(57)【要約】  サイトカイン類とは異なる新しいクラスに属する免疫機能調節因子であり、自己免疫疾患をはじめとする様々な免疫関連疾患に対する治療薬としての利用が期待されるガレクチン9は、プロテアーゼに感受性、低溶解性など、治療薬開発において解決すべき問題点があるのでこれを解決する。  ガレクチン-9、特には安定化ガレクチン-9をポリマー（例えば、ポリエチレングリコール: PEG）とコンジュゲーションせしめて得られた化学修飾ガレクチン9では、より優れた溶解性が得られ、体内動態の改善（例えば、血中半減期の延長といった作用持続時間の延長など）、血球凝集活性の抑制などの改善が確認され、医薬として優れた特性を有している。
2008013082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとポリマーとが共有結合を介して結合しているガレクチン9-ポリマーコンジュゲートであることを特徴とする化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
【請求項２】
ポリマーが、ポリアルキレンオキシド又はアルコキシ末端基の付いたポリアルキレンオキシドであることを特徴とする請求項１に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
【請求項３】
ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)又は低級アルコキシ末端基の付いたポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１又は２に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
【請求項４】
ポリマーが、モノメトキシ-ポリエチレングリコール(mPEG)であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
【請求項５】
ポリマーの分子量が、約200〜100,000であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
【請求項６】
ポリマーの分子量が、約5,000〜40,000であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
【請求項７】
mPEG-SPA又はmPEG2-NHSを、ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものと反応させて得られたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
【請求項８】
ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとしてG9NC(null)を使用していることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
【請求項９】
ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとポリマーとが共有結合を介して結合しているガレクチン9-ポリマーコンジュゲートである化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体を含有していることを特徴とする医薬。
【請求項１０】
ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとポリマーとのコンジュゲートの位置異性体混合物を含有していることを特徴とする請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
抗腫瘍剤（抗ガン剤）、抗アレルギー剤、免疫抑制剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の医薬。
【請求項１２】
ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとPEG化試薬とを共有結合が形成されてタンパク質がPEG化される条件下に反応させ、PEG化ガレクチン9コンジュゲートを形成させることを特徴とする化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体の製造法。
【請求項１３】
PEG化試薬が、カルボニルオキシ-N-ジカルボキシイミド体であることを特徴とする請求項１２に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体の製造法。
【請求項１４】
PEG化試薬が、mPEG-SPA又はmPEG2-NHSであることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガレクチン9−ポリマーコンジュゲートに関する。本発明は、化学的に修飾されているガレクチン9及びその改変体(安定化ガレクチン9)に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガレクチンはβ-ガラクトシドに親和性を持ち、一次配列上に保存された領域を持つレクチンファミリーである。現在までに、10種類以上の哺乳類ガレクチンが発見され、細胞-細胞接着又は細胞-細胞外基質接着、細胞活性化、細胞増殖、アポトーシスなど多彩な生物活性が報告されている。
本発明者等のグループはヒトＴ細胞由来好酸球遊走因子のクローニングに成功し、それによりそれが Tureci 等が報告したヒトガレクチン9 (human galectin 9: hGal9、非特許文献１）のバリアント、エカレクチンであることを見出した（非特許文献２）。さらに、本発明者等のグループはエカレクチンとGal9は同一の物質であることを明らかにし、ヒトのGal9はそのリンクペプチドの長さの違いにより、ショートタイプ、メディアムタイプ、ロングタイプの3 種類があることをも明らかにした（非特許文献３）。Gal9含有医薬が、抗腫瘍剤（抗ガン剤）、抗アレルギー剤、免疫抑制剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として有望であることは、WO 2004/064857 (2004.08.05) 〔特許文献１〕に開示してある。Gal9は、活性化T細胞にアポトーシスを誘導することも報告されている。さらに、安定化Gal9（Gal9改変体）及びその用途についてWO 2005/093064 (2005.10.06)〔特許文献２〕に開示を行っている。【０００３】
生物学的に活性なタンパク質をポリマーとコンジュゲート化せしめて、免疫反応が生ずるのを抑制したり、生体内での当該タンパク質の循環寿命を延長させたり、水溶性及び／又は抗原性といった特性を改良しようとする技術は、インスリン、ヘモグロビン、インターフェロン、インターロイキン-2などで適用され、現在も、様々なタンパク質でその研究開発が試みられている。代表的な例は、ペプチド又はポリペプチドをポリエチレングリコール〔poly(ethylene glycol): PEG〕あるいは類似した水溶性ポリマーとカップリングせしめるものである〔特許文献３〕。
しかしながら、多くの生物学的に活性な物質にとっては、コンジュゲート化は、生物活性の著しい低下や喪失を引き起こすこととなり、その問題を解決することは依然として困難な問題と認識されている。薬学的な活性を得るのに必要な活性部位や生物学的な活性に関与する部位が、ポリマーによりブロックされる場合にも、問題が生ずる可能性がある。一般的には、タンパク質をポリマーでコンジュゲート化する反応は、溶液系で行われることから、こうした問題を回避することは、非常に難しいのが現状である。【０００４】
【特許文献１】WO 2004/064857 (2004.08.05)
【特許文献２】WO 2005/093064 (2005.10.06)
【特許文献３】特公昭56-23587号公報
【非特許文献１】Tureci O. et al., J Biol Chem., 1997, 272(10):6416-22
【非特許文献２】Matsumoto R. et al., J Biol Chem., 1998, 273:16976-84
【非特許文献３】Matsushita N. et al., J Biol Chem., 2000, 275:8355-60
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ガレクチン9は、既知のサイトカイン類とは異なる新しいクラスに属する免疫機能調節因子であり、自己免疫疾患をはじめとする様々な免疫関連疾患に対する治療薬としての利用が期待される。しかし、ガレクチン9には、プロテアーゼに対する高感受性、低溶解性など、治療薬開発において解決すべき問題点がある。このような、天然型ガレクチン9自身の性質に基づく問題に対処するため、ガレクチン9のリンカーペプチドを改変し、ガレクチン9の改変体、すなわち、安定化ガレクチン9が作製されている。安定化ガレクチン9は、天然型と比較して以下のような特徴を持つ。
(1)プロテアーゼに対する耐性の上昇、(2)生物活性の上昇、そして(3)溶解性の上昇
ガレクチン9を治療薬として利用するためには、溶解性のより一層の向上、体内動態の改善（例えば、血中半減期の延長といった作用持続時間の延長など）、血球凝集活性の抑制などの改善が求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を進め、バイオコンジュゲーション（Bioconjugation）：人工的に合成・精製した高分子と、ガレクチン9及びその改変体とを結合させ、その高分子に様々な機能（Targeting、徐放化などの機能）を担わせること、そして、高分子の持つ性質を薬物に付与することにつき研究した結果、ガレクチン９、特には安定化ガレクチン９のバイオコンジュゲーションの１つであるPEG化による化学修飾で、ガレクチン９の性能向上に成功し、本発明を完成した。
本発明では、次なる態様が提供される。
〔１〕ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとポリマーとが共有結合を介して結合しているガレクチン9-ポリマーコンジュゲートであることを特徴とする化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
〔２〕ポリマーが、ポリアルキレンオキシド又はアルコキシ末端基の付いたポリアルキレンオキシドであることを特徴とする上記〔１〕に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
〔３〕ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)又は低級アルコキシ末端基の付いたポリエチレングリコールであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
〔４〕ポリマーが、モノメトキシ-ポリエチレングリコール(mPEG)であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
〔５〕ポリマーの分子量が、約200〜100,000であることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれか一に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
〔６〕ポリマーの分子量が、約5,000〜40,000であることを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
〔７〕mPEG-SPA又はmPEG2-NHSを、ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものと反応させて得られたものであることを特徴とする上記〔１〕〜〔６〕のいずれか一に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
〔８〕ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとしてG9NC(null)を使用していることを特徴とする上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体。
