化する酵素活性に優れた改変型ＣｕｅＯを提供すること。
（２）過酸化水素等の酸化剤を用いずに酵素を利用して酸化染料の酸化重合反応が効率よく進行し、一剤型とすることが可能なケラチン繊維染色用組成物であって、アルカリ条件を含む幅広いｐＨ領域での効率的なケラチン繊維の染色が可能で、かつ、直接染料の調色能を害することがなく、幅広い領域での温度及びｐＨにおいて安定なケラチン繊維染色用組成物、並びに、上記酵素を利用したケラチン繊維染色方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、野生型ＣｕｅＯから、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７からなる群より選択される少なくとも１つを除去してなる組換えタンパク質が以下の特性を有することを見出して、本発明を完成するに至ったものである。
（１）種々の酸化染料の直接的酸化重合反応を効率よく触媒する酵素活性を有しており、かつ、その酵素活性が、野生型ＣｕｅＯの酵素活性と比較して優れている。
（２）弱酸性〜アルカリ条件下で十分な酸化重合活性を発揮し、かつ、至適ｐＨをアルカリ領域に有している。
（３）直接染料を分解する性質を有していない。
（４）幅広い領域でのｐＨ及び温度において安定性に優れており、至適ｐＨを含むアルカリ領域においても安定性に優れている。【００１４】
すなわち本発明は以下のものに関する。
［１］パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性を有する組換えタンパク質であって、
ＣｕｅＯから、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７からなる群より選択される少なくとも１つを除去してなる組換えタンパク質。
［２］ＣｕｅＯから少なくともヘリックス５を除去してなる［１］記載の組換えタンパク質。
［３］ＣｕｅＯから、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７を除去し、かわりにスペーサを挿入してなる［１］又は［２］記載の組換えタンパク質。
［４］配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む［３］記載の組換えタンパク質。
［５］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子。
［６］上記［５］記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
［７］上記［６］記載の組換えベクターを含む形質転換体。
［８］受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４３１である［７］記載の形質転換体。
［９］上記［１］〜［４］のいずれかに記載の組換えタンパク質を製造する方法であって、
上記［７］又は［８］記載の形質転換体を培養し、産出された組換えタンパク質を採取することからなる製造方法。
［１０］上記［１］〜［４］のいずれかに記載の組換えタンパク質、及び、酸化染料を含有するケラチン繊維染色用組成物。
［１１］さらに、アルカリ性化合物を含有する［１０］記載のケラチン繊維染色用組成物。
［１２］ケラチン繊維が毛髪である［１０］又は［１１］記載のケラチン繊維染色用組成物。
［１３］酸素含有雰囲気下、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の組換えタンパク質の存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることからなる、ケラチン繊維の染色方法。
［１４］上記接触を、アルカリ条件下で行う［１３］記載の染色方法。
以下に本発明を詳述する。【００１５】
まず、本発明の組換えタンパク質について説明する。
本発明の組換えタンパク質は、パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性を有するものであって、ＣｕｅＯから、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７からなる群より選択される少なくとも１つを除去してなるものである。【００１６】
上記ＣｕｅＯとしては、天然に由来するＣｕｅＯ（野生型ＣｕｅＯ）であってもよいし、野生型ＣｕｅＯの性能を維持している限り、野生型ＣｕｅＯに修飾を施したＣｕｅＯであってもよい。【００１７】
上記ＣｕｅＯの由来は特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するものが好ましい。
上記ＣｕｅＯは、シグナル配列を含んだ未成熟ＣｕｅＯであってもよいし、シグナル配列を含まない成熟ＣｕｅＯであってもよい。【００１８】
本発明において、ＣｕｅＯにおけるヘリックス５とは、配列番号１における３５７位のＰｒｏから３７２位のＧｌｙまでのアミノ酸配列から構成されるα−ヘリックスのことをいう。
配列番号１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する野生型ＣｕｅＯの未成熟タイプにおけるアミノ酸配列を表すものであり、１−２８位のアミノ酸配列は、ＣｕｅＯがペリプラズムに運ばれる際に切断されるシグナル配列である。【００１９】
一方、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列から１−２８位のシグナル配列を削除したものであり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する野生型ＣｕｅＯの成熟タイプを表すアミノ酸配列である。
従って、ＣｕｅＯにおけるヘリックス５は、配列番号２においては、３２９位のＰｒｏから３４４位のＧｌｙまでのアミノ酸配列から構成される。【００２０】
本発明において、ＣｕｅＯにおけるヘリックス６とは、配列番号１における３７３位のＡｓｐから３７７位のＡｌａまでのアミノ酸配列（すなわち、配列番号２における３４５位のＡｓｐから３４９位のＡｌａまでのアミノ酸配列）から構成されるα−ヘリックスのことをいう。【００２１】
本発明において、ＣｕｅＯにおけるヘリックス７とは、配列番号１における４０３位のＡｓｐから４０６位のＨｉｓまでのアミノ酸配列（すなわち、配列番号２における３７５位のＡｓｐから３７８位のＨｉｓまでのアミノ酸配列）から構成されるα−ヘリックスのことをいう。【００２２】
ＣｕｅＯにおけるヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７は、図１で示すように、ＣｕｅＯに含まれるタイプＩ銅の上部を覆うものである。ＣｕｅＯが基質を酸化する際には、タイプＩ銅に基質が接近し、基質からタイプＩ銅に電子が移動する、という過程を経るものと考えられている。本発明においては、タイプＩ銅の上部を覆うヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７のいずれかを除去することにより、基質がタイプＩ銅に接近することが容易になり、基質を酸化する酵素活性が向上するものと考えられる。
なお、ヘリックス６とヘリックス７は上記構造未知配列を介して本来結合しているものであるが、両者の間の構造が不明であることから、図１では両者は切断されて表示されている。【００２３】
本発明において、ヘリックス５の除去とは、ヘリックス５を構成するアミノ酸配列（配列番号１における３５７位のＰｒｏから３７２位のＧｌｙまで、すなわち、配列番号２における３２９位のＰｒｏから３４４位のＧｌｙまで）の全てを除去するものであってもよいが、一部のアミノ酸配列の除去であってもよい。後者の場合、タイプＩ銅への基質の接近が容易になるような除去であればよく、その除去によって、ヘリックス５のヘリックス構造の全て又は一部が消失するものであればよい。具体的には、配列番号１における３５８位のＭｅｔから３７２位のＧｌｙまでのアミノ酸配列（すなわち、配列番号２における３３０位のＭｅｔから３４４位のＧｌｙまでのアミノ酸配列）を除去する場合や、ヘリックス５を構成するアミノ酸配列のおよそ半分を除去してヘリックス５のヘリックス構造を少なくする場合等が挙げられる。【００２４】
同様に、本発明において、ヘリックス６の除去とは、ヘリックス６を構成するアミノ酸配列（配列番号１における３７３位のＡｓｐから３７７位のＡｌａまで、すなわち、配列番号２における３４５位のＡｓｐから３４９位のＡｌａまで）の全てを除去するものであってもよいし、タイプＩ銅への基質の接近が容易になるものであれば一部のアミノ酸配列の除去であってもよい。【００２５】
さらに、本発明において、ヘリックス７の除去とは、ヘリックス７を構成するアミノ酸配列（配列番号１における４０３位のＡｓｐから４０６位のＨｉｓまで、配列番号２における３７５位のＡｓｐから３７８位のＨｉｓまで）の全てを除去するものであってもよいし、タイプＩ銅への基質の接近が容易になるものであれば一部のアミノ酸配列の除去であってもよい。【００２６】
本発明の組換えタンパク質は、ＣｕｅＯから、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７からなる群より選択される少なくとも１つを除去してなるものであるが、具体的には、ヘリックス５、６又は７のいずれか１つを除去したものでもよいし、ヘリックス５及び６を除去したものでよいし、ヘリックス５及び７を除去したものでよいし、ヘリックス６及び７を除去したものでもよいし、ヘリックス５、６及び７を除去したものでもよい。酸化重合活性の観点から、好ましくは、少なくともヘリックス５を除去したものであり、より好ましくは、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７を除去したものである。
本発明の組換えタンパク質の好ましい態様は、ＣｕｅＯから、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７を除去し、かわりにスペーサを挿入してなるものである。【００２７】
ヘリックス６及び７を除去する場合、又は、ヘリックス５、６及び７を除去する場合には、ヘリックス６とヘリックス７の間に存在する構造未知配列（配列番号１における３７８位のＧｌｙから４０２位のＰｈｅまで）をともに除去することがより好ましい。【００２８】
本発明において、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７からなる群より選択される少なくとも１つを除去してなる組換えタンパク質は、上述したようなアミノ酸配列を含まないものであるが、その上流のペプチド鎖と下流のペプチド鎖を結合することによって１個のペプチド鎖として構成されるものである。上流のペプチド鎖と下流のペプチド鎖とは直接結合させてもよいが、ＣｕｅＯの立体構造を維持できるようスペーサを介して結合させることが好ましい。当該スペーサについては後述する。【００２９】
本発明において、「パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性」とは、本願明細書の試験例１で示した条件下でパラフェニレンジアミンを酸化することができる性質のことをいう。すなわち、「パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性を有する」とは、常温（２３℃）で、ｐＨ５．５の水溶液中、パラフェニレンジアミンと、対象酵素を、パラフェニレンジアミン１モルに対して０．０００５モルの割合で混合し、３０秒間反応させることにより、４７０ｎｍで測定した吸光度が変化することをいう。【００３０】
本発明における好ましい組換えタンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の野生型ＣｕｅＯ（配列番号２）と比較して、パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性の点で優れている。【００３１】
本発明の組換えタンパク質は、さらに、パラアミノフェノールを酸化する酵素活性、オルトアミノフェノールを酸化する酵素活性、シリンガルダジンを酸化する酵素活性、ビリルビンを酸化する酵素活性、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を酸化する酵素活性のうち少なくとも１つ、又は、すべての酵素活性を有することが好ましい。各酵素活性は、本願明細書の試験例１で示した条件、及び、上記でパラフェニレンジアミンに関して示した条件に準じて測定することができる。
本発明における好ましい組換えタンパク質は、上述した酵素活性すべての点で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の野生型ＣｕｅＯ（配列番号２）よりも優れている。【００３２】
本願明細書において、スペーサとは、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７からなる群より選択される少なくとも１つを除去してなる本発明の組換えタンパク質においてＣｕｅＯの立体構造をより良好に維持するために、除去配列のかわりに挿入するアミノ酸残基又は配列である。
組換えタンパク質が上記酵素活性を有するものである限り、スペーサを構成するアミノ酸残基又は配列は特に限定されないが、好ましくは、１個のアミノ酸残基、又は、２〜１５個のアミノ酸残基からなる配列である。なかでも、１個のアミノ酸残基、又は、２〜１０個のアミノ酸残基からなる配列が好ましい。【００３３】
具体的には、ヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７を除去してなる態様においては、ヘリックス５−７に隣接するβ−シート構造が維持されるよう、１個のアミノ酸残基からなるスペーサとしては、Ｇｌｙ、Ｐｒｏが好ましく、２個のアミノ酸残基からなるスペーサとしては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ａｌａが好ましい。特に、フレキシブルな性質を持つことから、Ｇｌｙ−Ｇｌｙが好ましい。５個のアミノ酸残基からなるスペーサとしては、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａが好ましい。９個のアミノ酸残基からなるスペーサとしては、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａが好ましい。１０個のアミノ酸残基からなるスペーサとしては、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙが好ましい。【００３４】
本発明の組換えタンパク質の具体例として、野生型ＣｕｅＯにおいて配列番号１３で表されるアミノ酸配列（配列番号１における３５７位のＰｒｏから４０６位のＨｉｓまでのアミノ酸配列、すなわち、配列番号２における３２９位のＰｒｏから３７８位のＨｉｓまでのアミノ酸配列）を除去し、その後に、スペーサを挿入したものが挙げられる。【００３５】
