【手続補正書】
【提出日】平成19年8月29日(2007.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】ガラナエキスを有効成分とする肝機能改善予防剤、腫瘍免疫賦活剤及びガラナエキスを含有する機能食品並びにガラナエキスの製造方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラナ果実の粉砕物に糖質分解酵素を作用させて得られるガラナエキスを有効成分とすることを特徴とする肝機能障害改善予防剤。
【請求項２】
糖質分解酵素は、液化酵素、セルラーゼ及び糖化酵素とからなることを特徴とする請求項１に記載の肝機能障害改善予防剤。
【請求項３】
ガラナ果実の粉砕物に糖質分解酵素を作用させて得られるガラナエキスを有効成分とすることを特徴とする腫瘍免疫賦活剤。
【請求項４】
糖質分解酵素は、液化酵素、セルラーゼ及び糖化酵素とからなることを特徴とする請求項３に記載の腫瘍免疫賦活剤。
【請求項５】
ガラナ果実の粉砕物に糖質分解酵素を作用させて得られるガラナエキスを含有することを特徴とする機能食品。
【請求項６】
糖質分解酵素は、液化酵素、セルラーゼ及び糖化酵素とからなることを特徴とする請求項５に記載の機能食品。
【請求項７】
ガラナ果実の粉砕物に液化酵素、セルラーゼ及び糖化酵素を作用させることを特徴とするガラナエキスの製造方法。
【請求項８】
以下の各工程からなる請求項７に記載のガラナエキスの製造方法。
（１）ガラナ果実を粉砕して粉末化する工程
（２）高温水にガラナ果実の粉末を加え、さらに液化酵素を添加してデンプン質を液化する工程
（３）前記で得た酵素液化溶液にセルラーゼと糖化酵素を添加して糖化処理する工程
（４）前記で得た糖化処理液を濾過する工程
（５）前記で得た濾液を濃縮する工程
【請求項９】
液化酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ及びイソアミラーゼから選ばれる１種又は２種以上であり、糖化酵素はα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼから選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求項７又は請求項８に記載のガラナエキスの製造方法。
【請求項１０】
請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の製造方法により得られたガラナエキスに所定量のブドウ糖を添加してガラナエキス結晶粉末とすることを特徴とするガラナエキスの製造方法。  
【発明の詳細な説明】
【０００１】    
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラナ果実の粉砕物に糖質分解酵素を作用させて得られるガラナエキスを有効成分とする肝機能障害改善予防剤、腫瘍免疫賦活剤及びガラナエキスを含有する機能食品並びにガラナエキスの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蔓状の低灌木の一種であるブラジル産ガラナ（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ  ｃｕｐａｎａ）の果実は、カフェインと類似の分子構造を有するグアラニンを含有しており、古来からアマゾン川流域に先住しているグアラン族が興奮性飲料として愛用していたのが始まりといわれている。このようなガラナ果実は、カテキンやタンニン（ポリフェノール）などを含有しているため、飲用による好ましい薬理活性が期待され、これまでに種々のガラナエキスが添加された飲料が提供されている。
【０００３】
