(57)【要約】  乳酸菌などの免疫賦活素材の活性を増強させる素材を提供すること。そのような素材を提供することにより、免疫賦活素材の使用量を低減させることが可能となる。また、そのような素材を提供することにより、強力な免疫賦活活性と好ましい発酵特性を有する乳酸菌の選抜にかかる時間を短縮させることも可能となる。これら目的のため、フコイダンを酸加水分解することにより得られる生成物またはオリゴ糖を免疫賦活素材と組み合わせて用いる。このような組み合わせにより、それらの免疫機能調節作用または免疫賦活活性を相乗的に増強する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダン又はフコイダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物。
【請求項２】
前記加水分解生成物が、フコイダンを０．１〜６．０Ｎの酸で、２５〜１００℃、０．２５〜２．５時間加水分解して得られるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記加水分解生成物が、フコイダンを０．５〜４．０Ｎの酸で、３０〜９０℃、０．５〜２．０時間加水分解して得られるものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記加水分解が塩酸又は硫酸で行なわれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記加水分解生成物がオリゴ糖である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記オリゴ糖が、フコース、硫酸化フコース、アセチル化フコース、及びグルクロン酸からなる群から選択される少なくとも一種の糖で構成される二糖から五糖までのオリゴ糖である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記オリゴ糖として、下記構造式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）および（XI）で示される化合物から選択される少なくと
も一種を含む、請求項６に記載の組成物。
【化１】
2007013613.tif 000020
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【請求項８】
前記免疫賦活素材が、乳酸菌、酵母、真菌類のような微生物；シイタケ、マイタケ、霊芝、アガリクスなどのキノコ類；ＣｐＧモチーフを含む免疫原性オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、ＰｏｌｙＩ：Ｃのような核酸由来物質；リポ多糖（ＬＰＳ）、β−グルカン；海藻類；漢方薬；ＭＭ４６癌抗原のような癌ワクチン；コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）；ＢＲＭ（生物学的応答修飾剤）から選択される少なくとも一種である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記免疫賦活素材が乳酸菌である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を含む免疫機能調節剤。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を添加した飲食品。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を含む化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコイダン又はフコイダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含み、免疫力の増強、免疫機能の調節などを目的とした飲食品、医薬品、健康食品、機能性食品、化粧品等に利用可能な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫賦活素材
近年、健康食品分野においては、免疫賦活作用を有する素材が注目されており、それらを含む健康食品が多く開発されている。これらは、加齢やストレス、疾患などにより低下した免疫力の回復等の目的に用いられる。そのような素材には、例えば、乳酸菌（乳酸球菌、乳酸桿菌）、酵母、真菌類のような微生物；シイタケ、マイタケ、霊芝、アガリクスなどのキノコ類；海藻類；漢方薬等が含まれる。【０００３】
乳酸菌
上記免疫賦活素材の中でも、乳酸菌は、その免疫賦活作用が注目されており、一部の乳酸菌に関して、ＮＫ（ナチュラルキラー）活性を増強する作用やＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善する作用等が報告されている。また、乳酸菌は、従来から飲食用に供されており、安全性が高いことも知られている。従って、乳酸菌は、免疫力の低下を回復する手段として望ましいと考えられる。【０００４】
乳酸菌の免疫賦活作用の効果を高めるには、飲食品中の乳酸菌の含量を増やせばよい。しかし、乳酸菌を多量に飲料などに添加すると沈殿を生じるという問題があった。このような理由から、これまで乳酸菌を用いた飲食品としては、漬物のような固体のものや、沈殿が気にならない飲食品（たとえばヨーグルトや乳飲料）がほとんどだった。また、たとえばヨーグルトのように、発酵により乳酸菌を増やす場合でも、乳酸菌の数が一定量に達すればそれ以上は増えないため、飲食品中の乳酸菌含量を増やすのには限界があった。しかも、発酵食品を作る以上、機能だけでなく、発酵の度合い、発酵後の香味、発酵後の乳酸菌の数、なども考慮する必要があった。従って、乳酸菌を用いて機能性飲食品、特に免疫機能調節を目的とした機能性発酵飲食品を開発するためには、発酵特性に優れ、かつ免疫機能調節作用にも優れた乳酸菌を用いることが必須である。しかし、乳酸菌の発酵特性と免疫機能調節作用には全く相関が無い。したがってこのような乳酸菌を探索するのは容易なことではない。【０００５】
近年では乳酸菌などの免疫賦活素材の活性を高めるためのいくつかの方法が報告されている。たとえば、３〜８種の乳酸菌や酵母を混合培養することで免疫賦活作用が増強するという報告や（特許文献１）、乳酸菌とキノコを併用することで免疫賦活作用を増強させる方法（特許文献２）などの報告がある。【０００６】
フコイダンおよびフコイダン加水分解生成物
フコイダンは藻類に含まれる硫酸化多糖であり、抗血液凝固作用、脂血清澄作用（血液中のコレステロールや過酸化脂質を除去する作用）、抗腫瘍作用、癌転移抑制作用、抗エイズウイルス感染作用等の様々な活性を有することが報告されている。中でも、生体の免疫機能を正常化する作用が注目されており、免疫機能調節作用を有する医薬品や健康食品の素材として有用であると考えられている。しかし、フコイダンは分子量が極めて大きい硫酸化多糖であり、そのまま飲食品や医薬品等として用いる際には、吸収性、抗原性、均一性、抗凝血活性等に関する問題がある。【０００７】
これらの問題を解決するために、フコイダンから低分子化合物を得るための試みがいくつかなされている。例えばこれまでに、化学合成によるフコース含有オリゴ糖が報告されているが（非特許文献１、２および３）、これらは有機合成反応により調製されているため食品などに使用するのは好ましくなかった。【０００８】
一方、フコイダンを加水分解してフコイダンを低分子化する方法も報告されている。例えば、特許文献３には、フコイダンを酸加水分解する方法が開示されており、得られた低分子フコイダンは、５×１０3以下の分子量分布を有していたことが記載されている。また、特許文献４には、酸を外部から添加することなくフコイダンを加水分解してオリゴ糖を得る方法が記載されている。また、特許文献５のように酵素によりフコイダンを加水分解する方法も報告されている。
【特許文献１】特開２００５−６８０９２
【特許文献２】特開２００４−５１５０４
【特許文献３】特開平７−２１５９９０
【特許文献４】特開２００２−２２６４９６
【特許文献５】特開２０００−２３６８８９
【非特許文献１】Carbohydrate research 4, 189-195 (1967)
【非特許文献２】Carbohydrate research 37, 75-79 (1974)
【非特許文献３】Carbohydrate research 41, 308-312 (1975)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１および２の方法では、いずれも不溶性素材同士を組み合わせる方法であって、沈殿を防ぐことには至っていない。また、乳酸菌以外の免疫賦活素材の活性を効果的に高めるような素材については、これまで検討がなされていない。【００１０】
そこで、免疫賦活素材や乳酸菌の活性を相乗的に高める水溶性素材があれば、より強い効能を持った免疫機能調節剤や飲食品が開発できるだけでなく、活性を維持したまま免疫賦活素材や乳酸菌の使用量を減らすこともできるため、結果として免疫賦活素材や乳酸菌の含有食品の開発範囲が広げることができる。更には良好な発酵特性と免疫機能調節作用を兼ね備えた乳酸菌を探索する負担も軽減される。また、食品や医薬品における用途を考慮すると、その物質は安全性が高くかつ簡便に製造できるものであることが必要とされる。【００１１】
したがって本発明の目的は、免疫賦活素材を組み合わせることによりそれらの免疫機能調節作用を増強することができる物質を提供することである。【００１２】
なお、ここでいう免疫機能調節作用とは、例えばキシロオリゴ糖のように腸内細菌叢を改善して間接的に免疫機能を整えるものではなく、いくつかのフコイダンで示されているように直接的に免疫担当細胞を活性化するものを指す。【００１３】
本発明のさらなる目的は、効果量を的確に飲食品または医薬組成物に添加することができる組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、フコイダン又はフコイダンの酸加水分解生成物、好ましくはオリゴ糖を任意の乳酸菌や免疫賦活素材と組み合わせることでそれらの免疫機能調節または免疫賦活活性が相乗的に増強することを見出し、本発明の完成に至った。本発明においては、フコイダン由来のそれらオリゴ糖をフコイダンオリゴ糖とも称する。【００１５】
すなわち本発明は、
（１）フコイダン又はフコイダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物；
（２）加水分解生成物が、フコイダンを０．１〜６．０Ｎの酸で、２５〜１００℃、０．２５〜２．５時間加水分解して得られるものである、（１）に記載の組成物；
（３）加水分解生成物が、フコイダンを０．５〜４．０Ｎの酸で、３０〜９０℃、０．５〜２．０時間加水分解して得られるものである、（２）に記載の組成物；
（４）加水分解が塩酸又は硫酸で行なわれる、（１）〜（３）のいずれか１つ記載の組成物；
（５）加水分解生成物がオリゴ糖である、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の組成物；
（６）オリゴ糖が、フコース、硫酸化フコース、アセチル化フコース、及びグルクロン酸からなる群から選択される少なくとも一種の糖で構成される二糖から五糖までのオリゴ糖である、（５）に記載の組成物；
（７）オリゴ糖として、下記構造式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）および（XI）で示される化合物から選択される少なくとも一種を含む、（６）に記載の組成物；【００１６】
【化１】
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【００１７】
（分子量３４０）【００１８】
【化２】
2007013613.tif 000003
【００１９】
（分子量４８６）【００２０】
【化３】
