【手続補正書】
【提出日】令和1年7月26日(2019.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物中でステビオールグリコシドを産生することができる組換え宿主細胞であって、
（ａ）糖排出トランスポーター（ＳＥＴ）ポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ＳＥＴポリペプチドが、配列番号１８、２０、または２２のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；及び／または
（ｂ）糖トランスポーターＳＷＥＥＴ（ＳＷＥＥＴ）ポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ＳＷＥＥＴポリペプチドが、配列番号２４、２６、または２８のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
ここで、前記遺伝子のうちの少なくとも１つが、組換え遺伝子である、
を含む、前記組換え宿主細胞。
【請求項２】
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、１６６、１６８、１７０、１７２、または１７４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上の輸送アダプターポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失をさらに含む、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
（ａ）配列番号３０、４２、４６、または１６６のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失が、レバウディオサイドＤ（ＲｅｂＤ）の排出を増加させる；及び／または
（ｂ）配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、１６６、１７０、１７２、または１７４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失が、レバウディオサイドＭ（ＲｅｂＭ）の排出を増加させる、
請求項１または２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
配列番号１６、５４、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、または１４６のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはそれらの機能的ホモログを有する１つ以上のトランスポーターポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
１つ以上の遺伝子の欠失が、相同組換えにより行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）ファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号１８２、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、または２２０のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｂ）ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリルジホスファートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号１８４、２２２、２２４、２２６、２２８、または２３０のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号１８８、２０６、２４６、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、または２６１のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｄ）ｅｎｔ−コパリルピロホスファートからｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号１８６、２３２、２３４、２３６、または２３８のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｅ）ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号１９２、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、または２８３のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｆ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号１９０、１９４、２６３、２６５、２８７、２８９、２９１、または２９３のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；または
（ｇ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号１９６に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｈ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化をすることができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号２００に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｉ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号１９８に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；及び／または；
（ｊ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化をすることができるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、前記ポリペプチドが、配列番号２０２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または配列番号２０４に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
ここで、項目（ａ）〜（ｊ）の前記遺伝子のうちの少なくとも１つが、組換え遺伝子である；及び
ここで、ステビオールグリコシドが、レバウディオサイドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウディオサイドＢ（ＲｅｂＢ）、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体である、
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
（ａ）１つ以上のトランスポーターポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失を有しないステビオールグリコシド産生宿主細胞と比較して、減少した量のステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）を排出する；
（ｂ）１つ以上のトランスポーターポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失を有しないステビオールグリコシド産生宿主細胞と比較して、増加した量のＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を排出する；及び／または
（ｃ）１つ以上のトランスポーターポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失を有しないステビオールグリコシド産生宿主細胞と比較して、増加した量のＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を産生する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
細胞培養物中でステビオールグリコシドを産生することができる組換え宿主細胞であって、
前記組換え宿主細胞が、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、１６６、１６８、１７０、１７２、または１７４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上の輸送アダプターポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失を含む、
配列番号３０、４２、４６、または１６６のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失が、ＲｅｂＤの排出を増加させる；及び
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、１６６、１７０、１７２、１７４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失が、ＲｅｂＭの排出を増加させる、
前記組換え宿主細胞。
【請求項９】
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、１６６、１６８、１７０、１７２、または１７４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上の輸送アダプターポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失を含む、細胞培養物中でステビオールグリコシドを産生することができる組換え宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、５４、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、または１４６のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはそれらの機能的ホモログを有する１つ以上のトランスポーターポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失を含む、細胞培養物中でステビオールグリコシドを産生することができる組換え宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を、前記遺伝子のうち１つ以上が発現される条件下、細胞培養物中で培養することを含む、組換え宿主細胞においてステビオールグリコシドの産生を増加させるか、またはステビオールグリコシドの細胞培地への排出を増加させる方法であって、
ステビオールグリコシドが、組換え宿主細胞によって産生される；及び
ステビオールグリコシドが、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体である、
前記方法。
【請求項１２】
（ａ）ＲｅｂＡが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することができるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化をすることができるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することができるポリペプチド；及び、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化をすることができるポリペプチドを発現する組換え宿主細胞において産生される；
（ｂ）ＲｅｂＢが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することができるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化をすることができるポリペプチド；及び、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化をすることができるポリペプチドを発現する組換え宿主細胞において産生される；
（ｃ）ＲｅｂＤが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することができるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化をすることができるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することができるポリペプチド；及び、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化をすることができるポリペプチドを発現する組換え宿主細胞において産生される；及び／または
（ｄ）ＲｅｂＭが、ステビオールの１３−ＯＨのグリコシル化をすることができるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化をすることができるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することができるポリペプチド；及び、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化をすることができるポリペプチドを発現する組換え宿主細胞において産生される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞培養物中で請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞によって産生されるＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体の量を増加させる方法であって、
１３−ＳＭＧの組換え宿主細胞から培養物への排出が、１つ以上のトランスポーターポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の欠失を有しないＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ産生宿主細胞と比較して減少する；
ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体が、組換え宿主細胞によって産生される、
前記方法。
【請求項１４】
ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を単独または組み合わせて細胞培養物から単離することをさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、
単離ステップが、細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離して、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を単独または組み合わせて含む上清を得ること、及び
（ａ）ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体の少なくとも一部を単独または組み合わせて得るために、上清を１つ以上の吸着樹脂と接触させること；または
（ｂ）ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体の少なくとも一部を単独または組み合わせて得るために、上清を１つ以上のイオン交換クロマトグラフィーカラムまたは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させること；または
（ｃ）ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を単独または組み合わせて結晶化または抽出すること；
それにより、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を単独または組み合わせて単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
細胞培養物から、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を単独で回収するか、またはＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を含む組成物を回収することをさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、
回収された組成物が、ステビア植物のグリコシド組成物と比較して、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭについて富化され、及び、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルの非グリコシドステビア植物由来構成成分を有する、
前記方法。
【請求項１６】
細胞培養物が、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞によって産生されたＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン；及び
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）、及び／またはアミノ酸を含む補助栄養素
を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、細胞培養物であって、
（ａ）宿主細胞によって産生されたＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体；
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン；及び
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、及び／またはアミノ酸を含む補助栄養素；
ここで、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体が、細胞培養物の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で存在する、
をさらに含む、前記細胞培養物。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞によって産生されたＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を含む細胞溶解物であって、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、及び、微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、及び／またはアミノ酸を含む補助栄養素をさらに含む、前記細胞溶解物。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞によって、または、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって産生される、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体。
【請求項２０】
組換え宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞または請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法であって、
細菌細胞が、Escherichia属細菌細胞、Lactobacillus属細菌細胞、Lactococcus属細菌細胞、Cornebacterium属細菌細胞、Acetobacter属細菌細胞、Acinetobacter属細菌細胞、またはPseudomonas属細菌細胞である；
真菌細胞が、酵母細胞である；
酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae種、Schizosaccharomyces pombe種、Yarrowia lipolytica種、Candida glabrata種、Ashbya gossypii種、Cyberlindnera jadinii種、Pichia pastoris種、Kluyveromyces lactis種、Hansenula polymorpha種、Candida boidinii種、Arxula adeninivorans種、Xanthophyllomyces dendrorhous種、またはCandida albicans種由来の細胞である、
前記組換え宿主細胞または方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載のＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、またはそれらの異性体を含む、甘味料組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の甘味料組成物を含む、食品。
【請求項２３】
請求項２１に記載の甘味料組成物を含む、飲料または飲料濃縮物。