(57)【要約】ＯＡＳＩＳ遺伝子の機能が欠損したマウス、およびこのマウスを用いて骨粗鬆症治療薬をスクリーニングまたは薬効評価する方法。
2007102240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞体局在転写因子ＯＡＳＩＳ遺伝子の機能が欠損したマウス。
【請求項２】
骨粗鬆症モデルマウスである、請求項１記載のマウス。
【請求項３】
野生型と比較して、減少した体重、変形した四肢、及び減少した骨量を特徴とする、請求項１記載のマウス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のマウスに候補薬剤を投与することを含む、骨粗鬆症の治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のマウスに骨粗鬆症治療薬を投与することを含む、骨粗鬆症治療薬の薬効を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウス、より具体的には骨粗鬆症モデルマウスに関する。
本発明はまた、上記マウスを使用して骨粗鬆症の治療薬をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患や糖尿病などの多くの難治性疾患の発症に小胞体ストレスが深く関与することが明らかになってきた。本発明者らは先に、小胞体ストレスから回避するためのシグナル伝達に重要な役割を担う新規の小胞体局在転写因子であるＯＡＳＩＳ（Ｏｌｄ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を見出した（特許文献１）。
ＯＡＳＩＳ蛋白質は、ＣＲＥＢ（Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）／ＡＴＦ（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）ファミリーに属する、膜一回貫通型の塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）転写因子であり、長期培養後のマウス星状神経膠細胞（アストロサイト）で特異的に発現している遺伝子として同定され、その配列及びコードする蛋白質が解析された（非特許文献１）。その後、ヒト由来のＯＡＳＩＳ遺伝子も単離され、その塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列も同定された（非特許文献２）。
本発明者らは先に、ＯＡＳＩＳ蛋白質は正常状態ではグリア細胞の小胞体膜上に存在するが、グリア細胞に小胞体ストレスが負荷されると、ＯＡＳＩＳ蛋白質はＲＩＰ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）という現象（非特許文献３）によって膜内で切断され、切断された断片（ＣＲＥＢ／ＡＴＦ転写因子に共通する塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）を含む）が核内に輸送され、核内では、こうして切断された断片が、小胞体ストレス応答要素（ＥＲＳＥ：ＥＲ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）およびサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ：Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）（非特許文献４）に結合して、小胞体ストレス抵抗性シャペロンであるＧＲＰ７８等の発現を誘導すること、更に、ＯＡＳＩＳ蛋白質の活性化又は発現を促進することにより、小胞体ストレスから生じる神経細胞死を抑制し得ることや、神経変性疾患を治療する可能性があることなどを見出した（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００５−５２０１６
【非特許文献１】Ｈｏｎｍａ  Ｙ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９：９３−１０３，１９９９
【非特許文献２】Ｏｍｏｒｉ  Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２６：２９３（１）：４０７−７（２００２）
【非特許文献３】Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ，１００，３９１−３９８，２０００
【非特許文献４】Ｍｏｒｉ，Ｋ．Ｃｅｌｌ，１０１，４５１−４５４，２０００
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは、ＯＡＳＩＳ蛋白質の生体内での役割又は機能を理解するために、ＯＡＳＩＳ遺伝子を欠損（又はノックアウト）させたマウスを作製することを試みた。
