(57)【要約】  本発明においては、体液性ならびに細胞性免疫応答を効率よく誘導できるワクチンの製造のために使用することができる、新規なワクチン担体を作製することを課題とする。本発明はまた、体液性ならびに細胞性免疫応答を効率よく誘導できるワクチンを提供することもまた、課題とする。  本発明の発明者らは、サクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームを使用することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにし、発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、サクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームから構成されるワクチン担体を提供することにより、上述した課題を解決することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームから構成されるワクチン担体。
【請求項２】
サクシニル化ポリグリシドールを、10〜40重量％含む、請求項1に記載のワクチン担体。
【請求項３】
サクシニル化ポリグリシドールを、30重量％含む、請求項2に記載のワクチン担体。
【請求項４】
リポソームを構成する脂質が、ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（DSPE）、ジパルミトイルフォスファチジルセリン（DPPS）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（DMPC）、卵黄レシチン（egg PC）またはコレステロールのいずれか、もしくはこれらのいずれかの組み合わせから構成される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のワクチン担体。
【請求項５】
リポソームが、ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）およびジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（DSPE）の組み合わせから構成される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のワクチン担体。
【請求項６】
リポソーム中に含まれる免疫原を抗原提示細胞への内在化を可能にすることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載のワクチン担体。
【請求項７】
リポソーム中に含まれる免疫原を経粘膜的に投与するための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のワクチン担体。
【請求項８】
リポソーム中に含まれる免疫原を非経粘膜的に投与するための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のワクチン担体。
【請求項９】
免疫化のために投与すべき免疫原を、サクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームから構成されるワクチン担体中に含ませた、ワクチン。
【請求項１０】
免疫原に対する細胞性免疫を誘導させるための、請求項9に記載のワクチン。
【請求項１１】
免疫原に対する体液性免疫もまた誘導させるための、請求項10に記載のワクチン。
【請求項１２】
ワクチン担体中にサクシニル化ポリグリシドールを10〜40重量％含む、請求項9〜11のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項１３】
ワクチン担体中にサクシニル化ポリグリシドールを30重量％含む、請求項12に記載のワクチン。
【請求項１４】
ワクチン担体のリポソームを構成する脂質が、ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（DSPE）、ジパルミトイルフォスファチジルセリン（DPPS）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（DMPC）、卵黄レシチン（egg PC）またはコレステロールのいずれか、もしくはこれらのいずれかの組み合わせから構成される、請求項9〜13のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項１５】
ワクチン担体中のリポソームが、ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）およびジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（DSPE）の組み合わせから構成される、請求項9〜14のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項１６】
リポソーム中に含まれる免疫原を抗原提示細胞中に内在化させることを可能にする、請求項9〜15のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項１７】
免疫原を経粘膜的に投与するための、請求項9〜16のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項１８】
免疫原を非経粘膜的に投与するための、請求項9〜16のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項１９】
免疫原が、細菌、ウィルス、原虫のいずれかに由来する抗原から選択される、請求項9〜18のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２０】
細菌が、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、エロモナス、マイコプラズマから選択される、請求項19に記載のワクチン。
【請求項２１】
ウィルスが、ニューカッスル病ウイルスである、請求項19に記載のワクチン。
【請求項２２】
原虫が、トリパノソーマである、請求項19に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜融合性脂質膜を有するリポソームを使用した新規ワクチン担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の免疫系は、自己と非自己とを識別し、非自己を体内から排除する様に機能する。このような自己と非自己との区別を行う生体内の免疫反応は、MHCクラスI分子を利用した細胞性免疫、そしてMHCクラスII分子を利用した体液性免疫により担われている。例えば感染症病原体であるウィルスや細菌が感染した場合、生体は、これらの細胞性免疫や体液性免疫を使って、これらの感染症病原体を排除する。【０００３】
このような感染症病原体に対する予防手段としてしばしば利用されるのがワクチン接種である。ヒトの場合にも、家畜動物やコンパニオンアニマルの場合にも、非常に他種類のワクチンが利用されている。【０００４】
これらのワクチンは、大きく分けて、不活化ワクチン（トキソイドワクチンも含む）と弱毒生ワクチンの2種類のタイプに分類される。不活化ワクチンは、病原体またはトキソイドをホルマリンやその他の化学処理により感染力を失わせ、不活化した形態で投与するワクチン、または病原体の抗原部分のみを投与するワクチンのことであり、例えばヒトのワクチンの場合、三種混合ワクチン（ジフテリア、破傷風トキソイド、百日咳）や日本脳炎ワクチン、インフルエンザワクチン、破傷風トキソイドワクチン等がこのタイプである。一方、弱毒生ワクチンは、毒力は弱いが感染力を有する病原体、すなわち天然に存在する弱毒株や人為的に作られた弱毒変異株を投与するワクチンのことであり、例えばヒトのワクチンの場合、BCGワクチン、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、おたふくかぜワクチン、水痘ワクチン（水疱瘡）等がこのタイプである。【０００５】
不活化ワクチンは、ワクチン投与の結果として、病原体による感染の可能性が低く、副作用が生じにくいという利点があり、その一方で体液性免疫しか獲得できないという特徴を有する。一方、弱毒生ワクチンの場合には、生きている病原体を使うため、何らかの理由で毒性を回復して副作用を発現する可能性もあるという欠点を有する。そして、経口投与する一部の弱毒生ワクチン（例えば、ポリオ）の事例を除き、一般にワクチンは筋肉注射により投与するため、IgG抗体の抗体価は上昇するものの、その他のクラスの抗体（例えば、IgAやIgM）の抗体価が上昇しないという問題点、また感染防御に重要である細胞性免疫応答も十分に誘導できないという問題点もまた有している。【０００６】
感染症病原体の感染は、鼻、気管、腸管、目などの粘膜表面から病原体が体内に侵入することから始まるため、ワクチン接種により細胞性免疫を誘導することができれば、病原体の体内への侵入を水際で防御することができることになる。しかしながら、生体における粘膜は、口腔、鼻腔、消化管および生殖器などの管腔表面および眼の粘膜表面を覆っているが、その表面では、絶えず曝露されているウィルス、細菌などの病原微生物、食餌性抗原、異物に対して、分泌型IgAや粘膜付属リンパ組織を主体とした、粘膜免疫が機能している。この粘膜免疫は、粘膜面からのタンパク質抗原の吸収を抑制し、細菌やウィルスの粘膜上皮への吸着を阻止し、上皮細胞に観戦したウィルスを中和する等の多様な作用を発揮して、これら異物が体内に侵入することを防止している。【０００７】
しかしながら、上述したように、従来からのワクチン接種の多くは、IgG抗体以外のクラスの抗体（例えば、IgAやIgM）の抗体価が上昇せず、また細胞性免疫応答も十分に誘導できないため、感染性病原体の感染部位である粘膜面に対しては、効果的に抗原特異的な抗体（分泌型IgA）産生を含む免疫応答を誘導することができないという問題点があった。その様な問題点を解決するために、経口免疫や経鼻免疫などといった、粘膜面を介して抗原を投与することにより、全身性ならびに全身の粘膜面に抗原特異的免疫応答を誘導することができると考えられ、検討が行われた。【０００８】
