(57)【要約】  本発明は、生物学的活性に優れる新規なカワラタケ（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）であるカワラタケ株を提供する。本カワラタケ株は、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用、抗高血圧作用、免疫調節作用に優れる。さらに、微細藻類や他の担子菌類と組み合わせれば、その作用が相乗的に向上する。本発明のカワラタケ株は安全性が高く、長期の連用によっても副作用を生じる可能性は非常に低く、抗炎症、アレルギー、抗腫瘍、その他の疾病の予防、改善を目的とした飲食物、化粧料、医薬品などに有用である。また、本発明のカワラタケ株は、従来品種に比べて菌糸の成長性や生理的機能が非常に高いので、安定的に利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３であるカワラタケ株。
【請求項２】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む血小板凝集抑制剤。
【請求項３】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含むケモカイン遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む抗変異原性剤。
【請求項５】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む抗腫瘍剤。
【請求項６】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む抗高血圧剤。
【請求項７】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む免疫調節剤。
【請求項８】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を含む経口用組成物。
【請求項９】
請求項８記載の組成物において、さらに微細藻類及び他の担子菌類及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする経口用組成物。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の組成物からなる飲食物。
【請求項１１】
請求項８又は９記載の組成物からなる医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を含む皮膚外用組成物。
【請求項１３】
請求項１２記載の組成物において、さらに微細藻類及び他の担子菌類及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする皮膚外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００５年７月２８日付け出願の日本国特許出願２００５−２１８５５４号の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、カワラタケ株、その抽出物、ならびにその利用に関し、特に血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗癌作用、抗高血圧作用などの生物学的活性に優れたカワラタケ株に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来より、キノコ類は食用ばかりでなく薬用にも用いられ、様々な薬効を有するキノコ類が知られている。そのうち、カワラタケは漢方では「雲芝（ウンシ）」と呼ばれ、抗腫瘍活性があるとされている。また、臨床的にも、カワラタケ由来の蛋白多糖体から開発された抗腫瘍剤（一般名：ＰＳＫ、商品名：クレスチン）が使用されている。
また、近年では、ＴＧＦ−βやＰＤＧＦへの選択的結合作用（特許文献１）、免疫系未熟期動物への投与による癌や感染症の予防効果（特許文献２）、前駆脂肪細胞分化抑制効果（特許文献３）なども報告されている。【０００４】
しかしながら、カワラタケの薬効についてその全てが明らかにされたものではなく、また既知の効果についてもより優れた効果を有する菌株が求められていた。
【特許文献１】特開平８−１１３５４０号公報
【特許文献２】特開平１１−６０４９５号公報
【特許文献３】特開平２００４−７５６４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、有用な活性に非常に優れる新規なカワラタケ株ならびにその利用について提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明者らは市販あるいは野生のカワラタケについて交雑育種を重ね鋭意研究を行った結果、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用、抗高血圧作用、免疫調節作用などにおいて特に優れるカワラタケ株を得ることに成功した。また、本発明者らは、このカワラタケにさらに微細藻類や他の担子菌類などを組み合わせることにより、その作用が相乗的に向上することも見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明にかかるカワラタケ株は、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３であるカワラタケ株である。
本発明の血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤、抗変異原性剤、抗腫瘍剤、抗高血圧剤、あるいは免疫調節剤は、前記カワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む。
また、前記カワラタケ及び／又はその抽出物は、飲食物、医薬組成物などの経口用組成物に配合できる。
また、前記カワラタケ及び／又はその抽出物は、化粧料、医薬用外用剤などの皮膚外用組成物に配合できる。
また、本発明において、前記カワラタケ及び／又はその抽出物とともに、さらに微細藻類及び他の担子菌類及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる一つ以上を併用することが好適である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の特定のカワラタケ及び／又はその抽出物は、優れた血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用、抗高血圧作用、免疫調節作用を有する。さらに、微細藻類や他の担子菌類などを組み合わせれば、その作用が相乗的に向上する。本発明のカワラタケは安全性が高く、長期の連用によっても副作用を生じる可能性は非常に低く、炎症、アレルギー、腫瘍、その他の疾病の予防、改善を目的とした飲食物、化粧料、医薬品などに有用である。また、本発明のカワラタケ株は、従来品種に比べて菌糸の成長性や生理的機能が非常に高いので、安定的に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明のカワラタケ株（試験株１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）、その他の作出雑種株（試験株２〜４）、試験株作出に使用した親株Ａ及び親株Ｂ、従来品種であるカワラタケＩ及びカワラタケＩＩについて、その子実体熱水抽出物の血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用を比較した図である（コントロールはＤＭＳＯ）。
【図２】本発明のカワラタケ株（試験株１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）の子実体の熱水抽出物及び含水エタノール抽出物の血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用を比較した図である（コントロールはＤＭＳＯ）。
【００１０】
【図３】本発明のカワラタケ株（試験株１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）の子実体の熱水抽出物にクロレラ及び／又はシイタケ子実体の熱水抽出物を混合した場合の、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用における相乗効果を示す図である（コントロールはＤＭＳＯ）。
【図４】本発明のカワラタケ株（試験株１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）の子実体の熱水抽出物を含有する組成物をＳＨＲに単回投与した後の、コントロール（非投与）に対する収縮期血圧の経時的変化を示す図である。
