【手続補正書】
【提出日】平成30年11月22日(2018.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜３０アミノ酸長を有し、配列番号：９または１１のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって、
（ａ）配列番号：２、１、３、４または５のアミノ酸配列から選択される９アミノ酸を超える長さを有する連続するアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を誘導する能力を有する、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドまたはその断片が少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＰ２およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択される、請求項２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
ＧＰＣ３特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号：２、１、３、４および５からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
からなる群より選択される細胞の少なくとも１つを誘導するための組成物であって、請求項１から５のいずれか一項に記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項８】
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、かつ
（ｉ）がんの治療、
（ｉｉ）がんの予防、
（ｉｉｉ）がんにおける術後再発の予防、および
（ｉｖ）上記（ｉ）から（ｉｉｉ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。
【請求項９】
ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＰ２およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択される少なくとも１つを有する対象への投与用に製剤化されている、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＣＴＬ誘導能を有する１つまたは複数のペプチドをさらに含有する、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する、組成物。
【請求項１２】
Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣをインビトロで誘導するための方法であって、
（ａ）ＡＰＣを請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロで接触させる段階；および
（ｂ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
からなる群より選択される段階を含む、方法。
【請求項１３】
Ｔｈ１細胞をインビトロで誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）両方のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
からなる群より選択される段階を含む、方法。
【請求項１４】
ＣＴＬをインビトロで誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、請求項４または５に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、請求項４または５に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階
からなる群より選択される段階を含む、方法。
【請求項１５】
ＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１６】
ＡＰＣの表面に提示された請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を認識する、単離されたＴｈ１細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
【図１Ａ】図１は、健常ドナーからのＧＰＣ３−ＬＰ特異的ヘルパーＴ細胞の誘導を示す。図に示すように、ＧＰＣ３特異的ヘルパー（Ｔｈ）細胞を、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＧＰＣ３−ＬＰで刺激することによって、健常ドナー（ＨＤ）から生成した。生成されたＴｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰでパルスされた自己ＰＢＭＣによって再刺激された。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数はＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって解析された。同様の結果を示した少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。ドナーのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型をパネル上部に示す。下線の引かれたＨＬＡ−クラスＩＩアリルは、図２から取り入れられるＴｈ細胞にペプチドを提示したＨＬＡ−クラスＩＩ分子をコードする。（Ａ）ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ１特異的Ｔｈ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２＋健常ドナー（ＨＤ１０、左パネル）のＰＢＭＣおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５／０９：０１＋健常ドナー（ＨＤ５、右パネル）のＰＢＭＣから生成した。
