(57)【要約】ウシ水疱性口内炎ウイルスとB型肝炎ウイルスとの表現型混合ウイルスを生成させ、表現型混合ウイルスを肝細胞に感染させ、肝細胞に感染した表現型混合ウイルスを検出することによってB型肝炎ウイルスの感染性を測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
B型肝炎ウイルスの感染性を測定する方法であって、ウシ水疱性口内炎ウイルスとB型肝炎ウイルスとの表現型混合ウイルスを生成させ、該表現型混合ウイルスを肝細胞に感染させ、肝細胞に感染した表現型混合ウイルスを検出することによってB型肝炎ウイルスの感染性を測定する方法。
【請求項２】
肝細胞がヒト肝がん由来の樹立培養肝細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト肝がん由来の樹立培養肝細胞株が、HepG2細胞またはJHH-7細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
肝細胞が初代培養ヒト肝細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ウシ水疱性口内炎ウイルスが、その外被Gタンパク質遺伝子が欠損し、レポーター遺伝子が挿入されたウシ水疱性口内炎ウイルスであり、レポーター遺伝子にコードされるタンパク質を指標に前記表現型混合ウイルスを検出する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
レポーター遺伝子がgreen fluorescent protein遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
肝細胞に医薬品候補物質を添加し、該肝細胞にウシ水疱性口内炎ウイルスとB型肝炎ウイルスとの表現型混合ウイルスを感染させ、表現型混合ウイルスの感染に対する医薬品候補物質の影響を調べることを特徴とする、抗B型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
B型肝炎ウイルスワクチン候補物質で免疫されたヒトまたは動物由来の血清又は血漿をウシ水疱性口内炎ウイルスとB型肝炎ウイルスとの表現型混合ウイルスと反応させ、反応後の表現型混合ウイルスを肝細胞に添加し、表現型混合ウイルスの感染を測定することを特徴とする、B型肝炎ウイルスワクチンの評価方法。
【請求項９】
ウシ水疱性口内炎ウイルスとB型肝炎ウイルスとの表現型混合ウイルスと、被検血清又は被検血漿とを反応させ、反応後の表現型混合ウイルスを肝細胞に添加し、表現型混合ウイルスの感染を測定することを特徴とする、血中の抗B型肝炎ウイルス抗体価またはB型肝炎ウイルス感染抑制活性の測定方法。
【請求項１０】
表現型混合ウイルスと被検血清又は被検血漿とを補体存在下で反応させる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、B型肝炎ウイルス(hepatitis B virus, HBV)の感染性を容易に短期間に判定することができる方法に関し、さらには、この方法を用いて抗HBV剤の開発やHBVワクチンの評価を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
HBVの感染性を組織培養系で検定する方法として、以前からHBV陽性のヒトの血清をウイルス源として用い、ヒトの初代培養肝細胞を感染の標的として用いる方法が行われてきた。しかしながら、HBVを大量に産生する患者血液を安定的に入手することは困難であり、また正常のヒト肝細胞を入手し、肝細胞を分離し培養することも、現在ほとんど不可能である。【０００３】
従来の方法では、HBVを感染させてから1-2週後に培養上清を集め、HBV由来のタンパク質を検出することでHBVの感染が成立したか決定されている。この方法は判定までに1-2週間培養する必要があり、更に培養上清中のHBVタンパク質量を定量しなければならず、手技的にも複雑である。【０００４】