【図５】本発明のカワラタケ株（試験株１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）の子実体の熱水抽出物を含有する組成物をＳＨＲに慢性投与した場合と、非投与（コントロール）の場合の収縮期血圧の経時的変化を示す図である。
【００１１】
【図６】本発明のカワラタケ株（試験株１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）の子実体の熱水抽出物を含有する組成物を高血圧症患者に慢性投与した場合の（ａ）拡張期血圧、及び（ｂ）収縮期血圧の経時的変化を示す図である。
【図７】本発明のカワラタケ株（試験株１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）の子実体の熱水抽出物を含有する組成物を高血圧症患者に慢性投与した場合の（ａ）血中レニン濃度、及び（ｂ）血中アンジオテンシンＩ濃度の経時的変化を示す図である。
【図８】本発明のカワラタケ株（試験株１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）の子実体の熱水抽出物を含有する組成物を３０名の健常人に１ヶ月間慢性投与し次いで２ヶ月間投与停止した場合の、Ｔ細胞数及びＮＫ細胞数の経時的変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明で用いるカワラタケは、サルノコシカケ科（Ｐｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ）カワラタケ属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）に属するＴｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．：Ｆｒ．）Ｐｉｌａｔであり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、平成１８年６月２８日に受託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３であるカワラタケ株（商標名：タナカヨシホ株）である。これは、同センターに国内寄託された受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３７７（平成１７年１月２６日受託）から移管されたものである。何れも本発明者の一人である江口文陽によって寄託された。【００１３】
本カワラタケ株は、熊本県に自生していた野生のカワラタケから、プロトプラスト化技術を利用した交雑育種により得られた新規なカワラタケ株であり、従来品種や親株に比べて、菌糸の成長性や生理的機能、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用において最も高い活性を有するものである。また、抗高血圧作用、免疫抑制作用においても高い活性を有する。本株の作出方法や選定方法ならびに効果については、実施例に詳細に記載されている。【００１４】
本発明にかかる受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３のカワラタケ株の科学的性質等は以下の通りである。
１．科学的性質…菌の特徴：炭素源と窒素源を含む栄養培地下において、白色のコロニーを形成する。また、光学顕微鏡下において、クランプコネクション（かすがい連結）が観察される。
２．分類学上の位置…担子菌【００１５】
３．培養条件
（１）培地名…ＳＭＹＡ培地（Ｓ：サッカロース、Ｍ：マルトエキストラクト、Ｙ：イーストエキストラクト、Ａ：寒天）
Ｓ，Ａ→市販品  Ｍ，Ｙ→ディフコ社製（Ｄｉｆｃｏ）
（２）培地の組成…培地１０００ｍｌ当たり
１％      サッカロース          （１０ｇに相当）
１％      マルトエキストラクト  （１０ｇに相当）
０．４％  イーストエキストラクト（  ４ｇに相当）
２％      寒天                  （２０ｇに相当）
（３）培地のｐＨ…５．０〜７．０（最適ｐＨ５．５）
（４）培地の殺菌条件…１２１℃  ２０分
（５）培地温度…２８℃
（６）培養期間…１０日間
（７）酸素要求性…好気性【００１６】
４．保管条件
凍結法にて保管できる。
（１）凍結条件…−８０℃
（２）保護剤…１０〜２０％グリセリン水溶液（最適は２０％）
（３）凍結後の復元率…１年で１００％、３年で９９％
５．生存試験の条件
（１）微生物の復元…４０℃
（２）接種・培養・確認法…培養条件と同一条件による。【００１７】
本発明において、カワラタケは子実体、該子実体の抽出物、あるいは該抽出物の乾燥物を用いてもよく、また、子実体は生のままあるいは乾燥したもののいずれでもよいが、取り扱い性、保存性及び抽出効率等の点から乾燥子実体が望ましい。有効量を効率的に摂取するためには、子実体の乾燥粉末あるいはその抽出物を用いることが好適であり、特に抽出物の利用が好ましい。
また、本発明においては、好適には子実体を用いるが、その菌糸体にも効果が期待できる。菌糸体は炭素源および窒素源を含む培地で種菌を培養して得られる生あるいは乾燥菌糸体を利用できる。乾燥したものが簡便である。【００１８】
カワラタケ抽出物を得るに先立ち、カワラタケの組織を破壊処理することが好適である。これによって効率よく抽出することが出来る。カワラタケの組織を破壊する手段としては、ビーズミル、ワーリングブレンダー、ホモジナイザー等の各種粉砕混合機による粉砕処理、爆砕機等による衝撃破砕処理、凍結処理、超音波処理等の物理的処理、水酸化ナトリウム等の水溶液によるアルカリ処理、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解作用のある酵素による処理、浸透圧処理等の化学的処理があり、これらを単独であるいは適宜に組み合わせて行なうことができる。これらの組織破壊処理のうち、カワラタケの子実体を原料とした場合は粉砕処理または酵素処理が、また菌糸体を原料とした場合は酵素処理が好適である。【００１９】
酵素処理では、公知の細胞壁分解酵素あるいは多糖分解酵素を利用でき、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、α−およびβ−グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、α−およびβ−グルカナーゼ等のうちの１種または２種以上を用いることができる。カワラタケを酵素処理するには、適宜に細断あるいは粉砕処理を施したカワラタケに前記酵素を水溶液として加え、振とうあるいは撹拌すればよい。
本発明のカワラタケ抽出物を得るためには、前述のように組織を破壊処理したカワラタケに、抽出溶媒を加え適宜攪拌し、抽出処理すればよい。
抽出溶媒としては特に限定されず、例えば、水、メタノール、エタノール等の一級アルコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素、エチルエーテル、アセトン等が挙げられ、これらを２種以上組み合わせて用いることもできる。好ましい抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混合溶媒が挙げられる。特に、カワラタケ子実体乾燥粉末を熱水で抽出したものが好ましい。【００２０】
また、抽出操作は常圧下、常温下で行っても良いが、１〜５気圧、６０〜１５０℃の加圧、加熱下で行なっても良い。具体的には、例えば、熱水等で抽出した後、遠心分離や減圧濾過により抽出液と残渣に分離することが好ましい。
なお、抽出残渣に対して前記と同様の条件下再抽出処理を行ない、この抽出操作を数回繰り返してもよい。
また、抽出物は、抽出液でもその乾燥物でもよい。乾燥物とする場合には、抽出液を減圧濃縮、殺菌、フリーズドライ、スプレードライ等の処理に供して抽出溶媒を除去する。【００２１】
カワラタケの菌糸体の伸長は２７℃付近で最も良好で、子実体発生には１０〜１２℃の低温処理が適している。栽培期間は菌糸蔓延に２０〜２５日間、続いての子実体発生に２０日程度を要する。２．５ｋｇ容量の袋栽培で２００ｇ位の収穫が期待できる。培地基材のおが屑は大部分の広葉樹が適し、スギでも加水堆積したものは使用可能である。【００２２】
本発明のカワラタケ株は血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用に優れるので、血栓形成の予防・改善、血流改善、炎症性あるいはアレルギー性疾患の予防・改善などに有用である。また、皮膚外用剤として経皮的に投与すれば炎症性あるいはアレルギー性の皮膚疾患に対して予防・改善効果が期待できる。【００２３】
また、本発明のカワラタケ株は、抗変異原性作用、抗腫瘍作用にも優れる。環境中には様々な変異原性物質が存在し、これが生体内でＤＮＡを傷つけることが、ガンやその他の疾病の原因の一つであると考えられている。よって、変異原の活性を抑制することができる本発明のカワラタケ株はこのような病気の予防に有用である。また、腫瘍細胞の増殖抑制にも有用である。
