(57)【要約】  本発明は、デッケラ属酵母種およびブレタノミセス属酵母種を、正確、迅速、かつ簡便に識別できるＬＡＭＰ法用プライマーセットの提供を目的とする。本発明によれば、配列番号１〜２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドからなる群から選択されるプライマーを含んでなる、デッケラ属酵母種およびブレタノミセス属酵母種の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
2007132589.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、デッケラ・アノマラ（Dekkera anomala）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１）；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド２）；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド３）；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド４）。
【請求項２】
下記ポリヌクレオチドのいずれか一方あるいは両方を更に含んでなる、請求項１に記載のプライマーセット：
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド５）；および
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド６）。
【請求項３】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、デッケラ・ブルクセレンシス（Dekkera bruxellensis）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド７）；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド８）；
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド９）；および
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１０）。
【請求項４】
配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１１）を更に含んでなる、請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項５】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、デッケラ・クステルシアナ（Dekkera custersiana）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１２）；
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１３）；
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１４）；および
配列番号１５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１５）。
【請求項６】
配列番号１６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１６）を更に含んでなる、請求項５に記載のプライマーセット。
【請求項７】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、ブレタノミセス・ナーデネンシス（Brettanomyces naardenensis）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１７）；
配列番号１８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１８）；
配列番号１９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１９）；および
配列番号２０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド２０）。
【請求項８】
配列番号２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド２１）を更に含んでなる、請求項７に記載のプライマーセット。
【請求項９】
配列番号１〜２１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
配列番号１〜２１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１１】
配列番号１〜２１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１２】
請求項１または２に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、デッケラ・アノマラの検出方法。
【請求項１３】
請求項３または４に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、デッケラ・ブルクセレンシスの検出方法。
【請求項１４】
請求項５または６に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、デッケラ・クステルシアナの検出方法。
【請求項１５】
請求項７または８に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、ブレタノミセス・ナーデネンシスの検出方法。
【請求項１６】
請求項１または２のプライマーセット、請求項３または４のプライマーセット、請求項５または６のプライマーセット、および請求項７または８のプライマーセット、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるプライマーセットを含んでなる、デッケラ属酵母および／またはブレタノミセス属酵母の検出キット。
【請求項１７】
請求項１または２のプライマーセット、請求項３または４のプライマーセット、請求項５または６のプライマーセット、および請求項７または８のプライマーセット、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるプライマーセットを含んでなる、酒類および／または清涼飲料の品質管理に用いられるキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、酒類や清涼飲料の品質低下に関連するデッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母の検出用プライマーセットに関し、更には、このプライマーセットを使用するデッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母の検出および定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母が飲料中に汚染して増殖することによって起こる変敗が経済的な損害を与える品質事故は世界的に発生している。変敗の原因菌としてのデッケラ属（無性世代はブレタノミセス属と呼ばれる）酵母は、ビール、ワイン、清涼飲料水において混濁および不快な臭気を引き起こすことで知られている（Kurtzman, C.P. & Fell, J.W. The Yeasts, A Taxonomic Study, 4th edition, 1998, Elsevier Science B.V., The Netherlands）。【０００３】
ビール産業では、デッケラ属酵母は、一般的なビールで増殖すると酢酸、あるいは酢酸エステル類を生産し、ビール品質に損害を与える（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg、European Brewery Convention：ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg）。ワイン産業では、デッケラ属酵母は４−エチルフェノールなどのフェノール臭物質、アミン類、酢酸等を生成する。これら酵母が汚染したワインは、官能検査では「獣様」「家畜小屋様」等の用語で表現され、商品価値が低下する（Mitrakulら：Food Microbiology, 1999, vol. 16, 3-14、Phisterら：Applied and Environmental Microbiology, 2003, vol. 69, 7430-7434、Silvaら：Am. J. Enol. Vitic., 2004, vol. 55, 65-72）。【０００４】
