(57)【要約】温度センサとして生体細胞の温度を感知することができる温度感応タンパク質を創出するとともに、当該温度感応タンパク質を利用した生体細胞の温度計測方法を提供するために、温度感応タンパク質として、温度変化に伴って構造変化を生じる複数のペプチド鎖からなる温度感受性領域と、この温度感受性領域を複数結合させたペプチド鎖からなり該温度感受性領域の構造変化に起因して所定のシグナルを呈するシグナル領域と、を含有して構成されるものを構築し、この温度感応タンパク質を形質導入した細胞における前記シグナルを計測することで、細胞の温度計測を可能とした。
2007142208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度変化に伴って構造変化を生じる温度感受性領域と、当該温度感受性領域を複数結合させ当該温度感受性領域の構造変化に起因して所定のシグナルを呈するシグナル領域と、を含有して構成されることを特徴とする温度感応タンパク質。
【請求項２】
前記温度感受性領域と前記シグナル領域は、ペプチド鎖からなるものである請求項１に記載の温度感応タンパク質。
【請求項３】
前記温度感受性領域は、主として所定の温度領域を境にした温度変化に伴って二量体と単量体との間を可逆的に相互変化するコイルドコイルタンパク質を含み、前記シグナル領域は、相互に近接又は離間することにより前記所定のシグナルを呈するペプチド鎖を含む請求項２に記載の温度感応タンパク質。
【請求項４】
前記シグナル領域に、少なくとも２以上の温度感受性領域が結合する請求項２又は３に記載の温度感応タンパク質。
【請求項５】
前記シグナル領域を構成するペプチド鎖のＮ末端とＣ末端とにそれぞれ温度感受性領域が少なくとも１つ結合する請求項４に記載の温度感応タンパク質。
【請求項６】
前記シグナル領域が呈する前記所定のシグナルは、酵素反応又は蛍光反応によるシグナルである請求項２乃至５の何れかに記載の温度感応タンパク質。
【請求項７】
前記シグナル領域には、蛍光タンパク質を適用している請求項２乃至５の何れかに記載の温度感応タンパク質。
【請求項８】
前記蛍光タンパク質は、Ｃ末端側のＤＮＡ結合部位を除去したものである請求項７に記載の温度感応タンパク質。
【請求項９】
前記温度感受性領域には、サルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質であるＴｌｐＡの温度感受性部位を適用している請求項２乃至８の何れかに記載の温度感応タンパク質。
【請求項１０】
配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、中央部に前記シグナル領域としてＣ末端側を除去した蛍光タンパク質であるＧＦＰを配し、当該ＧＦＰのＮ末端及びＣ末端にそれぞれ前記温度感受性領域としてサルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質であるＴｌｐＡの温度感受性部位を配している請求項３に記載の温度感応タンパク質。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れかに記載の温度感応タンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項１２】
温度感応タンパク質を発現するプラスミドであって、請求項１乃至１０の何れかに記載の温度感応タンパク質をコードする塩基配列を含有することを特徴とする温度感応タンパク質発現プラスミド。
【請求項１３】
前記温度感応タンパク質発現プラスミドにおいて、細胞膜移行シグナルをコードする塩基配列をさらに含有する請求項１２に記載の温度感応タンパク質発現プラスミド。
【請求項１４】
前記温度感応タンパク質発現プラスミドにおいて、細胞小器官移行シグナルをコードする塩基配列をさらに含有する請求項１２に記載の温度感応タンパク質発現プラスミド。
【請求項１５】
前記細胞小器官移行シグナルは、ミトコンドリア移行シグナルである請求項１４に記載の温度感応タンパク質発現プラスミド。
【請求項１６】
請求項１２乃至１５の何れかに記載の温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなることを特徴とする温度感応タンパク質発現細胞。
【請求項１７】
前記温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入される細胞は、動物細胞である請求項１６に記載の温度感応タンパク質発現細胞。
【請求項１８】
請求項１６又は１７の何れかに記載の温度感応タンパク質発現細胞において呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する前記所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記細胞の温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用した細胞の温度計測方法。
【請求項１９】
請求項１２乃至１５の何れかに記載の温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞において呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する前記所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記細胞の局所的な温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用した細胞の温度計測方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞に試薬を添加する工程と、前記細胞内のミトコンドリアにおいて呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する前記所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記ミトコンドリアの局所的な温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用したミトコンドリアに対する安全性確認試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コイルドコイルタンパク等の温度感受的に構造変化する高分子鎖を利用して細胞レベルの温度観察を可能にする温度感応タンパク質、及び当該温度感応タンパク質を利用する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとする恒温動物の生体は一定温度に保持されており、体温計等の温度計やサーモグラフィックカメラ等で外的に生体の温度を計測する方法は従来から種々利用されているところである。しかしながら、生体の個々の細胞に着目した場合、例えばミトコンドリアはエネルギー産生工場であったり、ＴＲＰチャネルは様々な温度領域で活性するものであったりするために、全体が均一な温度であるとは限らない。しかしながら、細胞内に温度分布があることが実験事実として確認されたという報告は今のところ存在しない。一方、細胞内には、種々の刺激に応答するためのパラメータ、例えば酸化・還元、ｐＨ、温度等、がいくつか存在しており、これらのパラメータの何れかに基づいて細胞内の温度を検知・追跡することにより、細胞の代謝変化や生理機能を定量化することが可能になると考えられる。すなわち、細胞内の局所温度を感知できるバイオセンサは、様々な生理機能の解明に応用することができるものと考えられる。【０００３】
このような考えから、温度感受性に優れ、温度変化に応じて構造を変化させるサルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質ＴｌｐＡ（Toll/interleukin-1 receptor like protein A）（非特許文献１参照）を使用した「温度センサ」が提案されている（非特許文献２参照）。この「温度センサ」は、蛍光タンパク質であるＧＦＰ（Green fluorescent protein）のＣ末端に全長ＴｌｐＡを１つ融合させたタンパク質ＧＦＰ-ＴｌｐＡであり、同文献では試験管内で温度応答性が評価されたと報告されている。すなわち、同文献では、３７℃近傍でＴｌｐＡが二量体と単量体との間で相互に変化するため、約３７℃未満で二量体となったＧＦＰ-ＴｌｐＡでのＧＦＰの蛍光強度が高い一方で、約３７℃以上で単量体となったＧＦＰ-ＴｌｐＡでのＧＦＰの蛍光強度が低下するため、このような性質を温度センサとして利用することができる、とされている。
【非特許文献１】ReiniHurme，et.al，「A Proteinaceous Gene RegulatoryThermometer in Salmonella」，Cell，90，pp55-64，July 11, 1997
【非特許文献２】RajeshR. Naik，et.al，「The thermostability of an a-helicalcoiled-coil protein and its potential use in sensor applications」，Biosensors & Bioelectronics，16，pp1051-1057，2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、非特許文献２には前記融合タンパク質ＧＦＰ-ＴｌｐＡを利用することにより試験管内で３７℃付近で蛍光強度の変化が認められたとの記述があるものの、本発明者らが同文献に開示されている方法に従ってＧＦＰ-ＴｌｐＡを用いて追試を行ったところ、蛍光強度測定によるＧＦＰ-ＴｌｐＡの温度応答性は確認することができず、また、同文献に記載のＧＦＰ-ＴｌｐＡでは細胞内に導入することができなかった。すなわち、引用文献２に開示されている技術を基礎にしては細胞内の温度を非破壊的な方法で測定することは不可能であり、それに基づく生体内、特に細胞レベルでの温度センサの実現は困難であるといえる。【０００５】
このように、前記融合タンパク質ＧＦＰ-ＴｌｐＡを利用して温度応答性が認められない原因を探究した結果、このＧＦＰ-ＴｌｐＡは、蛍光タンパク質ＧＦＰのＣ末端に全長ＴｌｐＡを１つだけ結合させたものであるため、ＴｌｐＡが二量体化してもそれぞれのＴｌｐＡとＧＦＰとの結合領域での回転自由度が高く、２つのＧＦＰを構造的に十分に近接させることができないことが一因なのではないか、と想定された。【０００６】
斯かる観点に鑑みて、本発明は、ＴｌｐＡとＧＦＰに限らず、温度変化に伴って構造が変化するコイルドコイルタンパク質に代表される複数のペプチド鎖と、その構造変化に伴って所定のシグナルを発するペプチド鎖とを融合させて利用することで、真に温度センサとして生体細胞の温度を感知することができる温度感応タンパク質を創出するとともに、その有益な利用方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明に係る温度感応タンパク質は、温度変化に伴って構造変化を生じる温度感受性領域と、当該温度感受性領域を複数結合させ当該温度感受性領域の構造変化に起因して所定のシグナルを呈するシグナル領域と、を含有して構成されることを特徴としている。【０００８】
ここで、温度感受性領域及びシグナル領域を構成し得る物質としては、ペプチド鎖やヌクレオチド鎖等（これらにリンカー等の領域が一部に含まれていてもよい）の高分子鎖を挙げることができる。このような構成のタンパク質であれば、引用文献２に開示された融合タンパク質ＧＦＰ-ＴｌｐＡとは異なり、温度変化に伴って、温度感受性領域を構成する複数の物質が構造変化を生ずるので、これらの物質の構造変化に対応して各温度感応タンパク質のシグナル領域が発するシグナルを明確に把握することができるようになる。したがって、本発明の温度感応タンパク質は、温度センサとしての利用に供することができ、特にこの温度感応タンパク質を生体細胞に導入することで、これまで困難であった細胞ごとの温度分布や、細胞内での局所的な温度分布のいずれもが可能となる。【０００９】
特に、温度感受性領域及びシグナル領域は、ペプチド鎖からなるものが、本発明の温度感応タンパク質の構成として適している。この場合、特に前述した引用文献２の融合タンパク質ＧＦＰ-ＴｌｐＡとの比較において、温度変化に伴って構造変化を生じるペプチド鎖が複数となるため、シグナル領域が発するシグナルをより明確に把握することができるようになる。【００１０】
