【手続補正書】
【提出日】平成20年3月3日(2008.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】        明細書
【発明の名称】    ミスマッチ識別のための修飾オリゴヌクレオチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】  約4〜約70の塩基と、付着した小溝バインダとを有する修飾オリゴヌクレオチドにおいて、前記塩基の少なくとも1つが、5-置換ピリミジンと非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンとからなるグループから選択される修飾塩基によって置換されている修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項２】  請求項１の修飾オリゴヌクレオチドであって、更に、付着したレポータ基を有する。
【請求項３】  請求項１の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記小溝バインダは、以下からなるグループから選択される式を有する、
【化１】
2003525292.tif 000001
【化２】
2003525292.tif 000002
及び
【化３】
2003525292.tif 000003
ここで、前記添字mは、2〜5の整数、
前記添字rは、2〜10の整数、そして、
RaとRbとは、夫々、独立的に、前記修飾オリゴヌクレオチドに対する結合基, H, -ORc, -NRcRd, -COORc又は-CONRcRdであり、各RcとRdは、H, (C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、(C1-C12)アルキル、 (C2-C12) アルケニル、 (C2-C12) アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル及びアリルからなるグループから選択される。
【請求項４】  請求項１の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、以下からなるグループから選択される、
【化４】
2003525292.tif 000004
ここで、X1及び,X2は、H, NH2, OH,及びSHからなるグループから独立的に選択され、そして
R5は、(C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-0-(C2-C12)アルケニル、-O-(C2-C12)アルキニル、-S-(C1-C12)アルキル、-S-(C2-C12)アルケニル、-S-(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル(C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN,-CONH2及び、それらの保護された形態からなるグループから選択される。
【請求項５】  請求項１の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記修飾塩基は、下記からなるグループから選択される、
【化５】
2003525292.tif 000005
ここで、前記各X1基及び,X2基は、H, OH,NH2,及び保護されたアミノ基からなるグループから独立的に選択され、そして
R6は、(C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-0-(C2-C12)アルケニル、-O-(C2-C12)アルキニル、-S-(C1-C12)アルキル、-S-(C2-C12)アルケニル、-S-(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル(C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN,-CONH2及び、それらの保護された形態からなるグループから選択される。
【請求項６】  下記の式を有するオリゴヌクレオチド、
【化６】
2003525292.tif 000006
ここで、各Z1は、H, F又はORａからなるグループから独立的に選択されるメンバであり、ここでRａは、H, (C1-C8)アルキル及びヒドロキシ保護基からなるグループから選択されるメンバ、
各Z2は、H又は(C1-C8)アルキルからなるグループから選択されるメンバ、あるいは、オプションとして、単数若しくは複数の同一のフラノシル環上でZ２とZ1と組み合わされて5〜7員環を形成し、
各Z3は、O, S又はNHからなるグループから選択され、
各Yは、P(O)OH, P(S)OH及びP(O)CH3からなるグループから独立的に選択されるメンバ、
前記添字nは、1〜98の整数であり、
W1とW2は、夫々、H, モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート及び、オプションとしてレポータ基が付着した小溝バインダ基モアエティからなるグループから独立的に選択され、そして
各Bは、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジン及び下記の式の修飾塩基からなるグループから独立的に選択される、
【化７】
2003525292.tif 000007
【化８】
2003525292.tif 000008
【化９】
2003525292.tif 000009
及び
【化１０】
2003525292.tif 000010
ここで、X11及びX12は、夫々、H,NH2及び保護されたアミノ基からなるグループから独立的に選択され;
各R11は、保護又は未保護形態の、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル及び3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから独立的に選択され;
各R12は、保護又は未保護形態の、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリルからなるグループから独立的に選択され、ここで、前提としてR12は、2-ピリジルエチニル以外であり、そして
更に前提として、前記Bの少なくとも1つは修飾塩基から選択され、更に、オプションとして、これらBのうちの単数又は複数は、付着した小溝バインダ−結合基モアエティ、レポータ基又はそれらの組み合わせを有する。
【請求項７】  請求項６のオリゴヌクレオチドであって、nは、4〜30の整数である。
【請求項８】  請求項６のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのBは、
【化１１】
2003525292.tif 000011
である。
【請求項９】  請求項６のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのBは、
【化１２】
2003525292.tif 000012
である。
【請求項１０】  請求項６のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのBは、
【化１３】
2003525292.tif 000013
である。
【請求項１１】  請求項６のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのBは、
【化１４】
2003525292.tif 000014
である。
【請求項１２】  修飾オリゴヌクレオチドアレイであつて、前記アレイが固体支持体と複数の付着したオリゴヌクレオチドとを有するものにおいて、前記アレイ中の前記オリゴヌクレオチドの少なくとも50%は、非置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、及び5-置換ピリミジンからなるグループから選択される修飾塩基を含む。
【請求項１３】  請求項１２の修飾オリゴヌクレオチドアレイであって、前記付着したオリゴヌクレオチドは、互いに約２℃内に納まるTmと、互いに約2塩基内に納まる塩基対長とを有する。
【請求項１４】  非置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、及び5-置換ピリミジンからなるグループから選択される少なくとも1つの塩基と、更に、付着したフルオロホアとを有する複数の修飾オリゴヌクレオチドを有する組成物。
【請求項１５】  請求項１４の組成物であって、前記複数のオリゴヌクレオチドの夫々は、付着したフルオロホアと、付着したクエンチャとを有する。
【請求項１６】  請求項１５の組成物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの夫々は、4〜30塩基長で、かつ、互いに約２℃内に納まるTmを有する。
【請求項１７】  請求項１６の組成物であって、前記複数は、約6〜約100である。
【請求項１８】  ポリヌクレオチド中の標的配列の存在を検出するための方法であって、該方法は以下を有する、
(a)  前記標的配列の存在をテストすべきポリヌクレオチドを、前記標的配列に対して実質的に相補的な配列を有する修飾オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする工程、そして
(b)  ハイブリダイズした核酸を同定する工程、
ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、プリン残基の代わりに、少なくとも1つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンを有する。
【請求項１９】  標的配列を含むポリヌクレオチドを、前記標的配列に対して相補的な単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマとともに、重合化酵素とヌクレオチド基質との存在下で、重合化に有利な条件下で、インキュベートする工程を有するプライマ伸長方法において、前記オリゴヌクレオチドプライマのうちの少なくとも1つは、プリン塩基又はピリミジン塩基の代わりに、非置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基又は5-置換ピリミジン塩基からなるグループから選択される修飾塩基を有する。
【請求項２０】  ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
(a)  前記ポリヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドアレイと、ハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする工程、そして
(b)前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたかを測定する工程。
【請求項２１】  ポリヌクレオチド中の標的配列のヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
(a)  前記標的配列を有するポリヌクレオチドを、少なくとも2つの既知の配列のオリゴヌクレオチドに接触させる工程、ここにおいて、それらオリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基が3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンによって置換され、前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドの1つは前記標的配列に対して完全に相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つの別のオリゴヌクレオチドは関連する標的配列を有する、そして、これらオリゴヌクレオチドの夫々を、前記ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする工程、そして
(b)前記オリゴヌクレオチドの夫々と前記ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの程度を測定する工程。
【請求項２２】  細胞中の遺伝子発現を調べる方法であって、該方法は以下の工程を有する、
(a)  前記細胞中の前記遺伝子の発現を表すポリヌクレオチドの集団を、ハイブリダイゼーション条件下で、異なる配列の複数の修飾オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドアレイと共にインキュベートする工程、そして
(b)  前記アレイ中のどの修飾オリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを判定する工程、
ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、プリンの代わりに、少なくとも1つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンを有する。
【請求項２３】  対象の遺伝子の標的配列中の突然変異を同定するための方法であって、該方法は以下の工程を有する、
(a)  前記標的配列を有するポリヌクレオチドを、野生型配列と種々の変異標的配列とを含む種々の配列のオリゴヌクレオチドのアレイと、ハイブリダイゼーション条件下で、インキュベートする工程、そして
(b)  前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを判定する工程、
ここで、前記複数のオリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンによって置換されている。
【請求項２４】  請求項６のオリゴヌクレオチドであって、単数又は複数の同じフラノース環上のZ1とZ2とが、結合して5〜7員環を形成する。
【請求項２５】  複数のオリゴヌクレオチドを有する組成物であって、該組成物は以下を有する、
少なくとも1つの修飾塩基と第1のTmとを備える第1配列を有する第1オリゴヌクレオチド、そして
第2配列と第2のTmとを備える第2オリゴヌクレオチド、ここで、前記第1のTmと第2のTmとは平衡(level)である。
【請求項２６】  請求項２５の組成物であって、前記第1配列中の前記少なくとも1つの修飾塩基は、PPA, PPG, PPPA, PPPG, PU, PC, HOPU, HOBuU, HOBuC, (NH2)2PPPA, (NH2)2PPPAOH, (NH2)2BuPPAOH, (NH2)2PPAI及びHOBuPPGから成るグループから選択されるメンバである。
【請求項２７】  請求項２５の組成物であって、前記配列(array)は、固体支持体と、複数の付着したオリゴヌクレオチドとを有し、前記複数のオリゴヌクレオチドは、非置換ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、3-置換ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン及び5-置換ピリミジンから成るグループから選択される少なくとも1つの修飾塩基を含む。
【請求項２８】  平衡化された(leveled)Tmを有する修飾オリゴヌクレオチドを設計する方法であって、以下の工程を有する、
a) n個の塩基と既知のTmとを有する既知の配列のオリゴヌクレオチドを提供する、そして
b) 少なくとも1つの修飾塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドを、前記少なくとも1つの修飾塩基の配列依存熱力学的貢献を利用して設計する、ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、n個以下の塩基と、前記既知のTmと平衡化したTmを有する。
【請求項２９】  請求項２８の方法であって、更に以下を決定する工程を有する、
i) 前記オリゴヌクレオチドに付着した前記小溝バインダの前記配列依存熱力学的貢献、そして
ii)  前記オリゴヌクレオチドの前記配列依存熱力学的貢献、ここで、
前記オリゴヌクレオチド-小溝バインダ接合体の設計は、前記小溝バインダと前記オリゴヌクレオチドとの決定された配列依存熱力学的貢献を使用して行われる。
【請求項３０】  請求項２９の方法であって、更に、前記設計工程を反復して、そのそれぞれが前記既知Tmと平衡化されたTmを有する複数種のオリゴヌクレオチド-小溝バインダ接合体を生成する工程を有する。
【請求項３１】  請求項２８〜３０いずれか一項の方法であって、コンピュータシステムで実施される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互対照
本出願は、その夫々の開示内容をここに参考文献として合体させる、2000年3月1日出願の仮出願第60/186,046号と、2000年11月28日出願の出願第09/724,959号とにおける利益を請求するものである。
【０００２】
国家支援研究及び開発に基づいてなされた発明に対する権利の陳述
該当せず。
【０００３】
発明の背景
本出願は、液体、固体及び混合相アッセイにおけるプローブ及びプライマとしてのオリゴヌクレオチドの利用に関する分子生物学の分野に関連している。本出願は、更に、アッセイにおいて使用され、又は、プローブ及びプライマとして使用される、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性と識別能力とを改善するための、修飾核酸塩基と修飾オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【０００４】
分子生物学において現在使用されている多くの技術は、プローブ及び／又はプライマとしてオリゴヌクレオチドを利用している。これら技術の実施においては、多くの場合、互いに関連してはいるが、単数又は複数のヌクレオチドが異なる2つ以上の配列間を識別できることが望ましい。例えば、臨床的に重要な突然変異の多くは、野生型の配列から1つのヌクレオチドだけが異なっている。哺乳動物ゲノムにおけるポリモルフォリズムも又、多くの場合、1つ又は2〜3のヌクレオチドの違いによって特徴付けられる。実際には、そのような識別ができる能力は、ミスマッチ識別として知られる。実際には、ミスマッチ識別は、所定の配列のオリゴヌクレオチドが、所与のストリンジェンシにおいて、その全長に沿ってそれが相補的である（完全なハイブリッド又は完全なマッチ）標的配列に対しては強力にハイブリダイズするが（その1つの現われは、そのハイブリッドが高い融解温度を有することである）、１つ又は2〜3のヌクレオチドにおいてそのオリゴヌクレオチドの配列に対して非相補的である（ミスマッチ）標的配列に対しては検出可能に弱くしかハイブリダイズしないという特性をいうものである。ハイブリダイゼーション強度の違いは、完全なマッチがハイブリッドとして検出可能であり、ミスマッチはハイブリッドを形成できような特定のストリンジェンシが選択可能であるようなものである。
【０００５】
核酸二体鎖において、各塩基対は安定性に貢献している。従って、その二体鎖が短ければ短いほど、二本鎖の安定性に対する各個の塩基対の相対的な貢献は大きくなる。その結果、完全なマッチとミスマッチの間の安定性の違いは、短いオリゴヌクレオチドにおいてより大きくなる。しかしながら、短いオリゴヌクレオチドは、完全に相補的な配列に対してすら、弱くしかハイブリダイズせず、従って、低いストリンジェンシでハイブリダイズしなければならない。このように、短いオリゴヌクレオチドの潜在的識別力は、低いストリンジェンシ条件下でしか容易に実現することができない。
【０００６】
当該技術において必要とされているのは、ミスマッチ識別のための新しい方法、特に、大半の核酸増幅反応の特徴である高温状態等の高いストリンジェンシ条件下での単一ヌクレオチドミスマッチ用の方法である。驚くべきことに、本発明は、そのような方法と、これらの方法において使用可能な新規な試薬及び組成物とを提供する。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、種々のアッセイにおいて異例の特性と有用性を有することが分かった多くの修飾オリゴヌクレオチドを提供する。従って、本発明は、ここに記載される前記修飾オリゴヌクレオチドを使用する方法も提供する。
【０００８】
一態様において、本発明は、非置換及び3-置換ピラゾロ［3,4-d］ピリミジン
から選択される少なくとも2つの塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドを提供する。好適実施例において、修飾塩基を含有する前記オリゴヌクレオチドは、更に、検出可能標識、蛍光発光及び化学発光クエンチャ及び／又は小溝バインダ及び／又はその他のタイプの修飾塩基又は塩基アナログ等の他のモアエティ（moieties）を有する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、少なくとも1つの5-置換ピリミジン塩基と少なくも1つの3-置換ピラゾロ［3,4-d］ピリミジン塩基とを有する修飾オリゴヌクレオチドを提供する。好適実施例において、これらの修飾オリゴヌクレオチドは、更に、検出可能標識、蛍光発光及び化学発光クエンチャ及び／又は小溝バインダ等の他のモアエティ（上述したような）を有する。
【００１０】
更に別の態様において、本発明は、関連する配列を有するポリヌクレオチド間を識別するための方法を提供する。
【００１１】
更に別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチド中の標的配列の存在を検出するための方法を提供する。
【００１２】
更に別の態様において、本発明は、プライマ伸長のための方法と、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法とを提供する。
【００１３】
関連する態様において、本発明は、細胞中の遺伝子の発現を検査する方法と、対象の遺伝子の標的配列中の突然変異又はポリモルフォリズムを同定する方法とを提供する。
【００１４】
更に別の態様において、本発明は、ここに記載の方法と、その他の従来のアッセイ及び方法とのための、修飾オリゴヌクレオチドを作成するのに有用な多数の修飾塩基を提供する。
【００１５】
更に別の態様において、本発明は、そのアレイメンバが約1〜2℃内に納まるTmと、互いに1〜2塩基内に納まる長さとを有する修飾オリゴヌクレオチドアレイを提供する。これらアレイメンバの配列を決定するための方法も提供される。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１８３］に示す発明を提供する。
【００１７】
［１］  非置換及び3-置換ピラゾロ［3,4-d］ピリミジン塩基からなるグループから選択される少なくとも2つの塩基を有する修飾オリゴヌクレオチド。
［２］上記［１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、更に、共有結合的に付着した小溝バインダを有する。
［３］上記［１］のの修飾オリゴヌクレオチドであって、更に、少なくとも1つの共有結合的に付着したレポータ基を有する。
［４］上記［１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、更に、少なくとも1つの共有結合的に付着したクエンチャを有する。
［５］上記［３］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記レポータ基はフルオロホアである。
［６］上記［３］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記レポータ基はフルオロホアであり、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、付着したクエンチャを有する。
［７］上記［１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、4〜70の塩基を有する。
［８］上記［１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、4〜70の塩基を有するとともに、更に、付着した小溝バインダを有する。
［９］上記［１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、4〜70の塩基を有するとともに、更に、付着したフルオロホアとクエンチャとを有する。
［１０］上記［２］の修飾オリゴヌクレオチドであって、4〜70の塩基を有するとともに、更に、付着したフルオロホアとクエンチャとを有する。
［１１］上記［１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記少なくとも2つの塩基のうちの少なくとも1つの塩基は、下記の式を有する非置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基であり、
【化１５】
2003525292.tif 000015
そして、前記少なくとも2つの塩基のうちの少なくとも1つは、下記の式を有する3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基であり、
【化１６】
2003525292.tif 000016
ここで、前記X1基とX2基とは、H,OH、NH2及び保護されたアミノ基からなるグループから独立的に選択されるメンバであり、そして
前記R1基の夫々は、(C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-O-(C2-C12) アルケニル、-O-(C2-C12) アルキニル、-S-(C1-C12)アルキル、-S-(C2-C12)アルケニル、-S-(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル (C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN, -CONH2及びそれらの保護された形態からなるグループから独立的に選択されるメンバである。
［１２］上記［１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、以下の式を有する、
【化１７】
2003525292.tif 000017
R2は前記修飾オリゴヌクレオチドの第1末端を表し、
R3は、前記修飾オリゴヌクレオチドの第2末端を表し、
前記添字nは、4〜70の整数であり、
各Bは、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン、及び3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジンからなるグループから独立的に選択されるメンバであり、そして、
各Mは、オリゴマー形成糖及びペプチド核酸形成アミノ酸からなるグループから選択されるメンバである。
［１３］上記［１２］の修飾オリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのMは、非天然オリゴマー形成糖である。
［１４］少なくとも1つの5-置換ピリミジン塩基と、少なくとも1つの非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基とを有する修飾オリゴヌクレオチド。
［１５］上記［１４］の修飾オリゴヌクレオチドであって、更に、共有結合的に付着した小溝バインダを有する。
［１６］上記［１４］の修飾オリゴヌクレオチドであって、更に、少なくとも1
つの共有結合的に付着したレポータ基を有する。
［１７］上記［１４］の修飾オリゴヌクレオチドであって、更に、少なくとも1
つの共有結合的に付着したクエンチャを有する。
［１８］上記［１６］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記レポータ基はフルオロホアである。
［１９］上記［１６］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記レポータ基はフルオロホアであり、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、付着したクエンチャを有する。
［２０］上記［１４］の修飾オリゴヌクレオチドであって、4〜70の塩基を有する。
［２１］上記［１４］の修飾オリゴヌクレオチドであって、4〜70の塩基を有するとともに、更に、付着した小溝バインダを有する。
［２２］上記［１４］の修飾オリゴヌクレオチドであって、4〜70の塩基を有するとともに、更に、付着したフルオロホアとクエンチャとを有する。
［２３］上記［１５］の修飾オリゴヌクレオチドであって、4〜70の塩基を有するとともに、更に、付着したフルオロホアとクエンチャとを有する。
［２４］上記［１４］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記少なくとも1つの5-置換ピリミジンは下記のグループから選択される式を有する、
【化１８】
2003525292.tif 000018
そして、前記少なくとも1つの非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基は、下記のグループから選択される、
【化１９】
2003525292.tif 000019
ここで、前記各X1,X2及びX3基は、独立的に、H, OH, NH2及び保護されたアミノ基からな
るグループから選択され、そして
R1及びR4基は、夫々、独立的に、(C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-0-(C2-C12)アルケニル、-O-(C2-C12)アルキニル、-S-(C1-C12)アルキル、-S-(C2-C12)アルケニル、-S-(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル(C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN,-CONH2及び、それらの保護された形態からなるグループから選択される。
［２５］上記［１４］の修飾オリゴヌクレオチドであって、以下の式を有する、
【化２０】
2003525292.tif 000020
R2は前記修飾オリゴヌクレオチドの第1末端を表し、
R3は、前記修飾オリゴヌクレオチドの第2末端を表し、
前記添字nは、4〜70の整数であり、
各Bは、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、5-置換ピリミジン、及び3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジンからなるグループから独立的に選択されるメンバであり、そして、
各Mは、オリゴマー形成糖及びペプチド核酸形成アミノ酸からなるグループから選択されるメンバである。
［２６］上記［２５］の修飾オリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのMは、ロックされたオリゴマ形成糖である。
［２７］約4〜約70の塩基と、付着した小溝バインダとを有する修飾オリゴ
ヌクレオチドにおいて、前記塩基の少なくとも1つが、5-置換ピリミジンと非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンとからなるグループから選択される修飾塩基によって置換されている修飾オリゴヌクレオチド。
［２８］上記［２７］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記塩基の少なくとも1つは、5-置換ピリミジンによって置換されている。
［２９］上記［２７］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記塩基の少なくとも1つは、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンによって置換されている。
［３０］上記［２７］の修飾オリゴヌクレオチドであって、更に、付着したレポータ基を有する。
［３１］上記［３０］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記レポータ基はフルオロホアであり、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、付着したクエンチャを有する。
［３２］上記［３１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、約4〜約20の塩基を有する。
［３３］上記［３２］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記フルオロホアは5’-末端に付着し、前記クエンチャは3’-末端に付着している。
［３４］上記［３２］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記フルオロホアは3’-末端に付着し、前記クエンチャは5’-末端に付着している。
［３５］上記［２７］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記小溝バインダは、以下からなるグループから選択される式を有する、
【化２１】
2003525292.tif 000021
【化２２】
2003525292.tif 000022
及び
【化２３】
2003525292.tif 000023
ここで、前記添字mは、2〜5の整数、
前記添字rは、2〜10の整数、そして、
RaとRbとは、夫々、独立的に、前記修飾オリゴヌクレオチドに対する結合基, H, -ORc,-NRcRd, -COORc又は-CONRcRdであり、各RcとRdは、H, (C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、(C1-C12)アルキル、 (C2-C12) アルケニル、 (C2-C12) アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル及びアリルからなるグループから選択される。
［３６］上記［３０］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記レポータ基は、レゾルフィン色素、クーマリン色素、ローダミン色素、シアニン色素、BODIPY色素、フルオレセイン色素、ピレンからなるグループから選択される。
［３７］上記［３１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記レポータ基は、レゾルフィン色素、クーマリン色素、ローダミン色素、シアニン色素、BODIPY色素、フルオレセイン色素、ピレンからなるグループから選択され、前記クエンチャは、非蛍光クエンチャ、1-アザ-1,2-ジフェニルエテン誘導体、及びローダミン誘導体からなるグループから選択される。
［３８］上記［２７］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、以下からなるグループから選択される、
【化２４】
2003525292.tif 000024
ここで、X1及び,X2は、H, NH2, OH,及びSHからなるグループから独立的に選択され、そして
R5は、(C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-0-(C2-C12)アルケニル、-O-(C2-C12)アルキニル、-S-(C1-C12)アルキル、-S-(C2-C12)アルケニル、-S-(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル(C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN,-CONH2及び、それらの保護された形態からなるグループから選択される。
［３９］上記［３８］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記ヘテロシクリル基及びアリル基は、フェニル、トリル、ピリジル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、チエニル、ピロリル、ベンズイミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズチアゾリル、インドリル、トリアジニル、ピリミジニル、及びナフチルからなるグループから選択される。
［４０］上記［２７］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記修飾塩基は、下記からなるグループから選択される、
【化２５】
2003525292.tif 000025
ここで、前記各X1基及び,X2基は、H, OH,NH2,及び保護されたアミノ基からなるグループから独立的に選択され、そして
R6は、(C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-0-(C2-C12)アルケニル、-O-(C2-C12)アルキニル、-S-(C1-C12)アルキル、-S-(C2-C12)アルケニル、-S-(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル(C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN,-CONH2及び、それらの保護された形態からなるグループから選択される。
［４１］上記［４０］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記ヘテロシクリル基及びアリル基は、フェニル、トリル、ピリジル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、チエニル、ピロリル、ベンズイミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズチアゾリル、インドリル、トリアジニル、ピリミジニル、及びナフチルからなるグループから選択される。
［４２］上記［３９］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記小溝バインダは、以下からなるグループから選択される式を有する、
【化２６】
2003525292.tif 000026
【化２７】
2003525292.tif 000027
及び
【化２８】
2003525292.tif 000028
ここで、前記添字mは、2〜5の整数、
前記添字rは、2〜10の整数、そして、
RaとRbとは、夫々、独立的に、前記修飾オリゴヌクレオチドに対する結合基,H, -ORc, -NRcRd, -COORc又は-CONRcRdであり、各RcとRdは、H, (C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、(C1-C12)アルキル、(C2-C12) アルケニル、(C2-C12) アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル及びアリルからなるグループから選
択される。
［４３］上記［４１］の修飾オリゴヌクレオチドであって、前記小溝バインダは、以下からなるグループから選択される式を有する、
【化２９】
2003525292.tif 000029
【化３０】
2003525292.tif 000030
及び
【化３１】
2003525292.tif 000031
ここで、前記添字nは、2〜5の整数、
前記添字rは、2〜10の整数、そして、
RaとRbとは、夫々、独立的に、前記修飾オリゴヌクレオチドに対する結合基, H, -ORc,-NRcRd, -COORc又は-CONRcRdであり、各RcとRdは、H, (C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、(C1-C12)アルキル、 (C2-C12) アルキニル、(C2-C12) アルケニル、アリル(C1-C12)アルキル及びアリルからなるグループから選択される。
［４４］以下の式を有する化合物、
【化３２】
2003525292.tif 000032
ここで、Z1は、H, F及びORａからなるグループから選択されるメンバ、ここで、Rａは、H, (C1-C8)アルキル及びヒドロキシ保護基からなるグループから選択されるメンバ、
Z2は、H,(C1-C8)アルキルからなるグループから選択されるメンバ、又は、オプションとして、Z1と組み合わされて5〜7員環を形成する、
Y1は、OH,保護されたヒドロキシ基、及び0-P1からなるグループから選択されるメンバ、ここでP1は、ホスホルアミダイト又はH-ホスホネート基であり、
Y2は、OH,保護されたヒドロキシ基、及び0-P2からなるグループから選択されるメンバ、ここでP2は、ホスホルアミダイト、H-ホスホネート、モノホスフェート、ジホスフェート又はトリホスフェートであり、そして
Bは、以下からなるグループから選択される修飾ヌクレオチド、
【化３３】
2003525292.tif 000033
【化３４】
2003525292.tif 000034
【化３５】
2003525292.tif 000035
及び
【化３６】
2003525292.tif 000036
ここで、X11及びX12は、H, NH2及び保護されたアミノ基からなるグループから夫々独立的に選択され;
各R11は、保護又は未保護形態の、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから独立的に選択され;そして
各R12は、保護又は未保護形態の、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル及びヘテロシクリルからなるグループから独立的に選択され、但し、R12は、2-ピリジルエチニル以外である。
［４５］上記［４４］の化合物であって、Bは、
【化３７】
2003525292.tif 000037
である。
［４６］上記［４４］の化合物であって、Bは、
【化３８】
2003525292.tif 000038
である。
［４７］上記［４４］の化合物であって、Bは、
【化３９】
2003525292.tif 000039
である。
［４８］上記［４４］の化合物であって、Bは、
【化４０】
2003525292.tif 000040
である。
［４９］上記［４５］の化合物であって、X11及びX12は、夫々、NH2である。
［５０］上記［４９］の化合物であって、Y1は0-P1であり、Y2は保護されたヒドロキシであり、Z1はHであり、そしてR12は、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、及び3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから選択される。
［５１］上記［５０］の化合物であって、Y1は、-O-[(2-シアノエチル)N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]であり、そしてY2は、-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)である。
