(57)【要約】  癌細胞で特異的に発現する遺伝子を用いて、癌の早期発見や微小転移等の予後診断に有用なプライマー、腫瘍マーカー、および癌の検出方法を提供する  本発明のプライマーは、Ｅｒａｓ遺伝子をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを含む。このようなプライマーで増幅されたｍＲＮＡを腫瘍マーカーとして利用される。まは、本発明は、採取された生体試料中のＥｒａｓ遺伝子の発現を検出する、癌の検出方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｒａｓ遺伝子をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを含む、プライマー。
【請求項２】
前記核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとからなるプライマーセット、配列番号３のプライマーと配列番号４のプライマーとからなるプライマーセット、配列番号５のプライマーと配列番号６のプライマーとからなるプライマーセット、および配列番号７のプライマーと配列番号８のプライマーとからなるプライマーセットから選択される一つのプライマーセットである、請求項３に記載のプライマー。
【請求項３】
請求項３または４に記載されたプライマーを用いて増幅された、Ｅｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡである、腫瘍マーカー。
【請求項４】
採取された生体試料中のＥｒａｓ遺伝子の発現を検出する、癌の検出方法。
【請求項５】
前記Ｅｒａｓ遺伝子の発現量の検出は、Ｅｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項６】
請求項３に記載された腫瘍マーカーを検出する、請求項４に記載の癌の検出方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマー、腫瘍マーカー、および癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍マーカーは、採取された生体材料から検出される物質であり、癌の早期発見や微小転移等の予後診断に有用である。特に、近年、分子細胞生物学的手法が進歩したことによる解析技術の進歩により、癌の早期発見や微小転移等の予後診断の重要性が増している。例えば、リンパ節や血液中に存在する腫瘍特異的遺伝子のｍＲＮＡをリアルタイム−逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法で検出することが行われている。この方法を用いれば、１０６個の細胞に１個のがん細胞が含まれていても、検出可能である。この方法に用いられる腫瘍特異的遺伝子としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子や糖鎖抗原（ＣＡ１９−９）遺伝子などが知られている。【０００３】
しかし、上記の遺伝子は、正常細胞においても発現する。このため、これらの遺伝子の発現をマーカーとして用いると、偽陽性を生ずることがあり、精度に問題がある。例えば、腹腔細胞診で癌細胞を認めないもの（ＣＹ０）のなかに、腹膜再発をきたす症例が少なからず存在する。腹腔内洗浄細胞中に微量に存在する癌細胞の有無をサイトケラチン２０（ＣＫ２０）およびＣＥＡのｍＲＮＡ発現で同定し予後や再発率に相関するといった報告がみられる。ＣＥＡのｍＲＮＡは中皮細胞にも発現するといった報告も散見され，偽陽性の判断が今後の課題である。従って、精度の高い腫瘍マーカーとして使用するためには、癌細胞で特異的に発現する遺伝子を選出することが重要である。【０００４】
また、胃癌に特異的かつ高頻度にみられる遺伝子が同定されていない。このため、現時点においてＰＣＲ法を用いた診断は，微量腫瘍細胞の存在を確定診断するには至っていない。従って、胃癌に特異的な遺伝子の同定とその高感度検出法の開発が期待される。【０００５】
胚性幹細胞（以下、「ＥＳ細胞」という）は、あらゆる種類の細胞に分化できる多分化能と、移植すると腫瘍を形成する腫瘍形成能とを有する。ＥＳ細胞における腫瘍形成の原因遺伝子群のひとつとして、Ｅｒａｓ遺伝子がクローニングされた（例えば、非特許文献１参照）。Ｅｒａｓ遺伝子は、ＫｒａｓやＨｒａｓのような他のｒａｓ遺伝子と相同性を有する。また、Ｅｒａｓ遺伝子は、増殖シグナルに関与する癌遺伝子であり、ヒトでは胎生期にのみ発現を認めるとされている。Ｅｒａｓ遺伝子の発現は、細胞分化に伴ってＤＮＡメチル化及び脱アセチル化などのエピジェネティックなレベルで調整されていると考えられている。
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  （２００３）４２３（６９３９），５４１−５４５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、癌細胞で特異的に発現する遺伝子を用いて、癌の早期発見や微小転移等の予後診断に有用なプライマー、腫瘍マーカー、および癌の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、上記Ｅｒａｓ遺伝子が、癌細胞で特異的に発現し、しかも正常組織では全く発現しないことを見出した。また、Ｅｒａｓ遺伝子の発現は、ｍＲＮＡの発現を分子細胞生物学的手法で検出する。この結果、１０６個の細胞に１個のがん細胞が含まれていても、検出可能である。したがって、癌の早期発見や微小転移等の予後診断に有用である。【０００８】
