【手続補正書】
【提出日】平成20年2月13日(2008.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２】
配列番号２を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号４を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
相補性決定領域（ＣＤＲ）中にＲ−Ｇ−Ｄ配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記相補性決定領域がＣＤＲ−Ｈ３である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記転移細胞が、乳房、脳、肺、肝臓、または骨から選択される組織を標的とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体を含有する、薬学的組成物。
【請求項８】
活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合し、非活性化αｖβ３インテグリンレセプターには結合しない、単離された抗体。
【請求項９】
前記活性化αｖβ３インテグリンレセプターが類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合するリガンド模倣物を含む、単離された抗体。
【請求項１１】
類似の非転移細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体を含む、哺乳動物の病状を処置するための組成物。
【請求項１２】
前記病状が、腫瘍性疾患、充実性腫瘤、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、良性または悪性の乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記腫瘍性疾患が前記哺乳動物における腫瘍細胞の転移である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記病状が前記哺乳動物における乳癌の転移である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
配列番号２または配列番号４を含む抗体を含む、哺乳動物の病状を処置するための組成物。
【請求項１６】
前記病状が、腫瘍性疾患、充実性腫瘤、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記腫瘍性疾患が前記哺乳動物における腫瘍細胞の転移である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記病状が前記哺乳動物における乳癌の転移である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
標的組織への転移性ホーミング傾向を有する腫瘍細胞改変体を含む、細胞株。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞改変体が、充実性腫瘤、血液悪性疾患、白血病、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨肉腫、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫に由来する、請求項１９に記載の細胞株。
【請求項２１】
前記標的組織が脳、肝臓、肺または骨から選択される、請求項１９に記載の細胞株。
【請求項２２】
腫瘍細胞標的に対して親和性を有する抗体ファージ群の作製方法であって、以下：
癌患者のコホートから得た血中リンパ球ｃＤＮＡライブラリー由来のファージライブラリーを提供する工程；
非転移性表現型を発現する細胞株にて該ファージライブラリーをサブトラクトする工程；
該非転移性表現型を発現する細胞株とは結合しない第１の抗体ファージ群を選択する工程；
転移性表現型を発現する細胞株にて該第１の抗体ファージ群をパンニングする工程；
該転移性表現型を発現する細胞株に結合する第２の抗体ファージ群を選択する工程；
該転移性表現型を発現する細胞株に結合し、かつ、前記腫瘍細胞標的に結合する抗体ファージクローンを精製する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記転移性表現型を発現する細胞株が活性化細胞表面レセプターを発現する細胞株である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性化細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記活性化インテグリンレセプターがαｖβ３インテグリンレセプターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記転移性表現型を発現する細胞株が、標的組織に対して転移性ホーミング傾向を有する腫瘍細胞改変体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的組織が、脳、肝臓、肺または骨から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法であって、さらに以下：
前記抗体ファージクローンを（ａ）細胞表面上に活性化インテグリンレセプターを発現する腫瘍細胞への結合；および（ｂ）細胞表面上に非活性化インテグリンレセプターを発現する腫瘍細胞への結合の低下について試験する工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記腫瘍細胞標的が転移細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記転移細胞が転移性の乳癌細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２４に記載の方法であって、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋またはＭｎ＋＋から選択される陽イオン存在下で増加する活性化インテグリンレセプターを発現する前記細胞株に対する前記抗体ファージ群の結合効率を測定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３２】
前記抗体ファージ群が単鎖（ｓｃＦｖ）抗体ファージ群である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
