(57)【要約】シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、８０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程；およびアスタキサンチンを含有する油分を抽出する工程により、アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む緑藻抽出物を得ることができる。好ましい緑藻は、ヘマトコッカス属に属する緑藻である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む、緑藻抽出物。
【請求項２】
前記緑藻がヘマトコッカス属に属する単細胞藻類である、請求項１に記載の緑藻抽出物。
【請求項３】
前記緑藻がヘマトコッカス・プルビアリスである、請求項１または２に記載の緑藻抽出物。
【請求項４】
前記緑藻が、独立栄養培地にて培養される、請求項１から３のいずれかの項に記載の緑藻抽出物。
【請求項５】
シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、８０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程；およびアスタキサンチンを含有する油分を抽出する工程；を含む、アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む緑藻抽出物の製造方法。
【請求項６】
前記栄養培地が、独立栄養培地である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記光合成有効光量子束投入量が、２４００００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以下である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記緑藻がヘマトコッカス属に属する単細胞藻類である、請求項５から７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
前記緑藻がヘマトコッカス・プルビアリスである、請求項５から８のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１０】
シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、８０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程；アスタキサンチンを含有する油分を抽出する工程；および該抽出されたアスタキサンチンを含有する油分からアスタキサンチンを回収する工程；を含む、アスタキサンチンの製造方法。
【請求項１１】
前記栄養培地が、独立栄養培地である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記光合成有効光量子束投入量が、２４００００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以下である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記緑藻がヘマトコッカス属に属する単細胞藻類である、請求項１０から１２のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１４】
前記緑藻がヘマトコッカス・プルビアリスである、請求項１０から１３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１５】
アスタキサンチンを３．１質量％以上の濃度で含む緑藻乾燥物から得られる、緑藻抽出物。
【請求項１６】
アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む、請求項１５に記載の緑藻抽出物。
【請求項１７】
前記緑藻が、独立栄養培地にて培養される、請求項１５または１６に記載の緑藻抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アスタキサンチンの効率的な生産に関する。さらに詳しくは、アスタキサンチン含量が高い緑藻抽出物およびその製造方法に関する。
【背景技術】  アスタキサンチンは、赤色のカロチノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。そのため、食材用色素、化粧品、健康食品、医薬品などとして使用されている。アスタキサンチンは、化学合成されるものの他、天然物由来のものがある。天然物由来のアスタキサンチンは、オキアミ、アマエビなどのエビ類、ファフィア酵母、藻類などから抽出されている。しかし、オキアミなどのエビ類あるいは酵母は、アスタキサンチン含量が低いため、これらから効率よくアスタキサンチンを抽出できない。
