【手続補正書】
【提出日】平成20年3月21日(2008.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＤＮＡセグメントをライゲーションしてライゲーション生成物を得るための方法であって、該ライゲーション生成物は、該ＤＮＡセグメントの各々由来の配列を所定の順序で含み、該方法は：
ａ）少なくとも３つの異なるＤＮＡベクター分子を提供する工程であって、該少なくとも３つの異なるＤＮＡベクター分子の各々はＤＮＡセグメントを含み、各セグメントは、該ライゲーション生成物中の１つまたは２つの他のセグメントに隣接し、各セグメントは、第１の隣接するＤＮＡセグメントとの配列同一性を有する第１の領域と、第２の隣接するＤＮＡセグメントが存在する場合には該第２の隣接するＤＮＡセグメントとの配列同一性を有する第２の領域とを含み、各ベクターは選択マーカーを含む、工程；
ｂ）１つまたは２つのライゲーション可能な末端を有するＤＮＡセグメントを生成するために、各ＤＮＡ分子を切断する工程であって、各ライゲーション可能な末端は、隣接するＤＮＡセグメントとの配列同一性を有する少なくとも一部の領域を含み；少なくとも１つのセグメントは、切断後に２つのライゲーション可能な末端を含む、工程；
ｃ）該隣接するセグメントに各セグメントを同時にライゲーションする、工程；および
ｄ）該ＤＮＡセグメントの各々由来の配列を所定の順序で含むライゲーション生成物を選択する工程であって、該選択は、該３つのＤＮＡベクターのうちの１つの選択可能なマーカーに基づく、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
複数のＤＮＡセグメントをライゲーションしてライゲーション生成物を得るための方法であって、該ライゲーション生成物は、該ＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含み、該方法は：
ａ）最終ライゲーション生成物中の１つまたは２つの他のセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを各々が含む、１型ＤＮＡ分子、２型ＤＮＡ分子および少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子を提供する工程であって、ここで：
ｉ）該１型ＤＮＡ分子は、第１のＤＮＡセグメント、第１の選択可能なマーカー、第１の対抗選択可能なマーカー、第１の切断部位、および第２の切断部位を含み、該第２の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該第１のＤＮＡセグメント中に生成し；
ｉｉ）該２型ＤＮＡ分子は、第２のＤＮＡセグメント、第２の選択可能なマーカー、第２の対抗選択可能なマーカー、第３の切断部位、および第４の切断部位を含み、該第４の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該第２のＤＮＡセグメント中に生成し；
ｉｉｉ）各該３型ＤＮＡ分子は、ＤＮＡセグメント、第３の対抗選択マーカー、５’切断部位および３’切断部位を含み、該５’切断部位は、切断の際に、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該セグメント中に生成し、そして該３’切断部位は、切断の際に、異なる隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該セグメント中に生成し；
該第１の選択可能なマーカーおよび該第２の選択可能なマーカーは、異なり；
該第１の対抗選択可能なマーカー、該第２の対抗選択可能なマーカーおよび該第３の対抗選択可能なマーカーは、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；
該第１の切断部位および該第３の切断部位は、同じであるか、または適合性であり；
該第２の切断部位および該第４の切断部位は、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；そして
各該５’切断部位および各該３’切断部位は、各該３型ＤＮＡ分子において独立して選択され、そして同じであるか、または異なる、
工程；
ｂ）各ＤＮＡ分子を、該第１の切断部位、該第２の切断部位、該第３の切断部位、および該第４の切断部位、該５’切断部位（単数または複数）および該３’切断部位（単数または複数）にて切断する、工程；ならびに
ｃ）得られたフラグメントを互いにライゲーションし、それによって該ＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含むライゲーション生成物を生成する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、以下：
ｄ）工程（ｃ）において生成されたライゲーション生成物によって細胞を形質転換する、工程；および
ｅ）前記第１の選択可能なマーカーおよび前記第２の選択可能なマーカーを発現し、そして前記第１の対抗選択可能なマーカー、前記第２の対抗選択可能なマーカー、または前記第３の対抗選択可能なマーカーを発現しない形質転換体を選択する、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、以下：
ｆ）前記ＤＮＡセグメントの各々からの配列を所定の順序で含む前記ライゲーション生成物を、前記形質転換体またはこれらの子孫から単離する、工程
