(57)【要約】【課題】個体差を生じやすい生体の酵素に依存することのない薬剤の放出が可能であり、有効な治療効果が期待でき、且つ、水溶性を有するコンブレタスタチン類の新規誘導体が求められている。【解決手段】ポリエチレングリコール構造部分とポリアスパラギン酸やポリグルタミン酸等の２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とがエステル結合した構造を有することを特徴とするコンブレタスタチン類の高分子結合体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基とコンブレタスタチン類の水酸基とがエステル結合しているコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項２】
カルボン酸基を有するポリマー部分がコハク酸モノアミド構造部分を有するポリマーである請求項１記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項３】
コハク酸モノアミド構造部分を有するポリマーがポリアスパラギン酸である請求項２記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項４】
コンブレタスタチン類の高分子結合体が、一般式（Ｉ）
【化６】
2008010463.tif 000009
［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４はコンブレタスタチン類の水酸基の残基を示し、Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）からなる群から選ばれる基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｔは５〜１１５００の整数を示し、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ若しくはｊは各々独立に０〜２００の整数を示し、ただしｄ＋ｅは１〜２００の整数を示し、且つ、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊは３〜２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸の各構成単位の結合順は任意である］
で表される化合物である請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項５】
Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基であり、ｔが８〜２３００の整数であり、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ若しくはｊが各々独立に０〜１００の整数であり、ただしｄ＋ｅが１〜１００の整数であり、且つ、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊが６〜１００の整数である請求項４記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項６】
Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基であり、ｔが１００〜３００の整数であり、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ若しくはｊが各々独立に０〜９０の整数であり、ただしｄ＋ｅが１〜９０の整数であり、且つ、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊが１５〜９０の整数である請求項４又は５に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項７】
カルボン酸基を有するポリマー部分がポリグルタミン酸である請求項１記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項８】
コンブレタスタチン類の高分子結合体が、一般式（ＩＩ）
【化７】
2008010463.tif 000010
［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４はコンブレタスタチン類の水酸基の残基を示し、Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）からなる群から選ばれる基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｔは５〜１１５００の整数を示し、ｋは１〜２００の整数を示し、ｍ、ｎは各々独立に０〜２００の整数を示し、ただし、ｋ＋ｍ＋ｎは３〜２００の整数を示し、ポリグルタミン酸の各構成単位の結合順は任意である］
で表される化合物である請求項１又は７に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項９】
Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基であり、ｔが８〜２３００の整数であり、ｋが１〜９０の整数であり、ｍ，ｎが各々独立に０〜９０の整数であり、ただしｋ＋ｍ＋ｎが６〜９０の整数である請求項８記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項１０】
Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基であり、ｔが１００〜３００の整数であり、ｋが３〜６０の整数であり、ｍ，ｎが各々独立に０〜６０の整数であり、ただしｋ＋ｍ＋ｎが６〜６０の整数である請求項８又は９に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項１１】
コンブレタスタチン類がコンブレタスタチンＡ−４である請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項１２】
ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とを有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合させて得られるコンブレタスタチン類の高分子結合体。
【請求項１３】
ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とを有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合させることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体を有効成分とする抗癌剤。
【請求項１５】
