【手続補正書】
【提出日】令和1年9月9日(2019.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合部分を含む複数の第１のオリゴヌクレオチドを、少なくとも１つの高存在種を含む第１の複数の核酸分子とハイブリダイズさせること、
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドを伸長して結合部分を含む、前記第１の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記第１の複数の核酸分子に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記第１の複数の核酸分子に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および
１つ以上の固体担体上に固定された、前記結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、前記第１の複数の核酸分子に対する前記再アニールされた相補鎖を除去して第２の複数の核酸分子を生成すること、を含み、
第２の複数の核酸分子中の少なくとも１つの高存在種の含有量は、第１の複数の核酸分子中の少なくとも１つの高存在種の含有量と比較して減少されている、
複数の核酸分子から高存在種を除去する方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、
（ａ）前記結合部分が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第１級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基であり、ここで、前記結合部分がビオチンであってもよく、前記捕捉分子がストレプトアビジンであってもよく、及び／又は
（ｂ）前記第１の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖の少なくとも１つにつき第２の鎖を合成して、前記第１の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を含む、１つ以上の前記複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含み、ここで、前記合成が、複数の第２のオリゴヌクレオチドを前記第１の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、前記複数の第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含んでいてもよく、前記複数の第１のオリゴヌクレオチドまたは前記複数の第２のオリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー結合部位を含んでいてもよく、及び／又は
（ｃ）前記方法が、前記複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む、
前記方法。
【請求項３】
（ａ）前記第１の複数の核酸分子が、複数の高存在種を含む、及び／又は
（ｂ）前記少なくとも１つの高存在種が、前記第１の複数の核酸分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％に相当する、及び／又は
（ｃ）前記少なくとも１つの高存在種の量の減少が、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％である、及び／又は
（ｄ）前記第１の複数の核酸分子が、ｍＲＮＡを含む、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の複数の核酸分子が、前記複数の高存在種を含み、ここで、前記第２の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第２の複数の核酸分子の５０％未満、４０％未満、又は３０％未満に相当してもよい、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の複数の核酸分子が、複数の低存在種を含み、ここで、
前記複数の低存在種が、前記第１の複数の核酸分子の１０％未満、５％未満、又は１％未満に相当してもよく、
前記第２の複数の核酸分子が、前記複数の低存在種を含んでいてもよく、ここで、前記第２の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第２の複数の核酸分子の少なくとも５％、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％に相当してもよい、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）前記第１の複数の核酸分子のそれぞれまたは前記第２の複数の核酸分子のそれぞれが、確率バーコードを含む、及び／又は
（ｂ）前記方法が、前記第２の複数の核酸分子をシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含み、ここで、前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの５０％未満、４０％未満、又は３０％未満であってよく、前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも５％、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％であってもよく、及び／又は
（ｃ）前記方法が、前記部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含み、ここで、前記複数のブロッカーが、前記第１のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第２のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズしてもよく、前記複数のブロッカーが、前記第１のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第２のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列との間のハイブリダイゼーションを妨げてもよい、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
結合部分を含む複数の第１のオリゴヌクレオチドを、複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記結合部分を含む、前記複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および  １つ以上の固体担体上に固定された、前記結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、前記複数の標的核酸に対する前記再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、  前記複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、
正規化核酸ライブラリーの生成方法。
【請求項８】
（ａ）前記結合部分が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第１級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基であり、ここで、前記結合部分がビオチンであってもよく、前記捕捉分子がストレプトアビジンであってもよく、及び／又は
（ｂ）前記方法が、前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖の１つ以上につき第２の鎖を合成して、前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、１つ以上の前記複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含み、ここで、前記合成が、複数の第２のオリゴヌクレオチドを前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、前記複数の第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含んでもよく、前記複数の第１のオリゴヌクレオチドまたは前記複数の第２のオリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー結合部位を含んでもよく、及び／又は
（ｃ）前記方法が、前記複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）前記複数の標的核酸が、複数の低存在標的核酸を含み、ここで、前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の１０％未満、５％未満又は１％未満に相当してもよく、及び／又は
