(57)【要約】  ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物、好ましくはストレプトコッカス属に属する微生物の培養物から取得されたヒアルロン酸塩の粗精製物と、塩および親水性有機溶媒を含有する溶液とを接触させ、該粗精製物に含まれるタンパク質、核酸、着色物質およびエンドトキシンなどの不純物を液相に移行させた後、ヒアルロン酸を沈殿物として採取する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物の培養物から取得されたヒアルロン酸塩の粗精製物と、塩および親水性有機溶媒を含有する溶液とを接触させ、該粗精製物に含まれる不純物を液相に移行させた後、ヒアルロン酸塩を沈殿物として採取することを特徴とするヒアルロン酸塩の精製方法。
【請求項２】
ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物がストレプトコッカス属に属する微生物である、請求項１記載の精製方法。
【請求項３】
ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物がタンパク質、核酸、着色物質およびエンドトキシンからなる群より選ばれる不純物である、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物がエンドトキシンである、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項５】
ヒアルロン酸塩がアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項６】
ヒアルロン酸塩がナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩からなる群より選ばれる塩である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項７】
ヒアルロン酸塩がナトリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムからなる群より選ばれる1種以上の塩である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項８】
ヒアルロン酸塩がナトリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化ナトリウムである、請求項１〜４のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項９】
ヒアルロン酸塩がカリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化カリウム、硫酸カリウムおよび酢酸カリウムからなる群より選ばれる1種以上の塩である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項１０】
ヒアルロン酸塩がカルシウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化カルシウム、硫酸カルシウムおよび酢酸カルシウムからなる群より選ばれる1種以上の塩である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項１１】
溶液に含まれる親水性有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびアセトンからなる群より選ばれる親水性有機溶媒である、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項１２】
溶液の塩濃度が3〜6 %(w/v)、メタノール濃度が55〜65 %(v/v)であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１３】
溶液の塩濃度が1〜3 %(w/v)、エタノール濃度が44〜60 %(v/v)であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１４】
溶液の塩濃度が3〜4 %(w/v)、アセトン濃度が40〜50 %(v/v)であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸塩の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸塩の製造方法としては、ヒアルロン酸を含有する生体組織、例えば鶏冠から抽出、精製する方法およびヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養して得られる培養液から分離、精製する方法が知られている。ヒアルロン酸塩は分子量数万〜数百万の高分子であるため、蛋白質、核酸、発熱性物質(エンドトキシン)等の、高分子不純物の除去が精製上の重要な課題となっている。そのため、ヒアルロン酸塩を取得する前に、あらかじめ不純物を除去する方法として、イオン交換樹脂で処理する方法(特許文献１参照)、アルミナで処理する方法(特許文献２参照)、シリカゲルで処理する方法(特許文献３参照)、正に帯電したマイクロフィルターで処理する方法(特許文献４参照)、四級アンモニウム塩を添加する方法(特許文献５参照)、塩を含む有機溶媒溶液で鶏冠破砕物を前処理する方法(特許文献６参照)等が知られている。【０００３】
ヒアルロン酸塩の水溶液は不安定であるため、工業的に生産する際は最終的に固体として得ることが多い。このため、上記のように高分子不純物を除去したヒアルロン酸塩水溶液に塩を添加後、さらに親水性有機溶媒を添加して、ヒアルロン酸塩を沈殿として析出させ、それを分離、乾燥し、ヒアルロン酸塩を固体として取得している。
しかしながら、高品質のヒアルロン酸の取得に必要な、上記したいずれの高分子不純物除去方法も、使用する溶液の量が多く、工程が煩雑である。また、使用する材料が高価で、ヒアルロン酸塩の回収率が低いため、高コストである。塩を含む有機溶媒溶液で鶏冠由来のヒアルロン酸塩の粗結晶を洗浄する方法(特許文献７参照)も知られているが、エンドトキシンの除去ができることは知られていない。
【特許文献１】特公平5-56957号
【特許文献２】特許第2938880号
【特許文献３】特許第2731546号
【特許文献４】特開平9-324001号
【特許文献５】特開平11-60608号
【特許文献６】特開昭58-84801号
【特許文献７】特開昭61-171703号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、簡便な操作で、不純物含量の少ないヒアルロン酸塩を安価に製造することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物の培養物から取得されたヒアルロン酸塩の粗精製物と、塩および親水性有機溶媒を含有する溶液とを接触させ、該粗精製物に含まれる不純物を液相に移行させた後、ヒアルロン酸塩を沈殿物として採取することを特徴とするヒアルロン酸塩の精製方法。