この具体例において、スペーサとしてＧｌｙ−Ｇｌｙを用いた場合、そのアミノ酸配列は配列番号３又は配列番号４で表すことができる。配列番号３で表されるアミノ酸配列は、１−２８位のシグナル配列を含む未成熟タイプのものである。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、１−２８位のシグナル配列を含まない成熟タイプのものである。また、スペーサとしてＡｌａ−Ａｌａを用いた場合、そのアミノ酸配列は配列番号３６で表すことができる。このアミノ酸配列はシグナル配列を含まない成熟タイプのものである。【００３６】
そのほか、本発明の組換えタンパク質の具体例としては、野生型ＣｕｅＯにおいてヘリックス６及びヘリックス７を除去し、かわりにスペーサを挿入したもの（より具体的には、アミノ酸配列が配列番号３７で表されるもの。これは成熟タイプのもの）；野生型ＣｕｅＯにおいてヘリックス５を除去し、かわりにスペーサを挿入したもの（より具体的には、アミノ酸配列が配列番号３８で表されるもの。これは成熟タイプのもの）；野生型ＣｕｅＯにおいてヘリックス６及びヘリックス７のほか、ヘリックス５を構成するアミノ酸配列のおよそ半分を除去し、かわりにスペーサを挿入したもの（より具体的には、アミノ酸配列が配列番号３９で表されるもの。これは成熟タイプのもの）等が挙げられる。【００３７】
本発明の組換えタンパク質の最も好ましい態様は、配列番号４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含むものである。この態様には、上記配列番号で表されるアミノ酸配列のみからなるアミノ酸配列のほか、上記配列番号で表されるアミノ酸配列のＣ末端又はＮ末端に対して、ヒスチジンタグ等の、酵素活性に影響しない配列を付加してなるアミノ酸配列も含まれる。配列番号４で表されるアミノ酸配列のＣ末端に対してヒスチジンタグを付加したアミノ酸配列は配列番号５で表される。【００３８】
本発明の組換えタンパク質には、本願明細書において記載したアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
アミノ酸配列における置換、欠失及び／又は付加は、周知の技術である部位特異的突然変異誘発法等により実施することができ、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４６６２−５６６６，１９８４；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００，１９８２；ＷＯ８５／００８１７；Ｎａｔｕｒｅ  ３１６，６０１−６０５，１９８５などに記載の方法に準じて行うことができる。【００３９】
「１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、置換、欠失及び／又は付加できる程度の個数のアミノ酸が、本願明細書において記載したアミノ酸配列において、置換、欠失及び／又は付加されることを意味する。【００４０】
例えば、本願明細書において記載したアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、本願明細書において記載したアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、本願明細書において記載したアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。【００４１】
このようなアミノ酸配列が、パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性を有することは上述の方法によって容易に確認することができる。
さらに、上記と同様、パラアミノフェノールを酸化する酵素活性、オルトアミノフェノールを酸化する酵素活性、シリンガルダジンを酸化する酵素活性、ビリルビンを酸化する酵素活性、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を酸化する酵素活性のうち少なくとも１つ、又は、すべての酵素活性を有することが好ましい。これらの酵素活性についても上述の方法によって容易に確認することができる。【００４２】
本発明の組換えタンパク質は、後述する形質転換体を用いた方法によって容易に製造することができる。【００４３】
次に、本発明の遺伝子、組換えベクター及び形質転換体について説明する。
本発明の遺伝子は、上述した本発明の組換えタンパク質をコードするものである。
その塩基配列は上述した本発明の組換えタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、具体的には、配列番号６、７、１４、２０、２６、３２又は４０で表される塩基配列を挙げることができる。【００４４】
本発明の遺伝子には、本願明細書において記載した塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、パラフェニレンジアミンを酸化する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるものも含まれる。本発明において、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。【００４５】
本発明の遺伝子を製造する方法を詳述する。
本発明の遺伝子は、例えば、野生型ＣｕｅＯ遺伝子を鋳型として用いたＰＣＲ法によって製造することができる。具体的には、野生型ＣｕｅＯをコードする塩基配列から除去すべき塩基配列から上流の塩基配列（以下、上流配列という）、及び、下流の塩基配列（以下、下流配列という）を、それぞれ、適切なプライマーを用いて増幅すればよい。この際、プライマーに、上記スペーサをコードする塩基配列及び／又はその相補配列を挿入することにより、上流配列の３′末端側及び／又は下流配列の５′末端側に、上記スペーサをコードする塩基配列及び／又はその相補配列を含ませることができる。【００４６】
上記ＰＣＲ法の条件としては特に限定されず、周知の条件で行うことができるが、例えば、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長からなる１サイクルを、２５回繰り返す条件を挙げることができる。【００４７】
次いで、得られた上流配列の３′末端と下流配列の５′末端とを連結することによって、目的の組換えタンパク質をコードする本発明の遺伝子を製造することができる。
連結する際の反応条件としては特に限定されないが、例えば、９４℃で５分間の変性後、−２℃／分の速度で４０℃まで徐冷することにより行うことができる。【００４８】
上記連結の後に、適切なプライマーを用いて、再度、ＰＣＲ法を行うことによって、本発明の遺伝子を増幅してもよい。この２度目のＰＣＲ法の条件としても特に限定されず、周知の条件で行うことができるが、例えば、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長からなる１サイクルを、２５回繰り返す条件を挙げることができる。【００４９】
本発明の組換えベクターは、上述した本発明の遺伝子を含有するものである。
本発明で用いられるベクターとしては特に限定されないが、大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９等を挙げることができる。好ましくは、ｐＵＣ１８である。【００５０】
本発明の組換えベクターを製造する条件としては特に限定されず、周知の方法で行うことができる。具体的には、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１  （タカラバイオ社製）を用い、１６℃で一晩反応させることにより行うことができる。【００５１】
本発明の形質転換体は、上述した本発明の組換えベクターを含むものである。
本発明の形質転換体を製造する際に用いられる宿主としては特に限定されないが、例えば、微生物、動物細胞、植物細胞等を挙げることができる。好ましくは微生物であり、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉとしては特に限定されず、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１、ＪＭ１０９、ＮＭ５２２、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＤＨ５等を挙げることができる。【００５２】
本発明の形質転換体を製造する方法としては特に限定されず、エレクトロポレーション法など周知の方法で行うことができる。【００５３】
本発明の組換えタンパク質の製造方法は、上述した本発明の形質転換体を、常法に従い培養して、産出された組換えタンパク質を採取することによって実施することができる。
培養をするにあたって、宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである場合、培地として、ＬＢ培地や、Ｍ９培地などを使用することができる。培地には、イソプロピル  チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）、アンピシリン等の薬剤を添加してもよい。培養は、例えば、３０〜３７℃で１時間〜２４時間程度行い、この際必要により通気や攪拌を行ってもよい。【００５４】
形質転換体を培養した後の培地から組換えタンパク質を採取するには、特に限定されないが、オスモティックショック法等によって細胞を破壊して粗酵素液を得た後、精製を行えばよい。精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析法、限外ろ過法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動法等、公知の方法を利用することができる。【００５５】
次に本発明のケラチン繊維染色用組成物について説明する。
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、上記組換えタンパク質、及び、酸化染料を含有するものである。形質転換体等の菌体が産出した組換えタンパク質を使用する場合には、精製された純粋な組換えタンパク質のほか、組換えタンパク質を含む粗精製物を使用することも可能である。【００５６】
本発明のケラチン繊維染色用組成物における上記組換えタンパク質の配合量は、使用するケラチン繊維の種類、染色時の条件、酸化染料の種類等に応じて種々調整することができ、特に限定されるものではないが、組成物全量１００重量部に対して、０．００１〜１０重量部が好ましく、０．０１重量部〜１重量部がより好ましい。【００５７】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、酸化染料を含有する。酸化染料とは、酸化反応及び重合反応を経て発色することによって、染色を達成するものである。酸化染料には、それ自体が酸化重合して発色し得る「染料前駆体」と、当該染料前駆体と重合することによって種々の色調となる「カップラー」が含まれる。
染料前駆体には、オルト又はパラ体のフェニレンジアミン又はアミノフェノール等が含まれ、カップラーには、メタ体のフェニレンジアミン又はアミノフェノール等が含まれる。【００５８】
酸化染料としては特に限定されないが、例えば、具体的には、パラフェニレンジアミン、５−アミノオルトクレゾール、オルトアミノフェノール、メタアミノフェノール、パラアミノフェノール、２，６−ジアミノピリジン、５−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−２−メチルフェノール、Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシ）−パラフェニレンジアミン硫酸塩、パラニトロ−オルトフェニレンジアミン、パラニトロ−２′，４′−ジアミノアゾベンゼン・硫酸ナトリウム、トルエン−２，５−ジアミン、５−アミノオルトクレゾール・硫酸塩、パラアミノフェノール・硫酸塩、オルトクロロ−パラフェニレンジアミン・硫酸塩、４，４′−ジアミノジフェニルアミン・硫酸塩、パラメチルアミノフェノール・硫酸塩、パラフェニレンジアミン・硫酸塩、メタフェニレンジアミン・硫酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノキシエタノール・塩酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・塩酸塩、メタフェニレンジアミン・塩酸塩、２，４−ジアミノフェノール・塩酸塩、３，３′−イミノジフェノール、パラフェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−パラフェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−パラフェニレンジアミン・酢酸塩、１，５−ジヒドロキシナフタレン、トリレン−３，４−ジアミン、パラメチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ′−ビス（４−アミノフェニル）−２，５−ジアミノ−１，４−キノンジイミン、オルトアミノフェノール・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノール・硫酸塩、メタアミノフェノール・硫酸塩等を挙げることができる。以上に例示した化合物は、医薬部外品原料規格に収載されているものである。【００５９】
本発明においては、酸化染料として、インドリン化合物や、インドール化合物を用いることもできる。
インドリン化合物としては特に限定されないが、例えば、インドリン、５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−ブチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドリン、６，７−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドロキシインドリン、４−メトキシ−６−ヒドロキシインドリン、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシインドリン、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドリン、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドリン、４−ヒドロキシプロピルインドリン、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシインドリン、５−ヒドロキシインドリン、７−ヒドロキシインドリン、７−アミノインドリン、５−アミノインドリン、４−アミノインドリン、５，６−ジヒドロキシインドリンカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、これらの塩類等を挙げることができる。【００６０】
インドール化合物としては特に限定されないが、例えば、４，５−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール、６，７−ジヒドロキシインドール、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドール、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドール、４−ヒドロキシプロピルインドール、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドール、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、７−アミノインドール、５−アミノインドール、４−アミノインドール、５，６−ジヒドロキシインド−ルカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、およびこれらの塩等を挙げることができる。【００６１】