ウシ水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus）のGタンパク質を欠損させ、green fluorescent protein（GFP）遺伝子を挿入したVSV△G*遺伝子は、Whittらにより作製され、エボラウイルスの表現型混合ウイルス（pseudotypeウイルス）作製に用いられた(非特許文献１)。さらに、このキメラ遺伝子を用いたpseudotypeウイルスは、麻疹ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、RSウイルス、ハンタウイルス、C型肝炎ウイルスなどで作製可能であることが知られている(非特許文献２または３など)。【０００５】
HBVのpseudotypeウイルスとしては、マウス白血病ウイルスを用いた報告がある（非特許文献４）。しかしながら、この報告では、感染の標的細胞としてヒト初代培養肝細胞が必要であり、しかもpseudotypeウイルスの感染価は非常に低い。樹立培養細胞株でHBV感受性の例外的な細胞としてHepaRG細胞が報告されている。この細胞は、市販されているが増殖して用いることが許可されていない。
【非特許文献１】Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 94, 14764-14769, 1997
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 81:2886-2889
【非特許文献３】J. Virol. 72:3539-3546
【非特許文献４】J. Virol. 76:912-917
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、組織培養系でその感染を定量することが困難なHBVについて、その細胞への感染性を簡便に短期間に定量し、解析することを課題とする。また本発明は、HBV感染を阻害する薬剤を簡便に短期間に同定することを課題とする。また本発明は、HBV感染を阻害する抗体の探索、HBVワクチンの有効性・効果を定量的に解析することを可能とする方法を開発することを課題とする。
【０００７】
本発明者達は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、HBV外被タンパク質(HBs)、L、M、S発現細胞、あるいはHBV感染者由来ヒト肝がん細胞Alexander（別名PLC/PRF/5）などにVSV△G*-Gウイルスを感染させるとHBVの外被を持つVSV△G*(HBs)が形成され、ヒト肝がん細胞に効率よく感染することを見出した。さらに、GFPタンパク質の蛍光を測定することでHBVの感染が短時間かつ簡便に測定できることを見出して本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）B型肝炎ウイルスの感染性を測定する方法であって、ウシ水疱性口内炎ウイルスとB型肝炎ウイルスとの表現型混合ウイルスを生成させ、表現型混合ウイルスを肝細胞に感染させ、肝細胞に感染した表現型混合ウイルスを検出することによってB型肝炎ウイルスの感染性を測定する方法。
（２）肝細胞がヒト肝がん由来の樹立培養肝細胞株である、（１）の方法。
（３）ヒト肝がん由来の樹立培養肝細胞株が、HepG2細胞またはJHH-7細胞である（２）の方法。
（４）肝細胞が初代培養ヒト肝細胞である、（１）の方法。
（５）ウシ水疱性口内炎ウイルスが、その外被Gタンパク質遺伝子が欠損し、レポーター遺伝子が挿入されたウシ水疱性口内炎ウイルスであり、レポーター遺伝子にコードされるタンパク質を指標に表現型混合ウイルスを検出する、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）レポーター遺伝子がgreen fluorescent protein遺伝子である（５）の方法。
（７）ヒト肝細胞に医薬品候補物質を添加し、該細胞株にウシ水疱性口内炎ウイルスとB型肝炎ウイルスとの表現型混合ウイルスを感染させ、表現型混合ウイルスの感染に対する医薬品候補物質の影響を調べることを特徴とする、抗B型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法。
