(57)【要約】  本発明によって、極めて安全でかつ有用な真菌増殖抑制剤等を提供される。具体的には、本発明によって、（１）ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）を有効成分とする真菌増殖抑制剤、及びヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）と真菌とを接触させるステップを少なくとも含む真菌増殖抑制方法、（２）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡを有効成分とする細胞が有する真菌増殖抑制作用の増強剤、（３）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡを細胞に導入するステップを少なくとも含む細胞の真菌増殖抑制作用の増強方法、（４）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡが導入された細胞と真菌とを接触させるステップを少なくとも含む真菌増殖抑制方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）を有効成分とする、真菌増殖抑制剤。
【請求項２】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、６万〜２５０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、１０万〜２５０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項４】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、２０万〜２５０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項５】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、２５万〜２５０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項６】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、５０万〜２５０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項７】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、７５万〜２５０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項８】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、８０万〜２５０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項９】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、１００万〜２５０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項１０】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、１５０万〜２５０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項１１】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の重量平均分子量が、１８０万〜２２０万である、請求項１に記載の剤。
【請求項１２】
真菌と接触させる際に溶液状態で用いられることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１３】
真菌と接触させる際のヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の濃度が、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の剤。
【請求項１４】
真菌と接触させる際のヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の濃度が、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の剤。
【請求項１５】
真菌と接触させる際のヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の濃度が、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の剤。
【請求項１６】
真菌と接触させる際のヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の濃度が、０．５ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の剤。
【請求項１７】
真菌と接触させる際のヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）の濃度が、０．８ｍｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の剤。
【請求項１８】
真菌が、カンジダ属に属するもの、アスペルギルス属に属するもの、クリプトコッカス属に属するもの、ヒストプラズマ属に属するもの、トリコフィトン属に属するもの、ミクロスポラム属に属するもの、マラセチア属に属するもの、コクシディオイデス属に属するもの、ブラストミセス属に属するもの及びムコール属に属するものからなる群から選ばれる１又は２以上の真菌である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１９】
ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む、真菌増殖抑制方法。
【請求項２０】
ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡを有効成分とする、細胞が有する真菌増殖抑制作用の増強剤。
【請求項２１】
細胞に導入して用いられることを特徴とする、請求項２０に記載の剤。
【請求項２２】
ヒアルロン酸合成酵素が、ヒアルロン酸合成酵素１、ヒアルロン酸合成酵素２及びヒアルロン酸合成酵素３からなる群から選ばれる１又は２以上のヒアルロン酸合成酵素である、請求項２０又は２１に記載の剤。
【請求項２３】
細胞が、上皮細胞又は線維芽細胞である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の剤。
【請求項２４】
ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡを細胞に導入するステップを少なくとも含む、細胞の真菌増殖抑制作用の増強方法。
【請求項２５】
ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡが導入された細胞と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む、真菌増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸又はその塩（重金属塩を除く。）を有効成分とする、真菌増殖抑制剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書において用いた略号について説明する。
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＡＳ：ヒアルロン酸合成酵素
以下、本発明に関連する技術について説明する。【０００３】
特許文献１及び特許文献２には、金属が銀、金、セリウム及びタングステンから選択されることを特徴とするＨＡの重金属塩、及び、微生物を有効量のＨＡ銀と接触させることを含むことを特徴とする微生物の増殖抑制方法が開示されている。またＨＡ銀が、カンジダ・アルビカンス及びカンジダ・トロピカンスの増殖を阻害する旨が記載されている。【０００４】
