【手続補正書】
【提出日】平成20年6月19日(2008.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む目的RNAの検出方法:
a）該目的RNAを含むと疑われる核酸サンプルを提供する工程:
b）該目的RNAの少なくとも第一の部分にハイブリダイズする少なくとも第一の核酸プローブを提供する工程、ここで該少なくとも第一の核酸プローブは、蛍光体基および蛍光消光脱離基を含む;
c）該第一の部分に隣接する該目的RNAの少なくとも第二の部分にハイブリダイズする少なくとも第二の核酸プローブを提供する工程、ここで、該少なくとも第二の核酸プローブは求核基を含む;
d）該少なくとも第一および第二の核酸プローブと該核酸サンプルとのハイブリダイゼーションに好適な条件下で、該核酸サンプルと、該少なくとも第一および第二の核酸プローブとを一緒にして混合物を形成させる工程;および、
e）該混合物の蛍光を検出する工程、ここで蛍光の検出は、該核酸サンプルにおける該目的RNAの存在を示し、それによって該目的RNAが検出される。
【請求項２】
以下の工程を含む細胞における目的RNAを検出する方法:
a）該目的RNAを含むと疑われる細胞を提供する工程:
b）該目的RNAの少なくとも第一の部分にハイブリダイズする少なくとも第一の核酸プローブを提供する工程、ここで、該少なくとも第一の核酸プローブは、蛍光体基および蛍光消光脱離基を含む;
c）該少なくとも第一の部分に隣接する該目的RNAの少なくとも第二の部分にハイブリダイズする少なくとも第二の核酸プローブを提供する工程、ここで、該少なくとも第二の核酸プローブは求核基を含む;
d）該少なくとも第一および第二の核酸プローブの該細胞へのハイブリダイゼーションに好適な条件下で該少なくとも第一および第二の核酸プローブを該細胞に導入して混合物を形成させる工程; および
e）該混合物の蛍光を検出する工程、ここで蛍光の検出は該細胞における該目的RNAの存在を示し、それによって該細胞における該目的RNAが検出される。
【請求項３】
該細胞が固定されているか、または固定されていない、請求項 2の方法。
【請求項４】
該細胞が生細胞である請求項 3の方法。
【請求項５】
該細胞が細菌細胞またはヒト細胞である請求項2 〜4のいずれかの方法。
【請求項６】
該蛍光消光脱離基が該少なくとも第一の核酸プローブの5'末端に共有結合しており、該求核基が該少なくとも第二の核酸プローブの3' 末端に共有結合している請求項1〜5のいずれかの方法。
【請求項７】
該蛍光消光脱離基が該少なくとも第一の核酸プローブの3' 末端に共有結合しており、該求核基が該少なくとも第二の核酸プローブの5'末端に共有結合している請求項1〜5のいずれかの方法。
【請求項８】
該蛍光消光脱離基が該少なくとも第一の核酸プローブの5' 水酸基に結合している請求項1〜5のいずれかの方法。
【請求項９】
該蛍光消光脱離基が該少なくとも第一の核酸プローブの5' 水酸基以外の水酸基に結合している請求項1〜5のいずれかの方法。
【請求項１０】
該蛍光消光脱離基が該蛍光体基から１ヌクレオチド離れて該少なくとも第一の核酸プローブに共有結合している請求項1〜9のいずれかの方法。
【請求項１１】
該蛍光消光脱離基が該蛍光体基から２ヌクレオチド離れて該少なくとも第一の核酸プローブに共有結合している請求項1〜9のいずれかの方法。
【請求項１２】
該蛍光消光脱離基が該蛍光体基から３ヌクレオチド離れて該 少なくとも第一の核酸プローブに共有結合している請求項1〜9のいずれかの方法。
【請求項１３】
該少なくとも第一または第二の核酸プローブが、DNA、RNA、2'-0-メチル-RNA、ホスホロチオエートDNA、ロックされた核酸 (「LNA」)、またはPNAである請求項1-12のいずれかの方法。
【請求項１４】
該検出工程が、目視による検出、蛍光顕微鏡による検出、蛍光分光計による検出、フローサイトメーターによる検出または、蛍光マイクロプレートリーダーによる検出を含む、請求項1-13のいずれかの方法。
【請求項１５】
該少なくとも第一の核酸プローブが少なくとも 2倍の消光効率を有することを特徴とする請求項1-14のいずれかの方法。
