【手続補正書】
【提出日】平成31年3月22日(2019.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水和すると擬塑性を示し、架橋ＰＥＧ化タンパク質、架橋ＰＥＧ化タンパク質系生体高分子を含有する水不溶性ミクロゲル粒子を含む組成物であって、
水和するとミクロゲル粒子のクラスターの粘性がせん断力の印加により減少し、せん断力がなくなるとミクロゲルクラスターを再構成し、
水和すると水和した前記ミクロゲル粒子が粘弾性固体の性質を持ち、貯蔵弾性率が損失弾性率よりも大きく、損失正接の値が１未満となることを特徴とする組成物。
【請求項２】
ＰＥＧ化剤のタンパク質およびタンパク質系生体高分子に対するモル比が１：１から１００：１までにあることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物はせん断力の印加により粘性が減少し、また、せん断力がなくなるとミクロゲルクラスターを形成し、前記組成物には粘弾性固体の性質があり、貯蔵弾性率が損失弾性率より大きく、損失正接の値が１未満となることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質およびタンパク質系生体高分子が、細胞外基質、糖タンパク質、構造タンパク質、線維性タンパク質、酵素、プロテオグリカン、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、球状タンパク質、膜タンパク質、血漿タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、抗微生物ペプチド、ペプチド・ホルモン、シャペロン、金属タンパク質、ヘムタンパク質、凝固タンパク質、免疫系タンパク質、イオンチャンネルタンパク質、細胞接着タンパク質、神経ペプチド、核タンパク質、硬タンパク質、色素タンパク質、共役タンパク質、タンパク質−タンパク質複合体、タンパク質多糖類複合体、タンパク質・脂質複合体、モーター・タンパク質、ムコタンパク質、リンタンパク質、収縮性タンパク質、輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、増殖因子タンパク質、感知タンパク質、防御タンパク質、貯蔵タンパク質、受容タンパク質、抗体、組み換えタンパク質、フィブリノゲン、フィブリン、トロンビン、コラーゲン、エラスチン、アルブミン、ゼラチン、ケラチン、ラミニン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
α−スクシンイミジルオキシグルタリル−ω−スクシンイミジルオキシグルタリルオキシポリオキシエチレン（ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ）、α−アミノプロピル−ω−アミノプロポキシポリオキシエチレン、α−アミノプロピル−ω−カルボキシペンチルオキシポリオキシエチレン、α，ω−ビス｛２−［（３−カルボキシ−１−オキソプロピル）アミノ］エチル｝ポリエチレングリコール、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロポキシポリオキシエチレン、ペンタエリトリトールテトラ（アミノプロピル）ポリオキシエチレン、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−（スクシンイミジルオキシカルボキシ）ポリオキシエチレン、ペンタエリトリトールテトラ（スクシンイミジルオキシグルタリル）ポリオキシエチレン、ペンタエリトリトールテトラ（メルカプトエチル）ポリオキシエチレン、ヘキサグリセリンオクタ（スクシンイミジルオキシグルタリル）ポリオキシエチレン、ヘキサグリセリンオクタ（４−ニトロフェノキシカルボニル）ポリオキシエチレン、４−アームポリ（エチレングリコール）テトラアクリラート、４−アームスクシンイミジルオキシグルタリル」ポリオキシエチレン、ビス（ポリオキシエチレンビス［イミダゾイルカルボニル］）、Ｏ−（３−カルボキシプロピル）−Ｏ′−［２−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール、Ｏ，Ｏ′−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジルスクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール、Ｏ，Ｏ′−ビス（２−アジドエチル）ポリエチレングリコール、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、ポリ（エチレングリコール）二（炭酸ｐ−ニトロフェニル）、ポリ（エチレングリコール）ジ（ビニルスルホン）、ポリ（エチレングリコール）ジ（プロプリオンアルデヒド）、ポリ（エチレングリコール）ジ（炭酸ベンゾトリアゾリル）、およびこれらの組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質ＰＥＧ化架橋剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物、水和した前記水不溶性ミクロゲル粒子、またはこれら両方の貯蔵弾性率の値が１０Ｐａから２５０，０００Ｐａまでの間にあり、損失弾性率の値が５Ｐａから１００，０００Ｐａまでの間にあることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
抗菌剤、抗真菌薬、抗原虫薬、抗ウイルス薬、抗生物質、モノアシルグリセリン、モノアルキルグリコール、ビス（ビグアニド）およびその塩、ポリ（ヘキサメチレンビグアニド）およびその塩、グリセリンモノラウラート、クロルヘキシジン、クロルヘキシジンジグルコン酸塩、クロルヘキシジン二酢酸塩、アレキシジン、アレキシジン塩酸塩、銀塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、硫酸ゲンタマイシン、ヨード、ポビドンヨード、でんぷん・ヨード、硫酸ネオマイシン、ポリミキシンＢ、バシトラシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、ゲンタマイシン、ニトロフラゾン、酢酸マフェニド、スルファジアジン銀、テルビナフィン塩酸塩、硝酸ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、メトロニダゾール、抗微生物ペプチド、ポリクオタニウム−１、ポリクオタニウム−６、ポリクオタニウム−１０、カチオン性グアー、水溶性キトサン誘導体、これらの塩、またはこれらの組み合わせをさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
水溶性ポリマーを０．０１重量％から２５重量％までの濃度で含有し、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキサイド）、ポリ（ビニルアルコール）およびその共重合体、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）およびその共重合体、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グァーガム、ヒドロキシエチルグァー、ヒドロキシプロピルグァー、ゼラチン、アルブミン、ヒドロキシプロピルメチルグァー、カルボキシメチルグァー、カルボキシメチルキトサン、ローカストビーンガム、カラギナン、キサンタンガム、ジェランガム、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、アロエベラゲル、スクレログルカン、シゾフィラン、アラビアゴム、タマリンドゴム、ポリ（メチルビニルエーテル）、エチレン酸化プロピレン酸化エチレンオキサイドブロック共重合、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、デキストラン、カルボマーおよびその塩、ポリ（アクリル酸）およびその塩、ポリ（メタクリル酸）およびその塩、ポリ（エチレン−ｃｏ−アクリル酸）、ポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリ（ビニルリン酸）塩、ポリ（ビニルスルホン酸）塩、ナトリウムポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホナート）、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルホルムアミド）、ポリ（２−ヒドロキシメタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸グリセリル）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）であってこの２つは臨界共溶温度未満で水和、ポリクオタニウム−１、ポリクオタニウム６、ポリクオタニウム−１０、イオネンポリマー、カチオン性グアー、ピリジニウム重合体、イミダゾリウム重合体、ジアリルジメチルアンモニウム重合体、ポリ（エルリジン）、アクリロイル／メタクリロイル／スチリルトリメチルアンモニウム重合体、アクリルアミド／メタクリルアミド−トリメチルアンモニウム重合体、および抗微生物ペプチド、からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
細胞、幹細胞、細片化された羊膜組織、胎盤組織、刻まれた組織、微粉末化組織および微粉末脱細胞化組織、合成または天然由来の細胞外基質成分、ヒドロキシアパタイト、粒状架橋ウシ腱コラーゲンおよびグリコサミノグリカン、はちみつ、多糖類、生分解性ポリマー、およびこれらの組み合わせ、からなる群より選択され、
前記刻まれた組織には、刻まれた皮膚組織、筋組織、血管組織、神経組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、腱組織、膀胱組織、腸組織、心臓組織、肺組織、腎組織、肝組織、膵組織、および声帯組織が含まれ、
前記微粉末化組織および微粉末脱細胞化組織には、皮膚組織、筋組織、血管組織、神経組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、腱組織、膀胱組織、腸組織、心臓組織、肺組織、腎組織、肝組織、膵組織、声帯組織、が含まれ、
前記合成または天然由来の細胞外基質成分には、コラーゲン、グリコサミノグリカン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチンが含まれ、
生分解性ポリマーには、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリ（トリメチレンカルボナート）、ポリ（プロピレンフマラート）、ポリウレタン、ポリ（エステルアミド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリホスファゼン、細菌ポリエステル、
が含まれる生物成分をさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞、羊膜幹細胞、誘導多能性幹細胞、胎児幹細胞、組織幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄幹細胞、ヒト臍帯血幹細胞、血液前駆細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、内皮前駆細胞、上皮幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、心臓幹細胞、膵臓幹細胞、神経幹細胞、角膜輪幹細胞、周産期幹細胞、衛星細胞、サイドポピュレーション細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、単能性幹細胞、およびこれらの混合物、からなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、シュワン細胞、後根神経節、含脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、繊維状軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、肝細胞、腱細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞、間質細胞、好中球、リンパ球、骨髄細胞、周皮細胞、血小板、およびこれらの混合物、からなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
塩形態または中性の形態にある、ナノ粒子、ミクロ粒子、消毒剤、抗感染症薬、抗微生物剤、殺胞子剤、駆虫剤、末梢神経障害治療薬、神経障害治療薬、走化性剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗高血圧薬、マイトマイシン型抗生物質、ポリエン系抗真菌薬、発汗抑制剤、充血除去剤、酔い止め薬、中枢神経系薬、創傷治療薬、抗ＶＥＧＦ薬、抗腫瘍薬、腐食剤、抗乾癬薬、抗糖尿病薬、抗関節炎薬、かゆみ止め、かゆみ止め薬、麻酔剤、抗マラリア剤、皮膚病薬、抗不整脈薬、抗けいれん薬、抗嘔吐薬、抗リウマチ薬、抗アンドロゲン剤、アントラサイクリン、禁煙剤、抗にきび薬、抗コリン剤、老化防止剤、抗ヒスタミン剤、駆虫剤、止血剤、血管収縮剤、血管拡張剤、血栓症薬、抗凝固薬、心・血管作動薬、抗狭心症薬、勃起不全薬、性ホルモン、成長ホルモン、イソフラボン、インテグリン結合シークエンス、生物活性リガンド、細胞付着メディエータ、免疫調節剤、腫瘍壊死因子アルファ、抗がん剤、抗腫瘍薬、抗鬱剤、鎮咳薬、抗−腫瘍薬、麻薬拮抗薬、抗高コレステロール薬、アポトーシス誘導剤、避妊薬、サンレス・タンニング剤、軟化剤、アルファヒドロキシ酸、マヌカ蜂蜜、局所レチノイド、ホルモン、腫瘍特異的抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗ＶＥＧＦＲＮＡアプタマー、核酸、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ＤＮＡプラスミド、Ｓｉ−ＲＮＡ、トランスフェクション剤、ビタミン、精油、リポソーム、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、薬物含有ナノ粒子、アルブミン系ナノ粒子、キトサン含有ナノ粒子、多糖系ナノ粒子、デンドリマーナノ粒子、リン脂質ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ビスマスナノ粒子、ガドリニウムナノ粒子、金属ナノ粒子、セラミックナノ粒子、石英系ナノ粒子、ウイルス由来ナノ粒子、ウイルス様ナノ粒子、抗生物質含有ナノ粒子、酸化窒素含有ナノ粒子、ナノシェル、ナノロッド、高分子ミセル、銀塩、亜鉛塩、量子ドットナノ粒子、高分子系微粒子、高分子系ミクロスフェア、薬物含有微粒子、薬物含有ミクロスフェア、抗生物質含有、抗生物質含有ミクロスフェア、抗菌性微粒子、抗菌性ミクロスフェア、サリチル酸、過酸化ベンゾイル、５−フルオロウウラシル、ニコチン酸、ニトログリセリン、クロニジン、エストラジオール、テストステロン、ニコチン、乗り物酔い止め薬、スコポラミン、フェンタニル、ジクロフェナク、ブプレノルフィン、ブピバカイン、ケトプロフェン、オピオイド、カンナビノイド、酵素、酵素阻害薬、オリゴペプチド、シクロペプチド、ポリペプチド、タンパク質、プロドラッグ、プロテアーゼ阻害薬、サイトカイン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、副交感神経遮断薬、キレート剤、育毛促進剤、脂質、糖脂質、糖タンパク質、内分泌性ホルモン、成長ホルモン、増殖因子、分化因子、熱ショックタンパク質、免疫反応修飾物質、単糖類、多糖類、インスリンおよびインスリン誘導体、ステロイド、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、およびこれらの組み合わせ、からなる群から選択される生物活性剤をさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記水不溶性ミクロゲル粒子が乾燥粉末状であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
水、等張食塩水、平衡塩類溶液、緩衝溶液、リンゲル液、細胞培地、幹細胞培地、血清、血漿、羊水、ワルトンゼリー、栄養培地、消毒液、またはこれらの組み合わせから選択される水性媒体をさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
タンパク質、タンパク質系生体高分子、またはこれら両方の組み合わせを含有する生物開始材料を提供するステップと、
前記生物開始材料をＰＥＧ化剤と反応させるステップと、
前記生物開始材料を前記ＰＥＧ化剤と架橋させて二官能性または多官能性のＰＥＧ化を形成することで前記生物開始材料をＰＥＧ化するステップと、
ＰＥＧ化された前記生物開始材料を水和または脱水した条件で粉砕またはせん断することにより複数のミクロゲル粒子を生成するステップと、  を備えた水不溶性ミクロゲル粒子を調製する方法であって、
前記ミクロゲル粒子は水溶液中で擬塑性を示し、
水和した前記ミクロゲル粒子の溶液はせん断力の印加により粘性が減少し、せん断力がなくなるとミクロゲルクラスターを形成し、
ＰＥＧ化剤の生物開始材料に対するモル比は１：１から１００：１にあり、水和した前記ミクロゲル粒子は粘弾性固体の性質があり、貯蔵弾性率が損失弾性率より大きく、損失正接の値が１未満となることを特徴とする水不溶性ミクロゲル粒子を調製する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】擬塑性ミクロゲルマトリクスの組成物およびキット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、タンパク質およびタンパク質系生体高分子からなる架橋性水膨潤性ミクロゲル粒子に関し、擬塑性があり、せん断力下の水性媒体で流動し、組織、臓器、および創傷の空隙スペースに被覆、注入、噴霧、塗布、または移植させ、また代用組織を取り囲むことができ、このミクロゲル粒子は、せん断力がなくなると単一のミクロゲルクラスターとして凝集するミクロゲル粒子に関する。このミクロゲル粒子は、細胞の成長、生存率、および増殖を支える粘弾性マトリクスとして機能する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的に適合性のある高分子として使用されるハイドロゲルの分野は、単一的な架橋ソフトコンタクトレンズ材料をはじめとして（米国特許第３，４０８，４２９号明細書）、これまで精力的に研究されてきた。そのソフトで可撓性のある性質のため、ハイドロゲルは生物医学の多くの用途として優れた材料であり、このようなものとしては、長期装用シリコーンハイドロゲルコンタクトレンズ、医薬品その他の医薬有効成分の送達、新規生体材料の開発、生体材料の被覆、細胞カプセル化および送達のための生体接着材およびシーラント、組織再生のための足場および細胞培養基質、が挙げられる。
【０００３】
組織工学的な用途に用いられる足場を作成するためには、天然ポリマーと合成ポリマーの両方を使用できる。天然ポリマーは生来的に生体適合性を有している場合が多く、生物活性を有することができる。細胞足場として使用することのでき、通常使用されている天然ポリマーには、特に、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリン、フィブリノゲン、シルク、アルギン酸塩、キトサン、デキストラン、およびアガロースが含まれる。
【０００４】
合成ポリマーベースの細胞足場により、安定性、分解速度、物理的特性、機械的強度などの、物理化学的な性質がコントロールされる。組織工学的な足場マトリクスの使用について、これまで数多くの合成ポリマーが研究されてきたが、このようなものとして、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（乳酸）、ポリグリコール酸、乳酸／グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、およびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。特に、足場材料としてこれまでＰＥＧが広く用いられてきたが、これは、水および有機溶媒への可溶性、非毒性、低タンパク質付着性、非免疫原性など、ＰＥＧに特有の物理化学的な性質に由来する。加えて、ＰＥＧには高分子修飾を促進する末端ヒドロキシル基が含まれ、これにより異なる化学的、物性、生物学的な性質、特にその生物活性が高められる生物的部分のある新規な構造およびアーキテクチャが形成される。ポリ（エチレングリコール）は別のポリマーと組み合わせて使用されることが多く、これにより軟骨、骨、神経、脈管構造、筋肉など、数多くの組織を再生するための足場が形成される。
