(57)【要約】  本発明の目的は、化学発光等の発光をより高感度に増幅することができ、かつ発光を長時間持続させることのできる発光増幅剤を提供することにある。すなわち本発明は、ヘテロポリマーを有効成分として含有することを特徴とする発光増幅剤、発光基質と、前記発光増幅剤とを用いることを特徴とする発光測定法、及び検体と、測定対象物に対する抗原及び／又は抗体、該抗原及び／又は抗体の活性化剤による標識体、及び発光基質とを、前記発光増幅剤の存在下反応させ、発光測定することを特徴とする、検体中の測定対象物の分析方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロポリマーを有効成分として含有することを特徴とする発光増幅剤。
【請求項２】
前記へテロポリマーが、水に不溶なポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の発光増幅剤。
【請求項３】
前記へテロポリマーが、水に可溶なポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の発光増幅剤。
【請求項４】
前記ヘテロポリマーを形成するモノマー成分として、少なくとも、水溶性ビニル化合物とカチオンモノマーとが含まれることを特徴とする請求項１に記載の発光増幅剤。
【請求項５】
前記ヘテロポリマーを形成するモノマー成分として、少なくとも、水溶性ビニル化合物とカチオンモノマーとジビニルベンゼンとを含むことを特徴とする請求項２に記載の発光増幅剤。
【請求項６】
前記水溶性ビニル化合物が、窒素含有複素環ビニル化合物であることを特徴とする請求項４に記載の発光増幅剤。
【請求項７】
前記カチオンモノマーが、アンモニウム化合物及び／又はホスホニウム化合物である請求項４に記載の発光増幅剤。
【請求項８】
前記カチオンモノマーが、下記一般式（１）及び／又は下記一般式（２）で表される化合物であることを特徴とする請求項４に記載の発光増幅剤。
【化１】
2007142314.tif 000010
【化２】
2007142314.tif 000011
（式（１）及び（２）中、Ｒ1はＨ又はＣＨ3であり、Ｒ2〜Ｒ5はそれぞれ独立してＨ，炭素数１〜１６のアルキル基またはＮ（ＣＨ3）2であり、Ｘ1はＮ又はＰである。式（２）中のＹ1はＮＨ，Ｏ又はＣＨ2である。）
【請求項９】
前記カチオンモノマーが、メタクリロイロキシトリメチルアンモニウム塩、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリブチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリヘキシルホスホニウム塩、ビニルベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリオクチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム塩の中から選ばれる１種以上の化合物であることを特徴とする請求項４に記載の発光増幅剤。
【請求項１０】
前記へテロポリマーが、少なくとも、１−ビニル−２−ピロリドン、ビニルベンジルブロミド，ビニルベンジルクロライド，ビニルベンジルジメチルアミン，ビニルベンジルシアニド，４−ニトロ−ビニルベンゼン，４−メチルスチレン，３−メチルスチレン，２−メチルスチレン，酢酸ビニル，４−アミノスチレン，酢酸４−ビニルフェニルエステル，アジピン酸ジビニル，安息香酸ビニルエステル，４−ｔｅｒｔ−ブチル安息香酸ビニルエステル，１，４−ビス［４−（ジ−ｐ−トリル−アミノ）スチリル］ベンゼン，クロロメチルスチレン，ビニルデカン酸，ｎ−オクタン酸ビニル，クロトン酸ビニル，ヘキサン酸ビニル，ケイ皮酸ビニル，２−クロロ安息香酸ビニルエステル，４−クロロメチルスチレン，塩化ビニリデン，メタクリル酸ビニル，４−メトキシスチレン，ラウリン酸ビニル，４−ビニルベンゼンホウ素酸、及びビニルピリジンの中から選ばれる１種以上の化合物をモノマー成分として更に含有することを特徴とする請求項４に記載の発光増幅剤。
【請求項１１】
前記ヘテロポリマーに含まれる、アンモニウム化合物、又はアンモニウム化合物及びホスホニウム化合物の、ヘテロポリマー全体に占める割合が５０ｗ／ｖ％以下であることを特徴とする、請求項４に記載の発光増幅剤。
【請求項１２】
前記カチオンモノマーが、アルキル鎖を異にする２種以上のホスホニウム化合物であることを特徴とする、請求項４に記載の発光増幅剤。
【請求項１３】
発光基質と、請求項１に記載の発光増幅剤とを用いることを特徴とする発光測定法。
【請求項１４】
前記発光基質が、化学発光反応の過程で１，２−ジオキセタン構造を形成する化合物であることを特徴とする請求項１３に記載の発光測定法。
【請求項１５】
前記発光基質が、ジオキセタン類であることを特徴とする請求項１３に記載の発光測定法。
【請求項１６】
前記ジオキセタン類が、下記一般式（３）で表される化合物であることを特徴とする請求項１５に記載の発光測定法。
【化３】
2007142314.tif 000012
（上記式（３）中、Ｒ7はＸ2−オキシ基で置換されたアリール基である。Ｒ6はアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキシ基、アリール基、及びアリール基Ｒ7と結合してＸ2−オキシ基置換の多環式アリール基を形成するアリール基から成る群から選択されたものである。またＲ8，Ｒ9はそれぞれアルキル基又はヘテロアルキル基であって、Ｒ8とＲ9が互いに結合して多環式アルキレン基を形成していてもよい。）
【請求項１７】
前記ジオキセタン類が、下記一般式（４）で表される化合物であることを特徴とする請求項１５に記載の発光測定法。
【化４】
2007142314.tif 000013
（上記式（４）中、Ｘ3はグルコシド基或いはＰＯ3Ｚ（但し、ＺはＨ，Ｎａ，Ｋ又はＮＨ4を表わす。）を表し、Ｙ2はＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，メチル基またはメトキシ基を表わす。）
【請求項１８】
検体と、測定対象物に対する抗原及び／又は抗体、該抗原及び／又は抗体の活性化剤による標識体、並びに発光基質とを、請求項１に記載の発光増幅剤の存在下反応させ、発光測定することを特徴とする、検体中の測定対象物の分析方法。
【請求項１９】
測定対象物に対応する抗体及び／又は抗原が固定化されてなる固相、該抗体及び／又は抗原の活性化剤による標識体、及び請求項１に記載の発光増幅剤を含むことを特徴とする検体中の測定対象物分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光増幅剤に関し、好ましくは、化学発光等の発光をより高感度に増幅することができ、かつ発光を長時間持続させることのできる発光増幅剤及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学発光基質に酵素等を作用させて化学発光を起こさせる化学発光測定法は、検体中の測定対象物の存在又は濃度を迅速、高感度に測定することができるため、広く用いられている。【０００３】
化学発光法における発光時間が短いなどの欠点を克服するため、発光を増幅するための発光増幅剤（エンハンサー）の開発が進んでいる。例えば、特許文献１（特許第２６６０９３２号公報）には、パーオキシダーゼ活性の測定方法に使用される発光増幅剤が開示されている。また、特許文献２（特許第２９８４２８２号公報）には、酸ホスファターゼやアルカリホスファターゼの測定に利用される有機エンハンサーが開示されている。【０００４】
【特許文献１】特許第２６６０９３２号公報
【特許文献２】特許第２９８４２８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記従来の発光増幅剤は、発光増幅効果が不十分であり、また、時間の経過と共に発光の減衰が引き起こされるという欠点を有していた。
本発明は、上述した従来技術の欠点を解消し、化学発光等の発光をより高感度に増幅することができ、かつ発光を長時間持続させることのできる発光増幅剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の発明を提供する。
〔１〕  ヘテロポリマーを有効成分として含有することを特徴とする発光増幅剤。
