(57)【要約】  ＩｇＧを効率よく高純度に分離精製し得るＩｇＧ精製用分離剤、及びそれを用いたＩｇＧ単量体の精製方法を提供する。  ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸が多孔性の担体に固定化されていることを特徴とするＩｇＧ精製用分離剤、及び該分離剤にＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体を含む不純物とを含む混合物を接触させ、次いで溶出させるＩｇＧ単量体の精製方法。
2007123242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸が担体に固定化されていることを特徴とするＩｇＧ精製用分離剤。
【請求項２】
ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸が、担体の表面上に分散して多点で固定化されていることを特徴とする請求項１に記載の分離剤。
【請求項３】
ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸の粘度平均分子量が５，０００以上であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の分離剤。
【請求項４】
担体が多孔性の担体であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の分離剤。
【請求項５】
多孔性の担体が、無機多孔質材料、多糖類及び合成高分子からなる群より選ばれることを特徴とする請求項４に記載の分離剤。
【請求項６】
担体の形状が、球状粒子、非球状粒子、膜、又はモノリス（連続体）であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の分離剤。
【請求項７】
ＩｇＧ単量体と不純物を含む混合物を請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の分離剤と接触させ、溶出させることを特徴とするＩｇＧ単量体の精製方法。
【請求項８】
不純物がＩｇＧの二量体乃至多量体及び／又は凝集体を含有することを特徴とする請求項７に記載の精製方法。
【請求項９】
溶出させる方法が、溶離液塩濃度若しくは溶離液ｐＨを直線的に増加させ、前記分離剤に吸着したＩｇＧを溶出させる方法；溶離液塩濃度若しくは溶離液ｐＨを段階的に増加させ、前記分離剤に吸着したＩｇＧを溶出させる方法；又はＩｇＧの単量体を前記分離剤に吸着させず、ＩｇＧの重合体のみを吸着させる方法、であることを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＧ精製用分離剤、その製造方法及びそれを用いたＩｇＧ単量体の精製方法に関する。より具体的には、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー等により精製されたＩｇＧ溶出画分中に存在するＩｇＧの二量体〜多量体及び／又は凝集体（以下、これらをＩｇＧの重合体と称する。）を含む不純物を、イオン交換クロマトグラフィーにより、ＩｇＧの単量体から除去する際に用いられる分離剤、及びそれを用いたＩｇＧ単量体の精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）は治療薬、体外診断薬として有用であり、今後も益々需要が高まることが予測されている。このような用途に使用するためにはＩｇＧを高純度で精製できる技術の開発が必要である。ＩｇＧの精製には一般にプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーが用いられている。プロテインＡはＩｇＧに結合特性を示す、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃａｌ  ａｕｒｅｕｓの菌体膜より分離されたタンパク質である。プロテインＡは、種々の動物由来のＩｇＧと特異的に結合する性質があり、かつ単位タンパク質あたりのＩｇＧの結合量が多いため、このプロテインＡを固定化した担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーが工業スケールの抗体精製プロセスに使用されている。しかしながら、このプロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーは、吸着したＩｇＧを溶出する方法としてｐＨ４以下の酸性溶液を使用するため、抗体の高次構造が変化し、さらに会合、凝集へと進行することが起こる。また、細胞培養の段階で凝集体も発現しており、これらＩｇＧの重合体を含む不純物をプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーで除去するのは困難であった。【０００３】
