【誤訳訂正書】
【提出日】令和1年5月29日(2019.5.29)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】消化管炎症低下および／または消化管粘膜バリア強化の利益を享受する疾患処置のために操作された細菌
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月２日に出願したＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２０５３０号の一部継続出願であり、２０１５年１０月３０日に出願した米国特許仮出願第６２／２４８，８１４号、２０１５年１０月３０日に出願した米国特許仮出願第６２／２４８，８２５号、２０１５年１０月３０日に出願した米国特許仮出願第６２／２４８，８０５号、２０１５年１１月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／２５６，０４２号、２０１５年１１月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／２５６，０４４号、２０１５年１１月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／２５６，０４８号、２０１６年２月４日に出願した米国特許仮出願第６２／２９１，４６１号、２０１６年２月４日に出願した米国特許仮出願第６２／２９１，４７０号、２０１６年２月４日に出願した米国特許仮出願第６２／２９１，４６８号、および２０１５年１２月２２日に出願した米国特許出願第１４／９９８，３７６号の利益を主張する。開示の連続性を与えるため、前記出願の全体が参照により本明細書に援用される。
配列リスト
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されたシーケンスリストを含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。上記のＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年１月５日に作成され、１２６７１＿０００８−０１３０４＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは８１５，３８０バイトである。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、消化管において炎症性メカニズムを抑制し、消化管粘膜バリア機能を回復および強化し、および／または自己免疫障害を処置および防止するための組成物および治療上の方法に関する。一定の態様において、本開示は、消化管において炎症を低減し、および／または消化管バリア（腸障壁とも言う）機能を高めることが可能な遺伝学的に操作された細菌に関する。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、消化管炎症を低減し、および／または消化管バリア機能を高めることが可能であり、それによって自己免疫障害が改善または防止される。いくらかの態様では、ここに開示される組成物および方法は、自己免疫障害、ならびに消化管炎症および／または低下した消化管バリア機能に関連する疾患および状態、例は、下痢性疾患、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、および関連疾患を処置または防止するために使用されうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
炎症性腸疾患（ＩＢＤｓ）は、Ｔ細胞および活性化マクロファージにより典型的に駆動される胃腸管において顕著な局所炎症によって、および宿主循環系からの消化管の内腔内容物を分離する上皮バリアの機能低下によって特徴付けられる疾患のグループである〔Ｇｈｉｓｈａｎ（ギースハン）ら、２０１４〕。ＩＢＤの病因は、遺伝学的要因および環境的要因の双方に関連しており、および消化管細菌と腸免疫系との間の変動した相互作用によって引き起こされる可能性がある。ＩＢＤを処置するための現在のアプローチは免疫系を調節し、および炎症を抑止する治療学に焦点が当てられる。これらの治療には、ステロイド、たとえば、プレドニゾンなどのようなもの、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）インヒビター、たとえば、Ｈｕｍｉｒａ（ヒュミラ）(R)（商標）などのようなものが含まれる〔Ｃｏｈｅｎ（コーエン）ら、２０１４〕。このアプローチの欠点は、全身免疫抑制に関連し、それには、感染性疾患およびガンに対する罹患率がより一層高いことが含まれる。
【０００５】
他のアプローチは、短鎖脂肪酸ブチラートを、注腸を介して供給することによってバリア機能低下の処置に焦点があてられた。近年、いくつかのグループは、消化管での免疫系の調節において共生細菌による短鎖脂肪酸産生の重要性を実証しており〔Ｓｍｉｔｈ（スミス）ら、２０１３〕、ブチラートが調節性Ｔ細胞の分化を誘導し、およびＩＢＤにおける炎症に関連する免疫応答を抑制することにおいて直接役割を果たすことが示された〔Ａｔａｒａｓｈｉ（アタラシ）ら、２０１１；Ｆｕｒｕｓａｗａ（フルサワ）ら、２０１３〕。ブチラートは通常、食物繊維の微生物発酵によって生成され、結腸上皮細胞恒常性およびバリア機能を維持する中心的な役割を果たす〔Ｈａｍｅｒ（ハマー）ら、２００８〕。ブチラート注腸剤を用いた研究は、ペイシェント（主として患者を意味する）にいくらかの利益をもたらすが、この処置は長期療法には実用的ではない。より最近では、ＩＢＤを有する患者は健康な患者から糞便移送により処置され、いくらか成功している〔Ｉａｎｉｒｏ（イアニロ）ら、２０１４〕。この成功は、消化管微生物が疾患の病理学において果たす中心的役割を例示し、一定の微生物機能がＩＢＤ疾患プロセスの改善に関連することを示唆する。しかしながら、このアプローチは、感染性疾患をドナーからレシピエントに伝達することに対する安全性の懸念を提起する。さらに、この処置の性質はネガティブスティグマ（否定的とも言う）であり、そして従って広く受け入れられる可能性は低い。
【０００６】
低下した消化管バリア機能はまた、自己免疫疾患の病因において中心的な役割を果たす〔Ｌｅｒｎｅｒ（ラーナー）ら、２０１５ａ；Ｌｅｒｎｅｒら、２０１５ｂ；Ｆａｓａｎｏ（ファザーノ）ら、２００５；Ｆａｓａｎｏ、２０１２〕。上皮細胞の単一の層は、体において免疫細胞から消化管内腔を分離する。上皮は細胞間タイトジャンクションによって調節され、および耐性と非自己抗原に対する免疫との間の平衡を制御する（Ｆａｓａｎｏら、２００５）。上皮層を破壊することにより、高度に免疫反応性の上皮下組織の病理学的暴露が内腔において膨大な数の外来抗原に対して導かれることがあり（Ｌｅｒｎｅｒら、２０１５ａ）、結果として増加した罹患率がもたらされ、および腸内および腸管外の自己免疫障害の双方が起こりうる″（Ｆａｓａｎｏら、２００５）。いくらかの外来抗原は、自己抗原に似ていると考えられ、および既存の自己免疫疾患の進行を促進し、または自己免疫疾患を惹起するエピトープ特異的交差反応を誘発することができる（Ｆａｓａｎｏ、２０１２）。関節リウマチおよびセリアック病は、たとえば、腸の透過性の増加を伴うと考えられる自己免疫障害である（Ｌｅｒｎｅｒら、２０１５ｂ）。遺伝学的に自己免疫疾患に罹患し易い個体では、細胞間タイトジャンクションの調節不全が疾患発症を引き起こす可能性がある（Ｆａｓａｎｏ、２０１２）。実際、自己免疫が発達するためには、環境と相互作用する粘膜バリアの防御機能の喪失が必要である（Ｌｅｒｎｅｒら、２０１５ａ）。
【０００７】
消化管微生物における変化は宿主の免疫応答を変動させる可能性がある〔Ｐａｕｎ（ポーン）ら、２０１５；Ｓａｎｚ（サンス）ら、２０１４；Ｓａｎｚら、２０１５；Ｗｅｎ（ウェン）ら、２００８〕。たとえば、１型糖尿病について遺伝学的リスクが高い小児では、疾患について自己免疫を発達させる子供と健康を維持する者との間に消化管内微生物に著しい差異がある〔Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（リチャードソン）ら、２０１５〕。他は、消化管細菌が喘息の防止における潜在的な治療上の標的であり、および肺の炎症における強力な免疫調節能力を見せることが示された〔Ａｒｒｉｅｔａ（アーリエータ）ら、２０１５〕。したがって、胃腸管におけるバリア機能の増強および炎症の減少は、自己免疫疾患の処置または防止のための潜在的な治療メカニズムである。
【０００８】
最近では、抗炎症性分子、たとえば、ＩＬ−１０などのようなものを生成する微生物を作製し、および治療用物質を消化管において炎症の部位に直接送るためにそれらを患者に経口施与する努力がなされている。このアプローチの利点は、免疫抑制剤の全身投与が避けられ、および治療用物質が胃腸管に直接送られることである。しかしながら、これらの操作された微生物はいくらかの前臨床モデルにおいて有効性を示しているが、患者における有効性は観察されていない。患者の処置における成功の欠如の一つの理由は、多量の非天然タンパク質、たとえば、ヒトインターロイキンの構成上の生産に起因して、微生物の生存能力および安定性が損なわれることである。したがって、消化管炎症を減少させ、消化管バリア機能を増強し、および／または自己免疫疾患を処置し、およびそれらが望ましくない副作用を回避するものであるためにさらなる治療に対する大きな必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ここに開示される遺伝学的に操作された細菌は、治療上の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を生成することが可能である。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、それらが誘発性の環境、例は、哺乳動物の消化管に達するまで、機能的にサイレントであり、そこで治療上の分子の発現が誘導される。一定の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は自然に非病原性であり、および消化管炎症を減少させ、および／または消化管バリア機能を増強するために消化管に導入することができ、およびそれによって自己免疫障害をさらに改善または防止しうる。一定の実施態様において、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は、遺伝学的に操作された細菌によって安定的に生成され、および／または遺伝学的に操作された細菌は、インビボおよび／またはインビトロで安定に維持される。本発明はまた、遺伝学的に操作された細菌を含む製薬上組成物、および消化管炎症の減少および／または消化管粘膜バリア機能の強化、例は、炎症性腸疾患または自己免疫障害からの利益を享受する疾患を処置する方法も提供する。
【００１０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、環境条件、例は、哺乳類の消化管で見出される環境条件、たとえば、炎症状態または低酸素状態によって誘導される一またはそれよりも多く（一以上とも言う）のプロモーターの制御下に一以上の治療上の分子（群、複数でもありうる）を生成する。したがって、いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、酸素レベル依存性プロモーター、反応性酸素種（ＲＯＳ、活性酸素種とも言う）依存性プロモーター、または反応性窒素種（ＲＮＳ、活性窒素種とも言う）依存性プロモーター、および対応する転写因子の制御下で一以上の治療上の分子（群）を生成する。いくらかの実施態様では、治療上の分子はブチラート（酪酸塩、酪酸、ブチレートとも言う）であり；誘導性環境において、酪酸塩生合成遺伝子カセットが活性化され、および酪酸塩が生成される。酪酸塩の局所生産は、消化管において調節性（制御性とも言う）Ｔ細胞の分化を誘導し、および／または結腸上皮細胞のバリア機能を促進する。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、誘導性環境、たとえば、消化管などのようなものにおいてだけそれらの治療上の効果を生じ、それによって全身暴露に関連する安全性の問題が低減される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】ＦＮＲ応答性プロモーター制御下で、プロピオナート生合成カセットを発現するように遺伝子操作された大腸菌の概略図である。
【図１Ｂ】ＦＮＲ応答性プロモーター制御下で、ブチラート生合成カセットを発現するように遺伝子操作された大腸菌の概略図である。
【図１Ｃ】ＦＮＲ応答性プロモーター制御下で、アセタート生合成カセットを発現するように遺伝子操作された大腸菌の概略図である。
【図１Ｄ】ＦＮＲ応答性プロモーター制御下で、ＧＬＰ−２発現カセットを発現するように遺伝子操作された大腸菌の概略図である。発現したポリペプチドを細胞外に分泌するための分泌系をさらに含み得る。
【図１Ｅ】ＦＮＲ応答性プロモーター制御下で、ヒトＩＬ−１０発現カセットを発現するように遺伝子操作された大腸菌の概略図である。発現したポリペプチドを細胞外に分泌するための分泌系をさらに含み得る。
【図１Ｆ】遺伝子操作された大腸菌の概略図である。発現したポリペプチドを細胞外に分泌するための分泌系をさらに含み得る。
【図２Ａ】ブチラート生成の代謝経路を示す模式図である。
【図２Ｂ】テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、例示的なブチラート生成回路の模式図である。プラスミド上のｔｅｔプロモーター制御下にあるｂｄｃ２ブチラートカセットを示す。「ｂｄｃ２カセット」または「ｂｄｃ２ブチラートカセット」は、少なくとも以下の遺伝子を含むブチラート生成カセットのことをいう：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ遺伝子。
【図２Ｃ】テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、例示的なブチラート生成回路の模式図である。プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下にあるブチラートカセット（ｔｅｒ遺伝子がｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、およびｅｔｆＡ３遺伝子を置換する）を示す。「ｔｅｒカセット」または「ｔｅｒブチラートカセット」は、少なくとも以下の遺伝子を含むブチラート生成カセットのことをいう：ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ。
【図２Ｄ】テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある第３の例示的なブチラート遺伝子カセット、具体的には、プラスミド上のｔｅｔプロモーーター制御下にあるｔｅｓＢブチラートカセット（ｔｅｒ遺伝子が存在し、ｔｅｓＢ遺伝子がｐｂｔ遺伝子およびｂｕｋ遺伝子を置換する）の模式図である。「ｔｅｓカセットもしくはｔｅｓＢカセット」または「ｔｅｓブチラートカセットもしくはｔｅｓＢブチラートカセット」とは、少なくともｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含むブチラート生成カセットをいう。本開示における代替のブチラートカセットは、少なくともｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｔｅｓカセットまたはｔｅｓＢカセットは、テトラサイクリン誘導性プロモーター以外の誘導性プロモーターの制御下にある。ｔｅｓＢカセットの発現を制御しうる例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターが含まれる。
【図３Ａ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の模式図である。本発明の例示的な操作細菌の遺伝子構成および低酸素条件下におけるブチラート生成の誘導を示す。好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付きの「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、ブチラート生成が比較的低くなることを示す。したがって、ブチラート生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ；白いボックス）はいずれも発現しない。
【図３Ｂ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の模式図である。本発明の例示的な操作細菌の遺伝子構成および低酸素条件下におけるブチラート生成の誘導を示す。低酸素または嫌気性条件下では、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付きの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびブチラート生合成酵素の発現誘導によりブチラート生成がもたらされ、ブチラート生成が増加することを示す。
【図３Ｃ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の模式図である。本発明の例示的な組換え細菌の遺伝子構成および一酸化窒素（ＮＯ）の存在下における抑制解除を示す。ＮＯ非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（サークル、「ＮｓｒＲ」）は、対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、ブチラート生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ）はいずれも発現しない。
【図３Ｄ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の模式図である。本発明の例示的な組換え細菌の遺伝子構成および一酸化窒素（ＮＯ）の存在下における抑制解除を示す。ＮＯ存在下では、ＮｓｒＲ転写因子はＮＯと相互作用し、もはや調節配列に結合または抑制しない。これにより、ブチラート生合成酵素の発現（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）および最終的にはブチラートの生成がもたらされる。
【図３Ｅ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の模式図である。本発明の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２の存在下における誘導を示す。Ｈ２Ｏ２非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（サークル、「ＯｘｙＲ」）はｏｘｙＳプロモーターに結合するが、誘導はしない。したがって、ブチラート生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ）はいずれも発現しない。
【図３Ｆ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の模式図である。本発明の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２の存在下における誘導を示す。Ｈ２Ｏ２存在下では、ＯｘｙＲ転写因子はＨ２Ｏ２と相互作用し、次いでｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これにより、ブチラート生合成酵素の発現（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）および最終的にはブチラート生成がもたらされる。
【図４Ａ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な操作細菌の遺伝子構成と、図３のものとは異なるブチラート回路を用いた低酸素条件下におけるブチラート生成の誘導を示す。好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付きの「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、ブチラート生成量が比較的低くなることを示す。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ；白いボックス）はいずれも発現しない。
【図４Ｂ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な操作細菌の遺伝子構成と、図３のものとは異なるブチラート回路を用いた低酸素条件下におけるブチラート生成の誘導を示す。低酸素または嫌気条件下において、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付きの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびブチラート生合成酵素の発現誘導によりブチラート生成がもたらされ、ブチラート生成が増加することを示す。
【図４Ｃ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＮＯ存在下での抑制解除を示す。ＮＯ非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（サークル、「ＮｓｒＲ」）は、対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ）はいずれも発現しない。
【図４Ｄ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＮＯ存在下での抑制解除を示す。ＮＯ存在下では、ＮｓｒＲ転写因子はＮＯと相互作用し、もはや調節配列に結合または抑制しない。これにより、ブチラート生合成酵素の発現（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）および最終的にはブチラート生成がもたらされる。
【図４Ｅ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２存在下での誘導を示す。Ｈ２Ｏ２非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（サークル、「ＯｘｙＲ」）はｏｘｙＳプロモーターに結合するが、誘導はしない。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ）はいずれも発現しない。
【図４Ｆ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２存在下での誘導を示す。Ｈ２Ｏ２存在下では、ＯｘｙＲ転写因子はＨ２Ｏ２と相互作用し、次いでｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これにより、ブチラート生合成酵素の発現（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）および最終的にはブチラート生成がもたらされる。
【図５Ａ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の例示的な組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下での誘導を示す。好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付きの「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、ブチラート生成が比較的低くなることを示す。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ）はいずれも発現しない。
【図５Ｂ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の例示的な組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下での誘導を示す。低酸素条件下では、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付きの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびブチラート生合成酵素の発現誘導によりブチラート生成がもたらされ、ブチラート生成が増加することを示す。
【図５Ｃ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＮＯ存在下での抑制解除を示す。ＮＯ非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（「ＮｓｒＲ」）は、対応する調節領域に結合し、これを抑制する。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｔｅｓＢ）はいずれも発現しない。
【図５Ｄ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＮＯ存在下での抑制解除を示す。ＮＯ存在下では、ＮｓｒＲ転写因子はＮＯと相互作用し、もはや調節配列に結合または抑制しない。これにより、ブチラート生合成酵素の発現（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）および最終的にはブチラート生成がもたらされる。
【図５Ｅ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２存在下での誘導を示す。Ｈ２Ｏ２非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（サークル、「ＯｘｙＲ」）はｏｘｙＳプロモーターに結合するが、誘導はしない。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｔｅｓＢ）はいずれも発現しない。
【図５Ｆ】本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２存在下での誘導を示す。Ｈ２Ｏ２存在下では、ＯｘｙＲ転写因子はＨ２Ｏ２と相互作用し、次いでｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これにより、ブチラート生合成酵素の発現（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）および最終的にはブチラート生成がもたらされる。
【図６Ａ】誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付きの「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、プロピオナート生成が比較的低くなることを示す。したがって、プロピオナート生合成酵素（ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、ａｃｒＣ）は、いずれも発現しない。
【図６Ｂ】誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。低酸素または嫌気条件下では、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付きの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現誘導によりプロピオナート生成がもたらされ、プロピオナート生成が増加することを示す。他の実施形態では、前記の図３Ｃ〜３Ｆ、図４Ｃ〜４Ｆ、図５Ｃ〜５Ｆのブチラートカセット（複数可）について図示および記載されているように、プロピオナート生成はＮＯまたはＨ２Ｏ２によって誘導される。
【図７】例示的なプロピオナート生合成遺伝子カセットを示した図である。
【図８Ａ】誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付きの「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、プロピオナート生成が比較的低くなることを示す。したがって、プロピオナート生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ）は、いずれも発現しない。
【図８Ｂ】誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。低酸素または嫌気性条件下では、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付きの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現誘導によりプロピオナート生成がもたらされ、プロピオナート生成が増加することを示す。
【図８Ｃ】誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。例示的なプロピオナート生合成遺伝子カセットを示す。他の実施形態では、前記の図３Ｃ〜３Ｆ、図４Ｃ〜４Ｆ、図５Ｃ〜５Ｆのブチラートカセット（複数可）について図示および記載されているように、プロピオナート生成はＮＯまたはＨ２Ｏ２によって誘導される。
【図９Ａ】誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付きの「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、プロピオナート生成が比較的低くなることを示す。したがって、プロピオナート生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、ｔｅｓＢ）のいずれも発現しない。
【図９Ｂ】誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略図である。低酸素または嫌気性条件下では、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付きの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現誘導によりプロピオナート生成がもたらされ、プロピオナート生成が増加することを示す。他の実施形態では、前記の図３Ｃ〜３Ｆ、図４Ｃ〜４Ｆ、図５Ｃ〜５Ｆのブチラートカセット（複数可）について図示および記載されているように、プロピオナート生成はＮＯまたはＨ２Ｏ２によって誘導される。
【図１０Ａ】本開示の例示的な細菌のスリーピングビューティー経路の概略図である。プロピオナート生成のために遺伝子操作を行った大腸菌スリーピングビューティー代謝経路の概略図を示す。ＳＢＭ経路は循環的であり、出発分子のスクシニル−ＣｏＡを再生しながら、発酵産物としてプロピオナートを形成する一連の生化学的変換からなる。
【図１０Ｂ】本開示の例示的な細菌のスリーピングビューティー遺伝子の構成概略図である。本発明の別の例示的な操作細菌の遺伝子構成および低酸素条件下におけるプロピオナート生成の誘導を示す。好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付きの「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、プロピオナート生成が比較的低くなることを示す。したがって、プロピオナート生合成酵素（ｓｂｍ、ｙｇｆＤ、ｙｇｆＧ、ｙｇｆＨ）は、いずれも発現しない。
【図１０Ｃ】本開示の例示的な細菌のスリーピングビューティー遺伝子の構成概略図である。本発明の別の例示的な操作細菌の遺伝子構成および低酸素条件下におけるプロピオナート生成の誘導を示す。低酸素または嫌気条件下では、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付きの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現誘導によりプロピオナート生成がもたらされ、プロピオナート生成が増加することを示す。他の実施形態では、前記の図３Ｃ〜３Ｆ、図４Ｃ〜４Ｆ、図５Ｃ〜５Ｆのブチラートカセット（複数可）について図示および記載されているように、プロピオナート生成はＮＯまたはＨ２Ｏ２によって誘導される。
【図１１】本開示のブチラート生成菌株によるブチラート生成を示す棒グラフである。酸素の存在下および非存在下におけるｐＬＯＧＩＣ０３１株およびｐＬＯＧＩＣ０４６株によるブチラート生成を示しており、ブチラート生成に有意差はない。最終２遺伝子（ｐｔｂ−ｂｕｋ）の欠失およびそれらの内因性大腸菌ｔｅｓＢ遺伝子（ブチリルＣｏＡからブチラート部分を切除するチオエステラーゼ）による置換を含むｐＬＯＧＩＣ０４６について、当該ｐＬＯＧＩＣ０４６を発現する低コピープラスミドのニッスルでは、ブチラート生成の増加が示された。一晩培養した細胞をＬｂで１：１００に希釈し、対数期初期に達するまで１．５時間増殖させてから、無水ｔｅｔを最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加してプラスミド発現を誘導した。誘導から２時間後に、細胞を洗浄し、０．５％グルコースを含むＭ９最小培地にＯＤ６００＝０．５になるように再懸濁した。指定時間にサンプルを取り出し、細胞を遠心により沈殿させた。ＬＣ−ＭＳを用いて、上清中のブチラート生成量について検査した。
【図１２】本開示のブチラート生成菌株によるブチラート生成を示す棒グラフである。ｔｅｒ置換（ｐＬＯＧＩＣ０４６）またはｔｅｓＢ置換（ｐｔｂ−ｂｕｋ欠失）を含むｔｅｔ−ブチラートカセットについて、当該ブチラートカセットの含有菌株におけるブチラート生成を示す。ｔｅｓＢ置換株では、ブチラート生成がより高いことを実証している。
【図１３】ｎｕｏＢ遺伝子欠失を含む種々のブチラート生成回路によるブチラート生成のグラフである。ｂｃｄ−ブチラートカセット含有ＢＷ２５１１３株（ｎｕｏＢ欠失あり・なし）、ｔｅｒ−ブチラートカセット含有ＢＷ２５１１３株（ｎｕｏＢ欠失あり・なし）が示されている。ｎｕｏＢ欠失のある菌株には、ｎｕｏＢの表示が付されている。ＮｕｏＢ遺伝子の欠失は、ブチラート生成菌株における野生型の親コントロールと比較して、ブチラート生成レベルの上昇をもたらす。ＮｕｏＢは、呼吸性増殖の間にＮＡＤＨの酸化に関与するタンパク質複合体である。ＮＡＤＨ酸化の電子輸送へのカップリングを妨げることで、ブチラート生成を支持するために用いるＮＡＤＨ量を増加させることが可能になる。
【図１４Ａ】ＦＮＲプロモーターの制御下のブチラート生成回路を示す模式図である。
【図１４Ｂ】ＦＮＲプロモーターの制御下にあるブチラート生成回路によるブチラート生成を示すグラフである。嫌気性誘導によるブチラート生成を示す棒グラフである。ＦＮＲ応答性プロモーターを、ｂｃｄ回路またはｔｅｒ回路のいずれかを含むブチラートカセットに融合させた。形質転換した細胞をＬＢ中で対数期初期まで増殖させ、嫌気性チャンバーに４時間置いて、ブチラート遺伝子の発現を誘導した。細胞を洗浄してから、０．５％（ｗ／）グルコースを含む最小培地に再懸濁し、経時的にブチラート生成をモニターするために微好気的にインキュベートした。ＳＹＮ−５０１は、嫌気性条件下で有意なブチラート生成をもたらした
【図１４Ｃ】ＦＮＲプロモーターの制御下にあるブチラート生成回路によるブチラートを示すグラフである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるグルコースおよび酸素の存在下ならびに非存在下でのＳＹＮ−５０１の結果を示す。ＳＹＮ−５０１は、ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒブチラートプラスミドを含む；ＳＹＮ−５００は、ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｂｃｄブチラートプラスミドを含む；ＳＹＮ−５０６は、ｐＳＣ１０１  ｎｉｒＢ−ｂｃｄブチラートプラスミドを含む。
【図１４Ｄ】ＦＮＲプロモーターの制御下にあるブチラート生成回路によるバイオマーカー生成を示すグラフである。ｉｎ  ｖｉｖｏモデルの糞便試料を用いたＥＬＩＳＡによって定量されたマウスリポカリン２（左）およびカルプロテクチン（右）のレベルを示す。野生型ニッスルコントロールと比較して、ＳＹＮ−５０１は炎症を低減し、および／または消化管バリア機能を保護する。
【図１５】デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）によって誘発したＩＢＤのマウスモデルにおいて、消化管バリア機能の測定結果を示すグラフである。消化管バリア機能の指標として、様々な濃度のＤＳＳを投与したマウス血漿中のＦＩＴＣデキストラン量を測定した。
【図１６】分光光度測定によって分析した、血清中のＦＩＴＣ-デキストラン量を示す図である。ＦＩＴＣ−デキストランは、ＤＳＳによって誘発したＩＢＤのマウスモデルにおける消化管バリア機能の読み出し情報である。
【図１７】Ｈ２Ｏ、１００ｍＭブチラート（Ｈ２０中）、ストレプトマイシン耐性ニッスルコントロールまたはＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ−＞ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートプラスミドを含むＳＹＮ５０１のいずれかを強制投与したマウスについて、当該マウス糞便中のブチラート濃度の散布図である。ニッスルコントロールを強制投与したマウスまたは水のみを与えたマウスと比較して、ＳＹＮ５０１を強制投与したマウスの糞便中からは、有意により高濃度のブチラートが検出された。検出された濃度は２ｍＭに近く、Ｈ２０（+）２００ｍＭブチラートを与えたマウスで見られる濃度よりも高かった。
【図１８】好気性条件下および嫌気性条件下において、示された時点で、ブチラートカセットプラスミド株ＳＹＮ５０１がｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成するブチラート濃度を示す棒グラフである。クロストリジウム・ブチリカムＭＩＹＡＲＩＳＡＮ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＭＩＹＡＲＩＳＡＮ）（日本のプロバイオティク株）、クロストリジウム・チロブチリカムＶＰＩ  ５３９２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＶＰＩ  ５３９２）（基準株）、およびクロストリジウム・ブチリカムＮＣＴＣ  ７４２３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＮＣＴＣ  ７４２３）（基準株）と比較して示している。ブチラートカセット含有ニッスル株は、ＲＣＭ培地中のクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）に匹敵する濃度のブチラートを生成する。
【図１９】プラスミドコピー菌株と比較して、染色体に組み込まれたブチラートコピー含有菌株がｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成したブチラート濃度を示す棒グラフである。染色体に組み込まれたブチラート菌株、すなわちＳＹＮ１００１およびＳＹＮ１００２（共にａｇａＩ／ｒｓｍｌ遺伝子座で組み込まれている）は、プラスミド菌株ＳＹＮ５０１に匹敵するブチラートを生成した。
【図２０Ａ】ＮｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢからの調節配列、およびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なプラスミド（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物）の構造および遺伝子構成を示す図である。
【図２０Ｂ】ＮｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢからの調節配列、およびブチロジーニック遺伝子カセットを含む別の例示的プラスミド（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチロジーニック遺伝子カセット）の構造および遺伝子構成を示す図である。
【図２１】ＳＹＮ００１＋ｔｅｔ（プラスミドを含まない野生型ニッスルコントロール）、ＳＹＮ０６７＋ｔｅｔ（ｐＬＯＧＩＣ０３１  ＡＴＣ誘導性ブチラートプラスミドを含むニッスル）、およびＳＹＮ０８０＋ｔｅｔ（ｐＬＯＧＩＣ０４６  ＡＴＣ誘導性ブチラートプラスミドを含むニッスル）によるブチラート生成を示す図である。
【図２２】ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物（ＳＹＮ１３３）またはｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物（ＳＹＮ１４５）を有する遺伝子操作ニッスルによるブチラート生成を示す図である。当該遺伝子操作ニッスルは、野生型ニッスル（ＳＹＮ００１）と比較して、より多くのブチラートを生成する。
【図２３】ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｏｘｙＳ−ブチロジーニック遺伝子カセット）を含む例示的なプラスミドの構成および遺伝子構成を示す図である。
【図２４】ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｏｘｙＳ−ブチロジーニック遺伝子カセット）を含む別の例示的なプラスミドの構成および遺伝子構成を示す図である。
【図２５】操作細菌のブチラートおよびアセタート生成を増加させるための戦略を描いた概略図である。クエン酸回路（ＴＣＡ回路）（斜線で除外されている）による好気的代謝は、結腸の嫌気的環境では不活性である。大腸菌は発酵の最終産物として高レベルのアセタートを生成する。高レベルのブチラート生成を依然として維持しながら、アセタート生成量を改善するために、標的化欠失を導入して、不要な代謝発酵副産物の生成を防止することができる（それによって同時にブチラートおよびアセタート生成を増加させる）。競合経路（角の丸いボックスで示されている）の非限定的な例は、ｆｒｄＡ（ホスホエノールパイルベートをスクシナートに変換する）、ｌｄｈＡ（パイルベートをラクタートに変換する）およびａｄｈＥ（アセチル−ＣｏＡをエタノールに変換する）である。したがって、目的の欠失には、ａｄｈＥ、ｌｄｈ、およびｆｒｄの欠失が含まれる。したがって、特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｆｒｄＡ、ｌｄｈＡ、およびａｄｈＥの１つ以上に変異および／または欠失をさらに有する。
【図２６Ａ】０．５％グルコース含有ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）におけるアセタート／ブチラート生成を示す棒グラフである。内因性ａｄｈＥ（アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ）およびｌｄｈ（ラクタートデヒドロゲナーゼ）の欠失は、ＦＮＲＳ  ｔｅｒ−ｔｅｓＢブチラートカセットまたはＦＮＲＳ−ｔｅｒ−ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートカセットのいずれかを組み込んだニッスル株に導入した。
【図２６Ｂ】０．５％グルクロン酸含有ＭＯＰＳ（ｐＨ６．３）におけるアセタート／ブチラート生成（図２６Ｂ）を示す棒グラフである。
【図２７】例示的なプロピオナート生合成遺伝子カセットの概略図である。
【図２８】異種ＦｎｒＳプロモーターの制御下にある大腸菌スリーピングビューティームターゼオペロンを含む構築物の模式図である。
【図２９】野生型大腸菌ＢＷ２５１１３株、およびＦｎｒＳプロモーター制御下の内在性ＳＢＭオペロンを有するＢＷ２５１１３株（図２８の概略図に示すように）によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたプロピオナート濃度を示す棒グラフである。
【図３０Ａ】治療用ポリペプチド発現のための本開示の例示的回路の遺伝子構成の概略図である。当該治療用ポリペプチドは、鞭毛タイプＩＩＩ分泌系のコンポーネントを用いて分泌される。ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、およびＩＬ−２２などの目的の治療用ポリペプチドは、ｆｌｉＣ−５’ＵＴＲの後ろに組み立てられ、天然ｆｌｉＣおよび／またはｆｌｉＤプロモーターによって駆動される。別の実施形態では、誘導性プロモーターを使用することができる。当該誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＩＢＤ特異的分子によって誘導されるプロモーターまたは炎症もしくは炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るもしくはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターなどである。目的の治療用ポリペプチドは、プラスミド（例えば、中コピープラスミド）から発現するか、またはｆｌｉＣ遺伝子座に組み込まれる（それによってｆｌｉＣおよび／またはｆｌｉＤの全部または一部が欠失される）。
【図３０Ｂ】治療用ポリペプチド発現のための本開示の例示的回路の遺伝子構成の概略図である。当該治療用ポリペプチドは、鞭毛タイプＩＩＩ分泌系のコンポーネントを用いて分泌される。ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、およびＩＬ−２２などの目的の治療用ポリペプチドは、ｆｌｉＣ−５’ＵＴＲの後ろに組み立てられ、天然ｆｌｉＣおよび／またはｆｌｉＤプロモーターによって駆動される。必要に応じて、ＦｌｉＣのＮ末端部分が構築物に含まれる。
【図３０Ｃ】治療用ポリペプチド発現のための本開示の例示的回路の遺伝子構成の概略図である。当該治療用ポリペプチドは、鞭毛タイプＩＩＩ分泌系のコンポーネントを用いて分泌される。ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、およびＩＬ−２２などの目的の治療用ポリペプチドは、ｆｌｉＣ−５’ＵＴＲの後ろに組み立てられ、ｔｅｔ誘導性プロモーターによって駆動される。必要に応じて、ＦｌｉＣのＮ末端部分が構築物に含まれる。
【図３１Ａ】拡散性外膜（ＤＯＭ）系を介して分泌される治療用ポリペプチド発現のための本開示の例示的回路の遺伝子構成の模式図である。目的の治療用ポリペプチドは、プロトタイプの（ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ）Ｎ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルまたはＴａｔ依存性分泌シグナルに融合され、当該分泌シグナルはペリプラズム空間への分泌の際に切断される。例示的な分泌タグには、ｓｅｃ依存性ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＡ、ｃｖａＣ、およびＴａｔ依存性タグ（ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡ）が含まれる。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｌｐｐ、ｐａｌ、ｔｏｌＡ、および／またはｎｌｐＩのうちの１つ以上に欠失を有する。必要に応じて、例えば、ペリプラズムでのポリペプチドの安定性を高めるために、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴを含むがそれらに限定はされないペリプラズムプロテアーゼもまた欠失される。下流の組み込みには、ＦＲＴ−ＫａｎＲ−ＦＲＴカセットを使用する。発現はｔｅｔプロモーターまたは誘導性プロモーターによって駆動され、当該誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＩＢＤ特異的分子によって誘導されるプロモーターまたは炎症もしくは炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るもしくはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターなどである。ｔｅｔプロモーターによって駆動される例示的回路の遺伝子構成の模式図を示す。
【図３１Ｂ】拡散性外膜（ＤＯＭ）系を介して分泌される治療用ポリペプチド発現のための本開示の例示的回路の遺伝子構成の模式図である。ＦＮＲ誘導性プロモーターによって駆動される例示的回路の遺伝子構成を示す。
【図３２Ａ】細菌分泌のためのＧＬＰ２発現構築物の非限定的な例の模式図を示す。天然ＦｌｉＣプロモーターの制御下で、ＦｌｉＣ遺伝子座に挿入されたヒトＧＬＰ２構築物の模式図である。
【図３２Ｂ】天然ＦｌｉＣプロモーターの制御下でＦｌｉＣ遺伝子座に挿入された、ＦｌｉＣのＮ末端２０アミノ酸を含むヒトＧＬＰ２構築物の模式図である。
【図３２Ｃ】ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下でＦｌｉＣ遺伝子座に挿入された、ＦｌｉＣのＮ末端２０アミノ酸を含むヒトＧＬＰ２構築物の模式図である。
【図３２Ｄ】ｔｅｔ誘導性プロモーター制御下に、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグ（ｓｅｃ依存性分泌系）を有するヒトＧＬＰ２構築物の模式図である。
【図３２Ｅ】ｔｅｔ誘導性プロモーター制御下に、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグ（ｔａｔ分泌系）を有するヒトＧＬＰ２構築物の模式図である。
【図３３Ａ】操作細菌の上清で処理した血清飢餓Ｃｏｌｏ２０５細胞の抽出物に対して行ったホスホ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）ＥＬＩＳＡの結果を示す線グラフである。当該操作細菌は、ＰＡＬ欠失およびｐｈｏＡ分泌タグ付きｈＩＬ−２２をコードする組み込み構築物を有する。データは、操作細菌が分泌したｈＩＬ−２２が機能的に活性を有することを証明している。
【図３３Ｂ】抗体コンプリーションアッセイ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を示すホスホ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）ＥＬＩＳＡの結果を示す線グラフである。Ｃｏｌｏ２０５細胞の抽出物を、ＩＬ−２２過剰発現株の細菌上清で処理した。当該細菌上清は、漸増濃度の中和抗ＩＬ−２２抗体とプレインキュベートした。データから、分泌ｈＩＬ−２２によって誘導されたホスホ−Ｓｔａｔ３シグナルが、ｈＩＬ−２２抗体ＭＡＢ７８２１によって競合除外されることが証明された。
【図３４】キヌレニンおよびセロトニン系列に沿った、ヒトのトリプトファン代謝の模式図である。酵素の略号は以下のとおりである：３−ＨＡＯ：３−ヒドロキシル−アントラニラート３，４−ジオキシダーゼ；  ＡＡＡＤ：芳香族−アミノ酸デカルボキシラーゼ；  ＡＣＭＳＤ、α−アミノ−β−カルボキシムコネート−ε−セミアルデヒドデカルボキシラーゼ；  ＨＩＯＭＴ、ヒドロキシル−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ；  ＩＤＯ、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ；  ＫＡＴ、キヌレニンアミノトランスフェラーゼＩ−ＩＩＩ；  ＫＭＯ：キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ；  ＫＹＮＵ、キヌレニナーゼ；  ＮＡＴ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ；  ＴＤＯ、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ；  ＴＰＨ、トリプトファンヒドロキシラーゼ；  ＱＰＲＴ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ。
【図３５】細菌トリプトファン異化機構の概略図である。当該異化機構は、ＩＤＯ１酵素活性と遺伝学的および機能的に相同であることが、Ｖｕｊｋｏｖｉｃ−Ｃｖｉｊｉｎら、「Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ」、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．、２０１３年７月１０日；  ５（１９３）：  １９３ｒａ９１によって記載されており、当該内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示の特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、図３５の細菌トリプトファン代謝酵素の１つ以上を含む遺伝子カセットを有する。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、図３５の１つ以上の代謝産物を生成する１つ以上の遺伝子カセットを有し、当該代謝産物には、キヌレニン、インドール−３−アルデヒド、インドール−３−酢酸、および／またはインドール−３アセトアルデヒドが含まれるが、これらに限定されない。
【図３６Ａ】インドール代謝産物作用様式の模式図である。宿主の生理機能および疾患に対するインドールおよびその代謝産物の作用の分子機構の概略を示している。トリプトファンは消化管内腔において、細菌によって分解され、インドールおよび他のインドール代謝産物、例えばインドール−３−プロピオナート（ＩＰＡ）およびインドール−３−アルデヒド（Ｉ３Ａ）が生成する。ＩＰＡは、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）を介して腸管細胞に作用し、粘膜の恒常性およびバリア機能の維持に働く。Ｉ３Ａは、腸管免疫細胞上に見出されるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）に作用し、ＩＬ−２２生成を促進する。ＡｈＲの活性化は、上皮バリア機能の維持および免疫寛容の促進によって、病原性感染から防御しながら微生物の共生を促進するなど、消化管免疫において重要な役割を果たす。インドールは、グルカゴン様タンパク質１（ＧＬＰ−１）を産生する腸管Ｌ細胞のシグナル伝達分子やＡｈＲのリガンド（Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．２０１６年；８巻：４６頁）など、多くの役割を有する。本開示の特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上の細菌トリプトファン代謝酵素を含む遺伝子カセットを有し、当該酵素は図３６Ａおよび図３６Ｂの反応を触媒する。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、図３６Ａおよび図３６Ｂの１つ以上の代謝産物を生成する遺伝子カセットを１つ以上有し、当該代謝産物はキヌレニン、インドール−３−アルデヒド、インドール−３−酢酸、および／またはインドール−３−アセトアルデヒドを含むが、これらに限定されない。
【図３６Ｂ】インドール生合成の模式図である。トリプトファン異化経路／インドール生合成経路の概略を示す。ＡｈＲアゴニスト活性を有する宿主代謝産物および微生物叢代謝産物を、それぞれひし形および円形で示す（例えば、Ｌａｍａｓら、２０１６年、ＣＡＲＤ９  ｉｍｐａｃｔｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎｔｏ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ；  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、  ２２巻、５９８〜６０５頁を参照）。本開示の特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上の細菌トリプトファン代謝酵素を含む遺伝子カセットを有し、当該酵素は図３６Ａおよび図３６Ｂの反応を触媒する。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、図３６Ａおよび図３６Ｂの１つ以上の代謝産物を生成する遺伝子カセットを１つ以上有し、当該代謝産物はキヌレニン、インドール−３−アルデヒド、インドール−３−酢酸、および／またはインドール−３−アセトアルデヒドを含むが、これらに限定されない。
【図３７Ａ】細菌のトリプトファン代謝の模式図である。酵素に以下のように番号付している。１）トリプトファン２，３ジオキシゲナーゼ（ＥＣ  １．１３．１１．１１）；  ２）キヌレニンフォルミダーゼ（ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ  ｆｏｒｍｉｄａｓｅ）（ＥＣ３．５．１．４９）；  ３）キヌレニナーゼ（ＥＣ  ３．７．１．３）；  ４）トリプトファナーゼ（ＥＣ  ４．１．９９．１）；  ５）トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２７）；  ６）インドールラクタートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１０）；  ７）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．２８）；  ８）トリプタミンオキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．４）；  ９）Ｔｒｐ側鎖オキシダーゼ（ＥＣ  ４．１．１．４３）；  １０）インドールアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）；  １１）インドール酢酸オキシダーゼ；  １３）トリプトファン２−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ  １．１３．１２．３）；  １４）インドールアセトアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．０）。点線（−−−−−）は自発反応を示す。本開示の特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、図中の細菌トリプトファン代謝酵素の１つ以上を含む遺伝子カセットを有する。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、図中の１つ以上の代謝産物を生成する１つ以上の遺伝子カセットを有する。特定の実施形態では、１つ以上のカセットはプラスミド上にある。他の実施形態では、当該カセットはゲノム中に組み込まれる。特定の実施形態では、１つ以上のカセットは誘導性プロモーターの制御下にあり、当該プロモーターは低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で誘導される。
【図３７Ｂ】トリプトファン由来経路の模式図である。既知のＡＨＲアゴニストにはアスタリスクを付している。略語は以下の通りである。Ｔｒｐ：トリプトファン；  ＴｒＡ：トリプタミン；  ＩＡＡｌｄ：インドール−３−アセトアルデヒド；  ＩＡＡ：インドール−３−酢酸；  ＦＩＣＺ：６−フォルミルインドロ（３，２−ｂ）カルバゾール；  ＩＰｙＡ：インドール−３−ピルビン酸；  ＩＡＭ：インドール−３−アセトアミン；  ＩＡＯｘ：インドール−３−アセタールドキシム；  ＩＡＮ：インドール−３−アセトニトリル；  Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ  Ｋｙｎ：Ｎ−フォルミルキヌレニン；Ｋｙｎ：キヌレニン；  ＫｙｎＡ：キヌレン酸；  Ｉ３Ｃ：インドール−３−カルビノール；  ＩＡｌｄ：インドール−３−アルデヒド；  ＤＩＭ：３．３’−ジインドリルメタン；ＩＣＺ：インドロ（３，２−ｂ）カルバゾール。酵素には、以下のように番号が付けられている：１．ＥＣ  １．１３．１１．１１（Ｔｄｏ２、Ｂｎａ２）、ＥＣ  １．１３．１１．１１（Ｉｄｏ１）；  ２．ＥＣ  ４．１．１．２８（Ｔｄｃ）；  ３．ＥＣ  １．４．３．２２、ＥＣ  １．４．３．４（ＴｙｎＡ）；  ４．ＥＣ  １．２．１．３（ｌａｄ１）、ＥＣ  １．２．３．７（Ａａｏ１）；  ５．ＥＣ  ３．５．１．９（Ａｆｍｉｄ  Ｂｎａ３）；  ６．ＥＣ  ２．６．１．７（Ｃｃｌｂ１、Ｃｃｌｂ２、Ａａｄａｔ、Ｇｏｔ２）；  ７．ＥＣ  １．４．９９．１（ＴｎａＡ）；８．ＥＣ  １．１４．１３．１２５（ＣＹＰ７９Ｂ２、ＣＹＰ７９Ｂ３）；  ９．ＥＣ  １．４．３．２（ＳｔａＯ）、ＥＣ  ２．６．１．２７（Ａｒｏ９、ａｓｐＣ）、ＥＣ  ２．６．１．９９（Ｔａａ１）、ＥＣ  １．４．１．１９（ＴｒｐＤＨ）；  １０．ＥＣ  １．１３．１２．３（ｌａａＭ）；  １１．ＥＣ  ４．１．１．７４（ＩｐｄＣ）；  １２．ＥＣ  １．１４．１３．１６８（Ｙｕｃ２）；  １３．ＥＣ  ３．５．１．４（ＩａａＨ）；  １４．ＥＣ  ３．５．５．１（Ｎｉｔ１）；  １５．ＥＣ  ４．２．１．８４（Ｎｉｔ１）；  １６．ＥＣ  ４．９９．１．６（ＣＹＰ７１Ａ１３）；  １７．ＥＣ  ３．２．１．１４７（Ｐｅｎ２）。本開示の特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、図中の細菌トリプトファン代謝酵素の１つ以上を含む遺伝子カセットを有する。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、図中の１つ以上の代謝産物を生成する１つ以上の遺伝子カセットを有する。特定の実施形態では、１つ以上のカセットはプラスミド上にある。他の実施形態では、当該カセットはゲノム中に組み込まれる。特定の実施形態では、１つ以上のカセットは誘導性プロモーターの制御下にあり、当該プロモーターは低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で誘導される。
【図３８】大腸菌トリプトファン合成経路の模式図である。コリスマート代謝のスーパー経路（ｓｕｐｅｒｐａｔｈｗａｙ）に示すように、大腸菌では、トリプトファンは、芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン）の主要な共通前駆体であるコリスマート、ならびに必須化合物であるテトラヒドロ葉酸、ユビキノン−８、メナキノン−８およびエンテロバクチン（エンテロケリン）から生合成される。コリスマートからのトリプトファン生合成を触媒する５つの酵素は、５つの遺伝子コードによってコードされる。ｔｒｐＥ  ｔｒｐＤ  ｔｒｐＣ  ｔｒｐＢ  ｔｒｐＡの５つの遺伝子は、単一の転写単位、すなわちｔｒｐオペロンを形成する。ｔｒｐＤ構造遺伝子内には、弱い内部プロモーターも存在し、低レベルで構成的レベルのｍＲＮＡを供給する。
【図３９】例示的なトリプトファン回路を示す概略図である。トリプトファンは、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ（ｔｒｐＤとも呼ばれる）、ｔｒｐＣ−Ｆ（ｔｒｐＣとも呼ばれる）、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子の発現を介して、コリスマート前駆体から生成される。トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）の任意のノックアウトについても示している。ａｒｏＧ／Ｆ／ＨならびにａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびａｒｏＣ遺伝子の発現によるコリスマート前駆体の任意生成も示されている。前記遺伝子の全ては、誘導性プロモーター、例えばＦＮＲ誘導性プロモーターから、任意に発現される。細菌はまた、栄養要求性、例えばｔｈｙＡの欠失（ΔｔｈｙＡ；チミジン依存性）を含み得る。細菌はまたｙｄｄＧの遺伝子配列を有し、ＹｄｄＧを発現することにより、トリプトファンの排出輸送を介助することができる。細菌株の非限定的な例を列挙する。
【図４０】大腸菌トリプトファン（ＴＲＰ）合成酵素が、テトラサイクリン誘導系の制御下にある構築物から発現する、本開示の一実施形態を示した図である。
【図４１Ａ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンからトリプタミンを生成する、本開示の一実施形態を示す模式図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンデカルボキシラーゼ回路（例えば、ニチニチソウ由来のもの）を有し、トリプトファンデカルボキシラーゼは、例えば誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下で、トリプトファンをトリプタミンに変換する。すべての実施形態において、排出輸送体をコードする遺伝子も任意で含まれ得る。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４１Ｂ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを生成する、本開示の一実施形態を示す模式図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、例えば、Ｓ．セレビシエ由来）またはａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、例えば、大腸菌由来）、またはｔａａ１（Ｌ−トリプトファン−パイルベートアミノトランスフェラーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）またはｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ、例えば、ストレプトマイセスｓｐ．  ＴＰ−Ａ０２７４由来）またはｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ、例えば、ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８由来）およびｉｐｄＣ（インドール−３−パイルベートデカルボキシラーゼ、例えば、エンテロバクター・クロアカ由来）のための回路を有し、当該酵素群は一緒になって、例えば誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下で、トリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを生成する。すべての実施形態において、排出輸送体をコードする遺伝子も任意で含まれ得る。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４１Ｃ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを生成する、本開示の一実施形態を示す模式図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｃ（トリプトファンデカルボキシラーゼ、例えば、ニチニチソウ由来）、およびｔｙｎＡ（モノアミンオキシダーゼ、例えば、大腸菌由来）を含む回路を有し、例えば誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下で、トリプトファンをインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺに変換する。すべての実施形態において、排出輸送体をコードする遺伝子も任意で含まれ得る。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４１Ｄ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを生成する、本開示の一実施形態を示す模式図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）またはｃｙｐ７９Ｂ３（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）のための回路を有し、当該酵素群は一緒になって、例えば誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下で、トリプトファンをインドール−３−アセトニトリルに変換する。すべての実施形態において、排出輸送体をコードする遺伝子も任意で含まれ得る。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４１Ｅ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンからキヌレニンを生成する、本開示の一実施形態を示す模式図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ、例えば、ヒト由来）またはＴＤＯ２（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ、例えば、ヒト由来）またはＢＮＡ２（インドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ、例えば、Ｓ．セレビシエ由来）およびＡｆｍｉｄ：キヌレニンフォルムアミダーゼ、例えば、マウス由来）またはＢＮＡ３（キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ、例えば、Ｓ．セレビシエ由来）を含む回路を有し、当該酵素群は一緒になって、例えば誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下で、トリプトファンをキヌレニンに変換する。すべての実施形態において、排出輸送体をコードする遺伝子も任意で含まれ得る。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４１Ｆ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンからｋｙｎｕｒｅｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄを生成する、本開示の一実施形態を示す模式図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ、例えば、ヒト由来）またはＴＤＯ２（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ、例えば、ヒト由来）またはＢＮＡ２（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ、例えば、Ｓ．セレビシエ由来）およびＡｆｍｉｄ：キヌレニンフォルムアミダーゼ、例えば、マウス由来）またはＢＮＡ３（キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ、例えば、Ｓ．セレビシエ由来）およびＧＯＴ２（ミトコンドリア型アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、例えば、ヒト由来）またはＡＡＤＡＴ（ミトコンドリア型キヌレニン／アルファ−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、例えば、ヒト由来）、またはＣＣＬＢ１（キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ１、例えば、ヒト由来）またはＣＣＬＢ２（キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ３、例えば、ヒト由来）を含む回路を有し、当該酵素群は一緒になって、誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下で、トリプトファンからｋｙｎｕｒｅｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄを生成する。すべての実施形態において、排出輸送体をコードする遺伝子も任意で含まれ得る。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４１Ｇ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンからインドールを生成する、本開示の一実施形態を示す模式図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｎａＡ（トリプトファナーゼ、例えば、大腸菌由来）のための回路を有し、例えば誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下で、トリプトファンをインドールに変換する。すべての実施形態において、排出輸送体をコードする遺伝子も任意で含まれ得る。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４１Ｈ】遺伝学的に操作された細菌が、食物を通じて取り込んだインドールグルコシノラートから、インドール−３−カルビノール、インドール−３−アルデヒド、３，３’ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、インドロ（３，２−ｂ）カルバゾール（ＩＣＺ）を生成する、本開示の一実施形態を示す模式図である。遺伝学的に操作された細菌は、誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下に、ｐｎｅ２（ミロシナーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）を含む回路を有する。すべての実施形態において、排出輸送体をコードする遺伝子も任意で含まれ得る。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４２Ａ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンをインドール−３−酢酸に変換する、本開示の例示的な実施形態の概略図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、例えば、Ｓ．セレビシエ由来）またはａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、例えば、大腸菌由来）、またはｔａａ１（Ｌ−トリプトファン−パイルベートアミノトランスフェラーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）またはｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ、例えば、ストレプトマイセスｓｐ．  ＴＰ−Ａ０２７４由来）またはｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ、例えば、ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８由来）およびｉｐｄＣ（インドール−３−パイルベートデカルボキシラーゼ、例えば、エンテロバクター・クロアカ由来）およびｉａｄ１（インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えば、ウスチラゴ・メイディス由来）またはＡＡＯ１（インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）を含む回路を有し、当該酵素群は一緒になって、例えば、誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下で、トリプトファンからインドール−３−酢酸を生成する。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４２Ｂ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンをインドール−３−酢酸に変換する、本開示の例示的な実施形態の概略図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｃ（トリプトファンデカルボキシラ−ゼ、例えば、ニチニチソウ由来）またはｔｙｎＡ（モノアミンオキシダーゼ、例えば、大腸菌由来）および／またはｉａｄ１（インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えば、ウスチラゴ・メイディス由来）またはＡＡＯ１（インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）を含む回路を、例えば、誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下に有する。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４２Ｃ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンをインドール−３−酢酸に変換する、本開示の例示的な実施形態の概略図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、例えば，Ｓ．セレビシエ由来）またはａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、例えば、大腸菌由来）、またはｔａａ１（Ｌ−トリプトファン−パイルベートアミノトランスフェラーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）またはｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ、例えば、ストレプトマイセスｓｐ．  ＴＰ−Ａ０２７４由来）またはｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ、例えば、ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８由来）およびｙｕｃ２（インドール−３−パイルベートモノオキシゲナーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）を含む回路を、例えば、誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下に有する。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４２Ｄ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンをインドール−３−酢酸に変換する、本開示の例示的な実施形態の概略図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ＩａａＭ（トリプトファン２−モノオキシゲナーゼ、例えば、シュードモナス・サバスタノイ由来）およびｉａａＨ（インドールアセトアミドヒドロラーゼ、例えば、シュードモナス・サバスタノイ由来）を含む回路を、例えば、誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下に有する。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４２Ｅ】遺伝学的に操作された細菌がトリプトファンをインドール−３−酢酸に変換する、本開示の例示的な実施形態の概略図である。トリプトファン生成の任意の回路は、図３９に図示・説明されている通りである。当該株は、必要に応じて、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに、図示および／または記載されるような追加の回路を有する。あるいは、場合によっては、輸送体を介してトリプトファンを取り込むことが可能である。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）またはｃｙｐ７９Ｂ３（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）およびｃｙｐ７１ａ１３（インドールアセトアルドキシムデヒドラターゼ、例えば、シロイヌズナ由来）およびｎｉｔ１（ニトリラーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）およびｉａａＨ（インドールアセトアミドヒドロラーゼ、例えば、シュードモナス・サバスタノイ由来）を含む回路を、例えば、誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下に有する。操作細菌はまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、大腸菌ニッスルゲノム中のｔｈｙＡ遺伝子に変異を導入して、当該細菌が増殖するためには、培養液中にチミジンを添加しなければならないようにすることができる。
【図４３Ａ】インドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）合成回路の概略図である。腸内微生物叢が生成するＩＰＡは、消化管バリアの保全において有意なプラス効果を有する。  ＩＰＡはＡｈＲを介してシグナルを伝達するのではなく、異なる受容体（ＰＸＲ）を介してシグナル伝達する（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら、Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒ  ＰＸＲ  ａｎｄ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４；  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１巻，  ２９６−３１０頁，  ２０１４年８月２１日）。いくつかの実施形態では、ＩＰＡは、２つの酵素、すなわちトリプトファンアンモニアリアーゼおよびインドール−３−アクリラートレダクターゼを発現させることによって、合成回路で生成することができる（例えば、トリプトファンアンモニアリアーゼ（ＷＡＬ）（例えば、ルブリヴィヴァックス・ベンゾアチリチカス由来）およびインドール−３−アクリラートレダクターゼ（例えば、クロストリジウム・ボツリヌム由来））。トリプトファンアンモニアリアーゼはトリプトファンをインドール−３−アクリル酸に変換し、インドール−３−アクリラートレダクターゼはインドール−３−アクリル酸をＩＰＡに変換する。理論に拘束されることは望まないが、前記反応は酸素を必要とせず、例えば、哺乳動物の消化管に見られるような低酸素または無酸素条件下でも進行する。図３９および／または図４５Ａおよび／または図４５Ｂに図示・説明されているように、当該菌株は、トリプトファン生成のための任意の回路をさらに有する。
【図４３Ｂ】別のインドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）合成回路の概略図である。酵素は以下の通りである：１．ＴｒｐＤＨ：トリプトファンデヒドロゲナーゼ、例えば、ノストク・プンクチフォルム  ＮＩＥＳ−２１０８由来；  ＦｌｄＨ１／ＦｌｄＨ２：インドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼ、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来；  ＦｌｄＡ：インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−ラクタートＣｏＡトランスフェラーゼ、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来；  ＦｌｄＢＣ：インドール−３−ラクタートデヒドラターゼ、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来；  ＦｌｄＤ：インドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来；  ＡｃｕＩ：  アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、ロドバクター・スフェロイデス由来。トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１９）は、Ｌ−トリプトファン、ＮＡＤ（Ｐ）および水を（インドール−３−イル）パイルベート、ＮＨ３、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＨ＋に変換する可逆的化学反応を触媒する酵素である。インドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１１０、例えば、クロストリジウム・スポロゲネスまたはラクトバチルス・カゼイ）は、（インドール−３−イル）パイルベートおよびＮＡＤＨおよびＨ＋をインドール−３−ラクタートおよびＮＡＤ＋に変換する。インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−ラクタート−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＦｌｄＡ）は、インドール−３−ラクタートおよびインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡを、インドール−３−プロピオン酸およびインドール−３−ラクタート−ＣｏＡに変換する。インドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦｌｄＤ）およびアクリリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＡｃｕＩ）は、インドール−３−アクリリル−ＣｏＡをインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡに変換する。インドール−３−ラクタートデヒドラターゼ（ＦｌｄＢＣ）は、インドール−３−ラクタート−ＣｏＡをインドール−３−アクリリル−ＣｏＡに変換する。図３９および／または図４５Ａおよび／または図４５Ｂに図示・説明されているように、当該菌株は、トリプトファン生成のための任意の回路をさらに有する。
【図４４Ａ】様々なトリプトファン生成菌株によるトリプトファン生成量を示す棒グラフである。データは、トリプトファン生成には、フィードバック抵抗型ＡｒｏＧ（ＡｒｏＧｆｂｒ）の発現が必要であることを示している。さらに、フィードバック抵抗性ｔｒｐＥ（ｔｒｐＥｆｂｒ）の使用は、トリプトファン生成にプラスの効果をもたらす。
【図４４Ｂ】ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ構築物を含む菌株からのトリプトファン生成を示す図である。酸素の存在下および非存在下で、グルコースおよびグルクロナートを炭素源として用いた結果を比較している。大腸菌は２分子のホスホエノールパイルベート（ＰＥＰ）から、１分子のトリプトファンを生成する。グルコースが炭素源として使用されると、ＰＴＳ系（ホスホトランスフェラーゼ系）を介して細胞内にグルコースを取り込むのに、利用可能な全ＰＥＰの５０％が使用される。トリプトファン生成量は、非ＰＴＳ糖（グルクロナート）を好気的に使用することによって改善される。図のデータはまた、ｔｎａＡの欠失（好気的に初期の時点でのみ）がプラスの効果をもたらすことを示している。
【図４４Ｃ】ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒを含む操作菌株によるトリプトファン生成量が、セリン添加によって改善したことを示す棒グラフである。
【図４５Ａ】本発明の例示的な実施形態の概略図である。遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン、トリプタミン、インドール酢酸およびインドールプロピオン酸の生成回路を有する。遺伝子、遺伝子配列および／または遺伝子回路もしくはカセットのいずれかは、必要に応じて、誘導性プロモーターから発現する。遺伝子、遺伝子配列および／または遺伝子回路もしくはカセットの発現を制御し得る例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症もしくは炎症反応によって誘導されるプロモーター（ＲＮＳプロモーター、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンなどによって誘導されるプロモーターが含まれる。細菌はまた、栄養要求性、例えばｔｈｙＡの欠失（ΔｔｈｙＡ；チミジン依存性）を含み得る。ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子の発現により、コリスマート前駆体からトリプトファンを生成するトリプトファン生成菌株を示す。トリプトファン生成量を改善するために、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥをフィードバック抵抗型に置換している。必要に応じて、細菌は、図３９に図示し、および／または図３９および／または図４５Ｂの説明に記載される輸送体および／または追加のトリプトファン回路のいずれかを有し得る。必要に応じて、トリプトファンリプレッサー（Ｔｒｐ  Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）および／またはｔｎａＡ遺伝子（トリプトファンをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードする）を欠失させて、トリプトファンの生成レベルをさらに増加させる。細菌はまた、トリプトファンの移出を補助するために、ＹｄｄＧ発現のためのｙｄｄＧ遺伝子配列を有し得る。
【図４５Ｂ】トリプトファン生成菌株を示す図である。当該株ではｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子の発現により、トリプトファンがコリスマート前駆体から生成される。トリプトファン生成量を改善するために、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥをフィードバック抵抗型に置換している。当該株は、野生型またはフィードバック抵抗性ＳｅｒＡ遺伝子のいずれかをさらに有する。大腸菌ｓｅｒＡがコードする３−ホスホグリセラート（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ、３ＰＧ）デヒドロゲナーゼは、Ｌ−セリン（Ｓｅｒ）生合成の主要なリン酸化経路の第１段階を触媒する。この段階は、３ＰＧの３−ホスホヒドロキシパイルベート（３ＰＨＰ）への酸化にあたり、ＮＡＤ１のＮＡＤＨへの還元を伴う。大腸菌はトリプトファンを１つ生成するごとに、セリンを１つ使用する。その結果、ｓｅｒＡを発現させることにより、トリプトファン生成量が改善される。必要に応じて、細菌は、図３９に図示し、および／または図３９の説明に記載される輸送体および／または追加のトリプトファン回路のいずれかを有し得る。必要に応じて、トリプトファンリプレッサーおよび／またはｔｎａＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードする）を欠失させて、トリプトファンの生成レベルをさらに増加させる。細菌はまた、トリプトファンの移出を補助するために、ＹｄｄＧ発現のためのｙｄｄＧ遺伝子配列を有し得る。
【図４５Ｃ】トリプタミン生成菌株の非限定的な例を示す図である。トリプトファンは、必要に応じて、コリスマートから生成され、当該株は、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび／または図３９に図示および／または記載する追加の回路を任意で有する。さらに、当該株は、トリプトファンをトリプタミンに変換するｔｄｃ（トリプトファンデカルボキシラーゼ、例えばニチニチソウ由来）を有する。
【図４５Ｄ】インドール−３−アセタート生成菌株の非限定的な例を示す図である。トリプトファンは、必要に応じて、コリスマート前駆体から生成され、当該株は、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび／または図３９に図示および／または記載する追加の回路を任意で有する。さらに、当該株は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ、例えば、ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８由来）およびｉｐｄＣ（インドール−３−パイルベートデカルボキシラーゼ、例えば、エンテロバクター・クロアカ由来）およびｉａｄ１（インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えば、ウスチラゴ・メイディス由来）を有する。ｔｒｐＤＨとｉｐｄＣは共同で、（インドール−３イル）パイルベート中間体を介してインドール−３−アセトアルデヒドとＦＩＣＺを生成し、ｉａｄ１はインドール−３−アセトアルデヒドをインドール−３−アセタートに変換する。
【図４５Ｅ】インドール−３−プロピオナート生成菌株の非限定的な例を示す図である。トリプトファンは、必要に応じて、コリスマート前駆体から生成され、当該株は、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび／または図３９に図示および／または記載する追加の回路を任意で有する。さらに、当該株は、図４４に記載の回路を有し、当該回路はｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ、例えば、ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８由来で、トリプトファンから（インドール−３イル）パイルベートを生成する）、ｆｌｄＡ（インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−ラクタートＣｏＡトランスフェラーゼ、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来で、インドール−３−ラクタートとインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡをインドール−３−プロピオン酸とインドール−３−ラクタート−ＣｏＡに変換する）、ｆｌｄＢおよびｆｌｄＣ（インドール−３−ラクタートデヒドラターゼ、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来で、インドール−３−ラクタート−ＣｏＡをインドール−３−アクリリル−ＣｏＡに変換する）、ｆｌｄＤおよび／またはＡｃｕＩ：（インドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来および／またはアクリリル−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、ロドバクター・スフェロイデス由来で、インドール−３−アクリリル−ＣｏＡをインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡに変換する）を含む。当該回路はさらに、ｆｌｄＨ１および／またはｆｌｄＨ２（インドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼ１および／またはインドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼ２、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来）を含み、ｆｌｄＨ１および／またはｆｌｄＨ２は、（インドール−３−イル）パイルベートをインドール−３−ラクタートに変換する。
【図４６Ａ】本明細書に記載の１つ以上の遺伝子配列および／または遺伝子カセットを有する、本開示の遺伝学的に操作された細菌の非限定的な例を示す模式図である。
【図４６Ｂ】本明細書に記載の１つ以上の遺伝子配列および／または遺伝子カセットを有する、本開示の遺伝学的に操作された細菌の非限定的な例を示す模式図である。
【図４６Ｃ】本明細書に記載の１つ以上の遺伝子配列および／または遺伝子カセットを有する、本開示の遺伝学的に操作された細菌の非限定的な例を示す模式図である。
【図４６Ｄ】本明細書に記載の１つ以上の遺伝子配列および／または遺伝子カセットを有する、本開示の遺伝学的に操作された細菌の非限定的な例を示す模式図である。
【図４６Ｅ】本明細書に記載の１つ以上の遺伝子配列および／または遺伝子カセットを有する、本開示の遺伝学的に操作された細菌の非限定的な例を示す模式図である。
【図４７】大腸菌ニッスル染色体内の組込み部位のマップである。当該部位は、必須遺伝子の発現を妨げることなく、回路構成要素が染色体に挿入され得る領域を示す。発散的または収束的に発現した遺伝子間に生じる挿入を示すのに、バックスラッシュ（／）を用いている。ｔｈｙＡのような生合成遺伝子内への挿入は、栄養要求性を作製するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、個々の回路構成要素が、図中で示された部位の２つ以上に挿入される。
【図４８】複数の作用機序（ＭｏＡｓ）を有する大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的な模式図である。
【図４９Ａ】細菌染色体、例えば大腸菌ニッスル１９１７染色体の模式図である。ブチラート生成回路、プロピオナート生成回路、およびＩＢＤに関連する１つ以上のインターロイキンの生成回路を有する操作細菌を模式的に示す。
【図４９Ｂ】細菌染色体、例えば大腸菌ニッスル１９１７染色体の模式図である。３つの回路、すなわち、ブチラート生成回路、ＧＬＰ−２発現回路、およびＩＢＤに関連する１つ以上のインターロイキンの生成回路を有する操作細菌を模式的に示す。
【図５０】細胞内で発現したキメラペプチドを内膜および外膜を越えて周囲宿主環境に移動させることができるようにペプチドを天然鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換えにより融合させることによって、不完全鞭毛を用いて、目的の治療用ペプチド（スター）を分泌する鞭毛ＩＩＩ型分泌に基づく分泌システムの概略図である。
【図５１】治療用ペプチド（スター）をＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己輸送体のベータ−ドメインに融合させることができる、組換えタンパク質の細胞外産生のためのＶ型分泌システムの概略図である。このシステムにおいて、Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜を越えてペリプラズム内に移動させるＳｅｃＡ−ＹＥＧマシーナリーにタンパク質を導き、その後、シグナル配列の切断が起こる。ベータ−ドメインは、Ｂａｍ複合体に動員され、そこでベータ−ドメインが折りたたまれ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。次いで治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ−バレル構造の中空孔を通り抜ける。治療用ペプチドは、自触媒切断によってまたはリンカーにおける相補的プロテアーゼ切断部位への膜結合ペプチド（ハサミ）の標的化によってリンカーシステムから解放される。
【図５２】内膜および外膜の両方を通るチャンネルを形成するＨｌｙＢ（ＡＴＰ結合カセット輸送体）、ＨｌｙＤ（膜融合タンパク質）およびＴｏｌＣ（外膜タンパク質）を用いて、パッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外空間に直接転位させる、Ｉ型分泌システムの概略図である。ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（スター）のＣ末端部分に融合させて、このペプチドの分泌を媒介する。
【図５３】漏出性または不安定化外膜を作製し、それにより、細胞外腔への治療用ポリペプチド、例えば、ジスルフィド結合を含む真核生物由来の治療用ポリペプチドの転位を促進するためのグラム陰性細菌の外および内膜、ならびにいくつかの欠失標的の概略図である。外膜をペプチドグリカン骨格につなぎ留めるタンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、および／またはペリプラズムプロテアーゼをコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ｎｌｐｌの不活性化突然変異は、漏出性表現型を発生させる。突然変異の組合せは、漏出性表現型を相乗的に増強させ得る。
【図５４】細菌が消化管内腔に分泌治療用タンパク質を注入することを可能にする改変型タイプ３分泌装置（Ｔ３ＳＳ）を示す図である。誘導性プロモーター（小矢印、上）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、タグ付きペプチドを細胞外に分泌する装置を作るＴ３分泌システム遺伝子カセット（３つの大矢印、上）の発現を誘導する。誘導性プロモーター（小矢印、下）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、次にタグ付き治療用ペプチド（六角形）の発現を活性化する、調節因子、例えば、Ｔ７ポリメラーゼの発現を駆動する。
【図５５Ａ】異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制するコンホメーションをとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はコンホメーション変化をして、ＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に結合し、ＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化する。ＰａｒａＢＡＤプロモーターが活性化されると、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現が誘導される。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは、毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素が発現し、細胞を殺滅する。組換え細菌に見いだされない必須遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態も示す。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の必須遺伝子の転写を抑制するコンホメーションをとり、細菌細胞は生存することができない。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はコンホメーション変化をして、ａｒａＢＡＤプロモーターに結合し、ａｒａＢＡＤプロモーターを活性化する。ａｒａＢＡＤプロモーターが活性化されると、必須遺伝子の発現が誘導されて、細菌細胞の生存能力が維持される。
【図５５Ｂ】抗毒素が構成的プロモーターから発現し、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制するコンホメーションをとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子がコンホメーション変化をして、ＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合し、ＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化する。ＰａｒａＢＡＤプロモーターが活性化されると、ＴｅｔＲの発現が誘導され、ひいては毒素の発現が妨げられる。しかし、アラビノースが存在しない場会、ＴｅｔＲは発現せず、毒素が発現し、最終的に抗毒素に打ち勝ち、細胞を殺滅する。抗毒素の発現を調節する構成的プロモーターは、毒素の発現を駆動するプロモーターより弱いプロモーターであるべきである。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターの制御下にある。
【図５５Ｃ】異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制するコンホメーションをとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子がコンホメーション変化をして、ＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合し、ＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化する。ＰａｒａＢＡＤプロモーターが活性化されると、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現が誘導される。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素が発現して細胞を殺滅する。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ＡｒａＣプロモーター）の制御下にある。
【図５６】外因性環境条件または１つ以上の環境シグナルが、１つ以上の誘導性プロモーターからの異種遺伝子および少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の１つの非限定的な実施形態を示す図である。次いで、リコンビナーゼは毒素遺伝子をフリップして活性コンホメーションにし、リコンビナーゼの天然の速度論により毒素発現の時間遅延が生じ、その結果、異種遺伝子を完全に発現することが可能となる。毒素は発現すると、細胞を死滅させる。
【図５７】本開示の別の非限定的な実施形態を描いた図である。外因性環境条件または１つ以上の環境シグナルによって、１つ以上の誘導性プロモーターから、異種遺伝子、抗毒素、および少なくとも１つのリコンビナーゼの発現が活性化される。次いで、リコンビナーゼは、毒素遺伝子を活性化コンホメーションにフリップするが、蓄積した抗毒素の存在により毒素の活性は抑制される。外因性環境条件またはシグナル（複数可）がもはや存在しなくなると、抗毒素の発現は停止する。毒素は構成的に発現され、蓄積し続け、細菌細胞を死滅させる。
【図５８】外因性環境条件または１つ以上の環境シグナルが、１つ以上の誘導性プロモーターからの異種遺伝子および少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の別の非限定的な実施形態を示す図である。次いで、リコンビナーゼは、少なくとも１つの切除酵素をフリップして、活性コンホメーションにする。次いで、少なくとも１つの切除酵素は、１つ以上の必須遺伝子を切除し、その結果、老化、そして最終的には細胞死に至る。リコンビナーゼおよび切除遺伝子の天然の速度論は、時間遅延を引き起こし、その速度論を切除すべき必須遺伝子の数および選択に依存して変更および最適化することができ、それにより数時間または数日のうちに細胞死が起こることが可能となる。入れ子状態の複数のリコンビナーゼの存在を用いて、細胞死のタイミングをさらに制御することができる。
【図５９】外因性環境条件または１つ以上の環境シグナルが、１つ以上の誘導性プロモーターからの異種遺伝子および第１のリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の１つの非限定的な実施形態を示す図である。次いで、リコンビナーゼは、第２のリコンビナーゼを逆方向から活性コンホメーションにフリップする。次いで、活性化された第２のリコンビナーゼが毒素遺伝子をフリップして活性コンホメーションにし、リコンビナーゼの天然の速度論により毒素発現の時間遅延が生じ、それにより、異種遺伝子を完全に発現することが可能となる。毒素は発現すると、細胞を死滅させる。
【図６０】操作された安全構成要素としてのＧｅｎｅＧｕａｒｄｓの使用を示す図である。すべての操作されたＤＮＡは、条件付きで破壊することができるプラスミド上に存在する。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）４巻、３０７〜３１６頁を参照されたい。
【図６１】表２５の例示的ＦＮＲプロモーター（Ｐｆｎｒ１−５）から選択されるＦＮＲ応答性プロモーターからｌａｃＺを発現する低コピープラスミドについて、当該低コピープラスミド含有細菌を含む試料における、β−ガラクトシダーゼレベルを示す図である。種々のＦＮＲ応答性プロモーターを用いて、様々な発現レベルおよびダイナミックレンジを有する嫌気性誘導性レポーターのライブラリーを作製した。これらのプロモーターは、強力なリボソーム結合部位を含んでいた。細菌培養物は、好気性（+Ｏ２）または嫌気性条件（−Ｏ２）のいずれかで増殖させた。４時間後に試料を取り出し、標準的なβ−ガラクトシダーゼ比色アッセイによって、β−ガラクトシダーゼレベルに基づくプロモーター活性を分析した。
【図６２Ａ】例示的なＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）制御下にあるｌａｃＺ遺伝子の模式図である。ＬａｃＺは酵素β−ガラクトシダーゼをコードする、細菌の一般的なレポーター遺伝子である。
【図６２Ｂ】例示的なＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）制御下にあるｌａｃＺ遺伝子のグラフデータである。ＳＹＮ３４０におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の関数として、ＦＮＲプロモーター活性を示す。低コピーｆｎｒＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子を有する操作細菌株であるＳＹＮ３４０を、酸素の存在または非存在下で増殖させた。標準的β−ガラクトシダーゼ比色アッセイについての値は、ミラー単位（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）で表される。これらのデータは、ｆｎｒＳプロモーターが嫌気的条件下で１時間以内に高レベル遺伝子発現を駆動し始めることを示唆している。
【図６２Ｃ】例示的なＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）制御下にあるｌａｃＺ遺伝子のグラフデータである。ｌａｃＺを発現する細菌細胞培養物の酸素存在下および非存在下両方における増殖を経時的に示す。
【図６３Ａ】レポーター構築物の構造または活性を示す棒グラフである。ＡＴＣ誘導性レポーター構築物の発現を示す。これらの構築物は、それらの同種誘導因子により誘導された場合、ＧＦＰの発現をもたらす。コントロール、ＡＴＣ−誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰレポーター構築物または一酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰレポーター構築物のいずれかを含むプラスミドを有するニッスル細胞は、ある範囲の濃度にわたって誘導された。プロモーター活性は、相対蛍光単位として表す。
【図６３Ｂ】レポーター構築物の活性を示す棒グラフである。一酸化窒素誘導性レポーター構築物の発現を示す。これらの構築物は、それらの同種誘導因子により誘導された場合、ＧＦＰの発現をもたらす。プロモーター活性は、相対蛍光単位として表す。
【図６３Ｃ】レポーター構築物の模式図である。
【図６３Ｄ】構成的プロモーターの制御下にＮｓｒＲを発現するプラスミドを、ＮｓｒＲ誘導性プロモーターの制御下にレポーター遺伝子ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）を有する細菌のドットブロットを示す。ＤＳＳ投与マウスは、ＨＥの典型的なモデルとして役立つ。ＨＥ対象と同様に、マウスの消化管は、飲料水に２〜３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を添加することによって損傷する。化学発光は、ＤＳＳ投与マウスにおいて誘導されたＮｓｒＲ調節プロモーターで示されている。
【図６４】ニッスルのｉｎ  ｖｉｖｏでの滞在を示すグラフである。ストレプトマイシン耐性ニッスルを、抗生物質を前投与せずに強制経口投与によりマウスに投与した。６匹すべてのマウスからの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管内に滞在している投与ニッスルの量を測定した。バーは、マウスに投与した細菌の数を表す。線は、１０日間連日にわたる各日の糞便試料から回収されたニッスルの数を表す。
【図６５】強制経口投与後１、４、８、１２、２４および３０時間の時点の腸管の様々なコンパートメントにおけるストレプトマイシン耐性ニッスルの滞在の経時的な棒グラフである。マウスに約１０９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈プレーティングにより、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。
【図６６Ａ】野生型ｃｌｂＡ構築物の模式図である。
【図６６Ｂ】ｃｌｂＡノックアウト構築物の模式図である。
【図６７】設計−構築−試験サイクルの概略図である。ステップは次のとおりである。１：疾患経路を定義する。２：標的代謝産物を同定する。３：遺伝子回路を設計する。４：合成ｂｉｏｔｉｃを構築する。５：ｉｎ  ｖｉｖｏで回路を活性化する。６：回路活性化動態を特徴付ける。７：ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生産性を疾病閾値に最適化する。８：動物疾患モデルにおいて最適化回路を試験する。９：微生物に同化する。１０：ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物動態および投薬レジメンの理解を発展させる。配列番号２９２〜２９３を、それぞれ出現順に開示する。
【図６８】本開示の遺伝学的に操作された細菌の上流および下流産生のための非限定的な製造方法の概略図である。ステップ１は、種培養１（ＳＣ１）のパラメーター：白金耳量−グリセロール保存液、継続時間一夜、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。ステップ２は、種培養２（ＳＣ２）のパラメーター：ＳＣ１からの１／１００希釈、継続時間１．５時間、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。ステップ３は、生産バイオリアクターのパラメーター：接種物−ＳＣ２、温度３７℃、ｐＨ設定点７．００、ｐＨ不感帯０．０５、溶存酸素設定点５０％、溶存酸素カスケード撹拌／ガスＦＬＯ、撹拌限界３００〜１２００ｒｐｍ、ガスＦＬＯ限界１分当たり０．５〜２０標準リットル、継続時間２４時間を示す。ステップ４は、収集のパラメーター：４０００ｒｐｍの速度および３０分の継続時間での遠心分離、洗浄１×１０％グリセロール／ＰＢＳ、遠心分離、再懸濁１０％グリセロール／ＰＢＳを示す。ステップ５は、バイアル充填／貯蔵のパラメーター：１〜２ｍＬの小分け、−８０℃を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下は実施態様の説明である。
本開示は、遺伝学的に操作された細菌、その製薬上組成物、ならびに消化管炎症を減少させ、消化管バリア機能を増強し、および／または自己免疫障害を処置または防止する方法を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的操作細菌には、ノンネイティブな（非自然なとも言う）抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を生成するための少なくとも一の非自然遺伝子および／または遺伝子カセットが含まれる。いくらかの実施態様では、少なくとも一の遺伝子および／または遺伝子カセットは、誘発性条件、例は、低酸素環境、ＲＯＳの存在、またはＲＮＳの存在を感知することが可能な転写因子によって制御される調節領域にさらに作動可能に連結される。遺伝学的に操作細菌は、誘導性環境、例は、消化管内で抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を生成することが可能である。したがって、遺伝学的に操作された細菌およびそれらの細菌を含む製薬上組成物は、自己免疫障害および／または消化管炎症および／またはＩＢＤを含む消化管バリア機能低下に関連する疾患または状態を処置または防止するために使用されうる。
【００１３】
本開示がより一層容易に理解されうるように、一定の用語を最初に規定する。これらの規定は、開示の残りの部分に照らして、またこの技術において熟練した技量の者（当業者とも言う）に理解されるように読まれるべきである。他に規定されない限り、ここで使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって不通に理解されるのと同じ意味を有する。追加の規定は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
【００１４】
ここに使用されるように、「消化管炎症および／または消化管バリア機能低下に関連する疾患および状態」には、制限されないが、炎症性腸疾患、下痢性疾患、および関連疾患が含まれる。「炎症性腸疾患」および「ＩＢＤ」は、ここにおいて互換的に使用され、消化管炎症に関連する疾患の群に言及し、これには、制限されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎（コラーゲン蓄積性大腸炎とも言う）、リンパ球性大腸炎、転換大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、ベーチェット病、および不確定な大腸炎（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）が含まれる。ここに使用されるように、「下痢性疾患」には、制限されないが、急性水様性下痢、例は、コレラ；急性血性下痢、例は、赤痢；持続性下痢が含まれる。ここに使用されるように、関連疾患には、制限されないが、短腸症候群、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側結腸炎（左腸大腸炎とも言う）、全結腸炎（全大腸炎）、および劇症性大腸炎が含まれる。
【００１５】
上記の疾患および状態に関連する症状には、制限されないが、下痢、血便、口内炎（ｍｏｕｔｈ  ｓｏｒｅｓ、口のびらんとも言う）、肛門周囲疾患、腹痛、腹部痙攣、発熱、疲労、体重減少、鉄欠乏、貧血、食欲の喪失（食欲不振とも言う）、重量減少、無食欲、増殖遅延（発育遅延とも言う）、思春期発達の遅れ（ｄｅｌａｙｅｄ  ｐｕｂｅｒｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、皮膚の炎症、目の炎症、関節の炎症、肝臓の炎症、および胆管の炎症の一以上が含まれる。
【００１６】
消化管炎症および／または消化管バリア機能低下に関連する疾患または状態は、自己免疫障害でありうる。消化管炎症および／または消化管バリア機能低下に関連する疾患または状態は、自己免疫障害と併発する（ｃｏ−ｍｏｒｂｉｄ  ｗｉｔｈ）可能性がある。ここに使用されるように、「自己免疫障害」には、制限されないが、急性散在性（急性播種性とも言う）脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎（ａｃｕｔｅ  ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、無ガンマグロブリン（アガンマグロブリンまたはアマガングロブリンとも言う）血症、円形脱毛症、アミロイドーシス（類でんぷん症）、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全（症）、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索アンド神経ニューロパシー（ａｘｏｎａｌ  ＆  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、バロー病（Ｂａｌｏ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、水疱性類天疱瘡、心筋ミオパチー（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ、心筋症）、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｏｓｔｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、慢性再発性多巣性耳状骨症）（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（チャーグ病、Ｃｈｕｒｇｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患（ＣＲＥＳＴ病）、本態性混合性クリオグロブリン血症（必須混合性クリオグロブリン血症とも言う）、脱髄性ニューロパチー、疱疹状（疱疹性とも言う）皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（デヴィス病とも言う）（視神経脊髄炎）（神経鞘炎とも言う）、円板状ループス（円板状狼瘡とも言う）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト脳炎、ハシモト甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、カワサキ症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性（白血球梗塞性）血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬（苔状硬化症）、木質性結膜炎（羊膜結膜炎）、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（狼瘡）（全身性エリトマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、視神経炎、パリンドロームリウマチ（回帰性リウマチ）、ＰＡＮＤＡＳ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、連鎖球菌に関連する小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症（傍腫瘍性小脳変性症）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソンネージターナー症候群（Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群（ｐｏｓｔｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群（むずむず脚症候群）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、脈管炎、小水疱性外皮疾患、白斑、およびウエゲナー肉芽腫症が含まれる。
【００１７】
ここに使用されるように「抗炎症分子」および／または「消化管バリア機能エンハンサー分子」は、制限されないが、短鎖脂肪酸、ブチラート、プロピオナート、アセタート（酢酸塩、アセテートとも言う）、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ＧＬＰ−２およびアナログ、ＧＬＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥｓ）、エラフィン（またペプチダーゼインヒビター３およびＳＫＡＬＰとも呼ばれる）、トレフォイル因子、メラトニン、トリプトファン、ＰＧＤ２、およびキヌレン酸、インドール代謝物、および他のトリプトファン代謝物、ならびにここに開示される他の分子が含まれる。そのような分子はまた、炎症促進分子を抑制する化合物、例は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、および／またはケモカイン、例は、ＣＸＣＬ−８およびＣＣＬ２を中和する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを含むこともできる。このような分子にはまた、本明細書に記載のＡＨＲアゴニスト（例えば、ＩＬ−２２生成をもたらす、例えばインドール酢酸、インドール−３−アルデヒド、およびインドール）およびＰＸＲアゴニスト（例えば、ＩＰＡ）が含まれる。このような分子にはまた、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ブチラート）、ＧＰＲ４１および／またはＧＰＲ４３の活性化因子（例えば、ブチラートおよび／またはプロピオナートおよび／またはアセタート）、ＧＰＲ１０９Ａの活性化因子（例えば、ブチラート）、ＮＦ−κＢシグナル伝達の阻害因子（例えば、ブチラート）、およびＰＰＡＲγの調節因子（例えば、ブチラート）、ＡＭＰＫシグナル伝達の活性化因子（例えば、アセタート）、およびＧＬＰ−１分泌の調節因子が含まれる。そのような分子にはまた、ヒドロキシルラジカル捕捉剤および抗酸化剤（例えば、ＩＰＡ）が含まれる。ある分子は、主として抗炎症剤、例は、ＩＬ−１０、または主に消化管バリア機能増強性、例は、ＧＬＰ−２でありうる。ある分子は抗炎症性および消化管バリア機能増強性の双方であることができる。抗炎症性および／または消化管バリア機能エンハンサー分子は、単一遺伝子によってコードされてもよく、例は、エラフィンはＰＩ３遺伝子によってコードされる。あるいはまた、消炎および／または消化管バリア機能エンハンサー分子は、複数の遺伝子を必要とする生合成経路、例は、ブチラートによって合成されてよい。これらの分子はまた、治療上の分子と称されうる。場合によっては、「抗炎症分子」および／または「消化管バリア機能エンハンサー分子」は、本明細書において「エフェクター分子」または「治療分子」または「治療用ポリペプチド」と呼ばれる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「組換え微生物」という用語は、その天然の状態から遺伝子改変された微生物、例えば、細菌もしくは酵母もしくはウイルスの細胞、または細菌もしくは酵母もしくはウイルスを意味する。したがって、「組換え細菌細胞」または「組換え細菌」は、それらの天然の状態から遺伝子改変された、細菌細胞または細菌を意味する。例えば、組換え細菌細胞は、それらのＤＮＡに導入されたヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再構成およびヌクレオチド改変を有し得る。これらの遺伝子改変は、細菌もしくは細菌細胞の染色体内に存在することもあり、または細菌もしくは細菌細胞におけるプラスミド上に存在することもある。本明細書で開示する組換え細菌細胞は、プラスミド上に外因性ヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、組換え細菌細胞は、それらの染色体に安定に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
【００１９】
「プログラム（された）または操作（された）微生物」は、その天然の状態から、特定の機能を果たすように遺伝子改変された微生物、例えば、細菌もしくはウイルス細胞、または細菌もしくはウイルスを意味する。したがって、「プログラム（された）もしくは操作（された）細菌細胞」または「プログラム（された）もしくは操作（された）細菌」は、その天然の状態から、特定の機能を果たすように遺伝子改変された細菌細胞または細菌を意味する。特定の実施形態では、プログラムされたまたは操作された細菌細胞は、１つ以上のタンパク質、例えば、治療活性を有するまたは治療目的に役立つ１つ以上のタンパク質を発現するように改変されたものである。プログラムされたまたは操作された細菌細胞は、目的のタンパク質（複数可）が発現すると、増殖を停止させるまたはそれ自体を破壊する能力を、さらに有し得る。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、タンパク質またはその断片をコードする核酸断片であって、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）、およびコード配列の後に続く調節配列（３’非コード配列）を任意選択で含む核酸配列を意味する。一実施形態では、「遺伝子」は、コード配列に先行するおよびコード配列の後に続く調節配列を含まない。「ネイティブ遺伝子」は、天然で見いだされるような遺伝子であって、コード配列に先行するまたはコード配列の後に続くそれ固有の調節配列を任意選択で有する遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、ネイティブ遺伝子でない任意の遺伝子であって、コード配列に先行するまたはコード配列の後に続く調節配列を任意選択で含み、前記コード配列および／または調節配列の全部または一部が天然では一緒に見いだされないものである、任意の遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが天然で見いだされるものとは構成が異なる調節配列およびコード配列を含み得る。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「遺伝子配列」という用語は、遺伝子配列、例えば、核酸配列を意味する。遺伝子配列（ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または遺伝子配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、完全な遺伝子配列または部分的遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子配列（ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または遺伝子配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝子配列、例えば、調節配列、リーダー配列、シグナル配列または他の非タンパク質コード配列を含むことも意味する。
【００２２】
いくつかの実施態様では、用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、ここに説明される抗炎症および消化管バリア機能増強性分子、例は、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、キヌレニン、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）、エラフィンおよびトレフォイル因子、ならびにその他のいずれかをコードする核酸配列に言及することを意味する。核酸配列には、遺伝子配列の全体または機能的分子をコードする部分的な遺伝子配列が含まれうる。核酸配列は、自然配列または合成配列であってもよい。核酸配列には、自然型または野生型配列が含まれてよく、または一以上の挿入、欠失、置換、または他の修飾を有する修飾配列が含まれてよく、たとえば、核酸配列はコドン最適化されうる。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「異種」遺伝子または「異種配列」は、所定の細胞において通常は天然で見いだされないヌクレオチド配列を意味する。本明細書で使用する場合、異種配列は、所定の細胞に外から導入される核酸配列であって、（細胞において天然に見いだされるまたは発現する）天然配列であってもよく、または（細胞において天然に見いだされも、発現しもしない）非天然配列であってもよく、および天然もしくは野生型配列であってもよく、または変異体、非天然もしくは合成配列であってもよい、核酸配列を含む。「異種遺伝子」は、対応するネイティブ遺伝子とは異なる形態で宿主細胞に導入された、ネイティブ遺伝子またはその断片を含む。例えば、異種遺伝子は、宿主細胞に再導入される非天然調節領域を含むためのキメラ遺伝子の一部分である天然コード配列を含み得る。異種遺伝子は、非天然宿主細胞に導入されるネイティブ遺伝子またはその断片も含み得る。したがって、異種遺伝子は、受容細胞にとって異質なものであってもよく、もしくは生得のものであってもよく；所定の細胞において天然に見いだされるが、核酸および／もしくはそれをコードするポリペプチドを不自然な量を発現する、核酸配列であってもよく；ならびに／または天然の場合と同じ互いとの関連性では見いだされない２つもしくはそれ以上の核酸配列であってもよい。本明細書で使用する場合、「内在性遺伝子」という用語は、生物のゲノム内のその天然の位置にあるネイティブ遺伝子を意味する。本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」という用語は、宿主生物、例えば宿主細菌細胞、ゲノムに導入された遺伝子を意味する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「非天然」核酸配列は、微生物に通常は存在しない核酸配列、例えば、内因性配列の余剰のコピー、あるいは異種配列、例えば、細菌もしくはウイルスの異なる種、株もしくは亜株に由来する配列、または同じサブタイプの細菌もしくはウイルスに由来する非改変配列と比較して改変されているおよび／もしくは突然変異している配列を意味する。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は、合成非天然型配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌら、２０１３参照）。非天然核酸配列は、遺伝子カセットにおける調節領域、プロモーター、遺伝子および／または１つ以上の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、「非天然」は、天然で互いに同じ関係性が見いだされない２つ以上の核酸配列を意味する。非天然核酸配列は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作微生物は、遺伝子であって、当該遺伝子と天然では会合していないプロモーターに作動可能に連結している前記遺伝子を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で開示する遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子であって、当該遺伝子と天然では会合していない直接的または間接的誘導性プロモーター、例えば、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子に作動可能に連結しているＦＮＲ応答性プロモーター（または本明細書で開示する他のプロモーター）に、作動可能に連結している前記遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作されたウイルスは、遺伝子であって、当該遺伝子と天然では会合しない直接的または間接的誘導性プロモーター、例えば、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーターに、作動可能に連結している前記遺伝子を含む。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「コード領域」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意味する。「調節配列」という用語は、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列（５’非コード配列）、コード配列内に位置するヌクレオチド配列、またはコード配列の下流に位置するヌクレオチド配列（３’非コード領域）であって、転写、ＲＮＡプロセッシング、ＲＮＡ安定性、または付随するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、エフェクター結合部位、シグナル配列、およびステム−ループ構造を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、調節配列は、プロモーター、例えば、ＦＮＲ応答性プロモーターまたは本明細書で開示する他のプロモーターを含む。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、生合成経路をコードする「遺伝子カセット」または「オペロン」は、抗炎症または消化管バリアエンハンサー分子を産生するために必要とされる２つ以上の遺伝子をいう。前記分子を生成可能な遺伝子のセットをコードすることに加え、遺伝子カセットまたはオペロンにはまた、追加的な転写および翻訳要素、例は、リボソーム結合部位も含まれうる。
【００２７】