［５２］上記［４５］の化合物であって、X11はNH2であり、そしてX12はHである。
［５３］上記［５２］の化合物であって、Y1は0-P1であり、Y2は保護されたヒドロキシであり、Z1はHであり、そしてR12は、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、及び3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから選択される。
［５４］上記［５３］の化合物であって、Y1は、-O-[(2-シアノエチル)N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]であり、そしてY2は、-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)である。
［５５］上記［４６］の化合物であって、X12はH又はNH2である。
［５６］上記［５５］の化合物であって、Y1は0-P1であり、Y2は保護されたヒドロキシであり、Z1はHであり、そしてR12は、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、及び3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから選択される。
［５７］上記［５６］の化合物であって、X1は、-O-[(2-シアノエチル)N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]であり、そしてX2は、-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)である。
［５８］上記［４７］の化合物であって、X11はNH2である。
［５９］上記［５８］の化合物であって、Y1は0-P1であり、Y2は保護されたヒドロキシであり、Z1はHであり、そしてR11は、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、及び3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから選択される。
［６０］上記［５９］の化合物であって、Y1は、-O-[(2-シアノエチル)N, N-ジ
イソプロピルホスホルアミダイト]であり、そしてY2は、-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)である。
［６１］上記［４８］の化合物であって、Y1は0-P1であり、Y2は保護されたヒドロキシであり、Z1はHであり、そしてR11は、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、及び3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから選択される。
［６２］上記［６１］の化合物であって、Y1は、-O-[(2-シアノエチル)N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]であり、そしてY2は、-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)である。
［６３］下記の式を有するオリゴヌクレオチド、
【化４１】
2003525292.tif 000041
ここで、各Z1は、H, F又はORａからなるグループから独立的に選択されるメンバであり、ここでRａは、H, (C1-C8)アルキル及びヒドロキシ保護基からなるグループから選択されるメンバ、
各Z2は、H又は(C1-C8)アルキルからなるグループから選択されるメンバ、あるいは、オプションとして、単数若しくは複数の同一のフラノシル環上でZ２とZ1と組み合わされて5〜7員環を形成し、
各Z3は、O, S又はNHからなるグループから選択され、
各Yは、P(O)OH, P(S)OH及びP(O)CH3からなるグループから独立的に選択されるメンバ、
前記添字nは、1〜98の整数であり、
W1とW2は、夫々、H, モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート及び、オプションとしてレポータ基が付着した小溝バインダ基モアエティからなるグループから独立的に選択され、そして
各Bは、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジン及び下記の式の修飾塩基からなるグループから独立的に選択される、
【化４２】
2003525292.tif 000042
【化４３】
2003525292.tif 000043
【化４４】
2003525292.tif 000044
及び
【化４５】
2003525292.tif 000045
ここで、X11及びX12は、夫々、H,NH2及び保護されたアミノ基からなるグループから独立的に選択され;
各R11は、保護又は未保護形態の、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル及び3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから独立的に選択され;
各R12は、保護又は未保護形態の、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリルからなるグループから独立的に選択され、ここで、前提としてR12は、2-ピリジルエチニル以外であり、そして
更に前提として、前記Bの少なくとも1つは修飾塩基から選択され、更に、オプションとして、これらBのうちの単数又は複数は、付着した小溝バインダ−結合基モアエティ、レポータ基又はそれらの組み合わせを有する。
［６４］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、nは、4〜30の整数である。
［６５］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのBは、
【化４６】
2003525292.tif 000046
である。
［６６］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのBは、
【化４７】
2003525292.tif 000047
である。
［６７］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのBは、
【化４８】
2003525292.tif 000048
である。
［６８］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのBは、
【化４９】
2003525292.tif 000049
である。
［６９］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、W1は、小溝バインダ−結合基モアエティである。
［７０］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、W1は、付着したレポータ基を有する小溝バインダ−結合基モアエティである。
［７１］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、W2は、小溝バインダ−結合基モアエティである。
［７２］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、W2は、付着したレポータ基を有する小溝バインダ−結合基モアエティである。
［７３］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのZ3はNHである。
［７４］修飾オリゴヌクレオチドアレイであつて、前記アレイが固体支持体と複数の付着したオリゴヌクレオチドとを有するものにおいて、前記アレイ中の前記オリゴヌクレオチドの少なくとも50%は、非置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、及び5-置換ピリミジンからなるグループから選択される修飾塩基を含む。
［７５］上記［７４］の修飾オリゴヌクレオチドアレイであって、前記付着したオリゴヌクレオチドは、互いに約２℃内に納まるTmと、互いに約2塩基内に納まる塩基対長とを有する。
［７６］上記［７４］の修飾オリゴヌクレオチドアレイであって、前記付着したオリゴヌクレオチドは、互いに約1℃内に納まるTmと、互いに約2塩基内に納まる塩基対長とを有する。
［７７］上記［７４］の修飾オリゴヌクレオチドアレイであって、前記アレイは約10〜約10,000の付着したオリゴヌクレオチドを有し、これらの夫々は、互いに約２℃内に納まるTmと、互いに約2塩基内に納まる塩基対長とを有する。
［７８］上記［７４］の修飾オリゴヌクレオチドアレイであって、前記アレイは約10〜約10,000の付着したオリゴヌクレオチドを有し、これら付着したヌクレオチドの一部に、共有結合的に付着した小溝バインダを有する。
［７９］非置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、及び5-置換ピリミジンからなるグループから選択される少なくとも1つの塩基と、更に、付着したフルオロホアとを有する複数の修飾オリゴヌクレオチドを有する組成物。
［８０］上記［７９］の組成物であって、前記複数のオリゴヌクレオチドの夫々は、付着したフルオロホアと、付着したクエンチャとを有する。
［８１］上記［８０］の組成物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの夫々は、4〜30塩基長で、かつ、互いに約２℃内に納まるTmを有する。
［８２］上記［８１］の組成物であって、前記複数は、約6〜約100である。
［８３］関連する配列を有するポリヌクレオチドを識別する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
(a)  プリン又はピリミジン塩基の代わりに、少なくとも1つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン又は5-置換ピリミジンを有する所定の配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを、少なくとも2つのポリヌクレオチドと接触させる工程、ここで、前記ポリヌクレオチドの1つは、前記修飾オリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な標的配列を有し、その他のポリヌクレオチドの内の少なくとも1つは、少なくとも1つの塩基ミスマッチを含む標的配列を有する、そして
(b)  前記修飾オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドの夫々との間のハイブリダイゼーションの程度を測定する工程。
［８４］上記［８３］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、レポータ基を有する。
［８５］上記［８４］の方法であって、前記レポータ基は、フルオロホアである。
［８６］上記［８３］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、小溝バインダを有する。
［８７］上記［８３］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、小溝バインダとフルオロホアとを有する。
［８８］上記［８３］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、小溝バインダとフルオロホアとクエンチャとを有する。
［８９］ポリヌクレオチド中の標的配列の存在を検出するための方法であって、該方法は以下を有する、
(a)  前記標的配列の存在をテストすべきポリヌクレオチドを、前記標的配列に対して実質的に相補的な配列を有する修飾オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする工程、そして
(b)  ハイブリダイズした核酸を同定する工程、
ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、プリン残基の代わりに、少なくとも1つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンを有する。
［９０］上記［８９］の方法であって、前記インキュベーション工程は、クレアベース酵素の存在下で行われる。
［９１］上記［８９］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、レポータ基を有する。
［９２］上記［９１］の方法であって、前記レポータ基は、フルオロホアである。
［９３］上記［９２］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、付着したクエンチャを有する。
［９４］上記［８９］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、付着した小溝バインダを有する。
［９５］標的配列を含むポリヌクレオチドを、前記標的配列に対して相補的な単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマとともに、重合化酵素とヌクレオチド基質との存在下で、重合化に有利な条件下で、インキュベートする工程を有するプライマ伸長方法において、前記オリゴヌクレオチドプライマのうちの少なくとも1つは、プリン塩基又はピリミジン塩基の代わりに、非置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基又は5-置換ピリミジン塩基からなるグループから選択される修飾塩基を有する。
［９６］上記［９５］の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプライマの1つは、単一塩基によって延長される。
［９７］上記［９５］の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプライマの少なくとも1つは、更に、付着した小溝バインダを有する。
［９８］上記［９５］の方法であって、前記インキュベーション工程は、増幅反応の一部である。
［９９］上記［９８］の方法であって、前記増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
［１００］上記［９５］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、共有結合的に付着した小溝バインダを有する。
［１０１］ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
(a)  前記ポリヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドアレイと、ハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする工程、そして
(b)前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたかを測定する工程。
［１０２］上記［１０１］の方法であって、前記アレイは、10〜100,000の相異なる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
［１０３］上記［１０１］の方法であって、前記アレイは、10〜1000の相異なる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
［１０４］ポリヌクレオチド中の標的配列のヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
(a)  前記標的配列を有するポリヌクレオチドを、少なくとも2つの既知の配列のオリゴヌクレオチドに接触させる工程、ここにおいて、それらオリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基が3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンによって置換され、前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドの1つは前記標的配列に対して完全に相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つの別のオリゴヌクレオチドは関連する標的配列を有する、そして、これらオリゴヌクレオチドの夫々を、前記ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする工程、そして
(b)前記オリゴヌクレオチドの夫々と前記ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの程度を測定する工程。
［１０５］上記［１０４］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、更に、レポータ基を有する。
［１０６］上記［１０４］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、更に、小溝バインダを有する。
［１０７］上記［１０４］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、更に、小溝バインダとレポータ基とを有する。
［１０８］細胞中の遺伝子発現を調べる方法であって、該方法は以下の工程を有する、
(a)  前記細胞中の前記遺伝子の発現を表すポリヌクレオチドの集団を、ハイブリダイゼーション条件下で、異なる配列の複数の修飾オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドアレイと共にインキュベートする工程、そして
(b)  前記アレイ中のどの修飾オリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを判定する工程、
ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、プリンの代わりに、少なくとも1つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンを有する。
［１０９］対象の遺伝子の標的配列中の突然変異を同定するための方法であって、該方法は以下の工程を有する、
(a)  前記標的配列を有するポリヌクレオチドを、野生型配列と種々の変異標的配列とを含む種々の配列のオリゴヌクレオチドのアレイと、ハイブリダイゼーション条件下で、インキュベートする工程、そして
(b)  前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを判定する工程、
ここで、前記複数のオリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンによって置換されている。
［１１０］上記［４４］の化合物であって、Y1とY2の一方は、ホスホルアミダイト基である。
［１１１］上記［１１０］の化合物であって、Y1とY2の他方は、保護されたヒドロキシ基である。
［１１２］上記［１１１］の化合物であって、前記保護されたヒドロキシ基は、4,4’-ジメトキシトリチロキシ基である。
［１１３］上記［１１０］の化合物であって、前記ホスホルアミダイト基は、- O -(2-シアノエチル)-N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイトである。
［１１４］上記［１１２］の化合物であって、前記ホスホルアミダイト基は、- O -(2-シアノエチル)-N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイトである。
［１１５］上記［１１０］の化合物であって、Bは
【化５０】
2003525292.tif 000050
である。
［１１６］上記［１１５］の化合物であって、X11とX12とは、保護されたアミノ基である。
［１１７］上記［１１６］の化合物であって、Y1とY2の一方は、-O-(2-シアノエチル)-N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイトであり、Y1とY2の他方は、4,4’-ジメトキシトリチロキシ基である。
［１１８］上記［１１６］の化合物であって、前記保護されたアミノ基の一方又は両方は、ベンゾイル類似保護基である。
［１１９］上記［１１０］の化合物であって、Bは、
【化５１】
2003525292.tif 000051
である。
［１２０］上記［１１９］の化合物であって、X12は、保護されたアミノ基である。
［１２１］上記［１２０］の化合物であって、X12は、-N=CH-N(CH3)2である。
［１２２］上記［１２１］の化合物であって、Y1とY2の一方は、-O-(2-シアノエチル)-N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイトであり、Y1とY2の他方は、4,4’-ジメトキシトリチロキシ基である。
［１２３］上記［１１０］の化合物であって、Bは、
【化５２】
2003525292.tif 000052
である。
［１２４］上記［１２３］の化合物であって、前記ホスホルアミダイト基は、-O-(2-シアノエチル)-N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイトである。
［１２５］上記［１１０］の化合物であって、Bは、
【化５３】
2003525292.tif 000053
である。
［１２６］上記［１２５］の化合物であって、前記ホスホルアミダイト基は、-O-(2-シアノエチル)-N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイトである。
［１２７］上記［１１０］の化合物であって、Bは、
【化５４】
2003525292.tif 000054
【化５５】
2003525292.tif 000055
【化５６】
2003525292.tif 000056
であり、そしてX11とX12とは、保護されたアミノ基である。
［１２８］上記［１２７］の化合物であって、Y1とY2の他方は、保護されたヒドロキシ基である。
［１２９］上記［１２８］の化合物であって、前記ホスホルアミダイト基は、-O-(2-シアノエチル)-N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイトである。
［１３０］上記［１２９］の化合物であって、Y1とY2の他方は、4,4’-ジメトキシトリチロキシ基である。
［１３１］上記［１２８］の化合物であって、前記保護されたアミノ基の一方又は両方は、ベンゾイル類似保護基である。
［１３２］上記［１１０］の化合物であって、Z1は水素であり、Y1はOHであり、Y2はOHである。
［１３３］上記［１１０］の化合物であって、Z1とZ2とは、結合して5〜7員環を形成する。
［１３４］上記［６３］のオリゴヌクレオチドであって、単数又は複数の同じフラノース環上のZ1とZ2とが、結合して5〜7員環を形成する。
［１３５］複数のオリゴヌクレオチドを有する組成物であって、該組成物は以下を有する、
少なくとも1つの修飾塩基と第1のTmとを備える第1配列を有する第1オリゴヌクレオチド、そして
第2配列と第2のTmとを備える第2オリゴヌクレオチド、ここで、前記第1のTmと第2のTmとは平衡(level)である。
［１３６］上記［１３５］の組成物であって、前記第1のTmは、前記第2のTmの約5℃以内である。
［１３７］上記［１３５］の組成物であって、前記第1オリゴヌクレオチドは
、前記第2オリゴヌクレオチドの約±2塩基内である。
［１３８］上記［１３５］の組成物であって、前記第1配列中の前記少なくとも1つの修飾塩基は、アミノ酸に付着した塩基、ロックされた核酸塩基、及び共通塩基（universal  bases）から成るグループから選択されるメンバである。
［１３９］上記［１３５］の組成物であって、前記第1配列中の前記少なくとも1つの修飾塩基は、3-置換ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンと5-置換ピリミジンとから成るグループから選択される。
［１４０］上記［１３５］の組成物であって、前記第1配列中の前記少なくとも1つの修飾塩基は、PPA, PPG, PPPA, PPPG, PU, PC, HOPU, HOBuU, HOBuC, (NH2)2PPPA, (NH2)2PPPAOH, (NH2)2BuPPAOH, (NH2)2PPAI及びHOBuPPGから成るグループから選択されるメンバである。
［１４１］上記［１３５］の組成物であって、前記第2配列は、少なくとも1つの修飾塩基を有する。
［１４２］上記［１４１］の組成物であって、前記第2配列中の前記少なくとも1つの修飾塩基は、アミノ酸に付着した塩基、ロックされた核酸塩基、及び共通(universal)塩基から成るグループから選択されるメンバである。
［１４３］上記［１４１］の組成物であって、前記第2配列中の前記少なくとも1つの修飾塩基は、PPA, PPG, PPPA, PPPG, PU, PC, HOPU, HOBuU, HOBuC, (NH2)2PPPA, (NH2)2PPPAOH, (NH2)2BuPPAOH, (NH2)2PPAI及びHOBuPPGから成るグループから選択されるメンバである。
［１４４］上記［１３５］の組成物であって、前記第1配列は、付着した小溝バインダを有する。
［１４５］上記［１３５］の組成物であって、前記第2配列は、付着した小溝バインダを有する。
［１４６］上記［１３５］の組成物であって、前記第1配列中の前記少なくとも1つの修飾塩基は、前記第1オリゴヌクレオチドの安定性を減少させる。
［１４７］上記［１３５］の組成物であって、前記第1配列中の前記少なくとも1つの修飾塩基は、前記第1オリゴヌクレオチドの安定性を増加させる。
［１４８］上記［１３５］の組成物であって、前記第1オリゴヌクレオチドと前記第2オリゴヌクレオチドとは、表面上に配列される。
［１４９］上記［１４８］の組成物であって、前記配列(array)は、固体支持体と、複数の付着したオリゴヌクレオチドとを有し、前記複数のオリゴヌクレオチドは、非置換ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、3-置換ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン及び5-置換ピリミジンから成るグループから選択される少なくとも1つの修飾塩基を含む。
［１５０］上記［１４８］の組成物であって、前記配列(array)は、固体支持体と、複数の付着したオリゴヌクレオチドとを有し、前記複数のオリゴヌクレオチドは、3-置換ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンと5-置換ピリミジンから成るグループから選択される少なくとも1つの修飾塩基を含む。
［１５１］上記［１４８］の組成物であって、前記配列(array)は、約10〜約10,000の付着したオリゴヌクレオチドを有し、そのそれぞれは、互いの約2℃以内のTmと、互いの約2塩基内の塩基対長とを有する。
［１５２］平衡化された(leveled)Tmを有する修飾オリゴヌクレオチドを設計する方法であって、以下の工程を有する、
a) n個の塩基と既知のTmとを有する既知の配列のオリゴヌクレオチドを提供する、そして
b) 少なくとも1つの修飾塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドを、前記少なくとも1つの修飾塩基の配列依存熱力学的貢献を利用して設計する、ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、n個以下の塩基と、前記既知のTmと平衡化したTmを有する。
［１５３］上記［１５２］の方法であって、前記少なくとも1つの修飾塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドの配列依存熱力学的貢献は、最近接パラメータを使用して決定される。
［１５４］上記［１５２］の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、ジェンバンク（Genbank）由来である。
［１５５］上記［１５２］の方法であって、前記少なくとも1つの修飾塩基は、アミノ酸に付着した塩基、ロックされた核酸塩基、及び共通(universal)塩基から成るグループから選択されるメンバメンバである。
［１５６］上記［１５２］の方法であって、前記少なくとも1つの修飾塩基は、PPA, PPG, PPPA, PPPG, PU, PC, HOPU, HOBuU, HOBuC, (NH2)2PPPA, (NH2)2PPPAOH, (NH2)2BuPPAOH, (NH2)2PPAI及びHOBuPPGから成るグループから選択されるメンバである。
［１５７］上記［１５２］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、付着した小溝バインダを有する。
［１５８］上記［１５７］の方法であって、前記小溝バインダは、クエンチャ分子を介して前記オリゴヌクレオチドに付着している。
［１５９］上記［１５７］の方法であって、更に以下を決定する工程を有する、
i) 前記オリゴヌクレオチドに付着した前記小溝バインダの前記配列依存熱力学的貢献、そして
ii)  前記オリゴヌクレオチドの前記配列依存熱力学的貢献、ここで、前記オリゴヌクレオチド-小溝バインダ接合体の設計は、前記小溝バインダと前記オリゴヌクレオチドとの決定された配列依存熱力学的貢献を使用して行われる。
［１６０］上記［１５９］の方法であって、前記オリゴヌクレオチドに付着した前記小溝バインダの前記配列依存熱力学的貢献は、前記オリゴヌクレオチドの第1二本鎖の二本鎖安定性を、付着した小溝バインダを備える前記オリゴヌクレオチドの第2二本鎖の安定性と比較することによって決定される。
［１６１］上記［１５９］の方法であって、前記オリゴヌクレオチドの前記既知Tmは、経験的に決定される。
［１６２］上記［１５９］の方法であって、前記オリゴヌクレオチドの前記既知Tmは、最近接パラメータを使用して決定される。
［１６３］上記［１５９］の方法であって、前記n個の塩基を有する前記既知配列は、前記既知Tmに貢献する。
［１６４］上記［１５９］の方法であって、前記オリゴヌクレオチド-小溝バインダ接合体の前記Tmは、前記既知Tmの約5℃以内である。
［１６５］上記［１５９］の方法であって、更に、前記設計工程を反復して、そのそれぞれが前記既知Tmと平衡化されたTmを有する複数種のオリゴヌクレオチド-小溝バインダ接合体を生成する工程を有する。
［１６６］上記［１６５］の方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド-小溝バインダ接合体は、互いに約1-2塩基以内である。
［１６７］上記［１６５］の方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド-小溝バインダ接合体は、支持体上に固定される。
［１６８］上記［１６５］の方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド-小溝バインダ接合体は、支持体上で合成される。
［１６９］上記［１６７］の方法であって、前記支持体は、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、ガラス、シリコンウエハ、光ファイバ、及びプラスチックから成るグループから選択される。
［１７０］上記［１５７］の方法であって、前記小溝バインダは、
【化５７】
2003525292.tif 000057
【化５８】
2003525292.tif 000058
【化５９】
2003525292.tif 000059
から成るグループから選択される式を有し、
ここで、添え字mは2-5の整数、
添え字rは2-10の整数、そして
RaとRbのそれぞれは、独立的に、前記修飾オリゴヌクレオチドに対する結合基, H, -ORc, -NRcRd, -COORc及び-CONRcRdであり、ここで、RcとRdのそれぞれは、H, (C1-C12)ヘテロアルキル、(C1-C12)ヘテロアルケニル、(C1-C12)ヘテロアルキニル、(C1-C12)アルキル、(C1-C12)アルケニル、(C1-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル及びアリルから成るグループから選択される。
［１７１］上記［１５７］の方法であって、前記小溝バインダは、前記修飾オリゴヌクレオチドの3’-末端に付着している。
［１７２］上記［１５７］の方法であって、前記小溝バインダは、前記修飾オリゴヌクレオチドの5’-末端に付着している。
［１７３］上記［１５７］の方法であって、前記小溝バインダは、前記修飾オリゴヌクレオチドの3’-末端、5’-末端以外に付着している。
［１７４］上記［１５２］の方法であって、前記少なくとも1つの修飾塩基は、前記修飾オリゴヌクレオチドの安定性を減少させる。
［１７５］上記［１５２］の方法であって、前記少なくとも1つの修飾塩基は、前記修飾オリゴヌクレオチドの安定性を増加させる。
［１７６］上記［１５２］の方法であって、更に、工程(b)を反復して、そのそれぞれが前記既知Tmと平衡化されたTmを有する複数種の修飾オリゴヌクレオチドを生成する工程を有する。
［１７７］上記［１７６］の方法であって、そのそれぞれが前記既知Tmと平衡化されたTmを有する前記複数種の修飾オリゴヌクレオチドは、修飾塩基を備えない少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを有する。
［１７８］上記［１７６］の方法であって、前記複数種の修飾オリゴヌクレオチドは、付着した小溝バインダ接合体を有する。
［１７９］上記［１５２］の方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチドは、支持体上に固定される。
［１８０］上記［１５２］の方法であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの設計は、更に、前記修飾オリゴヌクレオチド中の天然塩基の前記配列依存熱力学的貢献を利用する工程を含む。
［１８１］上記［１５２］の方法であって、前記オリゴヌクレオチドと前記修飾オリゴヌクレオチドとは、互いに類似のハイブリダイゼーション特性を有する。
［１８２］上記［１５２］の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、フルオロホアとそれに付着したクエンチャ分子とを単数又は複数有する。
［１８３］上記［１５２］〜［１８２］のいずれかの方法であって、コンピュータシステムで実施される。
【００１８】
発明の記載
略語と定義
ここに記載される多数の修飾塩基の略語は、以下のように提供される（これらの塩基の構造は図１Ａと１Ｂとに図示されている）。6-アミノ-3-プロプ-1-イニル-5-ヒドロピラゾロ［3,4−d］ピリミジン-4-オン,PPPG; 6-アミノ-3-(3-ヒドロキシプロプ-1-イニル)1-5-ヒドロピラゾロ［3,4−d］ピリミジン−4−オン, HOPPPG; 6-アミノ-3-(3-アミノプロプ-1-イニル)-5-ヒドロピラゾロ［3,4−d］ピリミジン−4−オン, NH2PPPG; 4-アミノ-3-(プロプ-1-イニル)ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン, PPPA; 4-アミノ-3-(3-ヒドロキシプロプ-1-イニル)ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン, HOPPPA; 4-アミノ-3-(3-アミノプロプ-1-イニル)ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン, NH2PPPA; 3-プロプ-1-イニルピラゾロ［3,4−d］ピリミジン-4,6-ジアミノ, (NH2)2PPPA; 2-(4,6-ジアミノピラゾロ［3,4−d］ピリミジン-3-イル)エチン-1-オール, (NH2)2PPPAOH; 3-(2-アミノエチニル)ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン-4, 6-ジアミン, (NH2)2PPPANH2; 5-プロプ-1-イニル-1,3-ジヒドロピリミジン-2,4-ジオン, PU; 5-(3-ヒドロキシプロプ-1-イニル)-1,3-ジヒドロピリミジン-2,4-ジオン, HOPU; 6-アミノ-5-プロプ-1-イニル-3-ジヒドロピリミジン-2-オン, PC; 6-アミノ-5-(3-ヒドロキシプロプ-1-イニル)-1,3-ジヒドロキシピリミジン-2-オン, HOPC; 及び6-アミノ-5-(3-アミノプロプ-1-イニル)-1,3-ジヒドロピリミジン-2-オン, NH2PC; 5-[4-アミノ-3-(3-メトキシプロプ-1-イニル)ピラゾロ［3,4−d］ピリミジニル]-2-(ヒドロキシチメル) オキソラン-3-オール, CH3OPPPA; 6-アミノ-1-[4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)オキソラン-2-イル]-3-(3-メトキシプロプ-1-イニル)-5-ヒドロピラゾロ［3,4−d］ピリミジン-4-オン, CH3OPPPG; 5-(4-ヒドロキシブト-1-イニル)-1,3-ジヒドロピリミジン-2,4-ジオン, HOBuU; 6-アミノ-5-(4-ヒドロキシブト-1-イニル)-3-ヒドロピリミジン-2-オン, HOBuC; 4-(4-アミノピラゾロ［3,4−d］ピリミジン-3-イル)ブト-3-イン-1-オール, HOBuPPA; 6-アミノ-3-(4-ヒドロキシブト-1-イニル)ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン-4-オール, HOBuPPG; 4-(4,6-ジアミノピラゾロ［3,4−d］ピリミジン-3-イル)ブト-3-イン-1-オール, (NH2)2BuPPAOH。
【００１９】
特に明記の無い限り、本明細書及び請求項に使用される下記の用語は以下の意味を有する。
【００２０】
「アルキル」という用語は、接頭辞に示す数の炭素原子を有する、直鎖、分岐、又は環状の飽和一価炭化水素ラジカル、又は、環状及び直鎖又は分岐の組み合わせによる飽和一価炭化水素ラジカルを意味する。例えば、(C1-C8)アルキルは、メチル、エチル、n-プロピル、2-プロピル、tert-ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル等を含むことを意味する。ここに記載の定義(例えば、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルアルキルオキシ)の夫々において、アルキル部分の主鎖炭素原子の数を示すために接当部が含まれていない場合、そのラジカル又は部分は、８以下の主鎖炭素原子を有する。
【００２１】
「アルキレン」という用語は、その接頭辞に示される数の炭素原子を有する、直鎖飽和二価炭化水素ラジカル又は、分岐飽和二価炭化水素ラジカルを意味する。例えば、(C1-C6)アルキレンは、メチレン、エチレン、プロピレン、2-メチルプロピレン、ペンチレン等を含むことを意味する。
【００２２】
「アルケニル」という用語は、接頭辞に示された数の炭素原子を有するとともに少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖一価炭化水素ラジカル又は分岐一価炭化水素ラジカルを意味する。例えば、(C2-C6)アルケニルは、エテニル、プロペニル等を含むことを意味する。
【００２３】
「アルキニル」という用語は、接頭辞に示された数の炭素原子を有するとともに少なくとも1つの三重結合を含む、直鎖一価炭化水素ラジカル又は分岐一価炭化水素ラジカルを意味する。例えば、(C2-C6)アルキニルは、エチニル、プロピニル等を含むことを意味する。
【００２４】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）という用語は、伝統的な意味で使用され、夫々、酸素原子、アミノ基、又は硫黄元素を介して分子のその他の部分に付着するアルキル基を意味する。同様に、ジアルキルアミノという用語は、互いに同じ又は異なることが可能な2つの付着したアルキル基を有するアミノ基を意味する。
【００２５】
「アリル」という用語は、非置換又は１〜４の置換基によって独立に置換された６〜１０員環の、一価の単環式又二環式のラジカルを意味する。前記置換基は、好ましくは、以下から選択される１、２、又は３の置換基である。その置換基は、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、COR（ここで、Rは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、フェニル又はフェニルアルキル）、-(CR’R’’）n-COOR（ここで、nは、0〜5の整数であり、R’及びR’’は、独立的に、水素又はアルキルであり、Rは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニル、又はフェニルアルキルである）、又は-(CR’R’’）n-CONRaRb（ここで、nは、0〜5の整数であり、R’及びR’’は、独立的に、水素又はアルキルであり、Ra及びRbは、互いに独立的に、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニル、又はフェニルアルキルである）である。より具体的には、アリルという用語は、例えば、非限定的に、フェニル、バイフェニル、1-ナフチル、及び2-ナフチル、及びそれらの置換形態を含む。同様に、「ヘテロアリル」という用語は、ピリジル、キノリニル、キナゾリニル、チエニル等の芳香族特性を保持しながら、単数又は複数の複素原子又は複素原子官能基が環炭素に置換したアリル基を意味する。簡略化のために、他のラジカル（例えば、アリルオキシ、アリルアルキル）との組み合わせにおいて使用される場合、アリルという用語は、上述したアリル基とヘテロアリル基との両方を含むことを意味する。
【００２６】
「アリルアルキル」という用語は、ラジカル-RaRbを意味し、ここで、Raはア
ルキレン基（示される数の炭素原子、又は、特定されていない場合には、６以下の主鎖炭素原子を有する）であり、Rbは、ここに定義されるアリル基である。アリルアルキル基の具体例としては、ベンジル、フェニルエチル、3-(3-クロロフェニル)-2-メチルペンチル等がある。
【００２７】
同様に、「アリルアルケニル」という用語は、ラジカル-RaRbを意味し、ここ
で、Raはアルケニレン基であり、Rbは、ここに定義されるアリル基であり、例えば、3-フェニル-2-プロペニル等である。
【００２８】
同様に、「アリルヘテロアルキル」という用語は、ラジカル-RaRbを意味し、