【０００５】
物理化学的な架橋プロセスを組み合わせてハイドロゲルをｉｎ−ｓｉｔｕ形成する組成物および方法が米国特許第６，８１８，０１８号明細書に記載されている。ｉｎ−ｓｉｔｕ形成されたハイドロゲルは、そのハイドロゲル内に溶解または分散された生物活性分子と組み合わせて使用することができる。この種のハイドロゲルを、術後癒着を防止する組織被覆剤として、組織増強もしくは管腔閉塞エイドとして、細胞、薬剤その他の生物活性種を運ぶマトリクスとして、組織シーラントまたは生体接着材として、および医療機器被覆剤として使用する方法もまた提案されている。
【０００６】
米国特許第７，７７６，２４０号明細書および米国特許第８，３２３，７９４号明細書には、ハイドロゲル前駆体を水相に分散させ、このハイドロゲル前駆体が重合するエマルションが形成されることにより、架橋されたミクロスフェアが得られる、注入可能なハイドロゲルミクロスフェアが記載されている。好ましくは、ハイドロゲル前駆体は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートおよびＮ−イソプロピルアクリルアミドであって、エマルションの連続相は、デキストランおよびデキストラン溶解性減少剤からなる水溶液である。サイトカインなどのタンパク質を、ミクロスフェアの中に装填させることができる。
【０００７】
米国特許出願公開第２００４／０２２０２９６号明細書には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を含み、液状で注入することもできるゲル製剤が開示されている。このポリマー、コポリマー、またはポリマーと別のポリマーの混合物、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコール）などからなる溶液は、常温で液体であるが体温で固体となる。溶液を体温以下の温度で液体として注入し、その後、移植物が体温まで加温されると共に、熱相転移を経て、体内に固体ハイドロゲルがｉｎ−ｓｉｔｕ形成されることにより、ハイドロゲルを哺乳動物に移植する方法が記載されている。
【０００８】
米国特許出願公開第２００８／０２６８０５６号明細書には、脊椎圧迫骨折を修復する上で有用な生体適合性物質が記載されている。この生体適合性物質は物理的な架橋を経て２以上の生体適合性ポリマーハイドロゲルから作成することができる。このようにして作られた生体適合性物質は熱応答性があり、下限臨界溶液温度を示す。生体適合性物質は２５℃〜３４℃の範囲内の温度で体積変化および段階変化を経る。生体適合性物質は常温で液体注入可能な形状をとり、人体内部のより高い温度でゲル化できる。合成ポリマーをベースとしたまた別の注入用熱応答性ハイドロゲルが、米国特許出願公開第２００９／００５３２７６号明細書に記載されている。
【０００９】
注入可能なヒアルロナンハイドロゲルの調製プロセスが米国特許出願公開第２００５／０２８１８８０号明細書に報告されている。このプロセスには、１種類以上のポリマーを架橋させ、その後形成されたゲルを洗浄して、インペラ攪拌による均一化および精製を行うことで注入可能なハイドロゲルを作成すること、が含まれている。リン酸緩衝生理食塩水でのゲルの膨張度は約４，０００％〜５，０００％とされる。このゲルは５００マイクロメートルオーダーの粒子サイズを有することができる。この架橋反応は、エポキシド、アルデヒド、ポリアジリジルまたはジビニルスルホンなどの二官能性または多官能性の架橋剤を用いて引き起こすことができる。架橋剤を１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルとしてもよい。このプロセスは３７℃〜６０℃の温度、１１以上のpＨで実行することができる。
【００１０】
米国特許第４，１７２，０６６号明細書には、水溶性エチレン不飽和モノマーから本質的に構成される水膨張性、または水膨張している架橋ポリマーからなる回転楕円ミクロゲルが記載されており、これは水その他の水溶媒体に分散され、水性溶媒に分散されると擬塑流動性を示す有用な増粘剤である。水膨張しているときの直径が概して約０．５マイクロメーターから約２００マイクロメーターの範囲にある一様で小さな粒子サイズと、相当量の水を吸収できる性質から、ミクロゲルは液体の高速吸収など、増粘剤が必要とされる用途に特に適しており、このようなものとしては、おむつ等の生理用品、ベルトパッド等があり、またポリマーの膨張性または部分閉栓特性が特に重要となる場面、例えば、多孔性の形状または構造を閉栓する場面での用途に適している。
【００１１】
米国特許第８，０３８，７２１号明細書は、粒子サイズが３２から９０ミクロンまでのテクスチャー加工表面を有する球状固体粒子からなる軟性、非毒性組織填塞材料を開示している。この粒子はキャリアとしてゲル中に均一に懸濁されており、固体粒子は好ましくはポリ（メタクリル酸メチル）等の非セラミクス硬化ポリマーである。ゲルは、水その他の溶媒に溶解している、カルボキシメチルセルロース等のセルロース多糖類とポリ（ビニルアルコール）等のアルコールの組み合わせである。填塞材料は患者の軟組織を増強して軟組織欠陥を修復するために、注入により使用される
【００１２】
米国特許第８，５７４，６２９号明細書には予め架橋されたバイオポリマー粒子がマトリクスと共架橋された架橋バイオポリマー系マトリクスを含有する注入可能なゲルが記載されており、このバイオポリマーは、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、セルロースおよびその誘導体、アルギン酸塩、キサンタン、カラギナン、タンパク質、核酸およびこれらの混合物からなる群から選択され、また架橋剤はブタンジオールジグリシジルエーテルとする。
【００１３】
米国特許出願公開第２０１２／００３４２７１号明細書には、ゲル化プロセスがシリンジ中で完成する注入可能なｉｎ−ｓｉｔｕジスルフィド結合架橋ハイドロゲルが開示されており、封止された注入可能容器内にある架橋活性溶液の中に溶解している酸素によりチオール基がジスルフィド結合に酸化されて架橋ハイドロゲルが形成され、ここでｉｎ−ｓｉｔｕ架橋されたハイドロゲルは、一以上の化学修飾により生成された合成高分子、タンパク質、または多糖類の誘導体である。
【００１４】
米国特許第６，１２９，７６１号明細書には、分離細胞を患者に送達して臓器等価物または軟骨などの組織を形成するハイドロゲルを形成するために架橋することのできる、徐々に重合し、生体適合性、生分解性のあるポリマーが報告されている。このポリマーは、修飾ヒアルロン酸、合成修飾型アルギン酸塩、ラジカル反応により共有結合的に架橋可能なポリマー、および一価イオンに晒されてゲル化するポリマー、からなる群より選択される。このゲルは生着を促進し、新細胞の成長のための３次元の鋳型を提供すると報告されている。一実施形態では、細胞がポリマー溶液中に懸濁され、患者部位に直接注入され、ポリマーが架橋することで、内部に細胞が分散されたハイドロゲルマトリクスが形成される。また別の実施形態では、ポリマー溶液中に細胞が懸濁され、これが所望の解剖学的形状を有する型に流入または注入された後に架橋され、内部に細胞が分散し、患者に移植することのできるハイドロゲルマトリクスが形成される。
【００１５】
軟組織管腔および空隙填塞材料として使用されるミクロ多孔性で注入可能な、軟質弾性、完全再吸収可能なフィブリン系組成物が米国特許出願公開第２０１３／０２０９３７０号明細書に記載されている。この組成物はフィブリノゲン成分、トロンビン成分、可塑剤、および平均直径０．０１μｍ〜２００μｍのカルシウム含有粒子を組み合わせたものである。注入可能な軟組織空隙填塞材料組成物の調製は、各成分を混合して、および／または、これら成分を均一化することによりなされると記載されている。
【００１６】
米国特許第６，２９０，７２９号明細書には、剪断減粘性を示す揺変性擬塑性ポリマーが記載されており、せん断力の下でポリマーが流動的となり、また、せん断力がなくなると高弾性またはゲル化した形状に戻る性質がある。‘７２９特許には、架橋剤、ゲル化剤、または架橋触媒を流動材料と共に導入することにより、またはポリマー中の熱応答挙動を引き出して、その後、架橋および／またはゲル化がｉｎ−ｓｉｔｕで引き起こされるように条件変化させることにより、調節可能な被覆の形成が記載されている。組織の増殖が起こる部位にポリマー材料を塗布し、ポリマー材料が第１の流動状態で塗布された後に、その場で第２の非流動状態に変換されることが含まれる、組織の修復または内部成長を制御する方法が記載されている。
【００１７】
細胞外基質粉末を調製する方法が米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０２６４１９０号明細書に記載されている。‘１９０公開公報によれば、この組成物は移植、注入用の三次元移植片構成体の形成に使用することができ、粉末状、又は微粒子状の細胞外基質材を局所使用のゲルまたは軟膏の中に分散させて、宿主内の損傷組織または病変組織の修復を促進させることができる。この組成物は、常温で液状となり、常温より高い温度、または正常な体温でゲル状となる熱応答性ハイドロゲルである。
【００１８】
米国特許第８，８０２，４３６号明細書には、組織修復を促すのに十分な生物活性を保有する細胞外基質から生物活性ゲルを製造する改善方法が提示されており、この改善方法は、細胞外基質を約１μｍから約１，０００μｍの範囲にある粒子サイズまで粒子化し、粒子化された粉末を水酸化ナトリウムに溶解させ、溶解された細胞外基質を塩酸で中和し、任意に、細胞外基質を凍結または凍結乾燥させ、任意に、凍結乾燥ゲルを水または生理食塩水に再構成する。全ゲルの最終稠度はフォーム状となる。
【００１９】
米国特許第７，５８２，３１１号明細書には、粒子状態懸濁液を投与するのに適する注入賦形剤が記載されている。この例としては、ポリマー系製剤、関連する医薬製剤、製造品およびキットがある。この注入賦形剤は、注入性能を改善する擬塑性組成物を含むと報告されている。注入賦形剤にはヒアルロン酸またはその誘導体などの可撓性粒子が含まれ、生理食塩水などの生理緩衝液に溶解している。
【００２０】
米国特許出願公開第２００４／０２０８９３８号明細書には、注入性が改善された注入可能組成物、および、このような注入可能組成物の調製方法が記載されている。‘９３８公開公報によれば、乾燥マイクロ粒子が水性の注入賦形剤と共に懸濁液を形成し、その後、注入性を改善するために、該懸濁液が増粘剤と混和され、該懸濁液の液相の粘度が所望とされるレベルまで高められる。
【００２１】
米国特許出願公開第２０１０／０３３０１８４号明細書には、ポリマー系製剤などの粒子状懸濁液を投与するのに適する注入賦形剤、および関連する医薬製剤、製造品およびキットが記載されている。‘１８４公開公報による注入賦形剤は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、およびこれらの混合物からなる溶液などの偽塑性組成物を含むという点において、従来の注入賦形剤よりも優れており、注入性能を改善し、所望とされる投与量の送達を促進する。
【００２２】
細胞送達賦形剤として使用される注入可能ポリマー組成物が米国特許出願公開第２０１３／０１８９２３０号明細書で議論されている。‘２３０公開公報による注入可能ポリマー組成物には、少なくとも１つの熱ゲル化ポリマー（メチルセルロース）、少なくとも１つのアニオン性ゲル化ポリマー（ヒアルロナン）、および水性キャリアが含まれており、剪断減粘性、揺変性、および再吸収性があると報告されている。
【００２３】
米国特許第８，３５７，４０２号明細書には、コラーゲンマトリクス、好ましくはコラーゲン／グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）マトリクスからなる粒子からなり、水和すると、創傷部位に効果的に送達できるとされている流動性創傷マトリクス材料が提示されている。報告によれば、流動性創傷マトリクスは、様々な深さおよび形状を有する創傷に効果的に送達され、細胞内部成長の足場として機能する構造的な枠組みを提供する。
【００２４】
米国特許第７，４４２，３９７号明細書には、フィブリン系バイオマトリクスに関する方法および材料が提示されており、幹細胞または前駆細胞を、フィブリン系バイオマトリクスを用いて疾患のある心臓に送達することにより、心機能を補助または回復させることができる。‘３９７特許には、細胞を含有するフィブリンバイオマトリクスが導入部位または導入部位付近に形成される条件の下で、幹細胞または前駆細胞を含むフィブリノゲン溶液を、修復の必要な組織の表面あるいは内部に導入させることで、哺乳動物の損傷組織を修復させる方法が提供されると報告されている。一実施形態によれば、フィブリノゲン溶液はＰＥＧ化されている。フィブリンバイオマトリクスを形成する条件として、フィブリノゲン変換物質（例えば、トロンビンなどのセリンプロテアーゼ）を含有する溶液をフィブリノゲン溶液に導入することが含まれていてもよい。
【００２５】
米国特許第５，７３３，５６３号明細書には、適当な活性剤により活性化され、水溶液に溶解している二官能性ポリ（エチレンオキサイド）とアルブミン型タンパク質の架橋混合物からなる親水性水膨張性ゲルが報告されている。得られたハイドロゲルは、タンパク質、特にウシ血清アルブミンなどの種々のソースに由来するアルブミンを、二官能性ポリ（アルケン酸化物）に、好ましくはポリ（エチレンオキサイド）に、より好ましくはポリ（エチレングリコール）に架橋させること、または種々の分子量を有する二官能性ポリ（アルケン酸化物）の混合物に基づいている。ハイドロゲルの機械的性質は、非反応性ポリ（エチレングリコール）または他の高分子量不活性ポリマーを添加することにより改質することができる。この新規なハイドロゲルは、コンタクトレンズ、薬物制御放出デバイス、治療に関連する酵素または細胞の固定化マトリックス、創傷被覆材、および人工皮膚、の製造に使用することができる。
【００２６】
米国特許出願公開第２０１１／０２３８０００号明細書には、治療薬を制御放出送達するポリマー結合アルブミン分子を含有するハイドロゲルシステムが記載されている。このポリマーは官能性合成ポリマー、好ましくはＰＥＧジアクリレートである。このポリマー結合アルブミンは、好ましくはモノＰＥＧ化アルブミンである。このハイドロゲルシステムはマトリクスを含み、ポリマーの第二官能基を介して、このマトリクスにポリマー結合アルブミン分子が結合している。このマトリクスは、ポリマー／アルブミン結合体のポリマーと同じポリマーから形成することができる。
【００２７】
米国特許出願公開第２０１０／０１３７５１０号明細書には、チオール化タンパク質と、このチオール化タンパク質のチオール基に共役結合された少なくとも２つの合成ボリマーと、を含有するポリマー／タンパク質前躯体分子が開示されていると報告されており、これら少なくとも２つの合成ボリマーは官能基を持ち、該官能基は、別の少なくとも１つのポリマー／タンパク質前駆体に共有結合された、少なくとももう１つの合成ポリマーの官能基と架橋できることにより、足場が形成されるように選択される。ここでの官能基はアクリレートまたはビニルスルホンとすることができて、何れも光開始を用いて架橋される。ＰＥＧ−コラーゲン、ＰＥＧ−アルブミン、およびＰＥＧ−フィブリノゲンからなる可溶性タンパク質を組み合わせて光架橋し、ハイドロゲル足場材料を形成することができる。
【００２８】
米国特許出願公開第２００３／０１６６８６７号明細書には、平均直径が２００〜２０００ｎｍ（０．２〜２．０μｍ）のフィブリンナノ粒子が開示されており、フィブリノゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液を、５０〜８０℃の温度にて油エマルジョン中、外因性化学架橋剤を添加することなく混合することにより、取得することができる。関連米国特許第６，１５０，５０５号明細書には、フィブリノゲンとトロンビンを内因性第ＸＩＩＩ因子の存在下で、加熱植物油中（７０℃〜８０℃）で反応させることにより、５０μｍ〜２００μｍの直径を有するフィブリンミクロビーズの調製が報告されている。
【００２９】
米国特許第８，８５８，９２５号明細書には、天然由来のタンパク質骨格から構成された生分解性足場材料が開示されていると報告されており、このタンパク質骨格は、ＰＥＧ化フィブリノゲン足場を生成する合成ポリマーポリ（エチレングリコール）の修飾により架橋されるフィブリノゲンからなり、組織再生が必要とされる疾患の治療に使用される。‘９２５特許は、足場を形成する活性を保有する変性したフィブリノゲンタンパク質と、前記変性フィブリノゲンタンパク質の遊離チオール基に共有結合した少なくとも２つのポリ（エチレングリコール）分子を含有する前駆体分子を使用しており、前記少なくとも２つのＰＥＧ分子にはそれぞれ、ハイドロゲル足場を形成するために架橋する官能基が含まれている。架橋は、前駆体分子を生体内または生体外でフリーラジカル重合させることにより、好ましくはアクリル化ＰＥＧの光開始により行われる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１はＰＥＧ化フィブリンまたはＰＥＧ化フィブリノゲンからなるミクロゲル粉末の調製プロセスを示した画像である、
【図２】図２は１０：１モル比ＰＥＧ−フィブリンミクロゲルおよび２０：１モル比のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲルの剪断減粘性を示すグラフである。冷凍粉砕されたミクロゲルはリン酸緩衝生理食塩に３００ｍｇ／ｍＬで再水和された。傾きの値は、ＰＥＧ−フィブリノゲン（−０．９０）およびＰＥＧ−フィブリン（−０．９８）であった。−１に近い傾きは完全な剪断減粘性材料であることを示している。
【図３】図３はリン酸緩衝生理食塩水に３００ｍｇ／ｍＬで再水和された２０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲル粒子の弾性係数と回転数を示す図である。１％の歪みに繰り返し晒された後に粘弾性が回復可能であった。繰り返しの試験に対して僅かに高くなった貯蔵弾性率および損失弾性率は、時間経過後のミクロゲル脱水の影響である。
【図４】図４は１０：１のＰＥＧ−フィブリンミクロゲルと２０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ”）を、弾性率と回転数のプロットにより比較したグラフである。ミクロゲルは、リン酸緩衝生理食塩水に３００ｍｇ／ｍＬの濃度で再水和された。
【図５】図５はせん断速度に対する粘度を示すグラフであって、臼と杵および凍結粉砕により粉砕された５０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲル粒子の剪断減粘性が示されている。ミクロゲルは、リン酸緩衝生理食塩水に３００ｍｇ／ｍＬで再水和された。
【図６】図６は、ＰＥＧ−フィブリノゲン（ＰＥＧ−ＦＧＮ）およびＰＥＧ−フィブリンからなるミクロゲル粒子での脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の、１日目、４日目および７日目の増殖を示すチャートである。
【図７】図７は１０：１、２０：１、および５０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲルおよびＰＥＧ−フィブリンミクロゲル上におけるヒトＡＤＳＣの、７日目の生細胞染色画像を示し、２０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンおよび５０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲルでＡＤＳＣが生存していたことを示している。
【図８】図８は染色２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮミクロゲルの生体外皮下注射（ラット）画像を示す。ミクロゲルは注射後に固体としてふるまい、その形状を保ったまま注射部位に保持されていた。
【図９】図９は粘度とせん断速度のグラフであって、ＰＨＭＢが１０００ｐｐｍの再水和濃度で組み込まれた２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮゲルとＰＨＭＢを含まない２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮゲルの剪断減粘性を示している。このミクロゲルはリン酸緩衝生理食塩水に３００ｍｇ／ｍＬで再水和された。
