【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年5月8日(2008.5.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
本発明は一般的には、ミオイノシトール、グルクロン酸、グルカル酸、およびアスコルビン酸のような有機化合物を産生するための方法と材料に関する。具体的には本発明は、種々の有機化合物を産生するための、細胞（例えば細菌、真菌、および昆虫細胞）、細胞の培養方法、単離された核酸分子、および方法と材料を提供する。本発明は、細胞が所望の有機産物を産生する能力を有するように、細胞を遺伝子操作することができるという発見に基づく。例えば本明細書に記載の細胞は、アスコルビン酸を産生することができる。「アスコルビン酸塩」、「アスコルビン酸」、「L-アスコルビン酸塩」、「L-アスコルビン酸」および「ビタミンＣ」という用語は、L-アスコルビン酸を意味するのに同義で使用することができることを理解されたい。また本明細書に記載の「グルカル酸」という用語は、グルカル酸、グルカロ-1,4-ラクトン、およびグルカロ-6,3-ラクトンを意味する（これらの３つの化合物は、溶液中で自由に相互変換できるためである）ことも理解されたい。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
別の実施形態において本発明は、グルカル酸の産生方法ならびにグルカル酸を産生することができる細胞を特徴とする。これらの方法は、ミオイノシトールをグルクロン酸に変換し、グルクロン酸をグルカル酸に変換する。基質（例えばミオイノシトールとグルクロン酸）は、ポリペプチドまたは化学変換を使用して、その対応する生成物に変換することができる。本明細書において「化学変換」は、酵素活性を有するポリペプチドの助け無しで、基質を生成物に変換することができることを意味する。さらにこれらの方法は、in vivo、in vitro、またはin vitroとin vivo工程の組合せを使用して行われる。ポリペプチドを使用してグルクロン酸をグルカル酸に変換する時、ポリペプチドは、アルデヒド脱水素酵素活性、ヘキソースオキシダーゼ活性、またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有することができる。ポリペプチドを使用してミオイノシトールをグルクロン酸に変換する時、ポリペプチドはミオイノシトールオキシゲナーゼ活性を有することができる。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
グルカル酸（２つのカルボン酸官能基を含有する）は、食物および動物の餌の業界で酸味物質として有用である。グルカル酸はまた、キレート剤として有用であることが証明されており、生分解性界面活性剤およびセメントの添加剤として使用することができる。グルカル酸はまた、酵素ベータグルクロニダーゼの強力インヒビターであるため、抗癌剤として有用であることが証明されており、哺乳動物において血清コレステロールを低下させることが証明されている。高レベルのグルカル酸を有する天然の供給源には、果実（例えばリンゴおよびグレープフルーツ）や植物（例えば芽キャベツおよびブロッコリ）がある。その金属キレート化性のために、これは、心筋梗塞の検出や腫瘍の放射イメージングのために、99Tcmのキレート剤として使用することができる。これはまた、ポリヒドロキシル化ポリマーの産生のための原料であり、従って繊維、フィルム、および接着剤の生産に使用することができる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
５．グルカル酸
本発明は、グルカル酸を産生するのに使用することができる経路を提供する（図18）。例えばグルコースまたはフィチン酸は、本明細書に記載のようにグルクロン酸に変換することができる。得られるグルクロン酸は、非特異的ヘキソースオキシダーゼ活性（EC1.1.3.5）を有するポリペプチドにより、アルデヒド脱水素酵素［NAD(P)］活性（EC1.2.1.5、EC1.2.1.3（NAD）、またはEC1.2.1.4（NADP））を有するポリペプチドにより、またはアルデヒドオキシダーゼ活性（EC1.2.3.1）を有するポリペプチドにより、グルカル酸に変換することができる。例えば非特異的ヘキソースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを使用して、グルクロン酸をグルカル酸に変換することができる。非特異的ヘキソースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドならびにそのようなポリペプチドをコードする核酸は、特に限定されないが、コンドルス・クリスプス（Chondrus crispus）、ペスト菌（Yersinia pestis）、偽結核エルシニア菌（Yersinia pseudotuberculosis）、ラルストニア・ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）を含むいろいろな種から得られる。例えば非特異的ヘキソースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、コンドルス・クリスプス（Chondrus crispus）から得られ、ジーンバンク（GenBank）（登録商標）受け入れ番号AAB49376.1に記載の配列をコードすることができ、またはペスト菌（Yersinia pestis）から得ることができ、ジーンバンク（GenBank）（登録商標）受け入れ番号NP_403959.1に記載のアミノ酸配列をコードすることができ、またはラルストニア・ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）から得られ、ジーンバンク（GenBank）（登録商標）受け入れ番号NP_518171.1に記載のアミノ酸配列をコードすることができる。