清涼飲料産業では、デッケラ属酵母は、グルコースやその他の炭素源から大量の酢酸等の酸を生成し、酢酸エステル等に起因する特徴的な臭気の原因となる（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil II, 1999, Verlag Hans Carl, Nuernberg）。 
このようにデッケラ属酵母は、製品、あるいは工程中で増殖すると産業に与える影響が大きいために、これら酵母を迅速に検出・同定する技術は、品質管理上重要である。【０００５】
伝統的な野生酵母の検出法は培養法であるが、デッケラ属酵母の場合はシクロヘキシミドを添加した選択培地を使って、通常１〜２週間程度はかかる。さらに生化学的な同定方法は３〜４週間かかり、しかも結果はしばしば曖昧である（Phisterら：Applied and Environmental Microbiology, 2003, vol. 69, 7430-7434、Silvaら：Am. J. Enol. Vitic., 2004, vol. 55, 65-72）。【０００６】
これらのデッケラ属酵母を分子生物学的手法で検出する方法は過去にいくつか報告されている。Ibeasら（Applied and Evironmental Microbiology, 1996, vol. 62, 998-1003）は、２ステップＰＣＲで汚染されたシェリー酒中の１０細胞程度のデッケラ属酵母を検出できたと報告した。Hyldig-Nielsenら（ＷＯ００／７７２５９号公報）、およびStenderら（Applied and Environmental Microbiology, 2001, vol. 67, 938-941）はデッケラ・ブルクセレンシスの２６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対するペプチド核酸プローブを開発し、蛍光in situハイブリダイゼーション法によって、ワインからデッケラ・ブルクセレンシスを検出、識別する方法を開発した。Delahercheら（Journal of Applied Microbiology, 2004, vol. 97, 910-915）、およびPhisterら（Applied and Environmental Microbiology, 2003, vol. 69, 7430-7434）は、リアルタイムＰＣＲ技術によりワインからデッケラ・ブルクセレンシスを検出する技術について報告している。【０００７】
また、デッケラ属酵母の菌種レベルの識別については以下のような報告がある。すなわち、Mitrakulら（Food Microbiology, 1999, vol. 16, 3-14）はＲＡＰＤ  ＰＣＲによりデッケラ属酵母の種、あるいは株レベルでの区別が可能であったと報告した。また、 Cocolinら（FEMS Microbiol. Lett., 2000, vol. 189, 81-87）は、ワイン中のデッケラ属酵母から直接ＰＣＲで遺伝子を増幅して、denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）により区別する方法を報告した。【０００８】
Egliら（Am. J. Enol. Vitic., 2001, vol. 52, 241-247）は、デッケラ属酵母のリボゾームＲＮＡ遺伝子に挟まれた２つのinternal transcribed spacer （ＩＴＳ）領域およびその間に存在する５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子について、ＰＣＲで増幅した後、制限酵素処理により得られた断片のパターンの多様性により区別した。【０００９】
Morrisseyら（Journal of Applied Microbiology 2004, vol. 97, 647-655）は、伝統的アイルランドサイダー醸造におけるデッケラ属酵母のフローラの研究のため、ＩＴＳ領域と５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増副産物の制限酵素切断断片解析により、解析した。【００１０】
しかしＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、および蛍光in situハイブリダイゼーション法は高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高価な機器を必要とする。また２ステップＰＣＲ法、ＲＡＰＤ  ＰＣＲ法、増幅産物の制限酵素処理、およびＤＧＧＥ法は、時間がかかるとともに、煩雑な操作が必要であり、日々の微生物検査業務の中で行うことには問題があった。【００１１】
ＬＡＭＰ（loop mediated isothermal amplification）法と言う核酸増幅技術は、等温で反応が進む、６領域を認識する４種類のプライマーを使用するために特異性が高い、増幅効率が高く、短時間に増幅が可能である、増幅産物量が多く、簡易検出に適している等の特徴を有している（ＷＯ００／２８０８２号公報およびT. Notomiら： Nucleic Acids research, 2000, 28(12), e63）。土屋らは、ブレタノミセス属、デッケラ属酵母のｒＲＮＡ遺伝子のＤ２領域から、これらの属の酵母を検出するＬＡＭＰ法用のプライマーを開発した（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）。【００１２】
しかし、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母のＩＴＳ領域を標的にしたＬＡＭＰ法プライマーセットは、これまでに知られていない。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を正確に識別でき、かつ定量できるＬＡＭＰ法プライマーセットの作製に成功した。
【００１４】
本発明は、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を、菌種レベルで、正確、迅速、かつ簡便に識別できるとともに、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を正確に定量できるＬＡＭＰ法プライマーセットを提供することを目的とする。
【００１５】
以下、デッケラ・アノマラ（Dekkera anomala）の検出に関する発明を第一の態様とし、デッケラ・ブルクセレンシス（Dekkera bruxellensis）の検出に関する発明を第二の態様とし、デッケラ・クステルシアナ（Dekkera custersiana）の検出に関する発明を第三の態様とし、ブレタノミセス・ナーデネンシス（Brettanomyces naardenensis）の検出に関する発明を第四の態様とする。
【００１６】
第一の態様
本発明の第一の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、デッケラ・アノマラ（Dekkera anomala）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット（以下「第一の態様のプライマーセット」ということがある。）が提供される：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１）；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド２）；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド３）；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド４）。
【００１７】
本発明の第一の態様によれば、また、ポリヌクレオチド１、２、３、および４からなるプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなるデッケラ・アノマラの検出方法が提供される。
【００１８】
第二の態様
本発明の第二の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、デッケラ・ブルクセレンシス（Dekkera bruxellensis）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット（以下「第二の態様のプライマーセット」ということがある。）が提供される：
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド７）；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド８）；
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド９）；および
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１０）。
【００１９】
