(57)【要約】本発明はアスペルギルス属に属し、ステンフォンＤ物質、ステンフォンＥ物質、ステンフォンＥ１物質、ステンフォンＥ２物質、ステンフォンＥ３物質、ステンフォンＦ物質よりなる群から選択されるステンフォン類の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にステンフォン類の化合物を蓄積せしめ、該培養物からステンフォン類の化合物を採取する新規ステンフォン類の化合物である。得られた化合物はイミペネム活性増強作用をするとともに、細胞毒性の低下が認められることから、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症の併用薬のリードとして有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［Ｉ］
2007108108.tif 000011
で表されるステンフォンＤ物質、下記式［ＩＩ］
2007108108.tif 000012
で表されるステンフォンＥ物質、下記式［ＩＩＩ］
2007108108.tif 000013
で表されるステンフォンＥ１物質、下記式［ＩＶ］
2007108108.tif 000014
で表されるステンフォンＥ２物質、下記式［Ｖ］
2007108108.tif 000015
で表されるステンフォンＥ３物質、下記式［ＶＩ］
2007108108.tif 000016
で表されるステンフォンＦ物質よりなる群から選択されるステンフォン類の化合物。
【請求項２】
アスペルギルス属に属し、請求の範囲１に記載のステンフォンＤ物質、ステンフォンＥ物質、ステンフォンＥ１物質、ステンフォンＥ２物質、ステンフォンＥ３物質、またはステンフォンＦ物質よりなる群から選択されるステンフォン類の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にステンフォン類の化合物を蓄積せしめ、該培養物からステンフォン類の化合物を採取する新規ステンフォン類の化合物の製造法。
【請求項３】
アスペルギルス属に属し、ステンフォン類の化合物を生産する能力を有する微生物が、アスペルギルス  エスピーＦＫＩ−２１３６（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＦＫＩ−２１３６）（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８３）である請求項２記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌剤として利用されているβ−ラクタム抗生物質イミペネムと併用することによりその効果を増強する新規ステンフォン（ｓｔｅｍｐｈｏｎｅ）類の化合物及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、院内感染の主な原因菌として社会的問題となっている。この病原菌は、β−ラクタム抗生物質など種々の薬剤に対する耐性を有しており、一般にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症の治療には、現時点ではほとんど耐性化が報告されていないグリコペプチド系のバンコマイシンやアミノグリコシド系のアルベカシンといった抗生物質が使用されている。またこの他に、β−ラクタム抗生物質同士、もしくはβ−ラクタム抗生物質と他の作用点の異なる抗生物質との併用療法が行われている（長谷川裕美ら、抗菌薬投与の科学、２６４−２７３、１９９８年）。
従来の技術
バンコマイシンやアルベカシンについてもすでにこれらの薬剤に対する耐性菌が出現している。また、これらの薬剤については、第８脳神経障害による聴力障害などの副作用を有することが知られており、問題となている。現在までに、このような状況に対処すべく、β−ラクタム抗生物質の効力を回復させる作用を有する物質が報告されている。例えば、β−ラクタム抗生物質を含む抗菌剤と組み合せて使用することで相乗的効果を示す茶エキスまたはその活性フラクション（特表平９−５０９６７７）がこれに相当する。
【発明の開示】
【０００３】
新規ステンフォン類は、茶エキスまたはその活性フラクションに有する活性成分であるポリフェノール化合物とは、分子式および化学構造が明確に区別される。また、本発明者らは、糸状菌ＦＫＩ−２１３６株の培養液中より単離したステンフォンＢ物質及びステンフォンＣ物質と命名した２種のイミペネム活性物質を既に報告している。とくにステンフォンＣ物質は、イミペネムのＭＩＣを１６μｇ／ｍＬから０．０３μｇ／ｍＬまで５１２倍の活性増強を有しており、クロキサシリンやセファゾリンにおいても、それぞれ、５１２および１６倍の活性増強が確認されたことから、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症のβ−ラクタム抗生物質併用薬への応用が期待される。
β−ラクタム抗生物質の活性を増強する薬剤は、β−ラクタム抗生物質の投与量を減量させ、投与期間を短縮させることにより耐性菌出現の頻度を低減させることが期待される。また同時に、作用の異なる２つの薬剤を併用することにより、β−ラクタム抗生物質に対する耐性を克服することも期待される。
