【手続補正書】
【提出日】平成20年2月27日(2008.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  固相支持体上に固定されたタンパク質のアレイであって、各タンパク質が少なくとも1つの無作為化ループ、少なくとも1つの無作為化βシート、またはそれらの組み合わせを有するフィブロネクチン3型ドメインを含み、対応する天然に存在するフィブロネクチンが結合しない化合物に結合する能力を特徴とするアレイ。
【請求項２】  フィブロネクチン3型ドメインが哺乳類のフィブロネクチン3型ドメインである、請求項1記載のアレイ。
【請求項３】  フィブロネクチン3型ドメインがヒトのフィブロネクチン3型ドメインである、請求項2記載のアレイ。
【請求項４】  各タンパク質がフィブロネクチン3型ドメインの10番目のモジュール（10Fn3）を含む、請求項1記載のアレイ。
【請求項５】  各タンパク質が1つ、2つ、または3つの無作為化ループを含み、該ループのうち少なくとも1つが該タンパク質の化合物への結合に寄与する、請求項4記載のアレイ。
【請求項６】  無作為化ループのうち少なくとも2つが、タンパク質の化合物への結合に寄与する、請求項5記載のアレイ。
【請求項７】  無作為化ループのうち少なくとも3つが、タンパク質の化合物への結合に寄与する、請求項6記載のアレイ。
【請求項８】  10Fn3がインテグリン結合モチーフを欠く、請求項4記載のアレイ。
【請求項９】  各タンパク質がジスルフィド結合を欠く、請求項1記載のアレイ。
【請求項１０】  各タンパク質が単量体または二量体である、請求項1記載のアレイ。
【請求項１１】  各タンパク質が核酸に共有結合している、請求項1記載のアレイ。
【請求項１２】  核酸が共有結合したタンパク質をコードしている、請求項11記載のアレイ。
【請求項１３】  核酸がRNAである、請求項12記載のアレイ。
【請求項１４】  固相支持体がチップである、請求項1記載のアレイ。
【請求項１５】  以下の段階を含む、化合物に結合するタンパク質を得る方法：
(a) 各候補タンパク質が少なくとも1つの無作為化ループ、1つの無作為化βシート、またはそれらの組み合わせを有するフィブロネクチン3型ドメインを含む、固相支持体上に固定された候補タンパク質のアレイを化合物に接触させる段階であって、該接触が化合物-タンパク質複合体を形成させる条件下で行われる段階；および
(b) 該複合体から、該化合物に結合するタンパク質を得る段階。
【請求項１６】  以下の段階を含む、少なくとも1つの無作為化ループ、少なくとも1つの無作為化βシート、またはそれらの組み合わせを有するフィブロネクチン3型ドメインを含む、タンパク質に結合する化合物を得る方法：
(a) 各タンパク質が少なくとも1つの無作為化ループ、1つの無作為化βシート、またはそれらの組み合わせを有するフィブロネクチン3型ドメインを含む、固相支持体上に固定されたタンパク質のアレイを、候補化合物に接触させる段階であって、該接触が化合物-タンパク質複合体の形成を可能にする条件下で行われる段階；および
(b) 該複合体から、アレイのタンパク質に結合する化合物を得る段階。
【請求項１７】  さらに以下の段階を含む、請求項15記載の方法：
(c) 段階(b)の化合物に結合するタンパク質をさらに無作為化する段階；
(d) 段階(c)のさらに無作為化されたタンパク質で固相支持体上にアレイを形成する段階；および
(e) 段階(a)において、候補タンパク質のアレイとしてさらに無作為化されたタンパク質のアレイを使用して、段階(a)および(b)を繰り返す段階。
【請求項１８】  さらに以下の段階を含む、請求項16記載の方法：
(c) 段階(b)のタンパク質に結合する化合物を改変する段階；および
(d) 段階(a)において、候補化合物としてさらに改変された化合物を使用して、段階(a)および(b)を繰り返す段階。
【請求項１９】  固相支持体がチップである、請求項15または16記載の方法。
【請求項２０】  以下の段階を含む、試料中の化合物を検出する方法：
(a) 化合物に結合するタンパク質であって、少なくとも3つの無作為化ループを有するフィブロネクチン3型ドメインを含むタンパク質と、試料を接触させる段階であって、該接触が化合物-タンパク質複合体の形成を可能にする条件下で行われる段階；および
(b) 該複合体を検出し、それによって該試料中の該化合物を検出する段階。
【請求項２１】  試料が生物試料である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】  タンパク質が固相支持体上に固定されている、請求項20記載の方法。
【請求項２３】  タンパク質がアレイの一部として固相支持体上に固定されている、請求項22記載の方法。
【請求項２４】  固相支持体がビーズまたはチップである、請求項22記載の方法。
【請求項２５】  化合物がタンパク質である、請求項15、16、または20記載の方法。
