(57)【要約】  脳移行性ポリペプチドを細胞表層に発現させた細胞は、血液脳関門を通過し、脳への移行活性を有することが見出された。この脳移行性細胞へ所望の化合物を導入することにより、該化合物を脳内へ移行させることが可能である。例えば、脳疾患に対して治療効果を有する薬剤を導入した脳移行性細胞を静脈投与することにより、脳内へ効率的にデリバリーさせることができ、脳疾患に対して有効な治療を行うことが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表層に、脳移行活性を有するポリペプチドが発現していることを特徴とする、脳移行性細胞。
【請求項２】
脳移行活性を有するポリペプチドが、以下のアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載の脳移行性細胞。
Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、Ｘ１はＳ、Ｔ、Ｎ、Ｐ、ＶまたはＬ、Ｘ３は任意のアミノ酸、Ｘ４はＧ，Ｓ，Ｔ，Ｃ，Ｎ，Ｌ，Ｑ，またはＹを表す
【請求項３】
アミノ酸モチーフ配列が以下の配列である、請求項２に記載の脳移行性細胞。
Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、Ｘ１はＳ、Ｔ、Ｎ、ＰまたはＶ、Ｘ３は任意のアミノ酸、Ｘ４は非電荷極性アミノ酸（Ｇ，Ｓ，Ｔ，Ｃ，Ｎ，Ｑ，Ｙ）を表す
【請求項４】
アミノ酸モチーフ配列が以下の配列である、請求項２に記載の脳移行性細胞。
Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、Ｘ１はＳ、Ｔ、ＰまたはＬ、Ｘ３は任意のアミノ酸、Ｘ４はＳ，Ｔ，Ｃ，Ｌ，またはＱを表す
【請求項５】
脳移行活性を有するポリペプチドが、配列番号：１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載の脳移行性細胞。
【請求項６】
脳移行活性を有するポリペプチドの長さが９アミノ酸以内である、請求項１〜５のいずれかに記載の脳移行性細胞。
【請求項７】
血液脳関門透過能を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の脳移行性細胞。
【請求項８】
細胞が酵母細胞である、請求項１〜７のいずれかに記載の脳移行性細胞。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の脳移行性細胞を有効成分として含有する、脳送達用キャリア。
【請求項１０】
請求項９に記載の脳送達用キャリアへ生理活性物質を含んで成る、脳移行性薬剤。
【請求項１１】
前記生理活性物質が、脳疾患治療効果を有する物質である、請求項１０に記載の脳移行性薬剤。
【請求項１２】
細胞表層へ脳移行活性を有するポリペプチドを発現させる工程を含む、脳移行性細胞の製造方法。
【請求項１３】
脳移行活性を有するポリペプチドをコードする核酸を、細胞内へ導入する工程を含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれかに記載の脳移行性細胞へ、生理活性物質を導入する工程を含む、脳移行性薬剤の製造方法。
【請求項１５】
細胞、および脳移行活性を有するポリペプチドをコードする核酸を構成要素として含む、脳移行性細胞の製造用キット。
【請求項１６】
非ヒト動物の脳へ所望の物質を移行させる方法であって、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法。
（ａ）請求項１〜８のいずれかに記載の脳移行性細胞へ該物質を導入し、該物質を含有する脳移行性細胞を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製される脳移行性細胞を、非ヒト動物の体内へ投与する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳移行活性が付与された細胞、および、脳へ所望の物質を移行させるための該脳移行性細胞のキャリア分子としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
高次機能中枢をつかさどる脳は、血液脳関門と呼ばれるバリヤー構造によって物質や細胞の輸送を制限されている。そのため外科的手術を除いては効果的に治療を行い難い部位であった。血流中を循環する単球などの白血球を採取し成体動物に移植を行っても、血液脳関門が外的因子によって破綻した場合を除いて脳実質内へ移行しないことが知られている（非特許文献１参照）。【０００３】
また、薬物などを経口摂取しても注射などにより投与しても、血液脳関門が存在するため、ほかの臓器に比べて有効濃度が得られにくい特徴がある。一方、大量投与することにより有効な濃度を脳内で確保することが可能にはなるが、末梢血液中には大過剰の薬物を注入することになり、腎障害や肝障害などの副作用の問題が生じる。そこで、脳への選択的薬物輸送のシステムを開発することが必要となり、実際に多くの研究がなされてきている。このような研究開発の多くは、脂溶性が高い物質ほど血液脳関門を通過しやすいという脳の血管内皮細胞の性質を利用した、薬物そのものの化学修飾による脳移行性の増大をはかるものであった。しかし、このような方法論では薬物の脳移行性が最大数倍程度改善するものの、全体としてはほとんど誤差範囲に留まるにすぎないという結果である。これは、末梢臓器への物質の浸透が血管内皮細胞の細胞間隙を通過するのに対して、脳の血管内皮細胞は細胞間隙が密着帯という特殊な構造を形成し細胞間隙からの血液成分の浸透がほとんどみられないため、脳への物質輸送は脂溶性の化学修飾を行い直接細胞膜にとけ込ませて浸透させるということを行わなければならない。つまり、脳への物質輸送は末梢臓器と違って迂回路がないため、正面突破により細胞の中を浸透させるということを行う方法論である。しかしそのメカニズムが異なるため、効率が数千から数万倍低く、したがって、脳特異的な薬物輸送とはいえない。【０００４】
