(57)【要約】  本願発明は、キナーゼの阻害ペプチドと細胞内オルガネラ局在化ペプチドとを有し、細胞内オルガネラ特異的にキナーゼ活性化を阻害することを特徴とするキナーゼ阻害性融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質は、細胞内オルガネラにおいて局所的に活性化するキナーゼを、そのオルガネラにおいて特異的に阻害することを作用機序とする。
2008015841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キナーゼの阻害ペプチドと細胞内オルガネラ局在化ペプチドとを有し、細胞内オルガネラ特異的にキナーゼ活性化を阻害することを特徴とするキナーゼ阻害性融合タンパク質。
【請求項２】
キナーゼの阻害ペプチドがチロシンキナーゼSrcの阻害ペプチドであり、細胞内オルガネラ局在化ペプチドが脂質ラフト局在化ペプチドである請求項１のキナーゼ阻害性融合タンパク質。
【請求項３】
チロシンキナーゼSrcの阻害性ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなり、脂質ラフト局在化ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなる請求項２のキナーゼ阻害性融合タンパク質。
【請求項４】
脂質ラフト局在化ペプチドが、パルミトイル基によって修飾されている請求項２または３のキナーゼ阻害性融合タンパク質。
【請求項５】
キナーゼの阻害ペプチドがセリン／スレオニンキナーゼAktの阻害ペプチドであり、細胞内オルガネラ局在化ペプチドがミトコンドリア局在化ペプチドである請求項１のキナーゼ阻害性融合タンパク質。
【請求項６】
セリン／スレオニンキナーゼAktの阻害ペプチドの阻害性ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなり、ミトコンドリア局在化ペプチドが配列番号４のアミノ酸配列からなる請求項５のキナーゼ阻害性融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のキナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に細胞膜透過性ペプチドを連結した、細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に、細胞膜非透過性ペプチドと、癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列とを連結した、癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１から６のいずれかに記載のキナーゼ阻害性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターを含有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載の癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を含有する抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、細胞内オルガネラ(脂質ラフト、ミトコンドリア、ゴルジ体等)において特異的なキナーゼ(Src、Akt、PKC等)の活性化を阻害することによって、キナーゼの活性化に依存する細胞機能を阻害または低下させることができるキナーゼ阻害性融合タンパク質と、このキナーゼ阻害性融合タンパク質を含有する医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リン酸化によるタンパク質活性の制御は、細胞内での情報伝達経路において大きな役割を占めている。【０００３】
チロシンキナーゼSrcの活性化は、インテグリンリガンドへの細胞の接着及び増殖因子によって誘発される有糸分裂生起等の腫瘍細胞の機能に必要であり（非特許文献１、２）、これらの機能は腫瘍形成および転移と密接に関連していることが知られている（非特許文献３）。そこでチロシンキナーゼSrcの阻害剤を投与することによって癌を治療する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。【０００４】
しかしながら、従来のSrc阻害剤を用いた治療法は必ずしも有効性が確認されていない。例えば、非特許文献４は、Srcに対する様々な擬似基質性の阻害性ペプチド（MIYKYYF等の約30種類ほどのペプチド）をv-Srcで形質転換した3T3細胞内に取り込ませても細胞内のリン酸化は阻害されず、また形態的な変化も引き起こされないことを報告している。このことは、Src阻害剤を単独で癌細胞に投与しても、癌細胞の効果的な増殖抑制や転移抑制が期待できないことを示している。【０００５】
一方、細胞内オルガネラの一つである脂質ラフト(lipid raft)と呼ばれるコレステロールが豊富なナノドメインは、細胞内のタンパク質シグナル伝達のためのプラットフォームとして機能すると考えられているが、チロシンキナーゼSrcは、細胞膜中の脂質ラフト領域と非ラフト領域の両方に分布することが知られている（非特許文献５、６）。【０００６】
また、セリン／スレオニンキナーゼAktは、細胞生存（cell survival）の促進やアポトーシス抑制などの細胞機能制御に関わっており、特に疾患細胞では、ガン化や動脈硬化などに関与していることが知られている。さらに本願発明者らは、新しい蛍光プローブを開発し、Aktの活性化はさまざまな細胞小器官で起きていることを明らかにしている（非特許文献７）。しかし、各細胞小器官におけるAktの活性化がそれぞれどういった細胞機能を担っているのかは不明である。
【特許文献１】特表2003-525862号公報
【非特許文献１】Playford, M.P. & Schaller, M.D. The interplay between Src and integrins in normal and tumor biology. Oncogene. 23, 7928-7946. (2004).
【非特許文献２】Bromann, P.A., Korkaya, H. & Courtneidge, S.A. The interplay between Src family kinases and receptor tyrosine kinases. Oncogene. 23, 7957-7968. (2004).
【非特許文献３】Summy, J.M. & Gallick, G.E. Src family kinases in tumor progression and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 22, 337-358. (2003).
【非特許文献４】Kamath, J.R., Liu, R., Enstrom, A.M., Lou, Q. & Lam, K.S. Development and characterization of potent and specific peptide inhibitors of p60c-src protein tyrosine kinase using pseudosubstrate-based inhibitor design approach. J. Pept. Res.62, 260-268, 2003
【非特許文献５】Sargiacomo, M., Sudol, M., Tang, Z. & Lisanti, M.P. Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells. J. Cell Biol. 122, 789-807. (1993).
【非特許文献６】Liang, X. et al. Heterogeneous fatty acylation of Src family kinases with polyunsaturated fatty acids regulates raft localization and signal transduction. J. Biol. Chem. 276, 30987-30994. (2001).
【非特許文献７】Sasaki et al. J. Biol. Chem. 273 30945-30951 (2003).
