【手続補正書】
【提出日】平成31年3月4日(2019.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤｓｂＡポリペプチドを含む細胞溶解物からの前記ＤｓｂＡポリペプチドの精製方法であって、
ａ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、０．０１％〜１．０％の最終濃度に、任意選択的に０．１％になるまで、前記ＤｓｂＡポリペプチドを含む細胞溶解物に添加することと、
ｂ）遠心分離により前記細胞溶解物を浄化することであって、任意選択的に前記浄化された細胞溶解物が１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．１を含む、浄化することと、
ｃ）前記ＤｓｂＡポリペプチドを含む前記浄化された細胞溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、
ｄ）前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料から前記ＤｓｂＡポリペプチドを溶出させて、前記ＤｓｂＡポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を生成することと、
ｅ）前記ＤｓｂＡポリペプチドを含む前記陰イオン交換溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、
ｆ）前記陽イオン交換クロマトグラフィー材料から前記ＤｓｂＡポリペプチドを溶出させて、精製されたＤｓｂＡポリペプチドを含む陽イオン交換溶出物を生成することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＤｓｂＡポリペプチドを含む前記細胞溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前に前記ＰＥＩ中に少なくとも約１６時間保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料が強陰イオン交換体であり、任意選択的に第四級アミンであり、さらに任意選択的に第四級アミンが架橋アガロースに結合している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｉ）前記ＤｓｂＡが、以下のステップ：
約４カラム体積の１５％の約２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．２）、
４カラム体積の２０％の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．２）、
ＤｓｂＡが前記カラムから溶出するまで２５％の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．２）で前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出される；
ｉｉ）ステップｂ）の前記ＤｓｂＡポリペプチドを含む前記浄化された溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前に０．２２μｍのフィルターに通される；
ｉｉｉ）ステップｂ）の前記ＤｓｂＡポリペプチドを含む前記浄化された溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前にｐＨ９．０に調整される；
ｉｖ）前記陰イオン交換溶出物が画分で収集され、任意選択的に前記画分が陽イオン交換クロマトグラフィー前にサイズ排除クロマトグラフィーによって分析される；
ｖ）少なくとも５５％のＤｓｂＡを含む陰イオン交換画分がさらなる精製のために選択される；
ｖｉ）ステップｄ）の前記陰イオン交換溶出物が陽イオン交換クロマトグラフィー前にｐＨ５．０に調整される；
ｖｉｉ）ステップｅ）の前記陽イオン交換クロマトグラフィー材料が溶出前に５カラム体積の１２．５ｍＭ  ＭＥＳで洗浄される；
ｖｉｉｉ）ステップｅ）の前記陽イオン交換クロマトグラフィー材料からＤｓｂＡが０％から６０％までの１２．５ｍＭ  ＭＥＳ及び１Ｍ  ＮａＣｌの１５カラム体積を超える塩勾配より溶出される；
ｉｘ）前記陽イオン交換溶出物が画分で収集され、任意選択的に前記画分がサイズ排除クロマトグラフィーによって分析される；および
ｘ）少なくとも９５％のＤｓｂＡを含む陽イオン交換画分がプールされる
のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記陽イオン交換材料がスルホプロピル部分を含み、任意選択的に前記スルホプロピル部分が、架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）マトリックスまたはその等価物に結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤｓｂＡポリペプチドがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤｓｂＡポリペプチドであり、任意選択的に前記ＤｓｂＡポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤｓｂＡがＥ．ｃｏｌｉ細胞で発現され、任意選択的に前記細胞がＤｓｂＡの内因性発現を超えるレベルでＤｓｂＡを発現するように操作される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
精製されたＤｓｂＡポリペプチドを含む組成物であって、少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＡポリペプチドを含み、前記組成物が：
ａ）２％未満の低分子量種；
ｂ）１％未満の高分子量種；及び
ｃ）５％未満の不純物であって、任意選択的に前記不純物が、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質（ＥＣＰ）、ＤｓｂＡ凝集体、ＤｓｂＡ断片、核酸、及び細胞培養培地成分のうちの１つまたは複数である不純物
のうちの１つまたは複数を含む組成物。
【請求項９】