【非特許文献１】Imai, F., Sawada, M., Suzuki, H. et al. Neurosci Lett 237 1 pp.49-52 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
薬物を脳特異的に輸送するためには、血液脳関門を効率的に通過し脳組織へ移行する特性を有するキャリア分子を開発し、該分子と結合、または該分子に内包させた状態で投与する方法が考えられる。【０００６】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、脳へ移行し得るキャリア分子の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、血液脳関門通過能を有する分子の同定を行い、脳移行活性を有するペプチドを同定することに成功した（WO 2005/014625）。本発明者らは、血液脳関門(BBB; Blood Brain Barrier)モデル培養系を用いて、本発明者らによって同定された脳移行活性を有するペプチドを細胞表層に発現させた酵母について、血液脳関門透過能を検討した。【０００８】
その結果、脳移行活性を有するペプチドが細胞表層に発現している酵母は、血液脳関門を透過することを見出した。この血液脳関門透過能は、脳移行活性を有するペプチドが細胞表層に発現していない場合には見られないことから、該透過能は該ペプチドが有する特性であることが示された。【０００９】
即ち、脳移行性ポリペプチドを細胞表層へ発現させることによって、酵母のような非常に大きな分子であっても、血液脳関門を透過し得ることが初めて明らかとなった。この脳移行活性を有するペプチドによって、酵母という非常に大きな物質までも脳移行活性が付与されたことは、当業者においても全く予想し得るものではなく、驚くべき知見と言える。即ち、酵母以外の細胞であっても、脳移行性ポリペプチドが細胞表層へ発現した細胞は、脳移行活性を有するものと言える。【００１０】
今回得られた知見によって、例えば、脳において薬効が期待される物質を、本発明の脳移行性細胞へ内包させることにより、効率的に脳へ運搬させることが可能となった。【００１１】
本発明の脳移行性細胞は、脳組織をターゲットとする有効なデリバリー分子であると言える。本発明の脳移行性細胞を脳送達用キャリアとして利用することにより、所望の化合物を、例えば、静脈投与することにより、脳へデリバリーすることが可能となった。【００１２】
上述の如く本発明者は、脳移行活性を有する細胞（脳移行性細胞）の作出に成功し、また、該細胞は所望の物質を脳へ移行させるためのキャリアとして有用であることを見出し、本発明を完成させた。【００１３】
本発明は、脳へ移行し得るキャリア分子に関し、より具体的には、
〔１〕  細胞表層に、脳移行活性を有するポリペプチドが発現していることを特徴とする、脳移行性細胞、
〔２〕  脳移行活性を有するポリペプチドが、以下のアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドである、〔１〕に記載の脳移行性細胞、
Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、Ｘ１はＳ、Ｔ、Ｎ、Ｐ、ＶまたはＬ、Ｘ３は任意のアミノ酸、Ｘ４はＧ，Ｓ，Ｔ，Ｃ，Ｎ，Ｌ，Ｑ，またはＹを表す
〔３〕  アミノ酸モチーフ配列が以下の配列である、〔２〕に記載の脳移行性細胞、
Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、Ｘ１はＳ、Ｔ、Ｎ、ＰまたはＶ、Ｘ３は任意のアミノ酸、Ｘ４は非電荷極性アミノ酸（Ｇ，Ｓ，Ｔ，Ｃ，Ｎ，Ｑ，Ｙ）を表す、
〔４〕  アミノ酸モチーフ配列が以下の配列である、〔２〕に記載の脳移行性細胞、
Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、Ｘ１はＳ、Ｔ、ＰまたはＬ、Ｘ３は任意のアミノ酸、Ｘ４はＳ，Ｔ，Ｃ，Ｌ，またはＱを表す、
〔５〕  脳移行活性を有するポリペプチドが、配列番号：１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、〔１〕に記載の脳移行性細胞、
〔６〕  脳移行活性を有するポリペプチドの長さが９アミノ酸以内である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の脳移行性細胞、
〔７〕  血液脳関門透過能を有することを特徴とする、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の脳移行性細胞、
〔８〕  細胞が酵母細胞である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の脳移行性細胞、
〔９〕  〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の脳移行性細胞を有効成分として含有する、脳送達用キャリア、
〔１０〕  〔９〕に記載の脳送達用キャリアへ生理活性物質を含んで成る、脳移行性薬剤、
〔１１〕  前記生理活性物質が、脳疾患治療効果を有する物質である、〔１０〕に記載の脳移行性薬剤、
〔１２〕  細胞表層へ脳移行活性を有するポリペプチドを発現させる工程を含む、脳移行性細胞の製造方法、
〔１３〕  脳移行活性を有するポリペプチドをコードする核酸を、細胞内へ導入する工程を含む、〔１２〕に記載の製造方法、
〔１４〕  〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の脳移行性細胞へ、生理活性物質を導入する工程を含む、脳移行性薬剤の製造方法、
〔１５〕  細胞、および脳移行活性を有するポリペプチドをコードする核酸を構成要素として含む、脳移行性細胞の製造用キット、
〔１６〕  非ヒト動物の脳へ所望の物質を移行させる方法であって、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法、
