(57)【要約】  本発明は、穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を培養原料とする液体培地で糸状菌を培養して得られる糸状菌培養物を製造するにあたり、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御することにより、糸状菌培養物の酵素、特にデンプン分解酵素や植物繊維分解酵素、タンパク分解酵素の生産性を調整する方法を提供することを目的とする。  本発明は、培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を含む液体培地を用いて、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とする糸状菌培養物の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を含む液体培地を用いて、当該培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とする糸状菌培養物の製造方法。
【請求項２】
培養原料として表面の全部又は一部が少なくとも穀皮に覆われた穀類を用い、当該穀類の精白歩合を調整することにより、当該穀類中の栄養分の培養系への放出速度を制御する、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項３】
培養原料として、穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、α化されていないものを用いることにより、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御する、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項４】
液体培地として加熱処理を施したものを用い、当該加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を調整することにより、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御する、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項５】
栄養分が、培養原料中のデンプンに由来する糖および／または培養原料中のタンパク質に由来するアミノ酸である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項６】
酵素が、デンプン分解酵素、植物繊維分解酵素、タンパク質分解酵素から選ばれた少なくとも１種類である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項７】
糸状菌が、麹菌、トリコデルマ属菌および白色腐朽菌から選ばれた少なくとも１種である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で得られた糸状菌培養物。
【請求項９】
請求項８に記載の糸状菌培養物を用いた酵素剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法で得られた酵素剤。
【請求項１１】
培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を含む液体培地を用いて、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とする酵素の生産方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法で得られた酵素。
【請求項１３】
請求項８に記載の糸状菌培養物を用いた発酵飲食品の製造方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の酵素剤を用いた発酵飲食品の製造方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の酵素を用いた発酵飲食品の製造方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法で得られた発酵飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体培地を用いた糸状菌培養物の製造方法、特に、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整する糸状菌培養物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
焼酎など発酵飲食品の製造には、糸状菌の一種である麹菌が用いられている。その培養形態は、穀類表面上に麹菌を生育させる固体培養法によるものであり、固体麹法と呼ばれている。このような固体麹を用いる方法は、伝統的な製造法であるが、固体培養という特殊な培養形態であるため、大規模製造に不向きな方法であるといえる。【０００３】
一方、麹菌を液体培養して得られる麹菌培養物である液体麹は、培養制御が容易であり、効率的な生産に適した培養方法であるといえるが、焼酎醸造などの発酵飲食品の製造に必要な酵素が充分に得られないことがよく知られており（非特許文献１−４参照）、これまで実製造で使用された例は少なかった。【０００４】
麹菌を含む糸状菌の液体培養による酵素生産などにおいては、培養系内のグルコースなどの栄養分濃度を低く制御することで酵素生産性が向上することが知られている。従来では、培養系外から糖などの栄養分を少量ずつ添加する流加培養法などによって糖などの栄養分濃度を抑えることが行われていたが、より簡便な手法の開発が望まれていた（非特許文献５−６参照）。【０００５】
我々は、穀皮や外皮のついた原料を用いた液体培地を用いて麹菌を培養することにより、グルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼといった酵素を充分に含有する麹菌培養物を製造する方法を開発し、既に特許出願を行った（特願2004−350661号明細書、特願2004−352320号明細書、特願2004−352324号明細書、特願2004−378453号明細書、特願2005−290651号明細書、特願2005−290648号明細書参照）。しかし、本製造法の酵素高生産機構や、それに基づく麹菌培養物の酵素生産性の調整法、ならびに麹菌以外の糸状菌における酵素生産性の調整方法についてはいまだ知られていない。【０００６】
一方、特別高い無蒸煮デンプン糖化力を有するコルテイシウム属新菌株を、無蒸煮原料とミネラル等を含む液体培地で培養して得られた酵素液を用いて無蒸煮デンプンを液化する方法（特許文献１参照）、並びに、該酵素液を無蒸煮原料に作用させて清酒を製造する方法（特許文献２参照）が提案されている。しかし、担子菌類であるコルテイシウム属菌は、発酵飲食品の製造に広く利用されている麹菌とは大きく異なっている。しかも、特許文献１、２では、黒麹菌（Aspergillus awamori）やリゾプス属には十分な糖化力がない旨記載されている。さらに、上記酵素液が十分な耐酸性α−アミラーゼ活性を有しているかは不明である。【０００７】
【非特許文献１】Hata Y. et. Al.：J. Ferment. Bioeng.，84，532-537(1997)
【非特許文献２】Hata Y. et. a1.：Gene.，207，127-134(1998)
【非特許文献３】Ishida H. et. al.：J. Ferment. Bioeng.，86，301-307(1998)
【非特許文献４】Ishida H. et. a1:Curr. Genet.，37，373-379(2000)
【非特許文献５】Bhargava S. et al: Biotechnol Bioeng., 82(1), 111-7(2003)
【非特許文献６】Pedersen H. et al: Appl Microbiol Biotechnol., 53(3):272-7(2000)
【特許文献１】特公平5-68237号公報
【特許文献２】特公平6-53059号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を培養原料とする液体培地で、培養原料である穀類中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素、特にデンプン分解酵素や植物繊維分解酵素、タンパク分解酵素の生産性を調整する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、液体培地の原料として穀皮のついた原料を用いる際に、その精白歩合を調整することにより、栄養分のひとつであるグルコースの培地中への遊離速度が制御可能であることを見出した。また、精白歩合の異なる原料を用いて糸状菌を培養した結果、精白歩合によって糸状菌培養物における酵素生産性を制御できることを見出した。
また、本発明者らは、穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、α化されていないデンプン原料を含む液体培地で麹菌を培養することによって、発酵飲食品の製造に必要なグルコアミラーゼおよび耐酸性α−アミラーゼを多く含有する液体麹を製造できることを見出した。これは、穀皮又は外皮に包まれていない原料でも、α化されていなければ分解されにくく、培養系への糖やアミノ酸等の放出が抑制され、結果的に必要な酵素活性が得られるためと予想される。
本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至ったのである。【００１０】
すなわち、請求項１に係る本発明は、培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を含む液体培地を用いて、当該培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とする糸状菌培養物の製造方法である。
請求項２に係る本発明は、培養原料として表面の全部又は一部が少なくとも穀皮に覆われた穀類を用い、当該穀類の精白歩合を調整することにより、当該穀類中の栄養分の培養系への放出速度を制御する、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項３に係る本発明は、培養原料として、穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、α化されていないものを用いることにより、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御する、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項４に係る本発明は、液体培地として加熱処理工程を含む滅菌処理を施したものを用い、当該加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を調整することにより、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御する、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。【００１１】
請求項５に係る本発明は、栄養分が、培養原料中のデンプンに由来する糖および／または培養原料中のタンパク質に由来するアミノ酸である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項６に係る本発明は、酵素が、デンプン分解酵素、植物繊維分解酵素、タンパク質分解酵素から選ばれた少なくとも１種類である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項７に係る本発明は、糸状菌が、麹菌、トリコデルマ属菌および白色腐朽菌から選ばれた少なくとも１種である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項８に係る本発明は、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で得られた糸状菌培養物である。【００１２】
請求項９に係る本発明は、請求項８に記載の糸状菌培養物を用いた酵素剤の製造方法である。
請求項１０に係る本発明は、請求項９に記載の方法で得られた酵素剤である。
請求項１１に係る本発明は、培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を含む液体培地を用いて、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とする酵素の生産方法である。
請求項１２に係る本発明は、請求項１１に記載の方法で得られた酵素である。【００１３】
請求項１３に係る本発明は、請求項８に記載の糸状菌培養物を用いた発酵飲食品の製造方法である。
請求項１４に係る本発明は、請求項１０に記載の酵素剤を用いた発酵飲食品の製造方法である。
請求項１５に係る本発明は、請求項１２に記載の酵素を用いた発酵飲食品の製造方法である。
請求項１６に係る本発明は、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法で得られた発酵飲食品である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御することにより、培養系内の糖やアミノ酸などの栄養分濃度が低く維持され、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することができる。【００１５】
