(57)【要約】【課題】簡便で、高い純度で、標的物質に高い結合能を有するＲＮＡアプタマーなどのオリゴヌクレオチドを取得し得る方法を提供する。【解決手段】本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法は、核酸分子と標的物質とからなる核酸分子／標的物質複合体の電気泳動を行う工程と、該核酸分子／標的物質複合体の回収を行う工程と、該核酸分子／標的物質複合体から核酸分子の抽出を行う工程と、該核酸分子の遺伝子増幅を行う工程と、を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子と標的物質とからなる核酸分子／標的物質複合体の電気泳動を行う工程と、
該核酸分子／標的物質複合体の回収を行う工程と、
該核酸分子／標的物質複合体から核酸分子の抽出を行う工程と、
該核酸分子の遺伝子増幅を行う工程と、
を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドの取得方法。
【請求項２】
前記の電気泳動を行う工程は、少なくともアガロースゲルを用いた電気泳動を行う工程であることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの取得方法。
【請求項３】
当該オリゴヌクレオチドの取得方法は、アガロースゲルを用いて前記の電気泳動を行う工程と、ポリアクリルアミドゲルを用いて前記の電気泳動を行う工程とを有することを特徴とする請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドの取得方法。
【請求項４】
前記の電気泳動を行う工程に先立ち、前記核酸分子と前記標的物質とを接触させる工程をさらに有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの取得方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡアプタマーであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの取得方法。
【請求項６】
前記標的物質は、タンパク質であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡ等のオリゴヌクレオチドは、主としてタンパク質の合成に関与する分子種としての機能を主として有するものと考えられてきたが、リボザイムやＲＮＡｉといった、遺伝子との相互作用により機能発現を行う分子種が多数発見され、治療分野等への応用に注目が集まっている。なかでも、アプタマーは、近年、タンパク質などの高分子に結合して、その機能を改変し得る核酸として、注目されており、医薬品等への応用を目的として、新規のアプタマーが多く取得されている。【０００３】
ＲＮＡアプタマー等のアプタマーは、一般的に、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と称される方法で取得されている（特許文献１等参照）。ＳＥＬＥＸ法を用いてＲＮＡアプタマーを取得する場合、まず、タンパク質などの標的物質と、ランダムな配列を有するＲＮＡライブラリーとを結合させて、ＲＮＡ／標的物質の複合体を形成させる。このＲＮＡ／標的物質複合体は、次に、ニトロセルロース膜などのタンパク質吸着性のフィルムに結合される。この膜上には、ＲＮＡ／標的物質の複合体の他に、この複合体の形成に関与しなかったフリーのＲＮＡが含まれる。フリーのＲＮＡは、その後、膜上から緩衝液などで物理的に洗浄される。この膜を尿素等を有する緩衝液で処理することにより、膜上に残存したＲＮＡ／標的物質複合体から、所望するＲＮＡが得られる。このようにして得たＲＮＡを、各種ＰＣＲ法を用いて増幅して得た遺伝子産物について、上記の複合体形成、膜を介した洗浄／処理等の各工程を繰り返し行う。ＳＥＬＥＸ法は、このような工程を繰り返すことにより、標的物質に特異的に結合し得る遺伝子群を取得する方法である。【０００４】
ＳＥＬＥＸ法を用いたＲＮＡアプタマーなどのオリゴヌクレオチドを取得する方法では、上記の通り、ＲＮＡライブラリーなどのオリゴヌクレオチドライブラリーと標的物質とを結合させて得たオリゴヌクレオチド／標的物質の複合体を含む混合物をニトロセルロース膜等のタンパク質吸着性のフィルムに結合させる必要がある。これにより、この膜上には、オリゴヌクレオチド／標的物質の複合体が結合されることとなるが、それとともに、標的物質に結合し得ないオリゴヌクレオチド、つまり、この方法で取得の目的とはしないオリゴヌクレオチドをも、膜との非特異的な吸着により、膜上に結合されることとなる。従って、オリゴヌクレオチド／標的物質の複合体から所望するオリゴヌクレオチドのみを取得するため、所望しないオリゴヌクレオチドが膜上に残らず、且つオリゴヌクレオチド／標的物質の複合体が膜上に残存するように洗浄した後、膜から所望するオリゴヌクレオチドを抽出する工程がさらに必要となる。従って、所望しないオリゴヌクレオチドと、フィルムとの相互作用のみならず、所望しないオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチド／標的物質の複合体との相互作用に起因して、上記の洗浄工程及び抽出工程で、所望するオリゴヌクレオチドのみを効率よく得ることが困難となる。【０００５】
また、ＳＥＬＥＸ法では、標的物質に高い結合能を有するオリゴヌクレオチドを取得するには、一般的に上記の各工程を数から十数回繰り返す必要があり、コストや作業効率の面で、不利である。【０００６】
さらに、上記の洗浄／抽出工程には、濾過マニフォールドなどの機器を必要とし、大規模にオリゴヌクレオチドを取得するには、不向きである。
