【手続補正書】
【提出日】平成19年12月12日(2007.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  １個またはそれ以上のＥＦ１α、Ａｃｔ８、Ａｃｔ２もしくはＡｃｔ１１プロモーターに作動可能に連結されたカリモウイルスプロモーターを含むハイブリッドプロモーター。
【請求項２】  カリモウイルスプロモーターがＣａＭＶまたはＦＭＶプロモーターである請求項１記載のハイブリッドプロモーター。
【請求項３】  ＦＭＶプロモーターが３４Ｓプロモーターである請求項２記載のハイブリッドプロモーター。
【請求項４】  ３４Ｓプロモーターが、重複エンハンサー（ｅＦＭＶ）を含む請求項３記載のハイブリッドプロモーター。
【請求項５】  ＣａＭＶプロモーターが、３５Ｓプロモーターである請求項２記載のハイブリッドプロモーター。
【請求項６】  ３５Ｓプロモーターが、重複エンハンサー（ｅ３５Ｓ）を含む請求項５記載のハイブリッドプロモーター。
【請求項７】  ハイブリッドプロモーターが、ＦＭＶ：Ａｃｔ１１、ＦＭＶ：ＥＦ１α、ＣａＭＶ：Ａｃｔ８またはＣａＭＶ：Ａｃｔ２を含む請求項１〜６のいずれか１記載のハイブリッドプロモーター。
【請求項８】  ハイブリッドプロモーターが、配列番号：２７〜３０のいずれかである請求項７記載のハイブリッドプロモーター。
【請求項９】  少なくとも１つの発現カセットが、請求項１〜８のいずれかのハイブリッドプロモーターに作動可能に連結した構造ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１０】  構造ＤＮＡ配列が、除草剤耐性蛋白質をコードする請求項９記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】  構造ＤＮＡ配列が、グリホセート(glyphosate)耐性蛋白質をコードする請求項１０記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１２】  グリホセート耐性蛋白質が、グリホセートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）蛋白質である請求項１１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１３】  グリホセート耐性蛋白質が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）蛋白質である請求項１１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１４】  グリホセート耐性蛋白質が、ａｒｏＡ：ＣＰ４  ＥＰＳＰＳである請求項１３記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１５】  グリホセート耐性蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列が、さらに、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）をコードする構造ＤＮＡ配列に作動可能に連結した請求項１１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１６】  葉緑体輸送ペプチドが、シロイヌナズナ（Arabidopsis）からのＣＴＰ２である請求項１５記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１７】  グリホセート耐性蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列が、さらに、転写ターミネーターに作動可能に連結した請求項１１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１８】  転写ターミネーターが、Ｅ９である請求項１７記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１９】  少なくとも１つの発現カセットが、ａｒｏＡ：ＣＰ４  ＥＰＳＰＳをコードする構造ＤＮＡ配列に作動可能に連結したＦＭＶ：ＥＦ１αを含み、その構造ＤＮＡ配列が、さらに、ＣＴＰ２をコードする構造ＤＮＡ配列およびＥ９  ３’終結領域に作動可能に連結した請求項９〜１８のいずれか１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２０】  第１および第２の発現カセットを含む請求項９〜１８のいずれか１記載のＤＮＡ構築物であって、
第１の発現カセットが、ａｒｏＡ：ＣＰ４  ＥＰＳＰＳをコードする構造ＤＮＡ配列に作動可能に連結したＦＭＶ：ＥＦ１αを含み、その構造ＤＮＡ配列が、さらに、ＣＴＰ２をコードする構造ＤＮＡ配列およびＥ９  ３’終結領域に作動可能に連結し、第２の発現カセットが、ａｒｏＡ：ＣＰ４  ＥＰＳＰＳをコードする構造ＤＮＡ配列に作動可能に連結したＣａＭＶ：Ａｃｔ８を含み、その構造ＤＮＡ配列が、さらに、ＣＴＰ２をコードする構造ＤＮＡ配列およびＥ９  ３’終結領域に作動可能に連結した該ＤＮＡ構築物。
【請求項２１】  構造ＤＮＡ配列が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ昆虫制御遺伝子である請求項９記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２２】  請求項９〜２１のいずれか１記載のＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項２３】  請求項９〜２１のいずれか１記載のＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物。
【請求項２４】  該トランスジェニック植物が、さらに、栄養および生殖グリホセート耐性を有すると特徴付けられる請求項２３記載のトランスジェニック植物。
【請求項２５】  該トランスジェニック植物が、４０００平方メートル当たり７２４８グラムまでの割合でのグリホセートに対する曝露を許容できる請求項２４記載のトランスジェニック植物。
【請求項２６】  該トランスジェニック植物が、４０００平方メートル当たり４５３〜１８１２グラムの範囲の割合でのグリホセートに対する曝露を許容できる請求項２５記載のトランスジェニック植物。
【請求項２７】  該植物が、単子葉植物作物種である請求項２３〜２６のいずれか１記載のトランスジェニック植物。
【請求項２８】  該単子葉植物作物が、オオムギ、トウモロコシ、コメ、ライムギ、モロコシまたはコムギである請求項２７のトランスジェニック植物。
【請求項２９】  該植物が、双子葉植物作物種である請求項２３〜２６のいずれか１記載のトランスジェニック植物。
【請求項３０】  該双子葉植物作物が、アルファルファ、トマト、ダイズ、綿、キャノーラまたはヒマワリである請求項２９記載のトランスジェニック植物。
