【手続補正書】
【提出日】平成20年7月15日(2008.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を提供する遺伝的修飾を含む、メバロン酸経路を介してイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物を生産する、遺伝的に修飾された真核宿主細胞であって、遺伝的修飾が、遺伝的修飾を含まない対照細胞におけるイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物のレベルより少なくとも約50%高いレベルでイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物の生産を提供する、遺伝的に修飾された真核宿主細胞：
a)メバロン酸経路の1つもしくは複数の酵素の活性レベルの上昇、
b)プレニルトランスフェラーゼの活性レベルの上昇、および
c)スクアレンシンターゼの活性レベルの低下。
【請求項２】
プレニルトランスフェラーゼがファルネシルピロリン酸シンターゼである、請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞。
【請求項３】
プレニルトランスフェラーゼがゲラニルピロリン酸シンターゼである、請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞。
【請求項４】
プレニルトランスフェラーゼがゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼである、請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞。
【請求項５】
遺伝的に修飾された真核宿主細胞が酵母細胞である、請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞。
【請求項６】
遺伝的に修飾された真核宿主細胞がサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項5記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項７】
短縮型のヒドロキシメチルグルタリル補酵素A還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝的に修飾されている、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項８】
野生型Ecm22pと比較して上昇した転写活性化活性を有し、メバロン酸経路の1つもしくは複数の酵素の転写レベルが高められるバリアントEcm22p転写因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝的に修飾されている、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項９】
ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、およびホスホメバロン酸キナーゼの転写レベルが高められる、請求項8記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１０】
野生型Upc2pと比較して上昇した転写活性化活性を有し、メバロン酸経路の1つもしくは複数の酵素の転写レベルが高められるバリアントUpc2p転写因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝的に修飾されている、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１１】
ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Aシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、およびホスホメバロン酸キナーゼの転写レベルが高められる、請求項10記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１２】
異種プロモーターを含む核酸で遺伝的に修飾されており、プロモーターが、ファルネシルピロリン酸シンターゼをコードする内因性のヌクレオチド配列に操作可能に連結された内因性のプロモーターと置換されており、異種プロモーターが、対照宿主細胞と比較してファルネシルピロリン酸シンターゼのレベルの上昇を提供する、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１３】
異種プロモーターがGAL1プロモーターである、請求項12記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１４】
異種プロモーターを含む核酸で遺伝的に修飾されており、プロモーターが、ゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする内因性のヌクレオチド配列に操作可能に連結された内因性のプロモーターと置換されており、異種プロモーターが、対照宿主細胞と比較してゲラニルピロリン酸シンターゼのレベルの上昇を提供する、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１５】
異種プロモーターがGAL1プロモーターである、請求項14記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１６】
異種プロモーターを含む核酸で遺伝的に修飾されており、プロモーターが、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする内因性のヌクレオチド配列に操作可能に連結された内因性のプロモーターと置換されており、異種プロモーターが、対照宿主細胞と比較してゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼのレベルの上昇を提供する、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１７】
異種プロモーターがGAL1プロモーターである、請求項16記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１８】
異種プロモーターを含む核酸で遺伝的に修飾されており、異種プロモーターが、スクアレンシンターゼをコードする内因性のヌクレオチド配列に操作可能に連結された内因性のプロモーターと置換されており、異種プロモーターが、対照宿主細胞と比較してスクアレンシンターゼのレベルの低下を提供する、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１９】
テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸でさらに遺伝的に修飾されている、請求項1記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２０】