（ａ）〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の脳移行性細胞へ該物質を導入し、該物質を含有する脳移行性細胞を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製される脳移行性細胞を、非ヒト動物の体内へ投与する工程
を、提供するものである。【００１４】
さらに本発明は、以下に関する。
〔１７〕  前記脳移行性細胞、前記脳送達用キャリア、または前記脳移行性薬剤を個体（患者等）へ投与する工程を含む、脳疾患の治療方法、
〔１８〕  前記骨髄前駆細胞または前記脳移行用キャリアの、脳移行性薬剤（脳疾患治療薬）の製造における使用。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】酵母を使ったスクリーニングの検証について、簡単な流れを表す図である。
【図２】BT-004V3Lペプチドの酵母表層での発現を示す写真である。左がBT-004V3Lが発現しているT2J004V3LYEAST株、右がBT-004V3Lの発現が見られなかった野生株EBY-100（ベクターが導入されていないEBY-100株）である。またベクター導入されていないEBY-100株（図２右）で光っているように見えるのは、バックグラウンドである。
【図３】MBEC4のBBBモデルにT2J004V3LYEAST株およびコントロール株を添加し、各株の酵母透過数を比較した写真および図である。写真上段はコントロール株、写真下段はT2J004V3LYEAST株である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者らは、脳移行活性を有するポリペプチドを細胞表層へ発現させた細胞が、脳へ移行する活性（脳移行活性）を有することを見出した。この脳移行活性を有する細胞（本明細書においては、該細胞を「脳移行性細胞」、または単に「本発明の細胞」と記載する場合あり）は、所望の物質を脳へ移行させる（運搬する）ためのキャリアとして有用である。【００１７】
本発明は、細胞表層に、脳移行活性を有するポリペプチドが発現していることを特徴とする脳移行性細胞を提供する。【００１８】
本発明の細胞は、血液脳関門を透過（通過）する活性を有することを特徴とする細胞である。【００１９】
一般に血液から脳組織内への物質の移行は、血液脳関門（blood-brain barrier; BBB）と呼ばれる仕組みによって制限されている。これによって脳は有害物質等から守られている。本発明において「脳移行活性」とは、細胞が生物（哺乳動物）体内へ投与（例えば、静脈投与等）された際に、該細胞が脳組織内へ移行する活性を言う。本発明の細胞は、通常、脳移行活性を有する細胞（脳移行性細胞）であると表現することができるが、例えば、血液脳関門の通過能を有する細胞と表現することも可能である。【００２０】
なお、本発明における脳への移行とは、より具体的には、脳実質あるいは脳組織への移行を意味する。また、上記血液脳関門通過のメカニズムは、トランスマイグレーションによるものと推察することができる。従って、本発明の細胞は、例えば、トランスマイグレーション（トランスサイトーシス）誘導能を有する細胞と表現することも可能であるが、本発明の細胞は、必ずしも、該活性を有する細胞であるものと限定して解釈されない。【００２１】
上記「トランスマイグレーション」とは、ある分子が脳へ侵入する際に、血管内皮細胞の細胞間隙を通過するのではなく、血管内皮細胞内を通過する現象を言う。これは「trans-endothelial cell migration」、「trans cellular pathway」、もしくは「トランスサイトーシス」とも呼ばれ、このメカニズムによって血管内皮細胞を通過する分子（細胞等）は、その表面にシグナル分子を持ち、血管内皮細胞表面上にある受容体を介して血管内皮細胞に上記現象を誘導するものと考えられる。【００２２】
なお、本発明における「細胞」は、特にその種類は制限されない。例えば、酵母程度の大きさの細胞であれば、本発明の脳移行活性を有するポリペプチドを細胞表層へ発現させることによって、効率的に脳へ送達させることが可能である。酵母より大きな細胞であっても、上述のトランスマイグレーションによって血液脳関門を通過し得る程度の大きさの細胞であれば、脳へ送達させることが可能である。従って、本発明における細胞は、特に制限されず、具体的には、哺乳動物（ヒト、サル、マウス、ラット等）の細胞、真核生物細胞（線虫、酵母、カビ等）、原核生物細胞（大腸菌、枯草菌等）等を例示することができる。本発明の細胞の大きさは、特に制限されないが、より好ましくは、酵母と同等もしくはそれ以下の大きさの細胞である。【００２３】
本発明の脳移行性細胞は、所望の物質（化合物）を脳神経細胞内へ移行するためのキャリアとして利用することが可能である。通常、所望の化合物を、本発明の細胞へ担持させることにより、脳へ移行させることができる。【００２４】
本発明において「担持させる」とは、所望の化合物を本発明の細胞の細胞内へ導入させること、あるいは、本発明の細胞の表面に結合もしくは吸着させることを指す。また、所望のタンパク質を本発明の脳移行性細胞の表層へ発現させた状態で、該タンパク質を脳へ送達させることも可能である。【００２５】
本発明の脳移行性細胞へ所望の化合物を担持させることは、当業者においては、一般的に知られる公知技術を利用して実施することができる。例えば、所望の化合物をリン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法エレクトロポレーション法、あるいはリポフェクション法等により、細胞内へ導入させることができる。【００２６】
本発明の細胞へ導入可能な化合物としては、特に制限されないが、例えば、タンパク質、核酸（発現ベクター、アンチセンスRNA、siRNA等）、糖鎖等を挙げることができる。例えば、所望のタンパク質の本発明の細胞への導入は、該タンパク質をコードするDNAもしくは該DNAを有する発現ベクターを、本発明の細胞へ導入することによって実施することも可能である。【００２７】