【図１０】図１０は弾性率と回転数のグラフであって、ＰＨＭＢが１０００ｐｐｍの再水和濃度（５０ｍｇ／ｍＬ）で組み込まれた２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮゲルと、ＰＨＭＢを含まない２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮゲルの貯蔵弾性率と損失弾性率を示している。このミクロゲルはリン酸緩衝生理食塩水に３００ｍｇ／ｍＬで再水和された。
【図１１】図１１は２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮミクロゲルの平滑筋アクチン（ＳＭＡ）染色の画像を示しており、単体で、または、ＡＤＳＣｓもしくは細片化羊膜を含有している場合の、７日目と１４日目のミクロゲルの中心部における血管形成を示している。
【図１２】図１２はＣＭ−ｄｉＩラベルされたラットＡＤＳＣｓの画像を示し、２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮミクロゲルのなかに移植された、７日後と１４日後の細胞の生存率を示している。ＤＡＰＩおよび平滑筋アクチン（ＳＭＡ）染色は、細胞核と微小血管の形成を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
タンパク質、タンパク質系高分子、またはこれら両方からなる水不溶性で水膨張性の変形可能な架橋ＰＥＧ化ミクロゲル粒子が記載される。このようなタンパク質およびタンパク質系高分子は、細胞外基質、糖タンパク質、構造タンパク質、線維性タンパク質、酵素、プロテオグリカン、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、球状タンパク質、膜タンパク質、血漿タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、抗微生物ペプチド、ペプチド・ホルモン、シャペロン、金属タンパク質、ヘムタンパク質、凝固タンパク質、免疫系タンパク質、イオンチャンネルタンパク質、細胞接着タンパク質、神経ペプチド、核タンパク質、硬タンパク質、色素タンパク質、共役タンパク質、タンパク質−タンパク質複合体、タンパク質多糖類複合体、タンパク質・脂質複合体、酵素・タンパク質複合体、タンパク質・ポリマー複合体、モーター・タンパク質、ムコタンパク質、リンタンパク質、収縮性タンパク質、輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、増殖因子タンパク質、感知タンパク質、防御タンパク質、貯蔵タンパク質、受容タンパク質、抗体、組み換えタンパク質、フィブリノゲン、フィブリン、トロンビン、コラーゲン、エラスチン、アルブミン、ゼラチン、ケラチン、ラミニン、およびこれらの組み合わせから選択可能であって、何れも擬塑性を有し、水性媒体のなかせん断力のもとで流動し、注入または流動させることが可能であって、ミクロゲル粒子は、せん断力がなくなると、ミクロゲル粒子のクラスターとして再構成される。
【００３２】
この架橋ＰＥＧ化ミクロゲル粒子は乾燥した状態で使用することも可能であって、体欠損部、創傷、熱傷部の表面もしくは内部、または代用組織の内部、表面、もしくは周囲に設置することができて、また、ミクロゲル粒子は内因性または外因性のソースにより水和させることができる。
【００３３】
特に興味深いのは、この種のタンパク質系ミクロゲル粒子を、組織、臓器、創傷の空隙スペース、代用組織、および皮膚代用物の中に被覆、注入、移植される材料としての使用であって、水性媒体中のせん断力の下では、水和ミクロゲル粒子は擬塑性となり、せん断力がなくなると凝集性のミクロゲルクラスターに再構成することができる。ミクロゲル粒子は、粉末状の乾燥状態で、または水和粒子として、何れかの状態で使用することができる。本明細書に記載される材料は、生体空隙、亀裂、軟組織管腔を填塞し、代用皮膚の被覆および土台が提供されることを含む方法に使用することができて、ミクロゲル粒子は細胞マトリクスとして機能する。
【００３４】
空隙の例として、損傷、裂傷、瘻孔および憩室が挙げられるがこれらに限定されない。これら空隙は生理的なもの、または感染症、手術、嚢胞、腫瘍除去、または、外傷、または皮膚および創傷治癒などの軟組織再形成、成形手術、美容整形手術、再建手術、皮膚代用物の被覆／シーリング、腱修復、ヘルニア修復、頭蓋顔面手術、眼科手術、頸顔面しわ切除、腹部形成、豊胸手術、心筋修復、軟骨修復、神経修復、脊髄修復、肝組織再生、嚢部修復、筋肉修復、乳房固定術、リウマチ、女性化乳房縮小化、体形矯正、肌若返り術、皮膚リサーフェシング、マイクロサージェリー、シワ埋めの皮膚美容、傷隠し、唇の増強、などの結果である可能性がある。
【００３５】
組織工学によって作製された代用皮膚と表面噴霧された細胞を利用した皮膚置換を用いることで、糖尿病による慢性創傷、第三度熱傷、外傷性創傷などの治療が困難な創傷の皮膚修復が提供される。皮膚代用物と創感染症を考慮しないことは、皮膚代用物を用いた創傷治癒が成功しない決定的な要因となり得る。皮膚代用物は創傷空隙の約６０％を補填する場合が多く、創傷部位の残りの４０％は、細胞運動能のために連続接触していない部分と、乾燥／浸軟および感染症が進行する開放的な領域である。本明細書に記載されているミクロゲル粒子含有製剤は周囲組織に適合性がある被覆を形成し、粉末として塗布されその場で水和されると、または水和ミクロゲル粒子として塗布されると、創傷の空隙スペースを補填し、前記水和ミクロゲル粒子が皮膚代用物と創傷床との間での細胞運動能を高めて、乾燥と浸軟が低減される。ミクロゲル粒子に抗微生物剤が添加されると、感染症が低減されるかまたは除去され、これにより治療の有効性が改善され、特に、トンネル創傷および穿掘性創傷、やけど、および臨床転帰に高い生着率を創出する皮膚代用物の治癒効果が改善される。
【００３６】
ミクロゲル粒子は天然由来または遺伝的に取得されたタンパク質およびタンパク質系生体高分子から導出されるものであって、コラーゲン、細胞外基質、アルブミン、血漿、フィブリノゲン、フィブリン、トロンビン、凝固因子、フォン・ヴィレブランド因子、ヘモグロビン、エラスチン、ゼラチン、ケラチン、無細胞真皮、羊膜、脂肪組織、マトリゲル、死後筋膜、心弁、血管、皮膚、神経、骨格筋、骨格筋、アグリカン、アクチン、ビトロネクチン、エラスチン、パーレカン、ケラチン、スペクトリン、胎盤、肝臓、膵臓、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、レチクリン、絨毛膜、臍帯、小腸粘膜下組織、大腸、膀胱無細胞基質、胃粘膜下組織、前立腺、デコリン、バイグリカン、パーレカン、ルミカン、フィブロモジュリン、インテグリン、カドヘリン、アグリン、エンタクチン、エピフィカン、アクチン、心膜、胎盤、あらゆる哺乳類器官の胎生組織、ウイルス誘導体、これらの組み合わせ、等から選択される。
【００３７】
注入可能な粒子系水和ミクロゲルは軟組織欠損を補填するのに有利である。このミクロゲル粒子含有組成物は、注射針の内部寸法に応じて、ミクロゲルの変形により注射針の中を流動することができ、剪断減粘性を有することによりトンネル創傷および穿掘性創傷の補填が可能であるが、これは、可動力の下で静止している粒子クラスターから個別のミクロゲル粒子が分離されることにより粘度が低減し、またせん断力がなくなると粒子クラスターが再構成され、成形可能で適合性のある粘弾性固形物質の形成により、擬塑性マトリクスが再生されることに由来する。水和ミクロゲル粒子の流動的な性質が、結果得られる粘弾固形状の特性と組み合わさることにより、注入可能な擬塑性マトリクスが不規則な創傷面を補填し、または組織欠損を補填できるようになる。
【００３８】
ＰＥＧ化による誘導体化タンパク質の調製には、膨張性で水性媒体に不溶性である、より親水性の状態にタンパク質成分を変換することが含まれる。この誘導体化タンパク質はハイドロゲルとして機能するが、多官能性ＰＥＧ化による誘導体化タンパク質の架橋により、水性媒体に単一的なゲル化を生じさせることができる。この単一ゲルはその後凍結乾燥され粉末状に磨り潰され、これが水和されると、ミクロゲル粒子を形成する。タンパク質およびタンパク質系高分子のＰＥＧ化は、タンパク質成分として圧倒的に多く利用可能なアミノ基またはスルフヒドリル基、との化学反応によって引き起こすことができる。ＰＥＧ化剤に反応性官能基が含まれることが多いが、このようなものとして、アジド、カーボネート、エルテル、アルデヒド、アクリル酸、カルボキシル、カルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、ジクロロトリアジン、エポキシ、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、炭酸ニトロフェニル、オルトピリジルジスルフィド、ピリジニルオキシカルボニル、スクシンイミジルカーボネート、スクシンイミジルグルタレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルコハク酸塩、コハク酸、スルフヒドリル、トレシレート、ビニルスルホン、等が含まれる。タンパク質および／またはタンパク質系高分子を誘導体化させるＰＥＧ化剤のタイプに応じて、他の利用可能な官能基、例えばカルボキシル基、グアニジノ基、ヒドロキシル基、イミダゾール基、チロシン（フェノール）基を、ＰＥＧ化させることもできる。ＰＥＧ化されるタンパク質またはタンパク質系高分子に対するＰＥＧ成分の分子量およびそのモル比は、結果的に得られる水和度、架橋度、およびＰＥＧ化された複合材料の物理的、機械的、生物的な性質を決定する。一般的に、ＰＥＧ部分が多ければ多いほど結果得られるゲルの水和度（膨張度）が高く、またゲルが強固であればあるほど、プロテアーゼ分解に対するゲルタンパク質成分の安定性が高くなり、また複合材料の生物活性度が低くなる。複合材料のタンパク質成分の生物活性度の低さは、ポリ（エチレングリコール）ユニットによる立体障害と、組成物の全体的な希釈に関係している可能性がある。
【００３９】
ミクロゲルの機械的な性質は流動性試験によって調べることができる。流動測定によれば、眼球組織（ガラス体など）や脂肪など、弱い生物材料の貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ”）は、筋肉、腱、軟骨などの強い生物材料の関連値と比べてかなり小さい。この点について、Ｇ’の値は１Ｐａから１ＭＰａまでの範囲に及び、Ｇ”の値は０．１Ｐａから１ＭＰａまでの範囲に及ぶ。本明細書に記載される実施態様によっては、貯蔵弾性率は１０Ｐａから２５０，０００Ｐａまで、または５０Ｐａから１７５０００Ｐａまで、または１００Ｐａから１０００００Ｐａまでの範囲に及ぶ。実施態様によっては、損失弾性率は５Ｐａから１００，０００Ｐａまで、または７．５Ｐａから５０Ｐａまで、または１０Ｐａから１０，０００Ｐａの範囲に及ぶ。実施態様によっては、架橋、水和、ＰＥＧ化されたミクロゲル粒子はせん断力の下で擬塑性を示す。この擬塑性現象は水不溶性の水和粒子自身に基づくものであって、可溶性高分子によるものではない。加えて、本明細書に記載される水和ミクロゲル粒子の流動学的な特性は、驚くべきことに、流動的と対照的な１未満の損失正接（ｔａｎデルタ）値（Ｇ”／Ｇ’）により示される通り、固体的なふるまいと関係がある。
【００４０】
実施態様によっては、本開示により、誘導体化タンパク質系生体高分子からなる架橋、水膨張性ミクロゲルが提供される。
【００４１】
実施態様によっては、本開示により、二官能性または多官能性のＰＥＧ化により架橋されたタンパク質系生体高分子が提供される。
【００４２】
実施態様によっては、本開示により、ＰＥＧ化剤とタンパク質のモル比は１：１から１００：１の範囲となる。
【００４３】
実施態様によっては、本開示は水溶媒中のせん断力下で擬塑性を有する水和ミクロゲル粒子を提供する。
【００４４】
実施態様によっては、本開示により、水和ミクロゲル粒子からせん断力がなくなると、ミクロゲル粒子のクラスターが再構成される組成物が提供される。
【００４５】
実施態様によっては、本開示は乾燥ミクロゲル粉末および水和ミクロゲル粒子を提供する。
【００４６】
実施態様によっては、本開示により、組織、臓器、創傷の空隙スペース、代用組織、包帯、および医療機器の表面または内部に被覆、注入、噴霧、塗布、または移植することのできるミクロゲル粒子が提供される。
【００４７】
実施態様によっては、本開示により、トンネル創傷および穿掘性創傷をミクロゲル粒子により治療する方法が提供される。
【００４８】
実施態様によっては、本開示により、水不溶性であるが水膨張性を有し、せん断力または圧迫下で変形可能なミクロゲル粒子が提供される。
【００４９】
実施態様によっては、ミクロゲル粒子のタンパク質部分は、細胞外基質、糖タンパク質、構造タンパク質、線維性タンパク質、酵素、プロテオグリカン、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、球状タンパク質、膜タンパク質、血漿タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、抗微生物ペプチド、ペプチド・ホルモン、シャペロン、金属タンパク質、ヘムタンパク質、凝固タンパク質、免疫系タンパク質、イオンチャンネルタンパク質、細胞接着タンパク質、神経ペプチド、核タンパク質、硬タンパク質、色素タンパク質、共役タンパク質、タンパク質−タンパク質複合体、タンパク質多糖類複合体、タンパク質・脂質複合体、タンパク質・ポリマー複合体、モーター・タンパク質、ムコタンパク質、リンタンパク質、収縮性タンパク質、輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、増殖因子タンパク質、感知タンパク質、防御タンパク質、貯蔵タンパク質、受容タンパク質、抗体、組み換えタンパク質、フィブリノゲン、フィブリン、トロンビン、コラーゲン、エラスチン、アルブミン、ゼラチン、ケラチン、ラミニン、およびこれらの組み合わせから選択される。
【００５０】
実施態様によっては、ミクロゲル粒子のタンパク質部分は、フィブリノゲン、フィブリン、アルブミン、血漿、細胞外基質およびコラーゲンから選択される。
【００５１】
実施態様によっては、ミクロゲル粒子は生体内で血管形成を引き起こす。
【００５２】
実施態様によっては、ミクロゲル粒子は生体内で移植細胞の生存を促進する。
【００５３】
実施態様によっては、タンパク質ＰＥＧ化剤は多官能性である。
【００５４】
実施態様によっては、タンパク質ＰＥＧ化剤はα−スクシンイミジルオキシグルタリル−ω−スクシンイミジルオキシグルタリルオキシポリオキシエチレン（ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ）である。
【００５５】
実施態様によっては、生物活性剤がＰＥＧ化タンパク質ミクロゲルの中に組み入れられる。
【００５６】
実施態様によっては、生物活性剤は細胞である。
【００５７】
実施態様によっては、前記細胞はヒト由来のものであって、自家移植または同種異系の何れかである。
【００５８】
実施態様によっては、前記細胞はヒト由来の幹細胞であって、自家移植または同種異系の何れかである。
【００５９】
実施態様によっては、本発明のさらなる目的は、生物活性剤が微粉脱細胞化皮膚組織である点にある。実施態様によっては、前記生物活性剤は微粉化または細片化された組織であって、例えば、脊髄、嚢、小腸粘膜下組織、皮膚、真皮、表皮、脂肪、軟骨、胎盤、細胞外基質、腱、臍帯、角膜、心臓、心筋、肝臓、膵臓、および筋肉、を挙げることができるがこれらに限られない。
【００６０】
実施態様によっては、前記生物活性剤は細片化された羊膜組織である。
【００６１】
実施態様によっては、前記生物活性剤は刻まれた組織である。
【００６２】
実施態様によっては、前記生物活性剤は微粉末化組織である。
【００６３】
実施態様によっては、前記生物活性剤は粒状架橋ウシ腱コラーゲンおよび／またはグリコサミノグリカンである。実施態様によっては、前記生物活性剤は羊水である。
【００６４】
実施態様によっては、前記生物活性剤はワルトンゼリーである。
【００６５】
実施態様によっては、前記生物活性剤は微粉末化された皮膚組織である。
【００６６】
実施態様によっては、前記生物活性剤は成長因子である。
【００６７】
実施態様によっては、前記生物活性剤は抗微生物特性を有する。
【００６８】
実施態様によっては、前記抗微生物剤はポリ（ヘキサメチレンビグアニド）およびその塩である。
【００６９】
実施態様によっては、ＰＥＧ化ミクロゲル粒子に水溶性ポリマーが添加される。
【００７０】
実施態様によっては、ＰＥＧ化ミクロゲル粒子に精油が添加される。
【００７１】
実施態様によっては、架橋ＰＥＧ化ミクロゲル粒子は、粉末状、液状、ゲル状、ペースト状、クリーム状、乳液状、またはこれらの組み合わせとして使用することができる。
【００７２】
実施態様によっては、水和ミクロゲル粒子のレオロジー的な貯蔵弾性率（Ｇ’）は、損失弾性率（Ｇ”）よりも大きく、損失正接が１より小さい。
【発明の詳細な説明】
【００７３】
水溶液中で擬塑性を示す架橋されＰＥＧ化された、タンパク質およびタンパク質系生体高分子から選択された水不溶性ミクロゲル粒子を含有する組成物が提供される。水和ミクロゲル粒子からなる溶液はせん断力が印加されると粘度が下がり、せん断力がなくなるとミクロゲルクラスターに再構成される。ＰＥＧ化剤の、タンパク質およびタンパク質系生体高分子に対するモル比は、１：１から１００：１である。実施態様によっては、組成物中のミクロゲル粒子濃度は１０ｍｇ／ｍＬから１０００ｍｇ／ｍＬまで、または２５ｍｇ／ｍＬから８００ｍｇ／ｍＬまで、または５０ｍｇ／ｍＬから７５０ｍｇ／ｍＬまで、または１００ｍｇ／ｍＬから５００ｍｇ／ｍＬまでである、個々の水和ミクロゲル粒子およびクラスター化した水和ミクロゲル粒子は、単独でも混合物でも何れにおいても、粘弾固体特性を有し、貯蔵弾性率が損失弾性率より大きく、損失正接の値を１より小さくすることができる。
【００７４】
水不溶性水膨張性ＰＥＧ化タンパク質の調製に、通常の単官能ＰＥＧ化を使用することは、一般には好まれず、これは可溶ゲルが得られることが多く、望ましい機械的特性が提供されないためである。この種の可溶ゲルでは、追加細胞に対して貧弱な足場が提供されてしまうおそれがある。実施態様によっては、本明細書に記載される水不溶性水膨張性ＰＥＧ化タンパク質単一ハイドロゲルを調製するために、直鎖または分岐マルチアームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の末端に、多官能性反応基によるＰＥＧ化を用いて水性媒体中に単一ゲルが生成され、これを乾燥して、杵と臼もしくは凍結粉砕などで粉砕すること等により粒子に転換された後に、不溶性ミクロゲル粒子に転換することができる。実施態様によっては、得られたゲルを高速で攪拌またはせん断することにより、ミクロゲル粒子は、タンパク質のＰＥＧ化調製の途中で直接的に取得することができる。実施態様によっては、単一ゲルの分離が好ましく、これはミクロゲル粒子形成前に未反応成分を抽出により分離させることができるからである、
【００７５】
実施態様によっては、ＰＥＧ化剤は、α−アミノプロピル−ω−アミノプロポキシポリオキシエチレン、α−アミノプロピル−ω−カルボキシペンチルオキシポリオキシエチレン、α，ω−ビス｛２−［（３−カルボキシ−１−オキソプロピル）アミノ］エチル｝ポリエチレングリコール、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロポキシポリオキシエチレン、ペンタエリトリトールテトラ（アミノプロピル）ポリオキシエチレン、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−（スクシンイミジルオキシカルボキシ）ポリオキシエチレン、ペンタエリトリトールテトラ（スクシンイミジルオキシグルタリル）ポリオキシエチレン、ペンタエリトリトールテトラ（メルカプトエチル）ポリオキシエチレン、ヘキサグリセリンオクタ（スクシンイミジルオキシグルタリル）ポリオキシエチレン、ヘキサグリセリンオクタ（４−ニトロフェノキシカルボニル）ポリオキシエチレン、４−アームポリ（エチレングリコール）テトラアクリラート、４−アームスクシンイミジルオキシグルタリル）ポリオキシエチレン、ビス（ポリオキシエチレンビス［イミダゾイルカルボニル］）、Ｏ−（３−カルボキシプロピル）−Ｏ′−［２−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール、Ｏ，Ｏ′−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジルスクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール、Ｏ，Ｏ′−ビス（２−アジドエチル）ポリエチレングリコール、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、ポリ（エチレングリコール）二（炭酸ｐ−ニトロフェニル）、ポリ（エチレングリコール）ジ（ビニルスルホン）、ポリ（エチレングリコール）ジ（プロプリオンアルデヒド）、ポリ（エチレングリコール）ジ（炭酸ベンゾトリアゾリル）、これらの類似物、およびこれらの組み合わせ、から選択される。実施態様によっては、前記ＰＥＧ化剤はα−スクシンイミジルオキシグルタリル−ω−スクシンイミジルオキシグルタリルオキシポリオキシエチレン（ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ）であって、３，４００ダルトンの分子量を有し、ＮＯＦアメリカ社（NOF America Corporation）からSUNBRIGHT（登録商標）ＤＥ−０３４ＧＳの商標で入手可能である（ＣＡＳ番号：［１５４４６７−３８−６］）。ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧはタンパク質アミノ基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドの脱離によりタンパク質と架橋し、複数のタンパク質部分とＰＥＧ化剤との間にカーバメート架橋が形成されると考えられる。したがって、ＰＥＧ化剤がフィブリノゲン部分との間に架橋を形成すると考えられる。
