(57)【要約】  本発明は、片頭痛の簡便な診断を可能とする診断マーカーおよびその利用方法を提供することに向けられる。αフォドリン（スペクトリン）遺伝子関連物質、あるいはＨＰＣＡＬ１遺伝子関連物質を診断マーカーとする。診断マーカーのアッセイ法として、片頭痛患者から得た末梢血リンパ細胞を不死化し、細胞抽出物を調整して、診断マーカーの発現レベルを調べる。このアッセイ法を用いれば、薬効スクリーニング法および新規片頭痛治療薬のスクリーニング方法が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
αフォドリン遺伝子関連物質またはＨＰＣＡＬ１（hippocalcin-like 1）遺伝子関連物質を含有する、片頭痛の診断マーカー。
【請求項２】
前記遺伝子関連物質がｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の診断マーカー。
【請求項３】
請求項1又は請求項2に記載の診断マーカーの検出薬を備えた片頭痛の診断キット。
【請求項４】
脊椎動物個体から単離したリンパ細胞におけるαフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルを調べる工程を含むアッセイ法。
【請求項５】
前記単離した細胞を不死化する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載のアッセイ法。
【請求項６】
前記単離した細胞をＥＢウィルスを用いて不死化することを特徴とする、請求項５に記載のアッセイ法。
【請求項７】
片頭痛患者に効果のある片頭痛治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）該片頭痛患者からリンパ細胞を単離する工程、
（ｂ）前記単離したリンパ細胞に片頭痛治療薬を投与する工程、および、
（ｃ）前記単離した細胞におけるαフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルを、前記投与の前および後で調べる工程とを含み、
前記発現レベルを前記投与後に前記投与前より低下させるような片頭痛治療薬を選択することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項８】
新規片頭痛治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）片頭痛患者からリンパ細胞を単離する工程、
（ｂ）前記単離した細胞に片頭痛治療薬の候補となる物質を投与する工程、および、
（ｃ）前記単離した細胞におけるαフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルを、前記投与の前および後で調べる工程とを含み、
前記発現レベルを前記投与後に前記投与前より低下させるような前記候補物質を選択することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項９】
αフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質の量を測定することにより、前記遺伝子の発現レベルを調べることを特徴とする、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記細胞を単離する工程が、前記単離した細胞を不死化する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項８または請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記単離した細胞をＥＢウィルスを用いて不死化することを特徴とする、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
被検者から単離したリンパ細胞におけるαフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルを調べることを特徴とする、片頭痛の診断方法。
【請求項１３】
（ａ）被検者から単離したリンパ細胞に、片頭痛治療薬を投与する工程、および、
（ｂ）前記単離した細胞におけるαフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルを、前記投与の前および後で調べる工程とを含み、
前記発現レベルが前記投与後に前記投与前より低下するような前記被験者を片頭痛に罹患していると診断することを特徴とする、片頭痛の診断方法。
【請求項１４】
αフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質の量を測定することにより、前記遺伝子の発現レベルを調べることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の診断方法。
【請求項１５】
