【手続補正書】
【提出日】平成20年7月9日(2008.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  微細藻類からの優れた免疫刺激物質
【特許請求の範囲】
【請求項１】  水または水および少なくとも１種の低級アルキルアルコール混合物を含む溶媒によって抽出可能な多糖を含む微細藻類（microalgae）から単離された免疫刺激調製物であって、ここに、該アルキル部分は１ないし４個の炭素原子であり、ここに、活性多糖はほぼ２００万ダルトンを超える見かけの分子量を有することを特徴とする該調製物。
【請求項２】  免疫刺激活性が単球／マクロファージの活性化によって発現される請求項１記載の免疫刺激調製物。
【請求項３】  微細藻類がＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅのものである請求項１記載の免疫刺激調製物。
【請求項４】  微細藻類がＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅのものである請求項２記載の免疫刺激調製物。
【請求項５】  微細藻類がＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａのものである請求項１記載の免疫刺激調製物。
【請求項６】  微細藻類がＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａのものである請求項２記載の免疫刺激調製物。
【請求項７】  微細藻類がＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓのものである請求項１記載の免疫刺激調製物。
【請求項８】  微細藻類がＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓのものである請求項２記載の免疫刺激調製物。
【請求項９】  活性多糖のグリコシル成分が、実質的に、マンノース、グルコース、ラムノース、ガラクトース、フコース、メチル化糖およびＮ−アセチル化アミノ糖よりなる請求項３記載の免疫刺激調製物。
【請求項１０】  活性多糖のグリコシル成分が、実質的に、マンノース、グルコース、ラムノース、ガラクトース、フコース、メチル化糖およびＮ−アセチル化アミノ糖よりなる請求項４記載の免疫刺激調製物。
【請求項１１】  活性多糖のグリコシル成分が、実質的に、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、グルコースおよびメチル化糖よりなる請求項５記載の免疫刺激調製物。
【請求項１２】  活性多糖のグリコシル成分が、実質的に、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、グルコースおよびメチル化糖よりなる請求項６記載の免疫刺激調製物。
【請求項１３】  活性多糖のグリコシル成分が、実質的に、ラムノース、グルクロン酸、フコース、ガラクトースおよびメチル化糖よりなる請求項７記載の免疫刺激調製物。
【請求項１４】  活性多糖のグリコシル成分が、実質的に、ラムノース、グルクロン酸、フコース、ガラクトースおよびメチル化糖よりなる請求項８記載の免疫刺激調製物。
【請求項１５】  請求項１ないし１４いずれか１に記載の免疫刺激調製物および医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１６】  請求項１ないし１４いずれか１に記載の免疫刺激調製物およびダイエット補充物用の許容される担体または賦形剤を含むダイエット補充物。
【請求項１７】  有効量の請求項１〜１４のいずれかに記載の免疫刺激調製物および医薬上許容される担体または賦形剤を含む、治療を必要とする個体において免疫機能を増強させるための医薬組成物。
【請求項１８】  個体がウイルス、細菌または菌類感染に罹っている請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】  個体が癌に罹っている請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項２０】  個体が免疫不全に罹っている請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項２１】  個体がヒトである請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項２２】  個体が動物である請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項２３】  有効量の請求項１〜１４のいずれかに記載の免疫刺激調製物およびダイエット補充物用の許容される担体または賦形剤を含む、治療を必要とする個体において免疫機能を増強させるためのダイエット補充物。
【請求項２４】  個体がウイルス、細菌または菌類感染に罹っている請求項２３記載のダイエット補充物。
【請求項２５】  個体が癌に罹っている請求項２３記載のダイエット補充物。
【請求項２６】  個体が免疫不全に罹っている請求項２３記載のダイエット補充物。
【請求項２７】  個体がヒトである請求項２３記載のダイエット補充物。
【請求項２８】  個体が動物である請求項２３記載のダイエット補充物。
【請求項２９】  （ａ）約４℃ないし１００℃の間の抽出温度にて、水または水およびアルキル部分が１ないし４個の炭素原子である少なくとも１種の低級アルキルアルコールを含む溶媒で、微細藻類を抽出することによって抽出物を生じさせ；
（ｂ）所望により、大容量が濃縮工程を望ましくする場合、抽出物を小容量まで濃縮し；
（ｃ）沈殿手段によって抽出物から多糖調製物を沈殿させ、
（ｄ）分離手段によって沈殿した多糖調製物を分離し；次いで、
（ｅ）９５％アルコールで（ｄ）の沈殿を洗浄する；
工程を含むことを特徴とする免疫刺激多糖が豊富な食品グレードの微細藻類から調製物を得る方法。
【請求項３０】  抽出で用いるアルコールがエタノールである請求項２９記載の方法。
【請求項３１】  抽出で用いるアルコールがメタノールである請求項２９記載の方法。
【請求項３２】  抽出で用いるアルコールがイソプロパノールまたはプロパノールである請求項２９記載の方法。
【請求項３３】  （ａ）における好ましいアルコール濃度が２０ないし８０％である請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項３４】  抽出の好ましい温度が４０ないし８０℃の間である請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項３５】  微細藻類がＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅのものである請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項３６】  微細藻類がＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａのものである請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項３７】  微細藻類がＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓのものである請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項３８】  濃縮工程（ｂ）が、（必要な場合）、好ましくは減圧下にて溶媒の蒸発によって行われる請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項３９】  濃縮工程（ｂ）が（必要な場合）凍結乾燥によって行われる請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項４０】  濃縮工程（ｂ）が（必要な場合）透析によって行われる請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項４１】  多糖調製物がエタノールの約８０％最終濃度までの添加によって工程（ｃ）において沈殿される請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項４２】  多糖調製物が抽出物を冷却させることによって工程（ｃ）において沈殿される請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項４３】  多糖調製物が塩の添加によって工程（ｃ）において沈殿される請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項４４】  塩が硫酸アンモニウムである請求項４３記載の方法。
【請求項４５】  沈殿された多糖調製物が濾過によって工程（ｄ）において分離される請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項４６】  沈殿された多糖調製物が遠心によって工程（ｄ）において分離される請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項４７】  沈殿された多糖調製物が９５％エタノールによって工程（ｅ）において洗浄される請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項４８】  さらに、沈殿を水に溶解させ、次いで、限外濾過によってほぼ１００，０００ダルトン分子質量未満の実質的に全ての成分を除去することによって沈殿を精製することを含む請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項４９】  さらに、沈殿を水に溶解させ、次いで、サイズ排除カラムクロマトグラフィーによってほぼ２００万ダルトン分子質量未満の実質的に全ての成分を除去することによって沈殿を精製することを含む請求項２９ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項５０】  食品グレードの微細藻類から抽出された有効量の多糖調製物および適当な担体を含む、個体に対して単球／マクロファージ活性の刺激を供するための免疫刺激多糖調製物。
【請求項５１】  投与して創傷治癒を増強させる請求項５０記載の免疫刺激多糖調製物。
【請求項５２】  投与して癌を治療する請求項５０記載の免疫刺激多糖調製物。
【請求項５３】  投与して免疫不全を治療する請求項５０記載の免疫刺激多糖調製物。
【請求項５４】  投与してウイルス、細菌または菌類感染を治療する請求項５０記載の免疫刺激多糖調製物。
【請求項５５】  個体がヒトである請求項５０記載の免疫刺激多糖調製物。
【請求項５６】  個体が動物である請求項５０記載の免疫刺激多糖調製物。
【請求項５７】  微細藻類がＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅのものである請求項５０記載の免疫刺激多糖調製物。
【請求項５８】  微細藻類がＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａのものである請求項５０記載の免疫刺激多糖調製物。
【請求項５９】  微細藻類がＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓのものである請求項５０記載の免疫刺激多糖調製物。
【請求項６０】  微細藻類がＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅのものである請求項３３記載の方法。
【請求項６１】  微細藻類がＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａのものである請求項３３記載の方法。
【請求項６２】  微細藻類がＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓのものである請求項３３記載の方法。
【請求項６３】  抽出の好ましい温度が４０および８０℃の間である請求項３３記載の方法。
【請求項６４】  濃縮工程（ｂ）が（必要な場合）、好ましくは減圧下で、溶媒の蒸発によって行われる請求項３３記載の方法。
【請求項６５】  濃縮工程（ｂ）が（必要な場合）凍結乾燥によって行われる請求項３３記載の方法。
【請求項６６】  濃縮工程（ｂ）が（必要な場合）透析によって行われる請求項３３記載の方法。
【請求項６７】  多糖調製物が、エタノールの約８０％エタノールの最終濃度までの添加によって工程（ｃ）において沈殿される請求項３３記載の方法。
【請求項６８】  多糖調製物が塩の添加によって工程（ｃ）において沈殿される請求項３３記載の方法。
【請求項６９】  塩が硫酸アンモニウムである請求項６８記載の方法。
【請求項７０】  多糖調製物が抽出物を冷却することによって工程（ｃ）において沈殿される請求項３３記載の方法。
【請求項７１】  沈殿された多糖調製物が濾過によって工程（ｄ）において分離される請求項３３記載の方法。
【請求項７２】  沈殿された多糖調製物が遠心によって工程（ｄ）において分離される請求項３３記載の方法。
【請求項７３】  沈殿された多糖調製物が９５％エタノールによって工程（ｅ）において洗浄される請求項３３記載の方法。
【請求項７４】  さらに、沈殿を水に溶解させ、次いで、限外濾過によってほぼ１００，０００ダルトン分子質量未満の実質的に全ての成分を除去することによって沈殿を精製することを含む請求項３３記載の方法。
【請求項７５】  さらに、沈殿を水に溶解させ、次いで、サイズ排除カラムクロマトグラフィーによってほぼ２００万ダルトン分子質量未満の実質的に全ての成分を除去することによって沈殿を精製することを含む請求項３３記載の方法。
【請求項７６】  微細藻類がＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅのものである請求項３４記載の方法。
【請求項７７】  微細藻類がＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａのものである請求項３４記載の方法。
【請求項７８】  微細藻類がＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓのものである請求項３４記載の方法。
【請求項７９】  濃縮工程（ｂ）が（必要な場合）、好ましくは減圧下で、溶媒の蒸発によって行われる請求項３４記載の方法。
【請求項８０】  濃縮工程（ｂ）が（必要な場合）凍結乾燥によって行われる請求項３４記載の方法。
【請求項８１】  濃縮工程（ｂ）が（必要な場合）透析によって行われる請求項３４記載の方法。
【請求項８２】  多糖調製物が、エタノールの約８０％エタノールの最終濃度までの添加によって工程（ｃ）において沈殿される請求項３４記載の方法。
【請求項８３】  多糖調製物が塩の添加によって工程（ｃ）において沈殿される請求項３４記載の方法。
【請求項８４】  塩が硫酸アンモニウムである請求項８３記載の方法。
【請求項８５】  多糖調製物が抽出物を冷却することによって工程（ｃ）において沈殿される請求項３４記載の方法。
【請求項８６】  沈殿された多糖調製物が濾過によって工程（ｄ）において分離される請求項３４記載の方法。
【請求項８７】  沈殿された多糖調製物が遠心によって工程（ｄ）において分離される請求項３４記載の方法。
【請求項８８】  沈殿された多糖調製物が９５％エタノールによって工程（ｅ）において洗浄される請求項３４記載の方法。
【請求項８９】  さらに、沈殿を水に溶解させ、次いで、限外濾過によってほぼ１００，０００ダルトン分子質量未満の実質的に全ての成分を除去することによって沈殿を精製することを含む請求項３４記載の方法。
【請求項９０】  さらに、沈殿を水に溶解させ、次いで、サイズ排除カラムクロマトグラフィーによってほぼ２００万ダルトン分子質量未満の実質的に全ての成分を除去することによって沈殿を精製することを含む請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、ここに引用してその内容を本明細書の一部と見なす２００１年７月１０日出願の米国仮出願シリアル番号６０／２１７，００１からの優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、食品グレードの微細藻類（microalgae）からの免疫刺激多糖調製物の抽出方法に関する。本発明は、さらに、２００万ダルトンを超える見かけの分子量を有する活性多糖を含有する食品グレードの微細藻類から単離された構造的に複雑な免疫刺激水溶性多糖調製物の同定に関する。また、本発明は、本発明の調製物を用いて種々の病気状態を治療および／または予防する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