（８）B型肝炎ウイルスワクチン候補物質で免疫されたヒトまたは動物由来の血清又は血漿をウシ水疱性口内炎ウイルスとB型肝炎ウイルスとの表現型混合ウイルスと反応させ、反応後の表現型混合ウイルスをヒト肝細胞に添加し、表現型混合ウイルスの感染を測定することを特徴とする、B型肝炎ウイルスワクチンの評価方法。
（９）ウシ水疱性口内炎ウイルスとB型肝炎ウイルスとの表現型混合ウイルスと、被検血清又は被検血漿とを反応させ、反応後の表現型混合ウイルスをヒト肝細胞に添加し、表現型混合ウイルスの感染を測定することを特徴とする、血中の抗B型肝炎ウイルス抗体価またはB型肝炎ウイルス感染抑制活性の測定方法。
（１０）表現型混合ウイルスと被検血清又は被検血漿とを補体存在下で反応させる、（９）の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】VSV△G*(HBs) pseudotypeウイルスの調製方法（一部写真）。AはHBVの外被Gタンパク質の構造を示す。BはpCAGGS/L、 pCAGGS/M、あるいはpCAGGS/Sを導入した293T細胞でのL、M、Sタンパク質それぞれの発現を間接蛍光抗体法で定量した結果を示す。CはpCAGGS、pCAGGS/L、 pCAGGS/M、 あるいはpCAGGS/Sを導入した293T細胞について3E7抗HBs Sモノクローナル抗体を用いて蛍光観察した結果を示す。aはpCAGGS、ｂはpCAGGS/L、cはpCAGGS/M、dはpCAGGS/Sをそれぞれ導入した細胞である。e、fはAlexander細胞で、一次抗体なし(e)で、また一次抗体としてHBSモノクローナル抗体2D1.2を用い(f),検討した。
【図２】HBV抗体のpseudotypeウイルスに対する中和効果を示す図。Aは各組合せのVSVタンパク質に対する3E7抗HBs Sモノクローナル抗体処理の効果を示す（■は3E7抗HBs Sモノクローナル抗体非処理、□は3E7抗HBs Sモノクローナル抗体処理）。BはVSV△G*(HBs/M) pseudotypeウイルスと、VSV△G*（HTLV-I）の感染に対する各種抗体の効果を示す。
【図３】Lactoferrinと硫酸化多糖の感染抑制効果を示す図。AはVSV△G*（HTLV-I）（■）またはVSV△G*(HBs/M) pseudotypeウイルス（□）に対するlactoferrinの感染抑制効果を示す。BはVSV△G*(HBs/M) pseudotypeウイルスに対するヘパリン（■）、デキストラン硫酸（□）およびデキストラン（斜線のグラフ）の感染抑制効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳しく説明する。【００１１】
本発明においては、ウシ水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）とB型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）との表現型混合ウイルス（pseudotypeウイルス）を生成させ、表現型混合ウイルスを肝細胞に感染させ、肝細胞に感染した表現型混合ウイルスを検出することによってB型肝炎ウイルスの感染性を測定する。
ＶＳＶとＨＢＶのpseudotypeウイルスとしては、ＨＢＶの外被タンパク質（HBsタンパク質）を含み、それ以外のウイルスの構成要素はＶＳＶに由来するpseudotypeウイルスを挙げることができる。このようなpseudotypeウイルスは、ＨＢＶのHBsタンパク質と、Ｇタンパク質を欠損したＶＳＶを混合することによって形成させることができる。ＨＢＶのHBsタンパク質には長さの異なるＬ型、Ｍ型、Ｓ型が存在しうることが知られているが、それらのうちのいずれか、あるいは任意の組合せを用いることができる。ＨＢＶのHBsタンパク質は、例えば、Nucleic Acids Res. 11:4601-4610に開示されたようなＨＢＶゲノム配列に基づいてＰＣＲなどの方法（実施例参照）によってその遺伝子を取得し、細胞などで発現させることによって得ることができる。一方、Ｇタンパク質を欠損したＶＳＶは、例えば、配列番号１のＶＳＶのゲノム配列において、Ｇタンパク質をコードする領域（塩基番号３０７８−４６１３）の一部または全部を欠失させることによって得ることができる。なお、ＶＳＶのゲノム配列はウイルスの型などによって異なるため、配列番号１には限定されない。