また、ヘキソースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドならびにそのようなポリペプチドをコードする核酸は、別に記載のように（US Patent No. 6,251,626、およびSullivanとIkawa、Biochim. et Biophys. Acta, 309:11-22 (1973)）得ることができる。さらに、グルクロン酸は、任意の化学的方法（例えば分子酸素と触媒を使用する酸化）を使用して、グルカル酸に変換することができる。例えばUS Patent No. 5,817,870またはGallezotら（Chem. Ind. (Dekker), 62:331-40 (1995)）に記載の方法と類似の方法を使用して、グルクロン酸をグルカル酸に変換することができる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
さらに、アルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドを使用して、グルクロン酸をグルカル酸に変換することができる。アルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドならびにそのようなポリペプチドをコードする核酸は、特に限定されないが、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（gi:1169292）および枯草菌（Bacillus subtilis）（gi:16077316またはNP_388129.1）を含むいろいろな種から得られる。同様に、アルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを使用して、グルクロン酸をグルカル酸に変換することができる。アルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドならびにそのようなポリペプチドをコードする核酸は、特に限定されないが、イネ（Oryza sativa）（gi:1844950またはAAL700116.1）、トウモロコシ（Zea mays）（BAA23226.1）、およびトマト（Lycopersicon esculentum）（AAG22607.1またはAF258810）を含むいろいろな種から得られる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６６】
７．遺伝子修飾細胞
本発明は、遺伝子修飾細胞（例えば外因性核酸分子を含有する細胞）を提供する。そのような細胞を使用して、アスコルビン酸、グルクロン酸、およびグルカル酸のような有機化合物を産生することができる。細胞は真核生物でも原核生物でもよい。例えば本発明の遺伝子修飾細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、ネズミ、およびウシ細胞）、植物細胞（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、およびダイズ細胞）、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、または細菌細胞（例えば大腸菌（E. coli）細胞）でもよい。本発明の細胞は、微生物でもよい。本明細書において用語「微生物」は、すべての微生物を意味し、特に限定されないが、細菌、藻類、真菌、および原生動物を含む。従って、大腸菌（E. coli）、エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、シーアール・テレウス（Cr. terreus）、シュ・オクシデンタリス（Sch. occidentalis）、およびシゾ・ポンベ（Sz. pombe）は、微生物と考えられる。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８８】
８．有機化合物産生と培養法
本発明は、有機化合物の産生方法を提供する。例えば本明細書に記載の方法と材料を使用して、D-グルコース、D-グルコース-1-ホスフェート、D-グルコース-6-ホスフェート、UDP-D-グルコース、D-ミオイノシトール、D-ミオイノシトール-1-ホスフェート、D-グルクロネート、D-グルクロネート-1-ホスフェート、UDP-D-グルクロネート、D-グルクロノ-3,6-ラクトン、L-グロネート、L-グロノ-γ-ラクトン、グルカル酸、およびL-アスコルビン酸を産生することができる。産生される化合物の他の例には、特に限定されないが、L-デヒドロアスコルビン酸、L-スレオニン、および3-デヒドロ-L-スレオニンがある。産生される化合物はＤ型でもＬ型でもよいことに注意されたい。さらに、所望の有機化合物が光学的に純粋（例えば純度が約75、80、85、90、95、99、または99.9％）であるように、特定の酵素活性を有するポリペプチドを使用することができる。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８９】
本明細書に記載の細胞を使用して、特定の有機化合物（例えば、ミオイノシトール、アスコルビン酸、またはグルカル酸）を産生することができる。例えば図１に記載のように、グルコースからアスコルビン酸を産生するのに必要なすべてのポリペプチドを含有する微生物を使用して、アスコルビン酸を産生することができる。あるいは異なる微生物を使用して、特定の有機化合物を産生することができる。それぞれが、グルコースからアスコルビン酸を産生するのに必要な異なるセットのポリペプチドを含有する３つの異なる混合物を使用して、アスコルビン酸を産生することができる。すなわち１つ以上の群の細胞を使用して、特定の有機化合物を産生することができる。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２２２】
