【手続補正書】
【提出日】平成19年2月7日(2007.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の生体試料におけるヒスタミン放出因子（ＨＲＦタンパク質）の存在量を測定し、ＨＲＦタンパク質量を正常生体試料のそれと比較し、正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦタンパク質量を示す被験者を、子宮内膜症関連疾患の患者またはそのハイリスク者と判定することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
【請求項２】
ＨＲＦタンパク質を認識する抗体。
【請求項３】
請求項２の抗体とは異なるエピトープと結合する抗体。
【請求項４】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列の９０〜１３０位から選択された連続した５〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチドを免疫抗原として得られた請求項２または３の抗体。
【請求項５】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１〜９５位から選択された連続した５〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチドを免疫抗原として得られた請求項２または３の抗体。
【請求項６】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１１５〜１７２位から選択された連続した５〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチドを免疫抗原として得られた請求項２または３の抗体。
【請求項７】
少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料を請求項２の抗体を固定化した担体と接触する工程；
（ｂ）工程（ａ）で生体試料と接触させた担体を洗浄する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で洗浄した担体に標識化した請求項３の抗体を接触させる工程；
（ｄ）担体上の結合標識あるいは遊離標識を測定する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で測定された標識量をＨＲＦタンパク質量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｆ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦタンパク質量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
【請求項８】
少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料を組織固定化処理に付す工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製された組織固定化標本を切片とする工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた切片化組織を請求項２の抗体による免疫組織染色に付す工程；
（ｄ）工程（ｃ）による免疫組織染色の程度をＨＲＦタンパク質量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｅ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦタンパク質存在量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
【請求項９】
少なくとも標識化した請求項２の抗体を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患診断キット。
【請求項１０】
少なくとも以下の要素：
（ａ）請求項２の抗体；および
（ｂ）標識化した請求項３の抗体
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患診断キット。
【請求項１１】
少なくとも以下の要素：
（ａ）請求項２の抗体を固定化した担体；および
（ｂ）標識化した請求項３の抗体
を含むことを特徴とする子宮内膜症診断キット。
【請求項１２】
ＨＲＦタンパク質を認識し、かつＨＲＦタンパク質の活性を中和する抗体。
【請求項１３】
請求項１２の抗体を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬。
【請求項１４】
ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２５。
【請求項１５】
ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２６。
【請求項１６】
ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２８。
【請求項１７】
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２５から産生され、ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体。
【請求項１８】
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２６から産生され、ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体。
【請求項１９】
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２８から産生され、ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】子宮内膜症関連疾患の判定方法
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
この出願の発明は、子宮内膜症関連疾患の分子生物学的な判定方法に関するものである。またこの出願の発明は、子宮内膜症関連疾患の分子メカニズムを利用した当該疾患の治療薬に関するものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
なおこの出願の発明者らは、ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ：ＨＲＦ）を含むＴＣＤＤ標的遺伝子を同定している（非特許文献２１〜２３）。しかしながら、このようなＴＣＤＤ標的遺伝子産物としてのＨＲＦと子宮内膜症との関係は一切知られていない。