このような粘膜免疫を付与することを目的として、リポソーム中に抗原を含ませて、それをワクチンとして粘膜に投与する試みが行われてきた。例えば、ニワトリにおいて、Salmonella enterica血清型Enteritidis抗原を免疫原としてリポソーム中に含ませ、そのリポソームをニワトリに点眼することにより、全身性の免疫応答を誘導でき、腸管内腔からのSalmonella enterica血清型Enteritidisの侵入を阻害することができることが示された（非特許文献1および非特許文献2）。【０００９】
しかしながら、ワクチン製造の分野においては、さらに効率的に様々なクラスの抗体の抗体価（体液性免疫応答）や細胞性免疫応答を上昇させることができるワクチン担体を開発することが求められている。
【非特許文献１】Fukutome, K., et al., Developmental and Comparative Immunology, 25, 2001, 475-484
【非特許文献２】Li, W., et al., Developmental and Comparative Immunology, 28, 2004, 29-38
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明においては、体液性ならびに細胞性免疫応答を効率よく誘導できるワクチンの製造のために使用することができる、新規なワクチン担体を作製することを課題とする。本発明はまた、体液性ならびに細胞性免疫応答を効率よく誘導できるワクチンを提供することもまた、課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の発明者らは、膜融合性脂質（サクシニル化ポリグリシドール）を含むリポソームを使用することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにし、発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、サクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームから構成されるワクチン担体を提供することにより、上述した課題を解決することができる。
【発明の効果】
【００１２】
上述したサクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームから構成されるワクチン担体を使用してワクチンを作製することにより、従来のリポソームから構成されるワクチン担体を使用した場合と比較して、顕著に抗体価を上昇させることができる効率的なワクチンを得ることができる。また、上述したワクチン担体を使用して作製したワクチンにより、体液性免疫だけでなく、細胞性免疫を効率よく誘導することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチン、OVA-リポソームによるワクチン、およびOVAのみによるワクチンを、BALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合の、血清中におけるOVA特異的IgM抗体、IgG抗体、およびIgE抗体の抗体価を示す図である。
【図２】図2は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチン、OVA-リポソームによるワクチン、およびOVAのみによるワクチンをBALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合の、血清中におけるOVA特異的IgG抗体のサブクラス（IgG1、IgG2aおよびIgG3）の抗体価を示す図である。
【図３】図3は、経鼻的に免疫した場合の腸液中の抗体クラス誘導の結果を示す図である。
【図４】図4は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを腹腔内に免疫したマウスの脾臓リンパ球におけるIFN-γ遺伝子およびIL-4遺伝子のmRNAの発現を、RT-PCR法により調べた結果を示す図である。
【図５】図5は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを腹腔内に免疫したマウスの脾臓リンパ球培養上清中におけるIFN-γおよびIL-4の定量結果を示す図である。
【図６】図6は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチン、OVA-リポソームによるワクチン、およびOVAのみによるワクチンをBALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合の、血清中におけるOVA特異的IgM抗体、IgG抗体、およびIgE抗体の抗体価を示す図である。
【図７】図7は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチン、OVA-リポソームによるワクチン、およびOVAのみによるワクチンをBALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合の、血清中におけるOVA特異的IgG抗体のサブクラス（IgG1、IgG2aおよびIgG3）の抗体価を示す図である。
【図８】図8は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを腹腔内に免疫したマウスの脾臓リンパ球におけるIFN-γ遺伝子およびIL-4遺伝子のmRNAの発現を、RT-PCR法により調べた結果を示す図である。
【図９】図9は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを腹腔内に免疫したマウスの脾臓リンパ球培養上清中におけるIFN-γおよびIL-4の定量結果を示す図である。
【図１０】図10は、Salmonella Enteritidis抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、点眼により投与して免疫したニワトリの血中抗体の抗体価についての結果を示す図である。
【図１１】図11は、トリパノソーマ（Trypanosoma brucei）の抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、経鼻的に投与して免疫したマウスの血中抗体の抗体価についての結果を示す図である。
【図１２】図12は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、経鼻的に投与して免疫したウシの血中抗体の抗体価についての結果を示す図である。
【図１３】図13は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、経鼻的に投与して免疫したウシの乳汁中抗体の抗体価についての結果を示す図である。
【図１４】図14は、Aeromonas salmonicidaの抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、経口的に投与して免疫したコイの血中抗体の抗体価についての結果を示す図である。
【図１５】図15は、Aeromonas salmonicidaの抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、経口的に投与して免疫したコイの腸液中および胆汁中抗体の抗体価についての結果を示す図である。
【図１６】図16は、Aeromonas salmonicidaの抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、経口的に投与して免疫したコイの生存率の推移を示す図である。
【図１７】図17は、Mycoplasma gallisepticumの抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、経鼻的に投与して免疫したマウスの血中抗体の抗体価についての結果を示す図である。
【図１８】図18は、ニューカッスル病ウイルスの抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、経鼻的に投与して免疫したマウスの血中抗体の抗体価についての結果を示す図である。
【発明の実施の形態】
【００１４】
上述したように、本発明は、サクシニル化ポリグリシドール（SucPG）を含むリポソームから構成されるワクチン担体を提供することを特徴とする。このリポソームから構成されるワクチン担体を使用する場合、リポソーム中に含まれる免疫原が不活化ワクチンであるか弱毒生ワクチンであるかに関わらず、また投与経路に関わらず、IgG抗体の抗体価だけでなくその他のクラスの抗体の抗体価もまた上昇させることができ、さらに体液性免疫だけでなく細胞性免疫もまた誘導することができた。
【００１５】
本発明のサクシニル化ポリグリシドール（SucPG）を含むリポソームから構成されるワクチン担体を使用する場合に誘導された細胞性免疫は、免疫原を抗原提示細胞内部に内在化させることにより、達成されたものであると考えられる。すなわち、本発明のワクチン担体を使用することにより、免疫原をリポソームの内腔に含ませることができるため、免疫原を抗原提示細胞内部に内在化させることが可能である。その結果、抗原提示細胞中に取り込まれた免疫原は、自己成分としてMHCクラスI分子と組み合わされて抗原提示細胞表面上に抗原提示され、その結果、細胞性免疫が誘導されたものと考えられた。
【００１６】