【請求項２６】  フィブロネクチン3型ドメインが哺乳類のフィブロネクチン3型ドメインである、請求項15、16、または20記載の方法。
【請求項２７】  フィブロネクチン3型ドメインがヒトのフィブロネクチン3型ドメインである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】  各タンパク質がフィブロネクチン3型ドメインの10番目のモジュール（10Fn3）を含む、請求項15、16、または20記載の方法。
【請求項２９】  3つのループの無作為化が、該タンパク質の化合物への結合をもたらす、請求項28記載の方法。
【請求項３０】  10Fn3がインテグリン結合モチーフを欠く、請求項28記載の方法。
【請求項３１】  各タンパク質が核酸に共有結合している、請求項15、16、または20記載の方法。
【請求項３２】  核酸が共有結合したタンパク質をコードしている、請求項31記載の方法。
【請求項３３】  核酸がRNAである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】  複合体または化合物が、Ｘ線撮影、蛍光検出、質量分光（mass spectroscopy）、または表面プラズモン共鳴によって検出される、請求項15、16、または20記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
各断片は2つの重複するオリゴヌクレオチドから構成され、最初にアニーリングさせた後、断片の2本鎖DNAの形状を形成するように伸長させた。3つの断片を構築および加工するのに使用されるオリゴヌクレオチドを以下の表に示す：「先端（top）」および「末尾（bottom）」の種は、10Fn3コード配列全体を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドの呼称において、「N」は、A、T、C、またはGを示し、「S」は、CおよびGを示す。
2003525487.tif 000001
2003525487.tif 000002
T7TMV（インビトロ翻訳に必要なT7プロモーターおよびTMV非翻訳領域を誘導する）：
2003525487.tif 000003
Unispl-s（Robertsら、1997、上記の、ピューロマイシン含有リンカーにmRNAを連結するために用いられるスプリントオリゴヌクレオチド）：
2003525487.tif 000004
A18---2PEG（DNAピューロマイシンリンカー）：
2003525487.tif 000005
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
次に、ショスタック（Szostak）ら、米国特許出願第09/007,005号および同第09/247,190号；ショスタック（Szostak）ら、国際公開公報第98/31700号；ならびにロバーツ（Roberts）およびショスタック（Szostak）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1997年、第94巻、第12297〜12302頁によって開発された技術を用いて、各2本鎖DNA断片をRNA-タンパク質融合体に形質転換した。簡単に言えば、アンビオンインビトロ転写キット（Ambion in vitro transcription kit）、MEGAshortscript（Ambion、Austin、TX）を用いて断片を転写し、得られたmRNA-DNA-ピューロマイシン-PROfusionタンパク質をオリゴdTセルロースを用いて精製し、逆転写酵素および上述したRTプライマー（Unisplint-SもしくはflagASA）を用いて、製造者の指示に従ってDNAの相補鎖を合成した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
次に、各断片について得られたRNA-タンパク質融合体を、そのペプチド精製タグに適した樹脂、すなわちHis6タグにはNi-NTAアガロースおよびFLAGタグにはM2アガロースを用いて、製造者に推奨された方法に従って精製した。タグと結合したRNA-タンパク質融合体のcDNA構成要素を、ファルマシアレディートゥゴーPCRビーズ（Pharmacia Ready-to-Go PCR Beads）、10pmolの5'および3' PCRプライマーを用いて、以下のPCRプログラム（Pharmacia、Piscataway、NJ）に従ってPCRにより増幅した：1段階目は95℃で3分間、2段階目は95℃で30秒間、58/62℃で30秒間、72℃で1分間を必要に応じて20/25/30サイクル、3段階目は72℃で5分間、4段階目は最後まで4℃。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
