【手続補正書】
【提出日】平成19年11月27日(2007.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のポリペプチドを検出する方法であって、該方法は
（ａ）第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物にサンプルを接触させるステップと、
（ｂ）第１のアプタマー構築物、第２のアプタマー構築物、およびポリペプチドの結合を検出方法により検出するステップと、
を含み、
（ｃ）第１のアプタマー構築物は前記ポリペプチドの第１のエピトープに結合でき、第２のアプタマー構築物はポリペプチドの第２のエピトープに結合でき、
（ｄ）第１アプタマー構築物は
（ｉ）第１のエピトープと結合できる第１のアプタマーと、
（ｉｉ）第１のシグナリングオリゴと、
（ｉｉｉ）第１の標識と
を含み、
（ｅ）第２のアプタマー構築物は
（ｉｖ）第２のエピトープと結合できる第２のアプタマーと、
（ｖ）第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴと、
（ｖｉ）第２の標識と
を含む、前記方法。
【請求項２】
第１と第２のシグナリングオリゴが、それぞれヌクレオチド５個〜ヌクレオチド７個からなる、請求項１の方法。
【請求項３】
第１のアプタマーは天然同族結合エレメント配列を含み、第２のアプタマーはインビトロ進化を用いて選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
第１の標識は蛍光ドナーであり、第２の標識は蛍光アクセプターである、請求項１の方法。
【請求項５】
第１の標識は蛍光アクセプターであり、第２の標識は蛍光ドナーである、請求項１の方法。
【請求項６】
検出方法が蛍光の変化を検出する請求項１の方法。
【請求項７】
検出方法が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によるものである請求項６の方法。
【請求項８】
第１のアプタマーと第２のアプタマーがインビトロ進化によって選択される請求項１の方法。
【請求項９】
ポリペプチドは元来は天然同族結合エレメント配列に結合しない請求項１の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドがトロンビンである請求項９の方法。
【請求項１１】
第１のアプタマーがトロンビンのヘパリンエクソサイトに結合し、第２のアプタマーがトロンビンのフィブリノゲンエクソサイトに結合する請求項１０の方法。
【請求項１２】
第１の標識がフルオレセインである請求項１１の方法。
【請求項１３】
検出方法が蛍光偏光である請求項１２の方法。
【請求項１４】
第２の標識がダブシルで、検出方法がフルオレセインの蛍光強度の変化を検出することである請求項１２の方法。
【請求項１５】
第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物がリンカーで連結されている請求項１の方法。
【請求項１６】
リンカーが柔軟なスペーサー１８リンカー（配列番号１７）である、請求項１の方法。
【請求項１７】
サンプル中の被分析物を検出する方法であって、該方法は
（ａ）第１のアプタマー構築物、第２のアプタマー構築物、およびポリペプチドにサンプルを接触させるステップと、
（ｂ）第１のアプタマー構築物、第２のアプタマー構築物、ポリペプチド、および被分析物の結合を検出方法により検出するステップと、
を含み、
（ｃ）被分析物の存在下で、第１のアプタマー構築物はポリペプチドの第１のエピトープに結合でき、第２のアプタマー構築物はポリペプチドの第２のエピトープに結合でき、
（ｄ）第１のアプタマー構築物は、第１のエピトープと結合できる第１のアプタマーと、第１のシグナリングオリゴと、第１の標識とを含み、
（ｅ）第２のアプタマー構築物は、第２のエピトープと結合できる第２のアプタマーと、第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴと、第２の標識とを含む、
前記方法。
【請求項１８】
第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴは、それぞれヌクレオチド５個〜ヌクレオチド７個からなる請求項１７の方法。
【請求項１９】
第１のアプタマーは天然同族結合エレメントの配列を含み、第２のアプタマーはインビトロ進化を用いて選択される請求項１７の方法。
【請求項２０】
第１の標識は蛍光ドナーであり、第２の標識は蛍光アクセプターである請求項１７の方法。
【請求項２１】
第１の標識は蛍光アクセプターであり、第２の標識は蛍光ドナーである、請求項１７の方法。
【請求項２２】
検出方法が蛍光の変化を検出する請求項１７の方法。
【請求項２３】
検出方法が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によるものである請求項２２の方法。
【請求項２４】