また、本発明のカワラタケ株は、抗高血圧作用を有し、高血圧症を改善することができる。
また、本発明のカワラタケ株は、免疫調節作用を有するので、生体内における免疫系のバランスを整えて疾病予防や健康体維持に寄与することができる。
本発明のカワラタケ株を、経口により摂取する場合には、個々の状態により異なり特に限定されるものではないが、カワラタケ抽出物（乾燥質量）としては、成人（６０ｋｇ体重）１日当たり０．００１〜１ｇ、さらには０．０１〜０．５ｇとすることができる。【００２４】
さらに、本発明のカワラタケ及び／又はその抽出物に、微細藻類及び他の担子菌類及びこれらの抽出物から選ばれる少なくとも一つを併用することにより、その活性が相乗的に向上することが明らかとなった。
微細藻類としては、クロレラ属が好適に使用でき、特にクロレラピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄａｏｓａ）が好適に使用できるが、これに限定されるものではない。
また、他の担子菌類としては、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、メシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）及び冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｓｉｓ）から選ばれる少なくとも一つが好適に使用できる。
これら微細藻類や担子菌類の抽出方法については、前期カワラタケの抽出方法あるいはその他の公知の方法により行うことができる。【００２５】
上記微細藻類や担子菌類には抗腫瘍活性が報告されているものがあるが、本発明のカワラタケと併用することにより、それらをそれぞれ単独で用いた場合に比べてその活性は相乗的に向上する。また、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用においても相乗的向上効果が認められる。
両者の混合比は特に限定されるものではないが、カワラタケ及び／又はその抽出物と、微細藻類、他の担子菌類及びこれら抽出物の合計量との比率は、質量比で１：１〜２５：１、さらには５：３〜１５：１の範囲が好ましい。【００２６】
本発明のカワラタケ又はその抽出物を用いて経口用組成物を調製する場合には、常法により散剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、茶剤、懸濁化剤、流エキス剤、液剤、シロップ剤等とすることができる。なお、製剤化の際には、通常の製剤化担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、賦香剤等を必要に応じて用いることができる。また、必要に応じて適当なコーティング剤等で剤皮を施すこともできる。
なお、これらは医薬用途に限らず、機能性食品、健康食品、サプリメントなどとしても摂取することができる。これらは例えば、ゼリー、キャンディー、グミ、クラッカー、ジュース、その他様々な形態で摂取される。【００２７】
また、皮膚外用剤とする場合には、通常公知の皮膚外用剤基剤にカワラタケ抽出物を配合すればよい。本発明の皮膚外用剤には、上記必須成分以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、防腐剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、香料、水性成分、水、高分子化合物、キレート剤、ｐＨ調整剤、ビタミン類、アミノ酸類、各種皮膚栄養剤・薬剤等を必要に応じて適宜配合することができる。【００２８】
皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品として適用可能であり、その剤型は軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤、シート状製剤、ムース、スプレー、スティック等、従来皮膚外用剤に用いられるものであれば特に制限されない。
これら経口用組成物中あるいは皮膚外用組成物中へのカワラタケ配合量は、目的や用途などに応じて適宜決定することができるが、通常カワラタケ抽出物（乾燥質量）として、組成物中０．０００１質量％以上とする。好ましくは０．００１〜２０質量％、さらには０．０１〜１０質量％である。
以下、具体例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
Ｉ．カワラタケ株及びその抽出物
本発明にかかるカワラタケ株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３は、下記のように、プロトプラスト化技術を利用した交雑育種法により得られた試験菌株のうち、生理生化学的試験及び薬理活性試験おいて従来品種や親株に比べて最も優れた株（試験株１）として選択、採用されたものである。【００３０】
Ｉ−１．試験株の作出
下記胞子由来一核菌糸である親株Ａ１、及びプロトプラスト由来一核菌糸である親株Ｂ１を用いて、キノコ類の一般的な交雑育種法により得られた二核化菌糸体を顕微鏡下で観察し、複数の試験株（雑種株）を得た。【００３１】
（１）胞子由来一核菌糸（親株Ａ１）の調製
熊本県菊池市に自生していた野生のカワラタケ子実体Ａから、無菌的に胞子（一核）を採取し、重層寒天培地で培養した。再生した一核菌糸のコロニーを培養し、交雑用菌株（親株Ａ１）とした。培養条件は、２６±２℃、関係湿度８０％以上で行った。【００３２】
（２）プロトプラスト由来一核菌糸（親株Ｂ１）の調製
熊本県菊池市に自生していた野生のカワラタケ子実体Ｂから、無菌的に二核菌糸体を分離した。
この菌糸体を、ＳＭＹ寒天培地（１％ショ糖、１％麦芽抽出物、０．４％酵母抽出物、２％寒天含有）で７日間培養し、得られた菌糸体を内径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた。これを、１００ｍＬ容三角フラスコに入れたＳＭＹ液体培地（１％ショ糖、１％麦芽抽出物、０．４％酵母抽出物含有）４０ｍＬ中に接種した。７日間静置培養後、菌糸体をマグネチックスターラーと攪拌子で磨砕し、菌糸体懸濁液を調製した。
この懸濁液２ｍＬを別のＳＭＹ液体培地中に接種して、３日間毎に継代培養を行い、プロトプラスト調製用菌糸体を得た。なお、培養条件は２６±２℃、関係湿度８０％以上で行った。【００３３】
プロトプラスト調製用菌糸体を、ナイロンメッシュ（孔径１０×１０μｍ）で濾過、集菌した。得られた菌糸体２００ｍｇ（生重量）を、２％Ｎｏｖｏｚｙｍ−２３４（Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ａ／Ｓ）、０．５％Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ（生化学工業株式会社）、０．２％Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，）及び０．５ｍｏｌ／Ｌのマンニトールを溶解した０．０５ｍｏｌ／Ｌマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬ中に入れ、振盪幅４０ｍｍ、振盪回数７０／ｍｉｎ、振盪温度２８℃で１時間振盪して、酵素処理（プロトプラスト化処理）を行った。【００３４】
この処理液を、ミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で濾過し、濾液を１１００ｇ×１０分間遠心分離した。得られた沈殿物（プロトプラスト）を、０．０５ｍｏｌ／Ｌマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０、浸透圧調節剤含む）を用い、遠心分離操作の繰り返しにより３回洗浄し、精製プロトプラストを得た。
この精製プロトプラストを重層寒天培地で培養し、再生したコロニーから一核菌糸をスクリーニングして、交雑用菌株（親株Ｂ１）とした。【００３５】
Ｉ−２．生理生化学試験
菌株を安定的に利用するには、菌糸の成長性や生理的機能の高いことが重要である。そこでまず、菌糸成長ならびにラッカーゼ活性を指標とするスクリーニングを行った。試験方法は、次の通りである。
（１）固体培地での菌糸成長
菌糸体をそれぞれＳＭＹ寒天培地で７日間培養し、得られた菌糸体を内径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた。これを、内径９０ｍｍのシャーレに分注した新しいＳＭＹ寒天培地２５ｍＬの上に接種した。培養温度２６±２℃、関係湿度８０％以上で８日間培養を行った後の菌糸体成長量（ｍｍ）と菌糸密度を肉眼で測定した（ｎ＝１０）。菌糸密度は、「高い：＋＋＋＋」「普通：＋＋＋」「低い：＋＋」「極めて低い：＋」で評価した。【００３６】
（２）液体培地での菌糸成長
