【手続補正書】
【提出日】令和1年6月25日(2019.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に特異的に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、
前記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖は、共有結合複合体を形成し：
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み；
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項２】
請求項１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項３】
前記薬学的に許容可能なキャリアは無菌液体である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記医薬組成物は静脈内投与用である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患又は状態を治療するための薬剤の製造における、請求項１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、又は請求項２乃至４の何れか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項６】
前記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記癌は：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）からなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、キット。
【請求項１０】
１つ又は複数の予防剤又は治療剤を更に含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に特異的に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、
前記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖は、共有結合複合体を形成し：
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み；
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
前記薬学的に許容可能なキャリアは無菌液体である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物は静脈内投与用である請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患又は状態を治療するための薬剤の製造における、請求項１１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、又は請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
前記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記癌は：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
請求項１１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、キット。
【請求項２０】
１つ又は複数の予防剤又は治療剤を更に含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に特異的に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、
前記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖は、共有結合複合体を形成し：
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み；
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項２２】
請求項２１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
前記薬学的に許容可能なキャリアは無菌液体である請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記医薬組成物は静脈内投与用である請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患又は状態を治療するための薬剤の製造における、請求項２１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、又は請求項２２乃至２４の何れか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
前記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記癌は：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
請求項２１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、キット。
【請求項３０】
１つ又は複数の予防剤又は治療剤を更に含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に特異的に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、
前記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖は、共有結合複合体を形成し：
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み；
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項３２】