〔９〕ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとポリマーとが共有結合を介して結合しているガレクチン9-ポリマーコンジュゲートである化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体を含有していることを特徴とする医薬。
〔10〕ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとポリマーとのコンジュゲートの位置異性体混合物を含有していることを特徴とする上記〔９〕に記載の医薬。
〔11〕抗腫瘍剤（抗ガン剤）、抗アレルギー剤、免疫抑制剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤からなる群から選択されたものであることを特徴とする上記〔９〕又は〔10〕に記載の医薬。
〔12〕ガレクチン9及びガレクチン9改変体からなる群から選択されたものとPEG化試薬とを共有結合が形成されてタンパク質がPEG化される条件下に反応させ、PEG化ガレクチン9コンジュゲートを形成させることを特徴とする化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体の製造法。
〔13〕PEG化試薬が、カルボニルオキシ-N-ジカルボキシイミド体であることを特徴とする上記〔12〕に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体の製造法。
〔14〕PEG化試薬が、mPEG-SPA又はmPEG2-NHSであることを特徴とする上記〔12〕又は〔13〕に記載の化学修飾ガレクチン9又は化学修飾ガレクチン9改変体の製造法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明で得られた化学修飾ガレクチン9又はその改変体、すなわち、ガレクチン9−ポリマーコンジュゲートは、より有用な可溶性と血中消失半減期延長を与え、腫瘍細胞、特には悪性腫瘍細胞に対してより増強された細胞傷害（障害）活性を示し、赤血球凝集作用の消失という副作用の低減が達成できるものであり、優れた生体内分布を図ることも可能と考えられる。したがって、ガレクチン9−ポリマーコンジュゲートは、医薬並びに生理活性物質として有用で且つ優れている。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明では、ガレクチン9−ポリマーコンジュゲートにおけるガレクチン9部分は、「ガレクチン9」 (galectin 9: Gal9)に由来するもので、当該ガレクチン9には、例えば、L型ガレクチン-9(Gal9L)、M型ガレクチン-9(Gal9M)、S型ガレクチン-9(Gal9S)、さらにはそれらのガレクチン9のアミノ酸配列を改変したガレクチン9改変体、例えば、安定化ガレクチン9 (例えば、G9NC(null))などが含まれていてよい。ガレクチン9は、各種の起源から調製又は単離・精製されたものであることができ、例えば、Gal9産生能を有するヒトの白血球や培養株化細胞から産生される天然型ガレクチン9 (native Gal9 or naturally-occurring Gal9)、及び、前記白血球や特定の培養株化細胞由来のGal9をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術により動物細胞や大腸菌などの微生物に組み込んで得られる組換え型ガレクチン9 (recombinant galectin 9: rGal9)などを意味し、その何れも有利に用いることができる。トランスジェニック動物などから得られるものであってもよい。当該トランスジェニック動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジなどが含まれてよい。当該Gal9として、２種以上のガレクチン9混合物を用いることも可能である。当該Gal9は、抗原性の面から見て、ヒトGal9 (hGal9)が有利に使用できる。【０００９】
本明細書中、「ガレクチン9」(galectin 9: Gal9)としては典型的には天然型Gal9が挙げられる。天然型Gal9としては、現在、ロングタイプ（L型）ガレクチン9(galectin 9 long isoform or long type galectin 9: Gal9L)、ミディアムタイプ（M型）ガレクチン9(galectin 9 medium isoform or medium type galectin 9: Gal9M)及びショートタイプ（S型）ガレクチン9(galectin 9 short isoform or short type galectin 9: Gal9S)が報告されているが、Gal9LはWO 02/37114 A1に開示の配列番号4 の推定リンクペプチド領域によりN端ドメイン(N末端側糖鎖認識部位、N-terminal carbohydrate recognition domain: NCRD)とC端ドメイン(C末端側糖鎖認識部位、C-terminal carbohydrate recognition domain: CCRD)とが連結されたもの、Gal9Mは該WO 02/37114 A1の配列番号5の推定リンクペプチド領域によりNCRDとCCRDとが連結されたもの、そしてGal9Sは該WO 02/37114 A1の配列番号6 の推定リンクペプチド領域によりNCRDとCCRDとが連結されたものであると考えられており、Gal9MではGal9Lの当該リンクペプチド領域より該WO 02/37114 A1の配列番号7の配列のアミノ酸残基が欠失している点でGal9Lと異なること、そしてGal9SではGal9Mの当該リンクペプチド領域より該WO 02/37114 A1の配列番号8の配列のアミノ酸残基が欠失している点でGal9Mと異なること、すなわちGal9SではGal9L推定リンクペプチド領域より該WO 02/37114 A1の配列番号9 のアミノ酸残基が欠失している点でL 型ガレクチン9と異なる。ところで、Gal9Lのアミノ酸配列は、WO 02/37114 A1に開示の配列番号１に、Gal9Mのアミノ酸配列は、WO 02/37114 A1に開示の配列番号２に、そしてGal9Sのアミノ酸配列は、WO 02/37114 A1に開示の配列番号３に、それぞれその典型的な配列のものが示されている。【００１０】
本明細書において、ガレクチン9としては、上記Gal9L、Gal9M及びGal9S、その他、それらガレクチン9ファミリーの天然に生ずる変異体、さらにそれらに人工的な変異（すなわち、一個または数個といった一個以上のアミノ酸残基において、欠失、付加、修飾、挿入など）を施したものあるいはそれらの一部のドメインや一部のペプチドフラグメントを含むものを意味してよい。WO 2004/064857 (2004.08.05)、J. Biol. Chem., 275 (12): pp. 8355-8360 (2000)に開示のものはすべて含まれてよい。当該ガレクチン9には、天然のガレクチン9バリアント、さらにPCT/JP 2005/006580 (出願日2005.03.29)に開示の「ガレクチン9改変体」、「ガレクチン9改変体ポリペプチド」、さらには「ガレクチン9改変体治療剤」はすべて含まれてよい。特に好ましいものとしては、PCT/JP 2005/006580 (出願日2005.03.29)の実施例１で製造取得されているG9NC(null)〔PCT/JP 2005/006580(出願日2005.03.29)の配列番号1で示される塩基配列によりコードされ、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〕が挙げられる。「ガレクチン9改変体」又は「ガレクチン9改変体ポリペプチド」のうちには、天然型ガレクチン9に比して、より安定化された性状を示すものが得られることが認識されており、そうしたものは本明細書において、「安定化ガレクチン9」と称されてもいる。該安定化ガレクチン9の代表的なものとしては、上記したG9NC(null)が挙げられるが、これに限定されるものではなく、同様な性状を示すものはそれに含まれてよい。
本発明の治療及び／又は予防剤並びにその治療及び／又は予防法は、WO 2004/064857 (2004.08.05)や、PCT/JP 2005/006580 (出願日2005.03.29)の開示に準じてそれを実施でき、それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】mPEG2-NHS分子量20,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9〔mPEG2-NHS(20K)PEG化G9NC(null)〕についての、RESOURCE Sカラム（GEヘルスケア バイオサイエンス(株)）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにおける蛋白質の溶出パターンと各画分のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。実線は280 nmにおける吸光度、破線は電気伝導度。
【図２】PEG化ガレクチン9改変体(PEG化安定化ガレクチン9)のヒト前立腺ガン由来細胞株PC-3に対する増殖抑制活性を調べた結果を示す。G9Null: G9NC(null), G9Null-PEG-5K-SE2: mPEG-SPA分子量5,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE2画分, G9Null-PEG-10K-SE2: mPEG2-NHS分子量10,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE2画分
【図３】PEG化ガレクチン9改変体(PEG化安定化ガレクチン9)のヒト前立腺ガン由来細胞株PC-3に対する増殖抑制活性を調べた結果を示す。G9Null: G9NC(null), G9Null-PEG-20K-SE2: mPEG2-NHS分子量20,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE2画分, G9Null-PEG-40K-SE2: mPEG2-NHS分子量40,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE2画分
【図４】PEG化ガレクチン9改変体(PEG化安定化ガレクチン9)のヒト前立腺ガン由来細胞株PC-3に対する増殖抑制活性を調べた結果を示す。G9Null-PEG-5K-SE2: mPEG-SPA分子量5,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE2画分, G9Null-PEG-5K-SE1: mPEG-SPA分子量5,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE1画分, G9Null-PEG-10K-SE2: mPEG2-NHS分子量10,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE2画分, G9Null-PEG-10K-SE1: mPEG2-NHS分子量10,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE1画分
【図５】PEG化ガレクチン9改変体(PEG化安定化ガレクチン9)のヒト前立腺ガン由来細胞株PC-3に対する増殖抑制活性を調べた結果を示す。G9Null-PEG-20K-SE2: mPEG2-NHS分子量20,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE2画分, G9Null-PEG-20K-SE1: mPEG2-NHS分子量20,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE1画分, G9Null-PEG-40K-SE2: mPEG2-NHS分子量40,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE2画分, G9Null-PEG-40K-SE2: mPEG2-NHS分子量40,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9(G9NC(null))のSE1画分