他方、藻類は、外部環境の変化の結果としてシスト化し、藻体内にアスタキサンチンを蓄積する。そのため、藻類によるアスタキサンチンの生産研究が行われている。Ｆａｂｒｅｇａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８９，ｐ６５，（２００１）には、ヘマトコッカスの栄養細胞を、１日に培養液の１０〜４０％を交換しながら培養を行い（すなわち、半回分培養）、さらに光を照射しながら１５日間回分培養することによる、２段階培養方法が記載されている。特表平２−５０１１８９号公報には、培養末期に培地成分の炭素と窒素との比率を変えてヘマトコッカスを培養することにより、アスタキサンチンを生産することが記載されている。また、特開平１−１８７０８２号公報には、金属塩を添加した培地で藻類を培養し、アスタキサンチンを生産する方法が記載されている。しかし、これらの文献には、藻体中のアスタキサンチンの含量についての記載はない。
特開平３−８３５７７号公報にはアスタキサンチンの藻体内含量として、乾燥藻体あたり０．３〜１０質量％の値が記載されているが、藻体を窒素制限下、４００００ルクスの培養条件で培養した実施例においては、アスタキサンチン含量は２質量％程度であり、実際に１０質量％あるいはこれを超えるアスタキサンチン濃度の藻体は得られていない。さらに、特開２０００−６０５３２号公報には、屋外培養池で培養したヘマトコッカスは藻体あたり４．５質量％のアスタキサンチンを有していたことが記載されている。
藻体内のアスタキサンチン含量についても検討されており、例えば、特開平７−３９３８９号公報およびＴｊａｈｊｏｎｏら、ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＬＥＴＴＥＲＳ，ｖｏｌ．１６，ｐ１３３−１３８，（１９９４）には、培養温度を３０℃とし、鉄イオンと酢酸との存在下で培養して、約６００ｐｇ／細胞のアスタキサンチンが生産されたことが記載されている。さらに、特開２００４−１２９５０４号公報には、アスタキサンチンを約７００ｐｇ／細胞以上の量まで上げることは可能であると記載されている。しかし、実際にはそのような高濃度でアスタキサンチンを含有する藻類は得られておらず、特開２００４−１２９５０４号公報に記載された実施例中の最高値でも、１５６ｐｇ／細胞にすぎない。
ＷＯ２００５／１１６２３８号には、キサントフィルを含有する微細藻類、例えば、シスト化した微細藻類を栄養培地に接種して栄養細胞として増殖させ、さらにシスト化させることにより、効率的にキサントフィルを製造する方法が開示されている。このＷＯ２００５／１１６２３８号の実施例において、乾燥藻体中のキサントフィル（アスタキサンチン）の最高含量は、３．５質量％である。
アスタキサンチンの効率的な製造のため、より高濃度でアスタキサンチンを含有する藻類が望まれている。
【発明の開示】
本発明は、アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む緑藻抽出物を提供する。
本発明はまた、シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、８０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程；およびアスタキサンチンを含有する油分を抽出する工程；を含む、アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む緑藻抽出物の製造方法を提供する。
本発明はさらに、シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、８０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程；アスタキサンチンを含有する油分を抽出する工程；および該抽出されたアスタキサンチンを含有する油分からアスタキサンチンを回収する工程；を含む、アスタキサンチンの製造方法を提供する。
ある実施態様では、上記栄養培地は、独立栄養培地である。
１つの実施態様では、上記光合成有効光量子束投入量は、２４００００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以下である。
ある実施態様では、上記緑藻はヘマトコッカス属に属する単細胞藻類である。
別の実施態様では、上記緑藻はヘマトコッカス・プルビアリスである。
１つの実施態様では、上記緑藻は、独立栄養培地にて培養される。
本発明はまた、アスタキサンチンを３．１質量％以上の濃度で含む緑藻乾燥物から得られる緑藻抽出物を提供する。この緑藻抽出物は、アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む。
本発明によれば、アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む緑藻抽出物が提供される。抽出物中のアスタキサンチン濃度が高いので、さらに精製・濃縮することなく、そのまま食品や医薬品の材料として用いることができる。さらに、本発明の緑藻抽出物を用いれば、精製アスタキサンチンの生産効率を従来よりも向上させることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明に用いる培養装置の一例において培養を行う場合の培養槽の模式縦断面図である。