〔２〕  前記へテロポリマーが、水に不溶なポリマーであることを特徴とする前記〔１〕に記載の発光増幅剤。
〔３〕  前記へテロポリマーが、水に可溶なポリマーであることを特徴とする前記〔１〕に記載の発光増幅剤。
〔４〕  前記ヘテロポリマーを形成するモノマー成分として、少なくとも、水溶性ビニル化合物とカチオンモノマーとが含まれることを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の発光増幅剤。
〔５〕  前記ヘテロポリマーを形成するモノマー成分として、少なくとも、水溶性ビニル化合物とカチオンモノマーとジビニルベンゼンとを含むことを特徴とする前記〔２〕に記載の発光増幅剤。
〔６〕  前記水溶性ビニル化合物が、窒素含有複素環ビニル化合物であることを特徴とする前記〔４〕または〔５〕に記載の発光増幅剤。
〔７〕  前記カチオンモノマーが、アンモニウム化合物及び／又はホスホニウム化合物である前記〔４〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の発光増幅剤。
〔８〕  前記カチオンモノマーが、下記一般式（１）及び／又は下記一般式（２）で表される化合物であることを特徴とする前記〔４〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の発光増幅剤。
【化１】
2007142314.tif 000002
【化２】
2007142314.tif 000003
（式（１）及び（２）中、Ｒ1はＨ又はＣＨ3であり、Ｒ2〜Ｒ5はそれぞれ独立してＨ，炭素数１〜１６のアルキル基またはＮ（ＣＨ3）2であり、Ｘ1はＮ又はＰである。式（２）中のＹ1はＮＨ，Ｏ又はＣＨ2である。）
〔９〕  前記カチオンモノマーが、メタクリロイロキシトリメチルアンモニウム塩、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリブチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリヘキシルホスホニウム塩、ビニルベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリオクチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム塩の中から選ばれる１種以上の化合物であることを特徴とする前記〔４〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の発光増幅剤。
〔１０〕  前記へテロポリマーが、少なくとも、１−ビニル−２−ピロリドン、ビニルベンジルブロミド，ビニルベンジルクロライド，ビニルベンジルジメチルアミン，ビニルベンジルシアニド，４−ニトロ−ビニルベンゼン，４−メチルスチレン，３−メチルスチレン，２−メチルスチレン，酢酸ビニル，４−アミノスチレン，酢酸４−ビニルフェニルエステル，アジピン酸ジビニル，安息香酸ビニルエステル，４−ｔｅｒｔ−ブチル安息香酸ビニルエステル，１，４−ビス［４−（ジ−ｐ−トリル−アミノ）スチリル］ベンゼン，クロロメチルスチレン，ビニルデカン酸，ｎ−オクタン酸ビニル，クロトン酸ビニル，ヘキサン酸ビニル，ケイ皮酸ビニル，２−クロロ安息香酸ビニルエステル，４−クロロメチルスチレン，塩化ビニリデン，メタクリル酸ビニル，４−メトキシスチレン，ラウリン酸ビニル，４−ビニルベンゼンホウ素酸，及びビニルピリジンの中から選ばれる１種以上の化合物をモノマー成分として更に含有することを特徴とする前記〔４〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の発光増幅剤。
〔１１〕  前記ヘテロポリマーに含まれる、アンモニウム化合物、又はアンモニウム化合物及びホスホニウム化合物の、ヘテロポリマー全体に占める割合が５０ｗ／ｖ％以下であることを特徴とする、前記〔４〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の発光増幅剤。
〔１２〕  前記カチオンモノマーが、アルキル鎖を異にする２種以上のホスホニウム化合物であることを特徴とする、前記〔４〕又は〔５〕に記載の発光増幅剤。
〔１３〕  発光基質と、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の発光増幅剤とを用いることを特徴とする発光測定法。
〔１４〕前記発光基質が、化学発光反応の過程で１，２−オキセタン構造を形成する化合物であることを特徴とする前記〔１３〕に記載の発光測定法。
〔１５〕  前記発光基質が、ジオキセタン類であることを特徴とする前記〔１３〕または〔１４〕に記載の発光測定法。
〔１６〕  前記ジオキセタン類が、下記一般式（３）で表される化合物であることを特徴とする前記〔１５〕に記載の発光測定法。
【化３】
2007142314.tif 000004
（上記式（３）中、Ｒ7はＸ2−オキシ基で置換されたアリール基である。Ｒ6はアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキシ基、アリール基、及びアリール基Ｒ7と結合してＸ2−オキシ基置換の多環式アリール基を形成するアリール基から成る群から選択されたものである。またＲ8，Ｒ9はそれぞれアルキル基又はヘテロアルキル基であって、Ｒ8とＲ9が互いに結合して多環式アルキレン基を形成していてもよい。）
〔１７〕  前記ジオキセタン類が、下記一般式（４）で表される化合物であることを特徴とする前記〔１５〕に記載の発光測定法。
【化４】
2007142314.tif 000005
（上記式（４）中、Ｘ3はグルコシド基或いはＰＯ3Ｚ（但し、ＺはＨ，Ｎａ，Ｋ又はＮＨ4を表わす。）を表し、Ｙ2はＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，メチル基またはメトキシ基を表わす。）
〔１８〕  検体と、測定対象物に対する抗原及び／又は抗体、該抗原及び／又は抗体の活性化剤による標識体、並びに発光基質とを、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の発光増幅剤の存在下反応させ、発光測定することを特徴とする、検体中の測定対象物の分析方法。
〔１９〕  測定対象物に対応する抗体及び／又は抗原が固定化されてなる固相、該抗体及び／又は抗原の活性化剤による標識体、及び前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の発光増幅剤を含むことを特徴とする検体中の測定対象物分析用キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、化学発光等の発光を、従来の発光増幅剤と比較してより高感度に増幅することができ、かつ発光を長時間持続させることのできる発光増幅剤及びその用途が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】図１−１は、ＴＢＱ基質液の発光カウントの測定結果を示す図である。
【図１−２】図１−２は、エンハンサーを含まない基質液の発光カウントの測定結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例１で調製したエンハンサー含有基質液の発光カウントの測定結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例６で調製したエンハンサー含有基質液の発光カウントの測定結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例７で調製したエンハンサー含有基質液の発光カウントの測定結果を示す図である。
【図５】図５は、エンハンサーを含まない基質液で酵素反応を３０秒から３００秒と種々変化させてから、ランダム共重合（７：３）エンハンサーを添加して測定した図である。
【符号の説明】
【０００９】
図５中の矢印はエンハンサーを添加した時間を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、発光増幅剤に関するものである。発光増幅剤とは、発光を増幅させる物質を意味し、エンハンサーとも別称する。【００１１】