本発明者らは、９アミノ酸長のポリペプチドが、他の物質（分子）に対し、有効な脳移行活性を付与できることを明らかにした。従って、少なくとも、９アミノ酸程度の短いポリペプチドであっても、他の分子に対し有効な脳移行活性を付与する機能があるものと言える。【００２８】
本発明において「脳移行活性を有するポリペプチド」の長さは、特に制限されないが、例えば１００アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは９アミノ酸以内であり、最も好ましくは４〜９アミノ酸長である。【００２９】
以下の配列を有するポリペプチドは、脳移行活性を有することが本発明者らによって見出されたポリペプチドである（WO 2005/014625）。本発明の脳移行活性を有するポリペプチドの具体例として以下に記載するが、特にこれらのペプチドに限定されない。【００３０】
【表１】
2007023930.tif 000002
【００３１】
上述のポリペプチドの中から任意に選択したポリペプチド（配列番号：５）について、酵母の細胞表層へ発現させたところ、該酵母は実際に血液脳関門を透過する機能を有することが実証された（後述の実施例参照）。即ち、本発明の脳移行活性を有するポリペプチドは、酵母のような非常に大きな分子であっても、脳移行活性を付与することができることが、本発明者らによって初めて見出された。【００３２】
また上述のポリペプチド以外であっても、例えば、配列番号：１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１または数個（例えば、１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が付加、欠失、もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、脳移行活性を有するポリペプチドは、本発明における脳移行活性を有するポリペプチドに含まれる。【００３３】
通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づいて(1)疎水性：アラニン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニンおよびロイシン；(2)中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニンおよびセリン；(3)酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸；(4)塩基性：アルギニン、ヒスチジンおよびリシン；(5)鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン；ならびに(6)芳香族性：チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンのグループに分類される。従って、本発明においてアミノ酸の改変を行う場合には、特に制限されないが、上述のように同様の性質を有するアミノ酸へ改変することが好ましい。【００３４】
所望のポリペプチドについて脳移行活性を有するか否かは、例えば、後述のMBEC4を用いたBBBモデルを利用する方法により評価することができる。従って、上述の配列番号：１〜１２のポリペプチドのアミノ酸配列に対してアミノ酸の改変を行った場合、これらの改変体の中から脳移行活性を有するポリペプチドを選択することは、当業者においては通常の試行の範囲内と言える。【００３５】
本発明における脳移行活性を有するポリペプチドの好ましい態様としては、以下の〔配列１〕に記載のアミノ酸モチーフ配列、より好ましくは〔配列２〕に記載のアミノ酸モチーフ配列、または〔配列３〕に記載のアミノ酸モチーフ配列を含むポリペプチドである。【００３６】
〔配列１〕      Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、
Ｘ１はＳ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｐ（プロリン）、Ｖ（バリン）またはＬ（ロイシン）；
Ｘ３は任意のアミノ酸；
Ｘ４はＧ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（チロシン）、Ｃ（システイン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｌ（ロイシン）、Ｑ（グルタミン）、またはＹ（チロシン）；
を表す。【００３７】
〔配列２〕      Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、
Ｘ１はＳ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｐ（プロリン）、またはＶ（バリン）〔ただし、Ｘ１は、さらに好ましくはＳまたはＴ〕；
Ｘ３は任意のアミノ酸；
Ｘ４はＧ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（チロシン）、Ｃ（システイン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｑ（グルタミン）、またはＹ（チロシン）〔ただし、Ｘ４は、さらに好ましくはＴ、ＱまたはＣ〕；
を表す。また、上記（ＲまたはＫ）は、さらに好ましくはＲである。
一般的に、これらアミノ酸（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ）は、非電荷極性アミノ酸に分類される。【００３８】
〔配列３〕      Ｘ１−（ＲまたはＫ）−Ｘ３−Ｘ４、または
Ｘ４−Ｘ３−（ＲまたはＫ）−Ｘ１
式中、
Ｘ１はＳ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｐ（プロリン）、またはＬ（ロイシン）；
Ｘ３は任意のアミノ酸；
Ｘ４はＧ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（チロシン）、Ｃ（システイン）、Ｌ（ロイシン）、またはＱ（グルタミン）；
