(57)【要約】  本発明は、水溶性に優れ、かつ、単一の励起波長を用いてレシオメトリックに細胞内亜鉛イオンの濃度の変化を高感度に観測可能な亜鉛蛍光プローブ、その製造方法、及び該亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定方法を提供する。亜鉛蛍光プローブとして、一般式（Ｉ）：［化１］2007013201.tif 000051（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｚは単結合又は式：［化２］2007013201.tif 000052で表される基を示し、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｙは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基を示す。）で表される化合物又はその塩を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2007013201.tif 000034
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｚは単結合又は式：
【化２】
2007013201.tif 000035
で表される基を示し、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｙは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
一般式（Ｉ）において、Ａｒがアルキル基、アルコキシ基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、モノ又はジ（ヒドロキシアルキル）アミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボキシアルコキシ基及びアルコキシカルボニルアルコキシ基からなる群より選ばれる少なくとも１個の基で置換されたアリール基である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
一般式（Ｉ）において、Ａｒがフェニル基、トルイル基、ナフチル基、カルボキシアルコキシ基置換フェニル基及び５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル基からなる群より選ばれる１個の基である請求項２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
一般式（Ｉ）において、Ｘ及びＹが−Ｏ−で示される基であり、ｎが２であり、Ａがベンゼン環である請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって、含窒素ヘテロアリール基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群より選ばれる少なくとも１個の基で置換されたアルキル基である請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
一般式（ＩＩ）：
【化３】
2007013201.tif 000036
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項７】
一般式（ＩＩＩ）：
【化４】
2007013201.tif 000037
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項８】
一般式（ＩＩ）：
【化５】
2007013201.tif 000038
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩の製造方法であって、一般式（１６）：
【化６】
2007013201.tif 000039
（式中、Ｒ３はアルキル基を示し、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ａ、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。）
で表されるエステル化合物を加水分解することを特徴とする製造方法。
【請求項９】
一般式（１６）：
【化７】
2007013201.tif 000040
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表されるエステル化合物。
【請求項１０】
一般式（１６）：
【化８】
2007013201.tif 000041
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表されるエステル化合物の製造方法であって、一般式（１４）：
【化９】
2007013201.tif 000042
（式中、Ｒ３はアルキル基を示し、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ及びＡは前記に同じ。）
で表されるアルデヒド化合物と、一般式（１５）：
ＨＮ（Ｒ１）（Ｒ２）          （１５）
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基を示す。）
で表されるアミン化合物を反応させることを特徴とする製造方法。
【請求項１１】
一般式（１４）：
【化１０】
2007013201.tif 000043
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表されるアルデヒド化合物。
【請求項１２】
一般式（６）：
【化１１】
2007013201.tif 000044
（式中、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、ｍは１又は２を示す）
で表される化合物。
【請求項１３】
一般式（１６）：
【化１２】
2007013201.tif 000045
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表されるエステル化合物の製造方法であって、一般式（２３）：
【化１３】
2007013201.tif 000046
（式中、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ａ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。）
で表される化合物と、トリアルキルホスファイトを反応させることを特徴とする製造方法。
【請求項１４】
一般式（２３）：
【化１４】
2007013201.tif 000047
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表される化合物。
【請求項１５】
一般式（１９）：
【化１５】
2007013201.tif 000048
（式中、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環を示す）
で表される化合物。
【請求項１６】
一般式（ＩＩＩ）：
【化１６】
2007013201.tif 000049
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩の製造方法であって、一般式（３４）：
【化１７】
2007013201.tif 000050
（式中、Ｒ３はアルキル基を示し、Ａｒ、Ｘ、ｎ、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。）
で表されるエステル化合物を加水分解することを特徴とする製造方法。
【請求項１７】
上記請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光プローブ。
【請求項１８】
上記請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む亜鉛イオン測定用試薬。
【請求項１９】
上記請求項１〜７のいずれかに記載の化合物及び亜鉛イオンを含む亜鉛錯体。
【請求項２０】
亜鉛イオンの測定方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を亜鉛イオンと反応させて亜鉛錯体を生成する工程、及び
（ｂ）上記（ａ）で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む測定方法。
【請求項２１】
前記工程（ｂ）において、単一の励起波長の光を照射し、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩と上記（ａ）で生成した亜鉛錯体のそれぞれの蛍光強度を測定する請求項２０に記載の測定方法。
【請求項２２】
前記励起波長が３４０〜４００ｎｍである請求項２０に記載の測定方法。
【請求項２３】
前記工程（ｂ）において、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩の蛍光スペクトルのピーク波長と、上記（ａ）で生成した亜鉛錯体の蛍光スペクトルのピーク波長との差が２０ｎｍ以上である請求項２０、２１又は２２に記載の測定方法。
【請求項２４】
細胞内の亜鉛イオンの測定方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を細胞内に取り込む工程、及び
（ｂ）上記（ａ）で細胞内に取り込んだ化合物又はその塩と細胞内の亜鉛イオンとから生成した亜鉛錯体のそれぞれの蛍光強度を測定する工程
を含む測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞や生組織中の亜鉛イオンを生理条件下で高感度に測定するための新規な亜鉛蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
亜鉛は、ヒトの体内において、鉄に次いで存在量の多い必須微量金属元素である。しかし、細胞内でフリーの亜鉛イオン（Zn2+）として存在するのは通常nmol/lレベル以下であり、細胞内のほとんどのZn2+は主にタンパクと強固な結合を作っていると考えられる。その機能は重要であり、タンパクの構造の維持、酵素活性の制御などが挙げられる。【０００３】
また、転写因子等のDNA結合タンパクはzinc fingerやLIM motif等のZn2+結合性のモチーフを有し、それを介してDNAに結合していると言われている。Zn2+の欠乏はDNAの転写などに影響を与え、発癌に関与している可能性も示唆されている。【０００４】
近年では、主に細胞死との関係に着目し、label Zn2+の局在や動態を関連付ける研究もさかんに行われている。例えば、外因性によるZn2+による脳細胞の選択的細胞死や、細胞死と相関の深い酵素の活性制御、酸化ストレスによる酵素活性中心への影響など種々の研究が行われ亜鉛の生体内での働きに関する知見が集積しつつある。しかしながら、その動態や局在について未解明の部分も多い。【０００５】
上記のような研究において汎用されているのが、組織内の亜鉛イオンを測定するために亜鉛イオンを特異的に捕捉して錯体を形成し、錯体形成に伴なって蛍光を発する化合物、すなわち「亜鉛蛍光プローブ」である。【０００６】
これまでにも亜鉛プローブは種々提案されており、例えば、特許文献１には、ポリアミン類を置換基とする化合物が提案されている。この化合物は、生体内の亜鉛を高感度に測定できるものの、導入される細胞の厚さの相違等により検出される蛍光強度が影響され、蛍光強度からZn2+イオン濃度を精度よく定量的解析を行うことが困難であるという問題があった。【０００７】