「ブチロジーニック遺伝子カセット」、「ブチラート生合成遺伝子カセット」および「ブチラートオペロン」は、生合成経路においてブチラートを産生することができる一組の遺伝子を指すために交換可能に使用される。内在性ブチラート生合成経路を介してブチラートを生成することができる非改変細菌には、制限されないが、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ペプトクロストリジウム属（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）が含まれる。本発明の遺伝学的に操作された細菌には、細菌の異なる種、菌株、または亜株（ｓｕｂｓｔｒａｉｎ、亜系とも言う）由来のブチラート生合成遺伝子、または細菌の異なる種、菌株、および／または亜株由来のブチラート生合成遺伝子の組合せが含まれてよい。ブチロジーニック遺伝子カセットには、たとえば、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ペプトクロストリジウム・ディフィシル）〔Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジウム・ディフィシル）とも称される〕由来のブチラート生成経路の八つの遺伝子：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋを含むことができ、それらはブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼサブユニット、電子伝達フラボタンパク質サブユニットベータ、電子伝達フラボタンパク質サブユニットアルファ、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ-アセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ、およびブチラートキナーゼをそれぞれコードする〔Ａｂｏｕｌｎａｇａ（アブルナガ）ら、２０１３〕。ブチラート生合成遺伝子の一以上は、機能的に置換または修飾されてもよく、例は、コドン最適化される。Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ペプトクロストリジウム・ディフィシル）菌株６３０および菌株１２９６はいずれもブチラートを生成することができるが、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋについて異なる核酸配列を含む。ブチロジーニック遺伝子カセットには、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株６３０由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、およびｔｈｉＡ１を、およびＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１２９６由来のｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋを含むことができる。あるいはまた、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来の単一遺伝子（ｔｅｒ、トランス２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする）は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、およびｅｔｆＡ３の遺伝子の三つすべてを機能的に置換することができる。したがって、ブチロジーニック遺伝子カセットは、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋを、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のｔｅｒを含むことができる。ブチロジーニック遺伝子カセットは、ブチラートの好気性生合成のための遺伝子および／またはブチラートの嫌気性または微好気性の生合成のための遺伝子を含み得る。ブチラート遺伝子カセットの別の例では、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子がｔｅｓＢ（例えば、大腸菌由来）で置換される。したがって、ブチロジーニック遺伝子カセットは、ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、およびｔｅｓＢを含み得る。
【００２８】
同様に、「プロピオナート遺伝子カセット」または「プロピオナートオペロン」は、生合成経路においてプロピオナートを生成することができる遺伝子のセットを指す。内在性プロピオナート生合成経路を介してプロピオナートを生成することができる非改変細菌には、制限されないが、クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、およびプレボテーラ・ルミニコーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）が含まれる。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子、または細菌の異なる種、菌株、および／または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子の組合せを含みうる。いくらかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、アクリラート経路のプロピオナート生合成遺伝子、例は、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、およびａｃｒＣを含み、それらは、プロピオナートＣｏＡ−トランスフェラーゼ、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼＡ、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼＢ、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼＣ、電子伝達フラボタンパク質サブユニットＡ、アクリロイル−ＣｏＡレダクターゼＢ、およびアクリロイル−ＣｏＡレダクターゼＣをそれぞれコードする（Ｈｅｔｚｅｌら、２００３、Ｓｅｌｍｅｒら、２００２、およびＫａｎｄａｓａｍｙ、 ２０１２；  「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ａｃｒｙｌａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｍｉｘｅｄ−ａｃｉｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」）。当該オペロンはラクタートからプロピオナートへの還元を触媒する。（Ｒ）−ラクトイル−ＣｏＡの脱水は、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＬｃｄＡＢＣ）によるアクリロイル−ＣｏＡ中間体の生成をもたらす。アクリロイル−ＣｏＡは、アクリロイル−ＣｏＡレダクダーゼ（ＥｔｆＡ、ＡｃｒＢＣ）によってプロピオニル−ＣｏＡに変換される。いくつかの実施形態では、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢおよびａｃｒＣがコードする酵素が触媒する律速段階について、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢおよびａｃｒＣの代わりにＲ．スフェロイデス由来のａｃｕＩ遺伝子を用いる。ＡｃｕＩ遺伝子産物は、ＮＡＤＰＨに依存したアクリリル−ＣｏＡの還元を触媒して、プロピオニル‐ＣｏＡを生成する（Ａｓａｏら、２０１３年、「Ａｃｒｙｌｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，  ａｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  ｂｙ  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ」）。したがって、プロピオナートカセットは、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣおよびａｃｕＩを含む。別の実施形態では、大腸菌のＡｃｕＩホモログであるＹｈｄＨが使用される（例えば、Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら、２００４年、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＹｈｄＨ，  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ  ���ｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ．」を参照）。この場合、プロピオナートカセットは、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣおよびｙｈｄＨを含む。代わりの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、ピルバート経路プロピオナート生合成遺伝子〔例は、Ｔｓｅｎｇ（ツェン）ら、２０１２参照〕、例は、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄを含み、それらは、ホモセリンデヒドロゲナーゼ１、ホモセリンキナーゼ、Ｌ−スレオニンシンターゼ、Ｌ−スレオニンデヒドラターゼ、ピルバートデヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ、およびジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをそれぞれコードする。いくらかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼをコードするｔｅｓＢをさらに含む。
【００２９】
プロピオナート遺伝子カセットの別の例では、スリーピングビューティームターゼオペロンの遺伝子、例えば大腸菌由来の遺伝子（ＳＢＭ、ｙｇｆＤ、ｙｇｆＧ、ｙｇｆＨ）が含まれる。当該経路は、最近、グリセロールからのプロピオナートの高収率工業生産のために検討・利用された（Ａｋａｗｉら、２０１５年、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ」、  Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、４２巻：１０５７〜１０７２頁）。当該参考文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書に記載のように、当該経路はまた、例えば本開示の遺伝学的に操作された細菌による、グルコースからのプロプリオナート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）の生成にも適していることが明らかになった。ＳＢＭ経路は循環的であり、出発分子のスクシニル−ＣｏＡを再生しながら、発酵産物としてプロピオナートを形成する一連の生化学的変換からなる。ＳＢＭ（メチルマロニル−ＣｏＡミューターゼ）がスクシニルＣｏＡをＬ−メチルマロニルＣｏＡへ変換する。ＹｇｆＤはＧＴＰアーゼ（ＧＴＰａｓｅ）活性を有し、ＳＢＭと相互作用するキナーゼである。ＹｇｆＧ（メチルマロニルＣｏＡデカルボキシラーゼ）はＬ−メチルマロニルＣｏＡをプロピオニルＣｏＡに変換し、ｙｇｆＨ（プロピオニルＣｏＡ／スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ）はプロピオニルＣｏＡをプロピオナートに、スクシナートをスクシニルＣｏＡに変換する（Ｆｒｏｅｓｅ、２００９年、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ  ｍｕｔａｓｅ  （ｓｂｍ）  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｙｇｆｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」）。この経路は、プロピオニバクテリウム属細菌の酸化的プロピオナート経路に非常に類似しており、当該経路もまたスクシナートをプロピオナートに変換する。スクシニル−ＣｏＡは、メチルマロニル−ＣｏＡミューターゼ（ｍｕｔＡＢ）によってＲ-メチルマロニル−ＣｏＡに変換される。Ｒ-メチルマロニル−ＣｏＡは、次に、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ（ＧＩ：１８０４２１３４）によってＳ-メチルマロニル−ＣｏＡに変換される。メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシトランスフェラーゼ（ｍｍｄＡ、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８７０、ｂｃｃｐ）をコードする３つの遺伝子が存在し、当該酵素はメチルマロニル−ＣｏＡをプロピオニル−ＣｏＡに変換する。
【００３０】
プロピオナート遺伝子カセットは、プロピオナートの好気性生合成のための遺伝子および／またはプロピオナートの嫌気性または微好気性生合成のための遺伝子を含みうる。   プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、機能的に置換または修飾されていてもよく、たとえば、コドン最適化である。
【００３１】
「アセタート遺伝子カセット」または「アセタートオペロン」は、生合成経路においてアセタートを生成することができる遺伝子のセットを意味する。細菌は、たとえば、セルロース、リグニン、および無機ガスなどのような様々な基質を含む「多数の炭素源およびエネルギー源からアセタートを合成」し、当該技術分野で公知の異なる生合成メカニズムおよび遺伝子を利用する（Ｒａｇｓｄａｌｅら、２００８）。本発明の遺伝学的に操作された細菌には、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のアセタート生合成遺伝子、または細菌の異なる種、菌株、および／または亜株由来のアセタート生合成遺伝子の組合せが含まれてよい。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）は、好気的増殖の間にグルコースおよび酸素を消費してアセタートおよび二酸化炭素を生成することができる〔Ｋｌｅｍａｎ（クレマン）ら、１９９４〕。いくつかの細菌、たとえば、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ（アセチトマクラム属）、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ（アセトアナエロビウム属）、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ（アセトハロビウム属）、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ（アセトネマ属）、Ｂａｌｕｔｉａ（ブラウティア属）、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ブチリバクテリウム属）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム属）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ（モーレラ属）、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ（オキソバクター属）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ（スポロミュサ属）、およびＴｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ（サーモアセトゲニウム属）などのようなものは、例は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ  ｐａｔｈｗａｙ（ウッド-ユングダール経路）を使用して、ＣＯまたはＣＯ２＋Ｈ２をアセタートに変換することができるアセトジーニック嫌気性菌である〔Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ（シーレ-ベンゲルスドルフ）ら、２０１２〕。種々の細菌種のためのＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ  ｐａｔｈｗａｙの遺伝子が当技術で知られる。アセタート遺伝子カセットはアセタートの好気性生合成のための遺伝子および／またはアセタートの嫌気性または微好気性の生合成のための遺伝子を含んでよい。アセタート生合成遺伝子の一以上は機能的に置換または修飾されてよく、たとえば、コドン最適化される。
【００３２】
各遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミドまたは細菌染色体上に存在し得る。さらに、任意の遺伝子、遺伝子カセット、または調節領域の複数のコピーが細菌に存在してもよく、そこでは遺伝子、遺伝子カセットまたは調節領域の一以上のコピーは、ここに記載されるように変異または他の方法で変動してもよい。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、コピー数を増強するために、同じ遺伝子、遺伝子カセット、または調節領域の複数のコピーを含むように操作される。
【００３３】
各遺伝子または遺伝子カセットは、低酸素条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結され得る。「作動可能に連結した」は、その核酸配列の発現を可能にする形で調節配列に連結している（例えば、シスで作動する）核酸配列、例えば、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを意味する。「作動可能に連結した」調節領域は、単一核酸断片上の核酸配列が、ある配列の機能が他の配列による影響を受けるように、会合することを意味する。調節エレメントとコード配列は、調節エレメントとコード配列間の距離に関係なく、調節エレメントが遺伝子コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、作動可能に連結している。より具体的には、「作動可能に連結した」は、核酸配列の発現、例えば、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子の発現を可能にする形で調節配列に連結している核酸配列、例えば、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子に当てはまる。換言すると、調節配列は、シスで作動する。一実施形態では、遺伝子は、当該遺伝子の発現を可能にする形で調節配列に「直接的に連結した」ものであってもよい。他の実施形態では、遺伝子は、当該遺伝子の発現を可能にする形で調節配列に「間接的に連結した」ものであってもよい。一実施形態では、２つ以上の遺伝子は、当該２つ以上の遺伝子の発現を可能にする形で調節配列に直接的または間接的に連結したものであってもよい。調節領域または配列は、目的の遺伝子の転写を指示することができる核酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列ならびにイントロンを含むことができる。
【００３４】
「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、コード配列または遺伝子の発現を制御することができるヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは、一般に、それらが調節する配列の５’側に位置する。プロモーターは、それらの全部がネイティブ遺伝子に由来することもあり、または天然で見いだされるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていることもあり、および／または合成ヌクレオチドセグメントを含むこともある。異なるプロモーターが、特定の刺激に例えば細胞もしくは組織特異的な形で応答して、異なる環境もしくは生理的条件に応答して、または特定の化合物に応答して、コード配列または遺伝子の発現を調節し得ることは、当業者には容易に確かめられるであろう。原核生物プロモーターは、一般的に２つのクラスに分類される：誘導性および構成的。「構成的プロモーター」は、その制御下のコード配列または遺伝子の連続転写を可能にするプロモーターを意味する。
【００３５】
「構成的プロモーター」は、その制御下の、かつ／またはそれが作動可能に連結したコード配列もしくは遺伝子の連続的転写を駆動することができるプロモーターを意味する。構成的プロモーターおよび変異体は、当該技術分野で周知であり、Ｐｔａｃプロモーター、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的大腸菌σＳプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ｉＧＥＭ）  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓ  Ｎａｍｅ  ＢＢａ＿Ｊ４５９９２；  ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的大腸菌σ３２プロモーター（例えば、ｈｔｐＧ熱ショックプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成的大腸菌σ７０プロモーター（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；  ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、大腸菌ＣｒｅＡＢＣＤリン酸感知オペロンプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｉプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０）、構成的枯草菌σＡプロモーター（例えば、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、プロモーター４３（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、ＰｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、ＰｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００２）、Ｐｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３）、構成的枯草菌σＢプロモーター（例えば、プロモーターｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プロモーター（例えば、サルモネラ属に由来するＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、サルモネラ属に由来するＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、およびバクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
「誘導性プロモーター」は、１つ以上の遺伝子に作動可能に連結している調節領域であって、前記遺伝子（複数可）の発現が前記調節領域の誘導因子の存在下で増加する、前記調節領域を意味する。「誘導性プロモーター」は、その制御下のコード配列または遺伝子の転写レベル上昇を刺激または外因性環境条件に応答して開始するプロモーターを意味する。「直接的誘導性プロモーター」は、タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結している調節領域であって、該調節領域の誘導因子の存在下で前記タンパク質またはポリペプチドが発現する、前記調節領域を意味する。「間接的誘導性プロモーター」は、２つ以上の調節領域を含む調節システムであって、例えば、第２の遺伝子に作動可能に連結している第２の調節領域を調節することができる、第１のタンパク質、ポリペプチドまたは因子、例えば、転写調節因子をコードする第１の遺伝子に作動可能に連結している第１の調節領域を含み、前記第２の調節領域が活性化または抑制されることにより、第２の遺伝子の発現が活性化または抑制される、調節システムを意味する。直接的誘導性プロモーターと間接的誘導性プロモーターの両方が「誘導性プロモーター」に含まれる。本明細書に記載の例示的誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例は、本明細書中でより詳細に説明する、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＰａｒａＣプロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーターおよびＰＴｅｔＲプロモーターを含むが、これらに限定されない。他の誘導性プロモーターの例は、本明細書中の後段にて提供する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌は、非天然遺伝物質が保持され、発現し、伝播するように、宿主ゲノムに組み込まれるまたは自己複製染色体外プラスミド上に伝播する非天然遺伝物質、例えば、プロピオナート異化酵素をコードする遺伝子を有する細菌宿主細胞を指すために用いられる。安定な細菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、例えば培地中での、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの、例えば消化管内での生存および／または増殖の能力を有する。例えば、安定な細菌は、プロピオナート異化酵素をコードする遺伝子を含む遺伝学的に操作された細菌であって、前記遺伝子を有するプラスミドまたは染色体が、プロピオナート異化酵素を当該細菌において発現させることができるように、かつ、当該細菌がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで生存および／または増殖することができるように、細菌内で安定に維持されている、遺伝学的に操作された細菌であり得る。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質の発現の安定性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質の発現レベルに影響を及ぼす。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、核酸に由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もしくはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積、および／またはｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「プラスミド」または「ベクター」という用語は、細菌細胞のゲノムに組み込まれない、染色体外核酸、例えばＤＮＡ、構築物を意味する。プラスミドは、通常は環状であり、自律増殖することができる。プラスミドは、当該技術分野で周知であるように、低コピー、中コピー、または高コピーであり得る。プラスミドは、当該プラスミドを含有する細菌細胞についての選択を助け、かつ当該プラスミドが前記細菌細胞内に確実に保持されるようにする、選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子を任意選択で含み得る。本明細書中に開示されるプラスミドは、異種遺伝子、例えば、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子、をコードする核酸配列を含み得る。
【００４０】
本明細書で使用される「形質転換」または「形質転換」という用語は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、核酸断片の宿主細菌細胞への移入を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主細菌細胞は、「組換え」または「トランスジェニック」または「形質転換」された生物と呼ばれる。
【００４１】
「遺伝子改変」という用語は、本明細書で使用する場合、任意の遺伝子変化を意味する。例示的遺伝子改変は、例えば、天然染色体または染色体外遺伝物質の改変を含む、遺伝子の発現を増加、減少または消失させるものを含む。例示的遺伝子改変は、少なくとも１つのプラスミドの導入、染色体または染色体外遺伝物質（複数可）の改変、突然変異、塩基欠失、塩基付加、塩基置換および／もしくはコドン改変、遺伝子過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子抑制、プロモーター改変もしくは置換、遺伝子付加（単コピーもしくは多コピーのどちらか）、アンチセンス発現もしくは抑制、または宿主細胞の遺伝要素に対する任意の他の変化（その変化が表現型の変化を生じさせるか否かを問わない）も含む。遺伝子改変は、プラスミド、例えば、プロモーターに作動可能に連結した抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子を含むプラスミドの、細菌細胞への導入を含み得る。遺伝子改変は、染色体内での、例えば、ネイティブ遺伝子プロモーターを誘導性プロモーター、調節プロモーター、強いプロモーターまたは構成的プロモーターで置換するための、標的化置換も含み得る。遺伝子改変は、遺伝子増幅、例えば、細胞の染色体へのネイティブ遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーの導入も含み得る。あるいは、染色体遺伝子改変は、遺伝子突然変異を含み得る。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「遺伝子突然変異」という用語は、遺伝子または関連調節領域のヌクレオチド配列の、当該ヌクレオチド配列をその天然または野生型配列と比較して変更する、１つ以上の変化を意味する。突然変異は、例えば、野生型配列内での、全体的または部分的、置換、付加および欠失を含む。そのような置換、付加または欠失は、配列への実質的変化をもたらし得る、単一ヌクレオチド変化（例えば、１つ以上の点突然変異）であってもよく、または２以上の変化であってもよい。突然変異は、遺伝子のコード領域内ならびに遺伝子の非コードおよび調節配列内で起こり得る。「遺伝子突然変異」という用語は、コード領域内でのサイレントおよび保存的突然変異、ならびに遺伝子によりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更する変化を含むことを意図するものである。遺伝子コード配列における遺伝子突然変異は、例えば、その遺伝子のポリペプチド産物の活性（例えば、酵素的活性）を増加させることもあり、減少させることもあり、または別様に変更することもある。調節配列の遺伝子突然変異は、変更された調節配列に作動可能に連結した配列の発現を増加させるか、減少させるか、または別様に変更する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「輸送体（トランスポーター）」という用語は、分子、例えば、アミノ酸、ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド等）、毒素、代謝産物、基質、ならびに他の生体分子を細胞外環境から微生物に移入するための機構、例えば、１つのタンパク質、複数のタンパク質、またはタンパク質複合体を意味する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「外因性環境条件」または「外因性環境シグナル」という語句は、本明細書に記載のプロモーターが直接的または間接的に誘導される、状況、環境、刺激、または生体分子を意味する。「外因性環境条件」という語句は、操作された微生物にとっては外部であるが、宿主対象の環境にとっては内因性または天然の環境条件を意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、同義で用いて、環境条件が哺乳動物の身体に対して内因性であるが、完全な微生物細胞に対しては外部または外因性である環境条件を意味することができる。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の上部胃腸管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の下部胃腸管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の小腸に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環境のような、低酸素、微好気的または嫌気的条件である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に固有である分子もしくは代謝産物、例えば、プロピオナートである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、組織に固有または疾患に固有の代謝産物もしくは分子（複数可）である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、炎症性疾患に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、低ｐＨ環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ｐＨ依存性プロモーターを有する。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを有する。いくつかの態様では、細菌は、酸素レベルを感知することができる転写因子を発達させた。異なるシグナル伝達経路は、異なる酸素レベルにより誘発され、異なる速度論で発生し得る。「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つ以上の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流遺伝子発現を活性化する。
【００４５】
酸素レベル依存性転写因子の例は、ＦＮＲ（フマレートおよびナイトレートレダクターゼ）、ＡＮＲおよびＤＮＲを含むが、これらに限定されない。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ（嫌気硝酸呼吸）応答性プロモーター、およびＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）応答性プロモーターは、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒら、１９８９；Ｇａｌｉｍａｎｄら、１９９１；Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８；Ｈｏｅｒｅｎら、１９９３；Ｓａｌｍｏｎら、２００３参照）、非限定的な例を表１に示す。
【００４６】
非限定的な例において、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、低または無環境酸素の条件下で高度に発現することが公知である大腸菌ニッスルのフマレートおよびナイトレートレダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）に由来していた（ＤｕｒａｎｄおよびＳｔｏｒｚ、２０１０；Ｂｏｙｓｅｎら、２０１０）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、ニッスルに天然で見いだされるグローバルな転写調節因子ＦＮＲにより嫌気的条件下で活性化される。嫌気的条件下では、ＦＮＲは、二量体を形成し、その制御下の特定の遺伝子のプロモーターにおける特定の配列に結合し、それにより、それらの発現を活性化する。しかし、好気的条件下では、酸素がＦＮＲ二量体における鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性形に変換する。このようにして、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターは、タンパク質またはＲＮＡの発現を調整するために採用される。ＰｆｎｒＳは、本明細書においてＦＮＲＳ、ｆｎｒｓ、ＦＮＲ、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーターおよびＰｆｎｒＳプロモーターを示すための他のそのような関連する記号表示と同義で用いる。
【表１】
2018532412.tif 000001
【００４７】
ここに使用されるように、「チューナブル（調整可能）調節領域」は転写因子の直接的または間接的コントロール下にある核酸配列に言及し、およびそれはインデューサーのレベルと比較して遺伝子発現を活性化、抑制、抑制解除、またはさもなければ制御することができる。いくらかの実施態様において、調整可能調節領域はプロモーター配列を含む。インデューサー（誘導物質とも言う）は、ＲＮＳまたはここに記載の他の誘導物質であってもよく、および調整可能調節領域はＲＮＳ応答性調節領域またはここに記載の他の応答性調節領域であってもよい。調整可能な調節領域は、１つまたは複数のペイロード、例えば、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列の生成のために、遺伝子配列または遺伝子カセットに作動可能に連結され得る。たとえば、一の特定の実施態様では、調整可能調節領域はＲＮＳ抑制解除性調節領域であり、ＲＮＳが存在するとき、ＲＮＳ感知性転写因子はもはや調節領域に結合せず、および／または調節領域を抑制せず、それによって作動可能に連結される遺伝子または遺伝子カセットの発現が可能である。この場合、調整可能調節領域は、ＲＮＳレベルと比較して遺伝子または遺伝子カセット発現を抑制解除する。各遺伝子または遺伝子カセットは、少なくとも一のＲＮＳを感知することができる転写因子によって直接または間接にコントロールされる調整可能調節領域に作動可能に連結されうる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の存在または非存在である。他の実施形態では、外因性環境条件は、反応性窒素種（ＲＮＳ）の存在または非存在である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、炎症反応に関与する生体分子、例えば、消化管の炎症性障害の際に存在する分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件またはシグナルは、組換え細菌細胞が滞留する環境に、天然に存在する、または天然に存在しない。いくつかの実施形態では、外因性環境条件またはシグナルは、例えば、生物学的条件の作出もしくは除去、および／または生体分子の投与もしくは除去により、人工的に作出される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、外因性環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）は、誘導性プロモーターの活性を刺激する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）は、哺乳動物の消化管内に天然に存在しない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、本開示の製薬上組成物と併用して投与される分子または代謝産物、例えば、テトラサイクリン、アラビノース、または誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ任意の生体分子によって刺激される。いくつかの実施形態では、外因性環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）は、本開示の組換え細菌細胞を含む培養培地に加えられる。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件は、哺乳動物の消化管内に天然に存在する（例えば、低酸素もしくは嫌気的条件、または炎症反応に関与する生体分子）。いくつかの実施形態では、外因性環境条件への（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの）曝露の喪失は、プロモーターを誘導するための外因性環境条件が存在しない（例えば、消化管外の好気的環境）ため、誘導性プロモーターの活性を阻害する。「消化管（腸を含む）」は、食物の移動および消化、栄養素の吸収、および廃棄物の排出を担う器官、腺、管、およびシステムに言及する。ヒトでは、消化管は胃腸（ＧＩ）管を含み、それは口から始まり、および肛門で終わり、さらに加えて食道、胃、小腸、および大腸を含む。消化管はまた、副器官および腺、たとえば、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓などのようなものを含む。上部胃腸管には、食道、胃および小腸の十二指腸が含まれる。下部胃腸管には、小腸の残りの部分、すなわち、空腸および回腸、および大腸のすべて、すなわち、盲腸、結腸、直腸、および肛門管が含まれる。細菌は、消化管、例は、胃腸管において、および特に腸において、その全体にわたって見出すことができる。
【００５０】
「微生物」は、一般的に単細胞からなる顕微鏡的、超顕微鏡的または極超微鏡的サイズの生物または微小生物を意味する。微生物の例は、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻類、酵母（例えばサッカロマイセス属）、および原虫を含む。いくらかの態様では、微生物は、１つ以上の治療分子、例えば、抗炎症性またはバリアエンハンサー分子を生成するように操作されている（「操作（された）微生物」である）。特定の態様では、操作された微生物は、操作細菌である。特定の実施形態では、操作された微生物は、操作されたウイルスである。
【００５１】
「非病原性細菌」は、宿主において疾患または有害な応答を引き起こすことが可能でない細菌に言及する。いくらかの実施態様では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくらかの実施体態様では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。いくらかの実施態様では、非病原性細菌はリポ多糖類（ＬＰＳ）を含有しない。いくらかの実施態様では、非病原性細菌は共生細菌である。非病原性細菌の例には、制限されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス属）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（バクテロイデス属）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ビフィドバクテリウム属）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ（ブレビバクテリウム属）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム属）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（エンテロコッカス属）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（ラクトバチルス属）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ（ラクトコッカス属）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス属）、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（スタフィロコッカス属）で、例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ（バチルス・コアグランス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・サブティリス）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（バクテロイデス・フラジリス）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バクテロイデス・サブティリス）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（バクテロイデス・テタイオタオミクロン）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ（ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・インファンティス）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（ビフィドバクテリウム・ロングム）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（クロストリジウム・ブチリカム）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ（エンテロコッカス・フェシウム）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ（エシェリキア・コリ・ニッスル）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ラクトバチルス・アシドフィラス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・ブルガリカス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・カゼイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ラクトバチルス・ジョンソニイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・パラカゼイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ラクトバチルス・プランタルム）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（ラクトバチルス・ロイテリー）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノーサス）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（ラクトコッカス・ラクティス）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ（サッカロミセス・ブラウディ）が含まれる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９；Ｄ���ｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４；米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。非病原性細菌は、消化管の常在微生物叢に存在する共生細菌も含む。一実施形態では、本開示は、非病原性サッカロマイセス属、例えば、サッカロマイセス・ブラウディをさらに含む。天然で病原性の細菌を遺伝子操作して、病原性を低下または消失させることができる。
【００５２】
「プロバイオティク」は、生きた、非病原性の微生物、例は、細菌に言及するために使用され、それは微生物の適量を含む宿主有機体に健康上の利益を与えることができる。いくらかの実施態様では、宿主有機体は哺乳動物である。いくらかの実施態様では、宿主有機体はヒトである。いくつかの実施形態では、プロバイオティク細菌は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、プロバイオティク細菌は、グラム陽性細菌である。非病原性細菌のいくつかの種、菌株および／またはサブタイプは、現在プロバイオティク細菌と認識されている。プロバイオティク細菌の例は、ビフィドバクテリウム属、大腸菌、乳酸桿菌属およびサッカロマイセス属に属する特定の菌株、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エンテロコッカス・ファシウム、大腸菌ニッスル株、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・ブルガリクス、ラクトバシラス・パラカゼイ、およびラクトバシラス・プランタルム、ならびにサッカロミセス・ブラウディを含むが、これらに限定されない（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４；  米国特許第５，５８９，１６８号；  米国特許第６，２０３，７９７号；  米国特許第６，８３５，３７６号）を含むが、これらに限定されない。プロバイオティクは、細菌の変形体または変異体株であってもよい（Ａｒｔｈｕｒ（アーサー）ら、２０１２；  Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓ（クエバス-ラモス）ら、２０１０；  Ｏｌｉｅｒ（オリエ）ら、２０１２；  Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ（ヌーガイリーデ）ら、２００６）。非病原性細菌は、望ましい生物学的特性、例は、生存性を増強または改善するために遺伝学的に操作されうる。非病原性細菌は、プロバイオティク特性を提供するように遺伝学的に操作されうる。プロバイオティク細菌は、プロバイオティク特性を増強または改善するために遺伝学的に操作されうる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「調整する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」およびその同議語は、標準的、平均的、野生型、またはベースライン測定値と比較して、分子的もしくは生理学的な読出し、結果もしくはプロセスを正または負に変更、制御または調節して、前記読出し、結果またはプロセスに変化をもたらすことを意味する。したがって、例えば、「調整する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「調整（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」には、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションが含まれる。読出し、結果、またはプロセスを調整する非限定的な例は、生体分子（例えば、タンパク質、酵素、サイトカイン、成長因子、ホルモン、代謝産物、短鎖脂肪酸、または他の化合物など）の正常もしくはベースライン機能、活性、発現、または分泌の変化または変更をもたらすことである。読出し、結果、またはプロセスを調節する別の非限定的な例は、目的の生体分子（例えば、血清中および／または腸管腔内に存在する）の量またはレベルの変化をもたらすことである。別の非限定的な例では、読出し、結果、またはプロセスを調節することは、表現型の変化または１つ以上の疾患症状の変化に関連する。したがって、「調整する」は、正常な機能、活性、または読出し、結果もしくはプロセスのレベル（例えば、目的の生体分子、および／または分子的もしくは生理学的なプロセス、および／または１つ以上の疾患症状における表現型の変化）の増加、減少、マスキング、変更、上書き、または回復を意味するために用いられる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「栄養要求体」または「栄養要求性の」という用語は、その成長を支持するために特定の因子（例えば、アミノ酸、糖または他の栄養素）を必要とする生物を意味する。「栄養要求性の改変」は、外から加えられる生存または成長に必須の栄養素の非存在下で生物が前記栄養素を生成できないため死滅する原因となる、遺伝子改変である。本明細書で使用する場合、「必須遺伝子」という用語は、細胞の増殖および／または生存に欠くことのできない遺伝子を意味する。必須遺伝子は、より詳細に下で説明するものであり、ＤＮＡ合成遺伝子（例えば、ｔｈｙＡ）、細胞壁合成遺伝子（例えば、ｄａｐＡ）、およびアミノ酸遺伝子（例えば、ｓｅｒＡおよびｍｅｔＡ）を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用する場合、疾患を「調整する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」および「処置する（ｔｒｅａｔ）」という用語ならびにそれらの同語源語は、疾患、障害および／もしくは状態、またはその少なくとも１つの認識できる症状の改善を意味する。他の実施形態では、「調整する」および「処置する」は、ペイシェントによって必ずしも認識できない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を意味する。他の実施形態では、「調整する」および「処置する」は、疾患、障害および／または状態の進行を、物理的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）または両方により、抑制することを意味する。他の実施形態では、「調整する」および「処置する」は、疾患、障害および／または状態の進行を遅くすることまたは進行を逆転することを意味する。本明細書で使用する場合、「妨げる」およびその同語源語は、所定の疾患、障害および／または状態あるいはそのような疾患、障害および／または状態に関連する症状の発生を遅延させることまたはかかるリスクを低下させることを意味する。
【００５６】
処置を必要とするものには、既に特定の医学的障害を有する個体、ならびにその疾患を有する危険性のあるもの、または最終的にはその障害を獲得する可能性のあるものが含まれうる。処置の必要性は、たとえば、障害の発症、障害の存在または進行、または障害を有する対象の処置への受容性に関連する一以上の危険因子の存在によって評価される。消化管炎症および／または消化管バリア機能の低下に関連する自己免疫障害および／または疾患および状態を処置することには、過剰な炎症および／または関連する症状を軽減または排除することを含み、必ずしも根底にある疾患の排除を包含するとは限らない。
【００５７】
本明細書に記載の疾患を処置することは、ブチラートのレベルを増加させること、アセタートのレベルを増加させること、ブチラートのレベルを上昇させること、およびＧＬＰ−２、ＩＬ−２２および／またはｒＩＬ−１０を増加させること、および／またはトリプトファンおよび／またはトリプトファン代謝産物のレベルを調節すること、および／または任意の他の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を提供することを含み得るが、根底にある疾患を排除することは必ずしも含まない。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「製薬上組成物」は本開示の遺伝子操作された微生物、例えば、生理学的に適切な担体および／または賦形剤などの他の成分と、遺伝学的に操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスの調製物を指す。
【００５９】
交換可能に使用されうる語句「生理学的に許容可能な担体」および「薬学的に許容可能な担体」は、有機体に著しい刺激を引き起こさず、および施与される細菌性またはウイルス性化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤に言及する。アジュバントはこれらの語句の下に含まれる。
【００６０】
用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例としては、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウムリン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
用語「治療上有効な用量」および「治療上有効な量」は、症状の発症の予防、遅延、または状態の症状、例は、炎症、下痢、自己免疫障害の改善を生じる化合物の量に言及するために使用される。治療的に有効な量は、たとえば、重症度を処置、防止、低減し、発症を遅延し、および／または自己免疫障害および／または消化管炎症および／または消化管バリア機能の低下に関連する疾患または状態の一以上の症状の発生のリスクを軽減するために十分でありうる。治療上有効な量、ならびに治療上有効な施与の頻度は、当該技術で知られ、および以下に議論される方法によって定めることができる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「静菌性」または「細胞増殖抑制性」という用語は、本開示の組み換え細菌細胞の成長、分裂、増殖または複製を停止、遅延または阻害することができる、分子またはタンパク質を意味する。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「殺菌性」は、本開示の組換え細菌細胞を死滅させることができる分子またはタンパク質をいう。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「毒素」という用語は、本開示の操作細菌の成長、分裂、増殖または複製を停止、遅延もしくは阻害することができる、または本開示の操作細菌細胞を殺滅することができる、タンパク質、酵素、もしくはそのポリペプチド断片、または他の分子を指す。「毒素」という用語は、静菌性タンパク質および殺菌性タンパク質を含むことを意図するものである。「毒素」という用語は、これらに限定されないが、溶解性タンパク質、バクテリオシン（例えば、ミクロシンおよびコリシン）、ジャイレース阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、転写阻害剤、翻訳阻害剤、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼを含むことを意図するものである。「抗毒素（ａｎｔｉ−ｔｏｘｉｎ）」または「抗毒素（ａｎｔｉｔｏｘｉｎ）」という用語は、本明細書で使用する場合、毒素の活性を阻害することができる、タンパク質または酵素を意味する。抗毒素という用語は、これらに限定されないが、免疫モジュレーター、および毒素発現の阻害剤を含むことを意図するものである。毒素および抗毒素の例は当該技術分野で公知であり、より詳細に下で説明する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「ペイロード」は、細菌またはウイルスなどの遺伝子操作された微生物により生成される、目的の１つ以上の分子を意味する。いくつかの実施形態では、ペイロードは治療用ペイロード、例えば、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子（例えばブチラート、アセタート、プロピオナート、ＧＬＰ−２，ＩＬ−１０，ＩＬ−２２，ＩＬ−２，他のインターロイキン、および／またはトリプトファンおよび／または１つ以上のその代謝産物）である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、調節分子、例えば、ＦＮＲのような転写調節因子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、プロモーターまたはリプレッサーのような、調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＦＮＲＳのような、誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、キルスイッチのような、リプレッサーエレメントを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つ以上の抗生物質耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つの遺伝子、複数の遺伝子、遺伝子カセット、またはオペロンによりコードされる。代わりの実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路により生成されるものであって、前記生合成または生化学的経路は、任意選択で微生物に対して内因性であってもよい。代わりの実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路により生成されるものであって、前記生合成または生化学的経路は、微生物に対して内因性でない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物は、２つ以上のペイロードを含む。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「従来の処置」または「従来の治療」という用語は、現在受け入れられている現行のケア標準と見なされる、および／またはＢＣＡＡに関連する疾患または障害の処置に携わる大部分の医療従事者が用いる処置または治療を意味し、広く用いられていない代替治療または補完治療とは異なる。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド」ならびに「（複数の）ポリペプチド」を含み、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）により直線状に連結したアミノ酸単量体から構成される分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸の１つ以上の鎖を意味し、特定の長さの生成物を意味しない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の１つもしくは複数の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはそれらと同義で用いることができる。「ポリペプチド」という用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断または非天然アミノ酸による修飾を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の生成物も指すものとする。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得ることができ、または組換え技術により生成することができる。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝学的に操作された細菌またはウイルスにより産生される。本発明のポリペプチドは、約３もしくはそれ以上、５もしくはそれ以上、１０もしくはそれ以上、２０もしくはそれ以上、２５もしくはそれ以上、５０もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、１００もしくはそれ以上、２００もしくはそれ以上、５００もしくはそれ以上、１０００もしくはそれ以上、または２０００もしくはそれ以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、必ずしもそのような構造を有さないが、一定の３次元構造を有し得る。一定の３次元構造を有するポリペプチドは、折れ畳まれていると呼ばれ、一定の３次元構造を有さず多数の異なるコンホメーションをとり得るポリペプチドは、アンフォールドしていると呼ばれる。「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、タンパク質もしくはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を意味し、または非タンパク質配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列および他のペプチド配列から選択される配列と一致するアミノ酸配列を意味し得る。
【００６８】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、その天然環境中に存在しないポリペプチドを意味する。特定のレベルの精製は、要求されない。細菌または哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない宿主細胞において発現した組換えにより生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術により分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたと見なされる。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生成された、すなわち、ポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物により形質転換した、細胞、微生物または哺乳動物から生成されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。大部分の細菌培養において発現するタンパク質またはペプチドは、一般的にグリカンを含まない。前述のポリペプチドの断片、誘導体、アナログまたは変異体、およびそれらのいずれかの組合せもポリペプチドとして含まれる。「断片」、「変異体」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、最初のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する最初のポリペプチドの少なくとも１つ以上の特性を保持している、任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、タンパク質分解性断片ならびに欠失断片を含む。断片は、本明細書に記載の任意のポリペプチドに由来する特異抗体または生物活性断片もしくは免疫学的に活性な断片も含む。変異体は、天然型または非天然型であり得る。非天然型変異体は、当該技術分野で公知の突然変異誘発法を用いて生成することができる。変異型ポリペプチドは、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
【００６９】
ポリペプチドは、融合タンパク質も含む。本明細書で使用する場合、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、最初のペプチド配列または最初のペプチドと十分に類似した配列を含む、融合タンパク質を含む。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」という用語は、２つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を意味する。一般的に、融合タンパク質は、周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術により得られる。融合タンパク質は、融合タンパク質の成分である個別の最初のタンパク質と類似の構造的機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／または類似の調節機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／または類似の生化学的機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／または免疫学的活性（ただし必ずしも同じ程度でない）を有し得る。「誘導体」は、２０種の標準アミノ酸の１つ以上の天然アミノ酸誘導体を含む、ペプチドを含むが、これに限定されない。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。それが同一または同類アミノ酸置換である場合、１つのペプチドのアミノ酸は、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ  Ｍ．Ｏ．編、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．（１９７８年）およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９年）、７７９〜７８５頁に記載されているものを含む。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換を示す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００７０】
抗体は、一般に、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、または対応する抗原に非共有結合的に、可逆的に、および特異的に結合することができる免疫グロブリンのフラグメントを含むポリペプチドを指す。例示的な抗体の構造単位には四量体が含まれる。それぞれの四量体はポリペプチド鎖の２つの同一組からなり、各組はジスルフィド結合によって連結された１つの「軽」（約２５ｋＤ）鎖および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。認知されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの免疫グロブリンのクラスを規定する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、軽鎖および重鎖のこれらの領域を指す。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」または「抗体（複数）」は、１つ以上の特定の結合特異性を有する抗体およびその断片のすべてのバリエーションを包含することを意味する。したがって、「抗体」または「抗体（複数）」という用語には、全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ、ラクダ科動物）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、これらのフラグメントの多量体型（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ、ＶＨＨ断片）、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）が含まれる。抗体は、２つ以上の結合特異性、例えば二重特異性を有することができる。用語「抗体」はまた、いわゆる抗体模倣物を含むことを意味する。抗体模倣物は低分子、例えば３〜３０ｋＤａで、抗原に特異的に結合することができるが、抗体関連構造を有さない、１つのアミノ酸鎖分子を指す。抗体模倣物には、アフィボディ分子（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、プロテインＡのＺドメイン）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ、γＢ−クリスタリン）、ユビキチン、アフィマー（Ａｆｆｉｍｅｒｓ、シスタチン）、アフィチン（Ａｆｆｉｔｉｎｓ、Ｓａｃ７ｄ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来））、アルファボディ（三重らせんコイルルドコイル）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、リポカリン）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ、種々の膜受容体のドメイン）、ＤＡＲＰｉｎｓ（アンキリンリピートモチーフ）、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ、ＦｙｎのＳＨ３ドメイン）、クニッツドメインペプチド（種々のプロテアーゼ阻害剤のクニッツドメイン）、エカランタイド（Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ、Ｋａｌｂｉｔｏｒ）、およびモノボディが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、用語「抗体」または「抗体（複数）」は、一本鎖抗体（複数可）、単一ドメイン抗体（複数可）、およびラクダ抗体（複数可）を意味する。癌の処置における抗体の有用性および追加の抗癌抗体（複数可）については、例えばＳｃｏｔｔら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２年４月第１２巻（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【００７２】
「一本鎖抗体」または「一本鎖抗体（複数）」は、典型的には、免疫グロブリンの重鎖、免疫グロブリンの軽鎖、および必要に応じてジスルフィド結合などのリンカーまたは結合を含むペプチドを指す。一本鎖抗体は、従来の抗体に見られる定常的なＦｃ領域を欠いている。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体は天然に存在する一本鎖抗体、例えばラクダ抗体である。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体は、合成、改変、または修飾された一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体は、リンカーの付加および定常領域の除去にもかかわらず、元の免疫グロブリンと比較して実質的に同じ抗原特異性を保持することができる。いくつかの態様では、一本鎖抗体は、「ｓｃＦｖ抗体」、すなわち、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域を、１０〜約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドで繋いだ（一切の定常領域を有さない）融合タンパク質を意味する。前記のｓｃＦｖ抗体については、例えば、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｆｖフラグメントは、抗体の結合部位を保持する最小のフラグメントであり、当該結合部位は、いくつかの態様では、元の抗体の特異性を維持しうる。一本鎖抗体の製造技術は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。ｓｃＦｖのＶｈおよびＶＬ配列は、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に繋げるか、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に繋げることによって、連結することができる。ＳｃＦｖフラグメントは、いずれかの末端で他のエピトープタグまたはタンパク質ドメインに区別できない形で融合可能な、独立した折れたたみ構造単位である。ＶｈおよびＶＬ配列を連結するのに、様々な長さのリンカーを用いることができ、当該リンカーはグリシンリッチ（柔軟性を与える）ならびにセリンもしくはスレオニンリッチ（溶解度を向上させる）であり得る。リンカーが短いと、２つのドメイン間の結合が妨げられ、多量体（ダイアボディ、トリボディなど）が形成されうる。リンカーが長いと、タンパク質分解を受け、またはドメイン間の結合が弱くなる可能性がある（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２０１１に記載）。１５〜２０アミノ酸または１８〜２０アミノ酸の長さのリンカーが最も頻繁に使用される。他の柔軟なリンカーを含むリンカーのさらなる非限定的な例は、Ｃｈｅｎら、２０１３年（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７−１３６９、「Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ」に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。柔軟なリンカーはまた、グリシンおよびセリンのような小型または極性アミノ酸に富むが、柔軟性を維持するためにスレオニンおよびアラニンのような追加のアミノ酸、ならびに溶解性を維持するためにリジンおよびグルタミン酸のような極性アミノ酸を含み得る。例示的なリンカーには、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２８４）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２８５）ならびにＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列���号２８６）、（Ｇｌｙ）８（配列番号２８７）、ならびにＧｌｙおよびＳｅｒリッチで柔軟なリンカーＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号２８８）が含まれるが、これらに限定されない。本発明で用いられる「一本鎖抗体」には、また単一ドメイン抗体が含まれる。当該単一ドメイン抗体には、ヒト、マウスもしくは他の種に由来するナノボディおよび単一ドメインＶＨもしくはＶＬドメインを含むラクダ抗体および他の重鎖抗体、軽鎖抗体が含まれる。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。単一ドメイン抗体には、ラクダ、ラマまたはアルパカ由来のラクダ科抗体を足場とするドメイン抗原結合単位が含まれる。ラクダ科動物は、軽鎖がない機能性抗体を生成する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自発的に折り畳まれ、抗原結合単位として独立して機能する。従来からの抗原結合分子（Ｆａｂ）または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＣＤＲが６つなのに対して、ＶＨドメインの結合表面はＣＤＲを３つだけ含む。ラクダ科動物抗体は、従来の抗体と同等の結合親和性を獲得することができる。ラクダ科抗体を足場とする抗体は、当該技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。軟骨魚類もまた重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新抗原受容体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」）を有し、ＩｇＮＡＲからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることが可能である。あるいは、ヒトまたはマウス由来のＩｇＧ二量体可変ドメインを、単量体に分割することも可能である。ナノボディは、軽鎖由来の一本鎖抗体である。「一本鎖抗体」という用語はまた、抗体模倣物を指す。
【００７３】
いくつかの実施形態では、操作された微生物が発現する抗体は二重特異性である。一定の実施形態では、二重特異性抗体分子はｓｃＦｖまたはその断片を含み、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、およびｓｃＦｖまたはその断片は第２のエピトープに対する結合特異性を有する。抗原結合断片または抗体部分には、二価ｓｃＦｖ（ダイアボディ）、抗体分子が２つの異なるエピトープを認識する二重特異性ｓｃＦｖ抗体、単一結合ドメイン（ｄＡｂ）およびミニボディが含まれる。単量体一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、細菌および哺乳動物細胞内で容易に構築され、生理学的条件下で改善された安定性を示す（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２００１年およびその参考文献；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（２００１）１４（１０）：８１５−８２３（単量体および二量体の二重特異性一本鎖ダイアボディの発現のための最適化されたリンカー配列について記載））。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「十分に類似している」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第２のアミノ酸配列と比べて十分なまたは最小限の数の同一または同等のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書で十分に類似していると定義される。好ましくは、変異体は、本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似している。そのような変異体は、一般的に本発明のペプチドの機能活性を保持している。変異体は、１つ以上のアミノ酸欠失、付加および／または置換により、それぞれ天然および野生型ペプチドとアミノ酸配列が異なるペプチドを含む。これらは、天然に存在する変異体ならびに人工的に設計されたものであり得る。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を結合または連結する、例えば、２つのポリペプチドドメインを連結する合成または非天然もしくは非天然型アミノ酸配列を意味する。本明細書で使用する場合、「合成」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列を意味する。例示的リンカーは、本明細書に記載されている。さらなる例示的リンカーは、その内容がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４００７９７０１号に記載されている。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「コドン最適化」という用語は、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変であって、前記核酸分子によりコードされたポリペプチドを変更することなく、宿主生物の一般的なコドン使用を反映するような改変を意味する。そのような最適化は、コドンの少なくとも１つ以上、または有意な数を、宿主生物の遺伝子においてより高頻度に使用されている１つ以上のコドンで置換することを含む。「コドン最適化配列」は、例えば、コード配列から転写された転写物ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するために、またはコード配列の転写を改善するために、既存のコード配列から改変された、または設計された配列を意味する。コドン最適化は、発現宿主生物のコドン選択に適合するコード配列のコドンを選択することを含む過程を含むが、これに限定されない。多くの生物は、伸長中のポリペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンの使用についてバイアスまたは選択を示す。コドン選択またはコドンバイアスは、生物間のコドン使用の差であり、遺伝コードの縮重によって可能になるものであり、多くの生物で十分に立証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率としばしば相関しており、これがひいては、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞における選択されるｔＲＮＡｓが優位であることは、一般的にペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンを反映するものである。したがって、コドン最適化に基づいて所定の生物における最適の遺伝子発現を得るために遺伝子を調整することができる。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「分泌システム」または「分泌タンパク質」という用語は、微生物の細胞質、例えば、細菌の細胞質から、生体分子、例えば、ポリペプチドを分泌または排出輸送することができる天然または非天然分泌機構を意味する。分泌システムは、単一タンパク質を含み、または複合体、例えば、ＨｌｙＢＤに集合する２つ以上のタンパク質を含み得る。グラム陰性細菌の分泌システムの非限定的な例は、改変型タイプＩＩＩ鞭毛、Ｉ型（例えば、ヘモリシン分泌システム）、タイプＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、タイプＶＩおよびタイプＶＩＩ分泌システム、レジスタンス−ノジュレーション−ディビジョン（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、様々な単一膜分泌システムを含む。グラム陽性細菌の分泌システムの非限定的な例は、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌システムを含む。いくつかの実施形態では、分泌されるポリペプチドは、特定の分泌システムにそのポリペプチドを導くための、ＲＮＡまたはペプチド起源の「分泌タグ」を含む。いくつかの実施形態では、分泌システムは、操作細菌からポリペプチドを分泌する前にこのタグを除去することができる。例えば、Ｖ型自己分泌媒介性分泌では、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然Ｓｅｃシステムにより「パッセンジャー」ペプチドの細胞質からペリプラズムコンパートメント内への転位時に除去される。さらに、自己分泌体が外膜を越えて転位すると、Ｃ末端分泌タグが自己触媒性切断またはプロテアーゼ触媒型切断、例えばＯｍｐＴ切断、によって除去され、それにより抗炎症性またはバリアエンハンサー分子（複数可）を細胞外環境中に放出することができる。いくつかの実施形態では、分泌システムは、「漏出性」または不安定な外膜の生成を伴い、これは、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌを含む、外膜を強固なペプチドグリカン骨格につなぎ留めることに関与する遺伝子を欠失または突然変異させることによって達成することができる。Ｌｐｐは、ペプチドグリカンへの細菌細胞壁の主要な「ステープル」として機能する。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を得るための他の欠失標的である。さらに、漏出性表現型は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐｌなどの、ペリプラズムプロテアーゼが不活性化した場合に認められた。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、例えばｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される、１つ以上の欠失または突然変異膜遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、例えばｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される、１つもしくは複数の欠失または突然変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される、１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子を有する。
【００７８】
ここに使用されるように、冠詞「ａ（ある一つの）」および「ａｎ（母音の前の不定冠詞）」は、反対のことが明確に示されていない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解すべきである。
【００７９】
語句「および／または」は、リスト内の要素間で使用されるとき、次のいずれかを意味することを意図し、（１）単一のリストされた要素だけが存在すること、または（２）リストの一よりも多くの要素が存在することである。たとえば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、その選定は、Ａ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、Ｂ、およびＣでありうることを示す。語句「および／または」は、リストの要素の「少なくとも一つ」または「一またはそれよりも多く（一以上とも言う）」と交換可能に使用されてもよい。
【００８０】
本明細書において提供する範囲は、範囲内の値の全てについての省略表現であると解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと解される。
細菌
【００８１】
遺伝子操作された微生物またはプログラムされた微生物、例えば本開示の遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上の非天然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成することができる。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、偏性嫌気性細菌である。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、通性嫌気性細菌である。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、好気性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、グラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、グラム陽性細菌であり、ＬＰＳを欠く。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、グラム陽性かつ偏性嫌気性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、グラム陽性かつ通性嫌気性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、共生細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、プロバイオティク細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、病原性を低下または消失させるように改変または突然変異されている、天然では病原性の細菌である。例示的な細菌は、バシラス属、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属、腸球菌属、大腸菌、乳酸桿菌属、乳酸球菌属、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サッカロマイセス属、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、バシラス・コアグランス、枯草菌、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ズブチリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）ＵＣ２００３、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・ブチリカムＭ−５５、クロストリジウム・コクレアリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ）、クロストリジウム・フェルシネウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ）、クロストリジウム・ヒストリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）、多発酵性クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ）−ＮＴ、クロストリジウム・パラピュトリフィカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パステリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ）、クロストリジウム・ペクチノボルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ロゼウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・テルチウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｒｔｉｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、大腸菌ＭＧ１６５５、大腸菌ニッスル１９１７、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ブタコレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、エンテロコッカス・ファシウム、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・ブルガリクス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトコッカス・ラクティス、およびサッカロミセス・ブラウディからなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ズブチリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌、大腸菌ニッスル、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリ、およびラクトコッカス・ラクティス細菌細胞から選択される。
【００８２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、自然に高レベルのブチラートを生成することができるグラム陽性菌、例は、クロストリジウム属である。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ブチリカム）ＺＪＵＣＢ、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  Ｓ２１、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（サーモブチリカム）ＡＴＣＣ  ４９８７５、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ（ベイジェリンキイ）、Ｃ．ｐｏｐｕｌｅｔｉ（ポプレティ）ＡＴＣＣ  ３５２９５、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（チロブチリカム）ＪＭ１、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＣＩＰ  １−７７６、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５７５５、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＣＮＲＺ  ５９６、およびＣ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＺＩＵ  ８２３５からなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＣＢＭ５８８、タンパク質分泌に非常に敏感なプロバイオティク細菌であり、およびＩＢＤの処置において立証された有効性を有する（Ｋａｎａｉ（カナイ）ら、２０１５）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子的に非常に扱いやすく、および工業的タンパク質生産のための一般的なシャーシ（胴体とも言う）であったＳａｃｉｌｌｕｓ（バチルス属）、プロバイティク細菌である。いくらかの実施態様では、細菌は高度に活性な分泌および／または毒性副生成物を有さない（Ｃｕｔｔｉｎｇ（カッティング）、２０１１）。
【００８３】
一実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・フラジリス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・シータイオタオミクロン細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、バクテロイデス・ズブチリス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・インファンティス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ラクティス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、クロストリジウム・ブチリカム細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、大腸菌細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトバシラス・アシドフィラス細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトバシラス・プランタルム細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトバシラス・ロイテリ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、ラクトコッカス・ラクティス細菌細胞である。
【００８４】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、最も特徴付けられたプロバイオティクの一つに進化したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）、腸内細菌科ファミリーのグラム陰性菌である（Ｕｋｅｎａ（ウケナ）ら、２００７）。その菌株は完全無害で特徴付けられ（Ｓｃｈｕｌｔｚ（シュルツ）、２００８）、およびＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ、一般に安全と認められている）状態を有する（Ｒｅｉｓｔｅｒ（レイスター）ら、２０１４、強調が加えられる）。ゲノムシーケンシングにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅは顕著なビルレンス（病原性とも言う）因子（例は、Ｅ．ｃｏｌｉα−溶血素、Ｐ−線毛アドヘシン（付着因子とも言う））を欠くことが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅは病原性接着因子を保有せず、エンテロトキシン（腸毒素とも言う）または細胞毒を生成せず、侵襲性でなく、および泌尿器病原性でもないことが示されている。（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９）。１９１７年の早くにも、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅは、治療用途のために、薬用カプセルにパッケージングされ、Ｍｕｔａｆｌｏｒ（ムータフロル）と呼ばれた。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅは、以来、インビボでヒトの潰瘍性大腸炎を処置するために（Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ（レムバッケン）ら、１９９９）、インビボでヒトの炎症性腸疾患、クローン病、および嚢炎（回腸嚢炎とも言う）を処置するために（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８）、腸管組織侵入性のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（レジオネラ属）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（エルシニア属）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ（シゲラ属）をインビボで抑制するために使用された（Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒ（アルテンホーファー）ら、２００４）。Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅの治療上の効果および安全性が納得がいくように証明されていることは一般に認められている（Ｕｋｅｎａら、２００７）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅであり、自然にタイトジャンクション（密着結合とも言う）および消化管バリア機能を促進することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＥ．ｃｏｌｉであり、および組換えタンパク質技術に非常に適している。
【００８５】
当業者は、ここに開示される遺伝学的修飾が細菌の他の種、菌株、およびサブタイプに適合しうることを理解するであろう。たとえば、クロストリジウムのブチロジーニック経路遺伝子が、ゲノム配列のクロストリジウムおよび関連する種に広く存在することは知られている（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３）。さらに、一以上の異なる種の細菌由来の遺伝子を互いに導入することができ、例は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ペプトクロストリジウム・ディフィシル）由来のブチロジーニック遺伝子がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現された（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３）。
【００８６】
一実施態様では、組換え細菌細胞は、障害を有する対象に定着しない。非修飾Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅおよび本発明の遺伝学的に操作された細菌は、例は、消化管または血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９）、またはキルスイッチの活性化によって、施与後数時間または数日で破壊されうる。そのようにして、遺伝学的に操作された細菌は、継続的な施与を必要とすることがある。インビボでの滞留時間は、遺伝学的に操作された細菌について算出されうる。いくらかの実施態様において、滞留時間はヒト対象について算出される。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載のように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間を本発明の遺伝学的に操作された細菌について計算する。
【００８７】
いくつかの実施態様において、細菌細胞は、遺伝子操作された細菌細胞である。別の実施態様では、細菌細胞は組換え細菌細胞である。いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に開示される細菌細胞のコロニーを含む。
【００８８】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示された細菌細胞を含む組換え細菌培養物を提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子を含む遺伝学的に操作された細菌は、キルスイッチ回路、例えば、本明細書で示すキルスイッチ回路のいずれかをさらに有する。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の遺伝子と、逆方向毒素配列とをさらに有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、抗毒素をコードする１つ以上の遺伝子をさらに有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の遺伝子と、１つ以上の逆方向切除遺伝子とをさらに含み、前記切除遺伝子（複数可）は、必須遺伝子を欠失させる酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、抗毒素をコードする１つ以上の遺伝子をさらに有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ＴｅｔＲリプレッサー結合部位を有するプロモーターの制御下の毒素をコードする１つ以上の遺伝子と、ＰａｒａＢＡＤのような、アラビノースにより誘導される誘導性プロモーターの制御下のＴｅｔＲをコードする遺伝子とをさらに有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、抗毒素をコードする１つ以上の遺伝子をさらに有する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子配列を有する栄養要求体であり、キルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載のキルスイッチ回路のいずれかをさらに有する。
【００９１】
上記遺伝学的に操作された細菌のいくつかの実施形態では、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子は、細菌におけるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子配列は、細菌染色体内に存在する。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質または分泌タンパク質複合体、例えば、本明細書で開示する生体分子（例えば、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子）を分泌するための分泌システムのいずれかをコードする遺伝子配列は、細菌中のプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、生体分子を分泌するための分泌タンパク質または分泌タンパク質複合体、例えば、本明細書で開示する分泌システムのいずれかをコードする遺伝子配列は、細菌染色体内に存在する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌中のプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌染色体内に存在する。
抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子
【００９２】
遺伝学的に操作された細菌は、非自然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための一以上の遺伝子配列（群）および／または遺伝子カセット（群）を含む。いくらかの実施態様では、遺伝子的に操作された細菌は、非自然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するために一以上の遺伝子配列（群）を含む。たとえば、遺伝子的に操作された細菌は、非自然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための二以上の遺伝子配列（群）を含みうる。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子配列は、同じ遺伝子の複数のコピーである。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子配列は異なる遺伝子をコードする配列である。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子配列は一以上の異なる遺伝子の複数のコピーをコードする配列である。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、非自然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための一以上の遺伝子カセット（群）を含む。たとえば、遺伝学的操作細菌は、非自然抗炎症性および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための二以上の遺伝子カセットを含むことができる。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子カセットは同じ遺伝子カセットの複数のコピーである。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子カセットは同じか、または異なる抗炎症性および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）のいずれかをも生成するための異なる遺伝子カセットである。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子カセットは、一以上の異なる抗炎症性および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）の複数のコピーを生成するための遺伝子カセットである。いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子は、短鎖脂肪酸、ブチラート、プロピオナート、アセタート、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１、ＩＬ−１０（ヒトまたはウイルス性）、  ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥｓ）、エラフィン（ペプチダーゼインヒビター３またはＳＫＡＬＰとしても知られる）、トレフォイル因子、メラトニン、ＰＧＤ２、キヌレン酸、キヌレニン、トリプトファン代謝産物、インドール、インドール代謝産物、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、および／またはケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ−８およびＣＣＬ２）を中和する一本鎖可変抗体（ｓｃＦＶ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、ＡＨＲアゴニスト（例えば、インドール酢酸、インドール−３−アルデヒドおよびインドール）、ＰＸＲアゴニスト（例えば、ＩＰＡ）、ＨＤＡＣの阻害因子（例えば、ブチラート）、ＧＰＲ４１および／またはＧＰＲ４３の活性化因子（例えば、ブチラートおよび／またはプロピオナートおよび／またはアセタート）、ＧＰＲ１０９Ａの活性化因子（例えば、ブチラート）、ＮＦ−κＢシグナル伝達の阻害因子（例えば、ブチラート）、ＰＰＡＲγの調節因子（例えば、ブチラート）、ＡＭＰＫシグナル伝達の活性化因子（例えば、アセタ��ト）、ＧＬＰ−１分泌の調節因子、ならびにヒドロキシルラジカル捕捉剤および酸化防止剤（例えば、ＩＰＡ）からなる群から選択される。分子は、主として抗炎症性、例えば、ＩＬ−１０、または主に消化管バリア機能増強性、例えば、ＧＬＰ−２でありうる。あるいは、分子は抗炎症性および消化管バリア機能エンハンサー性の双方であることができる。
【００９３】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、単一の遺伝子によってコードされる一以上の抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を発現し、例は、分子がエラフィンであり、およびＰＩ３遺伝子であるか、または分子はインターロイキン−１０であり、ＩＬ１０遺伝子によってコードされる。代わりの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、複数の遺伝子を必要とする生合成経路によって合成される、一以上の抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）、例は、ブチラートをコードする。
【００９４】
１つ以上の遺伝子配列および／または遺伝子カセットは、高コピープラスミド、低コピープラスミド、または染色体上で発現し得る。いくつかの実施形態では、プラスミドからの発現は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子の発現を増加させるうえで、有用であり得る。いくつかの実施形態では、染色体からの発現は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子の発現安定性を高めるうえで、有用であり得る。いくつかの実施形態では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（複数可）を生成するための遺伝子配列または遺伝子カセットは、遺伝学的に操作された細菌の１つ以上の組み込み部位で細菌染色体に組み込まれる。例えば、ブチラート生合成遺伝子カセットの１つ以上のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための遺伝子配列または遺伝子カセットは、遺伝学的に操作された細菌内のプラスミドから発現する。いくつかの実施形態では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための遺伝子配列または遺伝子カセットは、大腸菌ニッスルにおける以下の挿入部位の１つ以上で細菌ゲノム中に挿入される：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ。任意の適切な挿入部位を使用することができる（例は、模範的挿入部位について図５１を参照）。挿入部位は、例は、生存および／または生存に必要な遺伝子、たとえば、ｔｈｙＡのようなものにおいて（栄養要求体を作り出すために）；ゲノムの活性領域、たとえば、ゲノム複製の部位の近くなどにおいて；および／または意図しない転写のリスクを低減するために、ダイバージェント（分岐や発散などとも言う）プロモーターの間、たとえば、アラビノースオペロンのＡｒａＢおよびＡｒａＣの間などのようなものにおいて、ゲノム中のどこにあってもよい。
短鎖脂肪酸およびトリプトファン代謝産物
【００９５】
炎症性腸疾患の処置、予防および／または管理における１つの戦略は、消化管バリア機能の維持および／または再確立を助けるためのアプローチを含み得る。当該アプローチの例としては、増大した透過性の根底にある炎症事象の予防、処置および／または管理、抗炎症性エフェクターの投与が挙げられる。
【００９６】
例えば、消化管の保護的役割を果たす主要な代謝産物は、短鎖脂肪酸、例えば、アセタート、ブチラートおよびプロピオナート、ならびにトリプトファン代謝に由来するものが挙げられる。これらの代謝産物は、炎症性疾患の予防において主要な役割を果たすことが示されている。したがって、消化管バリアの健康状態の処置、予防、および／または管理における１つのアプローチは、前記のような代謝産物の１つ以上を含む処置を提供することであり得る。
【００９７】
例えば、ブチラートおよび他のＳＣＦＡ、例えば微生物叢に由来するものは、腸の健全性維持を促進することが知られている（例えば、Ｔｈｏｒｂｕｒｎらのレビュー、Ｄｉｅｔ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  “Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ”  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第４０巻、第６号、２０１４年６月１９日、８３３−８４２頁）。（Ａ）おそらくＧＰＣＲを感知する代謝産物を介したシグナル伝達による、ＳＣＦＡ誘導による消化管上皮細胞による粘液分泌の促進；（Ｂ）ＳＣＦＡ誘導によるＢ細胞のＩｇＡ分泌；（Ｃ）ＳＣＦＡ誘導による組織修復および創傷治癒の促進；（Ｄ）免疫寛容をおそらく容易にする過程における、ＳＣＦＡ誘導による消化管内Ｔｒｅｇ細胞（制御性Ｔ細胞）の分化促進；（Ｅ）インフラマーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）活性化（例えば、ＮＡＬＰ３を介した）およびＩＬ−１８産生に依存する過程における、ＳＣＦＡによって媒介される上皮の健全性増強；（Ｆ）抗炎症性効果、炎症性サイトカイン生成（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−６、およびＩＦＮ−ガンマ）の阻害、およびＮＦ−κＢの阻害。消化管の恒常性におけるＳＣＦＡのこれらの作用の多くは、結腸上皮、炎症性白血球（例えば、好中球およびマルコファージ）およびＴｒｅｇ細胞が発現するＧＰＲ４３およびＧＰＲ１０９Ａに帰することができる。これらの受容体は、ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲに共役したＧタンパク質、ならびにＮＦκＢ阻害をもたらす別個のアレスチン経路を介してシグナル伝達する。他の効果は、ＳＣＦＡが媒介するＨＤＡＣ阻害に帰することができ、例えば、ブチラートはマクロファージ機能を調節し、ＴＲｅｇ細胞を促進し得る。
【００９８】
さらに、キヌレニンおよびキヌレン酸を含む多くのトリプトファン代謝産物ならびにインドール−３アルデヒド、インドール−３−プロピオン酸および以下に記載のいくつかの他のインドール代謝産物（微生物叢または食物に由来しうる）などのいくつかのインドールは、消化管の恒常性に必須であり、消化管バリアの健康状態を促進することが示されている。これらの代謝産物はアリール炭化水素受容体（Ａｈｒ）に結合する。アゴニストの結合後、ＡｈＲは核に移動し、ＡｈＲ核トランスロケーター（ＡＲＮＴ）とヘテロ二量体を形成する。ＡｈＲ依存性遺伝子発現には、消化管の恒常性にとって重要なメディエーターの生成に関与する遺伝子が含まれる；これらのメディエーターには、ＩＬ−２２、抗菌性因子、Ｔｈ１７細胞活性の増加、ならびに上皮内リンパ球およびＲＯＲγｔ＋先天性リンパ系細胞の維持が含まれる。
【００９９】
トリプトファンはまた、アンギオテンシンＩ変換酵素２（Ａｃｅ２）を含む輸送マシーナリーによって、上皮を越えて輸送され得る。トリプトファンは、Ｔ細胞応答の抑制、Ｔｒｅｇ細胞の促進、および免疫寛容に関連する免疫調節酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によって、別のＡｈＲアゴニストであるキヌレニンに分解される。さらに、キヌレン酸およびナイアシンを含む多くのトリプトファン代謝産物は、ＧＰＲ３５およびＧＰＲ１０９Ａなどの代謝産物感知性ＧＰＣＲを刺激するので、トリプトファン異化の複数要素が消化管の恒常性を促進する。
【０１００】
さらに、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）は、消化管バリア機能の必須調節因子として重要な役割を果たすと考えられているが、インドール３−プロピオン酸（ＩＰＡ）などのいくつかのインドール代謝産物は、ＴＬＲ４シグナル伝達のダウンレギュレーションを介して、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）の活性化リガンドしての作用を発揮し得る（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら、「Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒ  ＰＸＲ  ａｎｄ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４」；  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１巻、２９６−３１０頁、２０１４年８月２１日）。その結果、インドールのレベルは、ＰＸＲの活性化を介して、ＴＬＲ４の発現レベルの調節およびバランスを図り、恒常性および消化管バリアの健康状態を促進することができる。
【０１０１】
したがって、いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子操作された細菌は、１つ以上の短鎖脂肪酸および／または１つ以上のトリプファン代謝産物を産生する。
ブチラート
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ブチロジーニック遺伝子カセットを有し、特定の外因性環境条件下でブチラートを生成することができる。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切なブチロジーニック遺伝子の組を含み得る（例えば、表２および表３を参照）。ブチラート生合成遺伝子を含む非改変細菌は公知であり、ペプトクロストリジウム属（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）が含まれるが、これらに限定されない。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のブチラート生合成遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ペプトクロスジウム・ディフィシル）、例は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０由来の８つの酪酸生合成経路遺伝子：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３）を含み、およびブチラートを生産することができる。Ｐｈｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０および株１２９６は、いずれもブチラートを産生することができるが、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋについて異なる核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、および／または亜株由来のブチロジーニック遺伝子の組合せを含み、およびブチラートを産生することができる。たとえば、いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、およびｔｈｉＡ１、およびＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株１２９６由来のｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋを含む。あるいは、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）由来の単一遺伝子（ｔｅｒ、トランス−２−エノイル（ｅｎｏｙｎｌ）−ＣｏＡレダクターゼをコードする）は、ペプトクロストリジウム・ディフィシル由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、およびｅｔｆＡ３遺伝子の全てを機能的に置換することができる。したがって、ブチロジーニック遺伝子カセットは、ペプトクロストリジウム・ディフィシル由来のｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋならびにトレポネーマ・デンティコラ由来のｔｅｒを含み得る。ブチラート遺伝子カセットの別の例では、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子はｔｅｓＢ（例えば、大腸菌由来）で置換される。したがって、ブチロジーニック遺伝子カセットは、ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢを含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下でブチラート生合成カセットを発現し、ブチラートを生成することができる。ブチラート生合成遺伝子の１つ以上は、例えば、コドン最適化のように、機能的に置換または改変されうる。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、ブチラート生成のレベルをさらに増加させるために、追加の
遺伝子を変異させるかまたはノックアウトすることができる。嫌気性条件下での生産は、内因性ＮＡＤＨプールに依存する。したがって、ＮＡＤＨを利用する競合経路を排除することにより、ブチラート経路を通る流量を増やすことができる。そのような競合経路の非限定的な例には、ｆｒｄＡ（ホスホエノールパイルベートをスクシナートに変換する）、ｌｄｈＡ（パイルベートをラクタートに変換する）およびａｄｈＥ（アセチル−ＣｏＡをエタノールに変換する）が存在する。したがって、特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｆｒｄＡ、ｌｄｈＡ、およびａｄｈＥの１つ以上について、変異および／または欠失をさらに有する。
【０１０４】
表２は、例示的なブチラート生合成遺伝子カセットにおける例示的遺伝子の核酸配列を示す。
【表２−１】
2018532412.tif 000002
【表２−２】
2018532412.tif 000003
【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【０１０５】
遺伝子操作された細菌によるブチラートの産生のための例示的なポリペプチド配列を表３に示す。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０１０６】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにおいてｂｃｄ２、ｅｔｆＡ３、およびｅｔｆＢ３遺伝子の遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する複合体を形成し、それらは酸素依存性共酸化剤として機能し得る。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、微好気性または酸素制限環境、例は、哺乳類の消化管においてブチラートを産生するように設計され、酸素依存性は消化管においてブチラート生成に悪影響を及ぼし得る。Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの単一遺伝子（ｔｅｒ、トランス−２−エノイル（ｅｎｏｙｎｌ）−ＣｏＡレダクターゼをコードする）は酸素非依存マナーでこの３遺伝子複合体を機能的に置き換えることができることが示された。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、ｔｅｒ遺伝子、例は、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のものを含み、それはｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、およびｅｔｆＡ３遺伝子の三つすべて、例は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のものを機能的に置換することができる。この実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ（例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシル由来）ならびにｔｅｒ（例えば、トレポネーマ・デンティコラ由来）を有し、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、ブチラートを生成する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ（例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシル由来）、ｔｅｒ（例えば、トレポネーマ・デンティコラ由来）、ならびに１つ以上のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３（例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシル由来）を有し、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、ブチラートを生成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のブチラート生合成遺伝子は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下における安定性向上および／またはブチラート生成量の増加のために、機能的に置換、改変、および／または突然変異されうる。
【０１０８】
ｐｂｔおよびｂｕｋの遺伝子産物は、ブチリルＣｏＡをブチラートに変換する。いくつかの実施形態では、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子をｔｅｓＢ遺伝子で置き換えることができる。ｔｅｓＢを使用して、ブチリル−ｃｏＡからＣｏＡを切除することができる。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄおよびｃｒｔ２（例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシル由来）ならびに大腸菌由来のｔｅｓＢを有し、低酸素条件下、分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、ブチラートを生成する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｅｒ遺伝子（トランス−２−エノイル（ｅｎｏｙｎｌ）−ＣｏＡレダクターゼをコードする。例えば、トレポネーマ・デンティコラ由来）、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ（例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシル由来）および大腸菌由来のｔｅｓＢを有し、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、ブチラートを生成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のブチラート生合成遺伝子は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下における安定性向上および／またはブチラート生成量の増加のために、機能的に置換、改変、および／または突然変異される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ブチラートの局所的な生成は、消化管において制御性Ｔ細胞の分化を誘導し、および／または結腸上皮細胞のバリア機能を促進する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、好気性ブチラート生合成遺伝子および／または嫌気性もしくは微好気性ブチラート生合成遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、局所的なブチラート生成は、ＩＢＤおよび他の消化管関連障害の症状である消化管炎症を軽減する。
【０１１０】
一実施形態では、ｂｃｄ２遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｂｃｄ２遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｂｃｄ２遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｂｃｄ２遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｂｃｄ２遺伝子は配列番号１に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｂｃｄ２遺伝子は配列番号１に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｂｃｄ２遺伝子は配列番号１の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｂｃｄ２遺伝子は配列番号１の配列から構成される。
【０１１１】
一実施形態では、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｅｔｆＢ３遺伝子は配列番号２に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｅｔｆＢ３遺伝子は配列番号２に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２の配列から構成される。
【０１１２】
一実施形態では、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｅｔｆＡ３遺伝子は配列番号３に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｅｔｆＡ３遺伝子は配列番号３に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｅｔｆＡ３遺伝子は配列番号３の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｅｔｆＡ３遺伝子は配列番号３の配列から構成される。
【０１１３】
一実施形態では、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｈｉＡ１遺伝子は配列番号４に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｔｈｉＡ１遺伝子は配列番号４に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｈｉＡ１遺伝子は配列番号４の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｔｈｉＡ１遺伝子は配列番号４の配列から構成される。
【０１１４】
一実施形態では、ｈｂｄ遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｈｂｄ遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｈｂｄ遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｈｂｄ遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｈｂｄ遺伝子は配列番号５に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｈｂｄ遺伝子は配列番号５に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｈｂｄ遺伝子は配列番号５の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｈｂｄ遺伝子は配列番号５の配列から構成される。
【０１１５】
一実施形態では、ｃｒｔ２遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｃｒｔ２遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｃｒｔ２遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｃｒｔ２遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｃｒｔ２遺伝子は配列番号６に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｃｒｔ２遺伝子は配列番号６に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｃｒｔ２遺伝子は配列番号６の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｃｒｔ２遺伝子は配列番号６の配列から構成される。
【０１１６】
一実施形態では、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｐｂｔ遺伝子は配列番号７に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｐｂｔ遺伝子は配列番号７に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｐｂｔ遺伝子は配列番号７の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｐｂｔ遺伝子は配列番号７の配列から構成される。
【０１１７】
一実施形態では、ｂｕｋ遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｂｕｋ遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｂｕｋ遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｂｕｋ遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｂｕｋ遺伝子は配列番号８に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｂｕｋ遺伝子は配列番号８に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｂｕｋ遺伝子は配列番号８の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｂｕｋ遺伝子は配列番号８の配列から構成される。
【０１１８】
一実施形態では、ｔｅｒ遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｅｒ遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｅｒ遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｅｒ遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｅｒ遺伝子は配列番号９に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｔｅｒ遺伝子は配列番号９に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｅｒ遺伝子は配列番号９の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｔｅｒ遺伝子は配列番号９の配列から構成される。
【０１１９】
一実施形態では、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｅｓＢ遺伝子は配列番号１０に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｔｅｓＢ遺伝子は配列番号１０に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｅｓＢ遺伝子は配列番号１０の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｔｅｓＢ遺伝子は配列番号１０の配列から構成される。
【０１２０】