【００７６】
実施態様によっては、ＰＥＧ化フィブリノゲンおよびＰＥＧ化フィブリン水和ミクロゲル粒子は、軟組織填塞材料として、または、組織、臓器、創傷の空隙スペースの表面または内部への被覆、移植、または注入のため、ならびに代用組織の適合被覆として使用される便利な送達フォーマットを提供し、創傷環境を管理する分解可能な足場として機能し、治療中の血管形成を促進する。血管新生および血管形成は創傷治癒転帰の決定的な要因となっており、これは新しく形成された欠陥が治療プロセスに加わることで、細胞および成長中の組織に酸素と栄養分を提供するためである。創傷治癒はフィブリノゲンおよびフィブリンの分解産物であるフィブリノペプチドにより促進されることが知られており、フィブリノゲンおよびフィブリンは血管新生および組織再生を高めることに関与していることが知られている。
【００７７】
単一ハイドロゲルとは対照的に、各々の水和ミクロゲル粒子は細胞接着のための大きな表面積と大きな細孔径を有する。本明細書に記載される特徴的な流動特性だけでなく、ミクロゲル粒子システムの可撓性と開放性により、細胞運動が可能となる。乾燥ミクロゲル粒子の実施態様によっては、細孔サイズは０．９μｍから４０．７μｍまでの範囲にあり、粒子の長さは１０．９μｍから１，３４７．７μｍまで、幅は２．２μｍから８７４．２μｍまでの範囲となる。乾燥ミクロゲル粒子の実施態様によっては、細孔サイズは０．９μｍから２３．７μｍまでの範囲にあり、粒子の長さは５．３μｍから１，８３２．８μｍまで、幅は１．６μｍから８９４．２μｍまでの範囲となる。
【００７８】
実施態様によっては、乾燥ミクロゲル粒子は凍結粉砕または杵と臼で調製される。実施態様によっては、細胞足場として使用される場合、乾燥ミクロゲルは細胞を含有する溶液で急速に再水和される。実施態様によっては、乾燥ミクロゲル粉末がシリンジにプレロードされ、細胞をシリンジに引き込み、これによりミクロゲル粉末が水和され、その後、細胞を含む組成物が創傷または欠損部に注入される。また別の実施態様では、乾燥ミクロゲル粉末がバイアルにプレロードされた後に、溶液中の細胞が中隔（septum）からバイアルに注入され、これによりミクロゲルが水和された後に、細胞を含むシステムをシリンジに引き込み、これを必要とする組織、空隙、または創傷に注入される。実施態様によっては、水和された擬塑性細胞組成物を、シリンジまたはカニューレから組織、空隙、創傷に注入するか、または局所的な送達のために被覆により塗布することができる。塗布する際には、水和ミクロゲル粒子が自身および周囲組織に接着することによって、水和ミクロゲル粒子が凝集し、ミクロゲルクラスターが形成される。このミクロゲルクラスターは、ミクロゲル粒子の表面と内部、ならびにミクロゲル粒子の隙間に空隙を含む、凝集性ハイドロゲルネットワークを形成する。ミクロゲル粒子の剪断減粘性および急速的な自己凝集特性が、空隙に細胞その他の生物剤を受容する機能と組み合わさり、さらにミクロゲルと組織の境界にある空隙の形状を埋め合わせることのできる機能によって、生物剤の送達に優れたネットワークが提供される。そのため、本明細書に記載されている水不溶性ミクロゲル粒子組成物は、細胞送達に優れたシステムを提供する。
【００７９】
凍結乾燥され粉末状に粉砕されたＰＥＧ化フィブリノゲン粒子が再水和されると、剪断減粘性、流動性のふるまいを示す。実施態様によっては、ミクロゲル粒子は自重の約１５倍の生理食塩水（９３  重量％生理食塩水）を吸水し、これと類似するＰＥＧ化フィブリン粒子が同程度のＰＥＧ化で、自重の約７倍の生理食塩水（８９重量％生理食塩水）を吸水するのと比べて、より水和している（５０：１のモル比、表１）。単一の固体ゲルが形成されるというよりは、これらＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲル粒子は隣接するＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲル粒子と水素結合による相互作用することにより、剪断減粘性を有する「ゲル状」固体物が形成される
【００８０】
ホスト内でｉｎ−ｓｉｔｕ調製された単一ハイドロゲルと比較した時の、本明細書に記載されるミクロゲル粒子の利点としては、注入物を予備浄化させて未反応成分を除去できる点と、剪断減粘性特性に基づいて注入物を所定位置に水和ミクロゲル状で注入し、これにより軟組織欠損の補填を促進できる点と、常温で粉末状に貯蔵できる点と、細胞溶液をミクロゲル粉末と一緒にシリンジに引き込むか、または細胞溶液をミクロゲル粉末に接触させることによって、臨床処置中に細胞を混合することができる点がある。水和ミクロゲル粒子の多孔性ネットワークはまた、細胞の運動能を確保し、栄養素の交換と、細孔および空隙スペースの内部への宿主細胞の浸潤とにより、細胞生存率を改善する。このような可撓性は、足場としてのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ハイドロゲルに報告されているような単一ハイドロゲルとは全く対照的なものであって、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ハイドロゲルでは、ＰＥＧハイドロゲルの密度から、細胞の湿潤が困難である（米国特許第８，５５７，２８８号明細書）。
【００８１】
加えて、単一ゲルのｉｎ−ｓｉｔｕ調製は、ＰＥＧ化材料または他のビニル型モノマーのペンダントアクリル基の光重合を使用することが多い。このような方法は臨床環境では面倒であり、フリーラジカル重合をｉｎ−ｓｉｔｕ開始すると熱も一緒に発生するため、周囲組織、または添加された細胞に悪影響を及ぼす虞がある。このようなプロセスは、細胞毒性を示すかもしれない残留未反応モノマーを、体内に残す可能性を生じさせる。
【００８２】
実施態様によっては、本明細書に記載されるミクロゲル粒子は、形状が不規則か、球、楕円など定まった形状を有することができる。実施態様によっては、ミクロゲル粒子はミクロ多孔性、メソ多孔性、またはマクロ多孔性とすることができる。このため、実施態様によっては、ミクロゲル粒子に、調節可能な寸法、調節可能な水和度、生物剤添加用もしくは細胞接着用の大きな表面積、および他の生分子を取り込む内部細孔ネットワークを具備することができる。加えて、ミクロゲル粒子は生来的に生分解性である。さらに、単一（バルク）ハイドロゲルとは対照的にサイズが小さいために、屈曲、変形、圧縮が容易に行え、またミクロゲル粒子は環境変化に応答性がある。
【００８３】
実施態様によっては、擬塑性ミクロゲル粒子組成物に、羊水、細片化された羊膜組織、刻まれた組織、微粉末化組織、微粉末脱細胞化組織、血漿、血液、粒状架橋ウシ腱コラーゲンおよびグリコサミノグリカン、細胞培地中の細胞および幹細胞、合成または天然由来の細胞外基質成分、例えばコラーゲン、グリコサミノグリカン、フィブリン、ラミニン、およびフィブロネクチン、ヒドロキシアパタイト、はちみつ、多糖類などの成分、生分解性ポリマー、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリ（トリメチレンカルボナート）、ポリ（プロピレンフマラート）、ポリウレタン、ポリ（エステルアミド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリホスファゼン、および細菌ポリエステルなどの生分解性ポリマー、ならびにこれらの組み合わせ、を含む水溶液を含有することが可能であって、これらは軟組織、空隙、または創傷に注入できる。
【００８４】
実施態様によっては、該刻まれた組織は皮膚組織、筋組織、血管組織、神経組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、腱組織、膀胱組織、腸組織、心臓組織、肺組織、腎組織、肝組織、膵組織、および声帯組織から選択される。実施態様によっては、微粉末化組織と微粉末脱細胞化組織は、皮膚組織、筋組織、血管組織、神経組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、腱組織、膀胱組織、腸組織、心臓組織、肺組織、腎組織、肝組織、膵組織、および声帯組織から選択される。擬塑性ミクロゲルマトリクスは、トンネル創傷および穿掘性創傷が認められる糖尿病性足潰瘍の治療、または流動可能な粘弾性マトリクスが望まれる他の創傷または外科処置などに使用することができる。
【００８５】
フィブリノゲンは脊椎動物に認められる水溶性糖タンパク質であって、血液凝固の形成を補助する。フィブリノゲン分子は水溶性の３４０ｋＤａ血漿糖タンパク質であって、血液凝固形成の過程でトロンビンにより水不溶性フィブリンに変換される。フィブリノゲンは棒状の形状をしていて、おおよそ９×４７．５×６ｎｍの寸法を有し、また生理的ｐＨ（ｐＨ５．２の等電点）で負の実効電荷をもつ。ヒト血漿、ウシ血漿、サケ血漿、ヒヒ血漿、ネズミ血漿、マウス血漿、ラット血漿、イヌ血漿、およびネコ血漿に由来するフィブリノゲンが商用入手可能である。実施態様によっては、ヒト血漿が好ましい。実施態様によっては、５０％〜７０％タンパク質を含有するシグマアルドリッチ社（Ｆ３８７９）のヒト血漿由来フィブリノゲンが使用され、≧８０％のタンパク質で凝固可能である。また別の実施態様では、自己移植、同種異系、または異種由来のフィブリノゲンを利用することができる。また別の実施態様では、組み換えフィブリノゲンを利用することができる。実施態様によっては、自己ヒトフィブリノゲンが好ましい。
【００８６】
トロンビンは、フィブリノゲンを不溶性のフィブリン繊維に変換し、また他の多くの凝固性反応に触媒作用を及ぼす、セリンプロテアーゼとして機能するタンパク質分解酵素である。トロンビンは、例えば、人、ウシ、ブタ、ウマ、ネズミ、ウサギ、および組み換え型に由来するいくつかの血漿タイプから入手可能である。実施態様によっては、ＰＥＧ化フィブリノゲンをＰＥＧ化フィブリンに変換するために、ヒト血漿由来、≧１，０００ＮＩＨユニット／ｍｇタンパク質のシグマアルドリッチ社（Ｔ７００９）トロンビンが好ましい。
【００８７】
実施態様によっては、ミクロゲル組成物はフィブリノゲンまたはフィブリンの粉砕粒子から構成され、何れも、二官能性または多官能性のＰＥＧ化剤と架橋して、主として、フィブリノゲンタンパク質鎖またはフィブリンタンパク質鎖の間のペンダントアミノ基の間に、種々のポリ（エチレングリコール）置換基の組み合わせからなる水不溶性ゲル粒子を形成する。ミクロゲル粒子は各々が、数多くのフィブリノゲンタンパク質鎖またはフィブリンタンパク質鎖の複合材料であって、これより短く、より多数のポリ（エチレングリコール）鎖が、間に散りばめられている。ミクロゲル粒子は、組織、臓器、創傷、および代用組織に塗布される前に形成され、これにより、重合がその場で形成されることが防止され、体内に導入される前に汚染モノマーおよび開始剤を除去することが可能になり、移植部位での重合熱の発生が防止される。この組み合わせにより注入が成功しやすくなる。
【００８８】
タンパク質置換基および／またはタンパク質系高分子のＰＥＧ化は、ＰＥＧ剤とタンパク質成分が、１００：１、７５：１、５０：１、３５：１、２０：１、１５：１、１０：１、７．５：１、５：１、２．５：１および１：１のモル比、またはこれらのモル比の何れかで開始または終了するモル比（例えば、１００：１から１：１までの範囲、５０：１から２．５：１までの範囲、５０：１から１０：１までの範囲、３５：１から５：１までの範囲）で行うことができる。実施態様によっては、ＰＥＧ化剤とタンパク質成分のモル比は１０：１、２０：１、３５：１、および５０：１となる。実施態様によっては、単一ゲルを凍結乾燥した後に、凍結乾燥されたポリマーは凍結粉砕または杵と臼で粉末化され、さらにふるいによって分離され、平均粒子サイズ長が１０μｍから１０００μｍまで、または５０μｍから５００μｍまで、または７５μｍから２５０μｍの範囲に及ぶ乾燥ミクロゲル粒子が生じる。実施態様によっては、単一ゲルを凍結乾燥した後に、凍結乾燥されたポリマーは凍結粉砕または杵と臼で粉末化されて、平均粒子サイズ長が１０μｍから１０００μｍまで、または５０μｍから５００μｍまで、または７５μｍから２５０μｍまでの範囲に及ぶ乾燥ミクロゲル粒子が生じる。
【００８９】
実施態様によっては、ミクロゲル粒子は流体で水和される。実施態様によっては、流体の移動相は水、等張食塩水、平衡塩類溶液、緩衝溶液、リンゲル液、細胞培地、幹細胞培地、血清、血漿、羊水、ワルトンゼリー、栄養培地、消毒液、またはこれらの組み合わせである。ミクロゲル粒子の水和度は、誘導体化タンパク質に対するＰＥＧ化剤のモル比、得られたミクロゲル粒子の多孔度および表面積、ならびに移動相のｐＨ、浸透圧、および温度の、少なくとも１つに依存する。実施態様によっては、流体が水性媒体である場合、この水性媒体は４．５〜８．０、または５．５〜７．５の範囲のｐＨをもつことができる。実施態様によっては、ミクロゲル粒子の水和（膨張）度は、生理食塩水を用いて測定して、ミクロゲル粒子の乾燥重量の少なくとも５０倍、少なくとも４０倍、少なくとも３０倍、少なくとも２０倍、少なくとも１０倍、少なくとも５倍、または少なくとも２倍とできる。
【００９０】
実施態様によっては、抗微生物剤をミクロゲル粒子に添加して微生物の成長または増殖を阻害させることができる。実施態様によっては、抗微生物剤の添加により、微生物コロニーおよびバイオフィルム形成の縮小または除去を補助することができる。穿刺、創傷、やけど部分での感染症のおそれから、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル組成物に、微生物を阻害または根絶するのに十分な量の生物剤を含有させることができる。
【００９１】
生物剤の例として、抗生物質、消毒剤、抗感染症薬、抗微生物剤、抗菌剤、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗原虫薬、殺胞子剤、および駆虫剤が挙げられるが、これらには限定されない。実施態様によっては、生物剤は生分解性、ヒトと動物に対して非毒性、または生分解性で且つ非毒性である。
【００９２】
殺生剤の例としては、ポリ（ヘキサメチレンビグアニド）（ＰＨＭＢ）およびその塩、低分子量合成カチオン性ビグアニドポリマーなどのビグアニド、クロルヘキシジンジグルコン酸塩などクロルヘキシジンおよびその塩、アレキシジン二塩酸塩などアレキシジンおよびその塩、であって最後の２つはビス（ビグアニド）である、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、グリセリンモノラウラート、カプリリルグリコール、硫酸ゲンタマイシン、ヨード、ポビドンヨード、でんぷん・ヨード、硫酸ネオマイシン、ポリミキシンＢ、バシトラシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、ゲンタマイシン、ニトロフラゾン、酢酸マフェニド、銀ナノ粒子、スルファジアジン銀、硝酸銀、テルビナフィン塩酸塩、硝酸ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、メトロニダゾール、抗微生物ペプチド、ポリクオタニウム−１、ポリクオタニウム−６、ポリクオタニウム−１０、これらの塩、およびこれらの組み合わせが挙げられるがこれらには限定されない。
【００９３】
実施態様によっては、抗微生物ビグアニドはポリ（ヘキサメチレンビグアニド）塩酸塩（ＰＨＭＢ）である。ＰＨＭＢは、微生物に対する高い抗菌性に加えて、その生分解性と低細胞毒性から使用される場合がある。ＰＨＭＢは主にグラム陰性菌およびグラム陽性菌、菌類、並びにウイルスに有効性がある。規制医薬品と見なされ菌耐性が起こる抗生物質とは違い、ＰＨＭＢにこのような耐性は起こらない。本明細書において、「抗微生物剤」とは微生物を殺生するか、その成長または複製を阻害する物質を指し、また「抗感染症薬」とは微生物等の感染性因子を殺生するか、その拡散を防止する物質の事である。両者は区別する事なく使用される場合が多い。本明細書において、「ＰＨＭＢ」は抗微生物剤と見なされる。
【００９４】
実施態様によっては、本明細書に記載される水和または再水和ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子を含有する組成物には、殺生ＰＨＭＢが組成物の全重量に基づいて、０．０００１重量％（１ｐｐｍ）から重量％（１０，０００ｐｐｍ）までの範囲、または０．０１重量％（１００ｐｐｍ）から０．７５重量％（７，５００ｐｐｍ）までの範囲、または０．０５重量％（５００ｐｐｍ）から０．５重量％（５，０００ｐｐｍ）までの範囲、または０．１重量％（１，０００ｐｐｍ）から０．２５重量％（２，５００ｐｐｍ）までの範囲の濃度で含有できる。実施態様によっては、本明細書に記載される乾燥ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物は、組成物の全重量に基づいて殺生ＰＨＭＢを、０．００２重量％（２０ｐｐｍ） から２５．０重量％（２５０，０００ｐｐｍ）までの範囲、または０．２０重量％から１５．０重量％（１５０，０００ｐｐｍ）までの範囲、または１．０重量％（１０，０００ｐｐｍ）から１０．０重量％（１００，０００ｐｐｍ）までの範囲、または２．０重量％（２０，０００ｐｐｍ）から４．０重量％（４０，０００ｐｐｍ）までの範囲の濃度で含有できる。
【００９５】
実施態様によっては、アレキシジンおよびその塩、ならびにクロルヘキシジンおよびその塩などのビス（ビグアニド）を、抗微生物ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に０．００１  重量％（１０ｐｐｍ）から４．０重量％（４０，０００ｐｐｍ）までの濃度で添加することができる。
【００９６】
実施態様によっては、塩化ベンゼトニウムまたは塩化ベンザルコニウムなどの界面活性剤型抗微生物剤を、抗微生物ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に、０．００１重量％（１０ｐｐｍ）から２．０重量％（２０，０００ｐｐｍ）までの濃度で添加できる。
【００９７】
実施態様によっては、グリセリンモノラウラートやカプリリルグリコールなどの脂溶性抗微生物剤を、抗微生物ＰＥＧ化ミクロゲル粒子タンパク質組成物に、０．１重量％（１，０００ｐｐｍ）から２．０重量％（２０，０００ｐｐｍ）までの範囲の濃度で添加できる。
【００９８】
実施態様によっては、アミノ基、イミノ基、イミダゾイル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、フェノール基、インドリル基、グアニジウム基、グアニジン基およびカルボキシル基などの反応性官能基を持つ抗微生物剤を、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲルに共有結合的に組み込むことで、ＰＥＧ化タンパク質／抗微生物剤の三元複合材料を形成することができる。実施態様によっては、ＰＥＧ化フィブリノゲン／ＰＨＭＢミクロゲル粒子の共有結合性三元複合材料が形成される。
【００９９】