を表す。【００３９】
なお、本明細書におけるアミノ酸は、一般的に使用される一文字表記にならって記載した（例えば、Ｒはアルギニン、Ｋはリシン）。また、一般的な記載方法にならい、Ｎ末からＣ末方向の順にアミノ酸配列を記載した。【００４０】
また、ペプチドが環状化された（より具体的には、上記ペプチドにおける両端のシステイン間でジスルフィド結合(S-S結合)が形成され環状化された）構造を有するポリペプチドは、さらに高い脳移行活性を有することが期待される。従って本発明において、脳移行活性を有するポリペプチドの好ましい態様としては、環状構造を有するポリペプチドである。この環状領域を構成するポリペプチドには、好ましくは、上記モチーフ配列が含まれる。該モチーフ配列を構成するアミノ酸は、互いに隣接する４アミノ酸残基から構成される。これら隣接するアミノ酸同士は、通常、ペプチド結合を形成するが、隣接するアミノ酸がシステイン残基同士である場合には、ジスルフィド結合を形成し得る。本発明のモチーフ配列における上記「隣接する４アミノ酸残基」とは、互いにペプチド結合を形成している場合に制限されず、隣接するアミノ酸がシステインである場合には、ジスルフィド結合を形成している場合であってもよい。即ち、本明細書における上記〔配列１〕〜〔配列３〕の、「−」は、通常、ペプチド結合を意味するが、隣接するアミノ酸がシステインである場合には、該「−」はジスルフィド結合(S-S結合)であってもよい。例えば、直鎖上のポリペプチドのアミノ酸配列において、上記モチーフ配列が見出されない場合であっても、環状構造を形成することにより隣接するようになったアミノ酸によって、上記モチーフが形成される場合がある。【００４１】
また、本発明の好ましい態様において脳移行活性を有するポリペプチドは、上記の４アミノ酸からなるモチーフ配列を含むようなポリペプチドであれば、上記のモチーフ配列以外のアミノ酸配列の種類は特に制限されない。【００４２】
また、表１に記載した脳移行活性を有するポリペプチドは、以下の特徴を有する。
環状構造を形成し得るポリペプチド領域（即ち、両端のシステインを除くアミノ酸配列）において、（１）全てのポリペプチドには塩基性アミノ酸のＫまたはＲが含まれ、（２）残りのアミノ酸残基は、１０種のアミノ酸〔Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｑ、Ｈ、Ｎ〕のいずれかから構成される。【００４３】
従って、本発明における脳移行活性を有するポリペプチドの好ましい態様においては、環状領域を有するポリペプチドであって、該環状領域に少なくとも１以上の塩基性アミノ酸残基（ＫまたはＲ）を有し、かつ、該環状領域の残りのアミノ酸残基がアミノ酸残基〔Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｑ、Ｈ、Ｎ〕から選択される（通常、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）ことを特徴とする（この特徴を、本明細書において「特徴１」と記載する場合あり）、脳移行活性ポリペプチドである。本発明における脳移行活性を有するポリペプチドのさらに好ましい態様においては、上記「特徴１」を有するポリペプチドであって、本発明のモチーフ配列（〔配列１〕〜〔配列３〕）を含むポリペプチドである。【００４４】
また、上記「特徴１」において記載したように、本発明における脳移行活性を有する全てのポリペプチドには、塩基性アミノ酸（ＫまたはＲ）が含まれるという特徴が見出された。例えば、上述の９アミノ酸のポリペプチドにおいては、少なくとも１つの塩基性アミノ酸が見出された（全アミノ酸に対する含有率は、１／９＝０．１１（１１％）以上）。【００４５】
従って、本発明における脳移行活性を有するポリペプチドの一つの態様として、以下のポリペプチドを挙げることができる。
（ａ）塩基性アミノ酸残基（ＫまたはＲ）を１０％以上含有する、脳移行活性を有するポリペプチド。
（ｂ）環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、該環状ペプチド領域において塩基性アミノ酸残基（ＫまたはＲ）が１０％以上含まれる、脳移行活性を有するポリペプチド。
（ｃ）環状ペプチド領域を有するポリペプチドであって、該環状ペプチド領域に少なくとも１以上の塩基性アミノ酸残基（ＫまたはＲ）を有する、脳移行活性を有するポリペプチド。【００４６】
本発明における脳移行活性を有するポリペプチドの長さの上限についても、特に制限されるものではないが、通常、上記４アミノ酸配列のモチーフあるいは前記「特徴１」を有する７アミノ酸もしくはそれ以上の長さのポリペプチドであれば、効率的な脳移行活性を有するものと考えられる。長さの上限についても特に制限されないが、一般に５０アミノ酸長以下、好ましくは３５アミノ酸長以下のポリペプチドについては、十分に脳移行活性を有するものと考えられる。また、該ポリペプチドを含むさらに長いポリペプチドであっても、通常、脳移行活性を有することから、本発明における脳移行活性を有するポリペプチドは、その長さを制限されない。【００４７】
本発明の脳移行活性を有するポリペプチドの好ましい態様において、環状化されるポリペプチド領域の長さは、特に制限されない。該ポリペプチドにおける環状ペプチド領域の長さは、特に制限されないが、例えば１００アミノ酸以内であり、好ましくは５０アミノ酸以内であり、より好ましくは４〜３０アミノ酸であり、さらに好ましくは４〜１５アミノ酸であり、さらに好ましくは４〜９アミノ酸であり、最も好ましくは４〜７アミノ酸である。【００４８】
また本発明の脳移行性細胞は、血液脳関門を透過する活性を有することによって特徴付けられる。従って、本発明の細胞は、例えば、この血液脳関門透過能を指標とすることによって、他の細胞と区別することが可能である。【００４９】
所望の細胞について血液脳関門透過能の有無は、例えば、マウス脳毛細血管内皮細胞であるMBEC4を用いたBBBモデルを利用して、適宜評価することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の方法、もしくは該方法を適宜改変した方法によって、所望の細胞について、血液脳関門透過能の有無を検討することができる。従って、種々の細胞からなるヘテロな集団から本発明の細胞を適宜選択することも可能である。【００５０】