本発明の第二の態様によれば、また、ポリヌクレオチド７、８、９、および１０からなるプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなるデッケラ・ブルクセレンシスの検出方法が提供される。
【００２０】
第三の態様
本発明の第三の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、デッケラ・クステルシアナ（Dekkera custersiana）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット（以下「第三の態様のプライマーセット」ということがある。）が提供される：
配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１２）；
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１３）；
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１４）；および
配列番号１５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１５）。
【００２１】
本発明の第三の態様によれば、また、ポリヌクレオチド１２、１３、１４、および１５からなるプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなるデッケラ・クステルシアナの検出方法が提供される。
【００２２】
第四の態様
本発明の第四の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、ブレタノミセス・ナーデネンシス（Brettanomyces naardenensis）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット（以下「第四の態様のプライマーセット」ということがある。）が提供される：
配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１７）；
配列番号１８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１８）；
配列番号１９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１９）；および
配列番号２０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド２０）。
【００２３】
本発明の第四の態様によれば、また、ポリヌクレオチド１７、１８、１９、および２０からなるプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなるブレタノミセス・ナーデネンシスの検出方法が提供される。
【００２４】
本発明によるプライマーセットによれば、極めて高い検出感度で、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を菌種レベルで正確に識別することができるとともに、極めて高い感度でデッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を検出することができる。また、本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーセットによれば、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を、菌種レベルで、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００２５】
本発明によるプライマーセットによれば、更に、試料中のデッケラ属酵母やブレタノミセス属酵母の菌体数を測定することができる。従って、本発明によるプライマーセットによれば、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を、正確に定量することができる。
【００２６】
デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母は、酒類および清涼飲料などの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（例えば、酒類および清涼飲料、特に、ビール、発泡酒、ワイン）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】デッケラ・アノマラ検出用プライマーセット（ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。ＷＹ９７：ビール醸造所分離デッケラ・ブルクセレンシス、ＷＹ１０１：ビール醸造所分離サッカロミセス・セレビシェ、ＢＦＹ７０：ビール醸造用酵母、ＮＢＲＣ１５８８：ブレタノミセス・ナーデネンシス、ＤＳＭ７０００１：デッケラ・ブルクセレンシス、ＤＳＭ７０７３６：デッケラ・クステルシアナ、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加、ＤＳＭ７０７２７：デッケラ・アノマラ。
【図２】検出試料（ＷＹ９７）として段階的に薄くしたＤＮＡ溶液を使った場合のＬＡＭＰ法の検出結果を示した図である。ＤＢ１ＬＦ１をＬＡＭＰ法プライマーセットとして用いた。
【図３】検出試料（ＷＹ９７）として段階的に薄くしたＤＮＡ溶液を使った場合のＰＣＲ法の検出結果を示した図である。配列番号２２および２３に記載のＤＮＡ配列をＰＣＲ法プライマーセットとして用いた。ＭＷ：分子量マーカー、レーン１：１０７ｃｆｕ（ＷＹ９７）、レーン２：１０６ｃｆｕ、レーン３：１０５ｃｆｕ、レーン４：１０４ｃｆｕ、レーン５：１０３ｃｆｕ、レーン６：１０２ｃｆｕ、レーン７：１０１ｃｆｕ。
【図４】デッケラ・アノマラ（ＡＴＣＣ５６８６８）のコロニー形成数とＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１によるＬＡＭＰ法検出時間の近似曲線を示した図である。横軸の時間（threshold time）は、濁度が０．１を超えたときの反応時間を示す。
【図５】デッケラ・クステルシアナ用プライマーセット（ＤＣ２）の検出反応性を示した図である。使用菌株は次の通りである。ＷＹ９７：ビール醸造所分離デッケラ・ブルクセレンシス、ＷＹ１０１：ビール醸造所分離サッカロミセス・セレビシェ、ＢＦＹ７０：ビール醸造用酵母、ＮＢＲＣ１５８８：ブレタノミセス・ナーデネンシス、ＤＳＭ７０７２７：デッケラ・アノマラ、ＤＳＭ７０００１：デッケラ・ブルクセレンシス、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加、ＤＳＭ７０７３６：デッケラ・クステルシアナ。
【図６】デッケラ・クステルシアナ検出用プライマーセットの比較対照プライマーセット（ＤＣ１）の検出反応性を示した図である。使用菌株は次の通りである。ＷＹ９７：ビール醸造所分離デッケラ・ブルクセレンシス、ＷＹ１０１：ビール醸造所分離サッカロミセス・セレビシェ、ＢＦＹ７０：ビール醸造用酵母、ＮＢＲＣ１５８８：ブレタノミセス・ナーデネンシス、ＤＳＭ７０７２７：デッケラ・アノマラ、ＤＳＭ７０００１：デッケラ・ブルクセレンシス、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加、ＤＳＭ７０７３６：デッケラ・クステルシアナ。
【図７】デッケラ・アノマラ検出用プライマーセット（ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１）の検出反応性を示した図である。使用菌株は次の通りである。ＷＹ１２６：ビール醸造所分離野生酵母、ＷＬＹ９・ＷＬＹ１０・ＷＬＹ１３・ＷＬＹ１５・ＷＬＹ１６・ＷＬＹ１７：ワイン分離野生酵母、ＢＦＹ８４・ＴＦＹ３・ＴＦＹ２３：ビール醸造用酵母、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加、ＤＳＭ７０７２７：デッケラ・アノマラ。
【図８】デッケラ・アノマラ用検出用プライマーセットの比較対照プライマーセット（ＤＡ２ＬＦ１ＬＢ１）の検出反応性を示した図である。使用菌株は次の通りである。ＷＹ１２６：ビール醸造所分離野生酵母、ＷＬＹ９・ＷＬＹ１０・ＷＬＹ１３・ＷＬＹ１５・ＷＬＹ１６・ＷＬＹ１７：ワイン分離野生酵母、ＢＦＹ８４・ＴＦＹ３・ＴＦＹ２３：ビール醸造用酵母、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加、ＤＳＭ７０７２７：デッケラ・アノマラ。
【発明の具体的説明】
【００２８】
プライマーおよびプライマーセット