ここで、サクシニル化ポリグリシドール（SucPG）とは、アルキル基を有することを特徴とする両親媒性の化合物である。アルキル基を有することにより、SucPGはリポソーム膜にアンカリングが可能となる。SucPGのアルキル基の炭素数は6〜24で良く、炭素数6〜18のアルキル基がより好ましい。最も好ましくは、アルキル基は、炭素数10のn-デシル基である。SucPGは、両親媒性のポリエチレングリコールと類似の主鎖骨格および側鎖にカルボキシル基を有するため、中性環境下ではリポソーム膜を安定化させるが、酸性環境下では側鎖カルボキシル基がプロトン化され、膜融合を誘起するという特徴を有する。このSucPGをリポソーム膜に組み込むことにより、そのリポソーム（SucPG-リポソーム）は、酸性環境下において膜融合能を発現するようになる。つまり、SucPG-リポソームがエンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれた場合、ライソゾーム内のpHが低下する。そのときSucPG-リポソームは、膜融合性を発揮してライソゾーム膜と融合し、封入している抗原物質を細胞質内に放出させる（抗原の内在化）ことができる。
【００１７】
本発明において使用するSucPGは、合成高分子ポリグリシドールを無水コハク酸とN,N-ジメチルフォルムアミド中において80℃で6時間反応させることにより作製することができる。
【００１８】
本発明においては、ワクチン担体に使用するリポソームを構成する脂質に対して、サクシニル化ポリグリシドールを添加することが特徴である。より具体的には、本発明のワクチン担体においては、リポソームを構成する脂質に対して、10〜40重量％、好ましくは20〜35重量％、最も好ましくは30重量％のサクシニル化ポリグリシドールが含まれる。
【００１９】
本発明のワクチン担体は、リポソームの内部に含まれる免疫原を経粘膜的に投与するために使用することができる。本発明において「粘膜」という場合、消化器、呼吸器、泌尿生殖器などの管腔臓器の内腔面を覆う部位の総称を意味し、その自由面は粘液腺や杯細胞からの分泌物で常に湿潤している。本発明のワクチン担体を適用することができる粘膜としては、口腔、咽喉、鼻腔、耳腔、結膜のう、腟、肛門などがある。これらの粘膜面に対して免疫原を含むリポソームを適用することにより、粘膜面を経由して免疫原を体内に取り込むことができる。
【００２０】
本発明のワクチン担体は、ワクチン担体のリポソームの内部に含まれる免疫原を非経粘膜的に投与することにより送達するために使用することもできる。本発明において経粘膜以外の経路という場合、ワクチン担体のリポソームの内部に含まれる免疫原を腹腔内投与することなどが含まれる。例えば、免疫原を腹腔内に投与すると、腹腔内の胃腸管、生殖器、肝臓、膵臓などの臓器表面から、免疫原を体内に取り込むことができる。このようにして免疫原を体内に投与すると、体内の至る所の存在する抗原提示細胞へ免疫原を取り込ませることができる。
【００２１】
本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジルセリン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、もしくはフォスファチジルグリセロール類、コレステロール（Chol）類等が挙げられる。本発明においてリポソームを作製する場合、ここに列挙する脂質を単独で使用しても、もしくはこれらのいずれかを組み合わせて使用してもよい。
【００２２】
本発明のリポソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン（DMPC）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジオレイルフォスファチジルコリン（DOPC）卵黄レシチン（egg PC）等が好ましい。
【００２３】
また、本発明のリポソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（DSPE）等が好ましい。
【００２４】
また、本発明のリポソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジルセリン類としては、ジオレイルフォスファチジルセリン（DOPS）、ジパルミトイルフォスファチジルセリン（DPPS）等が好ましい。
【００２５】
本発明のリポソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が好ましい。
【００２６】
本発明のリポソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好ましい。
【００２７】
好ましくは、上記に挙げた化合物の中でも、DOPE、DPPC、DSPC、DPPS、DSPE、Chol等が用いられる。
【００２８】
上記の脂質を混合して使用する場合、それぞれの脂質の配合比率は、リポソームの所望の大きさ、所望の流動性等により適宜決定することができる。本発明においては、DOPE：DPPCを1：1で混合してリポソームを作製することが好ましい。
【００２９】
リポソームは、その構造又は作製法によって、MLV（multilamellar vesicles、多重層リポソーム）、DRV（dehydration-rehydration vesicles、再水和リポソーム）、LUV（large umilamellar vesicles、大きな単層リポソーム）あるいはSUV（small unilamellar vesicles、小さな単層リポソーム）などに分類される。本発明のサクシニル化ポリグリシドール（SucPG）を含むリポソームにも多層膜で構成されるMLV、DRV、LUV、又はSUVなどの種類が存在する。
【００３０】
SucPGを含むリポソームを作製する際には、従来から知られているリポソームの製造方法であれば、どのような方法を使用してもよい。リポソームの製造方法としては、当該技術分野において、これまで種々の方法が知られている。
【００３１】
例えば、一般的なリポソームの製造方法として（1）脂質を適当な有機溶媒（たとえば、クロロホルム、エーテル等）に溶解させ、減圧下にてこれらの溶媒を留去し、一旦脂質薄膜を形成させた後、この脂質薄膜を機械的撹拌手段により水に水和（または膨潤）させる方法、（2）脂質をエーテルあるいはエタノール等の有機溶媒に溶解させ、この溶液を高温に暖めた水中にシリンジあるいはノズル等より、加圧下、一定速度で注入し、注入とともに有機溶媒が留去あるいは希釈されることにより脂質が二重層を形成し、リポソームが調製される方法、（3）脂質をコール酸あるいはデオキシコール酸などの界面活性剤とともに水溶液中で混合ミセルを形成させ、該ミセル溶液を透析あるいはゲル濾過等の操作によりコール酸あるいはデオキシコール酸などの界面活性剤を除去し、リポソームを調製する方法、（4）脂質を溶解した有機溶媒を水相に加え、超音波処理し、一旦W／O型エマルションを形成し、ついで有機溶媒を除去することによりゲル化させ、このゲルを機械的撹拌により転相させリポソームを調製する方法、（5）薄膜を形成させた脂質に水系溶媒を加えて水和・膨潤させ、機械的振動により容器から脂質薄膜を剥離させた後、超音波処理、またはフレンチプレス、加圧ろ過器あるいはエクストルーダーを用いて一定の大きさの孔を通す事によってリポソームを作製する方法、（6）リポソームを凍結乾燥した後、水系溶媒で再水和させることによりリポソームを作製する方法等が挙げられる。
【００３２】
本発明のワクチン担体には、免疫賦活活性を追加することを目的として、アジュバントがさらに含まれてもよい。本発明のワクチン担体に含ませることができるアジュバントとしては、モノフォスフォリルリピドA、サイトカイン、レクチン等が挙げられる。
【００３３】
本発明のワクチン担体に含ませる免疫原には、特に限定はなく、ヒトまたは動物（哺乳動物、魚類など）においてワクチン接種が望まれる免疫原のいずれを含ませてもよい。免疫原としては、細菌由来の免疫原、ウィルス由来の免疫原、原虫由来の免疫原などが含まれる。
【００３４】
例えば、本発明のワクチン担体をヒトの免疫原に適用する場合、ウィルス由来の免疫原としてインフルエンザウィルス抗原、SARSウイルス抗原、AIDSウイルス抗原などのいずれかを、細菌由来の免疫原として病原性大腸菌O-157抗原、サルモネラ抗原、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス抗原、結核菌抗原などのいずれかを、原虫由来の免疫原としてトリパノソーマ抗原、コクシジウム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原などのいずれかを、ワクチン担体に含ませてもよい。
【００３５】
本発明のワクチン担体を動物の免疫原に適用する場合、家畜の感染症として重要な感染病原体由来の抗原のいずれか、例えばニワトリの場合には、細菌由来の免疫原であるSalmonella enterica血清型Enteritidis抗原、Haemophilus paragallinarum抗原など、ウィルス由来の免疫原であるニワトリインフルエンザウィルス抗原、ニューカッスル病ウイルス抗原、伝染性気管支炎ウイルス抗原など、原虫由来の免疫原であるロイコチトゾーン抗原、アイメリア抗原など；ブタの場合には、ウィルス由来の免疫原である伝染性胃腸炎ウイルス抗原、細菌由来の免疫原であるBordetella bronchiseptica抗原、原虫由来の免疫原であるトキソプラズマ抗原、アイメリア抗原など；ウシの場合には、ウィルス由来の免疫原である牛ウイルス性下痢・粘膜病ウイルス抗原、細菌由来の免疫原である黄色ブドウ球菌抗原、Mycobacterium avium亜種paratuberculosis抗原、原虫由来の免疫原であるタイレリア抗原、バベシア抗原など；ウマの場合には、ウィルス由来の免疫原である馬鼻肺炎ウイルス抗原、馬インフルエンザウイルス抗原、原虫由来の免疫原であるトリパノゾーマ抗原、バベシア抗原など；魚類の場合には、細菌由来の免疫原であるビブリオ抗原、エロモナス抗原など、ウィルス由来の免疫原である伝染性膵臓壊死症ウイルス抗原、イリドウイルス抗原など、原虫由来の免疫原であるイクチオボド原虫抗原、ヘキサミタ原虫抗原など；を含ませることができる。
【実施例】
【００３６】
実施例1：サクシニル化ポリグリシドール（SucPG）リポソームの作製