本発明は、ＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウスを作製し、その特性を明らかにすることを目的とする。
本発明はまた、ＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウスを治療薬のスクリーニング又は薬効評価のために使用することを目的とする。
（発明の概要）
本発明者らは、意外にも、作製したマウスが骨粗鬆症と極めて類似する病変を示すことを今回見出した。
本発明は、第１の態様において、小胞体局在転写因子ＯＡＳＩＳ遺伝子の機能が欠損したマウスを提供する。
その実施形態において、本発明のマウスは、骨粗鬆症モデルマウスであることを特徴とする。
別の実施形態において、本発明のマウスは、野生型と比較して、減少した体重、変形した四肢、及び減少した骨量を特徴とする。
本発明は、第２の態様において、本発明のマウスに候補薬剤を投与することを含む、骨粗鬆症の治療薬をスクリーニングする方法を提供する。
本発明は、第３の態様において、本発明のマウスに骨粗鬆症治療薬を投与することを含む、骨粗鬆症治療薬の薬効を評価する方法を提供する。
（定義）
本明細書で使用する「機能が欠損した」なる用語は、野生型マウスゲノム上のＯＡＳＩＳ遺伝子の一部または全部が改変（例えば、置換、欠失、付加及び／又は挿入）または破壊されることによって、該遺伝子の発現産物がＯＡＳＩＳ蛋白質としての機能を示さないこと、あるいは該蛋白質が発現しないことをいう。本明細書中では、そのようなマウスをＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウス又はＯＡＳＩＳ遺伝子ノックアウトマウスという。
本明細書で使用する「骨粗鬆症」なる用語は、骨量が減って骨が弱く脆くなり、骨折しやすくなる疾患又は症状を指す。構造的には、皮質骨よりも海綿骨で骨量の減少が顕著であり、そのために骨梁が減少し、骨が弱くなる。骨の新陳代謝は、皮質骨よりも海綿骨でより活発に行われるため、骨代謝に異常が生じると、先ず海綿骨で変化が起きて海綿骨の量が減る。骨粗鬆症が発症すると、海綿骨の占める割合が比較的多い背骨などが最初に弱くなっていく傾向が認められている。さらにまた、本発明のマウスの症状の一つとして四肢の変形が含まれているが、このような症状も続発性骨粗鬆症（例えば関節リウマチ）に見られるものである。
本明細書で使用する「野生型」なる用語は、正常ＯＡＳＩＳ遺伝子をもつマウスを指す。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−０６３１９７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＯＡＳＩＳノックアウトマウスの作製を示す。図１ａは、ターゲティングベクターの構築を示す。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４はそれぞれ、ＯＡＳＩＳ遺伝子のエキソン１、エキソン２、エキソン３及びエキソン４を表す。Ｎｅｏｒはネオマイシン耐性遺伝子を、また、ＨＳＶ−ｔｋはＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子をそれぞれ表す。図１ｂは、ゲノムＰＣＲによるＯＡＳＩＳ遺伝子の欠損確認を示す。ここで、＋／＋は野生型マウス、＋／−はヘテロマウス、−／−はノックアウトマウスである。図１ｃは、ＯＡＳＩＳ遺伝子をＫｐｎＩ消化およびＮｈｅＩ消化したときのサザンブロッティングを示す。ＯＡＳＩＳ遺伝子ノックアウトゲノムでは、ＫｐｎＩ消化の際には５．７ｋｂｐ、ＮｈｅＩ消化の際には６．８ｋｂｐのバンドがそれぞれ検出された。
図２は、ＯＡＳＩＳノックアウトマウス（ＫＯ）の生後１週目からの体重推移を示す。図中、ＷＴは野生型マウスを、またｈｅｔｅｒｏはヘテロ接合体マウスをそれぞれ表わす。
図３は、１２週齢の雄の野生型マウス２Ｆ−Ｍ２（ＯＡＳＩＳ＋／＋；体重２９．８８ｇ、体長９．０ｃｍ）及びＯＡＳＩＳノックアウトマウス２Ｆ−Ｍ３（ＯＡＳＩＳ−／−；体重２４．３３ｇ、体長８．０ｃｍ）の肉眼写真を示す。
図４は、８週齢ＯＡＳＩＳノックアウトマウスの肉眼病変を示す。上図では、前肢の変形が観察される。下図では、後肢の踵の部分に関節炎、発赤腫脹が観察される。
図５は、野生型マウス（左図）とＯＡＳＩＳノックアウトマウス（右図）の脊椎骨における骨量の比較を示すヘマトキシリン・エオリン（ＨＥ）組織染色図である。
図６は、野生型マウス（左図）とＯＡＳＩＳノックアウトマウス（右図）の骨芽細胞の電子顕微鏡写真を示す。
発明の詳細な説明
１．ＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウス
本発明のＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウスは、そのゲノム上のＯＡＳＩＳ遺伝子が欠失されたか、或いは機能不全にされた、所謂ノックアウトマウスである。すなわち、ＯＡＳＩＳ遺伝子のゲノムＤＮＡの一部に欠失、置換、付加又は挿入を生じさせることによって、該遺伝子の機能が全く又は実質的に不全となるか或いは欠損される。遺伝子欠損のためにＯＡＳＩＳ遺伝子が発現されず、その結果、ＯＡＳＩＳ蛋白質が合成されないため、生体内でその機能を果たすことができない。このとき、生体内で重要な働きをする蛋白質であれば、マウスの発生及び発達の過程に影響し、病的な症状が現れると考えられる。
本発明のＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウスは、次のような特性を有する。
すなわち、本発明のマウスは、生後２週間目ごろから体重の減少が認められること（図２）、肉眼観察において四肢の変形、並びに関節及びその周囲の発赤や腫脹などの変化（これは骨折に因る）が認められること（図２及び図３）、病理組織学的解析の結果、長管骨及び海綿骨の骨量が著しく減少し、骨粗鬆症の病変が認められること（図４）などの特徴を有する。
このように、本発明のマウスは骨粗鬆症と酷似した病変を形成することからモデルマウスとして有用である。従来、ＯＡＳＩＳは、小胞体ストレスに起因する例えば神経細胞死からの保護作用を有するため、神経変性疾患の治療のために有用であることは知られていた（特開２００５−５２０１６）が、骨粗鬆症や骨形成などとの関係については全く知られていなかった。このような特性は、ＯＡＳＩＳ遺伝子を欠損させたマウスを作製し得たことによって初めて明らかになった。
本発明のマウスは、一般に、公知の標的遺伝子組換え法（ジーンターゲティング法：例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２５：８０３−８９０，１９９３）を使用することによって作製することができる。
マウスＯＡＳＩＳ蛋白質及びそれをコードするＤＮＡの各配列は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿０１１９５７で登録されており、後述の配列表中、それぞれ配列番号１、配列番号２として示されている。この塩基配列に基づいてプローブ（例えば約３０〜１５０塩基）を作製し、放射性又は蛍光ラベルで標識し、ＯＡＳＩＳ遺伝子のゲノムＤＮＡを検出又は単離するために使用することができる。脳、尾などの組織由来の細胞から定法に従いゲノムＤＮＡを取り出したのち、ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断後、サザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション法によって上記プローブを用いて、目的のＯＡＳＩＳ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を探索する。必要に応じて制限酵素地図を作成し、相同組換えを行うための任意のターゲット部位を決定する。ＯＡＳＩＳ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したプライマー（例えば約１５〜２５塩基）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＯＡＳＩＳ遺伝子含有ゲノムＤＮＡ断片を増幅し、部分的に配列決定する。相同組換えするための相同領域は、約３〜７ｋｂ以上が好ましい。
ＯＡＳＩＳ遺伝子をノックアウトするために、ターゲティングベクター中の上記相同領域内に薬剤耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子など）などの外来ＤＮＡを挿入又は置換してもよいし、或いは、ＯＡＳＩＳ遺伝子の一部を欠失してもよい。欠失位置又は外来ＤＮＡの挿入若しくは置換位置は、例えばＯＡＳＩＳ遺伝子のいずれかのエキソン、例えばエキソン２（図１のＥ２）である。ここで、外来ＤＮＡとしての薬剤耐性遺伝子は、ターゲティングベクターを有する胚性幹細胞のポジティブ選択のために有用となる。また、ベクターには、ネガティブ選択用遺伝子を導入してもよく、そのような遺伝子には、例えばＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子などが含まれる。ネガティブ選択は、抗ヘルペス薬、ＦＩＡＵ、ガンシクロビルなどの薬剤に感受性のランダムベクター組込み胚性幹細胞の選択のために有用である。
ターゲティングベクターは、任意のベクターでよく、例えばｐＧＴ−Ｎ２８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＰ７２、ｐＰＮＴなどが含まれる。