前記細胞を単離する工程が、前記単離した細胞を不死化する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１２または請求項１３に記載の診断方法。
【請求項１６】
前記単離した細胞をＥＢウィルスを用いて不死化することを特徴とする、請求項１５に記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
片頭痛の診断マーカー及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
片頭痛は、器質的疾患に伴わないいわゆる機能性頭痛であり、それに罹患する患者の数も比較的多い。ところが、片頭痛は、致命的な疾患でないことや、動物を使用して行う試験研究が困難なことなどもあり、その病態については未だに明確なものは示されていない。【０００３】
一方、解析の進んだ特定の疾病においては、その遺伝子関連物質を診断のための指標（マーカー）として的確な診断を下すことのできる、遺伝子診断が可能となってきた（例えば特開２００３−１１６５４３号公報、再公表２００３−７４７３６号公報を参照）。マーカーによる病気の診断は、例えば症状による診断においては個人により症状に違いがあるというような、不確定な要素が比較的少ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、片頭痛の簡便な診断を可能とする診断マーカーおよびその利用方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく、発明者らは、健常者及び片頭痛患者から採取したリンパ球を培養し、それらの細胞の全ＲＮＡを鋳型とするｃＲＮＡをそれぞれ作製した。これらのｃＲＮＡを用い、プローブとして約２万の既知ヒト遺伝子をスポットしたＲＮＡアレイ（同キットに含有）に対して、ｍＲＮＡ発現量解析を行った。健常者群に比べて片頭痛患者群における発現量が２倍以上であったプローブを同定し、解析したところ、細胞骨格系の遺伝子とカルシウム関連遺伝子に大別された。そして、前者の一つとして細胞膜の裏打ちたんぱく質であるαフォドリン（スペクトリンとも呼ばれる）を、後者の一つとして、脳内に存在するカルシウム結合蛋白質であるＨＰＣＡＬ１（hippocalcin-like 1）を同定し、本発明の完成に至った。【０００６】
すなわち、まず本発明に係る診断マーカーは、αフォドリン遺伝子関連物質またはＨＰＣＡＬ１遺伝子関連物質を含有する、片頭痛の診断マーカーであり、これらの遺伝子関連物質がｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質であってもよい。そして本発明に係る診断キットは、上記の診断マーカーを備えた片頭痛の診断キットである。【０００７】
次に、本発明に係るアッセイ法は、脊椎動物個体から単離したリンパ細胞におけるαフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルを調べる工程を含むアッセイ法である。単離された細胞は、さらに不死化されてもよく、不死化には、ＥＢウィルスを用いてもよい。【０００８】
続いて、本発明に係る片頭痛治療薬のスクリーニング方法は、片頭痛患者からリンパ細胞を単離して、片頭痛患者に効果のある片頭痛治療薬を添加し、投与の前および後でαフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルを調べて、発現レベルを投与後に投与前より低下させるような片頭痛治療薬を選択するスクリーニング方法である。このスクリーニング方法は、新規片頭痛治療薬の候補となる物質を同様にリンパ細胞に投与して、片頭痛治療薬を選択するために実施することもできる。そして発現レベルを調べるためには、αフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質の量を測定してもよい。また単離された細胞は、さらに不死化されてもよく、不死化には、ＥＢウィルスを用いてもよい。【０００９】
さらに、本発明に係る片頭痛の診断方法は、被検者から単離したリンパ細胞におけるαフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルを調べる診断方法である。この診断方法は、被検者から単離したリンパ細胞に、片頭痛治療薬を投与して、投与の前および後でαフォドリン遺伝子またはＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルを調べることとしてもよく、発現レベルが投与後に投与前より低下するような被験者を片頭痛に罹患していると診断してもよい。単離された細胞は、さらに不死化されてもよく、不死化には、ＥＢウィルスを用いてもよい。【００１０】