請求項１〜１２に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体を有効成分とする血管標的化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とがエステル結合しているコンブレタスタチン類の高分子結合体、その製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンブレタスタチンは、１９８０年代にアフリカの樹木であるＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｃａｆｆｒｕｍ等から単離され、チューブリン重合阻害活性が確認された。特に、血管内皮細胞に形態学的な変化を引き起こして血流抑制活性を有する。従って、固形癌や慢性関節リウマチ等の新血管形成に関連した疾患の治療剤として期待されている。なお、コンブレタスタチン類の製造法は非特許文献１に開示されている。しかし、コンブレタスタチン類は一般に水に極めて難溶性であるため水溶性を付与する研究や、患部で効率的に薬効を発揮させるための研究が行われてきた。【０００３】
これまでに、コンブレタスタチンのリン酸エステル型プロドラッグの製造法が特許文献１に開示されている。又、非特許文献２にはアミノ基を有するコンブレタスタチン誘導体、およびその誘導体が患部で選択的に薬効を発現するためのアミノ酸結合プロドラッグが記述されている。【０００４】
一方、難水溶性抗がん剤への水溶性の付加や患部への集積を目的に、高分子を担体とする研究も行われている。例えば、特許文献２や特許文献３にはポリエチレングリコールを結合したプロドラッグとしての難水溶性抗がん剤の高分子誘導体について記載されている。しかしながら、コンブレタスタチン類の結合体については記載されていない。又、これらの難水溶性抗がん剤の高分子誘導体は、構造上ポリエチレングリコール一分子に対して１〜２個の分子しか結合できない。このため、有効量の薬剤を投与するためには大量のポリマーの投与が必要となる。【０００５】
特許文献４にはミセルを形成し水溶性を示すポリエチレングリコールとポリアスパラギン酸のブロック共重合体に薬剤を結合した分子が記載されている。特許文献５にはポリエチレングリコール類とポリ酸性アミノ酸とのブロック共重合体の側鎖カルボン酸基に疎水性物質を結合した高分子薬物運搬体となる高分子担体が記載されている。特許文献６には、ポリエチレングリコール類とポリグルタミン酸とのブロック共重合体の側鎖カルボン酸基と、カンプトテシン類のフェノール性水酸基を結合させたカンプトテシン類の高分子誘導体が記載されている。しかしながら、特許文献４、特許文献５、特許文献６にはコンブレタスタチン類の結合体については記載されていない。
【特許文献１】国際公開第０２／０６２７９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９３／２４４７６号パンフレット
【特許文献３】特表平１０−５１３１８７号公報
【特許文献４】特許第２６９４９２３号公報
【特許文献５】特許第３２６８９１３号公報
【特許文献６】国際公開第０４／３９８６９号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６６，８１３５−８１３８（２００１）
【非特許文献２】Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，１４，５３９−５４８（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献２に記載のコンブレタスタチンのプロドラッグは、コンブレタスタチンＡ−４と比較して水への溶解度は増加している。しかし、コンブレタスタチンＡ−４の放出は投与される被験体の血液中の内因性アミノペプチダーゼに依存するため、放出される薬剤の効果に個体差を生じることが危惧される。【０００７】
特許文献１のコンブレタスタチンのリン酸エステル型プロドラッグは、コンブレタスタチンＡ−４と比較して水への溶解度は増加している。しかし、生体投与直後にリン酸エステルが加水分解されることが予想され、疾患部までプロドラッグがデリバリーされ、効率よくコンブレタスタチンＡ−４が効果を発揮するか不明である。特許文献２や特許文献３に記載のポリエチレングリコール類部分と薬剤との結合も生体の加水分解酵素によって切断されることを利用して薬剤の運搬と放出を制御している。しかしながら、生体の加水分解酵素は、種差はもとより同一種においても個体差が大きいと考えられている。従って、これらの文献に記載されている薬剤結合体については、薬剤との結合の切断が生体の加水分解酵素に依存するため、放出される薬剤の効果に個体差を生じることが危惧される。【０００８】
又、特許文献５に記載されているアドリアマイシン結合体は、ブロック共重合体とアドリアマイシンがアミド結合で結合されている。しかしながら、アミド結合は化学的に安定な結合様式であるため加水分解による薬剤の放出が遅く、その薬効には疑問がある。【０００９】
コンブレタスタチンＡ−４等のコンブレタスタチン類化合物は有用な抗癌剤であるが難溶性である。従って、水溶性を有し抗癌活性に優れる新規な誘導体が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は前記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とがエステル結合したコンブレタスタチン類の高分子結合体が、加水分解酵素に依存することなくコンブレタスタチン類を放出することを見出し、本発明を完成した。【００１１】
即ち、本発明は以下の１）〜１５）に関する。
１）ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とがエステル結合しているコンブレタスタチン類の高分子結合体。
２）カルボン酸基を有するポリマー部分がコハク酸モノアミド構造部分を有するポリマーである上記１）記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
３）コハク酸モノアミド構造部分を有するポリマーがポリアスパラギン酸である上記２）記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。【００１２】
４）コンブレタスタチン類の高分子結合体が、一般式（Ｉ）【００１３】
【化１】
2008010463.tif 000002
［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４はコンブレタスタチン類の水酸基の残基を示し、Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）からなる群から選ばれる基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｔは５〜１１５００の整数を示し、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ若しくはｊは各々独立に０〜２００の整数を示し、ただしｄ＋ｅは１〜２００の整数を示し、且つ、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊは３〜２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸の各構成単位の結合順は任意である］
