【手続補正書】
【提出日】令和1年5月15日(2019.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含むことを特徴とする、変異ウイルス。
【請求項２】
手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の変異ウイルス。
【請求項３】
ウイルスがインフルエンザウイルスであり、インフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳまたはＭタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する１つ以上の位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含む、請求項１に記載の変異ウイルス。
【請求項４】
ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳまたはＭタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つ、３つまたは４つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する１つ以上の位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含む、請求項３に記載の変異インフルエンザウイルス。
【請求項５】
ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つ、３つまたは４つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する１つ以上の位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含む、請求項３に記載の変異インフルエンザウイルス。
【請求項６】
インフルエンザウイルスが、本明細書の表２ａ）、２ｂ）、２ｃ）、２ｄ）、２ｅ）、２ｆ）、２ｇ）、２ｈ）および２ｉ）に列挙される１つ以上の遺伝子座位内の１つ以上の位置においてＵＡＧコドンを含む、請求項３に記載の変異インフルエンザウイルス。
【請求項７】
インフルエンザウイルスが、ＰＡタンパク質のＲ２６６、ＰＢ１タンパク質のＲ５２、ＰＢ２タンパク質のＫ３３、および／またはＮＰタンパク質のＤ１０１をコードする核酸のコドンの位置においてＵＡＧコドンを含む、請求項３に記載の変異インフルエンザウイルス。
【請求項８】
ウイルス内のタンパク質が、ＵＡＧコドンに対応する位置において非天然アミノ酸を含み、好ましくは非天然アミノ酸が、式（Ｉ）
【化１】
2019500051.tif 000001
(I)
に示されるＬｙｓ−ジアジリン、式（ＩＩ）
【化２】
2019500051.tif 000002
(II)
に示されるＬｙｓ−アジド、またはジアジリンもしくはアジド構造を含む少なくとも１つの他の非天然アミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の変異ウイルス。
【請求項９】
非天然アミノ酸がｎ位に位置するＬｙｓ−ジアジリンであり、非天然アミノ酸が次の様式：
【化３】
2019500051.tif 000003
でウイルスタンパク質に連結し、
式中、Ｒ1からＲ2への向きが、アミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への向きであり、ｎ位がインフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳ、またはＭタンパク質のいずれか１つのアミノ酸配列の任意の位置であってよく、Ｒ1が１位からｎ−１位までのアミノ酸残基を表し、Ｒ2がｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸残基を表し、Ｒ3が、
【化４】
2019500051.tif 000004
であり、
好ましくは、ｎがタンパク質の開始コドンのｐ−１位下流からその天然の終止コドンのｑ位上流までの任意の位置であり、ｐおよびｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または全長のアミノ酸配列の長さから１引いたものと等しい値までから独立して選択される、請求項８に記載の変異ウイルス。
【請求項１０】
非天然アミノ酸がｎ位に位置するＬｙｓ−ジアジドであり、非天然アミノ酸が次の様式：
【化５】
2019500051.tif 000005
でウイルスタンパク質に連結し、
式中、Ｒ1からＲ2への向きが、アミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への向きであり、ｎ位がインフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳ、またはＭタンパク質のいずれか１つのアミノ酸配列の任意の位置であり得、Ｒ1が１位からｎ−１位までのアミノ酸残基を表し、Ｒ2がｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸残基を表し、Ｒ4が、
【化６】
2019500051.tif 000006
であり、
好ましくは、ｎがタンパク質の開始コドンのｐ−１位下流からその天然の終止コドンのｑ位上流までの任意の位置であり、ｐおよびｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または全長のアミノ酸配列の長さから１引いたものと等しい値までから独立して選択される、請求項８に記載の変異ウイルス。
【請求項１１】
タンパク質内の複数の位置において非天然アミノ酸を含む、請求項８から１０のいずれか１項に記載の変異ウイルス。
【請求項１２】
ウイルスがインフルエンザウイルスであり、ＰＡのＲ２６６、ＰＢ１のＲ５２、ＰＢ２のＫ３３、およびＮＰのＤ１０１において非天然アミノ酸を含む、請求項１１に記載の変異ウイルス。
【請求項１３】
ウイルスのタンパク質をコードする配列の内在性ＵＡＧ終止コドンが、ＵＡＡ終止コドンを提供するように変異している、請求項１から１２のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１４】
ウイルスがインフルエンザウイルスであり、
非変異ＰＢ２のアミノ酸配列が配列番号２に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＰＢ１のアミノ酸配列が配列番号３に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＰＡのアミノ酸配列が配列番号４に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＨＡのアミノ酸配列が配列番号５に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＮＰのアミノ酸配列が配列番号６に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＮＡのアミノ酸配列が配列番号７に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異Ｍのアミノ酸配列が配列番号８に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、または
非変異ＮＳのアミノ酸配列が配列番号９に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一である、
請求項３から１３のいずれか１項に記載の変異ウイルス。
【請求項１５】
変異ウイルスが、ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧであり、ＰＡタンパク質のＲ２６６、ＰＢ１タンパク質のＲ５２、ＰＢ２タンパク質のＫ３３、およびＮＰタンパク質のＤ１０１をコードするコドンの位置においてＵＡＧコドンを含む、請求項１４に記載の変異ウイルス。
【請求項１６】
ウイルスがヒトまたは他の動物起源のインフルエンザウイルス、好ましくは、インフルエンザＡ、ＢまたはＣウイルスである、請求項３に記載の変異ウイルス。