本発明によるプライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００２９】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００３０】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００３１】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００３２】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００３３】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００３４】
本発明によるプライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ＬｏｏｐプライマーをＦ１−Ｆ２間の領域、あるいはＢ１−Ｂ２間の領域にアニールするように設計し、ＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００３５】
具体的には、第一の態様のプライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド５）；および配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド６）のいずれか一方あるいは両方を、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００３６】
第二の態様のプライマーセットは、配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１１）を、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００３７】
第三の態様のプライマーセットは、配列番号１６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド１６）を、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００３８】
第四の態様のプライマーセットは、配列番号２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド２１）を、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００３９】
本発明では、配列番号１〜２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜２１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、ＬＡＭＰ法プライマーとして用いることができる。
【００４０】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００４１】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００４２】
ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基（例えば、３０〜６０塩基）、より好ましくは、少なくとも３９塩基（例えば、３９〜５２塩基）とすることができる。ＦＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、特に好ましくは、少なくとも３９塩基（例えば、３９〜４６塩基）とすることができる。ＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、特に好ましくは、少なくとも４６塩基（例えば、４６〜５２塩基）とすることができる。
【００４３】
また、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１２塩基（例えば、１２〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも１６塩基（例えば、１６〜２５塩基）とすることができる。Ｆ３の相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、特に好ましくは、少なくとも１６塩基（例えば、１６〜２０塩基および１６〜２５塩基）とすることができる。Ｂ３の相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、特に好ましくは、少なくとも１９塩基（例えば、１９〜２２塩基および１９〜２５塩基）とすることができる。ＬＦおよびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、特に好ましくは、少なくとも１９塩基（例えば、１９〜２２塩基および１９〜２５塩基）とすることができる。
【００４４】
相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００４５】
配列番号１〜２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも３４個（３４〜４２個）、より好ましくは、少なくとも３９個（３９〜４２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５２塩基、より好ましくは最大で４６塩基とすることができる）
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも１６個（１６〜２０個）、より好ましくは、１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも４２個（４２〜５１個）、より好ましくは、少なくとも４６個（４６〜５１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５２塩基とすることができる）
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも１６個（１６〜２１個）、より好ましくは、１９個（１９〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＦの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも１６個（１６〜２２個）、より好ましくは、１９個（１９〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）
・配列番号６の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号６の連続する少なくとも１４個（１４〜１９個）、より好ましくは、１６個（１６〜１９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）
・配列番号７の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号７の連続する少なくとも３９個（３９〜４５個）、より好ましくは、少なくとも４１個（４１〜４５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５２塩基、より好ましくは最大で４６塩基とすることができる）
・配列番号８の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号８の連続する少なくとも１２個（１２〜１６個）、より好ましくは、１４個（１４〜１６個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる）
・配列番号９の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号９の連続する少なくとも４２個（４２〜５１個）、より好ましくは、少なくとも４６個（４６〜５１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５２塩基とすることができる）
・配列番号１０の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１０の連続する少なくとも１４個（１４〜１９個）、より好ましくは、１６個（１６〜１９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる）
・配列番号１１の塩基配列で表されるＬＦの相同ポリヌクレオチド：配列番号１１の連続する少なくとも１４個（１４〜１９個）、より好ましくは、１６個（１６〜１９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる）
・配列番号１２の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１２の連続する少なくとも３３個（３３〜３９個）、より好ましくは、少なくとも３６個（３６〜３９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５２塩基、より好ましくは最大で４６塩基、特に好ましくは最大で４２塩基とすることができる）