過去３０年の間に、免疫治療は、免疫応答を変調するように設計された方法の使用を通じてヒトの病気および疾患を治療するための重要なアプローチとなった。これは、免疫系が易感染性となる病理学的疾患において特に重要である。病気モデルおよび臨床試験で行われた研究は、宿主防御メカニズムの増大は、微生物感染、免疫不全、癌および自己免疫疾患に対する治療および予防で有用であることを示す（１−５）。また、免疫増強プロトコルは創傷治癒を促進するための用途を有することができる。創傷治癒のプロセスにおいて、マクロファージは、細胞増殖および新しい組織の形成／再生を変調することによって主要な役割を呈する。それらは、食細胞、デブリドメント（debridement）剤として機能し、創傷修復の血管形成段階に影響する成長因子を生産する（６）。
【０００４】
歴史的には、開発された最初の免疫刺激物質は細菌の産物（溶解物および粗製画分）、弱毒化微生物または加熱殺傷細菌であった。これらはｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｍ（ＢＣＧ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍおよびリポ多糖のごとき剤を含んだ（１，２）。これらの剤は毒性および副作用のため成功が制限されていたが、多くは動物医学において免疫刺激のためにＵＳＶＡに認可されてきた（３）。他の物質は種々の源から開発され、天然起源のもの、化学合成によって誘導されたもの、または組換え技術を用いて合成されたものを含む。天然起源のほとんどの免疫刺激物質は高分子量の多糖、糖蛋白質または複合ペプチドである（１）。例えば、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ（シゾフィラン）、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ（レンチナン）およびＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（クレスチン）から誘導された三種の菌類多糖は、現在、生物学的応答モディファイアーとして日本国において臨床的に使用されている（４）。もう１つの多糖、（Ａｌｏｅ  ｖｅｒａから単離された）アセマンナンは、イヌおよびネコにおいて、線維肉腫の治療のために米国農務省によって認可されている（７）。グリコスフィンゴ脂質ＫＲＮ−７０００のごとき天然生成物に由来する数個の小さな分子量の免疫刺激物質がある。固体腫瘍の治療のために免疫刺激物質としてＫＲＮ−７０００を用いる臨床試験が現在進行中である（８）。また、イソプリノシンおよびムラミルペプチドのような化合物を含む合成起源のいくつかの免疫刺激物質が開発されている（２）。最近、内因性起源の多数の他の免疫モジュレーターが、組換え技術を用いて開発されおり、これはＦＤＡの認可を得ている。これらの剤はコロニー−刺激因子、インターフェロンおよび組換え蛋白質を含む（５）。しかしながら、これらの化合物はしばしば短い半減期を有し、最適な投与および適当な組み合わせを決定するのが困難である。
【０００５】
現在の免疫刺激物質は有望であるが、より優れた剤を開発し、免疫治療のための入手可能な薬物の保有量を増加させる必要性が依然としてある。免疫刺激物質の薬物発見のために用いることができる化学的に多用な化合物の１つの源は天然産物である。数世紀の間、天然産物は治療上有用な剤として開発されており、その多くは今日臨床で用いられている。薬物発見に対する手段の１つとして天然産物として興味があるのは、それらの圧倒的な分子の多様性および生物学的活性の多用なスペクトルに基づいている（９）。
【０００６】
古代より、微細藻類は栄養が密な食品源として用いられてきた。歴史的記録は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓのごとき微細藻類が、アフリカのチャド湖の周りの種族によって、およびメキシコのテヒコ湖近くに生存するアズテック人によって消費された（１０）。ここ数十年の間、ヒトの消費のためのおよび家畜の飼料としての食品グレードの微細藻類の商業的な生産に対する興味が増大してきた。商業的に優れたＳｐｉｒｕｌｉｎａ種、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種およびＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ（ＡＦＡ）につき開発されてきた種々の微細藻類の中には、成功して生産され、世界中で使用されている３つの主なタイプがある。
【０００７】
食品グレードの微細藻類の消費についての事例報告および最近の研究は、動物およびヒト双方における免疫機能の増強を報告してきた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａの経口投与は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに感染したマウスにおいて、増強されたナチュラルキラー細胞活性（１１）および顆粒球−マクロファージ前駆細胞（１２）と関連付けられてきた。規定食Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓはニワトリにおいてマクロファージの食作用活性を増加させ（１３）、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓはヒトにおいて化学予防効果を呈する（１４）。ＡＦＡのヒト消費は、免疫細胞輸送および増強された免疫学的監視の変化を生じさせると報告されてきた（１５）。全てのこれらの効果のための活性な成分は決定的には確立されていない。
【０００８】
種々の化合物がここに研究された微細藻類から単離された。ＣｈｌｏｒｅｌｌａおよびＳｐｉｒｕｌｉｎａ種からの多数の多糖および糖蛋白質が、それらの抗腫瘍、抗ウイルスおよび免疫刺激活性につき特徴付けられてきた。対照的に、いずれかの生物学的活性を示すそのような化合物はＡＦＡからは単離されていない。
【０００９】
多数の多糖が生物学的活性を保有するＣｈｌｏｒｅｌｌａ種から同定されている。米国特許第４，５３３，５４８号において、酸性多糖が、抗腫瘍および抗ウイルス活性を呈するＣｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａから単離されている（１６）。この多糖についてのグリコシル組成はほとんどがラムノースであり、少量はガラクトース、アラビノース、グルコースおよびグルクロン酸であった。米国特許第４，８３１，０２２号に報告された海洋Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａから単離されたもう１つの多糖は、腫瘍増殖阻害効果を有するようである。しかしながら、分子量またはグリコシル組成は報告されていない（１７）。
【００１０】
米国特許第４，７８６，４９６号において、海洋Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の脂質画分（糖脂質）は抗腫瘍特性を呈した（１８）。また、いくつかの糖蛋白質がＣｈｌｏｒｅｌｌａ種から単離されている。例えば、米国特許第４，８２２，６１２号は、抗癌効果を有する４５，０００ダルトンの糖蛋白質を報告している（１９）。また、免疫増強および抗腫瘍特性を有するであろう種々の他の糖蛋白質（２０−２３）およびグリセロ糖脂質（２４）が科学文献に報告されている。これらの化合物のいずれも多糖ではない。
【００１１】
生物学的活性を呈するいくつかの異なるタイプの多糖がＳｐｉｒｕｌｉｎａ種から単離されている。例えば、硫酸化多糖カルシウムスピルランは腫瘍侵入および転移を阻害する（２５）。カルシウムスピルラン（分子量７４，６００ダルトン）はラムノース（５２．３％）、３−Ｏ−メチルラムノース（３２．５％）、２，３−ジ−Ｏ−メチルラムノース（４．４％）、３−Ｏ−メチルキシロース（４．８％）、ウロン酸（１６．５％）およびスルフェートよりなる（２６）。
【００１２】
米国特許第５，５８５，３６５号は、２５０，０００および３００，０００ダルトンの間の分子量を持つ抗ウイルス多糖が熱水抽出を用いてＳｐｉｒｕｌｉｎａ種から単離されたことを開示する（２７）。この多糖はラムノース、グルコース、フルクトース、リボース、ガラクトース、キシロース、マンノース、グルクロン酸およびガラクツロン酸よりなる。１２，６００および６０，０００ダルトンの間の範囲の多数の他の低分子量多糖が、最近、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ種から単離されている（２８−３０）。
【００１３】
免疫刺激活性を測定する１つの方法は、マクロファージが関与する生物学的アッセイを用いることである。単球／マクロファージは、現実的には、それらが
免疫応答および多数の生物学的プロセスを協調させるのに非常に重要な身体の各組織で見出される（３１）。それらは食作用、免疫学的監視、創傷治癒、微生物および腫瘍細胞の殺傷、およびＴリンパ球への抗原提示において主な役割を演じている（３２）。癌においては、マクロファージはサイトカインおよび他の免疫因子の産生を介して腫瘍細胞毒性機能を媒介する（３３）。適応的および先天性免疫において主な役割をマクロファージに演じさせるためには、マクロファージはまず活性化されることによって環境の剤に対して効果的に応答しなければならない（３４）。マクロファージの活性化は、核因子カッパＢ（ＮＦ−カッパＢ）のごときプロ炎症転写因子によって媒介される。次いで、そのような転写因子は、種々の免疫応答を媒介する遺伝子のアレイの活性化／抑制を制御し変調する。
【００１４】
未刺激マクロファージにおいては、ＮＦ−カッパＢは、サイトゾル内の阻害性カッパＢ（Ｉ−カッパＢ）蛋白質によって隔離された不活性なヘテロダイマーとして存在する。Ｉ−カッパ蛋白質を解離させ、分解させる剤は、ＮＦ−カッパＢダイマーの核への転移を可能とし、そこで、それが下流遺伝子の転移を活性化させることができる（３５）。ＮＦ−カッパＢによって調節される標的遺伝子はプロ炎症サイトカイン、ケモカイン、炎症酵素、接着分子および受容体を含む（３６）。
【００１５】
本発明においては、ヒト単球におけるＮＦ−カッパＢについての転写因子ベースのアッセイを用いて、食品グレードの微細藻類からの免疫刺激多糖調製物の抽出、単離、特徴づけおよび開発をガイドした。本発明の多糖は、今日入手可能なほとんど全ての他の多糖とは異なり、水溶性であって、かつ水性エタノール溶液に可溶である。
【００１６】
発明の概要
マクロファージ免疫刺激活性を有し、２００万ダルトンを超える見かけの分子量を有する活性な多糖を含有する新規な水溶性多糖調製物がＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ（ＡＦＡ）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａおよびＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離された。本発明の多糖調製物は、現在癌患者において免疫治療で臨床的に用いられる多糖調製物よりも少なくとも千倍単球活性化につき活性である。
【００１７】
本発明の１つの具体例によると、水または水およびアルキル部分が１ないし４個の炭素原子である少なくとも１種の低級アルキルアルコールの混合物によって抽出可能な多糖を含み、ここに活性多糖がほぼ２００万ダルトンを超える見かけの分子量を有する免疫調製物が微細藻類から単離される。もう１つの具体例によると、免疫刺激調製物の免疫刺激活性は単球／マクロファージ活性化によって発現される。もう１つの具体例によると、免疫刺激調製物は微細藻類Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅから抽出される。もう１つの具体例によると、免疫刺激調製物は微細藻類Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａから抽出される。もう１つの具体例によると、免疫刺激調製物は微細藻類Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓから抽出される。もう１つの具体例によると、免疫刺激調製物の活性多糖のグリコシル成分は、実質的に、マンノース、グルコース、ラムノース、ガラクトース、フコース、メチル化糖およびＮ−アセチル化アミノ糖よりなる。もう１つの具体例によると、免疫刺激調製物の活性多糖のグリコシル成分は、実質的に、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、グルコースおよびメチル化糖よりなる。もう１つの具体例によると、免疫刺激調製物の活性多糖のグリコシル成分は、実質的にラムノース、グルクロン酸、フコース、ガラクトースおよびメチル化糖よりなる。もう１つの具体例において、医薬組成物はこれまでの免疫調製物のいずれか１つおよび医薬上許容される担体または賦形剤を含む。もう１つの具体例によると、ダイエット補充物はこれまでの免疫刺激調製物のいずれか１つおよびダイエット補充物用の許容される担体または賦形剤を含む。
【００１８】
もう１つの具体例によると、治療を必要とする個体において免疫機能を増強させる方法は、有効量の医薬組成物またはダイエット補充物を個体に投与することを含む。もう１つの具体例によると、個体はウイルス、最近または菌類感染に罹っている。もう１つの具体例によると、個体は癌に罹っている。もう１つの具体例によると、個体は免疫不全に罹っている。もう１つの具体例によると、個体はヒトである。もう１つの具体例によると、個体は動物である。
【００１９】
もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖が豊富な食品グレードの微細藻類から調製物を得るための方法は、（ａ）水または水およびアルキル部分が１ないし４個の炭素原子である少なくとも１種の低級アルキルアルコールの混合物を含む溶媒で微細藻類を抽出することによって抽出物を生じさせ、ここに、混合物のアルコール濃度は、約４０℃ないし１００℃の間の抽出温度において０ないし１００容量％の間であり；（ｂ）所望により、大容量は濃縮工程を望ましくする場合、抽出物を小容量まで濃縮し；（ｃ）沈殿手段によって、抽出物が多糖抽出物を沈殿させ；（ｄ）分離手段によって沈殿した多糖調製物を分離し；次いで、（ｅ）９５％アルコールで（ｄ）の沈殿を洗浄する工程を含む。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖が豊富な食品グレードの微細藻類から調製物を得る抽出方法で用いられるアルコールはエタノールである。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖が豊富な食品グレードの微細藻類から調製物を得る抽出方法で用いられるアルコールはメタノールである。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖が豊富な食品グレードの微細藻類から調製物を得る抽出方法で用いられるアルコールはイソプロパノールまたはプロパノールである。もう１つの具体例によると、工程（ａ）における好ましいアルコール濃度は２０ないし８０％である。もう１つの具体例によると、抽出の好ましい温度は４０および８０℃の間である。もう１つの具体例によると、該方法は、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅから免疫刺激多糖が豊富な調製物を得るのに用いられる。もう１つの具体例によると、該方法は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａから免疫刺激多糖が豊富な調製物を得るのに用いられる。もう１つの具体例によると、該方法は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓから免疫刺激多糖が豊富な調製物を得るのに用いられる。もう１つの具体例によると、濃縮工程（ｂ）は、（必要な場合）好ましくは、減圧下にて、溶媒の蒸発によって行われる。もう１つの具体例によると、濃縮工程（ｂ）は（必要である場合）凍結乾燥によって行われる。もう１つの具体例によると、濃縮工程（ｂ）は（必要である場合）透析によって行われる。もう１つの具体例によると、多糖調製物は、エタノールの約８０％エタノールの最終濃度までの添加によって工程（ｃ）において沈殿される。もう１つの具体例によると、多糖調製物は抽出物を冷却することによって工程（ｃ）において沈殿される。もう１つの具体例によると、多調製物は塩の添加によって工程（ｃ）において沈殿される。もう１つの具体例によると、塩は硫酸アンモニウムである。もう１つの具体例によると、沈殿された多糖調製物は濾過によって工程（ｄ）において分離される。もう１つの具体例によると、沈殿された多糖調製物は遠心によって工程（ｄ）において分離される。もう１つの具体例によると、沈殿された多糖調製物は９５％エタノールによって工程（ｅ）において洗浄される。もう１つの具体例によると、該方法は、さらに、沈殿を水に溶解させ、次いで、限外濾過によってほぼ１００，０００ダルトン分子質量未満の実質的に全ての成分を除去することによって沈殿を精製することを含む。もう１つの具体例によると、該方法は、さらに、沈殿を水に溶解させ、次いでサイズ排除カラムクロマトグラフィーによってほぼ２００万ダルトン未満の実質的に全ての成分を除去することによって沈殿を精製することを含む。
