(57)【要約】  本発明は、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性、即ちＬ−ロイシンを（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンに変換する活性を有する新規蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた該蛋白質、および（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの製造法に関する。本発明によれば、医薬品など各種有用物質製造における出発原料としての利用が期待できる（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの生物または酵素等を利用した製造方法が提供される。本発明によれば、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを効率的に製造することができる。
2008013262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記からなる群より選択される、蛋白質：
（ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、蛋白質、
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する、蛋白質、および
（ｃ）  配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する、蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２で表される塩基配列を有する、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
下記からなる群より選択される、ＤＮＡ：
(i)  配列番号２で表される塩基配列を有する、ＤＮＡ、
(ii)  配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ、
(iii)  配列番号２において、１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ、および
(iv) 配列番号２で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項５】
ＤＮＡが藍藻（Cyanobacteria）に属する微生物由来のＤＮＡである、請求項３または４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
藍藻に属する微生物由来のＤＮＡが、ノストック（Nostoc）属に属する微生物由来のＤＮＡである、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
ノストック（Nostoc）属に属する微生物が、ノストック・パンクチフォルム（Nostoc punctiforme）である、請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号３で表される塩基配列を有する、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
下記からなる群より選択される、ＤＮＡ：
(I)  配列番号３で表される塩基配列を有する、ＤＮＡ、
(II)  配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ、
(III)  配列番号３において、１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ、および
(IV) 配列番号３で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項２〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる、組換えＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる、形質転換体。
【請求項１２】
宿主細胞がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
宿主細胞がストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）である、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１４】
Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼを発現する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の形質転換体を、培地を用いて培養して、培養物中にＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質を生成し蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを含んでなる、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質の製造方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源とＬ−ロイシンとを水性媒体中に存在せしめて、該水性媒体中で（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを生成し蓄積させ、該水性媒体中から（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを採取することを含んでなる、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの製造法。
【請求項１７】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的磨砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物、または該菌体より抽出して得られる酵素標品である、請求項１６に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国特許出願である特願２００６−２０５７５５号（出願日：２００６年７月２８日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ、即ちＬ−ロイシンを（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンに変換する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いるＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質の製造法、および該形質転換体を用いる（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの製造法に関する。
【０００３】
背景技術
（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンは、非天然型アミノ酸で、かつ光学活性異性体であることから、医薬品など各種有用物質製造における出発原料としての利用が期待される。この物質の製造方法としては、化学合成による方法が報告されているのみであり（J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,Organic and Bio-Organic Chemistry,8,2075(1988)；  J.Org.Chem.,68,83(2003)）、生物または酵素等を利用して製造する方法については、本発明者らの知る限りこれまで報告されていない。
【０００４】
（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンは、藍藻の一種であるNostoc sp. GSV224が生産するポリペプチド（nostopeptolide A1 および nostopeptolide A2）の生合成経路中において、生合成中間体として存在することが予想されている（J.Org.Chem.,68,83(2003)；  Gene,311,171(2003)）。しかしながら、Nostoc sp. GSV224においてＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子の特定は行われておらず、そのような示唆もされていない。また、その他の生物においても、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する酵素および該酵素をコードする遺伝子について、本発明者らの知る限り、これまで報告されていない。