請求項２に係る本発明によれば、精白歩合を調整することにより、培養系における培地中へのグルコースの遊離速度を制御することができた。精白歩合の異なる原料を用いて麹菌液体培養物を製造した結果、精白歩合によって、デンプン分解酵素や植物繊維分解酵素の酵素生産性を制御できることを見出した。また、麹菌以外の糸状菌により生産される他の酵素についても、同様の方法により、その生産性を制御できることを見出した。【００１６】
請求項３に係る本発明によれば、穀皮や外皮が付着していない原料を用いて、焼酎等の発酵飲食品の製造に必要なグルコアミラーゼと耐酸性α−アミラーゼをバランスよく含む糸状菌培養物を製造することができる。
したがって、例えば麦焼酎などの製造について言えば、液体麹製造工程と発酵工程で同一の原料を使用することが可能になり、製造コストを抑えることができる。また、麦の外皮や糠が酒質に良くない影響を与える場合もある。さらに、原料を加熱しないで用いるため、エネルギーの節約にもつながる。
しかも、種々の原料や糸状菌株を用いた糸状菌培養物を組み合わせて製造した糸状菌培養物を使用することで、発酵飲食品のバラエティー化を図ることが容易となる。【００１７】
本発明の方法により、グルコース以外にも、さまざまな糖やアミノ酸など、穀類中に含まれる多くの栄養分の遊離速度も同様に制御されていると予想されるため、培養系内の糖濃度やアミノ酸濃度によりカタボライト抑制を受けるような酵素生産は広く調整されると予想される。
また、デンプン分解酵素遺伝子などのプロモーター領域を使用した異種タンパク質生産にも適用の可能性が高い。【００１８】
また、本発明によれば、流加培養よりも簡便な回分培養においても、培養系内に既に添加されている原料からの栄養分の遊離速度を調整することで、培地中の糖などの栄養分濃度を低く抑えることが可能となるので、流加培養と同様の培養効果が達成できる。したがって、本発明の培養法は、これまで報告のない新たな培養モードであると考えられる。【００１９】
さらに、液体培養は固体培養に比べ厳密な培養コントロールが可能であるため、本発明によれば、品質が安定した糸状菌培養物を安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各精白歩合の大麦基質溶液と麹菌培養上清液とを反応させたときの、反応液中のグルコース濃度の経時変化を示す図である。
【図２】各精白歩合の大麦基質溶液と麹菌培養上清液とを反応させたときの、初発1時間におけるグルコース遊離速度を示す図である。
【図３】各精白歩合の大麦を培養原料として用いた白麹菌培養物における酵素活性を示す図である。（Ａ）はグルコアミラーゼ（白棒）およびα−アミラーゼ（黒棒）の酵素活性を、（Ｂ）は耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を示す。
【図４】各精白歩合の大麦を培養原料として用いた白麹菌培養物における酵素活性を示す図である。（Ａ）はセルラーゼ活性を、（Ｂ）はβ-グルコシダーゼの酵素活性を示す。
【図５】各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黒麹菌培養物におけるグルコアミラーゼ活性（GA）を示す図である。
【図６】各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黒麹菌培養物におけるα−アミラーゼ活性（AA）を示す図である。
【図７】各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黒麹菌培養物における耐酸性α−アミラーゼ活性（ASAA）を示す図である。
【図８】各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黄麹菌培養物におけるグルコアミラーゼ活性（GA）を示す図である。
【図９】各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黄麹菌培養物におけるα−アミラーゼ活性（AA）を示す図である。
【図１０】各精白歩合の大麦を培養原料として用いたトリコデルマ・ビリデ培養物におけるセルラーゼ活性（CEL）を示す図である。
【図１１】各精白歩合の大麦を培養原料として用いたトリコデルマ・リーセイ培養物におけるセルラーゼ活性（CEL）を示す図である。
【図１２】各精白歩合の大麦を培養原料として用いたトリコデルマ・リーセイ培養物におけるキシラナーゼ活性（XYL）を示す図である。
【図１３】各精白歩合の大麦を培養原料として用いたトリコデルマ・リーセイ培養物におけるβ−グルコシダーゼ活性（BGL）を示す図である。
【図１４】各精白歩合の大麦を培養原料として用いたアスペルギルス・アキュレータス培養物におけるセルラーゼ活性（CEL）を示す図である。
【図１５】各精白歩合の大麦を培養原料として用いたアスペルギルス・アキュレータス培養物におけるβ−グルコシダーゼ活性（BGL）を示す図である。
【図１６】各精白歩合の大麦を培養原料として用いた白色腐朽菌培養物におけるセルラーゼ活性（CEL）を示す図である。
【図１７】各精白歩合の大麦を培養原料として用いた白色腐朽菌培養物におけるキシラナーゼ活性（XYL）を示す図である。
【図１８】滅菌時の塩濃度が異なる大麦基質溶液と麹菌培養上清液とを反応させたときの、反応液中のグルコース濃度を示す図である。
【図１９】滅菌時の塩濃度が異なる液体培地を用いた白麹菌培養物におけるグルコアミラーゼ活性（GA）を示す図である。
【図２０】滅菌時の塩濃度が異なる液体培地を用いた白麹菌培養物における耐酸性α−アミラーゼ活性（ASAA）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明について具体的に説明する。
請求項１に係る本発明は、糸状菌培養物の製造方法に関し、培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を含む液体培地を用いて、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とするものである。【００２２】
本発明においては、培養原料に含まれる栄養分の培養系への放出速度を制御することにより、培養系内の糖やアミノ酸などの栄養分濃度が低く維持され、糸状菌培養物中の酵素活性が増強される。
培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御する手段としては、穀類の精白歩合の調整による方法、外皮の付着した豆類、芋類、アマランサス又はキヌアを培養原料に用いる方法、穀皮又は外皮が除去されているがα化されていない培養原料を用いる方法、液体培地を加熱処理する際の無機塩濃度の調整による方法、穀類表面上に食用可能な膜などを人工的に形成し、穀類デンプン質や穀類タンパク質を保護する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、培養原料の培養液中での物理的な崩壊を抑えることで栄養分の放出速度を制御することも可能であり、例えば、攪拌せん断力の弱い培養装置を用いることで、栄養分の放出速度を抑制することができる。【００２３】
ここで、糸状菌が生産する酵素としては、培養系内のグルコースなどの糖や、アミノ酸などのタンパク分解物の濃度により、その生産性がカタボライト抑制を受ける酵素群を挙げることができる。具体的には、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ、α−アミラーゼ等のデンプン分解酵素や、セルラーゼ、キシラナーゼ、β−グルコシダーゼ等の植物繊維分解酵素、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、グルタミナーゼなどのタンパク分解酵素が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。【００２４】
本発明において培養原料としては、大麦、米、小麦、そば、ヒエ、アワ、キビ、コウリャン、トウモロコシ等の穀類、大豆、小豆等の豆類、サツマイモ等の芋類、アマランサス、キヌア等の雑穀類などを用いることができる。
ここで、アマランサスとは、ヒユ科ヒユ属植物の総称で、穀類のなかでは蛋白質含量が高く、アミノ酸の一つであるリジンの含量は大豆に匹敵する。また、精白米に比べてもカルシウム、鉄分、繊維質を多く含む高栄養価穀物であり、原産国は、中南米諸国、インド、ヒマラヤ、ネパールの特定地域である。
また、キヌアは、アガサ科の一年草であり、主にペルー南部やボリビア西部のアンデス山脈などの高地で栽培されており、ミネラル、ビタミン、蛋白質、食物繊維を豊富に含んでいる。
なお、これらの培養原料は、単独あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。また、これらの原料の形状は特に限定されない。【００２５】
上記培養原料は、水と混合して液体培地を調製する。
この培養原料の配合割合は、糸状菌培養物中に蓄積させようとする目的の酵素が選択的に生成、蓄積される程度のものに調製される。
例えば、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼをバランスよく高生産させるためには、大麦を原料とした場合には、水に対して玄麦を１〜２０％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。また、玄麦として無精白の大麦を用いた場合には、さらに好ましくは８〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製され、玄麦として９５％精白した大麦を原料とした場合には、さらに好ましくは１〜４％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。
玄麦の使用量が２０％（ｗ／ｖｏｌ）より多くなると、培養液の粘性が高くなり、糸状菌を好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が進み難くなるので好ましくない。【００２６】
次に、米を培養原料とした場合には、水に対して米を１〜２０％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは５〜１３％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは８〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。【００２７】
豆類を培養原料とした場合には、水に対して豆類を１〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは大豆であれば８〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）、小豆であれば１〜２％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。また、芋類を培養原料とした場合には、水に対して芋類を１〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。【００２８】
また、例えば、アマランサスを培養原料とした場合は、水に対して１．５〜１５％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは２〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは２〜８％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。一方、キヌアの場合は、水に対して１．５〜７％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは２〜６％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは２〜４％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。【００２９】
このように、目的とする酵素や、使用する原料の精白度、使用する糸状菌株、原料の種類等によって、最適な配合使用量は異なるので、任意に選択すればよい。【００３０】
液体培地には、前述の原料の他に栄養源として有機物、無機塩等を添加するのが好ましい。
たとえば、糸状菌としてアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）等の白麹菌、および、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等の黒麹菌を用いる場合は、硝酸塩およびリン酸塩を併用することが好ましく、さらに好ましくは、これらと共に硫酸塩を併用する。ここで、硝酸塩としては硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどを用いることができ、特に硝酸カリウムが好ましい。リン酸塩としてはリン酸２水素カリウム、リン酸アンモニウムなどを用いることができ、特にリン酸２水素カリウムが好ましい。硫酸塩としては硫酸マグネシウム７水和物、硫酸鉄７水和物、硫酸アンモニウムなどを用いることができ、特に硫酸マグネシウム７水和物、硫酸鉄７水和物が好ましい。これらの無機塩は、複数種を組み合わせて用いることもできる。【００３１】