（２）ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物がストレプトコッカス属に属する微生物である、上記（１）の精製方法。
（３）ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物がタンパク質、核酸、着色物質およびエンドトキシンからなる群より選ばれる不純物である、上記（１）または（２）の精製方法。
（４）ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物がエンドトキシンである、上記（１）または（２）の精製方法。
（５）ヒアルロン酸塩がアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である、上記（１）〜（４）のいずれか1つの精製方法。
（６）ヒアルロン酸塩がナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩からなる群より選ばれる塩である、上記（１）〜（４）のいずれか1つの精製方法。
（７）ヒアルロン酸塩がナトリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムからなる群より選ばれる1種以上の塩である、上記（１）〜（４）のいずれか1つ載の精製方法。
（８）ヒアルロン酸塩がナトリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化ナトリウムである、上記（１）〜（４）のいずれか1つの精製方法。
（９）ヒアルロン酸塩がカリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化カリウム、硫酸カリウムおよび酢酸カリウムからなる群より選ばれる1種以上の塩である、上記（１）〜（４）のいずれか1つの精製方法。
（１０）ヒアルロン酸塩がカルシウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化カルシウム、硫酸カルシウムおよび酢酸カルシウムからなる群より選ばれる1種以上の塩である、上記（１）〜（４）のいずれか1つの精製方法。
（１１）溶液に含まれる親水性有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびアセトンからなる群より選ばれる親水性有機溶媒である、上記（１）〜（１０）のいずれか1つの精製方法。
（１２）溶液の塩濃度が3〜6 %(w/v)、メタノール濃度が55〜65 %(v/v)であることを特徴とする、上記（１）〜（１１）のいずれか１つの精製方法。
（１３）溶液の塩濃度が1〜3 %(w/v)、エタノール濃度が44〜60 %(v/v)であることを特徴とする、上記（１）〜（１１）のいずれか１つの精製方法。
（１４）溶液の塩濃度が3〜4 %(w/v)、アセトン濃度が40〜50 %(v/v)であることを特徴とする、上記（１）〜（１１）のいずれか１つの精製方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、高価な材料の使用や煩雑な処理を行うことなく、低コストで容易に高純度のヒアルロン酸塩を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の方法で精製することができるヒアルロン酸塩としては、好ましくはヒアルロン酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩をあげることができ、より好ましくはナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等をあげることができ、さらに好ましくはナトリウム塩をあげることができる。
本発明の方法で精製することができるヒアルロン酸塩の平均分子量には特に制限はなく、いかなる分子量のヒアルロン酸塩も精製することができるが、平均分子量10万〜300万のヒアルロン酸塩が好ましい。【０００８】
ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物としては、当該能力を有する微生物であれば特に限定されないが、好ましくはストレプトコッカス属に属する微生物、より好ましくはストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptcoccus pyogenes)、ストレプトコッカス・エキ(Streptcoccus equi)、ストレプトコッカス・エキシミリス(Streptcoccus equismilis)、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ(Streptcoccus dysgalactiae)、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptcoccus zooepidemicus)等の微生物をあげることができる。【０００９】
微生物の培養物としては、該微生物を培地に培養して得られる培養物をあげることができる。
微生物を培養する培地として、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００１０】
炭素源としては、微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。【００１１】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜50℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中のpHは3〜9に保持することが好ましい。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ性溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。【００１２】
微生物の培養物からヒアルロン酸塩の粗精製物を取得する方法としては、微生物の培養物をろ過、遠心分離などの固液分離により菌体などの固形分を分離し、培養上清を取得した後、該培養上清に塩を添加した後に親水性有機溶媒を加えてヒアルロン酸塩を析出させ、静置または遠心分離することによりヒアルロン酸塩を沈殿させる方法等をあげることができる。微生物の培養物をろ過、遠心分離などの固液分離により菌体などの固形分を分離する前後に、微生物の培養物に、水酸化ナトリウム等の塩基類、または塩酸などの酸類を添加することにより、培養物中に含まれるヒアルロン酸塩を加水分解し、ヒアルロン酸の低分子化を行ってもよい。【００１３】
上記で用いられる塩は、水に充分に溶解するものであればいずれでもよく、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウムおよび酢酸カリウム等をあげることができ、好ましくは塩化ナトリウムをあげることができる。上記した塩は、単独または組み合わせて用いることができる。
上記で用いられる親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類をあげることができる。【００１４】