一実施形態では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上に対して少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上を有する配列を含む。さらに別の実施形態では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上を有する配列から構成される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ブチラート生合成遺伝子の１つ以上は、合成ブチラート生合成遺伝子である。いくつかの実施形態では、ブチラート生合成遺伝子の１つ以上は、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）のブチラート生合成遺伝子である。いくつかの実施形態では、ブチラート生合成遺伝子の１つ以上は、Ｃ．  グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のブチラート生合成遺伝子である。いくつかの実施形態では、ブチラート生合成遺伝子の１つ以上は、ペプトクロストリジウム・ディフィシレ（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｃｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のブチラート生合成遺伝子である。ブチラート遺伝子カセットは、ブチラートの好気的生合成のための遺伝子および／またはブチラートの嫌気的もしくは微好気的生合成のための遺伝子を含み得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、異なる細菌の種、株および／またはサブタイプ由来のブチラート生合成遺伝子の組み合わせを有し、ブチラートを生成することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のブチラート生合成遺伝子は、安定性を増強し、および／またはブチラート生成量を増加させるために、機能的に置換、改変、および／または突然変異される。いくつかの実施形態では、ブチラートの局所的生成は、食物摂取を減少させ、消化管バリア機能を回復・改善し、炎症を軽減する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、ブチラート生合成カセットを発現し、ブチラートを生成することができる。
【０１２３】
一実施形態では、ブチラート遺伝子カセットは、第１プロモーターに直接的に作動可能に連結される。別の実施形態では、ブチラート遺伝子カセットは、第１プロモーターに間接的に作動可能に連結される。一実施形態では、プロモーターは、本質的にブチラート遺伝子カセットと機能的に連結されていない。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ブチラート遺伝子カセットは、構成的プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態では、ブチラート遺伝子カセットは、誘導性プロモーターの制御下で発現する。いくつかの実施形態では、ブチラート遺伝子カセットは、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現する。一実施形態では、ブチラート遺伝子カセットは、低酸素または嫌気性条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現し、ブチラート遺伝子カセット発現は、哺乳動物の消化管の環境のような低酸素または嫌気性環境下で活性化する。誘導可能なプロモーターについては、以下でさらに詳細に記載する。
【０１２５】
ブチラート遺伝子カセットは、細菌細胞内のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施形態では、ブチラート遺伝子カセットは、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、ブチラート遺伝子カセットは、細菌細胞の染色体中に位置する。さらに別の実施形態では、ブチラート遺伝子カセットの天然コピーが細菌細胞の染色体中に位置し、別種の細菌に由来するブチラート遺伝子カセットが細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、ブチラート遺伝子カセットの天然コピーが細菌細胞内のプラスミド上に位置し、別種の細菌に由来するブチラート遺伝子カセットが細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、ブチラート遺伝子カセットの天然コピーが細菌細胞の染色体中に位置し、別種の細菌に由来するブチラート遺伝子カセットが細菌細胞の染色体中に位置する。
【０１２６】
いくつかの実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは低コピープラスミド上に発現される。いくつかの実施態様において、ブチラート遺伝子カセットは、高コピープラスミド上に発現される。いくつかの実施態様において、高コピープラスミドは、ブチラート発現を増加させるために有用であり得る。
プロピオナート
【０１２７】
代わりの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子、例えばプロピオナートを生成することができ、当該分子は複数の遺伝子および／または酵素を必要とする生合成経路によって合成される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート遺伝子カセットを有し、特定の外因性環境条件下でプロピオナートを生成することができる。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切なセットのプロピオナート生合成遺伝子を発現することができる（例は、表４、表５、表６、表７参照）。内在性プロピオナート生合成経路を介してプロピオナートを生成することができる未修飾細菌には、制限されないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ、およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａが含まれる。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来の遺伝子ｐｃｔ、ｌｃｄ、およびａｃｒを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオナート生合成のためのアクリラート経路遺伝子、例は、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、およびａｃｒＣを含む。いくつかの実施形態では、Ａｃｒ酵素が触媒する律速段階が、Ｒ．スフェロイデス由来のＡｃｕＩによって置換され、ＡｃｕＩはＮＡＤＰＨに依存したアクリリル−ＣｏＡ還元を触媒して、プロピオニル−ＣｏＡを生成する。したがって、プロピオナートカセットは、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、およびａｃｕＩを含む。別の実施形態では、ＡｃｕＩの大腸菌ホモログであるｙｈｄＨを用いる。このプロピオナート遺伝子カセットはｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、およびｙｈｄＨを含む。代わりの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのパイルベート経路遺伝子、例えば、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄを有し、および任意でｔｅｓＢをさらに有する。別の実施形態では、プロピオナート遺伝子カセットは、スリーピングビューティームターゼ（Ｓｌｅｅｐｔｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  Ｍｕｔａｓｅ）オペロン遺伝子、例えば、大腸菌由来の遺伝子（ｓｂｍ、ｙｇｆＤ、ｙｇｆＧ、ｙｇｆＨ）を含む。ＳＢＭ経路は循環的であり、出発分子であるスクシニル−ＣｏＡを再生しながら、発酵産物としてプロピオナートを形成する一連の生化学的変換からなる。ＳｂｍはスクシニルＣｏＡをＬ−メチルマロニルＣｏＡに変換し、ｙｇｆＧがＬ−メチルマロニルＣｏＡをプロピオニルＣｏＡに変換し、そしてｙｇｆＨがプロピオニルＣｏＡをプロピオナートに、スクシナートをスクシニルＣｏＡに変換する。
【０１２９】
当該経路は、スクシナートをプロピオナートに変換するプロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）の酸化的プロピオナート経路に非常に類似している。スクシニル−ＣｏＡは、メチルマロニル−ＣｏＡミューターゼ（ｍｕｔＡＢ）によってＲ−メチルマロニル−ＣｏＡに変換される。次いで、Ｒ−メチルマロニル−ＣｏＡが、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ（ＧＩ：１８０４２１３４）を介してＳ−メチルマロニル−ＣｏＡに変換される。メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシトランスフェラーゼ（ｍｍｄＡ、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８７０、ｂｃｃｐ）をコードする３つの遺伝子が存在し、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシトランスフェラーゼは、メチルマロニル−ＣｏＡをプロピオニル−ＣｏＡに変換する。
【０１３０】
遺伝子はコドン最適化されることができ、翻訳要素および転写要素を加えることもできる。プロピオナート生合成遺伝子カセット中の例示的遺伝子の核酸配列を、表４〜６に列挙する。表７に、例示的なプロピオナート生合成遺伝子が発現するポリペプチド配列を列挙する。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【０１３１】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【０１３２】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表４（配列番号２１〜配列番号３５、および配列番号１０）の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性のために、表４の１つ以上の核酸配列（配列番号２１〜配列番号配列番号３５、および配列番号１０）またはその機能的断片と同じポリペプチドをコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。以下の配列とは、表４の１つ以上の核酸配列（配列番号２１〜配列番号３５および配列番号１０）もしくはその機能的断片、または遺伝暗号の冗長性のため、表４の１つ以上の核酸配列（配列番号２１〜配列番号３５および配列番号１０）もしくはその機能的断片と同じポリペプチドをコードする核酸配列のＤＮＡ配列のことである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表５（配列番号３６〜配列番号３９）の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性のために、表５の１つ以上の核酸配列（配列番号３６〜配列番号３９）またはその機能的断片と同じポリペプチドをコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。以下のＤＮＡ配列とは、表５（配列番号３６〜配列番号３９）の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片、または遺伝暗号の冗長性のため、表５（配列番号３６〜配列番号３９）の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片と同じポリペプチドをコードする核酸配列のＤＮＡ配列のことである。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表６（配列番号４０〜配列番号４５）の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性のために、表６の１つ以上の核酸配列（配列番号４０〜配列番号４５）またはその機能的断片と同じポリペプチドをコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。以下のＤＮＡ配列とは、表６（配列番号４０〜配列番号４５）の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片、または遺伝暗号の冗長性のため、表６（配列番号４０〜配列番号４５）の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片と同じポリペプチドをコードする核酸配列のＤＮＡ配列のことである。
【０１３５】
遺伝学的に操作された細菌のプロピオナート生成遺伝子（複数可）またはカセット（複数可）がコードする例示的なポリペプチド配列を表７に列挙する。
【０１３６】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【０１３７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表７の１つ以上のポリペプチド配列（配列番号４６〜配列番号７０、および配列番号２０）もしくはその機能的断片またはその変異体（ｖａｒｉａｎｔ）をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表７の１つ以上のポリペプチド配列（配列番号４６〜配列番号７０、および配列番号２０）またはその機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同なポリペプチド配列を有する。
【０１３８】
一実施形態では、細菌細胞は、非天然または異種のプロピオナート遺伝子カセットを有する。いくつかの実施形態では、本開示は、非天然または異種のプロピオナート遺伝子カセットを有する細菌細胞を提供し、当該遺伝子カセットは第１のプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、第１のプロモーターは誘導性プロモーターである。一実施形態では、細菌細胞は、異なる生物、例えば、別種の細菌に由来するプロピオナート遺伝子カセットを有する。別の実施形態では、細菌細胞は、プロピオナート遺伝子カセットをコードするネイティブ遺伝子を２コピー以上有する。さらに別の実施形態では、細菌細胞は、プロピオナート遺伝子カセットをコードする少なくとも１つのネイティブ遺伝子ならびに異なる生物、例えば別種の細菌に由来するプロピオナート遺伝子カセットを少なくとも１コピー有する。一実施形態では、細菌細胞は、プロピオナート遺伝子カセットをコードする遺伝子を少なくとも１、２、３、４、５または６コピー有する。一実施形態では、細菌細胞は、プロピオナート遺伝子カセットをコードする遺伝子または遺伝子群の複数コピーを有する。
【０１３９】
複数の異なるプロピオナート遺伝子カセットが当該分野で公知である。いくつかの実施形態では、プロピオナート遺伝子カセットは、細菌種由来の遺伝子カセットによってコードされる。いくつかの実施形態では、プロピオナート遺伝子カセットは、非細菌種由来の遺伝子カセットによってコードされる。いくつかの実施形態では、プロピオナート遺伝子カセットは、真核生物種、例えば、真菌に由来する遺伝子によってコードされる。一実施形態では、プロピオナート遺伝子カセットをコードする遺伝子は、クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）またはプレボテーラ・ルミニコーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）を含む属または種の生物に由来するが、これらに限定されない。
【０１４０】
一実施形態では、プロピオナート遺伝子カセットは、操作細菌細胞で使用するためにコドン最適化されている。一実施形態では、プロピオナート遺伝子カセットは、大腸菌で使用するためにコドン最適化されている。別の実施形態では、プロピオナート遺伝子カセットは、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）で使用するためにコドン最適化されている。操作細菌細胞においてプロピオナート遺伝子カセットが発現すると、細菌細胞は、同一条件下（例えば、培養または環境条件）で、同じサブタイプの非改変細菌よりも多くのプロピオナートを生成する。したがって、異種プロピオナート遺伝子カセットを有する遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナートを生成し、自己免疫疾患、例えばＩＢＤを処置するために使用され得る。
【０１４１】
本開示は、プロピオナート生合成酵素の機能的断片またはプロピオナート生合成酵素の機能性変異体をコードする遺伝子をさらに含む。本明細書で使用する場合、プロピオナート生合成酵素の「その機能的断片」または「その機能性変異体」という用語は、当該断片または変異体が由来した野生型プロピオナート合成酵素と同様の質の生物学的活性を有するエレメントに関する。例えば、突然変異プロピオナート合成酵素の機能的断片または機能性変異体は、当該機能的断片または機能性変異体が由来したプロピオナート合成酵素と本質的に同じプロピオナート合成能力を保持するものである。例えば、プロピオナート生合成酵素活性を有するポリペプチドをＮ末端またはＣ末端で切断し、本明細書で示す例示的アッセイを含む当業者に公知のアッセイを用いてプロピオナート生合成酵素活性の滞留を評価することができる。一実施形態では、操作細菌細胞は、プロピオナート生合成酵素の機能性変異体をコードする異種遺伝子を有する。他の実施形態では、操作細菌細胞は、プロピオナート生合成酵素の機能的断片をコードする異種遺伝子を有する。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、「相同性」も含めて、「パーセント（％）配列同一性」または「パーセント（％）同一性」という用語は、配列をアラインし、最大配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義する。比較のための最適な配列アランメントは、手作業でのほかに、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１年、Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２巻、４８２頁の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻、４４３頁の局所相同性アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５巻、２４４４頁の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、生成することができる。
【０１４３】
本開示は、本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸をその配列中に含むプロピオナート生合成酵素をコードする遺伝子を含む。本明細書に記載の配列と実質的に同じであるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換ならびにアミノ酸欠失および／または挿入を含む配列を含む。保存的アミノ酸置換は、第１のアミノ酸のものと類似している化学的および／または物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸による第１のアミノ酸の置換を意味する。保存的置換は、以下の群内のあるアミノ酸の別のものによる置換を含む：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＤおよびＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）およびグリシン（Ｇ）；Ｆ、ＷおよびＹ；Ｃ、ＳおよびＴ。同様に、ある塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸での置換（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間の置換）、ある酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸での置換（例えば、ＡｓｐとＧｌｕ間の置換）、ある中性アミノ酸の別の中性アミノ酸での置換（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌの間の置換）が企図される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、プロピオナート生合成酵素に突然変異が導入される。活性増加を示す突然変異体を選択する；プロピオナート生合成酵素をコードする突然変異を起こした遺伝子を単離し、本開示の細菌細胞に挿入する。本明細書に記載の改変を含む遺伝子は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０１４５】
一実施形態では、プロピオナート生合成遺伝子カセットは、クロストリジウム属菌由来である。一実施形態では、クロストリジウム属菌は、クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）である。別の実施形態では、プロピオナート生合成遺伝子カセットは、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属菌由来である。一実施形態では、メガスファエラ属菌は、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）である。別の実施形態では、プロピオナート生合成遺伝子カセットは、プレボテーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属菌由来である。一実施形態では、プレボテーラ属菌は、プレボテーラ・ルミニコーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）である。他のプロピオナート生合成遺伝子カセットは、当業者に公知である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、クロストリジウム・プロピオニクム由来のｐｃｔ、ｌｃｄおよびａｃｒ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのアクリラート経路遺伝子、例えばｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢおよびａｃｒＣを有する。代わりの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのパイルベート経路（ピルビン酸経路）遺伝子、例えばｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦおよびｌｐｄを有し、任意でｔｅｓＢをさらに有する。当該遺伝子は、コドン最適化されていてもよく、翻訳要素および転写要素が加えられてもよい。
【０１４７】
一実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約８０％、８２１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９２１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は配列番号２１の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は配列番号２１の配列からなる。
【０１４８】
一実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約８０％、８１％、８２２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は配列番号２２の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は配列番号２２の配列からなる。
【０１４９】
一実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８２３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は配列番号２３の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は配列番号２３の配列からなる。
【０１５０】
一実施態様において、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８２４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９２４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は配列番号２４の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は配列番号２４の配列からなる。
【０１５１】
一実施態様では、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約８２５％の同一性を有する。一実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約９２５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８２５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９２５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は配列番号２５の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は配列番号２５の配列からなる。
【０１５２】
一実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｒＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６と少なくとも約９２６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８２６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９２６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６の配列を含む。さらに別の実施態様において、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６の配列からなる。
【０１５３】
一実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約９６％、９２７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８２７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９２７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ａｃｒＣ遺伝子は配列番号２７の配列を含む。さらに別の実施態様では、ａｃｒＣ遺伝子は配列番号２７の配列からなる。
【０１５４】
一実施態様では、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約２８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約２８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約９６％、９７％、９２８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約２８０％、２８１％、２８２％、２８３％、２８４％、２８５％、２８６％、２８７％、２８２８％、２８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９２８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は配列番号２８の配列を含む。さらに別の実施態様においてｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８の配列からなる。
【０１５５】
一実施態様では、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約２９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約２９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約２９６％、２９７％、２９８％、または２９２９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８２９％、２９０％、２９１％、２９２％、２９３％、２９４％、２９５％、２９６％、２９７％、２９８％、または２９２９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は配列番号２９の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は配列番号２９の配列からなる。
【０１５６】
一実施態様では、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＣ遺伝子は配列番号３０の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｔｈｒＣ遺伝子は配列番号３０の配列からなる。
【０１５７】
一実施態様では、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は配列番号３１の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は配列番号３１の配列からなる。
【０１５８】
一実施態様では、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は配列番号３２の配列を含む。さらに別の実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は配列番号３２の配列からなる。
【０１５９】
一実施態様では、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は配列番号３３の配列を含む。さらに別の実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は配列番号３３の配列からなる。
【０１６０】
一実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は配列番号３４の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は配列番号３４の配列からなる。
【０１６１】
一実施態様では、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０の配列からなる。
【０１６２】
一実施態様では、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。他の実施態様では、ａｃｕＩ遺伝子は配列番号３５の配列を含む。さらに別の実施態様では、ａｃｕＩ遺伝子は配列番号３５の配列からなる。
【０１６３】
一実施態様では、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６．０と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。他の実施態様では、ｓｂｍ遺伝子は配列番号３６の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｓｂｍ遺伝子は配列番号３６の配列からなる。
【０１６４】
一実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＤ遺伝子は配列番号３７の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｙｇｆＤ遺伝子は配列番号３７の配列からなる。
【０１６５】
一実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は配列番号３８の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は配列番号３８の配列からなる。
【０１６６】
一実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は配列番号３９の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は配列番号３９の配列からなる。
【０１６７】
一実施態様では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は配列番号４０の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は配列番号４０の配列からなる。
【０１６８】
一実施態様では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は配列番号４１の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は配列番号４１の配列からなる。
【０１６９】
一実施態様では、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は配列番号４２と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は配列番号４２の配列を含む。さらに別の実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は配列番号４２の配列からなる。
【０１７０】
一実施態様では、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。  したがって、一実施態様では、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｍｍｄＡ遺伝子は配列番号４３の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｍｍｄＡ遺伝子は配列番号４３の配列からなる。
【０１７１】
一実施態様では、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。  したがって、一実施態様では、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は配列番号４４の配列を含む。さらに別の実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は配列番号４４の配列からなる。
【０１７２】
一実施態様では、Ｂｃｃｐ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、Ｂｃｃｐ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、Ｂｃｃｐ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、Ｂｃｃｐ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、Ｂｃｃｐ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、Ｂｃｃｐ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、Ｂｃｃｐ遺伝子は配列番号４５の配列を含む。さらに別の実施態様では、ＢＣＣＰ遺伝子は配列番号４５の配列からなる。
【０１７３】
一実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６〜配列番号７０の１つ以上に対して、少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６〜配列番号７０の１つ以上に対して、少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、プロピオナート回路によりコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６〜配列番号７０の１つ以上に対して、少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６〜配列番号７０の１つ以上に対して、少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６〜配列番号７０の１つ以上に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６〜配列番号７０の１つ以上に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６〜配列番号７０の１つ以上の配列を含む。さらに別の実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６〜配列番号７０の１つ以上の配列からなる。
【０１７４】
いくらかの実施態様において、プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、合成プロピオナート生合成遺伝子である。いくらかの実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、Ｅ．ｃｏｌｉプロピオナート生合成遺伝子である。いくらかの実施態様において、プロピオナート生合成遺伝子の一以上はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（グルタニカム）プロピオナート生合成遺伝子である。いくらかの実施態様において、プロピオナート生合成遺伝子の一以上はＣ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍプロピオナート生合成遺伝子である。いくつかの実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子の１つ以上がＲ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓプロピオナート生合成遺伝子である。プロピオナート遺伝子カセットは、プロピオナートの好気性生合成のための遺伝子および／またはプロピオナートの嫌気性または微好気性生合成のための遺伝子を含み得る。
【０１７５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株および／または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子の組合せを含み、およびプロピオナートを生成することができる。いくらかの実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、安定性を増強し、および／またはプロピオナート生成を増加させるために、機能的に置換、修飾、および／または変異される。いくつかの実施態様では、プロピオナートの局所産生は、食物摂取を減少させ、消化管バリア機能を改善し、炎症を軽減する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成カセットを発現し、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、プロピオナートを生成することができる。
【０１７６】
一実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、第１のプロモーターに直接作動可能に連結される。別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、間接的に作動可能に第１プロモーターに連結される。一実施態様では、プロモーターは、天然ではプロピオナート遺伝子カセットと作動可能に連結されていない。
【０１７７】
いくつかの実施態様において、プロピオナート遺伝子カセットは、構成的プロモーターの制御下で発現される。別の実施態様において、プロピオナート遺伝子カセットは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、低酸素または嫌気性条件によって直接または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、プロピオナート遺伝子カセットの発現は、哺乳類の消化管の環境などの低酸素または嫌気性環境下で活性化される。誘導可能なプロモーターは、以下においてより詳細に記載される。
【０１７８】
プロピオナート遺伝子カセットは、細菌細胞中のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、細菌細胞の染色体に位置する。さらに別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットの天然コピーが細菌細胞の染色体に位置し、異なる種の細菌由来のプロピオナート遺伝子カセットが細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットの天然コピーは細菌細胞内のプラスミド上に位置し、異なる種の細菌由来のプロピオナート遺伝子カセットは細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットの天然コピーが細菌細胞の染色体に位置し、異なる種の細菌由来のプロピオナート遺伝子カセットが細菌細胞の染色体に位置する。
【０１７９】
いくつかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、低コピープラスミドで発現される。いくつかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、高コピープラスミドで発現される。いくつかの実施態様において、高コピープラスミドは、プロピオナートの発現を増加させるために有用であり得る。
アセタート
【０１８０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、アセタート遺伝子カセットを含み、およびアセタートを生成することができる。遺伝学的に操作された細菌は、アセタート生合成遺伝子の任意の適切なセットを含み得る。アセタート生合成遺伝子を含む非修飾細菌は当該技術において知られ、および好気性および／または嫌気性条件下で種々の基質を消費してアセタートを生成することができ（例はＲａｇｓｄａｌｅ、２００８参照）、およびこれらの内因性アセタート生合成経路は、本発明の遺伝学的に操作された細菌についての遺伝子の供給源でありうる。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜株由来のアセタート生合成遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌中の自然アセタート生合成遺伝子が増強される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、好気性アセタート生合成遺伝子、例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、嫌気性アセタート生合成遺伝子、例は、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ、Ｂａｌｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、および／またはＴｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ由来のものを含む。遺伝学的に操作された細菌は、好気性アセタート生合成のための遺伝子、または嫌気性もしくは微好気性アセタート生合成のための遺伝子を含み得る。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、好気性および嫌気性または微好気性アセタート生合成遺伝子の両方を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、および／または亜株に由来するアセタート生合成遺伝子の組合せを含み、およびアセタートを生成することができる。いくらかの実施態様において、アセタート生合成遺伝子の一以上は、安定性および／またはアセタート産生を増強するために、機能的に置換、修飾、および／または変異される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下でアセタート生合成カセットを発現し、およびアセタートを生成することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、代わりの短鎖脂肪酸を産生することができる。
トリプトファンおよびトリプトファンの代謝
キヌレニン
【０１８１】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニンを産生することができる。キヌレニンは、トリプトファン異化作用の最初の律速段階で生成される代謝産物である。このステップは、トリプトファンのキヌレニンへの変換を含み、遍在的に発現する酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）、または肝臓に主に局在する酵素トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）によって触媒され得る（Ａｌｖａｒａｄｏら、２０１５）。ＩＢＤに罹患したヒト患者（ペイシェント）の生検では、健康な個体のそれに比して、特に潰瘍部位付近において、ＩＤＯ−１発現のレベルの上昇がみられる（Ｆｅｒｄｉｎａｎｄｅら、２００８；  Ｗｏｌｆら、２００４）。同様に、ＩＤＯ−１（酵素）発現は、トリニトロベンゼンスルホン酸およびデキストラン硫酸ナトリウムによって誘導されるＩＢＤのマウスモデルにおいて、アップレギュレートされる。すなわち、ＩＤＯ−１を阻害すると、各誘導因子によって誘起される炎症反応が有意に増加する（Ｃｉｏｒｂａら、２０１０；  Ｇｕｒｔｎｅｒら、２００３；  Ｍａｔｔｅｏｌｉら、２０１０）。キヌレニンは、好中球においてアポトーシスを直接誘導することも示されている（Ｅｌ−Ｚａａｔａｒｉら、２０１４）。これらの所見を合わせると、ＩＤＯ−１およびキヌレニンが炎症を制限する役割を果たすことが示唆される。遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニンを生成するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン輸送体を生成する遺伝子または遺伝子カセット、ＩＤＯ−１を生成する遺伝子または遺伝子カセット、ならびにＴＤＯを生成する遺伝子または遺伝子カセットを含み得る。いくつかの実施形態では、例えば、安定性を高め、キヌレニン生成を増加し、および／または誘導条件下における抗炎症効能を向上するため、キヌレニン生成遺伝子の改変および／または変異導入が行われる。いくつかの実施形態では、操作細菌のトリプトファン取り込みまたは移入（ｉｍｐｏｒｔ）が向上している（例えば、操作細菌は、細菌細胞へのトリプトファン取り込みを増やすトランスポーターまたは他のメカニズムを有する）。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関係する条件下で、キヌレニンを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でキヌレニンを生成することができる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレン酸を生成することができる。キヌレン酸は、酵素キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼが触媒する反応における、キヌレニンの不可逆的アミノ基転移から生成される。キヌレン酸は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体のアンタゴニストとして作用する（Ｔｕｒｓｋｉら、２０１３）。グルタミン酸は中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質であることが知られているが、現在では、末梢神経系においてグルタミン酸がさらなる役割を示唆する証拠が存在する。例えば、消化管への主要な神経供給部（すなわち、筋層間神経叢）におけるＮＭＤＡグルタミン酸受容体の活性化は、消化管運動の亢進をもたらすが（Ｆｏｒｒｅｓｔら、２００３年）、キヌレン酸で処置したラットは、急性大腸炎の初期に、消化管運動の減退および炎症を示す（Ｖａｒｇａら、２０１０）。したがって、ＩＢＤ患者（ペイシェント）で報告されたキヌレン酸のレベル上昇は、消化管内ニューロン活性化の増加に対する代償的応答の可能性がある（Ｆｏｒｒｅｓｔら、２００３）。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切なキヌレニナーゼ生成遺伝子、キヌレニナーゼ生成遺伝子群、またはキヌレニナーゼ生成遺伝子カセットを有することができる。いくつかの実施形態では、キヌレン酸を生成するための遺伝子は、例えば、安定性を増強し、キヌレニン酸生成を増加させ、および／または誘導条件下において抗炎症効力を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関連する条件（複数可）下で、でキヌレン酸を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でキヌレン酸を生成することができる。
トリプトファン、トリプトファン代謝、およびトリプトファン代謝産物
トリプトファンおよびキヌレニン経路
【０１８３】
トリプトファン（ＴＲＰ）は必須アミノ酸であり、摂取後は、新たなタンパク質合成によってタンパク質に組み込まれるか、または健康および疾患において多くの異なる役割をもつ多数の生物学的に活性な代謝産物に変換される（Ｐｅｒｅｚ−Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚら、２００７年、「Ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、ＣＮＳ＆Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  −Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、６巻，３９８−４１０頁）。トリプトファン異化の１アーム（ａｒｍ）に沿って、トリプトファンはトリプトファンヒドロキシラーゼによって、神経伝達物質セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）に変換される。セロトニンはさらにホルモンであるメラトニンに変換され得る。しかし、トリプトファンの大部分は、キヌレニン経路（ＫＰ）と呼ばれる第２のアームに沿って、キヌレニンと総称される多数の生物活性代謝産物に代謝される。異化の第一段階では、ＴＲＰはキヌレニン（ＫＹＮ）に変換される。ＫＹＮは、いくつかのタイプの免疫細胞において、免疫抑制機能を有することが十分に実証されており、最近ではアリール炭素受容体（ＡｈＲ；ダイオキシン受容体として知られている）の活性化リガンドであることが明らかになっている。ＫＹＮは当初は癌の設定で、免疫および腫瘍細胞における内在性ＡＨＲリガンドであることが明らかになり、オートクリン（自己分泌）およびパラクリン（傍分泌）様式の両方で作用し、腫瘍細胞の生存を促進する。消化管内では、キヌレニン経路の代謝は腸内微生物叢によって制御されており、当該腸内微生物叢はキヌレニン経路の代謝に利用可能なトリプトファン量を調節することができる。
【０１８４】
より最近では、例えば、インドール−３アルデヒド、インドール−３アセタート、インドール−３プロピオン酸、インドール、インドール−３アセトアルデヒド、インドール−３アセトニトリル、ＦＩＣＺなどを含む、本明細書では総称して「インドール」と呼ばれる追加のトリプトファン代謝産物が、ヒト宿主や食物由来の微生物叢によって生成され、またＡｈＲアゴニストとして機能することができることが明らかになった（例えば、表８および図３７および本明細書の他の箇所、ならびにＬａｍａら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１６年６月、ＣＡＲＤ９  ｉｍｐａｃｔｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎｔｏ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ．、２２巻（６）：５９８−６０５頁を参照）。
【０１８５】
多環式芳香族炭化水素などの生体異物の受容体として最もよく知られているＡｈｒは、リガンド結合後に細胞核に転位することができるリガンド依存性細胞質転写因子である。キヌレニンに加えて、最近、トリプトファン代謝産物であるＬ−キヌレニン、６−フォルミルインドールカルバゾール（ＦＩＣＺ、ＴＲＰの光産物）、およびＫＹＮＡが、免疫抑制機能を媒介する内因性ＡｈＲリガンドとして同定された。核内でＡｈＲ標的遺伝子の転写を誘導するために、ＡｈＲは、ＡｈＲ核トランスロケーター（ＡＲＮＴ）またはＮＦ−κＢサブユニットＲｅｌＢのようなタンパク質と協同する。ヒト癌細胞の研究から、ＫＹＮはＡｈＲ−ＡＲＮＴに伴うＩＬ−６の転写を活性化し、それによりＳＴＡＴ３を介したＩＤＯ１の自己分泌活性化が誘導されることが示されている。このＡｈｒ−ＩＬ−６−ＳＴＡＴ３ループは肺癌における不良な予後と関連しており、このことはＩＤＯ／キヌレニンが媒介する免疫抑制によって、腫瘍細胞が免疫を回避することが可能になるという考えを支持する。
【０１８６】
消化管内では、トリプトファンは、アンギオテンシンＩ変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む輸送マシーナリーによって上皮を横切って輸送されてからキヌレニンに変換され、Ｔ細胞応答の抑制およびＴｒｅｇ細胞の促進において機能する。
【０１８７】
トリプトファン（ＴＲＰ）のキヌレニン（ＫＹＮ）への律速変換は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）またはトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）の２つの形態のいずれかによって媒介され得る。ＴＲＰ代謝の１つの特徴は、ＴＲＰからＫＹＮへの触媒の律速段階が、肝酵素トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）および偏在発現性の酵素ＩＤＯ１の両方によって生じることである。ＴＤＯは、生物におけるトリプトファン濃度の恒常性に必須であり、ＩＤＯ１よりもＴＲＰに対する親和性が低い。ＴＤＯの発現は、主に血漿中ＴＲＰ濃度の増加によって活性化されるが、グルココルチコイドおよびグルカゴンによっても活性化され得る。トリプトファン・キヌレニン経路はまた、多くの微生物叢、最も顕著には腸内細菌において発現し、キヌレニンおよび代謝産物は消化管内で合成され得る（図１４およびＳｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３年７月１０日；５巻（１９３）：１９３ｒａ９１）。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、腸内細菌由来の１つ以上の異種細菌由来遺伝子を有し、その遺伝子産物はＴＲＰ：ＫＹＮの変換を触媒する。１つの経路に沿って、ＫＹＮは、他の生物活性代謝産物であるキヌレニン酸（ＫＹＮＡ）にさらに代謝され得る。キヌレニン酸（ＫＹＮＡ）は、グルタミン酸受容体に拮抗することができ、またＡＨＲおよびＧＰＣＲ、例えばＧＰＲ３５、グルタミン酸受容体、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）−受容体、および他の受容体にも結合することができる。ＫＰの第３の経路に沿って、ＫＹＮは、アントラニル酸（ＡＡ）およびさらに下流のキノリン酸（ＱＵＩＮ）に変換されることができ、ＱＵＩＩＮはグルタミン酸受容体アゴニストであり、神経毒としての役割を有する。
【０１８８】
したがって、ＫＰを介したフラックスのレベルをアップレギュレートおよび／またはダウンレギュレートする手段の発見、ならびにトリプトファンおよびその種々の生物活性代謝産物の相対的な量および／または比率をリセットすることは、本明細書に記載の多くの疾患の予防、処置および／または管理において有用であり得る。本開示は、トリプトファンおよび／またはトリプトファン代謝産物の合成、細菌摂取、および異化を可能にする回路を有する遺伝学的に操作された細菌を介して、例えば血清中または胃腸系における、トリプトファンおよびトリプトファン代謝産物のレベルを調節、制御および微調整するための組成物を記載し、多くの様々な疾患の処置、管理および／または予防において、当該組成物を使用するための方法を提供するものである。
他のインドールトリプトファン代謝物
【０１８９】
キヌレニンおよびＫＹＮＡに加えて、内因性ＡＨＲリガンドとして多数の化合物が提案されており、その多くはトリプトファンおよびインドールの代謝に関与する経路を介して生成される（Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒら、２００３；  ＣｈｕｎｇおよびＧａｄｕｐｕｄｉ、２０１１）。トリプトファンインドール経路を介して生成される多数の代謝産物が、腸内微生物叢によって生成される。例えば、細菌はトリプトファンを取り込み、取り込まれたトリプトファンはインドール酢酸（ＩＡＡ）およびトリプタミンなどの一置換インドール化合物、ならびにＡＨＲを活性化することが判明している他の化合物に変換され得る（Ｈｕｂｂａｒｄら、２０１５、Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｏ  ｓｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｏｌｅｓ；  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｏｐｏｒｔｓ  ５巻：１２６８９頁）。
【０１９０】
消化管では、食餌由来および細菌性のＡｈＲリガンドは、グループ３ＩＬＣと呼ばれる、先天性リンパ系細胞（ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ）によるＳｐ−２２生成を促進する（Ｓｐｉｔｓら、２０１３；Ｚｅｌａｎｔｅら、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  Ｅｎｇａｇｅ  Ａｒｙｌ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｖｉａ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２２；２０１３年８月２２日、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９巻、３７２−３８５頁）。
【０１９１】
ＩＬ−２２発現は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を惹起し、抗菌化合物の発現ならびにある範囲の細胞増殖に関連する経路を誘発することができ、その両方が組織修復機序を増強する。ＩＬ−２２は、炎症状態を調節しながら、腸バリアのフィデリティーを促進し、治癒する上で重要である。マウスモデルによって、ＩＬ−２２投与後に、腸炎症状態が改善することが実証されている。さらに、ＩＬ−２２は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を活性化して、粘液生成量の増加を促進し、バリア機能を保持する。
【０１９２】
表８は、ＡｈＲに結合することが示され、本開示の遺伝子操作された細菌によって産生され得る例示的なトリプトファン代謝産物を列挙する。
【表８】
2018532412.tif 000037
【０１９３】
さらに、いくつかのインドール代謝産物は、腸のバリア機能の必須調節因子として重要な役割を果たすと考えられるプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）を介して、その効果を発揮し得る。ＰＸＲ欠損（Ｎｒ１ｉ２−／−）マウスは、ＬＰＳを認識し、先天性免疫系を活性化することでよく知られる受容体、すなわちＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）のアップレギュレーションと共役するはっきりとした「漏出性（ｌｅａｋｙ）」の消化管生理機能を示した（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら、２０１４、Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒ  ＰＸＲ  ａｎｄ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１巻、２９６−３１０頁、２０１４年８月２１日）。特に、腸内微生物叢が生成するインドール３−プロピオン酸（ＩＰＡ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＸＲのリガンドであることが示されている。
【０１９４】
ＰＸＲアゴニズムの結果として、例えば、共生細菌または遺伝学的に操作された細菌が生成するインドールレベルは、ＰＸＲの活性化を介して、ＴＬＲ４の発現レベルを調節して釣り合いをとることで、恒常性および消化管バリアの健康を促進することができる。すなわち、低レベルのＩＰＡおよび／またはＰＸＲならびに過剰のＴＬＲ４は、腸バリアの機能不全につながる可能性があり、一方、ＩＰＡレベルの増加は、ＰＸＲ活性化およびＴＬＲ４ダウンレギュレーション、および消化管バリアの健康改善を促進し得る。
【０１９５】
微生物によるトリプトファンのインドール−３−プロピオナートへの分解は、多くの微生物において示されているが（例えば、Ｅｌｓｄｅｎら、Ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７６年４月１日；  １０７巻（３）：２８３−８頁）、トリプトファンからＩＰＡにいたる細菌による生合成経路の全貌は、現在まで不明である。クロストリジウム・スポロゲネスにおいて、トリプトファンは、インドール−３−パイルベート、インドール−３−ラクタート、およびインドール−３−アクリラートを介して、インドール−３−プロピオナートに異化される（Ｏ’ＮｅｉｌｌおよびＤｅＭｏｓｓ、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９６８年９月２０日；１２７巻（１）：３６１−９頁）。Ｃ．スポロゲネスから精製された２つの酵素は、トリプトファントランスアミナーゼおよびインドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼである（ＪｅａｎおよびＤｅＭｏｓｓ、Ｉｎｄｏｌｅｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９６８年４月；１４巻（４）：４２９−３５頁）。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）は、アミノトランスフェラーゼによって、トリプトファンをインドール−３−パイルベートに異化する。ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）およびラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）では、トリプトファンはまた、連続的なアミノ基転移および脱水素化によって、インドール−３−ラクタートに異化される（例えば、Ｇｕｍｍａｌｌａ，  Ｓ．，  Ｂｒｏａｄｂｅｎｔ，  Ｊ．  Ｒ．、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｂｙ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ｃｈｅｅｓｅ  ｆｌａｖｏｒ  ａｄｊｕｎｃｔｓ、Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ８２巻：２０７０−２０７７頁およびその中の参考文献を参照）。
【０１９６】
Ｌ−トリプトファントランスアミナーゼ（例えば、ＥＣ  ２．６．１．２７、例えばクロストリジウム・スポロゲネスまたはラクトバチルス・カゼイ）は、Ｌ−トリプトファンおよび２−オキソグルタラートを、（インドール−３−イル）パイルベートおよびＬ−グルタミン酸に変換する。インドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１１０、例えばクロストリジウム・スポロゲネスまたはラクトバチルス・カゼイ）は、（インドール−３−イル）パイルベートおよびＮＡＤＨおよびＨ＋を、インドール−３−ラクタートおよびＮＡＤ＋に変換する。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、操作細菌は、トリプトファントランスアミナーゼ（例えば、Ｃ．スポロゲネス由来）および／またはインドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼ（例えば、Ｃ．スポロゲネス由来）、および／またはインドール−３−パイルベートアミノトランスフェラーゼ（例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来）から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子配列を有する。他の実施形態では、細菌がコードするそのような酵素は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）および／またはラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）由来である。
【０１９８】
他の実施態様では、ＩＰＡ生成回路は、図４４および本明細書の他の箇所に示され、記載される酵素を含む。
【０１９９】
いくつかの実施態様では、細菌は、１つ以上のトリプトファン代謝産物、例えば「インドール」を産生するための遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、当該細菌はインドール−３アルデヒド、インドール−３アセタート、インドール−３−プロピオン酸、インドール、インドール−３アセトアルデヒド（ａｃｅｔａｌａｄｅｈｙｄｅ）、インドール−３−アセトニトリル、ＦＩＣＺから選択されるインドールを産生するための遺伝子配列を有する。いくつかの実施態様において、細菌は、ＡｈＲアゴニストとして機能するインドールを産生するための遺伝子配列を含む（例えば、表８および図３７を参照）。
【０２００】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＰＡ生成のための回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンアンモニアリアーゼおよびインドール−３−アクリラートレダクターゼ（例えば、トリプトファンアンモニアリアーゼ（ＷＡＬ）（ルブリヴィヴァックス・ベンゾアチリチカス）およびインドール−３−アクリラートレダクターゼ（クロストリジウム・ボツリヌム））をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。ＩＰＡ生合成カセットの発現を制御し得る例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターが含まれる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、細菌は、図３９、図４１Ａ〜Ｈ、図４２Ａ〜Ｅ、図４３Ａ、図４３Ｂ、図４５Ａ〜Ｅに記載および図示される任意の１つ以上の回路を有する。
メトキシインドール経路、セロトニンおよびメラトニン
【０２０２】
メトキシインドール経路は、セロトニン（５−ＨＴ）およびメラトニンの形成をもたらす。セロトニンは２段階の酵素反応によって合成される生体アミンである：第１に、２つのトリプトファンヒドロキシラーゼ遺伝子（Ｔｐｈ１またはＴｐｈ２）のうちのいずれかによってコードされる酵素が、トリプトファンから５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）への律速変換を触媒し、その結果、セロトニンの生理活性は脳（Ｔｐｈ２）または末梢（Ｔｐｈ１）のいずれかに割り振られる。次に、５−ＨＴＰが脱カルボキシル化されて、セロトニンになる。腸内セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）は、エンテロクロマフィン細胞（ｅｎｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ  ｃｅｌｌｓ）およびニューロンによって放出され、セロトニン再取り込みトランスポーター（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅ−ｕｐｔａｋｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＳＥＲＴ）を介して調節される。ＳＥＲＴは、腸の上皮細胞およびニューロン上に存在する。特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝学的に操作された細菌は、腸内のセロトニンレベルの調節、例えばセロトニンレベルを低下させることができる。
【０２０３】
５−ＨＴはまた、メラトニン生合成の基質として機能する。メラトニン生合成の律速段階は、Ｎ−アセチル−セロトニン（ＮＡＳ）の形成をもたらす５−ＨＴ−Ｎ−アセチル化であり、Ｎ−アセチル−セロトニン（ＮＡＳ）は続いてＯ−メチル化されて５−メトキシ−Ｎ−アセチルトリプタミン（メラトニン）となる。５−ＨＴ、ＮＡＳ、およびメラトニンの生産不足は、気分の落ち込み、睡眠障害および概日リズムの障害に寄与する。メラトニンは、神経ホルモンとして作用し、概日リズムおよび睡眠−覚醒サイクルの発達に関連する。
【０２０４】
特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、５−ＨＴ合成、放出および／または分解に影響を与える。腸内微生物叢は、宿主のセロトニン産生を介して、セロトニンシグナル伝達およびセロトニンレベルを増加させることができるケアと相互に連結されている（Ｊａｎｏら、Ｃｅｌｌ．２０１５年４月９日；１６１巻（２）：２６４−７６頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０２．０４７、Ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｈｏｓｔ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、消化管内のセロトニンレベルを調節して、炎症の症状を改善することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、セロトニンを環境から、例えば消化管から取り込む。非限定的な例において、セロトニンを、例えば、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）、ヒドロキシル−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＨＩＯＭＴ）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）、芳香族−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＡＤ）によってメラトニンに変換することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたバクテリアは、宿主によって産生されるセロトニンレベルに影響する。
【０２０５】
細菌において、メラトニンは、トリプトファンとともに、シキミ酸経路の中間生成物として間接的に合成される。これらの細胞では、合成はｄ−エリスロース−４−ホスファートおよびホスホエノールパイルベートから開始される。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、メラトニン生成のための内因性または外因性のカセットを有する。非限定的な例として、１つの経路またはカセットが、Ｂｏｃｈｋｏｖ、Ｄｅｎｉｓ  Ｖ．；Ｓｙｓｏｌｙａｔｉｎ、Ｓｅｒｇｅｙ  Ｖ．；  Ｋａｌａｓｈｎｉｋｏｖ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｉ．；  Ｓｕｒｍａｃｈｅｖａ、Ｉｒｉｎａ  Ａ．（２０１１）「Ｓｈｉｋｉｍｉｃ  ａｃｉｄ：  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５巻（１）：５−１７頁、ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２１５４−０１１−００６４−８、に記載されている。
例示的なトリプトファンおよびトリプトファン代謝産物回路
外因性トリプトファンの減少
【０２０６】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンのレベルおよび／またはトリプトファン代謝産物のレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、操作細菌は、１つ以上の芳香族アミノ酸輸送体をコードする遺伝子配列を有する。一実施形態では、アミノ酸輸送体は、トリプトファン輸送体である。トリプトファン輸送体は、細胞内へのトリプトファン輸送を増強するために、本明細書に記載の組換え細菌中で発現または改変され得る。具体的には、本明細書に記載の組換え細菌細胞においてトリプトファン輸送体が発現される場合、同一条件下で同じサブタイプの非改変細菌で当該輸送体が発現される場合よりも、多くのトリプトファンが細胞内に取り込まれる。したがって、遺伝学的に操作された細菌はトリプトファン輸送体をコードする異種遺伝子を有し、当該輸送体は細菌にトリプトファンを取り込むために使用し得る。
【０２０７】
細菌細胞へのトリプトファン取り込みは、当業者によく知られているタンパク質によって媒介される。例えば、トリプトファンへの親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）に基づいて識別可能な３つの異なるトリプトファン輸送体が、大腸菌で同定されている（例えば、Ｙａｎｏｆｓｋｙら、１９９１年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３巻：６００９−１７頁を参照）。細菌遺伝子ｍｔｒ、ａｒｏＰ、およびｔｎａＢは、細菌のトリプトファン取り込みを担うトリプトファンパーミアーゼをコードする。高親和性パーミアーゼＭｔｒは、ｔｒｐリプレッサーによって負に調節され、ＴｙＲ産物によって正に調節されるが（例えば、Ｙａｎｏｆｓｋｙら、１９９１年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３巻：６００９−１７頁およびＨｅａｔｗｏｌｅら、１９９１年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３巻：３６０１−０４頁を参照）、ＡｒｏＰはｔｙＲ産物によって負に調節される（Ｃｈｙｅら、１９８７年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９巻：３８６−９３頁）。
【０２０８】
一実施形態では、トリプトファン輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｍｔｒ、ａｒｏＰおよびｔｎａＢからなる群より選択される遺伝子である。一実施形態では、
本明細書に記載の細菌細胞は、ｍｔｒ、ａｒｏＰおよびｔｎａＢからなる群から選択される異種遺伝子を、少なくとも１つは含むように遺伝子操作されている。一実施形態では、トリプトファン輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、大腸菌ｍｔｒ遺伝子である。一実施形態では、トリプトファン輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、大腸菌ａｒｏＰ遺伝子である。一実施形態では、トリプトファン輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子は、大腸菌ｔｎａＢ遺伝子である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、トリプトファン輸送体は、トリプトファン輸送体遺伝子によってコードされ、当該遺伝子はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を含むが、それらに限定はされない細菌属または細菌種に由来する。いくつかの実施形態では、細菌種は大腸菌である。いくつかの実施形態では、細菌種は大腸菌ニッスル（Ｎｉｓｓｌｅ）株である。
【０２１０】
トリプトファン輸送体、トリプトファン輸送体の機能性変異体、またはトリプトファン輸送体の機能的断片の活性を試験するためのアッセイは、当業者に公知である。例えば、トリプトファンの取り込みは、Ｓｈａｎｇら、２０１３年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９５巻：５３３４−４２頁に記載の方法によって決定することができ、これらの各々の全内容は、本明細書中に参照により明示的に組み込まれる。
【０２１１】
一実施形態では、トリプトファン輸送体が本明細書に記載の組換え細菌細胞で発現される場合、細菌細胞は、同一条件下で同じサブタイプの非改変細菌で輸送体が発現される場合よりも、細菌細胞にトリプトファンを１０％多く取り込む。別の実施形態では、トリプトファン輸送体が本明細書に記載の組換え細菌細胞で発現される場合、細菌細胞は、同一条件下で同じサブタイプの非改変細菌で輸送体が発現される場合よりも、細菌細胞にトリプトファンを２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％多く取り込む。さらに別の実施形態では、トリプトファン輸送体が本明細書に記載の組換え細菌細胞で発現される場合、細菌細胞は、同一条件下で同じサブタイプの非改変細菌で輸送体が発現される場合よりも、細菌細胞にトリプトファンを２倍多く取り込む。さらに別の実施形態では、トリプトファン輸送体が本明細書に記載の組換え細菌細胞で発現される場合、細菌細胞は、同一条件下で同じサブタイプの非改変細菌で輸送体が発現される場合よりも、細菌細胞にトリプトファンを３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍多く取り込む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン取り込み輸送体に加えて、本明細書に記載のように、トリプトファン代謝産物の生成回路、例えばキヌレニン生成回路、キヌレニン代謝産物の生成回路、または表８に示すインドールトリプトファン代謝産物の生成回路を、さらに有する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンのレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、操作細菌は、トリプトファンをキヌレニンに変換するための遺伝子配列を１つ以上有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、酵素トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）および酵素トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１３．１１．５２；トリプトファンからＮ−フォルミルキヌレニンを生成する）およびキヌレニンフォルムアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．９；ｎ−フォルミルキヌレニンからキヌレニンを生成する）をコードする遺伝子カセットを有する。いくつかの実施形態では、例えば、Ｖｕｊｋｏｖｉ−Ｃｖｉｊｉｎら、２０１３に記載のように、前記の酵素は細菌由来である。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、本明細書に記載の遺伝子（複数可）および遺伝子カセット（複数可）の発現によって、例えばインドール代謝産物の生成と合わせて、トリプトファンのレベルを低下させることができる。
キヌレニンの増加
【０２１５】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニンを生成することができる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンのレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、操作細菌は、トリプトファンをキヌレニンに変換するための１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、酵素トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）および酵素トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）をコードする遺伝子配列を１つ以上有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１３．１１．５２；トリプトファンからＮ−フォルミルキヌレニンを生成する）およびキヌレニンフォルムアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．９；ｎ−フォルミルキヌレニンからキヌレニンを生成する）をコードする遺伝子カセットを有する。いくつかの実施形態では、例えば、Ｖｕｊｋｏｖｉ−Ｃｖｉｊｉｎら、２０１３に記載のように、前記の酵素は細菌由来である。
【０２１７】
遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニンを生成するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、キヌレニンを生成するための遺伝子は、例えば、安定性を増強し、キヌレニン生成を増加させ、および／または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施形態では、上で詳細に説明したように、操作細菌はまたトリプトファンの摂取または取り込みが増強されており、例えば、輸送体またはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例えば炎症に関連する条件下でキヌレニンを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、キヌレニンを生成することができる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレン酸を生成することができる。キヌレニン酸は、酵素キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼが触媒する反応における、キヌレニンの不可逆的アミノ基転移によって生成する。遺伝学的に操作された細菌は、キヌレン酸を生成するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、キヌレン酸を生成するための遺伝子は、例えば、安定性を増強し、キヌレニン酸生成を増加させ、および／または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関連する条件下でキヌレン酸を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、キヌレン酸を生成することができる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン消費およびキヌレニン生成のための細菌由来の１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットを有する。いくつかの実施形態では、トリプトファン（ＴＲＰ）をキヌレニン（ＫＹＮ）に変換する酵素は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の１つ以上、および／またはロドバクター科（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、およびハロモナス科（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）のメンバーに由来する。いくつかの実施形態では、当該酵素は、Ｖｕｊｋｏｖｉｃ−Ｃｖｉｊｉｎら、「Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１３年７月１０日；  ５（１９３）：  １９３ｒａ９１」の表Ｓ７に列挙された種に由来し、その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、キヌレニンを生成するための１つ以上の遺伝子は、例えば、安定性を増強し、キヌレニン生成を増加させ、および／または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施形態では、操作細菌は、トリプトファン摂取または取り込みが増強されていて、例えば、輸送体またはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させる他の機構を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関連する条件下で、キヌレニンを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、キヌレニンを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレン酸を生成することができる。キヌレニン酸は、酵素キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼが触媒する反応において、キヌレニンの不可逆的アミノ基転移によって生成する。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニン経路（ＫＰ）におけるキヌレニン後の代謝産物、例えば、神経毒性代謝産物または糖尿病誘発性代謝産物の蓄積を防止する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のキヌレニナーゼをコードする。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットを有する遺伝学的に操作された細菌は、例えば循環中に、ＴＲＰ：ＫＹＮ比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、ＴＲＰ：ＫＹＮ比が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＲＰ：ＫＹＮ比は減少する。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットを有する遺伝学的に操作された細菌は、ＫＹＮＡ：ＱＵＩＮ比を変化させることができる。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、疾患もしくは組織特異的分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るまたはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、記載された任意の１つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載された任意の１つ以上の回路が、１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、記載された任意の１つ以上の回路をさらに発現することができ、さらに以下の１つ以上を有する：（１）１つ以上の栄養要求性、例えば当業者に公知であり本明細書に記載の栄養要求性のいずれか（例、ｔｈｙＡ栄養要求性）、（２）１つ以上のキルスイッチ回路、例えば本明細書に記載かあるいはそうでなければ当業者に公知のキルスイッチのいずれか、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）生物学的分子または基質の取り込み輸送を行う１つ以上の輸送体、例えば本明細書に記載あるいはそうでなければ当業者に公知の輸送体のいずれか、（５）１つ以上の分泌回路、例えば本明細書に記載されていて、そうでなければ当業者に公知の分泌回路のいずれか、６）前記追加回路の１つ以上の組合せ。
増加するトリプトファン
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、トリプトファンを生成することができる。トリプトファン生成のための例示的な回路を図３９、図４５Ａおよび図４５Ｂに示す。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、トリプトファンを生成する遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンオペロンを有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌のトリプトファンオペロンを有する。（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、ＲＮＡ、（２００７）、１３巻：１１４１−１１５４頁）。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のトリプトファンオペロンを有する。（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、ＲＮＡ（２００７）、１３巻：１１４１−１１５４頁）。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、枯草菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＤ、ｔｒｙｐＣ、ｔｒｙｐＦ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を有する。
【０２２６】
また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスマート生成のための遺伝子配列を任意に有する。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣをコードする配列を任意に有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列、およびコリスマート生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列（複数可）ならびにａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、枯草菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＤ、ｔｒｙｐＣ、ｔｒｙｐＦ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡをコードする配列（複数可）ならびにａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ，ａｒｏＫおよびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列（複数可）を有する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型またはフィードバック抵抗性ＳｅｒＡ遺伝子（表１０）をコードする配列を有する。大腸菌ｓｅｒＡがコードする３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）デヒドロゲナーゼは、Ｌ−セリン（Ｓｅｒ）生合成の主要なリン酸化経路の第１段階を触媒する。このステップでは、３ＰＧが３−ホスホヒドロキシピルビン酸（３ＰＨＰ）に酸化され、それに伴いＮＡＤ＋がＮＡＤＨに還元される。トリプトファン生合成の一環として、大腸菌はトリプトファンを生成するごとに１つのセリンを使用する。その結果、ｓｅｒＡを発現させることにより、トリプトファン生成が改善する（例えば、図３８参照）。
【０２２８】
これらの実施形態のいずれにおいても、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥは、トリプトファン生成を改善するために、必要に応じてフィードバック抵抗型に置き換えられる（表１０）。
【０２２９】
これらの実施態様のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、そのリプレッサー機能を低下または消失させるように、任意に欠失、突然変異、または改変され得る。
【０２３０】
これらの実施形態のいずれにおいても、ｔｎａＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードする）を任意で欠失させ、当該経路に沿ったトリプトファン異化を防ぎ、生成するトリプトファンのレベルをさらに増加させることができる（表１０）。
【０２３１】
ｙｄｄＧ遺伝子がコードする大腸菌の内膜タンパク質ＹｄｄＧは、既知のアミノ酸排出輸送体ＲｈｔＡおよびＹｄｅＤのホモログである。研究により、ＹｄｄＧはトリプトファンを含む芳香族アミノ酸を排出輸送できることが明らかになっている。したがって、ＹｄｄＧは、トリプトファン排出輸送体またはトリプトファン分泌装置（またはトリプトファン分泌タンパク質）として機能し得る。他の芳香族アミノ酸排出輸送体については、Ｄｏｒｏｓｈｅｎｋｏら、２００７年、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｅｔｔ．、２７５巻：３１２−３１８頁に記載されている。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、必要に応じて、ＹｄｄＧをコードする遺伝子配列をさらに有する。いくつかの実施形態では、操作細菌はＹｄｄＧを過剰発現することができる。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｙｄｄＧ遺伝子の１つ以上のコピーを任意で有する。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニンの代謝機構または分解機構を有し、その結果、いくつかの実施形態ではトリプトファン生成も増加する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、酵素キヌレニナーゼをコードする配列を有する。キヌレニナーゼは、細胞内で、キヌレニンをアントラニル酸に代謝するために産生される（Ｓｃｈｗａｒｃｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１３巻；４６５−４７７頁；２０１２年、Ｃｈｅｎ＆Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ、Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｒｅｓ．、２巻；１−１９頁；２００９年）。例示的なキヌレニナーゼ配列を、本明細書の以下の表１１に示す。いくつかの実施形態では、操作された微生物に、局所環境から細胞へのキヌレニン取り込み（輸送）機構が存在する。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニナーゼ分泌体をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏＰ、ｔｎａＢまたはｍｔｒ遺伝子の１つ以上のコピーを有する。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン生合成経路の酵素をコードする配列（複数可）およびキヌレニナーゼをコードする配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンオペロン、例えば、大腸菌もしくは枯草菌のトリプトファンオペロン、ならびにキヌレニナーゼをコードする配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子（例えば、大腸菌由来の）をコードする配列、ならびにキヌレニナーゼをコードする配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＤ、ｔｒｙｐＣ、ｔｒｙｐＦ、ｔｒｙｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子（例えば、枯草菌由来の）をコードする配列、ならびにキヌレニナーゼをコードする配列を有する。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、当該リプレッサー機能を低下または消失させるために、必要に応じて欠失、突然変異、または改変され得る。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスミマートを生成するための配列（複数可）、例えばａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を任意で有する。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列、ならびにキヌレニナーゼをコードする配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、枯草菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＤ、ｔｒｙｐＣ、ｔｒｙｐＦ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列、ならびにキヌレニナーゼをコードする配列を有する。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、内在性ｔｒｐＥに欠失または変異を任意で有し、ｔｒｐＥの機能を失うことがあり得る。したがって、一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＡ、およびｔｒｐＤおよびキヌレニナーゼをコードする１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットを含み得る（例えば、図１８参照）。当該欠失によって、内在性コリスマート経路を介したトリプトファン生成が妨げられ、キヌレニナーゼによるキヌレニンからのトリプトファン生成が増加する可能性がある。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型またはフィードバック抵抗性ＳｅｒＡ遺伝子のいずれかをコードする配列を有する（表１０）。
【０２３６】
これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファン生成を改善するために、必要に応じて、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥをフィードバック抵抗型で置き換えることができる（表１０）。
【０２３７】
これらの実施態様のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、そのリプレッサー機能を低下または消失させるように、任意に欠失、変異、または修飾されていてもよい。
【０２３８】
これらの実施態様のいずれにおいても、Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードするｔｎａＡ遺伝子は、この経路に沿ったトリプトファン異化を防ぎ、産生されるトリプトファンのレベルをさらに増加させるために、必要に応じて欠失させることができる（表１０）。
【０２３９】
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌は、細胞からトリプトファンを排出または分泌するための遺伝子配列をさらに有することができる。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、ＹｄｄＧをコードする遺伝子配列（複数可）をさらに有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、芳香族アミノ酸の排出輸送体であるＹｄｄＧを過剰発現することができる。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｙｄｄＧ遺伝子の１つ以上のコピーを任意に有する。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニンの細胞内への取り込みまたは輸送のための遺伝子配列をさらに有する。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニナーゼ分泌体をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏＰ、ｔｎａＢまたはｍｔｒ遺伝子の１つ以上のコピーを有する。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌または遺伝子操作された微生物は、トリプトファンおよび／またはキヌレニナーゼ生成のための１つ以上の遺伝子を有し、当該遺伝子は低酸素状態、炎症状態によって活性化されるプロモーター、例えば前記条件下で活性化される本明細書に記載のいずれかのプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンおよび／またはキヌレニナーゼ生成のための１つ以上の遺伝子を発現し、当該遺伝子は癌特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば本明細書に記載のいずれかのプロモーターの制御下にある。本開示の遺伝学的に操作された細菌がコードする例示的なトリプトファン合成カセットを表９に列挙する。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【０２４１】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表９の核酸配列またはその機能的断片を１つ以上有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性のために、表９の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片がコードするポリペプチドと同じポリペプチドをコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。前記の以下のＤＮＡ配列とは、表９の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片、または遺伝コードの冗長性のためであるが、表９の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片と同じポリペプチドをコードする核酸配列である。
【０２４２】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上に対して、少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上に対して、少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上に対して、少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上に対して、少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％，８７％  ８８％、８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上の配列を含む。別の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上の配列からなる。
【０２４３】
フィードバック抵抗性ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥの例示的なポリペプチド配列を表１０に示す。例示的なＴｎａＡ（大腸菌由来トリプトファナーゼ）配列も表１０に示す。いくつかの実施形態では、当該配列は、トリプトファンをインドールに異化する回路において、コードされる。他の実施形態では、トリプトファンのレベルを増加させるために、当該配列を大腸菌染色体から欠失させる。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【０２４４】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上に対して、少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上に対して、少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上に対して、少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上に対して、少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上に対して、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％，８７％  ８８％、８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上の配列を含む。別の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし発現する１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上の配列から構成される。
【０２４５】
表１１は、特定の実施態様において、本開示の遺伝学的に操作された細菌によりコードされるキヌレニナーゼをコードする例示的な遺伝子を列挙する。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【０２４６】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードし、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９〜配列番号９１の１つ以上と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９〜配列番号９１の１つ以上と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９〜配列番号９１の１つ以上と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９〜配列番号９１の１つ以上と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９〜配列番号９１の１つ以上と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９〜配列番号９１の１つ以上と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９〜配列番号９１の１つ以上の配列を含む。別の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９〜配列番号９１の１つ以上の配列からなる。
【０２４７】
表１２は、例示的なコドン最適化キヌレニナーゼカセット配列を列挙する。
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０２４８】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表１２の核酸配列またはその機能的断片を１つ以上有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性のために、表１２の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片がコードするポリペプチドと同一のポリペプチドをコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表１２の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片、または遺伝コードの冗長性のためであるが、表１２の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片と同じポリペプチドをコードする核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。
【０２４９】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコードして発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号９２〜配列番号９４の１つ以上と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号９２〜配列番号９４の１つ以上と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号９２〜配列番号９４の１つ以上と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号９２〜配列番号９４の１つ以上と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号９２〜配列番号９４の１つ以上と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号９２〜配列番号９４の１つ以上と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％  、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号９２〜配列番号９４の１つ以上の配列を含む。別の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌がコード、発現する１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号９２〜配列番号９４の１つ以上の配列からなる。
【０２５０】
遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニナーゼ生成のための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、キヌレニナーゼ生成のための遺伝子は、例えば、安定性を高めるために、キヌレニナーゼ生成を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施形態では、操作細菌はまた、トリプトファンの摂取または取り込みが増強されており、例えば、上記で詳述したように、輸送体またはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関連する条件下で、キヌレニナーゼを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、キヌレニナーゼを生成することができる。
【０２５１】
遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニナーゼ生成のための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、キヌレニナーゼ生成のための遺伝子は、例えば、安定性を高めるために、キヌレニナーゼ生成を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施形態では、操作細菌はまた、トリプトファンの摂取または取り込みが増強されており、例えば、上記で詳述したように、輸送体またはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関連する条件下で、キヌレニナーゼを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でキヌレニナーゼを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、キヌレニナーゼを生成することができる。
キヌレン酸の産生
【０２５２】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレン酸を生成することができる。キヌレン酸は、酵素キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼが触媒する反応における、キヌレニンの不可逆的アミノ基転移から生成される。キヌレン酸は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体のアンタゴニストとして作用する（Ｔｕｒｓｋｉら、２０１３）。グルタミン酸は中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質であることが知られているが、現在では、末梢神経系においてグルタミン酸がさらなる役割を示唆する証拠が存在する。例えば、消化管への主要な神経供給部（すなわち、筋層間神経叢）におけるＮＭＤＡグルタミン酸受容体の活性化は、消化管運動の亢進をもたらすが（Ｆｏｒｒｅｓｔら、２００３）、キヌレン酸で処置したラットは、急性大腸炎の初期に、消化管運動の減退および炎症を示す（Ｖａｒｇａら、２０１０）。したがって、ＩＢＤ患者（ペイシェント）で報告されたキヌレン酸のレベル上昇は、消化管内ニューロン活性化の増加に対する代償的応答の可能性がある（Ｆｏｒｒｅｓｔら、２００３）。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切なキヌレニナーゼ生成遺伝子（複数可）を有することができる。いくつかの実施形態では、操作細菌は、１つ以上のキヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ（キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩなど）とも呼ばれる）をコードする遺伝子配列を有する。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、キヌレン酸生成のための遺伝子または遺伝子群は、例えば、安定性を増強して、誘導条件下でキヌレン酸生成を増加させるように、改変および／または突然変異される。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関連する条件下で、キヌレン酸を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、キヌレン酸を生成することができる。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌由来のトリプトファン消費およびキヌレン酸生成のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットを有する。いくつかの実施形態では、キヌレン酸の生成酵素は、シュードモナス、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ、およびバシラスの１つ以上、および／またはロドバクター科（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、およびハロモナス科（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）のメンバーに由来する。いくつかの実施形態では、当該酵素は、Ｖｕｊｋｏｖｉｃ−Ｃｖｉｊｉｎら、「Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１３年７月１０日；  ５（１９３）：  １９３ｒａ９１」の表Ｓ７に列挙された種に由来し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のトリプトファントランスポーターをコードする遺伝子配列およびキヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む。  いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、１つ以上のトリプトファン輸送体をコードする遺伝子配列および１つ以上のキヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ（キヌレニンアミノトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、１つ以上のトリプトファン輸送体をコードする遺伝子配列、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列、および１つ以上のキヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ（キヌレニンアミノトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列および１つまたは複数のキヌレニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列を含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、キヌレン酸を生成する１つ以上の遺伝子は、例えば、安定性を増強し、誘導条件下でキヌレン酸生成が増加するように、改変および／または突然変異導入される。いくつかの実施形態では、操作細菌のトリプトファン摂取または取り込みが増強している（例えば、輸送体または細菌細胞へのトリプトファン摂取を増加させるための他の機構を有する）。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関連する条件下でキヌレン酸を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、キヌレン酸を生成することができる。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、疾患もしくは組織特異的分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、記載された任意の１つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載された任意の１つ以上の回路が、１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、記載された任意の１つ以上の回路をさらに発現することができ、さらに以下の１つ以上を有する：（１）１つ以上の栄養要求性、例えば当業者に公知であり本明細書に記載の栄養要求性のいずれか（例、ｔｈｙＡ栄養要求性）、（２）１つ以上のキルスイッチ回路、例えば本明細書に記載かあるいはそうでなければ当業者に公知のキルスイッチのいずれか、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）生物学的分子または基質の取り込み輸送を行う１つ以上の輸送体、例えば本明細書に記載あるいはそうでなければ当業者に公知の輸送体のいずれか、（５）１つ以上の分泌回路、例えば本明細書に記載されていて、そうでなければ当業者に公知の分泌回路のいずれか、６）前記追加回路の１つ以上の組合せ。
インドールトリプトファン代謝物およびトリプタミンの産生
トリプタミン
【０２５８】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含み、トリプトファンからトリプタミンを生成する。モノアミンアルカロイドであるトリプタミンは、トリプトファンの直接脱カルボキシル化によって生成する。トリプトファンは、インドール−３−アセトアミド（ＩＡＭ）経路を構成する酵素トリプトファンモノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）およびインドール−３−アセトアミドヒドロラーゼ（ＩａａＨ）によって、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）に変換される（例えば、図３６Ｂ、図３７Ａおよび図３７Ｂを参照）。
【０２５９】
菌株の非限定的な例を図４１に示す。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のトリプトファンデカルボキシラーゼ、例えばニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）由来のものをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のトリプトファンデカルボキシラーゼ、例えばニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）由来のものをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のトリプトファンデカルボキシラーゼ、例えば、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｇｎａｖｕｓ）由来のものをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。菌株の別の非限定的な例を図４５Ｃに示す。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）由来のｔｄｃをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、トリプトファンからトリプタミンを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび本明細書の他の部分に記載のように、１つ以上のトリプトファン生成酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および遺伝子欠失／または突然変異を任意で有する。いくつかの実施形態では、トリプトファンからトリプタミンを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上の輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で含み、当該輸送体を通じてトリプトファンを取り込み輸送することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、トリプトファンからトリプタミンを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意に有し、当該排出輸送体を介してトリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを排出することができる。
インドール−３−アセトアルデヒド（Ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）  およびＦＩＣＺ
【０２６１】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有し、当該酵素はトリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを生成する。トリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを生成する例示的な遺伝子カセットを図４１Ｂに示す。
【０２６２】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来である。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｐｄＣ（インドール−３−パイルベートデカルボキシラーゼ、例えば、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ由来））をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９およびｉｐｄＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌由来のａｓｐＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｓｐＣおよびｉｐｄＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔａａ１（Ｌ−トリプトファン−パイルベートアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のｔａａ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔａａ１およびｉｐｄＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ストレプトマイセスｓｐ．ＴＰ−Ａ０２７４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＴＰ−Ａ０２７４）由来のｓｔａＯをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｓｔａＯおよびｉｐｄＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８）由来のｔｒｐＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｉｐｄＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９またはａｓｐＣまたはｔａａ１またはｓｔａＯまたはｔｒｐＤＨの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９またはａｓｐＣまたはｔａａ１またはｓｔａＯまたはｔｒｐＤＨおよびｉｐｄＣの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２６３】
トリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを生成するためのさらなる例示的な遺伝子カセットを図４１Ｃに示す。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｃ（トリプトファンデカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）由来のｔｄｃをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｙｎＡ（モノアミンオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌由来のｔｙｎＡをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｃおよびｔｙｎＡをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２６４】
これらの実施形態のいずれにおいても、インドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび本明細書の他の部分に記載のように、１つ以上のトリプトファン生成酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および遺伝子欠失／または突然変異を任意で有する。いくつかの実施形態では、インドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上の輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で含み、当該輸送体を通じてトリプトファンを取り込み輸送することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、インドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意に有し、当該排出輸送体を介してトリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを排出することができる。
インドール−３−アセトニトリル（Ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）
【０２６５】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有し、当該異化酵素はトリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを生成する。遺伝学的に操作された細菌によるトリプトファンからインドール−３−アセトニトリルの生成を可能にするそのような遺伝子配列（複数可）の非限定的な例を図４１Ｄに示す。
【０２６６】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のｃｙｐ７９Ｂ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７１ａ１３（インドールアセトアルドキシムデヒドラターゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌナズナ由来のｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２６７】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌナズナ由来のｃｙｐ７９Ｂ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３およびｃｙｐ７１Ａ１３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、７９Ｂ３、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２６８】
これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび本明細書の他の部分に記載のように、１つ以上のトリプトファン生成酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および遺伝子欠失／または突然変異を任意で有する。いくつかの実施形態では、トリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上の輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で含み、当該輸送体を通じてトリプトファンを取り込み輸送することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、トリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意に有し、当該排出輸送体を介してトリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを排出することができる。
キヌレニン
【０２６９】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンからキヌレニンを生成する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。そのような遺伝子配列の非限定的な例が、図４１Ｅにあり、また本明細書の他の箇所に記載されている。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ヒト由来のＩＤＯ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＴＤＯ２（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ヒト由来のＴＤＯ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＢＮＡ２（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、サッカロマイセス・セレビシエ（出芽酵母、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、Ａｆｍｉｄ：キヌレニンフォルムアミダーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、マウス由来のＡｆｍｉｄ：キヌレニンフォルムアミダーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２の１つ以上と組み合わせて、Ａｆｍｉｄをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１と組み合わせてＡｆｍｉｄをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｏ２と組み合わせてＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｂｎａ２と組み合わせてＡｆｍｉｄをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＢＮＡ３（キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、サッカロマイセス・セレビシエ（出芽酵母、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＢＮＡ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２の１つ以上と組み合わせて、ＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１と組み合わせて、ＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｏ２と組み合わせて、ＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｂｎａ２と組み合わせて、ＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２の１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｆｍｉｄおよび／またはｂｎａ３の１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のａｆｍｉｄおよび／またはｂｎａ３と組み合わせて、１つ以上のｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２７０】
これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンからキヌレニンを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび本明細書の他の部分に記載のように、１つ以上のトリプトファン生成酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および遺伝子欠失／または突然変異を任意で有する。いくつかの実施形態では、トリプトファンからキヌレニンを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上の輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で含み、当該輸送体を通じてトリプトファンを取り込み輸送することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、トリプトファンからキヌレニンを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列任意に有し、当該排出輸送体を介してトリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを排出することができる。
キヌレン酸（Ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）