（ｂ）前記複数の標的核酸の前記正規化核酸ライブラリーが、前記複数の低存在標的核酸を含み、ここで、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも５％、少なくとも１０％又は少なくとも２０％に相当してもよい、
請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）前記複数の標的核酸が、複数の高存在標的核酸を含み、ここで、前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％に相当してもよく、
（ｂ）前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少されており、及び／又は
（ｃ）前記複数の標的核酸の前記正規化核酸ライブラリーが、前記複数の高存在標的核酸を含み、ここで、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の５０％未満、４０％未満、又は３０％未満に相当してもよく、及び／又は
（ｄ）前記複数の第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれまたは前記複数の第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、確率バーコードを含む
請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記方法が、前記正規化核酸ライブラリーをシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含み、ここで、前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの５０％未満、４０％未満、又は３０％未満であってもよく、及び／又は
（ｂ）前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも５％、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％である
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）前記方法が、前記部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含み、ここで、前記複数のブロッカーが、前記第１のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第２のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズしてもよく、前記複数のブロッカーが、前記第１のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第２のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列との間のハイブリダイゼーションを妨げてもよく、及び／又は
（ｂ）前記複数の標的核酸が、ｍＲＮＡ又はミトコンドリアｍＲＮＡ又はリボソームタンパク質ｍＲＮＡを含み、ここで、前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない７，０００個の遺伝子、最も少ない４，０００個の遺伝子、又は最も少ない２，０００個の遺伝子を含んでいてもよく、及び／又は
（ｃ）前記複数の第１のオリゴヌクレオチドが、標的特異的プライマー又は標的非特異的プライマーを含む、及び／又は
（ｄ）前記複数の標的核酸が単一細胞由来である、
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の標的核酸が、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含み、ここで、前記複数の標的核酸がゲノムＤＮＡであってもよく、前記高存在標的核酸が、短いタンデム反復配列、テロメア配列、又はセントロメア配列を含んでいてもよく、及び／又は
前記複数の標的核酸が単一細胞由来である、
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
非正規化核酸ライブラリーにおいて、結合部分を含む複数の第１のオリゴヌクレオチドを複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記結合部分を含む、前記複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および  前記複数の標的核酸に対する前記再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、
前記複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、
正規化核酸ライブラリーの生成方法。
【請求項１５】
（ａ）前記非正規化核酸ライブラリーが、１つ以上の高存在標的核酸および１つ以上の低存在標的核酸を含み、ここで、前記１つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％に相当してもよく、
（ｂ）前記正規化核酸ライブラリー中の前記１つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％減少されている、及び／又は
（ｃ）前記１つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの１０％未満、５％未満、又は１％未満に相当する、及び／又は
（ｄ）前記１つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも５％、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％に相当する、及び／又は
（ｅ）前記１つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの５０％未満、４０％未満、又は３０％未満に相当する、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）前記非正規化核酸ライブラリーがｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーである、及び／又は
（ｂ）前記非正規化核酸ライブラリーが単一細胞核酸ライブラリーである、及び／又は
（ｃ）前記非正規化核酸ライブラリーがｍＲＮＡを含む、
請求項１４又は１５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
当業者であれば理解されるであろうが、あらゆる目的で、たとえば、明細書の提供に関して、本明細書に開示された範囲はすべて、あらゆる可能なサブ範囲およびそのサブ範囲の組合せをも包含する。いずれの列挙された範囲も、十分に記述されたものとしてかつその範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などされうるものとして容易に認識可能である。たとえば、限定されるものではないが、本明細書で考察した各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１に容易に分解可能である。同様に、当業者であれば理解されるであろうが、「〜まで」、「少なくとも〜」、「〜超」、「〜未満」などの表現はすべて、リサイトされた数を含み、以上で考察したように後続的にサブ範囲に分解可能な範囲を意味する。最終的に、当業者であれば理解されるであろうが、範囲は各個別のメンバーを含む。したがって、たとえば、１〜３個の物品を有するグループは、１、２、または３個の物品を有するグループを意味する。同様に、１〜５個の物品を有するグループは、１、２、３、４、または５個の物品を有するグループを意味し、他も同様である。
なお、本発明としては、以下の態様も好ましい。
〔１〕
結合部分を含む複数の第１のオリゴヌクレオチドを、少なくとも１つの高存在種を含む第１の複数の核酸分子とハイブリダイズさせること、
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドを伸長して結合部分を含む、前記第１の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記第１の複数の核酸分子に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記第１の複数の核酸分子に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および
１つ以上の固体担体上に固定された、前記結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、前記第１の複数の核酸分子に対する前記再アニールされた相補鎖を除去して第２の複数の核酸分子を生成すること、を含み、
第２の複数の核酸分子中の少なくとも１つの高存在種の含有量は、第１の複数の核酸分子中の少なくとも１つの高存在種の含有量と比較して減少する、
複数の核酸分子から高存在種を除去する方法。
〔２〕
前記結合部分が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第１級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記結合部分がビオチンである、〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記捕捉分子がストレプトアビジンである、〔３〕に記載の方法。