このような問題点を解決するために、特許文献２では、レシオメトリックな蛍光プローブが提案された。これは、プローブが亜鉛イオンに結合する際の励起波長のシフトを利用する解析手法である。この手法だと、２つの励起波長の比（ratio）をとるため正確な定量的解析を行うことができる。しかし、２つ励起波長の光を使用するため、光源や検出系（蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー等）に大掛かりで複雑な機器を使用せざるを得ず、汎用性に乏しいという問題があった。【０００８】
この様な問題に鑑み、本発明者等は単一の励起波長を用いて、亜鉛イオンの濃度による蛍光波長の変化を観測できる亜鉛プローブを開発した（非特許文献１）。しかし、この化合物は、水溶性及び亜鉛イオンに対する感度が十分でないという問題があった。さらに、励起波長が紫外領域であるため、細胞にとっては好ましくないという問題があった。
【特許文献１】特開2000-239272号公報
【特許文献２】国際公開第02/102795号パンフレット
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc. Communications, 2004,126, p712-713
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、水溶性に優れ、かつ、単一波長の励起光を用いてレシオメトリックに細胞内亜鉛イオンの濃度の変化を高感度に観測可能な亜鉛蛍光プローブ、その製造方法、及び該亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記の課題に鑑みて鋭意研究を行った結果、後述する一般式（Ｉ）で表される化合物を亜鉛プローブとして用いた場合に、上記の課題を改善或いは解決できることを見出した。かかる知見に基づき、さらに研究を重ねた結果本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明は、以下の化合物、亜鉛蛍光プローブ、その製造方法、該亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定方法等を提供する。【００１２】
項１．  一般式（Ｉ）：【００１３】
【化１】
2007013201.tif 000002
【００１４】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｚは単結合又は式：【００１５】
【化２】
2007013201.tif 000003
【００１６】
で表される基を示し、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｙは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基を示す。）
で表される化合物又はその塩。【００１７】
項２．  一般式（Ｉ）において、Ａｒがアルキル基、アルコキシ基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、モノ又はジ（ヒドロキシアルキル）アミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボキシアルコキシ基及びアルコキシカルボニルアルコキシ基からなる群より選ばれる少なくとも１個の基で置換されたアリール基である項１に記載の化合物又はその塩。【００１８】
項３．  一般式（Ｉ）において、Ａｒがフェニル基、トルイル基、ナフチル基、カルボキシアルコキシ基置換フェニル基及び５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル基からなる群より選ばれる１個の基である項２に記載の化合物又はその塩。【００１９】
項４．  一般式（Ｉ）において、Ｘ及びＹが−Ｏ−で示される基であり、ｎが２であり、Ａがベンゼン環である項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩。【００２０】
項５．  一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって、含窒素ヘテロアリール基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群より選ばれる少なくとも１個の基で置換されたアルキル基である項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩。【００２１】
項６．  一般式（ＩＩ）：【００２２】
【化３】
2007013201.tif 000004
【００２３】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩。【００２４】
項７．  一般式（ＩＩＩ）：【００２５】
【化４】
2007013201.tif 000005
【００２６】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩。【００２７】
項８．  一般式（ＩＩ）：【００２８】
【化５】
2007013201.tif 000006
【００２９】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩の製造方法であって、一般式（１６）：
【００３０】
【化６】
2007013201.tif 000007
【００３１】
（式中、Ｒ３はアルキル基を示し、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ａ、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。）
で表されるエステル化合物を加水分解することを特徴とする製造方法。【００３２】
項９．  一般式（１６）：【００３３】
【化７】
2007013201.tif 000008
【００３４】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表されるエステル化合物。【００３５】
項１０．  一般式（１６）：
【００３６】
【化８】
2007013201.tif 000009
【００３７】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表されるエステル化合物の製造方法であって、一般式（１４）：【００３８】
【化９】
2007013201.tif 000010
【００３９】
（式中、Ｒ３はアルキル基を示し、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ及びＡは前記に同じ。）
で表されるアルデヒド化合物と、一般式（１５）：
ＨＮ（Ｒ１）（Ｒ２）          （１５）
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基を示す。）
で表されるアミン化合物を反応させることを特徴とする製造方法。【００４０】
項１１．  一般式（１４）：
【００４１】
【化１０】
2007013201.tif 000011
【００４２】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表されるアルデヒド化合物。【００４３】
項１２．  一般式（６）：【００４４】
【化１１】
2007013201.tif 000012
【００４５】
（式中、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、ｍは１又は２を示す）
で表される化合物。【００４６】
項１３．  一般式（１６）：
【００４７】
【化１２】
2007013201.tif 000013
【００４８】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表されるエステル化合物の製造方法であって、一般式（２３）：【００４９】
【化１３】
2007013201.tif 000014
【００５０】
（式中、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ａ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。）
で表される化合物と、トリアルキルホスファイトを反応させることを特徴とする製造方法。【００５１】
項１４．  一般式（２３）：
【００５２】
【化１４】
2007013201.tif 000015
【００５３】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｒ３はアルキル基を示す。）
で表される化合物。【００５４】
項１５．  一般式（１９）：【００５５】
【化１５】
2007013201.tif 000016
【００５６】
（式中、Ｘ及びＹは同一又は異なって−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環を示す）
で表される化合物。【００５７】
項１６．  一般式（ＩＩＩ）：
【００５８】
【化１６】
2007013201.tif 000017
【００５９】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基を示す。）
で表される化合物又はその塩の製造方法であって、一般式（３４）：【００６０】
【化１７】
2007013201.tif 000018
【００６１】
（式中、Ｒ３はアルキル基を示し、Ａｒ、Ｘ、ｎ、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。）
で表されるエステル化合物を加水分解することを特徴とする製造方法。【００６２】
項１７．  上記請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光プローブ。【００６３】
項１８．  上記請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む亜鉛イオン測定用試薬。【００６４】
項１９．  上記請求項１〜７のいずれかに記載の化合物及び亜鉛イオンを含む亜鉛錯体。【００６５】
項２０．  亜鉛イオンの測定方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を亜鉛イオンと反応させて亜鉛錯体を生成する工程、及び
（ｂ）上記（ａ）で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む測定方法。【００６６】
項２１．  前記工程（ｂ）において、単一の励起波長の光を照射し、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩と上記（ａ）で生成した亜鉛錯体のそれぞれの蛍光強度を測定する請求項２０に記載の測定方法。【００６７】
項２２．  前記励起波長が３４０〜４００ｎｍである請求項２０に記載の測定方法。【００６８】
項２３．  前記工程（ｂ）において、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩の蛍光スペクトルのピーク波長と、上記（ａ）で生成した亜鉛錯体の蛍光スペクトルのピーク波長との差が２０ｎｍ以上である請求項２０、２１又は２２に記載の測定方法。【００６９】
項２４．  細胞内の亜鉛イオンの測定方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を細胞内に取り込む工程、及び
（ｂ）上記（ａ）で細胞内に取り込んだ化合物又はその塩と細胞内の亜鉛イオンとから生成した亜鉛錯体のそれぞれの蛍光強度を測定する工程
を含む測定方法。
以下、本発明を詳述する。
Ｉ．亜鉛蛍光プローブ
亜鉛蛍光プローブとは亜鉛と錯体形成することにより蛍光応答を示す化合物であり、生体内のフリーの亜鉛イオンをイメージングするのに利用される。【００７０】
