【手続補正書】
【提出日】令和1年10月15日(2019.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロまたはインビボの宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子の不活性化に用いられる組成物であって、
Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、
少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、上記標的遺伝子中の標的配列に対して少なくとも７５％の相補的配列同一性を有する少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む、組成物。
【請求項２】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、上記標的遺伝子中の標的配列に相補的である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
標的遺伝子は、レトロウイルスゲノムのコード核酸配列および非コード核酸配列を含み、
上記レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記非コード領域は、ＨＩＶの長い末端反復、または、ＨＩＶの上記長い末端反復中の配列を含み、
ＨＩＶの上記長い末端反復中の上記配列は、Ｕ３領域、Ｒ領域、またはＵ５領域中の配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ヒト免疫不全ウイルスの複数の標的核酸配列に相補的な複数のガイドＲＮＡ核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
標的遺伝子は、配列番号１から３３を含む配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
標的遺伝子は、配列番号１から３３を含む配列のいずれか１つを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする上記１つの単離核酸配列、および、上記少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする単離核酸配列は、ベクターによって発現される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする上記１つの単離核酸配列は第１のベクターによって発現され、上記少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする単離核酸配列は第２のベクターによって発現される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
任意で、抗ウイルス剤、化学療法剤、抗真菌剤、駆虫剤、抗細菌剤、抗炎症剤、免疫調整剤、またはそれらの組み合わせのうち１つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
宿主細胞のゲノム中に組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化する方法であって、
組み込まれたプロウイルスＤＮＡを含む上記宿主細胞を、Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列で処置する工程と、
上記宿主細胞を、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの単離核酸配列で処置する工程であって、当該少なくとも１つのｇＲＮＡは上記プロウイルスＤＮＡ中の標的配列と相補的である、工程と、
上記プロウイルスＤＮＡを不活性化する工程と、を含む方法。
【請求項１２】
上記プロウイルスＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ‐１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ‐２）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ‐Ｉ）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ‐ＩＩ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ‐１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）、またはＪＣウイルス（ＪＣＶ）のプロウイルスＤＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記標的配列は、プロウイルスＨＩＶ‐１ＤＮＡの中に位置している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記ＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡの中に位置している上記標的配列は、上記プロウイルスＨＩＶ−１ＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）の中に位置している標的配列である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
インビトロまたはインビボの宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子の不活性化に用いられるベクター組成物であって、
Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、
少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、上記標的遺伝子中の標的配列と相補的である少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含み、
上記少なくとも１つのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする上記少なくとも１つの単離核酸配列と、上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、少なくとも１つの発現ベクターに含まれ、
上記少なくとも１つの発現ベクターは、宿主細胞内で、上記少なくとも１つのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと上記少なくとも１つのｇＲＮＡの発現を誘導する、ベクター組成物。
【請求項１６】
上記少なくとも１つの発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターを含む、請求項１５に記載のベクター組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
本発明は、例示を用いて記載してきた。用いられた用語は、限定のための語ではなく説明のための語であることを意図している。上記教示に照らして、本発明をさまざまに変形・変更可能であることは明らかである。したがって、本発明は、添付の請求項の範囲内であるならば、具体的に説明されたのとは異なるように実施し得ることを理解されたい。また、本発明は、以下の［１］〜［４０］に示すものであり得る。
［１］インビトロまたはインビボの宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子の不活性化に用いられる組成物であって、
Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、
少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、上記標的遺伝子中の標的配列に対して少なくとも７５％の相補的配列同一性を有する少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む、組成物。
［２］上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、上記標的遺伝子中の標的配列に対して少なくとも９５％の相補的配列同一性を有する、［１］に記載の組成物。