ここで、温度感受性領域には、例えば上述したＴｌｐＡだけでなく、温度変化に伴って構造が変化する部位を含むペプチド鎖であれば、現時点での既知又は未知に関わらず種々のものを利用することができる。このようなペプチド鎖としては、例えば、転写因子の1つであるc-Fos、c-Jun、GCN4、Tropomyosin、DNA
polymerase、Seryl tRNA synthase等を例示することができる。これらのペプチド鎖が構造変化を生じる温度は、それぞれ固有であるので、適宜のものを目的に応じて利用すればよい。また、温度感受性領域を構成するペプチド鎖の構造変化は、可逆的又は不可逆的な変化の何れであってもよく、適宜変更可能である。可逆的に構造変化をするものであれば、繰り返しの使用が可能であって好ましいが、不可逆的な構造変化をするものであっても、１度限りではあるが温度センサとしての機能は発揮することできる。【００１１】
また、シグナル領域には、前記温度感受性領域の構造変化に伴って外部から観察可能なシグナルを呈するペプチド鎖であれば、現時点での既知又は未知に関わらず種々のものを利用することができる。【００１２】
温度変化に伴って構造が変化するペプチド鎖として温度感受性領域に利用しやすいものとしては、主として所定の温度領域を境にした温度変化に伴って二量体と単量体との間を可逆的に相互変化するコイルドコイルタンパク質を含むものを適用することができ、この場合シグナル領域には、相互に近接又は離間することにより前記所定のシグナルを呈するペプチド鎖を含むものを利用することが好適である。なお、ペプチド鎖が構造変化を生じる温度領域は、それぞれ固有であり、測定しようとする細胞の目標温度に応じて適切なペプチド鎖を利用すればよい。【００１３】
本発明の温度感応タンパク質は、シグナル領域に、少なくとも２以上の温度感受性領域が結合した態様が望ましく、本発明には３以上の温度感受性領域が結合した態様も含まれるのは勿論である。【００１４】
すなわち、シグナル領域を構成するペプチド鎖に結合される温度感受性領域を構成する複数のペプチド鎖は、全て同一であっても異なっていてもよく、さらにその種類についても同一種類であってもよいし、異種類であってもよく、本発明の温度感応タンパク質の立体構造が許容する限り複数であれば温度感受性領域の数は制限されるものではない。【００１５】
さらに、シグナル領域を構成するペプチドに対して温度感受性領域を構成するペプチド鎖を２つ以上簡易に結合させるには、シグナル領域を構成するペプチド鎖のＮ末端とＣ末端とにそれぞれ温度感受性領域が少なくとも１つ結合した態様が好ましい。この場合も、各温度感受性領域を構成するペプチド鎖の異同は問われない。【００１６】
前記シグナル領域が呈する前記所定のシグナルとしては、酵素反応又は蛍光反応によるシグナルを例示することができる。酵素反応には、例えば、ルシフェラーゼやエクオリンによる発光又は消光（あるいは発光の増減）、β-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等による発色又は消色（あるいは発色度合いの増減）等を挙げることができる。蛍光反応としては、青色タンパク質（ＢＦＰ）、シアン色タンパク質（ＣＦＰ）、緑色タンパク質（ＧＦＰ）、黄色タンパク質（ＹＦＰ）、赤色タンパク質（ＤｓＲｅｄ）等の蛍光強度の増加あるいは減少、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer；ＦＲＥＴ）やProximity Imaging（ＰＲＩＭ）等を挙げることができる。【００１７】
特に、シグナル領域として利用しやすい既知の物質としては、蛍光タンパク挙げることができる。蛍光タンパク質としては、上述したＧＦＰ、ＣＦＰ若しくはＹＦＰ等の他にも、それらの強化蛍光タンパク質であるＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ若しくはＥＹＦＰ等や、それらの改変体を利用することができる。例えばＧＦＰは、オワンクラゲ（Aequorea coerulescens Brandt）から発見された蛍光タンパク質であり、２３８個のアミノ酸で構成される。第６５から第６７番目のアミノ酸から構成されるトリペプチドが発色団（p-hydroxylbenzylidenemidazolinone）を形成し（図１（ａ）に発色団の構造式を示す）、残りのアミノ酸で１１本のβシートを形成して前記発色団を保護している（図１（ｂ）にＧＦＰの三次元モデル図を示す）。野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）ＧＦＰ（以下、「ｗｔＧＦＰ」）は、励起スペクトルに３９５ｎｍにメジャーピークを有し、４７５ｎｍにマイナーピークを有する。これは発色団のチロシン残基のフェノールがイオン化されているか否かに由来する（参考文献；宮脇敦史，「ＧＦＰとバイオイメージング」，羊土社，２００２年）。ＧＦＰ同士を近接させると立体的な障害により、そのフェノール型とフェノレート型との平衡関係が変化し、３９５ｎｍの吸収強度が減少し、４７５ｎｍの吸収強度が増加する一方で、ＧＦＰ同士を離間させると３９５ｎｍの吸収強度が増加し、４７５ｎｍの吸収強度が減少する（参考文献；Angelis et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A，１９９８年）。すなわち、本発明の温度感応タンパク質において、温度感受性領域の構造変化に伴ってシグナル領域としてのＧＦＰ同士が近接又は離間する場合、前記２つのスペクトルのピークについてレシオ（比率）を調べることで、温度変化を数値化することができるのである。【００１８】
ところで、非特許文献２で提案された融合タンパク質ＧＦＰ-ＴｌｐＡが追試では温度応答性が認められなかった原因として、全長ＧＦＰを利用したことも一因である可能性が考えられる。すなわち、ｗｔＧＦＰのＣ末端の９アミノ酸は、発色団にもβシート構造にも関与していない領域であり、このＣ末端にＴｌｐＡを結合させていることによっても両者の回転自由度が高まっており、その結果としてＧＦＰ-ＴｌｐＡの温度応答性が現れなかったとも考えられる。したがって、本発明においてシグナル領域としてＧＦＰ等の蛍光タンパク質又は強化蛍光タンパク質を利用する場合には、そのＣ末端側の９アミノ酸を除去したものを利用することも有効であるといえる。ただし、非特許文献２のＧＦＰ-ＴｌｐＡとは異なり、本発明の温度感応タンパク質は温度感受性領域を複数有しているので、シグナル領域としてＧＦＰを利用する場合に必ずしもＣ末端を削除しなければならないわけではない。【００１９】
また、本発明において前記温度感受性領域には、サルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質であるＴｌｐＡの温度感受性部位を適用することも有用である。ＴｌｐＡは、サルモネラ菌（Salmonella）から発見された転写因子のひとつであり、Ｎ末端にＤＮＡ結合ドメインを持ち、残りはコイルドコイル（coiled-coil）と呼ばれるαへリックスダイマーを形成するドメインである（図２（ａ）にＴｌｐＡのモデル図を示す）。ＴｌｐＡは、３７℃付近の温度領域を超えるとコイルドコイルからモノマーへ完全可逆的に解離し（図２（ｂ）に温度変化によるＴｌｐＡの構造変化モデル図を示す）、そのＴｍ値は濃度に殆ど依存しない（参考文献；Hurme et al.，J. Bio. Chem，１９９６年，Cell，１９９７年）。したがって、本発明における温度感受性領域にＴｌｐＡの温度感受性部位を適用すれば、３７℃近傍の温度領域での生体の温度変化の観測が可能となる。【００２０】
具体的な本発明の温度感応タンパク質の好適な例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、中央部に前記シグナル領域としてＣ末端側を除去した蛍光タンパク質であるＧＦＰを配し、当該ＧＦＰのＮ末端及びＣ末端にそれぞれ前記温度感受性領域としてサルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質であるＴｌｐＡの温度感受性部位を配したものである。【００２１】
また、本発明は、上述した温度感応タンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドである。【００２２】
また、生体細胞での温度観察を可能にするためには、上述した温度感応タンパク質を発現するプラスミドを得ることが望ましく、斯かる本発明のプラスミドは、前記何れかの温度感応タンパク質をコードする塩基配列を含有する温度感応タンパク質発現プラスミドである。【００２３】
さらに、このような前記温度感応タンパク質発現プラスミドにおいては、温度感応タンパク質をコードする塩基配列に、細胞膜移行シグナルをコードする塩基配列や、ミトコンドリア等の細胞小器官移行シグナルをコードする塩基配列をさら加えたプラスミドとすることで、細胞膜や細胞小器官をターゲットとして温度感応タンパク質を形質導入することができるプラスミドを得ることができる。なお、温度感応タンパク質を形質導入する細胞小器官としては、ミトコンドリアの他にも、核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、葉緑体、ペルオキシソーム等をターゲットとして挙げることができる。【００２４】
そして、このような温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞であれば、当該細胞の内部の局所的な温度変化、例えば細胞小器官や細胞膜等の局所の温度変化をも温度感応タンパク質が呈するシグナルに基づいて計測することが可能となる。なお、温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入される細胞には、ヒトを含む動物細胞を適用することも可能である。【００２５】
さらに、このような温度感応タンパク質を利用する本発明の温度計測方法は、前記温度感応タンパク質発現細胞において呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する前記所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記細胞の温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用した細胞の温度計測方法である。【００２６】
特に、温度感応タンパク質をコードする塩基配列に加えて細胞膜移行シグナルをコードする塩基配列や、細胞小器官移行シグナルをコードする塩基配列を有する温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞においては、当該細胞の温度感応タンパク質が導入された部位で呈せられる温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより細胞の局所的な温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用した細胞の温度計測方法とすることで、従来は困難とされてきた当該細胞内の局所的な温度変化を計測することが可能となる。【００２７】
さらにまた、温度感応タンパク質とミトコンドリア移行シグナルとをコードする塩基配列を有する温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞に試薬を添加する工程と、前記細胞内のミトコンドリアにおいて呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記ミトコンドリアの局所的な温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用したミトコンドリア（又は細胞自体）に対する安全性確認試験方法、換言すればミトコンドリア（又は細胞自体）に対する毒性試験方法を確立することが可能である。すなわち、細胞内において酸素呼吸を行うミトコンドリアでは、酸素呼吸によるエネルギー産生に伴って顕著に熱を発生していると考えられることから、試薬の添加により前記シグナルの変化が検出されるか否かによって、ミトコンドリア又はそれを含む細胞自体の安全性又は毒性を確認することが可能となるのである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の温度感応タンパク質は、温度感受性部位として温度変化に伴って構造が変化する複数のペプチド鎖を、その構造変化に伴って所定のシグナルを発するペプチド鎖に融合させたものであるので、温度センサとして生体細胞の温度を感知することを可能ならしめるものであり、斯かる温度感応タンパク質を動物等の細胞に導入することで、生体細胞単位や細胞内の局所単位での温度変化を計測することが可能である。さらにこのような温度変化の検出を利用することで、細胞又は細胞内のミトコンドリアに対する試薬の安全性確認試験を行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】（ａ）ＧＦＰの発色団の構造式及び（ｂ）ＧＦＰの立体構造、を示す図。