ところで、従来よりガラナ果実からガラナエキスを抽出する方法にアルコール抽出法と高温水抽出法とがある。アルコール抽出法はエチルアルコールを主にした有機溶媒によりガラナ果実を抽出する方法で、ガラナ果実に含有される親油性（疎水性）組成成分を複雑な操作によることなく容易に抽出でき、また抽出・分画が効率的に行えるという長所がある反面、（１）親水性組成成分残渣が多いため収率が悪く（３０〜５０％）、（２）ガラナ果実に含有されるデンプン質がアルコールにより変性されやすい、（３）ガラナ果実に含有される親水性組成成分が十分に抽出されない、という短所があった。一方、高温水抽出法は塩類を含む高温水によりガラナ果実を抽出する方法で、ガラナ果実の組成成分にとって極めて温和な抽出法であり、また高度の技術が不要で抽出操作が簡便であるという長所がある反面、（１）親油性組成成分残渣が多いため収率が悪く（２５〜３５％）、（２）ガラナ果実に含有される親油性組成成分の抽出が困難で、抽出されるのは主として親水性組成成分であるカフェイン（グアラニン）、カテキン、タンニンなどであり、一般的に好ましい薬理活性を有するとされるフラボン系やテルペン系などの複雑な環状構造の組成成分の回収は不十分である、という短所があった。  
【０００４】
また、従来より飲料として提供されているガラナエキスの薬理活性については、ガラナ果実に含有されるカテキンやタンニンなどについての研究報告がなされているにすぎず、これまでにガラナエキス固有の薬理活性についての研究報告は皆無である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来のガラナエキスの抽出法の問題点を解決し、ガラナ果実に含有される親油性組成成分と親水性組成成分のいずれをも高収率で回収し、簡便な操作で行えるガラナエキスを有効成分とする肝機能障害改善予防剤、腫瘍免疫賦活剤及び機能食品並びにガラナエキスの製造方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、肝機能障害・機能低下マウスをモデルにＧＯＴとＧＰＴの酵素活性値を指標としてガラナエキスの新規な薬理活性を検討すると共に、マウス・サルコーマ１８０癌細胞を移植したマウスをモデルにガラナエキスの新規な薬理活性を検討し、本発明に想到した。すなわち、本発明はガラナ果実の粉砕物に糖質分解酵素を作用させて得られるガラナエキスを有効成分とすることを特徴とする肝機能障害改善予防剤、腫瘍免疫賦活剤及び機能食品に関する。これらの発明において、糖質分解酵素は液化酵素、セルラーゼ及び糖化酵素としてもよい。
【０００７】
上記の発明では、ガラナ果実に含まれる親油性組成成分、親水性組成成分、糖質分解酵素の作用を受けない残存高分子多糖体、アミロペクチンや繊維質などにより肝機能改善予防作用、腫瘍免疫賦活作用を発揮するものと推測される。  
【０００８】
また、本発明者らは糖質分解酵素の性質に着目して、ガラナ果実に含まれる繊維質やデンプン質などを効率よく分解すると共に、残渣物を減らし高収率でガラナエキスを得る製造方法に想到し本明を完成した。すなわち、ガラナ果実の粉砕物に液化酵素、セルラーゼ及び糖化酵素を作用させることを特徴とするガラナエキスの製造方法に関する。また、該発明において、以下の工程からなることを特徴とするガラナエキスの製造方法に関する。
（１）ガラナ果実を粉砕して粉末化する工程
（２）高温水にガラナ果実の粉末を加え、さらに液化酵素を添加してデンプン質を液化する工程
（３）前記で得た酵素液化溶液にセルラーゼと糖化酵素を添加して糖化処理する工程
（４）前記で得た糖化処理液を濾過する工程
（５）前記で得た濾液を濃縮する工程
これらのガラナエキスの製造方法の発明において、液化酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ及びイソアミラーゼから選ばれる１種又は２種以上であり、糖化酵素はα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼから選ばれる１種又は２種以上としてもよい。また、これらの製造方法で得られたガラナエキスに所定量のブドウ糖を添加してガラナエキス結晶粉末とすることを特徴とするガラナエキスの製造方法に関する。
【０００９】
上記のガラナエキスの製造方法では、主として細胞壁の構造を維持するセルロースがセルラーゼにより分解され、またガラナ果実に含まれる多糖体は糖化分解されるので、リグニン、フラボン系組成成分その他の組成成分が遊離し易くなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