をさらに包含する、方法。
【請求項５】
前記第１の選択可能なマーカーおよび前記第２の選択可能なマーカーは、薬剤耐性を付与する遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の対抗選択可能なマーカー、前記第２の対抗選択可能なマーカーおよび前記第３の対抗選択可能なマーカーは、ｃｃｄＢ（抗ＤＮＡジャイレースタンパク質）、ｓａｃＢ（スクロース感受性）、ａｒａＢ（リブロース感受性）、ｔｅｔＡＲ（テトラサイクリン耐性／フザリン酸過感受性）からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法であって、以下：
ａ）前記第１の切断部位および前記第３の切断部位は、同じであり；
ｂ）前記第２の切断部位および前記第４の切断部位は、同じであり；
ｃ）少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位は、同じ３型ＤＮＡ分子の前記３’切断部位と同じであり；そして／または
ｄ）少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位は、異なる３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位と同じである、
方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法であって、以下：
ａ）前記第１の切断部位および前記第３の切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位であり；
ｂ）前記第２の切断部位および前記第４の切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位であり；そして／または
ｃ）少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位および前記３’切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位である、
方法。
【請求項９】
前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、前記第４の切断部位、前記５’切断部位および前記３’切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、前記第４の切断部位、前記５’切断部位および前記３’切断部位は、同じＩＩＳ型制限酵素によって切断される部位である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記１型ＤＮＡ分子、前記２型ＤＮＡ分子および前記３型ＤＮＡ分子の前記ＤＮＡセグメントは、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをコードする配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記１型ＤＮＡ分子、前記２型ＤＮＡ分子および前記３型ＤＮＡ分子の前記ＤＮＡセグメントは、ポリケチドシンターゼドメインをコードする配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において切断される前記ＤＮＡ分子は、同じ容器中で切断される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
組成物であって、以下：
ｉ）第１のＤＮＡセグメント、第１の選択可能なマーカー、第１の対抗選択可能なマーカー、第１の切断部位、および第２の切断部位を含む１型ＤＮＡ分子であって；該第２の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該第１のセグメント中に生成する、１型ＤＮＡ分子；
ｉｉ）第２のＤＮＡセグメント、第２の選択可能なマーカー、第２の対抗選択可能なマーカー、第３の切断部位、および第４の切断部位を含む２型ＤＮＡ分子であって、該第４の切断部位の切断は、隣接するセグメントの一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該第１のセグメント中に生成する、２型ＤＮＡ分子；
ｉｉｉ）ＤＮＡセグメント、第３の対抗選択可能なマーカー、５’切断部位および３’切断部位を含む少なくとも１つの３型ＤＮＡ分子であって、該５’切断部位および該３’切断部位は、切断の際に、２つの隣接するセグメントの各々の一本鎖突出にライゲーション可能である一本鎖突出を該セグメント中に生成する、３型ＤＮＡ分子；
を含有し、ここで：
該第１の選択可能なマーカーおよび該第２の選択可能なマーカーは、異なり；
該第１の対抗選択可能なマーカー、該第２の対抗選択可能なマーカーおよび該第３の対抗選択可能なマーカーは、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；
該第１の切断部位および該第３の切断部位は、同じであるか、または適合性であり；
該第２の切断部位および該第４の切断部位は、独立して選択され、そして同じであるか、または異なり；そして
各該５’切断部位および各該３’切断部位は、独立して選択される、
組成物。
【請求項１５】