SucPGを含むリポソームとして、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）（Sigma）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）（Sigma）のモル比1：1（それぞれ10μモル）からなる脂質組成に、SucPGを脂質重量比で10％、20％または30％添加し、SucPG濃度の異なる3種類のSucPGを含むリポソームを作製した。本実施例で使用するSucPGは、アルキル基として炭素数10のn-デシル基を有するものであり、文献に記載された方法にしたがって、合成した（Kono K., et al., J. Controlled Release, 68, 225-235 (2000)；Kono K., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1325, 143-154 (1997)；またはKono K., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1193, 1-9 (1994)）。具体的には、ポリエピクロロホドリンをジメチルホルムアミド中、酢酸カリウム存在下で、175℃、6時間反応させることによりポリグリシジルアセテートを作製し、作製されたポリグリシジルアセテートをさらにメチルカルビトール中、酢酸カリウム存在下で150℃、1時間反応させることによりポリグリシドールを合成した。この様に合成した合成高分子ポリグリシドールを無水コハク酸とN,N-ジメチルフォルムアミド中において80℃で6時間反応させることによりSucPGを作製した。【００３７】
リポソームの作製は、例えば特許文献1に記載する様に製造する。具体的には、まず2μモルのDPPC、2μモルのDOPEおよびSucPGを有機溶媒中に溶解し、コニカルフラスコ中で混合する。この脂質を、ロータリーエバポレーターを使用して乾燥し、そしてデシケーター中で減圧下にて30分間静置する。モデル抗原として4 mg/mlの卵白アルブミン（OVA）を添加し35〜40℃にて3分間インキュベートした後、激しく振動攪拌することにより、脂質フィルムを分散させる。このようにして、リポソーム中にモデル抗原のOVAを封入させる。一方、リポソーム中に封入されなかったOVAを、14000 gで20分間、4℃にて遠心処理することを繰り返すことにより除去し、モデル抗原OVAを封入したリポソームを精製する。このようにして、多重層型のリポソーム（OVA-SucPG-リポソーム）（MLV）を作製した。【００３８】
実施例2：サクシニル化ポリグリシドール（SucPG）リポソームによるワクチンを経粘膜投与した場合の免疫応答の検討
本実施例は、実施例1において作製したSucPGを含むリポソームによるワクチンを経粘膜投与した場合の免疫応答について、SucPGを含まないリポソームによるワクチンと比較検討することを目的として行った。【００３９】
SucPGを含むリポソームによるワクチンは、実施例1に記載する様に作製した。一方、SucPGを含まないリポソームによるワクチンとして、DPPC：DOPEのモル比1：1からなる脂質組成でOVAを封入させることにより、多重層型のリポソーム（OVA-リポソーム）（MLV）によるワクチンを作製した。【００４０】
上記の様にして作製したOVA-SucPG-リポソームによるワクチンおよびOVA-リポソームによるワクチン、さらにOVAのみによるワクチンのそれぞれを、BALB/cマウスに対して経鼻的に7日間隔で2回、それぞれ100μg/匹のOVAとなるように投与した。【００４１】
免疫原の最終投与後7日後に眼窩静脈叢から血液を0.1 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗OVA抗体（IgM、IgG、またはIgE）の産生についてELISA法により検討した。また、最終投与後7日後に腸液を採取し、抗OVA抗体（IgA、またはIgG）の産生についてELISA法により検討した。さらに、得られた免疫血清を用いて、抗OVA-IgGのサブクラスについてもELISA法を用いて解析した。【００４２】
結果を図1〜図3に示す。図1は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチン、OVA-リポソームによるワクチン、およびOVAのみによるワクチンを、BALB/cマウスの経鼻的に免疫した場合の免疫応答について血清中の抗体クラス誘導の結果を示したものであり、黒色カラムはOVAのみを免疫した場合（OVA）、灰色カラムはOVA-リポソームを免疫した場合（OVA-lipo）、そして白色カラムはOVA-SucPG-リポソームを免疫した場合（OVA-SucPG-lipo）の結果をそれぞれ示す。図2は、血清中に誘導された抗OVA-IgG抗体のサブクラスをさらに示したものである。図3は、経鼻的に免疫した場合の腸液中の抗体クラス誘導の結果を示したものである。図2および図3において、各カラムの免疫抗原に関する説明は、図1において上述したものと同様である。【００４３】
図1に示される結果から、各種免疫原をBALB/cマウスの鼻腔内に免疫した場合、IgAおよびIgGクラスの抗体が体内で生成されることがわかり、全体的にIgGクラス抗体の方がIgAクラス抗体よりも産生量が多かった。また、各クラスの抗体について、ワクチン担体の種類と産生される抗体量とを対比したところ、OVAのみによるワクチンまたはOVA-リポソームによるワクチンを免疫した場合と比較したところ、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを用いて免疫した場合には、顕著に効率よく抗体産生を誘導できることが示された（p＜0.0027）。【００４４】
また、図2に示される結果から、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを用いて免疫した場合には、Th2（体液性免疫）タイプのIgGサブクラスであるIgG1のみならず、Th1（細胞性免疫）タイプのIgGサブクラスであるIgG2aおよびIgG3を誘導できることが示された。これに対して、OVA-リポソームによるワクチンを用いて免疫した場合、およびOVAのみによるワクチンを用いて免疫した場合には、ほぼIgG1しか産生できなかったが、そのIgG1抗体の産生量についても、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを用いて免疫した場合には、他のワクチン担体によるワクチン（OVA-リポソームによるワクチンまたはOVAのみによるワクチン）を用いて免疫した場合よりも、顕著に効率よく抗体産生を誘導できることが示された（p＜0.011）。【００４５】
さらに、図3から、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを経鼻的に使用すると、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンと比較して、効率よく腸管に抗体産生を誘導できることが示された。【００４６】
したがって、一般に、SucPGを含むリポソームによるワクチンを経粘膜投与した場合、抗原提示細胞に対して効率よく抗原導入をすることができ、その結果として高い血中での抗体産生および高い腸管での抗体産生を誘導できること、そしてさらに体液性免疫のみならず、細胞性免疫応答の誘導を行う可能性が示された。【００４７】
実施例3：SucPGを含むリポソームによるワクチンの経粘膜投与による細胞性免疫応答の誘導
実施例2において、SucPGを含むリポソームによるワクチンを用いて抗原を経粘膜投与を通じて免疫することにより、細胞性免疫応答の誘導を行う可能性が示されたことから、本実施例においては、SucPGを含むリポソームによるワクチンを用いた場合の細胞性免疫応答能について検討した。【００４８】
実施例1において作製したOVA-SucPG-リポソームによるワクチンを、BALB/cマウスの鼻腔内に7日間隔で2回、100μg/匹のOVAとなるように投与した。最終投与後7日後にマウスを犠死させ、脾臓を摘出し、比重遠心法により、脾臓リンパ球を精製した。【００４９】
精製脾臓リンパ球からTRIzolTM（Invitrogen社）を用いて全RNAを抽出し、細胞性免疫の指標であるIFN-γおよび、IL-4のmRNA発現について、RT-PCR法で調べた。【００５０】
まず、全RNAからcDNAを合成した。全RNA 1μg〜5μgとオリゴ（dT）12-18プライマー500 ng、dNTP Mix 10 nmolを総量が12μlになるように混合し、65℃で5分間反応させ、氷上で急速に冷却した。ついで、4μlの5×First-Strand Buffer、2μlの0.1M DTT、1μlのRNaseOUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor（40 units/μl）（Invitrogen社）を加えて、42℃で2分間反応させ、SuperScriptTM II逆転写酵素（Invitrogen社）を200 units加えた。さらに42℃で50分間反応させた後、逆転写酵素を不活化するため、70℃で15分間反応させた。【００５１】
得られたcDNA 1μlと各プライマー2.5 pmol、37.5 nmol MgCl2、10 nmol dNTP Mix、1 unit Taq DNA Polymerase（Invitrogen社）をPCR Bufferに加えて総量を25μlとし、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000（TaKaRa社）でPCR反応をおこなった。PCR反応は、94℃で5分間反応後、94℃ 45秒、60℃ 45秒、72℃ 2分の反応を35回繰り返し、72℃で7分間反応させることにより行った。PCR後のサンプルは2％のアガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。【００５２】
本実施例においては、マウスIFN-γ遺伝子を増幅するためのプライマーとして、
フォワードプライマー：5'-tgcatcttggcttgcagctcttcctcatggc-3'（SEQ ID NO: 1）、および
リバースプライマー：5'-tggacctgtgggttgttgacctcaaacttggc-3'（SEQ ID NO: 2）、
そしてマウスIL-4遺伝子を増幅するためのプライマーとして、