癌治療薬を用いた処置により哺乳動物における腫瘍細胞を検出するための組成物であって、
活性化インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体組成物に連結した検出可能なマーカー
を含む、組成物。
【請求項３４】
前記腫瘍細胞が転移性腫瘍細胞である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
哺乳動物における抗原への免疫応答を誘導または増強するための組成物であって、
転移細胞上の細胞表面レセプターに対する抗体
を含み、該抗細胞表面レセプター抗体の血漿中濃度が少なくとも４ヶ月間検出可能レベルを超えて維持されることを特徴とする、組成物。
【請求項３６】
前記細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記活性化インテグリンレセプターがαｖβ３インテグリンレセプターである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記抗細胞表面レセプター抗体が、その血漿中濃度が少なくとも４ヶ月間検出可能レベルを超えて維持されるように複数回投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記抗細胞表面レセプター抗体が、前記哺乳動物における前記抗インテグリンレセプター抗体の血漿中濃度を少なくとも４ヶ月間、少なくとも２μｇ／ｍｌとするような量および間隔で投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗細胞表面レセプター抗体が、前記哺乳動物における前記抗細胞表面レセプター抗体の血漿中濃度を少なくとも４ヶ月間、少なくとも５μｇ／ｍｌとするような量および間隔で投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
前記抗細胞表面レセプター抗体が、前記哺乳動物における前記抗細胞表面レセプター抗体の血漿中濃度を少なくとも４ヶ月間、少なくとも１０μｇ／ｍｌとするような量および間隔で投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４３】
活性化インテグリンレセプターに対する前記抗体がヒト抗活性化インテグリンレセプター抗体である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４４】
活性化インテグリンレセプターに対する前記抗体がヒト化抗活性化インテグリンレセプター抗体である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４５】
活性化インテグリンレセプターに対する前記抗体がヒト配列抗活性化インテグリンレセプター抗体である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４６】
哺乳動物の転移性癌疾患を処置するための組成物であって、
細胞傷害性物質と結合した、転移細胞上の細胞表面レセプターに対する抗体
を含む、組成物。
【請求項４７】
前記細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記細胞傷害性物質が細胞傷害性薬物である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記細胞傷害性物質が放射性同位体である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５０】
哺乳動物組織サンプルにおける転移性腫瘍細胞表面上の活性化細胞表面レセプターを検出する方法であって、以下：
該哺乳動物組織を固相に固定化された第１のヒト抗体、および溶液中の第２のヒト抗体と接触させる工程であって、前記活性化細胞表面レセプターが該組織サンプル中に存在する場合に、前記第１の抗体および第２の抗体が前記活性化細胞表面レセプターの異なるエピトープに結合する、工程；
該組織サンプル中の該活性化細胞表面レセプターの存在を示唆する結合である、該第１の抗体および該第２の抗体への該活性化細胞表面レセプターの結合を検出する工程であって、該第１のヒト抗体および第２のヒト抗体が、癌患者のコホートから得られた血中のリンパ球ｃＤＮＡライブラリー由来のファージライブラリーにより提供される該第１のヒト抗体および該第２のヒト抗体をコードする核酸をサブクローニングすることにより産生される、工程；
非転移性表現型を発現する細胞株について該ファージライブラリーをサブトラクトする工程；
該非転移性表現型を発現する細胞株とは結合しない第１の抗体ファージ群を選択する工程；
転移性表現型を発現する細胞株において前記第１の抗体ファージ群をパンニングする工程；
該転移性表現型を発現する細胞株に結合する第２の抗体ファージ群を選択する工程；
該転移性表現型を発現する細胞株に結合し、かつ、腫瘍細胞標的に結合する抗体ファージクローンを精製する工程；
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記活性化細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記活性化インテグリンレセプターがαｖβ３インテグリンレセプターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の抗体が標識され、前記検出工程が前記活性化細胞表面レセプターへの前記第２の抗体の結合を検出する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記組織サンプルは、前記固相に固定化された第１のヒト抗体群および溶液中の第２のヒト抗体群と接触され、該第１の群および該第２の群の構成要素が前記活性化細胞表面レセプターの異なるエピトープに結合する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２のヒト抗体群が標識されている、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の各々が、前記活性化細胞表面レセプター上のそれらの各エピトープに対し少なくとも１０９Ｍ−１の親和性を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の各々が、前記活性化細胞表面レセプターに対し少なくとも１０１０Ｍ−１の親和性を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体が、前記活性化細胞表面レセプターに対し少なくとも１０１１Ｍ−１の親和性を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記活性化細胞表面レセプターに対する前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体の結合が１時間以内に平衡に達する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１のヒト抗体および第２のヒト抗体がＥ．ｃｏｌｉにおける組換え構築物の発現により産生される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の抗体および第２の抗体の分子の少なくとも９０％が前記活性化細胞表面レセプターに免疫反応性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