【図６】PEG化安定化ガレクチン9のウサギ赤血球およびヒト赤血球に対する血球凝集活性を測定した結果を示す。
【図７】PEG化安定化ガレクチン9のラットCIAモデルに対する治療活性を調べた結果を示す。
【００１２】
本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用して所定の核酸（ポリヌクレオチド）や所定のペプチド（ポリペプチド）を構築したり取得すること、また単離・配列決定したり、組換え体を作製したりできる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術（組換えDNA技術を含む)としては、当該分野で知られたものが挙げられ、例えば J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition (1989) & 3rd edition (2001) ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人 (1992); M. J. Gait (Ed), Oligonucleotide Synthesis, IRL Press （1984); B. D. Hames and S. J. Higgins (Ed), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press Ltd., Oxford, UK (1985); B. D.Hames and S. J. Higgins (Ed), Transcription and Translation: A Practical Approach (Practical Approach Series), IRL Press Ltd., Oxford, UK (1984); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (2nd Edition), John Wiley & Sons, New York (1988); J. H. Miller and M. P. Calos (Ed), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1987); R. J. Mayer and J. H. Walker (Ed), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, (1987); R. K. Scopes et al. (Ed), Protein Purification: Principles and Practice (2nd Edition, 1987 & 3rd Edition, 1993), Springer-Verlag、N.Y.; D. M. Weir and C. C. Blackwell (Ed), Handbook of Experimental Immunology, Vol.1, 2, 3 and 4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, (1986); L. A. Herzenberg et al. (Ed), Weir's Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1, 2, 3 and 4, Blackwell Science Ltd. (1997); R. W. Ellis (Ed), Vaccines new approaches to immunological problems, Butterworth-Heinemann, London (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101(Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York (1993); S. Weissman (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York (1999); Jeremy Thorner et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 326 to 328, Academic Press, New York (2000); David R. Engelke et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 392, Academic Press, New York (2005)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる (それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 〔以下、これら全てを「遺伝子組換え技術」という）。【００１３】
本発明のガレクチン9ポリペプチド、あるいはガレクチン9改変体ポリペプチドを製造するためには広範な単細胞および多細胞発現系（すなわち宿主−発現ベクターの組み合わせ）を使用しうる。可能なタイプの宿主細胞には細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、植物などが含まれるが、これらに限定されない。大腸菌の場合、例えば大腸菌K12株あるいはB株に由来するものなどを挙げることができ、例えば、NM533, XL1-Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5α, DH10B, HB101, MC1061, JM109, STBL2, B834株由来としては、BL21(DE3)pLysSなどが挙げられ、それに適した発現ベクターを選択して使用できる。酵母菌として、パン酵母、分裂酵母などが含まれてよく、例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、ピキア(Pichia)属菌などである。より具体的には、サッカロミセス・セレビッシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などを挙げることができ、それに適した発現ベクターを選択して使用できる。代表的な発現ベクターとしては、例えば、pBR322、pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pGEMEX-1(Promega), pBC KS (Stratagene), pBC SK (Stratagene), pBluescriptTM SK (Stratagene), pBluescriptTM II SK (Stratagene社), pBluescriptTM II KS (Stratagene), pBS (Stratagene), pAS, pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech), pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B (Invitrogen), pSE280(Invitrogen), pBTrp2(Boehringer Mannheim), pBTac1(Boehringer Mannheim), pBTac2(Roche社), pGEX(Amersham Biosciences), pQE series(QIAGEN), pET Expression System (Novagen), YEP13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15、さらには、invitrogen vectors for Mammalian Expression (例えば、BsdCassetteTM Vectors, Epitope-Tagged pcDNATM Vectors, Eukaryotic TA Expression Kit, Flp-InTM Expression Vectors and Kits, Flp-InTM T-RExTM Expression Vectors, FreeStyleTM 293 Expression System, GeneSwitchTM System, pBC1 Milk Expression Vector Kit, pBudCE4.1, pcDNATM GatewayTM Vectors, pcDNATM3.1 Directional TOPOTM Expression Kit, pcDNATM3.1-E EchoTM Expression Vector Kit, pcDNATM3.1/V5-His TOPOTM Expression Kit, pcDNATM4/HisMax and pcDNATM4/HisMax TOPOTM TA Expression Kit, pcDNATM4/TO-E EchoTM Vector Expression Kit, pcDNATM6 BioEaseTM GatewayTM Biotinylation System, pcDNA/V5-GW/D-TOPOTM Vectors, pCEP4 and pREP4, pDisplayTM Vector, pEF6/V5-His TOPOTM TA Expression Kit, pFRT/lacZeo and pFRT/lacZeo2, pSecTag2 and pSecTag2/Hygro, pShooterTM Vectors, pVAXTM200-DEST Vector System, pVAX1, pZeoSV2, T-RExTM GatewayTM Vectors, T-RExTM System, Tag-On-DemandTM Technology, Untagged pcDNATM Vectors, Vivid ColorsTM pcDNATM 6.2 Fluorescent Protein GatewayTM Destination Vectors, ZeoCassetteTM Vectorsなど), Clontech vectors (例えば、Adenoviral Expression Vectors, CreatorTM System Vectors, IRES Bicistronic Expression Vectors, Living ColorsTM Fluorescent Protein Vectors, MATCHMARJER Vectors, Retroviral Expression Vectors, Signal Transduction Vectors, Tet Expression System Vectors, BacPak Baculovirus Expression Vectors, HAT Protein Expression System Vectorsなど), HaloTagTM pHT2 Vector, pACT Vectors, pBIND Vectors, pCATTM3 Vectors, pCI Vectors, phRG Vectors, phRL Vectors (Promega Corp.), Novagen vectors for protein expression (例えば、pTriEXTM Multisystem Expression Vectors, pBiEXTM Multisystem Expression Vectors, pTandemTM-1 Vector, pTK-neo DNAなど)などが挙げられるが、その他当該分野で知られていたり、市販されているものも適宜選択して使用できる。【００１４】