本発明の発光増幅剤は、ヘテロポリマーを有効成分として含有することを特徴とする。ヘテロポリマーとは、２種以上のモノマー成分によりなるポリマーを意味し、共重合体と言い換えることもできる。ヘテロポリマーは、２種以上のモノマー成分が交互に並ぶものであっても良いし、ランダムに並ぶものであっても良い。また、自身がヘテロポリマーである複数種の成分が結合したもの（ブロック共重合体）でも良いし、幹のブロックに異なる枝のブロックが１本又は複数本結合したもの（グラフト共重合体）であっても良い。【００１２】
本発明で用いられるヘテロポリマーは、水に可溶なものであっても良いし、一方、水に不溶なものであっても良い。水に不溶なポリマーの中でも、当業者間でラテックスポリマーと呼ばれているポリマーが好ましい。尚、本発明において水に可溶とは、４〜４０℃の水溶液（例えば緩衝液、蒸留水等）に１重量％以上の濃度で溶解することを言う。【００１３】
ヘテロポリマーの分子量、重合度も、発光増幅剤としての機能が発揮される限り特に限定されない。水に可溶なヘテロポリマーの分子量は、通常１０，０００〜２００，０００、好ましくは２０，０００〜１００，０００の範囲のものを用いることができる。また、重合度については、通常６０〜１，４００、好ましくは２００〜７００の範囲のものを用いることができる。一方、水に不溶なヘテロポリマーについては、ほとんどの溶媒にも不溶であるため、分子量及び重合度を求めることは困難であるが、直径が０．０５〜５．０μｍの粒子が好ましい。【００１４】
モノマー成分とは、ポリマーの基本構成単位となりうる分子を意味する。通常は、重合反応によりポリマーを形成するものであり、本発明の場合はヘテロポリマーを形成する必要上、２種以上の互いに異なる構造を持つモノマー成分が用いられる。２種以上のモノマー成分は、例えば、水溶性ビニル化合物とカチオンモノマーが、それぞれ少なくとも１種類ずつ含まれるように適宜選択して用いることができる。モノマー成分の一つとして水溶性ビニル化合物とカチオンモノマーを用いることにより、発光基質の発光中間体であり、下記の構造式（５）で表されるメチル−３−オキシ安息香酸（methyl-3-oxy
benzoate）をヘテロポリマー側に引き寄せることができる。
【化５】
2007142314.tif 000006
【００１５】
水溶性ビニル化合物としては、水に可溶であり、かつビニル基を含む化合物を挙げることができる。例えば、窒素含有複素環ビニル化合物のほか、アクリルアミド、メタクリルアミドなどイミド基やヒドロキシエチルアクリレートのような水酸基を持つ化合物を挙げることができ、中でも窒素含有複素環ビニル化合物が好ましい。窒素含有複素環ビニル化合物としては、ビニルピリジン、１−ビニル−２−ビニルピロリドン、ビニルサクシミド等が挙げられる。ビニルピリジンとして更に具体的には、４−ビニルピリジン、メチルビニルピリジン、メトキシビニルピリジン、エチルビニルピリジン、エトキシビニルピリジンを挙げることができる。【００１６】
カチオンモノマーとは、１つ以上のカチオンを含む化合物であり、いわゆるオニウム塩、イミニウム塩のいずれであっても良く、また、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物であっても良い。例えば、アンモニウム化合物、ホスホニウム化合物、オキソニウム化合物、スルホニウム化合物等を挙げることができ、このうちアンモニウム化合物、ホスホニウム化合物が好ましい。【００１７】
アンモニウム化合物としては、ＮＨ4+（アンモニウムイオン）を含む化合物又はそのＨの一部又は全部が炭化水素基やＯＨ基等で置換した化合物（アンモニウム誘導体）；一般式Ｒ10Ｃ＝ＮＲ10+で表される化合物（イミニウム）；一般式Ｒ−Ｎ2で表される化合物（ジアゾニウム）；非環式窒素骨格のカチオンを含む化合物、含窒素環式骨格のカチオンを含む化合物；含窒素共鳴安定化カチオンを含む化合物（Ｒ10はアルキル基、ビニル基等の炭化水素基を表し、２つ以上のＲが結合している場合は互いに異なる基であっても良い）などを挙げることができる。これらのうち、ＮＨ4+（アンモニウムイオン）を含む化合物、少なくとも１箇所のビニル基又はビニル基を含む置換基を有する化合物が好ましい。一方、ホスホニウム化合物としては、ＰＨ4+を含む化合物又はそのＨの一部又は全部が炭化水素基やＯＨ等で置換されたカチオンを含む化合物を挙げることができる。このうち、アンモニウム化合物、ホスホニウム化合物の好ましい化合物は、前記一般式（１）、前記一般式（２）で表すことができる。一般式（１）及び（２）中、Ｒ1はＨ又はＣＨ3であり、Ｒ2〜Ｒ5は、それぞれ独立してＨ，炭素数１〜１６のアルキル基またはＮ（ＣＨ3）2であり、Ｘ1はＮ又はＰである。一般式（２）中のＹ1はＮＨ，Ｏ又はＣＨ2である。
一般式（１）で表される化合物の具体例としては、ビニルベンジルトリメチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリプロピルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリブチルアンモニウム塩、ビニルベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリヘキシルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリオクチルアンモニウム塩、ビニルベンジルジエチルデシルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリメチルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリプロピルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩、ビニルベンジルジメチルヘキサデシルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリヘキシルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩、ビニルベンジルジエチルデシルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム塩を挙げることができる。また、一般式（２）で表される化合物の具体例としては、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム塩、メタクリロイロキシトリメチルアンモニウム塩、メタクリロアミドプロピルトリメチルアンモニウム塩、２−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウム塩、ジアリルジメチルアンモニウム塩を挙げることができる。中でも、メタクリロイロキシトリメチルアンモニウム塩、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリブチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩、ビニルベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリオクチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム塩が好ましい。特に、ビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム塩、ビニルベンジルトリヘキシルホスホニウム塩、ビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩が好ましい。【００１８】
オキソニウム化合物としては、Ｈ3Ｏ+又はＨをアルキル基で置換したカチオンを含む化合物を挙げることができる。スルホニウムイオンとしては、Ｒ11Ｓ+（Ｒ11はアルキル基又はアリール基で３個とも同じか或いは異なる）を含む化合物を挙げることができる。【００１９】