実施態様によっては、水性ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物は１０〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度にできる。実施態様によっては、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物が水性の溶液、ペースト、乳液、またはフォームであるとき、水溶性ポリマーを添加することで溶液粘度を高めて、組織、空隙または創傷の表面での残存時間、または空隙もしくは創傷の中での皮下残留時間を長くすることができる。実施態様によっては、有用な水性ポリマーとして、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキサイド）、ポリ（ビニルアルコール）およびその共重合体、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）およびその共重合体、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グァーガム、ヒドロキシエチルグァー、ヒドロキシプロピルグァー、ゼラチン、アルブミン、ヒドロキシプロピルメチルグァー、カルボキシメチルグァー、カルボキシメチルキトサン、ローカストビーンガム、カラギナン、キサンタンガム、ジェランガム、プルラン、アルギン酸塩、コンドロイチン硫酸、デキストラン、硫酸デキストラン、アロエベラゲル、スクレログルカン、シゾフィラン、アラビアゴム、タマリンドゴム、ポリ（メチルビニルエーテル）、エチレン酸化プロピレン酸化エチレンオキサイドブロック共重合、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、デキストラン、カルボマーおよびその塩、ポリ（アクリル酸）およびその塩、ポリ（メタクリル酸）およびその塩、ポリ（エチレン−ｃｏ−アクリル酸）、ポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリ（ビニルリン酸）塩、ポリ（ビニルスルホン酸）塩、ナトリウムポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホナート）、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルホルムアミド）、ポリ（２−ヒドロキシメタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸グリセリル）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）であってこの２つは臨界共溶温度未満で水和、ポリクオタニウム−１、ポリクオタニウム−６、ポリクオタニウム−１０、イオネンポリマー、カチオン性グアー、ピリジニウム重合体、イミダゾリウム重合体、ジアリルジメチルアンモニウム重合体、ポリ（エルリジン）、アクリロイル／メタクリロイル／スチリルトリメチルアンモニウム重合体、アクリルアミド／メタクリルアミド−トリメチルアンモニウム重合体、抗微生物ペプチド、これらの類似物、これらの誘導体、およびこれらの組み合わせ、を挙げることができるが、これらには限られない。
【０１００】
ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物を粘性のある溶液、ゲル、クリーム、乳液、香油の形態に調製することは、水溶性ポリマー粘性ビルダーを、約０．０１から約５０．０重量％、０．１から４５重量％、０．５から２５重量％、または１．０から１０．０重量％までの範囲の量で含有させることにより促進させることができる。
【０１０１】
実施態様によっては、ミクロゲル粒子組成物に精油を、芳香剤またはアロマ剤として、および／または、抗微生物剤として添加することができる。本明細書に記載されるミクロゲル粒子組成物に有用な精油の例として、チモール、メントール、ビャクダン、ショウノウ、カルダモン、シナモン、ジャスミ、ラベンダー、ゼラニウム、ジュニパー、メントール、マツ、レモン、バラ、ユーカリ、クローブ、オレンジ、オレガノ、ミント、リナロール、スペアミント、ペパーミント、レモングラス、ベルガモット、シトロネラ、ヒノキ、ナツメグ、トウヒ、ティー・ツリー、ウィンターグリーン（サルチル酸メチル）、バニラ、などを挙げることができるがこれらには限定されない。実施態様によっては、精油は、チモール、ビャクダンオイル、ウィンターグリーンオイル、オイカリプトール、マツオイル、およびこれらの組み合わせ、から選択することができる。実施態様によっては、精油はＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物の重量に基づいて０％から５重量％までの範囲に存在することができる。実施態様によっては、精油はＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物の重量に基づいて少なくとも０．１重量％、または少なくとも０．２５重量％、または少なくとも０．５重量％範囲に存在することができる。
【０１０２】
実施態様によっては、クロロフィルの水溶性半合成誘導体であるクロロフィリンを用いて創傷の臭いをコントロールし、また抗炎症効果を提供することができる。実施態様によっては、クロロフィリンは、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物の重量に基づいて０％重量％から５  重量％の範囲に存在できる。実施態様によっては、クロロフィリンは、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物の重量に基づいて、少なくとも０．１重量％、または少なくとも０．２５重量％、または少なくとも０．５重量％だけ存在できる。
【０１０３】
実施態様によっては、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に湿潤剤、緩衝剤、ゲル化剤、または乳化剤を含有させることができる。添加剤としては他にも、pＨが５．０〜７．５の種々の緩衝剤、界面活性剤、シリコーン、ポリエーテル共重合体、野菜および植物の脂質および油、親水性および疎水性のアルコール、ビタミン、モノグリセリド、ラウリン酸エステル、ミスチリン酸エステル、パルミチン酸エステル、およびステアリン酸エステルが含まれていてもよい。実施態様によっては、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物は、液状、ゲル状、ペースト状、クリーム状、乳液状、これらの組み合わせなどの形態をとることができるが、これらには限られない。実施態様によっては、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物は乾燥粉末状に乾燥凍結される。冷凍凍結されたＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物は粉末状で使用可能であって、またその粉末をさらに溶液、懸濁液、クリーム、ローション、ジェル、ペースト、乳液、香料、スプレー、フォーム、エアロゾール、膜状、その他の形状に加工（再水和、など）することができる。
【０１０４】
実施態様によっては、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子はナノ粒子、ナノシェル、ナノロッド、およびこれらの組み合わせの形状をとる。実施態様によっては、脱水または凍結乾燥ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子は、ナノ粒子、ナノシェル、ナノロッド、およびこれらの組み合わせの形状をとる。
【０１０５】
本明細書中、「水性媒体」とは、水中に可溶化成分を含む均一溶液、細胞培地溶液、緩衝溶液、等張液、塩水、乳化溶液、界面活性剤溶液、羊水、ワルトンゼリー、血清、親水性ポリマー、および水中で粘化またはゲル化している均一または乳化溶液、を含む広範囲の水性溶液のことを指すが、これらには限られない。
【０１０６】
本明細書中、「界面活性剤」とは通常の意味を有し、２つの液体間または液体と固体の間の表面張力（界面張力）を下げる化合物を含み、乳化薬剤、乳化剤、洗剤、湿潤剤、および表面活性剤が含まれる。
【０１０７】
本明細書中、「親水性」とは通常の意味を有し、水に親和性があり、イオン性または中性、またはその構造に水を引きつける極性基を含む化合物が含まれる。例えば、親水性化合物は水に対して混和性、膨張性、吸水性、可溶性があり、水に対する静的接触角が常温の水中で≦９０°となる。
【０１０８】
本明細書中、「疎水性」とは水を撥水し、水に不溶か比較的不溶であって、水に対する親和性を欠いており、水に対する静的接触角が常温の水中で≧９０°となることを指す。隣接ジオールなどの親水性置換基を有する疎水性化合物は、界面活性剤のあるなしにかかわらず、水中にエマルションを形成することができて、親水性置換基が水との境界面、化合物の疎水部分がエマルションの内部に存在する。
【０１０９】
本明細書中で、「水膨張性」とは、官能基、表面、細孔、ミクロ細孔、ナノ細孔、孔部、間質ネットワークに流体を、取り込み、吸水し、および／または吸着する材料を指す。
【０１１０】
本明細書中、「ＰＥＧ化」とは、反応置換基のあるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を、アミノ基またはスルフヒドリル基など、タンパク質の反応性官能基に共有結合的に結合させることにより、タンパク質またはタンパク質系高分子を修飾することに関し、また「ＰＥＧ化」とはＰＥＧ置換基が結合したタンパク質を指す。
【０１１１】
本明細書で使用される「タンパク質」には、タンパク質系高分子が含まれるものとし、細胞外基質、糖タンパク質、構造タンパク質、線維性タンパク質、酵素、プロテオグリカン、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、球状タンパク質、膜タンパク質、血漿タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、抗微生物ペプチド、ペプチド・ホルモン、シャペロン、金属タンパク質、ヘムタンパク質、凝固タンパク質、免疫系タンパク質、イオンチャンネルタンパク質、細胞接着タンパク質、神経ペプチド、核タンパク質、硬タンパク質、色素タンパク質、共役タンパク質、タンパク質−タンパク質複合体、タンパク質多糖類複合体、タンパク質・脂質複合体、酵素・タンパク質複合体、タンパク質・ポリマー複合体、モーター・タンパク質、ムコタンパク質、リンタンパク質、収縮性タンパク質、輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、増殖因子タンパク質、感知タンパク質、防御タンパク質、貯蔵タンパク質、受容タンパク質、抗体、組み換えタンパク質、フィブリノゲン、フィブリン、トロンビン、コラーゲン、エラスチン、アルブミン、ゼラチン、ケラチン、ラミニン、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【０１１２】
本明細書で使用される「誘導体化タンパク質」は、他の材料に付着、結合、配位、錯体形成するタンパク質成分であり、前記他の材料には、別のタンパク質、多糖類、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、脂質、リン脂質、リポソーム、合成ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ポリマー、界面活性剤、金属原子、ナノ粒子、抗微生物剤、抗生物質、薬剤、これらの塩、などが含まれる。
【０１１３】
本明細書で使用される「ハイドロゲル」は、高分子鎖のなかにおける共有結合性相互作用、イオン性相互作用、または物理的相互作用によって、架橋または擬似的に架橋された状態で存在する、通常は水溶性の高分子からなる不溶性ポリマーネットワークであり、不溶性ポリマーネットワークは自重の少なくとも１０％の水を吸水する。ハイドロゲルは、一または複数の親水性ポリマー種を含有することができる。
【０１１４】
本明細書で使用される「単一」ハイドロゲルは、一種または複数種の架橋親水性ポリマーからなる１つの大きなネットワークからなり、これをより小さな架橋ミクロゲル粒子に分割することができる。
【０１１５】
本明細書で使用される「ミクロゲル」は、ゼリー状、水不溶性、親水性の粒子であって、１マイクロメートルから１，０００マイクロメートルまでの範囲におよぶ長さと、１マイクロメートルから１，０００マイクロメートルまでの範囲におよぶ直径を有する粒子か、または、これらの性質を示すことのできる脱水化粒子のことである。
【０１１６】
本明細書で使用される「ミクロゲル粒子」は、水不溶性、水膨張性のゲル断片からなる混合粒子のことであって、前記ゲル断片はその形成方法に応じて、球状、楕円状、角状、規則的（組織化された）または不規則な形状などの種々の形状を有し、また、中空状、ミクロ多孔性、メソ多孔性、またはマクロ多孔性、空隙スペース、またはこれらの結合を有するものとする。
【０１１７】
本明細書で使用されるように、「ミクロ多孔性」との用語は、２ｎｍ未満の細孔径を有する材料を指し、「メソ多孔性」粒子は２ｎｍから５０ｎｍまでの細孔径を有し、また「マクロ多孔性」粒子は５０ｎｍより大きい細孔を有する粒子を指すものとする。
【０１１８】
本明細書で使用される「流動性」とは、あらゆる形状を有する流路、例えば、スクィーズチューブ、ポンプ、カニューレ、またはシリンジなどを通過することのできる一定量の流体またはゲルに関する。
【０１１９】
本明細書で「注入可能」とは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、またはミクロゲルが皮下注射針またはカニューレの中を通過可能であることを説明している。
【０１２０】
本明細書で「ニュートン流体」は、実験するせん断条件に依存しない粘性を示す流体を意味する。
【０１２１】
本明細書で「非ニュートン流体」は、実験するせん断条件に依存した粘性を示す流体を意味する。
【０１２２】
本明細書で「擬塑性」とは、せん断速度の上昇と共に粘性が下がる流体組成物、つまり剪断減粘性の流体組成物に関する。
【０１２３】
本明細書で「せん断速度」（せん断ひずみ速度とも呼ばれる）とは、時間に対するひずみの変化速度である。
【０１２４】
本明細書で「損失弾性率（Ｇ”）」とは、変形（せん断等）の下で材料中に放散されたエネルギーの尺度である。Ｇ”は弾性変形ではなく粘性流に起因するものである。損失弾性率は粘性係数としても知られている。
【０１２５】
本明細書で「貯蔵弾性率（Ｇ’）」とは、変形（せん断等）の下で材料に貯蔵されたエネルギーの尺度を意味する。Ｇ”は弾性変形に起因するものである。貯蔵弾性率は弾性係数としても知られている。
【０１２６】
本明細書で「損失正接」（タンデルタ、ｔａｎδとも呼ばれる）とは、貯蔵（弾性）係数に対する損失（粘性）係数の比率、つまりｔａｎ  δ＝Ｇ”／Ｇ’としたときの位相角（δ）の正接を意味する。この損失正接は流体の弾性の存在または弾性度を示す有用な指標となる。１未満の損失正接は弾性が優位（つまり固体状）の性質を意味し、１より大きな値は粘性が優位（つまり液状）の性質を意味する。
【０１２７】
本明細書で「生物活性剤」とは、標準的な意味を持ち、人間または動物の健康および福祉に有益的な影響を与えるか、あるいは感染症や病気の治療、緩和、処置、防止、または診断での使用を意図しているか、あるいは微生物の増殖に破壊的であるか増殖を抑制する、化学的または生物的な物質もしくは製剤が含まれる。
【０１２８】
本明細書で「抗微生物剤」とは標準的な意味を持ち、微生物を殺生するか、あるいは微生物の成長または増殖を抑制する物質が含まれ、また「抗感染症薬」とは、微生物等の感染性因子を殺生するか、拡散を防止する事で感染症を防ぐ物質として定められる。両者は区別する事なく使用される場合が多い。
【０１２９】
本明細書で「抗生物質」とは標準的な意味を持ち、他の微生物を殺生するか微生物の増殖を阻害することのできる活性的な属性を備えて合成されたか、生来的に微生物から生成された物質が含まれる。抗生物質との用語は、感染症を取り除こうとするほぼすべての処方薬を意味するものとして慣用的に使用されている。
【０１３０】
本明細書で「添加剤」とは、標準的な意味を持ち、液状、流体状、ゲル状等の賦形剤を形成し、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物を可溶化または分散させる不活性物質が含まれ、これにその他添加成分が含有されてもよい。
【０１３１】
本明細書で「粘弾性」とは、変形されると粘性と弾性の両方の性質を示す材料特性を意味する。
【０１３２】
本明細書で使用される「粘弾性固体」は、印加されたせん断負荷がなくなると、もとの形状に戻ることができるが、粘弾性流体はもとの形状に戻らない。
【０１３３】
本明細書で「軟組織」は標準的な意味を持ち、生体の構造および臓器を、接続、支持、または取り囲む生体組織が含まれるが、骨組織は含まれない。軟組織の例として、腱、靭帯、筋膜、皮膚、繊維組織、脂肪、滑膜、筋肉、神経 および 血管が含まれる。
【０１３４】
本明細書で「ナノ粒子」とは、１ナノメートルから５００ナノメートルまでのサイズの粒子を意味し、また、１ナノメートルから１００ナノメートルまでのサイズの粒子も意味する。
【０１３５】
本明細書で「ナノシェル」とは、粒子状化合物からなる球状コアが、数ナノメートル厚のシェルその他の外膜により周囲されている状態を指す。
【０１３６】
本明細書で「ナノロッド」とは、直径または幅の少なくとも２倍の長さがあり、典型的に１ｎｍから１００ｎｍまでの長さをもつロッド状粒子のことである。
【０１３７】
本明細書で「ミクロ粒子」とは、０．１μｍから１００μｍまでのさまざまな寸法を有する粒子を意味する。
【０１３８】
本明細書で「ミクロスフェア」とは典型的に１μｍから１，０００μｍまでの直径を有する球状粒子を意味する。ミクロスフェアをミクロ粒子とよぶ場合もある。
【０１３９】
実施態様によっては、一以上の観測可能または検知可能な薬剤を、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に取り込むことで視認性を高め、また適切な設置を支援することができる。このような薬剤としては、他の実施態様において、染料、蛍光物質、紫外線吸収剤、放射性物質、顔料、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４０】
実施態様によっては、一以上の生物活性剤をＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に取り込むことによって、哺乳類宿主に医学的な利益を提供することができる。ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に取り込むことのできる生物活性剤の例としては、塩形態または中性の形態で、内在的に親水性の状態、または親水性のミクロ粒子もしくはナノ粒子の中に封入された状態にある、細胞、幹細胞、羊膜組織、羊膜細胞、増殖因子、微粉脱細胞化皮膚組織、粒状架橋ウシ腱コラーゲンおよびグリコサミノグリカン、抗生物質、消毒剤、抗感染症薬、抗微生物剤、抗菌剤，抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗原虫薬、殺胞子剤、駆虫剤、末梢神経障害治療薬、神経障害治療薬、走化性剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗高血圧薬、マイトマイシン型抗生物質、ポリエン系抗真菌薬、発汗抑制剤、充血除去剤、酔い止め薬、中枢神経系薬、創傷治療薬、抗ＶＥＧＦ薬、抗腫瘍薬、腐食剤、抗乾癬薬、抗糖尿病薬、抗関節炎薬、かゆみ止め、かゆみ止め薬、麻酔剤、抗マラリア剤、皮膚病薬、抗不整脈薬、抗けいれん薬、抗嘔吐薬、抗リウマチ薬、抗アンドロゲン剤、アントラサイクリン、禁煙剤、抗にきび薬、抗コリン剤、老化防止剤、抗ヒスタミン剤、駆虫剤、止血剤、血管収縮剤、血管拡張剤、血栓症薬、抗凝固薬、心・血管作動薬、抗狭心症薬、勃起不全薬、性ホルモン、成長ホルモン、イソフラボン、インテグリン結合シークエンス、生物活性リガンド、細胞付着メディエータ、免疫調節剤、腫瘍壊死因子アルファ、抗がん剤、抗腫瘍薬、抗鬱剤、鎮咳薬、抗−腫瘍薬、麻薬拮抗薬、抗高コレステロール薬、アポトーシス誘導剤、避妊薬、サンレス・タンニング剤、軟化剤、アルファヒドロキシ酸、マヌカ蜂蜜、局所レチノイド、ホルモン、腫瘍特異的抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗ＶＥＧＦＲＮＡアプタマー、核酸、ＤＮＡ，ＤＮＡ断片、ＤＮＡプラスミド、Ｓｉ−ＲＮＡ，トランスフェクション剤、ビタミン、精油、リポソーム、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、薬物含有ナノ粒子、アルブミン系ナノ粒子、キトサン含有ナノ粒子、多糖系ナノ粒子、デンドリマーナノ粒子、リン脂質ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ビスマスナノ粒子、ガドリニウムナノ粒子、金属ナノ粒子、セラミックナノ粒子、石英系ナノ粒子、ウイルス由来ナノ粒子、ウイルス様ナノ粒子、抗生物質含有ナノ粒子、酸化窒素含有ナノ粒子、ナノシェル、ナノロッド、高分子ミセル、銀塩、亜鉛塩、量子ドットナノ粒子、高分子系微粒子、高分子系ミクロスフェア、薬物含有微粒子、薬物含有ミクロスフェア、抗生物質含有、抗生物質含有ミクロスフェア、抗菌性微粒子、抗菌性ミクロスフェア、サリチル酸、過酸化ベンゾイル、５−フルオロウウラシル、ニコチン酸、ニトログリセリン、クロニジン、エストラジオール、テストステロン、ニコチン、乗り物酔い止め薬、スコポラミン、フェンタニル、ジクロフェナク、ブプレノルフィン、ブピバカイン、ケトプロフェン、オピオイド、カンナビノイド、酵素、酵素阻害薬、オリゴペプチド、シクロペプチド、ポリペプチド、タンパク質、プロドラッグ、プロテアーゼ阻害薬、サイトカイン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、副交感神経遮断薬、キレート剤、育毛促進剤、脂質、糖脂質、糖タンパク質、内分泌性ホルモン、成長ホルモン、増殖因子、分化因子、熱ショックタンパク質、免疫反応修飾物質、単糖類、多糖類、インスリンおよびインスリン誘導体、ステロイド、コルチコステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬またはその類似材料を挙げることができるが、これらには限定されない。このような生物活性剤は、（Ｒ）配置、（Ｒ，Ｓ）配置、または（Ｓ）配置、またはこれらの組み合わせをとることができる。