【請求項３１】  該双子葉植物作物が、綿である請求項３０記載のトランスジェニック植物。
【請求項３２】  該綿が、４葉期の後のグリホセート曝露後に３又はそれ以上のさくマップ値を有する請求項３１記載のトランスジェニック植物であって、
そのさくマップ値が、４０００平方メートル当たり１３５９グラムの割合にて４葉期後の綿にグリホセートを散布し、綿植物を成熟まで成長させ、次いで、その最初の５つのさくについて最初の位置のさくの数を測定することにより決定されることを特徴とする該トランスジェニック植物。
【請求項３３】  種子が該ＤＮＡ構築物を含む請求項２３〜３２のいずれか１記載のトランスジェニック植物からの種子。
【請求項３４】  植物において構造ＤＮＡ配列を発現させる方法であって、
（１）請求項９〜２１のいずれか１記載のＤＮＡ構築物を供し；
（２）そのＤＮＡ構築物を植物細胞に導入し；次いで
（３）その構造ＤＮＡ配列が植物において発現可能であるように植物細胞を再生して植物を生産することを特徴とする該方法。
【請求項３５】  （１）請求項１０〜２０のいずれかに記載のＤＮＡ構築物で形質転換した作物植物を供し；次いで
（２）作物植物を害することなく雑草を防除するのに十分な量のグリホセートをその作物植物に施用することを特徴とする雑草を防除する方法。
【請求項３６】  トランスジェニック植物が該ハイブリッドプロモーターを含むことを特徴とするトランスジェニック植物の構築における請求項１〜８のいずれかのハイブリッドプロモーターの使用。
【請求項３７】  請求項２３〜３２のいずれかに記載のトランスジェニック植物および請求項３３記載の種子から生産された作物栽培学的に有用な製品であって、該ＤＮＡ構築物を含む該製品。
【請求項３８】  食品製品である請求項３７記載の製品。
【請求項３９】  ダイズミールである請求項３８記載の製品。
【請求項４０】  綿糸くずである請求項３７記載の製品。
【請求項４１】  栄養分である請求項３７記載の製品。
【請求項４２】  請求項２２記載のトランスジェニック植物細胞をトランスジェニック植物中で再生させることを特徴とするトランスジェニック植物を生産する方法であって、該トランスジェニック植物が、該ＤＮＡ構築物を含む該方法。
【請求項４３】  （１）トランスジェニック植物ともう一つの植物を交配させ、ここに、該トランスジェニック植物は、請求項９〜２１のいずれかに記載されたＤＮＡ構築物を含み；
（２）（１）の交配から誘導された少なくとも１つの子孫植物を得；次いで
（３）該ＤＮＡ構築物を含む子孫を選択し、それによりトランスジェニック子孫植物を生産することを特徴とするトランスジェニック子孫植物を生産する方法。
【請求項４４】  該トランスジェニック子孫植物が、グリホセート耐性であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
【請求項４５】  （１）請求項９〜２１のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を含む少なくとも１つの種子を植え；次いで
（２）植物が該種子から成長するのを可能とし、それにより該ＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物を成長させることを特徴とするトランスジェニック植物を成長させる方法。
【請求項４６】  該トランスジェニック植物が、グリホセート耐性であることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アクチン（Ａｃｔｉｎ）プロモーター配列Ａｃｔ１ａ、Ａｃｔ１ｂ及び延長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター配列、及び作物細胞において機能する異種構造遺伝子配列に作動可能に連結されたこれらのプロモーターから誘導される断片及びシスエレメントを含むＤＮＡ植物発現構築物に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
それ故、本発明の１つの実施形態に従えば、作動可能に連結された、作物の細胞において機能性である、配列番号１２、配列番号２２及び配列番号２３から誘導される少なくとも１個のシスエレメントを備えるプロモーター、プロモーターに対して異種の構造ＤＮＡ配列、及び植物においてＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を含む、組換えＤＮＡ構築物が提供される。例えば、プロモーターは基本的に、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のいずれかから誘導される５’調節領域（その中に位置するイントロン配列を含めて又は除いて）から構成されうる。構造遺伝子は、配列の発現がトランスジェニック作物において作物栽培学的に有用な形質又は産物をもたらす、いかなる異種ヌクレオチド配列も含みうる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明のもう１つの実施形態に従えば、ＤＮＡ構築物を植物細胞に導入したとき、グリホセート１リットル当たり少なくとも５０グラム酸当量（ｇ ａ．ｅ．／ｌ）を含む水性グリホセート製剤に対する耐性を植物細胞に付与するように、構造ＤＮＡ配列がグリホセート耐性遺伝子である、上述したようなＤＮＡ構築物が提供される。他の関連実施形態では、ＤＮＡ構築物は、より高いグリホセート濃度、例えばグリホセート１リットル当たり少なくとも３００グラム酸当量を含むグリホセート製剤に対する耐性を植物細胞に付与する。１つの実施形態に従えば、ＤＮＡ構築物は、例えば１エーカー当たり１６オンス（ｏｚ）（４０００平方メートル当たり４５３グラム）の割合のＲｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（登録商標）の少なくとも１回の施用に対する耐性を植物細胞に付与し、また他の実施形態では、グリホセート耐性は、例えば１エーカー当たり１６オンス（４０００平方メートル当たり４５３グラム）、１エーカー当たり３２オンス（４０００平方メートル当たり９０６グラム）、又は１エーカー当たり６４オンス（４０００平方メートル当たり１８１２グラム）の１回から２回又はそれ以上の施用にまで及ぶ。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
配列番号２７は、Ａｃｔ１１遺伝子の第一イントロンを含むキメラＦＭＶ−Ａｃｔ１１プロモーターの配列である。塩基１−５３６位はＦＭＶプロモーター配列を表わす；塩基５５３−１９４６位はシロイヌナズナアクチン１１プロモーター、イントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