【特許文献１】特許２７６３９５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであり、簡便で、高い純度で、標的物質に高い結合能を有するＲＮＡアプタマーなどのオリゴヌクレオチドを取得し得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法は、核酸分子と標的物質とからなる核酸分子／標的物質複合体の電気泳動を行う工程と、該核酸分子／標的物質複合体の回収を行う工程と、該核酸分子／標的物質複合体から核酸分子の抽出を行う工程と、該核酸分子の遺伝子増幅を行う工程と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、コスト的に有利で、短時間で高い結合能を有するオリゴヌクレオチドを取得することが可能となる。【００１０】
また、従来では不可能であった、斯かるオリゴヌクレオチドを小規模で大量に取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】参考例１で得た電気泳動像である。
【図２】参考例２で得た電気泳動像である。
【図３】実施例２並びに比較例１及び２で得た可視化像である。
【図４】実施例２−１で得た第２世代のラジオアイソトープ図である。
【図５】実施例２−１で得た第３世代のラジオアイソトープ図である。
【図６】実施例２−１で得た第４世代のラジオアイソトープ図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法＞
本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法は、核酸分子と標的物質とからなる核酸分子／標的物質複合体の電気泳動を行う工程と、該核酸分子／標的物質複合体の回収を行う工程と、該核酸分子／標的物質複合体から核酸分子の抽出を行う工程と、該核酸分子の遺伝子増幅を行う工程と、を有することを特徴とする。以下、「核酸分子と標的物質とからなる核酸分子／標的物質複合体の電気泳動を行う工程」を、電気泳動工程と、「該核酸分子／標的物質複合体の回収を行う工程」を、回収工程と、「該核酸分子／標的物質複合体から核酸分子の抽出を行う工程」を、抽出工程と、「該核酸分子の遺伝子増幅を行う工程」を、増幅工程と、それぞれ称する。【００１３】
本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法は、電気泳動工程、回収工程、抽出工程及び増幅工程の各工程を行い、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの遺伝子産物を得、得た遺伝子産物について、必要に応じて、電気泳動工程以下の各工程を行い、核酸分子から、標的物質と結合し得るオリゴヌクレオチドを取得する方法である。【００１４】
（電気泳動工程）
本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法において、電気泳動工程は、一本鎖ＲＮＡなどの核酸分子と、タンパク質などの標的物質とからなる核酸分子／標的物質複合体を含む混合物を、アガロースゲルなどの適当な担体に導入し、担体に電圧を印加することにより、行われる。これにより、この混合物中に含まれる核酸分子と、核酸分子／標的物質複合体とは、担体中の移動度の違いにより分離される。【００１５】
本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法において、電気泳動工程は、効率よくオリゴヌクレオチドを取得し得る点で、少なくとも１〜３回、特に、１回、アガロースゲルを用いて行われることが好ましい。また、本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法において、最初に行う電気泳動工程は、アガロースゲルを用いて行うことが好ましい。これにより、非特異的に結合するＲＮＡ分子などの核酸分子を効率的に取り除くことが出来る。さらに、本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法において、アガロースゲルを用いて行う電気泳動工程と、ポリアクリルアミドゲルを用いて行う電気泳動工程とを有することが好ましい。これにより、アガロースゲル法では、操作が簡便でアプタマーなどの取得と対象となり得る候補を短時間で分画分取できる。ポリアクリルアミドゲル法では、このような候補をより特異的に分画分取できる。【００１６】
［核酸分子］
本発明において、核酸分子とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルなどのいわゆる核酸、及び／又は核酸類縁物質を有するヌクレオシドの糖部とリン酸とがエステル結合した、いわゆる遺伝子関連物質を総称する。例えば、核酸分子としては、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡなどが例示される。以下、特記しない限り、一本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡアプタマー）を取得対象とする場合について、説明する。【００１７】
この場合、核酸分子は、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵからなるランダムな配列を有する領域（以下、ランダム領域とも称する。）と、この領域の５’側及び３’側に、既知の配列を有する固定領域（以下、それぞれ、５’側固定配列及び３’側固定配列とも称する。）とを有すればよい。これらの固定配列は、本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法における下記の増幅工程の際、各種ＰＣＲ法等に必要なプライマー領域に相当する。【００１８】