得られた増幅DNAを、1μgのDNAにつき5UのEar I（ニュー・イングランド・バイオラボ（New England Biolabs））で切断した。反応は、T4 DNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）中で37℃にて1時間行い、続いてEar Iを失活させるために70℃にて15分間インキュベートした。無作為化されたループを持つ10Fn3遺伝子の全長を形成させるために、等量のBC断片、DE断片、およびFG DNA断片を混合して連結した。連結には10Uの新鮮なEar I（New England Biolabs）および20UのT4 DNAリガーゼが必要であり、37℃にて1時間かかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
構築された3つのライブラリーは、選択工程を単純化するために混合され、1つのマスターライブラリーとし、標的との結合それ自体によって、特定の誘発に最も適したライブラリーを選択することにした。ショスタック（Szostak）ら、米国特許出願第09/007,005号および同第09/247,190号；ショスタック（Szostak）ら、国際公開公報第98/31700号；ならびにロバーツ（Roberts）およびショスタック（Szostak）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1997年、第94巻、第12297〜12302頁に述べられた一般的な方法に従って、マスターライブラリーからRNA-タンパク質融合体を得た（図8）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
融合体の選択
RNA-タンパク質融合体の形態のマスターライブラリーが、TNF-αとの結合を選択するために供された。2つの方法が行われ、1つでは標的をアガロースカラムに固定化し、1つでは標的をBIACOREチップに固定化した。最初に、アガロースカラムへのバックグラウンドの結合物を最小限にするために条件の大幅な最適化を行い、50mM HEPES pH 7.4、0.02％ Triton、100μg/ml変性されたサケ精子DNAという好ましい緩衝液の条件を得た。この緩衝液中では、10Fn3 RNA融合体のTNF-αセファロースへの非特異的結合は0.3％であった。10Fn3 RNA-DNAのTNF-αセファロースへの非特異的結合バックグラウンドは0.1％であることが見出された。TNF-αセファロース上での各々の選択ラウンドにおいて、残存している非特異的な結合物のいかなるものも除去するために、最初にPROfusion（商標）ライブラリーを非誘導体化されたセファロースと共に1時間プレインキュベートし、この前除去により得られた流出液をTNF-αセファロースと共にさらに1時間インキュベートした。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
TNF-αセファロース上での各々の選択ラウンドにおいて、残存している非特異的な結合物のいかなるものも除去するために、最初にRNA-タンパク質融合体ライブラリーを非誘導体化されたセファロースと共に1時間プレインキュベートし、この前除去により得られた流出液をTNF-αセファロースと共にさらに1時間インキュベートした。TNF-αセファロースを3〜30分間洗浄した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
各選択後に、0.3M NaOHまたは0.1M KOHを用いてRNA-タンパク質融合体に由来するcDNAを固相支持体から溶出させ、PCRにより増幅させた。所望の大きさのDNAのバンドは、選択ラウンドを複数回行っても残留していた（図9）。2つの他の選択法でも同様な結果が観察されたが、アガロースカラム選択で得られたデータのみを図9に示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
最初の7ラウンドにおいては、RNA-タンパク質融合体ライブラリーの標的への結合は低いままであり；対照的に、選択の異なる段階においてDNAプールから遊離タンパク質が翻訳された場合には、カラムに結合した種の割合はラウンド間で有意に増加した（図10）。他の任意の標的結合種（例えばIL-1およびIL-13）についても、同様の選択を行うことができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