本発明の亜鉛蛍光プローブは、一般式（Ｉ）：
【００７１】
【化１８】
2007013201.tif 000019
【００７２】
（式中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基、Ｘは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基、ｎは２又は３、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいヘテロアリール基、Ｚは単結合又は式：【００７３】
【化１９】
2007013201.tif 000020
【００７４】
で表される基を示し、Ａは置換基を有してもよいベンゼン環、Ｙは−Ｏ−又は−Ｓ−で示される基を示す。）
で表される化合物又はその塩を含有する。【００７５】
Ａｒで示される置換基を有してもよいアリール基のアリール基としては、例えば、フェニル基、（ｏ−、ｍ−又はｐ−）トルイル基、ナフチル基等の単環又は２環のＣ６−１０のアリール基が挙げられる。このうち、フェニル基又はｐ?トルイル基が好適である。【００７６】
該アリール基上の置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、モノ又はジ（ヒドロキシアルキル）アミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルボキシアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボキシアルコキシ基、アルコキシカルボニルアルコキシ基等が例示され、これらのうちから選ばれる１〜３個（好ましくは１個）の基がアリール基上に置換されていてもよい。【００７７】
上記のアルキル基としては、例えば、エチル基、プロピル基、ブチル基等のＣ１−６のアルキル基が挙げられる。【００７８】
アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等のＣ１−６のアルコキシ基が挙げられる。【００７９】
モノ又はジアルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基等のモノ又はジＣ１−６アルキルアミノ基が挙げられる。【００８０】
モノ又はジ（ヒドロキシアルキル）アミノ基としては、例えば、２−ヒドロキシエチルアミノ基、ヒドロキシプロピルアミノ基、ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ基、ジ（ヒドロキシプロピル）アミノ基等のモノ又はジ（ヒドロキシＣ１−６アルキル）アミノ基が挙げられる。【００８１】
アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等のＣ１−６アルコキシカルボニル基が挙げられる。【００８２】
カルボキシアルキル基としては、例えば、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基等のカルボキシＣ１−６アルキル基が挙げられる。【００８３】
アルコキシカルボニルアルキル基としては、例えば、エトキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルメチル基等のＣ１−６アルコキシカルボニルＣ１−６アルキル基が挙げられる。【００８４】
カルボキシアルコキシ基としては、例えば、カルボキシメトキシ基、カルボキシエトキシ基等のカルボキシＣ１−６アルキル基が挙げられる。【００８５】
アルコキシカルボニルアルコキシ基としては、例えば、メトキシカルボニルメトキシ基、エトキシカルボニルメトキシ基等のＣ１−６アルコキシカルボニルＣ１−６アルコキシ基が挙げられる。【００８６】
このうち、Ａｒとして、フェニル基、トルイル基、ナフチル基、カルボキシメトキシ基置換フェニル基、５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル基（ダンシル基）等が好適である。【００８７】
Ｘは−Ｏ−で示される基が好ましく、ｎは２が好ましい。【００８８】
Ｚが式：
【００８９】
【化２０】
2007013201.tif 000021
【００９０】
（式中、Ａ及びＹは前記に同じ。）
で表される基の場合、Ａが置換基を有する場合、その置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子等が挙げられる。Ａとして好ましくはベンゼン環である。また、Ｙが−Ｏ−で示される基が好ましい。【００９１】
Ｒ１又はＲ２で示される置換基を有してもよいアルキル基のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等のＣ１−３のアルキル基が好適である。【００９２】
該アルキル基上の置換基としては、例えば、含窒素ヘテロアリール基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、アルコキシ基（例えば、Ｃ１−３アルコキシ基）等が例示される。含窒素ヘテロアリール基としては、例えば、ピリジル基（特に、２−ピリジル基）、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等の含窒素六員環ヘテロアリール基が挙げられる。モノ又はジアルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基等のモノ又はジＣ１−６アルキルアミノ基が挙げられる。これらの１又は２個（好ましくは１個）がアルキル基上に置換されていてもよい。【００９３】
Ｒ１又はＲ２で示される置換基を有してもよいアルキル基として好ましくは、２−ピリジルメチル基、２−ピリジルエチル基、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、ジメチルアミノ基などが挙げられる。【００９４】
Ｒ１又はＲ２で示される置換基を有してもよいアリール基のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等の単環又は２環のＣ６−１０のアリール基が挙げられる。【００９５】
該アリール基上の置換基としては、例えば、含窒素ヘテロアリール基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、アルコキシ基（例えば、Ｃ１−３アルコキシ基）等が例示される。含窒素ヘテロアリール基としては、例えば、ピリジル基（特に、２−ピリジル基）、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等の含窒素六員環ヘテロアリール基が挙げられる。モノ又はジアルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基等のモノ又はジＣ１−６アルキルアミノ基が挙げられる。これらの１又は２個（好ましくは１個）がアリール基上に置換されていてもよい。【００９６】
Ｒ１又はＲ２で示される置換基を有してもよいヘテロアリール基のヘテロアリール基としては、例えば、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群より選ばれる少なくとも１種のヘテロ原子を含むＣ６−１０のヘテロアリール基が挙げられる。具体的なヘテロアリール基としては、例えば、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、チエニル基、フリル基等が挙げられる。【００９７】
該ヘテロアリール基上の置換基としては、例えば、含窒素ヘテロアリール基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、アルコキシ基（例えば、Ｃ１−３アルコキシ基）等が例示される。含窒素ヘテロアリール基としては、例えば、ピリジル基（特に、２−ピリジル基）、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等の含窒素六員環ヘテロアリール基が挙げられる。モノ又はジアルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基等のモノ又はジＣ１−６アルキルアミノ基が挙げられる。これらの１又は２個（好ましくは１個）がヘテロアリール基上に置換されていてもよい。【００９８】
一般式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が例示される。【００９９】
一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩のうち、典型的には、一般式（ＩＩ）：【０１００】
【化２１】
2007013201.tif 000022
【０１０１】
（式中、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ａ、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。）
で表される化合物又はその塩、或いは、一般式（ＩＩＩ）：【０１０２】
【化２２】
2007013201.tif 000023
【０１０３】
（式中、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。）
で表される化合物又はその塩が挙げられる。【０１０４】
一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩のうち、亜鉛蛍光プローブとして好適な具体例として、一般式（ＩＩａ）：【０１０５】
【化２３】
2007013201.tif 000024
【０１０６】
（式中、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。）
で表される化合物又はその塩が挙げられる。【０１０７】
さらに好適な具体例として、一般式（ＩＩｂ）：【０１０８】
【化２４】
2007013201.tif 000025
【０１０９】
（式中、Ａｒ、Ｘ、Ｙ及びｎは前記に同じ。）
で表される化合物又はその塩、或いは、一般式（ＩＩｃ）：【０１１０】
【化２５】
2007013201.tif 000026
【０１１１】
（式中、Ａｒ、Ｘ、Ｙ及びｎは前記に同じ。）
で表される化合物又はその塩が挙げられる。【０１１２】
一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩のうち、亜鉛蛍光プローブとして好適な具体例として、一般式（ＩＩＩａ）：【０１１３】
【化２６】
2007013201.tif 000027
【０１１４】
（式中、Ａｒ、Ｘ、ｎ、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。）
で表される化合物又はその塩が挙げられる。【０１１５】
さらに好適な具体例として、一般式（ＩＩＩｂ）：【０１１６】
【化２７】
2007013201.tif 000028
【０１１７】
（式中、Ａｒ、Ｘ及びｎは前記に同じ。）
で表される化合物又はその塩、或いは、一般式（ＩＩＩｃ）：【０１１８】
【化２８】
2007013201.tif 000029
【０１１９】
（式中、Ａｒ、Ｘ、Ｙ及びｎは前記に同じ。）
で表される化合物又はその塩が挙げられる。【０１２０】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、亜鉛イオン測定のための蛍光プローブとして好適に用いられる。該化合物は、次のような特徴を有している。
（１）レシオメトリックタイプの蛍光プローブであるため、細胞数、励起光、基質濃度等に起因する測定値の変動が小さく、亜鉛イオンの濃度をより正確に定量解析できる。なお、レシオメトリックとは、異なる２波長における強度の比の変化を観測する手法を意味する。ここでは、フリーの亜鉛蛍光プローブとその亜鉛錯体についてそれぞれの蛍光波長のピーク強度比の変化を観測する。