第１のアプタマーと第２のアプタマーはインビトロ進化を用いて選択される請求項１７の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが元々は天然同族結合エレメント配列に結合しない請求項１７の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが被分析物との結合の際に構造上の変化を起こす請求項１７の方法。
【請求項２７】
被分析物が薬物であり、前記ポリペプチドは該薬物に結合できる請求項２６の方法。
【請求項２８】
被分析物がスタチン薬物であり、前記ポリペプチドがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼである請求項２７の方法。
【請求項２９】
被分析物が環境中に見出される毒素である請求項１７の方法。
【請求項３０】
第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物がリンカーで連結されている請求項１７の方法。
【請求項３１】
リンカーが柔軟なスペーサー１８リンカー（配列番号１７）である請求項３０の方法。
【請求項３２】
第１と第２のアプタマー構築物を含むアプタマー構築物セットを作製する方法であって、該方法は
（ａ）第１のエピトープを含む第１の基質に対する第１のアプタマーを選択し、第２のエピトープを含む第２の基質に対する第２のアプタマーを選択することとを含むステップであって、第１のアプタマーは第１のエピトープに結合でき、第２のアプタマーは第２のエピトープに結合できるステップと、
（ｂ）第１の標識を第１のアプタマーに結合させ、第２の標識を第２のアプタマーにさせるステップと、
（ｃ）第１のシグナリングオリゴを第１のアプタマーに結合させ、第２のシグナリングオリゴが第２のアプタマーに結合させるステップであって、第２のシグナリングオリゴが第１のシグナリングオリゴに相補的であるステップと、
（ｄ）その結果（ｉ）第１のアプタマー構築物が第１のアプタマー、第１の標識、および第１のシグナリングオリゴを含み、（ｉｉ）第２のアプタマー構築物が第２のアプタマー、第２の標識、および第２のシグナリングオリゴを含むステップと
を含む前記方法。
【請求項３３】
第１の基質がポリペプチドであり、第２の基質が第１のアプタマーと結合したポリペプチドであり、第１のアプタマーが第１のエピトープをマスクする請求項３２の方法。
【請求項３４】
第１の基質がポリペプチドあるいは大分子複合体であり、第２の基質が第１のアプタマーと結合したポリペプチドあるいは大分子複合体であり、第１のアプタマーが（ａ）第１のシグナリングオリゴあるいは第１の標識上に結合され、（ｂ）第１のエピトープをマスクしている、請求項３２の方法。
【請求項３５】
第１の基質が本質的に第１のエピトープからなるポリペプチドの断片であり、第２の基質が本質的に第２のエピトープからなるポリペプチドの断片である請求項３２の方法。
【請求項３６】
第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが、各々ヌクレオチド５個〜ヌクレオチド７個からなる請求項３２の方法。
【請求項３７】
第１のアプタマーが天然同族結合エレメント配列を含み、第２のアプタマーはインビトロ進化を用いて選択される、請求項３２の方法。
【請求項３８】
第１の標識が蛍光ドナーであり、第２の標識が蛍光アクセプターである請求項３２の方法。
【請求項３９】
第１の標識が蛍光アクセプターであり、第２の標識が蛍光ドナーである請求項３２の方法。
【請求項４０】
第１のアプタマーと第２のアプタマーがインビトロ進化を用いて選択される請求項３２の方法。
【請求項４１】
柔軟なリンカーで第１のアプタマー構築物を第２のアプタマー構築物に連結するステップを含む請求項３２の方法。
【請求項４２】
第１のアプタマー、第１の標識、第１のシグナリングオリゴ、第２のアプタマー、第２の標識、第２のシグナリングオリゴおよびリンカを包む二価アプタマー構築物であって、第１のアプタマーが第１のエピトープに結合でき、第２のアプタマーが第２のエピトープに結合できる二価アプタマー構築物。
【請求項４３】
第１のエピトープと第２のエピトープが同一のポリペプチドの重複しない異なるエピトープである請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項４４】
リンカーが柔軟なリンカーである請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項４５】
リンカーがスペーサー１８リンカー（配列番号１７）である請求項４４の二価アプタマー構築物。
【請求項４６】
リンカーがデオキシチミジンポリマーである請求項４４の二価アプタマー構築物。
【請求項４７】
第１の標識が蛍光ドナーである請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項４８】
第２の標識が蛍光受容体である請求項４７の二価アプタマー構築物。
【請求項４９】
