【手続補正書】
【提出日】平成19年3月19日(2007.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗マラチオンモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子であって、当該抗マラチオンモノクローナル抗体の重鎖可変領域が、以下のｉ）及びｉｉ）：
ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１−１１５を有するアミノ酸配列；
ｉｉ）上記ｉ）のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、抗原結合部位を形成してマラチオンと相互作用することが可能である、前記遺伝子。
【請求項２】
抗マラチオンモノクローナル抗体の重鎖可変領域が、以下のｉ）:
ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１−１１５
のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列１−３４５を有する、請求項１または２に記載の遺伝子。
【請求項４】
抗マラチオンモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子であって、当該抗マラチオンモノクローナル抗体の軽鎖可変領域が、以下のｉ）−ｉｉ）：
ｉ）配列番号４のアミノ酸残基１−１１３を有するアミノ酸配列；
ｉｉ）上記ｉ）のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、抗原結合部位を形成してマラチオンと相互作用することが可能である、前記遺伝子。
【請求項５】
抗マラチオンモノクローナル抗体の軽鎖可変領域が、以下のｉ）：
ｉ）配列番号４のアミノ酸残基１−１１３
のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号３の塩基配列１−３３９を有する、請求項４または５に記載の遺伝子。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項８】
プラスミドである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
宿主細胞内で自己増殖可能な請求項７または８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項７ないし９のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
抗マラチオンモノクローナル抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域を含む組換えタンパク質を製造する方法であって、請求項７ないし９のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を、抗マラチオンモノクローナル抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域の発現を促進する条件下で培養し、そして、当該培養物から抗マラチオンモノクローナル抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域を含む組換えタンパク質を回収することを含む方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法によって製造された、抗マラチオンモノクローナル抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域を含む組換えタンパク質。
【請求項１３】
抗マラチオンモノクローナル抗体の重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域がリンカーで結合されている、請求項１２の組換えタンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
近年、土壌、水、大気等の環境中での残留農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハーベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられている。マラチオンについては、食品衛生法に基づき残留基準値が、米（０．１ｐｐｍ）、穀類（２−８ｐｐｍ）、豆類、果実、野菜（０．５−８ｐｐｍ）、小麦粉（１．２ｐｐｍ）、オイルシード（０．１−８ｐｐｍ）、ナッツ類（８ｐｐｍ）、ホップ（１ｐｐｍ）等定められている（「最新農薬の残留分析法」  同上）。さらに、水質に関しても、水質汚濁に係る登録保留基準値が０．１ｍｇ／ｌと定められている（改訂３版  農薬登録保留基準ハンドブック  第８７４頁−第８７６頁  １９９８年９月２５日  化学工業日報社）。よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これらに含有される、マラチオンの量を迅速かつ正確に測定することが必要である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
ｉｉｉ）ｋ＝１かつＺ＝ＮＨの場合
先ず、式（Ｙ２）の化合物の合成と同様に、五硫化二リンに有機溶媒中、メタノールを反応させる。次いで、塩基を加え、さらに、以下の式（Ｙ１０）：
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
例えば、保護基としてベンジルオキシカルボニル基を導入する場合、水中、塩基の存在下、ベンジルオキシカルボニルクロリドを反応させて、保護基を（Ｙ１７）の化合物に導入する。塩基としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン等を用いることができる。反応は、０℃から溶媒の沸点、好ましくは０℃から８０℃で、１時間から２０時間、好ましくは１時間から３時間行う。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
例えば、Ｐがベンジル基、Ｐ’がベンジルオキシカルボニル基の場合、除去は水素による加水素分解によって行うことができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
［式（Ｙ２１）中、Ｐ’、ｋおよびｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
さらに、上記ハプテン化合物を適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として用いて、慣用化された方法に従って、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作成する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
マラチオンハプテンと高分子化合物との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４２，  ３０１−３０９（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４，  １０９０‐１０９４（１９５４））等の公知の方法によって行うことができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
本発明者らは、前記課題解決を目的として鋭意研究に努めた結果、抗マラチオンモノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、本発明を完成した。以下、詳述する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
限定されるわけではないが、本発明の組換えタンパク質の発現においてファージを利用する場合、目的のタンパク質の選抜とそれをコードするＤＮＡの回収を同時に行えるという利点が得られる。具体的には、本発明の抗マラチオン抗体をコードする遺伝子を得る際にＰＣＲを用い得るが、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の際には、ある一定の割合で塩基の置換や脱落などのエラーが生じる可能性がある。１塩基でもエラーが生じれば、組換えタンパク質のアミノ酸配列にも変化が生じ、それによってマラチオンに対する反応性も変化すると考えられる。組換えタンパク質をコードするｃＤＮＡをファージに導入した場合、組換えタンパク質を発現した大量のファージをパンニングによりマラチオンと反応するクローンを一度に選抜し、それと同時に得られたクローンを大腸菌に感染させることで目的のＤＮＡを容易に獲得できる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