【図２】（ａ）ＴｌｐＡの構造モデル図及び（ｂ）温度変化によるＴｌｐＡの構造変化を示すモデル図。
【図３】ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸの温度変化による構造変化を示すモデル図。
【図４】ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸの構造説明図。
【図５】ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸの２５μＭにおける（ａ）熱変性曲線をグラフで、及び（ｂ）メジャーピークとマイナーピークの比率と温度との関係をグラフで示す図。
【図６】ＴＷＩＸの各種濃度における（ａ）熱変性曲線をグラフで、（ｂ）メジャーピークとマイナーピークの比率と温度との関係をグラフで示す図。
【図７】各濃度におけるｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸの熱変性曲線を二状態遷移理論に基づいてプロットしたものをグラフで示す図。
【図８】ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸの温度変化による可逆性を、（Ａ）熱変性を表すグラフ、及びそのメジャーピークとマイナーピークの比率と温度との関係をグラフで示す図。
【図９】酸化剤、還元剤、他のイオン種がｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸの温度感受性に与える影響をグラフで示す図。
【図１０】ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸのＣＤスペクトルの（ａ）模式図、（ｂ）測定データのグラフ、（ｃ）各温度におけるθ２２２の値のグラフ、（ｄ）同二状態遷移理論を用いて補正してグラフで示す図。
【図１１】ＨＥＫ２９３細胞に形質導入したｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸの熱変性曲線（（ａ）３８０ｎｍ、（ｂ）４８０ｎｍ）とその（ｃ）レシオ及び（ｄ）レシオの平均値をグラフで示す図。
【図１２】ＨＥＫ２９３細胞に形質導入したｗｔＧＦＰの（ａ）熱変性曲線（（ａ）３８０ｎｍ、（ｂ）４８０ｎｍ）とその（ｃ）レシオ及び（ｄ）レシオの平均値をグラフで示す図。
【図１３】ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-ＦとｗｔＧＦＰ-Ｆの共焦点顕微鏡画像（ａ１）（ｂ１）、及び温度変化と蛍光強度比の関係（ａ２）（ｂ２）をグラフで示す図。
【図１４】細胞外の温度を物理的に変化させたときの細胞内における蛍光強度のレシオ値の変化の結果をグラフで示す図。
【図１５】ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆ、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏをそれぞれ導入したＨｅｌａ細胞の共焦点顕微鏡画像を示す図。
【図１６】ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏを用いたＣＣＣＰによるＨｅＬａ細胞の熱産生の評価試験結果をグラフで示す図。
【図１７】Ｒｏｔｅｎｏｎｅを用いたＣＣＣＰによるＨｅＬａ細胞の熱産生の評価結果をグラフで示す図。
【図１８】ＦＲＥＴによる温度変化検出の概念図。
【図１９】ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸのＦＲＥＴによる蛍光強度測定結果をグラフで示す図。
【図２０】ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰのＦＲＥＴによる蛍光強度測定結果をグラフで示す図。
【図２１】ＥＹＦＰの蛍光ピークＦ５２７を２０℃における蛍光Ｆ５２７，２０℃で一般化して温度に対してプロットし、グラフで表す図。
【図２２】熱変性曲線を二状態遷移理論に基づいてプロットしたものについて（ａ）蛍光強度値をグラフで、（ｂ）レシオ値をグラフで示す図。
【図２３】ｐＥＴ２３ａ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸプラスミドの作成工程及び構成図。
【図２４】ｐＥＴ２３ｂ-ｗｔＧＦＰプラスミドの作成工程及び構成図。
【図２５】ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸプラスミドの作成工程及び構成図。
【図２６】ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆプラスミドの作成工程及び構成図。
【図２７】ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ｗｔＧＦＰ-Ｆプラスミドの作成工程及び構成図。
【図２８】ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏの作成工程及び構成図。
【図２９】ｐＣＩ-ＥＣＦＰ-ＴＷＩＸの作成工程及び構成図。
【図３０】ｐＣＩ-ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸの作成工程及び構成図。
【図３１】ＴＷＩＸを形質導入した動物細胞の温度変化による蛍光強度比の測定装置の概観を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明の実施形態を、図面を参照して説明する。
本発明の第１実施形態は、本発明に係る温度感応タンパク質の一例として、図３にモデル図を示すように、温度感受性領域（１１）に２つのＴｌｐＡを適用するとともにシグナル領域（１２）にＧＦＰ（ｗｔＧＦＰ）を適用した融合タンパク質（１）であり、３７℃近傍の温度領域において２つの融合タンパク質（１）の温度感受性領域（１１）が二量体又は単量体となってシグナル領域（１２）同士が近接又は離間することで当該シグナル領域における励起波長の変化に伴う細胞内温度の変化を観察できるようにするものである。【００３１】
具体的に、本実施形態における前記融合タンパク質（１）は、シグナル領域を構成するＧＦＰのＣ末端とＮ末端に、それぞれＴｌｐＡのコイルドコイルドメインを結合させたものであり、以下、この融合タンパク質（１）を「ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ」（図中の符号は１）と称することとする。「ＴＷＩＸ」とは、「Ｔａｎｄｅｍ  ｗｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｉｌｓ  ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｏｒ」から名付けた略称である。より詳細に図４を参照して説明すると、ＴｌｐＡには、長短２つのコイルドコイルを形成するドメインがあり（前掲参考文献；Hurme et al.，J. Bio. Chem，１９９６年）、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の温度感受性領域（１１）には、そのうち長い方のコイルドコイルドメイン（第９４番目から第２５７番目のアミノ酸残基；ＴｌｐＡ-Ｎ）を２つ利用している（同図上段のＴｌｐＡのコイルドコイル性を表すグラフを参照）。一方、シグナル領域（１２）には、ｗｔＧＦＰの発色団（第１番目から第２２９番目のアミノ酸残基）のみを利用し、Ｃ末端側９アミノ酸残基（第２３０番目から第２３８番目）を削除して、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）のシグナル領域（１２）として利用している。すなわち、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）は、ＧＦＰの発色団を２つの同一のＴｌｐＡコイルドコイルドメイン（ＴｌｐＡ-Ｎ）で挟み込むように設計したものである（同図下段のＴＷＩＸの構造説明図を参照）。ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示したとおりである。以下、必要に応じて融合タンパク質（１）を少々する場合にはＴＷＩＸ（１）と呼ぶものとする。【００３２】
このｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）は、例えば大腸菌発現ベクターにライゲーションして発現させ、生成することで得ることができる（詳細は後述する実施例を参照のこと）。３７℃を境にした加温、冷却に伴うｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の構造変化については、３７℃以上では、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）が１分子ずつ独立しているのに対して、３７℃未満では、一方のｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）における各温度感受性領域（１１）を構成するＴｌｐＡ-Ｎが他方のｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）における各温度感受性領域（１１）のＴｌｐＡ-Ｎと二量体化しているのに伴って、シグナル領域（１２）を構成するＧＦＰの発色団同士が近接することとなる。【００３３】
このようなｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の温度変化に伴う構造変化が生じていることを検証するために、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の発現・精製を行い、蛍光強度と温度変化との関係を試験した。図５（ａ）に、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の２５μＭでの熱変性曲線を示す。温度変化は１５℃から５０℃まで５℃刻みとして、横軸に波長、縦軸に蛍光強度を設定した。概ね４５０ｎｍ以下では温度が低い方が蛍光強度が大きく、４５０ｎｍ以上では温度が高い方が蛍光強度が大きいという結果が得られたが、何れの温度でも４００ｎｍにメジャーピーク、４８０ｎｍにマイナーピークが認められた。このメジャーピークとマイナーピークの比率（Ratio (ex400/ex480)）と温度との関係を同図（ｂ）に示す。同図から明らかなように、３７℃付近を中心として３５℃から４０℃の間で蛍光強度が大きく変化していることが示されており、この温度領域を高温側に超えることでｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）におけるＧＦＰの立体障害が解消されていることが明らかとなった。なお、比較のため、ｗｔＧＦＰを例えば大腸菌発現ベクターにライゲーション（詳細は後述する実施例を参照のこと）して発現させ、生成したものを用いて、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）と同様の試験を行い、メジャーピークとマイナーピークの比率と温度との関係を同様に調べたところ、同図（ｂ）に×印で示す曲線のように、ｗｔＧＦＰ単独では温度上昇に伴って前記比率がなだらかに変化しているに過ぎないことが分かる。【００３４】