【請求項１６】
該少なくとも第一の核酸プローブが少なくともl00倍の消光効率を有することを特徴とする請求項 15の方法。
【請求項１７】
該少なくとも第一の核酸プローブが少なくともl000倍の消光効率を有することを特徴とする請求項 16の方法。
【請求項１８】
該求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである請求項1-17のいずれかの方法。
【請求項１９】
該蛍光体基が、フルオレセイン、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、BODIPY 蛍光体、ROX、JOE、または オレゴングリーンである請求項1-18のいずれかの方法。
【請求項２０】
該蛍光消光脱離基が、ダブシル基、ジマプダブシル基、アゾベンゼン-スルホニル基、アミノベンゼンスルホニル基、ジアルキルアミノベンゼンスルホニル基、ニトロベンゼンスルホニル基、フルオロベンゼンスルホニル基、シアノベンゼンスルホニル基、アレーンスルホニル基、アリールアゾ-置換ダブシル基、または金粒子抱合スルホニル脱離基である、請求項1-19のいずれかの方法。
【請求項２１】
以下の工程を含む、１ヌクレオチドの特異性をもって細胞における目的RNAを検出する方法：
a）該細胞を含む第一のサンプルを提供する工程;
b）第一の求電子プローブおよび求核プローブを含む第一対のプローブを提供する工程、ここで、該第一の求電子プローブは蛍光体基および蛍光消光脱離基を含み、該目的RNAの第一の部分にハイブリダイズし、該求核プローブは求核基を含み、該第一の部分に隣接する該目的RNAの第二の部分にハイブリダイズする;
c）該第一対のプローブの該細胞へのハイブリダイゼーションに好適な条件下で該第一対のプローブを該第一のサンプルに導入して第一の混合物を形成させる工程;
d）該第一の混合物の蛍光を検出する工程;
e）該細胞を含む第二のサンプルを提供する工程;
f）第二の求電子プローブおよび(b)からの該求核プローブを含む第二対のプローブを提供する工程、ここで該第二の求電子プローブは(b)からの該第一の求電子プローブと１ヌクレオチド異なっており、異なる色の標識を有する;
g）該第二対のプローブの該細胞へのハイブリダイゼーションに好適な条件下で該第二対のプローブを該第二のサンプルに導入して第二の混合物を形成させる工程;
h）該第二の混合物の蛍光を検出する工程;
i） (d)および(h)の結果を比較する工程、ここで該第一または第二の混合物からの蛍光の検出と、該第二または第一の混合物からの蛍光のわずかな存在または非存在の検出が、１ヌクレオチドの特異性での該細胞における該目的RNAの検出を示す。
【請求項２２】
以下を含む目的核酸配列の検出のためのキット:
a）該目的の核酸配列の少なくとも第一の部分にハイブリダイズする少なくとも第一の核酸プローブ、ここで該少なくとも第一の核酸プローブは蛍光体基および蛍光消光脱離基を含む; および、
b）該少なくとも第一の部分に隣接する該目的の核酸配列の少なくとも第二の部分にハイブリダイズする少なくとも第二の核酸プローブ、ここで該少なくとも第二の核酸プローブは求核基を含む。
【請求項２３】
該蛍光消光脱離基が該少なくとも第一の核酸プローブの5'末端に共有結合しており、該求核基が該少なくとも第二の核酸プローブの3' 末端に共有結合している請求項 22のキット。
【請求項２４】
該蛍光消光脱離基が該少なくとも第一の核酸プローブの3'末端に共有結合しており、該求核基が該少なくとも第二の核酸プローブの5'末端に共有結合している請求項 22のキット。
【請求項２５】
該蛍光消光脱離基が該少なくとも第一の核酸プローブの5' 水酸基に結合している請求項 22のキット。
【請求項２６】
該蛍光消光脱離基が該少なくとも第一の核酸プローブの5' 水酸基以外の水酸基に結合している請求項 22のキット。
【請求項２７】
該蛍光消光脱離基が該蛍光体基から１ヌクレオチド離れて該少なくとも第一の核酸プローブに共有結合している請求項22〜26のいずれかのキット。
【請求項２８】
該蛍光消光脱離基が該蛍光体基から２ヌクレオチド離れて該少なくとも第一の核酸プローブに共有結合している請求項22〜26のいずれかのキット。