ここで、Raはヘテロアルキレン基（示される数の炭素原子を有する）であり、Rbは、ここに定義されるアリル基であり、例えば、2-ヒドロキシ-2-フェニル-エチル,2-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-2-フェニル-エチル等である。
【００２９】
「アリルオキシ」という用語は、ラジカル-ORを意味し、ここでRはアリル基、例えば、フェノキシ、ナフチルオキシ等である。
【００３０】
接頭辞「ハロ」と「ハロゲン」という用語は、置換基を記載するのに使用される場合は、-F, -Cl, -Br及び-Iを意味する。
【００３１】
「ヘテロアルキル」という用語は、互いに独立的に、シアノ, - ORa, -NRbRc,及び-S(O)nRd（ここで、nは０〜２の整数）から選択される１つ、２つ、又は３つの置換基を備える、アルキルラジカルであり、ここで、このヘテロアルキル基の付着ポイントは、ヘテロアルキル基の炭素原子を介したものである。Raは、水素、アルキル、アリル、アリルアルキル、アルコキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、カルボキシアミド又はモノ-又はジ-アルキルカルバモイルである。Rbは、水素、アルキル、アリル、又はアリルアルキルである。Rcは、水素、アルキル、アリル、アリルアルキル、アルコキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、カルボキシアミド又はモノ-又はジ-アルキルカルバモイル又はアルキルスルホニルである。Rdは、水素（nが０の場合），アルキル、アリル、アリルアルキル、アミノ、モノ-アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、又はヒドロキシアルキルである。代表的な例としては、例えば、2-ヒドロキシエチル, 2,3-ジヒドロキシプロピル, 2-メトキシエチル、ベンジルオキシメチル、2-シアノエチル、及び2-メチルスルホニル-エチルがある。上記の夫々につき、Ra, Rb, Rc及びRdは、更に、NH2、フッ素、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、OH又はアルコキシによって置換することができる。更に、炭素原子の数を示す前記接頭辞（例えばC1-C10）は、シアノ、-ORa、-NRbRc又は-S(O)nRd部分を除く、前記ヘテロアルキル基の部分中の炭素原子の総数を示す。
【００３２】
「ヘテロシクリル（heterocyclyl）」という用語は3〜8の環原子の飽和又は不飽和非芳香環ラジカルを意味し、ここで、1つ又は２つの環原子がO, NR(ここで、Rは独立的に水素又はアルキル)又はS(O)n(ここで、nは、0〜2の整数)から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子がCであり、ここで1つ又は２つのC原子はオプションとしてカルボニル基によって置換可能である。前記ヘテロシクリル環は、オプションとして、アルキル、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、-COR（ここで、Rは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、フェニル又はフェニルアルキル）,-(CR’R’’）n-COOR（nは、0〜5の整数、R’とR’’は、独立的に、水素又はアルキル、そしてRは水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、フェニル又はフェニルアルキル）又は-(CR’R’’）n-CONRaRb(ここで、nは、0〜5の整数、R’とR’’は、独立的に、水素又はアルキル、そしてRaとRbは、互いに独立的に、水素、アルキル、フェニル又はフェニルアルキルである)から選択される、１つ、２つ又は３つの置換基によって独立的に置換可能である。更に具体的には、ヘテロシクリルという用語は、非限定的に、テトラヒドロピラニル、ピペリジノ、N-メチルピペリジン-3-イル、ピペラジノ、N-メチルピロリジン-3-イル、3-ピロリジノ、2-ピロリドン-1-イル、モルホリノ、チオモルホリノ、チオモルホリノ-1-オキシド、チオモルホリノ-1,1-ジオキド、ピロリジニル、及びそれらの誘導体を含む。炭素原子の数を示す接頭辞(例えば、C3-C10)は、ヘテロ原子の数を除く、ヘテロシクリル基の部分中の炭素原子の総数を示す。
【００３３】
「ヘテロシクリルアルキル」、「ヘテロシクリルアルケニル」、「ヘテロシクリルアルキニル」という用語は、ラジカル-RaRbを示し、ここでRaは、夫々、ア
ルキレン、アルケニレン又はアルキニレン基であり、Rbは、ここに定義されるヘテロシクリル基、例えば、テトラヒドロピラン-2-イルメチル,4-メチルピペラジン-1-イルエチル,3-ピペリジニルメチル等である。
【００３４】
「ヘテロアルキレン」という用語は、-ORa、-NRbRc、及び-S(O)nRd(ここで、nは0〜2の整数)から独立的に選択される１つ２つ又は３つの置換基を有する1〜6の炭素原子の直鎖飽和二価炭化水素ラジカル又は3〜6の炭素原子の分岐飽和炭化水素ラジカルであり、Ra, Rb, Rc及びRdは、ここでヘテロアルキルラジカルに関して定義されたものである。具体例としては、2-ヒドロキシエタン-1, 2-ジイル, 2-ヒドロキシプロパン-1, 3-ジイル等がある。
【００３５】
上記用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」及び「アリル」）の夫々は、上述したラジカルの置換形態と非置換形態を含むことを意味している。各タイプのラジカルの好適な置換基を次に示す。
【００３６】
前記アルキル及びヘテロアルキルラジカル（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、ヘテロシクロアルキル、及びヘテロシクロアルケニルと称されるものを含む）に対する置換基は、0から4、好ましくは0, 1, 2又は3の範囲の数で、-OR’、=O、=NR’、=N-OR’、-NR’R’’、-SR’、-ハロゲン、SiR’R’’R’’’、-OC (O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R’’、-OC(O)NR’R’’、-NR’’C(O)R’、-NR’-C(O)NRR’’R’’’、-NR’’C(O)2R’、-NH-C(NH2)=NH, -NR’C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R’’、-CN及び-NO2から選択される種々の基とすることができる。R’、 R’’及びR’’’は、夫々、独立的に、水素、非置換(C1-C8)アルキル及びヘテロアルキル、非置換アリル、1〜3のハロゲンで置換されたアリル、非置換アルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基、又は、アリル-(C1-C4)アルキル基を意味する。R’及びR’’が同じ窒素原子に付着している場合には、それらをその窒素原子と組み合わせて5-, 6-又は7-員の環を形成することができる。例えば、-NR’R’’は、1-ピロリジニルと4-モルホリニルを含むものと意味する。置換基に関する上記記載から、当業者は、「アルキル」という用語は、その最も広い意味において、ハロアルキル(例えば、-CF3と-CH2CF3)及びアシル(例えば、-C(O)CH3,、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等の基を含むことを意味するものであると理解するであろう。好ましくは、前記アルキル基は、特に明記されない限り、0〜3の置換基、より好ましくは0,1又は2の置換基を有する。
【００３７】
同様に、前記アリル基の置換基は様々であり、ゼロから芳香環系のオープン原子価の総数までの数において、-ハロゲン、-OR’、-OC(O)R’、-NR’R’’、-SR’、-R’、-CN、-NO2、-CO2R’、-CONR’R’’、-C(O)R’、-OC(O)NR’R’’、-NR’’C(O)R’、-NR’’C(O)2R’、-NR’-C(O)NRR’’R’’’、-NH-C(NH2)=NH,-NR’C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R’’、-N3，- CH(Ph)2、 ペルフルオロ(C1-C4)アルコキシ、及びペルフルオロ(C1-C4)アルキルから選択され、ここで、R’、R’’及びR’’’は、独立的に、水素、(C1-C8)アルキル及びヘテロアルキル、非置換アリル及びヘテロアリル、(非置換アリル)-(C1-C4)アルキル、及び(非置換アリル)オキシ-(C1-C4)アルキルから選択される。
【００３８】
前記アリル又はヘテロアリル環の隣接原子の置換基のうちの２つは、オプションとして、式-T-C(O)-(CH2)q-U-の置換基によって交換可能であり、ここで、TとUとは、独立的に、-NH-, -O-, -CH2-又は単結合であり、qは0〜2の整数である。あるいは、前記アリル又はヘテロアリル環の隣接原子の置換基のうちの2つは、オプションとして、式-A-(CH2)r-B-の置換基によって交換可能であり、ここで、A及びBは、独立的に、-CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)２-,-S(O)2NR’-又は単結合であり、rは1〜3の整数である。このように形成された新規の環の前記単結合のうちの1つは、オプションとして、二重結合によって置き換え可能である。あるいは、前記アリル又はヘテロアリル環の隣接原子の置換基のうちの２つは、オプションとして、式-(CH2)s-X-(CH2)t-の置換基によって交換可能であり、ここで、sとtとは、独立的に0〜3の整数であり、Xは-O-, -NR’-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 又は-S(O)2NR’-である。-NR’-と-S(O)2NR’-との前記置換基R’は、水素又は非置換(C1-C6)アルキルから選択される。
【００３９】
本発明のいくつかの化合物又はオリゴヌクレオチドは、塩形態で存在することができる。そのような塩には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、又はマグネシウム塩、その他類似の塩等の塩基付与塩（base  addition solts）がある。本発明の前記化合物又は修飾オリゴヌクレオチドが比較的塩基性の官能基性を有する場合には、そのような化合物の中性形態を、十分な量のニート状又は適当な不活性溶媒形態の所望の酸と接触させることによって、酸付与塩（acid  addition  solts）を得ることができる。許容可能な酸付与塩の具体例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一炭化水素酸（monohydrogencarbonic）、リン酸、一水素リン酸（monohydrogenphosphoric）、二水素リン酸（dihydrogenphosphoric）、硫酸、一水素硫酸（monohydrogensulfuric）、ヨウ化水素酸、又は亜リン酸等の無機酸から誘導されるもの、更に、酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マレイン酸、マロン酸、乳酸、安息香酸、琥珀酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等の有機酸から誘導されるものを含む。更に、アルギン酸等のアミノ酸の塩や、グルクロン酸やガラクツロン酸等の有機酸の塩も含まれる(例えば、バージ（Berge）、S. M.他、“Pharmaceutical Salts”、Journal of Pharmaceutical Science、1977、66、1-19を参照)。本発明のいくつかの特定の化合物は、それら化合物を塩基又は酸付与塩に変換することを可能にする塩基性官能基性と酸性官能基性との両方を含む。
【００４０】
中性形態の前記化合物は、前記塩を塩基又は酸に接触させ、その原化合物を従来方法で分離することによって再生することができる。原形態の前記化合物は、極性溶媒中における溶解性等のある種の物理的特性において前記種々の塩形態と異なっているかもしれないが、その他の点では、それらの塩は、本発明の目的のために、前記原形態の化合物と均等である。
【００４１】
本発明のある種の化合物は、水和形態を含めて、非溶媒和形態と溶媒和形態との両方で存在することが可能である。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と均等であり、本発明の範囲に含まれることが意図される。本発明のある種の化合物は、複合的な結晶又はアモルファス形態で存在しうる。一般に、すべての物理形態は、本発明によって意図される使用に対して均等であり、本発明の範囲に含まれることが意図されている。
【００４２】
本発明のある種の化合物は不斉炭素原子（光学中心）又は二重結合を有し、ラセミ化合物、ジアステレオマー、幾何学異性体及び個々の異性体は、すべて本発明の範囲に含まれることが意図される。立体化学的測定方法と、異性体の分離方法とは、周知である(例えば、“Advanced Organic Chemistry”第４版、J マーチ（March）、ジョン・ウィリー（John Wiley）及びサンズ（Sons）、New York、 1992の第４章の記載を参照)。
【００４３】
本発明の化合物は、更に、これら化合物を構成する原子の内の1つ又は複数において人工的な比率の原子同位体を含むことができる。例えば、これら化合物は、トリチウム(3H), ヨウ素-125(125I)、又は炭素-14(14C)等の放射性同位体によって放射性標識することができる。放射性であっても放射性でなくても（例えば2H）、本発明の化合物のすべての同位体変種は、本発明の範囲に含まれることが意図される。
【００４４】
「保護基（protecting  group）」又は「その保護された形態（protected  form  thereof）」とは、分子中の反応基に付着した時に、その反応性をマスク、低減又は阻止する一群の原子を意味する。保護基の具体例は、T. W. グリーン（Green）及びP. G. フッツ（Futs）、Protective Groups in Organic Chemistry、(ウィリ（Wiley）、第二版、 1981)、ビューケージ（Beaucage）及びアイヤー（Iyer）, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992)及びハリソン（Harrison）及びハリソン（Harrison）他、Compendium of Synthetic Organic Methods、Vols. 1-8 (ジョン・ウィリー（John Wiley）及びサンズ（Sons）、1971-1996)に見いだすことができる。代表的なアミノ保護基としては、ホルミル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基(CBZ)，第３ブトキシカルボニル基(Boc)、トリメチルシリル基(TMS)、2-トリメチルシリル-エタンスルホニル(SES)、トリチル及び置換トリチル基、アリルオキシカルボニル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(FMOC)、ニトロ-ベラトリルオキシカルボニル(NVOC)等がある。代表的なヒドロキシ保護基としては、ベンジル及びトリチルエーテル等のようにヒドロキシ基がアシル化又はアルキル化されているものや、更に、アルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル、及びアリルエーテル等がある。
【００４５】
上記定義における「オプションの」又は「オプションとして」とは、そのあとに記載の事象又は状況が、必ずしも発生する必要がないこと、そして、その記載が、その事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むものであることを意味している。例えば、「オプションとしてアルキル基によって１又は２置換されたヘテロシクロ（heterocyclo）基」とは、そのヘテロシクロ基がアルキル基によって１又は２置換される状況と、そのヘテロシクロ基がアルキル基によって１又は２置換されない状況とを含んでいる。
【００４６】
本発明の実行には、特に明記されない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成及び修飾、生結合（bioconjugate）化学、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝学、組換DNA、及び当業者技術範囲内のその他の関連分野における従来式の技術を使用する。これらの技術は文献に完全に説明されている。例えば、マニアティス（Maniatis）、フリッシュ（Fritsch）及びサムブルック（Sambrook）、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982); サムブルック（Sambrook）、フリッシュ（Fritsch）及びマニアティス（Maniatis）、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); オースベル（Ausubel）他、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、ジョン・ウィリー（John Wiley）及びサンズ（Sons） (1987、1988、1989、1990、1991、1992、1993、1994、1995、1996); ゲイト（Gait） (編集)、OLOGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH、IRL Press (1984); エクスタイン（Eckstein） (編集)、OLOGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES:A PRACTICAL APPROACH、IRL Press (1991)を参照。
【００４７】
概論
オリゴヌクレオチドはヌクレオチドの短いポリマであり、その長さが、一般には２００ヌクレオチド以下、好ましくは１５０ヌクレオチド以下、より好ましくは１００ヌクレオチド以下、更に好ましくは５０ヌクレオチド以下、そして最も好ましくは２１ヌクレオチド以下である。ポリヌクレオチドは、当該技術においては一般に、オリゴヌクレオチドよりも長いヌクレオチドのポリマであるとみなされている。但し、当該技術において、オリゴヌクレオチドの長さの限度と、ポリヌクレオチドの長さの限度との間には重なりがあると認識されている。本発明に関しては、「オリゴヌクレオチド」は、一般に、プローブ又はプライマとして使用される、通常は検出可能標識を有する核酸を意味し、これに対して、ポリヌクレオチドは、標的配列を含有する核酸を意味する。従って、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリマの長さに関して限定的なものと見なされてはならない。
【００４８】
本発明は、非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、新規で驚異的に優れたミスマッチ識別性を有する修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本発明の修飾オリゴヌクレオチドはプローブとして使用され、そこで、標的配列へのハイブリダイゼーションが検出され、又は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドはプライマとして使用され、標的配列に対するそれらのハイブリダイゼーション後に前記修飾オリゴヌクレオチドの3’末端からポリヌクレオチド合成が開始し、その合成生成物(すなわち、その伸長生成物)が形成される。
【００４９】
標的配列とは、プローブ又はプライマのためのハイブリダイゼーション部位を有するヌクレオチド配列を意味する。標的配列は、非限定的に、ゲノムDNA、cDNA、RNA、及びそれらの増幅生成物を含むすべての核酸に見出すことができ、野生型遺伝子配列、突然変異遺伝子配列、非コード化配列、調節配列等を含むことができる。標的配列は、一般には、長さが１００ヌクレオチド以下、好ましくは３０ヌクレオチド以下、そして最も好ましくは２１ヌクレオチド以下である。
【００５０】
実施例の記載
本発明は、多数の修飾オリゴヌクレオチドを提供し、これらは大きく3つのグループに分類することが可能である。
【００５１】
第１のグループの修飾オリゴヌクレオチドは、自然発生塩基に置換する少なくとも2つの修飾塩基を有するにものである。ここで、これらの修飾塩基は、非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4-d］ピリミジンである。しかしながら、いくつかの実施例においては、前記修飾塩基は、それらの塩基の少なくとも1つが5-置換ピリミジンであり、それらの塩基の少なくとも1つが非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4-d］ピリミジンとなるように選択される。好ましくは、このグループの修飾オリゴヌクレオチドは、アッセイ中に標的配列を検出するのに役立つ追加の付着基（例えば、小溝バインダ、レポータ基、クエンチャ等）を有する。
【００５２】
第２のグループの修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾塩基を有するとともに、更に、付着した、小溝バインダ、レポータ基、クエンチャ等を有する。
【００５３】
第３のグループの修飾オリゴヌクレオチドは、単数又は複数の下記の新規な修飾塩基を有する。前記第１グループと同様に、このグループの修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくは、例えば小溝バインダ、レポータ基又はクエンチャから選択される付着基を有する。
【００５４】
修飾オリゴヌクレオチド
一態様において、本発明は、非置換及び3-置換ピラゾロ［3,4-d］ピリミジン
塩基からなるグループから選択される少なくとも2つの塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【００５５】
前記ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基は、ピラゾール環が、下記の特定の配向でピリミジン環に溶着(fuse)している塩基である。
【００５６】
【化６０】
2003525292.tif 000060
【００５７】
ここで、波線は、前記塩基と、付着したオリゴマ形成糖又はペプチド核酸形成に関与するアミノ酸との間の付着点を示している。更に、前記基X1とX2は、独立的に、H,OH又はNH2であり、これにより、前記ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基は、天然のプリン塩基、グラアノシン、アデニン、及びイノシン、更に、それら塩基の関連誘導体の構造に近似する。このグループの実施例において、「非置換ピラゾロ［3,4-d］ピリミジン塩基」とは、一般式Iaの塩基を意味し、他方、「3-置換ピラゾロ［3,4-d］ピリミジン塩基」とは、式Ibを有する塩基を意味し、ここでR1は下記のように定義される。
【００５８】
【化６１】
2003525292.tif 000061
【００５９】
式Ibにおいて、前記記号X1とX2は、独立的に、H,OH又はNH2又はその保護された形態を表す。前記記号R1は、(C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-O-(C2-C12) アルケ
ニル、-O-(C2-C12) アルキニル、-S-( C1-C12)アルキル、-S- (C2-C12)アルケニル、-S- (C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル (C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN, -CONH2及びそれらの保護された形態から選択されるメンバを表す。好適な、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、及びヘテロアルキニル基は、ヘテロ原子基(例えば、OH, NH2, SH等)で終端(ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン環系に対して遠位)するものである。例えば、好適なヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、及びヘテロアルキニル基は、3-アミノ-1-プロピル、4-ヒドロキシ-1-ブチル、3-アミノ-1-プロピン-1-イル、3-ヒドロキシ-1-プロピン-1-イル、4-ヒドロキシ-3-ヒドロキシメチル-1-ブチン-1-イル及び4-ヒドロキシ-1-ブチン-1-イル、更に、これら夫々のより高位の同族体（higher  homologs）を含む。他の好適なR1基は、アリル又はヘテロサイクリック基で終端するもの(例えば、ヘテロシクリル( C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル及びアリル (C2-C12)アルキニル)を含む。好適なアリル及びヘテロサイクリック基は、置換又は非置換フェニル、チエニル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、ピリジニル、ピロリル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、及びベンゾオキサゾリルである。
【００６０】
特に好適な実施例において、前記ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基は、下記から選択される。
【００６１】
【化６２】
2003525292.tif 000062
【００６２】
【化６３】
2003525292.tif 000063
【００６３】
【化６４】
2003525292.tif 000064
【００６４】
更に好適には、前記修飾塩基は、Ic, Id又はIeから選択され、ここで、各R1は、前記ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン環系に対して直接的に、又は、飽和（例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン）又は未飽和(例えば、アセチレニル、プロピニレン、ブチニレン、ブテニレン)とすることができる1〜4の炭素結合基を介して前記環系に付着した、プロピニル、ヒドロキシプロピニル、アミノプロピニル、アミノブチニル、ヒドロキシブチニル、又は置換あるいは非置換フェニル、チエニル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、ピリジニル、ピロリル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、及びベンゾオキサゾリル基である。
【００６５】
本発明の前記修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、自然発生オリゴヌクレオチド、又は、ペプチド核酸(例えば、オリゴマ形成糖あるいはペプチド核酸形成アミノ酸に付着したヘテロサイクリック塩基)に見られるもののような骨格鎖を有する。別のオリゴマ骨格鎖（以下、「修飾」骨格鎖又は骨格鎖修飾を有する、と称する）は、当業者に知られている。本発明の目的において、修飾オリゴヌクレオチドは、天然及び／又は修飾塩基を含み、相補的核酸と特異的にハイブリダイズして安定的な二体鎖を形成する能力を保持している、天然のリン酸塩骨格鎖と非天然骨格鎖とを含む、すべてのオリゴマポリマである。
【００６６】
好適実施例において、本発明の前記修飾オリゴヌクレオチドは、糖又はグリコシドモアエティ、好ましくは、2-デオキシリボフラノシドの骨格鎖を有し、ここで、すべてのヌクレオチド間結合は、自然発生ホスホジエステル結合である。しかしながら別実施例において、前記2-デオキシ-β-D-リボフラノース基は、他の糖、例えば、β-D-リボフラノースによって置換される。更に、β-D-リボフラノースは、リボースモアエティの2-OHが、C1-6アルキル基によってアルキル化されたり(2-(O-C1-6アルキル)リボース)又はC2-6アルケニル基によってアルキル化されたり(2-(O-C2-6アルケニル)リボース)、あるいは、フルオロ基によって置換された(2-フルオロリボース)状態で存在することが可能である。本発明において有用な関連オリゴマ形成糖は、「ロックされた(locked)」もの、すなわち、C-4’とC-2’の酸素原子との間にメチレンブリッジを含むもの、である。前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適合可能なその他の糖モアエティも使用可能であり、それらは、非限定的に、α-D-アラビノフラノシド、α-2’-デオキシリボフラノシド、又は2’,3’-ジデオキシ-3’-アミノリボフラノシドを含めて当業者に知られている。α-D-アラビノフラノシドを含有するオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,177,196号に記載されているように作成することができる。2’,3’-ジデオキシ-3’-アミノリボフラノシドを含有するオリゴヌクレオチドは、チェン（Chen）他 ((1995) Nucleic Acids Res.、23: 2661-2668)に記載されている。ロックされた核酸(シン（Singh）他, Chem. Comm., 455-456 (1998); ウェンゲル（Wengel）、J., Acc. Chem. Res.、32: 301-310 (1998))、及び、2’-ハロゲン-2’-デオキシリボフラノシドを含有するオリゴヌクレオチド(パリッサ（Palissa）他、Z. Chem. 27: 216 (1987) の合成のための手法が記載されている。ここに記載される修飾オリゴヌクレオチドのリン酸塩骨格鎖は、更に、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合及び／又はメチルホスホネート及び／又はホスホロアミデートを含有するようにも修飾可能である(チェン（Chen）他、Nucl. Acids Res.、23: 2662-2668(1995))。オリゴヌクレオチド結合の組み合わせも、本発明の範囲内である。更に別の骨格鎖修飾が当業者に知られている。
【００６７】
別のグループの実施例において、ここに記載の修飾塩基は、Tmをバランスし、改善されたミスマッチ識別能力を有する修飾オリゴヌクレオチドを提供するためにPNA及びDNA/PNAキメラに組み込まれる。種々の修飾形態のDNA及びDNAアナログが、プローブ又はプライマとしてのDNA分子の使用の問題的のいくつかを解決する試みにおいて使用されてきた。これらの中には、ペプチド核酸(PNA、ポリアミド核酸としても知られる)がある, ニールセン（Nielsen）他, (1991) Science 254: 1497-1500。PNAはDNAやRNAに見られるようにヘテロサイクリック塩基ユニットを有しており、それはDNA及びRNAに特徴的な糖-リン酸骨格鎖の代わりにポリアミド骨格鎖によって連結されている。PNAは、相補的DNA及びRNA標的配列に対するハイブリダイゼーションが可能であり、事実、対応の核酸プローブよりも強力にハイブリダイズする。PNAオリゴマの合成と、PNAオリゴマの合成に使用される反応性単量体は、米国特許5,539,082; 5,714,331; 5,773,571; 5,736,336及び5,766,855に記載されている。PNA及びDNA/PNAキメラ合成とPNA合成用の単量体に対する別方法は、ウールマン（Uhlmann）他 (1998) Angew. Chem. Int. ed. 37: 2796-2823に記載されている。従って、PNA又はDNA/PNAキメラのTmをバランスするために、通常の塩基、非置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基(例えば、PPG及びPPA)、3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、5-置換ピリミジン、共通塩基（universal  bases）又は小溝バインダの如何なる組み合わせの使用も、本発明の範囲内である。種々の共通塩基が知られている。その他の共通塩基も、最近記載されており、それらも本発明において使用可能である（例えば、シーラ（Seela）他、XIV International Round Table : Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications、2000年9月10〜14日、サンフランシスコ、カリフォルニア,pp.40）。PNA及びPNA/DNAキメラ合成に必要な修飾塩基単量体ユニットの合成に必要な合成方法は、当該技術において利用可能であり、本出願の方法と、ウールマン（Uhlmann）他、Angew. Chem. Int. Ed. 37: 2796-2832(1998)を参照。
【００６８】
同様に、本発明は、すべてのオリゴヌクレオチドプライマ又はオリゴポリマ／DNAキメラのTmをバランスするために、通常の塩基、非置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基(例えば、PPG及びPPA)、3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、5-置換ピリミジン、共通塩基又は小溝バインダの組み合わせを使用することが可能であることを示す。
【００６９】
ここに記載される使用において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくは、4〜70の塩基、より好ましくは4〜25の塩基を有する。いくつかの実施例において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、15以下、より好ましくは10以下の塩基を有する。更に、前記修飾オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施例において、3, 4, 5, 6, 7, 8又は9又はそれ以上の修飾塩基(非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン)を有する。複数の3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基が存在する各実施例において、前記修飾塩基は、互いに同じもの、又は異なったものとすることができる。
【００７０】
前記修飾塩基成分に加えて、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施例において、内部に位置するヌクレオチド塩基のうちの1つ又はそれ以上、3’，５’末端、両方の末端に付着した、例えば、インターカレータ、脂肪親和性基、小溝バインダ、レポータ基、キレート剤、クエンチャ、架橋剤等の追加のペンダント基、あるいは、内部と、片方又は両方の末端との両方に付着したペンダント基を有することができる。インターカレータ、脂肪親和性基、小溝バインダ、レポータ基、キレート剤、クエンチャ、架橋剤をオリゴヌクレオチドに付着させるのに適した方法は、例えば、米国特許5,512,667及び5,419,966、PCT公報WO96/32496及び米国出願09/457,616に記載されている。本発明の前記オリゴヌクレオチドは、更に、3’又5’末端、あるいは両末端に付着した比較的低分子量の「尾モアエティ（tail  moiety）」を備えることができる。例えば、尾モアエティは、リン酸塩、リン酸塩エステル、アルキル基、アミノアルキル基、又は脂肪親和性基とすることができる。この尾モアエティは、又、前記インターカレータ、脂肪親和性基、小溝バインダ、レポータ基、キレート剤、架橋機能基を本発明のオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
【００７１】
尾モアエティの性質と種々の尾モアエティを有するオリゴヌクレオチドを得るための方法も、上述した米国特許5,512,667及び及5,419,966に記載されている。
【００７２】
小溝バインダ
あるグループの実施例において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、共有結合的に付着した小溝バインダ(MBG)を有する。種々の適当な小溝バインダが文献に記載されている。例えば、クチヤビン（Kutyavin）他  米国特許5,801,155; ウィマー（Wemmer）, D. E., 及びダーバン（Dervan） P. B., Current Opinion in Structural Biology, 7:355-361 (1997);ウォーカー（Walker）, W. L.,コプカ（Kopka）, J.L. 及びグッドセル（Goodsell）, D. S.Biopolymers, 44:323-334 (1997); ジマー（Zimmer）, C 及び ワーナート（Wahnert）、U. Prog. Biophys. Molec. Bio. 47: 31-112 (1986)及びレディー（Reddy）、B.S.P., ドンディー（Dondhi）、S.M., 及びロウン（Lown）、J.W., Pharmacol. Therap., 84: 1-111(1999)。
【００７３】
MGB(更に、下記のフルオロホアやクエンチャのようなレポータ基)を、リンカを介してオリゴヌクレオチドに付着させるのに適した方法は、例えば、米国特許5,512,677; 5,419,966; 5,696,251; 5,585,481; 5,942,610及び5,736,626に記載されている。
【００７４】
前記MGBは、オリゴヌクレオチドの片側末端又は両末端に付着させることができる。更に又はそれに代えて、単数又は複数のMGBを、オリゴヌクレオチドの長さに応じて、そのオリゴヌクレオチドの内部に付着させることができる。一般に、オリゴヌクレオチド二本鎖の溶解はその末端から始まるため、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に対するMBGの接合は最大度のハイブリッド安定性を提供するものである。しかしながら、もしもオリゴヌクレオチドによって形成される二本鎖の両末端が、例えば、高いG+C含有率によって比較的安定的であるならば、MGBをオリゴヌクレオチドの内部（例えば、A+Tリッチ配列近辺）に付着させることによっても安定性は向上されるであろう。MGB-オリゴヌクレオチド接合体の意図される用途も、接合MGBの位置に対して制限を加えるかもしれない。例えば、もしもオリゴヌクレオチドがプライマとして使用されるように構成されるならば、3’-ヒドロキシ基がフリーであり、重合化酵素によって伸長可能であることが必要である。あるいは、標識化5’-末端を有するオリゴヌクレオチドを必要とするアッセイは、内部又は3’-末端へのMGBの付着を必要とするであろう。
【００７５】
MGB修飾オリゴヌクレオチド接合体内のMGBの位置は、又、そのような接合体の識別性にも影響を与える可能性がある。二本鎖内の不対合領域によって、誤対合塩基（単数又は複数）の近傍での小溝バインダの形状が変化するであろう。MGBは完全マッチDNAの小溝内に最もよく納まるため、小溝の形状の変化をもたらすミスマッチは、ミスマッチを含む領域へのMGBの結合の強度を低下させるであろう。従って、そのようなハイブリッドを安定化させるMGBの能力が低下し、それによって、MGB-オリゴヌクレオチド接合体が完全マッチ二本鎖からミスマッチを識別する能力が増大するであろう。他方、もし、ミスマッチがMGB-オリゴヌクレオチド接合体に対して相補的な領域の外部にある場合には、同じ長さの非接合オリゴヌクレオチドとMGB-接合オリゴヌクレオチドとの識別能力はほぼ同じとなることが予想される。オリゴヌクレオチドプローブが単一塩基対ミスマッチを識別する能力は、その長さに依存するため、オリゴヌクレオチドが短ければ短いほど、ミスマッチを識別するのにより効果的になる。この点に関するMGB-オリゴヌクレオチド接合体の主たる利点は、MGB結合の顕著な安定化作用によって、従来技術において使用されているもの(すなわち、20量体以下)と比較して、それらよりも遥かに短い、より大きな識別力を有するオリゴヌクレオチドを使用することが可能であることである。
【００７６】
好適な小溝バインダは、下記の式から選択されるものである。
【００７７】
【化６５】
2003525292.tif 000065
【００７８】
【化６６】
2003525292.tif 000066
【００７９】
及び
【００８０】
【化６７】
2003525292.tif 000067
【００８１】
添字mは、2〜5の整数、添字rは、2〜10の整数、そして、RaとRbとは、夫々、独立的に、前記修飾オリゴヌクレオチドに対する結合基, H, -ORc, -NRcRd, -COORc又は-CONRcRdあり、各RcとRdは、H, (C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、 (C1-C12)アルキル、(C2-C12) アルケニル、 (C2-C12) アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル及びアリルから選択される。
【００８２】
特に好適な小溝バインダは、3-カルバモイル-1,2-ジヒドロ-(3H)-ピロロ[3,4-e]インドール-7-カルボキシレート(CDPI3)の三量体、N-メチルピロール-4-カルボックス-2-アミド(MPC5)の5量体、及び増加したミスマッチ識別性を示すその他の小溝バインダである。本発明の実施に使用されるその他のMGBモアエティは、共有の米国特許5,801,155に開示されている。いくつかの実施例において、前記MGBは、付着した水溶性増強基(例えば、糖又はアミノ酸)を備えることができる。
【００８３】
レポータ基
別のグループの実施例において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、更に、少なくとも1つの共有結合的に付着したレポータ基を有する。これらレポータ基は、MGBに関して上述した方法及び結合基を使用して付着させることができる。本発明の修飾オリゴヌクレオチド用に適当なレポータ基としては、ビーズ、ナノ粒子(タトン（Taton）, T.A. 他, Science 289:1757-1760(2000)）,化学発光剤、同位元素、酵素、フルオロホアがある。好適には、前記レポータ基は、フルオロホアである(ホーグランド（Haugland）R.P.、HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS、第６版、Molecular Probes、Eugene、OR、1996を参照)。適当なフルオロホアとしては、レゾルフィン色素、クーマリン色素、ローダミン色素、シアニン色素、BODIPY色素、及びピレンがある。