本発明で用いられる酸化染料としては、本発明の組換えタンパク質の基質特異性の観点から、パラフェニレンジアミン、パラアミノフェノール、オルトアミノフェノール、２，４−ジアミノフェノール、トルエン−２，５−ジアミンおよびこれらの塩等が好ましい。【００６２】
これらの酸化染料は単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよいが、好ましくは、染料前駆体に属する化合物のうち一種類又は複種類を用いるか、又は、染料前駆体に属する化合物のうち一種類又は複種類と、カップラーに属する化合物のうち一種類又は複種類とを組み合わせて用いる。【００６３】
本発明のケラチン繊維染色用組成物における酸化染料の配合量としては特に限定されず、好適な染色能力を発揮することができるよう適宜調整すればよいが、例えば、組成物全量に対して０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の配合量を例示することができる。【００６４】
本発明のケラチン繊維染色用組成物には、酸化染料以外に、直接染料を配合することによって、得られる色調を調整することもできる。
直接染料としては特に限定されないが、例えば、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、１−アミノ−４−メチルアミノアントラキノン、ニトロ−パラフェニレンジアミン・塩酸塩、１，４−ジアミノアントラキノン、ニトロ−パラフェニレンジアミン、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、２−アミノ−５−ニトロフェノール・硫酸塩、レゾルシノール、ニトロ−パラフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ−オルトフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ−メタフェニレンジアミン・硫酸塩、ナチュラルオレンジ６（２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルー、エバンスブルー、アシッドブルー８０等を挙げることができる。【００６５】
本発明のケラチン繊維染色用組成物における直接染料の配合量としては特に限定されず、所望の色調に応じて種々調整することができるが、例えば、組成物全量に対して０．０〜２０重量％の配合量を例示することができる。【００６６】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、さらに、アルカリ性化合物を含有することが好ましい。本発明の組換えタンパク質は弱酸性〜アルカリ条件でその酵素能力を発揮するものであるが、至適ｐＨをアルカリ領域に有しているために、アルカリ性化合物の配合によって、本発明の組成物をアルカリ性にすることが、染色能力の観点から好ましい。組成物をアルカリ性にすることによって、ケラチン繊維が膨潤し、染料が毛皮質内に浸透、沈着することから染色効果を向上させることができる。【００６７】
本発明のケラチン繊維染色用組成物に配合できるアルカリ性化合物としては特に限定されないが、一般に染色剤に配合することができるものを使用することができ、例えば、モノエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン等のアミン化合物、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸アンモニウム等の無機化合物等を挙げることができる。【００６８】
本発明のケラチン繊維染色用組成物におけるアルカリ性化合物の配合量としては特に限定されず、所望のｐＨ（好ましくはｐＨ７．５〜１０．５）を達成できる量を適宜配合すればよい。例えば、組成物全量に対して、０．０〜２０重量％の配合量を例示することができる。【００６９】
本発明のケラチン繊維染色用組成物には、上記の各成分のほか、種々の成分を配合することができる。特に限定されないが、具体的には、チオ乳酸、亜硫酸ナトリウム、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン等の還元剤、界面活性剤、油性成分、シリコーン類、増粘剤、溶剤、水、キレート剤、香料等を挙げることができる。
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、水溶液とすることが好ましい。【００７０】
本発明の組成物はケラチン繊維を染色するためのものであるが、上記ケラチン繊維には、ヒト等の哺乳動物の毛髪のほか、各種繊維が含まれる。繊維としては特に限定されないが、天然繊維、合成繊維のいずれでもよく、例えば、綿、ジアセテート、亜麻、リンネル、リオセル、ポリアクリル、ポリアミド、ポリエステル、ラミー、レーエン、テンセル、トリアセテート、毛皮、獣皮、皮革、絹、ウール等を挙げることができる。繊維の形態としても特に限定されず、布帛、糸、衣料、フィルム等、いずれの形態であってもよい。【００７１】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、無酸素雰囲気下で上記各成分を混合して、無酸素雰囲気下の容器内に収容することにより、一剤型の組成物として調製することができる。
さらに、本発明のケラチン繊維染色用組成物は、上記組換えタンパク質を含む第一組成物と、酸化染料を含む第二組成物からなる二剤型の組成物として調製することもできる。この場合には、各成分の混合及び保存を無酸素雰囲気下で行う必要はない。【００７２】
本発明のケラチン繊維染色用組成物は、一剤型の組成物の場合には、ケラチン繊維に直接適用することによって、二剤型の組成物の場合には、２つの組成物を混合した後直ちにケラチン繊維に適用することによって、簡便に、効率よく、ケラチン繊維の染色を達成することができる。【００７３】
本発明のケラチン繊維染色方法は、酸素含有雰囲気下、上記組換えタンパク質の存在下に、ケラチン繊維と酸化染料とを接触させることからなる。酸素含有雰囲気とは、特に限定されないが、通常、空気でよい。接触時の温度は特に限定されないが、１０〜１００℃程度が好ましい。毛髪に適用する場合には、人体に対する影響の観点から、２０〜４０℃程度がより好ましい。【００７４】
本発明の組換えタンパク質は弱酸性〜アルカリ条件下で十分な酸化重合活性を発揮するので、上記接触は弱酸性〜アルカリ条件（例えば、ｐＨ６〜１１）下で好適に行うことができるが、本発明の組換えタンパク質は至適ｐＨをアルカリ領域に有するので、上記接触はアルカリ条件下（好ましくはｐＨ７．５〜１０．５）でより好適に行うことができる。本発明の染色方法に関する詳細は、本発明の組成物について上述したものと同様である。
【発明の効果】
【００７５】
本発明は、上述の構成よりなるので、野生型ＣｕｅＯと比較して、パラフェニレンジアミン等を酸化する酵素活性に優れた改変型ＣｕｅＯを提供することができる。
さらに、本発明は、過酸化水素等の酸化剤を用いずに酵素を利用して酸化染料の酸化重合反応が効率よく進行し、一剤型とすることが可能なケラチン繊維染色用組成物であって、アルカリ条件を含む幅広いｐＨ領域での効率的なケラチン繊維の染色が可能で、かつ、直接染料の調色能を害することがなく、幅広い領域での温度及びｐＨにおいて安定なケラチン繊維染色用組成物、並びに、上記酵素を利用したケラチン繊維染色方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
参考製造例１：野生型ＣｕｅＯ遺伝子を含む発現ベクターの作成
改変型ＣｕｅＯ遺伝子をクローニングする際の鋳型として用いるために、野生型未成熟ＣｕｅＯ遺伝子の塩基配列に、ヒスチジンタグをコードする塩基配列を付加してなる塩基配列を導入した発現ベクターを以下の手順で作成した。【００７７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲ法により野生型未成熟ＣｕｅＯ遺伝子を増幅した。増幅には、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、以下に示すＰＣＲ反応液を用い、以下の反応サイクルでＰＣＲ反応を行った。
N-EcoRI:
5'-gaagaattcatgcaacgtcgtgatttcttaaaat-3'（配列番号９）
（４〜９位のgaattcがＥｃｏＲＩ認識部位である。）
3'-His-Bam:
5'-ttggatccttaatgatgatgatgatgatggcctaccgtaaaccctaac-3'（配列番号１０）
（３〜８位のggatccがＢａｍＨＩ認識部位であり、１２〜２９位のatgatgatgatgatgatgがヒスチジンタグをコードする配列である。）【００７８】
ＰＣＲ反応液
Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（０．５μｇ／μＬ）  １μＬ
プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）            各１μＬ
ＰＣＲ緩衝液（Ｘ１０）                        ５μＬ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ．（２．５ｍＭ）                ４μＬ
ジメチルスルホキシド                        ２．５μＬ
精製水                                  ３５．２５μＬ
Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ                ０．２５μＬ【００７９】
反応サイクル
（１）９５℃、２ｍｉｎ予熱
（２）９５℃、１ｍｉｎ変性
（３）５０℃、１ｍｉｎアニーリング
（４）７２℃、１ｍｉｎ伸長→（２）に戻る（２５サイクル）
（５）７２℃、１０ｍｉｎ伸長
上記ＰＣＲ反応後、下記のエタノール沈殿で増幅産物を濃縮した。【００８０】
エタノール沈殿
５０μＬのサンプルに５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００％エタノールを１００μＬ加え混合し、−８０℃で１０分静置した。その後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。ペレットに７０％エタノールを５００μＬ加え洗浄後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。５分ほど減圧乾燥を行い、ペレットを３０μＬの制限酵素消化反応液に溶かした。【００８１】
１．制限酵素消化
以下の反応系で増幅断片とベクターｐＵＣ１８の制限酵素処理を行った。
反応液（ＣｕｅＯ増幅断片処理用）
ＣｕｅＯ増幅断片              約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液      ３．０μＬ
ＥｃｏＲＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）  ０．３μＬ
ＢａｍＨＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）  ０．３μＬ
精製水                      ２６．４μＬ
合計                        ３０．０μＬ【００８２】
反応系（ｐＵＣ１８処理用）
ｐＵＣ１８                    約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液      ３．０μＬ
ＥｃｏＲＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）  ０．３μＬ
ＢａｍＨＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）  ０．３μＬ
アルカリフォスファターゼ      １．０μＬ
精製水                      ２５．４μＬ
合計                        ３０．０μＬ
各溶液調製後、３７℃で１晩消化した。【００８３】
２．アガロースゲル電気泳動
３０μＬのサンプル溶液にそれぞれに６μＬの色素液を加え、１％アガロースゲル（１Ｘ  ＴＡＥ緩衝液）にロードし、１００Ｖ定電圧で１時間泳動終了後、エチジウムブロマイド溶液でＤＮＡバンドを染色した。ＵＶイルミネーターで確認しながらゲルから１．５ｋｂｐの目的断片と２．７ｋｂｐのｐＵＣ１８を切り出した。【００８４】
３．ＤＮＡ断片抽出
ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＵＩＡＧＥＮ製）のプロトコールに従いアガロースゲルからＤＮＡ断片とｐＵＣ１８を抽出した。溶出にはそれぞれ１０μＬのＴＥ緩衝液を用いた。【００８５】
４．ライゲーション
Ｔａｋａｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ製）のプロトコールに従い、以下の反応液でＣｕｅＯ遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化断片とｐＵＣ１８の消化断片を連結した。
反応液
ＣｕｅＯ遺伝子ゲル抽出断片                            ４．５μＬ
ｐＵＣ１８ゲル抽出断片                                ０．５μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ２．１  Ｓｏｌ．Ｉ    ５．０μＬ
合計                                                １０．０μＬ
溶液調製後、サーマルサイクラーを用いて１６℃で１晩反応した。【００８６】
５．ブタノール濃縮
１０μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ溶液に２００μＬのブタノールを加え撹拌後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。ペレットに４００μＬのジエチルエーテルを加え、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。１０分ほど自然乾燥した後、１０μＬの滅菌水に溶解した。得られた発現ベクターをｐＵＣ−ＣｕｅＯとする。【００８７】
実施例１：本発明の改変型ＣｕｅＯ（１）：ＣｕｅＯ（Δα５−７）遺伝子の製造
野生型ＣｕｅＯ遺伝子に変異を導入した本発明の改変型ＣｕｅＯ（１）遺伝子を以下の手順で製造した。