双子葉植物を特異的に形質転換するための方法は、主としてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用する。例えば、報告されているトランスジェニック植物は、綿（米国特許第５，００４，８６３号；米国特許第５，１５９，１３５号；米国特許第５，５１８，９０８号、ＷＯ９７／４３４３０号）、ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号；米国特許第５，４１６，０１１号；ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３，１９８８；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８７：６７１，１９８８）；アブラナ（米国特許第５，４６３，１７４号）、落花生（Ｃｈｅｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、１５：６５３，１９９６）、及びアルファルファ（Ｍａｓｏｕｄ，Ｓ．Ａ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎ．Ｒｅｓ．，５：３１３，１９９６）を含むが、これらに限定されない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
同様の方法が単子葉植物の形質転換において報告されている。これらの方法を用いた形質転換と植物再生は、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４：５３４５，１９８７）；オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒａｅ；ＷａｎとＬｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４：３７，１９９４）；トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ；Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：２０４，１９８８；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３，１９９０；Ｆｒｏｍｍｒａ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３，１９９０；Ｋｏｚｉｅｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１９４，１９９３）；カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ；Ｓｏｍｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１５８９，１９９２）；オルチャードグラス（ｏｒｃｈａｒｄｇｒａｓｓ）（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ；Ｈｏｒｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、７：４６９，１９８８）；イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、インディカ及びジャポニカ品種を含む、Ｔｏｒｉｙａｍａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１０，１９８８；Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、７：３７９，１９８８；ＬｕｏとＷｕ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，６：１６５，１９８８；ＺｈａｎｇとＷｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７６：８３５，１９８８；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７，１９９１）；モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；Ｃａｓａｓ，Ａ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：１１２１２，１９９３）；サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．；ＢｏｗｅｒとＢｉｒｃｈ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２：４０９，１９９２）；ｔａｌｌ ｆｅｓｃｕｅ（ウシノケグサ）（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ；Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｙ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６９１，１９９２）；芝生（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ；Ｚｈｏｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、１３：１，１９９３）；及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ；Ｖａｓｉｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６６７，１９９２；Ｗｅｅｋｓ Ｔ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０２：１０７７，１９９３；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．，５：２９９，１９９４）を含むがこれらに限定されない多くの作物について記述されている。対象とする数多くの標的作物から安定なトランスジェニック植物を生産するために多くの形質転換法が使用でき、修正できることは当業者には明白である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