［３］上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、上記標的遺伝子中の標的配列に相補的である、［２］に記載の組成物。
［４］標的遺伝子は、レトロウイルスゲノムのコード核酸配列および非コード核酸配列を含む、［１］に記載の組成物。
［５］上記レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、［４］に記載の組成物。
［６］上記非コード領域は、ＨＩＶの長い末端反復、または、ＨＩＶの上記長い末端反復中の配列を含む、［４］に記載の組成物。
［７］ＨＩＶの上記長い末端反復中の上記配列は、Ｕ３領域、Ｒ領域、またはＵ５領域中の配列を含む、［６］に記載の組成物。
［８］ヒト免疫不全ウイルスの複数の標的核酸配列に相補的な複数のガイドＲＮＡ核酸配列をさらに含む、［１］に記載の組成物。
［９］標的遺伝子は、配列番号１から３３を含む配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する、［１］に記載の組成物。
［１０］標的遺伝子は、配列番号１から３３を含む配列のいずれか１つを含む、［１］に記載の組成物。
［１１］Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする上記１つの単離核酸配列、および、上記少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする単離核酸配列は、ベクターによって発現される、［１］に記載の組成物。
［１２］Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする上記１つの単離核酸配列は第１のベクターによって発現され、上記少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする単離核酸配列は第２のベクターによって発現される、［１］に記載の組成物。
［１３］任意で、抗ウイルス剤、化学療法剤、抗真菌剤、駆虫剤、抗細菌剤、抗炎症剤、免疫調整剤、またはそれらの組み合わせのうち１つ以上を含む、［１］に記載の組成物。
［１４］インビトロまたはインビボの宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子の不活性化に用いられる組成物であって、
Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、
少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、上記標的遺伝子中の標的配列と相補的である少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む、組成物。
［１５］宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子を不活性化する方法であって、
上記宿主細胞を、Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列で処置する工程と、
上記宿主細胞を、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの単離核酸配列で処置する工程であって、当該少なくとも１つのｇＲＮＡは上記標的遺伝子中の標的配列と相補的である、工程と、
上記標的遺伝子を不活性化する工程と、を含む方法。
［１６］宿主細胞のゲノム中に組み込まれたプロウイルスＤＮＡの不活性化に用いられる組成物であって、
Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、
少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列と相補的である少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む、組成物。
［１７］上記プロウイルスＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ‐１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ‐２）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ‐Ｉ）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ‐ＩＩ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ‐１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）、またはＪＣウイルス（ＪＣＶ）のプロウイルスＤＮＡを含む、［１６］に記載の組成物。
［１８］上記プロウイルスＤＮＡはＨＩＶ‐１ＤＮＡであり、上記少なくとも１つのｇＲＮＡは上記ＨＩＶ‐１ＤＮＡの標的配列に相補的である、［１７］に記載の組成物。
［１９］上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、上記ＨＩＶ‐１ＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的である、［１８］に記載の組成物。
［２０］宿主細胞のゲノム中に組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化する方法であって、
組み込まれたプロウイルスＤＮＡを含む上記宿主細胞を、Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列で処置する工程と、
上記宿主細胞を、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの単離核酸配列で処置する工程であって、当該少なくとも１つのｇＲＮＡは上記プロウイルスＤＮＡ中の標的配列と相補的である、工程と、
上記プロウイルスＤＮＡを不活性化する工程と、を含む方法。
［２１］上記プロウイルスＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ‐１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ‐２）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ‐Ｉ）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ‐ＩＩ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ‐１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）、またはＪＣウイルス（ＪＣＶ）のプロウイルスＤＮＡを含む、［２０］に記載の方法。
［２２］上記標的配列は、プロウイルスＨＩＶ‐１ＤＮＡの中に位置している、［２１］に記載の方法。
［２３］上記ＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡの中に位置している上記標的配列は、上記プロウイルスＨＩＶ−１ＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）の中に位置している標的配列である、［２２］に記載の方法。
［２４］インビトロまたはインビボの宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子の不活性化に用いられるベクター組成物であって、
Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、
少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、上記標的遺伝子中の標的配列と相補的である少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含み、