図２は、緑藻抽出物中のアスタキサンチン濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  （緑藻）
本発明に用いられる緑藻は、アスタキサンチンを生産し得る能力がある緑藻であれば、特に制限はない。例えば、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する単細胞藻類が好ましく用いられる。好ましい緑藻としては、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、ヘマトコッカス・ラクストリス（Ｈ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈ．ｃａｐｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（Ｈ．ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉ）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（Ｈ．ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。
ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）としては、独立行政法人国立環境研究所に寄託されているＮＩＥＳ１４４株、米国テキサス大学藻類保存施設に寄託されているＵＴＥＸ２５０５株、デンマークのコペンハーゲン大学のＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ，Ｂｏｔａｎｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに保存されているＫ００８４株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・ラクストリス（Ｈ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）としては、ＡＴＣＣに寄託されているＡＴＣＣ３０４０２株および同３０４５３株、東京大学分子細胞生物学研究所に寄託されているＩＡＭ  Ｃ−３９２株、同Ｃ−３９３株、同Ｃ−３９４株および同Ｃ−３３９株、あるいはＵＴＥＸ  １６株および同２９４株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈ．ｃａｐｅｎｓｉｓ）としては、ＵＴＥＸ  ＬＢ１０２３株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（Ｈ．ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉ）としては、ＵＴＥＸ  ５５株が挙げられる。
ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（Ｈ．ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）としては、ＵＴＥＸ  ＬＢ１７５８株などが挙げられる。
中でも、本発明においては、ヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
（シスト化）
本発明においては、アスタキサンチンを含有する上記の緑藻が用いられる。緑藻は、例えば、栄養飢餓状態、酸化物の存在など、生育環境からのストレスを受けると、細胞内にアスタキサンチンを蓄積し、休眠胞子化する。この休眠状態に入ることをシスト化という。本明細書では、シスト化は、休眠状態に入りアスタキサンチンを蓄積し始めた状態から完全にシスト化し休眠胞子となった状態までのいずれかの状態をいう。アスタキサンチン含量を高める観点からは、できるだけシスト化が進行し、アスタキサンチンを多く蓄積した緑藻を用いることが好ましい。なお、「シスト化した緑藻を培養する」というときには、緑藻がシスト化の状態に達した後に栄養培地で生育したアスタキサンチンを含有する緑藻を接種する過程も含むものとする。本明細書において、「緑藻」は、シスト化した緑藻を含むことも意図する。
（培地）
緑藻の培養に用いる培地としては、特に制限がない。一般に、増殖に必要な窒素と、微量金属の無機塩（例えば、リン、カリウム、マグネシウム、鉄など）、ビタミン類（例えば、チアミンなど）などを含む培地が用いられる。例えば、ＶＴ培地、Ｃ培地、ＭＣ培地、ＭＢＭ培地、ＭＤＭ培地などの培地（これらは、藻類研究法  千原光雄・西澤一俊編、共立出版（１９７９）を参照のこと）、ＯＨＭ培地（Ｆａｂｒｅｇａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８９，ｐ６５，（２００１）を参照のこと）、ＢＧ−１１培地、およびこれらの改変培地などが用いられる。本発明においては、雑菌の繁殖を防止できる点で、有機炭素源を実質的に含まない独立栄養培地を用いることが好ましい。