請求項３１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項３３】
前記薬学的に許容可能なキャリアは無菌液体である請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記医薬組成物は静脈内投与用である請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患又は状態を治療するための薬剤の製造における、請求項３１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、又は請求項３２乃至３４の何れか１項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３６】
前記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記癌は：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）からなる群から選択される、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
請求項３１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、キット。
【請求項４０】
１つ又は複数の予防剤又は治療剤を更に含む、請求項３９に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
【図１】図１は、２つのポリペプチド鎖で構成され、Ｆｃ領域を含まない、共有結合二重特異性１価ダイアボディの構造を示す。上記ポリペプチド鎖は、システイン（「Ｃ」）残基間に形成されるジスルフィド結合によって互いに共有結合される。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の３鎖二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１、第２及び第３のポリペプチド鎖の２つのバージョンの構造を示す（バージョン１、図２Ａ；バージョン２、図２Ｂ）。上記ポリペプチド鎖は、システイン（「Ｃ」）残基間に形成されるジスルフィド結合によって互いに共有結合される。
【図３Ａ−３Ｊ】図３Ａ〜３Ｊは、Ａ４９８（腎臓癌）（図３Ａ）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（乳癌）（図３Ｂ）、Ａ３７５（黒色腫）（図３Ｃ）、２２Ｒｖ１（前立腺癌）（図３Ｄ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（咽頭癌）（図３Ｅ）、ＤＵ１４５（前立腺癌）（図３Ｆ）、ＢｘＰＣ‐３（膵臓癌）（図３Ｇ）、ＳＫＭＥＳ‐１（肺癌）（図３Ｈ）、Ｕ８７（神経膠芽細胞腫）（図３Ｉ）、及びＲａｊｉ（Ｂリンパ腫）（図３Ｊ）細胞株のＦＡＣＳヒストグラムを示す。破線は、アイソタイプ対照ＰＥ標識抗体で染色された細胞を表し、実線は、抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＰＥ抗体で染色された細胞を表す。
【図４Ａ−４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、Ｂ７‐Ｈ３発現標的癌細胞株（図４Ａ〜４Ｄ）又はヒト一次Ｔ細胞（図４Ｅ）における抗ＥＫコイル抗体の蛍光のＦＡＣＳヒストグラムを示す。濃度１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａを、Ｂ７‐Ｈ３発現癌細胞株（Ａ４９８（図４Ａ）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（図４Ｂ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（図４Ｃ）若しくは２２Ｒｖ１（図４Ｄ））又はヒト一次Ｔ細胞（図４Ｅ）に添加し、３０分間インキュベートした。ＡＰＣストレプトアビジンと混合したビオチンコンジュゲート抗ＥＫコイル抗体を用いた更なるインキュベーションの後、細胞を、ＤＡＲＴ‐Ａ細胞表面結合に関して、ＦＡＣＳによって分析した。実線は、細胞に対するＤＡＲＴ‐Ａ結合プロファイルを表す。ビオチンコンジュゲート抗ＥＫコイル抗体からの細胞の非特異的な染色は、破線で示されている。
【図５Ａ−５Ｌ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｂ７‐Ｈ３発現細胞株（Ａ４９８（図５Ａ）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（図５Ｂ‐５Ｃ）、Ａ３７５（図５Ｄ）、Ｕ８７（図５Ｅ）、ＤＵ１４５（図５Ｆ）、ＢｘＰＣ‐３（図５Ｇ）、ＳＫＭＥＳ‐１（図５Ｈ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（図５Ｉ）及び２２Ｒｖ１（図５Ｊ））、並びにＢ７‐Ｈ３陰性細胞株（ＣＨＯ（図５Ｋ）及びＲａｊｉ（図５Ｌ））に対するＤＡＲＴ‐Ａ仲介細胞毒性に関する、用量応答曲線を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴを、様々な腫瘍細胞株及び一次ヒトＴ細胞を、５：１のエフェクタ細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で用いて、約２４時間インキュベートした。％細胞毒性を、全ての細胞株に関してＬＤＨ放出アッセイを用いて評価した（図５Ａ〜５Ｂ及び５Ｄ〜５Ｌ）。更に、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ細胞株（図５Ｃ）に関して、ＬＵＭアッセイを用いて細胞毒性を測定した。複数のドナーからのＴ細胞を用いた複数の実験からの代表的なデータを示す。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■である。
【図６Ａ−６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、Ｅ：Ｔ比１０：１（図６Ａ及び６Ｂ）、５：１（図６Ｃ及び６Ｄ）並びに１：１（図６Ｅ及び６Ｆ）における、Ａ４９８細胞（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｅ）並びにＡ３７５細胞（図６Ｂ、６Ｄ及び６Ｆ）のＤＡＲＴ‐Ａ仲介標的転換殺滅を示す。細胞毒性は、ＬＤＨアッセイによって決定した。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■である。