〔５〕
前記第１の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖の少なくとも１つにつき第２の鎖を合成して、前記第１の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を含む、１つ以上の前記複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含む、〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕
前記合成が、複数の第２のオリゴヌクレオチドを前記第１の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、前記複数の第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含む、〔５〕に記載の方法。
〔７〕
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドまたは前記複数の第２のオリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー結合部位を含む、〔６〕に記載の方法。
〔８〕
前記複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む、〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９〕
前記第１の複数の核酸分子が、複数の高存在種を含む、〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０〕
前記少なくとも１つの高存在種が、前記第１の複数の核酸分子の少なくとも５０％に相当する、〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１〕
前記少なくとも１つの高存在種が、前記第１の複数の核酸分子の少なくとも６０％に相当する、〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２〕
前記少なくとも１つの高存在種が、前記第１の複数の核酸分子の少なくとも７０％に相当する、〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３〕
前記少なくとも１つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも８０％である、〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４〕
前記少なくとも１つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも９０％である、〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１５〕
前記少なくとも１つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも９５％である、〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１６〕
前記少なくとも１つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも９９％である、〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１７〕
前記第２の複数の核酸分子が、前記複数の高存在種を含む、〔９〕〜〔１６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１８〕
前記第２の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第２の複数の核酸分子の５０％未満に相当する、〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕
前記第２の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第２の複数の核酸分子の４０％未満に相当する、〔１７〕に記載の方法。
〔２０〕
前記第２の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第２の複数の核酸分子の３０％未満に相当する、〔１７〕に記載の方法。
〔２１〕
前記第１の複数の核酸分子が、複数の低存在種を含む、〔１〕〜〔２０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２２〕
前記複数の低存在種が、前記第１の複数の核酸分子の１０％未満に相当する、〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕
前記複数の低存在種が、前記第１の複数の核酸分子の５％未満に相当する、〔２１〕に記載の方法。
〔２４〕
前記複数の低存在種が、前記第１の複数の核酸分子の１％未満に相当する、〔２１〕に記載の方法。
〔２５〕
前記第２の複数の核酸分子が、前記複数の低存在種を含む、〔２１〕〜〔２４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２６〕
前記第２の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第２の複数の核酸分子の少なくとも５％に相当する、〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕
前記第２の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第２の複数の核酸分子の少なくとも１０％に相当する、〔２５〕に記載の方法。
〔２８〕
前記第２の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第２の複数の核酸分子の少なくとも２０％に相当する、〔２５〕に記載の方法。
〔２９〕
前記第１の複数の核酸分子のそれぞれまたは前記第２の複数の核酸分子のそれぞれが、確率バーコードを含む、〔１〕〜〔２８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３０〕
前記第２の複数の核酸分子をシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含む、〔１〕〜〔２９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３１〕
前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの５０％未満である、〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕
前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの４０％未満である、〔３０〕に記載の方法。
〔３３〕
前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの３０％未満である、〔３０〕に記載の方法。
〔３４〕
前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも５％である、〔３０〕〜〔３３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３５〕
前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも１０％である、〔３０〕〜〔３３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３６〕
前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも２０％である、〔３０〕〜〔３３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３７〕
前記部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含む、〔１〕〜〔３６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３８〕
前記複数のブロッカーが、前記第１のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第２のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズする、〔３７〕に記載の方法。
〔３９〕
前記複数のブロッカーが、前記第１のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第２のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列との間のハイブリダイゼーションを妨げる、〔３８〕に記載の方法。
〔４０〕