上記の白麹菌や黒麹菌を用いる場合の液体培地における上記の無機塩の濃度は、麹菌培養物中にグルコアミラーゼ及び耐酸性α−アミラーゼが選択的に生成、蓄積される程度のものに調整される。具体的には、硝酸塩の場合は０．１〜２．０％、好ましくは０．２〜１．５％、リン酸塩の場合は０．０５〜１．０％、好ましくは０．１〜０．５％、硫酸塩の場合は０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．１％（いずれもw/vol）とする。【００３２】
また、糸状菌としてアスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）等の黄麹菌を用いる場合は、液体培地において硝酸塩、リン酸塩および硫酸塩を併用することが好ましい。ここで、硝酸塩としては硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどを用いることができ、特に硝酸ナトリウムが好ましい。リン酸塩としてはリン酸２水素カリウム、リン酸アンモニウムなどを用いることができ、特にリン酸２水素カリウムが好ましい。硫酸塩としては硫酸マグネシウム７水和物、硫酸鉄７水和物、硫酸アンモニウムなどを用いることができ、特に硫酸マグネシウム７水和物、硫酸鉄７水和物が好ましい。これらの無機塩は、複数種を組み合わせて用いることもできる。【００３３】
上記の黄麹菌を用いる場合の液体培地における上記の無機塩の濃度は、麹菌培養物中にグルコアミラーゼ及び耐酸性α−アミラーゼが選択的に生成、蓄積される程度のものに調整される。具体的には、硝酸塩の場合は０．１〜２．０％、好ましくは０．２〜１．５％、リン酸塩の場合は０．０５〜１．０％、好ましくは０．１〜０．５％、硫酸塩の場合は０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．１％（いずれもw/vol）とする。【００３４】
本発明における液体培地には、前述の無機塩以外の有機物や無機塩等も、栄養源として適宜添加することができる。これらの添加物は糸状菌の培養に一般に使用されているものであれば特に限定はないが、有機物としては米糠、小麦麩、コーンスティープリカー、大豆粕、脱脂大豆等を、無機塩としてはアンモニウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物を挙げることができ、２種類以上の有機物及び／又は無機塩を同時に使用してもよい。これらの添加量は糸状菌の増殖を促進する程度であれば特に限定はないが、有機物としては０．１〜５％（w/vol）程度、無機塩としては０．１〜１％（w/vol）程度添加するのが好ましい。
上限値を超えてこれらの栄養源を添加した場合は、糸状菌の増殖を阻害するため好ましくない。また、添加量が下限値未満である場合は、酵素が十分に生産されないため、やはり好ましくない。
なお、これらの栄養源の他にも、抗生物質、防腐剤等の添加物を必要に応じて液体培地に用いることができる。【００３５】
請求項４に記載したように、本発明において、液体培地として加熱処理を施したものを用いる場合は、当該加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を適宜調整することによっても、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御することができる。
すなわち、加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を上げることによって、培養原料中の栄養分の培養系への放出を抑制することができるのである。これは、培養原料を無機塩存在下で加熱することにより、当該原料の物理的な崩壊が抑えられるためと考えられる。【００３６】
ここで、無機塩としては特に制限はなく、上述のように糸状菌用の液体培地に通常用いられるものを用いることができるが、硝酸塩やリン酸塩、硫酸塩がより好ましい。
また、加熱処理時における液体培地中の無機塩濃度としては、既述した液体培地中の好適な濃度の１〜１０倍程度とすることができる。
なお、加熱処理時における液体培地中の無機塩濃度が、糸状菌の培養に好適な濃度範囲を超えている場合は、加熱処理後に希釈して無機塩濃度を適宜調整した後、培養に供することができる。【００３７】
上記の加熱処理条件としては、８０〜１３０℃、好ましくは１００〜１２１℃で、５〜１２０分間、好ましくは１０〜３０分間とすることができる。特に、オートクレーブなどによる一般的な液体培地の加熱滅菌処理条件である１１０〜１２１℃、５〜２０分間とすると、培地の滅菌処理も同時に行うことができるので好ましい。【００３８】
次に、糸状菌を液体培地に接種する。本発明で用いる糸状菌としては、培養系内の糖やアミノ酸などの栄養分の濃度によりカタボライト抑制を受ける酵素を生産する糸状菌を広く用いることができ、アスペルギルス属菌やトリコデルマ属菌、白色腐朽菌イルペックス・ラクテウス（Irpex lacteus）などを例示することができる。アスペルギルス属菌の具体例としては、たとえばアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）等に代表される白麹菌、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）等に代表される黄麹菌、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等に代表される黒麹菌などの麹菌、および、アスペルギルス・アキュレータス（Aspergillus aculeatus）などを挙げることができる。トリコデルマ属菌の具体例としては、セルラーゼ生産菌であるトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）やトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）などを挙げることができる。【００３９】
これらの糸状菌は一種類の菌株による培養、又は同種若しくは異種の二種類以上の菌株による混合培養のどちらでも用いることができる。これらは胞子又は前培養により得られる菌糸のどちらの形態のものを用いても問題はないが、菌糸を用いる方が対数増殖期に要する時間が短くなるので好ましい。糸状菌の液体培地への接種量には特に制限はないが、液体培地１ｍｌ当り、胞子であれば１×１０４〜１×１０６個程度、菌糸であれば前培養液を０．１〜１０％程度接種することが好ましい。【００４０】
糸状菌の培養温度は、生育に影響を及ぼさない限りであれば特に限定はないが、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３０〜４０℃で行なうのがよい。培養温度が低いと糸状菌の増殖が遅くなるため雑菌による汚染が起きやすくなる。培養時間は２４〜１２０時間で培養するのが好ましい。培養装置は液体培養を行なうことができるものであればよいが、糸状菌は好気培養を行なう必要があるので、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行なう必要がある。また、培養中は培地中の原料、酸素、及び糸状菌が装置内に均一に分布するように撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよく、培養装置、培地の粘度等により適宜選択すればよい。【００４１】
請求項２に係る本発明は、上記の糸状菌培養物の製造方法において、培養原料として表面の全部又は一部が少なくとも穀皮に覆われた穀類を用い、当該穀類の精白歩合を調整することにより、穀類中の栄養分の培養系への放出速度を制御するものである。
本発明において、穀類の形状としては、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われていることが必要であって、未精白物、または少なくとも穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精白された精白歩合以上のもの等を用いることができ、玄米、玄麦なども使用できる。例えば、穀類が大麦の場合には、未精白の精白歩合１００％のもの、或いは未精白の精白歩合を１００％とし、この未精白の精白歩合（１００％）から大麦の穀皮歩合（一般的には７〜８％）を差し引いた割合、すなわち、９２〜９３％程度の精白歩合以上のものである。【００４２】
請求項２に係る本発明においては、穀類の精白歩合を調整することによって、栄養分の培養系への放出速度を制御し、糸状菌培養物における酵素活性の増強を図る。したがって、生産しようとする酵素や、原料穀類の種類等に応じて最適の精白歩合のものを選択する。たとえば、グルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼを製造する場合であって、大麦を原料とするときは、精白歩合を９０〜１００％、好ましくは９８％とすることにより、両酵素をバランスよく高生産することができる。【００４３】
ここで、精白歩合とは穀類を精白して残った穀類の割合を言い、例えば精白歩合９０％とは、穀類の表層部の穀皮等を１０％削り取ることを意味する。また、本発明において玄麦とは、未精白の麦から、穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精白されたものまで、すなわち精白歩合９０％以上のものを含む。また、穀皮とは穀類の粒の表面を覆っている外側部位のことを言う。【００４４】
穀類に含まれるでん粉は、培養前にあらかじめ糊化しておいてもよい。でん粉の糊化方法については特に限定はなく、蒸きょう法、焙炒法等常法に従って行なえばよい。後述する液体培地の殺菌工程において、高温高圧滅菌等によりでん粉の糊化温度以上に加熱する場合は、この処理によりでん粉の糊化も同時に行なわれる。【００４５】
請求項２に係る本発明の液体培地は、水、上記した培養原料、及びその他の培地成分を混合して調製される。液体培地は必要に応じて滅菌処理を行なってもよく、処理方法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、１２１℃で１５分間行なえばよい。【００４６】
請求項３に係る本発明は、上記の糸状菌培養物の製造方法において、培養原料として穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、α化されていないものを用いることにより、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御するものである。【００４７】
請求項３に係る本発明において、上記培養原料は、穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、α化されていないことが必要である。
例えば、培養原料が大麦の場合は、未精白の精白歩合（１００％）から穀皮歩合（一般的には７〜８％）を差し引いた割合、すなわち、９２〜９３％程度の精白歩合以下のものを用いることができ、丸麦（精白歩合６５％）も用いることができる。
上記培養原料については、加熱などデンプンをα化させるような処理は行わないが、必要に応じて脱穀、精白、皮むき、洗浄、細断、細砕、凍結などの処理を施すことができる。【００４８】
請求項３に係る本発明において、液体培地における上記の培養原料の配合割合は、糸状菌培養物中にグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼが選択的に生成、蓄積される程度とする。具体的には、液体培地に対して培養原料を１〜10％（w／vo1）、好ましくは2〜6％（w／vo1）添加すればよいが、使用する糸状菌株、培養原料の種類等によって最適な配合割合は異なるので、これらを考慮して適宜に選択すればよい。
培養原料の使用量が上限値より多くなると、好気性糸状菌を用いる場合、培養液の粘性が高くなり糸状菌を好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が進み難くなるので好ましくない。一方、該原料の使用量が下限値に満たないと、グルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼが高生産されない。【００４９】
請求項３に係る本発明の液体培地は、水、上記した培養原料、及びその他の培地成分を混合して調製される。このとき、必要であれば培養原料以外の培地成分を水と混合して、予め滅菌処理を行った後に、α化されていないデンプン原料をさらに添加することができる。あるいは、培養原料の一部およびその他の培地成分を水と混合して、予め滅菌処理を行った後に、α化されていない残りの培養原料をさらに添加する方法を採ることもできる。
なお、滅菌処理方法は特に限定されない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、１２１℃で１５分間行なえばよい。【００５０】
上記の培養法で糸状菌を培養することにより、目的とする酵素が効率よく生成・蓄積された糸状菌培養物が得られる。尚、本発明において糸状菌培養物とは、培養したそのものの他に、培養物を遠心分離等することにより得られる培養液、それらの濃縮物や精製物、乾燥物等を包含するものとする。【００５１】
上述の通り、上記の培養法によれば、培養系内のグルコースなどの糖や、アミノ酸などのタンパク分解物の濃度により、その生産性がカタボライト抑制を受ける酵素群を高生産することができる。
したがって、請求項１１に記載の酵素の生産方法は、上記した糸状菌培養物の製造方法と同様である。【００５２】