【非特許文献１】Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｊ．Ｍ．  Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ．  １９８９，  ３４（１）：４１−６
【非特許文献２】Ｃａｎｄｉａｎｉ  Ｇ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｂｓｔｃｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｓｕｒｖ．  １９９１，  ４６（６）：３７４−８２
【非特許文献３】Ｇａｒｃｉａ−Ｖｅｌａｓｃｏ  Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ａｒｉｃｉ  Ａ．  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．  １９９９，  ７１（６）：９８３−９３
【非特許文献４】Ｂａｒｃｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ｍｏｎｉｔ．  ２０００，  ６（５）：１０４２−６
【非特許文献５】Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １９９８，  １５２（１）：１２５−３３
【非特許文献６】Ｌｅｂｏｖｉｃ  Ｄ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ２００１，  ７５（１）：１−１０
【非特許文献７】Ｈｏｒｎｕｎｇ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００１，  １５８（６）：１９４９−５４
【非特許文献８】Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  Ｒ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２０００，  １５６（５）：１５８１−８
【非特許文献９】Ｃｈａｐｍａｎ  Ｄ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  Ｃ．Ｍ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １９８５，  ７８（１）：１４７−５７
【非特許文献１０】ＭｃＧｒｅｇｏｒ  Ｄ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．  １９９８，  １０６  Ｓｕｐｐｌ  ２：７５５−６０
【非特許文献１１】Ｓａｇａｗａ  Ｋ．  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｉ−Ｋｕｒｉｙａｍａ  Ｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （Ｔｏｋｙｏ）  １９９７，  １２２（６）：１０７５−９
【非特許文献１２】Ｎｅｂｅｒｔ  Ｄ．Ｗ．  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １９８９，  ２０（３）：１５３−７４
【非特許文献１３】Ｒｉｅｒ  Ｓ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｎｄａｍ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １９９３，２１（４）：４３３−４１
【非特許文献１４】Ｇｉｂｂｓｏｎｓ  Ａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，  ２６２（５１８３）：１３７３
【非特許文献１５】Ｏｂｓｔｅｅｎ  Ｋ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｒｒａ−Ｒｉｖｅｒａ  Ｅ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １９９７，  １５（３）：３０１−８
【非特許文献１６】Ｂｒｕｎｅｒ−Ｔｒａｎ  Ｋ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９９，  ４８  Ｓｕｐｐｌ．  １：４５−５６
【非特許文献１７】Ｊｏｈｓｏｎ  Ｋ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  １９９７，  １０５（７）：７５０−５
【非特許文献１８】Ｙａｎｇ  Ｊ．Ｚ．  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｗ．Ｇ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｉｎｄ．  Ｈｅａｌｔｈ  １９９７，  １３（１）：１５−２５
【非特許文献１９】Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｊ．  １９９９，  ４６（６）：７６５−７２
【非特許文献２０】Ｐａｕｗｅｌｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２００１，  １６（１０）：２０５０−５
【非特許文献２１】Ｏｉｋａｗａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１，  ６１（１５）：５７０７−９
【非特許文献２２】Ｏｉｋａｗａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００２，  ２９０（３）：９８４−７
【非特許文献２３】Ｏｈｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２００１，  ５０８（３）：３４１−４
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
子宮内膜症の判定は、従来は、腹腔内視鏡による観血的な方法以外には有効な方法は存在しなかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
一方、各種のヒト疾患に対して、その疾患に特異的なマーカータンパク質やその遺伝子発現を指標とする分子生物学的診断が普及しつつある。この方法は、大がかりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験者に対しても広範囲に実施することが可能である。しかしながら、子宮内膜症については、このような分子生物学的な判定方法を行うための有効なマーカータンパク質やその遺伝子は知られていない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、子宮内膜症に密接に関連するマーカーを利用した分子生物学的な判定方法を提供することを課題としている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