相同組換え効率を高めるために、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系（Ｒ．Ｋｕｈｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６９：１４２７−１４２９）を利用することもできる（下記参照）。
本発明のマウスを作製するために、マウス受精卵に直接ベクターＤＮＡを注入し仮親に移植する方法もあるが、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を用いる方法が好ましい。
ＥＳ細胞は、受精後の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）又は８細胞期胚内に存在する未分化細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、細胞塊の解離と継体を繰り返しながら樹立された未分化状態を保持したまま増殖を続ける細胞株である。マウスＥＳ細胞株の例は、Ｄ３細胞株、Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞株、ＴＴ２細胞株、ＡＢ−１細胞株、Ｊ１細胞株、Ｒ１細胞株などであるが、これらに限定されない。
上記のようにＯＡＳＩＳ遺伝子を改変してその機能を欠損させたターゲティングベクターを、公知の方法でマウスＥＳ細胞に導入する。導入方法には、ミクロセル法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などが含まれるがこれらに限定されない。
得られた組換えＥＳ細胞について、相同組換えが起こっているかどうかのスクリーニングを、例えば、プローブ又はプライマーを使用するサザンブロット法又はゲノムＰＣＲ法によって行うことができる。これによって、正しく相同組換えが起こった細胞を選択する。
ＯＡＳＩＳ遺伝子がノックアウトされたＥＳ細胞を、野生型マウスの胚盤胞又は８細胞期胚内に導入する。そして、このＥＳ細胞を含む胚を偽妊娠仮親マウスの子宮に移植し、出産させることによりキメラ動物を作製することができる。
ＥＳ細胞を胚盤胞等の胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法が知られているが、いずれの方法を用いることも可能である。マウスの場合には、ホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させて初期発生胚を得るが、組換えＥＳ細胞の導入胚として、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、８細胞期胚を用いる場合には２．５日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組換えを行ったＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて注入し、キメラ胚を作製する。
一方、仮親とするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上記の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラマウスを作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするため、受精卵を採取する雌マウスと仮親となる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作出することが望ましい。
ＥＳ細胞移植胚に由来するマウス個体が、このようなキメラマウスの中から得られた場合、このキメラマウスを純系のマウスと交配し、そして次世代個体にＥＳ細胞由来の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウス生殖系列へ導入されたことを確認することができる。ＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するには、様々な形質を指標として用いることができるが、確認の容易さを考慮して、被毛色によることが望ましい。また、体の一部（例えば尾部）からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行うことにより、選抜を行うこともまた可能である。
このように、胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、そのキメラ動物を繁殖させることにより、目的とする遺伝子を欠損した個体を得ることができる。得られたＯＡＳＩＳ遺伝子欠損ヘテロ接合体マウス（＋／−）同士を交配させることにより、あるいはキメラマウスと野生型マウスを交配させることにより、目的とする遺伝子欠損ホモ接合体マウス（−／−）を得ることができる。作製されたＯＡＳＩＳ変異遺伝子を保有するヘテロ接合体、あるいはホモ接合体は生殖細胞および体細胞のすべてに安定的にＯＡＳＩＳ遺伝子欠損を有しており、この遺伝子欠損は子孫動物に遺伝的に伝達される。本発明のマウスは、したがって、ＯＡＳＩＳ遺伝子の機能が欠損したキメラマウスおよび子孫マウスの両方を包含する。