細胞(培養細胞を含む)、培養上清、あるいは抽出液中に含まれる目的生成物は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせてその精製を行なうことができ、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティー・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ることができる。好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、リガンドなどを固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。該リガンドとしては、特異的認識をするモノクローナル抗体を含めた抗体又はそのフラグメント、レクチン、糖、結合ペアーの一方などが挙げられる。例えば、イムノ・アフィニティー・クロマトグラフィー、ゼラチン−アガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマトグラフィー、ラクトース−アガロース・クロマトグラフィーなどを含めたβ-ガラクトシドがリガンドとして固定されているアガロースなどの担体を使用するクロマトグラフィーなどが挙げられる。特には遺伝子組換え技術を利用し、融合タンパク質あるいは融合ポリペプチドとして産生せしめ、融合部（タグ）を利用して、それに対する抗体などの特異的結合リガンドを利用して、アフィニティー・クロマトグラフィーなどで簡便に精製できる。【００１５】
ガレクチン9、及びその改変体は、化学合成されたものであってよい。例えば、タンパク質及びその一部のペプチドの合成には、当該ペプチド合成分野で知られた方法、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。こうした方法では、例えばタンパク質あるいはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、それ自体公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくはそれ自体公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。同様に、ガレクチン9、及びその改変体からなる群から選択されたものをコードする核酸は、化学合成されたものであってよい。例えば、フォスフォトリエステル法、フォスフォジエステル法、フォスファイト法、フォスフォアミダイト法、フォスフォネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られており、例えば、自動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は市販されている。ガレクチン9、及びその改変体からなる群から選択されたものをコードする核酸の配列内には、例えば、選択した宿主細胞で好適に発現するに適した修飾されたコドン（例えば、コドンの置換）を含むようにしてあってよいし、制限酵素部位が設けられていても良いし、目的とする遺伝子の発現を容易にするための発現制御配列、調節配列など、目的とする遺伝子を操作するのに適した、リンカー、アダプターなど、さらには抗生物質耐性などを制御したり、栄養要求性・代謝を制御したり、選別・検知などに有用な配列などを含む、便利又は有用な修飾が施されていても良い。本発明のコンジュゲートのためのガレクチン9の調製法は本明細書で記載されたものに限定されない。【００１６】
本発明で、ガレクチン9−ポリマーコンジュゲートにおけるポリマー部分は、「水溶性ポリマー」に由来するもので、当該ポリマー部分を与えるポリマーとしては、例えば、ポリアルキレンオキシド、リン脂質ポリマー、ポリビニルピロリドン、デキストランなどの多糖類などが挙げられる。ポリマーとしては、室温で水溶性のものが広く知られており、それから選択できるが、例えば、代表的なものとしては、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、これらのコポリマー、及びこれらのブロックコポリマーなどが挙げられる。ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールなどが包含されてよい。PEGコポリマーとしては、分岐されていないもの、例えば、直鎖状のものを好ましく使用することができ、また、置換されていないものが好適であるが、その一つの末端がアルキル基で置換されているものも好適である。当該末端に存在するアルキル基としては、C1〜C5アルキル基であってよく、好適にはC1〜C3アルキル基であってよく、さらにはメチル基が好ましい。
ポリオキシエチレン化ポリオールとしては、ポリオキシエチレン化グリセロール、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコースなどが包含されてよい。ポリオキシエチレン化グリセロールにおけるポリオキシエチレン化(PEG化: PEGylation)は、例えば、モノPEG化、ジPEG化、及びトリPEG化を包含するものであってよい。
好ましいポリマーとしては、非置換のPEGホモポリマー、末端にモノメチル置換されているPEGホモポリマー（メトキシポリエチレングリコール: mPEG）、PEG化グリセロールなどが挙げられ、最も好ましくはmPEGが挙げられる。
ポリマーは所定の目的が得られる限りある特定の分子量を有するものに制限されるということはないが、代表的には数平均分子量が約200〜100,000のものを通常選択することができ、約500〜90,000のもの、約1,000〜80,000のもの、約2,000〜70,000のもの、約3,000〜60,000のもの、約4,000〜50,000のもの、約4,500〜45,000のもの、約5,000〜40,000のものを選択できる。また、ポリマーは、mPEGの場合、例えば、数平均分子量が約2,500〜7,500のもの、さらには約4,000〜6,000のもの、別の場合では、約8,000〜15,000のもの、さらには約9,000〜12,000のもの、さらに別の目的の場合では、約15,000〜25,000のもの、さらには約18,000〜22,000のもの、さらに別の例では、約25,000〜50,000のもの、さらには約30,000〜45,000のものを選択できる。【００１７】
当該ポリマー部分とタンパク質であるガレクチン9との間は直接の共有結合を介したもの、あるいはカップリング剤あるいはリンカーに由来するもの、又は、ガレクチン9−ポリマー間の相互関係を適切にするためのものである、スペーサー(又はスペーサーアーム)を介したものであってよく、当該スペーサーとしては、該ポリマー部分とガレクチン9部分間に共有結合が存在して連結しているようにしているものが挙げられる。該ポリマー部分とガレクチン9部分間の結合には、炭素−炭素間結合、炭素−酸素間結合、炭素−硫黄間結合、炭素−窒素間結合、及び硫黄−硫黄間結合などからなる群から選択されたものが含まれていてよく、例えば、エステル結合(-CO-O-)、チオエステル結合、アミド結合(-NH-CO-)、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合(-S-S-)、ウレタン結合(-O-CO-NH-)などからなる群から選択されたものを有しているものであることができる。
mPEGなどのポリマーとガレクチン9とを結合せしめてコンジュゲートを形成するためには、通常は、ポリマーの水酸基の一つ（例えば、mPEGなどでは末端の水酸基の一つ）は、コンジュゲーションが可能となるように反応性の官能基に変えられる。この変換工程は、多くの場合、活性化と称される。そして、当該活性化処理して得られた生成物は、活性化ポリマーあるいは官能基化されたポリマーといわれる。別の手法では、ポリマーの水酸基の一つ（例えば、mPEGなどでは末端の水酸基の一つ）は、アミノ基あるいはスルフヒドリ基(HS-基)に置き換えられた後、活性化処理に付されて、対応する活性化ポリマーとされていてよい。また、活性化されたPEGは、当該分野では、PEG化剤又はPEG化試薬といわれる。【００１８】
タンパク質に存在するリジン残基のε-アミノ基やN末端アミノ基といった窒素原子の所で活性化されたポリマーに対する結合が起こるようにするためには、当該タンパク質窒素原子部と反応する基、すなわち、ポリマー側の活性化されている基(官能基)としては、好適にはスクシンイミジルオキシカルボニル基などの末端カルボニルオキシ-N-ジカルボキシイミド基などが好適に使用される。該N-ジカルボキシイミド基としては、N-スクシンイミド基、N-フタルイミド基、N-グルタルイミド基、N-テトラヒドロフタルイミド基、N-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基などが包含されてよいが、N-スクシンイミド基を好適に使用できる。該末端カルボニルオキシ-N-ジカルボキシイミド基を形成するには、様々な手法が知られているが、例えば、カルボニルハロゲン化物又はカルボニルオキシスルホニル化合物と、N-ヒドロキシスクシンイミドなどのN-ヒドロキシジカルボキシイミドとを反応させるなどの手法により得られる。N-ヒドロキシジカルボキシイミドとしては、N-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシフタルイミド、N-ヒドロキシグルタルイミド、N-ヒドロキシテトラヒドロフタルイミド、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドなどが挙げられる。【００１９】
上記したタンパク質窒素原子部と反応するポリマー側の活性化されている基(官能基)（例えば、末端カルボニルオキシ-N-ジカルボキシイミド基）とポリマーの主要骨格（例えば、ポリマーがPEGやmPEGなどの場合〔-CH2-CH2-O-〕の繰返し構造部分あるいは〔-CH2-CH2-O-〕の繰返し構造部に隣接して存在する末端部の〔-CH2-CH2-NH-〕部）との間には、例えば、上記カルボニルハロゲン化物又はカルボニルオキシスルホニル化合物などに存在する当該活性化されたカルボン酸残基部を与えるように、該ポリマーはカップリング剤で処理されていたり、あるいは当該カップリング剤での処理に便利なように及び／又はガレクチン9−ポリマー間の相互関係を適切にするために修飾されていてよく、そして、それに由来するスペーサー部が存在していてよい。ポリマーの主要骨格とガレクチン9との間に存在するものは、スペーサー又はスペーサーアームと称することができ、当該スペーサーは、窒素原子、酸素原子、硫黄原子などを有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素基であってよく、それは直鎖状あるいは分岐鎖状のいずれであってもよく、二価の結合手を提供するもの、三価の結合手を提供するもの、あるいはそれ以上の結合手を提供するものなどが挙げられる。スペーサーは、タンパク質修飾の分野で当業者に知られたものあるいはそれの修飾誘導体などから選択してよく、適宜適切なものを選択できる。典型的なスペーサーは、メチレン鎖の連結したものなど、リジンなどのアミノ酸から誘導されたもの、ジペプチドなどのオリゴペプチドから誘導されたもの、無水コハク酸、無水グルタル酸などの二官能性カルボン酸無水物などから誘導されたもの、ヒドロキシ酪酸などのヒドロキシカルボン酸から誘導されたものなどが挙げられ、例えば、-O-CH2CH2-CO-、-O-CH2-CH(CH3)-CO-、(-NH-CO-O-CH2)2CH-、-O-CH2-CO-、-O-CO-NH-CH2-CH2-CO-、-O-CO-NH-CH2-CH(CH3)-CO-、-O-CO-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(CO-)-CO-、-NH-CO-O-CH2CH2-CO-、-NH-CO-O-CH2-CH(CH3)-CO-、(-NH-CO-O-CH2)2CH-O-CH2CH2CH2-CO-、-O-CH2-CH2-NH-CO-O-CH2CH2-CO-、(-O-CH2-CH2-NH-CO-O-CH2)2CH-O-CH2CH2CH2-CO-など（ここで、ポリマー側に存在する-O-あるいは-NH-は、理解を容易にするため表示されている）が挙げられる。【００２０】