フォワードプライマー：5'-ccagctagttgtcatcctgctcttctttctcg-3'（SEQ ID NO: 3）、および
リバースプライマー：5'-cagtgatgtggacttggactcattcatggtgc-3'（SEQ ID NO: 4）、
を使用した（それぞれCLONTEC社）。対照としてマウスG3PDH遺伝子を増幅するためのプライマーとして、
フォワードプライマー：5'-accacagtccatgccatcac-3'（SEQ ID NO: 5）、および
リバースプライマー：5'-tccaccaccctgttgctgta-3'（SEQ ID NO: 6）、
も使用した。【００５３】
IFN-γおよびIL-4のmRNAの発現についての測定結果を、図4に示す。図4のレーン1は陽性対照、レーン2は200μlの生理食塩水を腹腔内に注射した陰性対照マウス由来の全RNA、レーン3はOVA-SucPG-リポソームを腹腔内に免疫したマウス由来の全RNA、そしてレーン4はOVAを含まないSucPG-リポソームを腹腔内に免疫した陰性対照マウス由来の全RNAを、それぞれ鋳型としてRT-PCRを行った結果を示す。図4に示す通り、OVA-SucPG-リポソームを免疫したマウスの脾臓リンパ球において、細胞性免疫反応の指標であるIFN-γのmRNAおよび体液性免疫反応の指標であるIL-4のmRNAの両方が発現されていることが明らかになった。【００５４】
また本実施例においては、同時に、精製脾臓リンパ球をOVA添加培地で5日間培養し、培養上清中に放出されたIFN-γ量およびIL-4量を細胞性免疫ならびに体液性免疫の指標として測定した。培養上清中のIFN-γおよびIL-4の定量は、それぞれの定量キット（Endogen社）を使用しておこなった。【００５５】
脾臓リンパ球培養上清中に放出されたIFN-γ量およびIL-4量の定量結果を図5に示す。図5のレーン1はOVAを含まないSucPG-リポソームを鼻腔内に免疫した陰性対照マウス由来の脾臓リンパ球から産生されたIFN-γ量およびIL-4量を、そしてレーン2は、OVA-SucPG-リポソームを鼻腔内に免疫したマウス由来の脾臓リンパ球から産生されたIFN-γ量およびIL-4量を、それぞれ示す。図5に示す通り、OVA-SucPG-リポソームを免疫したマウスの脾臓リンパ球の培養上清中において、細胞性免疫反応の指標であるIFN-γおよび体液性免疫反応の指標であるIL-4の両方が、有意に高く産生されていることが明らかになった（p＜0.0001）。【００５６】
実施例2および3に示す結果から、本発明のSucPGを含むリポソームによるワクチンは、経鼻免疫を行うことにより、体液性免疫のみならず、細胞性免疫もまた誘導できることが示され、本発明のSucPGを含むリポソームが、経粘膜ワクチンの抗原キャリアとして有用であることが示された。【００５７】
実施例4：サクシニル化ポリグリシドール（SucPG）リポソームによるワクチンの非経粘膜投与の場合の免疫応答の検討
本実施例は、実施例1において作製したSucPGを含むリポソームによるワクチンを非経粘膜投与した場合の免疫応答について、SucPGを含まないリポソームによるワクチン比較検討することを目的として行った。【００５８】
SucPGを含むリポソームによるワクチンは、実施例1に記載する様に作製した。一方、SucPGを含まないリポソームによるワクチンとして、DPPC：DOPEのモル比1：1からなる脂質組成でOVAを封入させることにより、多重層型のリポソーム（OVA-リポソーム）（MLV）によるワクチンを作製した。【００５９】
上記の様にして作製したOVA-SucPG-リポソームによるワクチンおよびOVA-リポソームによるワクチン、さらにOVAのみによるワクチンを、BALB/cマウスの腹腔内に7日間隔で2回、それぞれ100μg/匹のOVAとなるように投与した。【００６０】
免疫原の最終投与後7日後に眼窩静脈叢から血液を0.1 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗OVA抗体（IgM、IgG、またはIgE）の産生についてELISA法により検討した。さらに、得られた免疫血清を用いて、抗OVA-IgGのサブクラスについてもELISA法を用いて解析した。【００６１】
結果を図6および図7に示す。図6は、OVA-SucPG-リポソームによるワクチン、OVA-リポソームによるワクチン、およびOVAのみによるワクチンを、BALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合の免疫応答についての結果を示したものであり、黒色カラムはOVAのみを免疫した場合（OVA）、灰色カラムはOVA-リポソームを免疫した場合（OVA-lipo）、そして白色カラムはOVA-SucPG-リポソームを免疫した場合（OVA-SucPG-lipo）の結果をそれぞれ示す。図7は、抗OVA-IgG抗体のサブクラスに示したものであり、各カラムの免疫抗原に関する説明は、図6において上述したものと同様である。【００６２】
図6に示される結果から、各種免疫原をBALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合、IgMおよびIgGクラスの抗体が体内で生成されることがわかり、全体的にIgGクラス抗体の方がIgMクラス抗体よりも産生量が多かった。また、各クラスの抗体について、ワクチン担体の種類と産生される抗体量とを対比したところ、OVAのみによるワクチンを免疫した場合よりもOVA-リポソームによるワクチンを免疫した場合の方が抗体産生量は多かったもののt検定の結果、有意差は存在しなかったが、OVA-リポソームによるワクチンを免疫した場合とOVA-SucPG-リポソームによるワクチンを用いて免疫した場合とを比較したところ、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを用いて免疫した場合には、顕著に効率よく抗体産生を誘導できることが示された（p＜0.019）。【００６３】
また、図7に示される結果から、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを用いて免疫した場合には、Th2（体液性免疫）タイプのIgGサブクラスであるIgG1のみならず、Th1（細胞性免疫）タイプのIgGサブクラスであるIgG2aおよびIgG3を誘導できることが示された。これに対して、OVA-リポソームによるワクチンを用いて免疫した場合、およびOVAのみによるワクチンを用いて免疫した場合には、ほぼIgG1しか産生できなかったが、そのIgG1抗体の産生量についても、OVA-SucPG-リポソームによるワクチンを用いて免疫した場合には、他のワクチン担体によるワクチン（OVA-SucPG-リポソームによるワクチンまたはOVAのみによるワクチン）を用いて免疫した場合よりも、顕著に効率よく抗体産生を誘導できることが示された（p＜0.019）。【００６４】
したがって、一般に、SucPGを含むリポソームによるワクチンを非経粘膜投与した場合、抗原提示細胞に対して効率よく抗原導入をすることができ、その結果として高い抗体産生を誘導できること、そしてさらに体液性免疫のみならず、細胞性免疫応答の誘導を行う可能性が示された。【００６５】
実施例5：SucPGを含むリポソームによるワクチンの非経粘膜投与による細胞性免疫応答の誘導
実施例4において、SucPGを含むリポソームを用いて抗原を免疫することにより、細胞性免疫応答の誘導を行う可能性が示されたことから、本実施例においては、SucPGを含むリポソームを用いた場合の細胞性免疫応答能について検討した。【００６６】
実施例1において作製したOVA-SucPG-リポソームを、BALB/cマウスの腹腔内に7日間隔で2回、100μg/匹のOVAとなるように投与した。最終投与後7日後にマウスを犠死させ、脾臓を摘出し、比重遠心法により、脾臓リンパ球を精製した。このようにして調製した脾臓リンパ球について、実施例3に記載した様に、IFN-γおよび、IL-4のmRNA発現についてRT-PCR法で、培養上清中に放出されたIFN-γ量およびIL-4量をELISA法で、それぞれ測定した。【００６７】
IFN-γおよびIL-4のmRNAの発現についての測定結果を、図8に示す。図8のレーン1は、OVA-SucPG-リポソームを腹腔内に免疫したマウス由来の全RNA、レーン2は陽性対照、レーン3はOVAを含まないSucPG-リポソームを腹腔内に免疫した陰性対照マウス由来の全RNA、そしてレーン4は200μlの生理食塩水を腹腔内に注射した陰性対照マウス由来の全RNAを、それぞれ鋳型としてRT-PCRを行った結果を示す。図8に示す通り、OVA-SucPG-リポソームを免疫したマウスの脾臓リンパ球において、細胞性免疫反応の指標であるIFN-γのmRNAおよび体液性免疫の指標であるIL-4のmRNAの両方が発現されていることが明らかになった。【００６８】
また脾臓リンパ球培養上清中に放出されたIFN-γ量およびIL-4量の定量結果を図9に示す。図9のレーン1はOVAを含まないSucPG-リポソームを腹腔内に免疫した陰性対照マウス由来の脾臓リンパ球から産生されたIFN-γ量およびIL-4量を、そしてレーン2は、OVA-SucPG-リポソームを腹腔内に免疫したマウス由来の脾臓リンパ球から産生されたIFN-γ量およびIL-4量を、それぞれ示す。図9に示す通り、OVA-SucPG-リポソームを免疫したマウスの脾臓リンパ球の培養上清中において、細胞性免疫反応の指標であるIFN-γおよび体液性免疫の指標であるIL-4の両方が、有意に高く産生されていることが明らかになった（p＜0.0001）。【００６９】
実施例4および5に示す結果から、本発明のSucPGを含むリポソームによるワクチンは、非経鼻的免疫を行う場合でも、経鼻免疫を行う場合と同様に、体液性免疫のみならず、細胞性免疫もまた誘導できることが示され、本発明のSucPGを含むリポソームが、非経粘膜ワクチンの抗原キャリアとしても有用であることが示された。【００７０】
実施例6：サルモネラ抗原-SucPG-リポソームによるワクチンによる、ニワトリに対する点眼（経粘膜）免疫