１つの実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物を含む植物にグリホセート含有除草剤を施用し、グリホセート除草剤に対する耐性に関して植物を評価する。あらゆるグリホセート製剤が本発明のＤＮＡ構築物を含む植物を試験するために使用できる。例えば、Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）のようなグリホセート組成物が使用できる。植物のグリホセート耐性の評価のための試験パラメータは、多くの因子に依存して変化するであろう。因子は、グリホセート製剤の種類、製剤中で使用されるグリホセートの濃度と量、植物の種類、施用期間中の植物の生育段階、環境条件、施用方法、及び個々の製剤を施用する回数を含むが、これらに限定されない。例えば、散布施用法を用いて温室環境で植物を試験することができる。Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）を使用する試験範囲は、８オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり２５７グラム）から２５６オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり７２４８グラム）を含むが、これらに限定されない。好ましい市販の有効範囲は、作物及び植物の生育段階に依存して、Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）の１６オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり４５３グラム）から６４オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり１８１２グラム）でありうる。グリホセート製剤の少なくとも１回の施用により作物に散布することができる。綿の試験については、３葉期に３２オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり９０６グラム）を１回施用し、後期生育段階で追加施用することができる。コムギについては、３−５葉期にＲｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）の３２オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり９０６グラム）を１回施用し、試験するコムギの種類に依存して、収穫前又は収穫後施用を実施することができる所望する商業的に有効なグリホセート耐性レベルを与える本発明の構築物を含む特定植物を見出すために、各々の作物について試験パラメータを至適化することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
遺伝子エレメントは次のように説明される：Ｐ−ｅ３５Ｓは、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，４２４，４００号に述べられているような、−９０−３００領域の重複を含むＣａＭＶからの３５Ｓ ＲＮＡである；Ｐ−ＦＭＶは、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，３７８，６１９号に述べられているような、ゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルスからの３４Ｓプロモーターである；Ｐ−ｅＦＭＶは、重複ＦＭＶプロモーターを含むＦＭＶプロモーターの誘導体である；ＣＴＰ２は、米国特許第５，６３３，４３５号に述べられているようなシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＥＰＳＰシンターゼのシグナルペプチド領域である；ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ（ａｒｏＡ：ＣＰ４）は、米国特許第５，６３３，４３５号に述べられているような又は特定植物種のコドン使用に基づいて植物における発現のためにさらに修飾されたＣＰ４ ＥＰＳＰのコード領域（合成配列）である；Ｅ９ ３’は、ポリアデニル化シグナルとして機能するエンドウＲｂｃＳ遺伝子の単離物の３’末端である；ｎｏｓは、ポリアデニル化シグナルとして機能するノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端である；Ｈｓｐ７０は、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，３６２，８６５号に述べられているようなＰｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａからの非翻訳リーダー配列である；ＧＵＳは、大腸菌からのβ−グルクロニダーゼコード配列である（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８３：８４４７−８４５１、１９８７）；右ボーダー（ＲＢ）及び左ボーダー（ＬＢ）は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓオクトパイン及びノパリン菌株のＴｉプラスミドからである。Ｐ−ＡｔＡｃｔ２は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン２遺伝子からのプロモーターである；ＡｔＡｃｔ２ｉは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン２遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のイントロンである；ＡｔＡｃｔ８は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン８遺伝子からのプロモーターである；ＡｔＡｃｔ２ｉは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン８遺伝子の５’ＵＴＲ内のイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１１遺伝子からのプロモーターである；ＡｔＡｃｔ１１ｉは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１１遺伝子の５’ＵＴＲ内のイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ａは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１ａ遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ１ａは、アクチン１ａ遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ１ａはイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ｂは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１ｂ遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ１ｂは、アクチン１ｂ遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ１ｂはイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン３遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ３は、アクチン３遺伝��のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ３はイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ７は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン７遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ７は、アクチン７遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ７はイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１２は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１２遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ１２は、アクチン１２遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ１２はイントロンである；Ｐ−ＡｔＥＦ１α（Ｐ−ＡｔＥＦ１又はＥＦ１α）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ延長因子遺伝子１αからのプロモーターであり、ＡｔＥＦ１α−ｉ（ＡｔＥＦ１−ｉ）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ延長因子遺伝子１αの５’ＵＴＲ内のイントロンである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
図１から１８は、１個から３個の植物発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を示す。植物分子生物学の当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明のプロモーターと遺伝エレメントを含む植物発現カセットの多くの組合せを構築し、作物において試験することができる。図面に例示する構築物は作製しうる唯一の構築物と解釈すべきではなく、当業者にとっての例示としてのみ使用されるものである。図１（ｐＣＧＮ８０８６）は、対象とする１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ８）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図２（ｐＭＯＮ４５３２５）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の少なくとも１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１）を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図３（ｐＭＯＮ４５３３１）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＥＦ１プラスイントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図４（ｐＭＯＮ４５３３２）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の少なくとも１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＥＦ１プラスイントロン）を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図５（ｐＭＯＮ９１９０）は、本発明の少なくとも２個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＥＦ１プラスイントロン、ＡｔＥＦ１α−ｉ；Ｐ−ＡｔＡｃｔ２プラスイントロン、ＡｔＡｃｔ２ｉ）が対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結されており、Ｐ−ｅＦＭＶプロモーターがＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎに作動可能に連結されている、３個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図６（ｐＭＯＮ９１５３）の植物発現カセットは図４（ｐＭＯＮ４５３３２）に例示したものと同じであり、このプラスミドマップは、明細書に示すデータ表の中の植物表現型に関して表示したデータの発現カセットの同定のために例示している。図７（ｐＣＧＮ８０９９）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の転写を推進する、本発明のハイブリッドプロモーター、Ｐ−ＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α及びＰ−ｅ３５Ｓ−ＡｔＡｃｔ８を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図８（ｐＣＧＮ８０８８）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の発現を推進する、本発明の１個のプロモーター、Ｐ−ＡｔＡｃｔ８プラスイントロン、ＡｔＡｃｔ８ｉ及びＰ−ｅＦＭＶプロモーターを備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図９（ｐＣＧＮ８０６８）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の発現を推進する、本発明の１個のプロモーター、Ｐ−ＡｔＡｃｔ２プラスイントロン、ＡｔＡｃｔ２ｉ及びＰ−ｅＦＭＶプロモーターを備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１０（��ＣＧＮ８０９６）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の転写を推進する、本発明のハイブリッドプロモーター、Ｐ−ＦＭＶ／ＡｔＡｃｔ１１及びＰ−ｅ３５Ｓ−ＡｔＡｃｔ８を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１１（ｐＣＧＮ９１５１）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の転写を推進する、本発明のハイブリッドプロモーター、Ｐ−ＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α及びＰ−ｅ３５Ｓ−ＡｔＡｃｔ２を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１２（ｐＭＯＮ１０１５６）は、対象とするａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ遺伝子の発現を推進するＰ−ｅＦＭＶプロモーターを備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供し、このベクターは本発明のプロモーター配列との比較のために使用する。