カップリング剤としては、当該分野で知られたもの、特にはタンパク質修飾に利用することが知られたものなどが挙げられ、リンカーとして知られたものも包含されてよく、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、N,N'-ポリメチレンビスヨードアセトアミド、N,N'-エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ）プロピオネート(SPDP)、N-スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)、N-スルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート、N-スクシンイミジル (4-ヨードアセチル）アミノベンゾエート、N-スクシンイミジル 4-(1- マレイミドフェニル）ブチレート、 N-(ε-マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド(EMCS), イミノチオラン、S-アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル-3-(4'-ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル-4-メルカプトブチリルイミデート、メチル-3-メルカプトプロピオンイミデート、N-スクシンイミジル-S-アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
PEG化剤又はPEG化試薬としては、各種のものが当該分野で知られており、それらの中から選択して使用できるが、市販のものを使用するのが便利であり、例えば、NEKTAR, San Carlos, CA, USAなどから入手できるものを使用できる。該市販のPEG化試薬としては、例えば、mPEG-スクシンイミジルプロピオネート(mPEG-SPA)、分岐型PEG N-ヒドロキシスクシンイミド(mPEG2-NHS)などを挙げることができるが、それに限定されるものではない。代表的なPEG化試薬につき、その化学構造のいくつかを次に示す。【００２１】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【００２２】
ガレクチン9をポリマーと結合せしめる、すなわち、コンジュゲートを形成する反応は、コンジュゲーション又はコンジュゲート化（又はコンジュゲーション反応）と称される。そして、ポリマーがPEGの場合、このコンジュゲーションはPEG化(PEGylation)又はPEG化反応と呼ばれる。一般的には、本反応は水性溶媒中で行うことができるが、水性環境中担体に付着させた状態で行うこともできる。当該担体としては、タンパク質の単離精製において使用されるものの中から適当なものを適宜選択して使用できるが、例えば、アフィニティー・クロマトグラフィー用担体の中から選択して使用できる。代表的な担体としては、糖鎖などのリガンドを有している担体などが挙げられ、例えば、ラクトースアガロースなどβ-ガラクトシドがリガンドとして固定されているアガロースなどの担体が挙げられる。
本発明のコンジュゲーション反応では、好ましくは、ガレクチン9の生物活性に重要な部位のリジン残基に存在するアミノ基を修飾することを避けるようにして行うことを包含している。また、ガレクチン9の生理活性に重要な部位のリジン残基に存在するアミノ基を修飾することを避けるようにして行うことを包含しているものであってよいし、それが好ましい場合がある。【００２３】
本コンジュゲーションは、ガレクチン9改変体〔本明細書では、安定化されたヒトガレクチン9であることから、「安定化ガレクチン9」と称されることもあるが、代表的なものは、WO2005/093064(公開日:2005年10月06日)に開示されているもので、具体例としては、WO2005/093064(公開日:2005年10月06日)の配列表の配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するもので、G9NC(null)と略記されるものが挙げられる〕に関しては、６個のリジン残基〔WO2005/093064(公開日:2005年10月06日)の配列表の配列番号2で示されるアミノ酸配列における、Lys88, Lys95, Lys111, Lys180, Lys238, そしてLys259〕並びにN-末端のアミノ基において生起する可能性があり、M型ガレクチン9(Gal9M)についても、同様、６個のリジン残基〔WO 02/037114(公開日:2002年5月10日)の配列表の配列番号2で示されるアミノ酸配列における、Lys88, Lys95, Lys111, Lys207, Lys265, そしてLys286〕並びにN-末端のアミノ基において、及びS型ガレクチン9(Gal9S)についても、同様、６個のリジン残基〔WO 02/037114(公開日:2002年5月10日)の配列表の配列番号3で示されるアミノ酸配列における、Lys88, Lys95, Lys111, Lys195, Lys253, そしてLys274〕並びにN-末端のアミノ基において生起する可能性があり、さらに、L型ガレクチン9(Gal9L)に関しては、７個のリジン残基〔WO 02/037114(公開日:2002年5月10日)の配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列における、Lys88, Lys95, Lys111, Lys180, Lys239, Lys297, そしてLys318〕並びにN-末端のアミノ基において生起する可能性があり、例えば、該リジン残基の１カ所にPEG分子が結合した分子種（及びそれらの位置異性体を含んでよい)、該リジン残基の２カ所にPEG分子が結合した分子種（及びそれらの位置異性体を含んでよい)、該リジン残基の３カ所にPEG分子が結合した分子種（及びそれらの位置異性体を含んでよい)、該リジン残基の４カ所にPEG分子が結合した分子種（及びそれらの位置異性体を含んでよい)などを得ることが可能である。好ましい場合には、該リジン残基の１カ所にPEG分子が結合した分子種、あるいは該リジン残基の２カ所にPEG分子が結合した分子種であってよい。【００２４】
本コンジュゲーションでは、ガレクチン9に対してPEG化試薬などの活性化ポリマーは、その使用量に特には制限は無いが、所要の修飾物、すなわち、コンジュゲートを得るように選択できる。例えば、典型的な場合では、ガレクチン9に対してPEG化試薬は、比較的わずかに少ないモル量から比較的わずかに過剰なモル量までの範囲で使用されることができる。ある場合には、ガレクチン9に対してPEG化試薬は約0.8〜８倍のモル過剰量使用できるし、約１〜８倍のモル過剰量使用できるし、別の場合では、ガレクチン9に対してPEG化試薬は約1.25〜７倍のモル過剰量使用できるし、約1.75〜６倍のモル過剰量使用できる。反応温度は、特には制限はないが、通常、０〜50℃で行うことができるが、好ましくは、約４〜40℃で行うことができ、典型的な場合約４℃あるいは室温付近で行うことができ、また、15〜25℃で行うことができる。反応時間は、比較的短時間でよく、例えば、30分間〜３時間、ある場合には、約１〜２時間であるが、これには限定されない。反応は所定時間進行させた後、停止させることが可能であり、ある場合には好ましい。本反応における水性媒体中のpHは、約7.0〜約9.0、好ましくは約7.5〜約8.5であり、好ましくは緩衝溶液中で行われる。当該緩衝溶液には、リン酸イオン、塩素イオン、重炭酸イオン、炭酸イオンなどから選択されたものが含まれていてよく、例えば、NaCl, KCl, Na3PO4, K3PO4, Na2HPO4, K2HPO4, (NH4)2HPO4, NaH2PO4, KH2PO4, Na2CO3, K2CO3, NaHCO3, KHCO3, NH4Cl, (NH4)2CO3, などから選択された塩などを含有している水溶液などが好適に使用される。好ましい緩衝液系としては、Na2HPO4-NaH2PO4系を利用したものが挙げられる。反応終了後は、別の緩衝液系に交換することができるし、透析、ゲルろ過及び／又はイオン交換クロマトグラフィー、さらにはアフィニティー・クロマトグラフィーなどにより、共存するイオンを変えることも可能である。【００２５】
本コンジュゲーションではガレクチン9分子上の異なる部位に結合したポリマー鎖を含んでいるといった不均一な混合物として反応生成物溶液を得たものであってよい。これらコンジュゲートを含有する溶液はそれをそのまま使用しても有用であるが、分子量、あるいは、ガレクチン9分子上のポリマー鎖結合位置の違いなどに基いてコンジュゲートを分離・精製処理にかけることも好ましい。本コンジュゲーションで得られた反応混合物中のガレクチン9-ポリマーコンジュゲートの特性をカチオン交換クロマトグラフィーにより行うことができ、例えば、ポリマー鎖がガレクチン9分子上の１カ所に結合したもの、また、異なる部位に結合したもの、さらには、ポリマー鎖がガレクチン9分子上の２カ所に結合したもの、それの互いに異なる部位に結合したもの、例えば、位置異性体などを同定することが含まれてよい。本発明においては、ガレクチン9-ポリマーコンジュゲートの位置異性体を含有する混合物、及び／又は、ポリマー鎖のガレクチン9分子上の結合数の違う分子種が混ざった混合物、のいずれも、それを利用することが可能である。コンジュゲートを含有する溶液のいずれも、少なくとも２種の位置異性体を含有する混合物の形態のもの、ある場合には、３種の位置異性体を含有する混合物の形態のもの、さらには４種以上の位置異性体を含有する混合物の形態のものであってもよい。【００２６】
本コンジュゲーションで得られた反応生成溶液中に含まれる目的生成物は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせてその精製を行なうことができ、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミノエチル基、カルボキシメチル基、-SO3-基などを持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティー・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ることができる。好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、リガンドなどを固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。該リガンドとしては、特異的認識をするモノクローナル抗体を含めた抗体又はそのフラグメント、レクチン、糖、結合ペアーの一方などが挙げられる。例えば、イムノ・アフィニティー・クロマトグラフィー、ゼラチン−アガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマトグラフィー、ラクトース−アガロース・クロマトグラフィーなどを含めたβ-ガラクトシドがリガンドとして固定されているアガロースなどの担体を使用するクロマトグラフィーなどが挙げられる。好適には、強酸性カチオン交換樹脂、強酸性カチオン交換ゲルなどを使用するイオン交換クロマトグラフィーなどにより、所望の画分に分けることもできる。分子のサイズに基いた分離も可能なゲルろ過クロマトグラフィーを利用するのが有効な場合もあり、さらにアニオン交換クロマトグラフィーなどを利用しても有効な場合がある。担体からの目的コンジュゲートの溶離には、濃度勾配を利用することも可能である。溶離は、好ましくは水性媒体を使用するが、例えば、緩衝溶液が好適に使用できる。当該緩衝溶液には、リン酸イオン、塩素イオン、重炭酸イオン、炭酸イオンなどから選択されたものが含まれていてよく、例えば、NaCl, KCl, Na3PO4, K3PO4, Na2HPO4, K2HPO4, (NH4)2HPO4, NaH2PO4, KH2PO4, Na2CO3, K2CO3, NaHCO3, KHCO3, NH4Cl, (NH4)2CO3, などから選択された塩などを含有している水溶液などが好適に使用される。好ましい緩衝液系としては、Na2HPO4-NaH2PO4系を利用したものが挙げられる。本分画処理における水性媒体中のpHは、生成物に悪影響を及ぼさない限り特には制限はないが、通常、約5.0〜約10.0、好ましくは約6.0〜約9.0、より好ましくは約7.0〜約8.0である。溶離の場合の操作温度は、特には制限はないが、通常、０〜37℃で行うことができるが、好ましくは、約４〜30℃で行うことができ、典型的な場合約４℃あるいは室温付近で行うことができ、また、約４〜25℃で行うことができる。【００２７】