またこの出願の発明は、この判定方法に使用する各種材料を提供することを課題としている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１９）の発明を提供する。
（１）被験者の生体試料におけるヒスタミン放出因子（ＨＲＦタンパク質）の存在量を測定し、ＨＲＦタンパク質量を正常生体試料のそれと比較し、正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦタンパク質量を示す被験者を、子宮内膜症関連疾患の患者またはそのハイリスク者と判定することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
（２）ＨＲＦタンパク質を認識する抗体。
（３）前記発明（２）の抗体とは異なるエピトープと結合する抗体。
（４）配列表の配列番号２のアミノ酸配列の９０〜１３０位から選択された連続した５〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチドを免疫抗原として得られた前記発明（２）または（３）の抗体。
（５）配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１〜９５位から選択された連続した５〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチドを免疫抗原として得られた前記発明（２）または（３）の抗体。
（６）配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１１５〜１７２位から選択された連続した５〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチドを免疫抗原として得られた前記発明（２）または（３）の抗体。
（７）少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料を前記発明（２）の抗体を固定化した担体と接触する工程；
（ｂ）工程（ａ）で生体試料と接触させた担体を洗浄する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で洗浄した担体に標識化した前記発明（３）の抗体を接触させる工程； 
（ｄ）担体上の結合標識あるいは遊離標識を測定する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で測定された標識量をＨＲＦタンパク質量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｆ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦタンパク質量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
（８）少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料を組織固定化処理に付す工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製された組織固定化標本を切片とする工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた切片化組織を前記発明（２）の抗体による免疫組織染色に付す工程；
（ｄ）工程（ｃ）による免疫組織染色の程度をＨＲＦタンパク質量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｅ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦタンパク質存在量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法。
（９）少なくとも標識化した前記発明（２）の抗体を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患診断キット。
（１０）少なくとも以下の要素：
（ａ）前記発明（２）の抗体；および
（ｂ）標識化した前記発明（３）の抗体
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患診断キット。
（１１）少なくとも以下の要素：
（ａ）前記発明（２）の抗体を固定化した担体；および
（ｂ）標識化した前記発明（３）の抗体
を含むことを特徴とする子宮内膜症診断キット。
（１２）ＨＲＦタンパク質を認識し、かつＨＲＦタンパク質の活性を中和する抗体。
（１３）前記発明（１２）の抗体を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬。
（１４）ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２５。
（１５）ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２６。
（１６）ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２８。
（１７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２５から産生され、ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体。
（１８）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２６から産生され、ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体。
（１９）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２８から産生され、ＨＲＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体。

【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
なおこの発明において、「子宮内膜症関連疾患」とは、子宮内膜症、および子宮内膜症を原因とする月経困難症、不妊症および子宮腺筋症等を意味する。「診断（判定）」とは、被験者が子宮内膜症関連疾患に羅患しているか否かの判定、将来的に子宮内膜症関連疾患に羅患する危険性が存在するか否かの判定、および治療後に子宮内膜症関連疾患を再発する危険性が存在するか否かの判定を意味する。また、診断（判定）には、子宮内膜症関連疾患の羅患やその危険性がどの程度であるか測定することも含まれる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
