【手続補正書】
【提出日】平成31年3月28日(2019.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを製造する方法であって、
前記方法は、
（ｉ）天然アミノ酸の実質的にすべてのｔＲＮＡが、天然アミノ酸を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡから枯渇されるステップ；および
（ｉｉ）枯渇された一揃いのｔＲＮＡを、合成ｔＲＮＡと天然ｔＲＮＡとの混合物を用いて再構成するステップであって、天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡは、非天然部分に再割り当てされた該天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡにより置換され、少なくともアスパラギン、グルタミン酸およびイソロイシンのｔＲＮＡは、天然ｔＲＮＡである、ステップ
を含み、
前記一揃いのｔＲＮＡは、前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る、方法。
【請求項２】
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを含む組成物であって、
前記一揃いは、合成ｔＲＮＡと天然ｔＲＮＡとの混合物と、非天然部分に再割り当てされた天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡとを含み、少なくともアスパラギン、グルタミン酸およびイソロイシンのｔＲＮＡは、天然ｔＲＮＡであり、前記一揃いのｔＲＮＡは、前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る、組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系を製造する方法であって、
前記方法は、請求項１に記載の方法を用いて、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡを製造すること、および前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含む転写可能なＲＮＡを製造することを含み、ｍＲＮＡは、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る、方法。
【請求項４】
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系であって、
前記系は、合成ｔＲＮＡと天然ｔＲＮＡとの混合物と、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡとを含む一揃いのｔＲＮＡ、および非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含む翻訳可能なｍＲＮＡを含み、少なくともアスパラギン、グルタミン酸およびイソロイシンのｔＲＮＡは、天然ｔＲＮＡであり、前記ｍＲＮＡは、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る、翻訳系。
【請求項５】
少なくとも１つの非天然部分を含む組換えタンパク質を製造する方法であって、
前記方法は、
請求項１に記載の方法を用いて一揃いのｔＲＮＡを製造するステップ；および
非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む該一揃いのｔＲＮＡ中の、非天然部分に再割り当てされているｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを含むｍＲＮＡを翻訳するステップを含み、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る、方法。
【請求項６】
前記再割り当てされたアンチコドンが、通常、天然アミノ酸のものである、複数の異なるアンチコドンのうちの１種である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物、方法または系。
【請求項７】
アミノアシルｔＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物、方法または系。
【請求項８】
前記ｔＲＮＡが、ＲＮＡシンセターゼを使用して製造される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物、方法または系。
【請求項９】
前記ｔＲＮＡが、ＲＮＡシンセターゼを使用してアミノアシル化される、請求項８に記載の組成物、方法または系。
【請求項１０】
前記ＲＮＡシンセターゼが、ピロリジンｔＲＮＡシンターゼ媒介性アミノアシル化に適したＰｙｌＲＳまたはその変異体；メタノコッカス・ヤンナスキイ（Methanococcus jannaschii）チロシルトランスファーＲＮＡシンセターゼ（Ｍｊ  ＴｙｒＲＳ）またはその変異体；フレキシザイム；およびシステイニルｔＲＮＡシンセターゼから選択される、請求項９に記載の組成物、方法または系。
【請求項１１】
前記再割り当てされたアンチコドンを含む前記ｔＲＮＡが、突然変異体システインｔＲＮＡである、請求項１０に記載の組成物、方法または系。
【請求項１２】
前記アミノアシルｔＲＮＡが、システイニルｔＲＮＡシンターゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される、請求項１１に記載の組成物、方法または系。
【請求項１３】
前記突然変異体システインｔＲＮＡが、内因性システイニルｔＲＮＡシンセターゼによって再担持され得ない、請求項１２に記載の組成物、方法または系。
【請求項１４】
前記再割り当てされたアンチコドンが、４倍または６倍に縮重しているアンチコドンである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法、組成物または系。
【請求項１５】
前記再割り当てされたアンチコドンが、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＳｅｒのアンチコドンである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法、組成物または系。
【請求項１６】
前記一揃いのｔＲＮＡが、それぞれの非天然部分に再割り当てされた、それぞれの天然アミノ酸を通常コードする、２種以上の異なるアンチコドンを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法、組成物または系。
【請求項１７】
前記一揃いのｔＲＮＡが、天然アミノ酸のものではないアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含み、前記アンチコドンが、非天然部分に再割り当てされている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法、組成物または系。
【請求項１８】
前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンが、アンバーサプレッサーアンチコドンである、請求項１７に記載の方法、組成物または系。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９７】
本明細書において参照される、各特許および科学文献の開示内容、コンピュータプログラムならびにアルゴリズムは、参照によりその全体が組み込まれる。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを製造する方法であって、