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【００２１】
（分子量３９０）【００２２】
【化４】
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【００２３】
（分子量４２０）【００２４】
【化５】
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【００２５】
（分子量５６６）【００２６】
【化６】
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【００２７】
（分子量７１２）【００２８】
【化７】
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【００２９】
（分子量７５４）【００３０】
【化８】
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【００３１】
（分子量８０８）【００３２】
【化９】
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【００３３】
（分子量８５０）【００３４】
【化１０】
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【００３５】
（分子量８５８）【００３６】
【化１１】
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【００３７】
（分子量９００）
（８）免疫賦活素材が、乳酸菌（乳酸球菌および乳酸桿菌）、酵母、真菌類のような微生物；シイタケ、マイタケ、霊芝、アガリクスなどのキノコ類；ＣｐＧモチーフを含む免疫原性オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、ＰｏｌｙＩ：Ｃのような核酸由来物質；リポ多糖（ＬＰＳ）、β−グルカン；海藻類；漢方薬；ＭＭ４６癌抗原のような癌ワクチン；コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）；クレスチン（登録商標）、ＯＫ−４３２（ピシバニール、登録商標）、レンチナン（登録商標）のようなＢＲＭ（生物学的応答修飾剤）から選択される少なくとも一種である、（１）〜（７）のいずれか１つに記載の組成物；
（９）免疫賦活素材が乳酸菌である、（８）に記載の組成物；
（１０）（１）〜（９）のいずれか１つに記載の組成物を含む免疫機能調節剤；
（１１）（１）〜（９）のいずれか１つに記載の組成物を添加した飲食品；
（１２）（１）〜（９）のいずれか１つに記載の組成物を含有し、免疫機能調節作用を有する旨の表示を付した飲食品；
（１３）（１）〜（９）のいずれか１つに記載の組成物を含む医薬組成物；および
（１４）（１）〜（９）のいずれか１つに記載の組成物を含む化粧品
に関する。
【発明の効果】
【００３８】
本発明のフコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせは、それらを単独で用いた場合と比較して、相乗的に増強された免疫機能調節または免疫賦活作用を有する。従って、これまでの免疫賦活素材を用いた飲食品や医薬品よりも効果が高い製品を開発することが可能となる。また、その高い効果のため、免疫賦活素材の飲食品、医薬品、化粧品への添加量を減らすことも可能となる。【００３９】
これらの利点は、免疫賦活素材として乳酸菌を用いる際に特に重要となる。例えば、水溶性の低い乳酸菌においては、その添加量を削減できれば、その沈殿を防止できる。また、免疫賦活活性と好ましい発酵特性を兼ね備えた乳酸菌を選抜する過程も省略できる。結果として、乳酸菌含有製品の開発を有利に進めることができる。【００４０】
また、本発明の組成物の構成要件であるフコイダン又はその加水分解生成物は、食品素材から分離されたものであるため穏やかな作用を有し、極めて安全性が高い。【００４１】
従って、本発明組成物は非常に有用であり、その応用範囲は飲食品のみならず、医薬品および化粧品にも適用可能である。【００４２】
また、オリゴ糖として、上記構造式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）および（XI）で示される化合物から選択される少なくとも一種を含むものを用いることにより、簡便かつ正確に品質管理できる。また、これらフコイダン由来オリゴ糖は低分子で扱いやすくまた簡便に製造でき、安全性も高いため、これらオリゴ糖を免疫賦活素材と組み合わせた組成物は、飲食品や医薬品等、様々な用途に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、沖縄モズクから熱水抽出により得られるフコイダンの糖組成分析を示すＨＰＬＣチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、フコイダンを加水分解する際に用いる酸濃度が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、フコイダンを加水分解する際に用いる酸濃度が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、フコイダンを加水分解する際に反応させる温度が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、フコイダンを加水分解する際に反応させる温度が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。
【図４】図４は、フコイダンを加水分解する際に反応させる時間が免疫賦活活性に及ぼす影響を示す。
【図５】図５は、式（I）で表される分子量３４０のフコイダンオリゴ糖のＭＳスペクトルを示す。
【図６】図６は、式（II）で表される分子量４８６のフコイダンオリゴ糖のＭＳスペクトルを示す。
【図７】図７は、式（I）で表される分子量３４０のフコイダンオリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図８】図８は、式（I）で表される分子量３４０のフコイダンオリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図９】図９は、式（II）で表される分子量４８６のフコイダンオリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１０】図１０は、式（II）で表される分子量４８６のフコイダンオリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１１】図１１は、式（III）で表される分子量３９０のフコイダンオリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１２】図１２は、式（III）で表される分子量３９０のフコイダンオリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１３】図１３は、式（V）で表される分子量５６６のフコイダンオリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１４】図１４は、式（V）で表される分子量５６６のフコイダンオリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１５】図１５は、式（VI）で表される分子量７１２のフコイダンオリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１６】図１６は、式（VI）で表される分子量７１２のフコイダンオリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１７】図１７は、式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１８】図１８は、式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１９】図１９は、式（VIII）で表される分子量８０８のフコイダンオリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２０】図２０は、式（VIII）で表される分子量８０８のフコイダンオリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２１】図２１は、式（IX）で表される分子量８５０のフコイダンオリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２２】図２２は、式（IX）で表される分子量８５０のフコイダンオリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２３】図２３は、式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖を再生した後の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２４】図２４は、式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖を再生した後のＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図２５】図２５は、式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖を再生した後のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図２６】図２６は、式（IV）で表される分子量４２０のフコイダンオリゴ糖のＦＡＢ−ＭＳスペクトルを示す。
【図２７】図２７は、式（IV）で表される分子量４２０のフコイダンオリゴ糖のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図２８】図２８は、式（X）で表される分子量８５８および式（XI）で表される分子量９００のフコイダンオリゴ糖のＦＡＢ-ＭＳスペクトルを示す。
【図２９】図２９は、式（X）で表される分子量８５８のフコイダンオリゴ糖のＦＡＢ-ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図３０】図３０は、式（XI）で表される分子量９００のフコイダンオリゴ糖のＦＡＢ-ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図３１】図３１は、沖縄モズクを加水分解後、ＡＢＥＥで蛍光標識化したＥＳＩ−ＭＳのチャートを示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、式（Ｉ）で表されるフコイダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞のＩＦＮ−γ誘導効果を高めることを示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、式（II）で表されるフコイダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞のＩＦＮ−γ誘導効果を高めることを示す。
【図３３】図３３は、フコイダンオリゴ糖混合物と乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞のＩＦＮ−γ誘導効果を高めることを示す。
【図３４】図３４は、フコイダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に樹状細胞のＩＬ−１２誘導効果を高めることを示す。
【図３５】図３５は、フコイダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的に樹状細胞のＩＬ−１０誘導効果を高めることを示す。