本発明により得られた糸状菌培養物は、発酵飲食品の製造だけでなく、糖、アミノ酸およびこれらの誘導体の製造や、酵素剤、医薬消化剤などに用いることができる。例えば、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、焼酎を製造する場合には、もろみ仕込み段階において、しょうゆを製造する場合には、盛り込みの段階において、味噌を製造する場合には、仕込み段階において、醸造酢を製造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階において、甘酒を製造する場合には、仕込みの段階において、麹菌培養物を固体麹の代わりに用いることができる。なお、これら発酵飲食品の製造に用いる発酵原料（掛け原料）は、α化されていても、されていなくても良い。
また、得られた糸状菌培養物の一部を次の糸状菌培養物製造におけるスターターとして用いることもできる。このように糸状菌培養物を連続的に製造することにより、安定的な生産が可能になると同時に、生産効率の向上も図ることができる。【００５３】
本発明における糸状菌培養物から酵素剤を製造する方法としては、培養物をそのまま、もしくはその濾液や遠心分離上清等を液状酵素剤とすることもできるし、常法により乾燥あるいは担体に固定することにより粉末状・粒状酵素剤とすることもできる。また、このとき必要に応じて適当な賦形剤等を添加してもよい。【００５４】
また、上記の糸状菌培養物を用いて酒類等の発酵飲食品を製造する場合には、全工程を液相で行なうことができる。例えば、焼酎を製造する場合、トウモロコシ、麦、米、いも、さとうきび等を掛け原料に用い、該原料を約８０℃の高温で耐熱性酵素剤を使用して溶かして液化した後、これに上記した麹菌培養物、及び酵母を添加することでアルコール発酵させたもろみを、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製造することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５６】
＜実験例１＞精白歩合の異なる大麦におけるグルコース遊離速度の測定
65%から98%の精白歩合が異なる大麦（オーストラリア産スターリング種）を、麹菌培養物由来の酵素と反応させ、大麦からのグルコース遊離速度を測定した。【００５７】
具体的には、65％精白麦、83％精白麦、92％精白麦、95％精白麦、98％精白麦、98％精白麦粉砕品をそれぞれ2ｇずつはかり取り、水50ｍｌとともに200ｍｌ三角フラスコに入れた。これをオートクレーブで滅菌（121℃、15分間）することで、「大麦基質溶液」を調製した。【００５８】
続いて、大麦（オーストラリア産スターリング）を培養原料として用いて製造した麹菌培養物を、ろ紙ろ過にて固液分離することで「麹菌培養上清液」を得た。
本試験で用いた麹菌培養物の具体的な製造方法は以下に示すとおりとした。【００５９】
１．前培養方法
65％精白麦８ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC4308）を１×１０６個／ｍｌになるように植菌し、３７℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養し、前培養液とした。【００６０】
２．本培養方法
硝酸カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸２水素カリウム０．３％（ｗ／ｖｏｌ）を添加した水に、98％精白麦が２．０％（ｗ／ｖｏｌ）になるように加えた液体培地を調製した。調製した液体培地３０００ｍｌを容量５０００ｍｌのジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製）に張り込み、オートクレーブ滅菌（121℃、15分間）後、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養した白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC4308）３０ｍｌを接種した。その後、温度３７℃、攪拌速度３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍにて４２時間培養を行ない、ろ紙（東洋ろ紙Ｎｏ．２）でろ過することにより「麹菌培養上清液」を得た。【００６１】
３．測定方法
このように調製した大麦基質溶液50mlと麹菌培養上清液50ｍｌをそれぞれ37℃で５分間保温した後、これらを混合することで反応を開始した。反応開始から1hr後、2hr後、3hr後、および4hr後にサンプリングした反応液中のグルコース濃度を、グルコースC-IIテストワコー（和光純薬製）を用いて測定した。【００６２】
４．結果
反応液中のグルコース濃度の経時変化は、図１に示すとおりであり、大麦基質溶液に用いた大麦の精白歩合によって、グルコース遊離量が異なることが確認された。大麦の穀皮歩合は通常10％程度であり、本試験で用いた65％精白麦ならびに83％精白麦は、その表面に穀皮が存在しない。一方、92％精白麦、95％精白麦、98％精白麦は表面に穀皮が残った状態にある。
図１を見ると、表面に穀皮がない65％および83％精白麦と98％精白麦粉砕品を用いた試験区では、いずれも高いグルコース濃度を示していたのに対し、92％、95％および98％精白麦を用いた試験区では、精白歩合が低いほど、グルコース濃度が低いことが分かる。このことから、穀皮の存在によりグルコース遊離量が調整されることが示された。【００６３】
図２は、本試験における反応の初発1時間におけるグルコース遊離速度を計算したものである。この図から、精白歩合が低いほど、グルコース遊離速度が低く制御されることが確認できた。
一方、98％精白麦粉砕品を用いた試験区では、グルコース遊離速度が65％精白麦と同等レベルまで上昇しており、穀皮が大麦デンプン質を物理的に覆っていることが、グルコース遊離速度を調整している主要因であることが示唆された。【００６４】
＜実施例１＞精白歩合の異なる大麦を用いた白麹菌培養物の製造
各種精白麦（オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法で白麹菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。【００６５】
１．前培養方法
65％精白麦８ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC4308）を１×１０６個／ｍｌになるように植菌し、３７℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養し、前培養液とした。【００６６】
２．本培養方法
65％精白麦、83％精白麦、92％精白麦、95％精白麦、98％精白麦のいずれか２ｇと、硝酸カリウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ及び水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この本培養培地へ前培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、４８時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。【００６７】
３．測定方法
培養終了後、デンプン分解酵素であるグルコアミラーゼ活性（GA）とα−アミラーゼ活性（AA）、耐酸性α−アミラーゼ活性（ASAA）について測定した。
グルコアミラーゼ活性（GA）の測定は、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いて行い、α−アミラーゼ活性（AA）の測定は、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて行なった。また、耐酸性α−アミラーゼ活性（ASAA）の測定は、＜Sudo  S.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，76,105-110(1993)、Sudo  S.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，77，483-489(1994)、須藤茂俊ら:  日本醸造協会誌.，89，768-774(1994)＞に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて行なった。より具体的には、培養液１ｍｌに９ｍｌの１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ３）を添加し、３７℃で１時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて測定した。【００６８】
また、セルロース分解酵素であるセルラーゼ活性（CEL）とβ-グルコシダーゼ活性（BGL）の測定も同時に行なった。セルラーゼ活性（CEL）は、カルボキシメチルセルロース（CMC）を基質として加水分解により生じた還元糖量を、ジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS）法により定量する方法により行なった。より具体的には、１％CMC基質溶液（シグマ社製low viscosityを１00ｍM酢酸緩衝液（ｐH5）に溶解）１ｍｌに培養液１ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸０．７５％、水酸化ナトリウム１．２％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物２２．５％、乳糖１水和物０．３％を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。１単位のセルラーゼ活性（CEL）は、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。【００６９】
β-グルコシダーゼ活性測定は以下の方法により行なった。１ｍMのｐ−ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（PNPG）を基質とし、50ｍM酢酸緩衝液（ｐH５）中、３７℃で正確に１０分間酵素反応を行い、反応停止後、410nmの吸光度により生じたｐ−ニトロフェノールの量を定量し、酵素活性を算出した。なお、反応停止は、反応液の２倍量の200ｍM炭酸ナトリウム溶液を添加することにより行なった。活性１単位は、１分間に1μmolのグルコースを遊離する活性とした。
測定結果を図３ならびに図４に示す。【００７０】
４．結果
図３に示すように、精白歩合が低くなるにしたがってデンプン分解酵素の生産性が高くなった。また、精白歩合の低い98％精白麦であっても、粉砕すると酵素生産性が著しく低くなった。さらに、図４に示すように、セルロース分解酵素の生産性も精白歩合が低くなるに従って高くなる傾向が確認された。このように、白麹菌培養物の酵素生産性は実験例１にて示したグルコース遊離速度と逆相関する傾向が確認され、大麦精白歩合を変えることで白麹菌培養物の酵素生産性を制御できることが示された。【００７１】
＜実施例２＞精白歩合の異なる大麦を用いた黒麹菌培養物の製造
各種精白麦（オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法で黒麹菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。【００７２】
１．前培養方法
65％精白麦８ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に黒麹菌（Aspergillus awamori NBRC4388）を１×１０６個／ｍｌになるように植菌し、３７℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養し、前培養液とした。【００７３】
２．本培養方法
65％精白麦、83％精白麦、92％精白麦、95％精白麦、98％精白麦のいずれか２ｇと、硝酸カリウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ及び水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この本培養培地へ前培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、４８時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。【００７４】
３．測定方法
培養終了後、デンプン分解酵素であるグルコアミラーゼ活性（GA）とα−アミラーゼ活性（AA）、耐酸性α−アミラーゼ活性（ASAA）について測定した。
グルコアミラーゼ活性（GA）の測定は、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いて行い、α−アミラーゼ活性（AA）の測定は、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて行なった。また、耐酸性α−アミラーゼ活性（ASAA）の測定は、＜Sudo  S.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，76,105-110(1993)、Sudo  S.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，77，483-489(1994)、須藤茂俊ら:  日本醸造協会誌.，89，768-774(1994)＞に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて行なった。より具体的には、培養液１ｍｌに９ｍｌの１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ３）を添加し、３７℃で１時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて測定した。