【００８４】
クエンチャ
最近開発された検出法は、蛍光強度の直接的な検出ではなく、プローブハイブリダイゼーションの検出用の蛍光共鳴エネルギ転移(FRET)法を使用する。このタイプのアッセイにおいて、FRETは、クエンチャ分子の吸収スペクトルがドナーフルオロホアの放出スペクトルと重なり、これら2つの分子が近接しているときに、ドナーフルオロホア(レポータ)とアクセプタ分子(クエンチャ)との間で発生する。ドナーフルオロホアの励起状態エネルギは、共鳴双極誘導双極相互作用によって隣接するアクセプタに転移し、その結果、ドナー蛍光が消光される。もし、アクセプタ分子がフルオロホアであれば、その蛍光は、時として増大する。前記ドナー分子とアクセプタ分子との間のエネルギ転移の効率は、これら分子間の距離に大きく依存する。この関係を記載する等式は公知である。フォースター(Forster)距離(R0)は、前記エネルギ転移が50%の効率である場合のドナー分子とアクセプタ分子との間の距離として記載される。衝突及び電荷転移消光等の、蛍光消光に関するその他のメカニズムも公知である。当該技術には、クエンチャとフルオロホア対の選択及びそれらのオリゴヌクレオチドに対する付着に関して種々のガイダンスが提供されている(ホーグランド（Haugland） R.P.、HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS、第6版、Molecular Probes、 Eugene、OR、1996; 米国特許3,996,345及び4,351,760等)。
【００８５】
好適なクエンチャは、共有の米国出願09/457,616(1999年12月8日出願)に記載されている。
【００８６】
フルオロホア及びクエンチャ
本発明のいくつかの実施例において、蛍光標識(フルオロホア)及び／又は蛍光消光剤が使用される。1つの好適実施例において、オリゴヌクレオチドは、フルオロホアと消光剤との両方を含有する。蛍光標識は、非限定的に、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フィコエリスリン、及びここに記載のその他のフルオロホアを含む。更に別の好適なフルオロホアも当業者に知られている。上述したように、消光剤又はクエンチャは、フルオロホアによって放出されたエネルギを吸収し、放出された蛍光の量を低減させる(すなわち、蛍光標識の放出を消光する)。種々のフルオロホアが種々の消光剤によって消光される。一般に、特定のフルオロホア/消光剤対のスペクトル特性は、１以上の前記クエンチャの吸収波長が、前記フルオロホアの１以上の放出波長とオーバーラップするというものである。好適なフルオロホア／クエンチャ対は、当業者が、上述した特性に基づいて放出及び励起波長を比較することによって選択可能であるものである。
【００８７】
ポリメラーゼ連鎖反応及び熱安定性酵素を利用したその他の手法等の昇温で行われる増幅アッセイ用として、前記標識は、好ましくは、昇温で安定したものである。ポリメライゼーションに関するアッセイ用としては、前記標識は、その重合化酵素の活性に干渉しないものである。更に、前記標識は、前記オリゴヌクレオチドの5’及び／又は3’末端に存在し、及び／又は、非干渉位置に内部的に存在することも可能である。従って、前記標識は、オリゴヌクレオチドのいずれの塩基、糖又はリン酸モアエティ、あるいは、それ自身がこれらのモアエティの1つに付着したいずれの結合基にも付着させることが可能である。
【００８８】
本発明を、種々の塩基及びその他のオプション成分との関連で記載してきたが、これら修飾オリゴヌクレオチドの全体構造は、所望の構造を示す1つの式によっても表現することができる。
【００８９】
従って、あるグループの実施例において、前記修飾オリゴヌクレオチドは以下の式を有する。
【００９０】
【化６８】
2003525292.tif 000068
【００９１】
ここで、R2とR3は、修飾オリゴヌクレオチドの末端を表し、添字nは、4〜70、好ましくは4〜25、更に好ましくは4〜10の整数であり、各Bは、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、非置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン、及び3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジンから独立的に選択されるメンバであり、そして、各Mは、前記Bの少なくとも２つが非置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン及び3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジンから選択されるという前提で、オリゴマ形成糖及びペプチド核酸形成アミノ酸から選択される。いくつかの特定の実施例において、R2及びR3は、修飾オリゴヌクレオチドの5’-及び3’-末端を表し、Mはオリゴマ形成糖(例えば、2-デオキシ-β-D-リボフラノース、β-D-リボフラノース、α-D-アラビノリボフラノシド、α-2’-デオキシリボフラノシド、2’-3’-ジデオキシ-3’-アミノリボフラノシド、及びロックされた糖)。前記修飾オリゴヌクレオチドが、小溝バインダ、レポータ基等を付着している実施例において、前記R2及びR3基は、夫々、結合基、及び追加の機能性成分(MGB,フルオロホア、クエンチャ等)の付着に適した官能基を含むものと意味する。そのような官能基としては、例えば、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル酸又はエステル基、リン酸又はエステル基、ホスホン酸又はエステル基、又は、ホスフィン酸又はエステル基、スルホン酸及びエステル基等を含む。他の実施例において、MGB、レポータ基等は、従来の方法を使用して内部の塩基/骨格鎖基に付着する。
【００９２】
関連態様において、本発明は、少なくとも1つの5-置換ピリミジン基と、少なくとも1つの非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本発明のこの態様において有用な前記非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基は、実質的に、上述したものである(式Ia及びIbを参照)。米国特許5,645,985及び5,484,908に記載されているものを含めて種々の5-置換ピリミジン塩基が有用である。
【００９３】
好適実施例において、前記5-置換ピリミジン塩基は、下記の式を有する。
【００９４】
【化６９】
2003525292.tif 000069
【００９５】
そして前記非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基は、下記の式を有する。
【００９６】
【化７０】
2003525292.tif 000070
【００９７】
ここで、X1,X2及びX3基は、独立的に、H, OH, NH2及び保護されたアミノ基から選択され、R1及びR4基は、夫々、独立的に、(C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-0-(C2-C12)アルケニル、-O-(C2-C12)アルキニル、-S-(C1-C12)アルキル、-S-(C2-C12)アルケニル、-S-(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル(C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN,-CONH2及び、それらの保護された形態から選択され、R1がHでもありうるという追加特徴を有する。
【００９８】
特に好適な実施例において、前記5-置換ピリミジン塩基は下記から選択される。
【００９９】
【化７１】
2003525292.tif 000071
【０１００】
【化７２】
2003525292.tif 000072
【０１０１】
ここで、R4は、好ましくは、プロピニル、ヒドロキシプロピニル、アミノプロピニル、ヒドロキシブチニル、又は置換又は非置換のフェニル、チエニル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、ピリジニル、ピロリル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル又はベンズオキサゾリル基から選択され、これらは、ピリミジン環に直接付着するか、又は、飽和(例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン)若しくは不飽和(例えば、アセチレニル、プロピニレン、ブチニレン、プロピニレン、ブテニレン)とすることができる１〜４炭素の結合基を介して環に付着する。
【０１０２】
その他の好適実施例において、前記ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン塩基は、上述した好適塩基(Ic, Id及びIe)から選択される。更に、適当な塩基は図１にも示されている。
【０１０３】
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも２つの非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジンを有している本発明の前の態様と同様に、本発明のこの態様も、同じく、MBGやレポータ基(例えば、フルオロホア、クエンチャ等)と、更に、これら追加成分の付着に適した結合基を含むことができる。
【０１０４】
前記修飾オリゴヌクレオチドが下記の式で表される実施例も好ましい。
【０１０５】
【化７３】
2003525292.tif 000073
【０１０６】
ここで、R2は前記修飾オリゴヌクレオチドの第１末端を表し、R3は前記修飾オリゴヌクレオチドの第２末端を表し、添字nは4〜70の整数を表し、各Bは、独立的に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、5-置換ピリミジン、非置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン、及び3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン(少なくとも1つの塩基が5-置換ピリミジンで少なくとも1つの塩基がピラゾロ［3,4−d］ピリミジンであるという前提で)、各Mは、オリゴマ形成糖又はペプチド核酸形成アミノ酸である。
【０１０７】
本発明の更に別の態様において、付着した小溝バインダを有し、その塩基の1
つだけが修飾塩基によって置換された、修飾オリゴヌクレオチドが提供される。驚くべきことに、MGBと1つの修飾塩基(又は、オプションとして複数の修飾塩基)との組み合わせによって、ミスマッチ識別と、更に、プライマ伸長及び後述するその他の効用に対して特に有用な特性を有する修飾オリゴヌクレオチドが得られる。このグループの修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくは、4〜70の塩基と、付着した小溝バインダとを有し、ここで、それらの塩基の少なくとも1つは、5-置換ピリミジン及び非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジンからなるグループから選択される修飾塩基に置換されている。
【０１０８】
本発明のこの態様において、前記小溝バインダ、5-置換ピリミジン及び非置換又は3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジンは、実質的に、上述した成分のいずれであってもよい。
【０１０９】
あるグループの実施例において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの5-置換ピリミジンを有し、好ましくは下記の式を有する。
【０１１０】
【化７４】
2003525292.tif 000074
【０１１１】
ここで、X3は、H, NH2, OH及びSHから選択され、R4は、(C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-0-(C2-C12)アルケニル、-O-(C2-C12)アルキニル、-S-(C1-C12)アルキル、-S-(C2-C12)アルケニル、-S-(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル(C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN,-CONH2及び、それらの保護された形態から選択される。このグループの実施例において、好適なアリル及びヘテロシクリル基(例えば、アリルアルキル等の他の基の成分を含む)は、置換又は非置換形態の、フェニル、トリル、ピリジル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、チエニル、ピロリル、ベンズイミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズチアゾリル、インドリル、トリアジニル、ピリミジニル、及びナフチルから選択される。これらのアリル及びヘテロシクリル基の適当な置換基は、上述した一般定義に提供されている。
【０１１２】
より好ましくは、前記修飾オリゴヌクレオチドは、式IId及びIIeのグループをベースとした少なくとも1つの5-置換ピリミジンを有し、ここで、R4置換基は、置換又は非置換アルキル基又はアルキニル基から選択される。好適には、R4は、ヒドロキシプロピニル、ヒドロキシブチニル、アミノプロピニル、アミノブチニル又はプロピニル基である。あるいは、R4置換基は、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル基とすることができる(後に更に詳細に記載)。
【０１１３】
【化７５】
2003525292.tif 000075
【０１１４】
【化７６】
2003525292.tif 000076
【０１１５】
別のグループの好適実施例において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、次の式を有する少なくとも1つの修飾塩基を有する。
【０１１６】
【化７７】
2003525292.tif 000077
【０１１７】
ここで、X1及びX2基はH, OH, NH2及び保護されたアミノ基から選択され、R1は、H, (C1-C12)ヘテロアルキル、(C2-C12)ヘテロアルケニル、(C2-C12)ヘテロアルキニル、-O-(C1-C12)アルキル、-O-(C2-C12)アルケニル、-O-(C2-C12)アルキニル、-S-(C1-C12)アルキル、-S-(C2-C12)アルケニル、-S-(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、アリル(C1-C12)アルキル、アリル(C2-C12)アルケニル、アリル(C2-C12)アルキニル、アリル、ヘテロシクリル、ハロゲン、-CN,-CONH2及び、それらの保護された形態から選択される。このグループの実施例において、好適なアリル及びヘテロシクリル基(例えば、アリルアルキル、ヘテロシクリルアルキル等の他の基の成分を含む)は、置換又は非置換形態の、フェニル、トリル、ピリジル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、チエニル、ピロリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズチアゾリル、インドリル、トリアジニル、ピリミジニル、及びナフチルから選択される。これらのアリル及びヘテロシクリル基の適当な置換基は、上述した一般定義に提供されている。
【０１１８】
特に好適な実施例において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの、式Ifの単量体を有する。
【０１１９】
【化７８】
2003525292.tif 000078
【０１２０】
ここで、X1及びX2基はH, OH又は NH2から独立的に選択され、R1は、最も好ましくは、3-ヒドロキシプロピン-1-イル、プロピニル、3-アミノプロピン-1-イル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル、ハロゲン、又は3,3,3-トリフルオロプロピン-1-イルである。これらの単量体のうちのいくつかの合成は、すでに報告されている(バロー（Balow）他、Nuc Acid Res., 26: 3350-3357 (1998); シーラ（Seela） 他、J. Chem. Soc. Perkin Trans.、I、479-488(1999); ラムゼーバ（Ramzaeva） 他、Helv. Chim. Acta、80: 1809-1822(1997))。
【０１２１】
修飾塩基及びオリゴヌクレオチドの作成
反応スキーム1〜6は、本発明において有用な多数の修飾塩基(非置換及び3-置換ピラゾロ［3,4−d］ピリミジン及び5-置換ピリミジン)を作成する方法例を提供する。これらのスキームは、例えば、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを作成するための自動合成装置に使用可能な前記修飾塩基のホスホルアミダイト誘導体の作成を例示している。
【０１２２】
反応スキーム1は、5-ヨード-2’-デオキシウリジンから出発する、5-(プロプ-2-イニル-4-メチルベンゾエート)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-2’-デオキシウリジン  3’-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト](3)の作成を例示している。前記出発材料を、Pd(PPh3)4-CuIの存在下で、プロプ-2-イニル  4-メチルベンゾエートによって処理して、メチルベンゾエート誘導体(1)を得て、これを次に、5’-ブロックDMTr誘導体(2)に変換し、その後ホスホルアミダイト(3)に変換した。
【０１２３】
【化７９】
2003525292.tif 000079
【０１２４】
反応スキーム2及び3は、ピラゾロ［3,4−d］ピリミジンホスホルアミダイトの作成の1つの方法を提供している。具体的には、これらのスキームは、3-[-4((1E)-1-アザ-2-メチルプロプ-1-エニル)-1-((2R,5R)-4-{[ビス(メチルエチル)アミノ](2-シアノエトキシ) ホスフィノオキシ}-5-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン-2-イル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-3-イル]プロプ-2-イルニル 4-メチルベンゾエート(13; R1= −OCOPhCH3)の作成が、2つの部分で合成されることを示している。
【０１２５】
【化８０】
2003525292.tif 000080
【０１２６】
第１部分（反応スキーム２）において、(2R, 5R)-5-(4-アミノ-3-ヨードピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(9)が、1,5-ヒドロピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-4-オンから出発して合成された。出発物質は、一塩化ヨウ素とP2S5とによって連続的に処理されて、夫々ヨード(4)及びチオン(5)誘導体が得られた。前記チオン(5)は、エチルチオ-誘導体(6)に変換され、これを1-クロロ-1,2-デオキシ-3,5-ジ-O−トルオイルリボフラノース誘導体と組み合わせて、ブロックされたヌクレオシド(7)を得た。この化合物(7)とナトリウムメトキシドとを反応させ、その後、水酸化アンモニウムと反応させて、夫々、ヒドロキシメチル誘導体(8)と化合物(9)とを得た。
【０１２７】
第２部分（反応スキーム３）では、化合物(9)から出発して、2,3-[-4((1E)-1-アザ-2-メチルプロプ-1-エニル)-1-((2R, 5R)-4-{[ビス(メチルエチル)アミノ](2-シアノエトキシ) ホスフィノオキシ}-5-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン-2-イル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-3-イル]プロプ-2-イニル 4-メチルベンゾエート(13 R1= -OCOPhCH3)を作成した。プロプ-2-イニル 4-メチルベンゾエートの存在下で、反応物(9)とPd(PPh3)4-CuIとを反応させ、プロプ-2-イニル誘導体(10; R1= -OCOPhCH3)を得た。この化合物中のアミノ基を、N,Nジメチルアセトアミド ジメチル アセタールとの反応によって保護し (11; R1= -OCOPhCH3)を得た。この化合物(11; R1= -OCOPhCH3)をDMTr誘導体(12; R1= -OCOPhCH3)に変換し、次に、ホスホルアミダイト(13; R1= -OCOPhCH3)に変換した。
【０１２８】
【化８１】
2003525292.tif 000081
【０１２９】
反応スキーム4は、N-{3-[1-((2R, 5R)-5-{ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}-4-{[ビス(メチルエチル)アミノ](2-シアノエトキシ) ホスフィノオキシ} オキソラン-2-イル)-6-アミノ-4-オキソ(5-ヒドロピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-3-イル)]プロピル}-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(22)の作成を例示している。
【０１３０】
【化８２】
2003525292.tif 000082
【０１３１】
反応スキーム4において、6-アミノ-4-メトキシピラゾロ［3,4−d]ピリミジンは、ヨード誘導体(14)に変換され、これを1-クロロ-1,2-ジデオキシ-3, 5-ジ-O-トルオイルリボフラノースによって処理してヌクレオシド(15)を得た。この化合物(15)を、NaOMe/MeOHで処理して、トルオイル基を加水分解し、非ブロック・ヌクレオシド(16)を得た。この(16)を水性水酸化ナトリウム(17)によって処理して、トリフルオロ-N-プロプ-2-イニルアセトアミド誘導体(18)に変換可能な(17)を得た。前記化合物(18)を、水素とPd触媒で還元し、トリフルオロ-N-プロピルアセトアミド誘導体(19)を得た。前記化合物(19)の4-アミノ基を、N,N-ジメチルホルムアミド ジメチルアセタールでの処理によって保護し、化合物(20)を得て、これを、DMTr誘導体(21)に変換し、次に、ホスホルアミダイト誘導体(22)に変換した。
【０１３２】
式4の化合物(3-[((2R, 5R)-5-(6-アミノ-4-オキソ-3-プロプ-1-イニル(5-ヒドロピラゾロ［3,4−d]ピリミジン))-2-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]-メチル}オキソラン-3-イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]ホスフィノオキシ] プロパンニトリル)(PPPGホスホルアミダイト)は、反応スキーム４の反応のうちのいくつかを使用して合成することができる。
【０１３３】
【化８３】
2003525292.tif 000083
【０１３４】
【化８４】
2003525292.tif 000084
【０１３５】
(17)から(18)への変換において、プロプ-1-インが、2,2,2-トリフルオロ-N-プロプ-2-イニルアセトアミドの代わりに使用される。6-アミノ基は、化合物(20)に関しては上述したように保護することが可能であり、5'-ヒドロキシは、化合物(21)に関してはDMTr基によって保護することが可能である。最後に、前記ホスホルアミダイトを、化合物(22)に関して記載したように作成して、式４の化合物を得ることができる。同様に、R6が-OCOPhCH3又は-NHCOCF3である式5の化合物は、当該技術で知られている関連反応を使用して作成することができる。
【０１３６】
反応スキーム5は、3-{[5-(4,6-ビス{(1E)-1-アザ-2-[ビス(2-メチルプロピル)アミノ]ビニル}-3-プロプ-1-イニルピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-2-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]-メチル}オキソラン-3-イルオキシ][エチル(メチルエチル)アミノ}-ホスフィノ}プロパンニトリル(26)の作成を例示している。
【０１３７】
【化８５】
2003525292.tif 000085
【０１３８】
化合物(26)は、(NH2)2PPPA(23)から出発して合成することが可能である(シーラ（Seela）及びドリラー（Driller）, Helv. Chim. Acta 71: 757-761(1998)を参照)。化合物(23)は、ビス(メチルエチル)アミノ誘導体(24)に変換することができ(ビンセント（Vincent）他, J. Org. Chem., 64: 991-997(1999))、その後、先ず、DMTrClとの反応によって、ホスホルアミダイト(26)に変換可能な(25)を得る。
【０１３９】
反応スキーム6は、置換基がヘテロアルキル基である保護された3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンの合成を提供する。
【０１４０】
【化８６】
2003525292.tif 000086
【０１４１】
反応スキーム7は、置換基がメトキシプロピニル基である保護された3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンの合成を提供する。3-ヨード ジアミノ誘導体(23)を、無水DMF中で、Pd(PPh3)4-CuI、トリエチルアミンと反応させ、その後、メチルプロパルギルエーテルと反応させて3-メトキシプロピニル-2,4-ジアミノピラゾロ［3,4−d]ピリミジン誘導体(27)を得た。この化合物中のアミノ基を、N,N-ジメチルフォルムアミド  ジメチルアセタールとの反応によってブロックし、(28)を得た。ブロックされたヌクレオシドを、まず塩化ジメトキシトリチルと反応させ、次に、2-シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと反応させて、所望のブロックしたホスホルアミダイト(29)を得た。
【０１４２】
【化８７】
2003525292.tif 000087
【０１４３】
下記の反応スキームは、3-ヘテロサイクル置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン
の作成方法を提供する。ここに提供される一般的方法は、その他のヘテロサイクリック置換基の作成に適用可能である。
【０１４４】
【化８８】
2003525292.tif 000088
【０１４５】
反応スキーム8は、置換基がフラニル基である保護された3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンの合成を提供する。マロニトリルを、塩基の存在下で、2-フルフリル  クロライドと反応させ、次に、ジメチルスルフィドでの処理によって、メトキシ  ジニトリル誘導体(30)を得た。この(30)とヒドラジンとの反応によって、置換ピラゾール(31)を得て、これを、ホルムアミドと反応させて3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-4-イルアミン(32)を得た。この塩基(32)を、1-クロロ-1,2-ジデオキシ-3,5-ジ-O-トルオイルリボフラノースによって処理して、ブロックしたヌクレオシド(33)を得た。この化合物(33)を、まず、トリオイル基を加水分解するためにNaOMe/MeOHと反応させて非ブロック・ヌクレオシドを得て、これを、N, N-ジメチルフォルムアミド  ジメチルアセタールと反応させて保護されたヌクレオシド誘導体(34)を得た。この誘導体を、まず、塩化ジメトキシトリチルと反応させ、次に、2-シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと反応させて、所望のブロックされたホスホルアミダイト(35)を得た。
【０１４６】
【化８９】
2003525292.tif 000089
【０１４７】
反応スキーム9は、置換基がフラニル基である保護された3-置換2,4-ジアミノピラゾロ［3,4−d]ピリミジンの合成を提供する。前記カルボニトリル(31)を、
グアニジニウム  カルボネートと反応させて、3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]
ピリミジン-4,6-ジアミン(36)を得た。この塩基を、1-クロロ-1,2-デオキシ-3, 
5-ジ-O-トルオイルリボフラノースによって処理してブロックしたヌクレオシドを得て、トルオイル基を加水分解するためにこれをNaOMe／MeOHで処理し、非ブロック・ヌクレオシド誘導体(37)を得た。後者の化合物を、N, N-ジメチルフォルムアミド  ジメチルアセタールと反応させて、保護されたヌクレオシド誘導体(38)を得た。この誘導体を、まず、塩化ジメトキシトリチルと反応させ、次に、2-シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと反応させて所望のブロックされたホスホルアミダイト(39)を得た。
【０１４８】
【化９０】
2003525292.tif 000090
【０１４９】
反応スキーム10は、ヒドロキシで保護されたHOBU-ホスホルアミダイトへの1つの合成経路を提供する。このスキームにおいて、3-ブチン-1-オールは、ピリジンの存在下で、p-トルオイル  クロライドと共に、そのp-トルオイル  エステル(40)に変換される。前記保護されたブチノールを、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)とヨウ化銅との存在下で、5-ヨード-2’-デオキシウリジンと結合させ、次に、保護して(DMTエーテルとして)、41を形成し、次にこれを、その対応のホスホルアミダイト誘導体42に変換することができる。この試薬42は、修飾オリゴヌクレオチドの作成に直接使用することができる。p-トルオイルで保護された基の除去は、標準法によって達成することができる。
【０１５０】
上記各スキームにおいて、当業者は、その他の保護基及び／又は活性基を使用することが可能であると理解するであろう。更に、前記修飾オリゴヌクレオチドをうまく合成するためには、異なる官能基を備える種々の非天然塩基含有単量体は、異なるブロック基を必要とする可能性がある。種々の保護基、それらの合成及び脱保護法は、例えば、ビューケージ（Beaucage）及びアイヤー（Iyer）、Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992)に記載されている。
【０１５１】
オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドの合成は、前記第１塩基が付着する劈開可能リンカを含む固体支持体から開始することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、適当な3-ピラゾロ[3,4−d]ピリミジンを使用して、3’-末端の第１ヌクレオチドとして置換ピラゾロ[3,4−d]ピリミジンを含有して合成することが可能である。あるいは、5-置換ピリミジンを、最初に固体支持体に付着させることができる。反応スキーム11は、保護された3-置換ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン  dA CPG誘導体(C)の合成に対する一般的アプローチを例示している。反応スキーム3に記載された手法を用いて中間物(A)を作ることができ、他方( B),(C)は、同時係属の米国出願09/457,616に記載されているようにして合成することができる。
【０１５２】
【化９１】
2003525292.tif 000091
【０１５３】
本発明のこの態様において、その支持体が、自動オリゴヌクレオチド法に適用可能である限りにおいて、種々の固体支持体が有用であり、それらには、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、プラスチック等が含まれる。又、本発明は、関連する態様において、付着した修飾塩基、好ましくは式Ic, Id, Ie, If, IIb, IIc, IId, IIeを有する固体支持体(例えば、制御細孔ガラス(controlled pore glass)(CPG))を提供する。更に好ましくは、前記付着した修飾塩基は、置換基が上述した好適な基から選択される3-置換ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン又は5-置換ピリミジンモアエティであり、更に、より詳細に後述する新規な塩基を含む。
【０１５４】
本発明は、更に、前記非置換及び／又は3-置換ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン及び／又は5-置換ピリミジンのいずれかが、当該技術において公知のその他の修飾塩基と結合又は組み合わせて使用される組成物及び方法を提供する。その他の修飾単量体ユニットは、シェイト（Scheit）、NUCLEOTIDE ANALOG、ジョン・ウィリー（John Wiley）、New York、1980; ウールマン（Uhlmann）及びメイマン（Meyman）、Chemical Reviews、90: 543-584(1990)、シーラ（Seela）及びデベラック（Debelak）、Nucl. Acids. Res.、28: 3224-3232(2000); バロー（Balow）他、Nucl. Acids. Res.、26: 335-3357 (1998); ボリ（Bolli）他、Nucl. Acids. Res.、24: 4660-4667 (1996)に開示されている。
【０１５５】
修飾オリゴヌクレオチドアレイ
本発明の別実施例において、修飾オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションによる配列決定や、遺伝子発現のアレイベース分析等の、オリゴヌクレオチドのアレイを利用する手法に使用される。例えば、チップ又はプラットフォームアレイ、ビーズアレイ、液相アレイ、「ジップコード(zip-code)」アレイ等を含む種々のアレイが本発明によって意図される。ハイブリダイゼーションによる配列決定において、種々の公知の配列の秩序配列が、単数又は複数のテストポリヌクレオチド、核酸又は核酸集団のハイブリダイゼーション用のプラットフォームとして使用される。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの決定と、それらの既知の配列のアライメントとによって、テストポリヌクレオチドの配列を再構築することが可能である。あるいは、野生型配列と対象の遺伝子の所与の領域に関するすべての可能な変異配列とを有するオリゴヌクレオチドをアレイ上の置くことができる。アレイを、ハイブリダイゼーション条件下で、対象体又は生物標本由来のDNA又はRNAに対して暴露することによって、その対象遺伝子の野生型又は変異ステータスを決定することができる。例えば、米国特許5,492,806; 5,525,464; 5,556,752及びPCT公報WO 92/10588及びWO 96/17957を参照。これらの技術の両方は、関連する配列の識別、特に、単一ヌクレオチドレベルでの識別を必要とし、従って、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの高い識別性によって、これらの技術の改善が提供されるであろう。アレイを構成するための物質としては、非限定的に、ニトロセルロース、ガラス、シリコンウエハ、光ファイバ、及び、当業者にとって公知のもののようなアレイ構成に適したその他の材料がある。オリゴヌクレオチドアレイの合成は、同時係属米国出願09/364,320に記載されており、本発明のアレイを作成するために、そこに記載の方法に対して適当な改変を行うことが可能である。
【０１５６】
アレイ技術に対する本発明のもう1つの用途は、特定の細胞又は組織中の遺伝子の発現のパターンの検査にある。この場合、種々の遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを表面上に整列させ、例えば、特定の細胞又は組織体由来の核酸サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で前記アレイとともにインキュベートする。ハイブリダイゼーションが起こるアレイ上の部位を検出することによって、どのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたか、従って、どの遺伝子が、そのサンプルが採取されたその特定の細胞又は組織において活性であるのか、を判断することができる。
【０１５７】
又、アレイ法は突然変異又は多型の同定にも使用することができ、ここでは、野生型及び変異配列が表面上で秩序配列に載置される。ストリジェント条件下におけるアレイに対するポリヌクレオチドサンプルのハイブリダイゼーション、そして、そのアレイのどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするかを判断することによって、そのポリヌクレオチドが前記野生型又は変異配列を有するか否かを判定することが可能である。臨床的に関連する遺伝子の変異配列の多くは、1つ又は2〜3のヌクレオチド位置においてその野生型対応物と異なるので、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの高い識別力によって、突然変異検出における改善が提供されるであろう。
【０１５８】
アレイ技術の上述したすべての用途において、修飾オリゴヌクレオチドの増大した識別力によって、感度及び解像度における大幅な改善が提供される。
【０１５９】
例えばアレイにおける効率的なハイブリダイゼーションには、捕捉プローブが狭い温度範囲でTm’を含むことが必要とされる。本発明の一実施例において、アレイ用の捕捉オリゴヌクレオチドのTmは、3’-MGBと修飾塩基(例えば、PPPA及びPPPU)との組み合わせを使用することによって、バランスされ、GC及びATリッチ配列に関連する問題を解決する。表1と図2は、種々のG/C及びA/T塩基対を有するピリミジンリッチプローブのTmのバランス化を例示している。種々のプローブのTmをバランスするために、PPPA, PU及びMGBが組み合わせで使用された。プリン及びピリミジンリッチプローブと相補的標的が表1に図示され、これらのプローブのTmが図2に図示されている。図２に示されているように、GCリッチ及びATリッチプローブ間のTmの差は、50℃以上である。
【０１６０】
【表１】
2003525292.tif 000092
【０１６１】
図２に図示されているように、PPPA,PU及びMGBによる修飾によって、バランスされたTmを有するプローブセットが提供される。
【０１６２】
例えばアレイにおける効率的なハイブリダイゼーションには、捕捉プローブが狭い温度範囲でTm’を含むことが必要とされる。従って、関連する実施例において、ここに記載の前記修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのTmをバランスさせるために、通常の塩基、非置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基(例えば、PPG及びPPA)、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、5-置換ピリミジン、共通塩基、及び小溝バインダのいかなる組み合わせを含むことが可能である。
【０１６３】
複数修飾されたオリゴヌクレオチドのTmを予測し、「平衡」(level)させる能
力は、オリゴヌクレオチドアレイの開発又は複数のオリゴヌクレオチドを有する組成物用として特に有用である。又、修飾オリゴヌクレオチドについてTmを予測する能力は、ハイブリダイゼーション、変性、配列の塩基組成物のバリエーションのマッピング、配列複雑性及び相離の決定のための適当な条件の設定のために有用である。すべての可能な個々の塩基対最近接（nearest neighbors）のための二本鎖形成に熱力学的貢献度(contributions)を割り当てるモデルを使用して、Tm予測アルゴリズムを開発することができる。10の独立した塩基対の最近接の熱力学的パラメータは、DNA:RNAハイブリッド(スギモト（Sugimoto）他、Biochem. 34: 11211-11216 (1995)を参照)とdsDNA(サンタルチア（SantaLucia）他、Biochem. 36: 10581-10595 (1997))に関する刊行物から入手可能である。Tmに関してオリゴヌクレオチド二本鎖安定性を算出するためのプログラムを開発するために、最近接（nearest neighbor）パラメータを使用することは、記載されている(シュッツ（Shutz）及びフォン・アシェン（von Ashen）、Biotechniques、27: 1218-22 (1999); オウクザルジー（Owczarzy） 他、Biopolymers、44: 217-239 (1997)を参照; PNA/DNAに関しては、ゲイセン（Geisen）他、Nucl. Acids Res.、26: 5004-5006 (1998); ブレイク（Blake）他、Bioinformatics、15: 370-5 (1999)及び米国特許5,556,749。
【０１６４】
ミスマッチ識別の熱力学及び速度論的記載の基本原理は周知であり、以下に要約する。
【０１６５】
プローブ-標的相互作用は、以下のように記載可能な平衡反応である。
【０１６６】
A＋B⇔AB  ここで、A=プローブ、B=DNA標的
【０１６７】
温度Ｔにおいて、正(結合)反応及び逆(分離)反応の平衡は、平衡定数Kによって記載することができ、ここで、
【０１６８】
【数１】
2003525292.tif 000093
【０１６９】
均衡熱力学的には、
【０１７０】
K＝exp(−ΔH0AB/RT＋ΔS0AB/R）；
ΔG0AB＝ΔH0AB−TΔS0AB；
ΔG0AB＝−RTLn（K）
ここで、ΔH0AB, ΔS0AB, ΔG0ABは、二本鎖AB形成の、エンタルピー、
エントロピー、及び自由エネルギ変化
【０１７１】
二本鎖ABは、N塩基対(N-1の最近接)を有し、最近接近似は以下を前提とする。
【０１７２】
ΔH0AB＝ΔH0１＋ΔH0２＋. ..ΔH0ｎ−１＋ΔH0init＝Σ（ΔH0ｉ＋ΔH0init）