第１のシグナリングオリゴ及び第２のシグナリングオリゴは、ヌクレオチド５個〜ヌクレオチド７個からなる請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項５０】
第１のアプタマーが天然同族結合エレメント配列を含む請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項５１】
第２のアプタマーがインビトロ進化を用いて選択された、請求項５０の二価アプタマー構築物。
【請求項５２】
第１のアプタマーがインビトロ進化を用いて選択された請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項５３】
ポリペプチドがトロンビンであり、第１の標識がフルオレセインであり、第２の標識がダブシルであり、第１のエピトープがヘパリンエクソサイトであり、第２のエピトープがフィブリノゲンエクソサイトであり、リンカーがスペーサー１８（配列番号１７）である、請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項５４】
ポリペプチドがトロンビンであり、第１の標識がフルオレセインであり、第２の標識がダブシルであり、第１のエピトープがヘパリンエクソサイトであり、第２のエピトープがフィブリノゲンエクソサイトであり、リンカーがスペーサー１８（配列番号１７）である請求項４３の二価アプタマー構築物。
【請求項５５】
第１の標識が結合された第１のエピトープ結合剤および第２の標識が結合された第２のエピトープ結合剤を含むキットであって、
（ａ）第１のエピトープ結合剤と第２のエピトープ結合剤が、それぞれポリペプチドの第１のエピトープとポリペプチドの第２のエピトープに結合した時（ｂ）第１の標識と第２の標識が相互作用して観測可能なシグナルを生み出す、キット。
【請求項５６】
第１のエピトープ結合剤が抗体である請求項５５のキット。
【請求項５７】
第１のエピトープの結合剤は第１のアプタマー構築物であり、第１のアプタマー構築物は第１のアプタマー、第１の標識、および第１のシグナリングオリゴが含む請求項５５のキット。
【請求項５８】
第２のエピトープ結合剤が第２のアプタマー構築物であり、第２のアプタマー構築物は第２の標識と第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴを含む、請求項５７のキット。
【請求項５９】
第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴがヌクレオチド５個〜ヌクレオチド７個の長さである請求項５８のキット。
【請求項６０】
第１のアプタマーが天然同族結合エレメント配列を含む、請求項５８のキット。
【請求項６１】
第２のアプタマーがインビトロ進化を用いて選択される、請求項５８のキット。
【請求項６２】
第１の標識は蛍光ドナーであり、第２の標識は蛍光受容体である請求項５５のキット。
【請求項６３】
第１の標識がフルオレセインで第２の標識がダブシルである請求項６２のキット。
【請求項６４】
被分析物と結合できるポリペプチドをさらに含む請求項５５のキット。
【請求項６５】
キットを使用するためのプリントされた指示のセットをさらに含む請求項５５のキット。
【請求項６６】
疾病を診断する方法であって、該方法は
（ａ）患者からサンプルを得るステップと、
（ｂ）第１のエピトープ結合剤と第２のエピトープ結合剤に該サンプルを接触させるステップと、
（ｃ）該サンプル中のポリヌクレオチドの存在を検出方法を用いて検出するステップと、
を含み、該サンプル中の前記ポリペプチドの存在は患者に疾病があるかどうかを示す、疾病を診断する方法。
【請求項６７】
（ａ）第１のエピトープ結合剤は第１の標識と第１のシグナリングオリゴが結合された第１のアプタマーであり、（ｂ）第２のエピトープ結合剤は第２の標識と第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴが結合した第２のアプタマーであり、（ｃ）検出方法は蛍光検出法であり、
（ｄ）第１のアプタマーがポリペプチドに結合し第２のアプタマーもポリペプチドに結合した時、（ｅ）第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが互いに結合し、（ｆ）第１の標識が第２の標識に接近して蛍光の変化が起こる、請求項６６の方法。
【請求項６８】
サンプルが、血液、尿、腹水、および組織サンプルからなる群から選択される請求項６６の方法。
【請求項６９】
患者がヒトである請求項６６の方法。
【請求項７０】
疾病を診断する方法であって、該方法は
（ａ）患者からサンプルを得るステップと、
（ｂ）第１のエピトープ結合剤、第２のエピトープ結合剤、および第１のエピトープと第２のエピトープを含むポリペプチドにサンプルを接触させるステップと、
（ｃ）サンプル中の、前記ポリペプチドに結合できる被分析物の存在を検出方法を用いて検出するステップと、
を含み、前記分析物の存在は疾病が患者にあるかを示す、疾病を診断する方法。
【請求項７１】