【０２７１】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンからｋｙｎｕｒｅｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄを生成する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。そのような遺伝子配列の非限定的な例を図４１Ｆに示し、本明細書の他の箇所に記載する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ヒト由来のＩＤＯ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＴＤＯ２（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ヒト由来のＴＤＯ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＢＮＡ２（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、サッカロマイセス・セレビシエ（出芽酵母、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、Ａｆｍｉｄ：キヌレニンフォルムアミダーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、マウス由来のＡｆｍｉｄ：キヌレニンフォルムアミダーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２の１つ以上と組み合わせて、Ａｆｍｉｄをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１と組み合わせて、Ａｆｍｉｄをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｏ２と組み合わせてＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｂｎａ２と組み合わせてＡｆｍｉｄをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｃｌｂ１および／またはｃｃｌｂ２および／またはａａｄａｔおよび／またはｇｏｔ２をコードする１つ以上の遺伝子配列をさらに有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＢＮＡ３（キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、サッカロマイセス．セレビシエ（出芽酵母、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）由来のＢＮＡ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２の１つ以上と組み合わせて、ＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列をさらに有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１と組み合わせてＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｏ２と組み合わせてＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。���実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｂｎａ２と組み合わせてＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｃｌｂ１および／またはｃｃｌｂ２および／またはａａｄａｄおよび／またはｇｏｔ２をコードする１つ以上の遺伝子配列をさらに有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２の１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２７２】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のａｆｍｉｄおよび／またはｂｎａ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のａｆｍｉｄおよび／またはｂｎａ３と組み合わせて、１つ以上のｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２を、コードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＧＯＴ２（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ミトコンドリア）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ヒト由来のＧＯＴ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＡＡＤＡＴ（キヌレニン／アルファ−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、ミトコンドリア）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ヒト由来のＡＡＤＡＴをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＣＣＬＢ１（キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ヒト由来のＣＣＬＢ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＣＣＬＢ２（キヌレニン−オキソグルタラートトランスアミナーゼ３）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ヒト由来のＣＣＬＢ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｃｌｂ１および／またはｃｃｌｂ２および／またはａａｄａｔおよび／またはｇｏｔ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のａｆｍｉｄおよび／またはｂｎａ３と組み合わせて、ならびに１つ以上のｃｃｌｂ１および／またはｃｃｌｂ２および／またはａａｄａｔおよび／またはｇｏｔ２と組み合わせて、１つ以上のｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２７３】
これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンからキヌレン酸を生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび本明細書の他の部分に記載のように、１つ以上のトリプトファン生成酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および遺伝子欠失／または突然変異を任意で有する。いくつかの実施形態では、トリプトファンからキヌレン酸を生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上の輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で含み、当該輸送体を通じてトリプトファンを取り込み輸送することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、トリプトファンからキヌレン酸を生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列任意に有し、当該排出輸送体を介してトリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを排出することができる。
インドール
【０２７４】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有し、当該酵素はトリプトファンからインドールを生成する。そのような遺伝子配列の非限定的な例が図４１Ｇに示されており、本明細書の他の箇所に記載されている。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｎａＡ（トリプトファナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌由来のｔｎａＡをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２７５】
これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンからインドールを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび本明細書の他の部分に記載のように、１つ以上のトリプトファン生成酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および遺伝子欠失／または突然変異を任意で有する。いくつかの実施形態では、トリプトファンからインドールを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上の輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で含み、当該輸送体を通じてトリプトファンを取り込み輸送することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、トリプトファンからインドールを生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で有し、当該排出輸送体を介してトリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを排出することができる。
他のインドール代謝産物
【０２７６】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有し、当該異化酵素は、食物を通じで取り込まれたインドールグルコシノラートから、インドール−３−カルビノール、インドール−３−アルデヒド、３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、インドロ（３，２−ｂ）カルバゾール（ＩＣＺ）を生成する。そのような遺伝子配列の非限定的な例を図４１Ｇに示し、本明細書の他の箇所に記載する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｐｎｅ２（ミロシナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌズナ由来のｐｎｅ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２７７】
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌はまた、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび本明細書の他の部分に記載のように、１つ以上のトリプトファン生成酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および遺伝子欠失／または突然変異を任意で有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上の輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で含み、当該輸送体を通じてトリプトファンを取り込み輸送することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列任意に有し、当該排出輸送体を介してトリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを排出することができる。
インドール酢酸（Ｉｎｄｏｌｅ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
【０２７８】
一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、インドール−３−酢酸を産生する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。
【０２７９】
そのような遺伝子配列の非限定的な例を図４２Ａ、図４２Ｂ、図４２Ｃ、図４２Ｄ、および図４２Ｅに示す。
【０２８０】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）由来のａｒｏ９をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌由来のａｓｐＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔａａ１（Ｌ−トリプトファン−パイルベートアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌナズナ由来のｔａａ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ストレプトマイセス  ｓｐ．ＴＰ−Ａ０２７４由来のｓｔａＯをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８由来のｔｒｐＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉａｄ１（インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）由来のｉａｄ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＡＡＯ１（インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌズナ由来のＡＡＯ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｐｄＣ（インドール−３−パイルベートデカルボキシラーゼ、例えば、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）由来）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９および／またはａｓｐＣおよび／またはｔａａ１および／またはｓｔａＯおよび／またはｔｒｐＤＨから選択される酵素をコードする１つ以上の配列と組み合わせて、ｉｐｄＣ（インドール−３−パイルベートデカルボキシラーゼ、例えば、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）由来）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉａｄ１および／またはａａｏ１から選択される酵素をコードする１つ以上の配列と組み合わせて、ｉｐｄＣ（インドール−３−パイルベートデカルボキシラーゼ、例えば、エンテロバク���ー・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）由来）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９および／またはａｓｐＣおよび／またはｔａａ１および／またはｓｔａＯから選択される酵素をコードする１つ以上の配列と組み合わせて、ならびにｉａｄ１および／またはａａｏ１から選択される酵素をコードする１つ以上の配列と組み合わせて、ｉｐｄＣ（インドール−３−パイルベートデカルボキシラーゼ、例えば、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）由来）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する（例えば、図４２Ａを参照）。
【０２８１】
酢酸生成のための遺伝子配列の別の非限定的な例を図４２Ｂに示す。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｃ（トリプトファンデカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）由来のｔｄｃをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｙｎＡ（モノアミンオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌由来のｔｙｎＡをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉａｄ１（インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）由来のｉａｄ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＡＡＯ１（インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌズナ由来のＡＡＯ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｃおよびｔｙｎＡをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｃならびにｉａｄ１および／またはａａｏ１から選択される１つ以上の配列をコードする１つ以上の遺伝子配列有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｙｎＡならびにｉａｄ１および／またはａａｏ１から選択される１つ以上の配列をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｃならびにｔｙｎＡならびにｉａｄ１および／またはａａｏ１から選択される１つ以上の配列をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２８２】
酢酸生成のための遺伝子配列（複数可）の別の非限定的な例を図４５Ｄに示す。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８由来のｔｒｐＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉｐｄＣ（インドール−３−パイルベートデカルボキシラーゼ、例えば、エンテロバクター・クロアカ由来）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉａｄ１（インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ウスチラゴ・メイディス由来のｉａｄ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｉｐｄＣおよび／またはｉａｄ１の１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｉｐｄＣおよびｉａｄ１の１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２８３】
酢酸生成のための遺伝子配列の別の非限定的な例を図４２Ｃに示す。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｙｕｃ２（インドール−３−パイルベートモノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、エンテロバクター・クロアカエ由来のｙｕｃ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼはサッカロマイセス・セレビシエ（出芽酵母）由来である。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９およびｙｕｃ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌由来のａｓｐＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｓｐＣおよびｙｕｃ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔａａ１（Ｌ−トリプトファン−パイルベートアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌズナ由来のｔａａ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔａａ１およびｙｕｃ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ストレプトマイセスｓｐ．  ＴＰ−Ａ０２７４由来のｓｔａＯをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｓｔａＯおよびｙｕｃ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８由来のｔｒｐＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｙｕｃ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９またはａｓｐＣまたはｔａａ１またはｓｔａＯまたはｔｒｐＤＨの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９またはａｓｐＣまたはｔａａ１またはｓｔａ０またはｔｒｐＤＨおよびｙｕｃ２の１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２８４】
酢酸生成のための遺伝子配列（複数可）の別の非限定的な例を図４２Ｄに示す。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩａａＭ（トリプトファン２−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シュードモナス・サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）由来のＩａａＭをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉａａＨ（インドールアセトアミドヒドロラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シュードモナス・サバスタノイ由来のｉａａＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩａａＭおよびＩａａＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２８５】
酢酸生成のための遺伝子配列（複数可）の別の非限定的な例を図４２Ｅに示す。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７１ａ１３（インドールアセトアルドキシムデヒドラターゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌナズナ由来のｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｎｉｔ１（ニトリラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌナズナ由来のｎｉｔ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｉａａＨ（インドールアセトアミドヒドロラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シュードモナス・サバスタノイ由来のｉａａＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌズナ由来のｃｙｐ７９Ｂ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌズナ由来のｃｙｐ７９Ｂ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｎｉｔ１および／またはｉａａＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌナズナ由来のｃｙｐ７９Ｂ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３およびｃｙｐ７１ａ１３ならびにｎｉｔ１および／またはｉａａＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３、ならびにｎｉｔ１および／またはｉａａＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、シロイヌナズナ由来のｃｙｐ７９Ｂ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３およびｃｙｐ７１ａ１３およびｎｉｔ１およびｉａａＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３およびｎｉｔ１およびｉａａＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２８６】
これらの実施形態のいずれにおいても、インドール酢酸を生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂおよび本明細書の他の部分に記載のように、１つ以上のトリプトファン生成酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および遺伝子欠失／または突然変異を任意で有する。いくつかの実施形態では、インドール酢酸を生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上の輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で含み、当該輸送体を通じてトリプトファンを取り込み輸送することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、インドール酢酸を生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列任意に有し、当該排出輸送体を介してトリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを排出することができる。
インドール−３−プロピオン酸（Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  （ＩＰＡ））
【０２８７】
一実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンからインドール−３−プロピオン酸を生成する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。図４３Ａおよび図４３Ｂは、インドール−３−プロピオン酸生成のための例示的な回路の模式図を示す。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンアンモニアリアーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ルブリヴィヴァックス・ベンゾアチリチカス（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｂｅｎｚｏａｔｉｌｙｔｉｃｕｓ）由来のトリプトファンアンモニアリアーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、インドール−３−アクリラートレダクターゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、クロストリジウム・ボツリヌム（ボツリヌス菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）由来のインドール−３−アクリラートレダクターゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンアンモニアリアーゼおよびインドール−３−アクリラートレダクターゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２８９】
図４５Ｅは、インドール−３−プロピオナート生成菌株の別の非限定的な例を示す。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ノストク・プンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）ＮＩＥＳ−２１０８由来のｔｒｐＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｆｌｄＡ（インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−ラクタートＣｏＡトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）由来のｆｌｄＡをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｆｌｄＢおよびｆｌｄＣ（インドール−３−ラクタートデヒドラターゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｆｌｄＢおよびｆｌｄＣＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｆｌｄＤ（インドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、クロストリジウム・スポロゲネス由来のｆｌｄＤをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＡｃｕＩ（アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＡｃｕＩをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｆｌｄＨ１（３−ラクタートデヒドロゲナーゼ１）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、クロストリジウム・スポロゲネス由来のｆｌｄＨ１（３−ラクタートデヒドロゲナーゼ１）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｆｌｄＨ２（インドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼ２）をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、クロストリジウム・スポロゲネス由来のｆｌｄＨ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｆｌｄＡおよび／またはｆｌｄＢおよび／またはｆｌＤおよび／またはｆｌｄＨ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｆｌｄＡおよび／またはｆｌｄＢおよび／またはｆｌＤおよび／またはｆｌｄＨ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態で���、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｆｌｄＡおよび／またはｆｌｄＢおよび／またはａｃｕｌおよび／またはｆｌｄＨ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｆｌｄＡおよび／またはｆｌｄＢおよび／またはａｃｕｌおよび／またはｆｌｄＨ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｆｌｄＡおよびｆｌｄＢおよびｆｌＤおよびｆｌｄＨ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｆｌｄＡおよびｆｌｄＢおよびｆｌＤおよびｆｌｄＨ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｆｌｄＡおよびｆｌｄＢおよびａｃｕｌおよびｆｌｄＨ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｆｌｄＡおよびｆｌｄＢおよびａｃｕｌおよびｆｌｄＨ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０２９０】
これらの実施形態のいずれにおいても、インドール−３−プロピオン酸を生成する遺伝学的に操作された細菌は、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂならびに本明細書の他の部分に記載のように、１つ以上のトリプトファン生成酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および遺伝子欠失／または突然変異を任意で有する。いくつかの実施形態では、インドール−３−プロピオン酸を生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上の輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意で含み、当該輸送体を通じてトリプトファンを取り込み輸送することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、インドール−３−プロピオン酸を生成する遺伝学的に操作された細菌はまた、本明細書に記載の排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列を任意に有し、当該排出輸送体を介してトリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを排出することができる。
【０２９１】
特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン代謝産物を生成する１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の異なるトリプトファン代謝産物をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。特定の実施形態では、細菌は、トリプトファン代謝産物を生成する１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を有し、当該トリプトファン代謝産物はトリプタミンおよび／またはインドール−３アセトアルデヒド、インドール−３−アセトニトリル、キヌレニン、キヌレン酸、インドール、インドール酢酸ＦＩＣＺ、インドール−３−プロピオン酸から選択されるものとする。
【０２９２】
これらの実施形態のいずれにおいても、インドールおよび他のトリプトファン代謝産物の生成遺伝子配列の発現は誘導性プロモーターの制御下にある。当該インドールおよび他のトリプトファン代謝産物には、トリプタミンおよび／またはインドール−３アセトアルデヒド、インドール−３−アセトニトリル、キヌレニン、キヌレン酸、インドール、インドール酢酸ＦＩＣＺ、インドール−３−プロピオン酸が含まれるが、これらに限定されない。生合成カセットの発現を制御しうる例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターが含まれる。
【０２９３】
インドール代謝産物／誘導体生成の例示的な回路を図４１Ａ〜図４１Ｈ、図４２Ａ〜図４２Ｅ、図４３Ａ〜図４３Ｂ、および図４５Ａ〜４５Ｅに示す。
【０２９４】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【０２９５】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表１３の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性のため、表１３の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片と同一のポリペプチドをコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表１３の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片または（遺伝暗号の冗長性のためであるが）表１３の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片と同一のポリペプチドをコードする核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。
【０２９６】
一実施形態では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の配列を含む。さらに別の実施形態では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の配列からなる。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、例えばトリプトファンアミノトランスフェラーゼカセットによって、トリプトファンをインドール−３−アルデヒドおよびインドール酢酸に変換する、１つ以上の遺伝子カセットを有する。遺伝学的に操作された細菌が発現する前記トリプトファンアミノトランスフェラーゼの非限定的な例を、表１４に示す。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、内因性または外因性輸送体を介してトリプトファンを取り込み、さらに、トリプトファンからインドール−３−アルデヒドおよびインドール酢酸を生成する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、任意で、トリプトファン排出輸送体および／またはインドール代謝産物排出輸送体を有する。
【表１４−１】
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【表１４−２】
2018532412.tif 000055
【０２９８】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表１４の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性のためであるが、表１４の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片と同一のポリペプチドをコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、表１４の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片または（遺伝暗号の冗長性のためであるが）表１４の１つ以上の核酸配列もしくはその機能的断片と同一のポリペプチドをコードする核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。
【０２９９】
一実施形態では、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の配列を含む。さらに別の実施形態では、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の配列からなる。
【０３００】
遺伝学的に操作された細菌は、インドール−３−アルデヒドおよび／またはインドール酢酸および／またはトリプタミンを生成するための任意の適切な遺伝子を有し得る。いくつかの実施形態では、例えば、安定性向上、インドール−３−アルデヒドおよび／またはインドール酢酸および／またはトリプタミン生成量の増加、および／または誘導条件下における抗炎症効能の増加のために、キヌレニン生成遺伝子の改変および／または変異導入を行う。いくつかの実施形態では、操作細菌はまた、トリプトファンの摂取または取り込みが増強されており、例えば、先に詳述したように、細菌細胞へのトリプトファン取り込みを増加させるための輸送体または他の機構を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌はまた、インドールトリプトファン代謝産物の排出輸送が増強されており、例えば、先に詳述したように、トリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための排出輸送体または他の機構を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関連する条件下で、インドール−３−アルデヒドおよび／またはインドール酢酸および／またはトリプタミンを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、特定の分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るもしくはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースの存在下で、キヌレニンを生成することができる。
【０３０１】
表１５に、本開示の遺伝学的に操作された細菌がコードする、前記酵素のポリペプチド配列を示す。
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【０３０２】
一実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９〜配列番号１２６の１つ以上の全配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９〜配列番号１２６の１つ以上の全配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９〜配列番号１２６の１つ以上の全配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９〜配列番号１２６の１つ以上の全配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９〜配列番号１２６の１つ以上の全配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９〜配列番号１２６の１つ以上の全配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９〜配列番号１２６の１つ以上の配列を含む。さらに別の実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９〜配列番号１２６の１つ以上の配列からなる。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンからトリプタミンを生成するための遺伝子カセットを有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、本明細書中で上述したように、内因性または外因性の輸送体を介してトリプトファンを取り込む。いくつかの実施形態では、細菌はさらにトリプトファンからトリプタミンを生成する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、任意で、トリプタミン排出輸送体を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、生成したインドール代謝産物の排出輸送を増加させるために、１つ以上のインドール代謝産物の排出輸送体を有する。
【０３０４】
インドール３−プロピオン酸（ＩＰＡ）
【０３０５】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、インドール−３−プロピオナート（ＩＰＡ）を生成するための遺伝子回路を少なくとも１つ有する。いくつかの実施形態では、インドール−３−プロピオナート生成菌株は、コリスマート前駆体からトリプトファンを任意で生成し、また、当該菌株は、本明細書に記載のトリプトファン生成および／またはトリプトファン取り込み／輸送のための追加回路を任意に有する。さらに、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ、ｆｌｄＡ、ｆｌｄＢおよびｆｌｄＣ、ｆｌｄＤおよび／またはＡｃｕＩ
からなる回路を有し、ｔｒｐＤＨは、トリプトファンから（インドール−３−イル）パイルベートを生成するトリプトファンデヒドロゲナーゼ（例えば、ノストク・プンクチフォルム  ＮＩＥＳ−２１０８由来）で、ｆｌｄＡは、インドール−３−ラクタートおよびインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡをインドール−３−プロピオン酸およびインドール−３−ラクタート−ＣｏＡに変換するインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−ラクタートＣｏＡトランスフェラーゼ（例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来）で、ｆｌｄＢおよびｆｌｄＣは、インドール−３−ラクタート−ＣｏＡをインドール−３−アクリリル−ＣｏＡに変換するインドール−３−ラクタートデヒドラターゼ（例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来）で、ｆｌｄＤはインドール−３−アクリリル−ＣｏＡをインドール３−プロピオニル−ＣｏＡに変換するインドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ（例えば、クロストリジウム・スポロゲネス由来）で、ＡｃｕＩはインドール−３−アクリリル−ＣｏＡをインドール３−プロピオニル−ＣｏＡに変換するアクリリル−ＣｏＡレダクターゼ（例えば、ロドバクター・スフェロイデス由来）である。当該回路には、（インドール−３−イル）パイルベートをインドール−３−ラクタートに変換するｆｌｄＨ１および／またはｆｌｄＨ２（インドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼ１および／または２、例えばクロストリジウム・スポロゲネス由来のもの）が、さらに含まれる（例えば、図４４を参照）。
【０３０６】
表１６は、インドール−３−プロピオナート産生細菌によってコードされる企図されたポリペプチド配列の非限定的な例を示す。
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【０３０７】
一実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号１２７〜配列番号１３３の１つ以上の全配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号１２７〜配列番号１３３の１つ以上の全配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号１２７〜配列番号１３３の１つ以上の全配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号１２７〜配列番号１３３の１つ以上の全配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号１２７〜配列番号１３３の１つ以上の全配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号１２７〜配列番号１３３の１つ以上の全配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号１２７〜配列番号１３３の１つ以上の配列を含む。さらに別の実施形態では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号１２７〜配列番号１３３の１つ以上の配列からなる。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンまたはトリプトファン代謝産物から、本明細書に記載の１つ以上のインドール経路代謝産物を生成するための遺伝子カセットを有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、本明細書中で上述したように、内因性または外因性の輸送体を介してトリプトファンを取り込む。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、本明細書に記載のいずれかの経路、例えば図３９、図４５Ａおよび図４５Ｂの経路によって、トリプトファンおよび／またはコリスマートをさらに生成する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、生成したインドール代謝産物の排出輸出を増加させるために、１つ以上のインドール代謝産物の排出輸送体を有する。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件、疾患もしくは組織特異的分子もしくは代謝産物の存在下、炎症もしくは炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、あるいは消化管内に存在し得るまたはし得ない他のいくつかの代謝産物、例えば、アラビノースまたはテトラサイクリンの存在下で、記載された任意の１つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載した回路の１つ以上が１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体の１つ以上の部位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、トリプトファン合成カセットおよび／またはトリプトファン異化カセットは、誘導性プロモーターの制御下にある。少なくとも１つ以上の配列の発現を制御し得る例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターが含まれる。
【０３１０】
また、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、記載された任意の１つ以上の回路をさらに発現することができ、さらに以下の１つ以上を有する：（１）１つ以上の栄養要求性、例えば当業者に公知であり本明細書に記載の栄養要求性のいずれか（例、ｔｈｙＡ栄養要求性）、（２）１つ以上のキルスイッチ回路、例えば本明細書に記載かあるいはそうでなければ当業者に公知のキルスイッチのいずれか、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）生物学的分子または基質の取り込み輸送を行う１つ以上の輸送体、例えば本明細書に記載あるいはそうでなければ当業者に公知の輸送体のいずれか、（５）生物学的分子または基質の排出輸送を行う１つ以上の排出輸送体、例えば本明細書に記載かあるいはそうでなければ当業者に公知の排出輸送体のいずれか、（６）１つ以上の分泌回路、例えば本明細書に記載されていて、そうでなければ当業者に公知の分泌回路のいずれか、および（７）前記追加回路の１つ以上の組み合わせ。
トリプトファンリプレッサー（ＴｒｐＲ）
【０３１１】
これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、当該リプレッサー機能を低下または消失させるように、任意に欠失、変異、または改変されうる。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスマートを生成するための遺伝子配列（複数可）、例えばａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣをコードする配列（複数可）を任意で有する。
トリプトファンおよびトリプトファン代謝物の輸送
【０３１２】
トリプトファンまたはＫＰ代謝産物の細胞内への輸送を増強するために、本発明の遺伝学的に操作された細菌において、代謝産物輸送体をさらに発現または改変することができる。
【０３１３】
ｙｄｄＧ遺伝子によってコードされる大腸菌の内膜タンパク質ＹｄｄＧは、既知のアミノ酸輸出輸送体ＲｈｔＡおよびＹｄｅＤのホモログである。研究により、ＹｄｄＧはトリプトファンを含む芳香族アミノ酸を排出輸送することができることが示されている。したがって、ＹｄｄＧは、トリプトファン排出輸送体またはトリプトファン分泌系（またはトリプトファン分泌タンパク質）として機能し得る。他の芳香族アミノ酸の排出輸送体ついては、Ｄｏｒｏｓｈｅｎｋｏら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、２７５：３１２−３１８（２００７年）に記載されている。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、任意でＹｄｄＧをコードする遺伝子配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ＹｄｄＧを過剰発現することができる。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｙｄｄＧ遺伝子の１つ以上のコピーを任意に有する。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、操作された微生物は、キヌレニンを局所環境から細胞内へ取り込む（輸送する）機構を有する。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニナーゼ分泌体をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏＰ、ｔｎａＢまたはｍｔｒ遺伝子の１つ以上のコピーを有する。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンの細胞への取り込みを促進する輸送体を有する。３つの透過酵素（パーミアーゼ）、Ｍｔｒ、ＴｎａＢおよびＡｒｏＰは、大腸菌のＬ−トリプトファンの取り込みに関与する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｍｔｒ、ＴｎａＢ、およびＡｒｏＰの１つ以上について、１つ以上のコピーを有する。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はまた、輸送体遺伝子の複数コピーを有する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、別の細菌種由来の輸送体遺伝子も有する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、別の細菌種由来の輸送体遺伝子の複数コピーを有する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌の天然輸送体遺伝子は改変されていない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は輸送体遺伝子を有し、当該輸送体遺伝子は天然プロモーター、誘導性プロモーター、または天然プロモーターよりも強力なプロモーター、例えばＧｌｎＲＳプロモーター、Ｐ（Ｂｌａ）プロモーター、もしくは構成的プロモーターによって制御される。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌の天然輸送体遺伝子は改変されず、天然輸送体遺伝子の１つ以上の追加コピーが誘導性プロモーターの制御下でゲノムに挿入される。当該誘導性プロモーターは、ペイロードの発現を制御するプロモーター、例えばＦＮＲプロモーターと同一であるか、またはペイロードの発現を制御するプロモーターもしくは構成的プロモーターと異なる。別の実施形態では、天然輸送体遺伝子は改変されず、別の細菌種由来の非天然輸送体遺伝子の１コピーが誘導性プロモーターの制御下でゲノムに挿入される。当該誘導性プロモーターは、ペイロードの発現を制御するプロモーター、例えばＦＮＲプロモーターと同一であるか、またはペイロードの発現を制御するプロモーターもしくは構成的プロモーターと異なる。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌の天然輸送体遺伝子は改変されず、天然輸送体遺伝子の１つ以上の追加コピーが誘導性プロモーターの制御下にある細菌内のプラスミド上に存在する。当該誘導性プロモーターは、ペイロードの発現を制御するプロモーター、例えばＦＮＲプロモーターと同一であるか、またはペイロードの発現を制御するプロモーターもしくは構成的プロモーターと異なる。別の実施形態では、天然輸送体遺伝子は改変されておらず、別の細菌種由来の非天然輸送体遺伝子の１コピーが細菌内のプラスミド上に存在し、誘導性プロモーターの制御下にある。当該誘導性プロモーターは、ペイロードの発現を制御するプロモーター、例えばＦＮＲプロモーターと同一であるか、またはペイロードの発現を制御するプロモーターもしくは構成的プロモーターと異なる。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、天然輸送体遺伝子に突然変異を誘発し、アンモニア輸送の増加を示す突然変異体を選択する。当該変異輸送体の遺伝子を単離し、遺伝学的に操作された細菌に挿入する。いくつかの実施形態では、天然輸送体遺伝子に突然変異を誘発し、アンモニア輸送の増加を示す突然変異体を選択し、当該突然変異体を使用して本発明の細菌を作製する。本明細書に記載の輸送体の改変は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は大腸菌ニッスルであり、大腸菌ニッスルの天然輸送体遺伝子は改変されない。天然の大腸菌ニッスルの輸送体遺伝子の１つ以上の追加コピーが、誘導性プロモーターの制御下で、大腸菌ニッスルのゲノムに挿入される。当該誘導性プロモーターは、ペイロードの発現を制御するプロモーター、例えばＦＮＲプロモーターと同一であるか、またはペイロードの発現を制御するプロモーターもしくは構成的プロモーターと異なる。代わりの実施形態では、大腸菌ニッスルの天然輸送体遺伝子は改変されず、別の細菌、例えばラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の非天然輸送体遺伝子の１コピーが、誘導性プロモーターの制御下で、大腸菌ニッスルのゲノムに挿入される。当該誘導性プロモーターは、ペイロードの発現を制御するプロモーター、例えばＦＮＲプロモーターと同一であるか、またはペイロードの発現を制御するプロモーターもしくは構成的プロモーターと異なる。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は大腸菌ニッスルであり、大腸菌ニッスルの天然輸送体遺伝子は改変されない。天然の大腸菌ニッスルの輸送体遺伝子の１つ以上の追加コピーが細菌内のプラスミド上で、誘導性プロモーターの制御下にあり、当該誘導性プロモーターは、ペイロードの発現を制御するプロモーター、例えばＦＮＲプロモーターと同一の誘導性プロモーター、またはペイロードの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターである。代わりの実施形態では、大腸菌ニッスルの天然輸送体遺伝子は改変されず、別の細菌、例えばラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の非天然輸送体遺伝子の１コピーが細菌内のプラスミド上で、誘導性プロモーターの制御下に存在する。当該誘導性プロモーターは、ペイロードの発現を制御するプロモーター（例えばＦＮＲプロモーター）と同一の誘導性プロモーター、またはペイロードの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターである。
分泌ポリペプチド
ＩＬ−１０
【０３２２】
いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０を産生することができる。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、クラス２サイトカインで、サイトカイン、インターフェロン、およびインターフェロン様分子、たとえば、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＬ−２９、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ω、およびリミチン（ｌｉｍｉｔｉｎ）などのようなものを含むカテゴリーにある。ＩＬ−１０は、二の受容体、ＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−１０Ｒ２を通してシグナル伝達する抗炎症性サイトカインである。ヒトＩＬ−１０の抗炎症特性には、炎症誘発性サイトカインのダウンレギュレーション、樹状細胞上の抗原提示の阻害または主要組織適合性複合体発現の抑制が含まれる。ＩＬ−１０および／またはその受容体の欠損は、ＩＢＤおよび腸の感受性と関連する（Ｎｉｅｌｓｅｎ（ニールセン）、２０１４）。ＩＬ−１０またはプロテアーゼインヒビターを発現する細菌は、たとえば、クローン病および潰瘍性結腸炎などのような状態を改善し得る（Ｓｉｍｐｓｏｎ（シンプソン）ら、２０１４）。遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０をコードする任意の適切な遺伝子、例は、ヒトＩＬ−１０を含み得る。いくらかの実施態様において、ＩＬ−１０をコードする遺伝子は、誘導条件下で安定性を増強し、ＩＬ−１０産生を増加させ、および／または抗炎症効力を増加させるために、修飾および／または変異される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下でＩＬ−１０を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でＩＬ−１０を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−１０をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号１３４またはその機能的フラグメントを含む核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号４９またはその機能的フラグメントの核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【表１７】
2018532412.tif 000066
【０３２３】
野生型ＩＬ−１０（ｗｔＩＬ−１０）はドメインスワップ二量体であり、当該構造の維持は２本のペプチド鎖の二量体化に依存している。当該ドメイン間でスワップされた二次構造要素をつなぐループに６アミノ酸を挿入することにより、野生型ＩＬ−１０を単量体アイソマーに変換した（例えば、Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ、Ｋ．ら、「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｍｏｎｏｍｅｒ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年、２７５巻、１３５５２−１３５５７頁、およびＹｏｏｎ、ＳＩら、「Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ  ＩＬ−１０  Ｅｎｇａｇｅｓ  ＩＬ−１０Ｒ１  ｂｙ  ａ  Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２年、２８７巻、２６５８６−２６５９５頁を参照）。したがって、単量体ＩＬ−１０のリンカーは、野性型ヒトＩＬ１−１０と配列が異なる短いリンカーを有する。当該リンカーが原因となり、ＩＬ１０は二量体ではなく単量体として活性を示すようになる（例えば、Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ、Ｋ．ら、「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｍｏｎｏｍｅｒ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年、２７５巻、１３５５２−１３５５７頁、およびＹｏｏｎ、Ｓ．Ｉ．ら、「Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ  ＩＬ−１０  Ｅｎｇａｇｅｓ  ＩＬ−１０Ｒ１  ｂｙ  ａ  Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２年、２８７巻、２６５８６−２６５９５頁を参照）。
【０３２４】
単量体タンパク質の分泌には、ペリプラズム空間における二量体化という余分なステップを回避するという点で、利点が存在し得る。さらに、適切な分泌系を選択する上で、より融通が利きやすい。例えば、ｔａｔ依存性分泌系では、ポリペプチドは折れ畳まれた状態で分泌される。二量体は、ジスルフィド結合が形成されないと正確に折りたたまれない。しかしながら、ジスルフィド結合は、還元的な細胞内環境では形成されず、ペリプラズムの酸化的環境が必要とされる。したがって、適切に機能するために二量体化を必要とするタンパク質の分泌には、ｔａｔ依存性系は適切ではない可能性がある。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、単量体ヒトＩＬ−１０を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例えば炎症に関連する条件（複数可）下で、単量体ＩＬ−１０を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で単量体ＩＬ−１０を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、単量体ＩＬ−１０をコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１９８またはその機能的断片を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１９８またはその機能的断片を含む核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１９８またはその断片もしくは機能性変異体によってコードされるポリペプチドをコードする配列を有する。いくつかの実施形態では、細菌が発現する単量体ＩＬ−１０によって、ＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−１０Ｒ２が刺激され、シグナル伝達が開始される。当該シグナル伝達には、例えばＴｙｒ７０５および／またはＳｅｒ７２７のリン酸化を介した、Ｓｔａｔシグナル伝達が含まれる。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ウイルスＩＬ−１０を生成することができる。細菌がコードする例示的なウイルスＩＬ−１０ホモログには、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ＩＬ−１０およびエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ−１０が含まれる。ヒトＩＬ−１０は、抗炎症効果の他に、炎症促進活性、例えばＢ細胞の成熟およびナチュラルキラー細胞の増殖を刺激する活性も有する（Ｆｏｅｒｓｔｅｒら、「Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  Ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖｉａ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｅｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．」、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年；１３巻：８２、およびその参考文献を参照）。対照的に、ウイルスＩＬ−１０ホモログは、ｈＩＬ−１０と多くの生物学的活性を共有するものの、ウイルスの進化中の選択圧および宿主免疫系を回避する必要性の結果、安定性の増加および免疫賦活作用の欠如を含むユニークな形質を示す（Ｆｏｅｒｓｔｅｒら、およびその中の参考文献）。かくして、ウイルスＩＬ−１０ホモログは有用であり、抗炎症性および／または免疫抑制効果に関しては、おそらくｈＩＬ−１０よりも有効であり得る。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例えば炎症に関連する条件（複数可）下で、ウイルスＩＬ−１０を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でウイルスＩＬ−１０を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ウイルスＩＬ−１０をコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１９３および／または配列番号１９４またはその機能的断片を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１９３および／または配列番号１９４またはその機能的断片を含む核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細菌が発現するウイルスｄ  ＩＬ−１０によって、ＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−１０Ｒ２が刺激され、シグナル伝達が開始される。シグナル伝達には、例えばＴｙｒ７０５および／またはＳｅｒ７２７のリン酸化を介した、Ｓｔａｔシグナル伝達が含まれる。
ＩＬ−２
【０３２８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−２を産生することができる。インターロイキン２（ＩＬ−２）は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のヘルス（健全性）を維持することによって自己免疫を媒介する。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｆｏｘｐ３を発現するものを含み、典型的には、自己抗原に対して活性であるエフェクターＴ細胞を抑制し、およびその際、自己免疫活性を低下させる可能性がある。ＩＬ−２はＴｒｅｇ細胞の分化および活性を増強するためのサイトカインとして機能するが、一方で減少したＩＬ−２活性は自己免疫事象を促進することができる。ＩＬ−２は活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞によって、および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、活性化樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびＮＫ  Ｔ細胞を含む他の免疫メディエーターによって生じる。ＩＬ−２は、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、およびＣＤ１３２が含まれる三つの鎖から構成されるＩＬ−２Ｒに結合する。ＩＬ−２は、胸腺におけるＴｒｅｇ細胞の増殖を促進する一方、全身循環におけるそれらの機能および活性を維持する。Ｔｒｅｇ細胞活性はＩＢＤ設定において複雑な役割を果たすと共に、マウスの研究は疾病病因（疾病病理発生とも言う）における保護的役割を示唆する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３５またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３５またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下でＩＬ−２を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でＩＬ−２を産生することができる。
【表１８】
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【０３２９】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−２２を産生することができる。インターロイキン２２（ＩＬ−２２）サイトカインは、樹状細胞、リンパ系組織インデューサー様細胞、ナチュラルキラー細胞によって産生され、および適応リンパ球上に発現されることができる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の開始を通して、ＩＬ−２２発現は、抗微生物化合物の発現ならびに細胞増殖関連経路のある範囲を誘発することができ、双方とも組織修復機構を増強する。ＩＬ−２２は、腸バリアのフィデリティー（忠実度とも言う）および治癒を促進しながら、炎症状態を調節する上で重要である。マウスモデルはＩＬ−２２の施与後に改善された腸炎症状態を実証した。また、ＩＬ−２２はＳＴＡＴ３シグナル伝達を活性化して高められた粘液産生を促進し、バリア機能を保持する。ＩＢＤ感受性遺伝子とのＩＬ−２２の関連は、同様に疾患の表現型発現を調節し得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３６またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３６またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、ＩＬ−２２を産生することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でＩＬ−２２を産生することができる。
【表１９】
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【０３３０】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−２７を産生することができる。インターロイキン２７（ＩＬ−２７）サイトカインは、活性化抗原提示細胞によって主に発現される一方、ＩＬ−２７受容体は、中でもＴ細胞、ＮＫ細胞などを含め、ある細胞の範囲に見出される。特に、ＩＬ−２７は、炎症促進性Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞の発生を抑制し、これはＩＢＤ病因において重要な役割を果たす。さらに、ＩＬ−２７はＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の分化を促進し、およびＩＬ−１０産生量を高めることができ、それらの双方は抗炎症効果を有する。ＩＬ−２７は腸上皮細胞内のＭＡＰＫおよびＳＴＡＴシグナル伝達の活性化を介して、上皮バリア機能に対する保護効果を有する。さらに、ＩＬ−２７は、細菌増殖を抑える抗菌タンパク質の産生を増強する。バリア機能での改善および細菌増殖の減少はＩＢＤ病因におけるＩＬ−２７についての好ましい役割を示唆する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３７またはその機能的フラグメント（機能的断片とも言う）をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３７またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、ＩＬ−２７を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でＩＬ−２７を産生することができる。
【表２０】
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【０３３１】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はＳＯＤを産生することができる。増加したＲＯＳレベルは炎症性腸疾患の病態生理に寄与する。増加したＲＯＳレベルは、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の高められた発現を導くことがあり、それは、炎症性メディエーターの疾病患部組織への転換を促すことができ、およびより一層大きな程度の炎症負荷をもたらす。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を含む抗酸化システムは、全体のＲＯＳ負荷を軽減するように機能することができる。しかし、研究は、ＩＢＤの設定におけるＳＯＤの発現が損なわれ、例えば、ＩＢＤにおいてより一層低いレベルで産生され、それにより疾患病状が進行されることを示す。さらなる研究は、大腸炎モデル内でラットにＳＯＤを補給することは、結腸脂質過酸化および内皮ＶＣＡＭ−１発現の減少ならびに炎症環境の全体的な改善に関連することを示した。したがって、いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号１３８またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３８またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例えば、炎症に関連する状態（群）の下で、ＳＯＤを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でＳＯＤを産生することができる。
【表２１】
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【０３３２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＧＬＰ−２またはプログルカゴンを産生することができる。グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）は、腸内分泌細胞によって産生され、腸の成長を刺激し、および消化管バリア機能を増強する。  ＧＬＰ−２施与は、ＩＢＤ、短腸症候群、および小腸腸炎の処置において治療上の可能性を有する（Ｙａｚｂｅｃｋ（ヤズベック）ら、２００９）。遺伝学的に操作された細菌は、ＧＬＰ−２またはプログルカゴンをコードする任意の適切な遺伝子、例は、ヒトＧＬＰ−２またはプログルカゴンを含み得る。いくらかの実施態様において、プロテアーゼインヒビター（抑制剤、阻害剤とも言う）、例は、ジペプチジルペプチダーゼの阻害剤もＧＬＰ−２分解を減少させるために施与される。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、分解耐性ＧＬＰ−２類似体、例は、Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ（テデュグルチド）（Ｙａｚｂｅｃｋら、２００９）を発現する。いくらかの実施態様では、ＧＬＰ−２またはプログルカゴンをコードする遺伝子は、例は、安定性を増強し、ＧＬＰ−２産生を増加させ、および／または誘導条件下で消化管バリア増強効力を増加させるために、改変および／変異される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下でＧＬＰ−２またはプログルカゴンを産生することができる。ネズミモデルのＩＢＤにおけるＧＬＰ−２施与は、たとえば、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γなどのような炎症性メディエーターでの減少だけでなく、粘膜損傷および炎症の減少に関連する。さらに、ＧＬＰ−２補充はまた、大腸炎／回腸炎モデルにおいて粘膜ミエロペルオキシダーゼの減少をもたらし得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号１３９またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３９またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、ＧＬＰ−２を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でＧＬＰ−２を産生することができる。
【表２２】
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【０３３３】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ガテックス（Ｇａｔｔｅｘ）およびテデュグルチド（ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ）を含むがこれらに限定されないＧＬＰ−２アナログを生成することができる。テデュグルチドは、ＧＬＰ−２のプロテアーゼ耐性アナログである。テデュグルチドは３３アミノ酸残基からなり、ＧＬＰ−２とは１アミノ酸だけ異なる（アラニンがグリシンで置換されている）。当該置換の意義は、テデュグルチドが内在性ＧＬＰ−２よりも、ジペプチジルペプチダーゼ−４によるタンパク質分解に対して高い抵抗性を示し、その結果、作用期間がより長くなるという点にある。
【表２３】
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【０３３４】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１４０またはその機能的断片をコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１４０またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例えば炎症に関連する条件（複数可）下で、テデュグルチドを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でテデュグルチドを生成することができる。
ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、および／またはＩＬ−２４
【０３３５】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、および／またはＩＬ−２４を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下、例えば炎症に関連する条件下で、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、および／またはＩＬ−２４を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０および／またはＩＬ−２４を生成することができる。
炎症誘発性分子の阻害
【０３３６】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、炎症誘発性分子を抑制することが可能な分子を産生することができる。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切な抑制分子、例は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを発現してよく、それは、一以上の炎症誘発性分子、例は、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２６、ＩＬ−３２、アラキドン酸、プロスタグランジン（例は、ＰＧＥ２）セロトニン、トロンボキサン（例は、ＴＸＡ２）、ロイコトリエン（例は、ＬＴＢ４）、ヘポキシリン（ｈｅｐｏｘｉｌｌｉｎ）Ａ３、またはケモカインを中和することができる（Ｋｅａｔｅｓ（キートス）ら、２００８；Ａｈｍａｄ（アフマド）ら、２０１２）。遺伝学的に操作された細菌は、一以上の炎症促進性分子、例は、ＴＮＦ、ＩＬ−１７を抑制し得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、表２４に示される一以上の分子を調節することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は一以上の炎症分子を抑制、除去、分解、および／または代謝することができる。
【表２４−１】
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【表２４−２】
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【０３３７】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生し、およびさらに炎症分子を阻害することができる分子を産生することができる。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生し、さらに炎症分子を分解することができる酵素を産生することができる。たとえば、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ブチラートを産生するための遺伝子カセット、ならびに炎症分子、例は、ＰＧＥ２を阻害、除去、分解、および／または代謝するための分子または生合成経路を発現することができる。
ＲＮＡｉ、ｓｃＦＶ、他の機構
【０３３８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、植物および動物における転写後遺伝子サイレンシング機構である。ＲＮＡｉは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）がショート干渉（低分子干渉とも言う）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖にプロセシングされるとき活性化される（Ｋｅａｔｅｓ（キーツ）ら、２００８）。ＲＮＡｉは、標的細胞、たとえば、哺乳類細胞のようなものに対するｓｈＲＮＡの製造および配送のために設計される非病原性細菌によってインビトロおよびインビボで活性化されうる（Ｋｅａｔｅｓら、２００８）。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で一以上の炎症促進性分子のＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを誘導する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、低酸素条件下でＴＮＦを標的とするｓｉＲＮＡを産生する。
【０３３９】
一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、「ｗｉｄｅｌｙ  ｕｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ…  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ（原核生物において産生される広く用いられる抗体断片）」である（Ｆｒｅｎｚｅｌ（フレンゼル）ら、２０１３）。ｓｃＦｖは、伝統的な抗体の定常ドメインを欠き、および単一のペプチドとして抗原結合ドメインを発現する。細菌、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどのようなものは、炎症促進性サイトカイン、たとえば、ＴＮＦを標的とするｓｃＦｖを産生することができる（Ｈｒｉｓｔｏｄｏｒｏｖ（フリストドロフ）ら、２０１４）。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で一以上の炎症促進性分子を中和するための結合タンパク質を発現する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は低酸素条件下でＴＮＦを標的とするｓｃＦｖを産生する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下で一以上の炎症促進性分子を標的とするｓｃＦｖおよびｓｉＲＮＡの両方を産生する（例は、Ｘｉａｏ（シャオ）ら、２０１４参照）。
【０３４０】
当業者は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる追加の遺伝子および遺伝子カセットが当該技術で知られ、および本発明の遺伝学的に操作された細菌によって発現され得ることを理解するであろう。いくらかの実施態様において、治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、治療上分子の発現を増強するために、さらなる転写および翻訳エレメント、たとえば、リボソーム結合部位をも含む。
【０３４１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、二以上の抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生する。一定の実施態様において、二以上の分子は、消化管炎症を減少させるために、および／または消化管バリア機能を強化するために、相乗的に挙動する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、少なくとも一の抗炎症分子および少なくとも一の消化管バリア機能エンハンサー分子を発現する。一定の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０およびＧＬＰ−２を発現する。別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−１０およびブチラートを発現する。
【０３４２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、プロピオナート、およびブチラートを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびブチラートを産生することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ブチラート、およびプロピオナートを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＧＬＰ−２、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＳＯＤ、ブチラート、およびプロピオナートを産生可能である。治療上分子の任意の適切な組合せは遺伝学的に操作された細菌によって産生され得る。
アミノ酸輸送能の向上した細菌株の作製
【０３４３】
培養の容易さ、短い世代時間、極めて高い集団密度および小さいゲノムのため、微生物は短縮されたタイムスケールで固有の表現型に進化することができる。適応実験室進化（ＡＬＥ）は、好ましい表現型の菌株に進化させるために、選択圧下で微生物を継代する方法である。最も一般的には、ＡＬＥは、炭素／エネルギー源の利用を増やすため、または環境ストレス（例えば、温度、ｐＨ）に菌株を適応させるために適用される。集団内において、炭素基質の存在下またはストレス下における増殖能力が高い突然変異菌株は、適応性のより低い菌株を打ち負かし、最終的には集団を支配するようになるであろう。
【０３４４】
栄養要求体を作製することによって、この同じ方法を、任意の必須代謝産物に拡張することができる。栄養要求体は、必須代謝産物を合成することができない菌株であり、したがって、増殖するためには培地に代謝産物を供給しなければならない。筋書き通りにいくとすると、栄養要求体を作製し、代謝産物の量を減少させながら継代させると、その結果得られる優性株は、当該必須代謝産物を獲得して取り込む能力がより優れているはずである。
【０３４５】
例えば、特定のアミノ酸を生成するための生合成経路が破壊された場合、ＡＬＥによって、当該アミノ酸の高親和性捕捉が可能な菌株に進化させることができる。まず、増殖を支持するための最小濃度が確立されるまで、様々な濃度の栄養要求性アミノ酸中で菌株を増殖させる。次いで、菌株をその最低濃度で継代させ、定期的な間隔で希釈して、漸減アミノ酸濃度にする。時が経つにつれて、当該アミノ酸について−増殖制限濃度で−最も競争力の高い細胞が集団を支配するようになる。これらの菌株は、当該アミノ酸の輸送体中に突然変異を有し、その結果、必須および制限アミノ酸を取り込む能力が増大している可能性が高い。
【０３４６】
同様に、上流の代謝産物からアミノ酸を作ることができない栄養要求体を用いることにより、菌株を進化させて、上流の代謝産物をより効率的に取り込むだけでなく、代謝産物を必須の下流代謝産物に変換可能にすることができる。当該菌株は、上流の代謝産物の取り込みを増やすための突然変異を生じるであろうが、下流の酵素の発現または反応速度を増大させるための突然変異、または競合する基質利用経路を減少させるための突然変異も含有し得る。
【０３４７】
微生物に固有の代謝産物は、その内在性代謝産物の増殖制限性補給で作動される突然変異的栄養要求性および選択により必須のものにされ得る。しかし、非天然化合物を消費することができる表現型を、それらの消費を必須化合物の生成に結びつけることにより、進化させることができる。例えば、必須化合物または必須化合物の前駆体を生成することができる異なる生物からの遺伝子を単離した場合、この遺伝子を異種宿主に組換え導入し、その異種宿主において発現させることができる。この新たな宿主菌株には以前は代謝できなかった基質から必須栄養素を合成する能力が今ではあることになる。
【０３４８】
これにより、直ぐ下流の代謝産物を変換することができない栄養要求体を作出し、組換え酵素の同時発現とともに増殖制限量の非天然化合物中で選択することにより、同様のＡＬＥ方法を適用することができる。この結果、非天然基質の輸送、異種酵素の発現および活性、ならびに下流の天然酵素の発現および活性において、突然変異が生じる。強調すべきは、このプロセスにおける肝要な要件が、非天然代謝産物の消費を増殖に必須の代謝産物の生成に結びつける能力であることである。
【０３４９】
選択機構の基礎を確立し、最小補給レベルが確定したら、実際のＡＬＥ実験に取りかかることができる。このプロセスを通して、いくつかのパラメーターを注意深くモニターしなければならない。重要なのは、培養物を指数増殖期で維持し、飽和／定常期に到達させないことである。これは、各継代中に増殖速度をチェックし、それに応じてその後の希釈度を調整しなければならないことを意味する。希釈率が大きくなる程度に成長率が向上すれば、栄養補給の濃度を低下させて、増殖速度を遅くし、選択圧を高め、継代中に部分集団を大きく偏らせるほどの希釈はしないようにすべきである。さらに、定期的な間隔で、細胞を希釈し、固形培地で増殖させ、個々のクローンを試験してＡＬＥ培養物で観察された増殖速度表現型を確認すべきである。
【０３５０】
中断するタイミングを予測して、ＡＬＥ実験の停止にも警戒する必要がある。進化を方向づけることの成功は、実験を通して「スクリーニングされる」突然変異の数に直接関係しており、突然変異は、一般に、ＤＮＡ複製中のエラーの関数であるので、累積細胞分裂数（ＣＣＤ）は、スクリーニングされた全突然変異体数の代わりとして動作する。以前の研究により、異なる炭素源を用いる増殖に有益な表現型を約１０１１．２ＣＣＤ１で単離することができることが示された。この速度は、ＤＮＡ複製エラー増加を引き起こす−Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの−化学的突然変異誘発剤の培地への添加により、加速させることができる。しかし、連続継代の結果、増殖速度の向上がほとんどまたは全くなくなると、集団は、最大適応度に収束し、ＡＬＥ実験は中断され得る。
【０３５１】
ＡＬＥ実験の終わりに、細胞を希釈し、固形培地上で単離し、培養フラスコのものにマッチする増殖表現型についてアッセイするべきである。次いで、選択されたものから最も性能のよいものがゲノムＤＮＡ用に調製され、全ゲノム配列決定に送られる。配列決定は、向上した表現型をもたらすことができるゲノムの周囲に存在する突然変異を明らかにすることになるが、サイレント突然変異（恩恵をもたらさないが、所望の表現型を損なわないもの）も含有することになる。ＮＴＧまたは他の化学的突然変異誘発要因の存在下で進化させた培養物には、それよりサイレント性が有意に高いバックグラウンド突然変異が存在することになる。その現状で最も性能の良い菌株に納得がいけば、使用者は、その菌株での応用に進むことができる。そうでなければ、ゲノム操作技術により親菌株に突然変異を再導入することにより、進化菌株から寄与突然変異をデコンボリュートすることができる。例えば、Ｌｅｅ，Ｄ．−Ｈ．、Ｆｅｉｓｔ，Ａ．Ｍ．、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃ．Ｌ．およびＰａｌｓｓｏｎ，Ｂ．ＯＥ．、Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  Ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ  Ｔｉｍｅｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６、ｅ２６１７２（２０１１年）を参照されたい。
【０３５２】
同様の方法を用いて、トリプトファンの消費または取り込みを行う大腸菌ニッスル変異体を作製することができる。
誘導性調節領域
ＦＮＲ依存性調節
【０３５３】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターを有する。特定の実施形態では、細菌細胞は、ペイロード生成のための１つ以上の遺伝子配列を有する。本明細書で使用される場合、「ペイロード」という用語は、例えば、ラクタート、プロピオナート、アセタート、ＩＬ１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４、ＩＬ−１９、ＳＯＤ、ＧＬＰ２、および／またはトリプトファンおよび／またはそれらの代謝産物を含むが、これらに限定されない１つ以上の抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を意味する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、フマレートおよびナイトレートレダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下で発現する。特定の実施形態では、細菌細胞は、ペイロード（例えば、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子）の生成のための遺伝子配列を１つ以上有し、当該ペイロードはフマレートおよびナイトレートレダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下で発現する。特定の実施形態では、細菌細胞は、ペイロード生成のための遺伝子配列を１つ以上有し、当該遺伝子配列は、低酸素性、微好気性または嫌気性条件下で治療分子を発現するように、酸素レベル依存性プロモーターに作動可能に連結している。例えば、低酸素状態では、酸素レベル依存性プロモーターが対応する酸素レベル感知転写調節因子によって活性化され、それによって治療分子（複数可）の生成が促進される。一定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための１つ以上の遺伝子配列を有し、当該分子はそれぞれ転写因子ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲによって調節可能なフマレートおよびナイトレートレダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーター、アルギニンデイミナーゼ（ｄｅｉｍｉｎｉａｓｅ）およびナイトレート還元（ＡＮＲ）応答性プロモーターの嫌気的調節、または異化型硝酸呼吸調節因子（ＤＮＲ）応答性プロモーターの制御下で発現する。大腸菌では、ＦＮＲは、好気的代謝から嫌気的代謝への切り替えを制御する主要な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅｎら、１９９７）。嫌気的状態では、ＦＮＲは二量体を形成し、嫌気性増殖への適応に関与する数百もの遺伝子を活性化する活性ＤＮＡ結合タンパク質になる。好気的状態では、ＦＮＲは、酸素によって二量体化を妨げられ、不活性である。
【０３５４】
ＦＮＲ応答性プロモーターには、以下の表に列挙するＦＮＲ応答性プロモーターが含まれるが、これに限定されない。下線を付した配列は予想されるリボソーム結合部位であり、太字の配列はクローニングに使用される制限部位である。
【表２５】
2018532412.tif 000075
【０３５５】
１つの実施態様において、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１４１を含む。別の実施態様において、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１４２を含む。別の実施態様において、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１４３を含む。別の実施態様において、ＦＮＲ応答性プロモーターは配列番号１４４を含む。さらに別の実施態様では、ＦＮＲ応答性プロモーターは配列番号１４５を含む。さらなるＦＮＲ応答性プロモーターを以下に示す。
【表２６−１】
2018532412.tif 000076
【表２６−２】
2018532412.tif 000077
【表２６−３】
2018532412.tif 000078
【０３５６】
いくつかの実施態様では、遺伝子発現は、例えばリボソーム結合部位の最適化および／またはｍＲＮＡ安定性の増加など、当該分野で公知の方法によってさらに最適化される。ＦＮＲプロモーター配列は当該技術で知られ、および任意の適切なＦＮＲプロモーター配列（群）を本発明の遺伝学的に操作された細菌に使用することができる。任意の適切なＦＮＲプロモーターを、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための任意の適切な遺伝子または遺伝子カセットと組み合わせてもよい。非制限的なＦＮＲプロモーター配列は表２６に提供される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、以下の一以上を含む：配列番号１４６、配列番号１４７、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号１４８）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号１４９）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号１５０）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号１５１）、強いリボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号１５２）、強力なリボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター（配列番号１５３）、ｆｎｒＳ、嫌気的に誘導された低分子ＲＮＡ遺伝子（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号１５４またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号１５５）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号１５６）、およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番号１５７）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６または１５７、またはそれらの機能的断片のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、複数の異なるＦＮＲ核酸配列が遺伝学的に操作された細菌に挿入される。代わりの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７）の制御下で発現する、ペイロード（複数可）を産生するための１つ以上の遺伝子を含む。これらの実施形態では、ペイロードの発現は、低酸素または嫌気的環境において、例えば消化管内で、とりわけ活性化される。一実施形態では、哺乳動物の消化管は、ヒトの消化管である。
【０３５８】
他の実施形態では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成する１つ以上の遺伝子配列は、酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現し、当該プロモーターは、転写活性化因子（例えば、ＣＲＰ）の結合部位に融合している。ＣＲＰ（環状ＡＭＰ受容体タンパク質または異化代謝産物活性化タンパク質もしくはＣＡＰ）は、グルコースのような迅速代謝性炭水化物が存在する場合にさほど有益でない炭素源の取込み、代謝および同化に関与する遺伝子を抑制することによって細菌における調節における主要な役割を果たす（Ｗｕら、２０１５）。このグルコースに対する選択は、グルコース抑制ならびに炭素異化代謝産物抑制と呼ばれている（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、２００８；ＧｏｒｋｅおよびＳｔｕｌｋｅ、２００８）。いくつかの実施形態では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子の生成遺伝子または生成遺伝子カセットは、ＣＲＰ結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成する１つ以上の遺伝子配列は、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲプロモーターによって制御される。これらの実施形態では、グルコースが環境中に存在しない場合、環状ＡＭＰがＣＲＰに結合する。この結合が、ＣＲＰのコンホメーション変化を引き起こし、その結果、ＣＲＰがＣＲＰ結合部位に強固に結合することが可能になる。ＣＲＰの結合は、次いで、直接的なタンパク質間相互作用によりＲＮＡポリメラーゼをＦＮＲプロモーターにリクルートすることによって、遺伝子または遺伝子カセットの転写を活性化する。グルコースの存在下では、環状ＡＭＰはＣＲＰに結合せず、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成する遺伝子または遺伝子カセットの転写は抑制される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子の結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）を用いることにより、十分な量のグルコースが存在する場合（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖培地へのグルコース添加によって）、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子の生成遺伝子または生成遺伝子カセットが嫌気性条件下で発現しないことを確実にする。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株由来の酸素レベル依存性プロモーターを有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来の酸素レベル感知転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲを有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、異なる細菌種、菌株、または亜株由来の酸素レベル感知転写因子、および対応するプロモーターを有する。異種酸素レベル依存性転写調節因子および／またはプロモーターは、同じ条件下の細菌におけるネイティブ遺伝子（複数可）およびプロモーターと比較して、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えば、低酸素または嫌気的環境でペイロードを生成するための１つ以上の遺伝子配列の転写を増加させる。特定の実施形態では、非天然酸素レベル依存性転写調節因子は、淋菌（Ｎ．Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に由来するＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１を参照）。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、完全なままであり、野生型活性を保持する。代わりの実施形態では、対応する野生型転写調節因子を欠失または突然変異させて、野生型活性を低減または消失させる。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲ、および同じサブタイプの細菌に由来する野生型プロモーターと比べて突然変異している対応するプロモーターを含む。突然変異プロモーターは、同じ条件下の野生型プロモーターと比較して、野生型転写調節因子への結合を増強させ、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子の転写を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲプロモーター、および同じサブタイプの細菌に由来する野生型転写調節因子と比べて突然変異している対応する転写調節因子を含む。変異転写調節因子は、同じ条件下の野生型転写調節因子と比較して、低酸素または嫌気的環境において、野生型プロモーターへの結合を増強させ、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子の転写を増加させる。特定の実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化およびＦＮＲ活性を増加させるアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２００６参照）。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子および対応するプロモーターの両方が、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子の発現を低酸素条件下で増加させるために、同じサブタイプの細菌由来の野生型配列に対して変異される。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示する細菌細胞は、酸素レベル感知転写調節因子をコードする内在性遺伝子、例えばＦＮＲ遺伝子、の複数のコピーを有する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上のその遺伝子配列は、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上の遺伝子配列は、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上の遺伝子配列は、同じプラスミド上に存在する。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロード（複数可）を生成する１つ以上の遺伝子配列は、別々の染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロード（複数可）を生成する１つ以上の遺伝子配列は、同じ染色体上に存在する。
【０３６３】
いくつかの例では、発現安定性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上の遺伝子配列の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上の遺伝子配列の発現を制御するプロモーターと同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子およびペイロード（複数可）は、プロモーター領域から分岐して転写される。
【０３６４】
いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットはプラスミド上に存在し、および低酸素条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは染色体において存在し、および低酸素条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様において、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、発現は、例えば、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることなど、当技術分野で公知の方法によってさらに最適化される。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、安定に維持されたプラスミドまたは染色体を有し、当該プラスミドまたは染色体には、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成可能な遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）が存在する。前記の遺伝子または遺伝子カセットは宿主細胞内で発現することができ、その結果、宿主細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、培地中）および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、消化管内）で、生存および／または増殖することができる。いくらかの実施態様において、細菌は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを含み得る。いくらかの実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットは低コピープラスミドにて発現される。いくらかの実施態様において、低コピープラスミドは発現の安定性を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様では、低コピープラスミドは非誘導条件下で漏出性発現（ｌｅａｋｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を減少させるために有用であり得る。いくらかの実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットは高コピープラスミドで発現される。いくらかの実施態様において、高コピープラスミドは遺伝子または遺伝子カセット発現を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットは染色体上に発現される。
【０３６６】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）の複数のコピーを含み得る。いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）はプラスミド上に存在し、および酸素レベル依存性プロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は染色体において存在し、および酸素レベル依存性プロモーターに作動可能に連結される。
【０３６７】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で少なくとも一の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生して、局所消化管炎症を、同じ条件下同じサブタイプの未修飾細菌と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍だけ減少させる。炎症は、当技術で知られる方法、例は、内視鏡検査を用いて病変の病巣を計数すること；末梢血におけるＴ制御細胞の分化を、例は、蛍光活性化選別によって検出すること；Ｔ調節細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の領域を測定すること；炎症性バイオマーカーを、例は、ｑＰＣＲによってアッセイすること；ＰＣＲアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および／またはサイトカインアッセイキットによって測定し得る（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｑｉａｇｅｎ）（メソスケール、ケイマン・ケミカル、キアゲン）。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のペイロード、例えば、低酸素条件の１つ以上の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子について、同じ条件下の同じサブタイプの非改変細菌よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍多く生成する。特定の非改変細菌は、検出可能なレベルの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を有さないであろう。これらの細菌の遺伝子改変型を使用する実施形態では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は低酸素条件下で検出可能であろう。
【０３６９】
特定の実施形態では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はブチラートである。ブチラートレベルの測定方法、例えば、質量分析、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるものは、当該技術分野において公知である（例えば、Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３を参照）。いくつかの実施形態では、ブチラートはブチラートレベル／細菌光学密度（ＯＤ）として測定される。いくつかの実施形態では、ブチロジーニック遺伝子カセットでの１つ以上の遺伝子産物の活性および／または発現を測定することは、ブチラート生成のプロキシ測定として役立つ。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞を収集し、溶解させてブチラート生成を測定する。代わりの実施形態では、細菌細胞培地においてブチラート生成を測定する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素状態で、少なくとも約１ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約５００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１μＭ／ＯＤ、少なくとも約１０μＭ／ＯＤ、少なくとも約１００μＭ／ＯＤ、少なくとも約５００μＭ／ＯＤ、少なくとも約１ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約少なくとも約１０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３０ｍＭ／ＯＤ、または少なくとも約５０ｍＭ／ＯＤのブチラートを生成する。
【０３７０】
特定の実施形態では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はプロピオナートである。プロピオナートレベルの測定方法、質量分析法、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるものは、当該技術分野で公知である（例は、Ｈｉｌｌｍａｎ、１９７８；Ｌｕｋｏｖａら、２０１４参照）。いくつかの実施形態では、プロピオナート遺伝子カセットにおいて１つ以上の遺伝子産物の活性および／または発現を測定することは、プロピオナート生成のプロキシ測定として役立つ。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞を収集し、溶解させてプロピオナート生成を測定する。代わりの実施形態では、プロピオナート生成を細菌細胞培地において測定する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素状態で少なくとも約１μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ  、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、または少なくとも約５０ｍＭのプロピオナートを生成する。
ＲＮＳ依存性調節
【０３７１】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下で発現する１つ以上のペイロードを生成するための１つ以上の遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上の遺伝子配列を発現する遺伝学的に操作された細菌は、炎症状態により活性化されるプロモーターの制御下にある。一実施形態では、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上の遺伝子配列は、炎症性環境において活性化される炎症依存性プロモーター、例えば、反応性窒素種またはＲＮＳプロモーターの制御下で発現する。
【０３７２】
本明細書で使用する場合、「反応性窒素種」および「ＲＮＳ」は、同義で用い、分子状窒素に由来する高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを意味する。ＲＮＳは、ニトロソ化ストレスのような有害な細胞効果をもたらし得る。ＲＮＳは、一酸化窒素（ＮＯ・）、ペルオキシ亜硝酸またはペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）、二酸化窒素（・ＮＯ２）、三酸化二窒素（Ｎ２Ｏ３）、ペルオキシ亜硝酸（ＯＮＯＯＨ）およびニトロペルオキシカーボネート（ＯＮＯＯＣＯ２−）を含むが、これらに限定されない（不対電子を・により示す）。細菌は、ＲＮＳレベルを感知することができる転写因子を発達させた。異なるＲＮＳシグナル伝達経路は、異なるＲＮＳレベルにより誘発され、異なる速度論で発生する。
【０３７３】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ誘導性調節領域」は、１つ以上のＲＮＳ感知転写因子が結合可能な核酸配列で、対応する転写因子の結合および／または活性化によって下流の遺伝子発現が活性化される核酸配列を意味する；ＲＮＳの存在下で、転写因子は調節領域への結合および／または活性化をする。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、その後、ＲＮＳ誘導性調節領域に結合することにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代わりの実施形態では、ＲＮＳの非存在下で、転写因子はＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、ＲＮＳの存在下では、転写因子はコンホメーション変化をして、それにより下流の遺伝子発現を活性化する。ＲＮＳ誘導性調節領域は、ペイロード（複数可）を生成するための１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ誘導性調節領域を活性化することにより、作動可能に連結した遺伝子配列の発現を駆動する。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を誘導する。
【０３７４】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ抑制解除調節領域」は、１つ以上のＲＮＳ感知転写因子が結合可能な核酸配列で、対応する転写因子の結合によって下流の遺伝子発現が抑制される核酸配列を意味する；ＲＮＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合せず、抑制しない。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＮＳ抑制解除調節領域は、ペイロード（複数可）を生成するための１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下で、転写因子はＲＮＳを感知し、調節領域にもはや結合および／または抑制せず、それにより、作動可能に連結した遺伝子配列または遺伝子カセットを脱抑制する。このように、ＲＮＳは、当該遺伝子または／遺伝子（複数可）の発現を脱抑制する。
【０３７５】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ抑制性調節領域」は、１つ以上のＲＮＳ感知転写因子が結合可能な核酸配列で、対応する転写因子の結合によって下流の遺伝子発現が抑制される核酸配列を意味する；ＲＮＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合し、抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＮＳ抑制性調節領域は、遺伝子配列または遺伝子カセットに作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、１つ以上の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を阻止する。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を抑制する。
【０３７６】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ応答性調節領域」は、ＲＮＳ誘導性調節領域、ＲＮＳ抑制性調節領域および／またはＲＮＳ抑制解除調節領域を意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＮＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＮＳを感知する転写因子ならびにそれらの対応するＲＮＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域の例は、表２７に示すものを含むが、これらに限定されない。
【表２７】
2018532412.tif 000079
【０３７７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも１つの反応性窒素種を感知することができる転写因子により直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上の遺伝子に作動可能に連結しており、その結果として、ＲＮＳレベルに対してペイロード（複数可）の発現を制御する。例えば、調整可能な調節領域はＲＮＳ誘導性調節領域であり、ペイロードは本明細書に記載のペイロードのいずれかである。ＲＮＳが、例えば炎症組織に、存在する場合、ＲＮＳ感知転写因子は、調節領域に結合し、および／または調節領域を活性化し、ペイロード（複数可）の発現を駆動する。その後、炎症が改善し、ＲＮＳレベルが低下すると、ペイロード（複数可）の生成は、減少または消失する。
【０３７８】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ誘導性調節領域であり；ＲＮＳの存在下で、転写因子がＲＮＳを感知し、およびＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子群の発現が促進される。いくらかの実施態様では、転写因子はＲＮＳを感知し、および続いてＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。代わりの実施態様では、転写因子は、ＲＮＳの非存在下でＲＮＳ誘導調節領域に結合し；転写因子がＲＮＳを感知するとき、それはコンフォメーション変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が誘導される。
【０３７９】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ誘導性調節領域であり、およびＲＮＳを感知する転写因子はＮｏｒＲである。ＮｏｒＲは、「ｉｓ  ａｎ  ＮＯ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｒＶＷ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｆｌａｖｏｒｕｂｒｅｄｏｘｉｎ  ａｎｄ  ａｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，  ｗｈｉｃｈ  ｒｅｄｕｃｅ  ＮＯ  ｔｏ  ｎｉｔｒｏｕｓ  ｏｘｉｄｅ（フレーバーブレドキシンおよび関連するフラビンタンパク質をコードするｎｏｒＶＷ遺伝子の発現を調節するＮＯ応答性転写活性化因子であり、それはＮＯを亜酸化窒素に還元する」（Ｓｐｉｒｏ（スピロ）２００６）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＮｏｒＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＮｏｒＲによって活性化され得る遺伝子は当該技術で知られる（例は、Ｓｐｉｒｏ、２００６；Ｖｉｎｅ（バイン）ら、２０１１；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ（カーリンシー）ら、２０１２；表１参照）。特定の実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列に作動可能に連結されたｎｏｒＶＷ由来のＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＳの存在下では、ＮｏｒＲ転写因子はＲＮＳを感知し、ｎｏｒＶＷ調節領域に活性化し、それにより、作動可能に連結された遺伝子、遺伝子または遺伝子カセットの発現を駆動し、ペイロードを産生する。
【０３８０】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ誘導性調節領域であり、およびＲＮＳを感知する転写因子はＤＮＲである。ＤＮＲ（異化性ナイトラート呼吸調節因子）は、酸化窒素の存在下で「ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｒ，  ｔｈｅ  ｎｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｏｓ  ｇｅｎｅｓ（ｎｉｒ、ｎｏｒおよびｎｏｓ遺伝子の発現を促進する）」（Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＤＮＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＤＮＲによって活性化され得る遺伝子は当技術において知られる（例は、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９；Ｇｉａｒｄｉｎａ（ジャルディナ）ら、２００８；表１参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されるｎｏｒＣＢ由来のＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＤＮＲ転写因子はＲＮＳを感知し、ｎｏｒＣＢ調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結された遺伝子の発現を駆動し、１つ以上のペイロードを生成する。いくつかの実施態様では、ＤＮＲは緑膿菌ＤＮＲである。
【０３８１】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ抑制解除調節領域であり、および対応する転写因子の結合は下流の遺伝子発現を抑える。ＲＮＳの存在下、転写因子はもはや調節領域に結合せず、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットが抑制解除される。
【０３８２】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ抑制解除調節領域であり、およびＲＮＳを感知する転写因子はＮｓｒＲである。ＮｓｒＲは、「ａｎ  Ｒｒｆ２−ｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ［ｔｈａｔ］  ｃａｎ  ｓｅｎｓｅ  ＮＯ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ＮＯ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（Ｒｒｆ２型転写抑制因子で、［それは］ＮＯを感知し、およびＮＯ代謝を担う遺伝子の発現を制御することができる）」（Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＮｓｒＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。いくらかの実施態様では、ＮｓｒＲはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ナイセリア・ゴノレエ）ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲによって抑制され得る遺伝子は当該技術で知られる（例は、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９；Ｄｕｎｎ（ダン）ら、２０１０；表１参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上の遺伝子に作動可能に連結しているｎｏｒＢに由来するＲＮＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＮｓｒＲ転写因子はＲＮＳを感知し、ｎｏｒＢ調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結したペイロード（複数可）を生成する遺伝子、遺伝子（複数可）、または遺伝子カセットを脱抑制する。
【０３８３】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌において著しい数の自然な遺伝子の発現を調節しないＲＮＳ感知性転写因子を発現することが有利である。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＮＳ感知性転写因子を発現し、そこでは、転写因子は本発明の遺伝学的操作細菌において調節配列に結合しない。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり、およびＲＮＳ感知性転写因子はＮｓｒＲで、例は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来であり、そこでは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは前記ＮｓｒＲについての結合部位を含まない。いくらかの実施態様では、異種転写因子は、内因性調節領域および遺伝学的に操作された細菌における遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または排除する。
【０３８４】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ抑制性調節領域であり、および対応する転写因子の結合は下流の遺伝子発現を抑制し；ＲＮＳの存在下、転写因子はＲＮＳを感知し、およびＲＮＳ抑制性調節領域に結合し、それによって作動可能に連結される遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子は、プロモーター配列の上流または下流の調節領域に結合することができる。
【０３８５】
これらの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のペイロードを発現するために使用される２つのリプレッサー活性化調節回路を含むことができる。２つのリプレッサー活性化制御回路は、第１のＲＮＳ感知リプレッサーと、ペイロードを生成するための１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結された第２のリプレッサーとを含む。これらの実施態様の１つの態様において、ＲＮＳ感知性抑制因子は遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する第２の抑制因子の転写を抑制する。これらの実施態様において有用な第２の抑制因子の例には、制限されないが、ＴｅｔＲ、Ｃ１、およびＬｅｘＡが含まれる。第１の抑制因子による結合がない場合（ＲＮＳの不存在下で生じる）、第２の抑制因子が転写され、それは遺伝子または遺伝子群の発現を抑制する。第１の抑制因子による結合の存在下で（ＲＮＳの存在下で起こり）、第２の抑制因子の発現は抑制され、ペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列が発現される。
【０３８６】
ＲＮＳ応答性転写因子は、遺伝学的に操作された細菌において使用される調節領域配列に応じて、遺伝子発現を誘導、抑制解除、または抑制することができる。１つ以上のタイプのＲＮＳ感知性転写因子および対応する調節領域配列は、遺伝学的に操作された細菌において存在し得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、１つのタイプのＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲ、および対応する１つの調節領域配列、例は、ｎｏｒＢからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、１つのタイプのＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲ、および２つ以上の異なる対応する調節領域配列、例は、ｎｏｒＢおよびａｎｉＡからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、２つ以上のタイプのＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲおよびＮｏｒＲ、および２つ以上の対応する調節領域配列、例は、ｎｏｒＢおよびｎｏｒＲからのものそれぞれを含む。１つのＲＮＳ応答調節領域は、１よりも多くの転写因子に結合することができてよい。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、２つ以上のタイプのＲＮＳ感知性転写因子および１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかのＲＮＳ調節された調節領域の核酸配列は当該技術で知られる（例は、Ｓｐｉｒｏ、２００６；Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９；Ｄｕｎｎら、２０１０；Ｖｉｎｅら、２０１１；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙら、２０１２参照）。