目的とする改変型ＣｕｅＯ（１）のアミノ酸配列（配列番号５）は、ヘリックス５、６及び７を構成する配列並びにヘリックス６とヘリックス７の間に存在する構造未知配列からなるアミノ酸配列（配列番号２における３２９位のＰｒｏから３７８位のＨｉｓまで、配列番号１３で示す）を除去し、代わりにスペーサとしてＧｌｙ−Ｇｌｙの二残基を挿入し、Ｃ末端側にヒスチジンタグを追加したものである。【００８８】
参考製造例１で得られた野生型ＣｕｅＯ発現ベクターｐＵＣ−ＣｕｅＯを鋳型に用いて、ＰＣＲ法により、変異導入部位の上流断片（Ｎ末端側）と下流断片（Ｃ末端側）をそれぞれ増幅した（第一回ＰＣＲ）。上流断片の増幅には前述のＮ−ＥｃｏＲＩおよび以下の合成ヌクレオチドプライマーを用いた。
ＨｄｅｌＧＧ−Ｆｗ: 5'-gttggcaccaccgtccatggaagattgcagcttgcgtac-3'(配列番号１１)
（７〜１２位のaccaccがGly-Glyの二残基に相当する）
下流断片の増幅には前述の３′−Ｈｉｓ−Ｂａｍおよび以下の合成ヌクレオチドプライマーを用いた。
ＨｄｅｌＧＧ−Ｒｖ：5'-ctctccatggacggtggtgccaacaaaatcaacggtc-3'(配列番号１２)
（１３〜１８位のggtggtがGly-Glyの二残基に相当する）
反応には、以下に示すＰＣＲ反応液を用いた。【００８９】
第一回ＰＣＲ反応液
発現ベクターｐＵＣ−ＣｕｅＯ（３０ｎｇ／μＬ）  １μＬ
プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）              各１μＬ
ＰＣＲ緩衝液（Ｘ１０）                          ５μＬ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ．（２．５ｍＭ）                  ４μＬ
ジメチルスルホキシド                          ２．５μＬ
精製水                                    ３５．２５μＬ
Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ                  ０．２５μＬ【００９０】
反応サイクル
（１）９４℃、３ｍｉｎ予熱
（２）９４℃、３０ｓｅｃ変性
（３）５０℃、１ｍｉｎアニーリング
（４）７２℃、１ｍｉｎ伸長→（２）に戻る（２５サイクル）
（５）７２℃、７ｍｉｎ伸長
上記ＰＣＲ反応後、増幅産物を上記エタノール沈殿で濃縮後、上記アガロースゲル電気泳動で分離した。上記のように、ＱＩＡＥＸＩＩで目的バンド（上流ＰＣＲ断片（１．１ｋｂｐ）、下流ＰＣＲ断片（０．４ｋｂｐ））を抽出精製した。【００９１】
１．アニーリング
以下の反応液及び反応プログラムを用いて、ゲル抽出により精製したＤＮＡ断片をアニーリングさせた。
反応液
上流ＰＣＲ断片（１．１ｋｂｐ）     １．０μＬ
下流ＰＣＲ断片（０．４ｋｂｐ）     １．０μＬ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ．（２．５ｍＭ）      １０μＬ
ＰＣＲ緩衝液（Ｘ１０）                １０μＬ
精製水                            ７５．５μＬ【００９２】
反応プログラム
（１）９４℃、５ｍｉｎ変性
（２）４０℃まで徐冷（−２℃／ｍｉｎ）、アニーリング
（３）４０℃で保温【００９３】
２．鋳型鎖合成
アニーリング反応液にＴＯＹＯＢＯ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．５μＬを加え、以下の反応プログラムで鋳型鎖を合成した。
反応サイクル
（１）６０℃、１ｍｉｎ
（２）７２℃、２ｍｉｎ伸長
（３）９４℃、３０ｓｅｃ変性
（４）５０℃まで徐冷（−１５℃／ｍｉｎ）、アニーリング
（５）５０℃、１ｍｉｎアニーリング
（６）７２℃、１ｍｉｎ伸長→（３）に戻る（５サイクル）【００９４】
３．改変型ＣｕｅＯ（１）遺伝子全領域の増幅
鋳型鎖合成反応液に１０ｐｍｏｌ／μＬのＮ−ＥｃｏＲＩ、３’Ｈｉｓ−Ｂａｍプライマーを１μＬづつ添加し、以下の反応サイクルでＰＣＲ反応を行った。【００９５】
反応サイクル
（１）９４℃、３ｍｉｎ予熱
（２）９４℃、３０ｓｅｃ変性
（３）５５℃、１ｍｉｎアニーリング
（４）７２℃、１ｍｉｎ伸長→（２）に戻る（２５サイクル）
（５）７２℃、７ｍｉｎ伸長
上記ＰＣＲ反応後、上記のエタノール沈殿で増幅産物を濃縮した。
以上によって、配列番号４０で表される塩基配列を有する改変型ＣｕｅＯ（１）遺伝子（１．４ＫｂｐのＤＮＡ断片）を得た。【００９６】
実施例２：本発明の組換えベクターの製造
上記の方法に準じて、得られた１．４ＫｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同様に消化したプラスミドベクターｐＵＣ１８に連結した。得られた組換えベクター中に、配列番号４０で表される塩基配列を確認した。得られた組換えベクターをｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）とする。【００９７】
実施例３：本発明の形質転換体の製造
上記の手順でブタノール濃縮を行った後の試料溶液１０μＬをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル５０μＬに加え、よく攪拌した後、全量をキュベット（１ｍｍ電極ギャップ）に入れた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ製Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｌｓｅｒを用いてプログラムＥＣ１でエレクトロポレーションを行い、大腸菌を１ｍＬのＬＢ培地に懸濁し回収した。３７℃で１時間振盪した後、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。プレートを３７℃で１晩静置した。
なお、コンピテントセルの調製はＢｉｏ−Ｒａｄのインストラクションに従って行った。
得られた形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２００５年１０月５日、ブダペスト条約に基づいて寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４３１）。【００９８】
実施例４：本発明の組換えタンパク質の製造及び精製
（１）形質転換体の培養
形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ−ＣｕｅＯ（Δα５−７）を以下の二段階で培養して本発明の組換えタンパク質を発現させた。
１−１．前培養（試験管）
０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地４ｍＬ中、３７℃で、Ｏ／Ｎ好気培養を行った。
１−２．本培養（２Ｌバッフル付三角フラスコ）
１ｍＭのＣｕＣｌ２、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加した４００ｍＬの上記培地中、３２℃で、１２時間好気培養を行った。
その後、遠心分離により集菌し、０．８５％塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、直ちに以下のオスモティックショックを行った。【００９９】
（２）組換えタンパク質の採取及び精製
２−１．オスモティックショック
菌体を、氷冷した２０％ショ糖、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、氷水中で１０分間静置後、遠心分離にかけ菌体を回収した。
次に、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷蒸留水に懸濁し、氷水中で１０分間静置後、遠心分離にかけ上清を回収した。これを粗酵素液とした。【０１００】
２−２．ＩＭＡＣ
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＢＤ  ＴＡＬＯＮカラム（４０ｍＬ）に粗酵素液を重層し、同緩衝液で洗浄した。
１５０ｍＭイミダゾールを含む同緩衝液で、吸着したタンパク質を溶出させた。溶出画分は濃縮し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対し透析した。【０１０１】
２−３．陰イオン交換クロマトグラフィー
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＢＩＯ−ＲＡＤ  ＵｎｏＱ−１２カラム（１２ｍＬ）に試料を重層し、同緩衝液で洗浄した（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）。
同緩衝液を用いた０→１Ｍ塩化カリウム溶液の直線濃度勾配（１２０ｍＬ）により、吸着したタンパク質を溶出させた。活性画分を回収し濃縮した。
このようにして精製された本発明の組換えタンパク質である改変型ＣｕｅＯ（１）（アミノ酸配列は配列番号５で示される。以下、ｍＣｕｅＯ（１）とする）を以下の試験例及び実施例で使用した。【０１０２】
試験例１
ラッカーゼの代表的な基質に対するｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性の評価
（１）基質溶液の調製
２，６−ジメトキシフェノール、パラフェニレンジアミン、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、２−メトキシフェノール、カテコールはそれぞれ、イオン交換蒸留水に溶解し、５０ｍＭ水溶液とした。
４−ヒドロキシインドール、パラアミノフェノールはそれぞれ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液とした。【０１０３】
オルトアミノフェノールはＤＭＳＯに溶解した後、イオン交換蒸留水に溶解して５０ｍＭ、ＤＭＳＯ（１０％）−水溶液とした。
１−ニトロソ−２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム（ＮＮＳ）はイオン交換蒸留水に溶解し、５ｍＭ水溶液とした。
ビリルビンはＤＭＳＯに溶解し、０．５ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液とした。
シリンガルダジンはエタノールに溶解し、５ｍＭエタノール溶液とした。
Ｌ−チロシンは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解して、１ｍＭ溶液とした。【０１０４】
（２）活性測定方法
以下の方法では、緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用した。
ＮＮＳ、ビリルビン以外の基質については、キュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬと、基質溶液０．１ｍＬとを混合し、ｍＣｕｅＯ（１）水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０〜３０秒後までの各波長（表１に示す測定波長）における吸光度の変化を測定した。【０１０５】
ＮＮＳ、ビリルビンについては、キュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．９６ｍＬと、基質溶液０．０２ｍＬとを混合し、ｍＣｕｅＯ（１）水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０〜３０秒後までの各波長（表１に示す測定波長）における吸光度の変化を測定した。
酸化重合活性の単位（Ｕ）は、１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合、ｍＣｕｅＯ（１）  １ｍｇあたりの活性を示す。【０１０６】
比較のため、同様にして、野生型成熟ＣｕｅＯのＣ末端にヒスチジンタグを付加した酵素（配列番号８、以下、単に野生型ＣｕｅＯとして言及する）について酸化重合活性を測定した。酸化重合活性の単位（Ｕ）は、１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合、野生型ＣｕｅＯ  １ｍｇあたりの活性を示す。なお、上述のとおり測定した３０秒間の吸光度変化を、１分間の吸光度変化に換算して表す（以下、同様）。得られた結果を以下の表１に示した。【０１０７】
【表１】
2007063614.tif 000002
【０１０８】
以上の結果から、ｍＣｕｅＯ（１）は、野生型ＣｕｅＯと類似した基質特異性を示すが、その酸化重合能力は格段に優れていることが分かった。【０１０９】
試験例２
種々の基質に対するｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性の評価
（１）基質溶液の調製
カテキン、リグニン（イネ由来）、リグニン（針葉樹由来）以外の基質については、各基質をＤＭＳＯに溶解した後、イオン交換蒸留水に溶解して、１ｍＭ、ＤＭＳＯ（１．０％）水溶液とした。
カテキン、リグニン（イネ由来）、リグニン（針葉樹由来）については、各基質をＤＭＳＯに溶解した後、イオン交換蒸留水に溶解して、２ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ（１．０％）水溶液とした。【０１１０】
（２）活性測定法
以下の方法では、緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用した。
キュベット（１．０ｍＬ石英セル、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬと、基質溶液０．１ｍＬとを混合し、ｍＣｕｅＯ（１）水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０〜３０秒後までの各波長（表２に示す測定波長）における吸光度の変化を測定した。
酸化重合活性の単位（Ｕ）は、１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合、ｍＣｕｅＯ（１）  １ｍｇあたりの活性を示す。【０１１１】
比較のため、同様にして、野生型ＣｕｅＯについて酸化重合活性を測定した。酸化重合活性の単位（Ｕ）は、１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合、野生型ＣｕｅＯ  １ｍｇあたりの活性を示す。
得られた結果を以下の表２に示した。【０１１２】
【表２】
2007063614.tif 000003
【０１１３】
以上の結果から、ｍＣｕｅＯ（１）は、野生型ＣｕｅＯと類似した基質特異性を示すが、その酸化重合能力は格段に優れていることが分かった。【０１１４】
試験例３
ｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性のｐＨ依存性の評価
パラフェニレンジアミンを基質として用いてｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性のｐＨ依存性を以下の手順で評価した。
キュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で、ｐＨ２〜１２の範囲のいずれかのｐＨ値を示す２００ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液１．７８ｍＬと、１００ｍＭ  パラフェニレンジアミン水溶液０．２ｍＬとを混合し、ｍＣｕｅＯ（１）水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、得られた種々のｐＨ値を示す混合物について、０〜３０秒後までの４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。【０１１５】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合のｍＣｕｅＯ（１）  １ｍｇあたりの活性として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうちｐＨ７．５１での活性を１００として、酸化重合反応時の各ｐＨ値に関して相対活性（％）を図２に示した。
図２より、ｍＣｕｅＯ（１）がおよそｐＨ６〜９という中性〜アルカリ条件下で十分な酸化重合活性を示し、ｍＣｕｅＯ（１）の至適ｐＨは７．５〜８であることが分かった。【０１１６】
試験例４
ｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性の温度依存性の評価
パラフェニレンジアミンを基質として用いてｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性の温度依存性を以下の手順で評価した。
キュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．９３ｍＬと、４００ｍＭパラフェニレンジアミン水溶液０．０５ｍＬとを混合し、種々の温度条件（３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０及び６５℃）でプレヒートした後、ｍＣｕｅＯ（１）水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、得られた各混合物について、０〜３０秒後までの４８７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。【０１１７】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合のｍＣｕｅＯ（１）  １ｍｇあたりの活性として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうち６５℃での活性を１００として、酸化重合反応時の各温度に関して相対活性（％）を図３に示した。
以上の結果から、高温になるほどｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性が上昇し、広範な温度範囲で十分な酸化重合活性を示すことが分かった。【０１１８】
試験例５
ｍＣｕｅＯ（１）の直接染料分解活性の評価
種々の直接染料に対するｍＣｕｅＯ（１）の分解活性を以下の手順で評価した。
（１）染料溶液の調製
ナチュラルオレンジ６（２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルー、エバンスブルー、アシッドブルー８０をそれぞれ、イオン交換蒸留水に溶解して、０．２ｍｇ／ｍＬ水溶液とした。【０１１９】
（２）活性測定方法
以下の方法では、緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、又は、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を使用した。
キュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で０．１Ｍ緩衝液０．８８ｍＬと、染料溶液０．１ｍＬとを混合し、ｍＣｕｅＯ（１）水溶液０．０２ｍＬを加えて倒立混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて０、１及び２時間後の波長３００〜７００ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
混合直後（０時間）の吸光度から２時間後の吸光度までの変化量を以下の表３に示した。【０１２０】
【表３】
2007063614.tif 000004
【０１２１】
以上の結果から、ｍＣｕｅＯ（１）が、各ｐＨ条件下で直接染料を分解する活性を有しないことが分かった。【０１２２】
試験例６
ｍＣｕｅＯ（１）のｐＨ安定性の評価（１）
種々のｐＨ条件でｍＣｕｅＯ（１）を前処理した後に、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質として用いてｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性を測定することにより、ｍＣｕｅＯ（１）のｐＨ安定性を評価した。具体的には以下の手順で行った。
ｍＣｕｅＯ（１）を、ｐＨ２〜１２の範囲のいずれかのｐＨ値を示す２００ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液に溶解して、室温で１時間インキュベートすることにより、前処理を行った。【０１２３】
次いで、前処理後の混合物０．２ｍＬと、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．７８ｍＬと、２０ｍＭ  ＡＢＴＳ水溶液０．２ｍＬとをキュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中にて混合し、各混合物について、０〜３０秒後までの４２０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。【０１２４】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合のｍＣｕｅＯ（１）  １ｍｇあたりの活性として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうちｐＨ６．５及び８．５で前処理した場合の活性を１００として、前処理時の各ｐＨについて相対残存活性（％）を図４に示した。
以上の結果から、ｍＣｕｅＯ（１）が、ｐＨ４〜１２と幅広いｐＨ領域において十分な酸化重合活性を保持しており、ｐＨ安定性に優れていることが分かった。【０１２５】
試験例７
ｍＣｕｅＯ（１）のｐＨ安定性の評価（２）
前処理の条件を、５０℃で１０分間のインキュベートに変更し、インキュベートの後、氷冷したこと以外は、試験例６と同様にして、ｍＣｕｅＯ（１）のｐＨ安定性を評価した。
１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合のｍＣｕｅＯ（１）  １ｍｇあたりの活性として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうちｐＨ９．９６で前処理した場合の活性を１００として、前処理時の各ｐＨについて相対残存活性（％）を図５に示した。
以上の結果から、前処理時の温度条件を高くした場合であっても、ｍＣｕｅＯ（１）が、ｐＨ４〜１１と幅広いｐＨ領域において十分な酸化重合活性を保持しており、ｐＨ安定性に優れていることが分かった。【０１２６】
試験例８
ｍＣｕｅＯ（１）の熱安定性の評価
種々の温度条件でｍＣｕｅＯ（１）を前処理した後に、ＡＢＴＳを基質として用いてｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性を測定することにより、ｍＣｕｅＯ（１）の熱安定性を評価した。具体的には以下の手順で行った。
ｍＣｕｅＯ（１）を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して、種々の温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０℃）で３０分間インキュベートすることにより、前処理を行った。【０１２７】
次いで、前処理後の混合物を氷冷し、当該混合物０．０２ｍＬと、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．７８ｍＬと、２０ｍＭ  ＡＢＴＳ水溶液０．２ｍＬとをキュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中にて混合し、各混合物について、０〜３０秒後での４２０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。【０１２８】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合のｍＣｕｅＯ（１）  １ｍｇあたりの活性として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうち２０及び３０℃で前処理した場合の活性を１００として、前処理時の各温度に関して相対残存活性（％）を図６に示した。
以上の結果から、ｍＣｕｅＯ（１）が、２０〜５０℃と幅広い温度領域において十分な酸化重合活性を保持しており、熱安定性に優れていることが分かった。【０１２９】
試験例９
ｍＣｕｅＯ（１）の熱安定性の経時的変化の評価
６０℃で適当な時間ｍＣｕｅＯ（１）を保存した後に、ＡＢＴＳを基質として用いてｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性を測定することにより、ｍＣｕｅＯ（１）の熱安定性の経時的変化を評価した。具体的には以下の手順で行った。
ｍＣｕｅＯ（１）を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して、６０℃で適当な時間（０〜３００分間）インキュベートすることにより、前処理を行った。【０１３０】
次いで、前処理後の混合物を氷冷し、当該混合物０．０２ｍＬと、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．７８ｍＬと、２０ｍＭ  ＡＢＴＳ水溶液０．２ｍＬとをキュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）にて混合し、各混合物について、０〜３０秒後の４２０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて測定した。【０１３１】
１分間に吸光度を１変化させる活性を１とした場合のｍＣｕｅＯ（１）  １ｍｇあたりの活性として酸化重合活性を算出した後、算出された酸化重合活性のうち前処理をしていない場合（０分間）の活性を１００として、前処理時の各処理時間における相対活性（％）を図７に示した。
以上の結果から、ｍＣｕｅＯ（１）の加熱によってｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性が経時的に減少すること、及び、６０℃におけるｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性の半減期が３０分であることが分かった。【０１３２】
実施例５
本発明の組成物によるケラチン繊維の染色
（１）染色基剤の調製
パラフェニレンジアミン０．５ｇ、ヒドロキシエチルセルロース０．７５ｇ、ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油（ＨＣ−２０）１．０ｇ、及び、乳酸０．５ｇを混合し、モノエタノールアミンでｐＨを９．０に調整して、イオン交換蒸留水で重量を５０ｇに調製した。【０１３３】
（２）染色試験
実施例５では、前記染色基剤２ｇ及びｍＣｕｅＯ（１）水溶液（４Ｕ相当量）を混合し、得られた混合物をヒト白髪毛束１ｇと羊毛布１枚（３×５ｃｍ）とに対して塗布した。塗布後のヒト白髪毛束および羊毛布のそれぞれを、３０℃で３０分間保持した。
コントロールでは、ｍＣｕｅＯ（１）溶液を添加せずに前記染色基剤を直接塗布すること以外は同様に行った。
なお、上記の単位Ｕは、５ｍＭパラフェニレンジアミンを基質として用い、ｐＨ９．０において、４７０ｎｍの吸光度を１分間で１変化させる活性を１とした場合のｍＣｕｅＯ（１）  １ｍｇあたりの活性を表す。【０１３４】
（３）色差測定
染色前のヒト白髪毛束及び羊毛布、並びに、染色されたヒト白髪毛束及び羊毛布について、色差計（ミノルタ社製、商品名：Ｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ  ＣＭ−３６１０ｄ）を用いて、Ｌ値、ａ値、ｂ値を測定した。次いで、前記Ｌ値、ａ値、ｂ値に基づき、下記式（１）により、ΔＥ値を算出した。結果を以下の表４に示した。
なお、前記ΔＥ値は、染色前の色調と染色後の色調との色差を示しており、数値が高いほど染色力が高いことを示す。【０１３５】
【数１】
2007063614.tif 000005
【０１３６】
【表４】
2007063614.tif 000006
【０１３７】
以上の結果より、ｍＣｕｅＯ（１）を用いることによって、毛髪と羊毛布いずれの場合に対しても高い染色効果を達成できることが示された。
市販のヘアマニキュアのΔＥ値はおよそ４０であるため、以上の結果によって、本発明の組成物が毛髪の染色に好適に使用できることが示された。【０１３８】
実施例６：本発明の改変型ＣｕｅＯ（２）：ＣｕｅＯ（Δα５−７）′の製造
６−１．組換えベクターの製造
本実施例で目的とする改変型ＣｕｅＯ（２）のアミノ酸配列（配列番号１５）は、ヘリックス５、６及び７を構成する配列並びにヘリックス６とヘリックス７の間に存在する構造未知配列からなるアミノ酸配列（配列番号２における３２９位のＰｒｏから３７８位のＨｉｓまで、配列番号１３で示す）を除去し、代わりにスペーサとしてＡｌａ−Ａｌａの二残基を挿入し、Ｃ末端側にヒスチジンタグを追加したものである。【０１３９】
改変型ＣｕｅＯ（２）をコードする塩基配列は、上述したｍＣｕｅＯ（１）：ＣｕｅＯ（Δα５−７）のＧｌｙ−Ｇｌｙ配列に対応する塩基配列ggtggtを、Ａｌａ−Ａｌａ配列に対応する塩基配列gcggccに変更したものである。これによって新たにＮｏｔＩ認識部位が追加されたので、改変型ＣｕｅＯ（２）をコードする塩基配列を含む組換えベクターは、ＣｕｅＯのヘリックス５、６及び７に対応する遺伝子の位置に、様々なサイズのＤＮＡ断片の挿入を可能とする土台となる。【０１４０】
実施例２で得られた組換えベクターｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）を鋳型に用い、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法により、遺伝子を合成した。
ＣｕｅＯ−２Ａｌａ−１：5'-ctctccatggacgcggccgccaacaaaatc-3'（配列番号１６）（１３〜２０位のgcggccgcがＮｏｔＩ認識部位である）
Ｍ１３（−２１）：5'-gttttcccagtcacgac-3'（配列番号１７）
反応には、以下に示すＰＣＲ反応液を用いた。【０１４１】
ＰＣＲ反応液
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）（４６ｎｇ／μＬ）      １μＬ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）                        各１μＬ