（ａ）第１のエピトープ結合剤は第１の標識と第１のシグナリングオリゴが結合した第１のアプタマーであり、（ｂ）第２のエピトープ結合剤は第２の標識と、第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴとが結合した第２のアプタマーであり、（ｃ）検出方法は蛍光検出法であり、
（ｄ）被分析物がポリペプチドに結合した時、（ｅ）第１のアプタマーがポリペプチドに結合し、第２のアプタマーもポリペプチドに結合し、（ｆ）第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが互いに結合し、（ｇ）第１の標識が第２の標識に接近して蛍光の変化が起こる、請求項７０の方法。
【請求項７２】
サンプルが、血液、尿、腹水、および組織サンプルからなる群より選択される請求項７０の方法。
【請求項７３】
患者がヒトである請求項７０の方法。
【請求項７４】
有用な試薬についてサンプルをスクリーニングする方法であって、
（ａ）第１のエピトープ結合剤と第２のエピトープ結合剤にサンプルを接触させるステップと、
（ｂ）検出方法を用いてサンプル中の有用な試薬の存在を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項７５】
有用な試薬が第１のエピトープと第２のエピトープを含むポリペプチドである請求項７４の方法。
【請求項７６】
被分析物と結合できるポリペプチドにサンプルを接触させるステップをさらに含み、前記有用な試薬が被分析物である、請求項７４の方法。
【請求項７７】
前記有用な試薬が潜在的な治療組成物である、請求項７４の方法。
【請求項７８】
（ａ）第１のエピトープ結合剤が、第１の標識と第１シグナリングオリゴが結合した第１のアプタマーであり、（ｂ）第２のエピトープ結合剤が、第２の標識と第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴが結合した第２のアプタマーであり、（ｃ）検出方法が蛍光検出法であり、（ｄ）第１のアプタマーがポリペプチドに結合するとき、また第２のアプタマーとポリペプチドが結合した時、（ｅ）第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが互いに結合し、（ｆ）第１の標識が第２の標識に接近して蛍光の変化が起こる、請求項７４の方法。
【請求項７９】
有用な試薬が第１のエピトープと第２のエピトープとを含むポリペプチドである、請求項７８の方法。
【請求項８０】
被分析物に結合できるポリペプチドにサンプルを接触させるステップをさらに含み、有用な試薬が被分析物である、請求項７８の方法。
【請求項８１】
有用な試薬は潜在的な治療組成物である、請求項７８の方法。
【請求項８２】
請求項４２〜５４のいずれか一項の二価アプタマー構築物を含む薬理学的組成物。
【請求項８３】
サンプル中の分子間相互作用を促進する方法であって、請求項４２〜５４のいずれか一項の二価アプタマーをサンプルに投与するステップを含み、第１のエピトープと第２のエピトープは異なる分子上にあり、第１のエピトープと第２のエピトープは接近して分子間相互作用を行う、サンプル中の分子間相互作用を促進する方法。
【請求項８４】
サンプルが細胞、組織、脳脊髄液、血液、インビトロ反応混合液、および環境システムからなる群から選択される請求項８３の方法。
【請求項８５】
サンプル中のポリペプチドを検出する方法であって、該方法は
（ａ）第１の分子認識構築物と第２の分子認識構築物にサンプルを接触させるステップと、（ｂ）検出方法を用いて第１の分子認識構築物、第２の分子認識構築物、およびポリペプチドの結合を検出するステップと
を含み、
（ｃ）第１の分子認識構築物はポリペプチの第１のエピトープと結合でき、第２の分子認識構築物はポリペプチドの第２のエピトープと結合でき、
（ｄ）第１の分子認識構築物は（ｉ）第１のエピトープに結合できる第１のエピトープ結合剤と、（ｉｉ）第１のシグナリングオリゴと、（ｉｉｉ）第１の標識とを含み、
（ｅ）第２の分子認識構築物は（ｉｖ）第２のエピトープに結合できる第２のエピトープ結合剤と、（ｖ）第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴと、（ｖｉ）第２の標識とを含む、
サンプル中のポリペプチドを検出する方法。
【請求項８６】
第１のエピトープ結合剤がアプタマーである請求項８５の方法。
【請求項８７】
第２のエピトープ結合剤がアプタマーである請求項８６の方法。
【請求項８８】
第２のエピトープ結合剤が抗体である請求項８６の方法。
【請求項８９】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである請求項８６の方法。
【請求項９０】
第１のエピトープ結合剤が抗体である請求項８５の方法。
【請求項９１】
第２のエピトープ結合剤が第２の抗体である請求項９０の方法。
【請求項９２】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項９０の方法。
【請求項９３】
第１のエピトープ結合剤がポリペプチドへの第１の結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項８５の方法。