ΔS0AB＝ΔS0１＋ΔS0２＋...ΔS0ｎ−１＋ΔS0init＝Σ（ΔS0ｉ＋ΔS0init）
ΔG0AB＝ΔG0１＋ΔG0２＋...ΔG0ｎ−１＋ΔG0init＝Σ（ΔG0ｉ＋ΔG0init）
ここで、ΔH0ｉ, ΔS0ｉ, ΔG0ｉは、二本鎖AB形成の各最近接塩基対増分のエンタルピー、エントロピー、及び自由エネルギ変化、ΔH0init, ΔS0init, ΔG0initは、二本鎖AB形成開始の熱力学パラメータ
【０１７３】
総濃度等式Cprobe=Ctargetの場合、自由エネルギ、エンタルピー、及びエントロピーで表されるTmの等式は、下記のように得ることができる。
【０１７４】
【数２】
2003525292.tif 000094
【０１７５】
同様に、上に示すように、プローブがミスマッチを含む標的にハイブリダイズする場合、下記の関係を導くことができる。
【０１７６】
A ＋ B* ⇔ AB*  ここで、A=プローブ、B*=ミスマッチDNA標的
【０１７７】
ミスマッチ二本鎖AB*の熱力学パラメータは:K*,ΔH0AB*, ΔS0AB*, ΔG0AB*。である。例えば、最近接「3」及び「4」を含む、位置「4」におけるミスマッチ塩基対の最近接パラメータに関して、識別パラメータΔΔH0,ΔΔS0,ΔΔG0は、以下のように表すことができる。
【０１７８】
【数３】
2003525292.tif 000095
【０１７９】
本発明の一実施例において、正常プリン、ピリミジン、及び、オリゴヌクレオチドの3’-末端に付着した小溝バインダ  CDPI3を含むオリゴヌクレオチドの熱力学的最近接パラメータを決定するように、プローブ配列が構成される。別の実施例においては、正常プリン、ピリミジン及び3’-末端付着CDPI3を有するオリゴヌクレオチドであるが、ここでグアニンは、5-ヒドロピラゾロ［3,4−d]ピリミン-4-オンによって置換されている。これらの最近接熱力学パラメータは、これら2つの実施例において、CDPI3有り又は無しのこれらのタイプのオリゴヌクレオチドのTmを計算するために使用される。CDPI3が、3’-末端において塩基1に付着していた場合、以下のようにして導かれた新しいTm予測アルゴリズム及び式が使用された。
【０１８０】
【数４】
2003525292.tif 000096
【０１８１】
前記モデルは、オリゴヌクレオチドに付着したMGBが、追加の純粋エントロピー因子ΔΔS0MGBを有していることを前提としている。この価は、アルゴリズム
によって算出することができる：3’-プライマ末端からの6つの塩基(5最近接)が、出発塩基「1」又は「2」からのMGBによってカバーされる。カバーされる各最近接は、固有の値ΔΔS0iMGBを有する。塩基位置6,7又は8にアデノシンがみられる場合には、修正因子「A」が導入される。更に、因子「A」に対して統計因子が導入され、ここで、-AAA-の場合n=3; -AA-, -ANA-の場合n=2; -A-の場合n=1；-AN-及び-NA-(Nは、A以外の任意の塩基)の場合n=0である。最終値ΔΔS0MGBは、下記の式によって決定することができる。
【０１８２】
ΔΔS０ＭＧＢ= ΣΔΔS０ｉＭＧＢ+A(オプション)+R＊Ln(N)(オプション)
【０１８３】
表２a及び2bは、PPGのみと、MGBのエントロピー寄与分とを夫々含むオリゴヌクレオチドの最近接熱力学パラメータを含む。後者の場合、フルオレセイン及びダーククエンチャの寄与分が、熱力学処理に組み込まれるが、これは、一般的に、無視できるものであることが示されている。[クエンチャは、MGBとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーの一部である]
【０１８４】
【表２】
2003525292.tif 000097
【０１８５】
一好適実施例において、同じ数の塩基を含有する複数修飾されたオリゴヌクレオチドのTmは、正常塩基、共通塩基、PPA、PPG、PPPA、PPPG、PU、PC、HOPU、HOBuU、HOBuC、(NH2)2PPA、(NH2)2PPPAOH、(NH2)2BuPPAOH、(NH2)2PPAI、HOBuPPG、小溝バインダ、フルオロホア、クエンチャ、及び化学発光剤の任意の組み合わせから最近接パラメータを選択するためのアルゴリズムを使用して平衡される。
【０１８６】
あるいは、複数修飾されたオリゴヌクレオチドのTmは、同数の塩基プラス又はマイナス1又は2の塩基を含むことによって、約±2℃のTm範囲で、実質的に平衡される。
【０１８７】
いくつかの場合において、二本鎖安定性を低下させる修飾塩基に加えて、二本鎖安定性を改善する修飾塩基が使用される。二本鎖安定性を低下させる修飾塩基は、例えば、7-デアザアデニンや7-デアザグアニン等のように周知である。
【０１８８】
修飾オリゴヌクレオチドの使用法
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、未修飾オリゴヌクレオチドに対して、より優れたミスマッチ識別を含めて、多くの利点を提供する。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、特に、標的配列へのそれらのハイブリダイゼーションが検出されるプローブとして、又は、標的配列へのそれらのハイブリダイゼーション後に修飾オリゴヌクレオチドの3’末端から開始されるポリヌクレオチド合成が行われ、その合成生成物(すなわち、伸長生成物)が検出されるプライマとして有用である。
【０１８９】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、別の核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関連する他の技術にも有用である。これらの技術としては、非限定的に、標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが終点である技術；標的核酸に対する単数又は複数のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが、そのオリゴヌクレオチドをプライマとして使用し、その標的核酸をテンプレートとして使用する単数又は複数のポリメラーゼ介在伸長工程に先立って行われる技術；標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが、別のプライマの伸長を阻止するために使用される技術；標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの後に、付着標識を放出するためにそのオリゴヌクレオチドの加水分解が行われる技術；及び、単数又は複数のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズし、これら複数のオリゴヌクレオチド間の相互作用を測定する技術がある。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション条件、及び、温度、イオン強度、溶媒組成等の、ハイブリダイゼーションの程度と特異性に影響を与える要因は、当業者に周知である。例えば、サムブルック（Sambrook）他,前出、オースベル（Ausbel）他、前出、M. A. イニス（Innis）他 (編集)PCR Protocols、Academic Press、San Diego、1990; B. D. ヘイムス（Hames）他 (編集)、Nucleic Acid Hybridization; A Practical Approach、IRL Press、 Oxford、1985及びバン・ネス（van Ness）他 、(1991) Nucleic Acids Res. 19: 5143-5151を参照。
【０１９０】
標的配列に対するプローブ及び／又はプライマのハイブリダイゼーションは、アデニンはチミン又はウラシルと塩基対合し、グアニンはシトシンと塩基対合する等の、周知公認の塩基対合特性に従って行われる。それを第二のヌクレオチドと塩基対合可能とするヌクレオチドの特性は、相補性と称される。従って、アデニンはチミンとウラシルとの両方に対して相補的であり、その逆も真であり、同様に、グアニンはシトシンに対して相補的であり、その逆も真である。標的配列に対してその全長に沿って相補的であるオリゴヌクレオチドは、標的配列に対して、完全相補的、完全マッチ、又は、完全相補的であるといわれ、その逆も真である。オリゴヌクレオチドとその標的配列は、それら2つの配列中の塩基の大半が相補的であるが、単数又は複数の塩基が非相補的、又はミスマッチである、関連配列を有しうる。そのような場合、それらの配列は、互いに対して実質的に相補的であるということができる。もしも、あるオリゴヌクレオチドと標的配列との配列が、1つを除いてすべてのヌクレオチドにおいて相補的であるならば、そのオリゴヌクレオチドと標的配列は、互いに対して単一ヌクレオチドミスマッチを有する。
【０１９１】
本発明の前記修飾ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンヌクレオチドは、それらの自
然発生アナログの塩基対合特異性を保持しており、PPPGアナログは、シトシンに対して相補的であり、PPPAアナログはチミンとウラシルとに対して相補的である。これらPPPG及びPPPAアナログは、グアニンとアデニンとに比較して、非相補的塩基に対していわゆる「ゆらぎ(wobble)」塩基対合特異性の傾向が低いだけでなく、3-置換基は、二本鎖における結合親和性を増大させる。同様に、修飾ピリミジンは、それらの自然発生対応物に対して特異的にハイブリダイズする。
【０１９２】
ハイブリダイゼーションの条件は当業者にとって周知であり、比較的広い範囲で改変することが可能である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシとは、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチヌクレオチドを含むハイブリッドの形成に不利であることによって、完全マッチハイブリッド又はより少数のミスマッチを含むハイブリッドの形成を促進する程度を指し、高いストリンジェンシは、ミスマッチハイブリッドに対する低い許容度に対応する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシに影響を与える要因としては、非限定的に、温度、pH、イオン強度、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド及びカオトロープ等の有機溶媒の濃度が含まれる。当業者に周知のように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシは、温度を高めること、イオン強度を低くすること、そして溶媒濃度を低くすることによって増大する。例えば、オースベル（Ausbel）他, 前出、サムブルック（Sambrook）他、前出、M. A. イニス（Innis）他 (編集)PCR Protocols, Academic Press、San Diego、1990; B. D. ヘイムス（Hames）他 (編集) Nucleic Acid Hybridization; A Practical Approach、IRL Press、Oxford、1985及びバン・ネス（van Ness）他 (1991)、Nucleic Acids Res. 19: 5143-5151を参照。
【０１９３】
従って、オリゴヌクレオチドとその標的配列との間のハイブリッド(二本鎖)の形成において、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションに有利な温度、イオン強度、pH等の条件下、すなわち、ハイブリダイゼーション条件下において、標的配列を含むポリヌクレオチドと共に、溶液中でインキュベートされる。いくつかの状況において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション配列において単数又は複数のミスマッチを有する一対の核酸と比較して、完全マッチ核酸間のハイブリダイゼーションに有利となるように選択される。その他の状況において、ハイブリダイゼーション条件は、より少数のミスマッチを有する核酸間のハイブリダイゼーションに有利でありながら、ミスマッチ配列間のハイブリダイゼーションを許容するように選択される。
【０１９４】
ハイブリダイゼーション強度としても知られる、標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度は、周知技術の方法によって測定される。好適な方法は、ハイブリッド二本鎖のTmを測定する方法である。これは、上述したように、溶液中の二本鎖を、次第に高くなる温度に晒し、例えば、変性に伴う塩基対の解離（unstacking）と共に増加する紫外線光の吸光度によって、二本鎖の変性をモニタすることによって達成される。Tmは、一般に、変性に伴う紫外線光吸光度における変化の中間点の温度と定義される。あるいは、Tmが知られている場合は、それが所望の二本鎖のTm以下で、かつ、不要な二本鎖のTm以上となるように、ハイブリダイゼーション温度(一定のイオン強度、pH及び溶媒濃度で)を選択することができる。この場合、ハイブリダイゼーション度の測定は、単純に、ハイブリダイズしたプローブの存在を調べることによって達成される。
【０１９５】
もしもプローブが検出可能標識を有する場合は、ハイブリダイズしたプローブのアッセイは、通常、二本鎖物質中の標識の存在を検出するように構成される。これは、例えば、二本鎖物質を特異的に選択する、一本鎖物質を特異的に破壊する、又は、これらの方法のなんらかの組み合わせを利用することによって達成することができる。例えば、ハイブリダイゼーション反応混合物を、高ストリジェント条件下及び／又は一本鎖特異的ヌクレアーゼに晒すことができる。あるいは、一本鎖の核酸に相対する二本鎖の核酸に対して特異的な親和性技術によって、二本鎖を精製することができる。本発明の一好適実施例において、そのプローブが二本鎖にある場合にのみ標識が放出される条件下における、プローブからの標識の放出によって、二本鎖が検出される。別の実施例は、標識に対してハイブリダイズした時、標識とクエンチャの分離を必要とする。
【０１９６】
核酸プローブとの使用に適した検出可能標識又はタグは、当業者に周知であって、それらには、非限定的に、放射性同位体、発色団、フルオロホア、化学発光剤、及び電気化学発光剤、磁気標識、マイクロスフェア、コロイド状金属(タトン（Taton）他, Science 289: 1757-1760 (2000))、免疫学的標識、リガンド、及び酵素標識が含まれる。適当な標識は、更に、マス（mass）標識、と、コンビナトリアルケミストリライブラリの逆重畳(deconvolution)に使用されるもの、例えば、高速液体クロマトグラフィ (HPLC)、ガスクロマトグラフィ、マススペクトロメトリ、光撮像ファイバ、表面プラスモン共鳴、相関スペクトロスコピ、ナノテクノロジ(グーテンス（Guetence）他、J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 739: 139-150 (2000))他によって認識可能なタグがある。
【０１９７】
オリゴヌクレオチドの標識化の方法は、当業者にとって周知であり、それらには、例えば、化学法及び酵素法がある。例えば、特定の部位において、反応性化学基をオリゴヌクレオチドに導入する方法が当業者に周知である。化学的方法によって標識をプローブに結合するために、特定の部位に位置する反応化学基を含有するオリゴヌクレオチドを、相補的反応基に付着した標識と組み合わせることができる(例えば、求核性反応基を有するオリゴヌクレオチドを、求電子性反応基に付着した標識と反応させることができる)。標識及び標識をオリゴヌクレオチドに付着させるための方法の例は、例えば、米国特許5,824,796;米国特許5,210,015; ケスラー（Kessler）(編集)、Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules、Springer-Verlag、Berlin、1992; クリッカ（Kricka）(編集) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press、San Diego、1992; ホワード（Howard） (編集) Methods in Nonradioactive Detection、Appleton及びラング（Lange）、Norwalk, 1993に記載されている。オリゴヌクレオチドの非特異的化学標識化は、オリゴヌクレオチドを、例えば、ヌクレオチド塩基の特定の官能基と反応する化学物質と組み合わせ、同時又はその後に、そのオリゴヌクレオチドを標識と反応させることによって達成可能である。例えば、ドレイパー（Draper）他 (1980) Biochemistry 19: 1774-1781を参照。標識のオリゴヌクレオチドへの酵素的導入は、標識化前駆物質を使用してオリゴヌクレオチドの酵素的修飾又は重合化を行うこと、あるいは、既存のオリゴヌクレオチドに対して標識を酵素的に添加すること、によって達成することができる。例えば、米国特許5,449,767を参照。修飾酵素の具体例としては、非限定的に、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ等がある。既存のオリゴヌクレオチドに対して標識を添加することが可能な酵素の具体例としては、非限定的に、キナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、リガーゼ、グリコシラーゼ等がある。
【０１９８】
もしもオリゴヌクレオチドがプライマとして作用することが可能であるならば、そのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション度も、そのプライマの伸長生成物のレベルを測定することによって測定することが可能である。その場合、そのプライマを標識化するか、それとも、重合化のための単数又は複数の前駆物質(通常は、ヌクレオシド三リン酸エステル)を標識化することができる。伸長生成物は、例えば、サイズ(例えば、ゲル電気泳動)、親和性法、又は、当業者に周知のその他の技術によって検出することができる。
【０１９９】
プライマ伸長(「ミニ配列決定」、「遺伝子ビット分析」)アッセイは、SNPタ
イピングに一般的に使用されており、その他の遺伝子タイピング及び変異スクリーニング用途に使用される可能性を有する(パスティネン（Pastinen） T. 他、Genome Res., 10: 1031-42 (2000))。いくつかの実施例において、修飾塩基及び小溝バインダは、いくつかの方法でプライマ伸長アッセイを改善する。MGB又は5-置換ピリミジン又は3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンによって提供される二本鎖安定性の増加によって、より高い温度での伸長が可能となる。これは、高い温度においては、問題のある標的分子の二次構造物が除去されるため、有利である。又、プライマに対する標的のハイブリダイゼーションは、より高い温度で更に早くなる。TaqポリメラーゼやBstDNAポリメラーゼ等の熱安定性ポリメラーゼをそのような反応に使用することができる。
【０２００】
更に、あるクラスの擬似正信号を除去することによって、MGBと修飾塩基は、アッセイの特異性を改善する。ヘアピン構造又はホモダイマーを形成するプライマ配列は、テンプレートに依存しないで伸長し易く（プライマの5’末端がテンプレートとして作用する)、それによって擬似正信号を生成する傾向がある。「テンプレート」上のMGBと修飾塩基によって、DNAポリメラーゼによる伸長を抑制する。従って、プライマの5’末端のMGB又は、プライマの5’末端又は中間部の修飾塩基は、プライマヘアピン又はプライマダイマーからの伸長(擬似正信号)を阻止することができる。最後に、G-リッチオリゴヌクレオチドによって形成される非標準（non-canonical）構造を除去するために、PPGを使用して、そのような配列におけるプライマ伸長アッセイを可能にすることができる。
【０２０１】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドが特に有用なその他のアッセイは、同時係属出願09/054,832に記載されている。
【０２０２】
修飾オリゴヌクレオチドが有用な更に別の増幅アッセイとして、フラップエンドヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドプローブの侵入性劈開に基づく増幅アッセイ(リアミシーブ（Lyamichev）他、Nature Biotechnol.、17: 292-296 (1999)及びオルソン（Olson）他、High-Throughput Gene Expression Monitoring with the Invader（登録商標）Assay、Poster、Society for Biomolecular Screening Conference、Vancouver、British Columbia, Canada 2000); 自己持続配列複製アッセイ(ミューラー（Mueller）他、Histochem, Cell Biol., 108: 431-437 (1997))等がある。驚くべきことに、クレアベース（cleavase）に基づくアッセイのインベーダとゲノムプローブとの両方において、非天然塩基を置換することが可能である。これらの修飾は、非限定的に、ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン及び5-置換ピリミジンを含む。ペプチド核酸、ロックされた核酸等に使用される単量体等の非天然骨格鎖も含まれる。更に、前記修飾オリゴヌクレオチドは、付着した、小溝バインダ、フルオロホア、クエンチャ等を備えることができる。当業者は、最適な酵素活性及び性能を可能にするためにキメラも使用可能であることを理解するであろう。
【０２０３】
本発明において、クレアベースに基づくアッセイにおいて、インベーダとゲノムプローブとの両方において通常の塩基が修飾塩基によって置換されたときに、予想外に顕著な改善が見られた。従って、ヒドロプロピニルPPA(HOPPPA)、 (NH2)2PPPAOH及び3-ヨードジアミノPPA等の修飾塩基を使用することによって、インベーダとゲノムプローブとの両方の長さを縮小しながら、アッセイ性能の改善が提供される。更に別の実施例において、非天然塩基は、カセットプローブにも導入される。
【０２０４】
上記記載に鑑みて、本発明は、その1つの態様において、関連する配列を有するポリヌクレオチドを識別する方法であって、以下の工程を有する方法を提供する、
（ａ）プリン又はピリミジン塩基の代わりに、少なくとも1つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン又は5-置換ピリミジンを有する所定の配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを、少なくとも2つのポリヌクレオチドと接触させる工程、
ここで、前記ポリヌクレオチドの1つは、前記修飾オリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な標的配列を有し、その他のポリヌクレオチドの内の少なくとも1つは、少なくとも1つの塩基ミスマッチを含む標的配列を有する、そして
（ｂ）前記修飾オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドの夫々との間のハイブリダイゼーションの程度を測定する工程。
【０２０５】
好ましくは、前記その他のポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、1つ又は２つのミスマッチ、より好ましくは、1つだけのミスマッチを有する標的配列を有する。
【０２０６】
上述したように、標的配列とは、プローブ又はプライマのためのハイブリダイゼーションの部位を有するヌクレオチド配列をいう。標的配列は、非限定的に、ゲノムDNA、cDNA、RNA、及びその任意の増幅生成物を含む任意の核酸に見られ、野生型遺伝子配列、変異遺伝子配列、非コード化配列、調節配列等を含むことができる。標的配列の長さは、一般に、100ヌクレオチド以下、好ましくは50ヌクレオチド以下、最も好ましくは21ヌクレオチド以下、である。
【０２０７】
本発明のこの態様に使用される修飾オリゴヌクレオチドは、本質的には、修飾プローブであり、前記ポリヌクレオチドは、どのポリヌクレオチドが修飾プローブに対してハイブリダイズするかを判断することによって識別することができる。前記修飾プローブは、任意の検出可能標識によって標識化することができ、又は、前記プローブは、標識と結合可能な反応基を含有すること、あるいは、第２の標識化プローブにハイブリダイズ可能であることによって、ハイブリダイゼーション前又はハイブリダイゼーション後に、標識化することができる能力を備えることができる。 核酸プローブのハイブリダイゼーションのための条件は、当業者に周知である。例えば、サムブルック（Sambrook）他,前出; オースベル（Ausubel）他,前出、イニス（Innis）他、前出、ヘイムス（Hames）他, 前出、及びバン・ネス（van Ness）他, 前出、を参照。
【０２０８】
当業者に周知のいくつかの方法の1つにより、ハイブリダイズしたプローブを遊離プローブから識別することによって、ハイブリダイゼーションをアッセイすることができる(すなわち、ハイブリダイズした核酸を同定することができる)。これらには、非限定的に、直接的又は間接的な(第2の支持体結合プローブに対するハイブリダイゼーションによって、又は、表面結合リガンドとプローブ結合リガンドとの間の相互作用による）固体支持体に対する標的核酸の付着、その後の、プローブとの直接的又は間接的ハイブリダイゼーション、及び、未ハイブリダイズプローブを除去するための洗浄や、ヌクレアーゼ耐性の測定、浮上密度測定、核酸二本鎖に対して特異的な親和性法(例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ)や、同じ標的核酸にハイブリダイズした複数のプローブ間の相互作用等がある。例えば、ファルコー（Falkow）他,米国特許4,358,535; ウルデー（Urdea）他、米国特許4,868,105及び5,124,246; フレイフェルダー（Freifelder）、Physical Biochemistry、第2版、W. H. Freeman & Co., San Francisco、1982; サムブルック（Sambrook）他、前出、オースベル（Ausubel）他、前出、ヘイムス（Hames）他、前出、その他の関連文献、を参照。MGB-修飾オリゴヌクレオチド接合体の二本鎖安定化能力によって、標的核酸中の潜在的に妨害性の二次構造を最小化可能な、よりストリジェントな条件下でのハイブリダイゼーションが可能となる。従って、そのようなMGB-修飾オリゴヌクレオチドは、本発明のこの態様において特に好適である。
【０２０９】
関連態様において、本発明は、ポリヌクレオチド中の標的配列の存在を検出するための方法であって、以下の工程を有する方法を提供する。
（ａ）前記標的配列の存在をテストすべきポリヌクレオチドを、前記標的配列に対して実質的に相補的な配列を有する修飾オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする工程、そして
（ｂ）ハイブリダイズした核酸を同定する工程、
ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、プリン残基の代わりに、少なくとも１つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンを有する。
【０２１０】
好ましくは、前記修飾オリゴヌクレオチドは、標識化プローブであり、少なくとも２つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン塩基を有する。このグループの実施例において、標識化プローブは、標的及び／又は標的の伸長生成物にハイブリダイズし、前記標識の物理的状態の変化が、ハイブリダイゼーションの結果として生じる。ここでの使用において、「プローブ」とは、第2の核酸分子中の標的配列にハイブリダイズ可能な核酸分子である。例えば、このタイプのアッセイの1つである加水分解可能プローブアッセイは、DNAポリメラーゼ等の多くの重合化酵素が、本来的に5’-3’ エキソヌクレアーゼ活性を有するという事実を利用する。従って、もし、プローブが、重合化のためのテンプレートとして作用することが可能な配列にハイブリダイズするならば(例えば、もしもプローブが増幅反応中において、2つの増幅プライマ間に位置するDNAの領域に対してハイブリダイズするならば)、上流側の増幅プライマで重合化を開始した重合化酵素は、そのプローブをエキソヌクレアーゼ的に消化することができる。もし、そのプローブがその標的に対してハイブリダイズし、もし、プローブがハイブリダイズした領域を横断して増幅が発生しているのであれば、そのようなプローブに付着している標識は放出される。放出された標識は、標識化プローブから分離され、その標識の性質に応じて、当業者に周知の方法によって検出される。例えば、放射性標識フラグメントは、薄層クロマトグラフィによって分離され、オートラジオグラフィによって検出することが可能であり、他方、蛍光標識化されたフラグメントは、適当な放出波長での観察を伴う適当な励起波長での照射によって、検出することができる。例えば、米国特許5,210,015を参照。
【０２１１】
この技術のバリエーションにおいて、プローブは、蛍光標識と、この蛍光標識の蛍光発光を消光する消光剤とを含む。この場合、前記蛍光標識の前記消光剤に対するその空間関係が、例えば、前記蛍光標識の前記プローブからのエキソヌクレアーゼ的開放によって変化するまでは、検出することができない。従って、その標的配列へのハイブリダイゼーションに先立って、前記フルオロホア/クエンチャ二重標識プローブは蛍光を発しない。このフルオロホア/クエンチャ標識プローブのその標的へのハイブリダイゼーション後に、それは、上流側プライマにおいて重合化を開始した重合化酵素のエキソヌクレアーゼ的活性のための基質となる。プローブのエキソヌクレアーゼ的分解によって、蛍光標識が、プローブから、従って、消光剤の近傍から開放されて、これによって、適当な励起波長における発光時の蛍光信号の検出が可能となる。この方法は、開放された標識をインタクトなプローブから分離する必要がないという利点を有する。マルチプレックスなアプローチでは複数のプローブを利用し、その夫々が、異なる標的配列に対して相補的であって、識別可能な標識を坦持し、これによって、複数の標的配列の同時アッセイを可能にする。
【０２１２】
この方法及びそれに関連の方法においてMGB-修飾オリゴヌクレオチド接合体を使用することによって、これらのアッセイに、より大きな速度、感度、識別力を適用することが可能となる。特に、これらのMGB-修飾オリゴヌクレオチドの、完全ハイブリッドと1つの塩基のミスマッチを有するハイブリッドとの間を識別する高い能力によって、一塩基多型等の同定に、加水分解可能プローブアッセイを使用することが容易になるであろう。当業者は、単一ヌクレオチドミスマッチ間を識別することが可能な、本発明のものような組成物及び方法は、互いに２，３，４，５，６又はそれ以上のミスマッチを有する配列間を識別することも可能であることを理解するであろう。
【０２１３】
更に別の態様において、本発明は、プライマ伸長方法を提供し、この方法は、標的配列を含むポリヌクレオチドを、前記標的配列に対して相補的な単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマと共に、重合化に好適な条件下で、重合化酵素とヌクレオチド基質との存在下において、インキュベートする工程を有し、ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマのうちの少なくとも1つは、プリン又はピリミジン塩基の代わりに、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン又は5-置換ピリミジン塩基を有する。
【０２１４】
増幅手法は、1つの核酸配列の多くのコピーが、通常、連続的重合化及び／又は連結反応によって、指数関数的に生成される手法である。下記のより伝統的な増幅反応に加えて、本発明は、三元結合(WO99/37085を参照)、シグナル増幅(キャパルディ（Capaldi）他、Nuc. Acids Res.、28:E21 (2000))、T7ポリメラーゼ、逆転写酵素、R Nase H、RT-PCR、ローリング  サークル、クレアベース等を含む増幅において有用である。
【０２１５】
PCR等の多くの増幅反応は、反復プライマ依存重合化反応を利用する。プライマは核酸であり、第２のテンプレート核酸にハイブリダイズすることが可能で、一旦ハイブリダイズすると、その第２の核酸をテンプレートとして使用して、(ヌクレオチド基質の存在下で)重合化酵素によって伸長されることが可能である。重合化酵素としては、非限定的に、DNA及びRNAポリメラーゼ及び逆転写酵素等がある。種々の重合化酵素による重合化に有利な条件は、当業者に周知である。例えば、サムブルック（Sambrook）他,前出、オースベル（Ausubel）他, 前出、イニス（Innis）他,前出、を参照。一般に、重合化酵素によって伸長可能であるためには、プライマは、非ブロック3’-末端、好ましくは、遊離3’ヒドロキシ基を有していなければならない。増幅反応の生成物は伸長されたプライマであって、そのプライマは重合化酵素によって伸長されたものである。
【０２１６】
従って、本発明の一実施例において、ここに開示され特許請求の範囲に記載されている方法及び組成物は、PCR等の改良された増幅反応において有用である。例えば、米国特許4,683,202; 4,683,195及び4,800,159; ミュリス（Mullis）及びファローナ（Faloona）、前出、及びサイキ（Saiki）他、前出、を参照。PCRの重合化工程は、PCRの変性工程のための必要な昇温のために、非常に多くの場合、好熱性菌から分離したDNAポリメラーゼ等の熱安定性重合化酵素によって触媒される。前述したように、これまで、PCRの実施に関連する問題の1つは、PCRが行われる昇温でプライマとして作用するための十分なハイブリッド安定性を有する、比較的長いオリゴヌクレオチドが必要なことであった。修飾オリゴヌクレオチド、そして、特にMGB-修飾オリゴヌクレオチド接合体は、その修飾塩基及びMGBによってハイブリッド安定性が増加し、それによって、利用可能なプライマ長の下限が大幅に拡張するので、PCR等の増幅反応のプライマとして有用である。更に、MGB修飾オリゴヌクレオチド接合体は、短いプライマ長が望ましい特殊なPCRプロトコルにおいて有用である。これらには、非限定的に、最適プライマ長が10ヌクレオチド以下であるディファレンシャル・ディスプレイ、DNA(RAPD)技術における多型のランダム増幅、増幅長多型分析が含まれる。リャン（Liang ）他、前出、ウィリアムス（Williams）他、前出、を参照。
【０２１７】
本発明の前記修飾オリゴヌクレオチドは、PCR又はそれに関連の増幅技術が使用されるいかなるタイプのアッセイ又は手法にも適用可能であり、例えば、非限定的に、加水分解可能プローブアッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)によるプライミング、フラグメント長多型分析、一塩基多型(SNP)分析、及びマイクロサテライト分析を含む。これら及びその他の技術は、少数の用途を挙げるだけでも、遺伝子マッピング、疾患関連遺伝子の同定とスクリーニング、及び薬理遺伝学に有用である。
【０２１８】
更に別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を提供し、この方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション条件下で修飾オリゴヌクレオチドアレイとインキュベートする工程、そして
（ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記アレイ中の前記修飾オリゴヌクレオチドのどれにハイブリダイズしたかを判定する工程、
ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、プリン塩基の代わりに、少なくとも１つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンを有する。
【０２１９】
これらの手法において、異なる公知の配列の複数の修飾オリゴヌクレオチドを有する秩序配列が、単数又は複数のポリヌクレオチド、核酸又は核酸集団へのハイブリダイゼーションのためのプラットフォームとして使用される。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの決定と、それらの既知の配列のアラインメントとによって、前記テストポリヌクレオチドの配列を再構築することが可能である。例えば、米国特許5,492,806; 5,525,464; 5,556,752;及びPCT公報WO92/10588及びWO96/17957を参照。アレイを構築するための物質としては、非限定的に、ニトロセルロース、ガラス、シリコンウエハ、光ファイバ、及び、当業者に知られているもののようなアレイの構築用に適したその他の物質がある。
【０２２０】
現在のアレイ式配列決定及び分析法の大きな問題点は、アレイ中の異なるオリゴヌクレオチドが、夫々別のTmを有することである。従って、単一塩基ミスマッチを識別する能力を保持しつつ、最大感度を提供するストリンジェンシ条件を決定することが困難である。これは、全部ではなないにしても、大半のアレイ技術において特に重要な検討事項である。アレイ式配列決定及び分析技術に修飾オリゴヌクレオチド及び／又はMGB修飾オリゴヌクレオチド接合体を使用することによって、この問題に対する解決が提供される。驚くべきことに、MGBの修飾オリゴヌクレオチドに対する接合によって、そのTmは塩基組成に対して比較的独立的なものとなる。従って、所与の長さの、修飾オリゴヌクレオチドとMGB-修飾オリゴヌクレオチド結合体の集合について、完全ハイブリッドのTmは、配列に拘わらず、比較的狭い温度範囲に入る。同時に、単一ヌクレオチドミスマッチのTmは、完全マッチのTmよりも遥かに低い。従って、すべての修飾オリゴヌクレオチドが同じ長さであり、オプションとしてそれらのMGB接合体として存在するように構成されたアレイは、そのアレイ中の種々のオリゴヌクレオチド間の最小のTmバリエーションを示し、これによって、そのアレイ全体に対してより均一なハイブリダイゼーション条件を可能にする。これらの技術に修飾オリゴヌクレオチド及びMGB-修飾オリゴヌクレオチド接合体を使用することの更に別の利点は、それが、単一ヌクレオチド解像度を保持しながら、より短いオリゴヌクレオチドをより高い温度で(従って、より高いストリンジェンシで)使用することを許容するので、より高い感度を提供することにある。
【０２２１】
本発明のアレイ技術に対する更に別の用途は、特定の細胞又は組織中の遺伝子発現のパターンの検査にある(例えば、アイゼン（Eisen） 他、METHODS IN ENZYMOLOGY、303: 179-205(1999)を参照)。この場合、異なる遺伝子に対応するポリヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドを、表面上に配列させ、例えば、特定の細胞又は組織タイプ由来の核酸サンプルを、前記アレイと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする。前記アレイ上のハイブリダイゼーションが起こる部位を検出することによって、どの修飾オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたか、従って、そのサンプルが採取されたその特定の細胞又は組織においてどの遺伝子が活性であるのかを判断することができる。
【０２２２】
アレイ法は、又、突然変異又は多型の同定にも使用することができ、ここにおいて、野生型又は変異配列が表面上の秩序配列として置かれる (ハシア（Hacia）他, J. Mol. Genet.、36: 730-736 (1999)を参照)。ストリジェント条件下におけるアレイに対するポリヌクレオチドサンプルのハイブリダイゼーション、そして、そのアレイのどのオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを調べることによって、そのポリヌクレオチドが野生型配列を有するか、それとも変異配列を有するかを判断することが可能である。MGB-オリゴヌクレオチド接合体の高い識別能力は、アレイ技術のこの用途において特に有用である。
【０２２３】
従って、本発明は、対象の遺伝子の標的配列中の突然変異を同定するための方法を提供し、この方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを、前記野生型配列と種々の変異標的配列とを含む種々の配列のオリゴヌクレオチドのアレイと、ハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする工程、そして
（ｂ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを判断する工程、
ここで、前記複数のオリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンによって置換されている。
【０２２４】
更に別の関連する態様において、本発明は、ポリヌクレオチド中の標的配列のヌクレオチド配列を決定する方法を提供し、この方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを、それらオリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基が3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンによって置換された、少なくとも2つの既知の配列のオリゴヌクレオチドに接触させる工程、ここで、前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドの1つは前記標的配列に対して完全に相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つの別のオリゴヌクレオチドは関連する標的配列を有し、そして、これらオリゴヌクレオチドの夫々を、前記ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする工程、そして
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドの夫々と前記ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの程度を測定する工程。
【０２２５】