【発明の開示】
【０００７】
腫瘍形成や転移に密接に関連している各種キナーゼそれぞれが細胞内のどのオルガネラで活性化したときに、どの細胞機能が生起するのかが特定されれば、キナーゼ活性に依存する各種の細胞機能（特に疾患に関係する細胞機能）を効果的に阻害または低減することが可能となり、キナーゼを標的とする疾患治療（例えば癌治療）が大きく前進する。
【０００８】
本願発明者らは、生細胞の各種オルガネラにおけるキナーゼ活性化部位を検出するための、新しいオルガネラ局在型蛍光インジケーターを開発し、これを用いた解析によって、個々のキナーゼが特定のオルガネラで活性化し、その局在的な活性化を阻害することによって細胞機能（特に、疾患に関連した機能）を阻害または低下させることができることを見いだした。
【０００９】
本願発明は、以上のとおりの新規な知見に基づき、細胞内オルガネラにおいて局所的に活性化するキナーゼを、そのオルガネラにおいて特異的に阻害することを作用機序とする、新しい疾患治療手段を提供することを課題としている。
前記の課題を解決するため、本願発明は、キナーゼの阻害ペプチドと細胞内オルガネラ局在化ペプチドとを有し、細胞内オルガネラ特異的にキナーゼ活性化を阻害することを特徴とするキナーゼ阻害性融合タンパク質を提供する。
【００１０】
このキナーゼ阻害性融合タンパク質の一つの具体的態様は、キナーゼの阻害ペプチドがチロシンキナーゼSrcの阻害ペプチドであり、細胞内オルガネラ局在化ペプチドが脂質ラフト局在化ペプチドである融合タンパク質である。以下、このSrcに対するキナーゼ阻害性融合タンパク質を「Src阻害性融合タンパク質」あるいは「SIFP」（Src Inhibitory Fusion Protein）と記載することがある。また、後記の実施例では、コントロール（非ラフト局在型の融合タンパク質）と区別するため、SIFPを特に「脂質ラフト局在型SIFP」と記載している。
【００１１】
このSIFPにおける一つの好ましい態様は、チロシンキナーゼSrcの阻害性ペプチドとして配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することであり、脂質ラフト局在化ペプチドとして配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することである。
【００１２】
また、このSIFPは、その脂質ラフト局在化ペプチドがパルミトイル基によって修飾されていることを別の好ましい態様としている。
【００１３】
キナーゼ阻害性融合タンパク質の別の具体的態様は、キナーゼの阻害ペプチドがセリン／スレオニンキナーゼAktの阻害ペプチドであり、細胞内オルガネラ局在化ペプチドがミトコンドリア局在化ペプチドである阻害性融合タンパク質である。以下、このAktに対するキナーゼ阻害性融合タンパク質を「Akt阻害性融合タンパク質」あるいは「AIFP」（Akt Inhibitory Fusion Protein）と記載することがある。
【００１４】
このAIFPにおける一つの好ましい態様は、セリン／スレオニンキナーゼAktの阻害ペプチドの阻害性ペプチドとして配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することであり、ミトコンドリア局在化ペプチドとして配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することである。
【００１５】
なお、本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質は、その具体例であるSrc阻害性融合タンパク質（SIFP）およびAkt阻害性融合タンパク質（AIFP）に限定されるものではない。本願発明によって提供されるキナーゼ阻害性融合タンパク質の基本構造に従って、各種キナーゼの阻害ペプチドと各種オルガネラ局在化ペプチドとの組合せからなる融合タンパク質を作成し、本願発明に開示された試験方法に従ってそれぞれの有効性を確認することによって、任意のキナーゼに対する最も有効な活性阻害を実現することができる。
【００１６】
本願発明はまた、前記キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に細胞膜透過性ペプチドを連結した、細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を提供する。この細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質の具体的態様は、SIFPまたはAIFPのN末側に細胞膜透過性ペプチドを連結した「細胞膜透過性SIFP」または「細胞膜透過性AIFP」である。なお細胞膜透過性SIFPは、その脂質ラフト局在化ペプチドがパルミトイル基によって修飾されていてもよく、あるいは修飾されていなくてもよい。パルミトイル修飾されたものは、そのままの状態で脂質ラフトに局在化することができ、パルミトイル修飾されていないものは、細胞内の酵素によってパルミトイル修飾され、同じく脂質ラフトに局在化する。
【００１７】
さらに本願発明は、前記の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に、細胞膜非透過性ペプチドと癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列とを連結した、癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を提供する。この癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質の具体的態様は、「癌細胞膜透過性SIFP」または「細胞膜透過性AIFP」である。
【００１８】
またさらに、本願発明は、前記キナーゼ阻害性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを提供する。
【００１９】
本願発明は、さらにまた、前記の発現ベクター、細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質、および癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質のそれぞれ含有する医薬組成物を提供する。
本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質は、キナーゼが局所的に活性化する細胞内オルガネラにおいて特異的にその活性化を阻害することによって、そのキナーゼ活性に依存する細胞機能（特に、疾患に関連した機能）を阻害または低下させることができる。例えば、具体例として提供するSrc阻害性融合タンパク質（SIFP）は、生体膜の脂質ラフトにおけるチロシンキナーゼSrcの活性化を特異的に阻害することによって、癌細胞の細胞周期を停止させ、また癌細胞の細胞接着を阻害することができる。また、Akt阻害性融合タンパク質（AIFP）は、細胞のミトコンドリアにおけるセリン／スレオニンキナーゼAktの活性化を特異的に阻害することによって、少なくとも癌細胞の細胞周期を停止させることができる。従って、例えばSIFP発現ベクターやAIFP発現ベクターを癌細胞に導入して癌細胞内でSIFPやAIFPを発現させれば、癌細胞の増殖や転移を効果的に防止することができる。
【００２０】
また本願発明の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質の場合には、それ自体が細胞内に取り込まれるので、より簡便かつ有効な薬剤形態として癌組織等の疾患組織に適用できる。
【００２１】
さらに、癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質は、癌細胞にのみ取り込まれるので、例えば全身性に投与することによっても、癌細胞に特異的な作用を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、生体膜におけるSrc活性を検出するための蛍光インディケーター（TM-Srcus）。(a)は細胞膜のSrc活性を可視化するためのTM-Srcusの原理。Srcの活性化に伴い、チロシンリン酸化認識（SH2）ドメインがリン酸化Src基質（Y314）ドメインに結合することによって、TM-Srcusの構造変化が生じ、これによって分子内FRET反応が発生する。(b)はTM-SrcusおよびTM-Srcus314AのcDNA構成。TM-Srcusは直列状の融合タンパク質であり、７つの部分：膜貫通ドメイン、シアン蛍光タンパク質（CFP）、チロシンリン酸化部位（赤色Y）を含むY314、柔軟性リンカー（Ln）、SH2ドメイン、黄色蛍光タンパク質（YFP）、核外シグナル配列（NES）からなっている。Y314ドメインは、アラニン変異部位（赤色A）を含む変異Src基質ドメインである。