（２）単一の励起光波長を使用し、蛍光波長（可視光領域）の変化が観察されるため、励起系、検出系とも装置が簡素化できる。さらに、励起光波長が単一であるので共焦点レーザー顕微鏡の利用も容易である。
（３）励起光波長が紫外領域より長波長（340〜370nm付近）であるため、細胞への影響を極力低減化できる。
（４）亜鉛イオンに対する感度および選択性が良好である。つまり、ｎＭ〜μＭオーダーの亜鉛イオンを捕捉可能である。
（５）水溶性に優れており、細胞や組織を含む適切な水性媒体中でも十分な溶解性を有している。
II．亜鉛蛍光プローブの製造
本発明の亜鉛蛍光プローブに含まれる一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩（一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩）の製法について説明する。【０１２１】
製法Ａ
一般式（ＩＩ）で表される化合物は、例えば、次にようにして製造することができる。【０１２２】
【化２９】
2007013201.tif 000030
【０１２３】
（式中、Ｒ３はアルキル基、ｍは１又は２を示し、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ａ、Ｒ１及びＲ２は前記に同じ。）
上記Ｒ３で示されるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等のＣ１−３アルキル基が挙げられる。特に、メチル基、エチル基が好適である。【０１２４】
一般式（１）で表される化合物を、J. Am. Chem. Soc. Communications, 2002, 124(5), p776-778の記載に準じて、塩基（例えば、炭酸カリウム等）の存在下一般式（２）で表されるジブロモ化合物を反応させて、一般式（３）で表される化合物を得る。【０１２５】
一般式（３）で表される化合物を、酸触媒（例えば、パラトルエンスルホン酸（ｐＴｓＯＨ）、ピリジニウムパラトルエンスルホネート（ＰＰＴＳ）等）の存在下、一般式（３）で表されるジオールを反応させてアセタール（４）とし、これに塩基（例えば、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム等）の存在下一般式（５）で表されるアルデヒド化合物を反応させて、一般式（６）で表される化合物を得る。【０１２６】
一般式（６）で表される化合物を、ＮａＢＨ４等の還元剤によりホルミル基を還元して水酸基とし、これを無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）と反応させてアセチル基で保護して、一般式（７）で表される化合物を得る。【０１２７】
一般式（７）で表される化合物を、水素雰囲気下で水素化触媒（ＰｔＯ２、Ｐｄ−炭素等）の存在下、ニトロ基をアミノ基に還元して、一般式（８）で表される化合物を得る。【０１２８】
一般式（８）で表される化合物を、塩基（例えば、ピリジン等）の存在下、一般式（９）で表されるスルホン酸クロライドを反応させて、スルホン酸アミドとし、これをパラトルエンスルホン酸等の酸で処理することにより、アセタールの保護基を除去して一般式（１０）で表されるホルミル化合物を得る。【０１２９】
一般式（１０）で表されるホルミル化合物を、一般式（１１）で表されるWittig試薬と反応させて一般式（１２）で表されるオレフィン化合物を得る。これを、Ｐ（ＯＥｔ）３を用いて還元的に閉環させて一般式（１３）で表されるインドール化合物を得る。【０１３０】
一般式（１３）で表されるインドール化合物のアセチル基をＥｔＯＮａで除去し、ＭｎＯ２等の酸化剤で酸化して、一般式（１４）で表されるアルデヒド化合物を得る。これに、還元剤（例えば、トリアセトキシ水素化ほう素ナトリウム等）の存在下、一般式（１５）で表される２級アミンを反応（還元的アミノ化反応）させて、一般式（１６）で表される化合物を得る。【０１３１】
一般式（１６）で表される化合物のカルボン酸エステルを、ＬｉＯＨ等のアルカリ金属水酸化物を用いて加水分解することにより、一般式（ＩＩ）で表される本発明の化合物を得る。なお、Ａｒ、Ｒ１及び／又はＲ２にカルボン酸エステルを含む場合には、該カルボン酸エステルは、通常、本加水分解工程においてカルボン酸に加水分解される。【０１３２】
製法Ｂ
或いは、一般式（ＩＩ）で表される化合物は、例えば、次にようにして製造することもできる。【０１３３】
【化３０】
2007013201.tif 000031
【０１３４】
（式中、Ａｒ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ａ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。）
一般式（１７）で表される化合物を、Journal of Medicinal Chemical Society, 2003, 46, pp. 691-701の記載に従い合成する。一般式（１７）で表される化合物を、塩基（例えば、炭酸カリウム等）の存在下一般式（１８）で表される化合物と反応させて、一般式（１９）で表されるホルミル化合物を得る。【０１３５】
一般式（１９）で表されるホルミル化合物に、還元剤（例えば、トリアセトキシ水素化ほう素ナトリウム等）の存在下、一般式（１５）で表される２級アミンを反応（還元的アミノ化反応）させて、一般式（２０）で表される化合物を得る。【０１３６】
一般式（２０）で表される化合物を、水素雰囲気下で水素化触媒（ＰｔＯ２、Ｐｄ−炭素等）の存在下、ニトロ基をアミノ基に還元して、これに塩基（例えば、ピリジン等）の存在下、一般式（９）で表されるスルホン酸クロライドを反応させて、一般式（２１）で表されるスルホン酸アミドとする。【０１３７】
一般式（２１）で表されるスルホン酸アミドを、ＭｎＯ２等の酸化剤で酸化して、一般式（２２）で表される化合物を得る。これに、一般式（１１）で表されるWittig試薬を反応させて一般式（２３）で表されるオレフィン化合物を得る。これを、Ｐ（ＯＥｔ）３等のトリアルキルホスファイトを用いて還元的に閉環させて一般式（１６）で表されるインドール化合物を得る。【０１３８】
一般式（１６）で表されるインドール化合物のエステルを、製法Ａと同様にして加水分解して、一般式（ＩＩ）で表される本発明の化合物を得る。【０１３９】
製法Ｃ
一般式（ＩＩＩ）で表される化合物は、例えば、次にようにして製造することができる。【０１４０】
【化３１】
2007013201.tif 000032
【０１４１】
（式中、Ｗ１及びＷ２は脱離基を示し、Ａｒ、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。【０１４２】
一般式（１７）で表される化合物を、塩基（例えば、炭酸カリウム等）の存在下、一般式（２４）で表される化合物と反応させて、一般式（２５）で示される化合物を得る。【０１４３】
一般式（２５）で示される化合物を、水素雰囲気下で水素化触媒（ＰｔＯ２、Ｐｄ−炭素等）の存在下、ニトロ基をアミノ基に還元して、一般式（２６）で表される化合物を得る。【０１４４】
一般式（２６）で表される化合物を、塩基（例えば、ピリジン等）の存在下、一般式（９）で表されるスルホン酸クロライドを反応させて、一般式（２７）で表されるスルホン酸アミドを得る。【０１４５】
一般式（２７）で表されるスルホン酸アミドをＭｎＯ２等の酸化剤で酸化して、一般式（２８）で表されるアルデヒド化合物を得る。この化合物を、一般式（１１）で表されるWittig試薬と反応させて一般式（２９）で表されるオレフィン化合物とし、これを、Ｐ（ＯＥｔ）３を用いて還元的に閉環させて一般式（３０）で表されるインドール化合物を得る。【０１４６】
一般式（３０）で表されるインドール化合物を、酸（例えば、塩酸、トリフルオロ酢酸等）で処理してＢｏｃ基を除去して、一般式（３１）で表される化合物を得る。【０１４７】
一般式（３１）で表される化合物に、塩基（例えば、炭酸カリウム等）等の活性化剤の存在下、一般式（３２）及び（３３）で表される化合物を反応させて、一般式（３４）で表される化合物を得る。なお、一般式（３２）で表される化合物のＷ１と、一般式（３３）で表される化合物のＷ２は同一でも異なっていても良い。上記Ｗ１及びＷ２で示される脱離基としては、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、ＴｆＯ−、ＭｓＯ−、ＴｓＯ−、が例示される。【０１４８】
さらに、一般式（３２）及び（３３）で表される化合物に代えて、所定のアルデヒド化合物を用いて、還元剤（例えば、トリアセトキシ水素化ほう素ナトリウム等）の存在下、一般式（３１）で表される化合物と還元的アミノ化反応に付することにより、一般式（３４）で表される化合物を製造することもできる。【０１４９】
一般式（３４）で表されるインドール化合物のエステルを、製法Ａと同様にして加水分解して、一般式（ＩＩＩ）で表される本発明の化合物を得る。【０１５０】
なお、一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で表される化合物は、必要に応じ塩に変換することもできる。許容される塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。また、場合によっては、水、アルコール等の溶媒和物として得ることもできる。
III．亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定方法
上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩（一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩）は、亜鉛蛍光プローブ、亜鉛イオン測定用試薬として有用である。【０１５１】
化合物（Ｉ）又はその塩は、亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯体を形成しても、吸収スペクトルのピーク波長のシフトが少ない。そのため、照射する励起光の波長が単一でよいことになり、励起装置及び検出装置の簡素化を図ることができる。吸収光波長のピークは、化合物（Ｉ）又はその塩の化学構造により変化するが、通常340〜400nm程度、好ましくは340〜370nm程度であり、励起光の波長もこの範囲から適宜選択することができる。【０１５２】
また、化合物（Ｉ）又はその塩は、亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯体を形成すると、その蛍光スペクトルのピークが顕著な波長シフトを生じる。この蛍光スペクトルピークの波長シフトは、通常は約20nm以上、さらに25〜50nm程度、特に25〜45nm程度となる。【０１５３】
つまり、本発明の化合物を亜鉛蛍光プローブとして用い、適当な単一波長の励起光を照射し、その時の化合物（Ｉ）とその亜鉛錯体との蛍光強度比を測定することにより、試料中の亜鉛イオンをレシオ法によって測定することが可能になる。【０１５４】
なお、レシオ法については、Ｍａｓｏｎ Ｗ．Ｔ．の著書（Ｍａｓｏｎ Ｗ．Ｔ．ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍａｓｏｎ Ｗ．Ｔ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）などに詳細に記載されており、これに準じて測定できる。【０１５５】