で表される化合物である上記１）〜３）のいずれか一項に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。【００１４】
５）Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基であり、ｔが１００〜３００の整数であり、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ若しくはｊが各々独立に０〜１００の整数であり、ただしｄ＋ｅが１〜１００の整数であり、ただしｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊが６〜１００の整数である上記４）のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
６）Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基であり、ｔが１００〜３００の整数であり、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ若しくはｊが各々独立に０〜９０の整数であり、ただしｄ＋ｅが１〜９０の整数であり、ただしｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊが１５〜９０の整数である上記４）又は５）に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。【００１５】
７）カルボン酸基を有するポリマー部分がポリグルタミン酸である上記１）記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。【００１６】
８）コンブレタスタチン類の高分子結合体が、一般式（ＩＩ）【００１７】
【化２】
2008010463.tif 000003
［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４はコンブレタスタチン類の水酸基の残基を示し、Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）からなる群から選ばれる基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｔは５〜１１５００の整数を示し、ｋは１〜２００の整数を示し、ｍ、ｎは各々独立に０〜２００の整数を示し、ただしｋ＋ｍ＋ｎは３〜２００の整数を示し、ポリグルタミン酸の各構成単位の結合順は任意である］
で表される化合物である上記１）又は７）に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。【００１８】
９）Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基であり、ｔが１００〜３００の整数であり、ｋが１〜９０の整数であり、ｍ，ｎが各々独立に０〜９０の整数であり、ただしｋ＋ｍ＋ｎが６〜９０の整数である上記８）記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
１０）Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基であり、ｔが１００〜３００の整数であり、ｋが３〜６０の整数であり、ｍ，ｎが各々独立に０〜６０の整数であり、ただしｋ＋ｍ＋ｎが６〜６０の整数である上記８）又は９）に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。【００１９】
１１）コンブレタスタチン類がコンブレタスタチンＡ−４である上記１）〜１０）のいずれか一項に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体。
１２）ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とを、有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合させて得られるコンブレタスタチン類の高分子結合体。
１３）ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とを有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合させることを特徴とする上記１）〜１１）のいずれか一項に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体の製造方法。  
１４）上記１）〜１２）のいずれか一項に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体を有効成分とする抗癌剤。
１５）上記１）〜１２）のいずれか一項に記載のコンブレタスタチン類の高分子結合体を有効成分とする血管標的化剤。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体は、ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とがエステル結合している。このため、本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体は、生体の加水分解酵素に依存することなく薬剤放出が可能であり、個体差に影響されにくい有効な治療効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体は、ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマー部分のカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とがエステル結合している。本発明において２以上のカルボン酸基を有するポリマーとは特に限定されないが、例えば、２以上のコハク酸モノアミド構造部分を有するポリマーやポリグルタミン酸等が挙げられる。【００２２】
本発明においてコハク酸モノアミド構造部分とは、−ＨＮＣＯ−Ｃ−Ｃ−ＣＯ２Ｈ構造を意味する。例えば、コハク酸モノアミド（−ＨＮＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）や、アスパラギン酸の２個のカルボン酸基のうち１個がアミド化された構造（−ＨＮＣＯ−ＣＨ（−ＮＨ−）−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈあるいは−ＨＮＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ（−ＮＨ−）−ＣＯ２Ｈ）等が挙げられる。これらコハク酸モノアミド構造部分は、例えば、ポリアスパラギン酸のようにポリマーの主鎖を構成していてもよい。あるいは、デキストラン等のポリアルコール、ポリリジン等のポリアミン、ポリアスパラギン酸以外のポリカルボン酸（例えば、ポリ乳酸等）からなる主鎖ポリマーの官能基に結合したものでもよい。
コハク酸モノアミド構造部分は環化構造（コハク酸イミド）へ変化するのに伴って水酸基を有する化合物を遊離すると考えられる。【００２３】