本発明の目的はかかる実情において、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対するβ−ラクタム抗生物質の活性増強作用を有する物質を提供することであり、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症やβ−ラクタム抗生物質耐性を含む多剤耐性菌を起因とする感染症の新しい治療薬として有用なことである。
本発明者らは、以前に土壌から分離した糸状菌ＦＫＩ−２１３６株の培養液を精査したところ、ステンフォンＢ物質およびステンフォンＣ物質とは異なるイミペネム活性増強物質が産生されていることを見出した。次いで、該培養物から３種のイミペネム活性増強物質を分離、精製した。このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、本物質をそれぞれステンフォンＤ物質、ステンフォンＥ物質およびステンフォンＦ物質と称することにした。また、ステンフォンＥ物質については、誘導体の調製を行った結果、このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、本物質をそれぞれステンフォンＥ１物質、ステンフォンＥ２物質およびステンフォンＥ３物質と称することにした。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、請求の範囲１に記載のように、下記式［Ｉ］
2007108108.tif 000002
で表されるステンフォンＤ物質、下記式［ＩＩ］
2007108108.tif 000003
で表されるステンフォンＥ物質、下記式［ＩＩＩ］
2007108108.tif 000004
で表されるステンフォンＥ１物質、下記式［ＩＶ］
2007108108.tif 000005
で表されるステンフォンＥ２物質、下記式［Ｖ］
2007108108.tif 000006
で表されるステンフォンＥ３物質、下記式［ＶＩ］
2007108108.tif 000007
で表されるステンフォンＦ物質よりなる群から選択されるステンフォン類の化合物とするものである。
本発明はまた、アスペルギルス属に属し、請求の範囲１に記載のステンフォンＤ物質、ステンフォンＥ物質、ステンフォンＥ１物質、ステンフォンＥ２物質、ステンフォンＥ３物質、ステンフォンＦ物質よりなる群から選択されるステンフォン類の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にステンフォン類の化合物を蓄積せしめ、該培養物からステンフォン類の化合物を採取する新規ステンフォン類の化合物の製造法とするものである。
本発明は、さらに請求の範囲２に記載のように、アスペルギルス属に属し、ステンフォン類の化合物を生産する能力を有する微生物が、アスペルギルス  エスピーＦＫＩ−２１３６（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＦＫＩ−２１３６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−８３）とするものである。
前記の式［Ｉ］、［ＩＩ］、［ＩＩＩ］、［ＩＶ］、［Ｖ］および［ＶＩ］で表される新規ステンフォン類の化合物を生産するために使用される菌株としては、一例として、本発明者等によって沖縄県石垣島の土壌より新たに分離されたアスペルギルス  エスピーＦＫＩ−２１３６（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＦＫＩ−２１３６）株が挙げられる。本菌株の培養性状を示すと以下のとおりである。
形態的特徴
本菌株は、ツァペック・イーストエキス寒天培地、麦芽汁寒天培地、ショ糖２０％入りツァペック・イーストエキス寒天培地などで良好に生育し、各寒天培地での分生子の着生は良好であった。
ツァペック・イーストエキス寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は無色で隔壁を有していた。分生子柄は基底菌糸より直生し、その長さは、１７５〜７３０μｍで基部には逆Ｔ字型の足細胞を生じる。分生子柄の先端は、球形から亜球形に肥大し、直径１５〜６０μｍの頂嚢を形成する。アスペルギラは、複列性で、メトレ（６〜１２×３〜６μｍ）とアンプル型のフィアライド（５〜１０×２〜３μｍ）からなる。アスペルギラは頂嚢のほぼ全体を覆う。フィアライドの先端からは分生子が形成され、培養時間の経過とともに連鎖状となる。分生子は、球形から亜球形、薄い黄土色、大きさ２〜４μｍで表面は粗面であった。
培養性状
本菌株を各種寒天培地上で、２５℃、７日間培養した場合の肉眼的観察結果を次表に示す。
2007108108.tif 000008
なお、本菌株はツァペック・イーストエキス寒天培地で、５℃および３７℃で１４日間培養したが、生育しなかった。
生理的性状
１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件はｐＨ４〜８、温度１１．５〜２９℃である。
２）生育の範囲
本菌株の生育範囲はｐＨ３〜１０、温度１０〜３０．５℃である。
３）好気性、嫌気性の区別      好気性
微生物の国際寄託