培養上清に添加する塩は、1〜30％(W/V)となるように添加することが好ましい。その後添加する親水性有機溶媒の濃度は、該濃度においてヒアルロン酸塩が実質的に不溶であれば、いかなる濃度であってもよいが、30〜70％（V/V) となるように添加することが好ましい。
次に上記で得られたヒアルロン酸塩の粗精製物と塩および親水性有機溶媒を含む溶液とを接触させることにより、ヒアルロン酸塩の沈殿物を洗浄する。該溶液は、上記で得られた粗精製物にそのまま添加してもよいが、洗浄効率を上げるために、ヒアルロン酸塩の沈殿物と上澄み液からなる該粗精製物から上澄み液の大部分を除去することにより、少量の上澄み液とヒアルロン酸塩の沈殿物からなる混合物を取得した後に、該混合物に該溶液を添加してもよい。該混合物中に含まれる上澄み液は、ヒアルロン酸塩の沈殿物から不純物を取り除く操作中に、ヒアルロン酸塩の沈殿物がゼリー状に固まらず、かつ精製効率が極端に悪くなる量でない限り、その量に特に制限はなく、当業者であれば精製に用いる塩および親水性有機溶媒の種類に応じてその量を調整することができる。  該混合物中に含まれる上澄み液の量としては、好ましくは混合物中のヒアルロン酸塩の沈殿物に対し約20％(v/v)以上、好ましくは約20％以上、100％(v/v)以下、より好ましくは30％(v/v)以上、80％（v/v）以下、さらに好ましくは約50％(v/v)をあげることができる。【００１５】
上澄み液の除去の方法としては、静置分離、ろ過、遠心分離等の方法をあげることができる。
本発明に用いられる塩および親水性有機溶媒を含む溶液に含有される塩としては、水に充分に溶解するものであればいかなる塩でもよく、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウムおよび酢酸カリウム等をあげることができ、好ましくは塩化ナトリウムをあげることができる。上記した塩は、単独または組み合わせて用いることができる。【００１６】
本発明に用いられる塩および親水性有機溶媒を含む溶液に含有される親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類をあげることができる。
塩および親水性有機溶媒の濃度は、該濃度においてヒアルロン酸塩が実質的に不溶で、不純物が溶解する濃度であれば、いかなる濃度であってもよく、例えば、親水性溶媒としてメタノールを使用する場合の塩濃度としては3〜5 %(w/v)、好ましくは5 %(w/v)、メタノール濃度としては55〜65 %(v/v)、好ましくは55〜60 %(v/v)をあげることができる。親水性溶媒としてエタノールを使用する場合の塩濃度としては1〜3 %(w/v)、好ましくは2 %(w/v)、エタノール濃度としては44〜60 %(v/v)をあげることができる。親水性溶媒としてアセトンを使用する場合の塩濃度としては3〜4 %(w/v)、アセトン濃度としては40〜50 %(v/v) をあげることができる。【００１７】
上記した塩と親水性有機溶媒とを含む溶液をヒアルロン酸塩の粗精製物と接触させることにより、該粗精製物に含まれる不純物を液相へ移行させ、ヒアルロン酸塩の沈殿物と不純物が溶解した上澄み液とからなる混合物を取得することができ、該混合物から上澄み液を除去することで不純物を取り除かれたヒアルロン酸塩の洗浄スラリーを取得することができる。【００１８】
ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物としては、タンパク質、核酸、着色物質およびエンドトキシン等をあげることができ、好ましくは微生物に由来するエンドトキシンをあげることができる。
不純物が溶解した上澄み液を除去する方法としては、静置分離、ろ過、遠心分離等の方法をあげることができる。【００１９】
上記したヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物を取り除き、洗浄スラリーを取得する操作は、不純物を十分に取り除くために繰り返し行ってもよい。
次に、得られた洗浄スラリーと塩を含まない70〜100 %(v/v)の親水性有機溶媒とを接触させることにより、ヒアルロン酸塩の沈殿物を洗浄した後、上澄み液の大部分を取り除くことにより、ヒアルロン酸塩の沈殿物に含まれる親水性有機溶媒の濃度が高くなった少量の上澄み液とヒアルロン酸塩の沈殿物からなる混合物を取得する。該少量の上澄み液の量としては、好ましくは混合物中のヒアルロン酸塩の沈殿物に対し約20％(v/v)以上、好ましくは約20％以上、100％(v/v)以下、より好ましくは30％(v/v)以上、80％（v/v）以下、さらに好ましくは約50％(v/v)をあげることができる。【００２０】
上記した塩を含まない高濃度の親水性有機溶媒を用いたヒアルロン酸塩の沈殿物の洗浄操作は繰り返し行ってもよい。
上記洗浄操作により、ヒアルロン酸塩の沈殿物は半透明のゲル状から白色の粉末状となり、該粉末状の物質を分離して乾燥することで、高純度のヒアルロン酸の乾燥物を取得することができる。分離の方法としては、ろ過、遠心分離等の方法をあげることができ、乾燥の方法としては、真空乾燥、通風乾燥等の方法をあげることができる。【００２１】
洗浄操作中に除去した上澄み液を蒸留することにより、親水性有機溶媒を回収することができる。回収した親水性有機溶媒を再使用することにより、廃液量を減らし、更に低コストに本発明を実施することができる。
以下の実施例にて、本発明を詳細に記述する。
【実施例１】
【００２２】
メタノール水溶液を使用した精製１
ストレプトコッカス・ズーエピデミクス(Streptcoccus zooepidemicus) NCTC7023 [J. Gen. Microbial., 15, 485-491(1956)]をブレイン・ハート・インヒュージョン寒天培地(日本製薬社製)を用い、37℃で16時間培養した菌体を、グルコース1 %(w/v)、ペプトン（極東製薬社製）1.5 %(w/v)、酵母エキス（ディフコ社製）0.5 %(w/v)、コーンスチープリカー1 %(w/v)、グルタミン酸ナトリウム0.3 %(w/v)、リン酸二カリウム0.2 %(w/v)、硫酸マグネシウム0.05 %(w/v)、チオ硫酸ナトリウム0.1 %(w/v)、炭酸カルシウム2 %(w/v)からなる種培地(pH7.0) 300 mLに播種し、37 ℃で16時間振盪培養した。この種培養液150 mLを、グルコース2.5 %(w/v)、ペプトン1.5 %(w/v)、酵母エキス0.5 %(w/v)、コーンスチープリカー0.5 %(w/v)、リン酸二カリウム0.2 %(w/v)、硫酸マグネシウム0.005 %(w/v)、チオ硫酸ナトリウム0.1 %(w/v)からなる発酵培地(pH7.2) 3 Lが入っている5 L容ジャーファーメンターに播種し、37 ℃、通気量0.3 vvm、pH7.0で26時間培養し、平均分子量200万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液を取得した。なお、ヒアルロン酸の分子量は、Gel Permeation Chromatography(GPC)を用いて測定した。【００２３】