【００２０】
もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖調製物で個体を処置して、単球／マクロファージ活性の刺激を個体に与える方法は、許容される担体と組み合わせて食品グレードの微細藻類から抽出された有効量の多糖調製物を個体に投与することを含む。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖調製物を投与して創傷治癒を増強させる。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖調製物を投与して癌を治療する。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖調製物を投与して免疫不全を治療する。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖調製物を投与してウイルス、細菌または菌類の感染を治療する。もう１つの具体例によると、個体はヒトである。もう１つの具体例によると、個体は動物である。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖調製物で個体を処置して、単球／マクロファージ活性の刺激を個体に与える方法は、許容される担体を組み合わせて、Ａｐｈａｍｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅから抽出された有効量の多糖調製物を個体に投与することを含む。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖調製物で個体を処置して、単球／マクロファージ活性の刺激を個体に与える方法は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａから抽出された有効量の多糖調製物を個体に投与することを含む。もう１つの具体例によると、免疫刺激多糖調製物で、個体を処置して、単球／マクロファージ活性の刺激を個体に与える方法は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓから抽出された有効量の多糖調製物を個体に投与することを含む。
【００２１】
発明の詳細な記載
ＴＨＰ−１ヒト単球／マクロファージにおけるＮＦ−カッパＢの活性化についての転写因子−ベースのバイオアッセイを用いて、免疫刺激多糖の精製およびそれらの抽出の最適化をガイドした。このアッセイは、ＮＦ−カッパＢ−ルシフェラーゼレポーターの増大した発現によって示される免疫刺激活性を測定する。
５％ＣＯ２および９５％空気下、３７℃にて、胎児ウシ血清（１０％ｖ／ｖ）およびアミカシン（６０ｍｇ／Ｌ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で、ＴＨＰ−１ヒト単球（American Type Culture Collection, Rockville, MD)を培養した。ＤＥＡＥ−デキストラン（１０μｇ／１×１０６細胞）およびｐＢＩＩＸＬＵＣレポータープラスミド（１μｇ／１×１０６細胞）を用い、活発に増殖する細胞を一過的にトランスフェクトした。Dr. Riccardo Dalla-Faveraから贈られたこのプラスミドは、ＨＩＶ／ＩｇＫ（３７）からのＮＦ−カッパＢモチーフから２のコピーを含有する。ＴＨＰ−１細胞を含有するトランスフェクション溶液を３７℃の水浴中にて、７分間インキュベートした。次いで、トランスフェクトされた細胞を１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、ウエルあたり２×１０５細胞の細胞密度にて９６−ウエルプレートで平板培養した。２４時間後、微細藻類抽出物、画分および多糖調製物をトランスフェクトされた細胞に添加した。細胞を収穫し、試料の添加４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。Ｐａｃｋａｒｄフィルタープレートを用いて細胞を収穫し、３０μＬのルシフェラーゼＴＭミックス（１：１、Luciteルシフェラーゼ：１×ＰＢＳ、１ｍＭ  ＣａおよびＭｇ）を用いて溶解させた。LucLiteＴＭルシフェラーゼレポータ遺伝子アッセイキットはＰａｃｋａｒｄ  （Downers Grove, IL）から購入した。発光はＰａｃｋａｒｄマイクロプレートシンチレーションカウンターを用いて測定した。活性化は、陽性対照として用いた１０μｇ／ｍＬ  ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ、血清型０２６：Ｂ６、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）によるＮＦ−カッパＢの最大活性化に対するパーセンテージとして報告される。
【００２２】
グリコシル組成およびグリコシル結合の分析は、The University of Georgia, Complex Carbohydrate Research Centerによって行われた。グリコシル組成は、ＴＭＳ−メチルグリコシドのＧＣ−質量スペクトル分析を用いて決定した。ＴＭＳ−メチルグリコシド手法の間に検出されたＯ−メチル化糖を同定するために、グリコシル組成は酢酸アルジトール手法（３８）を用いても測定した。グリコシル結合分析は、ウロン酸結合を検出するためにカルボキシル−還元と組み合わせて、Ｈａｋｏｍｏｒｉ手法（３９）を用いて行った（４０）。
【００２３】
実施例１−優れた単球活性化特性を呈するＡＦＡ（ＮＰ１６８４７）からの高分子量多糖調製物の初期単離
ＡＦＡ（Cell Tech, Klamath Falls, ORからのロット番号０１１０ＦＡ）からの粗抽出物は、４０℃にて凍結乾燥された物質１２５ｇを７０％エタノールで３回（各々４時間）抽出することによって調製した。水性エタノール抽出を蒸発乾燥させ、次いで、溶媒を水およびクロロホルム（１：１）の間に分配した。活性は専ら水層に見出され、これをさらにｎ−ブタノール（水：ｎ−ブタノール、６３：３７）に対して分配した。より活性な水層（ＥＣ５０＝０．５μｇ／ｍｌ）を、−８０℃にてアルコール沈殿（水：メタノール：エタノール、１：２：３）に２４時間付した。プレ限外濾過物調製物というこの沈殿した物質が０．２μｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有し、３重量％の乾燥ＡＦＡの回収を表した。次いで、この物質を、１００，０００分子量カットオフのポリエーテルスルホン膜（Millipore, Bedford, MAからのCentricon Plus-20）を備えた限外濾過デバイスを通した。保持物を引き続いて３％ＫＣＩ（ｗ／ｖ）で数回洗浄して、（恐らくはイオン相互作用を介して）高分子量物質に付着した不純物を除去した。ポスト−限外濾過調製物という保持物は０．１μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を有し、０．６％の回収を表した。
【００２４】
ポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４７調製物の炭水化物含有量は、４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにおけるフェノール／硫酸での比色アッセイ（４１）を用いて９０％および１００％であると見積もられた。この結果より、この物質が多糖の調製物であると結論された。Galbraith Laboratories, Inc. (Knoxville, TN)によって行われた元素分析により、この物質は以下の元素：４９．１％の炭素、４０．８％の酸素、７．６２％の水素、２．４６％の窒素、痕跡量の硫黄を含有することが明らかとされた。ポスト−限外濾過物についてのグリコシル組成および結合分析を表１に示す。ＮＰ１６８４７は、他の単糖およびアセチル化アミノ糖と共に圧倒的にマンノース、グルコース、４−メチルマンノース、ラムノースおよびメチル化糖残基よりなる。これは、いずれかのタイプの生物学的活性を呈するＡＦＡから単離されたいずれかの多糖の最初の報告である。
【００２５】
ポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４７は，サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて分析した。条件は、モデル６００ＥシステムコントローラーＵＫ６シンジエクターモデル６００溶媒送達系、モデル４０１示差屈折率検出器およびモデル３３９６Ａ  Hewlett-Packardインテグレーターよりなるものであった。分析はＨＰＬＣグレードの水および３０℃に維持されたShodex Ohpak KB-805 SECカラム（３００ｍｍ長×８ｍｍＩＤ）を用い、１ｍＬ／分の流速で行った。このカラムは４００万ダルトンの推定分子量まで分子を分離することができる。ポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４７の分析は、ボイド容量で溶出する１つのピーク（図１）を示し、デキストラン標準との比較に基づき２００万ダルトンを超える見かけの分子量と合致する保持時間を有する。
【００２６】
ＡＦＡ多糖の精製について実施例１に記載した手法は新規である。というのは、初期抽出は，熱水を使用する先行技術と比較して７０％エタノールを用いるからである。他の食品グレードの微細藻類からの免疫刺激多糖の抽出のためのこの手法を用いることができるかを判断するために、実施例１に記載した手法を食品補充物として通常は消費される２種の他の微細藻類、すなわち、Chlorella pyrenoidosaおよびSpirulina platensisに適用した。
【００２７】
実施例２−優れた単球活性化特性を呈するChlorella pyrenoidosa（ＮＰ１６８４８）からの高分子量多糖調製物の初期単離
Chlorella（Sun Chlorella, Torrance, CAからのロット番号ＶＰ０９７８）からの粗抽出物は、４０℃にて凍結乾燥された物質（３５ｇ）を７０％エタノールで３回各々４時間）抽出することによって調製した。この粗抽出物は２５μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を有した。水性エタノール抽出物を蒸発乾燥させ、次いで、溶媒を水およびクロロホルム（１：１）の間に分配した。活性は専ら水層に見出され、これをさらｎ−ブタノール（水：ｎ−ブタノール、６３：３７）に対して分配した。より活性な水層を−８０℃にてアルコール沈殿（水：メタノール：エタノール、１：２：３）に２４時間付した。次いで、沈殿物質を１００，０００分子量カットオフのポリエーテルスルホン膜（Millipore, Bedford, MAからのCentricon Plus-20）を備えた限外濾過デバイスを通した。保持物を引き続いて３％  ＫＣＩ（ｗ／ｖ）で数回洗浄して、（おそらくはイオン相互作用を介して）高分子量物質に付着した不純物を除去した。ポスト−限外濾過物質は０．３μのＥＣ５０値を有し、０．２％の回収を表した。
【００２８】
ポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４８調製物の炭水化物組成は、４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにおけるフェノール−硫酸への比色アッセイ（４１）を用いて９０％および１００％の間であると見積もられた。この結果から、この物質は多糖の調製物であると結論される。ポスト−限外濾過物のグリコシル組成および結合分析を表２に示す。ＮＰ１６８４８は、他の単糖アセチル化アミノ糖と共に、圧倒的にアラビノース、ガラクトース、ラムノースおよびメチル化糖残基よりなる。Chlorella種からの他の免疫刺激多糖および水溶性抽出物が文献に報告されているが、ＮＰ１６８４８は新規な組成である。
【００２９】
実施例１に記載されたＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー手法を用いて分析したポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４８は、ボイド容量に溶出した１つのピークを含むことが見出され（図２）、デキストラン標準との比較に基づき２００万ダルトンを超える見かけの分子量と合致する保持時間を有した。
【００３０】
実施例３−優れた単球活性化特性を呈するSpirulina platensis（ＮＰ１６８４６）からの高分子量多糖調製物の初期単離
Spirulina（Triarco Industries, Wayne, NJからのロット番号Ｂ１６９３３）からの粗抽出物は、４０℃にて、凍結乾燥された物質３５ｇを７０％エタノールで３回（各々４時間）抽出することによって調製した。この粗抽出物は、５０μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を有した。水性エタノール抽出物を蒸発乾燥させ、次いで，水およびクロロホルム（１：１）の間に分配した。活性は専ら水層に見出され、これをさらにｎ−ブタノール（水：ｎ−ブタノール、６３：３７）に対して分配した。水層はより活性であり、−８０℃にてアルコール沈殿（水：メタノール：エタノール、１：２：３）に２４時間付した。次いで、沈殿物質を、１００，０００分子量カットオフのポリエーテルスルホン膜（Millipore, Bedford, MAからのCentricon Plus-20）を備えた限外濾過デバイスに通した。保持物を引き続いて３％ＫＣＩ（ｗ／ｖ）で数回洗浄して、（おそらくはイオン相互作用を介して）高分子量物質に付着した不純物を除去した。ポスト−限外濾過物質は０．３ｕｇ／ｍＬのＥＣ５０値を有し、０．１％の回収を表した。
【００３１】
ポスト−限外濾過物Spirulina調製物の炭水化物含有量は、４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにおけるフェノール−硫酸での比色アッセイ（４１）を用いて９０％および１００％の間であると見積もられた。この結果より、この物質は多糖の調製物であると結論される。ポスト−限外濾過物についてのグリコシル組成および結合分析を表３に示す。ＮＰ１６８４６は、他の単糖、ウロン酸およびアセチル化アミノ糖と共に、圧倒的に、ラムノース、グルクロン酸、フコース、ガラクトースおよびメチル化糖よりなる。Spirulina種からの同様のグリコシル組成を持つ他の多糖は文献に報告されているが、ＮＰ１６８４６よりもサイズがかなり小さい。
【００３２】
実施例１に記載したＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー手法を用いて分析したポスト−限外濾過ＮＰ１６８４６は、ボイド容量で溶出する１つのピークを含むことが判明し（図３）、デキストラン標準との比較に基づき２００万ダルトンを超える見かけの分子量と合致する保持時間を有した。
【００３３】
単球／マクロファージの活性化