上記少なくとも１つのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする上記少なくとも１つの単離核酸配列と、上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、少なくとも１つの発現ベクターに含まれ、
上記少なくとも１つの発現ベクターは、宿主細胞内で、上記少なくとも１つのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと上記少なくとも１つのｇＲＮＡの発現を誘導する、ベクター組成物。
［２５］上記少なくとも１つの発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターを含む、［２４］に記載のベクター組成物。
［２６］ウイルス感染のリスクがある患者の宿主細胞のウイルス感染を防ぐ方法であって、
患者がウイルスによる感染のリスクがあると判定する工程と、
上記感染のリスクがある患者の宿主細胞を、有効量の発現ベクター組成物に暴露する工程であって、当該発現ベクター組成物は、Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、上記ウイルスのゲノム中の標的配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、工程と、
上記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡを上記宿主細胞内に安定して発現させる工程と、
上記宿主細胞の上記ウイルスによる感染を防ぐ工程と、
を含む、方法。
［２７］上記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ‐１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ‐２）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ‐Ｉ）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ‐ＩＩ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ‐１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）、またはＪＣウイルス（ＪＣＶ）から選ばれる、［２６］に記載の方法。
［２８］哺乳類の被検体の細胞中に組み込まれたプロウイルスを不活性化する薬学的組成物であって、
Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列と、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、を含み、
上記各単離核酸配列は少なくとも１つの発現ベクターに含まれている、薬学的組成物。
［２９］上記プロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ‐１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ‐２）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ‐Ｉ）、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ‐ＩＩ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ‐１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）、またはＪＣウイルス（ＪＣＶ）を含む、［２８］に記載の薬学的組成物。
［３０］抗ウイルス剤、化学療法剤、抗真菌剤、駆虫剤、抗細菌剤、抗炎症剤、免疫調整剤、またはそれらの組み合わせのうち１つ以上をさらに含む、［２８］に記載の薬学的組成物。
［３１］ウイルスに感染した哺乳類の被検体を処置する方法であって、
哺乳類の被検体がウイルスに感染していると判定する工程と、
上記被検体に、［２８］に記載の薬学的組成物を有効量、投与する工程と、
上記被検体に対し、上記ウイルス感染の処置を行う工程と、
を含む方法。
［３２］細胞内の遺伝病を直す方法であって、
ＤＮＡが病原性変異ＤＮＡ配列を含む細胞を提供する工程と、
上記細胞を、上記病原性変異ＤＮＡ配列に隣接する標的部位に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に暴露する工程と、
上記細胞を、Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼに暴露する工程と、
上記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを、上記少なくとも１つのｇＲＮＡによって、上記標的部位へと導く工程と、
上記病原性変異ＤＮＡ配列に隣接する上記ＤＮＡに、上記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼによって二本鎖切断を生じさせる工程と、
上記細胞を、上記病原性変異ＤＮＡ配列に対応する野生型ＤＮＡ配列を含む単離一本鎖ドナーオリゴヌクレオチドに暴露する工程と、
上記病原性変異ＤＮＡ配列を、上記野生型ＤＮＡ配列と、相同組み換え修復によって置換する工程と、
上記遺伝病を直す工程と、を含む、方法。
［３３］ＤＮＡゲノム中の標的配列を検出する方法であって、
ＤＮＡゲノムをＣｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼのニッカーゼ変異体に暴露する工程と、
上記ＤＮＡゲノムを少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に暴露する工程であって、上記少なくとも１つのｇＲＮＡは上記標的部位内に位置する標的配列に相補的である、工程と、
上記ニッカーゼ変異体Ｃｐｆ１を、上記少なくとも１つのｇＲＮＡによって、上記標的配列へと導く工程と、
上記標的配列にニックを入れる工程と、
ニックを入れられた標的配列を作る工程と、
上記ニックを入れられた標的配列を少なくとも１つの標識ヌクレオチド（ＮＴ）に暴露する工程と、
上記標識ＮＴを上記ニックを入れられた標的配列に含ませる工程と、
上記ゲノム中の上記標的部位の上記ＤＮＡ配列を標識化する工程と、
上記ゲノム中の上記標的配列を検出する工程と、を含む、方法。
［３４］上記少なくとも１つの標識ＮＴは蛍光標識ＮＴである、［３３］に記載の方法。
［３５］上記標的部位は、プロウイルスレトロウイルスＤＮＡ、テロメア、またはレトロトランスポゾンから選ばれる場所の中にある、［３３］に記載の方法。
［３６］ゲノム内の標的部位における標的ＤＮＡ配列を検出する組成物であって、
少なくとも１つの触媒欠損Ｃｐｆ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1）エンドヌクレアーゼと、
少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、標的部位における標的配列に相補的である少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含み、
上記少なくとも１つの触媒欠損Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ、上記少なくとも１つのｇＲＮＡ、または上記少なくとも１つの触媒欠損Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと上記少なくとも１つのｇＲＮＡの両方は、検出可能な標識を含む、組成物。
［３７］上記少なくとも１つの触媒欠損Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、上記検出可能な標識を含む、［３６］に記載の組成物。
［３８］上記検出可能な標識は、蛍光ポリペプチドである、［３７］に記載の組成物。
［３９］上記蛍光ポリペプチドは、伸長緑色タンパク質（ＥＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）から選ばれる、［３８］に記載の組成物。
［４０］上記少なくとも１つのｇＲＮＡは上記検出可能な標識を含み、上記検出可能な標識は上記少なくとも１つのｇＲＮＡに対してアプタマーを介して結合している、［３９］に記載の組成物。