・配列番号１３の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１３の連続する少なくとも１６個（１６〜２０個）、より好ましくは、１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）
・配列番号１４の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１４の連続する少なくとも３９個（３９〜４６個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４６個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５２塩基とすることができる）
・配列番号１５の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１５の連続する少なくとも１６個（１６〜２１個）、より好ましくは、１９個（１９〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）
・配列番号１６の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号１６の連続する少なくとも１６個（１６〜２２個）、より好ましくは、１９個（１９〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）
・配列番号１７の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１７の連続する少なくとも３９個（３９〜４６個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４６個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５２塩基とすることができる）
・配列番号１８の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１８の連続する少なくとも１６個（１６〜２０個）、より好ましくは、１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）
・配列番号１９の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１９の連続する少なくとも４２個（４２〜５２個）、より好ましくは、少なくとも４７個（４７〜５２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基とすることができる）
・配列番号２０の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２０の連続する少なくとも１６個（１６〜２２個）、より好ましくは、１８個（１８〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）
・配列番号２１の塩基配列で表されるＬＦの相同ポリヌクレオチド：配列番号２１の連続する少なくとも１６個（１６〜２１個）、より好ましくは、１８個（１８〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）
【００４６】
相同ポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００４７】
相同ポリヌクレオチドは、更に、それぞれ、配列番号１〜２１の塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ配列番号１〜２１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００４８】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「１塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００４９】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００５０】
本発明によるプライマーセットを構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００５１】
本発明による検出方法のより具体的な態様としては、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母の検出方法が挙げられる。具体的には、以下の通りである。
【００５２】
本発明による第一の態様によれば、
（ａ）ポリヌクレオチド１、２、３、および４からなるプライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がデッケラ・アノマラの存在を示す、デッケラ・アノマラの検出方法が提供される。
【００５３】
本発明による第二の態様によれば、
（ｃ）ポリヌクレオチド７、８、９、および１０からなるプライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がデッケラ・ブルクセレンシスの存在を示す、デッケラ・ブルクセレンシスの検出方法が提供される。
【００５４】
本発明による第三の態様によれば、
（ｅ）ポリヌクレオチド１２、１３、１４、および１５からなるプライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｆ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がデッケラ・クステルシアナの存在を示す、デッケラ・クステルシアナの検出方法が提供される。
【００５５】
本発明による第四の態様によれば、
（ｇ）ポリヌクレオチド１７、１８、１９、および２０からなるプライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｈ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がブレタノミセス・ナーデネンシスの存在を示す、ブレタノミセス・ナーデネンシスの検出方法が提供される。
【００５６】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００５７】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については後述する。
【００５８】
試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無を決定することができる。ＬＡＭＰ法における濁度の測定は周知であり、市販のエンドポイント濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−１００）やリアルタイム濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−２００）を用いて濁度の測定をすることができる。
【００５９】
後記実施例で示すように、試料溶液がある一定の濁度に達するまでの時間を測定することにより、検定試料中の菌体数を決定することができる。すなわち、本発明による検出方法の別の面によれば、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施するとともに、核酸増幅反応の開始から試料がある一定の濁度に達するまでの時間を測定し、その時間から検体中の菌体数を求める工程を含む、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母の定量方法が提供される。具体的には、以下の通りである。
【００６０】
本発明による第一の態様によれば、
（ａ）ポリヌクレオチド１、２、３、および４からなるプライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｂ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｂ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、デッケラ・アノマラの定量方法が提供される。
【００６１】
本発明による第二の態様によれば、好ましくは、
（ｃ）ポリヌクレオチド７、８、９、および１０からなるプライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｄ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｄ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、デッケラ・ブルクセレンシスの定量方法が提供される。
【００６２】
本発明による第三の態様によれば、好ましくは、
（ｅ）ポリヌクレオチド１２、１３、１４、および１５からなるプライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｆ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；