【０１４１】
本明細書で「注入」とは標準的な意味を持ち、経皮、皮下、経口、筋内、粘膜下、皮下、経鼻、膣内、口腔、髄腔内、硬膜外、脳実質内、眼部、網膜下、歯科的、腫瘍内、心腔内、関節内、静脈内、陰茎海綿体内、骨内、 腹腔内、腹腔内、筋膜内、臓器内、および硝子体内的な処置を含むものとする。
【０１４２】
本明細書において、「注入」は、外科的に形成された体腔／空隙、疾患により生じた体腔／空隙、および怪我により生じた体腔／空隙に行うことができる。
【０１４３】
本明細書で「細胞培養」とは標準的な意味を持ち、動物あるいは植物由来の細胞、組織または臓器の移動と、その後、生存および／または増殖が促進される環境に移植することが含まれる。
【０１４４】
実施態様によっては、注入可能なＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物として細胞が含有してもよい。本明細書に記載されているＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に有用とされる細胞として、例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、シュワン細胞、後根神経節、含脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、繊維状軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、肝細胞、腱細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞、間質細胞、好中球、リンパ球、骨髄細胞、血小板、およびこれらの組み合わせ、を挙げることができるがこれらに限定されない。実施態様によっては、前記細胞は真核細胞または哺乳動物のものである。実施態様によっては、前記細胞はヒト由来である。実施態様によっては、前記細胞は自己移植または同種異系のものとできる。
【０１４５】
実施態様によっては、注入可能なＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に、成体幹細胞、胚性幹細胞、羊膜幹細胞、誘導多能性幹細胞、胎児幹細胞、組織幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄幹細胞、ヒト臍帯血幹細胞、血液前駆細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、内皮前駆細胞、上皮幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、心臓幹細胞、膵臓幹細胞、神経幹細胞、角膜輪幹細胞、周産期幹細胞、衛星細胞、サイドポピュレーション細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、単能性幹細胞、およびこれらの組み合わせが含有できる。実施態様によっては、前記幹細胞は哺乳動物のものである。実施態様によっては、前記幹細胞はヒト由来である。実施態様によっては、前記幹細胞は自己移植または同種異系のものとすることができる。
【０１４６】
実施態様によっては、本明細書に記載された注入可能なＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物を、治療効果のある１０，０００個から約１０億個までの数の細胞を送達する足場マトリクスとして使用することができる。
【０１４７】
実施態様によっては、哺乳類宿主に注入するため、胎盤組織から得られた生成物をＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に組み込むことができる。胎盤組織はコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、および増殖因子の供給源であって、血小板由来成長因子 （ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子 （ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、および形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）を含み、これらは組織の修復および再生を支えることができる。特に、羊膜組織には癒着防止性および抗微生物性があり、この種の組織は軟組織の修復を補助し、炎症を低減させ、瘢痕組織の形成を最小限に抑えると示されており、軟組織の損傷を治癒する上でたいへん有用である。
【０１４８】
羊膜組織は、羊膜組織の導入に際してヒト体内の免疫反応がめったに起こらないという点において免疫学的に恵まれているといわれている。実施態様によっては、軟組織に注入または被覆するため、または代用組織周辺への移植のために、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に、BioDRestore（商標）エレメンタルチッシュ―マトリクス（Elemental Tissue Matrix）としてＢｉｏＤ社から商用入手可能である、細片化され流動性を有する羊膜組織由来の組織同種移植片を添加することができる。例えば、ＰＥＧ化フィブリノゲンミクロゲル粒子組成物は、羊膜組織由来の細片流動性組織同種移植片を含有することができる。
【０１４９】
実施態様によっては、ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物に増殖因子が含まれていてもよい。有用な増殖因子の例として、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）ファミリー、ストロマ細胞由来因子（ＳＤＦ）、ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、筋肉形態形成因子（ＭＭＦ）、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
実施態様によっては、注入可能な軟組織空隙填塞材料として、多成分系のＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物を使用することが可能であって、また、軟組織を増強、強化、補強、修復、復元、治癒、閉塞、または補填するのに適したあらゆる成分を他に含むこともできる。
【０１５１】
水和ミクロゲル粒子組成物の流動特性は流量計を用いて決定でき、眼球組織（ガラス体）や脂肪などの生体的に弱い（軟らかい）材料の貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ”）は、筋、腱、軟骨などの強固な材料の関連値と比較して、十分に低い。この点において、Ｇ’の値は１Ｐａから１ＭＰａまでの範囲にあり、Ｇ”の値は０．１Ｐａから１ＭＰａまでの範囲にあり、これらは粒子状水和ミクロゲル粒子組成物（例えば、個々のミクロゲル粒子およびミクロゲル粒子のクラスター、単一でまたは自由液体もしくは固体成分を含むかどうかに関係なく）に属する性質を含んでいる。実施形態様によっては、本明細書に記載のＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物の貯留弾性率は、１０Ｐａから２５０，０００Ｐａまで、５０Ｐａから１７５，０００Ｐａまで、および１００Ｐａから１００，０００Ｐａまでの範囲にある。実施態様によっては、損失弾性率は５Ｐａから１００，０００Ｐａまで、７．５Ｐａから５０Ｐａまで、および１０Ｐａから１０，０００Ｐａまでの範囲にある。架橋され、水和されたＰＥＧ化ミクロゲル粒子は、せん断力の下で擬塑性を示し、せん断速度が高まるにつれて粘性が低下する。この擬塑性現象は水不溶性で水和している粒子自身に基づく現象であって、可溶高分子を含有する流体媒体に基づく現象ではない。さらには、ミクロゲル粒子組成物の持つレオロジー的な性質、例えば、本明細書に記載されている個々のあるいはクラスター化したミクロゲル粒子の性質は、驚くべきことに、その固体的な性質に関係しており、１未満の損失正接（Ｇ”／Ｇ’）で特徴付けられる、より流体的な性質とは対照的である。
【０１５２】
加えて、軟組織の障害または損傷を治癒する本明細書に記載の組成物の使用について開示する。本明細書に記載されるあらゆる組成物を使用することができる。とくに、このような組成物は軟組織に注入して使用することができる。注入は、経皮、皮下、経口、筋内、粘膜下、経鼻、膣内、口腔、髄腔内、硬膜外、脳実質内、眼部、網膜下、歯科的、腫瘍内、心腔内、関節内、静脈内、陰茎海綿体内、骨内、腹腔内、腹腔内、筋膜内、臓器内、および硝子体内で行うことができる。実施態様によっては、本明細書に記載された組成物からなる水不溶性ミクロゲル粒子は、乾燥粉末の形態をとり、その使用または方法として、該乾燥粉末を該注入ステップの前に水和することがさらに含まれる。この種の実施態様では、注入後、該組成物が血管形成を促進させる。
【０１５３】
試験結果
実験セクションにおいて下記の材料と略語が使用される。
ＡＤＳＣ：脂肪由来幹細胞、初代ヒト腹部形成細胞
ＡＨＦ：クリオプレシピテート抗血友病因子、南テキサス血液＆組織センター、Lot W1409114 212930
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ｂｉｏＷＯＲＬＤ，２２０７０００４−１，Ｌｏｔ  Ｖ１１１２１４０１
塩化カルシウム：シグマ社  Ｃ４９０１，Ｌｏｔ  １１０Ｍ０１０５Ｖ
カーボポール：ルブリゾール社、カーボポール（登録商標）Ａｑｕａ  ＳＦ−２，Ｌｏｔ  ０１０１０１４５０２
Ｉ型コラーゲン：コーニング社（Corning Incorporated）、製品番号３５４２３６、ラット尾腱、Ｌｏｔ３２９８５９９
ＥＣＭ：細胞外基質、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫、シグマ社Ｅ１２７０，Ｌｏｔ  ０９３Ｍ４００６Ｖ。
ジェランガム：ＣＰケルコ社（CP Kelco），ケルコゲルＣＧ−ＬＡ，Ｌｏｔ  １Ｅ０５６６Ａ
グァーガム：メイキングコスメティック社（Making Cosmetics）、Ｌｏｔ  １０９２１１８
ヒトフィブリノゲン（ＦＧＮ）：シグマ社Ｆ３８７９，Ｌｏｔｓ  ０６１Ｍ７０１０，０７１Ｍ７０３２Ｖ，ＳＬＢＨ０２２３Ｖ，ＳＬＢＫ３７４７Ｖ
ヒトトロンビン：シグマ社Ｔ７００９，Ｌｏｔｓ  ０４１Ｍ７００７Ｖ，０１１Ｍ７００９Ｖ，ＳＬＢＢ４３９４Ｖ
ヒドロキシエチルセルロース，カチオン性：ダウケミカル社（Dow Chemical Company），ＵＣａｒｅ（商標）ポリマーＪＲ−３０Ｍ，Ｌｏｔ  ＸＬ２８５０ＧＲＸＡ
ヒドロキシプロピルメチルセルロース：Amerchol Methocel  Ｋ１５Ｍ，Ｌｏｔ  ＷＦ１５０１２Ｎ０１
細片化羊膜：バイオディー社（ＢｉｏＤ，ＬＬＣ），BioDRestore（商標），組織ＩＤ    Ｒ０９２５１３１
ＮａＯＨ：水酸化ナトリウム，ピューリタンプロダクツ社（Puritan Products）７７０５，Ｌｏｔ  ０１１０４３．
ニードル：１８Ｇ，ＢＤ３０５１９５，Ｌｏｔ  ２０８９２１５
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水：ｐＨ７．８−８．０（カルシウムおよびマグネシウム無し），ＩＮＣＥＬＬＺＳＯＬ：Ｆ，ＬｏｔｓＡ２０１４ＳＥＰ１０−０１，Ｚ２０１５ＪＡＮ０５−０１；またはシグマアルドリッチ社Ｄ８５３７，Ｌｏｔｓ  ＲＮＢＢ９４５１，ＲＮＢＣ１１４３，ＲＮＢＣ８４００
ＰＨＭＢ：ポリ（ヘキサメチレンビグアニド）塩酸塩：アーチ・ケミカルズ社（Arch Chemicals），コスモシールＣＱ（商標），Ｌｏｔｓ  ９ＰＬ２１１２８０，１３７２６１またはローションクラフタービグアニド２０，Ｌｏｔ  １４ＲＣ１６９１５９−６３８０
ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート：ＭＷ  ５７５，シグマアルドリッチ社４３７４４１，Ｌｏｔ  ＭＫＢＮ７８００Ｖ
ポリ（ビニルアルコール）：デュポン社（DuPont），エルバノール（Elvanol）（登録商標），Ｌｏｔ  ９１０１１３
ＰＳＧ−（ＰＥＯ）４：ペンタエリトリトールテトラ（スクシンイミジルオキシグルタリル）ポリオキシエチレン，４アーム（四官能基），ＮＯＦアメリカ社（NOF America Corporation），サンブライト（Sunbright）（登録商標）ＰＴＥ−０５０ＧＳ  （ＭＷ  ５，０００），Ｌｏｔ  Ｍ８Ｎ５２６；  ＰＴＥ−１００ＧＳ  （ＭＷ  １０，０００），Ｌｏｔ  Ｍ９Ｄ１０５；およびＰＴＥ２００−ＧＳ  （ＭＷ  ２０，０００），Ｌｏｔ  Ｍ１１９６９１
プルラン：林原，Ｌｏｔ  １Ｇ３０２１
ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ  （ＰＥＧ）：ＮＯＦアメリカ社（NOF America Corporation），α−スクシンイミジルオキシグルタリル−ω−スクシンイミジルオキシグルタリルオキシポリオキシエチレン，（二官能性），  ＮＯＦアメリカ社（NOF America Corporation）；  サンブライト（Sunbright）（登録商標）ＤＥ−０３４ＧＳ  （ＭＷ  ３４００），Ｌｏｔ  Ｍ８３５４１；  ＤＥ−１００ＧＳ  （ＭＷ  １０，０００），Ｌｏｔ  Ｍ１０７５４３；  ＤＥ−２００ＧＳ  （ＭＷ  ２０，０００），Ｌｏｔ  Ｍ１１５７００
ＳＧ−ＰＥＧ：α−スクシンイミジルオキシグルタリル−ω−メトキシポリオキシエチレン，（単官能性），  ＮＯＦアメリカ社（NOF America Corporation），サンブライト（Sunbright）（登録商標）ＭＥ−０５０ＧＳ  （ＭＷ５，０００），Ｌｏｔ  Ｍ１０Ｎ５８７
キサンタンガム：ボブズレッドミル，Ｌｏｔ  １４３４５４
【実施例１】
【０１５４】
初期ハイドロゲル形成のプロトコル：
ポリ（エチレングリコール）−ヒトフィブリノゲン（ＰＥＧ−ＦＧＮ）
種々のモル比のＰＥＧ化フィブリノゲン（ＰＥＧ−フィブリノゲン，ＰＥＧ−ＦＧＮ）の調製について、２０：１モルＰＥＧ−ＦＧＮの調製を用いて説明する。フィブリノゲン（ＦＧＮ，ＭＷ  ３４０ｋＤａ）を、ｐＨ７．８〜８．０の滅菌ＰＢＳに、８０ｍｇ／ｍＬで溶解させた（カルシウムおよびマグネシウム無し）。フィブリノゲンを常温または３７℃で溶解させた。ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ（ＭＷ  ３．４ｋＤａ）を常温で（〜２２℃）ｐＨ７．８−８．０の滅菌ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウム無し）に１６ｍｇ／ｍＬで溶解させた。試験した全ロットのフィブリノゲンも同様に行った。ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧの反応性二官能ＰＥＧ溶液は０．２０−０．２２μｍフィルターを用いて滅菌濾過された。その後、ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧはＦＧＮと１：１ｖ／ｖ（等容積）で混和された。常温または３７ｏＣで５〜３０分のうちにゲル化が起こった。
【０１５５】
ＰＥＧ−ＦＧＮは１０：１、３５：１、または５０：１のモル比にも調製された。ＰＥＧ化の度合いが低いとフィブリノゲン取り込みの濃度が高くなり（足場マトリクスでの生物活性がより高い）、製造がますます容易となり（ＰＥＧが多いとより多くの水を保持し、冷凍凍結がいっそう難しくなり、小粒子に粉砕することが非常に困難となる）、また、３５：１および５０：１のＰＥＧ−ＦＧＮ足場と比較して、２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮ足場での脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの接着性および増殖が望ましいことが分かった。
【０１５６】
下記のＰＥＧ化剤を用いて２０：１のモル比でＰＥＧ−ＦＧＮが調製された。
ＰＥＧジアクリレート（二官能性）；
ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ，Sunbright  ＤＥ−０３４ＧＳ  （ＭＷ  ３４００），ＤＥ−１００ＧＳ（ＭＷ  １０，０００），ＤＥ−２００ＧＳ  （ＭＷ  ２０，０００）（二官能性）；
ＳＧ−ＰＥＧ：  Sunbright（登録商標）ＭＥ−０５０ＧＳ  （ＭＷ  ５，０００）（単官能性）；
ＰＳＧ−（ＰＥＯ）４，ＰＴＥ−０５０ＧＳ（ＭＷ  ５，０００），Sunbright  ＰＴＥ−１００ＧＳ（ＭＷ  １０，０００），ＰＴＥ２００−ＧＳ  （ＭＷ  ２０，０００）（四官能性）；
ここで、
ＤＥ：ＮＨＳ−ＯＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＰＥＧ−ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＮＨＳ；
ＭＥ：ＰＥＧ−ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＮＨＳ；
ＰＴＥ：ＰＥＧ−（ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＮＨＳ）４；
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド。
【０１５７】
ＰＥＧ化剤の分子量を高めるとより硬いゲルが得られた。二官能性のＰＥＧは、単官能性のＰＥＧと比較してより固いゲルを生成し、単官能性のＰＥＧでは流体が得られた。同じモル比ではＰＥＧの官能性が大きくなるとより固いゲルが生成された。ＰＥＧジアクリレートは試験された反応条件ではゲルを形成しなかった。
【実施例２】
【０１５８】
ＰＥＧ−ＦＧＮ−ＰＨＭＢ
ＰＥＧ−ＦＧＮハイドロゲル（モル比２０：１）を、ＰＨＭＢの量が０から１０００ｐｐｍまでの範囲に存在するように添加して調製した。ＰＥＧ−ＦＧＮ−ＰＨＭＢ複合材料の調製は、１００ｐｐｍのＰＨＭＢ（ミクロゲルが５０ｍｇ／ｍＬで再水和された濃度）を取り込むことにより説明され、他の濃度を有するＰＨＭＢも同様にして調製される。
【０１５９】
ＰＨＭＢは、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないｐＨ７．８−８．０の滅菌ＰＢＳに希釈された。添加すべきＰＨＭＢ溶液の算出濃度は、最終再水和粉末の０．０１％ｗ／ｗＰＨＭＢに基づいている（粉末生成物は５０ｍｇ／ｍＬに再水和されている）。これは、初期のハイドロゲルに、１００ｍＬ全ゲル容積に対して４８μＬのＰＨＭＢ溶液を取り込むことが必要とされる。１００ｍＬバッチに対して、０．０４８ｍＬ（４８μＬ）のＰＨＭＢ（コスモシルＣＱ）が５０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に添加された。この希釈ＰＨＭＢ溶液にＰＥＧ化剤が１６ｍｇ／ｍＬで溶解された。８０ｍｇ／ｍＬフィブリノゲン溶液を５０ｍＬ添加することでゲル形成が開始された。
【実施例３】
【０１６０】
ＰＥＧ−ＦＧＮ−ポリマー
