【手続補正書】
【提出日】平成31年4月22日(2019.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流れ領域と複数の単離チャンバとを備えるマイクロ流体デバイスにおいて生体細胞を処理及び貯蔵する方法であって、各単離チャンバは、単離領域と、前記単離領域を前記流れ領域に流体接続する接続領域とを含み、該方法は、
前記マイクロ流体デバイス内に、生体細胞を含む流動性媒体を導入することと、
前記マイクロ流体デバイスの１つ以上の各単離チャンバの前記単離領域に前記流動性媒体からの１つ以上の生体細胞を隔離することと、
内部で隔離された前記１つ以上の生体細胞を含む前記マイクロ流体デバイスを凍結することと、
を備える、方法。
【請求項２】
単一の生体細胞が複数の単離領域の各々において隔離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流れ領域は流れチャネルを備え、各単離チャンバの前記接続領域は、約２０ミクロン〜約１００ミクロンの幅Ｗｃｈをもつ前記流れチャネルに流体接続された近位開口と、前記単離チャンバの各単離領域に流体接続された遠位開口とを有し、前記近位開口から前記遠位開口までの前記接続領域の長さＬｃｏｎは、前記近位開口の前記幅Ｗｃｈの少なくとも１．倍である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記接続領域の前記長さＬｃｏｎは、前記近位開口の前記幅Ｗｃｈの少なくとも１．５倍である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記接続領域の前記長さＬｃｏｎは、前記近位開口の前記幅Ｗｃｈの少なくとも２．０倍である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
各接続領域の前記近位開口の前記幅Ｗｃｈは、約２０ミクロン〜約６０ミクロンの範囲内である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記接続領域の前記長さＬｃｏｎは、約２０ミクロン〜約５００ミクロンの範囲内である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記流れチャネルの幅は、約５０ミクロン〜約５００ミクロンの範囲内である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記流れチャネルの高さは、約２０ミクロン〜約１００ミクロンの範囲内である、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
各単離領域は約１．５×１０５立方ミクロン〜約１．５×１０６立方ミクロンの範囲内の体積を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイクロ流体デバイスを凍結する前に、前記１つ以上の隔離された生体細胞の各々について少なくともアイデンティティ及び単離領域位置を含む在庫目録を生成することと、前記マイクロ流体デバイスに関連付けられたメモリに前記在庫目録を記憶することと、を更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記在庫目録は、（ｉ）前記流動性媒体中の前記生体細胞がどのように取得されたか、（ｉｉ）前記マイクロ流体デバイス内に導入される前又は後に前記生体細胞に実行された処理が存在する場合はこの処理、（ｉｉｉ）前記マイクロ流体デバイス内で隔離された後に前記１つ以上の隔離された生体細胞に実行された処理が存在する場合はこの処理、及び（ｉｖ）そのような隔離前又は隔離後の処理の過程において得られたデータ、のうち１つ以上を識別する情報を更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記メモリは、前記マイクロ流体デバイスに結合されて前記マイクロ流体デバイスと共に凍結されるチップ又は他のデバイスを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロ流体デバイスを凍結することは、約０℃の温度までの前記マイクロ流体デバイスの最初の制御冷却、及び、その後の氷点下の温度までの前記マイクロ流体デバイスの冷却を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記最初の制御冷却は、毎分約０．１℃〜毎分約２℃の範囲内の速度で前記マイクロ流体デバイスを冷却することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記氷点下の温度は約−２０℃以下である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロ流体デバイスを凍結する前に、前記マイクロ流体デバイス内に細胞保存試薬を導入することを更に含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞保存試薬はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＭＳＯは、体積で約１５％から約２５％の濃度で前記マイクロ流体デバイスに導入され、隔離された生体細胞を含む前記１つ以上の単離領域に拡散される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記マイクロ流体デバイスを解凍することを更に含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記マイクロ流体デバイスを解凍した後、前記マイクロ流体デバイス内で１つ以上の生存細胞を培養し、これによって追加の細胞を生成することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の隔離された生体細胞は、第１の単離領域において隔離された少なくとも１つ以上の開始細胞を含み、前記方法は、
前記マイクロ流体デバイスを凍結する前に、前記１つ以上の開始細胞を培養して前記第１の単離領域において複数の新しい細胞を生成することであって、前記複数の新しい細胞は、前記マイクロ流体デバイスを解凍した後に前記第１の単離領域に少なくとも１つの生存細胞が位置するように適切な数である、ことを更に含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の隔離された生体細胞のアッセイを実行することを更に含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アッセイを用いて細胞分泌物又は細胞表面マーカを検出する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記流れ領域及び１つ以上の単離領域はブロッキング溶液で処理されて細胞接着を防止又は軽減する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ブロッキング溶液は、血清、ＢＳＡ、ポリマー、洗剤、酵素、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ流体デバイスは、コーティング材料を含む内側基板表面を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記コーティング材料は、連結基及びアルキル部分を有する分子を含み、前記連結基は前記内側基板表面に共有結合している、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記連結基はシロキシ連結基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アルキル部分は少なくとも１０の炭素原子を含む炭素の直鎖を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記コーティング材料の前記分子は、前記内側基板表面に共有結合している高密度充填単層構造を形成する、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記コーティング材料は、連結基及びカチオン性部分及び／又はアニオン性部分を有する分子を含み、前記連結基は前記内側基板表面に共有結合している、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記アニオン性部分は、ホスホン酸、カルボン酸、又はスルホン酸を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記コーティング材料は、アルキレンエーテル部分、サッカライド部分、又はアミノ酸部分を含むポリマーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記コーティング材料はデキストラン又はポリエチレングリコールを含む、請求項３４に記載の方法。