上記の問題を解決するため、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した後、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性相互作用クロマトグラフィーを組み合わせた方法が通常用いられている。しかしながら、従来のイオン交換クロマトグラフィーではＩｇＧの単量体と、ＩｇＧの重合体を含む不純物との分離が不十分なため、高純度のＩｇＧ（すなわち、ＩｇＧの単量体）を得るためにはＩｇＧの収量を犠牲にする必要があった。また疎水性相互作用クロマトグラフィーではＩｇＧの回収率が低く、また長時間を要するためコスト高となるという問題があった。【０００４】
一方、ポリアニオンを担体に固定化した分離剤が種々提案されており、例えば、低比重リポ蛋白質吸着材として、表面に分子量が２５０００以上である高分子ポリアニオン部を有する吸着材が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、免疫複合体の吸着体として、水不溶性多孔質担体にアニオン性官能基を有する化合物が固定化されてなる吸着体が知られている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、これらの文献には、ＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体を含む混合物からＩｇＧの単量体のみを分離精製することについては何ら開示されていない。【０００５】
また、バイオポリマー（生体高分子）の分離材料として、ヒドロキシ基を含有する支持体粒子の表面が共有結合した重合体で被覆されている分離材料が知られている（例えば、特許文献３参照）。同文献、例Ｅによれば、人間血清中の免疫グロブリン（ＩｇＧ）の分別が行なわれているが、ＩｇＧの単量体のみを高純度で分離精製することについては何ら開示されていない。また、当該分離材料では、表面特性と深く関わるグラフト鎖の分子量、分子量分布およびグラフト密度（グラフト鎖の表面密度）を制御することが困難であり、担体上に存在する重合体の分子量も小さくなるため、ＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との分離が不十分になることが予想される。【０００６】
以上のとおり、ＩｇＧを診断薬、治療薬として広く使用するためには、ＩｇＧ単量体を高純度でかつ安価に大量生産することが必要であるが、従来技術には解決しなければならない多くの問題があり、それらの問題を解決できる新規な分離剤、及びＩｇＧ単量体の精製方法の開発が望まれていた。【０００７】
【特許文献１】特開昭５９−２０６０４５号公報（特許請求の範囲第１項）
【特許文献２】特開平１−６８２７２号公報（特許請求の範囲第１項）
【特許文献３】特開平１−３１０７４４号公報（特許請求の範囲第１項、第９頁右上欄１５行〜１９行、第１２頁左下欄１３行〜２０行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＩｇＧを効率よく高純度に分離精製し得るＩｇＧ精製用分離剤、及びそれを用いたＩｇＧ単量体の精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、担体にポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸を固定化した分離剤が、ＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との分離を温和な条件下で実施できるとともに、上記した課題を一挙に解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下に示すとおりのＩｇＧ精製用分離剤、及びそれを用いたＩｇＧの精製方法である。【００１０】
［１］ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸が担体に固定化されていることを特徴とするＩｇＧ精製用分離剤。
［２］ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸が、担体の表面上に分散して多点で固定化されていることを特徴とする上記［１］に記載の分離剤。
［３］ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸の粘度平均分子量が、５０００以上であることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の分離剤。
［４］担体が多孔性の担体であることを特徴とする上記［１］乃至［３］のいずれかに記載の分離剤。
［５］多孔性の担体が、無機多孔質材料、多糖類、及び合成高分子からなる群より選ばれることを特徴とす上記［４］に記載の分離剤。
［６］担体の形状が、球状粒子、非球状粒子、膜、又はモノリス（連続体）であることを特徴とする上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の分離剤。
［７］ＩｇＧ単量体と不純物を含む混合物を上記［１］乃至［６］のいずれかに記載の分離剤と接触させ、溶出させることを特徴とするＩｇＧ単量体の精製方法。