このような核酸分子を簡便に取得するため、上記の一本鎖ＲＮＡ（５’側固定配列−ランダム領域−３’側固定配列）に相補的なＤＮＡを有する遺伝子を予め調製し、この遺伝子を使用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、核酸分子を調製してもよい。この際、使用するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター活性を発揮させ得る配列を、５’側固定配列に相補的な配列の上流に直結してもよい。【００１９】
核酸分子の５’側固定配列及び３’側固定配列は、核酸分子と標的物質との結合性への影響が少なく、且つ増幅工程での各種ＰＣＲ法等に必要なプライマー領域を提供する配列であれば、特に制約はない。核酸分子として一本鎖ＲＮＡを用いた場合、３’側固定配列は、増幅工程におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域を提供することとなり、５’側固定配列は、増幅工程におけるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域を提供することとなる。従って、５’側固定配列及び３’側固定配列は、これらのポリメラーゼの活性発現特性を考慮して、適宜選択してもよい。【００２０】
核酸分子のランダム領域は、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ（これらを総称して、配列表では、「ｎ」と称する。）からなる任意の塩基長を有する遺伝子である。この塩基長としては、取得対象となるオリゴヌクレオチドや、標的物質の特性に合わせて、種々変更すればよく、例えば、１５〜６０であってもよい。【００２１】
ランダム領域の作製方法としては、合成、半合成等、特に制約されるものではない。例えば、３４００ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ社製）など種々の核酸合成装置を用いて合成する方法や、天然由来の遺伝子産物をフェノール抽出等の公知の方法で抽出する方法や、このような遺伝子産物を種々の遺伝子切断酵素で切断して調製する方法などが挙げられる。【００２２】
なお、本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法において用いる核酸分子について、一本鎖ＲＮＡを例として説明したが、一本鎖ＲＮＡに限定されるものではなく、上記のその他の分子種については、分子種に応じて、配列、プライマー、酵素等を適宜選択して、核酸分子を調製すればよい。【００２３】
［標的物質］
標的物質とは、本発明において取得の対象とする物質を意味する。標的物質としては、オリゴヌクレオチドと、水素結合、イオン結合等の各種の分子間結合により、核酸分子と複合体を形成し得る分子、化合物、物質等を包含する。例えば、標的物質としては、ペプチド、タンパク質、糖蛋白質、ホルモン、成長因子、レセプター、抗原、抗体、核酸、多糖、炭水化物、合成化合物が挙げられる。【００２４】
［核酸分子／標的物質複合体］
核酸分子と標的物質とからなる核酸分子／標的物質複合体は、上記の核酸分子と標的物質とを、Ｔｒｉｓなどの緩衝液や、適当な溶媒中で一定時間インキュベートすることにより、調製される。この際、電気泳動工程の効率化を目的として、グリセロールなどの比重の高い溶液を添加することが好ましい。このような添加剤としては、グリセロール、サッカロース溶液等が挙げられる。このような添加剤の添加量としては、核酸分子／標的物質複合体の形成を阻害しない範囲であれば、特に限定されるものではなく、例えば、１０〜３０ｗ／ｖ％（反応液量の１０〜３０ｖ／ｖ％）が好ましい。また、核酸分子／標的物質複合体の形成を容易にすることを目的として、一価又は二価の陽イオンを添加してもよい。【００２５】
核酸分子／標的物質複合体の調製方法としては、特に限定されないが、上記の適用な溶媒中に、核酸分子及び標的物質を添加して、接触させることで行ってもよい。この接触は、この電気泳動工程を行うに際して、担体に導入する箇所で行ってもよく、また、担体に導入する前に、適当な容器中で行ったもよい。【００２６】
［担体］
本発明において、電気泳動工程に用いる担体としては、混合物中に含まれる核酸分子と核酸分子／標的物質複合体とをこの担体中で電気的に分離し得るものであれば、特に限定されない。例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、水溶性セルロースゲルが挙げられる。担体の濃度としては、担体中で核酸分子と核酸分子／標的物質複合体とを分離し得る濃度であれば、特に限定されない。例えば、担体としてアガロースを使用する場合、担体の濃度としては、０．５％〜２．０％が挙げられ、０．７％〜１．５％が好ましい。また、担体としてポリアクリルアミドゲルを用いる場合、担体の濃度としては、５〜２０％が挙げられ、７〜１２％が好ましい。【００２７】
電気泳動工程において、担体は、核酸分子、核酸分子／標的物質複合体等を帯電させ得る緩衝液に溶解して調製されればよい。この緩衝液としては、電気泳動に用い得る本技術分野公知の緩衝液を用いてもよく、例えば、Ｔｒｉｓ系、ＨＥＰＥＳ系が挙げられる。なかでも、アガロースゲルを用いて電気泳動工程を行う場合、例えば、ＴＢＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液）やＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液）が挙げられる。【００２８】