【請求項９４】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの第２の結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項９３の方法。
【請求項９５】
検出方法が、プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光相互相関分光（ＦＣＣＳ）、蛍光消光、蛍光偏光、着色物産生、化学発光、シンチレーション、生物発光、および発光共鳴エネルギー移動からなる群から選択される、請求項８５〜９４のいずれか一項の方法。
【請求項９６】
検出方法が発光共鳴エネルギー移動である請求項９５の方法。
【請求項９７】
ポリペプチドがトロンビンあるいはｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質（ＣＰＲ）である、請求項８５〜９６のいずれか一項の方法。
【請求項９８】
サンプルが、血液、尿、腹水、細胞サンプル、および組織サンプルからなる群より選択される、請求項８５〜９７のいずれか一項の方法。
【請求項９９】
第１の分子認識構築物と第２の分子認識構築物とを含む分子ビーコンであって、
（ａ）第１の分子認識構築物はポリペプチドの第１のエピトープと結合でき、また第２の分子認識構築物はポリペプチドの第２のエピトープと結合することができ、
（ｂ）第１の分子認識構築物は（ｉ）第１のエピトープに結合できる第１のエピトープ結合剤と、（ｉｉ）第１のシグナリングオリゴと（ｉｉｉ）第１の標識とを含み、
（ｃ）第２の分子認識構築物は（ｉｖ）第２のエピトープに結合できる第２のエピトープ結合剤と、（ｖ）第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴと、（ｖｉ）第２の標識とを含む、
分子ビーコン。
【請求項１００】
第１のエピトープ結合剤がアプタマーである、請求項９９の分子ビーコン。
【請求項１０１】
第２のエピトープ結合剤がアプタマーである、請求項１００の分子ビーコン。
【請求項１０２】
第２のエピトープ結合剤が抗体である請求項１００の分子ビーコン。
【請求項１０３】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの結合部位を包む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項１００の分子ビーコン。
【請求項１０４】
第１のエピトープ結合剤が抗体である、請求項９９の分子ビーコン。
【請求項１０５】
第２のエピトープ結合剤が第２の抗体である、請求項１０４の分子ビーコン。
【請求項１０６】
第２のエピトープの結合剤がポリペプチドへの結合部位を包む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項１０４の分子ビーコン。
【請求項１０７】
第１のエピトープ結合剤がポリペプチドへの第１の結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項９９の分子ビーコン。
【請求項１０８】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの第２の結合部位を包む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項１０７の分子ビーコン。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
生物あるいは環境サンプル中の特定タンパク質のレベルを検出および測定する簡便な方法が強く求められ続けている。タンパク質を検出しそのレベルを測定することは生物医学研究における最も基礎的でかつよく行われる方法の一つである。抗体ベースのタンパク質検出方法は研究および医学的診断において非常に有用であるが、迅速かつハイ・スループット（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）な並列蛋白質検出（ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）によく適合するものではない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の別の実施形態では本願は、ポリペプチドあるいは大分子複合体の第１のエピトープを認識し第１のシグナリングオリゴを含む第１のアプタマー構築物と、ポリペプチドあるいは大分子複合体の第２のエピトープを認識し第２のシグナリングオリゴを含む第２のアプタマー構築物とを含む二価アプタマーに関係し、ここで第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物は柔軟なリンカーによって互いに結合されている。好ましい実施形態では、第１のアプタマー構築物は第１の標識を含み、第２のアプタマー構築物は検出のための第２の標識を含む。