図１３（ｐＭＯＮ５２０５９）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の発現を推進するハイブリッドプロモーター（Ｐ−ＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１４（ｐＭＯＮ５４９５２）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ａプラスＡｔＡｃｔ１ａイントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１５（ｐＭＯＮ５４９５３）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ｂプラスＡｔＡｃｔ１ｂイントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１６（ｐＭＯＮ５４９５４）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ３プラスＡｔＡｃｔ３イントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１７（ｐＭＯＮ５４９５５）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ７プラスＡｔＡｃｔ７イントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１８（ｐＭＯＮ５４９５６）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１２プラスＡｔＡｃｔ１２イントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
実施例１０ 
Ｒ０綿植物を、様々な生育段階にある選択組織においてＧＵＳレポーター遺伝子の発現に関して試験した。花蕾をサイズによって段階付けた（小、中及び大；大＝キャンドル及び開花）。雄ずい群は、雄性生殖組織であった。雌ずい群は、花床全体（柱頭、花柱及び子房）を含む雌性生殖組織であった。花冠標本はがく片と花弁で構成された。組織を調製し、実施例８で述べたようにＧＵＳアッセイを実施した。結果を表３に要約する。試験した構築物は、ｐＭＯＮ４８４０７（Ｐ−ＥＦ１α＋イントロン／ｇｕｓ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ２６１７０（Ｐ−ＡｔＡｃｔ２＋イントロン／ｇｕｓ／ｎｏｓ）、及びｐＭＯＮ４８４０７（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１＋イントロン／ｇｕｓ／ｎｏｓ）を含んだ。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
【表４】
2003516753.tif 000001
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
トマト種子の収率を、トランスジェニックトマト植物にグリホセート耐性を与える上での、本発明において使用する様々なプロモーター配列及び発現カセットの組合せの効率の測定値として使用する。表５に、グリホセート耐性についてのａｒｏＡ：ＣＰ４コード配列の発現を推進する本発明のプロモーターを備える構築物を含むトランスジェニックトマト植物に関する３つの圃場実験の結果を示している。実験１は、天然及び重複バージョン（Ｐ−ｅＦＭＶ）中にゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター（Ｐ−ＦＭＶ）及び本発明のプロモーター配列を試験するために使用する構築物においても認められる構築物中の付加遺伝エレメントを含む構築物から生産される植物の試験である。５’非翻訳配列及び葉緑体シグナルペプチドのソースのような付加遺伝エレメントも試験する。構築物ｐＭＯＮ２０９９８は、ペチュニアＨｓｐ７０ ５’ＵＴＲに連結されたＰ−ｅＦＭＶ、Ｅ９ ３’終結領域に連結された、シロイヌナズナＥＰＳＰＳ葉緑体シグナルペプチドに連結されたリーダーを含む。構築物ｐＭＯＮ２０９９９は、プロモーターがＰ−ＦＭＶであるという点においてのみｐＭＯＮ２０９９８と異なる。構築物ｐＭＯＮ１０１５６は、ＣＴＰがＰｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳ葉緑体シグナルペプチド（ＣＴＰ４）からのものであるという点においてのみｐＭＯＮ２０９９８と異なる。構築物ｐＭＯＮ４５３１２は、リーダー配列が天然ＦＭＶリーダー配列であるという点においてのみｐＭＯＮ２０９９８と異なる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
【表６】
2003516753.tif 000002
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
シロイヌナズナゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）をＰＣＲ反応物５０ｍｌにおいて使用した。表５ａに示すプライマーを備える反応物は、０．２ｍＭ逆及び正プライマー溶液、２００ｎＭ ｄＮＴＰ及びマグネシウムを含むＰＣＲ緩衝液、ならびにＥｘｐａｎｄ（商標） Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からのＤＮＡポリメラーゼ混合物を含んだ。９４℃での最初の２分間の変性後、反応物を９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、及び７２℃で１．５分間の３５回のサイクルに供した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。アクチン１ａ、アクチン１ｂ、アクチン７、及びアクチン１２配列を表わすゲル単離ＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡキナーゼでリン酸化し、脱リン酸化したＳｍａ Ｉ切断ｐＵＣ１９クローニング構築物にライゲートした。コロニーを適切な挿入物の存在に関してスクリーニングし、Ｍ１３で配列決定してアクチンプロモーターの存在を確認した。