また、任意の細胞について本発明の脳移行活性を有するか否かは、例えば、実験動物等を用いて検討することも可能である。即ち、被検細胞へマーカー遺伝子（例えば、GFP等）を導入した後、該細胞をマウス等の被検動物の静脈（例えば、尾静脈等）から投与し、脳において該マーカーの存在の有無を検出することにより、評価することができる。静脈へ投与した細胞が脳へ送達していれば（例えば、脳において該細胞が検出されれば）、該細胞は本発明の脳移行活性を有するものと判定される。【００５１】
本発明における脳移行活性を有するポリペプチドとしては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを挙げることができる。
（ａ）配列番号：１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドの両端のシステイン同士のジスルフィド結合によって環状化されたペプチド領域を含む、ポリペプチド
（ｃ）配列番号：１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が付加、欠失、もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、脳移行活性を有するポリペプチド【００５２】
なお、本発明の細胞として、例えば、酵母を好適に利用することができる。酵母の種類は特に制限されないが、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を挙げることができる。【００５３】
また本発明の脳移行性細胞を利用することにより、所望の物質（化合物）を、脳へ運搬させることが可能である。即ち、本発明の脳移行性細胞へ、所望の物質を導入する、もしくは該細胞と結合させることにより、該物質を脳へ移行させることが可能である。【００５４】
従って本発明は、本発明の脳移行性細胞を含有する、脳送達用キャリア（キャリア分子）を提供する。本発明のキャリアは、例えば、担体、運搬体、ベクター、デリバリー分子等と表現することも可能である。【００５５】
本発明の脳送達用キャリアへ担持させる物質としては、特に制限されないが、通常、生理活性物質であることが好ましい。生理活性物質としては、例えば、脳において活性を有する物質であり、好ましくは、脳疾患（例えば、脳神経疾患等）に対して治療もしくは予防効果を有する物質である。該物質の一つの態様としては、DNA（ベクター等を含む）もしくはRNA（アンチセンスRNA、siRNA等を含む）等の核酸を好適に挙げることができる。例えば、脳疾患に対して治療効果を有するタンパク質をコードするDNAは、上記生理活性物質の一例である。【００５６】
本発明のキャリアを利用することにより、所望の薬剤を脳へ移行させることが可能である。例えば、脳疾患に対して治療効果を有する化合物（医薬組成物）を、上記キャリアに担持（内包）させることにより、該化合物を効率的に脳へ送達させ、有効な治療効果を発揮させることが可能である。該化合物（医薬組成物）を担持させたキャリア自体は、脳疾患治療剤として期待される。従って本発明は、本発明の上記脳送達用キャリアに薬物が担持された構造からなる、脳疾患治療剤を提供する。【００５７】
なお、上記「担持された」とは、薬物をキャリア分子である本発明の細胞の細胞内へ導入された（内包させた）状態でもよいし、本発明の細胞の表層と直接結合（吸着）させた状態でもよいし、あるいは、キャリア分子と混合させた状態でもよい。例えば、薬物をリポソームもしくはマイクロカプセル等により本発明の細胞へ内包させたり、あるいは、薬物がタンパク質である場合には、該タンパク質をコードするDNAが発現可能な状態で有する発現ベクターを、本発明の細胞の細胞内へ導入させてもよい。また、所望の薬剤をリポソームまたはマイクロカプセル等に内包させ、該リポソームまたはマイクロカプセルを、本発明のキャリア分子と結合（例えば、細胞表層と結合）させてもよい。【００５８】
本発明の脳移行性細胞（キャリア）によって、脳へ送達させる物質としては、基本的には、脳における疾病、疾患に合わせて種々の物質を挙げることができる。例えば、BDNFやGDNFといった神経栄養因子、IL-10やTGFβなどの抑制性サイトカインをはじめパーキンソン病治療のためのドーパミンやアルツハイマー病治療のための塩酸ドネペジルといった薬物等が考えられる。薬物の場合、ドーパミンプロドラッグのレボドパなどに示されるように薬物修飾がなされなければほとんど脳へ移行できない（脳へ移行するまでに分解されてしまう）薬物が多いため、in vitroでは効果があるにもかかわらずin vivoにおいて有効性を示さなかった薬物も本発明の細胞を使うことにより、利用することが可能になると考えられる。また、現在よく使用されている薬物、例えばアルツハイマー型痴呆症治療薬の塩酸ドネペジルのような薬物も脳へ直接移行することにより、投与量を減少させることが可能である。【００５９】
本発明の脳移行性細胞を用いた脳疾患の治療に対しての治療戦略としては、例えば、以下の４つの場合に応用することが可能である。【００６０】
（１）  欠損または変異などによって量や活性が低下した酵素や生理活性タンパク質を補う補充療法：
これは遺伝子欠損や遺伝子変異により特定の酵素またはタンパク質が脳内で欠乏することによって生じる様々な脳疾患に対し、欠乏するタンパク質や酵素の遺伝子を導入した細胞を注入することにより行われる。また、特定の神経細胞が変性脱落するパーキンソン病やアルツハイマー病に対し、神経の変性脱落により欠乏する神経伝達物質の合成を促進するような遺伝子、例えばパーキンソン病におけるチロシン水酸化酵素やビオプテリン合成酵素などのドーパミン生合成系の酵素遺伝子が考えられる。【００６１】
（２）  変性などで脱落する神経細胞を保護し機能を強化する保護療法：