これらのカチオンモノマーは、１種類を単独で用いてもよいが、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。特に、アルキル鎖を異にする２種以上のホスホニウム化合物を組み合わせることが好ましい。「アルキル鎖を異にする」とは、アルキル鎖の種類、鎖長のいずれかが異なることを意味する。好ましくはアルキル鎖以外の化学構造は共通しているものを組み合わせて用いることができる。具体的にはビニルベンジルトリヘキシルホスホニウム塩およびビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩を含む組み合わせが好ましく、特にこれら２種のみの組み合わせがより好ましい。さらに、ビニルベンジルトリヘキシルホスホニウム塩およびビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩を、１〜５：９〜５、中でも３〜４：７〜６の比率で組み合わせて用いることがより好ましい。【００２０】
本発明においては、モノマー成分として、上記水溶性ビニルモノマーとカチオンモノマーと共に、水溶性のヘテロポリマー、或いは不溶性のポリマー、好ましくはラテックスポリマーを形成することができる他のモノマーを用いることができる。このようなモノマー成分としては、アクリル系、スチレン系、ビニル系等の各種化合物を適宜選択して用いることができ、具体的には、ｐ−ジビニルベンゼンをはじめとするジビニルベンゼン（Divinyl-benzene）などのビニルベンゼン（vinyl-benzene）、ビニルベンジルブロミド（Vinylbenzyl
bromide），ビニルベンジルクロライド（Vinylbenzyl chloride），ビニルベンジルジメチルアミン（Vinylbenzyl
dimethylamine）、ビニルベンジルシアニド（Vinylbenzyl cyanide）、４−ニトロ−ビニルベンゼン（4-Nitro-Vinylbenzene）、４−メチルスチレン（4-Methylstyrene）、３−メチルスチレン（3-Methylstyrene）、２−メチルスチレン（2-Methylstyrene）、酢酸ビニル（Vinyl
Acetate）、４−アミノスチレン（4-Aminostyrene）、酢酸４−ビニルフェニルエステル（Acetic Acid 4-Vinylphenyl
Ester）、アジピン酸ジビニル（Divinyl Adipate）、安息香酸ビニルエステル（Benzoic Acid Vinyl Ester）、４−ｔｅｒｔ−ブチル安息香酸ビニルエステル（4-tert-Butylbenzoic
Acid Vinyl Ester）、１，４−ビス［４−（ジ−ｐ−トリル−アミノ）スチリル］ベンゼン（1，4-Bis［4-（di-p-tolyl-amino）styryl］benzene）、クロロメチルスチレン（Chloromethylstyrene），ビニルデカン酸（Vinyl
Decanoate）、ｎ−オクタン酸ビニル（Vinyl-n-Octanoate），クロトン酸ビニル（Vinyl Crotonate）、ヘキサン酸ビニル（Vinyl
n-Hexanoate），ケイ皮酸ビニル（Vinyl Cinnamate）、２−クロロ安息香酸ビニルエステル（2-Chlorobenzoic Acid
Vinyl Ester）、４−クロロメチルスチレン（4-Chloromethylstyrene）、塩化ビニリデン（Vinylidene Chloride）、メタクリル酸ビニル（Vinyl
Methacrylate）、４−メトキシスチレン（4-Methoxystyrene）、ラウリン酸ビニル（Vinyl Laurate）、４−ビニルベンゼンホウ素酸（4-Vinylbenzeneboronic
acid）、ビニルピリジン（Vinylpyridine）、２，２−ビス（４−メタクリロキシフェニル）プロパン（2,2-Bis(4-methacryloxyphenyl)
propane）、Ｎ，Ｎ−エチレンビスアクリルアミド（N, N' Ethylene Bisacrylamide）、Ｎ，Ｎ−システアミンビスアクリルアミド（N,N'-Cystaminebisacrylamide）等のアクリル系、スチレン系及び／又はビニル系化合物を挙げることができ、好ましくはこれらの化合物のうち１種以上を組み合わせて用いることができる。特に水に不溶なポリマーの場合には、上記具体例のうち少なくともジビニルベンゼン、特にｐ−ジビニルベンゼンが含まれていることが好ましい。尚、ヘテロポリマーに含まれるホスホニウム化合物が、アルキル鎖を異にする２種以上のホスホニウム化合物の場合は、上記列挙した化合物は特に用いなくてもよい。【００２１】
モノマー成分の含有割合は適宜定めることができるが、カチオンモノマーとしてアンモニウム化合物を含む場合（アンモニウム化合物を含みかつホスホニウム化合物を含まない場合）、アンモニウム化合物のヘテロポリマー全体に占める割合が５０ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、特に３〜１０ｗ／ｖ％であることが好ましい。また、カチオンモノマーとしてアンモニウム化合物及びホスホニウム化合物を含む場合は、アンモニウム化合物及びホスホニウム化合物の合計のヘテロポリマー全体に占める割合が５０ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、特に３〜１０ｗ／ｖ％であることが好ましい。５０ｗ／ｖ％を超えると、効果が減少するおそれがある。尚、アンモニウム化合物とホスホニウム化合物の両者を含む場合には、それらの合計の割合が上記範囲となることが好ましい。一方、カチオンモノマーとしてホスホニウム化合物を含む場合（ホスホニウム化合物を含みかつアンモニウム化合物を含まない場合）は、ヘテロポリマー全体に占めるホスホニウム化合物の割合は５０ｗ／ｖ％を超えても構わない。但し、ホスホニウム化合物として、アルキル鎖を異にする２種以上のホスホニウム化合物を用いる場合は、それらのヘテロポリマー全体に占める割合が５０ｗ／ｖ％以上であることが好ましく、１００ｗ／ｖ％であることがより好ましい。【００２２】
ヘテロポリマーは、常法によりモノマー成分を重合して製造することが可能である。例えば、モノマー成分に２，２−｛アゾビス（Ｎ−カルボキシエチル）２−メチルプロピオンアミド｝等の重合開始剤を添加して混和し、アルゴン雰囲気下、６０〜１００℃、０．５〜２４時間行う。水に不溶なヘテロポリマーの場合、得られる反応液を遠心して比重の大きな成分を取り除くことも可能である。一方水に可溶なヘテロポリマーの場合には得られる反応液の透析を繰り返すことにより精製が可能である。【００２３】
本発明の発光増幅剤は、上述のヘテロポリマーを有効成分とするものであれば良く、必要に応じて他の成分を添加することもできる。また、他の発光増幅剤と併用することもできる。【００２４】
本発明の発光増幅剤は、他の物質の発光機能を増幅させることができるので、例えば酵素を発光基質に作用させる際の反応系に添加すると化学発光等を増幅し、よって、検体中の測定対象物の、酵素活性などによる確実な検出（確認、判定）、定量等に用いることができる。【００２５】
すなわち、本発明の発光測定法は、発光基質を用いて測定するにあたり、上述した発光増幅剤を用いることを特徴とする。【００２６】
発光基質としては、例えば酵素、酸、アルカリ、塩、酵素、触媒等で化学発光反応を生じる物質を挙げることができる。ここで用いられる化学発光反応の基質としては、例えば化学発光反応の過程で１，２−オキセタン構造を形成する化合物、ルミノール、イソルミノールが挙げられる。このうち、化学発光反応の過程で１，２−オキセタン構造を形成する化合物が好ましい。
化学発光反応の過程で１，２−オキセタン構造を形成する化合物としては、ジオキセタン類、ロフィン（２，４，５−トリフェニルイミダゾール）、アクリジン誘導体（ルシゲニン（１０，１０´−ジメチル−９，９´−ピアクリジニウム二硝酸塩）、アクリジニウム塩、アクリジニウムエステルなど）、テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン、インドール（スカトール（３−メチルインドール）など）、シッフ塩基、シュウ酸誘導体（シュウ酸クロライド、シュウ酸エステル、シュウ酸オキサミドなど）、ジフェノイルペルオキシドを挙げることができる。これらのうち、ジオキセタン類が最も好ましい。【００２７】