pseudotypeウイルスの検出を容易にするため、Ｇタンパク質を欠損したＶＳＶにはレポーター遺伝子が挿入されていることが好ましい。レポーター遺伝子の種類はpseudotypeウイルスの検出の指標にできるものであれば特に制限されないが、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、蛍光タンパク質などをコードする遺伝子が挙げられるが、green fluorescent proteinなどの蛍光タンパク質をコードする遺伝子が特に好ましい。これらのレポーター遺伝子は市販のベクターから切り出したり、PCR増幅したりすることによって得ることができる。なお、レポーター遺伝子が挿入される位置は特に制限されず、欠損させたＧタンパク質の位置であってもよいし、その他のVSV構成タンパク質遺伝子の間であってもよい。外被Gタンパク質遺伝子が欠損し、その位置にＧＦＰ遺伝子が挿入されたＶＳＶ遺伝子として、Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 94, 14764-14769, 1997に開示されたVSV△G*が挙げられ、本発明において好適に用いることができる。ただし、その他のコンストラクトも容易に作製でき、本発明において用いることができる。【００１２】
ＨＢＶとＶＳＶのpseudotypeウイルスは、例えば、ＨＢＶの外被タンパク質HBsをプラスミドベクターなどを用いて細胞に導入し、得られた細胞にGタンパク質を欠いたウシ水疱性口内炎ウイルス（VSVΔG）を加えることによって作製することができる。pseudotypeウイルス産生細胞は特に制限されないが、例えば、２９３Ｔ細胞などを用いることができる。ウイルスの回収、感染は通常の手段に従って行うことができる。ただし、高い感染性を保持させるために、培養上清および細胞を回収した後、短時間の超音波処理、あるいは界面活性剤処理(0.001% Triton-X100など)することが好ましい。また、接種したVSVが残存するので、抗VSV抗体でこのVSVを中和した後にpseudotypeウイルスの感染に使用することが好ましい。【００１３】
ＨＢＶとＶＳＶのpseudotypeウイルスの調製は、上記の方法だけでなく、HBV感染者より分離され、HBs（HBVの外被タンパク質）を発現するヒト肝臓がん細胞Alexander(PLC/RF/5細胞)、JHH-7（Hum Cell. 1990 Jun;3(2):152-7.）などをVSV△G感染の標的とし、上記の手順によって調製してもよい。【００１４】
pseudotypeウイルスの感染の標的となる細胞は、肝細胞が好ましく、ヒト培養肝細胞がより好ましく、ヒト肝がん由来の培養樹立細胞株がさらに好ましい。ヒト肝がん由来の培養樹立細胞株としては、HepG2細胞,JHH-7細胞、Huh-7細胞などが挙げられ、そのうちHepG2細胞,JHH-7細胞が特に好ましい。また初代ヒト肝細胞を標的細胞として用いることもできる。これらの細胞を用いてインビトロで評価することが好ましい。【００１５】
HBV pseudotypeの感染性は、レポーター遺伝子の発現を指標として検出することが好ましい。例えば、ルシフェラーゼなどの酵素をレポーター遺伝子として用いる場合には、酵素活性を指標にして検出することができる。また、GFP遺伝子などの蛍光タンパク質遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合には、蛍光陽性細胞数や蛍光の強度を測定することによって検出することができる。より具体的には、pseudotypeウイルス接種細胞が感染の1-2日後GFP陽性となることを蛍光顕微鏡で確認し、感染性を判定することができる。【００１６】
上記のような方法は、HBVに対する治療効果や予防効果を有する薬剤のスクリーニングに使用することができる。例えば、ヒト肝がん由来の培養樹立細胞株に低分子化合物やペプチドなどの医薬品候補物質を添加し、該細胞株にHBsのＶＳＶ pseudotypeウイルスを感染させ、pseudotypeウイルスの感染性に対する医薬品候補物質の影響を調べることにより、ＨＢＶウイルスの感染を抑制するような薬剤をスクリーニングすることができる。【００１７】