ＰＣＲ緩衝液                                              ５μＬ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ．（２．５ｍＭ）                          ４μＬ
精製水                                            ３７．７５μＬ
ＴＯＹＯＢＯ  ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ                    ０．２５μＬ【０１４２】
反応サイクル
（１）９５℃、５ｍｉｎ予熱
（２）９５℃、０．５ｍｉｎ変性
（３）５０℃、１ｍｉｎアニーリング
（４）７２℃、１ｍｉｎ伸長→（２）に戻る（３５サイクル）
（５）７２℃、１０ｍｉｎ伸長
上記ＰＣＲ反応後、下記のエタノール沈殿で増幅産物を濃縮した。【０１４３】
エタノール沈殿
５０μＬのサンプルに５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００％エタノールを１００μＬ加え混合し、−８０℃で１０分静置した。その後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。ペレットに７０％エタノールを５００μＬ加え洗浄後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。５分ほど減圧乾燥を行い、ペレットを１０μＬの制限酵素消化液に溶かした。【０１４４】
制限酵素消化
以下の反応系で増幅断片とベクターｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）の制限酵素処理を行った。
反応系（増幅断片処理用）
ＣｕｅＯ増幅断片                約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液        １．０μＬ
ＢａｍＨＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）    ０．５μＬ
ＮｃｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）      ０．５μＬ
精製水                          ８．０μＬ
合計                          １０．０μＬ【０１４５】
反応系（ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）用）
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）  約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液            ０．７μＬ
ＢａｍＨＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）        ０．３μＬ
ＮｃｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）          ０．３μＬ
精製水                              ５．７μＬ
合計                                ８．０μＬ
各溶液調整後、３７℃で１晩消化した。【０１４６】
アガロースゲル電気泳動
各制限酵素消化物に２μＬの色素液を加え、２％アガロースゲル（１×ＴＡＥ緩衝液）にロードし、１００Ｖ定電圧で１時間泳動終了後、エチジウムブロマイド溶液でＤＮＡバンドを染色した。ＵＶイルミネーターで確認しながら、４００ｂｐのＰＣＲ断片と、３．７ｋｂのｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）断片を切り出した。【０１４７】
ＤＮＡ断片抽出
ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）のプロトコールに従いアガロースゲルからＤＮＡ断片をそれぞれ抽出した。溶出にはそれぞれ１０μＬのＴＥ緩衝液を用いた。【０１４８】
ライゲーション
Ｔａｋａｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ製）のプロトコールに従い、以下の反応液でＰＣＲ産物のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ消化断片とｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）の消化断片を連結した。
ＰＣＲ産物ゲル抽出断片                                  ４．５μＬ
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）ゲル抽出断片          ０．５μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１  Ｓｏｌ．Ｉ    ５．０μＬ
合計                                                  １０．０μＬ
溶液調整後、サーマルサイクラーを用いて１６℃で１晩反応した。その後エタノール沈殿を行い、１０μＬの滅菌水に溶解した。【０１４９】
得られた組換えベクター中に、配列番号１４で表される塩基配列を確認した。得られた組換えベクターをｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′とする。【０１５０】
６−２．形質転換体の製造
上記の手順でエタノール沈殿を行った後の試料溶液５μＬをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル５０μＬに加え、よく撹拌した後、全量をキュベット（１ｍｍ電極キャップ）に入れた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ製Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｌｓｅｒを用いてプログラムＥＣ１でエレクトロポレーションを行い、大腸菌を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、回収した。３７℃で１時間振とうした後、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。プレートを３７℃で１晩静置した。
なお、コンピテントセルの調整はＢｉｏ−Ｒａｄのインストラクションに従って行った。【０１５１】
６−３．組換えタンパク質の製造および精製
得られた形質転換体を以下の二段階で培養して本発明の組換えタンパク質を発現させた。
（１）前培養（試験管）
０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地中、３７℃で、Ｏ／Ｎ好気培養を行った。【０１５２】
（２）本培養（２Ｌバッフル付き三角フラスコ）
１ｍＭのＣｕＣｌ２、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加した４００ｍＬの上記培地中、３２℃で１２時間好気培養を行った。
その後、遠心分離により集菌し、０．８５％塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、直ちに以下のオスモティックショックを行った。【０１５３】
オスモティックショック
菌体を、氷冷した２０％ショ糖、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、氷水中で１０分間静置後、遠心分離をかけ菌体を回収した。
次に、氷冷蒸留水に懸濁し、氷水中で１０分間静置後、遠心分離にかけ菌体を回収した。これを粗酵素液とした。【０１５４】
ＩＭＡＣ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ  カラム（４０ｍＬ）に試料を重層し、同緩衝液で洗浄した。
２００ｍＭイミダゾールを含む同緩衝液で、吸着したタンパク質を溶出させた。溶出画分は濃縮し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した。
このようにして精製された本発明の組換えタンパク質を、改変型ＣｕｅＯ（２）：ＣｕｅＯ（Δα５−７）′とする（以下、ｍＣｕｅＯ（２）ともいう）。
配列番号１５は未成熟タイプのアミノ酸配列であり、１−２８位のアミノ酸配列はシグナル配列である。【０１５５】
実施例７：本発明の改変型ＣｕｅＯ（３）：ＣｕｅＯ（Δα６−７）の製造
本実施例で目的とする改変型ＣｕｅＯ（３）のアミノ酸配列（配列番号２１）は、ヘリックス６及び７を構成する配列並びにヘリックス６とヘリックス７の間に存在する構造未知配列からなるアミノ酸配列を除去し、Ｃ末端側にヒスチジンタグを追加したものである。【０１５６】
ヘリックス５、及び、立体構造を維持するための９つのアミノ酸をコードする遺伝子断片（配列番号１８、そのアミノ酸配列は配列番号１９）を作製し、実施例６で得たｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′に組み込み、組換えベクターを作製した。具体的には、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法により、遺伝子を合成した。
ＣｕｅＯ−α５−１：5'-ctctccatggacccgatgctcgatatgatggggatgcagatgctaatggagaaatatggcgc-3'（配列番号２２）（５〜１０位のccatggがＮｃｏＩ認識部位である。）
ＣｕｅＯ−α５−１Ｒ：5'-taaattagcggccgcagcacctgcagcaccagctgcgccatatttctccattagcatctgc-3'（配列番号２３）（８〜１５位のgcggccgcがＮｏｔＩ認識部位である。）
反応には、以下に示すＰＣＲ反応液を用いた。【０１５７】
ＰＣＲ反応液
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）        各１μＬ
ＰＣＲ緩衝液                              ５μＬ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ．（２．５ｍＭ）            ４μＬ
精製水                              ３８．７５μＬ
ＴＯＹＯＢＯ  ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ      ０．２５μＬ【０１５８】
反応サイクル
（１）９５℃、５ｍｉｎ予熱
（２）９５℃、０．５ｍｉｎ変性
（３）５０℃、０．５ｍｉｎアニーリング
（４）７２℃、０．５ｍｉｎ伸長→（２）に戻る（４０サイクル）
（５）７２℃、１０ｍｉｎ伸長
上記ＰＣＲ反応後、下記のエタノール沈殿で増幅産物を濃縮した。【０１５９】
エタノール沈殿
５０μＬのサンプルに５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００％エタノールを１００μＬ加え混合し、−８０℃で１０分静置した。その後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。ペレットに７０％エタノールを５００μＬ加え洗浄後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。５分ほど減圧乾燥を行い、ペレットを１０μＬの制限酵素消化液に溶かした。【０１６０】
制限酵素消化
以下の反応系で増幅断片とベクターｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′の制限酵素処理を行った。
反応系（ＰＣＲ増幅断片処理用）
ＰＣＲ増幅断片                  約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液        １．０μＬ
ＮｃｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）      ０．５μＬ
ＮｏｔＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）      ０．５μＬ
精製水                          ８．０μＬ
合計                          １０．０μＬ【０１６１】
反応系（ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′用）
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′  約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液              ０．７μＬ
ＮｃｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）            ０．３μＬ
ＮｏｔＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）            ０．３μＬ
精製水                                ５．７μＬ
合計                                  ８．０μＬ
各溶液調整後、３７℃で１晩消化した。【０１６２】
アガロースゲル電気泳動
各制限酵素消化物に２μＬの色素液を加え、２％アガロースゲル（１×ＴＡＥ緩衝液）にロードし、１００Ｖ定電圧で１時間泳動終了後、エチジウムブロマイド溶液でＤＮＡバンドを染色した。ＵＶイルミネーターで確認しながら、９０ｂｐのＰＣＲ断片と、４．１ｋｂのｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′断片を切り出した。【０１６３】
ＤＮＡ断片抽出
ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）のプロトコールに従いアガロースゲルからＤＮＡ断片をそれぞれ抽出した。溶出にはそれぞれ１０μＬのＴＥ緩衝液を用いた。【０１６４】
ライゲーション
Ｔａｋａｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ製）のプロトコールに従い、以下の反応液でＰＣＲ産物のＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ消化断片とｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′の消化断片を連結した。
ＰＣＲ産物ゲル抽出断片                                    ４．５μＬ