さらに、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の濃度を変化（５μＭ，１μＭ，０．２μＭ）させて、上記と同様に熱変性曲線を調べ、メジャーピークとマイナーピークの比率（Ratio (ex400/ex480)）と温度との関係をプロットすると、図６（ａ１，ａ２，ａ３に熱変性曲線、ｂ１，ｂ２，ｂ３にレシオ）に示すような結果となり、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の濃度により各温度での蛍光強度には差があるものの、４００ｎｍにメジャーピーク、４８０ｎｍにマイナーピークが認められ、３０℃強から３５℃強の間で蛍光強度が大きく変化するという、２５μＭの場合と類似の結果が得られた。この場合も比較のため、ＧＦＰについても各濃度（５μＭ，１μＭ，０．２μＭ）でメジャーピークとマイナーピークの比率と温度との関係を調べたが、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）のような温度による蛍光強度の大きな変化は認められなかった。【００３５】
そこで、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の前述した各濃度（２５μＭ，５μＭ，１μＭ，０．２μＭ）における熱変性曲線を二状態遷移理論に基づいてプロットすると、図７にグラフで示すように、具体的なＴＭ値は、２５μＭで３７．７℃、５μＭで３５．５℃、１μＭで３３．８℃、０．２μＭで３２．５℃である。以上の結果から、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）のＴＭ値には若干の濃度依存性があり、それには分子間相互作用が働いていることが示唆される。しかしながら、全体的な傾向としては、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）は、０．２μＭから２５μＭの濃度範囲では、３０℃を少し超えたところから４０℃を超えない温度領域において、メジャーピークとマイナーピークの比率が極端に変化する結果となった。【００３６】
ここで、以上のようなｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の温度感受性が可逆的であるかどうかを検証するために、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）に対して加熱、冷却を繰り返したときにおける温度感受性の変化を蛍光強度の計測により調べた。その結果を図８に示す。同図（Ａ）はｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）に対する加熱・冷却時における各温度での励起スペクトルの変化を示すものであり、（ａ）は２０℃から５０℃まで加熱したときの５℃毎の変化を、（ｂ）は同じサンプルを５０℃から２０℃まで冷却したときの５℃毎の変化を、（ｃ）はさらに同じサンプルを２０℃から５０℃まで加熱したときの５℃毎の変化を、（ｄ）はさらに同じサンプルを５０℃から２０℃まで冷却したときの５℃毎の変化を、それぞれプロットしたグラフを示している。また同図（Ｂ）は、（Ａ）におけるにメジャーピーク（４００ｎｍ）とマイナーピーク（４８０ｎｍ）の比率（Ratio (ex400/ex480)）と温度との関係を示している。これらの結果から判断すると、初回の加熱時（同図（Ａ）（ａ））におけるレシオ値の変化（同図（Ｂ））は少しだけずれてはいるが、それ以外のレシオ値の変化曲線は完全に一致していることから、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の蛍光強度変化から分かる温度感受性は、ほぼ完全可逆的である。さらに、この可逆的なｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の温度感受性には、タンパク質の相転移の場合にしばしば見受けられるヒステリシスがなく、加熱・冷却によるタンパク質の変性も生じていないことが確認された。以上により、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）は細胞に対して繰り返し何度も使用することが可能な温度センサとして極めて有用であるといえる。【００３７】
また、熱以外にもタンパク質の構造に影響を与える他の因子についても、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）自体にどのような影響を及ぼすかを検証した。すなわち、熱以外の因子として、ｐＨ（７〜８）、酸化剤（Ｈ２Ｏ２；）、還元剤（ＤＴＴ；Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋について、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）への滴下実験によって評価した。具体的な実験方法については、後述の実施例の項において詳述する。結果を図９に示す。ｐＨについては同図（ａ）に示すように、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を含む液のｐＨを徐々に変化させ、蛍光強度を測定してメジャーピーク（４００ｎｍ）とマイナーピーク（４８０ｎｍ）の比率（Ratio (ex400/ex480)）を縦軸、ｐＨを横軸としたグラフで表すと、ｐＨの変化によるｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の蛍光強度のレシオ値はほとんど変化がなく安定していた。酸化剤については同図（ｂ）に、還元剤については同図（ｃ）に示すように、Ｈ２Ｏ２又はＤＴＴを順次滴下してｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を含む液の濃度を適宜変化させ、蛍光強度を測定してメジャーピーク（４００ｎｍ）とマイナーピーク（４８０ｎｍ）の比率（Ratio (ex400/ex480)）を縦軸、Ｈ２Ｏ２又はＤＴＴの濃度の対数を横軸としたグラフで表すと、酸化剤・還元剤の濃度変化によってはｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の蛍光強度のレシオ値はほとんど変化がなく安定していた。Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋については、タンパク質間相互作用に影響する可能性が考えられたため、それらの存在によって熱に対する感受性が影響を受けるかどうかを蛍光強度を測定することにより調べたものである。同図（ｄ）（ｅ）に示すように、縦軸を蛍光強度を測定してメジャーピーク（４００ｎｍ）とマイナーピーク（４８０ｎｍ）の比率（Ratio (ex400/ex480)）、横軸を温度としてグラフで表すと、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋の濃度を変化させても、２０℃から５０℃の間でレシオ値に変化は認められなかった。以上の結果から、これら全ての外的環境因子は、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の機能に影響しないことが判明した。すなわち、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の温度感受性は、熱も含めて外的な環境の変化に極めて強く、細胞に対知る温度センサとして極めて優れたものであるといえる。【００３８】
また、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の構造変化は、上述のようなシグナル領域（１２）を構成するＧＦＰの蛍光強度比だけでなく、温度感受性領域（１１）を構成するＴｌｐＡ-Ｎのαへリックス構造の含有量によっても確認することができる。すなわち、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の円二色性スペクトル（ＣＤスペクトル）を測定することで、図１０（ａ）のモデル図に示すように、各温度におけるｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）がＴｌｐＡ-Ｎにおいて二量体化していれば２２２ｎｍでθ値が低下するが、単量体であれば２２２ｎｍにおけるθ値の低下は認められないこととなる。同図（ｂ）に２０℃から５５℃まで５℃刻みでのＣＤスペクトルの計測データのグラフ、同図（ｃ）に各温度におけるθ２２２の値のグラフ、同図（ｄ）に同図（ｃ）の値を二状態遷移理論を用いて補正したグラフを示す。同図（ｄ）のグラフから、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）のＴＭ値としては、３８．８℃が得られた。これらの結果と、前述した蛍光強度比と温度変化との関係の結果を総合すると、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）は３７℃を中心とした特に３５℃から４０℃の温度領域で大きな蛍光の変化を示し、この温度領域で二量体又は単量体に相互変化することが明らかとなった。【００３９】
以上の結果に鑑みて、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の蛍光強度比を測定することで、少なくとも３５℃から４０℃の温度領域での細胞の温度変化を確認することができることが明らかとなったことから、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の動物細胞への導入を行い、次いでその細胞に対して温度を変化させながら蛍光強度を測定した。すなわち、哺乳動物発現ベクターにライゲーションしたｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を、高分子ポリカチオン遺伝子導入剤を用いてヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞に形質導入した（詳細は後述する実施例を参照のこと）。そして、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を導入したＨＥＫ２９３細胞をガラスプレートに載せ、灌流法にて昇温条件にて温度を変化させながらガラスプレート上の細胞それぞれの蛍光強度を測定した。具体的な細胞内蛍光強度の測定試験方法については、後述の実施形態の項で詳述する。複数の細胞（本試験例では１１）について同様の試験を繰り返し、図１１に示すような熱変性曲線を得た。同図（ａ）〜（ｃ）は、１１株のｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を導入したＨＥＫ２９３細胞ごとの測定結果をプロットしたグラフであり、同図（ａ）は３８０ｎｍで励起した場合の熱変性曲線を示し、同図（ｂ）は４８０ｎｍで励起した場合の熱変性曲線を示す。何れも横軸は温度、縦軸は蛍光強度を表す。なお、蛍光強度の測定には、一般的に広く利用される３８０ｎｍの励起フィルターを使用したため、低波長側については４００ｎｍではなく３８０ｎｍの蛍光強度を測定したが、３８０ｎｍでも４００ｎｍを測定した場合と同様の結果が得られる。そして、細胞ごとの３８０ｎｍと４８０ｎｍの比率（Ratio (ex380/ex480)）と温度との関係は同図（ｃ）に示すようなものとなり、３８０ｎｍと４８０ｎｍ蛍光強度比の平均値をプロットすると同図（ｄ）に示す結果となった。すなわち、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に導入した場合であっても、３５℃から４０℃の間の温度領域、特に３７℃付近で蛍光強度比が大きく変化している。なお、比較のために、ｗｔＧＦＰを形質導入したＨＥＫ２９３細胞（詳細は後述する実施例を参照のこと）についても同様の試験を行い（細胞数１２）、図１２に示すような結果を得た。同図（ａ）〜（ｃ）は、１２株のｗｔＧＦＰを導入したＨＥＫ２９３細胞ごとの測定結果をプロットしたグラフであり、同図（ａ）は３８０ｎｍで励起した場合の熱変性曲線、同図（ｂ）は４８０ｎｍで励起した場合の熱変性曲線、同図（ｃ）は細胞ごとの３８０ｎｍと４８０ｎｍの比率（Ratio (ex380/ex480)）と温度との関係、同図（ｄ）は３８０ｎｍと４８０ｎｍ蛍光強度比の平均を表す。すなわち、ｗｔＧＦＰを導入したＨＥＫ２９３細胞では、蛍光強度比が大きく変化する温度領域は認められない。このことから、特に図１１（ｄ）と図１２（ｄ）の比較から分かるように、ＴＷＩＸが存在するｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を導入した細胞では、３５〜４０℃付近で蛍光強度が急激に変化しているが、ｗｔＧＰＦのみを導入した細胞では蛍光強度が比較的直線的に変化するため、温度感受性領域であるＴＷＩＸの存在により、本実施形態では少なくとも３５〜４０℃付近の温度変化を感度よく読みだして敏感に感知できるといえる。【００４０】