転移の危険性を有することが疑われる患者において病状に関連した転移が起こる傾向を有する細胞に干渉するための組成物であって、
類似する非転移性の細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体
を含み、該抗体には、細胞傷害性部分が結合している、組成物。
【請求項６３】
前記抗体組成物が配列番号２を含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記抗体組成物が配列番号４を含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６５】
前記細胞傷害性部分が化学的毒素である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６６】
前記細胞傷害性部分が生物学的毒素である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６７】
前記細胞傷害性部分が放射性物質である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６８】
前記結合が共有結合である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６９】
前記結合がリガンド相互作用である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項７０】
前記結合が物理学的相互作用である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項７１】
前記結合が管内への封じ込めを含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項７２】
前記管がリポソームまたは他の血液循環血管である、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
転移の危険性を有することが疑われる患者において病状に関連した転移が起こる傾向を有する細胞を同定するための組成物であって、
類似する非転移性の細胞と比較して転移状態にある細胞上に示差的に産生される活性化αｖβ３インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体
を含み、該抗体には、画像化部分が結合している、組成物。
【請求項７４】
前記画像化部分が、磁気共鳴スペクトロスコピー、Ｘ線スペクトロスコピー、または陽電子放射断層法（ＰＥＴ）によって画像化され得る、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記結合が共有結合である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７６】
前記関連が非共有結合である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７７】
哺乳動物の転移性癌疾患を処置するための組成物であって、
転移細胞上の細胞表面レセプターに対する抗体
を含み、該転移細胞のプログラム細胞死が誘導されることを特徴とする、組成物。
【請求項７８】
前記細胞表面レセプターが活性化インテグリンレセプターである、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記活性化インテグリンレセプターがαｖβ３インテグリンレセプターである、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離Ｂｃ−１２ポリヌクレオチド。
【請求項８１】
単離ポリペプチドであって、
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含み、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０３として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１２  ｓｃＦｖポリペプチドと生物学的機能を共有する、
単離ポリペプチド。
【請求項８２】
請求項８０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項８３】
前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、宿主細胞における該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に連結されている、請求項８０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８４】
請求項８０に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または該細胞の子孫。
【請求項８５】
配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離Ｂｃ−１５ポリヌクレオチド。
【請求項８６】
単離ポリペプチドであって、
配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含み、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０４として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１５  ｓｃＦｖポリペプチドと生物学的機能を共有する、単離ポリペプチド。
【請求項８７】
請求項８５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項８８】