この出願の発明（１）の判定方法は、被験者の生体試料におけるヒスタミン放出因子（ＨＲＦタンパク質）の存在量を測定し、このＨＲＦタンパク質量を指標として子宮内膜症関連疾患を判定する方法である。すなわち、ＨＲＦタンパク質量が正常生体試料と比較して有意に多い被験者を子宮内膜症関連疾患の患者またはそのハイリスク者と判定する。すなわち、ＨＲＦタンパク質の存在量が有意に多い被験者を子宮内膜症関連疾患の患者またはそのハイリスク者と判定する。ＨＲＦ遺伝子から発現するＨＲＦタンパク質の存在量は子宮内膜症関連疾患と密接に関連することから、被験者の生体試料（例えば子宮内膜組織等）におけるこのＨＲＦタンパク質量を指標として子宮内膜症の判定を行うことができる。またＨＲＦタンパク質量が「有意に多い」とは、被験者のＨＲＦタンパク質量が正常生体試料（すなわち健常者の生体試料）において測定されたＨＲＦタンパク質量と比較して、１０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは１００％以上である場合を意味する。またさらに、この「有意に多い」とは、例えば同一被験者の複数試料についてのＨＲＦポリヌクレオチド発現量の平均値と、複数の正常試料における同様の平均値とを統計的に検定した場合、前者が後者よりも有意に多い場合である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
以上のとおりのＨＲＦタンパク質量を指標とする発明（１）の判定方法は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定のタンパク質量を検知測定するために知られた手法、例えばｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティング、各種の免疫組織学的方法などによってＨＲＦタンパク質量を検知・測定して実施することができる。こうした技術を利用したＨＲＦタンパク質量測定系、子宮内膜症関連疾患の検出系、子宮内膜症関連疾患のリスク検出系、それに利用する試薬、方法、プロセス、解析プログラムなどは、すべてこの発明の技術およびそれに利用するシステムに含まれる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
この出願は、前記の発明（１）の判定方法に使用する材料として、特に以下の発明（２）および（３）の抗体を提供する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
発明（３）の抗体は、前記発明（２）の抗体とは異なるエピトープに結合する抗体である。このような抗体は、前記発明（２）の抗体作製のためのオリゴペプチドとは異なる断片を免疫原とすることによって、前記と同様のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として作製される。例えば、前記発明（４）〜（６）の抗体は、いずれか一が発明（２）の抗体となり、他が発明（３）の抗体となる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”  Ｊａｍｅｓ  Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）に従い作製することができる。この出願は、ＨＲＦを特異的に認識するモノクローナル抗体として、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２５、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２６およびＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＨＲＦ２８がそれぞれ産生するモノクローナル抗体（発明（１７）〜（１９））と、前記の各ハイブリドーマ細胞（発明（１４）〜（１６））を提供する。なお、前記の各ハイブリドーマ細胞は、２００４年７月１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに、ブタペスト条約に基づき特許生物寄託されている。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
なお、ＨＲＦポリヌクレオチドは各種の変異体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ／ＸＭ＿２９４０４５、ＸＭ＿０３８３９１、ＸＭ＿２９３２９１、ＸＭ＿２０９７４１、ＸＭ＿２１０５６６、ＸＭ＿０６６７０６、ＸＭ＿０６６６７５、ＸＭ＿０７１３２１等）が知られているが、ＳＥＱ  ＩＤ：１（塩基配列）に示したＨＲＦ  ｃＤＮＡ（またはＴＰＴ−１：ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿００３２９５）を好ましいものとして例示する。このようなポリヌクレオチドは、それぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、ｃＤＮＡの場合には、公知の方法（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  １６１−１７０，  １９８２；  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  ２５，  ２６３−２６９，１９８３；  Ｇｅｎｅ，  １５０，  ２４３−２５０，  １９９４）を用いてｃＤＮＡを合成し、それぞれ公知の塩基配列に基づいて作製したプローブＤＮＡを用いて、それぞれのｃＤＮＡを単離する方法によって取得することができる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても必要量の各ｃＤＮＡを得ることができる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
抗体を用いた別の判定法は、抗体とＨＲＦタンパク質との結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量のＨＲＦタンパク質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、発明（２）の抗体を樹脂プレートまたはメンブレン等に固定化し、この固定化抗体にＨＲＦタンパク質を結合させ、非結合タンパク質を洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋ＨＲＦタンパク質結合体に発明（３）の抗体を標識化した標識化抗体を結合させて、この標識化抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）」として広く用いられている方法である。２週類の抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、いずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