【図１Ｂ】（Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔｈ細胞を、ＨＤ１０（上左パネル）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０３／１４：０５＋健常ドナー（ＨＤ４、下左パネル）およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０１／１４：５４＋健常ドナー（ＨＤ１１、下右パネル）のＰＢＭＣから生成した。ＨＬＡ−ＤＰ拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔｈ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０２：０１／０４：０２＋健常ドナー（ＨＤ５、上右パネル）のＰＢＭＣから生成した。
【図１Ｃ】（Ｃ）ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ３特異的Ｔｈ細胞を、ＨＤ１０（左パネル）およびＨＤ５（右パネル）のＰＢＭＣから生成した。
【図１Ｄ】（Ｄ）ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ４特異的Ｔｈ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０２／１５：０２＋健常ドナー（ＨＤ３、左パネル）およびＨＤ１０（右パネル）のＰＢＭＣから生成した。
【図１Ｅ】（Ｅ）ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ５特異的Ｔｈ細胞を、ＨＤ１０（左パネル）およびＨＤ５（右パネル）から生成した。
【図２Ａ】図２は、ＧＰＣ３特異的Ｔｈ細胞の拘束ＨＬＡクラスＩＩ分子の正確な同定を示す。ＧＰＣ３特異的ヘルパー（Ｔｈ）細胞は、図１に示されるように、磁気ビーズ単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＧＰＣ３−ＬＰで刺激することによって健常ドナー（ＨＤ）から生成された。ＨＤから生成されたＴｈ細胞を、個々のＧＰＣ３−ＬＰでパルスした自己ＰＢＭＣまたは同種異系のＰＢＭＣまたはＬ細胞で再刺激した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数はＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって解析された。同様の結果を示した少なくとも２つの独立した実験からの代表的なデータを示す。ドナーのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型をパネル上部に示す。下線の引かれたＨＬＡ−クラスＩＩアリルは、ペプチドをＴｈ細胞に提示したＨＬＡ−クラスＩＩ分子をコードする。（Ａ）ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂおよびＤＲ９拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ１特異的Ｔｈ細胞は、ＨＤ１０（上パネル）およびＨＤ５（下パネル）のＰＢＭＣから生成された。
【図２Ｂ】（Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂおよびＤＰ２拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔｈ細胞は、ＨＤ１０（左パネル）およびＨＤ５（右パネル）のＰＢＭＣから生成された。
【図２Ｃ】（Ｃ）ＨＬＡ−ＤＲ７／５３およびＤＲ９拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ３特異的Ｔｈ細胞は、ＨＤ１０（上パネル）およびＨＤ５（下パネル）のＰＢＭＣから生成された。
【図２Ｄ】（Ｄ）ＨＬＡ−ＤＲ１５／５１およびＤＲ１３拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ４特異的Ｔｈ細胞は、ＨＤ３（上パネル）およびＨＤ１０（下パネル）のＰＢＭＣから生成された。
【図２Ｅ】（Ｅ）ＨＬＡ−ＤＲ１３およびＤＲ９拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ５特異的Ｔｈ細胞は、ＨＤ１０（上パネル）およびＨＤ５（下パネル）のＰＢＭＣから生成された。
【図３Ａ】図３はＧＰＣ３−ＬＰ１、２および４特異的Ｔ細胞クローンによって産生されたサイトカインプロファイルを示す。コグネイトペプチドでパルスした自己ＰＢＭＣとのＴｈ細胞の２４時間の共培養後、培養上清を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイシステムを用いてサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＩＰ１−β）の濃度を測定した。データは２連のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。
【図３Ｂ】図３（続き）
【図３Ｃ】図３（続き）
【図４】図４は、組換えヒトＧＰＣ３タンパク質をロードしたＤＣによるＧＰＣ３−ＬＰの天然プロセシングおよび提示を示す。（Ａ）ドナーＨＤ１０から樹立したＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ（ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２：０２）拘束性およびＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔｈクローンが、組換えヒトＧＰＣ３タンパク質をロードした自己ＤＣを認識した。同様の結果を示す、２連で行った２つの独立した実験からの代表的なデータを示す。（Ｂ）ドナーＨＤ１０から樹立したＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ１特異的Ｔｈクローンが、組換えヒトＧＰＣ３タンパク質をロードした自己ＤＣを認識した。（Ｃ）ドナーＨＤ１０から樹立したＨＬＡ−ＤＲ１３拘束性およびＧＰＣ３−ＬＰ４特異的Ｔｈクローンが、組換えヒトＧＰＣ３タンパク質をロードした自己ＤＣを認識した。同様の結果を示した、２連で行った３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。（Ｄ）ドナーＨＤ１０から樹立したＨＬＡ−ＤＲ１３拘束性およびＧＰＣ３−ＬＰ５特異的Ｔｈ細胞が、組換えヒトＧＰＣ３タンパク質をロードした自己ＤＣを認識した。