【図３６】図３６は、フコイダンオリゴ糖と乳酸菌の併用が相乗的にＣＴＬ活性を高めることを示す。
【図３７】図３７は、活性の殆どない乳酸菌とフコイダン加水分解生成物とによるＩＬ−１２産生の相乗的増強を示す。
【図３８】図３８は、乳酸菌以外の免疫賦活剤とフコイダン加水分解生成物とによる、ＩＦＮ−γ産生の相乗的増強を示す。
【図３９】図３９は、乳酸菌とフコイダン加水分解生成物が相乗的にＮＫ活性を増強することをin vivoで証明する。
【図４０】図４０は、フコイダンと乳酸菌の併用が相乗的に脾細胞のＩＦＮ−γ誘導効果を高めることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
免疫賦活素材
免疫賦活素材とは、動物の免疫応答力を増強する作用を有する素材のことをいう。免疫強化素材ともよばれる。本発明で用いる免疫賦活素材は、特に限定されないが、乳酸菌（乳酸球菌、乳酸桿菌）、酵母、真菌類のような微生物；シイタケ、マイタケ、霊芝、アガリクスなどのキノコ類；ＣｐＧモチーフを含む免疫原性オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、ＰｏｌｙＩ：Ｃのような核酸由来物質；リポ多糖（ＬＰＳ）；海藻類；漢方薬；癌ワクチン（例えば、ＭＭ４６癌抗原）；コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）；クレスチン（登録商標）、ＯＫ−４３２（ピシバニール、登録商標）、レンチナン（登録商標）のようなＢＲＭ（生物学的応答修飾剤）等の公知の免疫賦活剤が含まれる。【００４５】
ＣｐＧ−ＯＤＮとは、非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む（短い）オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）であり、そのようなＣｐＧモチーフを含有するＣｐＧ−ＯＤＮは、抗原提示細胞を直接活性化することができる。その結果、ＣｐＧ−ＯＤＮによるＮＫ細胞等の活性化は、Ｔｈ１型応答の誘発および細胞障害性Ｔ細胞の発生を促進する（特表２００４−５１９４５３）。【００４６】
ＰｏｌｙＩ：Ｃとは、イノシン酸とシチジル酸とからなるポリヌクレオチドコポリマーのことであり、ポリイノシンポリシチジン酸ともよばれる。霊長類においては、インターフェロンの体液中濃度を高める作用を有することが一般に知られている。【００４７】
リポ多糖は、自然免疫系を誘導する引き金となる物質として知られている。【００４８】
ＭＭ４６とは、乳癌または腫瘍の一種である。ＭＭ４６癌に対する抗原等の癌ワクチンは、癌細胞を攻撃する免疫機能を賦活化するため、癌の予防や治療に用いられる。【００４９】
ＣｏｎＡとは、タチナタマメ（Jack bean）の種子由来のレクチンである。種々の免疫賦活作用を有することが知られている。【００５０】
ＢＲＭとは、癌治療において宿主の免疫機能等を増強、調節することによって腫瘍と宿主の相互関係を修飾し、治療効果を導き出す薬剤や治療法のことである。そのような薬剤には、ＯＫ−４３２やクレスチン（登録商標）、レンチナン（登録商標）等が含まれる。ＯＫ−４３２とは、主成分としてストレプトコックス・ピオゲネス（Ａ群３型）Ｓｕ株ペニシリン処理凍結乾燥粉末、乾燥菌体を含有する、抗悪性腫瘍剤・リンパ管腫治療剤である。クレスチンとは、主成分としてカワラタケの菌糸体より得られた、たん白質と結合した多糖類を含有する、癌の治療に用いられる薬剤である。レンチナンとは、シイタケから得られたβ−１，３−グルカンである。【００５１】
乳酸菌
本発明で用いる乳酸菌は特定の株に限定されるものではないが、好ましくは、Lactobacillus属であり、その中でも植物素材を発酵できる植物性乳酸菌が好ましい。さらに好ましくは、Lactobacillus plantarum または Lactobacillus pentosus である。本発明においてフコイダン又はその加水分解生成物と組み合わせて用いる場合には、乳酸菌は、生きていてもよいし、死んでいてもよい。【００５２】
フコイダン
本発明の組成物のための原料として用いられるフコイダンは、どのような構造のものでもよく、またいずれの藻類から取得してもよい。藻類の例には、クロガシラ目（Sphacelariales）、ナガマツモ目（Chordariales）、カヤモノリ目（Scytosiphonales）、ウイキョウモ目（Dictyosiphonales）、ムチモ目（Cutleriales）、ケヤリモ目（Sporochnales）、アミジグサ目（Dictyotales）、コンブ目（Laminariales）、ヒバマタ目（Fucales）を含む褐藻綱Phaeophyceaeの海藻が含まれる。好ましくはモズク、より好ましくは沖縄モズク由来のフコイダンを用いる。【００５３】
フコイダンの抽出方法
フコイダンを藻類から抽出する方法は種々検討されており、広く知られている（例えば、特開平１０−２４５３３４に記載されているような水を用いる方法、特開平１０−１９５１０６に記載されているような酸を用いる方法、特開２００２−２６２７８８に記載されているようなアルカリ水性溶媒を用いる方法等である）。本発明において原料として用いるフコイダンはこれら公知の方法により取得することができる。本発明においては、例えば、以下の方法により取得したものを用いる。【００５４】
即ち、藻類（例えば沖縄モズク）に蒸留水５〜１０倍量を加え、５０〜１００℃で数分〜５時間、好ましくは６０〜９０℃で０．５〜２．０時間、さらに好ましくは８０〜９０℃で約１時間抽出する。このようにして得られた藻類抽出物を冷却、吸引濾過、脱塩および乾燥することにより、容易に水に溶解するフコイダン画分を得ることができる。このようにして得られたフコイダン画分は、さらに精製することなく次の工程に用いてもよいし、更に精製してから用いてもよい。【００５５】
フコイダンは、好ましくは上記のように藻類から抽出したものを用いるが、藻類に含まれた状態で用いてもよい。フコイダンまたはそれを含む藻類を次の加水分解工程に付すことによってフコイダン加水分解生成物が得られる。【００５６】
フコイダン加水分解生成物
フコイダン加水分解生成物とは、硫酸化多糖であるフコイダンを加水分解することにより得られうる単糖および多糖類を包含する糖誘導体、並びにそれらの混合物のことをいう。フコイダン加水分解生成物は、好ましくは多糖類であり、より好ましくは２〜１０個の単糖からなるオリゴ糖、さらにより好ましくは２〜５個の単糖からなるオリゴ糖である。本発明においては、フコイダンを加水分解して得られる上記のようなオリゴ糖をフコイダンオリゴ糖とも称する。オリゴ糖を構成する単糖は、好ましくはフコース、硫酸化フコース、アセチル化フコース、および／またはグルクロン酸である。特に好ましいオリゴ糖は、上記式（I）〜（XI）の化合物である。【００５７】
フコイダン加水分解生成物は以下の様にして製造される。【００５８】
フコイダン加水分解生成物の製造
（１）フコイダンの加水分解
本発明の構成要件であるフコイダン加水分解生成物は、特許文献３〜５に記載されているように、フコイダンを酸や酵素を用いる方法により加水分解することにより得られる。酸加水分解を行なう場合には、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸を用いてもよいし、酢酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、ギ酸、プロピオン酸等の有機酸を用いてもよい。好ましい酸は、塩酸および硫酸である。好ましくは、以下の様な酸加水分解条件を用いる。【００５９】
即ち、上記のようにして藻類から得られたフコイダンを含む画分またはフコイダンを、酸、好ましくは塩酸を用い、０．１〜６．０Ｎ、好ましくは０．５〜４．０Ｎ、さらに好ましくは０．５〜２．０ＮのＨＣｌを含む、２５〜１００℃、好ましくは３０〜９０℃、さらに好ましくは５０〜８０℃の水性溶媒中で、０．１〜３時間、好ましくは０．２５〜２．５時間、さらに好ましくは０．５〜２．０時間加水分解を行なう。得られた反応物を塩基、例えば約１ＮのＮａＯＨで中和した後、電気透析もしくはゲル濾過等の適切な手段で脱塩し、乾燥（例えば、凍結乾燥）することにより、フコイダンオリゴ糖混合物を含有する加水分解生成物を得ることができる。【００６０】
このようにして得られた加水分解生成物は、このままフコイダン加水分解生成物として用いてもよいが、さらに精製してその活性を高めることができる。【００６１】
（２）加水分解生成物の精製およびオリゴ糖の単離
フコイダン加水分解生成物の精製は、クロマトグラフィー、再結晶、透析、アルコール沈殿等の方法を単独で、または組み合わせて用いることができる。例えば、以下の操作に従って精製を行なう。【００６２】
先ず、オリゴ糖混合物を含有するフコイダン加水分解生成物を陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、吸着されずに通過する、硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（中性・酸性糖画分）と、酸性溶出液により溶出する、硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）とを分離する。【００６３】
本発明においては、このようにして得られた各画分をフコイダン加水分解生成物として用いることが好適であるが、以下の様にして、さらに精製してオリゴ糖を単離して用いてもよい。【００６４】
中性・酸性糖画分をさらにゲル濾過に付すことにより、式（I）で表される二糖と式（II）で表される三糖を得ることができる。【００６５】
一方、硫酸化糖画分をクロマトグラフィーに付すことにより、硫酸化オリゴ糖（III）、（IV）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）、または（XI）各成分を単離することができる。【００６６】
各オリゴ糖は、精製、構造解析をより容易にするために適宜標識化または誘導体化してもよい。例えば、オリゴ糖は、４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）のような試薬で蛍光標識化することができ、これによりオリゴ糖の検出が容易となる。標識化された各オリゴ糖を分離した後にその標識化部分を除去することにより、純粋なオリゴ糖を取得することができる。【００６７】
フコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせ
本発明は、上記のようにして得られるフコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせを含む組成物である。このような組み合わせにより、フコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材の免疫機能調節作用および／または免疫賦活作用が相乗的に増強される。【００６８】
当該組成物においては、フコイダン加水分解生成物として単一のフコイダンオリゴ糖を免疫賦活素材（例えば乳酸菌）と組み合わせて用いてもよい。また、フコイダンオリゴ糖を複数、例えば三種類またはそれ以上用いて、免疫賦活素材と組み合わせてもよい。【００６９】
乳酸菌を本発明の組み合わせにおいて用いる場合には、それは生きていてもよいし、死んでいてもよい。これに対して、キシロオリゴ糖の様なプレバイオティクスとして知られているオリゴ糖は、主に乳酸菌の増殖を促すことにより免疫機能調節作用を増強するものである。本発明の加水分解生成物は、死菌による免疫機能調節作用をも増強できる点で、従来のプレバイオティクスとして用いられているオリゴ糖よりも優れている。【００７０】
用いられるフコイダン又はその加水分解生成物の免疫賦活素材に対する好ましい比率は、重量で１：１〜１００００：１、より好ましくは２５０：１〜１０００：１である。【００７１】