【０００５】
藍藻の一種であるNostoc sp. ATCC29133株は、そのＤＮＡの塩基配列が解析されている。しかしながら、ここではＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子の特定は行われておらず、またその存在の示唆もこれまで行われていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは今般、藍藻に属する微生物、詳しくはノストック（Nostoc）属に属する微生物（Nostoc sp. ATCC29133株）由来のＤＮＡを用いて機能解析した結果、これまで特定されていなかった新規Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡを予想外にも見出し、該ＤＮＡを取得することに成功した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００７】
よって本発明は、医薬品など各種有用物質製造における出発原料となりうる（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを得るため、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する新規蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた上記蛋白質、および（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの製造法を提供することをその目的とする。
【０００８】
本発明による蛋白質は、下記からなる群より選択されるものである：
（ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、蛋白質、
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する、蛋白質、および
（ｃ）  配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する、蛋白質。
【０００９】
本発明によるＤＮＡは、本発明による蛋白質をコードするものである。好ましくは、このＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を有する。
【００１０】
また別の態様によれば、本発明によるＤＮＡは、下記からなる群より選択されるものである：
(i)  配列番号２で表される塩基配列を有する、ＤＮＡ、
(ii)  配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ、
(iii)  配列番号２において、１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ、および
(iv) 配列番号２で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡは、藍藻（Cyanobacteria）に属する微生物由来のものである。より好ましい態様によれば、藍藻に属する微生物由来のＤＮＡは、ノストック（Nostoc）属に属する微生物由来のＤＮＡである。本発明のさらに好ましい態様によれば、前記したノストック（Nostoc）属に属する微生物は、ノストック・パンクチフォルム（Nostoc punctiforme）である。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、本発明によるＤＮＡは、本発明による蛋白質をコードするものであって、配列番号３で表される塩基配列を有するものである。
【００１３】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明によるＤＮＡは、下記からなる群より選択されるものである：
(I)  配列番号３で表される塩基配列を有する、ＤＮＡ、
(II)  配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ、
(III)  配列番号３において、１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ、および
(IV) 配列番号３で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ。
【００１４】
本発明による組換えＤＮＡは、本発明によるＤＮＡをベクターに組み込んで得られる。
【００１５】
本発明による形質転換体は、本発明による組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる。ここで、宿主細胞は好ましくは、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）であり、より好ましくは、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）である。また本発明による形質転換体は好ましくは、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼを発現するものである。
【００１６】
本発明によるＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質の製造方法は、本発明による形質転換体を、培地を用いて培養して、培養物中にＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質を生成し蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを含んでなる。
【００１７】
本発明による（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの製造法は、本発明による形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源とＬ−ロイシンとを水性媒体中に存在せしめて、該水性媒体中で（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを生成し蓄積させ、該水性媒体中から（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを採取することを含んでなる。ここで、培養物の処理物は、好ましくは、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的磨砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物、または該菌体より抽出して得られる酵素標品である。
【００１８】
本発明はまた、下記の通りのものであることができる：
（１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質；
（２）  Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する（１）記載の蛋白質；
（３）  配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質；
（４）  前記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ；
（５）  配列番号２で表される塩基配列を有する（４）に記載のＤＮＡ；
（６）  配列番号３で表される塩基配列を有する（４）に記載のＤＮＡ；および
（７）  配列番号２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００１９】