前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、宿主細胞における該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に連結されている、請求項８５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８９】
請求項８５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または該細胞の子孫。
【請求項９０】
非ヒト哺乳動物中での試験化合物の抗転移活性を決定するための方法であって、以下：
標的組織への転移性ホーミング傾向を有する腫瘍細胞改変体を該哺乳動物に投与する工程；
該試験化合物を該哺乳動物へ投与する工程；
コントロール哺乳動物中のコントロール化合物の抗転移活性と比較して、該哺乳動物中の該試験化合物の抗転移活性を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９１】
前記哺乳動物の前記標的組織における転移性病巣を測定する工程をさらに包含する請求項９０に記載の方法であって、コントロール化合物に応答するコントロール動物の転移性病巣に対する前記試験化合物に応答する該哺乳動物の転移性病巣の縮小が該試験化合物の抗転移活性を示す、方法。
【請求項９２】
前記腫瘍細胞改変体および前記試験化合物が前記哺乳動物の末梢血循環へ投与される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記腫瘍細胞改変体および前記試験化合物が前記哺乳動物の乳腺脂肪パッドへと同所的に投与される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記哺乳動物が、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、または非ヒト霊長類である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記哺乳動物がマウスである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
前記哺乳動物が免疫欠損マウスである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
前記腫瘍細胞改変体が、ＢＣＭ−１、ＢＣＭ−２またはＢＭＳである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９８】
前記試験化合物が、抗体、単鎖Ｆｖ抗体、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
請求項１に記載の抗体であって、該単離された抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０３として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１２  ｓｃＦｖポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、抗体。
【請求項１００】
請求項９９に記載の抗体であって、該単離された抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０３として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１２  ｓｃＦｖポリペプチドである、抗体。
【請求項１０１】
請求項１に記載の抗体であって、該単離された抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０４として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１５  ｓｃＦｖポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、抗体。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載の抗体であって、該単離された抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０４として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１５  ｓｃＦｖポリペプチドである、抗体。
【請求項１０３】
単離された抗体であって、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０３として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１２  ｓｃＦｖポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、抗体。
【請求項１０４】
請求項１０３に記載の抗体であって、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０３として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１２  ｓｃＦｖポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、抗体。
【請求項１０５】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０３として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされる単離されたＢｃ−１２  ｓｃＦｖ抗体、または該抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１０６】
単離された抗体であって、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０４として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１５  ｓｃＦｖポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、抗体。
【請求項１０７】
請求項１０６に記載の抗体であって、
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０４として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされるＢｃ−１５  ｓｃＦｖポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列