【０３８７】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子、例は、ｎｓｒＲ遺伝子を含み、それはその自然なプロモーター、誘導性プロモーター、自然なプロモーターよりも強力なプロモーター、例は、ＧｌｎＲＳプロモーターまたはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御される。場合によっては、発現安定性を高めるために、誘導性プロモーターの制御下でＲＮＳ感知性転写因子を発現させることが有利であり得る。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様において、ＲＮＳ感知性転写因子および治療上の分子は、プロモーター領域から発散的に転写される。
【０３８８】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＮＳ感知性転写因子のための遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＮＳ応答性調節領域を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＮＳ感知性転写因子および対応するＲＮＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＮＳ感知性転写因子および調節領域は、同じ条件下で同じサブタイプの細菌からの自然な転写因子および調節領域と比較して、ＲＮＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結された遺伝子の転写を増加させることができる。
【０３８９】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳ感知性転写因子、ＮｓｒＲ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の対応する調節領域、ｎｓｒＲを含む。いくらかの実施態様では、自然なＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲは無傷のままであり、および野生型活性を保持する。代替的な実施態様では、野生型活性を減少または排除するために、自然なＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲを欠失または変異させる。
【０３９０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする内在性遺伝子、例は、ｎｓｒＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様において、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様において、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットをコードする遺伝子は、異なる染色体上に存在する。いくらかの実施態様において、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０３９１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳ感受性転写因子、例は、ＮｓｒＲ遺伝子をコードする野生型遺伝子、および対応する調節領域、例は、ｎｏｒＢ調節領域を含み、それは、同じサブタイプの細菌由来の野生型調節領域に対して変異される。変異した調節領域は、同じ条件下で野生型調節領域と比較して、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型ＲＮＳ応答性調節領域、例は、ｎｏｒＢ調節領域、および同じサブタイプの細菌由来の野生型転写因子に対して変異される対応する転写因子、例は、ＮｓｒＲを含む。変異型転写因子は、同じ条件下で野生型転写因子と比較して、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくつかの実施態様では、ＲＮＳ感受性転写因子および対応する調節領域の両方が、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させるために、同じサブタイプの細菌由来の野生型配列に対して変異される。
【０３９２】
いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、およびＲＮＳによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、発現は、当技術で知られる方法によって、例は、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることによってさらに最適化される。
【０３９３】
いくらかの実施態様では、本開示の遺伝子（群）のいずれかを、一以上の組込み部位で細菌染色体に組み込むことができる。たとえば、ペイロードの一以上のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。染色体に組み込まれた遺伝子または遺伝子（群）の複数のコピーを有することにより、ペイロードのより一層多くの産生が可能になり、および発現レベルの微調整も可能になる。あるいはまた、治療上の遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）に加えて、ここに記載の異なる回路、たとえば、任意の分泌回路または輸出回路などのようなものを、一以上の異なる組込み部位で細菌染色体に組み込んで、複数の異なる機能を実行することができた。
【０３９４】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、ＲＮＳの存在下で少なくとも１つの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生して、局所消化管炎症を、同じ条件下、同じサブタイプの未修飾細菌に比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍減少させる。炎症は、当技術で知られる方法、例は、内視鏡検査を用いて疾患病変を計数すること；末梢血におけるＴ制御細胞の分化を、例は、蛍光活性化選別によって検出すること；Ｔ調節細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の領域を測定すること；炎症バイオマーカーを、例は、ｑＰＣＲによってアッセイすること；ＰＣＲアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および／またはサイトカインアッセイキットによって測定することができる（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｑｉａｇｅｎ）。
【０３９５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子についてＲＮＳの存在下で、同じ条件下で同じサブタイプの未修飾細菌よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍多く生成する。一定の非修飾細菌は、検出可能なレベルの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を有さないであろう。これらの細菌の遺伝子修飾形態を使用する実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はＲＮＳの存在下で検出可能であろう。
【０３９６】
一定の実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はブチラートである。ブチラートレベルを測定する方法、例は、質量分析、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってのものは、当該技術において知られる（例は、Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３参照）。いくらかの実施態様において、ブチラートはブチラートレベル／細菌光学密度（ＯＤ）として測定される。いくらかの実施態様では、ブチロジーニック遺伝子カセットにおいて一以上の遺伝子産物の活性および／または発現の測定は、ブチラート産生のプロキシ測定として役立つ。いくらかの実施態様では、本発明の細菌細胞を収集し、および溶解させてブチラート生産を測定する。代わりの実施態様では、細菌細胞培地においてブチラート生産を測定する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳの存在下でブチラートの少なくとも約１ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約５００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１μＭ／ＯＤ、少なくとも約１０μＭ／ＯＤ、少なくとも約１００μＭ／ＯＤ、少なくとも約５００μＭ／ＯＤ、少なくとも約１ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約５ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３０ｍＭ／ＯＤ、または少なくとも約５０ｍＭ／ＯＤを生成する。
ＲＯＳ依存性調節
【０３９７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下で発現するペイロードを生成するための遺伝子、遺伝子（複数可）、または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施形態では、細胞損傷の状態により活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝学的に操作された細菌である。一実施形態では、ペイロードを生成するための１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、細胞または組織損傷が存在する環境において活性化される細胞損傷依存性プロモーター、例えば、反応性酸素種またはＲＯＳプロモーターの制御下で発現する。
【０３９８】
本明細書で使用する場合、「反応性酸素種」および「ＲＯＳ」は、同義で用いられ、分子状酸素に由来する高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを意味する。ＲＯＳは、好気的呼吸または金属触媒酸化の副産物として産生され、酸化的損傷などの有害な細胞効果をもたらし得る。ＲＯＳは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、有機過酸化物（ＲＯＯＨ）、ヒドロキシルイオン（ＯＨ−）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、スーパーオキシドまたはスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）、一重項酸素（１Ｏ２）、オゾン（Ｏ３）、炭酸ラジカル、過酸化物またはペルオキシルラジカル（・Ｏ２−２）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、一酸化窒素（ＮＯ・）およびペルオキシ亜硝酸またはペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）を含むが、これらに限定されない（不対電子を・により示す）。細菌は、ＲＯＳレベルを感知することができる転写因子を発達させた。異なるＲＯＳシグナル伝達経路は、異なるＲＯＳレベルによって誘発され、異なる速度論で発生する（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４）。
【０３９９】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ誘導性調節領域」は、１つ以上のＲＯＳ感知転写因子が結合可能な核酸配列で、対応する転写因子の結合および／または活性化によって、下流の遺伝子発現が活性化される核酸配列を意味する；ＲＯＳの存在下で、転写因子は調節領域への結合および／または活性化をする。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、その後、ＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代わりの実施形態では、転写因子は、ＲＯＳの非存在下でＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、ＲＯＳの存在下では、転写因子はコンホメーション変化をして、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。ＲＯＳ誘導性調節領域は、ペイロード（複数可）を生成するための１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、１つ以上の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を駆動する。このように、ＲＯＳは、１つ以上の遺伝子の発現を誘導する。
【０４００】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ抑制解除調節領域」は、１つ以上のＲＯＳ感知転写因子が結合可能な核酸配列で、対応する転写因子の結合によって下流の遺伝子発現が抑制される核酸配列を意味する；ＲＯＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合せず、抑制しない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＯＳ抑制解除調節領域は、ペイロード（複数可）を生成するための１つ以上の遺伝子に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えば、ＯｈｒＲは、ＲＯＳを感知し、もはや調節領域に結合し、かつ／または抑制することをせず、それにより、作動可能に連結した遺伝子配列または遺伝子カセットを脱抑制する。このように、ＲＯＳは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を脱抑制する。
【０４０１】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ抑制性調節領域」は、１つ以上のＲＯＳ感知転写因子が結合可能な核酸配列で、対応する転写因子の結合によって下流の遺伝子発現が抑制される核酸配列を意味する；ＲＯＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合し、抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＯＳ抑制性調節領域は、１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯＳの存在下では、転写因子、例えば、ＰｅｒＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、１つ以上の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を阻止する。このように、ＲＯＳは、遺伝子または遺伝子配列（複数可）の発現を抑制する。
【０４０２】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ応答性調節領域」は、ＲＯＳ誘導性調節領域、ＲＯＳ抑制性調節領域および／またはＲＯＳ抑制解除調節領域を意味する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＯＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＯＳを感知する転写因子ならびにそれらの対応するＲＯＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域の例は、表２８に示すものを含むが、それらに限定されない。
【表２８−１】
2018532412.tif 000080
【表２８−２】
2018532412.tif 000081
【０４０３】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも一の活性酸素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調整可能調節領域は、１つ以上のペイロードの発現を直接または間接的に駆動し、そうしてＲＯＳレベルに対してペイロード（群）の発現を制御することができる遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結される。  たとえば、調整可能な調節領域はＲＯＳ誘導性調節領域であり、および分子はブチラートであり；ＲＯＳが存在するとき、例は炎症組織において、ＲＯＳ感受性転写因子は調節領域を結合および／または活性化し、ペイロード（群）の遺伝子配列の発現を駆動し、それによってペイロード（群）が産生される。その後、炎症が緩和されるとき、ＲＯＳレベルが低下し、およびペイロード（群）の産生が減少または排除される。
【０４０４】
いくらかの実施態様では、チューナブル（調整可能な）調節領域はＲＯＳ誘導性調節領域であり；ＲＯＳの存在下で、転写因子はＲＯＳを感知し、およびＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現が促進される。いくらかの実施態様では、転写因子はＲＯＳを感知し、および続いてＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。代わりの実施態様では、転写因子は、ＲＯＳの非存在下で、ＲＯＳ誘導性調節領域に結合する。転写因子がＲＯＳを感知するとき、それはコンフォメーションの変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が誘導される。
【０４０５】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ誘導性調節領域であり、およびＲＯＳを感知する転写因子はＯｘｙＲである。ＯｘｙＲは、「ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ａｓ  ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ（主に過酸化水素ストレス応答の全体的調節因子として機能し」、および多数の遺伝子、例は、「ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ２  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ｋａｔＥ，  ａｈｐＣＦ），  ｈｅｍｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （ｈｅｍＨ），  ｒｅｄｕｃｔａｎｔ  ｓｕｐｐｌｙ  （ｇｒｘＡ，  ｇｏｒ，  ｔｒｘＣ），  ｔｈｉｏｌ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  （ｄｓｂＧ），  Ｆｅ−Ｓ  ｃｅｎｔｅｒ  ｒｅｐａｉｒ  （ｓｕｆＡ−Ｅ，  ｓｕｆＳ），  ｉｒｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  （ｙａａＡ），  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｉｍｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ  （ｆｕｒ）（Ｈ２Ｏ２解毒（ｋａｔＥ、ａｈｐＣＦ）、ヘム生合成（ｈｅｍＨ）、還元剤供給（ｇｒｘＡ、ｇｏｒ、ｔｒｘＣ）、チオール−ジスルフィド異性化（ｄｓｂＧ）、Ｆｅ−Ｓ中心修復（ｓｕｆＡ−Ｅ、ｓｕｆＳ）、鉄結合（ｙａａＡ）、鉄の取り込みシステムの抑制（ｆｕｒ）」および「ＯｘｙＳ，  ａ  ｓｍａｌｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ＲＮＡ（ＯｘｙＳ、低分子調節性ＲＮＡ）」（Ｄｕｂｂｓ（ダブス）ら、２０１２）において関与する遺伝子を調節可能である。遺伝学的に操作された細菌は、ＯｘｙＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｘｙＲによって活性化され得る遺伝子はこの技術において知られる（例は、Ｚｈｅｎｇ（ツェン）ら、２００１；Ｄｕｂｂｓら、２０１２；表１参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ペイロードを産生するために１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結されたｏｘｙＳ由来のＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳ、例は、Ｈ２Ｏ２の存在下、ＯｘｙＲ転写因子はＲＯＳを感知し、およびｏｘｙＳ調節領域に対して活性化し、それによって作動可能に連結されたペイロード（群）の発現を駆動し、およびペイロード（群）を産生する。いくらかの実施態様において、ＯｘｙＲはＥ．  ｃｏｌｉのｏｘｙＲ遺伝子によってコードされる。いくらかの実施態様において、ｏｘｙＳ調節領域はＥ．ｃｏｌｉのｏｘｙＳ調節領域である。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、ｋａｔＧ、ｄｐｓ、およびａｈｐＣの調節領域から選定される。
【０４０６】
代わりの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ誘導性調節領域であり、およびＲＯＳを感知する対応する転写因子はＳｏｘＲである。ＳｏｘＲが「ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ［２Ｆｅ−２Ｓ］  ｃｌｕｓｔｅｒ，  ｉｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＳｏｘＳ，  ｗｈｉｃｈ  ｔｈｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（その［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターの酸化によって活性化されるとき、それはＳｏｘＳの合成を増加させ、次いで、その標的遺伝子発現を活性化する）」（Ｋｏｏ（クー）ら、２００３）。「ＳｏｘＲ  ｉｓ  ｋｎｏｗｎ  ｔｏ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｔｏ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ（ＳｏｘＲは主にスーパーオキシドおよび一酸化窒素に反応することが知られ）（Ｋｏｏら、２００３）、Ｈ２Ｏ２にも応答することが可能である。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＳｏｘＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＳｏｘＲによって活性化され得る遺伝子は、当該技術で知られる（例は、Ｋｏｏら、２００３；表１参照）。特定の実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、一の遺伝子に作動可能に連結されたｓｏｘＳ由来のＲＯＳ誘導調節領域を含む。ＲＯＳの存在下、ＳｏｘＲ転写因子はＲＯＳを感知し、およびｓｏｘＳ調節領域を活性化し、それによってペイロード（群）を生成するために作動可能に連結された遺伝子、遺伝子（群）、または遺伝子カセットの発現を駆動する。
【０４０７】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制解除調節領域であり、および対応する転写因子の結合は下流の遺伝子発現を抑制し；ＲＯＳの存在下、転写因子はもはや調節領域に結合せず、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットが脱抑制される。
【０４０８】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制解除調節領域であり、およびＲＯＳを感知する転写因子はＯｈｒＲである。ＯｈｒＲは、「ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ａ  ｐａｉｒ  ｏｆ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｈｒＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｅｂｙ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ（ｏｈｒＡプロモーター部位と重複する一対の逆方向反復ＤＮＡ配列に結合し、およびそれによって転写事象を抑制する）」が、酸化型ＯｈｒＲは「ｕｎａｂｌｅ  ｔｏ  ｂｉｎｄ  ｉｔｓ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔ（そのＤＮＡ標的に結合できない）」（Ｄｕａｒｔｅ（デュアルテ）ら、２０１０）。ＯｈｒＲは、「ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ［ｔｈａｔ］…  ｓｅｎｓｅｓ  ｂｏｔｈ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ＮａＯＣｌ（有機過酸化物およびＮａＯＣｌの両方を感知する［ところの］転写抑制因子）」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）であり、「ｗｅａｋｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ２Ｏ２  ｂｕｔ  ｉｔ  ｓｈｏｗｓ  ｍｕｃｈ  ｈｉｇｈｅｒ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ（Ｈ２Ｏ２によって弱く活性化されるが、それは有機ヒドロペルオキシドに対してはるかに高い反応性を示す）」（Ｄｕａｒｔｅら、２０１０）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＯｈｒＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｈｒＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術において知られる（例は、Ｄｕｂｂｓら、２０１２；表１参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結されるｏｈｒＡからのＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。  ＲＯＳ、例は、ＮａＯＣｌの存在下、ＯｈｒＲ転写因子はＲＯＳを感知し、およびもはやｏｈｒＡ調節領域に結合せず、それによってペイロード（群）を産生するために、作動可能に連結された遺伝子、遺伝子（群）、または遺伝子カセットを脱抑制する。
【０４０９】
ＯｈｒＲはＲＯＳ応答性調節因子のＭａｒＲファミリーのメンバーである。「Ｍｏｓｔ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭａｒＲ  ｆａｍｉｌｙ  ａｒｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｆｔｅｎ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  −１０  ｏｒ  −３５  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｔｅｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ（ＭａｒＲファミリーのほとんどのメンバーは転写抑制因子であり、およびしばしばＲＮＡポリメラーゼ結合の立体的抑制を引き起こすプロモーターにおいて−１０または−３５領域に結合する）」（Ｂｕｓｓｍａｎｎ（バスマン）ら、２０１０）。このファミリーの他のメンバーは、当技術で既知であり、および制限されないが、ＯｓｐＲ、ＭｇｒＡ、ＲｏｓＲ、およびＳａｒＺが含まれる。いくらかの実施態様では、ＲＯＳを感知する転写因子はＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲ、および／またはＳａｒＺであり、および本発明の遺伝学的に操作された細菌はＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲ、および／またはＳａｒＺによって抑制される遺伝子由来の１つ以上の対応する調節領域配列を含む。ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲ、および／またはＳａｒＺによって抑制され得る遺伝子は、当技術で既知である（例は、Ｄｕｂｂｓら、２０１２参照）。
【０４１０】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制解除調節領域であり、およびＲＯＳを感知する対応する転写因子はＲｏｓＲである。ＲｏｓＲは、「１８−ｂｐ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＴＴＧＴＴＧＡＹＲＹＲＴＣＡＡＣＷＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２８９）（コンセンサス配列ＴＴＧＴＴＧＡＹＲＹＲＴＣＡＡＣＷＡ（配列番号２８９）で１８ｂｐの逆方向反復）」に結合し、および「ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｎｔ  Ｈ２Ｏ２（酸化剤Ｈ２Ｏ２によって可逆的に抑制される）」（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０）、「ａ  ＭａｒＲ−ｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＭａｒＲタイプ転写調節因子）」である。ＲｏｓＲは、制限されないが、「ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ｃｇ１３２２，  ｇｅｎｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｒｏｓＲ），  ａ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  （ｃｇｔＳ９），  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｐ／ＦＮＲ  ｆａｍｉｌｙ  （ｃｇ３２９１），  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  （ｃｇ１４２６），  ｔｗｏ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＦＭＮ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ  （ｃｇ１１５０  ａｎｄ  ｃｇ１８５０），  ａｎｄ  ｆｏｕｒ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ  （ｃｇ０８２３，  ｃｇ１８４８，  ｃｇ２３２９，  ａｎｄ  ｃｇ３０８４）（推定ポリイソプレノイド結合タンパク質（ｃｇ１３２２、ｒｏｓＲの上流およびそれから発散する遺伝子）、知覚性ヒスチジン（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）キナーゼ（ｃｇｔＳ９）、Ｃｒｐ／ＦＮＲファミリーの推定転写調節因子、グルタチオンＳトランスフェラーゼファミリー（ｃｇ０８２３）、二つの推定ＦＭＮレダクターゼ（ｃｇ１１５０およびｃｇ１８５０）、および四つの推定モノオキシゲナーゼ（ｃｇ１８２３、ｃｇ１８４８、ｃｇ２３２９、およびｃｇ３０８４））」を含む多くの遺伝子および推定遺伝子を抑制することができる（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＲｏｓＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＲｏｓＲによって抑制され得る遺伝子は当技術で既知である（例は、Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０；表１参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結されるｃｇｔＳ９由来のＲＯＳ抑制解除性調節領域を含む。ＲＯＳ、例は、Ｈ２Ｏ２の存在下、ＲｏｓＲ転写因子はＲＯＳを感知し、およびもはやｃｇｔＳ９調節領域に結合せず、それによってペイロードを生成しペイロードを生成するために、作動可能に結合した遺伝子、遺伝子（群）、または遺伝子カセットを脱抑制する。
【０４１１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌において著しい数の自然遺伝子の発現を調節しないＲＯＳ感受性転写因子を発現することが有利である。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＯＳ感知性転写因子を発現し、そこでは転写因子は本発明の遺伝学的操作細菌において調節配列に結合しない。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり、およびＲＯＳ感知性転写因子はＲｏｓＲ、例は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（コリネバクテリウム・グルタニカム）由来であり、そこではＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは前記ＲｏｓＲのための結合部位を含まない。いくらかの実施態様では、異種転写因子は、内因性調節領域および遺伝学的に操作された細菌における遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または排除する。
【０４１２】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制性制御領域であり、および対応する転写因子の結合は下流遺伝子発現を抑制し；ＲＯＳの存在下、転写因子はＲＯＳを感知し、およびＲＯＳ抑制性制御領域に結合し、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現が抑制される。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子はプロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子はプロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。
【０４１３】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制性調節領域であり、およびＲＯＳを感知する転写因子はＰｅｒＲである。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌とも言う）では、ＰｅｒＲは「ｗｈｅｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ＤＮＡ，  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  （ｋａｔＡ，  ａｈｐＣ，  ａｎｄ  ｍｒｇＡ），  ｍｅｔａｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  （ｈｅｍＡＸＣＤＢＬ，  ｆｕｒ，  ａｎｄ  ｚｏａＡ）  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｏｗｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （ｐｅｒＲ）（ＤＮＡに結合するとき、酸化ストレス応答（ｋａｔＡ、ａｈｐＣ、およびｍｒｇＡ）、金属恒常性（ｈｅｍＡＸＣＤＢＬ、ｆｕｒ、およびｚｏａＡ）およびそれ自身の合成（ｐｅｒＲ）に関与するタンパク質をコードする遺伝子を抑制する）」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４）。ＰｅｒＲは、「ｇｌｏｂａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｔｏ  Ｈ２Ｏ２（主としてＨ２Ｏ２に応答するグローバルレギュレーター（包括調節因子とも言う））」であり（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）、および「ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｅｒ  ｂｏｘ，  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  （ＴＴＡＴＡＡＴＮＡＴＴＡＴＡＡ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９０）  ｒｅｓｉｄｉｎｇ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎｄ  ｎｅａｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＰｅｒＲ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｇｅｎｅｓ（ｐｅｒボックス、ＰｅｒＲ制御遺伝子のプロモーター配列内およびその近くに存在する特定のパリンドロームコンセンサス配列（ＴＴＡＴＡＡＴＮＡＴＴＡＴＡＡ）（配列番号２９０）にてＤＮＡと相互作用する）」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４）。ＰｅｒＲは、「ｏｖｅｒｌａｐｓ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｒ  ｉｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆｒｏｍ  ｉｔ（プロモーターの一部と重複するか、またはプロモーターからのすぐ下流にある）」調節領域に結合することができる（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＰｅｒＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＰｅｒＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術で既知である（例は、Ｄｕｂｂｓら、２０１２；表１参照）。
【０４１４】
これらの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、アミノ酸異化酵素を発現させるために用いられる、２つのリプレッサー活性化調節回路を含み得る。２つのリプレッサー活性化調節回路は、第１のＲＯＳ感知リプレッサー、例えばＰｅｒＲと、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、またはそれ以上のペイロードに作動可能に連結している第２のリプレッサー、例えばＴｅｔＲとを含む。これらの実施態様の１つの態様において、ＲＯＳ感知性抑制因子は、遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する第２の抑制因子の転写を抑制する。これらの実施態様において有用な第２の抑制因子の例としては、ＴｅｔＲ、Ｃ１、およびＬｅｘＡが挙げられるが、これらに制限されない。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性抑制因子はＰｅｒＲである。いくらかの実施態様では、第２の抑制因子はＴｅｔＲである。この実施態様において、ＰｅｒＲ抑制性制御領域はＴｅｔＲの発現を駆動し、およびＴｅｔＲ抑制性調節領域は遺伝子または遺伝子カセット、例は、アミノ酸異化酵素の発現を駆動する。ＰｅｒＲ結合がない場合（ＲＯＳの不存在下で生じる）、ｔｅｔＲが転写され、およびＴｅｔＲは遺伝子または遺伝子カセット、例は、１以上の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子（群）の発現を抑制する。ＰｅｒＲ結合の存在下では（ＲＯＳの存在下で起こる）、ｔｅｔＲ発現が抑制され、および遺伝子または遺伝子カセットが発現される。
【０４１５】
ＲＯＳ応答性転写因子は、遺伝学的に操作された細菌において使用される調節領域配列に依存して、遺伝子発現を誘発、抑制解除、または抑制することができる。たとえば、「ＯｘｙＲ  ｉｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｔｈｏｕｇｈｔ  ｏｆ  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｕｎｄｅｒ  ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ…  ＯｘｙＲ  ｃａｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ｅｉｔｈｅｒ  ａ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｕｎｄｅｒ  ｂｏｔｈ  ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（ＯｘｙＲは主に酸化条件下で転写活性化因子と考えられている・・・が、ＯｘｙＲは酸化状態および還元状態の両方で抑制因子またはアクチベーターとして機能することができ）」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）、およびＯｘｙＲは「ｈａｓ  ｂｅｅｎ  ｓｈｏｗｎ  ｔｏ  ｂｅ  ａ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｏｗｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ｆｈｕＦ  （ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｆｅｒｒｉｃ  ｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）  ａｎｄ  ｆｌｕ  （ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４３  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（それ自体の発現の抑制因子であること、ならびにｆｈｕＦ（鉄イオンレダクターゼをコードする）およびｆｌｕ（抗原４３外膜タンパク質をコードする）のものであることが示された）」（Ｚｈｅｎｇら、２００１）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＯｘｙＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。いくらかの実施態様において、ＯｘｙＲは上記のように、２つの抑制因子活性化調節回路において用いられる。ＯｘｙＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術で既知である（例は、Ｚｈｅｎｇら、２００１；表１参照）。または、たとえば、ＲｏｓＲは多数の遺伝子を抑制することができるが、一定の遺伝子、例は、ｎａｒＫＧＨＪＩオペロンを活性化することもできる。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、ＲｏｓＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。さらに、「ＰｅｒＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｈａｓ  ａｌｓｏ  ｂｅｅｎ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ…ａｎｄ  ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  ｉｎｖｏｌｖｅ  ＰｅｒＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｓｉｔｅｓ（ＰｅｒＲ媒介陽性調節も観察されており、そして．遠隔上流部位へのＰｅｒＲ結合を含むようである）」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＰｅｒＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。
【０４１６】
１つ以上のタイプのＲＯＳ感知性転写因子および対応する調節領域配列が、遺伝学的に操作された細菌において存在し得る。たとえば、「ＯｈｒＲ  ｉｓ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｃｏｒｅｓｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｅｉｔｈｅｒ  ＯｘｙＲ  ｏｒ  ＰｅｒＲ  ｏｒ  ｂｏｔｈ（ＯｈｒＲは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に見出され、およびＯｘｙＲまたはＰｅｒＲまたは両方とも共存することができる）」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、１つのタイプのＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲ、および１つの対応する調節領域配列、例は、ｏｘｙＳからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、１つのタイプのＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲ、および２つ以上の異なる対応する調節領域配列、例は、ｏｘｙＳおよびｋａｔＧからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、２以上のタイプのＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲおよびＰｅｒＲ、および２以上の対応する調節領域配列、例は、それぞれｏｘｙＳおよびｋａｔＡからのものを含む。１つのＲＯＳ応答性調節領域は、１よりも多くの転写因子に結合することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、２以上のタイプのＲＯＳ感知性転写因子および１つの対応する調節領域配列を含む。
【０４１７】
いくつかの例示的なＯｘｙＲ調節された調節領域の核酸配列を表２９に示す。ＯｘｙＲ結合部位に下線を付し、および太字で示す。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１５８、１５９、１６０、または１６１、またはその機能的断片のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【表２９】
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【０４１８】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、その自然プロモーター、誘導性プロモーター、誘導性プロモーター、自然プロモーターよりも強いプロモーター、例は、ＧｌｎＲＳプロモーターまたはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御されるＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子、例は、ｏｘｙＲ遺伝子を含む。いくらかの場合、発現安定性を高めるために誘導性プロモーターの制御下でＲＯＳ感知性転写因子を発現させることが有利であり得る。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子の発現は、治療上分子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様において、ＲＯＳ感知性転写因子および治療上分子はプロモーター領域から発散的に転写される。
【０４１９】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＯＳ感知性転写因子の遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＯＳ応答性調節領域を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＯＳ感知受性転写因子および対応するＲＯＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＯＳ感知性転写因子および調節領域は、ＲＯＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結された遺伝子の転写を、同じ条件下で同じサブタイプの細菌からの自然転写因子および調節領域と比較して、増加させることができる。
【０４２０】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳ感知性転写因子、ＯｘｙＲ、および対応する調節領域、ｏｘｙＳ、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のものを含む。いくらかの実施態様では、自然なＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲは無傷のままであり、および野生型活性を保持する。代替的な実施態様では、野生型活性を減少または排除するために、自然なＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲが欠損または変異される。
【０４２１】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする内因性遺伝子、例は、ｏｘｙＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じものの上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくらかの実施態様において、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０４２２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする野生型遺伝子、例は、ｓｏｘＲ遺伝子、および対応する調節領域、例は、ｓｏｘＳ調節領域を含み、それは、同じサブタイプの細菌由来の野生型調節領域に対して変異される。変異した調節領域は、ＲＯＳの存在下でペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列の発現を、同じ条件下で野生型調節領域と比較して増加させる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型ＲＯＳ応答性調節領域、例は、ｏｘｙＳ調節領域、および対応する転写因子、例は、ＯｘｙＲを含み、それは同じサブタイプの細菌由来の野生型転写因子に対して変異される。変異型転写因子は、ＲＯＳの存在下でペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列の発現を、同じ条件下で野生型転写因子と比較して増加させる。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子および対応する調節領域の両方が、ペイロードの発現をＲＯＳの存在下で増加させるために、同じサブタイプの細菌由来の野生型配列に対して変異される。
【０４２３】
いくつかの実施態様では、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列がプラスミド上に存在し、ＲＯＳによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、ペイロードを生成するための１つまたは複数の遺伝子配列は、染色体に存在し、ＲＯＳによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、発現は、例えば、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることなど、当技術分野で公知の方法によってさらに最適化される。
【０４２４】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施態様において、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、プラスミド上に存在し、ＲＯＳ応答調節領域に作動可能に連結される。いくつかの実施態様において、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、染色体に存在し、ＲＯＳ応答調節領域に作動可能に連結される。
【０４２５】
したがって、いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、酸素レベル依存性プロモーター、反応性酸素種（ＲＯＳ）依存性プロモーターもしくは反応性窒素種（ＲＮＳ）依存性プロモーターならびに対応する転写因子の制御下で、１つ以上のアミノ酸異化酵素を生成する。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上の遺伝子配列を含む安定に維持されたプラスミドまたは染色体を有し、ペイロード（複数可）生成のための１つ以上の遺伝子配列を宿主細胞で発現させることができる。その結果、宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、培地中）および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、生存および／または増殖することができる。いくつかの実施形態では、細菌は、ペイロード生成のための１つ以上の遺伝子配列の複数コピーを含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロード生成のための１つ以上の遺伝子配列は、低コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性を増加させる上で有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、非誘導条件下での漏出発現を減少させるために有用であり得る。いくつかの実施形態では、ペイロード生成のための１つ以上の遺伝子配列は、高コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、ペイロード生成のための１つ以上の遺伝子配列の発現を増加させる上で有用であり得る。いくつかの実施形態では、ペイロード生成のための１つ以上の遺伝子配列は、染色体上で発現する。
【０４２７】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、ＲＯＳの存在下で少なくとも１つの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生して、局所消化管炎症を、同じ条件下、同じサブタイプの未修飾細菌に比べ、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍だけ減少させる。炎症は、当技術において既知の方法、例は、内視鏡検査を用いて病変の病巣を計数すること；末梢血におけるＴ制御細胞の分化を検出すること、例は、蛍光活性化選別によるもの；Ｔ調節細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の領域を測定すること；炎症バイオマーカーをアッセイすること、例は、ｑＰＣＲによるもの；ＰＣＲアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および／またはサイトカインアッセイキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｑｉａｇｅｎ）によって測定することができる。
【０４２８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳの存在下、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を、同じ条件下で同じサブタイプの未修飾細菌よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍より多く生成する。一定の非修飾細菌は、検出可能なレベルの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を有しないであろう。これらの細菌の遺伝子修飾形態を使用する実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はＲＯＳの存在下で検出可能である。
【０４２９】
一定の実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はブチラートである。ブチラートレベルの測定方法、例は、質量分析、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるものは、当技術において既知である（例は、Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３参照）。いくらかの実施態様において、ブチラートはブチラートレベル／細菌光学密度（ＯＤ）として測定される。いくらかの実施態様では、ブチロジーニック遺伝子カセット中の１つ以上の遺伝子産物の活性および／または発現の測定は、ブチラート産生のプロキシ測定として役立つ。いくらかの実施態様では、本発明の細菌細胞を収集し、および溶解させてブチラート生産を測定する。代わりの実施態様では、細菌細胞培地中でブチラート生産を測定する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳの存在下、ブチラートの少なくとも約１ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約５００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１μＭ／ＯＤ、少なくとも約１０μＭ／ＯＤ、少なくとも約１００μＭ／ＯＤ、少なくとも約５００μＭ／ＯＤ、少なくとも約１ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約５ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３０ｍＭ／ＯＤ、または少なくとも約５０ｍＭ／ＯＤを生成する。
複数の作用メカニズム
【０４３０】
いくらかの実施態様において、細菌は、複数の異なる作用を実行する複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例は、同じ生成物の複数のコピーを生成する（例は、コピー数を高める）回路または複数の異なる機能を行う回路を含むように遺伝学的に操作される。挿入部位の例には、図４７に示されるｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｄａｐＡ、ｃｅａ、およびその他が含まれるが、これらに制限されない。例えば、遺伝学的に操作された細菌は、４つの異なる挿入部位、例はｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、およびｌａｃＺ、に挿入されたＧＬＰ−２の四コピーを含みうる。あるいはまた、遺伝学的に操作された細菌は、３つの異なる挿入部位、例は、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、およびｌａｃＺに挿入された三コピーのＧＬＰ−１、および３つの異なる挿入部位、例は、ｄａｐＡ、ｃｅａ、およびａｒａＣ／ＢＡＤに挿入された三コピーのブチロジーニック遺伝子カセットを含みうる。
【０４３１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作によって、細菌が複数の作用機序（ＭＯＡｓ）、例えば、同じ産物の複数のコピーを産生する回路（例えば、コピー数を増加させるため）または複数の異なる機能を果たす回路を有するようにする。例えば、遺伝学的に操作された細菌は、４つの異なる挿入部位に挿入されたペイロード（複数可）生成のための遺伝子、遺伝子（複数可）、または遺伝子カセットを４コピー有し得る。あるいは、遺伝学的に操作された細菌は、３つの異なる挿入部位に挿入されたペイロード（複数可）生成のための遺伝子、遺伝子（複数可）、または遺伝子カセットを３コピー、ならびに３つの異なる挿入部位に挿入されたペイロード（複数可）生成のための遺伝子、遺伝子（複数可）、または遺伝子カセットを３コピー有し得る。
【０４３２】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、以下の（１）〜（１５）のうちの１つ以上を有する。（１）本明細書中に記載されるような、プロピオナート生成のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット、（２）本明細書中に記載されるような、ブチラート生成のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット、（３）本明細書中に記載されるような、アセタート生成のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット、（４）本明細書中に記載されるような、トリプトファンおよび／またはトリプトファン代謝産物（キヌレニン、インドール、インドール酢酸、インドール−３アルデヒドおよびＩＰＡを含むが、これらに限定されない）生成のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット、（５）本明細書中に記載されるような、１つ以上のＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２アナログ生成のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット、（６）本明細書中に記載されるような、ヒトＩＬ−１０もしくはウイルスＩＬ−１０もしくは単量体ＩＬ−１０生成のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット、（７）本明細書中に記載されるような、ヒトＩＬ−２２生成のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット、（８）本明細書中に記載されるような、ＩＬ−２および／またはＳＯＤおよび／またはＩＬ−２７ならびに他のインターロイキン生成のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット、（９）１つ以上の輸送体、例えば、トリプトファンおよび／または本明細書中に記載の代謝産物の取り込み輸送体、を生成するための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット、（１０）分泌のための１つ以上のポリペプチドで、ＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２アナログ、ＩＬ−１０、および／またはＩＬ−２２、ＳＣＦＡおよび／またはトリプトファン合成酵素および／またはトリプトファン異化酵素の野性型または変異体（安定性または代謝活性を増加させるための）が含まれるが、限定されない、（１１）本明細書中に記載されるような、分泌マシーナリーの１つ以上の構成要素、（１２）１つ以上の栄養要求性、例えば、デルタＴｈｙＡ、（１３）１つ以上の抗生物質耐性で、カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性が含まれるが、限定されない、（１４）本明細書中に記載されるような、１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットがコードする代謝経路を通るフラックスを増加させる１つ以上の突然変異／欠失（例えば、ＮＡＤＨ消費経路中の遺伝子の突然変異／欠失、当該遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされる代謝経路のフィードバック阻害に関わる遺伝子の突然変異／欠失）、（１５）内因性代謝経路（例えば、トリプトファン合成経路）中の１つ以上の遺伝子の１つ以上の突然変異／欠失。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、以下のエフェクター機能の１つ以上を促進する：（１）ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、および／またはケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ−８およびＣＣＬ２）を中和する、（２）ＡＨＲを活性化し含む（例えば、それにより、ＩＬ−２２が生成される）、および（３）ＰＸＲを活性化する、（４）ＨＤＡＣ（複数）を阻害する、（５）ＧＰＲ４１および／またはＧＰＲ４３および／またはＧＰＲ１０９Ａを活性化する、（６）ＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害する、（７）ＰＰＡＲγの調節因子、（８）ＡＭＰＫシグナル伝達を活性化する、（９）ＧＬＰ−１分泌を調整する、および／または（１０）ヒドロキシルラジカルを捕捉し、抗酸化剤として機能する。
【０４３４】
いくつかの実施形態では、ペイロードを生成するための遺伝子、遺伝子（複数可）、または遺伝子カセットが発現する条件下で、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、同じ条件下の同じサブタイプの非改変細菌と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍  少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍以上のペイロード（複数可）を生成する。
【０４３５】
いくつかの実施形態では、ペイロードを生成するための遺伝子、遺伝子（複数可）または遺伝子カセットのｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出、および／または定量化するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いる。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のｍＲＮＡを検出するために設計され、使用され得る。いくつかの実施形態では、ペイロードＲＮＡを含み得るサンプル反応混合物にフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を添加し、サーマルサイクラーを使用してサンプル反応混合物を特定波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の発光を検出する。反応混合物を所定の時間、所定の温度に加熱・冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、所定のサイクル数、反応混合物を９０〜１００℃、６０〜７０℃、および３０〜５０℃に加熱・冷却する。特定の実施形態では、所定のサイクル数、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃、および３５〜４５℃に加熱・冷却する。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲの各サイクル後に、蓄積した増幅産物の定量化を行う。蛍光が閾値を超える時点のサイクル数が、閾値サイクル（ＣＴ）である。各サンプルについてＣＴ結果を少なくとも１つ作成し、当該ＣＴ結果を用いて、ペイロード（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを決定することが可能である。
【０４３６】
いくつかの実施形態では、ペイロード（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出、および／または定量化するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いる。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のｍＲＮＡを検出するために設計され、使用され得る。いくつかの実施形態では、ペイロードＲＮＡを含み得るサンプル反応混合物にフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を添加し、サーマルサイクラーを使用してサンプル反応混合物を特定波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の発光を検出する。反応混合物を所定の時間、所定の温度に加熱・冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、所定のサイクル数、反応混合物を９０〜１００℃、６０〜７０℃、および３０〜５０℃に加熱・冷却する。特定の実施形態では、所定のサイクル数、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃、および３５〜４５℃に加熱・冷却する。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲの各サイクル後に、蓄積した増幅産物の定量化を行う。蛍光が閾値を超える時点のサイクル数が、閾値サイクル（ＣＴ）である。各サンプルについてＣＴ結果を少なくとも１つ作成し、当該ＣＴ結果を用いて、ペイロード（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを決定することが可能である。
【０４３７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、本明細書に記載の短鎖脂肪酸生成酵素をコードする遺伝子配列（複数可）、および／または本明細書に記載のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列、および本明細書に記載の代謝産物輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列、および／または本明細書に記載の１つ以上の分泌のための治療用ペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。
【０４３８】
いくつかの実施形態において、遺伝学的に操作された細菌は、ブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート遺伝子カセットを有し、プロピオナートを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、アセタート遺伝子カセットを有し、アセタートを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−２をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−２２をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−２７をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＳＯＤをコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニン（ｋｙｕｒｅｎｉｎｅ）を生成することができる。
【０４３９】
いくつかの実施形態において、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、ＩＬ−１０をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、ＩＬ−２をコードする遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、ＩＬ−２２をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、ＩＬ−２７をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、ＳＯＤをコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを生成することができ、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子配列を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、キヌレニン（ｋｙｕｒｅｎｉｎｅ）を生成することができる。
【０４４０】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、ＩＬ−１０をコードする遺伝子配列とならびにＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを有し、プロピオナートを生成することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はキヌレニン（ｋｙｕｅｒｎｉｎｅ）を生成することができる。
【０４４１】
いくつかの実施形態において、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、ＩＬ−２をコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７，ＧＬＰ−２，およびＳＯＤをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを有し、プロピオナートを生成することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はキヌレニン（ｋｙｕｅｒｎｉｎｅ）を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、ＩＬ−２２をコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを有し、プロピオナートを生成することができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、細菌はキヌレニン（ｋｙｕｅｒｎｉｎｅ）を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを生成することができ、ＩＬ−２７をコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−１０、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを有し、プロピオナートを生成することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はキヌレニン（ｋｙｕｅｒｎｉｎｅ）を生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを有し、ブチラートを生成することができ、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−１０、およびＳＯＤをコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを有し、プロピオナートを生成することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はキヌレニン（ｋｙｕｅｒｎｉｎｅ）を生成することができる。
【０４４２】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを生成することができ、ＳＯＤをコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＩＬ−１０をコードする１つ以上の遺伝子配列を有する。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを有し、プロピオナートを生成することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌はキヌレニン（ｋｙｕｅｒｎｉｎｅ）を生成することができる。
【０４４３】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０をコードする遺伝子配列と、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤから選択される１つ以上の分子をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−２をコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤから選択される１つ以上の分子をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−２２をコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−２、ＩＬ−２７、ＩＬ−１０、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤから選択される１つ以上の分子をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−２７をコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−１０、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤから選択される１つ以上の分子をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＳＯＤをコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＩＬ−１０から選択される１以上の分子をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子配列ならびにＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−１０、およびＳＯＤから選択される１以上の分子をコードする遺伝子配列（複数可）を有する。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌はキヌレニン（ｋｙｕｒｅｎｉｎｅ）を生成することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌はブチラートを生成することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌はプロピオナートを生成することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌はアセタートを生成することができる。
【０４４４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体（トランスポーター）および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、誘導性プロモーターの制御下で発現する。いくつかの実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現する。一実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、低酸素または嫌気性条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現する。その場合、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列の発現は、哺乳動物の消化管などの低酸素または嫌気性環境下で活性化される。いくつかの実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、炎症状態によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現する。本明細書に記載の例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例としては、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＰａｒａＣプロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーター、およびＰＴｅｔＲプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらの誘導性プロモーターの各々は、本明細書でより詳細に記載される。誘導性プロモーターについては、以下により詳細に記載する。
【０４４５】
少なくとも１つの短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、細菌細胞中のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、細菌細胞の染色体内に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞の染色体内に位置し、かつ少なくとも１つの短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする少なくとも１つの別の細菌種由来の遺伝子が細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞内のプラスミド上に位置し、かつ少なくとも１つの短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする少なくとも１つの別の細菌種由来の遺伝子が細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞内の染色体内に位置し、かつ少なくとも１つの短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする少なくとも１つの別の細菌種由来の遺伝子が細菌細胞内の染色体内に位置する。
【０４４６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、低コピープラスミド上において発現する。いくつかの実施形態では、１つ以上の短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする遺伝子配列は、高コピープラスミド上において発現する。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、少なくとも１つの短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドの発現を増加させるために有用であり得る。
【０４４７】
いくつかの実施形態では、本発明の組換え細菌は、高コピープラスミド上で発現する少なくとも１つの短鎖脂肪酸生成酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、トリプトファンおよび／またはトリプトファン代謝産物の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）取り込み輸送体（インポーター）ならびにトリプトファンおよび／またはトリプトファン代謝産物の天然（ｎａｔｉｖｅ）取り込み輸送体の追加コピーの非存在下で、低コピープラスミド上で発現する同一遺伝子を含む組換え細菌と比較して、トリプトファン異化作用を増加させない。別の実施形態では、トリプトファンおよび／またはトリプトファン代謝産物の取り込み輸送体は、高コピープラスミドとともに用いられる。いくつかの実施形態では、前記の遺伝学的に操作された細菌は、本明細書に記載の内在性遺伝子について、１つ以上の修飾、変異、および／または欠失をさらに有する。
分泌
【０４４８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細胞外環境において、細菌の細胞質から分子を分泌することができる自然な分泌機構または非自然な分泌機構をさらに含む。多くの細菌は、細菌細胞エンベロープを横切って基質を輸送するために高度化した分泌システムを進化させた。基質、たとえば、小分子、タンパク質、およびＤＮＡなどのようなものは、細胞外空間またはペリプラズム（たとえば、消化管内腔または他の空間など）中に放出され、標的細胞中に注入され、または細菌膜に結合され得る。
【０４４９】
グラム陰性細菌では、分泌機械は、内膜および外膜の一方または両方に広がっていてもよい。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、非自然な二重膜貫通分泌系（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）をさらに含む。膜貫通型分泌系には、制限されないが、Ｉ型分泌系（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分泌系（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ）、ＶＩ型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、および多剤排出ポンプ（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐｓ）の抵抗性結節分割（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）ファミリーが含まれる（Ｐｕｇｓｌｅｙ（パグスレイ）、１９９３；Ｇｅｒｌａｃｈ（ガーラック）ら、２００７；Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ（コリンソン）ら、２０１５；Ｃｏｓｔａ（コスタ）ら、２０１５；Ｒｅｅｖｅｓ（リーブス）ら、２０１５；ＷＯ２０１４１３８３２４Ａ１（国際公開第２０１４／１３８３２４  Ａ１号）、参照によりここに組み込まれる）。そのような分泌システムの例を図５０、図５１、図５２、図５３、および図５４に示す。グラム陰性様細胞エンベロープを有するマイコバクテリアはまた、ＶＩＩ型分泌系（Ｔ７ＳＳ）をコードし得る（Ｓｔａｎｌｅｙ（スタンリー）ら、２００３）。Ｔ２ＳＳを除いて、二重膜貫通分泌物（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）は概して、基質をバクテリア細胞質から直接細胞外空間または標的細胞に輸送する。対照的に、Ｔ２ＳＳおよび分泌系は、外膜だけに広がるもので二つの段階機構を用いるものであってもよく、そこでは内膜貫通型輸送体によって基質がペリプラズムに最初に転位され、および次いで外膜に移されるか、または細胞外空間中に分泌される。外膜貫通分泌系には、制限されないが、Ｖ型分泌または自己輸送体系または自己分泌体系（Ｔ５ＳＳ）、毛様体分泌系（ｃｕｒｌｉ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、および線毛アセンブリーのためのシャペロン−アッシャー経路（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｕｓｈｅｒ  ｐａｔｈｗａｙ）が含まれる（Ｓａｉｅｒ（サイアー）、２００６；Ｃｏｓｔａ（コスタ）ら、２０１５）。
【０４５０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（シゲラ属、赤痢菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（サルモネラ属）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ビブリオ（Ｂｉｖｒｉｏ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（バークホルデリア属）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（エルシニア属）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（クラミジア属）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス属）由来のＩＩＩ型またはＩＩＩ型様の分泌系（Ｔ３ＳＳ）をさらに含む。Ｔ３ＳＳは、針状複合体を通して細菌の細胞質から宿主の細胞質にタンパク質を輸送することができる。Ｔ３ＳＳは、細菌の細胞質から分子を分泌するが、宿主の細胞質に分子を注入しないように修飾することができる。したがって、分子は、消化管内腔または他の細胞外空間に分泌される。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、前記修飾Ｔ３ＳＳを含み、および細菌細胞質から目的の分子を分泌することができる。いくらかの実施態様では、異種タンパク質またはペプチドなどの分泌分子は、目的の分子が細菌から分泌されることを可能にするＩＩＩ型分泌配列を含む。
【０４５１】
いくつかの実施形態では、目的の分子を分泌するために、鞭毛タイプＩＩＩ分泌経路が用いられる。いくつかの実施形態では、不完全な鞭毛を使用して、天然の鞭毛構成要素のＮ末端鞭毛分泌シグナルに目的の治療用ペプチドを遺伝子組み換えで融合させることによって、目的の治療用ペプチドが分泌される。このようにして、細胞内で発現されたキメラペプチドを、内膜および外膜を越えて周囲の宿主環境へと動員することができる。例えば、ｆｌｉＣ遺伝子（フラジェリンをコードする）の上流の非翻訳ＤＮＡ断片（例えば、１７３ｂｐ領域）を目的のポリペプチドをコードする遺伝子に融合する。このような改変型鞭毛タイプＩＩＩの分泌装置を、異種ポリペプチドを分泌するために使用することができる（例えば、Ｍａｊａｎｄｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年４月；２３（４）：４７５−８１頁；  「Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｐｐａｒａｔｕｓ．」を参照）。いくつかの場合では、ｆｌｉＣ遺伝子座からの非翻訳領域は、鞭毛を介したパッセンジャーペプチドの移行を媒介するのに十分ではない可能性がある。その場合は、ＦｌｉＣのアミノ酸コード配列を含むようにＮ末端シグナルを延長する必要があるかもしれない。例えばＦｌｉＣの最初の２０アミノ酸とともに、１７３ｂｐの非翻訳領域を使用することが必要になるかもしれない（例えば、Ｄｕａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８年１２月；７４巻  ｎｏ．２３  ７４３７−７４３８頁；  「Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：  Ｒｅｗｉｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｕｔ  Ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ」を参照）。
【０４５２】
いくらかの実施態様において、Ｖ型自己輸送体分泌系を用いて、目的の分子、例えば治療用ペプチドを分泌する。機構の単純さおよび比較的大きなタンパク質フラックスを扱う能力のために、Ｖ型分泌系は組換えタンパク質の細胞外産生にとって魅力的である。図５１に示すように、治療上のペプチド（スター）は、Ｎ末端分泌シグナル、リンカー、および自己輸送体のベータドメインに融合することができる。Ｎ末端のＳｅｃ依存性シグナル配列はタンパク質をＳｅｃＡ−ＹＥＧ機構に導き、それがタンパク質を内膜通過させてペリプラズムに移動させ、その後シグナル配列の切断が続く。ベータドメインは、ベータドメインが折り畳まれ、およびベータ−バレル構造として外膜に挿入されるＢａｍ複合体（‘ベータ-バレルアセンブリ機構‘）に補充される。治療上のペプチドは、リンカー配列の前にベータ-バレル構造の中空細孔を貫通させられる。一旦細胞外環境に曝露されると、治療上のペプチドは、自己触媒的開裂（Ｂａｍ複合体の左側）によって、またはリンカーにおいてコンプリメンタリープロテアーゼ切断部位（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｕｔ  ｓｉｔｅ）に対する膜結合ペプチダーゼの標的化（黒色のはさみ；Ｂａｍ複合体の右側）によって、リンカーシステムから解放される。したがって、いくらかの実施態様では、分泌される分子、たとえば、異種タンパク質またはペプチドなどのようなものは、分子が細菌から分泌されるように、自己輸送体のＮ末端分泌シグナル、リンカー、およびベータドメインを含む。
【０４５３】
いくらかの実施態様では、目的の分子、例は治療上のペプチドを分泌するために溶血素に基づく分泌系が使用される。Ｉ型分泌系は、それらのパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外空間に直接転位させる利点を提供し、他の分泌型の２段階プロセスを回避する。図５２は、尿路病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのアルファ−溶血素（ＨｌｙＡ）を示す。この経路は、ＨｌｙＢ、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター；ＨｌｙＤ、膜融合タンパク質、およびＴｏｌＣ、外膜タンパク質を使用する。これらの３つのタンパク質の集合体は、内側膜および外側膜の両方を通るチャネルを形成する。自然には、このチャネルはＨｌｙＡを分泌するために使用されるが、しかし、本開示の治療上のペプチドを分泌するために、ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分は、治療上のペプチド（スター）のＣ末端部分に融合して、このペプチドの分泌が媒介される。
【０４５４】
代わりの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、非自然な単一膜貫通分泌系をさらに含む。単一膜貫通輸送体は、分泌系の成分として作用し得るか、または基質を独立して送り出し得る。そのような輸送体（トランスポーターとも言う）には、制限されないが、ＡＴＰ結合カセットトランスロカーゼ、鞭毛／毒性関連トランスロカーゼ、コンジュゲーション関連トランスロカーゼ、包括的分泌系（例は、Ｅ．ｃｏｌｉでのＳｅｃＹＥＧ複合体）、マイコバクテリアおよび種々のタイプのグラム陽性細菌におけるアクセサリー分泌系（例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（バチルス・アンシラシス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ（ストレプトコッカス・ゴルドニイ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（スタフィロコッカス・アウレウス））、およびツイン−アルギニン透過（ＴＡＴ）（Ｓａｉｅｒ、２００６；Ｒｉｇｅｌ（リゲル）およびＢｒａｕｎｓｔｅｉｎ（ブラウンスタイン）、２００８；Ａｌｂｉｎｉａｋ（アルビニアク）ら、２０１３）が含まれる。包括的分泌系およびＴＡＴ系は、開裂可能なＮ末端シグナルペプチドを有する基質を共にペリプラズム中に送り出すことができ、および生物製剤生産の関連において探求されたことが知られる。しかしながら、ＴＡＴ系は、折り畳まれた基質を輸送することができ、従って、早すぎるか、または不適切な折り畳みの可能性を排除するという点で、特別な利点を提供し得る。一定の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＴＡＴまたはＴＡＴ様の系を含み、細菌細胞質から目的の分子を分泌することができる。当業者は、ここに開示される分泌系が、細菌の異なる種、菌株、およびサブタイプにおいて作用するように修飾され得、および／または異なるペイロードを送るように適合され得ることを理解するであろう。
【０４５５】
タンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）を細胞外空間に移行させるために、ポリペプチドはまず細胞内で翻訳され、内膜を越えて動員され、最後に外膜を越えて動員されなければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）、特に真核生物起源のものは、三次構造および四次構造の安定化のため、ジスルフィド結合を有する。これらの結合は、ペリプラズムシャペロンの介助により、酸化的なペリプラズムコンパートメント内で正しく形成され得るが、ポリペプチドが外膜を越えて移行されるためには、ジスルフィド結合が還元され、タンパク質が再度アンフォールドしなければならない。
【０４５６】
グラム陰性細菌−とりわけジスルフィド結合を必要とするもの−が適切に折りたたまれたタンパク質を分泌する１つの方法は、不安定な外膜とともにペリプラズムの還元性環境を標的にすることである。この方法では、タンパク質は酸化環境中に移動させられ、適切に折りたたまれる。調和のとれた細胞外分泌システムとは対照的に、タンパク質は、膜からの漏出によって、正しく折りたたまれた形態でペリプラズム空間を脱出することができる。したがって、これらの「漏出性」グラム陰性突然変異体は、生物活性と適切なジスルフィド結合を有するポリペプチドを分泌することができる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、「漏出性」または不安定な外膜を有する。漏出を誘発するために細菌の外膜を不安定にすることは、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌを含む、外膜を強固なペプチドグリカン骨格につなぎ留めることに関与する遺伝子の欠失または突然変異によって達成することができる。Ｌｐｐは、細胞当たり約５００，０００コピーが存在し、細菌細胞内で最も豊富なポリペプチドであり、細菌細胞壁のペプチドグリカンへ主要な「ステープル」として機能する（１．  Ｓｉｌｈａｖｙ  Ｔ．  Ｊ．、Ｋａｈｎｅ  Ｄ．＆  Ｗａｌｋｅｒ  Ｓ．Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２、  ａ０００４１４  （２０１０年））。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を得る上での他の欠失標的である。さらに、漏出性表現型は、ペリプラズムプロテアーゼが不活性化したときに観察される。ペリプラズムは、タンパク質で非常に密に充填されており、したがって、タンパク質のターンオーバーを促進するためのいくつかのペリプラズムタンパク質がコードされている。ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩのようなペリプラズムプロテアーゼを除去することにより、ペリプラズムタンパク質の過剰な蓄積が促進されて、漏出性表現型を誘発することが可能になる。プロテアーゼの突然変異によっても、これらのプロテアーゼによる標的化分解が妨げられることにより、エフェクターポリペプチドを保持することが可能になる。さらに、これらの突然変異を組合せることによって、細胞の生存力を大きく犠牲にすることなく、細胞の漏出性表現型を相乗的に高めることができる。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、欠失または突然変異された１つ以上の膜遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、欠失または突然変異されたｌｐｐ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡおよびｏｍｐＦ遺伝子から選択される１つ以上の欠失または突然変異された遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される１つ以上の欠失または突然変異された遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、１つ以上の欠失または突然変異されたペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択��れる１つ以上の欠失または突然変異されたペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される１つ以上の欠失または突然変異された遺伝子を有する。
【０４５７】
細胞の生存力への擾乱を最小限にするために、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される１つ以上の膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を誘導性プロモーターの制御下におくことによって、漏出性表現型を誘導性にすることができる。例えば、治療用ポリペプチドを送達（分泌）させる必要がある状態において、ｌｐｐまたは他の細胞壁安定タンパク質またはペリプラズムプロテアーゼの発現を抑制することができる。例えば、誘導性条件下で、標的の膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子の転写または翻訳を低減する転写リプレッサータンパク質または設計されたアンチセンスＲＮＡを発現させることができる。逆に、特定のペプチドの過剰発現、例えば、コリシンまたはＴｏｌＡの３番目のトポロジードメインの過剰発現は、表現型の不安定化をもたらし得るものであり、治療用ポリペプチドを送達（分泌）させる必要がある状態において、当該ペプチドの過剰発現を誘導することができる。これらの類の戦略によって、脆弱な漏出性表現型がバイオマス産生から分離される。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、１つの誘導性プロモーターの制御下に、１つ以上の膜および／またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。
【０４５８】
以下の表３０および表３１は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の分泌系を列挙する。
【表３０−１】
2018532412.tif 000083
【表３０−２】
2018532412.tif 000084
【表３１−１】
2018532412.tif 000085
【表３１−２】
2018532412.tif 000086
【０４５９】
グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の上記の表は、操作細菌からポリペプチドおよび他の分子を分泌するために使用することができる分泌系装置を列挙したものである。それらは、Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈ．Ｓａｉｅｒ、Ｊｒ．  微生物／第１巻、第９号、２００６年、  「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｏｓｓｅｓｓ  ｍａｎｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｈａｔ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ」で概説されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４６０】
本明細書中に記載される分泌系のいずれも、本開示に従って、目的のタンパク質を分泌するために使用され得る。目的タンパク質の非限定的な例には、ＧＬＰ−２ペプチド、ＧＬＰ−２アナログ、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、単量体ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４、トリプトファン合成酵素、ＳＣＦＡ生合成酵素、トリプトファン異化酵素が含まれる。当該トリプトファン異化酵素にはＩＤＯ、ＴＤＯ、キヌレニナーゼ、他のトリプトファン経路の異化酵素（例えば、本明細書に記載のインドール経路および／またはキヌレニン経路におけるもの）が含まれるが、これらに限定はされない。当該ポリペプチドに突然変異を導入して、安定性、プロテアーゼ消化に対する耐性および／または活性を増加させることができる。
【表３２】
2018532412.tif 000087
【０４６１】
いくつかの実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、鞭毛タイプＩＩＩ分泌系の成分を用いて分泌される。非限定的な例では、ＧＬＰ−２ペプチド、ＧＬＰ−２アナログ、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、単量体ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４は、ｆｌｉＣ−５’ＵＴＲ（例えば、ｆｌｉＣ遺伝子座からの１７３ｂｐ非翻訳領域）の後ろに組み立てられ、天然プロモーターによって駆動される。他の実施形態では、鞭毛タイプＩＩＩ分泌系の成分を使用して分泌される目的の治療用ペプチドの発現は、ｔｅｔ誘導性プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＩＢＤ特異的分子によって誘導されるプロモーターまたは炎症もしくは炎症反応によって誘導されるプロモーター（ＲＮＳプロモーター、ＲＯＳプロモーター）、消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースによって誘導されるプロモーター、などの誘導性プロモーターが使用される。いくつかの実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、プラスミド（例えば、中コピープラスミド）から発現する。いくつかの実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、ｆｌｉＣ遺伝子座に組み込まれた構築物（それによってｆｌｉＣは欠失する）から発現され、天然ＦｌｉＣプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、分泌効率をさらに高めるために、ＦｌｉＣのＮ末端部分（例えば、ＦｌｉＣの最初の２０アミノ酸）が構築物に含まれる。
【０４６２】
いくつかの実施形態では、目的の治療用ポリペプチド、例えばＧＬＰ−２ペプチド、ＧＬＰ−２アナログ、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、単量体ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４は、拡散性外膜（ＤＯＭ）系を介して分泌される。いくつかの実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、Ｎ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルに融合される。このようなＮ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルの非限定的な例には、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＡおよびｃｖａＣが含まれる。代わりの実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、Ｔａｔ依存性分泌シグナルに融合される。例示的なＴａｔ依存性タグには、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、およびＤｍｓＡが含まれる。いくつかの実施形態では、分泌タグ付き治療用タンパク質の発現は、ｔｅｔプロモーターまたは酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）などの誘導性プロモーター、あるいはＩＢＤ特異的分子によって誘導されるプロモーターまたは炎症もしくは炎症反応によって誘導されるプロモーター（ＲＮＳプロモーター、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管内に天然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝産物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、目的の分泌タグ付き治療用ポリペプチドは、プラスミド（例えば、中コピープラスミド）から発現する。他の実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、細菌染色体に組み込まれた構築物から発現し、例えば図４７に示す１つ以上の組み込み部位で、細菌染色体に組み込まれる。特定の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、外膜タンパク質および／またはペリプラズムタンパク質の１つ以上に、欠失または突然変異を有する。そのようなタンパク質の非限定的な例には、ｌｐｐ、ｐａｌ、ｔｏｌＡ、および／またはｎｌｐＩが含まれ、そのうちの１つ以上が欠失されまたは変異されてもよい。いくつかの実施形態では、ｌｐｐが欠失または突然変異される。いくつかの実施形態では、ｐａｌが欠失または変異される。いくつかの実施形態では、ｔｏｌＡが欠失または変異される。他の実施形態では、ｎｌｐＩが欠失または変異される。さらに他の実施形態では、例えばペリプラズムにおけるポリペプチドの安定性を高めるために、特定のペリプラズムプロテアーゼが欠失または変異される。そのようなプロテアーゼの非限定的な例には、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴが含まれる。いくつかの実施形態では、ｄｅｇＰが欠失または突然変異される。いくつかの実施形態では、ｏｍｐＴが欠失または変異される。いくつかの実施形態では、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴが欠失または変異される。
【０４６３】
いくつかの実施形態では、目的の治療用ポリペプチド、例えば、ＧＬＰ−２ペプチド、ＧＬＰ−２アナログ、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、モノマー化ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４は、タイプＶ自己分泌体（ｐｉｃタンパク質）分泌を介して分泌される。いくつかの実施形態では、目的の治療用タンパク質は、天然ニッスルの自己分泌体Ｅ．ｃｏｌｉ＿０１６３５（ここで元のパッセンジャータンパク質は、目的の治療用ポリペプチドで置き換えられる）との融合タンパク質として発現される。
【０４６４】
いくつかの実施形態では、目的の治療用ポリペプチド、例えば、ＧＬＰ−２ペプチド、ＧＬＰ−２アナログ、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、モノマー化ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４は、Ｉ型ヘモリシン分泌を介して分泌される。一実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、大腸菌ＣＦＴ０７３のアルファ‐ヘモリシン（ｈｌｙＡ）のＣ末端の５３アミノ酸との融合タンパク質として発現される。
必須遺伝子および栄養要求体
【０４６５】
ここに使用されるように、用語「必須遺伝子」は、細胞増殖および／または生存のために必要な遺伝子に言及する。細菌の必須遺伝子は、当業者によく知られ、および遺伝子の指向的欠失および／またはランダム変異誘発およびスクリーニングによって識別することができる（例は、Ｚｈａｎｇ（チャン）およびＬｉｎ、２００９、ＤＥＧ５．０、原核生物および真核生物の双方における必須遺伝子のデータベース、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ）、３７：Ｄ４５５−Ｄ４５８およびＧｅｒｄｅｓ（ゲルデス）ら、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｐｓ（代謝マップに関する必須遺伝子）」、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー）、１７（５）：４４８−４５６、それらのそれぞれの全内容は参照によりここに明示的に組み込まれる）。
【０４６６】
「必須遺伝子」は有機体が存在する状況および環境に依存し得る。たとえば、必須遺伝子の変異、修飾、または切除により、本開示の遺伝学的に操作された細菌が栄養要求株になる可能性がある。栄養要求性改変は、その必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子が欠如しているため、生存または増殖に必須の外因的に添加される栄養素の不存在下で細菌の死滅が起こることを意図する。
【０４６７】
栄養要求性改変は、その必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子が欠損しているため、生存または増殖に必須の外因的に添加される栄養素の不存在下で細菌を死滅させることを意図する。いくらかの実施態様では、ここに記載の遺伝学的に操作された細菌のいずれも、細胞生存および／または増殖に必要な遺伝子の欠失または変異を含む。一実施態様では、必須遺伝子はＤＮＡ合成遺伝子、たとえば、ｔｈｙＡである。別の実施態様では、必須遺伝子は細胞壁合成遺伝子、たとえば、ｄａｐＡである。さらに別の実施態様において、必須遺伝子はアミノ酸遺伝子、たとえば、ｓｅｒＡまたはＭｅｔＡである。細胞生存および／または増殖に必要な任意の遺伝子は、標的にすることができ、制限されないが、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢおよびｔｈｉ１を、対応する野生型遺伝子産物が細菌中で産生されない限り含む。
【０４６８】
表３３のリストは、栄養要求株を産生するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子を示す。これらには、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要とされる遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【表３３】
2018532412.tif 000088
表３４は、胃管栄養法の２４時間後および４８時間後に検出された、マウス腸における種々のアミノ酸栄養要求株の生存を示す。これらの栄養要求株は、大腸菌のＮｉｓｓｌｅ株ではないＢＷ２５１１３を用いて作製した。
【表３４】
2018532412.tif 000089
【０４６９】
たとえば、チミンは、細菌細胞増殖に必要とされる核酸であり；その不存在下では、細菌は細胞死を受ける。ｔｈｙＡ遺伝子は、チミジル酸シンテターゼをコードし、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによってチミン合成における第１段階を触媒する酵素である（Ｓａｔ（サト）ら、２００３）。いくらかの実施態様では、本開示の細菌細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子が欠失され、および／または無関係な遺伝子で置換されたｔｈｙＡ栄養要求株である。ｔｈｙＡ栄養要求株は、インビトロで増殖培地にチミンを添加することによって、またはインビボでヒト消化管内で自然に見出される高チミンレベルの存在下で、十分な量のチミンが存在するときにだけ増殖することができる。いくらかの実施態様では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳類の消化管内に存在するときに補完される遺伝子において栄養要求性である。十分な量のチミンがなければ、ｔｈｙＡ栄養要求体は死ぬ。いくらかの実施態様において、栄養要求性改変は、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の不存在下（例は、消化管の外側）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０４７０】
ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リジン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、および細菌細胞壁発達に必要である（Ｍｅａｄｏｗ（メドウ）ら、１９５９；Ｃｌａｒｋｓｏｎ（クラークスン）ら、１９７１）。いくらかの実施態様では、ここに記載される遺伝学的に操作された細菌のいずれかは、ｄａｐＤが欠失し、および／または無関係の遺伝子で置換されたｄａｐＤ栄養要求株である。ｄａｐＤ栄養要求体は、十分な量のＤＡＰが存在するときだけ、例は、インビトロで増殖培地にＤＡＰを添加することによって増殖することができる。十分な量のＤＡＰがなければ、ｄａｐＤ栄養要求体は死ぬ。いくらかの実施態様において、栄養要求性改変は、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の不存在下（例は、消化管の外側）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０４７１】
他の実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、ｕｒａＡが欠失され、および／または無関係の遺伝子で置換されたｕｒａＡ栄養要求体である。ｕｒａＡ遺伝子は、ピリミジンウラシルの取り込みおよび引き続く代謝を促進する膜結合輸送体であるＵｒａＡをコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎ（アンデルセン）ら、１９９５）。ｕｒａＡ栄養要求体は、十分な量のウラシルが存在するときだけ、例は、インビトロで増殖培地にウラシルを添加することによって増殖することができる。十分な量のウラシルがなければ、ｕｒａＡ栄養要求体は死ぬ。いくらかの実施態様において、栄養要求性遺伝子産物の不存在下（例は、消化管の外側）で細菌が生存しないことを確実にするために、栄養要求性改変が使用される。
【０４７２】
複雑なコミュニティでは、細菌がＤＮＡを共有することが可能である。非常にまれな状況において、栄養要求性細菌株は、非栄養要求株からＤＮＡを受け取ることができ、それはゲノム欠失を修復し、および栄養要求株が恒久的に救出される。したがって、一よりも多くの栄養要求性を有する細菌株を操作することにより、栄養要求性を救済するのに十分な時間にＤＮＡ転移が起こる可能性を大きく低下させる可能性がある。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細胞生存および／または増殖に必要な２つ以上の遺伝子の欠失または変異を含む。
【０４７３】
必須遺伝子の他の例としては、制限されないが、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、およびｇｐｓＡが含まれる。他の必須遺伝子は当業者に既知である。
【０４７４】
いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でだけ増殖する１つ以上の必須遺伝子に変異を有する合成栄養要求体である（Ｌｏｐｅｚ（ロペズ）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ（アンダーソン）、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｒａｉｎ（ＢＬ２１（ＤＥ３）バイオセーフティ株についてリガンド依存性必須遺伝子を有する合成栄養要求体）」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＡＣＳシンセティック・バイオロジー）（２０１５）ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８５参照、その全体の内容は参照によりここに明示的に組み込まれる）。
【０４７５】
いくらかの実施態様では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は必須遺伝子において変異を含む。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ、およびａｄｋからなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、次の変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃの１つ以上を含むｄｎａＮである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、変異Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌの１以上を含むｐｈｅＳである。いくらかの実施態様において、必須遺伝子は、変異Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌを含むｐｈｅＳである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、以下の変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇの１以上を含むｔｙｒＳである。いくらかの実施態様において、必須遺伝子は、変異Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇを含むｔｙｒＳである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、次の変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃの１以上を含むｍｅｔＧである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、変異Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃを含むｍｅｔＧである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、以下の変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇの１以上を含むａｄｋである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、変異Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇを含むａｄｋである。
【０４７６】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はリガンドによって補完される。いくらかの実施態様において、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、およびＬ−ヒスチジンメチルエステルからなる群より選ばれる。たとえば、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、またはL-ヒスチジンメチルエステルによって補完される。ｄｎａＮ（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ａｄｋ（Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールによって補完される。
【０４７７】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、それをリガンドに対して栄養要求性にする一よりも多い変異必須遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、細菌細胞は２つの必須遺伝子において変異を含む。たとえば、いくらかの実施態様では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）およびｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）において変異を含む。他の実施態様では、細菌細胞は、３つの必須遺伝子において変異を含む。たとえば、いくらかの実施態様では、細菌細胞はｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）、およびｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）において変異を含む。
【０４７８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はコンディショナルな（条件的なとも言う）栄養要求体であり、その必須遺伝子（群）は、図５６に示されるアラビノース系を用いて置換される。
【０４７９】
いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は栄養要求株であり、およびキルスイッチ回路、たとえば、ここに記載のキルスイッチ構成要素およびシステムのいずれかなどのようなものも含む。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、細胞生存および／または増殖に必要な必須遺伝子において、たとえば、ＤＮＡ合成遺伝子において、たとえば、ｔｈｙＡ、細胞壁合成遺伝子、たとえば、ｄａｐＡおよび／またはアミノ酸遺伝子、例えばｓｅｒＡまたはＭｅｔＡにおいて、欠失または変異を含むことができ、およびまた環境条件（群）および／またはシグナル（群）に応答して（たとえば、記載のアラビノース系などのようなもの）発現する１以上の転写活性化因子によって調節される毒素遺伝子を含むことができ、または外因性環境条件（群）および／またはシグナル（群）（たとえば、ここに記載のリコンビナーゼ系などのようなもの）を感知して発現される1以上のリコンビナーゼによって調節されうる。他の実施態様は、Ｗｒｉｇｈｔ（ライト）ら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ（ジーンガード：バイオセーフティのために設計されたモジュラープラスミドシステム）」ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）４：３０７−１６に記載され、その全体の内容を参照によりここに明示的に組み込む）。いくらかの実施態様において、本開示の遺伝学的に操作された細菌は栄養要求体であり、およびまた、キルスイッチ回路、たとえば、ここに記載のキルスイッチ成分およびシステムなどのようなもの、ならびに別のバイオセキュリティ（生物学的に安全なとも言う）システム、たとえば、コンディショナルな複製の起点（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）などのようなものを含む（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５）。他の実施態様では、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子を産生する変異細菌をスクリーニングするために栄養要求性改変を使用することもできる。
遺伝学的調節回路
【０４８０】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ここに記載の構築物を発現させるための多層遺伝学的調節回路（ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ）を含む（例は、米国仮特許出願第６２／１８４，８１１号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３９４３４参照、それら両方の全体が参照によりここに組み込まれる）。遺伝学的調節回路は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するか、または栄養要求体を救出する変異細菌をスクリーニングするために有用である。特定の実施態様では、本発明は、関心がある１以上の遺伝子を産生する遺伝学的に操作された細菌を選定するための方法を提供する。
【０４８１】
いくらかの実施態様において、本発明は、治療上の分子（例は、ブチラート）およびＴ７ポリメラーゼ調節遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、Ｔ７ポリメラーゼをコードする第一の遺伝子で、そこでは、第一の遺伝子は、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；治療上の分子（例は、ブチラート）を産生するための第二の遺伝子または遺伝子カセットで、そこでは、第二の遺伝子または遺伝子カセットは、Ｔ７ポリメラーゼによって誘導されるＴ７プロモーターに作動可能に連結され；および抑制因子、ｌｙｓＹをコードする第三の遺伝子で、Ｔ７ポリメラーゼを抑制することができるものを含む。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、および治療上の分子（例は、ブチラート）は発現しない。ＬｙｓＹは構成的に発現され（Ｐ−ｌａｃ構成性）、およびさらにＴ７ポリメラーゼを抑制する。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、Ｔ７ポリメラーゼはｌｙｓＹ抑制を克服するのに十分なレベルで発現され、および治療上の分子（例は、ブチラート）が発現される。いくらかの実施態様では、ｌｙｓＹ遺伝子はさらなるＦＮＲ結合部位に作動可能に連結される。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化して上記のようにＴ７ポリメラーゼ発現を活性化し、およびまたｌｙｓＹ発現を抑制する。
【０４８２】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子（例は、ブチラート）およびプロテアーゼ調節された遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子は、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；Ｔｅｔ調節領域（ＴｅｔＯ）に作動可能に連結される治療上の分子を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセット；およびＴｅｔ抑制因子（ＴｅｔＲ）に連結されるｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルをコードする第３の遺伝子で、ＴｅｔＲがＴｅｔ制御領域に結合し、および第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものを含む。ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼは、ｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルを認識し、ＴｅｔＲを分解することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、抑制因子は分解されず、および治療上の分子は発現されない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターを二量体化し、およびそれに結合し、それによってｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼの発現が誘導される。ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼは、ｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルを認識し、およびＴｅｔＲを分解し、および治療上の分子が発現される。
【０４８３】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子および抑制因子調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、第１の抑制因子をコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子はＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；構成的プロモーターを含む第１調節領域に作動可能に連結される治療上の分子を産生するための第２遺伝子または遺伝子カセット；および第２の抑制因子をコードする第３の遺伝子で、第２の抑制因子は、第１の調節領域に結合し、および第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものを含む。第３の遺伝子は、構成的プロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に連結され、そこでは、第１の抑制因子は第２の調節領域に結合し、および第２の抑制因子の発現を抑制することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、第１の抑制因子は発現せず、第２の抑制因子は発現し、および治療上の分子は発現しない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターを二量体化し、およびそれに結合し、第１の抑制因子は発現し、第２の抑制因子は発現せず、および治療上の分子が発現される。
【０４８４】
これらの実施態様において有用な抑制因子の例には、制限されないが、ＡｒｇＲ、ＴｅｔＲ、ＡｒｓＲ、ＡｓｃＧ、ＬａｃＩ、ＣｓｃＲ、ＤｅｏＲ、ＤｇｏＲ、ＦｒｕＲ、ＧａｌＲ、ＧａｔＲ、ＣＩ、ＬｅｘＡ、ＲａｆＲ、ＱａｃＲ、およびＰｔｘＳ（ＵＳ２００３０１６６１９１）が含まれる。
【０４８５】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子および調節ＲＮＡで調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、調節ＲＮＡをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子はＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され、および治療上の分子を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットを含む。第２の遺伝子または遺伝子カセットは、構成的プロモーターに作動可能に連結され、および治療上の分子の翻訳を抑制するｍＲＮＡヘアピンを産生することができるヌクレオチド配列にさらに連結される。調節ＲＮＡは、ｍＲＮＡヘアピンを除去し、およびリボソーム結合部位を介して翻訳を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、調節ＲＮＡは発現せず、およびｍＲＮＡヘアピンは治療上の分子の翻訳を妨げる。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、調節ＲＮＡが発現され、ｍＲＮＡヘアピンが排除され、および治療上の分子が発現される。
【０４８６】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子およびＣＲＩＳＰＲ調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃａｓ９タンパク質；ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子は、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；治療上の分子を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットで、そこでは、第２の遺伝子または遺伝子カセットは、構成的プロモーターを含む調節領域に作動可能に連結され；および構成的プロモーターに作動可能に連結される抑制因子をコードする第３遺伝子で、抑制因子が、調節領域に結合し、および第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものを含む。第３の遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡに結合することができるＣＲＩＳＰＲ標的配列にさらに連結され、そこでは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡへの前記結合は、Ｃａｓ９タンパク質による開裂を誘導し、および抑制因子の発現を抑制する。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、ガイドＲＮＡは発現されず、抑制因子は発現され、および治療上の分子は発現されない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、ガイドＲＮＡは発現され、抑制因子は発現せず、および治療上の分子が発現される。