菌糸体をそれぞれＳＭＹ寒天培地で７日間培養し、得られた菌糸体を内径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた。１００ｍＬ容三角フラスコに入れたＳＭＹ液体培地４０ｍＬ中に接種した。培養温度２６±２℃、関係湿度８０％以上で２１日間静置培養後、予め恒量を計量した濾紙で菌糸体を濾過集菌した。乾燥機にて乾燥後、菌糸体を含む濾紙の恒量を計量し、差し引き法によって菌糸体増殖量（ｍｇ）を算出した（ｎ＝１０）。【００３７】
（３）ラッカーゼ活性
菌糸体を１ｍＭベラトルム酸（Ｖｅｒａｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）を含むＳＭＹ液体培地に接種し、培養温度２６±２℃、関係湿度８０％以上で１３日間培養した。濾液のラッカーゼ活性（ｎｋａｔ／Ｌ）を、分光光度計を用いて常法（木材学会誌，４０（１），１０７−１１０（１９９４）等参照）により測定した。【００３８】
（４）結果
試験結果を表１に示す。
親株Ａ１及び親株Ｂ１は、上記のようにして得られた一核菌糸である。
親株Ａ２及び親株Ｂ２は二核菌糸であり、それぞれ、親株Ａ１及び親株Ｂ１を作出する前に、カワラタケ子実体Ａ及びカワラタケ子実体Ｂから分離しておいた原種菌を継代して得られたものである。
カワラタケＩ、カワラタケＩＩは、それぞれ群馬県高崎市、東京都奥多摩町で採取した野性カワラタケから得られた分離株（二核菌糸）である。
試験の結果、得られた複数の試験株（表１には試験株１〜４のみを示す）の中でも、特に試験株１は菌糸の成長性、生理的機能が高く、親株や従来品種に比べても非常に優れていた。【００３９】
【表１】
2007013588.tif 000002
【００４０】
Ｉ−３．薬理活性試験
さらに、血小板凝集抑制試験、ケモカイン遺伝子発現抑制試験、抗変異原性試験を行った。
（１）カワラタケ熱水抽出エキス末の調製
カワラタケ乾燥子実体の微粉末４０ｇを７５０ｍｌの蒸留水と混合し、９０℃で１〜２時間攪拌しながら抽出を行った。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、回収した上清をエバポレーターにて濃縮（約１０倍）した。濃縮液を−８０℃で凍結させ、凍結乾燥してカワラタケ熱水抽出エキス末３．５ｇを回収し、これを試料として試験に供した。
なお、試験株１〜４の他に、親株であるカワラタケ子実体Ａ及びカワラタケ子実体Ｂ、ならびにカワラタケＩ（群馬県高崎市産）及びカワラタケＩＩ（東京都奥多摩町産）の子実体についても同様に処理して熱水抽出エキス末を調製し、試験に供した。【００４１】
（２）血小板凝集抑制試験
ヒト血液を室温にて１１００ｒｐｍで２０分間遠心し、多血小板血漿（ＰＲＰ）を分取した後、さらに３０００ｒｐｍで５分間遠心して乏血小板血漿（ＰＰＰ）を分取した。ＰＲＰ  ２２３μＬを３７℃にて予備加温した後、カワラタケ熱水抽出エキス末（２％濃度となるようにＤＭＳＯに溶解したもの）又はコントロールとしてＤＭＳＯをそれぞれ２μＬ添加し、さらに３分間３７℃でインキュベートした後、凝集誘発物質であるアラキドン酸ナトリウム水溶液（５００ｎＭ）を２５μＬ添加した。
惹起された凝集はアグリゴメーター（ＭＣＭヘマトレーサー  ＭＣＭメディカル株式会社製）を用いて測定した。被験試料の最大凝集率（ＰＰＰの値を１００として被験試料の凝集曲線より求められた最大値）をコントロールの最大凝集率と比較することにより、被験物質のアラキドン酸ナトリウム水溶液惹起血小板凝集に対する抑制作用を評価した。【００４２】
（３）ケモカイン遺伝子発現抑制試験
ヒト皮膚線維芽細胞を直径６ｃｍの培養皿で、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）でコンフルエントになるまで培養し、被験培地として実験に供した。
被験培地にカワラタケ熱水抽出エキス末（適量のＤＭＳＯに溶解したもの）、ＤＭＳＯ（陰性対照）、又はハイドロコルチゾン（陽性対照）を添加した。カワラタケ熱水抽出エキス末及びＤＭＳＯの終濃度はそれぞれ０．０１％（乾燥質量）、ハイドロコルチゾンの終濃度は１０−７Ｍであった。【００４３】
さらに、ケモカイン遺伝子発現を促進することが知られている腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で６時間培養した。
次に常法に従って、細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成したのち、定量的ＰＣＲ法（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法）により、ＩＬ−８遺伝子の発現量を測定した。なお、内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）遺伝子を用い、得られたデータを補正した。
なお、ヒト皮膚線維芽細胞は市販品として入手可能であり、例えば倉敷紡績株式会社から入手可能である。また、ヒト線維芽細胞の培養は、動物細胞を培養するための常法に従って行えばよいが、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地が特に好ましい。【００４４】
（４）抗変異原性試験
試験管に変異原（０．２Ｍの２−アミノ−３−メチルイミダゾ（４，５−ｆ）キノリンを含有するＤＭＳＯ溶液）０．１ｍＬ及びカワラタケ熱水抽出エキス末（０．２５〜１％濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したもの。後記図表においては１％）１．９ｍＬを混合し、３７℃で６時間静置した。
その後、この試験管にサルモネラＴＡ９８株液（Ｈｉｓ＋復帰変異、５〜７％濃度となるようにＤＭＳＯに添加したもの、後記図表においては７％）０．１ｍＬ、Ｓ９ｍｉｘ０．５ｍＬ、及び軟寒天２ｍＬを加えて混合した。
この混合液０．０５ｍＬを最小グルコース寒天培地に播種し、３７℃で４８時間培養した。増殖したヒスチジン非要求性コロニー数をカウントし、抗変異原性（％）を次式により算出した。【００４５】
抗変異原性(%)＝［（ＮＣ−ＮＢ）−（ＮＳ−ＮＢ）］／（ＮＣ−ＮＢ）×１００
ＮＳ：試料液を加えた時のコロニー数
ＮＣ：試料液の代わりにＤＭＳＯを加えた時のコロニー数（コントロール）
ＮＢ：試料液と変異原の代わりにＤＭＳＯを加えた時のコロニー数（ブランク）【００４６】
（５）結果
結果を図１に示す。図１からわかるように、試験株１は血小板凝集抑制作用、ケモカイン（ＩＬ−８）遺伝子発現量の抑制作用、抗変異原性作用の何れにおいても非常に高い活性を有しており、他の試験株や親株、従来品種に比べて非常に優れていた。【００４７】
種々の炎症性・アレルギー性皮膚疾患や肌荒れの発症には、アラキドン酸やその代謝物であるロイコトリエンやトロンボキサン、プロスタグランジンが関与していることが明らかにされつつある。例えば炎症性異常角化性疾患である乾癬では、その患部表皮において高いアラキドン酸代謝物の存在が認められており、アレルギー性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎や接触性皮膚炎、湿疹にもアラキドン酸代謝物の関与が示唆されている。また、プロスタグランジン類やトロンボキサン類は血小板を凝集させることから、アラキドン酸からプロスタグランジン類やトロンボキサン類への合成を抑制する化合物は、抗血栓効果、すなわち血流改善効果を有するものと考えられる。【００４８】
また、近年、種々の炎症性・アレルギー性皮膚疾患の発症に炎症性細胞の遊走・活性化を支配するケモカイン（Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）が強く関与することが明らかにされつつある。ケモカインは分子量８〜１０ｋＤａのヘパリン結合性を有する塩基性蛋白の総称であり、生体において炎症に関わる様々な細胞の炎症部位への遊走・活性化に中心的に作用し、炎症の惹起に重要な役割を果たしているものと考えられている。
皮膚疾患においては、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎などの炎症部位に好中球や好酸球などの炎症細胞が遊走・活性化し、炎症の発生・増幅に関与していると考えられている。そして、この場合に皮膚の角化細胞、線維芽細胞などの細胞からインターロイキン−８（ＩＬ−８，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）等のケモカインが産生されることが知られている。また、炎症性異常角化性疾患である乾癬ではその皮膚患部にＩＬ−８が多量に存在していることが知られている。【００４９】
従って、ＩＬ−８等のケモカインの発現を抑制することは、これらの炎症性あるいはアレルギー性の疾患症状の改善や予防に有効であると考えられる。
また、環境中には様々な変異原性物質が存在しており、これが生体内でＤＮＡを傷つけることが、ガンやその他の疾病の原因の一つであると考えられている。よって、変異原の活性を抑制することができる抗変異原性物質はこのような病気の予防に有用である。【００５０】
Ｉ−４．安全性試験