本発明のノックアウトマウスを作製するときには、ノックアウトマウスの作製において使用されるＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（Ｒ．Ｋｕｈｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６９：１４２７−１４２９）を用いることも可能である。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系においては、標的となる相同配列内にｌｏｘＰ配列で挟まれた外来ＤＮＡ配列が挿入された遺伝子をもつＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウスを、大腸菌のＰ１ファージ由来の組換え酵素であるＣｒｅ酵素を発現している動物と交配させた時に、Ｃｒｅ酵素はｌｏｘＰ配列で挟まれた配列を認識して削除するために、その領域を欠損させた動物を作出することが可能となる。そのようなＣｒｅ／ｌｏｘＰ系を用いて、組織特異的にＣｒｅ酵素を発現しているマウスと交配させることにより、組織特異的に遺伝子が欠損した特性を有するノックアウトマウスを作製することができる。
ジーンターゲティングに関する具体的な手法については、例えば相沢慎一，ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，バイオマニュアルシリーズ８，羊土社（東京、日本国）（１９９５年）を参照することができる。
２．骨粗鬆症治療薬のスクリーニング及び薬効評価
本発明のＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウスは、海綿骨の骨量が野生型に比べて著しく減少しており、その結果、骨折が四肢や脊椎で認められた（図２から図４）。また、骨芽細胞の電子顕微鏡観察によると、ＯＡＳＩＳノックアウトマウスでは、小胞体の著しい拡張に加え、その内腔に電子密度の高い物質が貯留していることが分かり、この所見から、ＫＯマウスの骨病変が確かに小胞体機能異常に基づくものであった（図６）。このような知見から、ＯＡＳＩＳ遺伝子は、骨形成に密接に関わり、この遺伝子を欠損させるとヒトの骨粗鬆症とよく似た病変が形成されることが判明した。
したがって、本発明のマウスを骨粗鬆症モデルマウスとして使用することができる。具体的には、骨粗鬆症の治療薬のスクリーニングや薬効評価のために、或いは、骨粗鬆症の発症機序の解析ツールや小胞体ストレス応答の分子機序解明のツールとして、本発明のマウスを使用することができる。
本発明は、第２の態様により、本発明のマウスに候補薬剤を投与することを含む、骨粗鬆症の治療薬をスクリーニングする方法を提供する。
本発明は、第３の態様により、マウスに骨粗鬆症治療薬を投与することを含む、骨粗鬆症治療薬の薬効を評価する方法を提供する。
候補薬剤は、限定されないが、例えば小分子、（ポリ）ペプチド、（糖）蛋白質、（ポリ）ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド、糖質、脂質などを含む。候補薬剤の例には、ＯＡＳＩＳ蛋白質、その修飾誘導体（例えばペグ化、アシル化、アルキル化、リン酸化、硫酸化誘導体など）、ＯＡＳＩＳホモログとその修飾誘導体などが含まれる。
骨粗鬆症治療薬は、限定されないが、例えば女性ホルモン、カルシトニン、ビスフォスフェート、イブリフラボン、ビタミンＫ２、ビタミンＤ３などが含まれる。
候補薬剤又は治療薬の投与方法は、限定されないが、経口投与又は非経口投与（例えば静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与など）などを含む。経口投与の場合には、候補薬剤を餌に混ぜて投与することができる。
投与量は、限定されないが、約１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。
製薬上許容可能な慣用の担体や希釈剤などの賦形剤、添加剤などと組み合わせて候補薬剤又は治療薬を投与することもできる。また、リポソーム（例えば正電荷リポソーム）やナノ粒子に候補薬剤または治療薬を封入または結合（付着）して投与してもよい。
評価は、骨粗鬆症の症状の軽減又は回復、海綿骨の骨量の増加、体重の増加、四肢変形の回復などを指標として、肉眼観察、体重測定、病理組織学的観察（例えば組織染色後の顕微鏡観察）などによって行うことができる（下記の実施例参照）。
以下に、実施例を挙げて、さらに本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０００５】