なお、本発明の開示において「診断マーカー」とは、ある対象物の状態又は作用の評価の指標となるもの（マーカー）であって、当該状態または作用がある遺伝子の発現量と相関するときの、当該遺伝子およびその関連物質のことを指す。これには例えば、遺伝子それ自体のほか、遺伝子が発現する過程における、遺伝子の転写物であるｍＲＮＡ、翻訳物であるペプチド、そして遺伝子発現の最終産物であるタンパク質、などが含まれる。また、「診断マーカーの発現量」とは、診断マーカーが遺伝子それ自体の場合は当該遺伝子の発現レベルを、また診断マーカーが遺伝子以外の場合は、診断マーカーの由来する遺伝子の転写レベル（マーカーが転写物などの場合）または翻訳レベルにおける発現量（マーカーがポリペプチド、タンパク質などの場合）、を意味する。なお、上記αフォドリンおよびＨＰＣＡＬ１各遺伝子は、ヒトの場合、国際塩基配列データベースにおいてそれぞれアクセション番号ＢＣ０５３５２１およびＢＣ０１７０２８で定義されるものであるが、本発明の実施に用いるための遺伝子としては、その由来となる生物種について限定されず、そのホモログ（homolog）やオーソログ（ortholog）もすべて含むものとする。【００１１】
＜関連文献とのクロスリファレンス＞
本願は、２００５年９月１５日付けで出願した特願２００５−２６８６０５号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例において、αフォドリン及びＨＰＣＡＬ１遺伝子の発現レベルについて、片頭痛患者群の健常者群に対するそれぞれの割合を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例において、片頭痛患者群と健常者群におけるαフォドリン遺伝子の発現レベルの、スマトリプタン（Ａ）、アスピリン（Ｂ）、およびガスター(登録商標)（ファモチジン）（Ｃ）の投与前後における相対値を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例において、片頭痛の病態モデル動物におけるαフォドリンの発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）、およびリアルタイムＰＣＲ（Ｂ）によって調べた結果を示す図である。Ｓは刺激によりＣＳＤを起こした大脳半球を、Ｎは刺激していない大脳半球を表わす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) や、F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれらを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００１５】
＝＝＝診断マーカー＝＝＝
本発明にかかる片頭痛の診断マーカーは、片頭痛患者の末梢血リンパ細胞において、特異的に発現レベルの高い２つの遺伝子、αフォドリン（スペクトリン）遺伝子およびＨＰＣＡＬ１（hippocalcin-like 1）遺伝子の関連物質を含む。ここで、遺伝子関連物質としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質など、がある。【００１６】
これらの遺伝子は、健常者群および片頭痛患者群から由来するリンパ細胞におけるそれぞれの発現レベルを比べると、有意に片頭痛患者群においてより高い発現レベルを示す。また、これらの遺伝子は、不死化リンパ細胞に片頭痛治療薬を添加する前後の発現レベルを比較すると、治療薬添加後にその発現レベルが低下する。【００１７】
従ってこれらの遺伝子並びにそれらの遺伝子関連物質は、末梢血のリンパ細胞において、片頭痛患者若しくは片頭痛患者候補における片頭痛の発症を判定するための指標、すなわちマーカーとして有用であると考えられる。【００１８】
＝＝＝診断マーカーを検出するためのアッセイ法＝＝＝
検体中で診断マーカーを検出するためのアッセイ法は、その遺伝子または遺伝子関連物質の発現レベルを調べる工程を含む。【００１９】
本発明に係るアッセイ法は、上述の診断マーカーを定量することにより、診断マーカーの発現レベルを調べるものである。測定のための試料としては、対象動物の末梢血に含まれるリンパ細胞を使用することができる。また、そのほかの体組織においても、前述と同様の遺伝子関連物質の発現レベルの違いが確認されれば、その組織由来の試料をアッセイに用いてよいが、リンパ細胞を用いる方法は、対象動物への侵襲性が比較的低いという点で好ましい。【００２０】
単離したリンパ細胞などの細胞に対し、不死化の処理を行って不死化細胞を作出してから、本アッセイの検体とすることもできる。この場合、不死化細胞は長期間にわたり同一の状態を保って継代培養できるので、上述の測定法を同一条件で繰り返し実施することが可能となり、本アッセイの再現性が向上することになる。さらに、対象となる動物からの採血が一度でよくなるため、本発明の実施に当たっての対象動物への侵襲回数も低減できる。細胞の不死化のための処理には、ＥＢウィルスによる感染を用いてもよいし、ＳＶ４０ウィルスによる感染や、その他の一般的な細胞不死化法を用いてよい。このような不死化細胞を用いるアッセイ方法は、片頭痛の診断や原因究明のための、新しい実験モデルを提供するものであると言える。【００２１】