該培養液400 mLに、水酸化ナトリウムを0.5 mol/Lとなるように加え、40 ℃で攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約100万以下となったところで塩酸を加え、pH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭26 gを加え、40 ℃で1時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。
該粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度5 %(w/v)となるように添加後、メタノールを最終濃度55 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。【００２４】
該沈殿物スラリーを2分割した後、それぞれを遠心分離して上澄み液の大部分を除去することにより、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し、以下の実験に用いた。
（１）該混合物に対する体積比で約5倍容の90 %(v/v)メタノール溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００２５】
同様の洗浄操作を２回繰り返した後、該混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
（２）該混合物に対する体積比で約5倍容の5 %(w/v)塩化ナトリウムを含む55 %(v/v)メタノール水溶液を加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。  【００２６】
同様の洗浄操作を２回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに対する体積比で約5倍容の90 %(v/v)メタノールを洗浄スラリーに加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し50％(v/v)程度の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００２７】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を２回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量をLowry法により測定した。結果を表１に示す。【００２８】
【表１】
2007142285.tif 000002
【実施例２】
【００２９】
メタノール水溶液を使用した精製２
実施例1と同様の方法により取得した平均分子量200万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液290 mLに、水酸化ナトリウムを0.4 mol/Lとなるように加えて、30℃で攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約100万以下となったところで塩酸を加えてpH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭13 gを加え、室温で2時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。【００３０】
該粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度5 %(w/v) となるように添加後、メタノールを最終濃度60 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。
該沈殿物スラリーを4分割し、それぞれを遠心分離して上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し、以下の実験に用いた。
（１）該混合物に対する体積比で約5倍容の100 %(v/v)メタノールを該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００３１】
同様の洗浄操作を２回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
（２）該混合物に対する体積比で約5倍容の5 %(w/v)塩化ナトリウムを含む55％(v/v)メタノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００３２】
同様の洗浄操作を２回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに対する体積比で約5倍容の100 %(v/v)メタノールを該洗浄スラリーに加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００３３】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を２回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
（３）該混合物に対する体積比で約5倍容の5 %(w/v)塩化ナトリウムを含む60％(v/v)メタノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製した。【００３４】
同様の洗浄操作を２回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに対する体積比で約5倍容の100 %(v/v)メタノールを該洗浄スラリーに加え攪拌することによりヒアルロン酸の沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製した。【００３５】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を２回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
（４）該混合物に対する体積比で約5倍容の4 %(w/v)塩化ナトリウムを含む65 %(v/v)メタノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００３６】
同様の洗浄操作を２回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに対する体積比で約5倍容の100 %(v/v)メタノールを該洗浄スラリーに加え攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００３７】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を２回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウムの蛋白質含量を実施例１と同様の方法により測定した。結果を表２に示す。【００３８】
【表２】
2007142285.tif 000003
【実施例３】
【００３９】
メタノール水溶液を使用した精製３
