【手続補正書】
【提出日】令和1年5月9日(2019.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、請求項1に記載の組換えプラスミド。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 1を有する、請求項1に記載の組換えプラスミド。
【請求項４】
SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むベクターカセットを含む、組換えプラスミド。
【請求項５】
前記ベクターカセットが、少なくとも2つの制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接しており、該少なくとも2つの制限エンドヌクレアーゼ部位が、sfiIおよびBsu36Iからなる群より独立して選択される、請求項4に記載の組換えプラスミド。
【請求項６】
前記ベクターカセットが、BstBI、MluI、NotI、およびClaI制限エンドヌクレアーゼ部位を有するマルチクローニングサイトを含み、該ベクターカセットの上流にテトラサイクリン抑制性プロモーターをさらに含む、請求項4または5に記載の組換えプラスミド。
【請求項７】
ヌクレオチド約6500個〜ヌクレオチド約6750個を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
ヌクレオチド約6600個〜ヌクレオチド約6700個を含む、請求項7に記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列とはヌクレオチド100個以下だけ異なるヌクレオチド配列を有する、組換えプラスミド。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド50個以下だけ異なる、請求項9に記載の組換えプラスミド。
【請求項１１】
(a)パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列と；(b)セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列と；(c)Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列と；(d)自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列と；(e)酵素BstBI、MluI、NotI、およびClaIに対する制限部位を有するマルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列とを含む、組換えプラスミド。
【請求項１２】
前記パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 3の配列を含み、
前記セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 4の配列を含み、
前記Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 5の配列を含み、
前記自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 6の配列を含み、かつ
前記マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 7の配列を含む、
請求項11に記載の組換えプラスミド。
【請求項１３】
(a)プラスミドのヌクレオチド配列のヌクレオチド約762からヌクレオチド約1104までに存在するパッケージング配列と；(b)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約1121からヌクレオチド約1597までに存在するセントラルポリプリントラクトと；(c)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約1598からヌクレオチド約2366までに存在するRev応答エレメントと；(d)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約409からヌクレオチド約589までに存在する自己不活性化末端反復配列と；(e)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約2376からヌクレオチド約2400までに存在するマルチクローニングサイトとを含む、組換えプラスミド。
【請求項１４】
BstBI、MluI、NotI、およびClaI制限エンドヌクレアーゼ部位を含むマルチクローニングサイトを含み、かつSEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項に記載のプラスミドを含む、細胞。
【請求項１６】
(i)請求項1〜14のいずれか一項に記載のプラスミドと、(ii)GPRパッケージング細胞株の細胞、GPRGパッケージング細胞株の細胞、GPRTパッケージング細胞株の細胞、GPRTGパッケージング細胞株の細胞、GPRT-Gパッケージング細胞株の細胞、およびそれらの派生物からなる群より選択されるパッケージング細胞株の細胞とを含む、キット。
【請求項１７】
ブレオマイシン耐性(ble)カセットをさらに含む、請求項16に記載のキット。
【請求項１８】
(a)請求項1〜14のいずれか一項に記載のプラスミドに1つまたは複数の遺伝子をクローニングすることによって、レンチウイルスベクターを合成する段階；(b)合成された該レンチウイルスベクターからDNA断片を生成する段階；(c)合成された該レンチウイルスベクター由来の生成された該DNA断片から、および抗生物質耐性カセットプラスミド由来のDNA断片から、コンカテマーアレイを形成する段階；(d)GPR、GPRG、GPRT、GPRGT、もしくはGPRT-Gパッケージング細胞株またはそれらの派生物に、形成された該コンカテマーアレイをトランスフェクトする段階；ならびに(e)安定した産生細胞株を単離する段階を含む、該安定した産生細胞株を作製する方法。
【請求項１９】
前記レンチウイルスベクターが、(i)HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNAおよび(ii)HIV-1融合阻害物質をコードし、該レンチウイルスベクターが、請求項1〜14のいずれか一項に記載のプラスミドに該短鎖ヘアピンRNAと該融合阻害物質の両方をコードするcDNAをクローニングすることによって合成される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
ベクター上清を約40時間〜約56時間毎に回収する、請求項18または19に記載の方法。