特許文献３及び特許文献４には、ＨＡ亜鉛会合体（錯体）又はＨＡコバルト会合体（錯体）を活性成分として含む、抗微生物活性を有する医薬組成物が開示されている。またＨＡ亜鉛溶液が、テストした多くの生物（カンジダ・アルビカンスや、アスペルギルス・ニガーを含む）で数桁の減少を誘導したが、ＨＡナトリウム溶液中では、テスト生物数は有意に変化しなかった旨が記載されている。また、ＨＡナトリウム溶液は、濃度が２０００μｇ／ｍｌの時でさえ、いかなるテスト生物に対しても阻害効果を発揮しなかった旨も記載されている。【０００５】
特許文献５及び特許文献６には、微生物等に対する抗接着性の有効成分としての、炭水化物若しくは炭水化物誘導体から成る群からの１種の化合物若しくは数種の化合物の使用が開示されている。また、炭水化物の一例としてＨＡが、微生物の一例として真菌やカンジダ・アルビカンス等が例示的に記載されている。しかし、同文献中には具体的な薬効薬理試験結果等の開示がなく、この方法を使用できるものであることが明らかであるように記載されていない。【０００６】
非特許文献１には、ＨＡの制菌作用に関する開示があるが、真菌やカンジダ属に関する記載や示唆はない。【０００７】
非特許文献２には、ＨＡナトリウムの制菌試験（カンジダ・アルビカンスを含む）に関する開示がある。しかしその結果、微生物はＨＡナトリウムを含有する培地中で良く増殖し、ＨＡナトリウムには制菌作用がないと結論づけられている。【０００８】
【特許文献１】特許第２６１３６０５号公報
【特許文献２】米国特許第４７４６５０４号公報
【特許文献３】特表２００１−５００８６０号公報
【特許文献４】米国特許第６３４８１９０号公報
【特許文献５】特表平１０−５１３１６５号公報
【特許文献６】国際公開第ＷＯ９６／２３４７９号公報
【非特許文献１】ピルナザー、Ｐ．（Ｐｉｒｎａｚａｒ  Ｐ．）ら、１９９９年、ジャーナル・オブ・ペリオドントロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ）、第７０巻、第４号、ｐ．３７０−３７４
【非特許文献２】タン、Ｚ．Ｈ．（Ｔａｎｇ  Ｚ．  Ｈ．）ら，２００２年、ツォングオ・シウ・フー・チョン・ジャン・ワイ・ケー・ザー・ツィ（Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｘｉｕ  Ｆｕ  Ｃｈｏｎｇ  Ｊｉａｎ  Ｗａｉ  Ｋｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ）、第１６巻、第４号、ｐ．２５９−２６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、極めて安全でかつ有用な真菌増殖抑制剤等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＨＡ又はその塩（重金属塩を除く。）が、真菌の増殖を顕著に抑制する作用を有することを見い出し、本発明に至った。また本発明者は、ＨＡＳをコードするＤＮＡを細胞に導入することによって、その細胞が有する真菌増殖抑制作用を増強できることを見い出し、本発明に至った。【００１１】
すなわち本発明は、ＨＡ又はその塩（重金属塩を除く。以下同じ。）を有効成分とする、真菌増殖抑制剤（以下「本発明抑制剤」という。）を提供する。
本発明抑制剤の有効成分であるＨＡ又はその塩の重量平均分子量は、６万〜２５０万であるものが好ましく、１０万〜２５０万であるものがより好ましく、２０万〜２５０万であるものがさらに好ましく、２５万〜２５０万であるものがさらに好ましく、５０万〜２５０万であるものがさらに好ましく、７５万〜２５０万であるものがさらに好ましく、８０万〜２５０万であるものがさらに好ましく、１００万〜２５０万であるものがさらに好ましく、１５０万〜２５０万であるものがさらに好ましく、１８０万〜２２０万であるものが特に好ましい。【００１２】
本発明抑制剤は、真菌と接触させる際に溶液状態で用いられることが好ましい。この場合、真菌と接触させる際のＨＡ又はその塩の濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌであることがより好ましく、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌであることがさらに好ましく、０．５ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌであることがさらに好ましく、０．８ｍｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌであることが特に好ましい。
また、本発明抑制剤による増殖抑制の対象とする真菌は、カンジダ属に属するもの、アスペルギルス属に属するもの、クリプトコッカス属に属するもの、ヒストプラズマ属に属するもの、トリコフィトン属に属するもの、ミクロスポラム属に属するもの、マラセチア属に属するもの、コクシディオイデス属に属するもの、ブラストミセス属に属するもの及びムコール属に属するものからなる群から選ばれる１又は２以上の真菌であることが好ましい。【００１３】
また本発明は、ＨＡ又はその塩と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む、真菌増殖抑制方法（以下「本発明抑制方法１」という。）を提供する。【００１４】
また本発明は、ＨＡＳをコードするＤＮＡを有効成分とする、細胞が有する真菌増殖抑制作用の増強剤（以下「本発明増強剤」という。）を提供する。
本発明増強剤は、細胞に導入して用いられることが好ましい。また「ＨＡＳ」としては、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３からなる群から選ばれる１又は２以上のＨＡＳであることが好ましい。また「細胞」は、上皮細胞又は線維芽細胞であることが好ましい。
また本発明は、ＨＡＳをコードするＤＮＡを細胞に導入するステップを少なくとも含む、細胞の真菌増殖抑制作用の増強方法（以下「本発明増強方法」という。）を提供する。
また本発明は、ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む、真菌増殖抑制方法（以下「本発明抑制方法２」という。）を提供する。  
【発明の効果】
【００１５】
本発明抑制剤及び本発明抑制方法１は、真菌の増殖を顕著に抑制することができ、かつその有効成分（ＨＡ又はその塩）の安全性も非常に高いことから極めて有用である。また本発明増強剤及び本発明増強方法は、細胞が有する真菌増殖抑制作用を強力に増強することができ、極めて有用である。また本発明抑制方法２は、本発明増強剤及び本発明増強方法を応用して、真菌の増殖を顕著に抑制することができ、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は上皮細胞によるカンジダの増殖阻害作用を示す図である。
【図２】図２は細胞表面のＨＡによるカンジダの増殖阻害作用を示す図である。
【図３】図３はＨＡによるカンジダの増殖阻害作用を示す図である。
【図４】図４はＨＡＳ遺伝子の導入による、細胞のカンジダ増殖阻害活性の増強作用を示す図である。
【図５】図５はＨＡによる種々のカンジダに対する増殖阻害作用を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。【００１８】
＜１＞本発明抑制剤
本発明抑制剤は、ＨＡ又はその塩を有効成分とする、真菌増殖抑制剤である。【００１９】
（１）有効成分
本発明抑制剤の有効成分として用いることができるＨＡ又はその塩の由来は特に限定されず、鶏冠、臍帯、ＨＡを産生する微生物等から分離されたものを用いることができる。【００２０】
また、その純度等も特に限定されず、真菌増殖の抑制が必要な場面、目的、部位等に応じて適宜選定することができる。例えば、生体内の組織等や、細胞・組織培養等をはじめとする高度の無菌性や清浄性等が求められる部位・場面における真菌増殖の抑制を目的とする場合には、高純度に精製され、かつ滅菌されているものを採用することが好ましい。また生体内に適用する場合には、さらに医学的に許容されない物質（例えば、エンドトキシン等）を実質的に含有しないものを用いることが好ましい。【００２１】