【図７Ａ−７Ｅ】図７Ａ〜７Ｅは、エフェクタ細胞としての精製Ｔ細胞と、Ａ４９８標的細胞とを、Ｅ：Ｔ細胞比１０：１で用いた、２４時間のインキュベーション後の、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介標的転換標的細胞殺滅（図７Ａ）、並びにＣＤ４＋（図７Ｂ及び７Ｄ）並びにＣＤ８＋（図７Ｃ及び７Ｅ）Ｔ細胞に対するＴ細胞活性化マーカＣＤ２５（図７Ｂ及び７Ｃ）並びにＣＤ６９（図７Ｄ及び７Ｅ）の導入の、用量応答曲線を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■；Ｔ細胞＋Ａ４９８細胞：黒の▽；Ｔ細胞単独：黒の△である。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、Ｂ７‐Ｈ３陽性標的細胞の存在下での、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介Ｔ細胞増殖を示す。ヒト一次Ｔ細胞の増殖は、１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａ（太線）又は対照ＤＡＲＴ（塗りつぶされた細線）の存在下での、ＣＦＳＥ標識ヒト一次Ｔ細胞とＡ４９８標的細胞（Ｅ：Ｔ比１０：１）との７２時間（図８Ａ）又は９６時間（図８Ｂ）に亘る共培養後に、ＦＡＣＳ分析によって評価した。
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、ＤＡＲＴ‐Ａが、（図９Ａ）及びカニクイザル（図９Ｂ）Ｂ７‐Ｈ３発現ＣＨＯ細胞に効率的に結合し、エフェクタ細胞としての精製ヒト一次Ｔ細胞と、Ｂ７‐Ｈ３発現ＣＨＯ標的細胞とを、Ｅ：Ｔ細胞比５：１で用いた２４時間のインキュベーションの後、ヒト（図９Ｃ）及びカニクイザル（図９Ｄ）Ｂ７‐Ｈ３発現ＣＨＯ細胞の標的転換殺滅を仲介することを示す。細胞毒性は、ＬＤＨアッセイを用いて測定した。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■である。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＤＡＲＴ‐Ａが、カニクイザル及びヒト一次Ｔ細胞に結合できることを示す。１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａをカニクイザル（図１０Ａ）又はヒト（図１０Ｂ）ＰＢＭＣに添加し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＡＰＣストレプトアビジンと混合したビオチンコンジュゲート抗ＥＫコイル抗体を用いた第２のインキュベーションを行った。細胞を、ゲートされ完全に組み合わされたＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞に対するＤＡＲＴ‐Ａ  Ｔ細胞表面結合（太線）に関して、ＦＡＣＳで分析した。ビオチンコンジュゲート抗ＥＫコイル二次抗体からの細胞に対する非特異的な染色は、細線／影付きの細線で示されている。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、カニクイザルＰＢＭＣをＥ：Ｔ比３０：１で用いた、Ｂ７‐Ｈ３陽性標的細胞株ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（図１１Ａ及び１１Ｂ）並びにＡ４９８（図１１Ｃ）のＤＡＲＴ‐Ａ仲介標的転換殺滅を示す。細胞毒性は、ＬＵＭアッセイ（図１１Ａ）又はＬＤＨアッセイ（図１１Ｂ及び１１Ｃ）を用いて測定した。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■である。
【図１２】図１２は、活性化ヒトＴ細胞の存在下で２２Ｒｖ１腫瘍細胞を埋入されたマウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａによる腫瘍成長の阻害を示す。０日目に、メスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８／群）に、活性化ヒトＴ細胞（１×１０6）と共混合した２２Ｒｖ１腫瘍細胞（５×１０6）をＳＣ埋入し、続いて、合計４用量をＩＶ投与するために０日目、１日目、２日目及び３日目に、ビヒクル対照（●）、対照ＤＡＲＴ（○）、又は０．５ｍｇ／ｋｇ（■）、０．１ｍｇ／ｋｇ（黒の△）、０．０２ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）若しくは０．００４ｍｇ／ｋｇ（◆）のＤＡＲＴ‐Ａで処置を行った。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１３】図１３は、活性化ヒトＴ細胞の存在下でＡ４９８腫瘍細胞を埋入されたマウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａによる腫瘍成長の阻害を示す。０日目に、メスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８／群）に、活性化ヒトＴ細胞（１×１０6）と共混合したＡ４９８腫瘍細胞（５×１０6）をＳＣ埋入し、続いて、合計４用量をＩＶ投与するために、０日目、１日目、２日目及び３日目に、ビヒクル対照（●）、０．５ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ（○）、又は０．５ｍｇ／ｋｇ（■）、０．１ｍｇ／ｋｇ（黒の△）、０．０２ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）若しくは０．００４ｍｇ／ｋｇ（◆）のＤＡＲＴ‐Ａで処置を行った。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１４】図１４は、Ａ４９８腫瘍細胞を埋入され、ヒトエフェクタ細胞で再構成されたＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａの抗腫瘍活性を示す。