本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体のポリマーにおけるポリエチレングリコール構造部分としては両末端又は片末端が修飾されたポリエチレングリコールが挙げられ、両末端が修飾されている場合、その修飾基は同一でも異なっていてもよい。該修飾基としては置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基が挙げられる。置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基のアルキル基としては後記のアルキル基が挙げられ、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基の置換基としては、例えば、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基等が挙げられる。【００２４】
ポリエチレングリコール構造部分の分子量としては３００〜５０００００程度であり、好ましくは５００〜１０００００程度、更に好ましくは１０００〜５００００程度である。【００２５】
本発明におけるポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体の分子量は５００〜５０００００程度、好ましくは６００〜１０００００程度、更に好ましくは８００〜８００００程度である。
なお、本発明における分子量とはＧＰＣ法で測定した重量平均分子量である。【００２６】
本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体において、ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体に結合するコンブレタスタチン類の結合量は、総カルボン酸基数の１〜１００％、好ましくは１〜９０％、更に好ましくは２〜６０％である。【００２７】
本発明においてコンブレタスタチン類としては、水酸基を有し、且つ、抗腫瘍活性を有しているコンブレタスタチン骨格化合物、即ち、酸素官能基を有するスチルベン構造を有する化合物であれば特に限定されない。該コンブレタスタチン類としては、例えば、下記式で表されるコンブレタスタチンＡ−１（ＩＩＩ）、コンブレタスタチンＡ−４（ＩＶ）、ＡＣ−７７００（Ｖ）等が挙げられる。コンブレタスタチン類の水酸基としては、下記式のようにフェノール性水酸基もアルコール性水酸基も挙げられ、その置換位置も限定されない。【００２８】
【化３】
2008010463.tif 000004
【００２９】
【化４】
2008010463.tif 000005
【００３０】
【化５】
2008010463.tif 000006
【００３１】
本発明において２以上のコハク酸モノアミド構造部分としてはポリアスパラギン酸が好ましい。又、その他の２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分としてはポリグルタミン酸が好ましい。【００３２】
本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体として好ましくは、ポリアスパラギン酸を含む上記一般式（Ｉ）［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４はコンブレタスタチン類の水酸基の残基を示し、Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）からなる群から選ばれる基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｔは５〜１１５００の整数を示し、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ若しくはｊは各々独立に０〜２００の整数を示し、ただしｄ＋ｅは１〜２００の整数を示し、且つ、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊは３〜２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸の各構成単位の結合順は任意である］で表される化合物、あるいは、ポリグルタミン酸を含む上記一般式（ＩＩ）［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４はコンブレタスタチン類の水酸基の残基を示し、Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）からなる群から選ばれる基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｔは５〜１１５００の整数を示し、ｋは１〜２００の整数を示し、ｍ、ｎは各々独立に０〜２００の整数を示し、ただしｋ＋ｍ＋ｎは３〜２００の整数を示し、ポリグルタミン酸の各構成単位の結合順は任意である］で表される化合物が挙げられる。【００３３】
上記一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のＲ１における（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基としては、直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６のアルキル基を挙げることができる。なかでも直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基が好ましく、特に直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基が好ましい。直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられ、特にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基が好ましく、中でもメチル基が好ましい。【００３４】
上記一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のＲ２で表される結合基としては、特に限定されないが、例えば、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基が挙げられ、なかでも（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン基が好ましい。（Ｃ２〜Ｃ４）アルキレン基としては例えば、エチレン基、トリメチレン基、ブチレン基等が挙げられ、特にトリメチレン基が好ましい。【００３５】
上記一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のＲ３における（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基としては、特に限定されないが、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ピバロイル基等が挙げられ、アセチル基が好ましい。【００３６】