前記方法は、天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを、非天然部分に再割り当てされた同一アンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡと置換するステップを含み、前記一揃いのｔＲＮＡは、前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る、方法。
［２］
（ｉ）天然アミノ酸を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡから、１種または複数のｔＲＮＡを枯渇させるステップと、（ｉｉ）枯渇された一揃いのｔＲＮＡを、非天然部分にそれぞれ再割り当てされ、前記非天然部分とそれぞれカップリングされる１種または複数のｔＲＮＡを用いて再構成するステップとのうち１つまたは複数を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］
ステップ（ｉ）において、天然アミノ酸の実質的にすべてのｔＲＮＡが、前記一揃いのｔＲＮＡから枯渇される、上記［２］に記載の方法。
［４］
ステップ（ｉ）において、天然アミノ酸の１種または複数のｔＲＮＡが、前記一揃いのｔＲＮＡから選択的に枯渇される、上記［２］に記載の方法。
［５］
ステップ（ｉｉ）で、再構成ｔＲＮＡが、合成ｔＲＮＡ、天然ｔＲＮＡまたはそれらの混合物を含む、上記［２］、上記［３］または上記［４］に記載の方法。
［６］
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを含む組成物であって、
前記一揃いは、非天然部分に再割り当てされた天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含み、前記一揃いのｔＲＮＡは、前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る、組成物。
［７］
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系を製造する方法であって、
前記方法は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡを製造すること、および前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含む転写可能なＲＮＡを製造することを含み、ｍＲＮＡは、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る、方法。
［８］
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系であって、
前記系は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡ、および非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含む翻訳可能なｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡは、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る、翻訳系。
［９］
少なくとも１つの非天然部分を含む組換えタンパク質を製造する方法であって、
前記方法は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡ中の、非天然部分に再割り当てされているｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを含むｍＲＮＡを翻訳するステップを含み、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る、方法。
［１０］
前記再割り当てされたアンチコドンが、通常、天然アミノ酸のものである、複数の異なるアンチコドンのうちの１種である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物、方法または系。
［１１］
アミノアシルｔＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される、上記項目のいずれかに記載の組成物、方法または系。
［１２］
前記ｔＲＮＡが、ＲＮＡシンセターゼを使用して製造される、上記［１１］に記載の組成物、方法または系。
［１３］
前記ｔＲＮＡが、ＲＮＡシンセターゼを使用してアミノアシル化される、上記［１２］に記載の組成物、方法または系。
［１４］
前記ＲＮＡシンセターゼが、ピロリジンｔＲＮＡシンターゼ媒介性アミノアシル化に適したＰｙｌＲＳまたはその変異体；メタノコッカス・ヤンナスキイ（Methanococcus jannaschii）チロシルトランスファーＲＮＡシンセターゼ（Ｍｊ  ＴｙｒＲＳ）またはその変異体；フレキシザイム；およびシステイニルｔＲＮＡシンセターゼから選択される、上記［１３］に記載の組成物、方法または系。
［１５］
前記再割り当てされたアンチコドンを含む前記ｔＲＮＡが、突然変異体システインｔＲＮＡである、上記［１４］に記載の組成物、方法または系。
［１６］
前記アミノアシルｔＲＮＡが、システイニルｔＲＮＡシンターゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される、上記［１５］に記載の組成物、方法または系。
［１７］
前記突然変異体システインｔＲＮＡが、内因性システイニルｔＲＮＡシンセターゼによって再担持され得ない、上記［１６］に記載の組成物、方法または系。
［１８］
前記再割り当てされたアンチコドンが、４倍または６倍に縮重しているアンチコドンである、上記項目のいずれかに記載の方法、組成物または系。
［１９］
前記再割り当てされたアンチコドンが、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＳｅｒのアンチコドンである、上記項目のいずれかに記載の方法、組成物または系。
［２０］
前記一揃いのｔＲＮＡが、それぞれの非天然部分に再割り当てされた、それぞれの天然アミノ酸を通常コードする、２種以上の異なるアンチコドンを含む、上記項目のいずれかに記載の方法、組成物または系。
［２１］
前記一揃いのｔＲＮＡが、天然アミノ酸のものではないアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含み、前記アンチコドンが、非天然部分に再割り当てされている、上記項目のいずれかに記載の方法、組成物または系。
［２２］
前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンが、アンバーサプレッサーアンチコドンである、上記［２１］に記載の方法、組成物または系。
［２３］
上記［９］から［２２］のいずれか一項に記載の方法によって製造される組換えタンパク質。
［２４］
ペグ化、小分子のコンジュゲーション、標識、固定化、分子間および／もしくは分子内架橋もしくはその他の相互作用、高次構造の形成ならびに／または１種もしくは複数の触媒活性を促進する１種または複数の同一または異なる非天然部分を含む、上記［２３］に記載の組換えタンパク質。
［２５］
分子内共有結合可能である、前記同一または異なる非天然部分の２種以上を含む、上記［２３］に記載の組換えタンパク質。
［２６］
大環状タンパク質である上記［２３］、上記［２４］または上記［２５］に記載の組換えタンパク質。
［２７］
上記［２３］から［２６］のいずれか一項に記載の複数の組換えタンパク質を含む、タンパク質ライブラリー。
［２８］
上記［２３］から［２６］のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする、または上記［２７］に記載のタンパク質ライブラリー中の前記複数の組換えタンパク質のうちの少なくとも１種をコードするｍＲＮＡ。