プロ炎症サイトカインＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルを測定して、微細藻類多糖調製物によるＴＨＰ−１単球／マクロファージ活性化を確認した。また、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのｍＲＮＡレベルの変化の特異性を決定するための対照として、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルをアッセイした。ＧＡＰＤＨはハウスキーピング遺伝子であるので、人工的に変化が誘導されない限り、ｍＲＮＡレベルは一定なままであると予測されよう。
【００３４】
ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＧＡＰＤＨ用のＲＴ−ＰＣＲプライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．  （Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。プライマーについての配列はＳｕらに記載されている（４２）。ＩＬ−１β順方向（５’−ＡＴＧ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＧＴＡ−ＣＣＴ−ＡＡＧ−ＣＴＣ−ＧＣ−３’）；  ＩＬ−１β逆方向（５’−ＡＣＡ−ＣＡＡ−ＡＴＴ−ＧＣＡ−ＴＧＧ−ＴＧＡ−ＡＧＴ−ＣＡＧ−ＴＴ−３’）；ＴＮＦ−α順方向（５’−ＧＡＧ−ＴＧＡ−ＣＡＡ−ＧＣＣ−ＴＧＴ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＴＧＴ−ＴＧＴ−ＡＧＣ−３’）；  ＴＮＦ−α逆方向（５’−ＧＣＡ−ＡＴＧ−ＡＴＣ−ＣＣＡ−ＡＡＧ−ＴＡＧ−ＡＣＣ−ＴＧＣ−ＣＣＡ−ＧＡＣ−Ｔ−３’）；  ＧＡＰＤＨ順方向（５’−ＴＧＡ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＧＡＧ−ＴＣＡ−ＡＣＧ−ＧＡＴ−ＴＴＧ−ＧＴ−３’）；  ＧＡＰＤＨ逆方向（５’−ＣＡＴ−ＧＴＧ−ＧＧＣ−ＣＡＴ−ＧＡＧ−ＧＴＣ−ＣＡＣ−ＣＡＣ−３’）。
【００３５】
活発に増殖するＴＨＰ−１細胞（３ｍＬ，１×１０６細胞／ｍＬ）を、テスト物質の存在下で２時間インキュベートした。フェノールおよびチオシアン酸グアニジンの組み合わせを用いて細胞を溶解させるＴＲＩ  ＲｅａｇｅｎｔＲキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を用いて、全ＲＮＡを単離した。ブロモクロロプロパンの添加の後、ＲＮＡを水性相に分離し、引き続いて、イソプロパノールで沈殿させた。この方法を用いて回収された全ＲＮＡは約３０μｇであった。０．８％アガロースゲルを用いて単離されたＲＮＡの電気泳動は、汚染ＤＮＡの兆候を示さなかった。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲ反応はＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのキット試薬を用いて行った。各反応は以下の成分（３０μＬの全容量）：  ６μＬ  ＡＭＶ／Ｔｆｌ  ５×反応緩衝液、０．６μＬ  ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）、１．２μＬ  ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）、０．６μＬ  ＡＭＶ逆転写酵素（５ユニット／μＬ）、０．６μＬ  Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／μＬ）、１．２μＬの各プライマー（１５ピコモル／μＬ）および２ｎｇの全ＲＮＡ（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）または５ｎｇの全ＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲプロトコルはＴｅｃｈｎｅ  Ｕｎｉｔ  Ｐｒｏｇｅｎｅ自動熱サイクラーを用いた。最初のサイクルは４８℃にて４５分間、引き続いての９４℃にて２分間よりなるものであった。増殖は３５サイクルの：４５秒間の９４℃での変性、１分間の６０℃でのアニーリング、および２分間の６８℃での伸長を用いて達成された。最終サイクルは試料を６８℃にて７分間保持した。ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動（ｍＲＮＡ  ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＧＡＰＤＨ）は、染色剤として用いた臭化エチジウムを含む５％ポリアクリルアミドゲルで１２μＬの反応ミックスを用いて達成された。
【００３７】
ＬＰＳまたは微細藻類多糖調製物いずれかでのＴＨＰ−１細胞の処理の結果、対照と比較して、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡ（８１０ｂｐ）およびＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ（４４４ｂｐ）双方における劇的な増加をもたらした。ハウスキーピンググリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ，１０００ｂｐ）のｍＲＮＡレベルは、全ての試料につき同一であった（図４）。
【００３８】
ＮＰ１６８４７、同じくＮＰ１６８４８およびＮＰ１６８４６による観察されたＮＰ−カッパＢの活性化は、調製物のエンドトキシン汚染によるものではなかった。これは、この可能性を調べるために行った以下の２つの実験の結果によって確認された。まず、各多糖調製物（０．１ないし１μｇ／ｍＬ）と組み合わせて、ポリミキシンＢ（１０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加して、ＮＦ−カッパＢの活性化にいずれかの抑止があるか否かを観察した。ポリミキシンＢは、当該分子の脂質Ａ部分に結合することによってＬＰＳの生物学的効果の多くをブロックすることが知られているポリカチオン性抗生物質である。全ての３種の微細藻類多糖調製物はポリミキシンＢ付加に対して非感受性であった（データは示さず）。ポリミキシンＢのＬＰＳへの添加（１０μｇ／ｍＬ）は、７５％だけＮＦ−カッパＢ活性化を抑制した。可能なエンドトキシン−媒介効果を調べるのに用いた第２の実験は、グリコシル組成分析においてβ−ヒドロキシミリステートの存在を探すものであった。ＮＰ１６８４８およびＮＰ１６８４６の試料調製物には検出可能なβ−ヒドロキシミリステートはなかった。かくして、ＮＰ１６８４８およびＮＰ１６８４６により観察されたマクロファージ活性化はエンドトキシンによるものである。
【００３９】
しかしながら、ＮＰ１６８４７の２つの異なる試料調製物において、少量のβ−ヒドロキシミリステート  （全ピーク面積の０．６％）が検出された。どれくらい多く「エンドトキシン−様」物質が存在するかを測定するために、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ溶解物（ＬＡＬ）アッセイを用いて、ＡＦＡの６つの試料を分析した（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤによって行われた分析）。このアッセイを用いて検出したＬＡＬ陽性物質の量は、０．００２％の微細藻類乾燥重量を表した。比較によると、ＮＰ１６８４７のパーセント回収は約３００倍大きかった（微細藻類乾燥重量の０．６％）。これは、ＮＰ１６８４７（１００ｎｇ／ｍＬ）による半最大ＮＦ−カッパＢ活性化を生じさせるのに必要な全ての濃度において、潜在的ＬＡＬ陽性物質の全量は３００ｐｇ／ｍＬ）であろう。エンドトキシンのこの濃度は、マクロファージアッセイ系を用いて検出できないであろう。従って、可能なエンドトキシンの濃度は、マクロファージ活性化に対するＮＰ１６８４７の刺激効果を説明することができない。
【００４０】
実施例１ないし３は、優れた免疫刺激活性を持つ多糖調製物が、４０℃の７０％エタノールを用いて食品グレードの微細藻類から抽出できることを示す。これらの多糖調製物の単離における引き続いての工程は、複雑なプロトコルおよび有機溶媒の使用に関連していた。多糖は、伝統的には、その高い水溶解度により、熱水を用いて天然源から抽出される。従って、この熱水単離手法は、７０％エタノールを用いる初期抽出と比較して、これらの多糖のより高いパーセント回収を生じると期待されるであろう。加えて、熱水は非極性物質を含有するようではないので、もしこの方法が首尾よいことが証明されても、有機溶媒分配を用いる必要はなかろう。しかしながら、予測された挙動とは反対に、水抽出（実施例４ないし６）が、水性エタノールを用いる手法よりも実質的に活性が低く（実施例１）、さらなる問題を付け加える。
【００４１】
ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー分析および免疫刺激活性（マクロファージ活性化）双方は、先の実施例に記載したごとく測定した。各実施例で用いた微細藻類は、Ｋｌａｍａｔｈ  Ａｌｇａｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｋｌａｍａｔｈ  Ｆａｌｌｓ，ＯＲから得た凍結乾燥ＡＦＡ（ロット０４１９００  Ｍｅｒｃ）であった。限外濾過（用いる場合）は、１００，０００分子量カットオフのポリエーテルスルホン膜  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたデバイスを用いて行った。各実験では、限外濾過からの保持物質を３％  ＫＣｌ  （Ｗ／Ｖ）で数回洗浄して、（おそらくはイオン相互作用を介して）高分子量物質に付着した不純物を除去した。
【００４２】
実施例４−４０℃水抽出およびアルコール沈殿でのフィコシアニン除去
４０℃におけるＡＦＡの水抽出は問題だった。なぜならば、この粗抽出物は大量のフィコシアニン（青色の蛋白質性色素）を含有したからである。限外濾過によってフィコシアニンを除去しようとする試みは不成功に終わった。というのは、この物質は１００，０００−ダルトン分子量カットオフフィルターにおいてＮＰ１６８４７多糖調製物と共に保持された。アルコールによるフィコシアニン物質の完全な沈殿は、７０％エタノールまたはそれよりも高いエタノールの溶液を必要とする（データを示さず）。この方法を評価するために、１０ｇの凍結乾燥ＡＦＡを４０℃にて各時間４および８時間の間水（各回６２．５ｍＬ）で３回抽出した。粗製水抽出物を凍結乾燥し、４０ｍＬの水に再溶解させた。室温でエタノールを添加し（９２ｍＬ）、７０％エタノールの最終濃度を達成した。沈殿物質（フィコシアニン含有）を除去し、上澄みを限外濾過デバイスに通した。単離手法における各工程での物質を、マクロファージ活性化につき評価した（図５）。明らかに、７０％エタノール沈殿の間に、免疫刺激活性の大部分は沈殿物では失われた。この方法を用いてのポスト−限外濾過物質（１００，０００ダルトンを超える）のパーセント回収は１．０％であった。このパーセント回収は、実施例１の７０％エタノール抽出手法を用いるポスト−限外濾過の０．６％回収よりも高いが、この物質はＮＰ１６８４７以外に他の物質を含有する。というのは、それは１０００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値を有したからである。比較により実施例１からの物質は１００ｇ／ｍＬのＥＣ５０値を有する。
【００４３】
実施例５−４０℃水抽出および硫酸アンモニウムでのフィコシアニン除去
フィコシアニンの単離のための方法（４３，４４）は、典型的には、硫酸アンモニウム沈殿（４０−６５％飽和）を用いる。このプロトコルは、硫酸アンモニウム沈殿が粗抽出物からフィコシアニンを選択的に除去できるか否かを評価するのを調べるものであった。凍結乾燥したＡＦＡ（１０ｇ）を４０℃にて水（各回６２．５ｍＬ）で３回、各回４および８時間の間抽出した。粗水抽出物を凍結乾燥し、４８ｇの硫酸アンモニウム（５０％飽和）を含有する４０ｍＬの水に再溶解させた。沈殿可能な物質（フィコシアニンを含有）を除去し、上澄みを限外濾過デバイスに通した。ポスト−限外濾過物質のパーセント回収は１．３２％であったが、おそらくは、ＮＰ１６８４７をほとんど含んでいなかった。というのは、その比活性はかなり低かったからである（ＥＣ５０＞１０００ｎｇ／ｍＬ）。図６は、単離手法における各工程での物質の免疫刺激活性をまとめる。従来のアプローチと同様に、ＮＰ１６８４７の大部分は、硫酸アンモニウムの沈殿によりフィコシアニンと共に沈殿した。
【００４４】
明らかに、粗水抽出物中のＮＰ１６８４７からフィコシアニンを分離しようとする試みは成功しなかった。加えて、高温での水性エタノール（例えば、５０％エタノール／６０℃）を用いるｍａｒｃ物質の再抽出（４０℃水抽出からの残余物）の結果、実質的な量のＮＰ１６８４７が単離された（実施例４３参照）。かくして、４０℃での水の抽出はＮＰ１６８４７の完全な回収を提供しなかった。
【００４５】
実施例６−７０℃熱水抽出
７０℃のごときより高い温度での水抽出はフィコシアニンを変性させ沈殿させ、ＮＰ１６８４７および他の極性分子を溶液中に残すであろう。このアプローチを評価するために、２０ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを、７０℃にて、水（各回１２５ｍＬ）で３回、各回４および８時間の間抽出した。この粗抽出物は、青色の欠如によって示されるごとく、いずれのフィコシアニン物質も含有しない量であった。粗水抽出物を凍結乾燥し、８０ｍＬの水に再溶解させた。−２０℃にて、アルコール（水：メタノール：エタノール、１：２：３）を用いてＮＰ１６８４７を２４時間沈殿させた。沈殿可能な物質を限外濾過デバイスに通した。図７は、単離手法における各工程での物質の免疫刺激活性をまとめる。ポスト−限外濾過物質（２００ｎｇ／ｍＬ）のマクロファージ活性化についてのＥＣ５０は、実施例１で得られた物質（１００ｎｇ／ｍＬ）よりもわずかに高かった。この方法を用いて得られたポスト−限外濾過物質のパーセント回収は１．７４％であり、実施例１の７０％エタノール手法から得られた０．６％のＮＰ１６８４７回収よりも実質的に高かった。従って、７０℃水での抽出は、ポスト−限外濾過物質の匹敵するＥＣ５０値によって示されるごとくＮＰ１６８４７の約３倍多く回収する。
【００４６】
（７０℃における）熱水抽出を用いるＮＰ１６８４７の単離は、実施例１における単離手法よりもいくつかの利点を供する。有機溶媒は用いられず、最終物質を得るのに数工程を必要としたにすぎず、約３倍多くのＮＰ１６８４７が抽出される。しかしながら、いくつかの不利がある。まず、粗水抽出物は、それを濃縮して沈殿物中の過剰に高い容量のアルコールを回避するのに凍結乾燥されなければならない。第２に、プレ−限外濾過物に、（図７における約５００ｎｇ／ｍＬの低いＥＣ５０値およびＨＰＬＣクロマトグラムによって示されるごとく）実質的な量の不活性な物質を含有し、この結果、限外濾過デバイスを用いて非常に遅い精製の結果となる。
【００４７】
実施例１に記載した７０％エタノール抽出手法に対する修飾に基づき、いくつかのさらなる方法を評価した。以下の実施例は単離手法を記載し、ここに、有機溶媒の使用は必要とされず、単離は限定された数の工程で達成される。熱水抽出に伴う全ての問題を克服する単純で、経済的かつ効果的なプロセスが開発された。
【００４８】
実施例７−クロロホルム分配での４０℃における７０％エタノール抽出
実施例１におけるＮＰ１４８４７の抽出では、ｎ−ブタノールおよび水の間の第２の溶媒分配工程の結果、免疫刺激活性がブタノール層に実質的に失われた。従って、実施例１におけるプロトコルを、ｎ−ブタノール溶媒分配工程を除くように修飾した。この新しい方法は、クロロホルムおよび水（１：１）の間のただ１つの溶媒分配があることを除き実施例１における手法と同一である。図８は、単離プロセスにおける各工程での単離スキームおよび免疫刺激活性をまとめる。この方法を用いて得られたポスト−限外濾過物質（２００ｎｇ／ｍＬ）についてのＥＣ５０値は、実施例１で得られた物質（１００ｎｇ／ｍＬ）よりもわずかに高かった。この手法を用いて得られたポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７のパーセント回収は１．９７％であった。従って、７０％エタノール抽出手法（実施例１）からブタノール溶媒分配工程を除くと、３倍以上にポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７の回収を増強させた。しかしながら、この手法の主な不利は、有機溶媒分配におけるクロロホルムの使用である。