測定結果を図５〜７に示す。【００７５】
４．結果
図５〜７に示すように、精白歩合が低くなるにしたがってデンプン分解酵素の生産性が高くなった。また、精白歩合の低い98％精白麦であっても、粉砕すると酵素生産性が著しく低くなった。このように、黒麹菌培養物の酵素生産性は実験例１にて示したグルコース遊離速度と逆相関する傾向が確認され、大麦精白歩合を変えることで黒麹菌培養物の酵素生産性を制御できることが示された。【００７６】
＜実施例３＞精白歩合の異なる大麦を用いた黄麹菌培養物の製造
各種精白麦（オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法で黄麹菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。【００７７】
１．培養方法
65％精白麦、83％精白麦、92％精白麦、95％精白麦、98％精白麦のいずれか２ｇと、硝酸ナトリウム１．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カリウム０．８％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸２水素カリウム０．４％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸鉄７水和物０．０８％（ｗ／ｖｏｌ）及び水を含む培地１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この培地へ黄麹菌（Aspergillus oryzae RIB40）を１×１０６個／ｍｌになるように植菌し、３０℃、７２時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。【００７８】
２．測定方法
培養終了後、デンプン分解酵素であるグルコアミラーゼ活性（GA）とα−アミラーゼ活性（AA）について測定した。
グルコアミラーゼ活性（GA）の測定は、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いて行い、α−アミラーゼ活性（AA）の測定は、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて行なった。
測定結果を図８，９に示す。【００７９】
３．結果
図８，９に示すように、精白歩合が低くなるにしたがってデンプン分解酵素の生産性が高くなった。特にグルコアミラーゼは98%精白麦で顕著に活性が上昇した。また、精白歩合の低い98％精白麦であっても、粉砕すると酵素生産性が著しく低くなった。このように、黄麹菌培養物の酵素生産性は実験例１にて示したグルコース遊離速度の影響を大きく受けており、大麦精白歩合を変えることで黄麹菌培養物の酵素生産性を制御できることが示された。【００８０】
＜実施例４＞精白歩合の異なる大麦を用いた糸状菌（トリコデルマ・ビリデ）培養物の製造
各種精白麦（オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法でセルロース分解酵素生産能を有する糸状菌（トリコデルマ・ビリデ）培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。【００８１】
１．前培養方法
グルコース２％、酵母エキス０．５％、硝酸カリウム０．１％、リン酸水素１カリウム０．１％、硫酸アンモニウム０．０７％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％、塩化カルシウム０．０２％（いずれもｗ／ｖｏｌ）および水を含む培地100ｍｌを500ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地にトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride NBRC31137）を１×１０６個／ｍｌになるように植菌し、３０℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養し、前培養液とした。【００８２】
２．本培養方法
精白大麦２％、トリプトン０．０８％、硫酸アンモニウム０．２５％、リン酸アンモニウム０．１％、塩化カルシウム０．０３％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％、硝酸カリウム０．１２％（いずれもｗ／ｖｏｌ）および水を含む培地１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、６５％精白麦、８３％精白麦、９２％精白麦、９５％精白麦、９８％精白麦、又は９８％精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液１０ｍｌを植菌し、３０℃、９０時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。【００８３】
３．測定方法
培養終了後、セルロース分解酵素であるセルラーゼ活性（CEL）測定を行なった。セルラーゼ活性（CEL）はカルボキシメチルセルロース（CMC）を基質として加水分解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS）法により定量する方法により行なった。より具体的には、１％CMC基質溶液（シグマ社製low viscosityを１00ｍM酢酸緩衝液（ｐH5）に溶解）１ｍｌに培養液１ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸０．７５％、水酸化ナトリウム１．２％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物２２．５％、乳糖１水和物０．３％を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。１単位のセルラーゼ活性（CEL）は、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。【００８４】
４．結果
測定結果を図１０に示す。麹菌以外の糸状菌であるトリコデルマ・ビリデにおいても、精白歩合によってセルラーゼ生産性に差が生じることが確認された。９８％精白麦を使用すると最も高い酵素生産性が得られたが、同粉砕品では酵素活性が著しく低下することから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果がセルラーゼ高生産に寄与することが示唆された。【００８５】
＜実施例５＞精白歩合の異なる大麦を用いた糸状菌（トリコデルマ・リーセイ）培養物の製造
各種精白麦（オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法でセルロース分解酵素生産能を有する糸状菌（トリコデルマ・リーセイ）培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。【００８６】
１．培養方法
（１）前培養方法
グルコース２％、酵母エキス０．５％、硝酸カリウム０．１％、リン酸水素１カリウム０．１％、硫酸アンモニウム０．０７％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％、塩化カルシウム０．０２％（いずれもｗ／ｖｏｌ）および水を含む培地100ｍｌを500ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地にトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma ressei NBRC31326）を１×１０６個／ｍｌになるように植菌し、３０℃、７２時間、１００ｒｐｍで振盪培養し、前培養液とした。【００８７】
（２）本培養方法
精白大麦２％、トリプトン０．０８％、硫酸アンモニウム０．２５％、リン酸アンモニウム０．１％、塩化カルシウム０．０３％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％、硝酸カリウム０．１２％（いずれもｗ／ｖｏｌ）および水を含む培地１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、６５％精白麦、８３％精白麦、９５％精白麦、９８％精白麦、又は９８％精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液１０ｍｌを植菌し、３０℃、９６時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。【００８８】
２．酵素活性測定方法
培養終了後、培養液から遠心分離により上清を回収し、上清中の植物繊維分解酵素の活性を測定した。【００８９】
（１）セルラーゼ活性測定法
セルラーゼ活性（CEL）はカルボキシメチルセルロース（CMC）を基質として加水分解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS）法により定量する方法により行なった。より具体的には、１％CMC基質溶液（シグマ社製low viscosityを１00ｍM酢酸緩衝液（ｐH5）に溶解）１ｍｌに培養液１ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸０．７５％、水酸化ナトリウム１．２％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物２２．５％、乳糖１水和物０．３％を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。１単位のセルラーゼ活性（CEL）は、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。【００９０】
（２）キシラナーゼ活性測定法
次に、キシラナーゼ活性（XYL）は、oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、540nmの吸光度の増加で定量した。より具体的には1％キシラン基質溶液［シグマ社製Xylan,from oat speltsを200ｍM酢酸緩衝液（ｐH4.5）に溶解］1.9ｍｌに培養液0.1ｍｌを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸０．７５％、水酸化ナトリウム１．２％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物２２．５％、乳糖１水和物０．３％を含む）4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した。1単位のキシラナーゼ活性は、40℃、10分間の反応条件下で、1分間に1μmolのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。【００９１】
（３）β-グルコシダーゼ活性測定法
β-グルコシダーゼ活性（BGL）測定は以下の方法により行なった。１ｍMのｐ−ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（PNPG）を基質とし、50ｍM酢酸緩衝液（ｐH５）中、３７℃で正確に１０分間酵素反応を行い、反応停止後、410nmの吸光度により生じたｐ−ニトロフェノールの量を定量し、酵素活性を算出した。なお、反応停止は、反応液の２倍量の200ｍM炭酸ナトリウム溶液を添加することにより行なった。活性１単位は、１分間に1μmolのグルコースを遊離する活性とした。【００９２】
３．結果
測定結果を図１１〜１３に示す。麹菌以外の糸状菌であるトリコデルマ・リーセイにおいても、精白歩合によって植物繊維分解酵素生産性に差が生じることが確認された。９５％もしくは９８％精白麦を使用すると高い酵素生産性が得られたが、９８％精白麦・粉砕品では酵素活性が著しく低下することから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果が植物繊維分解酵素高生産に寄与することが示唆された。【００９３】
＜実施例６＞精白歩合の異なる大麦を用いた糸状菌（アスペルギルス・アキュレータス）培養物の製造
各種精白麦（オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法でセルロース分解酵素生産能を有する糸状菌（アスペルギルス・アキュレータス）培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。【００９４】
１．培養方法
（１）前培養方法