ジオキセタン類とは、四員環ペルオキシド構造を有する化合物の総称である。ジオキセタン類の好ましい具体例として、前記一般式（３）で表されるジオキセタン誘導体を挙げることができる。前記一般式（３）中、Ｒ7はＸ2−オキシ基で置換されたアリール基である。このようなアリール基としては、酸、アルカリ、塩、酵素、有機又は無機触媒及び電子供与体から選択した活性化剤（本明細書において活性化剤とは、発光基質に直接的または間接的に作用して発光させる作用を有するものを言う。）でＸ2を除去して反応を誘発すると不安定なオキシド中間体の１，２−ジオキセタン構造を形成し、その不安定な１，２−ジオキセタン化合物が電子エネルギーを放出して分解し、光と下記の一般式（６）で表される２個のカルボニル含有化合物とを生成するものを挙げることができる。またＸ2は酵素により除去される化学的に易反応性の基である。Ｒ6はアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキシ基、アリール基、及び、前記したアリール基Ｒ7と結合して、例えば１，２−ジオキセタン環にスピロ結合するところの、Ｘ2−オキシ基置換の多環式アリール基を形成するアリール基から成る群から選択されたものである。またＲ8とＲ9はそれぞれアルキル基またはヘテロアルキル基であって、Ｒ8とＲ9が互いに結合して、例えば１，２−ジオセタン環にスピロ結合する多環式アルキレン基を形成していてもよい。
【化６】
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【００２８】
一般式（３）中、Ｒ6がＲ7と結合していないときは、このＲ6は前記したようにアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキシ基またはアリール基であり、好ましくは、１〜８個の炭素原子を有する低級のアルキル基またはアルコキシ基である。Ｒ6はまた、６〜２０個の炭素原子を有するアリール基、アリールオキシ基またはアリールシリルオキシ基であってもよい。Ｒ6がアリール基であるＲ7と結合して１，２−ジオキセタン環にスピロ結合する多環式アリール基を形成する場合、その多環式アリール基は炭素数３０までのものであることが好ましい。この場合の多環式アリール基はキサンテニル基のように、炭素原子に代わって酸素原子を含むものであってもよく、スピロ結合多環式アリール基が、同基のＣ９位で１，２−ジオキセタン環にスピロ結合するフルオレニル又はキサンテニルが好ましい。【００２９】
Ｒ7は、Ｘ2−オキシ基（例えば、ＯＸ2基）で置換されたアリール基であり、アリール基を含む基はフェニル基、ビフェニル基、結合フェニル基または他のアリール基で、６〜３０個の炭素原子を含み、且つ他の置換体を含んでいてもよい。Ｘ2は、安定なジオキセタン構造を分解して化学発光（シグナル）を生じさせるために、ジオキセタンから活性化剤により除去される基である。ＯＸ2基はヒドロキシ基、アルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキシ基、無機オキシ酸塩（特にリン酸塩または硫酸塩）、ピラノシド酸素、アリールカルボキシルエステルまたはアルキルカルボキシルエステル基から選択するのが好ましい。また、ＯＸ2基がヒドロキシ基である場合、同基の水素原子はカリウムｔ−ブトキシドのような有機塩基あるいは水酸化カリウムのような無機塩基と易反応性であって、塩基により分解させて化学発光を生じさせることができる。活性化剤が、免疫測定用またはＤＮＡプローブ検出用に、標識として通常良く用いられる酵素である場合には、該酵素と易反応性のＸ2を有するＯＸ2基を適宜、選択すればよい。例えば、免疫測定用またはＤＮＡプローブ検出において、比色基質又は蛍光基質により検出させるものとして、汎用されているアルカリホスファターゼ、β−ガラクシドダーゼ、アリールまたはアセチルコリンエステラーゼなどである場合、ＯＸ2基としてリン酸塩、ピラノシド酸素または酢酸エステル基を選択することができる。【００３０】
Ｒ8またはＲ9はそれぞれアルキル基またはヘテロアルキル基であり、また互に結合して環状構造を形成し、多環式アルキレン基としていてもよい。多環式アルキレン基は６〜３０個の炭素原子を含み、また異種原子（窒素、酸素、硫黄又はリン）を含んでいてもよい。好ましい多環式アルキレン基はアダマンチル基である。Ｒ8、Ｒ9はジオキセタン構造に対し安定性をもたらし、安定性を損なう置換基でない限り、置換基を有していてもよい。【００３１】
以上のような、一般式（３）で表されるジオキセタン誘導体の中で、好適な発光基質としては、前記一般式（４）で表される化合物を挙げることができる。前記一般式（４）中、Ｘ3はグリコシド基或いはＰＯ3Ｚを表し、ＺはＨ，Ｎａ，Ｋ又はＮＨ4を表わす。Ｙ2はＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，メチル基またはメトキシ基を表わす。【００３２】
一般式（４）で表される化合物としては、例えば、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２'−トリシクロ［３．３．１3.7］デカン〕−４−イル）フェニルリン酸およびその２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ：トロピックス社の登録商標である。）と、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１3.7］デカン〕−４−イル）フェニルリン酸およびその２ナトリウム塩（ＣＳＰＤ：トロピックス社の登録商標である。）と、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１3.7］デカン〕−４−イル）フェニル−６−クロロリン酸およびその２ナトリウム塩（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ：トロピックス社の登録商標である。）が挙げられる。中でも、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２'−トリシクロ［３．３．１3.7］デカン〕−４−イル）フェニルリン酸およびその２ナトリウム塩がもっとも好ましい。上述の発光基質は化学反応により合成することもできる他、市販品を用いることができる。例えば、ＡＭＰＰＤはトロピックス社製のものを利用することができる。【００３３】
本発明の発光測定法の実施にあたり、酵素を用いる場合、上記発光増幅剤の使用量は、通常は２．５〜１５０μＭ、好ましくは５〜１２５μＭとすることができ、酵素に対する比率としては５０〜５００μｌ、好ましくは１５０〜２５０μｌとすることができる。この範囲の使用量とすることにより、発光の増幅を効率良く行うことができる。【００３４】
本発明の発光測定法に用いることができる酵素は、上述の発光基質に作用させた際に化学発光等の発光を生ずる発光基質であれば特に限定されない。例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ又はエステラーゼを挙げることができ、好ましい例としては、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ及びエステラーゼを挙げることができる。このうち、アルカリホスファターゼが最も好ましい。酵素は動物、植物又は細菌などから公知の方法で精製することができ、また市販品も好ましく用いることができる。これらの酵素は遊離の状態であってもよく、また、抗原、抗体又はハプテンなどのタンパク質等の他の物質に結合された状態にあってもよい。【００３５】
本発明の発光測定法においては、発光基質と発光増幅剤を共に用いる以外の条件は特に限定されず、通常の化学発光等の発光測定法に従って行うことができる。すなわち、発光基質を水又は適当な緩衝液に溶解しておき、これに発光増幅剤を添加して発光基質液とし、更に発光基質液を酵素溶液と混合しても良いし、発光増幅剤と基質を個別に検体溶液に加えても良い。温度は２０〜４０℃が好ましく、特に３０〜３７℃が好ましい。また時間は、通常は２〜６０分間、好ましくは５〜１０分間とすることができる。
発光の測定は、フォトカウンターやルミノメーターを用いて通常の化学発光における検出と同様にして行うことができる。ルミノメーターとしては、例えばアロカ製発光測定装置等の市販の装置を使用することができる。【００３６】