をさらに含む、抗体。
【請求項１０８】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０４として寄託されたポリヌクレオチドによりコードされる単離されたＢｃ−１５  ｓｃＦｖ抗体、または該抗体の抗原結合フラグメント。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明はさらに、ｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２の発現および産生のためのファージディスプレイベクター中のｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２をコードするｃＤＮＡを提供する。詳細な実施形態において、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２をコードするｃＤＮＡは配列番号１を含む。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号  ＰＴＡ−６３０３、寄託日：２００４年１１月１２日である。本発明はさらに、ｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１５の発現および産生のためのファージディスプレイベクター中のｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５をコードするｃＤＮＡを提供する。詳細な実施形態において、ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５をコードするｃＤＮＡは配列番号３を含む。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号  ＰＴＡ−６３０４、寄託日：２００４年１１月１２日である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
ファージディスプレイベクターｐＣＧＭＴ９の構築：ベクターｐＣＧＭＴ９はｐＣＧＭＴに由来するものとした。プライマーＰ９（５’−ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＴＣＴ−３’）（配列番号１２）、およびＰ９ｒｅｖ（５’−ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＣＧ−３’）（配列番号１３）を用い、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３の単鎖ＤＮＡを鋳型として、遺伝子ＩＸ（ｇＩＸ）をＰＣＲにより増幅した。そのＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＮｈｅＩにより消化し、同じ制限酵素を用いて切断したｐＣＧＭＴベクターへと挿入した。このベクター中のｇＩＸの方向を特徴付けるために、ＳｐｅＩ消化およびさらなるＤＮＡ配列決定を行った。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４９】
細胞接着および移動：定常条件下での腫瘍細胞接着を上述ように解析した（１９）。接着バッファーはＨａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）ｐＨ７．４、０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＭｎＣｌ２であった。阻害については、細胞を５分間室温にて３μＭのｓｃＦｖまたは２００μＭのＧＲＧＤＳＰＫペプチド（配列番号１１）のいずれかと共にインキュベートし、次いで阻害剤存在下でプレーティングして、３０分間、３７℃において接着させた。フィブリノゲンに向かう走触性の腫瘍細胞の移動を、上述のようにトランスウェルチャンバー（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）中で解析した（Ｒｏｌｌｉ、Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：９４８２−９４８７、２００３）。アッセイの前に、腫瘍細胞を、血清非含有のＥＭＥＭ中で１６時間、３７℃にて飢餓状態にし、洗浄し、次いでＥＭＥＭを含まない血清中で、２μＭのｓｃＦｖまたは２００μＭのＧＲＧＤＳＰＫペプチド（配列番号１１）の存在または非存在下で１６時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下において移動を可能した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
（リガンド模倣物ｓｃＦｖ抗体は、αｖβ３が仲介する接着性腫瘍細胞機能を阻害する）
患者由来のｓｃＦｖ抗体Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は明らかにインテグリンαｖβ３の天然のリガンドを模倣するので、これらの抗体はαｖβ３が仲介するリガンドの結合および接着性腫瘍細胞機能を妨害し得るという仮説が立てられた。定常的条件下で適用した場合、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、これらの細胞中でαｖβ３により独占的に仲介されるプロセスである、固定化されたフィブリノゲンに対するＢＭＳヒト乳癌細胞の接着を効果的に阻害した。Ｒｏｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：９４８２−９４８７、２００３。３μＭ  ｓｃＦｖによる阻害の程度は、フィブロネクチン由来ペプチドである２００μＭ  ＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号１１）により観察されるものと類似であった（図３Ａ）。ビトロネクチンへのＢＭＳ細胞の接着もまたＢｃ−１２およびＢｃ−１５により阻害されたが、より低い程度までの阻害であった。このタンパク質への接着はこれらの細胞上の他のαｖインテグリンと共にαｖβ３により仲介される。この抗体は、主としてαｖβ３を含まないＢＭＳ細胞インテグリンα２β１により仲介されるＩ型コラーゲンへの乳癌細胞接着に対しては効果を有さなかった。腫瘍細胞の播種のために重大な別の機能は、マトリックス指向性移動である。腫瘍細胞はしばしば、接着性血漿タンパク質が腫瘍領域へと漏れ出す原因となる血管透過因子を産生する。ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：５３８１−５３８５、２００２。