結合部分を含む複数の第１のオリゴヌクレオチドを、複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記結合部分を含む、前記複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および  １つ以上の固体担体上に固定された、前記結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、前記複数の標的核酸に対する前記再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、  前記複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、
正規化核酸ライブラリーの生成方法。
〔４１〕
前記結合部分が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第１級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基である、〔４０〕に記載の方法。
〔４２〕
前記結合部分がビオチンである、〔４１〕に記載の方法。
〔４３〕
前記捕捉分子がストレプトアビジンである、〔４２〕に記載の方法。
〔４４〕
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖の１つ以上につき第２の鎖を合成して、前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、１つ以上の前記複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含む、〔４０〕〜〔４３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４５〕
前記合成が、複数の第２のオリゴヌクレオチドを前記複数の標的核酸の前記複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、前記複数の第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含む、〔４４〕に記載の方法。
〔４６〕
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドまたは前記複数の第２のオリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー結合部位を含む、〔４５〕に記載の方法。
〔４７〕
前記複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む、〔４４〕〜〔４６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４８〕
前記複数の標的核酸が、複数の低存在標的核酸を含む、〔４０〕〜〔４７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４９〕
前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の１０％未満に相当する、〔４８〕に記載の方法。
〔５０〕
前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の５％未満に相当する、〔４８〕に記載の方法。
〔５１〕
前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の１％未満に相当する、〔４８〕に記載の方法。
〔５２〕
前記複数の標的核酸の前記正規化核酸ライブラリーが、前記複数の低存在標的核酸を含む、〔４８〕〜〔５１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５３〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも５％に相当する、〔５２〕に記載の方法。
〔５４〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも１０％に相当する、〔５２〕に記載の方法。
〔５５〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも２０％に相当する、〔５２〕に記載の方法。
〔５６〕
前記複数の標的核酸が、複数の高存在標的核酸を含む、〔４０〕〜〔５５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５７〕
前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも５０％に相当する、〔５６〕に記載の方法。
〔５８〕
前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも６０％に相当する、〔５６〕に記載の方法。
〔５９〕
前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも７０％に相当する、〔５６〕に記載の方法。
〔６０〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも８０％減少する、〔５６〕〜〔５９〕に記載の方法。
〔６１〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも９０％減少する、〔５６〕〜〔５９〕に記載の方法。
〔６２〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも９５％減少する、〔５６〕〜〔５９〕に記載の方法。
〔６３〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも９９％減少する、〔５６〕〜〔５９〕に記載の方法。
〔６４〕
前記複数の標的核酸の前記正規化核酸ライブラリーが、前記複数の高存在標的核酸を含む、〔５６〕〜〔６３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６５〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の５０％未満に相当する、〔６４〕に記載の方法。
〔６６〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の４０％未満に相当する、〔６４〕に記載の方法。
〔６７〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の３０％未満に相当する、〔６４〕に記載の方法。
〔６８〕
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれまたは前記複数の第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、確率バーコードを含む、〔４０〕〜〔６７〕に記載の方法。
〔６９〕
前記正規化核酸ライブラリーをシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含む、〔４０〕〜〔６８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７０〕
前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの５０％未満である、〔６９〕に記載の方法。
〔７１〕
前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの４０％未満である、〔６９〕に記載の方法。
〔７２〕
前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの３０％未満である、〔６９〕に記載の方法。
〔７３〕
前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも５％である、〔６９〕〜〔７２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７４〕
前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも１０％である、〔６９〕〜〔７２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７５〕
前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも２０％である、〔６９〕〜〔７２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７６〕
前記部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含む、〔４０〕〜〔７５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７７〕
前記複数のブロッカーが、前記第１のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第２のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズする、〔７６〕に記載の方法。
〔７８〕