ガラナ果実は主として種子を用いるが、果肉などを用いることもできる。予め十分に乾燥したガラナ果実をミルなどの粉砕機により粉砕し粉末化する。ガラナ果実の粉末はその重量のおよそ８〜１２倍量の高温水に加える。高温水の水温は通常８０〜９０℃であるが、使用する糖質分解酵素に応じて適宜変更してもよい。また、ガラナ果実の粉末が加えられた高温水のｐＨは通常６〜７に調整するが、使用する糖質分解酵素に応じて適宜変更してもよい。
【００１１】
次いで、上記の調整液に液化酵素を加えてガラナ果実に含まれるデンプン質を液化する。液化酵素はアミラーゼを用い、動物由来、植物由来、微生物由来を問わず用いることができる。アミラーゼには、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ及びイソアミラーゼがあり、これらのアミラーゼを単独であるいは併用して用いることができ、特に加水分解効率の高いエンド型のα−アミラーゼが好ましく、また高温水に添加されるので耐熱性のα−アミラーゼがさらに好ましく、このようなアミラーゼは市販品を容易に入手することができる。さらに、デンプン質の液化は調整液にアミラーゼを添加後、使用する糖質分解酵素に応じ適宜変更してもよいが、通常８０〜９０℃で５０〜７０分間十分に撹拌して行う。  なお、液化酵素はガラナ果実の粉末１０００ｋｇに対し約６００ｇ前後の割合で添加するのが好ましい。
【００１２】
上記の処理により得た酵素液化溶液は、使用する糖質分解酵素に応じて適宜変更してもよいが、通常ｐＨを４〜６に調整した後、セルラーゼと糖化酵素を添加し、通常４０〜５０℃で４５〜５２時間酵素処理する。添加されるセルラーゼは市販品を容易に入手でき、動物由来、植物由来及び微生物由来を問わず用いることができる。また、糖化酵素も動物由来、植物由来及び微生物由来を問わず種々の酵素を用いることができ、特にα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼの中から１種又は２種以上を組み合わせて用いることが好ましく、これらの糖化酵素も市販品を用いることができる。また、ガラナエキスの甘味性を高めるためグルコースイソメラーゼなどの異性化酵素を添加してもよい。なお、セルナーゼと糖化酵素は出発原料たるガラナ果実の粉末１０００ｋｇに対して各々約６００ｇ前後の割合で添加するのが好ましい。
【００１３】
上記の処理で得た糖化処理液は、公知の操作により濾過を行い残渣と濾別する。この濾過操作は、所望により複数回繰り返される。さらに、得られた濾液は公知の操作により濃縮され、ガラナエキスを製造することができる。ガラナエキスは、白糖を加えてガラナエキスシロップに加工したり、あるいは凍結乾燥品とすることができる。また、ガラナエキスにブドウ糖を添加してガラナエキス結晶粉末に製することができ、製剤化にあたり打錠が容易となる。なお、ブドウ糖の添加量（容量）は、ガラナエキス２〜３に対して８〜７の割合が好ましい。
【００１４】
以上のようにして製造されたガラナエキスは、肝機能改善予防剤あるいは腫瘍免疫賦活剤として投与することができる。投与形態は、経口投与が一般的であるがこれに限定されない。また、剤型も用途に応じて適宜選択でき、薬学的に許容される賦形剤、結合剤、崩壊剤、軟膏基剤などを用いて散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、座剤、軟膏剤などの剤型とできる。さらに、本発明の肝機能改善予防剤及び腫瘍免疫賦活剤はそれらの薬効を失わない限り他の薬効を有する製剤（動植物由来を含む）を配合して医療用製剤として供することができ、例えば抗菌剤、制癌剤あるいはサイトカイン類を配合することができる。
【００１５】
また、本発明のガラナエキスを含有させて機能食品を供することもできる。これらの機能食品を摂取することにより肝機能の改善あるいは予防ができ、また悪性腫瘍に対する免疫機能を賦活化させることもできる。また、ガラナエキスは抗酸化作用と活性酸素消去能を有するので、加齢変化に伴う新陳代謝機能の低下によって惹起される動脈硬化症などの生活習慣病を予防することができる。ガラナエキスは介護食や栄養補給食・補給液に配合してもよく、またゼリー、キャンディー、ビスケット、チョコレートなどに添加することもでき、さらにこれらにＬ−酒石酸、結晶クエン酸、クエン酸ナトリウム、ソルビット、果実香料、麦芽水飴などを適宜添加することもでき、また飲料として供することもできる。