一実施例において、すべての可能なn-量体オリゴヌクレオチド(ここで、nは、約10以下の整数)の集合が、ヌクレオチド配列を決定するために加水分解可能プローブアッセイに使用される。各オリゴヌクレオチドは、固有に標識化され(かつ、好ましくは、修飾され)、放出された標識の分析は、前記オリゴヌクレオチドのどれが前記標的配列にハイブリダイズしたかを示す。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの配列のアラインメントが、前記ヌクレオチド配列を提供する。
【０２２６】
修飾オリゴヌクレオチド、より好ましくは、修飾オリゴヌクレオチド-MGB接合体は、初めてサンガー（Sanger）他、前出、に記載された鎖停止（chain-termination）法及びその派生法等のプライマに依存したDNA配列決定方法にも有用である。鎖停止シーケンシングにMGB-修飾オリゴヌクレオチド接合体を使用することによって、より短いプライマをより高いストリンジェンシで使用することが可能となり、配列決定中により高い程度のミスマッチ識別が可能となる。具体例としては、非限定的に、短いホモロジー領域(約2-3のアミノ酸)を共有する遺伝子の検索、非常に僅かの既存の情報しかない領域での配列決定がある。MGB-オリゴヌクレオチド接合体は、そのような短いプライマでの配列決定技術において有用である。
【０２２７】
更に別の実施例において、本発明は、細胞中の遺伝子発現を調べる方法を提供し、この方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記細胞中の前記遺伝子を表すポリヌクレオチドの集団を、ハイブリダイゼーション条件下で、異なる配列の複数の修飾オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドアレイと共にインキュベートする工程、そして
（ｂ）前記アレイ中のどの修飾オリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかを判定する工程、
ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、プリンの代わりに、少なくとも1つの3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンを有する。
【０２２８】
1つのグループの実施例において、前記方法は、複数の細胞タイプ又は組織由
来の複数の発現遺伝子によって行われる。前記遺伝子は、好ましくは、異なる検出標識によって標識化され、次に、同時に1つのアレイに対してハイブリダイズされ、各遺伝子の発現パターンを判定するために前記標識を介してモニタされる。
【０２２９】
上述したアッセイ及び診断方法に加えて、ここに記載される修飾オリゴヌクレオチドと修飾塩基は、アンチセンス技術における有用性を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を選択的に抑制し、疾病治療及び予防のための遺伝子学的アプローチを提供することが知られている(スミス（Smith）他, Int. J. Oncol., 17: 841-850 (2000))。アンチセンスオリゴヌクレオチドの性能を改善するために、他の修飾オリゴヌクレオチドが使用されている(チャン（Zhang）他、Nat. Biotechnol., 18: 862-867 (2000); フラナガン（Flanagan）他、Nat. Biotechnol., 14: 1139-1145 (1996))。従って、本発明の別実施例は、アンチセンスオリゴマの合成における、単体又は組み合わせでの、単量体としての5-置換ピリミジン、非置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン、及び3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジンの使用である。別の実施例において、ここに記載の前記修飾塩基は、前記アンチセンスオリゴマの酵素的分解を減少させるために、オリゴヌクレオチド中の単量体として使用することができる。
【０２３０】
新しい修飾塩基
別の態様において、本発明は、多数の新しい修飾塩基を提供する。これらの塩基は以下の一般式を有する、
【０２３１】
【化９２】
2003525292.tif 000098
【０２３２】
ここで、Z1は、H, F及びORａから選択されるメンバ、ここで、Rａは、H, (C1-C8)アルキル及びヒドロキシ保護基からなるグループから選択されるメンバ、Z2は、H, (C1-C8)アルキルのグループから選択されるメンバ、又は、オプションとして、Z1と組み合わされて、O, S及びNからなるグループから選択される1〜3のヘテロ原子を有する5〜7員環を形成する、Y1は、OH,保護されたヒドロキシ基、及び0-P1からなるグループから選択されるメンバ、ここでP1は、ホスホルアミダイト又はH-ホスホナート基であり、Y2は、OH,保護されたヒドロキシ基、及び0-P2からなるグループから選択されるメンバであり、ここでP2は、ホスホルアミダイト、H-ホスホナート、モノホスフェート、ジホスフェート又はトリホスフェートであり、Bは、以下からなるグループから選択される修飾ヌクレオチド、
【０２３３】
【化９３】
2003525292.tif 000099
【０２３４】
【化９４】
2003525292.tif 000100
【０２３５】
【化９５】
2003525292.tif 000101
【０２３６】
及び
【０２３７】
【化９６】
2003525292.tif 000102
【０２３８】
ここで、X11及びX12は、H, NH2及び保護されたアミノ基からなるグループから夫々独立的に選択され;夫々のR11は、保護又は未保護形態の、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、4-アミノ-1-ブチニル及び3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから独立的に選択され;各R12は、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリル、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、4-アミノ-1-ブチニル、及び3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから独立的に選択され、但し、R12は、2-ピリジルエチニル以外である。
【０２３９】
1つのグループの実施例において、Bは、以下である。
【０２４０】
【化９７】
2003525292.tif 000103
【０２４１】
好ましくは、X11はNH2でX12はHである。より好ましくは、X11はNH2でX12はHであり、Y1はO-P1であり、Y2は保護されたヒドロキシであり、Z1はHであり、R12は、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、4-アミノ-1-ブチニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、2-フラニル、3-フラニル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピロリル、3-ピロリル、1,3-イソキサゾール-4-イル、1,3-イソキサゾール-5-イル、1,3-イソキサゾール-2-イル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、2-ピリジル、3-ピリジル及び4-ピリジルから選択される。特に好適な実施例において、Y1は、-O-[(2-シアノエチル)N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]であり、Y2は、-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)である。
【０２４２】
別のグループの実施例において、Bは下記である。
【０２４３】
【化９８】
2003525292.tif 000104
【０２４４】
好ましくは、X12はNH2又はHである。より好ましくは、X12はNH2又はHであり、Y1はO-P1であり、Y2は保護されたヒドロキシであり、Z1はHであり、R12は、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、2-フラニル、3-フラニル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピロリル、3-ピロリル、1,3-イソキサゾール-4-イル、1,3-イソキサゾール-5-イル、1,3-イソキサゾール-2-イル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、2-ピリジル、3-ピリジル及び4-ピリジルから選択される。特に好適な実施例において、Y1は、- O-[(2-シアノエチル)N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]であり、Y2は、-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)である。
【０２４５】
更に別の好適実施例において、本発明の前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの式IIIの塩基を有する(アセチル保護基が除去されたものを含み、更に、それらのその他の保護及び活性化形態を含む)。
【０２４６】
【化９９】
2003525292.tif 000105
【０２４７】
式IIIの化合物(6-アミノ基が保護され、糖のヒドロキシ基が保護されるか又はホスホルアミダイトとして活性化されている化合物を含む)の作成は、上述した反応スキーム6に提供されている。
【０２４８】
本発明の最も好適な実施例において、前記修飾塩基は、式IVa, IVb又はIVcから選択される。
【０２４９】
【化１００】
2003525292.tif 000106
【０２５０】
【化１０１】
2003525292.tif 000107
【０２５１】
【化１０２】
2003525292.tif 000108
【０２５２】
これらの化合物は、自動オリゴヌクレオチド合成器での使用と、ここに記載されるある種の修飾オリゴヌクレオチドの作成とに特に好適である。
【０２５３】
本発明において有用なその他の修飾塩基は、式Va及びVbによって表されるものを含む。
【０２５４】
【化１０３】
2003525292.tif 000109
【０２５５】
【化１０４】
2003525292.tif 000110
【０２５６】
ここで、R7は、OH, SH又はNH2から選択される。これらの化合物は、ここに記載の方法によって合成することができる。
【０２５７】
別のグループの実施例において、Bは以下である。
【０２５８】
【化１０５】
2003525292.tif 000111
【０２５９】
好ましくは、X11はNH2である。より好ましくは、X11はNH2であり、Y1はO-P1であり、Y2は保護されたヒドロキシであり、Z1はHであり、R11は、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、4-アミノ-1-ブチニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル、及び3-メトキシプロプ-1-イニルから選択される。特に好適な実施例において、Y1は、-O-[(2-シアノエチル)N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]であり、Y2は、-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)である。
【０２６０】
別のグループの実施例において、Bは以下である。
【０２６１】
【化１０６】
2003525292.tif 000112
【０２６２】
好ましくは、Y1はO-P1であり、Y2は保護されたヒドロキシであり、Z1はHであり、R11は、3 -ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、4-アミノ-1-ブチニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル、及び3-メトキシプロプ-1-イニルから選択される。特に好適な実施例において、Y1は、-O-[(2-シアノエチル)N, N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]であり、Y2は、-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)である。
【０２６３】
関連する態様において、本発明は、下記の式を有する修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２６４】
【化１０７】
2003525292.tif 000113
【０２６５】
ここで、各Z1は、H, F又はORaから独立的に選択され、ここでRａは、H、(C1-C8)アルキル及びヒドロキシ保護基から選択されるメンバであり、各Z2は、H又は(C1-C8)アルキル、あるいは、オプションとして、Z1と組み合わされて5〜7員環を形成し、各Z3は、O、S又はNHから選択され、各Yは、P(O)OH、P(S)OH及びP(O)CH3から独立的に選択され、前記添字nは、1〜98の整数であり、W1とW2は、夫々、H、一リン酸、二リン酸、三リン酸、及び、小溝バインダ基モアエティ、前記小溝バインダ基モアエティにはオプションとしてレポータ基又はクエンチャが付着している、から独立的に選択され、そして各Bは、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジン及び下記の式の修飾塩基から独立的に選択される、
【０２６６】
【化１０８】
2003525292.tif 000114
【０２６７】
【化１０９】
2003525292.tif 000115
【０２６８】
【化１１０】
2003525292.tif 000116
【０２６９】
及び
【０２７０】
【化１１１】
2003525292.tif 000117
【０２７１】
ここで、X11及びX12は、H,及びNH2、保護されたアミノ基から独立的に選択され;各R11は、保護又は未保護形態の、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、4-アミノ-1-ブチニル及び3-（ヒドロキシメチル）-4-ヒドロキシ-1-ブチニルからなるグループから独立的に選択され;各R12は、保護又は未保護形態の、3-ヒドロキシプロプ-1-イニル、3-アミノプロプ-1-イニル、3-メトキシプロプ-1-イニル、4-ヒドロキシ-1-ブチニル、4-アミノ-1-ブチニル、3-(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシ-1-ブチニル、ヘテロシクリル(C1-C12)アルキル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルケニル、ヘテロシクリル(C2-C12)アルキニル、ヘテロシクリルからなるグループから独立的に選択され、ここで、前提としてR12は、2-ピリジルエチニル以外であり、
【０２７２】
更に前提として、前記Bの少なくとも1つは、修飾塩基から選択され、更に、オプションとして、これらBのうちの単数又は複数は、付着した小溝バインダ基モアエティ、レポータ基又はそれらの組み合わせを有する。
【０２７３】
特に好適な塩基は、上述したものである。  
【０２７４】
例
加水分解可能プローブアッセイにおいて、標識化プローブがPCR反応に添加される。前記プローブは、2つのPCRプライマ間の領域に対して相補的であり、かつ、それらのうちの一方が他方の蛍光を消光する、2つのフルオロホアによって標識化されている。前記プローブは、PCRに典型的に使用される鎖伸長温度(55-75℃)で、又はそれ以上の温度で、前記PCR生成物鎖の1つ上で、その相補的標的配列に対してハイブリダイズするように構成される。PCRに通常使用される重合化酵素(特にTaqポリメラーゼ)は、固有の5’-エキソヌクレアーゼ活性を有する。PCR反応の伸長工程での新しい鎖の合成中、この5’-エキソヌクレアーゼ活性が、テンプレートに結合した相補的鎖に対して作用する。もしも、上述したように標識化されたプローブが、テンプレートに結合しているのであれば、前記重合化酵素に関連する5’-エキソヌクレアーゼ活性によって、結合したフルオロホアが放出される。一旦放出されると、その蛍光は、もはや消光されず、蛍光信号が得られる。例えば、米国特許5,210,015; リバック（Livak）他 (1995) PCR Meth. App. 4: 357-362、及びヘイド（Heid）他 (1996) Genome Res. 6: 986-994を参照。
【０２７５】
薄層クロマトグラフィを、シリカゲル60F-254(EM Reagents)アルミニウム裏打ちプレート上で実行した。Varian VXR-300スペクトロメータ上で、300MHzで、1H NMRが得られた。二次元(Cosy)及びNOE実験によって、プロトン共鳴の割り当てを補助した。Quantitative Technologies Inc. (Boundbrook, NJ)によって元素分析を行った。
【０２７６】
例１
この例は、5-(プロプ-2-イニル-4-メチルベンゾエート)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-2’-デオキシウリジン  3’-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト](3)の合成を記載する。
【０２７７】
5-(プロプ-2-イニル-4-メチルベンゾエート) -2’-デオキシウリジン(1)。
30mLの無水DMF中の、5-ヨード-2’-デオキシウリジン(5.0g, 14.12mmol)、CuI (270 mg, 1.42mmol)、Pd (PPh3)4 (0.82 g, 0.714mmol)及びトリエチルアミン(2.4mL)の混合物に、プロプ-2-イニル  4-メチルベンゾエート(6.10 g, 35.06mmol)を添加した。この混合物を、アルゴン中で4時間攪拌し、次に、乾燥状態まで蒸発させた。その残渣を、メタノール中で粉砕し、沈殿した過剰のプロプ-2-イニル  4-メチルベンゾエートを濾過除去した。濾液を、蒸発させ、その残渣を、酢酸エチル中10%のメタノールで溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。その純粋生成物フラクションを、乾燥状態まで蒸発させ、その残渣を酢酸エチル−エーテルから沈殿させた:3.14 g (56%)収量; TLC (酢酸エチル中10%のメタノール)、Rf=0.50; 1H NMR (DMSO-d6)δ 11.68 (1H、s、ウラシルN-H)、8.29 (1H、s、6-H)、7.89及び7.35 (4H、2xd、J=8.2Hz、トルオイルHs)、6.10 (1H、t、J=6.4 Hz、1’-H)、5.24 (1H、d、J=4.4Hz、 3’-OH)、5.15 (2H、s、アルキニル-CH2)、5.12 (1H、t、J=5.2 Hz、5’-OH)、4.24 (1H、m、3’-H)、3.79 (1H、q、4’-H)、3.59 (2H、m、5’-Hs)、2.39 (3H、s、トルオイル-CH3)、2.13 (2H、m、2’-H)。  
【０２７８】
5-(プロプ-2-イニル-4-メチルベンゾエート) -5’-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-2’-デオキシウリジン(2)。
45mLの無水ピリミジン中の1(3.0g, 7.50mmol)の溶液に、塩化ジメトキシトリチル (3.0g)を添加した。得られた溶液を、室温で4時間攪拌し、次に、400mLの5%重炭酸ナトリウム中に注入した。この混合物を、酢酸エチル(2×300mL)で抽出し、その抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。その残渣を、酢酸エチル中5％のメタノールで溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。その純粋生成物フラクションを、プールし、蒸発させて、泡沫として2を得た: 4.16 g (79%)収量。
【０２７９】
5-(プロプ-2-イニル-4-メチルベンゾエート)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-2’-デオキシウリジン  3’-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト](3)。
3.0mLのN,N-ジイソプロピルエチレンを含有する130mLの無水塩化メチレン中の2(4.0g, 5.70mmol)の溶液に、クロロ(2-シアノエトキシ)(N, N-ジイソプロピルアミノ) ホスフィン(2.22mL)を、アルゴン下で添加した。この溶液を、室温で30分間攪拌し、次に、3.0mLのメタノールで処理した。この溶液を、300mLの酢酸エチルで希釈し、300mLの5 %重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。その水相を、300mLの酢酸エチルで抽出し、その組み合わせた有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。その残渣を、酢酸エチル(2%トリエチルアミン)中30〜0%のヘキサン勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。その純粋フラクションをプールし、蒸発させ、その残渣を酢酸エチル-ヘキサンから沈殿させた:3.35g (65%)収量; TLC (酢酸エチル中20%のヘキサン), Rf=0.82及び0.71(ジアステレオマー); 31 P NMR (DMSO-d6)δ 147.82及び147.45。
【０２８０】
例２
フェーズ1 (2R, 5R)-5-(4-アミノ-3-ヨードピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジニル)-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(9)の作成。
3-ヨード-1,5-ジヒドロピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン-4-オン(4)。
この化合物の合成は、N-ヨードスクシンイミドを使用して、テイラー（Taylor）他 (Tetrahedron, 48(37); 8089-8100(1992))によって以前に報告された。ヨウ素化剤として一塩化ヨウ素を使用する我々の合成を以下に記載する。
【０２８１】
1.2M酢酸ナトリウムの1.0L溶液に、4-ヒドロキシピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン(25g, 184mmol)を添加し、その後、一塩化ヨウ素(46g, 284mmol)を添加した。この混合物を、封止容器中で、4時間、110℃で攪拌した。完了した反応物を、室温まで冷却し、200mLの水中の30gのメタ重亜硫酸ナトリウムの溶液で処理した。形成された白色の沈殿物を、濾過し、冷水で濯いだ。次に、その固体を、200mLの3.2M水酸化カリウム溶液中に溶解させた。一水化ヒドラジン(5mL)を添加し、その溶液を、15分間攪拌した。次に、この溶液を、50mLの濃縮HCl、その後、酢酸によるpH微調節によって、約pH7に酸性化した。形成された固体を、濾過し、冷水で濯ぎ、乾燥させた:55.1g (114%収率)。註: 前記固体を真空下で乾燥させることによって残留水を除去することは困難である。残留水は、次の工程のピリジン蒸発プロセスによって除去される。
【０２８２】
3-ヨード-1,5-ジヒドロピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン-4-チオン(5)。
化合物4 (21.5 g, 82.1mmol)を、150mLの無水ピリジン中に懸濁させ、その混合物を蒸発乾燥させた。その固体を、170mLの乾燥ピリジン(アルゴン下)で再懸濁させ、P2S5(26.8g)を添加した。この混合物を、10分間65℃で攪拌し、次に、2〜6時間95℃で攪拌した。得られた溶液を、室温まで冷却し、溶液中にアルゴン流を起泡することによってガス抜きした(硫化ガスを、水酸化ナトリウム溶液を含むトラップに通す)。次に、その反応溶液を、濃いシロップが形成されるまで、容積を減少させた。激しい反応が止むまで1m Lのアリクオットの水を添加し、その後、500mLの水と10mLの酢酸とを添加することによって、過剰なP2S5を分解した。その混合物を70℃まで1時間暖めて硫化水素ガスの排出を促進し、次に、500mLの水で希釈し、氷浴中で冷却した。その固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥させた:19.8 g (87%)収量。
【０２８３】
4-エチルチオ-3-ヨードピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン(6)。
化合物5(43.5 g, 157mmol)を、水酸化カリウム溶液(350mLの水中の38.6g KOH)中で30分間攪拌した。その混合物を濾過し、濾液を、酢酸の添加によってpH10にまで酸性化し、次に、350mLの純粋エタノールで希釈した。ヨードエタン(10mL)を添加し、その溶液を室温で攪拌した。30分後と1時間後に、追加の10mLのヨードエタンのアリクオットを添加した。反応は、総計90分間後に完了した。他のラン（run）は、反応を完了させるために更にヨードエタンの追加を必要とした。その反応溶液を、700mLの水と、20mLの酢酸によって希釈した。その混合物を氷浴中で冷却し、固体を濾過し、水で濯いで乾燥させた。この粗生成物を300のDMF中に溶解させ、90℃で15分間攪拌した。不溶物を濾過除去し、濾水を1Lの水で希釈し、氷水中で冷却した。固体を濾過し、水で注ぎ、乾燥させた:19g (40%)収量。
【０２８４】
[(2R, 5-R)-5-(4-エチルチオ-3-ヨードピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジニル)-3-(4-メチルフェニルカルボニルオキシ)オキソラン-2-イル]メチル  4-メチルベンゾエート(7)。  
化合物6を、水中の1モル当量の水酸化カリウムとの反応によって対応のカリウム塩に変換した。得られた溶液を、蒸発乾燥し、残渣を乾燥アセトニトリルから蒸発させた。6のカリウム塩(29.0g,94.73mmol)を、80mLの無水DMF中に溶解させ、次に、830mLの無水アセトニトリルによって希釈した。クロロ糖誘導体(48g, 123mmol)を1ポーション添加し、その混合物を3時間攪拌し、次に、1.5Lの25%水性メタノールによって希釈した。混合物を5℃で一晩静置した。結晶を濾過し、25%の水性メタノールで濯ぎ、乾燥させた:32.2g (52%)収量。
【０２８５】
(2R, 5R) -2-(ヒドロキシメチル)-5-(3-ヨード-4-メチルピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジニル)オキソラン-3-オール(8)。
250mLのメタノール中の7(10.97g, 16.66mmol)の懸濁液に、22mLメタノール中のの1Nナトリウムメトキシドを添加した。この混合物を還流で攪拌し、その混合物が透明な溶液になった直後からその反応の進行をモニタした。尚、還流が5への完全な変換後も継続され場合は、副産物の形成が観察される。所望の生成物に対応する1つの成分がTLCによって観察されるやいなや、1.34mLの酢酸を添加することによって、反応を停止させた。溶液を蒸発させ、残渣をメタノール-エーテル-ヘキサンから沈殿させた。固体を濾過し乾燥させた:6.8g (104%)収量粗生成物(酢酸ナトリウムを含有)。
【０２８６】
(2R, 5R)-5-(4-アミノ-3-ヨードピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジニル)-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(9)。 
化合物8 (6.8g, 17.35mmol)を、200mLの濃縮水酸化アンモニウム(密封容器)中で、室温で36時間攪拌した。この混合物を、蒸発させ、残渣をアセトニトリル-エーテルから沈殿させた。固体を濾過し、乾燥させた: 5.36 g(82%)収量。この化合物のNMRと分光データは、と同一であった。
【０２８７】
フェーズ2  3-{4-((1E)-1-アザ-2-メトキシプロプ-1-エニル)-1-((2R, 5R)-5-{(ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}-4-{[ビス(メチルエチル)アミノ](2-シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン-2-イル)ピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン-3-イル]プロプ-2-イニル  4-メトキシベンゾエート(13；R1=-OCOPhCH3)の作成  
3-{1-{(2R, 5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)オキソラン-2-イル]-4-アミノピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン-3-イル}プロプ-2-イニル}  4-メチルベンゾエート(10；R1=-OCOPhCH3)。
12mLの無水DMF中の、9(2.40g,6.37mmol)、CuI (124 mg, 0.648mmol)、Pd (PPh3)4 (380 mg, 0.331mmol)及びトリエチルアミン(1.32mL)の混合物に、プロプ-2-イニル  4-メチルベンゾエート(1.87g, 11.85mmol)を添加した。この混合物をアルゴン下で12時間攪拌し、次に、蒸発乾燥させた。残渣を、酢酸エチル中の5%のメタノールで溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。この精製生成物フラクションを、蒸発させて泡沫を得た: 2.29 g(85%)収量; TLC (酢酸エチル中10%のメタノール)、Rf=0.43; 1H NMR (DMSO-d6)δ 8.26(1H、s、6-H)、7.92及び7.37(4H、2xd、J=8.5Hz、トルオイル-Hs), 6.55(1H、t、J=6.3 Hz、1’-H)、5.29 (2H、s、アルキニル-CH2)、5.28(1H、t、J=4.7 Hz、3’-OH)、4.76(1H、t、J=5.7 Hz、5’-OH)、4.41(1H、m、3’-H)、3.81(1H、m、4’-H)、3.49及び3.56(2H、2xm、5’-Hs)、2.76及び2.24(2H、2xm、2’-Hs)、2.39 (3H、s、ルオイル-CH3)。
【０２８８】
3-{4-((1E)-1-アザ-1 -メチルプロプ-1-エニル)-1-((2R, 5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)オキソラン-2-イル]ピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン-3-イル}プロプ-2-イニル-4-メチルベンゾエート(11；R1=-OCOPhCH3)。
化合物10(1.76g, 4.16mmol)を、5.0mLのN,N-ジメチルアセトアミドと、1.9mLのN,N-ジメチルアセトアミド  ジメチルアセタールと、2.0mLの無水トリエチルアミンとの溶液中で、15時間、室温で攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をキシレンから2回蒸発させ、泡沫として11を得た。TLC (酢酸エチル中10%のメタノール), Rf=0.29; 1H NMR (DMSO-d6)δ 8.51 (1H, s, 6-H)、7.90及び7.37(4H、2xd、J=8.3Hz、トルオイルプロトン)、7.28、7.14及び6.74 (13H、d及び2m、ダブレットの場合J=7.1 Hz)、トリチルプロトン)、6.63 (1H、m、1’-H)、5.32 (1H、d、J=5.0 Hz、3’-OH), 5.24 (2H、s、アルキニル-CH2)、4.56 (1H、m、3’-H)、3.93 (1H、m、4’-H)、3.68 (6H、s、メトキシ Hs)、3.32及び3.11 (6H、2xs、N-メチル), 3.09-2.95(2H、m、5’-Hs)、2.81及び2.32 (2H、2 xm、2’-Hs)、2.40 (3H、x、= -Me)、2.19 (3H、s、トルオイル-Me)。
【０２８９】
3-{4-((1E)-1-アザ-2-メチルプロプ-1-エニル)-1-((2R, 5R)-5-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}-4-ヒドロキシオキソラン-2-イル)ピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン-3-イル]プロプ-2-イニル  4-メチルベンゾエート(12；R1=-OCOPhCH3) 。
12mLの無水ピリジン中の11の溶液に、塩化ジメトキシトリチル（1.67g）を添加した。得られた溶液を４時間、室温で攪拌し、そして、250mLの5％重炭酸ナトリウム溶液に注入した。この混合液を酢酸エチルで抽出し、その抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。その残渣を酢酸エチル中の５％メタノールで溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。純粋生成物フラクションをプールし、蒸発させて泡沫としての12を得た：二段階のプロセスで2.06g（62％）収量。
【０２９０】
3-{4-((1E)-1-アザ-2-メチルプロプ-1-エニル)-1-((2R, 5R)-5-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}-4-{[ビス(メチルエチル)アミノ](2-シアノエトキシ) ホスフィノオキシ}オキソラン-2-イル)ピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン-3-イル]プロプ-2-イニル 4-メトキシベンゾエート(13；R1=-OCOPhCH3)、又は、1-[2-デオキシ-5-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-β-D-エリスロ-ペントフラノシル]-4-[(ジメチルアミノ)プロプ-1-エニル]-3-(プロプ-2-イニル-4-メチルベンゾエート)  1H-ピラゾロ［3,4−ｄ]ピリミジン  3’-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (13)。
1.33mLのN,N-ジイソプロピルエチルアミンを含有する、60mLの無水塩化メチレン中の12 (2.03 g, 2.56mmol)の溶液に、クロロ(2-シアノエトキシ)(N,N-ジイソプロピルアミノ) ホスフィン(1.0mL)をアルゴン下で添加した。この溶液を、1.0時間室温で攪拌し、次に、2.0mLのメタノールで処理した。この溶液を250mLの酢酸エチルで希釈し、200mLの5%重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を、酢酸エチル中の2%のトリエチリアミンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。この純粋生成物フラクションを、プールし、蒸発させた。ホスホルアミダイト(13)を、エーテル-ヘキサンから沈殿させた:1.82 g (71%)収量; TLC (酢酸エチル中5%のメタノール)、Rf=0.32; 31P NMR (DMSO-d6)δ147.90及び147.22。
【０２９１】
例３
この例は、N-{3-(1-((2R,5R)-5{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}-4-{[ビス(メチルエチル)アミノ](2-シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン-2-イル)-6-アミノ-4-オキソ(5-ヒドロピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-3-イル)プロピル}-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(22)の作成を例示する。
3-ヨード-4-メトキシピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-6-イルアミン(14)。
4-メトキシ-ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-6-イルアミン(6.75g、40.87mmol)を、酢酸ナトリウム(6.0g、44.09mmol)と一塩化ヨウ素(9.12g、56.17mmol)とを含有する水溶液中に懸濁させ、密封反応容器中で100℃で24時間攪拌した。得られた混合物を、室温まで冷却し、24mLの水中のメタ重亜硫酸ナトリウム(3.6 g、18.94mmol)で処理した。形成された固体を濾過し、水で濯ぎ、乾燥させた: 6.93 g (58%)収量。TLC (酢酸エチル中10%のメタノール)、Rf=0.57; 1H NMR (DMSO-d6)δ13.08(1h、br s、N-1プロトン)、10.58 (1H、 s、 N-5プロトン)、6.60(2H、br s、6-アミノ)。
【０２９２】
[(2R, 5R)-5-(6-アミノ-3-ヨード-4-メトキシピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-3-(4-メチルフェニルカルボニルオキシ)オキソラン-2-イル]メチル  4-メチルベンゾエート(15) 。
150mLのメタノール中の(14)(6.68g、22. 95mmol)の懸濁液に、8.05mLの2.85Mメタノリック水酸化カリウムを添加した。この混合物を、1分間攪拌し、次に、100mLのトルエンで希釈し、蒸発させた。1の固体カリウム塩を真空下で乾燥させた。カリウム塩を、75mLの無水DMF中で懸濁させ、次に、420mLの無水アセトニトリルで希釈した。1-クロロ-1,2-ジデオキシ-3,5-ジ-O-トルオイルリボフラノース(8.95g、22.95mmol)を即座に添加し、その反応混合物を、室温で、アルゴン下で1時間攪拌し、次に、濾過した。その濾過液を、蒸発させ、残りの泡沫を、メタノールから2回再結晶化した: 6.59 g(45%)収量; TLC (1:1, 酢酸エチル/ヘキサン)、Rf=0.52; 1H NMR (DMSO-d6)δ7.93及び7.37(8H、m 及びd、dについてJ=7.9H、芳香)、7.10 (2H、br s. 6-アミノ)、6.51 (1H、t、J=6.6Hz、1’-H) 、5.69 (1H、m、3’-H)、4.44 (3H、m、4’-及び5’-Hs)、3.99 (3H、s、4-メトキシ)、3.19及び2.63 (2H、2xm、2’-Hs)、2.40及び2.38 (6H、2 xs、トルオイルメチルプロトン)。
【０２９３】
[(2R, 5R)-5-(6-アミノ-3-ヨード-4-メトキシピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(16)。
600mLのメタノール中の15(32.4g, 50.40mmol)の懸濁液に、12.5mLのメタノール中の1Mナトリウムメトキシドを添加した。この反応混合物を、還流で18時間攪拌し、次に、フリーザ(-10℃)中で冷却した。形成された3の結晶を、濾過し、氷冷メタノールで濯いだ:10.95g収量。酢酸(12.5mL)を濾過液に添加し、その体積を約300mLまで減少させた。この溶液を、一晩フリーザ中で放置し、もう1つの収穫（crop）の結晶(3.95 g)を収集した。濾過液を蒸発乾燥させ、残渣のオイルをエーテル中で粉砕した。形成された固体を、濾過、乾燥し、沸騰水から再結晶化させた:2.03g  総収量=16.93g (83%); TLC (酢酸エチル中10%のメタノール)、Rf=0.23; 1H NMR (DMSO-d6)δ7.02 (2H、br s、6-アミノ)、6.33 (1H、t、J=6.1Hz)、5.24 (1H、d、J=4.4 Hz, 3’-OH)、4.73 (1H、t、J=5.6Hz、 5’-OH)、4.36 (1H、m、3’-H)、3.99 (3H、s、4-メトキシ)、3.75 (1H、m、4’-H)、3.51〜3.32 (2H、m、5’-Hs)、2.79及び2.17 (2H、2 x m、2’-Hs)。分析。計算。C11H14IN5O4・0.3H2Oについて; C、32.02; H、3.57; N、16.98. 結果 C、32.13; H、3.35; N、16.77。
【０２９４】
1-[(2R, 5R)-(5-ヒドロキシメチル)オキソラン-2-イル]-6-アミノ-3-ヨード-5-ヒドロピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-4-オン(17)。
1.5 Lの1N水酸化ナトリウム溶液中の(16) (16.48g, 41.36mmol)の懸濁液を、加熱還流させた。混合物は、均質な溶液に変化し、これを、氷冷水浴を使用して25℃にまで冷却させた。酢酸(90mL)を添加し、その溶液を5℃で一晩保存した。形成した結晶を濾過し、氷冷水で濯ぎ、乾燥させた: 4の収量  7.47g。濾水を約500mLの体積にまで蒸発させ、5℃で一晩保存した。第2の収穫分の結晶を収集した(3.75g)。濾過液を約200mLにまで蒸発させた。形成された酢酸ナトリウムを濾過除去し、濾液を5℃で一晩保存した。更に別の収穫分の結晶を収集した(2.25g)。総収量: 13.45g (83%); TLC (5:3:2、 n-ブタノール/水/酢酸)、Rf=0.74; 1H NMR (DMSO-d6)δ6.22 (1H、t、J=6.3Hz, 1’-H)、4.33 (1H、m、3’-H)、3.73 (1H、m、4’-H)、3.47及び3.36 (2H、2 x m、5’-Hs)、2.63及び2.12 (2H、2 x m、2’-Hs)。分析。計算。C10H12IN5O4・0.7H2Oについて; C、29.60; H、3.33; N、17.26。結果 C、29.81; H、3.02; N、17.00。
【０２９５】
N-(3-{1-[(2R, 5R)-4-(ヒドロキシメチル)オキソラン-2-イル]-6-アミノ-4-オキソ(5-ヒドロピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-3-イル)}プロプ-2-イニル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(18)。