【００４９】
実施例８−４０℃における７０％エタノール抽出および直接的アルコール沈殿
ブタノールおよびクロロホルム分配双方をスキップするアプローチを評価するために、４０℃にて、１０ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを７０％エタノール（各回１２５ｍＬ）で２回抽出した。第１回の抽出は３時間であり、第２の抽出は１２時間であった。粗７０％エタノール抽出物を−２０℃にて数時間貯蔵し、沈殿可能な物質を遠心によって除去した。沈殿を冷９５％エタノールで洗浄して、（残存する非極性物質を除去し、）水に再溶解させ、次いで、限外濾過デバイスに通した。図９は、単離手法における各工程での物質の免疫刺激活性をまとめる。ポスト−限外濾過物質のＥＣ５０値は、実施例１で得られた物質（１００ｎｇ／ｍＬ）と比較してわずかに高かった（２００ｎｇ／ｍＬ）。ポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７のパーセント回収は１．２％であった。この収率は、実施例１に記載した抽出手法を用いて得られたものよりも２倍高かったが、実施例７におけるプロトコルを用いて得られた回収よりも約３０％低い。このより低い収率が、おそらくは、７０％エタノールにおける不完全な沈殿のためである。
【００５０】
実施例９−４０℃における７０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
以前の方法（実施例８）を、ＮＰ１６８４７のより大きな回収が得られるようにわずかに修飾した。７０％エタノール抽出からの粗抽出物を、冷１００％エタノールの添加によって８０％エタノールに調整し、−２０℃にて数時間貯蔵した。沈殿可能な物質を前記したのと同様に処理した。図１０は、単離プロセスにおける各工程での単離スキームおよび免疫刺激活性をまとめる。この修飾された方法の結果、プレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の５．７％回収および単球活性化アッセイにおける２００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた。ポスト−限外濾過物質のパーセント回収は１．８％であった。ポスト−限外濾過物質（２００ｎｇ／ｍＬ）についてのＥＣ５０値は、実施例１で得られた物質（１００ｎｇ／ｍＬ）につき観察されたものよりもわずかに高かったが、実施例６および７から得られたポスト−限外濾過値と同一であった。
【００５１】
粗７０％エタノール抽出物（実施例９）からのＮＰ１６８４７多糖調製物の直接的沈殿の手法は、元来の目的を首尾よく達成する。有機溶媒（またはメタノール）は用いず、凍結乾燥／溶媒蒸発工程はなく、ＮＰ１６８４７の比較的純粋な調製物を得るのに数工程が必要なのにすぎない。ＮＰ１６８４７の半純粋調製物（その７０％は１００，０００ダルトン未満である）は、限外濾過精製工程（図１０ではプレ−およびポスト−限外濾過ＨＰＬＣクロマトグラムという）を排除して得ることができた。このプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物は、ダイエット補充物（植物学上の）抽出物で十分であろう。この物質の単離は、粗７０％エタノール抽出物からの直接的アルコール沈殿を必要とするに過ぎないであろう。
【００５２】
なぜこの単離手法（実施例９）がテストした他のものよりも優れているかを以下の点にまとめる。
【００５３】
１．  ４０℃における水抽出
ａ．限外濾過によって、またはエタノールもしくは硫酸アンモニウム沈殿によってＮＰ１６８４７から分離することができない高レベルのフィコシアニンを含有する。
ｂ．限外濾過に従って得られたＮＰ１６８４７は、低い特異的活性のものであった。ＥＣ５０〜１０００ｎｇ／ｍＬ−対−２００ｎｇ／ｍＬ（実施例９）。
ｃ．ｍａｒｃ物質は、この温度の水抽出を用いて回収することができない実質的な量のＮＰ１６８４７を含有した（実施例４３参照）。
【００５４】
２．７０℃における水抽出
ａ．この温度での水抽出は、プレ−限外濾過物中に過剰量の不活性な極性物質を含有する。これは２つの理由で望ましくない。まず、プレ−限外濾過抽出物の開発は低レベルのＮＰ１６８４７を含まないであろう。第２に限外濾過は、ポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物を得るのに極端に遅い。
ｂ．該手法は毒性有機溶媒を使用しないが、それは粗抽出物の凍結乾燥工程を必要とする。
【００５５】
３．７０％エタノール抽出、引き続いての有機溶媒分配
ａ．明らかに、この溶媒の主な不利は、非極性物質を除去するための有機溶媒（すなわち、クロロホルム）の使用である。
【００５６】
前記した実施例から、最適な一般的手法（実施例９）は、凍結乾燥されたＡＦＡの４０℃における７０％エタノールでの２回の初期抽出を含む。粗抽出物を８０％エタノールに調整し、−２０℃に冷却する。沈殿を収集し、冷９５％エタノールで洗浄して、残存する物質を親油性除去する〜３０％のプレ−限外濾過多糖調製物を含む高分子量物質（１００，０００ダルトンを超える）は、限外濾過を用いて単離することができる。以下に実施例９で得られたＮＰ１６８４７調製物および７０％エタノール／４０℃での抽出（実施例１）によって調製されたＮＰ１６８４７の間の比較を示す：
【００５７】
【表１】
2004502737.tif 000001
【００５８】
これらのデータは、実施例９における手法を用いてＡＦＡを抽出した結果、２倍以上のプレ−限外濾過物および３倍以上のポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４７がもたらされることを示す。しかしながら、この手法によって得られたポスト−限外濾過抽出物のＥＣ５０値は実施例１から得られたものよりもわずかに高く、これは、増強された回収のいくつかは不活性な物質によることを示す。従って、実施例９で用いた条件は、この新しい単離方法によって提供される以下の利点のため、ＮＰ１６８４７調製物の特異的活性を改良するさらなる最適化のための出発点として選択した：
【００５９】
１．プレ−およびポスト−両限外濾過ＮＰ１６８４７多糖調製物の最適収率および良好な特異的活性
２．毒性有機溶媒は用いない。
３．大容量の水または溶媒の回転蒸発または凍結乾燥は関与しない。
【００６０】
実施例１０ないし３８は、実施例９で用いた条件を最適化するための、抽出温度およびエタノール温度双方を変化させる詳細な分析を供する。
【００６１】
実施例１０−５０℃における７０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを５０℃にて７０％エタノールで抽出し、最初は７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．２ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は、冷１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空下で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬ）にて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいて、プレ−限外濾過物ＮＰ１６８４７調製物の６．５％回収、および１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００６２】
実施例１１−６０℃における７０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを６０℃にて７０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．２ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は、冷１００％エタノールの添加によって８０％まで調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空下で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬで水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいて、プレ−限外濾過物ＮＰ１６８４７調製物の７．１％回収および１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００６３】
実施例１２−７０℃における７０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを７０℃にて７０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方からの上澄みを遠心により合わせた（１１．４ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は、冷１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空下で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにより、プレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の７．１％回収および７５ｍｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。低分子量物質（＜１００，０００ダルトン）の除去の結果、ポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の２．７％回収および約３５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた。
【００６４】
実施例１３−８０℃における７０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを８０℃にて７０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．２ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の７．６％回収および５０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）
【００６５】
実施例１４−２３℃における７０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを２３℃にて７０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．５ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の４．５％回収および＞２５０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００６６】
実施例１５−２３℃における６０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを２３℃にて６０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．３ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の７．５％回収および＞２５０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００６７】
実施例１６−４０℃における６０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを４０℃にて６０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．２ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の８．４％回収および２００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００６８】
実施例１７−５０℃における６０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを５０℃にて６０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．０ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の９．４％回収および１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００６９】
実施例１８−６０℃における６０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを６０℃にて６０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．４ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の９．５％回収および１００ｍｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。低分子量物質（＜１００，０００ダルトン）の除去の結果、ポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の３．５％回収および約７５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた。
【００７０】
実施例１９−７０℃における６０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを７０℃にて６０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．２ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１０．０％回収および５０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００７１】
実施例２０−８０℃における６０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを８０℃にて６０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．２ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１１．２％回収および２５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００７２】
実施例２１−２３℃における５０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを２３℃にて５０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．３ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の９．１％回収および２００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００７３】
実施例２２−４０℃における５０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを４０℃にて５０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．３ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の８．９％回収および１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００７４】