この発明での判定はまた、免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ルミネッセント免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡなどを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはＲＩＡ、ＥＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。サンドイッチ型アッセイには、同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどが包含されてよい。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
この出願は、このような固相系において細胞抽出物や血液中のタンパク質量を測定する判定方法として発明（７）として提供する。すなわち、この発明（７）は、少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料を前記発明（２）の抗体を固定化した担体と接触する工程
（ｂ）工程（ａ）で生体試料と接触させた担体を洗浄する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で洗浄した担体に標識化した前記発明（３）の抗体を接触させる工程； 
（ｄ）担体上の結合標識あるいは遊離標識を測定する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で測定された標識量をＨＲＦタンパク質量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｆ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦタンパク質量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法である。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
また、このような判定方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１１）の診断キットが提供される。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
さらにこの出願は、固相系において組織または細胞のＨＲＦタンパク質量を測定する方法として、発明（８）の判定方法を提供する。すなわちこの方法は、少なくとも以下の工程：
（ａ）被験者の生体試料を組織固定化処理に付す工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製された組織固定化標本を切片とする工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた切片化組織を前記発明（２）の抗体による免疫組織染色に付す工程；
（ｄ）工程（ｃ）による免疫組織染色の程度をＨＲＦタンパク質量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および
（ｅ）正常生体試料と比較して有意に高いＨＲＦタンパク質存在量を、子宮内膜症関連疾患またはそのリスクの程度を示す指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする子宮内膜症関連疾患の判定方法である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
このような発明（８）の判定を効率的に行うための手段として発明（９）の診断キットが提供される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
発明（９）〜（１１）の診断キットは、前記の各判定方法を行うための試薬キットである。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗体および／または標識化抗体を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
なお、この出願によって提供される判定方法は、前記の各種方法の２以上を組み合わせて行うことができ、あるいは例えばＨＲＦタンパク質をコードする遺伝子の発現量を公知の手段（例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）で測定する方法と併用することもできる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
この出願は、前記発明（１２）の抗体または前記発明（１３）の治療薬を体内に投与することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療方法を提供する。前記治療方法は、前記の抗体または薬剤を生体内に投与することによって実施することができる。例えば、薬剤を子宮内膜に局所投与するか、あるいは静脈を介して全身投与する方法等である。抗体の投与量は、患者の体重、症状等に応じて、１日当たり約１００μｇ／Ｋｇ体重程度とすることができる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
感作抗原としてヒトＨＲＦタンパク質(配列番号２)のうちの１０１−１１６位のペプチドを選択して合成した。合成したペプチドはＨＬＡをキャリアーとしてそれに結合させ、次にＫＬＨと混合した（ペプチド５０μｇに対して５０μｇのＫＬＨ)。こうして得られた抗原液をフロイント完全アジュバントに混合し、感作抗原を有する溶液を調製した。この溶液を、体重３〜４ｋｇのウサギ（ＳＰＦ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔ）に対して２週間毎に１ｍｌの量で皮下注射（５回）した。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
まず、２０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した抗原ポリペプチドでポリスチレン製９６穴プレートをコートし（１００ｎｇ／ウエル）、次に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳを用いて洗浄して未吸着のペプチドを除去した。各ウエルに免疫兎より採血して得られた血清を添加し、室温で約１時間静置した。洗浄後、２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ免疫グロブリンを加え、さらに室温で約１時間静置した。洗浄後、基質である過酸化水素と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加え発色させる。各ウエルに２Ｎ硫酸を加え発色反応を停止し、発色の程度をマイクロプレート用吸光度測定機を用いて４５０ｎｍの吸光度で測定した。比較として、免疫前に採血しておいた血清と比較して、確かに血清に含まれる抗体がＨＲＦタンパク質を特異的に認識することを確認した。上記操作は、組換えタンパク質抗原を使用して行うことも可能である。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