変性疾患や脳虚血など色々な原因で生じる神経細胞死を抑制し、神経突起の再生を促す神経栄養因子(NGF, BDNF, GDNF, NT3など。特にパーキンソン病ではBDNFやGDNFが有効であることが知られている。）遺伝子を発現する細胞を注入することが考えられる。また多発性硬化症のように免疫細胞が関与する疾患では免疫抑制作用があるTGFβやIL-10遺伝子を本発明の細胞へ導入することが考えられる。【００６２】
（３）  腫瘍や血栓などを除去するような方法：
抗腫瘍作用を持つ因子を発現させたり、抗がん剤を導入した本発明の細胞を脳に移入したりすることが考えられる。血栓除去については線溶系の酵素を発現させることが考えられる。【００６３】
（４）  有効な薬物を脳にだけ導入するような方法：
神経系に作用を持つ薬物は末梢毒性が高かったり、末梢神経系に作用を持つ物、血液脳関門を通過しにくい物など色々あり、脳への特異的なドラッグデリバリーシステムが必要とされていた。本発明の細胞では末梢臓器にあまり影響を与えず脳に特異的に薬物を送達させることができると考えられる。【００６４】
本発明の脳移行性細胞を用いて、治療が可能な疾患としては、特に制限されるものではないが、例えば、ザンドホッフ病、ゴーシェー病等を挙げることができる。これら疾患は、リソソーム内にある酵素や蛋白質が欠損し本来代謝されるべき物質がリソソーム内に蓄積し種々の症状を引き起こすことから、リソソーム病とも呼ばれる。この疾病に対する治療法として現在のところ酵素を血流から注入する酵素補充療法により症状を緩解する方法が主だった治療法となっている。本発明の脳移行性細胞をリソソーム病に対して用いることができれば、細胞は酵素を正常に産生することができるので細胞に薬物や遺伝子などを運ばせることなく、酵素欠損した細胞の役割を補うことにより細胞治療を行うことができると考えられる。【００６５】
また、遺伝子や薬物を運ばせる場合においては、脳腫瘍、脳虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病など多種多様な疾患に用いることが可能であると考えられる。脳虚血時にはBDNFなどの神経栄養因子やエリスロポエチンなどによって局所での神経保護作用を促したり、慢性疾患であるパーキンソン病にはドーパミンを局所的に補充したりすることが可能になる。また脳腫瘍においては、腫瘍部に薬物が移行しないのみならず抗癌剤の多くが増殖性の細胞に作用するため（癌に対する選択性を持たないため）副作用が大きな問題となっているが、これらの問題も回避することが可能である。【００６６】
上述のように本発明は、本発明の脳移行性細胞（脳送達用キャリア）へ生理活性物質を含んで成る、脳移行性薬剤（脳移行性医薬組成物）を提供する。該生理活性物質は、通常、脳疾患に対して治療もしくは予防効果を有する物質（化合物）である。【００６７】
本発明の上記薬剤は、公知の製剤学的製造法によって、製剤化することもできる。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）、または保存剤（例、パラベン）等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは注射剤に調製することができる。例えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水剤等で提供できる。【００６８】
また体内への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行うことができるが、好ましくは動脈内、静脈内投与である。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。【００６９】
また本発明は、本発明の脳移行性細胞の製造方法に関する。該方法の好ましい態様としては、脳移行活性を有するポリペプチドを細胞の細胞表層へ発現させる工程を含む方法である。【００７０】
任意のポリペプチドを、微生物の細胞表層へ発現（提示）させることは、当業者においては、公知の技術もしくは知見に基づいて、適宜実施することができる。例えば、任意のポリペプチドを細胞の細胞表層へ発現させるために、市販のキット(Invitrogen, Catalog no. V835-01,「pYD1 Yeast Display Vector Kit」)を利用して実施することができる。例えば、脳移行活性を有するポリペプチドが、細胞表層において発現するタンパク質と融合タンパク質を形成するように発現し得るDNAベクターを作製し、該ベクターを細胞へ導入することによって行うことができる。該DNAベクターの作製は、当業者においては一般的な遺伝子工学技術を用いて、適宜実施することができる。【００７１】
従って、本発明の細胞の製造方法の好ましい態様としては、細胞表層へ脳移行活性を有するポリペプチドを発現（提示）させる工程を含む方法である。より具体的には、脳移行活性を有するポリペプチドをコードする核酸を、細胞内へ導入する工程を含む方法である。【００７２】
さらに本発明は、上記の生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造方法に関する。該製造方法の好ましい態様においては、本発明のキャリアへ、生理活性物質を導入する、もしくは結合させる工程を含む方法である。【００７３】
また、より具体的には、（ａ）細胞表層へ、脳移行活性を有するポリペプチドを発現させ、脳移行性細胞を作製する工程、（ｂ）工程（ａ）の脳移行性細胞の細胞内へ、生理活性物質を導入する工程、を含む製造方法である。【００７４】
また、本発明の脳移行性細胞は、脳移行活性を有するペプチドを細胞表層へ直接結合させることにより作製することも可能である。該方法もまた、本発明に含まれる。本発明の脳移行性細胞の製造方法の好ましい態様としては、脳移行活性を有するペプチドを細胞と接触させる工程を含む方法である。【００７５】
また本発明は、本発明の脳移行性細胞の調製用キット、および、本発明の生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造用キットを提供する。【００７６】