これらの培地は、増殖、シスト化などの目的に応じて選択することができる。例えば、緑藻の増殖を目的とする場合は、窒素源となる成分の多い培地（富栄養培地：窒素として、少なくとも０．１５ｇ／Ｌを含む培地）を用いる。シスト化を目的とする場合は、窒素源となる成分が少ない培地（シスト化培地：窒素として、０．０２ｇ／Ｌ未満）を用いる。あるいは、その中間の濃度の窒素源を含む培地（低栄養培地：窒素として、０．０２ｇ／Ｌ以上で、０．１５ｇ／Ｌ未満）を用いてもよい。
培地中の窒素源濃度、リン濃度などは、接種する緑藻の量に依存して決めればよい。例えば、１０５オーダーの緑藻が接種される場合、低栄養培地を用いると、ある程度まで緑藻は増殖するが、窒素源の量が少ないため、増殖はすぐに止まる。このような低栄養培地は、後述するように、一段階で（回分的に）増殖とシスト化を連続して行うに適した培地である。さらに、Ｎ／Ｐモル比を１０〜３０、好ましくは１５〜２５の値に調整することにより、シスト化へ導くこともできる。
接種する緑藻の数がさらに大きい場合、富栄養培地を用いて、上記培養を行うことができる。
このように、培地の組成は、種々の条件を考慮して決定することができる。なお、本発明で好適に用いられる培地、すなわち独立栄養培地には、酢酸、グルコースなどの有機炭素源がほとんど含まれないため、長期間にわたって培養を行っても、雑菌はほとんど繁殖しない。
（培養装置）
緑藻の培養装置は、二酸化炭素が供給でき、かつ培養液に光照射ができる装置であれば、特に制限はない。例えば、小スケールの場合は、扁平培養瓶が好ましく用いられる。大スケールの場合は、ガラス製、プラスチック製などの透明板で構成され、必要に応じて照明器および撹拌機を備えた培養槽が用いられる。このような培養槽としては、例えば、平板培養槽、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽などが挙げられる。また、いずれの場合も、密閉容器が好ましく用いられる。
本発明においては、培養装置として、例えば、一対の板材を所定の間隔で対向させてなる箱体を備え、一対の板材がそれぞれ外側に張り出したたわみを有するように構成されている、扁平型培養装置を用いることが好ましい（図１を参照のこと）。このような扁平型培養装置のたわみ部分の存在により、培養液中にゲルトラー渦を生じさせることができる。このゲルトラー渦は、上下方向への培養液の流れとほぼ垂直の方向（すなわち、水平方向）に発生するので、培養液は、水平方向に渦巻きながら上下方向に移動する。したがって、攪拌効率が向上するだけでなく、壁面への緑藻の付着も防止できる。
（培養条件）
培養条件に特に制限はなく、一般に、緑藻の培養に用いられる温度、ｐＨなどが用いられる。緑藻の培養は、例えば１５〜３５℃で行われ、好ましくは２０〜２５℃で行われる。培養中のｐＨは、６〜８に保たれることが好ましい。二酸化炭素は、１〜３容積％濃度の二酸化炭素を含有するガスを、例えば、０．２〜２ｖｖｍとなるように吹き込むことで、供給される。平板培養槽を用いる場合、この二酸化炭素の供給により、培養液が撹拌され、緑藻に対して光照射が均一に行われる。
（光照射）
本発明においては、緑藻の培養には、光合成有効光量子束投入量を８０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ（以下、この単位をμｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓと略す）以上、好ましくは１２０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓ以上、より好ましくは２５０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓ以上となるように光を照射する。また、強光によって光合成が阻害されると細胞の増殖が停止するため、光合成有効光量子束投入量は、２４００００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓ以下であることが好ましい。このような光合成有効光量子束投入量で、培養開始時からシスト化までの培養過程全般に亘って照射することにより、アスタキサンチンの生産量が非常に大きくなる。
なお、光合成有効光量子束投入量は、まず、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）を測定することにより、求められる。ＰＰＦＤは、培養装置の数箇所に平面光量子センサーＬＩ−１９０（ＬＩＣＯＲ  Ｉｎｃ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＳＡ）を配置し、光を照射して各箇所のＰＰＦＤを測定し、測定値を平均することにより、求めることができる。光源が複数存在する場合のＰＰＦＤは、それぞれの光源から受けるＰＰＦＤの合計となる。ガラス、アクリル樹脂などの透明板で構成された装置の場合、透明板を通過してくるＰＰＦＤを測定し、所定のＰＰＦＤに必要な光源の強さ、あるいは光源の距離を決定し、光源を配置すればよい。透明な２枚の平板から構成される培養槽を用い、両側から光照射する場合、それぞれの側からのＰＰＦＤの値を合計した値となる。