【図５Ａ】図５は、ＤＣが、インビトロでＡ２−ＧＰＣ３１４４−１５２−ＳＰ特異的およびＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬに対するＧＰＣ３−ＬＰ２の効率的な交差提示およびＨＬＡ−Ａ２  Ｔｇｍにおいてインビボでクロスプライミングを誘導することを示す。（Ａ）健常ドナーであるＨＤ５（ＨＬＡ−Ａ２＋およびＨＬＡ−ＤＰ２＋）から樹立されたＡ２−ＧＰＣ３１４４−１５２ＳＰ特異的ＣＴＬは、インビトロにおいて、リポソームに封入されたＧＰＣ３−ＬＰ２（Ｌｉｐ−ＧＰＣ３−ＬＰ２）、リポソームに封入されたＩＭＰ３５０７−５２７ＬＰ（Ｌｉｐ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ＬＰ）、リポソームおよび水溶性のＧＰＣ３−ＬＰ２（Ｌｉｐ＋ＧＰＣ３−ＬＰ２）またはリポソーム単独（Ｌｉｐ）でパルスされた自己ＤＣによって刺激された。同様の結果を示した３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。（Ｂ〜Ｄ）ＨＬＡ−Ａ２  Ｔｇｍマウスは、ＩＦＡ（ＳＰ−ＩＦＡ−ＰＢＳ）で乳化されたＡ２−ＧＰＣ３１４４−１５２ＳＰ、ＧＰＣ３−ＬＰ２（ＬＰ２−ＩＦＡ−ＰＢＳ）またはＩＦＡ（ＩＦＡ−ＰＢＳ）で乳化されたＰＢＳで免疫された。２回目の免疫から７日後、マウスＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞をプールされた鼠径リンパ節から単離し、エクスビボでＧＰＣ３−ＬＰ２もしくはＧＰＣ３−ＬＰ５（対照ＬＰ）およびＡ２−ＧＰＣ３１４４−１５２ＳＰ、Ａ２−ＣＤＣＡ１−ＳＰまたはＡ２−ＨＩＶ−ＳＰでパルスしたＢＭＤＣで刺激した。ＩＦＮ−γ産生マウスＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の数はエクスビボＥＬＩＳＰＯＴによって解析された。同様の結果を示す、２連または３連で行った、少なくとも２〜４つの独立した実験（各々のグループにおいて２から３匹のマウス）からの代表的なデータを示す。
【図５Ｂ】（Ｂ）等量のＳＰとＬＰ分子が、免疫化のために使用された。
【図５Ｃ】（Ｃ）等モル用量のペプチドを用いた場合、ＧＰＣ３−ＬＰ２免疫は、インビボでＧＰＣ３−Ａ２−ＳＰの免疫化と比較してＳＰ特異的ＣＴＬ応答の増加を誘導した。
【図５Ｄ】（Ｄ）同じプールされた鼠径リンパ節から単離されたＧＰＣ３−ＬＰ２特異的ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の応答。
【図６Ａ】図６は、ＧＰＣ３−ＳＰをワクチン接種した肝細胞がん（ＨＣＣ）患者のＰＢＭＣにおけるＧＰＣ３−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の存在を示す（Ａ〜Ｃ）。ＧＰＣ３−ＳＰ（表３）をワクチン接種したＨＣＣ患者由来の凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をインビトロでＧＰＣ３−ＬＰ１、２、３、４および５の混合物ならびにＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激した。７日後、（Ａ）で要約されるように、個々のＧＰＣ３−ＬＰ特異的Ｔ細胞の頻度を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで検出した。Ｔｈ細胞応答は、試験した１８人のＨＣＣ患者のうち１１人で観察された。ＧＰＣ３−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞のＨＬＡクラスＩＩ拘束は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱまたはＤＰ特異的モノクローナル抗体を使用したブロッキングアッセイによって決定された。
【図６Ｂ】ＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔｈ細胞応答。
【図６Ｃ】ＧＰＣ３−ＬＰ３特異的Ｔｈ細胞応答。
【図６Ｄ】ＧＰＣ３−ＬＰ４特異的Ｔｈ細胞応答。
【図６Ｅ】ＧＰＣ３−ＬＰ５特異的Ｔｈ細胞応答。
【図７Ａ】図７は、コンピュータアルゴリズムによって予測された、ＣＴＬエピトープを網羅したＧＰＣ３由来およびプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを示す。（Ａ）図７Ａにおいて、矢印はアスパラギンまたはセリンにおいてグリコシル化の可能性がある部位を示し、そのアミノ酸位置は、１２４、２４１、４１８、４９５および５０９である。ヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列を、アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｍｈｃｉｉ／）を用いて解析した。横軸の数字は、ＧＰＣ３由来の１５ｍｅｒペプチドのＮ末端のアミノ酸位置を示す。小さく番号付けられたコンセンサスパーセンタイル順位は、ＨＬＡクラスＩＩ分子への高い結合親和性を示す。候補ペプチドの選択のため、アスパラギンおよびセリンにおける潜在的なグリコシル化部位を含む領域を避けた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ５１６５４）。
【図７Ｂ】（Ｂ）複数のＨＬＡクラスＩＩアリル産物（ＤＲＢ１＊０９：０１、ＤＲＢ１＊０４：０５、ＤＲＢ１＊０７：０１、ＤＲＢ１＊１３：０２、ＤＲＢ１＊１５：０２、ＤＰＢ１＊０２：０１およびＤＲＢ１＊０５：０１）について高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつＨＬＡ−Ａ２または−Ａ２４拘束性ＣＴＬによって認識される９ｍｅｒペプチド（Ａ２−ＧＰＣ３１４４−１５２、Ａ２４−ＧＰＣ３２９８−３０６）を有する、ＬＰ、ＧＰＣ３−ＬＰ１；ＧＰＣ３９２−１１６（２５−ｍｅｒ）、ＧＰＣ３−ＬＰ２；ＧＰＣ３１３７−１６１（２５−ｍｅｒ）、ＧＰＣ３−ＬＰ３；ＧＰＣ３２８９−３１３（２５−ｍｅｒ）、ＧＰＣ３−ＬＰ４；ＧＰＣ３３８６−４１２（２７−ｍｅｒ）およびＧＰＣ３−ＬＰ５；ＧＰＣ３５５６−５７６（２１−ｍｅｒ）を個々に（Ａ）では棒で示し、（Ｂ）では下線を引いて示す。