電気泳動工程における電気泳動は、担体中で核酸分子／標的物質複合体の結合状態を保持しつつ、核酸分子と核酸分子／標的物質複合体とが異なる移動度で担体中を移動し得るように、担体に導入された混合物に、適当な電圧を印加して行えばよい。電圧の範囲や、印加の時間としては、担体中での混合物の移動性を考慮して、種々選択すればよく、例えば、アガロースゲルを用いて電気泳動工程を行う場合、５０〜１５０Ｖで５分〜３０分程度行えばよい。ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動工程を行う場合、１００〜２００Ｖで１〜４時間程度行えばよく、核酸分子／標的物質複合体と、核酸分子／標的物質複合体の形成に関与しなかった核酸分子又は標的物質とが電気泳動的に分離し得る時間であればよい。また、電気泳動工程の温度としては、移動相が固化しない温度であれば特に制約はないが、２℃〜室温であってもよい。【００２９】
電気泳動工程を行う移動相としては、少なくとも核酸分子／標的物質複合体の結合状態を保持し得るものを用いればよく、Ｔｒｉｓなどの公知の緩衝液からなる溶媒が挙げられる。移動相には、必要に応じて、陽イオン、陰イオンなどの電解質を添加してもよく、核酸分子／標的物質複合体の結合状態を保持する点で、一価又は二価の陽イオンを有してもよい。【００３０】
このように担体中で核酸分子と分離された核酸分子／標的物質複合体は、後の回収工程へと供される。【００３１】
（回収工程）
本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法において、回収工程は、電気泳動工程で得た担体から、核酸分子／標的物質複合体の回収を行う工程である。回収工程は、核酸分子／標的物質複合体の担体中での存在形態に応じて、適宜選択すればよく、例えば、担体のウェルにピペット等の適当な分配装置又は器具を直接挿入して採取する方法や、核酸分子／標的物質複合体を含む担体をカッター等で切断して担体片として回収する方法が挙げられる。【００３２】
電気泳動工程後の担体に含まれる核酸分子／標的物質複合体は、電気泳動の条件に応じて、担体に混合物を導入したウェル及び／又はウェル近傍に位置している場合や、担体中でバンドを形成している場合等がある。【００３３】
核酸分子／標的物質複合体がウェルに位置している場合には、ピペット等の適当な分配手段を用いて、この手段をウェルに挿入して、核酸分子／標的物質複合体を直接採取すればよい。このような手法は、核酸分子／標的物質複合体がウェル近傍に位置している場合に適用されてもよい。この場合、核酸分子／標的物質複合体は、溶液状態で回収される。【００３４】
核酸分子／標的物質複合体がウェル近傍に位置している場合であっても、上記のような手法を用いることが困難である場合には、ウェル近傍の担体を適当な大きさの担体片に切断して、担体を伴った形態で核酸分子／標的物質複合体を回収してもよい。このような手法は、核酸分子／標的物質複合体が担体中でバンドを形成している場合にも適用できる。つまり、核酸分子／標的物質複合体が担体中に存在する場合には、核酸分子／標的物質複合体の存在する担体の一部をカッター等で切断して、担体を伴った状態で核酸分子／標的物質複合体を回収してもよい。【００３５】
回収工程において、これらの手法は、単一で用いてもよく、また、適宜組み合わせて用いてもよい。【００３６】
回収工程において、担体中での核酸分子／標的物質複合体の存在を確認する方法は、対象となる核酸分子及び／又は標的物質の物性に応じて、これらのものを視認し得る方法を適宜選択すればよい。【００３７】
例えば、担体中で核酸分子の存在を確認する方法としては、エチジウムブロマイド、サイバーグリーン等の染色試薬など、公知の遺伝子産物検出試薬により、可視化する方法が挙げられる。また、予め、３２Ｐ−ＡＴＰなどの放射性化合物や、フルオレセイン、Ｃｙ５などの蛍光試薬を用いて核酸分子を標識しておき、これを検出する方法であってもよい。【００３８】
また、担体中で標的物質の存在を確認する方法としては、標的物質としてタンパク質を用いる場合には、銀染色、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色などのタンパク質を可視化する方法が挙げられる。【００３９】
このように回収された核酸分子／標的物質複合体は、後の抽出工程へと供される。【００４０】
（抽出工程）
本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法において、抽出工程は、回収工程で回収された核酸分子／標的物質複合体から、核酸分子の抽出を行う工程である。抽出工程は、上記の回収工程で得た核酸分子／標的物質複合体の存在形態（溶液状態、担体を伴った状態等）に応じて、適宜、行えばよく、例えば、フェノール抽出、エタノール沈殿、ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎなどの本技術分野公知の遺伝子回収方法が挙げられる。【００４１】
核酸分子／標的物質複合体が溶液状態で回収された場合、フェノール抽出や、エタノール沈殿などを用いて、核酸分子／標的物質複合体から核酸分子を抽出すればよい。核酸分子／標的物質複合体が担体を伴った状態で回収された場合、標的物質の分子量等を考慮した適当なカットオフ値を有するｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎを用いて、核酸分子／標的物質複合体から核酸分子を抽出すればよい。【００４２】
このようにして抽出された核酸分子は、後の増幅工程に供される。【００４３】
（増幅工程）