また、口腔、食道をはじめとする消化管内や、膣、皮膚、眼等の生体外の組織等における真菌増殖の抑制を目的とする場合には、高純度に精製されたＨＡを用いることが望ましいが、若干精製度が低いものを用いても差し支えない場合もある。また、生体以外の物における真菌増殖の抑制を目的とする場合には、高純度に精製されたＨＡを用いることが望ましいことは変わらないが、その目的や場面等に応じて、精製度が低いものを用いることもできる。【００２２】
また「ＨＡの塩」についても、「ＨＡの重金属塩」以外のものである限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜選定することができる。例えば、生体における真菌増殖の抑制を目的とする場合には、医学的に許容される塩を選定することができる。【００２３】
なお、本出願書類において「重金属」とは、密度が４ｇ・ｃｍ−３以上の金属を意味する。したがって当業者は、この定義に則していかなる金属が重金属に該当するか容易に理解することができる。重金属の例としては、銀、金、セリウム、タングステン、亜鉛、コバルト等を挙げることができる。【００２４】
本発明抑制剤の有効成分として用いることができるＨＡの塩としては、例えばアルカリ金属塩（リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（ベリリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等）、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩等が例示される。これらのなかでも無機塩基との塩が好ましい。無機塩基との塩のなかでも、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が好ましく、アルカリ金属塩がより好ましい。アルカリ金属塩のなかでも、ナトリウム塩が好ましい。【００２５】
本発明抑制剤の有効成分として用いることができるＨＡ又はその塩の重量平均分子量も特に限定されず、目的等に応じて適宜選定することができる。例えば、ＨＡ又はその塩の重量平均分子量として６万〜２５０万の範囲を例示することができる。なかでも、１０万〜２５０万であるものが好ましく、２０万〜２５０万であるものがより好ましく、２５万〜２５０万であるものがさらに好ましく、５０万〜２５０万であるものがさらに好ましく、７５万〜２５０万であるものがさらに好ましく、８０万〜２５０万であるものがさらに好ましく、１００万〜２５０万であるものがさらに好ましく、１５０万〜２５０万であるものがさらに好ましく、１８０万〜２２０万であるものが特に好ましい。【００２６】
なお、本発明抑制剤の有効成分として使用されるＨＡ又はその塩の重量平均分子量は、第十三改正日本薬局方：一般試験法・第３６項粘度測定法に従って極限粘度を測定し、Ｌａｕｒｅｎｔらの式（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ４２，  ４７６（１９６０））によって算出することができる。【００２７】
このようなＨＡ又はその塩を有効成分として用いることにより、極めて優れた効果を有する本発明抑制剤とすることができる。【００２８】
（２）本発明抑制剤の剤形等
本発明抑制剤の剤形等は、ＨＡ又はその塩を有効成分として含有しており、かつこれによる真菌増殖の抑制効果が発揮される限りにおいて特に限定されない。【００２９】
なお本発明抑制剤は、真菌と接触させる際に溶液状態で用いられることが好ましい。したがって本発明抑制剤の剤形は、使用する時点（真菌と接触させる時点）において溶液の状態とすることができるような種々の剤形のなかから選択することができる。【００３０】
例えば、本発明抑制剤を、ＨＡ又はその塩を含有する溶液状態の剤としてもよく、用時溶解用の粉末、顆粒その他の固形剤等としても良い。また、例えば溶液状態の剤として提供する場合は、凍結状態で提供されてもよく、溶液のまま提供されてもよい。【００３１】
本発明抑制剤は、真菌と接触させる際のＨＡ又はその塩の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌとなるようにすることが好ましい。なかでも、当該濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌとなるようにすることが好ましく、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌとなるようにすることがより好ましく、０．５ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌとなるようにすることがさらに好ましく、０．８ｍｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌとなるようにすることが特に好ましい。【００３２】
したがって、本発明抑制剤中のＨＡ又はその塩の含量は、使用する際（真菌と接触させる際）において前記のような濃度とすることができる量である限りにおいて特に限定されず、目的や剤形等に応じて適宜選定することができる。【００３３】
例えば、生体の組織（体液を除く。）や、生体以外の物（液体を除く。）における真菌増殖の抑制を目的とする場合において、本発明抑制剤を溶液状態の剤とする場合には、当該製剤におけるＨＡ又はその塩の濃度を、前記と同じ濃度（例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ）とすることができる。【００３４】
また、例えば、体液や液体状のものの中に存在する真菌の増殖の抑制を目的とする場合において、本発明抑制剤を溶液状態の剤とする場合には、当該製剤におけるＨＡ又はその塩を、前記の濃度よりも高い濃度となるように調製することができる。具体的には、これを体液や液体状のものと接触（混合等）させた際に、ＨＡ又はその塩が前記と同じ濃度（例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ）となるような濃度を選択すればよい。【００３５】
本発明抑制剤は、アンプル、バイアル、ボトル、シリンジ等の適当な容器に充填して、流通、保存、使用等をすることができる。【００３６】
本発明抑制剤の製剤化には、公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、ＨＡ又はその塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の真菌増殖抑制成分や、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、矯味剤、保存剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等の他の成分を配合することができる。【００３７】
本発明抑制剤は以上の通り製造することができるが、ＨＡ又はその塩を含有する市販の製品をそのまま本発明抑制剤として用いてもよい。このような市販の製品としては、例えば洗口液「絹水」（登録商標）（生化学工業株式会社）を挙げることができる。この製品はＨＡナトリウムの水溶液であり、他の成分として矯味剤（キシリトール）、保存剤（安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム）、ｐＨ調整剤（リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム）を含有するものである。【００３８】
（３）本発明抑制剤の適用対象・使用方法等
本発明抑制剤は、生体を含むあらゆる物における真菌増殖の抑制に用いることができる。したがって、本発明抑制剤が適用される物は、増殖が抑制されるべき真菌が既に存在している物若しくは今後存在することとなる物又はこれらの可能性がある物である限りにおいて特に限定されず、例えば、非生物体（例えば、工業生産物、培養液等）や生物体（動物、植物等）等が例示される。なかでも、培養液又は生物体であることが好ましい。【００３９】