また、上記のような方法は、HBVに対するワクチンの探索や接種効果の評価のために使用することができる。例えば、B型肝炎ウイルスワクチンまたはその候補物質で免疫されたヒトまたは動物由来の血清又は血漿をＶＳＶ pseudotypeウイルスと反応させ、反応後のpseudotypeウイルスをヒト肝細胞に添加し、pseudotypeウイルスの感染性を測定することによって、ワクチン候補物質がＨＢＶ感染を阻害しうるか、あるいは、ワクチンの接種効果があったかどうかを調べることができる。
上記のVSVΔG*を用いる場合、HBsがレセプターに吸着する過程を阻害する薬剤または有効なワクチンに対する抗体は、GFP発現細胞数を減少させる。このことに基づいて薬剤やワクチンを評価することができる。
HBsに対する抗体が吸着・侵入過程を阻害すれば、HBV感染は成立しなくなる。有効なワクチンに対する抗体は、この過程を阻害するので、ワクチンの有効性の判定に利用できる。【００１８】
さらに、本発明の方法は、HBV陽性患者において、血中の抗B型肝炎ウイルス抗体価を調べたり、B型肝炎ウイルス感染抑制活性が血中に存在するかを調べたりするために使用することもできる。例えば、HBsのＶＳＶpseudotypeウイルスと、被検血清又は被検血漿とを反応させ、反応後の表現型混合ウイルスを肝細胞に添加し、pseudotypeウイルスの感染性を測定することによって、抗B型肝炎ウイルス抗体価またはB型肝炎ウイルス感染抑制活性を調べることができる。この場合、ヒトあるいはウサギなどの補体存在下にウイルスと被検血漿または血清を反応させてもよい。これにより補体依存性のHBV感染阻害抗体を定量的に検出できる。
HBV感染者については、従来、抗HBeや抗HBs抗体が測定され、これらの抗体の陽性者ではHBV感染は沈静化しており、特に、抗HBs抗体の陽性者ではHBVに対する中和抗体があると判定されてきた。しかし、この方法では、実際のHBVの感染性に対する影響は測定されないできた。これに対し、本発明の方法を用いることによれば、HBs抗体陽性者の血清のHBV感染阻害活性が測定でき、HBV感染病態の状況や患者の予後を検討することもできる。【００１９】
本発明の方法は、本発明の実施例で使用されたadr以外の異なった血清型のHBsのpseudotypeの形成にも利用できる。HBsの血清型には、adw、adr、ayw、ayrなどが報告されている。血清型は本来中和活性を基に分類されているが、実際には現在の臨床検査では血清の中和活性は調べられていない。本発明においては、pseudotypeウイルスを用いてHBVの血清型を判定に応用することも可能である。HBVの血清型を同定することは、HBV感染経路、HBV感染の予後などの判定に利用でき、貴重な診療情報を提供しうる。【００２０】
[実施例]
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
293T細胞、およびヒト肝臓がん由来細胞、HepG2、 JHH-7、Alexander（別名PLC/PRF/5）は、独立行政法人医薬基盤研究所より入手した。HBVの外被タンパク質HBsの長さの異なるL、M、Sタンパク質遺伝子（図１A）は、既知のpBSadr4x2(R)プラスミド（Nucleic Acids Res. 11:4601-4610）よりそれぞれ配列番号７と１０、配列番号８と１０、配列番号９と１０のプライマーを用いたPCRによりクローニングし、発現ベクターpCAGGS （Gene 108:193-199）に導入、pCAGGS/L、 pCAGGS/M、 pCAGGS/Sと名付けた。VSVのGタンパク質を持つpseudotypeウイルスVSV△G*-Gは、M. A. Whitt氏より入手した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 94: 14764-14769, 1997）。HBsに対するマウスモノクローナル抗体（MAb）については、抗HBs S モノクローナル抗体の3E7はDAKO Japanより、ZCH16はZymod社より、2D1.2はChemicon社、anti-preS2のモノクローナル抗体S26はChemicon社からそれぞれ購入した。