【０４８７】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子およびリコンビナーゼ調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、リコンビナーゼをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子はＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され、および構成的プロモーターに作動可能に連結される治療上の分子を産生する第２の遺伝子または遺伝子カセットを含む。第２の遺伝子または遺伝子カセットは、方向が逆転し（３’から５’）、およびリコンビナーゼ結合部位に隣接し、およびリコンビナーゼは、リコンビナーゼ結合部位に結合して、その向きを元に戻し（５’から３’）て、第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現されず、遺伝子または遺伝子カセットは３’から５’配向のままであり、および機能的な治療分子は産生されない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、リコンビナーゼが発現され、遺伝子または遺伝子カセットは５’から３’方向に戻され、および機能的な治療上の分子が産生される。
【０４８８】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子およびポリメラーゼおよびリコンビナーゼ調節された遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、リコンビナーゼをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子は、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；Ｔ７プロモーターに作動可能に連結される治療上の分子を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセット；Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３の遺伝子で、Ｔ７ポリメラーゼがＴ７プロモーターに結合し、および治療上の分子の発現を誘導することができるものを含む。Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３の遺伝子は、向きを逆転され（３’から５’）、およびリコンビナーゼ結合部位に隣接し、およびリコンビナーゼは、リコンビナーゼ結合部位に結合し、その向きを戻す（５’から３’）ことによってＴ７ポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現せず、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は３’から５’配向のままであり、および治療上の分子は発現しない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは、二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターを結合し、リコンビナーゼは発現され、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は５’から３’方向に戻り、および治療上の分子が発現される。
【０４８９】
プラスミド上に発現される合成遺伝子回路は、短期間ではうまく機能することができるが、長期間では能力および／または機能を失うことがある（Ｄａｎｉｎｏ（ダニノ）ら、２０１５）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、興味がある遺伝子を長時間にわたって発現させるための安定した回路を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、治療上の分子を産生することができ、および毒素（ｈｏｋ）および短命の抗毒素（ｓｏｋ）を同時に産生する毒素−抗毒素系をさらに含み、プラスミドの損失が長寿命の毒素によって引き起こされる（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）プラスミドｐＬ２０由来のａｌｐ７をさらに含み、および細胞分裂中の均等な分離を確実にするためにプラスミドを細胞の極に押し出すことができるフィラメントを産生する（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５）。
宿主-プラスミド相互依存性
【０４９０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はまた、宿主−プラスミド相互依存性を作り出すように修飾されたプラスミドも含む。一定の実施態様において、相互に依存する宿主−プラスミドプラットフォームはＧｅｎｅＧｕａｒｄである（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５）。いくらかの実施態様では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、（ｉ）条件的複製起点で、そこで、必要な複製開始タンパク質がトランスで提供されるもの；（ｉｉ）栄養要求性改変で、ゲノム転座を介して宿主によって救済され、およびリッチメディア（富栄養培地とも言う）での使用にも適合するもの；および／または（ｉｉｉ）核酸配列で、広域スペクトル毒素をコードするものを含む。毒素遺伝子は、抗毒素を発現しない株（例は、野生型細菌）に対してプラスミドＤＮＡ自体を不利にすることにより、プラスミドの広がりに対して選定するために使用され得る。いくらかの実施態様では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、抗生物質の選択なしで少なくとも１００世代にわたって安定である。いくらかの実施態様では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは宿主の増殖を妨害しない。ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、本発明の遺伝学的に操作された細菌で意図しないプラスミド増殖を大幅に減少させるために使用される。
【０４９１】
相互依存性の宿主−プラスミドプラットフォームは、単独で、または他のバイオセーフティ機構、たとえば、ここに記載されているものなどのようなもの（例は、キルスイッチ、栄養要求性）と組み合わせて使用され得る。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドを含む。他の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１以上のキルスイッチを含む。他の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１以上の栄養要求性を含む。さらに他の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド、１以上のキルスイッチ、および／または１以上の栄養要求性を含む。
【０４９２】
プラスミド上に発現する合成遺伝子回路は、短期間ではうまく機能するが、長期間に能力および／または機能を失うことがある（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、興味がある遺伝子を長時間にわたって発現させるための安定した回路を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および／または消化管エンハンサー分子を産生することができ、および毒素（ｈｏｋ）および短命の抗毒素（ｓｏｋ）を同時に産生する毒素−抗毒素システムをさらに含み、そこで、プラスミドの損失は、細胞が長命毒素によって殺されるようにする（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５；図６６）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓプラスミドｐＬ２０由来のａｌｐ７をさらに含み、および細胞分裂中の均等な分離を確実にするためにプラスミドを細胞の極に押し出すことができるフィラメントを産生する（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５）。
キルスイッチ
【０４９３】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、キルスイッチも含む（例は、米国仮特許出願第６２／１８３，９３５号、第６２／２６３，３２９号、および第６２／２７７，６５４号参照、それらの各々は参照によりその全体においてここに組み込む）。キルスイッチは外部刺激に応答して遺伝学的に操作された細菌を積極的に殺すことを意図する。細菌が生存のために不可欠な栄養素を欠いているために死滅する栄養要求性変異とは対照的に、キルスイッチは、細胞死を引き起こす微生物内の毒性分子の産生を誘発する環境内の特定の因子によって引き起こされる。
【０４９４】
キルスイッチを含む細菌は、インビトロ研究目的のために、例は、実験室環境の外部のバイオ燃料生産微生物の広がりを制限するために設計されたものである。疾患を処置するためのインビボ施与のために操作された細菌は、異種遺伝子または遺伝子群（例は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子）の発現および送付の後、または対象が治療上の効果を経験した後に、特定の時間に死ぬようにプログラムされてもよい。たとえば、いくらかの実施態様では、キルスイッチは、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子、例は、ＧＬＰ−２の発現後ある期間後に細菌を殺すために活性化される。いくらかの実施態様では、キルスイッチは、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子の発現後に遅延した様式で活性化される。あるいは、細菌が疾患部位の外に広がった後、細菌は死滅するように操作されてもよい。具体的には、微生物による対象の長期コロニー形成、対象の内側の関心がある領域外（たとえば、消化管の外側）での微生物の拡散、または対象の外側の微生物の環境への拡散（たとえば、対象の便を通しての環境への広がり）を防ぐことは有用でありうる。キルスイッチに用いることができるそのような毒素の例には、制限されないが、バクテリオシン、リシン、および細胞膜を溶解すること、細胞ＤＮＡを分解すること、または他の機序によって細胞死を引き起こす他の分子が含まれる。そのような毒素は、個々に、または組み合わせて使用することができる。それらの産生をコントロールするスイッチは、たとえば、転写活性化（トグルスイッチ；例は、Ｇａｒｄｎｅｒ（ガードナー）ら、２０００参照）、翻訳（リボソームレギュレーター）、またはＤＮＡ組換え（リコンビナーゼ系スイッチ）に基づくことができ、および環境刺激、たとえば、嫌気生活または反応性酸素種のようなものを意味することができる。これらのスイッチは、単一の環境要因によって活性化することができ、または細胞死を誘発するために複数の活性化因子をＡＮＤ、ＯＲ、ＮＡＮＤおよびＮＯＲ論理構成において必要とすることがある。たとえば、ＡＮＤリボソームレギュレータースイッチは、リシンの発現を誘導するために、テトラサイクリン、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびアラビノースによって活性化され、それは、細胞膜を透過性にし、および細胞を殺す。ＩＰＴＧは、エンドリシンおよびホリンｍＲＮＡの発現を誘導し、それらはその後、アラビノースおよびテトラサイクリンの添加によって抑制解除される。細胞死を引き起こすためには、３種すべての誘導物質が存在しなければならない。キルスイッチの例は当技術で既知である（Ｃａｌｌｕｒａ（カルラ）ら、２０１０）。
【０４９５】
キルスイッチは、環境条件または外部信号に応答して毒素が生成されるように設計する（例は、外部キューに応答して細菌が殺され）か、あるいはまた、環境条件がもはや存在せず、または外部信号が停止されると、毒素が生成されるように設計することができる。
【０４９６】
したがって、いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、たとえば、ＲＯＳの存在下で、またはＲＮＳの存在下で、低酸素条件において、外因性環境シグナルを感知した後に死ぬようにさらにプログラムされる。いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、１以上のリコンビナーゼ（群）をコードする１以上の遺伝子を含み、それらの発現は環境条件またはシグナルに応答して誘導され、および１以上の組換え事象を引き起こし、それは細胞を死滅させる毒素の発現を最終的に導く。いくらかの実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、それが第１のリコンビナーゼによってフリッピング（反転とも言う）された後に構成的に発現される細菌毒素をコードする逆の異種遺伝子のフリッピングである。一実施態様では、細菌毒素の構成的発現は遺伝学的に操作された細菌を死滅させる。これらのタイプのキルスイッチシステムでは、一旦操作された細菌細胞が外因性環境条件を感知し、および興味がある異種遺伝子を発現すると、組換え細菌細胞はもはや生存可能ではない。
【０４９７】
本開示の遺伝学的操作細菌が、少なくとも１つの組換え事象を引き起こす環境条件またはシグナルに応答して１以上のリコンビナーゼ（群）を発現する別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、外因性の環境条件または信号に応答して抗毒素をコードする異種遺伝子を発現する。一実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向の異種遺伝子のフリッピングである。一実施態様では、細菌毒素をコードする逆方向の異種遺伝子は、第１の順方向リコンビナーゼ認識配列と第１の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによってフリッピングされた後に構成的に発現される。一実施態様では、抗毒素は毒素の活性を抑制し、それによって遺伝学的に操作された細菌の死が遅延される。一実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現されないとき、外因性環境条件がもはや存在しないときに、細菌毒素によって殺される。
【０４９８】
別の実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、第２のリコンビナーゼをコードする逆方向の異種遺伝子の第１のリコンビナーゼによるフリッピングであり、次に、細菌毒素をコードする逆方向の異種遺伝子の第２のリコンビナーゼによるフリッピングが続く。一実施態様では、第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子は、第１の順方向リコンビナーゼ認識配列と第１の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２の順方向リコンビナーゼ認識配列と第２の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、第２のリコンビナーゼをコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第２のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は細菌毒素によって殺される。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、外因性環境条件に応答して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施態様では、抗毒素は、外因性環境条件が存在するとき、毒素の活性を抑制し、それによって遺伝学的に操作された細菌の死を遅延させる。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現されないとき、外因性環境条件がもはや存在しないとき、細菌毒素によって死滅する。
【０４９９】
一実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子の第１のリコンビナーゼによるフリッピングであり、次いで、第３のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子の第２のリコンビナーゼによるフリッピングが続き、次に、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子の第３のリコンビナーゼによるフリッピングが続く。
【０５００】
一実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、第１の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子の第１のリコンビナーゼによるフリッピングである。一実施態様では、第１の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第１の順方向リコンビナーゼ認識配列と第１の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、第１の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、第１の切除酵素は第１の必須遺伝子を切除する。一実施態様では、プログラムされた組換え細菌細胞は第１の必須遺伝子が切除された後に生存できない。
【０５０１】
一実施態様では、第１のリコンビナーゼは、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子をさらに反転させる。一実施態様では、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２の順方向リコンビナーゼ認識配列と第２の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、第２の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、第１の必須遺伝子および第２の必須遺伝子が両方とも切除されるとき、遺伝学的に操作された細菌は死ぬか、またはもはや生存できない。一実施態様では、第１のリコンビナーゼによって第１の必須遺伝子が切除されるか、または第２の必須遺伝子が切除されるかのいずれかのとき、遺伝学的に操作された細菌は死ぬか、またはもはや生存できない。
【０５０２】
一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも１つの組換え事象が生じた後に死滅する。別の実施態様では、少なくとも１つの組換え事象が生じた後、遺伝学的に操作された細菌はもはや生存できない。
【０５０３】
これらの実施態様のいずれかにおいて、リコンビナーゼは、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、およびＩｎｔ３４、またはその生物学的に活性な断片からなる群より選ばれるリコンビナーゼであることができる。
【０５０４】
上記のキルスイッチ回路では、毒素は環境因子または信号の存在下で生成される。キルスイッチ回路の別の態様では、毒素は環境因子の存在下で抑制され（生成されず）、および環境条件または外部信号がもはや存在しなくなると生成され得る。そのようなキルスイッチは、抑制ベースのキルスイッチと呼ばれ、および細菌細胞が外部因子またはシグナル、たとえば、アラビノースまたは他の糖などのようなものの存在下だけで生存可能である系を表す。外因性因子またはシグナルの存在下で毒素が抑制される（および外部シグナルが除去された後に活性化される）例示的なキルスイッチ設計は、図５７、６０、６５において示される。本開示は、外因性環境においてアラビノースまたは他の糖を感知すると、１以上の異種遺伝子（群）を発現する組換え細菌細胞を提供する。この局面において、組換え細菌細胞は、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子、ならびにａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある１以上の遺伝子を含む。アラビノースの不存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下で遺伝子の転写を抑制するコンフォメーションを採用する。アラビノースの存在下で、ＡｒａＣ転写因子は、ＡｒａＢＡＤプロモーターに結合してこれを活性化し、それは毒素遺伝子の発現を抑制する望ましい遺伝子、たとえば、ｔｅｔＲの発現を誘導する構造変化を受ける。この実施態様では、毒素遺伝子は、アラビノースまたは他の糖の存在下で抑制される。アラビノースが存在しない環境では、ｔｅｔＲ遺伝子は活性化されず、おおび毒素が発現され、それによって細菌が死滅する。アラビノース系はまた、必須遺伝子がアラビノースまたは他の糖の存在下だけで発現され、アラビノースまたは他の糖が環境中に存在しない場合に発現されない必須遺伝子を発現するためにも使用され得る。
【０５０５】
したがって、外因性環境においてアラビノースを感知する際に１以上の異種遺伝子（群）が発現されるいくらかの実施態様において、１以上の異種遺伝子は、ａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）の制御下に直接的または間接的に存在する。いくらかの実施態様では、発現された異種遺伝子は、次の：異種の治療上の遺伝子、抗毒素をコードする異種遺伝子、抑制因子タンパク質またはポリペプチドをコードする異種遺伝子、たとえば、ＴｅｔＲ抑制因子、細菌細胞に見出されない必須タンパク質をコードする異種遺伝子、および／または調節タンパク質またはポリペプチドをコードする異種タンパク質の一以上から選定される。
【０５０６】
アラビノース誘導性プロモーターは、Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＣ、およびＰａｒａＢＡＤを含め、当技術において既知である。一実施態様では、アラビノース誘導性プロモーターはＥ．  ｃｏｌｉ由来である。いくらかの実施態様において、ＰａｒａＣプロモーターおよびＰａｒａＢＡＤプロモーターは、一方向において異種遺伝子（群）の発現を制御するＰａｒａＢＡＤプロモーターを伴って、双方向性プロモーターとして機能し、およびＰａｒａＣ（ＰａｒａＢＡＤプロモーターに近接近し、およびそれから逆ストランドにあり）、他の方向において異種遺伝子（群）の発現が制御される。アラビノースの存在下では、双方のプロモーターからの双方の異種遺伝子の転写が誘導される。しかし、アラビノースの不存在下では、双方のプロモーターからの双方の異種遺伝子の転写は誘導されない。
【０５０７】
本開示の１つの例示的な実施態様において、本開示の遺伝学的操作細菌は、少なくとも以下の配列：テトラサイクリン抑制因子タンパク質（ＴｅｔＲ）をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーター、ＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＣプロモーター、およびテトラサイクリン抑制因子タンパク質（ＰＴｅｔＲ）によって抑制されるプロモーターに作動可能に連結された細菌毒素をコードする異種遺伝子を有するキルスイッチを含む。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、それはＴｅｔＲタンパク質の転写を活性化し、それは次に毒素の転写を抑制する。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、ＡｒａＣはＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、およびＴｅｔＲタンパク質は発現しない。この場合、異種毒素遺伝子の発現が活性化され、および毒素が発現される。毒素は組換え細菌細胞中に蓄積し、および組換え細菌細胞は死滅する。一実施態様では、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にあり、および従って、構成的に発現される。
【０５０８】
本開示の１の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、構成的プロモーターの制御下に抗毒素をさらに含む。この状況では、アラビノースの存在下で、毒素はＴｅｔＲタンパク質による抑制のために発現されず、および抗毒素タンパク質は細胞内に蓄積する。しかし、アラビノースの不存在下では、ＴｅｔＲタンパク質は発現されず、および毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内に蓄積し始める。組換え細菌細胞は、毒素タンパク質が細胞中の抗毒素タンパク質の量と等しいかそれ以上の量で存在するともはや生存できず、および組換え細菌細胞は毒素によって死滅する。
【０５０９】
本開示の別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下に抗毒素をさらに含む。この状況では、アラビノースの存在下で、ＴｅｔＲおよび抗毒素が発現され、細胞内に抗毒素が蓄積し、および毒素はＴｅｔＲタンパク質による抑制のために発現されない。しかしながら、アラビノースの不存在下では、ＴｅｔＲタンパク質および抗毒素の双方が発現されず、および毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内に蓄積し始める。毒素タンパク質が発現されると、組換え細菌細胞はもはや生存できず、および組換え細菌細胞は毒素によって死滅する。
【０５１０】
本開示の別の例示的な実施態様において、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも以下の配列：組換え細菌細胞において見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーター（および生存のために必要とされる）、およびＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＣプロモーターを有するキルスイッチを含む。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、それは必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子の転写を活性化し、組換え細菌細胞が生存することを可能にさせる。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、ＡｒａＣはＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、生存に必要な必須タンパク質は発現しない。この場合、組換え細菌細胞はアラビノースの不存在下で死ぬ。いくらかの実施態様では、組換え細菌細胞に見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、ちょうど上記のＴｅｔＲ／毒素キルスイッチシステムと共に細菌細胞中に存在することができる。いくらかの実施態様において、組換え細菌細胞に見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、ちょうど上記のＴｅｔＲ／毒素／抗毒素キルスイッチシステムと併せて細菌細胞において存在することができる。
【０５１１】
さらに他の実施態様では、細菌は、短命の抗毒素および長命の毒素の双方を産生するプラスミドを伴うプラスミド安定性システムを含みうる。このシステムでは、細菌細胞は等量の毒素および抗毒素を産生して毒素を中和する。しかし、細胞がプラスミドを失う場合／とき、短命の抗毒素が崩壊し始める。抗毒素が完全に崩壊するとき、より一層長命の毒素が細胞を殺す結果として、その細胞が死ぬ。
【０５１２】
いくらかの実施態様では、本開示の操作された細菌は、上記のキルスイッチ回路のいずれかの成分をコードする遺伝子（群）をさらに含む。
【０５１３】
上記の実施態様のいずれかにおいて、細菌毒素は、リシン、Ｈｏｋ、Ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、Ｋｉｄ、ＳｙｍＥ、ＭａｚＦ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＸＣＶ２１６２、ｄｉｎＪ、ＣｃｄＢ、ＭａｚＦ、ＰａｒＥ、ＹａｆＯ、Ｚｅｔａ、ｈｉｃＢ、ｒｅｌＢ、ｙｈａＶ、ｙｏｅＢ、ｃｈｐＢＫ、ｈｉｐＡ、マイクロシンＢ、マイクロシンＢ１７、マイクロシンＣ、マイクロシンＣ７−Ｃ５１、マイクロシンＪ２５、マイクロシンＣｏｌＶ、マイクロシン２４、マイクロシンＬ、マイクロシンＤ９３、マイクロシンＬ、マイクロシンＥ４９２、マイクロシンＨ４７、マイクロシンＩ４７、ミクロシンＭ、コリシンＡ、コリシンＥ１、コリシンＫ、コリシンＮ、コリシンＵ、コリシンＢ、コリシンＩａ、コリシン１ｂ、コリシン５、コリシン１０、コリシンＳ４、コリシンＹ、コリシンＥ２、コリシンＥ７、コリシンＥ８、コリシンＥ９、コリシンＥ３、コリシンＥ４、コリシンＥ６、コリシンＥ５、コリシンＤ、コリシンＭ、およびクロアシンＤＦ１３、またはその生物学的に活性な断片からなる群より選ばれ得る。
【０５１４】
上記の実施態様のいずれかにおいて、抗毒素は、抗リジン、Ｓｏｋ、ＲＮＡＩＩ、ＩｓｔＲ、ＲｄｌＤ、Ｋｉｓ、ＳｙｍＲ、ＭａｚＥ、ＦｌｍＢ、Ｓｉｂ、ｐｔａＲＮＡ１、ｙａｆＱ、ＣｃｄＡ、ＭａｚＥ、ＰａｒＤ、ＹａｆＮ、Ｅｐｓｉｌｏｎ、ＨｉｃＡ、ｒｅｌＥ、ｐｒｌＦ、ｙｅｆＭ、ｃｈｐＢＩ、ｈｉｐＢ、ＭｃｃＥ、ＭｃｃＥＣＴＤ、ＭｃｃＦ、Ｃａｉ、ＩｍｍＥ１、Ｃｋｉ、Ｃｎｉ、Ｃｕｉ、Ｃｂｉ、Ｉｉａ、Ｉｍｍ、Ｃｆｉ、Ｉｍ１０、Ｃｓｉ、Ｃｙｉ、Ｉｍ２、Ｉｍ７、Ｉｍ８、Ｉｍ９、Ｉｍ３、Ｉｍ４、ＩｍｍＥ６、クロアシン免疫タンパク質（ｃｌｏａｃｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｃｉｍ）、ＩｍｍＥ５、ＩｍｍＤ、およびＣｍｉ、またはその生物学的に活性な断片からなる群より選ばれ得る。
【０５１５】
一実施態様では、細菌毒素は遺伝学的に操作された細菌に対して殺菌性である。一実施態様では、細菌毒素は遺伝学的に操作された細菌に対して静菌性である。
【０５１６】
いくらかの実施態様では、ここに提供される遺伝学的に操作された細菌は、栄養要求体である。一実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、  ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１栄養要求株である。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、１よりも多くの栄養要求性を有し、たとえば、それらはΔｔｈｙＡおよびΔｄａｐＡ栄養要求性であり得る。
【０５１７】
いくらかの実施態様では、ここに提供される遺伝学的に操作された細菌は、キルスイッチ回路、たとえば、ここに提供されるキルスイッチ回路などのようなものをさらに含む。たとえば、いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導性プロモーターおよび逆毒素配列の制御下に１以上のリコンビナーゼ（群）をコードする１以上の遺伝子をさらに含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする１以上の遺伝子をさらに含む。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、誘導性プロモーターおよび１以上の逆方向切除遺伝子の制御下に１以上のリコンビナーゼ（群）をコードする１以上の遺伝子をさらに含み、そこで、切除遺伝子（群）は必須遺伝子を削除する酵素をコードする。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする１以上の遺伝子をさらに含む。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、ＴｅｔＲ抑制因子結合部位を有するプロモーターの制御下に毒素をコードする１以上の遺伝子、およびアラビノースによって誘導される誘導性プロモーターの制御下にＴｅｔＲをコードする遺伝子、たとえば、ＰａｒａＢＡＤなどのようなものをさらに含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする１以上の遺伝子をさらに含む。
【０５１８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、治療上のペイロードを含む栄養要求体であり、およびキルスイッチ回路、たとえば、ここに記載のキルスイッチ回路などのようなものをさらに含む。
【０５１９】
上記の遺伝学的に操作された細菌のいくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、細菌のプラスミド上に存在し、およびプラスミド上で誘導性プロモーターに作動可能に連結される。他の実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、細菌染色体に存在し、および染色体において誘導性プロモーターに作動可能に連結される。
スクリーニング法
変異誘発
【０５２０】
いくらかの実施態様では、誘導性プロモーターは、検出可能な生成物に、例は、ＧＦＰに、作動可能に連結され、および変異体をスクリーニングするために使用することができる。いくらかの実施態様では、誘導性プロモーターは変異誘発され、および変形物は、検出可能な生成物のレベルに基づいて、例は、フローサイトメトリー、検出可能な生成物が蛍光を発するとき蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選定される。いくらかの実施態様では、１以上の転写因子結合部位は変異誘発されて結合を増加または減少させる。代わりの実施態様では、野生型結合部位は無傷のままであり、および調節領域の残りは変異誘発に供される。いくらかの実施態様では、誘導性条件下で抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子の発現を、同じ条件下で同じサブタイプの変異されていない細菌と比較して増加させるために、変異プロモーターが本発明の遺伝学的に操作された細菌に挿入される。いくらかの実施態様において、誘導性プロモーターおよび／または対応する転写因子は、合成の、非自然配列である。
【０５２１】
いくらかの実施態様において、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子は、誘発条件下で前記分子の発現および／または安定性を、同じ条件下で同じサブタイプの変異されていない細菌と比較して増加させるように変異される。いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子カセット中の１以上の遺伝子が、誘導性条件下で前記分子の発現を、同じ条件下に同じサブタイプの非変異細菌と比較して増加させるよう変異される。いくつかの実施形態では、目的の代謝産物の取り込み輸送体（ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ）および排出輸送体（ｅｘｐｏｒｔｅｒｓ）のいずれかの効力または活性を、前記遺伝子のいずれかの変異によって改善することが可能である。突然変異によって、同一条件下の同じサブタイプで変異のない細菌と比較して、トリプトファンを含むがこれらに限定されない代謝産物の取り込みまたは排出（例えば、誘導条件下における）が増加する。定方向突然変異およびスクリーニングの方法は、当該分野で公知である。
目的の代謝産物を輸送する能力を増強した細菌株の作製
【０５２２】
培養の容易さ、短い世代時間、極めて高い集団密度および小さいゲノムのため、微生物は短縮されたタイムスケールで固有の表現型に進化することができる。適応実験室進化（ＡＬＥ）は、好ましい表現型の菌株に進化させるために、選択圧下で微生物を継代する方法である。最も一般的には、ＡＬＥは、炭素／エネルギー源の利用を増やすため、または環境ストレス（例えば、温度、ｐＨ）に菌株を適応させるために、適用される。集団内において、炭素基質の存在下またはストレス下における増殖能力が高い突然変異菌株は、適応性のより低い菌株を打ち負かし、最終的には集団を支配するようになるであろう。
【０５２３】
この同じ方法を、栄養要求体を作製することにより、任意の必須代謝産物に拡張することができる。栄養要求体は、必須代謝産物を合成することができない菌株であり、したがって、増殖するためには培地中に代謝産物を供給しなければならない。栄養要求体を作製し、代謝産物の量を減少させながらそれを継代させことによるこのシナリオで得られる優性菌株は、この必須代謝産物または生体分子を獲得する能力および組み込む能力がより高いはずである。
【０５２４】
例えば、目的の代謝産物を生成するための生合成経路が破壊された場合、ＡＬＥによって目的の代謝産物の高親和性捕捉が可能な菌株に進化させることができる。まず、増殖を支持するための最小濃度が確立されるまで、様々な濃度の目的の栄養要求性代謝産物中で菌株を増殖させる。次いで、菌株をその濃度で継代させ、定期的な間隔で希釈して漸減代謝産物または生体分子濃度にする。時が経つにつれて、目的の代謝産物について−増殖制限濃度で−最も競争力の高い細胞が集団を支配するようになる。これらの菌株は、目的の代謝産物の輸送体中に突然変異を有し、その結果、目的の必須・制限代謝産物を取り込む能力が増大している可能性が高い。
【０５２５】
同様に、目的の代謝産物を形成するために上流に代謝産物を用いることができない栄養要求体を用いることにより、菌株を、上流の代謝産物をより効率的に移入することができるばかりでなく、代謝産物を関心のある必須の下流代謝産物に変換することもできるものに進化させることができる。これらの菌株は、上流の代謝産物の移入を増加させるために突然変異を進化させることにもなるが、下流の酵素の発現または反応速度を上昇させる突然変異、または競合的基質利用経路を低減する突然変異も含有し得る。
【０５２６】
微生物に固有の代謝産物は、その内因性代謝産物の増殖制限性補給で作動される突然変異的栄養要求性および選択により必須のものにされ得る。しかし、非天然化合物を消費することができる表現型を、それらの消費を必須化合物の生成に結びつけることにより、進化させることができる。例えば、必須化合物または必須化合物の前駆体を生成することができる異なる生物からの遺伝子を単離した場合、この遺伝子を異種宿主に組換え導入し、その異種宿主において発現させることができる。この新たな宿主菌株には以前は代謝できなかった基質から必須栄養素を合成する能力が今ではあることになる。
【０５２７】
これにより、直ぐ下流の代謝産物を変換することができない栄養要求体を作出し、組換え酵素の同時発現を用いて増殖制限量の非天然化合物中で選択することにより、同様のＡＬＥ方法を適用することができる。この結果、非天然基質の輸送、異種酵素の発現および活性、ならびに下流の天然酵素の発現および活性における突然変異が生じることになる。強調すべきは、この方法における肝要な要件が、非天然代謝産物の消費を増殖に必須の代謝産物の産生に結びつけることができることであるということである。
【０５２８】
選択機構の基礎を確立し、最小補給レベルを確定したら、実際のＡＬＥ実験に取りかかることができる。この方法を通して、いくつかのパラメーターを注意深くモニターしなければならない。重要なのは、培養物を指数増殖期で維持し、飽和／定常期に到達させないことである。これは、各継代中に増殖速度をチェックし、そしてそれに合うようにその後の希釈度を調整しなければならないことを意味する。希釈度が大きくなるような程まで増殖速度が向上した場合には、増殖速度が緩徐化され、選択圧が増大され、希釈度が継代中の亜集団を重度に偏らせるほど過酷なものにならないように、栄養要求体補給の濃度を低下させるべきである。加えて、定期的な間隔で、細胞を希釈し、固形培地で増殖させ、個々のクローンを試験してＡＬＥ培養物で観察された増殖速度表現型を確認すべきである。
【０５２９】
中断するタイミングを予測して、ＡＬＥ実験の停止にも警戒する必要がある。進化を方向づけることの成功は、実験を通して「スクリーニングされる」突然変異の数に直接関係しており、突然変異は、一般に、ＤＮＡ複製中のエラーの関数であるので、累積細胞分裂数（ＣＣＤ）は、スクリーニングされた全突然変異体数の代わりとして動作する。以前の研究により、異なる炭素源を用いる増殖に有益な表現型を約１０１１．２ＣＣＤ１で単離することができることが示された。この速度は、ＤＮＡ複製エラー増加を引き起こす−Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの−化学的突然変異誘発剤の培地への添加により、加速させることができる。しかし、連続継代の結果、増殖速度の向上がほとんどまたは全くなくなると、集団は、最大適応度に収束し、ＡＬＥ実験は中断され得る。
【０５３０】
ＡＬＥ実験の終わりに、細胞を希釈し、固形培地上で単離し、培養フラスコのものにマッチする増殖表現型についてアッセイするべきである。次いで、選択されたものから最も性能のよいものがゲノムＤＮＡ用に調製され、全ゲノム配列決定に送られる。配列決定は、向上した表現型をもたらすことができるゲノムの周囲に存在する突然変異を明らかにすることになるが、サイレント突然変異（恩恵をもたらさないが、所望の表現型を損なわないもの）も含有することになる。ＮＴＧまたは他の化学的突然変異誘発要因の存在下で進化させた培養物には、それよりサイレント性が有意に高いバックグラウンド突然変異が存在することになる。その現状で最も性能の良い菌株に納得がいけば、使用者は、その菌株での応用に進むことができる。そうでなければ、ゲノム操作技術により親菌株に突然変異を再導入することにより、進化菌株から寄与突然変異をデコンボリュートすることができる。例えば、Ｌｅｅ，Ｄ．−Ｈ．、Ｆｅｉｓｔ，Ａ．Ｍ．、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃ．Ｌ．およびＰａｌｓｓｏｎ，Ｂ．ＯＥ．、Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  Ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ  Ｔｉｍｅｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６、ｅ２６１７２（２０１１年）を参照されたい。
【０５３１】
同様の方法を用いて、代謝産物（トリプトファンを含むがこれに限定されない）を消費または取り込み輸送する、大腸菌ニッスル突然変異体を作製することができる。
製薬上組成物および剤型
【０５３２】
本発明の遺伝学的に操作された微生物を含む製薬上組成物は、消化管において炎症性機構を抑制し、消化管粘膜バリア機能を回復および強化し、および／または自己免疫疾患を処置または予防するために使用され得る。１以上の遺伝学的に操作された細菌および／または１以上の遺伝学的に操作されたウイルスを含む製薬上組成物は、単独で、または予防剤、治療剤、および／または薬学的に許容可能な担体と組み合わせて提供される。
【０５３３】
一定の実施態様では、製薬上組成物は、例は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するために、ここに記載の遺伝子修飾を含むように操作される細菌の１つの種、菌株、またはサブタイプを含む。代わりの実施態様において、製薬上組成物は、ここに記載の遺伝子修飾をそれぞれ含むように、例は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するために操作された細菌の２以上の種、菌株、および／またはサブタイプを含む。
【０５３４】
ここに記載の製薬上組成物は、活性成分の製薬上用途のための組成物への加工を容易にする、賦形剤および助剤を含む１以上の生理学的に許容可能な担体を用いて慣習的な方法で調剤しうる。製薬上組成物を調剤する方法は、当技術において既知である（例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ）」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（マック・パブリッシング社）、Ｅａｓｔｏｎ（イーストン）、ＰＡ（ペンシルベニア州）」参照）。いくらかの実施態様において、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロタブレット、ペレット、または紛体を形成するために、錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、慣習的混合、溶解、造粒、レビゲーティング（水簸とも言う）、乳化、エンカプスレーティング（被包とも言う）、エントラッピング（捕捉とも言う）、または噴霧乾燥に供され、それらは腸溶性にコーティングされるか、またはコーティングされていなくてもよい。適切な製剤は施与経路に依存する。
【０５３５】
遺伝学的に操作された微生物は、任意の適切な剤形（例は、液体、カプセル、サシェ、硬カプセル、軟カプセル、錠剤、腸溶錠、懸濁粉末、顆粒、または経口投与のためのマトリクス持続放出調剤）において、および任意の適切なタイプの施与（例は、経口、局所、注射可能、静脈内、皮下、即時放出、拍動放出、遅延放出、または持続放出）のために製薬上組成物に調剤し得る。遺伝学的に操作された細菌の適切な投薬量は、約１０５から１０１２細菌まで、例は、およそ１０５細菌、およそ１０６細菌、およそ１０７細菌、およそ１０８細菌、およそ１０９細菌、およそ１０１０細菌、およそ１０１１細菌、またはおよそ１０１１細菌に及んでよい。組成物は、毎日、毎週、または毎月１回以上施与することができる。組成物は、食餌の前、間、または後に施与することができる。一実施態様では、製薬上組成物は対象が食餌を取る前に施与される。一実施態様では、製薬上組成物は広く食餌と共に施与される。一実施態様では、製薬上組成物は、対象が食餌を取った後に施与される。
【０５３６】
遺伝学的に操作された細菌または遺伝学的に操作されたウイルスは、１以上の薬学的に許容可能な担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、緩衝化剤、界面活性剤、中性またはカチオン性（陽イオン性とも言う）脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容可能な担体または薬剤を含む製薬上組成物に調剤され得る。たとえば、製薬上組成物は、制限されないが、重炭酸（炭酸水素とも言う）カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびデンプンのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および界面活性剤の添加を含む。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、重炭酸ナトリウムの溶液、例は、重炭酸ナトリウムの１モル溶液において（たとえば、胃などのような酸性細胞環境を緩衝するために）調剤し得る。遺伝学的に操作された細菌は、中性または塩形態として施与および製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩には、アニオン（陰イオンとも言う）、たとえば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもののようなもので形成されるもの、およびカチオン（陽イオン）、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、などから導き出されるもののようなものから形成されるものが含まれる。
【０５３７】
遺伝学的に操作された微生物は、静脈内に、例えば、注入または注射によって投与され得る。
【０５３８】
本開示の遺伝子操作された微生物はくも膜下腔内に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された微生物は経口投与され得る。ここに開示される遺伝学的に操作された微生物は、局所的に施与され、および軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態、または当業者によく知られる他の形態において調剤され得る。例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照。一実施態様では、非噴霧可能な局所剤形のために、担体または局所適用に適合可能な、水よりも大きい動粘度を有する１以上の賦形剤を含む粘性から半固形または固形形態が用いられる。適切な調剤物には、制限されないが、溶液、懸濁物、エマルション、クリーム、軟膏、紛体、リニメント剤、サルブ（膏薬とも言う）、などが含まれ、それらは滅菌することができ、または種々の特性、例は、浸透圧に影響を及ぼすために、助剤（例は、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、または塩類）と混合することができる。他の適切な局所投与形態には、噴霧可能なエアロゾル調剤物が含まれ、そこでは、固形または液状の不活性担体と組み合わせられる活性成分が、加圧揮発性物質（例は、気体状推進物質、たとえば、フレオンなどのようなもの）との混合物において、またはスクイズボトルにおいて包装される。加湿剤または湿潤剤も、製薬上組成物および剤形に添加することができる。そのような追加の成分の例は当技術においてよく知られる。一実施態様では、本発明の組換え細菌を含む製薬上組成物は、衛生用品として調剤してよい。たとえば、衛生用品は、抗菌調剤物、または発酵生成物、たとえば、発酵ブロスなどのようなものであってもよい。衛生用品は、たとえば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローション、およびリップクリームであり得る。
【０５３９】
ここに開示される遺伝学的に操作された微生物は、経口的に投与され、および錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液状物、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物、などとして調剤され得る。経口使用のための薬理学的組成物は、錠剤またはドラジェ（糖衣錠）コアを得るために、固形賦形剤を用いること、得られる混合物を随意に、グラインディング（粉砕とも言う）すること、および所望により適切な助剤を加えた後、顆粒の混合物を処理することで作成することができる。適切な賦形剤には、制限されないが、充填材、たとえば、糖で、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含むもの；セルロース組成物で、たとえば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのようなもの；および／または生理学的に許容可能なポリマーで、たとえば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのようなものが含まれる。崩壊剤を添加してもよく、たとえば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、たとえば、アルギン酸ナトリウムなどのようなものである。
【０５４０】
錠剤またはカプセルは、薬学的に許容可能な賦形剤、たとえば、結合剤（例は、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガカント）などのようなもの；充填剤（例は、乳糖、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例は、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例は、デンプン、ジャガイモデンプン、グリコール酸デンプンナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉体）；または湿潤剤（例は、ラウリル硫酸ナトリウム）により慣習的な手段によって調製することができる。錠剤は、当技術においてよく知られる方法によってコーティングすることができる。コーティングシェルが存在してよく、および共通の膜には、制限されないが、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、他の生分解可能なポリマー、アルギナート（アルギン酸とも言う）−ポリリジン−アルギン酸（ＡＰＡ）、アルギン酸−ポリメチレン−コ−グアニジン−アルギン酸（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリラート−メチル−メタクリラート（ｈｙｄｒｏｙｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ−ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（ＨＥＭＡ−ＨＥＭＡ）、多層状ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリルビニルクロライド（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、シリカ質カプセル（ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｓ）、硫酸セルロース／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン−コ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸カルシウム、ｋ−カラギーナン−ローカストビーンガム−ゲルビーズ（ｋ−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−ｌｏｃｕｓｔ  ｂｅａｎ  ｇｕｍ  ｇｅｌ  ｂｅａｄｓ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ無水物、ポリメタクリル酸デンプン、ポリアミノ酸、および腸溶性コーティングポリマーが含まれる。
【０５４１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された微生物は、消化管または消化管の特定の領域、たとえば、大腸への放出のために腸溶性にコーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１−４（胃）、５．５−６（十二指腸）、７．３−８．０（回腸）、および５．５−６．５（結腸）である。いくつかの疾患では、ｐＨプロファイルは修飾されうる。いくらかの実施態様において、コーティングは、放出部位を特定するために、特定のｐＨ環境で分解される。いくらかの実施態様では、少なくとも２つのコーティングが使用される。いくらかの実施態様では、外側のコーティングおよび内側のコーティングは、異なるｐＨレベルで分解される。
【０５４２】
経口投与のための液状調製物は、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための溶液、シロップ、懸濁物、または乾燥生成物の形態をとり得る。このような液状調製物は、薬学的に許容される薬剤、たとえば、懸濁剤（例は、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油脂（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｅｄｉｂｌｅ  ｆａｔｓ））；乳化剤（例は、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例は、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および保存剤（例は、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）などのようなものによる慣習的な手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて緩衝剤塩、着香剤、着色剤、および甘味剤を含有してもよい。経口投与のための調製物は、ここに記載の遺伝学的に操作された微生物の徐放、制御放出、または持続放出のために適切に調剤され得る。
【０５４３】
一実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された微生物は、小児対象への施与に適する組成物において調剤され得る。当技術においてよく知られるように、胃内容排出、ｐＨ、消化管透過性、などの異なる速度を含め、チルドレンは多くの側面で成体と異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａ（イワノフスカ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（ペディアトリックス）、１３４（２）：３６１−３７２、２０１４）。さらに、小児の調剤受容性および嗜好、たとえば、施与経路および味覚属性は、許容可能な小児の服薬遵守を達成するために重要である。したがって、一実施態様では、小児対象への施与に適した組成物は、嚥下しやすいか、または溶解可能な剤形、またはより一層美味な組成物、たとえば、風味、甘味料、または味覚遮断剤を添加した組成物などのようなものを含み得る。１の実施態様において、小児対象への施与に適する組成物はまた、成体への施与に適していてもよい。
【０５４４】
一実施態様では、小児対象への施与に適した組成物は、溶液、シロップ、懸濁物、エリキシル、懸濁物または溶液として再構成するための粉体、分散性／発泡性錠剤、チュアブル錠、グミキャンディー、ロリポップ、フリーザー・ポップ（ｆｒｅｅｚｅｒ  ｐｏｐ）、トローチ、チューインガム、オーラル・ティン・ストリップ（ｏｒａｌ  ｔｈｉｎ  ｓｔｒｉｐ、口腔薄片とも言う）、口腔内崩壊錠（ｏｒａｌｌｙ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｔａｂｌｅｔ）、サシェ（小さな袋とも言われる）、軟質ゼラチンカプセル、スプリンクル・オーラル・パウダー（散剤経口粉末とも言う）、または顆粒が含まれ得る。一実施態様では、組成物は、キャンディー弾力性、望ましい噛む必要がある粘稠度、およびより一層長い貯蔵寿命を与える、ゼラチンベースから作られたグミ（ゴム状とも言う）キャンディーである。いくらかの実施態様では、グミキャンディーは甘味料または香味料を含むこともできる。
【０５４５】
一実施態様では、小児対象への施与に適した組成物は香味料を含むことができる。ここに使用するように、「香味料（フレーバー）」は、調剤物に明確な味および香りを提供する物質（液体または固体）である。香味料はまた、調剤物の嗜好性を改善するのに役立つ。香味料には、制限されないが、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、バブルガム、およびチェリーが含まれる。
【０５４６】
一定の実施態様において、遺伝学的に操作された微生物は、たとえば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与され得る。化合物はまた、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入されても、錠剤に圧縮されても、または対象の食餌に直接組み込んでもよい。経口治療投与のために、化合物は賦形剤と共に取り込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウエハー、およびその他同種類のものなどの形態で使用されてもよい。非経口投与以外の方法で化合物を投与するには、化合物をその不活性化を防止する物質でコーティングするか、化合物と一緒に投与することが必要な場合がある。
【０５４７】
別の実施態様では、本発明の組換え細菌を含む製薬上組成物は、食用に適した生成物、たとえば、食料生成物であってもよい。一実施態様では、食料生成物は、ミルク、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、サワーミルク（酸乳）、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、植物果実ジュース、果汁、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、乳児食（たとえば、乳児用ケーキなどのようなもの）、栄養上の食料生成物、動物飼料、または栄養補給剤である。一実施態様では、食料生成物は、発酵食料、たとえば、発酵乳生成物などのようなものである。一実施態様では、発酵乳生成物はヨーグルトである。別の実施態様において、発酵乳生成物は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクシェイク（ミルクセーキとも言う）、またはケフィアである。別の実施態様では、本発明の組換え細菌を、プロバイオティクスとして作用することが意図される他の生菌細胞を含む調製物において組み合わせる。別の実施態様において、食料生成物は飲料である。一実施態様では、飲料は、果汁系飲料または植物またはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施態様において、食料生成物はゼリーまたはプディング（プリンとも言う）である。本発明の組換え細菌の施与に適する他の食料生成物は当技術においてよく知られる。たとえば、米国特許出願公開第２０１５／０３５９８９４号および第２０１５／０２３８５４５号が参照され、それらの各々の全体の内容は参照によりここに明示的に組み込まれる。さらに別の実施態様では、本発明の製薬上組成物は、食料生成物、たとえば、パン、ヨーグルト、またはチーズなどのようなものに注入、噴霧、または散在される。
【０５４８】
いくらかの実施態様では、組成物は、腸溶性にコーティングされ、またはコーティングされていないナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、またはマイクロタブレットを介して、腸管内（小腸内とも言う）投与、内腔内（空腸内とも言う）投与、十二指腸内投与、腹腔内（回腸内とも言う）投与、胃シャント（ｇａｓｔｒｉｃ  ｓｈｕｎｔ）投与、または腸内（結腸内とも言う）投与のために調剤される。製薬上組成物はまた直腸組成物、たとえば、坐剤または停留浣腸などのようなものにおいて、例は、慣習的な座薬基剤、たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドなどのようなものを使用して調剤することができる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおいて懸濁物、溶液、またはエマルションであってもよく、および懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含んでいてもよい。
【０５４９】
ここに記載される遺伝学的に操作された微生物は、鼻腔内投与され、エアロゾル形態、スプレー、ミスト、または液滴の形態で調剤され得、そして好都合には、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で、適切な推進剤（例は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）の使用を伴ってデリバリーされる。加圧エアロゾル投与単位は、計量された量を送るためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器での使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例は、ゼラチン製のもの）は、化合物および適切な粉体基剤、たとえば、ラクトースまたはデンプンなどのようなものとの粉体混合物を含め、調剤することができる。
【０５５０】
遺伝学的に操作された微生物は、デポー製剤として投与され、および調剤され得る。そのような長時間作用性調剤物は、静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射、または注入を含め、移植によってか、または注射によって施与されうる。たとえば、組成物は、適切なポリマーまたは疎水性物質（例は、許容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ）誘導体として（例は、難溶性塩として）調剤され得る。
【０５５１】
いくらかの実施態様では、ここに開示されるものは、単一剤形において薬学的に許容可能な組成物である。単一剤形は、液状または固形形態であり得る。単一剤形は、改変することなくペイシェント（主として患者を意味する）に直接施与してもよく、または施与に先立ち希釈または再構成してもよい。一定の実施態様では、単一剤形をボーラス形態、例は、複数回の錠剤、カプセル、丸剤、などを含む経口投与を含め、単一注射、単一経口用量で施与することができる。代替実施態様では、単一剤形は、ある期間にわたって、例は、注入によって施与することができる。
【０５５２】
製薬上組成物の単一剤形は、製薬上組成物を、より一層小さなアリコート、単一用量容器、単一用量液状形態、または単一用量固形形態、たとえば、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロタブレット、ペレット、または粉末などのようなものに分けることによって調製することができ、それらは腸溶性コーティングまたは非コーティングであり得る。固形形態での単一用量は、ペイシェントに施与するのに先立ち、液体、典型的には滅菌水または生理的塩類溶液を添加することによって再構成することができる。
【０５５３】
他の実施態様では、組成物は制御放出システムまたは持続放出システムにおいて送ることができる。一実施態様では、制御されたか、または持続的な放出を達成するためにポンプを使用することができる。別の実施態様では、ポリマー材料を使用して、本開示の療法での制御または持続的な放出を達成することができる（例は、米国特許第５，９８９，４６３号参照）。持続放出性（徐放性とも言う）製剤に使用されるポリマーの例には、制限されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン-コ-ビニルアセタート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが含まれる。徐放性調剤物に使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能不純物フリーで、貯蔵時に安定であり、滅菌され、および生分解性であり得る。いくらかの実施態様では、制御放出または徐放性システムを予防または治療上の標的の近傍に配置することができ、それにより全身的投与量のほんの一部しか必要とされない。当業者に既知の任意の適切な技術を使用することができる。
【０５５４】
投薬量レジメンは、治療上の応答を提供するように調節され得る。投薬は、疾患の重篤度および応答性、投与経路、処置の時間経過（数日から数ヶ月から数年にかけて）、および疾患の改善時間を含め、いくつかの要因に依存し得る。たとえば、単一のボーラスを一度に施与することができ、いくつかの分割用量を所定の期間にわたって投与してもよく、または治療上の状況によって示されるように用量を減少または増加させることができる。投薬量の詳細は、活性化合物の独特な特徴および達成される特定の治療効果によって規定される。投薬量値は、緩和すべき状態のタイプおよび重症度によって変動し得る。いずれかの特定の対象について、個々の必要性および治療臨床医の専門的判断に従って、特定の投薬量計画を経時的に調整することができる。ここに提供される化合物の毒性および治療上の効力は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬学的手順によって決定することができる。たとえば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０、およびＩＣ５０を決定し、および毒性および治療上の効果の間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）を治療指数として算出することができる。有害な副作用を示す組成物を使用して、潜在的な損傷を最小限にして副作用を軽減するために注意深く修飾してもよい。施与は、初期に細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定することができる。インビトロおよびインビボアッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための投薬量の範囲を定式化する際に使用することができる。
【０５５５】
成分は、別個に、または密閉式のシール容器、たとえば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどのようなものにおいて乾燥した凍結乾燥粉体または水分フリー濃縮物のような単位剤形において一緒に混合して供給される。施与のモードが注射によるものである場合、注射のための滅菌水または生理的塩類溶液のアンプルを提供して、その結果成分を施与前に混合することができる。
【０５５６】
製薬上組成物は、密閉式のシールされた容器、たとえば、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどのようなものにおいて包装されてもよい。一実施態様では、製薬上組成物の１以上は、密閉式のシールされた容器内で乾燥した滅菌凍結乾燥粉体または水フリー濃縮物として供給され、および対象への施与のために適切な濃度に再構成（例は、水または生理的塩類溶液により）することができる。ある実施態様では、１以上の予防剤または治療剤または製薬上組成物は、２℃および８℃間で貯蔵された密閉式シール容器内で乾燥滅菌凍結乾燥粉体として供給され、および１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、または再構成後１週間以内に施与される。凍結保護物質は、凍結乾燥剤形のために、主に０−１０％のスクロース（最適には０．５−１．０％）で含まれることができる。他の適切な凍結保護物質には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。他の適切な増量剤には、グリシンおよびアルギニンが含まれ、そのいずれも０−０．０５％の濃度で、およびポリソルベート−８０（最適には０．００５−０．０１％の濃度で含まれる）が含まれることができる。追加の界面活性剤には、制限されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。製薬上組成物は、注射可能な溶液として調製することができ、およびアジュバントとして有用な薬剤、たとえば、吸収または分散を増加させるために使用されるもの、例は、ヒアルロニダーゼなどのようなものをさらに含むことができる。
処置の方法
【０５５７】
本発明の別の態様は、自己免疫障害、下痢性疾患、ＩＢＤ、関連疾患、および消化管炎の減少および／または消化管バリア機能の増強から利益を得る他の疾患を処置する方法を提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、薬の製造のための、ここに記載の細菌の少なくとも１つの遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプの使用を提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、自己免疫障害、下痢性疾患、ＩＢＤ、関連疾患、および消化管炎の減少および／または消化管バリア機能の増強から利益を得る他の疾患を処置するために、ここに記載の細菌の少なくとも１種の遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプの使用について提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、自己免疫疾患、下痢性疾患、ＩＢＤ、関連疾患、および消化管炎の減少および／または消化管バリア機能の増強から利益を得る他の疾患の処置に使用するために、ここに記載の細菌の少なくとも１つの遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプを提供する。
【０５５８】
いくらかの実施態様では、下痢性疾患は、急性水様性下痢、例は、コレラ、急性血性下痢、例は、赤痢、および持続性下痢からなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、ＩＢＤまたは関連疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎（コラーゲン蓄積性大腸炎とも言う）、リンパ球性大腸炎、転換大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、ベーチェット病、中間大腸炎（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、短腸症候群、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側結腸炎（左腸大腸炎とも言う）、全結腸炎（全大腸炎）、および劇症性大腸炎からなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、疾患または状態は、急性散在性（急性播種性とも言う）脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎（ａｃｕｔｅ  ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、無ガンマグロブリン（アマガングロブリン）血症、円形脱毛症、アミロイドーシス（類でんぷん症）、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全（症）、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索アンド神経ニューロパシー（ａｘｏｎａｌ  ＆  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、バロー病（Ｂａｌｏ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、水疱性類天疱瘡、心筋ミオパチー（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ、心筋症）、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｏｓｔｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、慢性再発性多巣性耳状骨症）（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（チャーグ病、Ｃｈｕｒｇｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患（ＣＲＥＳＴ病）、本態性混合性クリオグロブリン血症（必須混合性クリオグロブリン血症）、脱髄性ニューロパチー、疱疹状（疱疹性）皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（デヴィス病）（視神経脊髄炎）（神経鞘炎）、円板状ループス（円板状狼瘡）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト脳炎、ハシモト甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、カワサキ症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性（白血球梗塞性）血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬（苔状硬化症）、木質性結膜炎（羊膜結膜炎）、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（狼瘡）（全身性エリトマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、視神経炎、パリンドロームリウマチ（回帰性リウマチ）、ＰＡＮＤＡＳ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、連鎖球菌に関連する小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症（傍腫瘍性小脳変性症）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソンネージターナー症候群（Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、I型、II型およびIII型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群（ｐｏｓｔｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群（むずむず脚症候群）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、脈管炎、小水疱性外皮疾患、白斑、およびウエゲナー肉芽腫症からなる群より選ばれる自己免疫疾患である。いくらかの実施態様では、本発明は、制限されないが、下痢、血便、口内炎（ｍｏｕｔｈ  ｓｏｒｅｓ、口のびらんとも言う）、肛門周囲疾患、腹痛、腹部痙攣、発熱、疲労、体重減少、鉄欠乏、貧血、食欲の喪失（食欲不振とも言う）、重量減少、無食欲、増殖遅延（発育遅延とも言う）、思春期発達の遅れ（ｄｅｌａｙｅｄ  ｐｕｂｅｒｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、および皮膚、眼、関節、肝臓、および胆管の炎症を含め、それらの疾患に関連する一以上の症状（群）を軽減、改善、または排除するための方法を提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、消化管炎症を軽減し、および／または消化管バリ���機能を増強するための方法を提供し、それによって全身性自己免疫疾患、例は、喘息（Ａｒｒｉｅｔａら、２０１５）が改善または防止される。
【０５５９】
本方法は、ここに記載の細菌の少なくとも１つの遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプを伴う製薬上組成物を調製すること、および治療上有効な量において対象に本製薬上組成物を施与することを包含し得る。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、液状懸濁物において経口投与される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌をゲルキャップにおいて凍結乾燥し、および経口投与する。いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は栄養管を介して施与される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、直腸に、例は、浣腸によって施与される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、局所的、小腸内（ｉｎｔｒａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｌｙ）、空腸内（ｉｎｔｒａｊｅｊｕｎａｌｌｙ）、十二指腸内、回腸内、および／または結腸内（ｉｎｔｒａｃｏｌｉｃａｌｌｙ）に施与される。
【０５６０】
いくつかの実施形態では、効率的な送達および宿主抗ウイルス免疫反応を克服する必要性を考慮して、遺伝子操作されたウイルスが送達のために調製される。抗ウイルス応答を回避するアプローチには、投与計画（抗原型切り替え）の一環として異なるウイルス抗原型を投与すること、抗体認識からウイルスをマスクするポリマーコーティングなど剤型および送達媒体としての細胞の使用が含まれる。
【０５６１】
別の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いて、本開示の治療薬の制御または持続放出を達成することができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号参照）。持続放出製剤に用いられるポリマーの例は、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリメタクルリル酸、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエステルを含むが、これらに限定されない。持続放出製剤に用いられるポリマーは、不活性で、浸出性不純物を含まず、保存時に安定で、滅菌で、生分解性であり得る。いくつかの実施形態では、制御または持続放出システムは、予防および治療標的の近くに配置することができ、したがって、全身投与量の一部を必要とするにすぎない。当業者に公知の任意の適切な技術を用いることができる。
【０５６２】
本発明の遺伝学的に操作された細菌は、中性または塩の形態として投与すること、かつ製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来する陰イオンとの間で形成されるもの、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来する陽イオンとの間で形成されるものが含まれる。
【０５６３】
一定の実施態様では、ここに記載の製薬上組成物は、消化管炎症を軽減し、消化管バリア機能を増強し、および／または対象において自己免疫障害を処置または防止するために施与される。いくらかの実施態様では、本開示の方法は、対象において消化管炎症を、未処置またはコントロール対象におけるレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれらより多くだけ減少させることができる。いくらかの実施態様では、本開示の方法は、対象において消化管バリア機能を、未処置またはコントロール対象のレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれらより多くだけ増加させることができる。いくらかの実施態様では、炎症および／または消化管バリア機能の変化は、製薬上組成物の施与前および施与後の対象を比較することによって測定される。いくらかの実施態様では、自己免疫障害および／または消化管炎症および／または消化管バリア機能の低下に関連する疾患または状態を処置または改善する方法は、疾患または状態の１以上の症状が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれらよりも多くだけ改善されることを可能にする。
【０５６４】
いくつかの実施形態では、低下は、製薬上組成物の投与前後で、被験体の炎症レベルを比較することによって測定される。一実施形態では、被験体の消化管内において、炎症レベルが低下する。一実施形態では、被験体の消化管内において、消化管バリア機能が向上する。別の実施形態では、被験体の血液中において、炎症レベルが低下する。別の実施形態では、被験体の血漿中において、炎症レベルが低下する。別の実施形態では、被験体の脳内において、炎症のレベルが減少する。
【０５６５】
一実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、被験体の炎症レベルを正常レベルまで低下させるために投与される。別の実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物を投与して、被験体における炎症のレベルを正常よりも低下させる。
【０５６６】
いくつかの実施形態では、自己免疫障害を処置する方法は、状態または障害の１つ以上の症状が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上、改善することを可能にする。いくつかの実施形態では、障害を処置する方法は、状態または障害の１つ以上の症状が少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍改善することを可能にする。
【０５６７】
製薬上組成物の施与の前、その間およびその後に、消化管炎症および／またはバリア機能は、対象において、生物学的サンプル、たとえば、血液、血清、血漿、尿、糞便物質、腹腔液（腹水とも言う）、腸粘膜のスクレイピング、組織から収集した試料、および／または次のもの：胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管などのようなものの１以上の内容物から収集した試料において測定することができる。いくらかの実施態様では、本方法は、消化管バリア機能を増強するため、および／または消化管炎症をベースラインレベル、例は、対象において、健康コントロールのレベルに匹敵するものに低下させるため、本発明の組成物の施与を含み得る。いくらかの実施態様では、本方法は、対象において、消化管炎症を検出不能レベルまで、または処置前の対象のレベルの少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％または８０％未満に低下させるために、本発明の組成物の施与を含み得る。いくらかの実施態様では、本方法は、対象において、消化管バリア機能を、処置前の対象のレベルの少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％またはそれらよりも多くだけ高めるために、本発明の組成物の施与を含み得る。
【０５６８】
一定の実施態様では、組換え細菌はＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅである。組換え細菌は、例は、消化管または血清中の防御因子（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９）によって、または施与の数時間後または数日後にキルスイッチの活性化によって破壊され得る。したがって、組換え細菌を含む製薬上組成物は、治療上有効な用量および頻度で再施与され得る。別の実施態様では、組換え細菌は、施与後数時間または数日以内には破壊されず、および消化管で増殖および定着することができる。
【０５６９】
製薬上組成物は、単独で、または１以上の追加の治療剤、例は、コルチコステロイド、アミノサリチラート（アミノサリチル酸とも言う）、抗炎症剤と組み合わせて施与することができる。いくらかの実施態様において、製薬上組成物は、抗炎症薬物（例は、メサラジン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ブデソニド（ｂｕｔｅｓｏｎｉｄｅ））、免疫抑制薬物（例は、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、タクロリムス）、抗生物質（例は、メトロニダゾール、オルニダゾール、クラリスロマイシン、リファキシミン、シプロフロキサシン、抗ＴＢ）、他のプロバイオティクス、および／または生物学的物質（例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル）（Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｌｉｄｉｓ（トリアンタフィリディス）ら、２０１１）と組み合わせて施与される。１以上の追加の治療剤の選定における重要な考慮点は、薬剤が本発明の遺伝学的に操作された細菌と適合性でなければならないことであり、例は、薬剤（群）は本細菌を死滅させてはならない。一実施形態では、本明細書中に開示される細菌細胞は、１日１回被験体に投与される。別の実施形態では、本明細書に開示される細菌細胞は、１日２回被験体に投与される。別の実施形態では、本明細書に開示される細菌細胞は、食事と組み合わせて被験体に投与される。別の実施形態では、本明細書に開示される細菌細胞は、食事の前に被験体に投与される。別の実施形態では、本明細書に開示される細菌細胞は、食事の後に被験体に投与される。製薬上組成物の投薬量および施与頻度は、症状の重篤度および病気の進行に基づいて選定し得る。施与の適切な治療上有効な用量および／または頻度は、治療を行う医師によって選定することができる。
インビボでの処置
【０５７０】
本発明の遺伝学的に操作された細菌は、インビボで、例は、動物モデルにおいて評価することができる。消化管炎症、消化管バリア機能の低下、および／または自己免疫障害に関連する疾患または状態の任意の適切な動物モデルを使用し得る（例は、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ（ミゾグチ）、２０１２参照）。動物モデルはＩＢＤのマウスモデル、例は、ＣＤ４５ＲＢＨｉＴ細胞トランスファーモデルまたはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルであり得る。動物モデルは、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）のマウスモデルであり得、そしてＴ１Ｄは、ストレプトゾトシンでの処置によって誘導され得る。
【０５７１】
大腸炎は結腸の内層の炎症によって特徴付けられ、そしてＩＢＤの一形態である。マウスでは、モデル化大腸炎はしばしばＴ細胞および／またはサイトカインの異常な発現を伴う。ＩＢＤの１つの例示的なマウスモデルは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞をそのＣＤ４５ＲＢ発現レベルに従って選別し、および正常ドナーマウスからのＣＤ４５ＲＢ発現が高いＣＤ４＋  Ｔ細胞を免疫不全マウスに養子（適合とも言う）移入することによって生じさせることができる。移行のために使用され得る免疫不全マウスの非制限的な例には、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ（モリッシー）ら、１９９３；Ｐｏｗｒｉｅ（パウリー）ら、１９９３）、および組換え活性化遺伝子２（ＲＡＧ２）欠損マウス（Ｃｏｒａｚｚａ（コラザ）ら、１９９９）が含まれる。免疫不全マウスへの、例は、静脈内または腹腔内注射を介して、ＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞を移行することは、結腸内の上皮細胞過形成、組織損傷、および重度の単核細胞浸潤をもたらす（Ｂｙｒｎｅ（バーン）ら、２００５；Ｄｏｈｉ（ドヒ）ら、２００４；Ｗｅｉ（ウェイ）ら、２００５）。いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤのＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞移行マウスモデルにおいて評価され得る。
【０５７２】
マウスの飲料水にデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を補充することにより、ＩＢＤの別の例示的な動物モデルを生じさせることができる（Ｍａｒｔｉｎｅｚ（マルチネス）ら、２００６；Ｏｋａｙａｓｕ（オカヤス）ら、１９９０；Ｗｈｉｔｔｅｍ（ホイットム）ら、２０１０）。ＤＳＳによる処置は、結腸での数日間続く上皮損傷および頑強な炎症を生じる。急性傷害または急性傷害とその後の修復をモデル化するために、単一の処置を用いることができる。急性で処置されたマウスは、血便、直腸出血、下痢、および体重減少を含め、急性大腸炎の兆候を示す（Ｏｋａｙａｓｕら、１９９０）。対照的に、ＤＳＳの反復施与サイクルは慢性炎症性疾患をモデル化するために使用され得る。慢性大腸炎を発症するマウスは、結腸粘膜再生、たとえば、異形成、リンパ濾胞（リンパ球の小胞とも言う）形成、および大腸の短縮などのようなものの徴候を示す（Ｏｋａｙａｓｕら、１９９０）。いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤのＤＳＳマウスモデルにおいて評価され得る。
【０５７３】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、動物に、例は、経口強制飼養によって施与され、処置の有効性は、例は、内視鏡検査、結腸透光性、フィブリン付着、粘膜および血管病理、および／または便の特性によって定められる。いくらかの実施態様では、動物を屠殺し、および組織試料を採取し、そして分析し、例は、結腸切片を固定し、および炎症および潰瘍のスコアを付け、および／またはホモジナイズし、およびミエロペルオキシダーゼ活性およびサイトカインレベル（例は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）について分析する。
参考文献
Aboulnagaら、Effect of an oxygen-tolerant bifurcating butyryl coenzyme A dehydrogenase/ electron-transferring flavoprotein complex from Clostridium difficile on butyrate production in Escherichia coli.（エシェリキア・コリにおけるブチラート生産に及ぼすクロストリジウム・ディフィシレの酸素耐性分岐ブチリルコエンザイムAデヒドロゲナーゼ/電子伝達フラボタンパク質複合体の効果）J Bact.（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー）。2013；195（16）：3704-13。PMID：23772070。
Ahmadら、scFv antibody: principles and clinical application.（scFv抗体：本質および臨床適用）Clin Dev Immunol.（クリニカル・アンド・デベロップメンタル・イムノロジー）2012；2012:980250。PMID: 22474489。
Alavi（アラヴィ）ら、Treatment of inflammatory bowel disease in a rodent model with the intestinal growth factor glucagon-like peptide-2.（腸内成長因子グルカゴン様ペプチド-2を用いるげっ歯類モデルにおける炎症性腸疾患の処置）J Pediatr Surg.（ジャーナル・オブ・ペディアトリック・サージェリー）2000年6月；35（6）：847-51。PMID：10873024。
Albiniakら、High-level secretion of a recombinant protein to the culture medium with a Bacillus subtilis twin-arginine translocation system in Escherichia coli.（エシェリキア・コリにおけるバチルス・ズブチリスのツインアルギニン転位システムを用いる培養培地への組換えタンパク質の高レベル分泌）FEBS J.（ザ・FEBSジャーナル）2013；280（16）：3810-21。PMID：23745597。
Altenhoeferら、The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 interferes with invasion of human intestinal epithelial cells by different enteroinvasive bacterial pathogens.（プロバイオティックのエシェリキア・コリ菌株ニッスル1917は異なる腸内浸潤性細菌病原体によるヒト腸管上皮細胞の浸潤を妨害する。）FEMS Immunol Med Microbiol.（FEMSイムノロジー・アンド・メディカル・ミクロバイオロジー）2004年四月9；40（3）：223-9。PMID：15039098。
Alvaradoら、Targeting the Broadly Pathogenic Kynurenine Pathway.（広範囲に病原性のキヌレニン経路を標的とする。）2015。Sandeep（サンディープ）、ら編。Springer International Publishing（シュプリンガー・インターナショナル・パブリッシング）：Switzerland（スイス国）。
Appleyard（アップルヤード）CB、Wallace（ウォーレス）JL.、Reactivation of hapten-induced colitis and its prevention by anti-inflammatory drugs.（ハプテン誘導性大腸炎の再活性化および抗炎症薬によるその予防。Am J Physiol.（ジ・アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー）1995年7月；269（1 Pt 1）：G119-25。PMID：7631788。
Araiら、Expression of the nir and nor genes for denitrification of Pseudomonas aeruginosa requires a novel CRP/FNR-related transcriptional regulator, DNR, in addition to ANR.（シュードモナス・エルジノーサ、緑膿菌の脱窒のためのnirおよびnor遺伝子の発現には、ANRに加えて新規なCRP/FNR関連転写調節因子DNRが必要である。）FEBS Lett.（FEBSレターズ）。1995年8月28；371（1）：73-6。PMID：7664887。
Arrietaら、Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma.（初期の乳児期の微生物および代謝変化は、小児期の喘息のリスクに影響する。）Sci Transl Med.（サイエンス・トランスレーショナル・メディシン）。2015年9月30；7（307）：307ra152。PMID：26424567。
Arthurら、Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota（腸炎は、微生物のガン誘導活性を標的とする。）Science（サイエンス）2012年10月5日、338（6103）：120-3。PMID：22903521。
Atarashiら、Induction of colonic regulatory T cells by indigenous Clostridium species.（固有クロストリジウム種による結腸調節性T細胞の誘導。）Science。2011年1月21；331（6015）：337-41。PMID：21205640。
Boirivant（ボイリバント）ら、Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.（オキサゾロン大腸炎：インターロイキン4に対する抗体で処置可能なTヘルパー細胞2型大腸炎のネズミモデル。）J Exp Med.（ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン）。1998年11月16；188（10）：1929-39。PMID：9815270。
Bramhall（ブラムホール）ら、Quality of methods reporting in animal models of colitis.（大腸炎の動物モデルで報告される方法の質。）Inflamm Bowel Dis.（インフラマトリー・バウエル・ディジーズ）2015年6月；21（6）：1248-59。PMID：25989337。
Byrneら、CD4+CD45RBHi T cell transfer induced colitis in mice is accompanied by osteopenia which is treatable with recombinant human osteoprotegerin.（マウスでのCD4+CD45RBHi T細胞転移誘発大腸炎には、組換えヒトオステオプロテゲリンにより処置可能な骨減少症が伴う。）Gut（ガット）。2005年1月；54（1）：78-86。PMID：15591508。
Calluraら、Tracking, Tuning and terminating microbial physiology using synthetic riboregulators.（合成リボレギュレーターを用いる微生物生理の追跡、調整および終結。）Proc Natl Acad Sci.（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ）。2010；27（36）：15898-903。PMID：20713708。
Castiglioneら、The transcription factor DNR from Pseudomonas aeruginosa specifically requires nitric oxide and haem for the activation of a target promoter in Escherichia coli.（シュードモナス・エルジノーサ由来の転写因子DNRは、エシェリキア・コリにおける標的プロモーターの活性化のために、特に酸化窒素およびヘムを必要とする。）Microbiology（マイクロバイオロジー）。2009年9月；155（Pt 9）：2838-44。PMID：19477902。
Chassaing（シャサイング）ら、Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.（マウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発大腸炎。）Curr Protoc Immunol.（カレント・プロトコル・イン・イムノロジー）2014年2月4日；104：Unit 15.25（15.25項）。PMID：24510619。
Chassaingら、Fecal lipocalin 2, a sensitive and broadly dynamic non-invasive biomarker for intestinal inflammation.（糞便リポカリン2、腸炎症のための高感度かつ広範な動的非侵襲性バイオマーカー。）PLoS One.（PLoSワン）。2012；7（9）：e44328。PMID：22957064。
Ciorbaら、Induction of IDO-1 by immunostimulatory DNA limits severity of experimental colitis.（免疫刺激DNAによるIDO-1の誘導は、実験的大腸炎の重症度を制限する。）J Immunol.（ジャーナル・オブ・イムノロジー）2010年4月1日；184（7）：3907-16。PMID：20181893。
Clarksonら、Diaminopimelic acid and lysine auxotrophs of Pseudomonas aeruginosa 8602.（シュードモナス・エルジノーサのジアミノピメリン酸およびリシン栄養要求体8602。）J Gen Microbiol.（ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジー）。1971年5月；66（2）：161-9。PMID：4999073。
Cohenら、Biologic therapies in inflammatory bowel disease.（炎症性腸疾患における生物学的療法。）Transl Res.（トランスレーショナル・リサーチ）2014年6月；163（6）：533-56頁を参照のこと。PMID：24467968）  Transl Res. 2014 Jun;163(6):533-56.  PMID: 24467968.
Collinsonら、Channel crossing: how are proteins shipped across the bacterial plasma membrane?（チャネル交差：タンパク質はどのように細菌原形質膜を越えて輸送されるか？）Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.（フィロソフィカル・トランスアクションズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサエティ・オブ・ロンドン。シリーズB、バイオロジカル・サイエンシーズ）2015；370：20150025。PMID：26370937。
Corazzaら、Nonlymphocyte-derived tumor necrosis factor is required for induction of colitis in recombination activating gene (RAG)2(-/-) mice upon transfer of CD4(+)CD45RB(hi) T cells.（非リンパ球由来腫瘍壊死因子は、CD4（+）CD45RB（hi）T細胞の転移時に組換え活性化遺伝子（RAG）2（-/-）マウスにおける大腸炎の誘導に必要である。）J Exp Med.、1999年11月15；190（10）：1479-92。PMID：10562322。
Costaら、Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.（グラム陰性細菌での分泌系：構造的および機構的洞察）Nat Rev Microbiol.（ネイチャー・レビューズ。マイクロバイオロジー）2015；13（6）：343-59。PMID：25978706。
Cuevas-Ramosら、Escherichia coli induces DNA damage in vivo and triggers genomic instability in mammalian cells.（エシェリキア・コリは、インビボでDNA損傷を誘導し、および哺乳動物細胞においてゲノム不安定性を誘発する。）Proc Natl Acad Sci USA A.、2010年6月22；107（25）：11537-42。PMID：20534522。
Cutting（カッティング）、Bacillus probiotics.（バチルスプロバイオティクス。）Food Microbiol.（フード・マイクロバイオロジー）2011年4月；28（2）：214-20。PMID：21315976。
Daninoら、Programmable probiotics for detection of cancer in urine.（尿においてがんの検出のためのプログラム可能なプロバイオティクス。）Sci Transl Med.、2015年5月27日、7（289）：289ra84。PMID：26019220。
Davis-Richardsonら、A model for the role of gut bacteria in the development of autoimmunity for type 1 diabetes.（1型糖尿病についての自己免疫の発症における消化管細菌の役割のためのモデル。）Diabetologia.（ダイアビートロジア）2015年7月；58（7）：1386-93。PMID：25957231。
Dinleyiciら、Saccharomyces boulardii CNCM I-745 in different clinical conditions.（異なる臨床条件でのサッカロミセス・ブラウディCNCM I-745。）Expert Opin Biol Ther.（エクスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー）2014年11月；14（11）：1593~609頁。PMID：24995675。
Dohiら、CD4+CD45RBHi interleukin-4 defective T cells elicit antral gastritis and duodenitis.（CD4+CD45RBHiインターロイキン-4欠損T細胞は胃炎および十二指腸炎を誘発する。）Am J Pathol.（ジ・アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー）2004年10月；165（4）：1257-68。PMID：15466391。
Eiglmeierら、Molecular genetic analysis of FNR-dependent promoters.（FNR依存性プロモーターの分子遺伝学的分析。）Mol Microbiol.（モレキュラー・マイクロバイオロジー）1989年7月；3（7）：869-78。PMID：2677602。
Elson（エルソン）ら、The C3H/HeJBir mouse model: a high susceptibility phenotype for colitis.（C3H/HeJBirマウスモデル：大腸炎の高感受性表現型。）Int Rev Immunol.（インターナショナル・レビューズ・オブ・イムノロジー）2000；19（1）：63-75。PMID：10723678。
El-Zaatariら、Tryptophan catabolism restricts IFN-γ-expressing neutrophils and Clostridium difficile immunopathology.（トリプトファン異化は、IFN-γ発現好中球およびクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）免疫病理を制限する。）J Immunol.、2014年7月15；193（2）：807-16。PMID：24935925。
Erben（エルベン）ら、A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models.（マウスモデルにおける腸炎症の組織形態学的評価への指針。）Int J Clin Exp Pathol.（インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・パソロジー）2014年7月15；7（8）：4557-76。PMID：25197329。
Fasano A、Shea-Donohue（シェイ-ドナヒュー）T.、Mechanisms of disease: the role of intestinal barrier function in the pathogenesis of gastrointestinal autoimmune diseases.（病気のメカニズム：胃腸の自己免疫疾患の病因における腸のバリア機能の役割。）Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol.（ネイチャー・クリニカル・プラクティス。ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー）2005年9月；2（9）：416-22。PMID：16265432。
Fasano.、Leaky gut and autoimmune diseases.（漏消化管および自己免疫疾患。）Clin Rev Allergy Immunol.（クリニカル・レビュー・イン・アレルギー・アンド・イムノロジー）2012年2月；42（1）：71-8。PMID：22109896。
Ferdinandeら、Inflamed intestinal mucosa features a specific epithelial expression pattern of indoleamine 2,3-dioxygenase.（炎症腸粘膜はインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼの特異的な上皮発現パターンを特徴とする。）Int J Immunopathol Pharmacol.（インターナショナル・ジャーナル・オブ・イムノパソロジー・アンド・ファーマコロジー）2008年4月-6月；21（2）：289-95。PMID：18547472。
Forrestら、Levels of purine, kynurenine and lipid peroxidation products in patients with inflammatory bowel disease.（炎症性腸疾患の患者におけるプリン、キヌレニンおよび脂質過酸化生成物のレベル。）In: Developments in Tryptophan and Serotonin Metabolism.（イン：デベロップメント・イン・トリプトファン・アンド・セロトニン・メタボリズム）2003年；527：395-400。Allegri（アレグリ）ら、編。Springer Science + Business Media（スプリンガー・サイエンス+ビジネス・メディア）：New York（ニューヨーク）。
Frenzelら、Expression of recombinant antibodies.（組換え抗体の発現。）Front Immunol.（フロンティアーズ・イン・イムノロジー）2013年；4：217。PMID：23908655。
Furusawaら、Commensal microbe-derived butyrate induces the differentiation of colonic regulatory T cells.（共生微生物由来ブチレートは結腸調節性T細胞の分化を誘導する。）Nature。2013年；504：446-50。PMID：24226770。
Galimandら、Positive FNR-like control of anaerobic arginine degradation and nitrate respiration in Pseudomonas aeruginosa.（シュードモナス・エルジノーサにおける嫌気的アルギニン分解およびナイトラート呼吸の陽性FNR様制御。）J Bacteriol.（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー）1991年3月；173（5）：1598-606。PMID：1900277。
Gardnerら、Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.（エシェリキア・コリにおける遺伝子トグルスイッチの構築。）Nature。2000年；403：339-42。PMID：10659857。
Garrett（ギャレット）ら、Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system.（先天性免疫系におけるT-bet欠損により誘導される伝染性潰瘍性大腸炎。）Cell.（セル。）2007年10月；131（1）：33-45。PMID：17923086。
Gerlachら、Protein secretion systems and adhesins: the molecular armory of Gram-negative pathogens.（タンパク質分泌システムおよびアドヘシン：グラム陰性病原菌の分子兵器。）Int J Med Microbiol.（インターナショナル・ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジー）2007年；297：401-15。PMID：17482513。
Ghishanら、Epithelial transport in inflammatory bowel diseases.（炎症性腸疾患における上皮輸送。）Inflamm Bowel Dis.、2014年6月；20（6）：1099-109。PMID：24691115。
Gurtnerら、Inhibition of indoleamine 2,3-dioxygenase augments trinitrobenzene sulfonic acid colitis in mice.（インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼの抑制は、マウスにおけるトリニトロベンゼンスルホン酸大腸炎を増強する。）Gastroenterology.（ガストロエンテロロジー）、2003年12月；125（6）：1762-73。PMID：14724829。
Hamerら、Review article: the role of butyrate on colonic function.（レビュー記事：結腸機能に対するブチラートの役割。）Aliment Pharmacol Ther.（アリメンタリー・ファーマコロジー・アンド・テラピューティクス）、2008年1月15；27（2）：104-19。PMID：17973645。
Hammer（ハマ）ら、Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.（HLA-B27およびヒトベータ2mを発現するトランスジェニックラットにおける自発的炎症性疾患：HLA-B27関連ヒト疾患の動物モデル。）Cell、1990年11月30日；63（5）：1099-112。PMID：2257626。
Hasegawaら、Activation of a consensus FNR-dependent promoter by DNR of Pseudomonas aeruginosa in response to nitrite.（ナイトライトに反応するシュードモナス・エルジノーサのDNRによるコンセンサスFNR依存性プロモーターの活性化。）FEMS Microbiol Lett.（FEMSマイクロバイオロジー・レターズ）1998年9月15；166（2）：213-7。PMID：9770276。
Hermiston（ハーミストン）ML, Gordon（ゴードン）JI.、Inflammatory bowel disease and adenomas in mice expressing a dominant negative N-cadherin.（ドミナントネガティブN-カドヘリンを発現するマウスにおける炎症性腸疾患および腺腫。）Science。1995年11月17；270（5239）：1203-7。PMID：7502046。
Hetzelら、Acryloyl-CoA reductase from Clostridium propionicum.  An enzyme complex of propionyl-CoA dehydrogenase and electron-transferring flavoprotein.（クロストリジウム・プロピオニカム由来のアクリロイル-CoAレダクターゼ。プロピオニル-CoAデヒドロゲナーゼおよび電子伝達性フラビンタンパク質の酵素複合体。）Eur J Biochem.（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー）2003年3月；270（5）：902-10。PMID：12603323。
Hillman.、Simple, rapid method for determination of propionic acid and other short-chain fatty acids in serum.（血清におけるプロピオン酸およびその他の短鎖脂肪酸の測定のための簡単で、迅速な方法。）Clin Chem.（クリニカル・ケミストリー）1978年5月；24（5）：800-3。PMID：647915。
Hoerenら、Sequence and expression of the gene encoding the respiratory nitrous-oxide reductase from Paracoccus denitrificans.  New and conserved structural and regulatory motifs.（パラコッカス・デニトリフィカンス由来の呼吸性亜酸化窒素還元酵素をコードする遺伝子の配列および発現。新しく、および保存された構造的および調節性モチーフ。）Eur J Biochem.、1993年11月15；218（1）：49-57。PMID：8243476。
Hristodorovら、Recombinant H22(scFv) blocks CD64 and prevents the capture of anti-TNF monoclonal antibody.  A potential strategy to enhance anti-TNF therapy.（組換えH22（scFv）はCD64をブロックし、および抗TNFモノクローナル抗体の捕捉を妨げる。抗TNF療法を強化する潜在的戦略。）MAbs.（mAbs）2014年；6（5）：1283-9。PMID：25517313。
Hsu（スウ）ら、Differential mechanisms in the pathogenesis of autoimmune cholangitis versus inflammatory bowel disease in interleukin-2Ralpha(-/-) mice.（インターロイキン-2Rアルファ（-/-）マウスにおける炎症性腸疾患に対する自己免疫性胆管炎の病因における差異的メカニズム。）Hepatology.（ヘパトロジー）。2009年1月；49（1）：133-40。PMID：19065673。
Ianiroら、Fecal microbiota transplantation in inflammatory bowel disease: beyond the excitement.（炎症性腸疾患における糞便微生物叢移植：興奮を超えて。）Medicine (Baltimore)（メディシン（ボルチモア））。2014年10月；93（19）：e97。PMID：25340496。
Isabellaら、Deep sequencing-based analysis of the anaerobic stimulon in Neisseria gonorrhoeae.（ナイセリア・ゴノレエにおける嫌気性刺激物のディープ配列決定に基づく分析。）BMC Genomics.（BMCゲノミクス）2011年1月20日；12：51。PMID：21251255。
Iyer（イーヤー）SS、Cheng（チェン）G.、Role of interleukin 10 transcriptional regulation in inflammation and autoimmune disease.（炎症および自己免疫疾患におけるインターロイキン10転写調節の役割。）Crit Rev Immunol.（クリティカル・レビューズ・イン・イムノロジー）2012；32（1）：23-63。PMID：22428854。
Johansson（ヨハンソン）ら、The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria.（結腸において二つのMuc2ムチン依存性粘液層の内側には細菌が存在しない。）Proc Natl Acad Sci USA。2008年9月30；105（39）：15064-9。PMID：18806221。
Kanaiら、A breakthrough in probiotics: Clostridium butyricum regulates gut homeostasis and anti-inflammatory response in inflammatory bowel disease.（プロバイオティクスでのブレークスルー：クロストリジウム・ブチリカムは、炎症性腸疾患における消化管ホメオスタシスおよび抗炎症応答を調節する。）J Gastroenterol.（ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー）2015年9月；50（9）：928-39。PMID：25940150。
Keatesら、TransKingdom RNA interference: a bacterial approach to challenges in RNAi therapy and delivery.（生物界間のRNA干渉：RNAi療法およびデリバリーにおける課題への細菌的アプローチ。）Biotechnol Genet Eng Rev.（バイオテクノロジー・アンド・ジェネティック・エンジニアリング・レビューズ）2008；25：113-27。PMID：21412352。
Khor（ホール）B、Gardet（ガルデ）A、Xavier（ザビエル）RJ.、Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease.（炎症性腸疾患の遺伝学および病因。）Nature。2011年6月15；474（7351）：307-17。PMID：21677747。
Klemanら、Acetate metabolism by Escherichia coli in high-cell-density fermentation.（高細胞密度発酵におけるエシェリキア・コリによるアセタート代謝。）Appl Environ Microbiol.（アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー）1994年11月；60（11）：3952-8。PMID：7993084。
Lernerら、(a) Changes in intestinal tight junction permeability associated with industrial food additives explain the rising incidence of autoimmune disease.（（a）産業食物添加剤に関連する腸のタイトジャンクション透過性における変化は、自己免疫疾患の発生率の上昇を説明する。）Autoimmun Rev.（オートイムニティ・レビューズ）2015年6月；14（6）：479-89。PMID：25676324。
Lernerら、(b) Rheumatoid arthritis-celiac disease relationship: Joints get that gut feeling.（（b）リウマチ性関節炎-セリアック病の関係：関節はその消化管の感覚を得る。）Autoimmun Rev.、2015年11月；14（11）：1038-47。PMID：26190704。
Low（ロー）ら、Animal models of ulcerative colitis and their application in drug research.（潰瘍性大腸炎の動物モデルおよび薬物研究におけるその応用）Drug Des Devel Ther.（ドラッグ・デザイン、デベロップメント・アンド・セラピー）2013年11月12日；7：1341-57 PMID：24250223。
Lukovacら、Differential modulation by Akkermansia muciniphila and Faecalibacterium prausnitzii of host peripheral lipid metabolism and histone acetylation in mouse gut organoids.（マウス消化管オルガノイドにおける宿主末梢脂質代謝およびヒストンアセチル化のアッカーマンシア・ムシニフィラおよびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイによる差次的調節。）MBio.（mBio）2014年8月12日；5（4）。pii：e01438-14。PMID：25118238。
MacPherson（マクファーソン）BR、Pfeiffer（ファイファー）CJ.、Experimental production of diffuse colitis in rats.（ラットにおけるびまん性大腸炎の実験的生成。）Digestion.（ダイジェスチョン）1978；17(2)：135-50。PMID：627326。
Martinezら、Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis.（Mtgr1の欠損は結腸上皮を硫酸デキストラン誘発大腸炎に感作させる。）Gastroenterology。2006年8月；131（2）：579-88。PMID：16890610。
Matteoliら、Gut CD103+ dendritic cells express indoleamine 2,3-dioxygenase which influences T regulatory/T effector cell balance and oral tolerance induction.（消化管CD103+樹状細胞は、T調節/Tエフェクター細胞バランスおよび経口寛容誘導に影響を及ぼすインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼを発現する。）Gut。2010年5月；59（5）：595-604。PMID：20427394。
Meadowら、Biosynthesis of diaminopimelic acid and lysine in Escherichia coli.（エシェリキア・コリにおけるジアミノピメリン酸およびリジンの生合成。）Biochem J.（ザ・バイオケミカル・ジャーナル）1959年7月；72（3）：396-400。PMID：16748796。
Mizoguchi。Animal models of inflammatory bowel disease.（炎症性腸疾患の動物モデル。）Prog Mol Biol Transl Sci.（プログレス・イン・モレキュラー・バイオロジー・アンド・トランスレーショナル・サイエンス）2012；105：263-320。PMID：22137435。
Mombaerts（モンバーツ）ら、Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.（T細胞受容体変異マウスにおける炎症性腸疾患の自発的発生。）Cell。1993年10月22；75（2）：274-82。PMID：8104709。
Moolenbeek（ムーレンビーク）C、Ruitenberg（ルーテンバーグ）EJ.、The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.（「スイスロール」：げっ歯類の腸の組織学的研究のための簡単な技術。）Lab Anim.（ラボラトリー・アニマルズ）1981年1月；15（1）：57-9。PMID：7022018。
Mooreら、Regulation of FNR dimerization by subunit charge repulsion.（サブユニット電荷反発によるFNR二量化の調節。）J Biol Chem.（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー）2006年11月3；281（44）：33268-75。PMID：16959764。
Morrisseyら、CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice.  Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.（高レベルのCD45RBを発現するCD4+T細胞は、コンジェニックな重症複合免疫不全マウスに移入されるとき、消耗性疾患を誘発する。病気の発症は精製されたCD4+T細胞の共移入によって予防される。）J Exp Med.、1993年7月1；178（1）：237-44。PMID：8100269。
Mourelle（ムーレル）ら、Polyunsaturated phosphatidylcholine prevents stricture formation in a rat model of colitis.（多価不飽和ホスファチジルコリンは大腸炎のラットモデルにおける狭窄形成を防止する。）Gastroenterology.、1996年4月；110（4）：1093-7。PMID：8612998。
Nguyen（グエン）ら、Lymphocyte-dependent and Th2 cytokine-associated colitis in mice deficient in Wiskott-Aldrich syndrome protein.（ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質において欠損するマウスにおけるリンパ球依存性およびTh2サイトカイン関連大腸炎。）Gastroenterology、2007年10月；133（4）：1188-97。PMID：17764675。
Nielsen。New strategies for treatment of inflammatory bowel disease.（炎症性腸疾患の処置のための新しい戦略。）Front Med (Lausanne).（フロンティアーズ・イン・メディシン（ローザンヌ））2014；1：3。PMID：25685754。
Nougayredeら、Escherichia coli induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells.（エシェリキア・コリは真核細胞においてDNA二本鎖切断を誘導する。）Science。2006年8月11；313（5788）：848-51。PMID：16902142。
Ohman（オーマン）ら、Regression of Peyer's patches in G alpha i2 deficient mice prior to colitis is associated with reduced expression of Bcl-2 and increased apoptosis.（結腸炎に先立つGα2欠損マウスにおけるパイエル病のパッチの退行は、Bcl-2の発現の減少およびアポトーシスの増加と関連する。Gut。2002年9月；51（3）：392-7。PMID：12171962。
Okayasuら、A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.（マウスにおける信頼できる実験的に急性な、および慢性潰瘍性大腸炎の誘発における新規な方法。）Gastroenterology。1990年5月；98（3）：694-702。PMID：1688816。
Olierら、Genotoxicity of Escherichia coli Nissle 1917 strain cannot be dissociated from its probiotic activity.（エシェリキア・コリ・ニッスル1917株の遺伝毒性はそのプロバイオティクス活性から解離させることはできない。）Gut Microbes.（ガット・マイクローベス。）2012年11月12日；3（6）：501-9。PMID：22895085。
Ostanin（オスタニン）ら、T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade.（慢性大腸炎のT細胞移入モデル：そのトレードの概念、考察、およびトリック。）Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.（アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー．ガストロインテスティナル・アンド・リバーフィジオロジー）2009年2月；296（2）：G135-46。PMID：19033538。
Paunら、Immuno-ecology: how the microbiome regulates tolerance and autoimmunity.（免疫生態学：微生物がどのように耐性および自己免疫を調節するか。）Curr Opin Immunol.（カレント・オピニオン・イン・イムノロジー）2015年10月10日；37：34-9。PMID：26460968。
Pizarro（ピザロ）ら、SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis.（SAMP1/YitFcマウス株：クローン病様回腸炎の自然発症モデル。）Inflamm Bowel Dis.。2011年12月；17（12）：2566-84。PMID：21557393。
Powrieら、Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice.（表現型的に異なるCD4+T細胞のサブセットは、C．B-17 scid（重症複合免疫不全）マウスにおける慢性腸炎症を誘導または防御する。）Int Immunol.（インターナショナル・イムノロジー）1993年11月；5（11）：1461-71。PMID：7903159。
Pugsley。The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria.（グラム陰性菌における完全な包括的分泌経路。）Microbiol Rev.（マイクロバイオロジカル・レビューズ）1993年3月；57（1）：50-108。PMID：8096622。
Purcellら、Towards a whole-cell modeling approach for synthetic biology.（合成生物学のための全細胞モデル化アプローチに向けて。）Chaos.（カオス）2013年6月；23（2）：025112。PMID：23822510。
Ragsdale。Enzymology of the wood-Ljungdahl pathway of acetogenesis.（アセトゲネシス（酢酸生成）のウッド-ユングダール経路の酵素学。）Ann N Y Acad Sci.（アナールズ・オブ・ザ・ニュー・ヨーク・カデミー・オブ・サイエンス）2008年3月；1125：129-36。PMID：18378591。
Rayら、The effects of mutation of the anr gene on the aerobic respiratory chain of Pseudomonas aeruginosa.（シュードモナス・エルジノーサの好気性呼吸鎖に対するanr遺伝子の変異の影響。）FEMS Microbiol Lett.、1997年11月15；156（2）：227-32。PMID：9513270。
Reevesら、Engineering Escherichia coli into a protein delivery system for mammalian cells.（哺乳動物細胞のためにエシェリキア・コリのタンパク質デリバリーシステムへの組込み。）ACS Synth Biol.（ACSシンセティック・バイオロジー）2015；4（5）：644-54。PMID：25853840。
Reisterら、Complete genome sequence of the Gram-negative probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917.（グラム陰性プロバイオティクのエシェリキア・コリ株ニッスル1917の完全なゲノム配列。）J Biotechnol.（ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー）2014年10月10日；187：106-7。PMID：25093936。
Rembackenら、Non-pathogenic Escherichia coli versus mesalazine for the treatment of ulcerative colitis: a randomised trial.（潰瘍性大腸炎の処置のための非病原性エシェリキア・コリ対メサラジン：無作為化試験。）Lancet（ランセット）1999年8月21；354（9179）：635-9。PMID：10466665。
Remington’s Pharmaceutical Sciences, 22nd ed.  Mack Publishing Co.