本実施例は、Salmonella Enteritidis抗原を免疫原として含むSucPGを含むリポソームによるワクチンを、ニワトリに対して、点眼（経粘膜）投与した場合の免疫応答について、検討することを目的として行った。【００７１】
本実施例において使用する免疫原、Salmonella Enteritidis抗原は以下の様に調製した。まずSalmonella Enteritidis（1227株）をハートインフュジョン培地（日水製薬）に接種し、37℃で14時間培養した後、7×1014CFUのSalmonella Enteritidis細菌を採取した。この採取したSalmonella Enteritidis菌を過剰量のホルマリンにより変性させて不活化させ、ホルマリンを除いた後、さらに超音波処理をすることにより抗原液を調製した。このように調製したSalmonella Enteritidis抗原を含むSucPGを含むリポソームによるワクチン（Salmonella Enteritidis抗原-SucPG-リポソームによるワクチン）は、基本的に実施例1に記載する方法にしたがって作製した。【００７２】
上記の様にして作製したSalmonella Enteritidis抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、生後3週齢のニワトリ（白色レグホン）、5羽に対して、100μg/羽の量のSalmonella Enteritidis抗原となるように、点眼により1回投与した。【００７３】
免疫原の投与後14日後（2週（5週齢））、および35日後（5週（8週齢））に翼下静脈から血液を2.0 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗Salmonella Enteritidis抗原抗体（IgGまたはIgA）の産生についてELISA法により検討した。対照として、Salmonella Enteritidis抗原で免疫する前（pre（3週齢））のニワトリ個体から得た血清を使用した。【００７４】
結果を図10に示す。図10において、黒色カラムはIgG抗体の抗体価についての結果を（図10A）、そして白色カラムはIgA抗体の抗体価についての結果を（図10B）、それぞれ示す。そして、免疫前（Day 0）のニワトリ個体における抗体の抗体価と比較して、有意差（p＜0.0001）が存在する場合に＊印を付した。データは、平均±標準誤差を示す。【００７５】
図10に示される結果から、Salmonella Enteritidis抗原-SucPG-リポソームによるワクチンをニワトリに対して点眼投与することにより免疫した場合、IgGおよびIgAクラスの抗体が両方とも体内で、「pre（3週齢）」の場合と比較して顕著に生成されることがわかるが、長期的に（免疫原の最終投与後から5週間（8週齢））見ると、IgGクラス抗体の方がIgAクラス抗体よりも産生量が多いという傾向があった。【００７６】
この結果から、Salmonella Enteritidis抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを点眼（経粘膜）投与することによりニワトリを免疫すると、血中での高い抗体産生を誘導できることが示された。【００７７】
実施例7：トリパノソーマ抗原-SucPG-リポソームによるワクチンによる、マウスに対する経鼻（経粘膜）免疫
本実施例は、トリパノソーマ（Trypanosoma brucei）の抗原を免疫原として含むSucPGを含むリポソームによるワクチンを、マウスに対して、経鼻（経粘膜）投与した場合の免疫応答について、検討することを目的として行った。【００７８】
本実施例において使用する免疫原、T. brucei抗原を得るために、まずT. brucei原虫を採取した。採取の方法は文献に記載された方法にしたがった（Lanham, S. M., Nature, 218, 1273-1274 (1968)）。具体的には、T. brucei原虫（1×105個）をウイスターラット（日本SLC）の腹腔内に接種し、4日後心臓から全血を回収した。回収された血液はヘパリン（10 units/ml）で凝固防止を行い、遠心（1300×g、10分）処理によりバフィーコートを回収した。回収されたバフィーコートからDE52セルロース（Whatman社）カラムにより原虫を精製・採取した。採取されたT. brucei原虫を超音波処理することにより破砕し、T. brucei抗原を得た。このように得られたT. brucei抗原を含むSucPGを含むリポソームによるワクチン（T. brucei抗原-SucPG-リポソームによるワクチン）は、基本的に実施例1に記載する方法にしたがって作製した。【００７９】
上記の様にして作製したT. brucei抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、生後6週齢のBalb/cマウス（日本SLC）、5匹に対して、100μg/匹の量のT. brucei抗原となるように経鼻的に投与し、2週間後に同量のT. brucei抗原をさらに経鼻的に投与して免疫した。【００８０】
免疫原の初回投与後14日後（Day 14）、および最終投与後7日後（Day 21）に眼窩静脈叢から血液を0.1 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗T. brucei抗原抗体（IgGまたはIgM）の産生についてELISA法により検討した。対照として、T. brucei抗原で免疫する前（Day 0）のマウス個体から得た血清を使用した。【００８１】
結果を図11に示す。図11において、黒色カラムはIgM抗体の抗体価についての結果を、そして白色カラムはIgG抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。そして、免疫前（Day 0）のマウス個体における抗体価と比較して有意差（p＜0.0012）が存在する場合に＃印を、有意差（p＜0.0006）が存在する場合に＄印を、有意差（p＜0.0001）が存在する場合に＊印を、それぞれ付した。データは、平均±標準誤差を示す。【００８２】
図11に示される結果から、T. brucei抗原-SucPG-リポソームによるワクチンをマウスに対して経鼻投与することにより免疫した場合、IgMおよびIgGクラスの抗体が体内で、Day 0の場合と比較して顕著に生成されることがわかり、全体としては、IgGクラス抗体の方がIgMクラス抗体よりも産生量が多いという傾向があった。【００８３】
この結果から、T. brucei抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを経鼻的（経粘膜）投与することによりマウスを免疫すると、血中での高い抗体産生を誘導できることが示された。【００８４】
実施例8：黄色ブドウ球菌抗原-SucPG-リポソームによるワクチンによる、搾乳牛に対する経鼻（経粘膜）免疫
本実施例は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の抗原を免疫原として含むSucPGを含むリポソームによるワクチンを、ウシに対して、経鼻（経粘膜）投与した場合の免疫応答について、検討することを目的として行った。【００８５】
本実施例において使用する免疫原、S. aureus抗原は、まずS. aureus（Cowan I株）をLB培地（日水製薬）に接種し、37℃で14時間培養した後S. aureus細菌を採取した。この採取したS. aureus細菌を過剰量のホルマリンにより変性させて不活化させ、ホルマリンを除いた後、さらに超音波処理をすることにより抗原液を調製した。このように調製したS. aureus抗原を含むSucPGを含むリポソームによるワクチン（S. aureus抗原-SucPG-リポソームによるワクチン）は、基本的に実施例1に記載する方法にしたがって作製した。【００８６】
上記の様にして作製したS. aureus抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、ホルスタインの搾乳牛、3頭に対して、5 mg/頭の量のS. aureus抗原となるように経鼻的に投与し、14日後に同量のS. aureus抗原をさらに経鼻的に投与して免疫した。【００８７】
免疫原の初回投与後14日目（Day 14）、免疫原の最終投与後7日目（Day 21）、および14日目（Day 28）に頸静脈から血液を5 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗S. aureus抗原抗体（IgAまたはIgG）の産生についてELISA法により検討した。対照として、S. aureus抗原で免疫する前（Day 0）の搾乳牛個体から得た血清を使用した。【００８８】
結果を図12に示す。図12において、黒色カラムはIgA抗体の抗体価についての結果を、そして白色カラムはIgG抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。そして、免疫前（Day 0）の搾乳牛個体における抗体価と比較して、有意差（p＜0.018）が存在する場合に＃印を、有意差（p＜0.039）が存在する場合に＆印を、有意差（p＜0.0076）が存在する場合に＊印を、有意差（p＜0.0001）が存在する場合に＠印を、有意差（p＜0.017）が存在する場合に†印を、それぞれ付した。データは、平均±標準誤差を示す。【００８９】
図12に示される結果から、S. aureus抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを搾乳牛に対して経鼻投与することにより免疫した場合、血中ではほぼ同程度のIgGおよびIgAクラスの抗体が、Day 0の場合と比較して顕著に生成されることがわかった。【００９０】
また、免疫原の初回投与後14日目（Day 14）、免疫原の最終投与後7日目（Day 21）、および14日目（Day 28）に乳汁を採取し、抗S. aureus抗原抗体（IgGまたはIgA）の産生についてELISA法により検討した。対照として、S. aureus抗原で免疫する前（Day 0）の搾乳牛個体から得た乳汁を使用した。【００９１】
