【手続補正書】
【提出日】平成20年7月8日(2008.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ポリケチドシンターゼ（“PKS”）複合体内のアシルトランスフェラーゼ（“AT”）ドメイン又は少なくとも１つのATドメインを含むその一部の特異性の変更方法であって、前記ATドメインの残基の５％以下を選択的に変更することを含んで成り、ここで前記変更された残基の少なくとも１つが６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（“DEBS”）の第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列内に位置し、前記残基の変更が前記ATドメインの基質特異性の変更をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項２】  下記残基：
（ａ）DEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列のすぐ下流の残基；
（ｂ）GHSモチーフのすぐ下流の残基；
（ｃ）GQGモチーフから３残基下流の残基；及び
（ｄ）DEBSの第1モジュールにおいて残基252として見出されるような保護されたアルギニン残基の４残基下流の残基の１又は複数の残基がまた変更される請求項１記載の方法。
【請求項３】  前記モチーフが、
（ａ）ATドメインの配列を決定することにより；
（ｂ）他のATドメインの多くの配列との配列一列整列を行うことにより；そして
（ｃ）前記モチーフに対応する残基を同定することにより位置決定される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】  前記PKS酵素複合体が、モジュラーI型PKS酵素複合体の少なくとも一部である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】  前記変更されたATドメインが負荷モジュールに組込まれる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】  前記変更されたATドメインがKSqドメインの後に続く請求項５記載の方法。
【請求項７】  前記変更されたATドメインが、延長モジュールに組込まれる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】  前記変更された残基が、XAFH, XASH及びXAGHから選択されたモチーフ内にあり、そして/又はそのようなモチーフを創造する請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】  前記変更された残基がXAGH内にあり、そしてXがF、T、V及びHから選択される請求項８記載の方法。
【請求項１０】  前記変更された残基がXAFH内にあり、そしてXがHである請求項８記載の方法。
【請求項１１】  前記変更された残基がXASH内にあり、そしてXがY、 H、W及びVから選択される請求項８記載の方法。
【請求項１２】  前記変更がプロリン含有モチーフを生成するか又は変更し、前記モチーフが、DEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列である請求項１〜11のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】  前記変更がDEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列における残基の変更を包含し、そしてマロニル−CoAに対して特異的であるモチーフの生成をもたらす請求項１〜12のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】  前記４−前記配列に続いて、すでに存在しない場合、変更により生成されるSが存在する請求項13記載の方法。
【請求項１５】  前記活性部位におけるGHSモチーフに続く残基が、すでに存在しない場合、変更により生成される、V、I又はLである請求項13記載の方法。
【請求項１６】  前記GQGモチーフの３残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成される、R、H又はTである請求項13記載の方法。
【請求項１７】  前記DEBSの第１モジュールにおける残基252で見出されるような保存されたRの４残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されるMである請求項13記載の方法。
【請求項１８】  前記変更がDEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列における残基の変更を包含し、そしてメチルマロニル−CoAに対して特異的であるモチーフの生成をもたらす請求項１〜12のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】  前記４−前記配列に続いて、すでに存在しない場合、変更により生成される、S、G、C又はTから選択された残基が存在する請求項18記載の方法。
【請求項２０】  前記活性部位におけるGHSモチーフに続く残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されるQである請求項18記載の方法。
【請求項２１】  前記GQGモチーフの３残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されるWである請求項18記載の方法。
【請求項２２】  前記DEBSの第１モジュールにおける残基252で見出されるような保存されたRの４残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成される、I又はLである請求項18記載の方法。
【請求項２３】  前記変更がDEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列における残基の変更を包含し、そしてエチルマロニル−CoAに対して特異的であるモチーフの生成をもたらす請求項１〜12のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】  前記DEBSの第１モジュールにおける残基252で見出されるような保存されたRの４残基下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されるWである請求項23記載の方法。
【請求項２５】  前記ATドメインがGHSモチーフと共に活性部位を有し、そしてYASHモチーフに対応し、そして前記変更された残基に少なくとも１つを含む前記モチーフが前記GHSモチーフから80〜110下流の残基で開始する請求項１〜24のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】  １つの化合物又は個々の化合物の少なくとも一部がポリケチドシンターゼ（“PKS”）酵素複合体の生成物である、前記１つの化合物又は化合物の混合物の合成方法であって、（i）請求項１〜25のいずれか１項記載の方法を実施し、それにより、前記少なくとも１つの変更されたATドメインを含むPKS酵素複合体を供給し、そして（ii）前記PKS酵素複合体により合成をもたらし、１つの化合物又は前記化合物の混合物を生成することを含んで成る方法。
【請求項２７】  前記段階（i）が、前記複合体をコードする核酸分子を供給し、そして発現をもたらすことを含んで成る請求項26記載の方法。
【請求項２８】  前記核酸配列が、特定部位の突然変異誘発にゆだねられ、その結果、それらが前記変更されたATドメインをコードする請求項27記載の方法。
【請求項２９】  発現が、ポリケチドを生成できる発現生物においてもたらされる請求項27又は28記載の方法。
【請求項３０】  前記PKSが、特異性の変更の前、前記発現生物とは異なる第１生物において天然において発現され、前記発現生物が、前記変更が特異性を高める基質を供給するために前記第１生物よりも良好であり、そして/又は前記変更が特異性を低める基質を供給するために前記第１生物よりも十分に低い請求項29記載の方法。
【請求項３１】  前記変更されたATドメインを含む前記PKSが、ハイブリッドPKSにスプライスされる請求項26〜30のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】  ポリケチドの組合わせライブラリーの製造方法であって、
（i）請求項１記載の方法によりPKS複合体内のATドメインの特異性を変更し；そして
（ii）前記PKS酵素複合体により合成をもたらし、化合物の混合物を生成することを含んで成る方法。
【請求項３３】  請求項１〜25のいずれか１記載の方法により生成されるような変更されたATドメインを含むPKS酵素複合体をコードする核酸。
【請求項３４】  請求項33記載の核酸を含むベクター。
【請求項３５】  請求項33記載の核酸を含み、そしてPKS酵素複合体を発現することができる宿主生物。
【請求項３６】  少なくともその一部が、前記PKS酵素複合体の作用に起因するポリケチドである化合物を合成するよう適合される請求項35記載の宿主生物。
【請求項３７】  少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメインを含むポリケチドシンターゼ（PKS）酵素複合体の合成方法であって、前記ATドメインの残基の５％以下を選択的に変更することを含んで成り、ここで前記変更された残基の少なくとも１つが６−デオキシエリスロノリドBシンターゼ（“DEBS”）の第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列内に位置し、前記残基の変更が前記ATドメインの基質特異性の変更をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項３８】  下記残基：
（ａ）DEBSの第１モジュールのATドメインのYASHモチーフに対応する４−残基配列のすぐ下流の残基；
（ｂ）GHSモチーフのすぐ下流の残基；
（ｃ）GQGモチーフから３残基下流の残基；及び
（ｄ）DEBSの第1モジュールにおいて残基252として見出されるような保護されたアルギニン残基の４残基下流の残基の１又は複数の残基がまた変更される請求項37記載の方法。
【請求項３９】  請求項37又は38記載の方法により生成されるようなポリケチドシンターゼ酵素複合体。