実施例２３−５０℃における５０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを５０℃にて５０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．１ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の９．４％回収および７５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００７５】
実施例２４−６０℃における５０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを６０℃にて５０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．４ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１０．８％回収および２５ｍｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。低分子量物質（＜１００，０００ダルトン）の除去の結果、ポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物４．５％回収および約２０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた。
【００７６】
実施例２５−７０℃における５０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを７０℃にて５０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．４ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１０．２％回収および２５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。低分子量物質（＜１００，０００ダルトン）の除去の結果、ポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物５．６％回収および約２０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた。
【００７７】
実施例２６−８０℃における５０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを８０℃にて５０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．２ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１１．７％回収および２５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００７８】
実施例２７−２３℃における４０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを２３℃にて４０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．３ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１１．４％回収および＞２５０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００７９】
実施例２８−４０℃における４０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを４０℃にて４０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．４ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１０．７％回収および１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００８０】
実施例２９−５０℃における４０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを５０℃にて４０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．０ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１０．３％回収および１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００８１】
実施例３０−６０℃における４０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを６０℃にて４０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．４ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１０．８％回収および５０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。低分子量物質（＜１００，０００ダルトン）の除去の結果、ポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の３．３％回収および約２５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた。
【００８２】
実施例３１−７０℃における４０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを７０℃にて４０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．４ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１１．１％回収および５０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００８３】
実施例３２−８０℃における４０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを８０℃にて４０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．３ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１２．６％回収および５０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。低分子量物質（＜１００，０００ダルトン）の除去の結果、ポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の６．２％回収および約３０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた。
【００８４】
実施例３３−２３℃における３０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを２３℃にて３０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．２ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１３．７％回収および２００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００８５】
実施例３４−４０℃における３０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを４０℃にて３０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．３ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１３．８％回収および１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００８６】
実施例３５−５０℃における３０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを５０℃にて３０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．１ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１０．９％回収および１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００８７】
実施例３６−６０℃における３０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを６０℃にて３０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．２ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１０．５％回収および１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００８８】
実施例３７−７０℃における３０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを７０℃にて３０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．１ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１１．０％回収および７５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００８９】
実施例３８−８０℃における３０％エタノール抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを８０℃にて３０％エタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで３時間、次いで、６．２５ｍＬで１２時間行った。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．１ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって収集し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空化で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、単球活性化アッセイにおいてプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１１．９％回収および７５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値がもたらされた（表４）。
【００９０】
表４は、前記した終点に対する温度および初期抽出の間に用いたエタノール濃度双方の影響をまとめる。各抽出条件の有効性を評価するのに用いた終点は、そのＥＣ５０値に加えて、プレ−限外濾過物のパーセント回収であった。プレ−限外濾過物質を、ダイエット補充物または医薬製剤いずれかとしてのその潜在的用途のため、これらの分析につき選択した。限外濾過工程の排除は、単離手法の実質的単純化を代表するであろう。
【００９１】
実施例９で用いた条件（７０％エタノール／４０℃）の結果、プレ−濾過物ＮＰ１６８４７の５．７％回収がもたらされ、ＥＣ５０値は２００ｎｇ／ｍＬであった。初期抽出の間での７０％エタノールの存在とカップリングさせた４０℃を超えて上昇させる抽出温度は、ＮＰ１６８４７多糖調製物の回収および特異的活性を改良した。しかしながら、７０％エタノール、またはいずれかの他の濃度のエタノールと共に、４０℃ないし２３℃の抽出温度は、より低いＥＣ５０値をもたらさなかった。この温度（２３℃）において、回収はより低いエタノールの濃度において増強された。この増大した回収の一部は、おそらくは、物質の増強された青色によって証明されるごとくフィコシアニンのより効果的な抽出によるものであった。７０％エタノールを用いるより高い温度での抽出は回収をわずかに増強し、特異的活性を実質的に増加させた（例えば、７０％エタノール／８０℃）。４０℃を超えるいずれかの温度での５０％エタノールを用いる抽出の結果、他のエタノール濃度と比較して、より低いＥＣ５０値をもたらした。５０％エタノールを超えるおよびそれ未満のエタノール濃度において、特異的活性は、一般に、各温度条件で検証した。５０％を超えるおよびそれ未満のエタノール濃度は回収に対して悪影響を有し；回収はより高いエタノールと共に減少したが、（５０℃以下の温度において）より低い濃度と共にわずかに増加した。５０％よりも高いエタノール濃度における減少した特異的活性とカップリングさせたより低い回収は、ＮＰ１６８４７がこれらの条件下であまり抽出されないことを示唆する。５０％未満のエタノール濃度では、減少した特異的活性とカップリングさせたより高い回収は、より不活性な物質がＮＰ１６８４７と共に抽出されることを示唆する。３０％および４０％エタノールでの６０℃未満の温度にて、この不活性物質の一部は、再度、沈殿の増強された青色によって証明されるごとく、フィコシアニンのより効果的な抽出によるものであるらしい。
【００９２】
５０％エタノールにおける４０℃ないし８０℃の表４の領域は、最適な回収および特異的な活性双方についての条件を表す。より好ましい温度範囲は６０℃および７０℃の範囲である（実施例２４および２５）。なぜならば、８０℃、４０％ないし６０％エタノール抽出条件に由来するプレ−およびポスト−限外濾過物質双方のさらなる分析は実質的な量の水不溶性物質を示したからである。これらの最適条件は、４．５％および５．６％の間のポスト−限外濾過物回収（実施例１からの初期の７０％エタノール／４０℃条件の７．５ないし９．３倍）および約２０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値（７０％エタノール／４０℃条件よりも５倍小さい）を生じる。
【００９３】
実施例３９−より短い抽出時間
表４中のデータが、各条件下において、２回（最初は２時間および第２に１２時間）抽出した物質について収拾した。ＮＰ１６８４７の大規模な抽出につき最適化するために、各々１時間のより短い抽出時間をテストし、回収および特異的活性双方の点で同等であることが判明した。
【００９４】
実施例４０−９５℃における３０分間の単一熱水抽出
他のタイプの微細藻類（１７，２７）からの免疫刺激多糖の単離のための選考技術手法は、典型的には、９５℃における３０分間の単一熱水抽出を含む。この方法を評価するために、１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを９５℃において３０分間２０ｍＬの水で１回抽出した。水抽出物を８０％エタノールに調整し、−２０℃において数時間インキュベートした。収集された沈殿は１２．１％の回収を表したが、ＮＰ１６８４７はほとんど含有していなかった。というのは、この物質のＥＣ５０は約５００ｎｇ／ｍＬであったからである。限外濾過の結果、５．１％の回収がもたらされ、特異的活性の変化はもたらされなかたった。明らかに、これらの条件はＮＰ１６８４７のＡＦＡからの抽出に適していない。
【００９５】
実施例４１−４℃における水抽出、続いての５０％エタノール／６０℃での再抽出
汚染性極性物質は、ＮＰ１６８４７の実質的喪失なくして初期水抽出によって選択的に除去できる可能性がある。２段階の抽出手法をテストして、このアプローチを評価した。最初の段階は、４℃におけるＡＦＡの初期水抽出、続いての最適条件における（５０％エタノール／６０℃）ＡＦＡの第２段階再抽出を含む。この方法を用いるＮＰ１６８４７の特異的活性は最適条件単独と匹敵したが、回収はプレ−およびポスト−限外濾過物双方につき約７０％少なかった。
【００９６】
実施例４２−２３℃における水抽出、引き続いての５０％エタノール／６０℃での再抽出
抽出温度を４℃から２３℃に上昇させることによって、実施例４１で用いた手法をわずかに修飾した。かくして、第１の抽出は、２３℃におけるＡＦＡの初期水抽出、続いての最適条件（５０％エタノール／６０℃）におけるＡＦＡの第２段階再抽出を含んだ。結果は実施例４１におけるものと同様であった（すなわち、特異的活性は最適条件に匹敵したが、回収はプレ−およびポスト−限外濾過物双方に尽き約７０％少なかった）。