［８］不純物がＩｇＧの二量体〜多量体及び／又は凝集体（すなわち、ＩｇＧの重合体）を含有することを特徴とする上記［７］に記載の精製方法。
［９］溶出させる方法が、溶離液塩濃度若しくは溶離液ｐＨを直線的に増加させ、前記分離剤に吸着したＩｇＧを溶出させる方法；溶離液塩濃度若しくは溶離液ｐＨを段階的に増加させ、前記分離剤に吸着したＩｇＧを溶出させる方法；又はＩｇＧの単量体を前記分離剤に吸着させず、ＩｇＧの重合体のみを吸着させる方法、であることを特徴とする上記［７］又は［８］に記載の精製方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＩｇＧ精製用分離剤を使用すると、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー等で精製された、ＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体を含む不純物とを含む混合物から、当該不純物を効率良く分離することが可能となり、目的のＩｇＧ単量体のみを高純度に精製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例５に記載のヒト化モノクローナル抗体の分離結果を示すクロマトグラムである。
【図２】実施例６に記載のヒト化モノクローナル抗体の分離結果を示すクロマトグラムである。
【図３】比較例１に記載のヒト化モノクローナル抗体の分離結果を示すクロマトグラムである。
【図４】比較例２に記載のヒト化モノクローナル抗体の分離結果を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のＩｇＧ精製用分離剤は、ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸が担体に固定化されていることを特徴とする分離剤である。
本発明の分離剤によるＩｇＧの単量体の精製は、主として、ＩｇＧと分離剤との間の静電気的相互作用に基づくものである。上記したとおり、高分子ポリアニオン部を有する吸着材により血液中のリポ蛋白質を除去する方法が提案されているが、この方法はリポ蛋白質と吸着材との間の生物学的親和性に基づくものであり、本発明とは分離機構が異なるものである。本発明の分離剤はポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸がＩｇＧ吸着の担い手として機能するものであり、そのためにはＩｇＧと接触する分離剤の表面にポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸が固定化されていることが必要である。なお、分離能力を考慮すると、本発明の分離剤としては、ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸が担体表面上に分散して多点で固定化されているものが好ましい。【００１４】
本発明の分離剤において、担体に結合させるポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸の粘度平均分子量は好ましくは５，０００〜１００万の範囲であり、特に高分子量になるにつれて、ＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との分離度が向上する。
本発明の分離剤においては、ＩｇＧと接触しない分離剤内部の材質及び多孔性は、本発明の静電気的相互作用による分離機構とは直接には関係しないため、担体として無孔質の材料と多孔質の材料のいずれも使用することができる。実用面からは、時間的にもコスト的にも一回の操作で処理できるＩｇＧの量が多いほうが望ましいため、多孔性の担体から分離剤を調製して分離剤の表面積を大きくするのが好ましく、１ｍ２／ｇ以上の比表面積を有する分離剤が更に好ましい。【００１５】
本発明の分離剤において使用される多孔性の担体としては、カラムクロマトグラフィー用の充填剤として使用される公知の担体を特に制限なく使用することができ、特に限定するものではないが、例えば、多孔質ガラス、多孔質シリカゲル等の無機多孔質材料、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体等の合成高分子等が好適なものとして挙げられる。本発明の分離剤を工業スケールで使用する場合には、精製操作の後に分離剤のアルカリ洗浄が実施されるため、これらのうち、アルカリに対して耐性のある多糖類、合成高分子等からなる担体が好ましい。また、担体の形状としては、特に限定するものではないが、例えば、球状粒子、非球状粒子、膜、モノリス（連続体）等が挙げられる。【００１６】
本発明の分離剤の形状としては、その使用形態により異なるため、特に限定するものではないが、例えば、カラムクロマトグラフィー用の充填剤として用いる場合には、粒子状の分離剤とすることが好ましく、カラム中に均一な充填を行うためには球状粒子とすることがさらに好ましい。また、連続した一体型の円柱状の多孔質体をカラムに装着したものでもよい。さらには、膜状の分離剤を用いたクロマトグラフィーも可能である。
