【手続補正書】
【提出日】平成31年4月15日(2019.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者が、ニューモシスチス肺炎(PCP)を有するか又は発症するかどうかを決定又は予測するためのin vitroでの方法であって、
i.前記ヒト患者の気道から事前に得た生体液の試料のRNA材料において、2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物を定量化して、第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値及び第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値を得る工程であって、前記2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子の少なくとも1つが、その配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写されるP.イロベチイ遺伝子であり、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であるか、又はその配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写されるP.イロベチイ遺伝子であり、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写されるP.イロベチイ遺伝子である、工程と、
ii.i.の前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値のi.の前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比を算出する工程と、
iii.ii.の比の値を閾値と比較する工程
を含み、
ii.の比の値が、前記閾値に等しいか又は前記閾値よりも低い場合、前記ヒト患者は、PCPを有するか又は発症する危険性が高いと決定又は予測され、
ii.の比の値が、前記閾値よりも高い場合、前記ヒト患者は、PCPを有するか又は発症する危険性が低いと決定又は予測され、
前記ヒト患者を、それが属する可能性が最も高い参照コホートの患者に分類するために、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値の前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比が、
PCPを有するか若しくは発症するP.イロベチイ保因者、又は
PCPを有さず発症もしていないP.イロベチイ保因者
の状態に応じて事前に確立されたP.イロベチイ保因者の参照ヒトコホートで取る値又は該値の分布を比較することによって、前記閾値が事前に決定されており、
前記工程i.の定量化が、(cDNA)逆転写及びPCR増幅、特に、リアルタイムPCRによって実行される、方法。
【請求項２】
ニューモシスチス・イロベチイ保因者であり、ニューモシスチス肺炎(PCP)を有するか又は発症すると診断されたヒト患者におけるPCPに対する薬物又は治療の有効性を決定又は予測するin vitroでの方法であって、
-  第1の時点及び第2の時点で、前記ヒト患者の気道から事前に得た生体液の試料のRNA材料において、RNA転写物を定量化して、それぞれ前記第1の時点及び前記第2の時点での第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値並びに前記第1の時点及び前記第2の時点での第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値を得る工程であって、前記第2の時点が、前記第1の時点よりも遅く、前記第1の時点及び前記第2の時点の少なくとも1つが、前記ヒト患者が前記薬物又は治療を受けている期間に含まれ、前記RNA転写物が、2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物であり、前記2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子の少なくとも1つが、その配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写されるP.イロベチイ遺伝子であり、前記2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子の第1が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であるか、又はその配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写されるP.イロベチイ遺伝子であり、前記2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子の第2が、その配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写されるP.イロベチイ遺伝子であり、RNA転写物の前記定量化が、(cDNA)逆転写及びPCR増幅、特に、リアルタイムPCRによって実行される工程と、
-  前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値の前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比を算出して、前記第1の時点での前記比の値及び前記第2の時点でのその値を得る工程と、
-  前記第2の時点での前記比の値を前記第1の時点でのその値と比較する工程であって、前記第1の時点と比較した前記第2の時点での前記比の値の増加が、前記治療又は薬物が、前記ヒト患者においてPCPを治療又は緩和するのに効率的であるか、又は効率的と予想されることを示す、工程と
を含む方法。
【請求項３】
前記生体液の試料のRNA材料を抽出及び/又は精製する工程、並びに前記抽出及び/又は精製前にRNA抽出内部対照を添加する工程を含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト患者が、HIV陰性である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
その配列がP.イロベチイリボソームRNAをコードする前記P.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子又はミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第2のP.イロベチイリボソームRNAが、ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第1のP.イロベチイリボソームRNAが、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子、又はミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であり、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写されるP.イロベチイ遺伝子であり、特に、第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記閾値が、1.27〜1.66の範囲に存在し、より詳細には1.50を有し、第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記比の算出が、方程式
R=E(CYTb)-Cq(CYTb)/E(mtrDNA)-Cq(mtrDNA)
(式中、
Rは、前記比であり、
CYTBは、その配列がCytbタンパク質をコードする前記P.イロベチイ遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
mtrDNAは、その配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写される前記P.イロベチイ遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
Eは、指示したcDNAに関する対数期での1つの増殖サイクルのPCR効率の値であり、
Cqは、指示したcDNAに関するPCR定量化サイクルの値である)