培養液としては、動物細胞の培養液であることが好ましい。この動物細胞としては、上皮細胞又は線維芽細胞であることが好ましい。【００４０】
生物体としては動物が好ましい。動物の生体のなかでも、動物組織であることが好ましく、上皮組織であることがより好ましい。上皮組織の一例として、消化器官内（口腔内、食道内、胃内、十二指腸内、小腸内、大腸内等）の上皮、各種臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓等）表面の上皮、皮膚、眼の上皮、各種腔内（耳腔内、鼻腔内、等）の上皮、泌尿器官内（尿道内、膀胱内等）の上皮、生殖器官内（膣内、子宮内等）の上皮等が例示される。なかでも粘膜上皮であることが好ましい。粘膜上皮の種類等も特に限定されないが、消化器官内の粘膜上皮であることが好ましい。なかでも、口腔内の上皮であることがより好ましい。【００４１】
本発明抑制剤は、これらのいずれの物における真菌増殖の抑制にも用いることができる。【００４２】
本発明抑制剤による増殖抑制の対象となる「真菌」は、真菌類に属するものである限りにおいて特に限定されない。このようなものとしては、カンジダ属に属するもの、アスペルギルス属に属するもの、クリプトコッカス属に属するもの、ヒストプラズマ属に属するもの、トリコフィトン属に属するもの、ミクロスポラム属に属するもの、マラセチア属に属するもの、コクシディオイデス属に属するもの、ブラストミセス属に属するもの及びムコール属に属するものからなる群から選ばれる１又は２以上の真菌を例示することができる。【００４３】
本発明抑制剤は、なかでもカンジダ属に属する真菌の増殖抑制のために用いられることが好ましい。カンジダ属に属する真菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）及びカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等を例示することができる。【００４４】
本発明抑制剤の使用方法は、本発明抑制剤の有効成分であるＨＡ又はその塩の分子と、真菌とが接触する態様で使用される限りにおいて特に限定されず、本発明抑制剤が適用される物（真菌増殖の抑制が望まれる物）、場面、目的等に応じて適宜設定することができる。【００４５】
例えば、真菌増殖の抑制が望まれる物が液体状のものである場合には、これに本発明抑制剤を添加等することにより、ＨＡ又はその塩の分子と真菌とを接触させることができる。【００４６】
また例えば、真菌増殖の抑制が望まれる物が固体状のものである場合には、これを本発明抑制剤でコーティングする態様で使用してもよい。その際、真菌増殖の抑制が望まれる物を本発明抑制剤中に浸したり、当該物に本発明抑制剤を注いだり、噴射したり、真菌増殖の抑制が望まれる物と本発明抑制剤とを接触させた上で当該抑制剤を撹拌、振とうその他の物理的な刺激により流動させたりしてもよい。【００４７】
例えば、口腔内における真菌の増殖を抑制するためには、本発明抑制剤を用いて含嗽してもよい。このように、本発明抑制剤の使用方法は、その目的等に応じて適宜設定することができる。【００４８】
また、より効果的な真菌増殖の抑制を望む場合には、上記のような操作・動作を繰り返して行えばよい。【００４９】
本発明抑制剤の１回あたりの使用量、使用間隔等は、真菌増殖の抑制が望まれる物、場面、目的等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されるものではない。例えば、より多くの真菌の増殖を短時間に抑制する必要がある場合には、本発明抑制剤の１回あたりの使用量を増加させたり、前記のような操作・動作を短時間に繰り返して行えばよい。例えば、本発明抑制剤をヒトに投与する際には、通常成人１人あたりＨＡ又はその塩を５ｍｇ〜１０００ｍｇ程度を一日あたり１〜数回投与することができる。【００５０】
本発明抑制剤による真菌増殖抑制効果は、後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。【００５１】
＜２＞本発明抑制方法１
本発明抑制方法１は、ＨＡ又はその塩と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む、真菌増殖抑制方法である。【００５２】
ここで用いることができる「ＨＡ又はその塩」についての説明は、前記＜１＞と同じである。したがって、本発明抑制方法１において用いる「ＨＡの塩」は、「ＨＡの重金属塩」以外のものである必要がある。【００５３】
また「ＨＡ又はその塩」と真菌との接触方法、接触の際の「ＨＡ又はその塩」の濃度、適用の対象となる物、増殖抑制の対象となる真菌等は、全て前記＜１＞と同じである。本発明抑制方法は、前記＜１＞における本発明抑制剤の使用方法と同様の方法により行うことができると理解されたい。【００５４】
なお本発明抑制方法１は、ＨＡ又はその塩と真菌とを接触させるステップを少なくとも含む限りにおいて、さらに他のステップを含んでいてもよい。例えば、ＨＡ又はその塩と真菌とを接触させた後に真菌を除去したり殺菌するステップや、ＨＡ又はその塩と真菌とを接触させた後にＨＡ又はその塩を除去するステップ等をさらに含んでいてもよい。もちろん、ＨＡ又はその塩と真菌とを接触させるステップを繰り返し行ってもよい。【００５５】
本発明抑制方法１による真菌増殖抑制効果は、後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。【００５６】
＜３＞本発明増強剤
本発明増強剤は、ＨＡＳをコードするＤＮＡを有効成分とする、細胞が有する真菌増殖抑制作用の増強剤である。【００５７】
（１）有効成分
本発明増強剤の有効成分として用いることができる「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」は、ＨＡＳの活性を持つポリペプチドをコードしており、かつ、かかるポリペプチドの発現能を有するＤＮＡである限りにおいて特に限定されない。このＤＮＡは、ｃＤＮＡであることが好ましい。【００５８】
このＤＮＡにコードされているＨＡＳが由来する生物種等は特に限定されず、目的等に応じて当業者が適宜選択することができる。【００５９】
例えば、バクテリアでは１種類のＨＡＳ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙａｌｙｔｉｃｕｍ由来のｈａｓ−Ａ）が、アフリカツメガエルではＨＡＳであるＤＧ４２が、哺乳類では３種類のＨＡＳ（ＨＡＳ１、２、３）が見出されている。ＨＡＳ１はＢｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，２２２，  ｐ．８１６−８２０（１９９６）に、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３はＧｅｎｏｍｉｃｓ，４１（３），  ｐ．４９３−４９７（１９９７）にそれぞれ開示されている。また例えば、ＨＡＳ２をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）については、ヒト由来のものはＪ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７１（３８），  ｐ．２２９４５−２２９４８（１９９６）に、マウス由来のものはＪ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７１（３８），  ｐ．２３４００−２３４０６（１９９６）にそれぞれ開示されている。【００６０】
本発明増強剤の有効成分としては、これらのいずれのＨＡＳをコードするＤＮＡをも使用することができる。また、これらのＤＮＡに改変等を加えたものについても、その改変後のＤＮＡによってコードされるポリペプチドがＨＡＳの活性を保持している限りにおいて、同様に使用することができる。【００６１】
これらのなかでも、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３からなる群から選ばれる１又は２以上のＨＡＳをコードするＤＮＡを用いることが好ましい。【００６２】