（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンは非天然型アミノ酸であり、かつ光学活性異性体であることから、医薬品など各種有用物質製造における出発原料としての利用が期待されており、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの効率的なその製造法が強く望まれている。本発明によれば、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼを大量に取得することが可能となる。本発明により得られる該酵素を用いることによって、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図は、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ発現プラスミドｐｎｏｓ５Ａの造成工程を示す。  なお、本願の図中において、「Ａｍｐ」は、アンピシリン耐性遺伝子、「Ｋｍ」は、カナマイシン耐性遺伝子、「Ａｐｒ」は、アプラマイシン耐性遺伝子、「ｎｏｓ５」は、ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子、「ｎｏｓ５−ＧＣ」は、ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子（化学合成）、および「ｔｉｐＡｐ」はｔｉｐＡプロモーターをそれぞれ表す。
【図２】図は、化学合成した遺伝子断片を作成して構築した、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ発現プラスミドｐｎｏｓ５Ｄの造成工程を示す。
【図３】図は、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ発現プラスミドｐｎｏｓ５Ｅの造成工程を示す。
【発明の具体的説明】
【００２１】
Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ
本発明によるＬ−ロイシンヒドロキシラーゼとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質を挙げることができる。
【００２２】
ここで、「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、１つ若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を与えないアミノ酸配列を意味する。改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜８個、最も好ましくは１〜４個である。
【００２３】
ここで「ポリペプチドの活性」とは、Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有することをいう。「Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する」とは、Ｌ−ロイシンを（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンに変換することができる活性を有していることを言う。この活性については、慣用の方法にしたがって測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって測定することができる。
【００２４】
本発明でいう「活性に影響を与えない改変」の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００２５】
なお、アミノ酸の失、置換、付加および／または挿入による改変は、例えばそれをコードするＤＮＡに、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）を施すことにより行うことが出来る。他の方法としては、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、挿入および／または置換し、次いで連結する方法などがある。
【００２６】
前記した「実質的に同等なアミノ酸配列」には、さらにそのＮ末端（アミノ末端）およびＣ末端（カルボキシル末端）が改変または修飾されているものが包含されてもよい。例えば、Ｃ末端のカルボキシルが、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）とされていてもよい。なおここで前記Ｒは、例えば直鎖、分岐鎖もしくは環状のＣ１−６アルキル基、Ｃ６−１２アリール基等が挙げられる。
【００２７】
また「配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列」には、配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が包含され得る。ここで、相同性の割合は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。なお本明細書においては「相同性」は「同一性」の意味で使用され得る。
【００２８】
本明細書において、「相同性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば、相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）（全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ）より入手可）において、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
【００２９】
Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ
本発明によるＤＮＡとしては、本発明による蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号２または３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号２または３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
なお、本明細書においては、「ＤＮＡ」（デオキシリボ核酸）は、必要によりポリヌクレオチドと言い換えて使用してもよい。
【００３０】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡなどの本発明によるＤＮＡまたはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、該ＤＮＡとしては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Cloning 1：Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University(1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３１】
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、具体的には、上記アルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて計算した場合に例えば配列番号２で表される塩基配列に少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
このため、本発明によるＤＮＡには、例えば、配列番号２または３で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが包含され得る。
【００３２】
本発明によるＤＮＡとしてはまた、配列番号２または３において、１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡも包含されうる。ここで、欠失、置換、挿入もしくは付加されてもよい塩基の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個である。なおここでいう置換には、アミノ酸翻訳変異を伴なう置換およびアミノ酸翻訳変異を伴わない置換のいずれもが包含される。
【００３３】
Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼの特定
Gene,311,171(2003)において、藍藻の一種であるNostoc sp. GSV224が生産するポリペプチド（nostopeptolide A1 および nostopeptolide A2）の生合成経路中に、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンが生合成中間体として存在することが予想されている。しかしながら、Nostoc sp. GSV224においてＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子の特定に関する報告および示唆は報告されていない。
【００３４】