上記ＦＫＩ−２１３６株の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する一菌株と同定し、アスペルギルス・エスピーＦＫＩ−２１３６と命名した。本菌株は、アスペルギルス・エスピーＦＫＩ−２１３６（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＦＫＩ−２１３６）として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号（２−５−８  Ｋａｚｕｓａｋａｍａｔａｒｉ  Ｋｉｓａｒａｚｕ−ｓｈｉ，Ｃｈｉｂａ−ｋｅｎ  ２９２−０８１８  Ｊａｐａｎ）に所在する独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｃｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ（ＮＰＭＤ）に寄託してある。受託日は２００５年３月３日、受託番号はＮＩＴＥ  ＢＰ−８３である。
本発明で使用されるＦＫＩ−２１３６物質生産菌としては、前述のアスペルギルス・エスピーＦＫＩ−２１３６菌株が好ましい例として挙げられるが、菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導体剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリンなどを用いる人工変異株も含め、アスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属し、前記の式［Ｉ］、［ＩＩ］、［ＩＩＩ］、［ＩＶ］、［Ｖ］および［ＶＩ］で表されるステンフォン類の化合物を生産する能力を有する菌株は本発明に含まれる。
本発明を実施するに当たっては、先ずＦＫＩ−２１３６物質生産菌を培地に培養することにより行われる。上記ステンフォン類の化合物の生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。上記の同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉等の糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
消化し得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スティープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類が単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩等の重金属塩類やビタミン類、その他本ステンフォン類化合物の生産に好適なものが適宜添加される。
培養するに当たり、発泡が激しいときには、必要に応じて液体パラフイン、動物油、植物油、シリコン等、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい。少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。目的物質を大量に工業生産するには、他の発酵生産物と同様に、通気攪拌培養するのが好ましい。
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者とも同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込み等、既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したものを使用する。
培養温度は、本ＦＫＩ−２１３６物質生産菌が本ステンフォン類の化合物を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は２０〜３０℃、好ましくは２７℃前後で培養するのがよい。培養ｐＨは通常５〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は培養条件によっても異なるが、通常は４〜７日程度である。このようにして得られたステンフォン類の化合物は、培養菌体および培養濾液に存在する。培養物から目的とするステンフォン類の化合物を採取するには、全培養物をアセトンなどの水混和性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧下有機溶媒で留去後、続いて残渣を酢酸エチル等の水不混和性有機溶媒で抽出することによって行われる。
上記の抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、あるいは繰り返すことにより、本ステンフォン類の化合物を分離、精製することができる。
理化学的性状
本発明のステンフォン類化合物の理化学的性状について説明する。
ステンフォンＤ物質
（１）性状  ：黄色粉末
（２）分子式：Ｃ３０Ｈ４２Ｏ８
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値５５３．２７７７、実測値５５３．２７８８
（３）分子量：５３０
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］＋５３１を観測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは、λｍａｘ（ＭｅＯＨ，ε）：２０３ｎｍ（１７４４２）、２６５ｎｍ（８２８４）、３９６ｎｍ（６７８）の吸収を示す
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、νｍａｘ３４４２、２９７３、１７３５、１６４３、１６０４ｃｍ−１等に特徴的な吸収極大を示す