本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法において、増幅工程は、抽出工程までで得られた核酸分子の増幅を行う工程である。増幅工程は、抽出工程で得た核酸分子を、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写等の各種ＰＣＲ法を用いて、遺伝子増幅を行う工程である。増幅工程は、核酸分子の５’末端及び３’末端に含まれる固定配列を利用して、これら固定配列に相補的に結合するプライマーを用いて、行えばよい。例として、一本鎖ＲＮＡを用いた増幅工程について説明する。【００４４】
まず、抽出工程で得た一本鎖ＲＮＡと、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）などのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）と、一本鎖ＲＮＡの３’末端の固定配列に相補的なプライマーとをインキュベートして、この一本鎖ＲＮＡに相補的なＤＮＡを増幅する。増幅された相補的なＤＮＡは、その後、この相補的なＤＮＡに含まれる５’側固定配列及び３’側固定配列に相補的なプライマーと、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを用いて、二本鎖ＤＮＡにさらに増幅される。その後、この二本鎖ＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどの公知のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、一本鎖ＲＮＡに転写される。【００４５】
このようにして、標的物質に結合し得る対象となる核酸分子は、電気泳動工程、回収工程、抽出工程及び増幅工程を経て、特異的に増幅され、高収量で取得される。【００４６】
核酸分子として一本鎖ＲＮＡを例示したが、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ等の他の核酸を核酸分子として用いる場合には、増幅する対象の核酸分子に応じて各種ポリメラーゼ、プライマー等を適宜選択して、増幅工程を行えばよい。【００４７】
このようにして転写された核酸分子は、本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法により得たオリゴヌクレオチドとしてもよい。また、この核酸分子は、必要に応じて、標的物質を用いて、上記の各工程を繰り返してもよい。【００４８】
（その他の工程）
本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法は、上記の電気泳動工程に加えて、上記のＳＥＬＥＸ法に準じた膜を用いた工程をさらに有してもよい。このSELEX法に準じた膜を用いた工程は、従来技術に記載の通りである。
【実施例】
【００４９】
（参考例１）
２００ｎＭのオリゴヌクレオチド（配列番号１）と、０、２００ｎＭ、２μＭ及び４μＭのＣ型肝炎ウィルスのＮＳ３プロテアーゼに由来のΔＮＳ３タンパク質（配列番号２）のＮ末端側に６個のヒスチジン残基を有するＨｉｓ−Ｔａｇが結合したもの（以下、単に、ΔＮＳ３タンパク質と称する。）とを、終濃度２０％グリセロールの結合バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＣａＣｌ２）溶液中（反応量２０μＬ）、室温で２０分間、インキュベーションを行った。【００５０】
得た混合物を、０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％のアガロースゲルのウェルに導入し、ＴＢＥ緩衝液（４４．５ｍＭＴｒｉｓ、４４．５ｍＭホウ酸、ＥＤＴＡ（１ｍＭ、ｐＨ８．０））中、１００Ｖで７分間、電気泳動を行った。このゲルを１％のエチジウムブロマイド溶液に浸漬し、ＵＶイルミネーターで観察した。結果を図１に示す。図１中、レーン１は、ｔＲＮＡ、レーン２は、なし、レーン３〜６は、２００ｎＭのオリゴヌクレオチドとΔＮＳ３タンパク質とを含む混合物であって、それぞれ、０、２００ｎＭ、２μＭ及び４μＭのΔＮＳ３タンパク質に対応する。【００５１】
（参考例２）
参考例１において、０、２００ｎＭ、２μＭ及び４μＭのΔＮＳ３タンパク質に代えて、２μＭのΔＮＳ３タンパク質と、０、２００ｎＭ、１μＭ及び２μＭのｔＲＮＡ（商品名：１０  １０９  ５４１  ００１（Ｒｏｃｈｅ社製））とを含むように用いた以外は、参考例１と同様に行い、ゲルを観察した。結果を図２に示す。図２中、レーン１は、ｔＲＮＡ、レーン２は、なし、レーン３〜６は、２００ｎＭのオリゴヌクレオチドと２００ｎＭのΔＮＳ３タンパク質とｔＲＮＡとを含む混合物であって、それぞれ、０、２００ｎＭ、１μＭ及び２μＭのｔＲＮＡに対応する。【００５２】
（実施例１）
標的物質として、２００ｎＭのΔＮＳ３タンパク質を用いて、下記の［ゲル法］を５世代まで行った。その後、各世代の二本鎖ＤＮＡ産物を用いて、下記の［放射標識］を行い、放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。この転写物と、０ｎＭ（タンパク質なし）、５０ｎＭ及び１００ｎＭのΔＮＳ３タンパク質とを用いて、下記の［結合実験］を行った。得た放射強度の数値を表１に示す。【００５３】
（実施例２）
標的物質として、１μＭのマウスＩｇＧ（カタログ番号３Ｄ３（Ｈｙｔｅｓｔ社製））を用いて、下記の［ゲル法］を１世代行った後、下記の［ＳＥＬＥＸ法］を３世代行った。その後、最後の世代で得た二本鎖ＤＮＡ産物を用いて、下記の［放射標識］を行い、放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。この転写物と、標的物質として０ｎＭ、５０ｎＭ及び１００ｎＭのマウスＩｇＧ、０ｎＭ、５０ｎＭ及び１００ｎＭのｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）（カタログ番号Ｅ８０４４Ｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ社製））並びに０ｎＭ、５０ｎＭ及び１００ｎＭの精製グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（研究室で調製したもの）とを用いて、下記の［結合実験］を行った。得た放射強度の可視化像を図３に示し、その数値を表２に示す。【００５４】