以上の試験により、成長性、生理的機能性、及び活性の最も優れていた試験株１の安全性を調べるため、急性毒性試験、亜急性毒性試験を行った。
（１）試験方法
（ａ）急性毒性
ＯＥＣＤ化学物質毒性試験指針（１９８７）に準拠して、マウスにおける急性経口毒性試験を行った（ｎ＝１０）。試料としては、前記カワラタケ熱水抽出エキス末を用いた。投与量は２００、４００、６００、８００及び２０００ｍｇ／ｋｇで単回投与を行った。投与後、２４日まで個体観察を行った。
（ｂ）亜急性毒性
ＯＥＣＤ化学物質毒性試験指針（１９８７）に準拠して、マウスによる亜急性毒性試験（経口投与）も行った（ｎ＝１０）。試料としては、前記カワラタケ熱水抽出エキス末を用いた。投与量は２００、４００、６００、８００及び２０００ｍｇ／ｋｇ・日で、一日一回、２８日間毎日投与を行った。【００５１】
（２）結果
（ａ）急性毒性
試験株１は、急性毒性試験において２０００ｍｇ／ｋｇの経口投与量においても死亡個体ならびに臓器・血液における変性は認められず、非常に安全性が高いことが確認された。
（ｂ）亜急性毒性
試験株１は、亜急性毒性試験において２０００ｍｇ／ｋｇの経口投与量においても死亡個体ならびに臓器・血液における変性は認められず、非常に安全性が高いことが確認された。【００５２】
例えば、ケモカイン遺伝子発現抑制剤としてハイドロコルチゾンが強い作用を有することが知られている。上記ケモカイン遺伝子発現抑制試験においてもハイドロコルチゾンの遺伝子発現量は０．１３と高い抑制作用を示した。しかし、ステロイドホルモンは長期連用すると、炎症、組織障害、潰瘍形成等の副作用を引き起こす。これに対して、試験株１は抑制効果はハイドロコルチゾンほどではなかったものの、副作用の心配がなく安全性が高いので長期連用が可能である。【００５３】
Ｉ−５．対峙培養試験
また、試験株１について、親株Ａ、親株Ｂ、ならびに従来品種に対してそれぞれ対峙培養を行った。この試験では、対峙させた両者の菌そう（コロニー）の接触面での帯線（ゾーンライン）形成の有無を観察することにより、両者の相同性を簡便に判定することができる。試験は次のようにして行った。
径０．８ｍｍ（２０メッシュ）のふるいを通過したブナ（Ｆａｇｕｓ  ｃｒｅｎａｔａ  Ｂｌｕｍｅ）の木粉と米糠とを５：１（質量比）の割合で混合し、含水率が７５％となるように水を加えた。これを長さ２５０ｍｍ、径３０ｍｍのガラス管の中央に詰め、１２０℃、１．２気圧の条件で３０分間オートクレーブ滅菌した。この木粉培地の両端から菌株をそれぞれ接種して、温度２６℃、関係湿度７５％以上の条件で培養した。帯線形成の有無は肉眼で観察した。
その結果、試験株１は、何れの親株及び従来品種に対しても帯線を形成し、よってこれらとの相同性は低く、異なる品種であると考えられた。【００５４】
以上の結果から、本発明者らはこの試験株１を選択し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託し（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３７７）、さらにこれを国際寄託に移管し（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）、本発明のカワラタケとして採用したものである。
図２は、抽出溶媒を含水エタノールとし、抽出温度を室温（２５℃）とした以外は前記と同様の方法でカワラタケ抽出エキス末を調製し、薬理活性試験を行った結果である。図２からわかるように、熱水抽出の場合が最も活性は高かったが、含水エタノール抽出でも活性が認められた。また、抽出エキス末の回収率の点でも熱水抽出が好ましい傾向が認められた。【００５５】
Ｉ−６．抗腫瘍試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
さらに、カワラタケ株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３の抗腫瘍作用について、サルコーマ１８０培養細胞を用いて試験を行った。
（１）被験培地の調製
ＭＥＭアール液体培地（グルタミン不含、重層含：ＩＮＣ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）８７％、ウシ胎児血清（５６℃で３０〜６０分間の不活性化処理をしたもの：ＧＩＢＣＯ）１０％、２００ｍＭグルタミン液（２９．２３ｍｇ／ｍＬ：ＩＮＣ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）２％、ペニシリン・ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔ／ｍＬ：ＧＩＢＣＯ）１％の割合で添加混合したものを被験培地として使用した。【００５６】
（２）試料液の調製
カワラタケ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）熱水抽出エキス末を、ＰＢＳで１０００倍希釈し、オートクレーブにて滅菌処理した溶液を試料液として用いた。コントロールとしては、ＰＢＳのみを同様に滅菌処理した溶液を用いた。【００５７】
（３）試験方法
被験培地を９６ｗｅｌｌプレートにそれぞれ１８０μＬづつ分注し、さらにサルコーマ１８０癌細胞株１０μＬ、及び試料液１０μＬを添加した。サルコーマ１８０癌細胞数は、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２００μＬ）であった。３７℃、５％ＣＯ２で４８時間静置した後、細胞数を計測した。【００５８】
（４）結果
結果を表２に示す。試料液はサルコーマ１８０癌細胞に対して著しい増殖抑制効果を発揮した。よって、本発明にかかるカワラタケＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３は抗腫瘍作用を有するものと考えられる。【００５９】
【表２】
2007013588.tif 000003
【００６０】
Ｉ−７．抗腫瘍試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
また、カワラタケ株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３のサルコーマ１８０癌細胞に対する増殖抑制効果をｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。
（１）試験方法
ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ（ヌードマウス）４週齢雌マウス２４個体を供試動物とした。５週齢よりマウスの左腹部にサルコーマ１８０癌細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／０．０５ｍｌ移植し、以下のような３群に分けて投与を行った。
（ｉ）コントロール群：水を強制経口投与（カワラタケ子実体熱水抽出エキス末非投与）。
（ii）５０ｍｇ／ｋｇ投与群：５週齢からカワラタケ子実体熱水抽出エキス末を一日当たり５０ｍｇ／ｋｇ（マウス４０ｇ当たり２ｍｇ／０．２ｍｌ）を毎日強制経口投与。
（iii）５００ｍｇ／ｋｇ投与群：５週齢からカワラタケ子実体熱水抽出エキス末を一日当たり５００ｍｇ／ｋｇ（マウス４０ｇ当たり２０ｍｇ／０．２ｍｌ）を毎日強制経口投与。
サルコーマ１８０癌細胞移植後、１週間ごとに腫瘍の体積測定を行った。【００６１】
（２）結果
表３のように、試験群（投与群）では、コントロール群（非投与群）に比して、腫瘍の成長が顕著に抑制された。
【表３】
2007013588.tif 000004
【００６２】
ＩＩ．カワラタケ抽出物含有組成物
上記のように、本発明にかかるカワラタケ株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３は非常に高い活性を有するものであるが、さらなる活性の向上を目的として、微細藻類や他の担子菌類との併用についても検討を行った。【００６３】
ＩＩ−１．血小板凝集抑制試験、ケモカイン遺伝子発現抑制試験、抗変異原性試験
（１）試験１
まず、被験試料として、前記カワラタケ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）熱水抽出物エキス末、ならびに下記（i）〜（iii）のクロレラエキス末、シイタケエキス末、及びクロレラシイタケエキス末を用いて、前記と同様の方法により、血小板凝集抑制試験、ケモカイン遺伝子発現抑制試験、ならびに抗変異原性試験を行った。
その結果、図３に示すように、カワラタケ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）熱水抽出エキス末に、クロレラ抽出エキス末あるいはシイタケ抽出エキス末あるいはクロレラシイタケエキス末を併用した場合には、それぞれ単独の場合に比べて、血小板凝集抑制試験作用、ケモカイン遺伝子抑制作用、抗変異原性作用の相乗的な向上が認められた。特に、クロレラシイタケエキス末を混合した場合には、その効果が顕著であった。【００６４】