【図２】図２は、MCF7細胞の脂質ラフトにおけるSrcの活性化。（a）の左、中央は、MCF7細胞の基底細胞膜におけるTM-SrcusのCFP/YFP発光率の全反射型蛍光顕微鏡（TIRFM）による疑似カラー像である。白線で囲んだ領域は、単一MCF7細胞の基底細胞膜を示す。対象領域（ROI 1）はTM-SrcusのCFP/YFP発光率の変化を示す青にシフトした領域を含んでいる。対象領域（ROI 2）は、TM-SrcusがCFP/YFP発光率の変化を示さない場所に位置している。(a)の右は、単一MCF7細胞の基底細胞膜における脂質ラフトマーカーAlexa-647 CTXBの蛍光強度のTIRFMによる疑似カラー像である。Alexa-647 CTXBはROI 1に集中している。TM-Srcusを発現するMCF7細胞は、E2刺激の前にAlexa-647 CTXBで染色した。(b)はTM-Srcusを発現するMCF7細胞の基底細胞膜のROI 1およびROI 2における、１μM E2刺激に対するCFP/YFP発光率の時間経過である。(c)は、TM-Srcus（68 kDa）を発現するMCF7細胞の低密度および高密度画分のウェスタンブロット分析である。画分は、CTXBを結合したHRP、またはGFP、リン酸化チロシン、caveolin1およびSrcのそれぞれの抗体によってブロットした。脂質ラフトの低密度画分と、非ラフト＆細胞質画分の高密度画分がそれぞれ認められた。(d)は、脂質ラフトへのSrcのエストロジェンによる細胞内局在の変化を示す。E2刺激の有無による、高密度（非ラフト＆細胞質）画分に対する低密度画分（脂質ラフト）におけるSrc量の比率を示す（mean±S.D. n=3）。(e)は、脂質ラフトへのEGFPおよびERのエストロジェンによる細胞内局在の変化を示す。低密度および高密度画分は、CTXBを結合したHRP、またはEGFPおよびERのそれぞれの抗体によってブロットした。なお、この図２に示した結果は、独立した３回の測定結果の代表例を示す。
【図３】図３は、脂質ラフトまたは非ラフト局在型Src阻害性融合タンパク質（SIFP）(a)は、脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFP、SIFP Y6A、YFPコントロールとしてのSIFP DelのそれぞれのcDNA構成である。脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPは、YFP、フラッグタグ (flag tag)、チロシンリン酸化部位（赤色Y）を含むSrcの阻害性ペプチド、および局在化配列からなる。脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFP Y6Aは、アラニン変異部位（赤色A）を含むアラニン変異阻害性ペプチドを有している。脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFP Del（YFPコントロール）では、Srcに対する阻害性ペプチドが除去されている。(b)は、脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPを発現するMCF7細胞の、共焦点蛍光顕微鏡による蛍光像である。脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPにおけるYFP像は緑で示した。Alexa-647 CTXBによる染色は赤である。合併像と透過像を併せて示す。(c)は、密度勾配画分を用いて分析したMCF7細胞における脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPの細胞内局在と阻害効果である。脂質ラフトまたは非ラフト局在型のSIFPを発現するMCF7細胞の溶解物を密度勾配に供し、低密度および高密度の画分を得た。低密度および高密度画分は抗フラッグ抗体または抗pTy抗体で免疫沈降させ、抗GFP抗体でイムノブロッティングした。Src特異的阻害剤PP2の処置は１０μMで１０時間行った。(b)(c)の結果は、独立した３回の測定結果の代表例を示す。
【図４】図４は、脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPの細胞機能に対する生理的効果を示す。(a)は脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPを発現したMCF7細胞の接着能である。脂質ラフト局在型SIFPはMCF7細胞の接着性を低減させた。接着指標は、蛍光陽性の接着細胞数をはじめにプレーティングしてあった蛍光陽性の細胞数で割ったものである。この結果は、6回以上の独立した測定結果を示す。(b)は脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFP、SIFP Y6A、YFPコントロールをそれぞれ発現するMCF7細の細胞周期の分析結果である。PI（propidium iodide）染色を用いたフローサイトメトリーは、細胞周期のG1、SおよびG2/M期におけるYFP陽性細胞数を示す。脂質ラフト局在型SIFPのみが、MCF7細胞の細胞周期停止を誘導した。(b)の結果は、独立した３回の測定結果の代表例を示す。
【図５】図５は、実施例２で作成したAkt阻害性融合タンパク質（AIFP）の構成（上段）と、Akt阻害ペプチドを持たないコントロールAIFPの構成（下段）である。
【図６】図６は、AIFPを導入した乳癌細胞（MCF-7細胞）をミトコンドリアマーカーで染色し、またAIFPのGFPを可視化した顕微鏡像である。上段左はミトコンドリアマーカーによる染色像、上段右はGFPシグナルの像（AIFPの位置を示す）、下段左は透過光による像、下段右はミトコンドリアマーカーによる染色像とGFPシグナル像の重ね合わせである。
【図７】図７は、AIFPを発現するMCF-7細胞の細胞周期プロファイルをフローサイトメトリーにより測定した結果である。左はAIFP発現細胞、右はコントロールAIFP発現細胞の結果である。
【図８】図８は、脂質ラフト局在型SIFPを発現するヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞接着アッセイの結果である。黒バーが脂質ラフト局在型SIFPの結果、白バーが脂質ラフト局在型SIFP Del（コントロール）の結果である。
【図９】図９は、脂質ラフト局在型SIFPを発現するヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞周期アッセイの結果である。左図が脂質ラフト局在型SIFP Del（コントロール）の結果、右図が脂質ラフト局在型SIFPの結果である
【図１０】図１０は、実施例３で作成した癌細胞膜透過性SIFPの構成である。「targeting」は脂質ラフト局在化ペプチドであり、「inhibitory」はSrc阻害ペプチドである。「HA」はインフルエンザウィルス由来の蛋白質hemagglutininの一部である。黒枠で示した領域が癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列である。
【図１１】図１１は、精製した癌細胞膜透過性SIFPがMMP処理によって切断されることを確認したウェスタンブロット分析の結果である。MMP処理（MMP+）の場合にのみ切断されたバンド（矢印）が観察された。
【図１２】図１２は、上段は、MCF-7細胞の培地に癌細胞膜透過性SIFPのみを添加して3.5時間後の細胞を免疫染色した結果である。下段は、MCF-7細胞の培地に癌細胞膜透過性SIFPとMMPを添加して3．5時間後の細胞を免疫染色した結果である。左側は抗flag抗体による染色画像を示し、右側は透過光による画像を示している。
【図１３】図１３は、MCF-7細胞の培地に癌細胞膜透過性SIFPを添加した場合の細胞増殖の程度を、MMPの有無で比較した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質は、前記のとおり、キナーゼの阻害ペプチドと細胞内オルガネラ局在化ペプチドとが融合化したタンパク質である。【００２４】
例えば、その具体例であるSrc阻害性融合タンパク質（SIFP）は、Src阻害ペプチドと脂質ラフト局在化ペプチドとが融合化したタンパク質である。【００２５】
Src阻害性ペプチドとは、Srcに作用してその活性（チロシン残基のリン酸化）を特異的に阻害するペプチドであり、例えば、Srcに対する擬似基質性の阻害性ペプチド（MIYKYYF：配列番号１）（非特許文献４）を用いることができる。【００２６】
また、脂質ラフト局在化ペプチドは、細胞内の脂質ラフトに特異的に結合するペプチドであり、例えば、H-Rasタンパク質のC末端の9アミノ酸(CMSCKCVLS：配列番号２)からなるペプチドを用いることができる。【００２７】
なお、H-Rasタンパク質のような脂質ラフトに局在するタンパク質は、哺乳動物細胞内の酵素（パルミトイル転移酵素）による翻訳後修飾によってC末側のシステイン残基にパルミトイル酸のついた構造をとることで脂質ラフトへと局在する（例えば、Prior, I.A. et al. GTP-dependent segregation of H-ras from lipid rafts is required for biological activity. Nat. Cell Biol. 3, 368-375, 2001）。従って、本願発明のSIFPにおいては、Src阻害ペプチドのC末側に脂質ラフト局在ペプチドが位置するように両者を融合する。【００２８】