Rigelら、A new twist on an old pathway − accessory Sec systems.（古い通路での新しいツイスト-アクセサリーSecシステム。）Mol Microbiol.、2008年7月；69（2）：291-302。PMID：18544071。
Sabiu（サビウ）ら、Indomethacin-induced gastric ulceration in rats: Ameliorative roles of Spondias mombin and Ficus exasperata.（ラットにおけるインドメタシン誘導胃潰瘍形成：スポンディアス・モンビンおよびフィカス・エグザスペラタの改善的役割）Pharm Biol.（ファーマシューティカル・バイオロジー）2016年1月；54（1）：180-6。PMID：25815713。
Saier。Protein secretion and membrane insertion systems in Gram-negative bacteria.（グラム陰性細菌におけるタンパク質分泌および膜挿入システム）J Membr Biol.（ザ・ジャーナル・オブ・メンブレン・バイオロジー）2006；214（2）：75-90。PMID：17546510。
Salmonら、Global gene expression profiling in Escherichia coli K12.  The effects of oxygen availability and FNR.（エシェリキア・コリK12における全遺伝子発現プロファイリング。酸素利用率およびFNRの効果。）J Biol Chem.、2003年8月8；278（32）：29837-55。PMID：12754220。
Sanzら、Microbiota, inflammation and obesity.（微生物叢、炎症および肥満。）Adv Exp Med Biol.（アドバンシーズ・イン）・エクスペリメンタル・メディシン・アンド・バイオロジー）2014；817：291-317。PMID：24997040。
Sanzら、Understanding the role of gut microbiome in metabolic disease risk.（代謝疾患リスクにおける消化管微生物叢の役割の理解。）Pediatr Res.（ペディアトリック・リサーチ）2015年1月；77（1-2）：236-44。PMID：25314581。
Satら、The Escherichia coli mazEF suicide module mediates thymineless death.（エシェリキア・コリmazEF自殺モジュールはチミンレス死を媒介する。）J Bacteriol.、2003年3月；185（6）：1803-7。PMID：12618443。
Satoh（サトー）ら、New ulcerative colitis model induced by sulfhydryl blockers in rats and the effects of antiinflammatory drugs on the colitis.（ラットにおけるスルフヒドリル遮断薬によって誘導される新規潰瘍性大腸炎モデルおよび大腸炎に対する抗炎症薬の効果）Jpn J Pharmacol.（ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー）1997年4月；73（4）：299-309。PMID：9165366。
Sawers。Identification and molecular characterization of a transcriptional regulator from Pseudomonas aeruginosa PAO1 exhibiting structural and functional similarity to the FNR protein of Escherichia coli.（エシェリキア・コリのFNRタンパク質と構造的および機能的類似性を示すシュードモナス・エルジノーサPAO1の転写調節因子の同定および分子特性。）Mol Microbiol.、1991年6月；5（6）：1469-81。PMID：1787797。
Schiel-Bengelsdorfら、Pathway engineering and synthetic biology using acetogens.（アセトゲンを用いる経路工学および合成生物学。）FEBS Lett.、2012年7月16；586（15）：2191-8。PMID：22710156。
Schultz。Clinical use of E. coli Nissle 1917 in inflammatory bowel disease.（炎症性腸疾患におけるE. coliニッスル1917の臨床的使用。）Inflamm Bowel Dis.。2008年7月；14（7）：1012-8。Review（レビュー）。PMID：18240278。
Segui（セグイ）ら、Superoxide dismutase ameliorates TNBS-induced colitis by reducing oxidative stress, adhesion molecule expression, and leukocyte recruitment into the inflamed intestine.（スーパーオキシドジスムターゼは、炎症腸への酸化ストレス、接着分子発現、および白血球動員を減少させることによってTNBS誘発性大腸炎を改善する。）J Leukoc Biol.（ジャーナル・オブ・ロイコサイト・バイオロジー）2004年9月；76（3）：537-44。PMID：15197232。
Selmerら、Propionate CoA-transferase from Clostridium propionicum.  Cloning of gene and identification of glutamate 324 at the active site.（クロストリジウム・プロピオニカムからのプロピオナートCoAトランスフェラーゼ。活性部位におけるグルタマート324の遺伝子のクローニングおよび同定。Eur J Biochem.、2002年1月；269（1）：372-80。PMID：11784332。
Simpsonら、IBD: microbiota manipulation through diet and modified bacteria.（IBD：食餌および改変細菌を通した微生物の操作。）Dig Dis.（ダイジェスティブ・ディジーズ）2014；32 Suppl（付録）1：18-25。PMID：25531349。
Smithら、The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis.（微生物代謝物、短鎖脂肪酸は、結腸Treg細胞ホメオスタシスを調節する。）Science。2013年8月2；341（6145）：569-73。PMID：23828891。
Sonnenbornら、The non-pathogenic Escherichia coli strain Nissle 1917 −features of a versatile probiotic.（非病原性エシェリキア・コリ株ニッスル1917−汎用性のあるプロバイオティクスの特徴。）Microbial Ecology in Health and Disease（マイクロバイアル・エコロジー・イン・ヘルス・アンド・ディジーズ）。2009；21：122-58。
Stanleyら、Acute infection and macrophage subversion by Mycobacterium tuberculosis require a specialized secretion system.（マイコバクテリウム・ツベルクローシスによる急性感染症およびマクロファージ破壊は特殊な分泌系を必要とする。）Proc Natl Acad Sci USA。2003年10月；100（22）：13001-6。PMID：14557536。
Sugimoto（スギモト）ら、IL-22 ameliorates intestinal inflammation in a mouse model of ulcerative colitis.（IL-22は、潰瘍性大腸炎のマウスモデルにおける腸炎症を改善する。）J Clin Invest.（ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション）2008年2月；118（2）：534-44。PMID：18172556。
Triantafillidisら、Current and emerging drugs for the treatment of inflammatory bowel disease.（炎症性腸疾患の治療のための現在および新興の薬物。）Drug Des Devel Ther 5.5（2011）：185-210。
Trunkら、Anaerobic adaptation in Pseudomonas aeruginosa: definition of the Anr and Dnr regulons.（シュードモナス・エルジノーサにおける嫌気的適応：AnrおよびDnrレギュロンの定義。）Environ Microbiol.（エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー）2010年6月；12（6）：1719-33。PMID：20553552。
Tsengら、Controlled biosynthesis of odd-chain fuels and chemicals via engineered modular metabolic pathways.（操作されたモジュール式代謝経路を介する奇数鎖の燃料および化学物質の制御された生合成。）Proc Natl Acad Sci USA A. 2012年10月30；109（44）：17925-30。PMID：23071297。
Turskiら、Kynurenic Acid in the digestive system-new facts, new challenges.（消化器系でのキヌレニック酸-新しい事実、新たな挑戦。）Int J Tryptophan Res.（インターナショナル・ジャーナル・オブ・トリプトファン・リサーチ）2013年9月4日；6：47-55。PMID：24049450。
Ukenaら、Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 inhibits leaky gut by enhancing mucosal integrity.（プロバイオティックのエシェリキア・コリのニッスル1917は、粘膜の完全性を増強することによって漏出性の腸を抑制する。）PLoS One。2007年12月12日；2（12）：e1308。PMID：18074031。
Undenら、Alternative respiratory pathways of Escherichia coli:  energetics and transcriptional regulation in response to electron acceptors.（エシェリキア・コリの代替呼吸経路：電子受容体に応答するエネルギー論および転写調節。）Biochim Biophys Acta.（バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ）1997年7月4日；1320（3）：217-34。PMID：9230919。
Vargaら、N-Methyl-D-aspartate receptor antagonism decreases motility and inflammatory activation in the early phase of acute experimental colitis in the rat.（N-メチル-D-アスパラギン酸受容体アンタゴニズムは、ラットにおける急性実験的大腸炎の初期段階での運動性および炎症活性を低下させる。）Neurogastroenterol Motil.（ニューロガストロエンテロロジー・アンド・モーティリティ）2010年2月；22（2）：217-25。PMID：19735360。
Wagner（ワーグナー）ら、Semisynthetic diet ameliorates Crohn's disease-like ileitis in TNFΔARE/WT mice through antigen-independent mechanisms of gluten.（半合成餌料は、グルテンの抗原非依存性機構を介してTNFΔARE/ WTマウスにおけるクローン病様回腸炎を改善する。）Inflamm Bowel Dis.、2013年5月；19（6）：1285-94。PMID：23567784。
Watanabe（ワタナベ）ら、Interleukin 7 transgenic mice develop chronic colitis with decreased interleukin 7 protein accumulation in the colonic mucosa.（インターロイキン7トランスジェニックマウスは、結腸粘膜におけるインターロイキン7タンパク質蓄積の減少を伴う慢性大腸炎を発症する。）J Exp Med.、1998年2月2日；187（3）：389-402。PMID：9449719。
Weiら、Mesenteric B cells centrally inhibit CD4+ T cell colitis through interaction with regulatory T cell subsets.（腸間膜B細胞は調節性T細胞サブセットとの相互作用を介してCD4+ T細胞大腸炎を一元的に抑制する。）Proc Natl Acad Sci USA。2005年2月8；102（6）：2010-15。PMID：15684084。
Wenら、Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.（1型糖尿病の発症における先天性免疫および腸内微生物叢。）Nature。2008 Oct 23；455（7216）：1109-13。PMID：18806780。
Whittemら、Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (DSS).（デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を用いるマウス大腸炎モデル。）J Vis Exp.（ジャーナル・オブ・ビジュアライズド・エクスペリメンツ）2010 Jan 19；（35）。PMID：20087313。
Wilk（ウィルク）ら、The mdr1a-/- mouse model of spontaneous colitis: a relevant and appropriate animal model to study inflammatory bowel disease.（自然発症大腸炎のmdr1a -/-マウスモデル：炎症性腸疾患を研究するための関連し、および適切な動物モデル。）Immunol Res.（イムノロジック・リサーチ）2005；31（2）：151-9。PMID：15778512。
Williams（ウィリアムズ）GT、Williams WJ.、Granulomatous inflammation--a review.（肉芽腫性炎症-レビュー。）J Clin Pathol.（ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー）1983 Jul；36（7）：723-733。PMID：6345591。
Wintelerら、The homologous regulators ANR of Pseudomonas aeruginosa and FNR of Escherichia coli have overlapping but distinct specificities for anaerobically inducible promoters.  Microbiology.（シュードモナス・エルジノーサの相同調節因子ANRおよびエシェリキア・コリのFNRは嫌気的誘導性プロモーターに対して重複しているが明確な特異性を有する。）Microbiology（マイクロバイオロジー）1996 Mar；142（Pt 3）：685-93。PMID：8868444。
Wolfら、Overexpression of indoleamine 2,3-dioxygenase in human inflammatory bowel disease.（ヒト炎症性腸疾患におけるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼの過剰発現。）Clin Immunol.（クリニカル・イムノロジー）2004 Oct；113（1）：47-55。PMID：15380529。
Wrightら、GeneGuard: A Modular Plasmid System Designed for Biosafety.（ジーンガード：バイオセーフティのために設計されたモジュール式プラスミドシステム。）ACS Synth Biol.、2015年3月20日；4（3）：307-16。PMID：24847673。
Xiaoら、Nanoparticles with surface antibody against CD98 and carrying CD98 small interfering RNA reduce colitis in mice.（CD98に対する表面抗体およびCD98低分子干渉RNAを有するナノ粒子は、マウスにおいて大腸炎を減少させる。）Gastroenterology。2014 May；146（5）：1289-300。PMID：24503126。
Yazbeckら、Growth factor based therapies and intestinal disease: is glucagon-like peptide-2 the new way forward?（成長因子ベースの治療法および腸疾患：グルカゴン様ペプチド-2は新しい方法か？）Cytokine Growth Factor Rev.（サイトカイン・アンド・グロース・ファクター・レビューズ）2009 Apr；20（2）：175-84。PMID：19324585。
Zhangら、Deletion of interleukin-6 in mice with the dominant negative form of transforming growth factor beta receptor II improves colitis but exacerbates autoimmune cholangitis.（ドミナントネガティブ型のトランスフォーミング増殖因子β受容体IIを有するマウスにおけるインターロイキン-6の欠損は、大腸炎を改善するが、自己免疫性胆管炎を悪化させる。）Hepatology。2010 Jul；52（1）：215-22。PMID：20578264。
Zimmermannら、Anaerobic growth and cyanide synthesis of Pseudomonas aeruginosa depend on anr, a regulatory gene homologous with fnr of Escherichia coli.（シュードモナス・エルジノーサの嫌気的増殖およびシアン化物合成は、エシェリキア・コリのfnrと相同な調節遺伝子anrに依存する。）Mol Microbiol.、1991 Jun；5（6）：1483-90。PMID：1787798。
【実施例】
【０５７４】
以下の例は、本開示の例示的な実施態様を提供する。当技術において通常の技量の者（当業者とも言う）は、本開示の精神または範囲を変えることなく実行され得る多くの改変および変形を認識するであろう。そのような改変および変形は、本開示の範囲内に包含される。これらの例は本開示を何ら制限しない。
例１．治療上の分子を生成するためのベクターの構築
ブチラート
【０５７５】
エシェリキア・コリのニッスルにおいてブチラートの誘導性産生を促進するために、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ６３０由来のブチラート産生経路の８つの遺伝子（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ；ＮＣＢＩ；表２および表３６）、ならびに転写および翻訳要素が合成され（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（ケンブリッジ）、ＭＡ（マサチューセッツ州））、およびベクターｐＢＲ３２２中にクローニングされることにより、ｐＬｏｇｉｃ０３１（ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット、別名ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３ブチラートカセット、配列番号１６２）が作製される。
【０５７６】
ｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３遺伝子の遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する複合体を形成し、共酸化剤として酸素に対する依存性を示し得る。本発明の組換え細菌は、酸素が制限された環境下（例えば、哺乳動物の消化管）においてブチラートを生成するように設計されているので、前記の酸素依存性は消化管内でのブチラート生成に対してマイナスの効果をもつ可能性がある。トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）由来の単一遺伝子、すなわちトランス−２−エノイル（ｅｎｏｙｎｌ）−ＣｏＡレダクターゼ（ｔｅｒ、表２および表３６）が、酸素非依存的に、前記３つの遺伝子複合体を機能的に置換可能なことが示されている。したがって、第１のブチラートカセットのｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３遺伝子を、ｔｅｒ遺伝子で置換した第２のブチラート遺伝子カセットを合成する（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のオンラインコドン最適化ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｉｄｔｄｎａ.ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を用いて、大腸菌のコドン使用頻度に合わせて、ｔｅｒ遺伝子のコドン最適化を行う。第２のブチラート遺伝子カセット、ならびに転写要素および翻訳要素を合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングして、ｐＬｏｇｉｃ０４６（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット、本明細書ではｔｅｒブチラートカセットまたはｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセットとも呼ばれる、配列番号１６３）を作製する。
【０５７７】
第３のブチラート遺伝子カセットでは、ｐｂｔ遺伝子およびｂｕｋ遺伝子がｔｅｓＢ（配列番号１０）で置換されている。ＴｅｓＢは大腸菌に見出されるチオエステラーゼで、ブチリル−ｃｏＡからブチラートを切除するので、ｐｂｔ−ｂｕｋ（例えば、図２および表２および表３６を参照）の必要性を除くことができる。第３のブチラート遺伝子カセット、ならびに転写要素および翻訳要素を合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングして、ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ.ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット、本明細書ではｔｅｓＢブチラートカセットとも呼ばれる、配列番号１６４）を作製する。前記３つのカセット配列の非限定的な例を表３６に列挙する。
【表３５−１】
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【表３５−２】
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【表３５−３】
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【表３５−４】
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【表３５−５】
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【表３５−６】
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【表３５−７】
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【表３５−８】
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【０５７８】
特定の構築物では、ブチラート遺伝子カセット（例えば、ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋））は、ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制御下に置かれる。  いくつかの実施形態では、ブチラート遺伝子カセットは、ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制御下に置かれ、細菌は対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えばｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに有する（例えば、表３７および表３８および配列番号１６７を参照）。
【０５７９】
表３７は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢの調節領域、およびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なＲＮＳ調節構築物（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物；配列番号１６５）の核酸配列を示す。ＮｓｒＲをコードする配列を下線付きの太字で示し、ＮｓｒＲ結合部位、すなわちｎｏｒＢの調節領域を四角で囲んでいる。表３８は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢの調節領域、およびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なＲＮＳ調節構築物（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物；配列番号１６６）の核酸配列を示す。ＮｓｒＲをコードする配列を下線付きの太字で示し、ＮｓｒＲ結合部位、すなわちｎｏｒＢの調節領域を四角で囲んでいる。
【０５８０】
表３９（配列番号１６７）は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢの調節領域、およびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なＲＮＳ調節構築物（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物、配列番号１６７）の核酸配列を示す。
【０５８１】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１６５、１６６、１６７のＤＮＡ配列、またはそれらの機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【表３６−１】
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【表３６−２】
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【表３６−３】
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【表３６−４】
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【０５８２】
【表３７−１】
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【表３７−２】
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【表３７−３】
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【０５８３】
【表３８−１】
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【表３８−２】
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【表３８−３】
2018532412.tif 000107
【０５８４】
一定の構築物では、ブチラート遺伝子カセット（例えば、ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１）、および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ  ＋））は、ＲＯＳ応答性調節領域、例えばｏｘｙＳの制御下に置かれる。  一定の構築物では、ブチラート遺伝子カセット（例えば、ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１）、および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋））は、ＲＯＳ応答調節領域、例えばｏｘｙＳの制御下に置かれ、細菌はさらに対応するＲＯＳ応答性転写因子（例えば、表２８および表２９および本明細書の他の箇所を参照）、例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子を含む。
【０５８５】
ｏｘｙＳプロモーターを含む例示的なＲＯＳ調節構築物の核酸配列を、表４０および表４１および表４３に示す。ＯｘｙＲをコードする例示的構築物の核酸配列を表４２に示す。ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む、例示的なＲＯＳ調節構築物（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｏｘｙＳ−ブチラート構築物；配列番号１６８）の核酸配列を表４０に示す。ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なＲＯＳ調節構築物（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｏｘｙＳ−ブチラート構築物；配列番号１６９）の核酸配列を表４１に示す。ＯｘｙＲをコードする例示的な構築物（ｐＺＡ２２−ｏｘｙＲ構築物；配列番号１７０）の核酸配列を表４２に示す。ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なＲＯＳ調節構築物（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋−ｏｘｙＳ−ブチラート構築物；配列番号１７１）の核酸配列を表４３に示す。
【０５８６】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１６８、１６９、１７０もしくは１７１のＤＮＡ配列またはそれらの機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【表３９−１】
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【表３９−２】
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【表３９−３】
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【０５８７】
【表４０−１】
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【表４０−２】
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【表４０−３】
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【０５８８】
【表４１−１】
2018532412.tif 000114
【表４１−２】
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【０５８９】
【表４２−１】
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【表４２−２】
2018532412.tif 000117
【表４２−３】
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【０５９０】
いくつかの実施形態では、ブチラート遺伝子カセット（例えば、ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１）、および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋））を、表２５または２６ならびに配列番号１４１〜１５７から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置く。特定の構築物では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、強力なリボソーム結合部位配列にさらに融合される。ブチラート遺伝子の効率的な翻訳のために、オペロン中の各合成遺伝子を、Ｔ７プロモーター／翻訳開始部位に由来する１５塩基対のリボソーム結合部位によって分離した。
例２．ｔｅｔ誘導性プロモーターを用いるブチラート過剰発現のためのベクターの構築（ブチラート回路）
【０５９１】
大腸菌ニッスルにおいて、誘導性のブチラート生成を促進するために、ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３０由来のブチラート生成経路の８つの遺伝子（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｂｐｔ、およびｂｕｋ；ＮＣＢＩ）ならびに転写要素および翻訳要素を合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングしてｐＬｏｇｉｃ０３１を作製した。ブチラート遺伝子の効率的な翻訳のために、オペロン中の各合成遺伝子を、Ｔ７プロモーターに由来する１５塩基対のリボソーム結合部位によって分離した。
【０５９２】
ｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３の遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する複合体を形成し、共酸化剤として酸素に対するある程度の依存性を示し得る。実施例１に記載の理由により、大腸菌内でブチラート生成可能な（トランス−２−エノイル（ｅｎｏｙｎｌ）−ＣｏＡレダクターゼ；トレポネーマ・デンティコラ由来のｔｅｒで、ｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３を置換した第２のプラスミドを作製した。インバースＰＣＲによって、ｂｃｄ−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３領域外のｐＬｏｇｉｃ０３１の全配列を増幅した。ｔｅｒ遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のオンラインツールを用いて、大腸菌のコドン使用頻度に合わせてコドン最適化し、合成後（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ギブソン・アセンブリによって当該インバースＰＣＲ断片にクローニングし、ｐＬｏｇｉｃ０４６を作製した。
【０５９３】
ｐｂｔ遺伝子およびｂｕｋ遺伝子をｔｅｓＢ（配列番号１０）で置換した第３のブチラート遺伝子カセットをさらに作製した。ＴｅｓＢは大腸菌に見出されるチオエステラーゼで、ブチリル−ｃｏＡからブチラートを切除するため、ｐｂｔ−ｂｕｋの必要性が排除される（図２参照）。第３のブチラート遺伝子カセット、ならびに転写要素および翻訳要素を合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングして、ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット、本明細書ではｔｅｓＢブチラートカセットとも呼ばれる）を作製する。
【０５９４】
合成したときのように、前記の３つのブチラート遺伝子カセットをすべてテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に置き、ｔｅｔ誘導性合成ブチラートオペロンから分岐して、ｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）を構成的に発現させた。
【０５９５】
ｔｅｔプロモーターを含むテトラサイクリン調節構築物の核酸配列を表４４および表４５および表４６に示す。ｔｅｔプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なテトラサイクリン調節構築物の核酸配列（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｔｅｔ−ブチラート構築物；配列番号７８）を表４４に示す。ＴｅｔＲをコードする配列に下線を付し、重複するｔｅｔＲ／ｔｅｔＡプロモーターを四角で囲っている。表４５は、ｔｅｔプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なテトラサイクリン調節構築物（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｔｅｔ−ブチラート構築物；配列番号７９）の核酸配列を示す。ＴｅｔＲをコードする配列に下線を付し、重複するｔｅｔＲ／ｔｅｔＡプロモーターを四角で囲っている。
【０５９６】
表４６に、例示的なテトラサイクリン調節構築物（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋−ｔｅｔ−ブチラート構築物）の核酸配列を示す。当該構築物は、ｔｅｔＲリプレッサーの逆相補配列（下線）、ｔｅｔＲを制御する分岐プロモーターおよびブチラートオペロンおよびそれら各々のＲＢＳ（太字）を含む遺伝子間領域、ならびにＲＢＳによって分離されたブチラート遺伝子から構成される。
【０５９７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１７２、１７３もしくは１７４またはそれらの機能的断片のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を含む。
【表４３−１】
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【表４３−２】
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【表４３−３】
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【表４３−４】
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【０５９８】
【表４４−１】
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【表４４−２】
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【表４４−３】
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【０５９９】
【表４５−１】
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【表４５−２】
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【表４５−３】
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ブチラート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＧＬＰ−２
【０６００】
一定の構築物では、上記のブチラート（酪酸とも言う）産生経路に加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ、大腸菌とも言う）Ｎｉｓｓｌｅは、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＳＯＤ、キヌレニン（ｋｙｕｒｅｎｉｎｅ、キュレニンとも言う）、キヌレン酸（ｋｙｕｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ、キュレイク酸とも言う）、およびＧＬＰ−２を生産するために、上記の方法を用いてさらに操作される。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようなブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−１０をコードする遺伝子（例は、配列番号１３４、配列番号１９３、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９４参照）を含む。いくらかの実施態様において、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−２をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３５参照）。いくらかの実施態様において、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−２２をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３６、配列番号１９５、配列番号１９６参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−２７をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３７参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＳＯＤをコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３８参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＧＬＰ−２をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１３６１８９、配列番号１９０、配列番号１９２参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびキュレニン（ｋｙｕｒｅｎｉｎｅ）またはキュウリン酸（ｋｙｕｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２２、およびＧＬＰ−２をコードする遺伝子を含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号１４１〜配列番号１５７（表２５および表２６）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＮＳ応答性調節領域、例は、ｎｏｒＢの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２７および本明細書の他の箇所を参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＯＳ応答性調節領域、例は、ｏｘｙＳの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例は、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２８および表２９および本明細書の他の箇所を参照）。一定の構築物では、１以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
ブチラート、プロピオナート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２、ＩＬ−２７
【０６０１】
特定の構築物では、上記のブチラート生成経路に加えて、プロピオナートならびにＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＳＯＤ、キュレニン（ｋｙｕｒｅｎｉｎｅ）、キュレイク酸（ｋｙｕｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびＧＬＰ−２から選択される１つ以上の分子を生成するように、上記の方法を用いて大腸菌ニッスルをさらに操作する。特定の構築物では、上記のブチラート生成経路に加えて、プロピオナート、ならびにＩＬ−１０、ＩＬ−２およびＩＬ−２２から選択される１つ以上の分子を生成するように、大腸菌ニッスルをさらに操作する。特定の構築物では、上記のブチラート生成経路に加えて、プロピオナート、ならびにＩＬ−１０、ＩＬ−２およびＩＬ−２７から選択される１つ以上の分子を生成するように、大腸菌ニッスルをさらに操作する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのアクリラート経路遺伝子、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢおよびａｃｒＣをさらに有する。代わりの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのパイルベート（ピルビン酸）経路遺伝子、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦおよびｌｐｄを有する。別の代替の実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄおよびｔｅｓＢを有する。
【０６０２】
本細菌は、上記のようなブチラートを生成するための遺伝子カセット、上記のようなプロピオナートを生成するための遺伝子カセット、ＩＬ−１０をコードする遺伝子（例えば４９を参照）、ＩＬ−２７をコードする遺伝子（例えば、配列番号１３７を参照）、ＩＬ−２２をコードする遺伝子（例えば、配列番号１３６、配列番号１９５、配列番号１９６を参照）、およびＩＬ−２をコードする遺伝子（例えば、配列番号１３５）を有する。一実施形態では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、配列番号１４１〜１５７（表２５および表２６）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置かれる。代わりの実施形態では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＮＳ応答調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制御下に置かれ、細菌は対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えば、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに有する（例えば、表２７を参照）。さらに別の実施形態では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＯＳ応答調節領域、例えば、ｏｘｙＳの制御下に置かれ、細菌は対応するＲＯＳ応答性転写因子、例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに有する（例えば、表２８および本明細書の他の箇所を参照）。特定の構築物では、１つ以上の遺伝子がテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置かれる。
ブチラート、プロピオナート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、キヌレニン
【０６０３】
一定の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅをさらに操作して、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２およびキヌレニンから選択される１以上の分子を上記の方法を用いて生成する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、プロピオン酸塩、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２およびキヌレニンから選択される１以上の分子を上記の方法を用いて産生するようにさらに操作される。一定の構築物では、上記のブチラート生成経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２およびキヌレニンを上記の方法を用いて産生するようにさらに操作される。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、プロピオナート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２およびキヌレニンを上記の方法を用いて産生するようにさらに操作される。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオナート生合成のためのアクリラート経路遺伝子、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、およびａｃｒＣをさらに含む。代替の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのピルビン酸経路遺伝子、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄを含む。別の代替の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、およびｔｅｓＢを含む。
【０６０４】
本細菌は、上記のようにブチラートを生産するための遺伝子カセット、上記のようにプロピオン酸を生産するための遺伝子カセット、ＩＬ−１０をコードする遺伝子（例は、配列番号１３４参照）、ＩＬ−２２をコードする遺伝子（例は、配列番号１３６、配列番号１９５、配列番号１９６参照）、ＳＯＤをコードする遺伝子（例は、配列番号１３８）、ＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２アナログまたはＧＬＰ−２ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９２）、およびキヌレニン生成のための遺伝子または遺伝子カセットを含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号１４１−１５７（表２５および表２６）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＮＳ応答性調節領域、例は、ｎｏｒＢの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２７および本明細書中のその他の場所を参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＯＳ応答性調節領域、例は、ｏｘｙＳの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例は、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２８および表２９および本明細書中のその他の場所を参照）。一定の構築物では、１以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
ブチラート、プロピオナート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＩＬ−２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、キヌレニン
【０６０５】
一定の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅをさらに操作して、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＩＬ−２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、およびキヌレニンから選択される１以上の分子を上記の方法を用いて産生する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅをさらに操作して、プロピオン酸塩、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＩＬ−２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、およびキヌレニンから選択される１以上の分子を、上記の方法を使用して生成する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、上記の方法を用いてＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、およびキヌレニンを産生するようにさらに操作される。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオン酸生合成のためのアクリラート経路遺伝子、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、およびａｃｒＣをさらに含む。代替の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオン酸生合成のためのピルビン酸経路遺伝子、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄを含む。別の代替の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、およびｔｅｓＢを含む。
【０６０６】
本細菌は、上記のようにブチラートを生産するための遺伝子カセット、上記のようにプロピオン酸を生産するための遺伝子カセット、ＩＬ−１０をコードする遺伝子（例は、配列番号１３４、１９３、１９７、１９８、１９４参照）、ＩＬ−２７をコードする遺伝子（例は、配列番号１３７参照）、ＩＬ−２２をコードする遺伝子（例は、配列番号５１参照）、ＩＬ−２をコードする遺伝子（例は、配列番号５０参照）、ＳＯＤをコードする遺伝子（例は、配列番号５３参照）、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子（例は、配列番号５４参照）、およびキヌレニンを生産するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号１４１−１５７（表２５および表２６）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＮＳ応答性調節領域、例は、ｎｏｒＢの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２８および表２９および本明細書中のその他の場所を参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＯＳ応答性調節領域、例は、ｏｘｙＳの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例は、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２８および表２９および本明細書中のその他の場所を参照）。一定の構築物では、１以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
【０６０７】
いくらかの実施態様において、細菌遺伝子は栄養要求株を生成するために破壊または欠失され得る。これらには、制限されないが、表３３に示すように、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれる。
例３．Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換
【０６０８】
各プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ＮｉｓｓｌｅまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａに形質転換する。すべての試験管、溶液、およびキュベットは４℃まで予備チルド冷却する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｉｓｓｌｅまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａの一昼夜培養物を５ｍＬの溶原性ブロス（ＬＢ）において１：１００に希釈し、およびそれが０．４−０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させる。細胞培養培地は、選択マーカー、例は、プラスミドに適するアンピシリンを含む。次いでＥ．ｃｏｌｉ細胞を２，０００ｒｐｍにて５分間４℃で遠心分離し、上清を除去し、および細胞を１ｍＬの４℃の水に再懸濁する。Ｅ．ｃｏｌｉを再び２，０００ｒｐｍにて５分間４℃で遠心分離し、上清を除去し、および細胞を０．５ｍＬの４℃の水に再懸濁する。Ｅ．ｃｏｌｉを再び２，０００ｒｐｍにて５分間４℃で遠心分離し、上清を除去し、および最後に細胞を０．１ｍＬの４℃の水に再懸濁する。エレクトロポレーターは２．５ｋＶに設定される。０．５μｇの上記プラスミドの１つを細胞に添加し、ピペットによって混合し、およびピペットにより、滅菌してあるチルド冷却したキュベットに入れる。乾燥したキュベットをサンプルチャンバーに入れ、および電気パルスを適用する。室温でのＳＯＣ培地１ｍＬを直ちに加え、および混合物を培養管に移し、そして３７℃で１時間インキュベートする。細胞は、アンピシリンを含有するＬＢプレート上に広げ、および一昼夜インキュベートする。
【０６０９】
代わりの実施態様では、ブチラートカセットは相同組換え（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を通してＮｉｓｓｌｅゲノムに挿入することができる。構築物およびヌクレオチド配列の編成はここに提供される。構築物およびヌクレオチド配列の編成は図２に示されている。合成されたブチラートカセット構築物を染色体に組み込むことができるベクターを作製するために、ＮｉｓｓｌｅのｌａｃＺ座に相同なＤＮＡの１０００ｂｐ配列をＲ６Ｋ起点プラスミドｐＫＤ３に加えるために最初にＧｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ギブソンアセンブリ）を使用した。これは、これらのホモロジーアームの間でクローニングされたＤＮＡを標的にして、ＮｉｓｓｌｅゲノムのｌａｃＺ遺伝子座に組み込まれる。ギブソンアセンブリは、これらのアーム間の断片をクローン化するために使用した。ＰＣＲを使用して、相同性アームの全体の配列、ならびにそれらの間のブチラートカセットを含むこのプラスミドからの領域を増幅した。このＰＣＲ断片を用いて、エレクトロコンピテントＮｉｓｓｌｅ−ｐＫＤ４６を形質転換し、その株はラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含んだ。形質転換後、３７℃で２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール上に平板培養する前に、細胞を２時間培養した。３７℃での増殖により、ｐＫＤ４６プラスミドもキュアした。カセットを含む形質転換体はクロラムフェニコール耐性およびｌａｃ−マイナス（ｌａｃ−）であった。
例４．ｔｅｔ誘導性プロモーターを用いる組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるブチラートの生産
【０６１０】
ブチラートの生成に対する酸素の影響を決定するために、ブチラートの生成を上記のブチラートカセットを含むＥ．ｃｏｌｉのＮｉｓｓｌｅ株で評価した。試験されたｔｅｔ−誘導性カセットには、（１）８つの遺伝子のすべてを含むｔｅｔ−ブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０３１）；（２）ｔｅｒが置換されたｔｅｔ−ブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６）および（３）ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子の代わりにｔｅｓＢが置換されたｔｅｔ−ブチラートカセット、が含まれる。
【０６１１】
全てのインキュベーションを３７℃で行う。ブチラートカセットで形質転換した大腸菌ＤＨ５ａおよびニッスルの培養物をＬＢ中で一晩増殖させ、次いで０．５％グルコースを含む４ｍＬのＭ９最少培地に１：２００で希釈する。細胞を４〜６時間振とう培養（２５０ｒｐｍ）してから、好気的にまたはＣｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給）内で嫌気的にインキュベートした。１．５ｍＬ試験管に培養液を１ｍｌずつ分注し、培地への空気混入を制限するために、静置インキュベーター内でインキュベートした。各時点（０、１、２、４および２０時間）で試験管１本ずつ取り出し、ＬＣ−ＭＳによってブチラート濃度を分析して、前記の組換え株において低酸素環境下でのブチラート生成が達成できていることを確認する。
【０６１２】
図１１は、図２に示す異なるブチラート生成回路を用いたブチラート生成の棒グラフを示す。
【０６１３】
図１１Ａは、酸素の存在下および非存在下におけるｐＬＯＧＩＣ０３１株およびｐＬＯＧＩＣ０４６株のブチラート生成を示しており、ブチラート生成に有意差はない。最終２遺伝子（ｐｔｂ−ｂｕｋ）の欠失およびそれらの内因性大腸菌ｔｅｓＢ遺伝子（ブチリルＣｏＡからブチラート部分を切除するチオエステラーゼ）による置換を含むｐＬＯＧＩＣ０４６について、当該ｐＬＯＧＩＣ０４６を発現する低コピープラスミドのニッスルでは、ブチラート生成の増加が示された。
例５．組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるＴｅｔ駆動およびＲＮＳ駆動によるインビトロでのブチラート生産
【０６１４】
全てのインキュベーションは、３７℃で行った。ｐＬｏｇｉｃ０３１またはｐＬｏｇｉｃ０４６で形質転換し、溶原培地（ＬＢ）中で一晩増殖させた大腸菌ニッスルの培養液を、０．５％グルコースを含む１０ｍＬのＭ９最少培地に１：１００で継代培養した。２時間振とう培養（２００ｒｐｍ）した後、培養液に無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ｐＬｏｇｉｃ０３１またはｐＬｏｇｉｃ０４６からのブチラートオペロンの発現を誘導した。誘導から２時間後に、細胞を遠心分離により沈殿させ、上清を捨て、０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に細胞を再懸濁した。所定時間（（図２１に示すように、０時間から２４時間まで）に培養液上清の分析を行い、ＬＣ−ＭＳによってブチラート生成レベルを評価した。図２１に見られるように、ブチラート生成は、ｐＬｏｇｉｃ０３１構築物の含有株よりも、ｐＬｏｇｉｃ０４６構築物の含有株においてより高くなっている。
【０６１５】
上記のＲＮＳプロモーターによって駆動されるブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラートオペロン構築物およびｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラートオペロン構築物）を有する大腸菌ニッスル株についても、ブチラート生成を評価し、ブチラート生成に対する窒素の効果を明らかにした。一晩後の細菌培養液をフレッシュなＬＢに１：１００で希釈し、１．５時間増殖させて対数期初期に入るようにした。この時点で、長半減期の一酸化窒素供与体（ＤＥＴＡ−ＮＯ；ジエチレントリアミン−一酸化窒素付加体）を最終濃度０．３ｍＭで培養液に添加して、プラスミドからの発現を誘導した。誘導から２時間後に、細胞を遠心分離によって沈殿させ、上清を捨て、０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に当該細胞を再懸濁した。次いで、培養液上清を、指定時点（図２２に示すように、０時間から２４時間まで）に分析して、ブチラート生成レベルを評価した。図２２に示すように、ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラートオペロン構築物）または（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラートオペロン構築物）を有する遺伝子操作ニッスルは、野生型ニッスルと比較して、有意により多くのブチラートを生成した。
例６．誘導性ｔｅｔプロモーターブチラート回路を用いた組換え大腸菌におけるインビトロでのブチラート生成
【０６１６】
ＮｕｏＢは、呼吸性増殖（電子輸送を必要とする増殖の形態）の間にＮＡＤＨの酸化に関与するタンパク質複合体である。ＮＡＤＨ酸化の電子輸送への結合の防止は、ブチラート生成を支持するために使用されるＮＡＤＨの量にて増加を可能にする。ＮＡＤＨ酸化の電子輸送への結合の防止はブチラート生成増加を可能にするのかどうかを検証するため、ＮｕｏＢ欠失を有するＮｕｏＢ変異体が得られた。
【０６１７】
全てのインキュベーションは３７℃で行った。溶原培地（ＬＢ）で一晩増殖させたｐＬｏｇｉｃ０３１またはｐＬｏｇｉｃ０４６を含有する大腸菌株ＤＨ５ａおよびニッスルの培養液を、０．２％グルコースを含む１０ｍＬのＭ９最少培地に１：１００にて継代培養した。２時間振とう培養（２００ｒｐｍ）した後、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養液に添加して、ｐＬｏｇｉｃ０３１またはｐＬｏｇｉｃ０４６からのブチラートオペロンの発現を誘導した。培養液をフラスコ内で振とうしながら（＋Ｏ２）または嫌気性チャンバー（−Ｏ２）内でインキュベートしてから、試料を取り出し、２、４、２４時間後のブチラート量をＬＣ−ＭＳによって定量した。図１３を参照すると、ｎｕｏＢ遺伝子欠失を含む様々なブチラート生成回路を用いたブチラート生成量を示すグラフが示されている。図１３には、大腸菌のＢＷ２５１１３株を示しているが、当該株は共通のクローニング株であり、大腸菌突然変異体のＫＥＩＯコレクションのバックグラウンドである。図１３は、野生型ニッスルと比較して、ＮｕｏＢ欠失によって、ブチラート生成が増加することを示している。
例７．組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるブチラートの生産
【０６１８】
テトラサイクリンプロモーターの制御下でのブチラートのインビトロ産生を、（１）ブチラート遺伝子カセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラート）と（２）ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子がｔｅｓＢとともに配置されたブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａｐｂｔ−ｂｕｋ／ｔｅｓＢ  ＋−ブチラート；配列番号５６）との間で比較した。
【０６１９】
一晩の細菌培養物を新鮮なＬＢ中に１：１００に希釈し、および１．５時間増殖させて初期対数期に入るようにした。この時点で、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で培養物に添加して、プラスミドからのブチラート遺伝子の発現を誘導した。誘導から２時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨て、および細胞を０．５％グルコース含有Ｍ９最小培地に再懸濁した。次いで、培養上清を指示された時点で分析して、ブチラート産生レベルを評価した。図１１Ｂに示すように、ｐｂｔおよびｂｕｋをｔｅｓＢに置き換えることにより、より一層高いレベルのブチラート塩生成がもたらされる。
例８．ブチラート過剰発現のためのベクターの構築（ＦＮＲ駆動）
【０６２０】
実施例１に記載の３つのブチラートカセット（例えば、表３６、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５を参照）を、（配列番号１４１から配列番号１５７）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置く（表２５および表２６）。特定の構築物では、ＦＮＲ応答性プロモーターはさらに、強力なリボソーム結合部位配列に融合される。ブチラート遺伝子の効率的な翻訳のために、オペロン中の各合成遺伝子を、Ｔ７プロモーター／翻訳開始部位に由来する１５塩基対のリボソーム結合部位によって分離した。一定の実施形態では、ｙｄｆＺプロモーターが使用された。一実施形態では、ＦＮＲＳプロモーターが使用される。
例９．組換え大腸菌  （Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＦＮＲおよびＲＮＳ駆動によるインビトロでのブチラート産生
【０６２１】
ブチラート産生に対する酸素の影響を決定するために、ＦＮＲプロモーターによって駆動される、上記のブチラートカセットを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株でブチラートの産生を評価する。全てのインキュベーションを３７℃で行う。ブチラートカセットで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａおよびＮｉｓｓｌｅの培養物をＬＢ中で一晩増殖させ、次いで０．５％グルコースを含む４ｍＬのＭ９最小培地に１：２００に希釈する。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、好気的にまたはＣｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給）内で嫌気的にインキュベートする。培養液を１ｍｌずつ１．５ｍＬのキャップ付き試験管に分注し、培地への空気混入を制限するために、静置インキュベーター内にてインキュベートする。各時点（０、１、２、４および２０時間）で試験管を１本ずつ取り出し、ＬＣ−ＭＳによってブチラート濃度を分析して、前記の組換え株においてブチラート生成が低酸素環境下で達成できることを確認する。
【０６２２】
別の実施形態では、ＲＮＳプロモーターによって駆動される上記のブチラートカセットを含有する大腸菌ニッスル株において、ブチラート生成を評価し、ブチラート生成に対する窒素の影響を決定する。一晩後の細菌培養液をフレッシュなＬＢに１：１００で希釈してから、１．５時間増殖させて対数期初期に入るようにする。この時点で、長半減期の一酸化窒素供与体（ＤＥＴＡ−ＮＯ；ジエチレントリアミン−一酸化窒素付加体）を培養液に最終濃度０．３ｍＭで添加して、プラスミドからの発現を誘導する。誘導から２時間後に、細胞を遠心分離により沈殿させ、上清を捨てて、０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に細胞を再懸濁する。次いで、所定時間に培養液上清を分析して、ブチラート生成レベルを評価する。
例１０．組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるインビトロでのブチラート産生
【０６２３】
ＦＮＲプロモーター駆動によるブチラート生成に対する酸素およびグルコースの影響について、次の菌株の間で比較を行った。大腸菌ニッスル株ＳＹＮ５０１（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒブチラートプラスミド、すなわち、（ｙｄｆＺプロモーター制御下にｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ−ｂｕｋ遺伝子を有する）、ＳＹＮ−ＵＣＤ５００（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｂｃｄブチラートプラスミド、すなわち、ｙｄｆＺプロモーター制御下にｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋを有する）、およびＳＹＮ−ＵＣＤ５０６（ｐＳＣ１０１  ｎｉｒＢ−ｂｃｄブチラートプラスミド、すなわち、ｎｉｒＢプロモーター制御下にｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ）を有する。
【０６２４】
全てのインキュベーションを３７℃で行った。ブチラートカセットで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株の培養物をＬＢ中で一晩増殖させ、次いで０．５％グルコースを含む４ｍＬのＭ９最少培地に１：２００に希釈した。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、４時間にわたってＣｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給する）中で嫌気的にインキュベートした。細胞を洗浄し、０．５％グルコースを含む最小培地に再懸濁し、経時的にブチラート産生をモニターするために微好気的にインキュベートした。１つのアリコートを各時点（２、８および２４時間）に取り出し、ＬＣ−ＭＳによるブチラート濃度の分析を行い、これらの組換え株におけるブチラート生産が低酸素環境下で達成できることを確認した。図１４Ｂに示すように、ＳＹＮ−５０１は嫌気的条件下で有意なブチラート生成をもたらした。
【０６２５】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１７５、１７６、１７７、または１７８のＤＮＡ配列、またはその機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【表４６−１】
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【表４６−２】
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【表４６−３】
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【表４６−４】
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【表４６−５】
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【表４６−６】
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【表４６−７】
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【表４６−８】
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例１１．組換え大腸菌  （Ｅ．ｃｏｌｉ）  におけるブチラート産生
【０６２６】
ＦＮＲプロモーターによって駆動されるブチラートカセット（ｙｄｆＺプロモーター制御下のｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ−ｂｕｋ遺伝子）を用いて、ブチラート生成に対する酸素およびグルコースの効果を、大腸菌ニッスル株において、評価した。
【０６２７】
全てのインキュベーションを３７℃で行った。ブチラートカセットで形質転換した大腸菌株ＤＨ５ａおよびニッスル培養物をＬＢ中で一晩増殖させてから、グルコースを含まない４ｍＬのＬＢ、または０．５％グルコースを含む４ｍＬのＲＣＭ培地中に、１：２００で希釈した。細胞を振とう（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、好気的に、または嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給する）内で嫌気的にインキュベートした。培養液を１．５ｍＬキャップ付き試験管に１ｍｌずつ分注し、空気の混入を制限するために、静置インキュベーター内でインキュベートした。各時点（０、１、２、４および２０時間）で試験管を１本ずつ取り出し、ＬＣ−ＭＳによりブチラート濃度を分析し、低酸素環境下において前記の組換え株によるブチラート生成が達成できていることを確認した。
【０６２８】
図１４Ｃは、グルコースおよび酸素の存在下／不存在下でＦＮＲ−ブチラートカセット（ｔｅｒ置換を有する）を含む株におけるブチラート生産、および細菌がＦＮＲプロモーターからのブチラート産生のためにグルコースおよび嫌気的条件の両方を必要とすることを示す。細胞は、グルコースを含まない培地（ＬＢ）または０．５％グルコースを含む培地（ＲＭＣ）中で好気的にまたは嫌気的に増殖させた。培養サンプルを表示された時間ポイントで採取し、および上清画分をＬＣ−ＭＳを用いてブチラート濃度について評価した。これらのデータは、ＳＹＮ５０１がブチラート産生のためにグルコースを必要とし、グルコースの存在下でブチラート産生が嫌気性ＦＮＲ調節ｙｄｆＺプロモーターの制御下に嫌気性条件下で増強され得ることを示す。
例１２．損傷したバリア機能の検出のための低用量ＤＳＳ誘発大腸炎モデルの最適化
【０６２９】
種々の濃度のＤＳＳを用いたマウスで試験を行ったので、損傷したバリア機能を調べることができるようにマウスに投与する最適なＤＤＳ濃度を決定する。
【０６３０】
簡潔には、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢、Ｎ＝２５）を０．２５％、０．５％、１％および１．５％ＤＳＳならびにＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤ）で処置した。
【０６３１】
実験０日目に、動物の体重を測定し、マウスを以下のように体重によって無作為に５つの処置グループ（ｎ＝５／グループ）に分けた：グループ１‐Ｈ２Ｏコントロール、ｎ＝５；グループ２‐０．２５％ＤＳＳ、ｎ＝５；グループ３‐０．５％ＤＳＳ、ｎ＝５；グループ４‐１％ＤＳＳ、ｎ＝５；グループ５‐１．５％ＤＳＳ、ｎ＝５。糞便ペレットを収集し、水をＤＳＳ含有水に取り換えた。１日目および３日目に再度、動物の体重を測定した。２日目に、分光光度法によるＦＩＴＣ分析のために血液サンプルを収集した。４日目に、マウスを４時間絶食させ、全てのマウスに０．６ｍｇ／ｇのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤ）を強制投与した。ＦＩＴＣ−デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄｅｘ）投与の３時間後に、動物の体重を測定し、採血をした。糞便ペレットを収集し、結腸サンプルを採取した。血液試料をＦＩＴＣの分光光度分析のために処理し、血清を全血から調製した。
【０６３２】
図２５に示すように、マウスのリポカリン２およびカルプロテクチンのレベルについて、ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって糞便ペレットを分析する。ＣＲＰレベルについても、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析する。ＩＬ−１ａ／ｂ、−６、−１３、−１８、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ  ＥｐＣＡＭ、ＭＰＯおよびＧ−ＣＳＦのレベル増加について、結腸組織をｑＰＣＲにより分析する。分光光度法によって血清中のＦＩＴＣ−デキストランレベルを分析した。その結果を図１５に示す。図１５からわかるように、０．５％ＤＳＳが、ＦＩＴＣデキストランの増加が観察された最低用量である。
例１３．損傷したバリア機能の検出のための低用量ＤＳＳ濃度と異なるＦＩＴＣ分子量の比較
【０６３３】
損傷したバリア機能を調べるためにマウスに投与可能な最適ＤＳＳ濃度（０．７５または１．５％）およびＦＩＴＣ−デキストラン分子量（４または４０ｋＤＡ）を決定するために、研究を行った。
【０６３４】
Ｃ５７ＢＬ６（９週齢、ｎ＝１８）を以下のようにＤＳＳで処置した（ＤＳＳ‐０．７５％および１．５％）；ＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤおよび４０ｋＤ）。そして、大腸炎の分子マーカーへの影響（分光光度法およびＥＬＩＳＡによる評価）を評価し、体重および全体の動物の健康状態をモニターした。
【０６３５】
０日目に、マウスを体重測定し、マウスを以下のように体重に従って、無作為に３つの処置グループ（ｎ＝６／グループ）に分けた：グループ１、Ｈ２Ｏコントロール、ｎ＝６；グループ２、０．７５％ＤＳＳ、ｎ＝６；グループ３、１．５％ＤＳＳ、ｎ＝６。水をＤＳＳ含有水に変えた。
【０６３６】
１〜３日目に、再度マウスの体重を測定した。４日目にマウスを４時間絶食させ、各群から３匹のマウスに４ｋＤａまたは４０ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストラン０．６ｍｇ／ｇのいずれかを強制投与した。各グループのマウス１〜３および４〜６（尾部のマークで示される）を、それぞれ４ｋＤａおよび４０ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄｅｘ）の投与に用いた。ＦＩＴＣ−ｄｅｘ投与の３時間後に、マウスの体重を測定し、採血してから、糞便ペレットを収集した。血液試料をＦＩＴＣの分光光度分析のために処理し、全血から血清を調製した。
【０６３７】
分光光度法による血清中のＦＩＴＣ−デキストランレベルの分析結果を図１５に示す。
例１４．ブチラート生成細菌株は低用量ＤＳＳ誘導マウスモデルのＩＢＤにおいて消化管炎症を減少させる
【０６３８】
０日目に、４０匹のＣ５７ＢＬ６マウス（８週齢）を秤量し、および以下の５つの処置群（群当たりｎ＝８）に無作為化した：Ｈ２Ｏコントロール（グループ１）；０．５％ＤＳＳコントロール（グループ２）；０．５％ＤＳＳ＋１００ｍＭブチラート（グループ３）；０．５％ＤＳＳ＋ＳＹＮ９４（グループ４）；および０．５％ＤＳＳ＋ＳＹＮ３６３（グループ５）。無作為化後、グループ３のケージ水をブチラート（１００ｍＭ）を補充した水に変え、およびグループ４および５で、それぞれ１００μＬのＳＹＮ９４およびＳＹＮ３６３を経口強制飼養によって投与した。１日目に、グループ４および５は、朝に細菌で強制飼養され、計量され、そして夕方に再び強制飼養された。グループ４および５も、２日目および３日目に１日１回強制飼養した。
【０６３９】
４日目に、グループ４および５に、細菌を強制経口投与し、および次いですべてのマウスを秤量した。ケージ水をＨ２Ｏ＋０．５％ＤＳＳ（グループ２、４、および５）に、または１００ｍＭブチラート（グループ３）を補充したＨ２Ｏ＋０．５％ＤＳＳのいずれかに変化させた。グループ４および５のマウスを夕方に再び強制飼養した。５−７日目に、グループ４および５には、朝に細菌が強制飼養され、計量され、および夕方に再び強制飼養された。
【０６４０】
８日目に、すべてのマウスを４時間絶食させ、およびグループ４および５を、食物の除去直後に細菌で強制飼養した。次いで、すべてのマウスを秤量し、およびＦＩＴＣ−デキストラントレーサー（４ｋＤａ、０．６ｍｇ／ｇ体重）の単回用量で強制飼養した。糞便ペレットを集めたが；しかし、大腸炎が糞便収集を防ぐのに十分に重度であった場合、安楽死後に糞便を採取した。ＦＩＴＣ−デキストラン投与後、すべてのマウスを正確に３時間で安楽死させた。次いで、動物を心臓採血し、および血液サンプルを処理して血清を取得した。マウスリポカリン２、カルプロテクチン、およびＣＲＰ−１のレベルをＥＬＩＳＡによって定量し、およびＦＩＴＣ−デキストランの血清レベルを分光光度法によって分析した（例８も参照）。
【０６４１】
図１４Ｄは、研究の８日目にＥＬＩＳＡによって示される、すべての処置グループにおけるリポカリン２（ＬＣＮ２）レベルを示す。ＬＣＮ２は炎症疾患活性のバイオマーカーであるので、これらのデータは、低用量のＤＳＳ誘導性のＩＢＤマウスモデルにおいて、ＳＹＮ−５０１がＬＣＮ２濃度、ならびに消化管炎症を有意に低下させるのに十分なブチラートを産生することを示唆する。
例１５．染色体挿入およびプラスミド含有改変細菌株のインビトロブチラート生産効率の比較
【０６４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるブチラート生成効率について、染色体中にブチラートカセット挿入を有する操作細菌株を、プラスミド上にブチラートカセットを有する株と比較した。ＳＹＮ１００１およびＳＹＮ１００２では、ＦＮＲ誘導性プロモーターによって駆動されるブチラートカセット（それぞれ、ｔｅｒＢ−＞ｔｅｓＢまたはｔｅｒ−＞ｐｂｔ−ｂｕｋのいずれか）が、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ遺伝子座の間で、染色体に挿入されている。ＳＹＮ１００１およびＳＹＮ１００２を、同じくｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動される低コピープラスミド株ＳＹＮ５０１（Ｌｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ−＞ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートプラスミド）と並べて比較した。嫌気性誘導から４時間後および２４時間後に、培地中のブチラート濃度を測定した。
【０６４３】
簡潔には、細菌の凍結グリセロールストックを３ｍｌのＬＢに植え付けた。細菌を３７℃で一晩、振とう培養した。一晩後の培養液を、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ内のＬＢ１０ｍｌ（抗生物質を含む）に１：１００の希釈率で加えた。培養液を振とうしながら約１．５時間、３７℃で好気的に増殖させ、次いで３７℃の嫌気性チャンバーに移して、４時間インキュベートした。細菌（２Ｘ１０８ＣＦＵ）を、エッペンドルフチューブ内の０．５％グルコース、５０ｍＭ  ＭＯＰＳを含む１ｍｌのＭ９培地に添加した。細胞数を決定するために、細胞をプレートにまいた。アッセイチューブを３７℃の嫌気性チャンバー内に置いた。指定時間（４時間後および２４時間後）に、１２０μｌの細胞を取り出し、１４，０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離で沈殿させ、１００μｌの上清を９６穴のアッセイプレートに移し、アルミホイルで密封し、ＬＣ−ＭＳによるブチラート濃度の分析（実施例２２に記載）まで−８０℃で保存した。結果を図２９に示しており、ＳＹＮ１００１およびＳＹＮ１００２が、プラスミド株ＳＹＮ５０１に匹敵する量のブチラートを生成することを示している。
【０６４４】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１７９、１８０、１８１もしくは１８２のＤＮＡ配列またはその機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。
【０６４５】
【表４７−１】
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【表４７−２】
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【表４７−３】
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【表４７−４】
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【表４７−５】
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例１６．マウスにおけるＳＹＮ５０１投与に応答した腸内ブチラートレベルの評価
【０６４６】
遺伝学的に操作された細菌によるブチラート産生のインビボでの有効性を決定するために、ＳＹＮ５０１（Ｌｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ−＞ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートプラスミド））をＣ５７ＢＬ６マウスに投与したときのブチラートのレベルを最初に糞便中にて評価した。１００ｍＭブチラートを含む水をコントロールとして用いた。
【０６４７】
１日目に、Ｃ５７ＢＬ６マウス（計２４匹）の体重を測定し、無作為に４グループに分けた；グループ１：Ｈ２０コントロール（ｎ＝６）、グループ２：１００ｍＭブチラート（ｎ＝６）、グループ３：ストレプトマイシン耐性ニッスル（ｎ＝６）、グループ４：ＳＹＮ５０１（ｎ＝６）。マウスに１００μｌのストレプトマイシン耐性ニッスルまたはＳＹＮ５０１のいずれかを強制投与し、グループ２は１０ｅ１０細胞／１００μｌの投与量のＨ２Ｏ（＋）１００ｍＭブチラートに変更した。２〜４日目に、マウスの体重を測定し、午前および午後に、グループ３およびグループ４にストレプトマイシン耐性ニッスルまたはＳＹＮ５０１のいずれかを強制投与した。５日目に、マウスの体重を測定し、午前中にグループ３およびグループ４にストレプトマイシン耐性ニッスルまたはＳＹＮ５０１のいずれかを強制投与し、糞便を採取して、実施例２３に記載の要領でブチラート濃度の測定を行った。図２３に結果を示す。ニッスルコントロールを強制投与したマウスまたは水のみを与えたマウスと比較して、ＳＹＮ５０１を投与したマウスの糞便中から、有意により高い濃度のブチラートが検出された。濃度は２ｍＭに近く、Ｈ２Ｏ（＋）２００ｍＭブチラートを与えたマウスで見られる濃度よりも高かった。
【０６４８】
次に、盲腸、盲腸流出液、大腸および大腸排出液中のブチラート濃度に対するＳＹＮ５０１の影響を評価する。これらの区画では、ブチラートのベースライン濃度が高いので、腸内のブチラート生成を担う細菌を除去するために、抗生物質処理を事前に投与する。結果として、ブチラートレベルのより小さい差異をより正確に観察および測定することができる。ブチラート１００ｍＭを含む水をコントロールとして使用する。
【０６４９】
研究の第１週の間に、常在微生物叢のベースラインレベルを低下させるために飲料水中の抗生物質カクテルで動物を処置する。抗生物質カクテルは、ＡＢＸ−アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシンおよびメトロニダゾールからなる。第２週の間に、１００μｌのストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅまたは操作株ＳＹＮ５０１を１日２回、５日間（１０ｅ１０細胞／１００μｌの用量で）動物に経口投与する。
【０６５０】
１日目に、Ｃ５７ＢＬ６（雌、８週齢）を以下のように４つのグループに分ける。グループ１：Ｈ２０コントロール（ｎ＝１０）、グループ２：１００ｍＭブチラート（ｎ＝１０）、グループ３：ストレプトマイシン耐性ニッスル（ｎ＝１０）、グループ４：ＳＹＮ５０１（ｎ＝１０）。動物の体重を測定し、当該動物から糞便を採取する（Ｔ＝０時点）。動物に与えるものをＨ２Ｏ（＋）抗生物質カクテルに変更する。５日目に、動物の体重を測定し、糞便を採取する（Ｔ＝５ｄ時点）。Ｈ２Ｏ（＋）抗生物質カクテルボトルを交換する。８日目に、マウスの体重を測定し、糞便を採取する。午前および午後に、グループ３およびグループ４のマウスに、ストレプトマイシン耐性ニッスルまたはＳＹＮ５０１を強制経口投与する。全ケージの水を抗生物質なしの水に交換する。グループ２に、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭブチラートを与える。９〜１１日目に、マウスの体重を測定し、午前および午後に、グループ３およびグループ４のマウスにストレプトマイシン耐性ニッスルまたはＳＹＮ５０１を強制投与する。１２日目の午前中に、マウスにストレプトマイシン耐性ニッスルまたはＳＹＮ５０１を強制投与し、投与の４時間後に血液を採取し、盲腸、大腸内容物、組織および糞便を採取して、分析のために処理する。
例１７．ブチラートカセットをコードする遺伝学的に操作された細菌と、選択されたクロストリジウム菌株とのブチラート生成レベルの比較
【０６５１】
ＳＹＮ５０１（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ−＞ｐｂｔ−ｂｕｋ  ブチラートプラスミド）のブチラート生成の有効性を、ＣＢＭ５８８（クロストリジウム綱ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＭＩＹＡＲＩＳＡＮ、日本のプロバイオティク株）、クロストリジウム・チロブチリカムＶＰＩ  ５３９２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＶＰＩ  ５３９２）（基準株）、およびクロストリジウム・ブチリカムＮＣＴＣ  ７４２３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＮＣＴＣ  ７４２３）（基準株）と比較した。
【０６５２】
簡潔には、ＳＹＮ５０１の一晩後の培養液を１：１００に希釈して、ＲＣＭ（補強クロストリジウム培地、ＬＢと類似しているが０．５％グルコースを含む）中で３７℃、２時間振とう培養してから、嫌気性チャンバーに移すか、またはそのまま好気的に振とうした。クロストリジウム菌株は嫌気的にしか増殖しなかった。指定時間（２、８、２４、および４８時間）に、１２０μｌの細胞を取り出し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心して、ペレット化した。上清１００μｌを９６穴のアッセイプレートに移し、アルミニウムホイルで密封し、ＬＣ−ＭＳによるブチラート濃度の分析（実施例１８に記載のとおり）まで−８０℃で保存した。図１８に結果を示していて、ＳＹＮ５０１がＲＣＭ培地中で、クロストリジウム属に匹敵するブチラート濃度を生成することを示している。
例１８．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるブチラートの定量
【０６５３】
実施例３７のブチラート測定値を得るために、ブチラート定量のためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロトコルを使用した。
サンプル調整
【０６５４】
最初に、１０００、５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬの酪酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅ）標準液を、水を用いて新たに調製した。次いで、Ｖ底ポリプロピレン９６穴プレートに１０μＬのサンプル（細菌上清および標準液）をピペットで入れ、最終濃度４μｇ／ｍＬのブチラート−ｄ７（ＣＤＮ同位体）を内部標準として含む６７％ＡＣＮ（各反応につき、６０μＬのＡＣＮ＋３０μＬの水）を９０μＬずつ各試料に加えた。プレートをヒートシールし、十分に混合してから、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。丸底の９６穴ポリプロピレンプレート中で、１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．５，２０ｍＭ  ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）、および２０ｍＭ  ＴＦＥＡ（２，２，２−トリフルオロエチルアミン）を含む緩衝液１８０μＬに、２０μＬの希釈サンプルを加えた。プレートを再度ヒートシールし、十分に混合してから、サンプルを室温にて１時間インキュベートした。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
【０６５５】
ブチラートを、Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用いるタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。ＨＰＬＣの詳細を表４９および表５０に記載する。タンデム質量分析の詳細を表５１に記載する。
【０６５６】
【表４８】
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【０６５７】
【表４９】
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【０６５８】
【表５０】
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例１９．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる糞便中のブチラート定量
サンプル調整
【０６５９】
１０００、５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬの酪酸ナトリウム標準液を、水を用いて新たに調製した。単一の糞便ペレットを１００μＬの水中で粉砕し、４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。Ｖ底ポリプロピレン９６穴プレートに１０μＬのサンプル（糞便上清および標準液）をピペットで入れ、アセトニトリル中に５μｇ／ｍＬのブチラート−ｄ７とともに、５０ｍＭの２−ヒドラジノキノリン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（２−ＨＱ）、ジピリジルジスルフィド（ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）およびトリフェニルホスフィン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｉｎｅ）を含む誘導体化溶液９０μＬを各サンプルに加えた。プレートをヒートシールし、６０℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、誘導体化サンプル２０μＬを、０．１％ギ酸を含む２２％アセトニトリル１８０μＬと混合した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
【０６６０】
ブチラートを、Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用いるタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。ＨＰＬＣの詳細を表５２および表５３に記載する。タンデム質量分析の詳細を表５４に記載する。
【０６６１】
【表５１】
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【０６６２】
【表５２】
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【０６６３】
【表５３】
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例２０．操作されたＮｉｓｓｌｅにおけるインビトロでのブチラートおよびアセタート生成増加
【０６６４】
大腸菌は、発酵の最終生成物として高レベルのアセタートを生成する。高レベルのブチラート生成を維持しながらアセタート生成量を改善するために、内在性ａｄｈＥ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ−ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ）およびｌｄｈ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ラクタートデヒドロゲナーゼ）の欠失を発生させて、アセタートまたはブチラート生成につながらない経路による代謝流束を防止または低減させた（例えば、図２５を参照）。この研究では、ＦＮＲＳ  ｔｅｒ−ｔｅｓＢまたはＦＮＲＳ−ｔｅｒ−ｐｂｔ−ｂｕｋ  ブチラートカセットのいずれかを組み込んだニッスル株を使用した。さらに、この研究では、グルコースよりもグルクロン酸の方が消化管内で利用可能な炭素源をよりよく模倣するので、０．５％グルコースおよび５０ｍＭ  ＭＯＰＳを含むＭ９培地と、０．５％グルクロン酸を含む培地との比較を行った。
【０６６５】
簡潔には、細菌を３７℃で振とう培養により一晩、増殖させた。一晩後の培養液を、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ内のＬＢ１０ｍｌ（抗生物質を含む）に１：１００の希釈率で加えた。培養液を振とうしながら約１．５時間、３７℃で好気的に増殖させ、次いで３７℃の嫌気性チャンバーに移して、４時間インキュベートした。細菌（２Ｘ１０８ＣＦＵ）を、０．５％グルコースおよび５０ｍＭ  ＭＯＰＳあるいは０．５％グルクロン酸を含むエッペンドルフチューブ中のＭ９培地１ｍｌに加えた。細胞数を決定するために、細胞をプレーティングした。アッセイチューブを３７℃の嫌気性チャンバー内に置いた。１８時間後に、細胞を取り出し、１４，０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離で沈殿させ、１００μｌの上清を９６ウェルアッセイプレートに移し、アルミホイルで密封し、ＬＣ−ＭＳによるブチラートおよびアセタート濃度の分析（本明細書の実施例１８および実施例２１に記載）まで−８０℃で保存した。
【０６６６】
図２６Ａおよび図２６Ｂに示すように、いずれの組込み株も同程度の量のアセタートを生成し、ＦＮＲＳ−ｔｅｒ−ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートカセットの方がわずかながらより多くのブチラートを生成した。ａｄｈＥおよびｌｄｈＡの欠失は、ブチラートおよびアセタート生成に同じような影響を与える。アセタート生成量は、０．５％グルクロン酸の含有培地で、はるかに高かった。
【０６６７】
代わりの実施形態では、ｆｒｄ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、フマレートレダクターゼ）を欠失させて、アセタートおよびブチラート生成に対する当該欠失の影響を評価する。
例２１．  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる細菌上清中のアセタートおよびブチラートの定量
サンプル調整
【０６６８】
酢酸アンモニウムおよび酪酸ナトリウムのストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を水を用いて調整し、１．５ｍＬエッペンドルフに１００μＬずつ分注してから、−２０℃で保存した。標準溶液（１０００、５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬ）を、水を用いて調製した。サンプルおよび標準溶液（１０μＬ）を、氷上のＶ底ポリプロピレン９６穴プレートにピペットで加えた。２μｇ／ｍＬの酪酸ナトリウム−ｄ７を有するアセトニトリル中の５０ｍＭの２−ヒドラジノキノリン（２−ＨＱ）とジピリジルジスルフィドとトリフェニルホスフィンとを含有する９０μＬの誘導体化溶液を、最終溶液に加えた。プレートをＴｈｅｒｍＡＳｅａｌホイルでヒートシールし、十分に混合した。サンプルを６０℃で１時間インキュベートすることにより誘導体化して、４０００ｒｐｍで５分間遠心した。誘導体化サンプル（２０μＬ）を、丸底９６穴プレートにおいて、水／アセトニトリル（１４０：４０）中の０．１％ギ酸（１８０μＬ）に加えた。プレートをＣｌｅａｒＡＳｅａｌシートでヒートシールして、よく混合した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
【０６６９】
誘導体化代謝産物を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用いるタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。表５５および表５６にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の概要を示す。
【０６７０】
【表５４】
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【０６７１】
【表５５】
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【０６７２】
【表５６】
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例２２．遺伝学的に操作された大腸菌ＢＷ２５１１３およびＮｉｓｓｌｅにおけるスリーピングビューティームターゼ経路によるプロピオナート生産
【０６７３】
大腸菌において、４つの遺伝子オペロン、ｓｂｍ−ｙｇｆＤ−ｙｇｆＧ−ｙｇｆＨ（スリーピングビューティームターゼ経路）は、インビトロでスクシナート（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）からプロピオナートを生産する能力を有する推定コバラミン依存性経路をコードすることが示されている。スリーピングビューティームターゼ経路は大腸菌に存在するものの、強力なプロモーターの制御下にはなく、インビボで低活性であることが示されている。
【０６７４】
プロピオナート生産のためのこのオペロンの有用性を評価した。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは完全なオペロンを有していないので、最初の実験は大腸菌Ｋ１２（ＢＷ２５１１３）で行った。
【０６７５】
まず、ＢＷ２５１１３株の染色体上のスリーピングビューティームターゼオペロンの天然プロモーターをｆｎｒプロモーター（ＢＷ２５１１３  ｌｄｈＡ：：ｆｒｔ；ＰｆｎｒＳ−ＳＢＭ−ｃａｍ）に置き換えた。この構築物の配列を表５８に示す。ラクタートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子（ｌｄｈＡ）の変異は、プロピオナート産生を増加させることが報告されており、したがって一定の実施態様ではこの変異もまた加えられている。
【０６７６】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１８４または１８４、またはその機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０６７７】
【表５７−１】
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【表５７−２】
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【表５７−３】
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【表５７−４】
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【表５７−５】
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【表５７−６】
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【表５７−７】
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【表５７−８】
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【表５７−９】
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【０６７８】
次に、この株をプロピオナート産生について試験した。
【０６７９】
簡潔には、野生型大腸菌Ｋ１２株または遺伝学的に操作された細菌の凍結グリセロールストックを３ｍｌのＬＢ（必要な場合には、選択的抗生物質（ｃａｍ）を含む）に植菌した。当該遺伝学的に操作された細菌は、染色体中に、ＦＮＲプロモーター制御下のスリーピングビューティームターゼオペロンを有する。細菌を３７℃で一晩振とう培養した。一晩後の培養液を、１２５ｍｌバッフル付きフラスコ内のＬＢ１０ｍｌに１：１００の希釈率で加えた。培養液を振とうしながら約１．５時間、３７℃で好気的に増殖させた後、３７℃嫌気性チャンバーに移して、４時間インキュベートした。細菌（２Ｘ１０８ＣＦＵ）を、エッペンドルフチューブ内の０．５％グルコース、５０ｍＭ  ＭＯＰＳを含む１ｍｌのＭ９培地に加えた。細胞数を決定するために、細胞をプレートにまいた。アッセイチューブを３７℃嫌気性チャンバー内に置いた。１，２、および２４時間後に、１２０μｌの細胞を取り出し、１４，０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離で沈殿させた。上清１００μｌを９６穴のアッセイプレートに移し、アルミホイルで密封した後、記載のとおり、ＬＣ−ＭＳによるプロピオナート濃度の分析まで−８０Ｃ℃保存した。
【０６８０】
結果を図２９に示す。図２９では、大腸菌Ｋ１２野生型株からはプロピオナートがほとんどまたは全く検出されなかったのに対し、遺伝学的に操作された細菌は２４時間後に約２．５ｍＭのプロピオナートを生成することを示している。プロピオナート測定は、実施例２５に記載の要領で行った。
例２３．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるプロピオナート産生のためのスリーピングビューティームターゼ経路の評価
【０６８１】
次に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるプロピオナート生成について、ＳＢＭ経路の評価を行う。Ｎｉｓｓｌｅは４遺伝子からなるスリーピングビューティームターゼオペロンを完全には持っていない。第１遺伝子、および第２遺伝子の部分遺伝子のみを有し、第３遺伝子および第４遺伝子は欠損している。したがって、Ｎｉｓｓｌｅにこの経路を導入するためにリコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いる。ｆｒｔ−ｃａｍ−ｆｒｔ−ＰｆｎｒＳ−ｓｂｍ、ｙｇｆＤ、ｙｇｆＧ、ｙｇｆＨ構築物は、Ｎｉｓｓｌｅの内因性短縮ＳＢＭの位置に挿入される。次に、構築物を大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに形質転換し、実質的に上記の通りに、プロピオナート産生について試験する。
例２４．プロピオナート生成のためのクロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来アクリラート経路の評価
【０６８２】
大腸菌におけるプロピオナート生成への適応について、クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のアクリラート経路の評価を行う。大腸菌用にコドン最適化された構築物（Ｐｔｅｔ−ｐｃｔ−ｌｃｄＡＢＣ−ａｃｒＡＢＣ）は、Ｇｅｎｅｗｉｚ社によって合成され、高コピープラスミド（Ｌｏｇｉｃ０５１）中に配置されている。さらに、サイドバイサイド試験のため、ａｃｒＡＢＣ遺伝子（当該経路の律速段階であり得る）をロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のａｃｕＩ遺伝子で置換した別の構築物（Ｐｔｅｔ−ａｃｕＩ−ｐｃｔ−ｌｃｄＡＢＣ）を作製する。次いで、前記構築物をＢＷ２５１１３に形質転換し、実施例２４で上記したＢＷ５１１３株と比較して、プロピオナート生成能について評価する。プロピオナートの測定は実施例２７に記載の要領で行った。
【０６８３】
【表５８−１】
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【表５８−２】
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【表５８−３】
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【表５８−４】
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【表５８−５】
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【表５８−６】
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【表５８−７】
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【表５８−８】
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【表５８−９】
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【表５８−１０】
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【表５８−１１】
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【表５８−１２】
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【表５８−１３】
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【表５８−１４】
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【表５８−１５】
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【表５８−１６】
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【表５８−１７】
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【０６８４】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１８５、１８６、１８７もしくは１８８のＤＮＡ配列またはその機能的断片のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。
例２５．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるプロピオナート定量
サンプル調整
【０６８５】
最初に、１０００、５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬのプロピオン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）標準液を、水を用いて新たに調製した。次いで、Ｖ底ポリプロピレン９６ウェルプレートに２５μＬのサンプル（細菌上清および標準液）をピペットで入れ、最終濃度１０μｇ／ｍＬのブチラート−ｄ５（ＣＤＮ同位体）を内部標準として含む６０％ＡＣＮ（各反応につき、４５μＬのＡＣＮ  ＋３０μＬの水）を７５μＬずつ各試料に加えた。プレートをヒートシールし、十分に混合してから、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。丸底９６ウェルポリプロピレンプレート中で、１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．５，２０ｍＭ  ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）、および２０ｍＭ  ＴＦＥＡ（２，２，２−トリフルオロエチルアミン）を含む緩衝液９５μＬに、５μＬの希釈サンプルを加えた。プレートを再度ヒートシールし、十分に混合してから、サンプルを室温にて１時間インキュベートした。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