【図８Ａ】図８は、健常ドナーからのＧＰＣ３−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の誘導を示す。ＧＰＣ３−ＬＰによる刺激によって、健常ドナーのＰＢＭＣからＧＰＣ３−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞を生成した。生成されたＴｈ細胞を、ＧＰＣ３−ＬＰでパルスした自己ＰＢＭＣまたは同種異系のＰＢＭＣで再度刺激した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数はＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって解析された。同様の結果を示した少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。ドナーのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型をパネル上部に示す。下線の引かれたＨＬＡ−クラスＩＩアリルは、ペプチドをＴｈ細胞に提示したＨＬＡ−クラスＩＩ分子をコードする。（Ａ）ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ３特異的Ｔｈ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ９／１４＋健常ドナー（ＨＤ１１）から生成した（図１に関連する）。
【図８Ｂ】（Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ１３／５２ｂ拘束性ＧＰＣ３特異的Ｔｈ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ７／１３＋健常ドナー（ＨＤ１０）のＰＢＭＣから生成した。ＨＤ１０は、Ｌ細胞を用いて、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂであることが後ほど確認された。
【図８Ｃ】（Ｃ）ＨＬＡ−ＤＰ２拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔｈ細胞を、ＨＬＡ−ＤＰ２＋健常ドナー（ＨＤ５）のＰＢＭＣから生成した。
【図８Ｄ】（Ｄ）ＨＬＡ−ＤＲ８拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔｈ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０３／１４：０５＋健常ドナー（ＨＤ４）から生成した（（Ｂ）から（Ｄ）は、図２に関連する）。
【図８Ｅ】（Ｅ）ＨＬＡ−ＤＲ８拘束性ＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔｈ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０３／１４：０５＋健常ドナー（ＨＤ４）から生成した。
【図９】図９は、ＧＰＣ３−ＬＰ２の免疫化が、等モルのペプチド用量を使用した場合に、Ａ２−ＧＰＣ３−ＳＰの免疫化と比較して、インビボにおいてＳＰ特異的ＣＴＬ応答の増大を誘導することを示す。ＨＬＡ−Ａ２／（Ｉ−Ａｂ）Ｔｇｍ（３マウス／グループ）を、ＩＦＡ中に乳化した等モル用量のＡ２−ＧＰＣ３−ＳＰ（ＳＰ−ＩＦＡ−ＰＢＳ  ５０μｇ）、ＧＰＣ３−ＬＰ２（ＬＰ２−ＩＦＡ−ＰＢＳ、１３２．５μｇ）またはＰＢＳ（ＩＦＡ−ＰＢＳ）のみにて７日間隔で２回免疫した。（Ａ）２回目の免疫の７日後に、マウスＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気ビーズ（陽性選択）を用いて、３匹のマウスのプールされた鼠径リンパ節から単離し、エクスビボにて、Ａ２−ＧＰＣ３−ＳＰまたはＡ２−ＣＤＣＡ１−ＳＰでパルスしたＢＭＤＣで刺激した。（Ｂ）同じプールされた鼠径リンパ節から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞をＧＰＣ３−ＬＰ２またはＧＰＣ３−ＬＰ５（対照ＬＰ）でパルスしたＢＭＤＣで刺激した。ＩＦＮ−γ産生マウスＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の数をエクスビボＥＬＩＳＰＯＴによって解析した。同様の結果を示した、３連で行った２つの独立した実験（３マウス／グループ）からの代表的なデータを示す。
【図１０Ａ−１】図１０は、ＧＰＣ３−ＳＰをワクチン接種したＨＣＣ患者のＰＢＭＣにおける、ＧＰＣ３−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の存在を示す（Ａ〜Ｃ）。ＧＰＣ３−ＳＰ（表３）をワクチン接種したＨＣＣ患者由来の凍結末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、インビトロにおいて、ＧＰＣ３−ＬＰ１、２、３、４および５の混合物ならびにＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激した。７日後、個々のＧＰＣ３−ＬＰ特異的Ｔ細胞の頻度をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した。ＧＰＣ３−ＬＰ２特異的（Ａ）、ＬＰ３特異的（Ｂ）、ＬＰ４特異的（Ｃ）、ＬＰ５特異的（Ｄ）Ｔｈ細胞応答が、ＨＣＣ患者で観察された。ＧＰＣ３−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞のＨＬＡクラスＩＩ拘束は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱまたはＤＰ特異的モノクローナル抗体を用いたブロッキングアッセイによって決定した。
【図１０Ａ−２】図１０Ａ（続き）
【図１０Ｂ】ＧＰＣ３−ＬＰ３特異的Ｔｈ細胞応答。
【図１０Ｃ】ＧＰＣ３−ＬＰ４特異的Ｔｈ細胞応答。
【図１０Ｄ】ＧＰＣ３−ＬＰ５特異的Ｔｈ細胞応答。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
ＩＩ．ペプチド
以下で詳細に説明する本発明のペプチドは、「ＧＰＣ３ペプチド」または「ＧＰＣ３ポリペプチド」と称され得る。
ＧＰＣ３に由来するペプチドがＴヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞によって認識される抗原として機能することを明らかにするため、ＧＰＣ３（配列番号：９または１１）に由来するペプチドを、これらがＭＨＣクラスＩＩ分子によってプロミスキャスに拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定するために分析した。ＧＰＣ３に由来するプロミスキャスなＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＰ２およびＨＬＡ−ＤＰ５への結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドをロードした樹状細胞（ＤＣ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞のインビトロ刺激後、以下のペプチドの各々を用いてＴｈ１細胞を成功裏に樹立した：