30mLの無水DMF中の、17 (6.00g, 15.26mmol)とCuI（297mg,1.56mmol）とテトラキス[トリフェニルホスフィン]パラジウム[0]との混合物に、無水トリエチルアミン(3.14mL)、更にその後、プロパギルトリフルオロアセトイミド(4.29g, 28.41mmol)を添加した。この反応溶液を、アルゴン下で40時間攪拌した。DMFを蒸発除去し、残渣のオイルをクロロフォルム中で粉砕した。形成された粗精製固体5を、濾過し、クロロフォルムで濯ぎ、乾燥させた。固体を、最小体積のDMF中に溶解させ、シリカゲル上に吸着させ、蒸発させた。その乾燥混合物を、シリカゲルカラム上に装填し、酢酸エチル中の10%のメタノールで溶出させた。生成物フラクションを、プールし、蒸発させた。残渣を、酢酸エチル/エーテルから沈殿させた: 4.0g (63%)収量; TLC (酢酸エチル中20%のメタノール)、Rf=0.59; 1H NMR (DMSO-d6)δ10.79 (1H、s. N5-H)、10.16(1H、t、J=5.2Hz, トリフルオロアセトイミド  N-H)、6.77 (2H、br s、6-アミノ)、6.28 (1H、t、J=6.3 Hz、1’-H)、5.23 (1H、d、J=4.1 Hz、3’-OH)、4.72 (1H、t、J=5.1 Hz、5’-OH)、4.32 (3H、m、-CONH-CH2-及び3’-H)、3.75 (1H、m、4’-H)、3.50-3.29 (2H、2 x m、5’-Hs)、2.65及び2.15 (2H、2xm、2’-Hs)。分析。計算。C15H15F3N6O5・0.74H2Oについて; C、41.93; H、3.87; N、19.56。結果 C、42.33; H、3.64; N、19.13。
【０２９６】
N-(3-{1-[(2R, 5R)-4-(ヒドロキシメチル)オキソラン-2-イル]-6-アミノ-4-オキソ(5-ヒドロピラゾロ［5,4−d]ピリミジン-3-イル)}プロピル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(19)。
0.12gの20%水酸化パラジウム(予めギ酸で活性化)を含有する、100mLのメタノール中の(18) (1.0g, 2.40mmol)の溶液に、2.0mLの4Mトリエチルアンモニウムホルメート(pH6.5)を添加した。この混合物を、35 psiの水素ガス下で18時間振とうした(いくつかのラン中において、完全な還元のために、触媒を追加することが必要であった)。その混合物を、セライト（Celite）を通して濾過し、濾過水を蒸発させた。残渣オイルを、水から結晶化した: 0.79g (78%)収量; TLC (酢酸エチル中20%のメタノール)、Rf=0.52; 1H NMR (DMSO-d6)δ10.59 (1H、s、N5-H)、9.47 (1H、br t、トリフルオロアセトイミド N-H)、6.64 (2H、brs、 6-アミノ)、 6.27 (1H、t、J=6.3Hz、1’-H)、5.18 (1H、d、J=4.4 Hz、3’-OH)、4.75 (1H、t、J=5.9 Hz、5’-OH)、4.36 (1H、m、3’-H)、3.75 (1H、m、4’-H)、3.48及び3.61 (2H、2 x m、5’-Hs)、3.22、2.68及び1.87 (6H、3 x m、プロピル  メチレン  プロトン)、2.68及び2.21 (2H、2 x m、2’-Hs)。分析。計算。C15H19F3N6O5・0.90H2Oについて; C、41.27; H、4.80; N、19.25。結果 C, 41.57; H、4.50; N、19.11。
【０２９７】
N-(3-[(1E)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)プロプ-1-エニル]-[(2R, 5R)-4-(ヒドロキシメチル)オキソラン-2-イル]-6-アミノ-4-オキソ(5-ヒドロピラゾロ［5,4−d]ピリミジン-3-イル)}プロピル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(20) 。
5.0mLの無水DMF中の(19) (0.80g, 1.98mmol)の溶液に、N, N-ジメチルホルムアミド  ジメチルアセタール(3.1mL)を添加した。この溶液を、2.0時間、アルゴン下で攪拌し、蒸発させた。残渣を、キシレンから2回蒸発させ、次に、真空下に置いた。形成したアモルファス状固体(20)を、エーテルで粉砕し収集した:773 mg (82%)収量; TLC (酢酸エチル中20%のメタノール)、Rf=0.47; 1H NMR (DMSO-d6  δ 11.22  (1H、br s、N5-H)、9.47 (1H、t、J=5.5Hz、トリフルオロアセトイミド  N-H)、8.67 (1H、s、N=CH-N)、6.42 (1H、t、J=6.5 Hz、 1’-H)、5.22 (1H、d、J=4.3 Hz、3’-OH)、 4.75 (1H、t、J=6.1 Hz、5’-OH)、4.40 (1H、m、3’-H)、3.77 (1H、m、4’-H)、3.50及び3.38 (2H、2 x s、5’-Hs)、3.18及び3.05 (6H、2 x s、N,N-ジメチル Hs)、3.22、2.72及び1.89 (6H、3 x m、プロピル  メチレン Hs)、2.72及び2.15 (2H、2 x m、2’-Hs)。分析。計算。C18H24F3N7O5・0.4 0H2Oについて; C、44.80; H、5.18; N、20.32。結果 C、45.02; H、4.96; N、19.94。  
【０２９８】
N-{3-[1-((2R, 5R)-5-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}-4-ヒドロキシオ-イル]プロピル}-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(21)。
9.0mLの無水ピリジン中の(20) (723-mg, 1.52mmol)の溶液に、4, 4’-ジメトキシトリチル  クロライド (0.61g, 1.80mmol)を添加した。この反応溶液を、3.0時間、アルゴン下で攪拌し、100mLの5%重炭酸ナトリウム溶液に注入した。この水溶液を、酢酸エチル(2×200mL)で抽出し、その乾燥抽出物(硫酸ナトリウム)を蒸発させた。その粗生成物を、酢酸エチル(2%トリエチルアミン)中の０〜５%メタノールの溶媒勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。その生成物を蒸発させて、アモルファス状固体として21を得た。724 mg (61%)収量; TLC (酢酸エチル中5%のメタノール)、Rf=0.39; 1H NMR (DMSO-d6)δ11.27 (1H、s、N5-H)、9.43 (1H、t、J=5.3Hz、トリフルオロアセトイミドN-H)、8.71 (1H、s、N=CH-N)、7.32、7.17及び6.76(13H、3 x m、芳香)、6.45 (1H、t、J=6.3Hz、1’-H)、5.26 (1H、d、J=5.3Hz、3’-OH)、4.45 (1H、m、3’-H)、3.90 (1H、m、4’-H)、3.70 (6H、s、OMe Hs)、3.18及び3.05 (10H、2 x s、N,N-ジメチル、5’-Hs及びCONH-CH2)、2.62及び1.65 (4H、2 x m、メチレンHs)、2.62及び2.20 (2H、2 x m、 2’-Hs)。分析。計算。C39H42F3N7O7・0.30H2Oについて; C、59.81; H、5.48; N、12.52. 結果 C、59.80; H、5.39; N、12.63。  
【０２９９】           
N-{3-[1-((2R,5R)-5{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}- 4-{[ビス(メチルエチル)アミノ](2-シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン-2-イル)-6-アミノ-4-オキソ(5-ヒドロピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-3-イル)プロピル}-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(22)。
0.47mLのジイソプロピルエチルアミンを含有する22mLの無水塩化メチレン中の(21) (700-mg、0.900mmol)の溶液に、2-シアノエチル  N, N-ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト(0.34mL、1.52 mmmol)を添加した。25℃、アルゴン下で30分間の攪拌後、溶液を、3.0mLのメタノールで処理し、200mLの酢酸エチルで希釈した。その溶液を、100mLの5%重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。その粗生成物を、酢酸エチル中の2%トリエチルアミンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。その生成物フラクションを蒸発させ、残渣をエーテル-ヘキサンから沈殿させた: 583-mg (66%); TLC (酢酸エチル)、Rf=0.38; 31P NMR (DMSO-d6, 85%リン酸に対して)δ145. 50及び144.72。
【０３００】
例４
この例は、3-{[5-(4,6-ビス{(1E)-1-アザ-2-[ビス(2-メチルプロピル)アミノ]ビニル}-3-プロプ-1-イニルピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-2-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]-メチル}オキソラン-3-イルオキシ][エチル(メチルエチル)アミノ}-ホスフィノ}プロパンニトリル(26)の作成を例示する。
5-(4,6-ビス{(1E)-1-アザ-2-[ビス(2-メチルプロピル)アミノ]ビニル}-3-プロプ-1-イニルピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-2 (ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(24)
化合物(23)(1mmol)は、(ジメトキシメチル)ビス(2-メチルプロピル)アミン(0.5mL, 3.37mmol)と室温で5時間攪拌することができる。この反応混合物は、真空で還元し、保護された化合物を、シリカゲル上で精製して(24)を得ることができる(ビンセント（Vincent）他)。
【０３０１】
5-(4,6-ビス{(1E)-1-アザ-2-[ビス(2-メチルプロピル)アミノ]ビニル}-3-プロプ-1-イニルピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-2-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]-メチル}オキソラン-3-オール(25)
9.0mLの無水ピリミジン中の(24) (1.50mmol)の溶液に、4,4’-ジメトキシトリチル  クロライド(0.61 g、1.80mmol)を添加することができる。この反応溶液を、アルゴン下で3.0時間攪拌し、100mLの５％重炭酸ナトリウム溶液に注入することができる。この水溶液を、酢酸エチル(2×200mL)で抽出し、その抽出物を、乾燥し(硫酸ナトリウム)、蒸発することができる。この粗生成物を、適当な勾配でシリカゲルクロマトグラフィによって精製し、(25)を得ることができる。
【０３０２】
3-{[5-(4,6-ビス{(1E)-1-アザ-2-[ビス(2-メチルプロピル)アミノ]ビニル}-3-プロプ-1-イニルピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-2-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン-3-イルオキシ][エチル(メチルエチル)アミノ}ホスフィノ}プロパンニトリル(26)    
0.47mLのジイソプロピルエチルアミンを含有する2 2mLの無水塩化メチレン中の(25) (0.900mmol)の溶液に、2-シアノエチル N,N-ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト(0.34mL、1.52mmol)を添加することができる。この溶液を、30分間、アルゴン下で25℃で攪拌し、3.0mLのメタノールで処理し、200mLの酢酸エチルで希釈することができる。つぎに、この溶液を、100mLの5%重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させることができる。前記粗生成物を、適当な勾配でシリカゲルクロマトグラフィによって精製し、(26)を得ることができる。
【０３０３】
例５
この例は、5-[4,6-ジアミノ-3-(2-メトキシエチニル)ピラゾロ［3,4−d]ピリ
ミジニル]-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(27)の合成を例示する。
5-[4,6-ジアミノ-3-(2-メトキシエチニル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル]-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(27)
20mLの無水DMF中の、4,6-ジアミノ-1-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-3-ヨード-1H-ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン(4.2g, 10.71mmol)、CuI (211mg, 1.10mmol), Pd (PPh3)4(635mg, 0.553mmol)及びトリエチルアミン(2.2mL)の混合物に、メチルプロパルギルエーテル(1.82mL)を添加した。この混合物を、アルゴン下で16時間攪拌し、次に、蒸発乾燥させた。残渣を、エタノールから結晶化させた:3.20 g (89%)収量; TLC (酢酸エチル中30%のメタノール)、Rf=0.63; 1H NMR (DMSO-d6)δ7.44 (2H、br d、アミノ)、6.32 (1H、t、J=6.6Hz、1’-H)、6.33 (2H、br s、アミノ)、5.20 (1H、d、J=4.1 Hz, 3’-OH)、4.75 (1H、br t、5’-OH)、4.40 (2H、s、メチレン)、4.36 (1H、m、3’-H)、3.76 (1H、m、4’-H)、3.47&3.32 (2H、2 x m、5’-Hs)、3.32 (3H、s、メトキシ)、2.68&2.14  (2H、2 x m、2’-Hs)。
【０３０４】
5-{6-[(1E)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]-4-[(1Z)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル}-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール, 1-メトキシプロプ-1-イン(28)の合成
化合物27(3.1 g, 9.28mmol)を、30mLのN,N-ジメチルホルムアミドと15mLのN,N-ジメチルホルムアミド  ジメチル  アセタールとの溶液中で、14時間、45℃で攪拌した。これら溶媒を、蒸発させ、その残渣を、キシレンから2回蒸発させ、酢酸エチル-エーテルから沈殿した泡沫として28を得た：2.8g(68％）収量；TLC(酢酸エチル中50%のメタノール)、Rf=0.36。
【０３０５】
3-[(5-{6-[(1E)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]-4-[(1Z)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル}-2-{[ビス(4-メトキシフェニル-メトキシ]メチル}オキソラン-3-イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]ホスフィノオキシ]プロパンニトリル(29)の合成。
45mLの無水ピリジン中の28 (2.7 g, 6.08mmol)の溶液に、ジメチルトリチル  クロライド (2.4 g)を添加した。得られた溶液を、3時間、室温で攪拌し、次に、200mLの5%重炭酸ナトリウム溶液に注入した。この混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を、酢酸エチル中0〜40%メタノールの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。精製5’-O-DMT誘導体フラクションをプールし、蒸発させて、泡沫を得た:1.0 g (22%)収量。
【０３０６】
0.70mLのN,N-ジイソプロピルエチルアミンを含有する16mLの無水塩化メチレン中のDMT誘導体(0.98g, 1.31mmol)の溶液に、2-シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト(0.50mL)をアルゴン下で添加した。この溶液を、30分間室温で攪拌し、次に、1.0mLのメタノールで処理した。その溶液をシリカゲルカラム上に直接装填し、酢酸エチル(2%トリエチルアミン）中の0-20%メタノールの勾配で溶出した。純粋フラクションをプールし、蒸発させて、泡沫を得た: 0.25 g (20%)収量。
【０３０７】
例６
この例は、3-[(5-{4-[(1Z)-1-アザ-2-(メチルアミノ)ビニル]-3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル}-2-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン-3-イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]-ホスフィノオキシ]プロパンニトリル(35)の合成を例示する(反応スキーム８を参照)。
(2-フリルメトキシメチレン)メタン-1,1-ジカルボニトリル(30)
無水塩化メチレン(500mL)、トリエチルアミン(100mL)及びマロニトリル(30g, 454mmol)を含有する氷冷溶液に、2-塩化フラニル(50g, 383mmol)を、20分間に亘って、滴状添加した。次に、更に1時間大気温度で攪拌を続けた。反応溶液を、1.5Lの氷冷2N HCl溶液で洗浄し、次に、1.5Lの水で洗浄した。有機相を蒸発させてオイルを得た。
【０３０８】
前記生成物オイルの一部(4.6g, 28.75mmol)を、40mLのジオキサンと4.0mLの水とからなる溶液中に溶解させた。硫酸ジメチル(15mL)と重炭酸ナトリウム(15g)とを添加し、反応溶液を2.5時間、80℃で攪拌した。次に、この混合物を100mLの水に溶解させ、生成物を200mLの酢酸エチルで抽出した。有機溶液を、100mLの5%重炭酸ナトリウム溶液、次に、100mLの水、で洗浄した。この溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、真空で固化したオイルを得た: 2.72 g収量; TLC (1:1、酢酸エチル/ヘキサン)、Rf=0.42; 1H NMR (DMSO-d6)δ8.25 (1H、m、芳香)、7.63 (1H、m、芳香)、6.92 (1H、m、芳香)、4. 23 (3H、s、メトキシ)。
【０３０９】
2-アミノ-4-(2-フリル)フラン-3-カルボニトリル(31)。
一水化ヒドラジン(3.4mL, 80mmol)を、15分間に亘って、75mLのメタノール中の30 (2.72 g, 15. 63mmol)の氷冷溶液に滴状添加した。次に、その溶液を、蒸発乾燥させて、真空で固化するオイルを得た。次に、この固体を、エーテル中で粉砕し、濾過し、乾燥させた: 2.2 g (81%)収量; TLC (酢酸エチル), Rf=0.81; 1H NMR (DMSO-d6)δ7.77 (1H、s、フラニル)、6.80 (1H、m、フラニル)、6.61 (1H、m、フラニル)、6.41 (2H、br s、アミン)。
【０３１０】
3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-4-イルアミン(32)。
化合物31(25.7 g, 148mmol)を、250mLのホルムアミド中で、190℃で4時間攪拌した。次に、その溶液を室温まで冷却し、1.2 Lの水で希釈し、氷浴で冷蔵した。形成された固体を、濾過し、乾燥した: 22g (74%)収量; TLC (酢酸エチル中の5%メタノール), Rf=0.25。
【０３１１】
[5-(4-アミノ-3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-3-(4-メチルフェ
ニルカルボニルオキシ)-2-オキソエチル]オキソラン-2-イル]メチル  4-メチルベンゾエート(33) 。
化合物32(10g, 49.7mmol)を、200mLの0.29MメタノリックKOH溶液中で5分間攪拌した。その混合物を、蒸発乾燥し、次に、残渣を、40mLの高温無水DMF中に溶解させた。この溶液を室温まで冷却し、次に、230mLの無水アセトニトリルで希釈した。クロロ糖誘導体(23g、59.14mmol)をすぐに添加し、この混合物を45分間攪拌し、次に、蒸発乾燥させた。残渣を800mLの酢酸エチル中に溶解させ、水(2 x 800mL)で洗浄した。有機溶液を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。その粗生成物を、酢酸エチル中30〜0%ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。その精製生成物フラクションを、蒸発させ、残渣を高温メタノールから結晶化した: 3.4g(12%)収量; TLC (酢酸エチル)、Rf=0.47; 1H NMR (DMSO-d6)δ8.27 (1H、s、6-H)、7.96 (1H、m、フラニル)、7.95、7.84、7.36&7.23 (8H、4 x d、トルオイル芳香)、6.83 (1H、m、フラニル)、6.80 (1H、t、J=6.3Hz、1’-H)、6.70 (1H、m、フラニル)、5.86 (1H、m、3’-H)、4.64-4.42 (3H、m、4’-H及び5’-Hs)、3.28&2.76 (2H、2 x m、2’-Hs)、2.39&2.36 (6H、2 x s、トリオイルメチル)。
【０３１２】
5-{4-[(1Z)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]-3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル}-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(34)。
17mLの0.12Mメタノリック  ナトリウム  メトキシド溶液中の33(3.36g, 6.08mmol)の懸濁液を、30分間、還流させた。得られた溶液を、室温まで冷却し、0.12mLの酢酸の添加によって中和した。その溶液を蒸発乾燥させ、生成物を、メタノール-エーテルから沈殿させ、次に、沸騰水から再結晶化させた: 1.63 g (85%)収量の脱保護ヌクレオシド。
【０３１３】
上述したものからのヌクレオシド生成物のすべてを、30mLの無水DMFと15mLのN,N-ジメチルホルムアミド  ジメチルアセタールとからなる溶液中で5時間攪拌した。溶液を蒸発乾燥させ、次に、残渣をキシレンから2回蒸発させ、泡沫を得た:
1.89g (99%)収量; TLC (酢酸エチル中20%のメタノール), Rf=0.45; 1H NMR (DMSO-d6)δ8.98 & 8.46 (2H, 2 x s, ホルムアミジンC-H及び6-H)、7.97 (1H、m、フラニル), 7.81 (1H、m、フラニル), 6.65 (2H、m、 1’-H及びフラニル)、5.30 (1H、d、J=4.5Hz、3’-OH)、4.79 (1H、t、J=5.5Hz、5’-OH)、4.51 (1H、m、3’-H)、3.85 (1H、m、4’-H)、3.57&3.40 (2H、2 x m、5’-Hs)、3.26&3.21 (6H、2 x s、N-Meプロトン)、2.88&2.30 (2H、2 x m、2’-Hs)。
【０３１４】
3-[(5-(4-[(1Z)-1-アザ-2-(メチルアミノ)ビニル]-3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4
−d]ピリミジニル}-2-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン-3-イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]-ホスフィノオキシ]プロパンニトリル(35) 。
塩化ジメトキシトリチル (2.01g)を、30mLの乾燥ピリジンに溶解させた34 (1.84 g, 4.95mmol)の溶液に添加した。その反応溶液を、3時間、室温で攪拌し、次に、200mLの５％重炭酸ナトリウム溶液に注入した。その生成物を、300mLの酢酸エチルで抽出し、有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、酢酸エチル中0〜5%メタノールの勾配での溶出によってシリカゲルクロマトグラフィで精製した。その精製生成物フラクションを蒸発させて、泡沫を得た: 5’-O-DMT誘導体の2.26 g (68%)収量。
【０３１５】
1.75mLのN,N-ジイソプロピルエチルアミンを含有する40mLの乾燥塩化メチレン中に溶解したDMT誘導体(2.18g, 3.23mmol)の溶液に、1.25mLの2-シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトを添加した。この溶液を、アルゴン下で15分間室温で攪拌し、その後、5mLのメタノールで処理した。得られた溶液を、500mLの酢酸エチルによって希釈し、400mLの5%重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機溶液を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を、酢酸エチル(2%トリエチルアミン)中5〜10%のメタノールの勾配での溶出によってシリカゲルクロマトグラフィで精製した。その精製生成物フラクションを、蒸発させて、泡沫を得た: 1.62g (57%)収量; 31P NMR (DMSO-d6)δ147.81及び147.16。
【０３１６】
例７
この例は、3-[(5-{6-[(1E)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]-4-[(1Z)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]-3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル}-2-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン-3-イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]ホスフィノオキシ]プロパンニトリル(39, 反応スキーム9を参照)の作成を例示する。
3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン-4,6-ジアミン(36)
細かく粉砕された31(10.0g, 57.47mmol)と炭酸グアニジン(16.6g, 91.95mmol)との混合物を、230℃で45分間加熱した。混合物を室温まで冷却し、その固体を、100mLの沸騰水中で粉砕した。その固体(純粋な36)を、濾過し、水で濯ぎ、乾燥させた: 11.1ｇ(89%)収量; TLC (酢酸エチル中の40%メタノール)、Rf=0.66; 1H NMR ((DMSO-d6)δ12.68 (1H、br s、N-H)、7.86 (1H、m、フラニル)、6.93 (2H、br s、-NH2)、6.85 (1H、d、J=3.5Hz、フラニル)、6.65 (1H、m、フラニル)、6.10 (2H、br s、-NH2)。
【０３１７】
5-(4,6-ジアミノ-3-(2-フラニル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル)-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(37)  
化合物36 (10.5g, 48.61mmol)を、200mLの0.29MメタノリックKOH溶液中で5分間攪拌した。その混合物を蒸発乾燥し、次に、残渣を、105mLの高温無水DMF中に溶解させた。溶液を室温まで冷却し、次に、620mLの無水アセトニトリルで希釈した。すぐに、クロロ糖誘導体(23g, 59.14mmol)を添加し、その混合物を、40分間攪拌し、濾過した。濾液を蒸発乾燥させ、残渣を酢酸エチルでの溶出によってシリカゲルカラムクロマトグラフィで分析した。ヌクレオシドフラクションを蒸発させ、アルファとベータアノマーの混合物として2.8 g(10%収率)のトルオイル保護ヌクレオシドを得た。この混合物を、40mLの0.19Mメタノリック  ナトリウム  メトキシド中で45分間還流させた。その反応溶液を、一晩フリーザ中において、純粋ベータアノマー37に対応する結晶の収穫量を得た: 690 mg 収量; TLC (酢酸エチル中の20%メタノール)、Rf=0.32; 1H NMR ((DMSO-d6)δ7.90 (1H、m、フラニル)、6.99 (2H、br s、アミノ)、6.86 (1H、d、J=4.1Hz、フラニル)、6.68 (1H、m、フラニル)、6.41 (1H、t、J=6.6Hz、1’-H)、6.26 (2H、br s、アミノ)、5.21 (1H、d、J=4.4Hz、3’-OH)、4.82 (1H、t、J=5.8 Hz、5’-OH)、4.42 (1H、m、3’-H)、3.79 (1H、m、4’-H)、3.52&3.41 (2H、2 x m、5’-Hs)、2.75&2.18(2H、2 x m、2’-Hs)。
【０３１８】
5-{6-[(1E)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]-4-[(1Z)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]-3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル}-2-(ヒドロキシメチル)オキソラン-3-オール(38) 。
30mLの無水DMF中の37 (0.68g, 2.05mmol)の溶液と15mLのN,N-ジメチルホルムアミド  ジメチルアセタールとを、室温で24時間攪拌した。この溶液を蒸発乾燥させ、残渣を、キシレンから2回蒸発させて泡沫を得た: 0.90 g (99%)収量; TLC (酢酸エチル中の50%メタノール)、Rf=0.38; 1H NMR ((DMSO-d6)δ8.93&8.77 (2H、2 x s、ホルムアミドC-Hs)、7.94 (1H、m、フラニル)、7.76 (1H、m、フラニル)、6.62 (1H、m、フラニル)、6.60 (1H、t、J=6.6Hz, 1’-H)、5.25 (1H、d、J=4.4Hz、3’-OH)、4.84 (1H、t、J=5.9Hz、5’-OH)、4.47(1H、m、3’-H)、3.83 (1H、m、4’-H)、3.56&3.41 (2H、2 x m、5’-Hs)、3.25、3.18、3.16&3.03 (12H、4 x s、N-メチル)、2.82&2.22 (2H、2 x m、2’-Hs)]
【０３１９】
3-[(5-{6-[(1E)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]-4-[(1Z)-1-アザ-2-(ジメチルアミノ)ビニル]-3-(2-フリル)ピラゾロ［3,4−d]ピリミジニル}-2-{[ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン-3-イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]ホスフィノオキシ]プロパンニトリル(39) 。
塩化ジメトキシトリチル (0.85g)を、12mLの乾燥ピリジン中の38 (0.90g、2.04mmol)の溶液に、添加した。その反応溶液を2時間室温で攪拌し、次に、200mLの5%重炭酸ナトリウム溶液に注入した。生成物を、酢酸エチル(3 x 300mL)で抽出し、プールした有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、酢酸エチル中20〜30%メタノールの勾配でシリカゲルクロマトグラフィ溶出を使用して精製した。精製生成物フラクションを、蒸発させて泡沫を得た: 5’-O-DMT誘導体の286-mg収量。
【０３２０】
0.23mLのN,N-ジイソプロピルエチルアミンを含有する5mLの乾燥塩化メチレン中に溶解したDMT誘導体(286mg, 0.384mmol)の溶液に、0.17mLの2-シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトを添加した。この溶液をアルゴン下で15分間室温で攪拌し、次に、0.5mLのメタノールで処理した。得られた溶液を、100mLの酢酸エチルで希釈し、75mLの5%重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を、酢酸エチル(2%トリエチルアミン)中0〜30%のメタノールの勾配での溶出によってシリカゲルクロマトグラフィ精製した。その精製生成物フラクションを、蒸発させて、泡沫を得た: 230mg (12%)収量; 31P NMR (DMSO-d6)δ147.77及び147.08。
【０３２１】
例８
この例は、4-[1-(5-{(ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}-4-{[ビス(メチルエチル)アミノ](2-シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン-2-イル)-2,4-ジオキソ-1,3-ジヒドロピリミジン-5-イル]ブト-3-イニル  4-メチルベンゾエート(42、反応スキーム10を参照) の作成を例示する。
【０３２２】
3-ブチン-1-イル  p-トルエ−ト(40)の合成。
磁気攪拌棒を備える500mLの丸底フラスコ中で、不活性雰囲気下で、3-ブチン-1-オール(50.3g, 0.718 mol)を、無水ピリジン(200mL)と溶解させ、その溶液を氷水浴中で冷却した。この冷溶液に対して、追加の漏斗を使用して、p-トルイル  クロライド(136.6 g, 0.86mmol, 1.2eq)を滴状添加し、その反応混合物を一晩室温で攪拌した。
【０３２３】
この混合物に、ジエチルエーテル(350mL)と水(100mL)とを添加した。有機層を分離し、水溶液をジエチルエーテル(150mL)で洗浄した。有機フラクションをあわせて、10% HCl(3 x 100mL)、飽和NaHCO3溶液(2 x 100mL)及び水(1 x 50mL)で洗浄した。得られた溶液を、無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、溶媒を除去した、オフホワイト色の固体として142 g(量的収量)の(40)を得た。その生成物を、ヘキサン又はメタノールから再結晶化したが、次の工程に進むために十分な純度であった。
【０３２４】
1H NMR (CDCl3、 300MHz)δ(ppm) 7.95 (d、2H、J=8.1Hz)、7.24 (d、2H、J=8.1Hz)、4.41 (t、2H、J=6.8Hz)、2.67 (dd、2H、J1=2.6 J2=6.8Hz)、2.40 (s、3H)、2.03 (t、1H、J=2.4Hz)。
【０３２５】
5’-DMT-5-[4-(p-トルイルオキシ)ブチニル]-2’-デオキシウリジン(41)。
5-ヨード-2’-デオキシウリジン(4.0g, 11.30mmol), 4-(p-トルイルオキシ)ブチン(40)(5.7g, 30.3mmol), CuI (222mg, 1.16mmol), テトラキス[トリフェニルホスフィン]パラジウム[0] (0.67g, 0.583mmol)及びトリエチルアミン(2.0mL)の混合物を30mLの無水DMF中でアルゴン下で16時間攪拌した。この混合物を蒸発乾燥させ、残渣オイルが100mLのエーテル中での攪拌後に固化した。この固体を濾過し、真空乾燥させた。
【０３２６】
前記粗生成物の一部(1.5g)を、20mLの無水ピリジン中に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル (1.3g)で処理した。その溶液を、2.0時間アルゴン下で攪拌し、次に、150mLの5%重炭酸ナトリウム中に注入した。生成物を200mLの酢酸エチルによって抽出した。その抽出物を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣を、酢酸エチル中30〜0%ヘキサンの勾配での溶出によってシリカゲルクロマトグラフィで精製した。その生成物フラクションを蒸発させて、泡沫を得た: 957mg収量; TLC (酢酸エチル中の30%ヘキサン), Rf=0.37; 1H NMR ((DMSO-d6)δ11.66 (1H、s、N-H)、7.9-6.8 (18H、芳香プロトン)、6.11 (1H、t、J=6.6Hz、1’-H), 5.35 (1H、br s、3’-OH), 4.29 (1H、m、3’-H)、4.15 (2H、t、J=6.8Hz、ブチン  メチレン)、3.92 (1H、m、4’-H), 3.71(6H、s、メトキシ基)、3.24&3.07 (2H、2 x m、5’-Hs)、2.64 (2H、t、J=6.8Hz、ブチン  メチレン)、2.37 (3H、s、トルイル  メチル)、2.23 (2H、m、2’-Hs)。
【０３２７】
4-[1-(5-{(ビス(4-メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}-4-{[ビス(メチルエチル)アミノ](2-シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン-2-イル)-2,4-ジオキソ-1,3-ジヒドロピリミジン-5-イル]ブト-3-イニル  4-メチルベンゾエート(42)
0 .75mLのN,N-ジイソプロピルエチルアミンを含有する、15mLの無水塩化メチレン中の上記からのDMT誘導体(0.92g, 1.28mmol)の溶液に、2-シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト(0.56mL)を添加した。その溶液を、30分間室温でアルゴン下で攪拌し、次に、1.0mLのメタノールで処理した。その溶液を、約5mLの体積まで蒸発させ、シリカゲルカラムに直接ロードし、酢酸エチル(2%トリエチルアミン)中の40%ヘキサンで溶出した。精製フラクションをプールし、蒸発させた泡沫を得た; 0.91gの(42) (78%)収量; 31P NMR (DMSO-d6)δ147.72及び147.39。
【０３２８】
例９
この例は、関連する標的配列間を識別する修飾オリゴヌクレオチドの高い能力を例示する。
【０３２９】
この例において、PPPA, PPG及び小溝バインダを含有する修飾オリゴヌクレオ
チドを作成した。図３に示されているように、PPPAとPPGとの組み合わせでMGBを使用することによってTmが上昇し、PCR伸長温度に適合可能な短いプローブを構成することが可能となる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは、又、より高いミスマッチ識別性も提供する。18-量体フルオレセイン-ODN-Red 13-クエンチャ-MGBリアルタイムPCRプローブの第1構成では、図3Aに図示されているように不良なA/Tミスマッチ識別が観察された。ミスマッチをMGBの下に置き、AをPPPAに置換し、GをPPGに置換する、反対側の鎖に対する前記プローブの再構成によって、前記プローブを15量体にまで短縮することが可能になる。このプローブは、図３Ｂに示されているように良好なミスマッチ識別性を提供する。
【０３３０】
完全マッチ又は1つのミスマッチを含む標的のセットに対してハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのセットについて、ミスマッチ識別性の熱力学的調査を行った。標的配列は、夫々、a)正常A, b) PPPA, c)正常A及び3’-MGB及びd)PPPA及び3’-MGBを含む。前記プローブ及び標的の配列を以下表3a及び3bに示す。Tmの測定と、ΔΔＧ０５０の算定を例９に示す。
【０３３１】
【表３】
2003525292.tif 000118
【０３３２】
表3cは、AがPPPAによって置換されたときの増大したミスマッチ識別性と、PPPAがMGBと組み合わされたときの更に大きな識別性をはっきりと示している。
【０３３３】
HO-PPPA/HO-PUをPPPA/PUと共に含むMGB-ODNに形成されたミスマッチ塩基対の熱力学的識別性の37℃における比較を表４に示す。MGBと組み合わせて修飾塩基を含むODNは、それらの相補体にハイブリダイズした。表４に示される配列においてミスマッチは下線引きされている。この表に示すように、大半の部分が図示されたPPPAとPUと比較したHO-PPPA及びHO-PU置換は、ミスマッチ識別性を増大させた。
【０３３４】
【表４】
2003525292.tif 000119
【０３３５】
例１０
この例は、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して行われたUV融解研究を例示する。
【０３３６】
修飾ODN又はMGB-プローブと、それらの相補物との間に形成されたハイブリッドを、PTP-6自動マルチセル温度プログラマーを備えるラムダ2S(Perkin-Elmer)分光計で、0.5℃/分の速度で融解させた。Tmデータは、0.5xSSPEバッファ(Sigma, pH7.4)を使用して作成した。各ODN(各鎖１ｕＭ）を、その相補物と混合して1:1の比率を得た。融解の前に、サンプルを100℃で変性し、次に、10分間の時間をかけて10℃にまで冷却した。各タイプの二本鎖のミスマッチ識別性を、下記の等式を使用して50℃でΔΔGとして計算した。
【０３３７】
ΔΔG050=R0In(Kmatch/Kmismatch)
【０３３８】
項Kmatch/Kmismatchは、50℃での融解曲線から計算され二本鎖及び一本鎖の相対フラクションを使用して計算することができる(ローコブ（Lohkov）, S.G.及びサイシェニイ（Pyshnyi）, FEBS Letters 420:134-138 (1997))。
【０３３９】