（比較例１）
標的物質として、１μＭのマウスＩｇＧを用いて、下記の［ＳＥＬＥＸ法］を４世代行った。その後、最後の世代で得た二本鎖ＤＮＡ産物を用いて、下記の［放射標識］を行い、放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。この転写物と、実施例２に記載の標的タンパク質とを用いて下記の［結合実験］を行った。得た放射強度の可視化像を図３に示し、その数値を表２に示す。【００５５】
（比較例２）
比較例１において、４世代の［ＳＥＬＥＸ法］に代えて、７世代の［ＳＥＬＥＸ法］を行った以外は、比較例１と同様に行った。結果を図３及び表２に示す。【００５６】
［ＲＮＡプールの調製］
配列番号３に示すＤＮＡを、ＤＮＡ合成装置（３３４ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製））で合成した。このプール（約１０μＭ）と、５’端Ｔ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列を有するプライマーの塩基配列（配列番号４）とを、ＤＮＡポリメラーゼ存在下で反応させ、Ｔ７プロモーターが附加するようにした。その後、得られた二本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行い、ＲＮＡプール（配列番号５）を得た。【００５７】
［ゲル法］
２００ｎＭ〜２０μＭのＲＮＡプールを、結合バッファに添加し、室温で５分間放置した。その後、この液に、金属イオン（終濃度５ｍＭ  Ｍｇ２＋）と、終濃度が２０％となるようにグリセロールとを添加し、さらに、標的物質を添加し、室温で１０分間放置した。【００５８】
この混合物を、予めウェルの周辺に切り込みを入れた１％アガロースゲルのウェルに導入し、ＴＢＥ緩衝液中、１００Ｖで７分間、電気泳動を行った。【００５９】
電気泳動後のウェル中の溶液を回収するとともに、切り込みを入れたアガロースゲル片から、ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（商品名：Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ（ミリポア社製））を用いて、オリゴヌクレオチド溶液を回収した。ウェル中の溶液と、アガロースゲル片から回収したオリゴヌクレオチド溶液とを合わせて、エタノール沈殿を行い、オリゴヌクレオチドを得た。【００６０】
なお、これまでの工程、並びにこのオリゴヌクレオチドを用いて行う下記の［ＲＴ］から［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写］までの工程を１世代とする。また、次の世代からは、ＲＮＡプールに代えて、直前の世代で得たｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を用いて、当該次の世代の各工程を行った。【００６１】
［ＳＥＬＥＸ法］
２０μＭのＲＮＡプールと、標的物質とを、結合バッファ中で混合し、この混合物を、ポップトップホルダーに固定したニトロセルロース膜に導入してろ過し、膜を１ｍＬの結合バッファで洗浄した。その後、この膜を２００μＬの溶離液（０．４Ｍ酢酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、７Ｍ尿素（ＰＨ５．５））に浸漬して、９０℃、５分間加温した。得た液にエタノール沈殿を施し、オリゴヌクレオチドを得た。【００６２】
なお、これまでの工程、並びにこのオリゴヌクレオチドを用いて行う下記の［ＲＴ］、［ＰＣＲ］及び［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写］までの工程をＳＥＬＥＸ法の１世代とする。また、次の世代からは、ＲＮＡプールに代えて、直前の世代で得たｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を用いて、当該次の世代の各工程を行った。【００６３】
［ＲＴ］
回収した全オリゴヌクレオチドと、プライマー１（配列番号６）と、Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｉＴ  ＲＴａｓｅ  Ｂｌｅｎｄ（ＡＢｇｅｎｅ社製）とを用いて、逆転写反応を４２℃、１時間行った。【００６４】
［ＰＣＲ］
逆転写反応の反応産物の全量と、６０ｐｇのプライマー２（配列番号７）と、プライマー３（配列番号８）とを用いて、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社製ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ｅｎｚｙｍｅにより、９５℃×３０秒、５５℃×３０秒及び７２℃×３０秒の順で行うサイクルを１サイクルとして、１８サイクルでＰＣＲ反応を行い、二本鎖ＤＮＡ産物を得た。【００６５】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写］
ＰＣＲ反応で得た二本鎖ＤＮＡ産物（０．５μｇ）と、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（商品名：Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）、使用量１μＬ）とを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。【００６６】