下記水溶性ポリマーを取り込むことにより、ＰＥＧ−ＦＧＮ−水可溶性ポリマーハイドロゲル（ＰＥＧとＦＧＮが２０：１のモル比）が調製された：２７．６ｍｇ／ｍＬのカーボポール、２７．６ｍｇ／ｍＬのプルラン、２０．７ｍｇ／ｍＬのグァーガム、３．４ｍｇ／ｍＬのヒドロキシエチルセルロース、１．４ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン。カーボポールはアクリル酸をベースとした架橋合成ポリマーであり、プルランとグァーガムは天然多糖類であり、ヒドロキシエチルセルロースは修飾多糖類であり、Ｉ型コラーゲンはタンパク質であって、人体に最も豊富に存在するコラーゲンである。ＰＥＧ化の前に水溶性ポリマーが添加された。
【実施例４】
【０１６１】
ＰＥＧフィブリン
ＰＥＧ−フィブリンゲルを１０：１から５０：１までのモル比で調製した。２０：１を超えてＰＥＧ化が高まると、トロンビンの活性とフィブリンゲルの形成が阻害され、より長い反応時間が必要とされる。フィブリノゲンを架橋させるため、２．５−１２．５Ｕ／ｍＬゲルのトロンビン濃度で、ＰＥＧ−フィブリノゲンにトロンビンが添加された。
【０１６２】
ＰＥＧ−フィブリンゲルの調製は、２．５Ｕ／ｍＬのトロンビンを含有する１０：１モル比のＰＥＧ−フィブリンで説明する。フィブリノゲン（ＭＷ３４０ｋＤａ）を、ｐＨ７．８〜８．０の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（カルシウムおよびマグネシウムを含有せず）に、８０ｍｇ／ｍＬで溶解させた。ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ（ＭＷ３．４ｋＤａ）を常温でｐＨ７．８〜８．０の滅菌ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含有せず）に８ｍｇ／ｍＬで溶解させた。反応性ＰＥＧ溶液は０．２０−０．２２μｍフィルターを用いて滅菌濾過された。ＰＥＧはＦＧＮと１：１ｖ／ｖ（等容積）で混和され、５分反応させた（ＰＥＧ化フィブリノゲン溶液）。トロンビン（脱イオン水中に１００Ｕ／ｍＬ）は４０ｍＭ塩化カルシウムに、５Ｕ／ｍＬまで希釈された。ＰＥＧ−フィブリンゲルは、１部のＰＥＧ化フィブリノゲン溶液を塩化カルシウム中で、１部のＰＢＳと２部の５Ｕ／ｍＬトロンビンと混和させることにより形成された。ゲル化は常温または３７℃で５分間のうちに起こった。
【０１６３】
ＰＥＧ−フィブリンは、上記の手順に従って、２．５−１２．５Ｕ／ｍＬゲルの濃度を有するトロンビンにより、１０：１、３５：１，または５０：１のモル比でも調製された。これまで、トロンビンによりフィブリンに変換された、ＰＥＧとフィブリノゲンのモル比が、１：１、２．５：１、５：１、７．５：１、１０：１、１５：１、２０：１、１００：１である、ＰＥＧ−フィブリン単一ハイドロゲルが報告されている（チャンら、組織工学，１２（１），９−１９，２００６）
【実施例５】
【０１６４】
ＰＥＧ−フィブリン−ポリマー
ＰＥＧ化フィブリン（１０：１）ハイドロゲルは、２ｍｇ／ｍＬで取り込まれた下記の水性ポリマー：キサンタンガム、ジェランガム、グァーガム、カチオン性ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリ（ビニルアルコール）により調製された。キサンタンガム、ジェランガムおよびグァーガムは天然由来の多糖類、カチオン性のヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースは変性多糖類、ポリ（ビニルアルコール）は合成ビニル系ポリマーである。
【０１６５】
ＰＥＧ化フィブリン（１０：１）ハイドロゲルはまた、下記のポリマーを取り込んで調製される：２０ｍｇ／ｍＬのカーボポール、２０ｍｇ／ｍＬのプルラン、１５ｍｇ／ｍＬのグアガム、２．５ｍｇ／ｍＬのヒドロキシエチルセルロース、および１ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン。
【０１６６】
ＰＥＧ：フィブリン：ポリマーからなるハイドロゲルは、下記の通り調製される：フィブリノゲンは、ＰＥＧ化剤とフィブリノゲンを１０：１のモル比で混和することによりＰＥＧ化された。５分間ＰＥＧ化された後で、この溶液に水溶性ポリマーが添加され、その後にトロンビンが添加され架橋を開始した。
【実施例６】
【０１６７】
ＰＥＧタンパク質
実施例１と同様の手順を用いて、下記のタンパク質を２０：１のモル比でＰＥＧ化した：フィブリノゲン、ウシ血清アルブミン、Ｉ型コラーゲン、クリオプレシピテート抗血友病因子（ＡＨＦ）、および細胞外基質。１ＭのＮａＯＨを用いてpＨが＞７．０まで上昇すると、ＰＥＧ化によりゲル形成が誘発された。Ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用およびタンパク質安定性を考えると、６．６から８．０までの範囲にあるpＨを使用することができる。水和ＰＥＧ化ゲルは、急速に機械攪拌することよりミクロゲル粒子に変換された。得られたミクロゲル粒子の擬塑性は、水和ミクロゲル粒子をシリンジに装填し、このＰＢＳを含むミクロゲルを１８ゲージニードルから注入させることにより実証され、せん断力がなくなるとミクロゲルのクラスターが形成された。
【０１６８】
代わりに、下記のタンパク質を２０：１のモル比でＰＥＧ化した：ウシ血清アルブミン、Ｉ型コラーゲン、および細胞外基質。該ハイドロゲルを乾燥、再水和、機械混練することによりミクロゲルが形成された。ミクロゲルの擬塑性は、得られた水和ミクロゲル粒子をシリンジに装填し、ＰＢＳを含むミクロゲル粒子を１８ゲージニードルから注入させることにより実証され、せん断力がなくなるとミクロゲルのクラスターが形成された。
【０１６９】
ミクロゲル粒子形成の手順
ＰＥＧ化されたフィブリノゲン系およびフィブリン系のハイドロゲルが、２４−９６時間乾燥凍結された。乾燥凍結されたゲルはその後、臼と杵、またはスペックサンプルプレップ（Spex SamplePrep）６８７０（メアチェン、ニュージャージー）を用いて粉砕された。乾燥ミクロゲル粉末をその後、タイラー製またはレッチェ製のステンレス鋼試験用篩を用いて（＜２５０μｍ、＜１５０μｍ、＜１０６μｍ、または＜７５μｍ）の粒子サイズに篩い分けすることができる。乾燥ミクロゲル粉末は、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムは含有していてもしていなくてもよい）、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）、脱イオン水、細胞培地（細胞は含有していてもしていなくてもよい）、または細片化羊膜、により再水和された。
【０１７０】
１０：１のＰＥＧ：フィブリンのモル含有量を有する架橋ＰＥＧ化フィブリンを用いたミクロゲルの調製プロセスが図１に図示されており、初期の単一ゲル（ゲル化ＰＥＧ−フィブリン）が凍結乾燥され（凍結乾燥ＰＥＧ−フィブリン）、その後、凍結粉砕により粉末状に粉砕され（粉砕ＰＥＧ−フィブリン）、ミクロゲル粒子に再水和された（再水和ＰＥＧ−フィブリン）。ミクロゲル粉末はすべてこの手順で調製された。
【０１７１】
表１には、２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮおよび１０：１のＰＥＧ−フィブリンからなるミクロゲル粒子の膨張特性が提示されている。膨張性は、乾燥ミクロゲル粒子の吸水性、つまり、水和ミクロゲル重量／乾燥ミクロゲル重量を基にして決定される。ＰＥＧ−ＦＧＮおよびＰＥＧ−フィブリンからなる５０：１製剤に対して比較すると、フィブリノゲン製剤の方がフィブリン製剤よりも親水性が高い。これは、トロンビンによるフィブリノゲンからフィブリンへの転換に起因する、ＰＥＧ−フィブリンの付加的な架橋に関連性があると思われる。
【０１７２】
水溶性ポリマーが、１０：１のＰＥＧ−フィブリンミクロゲル粒子および２０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲル粒子に取り込まれると、吸水性が高くなった。これら吸水性親水ポリマーが取り込まれるとミクロゲル粒子ネットワークの親水性が高まり、膨張性の度合いが高くなった。試験を行った親水性ポリマーには、ＰＨＭＢ、カーボポール、プルラン、グァーガム、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、およびＩ型コラーゲン、が含まれる。ＰＥＧ−フィブリンゲルには、２０ｍｇ／ｍＬのカーボール、２０ｍｇ／ｍＬのプルラン、１５ｍｇ／ｍＬのグアーガム、２．５ｍｇ／ｍＬのヒドロキシエチルセルロースおよび１ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲンが含まれていた。ＰＥＧ−ＦＧＮゲルは、２７．６ｍｇ／ｍＬのカーボポール、２７．６ｍｇ／ｍＬのプルラン、２０．７ｍｇ／ｍＬのグァーガム、３．４ｍｇ／ｍＬのヒドロキシエチルセルロース、および１．４ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲンを用いて調製された。
【０１７３】
【表１】
2018511622.tif 000001
【０１７４】
レオロジー特性
水和ミクロゲル粒子に剪断減粘性があることが分かった。この予期しない性質により、所定部位への流体注入および移植が容易になり、ミクロゲル粒子組成物が注入後に直ちに、粘弾性固体として機能し、生体周囲組織に適合する形状が維持されるようになる。ミクロゲル粒子組成物の擬塑性および粘弾性を調べるため、レオメータ（アントンパール社製ＭＣＲ１０１、アントンパール社製ＭＣＲ３０２、アッシュランド、バージニア）が使用された。例として、凍結粉砕（または臼と杵）により製造された、２０：１モル比の再水和ＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲル粒子および１０：１モル比の再水和ＰＥＧ−フィブリンミクロゲル粒子を利用すると、図２に図示されている粘性に対するせん断速度は、これらのプロットの絶対的な傾きの値により説明されるように、架橋ＰＥＧ化タンパク質ミクロゲル粒子組成物は急速に剪断減することを示していて、ＰＥＧ−フィブリノゲンの傾きが−０．９０であって、またＰＥＧ−フィブリンの傾きは−０．９８であり、−１に近い傾きは、完全な剪断減粘性物質であることを示唆している。
【０１７５】
２０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンを例にすると、１％の歪みを繰り返して受けた後でも、粘弾性が失われることなく、機械的な特性が回復する（図３）。
【０１７６】
加えて、ＰＥＧ−フィブリノゲン水和ミクロゲル粒子組成物とＰＥＧ−フィブリン水和ミクロゲル粒子組成物は何れも、損失弾性率に比べて貯蔵弾性率が大きな粘弾性固体として機能する（図４、Ｇ’＞Ｇ”、損失正接＜１）（図２）。
【表２】
2018511622.tif 000002
臼と杵および凍結粉砕により粉砕された５０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲルの剪断減粘性を、粘性に対するせん断速度のプロットとして図５に図示した。臼と杵により得られた乾燥ミクロゲル粒子は、より扁平状でフレーク状に近かったのに対して、凍結粉砕により得られた乾燥粒子はより球状に近かった。ミクロゲルをリン酸緩衝生理食塩水で３００ｍｇ／ｍＬで再水和させた。プロットの傾きは、臼と杵に対して−０．８６、凍結粉砕に対して−０．８４であった。凍結粉砕された粒子は多少粘性度が高いが、これは小さな粒子サイズ分布および小さな平均粒子サイズに起因するものだと思われる。
【０１７７】
ヒト脂肪由来幹細胞
人間の腹部脂肪からヒト脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を分離し、MesenPRO RS（商標）培地（ライフテクノロジー社）にて、成長補助剤および１％ペニシリンストレプトマイシンと共に、継代培養した。１０：１、２０：１、および５０：１のＰＥＧ−ＦＧＮとＰＥＧ−フィブリンの粉末サンプル（１５ｍｇ）を、１２ウェルプレート（ｎ＝３）の細胞培養インサート（透明ＰＥＴ膜  サイズ＝８．０μｍ、ＢＤバイオサイエンス社）の中で、４００μＬの２．５×１０５細胞／ｍＬ懸濁液と混ぜた。このインサートに別の６００μＬ培地を添加して、別に１ｍＬを外部から添加し、全部で２ｍＬの培地容量となった。培地を毎日交換し、CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)(プロメガ社)を用いて細胞増殖をメーカーの手順に従って調べた。その後、カルセイン−ＡＭ（４ｍＭ）生体細胞染色試薬を用いて４５分間細胞が染色され、１０％ホルマリンを用いて固定された。各サンプルの巨視的蛍光画像を、デジタルカメラと共焦点顕微鏡をそれぞれ用いて取得した。
【０１７８】
図６はミクロゲル上にある幹細胞の数が１日目から４日目にかけて著しく上昇したことを示している。２０：１および５０：１の製剤では、４日目から７日目にかけて細胞が増殖し続けた。図７に図示されている生体細胞染色は、実験したすべてのミクロゲル粒子組成物でＡＤＳＣが生存可能であることを示している。細胞は、２０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲルおよび５０：１のＰＥＧ−フィブリノゲンミクロゲルにネットワークを形成しているように見える。
【０１７９】
したがって、ミクロゲル粒子組成物の使用で重要な事は、注入後または流体の動きにより、ミクロゲル粒子のクラスターに再構成される機能にある。図８には生体外でラットに皮下注入された２０：１のＰＥＧ化フィブリノゲンミクロゲルが図示されており、ミクロゲル粒子は凝集性のある固体を形成し、注入部位でその形状が保持されていた。
【０１８０】
抗微生物特性
ＰＥＧ化ミクロゲル粒子組成物に抗微生物特性を提供するために、フィブリノゲンとのＰＥＧ化反応にＰＨＭＢが取り込まれた。図９は、１，０００ｐｐｍのＰＨＭＢを含む２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮ−ＰＨＭＢ三重複合体の擬塑性を、２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮと比較して示している。ＰＥＧ−ＦＧＮの傾きの値は−１．０であり、ＰＥＧ−ＦＧＮ−ＰＨＭＢの値は−１．０６であって、−１に近い傾きは完全な剪断減粘性材料であることを示している。
【０１８１】
図１０はＰＨＭＢを含有する場合としない場合の、２０：１のＰＥＧ−ＦＧＮゲルの貯蔵弾性率および損失弾性率に対する、弾性率と回転数のプロットを示している。角振動数が１sec-1のとき、ＰＥＧ−ＦＧＮの損失正接は０．２５であって、一方、ＰＥＧ−ＦＧＮ−ＰＨＭＢの損失正接は０．２１であった。これらの弾性率データは、ＰＨＭＢを添加することにより、ＰＥＧ−ＦＧＮ−ＰＨＭＢ複合体の固体状の特徴が、ＰＥＧ−ＦＧＮ複合体と比較して大きくなることを明らかにしており、ＰＨＭＢがＰＥＧ化反応に共有結合的に取り込まれたことを示している。
【０１８２】
ＰＨＭＢがＰＥＧ化フィブリノゲン複合体に共有結合し、共有結合されたＰＥＧ−ＦＧＮ−ＰＨＭＢ三重複合体が形成される事は、ＰＨＭＢの抑制域（ＺＯＩ）における殺菌活性の抗微生物的な研究により裏付けられており、またＰＨＭＢはフィブリノゲンのＰＥＧ化（共有結合されたＰＨＭＢ）により含有されており、また、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ，ＡＴＣＣ＃７００７８７）に対して、ＰＨＭＢはＰＥＧ−フィブリノゲンが形成されてから添加された（非結合ＰＨＭＢ）。非結合ＰＨＭＢを含有するＰＥＧ−フィブリノゲンのＺＯＩは＜１．０ｍｍであり、また共有結合したＰＨＭＢ三重複合体には測定可能なＺＯＩが存在せず、抑制はミクロゲル粉末の下部のみであった。結合していないカチオン性ＰＨＭＢは、ＰＨＭＢの自由な移動性により非常に大きなＺＯＩを持つと期待されているが、該カチオン性ＰＨＭＢは、フィブリノゲンのアニオン部分に、イオン的には結合可能であるが共有結合的には結合しておらず、一方で共有結合したＰＨＭＢでは、微生物がミクロゲル粒子に直接接触している必要がある。
【０１８３】
体内皮下注入
ＰＥＧ−ＦＧＮ（２０：１モル）は単独で、または、自己移植の幹細胞（ラットＡＤＳＣ）もしくはBioDRestore（商標）細片化羊膜と組み合わせて評価された。エチレンオキシドで滅菌化されたミクロゲルが、２１ゲージのニードルを用いてラット背部皮下領域に注入された。５つの試験グループが複製により評価された：ラットＡＤＳＣｓ、BioDRestore（商標）、ＰＥＧ−ＦＧＮ、ラットＡＤＳＣ含有ＰＥＧ−ＦＧＮ、およびBioDRestore（商標）含有ＰＥＧ−ＦＧＮ。ミクロゲルが容易に注入され、凝集性の固体を形成し、７日目と１４日目に注入部位に維持されていたという結果が示されている。
【０１８４】
ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて７日目と１４日目の固定組織切片を染色し、細胞、コラーゲン、および組織の再形成を可視化した。Ｈ＆Ｅ染色はミクロゲルの宿主細胞再生にわずかな炎症反応しか示さなかった。ミクロゲルの再形成は１４日目にさらに顕著なものとなり、とくにＡＤＳＣｓまたはBioDRestore（商標）と組み合わせたときに顕著であった。
【０１８５】
平滑筋アクチン（ＳＭＡ）染色は、周皮細胞の指示薬であるが、７日目と１４日目に、ミクロゲルへの血管浸透が示されていた。同種異系のＡＤＳＣｓまたは細片化羊膜生成物（ＢｉｏＤ）をミクロゲルシステムに組み入れることによって、血管形成が向上した。図１１は、ミクロゲル中心部の血管浸潤を示している。単一ハイドロゲルシステムでは、血管形成が始まってもハイドロゲルの中心部に到達することはめったにない。
【０１８６】
加えて、ミクロゲル粒子システムを用いた注入により細胞生存率が高くなり、ミクロゲル粒子システムが細胞をせん断応力から保護しているようである。ＣＭ−ｄｉＩでラベルされたラットＡＤＳＣｓ（２．０×１０５細胞／ｍＬ）が注入されたＰＥＧ−ＦＧＮミクロゲル組成物が７日目と１４日目に注入部位に維持されていた。図１２は７日後と１４日後の生体内での幹細胞生存率を示している。血管新生に対するＤＡＰＩ核染色およびＳＭＡ染色は、生体内１４日後であっても、ミクロゲル内の細胞が結合し、広がり、生存し、血管形成が促進されていることを示していた。
【０１８７】
具体的な実施態様
第１の実施例は、水和すると擬塑性を示し、架橋ＰＥＧ化タンパク質、架橋ＰＥＧ化タンパク質系生体高分子を含有する水不溶性ミクロゲル粒子を含む組成物であって、
水和するとミクロゲル粒子のクラスターの粘性がせん断力の印加により減少し、せん断力がなくなるとミクロゲルクラスターを再構成し、
水和すると水和した前記ミクロゲル粒子が粘弾性固体の性質を持ち、貯蔵弾性率が損失弾性率よりも大きく、損失正接の値が１未満となることを特徴とする組成物に関する。
【０１８８】
第２の実施例は、ＰＥＧ化剤のタンパク質およびタンパク質系生体高分子に対するモル比が１：１から１００：１までにあることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０１８９】
第３の実施例は、前記ミクロゲル粒子が水和していることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０１９０】
第４の実施例は、前記組成物はせん断力の印加により粘性が減少し、また、せん断力がなくなるとミクロゲルクラスターを形成し、前記組成物には粘弾性固体の性質があり、貯蔵弾性率が損失弾性率より大きく、損失正接の値が１未満となることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０１９１】
第５の実施例は、前記タンパク質およびタンパク質系生体高分子が、細胞外基質、糖タンパク質、構造タンパク質、線維性タンパク質、酵素、プロテオグリカン、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、球状タンパク質、膜タンパク質、血漿タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、抗微生物ペプチド、ペプチド・ホルモン、シャペロン、金属タンパク質、ヘムタンパク質、凝固タンパク質、免疫系タンパク質、イオンチャンネルタンパク質、細胞接着タンパク質、神経ペプチド、核タンパク質、硬タンパク質、色素タンパク質、共役タンパク質、タンパク質−タンパク質複合体、タンパク質多糖類複合体、タンパク質・脂質複合体、モーター・タンパク質、ムコタンパク質、リンタンパク質、収縮性タンパク質、輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、増殖因子タンパク質、感知タンパク質、防御タンパク質、貯蔵タンパク質、受容タンパク質、抗体、組み換えタンパク質、フィブリノゲン、フィブリン、トロンビン、コラーゲン、エラスチン、アルブミン、ゼラチン、ケラチン、ラミニン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０１９２】