【０６８６】
プロピオナートを、Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用いるタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。ＨＰＬＣの詳細を表６０および表６１に記載する。タンデム質量分析の詳細を表６２に記載する。
【０６８７】
【表５９】
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【０６８８】
【表６０】
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【０６８９】
【表６１】
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例２６．分泌のための治療分子を過剰生産するための構築物の作製
【０６９０】
抗炎症性または消化管バリアエンハンサーポリペプチド、例えばＧＬＰ２、ＩＬ−２２、ＩＬ−１０（ウイルスまたはヒト）を分泌可能な株を作製するために、様々な分泌戦略を用いて、いくつかの構築物の設計を行う。例示的な構築物の構成を図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、ならびに図３１Ａおよび図３１Ｂ、図３２Ａ、図３２Ｂ、図３２Ｃ、図３２Ｄ、図３２Ｅに示す。様々なＧＬＰ２、ＩＬ−２２、ＩＬ−１０（ウイルスまたはヒト）構築物を合成し、大腸菌の形質転換のためにベクターｐＢＲ３２２にクローニングする。いくつかの実施形態では、エフェクター分子をコードする構築物は、ゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、エフェクター分子をコードする構築物は、プラスミド、例えば、中コピープラスミド上にある。表６３は、当該構築物において使用される例示的なポリペプチドコード配列の一覧である。
【０６９１】
【表６２−１】
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【表６２−２】
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【表６２−３】
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【表６２−４】
2018532412.tif 000183
【０６９２】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７もしくは配列番号１９８またはそれらの機能的断片のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。
【０６９３】
拡散性外膜（ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）法またはｆｌｉＣ法の使用時に、Ｎ末端に付加することができる例示的な分泌タグを、表６４に列挙する。
【０６９４】
【表６３−１】
2018532412.tif 000184
【表６３−２】
2018532412.tif 000185
【表６３−３】
2018532412.tif 000186
【０６９５】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、および配列番号２１７のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な核酸配列を有する。表６５に、例示的なプロモーター配列およびその他諸々の構築物配列を列挙する。
【０６９６】
【表６４−１】
2018532412.tif 000187
【表６４−２】
2018532412.tif 000188
【表６４−３】
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【０６９７】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、および配列番号２２３のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表６６は、例示的な分泌構築物を列挙する。
【０６９８】
【表６５−１】
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【表６５−２】
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【表６５−３】
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【表６５−４】
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【表６５−５】
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【０６９９】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表６７は、例示的な分泌構築物を列挙する。
【０７００】
【表６６−１】
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【表６６−２】
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【表６６−３】
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【表６６−４】
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【０７０１】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８および配列番号２３９のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
例２７．  ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０の細菌分泌
【０７０２】
操作された細菌が発現するヒトＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０が分泌されるかどうかを決定するために、様々なｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０構築物／株を含む操作株の細菌上清中のＩＬ−１０濃度の測定を行った（ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０構築物／株のコンポーネントおよび配列については、表６３、表６４、表６５、表６６、表６７を参照）。
【０７０３】
種々のｔｅｔ誘導性構築物または天然ｆｌｉＣプロモーター下の構築物を有する大腸菌ニッスルを、ＬＢ培地中で一晩増殖させた。培養液をＬＢで１：２００希釈し、２時間振とう培養（２００ｒｐｍ）した。培養物を光学密度０．５に希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加して、ｈＩＬ−１０の発現を誘導した。ｆｌｉＣ構築物が含まれる培養物には、テトラサイクリンを添加しなかった。誘導から１２時間後に、細胞を遠心分離により沈殿させ、上清を回収した。無細胞培地を作製するために、清澄化した上清をさらに０．２２ミクロンのフィルターで濾過して、残っている細菌を完全に除去し、氷上に置いた。さらに、細胞内組換えタンパク質産生を検出するために、沈殿させた細菌を洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁して、元の培養条件と比較して溶解物を１０倍濃縮した。室温で１０分間インキュベートした後、不溶性残渣を４℃、１２，０００ｒｃｆ、２０分間の遠心分離により沈殿させ、さらに処理するまで氷上に置く。
【０７０４】
無細胞培地および細菌細胞抽出液中のｈＩＬ−１０の濃度を、ｈＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＹ２１７Ｂ）によって、製造業者の指示に従って測定した。同様に、ｖＩＬ−１０の濃度を決定するために、市販の組換えｖＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、９１５−ＶＬ−０１０）を用いて、超高感度ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ、４５−Ｉ１０ＨＵＵ−Ｅ０１）を利用した。全てのサンプルについて、実験を３回繰り返し、検量線を用いてＩＬ−１０の分泌レベルを算出した。検量線は、ヒトおよびウイルスの組換えタンパク質の両方を用いて作成した。ネガティブコントロールとして野生型ニッスルがＥＬＩＳＡに含まれ、シグナルは観察されなかった。表６８および表６９は、上清中および細胞内表６８および細胞外表６９において測定されたｈＩＬ１０およびｖＩＬ−１０のレベルをまとめたものである。データは、ｖＩＬ−１０およびｈＩＬ−１０のいずれもが種々の細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
【０７０５】
【表６７】
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【０７０６】
【表６８】
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共培養実験
【０７０７】
表６８および表６９に示す遺伝学的に操作された細菌が発現するｈＩＬ−１０およびウイルスＩＬ−１０が生物学的に機能的であるかどうかを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行う。当該実験では、分泌されたヒトＩＬ−１０またはウイルスＩＬ−１０を含む細菌上清を、Ｒａｊｉ細胞（造血細胞株）およびＪ７７４ａ１細胞（マクロファージ細胞株）の増殖培地に添加する。ＩＬ−１０は、これらの細胞において、ＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導することが知られている。したがって、細菌が分泌したＩＬ−１０の機能活性は、ＲａｊｉおよびＪ７７４ａ１細胞において、当該ＩＬ−１０がＳＴＡＴ３をリン酸化する能力によって評価される。
【０７０８】
５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベーター内にて、１０％ウシ胎児血清を補充した１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃で、Ｒａｊｉ細胞を増殖させる。細菌上清で処理する前に、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（１ｅ６／２４ウェル）を一晩血清飢餓状態にする。ＬＢで希釈した組換えヒトＩＬ−１０または野生型ニッスルもしくは操作細菌の清澄化上清のいずれかを、３０分間、細胞に滴定する。細胞を採取し、溶解バッファーに再懸濁してから、ホスホ−ＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ  ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を、製造業者の指示に従って、全試料について３回繰り返して行う。ＰＢＳ処理細胞およびＰＢＳをネガティブコントロールとして加える。直線性を示すためにサンプルの希釈が含まれる。
競合実験
【０７０９】
特異性のさらなるコントロールとして、競合アッセイを行う。一定濃度のｒｈＩＬ２２（データは示さない）またはヒトＩＬ−２２もしくはウイルスＩＬ−２２を発現する操作細菌上清のいずれかに、抗ＩＬ１０抗体を滴定して、１５分間プレインキュベートする。次に、上清／ｒｈＩＬ２溶液を血清飢餓状態のＲａｊｉ細胞（１ｅ６／ウェル）に添加し、細胞を３０分間インキュベートした後、上記のようにｐＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡを行う。
【０７１０】
他の実施態様では、Ｊ７７４ａ１細胞で同様の研究が行われる。
例２７．ＧＬＰ−２の細菌分泌
【０７１１】
操作された細菌によって発現されたヒトＧＬＰ−２が分泌されるか否かを決定するために、ＧＬＰ−２構築物／株を含む２つの操作された株からの細菌上清中のＧＬＰ−２の濃度を測定した。第１の株は、ＰＡＬに欠失を含み、テトラサイクリン誘導性プロモーターに由来するＯｍｐＦ分泌タグを有するＧＬＰ−２を発現するプラスミドを含み、第２の株は、同じＰＡＬ欠失およびＧＬＰ−２を発現する同じプラスミドを含み、ｄｅｇＰ  （表７０参照）。
【０７１２】
種々のｔｅｔ誘導性構築物または天然ｆｌｉＣプロモーター下の構築物を含有する大腸菌ニッスルをＬＢ培地中で一晩増殖させた。培養液をＬＢで１：２００希釈し、２時間振とう培養（２００ｒｐｍ）した。培養液を光学密度０．５に希釈してから、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養液に添加して、ｈＩＬ−１０の発現を誘導した。ｆｌｉＣ構築物を含む培養液にはテトラサイクリンを添加しなかった。誘導から１２時間後に、細胞を遠心分離により沈殿させ、上清を回収した。無細胞培地を作製するために、清澄化した上清をさらに０．２２ミクロンのフィルターで濾過して、残存する細菌を完全に除去し、氷上に置いた。さらに、細胞内の組換えタンパク質産生を検出するために、沈殿した細菌を洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁して、元の培養条件と比較して溶解物を１０倍濃縮した。室温で１０分間インキュベートした後、不溶性残渣を４℃、１２，０００ｒｃｆで２０分間の遠心で沈殿させ、さらに処理するまで氷上に置く。
【０７１３】
無細胞培地および細菌細胞抽出液中のＧＬＰ−２の濃度を、ヒトＧＬＰ２  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＩＡ）（ＬＳＢｉｏ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。全ての試料について実験を３回繰り返し、検量線を用いてＧＬＰ−２の分泌レベルを算出した。検量線は、組換えＧＬＰ−２を用いて作成した。ＥＬＩＳＡには野生型ニッスルがネガティブコントロールとして含まれ、シグナルは観察されなかった。表７０に示すように、ｄｅｇＰ、すなわちペリプラズムプロテアーゼの欠失により、３倍を超える分泌レベルの改善がみられた。
【表６９】
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共培養実験
【０７１４】
遺伝学的に操作された細菌が発現するｈＧＬＰ−２が生物学的に機能的であるかどうかを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行う。当該実験では、分泌されたヒトＧＬＰ−２を含む細菌上清（上で示した両方の株に由来する）を、Ｃａｃｏ−２細胞およびＣＣＤ−１８Ｃｏ細胞の増殖培地に添加する。Ｃａｃｏ−２細胞株は、不均一性ヒト上皮性結腸直腸腺癌細胞の継代細胞である。例えば、Ｊａｓｌｅｅｎら（Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ．２００２年５月；４７（５）：１１３５−４０頁）に記載されているように、ＧＬＰ−２は、Ｃａｃｏ−２およびＴ８４細胞の増殖および［３Ｈ］チミジンの取り込みを刺激する。さらに、ＧＬＰ−２は、Ｃａｃｏ−２およびＴ８４細胞のＶＥＧＦＡ分泌を刺激する（例えば、Ｂｕｌｕｔら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００８年１月１４日；５７８（２−３）：２７９−８５頁を参照）。
【０７１５】
したがって、細菌が分泌したＧＬＰ−２の機能活性は、当該ＧＬＰ−２が増殖およびＶＥＧＦ分泌を誘導する能力によって評価される。
【０７１６】
５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベーター内にて、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）中、３７℃で、Ｃａｃｏ−２を増殖させる。細菌上清による処理前に、Ｃａｃｏ−２細胞（１ｅ６／２４ウェル）を一晩血清飢餓状態にする。ＬＢで希釈した組換えヒトＧＬＰ−２（５０ｎＭおよび２５０ｎＭ）または野生型ニッスルもしくは操作細菌の清澄化上清のいずれかを、規定の時間、細胞に滴定する。
【０７１７】
細胞増殖アッセイのために、細胞を採取し、溶解緩衝液中に再懸濁する。インキュベーションの１２、２４、４８および７２時間後に細胞をアッセイする。細胞増殖は、細胞増殖アッセイキットを使用して、製造業者の指示に従って測定する（例えば、細胞生存率は、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）−アッセイ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ−ａｓｓａｙ）によって評価した）。
【０７１８】
ＶＥＦＡ分泌の測定のために、細胞を採取し、溶解緩衝液に再懸濁し、ＥＬＩＳＡによって培地中のＧＬＰ−２濃度を決定する。
【０７１９】
ネガティブコントロールとして、ＰＢＳ処理細胞およびＰＢＳを追加する。線形性を示すために、サンプルの希釈が含まれる。
競合実験
【０７２０】
特異性のさらなるコントロールとして、競合アッセイを行う。一定濃度の組換えＧＬＰ−２または操作細菌の上清のいずれかに、抗ＧＬＰ−２抗体を滴定して、１５分間プレインキュベートする。次に、上清／ｒｈＩＬ２溶液を血清飢餓状態のＣａｃ−２細胞（１ｅ６／ウェル）に添加し、細胞を３０分間インキュベートした後、上記のようにＶＥＧＦＡ  ＥＬＩＳＡを行う。
例２８．ＩＬ−２２の細菌分泌
【０７２１】
操作細菌が発現したヒトＩＬ−２２が分泌されるか否かを決定するために、ＩＬ−２２構築物／株を含む２つの操作菌株について、細菌上清中のＩＬ−２２濃度を測定した。第１の株は、ＰＡＬ欠失およびテトラサイクリン誘導性プロモーターからＯｍｐＦ分泌タグ付きＩＬ−２２を発現するプラスミドを有し、第２の株は、第１の株と同一のＰＡＬ欠失およびＩＬ−２２発現プラスミドを有し、さらにｄｅｇＰ欠失を有する（表７１）。
【０７２２】
種々のｔｅｔ誘導性構築物または天然ｆｌｉＣプロモーター下の構築物を有する大腸菌ニッスルを、ＬＢ培地中で一晩増殖させた。培養液をＬＢで１：２００に希釈し、２時間振とう培養（２００ｒｐｍ）した。培養液を光学密度０．５に希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加して、ｈＩＬ−１０の発現を誘導した。ｆｌｉＣ構築物が含まれる培養物には、テトラサイクリンを添加しなかった。誘導から１２時間後に細胞を遠心分離により沈殿させ、上清を回収した。無細胞培地を作製するために、清澄化した上清をさらに０．２２ミクロンのフィルターで濾過して、残っている細菌を完全に除去してから、氷上に置いた。さらに、細胞内組換えタンパク質産生を検出するために、沈殿させた細菌を洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁して、元の培養条件と比較して溶解物を１０倍濃縮した。室温で１０分間インキュベートした後、不溶性残渣を４℃、１２，０００ｒｃｆ、２０分間の遠心分離により沈殿させ、さらに処理するまで氷上に置く。
【０７２３】
無細胞培地および細菌細胞抽出液中のＩＬ−２２の濃度を、ｈＩＬ−２２  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ＤＹ７８２）ｈＩＬ−２２用ＥＬＩＳＡ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。全ての試料について実験を３回繰り返し、検量線を用いてＩＬ−２２の分泌レベルを算出した。検量線は、組換えＩＬ−２２を用いて作成した。ＥＬＩＳＡには野生型ニッスルがネガティブコントロールとして含まれ、シグナルは観察されなかった。表７１は、上清中のＩＬ−２２レベルの測定結果をまとめたものである。データは、両方のｈＩＬ−２２が種々の細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
【表７０−１】
2018532412.tif 000202
【表７０−２】
2018532412.tif 000203
例２９．ＩＬ−２２の細菌分泌および機能アッセイ
細菌上清の生成およびＩＬ−２２濃度の測定
【０７２４】
操作された細菌によって発現されたヒトＩＬ−２２が分泌されるか否かを決定するために、細菌上清中のＩＬ−２２の濃度を測定した。
【０７２５】
ｔｅｔ−誘導性組み込み構築物（ＰｔｅｔからＰｈｏＡ−ＩＬ２２を発現するｄｅｌｔａ  ｐａｌ：：ＣｍＲ）を有する大腸菌ニッスルを、ＬＢ培地中で一晩増殖させた。培養液をＬＢで１：２００に希釈し、２時間振とう培養（２００ｒｐｍ）した。培養液を光学密度０．５に希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加して、ｈＩＬ−２２の発現を誘導した。誘導から１２時間後に、細胞を遠心分離によって沈殿させ、上清を回収した。無細胞培地を作製するために、上清を遠心分離し、０．２２ミクロンのフィルターで濾過して、残っている細菌を完全に除去した。
【０７２６】
無細胞培地中のＩＬ−２２の濃度を、ｈＩＬ−２２  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ＤＹ７８２）ｈＩＬ−２２用ＥＬＩＳＡ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。全ての試料について実験を３回繰り返し、検量線を用いてＩＬ−２２の分泌レベルを算出した。さらに、サンプルを希釈して、マトリクス効果がないことを確認し、直線性を実証した。ＥＬＩＳＡには野生型ニッスルがネガティブコントロールとして含まれ、シグナルは観察されなかった。ＰＡＬ欠失およびｐｈｏＡ分泌タグ付きｈＩＬ−２２をコードする組み込み構築物を有する操作細菌は、１９９ｎｇ／ｍｌ（上清１ｍｌ中に１９９ｎｇのｈＩＬ−２２）のＩＬ−２２を分泌していると決定された。
共培養実験
【０７２７】
遺伝学的に操作された細菌が発現するｈＩＬ−２２が生物学的に機能的であるかどうかを決定するために、分泌されたヒトＩＬ−２２を含有する細菌上清を哺乳動物結腸上皮細胞の増殖培地に添加するインビトロ実験を行った。ＩＬ−２２は、Ｃｏｌｏ２０５細胞において、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導することが知られている（例えば、Ｎａｇａｌａｋｓｈｍｉら、「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２２  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＳＴＡＴ３  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＩＬ−１０  ｂｙ  ｃｏｌｏｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４年５月；４（５）：６７９−９１頁を参照）。したがって、細菌が分泌したＩＬ−２２の機能活性は、Ｃｏｌｏ２０５細胞において、当該ＩＬ−２２がＳＴＡＴ３をリン酸化する能力によって評価した。
【０７２８】
５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベーター内にて、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地中、３７℃で、Ｃｏｌｏ２０５細胞を増殖させた。細菌上清で処理する前に、Ｃｏｌｏ２０５（１ｅ６／２４ウェル）を一晩血清飢餓状態にした。ＬＢで希釈した組換えヒトＩＬ−２２または野生型ニッスルもしくは操作細菌の清澄化上清のいずれかを、３０分間、細胞に滴定した。細胞を採取し、溶解バッファーに再懸濁してから、ホスホ−ＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ  ｐＳＴＡＴ３  （Ｔｙｒ７０５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を、製造業者の指示に従って、全試料について３回繰り返して行った。ＰＢＳ処理細胞およびＰＢＳをネガティブコントロールとして加えた。直線性を示すためにサンプルの希釈を含めた。野生型ニッスルについてシグナルは観察されなかった。ＰＡＬ欠失およびｐｈｏＡ分泌タグ付きｈＩＬ−２２をコードする組み込み構築物を有する操作菌株の結果を図３３Ａに示してあり、操作細菌が分泌したｈＩＬ−２２が機能的に活性であることが実証されている。
競合実験
【０７２９】
特異性に対する追加のコントロールとして、競合アッセイを行った。一定濃度の組換えｒｈＩＬ２２（データは示さない）または操作細菌の上清のいずれかに、抗ＩＬ−２２抗体（ＭＡＢ７８２１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を滴定し、１５分間プレインキュベートした。次に、上清／ｒｈＩＬ２溶液を血清飢餓状態のＣｏｌｏ２０５細胞（１ｅ６／ウェル）に添加し、細胞を３０分間インキュベートした後、上記のようにｐＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡを行った。図３３Ｂに示すように、分泌ＩＬ−２２によって誘導されたホスホ−Ｓｔａｔ３シグナルは、ｈＩＬ−２２抗体ＭＡＢ７８２１によって競合される。
例３０．インドールプロピオン酸菌株の生成とインビトロでのインドール生産
【０７３０】
大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおいてインドールプロピオン酸（ＩＰＡ）の誘導性産生を促進するために、トリプトファンからのインドールプロピオン酸の産生を可能にする６つの遺伝子ならびに転写および翻訳エレメントを合成し  （Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）  、ｔｅｔ誘導性プロモーター下のベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。他の実施態様では、ＩＰＡ合成カセットは、ＦＮＲ、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモーター（例は、本明細書に記載のもの）、または健常な腸または罹患した腸の状態（例は、炎症状態）によって誘導される他のプロモーターの制御下に置かれる。ＩＰＡ合成遺伝子の効率的な翻訳のために、カセット中の各合成遺伝子は、Ｔ７プロモーター／翻訳開始部位に由来する１５塩基対のリボソーム結合部位によって分離される。
【０７３１】
ＩＰＡ合成カセットには、ＴｒｐＤＨ（ノストク・プンクチフォルムＮＩＥＳ−２１０８由来トリプトファンデヒドロゲナーゼ）、ＦｌｄＨ１／ＦｌｄＨ２（クロストリジウム・スポロゲネス由来インドール−３−ラクタートデヒドロゲナーゼ）、ＦｌｄＡ（クロストリジウム・スポロゲネス由来インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−ラクタートＣｏＡトランスフェラーゼ）、ＦｌｄＢＣ（クロストリジウム・スポロゲネス由来インドール−３−ラクタートデヒドラターゼ）、ＦｌｄＤ（クロストリジウム・スポロゲネス由来インドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ）、およびＡｃｕＩ（ロドバクター・スフェロイデス由来アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０７３２】
上記のｔｅｔ誘導性ＩＰＡ構築物を、本明細書に記載のように大腸菌ニッスルに形質転換し、ＩＰＡ生成の評価を行う。特定の実施形態では、記載のＩＰＡ合成カセットを含有する当該大腸菌ニッスル株は、トリプトファン合成カセットをさらに有する。特定の実施形態では、当該菌株は、より高いトリプトファン（Ｔｒｐ）生成を達成するために、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥのフィードバック抵抗型を有する。特定の実施形態では、さらに、ｔｎａＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼ）が欠失される。
【０７３３】
全てのインキュベーションを３７℃で行う。ＩＰＡ生合成構築物のみ、あるいはトリプトファン生合成系構築物とフィードバック抵抗性ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥと組み合わせて形質転換した大腸菌ニッスルをＬＢで一晩培養し、０．５％グルコースを含むＭ９最少培地１０ｍＬに当該培養液を１：１００で継代して、２時間振とう培養（２００ｒｐｍ）する。その時点で、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養液に添加して、ＩＰＡ生合成構築物およびトリプトファン生合成構築物の発現を誘導する。誘導から２時間後に、細胞を遠心分離によって沈殿させ、上清を捨てて、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に再懸濁する。次いで、所定時間（例えば、０時間から２４時間まで）に培養液上清の分析を行い、ＩＰＡレベルを評価する。
【０７３４】
ＩＰＡ生成の窒素依存性誘導を評価するために、いずれもＲＮＳプロモーター（例えば、ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ＩＰＡ生合成構築物）によって駆動されるＩＰＡおよびトリプトファンカセットを含む大腸菌ニッスル株においても、ＩＰＡ生成を評価する。一晩後の細菌培養液を新鮮なＬＢに１：１００で希釈し、１．５時間増殖させて対数期初期に入るようにする。この時点で、長半減期の一酸化窒素供与体（ＤＥＴＡ−ＮＯ；ジエチレントリアミン−一酸化窒素付加体）を最終濃度０．３ｍＭで培養液に添加して、プラスミドからの発現を誘導する。誘導から２時間後に、細胞を遠心分離により沈殿させ、上清を捨て、０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に細胞を再懸濁する。次いで、所定時間（図３３に示すように、０時間から２４時間まで）に培養液上清の分析を行い、ＩＰＡレベルを評価する。
【０７３５】
別の実施形態では、ＩＰＡおよびトリプトファンカセットを含有する大腸菌ニッスル株について、ＩＰＡ生成の評価も行う。当該ＩＰＡおよびトリプトファンカセットは、いずれも低酸素誘導性ＦＮＲプロモーター（例えば、ＦＮＲＳ）または反応性酸素制御性ＯｘｙＳプロモーターによって駆動される。
例３１．ＦＮＲプロモーター活性
【０７３６】
種々のＦＮＲプロモーターのプロモーター活性を測定するために、ｌａｃＺ遺伝子ならびに転写要素および翻訳要素を合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。ｌａｃＺ遺伝子は、表２１に開示される例示的なＦＮＲプロモーター配列のいずれかの制御下に置いた。当該構築物のヌクレオチド配列を、表７２〜表７６（配列番号２４０〜２４４）に示す。しかし、前記のように、プロモーター活性の分析をするために、ｌａｃＺ遺伝子を他の誘導性プロモーターによって駆動させることもでき、また、プロモーター活性を読み取るのに、ｌａｃＺ遺伝子の代わりに他の遺伝子を用いることもできる。例示的な結果を図３９に示す。
【０７３７】
表７２は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的なＦＮＲプロモーターＰｆｎｒ１を含む、例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２４０）。当該構築物は、ニッスルｎｉｒＢ１遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合体を含み、当該翻訳融合体はインフレームでｌａｃＺコード領域の第８コドンに融合される。Ｐｆｎｒ１配列は太字の小文字で、プロモーター内の予想されるリボソーム結合部位には下線が付されている。ｌａｃＺ配列は下線付きの大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いるクローニング部位を通常の大文字で示す。
【０７３８】
表７３は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的なＦＮＲプロモーターＰｆｎｒ２を含む、例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す（列番号２４１）。当該構築物は、ニッスルｙｄｆＺ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合体（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ）を含み、当該翻訳融合体はｌａｃＺコード領域の第８コドンにインフレームで融合されている。Ｐｆｎｒ２配列は太字の小文字で、プロモーター内の予想されるリボソーム結合部位には下線が付されている。ｌａｃＺ配列は下線付きの大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いるクローニング部位を通常の大文字で示す。
【０７３９】
表７４は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的なＦＮＲプロモーターＰｆｎｒ３を含む、例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す（列番号２４２）。当該構築物は、ニッスルｎｉｒＢ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の転写融合体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ）を含み、当該転写融合体は強いリボソーム結合部位に融合されたプロモーター領域のみを使用する。Ｐｆｎｒ３配列は太字の小文字で、プロモーター内の予想されるリボソーム結合部位には下線が付されている。ｌａｃＺ配列は下線付きの大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いるクローニング部位を通常の大文字で示す。
【０７４０】
表７５は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的なＦＮＲプロモーターＰｆｎｒ４を含む、例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す（列番号２４３）。当該構築物は、ニッスルのｙｄｆＺ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の転写融合体を含む。Ｐｆｎｒ４配列は太字の小文字で、プロモーター内の予想されるリボソーム結合部位には下線が付されている。ｌａｃＺ配列は下線付きの大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いるクローニング部位を通常の大文字で示す。
【０７４１】
表７６は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的なＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒＳを含む、例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す（列番号２４４）。当該構築物は、嫌気的に誘導されたスモールＲＮＡ遺伝子ｆｎｒＳ１とｌａｃＺの転写融合体を含む。Ｐｆｎｒｓ配列は太字の小文字で、プロモーター内の予想されるリボソーム結合部位には下線が付されている。ｌａｃＺ配列は下線付きの大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物の合成に用いるクローニング部位を通常の大文字で示す。
【表７１−１】
2018532412.tif 000204
【表７１−２】
2018532412.tif 000205
【０７４２】
【表７２−１】
2018532412.tif 000206
【表７２−２】
2018532412.tif 000207
【０７４３】
【表７３−１】
2018532412.tif 000208
【表７３−２】
2018532412.tif 000209
【０７４４】
【表７４−１】
2018532412.tif 000210
【表７４−２】
2018532412.tif 000211
【０７４５】
【表７５−１】
2018532412.tif 000212
【表７５−２】
2018532412.tif 000213
例３２．一酸化窒素誘導性レポーター構築物
【０７４６】
ＡＴＣ誘導性レポーター構築物および一酸化窒素誘導性レポーター構築物を合成した（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。対応する誘導因子によって誘導されると、当該構築物はＧＦＰを発現し、プレートリーダーで３９５／５０９ｎｍの励起／発光で蛍光をモニターすることによって検出される。コントロール、ＡＴＣ−誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰレポーター構築物、または酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰレポーター構築物のいずれかを含むプラスミドを含有するニッスル細胞を、最初に対数期初期（ＯＤ６００が約０．４〜０．６）まで増殖させてから、９６穴のマイクロタイタープレートに移した。当該プレートにはＬＢおよび誘導因子（ＡＴＣ、または長半減期のＮＯドナーであるＤＥＴＡ−ＮＯ（Ｓｉｇｍａ））が入っており、誘導因子濃度は半分になっている。ＡＴＣおよびＮＯのいずれも、広範囲の濃度にわたって、前記それぞれの構築物におけるＧＦＰ発現を誘導可能であった（図２８）。プロモーター活性は相対蛍光単位で表している。一酸化窒素誘導性レポーター構築物の例示的な配列を示す。ｂｓｒＲ配列は太字で表示されている。ｇｆｐ配列には下線が付されている。ＰｎｓｒＲ（ＮＯ調節プロモーターおよびＲＢＳ）はイタリック体である。構成的プロモーターおよびＲＢＳは四角で囲まれている。
【０７４７】
【表７６】
2018532412.tif 000214
【０７４８】
前記構築物が対応する誘導因子によって誘導されると、ＧＦＰが高レベルで発現し、プレートリーダーで３９５／５０９ｎｍの励起／発光で蛍光をモニターすることによって検出される。ＡＴＣ誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰレポーター構築物または一酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰレポーター構築物のいずれかを含むプラスミドを含有するニッスル細胞を、初めに対数期初期（ＯＤ６００が約０．４〜０．６）まで増殖させてから、９６穴のマイクロタイタープレートに移した。当該プレートにはＬＢおよび誘導因子（ＡＴＣ、または長半減期のＮＯドナーであるＤＥＴＡ−ＮＯ（Ｓｉｇｍａ））が入っており、誘導因子は増殖時の半分になっている。ＡＴＣおよびＮＯのいずれもが、広範囲の濃度にわたって、前記それぞれの構築物におけるＧＦＰの発現を誘導可能であることが観察された。プロモーター活性を相対蛍光単位として表す。
【０７４９】
図６３Ｄ  ＮＯ−ＧＦＰ構築物（ドットブロット）一酸化窒素誘導性ＮｓｒＲ−ＧＦＰレポーター融合物を含有する大腸菌ニッスルを、カナマイシンを補充したＬＢ中で一晩増殖させた。次いで、細菌を、カナマイシンを含むＬＢで１：１００希釈し、光学密度０．４〜０．５まで増殖させ、次いで、遠心分離によりペレット化した。当該細菌をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、１００マイクロリットルを強制経口投与によりマウスに投与した。細菌の強制経口投与前に７日間、飲料水に２〜３％デキストラン硫酸ナトリウムを添加することにより、マウスにＩＢＤを誘導する。強制経口投与後４時間の時点でマウスを屠殺し、結腸試料から細菌を回収した。結腸の内容物をＳＤＳ中で煮沸し、可溶性画分を用いて、ＧＦＰ検出（ＮｓｒＲ調節プロモーターの誘導）のためにドットブロットを行った。ＧＦＰの検出は、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）に結合した抗ＧＦＰ抗体の結合により行った。Ｐｉｅｒｃｅ社製の化学発光検出キットを用いて検出を可視化した。図６３Ｄでは、ＮｓｒＲ調節プロモーターがＤＳＳ処理マウスにおいて誘導されることが示されているが、未処理マウスにおいて誘導されることは示されていない。このことは、ＮＯに応答するＮｓｒＲの役割、したがって炎症と一致する。
【０７５０】
構成的プロモーター制御下のＮｓｒＲおよびＮｓｒＲ誘導性プロモーター制御下のレポーター遺伝子ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）を発現するプラスミドを有する細菌を、カナマイシンを補充したＬＢ中で一晩増殖させた。次いで、細菌を、カナマイシンを含むＬＢで１：１００希釈し、光学密度約０．４〜０．５まで増殖させてから、遠心分離によりペレット化する。細菌をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、１００マイクロリットルを強制経口投与によりマウスに投与する。細菌の強制経口投与前に７日間、飲料水に２〜３％デキストラン硫酸ナトリウムを添加することにより、マウスにＩＢＤを誘導する。強制経口投与後４時間の時点でマウスを屠殺し、結腸試料から細菌を回収した。結腸の内容物をＳＤＳ中で煮沸し、可溶性画分を用いて、ＧＦＰ検出（ＮｓｒＲ調節プロモーターの誘導）のためにドットブロットを行った。ＧＦＰの検出は、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）に結合した抗ＧＦＰ抗体の結合により行った。Ｐｉｅｒｃｅ社製の化学発光検出キットを用いて検出を可視化した。図１５は、ＮｓｒＲ調節プロモーターがＤＳＳ処理マウスでは誘導されるが、未処理マウスでは誘導されないことを示している。
例３３．ΔＴｈｙＡの作製
【０７５１】
栄養要求性突然変異は、細菌が必須栄養素を生成するために必要な遺伝子（複数可）を欠いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下では細菌を死滅させる。栄養要求性の改変を有する遺伝学的に操作された細菌を作製するために、オリゴヌクレオチド合成に必須の遺伝子であるｔｈｙＡを欠失させた。大腸菌ニッスルにおけるｔｈｙＡの欠失は、チミジンが補給されない限り、ＬＢプレート上でコロニーを形成することができない菌株を生じさせる。
【０７５２】
ｔｈｙＡ：：ｃａｍ  ＰＣＲフラグメントを、以下のように３ラウンドのＰＣＲを用いて増幅した。１００μＭ度で使用したプライマーの配列を表７８に示す。
【表７７】
2018532412.tif 000215
【０７５３】
第１のＰＣＲラウンドでは、鋳型として１ｎｇのｐＫＤ３、２５μｌの２ｘｐｈｕｓｉｏｎ、０．２μｌのプライマーＳＲ３６およびＳＲ３８、ならびに０、０．２、０．４もしくは０．６μｌのＤＭＳＯを含む４×５０μｌのＰＣＲ反応物を、ヌクレアーゼ不含有水を用いて容量５０μｌとし、以下のサイクル条件下で増幅した。
【０７５４】
ステップ１：９８℃３０秒間
【０７５５】
ステップ２：９８℃、１０秒間
【０７５６】
ステップ３：５５℃、１５秒間
【０７５７】
ステップ４：７２℃、２０秒間
【０７５８】
ステップ２−４を３０サイクル繰り返す。
【０７５９】
ステップ５：７２℃、５分間
【０７６０】
続いて、５μｌの各ＰＣＲ反応をアガロースゲル上で行い、適切なサイズのＰＣＲ産物を確認した。ＰＣＲ産物は、ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して製造者の指示に従って残りのＰＣＲ反応から精製し、３０μｌのヌクレアーゼを含まない水で溶出させた。
【０７６１】
第２のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド１からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、０．２μｌのプライマーＳＲ３３およびＳＲ３４を除き、上で述べた４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。サイクル条件は、第１のＰＣＲ反応について上述したのと同じであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにかけて、増幅を確認し、精製し、上述のように３０μｌで溶出した。
【０７６２】
第３のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド２からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、プライマーＳＲ４３およびＳＲ４４を除いて、上で述べた４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。サイクル条件は、ラウンド１およびラウンド２について記載したものと同じであった。上述のように増幅を確認し、ＰＣＲ産物を精製し、溶出した。濃度および純度は、分光光度計を用いて測定した。ｔｈｙＡの上流に相同の９２ｂｐ、ｆｒｔ部位により隣接されたクロラムフェニコールカセットおよびｔｈｙＡ遺伝子の下流に相同の９８ｂｐを含む、得られた線状ＤＮＡ断片を組換えのために増殖させたｐＫＤ４６を有する大腸菌ニッスル１９１７株に形質転換させた。エレクトロポレーションの後、３ｍＭチミジンを含む１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、細胞を振盪しながら３７℃で２時間回復させた。次いで細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ  ｔｈｙおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上に広げた。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。ＬＢプレート上に出現したコロニーを再度ストリークした。＋ｃａｍ  ２０μｇ／ｍｌ＋または−ｔｈｙ  ３ｍＭ（ｔｈｙＡ栄養要求体はｔｈｙ  ３ｍＭを補充した培地中でのみ増殖する）。
【０７６３】
次に、ｐＣＰ２０形質転換によって抗生物質耐性を除去した。ｐＣＰ２０は、酵母Ｆｌｐ組換え遺伝子、ＦＬＰ、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子および温度感受性複製を有する。細胞を選択抗生物質を含むＬＢ培地中でＯＤ６００＝０．４〜０．６となるまで３７℃で増殖させた。１ｍＬの細胞を次のように洗浄した。細胞を１６，０００ｘｇで１分間ペレット化した。上清を捨て、ペレットを１ｍＬ氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。この洗浄ステップを３回反復した。最終ペレットを７０μｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。次に、細胞を１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡとともにエレクトロポレートし、３ｍＭチミジンを添加した１ｍＬのＳＯＣを直ちにキュベットに加えた。細胞を再懸濁し、培養管に移し、３０℃で１時間増殖させた。次に、細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ  ｔｈｙおよび１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３０℃で１６〜２４時間増殖させた。次に、形質転換細胞を４２℃で非選択的（抗生物質なし）にコロニー精製した。
【０７６４】
コロニー精製形質転換細胞を試験するために、コロニーを４２℃プレートからピペットチップで採取し、１０μｌのＬＢに再懸濁した。３μＬの細胞懸濁液を次の一組の３つのプレート上にピペッティングした：Ｃａｍ（３７℃；宿主菌株のゲノムにおけるＣａｍＲ遺伝子の存在／非存在について試験する）、Ａｍｐ（３０℃；ｐＣＰ２０プラスミドからのＡｍｐＲの存在／非存在について試験する）および３７℃のＬＢのみ（クロラムフェニコールカセットおよびｐＣＰ２０プラスミドを失った所望の細胞）。ＣａｍまたはＡｍｐプレートのいずれにおいても増殖が存在しない場合、コロニーは治癒したとみなし、採取し、ＬＢプレート上に再度ストリークして、単一コロニーを得て、３７℃で一晩増殖させた。
例３４．  Ｎｉｓｓｌｅの滞留
【０７６５】
改変されていない大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、腸または血清中の防御因子によって破壊され得る。インビボでの細菌の滞留時間を計算することができる。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのストレプトマイシン耐性株を使用する非限定的な例を以下に記載する。別の実施態様において、滞留時間は、本発明の遺伝子操作された細菌について計算される。
【０７６６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを動物施設で１週間馴化させた。１週間の馴化後（０日目）、１〜３日目に、ストレプトマイシン耐性ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）をマウスに強制経口投与した。抗生物質によるマウスの前処理は行わなかった。投与した細菌量、すなわち接種物量を表７９に示す。接種物のＣＦＵを決定するために、接種物を連続希釈し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。
【表７８】
2018532412.tif 000216
【０７６７】
２〜１０日目に、６匹までのマウスから糞便ペレットを採取した（ＩＤ番号１〜６；表８０）。ＰＢＳが入った試験管内でペレットを秤量し、ホモジナイズした。糞便ペレット中のニッスルＣＦＵを決定するために、ホモジナイズした糞便ペレットを連続希釈し、ストレプトマイシン（３００μｇ／  ｍＬ）を含むＬＢプレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。
【０７６８】
１日目の糞便ペレットも収集し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上にプレーティングして、マウス消化管に元々存在する菌株で、ストレプトマイシン耐性を有するものが存在するかどうかを決定した。時間経過および投与したニッスルでマウス消化管内に依然として滞留している量を、表８０に示す。
【０７６９】
図６４は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるニッスル滞留のグラフを示す。ストレプトマイシン耐性ニッスルを、抗生物質の前処理なしでマウスに強制経口投与した。計６匹のマウスの糞便ペレットを投与後からモニターして、投与ニッスルのうちマウス消化管内に依然として滞留している量を決定した。棒グラフは、マウスに投与した細菌数を表す。線は、連続する１０日間について、各日に糞便サンプルから回収されたニッスル数を表す。
【表７９】
2018532412.tif 000217
例３５．インビボでの腸内滞留と細菌株の生存
【０７７０】
ストレプトマイシン耐性ニッスルの局在および腸内滞留時間（図５６）を決定した。マウスに強制投与し、様々な時点で屠殺し、小腸盲腸および結腸の様々な領域から流出液を回収した。
【０７７１】
細菌培養物を一晩増殖させ、ペレット化した。当該ペレットをＰＢＳ中に約１０１０  ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度で再懸濁した。マウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、１０〜１２週齢）に１００μＬの細菌（約１０９ＣＦＵ）を強制投与した。マウスの飲料水を、０．１ｍｇ／ｍＬの無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）および嗜好性のために５％スクロースを含むものに変更した。各時点（強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間）で、動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を取り出した。小腸は３つの切片に切断され、大腸および大腸はそれぞれ２つの切片に切断された。各切片を０．５ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄し、別々の１．５ｍｌチューブに集めた。盲腸を取り出し、内容物を絞り出し、０．５ｍｌの冷ＰＢＳで洗い流し、１．５ｍｌチューブに集めた。連続希釈プレーティングのために、腸溶出液は氷上に置かれた。
【０７７２】
各流出液中の細菌のＣＦＵを決定するために、流出液を段階希釈し、カナマイシンを含有するＬＢプレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。各コンパートメントにおける細菌の量および滞留時間を図５６に示す。
例３６．ＩＢＤのマウスモデルにおけるブチラート発現細菌の有効性
【０７７３】
上記のブチラートカセットを有する細菌を一晩ＬＢ中で増殖させる。次いで、細菌を適切な選択マーカー、例は、アンピシリンを含むＬＢ中に１：１００に希釈し、および０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および次いで遠心分離によりペレット化する。細菌をリン酸塩緩衝化サリン（生理的塩類溶液）に再懸濁し、および１００マイクロリットルを経口強制飼養（経口胃管栄養法とも言う）によりマウスに投与する。細菌強制飼養の前に７日間、３％デキストラン硫酸ナトリウムを伴う飲料水を補充することにより、ＩＢＤをマウスに誘導する。マウスを１週間毎日処置し、および適切な選択マーカー、例あ、アンピシリンを補充した寒天プレート上に糞便ホモジネートをプレーティングすることによって糞便サンプル中の細菌を検出する。細菌処理の５日後、内視鏡検査を用いて生存マウスで大腸炎を採点する。内視鏡的損傷スコアは、結腸透光性、フィブリン付着性、粘膜および血管病理、および／または糞便特徴を評価することによって決定される。マウスを屠殺し、および結腸組織を分離する。遠位結腸切片を固定し、そして炎症および潰瘍形成についてスコアをつける。結腸組織をホモジナイズし、そして酵素アッセイキットを用いてミエロペルオキシダーゼ活性を、およびサイトカインレベル（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）を測定する。
例３７．ＩＢＤのＤＳＳ誘導マウスモデルの作製
【０７７４】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、大腸炎のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導マウスモデルにおいて試験することができる。動物へのＤＳＳの施与は、腸管上皮への化学的損傷をもたらし、炎症誘発性の腸内容物（例は、内腔抗原、腸内細菌、細菌生成物）が伝染して炎症を引き起こすことを可能にする（Ｌｏｗら、２０１３）。ＤＳＳ処置用にマウスを調製するために、耳パンチ、または任意の他の適切な標識方法を用いてマウスを標識する。マウスはＤＳＳ誘導に対する異なる感受性および応答性を示すので、個々のマウスを標識することにより、研究者は各マウスの疾患の進行を追跡することができる。次いで、マウスを秤量し、および必要であれば、平均群重量を平衡化して、群間の有意な体重差を排除する。糞便はまた、ＤＳＳ施与の前に、その後のアッセイのコントロールとして採取される。炎症の糞便マーカー（例は、サイトカインレベルまたはミエロペルオキシダーゼ活性）についての模範的アッセイを以下に記載する。
【０７７５】
ＤＳＳ施与のために、オートクレーブ水においてＤＳＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（ＭＰバイオメディカルズ）、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ（サンタアナ）、ＣＡ（カリフォルニア州）；カタログ番号１６０１１０）の３％溶液を調製する。次いで、ケージの水ボトルに１００ｍＬのＤＳＳ水を満たし、およびコントロールマウスにはＤＳＳ補給なしで同量の水を与える。この量は一般に５匹のマウスで２−３日間用に十分である。ＤＳＳは室温で安定であるが、双方の種類の水は２日ごとに、またはボトルにおいて濁度が観察されるときに交換する。
【０７７６】
ＤＳＳの施与量（通常１−５％）およびＤＳＳ施与の持続時間を改変すること（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２０１４）によって、腸炎症の急性、慢性、および解消（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）モデルが達成される。たとえば、急性および解消大腸炎は一週間以内を超えてＤＳＳに単回の連続曝露後に達成され得るが、慢性大腸炎は、典型的に、回復期間で断続されたＤＳＳの循環投与によって誘発される（例は、ＤＳＳ処置の４サイクルを７日間、続いて７−１０日間の水）。
【０７７７】
図１４Ｄは、ＦＮＲプロモーターの制御下でＤＳＳマウスモデルにおいてインビボで産生されるブチラート塩が腸防御性であり得ることを示す。ＬＣＮ２およびカルプロテクチンは両方とも、消化管バリア破壊の尺度である（このアッセイにおけるＥＬＩＳＡによる測定）。図１４Ｄは、Ｓｙｎ  ５０１（ｔｅｒ置換）が野生型Ｎｉｓｓｌｅと比較して（ｃｏｎｍｐａｒｅ）炎症を低減し、および／または消化管バリアを保護することを示す。
例３８．インビボでの疾患進行のモニタリング
【０７７８】
ＤＳＳの初期の施与後、１５−３０分間空のケージ（寝床材料なし）に単一のマウスを置くことによって、毎日各動物から糞便を採取する。しかし、ＤＳＳ施与が進行し、および炎症がより頑強になるにつれて、収集に要する時間が増加する。糞便サンプルは滅菌鉗子を用いて収集し、および微量遠心管に入れる。単一のペレットを用いて、以下の採点システムに従って潜血を監視する：０、陰性のヘモカルト（ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ）を有する正常な糞便粘稠度；１、陽性のヘモカルトを有する軟便；２、血液の痕跡を有する非常な軟便、および３、可視性直腸出血を伴う水様の便である。このスケールは、腸の出血の比較分析に使用される。残りのすべての便は、炎症マーカーの測定のために予定され、および−２０℃で凍結される。
【０７７９】
各動物の体重も毎日測定する。体重は、初期のＤＳＳ施与後最初の３日間はわずかに増加し、およびその後出血の開始時に徐々に減少し始める可能性がある。急性大腸炎のマウスモデルについては、ＤＳＳは典型的には７日間施与される。しかし、この時間の長さは研究者の裁量により変更され得る。
例３９．ＤＳＳ誘導後の遺伝学的に操作された細菌のインビボ有効性
【０７８０】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＳのＤＳＳ誘発動物モデルにおいて試験することができる。細菌は、適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩増殖させる。次いで、細菌は選択的抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。次いで、細菌をリン酸塩緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）に再懸濁する。細菌強制飼養の前に７日間３％ＤＳＳで飲料水を補充することにより、ＩＢＤをマウスに誘導する。ＤＳＳ処理の７日目に、１００μＬの細菌（またはビヒクル）を経口強制飼養によってマウスに投与する。細菌処理を１日１回、１週間繰り返し、および糞便サンプル中の細菌を、選択的寒天平板上に糞便のホモジネートをプレーティングすることによって検出する。
【０７８１】
細菌処理の５日後、Ｃｏｌｏｖｉｅｗ  ｓｙｓｔｅｍ（コロビュー・システム）（Ｋａｒｌ  Ｓｔｏｒｚ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ（カール・シュトルツ・ベテリナリー・エンドスコピー）、Ｇｏｌｅｔａ（ゴレタ）、ＣＡ）を用いて、生存マウスにおいて大腸炎を記録する。１．５−２．０％のイソフルラン麻酔下のマウスでは、結腸を空気で膨脹させ、および近位結腸の約３ｃｍを視覚化することができる（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２０１４）。内視鏡的損傷は、結腸透光性（スコア０−３）、腸壁へのフィブリン付着（スコア０−３）、粘膜細粒度（スコア０−３）、脈管病理（スコア０−３）、糞便特徴（正常ないし下痢；スコア０−３）、および内腔での血液の存在（スコア０−３）、最大スコア１８を生成する。マウスを犠牲にし、および結腸組織を例８および９に記載のプロトコルを用いて分離する。遠位結腸切片を固定し、および炎症および潰瘍形成についてスコアをつける。残りの結腸組織をホモジナイズし、およびミエロペルオキシダーゼ活性と同様にサイトカインレベル（例は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０）を以下に記載の方法を用いて測定する。
例４０．ＩＢＤのげっ歯類モデルの安楽死手順
【０７８２】
屠殺に先立ち４時間前および２４時間前に、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロゲン）、Ｗａｌｔｈａｍ（ウォルサム）、ＭＡ（マサチューセッツ州）；カタログ番号Ｂ２３１５１）を、供給者の推奨するようにマウスに腹腔内投与することができる。ＢｒｄＵは、標準的な抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｂｃａｍ（アブカム）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いた免疫組織化学による腸上皮細胞の増殖および／または移動をモニターするために使用される。
【０７８３】
屠殺の日に、マウスは４時間食物を摂取させ、および次いでＦＩＴＣ−デキストラントレーサー（４ｋＤａ、０．６ｍｇ／ｇ体重）で強制飼養する。糞便ペレットを収集し、およびマウスをＦＩＴＣ−デキストラン投与の３時間後に安楽死させる。次いで、動物を心臓から採血して（ｃａｒｄｉａｃ  ｂｌｅｄ）、溶血のない血清を収集する。腸の透光性は、適切に希釈した血清（励起、４８８ｎｍ；発光、５２０ｎｍ）の蛍光強度と相関し、および分光光度法を用いて測定する。マウス血清中の既知量のＦＩＴＣ−デキストランの連続希釈液を用いて標準曲線を作成する。
【０７８４】
あるいはまた、腸炎症は、血清ケラチノサイト由来ケモカイン（ＫＣ）、リポカリン２、カルプロテクチン、および／またはＣＲＰ−１のレベルに従って定量化する。これらのタンパク質は、炎症疾患活性の信頼できるバイオマーカーであり、およびＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（ヂュオセットＥＬＩＳＡ）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄシステムズ）、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ（ミネアポリス）、ＭＮ）を使用して製造者の指示に従って測定される。これらのアッセイのために、コントロール血清サンプルをＫＣについては１：２または１：４、およびリポカリン２については１：２００に希釈する。ＤＳＳ処理マウス由来のサンプルは、有意により一層高い希釈度を必要とする。
例４１．結腸組織の分離および保存
【０７８５】
マウスから腸組織を分離するために、腹側正中線切開によって各マウスを切り開く。次いで、脾臓を取り出し、および重さを量る。増加した脾臓重量は、一般に、動物における炎症および／または貧血の程度と相関する。非選択寒天プレート上に播種した脾臓溶解物（ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍＬ）も、散在性腸内細菌の指標である。細菌の蔓延の程度は、ＦＩＴＣ−デキストラン透光性データと一致するべきである。
【０７８６】
次に、腸間膜リンパ節を分離する。これらは、免疫細胞集団の特徴付け、および／または消化管細菌のトランスロケーションのアッセイに使用され得る。リンパ節の拡大も、ＤＳＳ誘発病理の信頼できる指標である。最後に、器官を鉗子で持ち上げて盲腸が見えるまで慎重に引っ張って結腸を取り除く。炎症プロセスにより、結腸組織が薄くなり、短くなり、および腸外組織に付着するので、重度に炎症を起こしたＤＳＳ処置マウスからの結腸切開は特に困難である。
【０７８７】
結腸および盲腸は、回盲接合部での小腸、および直腸の遠位端部の肛門から分離される。この時点で、マウスの腸（盲腸から直腸まで）はグロス分析（ｇｒｏｓｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ、肉眼的分析とも言う）のために画像化され、および結腸の長さは結腸をまっすぐにして（しかし延伸しないで）測定することができる。次いで、結腸は、回盲接合部での盲腸から分離され、および５または１０ｍＬのシリンジ（給餌針付き）を用いて冷ＰＢＳで短時間フラッシュされる。フラッシングは、任意の糞便および／または血液を除去する。しかし、ムチン層の組織学的染色または細菌の接着／転位が最終的に予想される場合、ＰＢＳで結腸を洗い流すことは避けるべきである。代わりに、結腸は、粘膜構造を維持するためにカルノア液（Ｃａｒｎｏｙ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（６０％エタノール、３０％クロロホルム、１０％氷酢酸；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、２００８）に浸漬する。ＤＳＳ誘発炎症は一般にこの領域では観察されないので、盲腸は捨てることができる。
【０７８８】
フラッシュ後、結腸重量を測定する。炎症を起こした結腸は、組織の浪費により正常結腸と比較して重量減少を見せ、および結腸重量の減少は急性炎症の重症度と相関する。対照的に、大腸炎の慢性モデルでは、炎症は結腸重量の増加と関連することが多い。重量の増加は、マクロファージ、上皮細胞、および多核巨細胞の病巣集合（ｆｏｃａｌ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）、および／または他の細胞、たとえば、リンパ球、線維芽細胞、形質細胞などのようなものの蓄積に起因する可能性がある（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、１９８３）。
【０７８９】
後のアッセイ用に結腸サンプルを得るため、結腸を適切な数の小片に切断する。アッセイを行うとき、マウスの異なるグループの結腸の同じ領域を比較することが重要である。たとえば、近位結腸を−８０℃で凍結し、およびＭＰＯ分析のために保存し、中結腸（ｍｉｄｄｌｅ  ｃｏｌｏｎ）をＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（ＲＮＡラター）において保存し、およびＲＮＡ分離のために保存し、直腸領域を組織学のために１０％ホルマリンで固定する。あるいはまた、洗浄した結腸をエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で培養してもよい。これらのアッセイの各々についての模範的なプロトコルを以下に記載する。
例４２．ミエロペルオキシダーゼ活性アッセイ
【０７９０】
げっ歯類の腸における顆粒球浸潤は、炎症と相関し、およびミエロペルオキシダーゼ、好中球顆粒球に豊富に発現されるものの活性レベルによって測定される。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は、ｏ−ジアニシジン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ（シグマ社）、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ（セントルイス）、ＭＯ（ミズーリ州）；カタログ番号Ｄ３２５２）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｔ２８８５）のいずれかを基板として用いて定量することができる。
【０７９１】
簡潔には、結腸組織のきれいに洗い流されたサンプル（５０−１００ｍｇ）を−８０℃で貯蔵物から取り出し、および直ちに氷上に置く。次いで、サンプルを５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中の０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｈ６２６９）中でホモジナイズする。次いで、ホモジネートを超音波処理により３０秒間破壊し、ドライアイスで急速冷凍し、および合計３回の凍結融解サイクルの間解凍した後、最終超音波処理を３０秒間行う。
【０７９２】
ｏ−ジアニシジン二塩酸塩でのアッセイのために、サンプルを４℃にて高速（１３，４００ｇ）で６分間遠心分離する。次いで、上清中のＭＰＯを、１ｍｇ／ｍＬのｏ−ジアニシジン二塩酸塩および０．５ｘ１０−４％のＨ２Ｏ２を添加し、光学密度を４５０ｎｍで測定することにより、９６ウェルプレートにおいてアッセイする。褐色がかった黄色は１０−２０分かけてゆっくりと発色するが；しかし、発色があまりにも速すぎる場合、サンプルをさらに希釈した後、アッセイを繰り返す。ヒト好中球ＭＰＯ（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｍ６９０８）を標準として、０．５−０．０１５単位／ｍＬの範囲で使用する。１酵素単位は、２５℃で１分間に１．０μｍｏｌの過酸化物を分解するために必要な酵素量として定義される。このアッセイは、げっ歯類結腸サンプル、特にＤＳＳ誘導組織におけるＭＰＯ活性を分析するために使用される。
【０７９３】
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いたアッセイのために、サンプルを６０℃で２時間インキュベートし、および次いで、４，０００ｇにて１２分間スピンダウンする。上清中の酵素活性を、６３０ｎｍで測光的に定量する。アッセイ混合物は、ジメチルスルホキシドに溶解した２０ｍＬの上清、１０ｍＬのＴＭＢ（最終濃度、１．６ｍＭ）、および８０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．４において希釈した７０ｍＬのＨ２Ｏ２（最終濃度、３．０ｍＭ）からなる。１酵素単位は、１分当たり１吸光度単位の増加をもたらす酵素の量として定義される。このアッセイは、げっ歯類結腸サンプル、特に、ここに記載のトリニトロベンゼン（ＴＮＢＳ）によって誘導された組織におけるＭＰＯ活性を分析するために使用される。
例４３．ＲＮＡ分離および遺伝子発現分析
【０７９４】
遺伝学的に操作された細菌がインビボで腸炎症をどのように減少させるかについてのさらなる機構的な洞察を得るために、半定量的および／またはリアルタイム逆転写ＰＣＲによって遺伝子発現を評価する。
【０７９５】
半定量的分析のために、ＲＮｅａｓｙ分離キット（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン）、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ（ジャーマンタウン）、ＭＤ（メリーランド州）；カタログ番号７４１０６）を用いて腸粘膜サンプルから合計ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡ濃度および純度は、２６０および２８０ｎｍでの吸光度測定値に基づいて決定する。１μｇの合計ＲＮＡを逆転写し、および以下の遺伝子、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、または、炎症に関連する任意の他の遺伝子についてｃＤＮＡを増幅する。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として使用する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応を、９５℃で２分間の融解ステップ、９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、および７５℃で１分の２５サイクルを行い、次いで６５℃で５分間の最終的伸長ステップを続ける。逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ産物を４％アガロースゲル上でサイズ別に分離し、および臭化エチジウムで染色する。相対的なバンド強度は、標準的な画像分析ソフトウェアを用いて分析する。
【０７９６】
リアルタイムで、定量的な分析のために、ＲＮＡ抽出まで腸サンプル（５０ｍｇ）をＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｒ０９０１）に貯蔵する。サンプルは−２０℃で凍結維持し、長期貯蔵する。ＲＮＡ抽出の日に、サンプルを解凍し、またはＲＮＡｌａｔｅｒから取り出し、Ｔｒｉｚｏｌ（トリゾール）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（フィッシャー・サイエンティフィク）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；カタログ番号１５５９６０２６）を用いて合計ＲＮＡを抽出する。任意の適切なＲＮＡ抽出方法を使用することができる。ＤＳＳ誘発サンプルで作業するとき、塩化リチウム法（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２０１２）を使用してすべての多糖類（ＤＳＳを含む）を除去する必要がある。結腸組織中の痕跡量のＤＳＳは、その後のステップでＰＣＲ増幅を妨げることが知られる。
【０７９７】
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｒ）（プライマー・エクスプレス商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライド・バイオシステムズ）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ（フォスターシティ）、ＣＡ）を用いて、免疫応答に関連する種々の遺伝子およびサイトカインのためにプライマーを設計する。合計ＲＮＡの分離後、ランダムプライマー、ｄＮＴＰｓおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）（スーパースクリプト商標）ＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１８０６４０１４）を用いて逆転写を行う。次いで、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター・ミックス）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；４３０９１５５）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００シーケンス・デテクション・システム）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリアルタイムＰＣＲのために、ｃＤＮＡを使用するが、任意の適切な検出方法を使用できる。ＰＣＲ産物は融解分析によって検証される。
例４４．組織学
【０７９８】
標準的な組織学的染色を使用して、顕微鏡レベルにて腸炎症を評価する。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって、細胞の浸潤、上皮の変化、および粘膜の構造の質および次元の視覚化が可能にされる（Ｅｒｂｅｎら、２０１４）。Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ（過ヨウ素酸シッフ）（ＰＡＳ）染色は、炭水化物（糖質とも言う）巨大分子（例は、グリコーゲン、糖タンパク質、ムチン）について染色するために使用される。杯細胞は、たとえば、ムチンの存在のためにＰＡＳ陽性である。
【０７９９】
大抵の組織学的染色にはスイスロールが推奨され、げっ歯類の腸の全長を検査することができる。これは、腸を部分に分け、縦に開き、および次に、粘膜で外側に圧延する単純な技術である（ＭｏｏｌｅｎｂｅｅｋおよびＲｕｉｔｅｎｂｅｒｇ、１９８１）。簡潔には、個々の結腸片を縦に切断し、ＰＢＳで湿らせた爪楊枝のまわりに包み、およびカセットに入れる。１０％ホルマリン中で２４時間固定した後、カセットを染色日まで７０％エタノール中に貯蔵する。ホルマリン固定結腸組織は、抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いてＢｒｄＵに対して染色することができる。あるいはまた、Ｋｉ６７を用いて上皮細胞の増殖を視覚化することができる。より一層特異的な標的に対する抗体（例は、免疫組織化学、免疫蛍光）を用いる染色のために、凍結切片を凍結保護包埋媒体、たとえば、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｒ）（ティッシュ−テク商標）ＯＣＴ（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ（ラドナー）、ＰＡ；カタログ番号２５６０８−９３０）などのようなもののにおいて固定する。
【０８００】
Ｈ＆Ｅ染色のために、染色された結腸組織は、上皮損傷、ならびに粘膜、粘膜下組織、および筋肉／漿膜への炎症浸潤の程度に基づいて各セクションに０−３の４つのスコアを割り当てることによって分析する。これらのスコアのそれぞれは、次のように増加する：１、変化が限局性である場合；２、変化がパッチ状である場合；３、変化が拡散する場合である。その後、４つの個々のスコアが各結腸について合計され、その結果、１つの動物につき合計スコア０−３６が得られる。コントロール群および罹患群の平均スコアを集計する。代わりの採点システムはここに詳述される。
例４５．げっ歯類の結腸のエクスビボ培養
【０８０１】
エクスビボで結腸を培養することにより、腸炎症の重篤度に関する情報を提供することができる。縦方向に切断した結腸（約１．０ｃｍ）を、１．０％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ（フィッシャー社）；カタログ番号ＢＰ２９５９５０）を伴うＨａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ハンクス平衡塩類溶液）中で３回連続して洗浄する。次に、洗浄した結腸を、１．０％ペニシリン／ストレプトマイシンを伴う１．０ｍＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１１８７５０９３）を各々含む２４ウェルプレートのウェルに入れ、および３７℃にて５．０％ＣＯ２と共に２４時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を集め、および４℃にて１０分間遠心分離する。上清は、炎症促進性サイトカインの分析前に−８０℃にて貯蔵される。
例４６．ＴＮＢＳ誘発後の遺伝学的に操作された細菌のインビボ有効性
【０８０２】
ＤＳＳとは別に、１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤの他の化学的に誘導された動物モデルにおいて試験することもできる。非制限的な例には、オキサゾロン（Ｂｏｉｒｉｖａｎｔら、１９９８）、酢酸（ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎおよびＰｆｅｉｆｆｅｒ、１９７８）、インドメタシン（Ｓａｂｉｕら、２０１６）、スルフヒドリルインヒビター（Ｓａｔｏｈら、１９９７）、およびトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（Ｇｕｒｔｎｅｒら、２００３；Ｓｅｇｕｉら、２００４）によって誘導されるものが含まれる。大腸炎のＴＮＢＳ誘発マウスモデルにおける遺伝学的に操作された細菌の効力を決定するために、細菌を、適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩増殖させる。次いで、選択性抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で細菌を１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をＰＢＳに再懸濁する。ＩＢＤは、０．２５ｍＬの５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール（Ｓｅｇｕｉら、２００４）中の３０ｍｇのＴＮＢＳの結腸内投与によってマウスにおいて誘導される。コントロールマウスに０．２５ｍＬの塩類溶液を施与する。誘発４時間後、１００μＬの細菌（またはビヒクル）を経口強制飼養によりマウスに対して管理する。細菌処理は１日１回、１週間繰り返す。動物の重量を毎日秤量する。
【０８０３】
７日間の細菌処理の後、マウスをチオブタバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によって屠殺する。結腸組織を鈍的切開（ｂｌｕｎｔ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）によって分離し、塩類溶液ですすぎ、および重量を測定する。血液サンプルは、１ｍＬ注射筒を使用して無菌条件下で開放心穿刺（ｏｐｅｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｕｎｃｔｕｒｅ）によって収集し、エッペンドルフバイアルに入れ、および４℃にて１，５００ｇで１０分間回転させる。次いで、上清血清をオートクレーブしたエッペンドルフバイアルに分注し、および定量的比色分析市販キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＩＬ−６レベルの後の検定のために−８０℃で凍結する。
【０８０４】
肉眼的損傷は、盲検の観察者によって解剖顕微鏡下で検査される。腸癒着（スコア０−２）、狭窄（スコア０−３）、潰瘍（スコア０−３）、および肉厚（スコア０−２）の存在／重症度を説明するために確立されたスコアリングシステムを使用する（Ｍｏｕｒｅｌｌｅら、１９９６）。その後、２つの結腸サンプル（５０ｍｇ）を切除し、液体窒素中で急速凍結し、およびその後のミエロペルオキシダーゼ活性アッセイのために−８０℃で貯蔵する。必要に応じて、組織標定のために１０％ホルマリン中に追加のサンプルを保存する。次いで、ホルマリン固定した結腸サンプルを、パラフィンに包埋し、および５μｍ切片をＨ＆Ｅで染色する。結腸の顕微鏡的炎症は、以前に規定された基準（ＡｐｐｌｅｙおよびＷａｌｌａｃｅ、１９９５）に従って、０−１１のスケールで評価される。
例４７．ＩＢＤの細胞移入マウスモデルの作製
【０８０５】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤの細胞移入動物モデルにおいて試験することができる。１つの典型的な細胞移入モデルは、大腸炎のＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞移入モデルである（Ｂｒａｍｈａｌｌら、２０１５；Ｏｓｔａｎｉｎら、２００９；Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、２００８）。このモデルは、ＣＤ４５＋  Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＢの発現のそれらのレベルに従って選別し、およびＣＤ４５ＲＢ発現が高いＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＢＨｉＴ細胞と称する）を正常ドナーマウスから免疫不全マウス（例は、ＳＣＩＤまたはＲＡＧ−／−マウス）に養子的に移入することによって生じさせる。具体的なプロトコルは以下の通りである。
ＣＤ４  Ｔ細胞についての豊富化
【０８０６】
いずれかの性のＣ５７ＢＬ／６野生型マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ジャクソン・ラボラトリーズ）、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ（バーハーバー）、ＭＥ（メイン州））を安楽死させた後、マウス脾臓を取り出し、１０−１５ｍＬのＦＡＣＳ緩衝剤（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない４％ウシ胎児血清を補充した１Ｘ  ＰＢＳ）を含む氷上の１００ｍｍペトリ皿中に置く。脾臓は、組織の大きな部分が残らなくなるまで、ＦＡＣＳ緩衝剤でコーティングされた２枚のガラススライドを用いて裂かれる。次いで、細胞懸濁物は、１０ｍＬ注射筒（針なし）を使用して皿から取り出し、および氷上に置かれた５０ｍＬコニカルチューブに注射筒から（２６ゲージ針を使用して）排出する。ペトリ皿を、５０ｍＬコニカルチューブがいっぱいになるまで、同じ針技術を用いてさらに１０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝剤いより洗浄する。細胞を４℃にて１０分間４００ｇで遠心分離することによりペレット化する。細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝剤の流れで穏やかに破壊した後、細胞を計数する。計数に使用した細胞を氷上に保持し、および次のセクションで説明する単色染色用に保存する。他のすべての細胞（すなわち、５０ｍＬコニカルチューブに残っているもの）を新しい５０ｍＬコニカルチューブに移す。各チューブには最大２５×１０７細胞が含まれている必要がある。
【０８０７】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞を濃縮するために、Ｄｙｎａｌ（Ｒ）（ダイナル商標）Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（マウスＣＤ４ネガティブ・アイソレーション・キット）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１１４−１５Ｄ）を製造業者の指示に従って使用する。同等の任意のＣＤ４＋  Ｔ細胞濃縮法を用いることができる。陰性選択の後、ＣＤ４＋細胞は上清中に残る。上清を氷上で新しい５０ｍＬコニカルチューブに注意深くピペットで入れ、および細胞を４℃にて１０分間４００ｇで遠心分離してペレットにする。次いで、すべての５０ｍＬチューブからの細胞ペレットを再懸濁し、単一の１５ｍＬチューブにプールし、および遠心分離によりもう一度ペレット化する。最後に、細胞を１ｍＬの新鮮なＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁し、および抗ＣＤ４−ＡＰＣおよび抗ＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣ抗体で染色する。
ＣＤ４＋  Ｔ細胞の蛍光標識
【０８０８】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞を標識するために、ＦＡＣＳ緩衝剤において予め滴定した抗ＣＤ４−ＡＰＣおよび抗ＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣ抗体の適切な希釈物を含有する抗体カクテル（およそ１ｍＬのカクテル／５×１０７細胞）を、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れ、および容量をＦＡＣＳ緩衝剤で１ｍＬに調整する。次いで、抗体カクテルを１５ｍＬチューブにおいて細胞と合わせる。チューブに蓋をし、適切に混合されるのを確実にするように穏やかに逆さにし、およびロッキングプラットフォーム上で４℃にて１５分間インキュベートする。
【０８０９】
インキュベーション期間中に、９６ウェル丸底染色プレートは、計数した細胞（前のセクションから保存したもの）の等しいアリコートを、単色コントロール染色に対応するプレートの各ウェル中に移すことによって用意する。次いで、これらのウェルをＦＡＣｓ緩衝液で２００μＬまで満たし、および予め冷却したプレート遠心分離機を用いて細胞を４℃にて３分間３００ｇでペレット化する。遠心分離後、上清を、真空ラインに取り付けた２１ゲージの針を用いて捨て、および非特異的結合を防ぐために各ウェルに１００μＬの抗ＣＤ１６／３２抗体（Ｆｃ受容体ブロッキング）溶液を加える。プレートをロッキングプラットフォーム上で４℃にて１５分間インキュベートする。次いで、細胞を２００μＬＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、および遠心分離によってペレット化する。上清を吸引し、廃棄し、および１００μＬの適切な抗体（すなわち、予め滴定した抗ＣＤ４−ＡＰＣまたは抗ＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣ）を各単色コントロールに対応するウェルに加える。染色されないコントロールウェル中の細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。プレートをロッキングプラットフォーム上で４℃にて１５分間インキュベートする。２回洗浄した後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、１５０−２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を含む１２本の７５ｍｍフローチューブに移し、およびチューブを氷上に置く。
【０８１０】
インキュベーション後、抗体カクテルを含む１５ｍＬチューブ中の細胞を、４℃にて１０分間４００ｇで遠心分離することによってペレット化し、およびＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して２５−５０×１０６細胞／ｍＬの濃度を得る。
ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞の精製
【０８１１】
ＣＤ４５ＲＢＨｉ集団およびＣＤ４５ＲＢＬｏｗ集団の細胞選別は、フローサイトメトリーを用いて行う。簡潔には、非染色細胞のサンプルを用いてベースライン自己蛍光を確立し、リンパ球の前方散乱対側方散乱ゲーティングを行う。単色コントロールは、各蛍光色素に適用する適切なレベルの補正を設定するために使用する。しかし、ＦＩＴＣおよびＡＰＣ蛍光色素では、概して補償は必要とされない。次いで、単一パラメータのヒストグラム（一重項リンパ細胞上にゲートされたもの）を用いてＣＤ４＋（ＡＰＣ＋）一重項細胞をゲートし、および第二の一重項パラメータ（ＣＤ４＋一重項細胞にゲートされたもの）を収集して、ソートゲートを確立する。ＣＤ４５ＲＢＨｉ集団は、最も明るいＣＤ４５ＲＢ染色を示す細胞の４０％として規定され、その一方で、ＣＤ４５ＲＢＬｏｗ集団は、最も暗いＣＤ４５ＲＢ発現を有する細胞の１５％として規定される。これらの集団のそれぞれを個別にソートし、およびＣＤ４５ＲＢＨｉ細胞を養子移入に用いる。
養子移入
【０８１２】
ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢＨｉ細胞の精製集団を、６ないし８週齢のＲＡＧ−／−雄性マウスに養子移入する。選別された細胞を含む収集チューブにＦＡＣＳ緩衝液を満たし、および細胞を遠心分離によってペレット化する。次いで上清を捨て、および細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁する。再懸濁した細胞を、１本のチューブにつき最大５×１０６細胞を用い、注入チューブに移し、および冷ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬの最終濃度にまで希釈する。注射チューブは氷上に保持する。
【０８１３】
注入の前に、レシピエントマウスを秤量し、および注射チューブを穏やかに数回反転させて細胞を混合する。混合細胞（０．５ｍＬ、約０．５×１０６細胞）を、２６Ｇ３／８針を取り付けた１ｍＬシリンジに注意深く引き込む。次いで、細胞をレシピエントマウスに腹腔内注入する。
例４８．ＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞トランスファーモデルにおける遺伝学的に操作された細菌の有効性
【０８１４】
本開示の遺伝学的に操作された細菌がＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞移入マウスにおいて有効であるかどうかを決定するために、養子移入後の疾患の進行について、各マウスを毎週秤量することによってモニターする。典型的には、移送後最初の３週間に控えめな体重増加が観察され、次に４−５週間では遅いが進行性の体重減少が観察される。体重減少は概して、緩い糞便および下痢の出現を伴う。
【０８１５】
レシピエントマウスが疾患の徴候を発症し始めるので、移入後４または５週で、例１に記載された遺伝学的に操作された細菌を、適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩増殖させる。次いで、選択性抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で細菌を１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をＰＢＳに再懸濁し、および１００μＬの細菌（またはビヒクル）をＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞トランスファーマウスに経口強制飼養によって投与する。細菌処置は、マウスを安楽死させる前に１日１回１−２週間反復する。ネズミの結腸組織を分離し、および上記の手順を用いて分析する。
例４９．遺伝学的マウスモデルのＩＢＤにおける遺伝学的に操作された細菌の有効性
【０８１６】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤの遺伝学的な（コンジェニックおよび遺伝子改変された）動物モデルにおいて試験することができる。たとえば、ＩＬ−１０は抗炎症性サイトカインであり、ＩＬ−１０をコードする遺伝子はクローン病および潰瘍性大腸炎の両方の感受性遺伝子である（Ｋｈｏｒら、２０１１）。炎症の研究のためのいくつかのマウスモデルを作り出すために、ＩＬ−１０またはその受容体の機能障害が用いられる（Ｂｒａｍｈａｌｌら、２０１５）。正常条件下で飼育されたＩＬ−１０ノックアウト（ＩＬ−１０−／−）マウスは腸内で慢性炎症を発症する（ＩｙｅｒおよびＣｈｅｎｇ、２０１２）。
【０８１７】
本開示の遺伝学的に操作された細菌がＩＬ−１０−／−マウスにおいて有効であるかどうかを定めるために、適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩細菌を増殖させる。次に、選択性抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で細菌を１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をＰＢＳに再懸濁し、および１００μＬの細菌（またはビヒクル）をＩＬ−１０−／−マウスに経口胃管栄養法によって投与する。細菌処置は、マウスを安楽死させる前に１日１回１−２週間反復する。ネズミの結腸組織を分離し、および上記の手順を用いて分析する。
【０８１８】
遺伝学的に操作された細菌を試験するためのプロトコルは、ＩＢＤの他の遺伝学的動物モデルと同様である。そのようなモデルには、制限されないが、ＳＡＭＰ１／ＹｉｔＦｃ（Ｐｉｚａｒｒｏら、２０１１）、ドミナントネガティブＮ−カドヘリン変異体（ＮＣＡＤデルタ；ＨｅｒｍｉｓｔｏｎおよびＧｏｒｄｏｎ、１９９５）、ＴＮＦΔＡＲＥ（Ｗａｇｎｅｒら、２０１３）、ＩＬ−７（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９８）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＢｉｒ（Ｅｌｓｏｎら、２０００）、およびドミナントネガティブＴＧＦ−βレセプターＩＩ変異体（Ｚｈａｎｇら、２０１０）；およびノックアウトマウスモデル、例は、ＴＣＲα−／−（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９３；Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、２００８）、ＷＡＳＰ−／−（Ｎｇｕｙｅｎら、２００７）、Ｍｄｒ１ａ−／−（Ｗｉｌｋら、２００５）、ＩＬ−２Ｒα−／−（Ｈｓｕら、２００９）、Ｇαｉ２−／−（Ｏｈｍａｎら、２００２）、およびＴＲＵＣ（Ｔｂｅｔ−／−Ｒａｇ２−／−；Ｇａｒｒｅｔｔら、２００７）が含まれる。
例５０．ＩＢＤのトランスジェニックラットモデルにおける遺伝学的操作細菌の有効性
【０８１９】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤの非ネズミ動物モデルにおいて試験することができる。Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆ３４４）ラットへのヒト白血球抗原Ｂ２７（ＨＬＡ−Ｂ２７）およびヒトβ２−ミクログロブリン遺伝子の導入は、ＧＩ管における自発的な、慢性炎症を誘発する（Ａｌａｖｉら、２０００；Ｈａｍｍｅｒら、１９９０）。本発明の遺伝学的操作細菌がこのモデルにおける消化管炎症を改善することができるかどうかを調べるために、細菌を適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩増殖させる。次いで、選択性抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で細菌を１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をＰＢＳに再懸濁し、およびトランスジェニックＦ３４４−ＨＬＡ−Ｂ２７ラットに経口胃管栄養法により１００μＬの細菌（またはビヒクル）を投与する。細菌処理を１日１回、２週間繰り返す。
【０８２０】
細菌処理が、２５週齢にてＦ３４４−ＨＬＡ−Ｂ２７ラットに通常存在する肉眼的および組織学的腸病変を軽減するかどうかを定めるために、初期の処置後１４日目にすべての動物を屠殺する。ＧＩ（胃腸）管を次に、腸間膜境界に沿って開き、トライツ（Ｔｒｅｉｔｚ）の靱帯から直腸まで切除し、およびフラットベッドスキャナを用いて画像化する。合計の粘膜損傷は、損傷した合計表面積のパーセントとして報告され、標準画像分析ソフトウェアを用いて定量化する。
【０８２１】
顕微鏡分析のために、サンプル（０．５−１．０ｃｍ）を小腸および大腸の正常領域および疾患領域の両方から切除する。Ｈ＆Ｅ染色のために切片（５μｍ）を処理する前に、サンプルをホルマリンで固定し、およびパラフィンに包埋する。染色された切片を分析し、および以下のように採点する：０、炎症なし；１、軽度の炎症が粘膜下層に広がる；２、中程度の炎症が筋固有層中に広がる；３、重度の炎症。スコアをまとめ、および平均±標準誤差として報告する。
例５１．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの操作株におけるトリプトファン産生
【０８２２】
宿主由来（例えば、トリプタミンまたはキヌレリン（ｋｙｎｕｒｅｒｉｎｅ）など）または腸内細菌由来の（例えば、インドールアセタートまたはインドールなど）多くのトリプトファン代謝産物は、ＡｈＲ受容体の活性化を介して、ＩＢＤとの関連で炎症をダウンレギュレートすることが明らかになっている。細菌由来のインドールプロピオナートのような他のトリプトファン代謝産物は、大腸炎の実験モデルにおいて、腸バリアが完全な状態に回復するのを助けることが示されている。本実施例では、大腸菌ニッスル株を操作して、前記の有益な代謝産物の全ての前駆体であるトリプトファンを生成するようにした。
【０８２３】
最初に、転写因子ＴｒｐＲが媒介するトリプトファン生合成遺伝子の負の制御を除くために、大腸菌ニッスルゲノムからｔｒｐＲ遺伝子を欠失させた。大腸菌ニッスルゲノムＤＮＡから、トリプトファンオペロンｔｒｐＥＤＣＢＡをＰＣＲによって増幅し、ｔｅｔプロモーター制御下にある低コピープラスミドｐＳＣ１０１のｔｅｔＲリプレッサー遺伝子の下流にクローニングした。次に、このｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡプラスミドをΔｔｒｐＲ突然変異体に形質転換して、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ株を得た。続いて、大腸菌ニッスルのフィードバック抵抗型ａｒｏＧ遺伝子（ａｒｏＧｆｂｒ）を合成し、ｔｅｔプロモーター制御下にある中コピープラスミドｐ１５ＡのｔｅｔＲリプレッサーの下流にクローニングした。ａｒｏＧ遺伝子は、芳香族アミノ酸生成の最初のコミットステップを触媒する酵素をコードする。こうして得られたプラスミドをΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ株に形質転換し、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を得た。最後に、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＢＣＤＡから、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＢＣＤＡ構築物のフィードバック抵抗型（ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＢＣＤＡ）を作製した。ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒおよびｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＢＣＤＡ構築物の両方をΔｔｒｐＲ突然変異体に形質転換して、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を得た。
【０８２４】
作製した全菌株を適切な抗生物質を含むＬＢ中で一晩増殖させ、培養試験管内の抗生物質を含む３ｍＬのＬＢに１／１００継代した。２５０ｒｐｍ、３７℃で２時間増殖させた後、１００ｎｇ／ｍＬの無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養液に添加して構築物の発現を誘導した。誘導の２時間後に、細菌細胞を４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって沈殿させ、３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁した。細胞を４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離で再び沈殿させ、０．５％グルコースを含む３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁し、２５０ｒｐｍ、３７℃に置いた。２時間後、４時間後および１６時間後に、細菌を２００μＬずつ取り出し、細菌上清中のトリプトファンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。図４４Ａは、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株がトリプトファンを生成・分泌することを示す。トリプトファン生成は、フィードバック抵抗型ｔｒｐＥの発現により有意に増加する。
【０８２５】
例５２．非ＰＴＳ炭素源の使用およびトリプトファンをインドールに変換するトリプトファナーゼ酵素をコードするｔｎａＡ遺伝子の欠失によるトリプトファン改善
【０８２６】
大腸菌におけるトリプトファン前駆体分子の１つは、ホスホエノールパイルベート（ＰＥＰ）である。通常、芳香族酸（トリプトファン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む）の生成には、利用可能なＰＥＰのわずか３％しか使用されていない。グルコースを唯一の炭素源として用いて大腸菌を増殖させると、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）によってグルコースを細胞内に取り込むのに、ＰＥＰの５０％を使用される。トリプトファン生成量を増加させるために、非ＰＴＳ酸化糖であるグルクロナートを用いて、大腸菌ニッスル操作菌株ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒによるトリプトファン分泌の試験を行った。さらに、トリプトファンのインドールへの変換をブロックするために、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株において酵素トリプトファナーゼをコードするｔｎａＡ遺伝子を欠失させ、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を得た。
【０８２７】
ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒおよびΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を適切な抗生物質を含むＬＢ中で一晩増殖させ、培養試験管中の抗生物質を含む３ｍｌのＬＢに１／１００継代した。２５０ｒｐｍ、３７℃で２時間増殖させた後、１００ｎｇ／ｍＬの無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養液に添加して構築物の発現を誘導した。誘導から２時間後に、細菌細胞を４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって沈殿させ、３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁した。細胞を４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心で再度沈殿させ、１％グルコースまたは１％グルクロナートを含む３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁し、３７℃で２５０ｒｐｍまたは３７℃の嫌気性チャンバー内に置いた。３時間および１６時間の時点で２００μｌを収集し、細菌上清中のトリプトファンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。図４４Ｂは、非ＰＴＳ酸化糖グルクロナートを使用した場合、好気的条件下でトリプトファン生成が倍増することを示す。さらに、ｔｎａＡ欠失は、３時間の時点では好気性および嫌気性条件下で、１６時間の時点では嫌気性条件下でのみ、トリプトファン生成に対してプラスの効果を示した。
例５２．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるセリン生合成速度の増加によるトリプトファン生産の改善
【０８２８】
大腸菌のトリプトファン生合成の最後の工程では、１分子のセリンが消費される。本実施例では、セリンの利用可能性がトリプトファン生成の制限因子であることを示し、トリプトファン生成大腸菌ニッスル株、すなわちΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒｓｅｒＡおよびΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒｓｅｒＡｆｂｒ株の構築について記載する。
【０８２９】
ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を適切な抗生物質を含むＬＢ中で一晩増殖させ、培養試験管内の抗生物質を含む３ｍＬのＬＢ中に１／１００継代した。３７℃、２５０ｒｐｍで２時間増殖させた後、１００ｎｇ／ｍＬの無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養液に添加して、構築物の発現を誘導した。誘導から２時間後に、細菌細胞を４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって沈殿させ、３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁した。細胞を４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で再び沈殿させてから、１％グルクロナート（ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）あるいは１％グルクロナートおよび１０ｍＭセリンを含む３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁し、３７℃の嫌気性チャンバー内に置いた。３時間および１６時間の時点で、チャンバー内のサンプルから２００μｌづつ取り出し、細菌上清中のトリプトファンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。図４４Ｃは、トリプトファン生成量が、セリン添加によって改善されて３倍になることを示している。
【０８３０】
ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株におけるセリン生合成速度を増加させるために、セリン生合成経路の第１段階を触媒する酵素をコードする大腸菌ニッスルのｓｅｒＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）によって、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒプラスミドにクローニングした。次に、新たに生成したｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ構築物をΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ株に形質転換して、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ株を作製した。ｓｅｒＡのフィードバック抵抗型（ｓｅｒＡｆｂｒ）をコードするように、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ構築物をさらに改変した。新たに生成したｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡｆｂｒ構築物を用いて、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡｆｂｒ株を作製し、セリン生合成速度が改善し、トリプトファン生成量が最大になるように最適化を行った。
例５３．トリプトファン生合成およびインドール代謝産物合成のための構築物の合成
【０８３１】
種々の構築物を合成し、大腸菌の形質転換のためにベクターｐＢＲ３２２にクローニングする。いくつかの実施態様において、エフェクター分子をコードする構築物はゲノムに組み込まれる。
【０８３２】
【表８０−１】
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【表８０−２】
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【表８０−３】
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【表８０−４】
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【表８０−５】
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【表８０−６】
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【表８０−７】
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【表８０−８】
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【表８０−９】
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【表８０−１０】
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【表８０−１１】
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【表８０−１２】
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【表８０−１３】
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【表８０−１４】
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【表８０−１５】
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【表８０−１６】
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【表８０−１７】
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【表８０−１８】
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【表８０−１９】
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【表８０−２０】
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【表８０−２１】
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【表８０−２２】
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【表８０−２３】
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【表８０−２４】
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【表８０−２５】
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【表８０−２６】
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【表８０−２７】
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【表８０−２８】
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【表８０−２９】
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