【００１６】
上記製造方法で得られたガラナエキスは肝機能改善予防剤あるいは腫瘍免疫賦活剤として連用効果と効果の持続性に優れるので、その投与量は健常者であれば肝機能低下予防・機能促進のために１日１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。肝機能が低下している患者や悪性腫瘍の罹患者は適宜増量でき、前記の５倍量を投与するのが好ましい。また、機能食品としてガラナエキスを含有させる場合は、前記健常者の投与量を摂取することが好ましい。
【００１７】
【実施例】
次に本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の説明において特に断らない限り％は重量％を意味する。
【００１８】
実施例１（ガラナ果実からのガラナエキスの製造）
ガラナ果実（種子）を粉砕機で粉砕し粉末化した粉末１５０ｇ（水分量：７．５±０．５％）を９０℃に加温した滅菌蒸留水１５００ｍｌに加えた後（ｐＨ５．５）、炭酸カルシウムにてｐＨを６．５に調整し、得られた約１５００ｍｌの調整液にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のα−アミラーゼ（アミラーゼＡＤ「アマノ」、天野製薬社製）９０ｍｇを添加し、９０℃で６０分間撹拌しながらガラナ果実粉末に含まれるデンプン質を液化した。得られた約１５００ｍｌの酵素液化溶液にシュウ酸を加えてｐＨを４．５に調整した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のα−グルコシダーゼ（α−グルコシダーゼ「アマノ」、天野製薬社製）とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のセルラーゼ（セルラーゼＡ「アマノ」、天野製薬社製）を各々９０ｍｇずつ添加し、４５℃で４８時間酵素処理した（液化工程）。この酵素処理によって、植物繊維質（セルローズ）はブドウ糖にまで分解される（糖化工程）。さらに、糖化された約１５００ｍｌの糖化処理液を表面に濾過剤（パーライト）が張り付けられたヒダ付き濾紙により吸引濾過を２回繰り返した。このようにして得られた濾液を回転式真空濃縮装置を用いて濃縮し、固形分６２．７％、水分３７．３％からなる約３５０ｍｌのガラナエキスを得た。
【００１９】
上記製造方法により得られたガラナエキスの収率は約７０％で、同時に行ったアルコール抽出法の収率約４５％と高温水抽出法の収率約３０％に比べ極めて高い収率であった。  また、ガラナエキスの１００ｍｌ当たりのカフェイン含有量は４．６５ｇ、タンニン含有量は１２．６ｇで、高温水抽出法で得た含有量とほぼ近似し、本発明のガラナエキスの製造方法によりガラナ果実に含まれる親水性組成成分を十分に回収できることが分かった。さらに、ガラナエキスの固形分１００ｇについて、各組成成分の含有比率を分析したところ、表１に示したようにセルラーゼとα−グルコシダーゼの分解による繊維由来ブドウ糖が最も大きな割合であった。なお、カフェインはＨＰＬＣ法、タンニンはフォーリン・デニス法、糖質はフェノール・硫酸法により分析した。
【００２０】
【表１】
2002104981.tif 000001
【００２１】
参考例１（肝機能障害・機能低下マウスの作製）
肝臓の機能障害・機能低下が惹起される肝機能障害・機能低下マウスは、Ｃｏｎｔｉらの方法（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６０：３１５，１９９２）に準じて行った。すなわち、後記実施例２の各実験群毎に３匹宛の５週齢の正常ｄｄＹ系雌マウス（平均体重：２５ｇ）を準備し、生理食塩水で６０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させたＤ−ガラクトサミン塩酸塩（以下、Ｇａｌ−Ｎという）試薬液０．２ｍｌをマウスの腹腔内に投与（４８０ｍｇ／ｋｇ）することにより肝機能障害・機能低下マウス（以下、Ｇａｌ−Ｎ処理マウスという）を作製した。
【００２２】
参考例２（ＧＯＴ及びＧＰＴ活性値の測定法）