実施例１と同様の方法により取得した平均分子量200万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液6 L (5 L容ジャーファーメンター2基分)に、水酸化ナトリウムを0.5 mol/Lとなるように加え、30 ℃で攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約100万以下となったところで塩酸を加えてpH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭400 gを加え、30 ℃で1.5時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。【００４０】
該粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度5 %(w/v) となるように添加した後、メタノールを最終濃度60 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。
該沈殿物スラリーを2分割してから静置し、ヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた後、それぞれ上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し、以下の実験に用いた。
（１）該混合物に対する体積比で約0.5倍容の100％(v/v)のメタノールを該混合物に加えて撹拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００４１】
同様の洗浄操作を10回繰り返して得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
（２）該混合物に対する体積比で約2倍容の5 %(w/v)塩化ナトリウムを含む55 %(v/v)メタノール水溶液を該混合物に加えて撹拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製した。【００４２】
同様の洗浄操作を3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに対する体積比で約0.5倍容の100 %(v/v)メタノールを該洗浄スラリーに加えて撹拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００４３】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を10回繰り返して得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウムの発熱性物質(エンドトキシン)含量を表３に示す。エンドトキシン含量はトキシカラー(生化学工業製)を使用して測定した。なお、エンドトキシン含量は、日本薬局方の一般試験法(エンドトキシン試験法)で定義されたエンドトキシン単位(EU)で表した。【００４４】
【表３】
2007142285.tif 000004
【実施例４】
【００４５】
エタノール水溶液を使用した精製１
実施例１と同様の方法により取得した平均分子量200万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液1.4 Lに、塩酸をpH3.5となるように加え、65 ℃で攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約20万なったところで水酸化ナトリウムを加えてpH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭15 gを加え、室温で2時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。【００４６】
該粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度2 %(w/v) となるように添加後、エタノールを最終濃度60 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。
該沈殿物スラリーを2分割してから静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させ、それぞれ上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し、以下の実験に用いた。
（１）該混合物に対する体積比で約1.2倍容の85 %(v/v)エタノールを該混合物に加え攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００４７】
同様の洗浄操作を9回繰り返して得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
（２）該混合物に対する体積比で約3倍容の2 %(w/v)塩化ナトリウムを含む60%(v/v)エタノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製した。【００４８】
同様の洗浄操作を3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに対する体積比で約1.2倍容の85 %(v/v)エタノールを該洗浄スラリーに加え攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００４９】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を9回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量、核酸含量および着色物質含量を表４に示す。蛋白質含量は実施例１と同様の方法で測定し、核酸含量および着色物質含量は、それぞれ0.3%(w/v)ヒアルロン酸ナトリウム水溶液のOD260nmおよびOD430nmを対照として測定した。  【００５０】
【表４】
2007142285.tif 000005
【実施例５】
【００５１】
エタノール水溶液を使用した精製２
実施例1と同様の方法により取得した平均分子量200万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液6 L (5 L容ジャーファーメンター2基分)に、水酸化ナトリウムを0.4 mol/Lとなるように加え、30 ℃で攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約100万以下となったところで塩酸を加えてpH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭400 gを加え、室温で2時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。【００５２】
該粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度2 %(w/v) となるように添加後、エタノールを最終濃度44 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。