上記一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のＲ４におけるコンブレタスタチン類の水酸基の残基においてコンブレタスタチン類としては、上記のコンブレタスタチン類を挙げることができる。ポリマー部分のカルボン酸基と脱水縮合剤によりエステル結合をする水酸基を有し、且つ、抗腫瘍活性を有するコンブレタスタチン類であれば特に限定されない。該コンブレタスタチン類として好ましくは、例えば、上記のコンブレタスタチンＡ−４が挙げられる。【００３７】
上記一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のＲ５としては、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）からなる群から選ばれる基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基である。一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のＲ５としては、一分子中同一でも異なっていてもよく、又、コンブレタスタチン類の高分子結合体に使用されるポリマーにおいて、単一でも混合物であってもよい。【００３８】
該（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基としては、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基を挙げることができる。なかでも直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ基が好ましく、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基等を挙げることができる。（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基としては、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、又は直鎖又は分岐鎖の（Ｃ７〜Ｃ１２）アラルキルオキシ基が好ましい。例えば、４−フェニルブトキシ基等を挙げることができる。【００３９】
該（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基又はジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基としては、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基又はジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基が挙げられ、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基又はジ（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基が好ましく、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジブチルアミノ基等が挙げられる。【００４０】
該カルボキシ基が保護されたアミノ酸としては、通常のペプチド合成で用いられるカルボキシ基が保護されたアミノ酸が挙げられる。例えば、フェニルアラニンベンジルエステル等が好ましい。【００４１】
一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のＲ５における−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）［Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基である］とは、特に限定されない。例えば、シクロヘキシルアミノカルボニルシクロヘキシルアミノ基、イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基等が挙げられる。【００４２】
本発明の上記一般式（Ｉ）で表されるコンブレタスタチン類の高分子結合体における２以上のコハク酸モノアミド構造部分であるポリアスパラギン酸には、α−アミノ酸型、β−アミノ酸型、環化したもの等の構成単位があるが、ポリアスパラギン酸のすべてが環化したものは含まない。これらの構成単位の結合順は限定されず、ブロック型でもランダム型でもよい。又、各構成単位はＬ型でもＤ型でもよい。【００４３】
上記一般式（Ｉ）で表されるコンブレタスタチン類の高分子結合体における全アスパラギン酸数はｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊで表され、３〜２００個程度であり、好ましくは６〜１００個程度であり、特に好ましくは１５〜９０個である。全アスパラギン酸数は、例えば、ポリエチレングリコール構造部分とポリアスパラギン酸のブロック共重合体の製造時における反応仕込み量により自由に変えることができる。
全アスパラギン酸数（ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ）に対するコンブレタスタチン類の結合したアスパラギン酸数（ｄ＋ｅ）の割合は１〜１００％、好ましくは３〜９０％、更に好ましくは４〜６０％である。又、アスパラギン酸数（ｄ＋ｅ）として１〜２００個程度、好ましくは１〜１００個程度、特に好ましくは１〜９０個程度である。コンブレタスタチン類の結合割合は、例えば、ブロック共重合体とコンブレタスタチン類の結合反応時における反応仕込み量により変えることができ、後記するように反応液の分析により求めることができる。【００４４】
全アスパラギン酸数（ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ）に対するα−アミノ酸型（ｄ＋ｆ＋ｈ）の割合は１０〜１００％であり、好ましくは２０〜１００％である。この割合は、例えば、ポリアスパラギン酸の保護基の脱保護条件等を選ぶことにより適宜変えることができる。【００４５】
本発明の上記一般式（ＩＩ）で表されるコンブレタスタチン類の高分子結合体におけるポリグルタミン酸は、α−アミノ酸型であり、Ｌ型でもＤ型でもよい。
本発明の上記一般式（ＩＩ）で表されるコンブレタスタチン類の高分子結合体における全グルタミン酸数はｋ＋ｍ＋ｎで表され、３〜２００個程度であり、好ましくは６〜９０個程度であり、特に好ましくは６〜６０個程度である。全グルタミン酸数は、例えば、ポリエチレングリコール構造部分とポリグルタミン酸のブロック共重合体の製造時における反応仕込み量により自由に変えることができる。【００４６】
全グルタミン酸数（ｋ＋ｍ＋ｎ）に対するコンブレタスタチン類の結合したグルタミン酸数（ｋ）の割合は１〜１００％、好ましくは３〜９０％、更に好ましくは４〜６０％である。又、グルタミン酸数（ｋ）として１〜２００個程度、好ましくは１〜９０個程度、特に好ましくは３〜６０個程度である。コンブレタスタチン類の結合割合は、例えば、ブロック共重合体とコンブレタスタチン類の結合反応時における反応仕込量により変えることができ、又、反応液の分析により求めることができる。【００４７】
