【手続補正書】
【提出日】平成20年1月21日(2008.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高レベルの可溶性且つ活性型の組換型スクロースシンターゼ（ＳＳ）酵素を効率的に作製する方法であって、
ａ）ジャガイモＳＳ４のＳＳのアイソフォームをコードする遺伝子のヌクレオチド配列から配列番号１及び配列番号２によって示される２種のプライマーを得、それらのプライマーを用いて、ジャガイモの葉のｃＤＮＡライブラリーに基づき、配列番号３によって示される２４１８塩基対のｃＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅するステップと、
ｂ）第１のベクター中に前記ｃＤＮＡ断片を挿入するステップと、
ｃ）前記第１のベクターを、増幅場所とする第１の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｄ）増幅された構築物を少なくとも２種の制限酵素で消化するステップと、
ｅ）先に消化した後に、演繹されるアミノ酸配列が配列番号４によって示されるＳＳＸをコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を得るステップと、
ｆ）ヒスチジンに富む配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと同じ制限部位に前記断片をクローニングし、前記ヒスチジンに富む末端をＳＳに融合し、第２の発現ベクターを作製するステップと、
ｇ）この第２のベクターを、発現場所とする第２の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｈ）前記形質転換された微生物を、可溶性且つ活性型のＳＳＸを合成するのに適した培養条件でインキュベートするステップと、
ｉ）活性型のＳＳＸを単離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップｂ）で使用される第１の発現ベクターが、配列番号３に挿入されると図３Ａの構築物ｐＳＳを生じるプラスミドｐＳＫであることを特徴とする、前記請求項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項３】
ｐＳＫプラスミドを増幅させるためにステップｃ）で使用される第１の宿主微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１  Ｂｌｕｅであることを特徴とする、前記請求項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項４】
ステップｄ）で使用される制限酵素がＮｃｏＩ及びＮｏｔＩであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項５】
ステップｆ）において、ステップｄ）後に遊離されるＤＮＡ断片がクローニングされる制限部位が、図３Ｂで示されるプラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）と同じであり、図３Ｃで示されるｐＥＴ−ＳＳプラスミドを生じることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項６】
ステップｇ）で使用される第２の宿主微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＢＬＲ（ＤＥ３）株であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項７】
可溶性且つ活性型のＳＳＸを合成するのに適した培養条件においてステップｈ）でインキュベートされる、ステップｇ）で形質転換された株がＣＥＣＴ５８５０であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項８】
ＳＳＸを合成するのに適した培養条件が、細菌培養物を２０℃の温度下に置くステップを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項９】
ＳＳＸの精製が、好ましくは、イミダゾールを好ましくは２００ｍＭの濃度で含む溶出緩衝液を用いた、ヒスチジン残基に富むアミノ酸配列に対するアフィニティクロマトグラフィーによって実施されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項１０】
活性型の精製されたＳＳＸ酵素を維持するために、アフィニティクロマトグラフィーから溶出された前記精製酵素を直ちに透析にかけて、微量のイミダゾールを除去することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項１１】
組換型のジャガイモＳＳ５アイソフォームの作製方法であって、
ａ）構築物ｐＳＳを鋳型として使用し、［配列番号５、配列番号６］、［配列番号７、配列番号８］、及び［配列番号９、配列番号１０］の配列を有するプライマー対を連続して使用した後に特異的突然変異誘発を起こすことによって、配列番号１１によって示される２４１８塩基対のＤＮＡ断片を得るステップと、
ｂ）第１のベクター中に前記ＤＮＡ断片を挿入するステップと、