ショスタック（Szostak）ら（RobertsおよびSzostak、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297, 1997; Szostakら、米国特許出願第09/007,005号、および米国特許出願第09/247,190号；Szostakら、国際公開公報第98/31700号）に記述されるように、クレノー酵素で伸長後、各DNAを転写し、転写物をピューロマイシン含有DNAリンカーと連結し、インビトロで翻訳し、mRNA-ペプチド融合体を作製し、これをDNA-mRNA-ペプチド融合体に逆転写した。FLAGタグの付いたペプチドをM2アガロースに結合することにより、フレームシフトまたは余分の終止コドンを含むものから、全長の融合分子が分離された；精製した全長の融合体に結合したDNAをPCRにより増幅した後、3つのDNA断片をEar I 制限エンドヌクレアーゼにより切断し、連結して全長の鋳型を形成させた。鋳型を転写し、転写物をピューロマイシン含有DNAリンカーに連結し、翻訳して10Fn3-RNA-タンパク融合体ライブラリーを作製した。その後、これを逆転写してDNA-mRNA-ペプチド融合ライブラリーを作製し、後に選択に使用した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
TNF-α結合物の選択は、50 mM HEPES、pH 7.4、0.02％ Triton-X、0.1 mg/mLサケ精子DNA中で行われた。RNA-タンパク融合体ライブラリーは、セファロース固定TNF-αとインキュベートした；洗浄後、最も強い結合物に伴うDNAを0.1 M KOHで溶出し、PCR増幅、転写、転写物を連結、翻訳、逆転写し、次の選択ラウンドの開始材料とした。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
そのような選択を10ラウンド行なった（図13に示す）；見かけの平均Kdが120 nMでTNF-αセファロースに結合するRNA-タンパク融合体プールが得られた。解析されたプールの特定のクローン成分は、50 nM〜500 nMの範囲でTNF-α結合を示した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ラクダ（濃青）およびラマ（淡青）より得られた抗体の重鎖における可変領域の構造間の比較を2つの配向からそれぞれ示す写真である。
【図２】  ラクダ抗体の重鎖の可変領域（濃青）、ラマ抗体の重鎖における可変領域（淡青）、および10番目のフィブロネクチン3型モジュール（10Fn3）（黄色）の構造間の比較を示す写真である。
【図３】  10番目のフィブロネクチン3型モジュール（10Fn3）を示す写真であり、IgG重鎖における抗原結合ループに対応するループを赤色で強調した。
【図４】  フィブロネクチン3型タンパク質ドメインおよび関連タンパク質ドメイン間の配列の整列化を図示するグラフである。
【図５】  10Fn3ドメイン、ならびにフィブロネクチン、テネイシン、コラーゲン、およびアンジュリンを含む15個の関連タンパク質間の構造の類似性を示す写真である。この写真では、領域は以下のように分類されている：定常領域は濃青、保存領域は淡青、中性領域は白、可変領域は赤、およびRGDインテグリン結合領域（可変）は黄。
【図６】  9番目および10番目のフィブロネクチン3型モジュールの空間充填モデルを2つの異なる配向からそれぞれ示す写真である。2つのモジュールおよびインテグリン結合ループ（RGD）が分類されている。この図では、青が正電荷を帯びた残基を示し、赤が負電荷を帯びた残基を示し、白が無電荷の残基を示している。
【図７】  7〜10番目のフィブロネクチン3型モジュールの空間充填モデルを3つの異なる配向からそれぞれ示す写真である。4つのモジュールが分類されている。この図では、青が正電荷を帯びた残基を示し、赤が負電荷を帯びた残基を示し、白が無電荷の残基を示している。
【図８】  フィブロネクチン3型ドメインを含むRNA-タンパク質融合体の異なる塩条件下における構造を図示する写真である。
【図９】  PCRシグナル解析によって測定されたフィブロネクチン3型ドメインを含むRNA-タンパク質融合体の選択を図示する一連の写真である。
【図１０】  RNA-タンパク質融合体および遊離タンパク質の選択間における比較、ならびに本明細書に記載の選択間において、TNF-αとの結合％での増加を図示するグラフである。
【図１１】  IgG、10Fn3、Fn-CH1-CH2-CH3、およびFn-CH2-CH3を示す一連の概略図である（左上から時計回りに）。
【図１２】  IgG（X線結晶学）および10Fn3（NMRおよびX線結晶学）の既知の三次元構造に基づいたFn-CH1-CH2-CH3の分子モデルを示す写真である。
【図１３】  TNF-α結合物の10Fn3に基づく核酸-タンパク質融合体の例示的な選択の時間経過を示すグラフである。TNF-α-セファロースに結合した、核酸-タンパク質融合体のプール（白抜きのひし形）および遊離のタンパク質のプール（白抜きの丸）の割合、ならびに未誘導化セファロースに結合した遊離タンパク質のプール（黒丸）の割合が示されている。
【図１４および１５】  TNF-αFn結合物によるTNF-α結合を示すグラフである。特に、これらの図はそれぞれ10Fn3融合体チップおよび非融合体チップから得られた質量スペクトルデータを示す。
【図１６および１７】  それぞれ10Fn3アレイのリン光画像および蛍光スキャンであり、TNF-α結合を示す。