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′ゲル抽出断片          ０．５μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１  Ｓｏｌ．Ｉ      ５．０μＬ
合計                                                    １０．０μＬ
溶液調整後、サーマルサイクラーを用いて１６℃で１晩反応した。その後エタノール沈殿を行い、１０μＬの滅菌水に溶解した。【０１６５】
得られた組換えベクター中に、配列番号２０で表される塩基配列を確認した。得られた組換えベクターをｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα６−７）とする。
このベクターを用いて実施例６と同様の手順で、形質転換体を製造し、さらに組換えタンパク質を製造、精製した。このようにして精製された本発明の組換えタンパク質を、改変型ＣｕｅＯ（３）：ＣｕｅＯ（Δα６−７）とする（以下、ｍＣｕｅＯ（３）ともいう）。配列番号２１は未成熟タイプのアミノ酸配列であり、１−２８位のアミノ酸配列はシグナル配列である。【０１６６】
実施例８：本発明の改変型ＣｕｅＯ（４）：ＣｕｅＯ（Δα５）の製造
本実施例で目的とする改変型ＣｕｅＯ（４）のアミノ酸配列（配列番号２７）は、ヘリックス５を構成する配列を除去し、Ｃ末端側にヒスチジンタグを追加したものである。
ヘリックス６及び７、並びに、立体構造を維持するための１０個のアミノ酸をコードする遺伝子断片（配列番号２４、そのアミノ酸配列は２５）を作製し、実施例６で得たｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′に組み込み、組換えベクターを作製した。具体的には、ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′を鋳型に用い、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法により、遺伝子を合成した。
ＣｕｅＯ−α６−１：5'-tatttagcggccgcaggagcagcaggagcagcaggagatcaggcgatggccgggatg-3'（配列番号２８）（４〜１１位のgcggccgcがＮｏｔＩ認識部位である。）
Ｍ１３（−２１）：5'-gttttcccagtcacgac-3'（配列番号２９）
反応には、以下に示すＰＣＲ反応液を用いた。【０１６７】
ＰＣＲ反応液
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′      ０．５μＬ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）            各１μＬ
ＰＣＲ緩衝液                                  ５μＬ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ．（２．５ｍＭ）                ４μＬ
精製水                                  ３７．２５μＬ
ＴＯＹＯＢＯ  ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ          ０．２５μＬ【０１６８】
反応サイクル
（１）９５℃、５ｍｉｎ予熱
（２）９５℃、０．５ｍｉｎ変性
（３）５０℃、０．５ｍｉｎアニーリング
（４）７２℃、０．５ｍｉｎ伸長→（２）に戻る（４０サイクル）
（５）７２℃、１０ｍｉｎ伸長
上記ＰＣＲ反応後、下記のエタノール沈殿で増幅産物を濃縮した。【０１６９】
エタノール沈殿
５０μＬのサンプルに５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００％エタノールを１００μＬ加え混合し、−８０℃で１０分静置した。その後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。ペレットに７０％エタノールを５００μＬ加え洗浄後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。５分ほど減圧乾燥を行い、ペレットを１０μＬのＴＥ緩衝液に溶かした。【０１７０】
アガロースゲル電気泳動
エタノール沈殿後のＰＣＲ産物に２μＬの色素液を加え、２％アガロースゲル（１×ＴＡＥ緩衝液）にロードし、１００Ｖ定電圧で１時間泳動終了後、エチジウムブロマイド溶液でＤＮＡバンドを染色した。ＵＶイルミネーターで確認しながら、５３０ｂｐのＰＣＲ断片を切り出した。【０１７１】
ＤＮＡ断片抽出
ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）のプロトコールに従いアガロースゲルからＤＮＡ断片をそれぞれ抽出した。溶出にはそれぞれ１０μＬのＴＥ緩衝液を用いた。【０１７２】
ＴＡクローニング
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）のプロトコールに従い、ＰＣＲ産物をＴＡクローン化した。
溶液調整後、４℃で１晩反応した。その後エタノール沈殿を行い、１０μＬの滅菌水に溶解した。【０１７３】
得られた組換えベクターの塩基配列を確認した。得られた組換えベクターをｐＧＥＭ−α６−７とする。【０１７４】
制限酵素消化
以下の反応系でｐＧＥＭ−α６−７とｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′の制限酵素処理を行った。
反応系（ｐＧＥＭ−α６−７用）
ｐＧＥＭ−α６−７              約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液        １．０μＬ
ＮｏｔＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）      ０．５μＬ
ＢａｍＨＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）    ０．５μＬ
精製水                          ８．０μＬ
合計                          １０．０μＬ【０１７５】
反応系（ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′用）
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′  約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液              １．０μＬ
ＮｏｔＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）            ０．５μＬ
ＢａｍＨＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）          ０．５μＬ
精製水                                ８．０μＬ
合計                                １０．０μＬ
各溶液調整後、３７℃で１晩消化した。【０１７６】
アガロースゲル電気泳動
各制限酵素消化物に２μＬの色素液を加え、２％アガロースゲル（１×ＴＡＥ緩衝液）にロードし、１００Ｖ定電圧で１時間泳動終了後、エチジウムブロマイド溶液でＤＮＡバンドを染色した。ＵＶイルミネーターで確認しながら、４８０ｂｐの断片と、３．７ｋｂのｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′断片を切り出した。【０１７７】
ＤＮＡ断片抽出
ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）のプロトコールに従いアガロースゲルからＤＮＡ断片をそれぞれ抽出した。溶出にはそれぞれ１０μＬのＴＥ緩衝液を用いた。【０１７８】
ライゲーション
Ｔａｋａｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ製）のプロトコールに従い、以下の反応液でｐＧＥＭ−α６−７のＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ消化断片とｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′の消化断片を連結した。
ｐＧＥＭ−α６−７抽出断片                                ４．５μＬ
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′ゲル抽出断片          ０．５μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１  Ｓｏｌ．Ｉ      ５．０μＬ
合計                                                    １０．０μＬ
溶液調整後、サーマルサイクラーを用いて１６℃で１晩反応した。その後エタノール沈殿を行い、１０μＬの滅菌水に溶解した。【０１７９】
得られた組換えベクター中に、配列番号２６で表される塩基配列を確認した。得られた組換えベクターをｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５）とする。
このベクターを用いて実施例６と同様の手順で、形質転換体を製造し、さらに組換えタンパク質を製造、精製した。このようにして精製された本発明の組換えタンパク質を、改変型ＣｕｅＯ（４）：ＣｕｅＯ（Δα５）とする（以下、ｍＣｕｅＯ（４）ともいう）。配列番号２７は未成熟タイプのアミノ酸配列であり、１−２８位のアミノ酸配列はシグナル配列である。【０１８０】
実施例９：本発明の改変型ＣｕｅＯ（５）：ＣｕｅＯ（Δα５−７）′＋１／２α５の製造
本実施例で目的とする改変型ＣｕｅＯ（５）のアミノ酸配列（配列番号３３）は、ヘリックス５のＣ末端側の半分、ヘリックス６及びヘリックス７を構成する配列、並びに、ヘリックス６とヘリックス７の間に存在する構造未知配列からなるアミノ酸配列を除去し、Ｃ末端側にヒスチジンタグを追加したものである。すなわち、改変型ＣｕｅＯ（５）には、ヘリックス５のＮ末端側の半分が含まれている。【０１８１】
ヘリックス５の半分と、立体構造を維持するための５つのアミノ酸をコードする遺伝子断片（配列番号３０、そのアミノ酸配列は配列番号３１）を作製し、実施例６で得たｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′に組み込み、組換えベクターを作製した。具体的には、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法により、遺伝子を合成した。
ＣｕｅＯ−ｐａｒα５−１：5'-ctctccatggacccgatgctcgatatgatggggatggga-3'（配列番号３４）（５〜１０位のccatggがＮｃｏＩ認識部位である）
ＣｕｅＯ−ｐａｒα５−１Ｒ：5'-aataatagcggccgcacctgctcccatccccatcatatc-3'（配列番号３５）（８〜１５位のgcggccgcがＮｏｔＩ認識部位である）
反応には、以下に示すＰＣＲ反応液を用いた。【０１８２】
ＰＣＲ反応液
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）        各１μＬ
ＰＣＲ緩衝液                              ５μＬ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ．（２．５ｍＭ）          ４μＬ
精製水                            ３８．７５μＬ
ＴＯＹＯＢＯ  ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ    ０．２５μＬ【０１８３】
反応サイクル
（１）９５℃、５ｍｉｎ予熱
（２）９５℃、０．５ｍｉｎ変性
（３）５０℃、０．５ｍｉｎアニーリング
（４）７２℃、０．５ｍｉｎ伸長→（２）に戻る（４０サイクル）
（５）７２℃、１０ｍｉｎ伸長
上記ＰＣＲ反応後、下記のエタノール沈殿で増幅産物を濃縮した。【０１８４】
エタノール沈殿
５０μＬのサンプルに５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００％エタノールを１００μＬ加え混合し、−８０℃で１０分静置した。その後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。ペレットに７０％エタノールを５００μＬ加え洗浄後、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を捨てた。５分ほど減圧乾燥を行い、ペレットを１０μＬの制限酵素消化液に溶かした。【０１８５】
制限酵素消化
以下の反応系で増幅断片とベクターｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′の制限酵素処理を行った。
反応系（ＰＣＲ増幅断片処理用）
ＰＣＲ増幅断片                  約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液        １．０μＬ
ＮｃｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）      ０．５μＬ
ＮｏｔＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）      ０．５μＬ
精製水                          ８．０μＬ
合計                          １０．０μＬ【０１８６】
反応系（ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′用）
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′      約２０μｇ
ＴＯＹＯＢＯ  Ｈ  緩衝液                  ０．７μＬ
ＮｃｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）                ０．３μＬ
ＮｏｔＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）                ０．３μＬ
精製水                                    ５．７μＬ
合計                                      ８．０μＬ
各溶液調整後、３７℃で１晩消化した。【０１８７】
アガロースゲル電気泳動
各制限酵素消化物に２μＬの色素液を加え、２％アガロースゲル（１×ＴＡＥ緩衝液）にロードし、１００Ｖ定電圧で１時間泳動終了後、エチジウムブロマイド溶液でＤＮＡバンドを染色した。ＵＶイルミネーターで確認しながら、５０ｂｐのＰＣＲ断片と、４．１ｋｂのｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′断片を切り出した。【０１８８】