（ｆ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、デッケラ・クステルシアナの定量方法が提供される。
【００６３】
本発明による第四の態様によれば、好ましくは、
（ｇ）ポリヌクレオチド１７、１８、１９、および２０からなるプライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｈ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｈ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、ブレタノミセス・ナーデネンシスの定量方法が提供される。
【００６４】
本発明による定量方法においては、菌体数と一定の濁度に達するまでの時間との検量線を予め作成しておき、この検量線に基づいて、測定した時間から検体中の菌体数を求めることができる。検量線は、例えば、菌体を段階的に希釈した試料を準備し、それぞれについてＬＡＭＰ法による核酸増幅法を実施し、菌体のコロニー形成数の対数に対して、核酸増幅反応の開始から濁度が０．１になるまでの時間をプロットすることにより作成することができる。
【００６５】
本発明による検出方法および定量方法においては、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３からなるプライマーセットに、ループプライマー（ＬＦおよび／またはＬＢ）を追加して、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施してもよい。具体的には、本発明による第一の態様の検出方法および定量方法においては、ポリヌクレオチド５およびポリヌクレオチド６のいずれか一方あるいは両方を、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。本発明による第二の態様の検出方法および定量方法においては、ポリヌクレオチド１１を、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。本発明による第三の態様の検出方法および定量方法においては、ポリヌクレオチド１６を、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。本発明による第四の態様の検出方法および定量方法においては、ポリヌクレオチド２１を、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。
【００６６】
本発明によるプライマーセットは、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、第一の態様のプライマーセット；第二の態様のプライマーセット、第三の態様のプライマーセット；および第四の態様のプライマーセット；並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるプライマーセット含んでなる、デッケラ属酵母および／またはブレタノミセス属酵母の検出キットが提供される。
【００６７】
本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００６８】
本発明によるプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施すると、酒類や清涼飲料の品質低下の原因となるデッケラ属酵母やブレタノミセス属酵母を菌種レベルで正確に識別することができるとともに、高い感度で検出することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、酒類（例えば、ビール、発泡酒、ワイン、果実酒）および／または清涼飲料（例えば、ラムネ、炭酸水のような非アルコール性発泡飲料）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００６９】
デッケラ・アノマラ、デッケラ・ブルクセレンシス、およびデッケラ・クステルシアナは、ビールおよび発泡酒の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、第一の態様のプライマーセット、第二の態様のプライマーセット、および第三の態様のプライマーセット、並びにこれらの組み合わせ、更にはこれらのいずれかを使用する検出および定量方法や、これらのいずれかを含んでなるキットは、好ましくは、ビールおよび発泡酒の品質管理に用いることができる。
【００７０】
デッケラ・ブルクセレンシスは、ワインの製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、第二の態様のプライマーセット、更にはこれを使用する検出および定量方法やこれを含んでなるキットは、好ましくは、ワインの品質管理に用いることができる。
【００７１】
ブレタノミセス・ナーデネンシスは、清涼飲料（特に、ソーダ水やレモネード）の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、第四の態様のプライマーセット、更にはこれを使用する検出および定量方法やこれを含んでなるキットは、好ましくは、清涼飲料（特に、ソーダ水やレモネード）の品質管理に用いることができる。
【００７２】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【００７３】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【００７４】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【００７５】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【００７６】
本発明によるプライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニ−リングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【００７７】
本発明によるプライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のＩＴＳ領域の中のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【００７８】
核酸増幅が観察されるならば、標的遺伝子が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的遺伝子が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００７９】
核酸試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；サイダー、ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００８０】
これらをＬＡＭＰ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする酵母株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする酵母菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白  核酸  酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００８１】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたデッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００８２】
まず、試料中に存在すると考えられるデッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法を実施し、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物は、プライマーセットの標的である菌株の存在を示す。
【００８３】
「デッケラ属」は「ブレタノミセス属」の有性世代の名称であるが、同じ酵母が有性世代と無性世代で違う名前を持つことは分類学上あり得ることであり、両名称の存在は矛盾しない。すなわち、本発明の第一の態様、第二の態様、および第三の態様のプライマーセットは、対応するブレタノミセス属の菌種の検出にも用いることができ、本発明の第四の態様のプライマーセットは、対応するデッケラ属の菌種の検出にも用いることができることは、言うまでもない。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８５】
実施例１：デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母の検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。【００８６】