０日目に、メスのＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウス（ｎ＝７／群）にＡ４９８腫瘍細胞（５×１０6細胞）をＩＤ埋入し、続いて１３日目に、ヒトＰＢＭＣ（１×１０7）をＩＰ埋入した。その後、この群を、３３、３５、３６、３９、４１、４３、４６、４８及び５０日目に、ビヒクル対照（●）、０．５ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ（○）、又は１ｍｇ／ｋｇ（■）、０．１ｍｇ／ｋｇ（黒の△）、０．０１ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）若しくは０．００１ｍｇ／ｋｇ（◆）のＤＡＲＴ‐Ａで処置した。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１５】図１５は、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞を埋入され、ヒトエフェクタ細胞で再構成されたＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａの抗腫瘍活性を示す。０日目に、メスのＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウス（ｎ＝８／群）にＤｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞（５×１０6）細胞をＩＤ埋入し、一方、‐１日目に、ヒトＰＢＭＣ（１×１０7）をＩＰ埋入した。続いて合計９用量をＩＶ投与するために、２０、２２、２３、２６、２８、３０、３３、３５及び３７日目に、これらの群を、ビヒクル対照（●）、０．５ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ（○）、又は１ｍｇ／ｋｇ（■）、０．５ｍｇ／ｋｇ（黒の△）、０．２５ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）若しくは０．１ｍｇ／ｋｇ（◆）のＤＡＲＴ‐Ａで処置した。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｂは、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞を埋入され、ヒトエフェクタ細胞で再構成されたＮＳＧ  ＭＨＣｌ１‐／‐マウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａの抗腫瘍活性を示す。０日目に、ＭＨＣｌ１  ‐／‐マウス（ｎ＝７／ビヒクル対照；７／群Ｉ；及び５／群ＩＩ）に、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞（５×１０6細胞）をＩＤ埋入し、ヒトＰＢＭＣ（１×１０7細胞）をＩＰ埋入した。続いてこれらの群を、ビヒクル対照（●）又は０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａ（黒の△）で処置した。群Ｉ（図１６Ａ）は、１５、２２、２９、３６及び４３日目にＩＶ投与された５用量を受けた。群ＩＩ（図１６Ｂ）は、１５、２９及び４３日目にＩＶ投与された３用量を受けた。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１７】図１７は、カニクイザルにおけるＤＡＲＴ‐Ａ及びＤＡＲＴ‐Ｂの薬物動態プロファイルを示す。カニクイザルの複数の群（ｎ＝２／群；１Ｍ／１Ｆ）に、ＤＡＲＴ‐Ａ又はＤＡＲＴ‐Ｂを１用量０．５ｍｇ／ｋｇを投与した後、週１回１用量１．０ｍｇ／ｋｇを３週間投与し、合計４用量をＩＶ投与した。研究の経過全体に亘って、４体の試験動物それぞれに関する、ＤＡＲＴ‐Ａ（実線）及びＤＡＲＴ‐Ｂ（破線）の血清濃度をプロットしている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
実施例２  腫瘍細胞株上でのＢ７‐Ｈ３発現のＦＡＣＳ分析
例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの生物活性を評価するために好適な標的細胞株を同定するために、異なるヒト組織腫瘍タイプに由来する複数の腫瘍細胞株のパネルに亘って、Ｂ７‐Ｈ３発現を評価した。図３は、様々な癌細胞株上で検出された抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＰＥ抗体結合のＦＡＣＳヒストグラムを示す。９個の細胞株がＢ７‐Ｈ３発現に関して陽性であると確認され、また抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＰＥ抗体結合の蛍光強度に基づく、Ｂ７‐Ｈ３発現レベルの範囲を示す。最高のＢ７‐Ｈ３発現を伴う細胞株は：Ａ４９８（腎臓癌）（図３Ａ）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（乳癌）（図３Ｂ）及びＡ３７５（黒色腫）（図３Ｃ）であり；中程度のＢ７‐Ｈ３発現は：２２Ｒｖ１（前立腺癌）（図３Ｄ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（咽頭癌）（図３Ｅ）及びＤＵ１４５（前立腺癌）（図３Ｆ）であり；低Ｂ７‐Ｈ３発現は：ＢｘＰＣ３（膵臓癌）（図３Ｇ）、ＳＫＭＥＳ‐１（肺癌）（図３Ｈ）及びＵ８７（神経膠芽細胞腫）（図３Ｉ）であった。Ｂ７‐Ｈ３発現に関して陰性であることが知られているＢリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞は、使用した抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＰＥ抗体によっていずれの蛍光も示さなかった（図３Ｊ）。評価された細胞株のパネルにおけるＢ７‐Ｈ３発現の範囲は、様々なレベルの標的密度を有しかつ異なるヒト組織に由来する複数の腫瘍細胞株に対するＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（例えばＤＡＲＴ‐Ａ）の生物活性を特性決定するための基礎を提供する。