グルコース２％、酵母エキス０．５％、硝酸カリウム０．１％、リン酸水素１カリウム０．１％、硫酸アンモニウム０．０７％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％、塩化カルシウム０．０２％（いずれもｗ／ｖｏｌ）および水を含む培地100ｍｌを500ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地にアスペルギルス・アキュレータス（Aspergillus aculeatus NBRC3530）を１×１０６個／ｍｌになるように植菌し、３０℃、７２時間、１００ｒｐｍで振盪培養し、前培養液とした。【００９５】
（２）本培養方法
精白大麦２％、トリプトン０．０８％、硫酸アンモニウム０．２５％、リン酸アンモニウム０．１％、塩化カルシウム０．０３％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％、硝酸カリウム０．１２％（いずれもｗ／ｖｏｌ）および水を含む培地１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、６５％精白麦、８３％精白麦、９５％精白麦、９８％精白麦、又は９８％精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液１０ｍｌを植菌し、３０℃、９６時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。【００９６】
２．酵素活性測定方法
培養終了後、培養液から遠心分離により上清を回収し、上清中の植物繊維分解酵素の活性を測定した。【００９７】
（１）セルラーゼ活性測定法
セルラーゼ活性（CEL）はカルボキシメチルセルロース（CMC）を基質として加水分解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS）法により定量する方法により行なった。より具体的には、１％CMC基質溶液（シグマ社製low viscosityを１00ｍM酢酸緩衝液（ｐH5）に溶解）１ｍｌに培養液１ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸０．７５％、水酸化ナトリウム１．２％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物２２．５％、乳糖１水和物０．３％を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。１単位のセルラーゼ活性（CEL）は、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。【００９８】
（２）β-グルコシダーゼ活性測定法
β-グルコシダーゼ活性（BGL）測定は以下の方法により行なった。１ｍMのｐ−ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（PNPG）を基質とし、50ｍM酢酸緩衝液（ｐH５）中、３７℃で正確に１０分間酵素反応を行い、反応停止後、410nmの吸光度により生じたｐ−ニトロフェノールの量を定量し、酵素活性を算出した。なお、反応停止は、反応液の２倍量の200ｍM炭酸ナトリウム溶液を添加することにより行なった。活性１単位は、１分間に1μmolのグルコースを遊離する活性とした。【００９９】
３．結果
測定結果を図１４、１５に示す。麹菌以外の糸状菌であるアスペルギルス・アキュレータスにおいても、精白歩合によって植物繊維分解酵素生産性に差が生じることが確認された。９８％精白麦を使用すると高い酵素生産性が得られた。一方、同粉砕品ではCEL活性、BGL活性が低下したことから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果がこれら酵素の高生産に寄与することが示唆された。【０１００】
＜実施例７＞精白歩合の異なる大麦を用いた白色腐朽菌培養物の製造
各種精白麦（オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法でセルロース分解酵素生産能を有する白色腐朽菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。【０１０１】
１．培養方法
（１）前培養方法
グルコース２％、酵母エキス０．５％、硝酸カリウム０．１％、リン酸水素１カリウム０．１％、硫酸アンモニウム０．０７％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％、塩化カルシウム０．０２％（いずれもｗ／ｖｏｌ）および水を含む培地100ｍｌを500ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地にイルペックス・ラクテウス（Irpex lacteus NBRC5367）の5mm四方の菌糸マット３０個を植菌し、２８℃、９６時間、１２０ｒｐｍで振盪培養し、前培養液とした。【０１０２】
（２）本培養方法
精白大麦２％、ポリペプトン０．１％、硫酸アンモニウム０．１４％、リン酸二水素カリウム０．２％、尿素０．０３％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％、塩化カルシウム０．０３％、ツィーン80  ０．１％（いずれもｗ／ｖｏｌ）および水を含む培地１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、６５％精白麦、８３％精白麦、９８％精白麦、又は９８％精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液１０ｍｌを植菌し、２８℃、９６時間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。【０１０３】
２．酵素活性測定方法
培養終了後、培養液から遠心分離により上清を回収し、上清中の植物繊維分解酵素の活性を測定した。【０１０４】
（１）セルラーゼ活性測定法
セルラーゼ活性（CEL）はカルボキシメチルセルロース（CMC）を基質として加水分解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS）法により定量する方法により行なった。より具体的には、１％CMC基質溶液（シグマ社製low viscosityを100ｍM酢酸緩衝液（ｐH5）に溶解）１ｍｌに培養液１ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸０．７５％、水酸化ナトリウム１．２％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物２２．５％、乳糖１水和物０．３％を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。１単位のセルラーゼ活性（CEL）は、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。【０１０５】
（２）キシラナーゼ活性測定法
次に、キシラナーゼ活性（XYL）は、oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、540nmの吸光度の増加で定量した。より具体的には1％キシラン基質溶液［シグマ社製Xylan,from oat speltsを200ｍM酢酸緩衝液（ｐH4.5）に溶解］1.9ｍｌに培養液0.1ｍｌを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸０．７５％、水酸化ナトリウム１．２％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物２２．５％、乳糖１水和物０．３％を含む）4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した。1単位のキシラナーゼ活性は、40℃、10分間の反応条件下で、1分間に1μmolのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。【０１０６】
３．結果
測定結果を図１６、１７に示す。白色腐朽菌においても、精白歩合によって植物繊維分解酵素生産性に差が生じることが確認された。９８％精白麦を使用すると最も高い酵素生産性が得られたが、同粉砕品では酵素活性が著しく低下することから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果が植物繊維分解酵素高生産に寄与することが示唆された。【０１０７】
＜実施例８＞α化されていない丸麦を用いた白麹菌培養物の製造
（１）前培養方法；  丸麦（オーストラリア産スターリング種）8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC 4308）を1×106個／mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振とう培養することにより前培養液を得た。【０１０８】
（２）本培養方法；  KNO3 0.2g、KH2PO4 0.3g、および水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフェニコール（和光純薬工業株式会社）を５０μｇ/ｍｌとなるように添加し、加熱処理していない丸麦２ｇを添加した。この本培養培地へ前培養液1mlを植菌し、37℃、72時間、100rpmで振盪培養することにより、麹菌培養物を得た。
対照として、α化された培養原料を用いて麹菌培養物を製造した。すなわち、丸麦２ｇ、KNO3 0.2g、KH2PO4 0.3g、水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフェニコールを５０μｇ/ｍｌとなるように添加した。この本培養培地へ前培養液1ml植菌し、37℃、72時間、100rpmで振盪培養することにより、麹菌培養物を得た。【０１０９】
（３）測定方法
各試験区で得られた麹菌培養物について、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼおよびα−アミラーゼの活性を測定した。すなわち、グルコアミラーゼ活性の測定は、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いて行った。耐酸性α−アミラーゼ活性の測定は、＜Sudo  S.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，76,105-110(1993)、Sudo  S.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，77，483-489(1994)、須藤茂俊ら:  日本醸造協会誌.，89，768-774(1994)＞に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて行なった。より具体的には、培養液１ｍｌに９ｍｌの１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ３）を添加し、３７℃で１時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて行った。また、α−アミラーゼ活性の測定は、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて行った。結果を以下の表１に示す。【０１１０】
（４）結果
本発明の生丸麦麹菌培養物において、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ共に良好に、かつ、バランスよく生産された。一方、α−アミラーゼはやや低い生産量であった。
対照において、耐酸性α−アミラーゼやα−アミラーゼが比較的多く生産されたのは、α化された原料を用いているが、KNO3 やKH2PO4の存在により栄養条件が好適な範囲に維持されているためと考えられる。
よって、本発明により、発酵飲食品の製造に使用可能な麹菌培養物が製造できることが明らかになった。【０１１１】
【表１】
2007040008.tif 000002
【０１１２】
＜実施例９＞α化されていない丸麦を用いた白麹菌培養物による麦焼酎の製造
（１）前培養方法；  丸麦（オーストラリア産スターリング種）8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC 4308）を1×106個／mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振盪培養することにより、前培養液を得た。
（２）本培養方法；  丸麦0.5ｇ、KNO3 0.2g、KH2PO4 0.3g、水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。この本培養培地へ前培養液を1mlずつ植菌し、37℃、24時間、100rpmで振とう培養した。その後、加熱処理していない丸麦を1.5ｇ添加し、37℃、48時間、100rpmでさらに振盪培養することにより、麹菌培養物を得た。
（３）酵母；鹿児島酵母を１ｍｌのYPD培地にて一晩100 rpmで振盪培養し、遠心集菌後、滅菌水で2回洗浄した。
（４）仕込み；  仕込み配合を以下の表２に示す。掛麦としては、丸麦を洗浄後、60分間水に浸漬し、30分間水切り後、40分間蒸したものを用いた。酵母は先に述べたものを全量用いた。【０１１３】
【表２】
2007040008.tif 000003
【０１１４】
（５）発酵条件；  ２５℃で20日発酵させた。１次仕込みから3日後に2次仕込みを行った。
（６）蒸留；−６５０mmHgの減圧下で減圧蒸留した。【０１１５】
（７）結果
発酵は順調に進んだ。発酵終了後のもろみのアルコール度数は１７．５％であった。