典型的な場合、カチオン交換ゲルを充填したカラムを常法にてコンジュゲーションしたガレクチン9溶液とそのpHや塩濃度などが同一の緩衝水溶液を使用して平衡化せしめ、次いで、コンジュゲートを含有する溶液をカラムに吸着せしめる。適宜必要により、コンジュゲーションしたガレクチン9溶液とそのpHや塩濃度などが同一の緩衝水溶液をカラムに流し、未吸着成分を溶出させる。次に、塩濃度を次第に増加させる勾配を与える溶離緩衝液をカラムに流し、溶出液を分画毎に分けて集める。分離精製により、得られた分画において本質的に均一な分子量並びに置換度のガレクチン9-ポリマーコンジュゲートのものとすることもできる。好適なガレクチン9-ポリマーコンジュゲート分画としては、ガレクチン9分子あたり１〜６本のポリマー鎖〔例えば、PEG化試薬にmPEG2-NHSを使用した場合、ガレクチン9上のアミノ酸残基にあるアミノ基の一つに結合した場合（１置換の結合）で、ポリマー鎖であるmPEGは、２本導入されたことになる〕を有するガレクチン9コンジュゲート分子を含むものであってよいし、ある場合には、当該分画は、ガレクチン9分子あたり１〜４本のポリマー鎖を有するガレクチン9コンジュゲート分子を含むものであってよいし、さらには、ガレクチン9分子あたり１〜２本のポリマー鎖を有するガレクチン9コンジュゲート分子を含むものであってよいし、また、ガレクチン9分子あたり１本のポリマー鎖を有するガレクチン9コンジュゲート分子を含むものであってよい。【００２８】
本発明で得られるガレクチン9-ポリマーコンジュゲートは、活性成分として医薬に有利に使用できる。該活性成分として使用する場合、ガレクチン9-ポリマーコンジュゲートは、単独の分子形態にまで分離精製されたものであってもよいし、本質的に均一な分子量並びに置換度のガレクチン9-ポリマーコンジュゲートを含有する分画、さらには、治療上均一とされる複数のガレクチン9-ポリマーコンジュゲート分子種を含有する混合物の形態のいずれであってもよく、適宜、目的並びに作用効果を勘案して選択使用できる。
本発明の活性成分を医薬として用いる場合、通常単独或いは薬理的に許容される各種製剤補助剤と混合して、医薬組成物又は医薬調製物などとして投与することができる。好ましくは、経口投与、局所投与、または非経口投与等の使用に適した製剤調製物の形態で投与され、目的に応じていずれの投与形態（吸入法、あるいは直腸投与も包含される）によってもよい。本発明の活性成分はそれぞれを混合物として、例えば、ガレクチン9-ポリマーコンジュゲートとネイティブなガレクチン9との混合物、ガレクチン9-ポリマーコンジュゲートとガレクチン-9改変体との混合物、ガレクチン9-ポリマーコンジュゲートとガレクチン9誘導因子との混合物、ガレクチン9-ポリマーコンジュゲートとガレクチン9とガレクチン9誘導因子との混合物、ネイティブなガレクチン9とガレクチン9-ポリマーコンジュゲートとガレクチン-9改変体との混合物などにして、それを使用してもよい。
また、本発明の活性成分は、各種医薬、例えば抗腫瘍剤（抗ガン剤）、抗生物質、腫瘍移転阻害剤、血栓形成阻害剤、関節破壊治療剤、鎮痛剤、消炎剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤及び／又は免疫抑制剤と配合して使用することもでき、それらは、有利な働きを持つものであれば制限なく使用でき、例えば当該分野で知られたものの中から選択することができる。【００２９】
好ましくはヒトを含む哺乳動物に非経口的（例、細胞内、組織内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内、点滴法、注腸、経直腸、点耳、点眼や点鼻、歯、皮膚や粘膜への塗布など）に投与することができる。具体的な製剤調製物の形態としては、溶液製剤、分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、成型製剤、浸出製剤などが挙げられ、例えば、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョン剤、灌注剤、水剤、乳剤、懸濁剤、エアゾール剤、スプレー剤、吸入剤、噴霧剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、塗布剤、輸液剤、注射用液剤などのための粉末剤、凍結乾燥製剤、ゲル調製品等が挙げられる。
医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。例えば、適宜必要に応じて、生理学的に認められる担体、医薬として許容される担体、アジュバント剤、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香料、甘味剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、pH調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩和剤、帯電防止剤、無痛化剤などを単独もしくは組合わせて用い、それとともに本発明のコンジュゲート等を混和することによって、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態にして製造することができる。【００３０】
非経口的使用に適した製剤としては、活性成分と、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る媒体との無菌性溶液、または懸濁液剤など、例えば注射剤等が挙げられる。一般的には、水、食塩水、デキストロース水溶液、その他関連した糖の溶液、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類が好ましい注射剤用液体担体として挙げられる。注射剤を調製する際は、蒸留水、リンゲル液、生理食塩液のような担体、適当な分散化剤または湿化剤及び懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方法で、溶液、懸濁液、エマルジョンのごとき注射しうる形に調製する。
注射用の水性液としては、例えば生理食塩液、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液などが挙げられ、薬理的に許容される適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノールなど）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート 80TM, HCO-50など）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）又は浸透圧調節のための試薬、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、アスコルビン酸などの酸化防止剤、吸収促進剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。【００３１】
非経口投与には、界面活性剤及びその他の薬学的に許容される助剤を加えるか、あるいは加えずに、水、エタノール又は油のような無菌の薬学的に許容される液体中の溶液あるいは懸濁液の形態に製剤化される。製剤に使用される油性ベヒクルあるいは溶剤としては、天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジあるいはトリグリセリド類、天然、半合成あるいは合成の油脂類あるいは脂肪酸類が挙げられ、例えばピーナッツ油、トウモロコシ油、大豆油、ゴマ油などの植物油が挙げられる。例えば、この注射剤は、通常本発明化合物を0.1〜10重量％程度含有するように調製されることができる。【００３２】
本発明の活性成分は、抗腫瘍剤（抗ガン剤）、抗アレルギー剤、免疫抑制剤、自己免疫疾患用剤、抗アレルギー剤、抗炎症剤、副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤などとして有望である。本発明の活性成分は、活性化T細胞にアポトーシスを誘導する活性を示し、これを利用した用途に有用である。本発明の活性成分は、免疫調節剤、抗腫瘍薬、例えば、脳腫瘍（多型性膠芽腫など）、脊髄腫瘍、上顎洞ガン、膵液腺ガン、歯肉ガン、舌ガン、口唇ガン、上咽頭ガン、中咽頭ガン、下咽頭ガン、喉頭ガン、甲状腺ガン、副甲状腺ガン、肺ガン、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道ガン、胃ガン、大腸ガン、胆管ガン、胆嚢ガン、膵臓ガン、肝ガン、腎臓のガン、膀胱ガン、前立腺ガン、陰茎ガン、精巣腫瘍、副腎のガン、子宮頸ガン、子宮体ガン、膣ガン、外陰ガン、卵巣ガン、繊毛上皮腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、乳ガン、皮膚ガン、悪性黒色腫、基底細胞腫、白血病、骨髄化性を伴う骨髄線維症、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、グリオーマなどを包含するガンおよび肉腫からなる群から選択された腫瘍に対する抗腫瘍薬、下記の疾患あるいは病気、又は病的な症状に対する医薬：
(A) 炎症性疾患であり、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等からなる群から選択されたもの；
(B) 急性および慢性疾患であり、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎、急性縦隔炎を含む肺の疾患、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎を含む肺以外の他の臓器の疾患、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎を含む炎症等からなる群から選択されたもの；
(C) 神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）、ガンや炎症に伴う痛みからなる群から選択されたもの；
(D) アレルギー性炎症疾患であり、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等からなる群から選択されたもの；
(E) 自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）であり、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM（HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、1型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臓（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、Goodpasture症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等からなる群から選択されたもの；
(F) 感染症であり、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患、あるいはヒトに感染症をもたらす病原体に起因する疾患で病原体が、1）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、2）ウイルス、3）真菌、4）植物（藻類）、5）原虫、6）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、7）節足動物からなる群から選択されたもので、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）を含むものから選択されたもの；