光合成有効光量子束投入量は以下の式により求められる。
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（培養方法）
培養は、上記培地、培養装置、培養条件などを適宜選択して組合せて、光照射下、行われる。培養方法には、２つの方法がある。一つは、シスト化した緑藻を、連続して同一の培地で増殖させ、シスト化させる、１段階培養法である。他の一つは、培地をシスト化した緑藻を増殖させるための培地とシスト化させるための培地とが互いに異なっており、増殖とシスト化とを別々に行う２段階培養法である。
（１段階培養法）
１段階培養法は、シスト化した緑類を栄養培地に接種してから培養終了までの間、培地を交換することなく連続的に培養する方法である。すなわち、所定の培地で、同一培養槽内で、緑藻の増殖およびシスト化を行う。この１段階培養法では、緑藻はいったん増殖し、培地中の栄養成分の消費による栄養飢餓ストレス、光照射によるストレスなどを受けて、シスト化状態にスムーズに移行する。この１段階培養法で得られたシスト化した緑藻は、さらに、次の１段階培養、あるいは後述の２段階培養の前培養培地に接種するために用いてもよい。
アスタキサンチンを含有する緑藻（好ましくはシスト化した緑藻）が栄養培地に接種されると、アスタキサンチンを含む遊走子が２ｎ個（ｎ＝１〜４）放出される。この遊走子がアスタキサンチンを含んだまま栄養細胞となるので、アスタキサンチンを含む栄養細胞の数が増加する（言い換えれば、緑藻が増殖する）。このアスタキサンチンを含有する栄養細胞をシスト化することにより、もともと有していたアスタキサンチンに加えて、新たにアスタキサンチンが蓄積されることから、細胞内のアスタキサンチン含量が一層高められる。
ところで、栄養細胞が増殖を続けると、結果として栄養細胞内のアスタキサンチン濃度が低下すると考えられるので、増殖は、いくらかのアスタキサンチンが細胞内に残っている時点で停止させることが好ましい。
ある程度栄養細胞が増殖した時点で、緑藻の増殖を停止させるためには、培地を栄養飢餓になるように設計することが好ましい。そのため、１段階培養法では、培地として、窒素源濃度が比較的低い培地、例えば、上記低栄養培地が好ましく用いられる。多量のシスト化細胞を接種する場合は、窒素源濃度が高い培地、例えば、上記富栄養培地を用いてもよい。
なお、低栄養培地で緑藻の生育が不十分である場合、富栄養培地あるいは低栄養培地を追加して、所望の濃度まで緑藻を増殖させてもよい。
また、低栄養培地を用いる場合、Ｎ／Ｐモル比を１０〜３０、好ましくは１５〜２５の値に調整しておくと、増殖後スムーズにシスト化させることができる。
１段階培養法では、工程の管理が簡便であること、別の培養槽に移し替える必要がないため、雑菌の混入が防止できること、用いる培養槽が一つのみでよいことなどの利点があるだけでなく、高濃度でアスタキサンチンを含有する緑藻を簡便に得ることができるという利点もある。
（２段階培養法）
２段階培養法は、シスト化した緑藻を栄養培地で増殖させ、次いで、栄養培地をシスト化培地に代えて、シスト化を行う培養方法である。すなわち、２段階培養法では、まず、シスト化した緑藻を栄養培地に、好ましくは富栄養培地に接種して緑藻を増殖させる第１工程と、この緑藻を回収して、窒素源をほとんど含まないシスト化培地に移して、シスト化する第２工程を含んでいる。
第１工程における緑藻の増殖は、アスタキサンチンが栄養細胞に残存している間に終了させる必要があるため、栄養培地での培養は短時間で行われる。培養の開始時に富栄養培地を用いて培養すると、栄養細胞の増殖速度が、低栄養培地で培養した場合の増殖速度よりも速いので、富栄養培地を用いることが好ましい。増殖終了後、緑藻は回収され、シスト化培地に移し替えられ、第２工程のシスト化が行われる。
この第１工程と第２工程とは、それぞれ、別の培養槽で回分的に行ってもよい。第１工程終了後、増殖した緑藻を洗浄、回収し、同一培養槽に戻して、第２工程を行ってもよい。
この２段階培養法でも、アスタキサンチン含量が高い緑藻が得られる。この２段階培養法は、１段階培養法に比べて、増殖工程が短時間であるという利点があるが、途中で増殖した緑藻を移し替える操作が必要となる。
得られたシスト化緑藻の一部はアスタキサンチンを含む緑藻抽出物の回収に、残りの一部は、再度、栄養培地への接種のために用いてもよい。
上記の培養により、培養液１Ｌあたり、アスタキサンチン（フリー体として）を１５０ｍｇ以上の濃度で、好ましくは、１５０〜２５０ｍｇ／Ｌで、より好ましくは、２００〜２５０ｍｇ／Ｌの濃度で含む緑藻培養液が得られる。培養液あたりのアスタキサンチン量は、所定量の培養液を採取し、その中に含まれるアスタキサンチン量を測定することにより求められる。
（アスタキサンチンを８質量％以上含有する緑藻抽出物）
本発明の緑藻抽出物は、アスタキサンチン（フリー体として）を８質量％以上、好ましくは９質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、さらに好ましくは１２〜１４質量％、あるいは１０質量％を超えて１４質量％以下の濃度で含む。
本発明において「緑藻抽出物」とは、上記の緑藻中に含まれる油分をいい、抽出操作以外にアスタキサンチンの濃縮・精製が行われていない油分をいう。
緑藻抽出物の製造方法は、シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、８０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程；およびアスタキサンチンを含有する油分を抽出する工程を含む。緑藻の培養工程は、上述のとおりである。
ここで、アスタキサンチンを含む油分の抽出手段には特に制限はなく、当業者が通常用いる手段が用いられる。例えば、まず、上記の方法で培養した緑藻を、当業者が通常用いる乾燥手段（ドラム乾燥、熱風式乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥など）によって乾燥させることにより、緑藻の乾燥物を得る。次いで、溶媒による抽出、機械的破砕（例えば、ビーズビーターなど）あるいは圧搾、およびこれらを組み合わせた抽出が行われる。溶媒としては、クロロホルム、ヘキサン、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒が用いられる。あるいは、超臨界抽出法を用いて抽出してもよい。抽出に溶媒を利用した場合は、抽出後、当業者が通常用いる手段によって、溶媒が除去される。
上記抽出に供する緑藻の乾燥物（すなわち、乾燥藻体）は、アスタキサンチン（フリー体として）を３．１質量％以上の濃度で含む。好ましくは５質量％以上、より好ましくは５〜８質量％、さらに好ましくは６〜７質量％の濃度で含む。なお、ここでいう緑藻乾燥物中の水分量は、７質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは２質量％程度である。このような緑藻乾燥物を用いると、アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含有する緑藻抽出物を得ることができる。
（アスタキサンチンの製造方法）
本発明のアスタキサンチンの製造方法は、上記の緑藻抽出物の製造方法において得られたアスタキサンチンを含有する油分（すなわち、緑藻抽出物）からアスタキサンチンを回収する工程をさらに含む。例えば、このアスタキサンチンを含有する緑藻抽出物を、晶析、合成樹脂（例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体など）による分画などの当業者が通常用いる分離・精製手段に供してアスタキサンチンを回収・精製することにより、アスタキサンチンが製造される。
【実施例】  以下に、ヘマトコッカス・プルビアリスＫ００８４株を用いた実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に制限されない。なお、本実施例において、アスタキサンチン量、細胞数、および乾燥藻体量は、それぞれ以下の方法で測定した。
（アスタキサンチン量の測定）
アスタキサンチン量は、以下の方法で測定した。まず、試料を一定量採取し、洗浄し、ビーズビーター専用のミクロチューブに採った。同チューブにジルコニアビーズを加えた後、アセトンを加え、ビーズビーターで破砕した。破砕後、試料を、遠心分離により上清と沈殿とに分け、上清（すなわち、アセトン画分）を回収した。沈殿に再びアセトンを加え、上記と同様の操作を、沈殿の色がほぼ完全に白くなるまで繰り返した。回収したアセトン画分を合わせて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１００倍に希釈し、４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ４９２）および７５０ｎｍにおける吸光度（Ａ７５０）を測定した。回収アセトン画分（試料）中のアスタキサンチン濃度は、以下の式を用いて算出され、この測定値から、培養液中のアスタキサンチン量を求めた。なお、抽出物中のアスタキサンチン量は、ＤＭＳＯにて適宜希釈した後、４９２ｎｍおよび７５０ｎｍの吸光度を測定し、以下の式から希釈液中のアスタキサンチン濃度を算出し、この値から希釈前の抽出物中のアスタキサンチン濃度を求めた。
アスタキサンチン濃度（μｇ／ｍＬ）＝４．５×１００×（Ａ４９２−Ａ７５０）
（細胞数の測定）
細胞数は、粒子径分布測定装置（ＳＹＳＭＥＸ  ＦＰＩ−３０００）を用いて測定した。
（乾燥藻体質量の測定）
緑藻の乾燥質量の測定を、以下のように行った。まず、所定量の培養液を採取し、ＧＣ５０ガラス繊維ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製）上で吸引濾過し、無機塩類を溶解するため、ｐＨ４の塩酸水溶液５ｍＬで２回洗浄した。次いで、緑藻の付いたろ紙を、１０５℃の恒温乾燥機で３時間乾燥させ、真空デシケーター中で室温まで１時間冷却し、乾燥質量を測定した。なお、ＧＣ５０ガラス繊維ろ紙は、予め、上記恒温乾燥機で、１０５℃にて１時間乾燥させて、その質量を測定しておいた。緑藻を吸着させた乾燥ろ紙の質量から、予め測定したろ紙の乾燥質量を差し引いて緑藻の乾燥質量を求めた。また、この所定量の培養液中のアスタキサンチン量を測定することにより、乾燥質量あたりのアスタキサンチン量を求めた。