上記一般式（ＩＩ）で表されるコンブレタスタチン類の高分子結合体におけるグルタミン酸構造の各構成部分は、その結合順は限定されず、ブロック型でもランダム型でもよい。【００４８】
上記一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のｔとしては５〜１１５００程度の整数であるが、好ましくは８〜２３００程度の整数であり、更に好ましくは１００〜３００程度の整数である。【００４９】
本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体は、水中でポリエチレングリコール構造部分を外殻とするミセルを形成してもよい。【００５０】
本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体は、ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸基を有するポリマー部分とのブロック共重合体における該ポリマーのカルボン酸基と、コンブレタスタチン類の水酸基とを有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合させることにより得られ、当該製造方法も本発明に含まれる。即ち、例えば、特許文献５に記載の方法にて調製されるポリエチレングリコール構造部分−ポリアスパラギン酸のブロック共重合体、あるいは、特開平５−９５５号公報に記載された方法にて調製されるポリエチレングリコール構造部分−ポリグルタミン酸ブロック共重合体と、必要に応じて反応させる基以外の官能基を保護したコンブレタスタチン類とを、両者が溶解する有機溶媒中、０〜１８０℃、好ましくは５〜５０℃で脱水縮合剤を用いた縮合反応に付す製造方法である。又、該縮合反応の際に反応補助剤を用いてもよい。該縮合反応に用いる有機溶媒は、特に限定はないが、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の非プロトン性極性溶媒である。脱水縮合剤としてはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリノン（ＥＥＤＱ）等を用いることができる。反応補助剤はＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等を用いることができる。縮合反応後、通常の分離精製等の操作によりコンブレタスタチン類の高分子結合体が得られる。必要に応じて脱保護を行こともある。例えば、コンブレタスタチン類がＡＣ−７７００（Ｖ）の場合には、アミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基等の保護基により保護し、ブロック共重合体と縮合反応に供した後、トリフルオロ酢酸等で脱保護することにより製造可能である。【００５１】
又、Ｒ５が−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）基であり、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基であるコンブレタスタチン類の高分子結合体は、上記のカルボジイミド類を縮合剤として用いる反応によっても得られる。【００５２】
一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）の化合物中のＲ５が（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基又はカルボキシ基が保護されたアミノ酸である化合物の製造方法としては、ポリマーのカルボン酸基を活性化してから結合させたい量の対応するアルコール又は対応するアミンやカルボキシ基が保護されたアミノ酸等を塩基性条件下に縮合反応させる方法、あるいは、対応するアルコール、対応するアミンやカルボキシ基が保護されたアミノ酸等を活性化させてからポリマーに縮合反応させる方法等が挙げられる。ポリマーを精製した後に同様の反応でポリマー中の未反応のカルボン酸基を再活性化させ、ここにコンブレタスタチン類の水酸基を縮合させてもよく、あるいは、異なるアルコール、アミン等を繰り返し反応させて、Ｒ５が種々の置換基で置換されている混成体ポリマーを合成し、次いで、コンブレタスタチン類の水酸基を縮合させてもよい。又、コンブレタスタチン類を縮合させた後に（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基又はカルボキシ基が保護されたアミノ酸等を導入してもよい。【００５３】
ただし、本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体の製造法は上記の方法に限定されるわけではない。【００５４】
本発明には、本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体を有効成分とする抗癌剤も含まれる。また、本発明には、本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体を有効成分とする血管標的化剤、即ち、血流の抑制による新血管形成に関連した疾患の治療剤、例えば、慢性関節リウマチ、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症等の治療剤も含まれる。該高分子結合体は、注射剤、錠剤、散剤等の通常使用されている剤型にて使用され得る。製剤化に当たり通常使用されている薬学的に許容される担体や、例えば、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、保存剤、無痛化剤、色素、香料等が使用できる。中でも、注射剤としての使用が好ましく、通常、例えば、水、生理食塩水、５％ブドウ糖又はマンニトール液、水溶性有機溶媒（例えば、グリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ポリエチレングリコール、クレモフォア等又はそれらの混合液）あるいは水と該水溶性有機溶媒の混合液等が使用される。【００５５】
本発明のコンブレタスタチン類の高分子結合体の投与量は、患者の性別、年齢、生理的状態、病態等により当然変更され得るが、例えば、非経口的に、通常、成人１日当たり、活性成分として０．０１〜５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．１〜２５０ｍｇ／ｍ２を投与する。注射による投与は、静脈内、動脈内、患部（腫瘍部）等に行われる。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。【００５７】
実施例１  化合物１（分子量５０００のメトキシポリエチレングリコール部分と重合数が３０のポリアスパラギン酸部分からなるブロック共重合体と、コンブレタスタチンＡ−４との結合体：一般式（Ｉ）のＲ１＝Ｍｅ（メチル基）、Ｒ２＝トリメチレン基、Ｒ３＝Ａｃ（アセチル基）、Ｒ４＝コンブレタスタチンＡ−４残基、Ｒ５＝イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＝３０、ｔ＝１１３）の合成