結果を図13に示す。図13において、黒色カラムはIgA抗体の抗体価についての結果を、そして白色カラムはIgG抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。そして、免疫前（Day 0）の搾乳牛個体における抗体価と比較して、有意差（p＜0.0046）が存在する場合に＃印を、有意差（p＝0.054）が存在する場合に＆印を、有意差（p＜0.011）が存在する場合に＊印を、有意差（p＜0.02）が存在する場合に＠印を、有意差（p＜0.025）が存在する場合に†印を、それぞれ付した。データは、平均±標準誤差を示す。【００９２】
図13に示される結果から、S. aureus抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを搾乳牛に対して経鼻投与することにより免疫した場合、乳汁中でIgGおよびIgAクラスの抗体が、Day 0の場合と比較して顕著に生成されることがわかり、全体としては、IgAクラス抗体の方がIgGクラス抗体よりも産生量が多いという傾向があった。【００９３】
これらの結果から、S. aureus抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを経鼻的（経粘膜）投与することにより搾乳牛を免疫すると、血中および乳汁中のいずれでも顕著に高い抗体産生を誘導できることが示された。【００９４】
実施例9：Aeromonas salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンによる、コイに対する経口免疫
本実施例は、Aeromonas salmonicidaの抗原を免疫原として含むSucPGを含むリポソームによるワクチンを、コイに対して、経口（経粘膜）投与した場合の免疫応答について、検討することを目的として行った。【００９５】
本実施例において使用する免疫原、A. salmonicida抗原は、まずA. salmonicida（T1031株）をハートインフュージョン培地に接種し、20℃で24時間培養した後、A. salmonicida細菌を採取し、この採取したA. salmonicida細菌を過剰量のホルマリンにより変性させて不活化させ、ホルマリンを除いた後、さらに超音波処理をすることにより調製した。このようにして調製したA. salmonicida抗原の一部はそのまま免疫原として、別の一部をA. salmonicida抗原を含むSucPGを含むリポソームによるワクチンを調製するために、それぞれ利用した。不活化したA. salmonicida抗原を含むSucPGを含むリポソームによるワクチン（A. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチン）は、基本的に実施例1に記載する方法にしたがって作製した。【００９６】
上記の様にして作製したA. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、コイ（大阪府立食とみどりの総合技術センター・水性生物センターから分与）、6匹に対して、200μg/匹の量のA. salmonicida抗原となるように、経口的に、2週間間隔で3回投与して免疫した。一方、対照として、A. salmonicida抗原のみを、4匹のコイに対して200μg/匹の量のA. salmonicida抗原となるように、経口的に、2週間間隔で3回投与して免疫した。【００９７】
免疫原の初回投与時（Day 0）、2回目投与時（Day 14）、3回目投与時（Day 28）、および最終投与後14日後（Day 42）に尾柄部から血液を1 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗A. salmonicida抗原抗体の産生についてELISA法により検討した。対照として、A. salmonicida抗原のみで免疫したコイ個体から得た血清を使用した。【００９８】
結果を図14に示す。図14において、黒丸（●）はA. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンにより経口免疫したコイの抗体の抗体価についての結果を、そして黒三角（▲）はA. salmonicida抗原のみにより経口免疫したコイの抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。そして、A. salmonicida抗原のみにより経口免疫したコイの抗体の抗体価と比較して、有意差（p＜0.01）が存在する場合に＊印を付した。データは、平均±標準誤差を示す。【００９９】
図14に示される結果から、A. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンをコイに対して経口投与することにより免疫した場合、A. salmonicida抗原のみにより経口免疫したコイと比較して、血中での抗体の抗体価が顕著に亢進されることがわかった。【０１００】
この結果を受けて、A. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンの最終投与後14日後（Day 42）に、コイから腸液と胆汁とを採取し、抗A. salmonicida抗原抗体の産生についてELISA法により検討した。対照として、非免疫のコイ個体から得た腸液および胆汁を使用した。【０１０１】
結果を図15に示す。図15において、腸管粘膜における抗体の抗体価についての結果を（図15A）、そして胆汁中における抗体の抗体価についての結果を（図15B）、それぞれ示す。それぞれの図において、黒色カラムは非免疫のコイ個体における抗体の抗体価についての結果を、そして白色カラムはA. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを投与したコイ個体における抗体の抗体価についての結果をそれぞれ示す。そして、非免疫のコイ個体における抗体の抗体価と比較して、有意差（p＜0.01）が存在する場合に＊印を付した。データは、平均±標準誤差を示す。【０１０２】
図15に示される結果から、A. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンをコイに対して経口投与することにより免疫した場合、腸液中および胆汁中のいずれでも、抗体の抗体価が顕著に亢進されることがわかった。【０１０３】
さらに、A. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンの最終投与後14日後に、6匹のコイをA. salmonicida菌液（1×106 cfu/ml）中に60分間浸漬することによりA. salmonicidaによる攻撃を行い、その後の生存率の推移を記録した。対照として、8匹の非免疫のコイ個体を同様に処理し、その後の生存率の推移を記録した。【０１０４】
結果を図16に示す。図16において、黒丸（●）はA. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンにより経口免疫したコイの生存率の推移を、そして黒三角（▲）は非免疫のコイの生存率の推移を、それぞれ示す。そして、A. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンにより経口免疫したコイの生存率は、非免疫のコイの生存率と比較して高いことが示された。【０１０５】
これらの結果から、魚類であるコイにおいても、A. salmonicida抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを経口的（経粘膜）投与して免疫すると、血中で高い抗体産生を誘導できることが示された。【０１０６】
実施例10：Mycoplasma gallisepticum抗原-SucPG-リポソームによるワクチンによる、マウスに対する経鼻（経粘膜）免疫
本実施例は、Mycoplasma gallisepticumの抗原を免疫原として含むSucPGを含むリポソームによるワクチンを、マウスに対して、経鼻（経粘膜）投与した場合の免疫応答について、検討することを目的として行った。【０１０７】
本実施例において使用する免疫原、Mycoplasma gallisepticum抗原は、まずMycoplasma gallisepticum（S6株）を新鮮イーストエキス添加Fray培地（Difco）に接種し、37℃で48時間以上培養した後、3.58ｘ1011CFUのMycoplasma gallisepticum細菌を採取した。この採取したMycoplasma gallisepticum細菌を過剰量のホルマリンにより変性させて不活化させ、ホルマリンを除いた後、さらに超音波処理をすることにより抗原液を調製した。このように調製したMycoplasma gallisepticum抗原を含むSucPGを含むリポソームによるワクチン（Mycoplasma gallisepticum抗原-SucPG-リポソームによるワクチン）は、基本的に実施例1に記載する方法にしたがって作製した。【０１０８】
上記の様にして作製したMycoplasma gallisepticum抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、生後5週齢のBalb/cマウス（日本SLC）、5匹に対して100μg/匹のMycoplasma gallisepticum抗原となるように経鼻的に投与し、2週間後に同量のMycoplasma gallisepticum抗原をさらに経鼻的に投与し免疫した。【０１０９】
免疫原の最終投与後7日後（Day 21）に眼窩静脈叢から血液を0.1 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗M. gallisepticum抗体（IgGおよびIgA）の産生についてELISA法により検討した。対照として、M. gallisepticum抗原で免疫する直前のマウス個体から得た血清（Day 0）を使用した。【０１１０】