すなわち、これらのタンパク質のうちで最も多量に存在するフィブリノゲンおよび重合フィブリンの勾配は、腫瘍を支持する血管へと向けて転移細胞を導き得る。乳癌細胞モデルにおいて、固定化フィブリノゲンまたはフィブリンに向かう移動は、インテグリンαｖβ３により独占的に仲介され、そのレセプターの活性化状態を必要とする。Ｒｏｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：９４８２−９４８７、２００３。従って、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５がフィブリノゲン指向性移動に影響を与え得るかどうかについて調べた。２μＭの濃度において、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、ＢＭＳヒト乳癌細胞の移動をほとんど完全に阻害した。この効果は２００μＭ  ＧＲＧＤＳＰＫペプチド（配列番号１１）で見られた効果と同様であった（図３Ｂ）。ＲＧＥを含有するｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５は、フィブリノゲン指向性移動に対して全く効果を示さず、Ｍｕｔ−１２はわずかな効果のみを示した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ：患者由来のｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、陽イオンおよび活性化に依存する様式で、腫瘍細胞インテグリンαｖβ３を認識する。１ｍＭ  Ｃａ２＋、１ｍＭ  Ｍｇ２＋、または０．２ｍＭ  Ｍｎ２＋存在下および非存在下でのＴＢＳ中でのフローサイトメトリー分析が示される。抗フラッグＭ２  マウスｍＡｂに続いてＦＩＴＣ−抗マウスＦ（ａｂ’）２とのインキュベーション後に検出される可溶性ｓｃＦｖの結合。（Ａ）ｓｃＦｖのヒト黒色腫細胞（Ｍ２１：αｖβ３プラス他のαｖインテグリン）（Ｍ２１−ＬＩＩｂ：αＩＩｂβ３を含む、αｖインテグリンを含まない）または肺腺癌細胞（ＵＣＬＡ−Ｐ３：αｖインテグリンを含む、β３インテグリンを含まない）に対する結合。（Ｂ）ｓｃＦｖのＭ２１黒色腫細胞に対する結合。（Ｃ）ｓｃＦｖの非活性化形態（β３ＷＴ、親Ｃｏ）または活性化形態（乳癌患者血液から単離されたβ３Ｄ７２３Ｒ、骨、肺、およびＢＭＳ転移性癌細胞）のいずれかの状態にあるαｖβ３を欠損する（β３−）または発現するＭＤＡ−ＭＢ４３５ヒト乳癌細胞の改変体に対する結合。これらの各細胞型について、Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５のための複数の独立した実験において同様の結果が得られた。
【図２Ａ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ：ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列分析の解釈。（Ａ）Ｂｃ−１２（配列番号７）およびＢｃ−１５（配列番号８）（活性化αｖβ３に特異的）のコンセンサスアミノ酸配列（配列番号９）をＢｃ−２０（αｖに特異的）（配列番号１０）と比較した。
【図２Ｂ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ：ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列分析の解釈。（Ｂ）ｓｃＦｖのＢＭＳヒト乳癌細胞への結合のフローサイトメトリーによる結果は、ＣＤＲ−Ｈ３  ＲＧＤがＲＧＥに変異した場合（Ｍｕｔ−１２およびＭｕｔ−１５）にＢｃ−１２およびＢｃ−１５との結合が失われることを示している。Ｍｕｔ−１５のシグナルは陰性コントロールに相当する。
【図２Ｃ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ：ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列分析の解釈。（Ｃ）ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２（配列番号１）およびｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５（配列番号３）に対するｃＤＮＡ配列。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０３、寄託日：２００４年１１月１２日を有する。ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６３０４、寄託日：２００４年１１月１２日を有する。
【図２Ｄ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ：ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列分析の解釈。（Ｄ）ｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１２（配列番号５）およびｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５（配列番号６）に対するｃＤＮＡ配列。ｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１２は、ＲＧＥを含むｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２の変異体バージョンである。ｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５は、ＲＧＥを含むｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５の変異体バージョンである。