ｃ）前記第１のベクターを、増幅場所とする第１の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｄ）増幅された構築物を少なくとも２種の制限酵素で消化するステップと、
ｅ）先に消化した後に、アミノ酸配列が配列番号１２によって示されるＳＳ５をコードするＤＮＡ断片を得るステップと、
ｆ）ヒスチジンに富む配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと同じ制限部位に前記断片をクローニングし、前記ヒスチジンに富む末端をＳＳ５に融合し、第２の発現ベクターを作製するステップと、
ｇ）この第２のベクターを、発現場所とする第２の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｈ）前記形質転換された微生物を、可溶性且つ活性型のＳＳ５を合成するのに適した培養条件でインキュベートするステップと、
ｉ）活性型のＳＳ５を単離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
ステップｂ）が構築物ｐＳＳ５を生じることを特徴とする、請求項１１に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１３】
ｐＳＳ５を増幅させるためにステップｃ）で使用される第１の宿主微生物が大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅであることを特徴とする、請求項１１又は１２のいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１４】
ステップｄ）で使用される制限酵素がＮｃｏＩ及びＮｏｔＩであることを特徴とする、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１５】
ステップｆ）において、ステップｄ）後に遊離されるＤＮＡ断片がクローニングされる制限部位が、プラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）と同じであり、プラスミドｐＥＴ−ＳＳ５を生じることを特徴とする、請求項１１から１４までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１６】
ステップｇ）で使用される第２の宿主微生物が大腸菌のＢＬＲ（ＤＥ３）株であることを特徴とする、請求項１１から１５までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１７】
可溶性且つ活性型のＳＳ５を合成するのに適した培養条件においてステップｈ）でインキュベートされる、ステップｇ）で形質転換された株がＣＥＣＴ５８４９であることを特徴とする、請求項１１から１６までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１８】
ＳＳ５を合成するのに適した培養条件が、細菌培養物を２０℃の温度下に置くステップを含むことを特徴とする、請求項１１から１７までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１９】
ＳＳ５の精製が、好ましくは、イミダゾールを好ましくは２００ｍＭの濃度で含む溶出緩衝液を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって実施されることを特徴とする、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項２０】
活性型の精製されたＳＳ５酵素を維持するために、アフィニティクロマトグラフィーから溶出された前記精製酵素を直ちに透析にかけて、任意の微量のイミダゾールを除去することを特徴とする、請求項１１から１９までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項２１】
配列番号４によって示される演繹された配列を有し、スクロースシンターゼ（ＳＳ）活性を示すことを特徴とする、請求項１から１０までに記載の方法で請求されるようにして得ることができる、可溶性且つ活性な組換型ＳＳＸ酵素製品。
【請求項２２】
スクロース及びＵＤＰが存在する場合の比活性がタンパク質１ｍｇ当たり８０ユニットであり、Ｋｍ（ＵＤＰ）＝０．２５ｍＭ及びＫｍ（スクロース）＝３０ｍＭの動態パラメータを有することを特徴とする、請求項２１に記載の可溶性且つ活性な組換型ＳＳＸ酵素製品。
【請求項２３】
配列番号１２によって示される演繹されたアミノ酸配列を有し、スクロースシンターゼ（ＳＳ）活性を示すことを特徴とする、請求項１１から２０までに記載の方法で請求されるようにして得ることができる、請求項２１及び２２に記載の可溶性且つ活性な組換型酵素製品のＳＳ５アイソフォーム。
【請求項２４】
ＵＤＰ及びＡＤＰが存在する場合の比活性がそれぞれタンパク質１ｍｇ当たり８０ユニット及び６０ユニットであり、ＵＤＰ及びＡＤＰに対する動態パラメータがＫｍ（ＵＤＰ）＝Ｋｍ（ＡＤＰ）＝０．３ｍＭであることを特徴とする、請求項２３に記載の組換型ＳＳ５アイソフォーム。
【請求項２５】