前記複数のブロッカーが、前記第１のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第２のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列との間のハイブリダイゼーションを妨げる、〔７７〕に記載の方法。
〔７９〕
前記複数の標的核酸が、ｍＲＮＡを含む、〔４０〕〜〔７８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８０〕
前記複数の標的核酸が、ミトコンドリアｍＲＮＡを含む、〔７９〕に記載の方法。
〔８１〕
前記複数の標的核酸が、リボソームタンパク質ｍＲＮＡを含む、〔７９〕に記載の方法。
〔８２〕
前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない７，０００個の遺伝子を含む、〔７９〕〜〔８１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８３〕
前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない４，０００個の遺伝子を含む、〔７９〕〜〔８１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８４〕
前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない２，０００個の遺伝子を含む、〔７９〕〜〔８１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８５〕
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドが、標的特異的プライマーを含む、〔４０〕〜〔８４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８６〕
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドが、標的非特異的プライマーを含む、〔４０〕〜〔８４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８７〕
前記複数の標的核酸が、ｃＤＮＡを含む、〔４０〕〜〔７８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８８〕
前記複数の標的核酸が、ゲノムＤＮＡを含む、〔４０〕〜〔７８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８９〕
前記高存在標的核酸が、短いタンデム反復配列を含む、〔８８〕に記載の方法。
〔９０〕
前記高存在標的核酸が、テロメア配列を含む、〔８８〕に記載の方法。
〔９１〕
前記高存在標的核酸が、セントロメア配列を含む、〔８８〕に記載の方法。
〔９２〕
前記複数の標的核酸が、単一細胞由来である、〔４０〕〜〔９１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９３〕
非正規化核酸ライブラリーにおいて、結合部分を含む複数の第１のオリゴヌクレオチドを複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、
前記複数の第１のオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記結合部分を含む、前記複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および  前記複数の標的核酸に対する前記再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、
前記複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、
正規化核酸ライブラリーの生成方法。
〔９４〕
前記非正規化核酸ライブラリーが、１つ以上の高存在標的核酸および１つ以上の低存在標的核酸を含む、〔９３〕に記載の方法。
〔９５〕
前記１つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも５０％に相当する、〔９４〕に記載の方法。
〔９６〕
前記１つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも６０％に相当する、〔９４〕に記載の方法。
〔９７〕
前記１つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも７０％に相当する、〔９４〕に記載の方法。
〔９８〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記１つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも８０％減少する、〔９４〕〜〔９７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９９〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記１つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも９０％減少する、〔９４〕〜〔９７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１００〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記１つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも９５％減少する、〔９４〕〜〔９７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０１〕
前記正規化核酸ライブラリー中の前記１つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも９９％減少する、〔９４〕〜〔９７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０２〕
前記１つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの１０％未満に相当する、〔９４〕〜〔１０１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０３〕
前記１つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの５％未満に相当する、〔９４〕〜〔１０１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０４〕
前記１つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの１％未満に相当する、〔９４〕〜〔１０１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０５〕
前記１つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも５％に相当する、〔９４〕〜〔１０４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０６〕
前記１つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも１０％に相当する、〔９４〕〜〔１０４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０７〕
前記１つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも２０％に相当する、〔９４〕〜〔１０４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０８〕
前記１つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの５０％未満に相当する、〔９４〕〜〔１０７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０９〕
前記１つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの４０％未満に相当する、〔９４〕〜〔１０７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１０〕
前記１つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの３０％未満に相当する、〔９４〕〜〔１０７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１１〕
前記非正規化核酸ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである、〔９３〕〜〔１１０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１２〕
前記非正規化核酸ライブラリーがゲノムライブラリーである、〔９３〕〜〔１１０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１３〕
前記非正規化核酸ライブラリーが単一細胞核酸ライブラリーである、〔９３〕〜〔１１２〕のいずれか一項に記載の方法。