【図３−１】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ：ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、αｖβ３が仲介する接着性乳癌細胞機能を阻害する。（Ａ）３μＭのＢｃ−１２、Ｂｃ−１５またはそれらのＲＧＥ変異体であるＭｕｔ−１２、Ｍｕｔ−１５が存在する場合と非存在の場合（２００μＭ  ＧＲＧＤＳＰＫペプチド（配列番号１１）の場合と比較）における、ＢＭＳヒト乳癌細胞と、フィブリノゲン（Ｆｇ）、ビトロネクチン（ＶＮ）またはタイプＩコラーゲン（Ｃｏｌ  Ｉ）との接着。タンパク質コーティング濃度：１０μｇ／ｍｌ（ＶＮ、Ｃｏｌ  Ｉ）または２０μｇ／ｍｌ（Ｆｇ）。接着時間：３７℃にて３０分間。（Ｂ）走触性ＢＭＳ細胞のフィブリノゲン基質への移動に対するｓｃＦｖの効果（２μＭ  Ｂｃ−１２、Ｂｃ−１５またはそれらのＲＧＥ変異体であるＭｕｔ−１２またはＭｕｔ−１５を含む場合と含まない場合（２００μＭ  ＧＲＧＤＳＰＫペプチド（配列番号１１）の場合と比較）において、トランスウェルチャンバー中で３７℃にて１６時間）。（Ｃ）血流中での乳癌細胞の捕捉に対するｓｃＦｖの影響。（ヒドロエチジンで標識された転移性ＢＭＳ細胞をヒト血液中（５０ｎＭ  ＰＰＡＣＫを用いて抗凝固処理されている）に懸濁し、コラーゲンＩマトリックス上で静脈壁剪断速度５０ｓ−１にて潅流させた。これらの条件のもと、乳癌細胞は、αｖβ３が仲介する結合により、接着性であって血栓を形成する血小板を捕捉する。腫瘍細胞の接着は、血流中の３０の所定の位置における画像の取得により定量化した。左：同一のｘ、ｙ位置における血小板シグナル（血栓、緑色蛍光）および腫瘍細胞シグナル（赤色蛍光）の代表的イメージ。右：３μＭの非機能性ブロッキング  抗αｖ  ｓｃＦｖ  Ｂｃ−２０または機能性ブロッキング  抗αｖβ３  ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２またはＢｃ−１５の存在下で捕捉された腫瘍細胞の数。（Ｄ）ｓｃＦｖＢｃ−１５はヒト乳癌細胞に内在化され、細胞増殖を減少させる。左：４℃（結合）対３７℃（内在化を可能にする）にてＦＩＴＣ−Ｂｃ−１５と４時間インキュベートしたＢＭＳ細胞の共焦点像。右：２μＭのＲＧＥ含有ｓｃＦｖ  Ｍｕｔ−１５またはＲＧＤ含有Ｂｃ−１５の存在下での播種後４日目のＢＭＳ細胞培養の位相差画像。
【図３−２】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ：ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、αｖβ３が仲介する接着性乳癌細胞機能を阻害する。（Ｅ）３．７μＭ  ｓｃＦｖまたはアポトーシス誘導コントロールとしての１４．３６μＭ  カンプトテシンの存在下または非存在下における極少接着性プレート中でのマトリックスを除去したＢＭＳ乳癌細胞の生存度に対するｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２の効果。アポトーシスの測定は２０時間後の細胞質のヒストンと結合するＤＮＡ断片に基づいた。
【図４】図４：活性化αｖβ３に対する患者由来リガンド模倣物ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、ヒト血漿中の乳癌細胞に内在化して結合し、乳癌の残存に影響する。患者血液サンプルから単離されたヒト転移乳癌細胞（ＢＭＳ）を用いたフローサイトメトリー分析。全ての結合および洗浄工程は、５０ｎＭ  ＰＰＡＣＫを用いて抗凝固した血液から調製した新鮮なヒト血漿中で行なった。
【図５−１】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ：ＳｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＳｃＦｖ  Ｂｃ−１５は血行性乳癌転移を抑制する。（Ａ）左：１×１０５個のＢＭＳヒト乳癌細胞を静脈内注射して３２日後のメスＳＣＩＤマウスの肺。マウスは、１日目、２日目、３日目および４日目に５０μｇのＢｃ−１２またはＢｃ−１５を含む１００μｌのＰＢＳを用いて処理した（静脈内）。コントロールにはＰＢＳのみ与えた。右：各動物の肺表面への転移の数。水平の線は群あたりの転移の平均数を示す。ＳｃＦｖ処理されたマウスは有意に少ない転移を有した（Ｐ＜０．００１、Ｋｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ試験による）。（Ｂ）左：ヘマトキシリン／エオシンで染色したマウス肺上部の組織学的切片。各肺について１４０μｍ毎に分離した３つの連続する切片６セットについて転移を計数した。右：各肺の切片において計数された転移の数。水平の線は動物群あたりの転移の平均数を示す。ＳｃＦｖ処理されたマウスは有意に少ない検出可能な転移を有した（Ｐ＜０．００５、Ｋｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ試験による）。
【図５−２】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ：ＳｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＳｃＦｖ  Ｂｃ−１５は血行性乳癌転移を抑制する。（Ｃ）肺に確立された乳癌転移に対するＢｃ−１５処置の効果。メスＳＣＩＤマウスに、構成的に活性化したインテグリンαｖβ３Ｄ７２３Ｒを発現する５×１０５個のＤｓＲｅｄ２標識ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞を静脈内注射した。マウスは、７日目、９日目、１１日目および１４日目、１６日目、１８日目にｓｃＦｖ  Ｂｃ−１５またはそのＲＧＥ変異体Ｍｕｔ−１５の静脈内注射により処理した（４０μｇ／用量）。１９日目に蛍光顕微鏡により転移性病巣を計数した。左：Ｍｕｔ−１５（上）またはＢｃ−１５処理されたマウス（下）の肺組織内の代表的な腫瘍病巣画像（バー：５０μｍ）。右：各動物の肺組織内における転移病巣の数（水平の線：群あたりの転移の平均数）。Ｂｃ−１５処理されたマウスはＭｕｔ−１５処理されたマウスよりも有意に少ない転移を有した（Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ両側順位和検定試験による）。
【図６】図６：ＭＤＡ−ＭＢ  ４３５乳癌細胞モデルの親細胞および腫瘍細胞改変体におけるαｖβ３インテグリンレセプターの発現。
【図７】図７：ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、転移乳癌細胞において見られるβ３の機能獲得変異体を発現する腫瘍細胞と反応する。フィブリノゲン指向性の移動およびＨＭＶ−１ヒト黒色腫細胞改変体のフローサイトメトリー分析。
【図８】図８：ｓｃＦｖ  Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５は、血流中において血小板が仲介する乳癌細胞の捕捉を抑制する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ａ】
2007523650.tif 000001