（i）クロレラエキス末の調製
クロレラ抽出槽に、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）４０ｋｇと蒸留水７５０Lを入れ、９０℃に昇温後、３０分間抽出を行った。その後、遠心分離により上清を回収して、クロレラ抽出液を得た。
この抽出液をエバポレーターにて約４５Ｌ（約１８倍）まで濃縮し、これにβ−サイクロデキストリン４０ｋｇを添加して、ニーダーで攪拌しながらドラム乾燥（ドラム表面温度約１５０℃、反応温度約９０℃）により水分含量５％以下となるまで乾燥した。乾燥物中に生じたチップ状乾燥物を粉砕機により粉砕し、約５０ｋｇのクロレラエキス末を得た。【００６５】
（ii）シイタケエキス末の調製
シイタケ抽出槽に、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）のチップ状乾燥子実体４０ｋｇと蒸留水７５０Ｌを入れ、８５℃に昇温後、６０分間抽出を行った。その後、シイタケ絞り機にて絞りながらエキス分を回収し、これをさらに遠心分離により上清を回収して、シイタケ抽出液を得た。
この抽出液をエバポレーターにて約４５Ｌ（約１８倍）まで濃縮し、これにβ−サイクロデキストリン４０ｋｇを添加して、ニーダーで攪拌しながらドラム乾燥（ドラム表面温度約１５０℃、反応温度約９０℃）により水分含量５％以下となるまで乾燥した。乾燥物中に生じたチップ状乾燥物を粉砕機により粉砕し、約５０ｋｇのシイタケエキス末を得た。【００６６】
（iii）クロレラシイタケエキス末の調製
前記クロレラ抽出液６５０Ｌと、前記シイタケ抽出液６２０Ｌとを混合し、エバポレーターにて７０Ｌまで濃縮した。これに、β−サイクロデキストリン２７．５ｋｇを添加し、ニーダーで攪拌しながらドラム乾燥（ドラム表面温度約１５０℃、反応温度約９０℃）により水分含量５％以下となるまで乾燥した。乾燥物中に生じたチップ状乾燥物を粉砕機により粉砕し、約４０ｋｇのクロレラシイタケエキス末を得た。【００６７】
（２）試験２
さらに、下記処方例１〜２に従ってドリンク剤も調製し、前記と同様の方法により試験を行った。その結果、表４に示すように、何れのドリンク剤も血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子抑制作用、抗変異原性作用において、非常に高い活性を示した。【００６８】
【表４】
2007013588.tif 000005
【００６９】
処方例１  機能性ドリンク（下記成分を精製水５０ｍＬ中に含む。）
カワラタケ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）熱水抽出エキス末  ２００ｍｇ
アガリクス熱水抽出物                                        １０
シイタケ菌糸体熱水抽出物                                    １０
メシマコブ菌糸体熱水抽出物                                  ２０
冬虫夏草菌糸体熱水抽出物                                    １０
クロレラエキス                                            ２００
カロテニック１％（β−カロチン１％含有乳液）                ５０
グリセリン脂肪酸エステル                                  １００
果糖ブドウ糖液糖                                        ５０００
ハチミツ                                                １０００
ヒハツエキス末                                            １５０
クエン酸                                                  ２００
ビタミンＢ６                                                １０
香料                                                      ２００【００７０】
処方例２  機能性ドリンク（下記成分を精製水５０ｍＬ中に含む。）
カワラタケ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）熱水抽出エキス末  ２００ｍｇ
アガリクス熱水抽出物                                        １０
シイタケ菌糸体熱水抽出物                                    １０
メシマコブ菌糸体熱水抽出物                                  ２０
冬虫夏草菌糸体熱水抽出物                                    １０
クロレラエキス                                            ２００
カロテニック１％（β−カロチン１％含有乳液）                ５０
グリセリン脂肪酸エステル                                  １００
果糖ブドウ糖液糖                                        ５０００
ハチミツ                                                １０００
緑茶抽出物（カテキン）                                    ５００
クエン酸                                                  ２００
ビタミンＢ６                                                １０
香料                                                      ２００【００７１】
ＩＩ−２．抗高血圧作用（ＳＨＲモデル）
高血圧自然発症ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  Ｒａｔ:ＳＨＲ（４週齢）、日本チャールスリバー（株）から入手）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで試験を行った。ＳＨＲは７〜１５週齢で１００％の個体が高血圧を自然発症する。その血圧は１０週齢で平均約１７１ｍｍＨｇ、最高血圧は約２００ｍｍＨｇ以上に達する。ＳＨＲマウスはコレステロール代謝異常やインスリン抵抗性も示す。【００７２】
（１）単回投与試験
ＳＨＲ（１０週齢、雄）に、カワラタケ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）熱水抽出エキス末、クロレラエキス末、またはその１：１混合物（質量比）をゾンデを用いてエキス末として３．３ｍｇ／ｋｇ用量で経口投与し、血圧をモニターした（ｎ＝６）。コントロールには水を投与した。投与後８時間の平均収縮期血圧を下記表５に示す。
表５のように、各投与群において血圧降下作用が認められ、混合物投与群で血圧が最も低下した。【００７３】
【表５】
2007013588.tif 000006
【００７４】
また、ＳＨＲ（１０週齢、雄）に、前記処方例２のドリンク剤をゾンデを用いてカワラタケ熱水抽出エキス末として３．３ｍｇ／ｋｇ用量で経口投与した。投与開始直前及び投与後４８時間までの血圧を経時的に測定した（ｎ＝５）。
図４に、コントロール群（非投与群）の平均収縮期血圧をゼロとして、試験群（投与群）の平均収縮期血圧をプロットした。この結果からわかるように、試験群では投与後３０分でコントロールよりも血圧が低下し始め、投与後４〜１０時間で血圧は最も低下した。その後は徐々に血圧が上昇したが、上昇は緩慢で、コントロールと同レベルの血圧になるまでに約４８時間を要した。【００７５】
（２）慢性投与試験
ＳＨＲ（５週齢、雄）に、前記処方例２のドリンク剤をゾンデを用いてカワラタケ熱水抽出エキス末として３．３ｍｇ／ｋｇ用量で１６週齢まで１１週間、一日一回、毎日経口投与した。投与開始直前及び各経口投与の直前に、血圧を測定した（ｎ＝５）。
図５に、コントロール群（非投与群）及び試験群（投与群）の１週間毎の平均収縮期血圧の変化を示した。コントロール群では週齢の増加とともに血圧が徐々に上昇し、１６週齢（１１週間投与）では血圧が２２０ｍｍＨｇを超えた。これに対して、試験群では８週齢（３週間投与）までは徐々に血圧が上昇したが、その後は１７０〜１８０ｍｍＨｇの範囲で安定に推移した。
このことから、本発明のカワラタケ抽出物含有組成物の継続的な摂取により、高血圧が改善され、さらには血圧が一定の範囲にコントロールされることが示唆された。【００７６】
ＩＩ−３．抗高血圧作用（ヒト）
さらに、高血圧症患者に対する抗高血圧作用について臨床的に調べた。