ＧＯＴ（ＡＳＴ）及びＧＰＴ（ＡＬＴ）の活性値の測定は、ＧＯＴあるいはＧＰＴ測定用キット試薬（アズウエル社製）をセットしたマルチ自動分析機（東芝マルチ６０Ｍ型）によるＵＶ−Ｒａｔｅ法（主波長：３４０ｎｍ／副波長：３７５ｎｍ）により行った。すなわち、血清１０μｌに酵素液（Ｒ１）３００μｌを添加後、３７℃で３分間インキュベートし、その後、基質液（Ｒ２）７５μｌを加え、１〜５分間に３４０ｎｍ付近での１分間当たりの吸光度の変化（ＮＡＤＨ→ＮＡＤ＋への減少速度）を測定し、ＮＡＤＨ分子吸光係数からＧＯＴあるいはＧＰＴの活性値（単位：ＩＵ／ｌ）を算出した。なお、以下の各実施例における有意差検定（危険率５％以下、ｐ∠０．０５、有意差有り）はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ法により算出した。
【００２３】
実施例２（ガラナエキスのＧＯＴ及びＧＰＴ活性値に与える効果の検討）
（ガラナエキスの濃度効果）上記参考例１で作製されたＧａｌ−Ｎ処理マウスにガラナエキスを投与し、Ｇａｌ−Ｎ処理マウスのＧＯＴ活性値及びＧＰＴ活性値に与えるガラナエキスの濃度効果を検討した。すなわち、Ｇａｌ−Ｎ処理後、４時間目に投与量が１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇとなるように実施例１で得られたガラナエキスの濃度を各々調整し、Ｇａｌ−Ｎ処理マウスに各々０．５ｍｌ経口投与した後、４８時間目にエーテル麻酔下マウスの眼球を摘出し、流血液をエチレンジアミン四酢酸ナトリウム添加小試験管に採取した。この血液を遠心分離（４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間）後、血清を採取（２００〜３００μｌ）し、ＧＯＴ及びＧＰＴの活性値を参考例２の方法で測定した。
【００２４】
上記のようにしてＧＯＴ及びＧＰＴの活性値を測定したところ、表２に示したように、非投与対照群（正常マウス）のＧＯＴ活性値は平均９２ＩＵ／ｌであったが、Ｇａｌ−Ｎ単独投与群では、ＧＯＴ活性値は著しく上昇（平均３１３５ＩＵ／ｌ）した。このＧａｌ−Ｎ処理マウスに、ガラナエキス（１００〜８００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した後、４８時間目にＧＯＴ活性値を測定したところ、投与濃度に依存して酵素活性値は低下し、ガラナエキスの２００ｍｇ／ｋｇ投与で有意差が認められ（危険率５％以下）、４００ｍｇ／ｋｇ以上の投与では顕著な有意差（危険率１％以下）が認められた。また、ＧＰＴ活性値においても、表３に示したようにＧＯＴと同様にガラナエキスの投与濃度に依存して酵素活性値の低下が認められた。このように、ガラナエキスの投与濃度を高めることにより、ＧＯＴとＧＰＴの活性値が正常の酵素活性閾値に近づく傾向を示したことから、ガラナエキスには機能障害・機能低下を招いた肝機能を緩解・回復させる組成成分が含まれていることが示唆された。なお、興味あることに、Ｇａｌ−Ｎ処理によって、ＧＯＴ活性値は正常値の約３４倍まで上昇したのに対して、ＧＰＴ活性値は１４ＩＵ／ｌから２１８２ＩＵ／ｌまで上昇し、約１５６倍にまで上昇したことから、Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩は肝由来ＧＯＴ活性値に対するよりもＧＰＴ活性値に対してより強く作用することが示唆された。
【００２５】
【表２】
2002104981.tif 000002
【００２６】
【表３】
2002104981.tif 000003
【００２７】
（ガラナエキスの投与回数効果）
Ｇａｌ−Ｎ処理後、２時間毎にガラナエキス（２００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与（計３回）した後、４８時間目に上記のガラナエキスの濃度効果の実験群と同様の方法で血清を採取し、ＧＯＴ及びＧＰＴの活性値を測定した。その結果、表４と表５に示したようにＧａｌ−Ｎ処理によって著しく上昇したＧＯＴとＧＰＴの活性値は投与回数の増加に伴い低下し、２回投与によって危険率５％以下の有意差が認められ、３回投与によっては危険率１％以下の有意差が認められ、投与回数を重ねることによりガラナエキスの肝機能改善予防効果が増強されることが示唆された。