【請求項２１】
GPRGパッケージング細胞株、GPRTパッケージング細胞株、GPRGTパッケージング細胞株、GPRT-Gパッケージング細胞株、またはGPRパッケージング細胞株の1つに基づいている、LVsh5/C46を産生させるのに適している安定した産生細胞株。
【請求項２２】
自己不活性化レンチウイルスベクターを産生させるのに適している安定した産生細胞株であって、該自己不活性化レンチウイルスベクターが、SEQ ID NO: 8の配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、該安定した産生細胞株が、GPRGパッケージング細胞株、GPRTパッケージング細胞株、GPRGTパッケージング細胞株、GPRT-Gパッケージング細胞株、またはGPRパッケージング細胞株の1つに由来する、安定した産生細胞株。
【請求項２３】
第1のプラスミドにおよび第2のプラスミドに由来するDNA断片を含むコンカテマーアレイであって、該第1のプラスミドがSEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、かつ該第2のプラスミドがブレオマイシン抗生物質耐性カセットを含み、該第1のプラスミド由来のDNA断片対該第2のプラスミド由来のDNA断片の比が、約25：1〜約1：25の範囲である、コンカテマーアレイ。
【請求項２４】
GPRパッケージング細胞株の細胞、GPRGパッケージング細胞株の細胞、GPRTパッケージング細胞株の細胞、GPRGTパッケージング細胞株の細胞、およびGPRT-Gパッケージング細胞株の細胞からなる群より選択されるパッケージング細胞株の細胞に、請求項23に記載のコンカテマーアレイをトランスフェクトすることによって作製される、安定した産生細胞株。
【請求項２５】
LVsh5/C46を産生し、かつ該LVsh5/C46を約40時間〜約56時間毎に回収することが可能である、請求項24に記載の安定した産生細胞株。
【請求項２６】
請求項1〜14のいずれか一項に記載のプラスミドを切断する段階、および切断された該プラスミドの末端を、導入されるポリヌクレオチドの適合性末端に連結する段階を含む、プラスミドベクターを作製するための方法。
【請求項２７】
前記導入されるポリヌクレオチドが、(i)HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNA、または(ii)HIV-1融合阻害物質の少なくとも1つをコードする、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
請求項1〜14のいずれか一項に記載のプラスミドに由来する、レンチウイルスベクター。
【請求項２９】
少なくとも1つの追加のヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項３０】
前記少なくとも1つの追加のヌクレオチド配列が、HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNAをコードするヌクレオチド配列およびHIV-1融合阻害物質をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される、請求項29に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項３１】
SEQ ID NO: 8の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、請求項28に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項３２】
請求項28〜31のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターを含む、細胞。
【請求項３３】
請求項28〜31のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターまたは請求項32に記載の細胞と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本開示の別の局面には、上記のレンチウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物がある。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、医薬品、例えばヒトへの投与に適した医薬品を製剤化するのに許容される溶媒、緩衝剤、溶液、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤と抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的担体を用いて化合物を製剤化する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, (第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1985)；およびGoodman & Gillman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics (第11版, McGraw-Hill Professional, 2005)に記載され；これらの各々の開示内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
[本発明1001]
SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1002]
前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、本発明1001の組換えプラスミド。
[本発明1003]
SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1004]
SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1005]
SEQ ID NO: 1に示された配列とはヌクレオチド100個以下だけ異なる配列を有する、組換えプラスミド。
[本発明1006]
前記配列が、SEQ ID NO: 1に示された配列とはヌクレオチド50個以下だけ異なる、本発明1005の組換えプラスミド。
[本発明1007]
ヌクレオチド約6500個〜ヌクレオチド約6750個を含み、かつSEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1008]
ヌクレオチド約6600個〜ヌクレオチド約6700個を含む、本発明1007の組換えプラスミド。
[本発明1009]
ヌクレオチド約6611個を含む、本発明1007の組換えプラスミド。