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＋９３．０°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノールやクロロホルムに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δＨ：０．８９（３Ｈ）、１．０２（３Ｈ）、１．１５（３Ｈ）、１．２０（３Ｈ）、１．２９（３Ｈ）、１．４８（１Ｈ）、１．６０（４Ｈ）、１．６１（３Ｈ）、１．８２（２Ｈ）、１．９４（３Ｈ）、２．００（１Ｈ）、２．１２（２Ｈ）、２．１５（１Ｈ）、２．５０（１Ｈ）、３．３４（１Ｈ）、３．５８（１Ｈ）、３．７０（１Ｈ）、３．９０（１Ｈ）、５．１４（１Ｈ）、５．５５（１Ｈ）、６．４８（１Ｈ）ｐｐｍ
δｃ：１１．６、１２．８、１３．１、１６．１、１７．１、２０．９、２１．１、２３．８、２４．９、２６．２、２９．９、３３．４、３６．７、３８．９、３９．７、６９．３、７１．８、７５．９、７８．９、８１．０、８１．６、１１７．７、１２５．０、１３２．０、１３２．４、１４８．０、１５２．４、１６９．９、１８１．３、１８７．１ｐｐｍ
以上のように、ステンフォンＤ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ステンフォンＤ物質は前記の式［Ｉ］で表される化学構造であることが決定された。
ステンフォンＥ物質
（１）性状  ：白色粉末
（２）分子式：Ｃ３０Ｈ４４Ｏ９
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値５４９．２９８６、実測値５４９．２９７７
（３）分子量：５４８
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］＋５４９を観測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは、λｍａｘ（ＭｅＯＨ，ε）：２０４ｎｍ（３４４４７）、２９２ｎｍ（４３７０）、３５６ｎｍ（４０３）の吸収を示す
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、νｍａｘ３４３４、２９２９、１７１８、１６２９ｃｍ−１等に特徴的な吸収極大を示す
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＋１００．８°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノールやクロロホルムに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δＨ：０．９７（３Ｈ）、０．９９（３Ｈ）、１．１３（３Ｈ）、１．１８（３Ｈ）、１．２４（３Ｈ）、１．５８（１Ｈ）、１．６０（１Ｈ）、１．６２（３Ｈ）、１．６４（３Ｈ）、１．７８（３Ｈ）、１．８０（１Ｈ）、１．８８−１．９２（３Ｈ）、２．３２（１Ｈ）、３．４４（１Ｈ）、３．５８（１Ｈ）、３．７０（１Ｈ）、４．１４（１Ｈ）、５．０６（１Ｈ）、５．３４（１Ｈ）、５．６３（１Ｈ）、６．１８（１Ｈ）ｐｐｍ
δｃ：１０．９、１２．９、１３．１、１７．６、２１．２、２２．１、２３．７、２５．１、２６．０、２８．１、３３．８、３７．６、４０．５、４６．５、６３．６、７０．７、７２．０、７６．６、７９．５、８０．４、８３．１、１０４．６、１１１．０、１２５．８、１２８．８、１３２．５、１３６．５、１３９．７、１４７．４、１７１．４ｐｐｍ
以上のように、ステンフォンＥ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ステンフォンＥ物質は前記の式［ＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
ステンフォンＥ１物質
（１）性状  ：白色粉末
（２）分子式：Ｃ３１Ｈ４６Ｏ９
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値５６３．３１４２、実測値５６３．３１５３
（３）分子量：５６２
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］−５６１を観測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは、λｍａｘ（ＭｅＯＨ，ε）：２０２ｎｍ（３４５０３）、２９１ｎｍ（３８８９）、３６０ｎｍ（４２２）の吸収を示す
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、νｍａｘ３４３２、２９３１、１７２７、１６３３ｃｍ−１等に特徴的な吸収極大を示す
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＋９７．０°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノールやクロロホルムに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δＨ：１．００（３Ｈ）、１．０８（３Ｈ）、１．１５（３Ｈ）、１．２１（３Ｈ）、１．２５（３Ｈ）、１．５０−１．６０（２Ｈ）、１．６４（３Ｈ）、１．６７（３Ｈ）、１．８０（３Ｈ）、１．８１（１Ｈ）、１．８８−２．０６（３Ｈ）、２．３５（１Ｈ）、３．４３（１Ｈ）、３．６０（１Ｈ）、３．７４（１Ｈ）、３．８２（３Ｈ）、４．１２（１Ｈ）、５．０６（１Ｈ）、５．２１（１Ｈ）、５．４５（１Ｈ）、５．６７（１Ｈ）、６．２７（１Ｈ）ｐｐｍ