（実施例１）
（シスト化した緑藻の調製）
ヘマトコッカス・プルビアリスＫ００８４株を、以下の表１に記載の組成を有する培地（低栄養培地）に接種した。
【表１】
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具体的には、１．５Ｌの扁平培養瓶に１Ｌの低栄養培地を入れ、シスト化したＫ００８４株を接種した。培養は、白色蛍光灯を用いて２５０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓの光合成有効光量子束投入量で光照射を行い、３容積％のＣＯ２を含む空気を０．５Ｌ／分の速度で吹き込みながら（すなわち、通気速度０．５ｖｖｍで）、２５℃にて７日間行った。７日後、シスト化したＫ００８４株を集め、低栄養培地で１．５×１０６個／ｍＬの濃度となるように調整した。
（本培養）
アクリル透明板を培養槽の内壁が３ｃｍの間隔となるように対向させて配置した扁平培養槽に、低栄養培地を９Ｌ入れ、１Ｌの上記シスト化したＫ００８４株を１．５×１０５個／ｍＬの濃度で接種し、培養を開始した。培養は、扁平培養槽の両側に各６本の白色蛍光灯を設置し、２５０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓの光合成有効光量子束投入量で照射を行い、３容積％のＣＯ２を含む空気を５Ｌ／分の速度で吹き込みながら（すなわち、通気速度０．５ｖｖｍで）、２５℃にて２１日間行った。培養液中のアスタキサンチン量、細胞数、および培養液から採取した藻体の乾燥質量を、定期的にそれぞれ上述の方法で測定し、細胞あたりのアスタキサンチン量を求めた。結果を表２に示す。
次いで、定期的に培養液５０ｍＬを取り出し、洗浄し、そしてビーズビーター専用のミクロチューブに採った。同チューブにジルコニアビーズを加えた後、アセトンを加えて、ビーズビーターで破砕した。破砕物を、遠心分離により上清と沈殿とに分け、上清を回収した。沈殿に再びアセトンを加え上記と同様の操作を、沈殿の色がほぼ完全に白くなるまで繰り返した。回収したアセトン画分を合わせ、緑藻抽出物を得た。この抽出物中のアスタキサンチン濃度を上述のように測定した。結果を表２および図２に示す。
（実施例２）
１２０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓの有効光量子束投入量で光照射したこと以外は、上記実施例１と同様に緑藻を培養して、緑藻抽出物を得、それぞれのアスタキサンチン濃度を測定した。結果を表２および図２に示す。
（実施例３）
８０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓの有効光量子束投入量で光照射したこと以外は、上記実施例１と同様に緑藻を培養して、緑藻抽出物を得、それぞれのアスタキサンチン濃度を測定した。結果を表２および図２に示す。
（比較例１）
１０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓの有効光量子束投入量で光照射したこと以外は、上記実施例１と同様に緑藻を培養して、緑藻抽出物を得、それぞれのアスタキサンチン濃度を測定した。結果を表２および図２に示す。
【表２】
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表２および図２から、緑藻を８０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養することにより、アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む緑藻抽出物が得られることがわかる。また、光合成有効光量子束投入量が多いほど、抽出物中のアスタキサンチン濃度も上昇することがわかった。また、乾燥藻体中のアスタキサンチン濃度が少なくとも３．１質量％であれば、アスタキサンチンを８質量％以上の濃度で含む緑藻抽出物が得られることもわかる。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、従来公知の抽出物に比べて、アスタキサンチン濃度が高い緑藻抽出物が提供される。したがって、本発明の緑藻抽出物は、さらなる精製を行わずにそのまま、抗酸化剤、食品、医薬品、化粧料などの分野に使用することが可能である。あるいは、本発明の緑藻抽出物を用いることにより、精製アスタキサンチンの生産効率を従来よりも大きく向上させることができる。したがって、アスタキサンチンの効率的な製造方法において、非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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