これらの細胞における上記診断マーカーの発現を調べるには、まず、細胞から細胞抽出物を調整し、その中の診断マーカーの発現を調べればよい。【００２２】
発現の検出法は種々のものが公知であるが、まず、遺伝子関連物質がｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡの場合、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などを用いることができる。なかでも高感度な測定が実施できる定量的ＰＣＲ法の使用は、測定のための試料が少量で済むという点で好ましく、さらにその改良法であるリアルタイムＰＣＲ法の使用が、より正確に測定できる点でいっそう好ましい。【００２３】
定量的ＰＣＲ法を実施する場合に用いるプライマーとしては、目的の診断マーカーを特異的に検出することができるものであれば特に制限されるものではないが、12〜26塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。その塩基配列は、対象となる脊椎動物もしくはヒトの既知の各遺伝子の配列情報（配列表参照）に基づいて決定する。そして、決定した配列を有するプライマーを、例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いて作製することができる。さらに、対象となる動物そのものの遺伝子が未知の場合でも、既知の関連遺伝子に対するホモログやオーソログの配列情報を元に、動物種間の類似性の仮定に基づく配列の推定、ならびにプライマー配列の縮重化により本アッセイの実施が可能である。【００２４】
一方、本発明にかかるマーカーとなる遺伝子関連物質が、遺伝子の翻訳物（ポリペプチド）又は最終産物（タンパク質）である場合、そのマーカーに対する特異性の高いポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いた免疫化学的手法、例えばＲＩＡ（radioimmunoassay、放射免疫測定法）や、ＥＩＡ（enzyme immunoassay、酵素免疫法）などの免疫化学的定量法を用いてアッセイすることができる。あるいはまた、マーカーとなるポリペプチドやタンパク質の精製方法が既知である場合は、その精製をさらに実施した後に、前記の免疫化学的定量法の他、標準的なポリペプチド・タンパク質定量法、例えばローリー法などを実施することができる。なお測定に用いるための抗体は、既に特異性の確認された市販されている抗体を利用してもよいし、あるいはまた、マーカー遺伝子の配列情報をもとに、標準的な抗体作製法により新たに作製してもよい。【００２５】
＝＝＝診断マーカーを含む診断キット＝＝＝
本発明の診断マーカーの検出試薬を用いて、片頭痛の簡易な診断に利用可能な診断キットを提供することができる。例えば、診断マーカーとなる遺伝子関連物質がｍＲＮＡやｃＤＮＡの場合、本キットには、定量的ＰＣＲに用いるためのプライマーならびにＰＣＲ反応に必要な試薬類を含ませることができる。あるいは、ノーザンブロット法に用いるためのプローブとして、遺伝子関連物質に対するｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ、またはそれらの一部を含ませてもよい。さらに、遺伝子関連物質がタンパク質やポリペプチドの場合には、本キットに免疫化学的定量法に用いるための特異的一次抗体、二次抗体、二次抗体に結合した酵素の検出試薬などを含ませることができる。【００２６】
＝＝＝薬効スクリーニング法＝＝＝
片頭痛治療薬は、患者によって効果のあるものと無いものがある。本発明の診断マーカーを用いることにより、ある片頭痛患者に対し、効果のある治療薬をin vitroでスクリーニングし、あらかじめ効果のある治療薬を選択して患者に投与することができる。【００２７】
まず、複数の片頭痛治療薬があるとき、まず、それらを患者から得たリンパ細胞もしくはリンパ細胞由来不死化細胞に添加する。そしてこの添加の前後に、それぞれ片頭痛診断マーカーの発現レベルを測定する。ここで、ある候補物質を用いた場合の添加後の発現レベルが、添加前より低減していれば、その片頭痛治療薬は、当該患者に対し効果があると判定できる。このようにして複数の片頭痛治療薬について測定を実施し、発現レベル低減の程度を比較すれば、各片頭痛治療薬の薬効を定量的に比較でき、当該患者に対して最も治療効果の高い治療薬を選択できることとなる。【００２８】
本発明の薬効スクリーニング法は、前述のように標準的な免疫化学的定量法もしくは核酸定量法を基礎とすることから、簡易に多数の試料を処理できる方法であることが特徴である。そして、片頭痛治療薬を投与する本人の細胞で行っているため、いわゆるオーダーメード治療として、薬効について定量的に正確な評価を下すことが可能である。【００２９】
＝＝＝新規片頭痛治療薬のスクリーニング方法＝＝