前記生合成経路において（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを経由している可能性、および、Nostoc sp. GSV224の配列情報をもとに、ノストック（Nostoc）属に属する微生物を解析しＬ−ロイシンヒドロキシラーゼを特定した。すなわち、機能が未知であるＯＲＦがロイシンの水酸化に寄与してると予測し、Nostoc sp. ATCC29133株において相同性の高いＤＮＡ配列を単離、取得することにより本発明を完成するに至った。
【００３５】
Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡの取得
本発明のＬ−ロイシンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下の方法によりノストック（Nostoc）属に属する微生物、好ましくはNostoc sp. ATCC29133株から単離することができる。また、開示されているNostoc sp. ATCC29133の配列をもとに人工的に化学合成することも可能である。
【００３６】
ノストック（Nostoc）属に属する微生物は、公知の方法［例えば、Microbiology,140,3233(1994)］により培養することができる。さらに、培養後の菌体から公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・モレキュラー・バイオロジー）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製することができる。また、ノストック・エスピー（Nostoc sp.）ATCC29133株については、そのゲノムＤＮＡがATCC29133DとしてＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）より市販されており、入手することができる。
【００３７】
ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素にて消化後、適当なベクターと連結することにより、ノストック（Nostoc）属に属する微生物のゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター等、多様なものが使用できる。
【００３８】
次に、本明細書において開示したＬ−ロイシンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて適当なプローブを作成し、ゲノムＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションによって所望のカナマイシン生合成遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することができる。また、本明細書において開示したＬ−ロイシンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて所望の遺伝子を増幅させるためのプライマーを作成し、ノストック（Nostoc）属に属する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することにより所望の遺伝子を単離することができる。更に、本発明によるＬ−ロイシンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡは、プラスミドｐｎｏｓ５／ｐＥＴ２４およびプラスミドｐｎｏｓ５−ＧＣ１／ｐＴＡ２およびｐｎｏｓ５−ＧＣ２／ｐＴＡ２に含まれていることから、これらをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして利用することが可能である。また、これらプラスミドから適当な制限酵素にて所望のＤＮＡ断片を調製することができる。
【００３９】
微生物の寄託
プラスミドｐｎｏｓ５Ａで形質転換された大腸菌（Escherichia coli）（Escherichia coli BL21(DE3)/pnos5A）は、平成１８（２００６）年６月１６日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８４５である。
プラスミドｐｎｏｓ５Ｄで形質転換された大腸菌（Escherichia coli）（Escherichia coli BL21(DE3)/pnos5D）は、平成１８（２００６）年６月１６日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８４６である。
プラスミドｐｎｏｓ５Ｅで形質転換された放線菌（Streptomyces lividans）（Streptomyces lividans /pnos5E）は、平成１８（２００６）年６月１６日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８４７である。
【００４０】
Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼの製造方法
本発明によるＬ−ロイシンヒドロキシラーゼは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等にしたがって、本発明のＬ−ロイシンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡを、宿主細胞において発現させることによって製造することができる。
【００４１】
本発明によるＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
【００４２】
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えＤＮＡを作製する。
【００４３】
該組換えＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
【００４４】
宿主細胞としては、細菌、放線菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。好ましくは、放線菌Streptomyces、大腸菌Escherichia coli等があげられ、さらに好ましくは放線菌Streptomyces等が挙げられる。
【００４５】
組換えＤＮＡとしては、上記宿主細胞において自立複製ないしは染色体中への組み込みが可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００４６】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有してなる組換えＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換えＤＮＡであることが好ましい。また、該組換えＤＮＡには、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。
【００４７】
発現ベクターとしては、ｐＴＡ２（東洋紡績株式会社製）、Ｈｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ２４（ノバジェン社製）、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９［Gene,33,103(1985)］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造株式会社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）、ｐＩＪ６９０２［Mol.Microbiol.,58,1276(2005)］、ｐＳＥＴ１５２［J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,4、417(2002)］等を例示することができる。好ましくは、ｐＴＡ２、ｐＥＴ２４、ｐＩＪ６９０２、ｐＵＣ１１８やｐＳＥＴ１５２等が挙げられ、さらに好ましくはｐＴＡ２、ｐＥＴ２４やｐＩＪ６９０２等が挙げられる。