例えば、癌のリンパ節転移は、最初にセンチネルリンパ節に起こるとされている。センチネルリンパ節とは、癌細胞がリンパ流に乗って最初に到達するリンパ節である。本発明の方法を用いれば、センチネルリンパ節の同定と微小転移の診断を行うことが可能となる。微小転移の有無を確認できれば、リンパ節郭清を省略する縮小手術を行うかどうかの判断が容易となる。【０００９】
また、本発明の癌の診断方法では、１０６個の細胞に１個のがん細胞が含まれていても、癌が検出可能なので、腹腔細胞診で癌細胞を認めないものであっても、腹腔内洗浄細胞中に微量に存在する癌細胞の有無を正確に診断できる。微小転移を早期に発見できれば、早期に治療を開始することが可能になる。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。【００１０】
本発明は、Ｅｒａｓをコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを含むことを、特徴とするプライマーである。【００１１】
さらに、上記プライマーは、前記核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとからなるプライマーセット、配列番号３のプライマーと配列番号４のプライマーとからなるプライマーセット、配列番号５のプライマーと配列番号６のプライマーとからなるプライマーセット、および配列番号７のプライマーと配列番号８のプライマーとからなるプライマーセットから選択される一つのプライマーセットであると好ましい。【００１２】
本発明の腫瘍マーカーは、上記プライマーを用いて増幅された、Ｅｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡである。【００１３】
本発明は、採取された生体試料中のＥｒａｓ遺伝子の発現を検出する、癌の検出方法である。【００１４】
また、上記検出方法においては、Ｅｒａｓ遺伝子の発現量の検出は、Ｅｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出するものである。【００１５】
また、本発明の癌の検出方法は、上記腫瘍マーカーを検出するものであるとよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、癌細胞で特異的に発現し、正常細胞では発現しないＥｒａｓ遺伝子を用い、Ｅｒａｓ遺伝子を分子細胞生物学的手法で検出するので、精度の高い、癌の早期発見や微小転移等の予後診断に有用なプライマー、腫瘍マーカー、および癌の検出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、作成した複数のプライマーによるＥｒａｓ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図２】図２は、正常細胞と癌細胞株とにおけるＥｒａｓ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図３】図３は、切除胃の癌部および正常部におけるＥｒａｓ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】図４は、切除大腸の癌部および正常部におけるＥｒａｓ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上記の通り、本発明の癌の検出方法では、採取された生体試料中のＥｒａｓ遺伝子の発現を検出する。以下に、本発明を詳細に説明する。なお、Ｅｒａｓ遺伝子のエキソン部分の塩基配列は、配列番号９に示す。【００１９】
本発明において、「採取された生体試料」としては、（ａ）組織、（ｂ）採取した組織の培養物、（ｃ）腹水、（ｄ）組織抽出物、（ｅ）喀痰、（ｆ）尿、（ｇ）糞便または（ｈ）血液などが挙げられる。組織は、バイオプシーにより採取できる。使用できる組織または器官としては、例えば、脳、脳下垂体、脊髄、唾液腺、甲状腺、肺、乳房、皮膚、骨格筋、心臓、肝臓、脾臓、副腎、膵臓、胃、小腸、大腸、直腸、膀胱、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨髄、末端単核球などが挙げられる。【００２０】
Ｅｒａｓ遺伝子は、１個のエキソンから構成される。したがって、Ｅｒａｓ遺伝子が発現する際に、スプライシングが起こらない。この結果、得られるｍＲＮＡは、欠失、置換、付加などが生じにくく、安定である。【００２１】
「Ｅｒａｓ遺伝子の発現」を測定するとは、癌化している細胞におけるＥｒａｓ遺伝子の発現量を測定することをいう。発現量の測定は、必ずしも発現量を定量する必要はなく、Ｅｒａｓ遺伝子の発現が検出できる程度で足りる。【００２２】
癌化している細胞におけるＥｒａｓ遺伝子の発現量を測定する方法としては、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、核酸配列増幅方法（ＮＡＳＢＡ）法、転写媒介増幅（ＴＭＡ）法などの公知の方法を用いることができる。【００２３】
ＲＴ−ＰＣＲは、例えば以下のようにして行う。まず、採取された生体試料中のＥｒａｓ遺伝子転写物であるＥｒａｓ  ｍＲＮＡまたはその断片に関して、逆転写酵素によりこのｍＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。次に、得られたｃＤＮＡまたはその断片を特異的に増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。得られたＤＮＡを電気泳動等に供して検出する。ＲＴ−ＰＣＲは、通常公知の方法を用いればよい。【００２４】