なお、マウス由来のＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３をコードするＤＮＡをそれぞれ配列番号１、２及び３に示すが、本発明増強剤の有効成分として用いることができるＤＮＡはこれに限定されるものではない。【００６３】
これらのＨＡＳをコードするＤＮＡは、公知の方法で製造することができる。【００６４】
本発明増強剤の有効成分である「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」は、ベクター等に保持された状態のものを用いてもよい。その場合には、発現ベクターに保持されたものを用いることが好ましい。【００６５】
「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」をベクター等に保持させる手法としては、ＤＮＡをベクターに導入するための一般的な遺伝子工学的手法を採用することができる。【００６６】
「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」を導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択することができる。【００６７】
（２）本発明増強剤の剤形等
本発明増強剤の剤形等は、ＨＡＳをコードするＤＮＡを有効成分として含有している限りにおいて特に限定されない。【００６８】
本発明増強剤は細胞に導入して用いることができる。したがって、本発明増強剤を細胞に導入した場合に、その有効成分である「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」が細胞内に入り、これにより当該細胞においてＨＡＳが発現し、これにより当該細胞においてＨＡが産生されることとなるような種々の剤形のなかから適宜選択することができる。【００６９】
例えば、本発明増強剤を、ＨＡＳをコードするＤＮＡを含有す溶液状態の剤としてもよく、用時溶解用の粉末、顆粒その他の固形剤等としても良い。また、例えば溶液状態の剤として提供する場合は、凍結状態で提供されてもよく、溶液のまま提供されてもよい。このように、本発明増強剤の剤形としては、細胞導入用の一般的なベクターやプラスミドと同様の形態を採用することができると理解されたい。【００７０】
本発明増強剤中の「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」の含量は、本発明増強剤が導入される細胞、その導入の際の諸条件等に応じて、当業者が適宜選定することができる。【００７１】
本発明増強剤は、アンプル、バイアル、チューブ等の適当な容器に充填して、流通、保存、使用等をすることができる。【００７２】
本発明増強剤の製剤化には、公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、ＨＡＳをコードするＤＮＡに悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、安定化剤、緩衝剤、保存剤、ｐＨ調整剤、着色剤、賦形剤等の他の成分を配合することができる。【００７３】
本発明増強剤は以上の通り製造することができるが、「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」をそのまま本発明増強剤として用いてもよい。【００７４】
（３）本発明増強剤の使用方法等
本発明増強剤は、細胞が保持している真菌増殖抑制作用を増強する目的で用いることができる。【００７５】
後述の実施例に示すように、本発明者は、細胞（例えば、上皮細胞や線維芽細胞など）が真菌増殖抑制作用を有していることを見い出した。本発明増強剤は、このように細胞が保持している真菌増殖抑制作用を増強させ、より高い真菌増殖抑制作用を発揮させんとするものである。【００７６】
本発明増強剤は、真菌増殖抑制作用を有しているあらゆる細胞に対して用いることができる。このような細胞としては、前記＜１＞の（３）において列挙した細胞や、前記＜１＞の（３）において列挙した種々の上皮組織に由来する細胞が好ましい。具体的な説明は、前記＜１＞の（３）を参照されたい。【００７７】
すなわち本発明増強剤は、動物細胞の真菌増殖抑制作用を増強する目的で用いられるものであることが好ましく、なかでも、上皮細胞又は線維芽細胞に用いられることが好ましい。また、本発明増強剤が適用される際の細胞の状態も特に限定されず、培養物の状態であってもよく、生体組織に存在している状態であってもよい。【００７８】
上皮細胞の具体例としては、消化器官内（口腔内、食道内、胃内、十二指腸内、小腸内、大腸内等）の上皮細胞、各種臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓等）表面の上皮細胞、皮膚細胞、眼の上皮細胞、各種腔内（耳腔内、鼻腔内、等）の上皮細胞、泌尿器官内（尿道内、膀胱内等）の上皮細胞、生殖器官内（膣内、子宮内等）の上皮細胞等が例示される。なかでも粘膜上皮細胞であることが好ましい。粘膜上皮細胞の種類等も特に限定されないが、消化器官内の粘膜上皮細胞であることが好ましい。なかでも、口腔内の上皮細胞であることがより好ましい。線維芽細胞についても上皮細胞と同様に、種々のものを採用することができる。【００７９】
本発明増強剤による増強の対象である「真菌増殖抑制作用」の内容も、真菌の増殖を抑制する作用である限りにおいて特に限定されない。ここにいう「真菌」の説明については、前記＜１＞と同じである。【００８０】
本発明増強剤の使用方法は、本発明増強剤の有効成分である「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」を、真菌増殖抑制作用を保持している細胞内に入れることができる限りにおいて特に限定されず、本発明増強剤の適用対象となる細胞、場面、目的等に応じて適宜設定することができる。例えば、細胞への遺伝子導入（細胞の形質転換）に用いられる一般的な遺伝子工学的手法と同様の方法を採用することができる。【００８１】
より具体的には、本発明増強剤と細胞とを接触させ、次いでＤＮＡ（本発明増強剤の有効成分）を当該細胞に導入する操作を行うことにより遂行することができる。【００８２】
ＤＮＡを細胞に導入する操作としては、市販のトランスフェクション用試薬を用いる方法や、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法等を採用することができる。このように本発明増強剤を使用することで、細胞が保持している真菌増殖抑制作用を増強させることができる。【００８３】
本発明増強剤による真菌増殖抑制作用の増強効果は、後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。【００８４】
＜４＞本発明増強方法
本発明増強方法は、ＨＡＳをコードするＤＮＡを細胞に導入するステップを少なくとも含む、細胞の真菌増殖抑制作用の増強方法である。【００８５】
ここで用いることができる「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」についての説明は、前記＜３＞と同じである。【００８６】
また「ＨＡＳをコードするＤＮＡ」の細胞への導入方法、ＤＮＡが導入される「細胞」その他についての説明も、全て前記＜３＞と同じである。本発明増強方法は、前記＜３＞における本発明増強剤の使用方法と同様の方法により行うことができると理解されたい。      【００８７】
なお本発明増強方法は、ＨＡＳをコードするＤＮＡを細胞に導入するステップを少なくとも含む限りにおいて、さらに他のステップを含んでいてもよい。例えば、ＨＡＳをコードするＤＮＡを細胞に導入した後にその細胞を増殖させるステップや、ＨＡＳをコードするＤＮＡを細胞に導入した後にその細胞と真菌とを接触させるステップ等をさらに含んでいてもよい。【００８８】
本発明増強方法による真菌増殖抑制作用の増強効果は、後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。【００８９】
＜５＞本発明抑制方法２