[表３］
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
１．２３−１．３５（３Ｈ，ｔ）、２．９０−３．１８（２Ｈ，ｍ）
３．７６−３．８７（６Ｈ，ｄ）、４．０６−４．２９（３Ｈ，ｍ）
（５）の合成
２．４６ｇ（８．１ｍｍｏｌ）の（４）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌに溶解し、この溶液を塩−氷で冷却しながら０．８２ｇ（８．１ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）のＴＨＦ溶液１０ｍｌ、次いでクロル蟻酸イソブチル１．１ｇ（８．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液１０ｍｌを滴下した。１０分間撹拌後に、１．５ｇ（８．１ｍｍｏｌ）の６−アミノヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのＴＨＦ溶液１０ｍｌを滴下した。５分間氷冷下で撹拌後、４℃で２０分、更に室温で１０分撹拌した。溶媒を留去後に残渣をジクロロメタンで再溶解させて、水洗、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１）で粗精製した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
[表７]
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
１．２０−１．３１（３Ｈ，ｔ）、２．８４−３．１１（２Ｈ，ｍ）
３．７２−３．８８（６Ｈ，ｍ）、４．０６−４．２７（３Ｈ，ｍ）
（５）の合成
１．５ｇ（５ｍｍｏｌ）の（４）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌに溶解し、この溶液を塩−氷で冷却しながら０．６７ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）のＴＨＦ溶液５ｍｌ、次いで０．９ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のクロル蟻酸イソブチルのＴＨＦ溶液５ｍｌを滴下した。２０分間撹拌後に、１．１ｇ（５．９ｍｍｏｌ）の６−アミノヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのＴＨＦ溶液５ｍｌを滴下した。３０分間氷冷下で撹拌後、更に室温で１５分撹拌した。溶媒を留去後に残渣をジクロロメタンで再溶解させて、水洗、脱水（無水硫酸マグネシウム）、ろ過、濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）で精製すると、透明油状物として３９０ｍｇ（収率１６％）の（５）を得た。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
【化３１】
2001275682.tif 000001
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
【化３２】
2001275682.tif 000002
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
（２）の合成
硫酸１０ｍｌをジエチルエーテル１００ｍｌに加えた後、撹拌しながらベンジルアルコール１００ｍｌを加えた。ジエチルエーテルを留去後に１３．４ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＬ−アスパラギン酸を少しずつ加えた。室温で１日撹拌後に、エタノール２００ｍｌとピリジン５０ｍｌを加えて、一晩冷蔵庫に放置した。析出した結晶をろ別し、エーテルと水で洗浄した後に乾燥させると、１１ｇ（収率４９％）の（２）を得た。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
各ウェルの反応性を定性的にスクリーニングした後、マラチオンとの反応性を示したウェルのハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングした。このようにして、マラチオンに反応性を有する抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞を３株（ＭＬＴ２−２３、ＭＬＴ４０−４、ＭＬＴ４５−３）分離した。これらの３株はいずれもマラチオンハプテン−５／ＫＬＨを抗原として得られたハイブリドーマである。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４５】
表２８において、ＩＣ５０は、反応を５０％阻害する化合物の濃度であり、交差反応率はマラチオンのＩＣ５０値／各化合物のＩＣ５０値×１００である。表２８より、モノクローナル抗体ＭＬＴ２−２３は、マラチオンの代謝物であるマラオクソンと１．６％の交差反応性を示したものの、他の化合物に対してはすべて１％以下しか交差反応をせず、マラチオンに対する高い特異性を持つことが明らかとなった。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５２】
両反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、軽鎖定常領域をコードする約３００ｂｐのｃＤＮＡ断片と重鎖定常領域をコードする約９００ｂｐのｃＤＮＡ断片の増幅を確認した。これらのｃＤＮＡ断片はＧｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ（Ｂｉｏ１０１より購入）を用いて付属の説明書に従ってアガロースゲルから抽出し、重鎖定常領域ｃＤＮＡを４５１Ｇ、軽鎖定常領域ｃＤＮＡを４５１Ｋとした。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５３】
（３）ＭＬＴ２−２３細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
（１）で調製・増幅したＭＬＴ２−２３細胞ｃＤＮＡライブラリーを、（２）で調製した重鎖定常領域ｃＤＮＡ断片（４５１Ｇ）および軽鎖定常領域ｃＤＮＡ断片（４５１Ｋ）をプローブに用いて付属の説明書に従い、プラークハイブリダイゼーション法によるスクリーニングを行った。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５６】
（４）抗マラチオン組換え抗体遺伝子ＭＬＴ２−２３ｓｃＦｖの構築
（３）で得られた重鎖ｃＤＮＡクローンＧ２０８および軽鎖ｃＤＮＡクローンＫ２１１を用いて、ＭＬＴ２−２３の重鎖と軽鎖の可変領域を連結したポリペプチドをコードする抗マラチオン組換え抗体遺伝子からなる、ＭＬＴ２−２３ｓｃＦｖ  ｃＤＮＡ断片を作製した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
［化３７］
プライマー１：
５’−ＴＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＡＧＣＣＴ−３’
（配列番号１５）
プライマー２：
５’−ＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣ−３’
（配列番号１６）
プライマー３：
５’−ＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣ−３’
（配列番号１７）
プライマー４
５’−ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴ−３’
（配列番号１８）
プライマー１は制限酵素ＳｆｉＩを、プライマー４は制限酵素ＮｏｔＩを認識する塩基配列を含み、プライマー２とプライマー３は合成ペプチドリンカーをコードする塩基配列を含んでおり、それぞれ下線で示している。なお、プライマー１および２は、各々配列番号１１の塩基１０５−１２７、塩基４２７−４４９と同一又は相同な配列を含む。プライマー３および４は、各々配列番号１３の塩基９１−１１５、塩基４０９−４２９と同一又は相同な配列を含む。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６４】
ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅは、図１に記載したように、ｌａｃプロモーター、ｇｅｎｅ３シグナル配列、抗Ｅ−ｔａｇ抗体認識配列、ｇｅｎｅ３タンパク質（ｇ３ｐ）、Ｍ１３ファージ遺伝子間領域（ＩＧ）、アンピシリン耐性遺伝子、ＣｏｌＥ１  複製起点等を有する。ＣｏｌＥ１  複製起点を有するため大腸菌内で複製可能であり、また、Ｍ１３ファージ遺伝子間領域（ＩＧ）を有するため、ヘルパーファージの感染により一本鎖ＤＮＡとなりファージを形成することが可能である。