また、本発明には、フコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材とを組み合わせて用いることによりそれらの免疫機能調節および／または免疫賦活作用を相乗的に増強する方法も含まれる。【００７２】
本発明の組み合わせを、例えば飲食品、医薬品および化粧品等に用いて、これらに免疫機能調節作用を付与することができる。【００７３】
免疫機能調節剤
本明細書における免疫機能調節作用とは、生体において低下している免疫反応を高める、および／または亢進している免疫反応を抑制する作用のことをいう。従って、その作用には、免疫賦活作用および免疫抑制作用が含まれる。【００７４】
本明細書における免疫機能調節作用は、当該技術分野で知られている方法で測定することができる。それは、例えば、免疫機能調節作用を有するサイトカインを誘導する作用を指標として測定することができる。この目的に用いられるサイトカインには、インターフェロン−γ、インターロイキン−１０、１２等が含まれる。また、免疫機能調節作用は、免疫応答に関与する樹状細胞の成熟化や、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性を指標として測定することもできる。【００７５】
本発明の免疫機能調節剤は健康増進のために用いることができるが、腫瘍、癌の転移、ウイルス性疾患（例えば、カゼ、エイズ、ウイルス性肝炎）、アレルギー性疾患（例えば、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー、喘息）、自己免疫疾患（例えば、リウマチ様関節炎）、炎症性疾患、糖尿病のような疾患または状態に有効である。【００７６】
フコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む食品添加物および飲食品
本発明のフコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせを飲食品に用いる場合には、それを含み免疫機能調節作用を有する食品添加物および飲食品として、並びにそれを添加した免疫機能調節作用を有する健康食品として実施することが好適である。これらは、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合してユーザーの嗜好に合う製品とすることができる。飲食品は、例えば、錠剤、カプセル剤、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤、ヨーグルトや乳酸菌飲料等の乳製品、調味料、加工食品、デザート類、菓子（例えば、ガム、キャンディ、ゼリー）等の形態で提供することが可能である。本発明の飲食品には、免疫機能調節作用を有する旨の表示を容器や説明書に付した機能性食品（特定保健用食品や条件付き特定保健用食品が含まれる）も含まれる。表示場所は容器またはそれに添付した指示書などが挙げられるが、これらに限られない。容器には、瓶、缶、ペットボトル、プラスチックボトル、紙パック等が含まれるが、それらに限定されない。また、表示の方法には、印刷、刻印、シール等が含まれるが、それらに限定されない。また、飲食品は、ペットの餌として加工したペットフードや動物飼料等でもよい。【００７７】
フコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせを含む医薬組成物
本発明の組成物を医薬品として用いる場合には、例えば、免疫機能調節剤、免疫賦活剤、抗アレルギー剤および免疫抑制剤として用いることができる。したがって、１つの態様において、本発明はフコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む、免疫機能調節作用、免疫賦活作用、抗アレルギー作用および／または免疫抑制作用を有する医薬組成物である。【００７８】
医薬組成物は、主薬に希釈剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、座剤、クリーム剤、軟膏剤、エマルジョン、ハップ剤、注射剤等を挙げることができ、特に限定されるものではない。本医薬品の投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経腸投与等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。【００７９】
フコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材との組み合わせを含む化粧品
本発明の組み合わせを用いることにより、免疫機能調節作用を有する化粧品を製造することができる。【００８０】
本発明の組み合わせを含む化粧品は、例えば、顔用、皮膚用、頭髪用のクリーム、ローション、ゲル、ムース、シャンプー、リンス等である。【００８１】
他の成分との併用
本発明の組み合わせを含む組成物は、飲食品、医薬組成物および化粧品において、それ自体単独で使用してもよいが、他の免疫機能調節作用または免疫賦活作用を有する食品素材または物質と併用することも好適である。そのような食品素材または物質としては、乳酸菌、キノコ類、フコイダン等が挙げられる。【００８２】
本発明の飲食品または組成物には、これら活性成分以外に、具体的な態様に応じて、一般的な成分、例えば、担体、希釈剤、賦形剤または添加剤等の成分を配合することができる。ここで希釈剤、担体、賦形剤としては、フコイダン又はその加水分解物および免疫賦活素材の生理活性を妨げないものであれば特に制限されず、例えばシュクロース、グルコース、果糖、マルトース、トレハロース、乳糖、澱粉、水飴、異性化液糖などの糖類、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール類、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、ラクチトール、キシリトール、マルチトール、還元パラチノース、還元澱粉分解物等の糖アルコール類、トリアセチン等の溶剤、アラビアガム、カラギナン、キサンタンガム、グァーガム、ジェランガム、ペクチン等の多糖類、または水を挙げることができる。また添加剤としては、キレート剤等の助剤、香料、香辛料抽出物、防腐剤などを挙げることができる。希釈剤、担体、添加剤等を本発明の効果を損なわない限り配合することができる。【００８３】
飲食品、医薬組成物および化粧品におけるフコイダン又はその加水分解物および免疫賦活素材の配合量は、選択する他の配合成分との関係等により適宜選択されるものであり、特に限定されるものではない。しかしながら、通常、フコイダン又はその加水分解生成物と免疫賦活素材の合計量は、飲料または食品中、医薬組成物中に添加する場合、個体の体重６０ｋｇに対して０.０１ｇ〜１０ｇ／日、好ましくは０.０５ｇ〜１ｇ／日、特に好ましくは０.０５ｇ〜０.５ｇ／日である。化粧品中には、０.０１〜２０重量％、好ましくは０.０５〜１５重量％用いられる。【００８４】
本発明のフコイダン又はその加水分解生成物およびオリゴ糖は、抽出精製品や合成製品を単独で飲食品、医薬組成物または化粧品に用いることもできる。【００８５】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。【００８６】
以下の実施例においては、特に明記しない限り、ＥＣＡ−６００型核磁気共鳴装置（日本電子株式会社）を用いてＮＭＲ分析を行なった。測定溶媒として重水（Ｄ2Ｏ）を用いた。構成糖の結合様式は、２Ｄ-ＮＭＲを用いて行なった。
【実施例１】
【００８７】
フコイダン画分の調製
沖縄モズク藻体１００ｇに蒸留水を１０００ｍｌ加え、１００℃で１時間抽出した。得られた抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析（脱塩）をして凍結乾燥し、フコイダン画分を２ｇ得た。このフコイダンを２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を含む１００℃の水溶液で１時間加水分解し、得られた水溶液を２Ｎ  ＮａＯＨを用いて中和し、ＡＢＥＥで蛍光標識化することで単糖分析サンプルを調製した。その構成糖の組成はＳＦｕｃ（硫酸化フコース）：ＧｌｃＡ（グルクロン酸）：Ｆｕｃ（フコース）：Ｘｙｌ（キシロース）＝４９．３：４．９：１２．１：１であることを確認した（図１）。
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  Ｃ１８  ＡＲ−II（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ）
移動相：１０％アセトニトリル含有０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液
流速：１．０ｍｌ／分
温度：４５℃
検出：蛍光検出器（株式会社島津製作所）、Ｅｘ：３０５ｎｍ、Ｅｍ：３６０ｎｍ
【実施例２】
【００８８】
フコイダン加水分解生成物の製造と免疫機能調節作用の測定
下記の各種条件でフコイダン加水分解生成物を得て、それらと乳酸菌との組み合わせを用いて免疫機能調節作用を検討した。【００８９】
加水分解の酸濃度が免疫機能調節活性に及ぼす影響
実施例１で得られたフコイダンを０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、２．０、４．０、５．０、６．０ＮのＨＣｌ（８０℃）で１時間加水分解し、その後それぞれに０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、２．０、４．０、５．０、６．０ＮのＮａＯＨを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコイダン加水分解生成物を得た。これを１００μｇ／ｍｌの濃度でＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から分離した脾細胞（５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に添加した。３０分後に０．１μｇ／ｍｌの乳酸菌（Lactobacillus pentosus;ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１００２８）を添加し、２４時間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図２Ａ）。また、フコイダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った（白の棒グラフ）。比較対照として、何も添加していないもの（白の棒グラフ中の“ｎｏｎｅ”）、乳酸菌のみを添加したもの（黒の棒グラフ中の“ｎｏｎｅ”）を用いた。その結果、加水分解して得た生成物を乳酸菌と併用すると、それら単独で得られる結果と比較してＩＦＮ−γ産生が相乗的に増強された。この相乗的効果は、０.５〜４.０ＮのＨＣｌで加水分解して得られた生成物において認められた。【００９０】
また、加水分解前のフコイダンだけを用いて上記の実験を行ない、他のサンプルと効果を比較した（図２Ｂ）。その結果、０．５〜４.０ＮのＨＣｌで加水分解して得た加水分解生成物（図２Ｂ、白い棒グラフ）は加水分解前のフコイダン（図２Ｂ“フコイダン”）と同程度の活性しか示さないが、乳酸菌を加えることにより（図２Ｂ、黒い棒グラフ）、フコイダンで得られたもの以上の活性を示すことが明らかとなった。【００９１】
反応温度が及ぼす影響