該沈殿物スラリーを静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた後、上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００５３】
該混合物に対する体積比で約3倍容の2 %(w/v)塩化ナトリウムを含む48 %(v/v)エタノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００５４】
同様の操作を3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに対する体積比で約1.2倍容の85 %(v/v)エタノールを該洗浄スラリーに加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００５５】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を9回繰り返した後、該混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量、核酸含量を実施例４と同様の方法で測定したところ、蛋白質含量は0.07%、核酸含量の指標となるOD260nmは0.018であった。
【実施例６】
【００５６】
アセトン水溶液を使用した精製１
実施例1と同様の方法により取得した平均分子量200万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液150 mLに、水酸化ナトリウムを0.4 mol/Lとなるように加え、30℃で攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約100万以下となったところで塩酸を加えてpH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭7 gを加え、室温で2時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。【００５７】
該粗精製ろ液を2分割し、以下の実験に用いた。
（１）粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度4 %(w/v) となるように添加後、アセトンを最終濃度40 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。該沈殿物スラリーを静置して析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた後、上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００５８】
該混合物に対する体積比で約3倍容の4 %(w/v)塩化ナトリウムを含む40 %(v/v)アセトン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄し、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対して約50％(v/v)の上澄み液が残留した混合物を取得した。
同様の洗浄操作を3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに対する体積比で約1.2倍容の80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリーに加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００５９】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を9回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
（２）粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度3 %(w/v) となるように添加後、アセトンを最終濃度50 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。該沈殿物スラリーを静置して析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた後、上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００６０】
該混合物に対する体積比で約3倍容の3 %(w/v)塩化ナトリウムを含む50 %(v/v)アセトン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄し、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００６１】
同様の洗浄操作を3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに対する体積比で約1.2倍容の80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリーに加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００６２】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を9回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウムの蛋白質含量を実施例１と同様の方法により測定した。結果を表５に示す。【００６３】
【表５】
2007142285.tif 000006
【実施例７】
【００６４】
アセトン水溶液を使用した精製２
実施例１と同様の方法により取得した平均分子量200万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液150 mLに、水酸化ナトリウムを0.4 mol/Lとなるように加え、30℃で攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約100万以下となったところで塩酸を加えてpH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭7 gを加え、室温で2時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。【００６５】
粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度4 %(w/v) となるように添加後、アセトンを最終濃度40 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。
該沈殿物スラリーを2分割してから静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させ、それぞれ上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し、以下の実験に用いた。