選択したクローンをｐＭＯＮ５４９４１（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ａ）、ｐＭＯＮ５４９４２（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ｂ）、ｐＭＯＮ５４９４３（Ｐ−ＡｔＡｃｔ７）及びｐＭＯＮ５４９４４（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１２）と称した。その後、アクチンプロモーターのＤＮＡ断片を、挿入配列を含むｐＵＣ１９構築物のＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｃｏＩ消化によって遊離し、ＤＮＡ断片をゲル単離して、同じ制限酵素で消化しておいたｐＭＯＮ２６１６５にライゲートした。アクチン３プロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ３）についてのＰＣＲ産物をＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｃｏＩで消化し、ｐＭＯＮ２６１６５に直接クローン化してｐＭＯＮ５４９５１を形成した。ｐＭＯＮ２６１６５はＧＵＳ／ｎｏｓターミネーター遺伝子セグメントを含む。プロモーターセグメントとのライゲーションは、植物細胞でのβ−グルクロニダーゼ酵素の発現により各プロモーターを機能的活性に関して検定することを可能にする。植物細胞、例えばタバコの葉のプロトプラストを単離することができる、若しくは植物細胞を葉、根、子葉、胚軸、胚芽、花又は貯蔵器官のような植物組織又は器官に含めることができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
【表８】
2003516753.tif 000003
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
実施例１６ 
ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４コード配列の発現を推進するハイブリッドプロモーターＰ−ＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α（図１３、ｐＭＯＮ５２０５９）及びＰ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’（ｐＭＯＮ１５７３７）の効果をトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいて比較した。トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ植物を真空浸透によって生成し（Ｂｅｃｈｔｏｌｄら、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｐａｒｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１６：１１９４−１１９９）、種子を、植物の正常な成長と発育を可能にする２４℃、１６時間光（１２０μＥｍ−２ｓ−１）サイクルに調整した生育室のトレー上で鉢の土壌に植え付けた。ｐＭＯＮ５２０５９ Ｖ１事象グリホセート耐性トランスジェニックシロイヌナズナ植物を２４オンス／エーカーの割合のグリホセート除草剤散布施用によって選択し、生存植物を個々の鉢に移植した。８つのｐＭＯＮ５２０５９ Ｖ１植物と８つのｐＭＯＮ１５７３７同型接合植物に、抽台所見に対応して、約１６日後に２４オンス／エーカーの割合で２回目の散布を行った。２回目の散布は、生殖耐性を与える２つの構築物の効果を測定するものである。グリホセート施用の栄養作用に関して植物を観察した。すべての植物が完全な栄養耐性を有しており、異常な花は認められなかった。しかし、長角果の発育停止の発生は、発育停止した長角果においては種子が定植していなかったことを示唆した。各々の植物が産生した長角果と種子を含む長角果（稔性長角果）の総数を計数し、表にまとめた。結果を表９に示すが、ハイブリッドプロモーターｐＭＯＮ５２０５９は稔性長角果の１０倍以上の改善を明らかにし、ｐＭＯＮ１５７３７の８％に対して８９％であったことが認められる。稔性結果構造の数は生産されうる種子の量に関係し、これは収率が種子数に関連する作物において特に重要である。綿、ダイズ、キャノーラ、コムギ及びトウモロコシなどの作物は、グリホセートに対する生殖耐性が良好な収率にとって不可欠である作物である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
【表１２】
2003516753.tif 000004
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
実施例１７ 
ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｕｕｓ Ｌ．）は油及び食品として作物栽培学的に重要な作物である。本発明の構築物ｐＭＯＮ４５３２５（図２）、ｐＭＯＮ４５３３２（図４）及びｐＭＯＮ４５３３１（図３）をヒマワリに形質転換した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介したヒマワリの形質転換が報告されている（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，９：５５−６０，１９９０；ＥＰ ０ ４８６ ２３４号）。トランスジーン発現構築物による植物形質転換の当業者に既知の方法は、胚軸、頂端分裂組織、原形質、及び他のヒマワリ組織を含みうる。トランスジェニックヒマワリ系統ＳＦＢ２５０−２７は、ｐＭＯＮ２０９９９（Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’）発現カセット；ＳＦＢ２８８−０１を含み、ＳＦＢ２９５−０９はｐＭＯＮ４５３２５（Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’：：Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１＋イントロン／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’）を含み；ＳＦＢ２８９−０１はｐＭＯＮ４５３３２（Ｐ−ＡｔＥＦ１α＋イントロン／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’：：Ｐ−ｅＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’）を含み；ＳＦＢ３０３−０８、ＳＦＢ３０３−０９、ＳＦＢ３０３−１１及びＨＡ３００Ｂは、ｐＭＯＮ４５３３１（Ｐ−ＡｔＥＦ１α＋イントロン／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９）を含む。これらの系統をグリホセート耐性に関して試験し、図１２に示している。