蒸留後のサンプルの官能評価を酒類専門パネル６名で行ったところ、きれいな酒質であり、評価が高かった。
この結果から、本発明の方法によって問題ない品質の麦焼酎が製造できることが明らかとなった。【０１１６】
＜実施例１０＞α化されていない丸麦を用いた黄麹菌培養物の製造
（１）前培養方法；  丸麦（オーストラリア産スターリング種）8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。この前培養培地に黄麹菌（Aspergillus oryzae NRIB40）を1×106個／mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振盪培養して、前培養液を得た。【０１１７】
（２）本培養方法；  KNO3 0.8g、KH2PO4 1.2g、MgSO4 0.2ｇ、水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフェニコール（和光純薬工業株式会社）を５０μｇ/ｍｌとなるように添加し、丸麦２ｇを添加した。この本培養培地へ前培養液を1ml植菌し、37℃、72時間、100rpmで振盪培養することにより、麹菌培養物を製造した。
ポジティブコントロールとして、請求項２に記載の本発明の方法により、麹菌培養物を製造した。すなわち、95%精麦（オーストラリア産スターリング種）２ｇ、KNO3 0.8g、KH2PO4 1.2g、MgSO4 0.2ｇ、および水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフェニコールを５０μｇ/ｍｌとなるように添加した。この本培養培地へ前培養液を1ml植菌し、37℃、72時間、100rpmで振盪培養することにより、麹菌培養物を製造した。【０１１８】
（３）結果
各試験区で得られた麹菌培養物について、実施例８と同様にしてグルコアミラーゼおよびα−アミラーゼの活性を測定した。結果を以下の表３に示す。
生丸麦麹菌培養物では、グルコアミラーゼが良好に生産され、α−アミラーゼ活性はやや低かった。両酵素とも、ポジティブコントロールに比べて活性は劣っているが、バランスよく生産されており、発酵飲食品の製造に使用可能な麹菌培養物が製造できることが明らかになった。【０１１９】
【表３】
2007040008.tif 000004
【０１２０】
＜実験例２＞滅菌時の無機塩濃度が異なる大麦基質溶液におけるグルコース遊離速度の測定
異なる塩濃度の大麦含有無機塩水溶液をオートクレーブ滅菌して得た大麦基質溶液を、麹菌培養物由来の酵素と反応させ、大麦からのグルコース遊離速度を測定した。【０１２１】
１．大麦基質溶液調製方法
まず、98％精白麦（オーストラリア産スターリング）を2ｇはかり取り、水50ｍｌとともに500ｍｌ三角フラスコに入れた。これをオートクレーブで滅菌（121℃、15分間）することで、大麦基質溶液を調製し、これを「No.1対照区」とした。
また、「No.2塩類使用区」では、「No.1対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム0.1ｇとリン酸２水素カリウム0.15ｇを含む無機塩水溶液50ｍｌを用いてオートクレーブ滅菌した。つまり、オークレーブ滅菌時の塩類濃度は硝酸カリウム0.2%とリン酸２水素カリウム0.3%である。
「No.3滅菌時高濃度塩類使用区」では、「No.1対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム0.1ｇとリン酸２水素カリウム0.15ｇを含む無機塩水溶液10ｍｌを用いてオートクレーブ滅菌後、滅菌水を40ml添加した。つまり、滅菌時の塩類濃度はNo.2の5倍量である硝酸カリウム1.0%とリン酸２水素カリウム1.5%であるが、滅菌・加水後の塩類濃度はNo.2と同じ硝酸カリウム0.2%とリン酸２水素カリウム0.3%になるように調製したものである。【０１２２】
２．麹菌培養上清液調製方法
続いて、大麦（オーストラリア産スターリング）を培養原料として用いて製造した麹菌培養物を、ろ紙ろ過にて固液分離することで「麹菌培養上清液」を得た。
本試験で用いた麹菌培養物の具体的な製造方法は以下に示すとおりとした。【０１２３】
（１）前培養方法
65％精白麦８ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC4308）を１×１０６個／ｍｌになるように植菌し、３７℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養し、前培養液とした。【０１２４】
（２）本培養方法
硝酸カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸２水素カリウム０．３％（ｗ／ｖｏｌ）を添加した水に、98％精白麦が２．０％（ｗ／ｖｏｌ）になるように加えた液体培地を調製した。調製した液体培地３０００ｍｌを容量５０００ｍｌのジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製）に張り込み、オートクレーブ滅菌（121℃、15分間）後、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養した白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC4308）３０ｍｌを接種した。その後、温度３７℃、攪拌速度３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍにて４２時間培養を行ない、ろ紙（東洋ろ紙Ｎｏ．２）でろ過することにより「麹菌培養上清液」を得た。【０１２５】
３．グルコース遊離速度の測定方法
大麦基質溶液50mlと麹菌培養上清液50ｍｌをそれぞれ37℃で５分間保温した後、これらを混合することで反応を開始した。反応開始から3hr後にサンプリングした反応液中のグルコース濃度をグルコースC-IIテストワコー（和光純薬製）を用いて測定し、グルコース遊離速度を算出した。【０１２６】
４．結果
反応液中のグルコース濃度測定結果から算出されたグルコース遊離速度は、図１８に示すとおりであり、大麦基質溶液調製時の塩類濃度によって、グルコース遊離速度が異なることが確認された。上記実験例１にて、大麦の精白歩合によってグルコース遊離速度の調整が可能なことを既に示したが、本試験によって、オートクレーブ滅菌等の加熱処理時における塩類の存在によっても、グルコース遊離速度が低くなることを確認した。これは、大麦の加熱処理時に塩類が存在することで、大麦の物理的な崩壊が抑えられることに起因すると推察された。【０１２７】
＜実施例１１＞滅菌時の無機塩濃度が異なる大麦を用いた白麹菌培養物の製造
各種精白麦（オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法で白麹菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。【０１２８】
１．前培養方法
65％精白麦８ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC4308）を１×１０６個／ｍｌになるように植菌し、３７℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養し、前培養液とした。【０１２９】
２．本培養方法
98％精白麦（オーストラリア産スターリング）を2ｇはかり取り、水100ｍｌとともに500ｍｌ三角フラスコに入れ、これをオートクレーブで滅菌（121℃、15分間）することで、本培養培地を調製し、これを「No.1対照区」とした。
また、「No.2塩類使用区」では、「No.1対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム0.2ｇとリン酸２水素カリウム0.3ｇを含む無機塩水溶液100ｍｌを用いてオートクレーブ滅菌した。
「No.3滅菌時高濃度塩類使用区」では、「No.1対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム0.2ｇとリン酸２水素カリウム0.3ｇを含む無機塩水溶液20ｍｌを用いてオートクレーブ滅菌後、滅菌水を80ml添加した。つまり、滅菌時の塩類濃度はNo.2の5倍量である硝酸カリウム1.0%とリン酸２水素カリウム1.5%であるが、滅菌・加水後の塩類濃度はNo.2と同じの硝酸カリウム0.2%とリン酸２水素カリウム0.3%になるように調製したものである。
上記のように調製した本培養培地を放冷後、前培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、４８時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。【０１３０】
３．測定方法
培養終了後、デンプン分解酵素であるグルコアミラーゼ活性（GA）と耐酸性α−アミラーゼ活性（ASAA）について測定した。
グルコアミラーゼ活性（GA）の測定は、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いて行なった。
また、耐酸性α−アミラーゼ活性（ASAA）の測定は、＜Sudo  S.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，76,105-110(1993)、Sudo  S.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，77，483-489(1994)、須藤茂俊ら:  日本醸造協会誌.，89，768-774(1994)＞に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて行なった。より具体的には、培養液１ｍｌに９ｍｌの１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ３）を添加し、３７℃で１時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて測定した。【０１３１】
４．結果
グルコアミラーゼ活性の測定結果を図１９に、耐酸性α−アミラーゼ活性の測定結果を２０に示す。
図１９，２０に示すように、滅菌時の塩類濃度が高いNo.3では、培養時の塩類濃度が同様のNo.2に比べて酵素生産性が向上した。実験例２においては、加熱処理時における大麦基質溶液の無機塩濃度が高いほど、大麦原料からの糖遊離速度が低くなることが確認された。したがってこれは、麹菌の増殖に対する塩類の効果以外に、糖遊離速度が酵素生産性に影響を与えることを示唆している。塩類の含まれないNo.1では、麹菌の増殖が抑えられるとともに、糖遊離速度が高いために酵素生産が著しく抑制されたと考えられる。
これまで、培地調製時に添加する無機塩類は、培養する際の麹菌増殖にのみ関与すると考えられていた。しかし、本実施例によって、大麦原料からの糖遊離抑制効果によっても、麹菌の液体培養における酵素生産が促進される可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の方法では、培養系内の栄養分濃度を低く制御することにより、培養系外から栄養分を少量ずつ添加する流加培養を行なわなくても、簡便な回分培養にて流加培養と同等な培養モードが可能となる。
また、本発明によれば、発酵飲食品の製造に用いる糸状菌培養物だけでなく、幅広い産業において用いられる糸状菌培養物や、それにより生産される酵素ならびに酵素剤を安定的かつ安価に製造する方法が提供される。
さらに、本発明は、デンプン分解酵素遺伝子などのプロモーター領域を使用した異種タンパク質生産などにも応用が期待される。
したがって、本発明は、食品製造業、発酵工業、医薬品製造業など幅広い産業に利用できる。
【図１】
2007040008.tif 000005
【図２】
2007040008.tif 000006
【図３】
2007040008.tif 000007
【図４】
2007040008.tif 000008
【図５】
2007040008.tif 000009
【図６】
2007040008.tif 000010
【図７】
2007040008.tif 000011
【図８】
2007040008.tif 000012
【図９】
2007040008.tif 000013
【図１０】
2007040008.tif 000014
【図１１】
2007040008.tif 000015
【図１２】
2007040008.tif 000016
【図１３】
2007040008.tif 000017
【図１４】
2007040008.tif 000018
【図１５】
2007040008.tif 000019
【図１６】
2007040008.tif 000020
【図１７】
2007040008.tif 000021
【図１８】
2007040008.tif 000022
【図１９】
2007040008.tif 000023
【図２０】
2007040008.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月11日(2007.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面の全部が穀皮で覆われた穀類及び無機塩を含み、加熱処理を施した液体培地を用いること、及び、当該加熱処理後の液体培地の無機塩濃度を調整することによって、当該穀類中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とする糸状菌培養物の製造方法。