【実施例１】
【００２１】
１．HBV由来のGタンパク質の発現
293T細胞を6cmのディシュにseedし、pCAGGS（コントロール）、pCAGGS/L、 pCAGGS/M、 あるいはpCAGGS/SプラスミドDNAを、0.5〜2μg導入した。翌日、細胞をslide glass上に播き、更に翌日アセトンで固定し、HBsに対する3E7モノクローナル抗体（MAb）を用い、間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）を実施し、HBs抗原陽性細胞の割合を測定した（図１Ｂ，Ｃ）。その結果、１μgのDNAの導入で20-60%の293T細胞がHBsタンパク質陽性になった。
また、表１では、プラスミド pCAGGS、 pCAGGS/L、 pCAGGS/M、 pCAGGS/Sを導入した293T 細胞について、上記のアセトン固定後のＩＦＡ、さらに、それとは別に、細胞をパラホルムアルデヒドで固定後Triton X-100処理なし（-）、あり（+）の条件でのIFA、パラホルムアルデヒド固定後サポニン処理なし（-）、あり（+）の条件でのFCM（フローサイトメトリー）で、それぞれHBs 陽性細胞の割合を求めた。これらの界面活性剤処理の結果から、L、M、Sタンパク質は細胞内部に多く発現していることがわかった。【００２２】
【表１】
2007029857.tif 000002
【００２３】
２．VSV△G*(HBs/M)ウイルスの形成と感染
上記のようにしてHBsタンパク質HBs/Mを発現した細胞に、VSV△G*-Gを導入して、VSV△G*(HBs/M)を生成させ、翌日、細胞培養上清と、cell scraperを用いて回収した感染細胞を混合し、短時間超音波処理した。超遠心で上清を分離し、-80℃に保存した。
Pseudotypeウイルスは、上記の凍結保存した遠心上清を希釈し、その114μlに高力価のヤギ抗ＶＳＶ血清６μｌを加えてVSVウイルスを中和した後、そのまま、あるいはHBsのSあるいはpreS2に対するモノクローナル抗体を加え、37℃30分保温後、標的の培養細胞に感染させた。1〜2日培養後、誘導されたGFP陽性細胞数を蛍光顕微鏡で測定し、感染力価（GFP誘導感染単位/ml）（infectious units/ml, IU/ml）とした。
感染の標的の培養細胞としては、HeG2, JHH-7, PH5CH8, Huh-7などのヒト肝臓由来細胞、および肝臓以外の臓器由来の293T, NP-2, U251MG, HeLa, Hos, C8160, MOLT-4, K562細胞などを用いた。すなわち、これらの標的細胞に、上記で調製したウイルス上清を添加し、VSV△G*(HBs/M)の感染によりGFP陽性となる細胞数を求め感染価として表した（表２）。表２の（＋）はHBVの抗体（3E7抗HBs Sモノクローナル抗体）を加えた場合の感染価であり、（−）はHBVの抗体を加えない場合の感染価である。【００２４】
【表２】
2007029857.tif 000003
【００２５】
なお、表２のa〜dは以下のとおりである。
a 感染価（IU/ml）は、VSVΔG*(HBs/M) pseudotypeを感染後、24時間でGFPを発現する細胞数を測定し、決定した。
b 293T 細胞にpCAGGS/M プラスミドDNAを導入後、VSVΔG*-G を感染させ、 VSVΔG*(HBs/M) のサンプルを調製した。このサンプルを抗HBs S モノクローナル抗体 3E7の存在下（-）と非存在下（+）で抗VSV 抗体で処理した。処理サンプルを上記に各種細胞に感染させ、1日後GFP陽性細胞数を蛍光顕微鏡を用い判定した。
c pCAGGS/Mプラスミドを導入していない293T 細胞にVSVΔG*-Gを感染させ、上記の（-）の条件で処理した時のGFP陽性細胞数を示す。この価は、pseudotypeでない実験のバックグラウンドを示す。
d 標的細胞のVSVΔG*-Gウイルスに対する感受性を示す。感受性でない細胞は、この方法でHBVのpseudotypeに対する感受性を判定できないが、上表にある細胞はすべてVSVには感受性である。【００２６】
