【手続補正書】
【提出日】平成20年3月24日(2008.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  （ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６より成る群から選択される単離された核酸フラグメント；
（ｂ）３７℃で６×ＳＳＣ（１Ｍ  ＮａＣｌ）、４０ないし４５％ホルムアミド、１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件、および５５ないし６０℃で０．５×ないし１×ＳＳＣ中での洗浄下で（ａ）の単離された核酸フラグメントとハイブリダイズする単離された核酸分子；ならびに
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に完全に相補性である単離された核酸フラグメントより成る群から選択される、ニトリラーゼ酵素もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸フラグメント。
【請求項２】  フラグメントがアシドボラックス属（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）の株から単離される、請求項１記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項３】  脂肪族ニトリルおよび芳香族ニトリルより成る群から選択されるニトリル含有基質に対するニトリラーゼ活性を特徴とする、請求項１もしくは２に記載の核酸フラグメントによりコードされるポリペプチド。
【請求項４】  適する調節配列に操作可能に連結された請求項１もしくは２に記載の単離された核酸フラグメントを含んで成るキメラ遺伝子。
【請求項５】  呼称ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＷ９１中に含有されるプラスミドｐＳＷ９１、呼称ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７６を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５  α：ｐｎｉｔ４中に含有されるプラスミドｐｎｉｔ４、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００２もしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１０１１のいずれか中に含有されるプラスミドｐｎｉｔｅｘ２より成る群から選択される、請求項４記載のキメラ遺伝子を含んで成る発現カセット。
【請求項６】  染色体に組み込まれ、且つ、
ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトリプトファンオペロンプロモーターＰｔｒｐ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のラクトースオペロンプロモーターＰｌａｃ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｔａｃプロモーター、ファージλライトプロモーターＰＲ、ファージλレフトプロモーターＰＬ、Ｔ７プロモーター、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのＡＯＸ１遺伝子のプロモーター、およびピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのＧＡＰ遺伝子のプロモーターより成る群から選択される最低１個のプロモーター、もしくは、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ドゥナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテリア属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）より成る群から選択される最低１個の強力なプロモーター、ならびに
ｂ）ファージλＣＩＩ遺伝子からの、もしくはコマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ドゥナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテリア属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の遺伝子からのリボソーム結合部位より成る群から選択される、最低１個のリボソーム結合部位、より成る群から選択される調節配列を含んで成る、
請求項５記載の発現カセットを含んで成る形質転換された微生物。
【請求項７】  （ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６より成る群から選択される核酸フラグメントの全部もしくは一部分でゲノムライブラリーをプロービングすること；
（ｂ）段階（ａ）の核酸フラグメントとハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定すること；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で同定されたＤＮＡクローンを含んで成る核酸フラグメントを配列決定すること
を含んで成り、
段階（ｂ）の配列決定された核酸フラグメントがニトリラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは実質的な一部分をコードする、
ニトリラーゼ酵素の全部もしくは実質的な一部分をコードする核酸フラグメントを得る方法。
【請求項８】  （ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１６より成る群から選択される配列の一部分に対応する最低１種のオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；ならびに
（ｂ）段階（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在する挿入物を増幅すること（段階（ｂ）の増幅された挿入物はニトリラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは実質的な一部分をコードする）
を含んで成る、ニトリラーゼ酵素の全部もしくは実質的な一部分をコードする核酸フラグメントを得る方法。
【請求項９】  （ａ）適する条件下で、請求項３記載のポリペプチドまたは請求項４記載のキメラ遺伝子を発現する形質転換された異種宿主をニトリル含有基質と接触させること；および
（ｂ）段階（ａ）で産生されたカルボン酸を場合によっては収集すること
を含んで成る、ニトリル含有基質のカルボン酸への酵素的転化方法。
【請求項１０】  （ａ）適する条件下で、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５と称される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＷ９１を２−メチルグルタロニトリルと接触させること；および
（ｂ）段階（ａ）で産生されたカルボン酸を場合によっては収集すること
を含んで成る、２−メチルグルタロニトリルの対応するカルボン酸への酵素的転化方法。
【請求項１１】  （ａ）水性反応混合物中の脂肪族α，ω−ジニトリルを酵素触媒と接触させて、それにより脂肪族α，ω−ジニトリルがω−シアノカルボン酸アンモニウム塩に転化されること；
（ｂ）段階（ａ）から生じる水性の産物混合物を水素および水素化触媒と接触させて、それによりω−シアノカルボン酸アンモニウム塩が、中間体ω−シアノカルボン酸、ω−シアノカルボン酸アンモニウム塩、ω−アミノカルボン酸もしくはω−アミノカルボン酸アンモニウム塩の単離を伴わずに対応するラクタムに直接転化されること；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）から生じる水性の産物混合物からラクタムを回収すること
を含んで成り、
段階（ａ）で、水性反応混合物中の脂肪族α，ω−ジニトリルを
（１）呼称ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＷ９１；
（２）呼称ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７６を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ：ｐｎｉｔ４；
（３）呼称ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１；および
（４）プラスミドｐｎｉｔｅｘ２を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００２、ならびに
（５）プラスミドｐｎｉｔｅｘ２を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１０１１
より成る群から選択される酵素触媒と接触させることを含んで成る、
脂肪族α，ω−ジニトリルからの５員環ラクタムもしくは６員環ラクタムの製造方法に対する改良。