本発明において、ＤＮＡを増幅するプライマーがＥｒａｓ検出に重要な役割を果たす。ＤＮＡを増幅するプライマーとしては、以下の配列番号１〜８のプライマーを用いる。具体的には、（１）配列番号１のプライマーはセンスプライマー、配列番号２のプライマーは配列番号１のアンチセンスプライマーからなるプライマーセットであり、（２）配列番号３のプライマーはセンスプライマー、配列番号４のプライマーは配列番号３のアンチセンスプライマーからなるプライマーセットであり、（３）配列番号５のプライマーはセンスプライマー、配列番号６のプライマーは配列番号５のアンチセンスプライマーからなるプライマーセットであり、（４）配列番号７のプライマーはセンスプライマー、配列番号８のプライマーは配列番号７のアンチセンスプライマーからなるプライマーセットである。好ましいのは、（４）の配列番号７と８のプライマーセットである。
【表１】
2007132864.tif 000002
【００２５】
上記プライマーは、標的遺伝子Ｅｒａｓ上の表1に示す部位を含んでいれば、塩基配列の長さが３０程度まで前後に長く設定してもよく、５’末端側に他の塩基配列を含んでいてもよい。プライマー全体の長さが前記範囲内であり、且つ塩基配列が相補的になっていれば５’側に伸ばしても３’側に伸ばしても、標的遺伝子の増幅に大きな影響は与えないからである。一方、５’末端側に他の塩基配列を含んでいてもよいのは、３’末端側の塩基配列がＰＣＲの特異的な増幅反応において重要であり、５’末端側の塩基配列が若干異なっていても、ＰＣＲの反応自体への悪影響が小さいからである。【００２６】
これらのプライマーセットは、配列番号１のｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ  ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。【００２７】
上記プライマーを用いて増幅したＥｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡは、腫瘍マーカーとして用いることができる。【００２８】
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用することができる。【００２９】
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、（１）反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば３２Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（２）ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（３）ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定することができる。【００３０】
蛍光色素を用いた定量方法としては、（１）二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（２）蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（３）増幅用プライマーに加えて、蛍光色素で修飾したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いることにより、定量的ＲＴ−ＰＣＲが可能でさらに遺伝子検出の特異性や感度が高くして、ＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定することができる。【００３１】
本発明の癌の検出方法では、癌化及び癌の進行に伴ってＥｒａｓ遺伝子が発現することを利用し、採取した生体試料におけるＥｒａｓ遺伝子の発現を指標として、当該試料における癌細胞の有無を診断する。すなわち、生体試料においてＥｒａｓ遺伝子が発現している場合に、生体試料に癌細胞が存在すると診断する。【００３２】
本発明の癌の診断方法は、広く癌一般の診断に利用することができる。本発明の癌の診断方法によって診断可能な癌としては、例えば、肝癌、胃癌、肺癌、大腸癌、乳癌等が挙げられる。特に、本発明で用いるＥｒａｓ遺伝子は、正常細胞には発現しないので、癌の早期診断や微小転移の検出に有用である。【００３３】
本発明のプライマーは、このようなＥｒａｓ遺伝子の発現を検出するために極めて有用である。【００３４】
また、本発明のプライマーを用いて増幅したＥｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡを腫瘍マーカーとして用いれば、有効な癌検出の腫瘍マーカーとして利用できる。また、本発明野のプライマーを含む癌検出キットを用いれば、癌の早期診断や微小転移の検出が容易である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。【００３６】
［実施例１］
（プライマーの作成）
Ｅｒａｓのエキソン領域の一部を挟む４種類のプライマーセット（１）配列番号１のプライマーはセンスプライマー、配列番号２のプライマーは配列番号１のアンチセンスプライマーからなるプライマーセット、（２）配列番号３のプライマーはセンスプライマー、配列番号４のプライマーは配列番号３のアンチセンスプライマーからなるプライマーセット、（３）配列番号５のプライマーはセンスプライマー、配列番号６のプライマーは配列番号５のアンチセンスプライマーからなるプライマーセット、（４）配列番号７のプライマーはセンスプライマー、配列番号８のプライマーは配列番号７のアンチセンスプライマーからなるプライマーセットを作成した。【００３７】
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
