【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）部分と、
（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインと
を含む融合タンパク質であって、
（ａ）部分と（ｂ）部分とが共に連結または融合される、前記融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＢＴｘまたはＴＴｘ部分が、ＢＴｘまたはＴＴｘの酵素部分及び転位ペプチドまたは転位ドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＢＴｘの酵素部分または転位ペプチドもしくは転位ドメインが、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、ＢＴｘ／Ｇ、及び非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のうちのいずれか１つのＢＴｘ軽鎖ドメイン及びＢＴｘ重鎖ドメインから選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
（ａ）前記ＢＴｘもしくはＴＴｘの酵素部分が、クロストリジウム神経毒素もしくは非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するＮ末端酵素ドメイン（ＬＣ）を含む；
（ｂ）前記ＢＴｘもしくはＴＴｘの酵素部分が、クロストリジウム神経毒素もしくは非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するＮ末端酵素ドメイン（ＬＣ）を含み、表１に記載のＬＣ酵素部分から選択される；
（ｃ）前記転位ペプチドもしくは転位ドメインが、クロストリジウム神経毒素もしくは非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するポア形成／転位ドメインを含む；
（ｄ）前記転位ペプチドもしくは転位ドメインが、クロストリジウム神経毒素もしくは非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するポア形成／転位ドメインを含み、表１に記載のＨＮ転位ペプチドから選択される；かつ／または
（ｅ）前記ＬＣと前記ＨＮとの間の接合部に対応する残基が切断された、
請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記酵素部分及び前記転位ペプチドもしくは転位ドメインが、リンカーペプチドによって連結される；または
前記酵素部分及び前記転位ペプチドもしくは転位ドメインが、リンカーペプチドによって連結され、前記リンカーペプチドが、
（ｉ）１〜２０アミノ酸長である；
（ｉｉ）ヒト血清において少なくとも１分間安定である；
（ｉｉｉ）ＧｌｙもしくはＳｅｒであるアミノ酸を少なくとも１個含む；かつ／もしくは
（ｉｖ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、もしくはその両方を含まない、
、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＢＴｘもしくはＴＴｘ部分及び前記ＰＡもしくはＰＡの前記Ｃ末端受容体結合ドメインが、リンカーペプチドによって連結される；または
前記ＢＴｘもしくはＴＴｘ部分及び前記ＰＡもしくはＰＡの前記Ｃ末端受容体結合ドメインが、リンカーペプチドによって連結され、前記リンカーペプチドが、
（ｉ）１〜２０アミノ酸長である；
（ｉｉ）ヒト血清において少なくとも１分間安定である；
（ｉｉｉ）ＧｌｙもしくはＳｅｒであるアミノ酸を少なくとも１個含む；かつ／もしくは
（ｉｖ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、もしくはその両方を含まない、
、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
（ｉ）前記ＰＡもしくはＰＡの前記Ｃ末端受容体結合ドメインが、プロテアーゼによる切断に抵抗性である；または
（ｉｉ）前記ＰＡもしくはＰＡの前記Ｃ末端受容体結合ドメインが、フーリンによる切断もしくはＬｙｓＣによる切断、もしくはそれらの両方に抵抗性である、
請求項１〜６のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＰＡの前記Ｃ末端受容体結合ドメインが、ＰＡｄ４ドメイン、ＰＡｄ２及びＰＡｄ４ドメイン、またはＰＡ６３を含む、請求項１〜７のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
（ｉ）前記融合タンパク質が、２〜１０個のＰＡｄ４ドメインを直列で含む；
（ｉｉ）天然のＰＡｄ４ドメインのＮ末端側隣接部に由来する１〜６０個の連続アミノ酸が、前記ＢＴｘもしくはＴＴｘ部分と前記ＰＡｄ４との間に組み込まれる；
（ｉｉｉ）配列番号１（配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを差し引いたもの）の位置５９４、位置６１３、位置６３３、位置６３７，位置６５３、位置６７３、位置６７９、位置６８０、位置６８４、位置６９５、位置７０３、位置７２２、位置７２３、位置７２９、及び位置７３０で、前記ＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つもしくは複数がＡｒｇもしくはＨｉｓによって交換されている；
（ｉｖ）配列番号１の位置６２３、位置６４２、位置６６２、位置６６６、位置６８２、位置７０２、位置７０８、位置７０９、位置７１３、位置７２４、位置７３２、位置７５１、位置７５２、位置７５８、及び位置７５９で、前記ＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つもしくは複数（それぞれを含めた最大数を含む）がＡｒｇもしくはＨｉｓに交換されている；または
（ｖ）配列番号１（配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを差し引いたもの）の位置６０１、位置７１３、位置７１９で、前記ＰＡｄ４ドメインにおけるＡｓｎ残基の１つもしくは複数がＡｓｐによって交換されている、
請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
アミノ酸残基ＲＫＫＲを含むフーリン切断部位が、フーリン抵抗性のアミノ酸配列によって交換された全ＰＡタンパク質を含み、
ＲＫＫＲが、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを配列番号１から差し引いたものの残基１６４〜１６７である；または