【００４８】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能し得るものであれば特に制限はなく、いずれのものでも使用可能である。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、Ｔ７プロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｔｉｐＡプロモーター［J.Bacteriol.,171,1459(1989)］、ｅｒｍＥ＊プロモーター［Gene,38,215(1985)］等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。好ましくは、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ｅｒｍＥ＊プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｉｐＡプロモーター等が挙げられ、さらに好ましくはｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）やｅｒｍＥ＊プロモーター等が挙げられる。
【００４９】
本発明においては、ベクターとして、リボゾーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００５０】
本発明の組換えＤＮＡにおいて、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００５１】
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ストレプトミセス属等に属する微生物、が挙げられ、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3726、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Serratia amyloliquefaciens、Brevibacterium immariophilum、Brevibacterium saccharolyticum、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium acetoacidophilum、Microbacterium ammoniaphilum、Streptomyces lividans、Streptomyces coelicolor等を挙げることができる。好ましくは、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli JM109、Streptomyces lividans等が挙げられ、さらに好ましくはEscherichia coli JM109、Streptomyces lividans等が挙げられる。
【００５２】
組換えＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Nucleic Acids Res.,15,6127(1988)］、コンジュゲーション法［J.Bacteriol.,171,3585(1989)］等を挙げることができる。
【００５３】
ここで、宿主細胞として酵母菌株を用いる場合を例に説明する。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
【００５４】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＫＧプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００５５】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、Saccharomyces cervisiae、Shizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、Candida utilis等を挙げることができる。
【００５６】
組換えＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Methods Enzymol.,194,182(1990)］、スフェロプラスト法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,4889(1984)］、酢酸リチウム法［J.Bacteriol.,153,163(1983)］等を挙げることができる。
【００５７】
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５８】
大腸菌・放線菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
【００５９】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであれば良く、グルコース、フルクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００６０】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００６１】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００６２】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うのが好ましい。培養温度は１５〜４０℃が好ましく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム等を用いて行う。
【００６３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリン、カナマイシン、アプラマイシン、チオストレプトン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質
を培地に添加しても良い。
【００６４】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターによって形質転換した微生物を培養するときは、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても良い。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときはインドールアクリル酸等を、ｔｉｐＡプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときはチオストレプトン等を培地に添加しても良い。
【００６５】
上記のとおり、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡを保有する微生物由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
【００６６】
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法がある。
【００６７】
本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
【００６８】
例えば、本発明の蛋白質が細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セフファロース、DIAION HPA-75（三菱化成株式会社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Separose FF（Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００６９】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体として生産された場合には、上記と同様に細胞を破砕後、遠心分離により得られた沈殿画分より、通常の方法で該蛋白質を回収し、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質を変性させない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００７０】
本発明の蛋白質またはその糖鎖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌生産された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００７１】
また、本発明の蛋白質が細胞内に溶解状態で生産された場合で、かつ無細胞抽出液で酵素活性が得られない場合は、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁して静止菌体を作成後、その静止菌体溶液をそのまま酵素反応に付することができる。
【００７２】
（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの製造方法