適切な条件下でＵＤＰ及びＳＳＸをインキュベートし、次いで、生成されたＵＤＰＧを単離及び精製することを含むことを特徴とする、請求項２１又は２２に記載の酵素製品を使用してＵＤＰＧを作製する方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、
ａ）以下の溶液、即ち、
スクロース  １Ｍ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０  ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ  １ｍＭ
ポリエチレングリコール  ２０％
ＭｇＣｌ２  １ｍＭ
ＫＣｌ  １５ｍＭ
ＵＤＰ  １００ｍＭ
ＳＳＸ  ３０Ｕ
の１００ｍｌを３７℃で１２時間インキュベートするステップと、
ｂ）好ましくは１００℃で９０秒間加熱することによって反応を停止するステップと、
ｃ）１００００ｇで１０分間遠心分離するステップと、
ｄ）上清をＨＰＬＣによるクロマトグラフィーにかけ、従来の方法によってＵＤＰＧを溶離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項２７】
適切な条件下でＡＤＰ及びＳＳ５をインキュベートし、次いで、生成されたＡＤＰＧを単離及び精製することを含むことを特徴とする、請求項２３又は２４に記載の酵素製品を使用してＡＤＰＧを作製する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、
ｅ）以下の溶液、即ち、
スクロース  １Ｍ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０  ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ  １ｍＭ
ポリエチレングリコール  ２０％
ＭｇＣｌ２  １ｍＭ
ＫＣｌ  １５ｍＭ
ＡＤＰ  １００ｍＭ
の１００ｍｌを３７℃で１２時間インキュベートするステップと、
ｆ）好ましくは１００℃で９０秒間加熱することによって反応を停止するステップと、
ｇ）１００００ｇで１０分間遠心分離するステップと、
ｈ）上清をＨＰＬＣによるクロマトグラフィーにかけ、従来の方法によってＡＤＰＧを溶離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項２９】
スクロースシンターゼ（ＳＳ）活性を有する酵素製品を含む、スクロースの分光光度的／蛍光定量的／アンペロメトリックな測定用のアッセイキット。
【請求項３０】
請求項２９に記載のアッセイキットであって、以下のインキュベーション媒体、即ち、
ａ．２ユニットのＳＳ
ｂ．２ｍＭのＡＤＰ
ｃ．２ユニットの植物、動物、又は微生物由来ＡＤＰＧピロホスファターゼ
ｄ．２ユニットのＰＧＭ
ｅ．２ユニットのＧ６ＰＤＨ
ｆ．０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）
ｇ．反応緩衝液１００ｍｌ：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ  ＫＣ１
ｈ．予めろ過した試験サンプル
と組合せて使用するための、上記アッセイキット。
【請求項３１】
請求項２９に記載のアッセイキットであって、以下のインキュベーション媒体、即ち、
ａ．２ユニットのＳＳ
ｂ．２ｍＭのＵＤＰ
ｃ．２ユニットの植物、動物、又は微生物由来ＵＤＰＧピロホスファターゼ
ｄ．２ユニットのＰＧＭ
ｅ．２ユニットのＧ６ＰＤＨ
ｆ．０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）
ｇ．反応緩衝液１００ｍｌ：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ  ＫＣ１
ｈ．予めろ過した試験サンプル
と組合せて使用するための、上記アッセイキット。
【請求項３２】
請求項２９に記載のアッセイキットであって、以下のインキュベーション媒体、即ち、
ａ．２ユニットのＳＳ
ｂ．２ｍＭのＵＤＰ
ｃ．２ユニットのＵＤＰＧデヒドロゲナーゼ
ｄ．０．５ｍＭのＮＡＤ
ｅ．反応緩衝液１００ｍｌ：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ  ＫＣ１
ｆ．予めろ過した試験サンプル
と組合せて使用するための、上記アッセイキット。
【請求項３３】
ＳＳが、任意選択で、ＳＳ４、ＳＳ５、若しくはＳＳＸ、又はそれらの組合せであることを特徴とする、請求項２９から３２までのいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項３４】
ＳＳをコードするＤＮＡであって、前記ＤＮＡを含み発現する遺伝子構築物を適切なベクター中に挿入し、前記遺伝子構築物を植物のゲノムに導入することによって、ＳＳを発現するトランスジェニック植物を作製する方法に使用される、上記ＤＮＡ。
【請求項３５】
使用されるｃＤＮＡがＳＳＸをコードしていることを特徴とする、請求項３４に記載のＤＮＡ。
【請求項３６】
請求項３５に記載のＤＮＡであって、前記方法が、以下のステップ、即ち、
ａ）ＳＳＸ遺伝子又はＳＳをコードする他の任意の変種のそれぞれ５’及び３’領域の３５Ｓプロモーター及びＮＯＳターミネーターをｐＳＳプラスミドに連続的に挿入することにより、図４Ｂに示す制限地図を有するプラスミドｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを作製するステップと、