実施例12−in vivoのミオイノシトールオキシゲナーゼ活性を上昇させる
グルクロン酸の産生を増加させるために、哺乳動物臓器（例えばヒト腎臓）中のmioの発現の上昇が設計される。mio発現により産生されるグルクロン酸レベルの上昇は、アルデヒド脱水素酵素の使用によりグルカル酸の産生上昇を引き起こすように設計される。グルカル酸レベルの上昇は、ベータ−グルクロニダーゼの活性を阻害し、こうして体内の毒性代謝物を解毒するように設計される。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２２６】
Adeno-X-mioを低継代HEK293細胞（クロンテク（Clontech））に移し、４〜７日でアデノウイルスDNAを採取する。200μlのAdeno-X-mio（＞1010pfu/ml）を、３月齢のFisherラット（実験群）の肝臓に注入し、200μlのAdeno-X（＞1010pfu/ml）を、３月齢のFisherラット（対照群）の肝臓に注入する。３日後、実験群と対照群のラットを屠殺し、腎臓組織をmio活性ならびにグルクロン酸とグルカル酸レベルについて測定する。mio活性、グルクロン酸、およびグルカル酸レベルを、実験群と対照群で比較する。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２２８】
枯草菌（B. subtilis）からのycbD（受け入れ番号16077068；領域gi｜16077068:268838-270304）とycbE（受け入れ番号16077068；領域gi｜16077068:270388-271755）配列を、pET30a（ノバゲン（Novagen））とpPRONdeベクター中にクローン化した。pPRONdeベクターは、pPROLAR.A122ベクター（クロンテクラボラトリーズ（Clontech Laboratories））の誘導体であり、ここで、部位特異的突然変異誘発によりbp132にNdeI部位が導入されている。ycbD遺伝子は、アルデヒド脱水素酵素をコードすることが確認されており、一方ycbE遺伝子は、グルカル酸トランスポーターをコードすることが確認されている。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３７】
実施例14−生物学的サンプル中のグルカル酸を検出する
生物学的サンプル（発酵ブロスと細胞抽出物の両方）中のグルカル酸の生成をHPLCにより追跡する。２つのラクトン（グルカレート-1,4-ラクトンとグルカレート-3,6-ラクトン）は、中性pHでグルカル酸と平衡にあり、その生成は別に記載のように追跡される（HortonとWalaszek、Carbohydrate Research 105:95-109 (1982)）。サンプルのアリコートを、0.2μmフィルターで無菌ろ過した後、クロマトグラフィーカラムに注入する。HPLCのパラメータは以下の通りである：(1) カラム：Aminex APX-87H 300 x 7.0 mm バイオラッド（BioRad）；(2) 溶出液：0.005N H2SO4；(3) 流速：0.6ml／分；(4)検出器：屈折率；(5) 温度：45℃；(6) 保持時間：グルカレート-1,4-ラクトン＝9.0分、とグルカリック-3,6-ラクトン＝9.1分、グルカル酸＝8.0分、グルクロノ-3,6-ラクトン＝10.8分、およびグルクロン酸＝8.1分。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３８】
実施例15−グルクロン酸からグルカル酸の酵素的生成
グルカル酸は、非特異的ヘキソースオキシダーゼ活性（EC1.1.3.5）を有する酵素により触媒される反応でグルクロン酸から合成される。藻類コンドルス・クリスプス（Chondrus crispus）（AAB49376.1 GI:1877522）から単離した酵素は、グルコースの酸化速度の２％の速度でこの反応を触媒する。fasta確率スコア（P-スコア）が4e-60を超えるこの酵素の同族体が、ペスト菌（Yersinia pestis）（NP_403959.1；gi:16120646）、偽結核エルシニア菌（Yersinia pseudotuberculosis）（Sangre Centre、Contig1834上の遺伝子配列（長さ8,117）、5,184から3,130）、ラルストニア・ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）（NP_518171.1；gi:17544769）、およびバークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）（Sangre Centre、Contig01233上の遺伝子配列（長さ58,761）、23,445〜25,103）中で、アミノ酸配列のBLAST分析により同定された。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３９】
グルクロン酸とヘキソースオキシダーゼとの反応により生成したグルカル酸の量は、別に記載（SullivanとIkawa、Biochim. et Biophys. Acta 309:11-22 (1973)とUS Patent No. 6,251,626）のように測定された。このアッセイでは、ペルオキシダーゼの存在下でグルクロン酸の酸化により生成した過酸化水素は、発色性基質オルトジアニシジンと反応して、402nmで吸収する色素を生成する。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２４１】