同様の方法を用いて、新規片頭痛治療薬をスクリーニングすることができる。すなわち、既存の片頭痛治療薬ではなく、片頭痛治療薬の候補になる化合物を用い、複数の片頭痛患者から得たリンパ細胞もしくはリンパ細胞由来不死化細胞に添加する。一人でも診断マーカーの発現レベルが低下すれば、その化合物は新規片頭痛治療薬の可能性を有する。それを確認するため、発現レベルの低下したリンパ球を取得した患者に直接投与し、実際に片頭痛治療薬として効果があるかどうか試すことができる。より多くの患者のリンパ球において診断マーカーも発現レベルを下げれば下げるほど、より一般的に効果のある片頭痛治療薬である可能性が高くなる。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例及び図を用いて本発明の実施の態様をより詳細に説明する。【００３１】
＝＝＝リンパ細胞の単離と細胞不死化＝＝＝
国際頭痛学会の頭痛分類第2版（ICHD-II）に従って診断された片頭痛の前兆のある患者５名、ならびにそれらと年齢と性別を一致させた比較対照となる健常者５名から、末梢血を採取した。片頭痛患者については、片頭痛発作間欠期に血液採取を行った。得られた末梢血から遠心分離にてリンパ細胞をそれぞれ分離した。【００３２】
リンパ細胞試料のそれぞれに対して、ＥＢウイルス上清液（ＥＢウイルス産生細胞であるB958細胞の培養上清）をリンパ細胞2×106個に対して1mL、およびシクロスポリン液（シクロスポリン原液（サンディミュン(登録商標)1A(5ml) 250mg）を100倍に希釈した溶液）をリンパ細胞2×106個に対して2μL添加して、RPMI(+)培地中で約4日静置しリンパ球に感染させた。その後、同培地で継代培養を続けて株化した細胞を、本発明におけるリンパ細胞由来の不死化細胞とした。これらの不死化細胞を、培養条件、継代回数などの条件を統一して以下の各実験に使用した。【００３３】
＝＝＝マイクロアレイとリアルタイムＰＣＲ＝＝＝
培養した不死化リンパ細胞を回収し、Amersham杜のCodeLink(登録商標)キットを用いて全ＲＮＡを抽出して、全ＲＮＡを鋳型とするｃＲＮＡを作製した。このｃＲＮＡをCy5-streptabidinで標識して、プローブとして約2万の既知ヒト遺伝子をスポットしたＲＮＡアレイ（同キットに含有）に対して、ｍＲＮＡ発現量解析を実施した。Cy5の発する蛍光シグナルの強度をオリンパス社のGenePix(登録商標) 4000B ＤＮＡマイクロアレイスキャナーで測定し、健常者群に比べて片頭痛患者群における発現量が二倍以上異なった遺伝子を同定したところ、細胞骨格系の遺伝子とカルシウム関連遺伝子に大別された。前者の一つとして細胞膜の裏打ちたんぱく質であるαフォドリン（スペクトリン）が、後者の一つとして、脳内に存在するカルシウム結合蛋白質であるＨＰＣＡＬ１が得られた。【００３４】
そこで、αフォドリンとＨＰＣＡＬ１について、片頭痛患者及び健常者から得た不死化リンパ細胞を試料として定量的リアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子発現のレベルを調べた。ＰＣＲの実施に当たっては、Applied Biosystems社のTaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイキット、同キットに含まれるプローブ、及びプライマー（αフォドリン:カタログ＃ Hs00162203_m1、ＨＰＣＡＬ１:カタログ＃ Hs00365962_m1）を使用した。ＰＣＲから得られた増幅曲線をもとにして、比較Ｃｔ(threshould cycle)法により各遺伝子の発現レベルを相対定量した。その結果、両遺伝子ともに、片頭痛患者群において健常者群より発現量が高かった（図１）。このことから、両遺伝子が片頭痛のマーカーになり得ると考えられる。【００３５】
＝＝＝薬効評価＝＝＝
上記と同様の方法で、片頭痛患者群ならびに健常者のリンパ細胞に由来する不死化細胞のｍＲＮＡ発現解析を実施した。ここで、培養中の不死化細胞に対し、トリプタン系の片頭痛治療薬であるスマトリプタン、または一般的な消炎鎮痛剤であるアスピリンを投与し、その投与前と投与後における不死化細胞の一部をそれぞれ試料として、αフォドリン遺伝子の発現レベルを解析した。その結果、スマトリプタンおよびアスピリンのいずれを投与した場合も、αフォドリンの発現量が低下した（図２Ａ，Ｂ）。低下の程度は、健常者由来の細胞の場合よりも、片頭痛患者由来の場合の方が顕著に大きかった。これらに対して、胃薬であるガスター(登録商標)（ファモチジン）を同様の方法で不死化細胞に投与したところ、αフォドリンの発現量は低下せず、片頭痛患者群由来の細胞および健常者由来の細胞のいずれにおいても逆に上昇した（図２Ｃ）。【００３６】
このように、本発明のアッセイ方法を用いて、片頭痛治療薬の薬効を評価できることが明らかとなり、このアッセイ法を用いることにより、薬効スクリーニング法や、新規片頭痛治療薬のスクリーニング方法に用いることができる。【００３７】
＝＝＝モデル動物における診断マーカーの使用＝＝＝