本発明の発光測定法は、酵素を標識（マーカー）として利用することにより、抗原や抗体等のタンパク質をはじめとする各種対象物の分析に応用することができ、本発明はこのようなタンパク質の分析方法をも提供するものである。すなわち、本発明の分析方法は、検体と、測定対象物に対する抗原及び／又は抗体、該抗原及び／又は抗体の活性化剤による標識体、及び発光基質とを、前述の発光増幅剤の存在下反応させ、発光測定することを特徴とする。本発明の発光測定法は、タンパク質のほか、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、生体内微量成分等を測定対象とすることができる。【００３７】
本発明の分析方法の対象となる代表的なタンパク質としては、インターロイキン等のサイトカイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの各種癌関連抗原、ＨＢｓなどの抗原、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）などの各種ホルモン、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの抗体、ＡＦＰ、インスリン、フェリチンなどのタンパク質を挙げることができる。測定すべきタンパク質は１種類であっても良いし、２種類以上であっても良い。【００３８】
本発明の分析方法における検体としては、測定対象物を含むかどうかは問わない。例えば、血液、血清、尿などの体液、細胞等の生体採取試料であることが可能である。検体は、必要に応じて水又は緩衝液で希釈して検体溶液として本発明を適用することもできる。【００３９】
測定対象物に対する抗原及び／又は抗体は、検出すべき対象物、例えばタンパク質に対し抗原抗体反応を示すものである限り、製造方法などは特に限定されない。例えば、常法により細胞培養により得られるものを利用することもできるし、遺伝子組み換えを行って得られるリコンビナント抗体や抗原を用いることもできる。また、２以上の抗原を融合させて製造された融合抗原、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）2フラグメント等の抗体断片、ハプテン等であっても良い。測定すべきタンパク質が２種類以上の場合には、それぞれのタンパク質に対する抗原や抗体を用意する必要がある。これらの抗原及び／又は抗体は、必要に応じてポリスチレンビーズ等の固相に結合させておくことができる。【００４０】
測定対象物に対する抗原及び／又は抗体の活性化剤による標識体は、抗体又は抗原と酵素などの活性化剤とが共有結合又は非共有結合により結合しているものを意味し、常法により製造することができる。
発光基質については、本発明の発光測定法の説明において述べた通りである。【００４１】
本発明の分析方法の一例を、測定対象物がタンパク質であり、活性化剤による標識体が酵素標識体の場合を挙げて説明すると以下の通りである。
まず、分析対象のタンパク質に対応する抗体及び／又は抗原を、検体と反応させる。検体が対象のタンパク質を含む場合には、タンパク質と抗原及び／又は抗体との結合体が形成される。【００４２】
次に、前記結合体に、測定すべき抗原及び／又は抗体に対応する抗体及び／又は抗原の酵素標識体を更に反応させる。この反応により抗原及び／又は抗体−タンパク質−酵素標識体の結合体が形成される。【００４３】
続いて、前述の複合体に、更に、発光基質を反応させる。係る工程により、抗原及び／又は抗体−タンパク質−酵素標識体のサンドイッチ複合体が形成される。そして、発光基質の添加と同時、或いは添加後速やかに前述の本発明の発光増幅剤を添加する。或いは発光増幅剤を含有する基質液を添加する。【００４４】
最後に、発光をルミノメーター等を利用して検出する。発光が検出された場合には検体中にタンパク質が含まれていることが明らかであり、一方検出されない場合にはタンパク質が含まれないことが分かる。また、予め発光量を量的に換算して検量線等を作成しておくことにより、検体中のタンパク質の量を定量することができる。このように、本発明の分析方法によれば、検体におけるタンパク質の存在又は不存在の検出、検体中に含まれるタンパク質の種類の判定、タンパク質の定量が可能である。【００４５】
本発明の分析方法は、測定対象物に対応する抗体及び／又は抗原が固定化されてなる固相、該抗体及び／又は抗原の活性化剤による標識体、及び本発明の発光増幅剤を含むキットにより簡便に実施することが可能であり、本発明はこのような分析用キットをも提供するものである。本発明の分析用キットは、反応容器などと共に提供することが可能である。
【実施例】
【００４６】
実施例１  ヘテロコポリマーラテックス−１の重合
はじめに、１０００ｍｌのナス型フラスコに、１．７４ｇのビニルベンジルシアニド（東京化成工業社製）、４．４ｇの４−ビニルピリジン（ナカライエスク社製）、４００ｍｇのメタクリロイロキシトリメチルアンモニウム（和光純薬社製）、２００μｌのｐ−ジビニルベンゼン（シグマ−アルドリッチ社製）、及び重合開始剤である２，２−｛アゾビス（Ｎ−カルボキシエチル）２−メチルプロピオンアミド｝（和光純薬社製）を７４０ｍｇ加え、十分に混和した。この中に水（ミリ−Ｑ水）を４００ｍｌ加えた。【００４７】
ナスフラスコに冷却管と３方コックを繋いだ。３方コックには更に、アルゴンガスを満たした風船と真空ポンプを繋いだ。
繋いだナスフラスコを超音波洗浄機（２８ＭＨｚ，２０Ｗ）に浸けながら真空ポンプでフラスコ内の陰圧／アルゴンガス置換を３方コックの切り替えで３０分間の内に４回行った。
３０分後、ナスフラスコを７５℃に加熱したオイルバスに入れ、１８時間反応させてラテックスを得た。ラテックスを含む反応液を３，０００ｒ．ｐ．ｍで遠心し、比重の大きなラテックス成分を取り除いた。【００４８】
得られた上清を更に、１２，０００ｒ．ｐ．ｍで２０分間遠心した。沈殿したラテックスを残し、上清を捨てた。このラテックスにエタノールを加え、分散させた。３０分間激しく攪拌した後、再度１２，０００ｒ．ｐ．ｍで２０分間遠心した。沈殿したラテックスを残し、上清を捨てた。
沈殿したラテックスにミリ−Ｑ水を加え、均一になるまで激しく攪拌した。再度１２，０００ｒ．ｐ．ｍで２０分間遠心した。
この操作を４回行い、未反応のモノマー類を取り除いた。
得られたラテックスを最小限のミリ−Ｑ水に懸濁させた。この懸濁液に終濃度が１ｗ／ｖ％となるようにトレハロースを加え、凍結乾燥した。
得られたラテックスの重量は添加したトレハロースを差し引いて３．３ｇであった。【００４９】
実施例２  ヘテロコポリマーラテックス−２の重合
はじめに、１０００ｍｌのナス型フラスコに、１．７４ｇのビニルベンジルシアニド（東京化成工業社製）、４．２ｇの１−ビニル−２−ピロリドン（東京化成工業社製）、４００ｍｇのメタクリロイロキシトリメチルアンモニウム（和光純薬社製）、２００μｌのｐ−ジビニルベンゼン（アルドリッチ社製）、及び重合開始剤である２，２−｛アゾビス（Ｎ−カルボキシエチル）２−メチルプロピオンアミド｝（和光純薬社製）を７４０ｍｇ加え、十分に混和した。この中に水（ミリ−Ｑ水）を４００ｍｌ加えた。【００５０】
ナスフラスコに冷却管と３方コックを繋いだ。３方コックには更に、アルゴンガスを満たした風船と真空ポンプを繋いだ。
繋いだナスフラスコを超音波洗浄機（２８ＭＨｚ，２０Ｗ）に浸けながら真空ポンプでフラスコ内の陰圧／アルゴンガス置換を３方コックの切り替えで３０分間の内に４回行った。
３０分後、ナスフラスコを７５℃に加熱したオイルバスに入れ、１８時間反応させてラテックスを得た。ラテックスを含む反応液を３，０００ｒ．ｐ．ｍで遠心し、比重の大きなラテックス成分を取り除いた。【００５１】
得られた上清を更に、１２，０００ｒ．ｐ．ｍで２０分間遠心した。沈殿したラテックスを残し、上清を捨てた。このラテックスにエタノールを加え、分散させた。３０分間激しく攪拌した後、再度１２，０００ｒ．ｐ．ｍで２０分間遠心した。沈殿したラテックスを残し、上清を捨てた。
沈殿したラテックスにミリ−Ｑ水を加え、均一になるまで激しく攪拌した。再度１２，０００ｒ．ｐ．ｍで２０分間遠心した。
この操作を４回行い、未反応のモノマー類を取り除いた。
得られたラテックスを最小限のミリ−Ｑ水に懸濁させた。この懸濁液に終濃度が１ｗ／ｖ％となるようにトレハロースを加え、凍結乾燥した。
得られたラテックスの重量は、添加したトレハロースを差し引いて１．２ｇであった。【００５２】
実施例３  水溶性ヘテロコポリマー−３の重合
はじめに、２００ｍｌのナス型フラスコに、１．７４ｇのビニルベンジルシアニド（東京化成工業社製）、４．１ｇの２−ヒドロキシエチルアクリレート（東京化成工業社製）、８００ｍｇのメタクリロイロキシトリメチルアンモニウム（和光純薬社製）、及び重合開始剤である２，２−アゾビス｛（Ｎ−カルボキシエチル）２−メチルプロピオンアミド｝（和光純薬社製）を７４ｍｇ加えた。この中に水（ミリ−Ｑ水）を１００ｍｌ加えた。【００５３】