分離剤の形状を粒子状にして使用する場合、分離剤粒子の大きさは、その使用条件によって適当な大きさを選択することが好ましく、特に限定するものではないが、例えば、、ＨＰＬＣ用の充填剤として用いる場合は、平均粒子径が通常５〜１５μｍ、少量の分取を目的とする場合には１５〜５０μｍ、工業プロセスで使用する目的では５０〜３００μｍ程度の粒子径を用いるのが好ましい。【００１７】
本発明において、担体にポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸を固定化する方法としては特に限定するものではなく、公知の方法を用いることができる。例えば、担体表面にエピクロルヒドリンや多官能エポキシ化合物等を用いて、担体表面にエポキシ基を導入した後、ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸を反応させる方法や、エポキシ基導入後、アンモニア等を用いてでアミノ化し、アミノ基とアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸のカルボキシル基とをカルボジイミド試薬で結合させる方法等が可能である。【００１８】
本発明のＩｇＧ単量体の精製方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー等で精製された、ＩｇＧの重合体を含む不純物とＩｇＧの単量体とを含む混合物を本発明の分離剤と接触させ、溶出させることをその特徴とする。
本発明の精製方法におけるＩｇＧの種類はポリクロナール抗体、モノクロナール抗体のいずれであってもよい。【００１９】
本発明の精製方法において、ＩｇＧの重合体を含む不純物とＩｇＧの単量体とを含む混合物を本発明の分離剤と接触させる方法としては、特に限定するものではないが、例えば、公知のイオン交換クロマトグラフィーによる方法を使用することができる。すなわち、当該混合物を緩衝液中で本発明の分離剤に吸着させ、その後、溶出させることにより、ＩｇＧの重合体を含む不純物からＩｇＧの単量体が分離される。【００２０】
本発明の精製方法において、本発明の分離剤に吸着したＩｇＧを溶出させる方法としては、特に限定するものではないが、例えば、溶離液塩濃度若しくは溶離液ｐＨを直線的に増加させ、吸着したＩｇＧを溶出させる方法（リニアグラジエント溶出）、溶離液塩濃度若しくは溶離液ｐＨを段階的に増加させ、吸着したＩｇＧを溶出させる方法（ステップワイズグラジエント溶出）を使用することができる。また、溶離液の塩濃度を高めておき、ＩｇＧの単量体を分離剤に吸着させず、ＩｇＧの重合体のみを吸着させる方法を使用することもできる。
【実施例】
【００２１】
以下に、本発明の実施例を挙げ、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。【００２２】
実施例１
親水性ビニル系ポリマーを基材としたゲル濾過クロマトグラフィー用充填剤ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−６５Ｃ（商品名、東ソー株式会社製、タンパク質排除限界分子量５×１０６、粒子径５０〜１００μｍ）１００ｍｌにエピクロルヒドリン１００ｇ、ＮａＯＨ水溶液（ＮａＯＨ；４０ｇ、Ｈ２Ｏ；１８０ｇ）を加え、４０℃で４時間反応しエポキシ化ゲルを得た。このゲルに濃アンモニア水１００ｍｌを加え、５０℃で２時間攪拌し、アミノ基が導入されたアミノ基含有ゲルを得た。
次にポリアクリル酸（粘度平均分子量；５，０００）２ｇを１００ｍｌの水に溶解し、上記アミノ基含有ゲル１００ｍｌを加えた。この溶液に、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド２ｇをｐＨ４．５に保ちながら４℃で添加し、同温度で２４時間攪拌した。反応終了後、０．５モル食塩水、次いで水で洗浄し、本発明のポリアクリル酸固定化ゲルを得た。固定化されたポリアクリル酸の量は４ｍｇ／ｍｌゲルであった。【００２３】
実施例２
ポリアクリル酸（粘度平均分子量；２５０，０００）を用い、実施例１と同様の反応を実施し、本発明の分離剤を得た。ポリアクリル酸の導入量は５ｍｇ／ｍｌゲルであった。【００２４】
実施例３
ポリアクリル酸（粘度平均；５，０００）２ｇを１００ｍｌの水に溶解し、次いでアガロースゲルに予めアミノ基が導入されたＥＡＨ−セファローズ４Ｂ（商品名、ＧＥ社製、粒子径４５〜１６５μｍ）１００ｍｌを加えた。この溶液に、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド２ｇをｐＨ４．５に保ちながら４℃で添加し、同温度で２４時間攪拌した。反応終了後、０．５モル食塩水、次に水で洗浄し、本発明の分離剤であるポリアクリル酸固定化ゲルを得た。固定化されたポリアクリル酸の量は６ｍｇ／ｍｌゲルであった。【００２５】
実施例４
実施例１で得られたエポキシ化ゲル１００ｍｌに、ポリメタクリル酸２ｇを１００ｍｌの水に溶解した水溶液を加え、４０℃で１６時間反応した。反応終了後、０．５モル食塩水、次いで水で洗浄し、本発明の分離剤であるポリアクリル酸固定化ゲルを得た。固定化されたポリメタクリル酸の量は４ｍｇ／ｍｌゲルであった。【００２６】