【請求項２】
栄養分が、穀類中のデンプンに由来する糖および／または穀類中のタンパク質に由来するアミノ酸である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項３】
酵素が、デンプン分解酵素、植物繊維分解酵素、タンパク質分解酵素から選ばれた少なくとも１種類である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項４】
糸状菌が、麹菌、トリコデルマ属菌および白色腐朽菌から選ばれた少なくとも１種である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項５】
加熱処理が、８０〜１３０℃で行なわれる、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項６】
無機塩が、硝酸塩、リン酸塩及び硫酸塩から選ばれた少なくとも１種類である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた糸状菌培養物を用いた酵素剤の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた糸状菌培養物を用いた発酵飲食品の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた糸状菌培養物を用いた酵素の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、請求項１に係る本発明は、表面の全部が穀皮で覆われた穀類及び無機塩を含み、加熱処理を施した液体培地を用いること、及び、当該加熱処理後の液体培地の無機塩濃度を調整することによって、当該穀類中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とする糸状菌培養物の製造方法である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
請求項２に係る本発明は、栄養分が、穀類中のデンプンに由来する糖および／または穀類中のタンパク質に由来するアミノ酸である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項３に係る本発明は、酵素が、デンプン分解酵素、植物繊維分解酵素、タンパク質分解酵素から選ばれた少なくとも１種類である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項４に係る本発明は、糸状菌が、麹菌、トリコデルマ属菌および白色腐朽菌から選ばれた少なくとも１種である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項５に係る本発明は、加熱処理が、８０〜１３０℃で行なわれる、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項６に係る本発明は、無機塩が、硝酸塩、リン酸塩及び硫酸塩から選ばれた少なくとも１種類である、請求項１に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
請求項７に係る本発明は、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた糸状菌培養物を用いた酵素剤の製造方法である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
請求項８に係る本発明は、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた糸状菌培養物を用いた発酵飲食品の製造方法である。
請求項９に係る本発明は、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた糸状菌培養物を用いた酵素の製造方法である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明によれば、精白歩合を調整することにより、培養系における培地中へのグルコースの遊離速度を制御することができた。精白歩合の異なる原料を用いて麹菌液体培養物を製造した結果、精白歩合によって、デンプン分解酵素や植物繊維分解酵素の酵素生産性を制御できることを見出した。また、麹菌以外の糸状菌により生産される他の酵素についても、同様の方法により、その生産性を制御できることを見出した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明によれば、穀皮や外皮が付着していない原料を用いて、焼酎等の発酵飲食品の製造に必要なグルコアミラーゼと耐酸性α−アミラーゼをバランスよく含む糸状菌培養物を製造することができる。
したがって、例えば麦焼酎などの製造について言えば、液体麹製造工程と発酵工程で同一の原料を使用することが可能になり、製造コストを抑えることができる。また、麦の外皮や糠が酒質に良くない影響を与える場合もある。さらに、原料を加熱しないで用いるため、エネルギーの節約にもつながる。
しかも、種々の原料や糸状菌株を用いた糸状菌培養物を組み合わせて製造した糸状菌培養物を使用することで、発酵飲食品のバラエティー化を図ることが容易となる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明は、糸状菌培養物の製造方法に関し、表面の全部が穀皮で覆われた穀類を含む液体培地を用いて、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とするものである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明において、液体培地として加熱処理を施したものを用いる場合は、当該加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を適宜調整することによっても、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御することができる。
すなわち、加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を上げることによって、培養原料中の栄養分の培養系への放出を抑制することができるのである。これは、培養原料を無機塩存在下で加熱することにより、当該原料の物理的な崩壊が抑えられるためと考えられる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本発明は、上記の糸状菌培養物の製造方法において、培養原料として表面の全部又は一部が少なくとも穀皮に覆われた穀類を用い、当該穀類の精白歩合を調整することにより、穀類中の栄養分の培養系への放出速度を制御するものである。
本発明において、穀類の形状としては、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われていることが必要であって、未精白物、または少なくとも穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精白された精白歩合以上のもの等を用いることができ、玄米、玄麦なども使用できる。例えば、穀類が大麦の場合には、未精白の精白歩合１００％のもの、或いは未精白の精白歩合を１００％とし、この未精白の精白歩合（１００％）から大麦の穀皮歩合（一般的には７〜８％）を差し引いた割合、すなわち、９２〜９３％程度の精白歩合以上のものである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明においては、穀類の精白歩合を調整することによって、栄養分の培養系への放出速度を制御し、糸状菌培養物における酵素活性の増強を図る。したがって、生産しようとする酵素や、原料穀類の種類等に応じて最適の精白歩合のものを選択する。たとえば、グルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼを製造する場合であって、大麦を原料とするときは、精白歩合を９０〜１００％、好ましくは９８％とすることにより、両酵素をバランスよく高生産することができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明の液体培地は、水、上記した培養原料、及びその他の培地成分を混合して調製される。液体培地は必要に応じて滅菌処理を行なってもよく、処理方法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、１２１℃で１５分間行なえばよい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明の他の態様は、上記の糸状菌培養物の製造方法において、培養原料として穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、α化されていないものを用いることにより、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御するものである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明において、上記培養原料は、穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、α化されていないことが必要である。
例えば、培養原料が大麦の場合は、未精白の精白歩合（１００％）から穀皮歩合（一般的には７〜８％）を差し引いた割合、すなわち、９２〜９３％程度の精白歩合以下のものを用いることができ、丸麦（精白歩合６５％）も用いることができる。
上記培養原料については、加熱などデンプンをα化させるような処理は行わないが、必要に応じて脱穀、精白、皮むき、洗浄、細断、細砕、凍結などの処理を施すことができる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明において、液体培地における上記の培養原料の配合割合は、糸状菌培養物中にグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼが選択的に生成、蓄積される程度とする。具体的には、液体培地に対して培養原料を１〜10％（w／vo1）、好ましくは2〜6％（w／vo1）添加すればよいが、使用する糸状菌株、培養原料の種類等によって最適な配合割合は異なるので、これらを考慮して適宜に選択すればよい。
培養原料の使用量が上限値より多くなると、好気性糸状菌を用いる場合、培養液の粘性が高くなり糸状菌を好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が進み難くなるので好ましくない。一方、該原料の使用量が下限値に満たないと、グルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼが高生産されない。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
本発明の液体培地は、水、上記した培養原料、及びその他の培地成分を混合して調製される。このとき、必要であれば培養原料以外の培地成分を水と混合して、予め滅菌処理を行った後に、α化されていないデンプン原料をさらに添加することができる。あるいは、培養原料の一部およびその他の培地成分を水と混合して、予め滅菌処理を行った後に、α化されていない残りの培養原料をさらに添加する方法を採ることもできる。
なお、滅菌処理方法は特に限定されない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、１２１℃で１５分間行なえばよい。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
上述の通り、上記の培養法によれば、培養系内のグルコースなどの糖や、アミノ酸などのタンパク分解物の濃度により、その生産性がカタボライト抑制を受ける酵素群を高生産することができる。
したがって、請求項９に記載の酵素の生産方法は、上記した糸状菌培養物の製造方法と同様である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
（２）本培養方法；  KNO3 0.8g、KH2PO4 1.2g、MgSO4 0.2ｇ、水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフェニコール（和光純薬工業株式会社）を５０μｇ/ｍｌとなるように添加し、丸麦２ｇを添加した。この本培養培地へ前培養液を1ml植菌し、37℃、72時間、100rpmで振盪培養することにより、麹菌培養物を製造した。
ポジティブコントロールとして、以下の方法により、麹菌培養物を製造した。すなわち、95%精麦（オーストラリア産スターリング種）２ｇ、KNO3 0.8g、KH2PO4 1.2g、MgSO4 0.2ｇ、および水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフェニコールを５０μｇ/ｍｌとなるように添加した。この本培養培地へ前培養液を1ml植菌し、37℃、72時間、100rpmで振盪培養することにより、麹菌培養物を製造した。
【国際調査報告】
2007040008.tif 000025
2007040008.tif 000026
2007040008.tif 000027
2007040008.tif 000028