Src阻害ペプチドや脂質ラフト局在ペプチドは、これらに限定されるものではなく、Src阻害ペプチドとしては、FVGFLGFLG(L. Ramdas, N.U. Obeyesekere, G. Sun, J.S. McMurray, R.J. Budde, N-myristoylation of a peptide substrate for Src converts it into an apparent slow-binding bisubstrate-type inhibitor, J. Pept. Res. 53(1999) 569-577.)、EFLYGVFF(T. Nishi, R.J. Budde, J.S. McMurray, N.U. Obeyesekere, N. Safdar, V.A. Levin, H. Saya, Tight-binding inhibitory sequences against pp60(c-src)identified using a random 15-amino-acid peptide library, FEBS Lett. 399 (1996) 237-240.)等を使用することができ、脂質ラフト局在ペプチドとしては、MLCCMRRTKQ（N末端側に融合）(Zacharias, D.A., J.D. Violin, A.C. Newton, and R.Y. Tsien. 2002. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296:913-6)等を使用することができる。【００２９】
また、本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質の別の具体例であるAkt阻害性融合タンパク質（AIFP）は、Akt阻害ペプチドとミトコンドリア局在化ペプチドとが融合化したタンパク質である。【００３０】
Akt阻害性ペプチドとは、Aktに作用してその活性（セリン／スレオニン残基のリン酸化）を特異的に阻害するペプチドであり、例えば、Aktに対する擬似基質性の阻害性ペプチド（ARKRERTYSFGHHA：配列番号３）を用いることができる。【００３１】
また、ミトコンドリア局在化ペプチドは、細胞内のミトコンドリアに特異的に結合するペプチドであり、例えば、ミトコンドリアタンパク質Tom20の1〜35番目のアミノ酸配列(MVGRNSAIAAGVCGALFIGYCIYFDRKRRSDPNFK：配列番号４)からなるペプチドを用いることができる。【００３２】
また、他のキナーゼ阻害性ペプチドやオルガネラ局在化ペプチドについても、既存のタンパク質データベース（例えば、GenBankデータベースなど）等から配列情報を入手して、各種のキナーゼ阻害性融合タンパク質を作成することができる。【００３３】
本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質を作成する場合には、キナーゼ阻害ペプチドとオルガネラ局在化ペプチドは、両者を直接に連結させてもよく、あるいは両者の間にリンカーを介在させてもよい。【００３４】
本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質は、例えば、遺伝子工学的方法により作成することができる。すなわち、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するベクターからインビトロ転写によってRNAを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロで目的の融合タンパク質を得ることができる。また発現ベクターによって組換えられた大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞から、キナーゼ阻害性融合タンパク質を大量に得ることができる。【００３５】
また、周知の化学合成法（例えば、Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000）等に準じてキナーゼ阻害性融合タンパク質を合成することもできる。【００３６】
次に、本願発明の医薬組成物について説明する。【００３７】
本願発明の医薬組成物は、前記のキナーゼ阻害性融合タンパク質を有効成分として含有し、細胞局在的なキナーゼ阻害の効果に従って、特定の疾患に対する治療効果または症状の改善効果を有している。例えば、キナーゼ阻害性融合タンパク質の具体例であるSIFPやAIFPは、癌細胞の細胞周期を停止させるなどの優れた作用によって、抗癌剤の有効成分として使用することができる。【００３８】
キナーゼ阻害性融合タンパク質を医薬組成物として用いるための一つの方法は、これらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを、遺伝子治療において使用されているようなウイルスベクターを用いて構築することである。ウイルスベクターとしては、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、またはピコルナウイルス科から選ばれるウイルスのゲノムに由来するものとすることができる。各々の親ベクターの都合のよい長所を利用したキメラベクターもまた用いることができる（例えば、Feng（1997）Nature Biotechnology 15:866-870参照）。このようなウイルスゲノムは、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントとなるべくさらに加工されてもよい。別の態様においては、ベクターはアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター、例えば米国特許第6,096,718号；6,110,458号；6,113,913号；5,631,236号参照）；アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノムに由来するベクターである。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびそれらの組合せを主成分とするものが含まれる（例えば、米国特許第6,117,681号；6,107,478号; 5,658,775号; 5,449,614号；Buchscher（1992）J. Virol. 66:2731-2739; Johann（1992）J. Virol. 66:1635-1640参照）。【００３９】
また、前記の組換えウイルスベクターにおいては、キナーゼ阻害性融合タンパク質が疾患組織特異的に発現するように、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、疾患遺伝子のプロモーター支配下に連結させることもできる。【００４０】
以上のような組換えウイルスベクターによって細胞内で発現したキナーゼ阻害性融合タンパク質は、そのキナーゼ阻害性ペプチドとオルガネラ局在化ペプチドの種類に応じて、細胞内の所与の部位において特定キナーゼの活性を特異的に阻害する。例えば、SIFPの場合には、細胞内の酵素による翻訳後修飾によって脂質ラフト局在ペプチドがパルミトイル化され、脂質ラフトにおいてSrcの活性化を選択的に阻害する。またAIFPはミトコンドリアにおいて特異的にAktの活性を阻害する。これによって、SIFPまたはAIFPが発現した癌細胞の増殖や転移が効果的に防止される。【００４１】
本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質を医薬組成物として用いるための別の方法は、キナーゼ阻害性融合タンパク質それ自体を細胞に取り込ませる方法である。すなわち、本願発明の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を疾患組織の細胞に接触させる方法である。具体的には、細胞膜透過性SIFPまたは細胞膜透過性AIFPを癌細胞に接触させる方法である。【００４２】
細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質は、キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に細胞膜透過性ペプチドを連結することによって作成される。細胞膜透過性ペプチドは、アルギニンを多く含む約10アミノ酸配列からなるペプチドであり、このペプチドを付加したタンパク質は細胞膜を透過し、細胞内に進入することが知られている。これまでに、例えば、Hiv-tat（Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A. and Dowdy, S. F. (1999) In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science 285, 1569-1572）、herpes virus tegument protein VP22（Elliott, G. and O’Hare, P. (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by herpesvirus structural protein. Cell (Cambridge, Mass.) 88, 223-233）、Drosophila melanogaster antennapedia (penetratin)（Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. and Prochiantz, A. (1996) Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J. Biol. Chem. 271, 18188-18193）、the protegrin 1(PG-1) antimicrobial peptide SynB（Kokryakov, V. N., Harwig, S. S., Panyutich, E. A., Shevchenko, A. A., Aleshina, G. M., Shamova, O. V., Korneva, H. A. and Lehrer, R. I. (1993) Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides that combine features of corticostatic defensins and tachyplesins. FEBS Lett. 327, 231-236）、the basic fibroblast growth factor（Jans, D. A. (1994) Nuclear signaling pathways for polypeptide ligands and their membrane receptors. FASEB J. 8, 841-847）等の細胞膜透過性ペプチドが知られている。【００４３】