ＧＰＣ３９２−１１６−ＬＰ／ＬＬＱＳＡＳＭＥＬＫＦＬＩＩＱＮＡＡＶＦＱＥＡＦＥ（配列番号：１）、
ＧＰＣ３１３７−１６１−ＬＰ／ＬＴＰＱＡＦＥＦＶＧＥＦＦＴＤＶＳＬＹＩＬＧＳＤＩ（配列番号：２）、
ＧＰＣ３２８９−３１３−ＬＰ／ＶＶＥＩＤＫＹＷＲＥＹＩＬＳＬＥＥＬＶＮＧＭＹＲＩ（配列番号：３）
ＧＰＣ３３８６−４１２−ＬＰ／ＳＲＲＲＥＬＩＱＫＬＫＳＦＩＳＦＹＳＡＬＰＧＹＩＣＳＨ（配列番号：４）、および
ＧＰＣ３５５６−５７６−ＬＰ／ＧＮＶＨＳＰＬＫＬＬＴＳＭＡＩＳＶＶＣＦＦ（配列番号：５）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
上記複合体に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象の型とマッチしなければならない。例えば、日本人においては、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＰ２およびＨＬＡ−ＤＰ５が一般的であり、それゆえ日本人患者の治療に適する。典型的には、臨床において、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を前もって検査し、これにより特定のＨＬＡクラスＩＩ抗原への結合能力を有するペプチドの適切な選択が可能になる。好ましい態様では、本発明のペプチドはＴｈ１細胞をプロミスキャスに誘導することができる。本明細書では、ペプチドが少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ１細胞を誘導することができる場合、このペプチドのＴｈ１細胞誘導能は「プロミスキャス」である。言い換えると、ペプチドが少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識される場合、そのような抗原認識は「プロミスキャス」とみなされる。ペプチドに関連して使用する場合、「少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識される」という語句は、ペプチドまたはその断片が少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できることを示す。例えば、ＧＰＣ３９２−１１６−ＬＰ（配列番号：１）は、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂおよびＨＬＡ−ＤＲ９によって認識され、かつＧＰＣ３１３７−１６１−ＬＰ（配列番号：２）は、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５によって認識され、ＧＰＣ３２８９−３１３−ＬＰ（配列番号：３）は、ＨＬＡ−ＤＲ９によって認識され、ＧＰＣ３３８６−４１２−ＬＰ（配列番号：４）は、ＨＬＡ−ＤＲ１３によって認識され、ＧＰＣ３５５６−５７６−ＬＰ（配列番号：５）は、ＨＬＡ−ＤＲ１３およびＨＬＡ−ＤＲ９によって認識される。それゆえ、これらのペプチドは「プロミスキャス」なエピトープの典型的な例である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂまたはＨＬＡ−ＤＲ９陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましくは使用される。ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＤＰ５陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましくは使用される。ＨＬＡ−ＤＲ９陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましくは使用される。ＨＬＡ−ＤＲ１３陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましくは使用される。ＨＬＡ−ＤＲ１３またはＨＬＡ−ＤＲ９陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：５のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましくは使用される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
したがって、好ましい態様では、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ５２ｂまたはＨＬＡ−ＤＲ９を有すると同定された対象において、Ｔｈ１細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＤＰ５を有すると同定された対象において、Ｔｈ１細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ９を有すると同定された対象において、Ｔｈ１細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ１３を有すると同定された対象において、Ｔｈ１細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号：５のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ１３またはＨＬＡ−ＤＲ９を有すると同定された対象において、Ｔｈ１細胞の誘導のために使用し得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