片頭痛の病態においては、大脳皮質で皮質拡散抑制（Cortical spreading depression，ＣＳＤ）という現象が起きている可能性が高いと言われている。そこで、マウスを用いて、以下の方法でＣＳＤを実験的に誘発し、大脳皮質におけるαフォドリンの発現を調べた。【００３８】
マウス（C57/Black6系統、オス）の両側の頭蓋骨に１ｃｍ大の頭窓をあけ、硬膜を除去して、脳表面に電極を設置した。右側の頭窓で、電極より5mm離れたところで0.3M KClをマイクロピペットにて滴下して刺激することにより、ＣＳＤを誘発した。その後、刺激側および非刺激側の大脳半球より全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりcDNAを作製した。TaqMan(登録商標)プローブとABI PRISM 7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いたリアルタイムＰＣＲ法により、αフォドリンの発現量を測定した。【００３９】
その結果、マウスの大脳において、ＣＳＤを起こした側の大脳半球におけるαフォドリンの発現が、ＣＳＤを起こしていない側の大脳半球よりも上昇していた（図３Ａ，Ｂ）。以上から、αフォドリンを片頭痛の診断マーカーとして使用できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により、片頭痛の簡便な診断を可能とする診断マーカーおよびその利用方法を提供することができる。
【図１】
2007032426.tif 000002
【図２】
2007032426.tif 000003
【図３】
2007032426.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月1日(2007.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
αフォドリン遺伝子関連物質を含有する、片頭痛の診断マーカー。
【請求項２】
前記遺伝子関連物質がｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の診断マーカー。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の診断マーカーの検出薬を備えた片頭痛の診断キット。
【請求項４】
脊椎動物個体から単離したリンパ細胞におけるαフォドリン遺伝子の発現レベルを調べる工程を含むアッセイ法。
【請求項５】
前記単離した細胞を不死化する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載のアッセイ法。
【請求項６】
前記単離した細胞をＥＢウィルスを用いて不死化することを特徴とする、請求項５に記載のアッセイ法。
【請求項７】
特定の片頭痛患者に効果のある片頭痛治療薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記特定の片頭痛患者から単離されたリンパ細胞に、前記片頭痛治療薬の候補となる片頭痛治療薬を投与する工程、および、
（ｂ）前記単離された細胞におけるαフォドリン遺伝子の発現レベルを、前記投与の前および後で調べる工程とを含み、
前記発現レベルを前記投与後に前記投与前より低下させるような片頭痛治療薬を選択することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項８】
新規片頭痛治療薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）片頭痛患者から単離されたリンパ細胞に片頭痛治療薬の候補となる物質を投与する工程、および、
（ｂ）前記単離された細胞におけるαフォドリン遺伝子の発現レベルを、前記投与の前および後で調べる工程とを含み、
前記発現レベルを前記投与後に前記投与前より低下させるような前記候補物質を選択することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項９】
αフォドリン遺伝子由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質の量を測定することにより、前記遺伝子の発現レベルを調べることを特徴とする、請求項７または８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記リンパ細胞が不死化されていることを特徴とする、請求項７から９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記リンパ細胞がＥＢウィルスを用いて不死化されていることを特徴とする、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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