本発明抑制方法２は、ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む、真菌増殖抑制方法である。【００９０】
「ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞」としては、例えば前記＜３＞における本発明増強剤による処理を受けた細胞や、前記＜４＞における「ＨＡＳをコードするＤＮＡを細胞に導入するステップ」を経た細胞をそのまま用いることができる。したがって、ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された「細胞」についての説明も前記＜３＞及び＜４＞と同様である。また接触の対象となる「真菌」についての説明も前記＜３＞及び＜４＞と同様である。【００９１】
「ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞」と真菌との接触方法は、当該細胞と真菌とが接触する態様である限りにおいて特に限定されず、場面、目的等に応じて、前記＜１＞における本発明抑制剤における使用方法と同様の方法により行うことができる。【００９２】
なお本発明抑制方法２は、ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞と、真菌とを接触させるステップを少なくとも含む限りにおいて、さらに他のステップを含んでいてもよい。例えば、ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞と真菌とを接触させた後に、真菌を除去するステップや、ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞と真菌とを接触させた後に、当該細胞を除去するステップ等をさらに含んでいてもよい。もちろん、ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞と真菌とを接触させるステップを繰り返し行ってもよい。【００９３】
より効果的な真菌増殖の抑制を望む場合には、真菌と接触させる「ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞」の使用量を増加させたり、ＨＡＳをコードするＤＮＡが導入された細胞と真菌とを接触させるステップを繰り返して行えばよい。【００９４】
本発明抑制方法２による真菌増殖抑制効果は、後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。
【実施例】
【００９５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
（１）材料及び方法
まず、本実施例において用いた材料及び方法について説明する。【００９６】
（１−１）細胞培養
ヒト口腔上皮細胞株であるＫＢ（ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）カタログ番号：ＣＣＬ−１７）及びＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル由来の腎細胞をシミアンウイルス４０（以下「ＳＶ４０」という）で形質転換した細胞）を、１０％ウシ胎仔血清（以下「ＦＣＳ」という）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ともにギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）を含有し、非必須アミノ酸及びＥａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを含む９０％  イーグル最少必須培地（以下「ＤＭＥＭ」という）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）中で、５％ＣＯ２条件下、３７℃で保持し、３〜４日毎に継代した。歯肉上皮（ＧＥ）１細胞株（ＧＥ１細胞株）は、温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子を導入したＣ５７ＢＬ／６マウスのＧＥ組織より樹立した（Ｊ．  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｍｅｄ．，３０（５），  ｐ．２９６−３０４（２００１））細胞を、プラスチックシャーレを用いて、１％ＦＣＳ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含有するＳＦＭ１０１（日水製薬株式会社）中、３３℃で培養した。ＳＦＭ１０１培地のカルシウム濃度は１．１３ｍＭであった。細胞は指数関数的に増殖し、培養後約１０日目でコンフルエントな状態となり、層状の上皮からなる三次元構造を形成した。【００９７】
（１−２）ＨＡ
ＨＡ（１４糖、重量平均分子量６０ｋＤａ、同２５０ｋＤａ、同８００ｋＤａ及び同２０００ｋＤａ）は、生化学工業株式会社中央研究所から恵与されたものを用いた。              【００９８】
（１−３）ターゲットとする真菌
真菌として、種々のカンジダ種（カンジダ・アルビカンス（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ１８８０４、カンジダ・グラブラータ（Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ）ＡＴＣＣ２００１、カンジダ・クルセイ（Ｃ．  ｋｒｕｓｅｉ）ＡＴＣＣ６２５８及びカンジダ・トロピカリス（Ｃ．  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ４５６３）を用いた。これらのカンジダは、カンジダＧＥ寒天培地（Ｃａｎｄｉｄａ  ＧＥ  ａｇａｒ；日水製薬株式会社）上で、２５℃の条件下で増殖させ、１つのコロニーを１０ｍｌのグルコースペプトンブロス（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  ｂｒｏｔｈ；日本製薬株式会社。以下「ＧＰブロス」という）に播種した。この培養物を２５℃で１８時間震盪し、定常期に至るまで増殖させた。【００９９】
（１−４）上皮細胞の処理
（１−４−１）細胞マトリックスからのＨＡの除去
細胞を、ヒアルロニダーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）（５０  ユニット／１０６  細胞）を用いて、３７℃で２時間処理した（Ｊ．  Ｏｒａｌ  Ｓｃｉ．，  ４５，  ｐ．８５−９１  （２００３））。処理後の細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２、以下「ＰＢＳ」という）で２回洗浄し、ＤＭＥＭに再懸濁させた。【０１００】
（１−４−２）トランスフェクション
細胞を、２４ウェルのプレートを用いて、９０％の集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に至るまで増殖させた。ＤＮＡ（５０μｌの溶液中に０．８μｇ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（５０μｌの溶液中に２．０μｇ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）を、別々に無血清ＤＭＥＭに希釈した後、混合し、室温で２０分間インキュベートした。これにより得られたＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ複合体１００μｌを、細胞と培地の混合物に添加した。この細胞を、３７℃で３６時間インキュベートした。細胞表面のＨＡを過剰に産生させるために、マウス由来のＨＡＳの各アイソフォームをコードするｃＤＮＡが組み込まれたプラスミド（ｐＥＸｎｅｏ−ＨＡＳ１、ｐＥＸｎｅｏ−ＨＡＳ２及びｐＥＸｎｅｏ−ＨＡＳ３）（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７４（３８），  ｐ．２５０８５−２５０９２（１９９９））を発現ベクターとして用いた。マウス由来のＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３をコードするｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列番号１、配列番号３及び配列番号５に示す。またこれらのｃＤＮＡによってコードされているＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２、配列番号４及び配列番号６に示す。