［放射標識］
上記の二本鎖ＤＮＡ産物を用いて、α−３２Ｐ−ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）存在下で、上記の［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写］を行い、放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。【００６７】
［結合実験］
放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物と、標的タンパク質とを、結合バッファ中、室温で１０分間インキュベーションを行った。【００６８】
得た混合物を、サッカーを用いて吸引したフィルター（商品名：ＭＦ?メンブレンフィルター（ミリポア社製））上に導入し、その後、混合物の２０倍量の結合バッファで、このフィルターを洗浄した。このようにして得たフィルターの放射強度を、ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製バイオ・イメージングアナライザー（ＢＡＳ−２５００（イメージングプレートとして、ＢＡＳ−ＭＳ２０４０を使用））を用いて、測定した。なお、放射強度は、ＩｍａｇｅＲｅａｄｅｒ（同前）で可視化し、得たデータをＩｍａｇｅＧａｕｇｅ  ｖｅｒ．  ４．０（同前）を用いて数値化した。【００６９】
【表１】
2008015884.tif 000002
【００７０】
【表２】
2008015884.tif 000003
【００７１】
なお、表１及び表２の数値は、いずれも、［結合実験］前の放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物の１／５量の放射強度を２０％としたときの百分率を示す。【００７２】
実施例１において、１世代目のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物の遺伝子配列を解析したところ、単離抽出したクローンのうち、４３％の配列が同一であった。また、３世代目のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物の遺伝子配列を解析したところ、単離抽出したクローンのうち、６６％の配列が同一であった。【００７３】
一方、実施例１において［ゲル法］に代えて［ＳＥＬＥＸ法］を用いて同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物についての配列の同一性について検討したところ、１世代目及び３世代目のいずれにおいても、ターゲット配列は検出限界以下であり、いずれも、実施例１で得た値よりも、有意に低値であった。【００７４】
また、実施例２で得た二本鎖ＤＮＡ産物に対応するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物について、配列の同一性を検討したところ、約６６％であった。【００７５】
（実施例２−１）
標的物質として、５０ｐＭのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ；配列番号９）を用いて、下記の［ゲル法２］を１世代行った。【００７６】
この１世代目の放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を用いて、下記の［ＰＡＧＥ法］を３世代分（先の世代と合わせて、２、３及び４世代）行った。２世代、３世代及び４世代で得たポリアクリルアミドゲルのラジオアイソトープ図をそれぞれ、図４、図５及び図６に示す。【００７７】
図４中、レーンＰは、ＲＮＡプール２のみを、レーン１及び２は、マウスＩｇＧとそれに対応するＲＮＡアプタマーとを、レーン３は、ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ−ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣｐＹＧＦＰ；配列番号１５）のみを、レーン４は、ＭＰＯのみを、レーン５は、ＭＰＯ、ＣｐＹＧＦＰ及びＭＢＰを混合したものを、それぞれ用いて得た放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物に対応する。また、図５中、レーンＰは、ＲＮＡプール２のみを、レーン１は、マウスＩｇＧとそれに対応するＲＮＡアプタマーとを、レーン２は、ＣｐＹＧＦＰのみを、レーン３は、ＭＰＯのみを、レーン４は、ＭＰＯ、ＣｐＹＧＦＰ及びＭＢＰを混合したものを、それぞれ用いて得た放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物に対応する。図６中、レーンＩは、上記マウスＩｇＧに対するＲＮＡアプタマーを、レーンＩＩは、マウスＩｇＧとそれに対応するＲＮＡアプタマーとを、レーンＩＩＩは、ＣｐＹＧＦＰのみを、レーンＩＶは、ＣｐＹＧＦＰから得た放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物とＭＰＯとを、レーンＶは、ＭＰＯから放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物とＭＰＯとを、それぞれ用いて得た図を示す。また、図４乃至図６において、点線で囲んだ領域は、採取したゲルを示す。【００７８】
［ＲＮＡプールの調製２］