テルペンシンターゼが、アモルファ-4,11-ジエンシンターゼ(ADS)、ベータ-カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンAシンターゼ、8-エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、(+)-デルタ-カジネンシンターゼ、ゲルマクレンCシンターゼ、(E)-ベータ-ファルネセンシンターゼ、カスベン(Casbene)シンターゼ、ベティスピラジエン(vetispiradiene)シンターゼ、5-エピ-アリストロチェンシンターゼ、アリストロチェンシンターゼ、ベータ-カリオフィレン、アルファ-フムレン、(E,E)-アルファ-ファルネセンシンターゼ、(-)-ベータ-ピネンシンターゼ、ガンマ-テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、1,8-シネオールシンターゼ、(+)-サビネンシンターゼ、E-アルファ-ビサボレンシンターゼ、(+)-ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエン(levopimaradiene)シンターゼ、アビエタジエン(Abietadiene)シンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、(E)-ガンマ-ビサボレンシンターゼ、タクサジエン(taxadiene)シンターゼ、コパリル(copalyl)ピロリン酸シンターゼ、カウレン(kaurene)シンターゼ、ロンギフォレンシンターゼ、ガンマ-フムレンシンターゼ、デルタ-セリネンシンターゼ、ベータ-フェランドレンシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、(-)-カンフェンシンターゼ、(+)-3-カレンシンターゼ、syn-コパリル二リン酸シンターゼ、アルファ-テルピネオールシンターゼ、syn-ピマラ-7,15-ジエンシンターゼ、ent-サンダアラコピマラジエン(sandaaracopimaradiene)シンターゼ、ステマー(stemer)-13-エンシンターゼ、E-ベータ-オシメン、S-リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ-テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、E-ベータ-オシメンシンターゼ、エピ-セドロールシンターゼ、アルファ-ジンギベレンシンターゼ、ギアジエン(guaiadiene)シンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、シス-ムーロラジエン(muuroladiene)シンターゼ、アフィジコラン(aphidicolan)-16b-オールシンターゼ、エリザベスアトリエン(elizabethatriene)シンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ジンザノール(Zinzanol)シンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオール(scareol)シンターゼ、コパロール(copalol)シンターゼ、およびマノール(manool)シンターゼから選択される、請求項19記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２１】
テルペンシンターゼがアモルファ-4,11-ジエンシンターゼである、請求項19記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２２】
以下の段階を含む、宿主細胞のメバロン酸経路を介してイソプレノイド前駆体またはイソプレノイドの生産を増強する方法：
請求項1記載の遺伝的に修飾された真核宿主細胞を適切な培地で、およびイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物が、遺伝的修飾を含まない対照細胞におけるイソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物のレベルより少なくとも約50%高いレベルで生産される、イソプレノイド化合物またはイソプレノイド前駆体化合物の生産を増強する条件下で培養する段階。
【請求項２３】
条件が、誘導型プロモーターを活性化する誘導薬剤の培地への含有を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
イソプレノイド化合物がモノテルペンである、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
イソプレノイドがポリテルペンである、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
イソプレノイドがジテルペンである、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
イソプレノイドがトリテルペンである、請求項22記載の方法。
【請求項２８】
イソプレノイドがカロテノイドである、請求項22記載の方法。
【請求項２９】
イソプレノイドがセスキテルペンである、請求項22記載の方法。
【請求項３０】
セスキテルペンがアモルファジエンである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞の染色体に組み込まれた1つまたは複数の異種核酸を含む真核宿主細胞であって、染色体に組み込まれた異種核酸が宿主細胞において以下の活性のレベルを変化させ、かつ宿主細胞が異種テルペンシンターゼをさらに含み、テルペンシンターゼの作用によって生じるイソプレノイドを作成することができる、細胞：
a) 1つまたは複数のメバロン酸経路酵素、
b) プレニルトランスフェラーゼ、および
c) スクアレン・シンターゼ。
【請求項３２】
1つまたは複数のメバロン酸経路酵素が、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素(HMGR)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、およびホスホメバロン酸キナーゼからなる群より選択される、請求項31記載の宿主細胞。
【請求項３３】
HMGRが短縮型HMGRである、請求項32記載の宿主細胞。
【請求項３４】
プレニルトランスフェラーゼが、ゲラニル二リン酸シンターゼ、ファルネシル二リン酸シンターゼ、およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼからなる群より選択される、請求項31記載の宿主細胞。
【請求項３５】
染色体に組み込まれた異種核酸がプロモーター配列を含み、該プロモーターが、スクアレン・シンターゼをコードする内因性ヌクレオチド配列に操作可能に結合された内因性プロモーターと置換され、異種プロモーターが、スクアレン・シンターゼの転写のレベルを減少させる、請求項31記載の宿主細胞。
【請求項３６】
テルペンシンターゼが、アモルファ-4,11-ジエンシンターゼ(ADS)、ベータ-カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンAシンターゼ、8-エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、(+)-デルタ-カジネンシンターゼ、ゲルマクレンCシンターゼ、(E)-ベータ-ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベティスピラジエンシンターゼ、5-エピ-アリストロチェンシンターゼ、アリストロチェンシンターゼ、アルファ-フムレンシンターゼ、(E,E)-アルファ-ファルネセンシンターゼ、(-)-ベータ-ピネンシンターゼ、ガンマ-テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、1,8-シネオールシンターゼ、(+)-サビネンシンターゼ、E-アルファ-ビサボレンシンターゼ、(+)-ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、(E)-ガンマ-ビサボレンシンターゼ、タクサジエンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギフォレンシンターゼ、ガンマ-フムレンシンターゼ、デルタ-セリネンシンターゼ、ベータ-フェランドレンシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、(-)-カンフェンシンターゼ、(+)-3-カレンシンターゼ、syn-コパリル二リン酸シンターゼ、アルファ-テルピネオールシンターゼ、syn-ピマラ-7,15-ジエンシンターゼ、ent-サンダアラコピマラジエンシンターゼ、ステマー-13-エンシンターゼ、E-ベータ-オシメン、S-リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ-テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、E-ベータ-オシメンシンターゼ、エピ-セドロールシンターゼ、アルファ-ジンギベレンシンターゼ、ギアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、シス-ムーロラジエンシンターゼ、アフィジコラン-16b-オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼ、およびマノールシンターゼから選択される、請求項31記載の宿主細胞。
【請求項３７】
宿主細胞の染色体に組み込まれた1つまたは複数の異種核酸を含む真核宿主細胞であって、染色体に組み込まれた異種核酸が以下をコードし、かつ宿主細胞が異種テルペンシンターゼをさらに含み、テルペンシンターゼの作用によって生じるイソプレノイドを作成することができる、細胞：
a) 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)をメバロネートに変換する酵素、
b)プレニルトランスフェラーゼ、および
c)抑制可能なプロモーターの制御下にあるスクアレン・シンターゼ。
【請求項３８】
HMG-CoAをメバロネートに変換する酵素が3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素(HMGR)である、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項３９】
HMG-CoAをメバロネートに変換する酵素が短縮型HMGRである、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項４０】
HMGRの発現が、誘導可能な制御下にある、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項４１】
HMGRの発現がGAL1プロモーターの制御下にある、請求項40記載の宿主細胞。
【請求項４２】
HMGRが構成的な制御下にある、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項４３】
プレニルトランスフェラーゼが、ゲラニル二リン酸シンターゼ、ファルネシル二リン酸シンターゼ、およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼからなる群より選択される、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項４４】
プレニルトランスフェラーゼがERG20遺伝子によってコードされる、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項４５】
プレニルトランスフェラーゼの発現が、誘導可能な制御下にある、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項４６】
プレニルトランスフェラーゼの発現がGAL1プロモーターの制御下にある、請求項45記載の宿主細胞。
【請求項４７】
プレニルトランスフェラーゼが構成的な制御下にある、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項４８】
抑制可能なプロモーターがMET3プロモーターである、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項４９】
抑制可能なプロモーターが銅によって抑制される、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項５０】
テルペンシンターゼが、アモルファ-4,11-ジエンシンターゼ、ベータ-カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンAシンターゼ、8-エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、(+)-デルタ-カジネンシンターゼ、ゲルマクレンCシンターゼ、(E)-ベータ-ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベティスピラジエンシンターゼ、5-エピ-アリストロチェンシンターゼ、アリストロチェンシンターゼ、アルファ-フムレンシンターゼ、(E,E)-アルファ-ファルネセンシンターゼ、(-)-ベータ-ピネンシンターゼ、ガンマ-テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、1,8-シネオールシンターゼ、(+)-サビネンシンターゼ、E-アルファ-ビサボレンシンターゼ、(+)-ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、(E)-ガンマ-ビサボレンシンターゼ、タクサジエンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギフォレンシンターゼ、ガンマ-フムレンシンターゼ、デルタ-セリネンシンターゼ、ベータ-フェランドレンシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、(-)-カンフェンシンターゼ、(+)-3-カレンシンターゼ、syn-コパリル二リン酸シンターゼ、アルファ-テルピネオールシンターゼ、syn-ピマラ-7,15-ジエンシンターゼ、ent-サンダアラコピマラジエンシンターゼ、ステマー-13-エンシンターゼ、E-ベータ-オシメン、S-リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ-テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、E-ベータ-オシメンシンターゼ、エピ-セドロールシンターゼ、アルファ-ジンギベレンシンターゼ、ギアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、シス-ムーロラジエンシンターゼ、アフィジコラン-16b-オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼ、およびマノールシンターゼから選択される、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項５１】
イソプレノイドがモノテルペン、セスキテルペン、またはジテルペンである、請求項37記載の細胞。
【請求項５２】
細胞の染色体に組み込まれた1つまたは複数の異種核酸を含むサッカロマイセス・セレビシエ細胞であって、染色体に組み込まれた異種核酸が以下をコードし、かつ宿主細胞が異種テルペンシンターゼをさらに含み、テルペンシンターゼの作用によって生じるイソプレノイドを作成することができる、細胞：
a) 短縮型3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素(HMGR)、
b)プレニルトランスフェラーゼ、および
c)抑制可能なプロモーターの制御下におけるスクアレン・シンターゼ。
【請求項５３】
イソプレノイドがモノテルペン、セスキテルペン、またはジテルペンである請求項52記載の細胞。