例１１
この例は、同時係属出願09/364,320に記載のように作成され、更に、8〜10量体MGBプローブ用に最適化されたオリゴヌクレオチドグラスマイクロアレイに対するDNAのハイブリダイゼーションを例示する。
【０３４０】
5XSSPE,0.1%Triton X-100, 10%ホルムアミド中、1〜5 x 10-7MのDNA(オリゴヌクレオチド又はPCRアンプリコン)を、下記の条件でFrame-Seal Chambers (MJ Research)の前記マイクロアレイにハイブリダイズした: 55℃で5分間、0.1℃/分で35℃まで徐冷、55℃で60分間。次に、スライドを、0.5XSSPE中で、5分間45℃で洗浄した。スライドを、空気流で乾燥させ、Array Works Fluorescentスキャナ(Applied Precision)を使用してスキャニングした。前記洗浄処理は、必要であれば、更にストリジェントな条件下で繰り返すことができる。
【０３４１】
例１２
この例は、単一塩基プライマ伸長アッセイを例示する。
【０３４２】
一本鎖テンプレートDNA及び6量体プライマ(各20μM)と,  1× サーモポール（Thermopol）緩衝液(New England Biolabs)と 10mM塩化マンガン(USB)とを組み合わせ、5分間50℃でインキュベートした。次に、5μCiα32P ddATPと8単位のBstボリメラーゼ(NEB)を添加し、全体積を10μlとし、15分間50℃でインキュベートした。インキュベーション後、6μlの停止溶液(95%ホルムアミド, 20mM EDTA)を添加し、反応物を室温まで冷却した。サンプルを、変性色素(35%ホルムアミド, 0.05%キシレンシアノール、0.0 5%ブロモフェノールブルー、1mM EDTA)中で1:10に希釈し、アリクオットを、変性10%ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分析した。
【０３４３】
SNPタイピング用のプライマ伸長アッセイにおける、修飾塩基の使用が表５に
示されている。Bstポリメラーゼ(NEB)でのプライマ伸長を、種々の修飾塩基で置換されたプライマで評価し、生成物の量を、ゲル電気泳動を使用して、取り込まれた放射能に基づいて測定した。
【０３４４】
【表５】
2003525292.tif 000120
【０３４５】
例１３
この例は、小溝バインダ(CDPI3)有りと無しとの両方のPPGを含有する修飾オリゴヌクレオチドのTmを予想するための、本明細書に記載の前記アルゴリズムの使用を例示する。
【０３４６】
表2a/2bの熱力学パラメータと、MGB寄与のための前記修正式とを使用して、MGB有り及び無しのPPGオリゴヌクレオチドのTmを、上述したアルゴリズム手法によって計算することができる。G-含有ではない最近接対の熱力学パラメータは、オリゴヌクレオチドがPPGによって置換されたときに変化しない。同様に、最近接対の熱力学パラメータは、MGB含有オリゴヌクレオチドがPPGによって置換された時、変化しない。表6は、PPG単体又は小溝バインダ(CDPI3)との組み合わせでPPGを含有するオリゴヌクレオチドのTmを予想するための、前記アルゴリズムの能力を示している。表６において、すべてのGは、PPGによって置換されている。
【０３４７】
【表６】
2003525292.tif 000121
【０３４８】
前記予想アルゴリズムの精度は、PPG含有オリゴヌクレオチドと、PPG含有MGB-オリゴヌクレオチドとにおいて、夫々、約+/-1及び+/-2℃である。従って、対象の配列を、Genbank等のソースから入手し、次に、Tmウインドウを、プローブ又はプライマ組に対する要件としてセットすることができる。上記アルゴリズムと、最近接パラメータからの情報を使用して、所望のTmでのプローブ又はプライマ集合を計算することができる。
【０３４９】
あるいは、前記アルゴリズムを、選択された修飾塩基から最近接パラメータを選択し、選択された修飾塩基で、同じ所定の熱力学的安定性を提供するための同じ長さの1つ以上の配列を安定性を計算するために使用することができる。
【０３５０】
更に、前記アルゴリズムは、同じ塩基長と実質的に同じ安定性(Tm)とを有するオリゴヌクレオチドを構成することを可能にする単数又は複数の修飾塩基を選択するために使用することができる。これらの修飾塩基は、修飾プリン及び／又は修飾ピリミジンのコレクション由来の所定の熱力学的最近接パラメータを含むデータベースから、選択することができる。好ましくは、前記データベースは、3-置換ピラゾロ［3,4−d]ピリミジン及び／又は5-置換ピリミジンの最近接パラメータを含む。
【０３５１】
例１４
この例は、Invader（登録商標）アッセイにおける修飾オリゴヌクレオチドの
使用を例示する。
【０３５２】
図４に示されている前記クレアベースに基づくアッセイは、2つの重複するオ
リゴヌクレオチドの標的に対するハイブリダイゼーションによって形成される複合体を劈開する特異的DNA及びRNA配列を検出するこの酵素は、検出カセットプローブにおいてインベーダプローブとして作用する、張り出した「フラップ」を劈開し、劈開によって蛍光シグナルが放出される。第１の劈開は、前記インベーダ中の単一塩基ミスマッチが完全マッチである場合にのみ起こる。ミスマッチ標的Bでは反応は起こらない。劈開された「フラップ」は、前記検出カセットにおいてインベーダとして作用し、第２の劈開工程における蛍光の放出をもたらす。
【０３５３】
【表７】
2003525292.tif 000122
【０３５４】
表7aは、前記インベーダとゲノミックプローブとにおいて置換された場合の、種々の修飾塩基の効果の比較を示す。従来型インベーダT(2)を、3-ヨードアミノPPPAと置換して、インベーダM1を得た。これは、59-量体(2)と類似のTmの32の長さを有する。同様に、従来型ゲノムプローブ(4)を、3-ヒドロキシプロピニルPPPAと3-ヨードジミノPPPAと置換して、夫々、(5)と(6)を得た。これらのプローブの両方は、従来型（４）よりも大幅に短い。インベーダM1(3)を、ゲノムプローブ4-6と個別に組み合わせて使用することによって、従来型ゲノミックプローブ(4)と比較して、修飾塩基(5と6)を含む両方のゲノミックプローブの性能が改善される(表7b)。エンドポイント  マッチ／ミスマッチ  シグナル比とエンドポイント蛍光との両方が、非修飾ゲノミックプローブと比較して増大することが示されている。
【０３５５】
本明細書に挙げた刊行物及び特許出願のすべてを、あたかも、これら各刊行物又は特許出願が、特定的かつ個々に参考文献として合体させるように示されているかのように、こ参考文献として合体する。以上の発明は、例示によって、又、理解の明瞭性のために、いくらか詳細に記載したが、本発明の教示内容に鑑みて、当業者においては、添付の請求項の意図又は範囲から逸脱することなく、いくつかの改変及び変更を行うことが可能であることを容易に理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ及び１Ｂは、いくつかの修飾塩基の構造とそれらの略語とを示している。波線は、付着した糖モアエティ（非保護、保護、活性化等）の位置を示すために使用されている。
【図２】
図２は、MBG, PPPA及びPUの組み合わせの異なる、8-量体GC-リッチ及びAT-リッチプローブのTmのバランスを示すグラフである。
【図３】
図３は、MGB-修飾オリゴヌクレオチドプローブにおいてPPPA及びPPGを使用することによって達成される1つの利点を図示するチャートである。この図に示されているように、修飾塩基によって、リアルタイムPCRにおいてミスマッチ識別の増加を示すプローブの短縮化が可能となる。PPAはAの文字の上に〜を付した記号で表されており、PPGはGの文字の上に円弧を付した記号で表されている。MGB修飾FAMプローブ＝配列識別番号1; MGB-修飾FAMプローブ相補体＝配列識別番号2; PPPA及びPPGを含有するMGB-修飾FAMプローブ相補体＝配列識別番号3; PPPA及びPPGを含有するMGB-修飾FAMプローブ＝配列識別番号4。
【図４】
図４は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを使用することが可能なInvader（登録商標）アッセイを示す。
【図５】
図５は、異なる数のPPGにおけるInvader（登録商標）プローブのパフォーマンスの比較を示している(配列識別番号5〜7)。
【配列表】
SEQUENCE LISTING                               
<110> Epoch Biosciences, Inc.
<120> Modified Oligonucleotides for Mismatch Discrimination
<130> 17682A-362PC
<140> PCT/US01/06900
<141> 2001-03-01
<150> US 60/186,046
<151> 2000-03-01
<150> US 09/724,959
<151> 2000-11-28
<160> 90                            
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:minor groove
binder (MGB)-modified FAM probe
<220> 
<221> modified_base
<222> (1)
<223> n = c modified by FAM
<220> 
<221> modified_base
<222> (18)
<223> n = t modified by a quencher (Q) and minor groove
binder (MGB)
<400> 1
nttttgacct aacaaatn                                               18    
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:minor groove
binder (MGB)-modified FAM probe complement
<400> 2
atgttaattt gttaggtcaa aagaaaaatc tttaga                           36    
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial
Sequence:4-amino-3-(prop-1-ynyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
(PPPA) analog of adenosine and pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
analog of guanosine (PPG) containing minor groove binder
(MGB)-modified FAM probe complement
<400> 3
tctaaagatt tttcttttga cctaacaaat taacat                           36    
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial
Sequence:4-amino-3-(prop-1-ynyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
(PPPA) analog of adenosine and pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
guanosine (PPG) containing minor groove binder
(MGB)-modified FAM probe
<220> 
<221> modified_base
<222> (1)
<223> n = pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analog of guanosine
modified by FAM
<220> 
<221> modified_base
<222> (5)..(6)
<223> n = pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analog of guanosine
<220> 
<221> modified_base
<222> (9)..(11)
<223> n =
4-amino-3-(prop-1-ynyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
analog of adenosine
<220> 
<221> modified_base
<222> (15)
<223> n = a modified by a quencher (Q) and minor groove
binder (MGB)
<400> 4
nttanntcnn nagan                                                  15    
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:TM-Invader
probe substituted with six
pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analogs of guanosine
<220> 
<221> modified_base
<222> (2)..(7)
<223> n = pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analog of guanosine
<400> 5
tnnnnnncct tggcggctac g                                           21    
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:TM-Invader
probe substituted with one
pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analog of guanosine
<220> 
<221> modified_base
<222> (5)
<223> n = pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analog of guanosine
<400> 6
tgggnggcct tggcggctac g                                           21    
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:TM-Invader
probe
<400> 7
tggggggcct tggcggctac g                                           21    
<210> 8
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:complementary
target 1
<400> 8
tcggcggcgt                                                        10    
<210> 9
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:complementary
target 2
<400> 9
acagcggcgt                                                        10    
<210> 10
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:complementary
target 3
<400> 10
acagcgacgt                                                        10    
<210> 11
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:complementary
target 4
<400> 11
tcagtgacga                                                        10    
<210> 12
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:complementary
target 5
<400> 12
tcagtgacaa                                                        10    
<210> 13
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:complementary
target 6
<400> 13
tcaatgacag                                                        10    
<210> 14
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:complementary
target 7
<400> 14
acaatgataa                                                        10    
<210> 15
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:complementary
target 8
<400> 15
ccaataataa                                                        10    
<210> 16
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:complementary
target 9
<400> 16
gtaataataa                                                        10    
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
1
<400> 17
aaagttatgt ctacttacag aaa                                         23    
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
2
<400> 18
aaagctatgt ctacttacag aaa                                         23    
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
3
<400> 19
aaagtcatgt ctacttacag aaa                                         23    
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
4
<400> 20
aaagttgtgt ctacttacag aaa                                         23    
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
5
<400> 21
aaagttacgt ctacttacag aaa                                         23    
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
6
<400> 22
aaagttatat ctacttacag aaa                                         23    
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
7
<400> 23
aaagttatgc ctacttacag aaa                                         23    
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
8
<400> 24
aaagttatgt ttacttacag aaa                                         23    
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
9
<400> 25
aaagttatgt ccacttacag aaa                                         23    
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
10
<400> 26
aaagttatgt ctgcttacag aaa                                         23    
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
11
<400> 27
aaagttatgt ctatttacag aaa                                         23    
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
12
<400> 28
aaagttatgt ctacctacag aaa                                         23    
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
13
<400> 29
aaagttatgt ctactcacag aaa                                         23    
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
14
<400> 30
aaagttatgt ctacttgcag aaa                                         23    
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:target sequence
1
<400> 31
gtaagtagac ataac                                                  15    
<210> 32
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:target sequence
2
<220> 
<221> modified_base
<222> (1)..(15)
<223> n = 4-amino-3-(prop-1-ynyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
analog of adenosine
<400> 32
gtnngtngnc ntnnc                                                  15    
<210> 33
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:target sequence
3
<220> 
<221> modified_base
<222> (15)
<223> n = c modified by minor groove binder (MGB)
<400> 33
gtaagtagac ataan                                                  15    
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:target sequence
4
<220> 
<221> modified_base
<222> (1)..(14)
<223> n = 4-amino-3-(prop-1-ynyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
analog of adenosine
<220> 
<221> modified_base
<222> (15)
<223> n = c modified by minor groove binder (MGB)
<400> 34
gtnngtngnc ntnnn                                                  15    
<210> 35
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement match
<400> 35
agctgtgact                                                        10    
<210> 36
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 1
<400> 36
agctgtgact                                                        10    
<210> 37
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 2
<400> 37
agcggtgact                                                        10    
<210> 38
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 3
<400> 38
agccgtgact                                                        10    
<210> 39
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 4
<400> 39
agcagagact                                                        10    
<210> 40
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 5
<400> 40
agcagggact                                                        10    
<210> 41
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 6
<400> 41
agcagcgact                                                        10    
<210> 42
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 7
<400> 42
agcaatgact                                                        10    
<210> 43
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 8
<400> 43
agcattgact                                                        10    
<210> 44
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 9
<400> 44
agcactgact                                                        10    
<210> 45
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement match
<400> 45
aataataacc                                                        10    
<210> 46
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 10
<400> 46
aattataacc                                                        10    
<210> 47
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 11
<400> 47
aatgataacc                                                        10    
<210> 48
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 12
<400> 48
aatcataacc                                                        10    
<210> 49
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 13
<400> 49
aataaaaacc                                                        10    
<210> 50
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 14
<400> 50
aataagaacc                                                        10    
<210> 51
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:duplex
complement 15
<400> 51
aataacaacc                                                        10    
<210> 52
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:primer
extension template
<400> 52
aaccactctg tccta                                                  15    
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 53
ctgtaagtag atataac                                                17    
<210> 54
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 54
ggcaagatat atag                                                   14    
<210> 55
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 55
gtgacgcaga ttcc                                                   14    
<210> 56
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 56
gtaagtagac ataac                                                  15    
<210> 57
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 57
cagggagctt tgga                                                   14    
<210> 58
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 58
cactcgtgaa gctg                                                   14    
<210> 59
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 59
gtaagtaggc ataac                                                  15    
<210> 60
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 60
ccggatgtag gatc                                                   14    
<210> 61
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 61
gattacctgg attt                                                   14    
<210> 62
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 62
ccgtcaatgg tcac                                                   14    
<210> 63
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 63
cagcacgtag cc                                                     12    
<210> 64
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 64
cggctacgtg ctgg                                                   14    
<210> 65
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 65
cggctacatg ctgg                                                   14    
<210> 66
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 66
ctaaatctgc cg                                                     12    
<210> 67
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 67
tctggatgat gggca                                                  15    
<210> 68
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 68
gttcatgggt gtaat                                                  15    
<210> 69
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 69
cggaggtagg atca                                                   14    
<210> 70
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 70
ccacccgcct cag                                                    13    
<210> 71
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 71
cacaggagtg gttgg                                                  15    
<210> 72
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 72
cggaccagtg cgtg                                                   14    
<210> 73
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 73
tcggaccagt gcgt                                                   14    
<210> 74
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 74
aacggggtac gata                                                   14    
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 75
cagttgagat tctaagac                                               18    
<210> 76
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 76
aggggcgtct tg                                                     12    
<210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 77
gtaagtaggc atagc                                                  15    
<210> 78
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 78
tgcccagccc cag                                                    13    
<210> 79
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 79
ccaacactcg tgaa                                                   14    
<210> 80
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 80
gtaagtagac acagc                                                  15    
<210> 81
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 81
tcggaccagt gc                                                     12    
<210> 82
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 82
cgatcacgct ggc                                                    13    
<210> 83
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 83
gtcctggggg tgg                                                    13    
<210> 84
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 84
gtaagtaggt gtgac                                                  15    
<210> 85
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 85
ggttgtacgg gttcacg                                                17    
<210> 86
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 86
ggaccagtgc gtga                                                   14    
<210> 87
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 87
gtaagtagac gcagc                                                  15    
<210> 88
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 88
gtaagtaggc gcagc                                                  15    
<210> 89
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 89
gtaagtaggc gcggc                                                  15    
<210> 90
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:probe sequence
<400> 90
ggttcccgag cg                                                     12