さらに、細胞内の局所的な温度変化が観測可能であるか確認すべく、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を哺乳動物の細胞膜に移行させ発現させたうえで温度による蛍光強度変化を測定した。ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の細胞膜への移行へは、哺乳動物発現ベクターにｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）をライゲーションする際にファルネシル化シグナルを付加し、その産物をヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞に形質導入した。なお、比較のために同様の手法を用いてｗｔＧＦＰにもファルネシル化シグナルを付加したうえで哺乳動物発現ベクターにライゲーションし、それをＨＥＫ２９３細胞に形質導入した（以上、詳細は後述する実施例を参照のこと）。そして、これらの細胞（ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆ，ｗｔＧＦＰ-Ｆと称する）を、温度を変化させながら蛍光変化を測定した。図１３（ａ１），（ｂ１）は、それぞれｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆ，ｗｔＧＦＰ-Ｆを４８８ｎｍで励起した際の共焦点顕微鏡画像である（具体的な発現の確認方法については、後述の実施例の項に詳述する）。各画像の左側の写真から分かるように、細胞膜に蛍光（リング状に白く光っている部分）が認められる。また、同図（ａ２），（ｂ２）は、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆ，ｗｔＧＦＰ-Ｆの温度による蛍光変化を計測し、その３８０ｎｍと４８０ｎｍの比率（Ratio (ex380/ex480)）との関係を示すグラフである。ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆでは３７℃付近で蛍光強度比が大きく変化しているが、ｗｔＧＦＰ-Ｆではそのような大きな変化は認められない。【００４１】
以上の結果から、本実施形態に係る温度感応タンパク質であるｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）は、哺乳動物細胞に形質導入した場合でも、約３７℃を中心とする温度領域において、温度感受性領域（１１）であるＴｌｐＡ-Ｎが二量体と単量体との間を相互変換し、それに伴ってシグナル領域（１２）であるＧＦＰが近接又は離間して２つの励起スペクトルの蛍光強度比を変化させる。したがって、この２つの励起スペクトルの蛍光強度比を測定すれば、細胞ごとの温度変化、或いは細胞内の局所的な温度変化を測定することができることとなり、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）は生体細胞の温度センサとして有用であることを明らかにすることができた。【００４２】
次に、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）が細胞内に導入しても温度センサとして機能することを検証するために、細胞内で温度センサを発現させた後に、細胞外液の温度を物理的に変化させると細胞内ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の蛍光がどのように変化するのかを調べた。この実験では、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を導入する細胞として、ヒト子宮頸ガン由来のＨｅＬａ細胞を利用し、ＨｅＬａ細胞内のミトコンドリアにｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を発現させることとした。ＨｅＬａ細胞を用いたのは、予備的な試験から、ＨＥＫ２９３細胞と比較して、増殖能が高い上にミトコンドリアの数も多く、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を導入した場合の蛍光感度が高いことが確認されたからである。蛍光測定は、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）について、細胞外液のコントロールは還流中の細胞外液を電熱線で過熱することでコントロールして行った（詳細は、後述の実施例の項を参照）。ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の利点は、形質導入するプラスミドＤＮＡが１つでよいこと、またレシオ値として算出するためにデータが細胞内のｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の発現量に左右されないということなどにある。この実験では、温度感受性領域（１１）とシグナル領域（１２）の両方を持つｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆ、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏをそれぞれ形質導入した細胞と、温度感受性領域のないｗｔＧＦＰ、ｗｔＧＦＰ-Ｆ、ｗｔＧＦＰ-Ｍｉｔｏをそれぞれ形質導入した細胞について、温度変化による蛍光強度の変化を比較することにより行った。ここでは各細胞を、それらに導入されたタンパク質の名称で呼ぶものとする。なお、タンパク質ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏ及びｗｔＧＦＰ-Ｍｉｔｏは、それぞれｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）又はｗｔＧＦＰにミトコンドリア移行シグナルを付加したものである。ＨｅＬａ細胞内のミトコンドリアへのｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）の形質導入については、後述の実施例の項に詳述する。【００４３】
この実験結果を図１４に示す。温度感受性部位の付いていないｗｔＧＦＰ（同図ａ２））、ｗｔＧＦＰ-Ｆ（同図ｂ２）、ｗｔＧＦＰ-Ｍｉｔｏ（同図ｃ２）を形質導入した細胞では特定の温度領域での急激な蛍光強度（レシオ値）の変化は認められなかったが、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）（同図（同図ａ１））、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆ（同図ｂ１）、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏ（同図ｃ１）を形質導入した細胞では、何れも特定の温度領域（概ね３５℃前後）において蛍光が大きく変化していることがわかった。これは３種のｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）がそれぞれ細胞外の物理的な温度変化を感知し、精製タンパク質での結果と同様に、特定の温度領域でレシオ値を変化させたためであると考えられる。この結果から、細胞内においても、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）は温度センサとして機能するということがわかった。図１５（ａ）（ｂ）（ｃ）は、それぞれｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆ、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏを導入したＨｅＬａ細胞を４８８ｎｍで励起した際の共焦点顕微鏡画像である（具体的な発現の確認方法については、後述の実施例の項に詳述する）。これら各図において白く光っている部分、すなわちＨｅＬａ細胞の細胞質全体（ａ）、細胞膜（ｂ）、ミトコンドリア（ｃ）に蛍光が認められる。すなわち、ターゲットとした細胞の特定部位にｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸを発現させることができていることが分かる。【００４４】
上記の検証結果から、生体細胞内のミトコンドリアに導入したｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）が生体内温度センサとして機能することが確認されたので、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を用いた細胞の熱産生を確認することとした。生体では様々な方法を用いて熱を産生している。中でもげっ歯類、冬眠明けの動物、赤ん坊などは褐色脂肪細胞において熱を産生していることが知られる。過去の報告から、褐色脂肪細胞ではミトコンドリア膜間スペースのプロトン勾配を脱共役タンパク質ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＵＣＰ１）によって脱共役させることで熱が産生されると考えられている。それを人工的に模倣する系として、ミトコンドリア脱共役剤であるＣＣＣＰ（carbonyl cyanide m-chloro phenyl hydrazone）を処置し人工的に脱共役状態すると、細胞培養液全体の温度が上昇することが知られている。そこで、ＣＣＣＰによって生細胞で熱が産生されているかを蛍光性温度センサーであるｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を用いて評価した。【００４５】
具体的な実験としては、ＨｅＬａ細胞にｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏを発現させたとき、ＣＣＣＰによって蛍光がどのように変化するかを検証した。２ｍＭのＣａ２＋存在下においてｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏを発現させたＨｅＬａ細胞の蛍光強度を測定し、測定開始から１２０秒後に１０μＭのＣＣＣＰを同細胞に処置した。対照として、ＴＷＩＸを有しないｗｔＧＦＰ-Ｍｉｔｏを発現させたＨｅＬａ細胞についても同様に試験した。具体的な実験方法については、後述の実施例の項において詳述する。その結果を図１６に示す。同図Ａは、蛍光強度の測定結果に基づいてレシオ値を時間毎にプロットしたグラフであり、（ａ）はｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏを発現させたＨｅＬａ細胞についての結果、（ｂ）はｗｔＧＦＰ-Ｍｉｔｏを発現させたＨｅＬａ細胞についての結果である。同図Ｂ（ａ）（ｂ）は、同図Ａの傾きをキャンセルし、変化量を比較した結果である。同図より分かるとおり、１０μＭのＣＣＣＰをｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏを発現させたＨｅＬａ細胞に処置したころレシオ値の減少が見られた。この変化はｗｔＧＦＰ-Ｍｉｔｏを発現させたＨｅＬａ細胞では見られなかった。なお、脱共役剤として上記のような試験に用いられるものには、この実験で用いたＣＣＣＰの他にも、２，４-ジニトロフェノール等を挙げることができる。【００４６】