リポフェクション工程によって、ＣＯＳ−７細胞をｐＥＸｎｅｏ−ＨＡＳ１、ｐＥＸｎｅｏ−ＨＡＳ２若しくはｐＥＸｎｅｏ−ＨＡＳ３又はベクターコントロール（ｐＥＸｎｅｏ）でトランスフェクションした。その２４時間後に、１：１０希釈となるように細胞を新鮮な培地に移し、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ中、３７℃で選択を行った。この選択期間中において生存していた細胞をクローニングし、実験に用いた。【０１０１】
（１−５）増殖阻害試験
（１−５−１）ＨＡのカンジダ増殖阻害活性の分析
ＨＡとカンジダとの共培養は、９６ウェルプレート（イワキ（Ｉｗａｋｉ）社）を用いて、１００μｌの培地中で行った。カンジダ・アルビカンスは、ＧＰブロス中で、好気的条件下、３７℃で一晩増殖させることにより調製した。このカンジダ・アルビカンスの培養物を、異なる終濃度（０．１ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ）の種々のサイズのＨＡ（１４糖、重量平均分子量６０ｋＤａ、同２５０ｋＤａ、同８００ｋＤａ又は同２０００ｋＤａ）の存在下で、１０％ＣＯ２条件下、３７℃で９時間インキュベートした。【０１０２】
また、他のカンジダ種（カンジダ・グラブラータ  ＡＴＣＣ２００１、カンジダ・クルセイ  ＡＴＣＣ６２５８及びカンジダ・トロピカリス  ＡＴＣＣ４５６３）は、ＧＰブロス上で、好気的条件下、３７℃で一晩増殖させることにより調製した。これらのカンジダ種の培養物（細胞濃度：５×１０５）を、異なる濃度（０．１ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ）の重量平均分子量２０００ｋＤａのＨＡとともに、１０％ＣＯ２条件下、３７℃で９時間インキュベートした。
インキュベーション終了後、それぞれのカンジダの増殖の程度を評価するために、培養液を十分に混合し、波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。以下、ＨＡ存在下でインキュベートしたサンプルの吸光度を「ＯＤｔｅｓｔ」と表記する。コントロールとして、ＨＡの非存在下でそれぞれのカンジダを同様にインキュベートしたサンプルを用い、波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。以下、このコントロールの吸光度を「ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ」と表記する。【０１０３】
「ＯＤｔｅｓｔ」の値と、これに対応するカンジダ種の「ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ」の値から、以下の計算式により増殖阻害率（％）を算出した。
増殖阻害率（％）＝（１−ＯＤｔｅｓｔ／ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ）ｘ１００
（１−５−２）定量プレートカウント
カンジダ・アルビカンスの増殖阻害をモニターするために、定量プレートカウント法も用いた（Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  １８２，  ｐ．１４７９−１４８５（２０００）、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ６９，  ｐ．７０９１−７０９９（２００１）、Ｍｅｄ．  Ｍｙｃｏｌ．，  ３７，  ｐ．２５１−２５９（１９９９））。簡単に説明すると、同様のエフェクターとターゲットとの共培養物を、５％ＣＯ２条件下、３７℃で９時間インキュベートした。その後、カンジダを除去するためにウェルに０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１００μｌ添加し、このサンプルを連続的に希釈（１：１０３）して、サブローデキストロース寒天培地（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ａｇａｒ）にプレーティングした。これを３０℃で４８時間インキュベートし、コロニー形成単位（以下「ＣＦＵ」という）をカウントした。以下、ＨＡ存在下でインキュベートしたサンプルにおけるＣＦＵのカウント値を「試験ＣＦＵ」と表記する。【０１０４】
コントロールとして、ＨＡの非存在下でそれぞれのカンジダを同様にインキュベートし、これを同様にプレーティングしたものを用いた。以下、このコントロールにおけるＣＦＵのカウント値を「コントロールＣＦＵ」と表記する。【０１０５】
「試験ＣＦＵ」の値と、これに対応するカンジダ種の「コントロールＣＦＵ」の値から、以下の計算式により増殖阻害率（％）を算出した。
増殖阻害率（％）＝（１−試験ＣＦＵ／コントロールＣＦＵ）ｘ１００
（１−６）カンジダの生体染色
上皮細胞とカンジダとの共培養（エフェクター：ターゲット比（以下「Ｅ：Ｔ」と略記する）が２０：１、４０：１又は８０：１）は、９６ウェルプレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）社）を用いて、１００μｌの培地中で行った。９時間インキュベートした後、この共培養物を回収して２回洗浄した。フルオレセインジアセテート（生細胞を染色する。以下「ＦＤＡ」という）（５０μｇ／ｍｌ）及びヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する。以下「ＰＩ」という）（１μｇ／ｍｌ）（いずれもシグマ（Ｓｉｇｍａ）社）（Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ６２，  ｐ．３３−７３（１９９８）、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３７，  ｐ．１２１９−１２２１（１９６５））を、細胞のペレットに同時に添加し、暗所において、室温で２０分間インキュベートした。なお、予備試験によってそれぞれの色素の最適濃度を決定した。【０１０６】
インキュベート後、共培養物をＰＢＳ、次いで２０％ＦＣＳを含有するＰＢＳでそれぞれ洗浄し、その後再度ＰＢＳで洗浄した。このペレットを１００μｌのＰＢＳで再懸濁し、その５μｌをスライドグラスに乗せて、蛍光位相差顕微鏡（オリンパス株式会社、ＤＰ−７０）で観察した。上皮細胞によるカンジダの増殖阻害は、９時間の増殖阻害アッセイによって確認した。【０１０７】
（１−７）ＭＴＴアッセイ
生細胞のアッセイは、既報と同様に行った（Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ６９，  ｐ．５９２５−５９３０（２００１））。
簡単に説明すると、まず、ＣＯＳ−７及びＫＢ細胞を、５ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートにプレーティングした。これに、１０、２０又は１００ユニット／ｍｌの各濃度のヒアルロニダーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を添加し、カンジダ・アルビカンスを２０時間培養した。培養の終期にＭＴＴ溶液（２０μｇ／ｍｌ）をウェルに添加し、プレートの内容物を４時間インキュベートした。これに酸性イソプロパノール（イソプロパノール中に０．０４ＭのＨＣｌを含有するもの）１００μｌを添加して赤色のホルマザンを溶離させ、十分に混合した。各ウェルにおける溶液中のホルマザン濃度は、試験波長として５７０ｎｍ、リファレンスの波長として６２０ｎｍをそれぞれ用い、プレートリーダー（ダイネックス（Ｄｙｎｅｘ）社）により測定した。【０１０８】