表2の結果から、特にHEpG2およびJHH-7細胞に感染させた時には高い感染価を示した。すなわち、HEpG2およびJHH-7細胞では3,800および3,300の細胞がGFP陽性となったが、3E7抗HBs Sモノクローナル抗体の処理でそれぞれ400, 200となったのでこの差がHBs/M pseudotypeウイルスであると判定した。他の細胞株では、これより低い感染価を示した。
なお、HBVのMタンパク質を発現しない293T細胞にVSVΔG*-Gを加えて得られたウイルス上清をネガティブコントロール（VSV△G*(-)ウイルス）、VSVのGタンパク質を発現する293T細胞にVSVΔG*-Gを加えて得られたウイルス上清をポジティブコントロール（VSV△G*-Gウイルス）として用いた。すべての細胞はVSV△G*-Gウイルスには感受性であった。
以上の結果、本発明の方法により、HBs/Mのpseudotypeが形成されていることを示している。
【実施例２】
【００２７】
HBV抗体のpseudotypeウイルスに対する中和効果
pCAGGS/L, pCAGGS/M, pCAGGS/SプラスミドDNA単独で、あるいはLとM、MとS, LとS, LとMとSの組み合わせでプラスミドDNAを293T細胞に導入し、上記の方法によりVSV△G*-Gを添加してpseudotypeウイルスを調製し、その感染価を測定した（図２）。まず、各組合せにおける感染性、および3E7抗HBs Sモノクローナル抗体処理の効果を調べた（図２A）。その結果、Mの場合が最も感染性が高かったが、いずれも3E7抗HBs Sモノクローナル抗体処理により中和された。
さらに、VSV△G*(HBs/M) pseudotypeウイルスと、VSVとHTLV-I のpseudotype であるVSV△G*（HTLV-I）の感染に対する各種抗体の効果を調べた。その結果、VSV△G*(HBs/M) pseudotypeウイルスの感染価は、抗HBs Sのモノクローナル抗体である3E7, ZY-ZCH16, CH-2D1.2抗体で中和されたが、抗preS2のモノクローナル抗体であるCH-S26, 抗HTLV-I モノクローナル抗体の LAT-27では中和されなかった。一方、VSVとHTLV-I のpseudotype であるVSV△G*（HTLV-I）は、LAT-27のみで中和された。これらの結果はそれぞれのpseudotypeがHBVとHTLV-Iの特異性を保持していることが明らかである（図２B）。
以上の結果は、本発明の方法により、HBVのpseudotypeが形成されており、ウイルスを中和する抗体の活性を測定できることを示している。したがって、本発明の方法により、ワクチン接種により誘導された抗体がHBVの感染を抑制する働きがあるか明らかにできる。
【実施例３】
【００２８】
感染抑制物質のpseudotypeウイルスに対する効果
HepG2細胞を96-well plateに接種した。翌日VSV△G*(HBs/M)サンプルを抗VSV抗体と37℃30分反応させてVSVウイルスを中和した後、lactoferrinあるいは硫酸化多糖（ヘパリン、デキストラン硫酸、デキストラン）と30分間反応後、HepG2細胞にVSV△G*(HBs/M)pseudotypeウイルスを感染させた。図３に示すように、lactoferrinと硫酸化多糖のいずれの場合にも濃度依存的にVSV△G*(HBs/M) pseudotypeの感染が阻止された。したがって、本発明の方法により医薬品候補薬剤とVSV△G*(HBs/m) pseudotypeウイルスとを反応させ、反応後にHepG2細胞に感染させ、GFP陽性細胞の数を検出することで、医薬品候補薬剤がHBVの細胞への進入を阻害する薬剤であるか判定できる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、簡便にかつ短時間でHBV感染を阻害する活性を測定することができる。これにより、抗HBV活性を有する医薬品候補物質のスクリーニング、HBV感染者の血清中の抗HBV活性の測定、ワクチンの有効性の検定などを容易に実施することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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