結果を図17に示す。図17は、M. gallisepticum抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、マウスに対して経鼻的に投与して免疫した場合の免疫応答について、血清中の抗体クラス誘導の結果を示したものであり、黒色カラムはIgG抗体の抗体価についての結果を、そして白色カラムはIgA抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。【０１１１】
図17に示される結果から、M. gallisepticum抗原をマウスに対して経鼻的に投与して免疫した場合、IgGクラスおよびIgAクラスの抗体が両方とも体内で生成されることがわかり、全体的にIgGクラス抗体の方がIgAクラス抗体よりも産生量が多かった。そして、M. gallisepticum抗原で免疫する直前のマウス個体から得た血清（Day 0）の抗体の抗体価と比較して、有意差（p＜0.0063）が存在する場合に＃印を、有意差（p＜0.0003）が存在する場合に＊印を、それぞれ付した。データは、平均±標準誤差を示す。【０１１２】
したがって、SucPGを含むリポソームによりM. gallisepticum抗原についてのワクチンを経粘膜投与すると、血中での高い抗体産生を誘導できること、そしてさらに体液性免疫のみならず、細胞性免疫応答の誘導を行う可能性が示された。【０１１３】
実施例11：ニューカッスル病ウイルス抗原-SucPG-リポソームによるワクチンによる、マウスに対する経鼻（経粘膜）免疫
本実施例は、ニューカッスル病ウイルスの抗原を免疫原として含むSucPGを含むリポソームによるワクチンを、マウスに対して、経鼻（経粘膜）投与した場合の免疫応答について、検討することを目的として行った。【０１１４】
本実施例において使用する免疫原、ニューカッスル病ウイルス抗原は、市販のニューカッスル病生ワクチンを超音波処理をすることにより不活化させ抗原液を調製した。このように調整したニューカッスル病ウイルス抗原を含むSucPGを含むリポソームによるワクチン（ニューカッスル病ウイルス抗原-SucPG-リポソームによるワクチン）は、基本的に実施例1に記載する方法にしたがって作製した。【０１１５】
上記の様にして作製したニューカッスル病ウイルス抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを、生後5週齢のBalb/cマウス（日本SLC）、5匹に対して100μg/匹のニューカッスル病ウイルス抗原となるように経鼻的に投与し、2週間後に同量のニューカッスル病ウイルス抗原をさらに経鼻的に投与し免疫した。【０１１６】
免疫原の最終投与後7日後（Day 21）に眼窩静脈叢から血液を0.1 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗ニューカッスル病ウイルス抗原抗体（IgGまたはIgA）の産生についてELISA法により検討した。対照として、ニューカッスル病ウイルス抗原抗原で免疫する前（Day 0）のマウス個体から得た血清を使用した。【０１１７】
結果を図18に示す。図18において、黒色カラムはIgG抗体の抗体価についての結果を、そして白色カラムはIgA抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。そして、免疫前（Day 0）のマウス個体における抗体価と比較して有意差（p＜0.0027）が存在する場合に＃印を、有意差（p＜0.00122）が存在する場合に＊印を、それぞれ付した。データは、平均±標準誤差を示す。【０１１８】
図18に示される結果から、ニューカッスル病ウイルス抗原-SucPG-リポソームによるワクチンをマウスに対して経鼻投与することにより免疫した場合、IgGクラスおよびIgAクラスの抗体が体内で、Day 0の場合と比較して顕著に生成されることがわかり、全体としては、IgGクラス抗体の方がIgAクラス抗体よりも増加率が高いという傾向があった。【０１１９】
この結果から、ニューカッスル病ウイルス抗原-SucPG-リポソームによるワクチンを経鼻的（経粘膜）投与することによりマウスを免疫すると、血中での高い抗体産生を誘導できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
上述したサクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームから構成されるワクチン担体を使用してワクチンを作製することにより、従来のリポソームから構成されるワクチン担体を使用した場合と比較して、顕著に抗体価を上昇させることができる効率的なワクチンを得ることができる。また、上述したワクチン担体を使用して作製したワクチンにより、体液性免疫だけでなく、細胞性免疫を誘導することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月20日(2007.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームから構成される、ペプチドまたはタンパク質を免疫原とするワクチン担体。
【請求項２】
サクシニル化ポリグリシドールを、１０〜４０重量％含む、請求項１に記載のワクチン担体。
【請求項３】
サクシニル化ポリグリシドールを、３０重量％含む、請求項２に記載のワクチン担体。
【請求項４】
リポソームを構成する脂質が、ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、卵黄レシチン（ｅｇｇ  ＰＣ）またはコレステロールのいずれか、もしくはこれらのいずれかの組み合わせから構成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン担体。
【請求項５】
リポソームが、ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）の組み合わせから構成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン担体。
【請求項６】
リポソーム中に含まれるペプチドまたはタンパク質の免疫原を抗原提示細胞への内在化  を可能にすることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン担体。
【請求項７】
リポソーム中に含まれるペプチドまたはタンパク質の免疫原を経粘膜的に投与するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン担体。
【請求項８】
リポソーム中に含まれるペプチドまたはタンパク質の免疫原を非経粘膜的に投与するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン担体。
【請求項９】
免疫化のために投与すべきペプチドまたはタンパク質の免疫原を、サクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームから構成されるワクチン担体中に含ませた、ワクチン。
【請求項１０】
ペプチドまたはタンパク質の免疫原に対する細胞性免疫を誘導させるための、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
ペプチドまたはタンパク質の免疫原に対する体液性免疫もまた誘導させるための、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
ワクチン担体中にサクシニル化ポリグリシドールを１０〜４０重量％含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１３】
ワクチン担体中にサクシニル化ポリグリシドールを３０重量％含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
ワクチン担体のリポソームを構成する脂質が、ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、卵黄レシチン（ｅｇｇ  ＰＣ）またはコレステロールのいずれか、もしくはこれらのいずれかの組み合わせから構成される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１５】
ワクチン担体中のリポソームが、ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およ  びジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）の組み合わせから構成される、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１６】
リポソーム中に含まれるペプチドまたはタンパク質の免疫原を抗原提示細胞中に内在化させることを可能にする、請求項９〜１５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１７】
ペプチドまたはタンパク質の免疫原を経粘膜的に投与するための、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１８】
ペプチドまたはタンパク質の免疫原を非経粘膜的に投与するための、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１９】
ペプチドまたはタンパク質の免疫原が、細菌、ウィルス、原虫のいずれかに由来するペプチドまたはタンパク質の抗原から選択される、請求項９〜１８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２０】
細菌が、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、エロモナス、マイコプラズマから選択される、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
ウィルスが、ニューカッスル病ウイルスである、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２２】
原虫が、トリパノソーマである、請求項１９に記載のワクチン。
【国際調査報告】
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