好ましい態様では、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂおよびＨＬＡ−ＤＲ９から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：１のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。別の態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５の中から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：２のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。別の態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ９のＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：３のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。別の態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ１３のＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：４のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。別の態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ１３およびＨＬＡ−ＤＲ９の中から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：５のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＰ２およびＨＬＡ−ＤＰ５は、それぞれＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２：０２、ＨＬＡ−ＤＲ１＊０９：０１、ＨＬＡ−ＤＲ１＊１３：０２、ＨＬＡ−ＤＲ１＊１４：０５、ＨＬＡ−ＤＲ１＊１５：０２、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２：０１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１であり得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
本発明はさらに、両方のＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドでの形質導入によって調製されるＴｈ１細胞を提供し、ここで、ＴＣＲサブユニットはＧＰＣ３ペプチド（例えばＨＬＡ−ＤＲ５２ｂもしくはＨＬＡ−ＤＲ９に関しては配列番号：１、ＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５もしくはＨＬＡ−ＤＰ５に関しては配列番号：２、ＨＬＡ−ＤＲ９に関しては配列番号：３、ＨＬＡ−ＤＲ１３に関しては配列番号：４およびＨＬＡ−ＤＲ１３もしくはＨＬＡ−ＤＲ９に関しては配列番号：５）に結合することができる。形質導入されたＴｈ１細胞は、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、インビトロで周知の培養方法によって増殖させることができる（例えばＫａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３４５２−３４６１（１９８９））。上述したように調製したＴｈ１細胞は、治療または予防を必要とする患者においてがんを治療するまたは予防する上で有用な免疫原性組成物を形成するために使用できる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
あるいは、好ましい態様では、本発明の過程で同定されたペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４を有する対象に適用された場合、ＧＰＣ３に特異的なＣＴＬを誘導することもできる。たがって、本発明のペプチドの投与を通して、Ｔｈ１細胞の誘導に加えてＧＰＣ３を発現するがんに対するＣＴＬ応答が誘導され得ることがさらに期待される。さらに、本発明のペプチドは、ＧＰＣ３発現細胞に対するＣＴＬ応答を、そのプロセシングを介して誘導することができるだけでなく、それによって媒介されるＴｈ１細胞誘導により、ＣＴＬ応答を増強することもできる。したがって、同じ対象においてＴｈ１細胞およびＧＰＣ３特異的ＣＴＬの両方の誘導を達成するために、例えば、治療される対象は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを投与する場合は、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５を有し、およびＭＨＣクラスＩ分子としてＨＬＡ−Ａ２を有する。したがって、同じ対象においてＴｈ１細胞およびＧＰＣ３特異的ＣＴＬの両方の誘導を達成するために、例えば、治療される対象は、配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドを投与する場合は、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ９を有し、およびＭＨＣクラスＩ分子としてＨＬＡ−Ａ２４を有する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドを投与する前に対象のＨＬＡ型を同定し得る。例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ５２ｂまたはＨＬＡ−ＤＲ９を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５、またはＨＬＡ−ＤＰ５を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ９を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ１３を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号：５のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ１３またはＨＬＡ−ＤＲ９を有すると同定された対象に投与する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
プロミスキャスなＧＰＣ３由来Ｔｈ細胞エピトープの同定
健常ドナーのＰＢＭＣから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、週１回の間隔で、ＧＰＣ３−ＬＰでパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。少なくとも３回の刺激後、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＧＰＣ３−ＬＰ特異的応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって調べた。