実施例５
実施例１で得られた本発明の分離剤を内径６ｍｍ、長さ４ｃｍのカラムに充填し、該カラムにヒト化モノクローナル抗体を注入した後、ＩｇＧの重合体（二量体〜凝集体）を含む不純物とＩｇＧの単量体との混合物の分離を溶離液塩濃度を直線的に増加させる方法（リニアグラジエント）で実施した。得られたクロマトグラムを図１に示す。
実施例１で得られた本発明の分離剤によるＩｇＧの単量体と重合体の分離は、具体的には、以下の方法で実施した。すなわち、カラム（６ｍｍ内径、長さ４ｃｍ）に実施例１で得られた分離剤を充填した後、ＦＰＬＣ装置（Ａｋｔａ  Ｐｒｉｍｅ、ＧＥ社製）に接続した。流速０．５ｍｌ／分でカラム容量１０倍量の５０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した後、ヒト化モノクローナル抗体（１００μｇ）を注入した。溶出は１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭりん酸緩衝液を用い、６０分の直線塩濃度勾配溶出法で分離した。図１において横軸は保持時間（分）を示し、２２分付近に溶出しているピークがＩｇＧの単量体で、３８分付近に溶出しているピークがＩｇＧの重合体である。【００２７】
実施例６
実施例２で得られた本発明の分離剤を用いる以外は、実施例５と同様の分離条件でＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との混合物の分離を行なった。得られたクロマトグラムを図２に示す。図２において、２３分付近に溶出しているピークがＩｇＧの単量体で、４２分付近に溶出しているピークがＩｇＧの重合体である。【００２８】
比較例１
分離剤として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−６５Ｃにカルボキシメチル基が導入されたＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０（商品名、東ソー株式会社製）を用いた以外は、実施例５と同様の分離条件でＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との混合物の分離を行なった。得られたクロマトグラムを図３に示す。図３において、２２分付近に溶出しているピークがＩｇＧの単量体で、３０分付近に溶出しているピークがＩｇＧの重合体である。
図１、図２と図３の比較から明らかなとおり、本発明の分離剤を使用すると、従来のカチオン交換体(ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０)を使用した場合に比べ、ＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との分離度が格段に向上し、高純度のＩｇＧ単量体が得られている。【００２９】
比較例２
分離剤として、アクリル酸を担体にグラフト重合させた分離剤であるＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＣＯＯ−（商品名、メルク社製）を用いた以外は、実施例５に記載と同一条件でＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体との混合物の分離を行なった。得られたクロマトグラムを図４に示す。図４において、２０分付近に溶出しているピークがＩｇＧ単量体で、３３分付近に溶出しているピークがＩｇＧ重合体である。
図１、図２と図４の比較から明らかなように、本発明の分離剤を使用すると、特許文献３に開示されたような分離材料(Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＣＯＯ−）を使用した場合に比べ、ＩｇＧ単量体が効率良く分離・精製されている。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製後の、更なる精製に通常用いられているイオン交換クロマトグラフィーによる方法が持つ、ＩｇＧの単量体と、ＩｇＧの重合体を含む不純物との分離が不十分、ＩｇＧの回収率が低い、また長時間を要するためコスト高、等の問題点が解消されるため、ＩｇＧ精製用分離剤として利用可能性は高い。
なお、２００６年４月２５日に出願された日本特許出願２００６−１２０６２６号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として取り入れるものである。
【図１】
2007123242.tif 000003
【図２】
2007123242.tif 000004
【図３】
2007123242.tif 000005
【図４】
2007123242.tif 000006
【国際調査報告】
2007123242.tif 000007
2007123242.tif 000008
2007123242.tif 000009
2007123242.tif 000010