【００２８】
【表４】
2002104981.tif 000004
【００２９】
【表５】
2002104981.tif 000005
【００３０】
（ガラナエキスの持続効果）
ＧＡＬ−Ｎ処理後、４時間目にガラナエキス（４００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した後、２４、４８及び７２時間目に上記のガラナエキスの濃度効果の実験群と同様の方法で血清を採取し、ＧＯＴとＧＰＴの活性値を測定した。その結果  、表６と表７に示したように、Ｇａｌ−Ｎ＋ガラナエキス投与群での両酵素活性値は共にＧａｌ−Ｎ単独投与群における活性値よりも著しく低値であり（２４〜４８時間後の危険率５％以下、７２時間後の危険率１％以下）、しかも時間と共に徐々に減少したことから、１回の投与によって機能障害・機能低下した肝機能に対するガラナエキスの緩解・回復効果が体内でかなりの間持続することが明らかになった。
【００３１】
【表６】
2002104981.tif 000006
【００３２】
【表７】
2002104981.tif 000007
【００３３】
ＧＰＴはＧＯＴに比べ、正常肝細胞に限局しており、しかも肝細胞の細胞質由来のＧＰＴ活性値はＧＯＴ活性値よりも高いことが知られており、ヒトが急性肝炎に罹患した場合にはＧＰＴ活性値の方がＧＯＴ活性値よりも急激に上昇することから、マウスをＧａｌ−Ｎ処理することによりヒトにみられる急性肝炎と類似の肝機能障害が誘発されたものと考えられ、上記の各実験結果からガラナエキスはヒトの急性肝炎に対し極めて有効であろうことが示唆された。
【００３４】
参考例３（肝ホモジネートの作製）
参考例１に記載の方法でマウスをＧａｌ−Ｎ処理（４８０ｍｇ／ｋｇ）し、その６０分後にガラナエキス（４００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。投与後、６、２４及び７２時間目にエーテル麻酔下のマウスを屠殺し、肝臓を摘出・細断した。次いで、肝の細断片を１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０ｍＭＥＤＴＡ添加１０ｍＭトリス塩酸緩衝液に入れ、ガラスホモジナイザーにて肝ホモジネートを作製した。肝ホモジネート中の蛋白質濃度は、ローリー法にて定量し、肝ホモジネート１ｍｌ当たり１００ｍｇ蛋白量に調整した。
【００３５】
実施例３（ガラナエキスの肝脂肪過酸化抑制作用（抗酸化作用））
肝脂肪の過酸化実験法は、Ｃａｍｐｏｓらの方法（Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ，５５：４１７，１９８９）に準じて行った。すなわち、参考例３に記載の方法でガラナエキスの経口投与後（４００ｍｇ／ｋｇ）、６、２４及び７２時間目の肝ホモジネート（肝ホモジネート１に対しトリス緩衝液４を加え、終濃度を２０ｍｇ蛋白質／ｍｌに調整）にマロンアルデヒド（以下、ＭＤＡという）・チオバルビタール酸複合体を添加し、産生されるＭＤＡ濃度をイムノアッセイ自動分析機（Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＥＬＩＳＡ  Ｐ−２型）にて５３５ｎｍで測定し、Ｅ＝１．５６×１０５１０００ｍｌ／ｍｏｌｅ／ｃｍの条件係数を用いて計測した（単位：ｎｍｏｌｅ／ｍｇ蛋白質）。なお、本法での標識物は、ＮＡＤ＋−ＡＴＰ補酵素を用い、ＮＡＤＰＨ−Ｆｅ＋−ＡＤＰ産生現象を利用した測定方法である。結果は表８に示したように、非投与対照群の正常マウス肝内におけるＭＤＡ産生量は実験期間（７２時間）を通じてほぼ一定（５０〜６８ｎｍｏｌｅ／ｍｇ蛋白質：平均５６．８ｎｍｏｌｅ／ｍｇ）であったが、Ｇａｌ−Ｎ処理によって４倍量以上のＭＤＡの増加がみられ、肝脂肪の酸化が著しく亢進されていることが認められた。これに対して、ガラナエキスを経口投与することによって、ＭＤＡの産生は時間の経過と共に軽減され、投与２４時間後では危険率１％以下、７２時間後では０．１％以下の著しい有意差が認められた。このことより、肝機能の低下によって生じ易くなる脂肪（特に、中性脂肪、脂肪酸）の酸化や過酸化に対して、ガラナエキスは抑制的に作用することが明らかになった。一方、ヒトの肝機能障害・肝機能低下時における肝内での過酸化脂肪の生成・蓄積は、肝癌発症の重要な要因となることからも、ガラナエキスには発癌予防効果をも有するであろうことが十分考えられる。また、脂肪酸の酸化などを防ぐことにより加齢変化に伴う生活習慣病の発症を予防する効果が期待される。