特許文献５に記載された方法によって調製したメトキシポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（アスパラギン酸部分：α型とβ型の混合体、重合数３０、２６７０ｍｇ）と非特許文献１に記載の方法で合成したコンブレタスタチンＡ−４（６００ｍｇ）をＤＭＦ（６０ｍｌ）に溶解し、ＤＭＡＰ（１７４ｍｇ）、ＤＩＰＣ（２．９７ｍｌ）を加え、２５℃にて２０時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（１８０ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（７２０ｍｌ）を加え、室温にて３０分攪拌した後沈析物を濾取し、酢酸エチル／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、３０ｍｌ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、１００ｍｌ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル社製ダウエックス５０（Ｈ＋）、１５ｍｌ）に通塔し、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、２０ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出画分に水（６０ｍｌ）を加え、アセトニトリルを減圧下留去し、その後凍結乾燥することによって化合物１（２６７０ｍｇ）を得た。【００５８】
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー：カラム；イナートシルＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス社製）、溶媒系；０．１％リン酸水溶液−アセトニトリル（５０％−５０％（ｖ／ｖ）））による反応液中の未反応コンブレタスタチンＡ−４量の計量から、化合物１中のコンブレタスタチンＡ−４含量は１０．４％（ｗ／ｗ）、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊに対するｄ＋ｅの割合は１０．６％であった。化合物１中、遊離のコンブレタスタチンＡ−４は未検出であった。
又、Ｒ５としてイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基が導入され、その存在比は化合物１を重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められる。化合物１におけるイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基がポリアスパラギン酸に占める割合、即ち、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊに対するｆ＋ｇの割合は１６．２％であった。その他のアスパラギン酸は遊離カルボン酸（ｈ＋ｉ）あるいは環状構造（ｊ）である【００５９】
実施例２  化合物２（分子量１２０００のメトキシポリエチレングリコール部分と重合数が２３のポリグルタミン酸部分からなるブロック共重合体と、コンブレタスタチンＡ−４との結合体）の合成：一般式（ＩＩ）のＲ１＝Ｍｅ（メチル基）、Ｒ２＝トリメチレン基、Ｒ３＝Ａｃ（アセチル基）、Ｒ４＝コンブレタスタチンＡ−４残基、Ｒ５＝イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、ｋ＋ｍ＋ｎ＝２３、ｔ＝２７３）の合成
特開平５−９５５号公報に記載された方法によって調製したメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（５８１ｍｇ）と非特許文献１記載の方法で合成したコンブレタスタチンＡ−４（１００ｍｇ）をＤＭＦ（４．５ｍｌ）に溶解し、ＤＭＡＰ（１６．５ｍｇ）、ＤＩＰＣ（０．２８３ｍｌ）を加え、２０℃にて４０時間撹拌した。反応液にＤＩＰＣ（０．０７０ｍｌ）を加え、２５℃に昇温後１．５時間攪拌を継続した。反応液にエタノール（６０ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（２４０ｍｌ）を加え、室温にて３時間攪拌した後沈析物を濾取し、エタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、５０ｍｌ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、５０ｍｌ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル社製ダウエックス５０（Ｈ＋）、１５ｍｌ）に通塔し、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、５０ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出画分に水（３ｍｌ）を加えた後アセトニトリルを減圧下留去し、その後凍結乾燥することによって、化合物２（５５０ｍｇ）を得た。【００６０】
ＨＰＬＣによる反応液中の未反応コンブレタスタチンＡ−４量の計量から化合物２中のコンブレタスタチンＡ−４含量は１１．２％（ｗ／ｗ）であった。化合物２中、遊離のコンブレタスタチンＡ−４は未検出であった。【００６１】
又、Ｒ５としてイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基が導入され、その存在比は化合物２を重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められ、イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基がポリアスパラギン酸に占める割合、即ち、ｋ＋ｍ＋ｎに対するｍの割合は３２％だった。【００６２】
実施例３  化合物３（分子量１２０００のメトキシポリエチレングリコール部分と重合数が３３のポリアスパラギン酸部分からなるブロック共重合体とコンブレタスタチンＡ−４との結合体：一般式（Ｉ）のＲ１＝Ｍｅ（メチル基）、Ｒ２＝トリメチレン基、Ｒ３＝Ａｃ（アセチル基）、Ｒ４＝コンブレタスタチン残基、Ｒ５＝イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基およびＯ−ベンジル−フェニルアラニル基、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＝３３、ｔ＝２７３）の合成