これらの細胞膜透過性ペプチドはキナーゼ阻害性融合タンパク質と直接融合させることによって細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を作成することができる。また、遺伝子工学的方法や化学合成法によって別個に調製したキナーゼ阻害性融合タンパク質と細胞膜透過性ペプチドとを、公知の方法によってペプチド結合するなどの方法によっても作成することができる。【００４４】
以上のような細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質は、細胞膜を透過して細胞内に取り込まれた後、そのオルガネラ局在化ペプチドの種類に応じて細胞内の所定部位に局在化し、そこで特定キナーゼの活性を阻害する。例えば、癌細胞に接触した細胞膜透過性SIFPは、脂質ラフト局在ペプチドのシステインがパルミトイル転移酵素によりパルミトイル修飾を受け、脂質ラフトへと局在化し、脂質ラフト特異的にSrcの活性化が阻害される。また、癌細胞に接触した細胞膜透過性AIFPはミトコンドリアへと局在化し、ミトコンドリア特異的にAktの活性化を阻害する。これによって、SIFPやAIFPを取り込んだ癌細胞の増殖や転移が効果的に防止される。【００４５】
また、細胞膜透過性SIFPの場合には、細胞内のパルミトイル転移酵素の働きに依存することなく、予め脂質ラフト局在化ペプチドのシステインをパルミトイル化した状態で細胞に取り込ませることもできる。例えば大腸菌等で発現させたり、あるいは化学合成したSIFPに、そのC末側のシステインをパルミトイル基で化学修飾することによって、脂質ラフトに特異的なSrc阻害活性を付与することができる。具体的には、マレイミド基のついたパルミトイルエステルを新たに合成し、SIFPと反応させる。システインのチオール基とマレイミド基は選択的に結合することが知られているので、この反応によりパルミトイル基をSIFPのシステインに人為的に結合させることができる。【００４６】
本願発明の医薬組成物における別の形態は、癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質（特に、SIFPまたはAIFP）の使用である。この癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質は、前記の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に、さらに細胞膜非透過性ペプチドと、癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列とを連結している。具体的には、N末端から順に、「細胞膜非透過性ペプチド」＋「癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列」＋細胞膜透過性ペプチド」＋「キナーゼ阻害性融合タンパク質」という構成を有している。すなわち、細胞膜非透過性ペプチド（例えば、ポリグルタミンからなるペプチド）の存在によって、その内側にある細胞膜透過性ペプチドは不活性化し、正常細胞に取り込まれることはない。ところが、癌細胞に接触した場合には、癌細胞特異的に発現するプロテアーゼ（例えば、MMP2）によって、その特異的認識配列（MMP2 cleavable site）が切断される。これによって細胞膜透過性ペプチドがN末端に露出し、細胞膜透過活性を獲得することになる。【００４７】
従って、この癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質（SIFPまたはAIFP）の場合には、全身性または癌細胞を含む広範な組織に投与しても、その作用を癌細胞に対してのみ発揮させることができる。【００４８】
なお、本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質の具体例であるSIFPおよびAIFPは、例えば、食道癌、胃癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頚部癌、骨・軟部肉腫、尿管癌、膀胱癌、子宮癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、卵管癌等のSrc活性化またはAkt活性化に伴って増殖や転移する癌細胞に対して治療効果を発揮することができる。【００４９】
本願発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、本願発明において使用する遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等の記載を、薬剤（医薬組成物）の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990等の記載を参考にすることができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を示して本願発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、本願発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１
チロシンキナーゼSrcの活性化部が脂質ラフトであることを確認した試験、および本願発明のSIFPが癌細胞特異的にその細胞周期の停止を誘導し、またその細胞接着を抑制することを確認した実施例について説明する。なお、以下の説明では、コントロール（非ラフト局在型SIFP）と区別するため、本願発明のSIFPを「脂質ラフト局在型SIFP」と記載する。
（1）材料および方法
1．プラスミド構築
TM-Srcus及びTM-Srcus Y314Aの発現ベクターとして、膜貫通リンタンパク質由来の膜貫通ドメイン（Cbp、アミノ酸1-5：Kawabuchi, M. et al. Transmembrane phosphoprotein Cbp regulates the activities of Src-family tyrosine kinases. Nature 404, 999-1003, 2000）、リンカーと融合させたCbpのTyr-314を含むリンペプチド由来のY314ドメイン、リンカーと融合させたY314Aドメイン、Srcキナーゼのカルボキシル末端由来のSH2ドメイン（Csk、アミノ酸80-162：Takeuchi, S., Takayama, Y., Ogawa, A., Tamura, K. & Okada, M. Transmembrane phosphoprotein Cbp positively regulates the activity of the carboxyl-terminal Src kinase, Csk. J. Biol. Chem. 275, 29183-29186, 2000）、CFP、ヒト免疫不全症ウイルス由来のタンパク質（Ullman, K.S., Powers, M.A. & Forbes, D.J. Nuclear export receptors: from importin to exportin. Cell 90, 967-970, 1997）に由来するNESを有するYFPのそれぞれのcDNA断片をPCRによって調製し、pBlueScript SK(+)にクローニングした。【００５１】
脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFP、そのアラニン変異体及び欠失変異体のそれぞれの発現ベクターを構築するために、リンカーと融合させた脂質ラフト局在化ペプチド（C末端H-Ras、CMSCKCVLS）、リンカーと融合させた非ラフト局在化ペプチド（C末端Rho-A、GCLVL）、フラッグタグと融合させたSrc阻害ペプチド(MIYKYYF)、フラッグタグと融合させたSrc阻害ペプチドのアラニン変異体(MIYKYAF)及びYFPのそれぞれのcDNA断片をPCRによって調製し、pBlueScript SK(+)にクローニングした。【００５２】
全てのクローニング用酵素（Takara Biochemical）は製造者の説明書にしたがって使用した。PCR断片は、ABI 310遺伝子分析機(genetic analyzer)(Applied Biosystems社)により配列決定した。このコンストラクトを、pcDNA3.1(+)(Invitrogen社)のKozak配列の後のHindIII−XhoI部位にサブクローニングした。
２．細胞のイメージング