ｂ）酵素ＮｏｔＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩでｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを連続的に消化するステップと、
ｃ）予めＥｃｏＲＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩで連続的に消化しておいたバイナリープラスミドｐＢＩＮ２０内に、作製した断片をクローニングして、図４Ｃに示すプラスミドｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを得るステップと、
ｄ）大腸菌（ＸＬ１  Ｂｌｕｅ）中でｐＢＩＮ３５Ａ−ＳＳ−ＮＯＳを増幅させるステップと、
ｅ）上記のステップで増幅された遺伝子構築物をアグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８：ＧＶ２２６０に挿入して、形質転換株ＣＥＣＴ  ５８５１を得るステップと、
ｆ）形質転換株ＣＥＣＴ  ５８５１で植物をトランスフェクションするステップと
を含むことを特徴とする、上記ＤＮＡ。
【請求項３７】
請求項３５に記載のＤＮＡであって、前記方法が、以下のステップ、即ち、
ａ）図５Ａで示す制限地図を有するプラスミドｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍを作製するために、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットをコードしている遺伝子のプロモーターをｐＧＥＭＴプラスミドに連続的に挿入するステップと、
ｂ）遊離された断片をｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳの対応する制限部位に挿入するために酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩでｐＧＥＭＰ−ＲＢＣＳを消化して、図５Ｂで示す制限地図を有するｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを作製するステップと、
ｃ）ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＮｏｔＩで連続的にｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを消化し、遊離された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＥｃｏＲＩで連続的に消化したｐＢＩＮ２０中にクローニングして、図５Ｃで示す制限地図を有するｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを作製するステップと、
ｄ）大腸菌（ＸＬ１  Ｂｌｕｅ）中でｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを増幅させるステップと、
ｅ）上記のステップで増幅された遺伝子構築物をアグロバクテリウムチュメファシエンスＣ５８：ＧＶ２２６０に挿入し、その形質転換株で植物をトランスフェクションするステップと
を含むことを特徴とする、上記ＤＮＡ。
【請求項３８】
ＳＳ酵素活性の過剰発現を特徴とする、請求項３４から３７までのいずれか一項に記載のＤＮＡを使用する方法によって得ることができるトランスジェニック植物。
【請求項３９】
前記過剰発現が、非トランスジェニック野生型植物の同じ組織中で認められる酵素活性の２〜１０倍程度高いＳＳ酵素活性レベルを呈することを特徴とする、請求項３８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４０】
タバコ、ジャガイモ、トマト、及びイネ植物から選択されることを特徴とする、請求項３８又は３９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４１】
さらに、同一の条件下で栽培された対応する野生型植物の同じ組織又は器官で観察される含有量より、スクロース、Ｇ６Ｐ、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量がより多いことを特徴とする、請求項３８から４０までのいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４２】
対応する野生型植物の葉で観察されるより、スクロース、Ｇ６Ｐ、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高い葉を有する、請求項４０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４３】
対応する野生型植物の同じ組織又は器官で観察されるより、スクロース、Ｇ６Ｐ、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高い根、塊茎、及び／又は種子を有する、請求項４０に記載のトランスジェニック植物。