ＲＫＫＲが、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを配列番号１から差し引いたものの残基１６４〜１６７であり、前記フーリン抵抗性のアミノ酸配列が、ＳＳＳＲ（配列番号３２）もしくはＳＳＳＳ（配列番号３３）である、
請求項１〜７のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
（ｉ）前記融合タンパク質のＮ末端に少なくとも１個のＤ−アミノ酸を含む；かつ／または
（ｉｉ）グリコシル化された、もしくはグリコシル化されていない、
請求項１〜９のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分；または
（ｉｉ）侵害受容器の表面受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分
からなる群から選択されるポリペプチドを含む第１のドメインと、
細胞内作用毒素の触媒ドメインを含む第２のドメインと
を含む、融合タンパク質。
【請求項１３】
（ａ）前記第２のドメインが、ＳＮＡＲＥタンパク質の１つもしくは複数を標的とする非細胞傷害性プロテアーゼを含む；
（ｂ）前記細胞内作用毒素の触媒ドメインが、ボツリヌス毒素もしくは破傷風毒素の触媒ドメインである；
（ｃ）前記侵害受容器の表面受容体が、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて侵害受容ニューロンに入る能力を有し、前記侵害受容ニューロンが、第２のドメインによって切断される能力を有するＳＮＡＲＥタンパク質を発現する；
（ｄ）侵害受容器の表面受容体を特異的に標的とする能力を有する前記分子が、侵害受容ニューロンで発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体に結合する抗体試薬もしくはアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）である；
（ｅ）前記ＰＡもしくはｍＰＡが、オリゴマー形態である；
（ｆ）前記第１のドメイン及び前記第２のドメインが、リンカーペプチドによって共に融合される；かつ／または
（ｇ）前記第１のドメイン及び前記第２のドメインが、リンカーペプチドによって共に融合され、前記リンカーペプチドが、
（ｉ）１〜２０アミノ酸長である；
（ｉｉ）ヒト血清において少なくとも１分間安定である；
（ｉｉｉ）ＧｌｙもしくはＳｅｒであるアミノ酸を少なくとも１個含む；かつ／もしくは
（ｉｖ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、もしくはその両方を欠失している、
請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記第２のドメインが、エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って前記融合タンパク質を侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）を含む、請求項１２または１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ＴＬが、炭疽毒素転位ペプチド、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン、非クロストリジウムのボツリヌス様毒素の転位ドメイン、またはＫＫＫ、ＫＫＫＫＫＫ（配列番号５９）、ＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号６０）、ＨＨＨ、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号６１）、ＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２）、ＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号６３）、もしくはＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号６４）などのポリカチオン性配列からなる群から選択される、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記クロストリジウム神経毒素が、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＴＬが、前記細胞内作用毒素の触媒ドメインと融合している、請求項１４〜１６のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含むベクター；または請求項１８に記載の核酸を含み、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス粒子、もしくはウイルスベクターであるベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸、または請求項１９に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２１】
（ａ）ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）部分と、
（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインと
を含み、（ａ）部分と（ｂ）部分とが共に連結または融合される、融合タンパク質の産生方法であって、
（ｉ）前記融合タンパク質が発現するような条件下での、請求項２０に記載の細胞の培養段階と、
（ｉｉ）前記融合タンパク質の回収段階と
を含む、融合タンパク質の産生方法。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質；または請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質及び医薬的に許容可能な担体、賦形剤、もしくは希釈剤を含む、組成物。
【請求項２３】
（ａ）侵害受容ニューロンにおけるイオンチャネルを遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素と、
（ｂ）前記イオンチャネルをそこで発現する前記侵害受容ニューロンの結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）と
を含む、融合タンパク質。
【請求項２４】
（ａ）ＡＢ毒素と、
（ｂ）侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはその断片と、
（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って前記プロテアーゼを前記侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と
を含む融合タンパク質。