[本発明1010]
図11にpUC57-TL20cとして示された組換えプラスミド。
[本発明1011]
BstBI、MluI、NotI、およびClaI制限エンドヌクレアーゼ部位から本質的になるマルチクローニングサイトを含む、組換えプラスミド。
[本発明1012]
パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列と；セントラルポリプリントラクトをコードするヌクレオチド配列と；Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列と；自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列とをさらに含む、本発明1011の組換えプラスミド。
[本発明1013]
(a)パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列と；(b)セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列と；(c)Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列と；(d)自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列と；(e)酵素BstBI、MluI、NotI、およびClaIに対する制限部位を有するマルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列とを含む、組換えプラスミド。
[本発明1014]
前記パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 3の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1015]
前記セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 4の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1016]
前記Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 5の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1017]
前記自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 6の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1018]
前記マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 7の配列を含む、本発明1013の組換えプラスミド。
[本発明1019]
(a)プラスミドのヌクレオチド配列のヌクレオチド約762からヌクレオチド約1104までに存在するパッケージング配列と；(b)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約1121からヌクレオチド約1597までに存在するセントラルポリプリントラクトと；(c)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約1598からヌクレオチド約2366までに存在するRev応答エレメントと；(d)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約409からヌクレオチド約589までに存在する自己不活性化末端反復配列と；(e)プラスミドヌクレオチド配列のヌクレオチド約2376からヌクレオチド約2400までに存在するマルチクローニングサイトとを含む、組換えプラスミド。
[本発明1020]
前記プラスミドヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1021]
前記パッケージングシグナルをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 3の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1022]
前記セントラルポリプリントラクト(cPPT)をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 4の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1023]
前記Rev応答エレメントをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 5の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1024]
前記自己不活性化末端反復配列をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 6の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1025]
前記マルチクローニングサイトをコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 7の配列を含む、本発明1019の組換えプラスミド。
[本発明1026]
BstBI、MluI、NotI、およびClaI制限エンドヌクレアーゼ部位を含むマルチクローニングサイトを含み、かつSEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
[本発明1027]
SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも95％の同一性を有するベクターカセットをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ該ベクターカセットが、少なくとも2つの制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接しており、該少なくとも2つの制限エンドヌクレアーゼ部位が、sfiIおよびBsu36Iからなる群より独立して選択される、組換えプラスミド。
[本発明1028]
SEQ ID NO: 2の配列に対して少なくとも90％の同一性を有するベクターカセットをコードするヌクレオチド配列を含み、該ベクターカセットが、BstBI、MluI、NotI、およびClaI制限エンドヌクレアーゼ部位を有するマルチクローニングサイトを含む、組換えプラスミドであって、該ベクターカセットの上流にテトラサイクリン抑制性プロモーターをさらに含む、組換えプラスミド。