TM-Srcusを発現している乳癌細胞（MCF-7）細胞を、ステロイド非含有培地（2％活性炭処理済みウシ胎児血清を含むフェノールレッド非含有Eagle最小必須培地）により12時間の飢餓培養し、Hankの平衡化培地（HBSS）（Sigma社）を用いて2回洗浄した。全反射蛍光イメージングのために、CCDカメラCoolSnap ES(Roper Scientific社)を備え、MetaFluor(Universal Imaging社)により制御された全反射型蛍光顕微鏡IX70(Olympus社)のもとで前記の細胞を観察した。励起光の波長は440±10nm、露光時間は300msであった。60×油浸対物 PlanApo60(Olympus社)を用いて、480±15nm及び535±12.5nmにおけるフィルターを通し、CFP及びYFPの蛍光イメージを得た。通常の蛍光イメージングのために、細胞をPP2(Calbiochem社)で前処理し、17β−エストラジオール(E2)(Sigma社)で刺激して、冷却CCDカメラMicroMax(Roper Scientific社)を備え、MetaFluorにより制御されたCarl Zeiss Axiovert 135顕微鏡(Carl Zeiss社)上で、室温にてイメージングした。励起光の波長は440±10nm、露光時間は200msであった。40×油浸対物(Carl Zeiss社）を用いて、480±15nm及び535±12.5nmにおけるフィルターを通し、蛍光イメージを得た。
3．密度勾配分画
TM-Srcus、及び、脂質ラフト及び非脂質ラフト局在型SIFPを発現している3枚の10cm径ディッシュ中のMCF-7細胞を氷冷HBSS中に掻き取り、2,000rpm、4℃において遠心分離して沈殿させ、180μlのTNE(10mM Tris-HCl、pH7.6、500mM NaCl、1mM EDTA）、1％ TritonX、10％シュークロース、2mMオルトバナジウム酸塩を用いて、200μlイエローチップを通したピペッティングによって4℃にて完全に溶解させ、20分間氷上でインキュベートした。360μlの冷した0％OptiprepTM(Axis-Shield PoC AS社)をこの抽出物に添加し、10分間氷上でインキュベートした。この抽出物と60％OptiprepTMの混合物をポリカーボネート製厚肉管（Beckman Coulter社）に移した。このサンプルに各層540μlずつの35％、30％、25％、20％、0％のOptiprepTM(TNE、1％ TritonX、１０％シュークロース、2mMオルトバナジウム酸塩中に溶解）を重層した。この勾配を200,000×g、4℃にて4時間遠心分離した。画分4は低密度画分、画分5は高密度画分であり、及び画分6は核成分を分画した後の上清画分である。
４．免疫沈降およびイムノブロット分析
免疫沈降用に、低密度及び高密度画分を等量のTNE、1％ TritonX、10％シュークロース、2mMオルトバナジウム酸塩を用いて希釈した。希釈されたサンプルを抗フラッグ抗体（Sigma社）、又は抗ホスホチロシン抗体（PY20、Santa Cruz Biotechnology社）を用いて免疫沈降させた。イムノブロッティング用に、前記サンプルを10％アクリルアミドSDSゲル上での電気泳動により分離し、電気泳動されたタンパク質をニトロセルロース膜へと転写した。その膜を1％ドライミルク又は3％BSAのTBST溶液を用いてブロックし、1次抗体；抗ホスホチロシン抗体（PY20、Santa Cruz Biotechnology社）、抗GFP抗体（Clontech社）、抗カベオリン1（BD Transduction Laboratories社）抗体、及び抗Src抗体（GD11、Upstate Biotechnology社）中でインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ又は抗マウスIgG(Amersham Life Science社)を用いて、バンドを視覚化した。
５．細胞培養及びトランスフェクション
10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び0.1mMの非必須アミノ酸を添加した最小必須培地（Sigma社）中で、5％CO2条件下、37℃においてMCF-7細胞を培養した。細胞をLipofectAMINE 2000(Invitrogen社）を用いてトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクトする24〜36時間前に、蛍光イメージングのためにガラス底面のディッシュ上に、あるいはイムノブロット分析のためにプラスチックディッシュ上に、それぞれプレーティングした。
６．免疫染色
TM-Srcusを発現しているMCF-7細胞を、4％パラホルムアルデヒドを用いて固定化した。固定化された細胞をSrcに対する1次抗体(sc18、Santa Cruz Biotechnology社）、次いでCy-5コンジュゲート抗IgG 2次抗体を用いて染色した。共焦点レーザー顕微鏡 LSM 510(Carl Zeiss社)のもと、室温にて、カバースライド上の細胞を観察した。
７．CTXB-Alexa647による細胞染色
TM-Srcus及び、脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞を、HBSSで洗浄し、2μg/mlのAlexa647-CTXB (Molecular probes社)と共に、0.01％BSA、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、25mM HEPES及び0.1mMの非必須アミノ酸を添加した最小必須培地中で、37℃、1時間インキュベートした。染色後、細胞をHBSSで2度洗浄し、TIRFM又は共焦点顕微鏡のもとで室温にて観察した。露光時間は633±10nm、励起は200msであった。60×油浸対物レンズPlanApo 60及び100×油浸対物レンズをそれぞれ用いて、TIRFM又は共焦点顕微鏡を通じたAlexa647-CTXBの蛍光イメージを得た。
８．細胞接着アッセイ
脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、PBSに再懸濁した。この細胞懸濁物（106細胞/ml）を24×24mmのマイクロカバーグラス（Matsunami社）上、及び6ウェルプレート（Nunc社）の底にまいた。24時間インキュベートした後、カバースライド上及びウェル底上の両方における80％のコンフルエントな細胞を、それぞれSIFPをコードして構築されたDNAにてトランスフェクトし、37℃、24時間インキュベートした。最初にプレーティングされた蛍光陽性の細胞を計数するために、カバースライド上のトランスフェクトされた細胞をHBSSにて洗浄し、メタノールで20分間、-20℃にて固定化した。カバースライド上の蛍光陽性の細胞は、蛍光顕微鏡（×40）下で直接計数した。接着した蛍光陽性の細胞を計数するために、ウェル底上のトランスフェクトされた細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁した。全細胞懸濁液（106細胞/ml）を、33μg/mlのフィブロネクチンPBS溶液にて4℃で一晩コーティングされたカバースライド上に置き、37℃、4時間インキュベートした。フィブロネクチンでコーティングされたカバースライド上に接着した細胞をHBSSにて洗浄し、メタノールで20分間、-20℃にて固定化した。接着した蛍光陽性の細胞を、蛍光顕微鏡（×40）下で直接計数した。接着指数は接着した蛍光陽性の細胞数を最初にプレーティングされた蛍光陽性の細胞数で割ったものである。
９．PI染色及びFACS分析
脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞（1.5×106細胞）を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、氷冷したPBSに再懸濁した。この細胞懸濁物を70％エタノールで30分間、4℃にて固定化した。固定化された細胞をPBSで2度洗浄し、100μg/mlのRNase A(Qiagen社)PBS溶液と共に室温にて30分間インキュベートし、4℃、30分間のPI染色（50μg/ml）に供した。PI染色された細胞をFACS(Beckman Coulter社)により分析した。
（2）  Src活性化部位の確認
1．方法
生細胞の細胞膜中におけるSrc活性化部位を調べるため、膜貫通型蛍光インジケーターTM-Srcus（図1a）を使用した。【００５３】
すなわち、TM-SrcusはSrc基質ドメイン、リン酸化認識ドメイン、リンカー配列、及び２つのGFP変異体を含む融合タンパク質である。活性化されたSrcによってTM-SrcusのSrc基質ドメイン中のチロシンにおいてリン酸化を受けるとき、隣接するリン酸化認識部位はこのリン酸化チロシンと特異的に結合する。この結合が起こるとき、TM-Srcus中のシアン蛍光タンパク質(CFP)と黄色蛍光タンパク質(YFP)との間の距離はより短くなることが予想され、分子内蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)応答が生じる（図1a）。発光比率は、CFPの蛍光強度をYFPの傾向強度で割ったものである。FRETが誘発されている場合、CFPの蛍光強度は増加し、YFPの蛍光強度は減少する。発光比率は結果として減少する。これによって、このインジケーターは、FRETによるCFP/YFP発光比率の減少としてin vivoにおけるSrcの活性化を測定する。細胞膜や細胞内オルガネラ膜等の生体膜全領域におけるSrcの活性化を直接検出するために、TM-Srcusは細胞膜に高い親和性を有する膜貫通ドメインを有する。このドメインは、パルミトイル化されたシステイン残基及び疎水性膜貫通配列からなる脂質化シグナル配列と共に、生体膜にこのインジケーターを局在させる。従って、インジケーターは、生体膜全体におけるSrcの活性化をモニターすることができる（図1a）。