［実施例１］  ターゲティングベクターの作製
マウスＯＡＳＩＳゲノム配列（ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２７２３０）に基づいて作製したプライマーを用い、１２９マウス由来ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＯＡＳＩＳ遺伝子のエキソン２前後のＤＮＡ断片１．５ｋｂ（短腕）および６ｋｂ（長腕）を単離した。このときに用いたプライマーは、短腕側が５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＡＧＧ−３’（配列番号３）および５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）、長腕側が５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＴＡＣ−３’（配列番号５）および５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＡＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＣＴＣ−３’（配列番号６）である。シーケンシングにより塩基置換が起こっていないことを確認した後、各ＤＮＡ断片をターゲッティン用ベクターｐＰＮＴ（Ｃｅｌｌ  １９９１  Ｊｕｎ  ２８，６５（７）：１１５３−１１６３；岡部勝博士（大阪大学、大阪、日本国）から恵与された）のＮｏｔＩ−ＸｈｏＩサイト（短腕側）およびＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩサイト（長腕側）にそれぞれ組み込んでターゲティングベクターを作製した（図１ａ参照）。
［実施例２］  ＯＡＳＩＳノックアウトマウスの作製
エレクトロポレーション法により、未分化の培養マウスＥＳ細胞（約０．８×１０７個）（Ｄ３細胞株（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｊ  Ｅｍｂｒｙｏｌ  Ｅｘｐ  Ｍｏｒｐｈｏｌ．１９８５，８７：２７−４５）に実施例１のターゲティングベクターを２５μｇ／ｍｌの割合で導入して遺伝子導入ＥＳ細胞を得た。これらの細胞をプレート（培地ＥＳＭ）に播き、２４時間後にＧ４１８、４８時間後にＧ４１８およびガンシクロビルを培地に添加して更に７〜１０日間培養し、Ｇ４１８およびガンシクロビルに耐性を示すコロニーを得た。これらのコロニーを個別に分離し、さらに培養したのち、ＤＮＡを抽出してサザンブロッティングにより相同組換えＥＳ細胞を選別した。
次いで、この相同組換えＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ＣＲ  ＳＬＣ系マウスの胚盤胞へ常法により注入し、仮親マウスへ移植して個体へと発生させた。その結果、２匹のキメラマウスを得た。得られたキメラマウスのうち、雄の個体と雌の野生型Ｃ５７Ｂ／６系マウスとを交配させて初代（Ｆ１）マウスを得た。これらのＦ１マウスから、サザンブロット分析により２倍体染色体の一方に変異配列が確認された個体（雄、雌）を選別し、これらを交配させて第２世代（Ｆ２）マウスを得た。
プライマーとして５’−ＣＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号７）、５’−ＴＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＣＴＴＧＴＧＧ−３’（配列番号８）、５’−ＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＣＣＧＡＴＣＣ−３’（配列番号９）を用い、ゲノムＰＣＲの結果、ノックアウトマウス（−／−）においてＯＡＳＩＳ遺伝子が欠損していることを確認した（図１ｂ参照）。また、図１ｃに示すように、ＯＡＳＩＳ遺伝子をＫｐｎＩ消化およびＮｈｅＩ消化したときのサザンブロッティングを行った結果、ノックアウトゲノムでは、ＫｐｎＩ消化の際には５．７ｋｂｐ、ＮｈｅＩ消化の際には６．８ｋｂｐのバンドがそれぞれ検出された。この結果は、ＯＡＳＩＳ遺伝子の相同組換えが上手く行われていることを示しており、本発明のＯＡＳＩＳ遺伝子ノックアウトマウスの作製に成功した。
［実施例３］  ＯＡＳＩＳノックアウトマウスの特徴付け
（体重の推移）
雄及び雌マウスの野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏ）及びホモ接合体（ＫＯ）について、生後１週から８週にかけて体重を測定し、その経時変化を観察した。
結果を図２に示した。図から、本発明のノックアウトマウス（ＫＯ）及びヘテロ接合体マウスは、３週齢ころから体重の増加が野生型に比べて有意に少ないこと、特にノックアウトマウスの雌は最も体重の増加が抑制されることが分かった。ＯＡＳＩＳ遺伝子をノックアウトしたことによって、骨形成異常を起こし、その結果、体重増加を抑制したことが分かる。