得られた抗ＨＲＦ抗体を含む抗血清は、ＮＩＨ３Ｔ３のｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ  １０μｇを１４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロットにて２０００倍に希釈した抗血清で検定してシングルバンドを与えることでその純度を確認した。この抗体は、マウスとヒト細胞で同じサイズの蛋白質を検出するものであった。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
精製抗ＨＲＦ抗体の調製は、上記ＨＲＦタンパク質の１０１−１１６位のペプチドをアフィゲル（バイオラッド社製）に固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって実施できる。精製ＨＲＦペプチドをアフィゲル−１０（バイオラッド社製）と混合し、４℃で１晩反応させた後、アフィゲルを２０ｍＭリン酸緩衝液-生理食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、アフィゲルの未反応官能基は１００ｍＭのモノエタノールアミンを含むＰＢＳ中で、１晩ブロッキングを行い、最終的にＰＢＳで再度洗浄して、ペプチド固定化カラムを調製した。この固定化カラムに抗ＨＲＦ抗体を含むウサギ血清を添加し、ＰＢＳで十分に洗浄した後、吸着した抗ＨＲＦ抗体を２０ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶出した。溶出した抗ＨＲＦ抗体溶液は直ちに２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液で中和し、ＰＢＳで１晩透析した後、−８０℃で凍結保存した。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
サンドイッチＥＩＡ
下記の方法に従えば、実施例２で調製した抗ＨＲＦ抗体及び公知の抗ＨＲＦ抗体から少なくとも１種を選択し、抗ＨＲＦ抗体の２種の適当な組み合わせによってヒトＨＲＦタンパク質を特異的に検出・測定するサンドイッチＥＩＡ系が構成できる。ＥＩＡ系は１ステップ法、２ステップ法のいずれも可能であり、標識抗体はＦａｂ’−ＨＲＰに限定されない。各反応緩衝液の組成や反応条件は測定の目的に応じて、短縮、延長など調整できる。また、標準品となるヒトＨＲＦは、組織培養上清、細胞培養上清または実施例１記載あるいはそれ以外の方法で発現した組換え体から精製することができる。精製にはイオン交換、ゲルろ過、抗ヒトＨＲＦ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーまたそれ以外の各種アフィニティークロマトグラフィーの組み合わせによって達成される。
（ａ）標識抗体の調製
抗ＨＲＦ抗体（ＨＲＦ−ＧＫＬ)を０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．２に抗体量の２％（Ｗ／Ｗ）のペプシンを加え、３７℃、２４時間消化した。消化物に３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を添加し、反応を停止する。０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムによるゲルろ過でＦ（ａｂ’）２画分を分取した。このＦ（ａｂ’）２画分に最終濃度０．０１Ｍとなるようにシステアミン塩酸塩を添加し、３７℃、１．５時間還元し、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４によるゲルろ過でＦａｂ’画分を分取した。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
上記の操作とは別にＨＲＰを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に溶解、ＨＲＰの２５倍モル量のＥＭＣＳをＤＭＦ溶液として加え、３０℃、３０分間反応させた。これを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したＮＩＣＫ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過しマレイミド標識ＨＲＰ画分を分取した。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
Ｆａｂ’画分とマレイミド標識ＨＲＰを等モルとなるように両画分を混合し、４℃、２０時間反応させた後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレイミドで未反応のチオール基をブロックした。これを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムでゲルろ過し、Ｆａｂ’−ＨＲＰ標識抗体を分取した。これに０．１％  ＢＳＡおよび０．００１％クロルヘキシジンを添加して４℃で保存した。他の抗ヒトＨＲＦ抗体を用いても同様に処理できる。
（ｂ）抗体結合担体の調製
抗ＨＲＦ抗体（ＨＲＦ−ＴＰＹ）を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解し、５０μｇ／ｍＬの濃度に調製した。この抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエルあたり１００μＬずつ加え、４℃、１８時間静置した。抗体溶液を除去し、生理食塩液で１回、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄後、１％  ＢＳＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０を加えブロッキングした。他の抗ヒトＨＲＦ抗体を用いても同様に処理でき、固相抗体を調製できる。
（ｃ）ステップサンドイッチＥＩＡ法