ナスフラスコに冷却管と３方コックを繋いだ。３方コックには更に、アルゴンガスを満たした風船と真空ポンプを繋いだ。
フラスコ内の陰圧／アルゴンガス置換を３方コックの切り替えで１０分間の内に４回行った。
１０分後、ナスフラスコを７５℃に加熱したオイルバスに入れ、４時間反応させて水溶性ヘテロポリマーを得た。得られた水溶性ヘテロポリマーを１２，０００カットの透析チューブに入れて３日間透析を行った。この間少なくとも５回透析外液の交換を行った。【００５４】
透析終了後、凍結乾燥した。
得られた水溶性ヘテロポリマーの重量は６．２ｇであった。【００５５】
実施例４  水溶性ヘテロコポリマー−４の重合
はじめに、２００ｍｌのナス型フラスコに、１．７４ｇのビニルベンジルシアニド（東京化成工業社製）、４．２ｇの４−ビニルピリジン（ナカライテスク社製）、８００ｍｇのメタクリロイロキシトリメチルアンモニウム（和光純薬社製）、及び重合開始剤である２，２−｛アゾビス（Ｎ−カルボキシエチル）２−メチルプロピオンアミド｝（和光純薬社製）を７４ｍｇ加えた。この中に水（ミリ−Ｑ水）を１００ｍｌ加えた。【００５６】
ナスフラスコに冷却管と３方コックを繋いだ。３方コックには更に、アルゴンガスを満たした風船と真空ポンプを繋いだ。
フラスコ内の陰圧／アルゴンガス置換を３方コックの切り替えで１０分間の内に４回行った。
１０分後、ナスフラスコを７５℃に加熱したオイルバスに入れ、４時間反応させて水溶性ヘテロポリマーを得た。得られた水溶性ヘテロポリマーを１２，０００カットの透析チューブに入れて３日間透析を行った。この間少なくとも５回透析外液の交換を行った。【００５７】
透析終了後、凍結乾燥した。
得られた水溶性ヘテロポリマーの重量は５．２ｇであった。【００５８】
実施例５  水溶性ヘテロコポリマー−５の重合
はじめに、２００ｍｌのナス型フラスコに、１．７４ｇのビニルベンジルシアニド（東京化成工業社製）、４．４ｇの１−ビニル−２−ピロリドン（東京化成工業社製）、４００ｍｇのメタクリロイロキシトリメチルアンモニウム（和光純薬社製）、及び重合開始剤である２，２−｛アゾビス（Ｎ−カルボキシエチル）２−メチルプロピオンアミド｝（和光純薬社製）を７４ｍｇ加えた。この中に水（ミリ−Ｑ水）を１００ｍｌ加えた。【００５９】
ナスフラスコに冷却管と３方コックを繋いだ。３方コックには更に、アルゴンガスを満たした風船と真空ポンプを繋いだ。
フラスコ内の陰圧／アルゴンガス置換を３方コックの切り替えで１０分間の内に４回行った。
１０分後、ナスフラスコを７５℃に加熱したオイルバスに入れ、１．５時間反応させて水溶性ヘテロポリマーを得た。得られた水溶性ヘテロポリマーを１２，０００カットの透析チューブに入れて３日間透析を行った。この間少なくとも５回透析外液の交換を行った。【００６０】
透析終了後、凍結乾燥した。
得られた水溶性ヘテロポリマーの重量は５．９ｇであった。【００６１】
参考例１
アルカリ性ホスファターゼの発光基質であるＡＭＰＰＤ（トロピクス社製）を０．２ｍｇ／ｍｌとなるように、１００ｍＭのジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ１０．２）溶解させた。これをエンハンサーを含まない基質液とした。
また、更にこのエンハンサーを含まない基質液にポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウム）（ＴＢＱ）（トロピクス社製）を０．４ｍｇ／ｍｌの割合でとｍＴＡＢ（ミリスチルトリブチルアンモニウム塩酸［Myristyltributyl
ammonium Cl］）とともに加えた基質液をＴＢＱ基質液とした。【００６２】
また、検体としてアルカリホスファターゼ標識抗インターロイキン−６−抗体を０．０５μｇ／ｍｌとなるように、ゼラチン入りトリス−塩酸緩衝液で希釈したものを用いた。【００６３】
測定参考例１  アルカリホスファターゼ活性の発光基質による測定
参考例１で調製したエンハンサーを含まない基質液とＴＢＱ基質液それぞれ２００μｌをプラスチック製のチューブに分注した。それぞれ３本ずつ分注した。
それぞれの基質液に参考例１で希釈したアルカリホスファターゼ標識抗インターロイキン−６−抗体を０．１μｇ／ｍｌの割合で２μｌ加え、反応を開始し、直ちに３７℃の恒温槽（ドライブロック）に入れ、加温した。
尚、それぞれの基質液のチューブ３本の内１本には、検体の代わりにアルカリホスファターゼ標識抗インターロイキン−６−抗体を測定しやすい濃度に希釈し、その希釈液を２μl加えた。
加温後、適当な時間経過毎にアロカ製発光測定装置（ＢＬＲ−２０）で発光カウントを測定した。
その結果得られたＴＢＱ基質液の発光カウント及びエンハンサーを含まない基質液の発光カウントを、それぞれ図１−１と１−２に示した。また、ＴＢＱ基質液について、エンハンサーを含まない基質液に対する増幅率を算出し、表１に示した。すなわち、同時測定において、増幅剤無添加の基質液のシグナル（コントロール）を１として、ＴＢＱ基質液を添加したときのシグナル（発光強度）との比を計算した。【００６４】
測定実施例１
参考例１で調製したエンハンサーを含まない基質液に対して実施例１で合成したヘテロコポリマーラテックス−１を１ｗ／ｖ％の割合で添加してエンハンサー含有基質液１を調製した。
この基質液１を参考例１と同様に操作してアルカリ性ホスファターゼ活性の発光カウントを適当な時間経過毎に測定した。その結果を図２に示した。また、測定参考例１と同様にして増幅率を算出し表１に示した。【００６５】
図２の結果から、参考例１で調製したエンハンサーを含まない基質液の場合には発光がほとんど検出されなかったのに対し、実施例１のラテックス−１を添加した基質液１の場合には、発光が大幅に増幅され、かつ、長時間持続することが明らかとなった。また、図１−１の結果との比較から、実施例１のラテックス−１を添加した基質液１は、ＴＢＱ基質液と比較しても発光増幅効果が高く、かつ、ＴＢＱ基質液のように長時間経過すると発光が減少することもないことが明らかとなった。【００６６】
実施例６  水溶性ヘテロコポリマー−６の重合（ホスホニウム）
はじめに、ホスホニウム化合物（ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）を作製するため、２００ｍｌのナスフラスコに、１．２２ｇの４−ビニルベンジルクロライド（アルドリッチ社製）、１．６ｇのトリブチルホスフィン（東京化成社製）、５ｍｌのジメチルホルムアミドを入れた。【００６７】
このナスフラスコに冷却管と３方コックを繋いだ。３方コックには更に、アルゴンガスを満たした風船と真空ポンプを繋いだ。
フラスコ内の陰圧／アルゴンガス置換を３方コックの切り替えで１０分間の内に４回行い、６０℃で１８時間攪拌反応させた。【００６８】
１８時間後、冷却管と３方コックを取り外し、１．７４ｇのビニルベンジルシアニド（東京化成工業社製）、４．４ｇの４−ビニルピリジン（東京化成工業社製）、及び２，２−｛アゾビス（Ｎ−カルボキシエチル）２−メチルプロピオンアミド｝（和光純薬社製）を１７０ｍｇ加えた。この中に水（ミリ−Ｑ水）１００ｍｌ加えた。
ナスフラスコに冷却管と３方コックを繋いだ。３方コックには更に、アルゴンガスを満たした風船と真空ポンプを繋いだ。
フラスコ内の陰圧／アルゴンガス置換を３方コックの切り替えで１０分間の内に４回行った。【００６９】
１０分後、ナスフラスコを７５℃に加熱したオイルバスに入れ、４時間反応させて水溶性ヘテロポリマーを得た。得られた水溶性ヘテロポリマーを１２，０００カットの透析チューブに入れて３日間透析を行った。この間少なくとも５回透析外液の交換を行った。【００７０】
透析終了後、凍結乾燥した。
得られた水溶性ヘテロポリマーの重量は７．２ｇであった。【００７１】
測定実施例２  アルカリホスファターゼ活性の発光基質による測定
参考例１で調製したエンハンサーを含まない基質液に対して実施例６で合成した水溶性ヘテロコポリマー−６を１ｗ／ｖ％の割合となるように添加した。この溶液２００μlをプラスチック製のチューブに分注した。それぞれ３本ずつ分注しておいた。