ヒト胃癌細胞及び正常組織それぞれ湿重１ｇに対して１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザ−にてホモジナイズし、５分間室温で放置した。２００μｌのクロロホルム（関東化学社製）を添加し、１５秒間上下に激しく撹拌した後、５分間室温で放置した。次いで、４℃、１２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、水層を新しい１．５ｍｌ遠心チュ−ブに回収した。更に、５００ｍｌの２−プロパノール（関東化学社製）を添加して、ピペッティングした後、室温で１０分間静置した。４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、上清を除去しペレットを得た。得られたペレットに、冷却した７５％  エタノールを加えヴォルテックスした。５０μｌのＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水（和光純薬工業社製）で溶解し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。正常組織についても、上記と同様の操作を行い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。【００３８】
（２）ｃＤＮＡの調製
上記（１）で胃癌組織から調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ及び正常組織から調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをそれぞれ１０μｇ、ＲＮＡｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．５μｌ、ＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水１０．５μｌの混合液を７０℃  ５分間加熱した後、１分間氷上で冷却した。Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）  １００ｐｍｏｌを含む１１μｌの混合液を、７０℃、１０分間加熱した後、氷上で冷却し、ＲＮＡ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを調製した。冷却後、このＲＮＡ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘにｏｌｉｇｏ（ｄＴ）  Ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μｇ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ  1μｌ（ＡＢ社製）、Ｍ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １μｌ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）、５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬを混合し３７℃  ５０分間インキュベートした。その後７０℃  １５分間加熱後、２分間氷上で冷却しｃＤＮＡを調整した。一方、正常組織から調製した  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡについても、上記と同様の操作を行うことによりｃＤＮＡ溶液を調製した。【００３９】
（プライマーの検定）
前記調製されたｃＤＮＡを鋳型として、以下のようにしてＰＣＲを行い、各プライマーセットにおけるＥｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡの発現を調べた。即ち、当該ｃＤＮＡ  １．５μｌ、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー１  １０ｐｍｏｌ、配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー２  １０ｐｍｏｌ、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ  ２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ０．５μl、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．２  μｌ、ＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水４０μｌを含む５０μｌの反応液を調製し、ＰＴＣ２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて、９４℃、１０分間前変性させ、次いで９４℃、５０秒間保温して、変性させた後、５９℃、５０秒間アニーリングをし、次いで７２℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル実施して、最後に７２℃で１０分間インキュベートする条件でＰＣＲを行った。（２）配列番号３のプライマーはセンスプライマー、配列番号４のプライマーは配列番号３のアンチセンスプライマーからなるプライマーセット、（３）配列番号５のプライマーはセンスプライマー、配列番号６のプライマーは配列番号５のアンチセンスプライマーからなるプライマーセット、（４）配列番号７のプライマーはセンスプライマー、配列番号８のプライマーは配列番号７のアンチセンスプライマーからなるプライマーセットについても同様に行った。増幅されたＤＮＡから、各プライマーセットにおけるＥｒａｓ遺伝子の発現を調べた。発現は、エチジウムブロマイド加２％アガロースゲルに電気泳動し、ＵＶにて確認した。なお、リファレンス遺伝子として、ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−フォスフェート  デヒドロゲナーゼ）に対するプライマーを用いた。結果を図１に示す。図１は、作成した複数のプライマーによるＥｒａｓ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。【００４０】