少なくとも２つの前記３型ＤＮＡ分子を含有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、もしくは前記第４の切断部位または１つ以上の５’切断部位もしくは３’切断部位にて切断するエンドヌクレアーゼを含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記エンドヌクレアーゼは、前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、および前記第４の切断部位ならびに１つ以上の５’切断部位または３’切断部位にて切断する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
５’切断部位または３’切断部位を含む少なくとも２つの３型ＤＮＡ分子を含み、そして前記エンドヌクレアーゼは、前記第３の切断部位および前記第４の切断部位、ならびに該３型ＤＮＡ分子の前記５’切断部位および３’切断部位にて切断する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１４に記載の前記１型ＤＮＡ、前記２型ＤＮＡおよび前記３型ＤＮＡの、前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、前記第３の切断部位、前記第４の切断部位、前記５’切断部位および前記３’切断部位における切断から得られる生成物を含有する組成物。
【請求項２０】
ＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
クローニングベクターであって、以下、
ａ）ＳＩＳ−ＣＳＭ−Ｒ−ＵＳＭもしくはＳＩＳ−ＵＳＭ−Ｒ−ＣＳＭ；または
ｂ）ＳＩＳ−ＣＳＭ−ＳＭ、
を示される順序で含み、ここで：
ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＣＳＭは、対抗選択可能なマーカーであり；ＳＭおよびＵＳＭは、選択可能なマーカーであり、そしてＲは、エンドヌクレアーゼ切断部位である、
クローニングベクター。
【請求項２２】
前記ＳＩＳは、−Ｎ１−Ｒ２−Ｎ２−を含み、Ｎ１およびＮ２は、ニック形成酵素のための認識部位であり、そして同じであっても異なっていてもよく、そしてＲ２は、エンドヌクレアーゼのための認識部位である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
ＳＭおよびＵＳＭは、薬剤耐性を付与する遺伝子である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２４】
ベクターであって、以下：
ａ）Ｒ１−Ｓｙ−２Ｓ１−ＣＳＭ−Ｒ２−ＵＳＭ；
ｂ）２Ｓ２−Ｓｙ−Ｒ３−ＵＳＭ−Ｒ４−ＣＳＭ；または
ｃ）２Ｓ３−Ｓｙ−２Ｓ４−ＣＳＭ−ＳＭ、
を示された順序で含み、ここで：
２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３および２Ｓ４は、ＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり、該ＩＩＳ型制限酵素は、同じであってもまたは異なっていてもよく；
Ｓｙは、シントンコード領域であり；
Ｒ１およびＲ３は、エンドヌクレアーゼ切断部位であり；
Ｒ２およびＲ４は、切断の際に適合性の末端を生じるエンドヌクレアーゼ切断部位であり；
ＣＳＭは、対抗選択可能なマーカーであり；そして
ＵＳＭおよびＳＭは、選択可能なマーカーである、
ベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクター、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３、または２Ｓ４のうちの１つ以上にて切断するエンドヌクレアーゼを含有する組成物。
【請求項２６】
組成物であって、以下：
ａ）式Ｒ１−Ｓｙ−２Ｓ１−ＣＳＭ−Ｒ２−ＵＳＭのベクター
ｂ）式２Ｓ２−Ｓｙ−Ｒ３−ＵＳＭ−Ｒ４−ＣＳＭのベクター；および
ｃ）式２Ｓ３−Ｓｙ−２Ｓ４−ＣＳＭ−ＳＭのベクター、
のうちの各々を含み、ここで：
２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３および２Ｓ４は、ＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり、該ＩＩＳ型制限酵素は、同じであっても異なっていてもよく；
各Ｓｙは、異なるシントンコード領域であり；
Ｒ１およびＲ３は、エンドヌクレアーゼ切断部位であり、そして同じであるか、または異なっており；
Ｒ２およびＲ４は、切断の際に適合性の末端を生じるエンドヌクレアーゼ切断部位であり；
２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３、および２Ｓ４は、エンドヌクレアーゼ切断部位であり、そして同じであるか、または異なっており；
ＣＳＭは、対抗選択可能なマーカーであり；そして
ＵＳＭおよびＳＭは、選択可能なマーカーである、
組成物。
【請求項２７】
式２Ｓ３−Ｓｙ−２Ｓ４−ＣＳＭ−ＳＭのベクターを２個か、３個か、４個か、５個か、または６個含有し、該ベクターは、それぞれ異なるＳｙを有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｒｌ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、２Ｓ１、２Ｓ２、２Ｓ３、および２Ｓ４のうちの１つ以上にて切断するエンドヌクレアーゼをさらに含有する、請求項２６の組成物。