フコイダンを２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００℃の１ＮのＨＣｌで１時間加水分解し、その後１ＮのＮａＯＨを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコイダン加水分解生成物を得た。これを１００μg／ｍｌの濃度でＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から分離した脾細胞（５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に添加した。３０分後０．１μg/mlの乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭ  ＡＢＰ-１００２８）を添加し、２４時間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図３Ａ）。また、フコイダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った（白い棒グラフ）。比較対照として、何も添加していないもの（白い棒グラフのｎｏｎｅ）、乳酸菌のみを添加したもの（黒い棒グラフのｎｏｎｅ）を用いた。その結果、ＨＣｌで加水分解して得たフコイダン加水分解生成物を乳酸菌と併用することで、それら単独で得られる結果と比較して相乗的に増強されたＩＦＮ−γ産生が認められた。この相乗的効果は、２５〜１００℃で加水分解して得られた全ての生成物において認められたが、特に、３０〜９０℃（好ましくは５０〜８０℃）で加水分解した場合に優れていた。【００９２】
また、加水分解前のフコイダンだけを用いて上記の実験を行ない、その効果を本願発明のものと比較した。その結果、５０〜１００℃のＨＣｌで加水分解して得た生成物は、乳酸菌と組み合わせて用いると、加水分解前のフコイダンと同程度以上の活性を示すことが明らかとなった（図３Ｂ）。【００９３】
反応時間が及ぼす影響
フコイダンを１ＮのＨＣｌ（８０℃）で３０、６０、１２０分間加水分解し、その後１ＮのＮａＯＨを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコイダン加水分解生成物を得た。これを１００μｇ／ｍｌの濃度でＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から分離した脾細胞（５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に添加した。３０分後０．１μｇ／ｍｌの乳酸菌（Lactobacillus pentosus; ＦＥＲＭ  ＡＢＰ-１００２８）を添加し、２４時間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図４）。また、フコイダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った。なお、比較対照として、何も添加していないもの、乳酸菌のみを添加したものを用いた。その結果、３０〜１２０分間加水分解して得られた全ての生成物は、乳酸菌と併用することで、それら単独で得られる結果と比較してＩＦＮ−γ産生が相乗的に増強された。【００９４】
したがって、フコイダン加水分解生成物は、乳酸菌と組み合わせて用いることにより、相乗的に増強した免疫機能調節または免疫賦活作用を有することが明らかとなった。
【実施例３】
【００９５】
精製したフコイダン加水分解生成物の免疫機能調節作用
フコイダン１ｇに２ＮＨＣｌを１００ｍｌ加えて８０℃で１時間酸加水分解を行ない、次いで１ＮＮａＯＨで中和した。得られた反応液をゲル濾過（バイオゲルＰ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に供して脱塩し、凍結乾燥を行なうことによりフコイダンオリゴ糖混合物を含む画分を得た（オリゴ糖画分）。得られたフコイダンオリゴ糖混合物は、蟻酸で活性化した陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社）を用いるクロマトグラフィーに供した。その結果、オリゴ糖画分は、水で溶出することで得られた硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（Ｆｒ．Ｂ）と、２ＮＨＣｌで溶出することで得られた硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）に分離された。硫酸化糖画分をゲル濾過（バイオゲルＰ−６）に供し、分子量５００未満のＦｒ．Ａと５００以上のＦｒ．Ｃに分けた。以上のように精製を行ったフコイダン加水分解生成物の各画分をそれぞれ１００μｇ/ｍｌの濃度で、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から分離した脾細胞（５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に添加した。３０分後０．１μｇ／ｍｌの乳酸菌（Lactobacillus pentosus; ＦＥＲＭ  ＡＢＰ-１００２８）を添加し、２４時間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（表１）。その結果、フコイダンに関は、濃度が低い時に活性を示したが、その濃度を高くすると活性が消失した。一方、加水分解生成物（オリゴ糖各分、Ｆｒ．Ａ〜Ｃ、硫酸化糖各分）の全てにおいて、濃度依存的に免疫賦活能が高まり、かつフコイダンの活性よりも強かった。特に、オリゴ糖を精製することによって活性が強まることも分かった。比較対照として用いた単糖（フコース、硫酸化フコース）やプレバイオティクスとして広く使われているキシロオリゴ糖にもこのような作用が無かった。【００９６】
【表１】
2007013613.tif 000013
【実施例４】
【００９７】
フコイダンオリゴ糖の製造
ａ）フコイダンの加水分解およびオリゴ糖混合物の分離
実施例１で得られたフコイダン画分１ｇに２ＮＨＣｌを１００ｍｌ加えて５０〜１００℃で１時間酸加水分解を行ない、次いで１ＮＮａＯＨで中和した。得られた反応液をゲル濾過（バイオゲルＰ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に付して脱塩し、凍結乾燥を行なうことによりフコイダンオリゴ糖混合物を８９５ｍｇ得た。得られたフコイダンオリゴ糖混合物は、蟻酸で活性化した陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社）を用いるクロマトグラフィーに付した。結果として、オリゴ糖混合物は、水で溶出することで得られた硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（中性・酸性糖画分）２８０ｍｇと、２Ｎ  ＨＣｌで溶出することで得られた硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）４２５ｍｇに分離された。【００９８】
ｂ）化合物（I）および（II）の単離
ａ）で得られた中性・酸性糖画分１００ｍｇをゲル濾過（バイオゲルＰ−４（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、溶出溶媒：０．２Ｍホウ酸カリウム（Ｋ2Ｂ4Ｏ7）水溶液）に付すことにより、当該画分から分子量３４０の二糖と分子量４８６の三糖が分離された(化合物I、II：図５、６)。これらの分子量は、ＦＡＢ−ＭＳにより求めた(化合物（I）［Ｍ−Ｈ］-：３３９．２、化合物（II）［Ｍ−Ｈ］-：４８５．０)。これらの化合物５ｍｇに、水１ｍｌ、ＡＢＥＥ（４−アミノ安息香酸エチル）１.６ｇ、ＮａＢＨ3ＣＮ（水素化シアノほう素ナトリウム）３５０ｍｇ、メタノール３.５ｍｌ、酢酸４１０μｌを加え、６５℃、４時間撹拌した。反応液をクロロホルムと水で分配することにより蛍光標識化された上記二糖および三糖を約７〜９ｍｇ取得した。これら標識化オリゴ糖について測定した1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲのチャートを図７〜１０に示し、それらを解析した結果を表２、３に示した。これらの結果より、得られた分子量３４０の二糖は式（I）で表されるα−Ｄ−ＧｌｃＡ−(１→２)−Ｌ−Ｆｕｃであり、分子量４８６の三糖は式（II）で表されるα−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃであることが分かった。【００９９】
【表２】
2007013613.tif 000014
【０１００】
【表３】
2007013613.tif 000015
【０１０１】
ｃ）化合物（III）〜（XI）の製造
次に、硫酸化糖画分をゲル濾過（バイオゲルＰ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に付すことにより脱塩した。得られた硫酸化糖画分１００ｍｇに、水１ｍｌ、ＡＢＥＥ（４−アミノ安息香酸エチル）１．６ｇ、ＮａＢＨ3ＣＮ（水素化シアノほう素ナトリウム）３５０ｍｇ、メタノール３．５ｍｌ、酢酸４１０μｌを加え、６５℃、４時間撹拌した。得られた生成物を真空で乾燥させ、水とクロロホルムに分配し、水層を逆相カラムで（担体：Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ−８（２５−４０μｍ）（Ｍｅｒｃｋ）、φ１０×２２０ｍｍ；溶媒条件：５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ）、８％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ）、１５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ）、２０％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ））処理することにより蛍光標識化されたオリゴ糖の混合物を得た。得られた蛍光標識化合物をＨＰＬＣ（カラム：ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−II、φ１０．０×２５０ｍｍ；溶媒条件：１２．５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（５分）、１２．５−２７．５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（５０分）；流速：３ｍｌ／分）でアセトニトリル：０．１％ＴＦＡ水溶液を５〜３０％の濃度勾配で溶出して、分子量が５３９、７１５、８６１、９０３、９５７、９９９であり硫酸基を有する６つの標識化フコイダンオリゴ糖を混合物から分離した（分子量は、ＥＳＩ−ＭＳにより決定した）。得られた標識化オリゴ糖についてＮＭＲスペクトルを測定し、その結果を解析した。標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲのチャートを図１１〜２２に示し、それらを解析した結果を表４〜７に示す。これら結果から、分子量５３９、７１５、８６１、９０３、９５７、９９９の化合物は、それぞれ、化合物（III）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）の標識体であることが明らかとなった。【０１０２】
確認のため、各オリゴ糖上に結合していたＡＢＥＥを除去し、再生したオリゴ糖の純品を得た。即ち、これら分離した各標識化オリゴ糖１０ｍｇ（１００μｌ）に、過酸化水素、酢酸を各１０μｌ加えて一昼夜放置した後、乾固した。こうして得られた再生オリゴ糖のうち、分子量９０３の化合物から得られたものを1Ｈ−ＮＭＲ（図２３）、ＴＯＦ−ＭＳ（装置Voyager DE-STR（Applied Biosystems）、Ion mode: negative、Mode of operation： reflector、Accelerating voltage： 20kV、Matrix： 2,5-dihydroxybenzoic acid）（図２４）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ（図２５）で解析したところ、その結果は、確かに式（VII）の構造を示していた。【０１０３】