（肉眼所見）
ともに１２週齢の野生型マウスと本発明のノックアウトマウスの身長及び体重を測定し比較した。
結果を図３に示した。図に示す野生型の体重及び身長はそれぞれ２９．８８ｇ、９．０ｃｍであるのに対して、ノックアウトマウスの体重及び身長はそれぞれ２４．３３ｇ、８．０ｃｍであった。すなわち、ＯＡＳＩＳ遺伝子ノックアウトマウスの身長及び体重はともに野生型マウスと比べて小さかった。これは、骨形成異常のために骨量が低下したためである。
さらに、８週齢のＯＡＳＩＳ遺伝子ノックアウトマウスの病変を肉眼で観察した。その結果、前肢の変形が観察された（図４上）。また、後肢の踵の部分に関節炎、発赤腫脹が観察された（図４下）。この発赤腫脹は骨折によるものであった。
（脊椎骨の骨病変の病理組織学的観察）
椎骨の骨量を、野生型マウスとＯＡＳＩＳノックアウトマウスで比較した。脊椎骨の組織サンプルを取り、蟻酸処理により脱灰し、定法に従ってパラフィン切片を作製したのち、ヘマトキシリン・エオジン染色を施した。顕微鏡観察により骨病変を観察した。
結果を図５に示した。図から、野生型マウス（左図）と比べて、ＯＡＳＩＳノックアウトマウス（右図）では、長管骨及び海綿骨の骨量が著しく減少していることが分かった。また、脊椎や四肢で骨折が認められた。ＯＡＳＩＳは骨芽細胞に発現することが知られている（Ｈｏｎｍａ  Ｙ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９：９３−１０３，１９９９）。そこで骨芽細胞を電子顕微鏡を用いて超微細構造を観察した。
結果を図６に示した。図から、野生型マウスの骨芽細胞（左図）と比べ、ＯＡＳＩＳノックアウトマウス（右図）では、小胞体の著しい拡張に加え、その内腔に電子密度の高い物質が貯留していることが分かった。この電子顕微鏡による所見は、ＫＯマウスの骨病変が確かに小胞体機能異常に基づくことを示している。
このようなことから、ＯＡＳＩＳ遺伝子は、骨形成に密接に関わり、この遺伝子を欠損させると、ヒトの骨粗鬆症によく似た病変が形成されることが判明した。
本発明により、骨粗鬆症モデルマウスが提供される。本発明のマウスを使用することによって、骨粗鬆症の治療薬の開発および効能評価や発症機序の解析、小胞体ストレス応答の分子機序の解明などが可能になるため、このマウスは産業上極めて有用である。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明により、ＯＡＳＩＳ遺伝子が骨形成に密接に関わることが判明した。また、この遺伝子を欠損させると、骨粗鬆症とよく似た病変が現れることも判明した。このように、本発明のマウスは、骨粗鬆症モデルマウスとして利用可能であるという格別の作用効果を有する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０００７】
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
［配列表］
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【図１ａ】
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【図２】
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【図１ｂ】
2007102240.tif 000011
【図１ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月28日(2007.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞体局在転写因子ＯＡＳＩＳ遺伝子が発現されないこと、四肢が変形していること、及び海綿骨の骨量が減少していることを特徴とする、骨粗鬆症モデルマウス。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
請求項１に記載のマウスに候補薬剤を投与することを含む、骨粗鬆症の治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項５】
請求項１に記載のマウスに骨粗鬆症治療薬を投与することを含む、骨粗鬆症治療薬の薬効を評価する方法。
【請求項６】
小胞体局在転写因子ＯＡＳＩＳ遺伝子の機能が欠損したマウスの、骨粗鬆症モデルマウスとしての使用であって、該機能欠損マウスが、ＯＡＳＩＳ遺伝子が発現されないこと、四肢が変形していること、及び海綿骨の骨量が減少していることを特徴する、前記使用。
【国際調査報告】
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