またこの変化が、電子伝達系複合体Ｉ阻害剤であるＲｏｔｅｎｏｎｅの存在下では起こり得るかについても検証した。図１７にその結果を示す。同図Ａにおいて、（ａ）は２ｍＭのＣａ２＋存在下においてｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏを発現させたＨｅＬａ細胞の蛍光強度を測定し、測定開始から１２０秒後に１０μＭのＣＣＣＰを同細胞に処置した場合の時間毎のレシオ値をプロットしたグラフであり、（ｂ）は、（ａ）の条件に加えて１０μＭのＲｏｔｅｎｏｎｅ存在下におけるグラフである。同図Ｂは、Ａにおけるレシオ値の変化量を比較した結果を示している。この結果から、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏを発現させたＨｅＬａ細胞にＣＣＣＰを添加することによる蛍光強度のピークのレシオ値の減少は、Ｒｏｔｅｎｏｎｅを処置することで抑制されることが明らかとなった。以上のことから、ＨｅＬａ細胞においては、ＣＣＣＰによるプロトン勾配の脱共役によって熱が産生されるということがわかった。【００４７】
上記の検証結果に基づけば、添加する試薬の細胞内のミトコンドリアへの安全性試験（又は毒性試験）として応用することができる。つまり、上記の結果によると、脱共役剤はミトコンドリアの呼吸作用を止める働きをすることから、脱共役剤（ＣＣＣＰ）の添加によりミトコンドリアの呼吸が止まり熱産生が停止したことを細胞の蛍光変化を測定することで確認することができる。すなわち、シグナル領域（１２）のＣ末端及びＮ末端にそれぞれ温度感受性領域（１１）を備えた本発明の融合タンパク質（１）（例えばｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ）にミトコンドリア移行シグナルを加えたものを用意し（例えばｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏ）、それを生体細胞に形質導入したものに対して試薬を添加して、当該シグナル領域（１２）により呈せられるシグナル（例えば蛍光）を測定すれば、ある温度領域におけるシグナルの急激な変化が認められた場合には、当該試薬にはミトコンドリアへの呼吸停止といった毒性が存することが確認できる。【００４８】
以上に述べた試験では、ｗｔＧＦＰが有するＰＲＩＭ（Proximity Imaging）という性質を温度変化の検出方法として採用してきたが、他の方法としてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動；Fluorescence Resonance Energy Transfer）によっても温度変化を検出できるかについて検証した。ここでは、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）に代えて、オワンクラゲ由来の蛍光タンパク質ＣＦＰとＹＦＰの強化蛍光タンパク質であるＥＣＦＰとＥＹＦＰ（何れも発色団である第１番目から第２２９番目のアミノ酸残基）を利用し、それぞれのＣ末端及びＮ末端にＴｌｐＡの長い方のコイルドコイルドメインである第９４番目から第２５７番目のアミノ酸残基（ＴｌｐＡ-Ｎ）を融合させたＥＣＦＰ-ＴＷＩＸ（２）とＥＹＦＰ-ＴＷＩＸ（３）を利用した。ＦＲＥＴによる温度変化検出の概念図を図１８に示す。理論的には、ＥＣＦＰ-ＴＷＩＸ（２）とＥＹＦＰ-ＴＷＩＸ（３）の混合溶液に３９５ｎｍの光を照射すると、低温域では両融合タンパク質（２及び３）のＴｌｐＡ-Ｎが二量体化してＥＣＦＰとＥＹＦＰが近接し、ＥＹＦＰに基づく励起された５２８ｎｍの蛍光が観察され、高温域では両融合タンパク質（２及び３）のＴｌｐＡ-Ｎが単量体となりＥＣＦＰとＥＹＦＰが離間して、ＥＣＦＰに基づく励起された４５７ｎｍの蛍光が観察されると考えられる。そこで、種々の濃度（０．２μＭ、１μＭ、５μＭ、２５μＭ）のＥＣＦＰ-ＴＷＩＸ（２）とＥＹＦＰ-ＴＷＩＸ（３）の混合溶液（以下、「ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸ」と称する）について、２０℃から５０℃までの間で５℃毎に温度変化させた場合の蛍光強度を測定した。その結果を図１９に示す。同図において、ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸの濃度が（ａ）は０．２μＭ、（ｂ）は１μＭ、（ｃ）は５μＭ、（ｄ）は２５μＭの場合における結果である。同図から明らかなように、ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸの何れの濃度においても、低温側（２０〜２５℃）でＥＹＦＰ-ＴＷＩＸに由来する蛍光と考えられる５２７ｎｍの蛍光ピークが認められた。なお、比較のため、図２０に示すように、コイルドコイルドメインを有さない発色団ＥＣＦＰとＥＹＦＰの混合溶液（「ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ」１μＭ（同図（ａ））、５μＭ（同図（ｂ））、２５μＭ（同図（ｃ）））ついて、２０℃から５０℃までの間で５℃毎に温度変化させた場合の蛍光強度を測定したところ、３５〜４０℃付近における大きな蛍光変化は観測されなかった。【００４９】
そこで、ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸの温度変化による蛍光変化を詳細に解析するために、ＦＲＥＴによって転移した励起エネルギーによるＥＹＦＰの蛍光ピークＦ５２７を２０℃における蛍光Ｆ５２７，２０℃で一般化して温度に対してプロットし、ＥＹＦＰのピークにおける温度依存性を検証した結果を図２１に示す。同図に示す結果から、ＥＣＦＰ-ＴＷＩＸとＥＹＦＰ-ＴＷＩＸとの混合タンパク質溶液（ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸ）では、何れの濃度（同図（ａ）１μＭ、同図（ｂ）５μＭ、同図（ｃ）２５μＭ）においても温度を上昇させると、３０〜３５℃にかけて大きな変化が認められた。一方、対照としたＥＣＦＰとＥＹＦＰとの混合タンパク質溶液（ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ）では、温度変化に伴う蛍光Ｆ５２７，２０℃の変化は直線的であり、急激な蛍光変化がある温度領域は存在しなかった。これらの結果から、シグナル領域にＥＣＦＰとＥＹＦＰを用いた場合でも、ＦＲＥＴを介して温度変化が検出できることがわかった。また、図２２（（ａ）は蛍光強度値、（ｂ）はレシオ値を示す）に示すように、その変化領域における濃度依存性はないことが確認された。以上の結果は、ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ（１）を用いてＰＲＩＮによって温度変化を検出したときの結果と同じであることから、ＦＲＥＴによる温度検出も有用であることが示された。【００５０】
なお、以上に説明した実施形態は本発明の一例であって、本発明は上述した実施形態に限定されるものではない。例えば、本発明の温度感応タンパク質のシグナル領域として上述のようなＧＦＰを利用する場合、温度感受性領域である２つのＴｌｐＡ-Ｎの結合部位は当該ＧＦＰの両端以外としても構わないし、ＧＦＰに３以上のＴｌｐＡ-Ｎを結合させて温度感応タンパク質を構成してもよい。また、シグナル領域には上述した実施形態のＧＦＰやｗｔＧＦＰを利用したり、それら以外（青色タンパク質（ＢＦＰ）、シアン色タンパク質（ＣＦＰ）、黄色タンパク質（ＹＦＰ）、赤色タンパク質（ＤｓＲｅｄ）等）の蛍光タンパク質又はそれらの強化蛍光タンパク質を利用してもよいし、２つの異なる蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動も利用できる。シグナル領域に酵素反応を行うペプチド、例えば発光／消光反応であればルシフェラーゼやエクオリン等、発色／消色反応であればβ-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等を、温度計測対象となる細胞に応じて適宜利用することができる。一方、温度感受性領域には、ＴｌｐＡ以外のコイルドコイルタンパク質や、所定の温度領域で構造が変化する適宜のペプチド（c-Fos、c-Jun、GCN4、Tropomyosin、DNA polymerase、Seryl tRNA synthase等）を利用することができ、シグナル領域に結合させる２つ以上の温度感受性領域は異なる種類（異なるアミノ酸配列）のものとしてもよく、測定温度や測定対象となる細胞との相性に応じて適宜のものを選択すればよい。また、本発明の温度感応タンパク質は、温度感受性領域を構成する複数のペプチドと、シグナル領域を構成するペプチドのみからなるものの他、温度感受性領域の構造変化やそれに伴うシグナル領域の反応性を阻害しない限り、他のアミノ酸配列が付加されたものとすることも可能である。さらに、ＴＷＩＸ（１）を発現させる動物細胞は、ＨＥＫ２９３以外にも、ＣＨＯ、ＰＣ１２、ＭＤＣＫ、ＨｅＬａ、ＢＨＫやＣＯＳ等の適宜のものを利用することができる。その他、各部の具体的構成についても上記実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
【実施例】
【００５１】
以下、上述した実施形態で利用した各種プラスミドの作成方法、各種試験方法の例について説明する。【００５２】
＜１．ｐｗｔＧＦＰ-Ｃ１プラスミドの構築＞  まず、ｗｔＧＦＰを得るために、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１を変異させてｐｗｔＧＦＰ-Ｃ１を作製した。変異はＰＣＲ法を用いて導入した。まず、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１を鋳型にしてＰＣＲ反応を行った。プライマーにはｗｔＧＦＰ-１（配列番号２）とｗｔＧＦＰ-２（配列番号３）を用いた。酵素はＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ-Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用し、反応液の組成や反応条件等は付属のマニュアルに従った。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、大腸菌ＤＨ５αに導入してサブクローニングすることでｐｗｔＧＦＰ-Ｃ１を得た。【００５３】
＜２．ｐＥＴ２３ａ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ大腸菌発現プラスミドの構築＞  Ｃ末端側を除去したＧＦＰ（１-２２９）は、上記＜１＞のｐｗｔＧＦＰ-Ｃ１プラスミドから、ＴｌｐＡの長い方のコイルドコイルドメイン（ＴｌｐＡ-Ｎ）（以下、ＴｌｐＡ（９４-２５７））は、Ｎ末端側，Ｃ末端側共にｐＫＤＳＣ５０（Haneda, T. et al.,
Infect Immun., 69, 2612-2620, (2001)）からそれぞれＰＣＲ法を用いて増幅させた。プライマーはｗｔＧＦＰ（１-２２９）の増幅にはＧＦＰ１-５’＿ＥｃｏＲＩ（配列番号４）とＧＦＰ２２９-３’＿ＳｐｅＩ（配列番号５）、ＴｌｐＡ（９４-２５７）の増幅にはＮ末端側，Ｃ末端側にそれぞれＴｌｐＡ９４-５’＿ＢａｍＨＩ（配列番号６）とＴｌｐＡ２５７-３’＿ＥｃｏＲＩ（配列番号７）、ＴｌｐＡ９４-５’＿ＳｐｅＩ（配列番号８）とＴｌｐＡ２５７-３’＿ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号９）を用いた。酵素はＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用し、反応条件等は付属のマニュアルに従った。得られた断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（-）＿ＥｃｏＲＶ  ｄｉｇｅｓｔベクターにライゲーションし大腸菌ＤＨ５αに導入することによりサブクローニングした。このうちｗｔＧＦＰ（１-２２９）とＴｌｐＡ-Ｎ（９４-２５７）のＣ末端側については、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩ、ＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、それらをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（-）ベクターにライゲーションし大腸菌ＤＨ５αに導入してサブクローニングした。得られたｗｔＧＦＰ（１-２２９）-ＴｌｐＡ-Ｎ（９４-２５７）とＴｌｐＡ-Ｎ（９４-２５７）のＮ末端側をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理し、あらかじめＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＥＴ２３ａ（+）ベクターにライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入してサブクローニングすることでｐＥＴ２３ａ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸプラスミドを得た。図２３に、ｐＥＴ２３ａ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸプラスミドの作成工程及び構成図を示す。【００５４】