(G) 皮膚科領域の疾患であり、i)皮膚感染症、アレルギー性炎症や自己免疫性炎症を含む皮膚炎症や、乾癬、水疱症、膿疱症、角化、角化異常症など特有の炎症を有する皮膚疾患、ii)美容皮膚科関連の障害あるいは老化で、a)メラニン代謝調節（美白）、b)毛髪成長（発毛）の調節、ｃ)コラーゲン産生調節に関わる皮膚科領域の疾患（老化を含む）から選択されたもの；
(H) 生活習慣病であり、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、糖尿病などを含むものから選択されたもの；
(I) 正常細菌叢の維持に関わる異常；
(J) アミロイドーシス、アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨折などを含むものから選択されたもの；
(K) 脳、神経領域における炎症反応、例えば、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血性病変の進展に伴い生じる炎症、統合失調症；
(L) 痛風；
(M) 骨粗鬆症；又は
(N) 間質性肺炎
として、副作用が低減されている（血球凝集活性の抑制を含む）、溶解性が向上している、体内動態の改善（例えば、血中半減期の延長といった作用持続時間の延長など）、好ましい生体内分布といった有利な特性を得ることが可能であり、優れている。
明細書及び図面において、用語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
DTT: チオスレイトール(thiothreitol)
PMSF: フェニルメチルスルホニルフルオライド(phenylmethylsulfonyl fluoride)
PBS: リン酸塩緩衝塩水溶液又はリン酸塩緩衝生理食塩水(phosphate-buffered saline)
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。5K SE2〜40K SE2はそれぞれ分子量5,000, 10,000, 20,000, 40,000のPEG化試薬で修飾した安定化ガレクチン9〔ガレクチン9改変体G9NC(null)〕を示す。【００３３】
〔参考例１〕
以下の実施例で使用のガレクチン9は、WO2005/093064(公開日:2005年10月06日)の実施例１で製造取得されている安定型ガレクチン9, G9NC(null)〔WO2005/093064(公開日:2005年10月06日)の配列番号1で示される塩基配列によりコードされ、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〕を使用した。
該安定型ガレクチン9(ガレクチン9改変体)、すなわちG9NC(null)は次のようにしても調製できる。
安定型ガレクチン9 (G9NC(null))の発現誘導は、pET-G9NC(null)でエレクトロポレーション法で形質転換した大腸菌(BL21(DE3))を2%(w/v)グルコース及び100 μg/mlアンピシリン含有2 x YT培地で培養し、600 nmの吸光度が0.7に達した時点でイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを最終濃度0.15 mMになるように添加して行った。20℃で 22.5時間培養した後、遠心により菌体を集め、これを-80℃で精製まで保存した。凍結保存した菌体を10 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.5 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM MgCl2, 25 μg/ml DNase, 0.2 mg/ml 卵白リゾチーム中によく懸濁した後に、最終濃度1%になるようにTriton X-100を加えて18分間超音波処理した。18,800 x gで75分間遠心し、得られた上清中の組み換えタンパク質をラクトースアガロースを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーで精製した後に、透析によってバッファーをPBSに置換した。これを0.22 μmの滅菌フィルターを通して沈殿物を除去した後に、セルロファイン ET-Clean L処理でエンドトキシンを除去し、さらに0.22 μmの滅菌フィルターを通して雑菌及び沈殿物を除去してG9NC(null) の最終標品とした。【００３４】
このようにして調製された G9NC(null) はタンパク質ポリアクリルアミド電気泳動で夾雑バンドを認めず、エンドトキシン量は 0.5 EU/ml 以下である。凍結・融解に安定で、4℃保存でも半年以上安定に生物活性を保持する。
ガレクチン9としては、ネイティブなL 型ガレクチン9、M 型ガレクチン9及びS 型ガレクチン9を「遺伝子組換え技術」を用い、宿主細胞中で発現して得られたリコンビナント体を使用してもよい。
【実施例１】
【００３５】
〔PEG化安定化ガレクチン9の作製〕
a) 組換え宿主である大腸菌から得た細胞上清中の安定化ガレクチン9〔G9NC(null)〕を結合したラクトースアガロースゲル8 mL（ゲル1 mLあたり約15 mgの安定化ガレクチン9を結合）をカラムに充填し、ゲル体積の３倍量（24 mL）の50 mM Na2HPO4-NaH2PO4 (pH 8.0), 150 mM NaClで洗浄する。洗浄したゲルを組換えガレクチン9源として使用した。
b) PEG化試薬を24 mLの25 mM Na2HPO4-NaH2PO4 (pH 8.0), 75 mM NaCl, 100 mM lactoseに溶解し、直ちに、上記a)で得た洗浄したゲルと混合する。PEG化試薬として、以下の４種類を用いた。【００３６】
【表１】
2008013082.tif 000014
【００３７】
mPEG-SPA: methoxy poly(ethylene glycol) succinimidyl propionate【００３８】
c) 上記各PEG化試薬と組換えガレクチン9源のゲルの混合物をコニカルチューブ（日本ベクトン・ディッキンソン(株)）に入れ、室温(20〜22℃)で1時間撹拌（ローテーター使用）する。
d) PEG化試薬とゲルの混合物をカラムに充填し、流出液(E1)を集める。12 mLのTBS(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl), 200 mM lactoseでゲルを洗浄し、流出液（E2）を集める。
e) E1とE2を混合し、1 Lの20 mM MES-NaOH (pH 6.0)に対して透析する（１回目、4時間；２回目、12時間；３回目、6時間）。MES: 2-Morpholinoethanesulfonic acid
f) 透析した液を遠心（15,000 x g、20分間）し、上清を集める。上清を0.2 μmのフィルターで濾過し、濾液を集める。【００３９】
〔PEG化タンパク質のイオン交換クロマトグラフィーによる精製〕
クロマトグラフィーの条件を以下に示す。
a) イオン交換カラム：RESOURCE S (6 mL) (GE Healthcare, 17-1180-01)を使用し、精製装置はAKTAprime (GE Healthcare)を使用した。上記のステップd) で得られた試料の半分を、数回に分けてカラムに流す（5 mLのサンプルループを使用）。
b) カラムを25 mLのBuffer A (20 mM MES-NaOH (pH 6.0), 20 mM lactose)で洗浄した後、グラジエントは%Buffer B (20 mM MES-NaOH (pH 6.0), 20 mM lactose, 500 mM NaCl) 0→30 in 300 mL、流速は5 mL/min、分画量は6 mL/fractionで溶出する。
c) １分子の安定化ガレクチン9あたり複数のPEG分子が導入された修飾体を多く含む画分（SE1；図１参照）と１個のPEG分子が導入された修飾体を多く含む画分（SE2）を各々集め、シングルホロファイバー濃縮器を用いて濃縮する。
d) 濃縮した試料を1 LのPBSに対して透析する（１回目、4時間；２回目、12時間；３回目、6時間）。
e) 透析した液を遠心（15,000 x g、20分間）し、上清を集める。滅菌用フィルターを用いて上清を濾過滅菌する。これを、精製PEG化安定化ガレクチン9標品として用いた。【００４０】
PEG化安定化ガレクチン9(PEG化G9NC(null))についての、RESOURCE Sカラム（GEヘルスケア バイオサイエンス(株)）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにおける蛋白質の溶出パターンと各画分のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果は、図１に示したものと同様な結果となった。図１には、mPEG2-NHS分子量20,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9〔mPEG2-NHS(20K)PEG化G9NC(null)〕についてのデータが示してある（そこで実線は280 nmにおける吸光度、破線は電気伝導度）。
mPEG2-NHS分子量20,000を用いてPEG化した安定化ガレクチン9は、大まかに４つの画分(SE1-SE4)に分離された（他のPEG化試薬を用いた場合も本質的に同じ結果であった）。SDS-PAGEの結果から、各画分には以下のような分子種が含まれていることが分かった。
SE1：主として２カ所以上にPEG分子が結合した分子種を含む
SE2：主として１カ所にPEG分子が結合した分子種を含む
SE3, SE4：主としてPEG化されていない分子種を含む
なお、PEG化された安定化ガレクチン9の移動度は実際の分子量より小さい（計算上の分子量よりも高分子量側に泳動される）が、これはPEG部分にSDSが結合しにくいためと考えられる。
安定化ガレクチン9(G9NC(null))には６個のリジン残基が存在する(WO2005/093064(公開日:2005年10月06日)の配列表の配列番号2で示されるアミノ酸配列における、Lys88, Lys95, Lys111, Lys180, Lys238, そしてLys259である)ため、N-末端のアミノ基を含めてPEG分子が結合する可能性のある部位が７カ所存在する。SE1とSE2には、PEG化部位の異なる分子種が混在していると考えられる。SE3とSE4には、PEG化試薬中に存在する不純物（分子量の小さな修飾試薬など）で修飾された分子が含まれている可能性があると思われた。
【実施例２】
【００４１】
〔PEG化安定化ガレクチン9の生物活性〕
１．増殖抑制活性の測定
PC-3 (ヒト前立腺ガン細胞, human prostate cancer cell line)及びMOLT-4 (human T-cell leukemia line)に対する増殖抑制性(増殖抑制性: cytotoxicity)を調べる。PC-3に対する増殖抑制性については、WST-8 (1-Methoxy PMS)添加後に吸光度を測定して評価する試験により実施した。MOLT-4に対する増殖抑制性については、WST-1 (4-[3-(4-ヨードフェニル)-2-(4-ニトロフェニル)-2H-5-テトラゾリオ]-1,3-ベンゼン、ジスルフォネート)添加後に吸光度を測定して評価する試験により実施する。
１）PC-3に対する増殖抑制性
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco BRL), 10% FBS (Thermo Trace Ltd.)に懸濁した細胞を96ウェルプレート(FALCON)に3 x 103個/well (90 μL)入れ、48時間37℃、 5% CO2で培養後、PEG化安定化ガレクチン9および安定化ガレクチン9を最終濃度0.1μM, 0.3μM, 1μM, 2μMになるように各10μLずつ添加し24時間37℃で培養した（対照はPBS）。培養後、WST-8 試薬(Wako, 343-07623)10μLを各ウェルに加え、37℃, 5% CO2条件下で2時間反応後、プレートリーダーにて450-600nmの吸光度を測定した。PEG化安定化ガレクチン9と安定化ガレクチン9を同時に測定し、結果を比較して活性を評価した。【００４２】