δｃ：１１．３、１３．３、１３．４、１７．６、２１．４、２２．３、２３．９、２５．４、２６．６、２８．４、３４．０、３７．８、４０．８、４６．９、５５．７、６３．５、７１．０、７２．０、７７．３、７９．７、８０．９、８２．５、１０１．２、１１２．２、１２５．６、１２８．６、１３２．９、１３７．９、１４０．１、１５０．３、１７０．４ｐｐｍ
以上のように、ステンフォンＥ１物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ステンフォンＥ１物質は前記の式［ＩＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
ステンフォンＥ２物質
（１）性状  ：白色粉末
（２）分子式：Ｃ３０Ｈ４２Ｏ８
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値５３１．２９８０、実測値５３１．２８９６
（３）分子量：５３０
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］−５２９を観測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは、λｍａｘ（ＭｅＯＨ，ε）：２０２ｎｍ（３３５３３）、２８７ｎｍ（２１７２２）の吸収を示す
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、νｍａｘ３４３４、２９７５、１７２０、１６３７ｃｍ−１等に特徴的な吸収極大を示す
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＋２００．５°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノールやクロロホルムに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δＨ：１．０４（３Ｈ）、１．１３（３Ｈ）、１．１８（３Ｈ）、１．２２（３Ｈ）、１．４２（３Ｈ）、１．６４（３Ｈ）、１．６７（３Ｈ）、１．７０（２Ｈ）、１．８１（３Ｈ）、１．８２（１Ｈ）、１．９６（１Ｈ）、２．０１（１Ｈ）、２．１２（１Ｈ）、３．４５（１Ｈ）、３．６４（１Ｈ）、３．８６（１Ｈ）、４．２８（１Ｈ）、５．４１（１Ｈ）、５．６６（１Ｈ）、６．２２（１Ｈ）、６．６０（１Ｈ）ｐｐｍ
δｃ：１１．０、１３．２、１７．６、２０．５、２１．３、２３．８、２４．０、２６．３、２６．６、２７．９、３４．６、３７．１、４４．３、６９．３、７１．９、７４．５、７７．９、７８．９、８２．８、１０５．９、１０８．８、１１３．７、１２５．７、１３０．０、１３２．５、１３６．６、１３８．３、１３９．５、１４４．２、１７０．９ｐｐｍ
以上のように、ステンフォンＥ２物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ステンフォンＥ２物質は前記の式［ＩＶ］で表される化学構造であることが決定された。
ステンフォンＥ３物質
（１）性状  ：赤色粉末
（２）分子式：Ｃ３０Ｈ４０Ｏ８
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋計算値５２９．２７２３、実測値５２９．２７２０
（３）分子量：５２８
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］−５２９を観測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは、λｍａｘ（ＭｅＯＨ，ε）：２０２ｎｍ（１５０１４）、２７２ｎｍ（１１４７８）、４７３ｎｍ（２７４８）の吸収を示す
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、νｍａｘ３４３４、２９２７、１７３３、１６４８、１６２１ｃｍ−１等に特徴的な吸収極大を示す
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＋７．１２°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノールやクロロホルムに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δＨ：０．９８（３Ｈ）、１．０８（３Ｈ）、１．１０（３Ｈ）、１．１５（３Ｈ）、１．４７（３Ｈ）、１．５２（３Ｈ）、１．５６（３Ｈ）、１．６４−１．８６（３Ｈ）、１．８７（３Ｈ）、１．９０−２．０３（２Ｈ）、２．２０（１Ｈ）、３．２７（１Ｈ）、３．５５（１Ｈ）、３．７７（１Ｈ）、４．２２（１Ｈ）、５．１０（１Ｈ）、５．４９（１Ｈ）、６．３４（１Ｈ）、６．４２（１Ｈ）ｐｐｍ
δｃ：１１．５、１３．２、１７．１、２０．８、２１．１、２３．９、２４．０、２６．３、２６．６、２８．２、３４．１、３６．７、４４．８、６９．１、７１．８、７３．８、７７．２、７８．９、８１．０、８１．５、１１１．５、１１７．０、１２５．３、１３１．６、１３１．８、１４３．５、１４９．０、１４９．３、１７０．０、１８０．８、１８４．６ｐｐｍ