【００３６】
【表８】
2002104981.tif 000008
【００３７】
実施例４（ガラナエキスの肝内の活性酸素抑制作用（フリーラジカル・スカベンジャー）
肝障害や肝炎等の発症に伴い増加する肝マクロファージであるクッパー細胞に起因する活性酸素（フリーラジカル酸素）は、Ｖｉｄｅｌａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３４：２２０９，１９８５）に準じて測定を行った。すなわち、参考例３に記載した方法でガラナエキスを経口投与後（４００ｍｇ／ｋｇ）、６時間目の肝ホモジネート（肝ホモジネート１に対してトリス緩衝液２００を加え、終濃度０．５ｍｇ蛋白質／ｍｌに調整）をバイアル瓶（１３×３０ｍｍ）に採取し、肝ホモジネート中に発生するケミルミニセンス（化学的発光量）の１分間当たりの発光数値（単位：ｃｐｍ／ｍｇ蛋白質）を液体シンチレーション測定装置（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  ＬＳ−３１５０Ｐ型）にて測定した。  なお、本法での化学発光標識物には、イソルミノール誘導体のひとつであるＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールを用いた。結果は表９に示したように、Ｇａｌ−Ｎ処理によって、正常マウス肝内に産生された活性酸素（フリーラジカル酸素）は平均１１７８ｃｐｍ／ｍｇ蛋白質から２．３倍（平均２６７５ｃｐｍ／ｍｇ蛋白質）にまで増加し、肝機能の低下が確実に惹起されていた。すなわち、Ｇａｌ−Ｎ処理によって受けた損傷あるいは破壊された肝細胞や肝由来細胞を体外へ排除するために、クッパー細胞内に存在する活性酸素による殺細胞（殺細菌）システムが異常に亢進し、その結果、クッパー細胞からの活性酸素が多量に産生されたことに起因していることが立証された。このようなマウスにガラナエキスを投与することによって、活性酸素は正常閾値（１２８０ｃｐｍ／ｍｇ蛋白質）にまで低下し、肝細胞等の損傷や障害が著しく軽減されたことを示している（危険率１％以下の有意差）。これらのことから、ガラナエキスにも脂溶性ビタミン類、セルロプラスミンあるいはスーパーオキシドデスムターゼ（ＳＯＤ）等と同様の強い活性酸素消去作用をすることが示唆された。このことにより、ガラナエキスには活性酸素に一因があるといわれる発癌や老化の予防効果が期待される。
【００３８】
【表９】
2002104981.tif 000009
【００３９】
参考例４（ガラナエキスの低中分子組成成分画分の分離と精製）
実施例１で製造したガラナエキスを３０％ガラナエキスに調整し（４００ｍｇ／ｍｌ）、冷却高速遠心機にて１０００ｒｐｍ、６０分遠心した後、その上清液を限外濾過用メンブランを装着した限外濾過器にて吸引濾過し濾液を採取した。この濾液中に含まれる分子量５０００以下の低中分子組成成分画分を凍結乾燥し、さらに生理食塩水にて１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し低中分子組成成分画分液を得た。このガラナエキスの低中分子組成成分画分液中には、カフェイン、カテキン、タンニン、リンゴ酸、α−グルコシダーゼ分解繊維質由来ブドウ糖、二糖類などが含まれており、これを以下の悪性肉腫形成・肥大抑制作用の実験に供試した。  
【００４０】
実施例５（ガラナエキスの悪性肉腫形成・肥大抑制作用）