＜３．ｐＥＴ２３ｂ-ｗｔＧＦＰ大腸菌発現プラスミドの構築＞  ｗｔＧＦＰ（１-２２９）は上記＜１＞のｐｗｔＧＦＰ-Ｃ１プラスミドからＰＣＲ法を用いて増幅させた。プライマーはＧＦＰ１-５’＿ＢａｍＨＩ（配列番号１０）とＧＦＰ２２９-３’＿ＥｃｏＲＩ（配列番号１１）を用いた。酵素はＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用し、反応条件等はマニュアルに従った。得られた断片は共にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（-）＿ＥｃｏＲＶ  ｄｉｇｅｓｔベクターにライゲーションし大腸菌ＤＨ５αに導入することによりサブクローニングした。これを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理し、あらかじめＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理したｐＥＴ２３ａ（+）ベクターにライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入してサブクローニングすることでｐＥＴ２３ｂ-ｗｔＧＦＰプラスミドを得た。図２４に、ｐＥＴ２３ｂ-ｗｔＧＦＰプラスミドの作成工程及び構成図を示す。【００５５】
＜４．ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ哺乳類細胞発現プラスミドの構築＞  ＴｌｐＡ（９４-２５７）のＮ末端側とＧＦＰ（１-２２９）-ＴｌｐＡ（９４-２５７）は、上記＜２＞のｐＥＴ２３ａ-ＴＷＩＸプラスミドからＰＣＲ法を用いて増幅させた。プライマーはそれぞれＴｌｐａ９４-５’＿ＮｈｅＩ（配列番号１２）とＴｌｐＡ２５７-３’＿ＥｃｏＲＩ（配列番号７）、ＧＦＰ１-５’＿ＥｃｏＲＩ（配列番号４）とＴｌｐＡ２５７-３’＿ＸｈｏＩ（配列番号１３）を用いた。酵素はＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用し、反応条件等はマニュアルに従った。得られた断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（-）＿ＥｃｏＲＶ  ｄｉｇｅｓｔベクターにライゲーションし大腸菌ＤＨ５αに導入することによりサブクローニングした。それらをそれぞれ制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理し、あらかじめＮｈｅＩとＸｈｏＩで処理したｐＣＩ-ｎｅｏベクターにライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入してサブクローニングすることでｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸプラスミドを得た。図２５に、ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸプラスミドの作成工程及び構成図を示す。【００５６】
＜５．ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆ哺乳類細胞発現プラスミドの構築＞  細胞膜への移行シグナルとしてはｃ-Ｈａ-Ｒａｓのファルネシル化シグナル（ＦＣ）であるＣＡＡＸ  ｂｏｘを利用した（参考文献；Aronheim, A. et al., Cell, 78, 949-961,
(1994)）。ファルネシル化シグナルは、ＰＣＲ法を用いて付加・増幅させた。まず上記＜２＞でｐＥＴ２３ａ-ＴＷＩＸプラスミドを構築する際に用いたＴｌｐＡ（９４-２５７）のＣ末端断片（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（-）に導入）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。プライマーはＴｌｐＡ９４-５’＿ＳｐｅＩ（配列番号８）とＴｌｐＡ２５７-３’＿ＣＡＡＸ１（配列番号１４）を用いた。酵素はＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ   Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、反応液の組成や反応条件はマニュアルに従った。さらにこのＰＣＲ産物を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。プライマーはＴｌｐＡ９４-５’＿ＳｐｅＩ（配列番号８）とＴｌｐＡ２５７-３’＿ＣＡＡＸ２（配列番号１５）を用いた。酵素はＣｌｏｎｔｅｃｈ社のＢＤ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用し、反応液の組成や反応条件等はマニュアルに従った。得られた断片はＰｒｏｍｅｇａ社のｐＧＥＭ-Ｔ-ｅａｓｙベクターにライゲーションし大腸菌ＤＨ５αに導入することによりサブクローニングした。これを制限酵素ＳｐｅＩとＸｈｏＩで処理し断片を得た。またＴｌｐＡ（９４-２５７）-ＧＦＰ（１-２２９）断片を、ｐＣＩ-ＴＷＩＸプラスミドを制限酵素ＳａｃＩとＳｐｅＩで処理することで得た。これらの断片を、あらかじめＳａｃＩとＸｈｏＩで処理したｐＣＩ-ＴＷＩＸプラスミドにライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入してサブクローニングすることでｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆプラスミドを得た。図２６に、ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｆプラスミドの作成工程及び構成図を示す。【００５７】
＜６．ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-Ｆ哺乳類細胞発現プラスミドの構築＞  ファルネシル化シグナルは、ＰＣＲ法を用いて付加・増幅させた。まず＜１＞のｐｗｔＧＦＰ-Ｃ１プラスミドを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。プライマーはＧＦＰ１-５’＿ＥｃｏＲＩ-２（配列番号１６）とＧＦＰ２２９-３’＿ＣＡＡＸ１（配列番号１７）を用いた。酵素はＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、反応液の組成や反応条件はマニュアルに従った。さらにこのＰＣＲ産物を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。プライマーはＧＦＰ１-５’＿ＥｃｏＲＩ（配列番号１６）とＧＦＰ２２９-３’＿ＣＡＡＸ２（配列番号１８）を用いた。酵素はＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用し、反応液の組成や反応条件等はマニュアルに従った。得られた断片はｐＧＥＭ-Ｔ-ｅａｓｙベクターにライゲーションし大腸菌ＤＨ５αに導入することによりサブクローニングした。これを制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで処理し、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで処理したｐＣＩ-ｎｅｏにライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入してサブクローニングすることでｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-Ｆプラスミドを得た。図２７に、ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-Ｆプラスミドの作成工程及び構成図を示す。【００５８】
＜７．ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏ哺乳類動物発現プラスミドの構築＞  ミトコンドリアへの移行は、ヒトシトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩＩのミトコンドリア移行シグナルを用いた。移行シグナル断片はオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることで作成した。まずオリゴヌクレオチドＭｉｔｏ１（＋）（配列番号１９）、Ｍｉｔｏ１（−）（配列番号２０）、Ｍｉｔｏ２（＋）（配列番号２１）、Ｍｉｔｏ２（−）（配列番号２２）、Ｍｉｔｏ３（＋）（配列番号２３）、Ｍｉｔｏ３（−）（配列番号２４）をリン酸化した。酵素はＴＯＹＯＢＯ社製のＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅを用い、反応はそのマニュアルに従った。その後、6つのオリゴヌクレオチドを全て混ぜ合わせ、１００℃で１分間加熱し、その場で放冷した。得られたミトコンドリア移行シグナル断片を、あらかじめ制限酵素ＮｈｅＩで処理していたｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入してサブクローニングすることでｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏを得た。図２８に、ｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸ-Ｍｉｔｏの作成工程及び構成図を示す。【００５９】
＜８．ｐＣＩ-ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸ哺乳類動物発現プラスミドの構築＞  ＥＣＦＰ（１-２２９）、ＥＹＦＰ（１-２２９）は、それぞれｐＥＣＦＰ−Ｎ１、ｐＥＹＦＰ-Ｎ１からＰＣＲ法を用いて増幅させた。プライマーはＧＦＰ（１-２２９）の増幅にはＧＦＰ１-５’＿ＥｃｏＲＩ（配列番号４）とＧＦＰ２２９-３’＿ＳｐｅＩ（配列番号５）を用いた。酵素はＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、反応条件等は付属のマニュアルに従った。得られた断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）＿ＥｃｏＲＶ  ｄｉｇｅｓｔベクターにライゲーションし大腸菌ＤＨ５αに導入することによりサブクローニングした。これをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで処理し、ＥＣＦＰ（１-２２９）、ＥＹＦＰ（１-２２９）を得た。またＮ末端側のＴｌｐＡ（９４-２５７）はｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸを制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏＲＩで処理することで、Ｃ末端側のＴｌｐＡ（９４-２５７）はｐＣＩ-ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸを制限酵素ＳｐｅＩとＸｈｏＩで処理することそれぞれ得た。これらの断片をあらかじめＳａｃＩとＸｈｏＩで処理したｐＣＩ-ｎｅｏベクターとライゲーションして、大腸菌ＤＨ５αに導入してサブクローニングすることでｐＣＩ-ＥＣＦＰ-ＴＷＩＸ、ｐＣＩ-ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸを得た。図２９にｐＣＩ-ＥＣＦＰ-ＴＷＩＸ、図３０にｐＣＩ-ＥＹＦＰ-ＴＷＩＸの作成工程及び構成図をそれぞれ示す。【００６０】