【請求項１７】
本明細書の表２ａ）〜２ｉ）および表４に列挙される１以上の変異を含む、請求項３に記載の変異ウイルス。
【請求項１８】
核酸分子が、天然終止コドンに加えて、人為的に導入されたＵＡＧをさらに含むことを特徴とする、請求項１から１７のいずれか１項に記載の変異ウイルスをコードする核酸分子またはそれによってコードされる変異タンパク質。
【請求項１９】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の変異ウイルスを調製するための方法であって、
（１）好適なベクターに作動可能に連結した１つ以上の変異遺伝子を含む変異核酸を含む発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む核酸を含む１つ以上の発現ベクターを、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異核酸を含む発現ベクターをｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
（２）トランスフェクトした細胞をＬｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドを含む培養培地中で培養するステップと、
（３）変異ウイルスを回収するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
ステップ（１）におけるプラスミドが、２０１１年６月１４日にＣｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：４９５１を有する大腸菌ｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳ内のプラスミドｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、またはｓｆ９細胞から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株が、２０１５年１１月１７日にＣＧＭＣＣに寄託され、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２の受託番号を有するＨＥＫ２９３−ＰＹＬである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
弱毒化ウイルスをスクリーニングする方法であって、
（１）遺伝子変異：ウイルスゲノム内の１つ以上の遺伝子の１つ以上の選択されたコドンを、遺伝子工学の方法によってＴＡＧコドンに変異させて１つ以上の変異遺伝子を得るステップと、
（２）発現ベクターの構築：ステップ（１）において得られた１つ以上の変異遺伝子を好適なベクターに作動可能に連結して、変異遺伝子の発現ベクターを得るステップと、
（３）ステップ（２）において得られた変異遺伝子の発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む遺伝子を含む１つ以上の発現ベクターを、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異遺伝子を含む発現ベクターをｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
（４）トランスフェクトされた細胞をＬｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドを含む培養培地中で培養し、培地の上清を収集し、Ｌｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドを含むプレートを用いて、非天然アミノ酸に対する上清中のウイルスの依存性を検出するステップと、
（５）非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドに対する依存性を維持する変異体を弱毒化ウイルスとして同定するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
ステップ（５）の後に、（６）ステップ（５）における成功裏に部位特異的変異させた候補の変異部位を組み合わせ、ウイルスを再パッケージングしてＵＡＧコドンが複数の遺伝子断片に導入され、非天然アミノ酸がパッケージングされたウイルス内の複数の対応するタンパク質に導入されるようにし、非天然アミノ酸に対するパッケージングされた生成物の依存性を再び検出し、長期間の継代の後に非天然アミノ酸に対する依存性を保持する組み合わされた変異体を、最適な部位特異的変異の候補として決定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（６）の後に、（７）ステップ（６）において得られた変異ウイルスの安全性を調べ、安全なウイルスを同定するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ウイルスが、手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
１つ以上の選択されたコドンが、コード配列のｎ位に独立して位置し、ｎがタンパク質の開始コドンのｐ−１位下流からその天然の終止コドンのｑ位上流までの任意の位置であり、ｐおよびｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または全長のアミノ酸配列の長さから１引いたものと等しい値までから独立して選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（３）におけるプラスミドが、２０１１年６月１４日にＣＧＭＣＣに寄託され、受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：４９５１を有する大腸菌ｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳ内のプラスミドｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、またはｓｆ９細胞から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株が、２０１５年１１月１７日にＣＧＭＣＣに寄託され、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２の受託番号を有するＨＥＫ２９３−ＰＹＬである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
変異、パッケージングおよびスクリーニングのステップが繰り返される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＡ、ＢまたはＣウイルスである、請求項２３から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含む組成物。
【請求項３５】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含むワクチン。
【請求項３６】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含む医薬組成物。
【請求項３７】
インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染を予防または治療するための生弱毒化ワクチンまたは関連する医薬の製造における、請求項１から１７のいずれか１項に記載の変異インフルエンザウイルスの使用。
【請求項３８】
インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染の予防または治療のための、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現することができ、２０１５年１１月１７日にＣＧＭＣＣに寄託され、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２の受託番号を有するＨＥＫ２９３−ＰＹＬである、哺乳動物細胞株。