図１において、Ｅｒａｓ１〜Ｅｒａｓ４の各レーンは、それぞれ（１）〜（４）の各プライマーセットにより増幅されたＥｒａｓ遺伝子の存在を示す。図１の各レーンにおける最も白く発色している部分が、Ｅｒａｓ遺伝子の発現を示す。図１から、（１）〜（４）の各プライマーセットは、いずれもＥｒａｓ遺伝子の発現を検出することができることがわかった。また、（１）〜（４）のプライマーセットのうち、（４）のプライマーセットが最もＥｒａｓ遺伝子の発現を検出するのに適していることがわかった。（４）のプライマーセットを用いて、以下の実験を行った。【００４１】
（実施例２）
（正常細胞におけるＥｒａｓ遺伝子の発現の評価）
胃癌細胞株（ＯＣＵＭ−２ＭＤ３）と、ヒト正常組織（リンパ球、中皮細胞、線維芽細胞株（ＮＦ２４、ＮＦ２５、ＮＦ２６））とを、上記実施例１と同様にして、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調整し、ｃＤＮＡを調整した。次に、（４）のプライマーセットを用いて、これらのｃＤＮＡにおけるＥｒａｓ遺伝子の発現を調べた。この実施例においても、リファレンス遺伝子として、ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−フォスフェート  デヒドロゲナーゼ）に対するプライマーを用いた。結果を、図２に示す。図２は、正常細胞と癌細胞株とにおけるＥｒａｓ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。図２から明らかなように、胃癌細胞株（ＯＣＵＭ−２ＭＤ３）のみに、Ｅｒａｓ遺伝子の発現が認められた。また、Ｅｒａｓ遺伝子は、正常細胞では発現していないことがわかった。このことから、本実施例のプライマーセットを用いて、増幅されたＥｒａｓ遺伝子は、腫瘍マーカーとして用いることができることがわかった。【００４２】
（臨床標本におけるＥｒａｓ遺伝子の発現の評価）
大阪市立大学の倫理委員会により承認されたガイドラインに従ってインフォームドコンセントを得た後、大阪市立大学病院において２００４年〜２００６年に手術を受けた患者の切除胃及び切除大腸の癌部および正常部を、上記実施例１と同様にして、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調整し、ｃＤＮＡを調整した。次に、（４）のプライマーセットを用いて、これらのｃＤＮＡにおけるＥｒａｓ遺伝子の発現を調べた。切除胃の癌部および正常部の結果を図３に、切除大腸の癌部および正常部の結果を図４に示す。図３は、切除胃の癌部および正常部２０例を、癌部および正常部における癌の種類、進達度、分化度ごとにＥｒａｓ遺伝子の発現を表す図である。図４は、切除大腸の癌部および正常部２例を、癌部および正常部における癌の種類、進達度ごとにＥｒａｓ遺伝子の発現を表す図である。【００４３】
なお、図３、４において、Ｔ；ｔｕｍoｒ（腫瘍）、Ｎ；ｎｏｒｍａｌ（正常）、  分化度［ｐｏｒ．；  ｐｏｏｒｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（未分化腺癌）、ｔｕｂ．；  ｔｕｂｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（管状腺癌）、ｓｉｇ．；  ｓｉｇｎｅｔ  ｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（印環細胞癌）］、  進達度  ［ｓｍ；  Ｔｅｌａ  ｓｕｂｍｕｃｏｓｅ（粘膜下組織）、ｍｐ；  Ｔｕｎｉｃａ  ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ  ｐｒｏｐｒｉａ（筋層）、ｓｓ；  Ｔｅｌａ  ｓｕｂｓｅｒｏｓａ（漿膜下組織）、ｓｅ；  ｓｅｒｏｓａ  ｅｘｐｏｓｅｄ（漿膜露出）］、  分化度［Ｍｏｄ；  ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（中分化腺癌）、Ｗｅｌ；  ｗｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（高分化腺癌）］をそれぞれ意味する。また、図３中に進達度を大文字で示したものもあるが、意味は同じである。ｔｕｂに付された同じ数字のものは、同じ患者の異なる部位を意味する。【００４４】
図３、４から明らかなように、Ｅｒａｓ遺伝子は、癌の種類、進達度、分化度を問わず、癌部すべてにおいて発現を認めた（１００％；  胃癌２０／２０、大腸癌２／２）。一方、正常部では発現は認めなかった（０％；  胃癌０／２０、大腸癌０／２）。【００４５】
以上から、本発明の癌検出方法は、実際の癌の診断に用いると、高い検出率を発揮することがわかった。
【図１】
2007132864.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
2007132864.tif 000006
【配列表】
2007132864000001.app
【国際調査報告】
2007132864.tif 000007
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