【手続補正書】
【提出日】平成30年11月20日(2018.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで肝細胞に分化するように栄養膜幹細胞を誘導する方法であって、
栄養膜幹細胞を線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と接触させて、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の形成を誘導すること、および
ＤＥ細胞を培地と接触させて、肝細胞への分化を誘導すること、
を含み、該培地は、ＦＧＦ、ステロイド、およびサイトカインを含む、上記方法。
【請求項２】
前記肝細胞が、肝臓前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記栄養膜幹細胞が、ヒト栄養膜幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記栄養膜幹細胞を、ＦＧＦＲ１に結合するＦＧＦと接触させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記栄養膜幹細胞を、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択されるＦＧＦと接触させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ステロイドが、グルココルチコイドステロイドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ステロイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロンからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ステロイドが、デキサメタゾンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サイトカインが、インターロイキン６グループのサイトカインである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サイトカインが、インターロイキン−６、オンコスタチンＭ、インターロイキン−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経向性因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、およびカルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインが、オンコスタチンＭである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記オンコスタチンＭが、ヒトオンコスタチンＭである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒトオンコスタチンＭが、組換えヒトオンコスタチンＭである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培地が、
ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択される前記ＦＧＦ；
デキサメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロンからなる群から選択される前記ステロイド；および
インターロイキン−６、オンコスタチンＭ、インターロイキン−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経向性因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、およびカルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）からなる群から選択される前記サイトカイン
を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が以下のものを含む、請求項１４に記載の方法：ＦＧＦ２；デキサメタゾン；およびオンコスタチンＭ。
【請求項１６】
前記培地が、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ４である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培地が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）およびヒト細胞質マーカーｓｔｅｍ  １２１（ｓｔｅｍ  １２１）を発現する、単離されたヒト肝細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の単離されたヒト肝細胞であって、該肝細胞は、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、表面抗原分類４（ＣＤ４）、フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）、マスト／幹細胞増殖因子受容体Ｃ−ｋｉｔ（Ｃ−ｋｉｔ）、ベータトロフィン、アポリポタンパク質Ｆ（ＡＰＯＦ）、アルコールデヒドロゲナーゼ−１（ＡＤＨ１）、カルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、ＧＡＴＡ転写因子４（ＧＡＴＡ４）、シトクロムＰ４５０ファミリー１のサブファミリーＡのポリペプチド１（ＣＹＰ１Ａ１）、シトクロムＰ４５０  ２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６）、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）、多剤耐性タンパク質−２（ＭＲＰ２）、コネクシン３２（ＣＸ３２）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＳＲＹ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、ヘキソサミニダーゼＡアルファポリペプチド（ＨＥＸＡ）、造血系で発現されるホメオボックス（ＨＨＥＸ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、アルブミン（ＡＬＢ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、シトクロムＰ４５０  ７Ａ１（ＣＹＰ７Ａ１）、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）、セルピンペプチダーゼ阻害剤クレードＡ（アルファ−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）のメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、ＡＴＰ結合カセットのサブファミリーＣ（ＡＢＣＣ２）、ＣＣＡＡＴ−エンハンサー結合タンパク質ベータ（Ｃ／ＥＢＰβ）、肝細胞核因子１−アルファ（ＨＮＦ１α）、肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４α）、アルファ−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、サイトケラチン８（ＣＫ８）、ミトコンドリアのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ２（ＰＣＫ２）、グリコーゲンシンターゼ２（ＧＹＳ２）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｃ（クラスＩ）ガンマポリペプチド（ＡＤＨ１Ｃ）、シトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、プロスペロホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、およびサイトケラチン１９（ＣＫ１９）からなる群より選択される１つまたはそれより多くのバイオマーカーをさらに発現する、前記単離されたヒト肝細胞。
【請求項２１】
状態の処置または予防で使用するための治療的化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項１９または２０に記載の単離されたヒト肝細胞を、該治療的化合物と接触させること；および
ｂ）該単離されたヒト肝細胞中のバイオマーカーの発現レベルを検出すること
を含む、上記方法。
【請求項２２】
請求項１９または２０に記載の単離されたヒト肝細胞を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１９または２０に記載の単離されたヒト肝細胞の、対象における状態を処置するための医薬の製造のための使用。
【請求項２４】
治療用タンパク質を生産するための、肝再生のための、またはバイオプリンティングのための、請求項１９または２０に記載の単離されたヒト肝細胞を含む組成物の使用。
【請求項２５】
組織足場の生成のための、請求項１９または２０に記載の単離されたヒト肝細胞の使用。
【請求項２６】
遺伝子治療用の医薬の製造のための、請求項１９または２０に記載の単離されたヒト肝細胞を含む組成物の使用。
【請求項２７】
請求項１９または２０に記載の単離されたヒト肝細胞から生成した人工組織または人工臓器。