イーグルＭＥＭ培養液１ｍｌ当たり５×１０５コのマウス・サルコーマ１８０癌細胞浮遊液０．２ｍｌ（１×１０５コ／マウス）をマウス背部皮下に移植（各群８匹宛）する２日前、移植直後（０日）、移植後１日目、２日目、５日目及び８日目に参考例４で得られたガラナエキスの低中分子組成成分画分液０．５ｍｌ（４００ｍｇ／ｋｇ）及び実施例１で得たガラナエキス０．５ｍｌ（４００ｍｇ／ｋｇ）を各々癌細胞移植周辺背部皮下に計６回投与した。移植後２８日に腫大化した肉腫を摘出し、重量を計測した。その結果、表１０及び図１に示したように非投与対照群の移植後２８日目における肉腫の平均重量は１５．３５ｇであったのに対して、ガラナエキスの低中分子組成成分画分液を投与した場合には、肉腫の形成と肥大は多少とも抑制されていたものの、有意差は認められなかった（平均重量：１２．４４ｇ）。一方、ガラナエキスを投与した場合には、肉腫に対する著しい形成・肥大抑制効果が認められ（平均重量：９．８８ｇ）、しかも危険率１％以下の有意差であった。このように、ガラナエキスの遠心上清画分中に含まれる低〜中分子量組成成分、例えばカテキンやタンニンの抗腫瘍効果の報告があるが、低分子量から高分子量のすべての組成成分を含有するガラナエキスそのものの方がマウス・サルコーマ１８０肉腫に対して極めて強い抗腫瘍効果を示したことから、本実験で得られたガラナエキスの強力な抗腫瘍効果は、カテキンやタンニンなどによる直接的な癌細胞傷害作用のみに起因するというより、むしろ糖質分解酵素で分解されなかったガラナ果実に由来する高分子多糖体、アミロペクチンや植物繊維などによる動物体内の免疫監視機構中の非特異性免疫系や腫瘍免疫系の活性化、すなわちナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、キラーＴリンパ球やマクロファージの活性化と免疫関連因子であるインターロイキン１２やγ−インターフェロンの産生亢進に基づいた間接的な癌細胞傷害作用との相乗効果によるものであろうことが推測された。さらに、実施例３と実施例４で示したように、ガラナエキス中には脂肪に対する抗酸化作用と活性酸素消去作用を有する組成成分が含まれていることからも、ガラナエキスのマウス・サルコーマ１８０悪性肉腫に対する抗腫瘍効果は、免疫学的実験結果からも裏付けられたものと考えられる。
【００４１】
【表１０】
2002104981.tif 000010
【００４２】
実施例６（ガラナエキスの急性毒性試験（ＬＤ５０））
ｄｄＹ系雌及び雄マウス（５週齢）を１群５匹宛準備し、２倍段階希釈ガラナエキス０．５ｍｌを各々経口（最大濃度：８０ｍｇ／マウス）あるいは皮下（最大濃度：１２０ｍｇ／マウス）投与した後、５日間に亘り死亡匹数を記録し、これら投与法によるＬＤ５０をベーレンス・カーバー法に従って計算した。その結果、ガラナエキスの経口投与における雌マウスに対するＬＤ５０は２８５７ｍｇ／ｋｇ、雄マウスに対しては２５６０ｍｇ／ｋｇであった。一方、皮下投与における雌及び雄マウスに対するＬＤ５０は、各々４２８４ｍｇ／ｋｇと３８４０ｍｇ／ｋｇであり、経口、皮下投与を問わず、雌マウスに対するガラナエキスの急性毒性は雄マウスに対するよりも低い濃度であった。
【００４３】
実施例７（錠剤）
ガラナエキス（凍結乾燥品）                ６０ｍｇ
デンプン                                  ４０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム      ２０ｍｇ
全量                                     １２０ｍｇ
を混合し常法により錠剤を製した。
【００４４】
実施例８（機能食品）
ガラナエキス５０ｍｇに果糖ブドウ糖液糖と香料を加え精製水にて全量１００ｍｌの飲料を製した。
【００４５】
【発明の効果】
上記で詳述した本発明によれば以下の効果を奏する。本発明のガラナエキスは肝機能の治療と予防に用いることできるばかりか、悪性腫瘍の治療と予防にも用いることができ、さらに抗酸化作用と活性酸素消去能を有するので、加齢変化に伴う代謝機能の低下を予防ができ、医薬及び機能食品として極めて有用である。また、本発明のガラナエキスの製造方法は、ガラナ果実に含まれる親油性組成成分と親水性組成成分のいずれも高収率で回収でき経済性に優れるばかりか、種々の薬理活性を有する組成成分を取得でき操作が簡便で有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】肉腫癌細胞の移植２８日目に摘出された肉腫の写真像
【符号の説明】        
１：非投与対照群
２：低中分子組成成分画分液投与群
３：ガラナエキス投与群