また、上記方法で分離できなかった分子量４２０、８５８、９００の化合物（それぞれ（IV）、（X）、（XI））に関しては、反応混合物をＦＡＢ−ＭＳ／ＭＳ（装置：HX110A/HX110A(JEOL)、Ion mode：MS, MS/MS(negative)、Xe atom beam：5kV、Ion source accelerating potential：10kV、Collision energy：2keV、Matrix：Glycerol）、およびＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳで分析することによりその存在を確認した。図２６に（IV）のＦＡＢ−ＭＳチャートを、図２７にＭＳ／ＭＳチャートを示した。また図２８に（X）および（XI）のＦＡＢ−ＭＳチャートを、図２９、３０にそれぞれのＭＳ/ＭＳチャートを示した。【０１０４】
これらの結果より、分子量３９０の二糖は化学式（III）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3-−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量４２０の二糖は化学式（IV）で表されるα−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量５６６の三糖は化学式（V）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3-−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量７１２の四糖は化学式（VI）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3-−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、そして分子量７５４の四糖は化学式（VII）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3-−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−アセチル−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量８０８の５糖は化学式（VIII）で表される［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）］−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量８５０の５糖は化学式（IX）で表される［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）］−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−４−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量８５８の５糖は化学式（X）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3-−（１→３）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量９００の５糖は化学式（XI）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3-−（１→３）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−アセチル−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃであることが分かった。【０１０５】
【表４】
2007013613.tif 000016
【０１０６】
【表５】
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【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
【表７】
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【実施例５】
【０１０９】
オキナワモズク藻体１００ｇに２ＮＨＣｌ１０００ｍｌを入れ、１時間、５０〜１００℃で酸加水分解を行った。得られた抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析（脱塩）を行ない凍結乾燥しフコイダン画分を２ｇ得た。得られたフコイダン画分をＡＢＥＥで蛍光標識化したものをＥＳＩ−ＭＳ（４０００Ｑ  ＴＲＡＰ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）分析条件  Ｐｏｌａｒｉｔｙ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ；Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：−５０ｖ；Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ：−１０ｅＶ；Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５５０℃）で分析した結果、図３１で示されるチャートが得られ、式（I）〜（XI）に示されるフコイダンオリゴ糖の存在が確認できた。
【実施例６】
【０１１０】
フコイダンオリゴ糖化合物と乳酸菌の組み合わせによる相乗効果
マウス脾細胞に対するＩＦＮ−γ誘導作用
実施例３と同様に調製した脾細胞５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌに分子量３４０のフコイダンオリゴ糖（化合物（I））を１００μｇ／ｍｌになるようにｗｅｌｌに添加した。比較対照としてフコースと硫酸化フコース(それぞれＭＷ１６４、２４４)、キシロオリゴ糖（ＸＯＳ）を等量用いた。３０分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭ  ＡＢＰ-１００２８）（死菌）を０．１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加した。２４時間培養後、培養上清を回収しＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図３２Ａ）。また、糖単独による効果を確認するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作を行なった。【０１１１】
また、化合物（II）に関しても、化合物（I）と同様に実験を行った。用いられた化合物（II）の量は、ｗｅｌｌ中、１０、１００及び３００μｇ／ｍｌであった（図３２Ｂ）。【０１１２】
化合物（I）に関しては、それを乳酸菌と併用すると著しく強いＩＦＮ−γ誘導能が得られた（図３２Ａ）。この作用は、化合物（I）と乳酸菌をそれぞれ単独で用いて得られた結果（図３２Ａ中、左から２番目および右から５番目）から予測できない程強く、両者を組み合わせて用いることにより相乗的効果が生じることを裏付けている。また、化合物（II）に関しても、同様に乳酸菌との相乗効果が認められた（図３２Ｂ）。構成成分のフコースや硫酸化フコースにはこのような活性が無く、プレバイオティクスとして広く使われているキシロオリゴ糖にもこのような作用が無かった。従って、本発明のフコイダンオリゴ糖は、乳酸菌と併用することで相乗的に脾細胞を活性化させ、生体の免疫機能の調節において非常に有用であることが明らかとなった。【０１１３】
また、同様に調製した脾細胞に、化合物（I）〜（VII）の化合物を任意に３種類均等に混合したものを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３０分後に乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭ  ＡＢＰ-１００２８）（死菌）を０．１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加した。２４時間培養後、培養上清を回収しＩＦＮ−γの産生量を測定した（図３３）。図に示すとおり、（V）、（VI）および（VII）の混合物、（I）、（V）および（VI）の混合物、および（I）、（V）および（VII）の混合物を用いると、高いＩＦＮ−γ産生量が観測された。したがって、化合物（I）〜（XI）が混在していている場合でも乳酸菌と併用することで免疫機能調節活性が上昇することがわかった。
【実施例７】
【０１１４】
フコイダンオリゴ糖による、マウス由来樹状細胞に対するＩＬ−１０、１２誘導作用、およびＣＴＬ活性増強作用
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、雄、日本ＳＬＣ株式会社）の大腿骨から骨髄細胞を分離し、１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、１０％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁し、２４ｗｅｌｌプレートで培養した。培養開始３、５日目に培地交換を行ない、付着性の未成熟樹状細胞を得た。得られた樹状細胞に、化合物（I）、（II）、（III）、（V）、（VI）、および（VII）をそれぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度で前処理した。前処理３０分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭ  ＡＢＰ-１００２８）（死菌）を０．１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加した。２日間培養後、培養上清と細胞を回収した。また、糖化合物単独による効果も確認するため、乳酸菌を添加しないで上記と同様の操作を行なった。【０１１５】
回収した培養上清はＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１２とＩＬ−１０を測定した。結果をそれぞれ図３４、３５に示した。化合物（I）は、それを乳酸菌と併用することで相乗的にＩＬ−１２を誘導した（図３４）。また、化合物（II）、（III）および（V）は乳酸菌と併用することでＩＬ−１０を誘導することも分かった（図３５）。これらのことにより、本発明で見つかったフコイダンオリゴ糖には生体の免疫機能を正にも負にも調節する（低下した免疫を活性化し、または過剰な免疫反応を抑制する）機能があることが分かった。キシロオリゴ糖には、このような作用は認められなかった。【０１１６】
さらに、回収した細胞をカウントし、１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製後、１ｍｌの細胞懸濁液中にマイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ）を処理し、３７℃で３０分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳの洗浄によりマイトマイシンＣを除去し、常法により調製したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞（５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１ｍｌ添加し、４日間混合培養した。培養後細胞を回収し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのアロ抗原を持つＰ−８１５細胞（５０００ｃｅｌｌｓ／１００μｌ）をターゲットにし、Ｅ：Ｔ比４０：１および８０：１の割合で４時間反応させ、殺傷されたＰ−８１５の数をフローサイトメトリーでカウントすることによりＣＴＬ活性を求めた（図３６）。化合物（I）、（III）、（V）、（VI）、（VII）は乳酸菌と併用することでＣＴＬ活性が増強されることも分かった。【０１１７】