また、本発明の化合物（Ｉ）又はその塩は、亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、極めて錯体形成が速やかであるという特徴を有している。例えば、化合物（Ｉ）又はその塩は、試料中に、亜鉛イオン以外に他の金属イオン（例えば、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン又はマグネシウムイオンなど）が共存していても、その影響をほとんど受けずに亜鉛イオンに対して特異的に錯体を形成する。【０１５６】
以上の特徴から、本発明の化合物（Ｉ）又はその塩は、生細胞や生組織中の亜鉛イオンを生理条件下で測定するための亜鉛蛍光プローブとして極めて有用である。なお、本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量及び定性を含めて最も広義に解釈される。【０１５７】
本発明の亜鉛蛍光プローブを用いた試料中の亜鉛イオンの測定方法について、その具体例を以下に示す。本発明の亜鉛イオンの測定方法は、（ａ）上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を亜鉛イオンと反応させて亜鉛錯体を生成する工程、及び、（ｂ）上記（ａ）で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程、を含むことを特徴とする。【０１５８】
具体的には、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水親和性有機溶媒と水との混合媒体などに、化合物（Ｉ）又はその塩を溶解する。この溶液を、細胞や組織を含む適切な緩衝液中に添加して、単一波長の励起光を照射して、化合物（Ｉ）とその亜鉛錯体のそれぞれの蛍光強度比を測定すればよい。なお、細胞膜の透過性を考慮して脂溶性を高めるため、化合物（Ｉ）の親水性基、例えば、カルボキシル基を所定のエステル基に変換しても良い。該エステルは、細胞内に入った後エステラーゼで加水分解され得るものであれば特に限定はない。【０１５９】
本発明の化合物（Ｉ）を亜鉛蛍光プローブとして用いて亜鉛濃度を測定する場合、化合物（Ｉ）の濃度は、例えば、0.05〜100μＭ程度、好適には0.1〜10μＭ程度であればよい。また、亜鉛イオンの濃度は、例えば、0.05ｎＭ〜200μＭ程度、好適には0.1ｎＭ〜100μＭ程度まで測定可能である。【０１６０】
具体例として、上記化合物（ＩＩｃ）は、吸収波長は３４２ｎｍ、蛍光波長は４２７ｎｍであり、0.1〜10μＭ程度の濃度で亜鉛蛍光プローブとして用いることができる。検出可能な生細胞又は生組織中の亜鉛イオンの濃度は、0.1ｎＭ〜100μＭ程度であればよい。化合物（ＩＩｃ）は、亜鉛イオンを捕捉し錯体を形成して、蛍光スペクトルのピークが30〜50nm程度長波長シフトする。従って、この化合物（ＩＩｃ）を亜鉛プローブとして用いる場合には、例えば、励起波長３４２ｎｍの励起光を用い、該励起波長における化合物（ＩＩｃ）及びその亜鉛錯体の蛍光強度を求めて比を算出すればよい。この蛍光強度比から、細胞や組織中に存在する亜鉛イオンの濃度を求めることができる。【０１６１】
本発明の亜鉛蛍光プローブを用いた亜鉛イオンの測定は、従来カルシウムイオンのレシオ測定に用いられている蛍光顕微鏡を用いて実施することができる。本発明の方法は二波長測光であるため、単一光の励起光しか使用できない装置においても使用できる点で有利である。【０１６２】
なお、本発明の亜鉛蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【発明の効果】
【０１６３】
本発明の化合物は、亜鉛測定のためのレシオメトリックタイプの蛍光プローブとして極めて有用である。【０１６４】
特に、本発明の化合物は、亜鉛イオンとの錯体を形成しても励起スペクトルのピークにほとんど波長シフトが生じず、亜鉛イオンとの錯体を形成すると蛍光スペクトルのピークが長波長シフトする。そのため、単一の波長を有する励起光を照射して、レシオメトリックに細胞内の亜鉛イオン濃度を高感度で検出することができる。また、単一の波長の励起光源でよいため、励起系及び検出系の装置も簡略化できるというメリットがある。
また本発明の化合物は、励起光波長が紫外領域よりも長波長（340〜370nm程度）であるために、細胞への影響は小さい。しかも、亜鉛イオンに対する感度及び選択性が良好であるという特徴を有している。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】化合物(IＩc)と亜鉛イオンとの錯形成模式図を示す。
【図２】化合物(IＩc)および亜鉛添加したときの吸収スペクトルを示す。
【図３】化合物(IＩc)および亜鉛添加したときの蛍光スペクトルを示す。
【図４】化合物(IＩc)の金属イオン選択性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１６６】
本発明を、実施例を用いて更に詳述するが、これに限定されるものではない。【０１６７】
実施例１（製法Ａ）
（１）3-(2-(2-ホルミルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-ニトロベンズアルデヒド  ジオキソラン(6)
Journal of the American Chemical Society, 2002, 124, pp. 776-778に記載の方法に従って、3-(2-ブロモエトキシ)-4-ニトロベンズアルデヒド  ジオキソランを合成した。該化合物4.8 g（15.1 mmol）とサリチルアルデヒド1.9 g (15.1 mmol)を50 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸カリウム2.76 g (20.0 mmol)を加え100 ℃で３時間撹拌した。反応液を氷水300 mlに撹拌しながら加え、析出した固体を濾取し、標記化合物(6) 4.3 gを得た（収率 80%）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 4.03-4.15 (4H, m), 4.50-4.59 (4H, m), 5.84 (1H, s), 7.04-7.10 (2H, m), 7.19 (1H, dd, J = 8.4, 1.4 Hz), 7.32 (1H, d, J = 1.4 Hz), 7.53 (1H, m), 7.82-7.85 (2H, m).
（２）3-(2-(2-アセトキシメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-ニトロベンズアルデヒド  ジオキソラン(7)
化合物(6) 3.6 g (10.0 mmol)を100 mlのメタノールに懸濁させた溶液に、テトラヒドロホウ酸ナトリウムNaBH40.38 g (10.0 mmol)を0 ℃で少しずつ加え、室温で一晩撹拌した。メタノールを減圧下留去後、残留物を水で洗浄し、エタノール／水にて再結晶してアルコール体3.6 gを得た（収率 定量的）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 4.03-4.14 (4H, m), 4.41-4.46 (2H, m), 4.51-4.55 (2H, m), 4.64 (2H, s), 5.84 (1H, s), 6.93 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.98 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.17 (1H, dd, J = 8.1, 1.4 Hz), 7.25-7.31 (3H, m), 7.84 (1H, d, J = 8.1 Hz).
上記化合物2.9 g (8.0 mmol)を30 mlのピリジンに溶かした溶液に、無水酢酸1.02 g (10.0 mmol)を0 ℃で加え、室温で一晩撹拌した。反応液にエタノール10 mlを加え、ピジリン／エタノールを減圧下留去した。残留物を酢酸エチル50 mlに溶かし、飽和食塩水で3回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下で留去し、標記化合物(7) 2.90 gを得た（収率 90%）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 2.06 (3H, s), 4.05-4.11 (4H, m), 4.39-4.43 (2H, m), 4.48-4.55 (2H, m), 5.15 (2H, s), 5.85 (1H, s), 6.94-7.01 (2H, m), 7.17 (1H, dd, J = 8.4, 1.4 Hz), 7.28-7.34 (3H, m), 7.83 (1H, d, J = 8.1 Hz).
（３）3-(2-(2-アセトキシメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-アミノベンズアルデヒド  ジオキソラン(8)
化合物(7) 2.0 g (5.0 mmol)を40 mlのテトラヒドロフランに溶かした溶液に、二酸化白金114 mg (0.5 mmol)を加え、２気圧の水素ガス下室温で一晩撹拌した。二酸化白金をセライトで濾去後、濾液を減圧下で濃縮し、標記化合物(8) 1.9 gを得た。（収率 定量的）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 2.05 (3H, s), 3.99-4.02 (2H, m), 4.11-4.14 (2H, m), 4.38 (4H, s), 5.18 (2H, s), 5.70 (1H, s), 6.69 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.93 (1H, dd, J = 8.0, 1.5 Hz), 6.95 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.97-7.00 (2H, m), 7.31 (1H, td, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.34 (1H, dd, J = 7.5, 1.5 Hz).
（４）3-(2-(2-アセトキシメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)ベンズアルデヒド (10)
化合物(8) 1.9 g (5.0 mmol)を20 mlのピリジンに溶かした溶液に、p-トルエンスルホニルクロリド1.14 g (6.0 mmol)を0 ℃で加え、室温で一晩撹拌した。反応液を氷水300 mlに撹拌しながら加え、室温で30分間撹拌を続けた。析出した固体を濾取し、スルホンアミド体 2.4 gを得た（収率 定量的）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 2.07 (3H, s), 2.31 (3H, s), 3.97-4.14 (4H, m), 4.22 (4H, s), 5.17 (2H, s), 5.69 (1H, s), 6.90 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.95 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.00-7.05 (2H, m), 7.12 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.23 (1H, s), 7.32-7.38 (2H, m), 7.54 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.61 (2H, d, J = 8.1 Hz).