本発明による形質転換体の培養物および該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源とＬ−ロイシンとを水系媒体中に存在せしめ、該水系媒体中で（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシン生成し蓄積させ、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを製造することができる。
【００７３】
ここで、培養物の処理物としては、例えば、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物、または該菌体より抽出して得られる酵素標品などを挙げることができる。
【００７４】
（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの製造に使用可能な水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などを挙げることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
【００７５】
（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの製造において、必要に応じて界面活性剤または有機溶媒を添加しても良い。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂株式会社製）などの非イオン界面活性剤、瀬チルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂株式会社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ，日本油脂株式会社製）などの三級アミン類など、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの生産を促進しうるものであればいずれでも良く、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪酸酸アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
【００７６】
（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの生成反応は、水系媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてグリセロールなどの炭素源やＭｎＣｌ２等の無機塩や添加することができる。
【００７７】
水性媒体中に生成した（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの定量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いて行うことができる。
【００７８】
反応液中に生成した（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの単離・精製は、活性炭、イオン交換樹脂、分取ＨＰＬＣなどを用いる通常の方法によって行うことができる。
【実施例】
【００７９】
以下本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００８０】
実施例１：  ノストック属に属する微生物由来のＬ−ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子の単離
Nostoc sp. ATCC29133のゲノムＤＮＡを、市販品としてＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）より入手した（ＡＴＣＣ２９１３３Ｄ）。配列番号４および５で表される塩基配列から成るプライマーを合成し、上記ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）２．５ｕｎｉｔｓ、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２５０μｍｏｌ、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭを含む反応液５０μｌを用い、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことによって行った。反応液の１／１０量をアガロース電気泳動し、ＤＮＡ断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液をHigh Pure PCR Product Purification Kit（ロシュ社製）のキットを用いてＤＮＡを精製した。【００８１】
得られた精製ＤＮＡ溶液１０μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにて切断し、アガロース電気泳動により１．７ｋｂのＤＮＡを分離した後、定法に従いアガロースゲルからＤＮＡを回収した。【００８２】
ｐＥＴ２４  ＤＮＡ（ノバジェン社製）約０．２μｇを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにて切断し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、５．３ｋｂＤＮＡ断片を回収した。【００８３】
１．７ｋｂおよび５．３ｋｂの断片を、ライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造株式会社製）を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、アガロース１５ｇ／ｌ］に塗布後、３７℃で一晩培養した。生育してきたコロニーを前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子ｎｏｓ５を含む組み換えプラスミドであるｐｎｏｓＡを取得した。該プラスミドの造成手順および構造を第１図に示した。【００８４】
実施例２：  Ｌ−ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子の化学合成
ＡＡ−１（配列番号６）、ＡＡ−２（配列番号７）、ＡＡ−３（配列番号８）、ＡＡ−４（配列番号９）、ＢＢ−１（配列番号１０）、ＢＢ−２（配列番号１１）、ＢＢ−３（配列番号１２）、ＢＢ−４（配列番号１３）の８本のプライマーを合成した。このうち、２本ずつを選択し、プライマーセットを鋳型ＤＮＡとして共用するＰＣＲを行った。【００８５】
まず、プライマー兼鋳型（ＡＡ−１、ＡＡ−２）各０．５μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）１．０ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ、ＭｇＳＯ４１ｍＭを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間の工程を１５回繰り返すことによって行った。その他のプライマーセット｛（ＡＡ−３、ＡＡ−４）、（ＢＢ−１、ＢＢ−２）、（ＢＢ−３、ＢＢ−４）｝についても同様にＰＣＲを行い、計４種類のＰＣＲ反応液を得た。【００８６】
次に、得られた反応液２．５μｌをプライマーセットと鋳型を共有として用い、再度ＰＣＲ反応を実施した。反応条件は、プライマー兼鋳型（ＡＡ−１、ＡＡ−２）の上記反応液２．５μｌ、プライマー兼鋳型（ＡＡ−３、ＡＡ−４）の上記反応液２．５μｌ、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）１．０ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ、ＭｇＳＯ４１ｍＭを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間の工程を１５回繰り返すことによって行った。同様にしてプライマー兼鋳型の組み合わせを（ＢＢ−１、ＢＢ−２）の上記反応液と（ＢＢ−３、ＢＢ−４）の上記反応液に変えてＰＣＲ反応を行い、計２種類の反応液を得た。【００８７】