実施例７の結果も、本発明のフコイダン加水分解生成物を乳酸菌と組み合わせることにより、相乗的に増強した免疫機能調節または免疫賦活作用が得られることを示している。
【実施例８】
【０１１８】
免疫機能調節活性をほとんど有さない乳酸菌との併用によるＩＬ−１２産生の相乗的増強
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、雄、日本ＳＬＣ株式会社）に４．０５％チオグリコレート培地（Ｄｉｆｃｏ）を腹腔内投与し、４日後１０ｍｌのＰＢＳを用いて腹腔内に浸潤した細胞を回収した。その後１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製後、２４ｗｅｌｌプレートで培養した。培養開始３時間後、培地交換により浮遊細胞を除去し、マクロファージを得た。各ｗｅｌｌに化合物（I）および実施例３記載のオリゴ糖画分を１００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３０分後、免疫機能調節活性の強い乳酸菌（Lactobacillus pentosus  DS84C株；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００４年５月２６日付けで受領されたＦＥＲＭ  ＡＢＰ-１００２８）、または免疫機能調節活性をほとんど有さない乳酸菌（市販のLactobacillus pentosus（以下乳酸菌Ａ））（市販のLactobacillus plantarum（以下乳酸菌Ｂ））０．１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、２４時間培養した。その後培養上清を回収し、ＩＬ−１２の産生量を測定した（図３７）。比較のため、これら３種類の株をそれぞれ単独で用いて上記と同様の操作を行なった。乳酸菌Ａも乳酸菌Ｂも、それ自身だけでは検出できる程度のＩＬ−１２誘導活性を示さなかったが、これらの株を化合物（I）やオリゴ糖画分と併用することで顕著に増大したＩＬ−１２誘導活性が得られた。したがって本発明で得られるフコダン加水分解生成物は、免疫機能調節活性のない乳酸菌と併用した場合でも、相乗的に強い免疫機能調節作用を発揮することが明らかとなった。
【実施例９】
【０１１９】
乳酸菌以外の物質との相乗効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から脾細胞を分離し、５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製し、２４ｗｅｌｌプレートで培養した。実施例３のＦｒ.Ｃ画分をそれぞれ３０μｇ／ｍｌになるように各ｗｅｌｌに添加した。３０分後に、免疫賦活作用または免疫機能調節作用のある物質として、ＰｏｌｙＩ：Ｃ（ＳＩＧＭＡ）を５μｇ/ｍｌ、ＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ）を２ｎｇ/ｍｌ、ＣｐＧ−ＯＤＮ（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ.から入手）を３μｇ/ｍｌ、ＭＭ４６癌抗原（ＭＭ４６乳癌細胞をＨＡＮＫ’ｓ液（ナカライテスク）中でホモジナイズし、そこから抽出された蛋白質：帝京大学医真菌研究センターにより提供された）を５０ｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ/ｍｌ、ＣｏｎＡ（和光純薬）を０.２５μｇ／ｍｌ、それぞれｗｅｌｌに添加した。２４時間培養後、培養上清を回収しＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図３８）。比較のため、Ｆｒ．Ｃを用いないで上記と同様の操作を行なった。各免疫機能調節物質は今回実験で用いた濃度においてほとんどＩＦＮ-γを誘導しなかった。しかしながら、それらをＦｒ．Ｃ、つまり、フコイダン加水分解生成物（オリゴ糖）と併用することで強いＩＦＮ−γ誘導能が得られた。したがって、フコイダン加水分解生成物およびそれから得られるオリゴ糖は、それを乳酸菌と併用した場合だけでなく、他の免疫賦活素材と併用した場合でも相乗的にそれらの免疫賦活または免疫機能調節作用が高まることが明らかとなった。
【実施例１０】
【０１２０】
ＮＫ活性増強効果（Ｉｎ  ｖｉｖｏ）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）を４群に分けそれぞれフコイダン加水分解生成物単独（実施例３記載の硫酸化糖画分５００ｍｇ/ｋｇ、図３９の「フコイダンオリゴ糖」）、乳酸菌単独（０.２ｍｇ/ｋｇ）、フフコイダン加水分解生成物＋乳酸菌（図３９の「乳酸菌＋フコイダンオリゴ糖」）をそれぞれ飲水中に混ぜ、自由摂取させた。コントロール群には水道水を摂取させた。摂取開始１週間後、マウスから脾細胞を定法にしたがって分離し、Ｙａｃ-１細胞（５０００ｃｅｌｌｓ／１００μｌ）をターゲットにしてＮＫ活性を測定した。ＮＫ活性はＥ：Ｔ比２０:１、４０:１の割合で４時間反応させ、殺傷されたＹａｃ-１の数をフローサイトメトリーでカウントすることにより算出した（図３９）。フコイダンから得られたフコイダンオリゴ糖を摂取することでＮＫ活性が増強した。さらにフコイダンオリゴ糖と乳酸菌を併用することでよりＮＫ活性が高くなった。したがって、フコイダン加水分解生成物と乳酸菌の組み合わせを摂取することで免疫機能が活性化することがin vivoでも確認できた。
【実施例１１】
【０１２１】
フコイダンと乳酸菌の組み合わせによる相乗効果
マウス脾細胞に対するＩＦＮ−γ誘導作用
実施例３と同様に調製した脾細胞５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌにフコイダンＡ（株式会社サウスプロダクト）、フコイダンＢ（株式会社沖縄発酵化学）、フコイダンＣ（実施例１で調製したもの）のそれぞれを、１、１０、１００μｇ／ｍｌとなるようにｗｅｌｌに添加した。フコイダン添加３０分後に乳酸菌（Lactobacillus pentosus；  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１００２８）(死菌)を０.１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加した。２４時間培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した(図４０)。また、フコイダン単独による効果を確認するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作を行った。【０１２２】
３種のフコイダン各々を単独で用いた場合には、ＩＦＮ−γ誘導能が認められた。さらに、その活性は、それらを乳酸菌と併用することで予想以上に強くなった。したがって、フコイダンは、乳酸菌と併用することで相乗的に脾細胞を活性化させ、生体の免疫機能の調節において非常に有用であることが明らかとなった。
【図１】
2007013613.tif 000031
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
2007013613.tif 000036
【図５】
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【図６】
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【図７】
2007013613.tif 000039
【図８】
2007013613.tif 000040
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2007013613.tif 000049
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
2007013613.tif 000072
【図４０】
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【配列表】
2007013613000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月12日(2007.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
加水分解の酸濃度が免疫機能調節活性に及ぼす影響
実施例１で得られたフコイダンを０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、２．０、４．０、５．０、６．０ＮのＨＣｌ（８０℃）で１時間加水分解し、その後それぞれに０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、２．０、４．０、５．０、６．０ＮのＮａＯＨを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコイダン加水分解生成物を得た。これを１００μｇ／ｍｌの濃度でＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から分離した脾細胞（５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に添加した。３０分後に０．１μｇ／ｍｌの乳酸菌（Lactobacillus pentosus;ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）を添加し、２４時間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図２Ａ）。また、フコイダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った（白の棒グラフ）。比較対照として、何も添加していないもの（白の棒グラフ中の“ｎｏｎｅ”）、乳酸菌のみを添加したもの（黒の棒グラフ中の“ｎｏｎｅ”）を用いた。その結果、加水分解して得た生成物を乳酸菌と併用すると、それら単独で得られる結果と比較してＩＦＮ−γ産生が相乗的に増強された。この相乗的効果は、０.５〜４.０ＮのＨＣｌで加水分解して得られた生成物において認められた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
反応温度が及ぼす影響
フコイダンを２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００℃の１ＮのＨＣｌで１時間加水分解し、その後１ＮのＮａＯＨを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコイダン加水分解生成物を得た。これを１００μg／ｍｌの濃度でＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から分離した脾細胞（５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に添加した。３０分後０．１μg/mlの乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭ  ＢＰ-１００２８）を添加し、２４時間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図３Ａ）。また、フコイダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った（白い棒グラフ）。比較対照として、何も添加していないもの（白い棒グラフのｎｏｎｅ）、乳酸菌のみを添加したもの（黒い棒グラフのｎｏｎｅ）を用いた。その結果、ＨＣｌで加水分解して得たフコイダン加水分解生成物を乳酸菌と併用することで、それら単独で得られる結果と比較して相乗的に増強されたＩＦＮ−γ産生が認められた。この相乗的効果は、２５〜１００℃で加水分解して得られた全ての生成物において認められたが、特に、３０〜９０℃（好ましくは５０〜８０℃）で加水分解した場合に優れていた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