上記化合物2.4 g (5.0 mmol)を70 mlのアセトンに溶かした溶液に、トルエンスルホン酸一水和物87 mg (0.5 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応液に飽和食塩水10 mlを加え、アセトンを減圧下で留去後、ジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。ジクロロメタンを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(10) 2.3 gを得た（収率 97 %）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 2.06 (3H, s), 2.34 (3H, s), 4.31-4.40 (4H, m), 5.15 (2H, s), 6.92 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.04 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.17 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.31-7.42 (4H, m), 7.64-7.71 (4H, m).
（５）3-ニトロ-4-[2-[3-(2-(2-アセトキシメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-トランス-ビニル]安息香酸  エチルエステル (12)
化合物(10) 0.43 g (1.0 mmol) を6 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、（4-エトキシカルボニル-2-ニトロベンジル）トリフェニルフォスフォニウムブロミド(11) 0.83 g (1.5 mmol)、炭酸カリウム0.69 g (5.0 mmol)を加え、90 ℃で一晩撹拌した。反応液を水100 mlに加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(12) 0.49 gを得た（収率 73 %）。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 1.42 (3H, t, J = 7.0 Hz), 2.05 (3H, s), 2.32 (3H, s), 4.27 (4H, s), 4.43 (2H, q, J = 7.0 Hz), 5.17 (2H, s), 6.92 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.02 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.04 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.08-7.11 (2H, m), 7.15 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.34-7.38 (3H, m), 7.46 (1H, d, J = 14.0 Hz), 7.56 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.64 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.81 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.21 (1H, dd, J = 8.0, 1.5 Hz), 8.57 (1H, d, J = 1.5 Hz).
（６）2-[3-(2-(2-アセトキシメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  エチルエステル (13)
化合物(12) 0.32 g (0.48 mmol) を3 mlの亜リン酸トリエチルに溶かし、125 ℃で４時間撹拌した。亜リン酸トリエチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(13) 0.23 gを得た（収率 74 %）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 1.42 (3H, t, J = 7.3 Hz), 2.03 (3H, s), 2.30 (3H, s), 4.22-4.28 (4H, m), 4.40 (2H, q, J = 7.3 Hz), 5.17 (2H, s), 6.76 (1H, d, J = 1.4 Hz), 6.90 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.03 (1H, t, J = 7.3 Hz), 7.14 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.22 (1H, dd, J = 1.8 Hz), 7.30 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.32-7.38 (2H, m), 7.59 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.61 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.65 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.80 (1H, dd, J = 8.4, 1.1 Hz), 8.15 (1H, s), 9.19 (1H, brs).
（７）2-[3-(2-(2-ホルミルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  エチルエステル(14)
化合物(13) 0.18 g (0.29 mmol) を20 mlのエタノールに溶かした溶液に、ナトリウムエトキシド0.39 g (5.7 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応液に酢酸0.34 g (5.7 mmol)を加え、エタノールを減圧下留去した。残留物に飽和食塩水25 mlを加え、酢酸エチルで３回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製してアルコール体0.12 gを得た（収率 69 %）。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 1.41 (3H, t, J = 7.0 Hz), 2.26 (3H, s), 4.21 (2H, t, J = 3.5 Hz), 4.30 (2H, t, J = 3.5 Hz), 4.39 (2H, q, J = 7.0 Hz), 4.67 (2H, s), 6.74 (1H, d, J = 1.0 Hz), 6.89 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.01 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.09 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.25 (1H, s), 7.29-7.34 (3H, m), 7.47 (1H, s), 7.58 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.59 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.61 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.74 (1H, dd, J = 8.3, 1.0 Hz), 8.13 (1H, s), 9.63 (1H, s).
上記化合物0.12 g (0.2 mmol) を15 mlのジクロロメタンに溶かした溶液に、二酸化マンガン0.17 g (2.0 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。不溶物をセライトで濾去後、濾液を減圧下留去し、化合物(14)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 1.34 (3H, t, J = 7.0 Hz), 2.28 (3H, s), 4.31 (2H, q, J = 7.0 Hz), 4.37-4.43 (4H, m), 6.99 (1H, s), 7.13 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.21 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.31 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.39-7.44 (2H, m), 7.53 (1H, s), 7.58-7.63 (4H, m), 7.72-7.73 (2H, m), 8.03 (1H, s), 9.55 (1H, brs), 10.31 (1H, s), 11.83 (1H, s).
（８）2-[3-(2-(2-ビス(2-ピリジルメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  エチルエステル(16b)
化合物(14) 53 mg (0.09 mmol) を10 mlの1,2-ジクロロエタンに懸濁させた溶液に、ジ-（2-ピコリル）アミン36 mg (0.18 mmol) を加えた後、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド38 mg (0.18 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応液に水20 mlを加え、クロロホルムで３回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(16b) 52 mgを得た（収率 75 %）。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 1.37 (3H, t, J = 7.0 Hz), 2.26 (3H, s), 3.60 (2H, s), 3.75 (4H, s), 3.97-3.99 (2H, m), 4.11-4.14 (2H, m), 4.36 (2H, q, J = 7.0 Hz), 4.37-4.43 (4H, m), 6.71 (1H, d, J = 7.5 Hz), 6.76 (1H, dd, J = 2.0, 1.0 Hz), 6.95 (1H, td, J = 7.5, 1.0 Hz), 7.04-7.07 (4H, m), 7.19 (1H, td, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.25 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.29 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz), 7.41 (1H, dd, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.47 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.52 (1H, td, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.55 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.59 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.61 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.78 (1H, dd, J = 5.5, 1.5 Hz), 8.04 (1H, d, J = 1.5 Hz), 8.46 (2H, ddd, J = 5.0, 2.0, 1.0 Hz), 10.39 (1H, s).
（９）2-[3-(2-(2-ビス(2-ピリジルメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸 (IIb)
化合物(16b) 12 mg (15 mmol) を10 mlのメタノールに溶かした溶液に、水酸化リチウム一水和物42 mg (1.0 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。メタノールを減圧留去し、希塩酸により中和した後、不溶物を濾取し化合物(IIb) 7.3 mgを得た（収率 81%）。【０１６８】
実施例２（製法Ａ）
（１）2-[3-(2-(2-ビス(エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  エチルエステル (16c)
上記実施例１（８）において、ジ-（2-ピコリル）アミンの代わりにジエチルイミノジアセテートを用いること以外、上記実施例（８）と同様にして、化合物(16c)を得た（収率68％）。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 1.17 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.40 (3H, t, J = 7.0 Hz), 2.30 (3H, s), 3.53 (4H, s), 3.93 (2H, s), 4.07 (4H, q, J = 7.0 Hz), 4.14-4.16 (2H, m), 4.25-4.27 (2H, m), 4.39 (2H, q, J = 7.0 Hz), 6.77 (1H, s), 6.84 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.98 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.13 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.24-7.28 (2H, m), 7.31 (1H, dd, J = 8.0, 1.5 Hz), 7.38 (1H, dd, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.48 (1H, brs), 7.58 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.59 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.66 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.89 (1H, dd, J = 8.0, 1.5 Hz), 8.14 (1H, s), 9.59 (1H, s).
（２）2-[3-(2-(2-ビス(カルボキシメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸 (IIc)
化合物(16c) 40 mg (52 mmol) を10 mlのメタノールに溶かした溶液に、水酸化リチウム一水和物42 mg (1.0 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。メタノールを減圧留去し、1 mlの３Ｎ塩酸を加え、不溶物を濾取した。これを1 mlの蒸留水に懸濁させ、希塩酸をｐＨ８になるまで加えた。Ｇ−２５セファデックスを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製して化合物(IIc) 4.1 mgを得た（収率 10 %）。【０１６９】
実施例３（製法Ａ）
（１）2-[3-(2-(2-ビス(エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(4-(エトキシカルボニルメトキシ)ベンゼンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  エチルエステル (16d)
上記実施例１（４）において、p-トルエンスルホニルクロリドの代わりにエチル（4-クロロスルフォニルフェノキシ）アセテートを反応させること以外、実施例１（１）〜（８）と同様にして反応させることにより、化合物(16d)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 1.27 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.42 (3H, t, J = 7.0 Hz), 3.61 (2H, s), 3.75 (4H, s), 4.19-4.24 (6H, m), 4.40 (2H, q, J = 7.0 Hz), 4.56 (2H, s), 6.77 (1H, s), 6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.91 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.02-7.07 (3H, m), 7.20-7.22 (2H, m), 7.32-7.38 (3H, m), 7.47 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.51 (2H, td, J = 7.5, 2.0 Hz), 7.58-7.61 (2H, m), 7.67 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.80 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.16 (1H, s), 8.46 (2H, dd, J = 5.0, 2.0 Hz), 9.79 (1H, s).
（２）2-[3-(2-(2-ビス(カルボキシメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(4-(カルボキシメトキシ)ベンゼンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸 (IId)
化合物(16d) 12 mg (15 μmol) を10 mlのメタノールに溶かした溶液に、水酸化リチウム一水和物42 mg (1.0 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。メタノールを減圧留去し、希塩酸により中和した後、不溶物を濾取し化合物(IId) 7.3 mgを得た（収率 81%）。【０１７０】
実施例４（製法Ｂ）
（１）3-(2-(2-ホルミルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-ニトロベンジルアルコール (19)
Journal of Medicinal Chemical Society, 2003, 46, pp. 691-701に記載の方法に従って、2-nitoro-5-hidroxymethyl-phenol(17) を合成した。該化合物(17) 3.4 g (20.0 mmol)と2-（2-ブロモエトキシ）ベンズアルデヒド4.6 g (20.0 mmol)を100 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸カリウム6.9 g (50.0 mmol)を加え100 ℃で５時間撹拌した。反応液を氷水300 mlに撹拌しながら加え、析出した固体を濾取し、標記化合物(19) 4.7 gを得た（収率 74%）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 4.03-4.15 (4H, m), 4.50-4.59 (4H, m), 5.84 (1H, s), 7.04-7.10 (2H, m), 7.19 (1H, dd, J = 8.4, 1.4 Hz), 7.32 (1H, d, J = 1.4 Hz), 7.53 (1H, m), 7.82-7.85 (2H, m).
（２）3-(2-(2-ビス(エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-ニトロベンジルアルコール (20)
化合物(19) 2.78 g (8.76 mmol) を50 mlの1,2-ジクロロエタンに溶かした溶液に、ジエチルイミノジアセテート6.24 g (33.0 mmol) を加えた後、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド2.12 g (10.0 mol)と酢酸0.60 g (10 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応液に水100 mlを加え、クロロホルムで３回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(20) 3.07 gを得た（収率 71 %）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 4.03-4.14 (4H, m), 4.41-4.46 (2H, m), 4.51-4.55 (2H, m), 4.64 (2H, s), 5.84 (1H, s), 6.93 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.98 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.17 (1H, dd, J = 8.1, 1.4 Hz), 7.25-7.31 (3H, m), 7.84 (1H, d, J = 8.1 Hz).
（３）3-(2-(2-ビス(エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)ベンジルアルコール (21)
化合物(20) 0.71 g (1.45 mmol)を20 mlのテトラヒドロフランに溶かした溶液に、5 %パラジウム／炭素70 mgを加え、２気圧の水素ガス下室温で一晩撹拌した。触媒をセライトで濾去後、濾液を減圧下で濃縮し、還元体のアミノ化合物0.67 gを得た。（収率 定量的）
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 1.22 (6H, t, J = 7.2 Hz), 3.55 (4H, s), 3.95 (2H, s), 4.10 (4H, q, J = 7.2 Hz), 4.32-4.39 (4H, m), 4.56 (2H, s), 6.67 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.79 (1H, dd, J = 7.8, 1.9 Hz), 6.89-6.92 (3H, m), 6.96 (1H, td, J = 7.3, 1.9 Hz), 7.23 (1H, td, J = 7.3, 1.6 Hz), 7.43 (1H, dd, J = 7.3, 1.6 Hz).
上記化合物0.67 g (1.45 mmol)を10 mlのクロロホルムに溶かした溶液に、150 mlのピリジンを加え、この溶液にトルエンスルホニルクロリド0.28 g (1.50 mmol)の2 mlクロロホルム溶液を0 ℃で加え、室温で一晩撹拌した。反応液に水100 mlを加え、クロロホルムで３回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(21) 3.07 gを得た（収率 71 %）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 1.21 (6H, t, J = 7.0 Hz), 2.31 (3H, s), 3.56 (4H, s), 3.89 (2H, s), 4.05-4.23 (8H, m), 4.61 (2H, s), 6.85 (2H, m), 6.92 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.00 (1H, td, J = 7.6, 1.1 Hz), 7.10 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.23-7.30 (2H, m), 7.43 (1H, dd, J = 7.6, 1.9 Hz), 7.49 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.6 Hz). 
（４）3-(2-(2-ビス(エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)ベンズアルデヒド (21)
化合物(21) 0.60 g (0.98 mmol) を15 mlのジクロロメタンに溶かした溶液に、二酸化マンガン0.34 g (4.0 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。不溶物をセライトで濾去後、濾液を減圧下留去し、化合物(21) 0.54 gを得た（収率 89 %）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 1.21 (6H, t, J = 7.0 Hz), 2.26 (3H, s), 3.49 (4H, s), 3.87 (2H, s), 4.00 (4H, q, J = 7.0 Hz), 4.19-4.30 (4H, m), 6.79 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.91 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.09 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.28-7.35 (3H, m), 7.59 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.64 (2H, d, J = 8.2 Hz).
（５）3-ニトロ-4-[2-[3-(2-(2-ビス(エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-トランス-ビニル]安息香酸  エチルエステル (23)
化合物(21) 0.54 g (0.87 mmol) を5 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、（4-エトキシカルボニル-2-ニトロベンジル）トリフェニルフォスフォニウムブロミド0.72 g (1.3 mmol)、炭酸カリウム0.60 g (4.4 mmol)を加え、90 ℃で一晩撹拌した。反応液を水50 mlに加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(23) 0.17 gを得た（収率 24 %）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 1.20 (6H, t, J = 7.3 Hz), 1.42 (3H, t, J = 7.3 Hz), 2.34 (3H, s), 3.57 (4H, s), 3.96 (2H, s), 4.08 (4H, q, J = 7.3 Hz), 4.20-4.29 (4H, m), 4.43 (2H, q, J = 7.3 Hz), 6.88 (1H, d, J = xx Hz), 6.94-7.16 (5H, m), 7.28-7.34 (2H, m), 7.43-7.49 (2H, m), 7.55-7.67 (4H, m), 7.80 (1H, d, J = 8.6 Hz), 8.21 (1H, dd, J = 8.1, 1.6 Hz), 8.56 (1H, d, J = 1.6 Hz).
（６）2-[3-(2-(2-ビス(エトキシカルボニルメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  エチルエステル (16c)
化合物(23) 0.17 g (0.21 mmol) を2 mlの亜リン酸トリエチルに溶かし、125 ℃で４時間撹拌した。亜リン酸トリエチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(16c) 40 mgを得た（収率 25 %）。
（７）2-[3-(2-(2-ビス(カルボキシメチル)アミノメチルフェノキシ)-1-エトキシ)-4-(p-トルエンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸 (IIe)
化合物(16c)を実施例１（９）と同様に処理して、化合物(IIe)を得た。【０１７１】
実施例５（製法Ｃ）
（１）（2-(5-ヒドロキシメチル-2-ニトロフェノキシ)エチル）カルバミック酸-tert-ブチルエステル (25)
化合物(17) 2.57 g (15.2 mmol)と（2-ブロモエチル）カルバミック酸-tert-ブチルエステル 3.40 g (15.2 mmol)を50 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸カリウム3.15 g (22.8 mmol)を加え100 ℃で２２時間撹拌した。反応液に水150 mlを加え、酢酸エチルで３回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(25) 0.85 gを得た（収率 18 %）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 1.44 (9H, s), 3.55-3.61 (2H, m), 4.18 (2H, t, J = 5.1 Hz), 4.77 (2H, d, J = 5.7 Hz), 5.18 (1H, bs), 6.99 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.13 (1H, s), 7.88 (1H, d, J = 8.4 Hz).