を使用して実行される、請求項8又は9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子であり、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記閾値が、2.7〜3.3の範囲に存在し、より詳細には3.2を有する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記比の算出が、方程式
R=E(mtSSU)-Cq(mtSSU)/E(mtLSU)-Cq(mtLSU)
(式中、
Rは、前記比であり、
mtSSUは、前記ミトコンドリアP.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
mtLSUは、前記ミトコンドリアP.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
Eは、指示したcDNAに関する対数期での1つの増殖サイクルのPCR効率の値であり、
Cqは、指示したcDNAに関するPCR定量化サイクルの値である)
を使用して実行される、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
各々のRNA転写物の定量化が、
-  第1のcDNA逆転写物を得るための第1のプライマー対を使用した前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物に含有される第1のRNA標的のcDNA逆転写、及び第1のアンプリコンを得るための同じ第1のプライマー対を使用した前記第1のcDNA逆転写物のPCR増幅、並びに
-  第2のcDNA逆転写物を得るための第2のプライマー対を使用した前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物由来の第2のRNA標的のcDNA逆転写、及び第2のアンプリコンを得るための同じ第2のプライマー対を使用した前記第2のcDNA逆転写物のPCR増幅
を含み、
前記第1のアンプリコン及び前記第2のアンプリコンの定量化を更に含み、
前記第1のアンプリコンの定量化の値が、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値であり、前記第2のアンプリコンの定量化の値が、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子である、又は、ミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であるとき、
前記第1のRNA標的が、100個〜120個のヌクレオチドで構成され、
-  配列番号29の配列、若しくは
-  配列番号29と同じ長さであり、配列番号29に対して少なくとも95%同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列であり、並びに、
前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子であるとき、
前記第1のRNA標的が、60個〜110個のヌクレオチドで構成され、
-  配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24の配列、又は
-  それぞれ配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24と同じ長さであり、配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24に対して少なくとも95%同一であるRNA配列
を含むか、或いはその配列である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子であり、
特に、前記第2のRNA標的が、115個〜125個のヌクレオチドで構成され、
-  配列番号9の配列、若しくは
-  配列番号9と同じ長さであり、配列番号9に対して少なくとも95%同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列である、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
-  前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であるとき、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化が、配列番号1、配列番号1に相補的な配列、配列番号2及び配列番号2に相補的な配列のいずれにもハイブリダイズせずに、配列番号30又はその相補配列にハイブリダイズする第1のプローブを使用して実行される、
又は、
- 前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子であるとき、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化が、配列番号3、配列番号3に相補的な配列、配列番号1及び配列番号1に相補的な配列のいずれにもハイブリダイズせずに、配列番号15若しくは配列番号15に相補的な配列に、又は配列番号20若しくは配列番号20に相補的な配列に、又は配列番号25若しくは配列番号25に相補的な配列にハイブリダイズする第1のプローブを使用して実行される、
又は、
- 前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子であるとき、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化が、配列番号3、配列番号3に相補的な配列、配列番号2及び配列番号2に相補的な配列のいずれにもハイブリダイズせずに、配列番号10又は配列番号10に相補的な配列にハイブリダイズする第2のプローブを使用して実行される、
請求項1から13、又は15から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者が、ニューモシスチス肺炎(PCP)を有するか若しくは発症するかどうかを決定若しくは予測するための、又はニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者におけるPCPに対する薬物若しくは治療の有効性を決定若しくは予測するための逆転写酵素及びオリゴヌクレオチドのin vitroでの使用であって、前記オリゴヌクレオチドが、プライマー及び/又はプローブを含み、前記プライマーが、第1のプライマー対及び第2のプライマー対を含み、前記プローブが、第1のプローブ及び第2のプローブを含み、
前記第1のプライマー対及び/又は前記第1のプローブが、第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に特異的にハイブリダイズし、
前記第2のプライマー対及び/又は前記第2のプローブが、第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に特異的にハイブリダイズし、
前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、請求項1から18のいずれか一項に規定の第1のミトコンドリアP.イロベチイ遺伝子であり、
前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、請求項1から18のいずれか一項に規定の第2のミトコンドリアP.イロベチイ遺伝子である、使用。
【請求項２０】
ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者においてニューモシスチス肺炎(PCP)を診断若しくは予測するのに、又はニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者におけるPCPに対する薬物若しくは治療の有効性を決定若しくは予測するのに適したキットであって、請求項19に規定の逆転写酵素及びオリゴヌクレオチド並びにポリメラーゼを含み、前記オリゴヌクレオチドが、請求項19に規定の前記第1のプライマー対、前記第1のプローブ、前記第2のプライマー対及び前記第2のプローブを含み、前記逆転写酵素及び前記ポリメラーゼが、同じチューブ中に含有される、キット。
【請求項２１】
請求項1から18のいずれか一項に記載の方法を実行するための説明書を含む、プロセシングユニットのメモリにおける、又は前記プロセシングユニットのリーダーとの連携のためのリムーバブルメモリ支持体上での保存のためのコンピュータープログラム製品。