[本発明1029]
本発明1001〜1028のいずれかのプラスミドを含む、細胞。
[本発明1030]
本発明1001〜1028のいずれかのプラスミドと、ブレオマイシン耐性(ble)カセットとを含む、キット。
[本発明1031]
(a)本発明1001〜1028のいずれかのプラスミドに1つまたは複数の遺伝子をクローニングすることによって、レンチウイルスベクターを合成する段階；(b)合成された該レンチウイルスベクターからDNA断片を生成する段階；(c)合成された該レンチウイルスベクター由来の生成された該DNA断片から、および抗生物質耐性カセットプラスミド由来のDNA断片から、コンカテマーアレイを形成する段階；(d)GPR、GPRG、GPRT、GPRGT、もしくはGPRT-Gパッケージング細胞株またはそれらの派生物に、形成された該コンカテマーアレイをトランスフェクトする段階；ならびに(e)安定した産生細胞株を単離する段階を含む、該安定した産生細胞株を作製する方法。
[本発明1032]
(a)HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNAをコードしかつHIV-1融合阻害物質をコードするレンチウイルスベクターを合成する段階であって、該レンチウイルスベクターが、本発明1001〜1028のいずれかのプラスミドに該短鎖ヘアピンRNAと該融合阻害物質の両方をコードするcDNAをクローニングすることによって合成される、段階；(b)合成された該レンチウイルスベクターからDNA断片を生成する段階；(c)合成された該レンチウイルスベクター由来の生成された該DNA断片から、および抗生物質耐性カセットプラスミド由来のDNA断片から、コンカテマーアレイを形成する段階；(d)GPR、GPRG、GPRT、GPRGT、もしくはGPRT-Gパッケージング細胞株またはそれらの派生物に、形成された該コンカテマーアレイをトランスフェクトする段階；ならびに(e)安定した産生細胞株を単離する段階を含む、該安定した産生細胞株を作製する方法。
[本発明1033]
ベクター上清を約40時間〜約56時間毎に回収する、安定した産生細胞株から該ベクター上清を回収する方法。
[本発明1034]
LVsh5/C46レンチウイルスベクターを含むベクター上清を約40時間〜約56時間毎に回収する、該ベクター上清を回収する方法。
[本発明1035]
LVsh5/C46を産生させるのに適している安定した産生細胞株。
[本発明1036]
GPRGパッケージング細胞株に基づいている、本発明1035の安定した産生細胞株。
[本発明1037]
GPRTパッケージング細胞株に基づいている、本発明1035の安定した産生細胞株。
[本発明1038]
GPRパッケージング細胞株に基づいている、本発明1035の安定した産生細胞株。
[本発明1039]
自己不活性化レンチウイルスベクターを産生させるのに適している安定した産生細胞株であって、該レンチウイルスベクターが、SEQ ID NO: 8の配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、安定した産生細胞株。
[本発明1040]
GPRGパッケージング細胞株に基づいている、本発明1039の安定した産生細胞株。
[本発明1041]
GPRTパッケージング細胞株に基づいている、本発明1039の安定した産生細胞株。
[本発明1042]
GPRパッケージング細胞株に基づいている、本発明1039の安定した産生細胞株。
[本発明1043]
第1のプラスミドにおよび第2のプラスミドに由来するDNA断片を含むコンカテマーアレイであって、該第1のプラスミドがpUC57-TL20cに由来し、該第2のプラスミドがブレオマイシン抗生物質耐性カセットを含み、該第1のプラスミド由来のDNA断片対該第2のプラスミド由来のDNA断片の比が、約25：1〜約1：25の範囲である、コンカテマーアレイ。
[本発明1044]
GPR、GPRG、GPRT、GPRGT、およびGPRT-Gパッケージング細胞株またはそれらの派生物からなる群より選択されるパッケージング細胞株に、本発明1043のコンカテマーアレイをトランスフェクトすることによって作製される、安定した産生細胞株。
[本発明1045]
LVsh5/C46を産生する、本発明1044の安定した産生細胞株。
[本発明1046]
前記LVsh5/C46を約40時間〜約56時間毎に回収することが可能である、本発明1045の安定した産生細胞株。
[本発明1047]
SEQ ID NO: 7に示されるヌクレオチド配列を含むマルチクローニングサイトを含む、図11のプラスミドマップを有する単離されたベクター。
[本発明1048]
本発明1001〜1028のいずれかのプラスミドを切断する段階、および切断された該プラスミドの末端を、導入されるポリヌクレオチドの適合性末端に連結する段階を含む、プラスミドベクターを作製するための方法。
[本発明1049]
前記導入されるポリヌクレオチドが、HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNAの少なくとも1つをコードするか、またはHIV-1融合阻害物質をコードする、本発明1048の方法。
[本発明1050]
(a)本発明1001〜1028のいずれかのレンチウイルストランスファーベクタープラスミドと；(b)パッケージング細胞株の細胞とを含む、キット。
[本発明1051]
前記パッケージング細胞株の細胞が、GPR、GPRG、GPRT、GPRTG、およびそれらの派生物からなる群より選択される、本発明1050のキット。
[本発明1052]
ブレオマイシン耐性(ble)カセットをさらに含む、本発明1050のキット。
[本発明1053]
本発明1001〜1028のいずれかのプラスミドに由来する、レンチウイルスベクター。
[本発明1054]
少なくとも1つの追加のヌクレオチド配列を含む、本発明1053のレンチウイルスベクター。
[本発明1055]
前記少なくとも1つの追加のヌクレオチド配列が、HIV-1共受容体の下方制御のための短鎖ヘアピンRNAをコードするヌクレオチド配列およびHIV-1融合阻害物質をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される、本発明1054のレンチウイルスベクター。
[本発明1056]
LVsh5/C46である、本発明1055のレンチウイルスベクター。
[本発明1057]
SEQ ID NO: 8の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、本発明1055のレンチウイルスベクター。
[本発明1058]
本発明1053〜1057のいずれかのレンチウイルスベクターを含む、細胞。
[本発明1059]
本発明1053〜1057のいずれかのレンチウイルスベクターと担体とを含む、薬学的組成物。