第６の実施例は、α−スクシンイミジルオキシグルタリル−ω−スクシンイミジルオキシグルタリルオキシポリオキシエチレン（ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ）、α−アミノプロピル−ω−アミノプロポキシポリオキシエチレン、α−アミノプロピル−ω−カルボキシペンチルオキシポリオキシエチレン、α，ω−ビス｛２−［（３−カルボキシ−１−オキソプロピル）アミノ］エチル｝ポリエチレングリコール、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロポキシポリオキシエチレン、ペンタエリトリトールテトラ（アミノプロピル）ポリオキシエチレン、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−（スクシンイミジルオキシカルボキシ）ポリオキシエチレン、ペンタエリトリトールテトラ（スクシンイミジルオキシグルタリル）ポリオキシエチレン、ペンタエリトリトールテトラ（メルカプトエチル）ポリオキシエチレン、ヘキサグリセリンオクタ（スクシンイミジルオキシグルタリル）ポリオキシエチレン、ヘキサグリセリンオクタ（４−ニトロフェノキシカルボニル）ポリオキシエチレン、４−アームポリ（エチレングリコール）テトラアクリラート、４−アームスクシンイミジルオキシグルタリル」ポリオキシエチレン、ビス（ポリオキシエチレンビス［イミダゾイルカルボニル］）、Ｏ−（３−カルボキシプロピル）−Ｏ′−［２−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール、Ｏ，Ｏ′−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジルスクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール、Ｏ，Ｏ′−ビス（２−アジドエチル）ポリエチレングリコール、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、ポリ（エチレングリコール）二（炭酸ｐ−ニトロフェニル）、ポリ（エチレングリコール）ジ（ビニルスルホン）、ポリ（エチレングリコール）ジ（プロプリオンアルデヒド）、ポリ（エチレングリコール）ジ（炭酸ベンゾトリアゾリル）、およびこれらの組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質ＰＥＧ化架橋剤をさらに含んでいることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０１９３】
第７の実施例は、前記組成物、水和した前記水不溶性ミクロゲル粒子、またはこれら両方の貯蔵弾性率の値が１０Ｐａから２５０，０００Ｐａまでの間にあり、損失弾性率の値が５Ｐａから１００，０００Ｐａまでの間にあることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０１９４】
第８の実施例は、抗菌剤、抗真菌薬、抗原虫薬、抗ウイルス薬、抗生物質、モノアシルグリセリン、モノアルキルグリコール、ビス（ビグアニド）およびその塩、ポリ（ヘキサメチレンビグアニド）およびその塩、グリセリンモノラウラート、クロルヘキシジン、クロルヘキシジンジグルコン酸塩、クロルヘキシジン二酢酸塩、アレキシジン、アレキシジン塩酸塩、銀塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、硫酸ゲンタマイシン、ヨード、ポビドンヨード、でんぷん・ヨード、硫酸ネオマイシン、ポリミキシンＢ、バシトラシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、ゲンタマイシン、ニトロフラゾン、酢酸マフェニド、スルファジアジン銀、テルビナフィン塩酸塩、硝酸ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、メトロニダゾール、抗微生物ペプチド、ポリクオタニウム−１、ポリクオタニウム−６、ポリクオタニウム−１０、カチオン性グアー、水溶性キトサン誘導体、これらの塩、またはこれらの組み合わせをさらに含有することを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０１９５】
第９の実施例は、水溶性ポリマーを０．０１重量％から２５重量％までの濃度で含有し、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキサイド）、ポリ（ビニルアルコール）およびその共重合体、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）およびその共重合体、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グァーガム、ヒドロキシエチルグァー、ヒドロキシプロピルグァー、ゼラチン、アルブミン、ヒドロキシプロピルメチルグァー、カルボキシメチルグァー、カルボキシメチルキトサン、ローカストビーンガム、カラギナン、キサンタンガム、ジェランガム、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、アロエベラゲル、スクレログルカン、シゾフィラン、アラビアゴム、タマリンドゴム、ポリ（メチルビニルエーテル）、エチレン酸化プロピレン酸化エチレンオキサイドブロック共重合、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、デキストラン、カルボマーおよびその塩、ポリ（アクリル酸）およびその塩、ポリ（メタクリル酸）およびその塩、ポリ（エチレン−ｃｏ−アクリル酸）、ポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリ（ビニルリン酸）塩、ポリ（ビニルスルホン酸）塩、ナトリウムポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホナート）、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルホルムアミド）、ポリ（２−ヒドロキシメタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸グリセリル）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）であってこの２つは臨界共溶温度未満で水和、ポリクオタニウム−１、ポリクオタニウム６、ポリクオタニウム−１０、イオネンポリマー、カチオン性グアー、ピリジニウム重合体、イミダゾリウム重合体、ジアリルジメチルアンモニウム重合体、ポリ（エルリジン）、アクリロイル／メタクリロイル／スチリルトリメチルアンモニウム重合体、アクリルアミド／メタクリルアミド−トリメチルアンモニウム重合体、および抗微生物ペプチド、からなる群より選択されることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０１９６】
第１０の実施例は、前記組成物が乾燥または水和した膜状であることを特徴とする実施例９に記載の組成物に関する。
【０１９７】
第１１の実施例は、細胞、幹細胞、細片化された羊膜組織、胎盤組織、刻まれた組織、微粉末化組織および微粉末脱細胞化組織、合成または天然由来の細胞外基質成分、ヒドロキシアパタイト、粒状架橋ウシ腱コラーゲンおよびグリコサミノグリカン、はちみつ、多糖類、生分解性ポリマー、およびこれらの組み合わせ、からなる群より選択され、
前記刻まれた組織には、刻まれた皮膚組織、筋組織、血管組織、神経組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、腱組織、膀胱組織、腸組織、心臓組織、肺組織、腎組織、肝組織、膵組織、および声帯組織が含まれ、
前記微粉末化組織および微粉末脱細胞化組織には、皮膚組織、筋組織、血管組織、神経組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、腱組織、膀胱組織、腸組織、心臓組織、肺組織、腎組織、肝組織、膵組織、声帯組織、が含まれ、
前記合成または天然由来の細胞外基質成分には、コラーゲン、グリコサミノグリカン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチンが含まれ、
生分解性ポリマーには、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリ（トリメチレンカルボナート）、ポリ（プロピレンフマラート）、ポリウレタン、ポリ（エステルアミド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリホスファゼン、細菌ポリエステル、が含まれる生物成分をさらに含有することを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０１９８】
第１２の実施例は、前記幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞、羊膜幹細胞、誘導多能性幹細胞、胎児幹細胞、組織幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄幹細胞、ヒト臍帯血幹細胞、 血液前駆細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、内皮前駆細胞、上皮幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、心臓幹細胞、膵臓幹細胞、神経幹細胞、角膜輪幹細胞、周産期幹細胞、衛星細胞、サイドポピュレーション細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、単能性幹細胞、およびこれらの混合物、からなる群から選択されることを特徴とする実施例１１に記載の組成物に関する。
【０１９９】
第１３の実施例は、前記細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、シュワン細胞、後根神経節、含脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、繊維状軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、肝細胞、腱細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞、間質細胞、好中球、リンパ球、骨髄細胞、周皮細胞、血小板、およびこれらの混合物、からなる群から選択されることを特徴とする実施例１１に記載の組成物に関する。
【０２００】
第１４の実施例は、塩形態または中性の形態にある、ナノ粒子、ミクロ粒子、消毒剤、抗感染症薬、抗微生物剤、殺胞子剤、駆虫剤、末梢神経障害治療薬、神経障害治療薬、走化性剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗高血圧薬、マイトマイシン型抗生物質、ポリエン系抗真菌薬、発汗抑制剤、充血除去剤、酔い止め薬、中枢神経系薬、創傷治療薬、抗ＶＥＧＦ薬、抗腫瘍薬、腐食剤、抗乾癬薬、抗糖尿病薬、抗関節炎薬、かゆみ止め、かゆみ止め薬、麻酔剤、抗マラリア剤、皮膚病薬、抗不整脈薬、抗けいれん薬、抗嘔吐薬、抗リウマチ薬、抗アンドロゲン剤、アントラサイクリン、禁煙剤、抗にきび薬、抗コリン剤、老化防止剤、抗ヒスタミン剤、駆虫剤、止血剤、血管収縮剤、血管拡張剤、血栓症薬、抗凝固薬、心・血管作動薬、抗狭心症薬、勃起不全薬、性ホルモン、成長ホルモン、イソフラボン、インテグリン結合シークエンス、生物活性リガンド、細胞付着メディエータ、免疫調節剤、腫瘍壊死因子アルファ、抗がん剤、抗腫瘍薬、抗鬱剤、鎮咳薬、抗−腫瘍薬、麻薬拮抗薬、抗高コレステロール薬、アポトーシス誘導剤、避妊薬、サンレス・タンニング剤、軟化剤、アルファヒドロキシ酸、マヌカ蜂蜜、局所レチノイド、ホルモン、腫瘍特異的抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗ＶＥＧＦＲＮＡアプタマー、核酸、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ＤＮＡプラスミド、Ｓｉ−ＲＮＡ、トランスフェクション剤、ビタミン、精油、リポソーム、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、薬物含有ナノ粒子、アルブミン系ナノ粒子、キトサン含有ナノ粒子、多糖系ナノ粒子、デンドリマーナノ粒子、リン脂質ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ビスマスナノ粒子、ガドリニウムナノ粒子、金属ナノ粒子、セラミックナノ粒子、石英系ナノ粒子、ウイルス由来ナノ粒子、ウイルス様ナノ粒子、抗生物質含有ナノ粒子、酸化窒素含有ナノ粒子、ナノシェル、ナノロッド、高分子ミセル、銀塩、亜鉛塩、量子ドットナノ粒子、高分子系微粒子、高分子系ミクロスフェア、薬物含有微粒子、薬物含有ミクロスフェア、抗生物質含有、抗生物質含有ミクロスフェア、抗菌性微粒子、抗菌性ミクロスフェア、サリチル酸、過酸化ベンゾイル、５−フルオロウウラシル、ニコチン酸、ニトログリセリン、クロニジン、エストラジオール、テストステロン、ニコチン、乗り物酔い止め薬、スコポラミン、フェンタニル、ジクロフェナク、ブプレノルフィン、ブピバカイン、ケトプロフェン、オピオイド、カンナビノイド、酵素、酵素阻害薬、オリゴペプチド、シクロペプチド、ポリペプチド、タンパク質、プロドラッグ、プロテアーゼ阻害薬、サイトカイン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、副交感神経遮断薬、キレート剤、育毛促進剤、脂質、糖脂質、糖タンパク質、内分泌性ホルモン、成長ホルモン、増殖因子、分化因子、熱ショックタンパク質、免疫反応修飾物質、単糖類、多糖類、インスリンおよびインスリン誘導体、ステロイド、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、およびこれらの組み合わせ、からなる群から選択される生物活性剤をさらに含有することを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０２０１】
第１５の実施例は、前記水不溶性ミクロゲル粒子が乾燥粉末状であることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０２０２】
第１６の実施例は、水、等張食塩水、平衡塩類溶液、緩衝溶液、リンゲル液、細胞培地、幹細胞培地、血清、血漿、羊水、ワルトンゼリー、栄養培地、消毒液、またはこれらの組み合わせから選択される水性媒体をさらに含有することを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０２０３】
第１７の実施例は、溶液、懸濁液、クリーム、ローション、ジェル、ペースト、乳液、香料、スプレー、フォーム、エアロゾール、またはその他の形状をさらに含むことを特徴とする実施例１６に記載の組成物に関する。
【０２０４】
第１８の実施例は、前記タンパク質が、フィブリノゲン、フィブリン、細胞外基質、血漿タンパク質、およびコラーゲンからなる群から選択され、前記ＰＥＧ化剤がα−スクシンイミジルオキシグルタリル−ω−スクシンイミジルオキシグルタリルオキシポリオキシエチレン（ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ）であることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０２０５】
第１９の実施例は、前記タンパク質はフィブリノゲンとフィブリンから選択され、前記ミクロゲル粒子が哺乳類の体内に血管形成を引き起こすことを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０２０６】
第２０の実施例は、前記タンパク質がフィブリノゲンとフィブリンから選択され、前記ＰＥＧ化剤がα−スクシンイミジルオキシグルタリル−ω−スクシンイミジルオキシグルタリルオキシポリオキシエチレン（ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ）であって、活性生物剤がポリ（ヘキサメチレンビグアニド）およびその塩であることを特徴とする実施例１に記載の組成物に関する。
【０２０７】
第２１の実施例は、タンパク質、タンパク質系生体高分子、またはこれら両方の組み合わせを含有する生物開始材料を提供するステップと、
前記生物開始材料をＰＥＧ化剤と反応させるステップと、
前記生物開始材料を前記ＰＥＧ化剤と架橋させて二官能性または多官能性のＰＥＧ化を形成することで前記生物開始材料をＰＥＧ化するステップと、
ＰＥＧ化された前記生物開始材料を水和または脱水した条件で粉砕またはせん断することにより複数のミクロゲル粒子を生成するステップと、
を備えた水不溶性ミクロゲル粒子を調製する方法であって、
前記ミクロゲル粒子は水溶液中で擬塑性を示し、
水和した前記ミクロゲル粒子の溶液はせん断力の印加により粘性が減少し、せん断力がなくなるとミクロゲルクラスターを形成し、
ＰＥＧ化剤の生物開始材料に対するモル比は１：１から１００：１にあり、水和した前記ミクロゲル粒子は粘弾性固体の性質があり、貯蔵弾性率が損失弾性率より大きく、損失正接の値が１未満となることを特徴とする水不溶性ミクロゲル粒子を調製する方法に関する。
【０２０８】
第２２の実施例は、実施例１に記載の組成物を提供するステップと、前記組成物を軟組織に注入するステップとを備え、前記注入は、経皮、皮下、経口、筋内、粘膜下、経鼻、膣内、口腔、髄腔内、硬膜外、脳実質内、眼部、網膜下、歯科的、腫瘍内、心腔内、関節内、静脈内、陰茎海綿体内、骨内、腹腔内、腹腔内、筋膜内、臓器内、および硝子体内であることを特徴とすることを特徴とする軟組織の損傷または外傷を治療する方法に関する。
【０２０９】
第２３の実施例は、実施例１に記載の水不溶性ミクロゲル粒子が乾燥粉末状であって、前記注入ステップの前にこの乾燥粉末を水和させるステップをさらに備えることを特徴とする実施例２２に記載の方法に関する。
【０２１０】
第２４の実施例は、注入後に前記組成物が血管形成を促進させることを特徴とする実施例２２に記載の方法に関する。
【０２１１】
第２５の実施例は、水和すると擬塑性を示す水不溶性ミクロゲル粒子と、前記水不溶性ミクロゲル粒子を哺乳類の体の内部または表面に留置するための指示とを含むキットであって、前記ミクロゲル粒子には架橋ＰＥＧ化タンパク質、架橋ＰＥＧ化タンパク質系生体高分子が含まれ、水和すると前記ミクロゲル粒子のベッドはせん断力の印加により粘性が減少し、せん断力がなくなるとミクロゲルクラスターを形成し、ＰＥＧ化剤のタンパク質系生体高分子に対するモル比が１：１から１００：１までにあり、水和すると、水和した前記ミクロゲル粒子が粘弾性固体の性質を持ち、貯蔵弾性率が損失弾性率よりも大きく、損失正接の値が１未満となることを特徴とするキットに関する。
【０２１２】
第２６の実施例は、前記水不溶性ミクロゲル粒子が乾燥粉末状であって、乾燥ミクロゲル粒子は１μｍから２５０μｍまでのサイズを有し、前記指示に前記水不溶性ミクロゲル粒子を乾燥粉末状に水和させることが含まれていることを特徴とする実施例２５に記載のキットに関する。
【０２１３】
第２７の実施例は、水和ミクロゲルが細胞と混合され、水和した細胞／ミクロゲル組成物が、使用の指示に従って、哺乳類の体の内部または表面に留置されることを特徴とする実施例２５に記載のキットに関する。
【０２１４】
第２８の実施例は、抗微生物剤をさらに含有し、前記指示には、前記水不溶性ミクロゲル粒子と前記抗微生物剤を含有する治療組成物を、使用の指示に従って、哺乳類の体の内部または表面に塗布することが含まれることを特徴とする実施例２５に記載のキットに関する。
【０２１５】
第２９の実施例は、前記ミクロゲルが哺乳類の体の内部または表面に留置されると血管形成を促進させることを特徴とする実施例２５に記載のキットに関する。
【０２１６】
上記の明細書は多くの詳細を含んでいるが、これらは本発明の範囲を限定するものではなく、その好ましい実施形態の例として解釈されるべきである。多くの他の変形が可能である。したがって、本発明の範囲は、記載されている実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲およびその法的均等物によって定められるべきである。