ＰＣＲにて得られた該反応液を、TArget CloneTM -Plus-のキット（東洋紡績株式会社製）を用いて、大腸菌プラスミドｐＴＡ２に組み込んだ。すなわち、９μｌのＰＣＲ反応液と１μｌの１０×Ａ-attachment Mix（東洋紡績株式会社製）を添加し撹拌後６０℃で１０分反応させた。その反応液２．５μｌと５ｎｇ／μｌのｐＴＡ２ベクター（東洋紡績株式会社製）を１μｌ加え、ライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて、最終反応液量１０μｌにて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから定法に従いプラスミドを抽出した。ＡＡ−１、ＡＡ−２、ＡＡ−３、ＡＡ−４（配列番号６，７，８，９）由来のＰＣＲ断片からはプラスミドｐＡ−８を、ＢＢ−１、ＢＢ−２、ＢＢ−３、ＢＢ−４（配列番号１０，１１，１２，および１３）由来のＰＣＲ断片からプラスミドｐＢ−５を得た。これらプラスミドを制限酵素ＭｒｏＩによる消化と、続くライゲーションによる連結により、配列番号３に示される塩基配列から成るＤＮＡ断片（ｎｏｓ５−ＧＣ）を含むプラスミド（ｐｎｏｓ５Ｂ）を取得した。【００８８】
次に、上記で得られたプラスミドｐｎｏｓ５Ｂを鋳型とし、合成ＤＮＡ（配列番号１４および１５）をプライマーセットとして用いたＰＣＲを実施することで、ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩの制限酵素サイトを末端に付与したＤＮＡ断片を増幅した。すなわち、ＰＣＲは鋳型体ＤＮＡ（プラスミドｐｎｏｓ５Ｂ）約０．１μｇ、プライマー各０．３μｍｏｌ／ｌ、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（東洋紡社製）１．０ｕｎｉｔｓ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ用×１０緩衝液５μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ、ＭｇＳＯ４１ｍＭを含む反応液５０μｌを用い、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間の工程を２５回繰り返すことによって行った。【００８９】
ＰＣＲにて得られた該反応液を、TArget CloneTM -Plus-のキット（東洋紡績株式会社製）を用いて、大腸菌プラスミドｐＴＡ２に組み込んだ。すなわち、９μｌのＰＣＲ反応液と１μｌの１０×Ａ-attachment Mix（東洋紡績株式会社製）を添加し撹拌後６０℃で１０分反応させた。その反応液２．５μｌと５ｎｇ／μｌのｐＴＡ２ベクター（東洋紡績株式会社製）を１μｌ加え、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、最終反応液量１０μｌにて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。次いで大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。生育してきたコロニーから定法に従ってプラスミドを抽出し、組み換えプラスミドであるｐｎｏｓ５Ｃを取得した。該プラスミドの構築方法および構造を第２図に示した。【００９０】
得られた組み換えプラスミドｐｎｏｓ５Ｃを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動により０．８ｋｂのＤＮＡを分離した後、定法に従いアガロースゲルからＤＮＡを回収した。【００９１】
ｐＥＴ２４  ＤＮＡ（ノバジェン社製）約０．２μｇを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、５．３ｋｂＤＮＡ断片を回収した。【００９２】
上記０．８ｋｂおよび５．３ｋｂの断片を、ライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、該形質転換体をカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。生育してきたコロニーを前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子ｎｏｓ５を含む組み換えプラスミドであるｐｎｏｓ５Ｄを取得した。該プラスミドの造成手順および構造を第２図に示した。【００９３】
実施例３：  組換えプラスミドｐｎｏｓ５Ｅの構築
実施例２にて化学合成したロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子を含み、放線菌Streptomyces lividansにて機能する組み換えプラスミドを、下記方法で実施した。【００９４】
実施例２にて取得した組み換えプラスミドｐｎｏｓ５Ｃに対し、ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩにて切断し、定法に従いアガロースゲルからＤＮＡを回収した。また、ｐＩＪ６９０２  ＤＮＡ約０．２μｇを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に約７．３ｋｂＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。【００９５】
上述の０．８ｋｂおよび約７．３ｋｂの断片を、ライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌Escherichia coli JM109（宝酒造株式会社製）を形質転換し、該形質転換体をアプラマイシン１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。生育してきたコロニーより定法に従ってプラスミドを抽出し、ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子ｎｏｓ５を含む組み換えプラスミドであるｐｎｏｓ５Ｅを取得した。該プラスミドの造成手順および構造を第３図に示した。【００９６】
実施例４：  大腸菌形質転換体（E.coli/pnos5A株）による（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの生産
実施例１で得られた、ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子ｎｏｓ５を含む組み換えプラスミドｐｎｏｓ５Ａを、大腸菌Escherichia coli BL21(DE3)（ノバジェン社製）に形質転換し、組み換え大腸菌（E.coli/pnos5A株）を得た。得られた組み換え大腸菌を、をカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬの入った三角フラスコに接種し、３７℃で１８時間培養した。該培養液をカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬの入った三角フラスコに１％接種し３７℃で６時間培養した後、該培養液１００ｍＬを遠心分離して湿菌体を取得した。【００９７】
取得した大腸菌組み換え体（E.coli/pnos５Ａ株）湿菌体を、１００ｍｍｏｌ／ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０％グリセロール、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−ロイシンからなる２０ｍＬの反応液中に懸濁し、反応液を三角フラスコに移して、２８℃、７２時間で反応を行った。【００９８】
反応終了後、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（株式会社島津製作所社製）を用いて以下の分析条件で分析し、反応液中に約３ｍｍｏｌ／ｌの（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンが生成蓄積していることを確認した。
分析条件：
カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ
移動相：０．１％ギ酸水溶液
カラム温度：４０℃
検出方法：  カラムからの溶出液に対し、ＯＰＡ反応液（０．３ｍｍｏｌホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）０．４ｇ／ｌ、エタノール１６ｍｌ／ｌ、２−メルカプトエタノール２ｍｌ／ｌ）を４０℃で作用させて第一級アミノ酸をＯＰＡ誘導体化し、３４０ｎｍの吸収を測定した。【００９９】