ＧＰＣ３−ＬＰ１：ＧＰＣ３９２−１１６は、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に健常ドナー（ＨＤ１０）ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂから抗原特異的Ｔｈ細胞を生成することができる（図１Ａ）。ＧＰＣ３−ＬＰ１もまた、ＨＬＡ−ＤＲ依存的にＨＤ５：ＤＲＢ１＊０４：０５／０９：０１／ＤＲ５３から抗原特異的Ｔｈ細胞を生成することができる（図１Ａ）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂ由来のＧＰＣ３−ＬＰ２：ＧＰＣ３１３７−１６１誘導Ｔｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ２でパルスしたＰＢＭＣに応答してＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１Ｂ）。他のＨＬＡクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ細胞において、ＧＰＣ３−ＬＰ２が応答を誘導するかどうかを調べるために、ＨＬＡ−ＤＲ１３陰性健常ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞を試験した。ＨＤ５：ＤＰＢ１＊０２：０１／０４：０２から生成されたＴｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ２でパルスしたＰＢＭＣに応答してＨＬＡ−ＤＰ依存的に有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１Ｂ）。ＧＰＣ３−ＬＰ２が、健常ドナー、ＨＤ４：ＤＲＢ１＊０８：０３／１４：０５（図１Ｂ）およびＨＤ１１：ＤＲＢ１＊０９：０１／１４：５４／ＤＲ５３（図１Ｂ）から、特異的Ｔｈ細胞をＨＬＡ−ＤＲ依存的に生成させたこともまた、認められた。ＨＤ３：ＤＲＢ１＊０８：０２／１５：０２からのＰＢＭＣにおけるペプチド特異的応答もまた検出された（データ示さず）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
次に、我々はＧＰＣ３−ＬＰ３；ＧＰＣ３２８９−３１３がペプチド特異的Ｔｈ細胞を生成することができるかどうかについて評価した。ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂから生成されたＴｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ３でパルスしたＰＢＭＣ応答において、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１Ｃ）。ＨＤ５：ＤＲＢ１＊０４：０５／０９：０１／ＤＲ５３から産生されたＴｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ３でパルスしたＰＢＭＣ応答において、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１Ｃ）。ＨＤ１１：ＤＲＢ１＊０９：０１／１４：５４／ＤＲ５３から産生されたＴｈ細胞もまた、ＧＰＣ３−ＬＰ３でパルスしたＰＢＭＣ応答において、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図８Ａ）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
抗原特異的Ｔｈ細胞を生成するＧＰＣ３−ＬＰ４；ＧＰＣ３３８６−４１２の能力についてもまた評価した。ＨＤ３：ＤＲＢ１＊０８：０２／１５：０２から生成されたＴｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ４でパルスしたＰＢＭＣ応答において、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１Ｄ）。ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂから生成されたＴｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ４でパルスしたＰＢＭＣ応答において、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１Ｄ）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３２】
次に、抗原特異的Ｔｈ細胞を生成するＧＰＣ３−ＬＰ５；ＧＰＣ３５５６−５７６の能力について評価した。ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂから生成されたＴｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ５でパルスしたＰＢＭＣ応答において、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１Ｅ）。ＨＤ５：ＤＲＢ１＊０４：０５／０９：０１／ＤＲ５３から生成されたＴｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ５でパルスしたＰＢＭＣ応答において、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１Ｅ）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
ＧＰＣ３特異的Ｔｈ細胞の拘束ＨＬＡクラスＩＩ分子の正確な同定
ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂ由来のバルクＧＰＣ３−ＬＰ１特異的Ｔｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ１でパルスされたＲＭ３−ＤＲ５２ｂ細胞（図２Ａ）をＨＬＡ−ＤＲ依存的に特異的に認識したが（データ示さず）、しかし、Ｌ−ＤＲ７、Ｌ−ＤＲ１３、Ｌ−ＤＲ５３、Ｌ−ＤＲ５２ａでパルスしたＧＰＣ３−ＬＰ１は認識しなかった。ＨＤ５：ＤＲＢ１＊０４：０５／０９：０１／ＤＲ５３由来の他のバルクＧＰＣ３−ＬＰ１特異的Ｔｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ１でパルスされたＬ−ＤＲ９細胞をＨＬＡ−ＤＲ依存的に特異的に認識したが、しかし、Ｌ−ＤＲ８またはＬ−ＤＲ５３でパルスされたＧＰＣ３−ＬＰ１は認識しなかった（図２Ａ）。これらの結果は、ＧＰＣ３−ＬＰ１が少なくともＨＬＡ−ＤＲ５２ｂおよびＨＬＡ−ＤＲ９によって提示されていることを示している。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂから生成されたバルクＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔ細胞の拘束ＨＬＡクラスＩＩ分子を同定するために、Ｔｈ細胞クローン（Ｔｈクローン）を生成した。Ｔｈクローン細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ２でパルスしたＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ（ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２：０２）がトランスフェクションされたＲＭ３細胞株および２人のＨＬＡ−ＤＲ１３＋ＤＲ７−健常ドナーからの同種異系ＰＢＭＣを特異的に認識した（図２Ｂ、図８Ｂ）。これらの結果は、ＧＰＣ３−ＬＰ２がＨＬＡ−ＤＲ５２ｂによって提示されたことを示している。ＨＤ５：ＤＰＢ１＊０２：０１／０４：０２から生成された、ＧＰＣ３−ＬＰ２特異的Ｔ細胞からのＴｈクローンは、ＧＰＣ３−ＬＰ２でパルスされた、Ｌ−ＤＰ細胞、および共通のＨＬＡ−ＤＰ２分子を有する同種異系ＰＢＭＣを特異的に認識することができるが、ＧＰＣ３をパルスしたＲＭ３−ＤＰ４細胞もＨＬＡ−ＤＰ２がない同種異系ＰＢＭＣも認識しない。ＧＰＣ３−ＬＰ２はＨＬＡ−ＤＰ２拘束性Ｔｈ細胞を誘導することが確認された（図２Ｂ、図８Ｃ）。ＧＰＣ３−ＬＰ２は、ＡＰＣとしての同種異系ＰＢＭＣおよびＬ細胞トランスフェクタントの両方によって確認される、ＨＬＡ−ＤＲ８−（ＤＲＢ１＊０８：０３）拘束性Ｔｈ細胞を生成した（図８Ｄ、図８Ｅ）。したがって、ＧＰＣ３−ＬＰ２がＨＬＡ−ＤＲ５２ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９／１４およびＨＬＡ−ＤＲ８／１５と結合すること（データ示さず）は、ＧＰＣ３−ＬＰ２が、いくつかの高頻度ＨＬＡクラスＩＩ分子（Ｓａｉｔｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５６：５２２−９．；Ｍａｃｋ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５５：３８３−４００）によって提示されるプロミスキャスなＴｈ細胞エピトープであることを示唆する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂから生成されたＧＰＣ３−ＬＰ３特異的バルクＴｈ細胞は、２人のＨＬＡ−ＤＲ１３＋ドナー（ＨＤ７、ＨＤ９）からの同種異系ＰＢＭＣを認識することができず、ＧＰＣ３−ＬＰ３がＨＬＡ−ＤＲ７またはＤＲ５３拘束性Ｔｈ細胞を生成することが結論付けられた（図２Ｃ）。ＨＤ５：ＤＲＢ１＊０４：０５／０９：０１／ＤＲ５３からのＧＰＣ３−ＬＰ３特異的バルクＴｈ細胞は、ＧＰＣ３−ＬＰ３でパルスしたＬ−ＤＲ９細胞をＨＬＡ−ＤＲ依存的に特異的に認識するが、ＧＰＣ３−ＬＰ３でパルスしたＬ−ＤＲ４またはＬ−ＤＲ５３細胞は認識しなかった（図２Ｃ）。これらの結果は、ＧＰＣ３−ＬＰ３が、ＨＬＡ−ＤＲ９によって提示されることを示す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
ＧＰＣ３−ＬＰ４反応性Ｔｈクローンは、ＨＤ３：ＤＲＢ１＊０８：０２／１５：０２から生成されたバルクＴｈ細胞から確立された。次に、同種異系ＰＢＭＣは、共通のＨＬＡ−ＤＲ分子による拘束を決定するためのＡＰＣとして用いられた。ＧＰＣ３−ＬＰ４はＨＬＡ−ＤＲ１５またはＤＲ５１拘束性Ｔｈ細胞を生成することが確認された（図２Ｄ）。ＧＰＣ３−ＬＰ４反応性Ｔｈクローンはまた、ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂから樹立された。ＧＰＣ３−ＬＰ４反応性Ｔｈクローンは、Ｌ−ＤＲ１３を特異的に認識し、ＧＰＣ３−ＬＰ４でパルスしたＬ−ＤＲ７を認識しなかった。ＧＰＣ３−ＬＰ４がＨＬＡ−ＤＲ１３拘束性Ｔｈ細胞を生成することが結論付けられた（図２Ｄ）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂ由来のＧＰＣ３−ＬＰ５反応性ＴｈクローンはＬ−ＤＲ１３を認識することができたが（図２Ｅ）、ＧＰＣ３−ＬＰ５でパルスしたＬ−ＤＲ７、Ｌ−ＤＲ５３、Ｌ−ＤＲ５２ａ細胞もＲＭ３−ＤＲ５２ｂ細胞も認識できなかった。もう一つのＨＤ５：ＤＲＢ１＊０４：０５／０９：０１／ＤＲ５３由来のＧＰＣ３−ＬＰ５反応性ＴｈクローンはＬ−ＤＲ９を認識することができたが、ＧＰＣ３−ＬＰ５でパルスしたＬ−ＤＲ−４細胞もＬ−ＤＲ５３細胞を認識することができなかった。したがって、ＧＰＣ３−ＬＰ５はＨＬＡ−ＤＲ１３およびＨＬＡ−ＤＲ９拘束性Ｔｈ細胞を生成すると結論付けられた（図２Ｅ）。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
ＤＣによるＧＰＣ３−ＬＰの天然のプロセシングおよび提示の可能性
ＤＣがＧＰＣ３タンパク質を取り込み、プロセシングして、ＬＰによる刺激によって生成されたＧＰＣ３−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞を刺激するかどうかを評価した。組換えＧＰＣ３タンパク質をロードしたＤＣを調製し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＡＰＣとして使用した（Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２０１１；１０２：７１−８．）；Ｈａｒａｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；１２３：２６１６−２５．）。ＨＤ１０：ＤＲＢ１＊０７：０１／１３：０２／ＤＲ５３／ＤＲ５２ｂから生成された４つのＧＰＣ３−ＬＰ（ＧＰＣ３−ＬＰ１、３、４および５）反応性Ｔｈ細胞は、ＧＰＣ３タンパク質をロードしたＤＣを効率よく認識したが、対照タンパク質をロードしたＤＣは認識せず、このことは、これらのエピトープが、ＧＰＣ３タンパク質から天然にプロセシングされることを示している（図４）。この結果はＧＰＣ３−ＬＰ１、３、４および５がＧＰＣ３タンパク質から天然にプロセシングされ、ＤＣによって提示されることを示唆している。