（１−８）競合ＥＬＩＳＡ−ｌｉｋｅアッセイによるＨＡ濃度の測定
指数関数的に増殖している細胞の培養物及びコンフルエントとなっている細胞の培養物を新鮮な培地を用いて２４時間培養し、その順化培地を回収した。この順化培地中のＨＡ濃度を、既報の競合的ＥＬＩＳＡ−ｌｉｋｅアッセイ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４，  ｐ．２５０８５−２５０９２（１９９９））により測定した。
簡単に説明すると、回収した順化培地とビオチン標識ＨＡ結合タンパク質（生化学工業株式会社）とを混合し、４℃で２０時間インキュベートした。この混合物を、ＨＡが結合した９６ウェルのプレートに添加し、室温で６時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンを２次プローブとして、パラニトロフェニルホスフェート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質としてそれぞれ用いて、アルカリホスファターゼ活性を測定した。ＨＡ濃度は検量線を用いて算出した。【０１０９】
（１−９）統計解析
全てのデータは、平均値±標準偏差（以下「ＳＤ」と略記する）で示した。有意差検定は、ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により行った。ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であるとした。全ての統計処理は、ＳＰＳＳ１１．０Ｊ（ＳＰＳＳジャパン社）を用いて行った。【０１１０】
（２）結果
（２−１）上皮細胞によるカンジダの増殖阻害
上皮細胞（ＫＢ細胞及びＧＥ１細胞）がカンジダ増殖阻害活性を有するか否かを調べるために、カンジダ・アルビカンスの増殖阻害率を、定量プレートカウントにより測定・算出し、３回の試験の平均値±ＳＤを算出した。結果を図１に示す。
図１より、両細胞がカンジダ増殖阻害活性を有することが示された。【０１１１】
（２−２）細胞表面のＨＡによるカンジダの増殖阻害
細胞外のＨＡの役割を検討するために、種々の濃度のヒアルロニダーゼで処理して細胞表面のＨＡを除去した上皮細胞（ＫＢ細胞）及び線維芽細胞（ＣＯＳ−７細胞）を用いて、前記（２−１）と同様にカンジダ・アルビカンスの増殖阻害率を測定・算出し、３回の試験の平均値±ＳＤを算出した。なお、Ｅ：Ｔ＝８０：１とした。結果を図２に示す。
図２より、ヒアルロニダーゼで細胞を処理することにより、ＫＢ細胞及びＣＯＳ−７細胞のカンジダ増殖阻害活性が低下することが示された。なお、ＭＴＴアッセイにより、ヒアルロニダーゼ処理は細胞の生死に影響を与えないことが示された（データは示していない）。【０１１２】
（２−３）ＨＡによるカンジダの増殖阻害
ＨＡがカンジダ増殖阻害活性を有するか否かを調べるために、カンジダ・アルビカンス（５×１０５（細胞／ｍｌ））を種々の濃度及び重量平均分子量のＨＡと共に９時間インキュベートしてカンジダ・アルビカンスの増殖阻害率を測定・算出し、３回の試験の平均値±ＳＤを算出した。結果を図３に示す。
図３より、ＨＡがカンジダ・アルビカンスの増殖阻害作用を有することが示された。さらにこの作用は、高分子のＨＡにおいて顕著であること及び高濃度のＨＡにおいて顕著であることが示された。【０１１３】
（２−４）ＨＡＳ遺伝子の導入による、細胞のカンジダ増殖阻害活性の増強
ＣＯＳ−７細胞を３種類のｐＥＸｎｅｏ−ＨＡＳ、又はｐＥＸｎｅｏ（コントロール）でトランスフェクトし、カンジダ・アルビカンスとともに９時間インキュベートした。一定濃度の細胞（１×１０６個細胞／ｍｌ）から産生されたＨＡ量を以下に示す。
ｐＥＸ−ＨＡＳ１：４５３．９  ｎｇ／ｍｌ
ｐＥＸ−ＨＡＳ２：４９４．０  ｎｇ／ｍｌ
ｐＥＸ−ＨＡＳ３：３４７．０  ｎｇ／ｍｌ
ｐＥＸｎｅｏ    ：  ７５．４  ｎｇ／ｍｌ
この結果から、３種類のＨＡＳトランスフェクタントは、いずれもｐＥＸｎｅｏに比して細胞外のＨＡを高レベルに産生することが示された。【０１１４】
また、これらのベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を用いて、前記（２−１）と同様にカンジダ・アルビカンスの増殖阻害率を測定・算出し、３回の試験の平均値±ＳＤを算出した。なお、Ｅ：Ｔ＝８０：１とした。結果を図４に示す。なお、図４中のアスタリスクは、コントロールに対し有意差があることを示す。【０１１５】
図４より、いずれのＨＡＳでトランスフェクトした細胞も、コントロールに比して有意に高いカンジダ増殖阻害活性を有することが示された。【０１１６】
（２−５）ＫＢ細胞の制菌又は殺菌活性
ＫＢ細胞によるカンジダ増殖阻害が、カンジダ・アルビカンスを殺菌することによるものか、増殖を遅延させることによるものかを調べるために、ＰＩ及びＦＤＡを、上皮細胞とカンジダ・アルビカンスの共培養物（Ｅ：Ｔ＝１０：１）由来の細胞に加えた。ＫＢ細胞の非存在下で培養したカンジダ・アルビカンスをコントロールとした。【０１１７】
その結果、ＫＢ細胞はカンジダ・アルビカンスを殺菌しなかった。この結果は、Ｅ：Ｔ＝８０：１においても同様であった。【０１１８】
また生体染色により、２，０００ｋＤａのＨＡを含有する培地で９時間インキュベートした後であっても、カンジダ・アルビカンスが生存していることが示された。さらに、ＫＢ細胞とカンジダ・アルビカンスとの９時間の共培養物の蛍光顕微鏡像から、ＨＡＳ１トランスフェクタントはカンジダ・アルビカンスを殺菌しないことが示され、その培養液には生存しているカンジダ・アルビカンスが存在することが示された。この結果は、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３トランスフェクタントにおいても同様であった。【０１１９】
これらの結果から、ＨＡが有するカンジダ増殖阻害活性は、殺菌ではなく、むしろ制菌的なものであることが示された。【０１２０】
（２−６）ＨＡによる種々のカンジダに対する増殖阻害活性
ＨＡが、カンジダ・アルビカンス以外のカンジダ種に対しても増殖阻害活性を発揮するか否か調べるために、他のカンジダ種（５×１０５（細胞／ｍｌ））を、２，０００ｋＤａのＨＡとともに、室温で９時間インキュベートし、カンジダ・アルビカンスの増殖阻害率を測定・算出し、３回の試験の平均値±ＳＤを算出した。結果を図５に示す。【０１２１】
図５より、ＨＡは、カンジダ・アルビカンスのみならず、他の種々のカンジダに対しても同様に増殖阻害活性を発揮することが示された。【０１２２】
以上の結果から、ＨＡが真菌に対して顕著な増殖阻害能を有することが示された。また、ＨＡＳをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞は、真菌に対する増殖阻害能が増強されていることが示された。【０１２３】
このことから、ＨＡが真菌増殖抑制剤の有効成分として有用であること、ＨＡＳをコードするｃＤＮＡが、細胞の真菌増殖抑制作用の増強用途として有用であること、ＨＡＳをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞が、真菌増殖抑制用途として有用であることが示された。【０１２４】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００６年２月１０日出願の日本特許出願（特願２００６−０３３４１８）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明抑制剤及び本発明抑制方法１は、真菌の増殖を顕著に抑制することができ、かつその有効成分（ＨＡ又はその塩）の安全性も非常に高いことから極めて有用である。また本発明増強剤及び本発明増強方法は、細胞が有する真菌増殖抑制作用を強力に増強することができ、極めて有用である。また本発明抑制方法２は、本発明増強剤及び本発明増強方法を応用して、真菌の増殖を顕著に抑制することができ、極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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