【００９７】
実施例４３−４０℃における水抽出、続いての５０％エタノール／６０℃での再抽出
抽出温度を４℃から４０℃に上昇させることによって、実施例４１で用いた手法をわずかに修飾した。かくして、第１の抽出は、４０℃におけるＡＦＡの初期水抽出、続いての最適条件（５０％エタノール／６０℃）におけるＡＦＡの第２の再抽出を含んだ。結果は実施例４１におけるものと同様であった（すなわち、特異的活性は最適条件と匹敵したが、回収はプレ−およびポスト−限外濾過物双方につき約７０％低かった）。
【００９８】
実施例４４−７０％エタノール／４０℃での抽出、引き続いての５０％エタノール／６０℃での再抽出
汚染性非極性物質が、ＮＰ１６８４７の実質的喪失なくして、初期エタノール抽出によって選択的に除去できる可能性がある。このアプローチを評価するために、２段階抽出手法をテストした。第１の段階は、４０℃における７０％エタノールでのＡＦＡの初期抽出、続いての最適条件（５０％エタノール／６０℃）におけるＡＦＡの第２段階再抽出を含んだ。この手法は、ポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４７につき、実施例２４および２５よりもわずかに良好なＥＣ５０値（１０ｎｇ／ｍＬ）を与えたが、回収は１．０％に過ぎなかった。プレ−限外濾過物は２．２％の回収であり、ＥＣ５０値は２０ｎｇ／ｍＬであった。
【００９９】
精製されたＮＰ１６８４７の１つの特性は、それがポリプロピレンピペットの先端に密着するようであったことである。系列希釈の間における物質のキャリオーバーによって引き起こされた過大評価ＥＣ５０値を回避するために、ピペットの先端を各希釈の間で交換した。
【０１００】
限外濾過の前後におけるＮＰ１６８４７のクロマトグラフィー分析を図５ないし１１に示す。実施例１に概略を説明した手法を用いて単離したＮＰ１６８４７調製物は、一般に、広い単一ピークとして溶出した（図１）。しかしながら、修飾された手法を用い（実施例４ないし９）、ポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４７は、３つのピークであるように見えるものを含有する広い領域として溶出した（図５ないし１０参照）。しかしながら、この三重ピークの特徴は、これらのポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４７調製物を水：クロロホルム（１：１）の間に溶媒分配することによって、広い１つのピークに変化させることができる。図９および１０は、このクロロホルムでの分配後における精製されたＮＰ１６８４７多糖ピークの形状を示す。各クロマトグラムのかなり右側の大きなピークがやはりブランク対照で現れ、従って、これはクロロホルムによるものである。複合ピークの単一ピークへの変換についてはいくつかの可能な説明がある。ＮＰ１６８４７多糖の分子内会合の原因であるＮＰ１６８４７と会合した痕跡量の非極性または脂質−様物質があるという可能性がある。これらのより大きな複合体は、複数ピークを生じさせるであろう。クロロホルムでの非極性物質での除去はこれらの会合体を破壊し、単一クロマトグラフィーピークを生じさせるであろう。脂質−様または非極性物質とＮＰ１６８４７との可能な会合は、なぜ、高濃度の水性エタノールを用いてこの多糖物質が抽出可能であるかを説明するであろう。ＮＰ１６８４７が単一多糖であるか、または関連多糖混合物であるかは、この物質の非常に高い分子量のため評価するのが困難である。しかしながら、複数ピークの現象は、最適抽出条件（５０％エタノール／６０℃ないし７０℃、図１１参照）を用いて得られたプレ−およびポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４７調製物では起こらない。これは、より低いエタノール濃度またはより高い抽出温度あるいはこれらの２つの因子の組み合わせによるものであろう。
【０１０１】
ＴＭＳ−メチルグリコシドのＧＣ−質量スペクトル分析を用い、異なるＮＰ１６８４７調製物の炭水化物組成を評価した（表５）。実施例１からのＮＰ１６８４７物質（ＮＰ１）を再分析し、以前の測定されたのと同一の炭水化物組成を有することが判明した。異なるバッチの（もう１つの会社から購入した）ＡＦＡを実施例４ないし４４で用いたので、ＮＰ１６８４７の調製物は、実施例１の抽出手法を用いてこの新しい物質から単離した（ＮＰ２）。このＮＰ１６８４７調製物およびＮＰ１双方は匹敵するグリコシル組成を有し、これは、ＡＦＡの異なるバッジの間の合致を示す。しかしながら、ｎ−ブタノール／水分配の間における活性多糖のｎ−ブタノール相への部分的喪失のため、ＮＰ２調製物はＮＰ１よりも活性が５倍低かった（図５）。一般に、最適抽出条件（６０℃および７０℃における５０％エタノール）を用いて得られたプレ−およびポスト−限外濾過物ＮＰ１６８４７調製物（ＮＰ３−ＮＰ６）においても同様の炭水化物組成が見出された。しかしながら、プレ−限外濾過物ＮＰ１６８４７は、合致して、ポスト−限外濾過調製物よりもグルコース組成が高く、Ｎ−アセチル化糖単位が低かった。これらの異なるＮＰ１６８４７調製物（ＮＰ１−ＮＰ７）の間の炭水化物組成の合致に基づくと、この物質に存在する主なグリコシル残基はマンノース、ラムノース、アラビノースおよびグルコースであることが明らかである。ＴＭＳ−メチルグリコシド手法の間に検出されたＯ−メチル化糖を同定するために、酢酸アルディトール分析を用い、グリコシル組成を測定した。これらの調製物に含有されたメチル化糖残基は２−メチルラムノース、３−メチルラムノース、４−メチルラムノース、２−メチルフコース、３−メチルアラビノースおよび３−メチルマンノースを含む。興味深いことには、これらのＮＰ１６８４７調製物は、５．１ないし１２．５％メチル化炭水化物残基および高いパーセンテージのデオキシヘキソース（例えば、ラムノースおよびフコース）を含有する。これらの双方の特徴は、比較的高濃度の水性エタノールを用いるＮＰ１６８４７多糖物質の異常な抽出性を説明するであろう。
【０１０２】
テストした試料（ＮＰ１ないしＮＰ７）はＥＣ５０値において５０倍の差までを表すので、それらの間で炭水化物組成にある程度差をみると予測するであろう。これは当てはまらないので、ＮＰ１６８４７調製物の純度または活性はこのパラメーターを用いて決定することができないのは明白である。従って、ＮＰ１６８４７調製物は、生物学的活性、サイズおよび水性エタノールへの抽出性によってより適切に特徴付けされるであろう。ユニークな構造的特徴は、特異的炭水化物組成よりはむしろ単球／マクロファージを活性化するＮＰ１６８４７の能力の
原因であろう。また、ＮＰ１ないしＮＰ７の炭水化物組成は水性エタノール溶液で抽出可能な多糖を反映し、免疫刺激性のものはこの群内の構造クラスとして存在するであろう可能性もある。この解釈は、熱水抽出で得られた物質（ＮＰ８およびＮＰ９）が、水性エタノール抽出を用いて単離したＮＰ１６８４７調製物（ＮＰ１ないしＮＰ７）とは非常に異なった炭水化物プロフィールを有するとうい観察によって裏付けられる。ＡＦＡの熱水抽出から得られたプレ−およびポスト−限外濾過物質双方からの支配的なグリコシル残基はグルコースであった（表５）。ＮＰ８およびＮＰ９のもう１つの区別される特徴は、水性エタノール抽出を用いて単離されたＮＰ１６８４７物質と比較してより低いラムノースのパーセント組成である。
【０１０３】
実施例４５−６５℃における６０％メタノールでの抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを６５℃にて６０％メタノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで１時間、次いで、６．２５ｍＬで１時間行った。双方からの抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．５ｍＬ）。上澄みのメタノール濃度は、冷１００％メタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心にして抽出し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空下で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、プレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１．８％回収、および単球活性化アッセイにおける７５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値が得られた。
【０１０４】
実施例４６−６５℃における４０％イソプロパノールでの抽出および直接的８０％アルコール沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを６５℃にて４０％イソプロパノールで抽出し、まず、７．５ｍＬで１時間、次いで、６．２５ｍＬで１時間行った。双方からの抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．５ｍＬ）。上澄みのイソプロパノール濃度は、冷１００％イソプロパノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心にて抽出し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空下で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、プレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の１２．０％回収、および単球活性化アッセイにおける１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値が得られた。
【０１０５】
実施例４７−環境による１００％エタノールでの抽出および−２０℃までの冷却による沈殿
１ｇの凍結乾燥されたＡＦＡを１００％エタノールを用いる環流によって抽出し、まず、８．０ｍＬで１時間、次いで、６．５０ｍＬで１時間行った。双方からの抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．０ｍＬ）。次いで、合わせた上澄みを−２０℃にて数時間保存し、沈殿可能な物質を遠心によって除去した。沈殿を冷９５％エタノールで引き続いて洗浄した。単離した物質を真空下で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。この抽出手法の結果、プレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物の０．６８％回収、および単球活性化アッセイにおける７５０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値が得られた。
【０１０６】
実施例４８−他の食品グレードの微細藻類（ＣｈｌｏｒｅｌｌａおよびＳｐｉｒｕｌｉｎａ）からの水性アルコールを用いる免疫刺激多糖物質の抽出
最適条件下での、水性アルコールでの初期抽出を用いるＡＦＡからＮＰ１６８４７を得るプロセスの結果、熱水抽出を用いて得られた物質よりも２０倍活性な調製物が得られる（各々、２５ｎｇ／ｍＬ−対−５００ｎｇ／ｍＬの単球活性化についてのＥＣ５０値）。
【０１０７】
また、同一の水性アルコール抽出手法を他の食品グレードの微細藻類に適用して、免疫刺激多糖が豊富な調製物を得ることもできる。例えば、以前の特許（１６、１７、２７）は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種およびＳｐｉｒｕｌｉｎａ種が、熱水を用いて抽出される免疫刺激多糖を含有すると報告している。しかしながら、（熱水の代わりの）水性アルコールでの抽出の結果、免疫刺激性である多糖が選択的に豊富となり、それにより、活性物質のより高いパーセント回収を同様に優れた生物学的活性を呈するこれらの生物からの調製物を得られる。以下の実験参照。
【０１０８】
以下の食品グレードの微細藻類をこれらの実験で用いた：  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓ（Ｓｕｎ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ，ロット番号ＷＳ１４２２）およびＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  （Ｎａｔｕｒｅ’ｓ  Ｗａｙ，  ロット番号９１２１２０）。全ての多糖調製物はプレ−限外濾過物質を表す。熱水抽出物の調製では、１ｇの凍結乾燥された微細藻類を９５℃において２５ｍＬの水で３０分間１回抽出した。熱水抽出物を８０％エタノールに調整し、−２０℃にて一晩インキュベートした。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａから収集した沈殿は１３．２％回収および１，０００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値を表した。Ｓｐｉｒｕｌｉｎａから収集した沈殿は、１６．５％回収および単球／マクロファージ活性化につき１０，０００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値を表した。
【０１０９】
水性エタノール抽出物は初期抽出の間に用いた温度および溶媒濃度（水中の％エタノール）双方を並列的に変化したことによって調製した。パーセント回収およびマクロファージ活性化についてのＥＣ５０値の終点を用いて、免疫刺激多糖物質の調製についての最適条件を決定した。ＣｈｌｏｒｅｌｌａおよびＳｐｉｒｕｌｉｎａ抽出物は，以下の手法を用いて調製した。１ｇの凍結乾燥された微細藻類を適切な温度で抽出した。（まず、７．５ｍＬの水性エタノール溶媒で２時間、６．２５ｍＬの水性エタノール溶媒で２時間）。双方の抽出からの上澄みを遠心により合わせた（１１．３ｍＬ）。上澄みのエタノール濃度は、冷１００％エタノールの添加によって８０％に調整した。−２０℃における数時間のインキュベーションに続き、沈殿を遠心によって抽出し、引き続いて、冷９５％エタノールで洗浄した。単離された物質を真空下で乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬにて水に溶解させた。
【０１１０】
ＣｈｌｏｒｅｌｌａおよびＳｐｉｒｕｌｉｎａからの免疫刺激多糖調製物の最適回収および特異的活性の双方についての抽出条件は、ＡＦＡからのＮＰ１６８４７の抽出についての最適条件と同様であった（５０％エタノールにおいて６０℃ないし７０℃）。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａでは、免疫刺激多糖物質の調製についての最適条件は、７０℃における５０％エタノールでの初期抽出を含む。この条件は、６．５％のプレ−限外濾過回収を与え、ＥＣ５０値は２５ｍｇ／ｍＬである。Ｓｐｉｒｕｌｉｎａでは、免疫刺激多糖物質の調製のための最適条件は、５０℃および７０℃の間の温度での４０％ないし５０％エタノールでの初期抽出を含む。これらの条件は約９．０％のプレ−限外濾過物質回収を与え、ＥＣ５０値５００ｎｇ／ｍＬであった。比較により、熱水抽出物、約２倍大きい物質の回収がもたらされていたが、それは、水性エタノールでの最適抽出条件を用いて得られた調製物よりも２０ないし４０倍活性が低い。
【０１１１】
まとめると、ＡＦＡからのＮＰ１６８４７の最適回収のための単純かつ効果的な単離手法が開発された。プレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物についての抽出方法は、６０℃ないし８０℃における５０％エタノールを各々用いる１時間の２つのプールされた抽出物からの直接的アルコール沈殿である。（−２０℃において８０％）。このプレ−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物はＡＦＡ乾燥重量の１１％回収を表す。１００，０００ダルトン未満の全ての物質を排除させるために限外濾過を含む１つのさらなる工程を用いて、ＮＰ１６８４７多糖の比較的純粋な抽出物は４．５％および５．６％の間の回収にて得ることができる。プレ−およびポスト−限外濾過調製物は、ほぼ同一のＥＣ５０値を有する（プレ−限外濾過物についての２５ｎｇ／ｍＬおよびポスト−限外濾過調製物についての２０ｎｇ／ｍＬ）。実施例１（４０℃における７０％エタノール抽出）で得られたＮＰ１６８４７物質と比較すると、この最適化されたポスト−限外濾過調製物は、５倍大きな活性と共に７．５および９．３倍より多いＮＰ１６８４７を含有する。この手法は、ダイエット補充物（植物学上の）抽出物ならびにバルク医薬生成物の調製の双方によく適合する。ＡＦＡ微細藻類から免疫刺激多糖組成物（ＮＰ１６８４７）を得るために記載された同一方法を用いて、（例えば、単球／マクロファージほ活性化する免疫刺激多糖が豊富な（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種およびＳｐｉｒｕｌｉｎａ種を含む）他の微細藻類から調製物を得る３つの全ての微細藻類多糖調製物のユニークな炭水化物組成は、免疫刺激性であるそれらにつき選択的に富む手法の使用を可能とする。これらの多糖は、伝統的な熱水抽出手法をほとんど用いずに抽出される。熱水抽出物は、最適化された手法を用いるものより２０ないし４０倍活性が低い。