2．結果
全反射型蛍光顕微鏡（TIRFM）のもとにおいて、TM-Srcusを発現しているMCF-7細胞を観察した。TIRFMは接触領域から約100nmの奥行きの範囲内における蛍光イメージを提供し、細胞の基底細胞膜の選択的可視化を可能にする（Steyer, J.A. & Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 268-275, 2001）。TM-Srcusを発現している細胞は、エストロゲン受容体を通じてSrcを活性化する17β-エストラジオール（E2）を用いて刺激した。CFP/YFP発光比率を表す疑似カラーイメージは、1μM E2による刺激に反応した基底細胞膜上での局所的な青色へのシフトを示した（図2a左部及び中間部）。このことは、Srcの活性化が細胞質膜の空間的に限られた領域において起こることを示す。【００５４】
次に、脂質ラフトマーカーAlexa 647-コレラトキシンBサブユニット（CTXB2）（Simons, K. & Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39, 2000）を用いてMCF-7細胞を染色した。Srcの活性化を表す青色にシフトした領域は、脂質ラフトマーカーが集中している対象領域1（ROI1）に位置する。一方、脂質ラフトマーカーが集中していない対象領域2（ROI2）は、この青色にシフトした領域を含まなかった（図2a中間部及び右部、及び図2b）。これらの結果から、E2で刺激した際に細胞膜内の空間的に限られた脂質ラフトにおいてSrcの活性化が引き起こされていることが示唆される。このことをさらに裏付けるために、TM-Srcusを発現している細胞の全溶解物を低密度画分、高密度画分、及び核成分を分画した後の上清画分に分離する密度勾配分画を行った。これらの勾配画分を、HRP-結合CTXBと、別のラフトマーカータンパク質（Zajchowski, L.D. & Robbins, S.M. Lipid rafts and little caves. Compartmentalized signalling in membrane microdomains. Eur. J. Biochem. 269, 737-752, 2002）として知られているカベオリン1に対する抗体を用いてブロッティングした。脂質ラフトは低密度画分内に分画され、非ラフト領域及び細胞質は高密度画分に分画されたことを確認した（図2c）。抗pTyr抗体による低密度画分と高密度画分のイムノブロッティングは、1μM E2によって刺激した際の活性化されたSrcによるTM-Srcusのリン酸化が低密度（脂質ラフト）画分（図2c）においてのみ生じることを示す。このことは、E2によって誘発されたSrcの活性化を表す図2a中の青色にシフトした領域が原形質膜中の脂質ラフトを正確に網羅していることを示す。さらに、この低密度画分におけるTM-Srcusのリン酸化が生理学的濃度の10nM E2によって誘導されることを確認した。さらに、このTM-Srcusの脂質ラフトに特異的なリン酸化はその他の性ホルモン（例えば、男性ホルモンのジヒドロテストステロン(DHT)、及びプロゲステロン(P4)（図2c））によって誘導されたが、これらは受容体を通じてSrcを活性化することが知られている（Losel, R. & Wehling, M. Nongenomic actions of steroid hormones. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 46-56, 2003）。したがって、性ホルモンE2、DHT、及びP4はそれぞれ、MCF-7細胞中の脂質ラフトにおいてのみSrcの活性化を誘発することが結論付けられる。【００５５】
次に、細胞膜中のSrc自体の分布を調べるため、低密度画分及び高密度画分に対して抗Src抗体を用いてイムノブロッティングを行った。Srcは、性ステロイドホルモンによる刺激の有無に関わらず、低密度（脂質ラフト）画分及び高密度（非ラフト及び細胞質）画分の両方に分布していることが確認された（図2c）。この結果と抗pTyr抗体を用いたイムノブロッティングの結果により、脂質ラフト中のSrcのみが性ステロイドによって活性化されることが確認された。【００５６】
次に、Srcは何故、性ステロイドによって独占的に脂質ラフト中で活性化されるのについて検討した。本願発明者らは最近、エストロゲン処理したMCF-7細胞中でSrcが、その活性化のためにER単独とはではなく、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)及びエストロゲン受容体（ER）の両方と一つの複合体を形成することを見出している（未発表）。細胞膜内におけるEGFR/ER/Src複合体の構成成分EGFR、ER、及びSrcの分布を、それぞれ抗Src抗体、抗EGFR抗体、及び抗ER抗体を用いて、MCF-7細胞溶解物由来の低密度画分及び高密度画分に対するウェスタンブロッティングによって分析した。その結果、Srcそれ自体だけでなく、EGFR及びERも、E2によってMCF-7細胞を刺激した際に、脂質ラフト内に移行することが見出された（図2d及びe）。したがって、脂質ラフト特異的なSrcの活性化は、その場所でのEGFR/ER/Src複合体の形成によるものであると結論付けることができる。
（3）  脂質ラフトにおけるSrc活性に対するSIFPの阻害効果
1．方法
脂質ラフト特異的なSrcの活性化を阻害する分子として脂質ラフト局在型SIFPを作成し、その効果を確認した。【００５７】
この実施例で作成したSIFPは、YFP、フラッグタグ、Src阻害ペプチド、脂質ラフト局在化ペプチド（H-RasのC末端9アミノ酸：CMSCKCVLS）からなる。また、生体膜の非脂質ラフトに局在させる分子として、Src阻害ペプチドのC末端にRho-AのC末端5アミノ酸(GCLVL)を連結した融合タンパク質を作成した（図3a上段）。さらに、Src阻害ペプチドのアラニン変異体を有する融合タンパク質（図3a中段）、Src阻害ペプチドを持たない融合タンパク質（図3a下段）を作成した。【００５８】
これらの融合タンパク質について、Src活性の阻害効果や、癌細胞に対する効果を試験した。
2．結果
脂質ラフトへと局在化するSIFP（以下、脂質ラフト局在型SIFP）は、脂質ラフトマーカーAlexa-647CTXBと共に局在するが、非脂質ラフトへと局在化するSIFP（以下、非ラフト局在型SIFP）はこのラフトマーカーと共に局在しなかった（図3b）。これらのSIFPの細胞内局在は密度勾配分画を用いてさらに確認した。低密度画分及び高密度画分を、抗フラッグ抗体を用いた免疫沈降に供し、次に、抗GFP抗体（Gagnoux-Palacios, L. et al. Compartmentalization of integrin alpha6beta4 signaling in lipid rafts. J. Cell Biol. 162, 1189-1196, 2003）を用いたイムノブロッティングに供した。脂質ラフト局在型SIFPは低密度（脂質ラフト）画分に局在し、非ラフト局在型SIFPは高密度（非ラフト及び細胞質）画分に局在した（図3c）。脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPは、細胞膜の脂質ラフト領域中及び非ラフト領域中にそれぞれ特異的に局在することが、これらの結果から明らかに示される。
次に、脂質ラフトにおけるSrc活性に及ぼす脂質ラフト局在型SIFPの阻害効果について検討するため、脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPがMCF-7細胞中でSrcによってリン酸化されるか否かを調べた。脂質ラフト又は非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞由来の低密度画分及び高密度画分を、抗pTyr抗体を用いて免疫沈降し、抗GFP抗体を用いてイムノブロッティングした。脂質ラフト局在型SIFPはMCF-7細胞の脂質ラフト中においてのみリン酸化されており、脂質ラフト中のこのリン酸化は、特異的Srcファミリーキナーゼ阻害剤PP2によってブロックされた（図3c）。この結果から、脂質ラフト局在型SIFPが脂質ラフト中においてのみSrcキナーゼ活性を特異的に阻害することが確認された。非ラフト局在型SIFPは細胞膜中の非ラフト領域でリン酸化されておらず（図3c）、このことはSrcの活性化が細胞膜の非ラフト領域では起こらないことを示す。
次に、脂質ラフト又は非脂質ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞の細胞接着について調べた。SIFPをトランスフェクトしたMCF-7細胞の接着の度合を測定し、接着している蛍光陽性細胞数を最初にプレーティングした蛍光陽性細胞数で割った接着指数(adhesion index)として表した。脂質ラフト局在型SIFPはインテグリンリガンドのひとつであるフィブロネクチンに接着する細胞の数を顕著に減少させた。対照的に、阻害ペプチドを持たない脂質ラフト局在型SIFP Del（図3a下段）はフィブロネクチンに対する細胞接着を損なわなかった（図4a）。脂質ラフト局在型SIFPに比べその阻害効果が１／６０に低減されている脂質ラフト局在型SIFP Y6A（図3a中段）と非ラフト局在型SIFPもMCF-7細胞の細胞接着を抑制しなかった（図4a）。また、前記と同様にして脂質ラフト又は阻害ペプチドを持たない脂質ラフト局在型SIFP Del（コントロール）を発現しているヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞接着について調べた。結果は図8に示したとおりであり、HEK293細胞においては脂質ラフト局在型SIFPと阻害ペプチドを持たない脂質ラフト局在型SIFP Delは同程度の接着指数を示した。すなわち、乳癌細胞（MCF-7細胞）における結果（図4）とは明らかに異なり、脂質ラフト局在型SIFPはヒト正常細胞の細胞接着を阻害しないことが確認された。