（１）該混合物に対する体積比で約1.2倍容の80 %(v/v)アセトンを該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００６６】
同様の洗浄操作を9回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
（２）該混合物に対する体積比で約3倍容の4 %(w/v)塩化ナトリウムを含む40 %(v/v)アセトン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００６７】
同様の洗浄操作を3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとして、該洗浄スラリーに対する体積比で約1.2倍容の80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリーに加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００６８】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を9回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウムの発熱性物質(エンドトキシン)含量を表６に示す。エンドトキシン含量は実施例３と同様の方法で測定した。【００６９】
【表６】
2007142285.tif 000007
【実施例８】
【００７０】
アセトン水溶液を使用した精製３
実施例１と同様の方法により取得した平均分子量200万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液700 mLに、水酸化ナトリウムを0.4 mol/Lとなるように加え、30℃で攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約10万となったところで塩酸を加えてpH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭20 gを加え、室温で2時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。【００７１】
該粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度4 %(w/v) となるように添加後、アセトンを最終濃度40 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。
該沈殿物スラリーを静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させ、上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿に対して約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００７２】
該混合物に対する体積比で約3倍容の4 %(w/v)塩化ナトリウムを含む40 %(v/v)アセトン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿に対して約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００７３】
同様の洗浄操作を3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとして、該洗浄スラリーに対する体積比で約1.2倍容の80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリーに加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００７４】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を9回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量を実施例１と同様の方法で測定したところ、0.03%であった。
【実施例９】
【００７５】
アセトン水溶液を使用した精製４
実施例１と同様の方法により取得した平均分子量200万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液3.3 Lを水で希釈して16.5 Lとし、活性炭200 gを加え、室温で12時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。
該粗精製ろ液に、塩化ナトリウムを最終濃度4 %(w/v) となるように添加後、アセトンを最終濃度40 %(v/v)となるように加えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。【００７６】
該沈殿物スラリーを静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させ、上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿に対して約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。
該混合物に対する体積比で約3倍容の4 %(w/v)塩化ナトリウムを含む40 %(v/v)アセトン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿に対して約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００７７】
同様の洗浄操作を3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとして、該洗浄スラリーに対する体積比で約1.2倍容の80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリーに加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約50％(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取得した。【００７８】
同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を9回繰り返した後、得られた混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量、および核酸含量をそれぞれ実施例１および４と同様の方法で測定したところ、蛋白質含量は0.02%、核酸含量は0.006（OD260nm）であった。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明により、簡便な操作で、不純物が少ないヒアルロン酸塩を安価に製造する方法を提供することが出来る。
【国際調査報告】
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