ＤＮＡ断片抽出
ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ製）のプロトコールに従いアガロースゲルからＤＮＡ断片をそれぞれ抽出した。溶出にはそれぞれ１０μＬのＴＥ緩衝液を用いた。【０１８９】
ライゲーション
Ｔａｋａｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ製）のプロトコールに従い、以下の反応液でＰＣＲ産物のＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ消化断片とｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′の消化断片を連結した。
ＰＣＲ産物ゲル抽出断片                                    ４．５μＬ
ｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′ゲル抽出断片          ０．５μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１  Ｓｏｌ．Ｉ      ５．０μＬ
合計                                                    １０．０μＬ
溶液調整後、サーマルサイクラーを用いて１６℃で１晩反応した。その後エタノール沈殿を行い、１０μＬの滅菌水に溶解した。【０１９０】
得られた組換えベクター中に、配列番号３２で表される塩基配列を確認した。得られた組換えベクターをｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ（Δα５−７）′＋１／２α５とする。
このベクターを用いて実施例６と同様の手順で、形質転換体を製造し、さらに組換えタンパク質を製造、精製した。このようにして精製された本発明の組換えタンパク質を、改変型ＣｕｅＯ（５）：ＣｕｅＯ（Δα５−７）′＋１／２α５とする（以下、ｍＣｕｅＯ（５）ともいう）。配列番号３３は未成熟タイプのアミノ酸配列であり、１−２８位のアミノ酸配列はシグナル配列である。【０１９１】
試験例１０
ラッカーゼの代表的な基質に対するｍＣｕｅＯ（２）〜（５）の酸化重合活性の評価
（１）基質溶液の調製
パラフェニレンジアミン（ＰＰＤ）、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）はそれぞれ、イオン交換蒸留水に溶解し、５０ｍＭ水溶液とした。
オルトアミノフェノール（ＯＡＰ）はＤＭＳＯに溶解した後、イオン交換蒸留水に溶解して５０ｍＭ、ＤＭＳＯ（１０％）−水溶液とした。【０１９２】
（２）活性測定方法
キュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．８７５ｍＬ、各酵素（ｍＣｕｅＯ（２）〜（５）又は野生型ＣｕｅＯ）水溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）０．０２５ｍＬ、及び、各基質溶液０．１ｍＬを混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて、各測定波長での吸光度の変化量を測定した（測定波長はＰＰＤは４７０ｎｍ、ＡＢＴＳ、ＯＡＰは４２０ｎｍ）。
野生型ＣｕｅＯによる吸光度の変化量／ｍｉｎ／ｍｏｌを１として比較した結果を、ＰＰＤに関しては図８に、ＯＡＰに関しては図９に、ＡＢＴＳに関しては図１０に示す。
これらの結果から、ｍＣｕｅＯ（２）〜（５）の酸化重合能力は、野生型ＣｕｅＯと比較して格段に優れていることが分かった。【０１９３】
調剤例
以下に、本発明のケラチン繊維染色用組成物の調剤例を示す。以下の組成物は、白髪の毛髪に適用すると、白髪を目立たなく染色することができるものである。なお、配合量は重量％で示す。
調剤例１（ジェルタイプ）
パラフェニレンジアミン                          １．５
レゾルシン                                      ０．３
メタアミノフェノール                            ０．１
本発明の組換えタンパク質                        ０．１
アスコルビン酸ナトリウム                        １．０
ヒドロキシエチルセルロース                      １．０
クエン酸                                          適量
モノエタノールアミン                              適量
精製水                                            残部
合  計                                      １００．０【０１９４】
調剤例２（クリームタイプ）
パラフェニレンジアミン                          １．０
パラアミノフェノール                            ０．８
メタアミノフェノール                            ０．１
セタノール                                      ６．０
本発明の組換えタンパク質                        ０．０５
ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル        ４．０
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム            １．０
Ｌ−システイン塩酸塩                            ０．２
クエン酸                                          適量
モノエタノールアミン                              適量
精製水                                            残部
合  計                                      １００．０【０１９５】
調剤例３（クリームタイプ）
５，６−ジヒドロキシインドリン                  １．０
５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸  ０．５
オルトアミノフェノール                            ０．５
エタノール                                      ５．０
ステアリルアルコール                            １．５
本発明の組換えタンパク質                        ０．２
ポリオキシエチレン（４０）硬化ヒマシ油          ３．０
ポリグリセリン脂肪酸エステル                    ４．０
Ｎ−アセチルシステイン                          ０．１
キサンタンガム                                  ０．５
アキュリン（登録商標）２２                      ０．１
ヒドロキシエチルセルロース                      ０．１
モノイソプロパノールアミン                        適量
モノエタノールアミン                              適量
精製水                                            残部
合  計                                      １００．０【０１９６】
調剤例４（エアゾールタイプ）
トルエン−２，５−ジアミン                      １．５
パラアミノフェノール                            ０．２
レゾルシン                                      ０．１
メタアミノフェノール                            ０．１
ポリオキシエチレン（５）セチルエーテル          ２．０
プロピレングリコール                            ５．０
亜硫酸ナトリウム                                ０．３
モノエタノールアミン                              適量
クエン酸                                          適量
本発明の組換えタンパク質                        ０．３
液化石油ガス                                    ４．０
精製水                                            残部
合  計                                      １００．０
【産業上の利用可能性】
【０１９７】
本発明によれば、野生型ＣｕｅＯと比較して、パラフェニレンジアミン等を酸化する酵素活性に優れた組換えタンパク質を提供することができ、かつ、ケラチン繊維の染色を、過酸化水素等の酸化剤を用いずに酵素を利用して、簡便にかつ効率よく、アルカリ条件下においても行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の野生型ＣｕｅＯの立体構造を示す図
【図２】試験例３で、ｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性のｐＨ依存性を評価した結果を示すグラフ
【図３】試験例４で、ｍＣｕｅＯ（１）の酸化重合活性の温度依存性を評価した結果を示すグラフ
【図４】試験例６で、ｍＣｕｅＯ（１）のｐＨ安定性を評価した結果を示すグラフ
【図５】試験例７で、ｍＣｕｅＯ（１）のｐＨ安定性を評価した結果を示すグラフ
【図６】試験例８で、ｍＣｕｅＯ（１）の熱安定性を評価した結果を示すグラフ
【図７】試験例９で、ｍＣｕｅＯ（１）の熱安定性の経時的変化を評価した結果を示すグラフ
【図８】試験例１０で、野生型ＣｕｅＯ及びｍＣｕｅＯ（２）〜（５）についてＰＰＤに対する酸化重合活性を比較した結果を示すグラフ
【図９】試験例１０で、野生型ＣｕｅＯ及びｍＣｕｅＯ（２）〜（５）についてＯＡＰに対する酸化重合活性を比較した結果を示すグラフ
【図１０】試験例１０で、野生型ＣｕｅＯ及びｍＣｕｅＯ（２）〜（５）についてＡＢＴＳに対する酸化重合活性を比較した結果を示すグラフ
【符号の説明】
【０１９９】
１：タイプＩ銅
５：ヘリックス５
６：ヘリックス６
７：ヘリックス７
【配列表フリーテキスト】
【０２００】
配列番号１：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の野生型ＣｕｅＯ（未成熟タイプ）のアミノ酸配列
配列番号２：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の野生型ＣｕｅＯ（成熟タイプ）のアミノ酸配列
配列番号３：本発明の一態様であるｍＣｕｅＯ（１）：ＣｕｅＯ（Δα５−７）（未成熟タイプ）のアミノ酸配列
配列番号４：ｍＣｕｅＯ（１）（成熟タイプ）のアミノ酸配列
配列番号５：ｍＣｕｅＯ（１）（成熟タイプ、ヒスチジンタグ付き）のアミノ酸配列
配列番号６：配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号７：配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号８：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の野生型ＣｕｅＯ（成熟タイプ、ヒスチジンタグ付き）のアミノ酸配列
配列番号９及び１０：参考製造例１で使用したプライマー
配列番号１１及び１２：実施例１で使用したプライマー
配列番号１３：ｍＣｕｅＯ（１）を作製するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の野生型ＣｕｅＯから除去したアミノ酸配列
配列番号１４：本発明の一態様であるｍＣｕｅＯ（２）：ＣｕｅＯ（Δα５−７）′（未成熟タイプ、ヒスチジンタグ付き）をコードする塩基配列
配列番号１５：配列番号１４の塩基配列がコードするアミノ酸配列
配列番号１６及び１７：実施例６で使用したプライマー
配列番号１８：本発明の一態様であるｍＣｕｅＯ（３）：ＣｕｅＯ（Δα６−７）を作製するために挿入した塩基配列
配列番号１９：配列番号１８の塩基配列がコードするアミノ酸配列
配列番号２０：ｍＣｕｅＯ（３）（未成熟タイプ、ヒスチジンタグ付き）をコードする塩基配列
配列番号２１：配列番号２０の塩基配列がコードするアミノ酸配列
配列番号２２及び２３：実施例７で使用したプライマー
配列番号２４：本発明の一態様であるｍＣｕｅＯ（４）：ＣｕｅＯ（Δα５）を作製するために挿入した塩基配列
配列番号２５：配列番号２４の塩基配列がコードするアミノ酸配列
配列番号２６：ｍＣｕｅＯ（４）（未成熟タイプ、ヒスチジンタグ付き）をコードする塩基配列
配列番号２７：配列番号２６の塩基配列がコードするアミノ酸配列
配列番号２８及び２９：実施例８で使用したプライマー
配列番号３０：本発明の一態様であるｍＣｕｅＯ（５）：ＣｕｅＯ（Δα５−７）′＋１／２α５を作製するために挿入した塩基配列
配列番号３１：配列番号３０の塩基配列がコードするアミノ酸配列
配列番号３２：ｍＣｕｅＯ（５）（未成熟タイプ、ヒスチジンタグ付き）をコードする塩基配列
配列番号３３：配列番号３２の塩基配列がコードするアミノ酸配列
配列番号３４及び３５：実施例９で使用したプライマー
配列番号３６：ｍＣｕｅＯ（２）（成熟タイプ）のアミノ酸配列
配列番号３７：ｍＣｕｅＯ（３）（成熟タイプ）のアミノ酸配列
配列番号３８：ｍＣｕｅＯ（４）（成熟タイプ）のアミノ酸配列
配列番号３９：ｍＣｕｅＯ（５）（成熟タイプ）のアミノ酸配列
配列番号４０：ｍＣｕｅＯ（１）（未成熟タイプ、ヒスチジンタグ付き）をコードする塩基配列
配列番号４１：配列番号４０の塩基配列がコードするアミノ酸配列
【図１】
2007063614.tif 000007
【図２】
2007063614.tif 000008
【図３】
2007063614.tif 000009
【図４】
2007063614.tif 000010
【図５】
2007063614.tif 000011
【図６】
2007063614.tif 000012
【図７】
2007063614.tif 000013
【図８】
2007063614.tif 000014
【図９】
2007063614.tif 000015
【図１０】
2007063614.tif 000016
【配列表】
2007063614000001.app
【国際調査報告】
2007063614.tif 000017
2007063614.tif 000018
2007063614.tif 000019
2007063614.tif 000020