精製したヒトＨＲＦ画分を標準抗原としてヒトＨＲＦ定量用標準曲線を作成した。１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で段階希釈した標準ヒトＨＲＦを分注し、それぞれに１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で調製した標識抗体Ｆａｂ’−ＨＲＰを添加し十分混和した。調製した抗体結合マイクロプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄し、標準抗原と標識抗体混合液を添加した。室温で１時間反応した後０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄した。次に、６％ジメチルホルムアミド、０．００５％過酸化水素含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解した０．０１％  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンをウエルに添加し、室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸を添加し反応を停止した。この反応混液の４５０ｎｍをマイクロプレートリーダーを用いて測定し、標準曲線を求めた。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
ウエスタンブロッティング
ヒトＨＲＦを発現する細胞又は組織の培養上清及び精製組換えヒトＨＲＦを還元条件下、１０−１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写した。続いて５％  ＢＳＡ又は５％スキムミルクおよび０．０５％アジ化ナトリウム含有ＴＢＳ（ブロッキングバッファー）を用いて室温で０．５−１時間ブロッキングした後、ＨＲＦ−ＧＫＬで処理し、２５℃で６時間以下の時間インキュベートした。それぞれの膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＴＢＳ(０．０５％アジ化ナトリウム含有)で４回洗浄し、結合した抗体をブロッキングバッファーで１：１，０００に希釈したＨＲＰ結合抗ウサギイムノグロブリン抗体と２５℃、１時間反応させた。反応後、膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＴＢＳ(０．０５%アジ化ナトリウム含有)で４回洗浄し、結合した抗体をＥｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ(ＥＣＬ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ)により検出した。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
【図１】正常子宮内膜組織、子宮内膜症患者に由来する正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片におけるＨＲＦとＣＹＰ１Ａ１の発現を調べた結果である。（Ａ）ＨＲＦ  ｍＲＮＡレベルはノーザンブロット分析により調べた。ブロットの再プローブをヒトβアクチンプローブを用いて行い、トータルＲＮＡレベルを決定した。ノーザンブロットにより調べた試料中のＣＹＰ１Ａ１  ｍＲＮＡレベルはサザンブロット分析を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。定量の精度を確認するため、５倍の異なる濃度のｃＤＮＡ試料（１×および５×）をＰＣＲテンプレートとして用い、同様な配置で調べた。βアクチンをｍＲＮＡ量に対する内部対照として用いた。（Ｂ）ＨＲＦおよびＣＹＰ１Ａ１のｍＲＮＡレベルに対する画像表示を同様に示す。ｍＲＮＡレベルはｄｅｎｓｉｎｔｏｍｅｔｒｙ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＡＧＥＲ，  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてβアクチンシグナルに対して正規化した。試料１１−２ＡはＨＲＦのｍＲＮＡレベル、１０−２ＡはＣＹＰ１Ａ１のｍＲＮＡレベルを示し、任意に１０に設定した。複数の試料が一個人由来である場合には、平均値を計算して表示した。エラーバーは複数試料の最大値を表す。１２−１、７−１、８−１および６Ｂは正常な子宮内膜組織であり、アステリスクが印字された１Ｃは子宮内膜症患者の正所性子宮内膜である。
【図２】子宮内膜症移植片におけるＨＲＦ発現を調べた結果である。（Ａ）正常な子宮内膜組織、子宮内膜症患者の正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片におけるＨＲＦ発現のノーザンブロット分析の結果である。ブロットはヒトβアクチンプローブを用いて再プローブを行い、トータルＲＮＡレベルを決定した。カラム上のＮ、ＥｕおよびＥｎはそれぞれ正常な子宮内膜組織、子宮内膜症患者の正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片を示す。（Ｂ）図１Ａおよび図２Ａにおいて調査した試料について、ノーザンブロット分析により測定したＨＲＦ  ｍＲＮＡレベルのグラフ表示である。ＨＲＦｍＲＮＡレベルはｄｅｎｓｉｎｔｏｍｅｔｒｙ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＡＧＥＲ，  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてβアクチンシグナルに対して正規化した。試料６ＢのｍＲＮＡレベルを任意に１に設定した。複数の試料が一個人由来である場合には、平均値を計算して表示した。エラーバーは複数試料の最大値を表す。
【図３】ＨＲＦおよびＣＤ６８発現の免疫組織化学的分析の結果である。茶色の染色で陽性部分が可視化されている。逆染色にはヘマトキシリンを用いた。（Ａ）および（Ｂ）正常な子宮内膜組織におけるＨＲＦタンパク質の検出（Ａ：増殖フェーズ、Ｂ：分泌フェーズ、原図倍率×２００）。（ｃ）卵巣の子宮内膜症移植片内部におけるＨＲＦタンパク質の検出（原図倍率×２００）。（Ｄ）子宮内膜症移植片の形態を示す連続切片のＨ＆Ｅ染色（原図倍率×２００）。（Ｅ）さらに高倍率で（Ｃ）と同じ視野のＨＲＦタンパク質を検出したもの（原図倍率×４００）。（Ｆ）子宮内膜症移植片の連続切片におけるＣＤ６８陽性マクロファージの免疫組織化学的局在（原図倍率×４００）。
【図４】移植アッセイの結果である。（Ａ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞内のＨＲＦタンパク質のウエスタンブロット分析の結果。ｗｔ：親のＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＲＦ：ＨＲＦを含むレトロウイルスベクターによる感染後に安定してＨＲＦを発現する細胞株（ｐＭＳＣＶ−ＨＲＦ−３Ｔ３）、ｖｅｃｔｏｒ：空のベクターを感染させた対照細胞（ｐＭＳＣＶ−３Ｔ３）。（Ｂ）ヌードマウスにおけるＨＲＦ過剰発現細胞の示す高い移植効率を示す。縦軸上のマークは次の状態を示す。＋＋＋：無数の移植コロニーが観察された状態、＋＋：数十個の移植コロニーが観察された状態、＋：数個の移植コロニーが観察された状態、−：移植コロニーは観察されなかった状態。対照細胞またはＨＲＦ過剰発現細胞を注射した個々のマウスは、それぞれ白丸または黒丸により示す。