それぞれの基質液に参考例１で希釈したアルカリホスファターゼ標識抗インターロイキン−６−抗体を０．０５μｇ／ｍｌの割合で２μl加え、反応を開始し、直ちに３７℃の恒温槽（ドライブロック）に入れ、加温した。
尚、チューブ３本のうち１本には、検体の代わりにアルカリホスファターゼ標識抗インターロイキン−６−抗体を測定しやすい濃度に希釈し、その希釈液を２μl加えた。
加温後、適当な時間経過毎にアロカ製発光測定装置（ＢＬＲ−２０）で発光カウントを測定した。
その結果を図３に示した。また、測定参考例１と同様にして増幅率を算出し表１に示した。【００７２】
図３に示したように、実施例６で調製したホスホニウムを持つヘテロコポリマーを用いることによって、最大で無添加の３５０倍のエンハンス率を得ることが出来た。また、ＴＢＱ／ｍＴＡＢに対して約６倍の効果を示した。【００７３】
実施例７    ヘテロコポリマーラテックス−７の重合（ホスホニウム）
はじめに、ホスホニウム化合物（ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）を作製するため、２００ｍｌのナスフラスコに１．２２ｇのビニルベンジルクロライド（アルドリッチ社製）と１．６ｇのトリブチルホスフィン（東京化成社製）、５ｍｌのジメチルホルムアミドを入れた。【００７４】
このナスフラスコに冷却管と３方コックを繋いだ。３方コックには更に、アルゴンガスを満たした風船と真空ポンプを繋いだ。
フラスコ内の陰圧／アルゴンガス置換を３方コックの切り替えで１０分間の内に４回行い、６０℃で１８時間攪拌反応させた。【００７５】
１８時間後、冷却管と３方コックを取り外し、１．７４ｇのビニルベンジルシアニド（東京化成工業社製）、４．４ｇの４−ビニルピリジン（東京化成工業社製）、２００μｌ  ｐ−ジビニルベンゼン（アルドリッチ社製）、２，２−｛アゾビス（Ｎ−カルボキシエチル）２−メチルプロピオンアミド｝（和光純薬社製）を１７０ｍｇ加えた。この中に１ｗ／ｖ％メチル化β−シクロデキストリン（塩水港社製）のミリ−Ｑ水溶液４００ｍｌ加えた。
ナスフラスコに冷却管と３方コックを繋いだ。３方コックには更に、アルゴンガスを満たした風船と真空ポンプを繋いだ。
このナスフラスコを超音波洗浄機（２８ＭＨｚ，２０Ｗ）に浸けながら、真空ポンプを繋いで、フラスコ内の陰圧／アルゴンガス置換を３方コックの切り替えで２０分間の内に４回行った。【００７６】
２０分後、ナスフラスコを７５℃に加熱したオイルバスに入れ、４時間反応させて水溶性ヘテロポリマーを得た。得られた水溶性ヘテロポリマーを１２，０００カットの透析チューブに入れて３日間透析を行った。この間少なくとも５回透析外液の交換を行った。【００７７】
透析終了後、凍結乾燥した。
得られた水溶性ヘテロポリマーの重量は４．８ｇであった。【００７８】
測定実施例３  アルカリホスファターゼ活性の発光基質による測定
参考例１で調製したエンハンサーを含まない基質液に実施例７で合成したヘテロコポリマーラテックス−７を０．４ｗ／ｖ％の割合となるように添加した。この溶液２００μlをプラスチック製のチューブに分注した。それぞれ３本ずつ分注しておいた。
それぞれの基質液に参考例１で希釈したアルカリホスファターゼ標識抗インターロイキン−６−抗体を０．０５μｇ／ｍｌの割合で２μl加え、反応を開始し、直ちに３７℃の恒温槽（ドライブロック）に入れ、加温した。
尚、チューブ３本のうち１本には、検体の代わりにアルカリホスファターゼ標識抗インターロイキン−６−抗体を測定しやすい濃度に希釈し、その希釈液を２μl加えた。
加温後、適当な時間経過毎にアロカ製発光測定装置（ＢＬＲ−２０）で発光カウントを測定した。
その結果を図４に示した。また、測定参考例１と同様にして増幅率を算出し表１に示した。【００７９】
図４に示したように、実施例７で調製したホスホニウムを持つヘテロコポリマーラテックスを用いることによって、最大で無添加の２００倍のエンハンス率を得ることが出来た。また、ＴＢＱ／ｍＴＡＢに対しては約６倍の効果を示した。【００８０】
【表１】
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【００８１】
実施例８
（１）ビニルベンジルトリヘキシルホスホニウムの合成
４−ビニルベンジルクロライド（東京化成工業社製）  １．５ｇとトリヘキシルホスフィン（東京化成工業社製）２．９ｇを５０ｍｌのナスフラスコに入れた。このフラスコに３方コックを取り付け、さらにコックの一つにアルゴンガスを満たした風船を繋げた。脱気とアルゴンガスの置換を３回行い、室温で５日間撹拌を継続した。【００８２】
５日後、エバポレーターで濃縮し、粘性が高くなったところで停止した。このフラスコにジエチルエーテル（和光純薬社製）を１００ｍｌ撹拌しながら加えた。うろこ状の結晶が析出してくるのでこれをＧ−４のガラスフィルターで濾取した。更に、ジエチルエーテルで結晶を十分に洗浄した。
洗浄後、結晶をデシケータ中で乾燥させた。大凡、乾燥重量で１．８ｇの目的物を得た。【００８３】
（２）ビニルベンジルトリブチルホスホニウムの合成
４−ビニルベンジルクロライド（東京化成工業社製）  １．５ｇとトリブチルホスフィン（東京化成工業社製）２．０ｇを５０ｍｌのナスフラスコに入れた。このフラスコに３方コックを取り付け、コックの一つにアルゴンガスを満たした風船を繋げた。脱気とアルゴンガスの置換を３回行い、室温で２日間撹拌を継続した。【００８４】
２日後、エバポレーターで濃縮し、粘性が高くなったところで停止した。このフラスコにミリ−Ｑを２０ｍｌ撹拌しながら加えた。この水溶液を１００ｍｌの分液ロートに入れ、更に酢酸エチル（和光純薬社製）５０ｍｌを加え、未反応物の抽出を行なった。この操作を３回行なった。【００８５】
酢酸エチルによる洗浄が終了したら、水溶液をエバポレーターで濃縮した。結晶が析出した時点で濃縮を停止した。
結晶をデシケータ中で乾燥させたところ、大凡、乾燥重量で２．３ｇの目的物を得た。【００８６】
（３）  ビニルベンジルトリヘキシルホスホニウムとビニルベンジルトリブチルホスホニウム（７：３）のランダム共重合物の作製
（１）で作製したビニルベンジルトリヘキシルホスホニウム１．８ｇと、（２）で作製したビニルベンジルトリブチルホスホニウム６４０ｍｇ、２，２−アゾビス（Ｎ−カルボキシエチル）２−メチルプロピオンアミド（和光純薬社製）８５ｍｇを１００ｍｌのナスフラスコに入れた。更に、この中にエタノール（和光純薬社製）２０ｍｌとミリ−Ｑ水２０ｍｌを加えた。このナスフラスコに三方コックを繋げた冷却管を取り付けた。三方コックには１Ｌのアルゴンガスを満たしたゴム風船を取り付けておいた。【００８７】
脱気・アルゴンガス置換を３回行い、撹拌しながら一昼夜７５℃で反応させた。反応終了後、エバポレーターで１／２程度になるまで濃縮した。濃縮後、１２，０００カットの透析チューブで時折外液を交換しながら３日間透析を行った。【００８８】
測定実施例４
基質液はＡＭＰＰＤ（トロピクス社製）を濃度が０．２mｇ／ｍｌとなるように０．１M  トリエタノールアミン−塩酸緩衝液  ｐＨ１０．５（１ｍＭ−Ｍｇ）に溶かした。この基質液に０．５５ｗ／ｖ％となる様に実施例８で作製したランダム共重合エンハンサーを溶かしてエンハンサー基質液とした。また、エンハンサーを含まない基質液も作製した。【００８９】
このエンハンサーを含む基質液、或いは含まない基質液２００μｌにアルカリホスファターゼ標識インターロイキン−６抗体（富士レビオ社製）  ０．０５μｇ／ｍｌを２μｌ入れて直ちに、アロカ製発光測定装置（ＢＬＲ−２０）に入れて２０秒毎にそれぞれ計測を行なった。その結果を表２に示した。増幅率は、各酵素反応時間（分）のときのエンハンサー無添加のカウントを１とし、エンハンサー濃度０．５５ｗ／ｖ％のときのカウントがその何倍となっているか計算して求めた。ランダム共重合（７：３）エンハンサーを含む基質液と含まない基質液を使用してアルカリ性ホスファターゼの活性を計測して比較した表である。【００９０】
また、後入れ法として、酵素反応３０秒後、６０秒後、２１０秒後、或いは３００秒後に実施例８で作製したランダム共重合エンハンサーを終濃度で０．５５ｗ／ｖ％となるように添加して、２０秒間隔で１秒のカウントを、計５回測定した。その結果を図５に示した。【００９１】
【表２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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