さらに、脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPがMCF-7細胞の細胞周期に影響を与えるか否かについて検討した。脂質ラフト又は非ラフト局在型SIFPをトランスフェクトしたMCF-7細胞のDNA含量をヨウ化プロピジウム(PI)染色を用いるフローサイトメトリーによりアッセイした。SIFPを発現しているYFP陽性細胞の細胞周期プロファイルをこのアッセイを用いて取得した（図4b）。脂質ラフト及び非ラフト局在型YFPの細胞周期プロファイルを、脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞における細胞周期の進行に対する対照としてそれぞれ使用した。脂質ラフト局在型SIFPは、G1期にある細胞に対するG2/M期にある細胞の割合を減少させたが、脂質ラフト局在型SIFP Y6Aはこの割合を減少させなかった（図4b上段）。一方、非ラフト局在型SIFPを発現しているYFP陽性細胞の細胞周期プロファイルは、非ラフト局在型YFPを発現しているYFP陽性細胞の細胞周期プロファイルと同様である（図4b下段）。また、非ラフト局在型SIFP Y6Aは非ラフト局在型YFPと同様の細胞周期プロファイルを示した（図4b下段）。一方、ヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞周期に対する脂質ラフト局在型SIFPの効果は、図9に示したとおり、阻害ペプチドを持たない脂質ラフト局在型SIFP Del（コントロール）と同程度であった。【００５９】
これらの結果は、MCF-7細胞の細胞周期が脂質ラフト中におけるSrc活性の阻害により停止することを示す。脂質ラフト局在型SIFPは脂質ラフト中のSrc活性を阻害することができ、それによって、細胞周期の進行と細胞の細胞接着が防止された。これに対して、脂質ラフト局在型SIFPはヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞周期および細胞接着には効果を示さなかった。このことは、脂質ラフト局在型SIFPが、副作用の少ない抗癌剤成分として有望であることを示している。
以前の研究において、Src基質であるインテグリンα6β4を脂質ラフトに局在しないよう改変した非パルミトイル化インテグリンα6β4がERKのリン酸化を低減し、有糸分裂生起を阻害することが示されている（Gagnoux-Palacios, L. et al. Compartmentalization of integrin alpha6beta4 signaling in lipid rafts. J. Cell Biol. 162, 1189-1196, 2003）。しかし、インテグリンα6β4、又はSrc等の上流のキナーゼのどちらのキナーゼが、この脂質ラフト特異的なインテグリンシグナル伝達カスケードの初期ステップを制御するのかは、内在性のSrc及びインテグリンが細胞膜中に遍在的に分布していることから、明確にされていなかった。Srcの活性化が脂質ラフト中で起こり、それにより細胞周期の進行が引き起こされるという知見は、Srcが脂質ラフト中のインテグリンシグナル伝達カスケードを引き起こし、有糸分裂生起により細胞周期の進行を制御するというプロセスを合理的に示唆するものである。【００６０】
病理学的な観点からは、細胞周期の進行及び腫瘍細胞の細胞接着は癌細胞の増殖や転移と密接に関連している。例えば、Src活性が結腸直腸腫瘍転移のフィルダーモデル由来転移細胞の細胞接着と関連すること（Jones, R.J. et al. Elevated c-Src is linked to altered cell-matrix adhesion rather than proliferation in KM12C human colorectal cancer cells. Br. J. Cancer. 87, 1128-1135, 2002）、Src依存的な細胞周期進行が腫瘍細胞増殖を促進すること（Summy, J.M. & Gallick, G.E. Src family kinases in tumor progression and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 22, 337-358, 2003）などが知られている。本願発明によって提供される空間的に限定されるSrc活性の阻害は、癌細胞の増殖や転移をより効果的に防止することを可能とする。
実施例２
セリン／スレオニンキナーゼAktの活性化部がミトコンドリアであることを確認した試験、および本願発明のAIFPが癌細胞特異的にその細胞周期の停止を誘導することを確認した実施例について説明する。
（１）材料および方法
基本的に、実施例１と同様の材料および方法に従って、ミトコンドリア局在化配列（配列番号４）とAkt阻害ペプチド（配列番号３）を含むAIFP（図５上段）の発現ベクターと、Akt阻害ペプチドを含まないコントロールAIFP（図５下段）の発現ベクターをそれぞれ構築した。【００６１】
これらの発現ベクターを実施例１と同様のヒト乳癌細胞由来MCF-7細胞に導入してAIFPおよびそのコントロールを発現させ、実施例１と同様に細胞染色し、またFACS分析した。
（2）  結果
AIFPをMCF-7細胞に導入し、ミトコンドリアマーカーで染色し、またAIFPのGFPを可視化した。結果は図６に示したとおりである。AIFPがミトコンドリアに局在して発現することが確認された。【００６２】
次に、AIFPを発現するMCF-7細胞の細胞周期プロファイルをフローサイトメトリーにより測定した。結果は図７に示したとおりであり、コントロールAIFP（図７右）と比較して、AIFP発現細胞では明らかにG2/M期の細胞数が増加していることから、Aktの活性化をミトコンドリアで特異的に抑制することにより、MCF-7細胞の細胞周期をG2/M期で停止可能であることが確認された。
実施例３
脂質ラフト局在型であり、かつ癌細胞膜透過性でるSIFPを作成し、その活性を試験した。
（１）材料
実施例１で作成した脂質ラフト局在型SIFP（図3a上段）のN末端に、細胞膜透過性ペプチド（１1個のアルギニンからなるペプチド）、癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列（PLGLAG：配列番号5）、細胞膜非透過性ペプチド（11個のグルタミンからなるペプチド）を連結した癌細胞膜透過性SIFP（図10）の発現ベクターを構築した。
（２）癌細胞膜透過性SIFPの癌細胞特異的プロテアーゼ（MMP）による切断
癌細胞膜透過性SIFP発現ベクターを大腸菌に導入し、ベクターから発現した癌細胞膜透過性SIFPをHis-tagカラムで生成した。この癌細胞膜透過性SIFPにMMPを添加した後、抗flag抗体を用いてウェスタンブロット分析した。【００６３】
結果は図11に示したとおりである。MMPで処理した場合のみ、癌細胞膜透過性SIFPから切断されたバンドが観察された。【００６４】
この結果から、癌細胞膜透過性SIFPは、MMPが存在する場合には、そのMMP認識配列が切断され、N末端側のポリグルタミン配列が切り離されることが確認された。
（３）癌細胞膜透過性SIFPの乳癌細胞MCF-7への取り込み
大腸菌で発現させ、精製した癌細胞膜透過性SIFP（1μM）を、培養MCF-7細胞の培地に添加した。そして、この培地へのプロテアーゼMMPの添加の有無による癌細胞膜透過性SIFPのMCF-7細胞への取り込みを、抗flag抗体を用いた免疫染色により観察した。【００６５】
結果は図12に示したとおりである。MMPを添加しない場合（図12上段）と比較して、MMPを添加した場合（図12下段）には、癌細胞膜透過性SIFPに結合した抗flag抗体からのシグナルが多く観察された。【００６６】
この結果から、癌細胞膜透過性SIFPはそのN末端のポリグルタミン配列（細胞膜非透過性ペプチド）がMMPによって切り離され、細胞膜透過性ペプチドが露出することによってMCF-7細胞に効率良く取込まれることが確認された。
（4）癌細胞膜透過性SIFPを取込んだMCF-7細胞の細胞増殖
精製した癌細胞膜透過性SIFP（１μM）、または癌細胞膜透過性SIFP（１μM）とMMPをMCF-7細胞の培地に添加し、それぞれの細胞増殖をした。【００６７】
図13は、培養開始から4日目の細胞数を、培養開始時の細胞数で割った値をグラフ化したものである。この図11の結果から明らかなように、癌細胞膜透過性SIFP＋MMPの条件で培養したMCF-7細胞は、培養4日後でもほとんど増殖しなかった。【００６８】
以上の結果は、MMPによる切断によって細胞膜透過性となったSIFPがMCF-7細胞に取込まれ、細胞の脂質ラフトでSrc活性を阻害し、その結果、乳癌細胞MCF-7の増殖が抑制されることを示している。
【図１】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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