（１）試験方法
被験患者は、収縮期血圧が常時１５０〜１７０ｍｍ／Ｈｇ前後の高血圧患者１０名（男７名、女３名）であった。被験者の平均収縮期血圧は１６２ｍｍＨｇ、平均拡張期血圧は９６ｍｍＨｇであり、これらは投与開始前１０日間ほぼ同じであった。
投与開始日（ｄａｙゼロ）から７０日間、毎日、一日一回、被験患者に前記処方例２のドリンク剤を経口摂取してもらった。摂取量は、１日に５０ｍＬ（カワラタケ熱水抽出エキス末として２００ｍｇ）であった。投与期間中は、投与直前に血圧を測定した。
また、患者の血液を凝固抑制剤入り採血管に採血し、一般的な臨床検査測定法に基づいて血中レニン濃度、血中アンジオテンシンＩ濃度も測定した。【００７７】
（２）結果
図６に、投与開始日（ｄａｙゼロ）の血圧をゼロとして、（ａ）拡張期血圧、及び（ｂ）収縮期血圧の変化を５日毎にプロットした。収縮期血圧は投与開始５日目には降下し始め、７０日目まで徐々に低下する傾向があった。拡張期血圧も投与開始１０日目には降下し始めたが、３０日目ぐらいからはほとんど低下せずに一定の範囲内で安定に推移した。
この結果から、本発明のカワラタケ抽出物含有組成物は高血圧患者の血圧を降下させるが、慢性的に摂取しても血圧を低下させ過ぎる懸念が非常に少ないことが示唆された。
また、図７に、被験者の血中レニン濃度、血中アンジオテンシンＩ濃度の変化を示した。投与日数の増加に伴って、レニン濃度は上昇し、一方、アンジオテンシンＩ濃度は減少していた。このことから、内分泌におけるレニン、アンジオテンシン及びその他ホルモンを生体内へ過剰に分泌あるいは過剰に抑制することなく血圧をコントロールできることが示唆された。【００７８】
ＩＩ−４．免疫調節作用
さらに、免疫調節作用についても調べた。
（１）試験方法
被験患者は、健常な成人３０名であった。被験患者に１ヶ月間、毎日、一日一回、前記処方例２のドリンク剤を経口摂取してもらった。摂取量は、１日に５０ｍＬ（カワラタケ熱水抽出エキス末として２００ｍｇ）であった。その後、摂取を２ヶ月間停止した。
摂取開始前、摂取開始後１０日及び１ヶ月、摂取停止後２ヶ月に、被験患者の血液を血液凝固抑制剤入り採血管に採血し、一般的臨床検査測定法に基づいてＴ細胞及びＮＫ細胞の免疫細胞百分率をそれぞれ測定した。【００７９】
（２）結果
図８に、投与期間（１ヶ月間）及びその後の投与停止期間（２ヶ月）のＴ細胞数（％）、ＮＫ細胞数（％）を示した。慢性投与期間中、投与日数の増加に伴って、Ｔ細胞数とＮＫ細胞数は共に増加した。そして、投与停止後は、ＮＫ細胞数とＴ細胞数は共に低下し始めたが、その低下は緩慢で、投与開始前のレベルに戻るまでに２ヶ月を要した。
このことから、本発明のカワラタケ抽出物含有組成物に免疫賦活効果があり、継続的な摂取により効果の持続性が高いことが示唆された。【００８０】
以下、本発明のカワラタケ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３）の抽出物を含む組成物の例をさらに示す。
処方例３  クリーム
ステアリン酸                              ２．０  質量％
ステアリルアルコール                      ７．０
水添ラノリン                              ２．０
スクワラン                                ５．０
２−オクチルドデシルアルコール            ６．０
ＰＯＥ（２５）セチルエーテル              ３．０
グリセリンモノステアリン酸エステル        ２．０
プロピレングリコール                      ５．０
カワラタケ熱水抽出物                      ０．０５
亜硫酸水素ナトリウム                      ０．０３
エチルパラベン                            ０．３
香料                                      適量
イオン交換水                              残余【００８１】
処方例４  乳液
マイクロクリスタリンワックス                      １．０  質量％
ミツロウ                                          ２．０
ラノリン                                        ２０．０
流動パラフィン                                  １０．０
スクワラン                                        ５．０
ソルビタンセスキオレイン酸エステル                ４．０
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノオレイン酸エステル    １．０
プロピレングリコール                              ７．０
カワラタケ熱水抽出物                              ２．０
クロレラ熱水抽出物                                ０．５
シイタケ熱水抽出物                                ０．５
亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０１
エチルパラベン                                    ０．３
香料                                                適量
イオン交換水                                        残余【００８２】
処方例５  ジェル
エタノール                                        １０．０  質量％
ジプロピレングリコール                            １５．０
ＰＯＥ（５０）オレイルエーテル                      ２．０
カルボキシビニルポリマー                            １．０
水酸化ナトリウム                                    ０．１５
Ｌ−アルギニン                                      ０．１
カワラタケ熱水抽出物                                ７．０
２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン
スルホン酸ナトリウム        ０．０５
エチレンジアミンテトラアセテート・ナトリウム・２水  ０．０５
メチルパラベン                                      ０．２
香料                                                  適量
イオン交換水                                          残余【００８３】
処方例６  ローション
１，３−ブチレングリコール                          ５．０質量％
グリセリン                                          ２．０
プロピレングリコール                                ２．０
オレイルアルコール                                  ０．１
カワラタケ熱水抽出物                                ０．５
クロレラ熱水抽出物                                  ０．１
シイタケ熱水抽出物                                  ０．１
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル      ０．５
ＰＯＥ（１５）ラウリルエーテル                      ０．５
エタノール                                        １０．０
香料                                                  適量
防腐剤                                                適量
緩衝剤                                                適量
イオン交換水                                          残余
【図１】
2007013588.tif 000007
【図２】
2007013588.tif 000008
【図３】
2007013588.tif 000009
【図４】