反応時間が及ぼす影響
フコイダンを１ＮのＨＣｌ（８０℃）で３０、６０、１２０分間加水分解し、その後１ＮのＮａＯＨを添加することで中和した後、電気透析による脱塩、凍結乾燥を経て、フコイダン加水分解生成物を得た。これを１００μｇ／ｍｌの濃度でＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から分離した脾細胞（５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に添加した。３０分後０．１μｇ／ｍｌの乳酸菌（Lactobacillus pentosus; ＦＥＲＭ  ＢＰ-１００２８）を添加し、２４時間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図４）。また、フコイダン加水分解生成物単独の効果も検討するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作も行った。なお、比較対照として、何も添加していないもの、乳酸菌のみを添加したものを用いた。その結果、３０〜１２０分間加水分解して得られた全ての生成物は、乳酸菌と併用することで、それら単独で得られる結果と比較してＩＦＮ−γ産生が相乗的に増強された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
精製したフコイダン加水分解生成物の免疫機能調節作用
フコイダン１ｇに２ＮＨＣｌを１００ｍｌ加えて８０℃で１時間酸加水分解を行ない、次いで１ＮＮａＯＨで中和した。得られた反応液をゲル濾過（バイオゲルＰ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に供して脱塩し、凍結乾燥を行なうことによりフコイダンオリゴ糖混合物を含む画分を得た（オリゴ糖画分）。得られたフコイダンオリゴ糖混合物は、蟻酸で活性化した陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社）を用いるクロマトグラフィーに供した。その結果、オリゴ糖画分は、水で溶出することで得られた硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（Ｆｒ．Ｂ）と、２ＮＨＣｌで溶出することで得られた硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）に分離された。硫酸化糖画分をゲル濾過（バイオゲルＰ−６）に供し、分子量５００未満のＦｒ．Ａと５００以上のＦｒ．Ｃに分けた。以上のように精製を行ったフコイダン加水分解生成物の各画分をそれぞれ１００μｇ/ｍｌの濃度で、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から分離した脾細胞（５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に添加した。３０分後０．１μｇ／ｍｌの乳酸菌（Lactobacillus pentosus; ＦＥＲＭ  ＢＰ-１００２８）を添加し、２４時間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（表１）。その結果、フコイダンに関は、濃度が低い時に活性を示したが、その濃度を高くすると活性が消失した。一方、加水分解生成物（オリゴ糖各分、Ｆｒ．Ａ〜Ｃ、硫酸化糖各分）の全てにおいて、濃度依存的に免疫賦活能が高まり、かつフコイダンの活性よりも強かった。特に、オリゴ糖を精製することによって活性が強まることも分かった。比較対照として用いた単糖（フコース、硫酸化フコース）やプレバイオティクスとして広く使われているキシロオリゴ糖にもこのような作用が無かった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
フコイダンオリゴ糖化合物と乳酸菌の組み合わせによる相乗効果
マウス脾細胞に対するＩＦＮ−γ誘導作用
実施例３と同様に調製した脾細胞５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌに分子量３４０のフコイダンオリゴ糖（化合物（I））を１００μｇ／ｍｌになるようにｗｅｌｌに添加した。比較対照としてフコースと硫酸化フコース(それぞれＭＷ１６４、２４４)、キシロオリゴ糖（ＸＯＳ）を等量用いた。３０分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭ  ＢＰ-１００２８）（死菌）を０．１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加した。２４時間培養後、培養上清を回収しＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図３２Ａ）。また、糖単独による効果を確認するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作を行なった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
また、同様に調製した脾細胞に、化合物（I）〜（VII）の化合物を任意に３種類均等に混合したものを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３０分後に乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭ  ＢＰ-１００２８）（死菌）を０．１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加した。２４時間培養後、培養上清を回収しＩＦＮ−γの産生量を測定した（図３３）。図に示すとおり、（V）、（VI）および（VII）の混合物、（I）、（V）および（VI）の混合物、および（I）、（V）および（VII）の混合物を用いると、高いＩＦＮ−γ産生量が観測された。したがって、化合物（I）〜（XI）が混在していている場合でも乳酸菌と併用することで免疫機能調節活性が上昇することがわかった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
フコイダンオリゴ糖による、マウス由来樹状細胞に対するＩＬ−１０、１２誘導作用、およびＣＴＬ活性増強作用
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、雄、日本ＳＬＣ株式会社）の大腿骨から骨髄細胞を分離し、１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、１０％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁し、２４ｗｅｌｌプレートで培養した。培養開始３、５日目に培地交換を行ない、付着性の未成熟樹状細胞を得た。得られた樹状細胞に、化合物（I）、（II）、（III）、（V）、（VI）、および（VII）をそれぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度で前処理した。前処理３０分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭ  ＢＰ-１００２８）（死菌）を０．１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加した。２日間培養後、培養上清と細胞を回収した。また、糖化合物単独による効果も確認するため、乳酸菌を添加しないで上記と同様の操作を行なった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
免疫機能調節活性をほとんど有さない乳酸菌との併用によるＩＬ−１２産生の相乗的増強
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、雄、日本ＳＬＣ株式会社）に４．０５％チオグリコレート培地（Ｄｉｆｃｏ）を腹腔内投与し、４日後１０ｍｌのＰＢＳを用いて腹腔内に浸潤した細胞を回収した。その後１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製後、２４ｗｅｌｌプレートで培養した。培養開始３時間後、培地交換により浮遊細胞を除去し、マクロファージを得た。各ｗｅｌｌに化合物（I）および実施例３記載のオリゴ糖画分を１００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３０分後、免疫機能調節活性の強い乳酸菌（Lactobacillus pentosus  DS84C株；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００４年５月２６日付けで受領されたＦＥＲＭ  ＢＰ-１００２８）、または免疫機能調節活性をほとんど有さない乳酸菌（市販のLactobacillus pentosus（以下乳酸菌Ａ））（市販のLactobacillus plantarum（以下乳酸菌Ｂ））０．１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、２４時間培養した。その後培養上清を回収し、ＩＬ−１２の産生量を測定した（図３７）。比較のため、これら３種類の株をそれぞれ単独で用いて上記と同様の操作を行なった。乳酸菌Ａも乳酸菌Ｂも、それ自身だけでは検出できる程度のＩＬ−１２誘導活性を示さなかったが、これらの株を化合物（I）やオリゴ糖画分と併用することで顕著に増大したＩＬ−１２誘導活性が得られた。したがって本発明で得られるフコダン加水分解生成物は、免疫機能調節活性のない乳酸菌と併用した場合でも、相乗的に強い免疫機能調節作用を発揮することが明らかとなった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
フコイダンと乳酸菌の組み合わせによる相乗効果
マウス脾細胞に対するＩＦＮ−γ誘導作用
実施例３と同様に調製した脾細胞５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌにフコイダンＡ（株式会社サウスプロダクト）、フコイダンＢ（株式会社沖縄発酵化学）、フコイダンＣ（実施例１で調製したもの）のそれぞれを、１、１０、１００μｇ／ｍｌとなるようにｗｅｌｌに添加した。フコイダン添加３０分後に乳酸菌（Lactobacillus pentosus；  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）(死菌)を０.１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加した。２４時間培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した(図４０)。また、フコイダン単独による効果を確認するため、乳酸菌を用いずに上記と同様の操作を行った。
【国際調査報告】
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