【請求項２９】
該蛍光消光脱離基が該蛍光体基から３ヌクレオチド離れて該少なくとも第一の核酸プローブに共有結合している請求項22〜26のいずれかのキット。
【請求項３０】
該少なくとも第一または第二の核酸プローブが、DNA、RNA、2'-0-メチル-RNA、ホスホロチオエートDNA、ロックされた核酸 (「LNA」)、またはPNAである請求項22 -29のいずれかのキット。
【請求項３１】
該少なくとも第一の核酸プローブが少なくとも 2倍の消光効率を有することを特徴とする請求項22-30のいずれかのキット。
【請求項３２】
該少なくとも第一の核酸プローブが少なくともl00倍の消光効率を有することを特徴とする請求項31のキット。
【請求項３３】
該少なくとも第一の核酸プローブが少なくともl000倍の消光効率を有することを特徴とする請求項 32のキット。
【請求項３４】
該求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである請求項22- 33のいずれかのキット。
【請求項３５】
該蛍光体基が、フルオレセイン、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、BODIPY 蛍光体、ROX、JOE、または オレゴングリーンである請求項22- 34のいずれかのキット。
【請求項３６】
該蛍光消光脱離基が、ダブシル基、ジマプダブシル基、アゾベンゼン-スルホニル基、アミノベンゼンスルホニル基、ジアルキルアミノベンゼンスルホニル基、ニトロベンゼンスルホニル基、フルオロベンゼンスルホニル基、シアノベンゼンスルホニル基、アレーンスルホニル基、アリールアゾ-置換ダブシル基、または金粒子抱合スルホニル脱離基である、請求項22 - 35のいずれかのキット。
【請求項３７】
細胞集団における特定の突然変異の存在または非存在を検出するための１または２の核酸分子の使用であって、該１または２の核酸分子が、蛍光体基、蛍光消光脱離基および求核基を同じ分子内に含むか、または１つの分子内に蛍光体基および蛍光消光脱離基を含み、もう１つの分子内に求核基を含む、使用。
【請求項３８】
特定の細胞タイプの存在または非存在を検出するための１または２の核酸分子の使用であって、該１または２の核酸分子が蛍光体基、蛍光消光脱離基および求核基を同じ分子内に含むか、または１つの分子内に蛍光体基および蛍光消光脱離基を含み、もう１つの分子内に求核基を含む、使用。
【請求項３９】
該１または２の核酸分子が該特定の細胞タイプに特有の核酸配列に結合し、該特定の細胞タイプが望ましくない細菌またはその他の有害微生物であり、蛍光の検出が該特定の細胞タイプの存在を示す、請求項 38の使用。
【請求項４０】
該細菌またはその他の有害微生物が、マイコバクテリウム・ツベルキュロシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、ボルダテラ・ペルツシス、ニッセリア・ゴノレア、ニッセリア・メニンギチジス、大腸菌O157:H7、またはバシラス・アントラシスである請求項 38 または 39の使用。
【請求項４１】
複数の核酸配列の検出のための複数の核酸分子の使用であって、該複数の核酸分子が蛍光体基、蛍光消光脱離基および求核基を同じ分子内に含むか、または蛍光体基および蛍光消光脱離基を１つの分子内に含み、求核基を別の分子内に含む、使用。
【請求項４２】
正常細胞と疾患細胞とを識別および同定するための複数の核酸分子の使用であって、該複数の核酸分子が、蛍光体基、 蛍光消光脱離基および求核基を同じ分子内に含むか、または、蛍光体基および蛍光消光脱離基を１つの分子内に含み、求核基を別の分子内に含む、使用。
【請求項４３】
ある時間にわたって、または、薬剤、候補薬剤またはその他の治療薬への曝露に応答しての、細胞における遺伝子発現の変化をモニターするための１または２の核酸分子の使用であって、該１または２の核酸分子が、蛍光体基、蛍光消光脱離基および求核基を同一の分子内に含むか、または、蛍光体基および蛍光消光脱離基を１つの分子内に含み、求核基をもう１つの分子内に含む、使用。