2007013588.tif 000010
【図５】
2007013588.tif 000011
【図６】
2007013588.tif 000012
【図７】
2007013588.tif 000013
【図８】
2007013588.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月28日(2006.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３であるカワラタケ株。
【請求項２】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む血小板凝集抑制剤。
【請求項３】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含むケモカイン遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む抗変異原性剤。
【請求項５】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む抗腫瘍剤。
【請求項６】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む抗高血圧剤。
【請求項７】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む免疫賦活剤。
【請求項８】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を含む経口用組成物。
【請求項９】
請求項８記載の組成物において、さらにクロレラピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄａｏｓａ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、メシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）及び冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｓｉｓ）及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする経口用組成物。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の組成物からなる飲食物。
【請求項１１】
請求項８又は９記載の組成物からなる医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１記載のカワラタケ及び／又はその抽出物を含む皮膚外用組成物。
【請求項１３】
請求項１２記載の組成物において、さらにクロレラピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄａｏｓａ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、メシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）及び冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｓｉｓ）及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする皮膚外用組成物。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】  すなわち、本発明にかかるカワラタケ株は、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３３であるカワラタケ株である。  本発明の血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤、抗変異原性剤、抗腫瘍剤、抗高血圧剤、あるいは免疫賦活剤は、前記カワラタケ及び／又はその抽出物を有効成分として含む。  また、前記カワラタケ及び／又はその抽出物は、飲食物、医薬組成物などの経口用組成物に配合できる。  また、前記カワラタケ及び／又はその抽出物は、化粧料、医薬用外用剤などの皮膚外用組成物に配合できる。  また、本発明において、前記カワラタケ及び／又はその抽出物とともに、さらにクロレラピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄａｏｓａ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、メシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）及び冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｓｉｓ）及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる一つ以上を併用することが好適である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】  本発明の特定のカワラタケ及び／又はその抽出物は、優れた血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用、抗高血圧作用、免疫賦活作用を有する。さらに、微細藻類や他の担子菌類などを組み合わせれば、その作用が相乗的に向上する。本発明のカワラタケは安全性が高く、長期の連用によっても副作用を生じる可能性は非常に低く、炎症、アレルギー、腫瘍、その他の疾病の予防、改善を目的とした飲食物、化粧料、医薬品などに有用である。また、本発明のカワラタケ株は、従来品種に比べて菌糸の成長性や生理的機能が非常に高いので、安定的に利用することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】  本カワラタケ株は、熊本県に自生していた野生のカワラタケから、プロトプラスト化技術を利用した交雑育種により得られた新規なカワラタケ株であり、従来品種や親株に比べて、菌糸の成長性や生理的機能、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用において最も高い活性を有するものである。また、抗高血圧作用、免疫賦活作用においても高い活性を有する。本株の作出方法や選定方法ならびに効果については、実施例に詳細に記載されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】  また、本発明のカワラタケ株は、抗変異原性作用、抗腫瘍作用にも優れる。環境中には様々な変異原性物質が存在し、これが生体内でＤＮＡを傷つけることが、ガンやその他の疾病の原因の一つであると考えられている。よって、変異原の活性を抑制することができる本発明のカワラタケ株はこのような病気の予防に有用である。また、腫瘍細胞の増殖抑制にも有用である。  また、本発明のカワラタケ株は、抗高血圧作用を有し、高血圧症を改善することができる。  また、本発明のカワラタケ株は、免疫賦活作用を有するので、生体内における免疫系のバランスを整えて疾病予防や健康体維持に寄与することができる。  本発明のカワラタケ株を、経口により摂取する場合には、個々の状態により異なり特に限定されるものではないが、カワラタケ抽出物（乾燥質量）としては、成人（６０ｋｇ体重）１日当たり０．００１〜１ｇ、さらには０．０１〜０．５ｇとすることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】  さらに、本発明のカワラタケ及び／又はその抽出物に、微細藻類及び他の担子菌類及びこれらの抽出物から選ばれる少なくとも一つを併用することにより、その活性が相乗的に向上することが明らかとなった。  微細藻類としては、クロレラ属が好適に使用でき、特にクロレラピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄａｏｓａ）が好適に使用できる。  また、他の担子菌類としては、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、メシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）及び冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｓｉｓ）から選ばれる少なくとも一つが好適に使用できる。  これら微細藻類や担子菌類の抽出方法については、前期カワラタケの抽出方法あるいはその他の公知の方法により行うことができる。
【国際調査報告】
2007013588.tif 000015
2007013588.tif 000016
2007013588.tif 000017
2007013588.tif 000018
2007013588.tif 000019