実施例16−グルクロン酸からグルカル酸への化学変換
以下の方法を使用してグルクロン酸をグルカル酸に変換した。５％パラジウム担持活性炭触媒（10ｇ；５％Pd/C触媒；Johnson Matthey Inc., Ward Hil, マサチューセッツ州）を、50mlの蒸留水を有する三ツ首フラスコに入れた。酸素を混合物中に約15分間バブリングした。一方、５ｇのグルクロン酸を25mlの蒸留水に溶解し、10％水酸化ナトリウムを加えてpHを８に調整した。次にグルクロネート溶液を、触媒を含有するフラスコに加えた。フラスコを、10％水酸化ナトリウム含有滴下ロート、pH電極、および金属フリットを有する酸素ラインとを備えた50℃の油浴に入れた。反応混合物を、酸素を連続的にバブリングしてpHを追跡しながら50℃で攪拌した。10％水酸化ナトリウムを定期的に加えてpHを８より高く維持した。10時間後、触媒をろ過して除去し、反応混合物をHPLCにより分析した。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２４２】
図21Aは、10時間目の出発物質、グルクロン酸、生成物、グルカル酸、および反応混合物のLC-MSクロマトグラムを示す。図21Bは、対応する質量スペクトルを示す。反応収率は、反応混合物の質量スペクトル中の146.1（グルカル酸の主要な娘断片）と140.4（グルクロン酸の主要な娘断片）のイオン化断片の比較により、90％を超えると測定された。これらの結果は、化学的または酵素的に得られたグルクロン酸が、触媒的酸化により高収率でグルカル酸に変換できることを示す。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２４５】
【図１】D-ミオイノシトールとL-グロン酸を中間体として使用して、グルコースからアスコルビン酸を産生することができる７工程の代謝経路を示す図。
【図２】D-ミオイノシトールとD-グルクロノ-3,6-ラクトンを中間体として使用して、グルコースからアスコルビン酸を産生することができる７工程の代謝経路を示す図。
【図３】UDP-D-グルクロネートとL-グロネートを中間体として使用して、グルコースからアスコルビン酸を産生することができる８工程の代謝経路を示す図。
【図４】UDP-D-グルクロネートとD-グルクロノ-3,6-ラクトンを中間体として使用して、グルコースからアスコルビン酸を産生することができる８工程の代謝経路を示す図。
【図５】UDP-D-グルクロネートとL-グロネートを中間体として使用して、グルコースからアスコルビン酸を産生することができる９工程の代謝経路を示す図。
【図６】UDP-D-グルクロネートとD-グルクロノ-3,6-ラクトンを中間体として使用して、グルコースからアスコルビン酸を産生することができる９工程の代謝経路を示す図。
【図７Ａ】17個のアミノ酸配列の整列である。
【図７Ｂ】図７Ａの続き。
【図７Ｃ】図７Ｂの続き。
【図８】記載の細胞抽出物について、１測定あたりに生成したグルクロネートのμgを１測定あたりのタンパク質のμgに対してプロットしたグラフ。
【図９】グルクロネート還元酵素活性を有するポリペプチドからのアミノ酸配列を含有する配列リスト。２位のスレオニンはアラニンでもよい。
【図１０】D-グルコノ-1,5-ラクトンラクトヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドからのアミノ酸配列を含有する配列リスト。２位のスレオニンはアラニンでもよい；16位のバリンはアラニンでもよい；17位のメチオニンはイソロイシンでもよい；34位のグルタミン酸はグルタミンでもよい；および162位のバリンの後にバリンを挿入してもよい。
【図１１】ウロノラクトナーゼ活性を有するポリペプチドからのアミノ酸配列を含有する配列リスト。２〜20位のアミノ酸残基は、除去して成熟ポリペプチドを生成することができる。
【図１２】グロノ-γ-ラクトンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドからのアミノ酸配列を含有する配列リスト。85位のイソロイシンはバリンでもよく、189位のグルタミンはヒスチジンでもよい。
【図１３】ガラクトノ-γ-ラクトンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドからのアミノ酸配列を含有する配列リスト。
【図１４】酸性ホスファターゼ活性を有するポリペプチドからのアミノ酸配列を含有する配列リスト。
【図１５】フィターゼ活性を有するポリペプチドからのアミノ酸配列を含有する配列リスト。
【図１６】フィターゼ活性を有するポリペプチドからのアミノ酸配列を含有する配列リスト。
【図１７】ホスファターゼ活性を有するポリペプチドからのアミノ酸配列を含有する配列リスト。
【図１８】グルコースまたはフィチン酸からD-グルカル酸を産生する代謝経路を示す図。
【図１９】記載のサンプルについて、０、３、または６時間インキュベーション後の１mlあたりOD600に対してアスコルビン酸μgをプロットしたグラフ。
【図２０】記載のサンプルについて、０、４、８、または19時間インキュベーション後の、アスコルビン酸の濃度をプロットしたグラフ。
【図２１】グルクロン酸からグルカル酸への変換を示すHPLCと質量スペクトルグラフを含む。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１８】
2004536577.tif 000001
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２１】
2004536577.tif 000002