特許文献５に記載された方法によって調製したメトキシポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（アスパラギン酸部分：α型とβ型の混合体、重合数３３、６０５．４ｍｇ）と国際公開第０２/０６２７９号パンフレット記載の方法で調製したコンブレタスタチンＡ−４（１００ｍｇ）をＤＭＦ（８．５ｍｌ）に溶解し、フェニルアラニンベンジルエステル塩酸塩（８３．４ｍｇ）、トリエチルアミン（０．０４ｍｌ）、ＤＭＡＰ（１６ｍｇ）およびＤＩＰＣ（０．４ｍｌ）を加え、１５℃にて２０時間撹拌し、その後さらに２５℃にて４時間攪拌した。反応液に酢酸エチル（７０ｍｌ）、ヘプタン（７０ｍｌ）を加え、室温にて３０分攪拌した後沈析物を濾取し、酢酸エチル／ヘプタン（１／１（ｖ／ｖ）、２０ｍｌ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、２０ｍｌ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル社製ダウエックス５０（Ｈ＋）、３ｍｌ）に通塔し、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、２０ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出画分に水（３５ｍｌ）を加え、アセトニトリルを減圧下留去し、その後凍結乾燥することによって化合物３（７１０ｍｇ）を得た。【００６３】
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による反応液中の未反応コンブレタスタチンＡ−４量の計量から、化合物３中のコンブレタスタチンＡ−４含量は７．９％（ｗ／ｗ）、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊに対するｄ＋ｅの割合は１４％であった。化合物３中、遊離のコンブレタスタチンＡ−４は未検出であった。【００６４】
Ｒ５の一つとして導入したＯ−ベンジル−フェニルアラニル基は、化合物３をアセトニトリル−水酸化ナトリウム水溶液中４０℃で６時間加水分解し、溶出したベンジルアルコールを定量することから求められ、Ｏ−ベンジル−フェニルアラニル基がポリアスパラギン酸に占める割合、即ち、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊに対するｆ＋ｇの割合は、Ｏ−ベンジル−フェニルアラニル基が結合したものについては２７％だった。又、Ｒ５としてイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基も導入され、その存在比は化合物３を重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められる。イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基がポリアスパラギン酸に占める割合、即ち、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊに対するｆ＋ｇの割合は、イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基が結合したものについては１５％であった。この結果、Ｒ５の総量がポリアスパラギン酸に占める割合、即ち、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊに対するｆ＋ｇの割合は４２％であった。その他のアスパラギン酸は遊離カルボン酸（ｈ＋ｉ）あるいは環状構造（ｊ）であった。【００６５】
試験例１  酵素非存在下での薬剤放出
化合物１、化合物２又は化合物３を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；ｐＨ７．１）にポリマー濃度で１ｍｇ／ｍｌで溶解し、３７℃にてインキュベートした。該高分子結合体より放出されたコンブレタスタチンＡ−４を、ＨＰＬＣにて分離し標準曲線を用いて定量した。定量値と高分子結合体の薬剤含有量から求めた全薬剤量との比を図１に示した。
図１に明らかなように、本発明の高分子結合体（化合物１、化合物２及び化合物３）は加水分解酵素がなくても有意にコンブレタスタチンＡ−４を放出した。特に、コハク酸モノアミド構造部分を持つ化合物１及び化合物３は、コハク酸モノアミド構造部分を持たない化合物２と比較して、より早いコンブレタスタチンＡ−４の放出をした。図１の結果は、酵素非存在下での本発明の高分子結合体の優れた薬剤放出性能を示している。【００６６】
試験例２  抗腫瘍作用
マウス皮下で継代しているマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６を約２ｍｍ角のブロックにし、套管針を用いて雌性ＣＤＦ１マウスの背側部皮下に移植した。腫瘍移植後７日目から本発明の高分子結合体（化合物１）又は対照薬（コンブレタスタチンＡ−４）を、各々コンブレタスタチンＡ−４換算した投与量でマウス尾静脈内に単回投与した。コントロールは薬物を投与しない群である。化合物１は５％ブドウ糖注射液で溶解し用いた。コンブレタスタチンＡ−４はジメチルスルホキシドとクレモホールＥＬ（シグマ社製）に溶解し、使用時に５％ブドウ糖注射液で希釈して用いた。投与後、腫瘍の長径（Ｌｍｍ）及び短径（Ｗｍｍ）を、ノギスを用いて計測し、腫瘍体積を（ＬｘＷ２）／２により計算して投与開始日の腫瘍体積に対する相対腫瘍体積として表１に示した。【００６７】
【表１】
2008010463.tif 000007
【００６８】
表１から本発明の高分子結合体（化合物１）は、コンブレタスタチンＡ−４よりも少ない投与量でコンブレタスタチンＡ−４より優れた抗癌活性を有することが明らかとなった。【００６９】
試験例３  抗腫瘍作用
マウス皮下で継代しているマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６を約１ｍｍ角のブロックにし、套管針を用いて雌性ＣＤＦ１マウス８の背側部皮下に移植した。腫瘍移植後７日目から本発明の高分子結合体（化合物２および化合物３）又は非特許文献１に記載の方法で合成した対照薬（コンブレタスタチンＡ−４リン酸エステル）を、各々コンブレタスタチンＡ−４換算した投与量でマウス尾静脈内に単回投与した。コントロールは薬物を投与しない群である。化合物２、化合物３および対照薬はすべて５％ブドウ糖注射液で溶解し用いた。投与後、腫瘍の長径（Ｌｍｍ）及び短径（Ｗｍｍ）を、ノギスを用いて計測し、腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２により計算して投与開始日の腫瘍体積に対する相対腫瘍体積として表２に示した。【００７０】
【表２】
2008010463.tif 000008
【００７１】
表２から本発明の高分子結合体(化合物２および３)は、コンブレタスタチンＡ−４リン酸エステルよりも少ない投与量で、より優れた抗癌活性を有することが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の実施例１の化合物１及び３（（メトキシポリエチレングリコール誘導体−ポリアスパラギン酸）−コンブレタスタチンＡ−４結合体）と実施例２の化合物２（（メトキシポリエチレングリコール誘導体−ポリグルタミン酸）−コンブレタスタチンＡ−４結合体）のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．１、３７℃）中でのコンブレタスタチンＡ−４の全結合量に対する放出量の割合
【図１】
2008010463.tif 000011
【国際調査報告】
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