（ｂ）ＬＡＭＰ用プライマー
以下のデッケラ属酵母４菌種用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。
［デッケラ・アノマラ検出用プライマーセット（ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１）］
FIP: ACCGCGTATTCTCATAACCACTCCGGGCATGCCTGTTTGAGC（配列番号１）
F3: AGTTCTTGAACGCACATTGC（配列番号２）
BIP: ACTGGGAGGAGTAATAATTACAAGGTTTCGGGGACTCAGTAGGAGTTGCTA （配列番号３）
B3: TCCTCCTACCTGATTTGAGGT（配列番号４）
LF: AGAGAAGTGAGAAGGAAATGAC（配列番号５）
LB: GCCGATTTATTGCGTCTTC（配列番号６）
［デッケラ・ブルクセレンシス検出用プライマーセット（ＤＢ１ＬＦ１）］
FIP: ACCCTCGTGTAATCTCATAACCACTAAGGAGGGCATGCCTGTTTG（配列番号７）
F3: ACATTGCGCCCTCTGG（配列番号８）
BIP: GATTTAAGGTTTCGGCCGTTCATTATTTTCTCCTACCTGATTTGAGGTCAA（配列番号９）
B3: TGCTTAAGTTCAGCGGGTC（配列番号１０）
LF: AGTGAGAAGGAAATGACGC（配列番号１１）
［デッケラ・クステルシアナ検出用プライマーセット（ＤＣ２ＬＢ１）］
FIP: CGGTGCCGTCATCACAACTACGGGCATGCCTGTTTGAGC（配列番号１２）
F3: AGTTCTTGAACGCACATTGC（配列番号１３）
BIP: GCGGTCCGTCGAAGAGAATGACGTAGATAAAAGTCAACGACTGGTC（配列番号１４）
B3: TCCTCCTACCTGATTTGAGGT（配列番号１５）
LB: AGTTAACGGAGTAAGGTTTC（配列番号１６）
［ブレタノミセス・ナーデネンシス検出用プライマーセット（ＢＮ１ＬＦ１）］
FIP: GAGAGGTATCTTCAAAACCACTTGCGATTCTGGGGGGTATTCCTGT（配列番号１７）
F3: AGTTCTTGAACGCACATTGC（配列番号１８）
BIP: GGAATTCTGAATTTAGTTGGCTTCTTGTTTGCTTTCAACGAATGGTCGAAAC（配列番号１９）
B3: AAACGTCAAGGTCATTGACTAC（配列番号２０）
LF: TGAGAAGGAAATGACGCTCAA（配列番号２１）【００８７】
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。【００８８】
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００を使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。【００８９】
（ｅ）各菌種用プライマーの特異性評価
デッケラ属酵母４菌種について、それぞれの菌種特異的なプライマーを作成し、各種菌株を使ってＬＡＭＰ法で評価した。【００９０】
その結果、それぞれのプライマーは対象とする菌種に特異的に反応し、他の酵母菌種とはほとんど反応しない事がわかった。図１では、プライマーが検出対象にしている菌株と反応した場合に、反応開始から６０分以内に増幅が起こり、反応チューブ内の濁度が上昇した経過が示されている。【００９１】
さらに、各種酵母標準株、ビール醸造用酵母、ビール工場分離野生酵母、ワイン分離野生酵母株を使用して各プライマーの特異性を評価した所、各プライマーが検査対象にしている株以外からはほとんど増幅が見られず、菌種に対する特異性が非常に高いことが分かった（表１〜４）。【００９２】
表１：各種デッケラ属酵母株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応６０分以内に増幅なし
【表１】
2007132589.tif 000003
【００９３】
表２：各種酵母標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応６０分以内に増幅なし）
【表２】
2007132589.tif 000004
【００９４】
表３：各種ビール醸造用酵母、ビール醸造所分離野生酵母株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応６０分以内に増幅なし）
【表３】
2007132589.tif 000005
【００９５】
表４：各種ワイン分離野生酵母株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応６０分以内に増幅なし）
【表４】
2007132589.tif 000006
【００９６】
以上により、酵母４菌種に対して作成した本発明によるプライマーセットは、デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を菌種レベルで正確に検出できることが示された。【００９７】
実施例２：ＬＡＭＰ法とＰＣＲ法の検出限界の比較
ＬＡＭＰ法と従来のＰＣＲ法の増幅効率を比較するために、寒天平板培地で培養したデッケラ・ブルクセレンシスＷＹ９７の菌体を段階的に希釈して上記した方法でＤＮＡ抽出し、これをＬＡＭＰ法とＰＣＲ法に供した。【００９８】
ＰＣＲ法にはタカラバイオ社製Ｅｘ  Ｔａｑを用いた。ＰＣＲに用いたデッケラ・ブルクセレンシス検出用プライマーの塩基配列は次の通りである。
センスプライマー：GATAAAAATACATTAAATTTATTTAGTT（配列番号２２）
アンチセンスプライマー：GAACGGCCGAAACCTTAAATC（配列番号２３）【００９９】
このプライマーセットのアンチセンスプライマーはＬＡＭＰ用プライマーの設計に用いられた配列と同じ領域のものを使用しており、本明細で使用されている菌種特異的配列は他の遺伝子増幅技術でも利用可能である。これらの試薬をタカラバイオ社製Ｅｘ  Ｔａｑの説明書に従って混合し、サーマルサイクラーにセットして９４℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・１分の温度プログラムを２５回繰り返してＰＣＲ反応を実施した。【０１００】
その結果、ＬＡＭＰ法では１０１ｃｆｕレベル（１．８×１０１ｃｆｕ）の菌体量からも増幅が観察されるのに対し、ＰＣＲ法では１０４ｃｆｕレベル（１．８×１０４ｃｆｕ）よりも低い菌体量ではバンドが観察されなくなった（図２および図３）。このようにＬＡＭＰ法を使ったデッケラ属酵母検出法は、同じＤＮＡを使ってもより薄い菌体量から遺伝子を増幅しているため、従来のＰＣＲ法に比べて検出感度が極めて高いと言える。【０１０１】
ＰＣＲ法でも、サイクル数を増やせば検出感度を増加させる事が出来るが、その場合サーマルサイクラーにかけている時間がさらに長く必要になる。またＰＣＲ法の場合は、サーマルサイクラーによる反応は１時間３０分程度必要であり、さらに電気泳動・ＤＮＡ染色しなければ結果が確認できない。ＬＡＭＰ法を使った検出法では、少ない菌体量でも反応６０分以内には検出できており、増幅効率および作業時間の点でＰＣＲ法に比べて有利であることが分かった。【０１０２】
ＤＢ１ＬＦ１以外のＬＡＭＰプライマーについて、同様の方法で各プライマーの対象とする菌種に対するＬＡＭＰ法による検出限界を検討した。その結果、ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１、ＤＣ２ＬＢ１、およびＢＮ１ＬＦ１についてもＤＢ１ＬＦ１と同様に、およそ１×１０１ｃｆｕの検出感度を持つことが分かった。【０１０３】
滅菌水へ菌体を懸濁した場合の各プライマーの検出限界を示すと以下の通りである。
ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１：９．８×１００ｃｆｕ
ＤＢ１ＬＦ１：１．８×１０１ｃｆｕ
ＤＣ２ＬＢ１：９．３×１００ｃｆｕ  
ＢＮ１ＬＦ１：６．３×１０１ｃｆｕ【０１０４】
また、菌体の各段階の希釈液から抽出したゲノムＤＮＡについてＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施し、反応開始から反応液の濁度が０．１を超えるまでの時間を測定した。ＤＢ１ＬＦ１、ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１、ＤＣ２ＬＢ１、およびＢＮ１ＬＦ１を用いた場合の時間（threshold time）とコロニー形成数の対数をグラフにしたところ、累乗近似により高い相関係数の近似曲線を描くことが出来た（Ｒ２＝０．９７１−０．９９９）。ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１について得られた近似曲線は図４に示される通りである。【０１０５】