上記の［ＲＮＡプールの調製］において、配列番号３に示すＤＮＡに代えて、配列番号１０に示すＤＮＡを用いた以外は、上記の［ＲＮＡプールの調製］と同様に行い、二本鎖ＤＮＡを得、この二本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行い、ＲＮＡプール２（配列番号１１）を得た。【００７９】
［ゲル法２］
５００ｐＭのＲＮＡプール２を、結合バッファ２（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び２０％のグリセロール）に加え、さらに、標的物質を添加し、室温で３０分間放置した。【００８０】
この混合物について、上記の［ゲル法］と同様に行い、オリゴヌクレオチドを得た。【００８１】
なお、これまでの工程、並びにこのオリゴヌクレオチドを用いて行う下記の［ＲＴ２］、［ＰＣＲ２］及び［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写］までの工程を１世代とする。また、次の世代からは、ＲＮＡプール２に代えて、直前の世代で得たｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を用いて、当該次の世代の各工程を行った。【００８２】
［ＰＡＧＥ法］
上記の［ゲル法２］において、５００ｐＭのＲＮＡプールを、直前の世代で得た放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物に代え、１％アガロースゲルを、ポリアクリルアミドゲル（８％、４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．４５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に代え、ＴＢＥ緩衝液を、Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．４５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に代えて、１６０Ｖ（ＣＶ）、４℃で２時間電気泳動を行った。【００８３】
電気泳動後のゲルの放射標識を検出するように、Ｘ線フィルムで感光させて観察しながら、ゲルシフトが観察された相当部分のバンドを切り出し緩衝液中に浸透して自由拡散によりＲＮＡ分子を緩衝液中に抽出し、アルコール沈殿法などを用いて効率的にオリゴヌクレオチドを得た。また、このオリゴヌクレオチドを用いて、［ゲル法２］と同様に行った。【００８４】
［ＲＴ２］
上記の［ＲＴ］において、プライマー１（配列番号６）に代えて、プライマー１１（配列番号１２）を用いた以外は、上記の［ＲＴ］と同様に逆転写反応を行った。【００８５】
［ＰＣＲ２］
上記の［ＰＣＲ］において、プライマー２（配列番号７）、及びプライマー３（配列番号８）を、プライマー１２（配列番号１３）、及びプライマー１３（配列番号１４）にそれぞれ代えた以外は、上記の［ＰＣＲ］と同様に行い、二本鎖ＤＮＡ産物を得た。【００８６】
（実施例２−２）
実施例２−１で得た第４世代のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物について、ＴＡクローニングを行い、クローニングした５０コロニーの塩基配列を分析したところ、配列番号１６及び１７のオリゴヌクレオチドを得た。【００８７】
これらのオリゴヌクレオチドに対応する放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物について、上記の［結合実験］を行った。この結合実験からそれぞれのオリゴヌクレオチドのＫｄ値、及びＢｍａｘを出したところ、表３の通りであった。【００８８】
【表３】
2008015884.tif 000004
【００８９】
（実施例２−３）
放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物として、配列番号１６、及びＲＮＡプール２に対応するものを用い、標的タンパク質として、０、５０、及び１００ｎＭのＭＰＯ、及び１００ｎＭのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用い、上記の［結合実験］を行った。その結果を表４に示す。【００９０】
【表４】
2008015884.tif 000005
【００９１】
なお、表４中、それぞれの値は、ｎ＝３で行って得たものであり、＊印は、ＲＮＡプール２で得た値に対して危険率５％以下の有意差を有することを示す。【００９２】
これらのことは、本発明によるオリゴヌクレオチドの取得方法は、標的物質に結合し得るオリゴヌクレオチドを効率よく取得し得ることを示すものである。【００９３】
以上、本発明の好適な実施の形態により本発明を説明した。ここでは特定の具体例を示して本発明を説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の広範な趣旨および範囲から逸脱することなく、これら具体例に様々な修正および変更を加えることができることは明らかである。すなわち、具体例の詳細および添付の図面により本発明が限定されるものと解釈してはならない。
【図１】
2008015884.tif 000006
【図２】
2008015884.tif 000007
【図３】
2008015884.tif 000008
【図４】
2008015884.tif 000009
【図５】
2008015884.tif 000010
【図６】
2008015884.tif 000011
【配列表】
2008015884000001.app
【国際調査報告】
2008015884.tif 000012
2008015884.tif 000013
2008015884.tif 000014
2008015884.tif 000015