２．測定結果
得られた結果を図２〜５に示す。図２〜５では、PC-3細胞に対する精製PEG化安定化ガレクチン9標品の増殖抑制作用を測定した結果が示されている。図２では、mPEG-SPA分子量5,000（G9Null PEG 5K SE2）とmPEG2-NHS分子量10,000（G9Null PEG 10K SE2）を用いてPEG化した安定化ガレクチン9、すなわち、G9Null-PEG-5K-SE2 (G9NC(null)-PEG-5K-SE2)及びG9Null-PEG-10K-SE2 (G9NC(null)-PEG-10K-SE2)の活性を調べた結果が示してある。G9Null PEG 5K SE2（以下、5K SE2）は安定化ガレクチン9とほぼ同等、G9Null PEG 10K SE2（以下、10K SE2）は安定化ガレクチン9よりやや高い活性（比活性）を示した。この活性測定では、細胞増殖に対する阻害効果を調べているため、試料中に培養細胞に対する毒性物質が含まれている場合、見かけ上高い活性を示す可能性がある。5K SE2と10K SE2の活性が安定化ガレクチン9と同様、ラクトースによって阻害されたことから、この活性がPEG化試薬由来の非特異的な毒性物質の混入によるものである可能性は否定される。
図３では、mPEG2-NHS分子量20,000（G9Null PEG 20K SE2）とmPEG2-NHS分子量40,000（G9Null PEG 40K SE2）を用いてPEG化した安定化ガレクチン9、すなわち、G9Null-PEG-20K-SE2 (G9NC(null)-PEG-20K-SE2)及びG9Null-PEG-40K-SE2 (G9NC(null)-PEG-40K-SE2)の活性を調べた結果が示してある。G9Null PEG 20 SE2（以下、20K SE2）、G9Null PEG 40K SE2（以下、40K SE2）ともに、安定化ガレクチン9より高い活性を示した。ラクトース阻害の結果は図２と同じ。図４では、SE1フラクションとSE2フラクションの比較（G9Null PEG 5KとG9Null PEG 10K）を示してある。PC-3細胞に対する増殖抑制活性とPEG分子の結合量（結合数）の関係を調べるために、SE1とSE2画分の比較を行った。5K、10Kいずれの場合もSE1画分の活性は低く、複数のPEG分子で修飾されることにより活性が低下することが分かった。１個のPEG分子で修飾された安定化ガレクチン9の場合でも、修飾部位の違いにより活性に差が生じる可能性がある。図５では、SE1フラクションとSE2フラクションの比較（G9Null PEG 20KとG9Null PEG 40K）を示してある。20K、40Kの場合も、5K、10Kと同じ結果が得られた。
PC-3細胞に対する増殖抑制活性については、5K SE2は安定化ガレクチン9とほぼ同等、10K SE2, 20K SE2, 40K SE2は安定化ガレクチン9よりも高い活性(in vitro)を示した。MOLT-4でも同様な結果が出ている。
【実施例３】
【００４３】
〔PEG化安定化ガレクチン9の生物活性〕
１．赤血球凝集活性の測定
ウサギ赤血球およびヒト赤血球に対する血球凝集活性（hemagglutination activity）を調べた。赤血球に対する凝集反応を目視により評価する試験により実施した。安定化ガレクチン9とPEG化安定化ガレクチン9を同時に測定し、結果を比較して活性を評価した。
１）ヒト赤血球凝集活性の測定
ヒト血球凝集アッセイ血球凝集活性は、Nowak et al.の方法(Nowak et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 68: 650-657 (1976))に準じて行った。96-ウェル(FALCON)に安定化ガレクチン9あるいはPEG化安定化ガレクチン9(5K,10K:100-0.05μg/mL, 20K,40K: 100-0.1μg/mL)をアッセイ用試料として調製した。最終濃度0.25 % (w/v)となるように牛血清アルブミンを、そして最終濃度 1 %(v/v) となるように赤血球の濃度を調製したABあるいはO型のクエン酸あるいはEDTA化全血をウェル内の液量が100μLになるように入れた。その反応混合物を室温で１時間インキュベーションした。凝集に必要な最小濃度を目視により判定した。【００４４】
２）ウサギ赤血球凝集活性の測定
a) グルタルアルデヒド固定トリプシン処理ウサギ赤血球の調製
ウサギ血液 (清水実験材料より購入、100mL)を2000rpm、15分遠心後、上清を除去し、沈殿物を0.15M NaClで洗浄した。赤血球濃度が4%になるように0.1M Na-phosphate/ 0.05M NaClを加えた。トリプシン(終濃度1mg/mL)(SIGMA)加え37℃、1時間インキュベート。2300rpm、15分遠心、上清除去し、沈殿物を0.15M NaClで洗浄した。グルタルアルデヒド(SIGMA)が1% になるようにPBS(pH7.2)で調製し室温1時間固定した。次に、遠心、上清除去し0.1M グリシン(WAKO)/PBS(pH7.2)で洗浄後、遠心上清を除去した。PBS(pH7.2)で洗浄後上清を除去し10% erythrocyte suspension in 0.05% NaN3/PBS(pH7.2)で4℃で保存した。
b) 測定法
血球凝集アッセイ血球凝集活性は、Nowak et al.の方法(Biochem. Biophys. Res. Commun., 68: 650-657 (1976))に準じて行った。96-ウェル(FALCON)に安定化ガレクチン9あるいはPEG化安定化ガレクチン9(5K,10K:100-0.05μg/mL, 20K,40K: 100-0.1μg/mL)をアッセイ用試料として調製した。最終濃度0.25 % (w/v)となるように牛血清アルブミンを、そして最終濃度 1 %(v/v) となるように前述のグルタルアルデヒドで固定化したトリプシン処理ウサギ赤血球の液量が100μLになるように加えた。その反応混合物を室温で１時間インキュベーションした。凝集に必要な最小濃度を目視により判定した。【００４５】
２．測定結果
得られた結果を図６に示す。安定化ガレクチン9の血球凝集活性に対するPEG化の効果を調べるため、レクチン活性の検出に一般的に利用されるウサギ赤血球（トリプシン処理した後、グルタルアルデヒドで固定した赤血球）と新鮮ヒト赤血球（糖鎖抗原を考慮してO型とAB型を使用）を用いて活性を測定した。安定化ガレクチン9は、ウサギ赤血球に対して12.5 - 25 nMで凝集活性を示す（凝集活性を示す最低濃度を活性の指標とする）。一方、PEG化安定化ガレクチン9画分である10K SE2, 20K SE2, 40K SE2は、12.8 μMでも凝集活性を示さず、このアッセイにおいて実質的に不活性と考えられる。5K SE2は、安定化ガレクチン9のおよそ1/4の活性（凝集活性を示す最低濃度：50 - 100 nM）を示した。5K・SE2の凝集活性が高濃度側（およそ1.6 μM以上）で検出されない理由は明らかではないが、安定化ガレクチン9の場合にも同じ現象が認められる。可能性としては、ガレクチンの濃度が高い場合、赤血球膜上の糖鎖リガンドがガレクチンによって飽和してしまうため、血球間の架橋が起こらなくなる状態が考えられる。
ヒト新鮮赤血球の場合も、安定化ガレクチン9は100 - 200 nMで凝集活性を示すが、10K SE2, 20K SE2, 40K SE2は12.8 μMでも凝集活性を示さなかった。
かくして、10K SE2, 20K SE2, 40K SE2は、ウサギおよびヒト赤血球に対して、実質的に凝集活性を示さなかった。5K SE2は安定化ガレクチン9の約1/4の活性を示した。
すなわち、次の結果が得られた。
40K SE2, 20K SE2, 10K SE2：不活性
5K SE2 ＜ 安定化ガレクチン
【実施例４】
【００４６】
〔ラットCIAモデルにおけるPEG化安定化ガレクチン9の効果〕
１.方法
ウシ  タイプIIコラーゲン（コラーゲン技術研修会）をimcomplete Freund's Adjuvant (IFA: Difco)に溶解し、作製した。エマルジョンをラット（Lewis メス6週齢：日本エスエルシー）の背部皮内に１mLずつ注射（コラーゲン800 μg/1mL/rat）した。その１週間後に二次感作として、同コラーゲンエマルジョン液（コラーゲン800 μg/0.3mL/rat）を動物の尾根部に投与した。二次感作の7日後にPEG化ガレクチン-9改変体〔PEG-Gal9-10K (PEG-Stable Gal9(10K)), PEG-Gal9-20K (PEG-Stable Gal9(20K))およびPEG-Gal9-40K (PEG-Stable Gal9(40K)), 0.6mg/kg）〕を静脈内に週３回、３１日まで行った。左右後肢の足容積はコラーゲン一次感作日（０日）と一次感作後は週３回（月，水、金）に測定し、次式に従い浮腫率(%)を算出した。【００４７】
浮腫率(swelling)(%)=[感作後の足蹠容積(mL)-感作前の足蹠容積(mL)]/[感作前の足蹠容積(mL)] ×100【００４８】
統計学的処理は次のように行った。左右後肢の加算を個体値とした浮腫率(%)の平均値及び標準誤差で表わした。PBS群とPEG化ガレクチン-９改変体群との間での差異は市販の統計ソフト（GraphPad Software, Inc., San Diego, USA）を使用してDunnett's Multiple Comparison Test又はBonferroni Post-Testにて評価した。いずれも有意水準は５%未満（p<0.05）を有意とし、５%未満および１%未満（p<0.0１）とに分けて表示した。
２.結果
得られた結果を図７に示す。PEG化安定化ガレクチン9（PEG化ガレクチン-９改変体）によりCIA（コラーゲン誘発関節炎）に対する治療効果が認められた。ヒトの慢性関節リウマチのモデルと考えられて利用される系に対して治療上の有効性を示していることから、PEG化安定化ガレクチン9（PEG化ガレクチン-９改変体）は、慢性関節リウマチ治療剤などとして有用と考えられる。同様にして、PEG化ガレクチン9及びPEG化ガレクチン-９改変体は、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤などとしても期待できることがわかる。
PEG（5K, 10K, 20K, 40K）を結合させた安定化ガレクチン9（PEG化安定化ガレクチン9）は、その性能試験の結果、PEG結合により安定化ガレクチン9の血中消失半減期の延長、PC-3（前立腺癌）細胞やMOLT-4細胞に対する増殖抑制活性の増強および赤血球凝集作用の消失が認められ、安定化ガレクチン9の可溶性と血中消失半減期延長に関して優れていると評価できるものであった。また、赤血球凝集作用が消失しているものが得られ、この赤血球凝集作用の消失は、安定化ガレクチン9に結合したPEG鎖の長さに比例することが確認された。ガレクチン9や安定化ガレクチン9（ガレクチン-９改変体）を生体に投与する場合に副作用となりうる赤血球凝集活性がPEG化により消失せしめることが可能であることから、PEG化ガレクチン9やPEG化安定化ガレクチン9（PEG化ガレクチン-９改変体）は、治療剤としての高められた有用性を持つ物質であることは明らかであろう。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明のガレクチン9−ポリマーコンジュゲートは、優れた医薬候補物質である。特には、PEG化安定化ガレクチン9（PEG化ガレクチン-９改変体）は、治療剤としての高められた有用性を持つ物質で、ガン細胞に対しての増殖抑制活性（又は増殖抑制活性）が増強されており、赤血球凝集作用といった望ましくない作用が低減あるいは除去せしめられており、抗腫瘍剤、抗ガン剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫調整剤、抗ウイルス疾患用剤などとしての開発、ガレクチン9の機能解明用の試薬などとして利用できる。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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