＜９．温度感応タンパク質の発現・回収・精製＞  大腸菌発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。得られたシングルコロニーは抗生物質として１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬに懸濁し３７℃で８時間培養し、さらに抗生物質を含むＬＢ培地２００ｍＬに加えてＯＤ６００が約０．３になるまで３７℃で培養した。得られた懸濁液にタンパク質発現誘導剤であるＩＰＴＧを０．１ｍＭになるように加えて、１４℃で１６時間培養した。発現誘導後、菌体を回収してＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，２．６８ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した後、超音波で破砕し、可溶画分と不溶画分に分離した。可溶画分はＨｉｓタグを用いて精製した。精製法はＮｏｖａｇｅｎ社のＨｉｓ  Ｂｉｎｄ  Ｋｉｔのマニュアルに従った。不溶画分は２％Ｔｒｉｔｏｎ-ＰＢＳで処理した後Ｕｒｅａ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（４Ｍ  Ｕｒｅａ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ＰＢＳ）で可溶化し、透析でＵｒｅａを除去することで精製した。発現の確認は、ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔで濃度を見積もった後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離し、クマシー染色することにより行った。【００６１】
＜１０．蛍光励起スペクトル測定＞  測定にはＨｉｔａｃｈｉ社の分光蛍光光度計Ｆ-４５００を用いた。タンパク質の温度は加熱した水をセルホルダーに灌流させることでコントロールした。タンパク質溶液はＰＢＳを用いて希釈した後、セルホルダー内で設定した温度まで灌流液で加熱もしくは冷却し、設定温度になってからもさらに３分間インキュベートした。ｗｔＧＦＰ-ＴＷＩＸの測定においては、まず励起波長を３８０ｎｍに設定し、４００〜６５０ｎｍ間の蛍光スペクトルを測定した。次に蛍光波長を得られた蛍光スペクトルのピーク値に設定し、温度を２０℃から５０℃に設定したときの３００〜４９５ｎｍ間の励起スペクトルを測定した。得られたスペクトルから４００ｎｍと４８０ｎｍのピークのレシオ値を計算し、温度に対して評価した。タンパク質の温度は加熱した水をセルホルダーに灌流させることでコントロールした。【００６２】
ｐＨの調整にはＨＣｌ、ＮａＯＨを用いた。また酸化剤と還元剤としてはそれぞれＨ２Ｏ２とＤＴＴを用いた。これらの試薬を加えた後、２５℃におけるレシオ値を評価した。Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋にはそれぞれＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２を用いた。これらの試薬を加えた後、２０℃から５０℃に設定したときの３００〜４９０ｎｍ間の励起スペクトルを測定した。得られたスペクトルから４００ｎｍと４８０ｎｍのピークのレシオ値を計算し、温度に対して評価した。【００６３】
ＥＣＦＰ-ＴＷＩＸとＥＹＦＰ-ＴＷＩＸにおいては、ヘテロダイマーにするために測定前に等量混合し、ブロックインキュベータで１０分間加熱し、その後氷浴で冷却した。測定時には、まず蛍光波長を５２７ｎｍに設定し、３００〜４５０ｎｍ間の励起スペクトルを測定した。次に励起波長を得られた励起スペクトルの最小値に設定し、温度が２０℃から５０℃に設定したときの４４０〜５９０ｎｍ間の蛍光スペクトルを測定した。得られたスペクトルから５２７ｎｍのピークを温度に対して評価した。【００６４】
＜１１．円二色性スペクトルの測定＞  測定にはＪＡＳＣＯ社のＪ-７２５  ＣＤ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いた。タンパク質溶液はＰＢＳを用いて希釈した後、セルホルダー内で設定した温度まで灌流液で加熱もしくは冷却し、設定温度になってからもさらに３分間インキュベートした。タンパク質の温度はペルチェ式恒温槽でコントロールした。スペクトルは、温度が２０℃から５０℃に設定したときの１９０〜２５０ｎｍ間を測定し、積算回数は４回とした。得られたモル楕円率から、α−へリックス性を示すθ２２２の値を温度に対して評価した。
タンパク質の温度はペルチェ式恒温槽でコントロールした。【００６５】
＜１２．細胞培養及びｃＤＮＡ発現＞  ＨＥＫ２９３細胞及びＨｅＬａ細胞は１０％ＦＢＳ、３０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、３０ｍｇ／ｍＬ硫酸スプレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。形質導入にはＱｉａｇｅｎ社のＳｕｐｅｒｆｅｃｔを使用した。方法は付属のマニュアルに従った。形質導入の２４時間後に、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで剥がして、あらかじめｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅでコートしたガラスプレートもしくはガラスボトムディッシュに撒きなおした。蛍光測定は撒きなおしてから６〜１２時間後に行った。【００６６】
発現確認にはＯＬＹＭＰＵＳ社の共焦点レーザ走査型顕微鏡ＦＬＵＯＶＩＥＷを用いた。ミトコンドリアのマーカーとしてはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標名）  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲｏｓを用いた。細胞の張り付いたガラスボトムディッシュの培地中に、２５ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒを加え３７℃で１０分間インキュベートすることでミトコンドリアを染色した。【００６７】
＜１３．細胞内蛍光強度測定＞  ガラスプレートに貼り付いた細胞の試料は顕微鏡ステージの灌流チャンバー上に置いて蛍光強度を測定した。温度は電熱線により灌流液を加熱することで制御した。図３１に、上記実施形態における細胞内蛍光強度測定に用いた測定装置の概略図を示す。細胞外液（灌流液）には２ｍＭ  Ｃａ２＋−ＨＢＳ（１０７ｍＭ  ＮａＣｌ，６ｍＭ  ＫＣｌ，１１．５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，ｐＨ７．４）を用いた。細胞の蛍光イメージはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社のＭｅｔａＭｏｒｐｈイメージングシステムで解析した。任意の温度において「Ｍｕｌｔｉｐｕｌ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ」という方法で個々の細胞について３８０ｎｍと４８０ｎｍの励起光を照射したときの５１０ｎｍの蛍光画像を撮影した。その値を元に、蛍光強度比（レシオ値）（Ｒａｔｉｏ（ｅｘ３８０／ｅｘ４８０））を算出し、温度に対してプロットすることで評価した。【００６８】
＜１４．脱共役剤によるミトコンドリアでの熱産生測定＞  ＣＣＣＰ（Ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｍ−ｃｈｌｏｒｏ  ｐｈｅｎｙｌ  ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）とＲｏｔｅｎｏｎｅはＳｉｇｍａ社から購入したものを使用した。これらの試薬は１００ｍＭずつＤＮＳＯに溶解させ、ストック溶液とした。測定はガラスプレートに貼り付いた細胞を顕微鏡ステージの灌流チャンバ上に置いて蛍光強度を測定した。灌流液は２ｍＭ  Ｃａ２＋−ＨＢＳ（１０７ｍＭ  ＮａＣｌ，６ｍＭ  ＫＣｌ，１１．５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，ｐＨ７．４）を用いた。灌流液の温度は電熱線により加熱することで制御した。ミトコンドリア脱共役剤や複合体Ｉ阻害剤は灌流液に溶解させて細胞に処置した。細胞の蛍光イメージはＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社のＥＭ−ＣＣＤカメラＣ９１００で撮影し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社のＭｅｔａＦｌｕｏｒイメージングシステムで解析した。個々の細胞について３８０ｎｍと４８０ｎｍの励起光を照射したときの５１０ｎｍの蛍光強度を測定した。その蛍光強度比（レシオ値））（Ｒａｔｉｏ（ｅｘ３８０／ｅｘ４８０））を算出し、時間に対してプロットすることで評価した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、斬新な温度感応タンパク質を提供し、この温度感応タンパク質を生体内温度センサとして細胞に形質発現させることができるものであるため、従来は不可能であった動物細胞も含めた細胞内の局所的な温度計測方法及び温度計測装置として利用することができる。また、特に細胞内のミトコンドリアをターゲットにしてもこの温度感応タンパク質を導入・発現できることから、ミトコンドリア又は細胞自体に対する試薬の安全性確認試験にも利用可能である。
【図１】
2007142208.tif 000003
【図２】
2007142208.tif 000004
【図３】
2007142208.tif 000005
【図４】
2007142208.tif 000006
【図５】
2007142208.tif 000007
【図６】
2007142208.tif 000008
【図７】
2007142208.tif 000009
【図８】
2007142208.tif 000010
【図９】
2007142208.tif 000011
【図１０】
2007142208.tif 000012
【図１１】
2007142208.tif 000013
【図１２】
2007142208.tif 000014
【図１３】
2007142208.tif 000015
【図１４】
2007142208.tif 000016
【図１５】
2007142208.tif 000017
【図１６】
2007142208.tif 000018
【図１７】
2007142208.tif 000019
【図１８】
2007142208.tif 000020
【図１９】
2007142208.tif 000021
【図２０】
2007142208.tif 000022
【図２１】
2007142208.tif 000023
【図２２】
2007142208.tif 000024
【図２３】
2007142208.tif 000025
【図２４】
2007142208.tif 000026
【図２５】
2007142208.tif 000027
【図２６】
2007142208.tif 000028
【図２７】
2007142208.tif 000029
【図２８】
2007142208.tif 000030
【図２９】
2007142208.tif 000031
【図３０】
2007142208.tif 000032
【図３１】
2007142208.tif 000033
【配列表】
2007142208000001.app
【国際調査報告】
2007142208.tif 000034
2007142208.tif 000035
2007142208.tif 000036
2007142208.tif 000037