以上のように、ステンフォンＥ３物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ステンフォンＥ３物質は前記の式［Ｖ］で表される化学構造であることが決定された。
ステンフォンＦ物質
（１）性状  ：赤色粉末
（２）分子式：Ｃ３３Ｈ４８Ｏ１０
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値６２７．３１４６、実測値６２７．３１５１
（３）分子量：６０４
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］＋６０５を観測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは、λｍａｘ（ＭｅＯＨ，ε）：２０１ｎｍ（１１６６９）、２４４ｎｍ（６４２７）、２８８ｎｍ（３６０３）、３６１ｎｍ（３８７）の吸収を示す
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは、νｍａｘ３４３８、２９６７、１６５８、１６２９、１６２３ｃｍ−１等に特徴的な吸収極大を示す
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＋１４８．９°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノールやクロロホルムに可溶、水に不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δＨ：０．９５（３Ｈ）、０．９９（３Ｈ）、１．１３（３Ｈ）、１．１８（３Ｈ）、１．２８（３Ｈ）、１．５８−１．６０（３Ｈ）、１．６１（３Ｈ）、１．６３（３Ｈ）、１．８２（１Ｈ）、１．９４−１．９６（２Ｈ）、１．９４（３Ｈ）、２．０６（１Ｈ）、２．３０（３Ｈ）、２．５０（１Ｈ）、２．９４（１Ｈ）、３．００（１Ｈ）、３．５６（１Ｈ）、３．６６（１Ｈ）、４．１１（１Ｈ）、４．７９（１Ｈ）、５．１４（１Ｈ）、５．７０（１Ｈ）、６．０６（１Ｈ）ｐｐｍ
δｃ：１１．１、１３．３、１３．４、２０．１、２１．５、２１．８、２３．８、２５．２、２６．５、２８．４、３３．５、３６．２、３７．４、４０．９、４６．４、４６．６、６２．４、７０．９、７１．９、７２．１、７６．７、８０．０、８３．１、８３．５、１１０．１、１２４．１、１２７．５、１３１．５、１６２．０、１６９．１、１６９．４、１８７．５、２０９．９ｐｐｍ
以上のように、ステンフォンＦ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ステンフォンＦ物質は前記の式［ＶＩ］で表される化学構造であることが決定された。
次に、本発明のステンフォン類化合物の生物学的性状について詳細に述べる。ペーパーディスク法によるイミペネム活性増強作用の評価方法
試験菌として、臨床分離されたメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｋ２４株を用いた。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ（２．１％  ｗ／ｖ）（ＤＩＦＣＯ）３７℃、２０時間培養後、同培地で０．５Ｍｃ  ＦＡＲＡＮＤ（約１０８ＣＦＵ／ｍＬ）相当に懸濁し、ＭＨＡ培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ  ２．１％（ｗ／ｖ）、Ａｇａｒ  １．５％）および同組成の培地にイミペネム（日本国、萬有製薬社チエナム筋注用力価０．５）を試験菌の生育に影響を与えない濃度、すなわち最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した培地に塗沫した。
塗沫は、米国臨床検査標準化委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ，ＮＣＣＬＳ）法に従い、滅菌綿棒（日本国、川本産業社）を用いて行った。試験菌に対する各培地上での抗菌活性は、ペーパーディスク法（薄手、６ｍｍ：ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）にて、３７℃で２０時間後の阻止円径の直径を単位ｍｍで表記した。その結果、１０μｇディスク条件下にて、ステンフォンＤ物質、ステンフォンＥ物質、ステンフォンＥ１物質、ステンフォンＥ２物質、ステンフォンＥ３物質およびステンフォンＦ物質いずれも、それ自身では阻止円が測定されなかったのに対して、イミペネム存在下では、それぞれ、２５ｍｍ、２２ｍｍ、１５ｍｍ、２２ｍｍ、２０ｍｍおよび２０ｍｍの阻止円が測定され、イミペネム活性増強作用が確認された。本発明者等のよって以前報告したステンフォンＢ物質およびステンフォンＣ物質は同条件下にて、それ自身では阻止円が測定されなかったのに対して、イミペネム存在下では、それぞれ、２０ｍｍおよび２２ｍｍの阻止円が測定されたため、新たに単離した上記物質はほぼ同等以上のイミペネム活性増強作用を有していることが明らかとなった。
細胞毒性の評価方法
Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する細胞毒性の評価は、ＭＴＴ法（Ｍｏｓｍａａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５巻、５５−６３頁、１９８３年）に従って行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞培養液をＲＰＭＩ−１６４０培地（日本国、イワキ社）に４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで懸濁して、９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に０．０５ｍＬずつまく。その後、ステンフォンＤ物質、ステンフォンＥ物質、ステンフォンＥ１物質、ステンフォンＥ２物質、ステンフォンＥ３物質またはステンフォンＦ物質（０．０５ｍＬ、２％メタノール／ＲＰＭＩ−１６４０培地）を添加し、５％炭酸ガスインキュベーター内で３７℃、４８時間後、濃度５．５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで溶解したＭＴＴ試薬（ＳＩＧＭＡ社）を０．０１ｍＬ加え、３７℃、４時間反応させた。反応後、０．０９ｍＬの細胞溶解液（４０％，Ｎ−ジチルホルムアミド（日本国、関東化学社）、２０％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（日本国、和光純薬社）、２％酢酸（日本国、関東化学社）、０．０３％塩酸（日本国、関東化学社）となるように精製水に溶液）を加え、室温で２時間振とうした後、５５０ｎｍの吸光度をＥＬｘ  ８０８（ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて測定した。その結果、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＩＣ５０値は、次表に示すとおりであり、本発明者等が以前報告したステンフォンＣ物質（Ｒａｔｉｏ：１．０）と比較して約４倍から６０倍の毒性の低下を認めた。
ステンフォン類化合物の細胞毒性試験結果
2007108108.tif 000009
2007108108.tif 000010
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものでない。
【実施例】
【０００５】
寒天斜面培地（グリセロール０．１％（日本国、関東化学社）、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０８％（日本国、関東化学社）、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０．０２％（日本国、関東化学社）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２％（日本国、和光純薬社）、ＫＣｌ  ０．０２％（日本国、関東化学社）、ＮａＮＯ３  ０．２％（日本国、和光純薬社）、酵母エキス０．０２％（日本国、オリエンタル酵母社）、寒天１．５％（日本国、清水食品社）、ｐＨ６．０に調製）で培養したＦＫＩ−２１３６株を、種培地（グルコース２％（和光純薬社）、ポリペトン０．５％（和光純薬社）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％（和光純薬社）、酵母エキス０．２％（日本国、オリエンタル酵母社）、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％（関東化学社）、寒天０．１％（清水食品社）、ｐＨ６．０に調製）１０ｍＬを分注した大試験管に一白金耳ずつ接種し、２７℃で２日間ロータリーシェイカー（３００ｒｐｍ）で培養した後、生産培地（グルコース１．０％（和光純薬社）、可溶性スターチ２．０％（関東化学社）、大豆油２．０％（和光純薬社）、ファーマメディア１．０％（日本国、イワキ社）、肉エキス０．５％（日本国  極東製薬社）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％（和光純薬社）、ＣａＣＯ３  ０．３％（関東化学社）、トレース塩溶液１．０％（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％（関東化学社）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１％（関東化学社）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％（関東化学社）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．１％（関東化学社）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．１％（和光純薬社）、寒天０．１％（清水食品社）、ｐＨ６．０に調製）１００ｍＬを分注した５００ｍＬ容三角フラスコ（５０本）に植菌し、２７℃、２１０ｒｐｍで７日間振とう培養した。うち三角フラスコ１本は、さらに２７℃、２１０ｒｐｍで８日間振とう培養した。