上記にて得られた反応液３００ｍｌを、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ（Ｈ＋）４００ｍｌにアプライした。次いで、脱イオン水１２００ｍｌにてレジンを洗浄し、０．１規定アンモニア水１６００ｍｌにて（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを含む画分を溶離した。（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを含む画分を濃縮し、高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所社製）を用いて（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを以下の条件により分取精製した。分取精製して得られた画分を凍結乾燥し、白色粉末５３ｍｇを得た。得られた白色粉末を１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＣ／ＭＳ、比旋光度測定により（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンであることを確認した。各機器分析は、別途有機合成にて得られた（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシン標準品［J.Org.Chem.,54,1859(1989)］との比較により実施し、酵素反応にて得られた（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンと、標準品の（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの機器分析特性値が完全に一致することを確認した。
分取ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３
溶離液：０．１％ギ酸水溶液
カラム温度：４０℃
検出方法：  分取にて得られた画分を、それぞれ実施例３にて記載のＯＰＡポストラベル誘導体化法ＨＰＬＣにて分析し、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの精製画分を同定した。【０１００】
実施例５：  大腸菌形質転換体（E.coli/pnos５Ｄ株）による（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの生産
実施例２で得られた、ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子ｎｏｓ５を含む組み換えプラスミドｐｎｏｓ５Ｄを、大腸菌Escherichia coli BL21(DE3)（ノバジェン社製）に形質転換し、組み換え大腸菌（E.coli/pnos５Ｄ株）を得た。得られた組み換え大腸菌を、カナマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬの入った三角フラスコに接種し、３７℃で１８時間培養した。該培養液をカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬの入った三角フラスコに１％接種し３７℃で６時間培養した後、該培養液１００ｍＬを遠心分離して湿菌体を取得した。【０１０１】
上記で取得した組み換え大腸菌（E.coli/pnos５Ｄ株）湿菌体を、１００ｍｍｏｌ／ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０％グリセロール、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−ロイシンからなる２０ｍＬの反応液中に懸濁し、反応液を三角フラスコに移して、２８℃、７２時間で反応を行った。【０１０２】
反応終了後、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（株式会社島津製作所社製）を用いて以下の分析条件で分析し、反応液中に約１ｍｍｏｌ／ｌの（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンが生成蓄積していることを確認した。
分析条件は実施例４に記載と同様の手法で行った。【０１０３】
上記で得られた反応液約８００ｍｌを、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ（Ｈ＋）４００ｍｌにアプライした。次いで、脱イオン水２０００ｍｌにてレジンを洗浄し、０．１規定アンモニア水１６００ｍｌにて（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを含む画分を溶離した。（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを含む画分を濃縮し、高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所社製）を用いて（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンを以下の条件により分取精製した。分取精製して得られた画分を凍結乾燥し、白色粉末約４７ｍｇを得た。得られた白色粉末を１Ｈ−ＮＭＲ、ＬＣ／ＭＳにより（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンであることを確認した。各機器分析は、別途有機合成にて得られた（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシン標準品［J.Org.Chem.,54,1859(1989)］との比較により実施し、酵素反応にて得られた（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンと、標準品の（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの機器分析特性値が完全に一致することを確認した。
分取ＨＰＬＣ条件は実施例４に記載と同様の手法で行った。【０１０４】
実施例６：  放線菌形質転換体（S.lividans/pnos5E株）による（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンの生産
実施例３で得られた、ロイシンヒドロキシラーゼ遺伝子ｎｏｓ５を含む組み換えプラス
ミドｐｎｏｓ５Ｅを放線菌Streptomyces lividansに接合伝達法で導入し、アプラマイシン１０μｇ／ｍｌを含むＭＳ寒天培地［マンニトール（関東化学社製）２０ｇ／ｌ、脱脂大豆（味の素製油社製）１０ｇ／ｌ、アガロース２０ｇ／ｌ］に塗布後、２８℃で培養することで、接合伝達体（S.lividans/pnos5E）を得た。【０１０５】
得られた接合伝達体を、アプラマイシン５μｇ／ｍｌを含む改変ＹＥＭＥ培地［バクトペプトン（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）３ｇ／ｌ、マルトエキストラクト（オキソイド社製）３ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ。シュークロース３０ｇ／ｌ］５０ｍＬの入った三角フラスコに接種し、３０℃で１８時間培養した。該培養液をアプラマイシン５μｇ／ｍｌ、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む改変ＹＥＭＥ培地５０ｍＬの入った三角フラスコに２％接種し３０℃２４時間培養した後、該培養液５０ｍＬを遠心分離して湿菌体を取得した。【０１０６】
上記で取得したS.lividans/pnos5E株湿菌体を、１００ｍｍｏｌ／ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０％グリセロール、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−ロイシンからなる２０ｍＬの反応液に懸濁し、反応液を三角フラスコに移し、３０℃、２４時間で反応を行った。【０１０７】
反応終了後、反応性生物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（株式会社島津製作所社製）を用いて以下の分析条件で分析し、反応液中に０．２ｍｍｏｌ／ｌの（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシンが生成蓄積していることを確認した。
分析条件は実施例４に記載の手法で行った。
【図１】
2008013262.tif 000003
【図２】
2008013262.tif 000004
【図３】
2008013262.tif 000005
【配列表】
2008013262000001.app
【国際調査報告】
2008013262.tif 000006
2008013262.tif 000007
2008013262.tif 000008
2008013262.tif 000009