前記ＤｓｂＡが１回以上の凍結融解サイクルに対して安定している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物中の前記ＤｓｂＡポリペプチドの純度が、クロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはウエスタンブロット分析のうちの１つ以上によって測定される、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体の精製方法であって、抗ＤｓｂＡ抗体を含む組成物を支持材料に結合しているＤｓｂＡを含むクロマトグラフィー材料と接触させることと、前記クロマトグラフィー材料を洗浄して、結合していない化合物を除去することと、前記抗ＤｓｂＡ抗体を溶出させることと、を含み、前記支持材料に結合しているＤｓｂＡが、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により調製される少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＡポリペプチドを含み、任意選択的に前記抗体の１％未満が、非ＤｓｂＡ化合物に特異的に結合する、前記方法。
【請求項１２】
試料中のＤｓｂＡの定量化方法であって、検出システムを使用して前記試料中のＤｓｂＡを検出することと、前記試料中で検出されたＤｓｂＡの量をＤｓｂＡ参照標準の１つ以上の濃度の検出と比較することと、を含み、前記ＤｓｂＡ参照標準が少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＡポリペプチドを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記ＤｓｂＡ参照標準が請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出システムが免疫アッセイである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫アッセイが９５％のＤｓｂＡに特異的に結合する抗体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＤｓｂＡの存在及び／または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して前記試料中のＤｓｂＡを検出することと、前記試料中で検出されたＤｓｂＡの量をＤｓｂＡ参照標準の１つ以上の濃度の検出と比較することと、を含み、前記ＤｓｂＡ参照標準が少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＡポリペプチドを含む、前記方法。
【請求項１７】
前記ＤｓｂＡ参照標準が請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫アッセイが９５％のＤｓｂＡに特異的に結合する抗体を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
９５％のＤｓｂＡに特異的に結合する前記抗体がポリクローナル抗体であり、ＤｓｂＡに特異的に結合する前記抗体が前記免疫アッセイにおいて捕捉抗体及び／または検出抗体として使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＤｓｂＡに特異的に結合する前記抗体が請求項１１に記載の方法に従って調製される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えポリペプチドが宿主細胞、任意選択的にＥ．ｃｏｌｉ細胞、さらに任意選択的にＤｓｂＡを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞内で調製される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が最終組換えポリペプチド精製産物であり、任意選択的に抗体またはイムノアドヘシンである、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
試料中のＤｓｂＡの検出のための免疫アッセイであって、前記試料が組換えポリペプチド調製物または宿主細胞株から得られ、前記方法が、
（ａ）ＤｓｂＡに結合する捕捉抗体を前記試料と接触させて、それにより試料−捕捉抗体組み合わせ材料を生成することと、
（ｂ）ＤｓｂＡに結合する検出抗体を前記試料−捕捉抗体組み合わせ材料と接触させることと、
（ｃ）前記試料−捕捉抗体組み合わせ材料に結合している前記検出抗体を検出することと、
（ｄ）前記試料中に存在するＤｓｂＡの量を、標準滴定曲線をＤｓｂＡ組成物について生成された標準滴定曲線と比較することによって決定することであって、前記ＤｓｂＡ組成物が少なくとも約９５％の単量体ＤｓｂＡポリペプチドを含む、ＤｓｂＡの量を決定することと
を含む、前記免疫アッセイ。
【請求項２４】
細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物の品質アッセイであって、放出アッセイが、前記薬学的組成物の試料を請求項２３に記載の免疫アッセイ方法に供することを含み、前記組成物中で検出されたＤｓｂＡの量が、前記薬学的組成物が動物への投与に好適であるかを決定する、前記品質アッセイ。
【請求項２５】
１ｐｐｍ未満の前記薬学的組成物中のＤｓｂＡの量が、前記薬学的組成物が前記動物への投与に好適であることを示す、請求項２４に記載の品質アッセイ。
【請求項２６】
前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞であり、任意選択的に前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＤｓｂＡを過剰発現する、請求項２３に記載の免疫アッセイまたは請求項２４もしくは２５に記載の品質アッセイ。
【請求項２７】
前記試料が細胞溶解物である、請求項２６に記載の免疫アッセイまたは品質アッセイ。
【請求項２８】
前記組換えポリペプチド調製物が最終精製産物である、請求項２６または２７に記載の免疫アッセイまたは品質アッセイ。
【請求項２９】
前記組換えポリペプチド調製物中に含有される前記組換えポリペプチドが抗体またはイムノアドヘシンであり、任意選択的に前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の免疫アッセイまたは品質アッセイ。
【請求項３０】
細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のＤｓｂＡの検出のためのキットであって、請求項１１に記載の抗ＤｓｂＡ抗体の組成物及び試料中のＤｓｂＡを定量するための標準曲線を生成する際の参照標準として使用するための、かつ／または陽性対照として使用するためのＤｓｂＡを含む組成物を含み、前記ＤｓｂＡを含む組成物が請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって調製され、かつ少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＡを含む、前記キット。