（２）（2-(5-ヒドロキシメチル-2-(4-（エトキシカルボニルメトキシ）フェニルスルホニルアミノ)エチル)カルバミック酸-tert-ブチルエステル (27)
化合物(25) 0.85 g (2.73 mmol)を30 mlのエタノールに溶かした溶液に、5 %パラジウム／炭素70 mgを加え、２気圧の水素ガス下室温で一晩撹拌した。触媒をセライトで濾去後、濾液を減圧下で濃縮し、還元体のアミノ化合物(26) 0.77 gを得た。（収率 85 %）
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 1.45 (9H, s), 3.54-3.61 (2H, m), 4.07 (2H, t, J = 5.1 Hz), 4.55 (2H, s), 4.98 (1H, bs), 6.69 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.77-6.81 (2H, m).
上記化合物(26) 0.65 g (2.31 mmol)を20 mlのジクロロメタンに溶かした溶液に、2 mlのピリジンを加え、この溶液にエチル（4-クロロスルフォニルフェノキシ）アセテート0.64 g (2.31 mmol)の2 mlクロロホルム溶液を0 ℃で加え、室温で一晩撹拌した。反応液に水50 mlを加え、酢酸エチルで３回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(27) 1.13 gを得た（収率 94 %）。
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz): δ 1.28 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.43 (9H, s), 3.25-3.29 (2H, m), 3.65-3.69 (2H, m), 4.24 (2H, q, J = 7.0 Hz), 4.57 (2H, s), 4.63 (2H, s), 5.44 (1H, bs), 6.70 (1H, s), 6.80-6.85 (3H, m), 7.44 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.60 (1H, bs), 7.65 (2H, d, J = 8.6 Hz).
（３）（2-(5-ホルミル-2-(4-（エトキシカルボニルメトキシ）フェニルスルホニルアミノ)エチル)カルバミック酸-tert-ブチルエステル (28)
化合物(27) 1.13 g (2.16 mmol) を30 mlのジクロロメタンに溶かした溶液に、二酸化マンガン1.88 g (21.6 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。不溶物をセライトで濾去後、濾液を減圧下留去し、化合物(28) を得た。
（４）3-ニトロ-4-[2-[3-(2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-エトキシ)-4-(4-(エトキシカルボニルメトキシ)ベンゼンスルホニルアミノ)-フェニル]-トランス-ビニル]安息香酸  エチルエステル (29)
化合物(28)を、実施例１（５）と同様にWittig反応することにより、化合物(29)を得る。
（５）2-[3-(2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-エトキシ)-4-(4-(エトキシカルボニルメトキシ)ベンゼンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  エチルエステル (30)
化合物(29)を、実施例１（６）と同様に反応することにより、化合物(30)を得る。
（６）2-[3-(2-アミノ-1-エトキシ)-4-(4-(エトキシカルボニルメトキシ)ベンゼンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  エチルエステル (31)
トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン１：１混合溶媒に、化合物(30)を０度で加え、３０分撹拌する。溶媒を減圧下で留去し、化合物(31)を得る。
（７）2-[3-(2-ビス(2-ピリジルメチル)アミノ-1-エトキシ)-4-(4-(エトキシカルボニルメトキシ)ベンゼンスルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  エチルエステル (34)
化合物(31)の1,2-ジクロロエタン溶液に、2-ピリジンカルボキシアルデヒドを加えた後、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを加え、室温で一晩撹拌する。反応液に水20 mlを加え、クロロホルムで３回抽出後、硫酸マグネシウムで乾燥する。クロロホルムを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物(34)を得る。
（８）2-[3-(2-ビス(2-ピリジルメチル)アミノ-1-エトキシ)-4-(4-(カルボキシメトキシベンゼン)スルホニルアミノ)-フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸  (IIIb) 
化合物(34)を実施例１（９）と同様に処理して、化合物(IIIb)を得る。
試験例１（化合物(IIc)の蛍光特性）
上記実施例１で得られた化合物(IＩc)の蛍光特性を調べた。化合物(IIc)を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２、５μＭ ＥＤＴＡ含有）に１０μＭとなるように溶解して吸収及び蛍光スペクトルを測定した。
＜測定条件＞
日本分光株式会社  分光蛍光光度計  ＦＰ-７５０ＤＳ
スリット：Ｅｘ、Ｅｍ ２．５ｎｍ
スキャン速度：２４０ｎｍ／ｍｉｎ
測定温度：２５℃
亜鉛イオン（２０μＭ ＺｎＣｌ２）の添加前及び亜鉛イオン添加後の化合物(IIc)の蛍光特性を、下記表１に示す。【０１７２】
【表１】
2007013201.tif 000033
【０１７３】
化合物(IIc)は、亜鉛イオンと配位することによっての吸収波長ピークは８ｎｍの波長側にシフトし、蛍光波長のピークは３７ｎｍ長波長側にシフトした。これは、亜鉛イオンとの相互作用により、化合物(IIc)のスルホンアミド基のｐＫａの値が小さくなったため、中性条件においても脱プロトン化して、共役系が広がったためであると考えられる。【０１７４】
亜鉛イオンの添加後における化合物(IIc)と亜鉛イオンの平衡状態の模式図を、図１に示す。また、それぞれの吸収スペクトルの変化を図２に、蛍光スペクトルの変化を図３に示す。なお、図３の励起波長は、図２の２つの吸収スペクトルの交点である３４２ｎｍを用いた。【０１７５】
これによれば、化合物(IIc)とその亜鉛錯体では、吸収波長のシフトが小さく、蛍光波長のピークが大きくなることが分かった。従って、化合物(IIc)を亜鉛蛍光プローブとして用いた場合、単一波長の励起光を用いることができ、かつ、化合物(IIc)とその亜鉛錯体の蛍光波長ピークが大きく異なり蛍光強度比を正確に検出することができるため、試料（細胞）中の亜鉛濃度を正確に測定することができる。
試験例２（化合物(IIc)の亜鉛イオン選択性）
１０μＭの化合物(IIc)を含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２、５μＭ ＥＤＴＡ含有）に、マンガン二価イオン、鉄三価イオン又は亜鉛イオンをそれぞれ濃度が５０μＭになるまで添加し、励起波長を３５０ｎｍに固定して、化合物(IIc)の蛍光波長４１０ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ４１０）及び化合物(IIc)の金属錯体の蛍光波長４８５ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ４８５）を測定し、その蛍光強度比（Ｉ４８５／Ｉ４１０）を算出した。【０１７６】
同様に、１０μＭの化合物(IIc)を含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２、５μＭ ＥＤＴＡ含有）に、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン又はマグネシウムイオンをそれぞれ濃度が５ｍＭになるまで添加し、励起波長３５０ｎｍに固定して、化合物(IIc)の蛍光波長４１０ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ４１０）及び化合物(IIc)の金属錯体の蛍光波長４８５ｎｍにおける蛍光強度（Ｉ４８５）を測定し、その蛍光強度比（Ｉ４８５／Ｉ４１０）を算出した。【０１７７】
その結果を、図４（Zn2+なし）に示す。【０１７８】
化合物(IIc)は、亜鉛イオンを添加した場合に高いレシオ変化（蛍光強度比）を示すが、生体内に多く存在する他のイオンを加えた場合にはレシオの変化がみられないか、又は蛍光の消光が観察された。このことから、化合物(IIc)が亜鉛イオンに対して高い選択性を示すことが分かった。【０１７９】
次に、上記で調製した各溶液に、５０μＭとなるように亜鉛イオンを添加し、同様の測定条件でスペクトルを測定した。その結果を、図４（Zn2+あり）に示す。これによれば、各溶液に亜鉛イオンを添加することにより、上記の亜鉛イオンのみを添加した場合と同等の亜鉛錯体の蛍光強度比が得られた。このことから、化合物(IIc)を用いると、他の金属イオンの影響を受けることなく亜鉛イオンのレシオ測定ができることがわかった。
【図１】
2007013201.tif 000053
【図２】
2007013201.tif 000054
【図３】
2007013201.tif 000055
【図４】
2007013201.tif 000056
【国際調査報告】
2007013201.tif 000057
2007013201.tif 000058
2007013201.tif 000059
2007013201.tif 000060
2007013201.tif 000061
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2007013201.tif 000063
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