【手続補正書】
【提出日】平成20年8月25日(2008.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよびｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質と接触させるステップであって、該基質が核酸であり、該核酸がバルジ−ヘリックス−バルジ構造内のｔＲＮＡイントロンまたは前駆体ｔＲＮＡの成熟ドメインを含む、上記ステップ；
（ｂ）切断された基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における切断基質の量が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における切断基質の量と比較して変化する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
化合物の存在下における切断基質の量が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における切断基質の量と比較して低減する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減する化合物が同定される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物の存在下における切断基質の量が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における切断基質の量と比較して増大する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大する化合物が同定される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
核酸がレポーター遺伝子を含み、該レポーター遺伝子内にバルジ−ヘリックス−バルジ構造内のｔＲＮＡイントロンまたは前駆体ｔＲＮＡの成熟ドメインが含まれる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する動物界の細胞と接触させるステップ；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を検出することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する動物界の無細胞抽出物と接触させるステップ；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を検出することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
化合物の存在下におけるレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における該タンパク質の発現と比較して低減する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減する化合物が同定される、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
化合物の存在下におけるレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における該タンパク質の発現と比較して増大する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大する化合物が同定される、請求項５または６記載の方法。
【請求項９】
核酸の５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されている、または核酸の５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されている、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する動物界の無細胞抽出物と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する動物界の細胞と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
化合物の存在下における基質により生成される蛍光シグナルが、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下において生成される蛍光シグナルよりも低く検出される場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減する化合物が同定される、請求項１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
化合物の存在下における基質により生成される蛍光シグナルが、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下において生成される蛍光シグナルよりも高く検出される場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大する化合物が同定される、請求項１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１５】
核酸の５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されている、または核酸の５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されている、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する動物界の無細胞抽出物と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する動物界の細胞と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における蛍光発光と比較して増大する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減する化合物が同定される、請求項１６、１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における蛍光発光と比較して低減する場合に、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大する化合物が同定される、請求項１６、１７または１８記載の方法。
【請求項２１】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼからなる群の少なくとも１つをコードする、請求項４、５または６記載の方法。
【請求項２２】
動物界の細胞がヒト細胞である、請求項５、１２または１８記載の方法。
【請求項２３】
動物界の無細胞抽出物がヒト無細胞抽出物である、請求項６、１０または１６記載の方法。
【請求項２４】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼがヒトｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中に微量注入またはトランスフェクトするステップであって、前記基質が５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質が５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
一実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）動物界の無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質が５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して、その化合物の存在下でより低い蛍光シグナルが検出可能な場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）動物界の無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
ＦＲＥＴアッセイは、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物を同定するために使用することができる。本明細書に記載するＦＲＥＴ−細胞に基づいたアッセイは、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を細胞内に微量注入またはトランスフェクション（たとえばリポソームまたはエレクトロポレーションを用いる）して、その細胞を化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、または前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、たとえば蛍光顕微鏡またはＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップとによって実施し得る。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、その結果検出可能な蛍光シグナルが生成される。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する化合物は、検出可能な蛍光シグナルの生成を防止する。あるいは、ＦＲＥＴ−細胞系アッセイは、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を細胞内に微量注入またはトランスフェクトして、その細胞を化合物と接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、または前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、たとえば蛍光顕微鏡またはＶｉｅｗｌｕｘやＡｎａｌｙｓｔなどの蛍光発光検出器によって基質の蛍光を測定するステップによって実施し得る。内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼは基質を切断し、蛍光ドナー部分の波長における蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分とによる検出可能な蛍光シグナルが生成される。しかしながら、内在性ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害する化合物は、蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光を増大する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
別の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中に微量注入またはトランスフェクトするステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）その細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において検出される蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して変化している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下での蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
一実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）動物界の無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の非存在下もしくは対照の存在下と比較して化合物の存在下における蛍光シグナルが検出可能でない場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害する抗増殖性化合物の同定方法であって、（ａ）動物界の無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において、蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害する抗増殖性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。