以上から、反応液が一定の濁度に達するまでの時間と菌体のコロニー形成数を検量線とすることにより、１×１０１ｃｆｕから１×１０７ｃｆｕの範囲で、サンプル中のデッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母を定量的に測定することが可能であることが示された。【０１０６】
実施例３：ワインおよびビール中の菌体の直接検出について
ワインからデッケラ属酵母を検出できるかどうか検討する為に、デッケラ・ブルクセレンシス（ＡＴＣＣ６４２７６）を麦芽寒天培地上で培養し、その菌体をフィルター滅菌済みの赤ワインに懸濁して、同じ赤ワインで段階的に希釈した。この菌体−赤ワイン希釈液を遠心分離し、上澄みを捨てて沈殿を得た。この沈殿へ前の実施例で述べた方法でアルカリ溶液を添加し、ＤＮＡ抽出したが、この抽出液からはＬＡＭＰ反応で増幅が起こらない、あるいは増幅までにかかる時間が１０分以上遅延する現象が起こった。遠心したチューブに残存した赤ワインがＬＡＭＰ反応を阻害したと考えられた。【０１０７】
同じように調製した菌体−赤ワイン希釈液を遠心分離し、上澄みを捨てた後、１ｍｌの滅菌水を加えて沈殿を洗浄し、その後遠心して再度沈殿を得てＤＮＡ抽出したところ、ＬＡＭＰ反応による菌体の検出が可能となった。このようにワイン等の飲料から直接ＬＡＭＰ反応で菌体の存在を検出する場合には、集菌洗浄が必要であることがわかった。集菌洗浄した場合、ワインに懸濁した菌体の検出限界は、滅菌水に菌体を懸濁したときとほぼ同じレベルになることが分かった。また、ビールにデッケラ・ブルクセレンシスＷＹ９７を懸濁したときも同様の検出限界が得られた。【０１０８】
ワイン、ビール、滅菌水に懸濁したときのデッケラ・ブルクセレンシスの検出限界（ワイン・ビールサンプルの場合は１回集菌洗浄した）を示すと以下の通りである。
滅菌水：１．８×１０１ｃｆｕ
ワイン：１．５×１０１ｃｆｕ
ビール：５．４×１０１ｃｆｕ【０１０９】
ワイン製造では、通常、果汁にワイン酵母であるサッカロミセス属酵母を添加して発酵させるが、デッケラ属酵母は外部から汚染する為に、発酵中のワインにおける菌数はサッカロミセス属酵母に比べると圧倒的に少ない。しかし、少ない菌数でもデッケラ属酵母が存在すると、発酵後半および貯蔵中にデッケラ属酵母が増殖してワイン品質に影響を与える為、早期発見が重要である。そこで、ワインに１×１０７ｃｅｌｌｓのサッカロミセス・セレビシェを懸濁し、そこへ前に述べた方法で作成したデッケラ・ブルクセレンシス（ＡＴＣＣ６４２７６）の菌体希釈液を混合して集菌洗浄後、まとめてＤＮＡ抽出し、ＬＡＭＰ法でデッケラ属酵母が検出可能かどうか検討した。【０１１０】
その結果、サッカロミセス属酵母の存在に関係なく、同じ検出限界でデッケラ属酵母が検出出来ることがわかった。また同様にビールに下面発酵酵母を懸濁して、デッケラ・ブルクセレンシスＷＹ９７の菌体希釈液を混合した場合でも同じ結果が得られた。【０１１１】
ワインおよびビールにサッカロミセス属酵母を添加した場合のデッケラ・ブルクセレンシスの検出限界を示すと以下の通りである。
ワイン＋サッカロミセス・セレビシェ（１×１０７ｃｅｌｌｓ）：１．５×１０１ｃｆｕ
ビール＋下面発酵酵母（１×１０７ｃｅｌｌｓ）：５．４×１０１ｃｆｕ【０１１２】
実施例４：検出用プライマーの比較
（ａ）デッケラ・クステルシアナ検出用プライマーについての比較
以下のデッケラ・クステルシアナ検出用プライマーセット（ＤＣ２）および比較対照プライマーセット（ＤＣ１）を、実施例１（ｂ）と同様に化学合成するとともに、ＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。比較対照プライマーセット（ＤＣ１）は、本発明によるプライマーセット（ＤＣ２）が標的とするＩＴＳ領域（ＩＴＳ２）とは異なるＩＴＳ領域（ＩＴＳ１）を標的としている。なお、ＩＴＳ２は、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（large subunit）の間の領域に対応する。
［デッケラ・クステルシアナ検出用プライマーセット（ＤＣ２）］
FIP: CGGTGCCGTCATCACAACTACGGGCATGCCTGTTTGAGC （配列番号１２）
F3: AGTTCTTGAACGCACATTGC（配列番号１３）
BIP: GCGGTCCGTCGAAGAGAATGACGTAGATAAAAGTCAACGACTGGTC（配列番号１４）
B3: TCCTCCTACCTGATTTGAGGT（配列番号１５）
［比較対照プライマーセット（ＤＣ１）］
F3：AACAAGGTTTCCGTAGGTGA（配列番号２４）
B3：AATTCACATTAGTTATCGCAATTCG（配列番号２５） 
FIP：CATGTGTTATAATGCTTGCACTCGGCTGCGGAAGGATCATTAACGA（配列番号２６） 
BIP：GCATACAAACACAACAAACCAAAATTTATCAACTTCATCGACGCGAGAACCA（配列番号２７）【０１１３】
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図５および図６に示される通りであった。【０１１４】
本発明によるプライマーセット（ＤＣ２）を用いた場合には、短時間で対象菌株を検出することができたが（図５）、比較対照プライマーセット（ＤＣ１）を用いた場合には、対象菌株を検出できるまでに非常に長い時間が必要であった（図６）。比較対照プライマーセット（ＤＣ１）にループプライマーを追加して同様の検出試験を実施したところ、濁度上昇にかかる時間の短縮が見られたが、本発明によるプライマーセット（ＤＣ２）と比較して、依然として１０分程度の差が認められた（データ省略）。【０１１５】
このように本発明によるプライマーセットは、他のＩＴＳ領域を標的とするプライマーセットと比較して、極めて高い検出反応性を有することが示された。【０１１６】
（ｂ）デッケラ・アノマラ検出用プライマーについての比較
以下のデッケラ・アノマラ検出用プライマーセット（ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１）および比較対照プライマーセット（ＤＡ２ＬＦ１ＬＢ１）を常法に従って化学合成し、実施例１（ｂ）と同様にＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。比較対照プライマーセット（ＤＡ２ＬＦ１ＬＢ１）のＦＩＰ、Ｆ３、およびＬＦは、本発明によるプライマーセット（ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１）と共通であるが、ＢＩＰ、Ｂ３、およびＬＢの設計位置は本発明によるプライマーセット（ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１）と若干異なる。
［デッケラ・アノマラ検出用プライマーセット（ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１）］
FIP: ACCGCGTATTCTCATAACCACTCCGGGCATGCCTGTTTGAGC（配列番号１）
F3: AGTTCTTGAACGCACATTGC（配列番号２）
BIP: ACTGGGAGGAGTAATAATTACAAGGTTTCGGGGACTCAGTAGGAGTTGCTA（配列番号３）
B3: TCCTCCTACCTGATTTGAGGT（配列番号４）
LF: AGAGAAGTGAGAAGGAAATGAC（配列番号５）
LB: GCCGATTTATTGCGTCTTC（配列番号６）
［比較対照プライマーセット（ＤＡ２ＬＦ１ＬＢ１）］
FIP：ACCGCGTATTCTCATAACCACTCC-GGGCATGCCTGTTTGAGC（配列番号１）
F3：AGTTCTTGAACGCACATTGC（配列番号２）
BIP：CCGGTGGGGAGTATACTGGGAGTAGGAGTTGCTAGAAGACG（配列番号２８）
B3：AAAATTGGGGGGGGACTC（配列番号２９）
LF: AGAGAAGTGAGAAGGAAATGAC（配列番号５）
LB：ATTACAAGGTTTCGGCCGATTT（配列番号３０）【０１１７】
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図７および図８に示される通りであった。【０１１８】
本発明によるプライマーセット（ＤＡ１ＬＦ１ＬＢ１）を用いた場合には、反応開始後６０分を経過しても非特異的反応は見られなかったが（図７）、比較対照プライマーセット（ＤＡ２ＬＦ１ＬＢ１）を用いた場合には、反応開始から６０分を経過すると検出菌株以外の菌株との反応が見られた（図８）。【０１１９】
このように本発明によるプライマーセットは、標的位置がわずかに変更されたプライマーセットと比較して、極めて高い特異性を有しており、対象菌株を確実に検出できることが示された。
【図１】
2007132589.tif 000007
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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