三角フラスコ（４９本）について培養終了後、培養液（４．９Ｌ）を遠心分離し、上清と菌体を得た。菌体にアセトン（２．５Ｌ）を加え、３０分攪拌後菌体を濾別して菌体抽出液を得た。菌体抽出液を減圧下でアセトンを留去して得られた水残査と前述の上清を混合し、酢酸エチル（５Ｌ）で活性成分を抽出し、酢酸エチル層を濃縮乾固し活性粗物質（６．４ｇ）を得た。この粗物質をシリカゲルカラム（シリカゲル６０、メルク社、６０ｇ）にて粗精製を行った。クロロホルム−メタノール（１００：０（１００ｍＬ）、１００：１（２００ｍＬ）、５０：１（３００ｍＬ）、１０：１（３００ｍＬ）、５：１（３００ｍＬ）、１：１（３００ｍＬ））の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィーによる分画を行った。
まず、活性画分（５０：１）を濃縮乾固することで、褐色油状物質７０４ｍｇを得た。再度、この粗物質をシリカゲルカラム（シリカゲル６０、メルク社、３０ｇ）にて精製を行った。クロロホルム−メタノール（１００：０（５０ｍＬ×２）、１００：１（３０ｍＬ×５）、５０：１（２５ｍＬ×１０）、１０：１（３０ｍＬ×５）、５：１（３０ｍＬ×５））の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィーによる分画を行った。活性画分（１０：１フラクション番号３−４）を濃縮乾固することで得られた粗物質３０ｍｇのメタノール可溶部１７ｍｇを分取ＨＰＬＣ（カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ、２０φ  ｘ  ２５０ｍｍ、移動層：４５％アセトニトリル水溶液、流速：６ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ２１０ｎｍ）で精製し、保持時間６４ｍｉｎのピークを分取して分取液を減圧下濃縮しステンフォンＤ物質を収量１．２ｍｇで単離した。
また、２回目のシリカゲルカラム後の活性画分（５０：１フラクション番号７−１０）を濃縮乾固することで、白色粉末のステンフォンＥ物質を収量３１８ｍｇで得た。ステンフォンＥ物質のメチル化体を合成するために、５０ｍｇのステンフォンＥ物質を１７０μＬのＴＭＳ−ジアゾメタン（日本国、ナカライテスク社）、１０％ヘキサン溶液）とメタノール３４０μＬ溶液中で４０℃、２４時間反応させた後、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ、２０φ×２５０ｍｍ、移動層：７０％アセトニトリル水溶液、流速：６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ２１０ｎｍ）で精製し、保持時間２２ｍｉｎのピークを分取して分取液を減圧下濃縮しステンフォンＥ１物質を収量１１．６ｍｇで単離した。また、ステンフォン脱水体を調製するために、５０ｍｇのステンフォンＥ物質を水溶液中で６０℃にて加温した後、濃縮乾固物を少量のメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ、２０φ×２５０ｍｍ）により精製を行った。７０％アセトニトリル水溶液のアイソクラティックを移動層とし、６ｍＬ／ｍｉｎの流速において、ＵＶ２１０ｎｍの吸収をモニターした。保持時間１４ｍｉｎおよび２１ｍｉｎのピークを分取して分取液を減圧下濃縮しステンフォンＥ２物質およびステンフォンＥ３物質をそれぞれ収量１２．０ｍｇと２．３ｍｇで単離した。
三角フラスコ（１本）については培養終了後、培養液（０．１Ｌ）を遠心分離し、上清と菌体を得た。菌体にアセトン（２．５Ｌ）を加え、３０分攪拌後菌体を濾別して菌体抽出液を得た。菌体抽出液を減圧下でアセトンを留去して得られた水残査と前述の上清を混合し、酢酸エチル（０．５Ｌ）で活性成分を抽出し、酢酸エチル層を濃縮乾固し活性粗物質（０．５ｇ）を得た。この粗物質をシリカゲルカラム（シリカゲル６０、メルク社、２．３ｇ）にて粗精製を行った。クロロホルム−メタノール（１００：０（１０ｍＬ×４）、１００：１（１０ｍＬ×２）、５０：１（１０ｍＬ×３）、１０：１（１０ｍＬ×３）、５：１（１０ｍＬ）、１：１（１０ｍＬ））の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィーによる分画を行った。活性画分（５０：１フラクション番号２−３）を濃縮乾固することで得られた粗物質１９．２ｍｇを分取ＨＰＬＣ（カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ、２０φ×２５０ｍｍ、移動層：５０％アセトニトリル水溶液、流速：６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ２１０ｎｍ）で精製し、保持時間１８ｍｉｎのピークを分取して分取液を減圧下濃縮しステンフォンＦ物質を収量１０．３ｍｇで単離した。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明の新規ステンフォン類の化合物を生産する能力を有するアスペルギルス属に属するＦＫＩ−２１３６株を代表とする微生物を培地に培養して、その培養液中から採取したステンフォンＤ物質、ステンフォンＥ物質、ステンフォンＥ１物質、ステンフォンＥ２物質、ステンフォンＥ３物質またはステンフォンＦ物質のそれぞれの化合物は、以前報告したステンフォンＣ物質と同等以上のイミペネム活性増強作用を有するとともに、細胞毒性の低下が認められることから、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症の併用薬のリードとして有用であると期待される。
【国際調査報告】
2007108108.tif 000017
2007108108.tif 000018