【０１１２】
医薬製剤
本発明は、さらに、低コストのバルク多糖調製物を含む。これらの多糖調製物が単離される微細藻類は、ヒトの消費のためのこれらの微細藻類を培養する現在の商業的方法と同様なタンク中で成長させることができる。これは、天然産物から単離した化合物の薬品開発のための主な論点としばしばなる供給問題ではないことを意味する。本発明の多糖調製物は、高濃度（微細藻類の６．５％および６％の間）で存在し、本発明の単純、迅速かつ低コストの技術を用いて単離することができる。
【０１１３】
本発明の多糖調製物は、免疫不全症候群、癌、創傷治癒、および感染病の治療において免疫療法剤として有用であるので、本発明は、所望により、許容される医薬担体または賦形剤と組み合わせる本発明の多糖調製物を含有する医薬組成物を含む。
【０１１４】
本発明で用いられる使用に適した医薬組成物は、有効成分が効果的な量で含まれる組成物を含む。より具体的には、治療上有効量は、治療すべき対象の存在する兆候の発症を妨げ、またはそれを軽減するのに効果的な量を意味する。有効量の決定は、特に、本明細書中に提供した詳細な開示に徴して当業者の技量内にある。
【０１１５】
投与される組成物の量は、治療すべき状態、治療すべき対象、対象の体重、病気の重篤度、投与方法および主治医の判断に依存するであろう。
【０１１６】
本発明の医薬組成物は、それ自体知られた方法、例えば、慣用的な混合、溶解、顆粒化、糖衣錠調製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【０１１７】
かくして、本発明で用いる医薬組成物は、組成物の化合物を医薬上用いることができる製剤に加工することを容易とする賦形剤および補助剤を含む１以上の生理学的に許容される担体を用い、慣用的な方法で処方することができる。適当な処方は、選択された投与経路に依存する。
【０１１８】
注射では、本発明の剤は、水性溶液中にて、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液のごとき生理学的に適合する水性溶液中にて処方することができる。経粘膜投与では、浸透すべきバリアに適した浸透剤を処方で用いる。そのような浸透剤は一般に当該分野で知られている。
【０１１９】
経口投与では、組成物は、活性組成物を当該技術分野でよく知られた医薬上許容される担体と合わせることによって、容易に処方することができる。そのような担体は、本発明の化合物が、治療すべき患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして処方するのを可能とする。経口用途のための医薬製剤は、所望により固体賦形剤を用意し、所望により、得られた混合物を粉砕し、必要であれば，適当な補助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して錠剤または糖衣錠のコアを得ることによって得ることができる。適当な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含めた糖のごとき充填剤；例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジヤガイモ澱粉、ゼラチン、トカラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＤ）のごときセルロース調製物である。
【０１２０】
所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸あるいはアルギン酸ナトリウムのごときその塩のような崩壊剤を添加することができる。
【０１２１】
糖衣錠のコアには適当なコーティングを施す。この目的では、所望により、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい濃縮された糖溶液を用いることができる。活性化合物の用量の同定またはその異なる組み合わせの特徴づけのために染料または色素を錠剤または糖衣錠のコーティングに添加することができる。
【０１２２】
経口的に用いることができる医薬製剤は、ゼラチンならびにフィットよりなるプッシュ−フィットカプセル剤ゼラチンおよびグリセロールおよびソルビトールのごとき可塑剤よりなる密封されたカプセル剤を含む。プッシュ−フィットカフセル剤は、ラクトースのごとき充填剤、澱粉のごとき結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのごとき滑沢剤および、所望により、安定化剤と混合して、有効成分を含有することができる。ソフトカプセルでは、活性な化合物を脂肪油、流動パラフィン、または液状ポリエチレングリコールのごとき適当な液体に溶解または懸濁させることができる。加えて、安定化剤を添加することができる。経口投与のための全ての処方は、そのような投与に適した用量とすべきである。
【０１２３】
口腔投与では、組成物は通常の方法で処方された錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。
【０１２４】
吸入による投与では、本発明で用いる組成物は、便宜には、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用い、圧縮カップまたはネビュライザーからのエアゾールスプレーの形態で送達される。圧縮エアロゾルの場合は、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを供することによって決定することができる。化合物およびラクトースまたは澱粉のごとき適当な粉末基剤のパワー（power）ミックスを含有する、例えば、インへラーおよび吸入器で用いられるゼラチンのカプセルを処方することができる。
【０１２５】
組成物は、注入によって、例えば、ボーラス注射または点滴による非経口投与のために処方することができる。注入用の手法は、例えば、防腐剤が添加されたアンプルまたは多用量の容器中にて単位投与形態で供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤または乳剤のような形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤のごとき処方剤を含有することができる。
【０１２６】
非経口投与用の医薬処方は、水溶性形態の活性化合物の水性溶液を含む。加えて、活性組成物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適当な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のごとき脂肪油またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのごとき合成脂肪酸エステルを含む。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのごとく懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる。所望により、懸濁液は適当な安定化剤、または高濃縮溶液の調製を可能とする化合物の溶解度を増加させる剤を含有することができる。別法として、有効成分、使用前には、適当なビヒクル、例えば、滅菌された発熱因子のない水で構成された粉末形態とすることができる。
【０１２７】
組成物は、例えば、カカオ脂または他のグリセリドのごとき慣用的な坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸のような直腸組成物に処方することもできる。
【０１２８】
前記した処方に加え、組成物はデポ製剤として処方することもできる。そのような長期作用処方は、埋込み（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与することができる。かくして、例えば、組成物が、（たとえば、許容される油中のエマルジョンとして）適当なポリマーまたは疎水性物質またはイオン交換樹脂で、あるいは難溶解性誘導体、例えば、難溶解性塩として処方することができる。
【０１２９】
また、医薬組成物が適当な固体またはゲル相担体または賦形剤を含むこともできる。そのような担体または賦形剤の例は、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのごときポリマーを含む。
【０１３０】
適当な投与経路は、たとえば、経口、直腸、経粘膜、経皮、腸投与、非経口送達（筋肉内、皮下、髄内注射を含む）、ならびに髄腔内、直接的心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内注射を含む。
【０１３１】
別法として、組成物が、しばしば、デポまたは徐放性処方にて、化合物の患部への直接的注射を介して、組成物を全身よりはむしろ直腸に投与することができる。さらに、例えば、侵された細胞に特異的な抗体で被覆されたリポソーム中にて、標的化薬物送達系で薬物を投与することができる。リポソームは細胞に標的化され、細胞によって選択的に摂取される。
【０１３２】
組成物は、所望であれば、有効成分を含有される１以上の単位投与形態を含むことができるパックまたはディスペンサーデバイス中で提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックのごとき金属またはプラスチックホイルを含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための指示書を伴わせることができる。適合する医薬担体中に処方された本発明の組成物を含む組成物を調製し、適当な容器に入れ、示された疾患の治療のために標識することができる。ラベルに示された適当な疾患は、病気の治療を含む。
【０１３３】
ダイエット補充物
本発明で用いるのに適したダイエット補充物は、有効成分がその意図した目的を達成するのに効果的な量にて含まれた組成物を含む。より具体的には、有効量は、治療すべき対象の存在する兆候の発祥を妨げ、またはそれを軽減するのに効果的な量を意味する。有効量の決定は、特に、本明細書中に供した詳細な開示に照らせば十分に当業者の能力内にある。投与される組成物の量は、治療すべき疾患、治療すべき対象、対象の体重、苦痛の重篤度、投与の様式および主治医の判断に依存するであろう。
【０１３４】
本発明のダイエット補充物の成分は、経口消費のための許容される賦形剤および／または担体に含有させる。担体、かくして、ダイエット補充物それ自体の現物の形態は、非常に重要ではないであろう。該担体は、液体、ゲル、ゲルキャップ、カプセル、粉末、（被覆されたまたは被覆されていない）錠剤、茶などであり得る。適当な賦形剤および／または担体はマルトデキストリン、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、マイクロクリスタリンセルロース、デキストロース、米粉、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、クロスカルメロースナトリウム、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスホビドン、スクロース、植物ガム、寒天、ラクトース、メチルセルロース、ホビドン、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシ澱粉など（その混合物を含む）を含む。種々の成分および賦形剤および／または担体は、慣用的な技術を用い、混合し、所望の形態に形成する。用量レベル／単位を調整して、理想的な数の単位にて、１日あたりの成分の推奨されるレベルを供することができる。
【０１３５】
また、ダイエット補充物は、例えば、薬草、ビタミン、ミネラル、増強剤、着色剤、甘味剤、フレーバー、不活性成分などを含めた任意の成分を含有することもできる。そのような任意の成分は天然に生じるまたは濃縮された形態いずれであってもよい。これらの成分の１または数個の選択は、処方、設計デザイン消費者の施行および末端使用者事項である。本発明のダイエット補充物に添加されるこれらの成分の量は当業者は用意に知るであろう。そのような量に対するガイドは子供および成人についてのＵ．Ｓ．ＲＤＡ用量によって供することができる。
【０１３６】
参考文献
本出願になされたまたは言及された全ての参考文献または引用を以下に出典明示して本明細書の一部とみなす。
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【０１４５】
【表２】
2004502737.tif 000002
【０１４６】
【表３】
2004502737.tif 000003
【０１４７】
【表４】
2004502737.tif 000004
【０１４８】
【表５】
2004502737.tif 000005
【０１４９】
【表６】
2004502737.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】
多糖調製物ＮＰ１６８４７（実施例１）、５００μｇ／ｍｌにて７５μｌ注入のサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】
多糖調製物ＮＰ１６８４８（実施例２）、１２５μｇ／ｍｌにて２００μｌ注入のサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】
多糖調製物ＮＰ１６８４６（実施例３）、３５μｇ／ｍｌにて２００μｌ注入のサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４】
微細藻類の多糖調製物ＮＰ１６８４７、ＮＰ１６８４８およびＮＰ１６８４６が、プロ炎症サイトカインｍＲＮＡ産物を増強することを示す。２時間でのＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−１β ｍＲＮＡ、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲ結果：対照、１０μｇ／ｍｌでの細菌ＬＰＳ、（１）０．５μｇ／ｍｌでの多糖調製物ＮＰ１６８４７、（２）０．５μｇ／ｍｌでの多糖調製物ＮＰ１６８４６、および（３）０．５μｇ／ｍｌでの多糖調製物ＮＰ１６８４８．
【図５】
フィコシアニン物質を除去するための４０℃の熱水抽出に続いての７０％エタノール沈殿についてのプロトコルを表すフローチャートを示す（実施例４）。
【図６】
フィコシアニン物質を除去するための４０℃の熱水抽出に続いての硫酸アンモニウム沈殿についてのプロトコルを表すフローチャートを示す（実施例５）。
【図７】
７０℃の熱水抽出についてのプロトコルを表すフローチャート示す（実施例６）。
【図８】
ブタノール分配のない４０℃の７０％エタノール抽出についてのプロトコルを表すフローチャートを示す（実施例７）。
【図９】
４０℃の７０％エタノール抽出に続いての直接的エタノール沈殿についてのプロトコルを表すフローチャートを示す（実施例８）。
【図１０】
４０℃の７０％エタノール抽出に続いての直接的８０％エタノール沈殿についてのプロトコルを表すフローチャートを示す（実施例９）。
【図１１】
５０％エタノール／６０℃の最適抽出条件を用いるプレ−およびポスト−限外濾過ＮＰ１６８４７調製物のＳＥＣ ＨＰＬＣ分析結果を示す（実施例２４）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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