本発明のキットは、例えば、細胞、脳移行活性を有するポリペプチド、細胞を培養するための培地、培養液等を構成要素とすることができる。【００７７】
本発明の脳移行性細胞の調製用キットの好ましい態様においては、細胞および脳移行活性を有するポリペプチドを少なくとも構成要素として含むキットである。【００７８】
また本発明のキットには、サンプル（対照）として、本発明の脳移行性細胞を含めることができる。【００７９】
また、本発明の生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造用キットは、本発明の脳移行性細胞と、細胞の培養のための培地、あるいは該細胞へ生理活性物質を導入するための試薬類等を構成要素とする。該試薬とは、例えば、細胞のトランスフェクションのための各種試薬を挙げることができる。【００８０】
また、本発明の生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造用キットの好ましい態様においては、例えば、以下の（ａ）を少なくとも構成要素として含有するキットであり、より好ましくは、以下の（ａ）および（ｂ）を少なくとも構成要素として含むキットである。
（ａ）本発明の脳移行性細胞
（ｂ）本発明の脳移行性細胞を培養するための培地（培養液等）【００８１】
本発明のキットには、上述の構成要素の他に、本発明の細胞へ導入すべき生理活性物質も併せてパッケージングさせることも可能である。【００８２】
上記「培地」としては、一般的に細胞の培養に使用される培地を利用することができる。当業者においては、上記「培地」の基本的な組成等は、文献あるいはマニュアル等から容易に知ることができる。【００８３】
また本発明のキットには、本発明の細胞を分離するための各種方法、例えば、MBEC4のBBBモデルに用いる各種試薬類を含めることができる。また、本発明のキットの仕様書、該方法の指示書等を適宜パッケージングさせることができる。【００８４】
また本発明は、本発明の脳移行性細胞を用いて、動物の脳へ所望の物質（例えば、生理活性タンパク質をコードするDNAを発現し得るベクター等）を移行させる方法に関する。該方法は、好ましくは以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法である。
（ａ）本発明の脳移行性細胞へ、脳へ移行させたい所望の物質を導入し、該物質を含有する脳移行性細胞を作製する工程
（ｂ）上記（ａ）で作製される脳移行性細胞を、動物に体内へ投与する工程【００８５】
上記方法において、「動物の体内」とは、通常、脳以外の部位を指す。例えば、本発明の脳移行性細胞を、動物の静脈内へ投与することにより、所望の物質を脳へ移行させることが可能である。【００８６】
上記方法において「動物」とは、血液脳関門を有する動物であれば、特に制限されないが、通常はヒト、あるいは、サル、マウス、イヌ、ネコ等の非ヒト動物が挙げられる。【００８７】
また本発明は、本発明の脳移行性細胞、本発明の脳送達用キャリア、または本発明の脳移行性薬剤に加えて、薬学的に許容された担体を含んでなる組成物を提供する。【００８８】
さらに本発明は、本発明の脳移行性細胞、本発明の脳送達用キャリア、または本発明の脳移行性薬剤を個体（患者等）へ投与する工程を含む、脳疾患の治療方法に関する。【００８９】
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適切な投与量を適宜選択することが可能である。【００９０】
また本発明は、本発明の脳移行性細胞または本発明の脳送達用キャリアの、脳移行性薬剤（脳疾患治療薬）の製造における使用に関する。【００９１】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
〔実施例１〕  脳移行活性を有するポリペプチドをコードするDNAを有するベクターの構築
脳移行活性を有するペプチドとして本発明者らによって同定されたT2J004V3L (BT004)（CVLRHLQQC；配列番号：５）のアミノ酸配列を基に、以下のプライマーを作製した。
T2J004V3L-Fwプライマー：GGTACCTGCGTCTTGAGACATCTACAACAATGTTAA（配列番号：１３）
T2J004V3L-Rvプライマー：CTCGAGTTAACATTGTTGTAGATGTCTCAAGACGCA（配列番号：１４）【００９３】
これらのT2J004V3L-FwプライマーとT2J004V3L-Rvプライマーを98℃で3分加熱し、除冷することでアニーリングさせた。これを制限酵素KpnIおよびXhoIで処理することにより、一端にKpnI接着末端もう一方にXhoI接着末端を作成した。
pyD1ベクター（pYD1酵母ディスプレイベクター（Invitrogen Co.Ltd,USA））を制限酵素KpnIおよびXhoIで切断し、T4 DNAリガーゼを用いてpyD1ベクターのKpnI-XhoIに、上記のアニーリングさせた配列を導入し、ペプチド発現ベクターpyD-T2J004V3Lを作成した。正しく導入されたかは、DNAシーケンスにより確認した。【００９４】
〔実施例２〕  酵母への導入
酵母として、Saccharomyces cerevisiae EBY100株（Invitrogen Co. Ltd.,USA）を利用した。本発明者らは、実施例１で得られたペプチド発現ベクターpyD-T2J004V3LをEBY100株へ形質転換により導入した。導入方法は、Gietzらの方法に準じた（Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 2002;350:87-96.、High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast. Methods Mol Biol. 2001;177:85-97.）。【００９５】
得られた形質転換株から、発現が認められるものを選抜し、発現株はT2J004V3LYEASTとし、またコントロールとしてpyD1ベクターのみを発現させたコントロール株も同時に作製した。これらの株を、以下の実施例４に示すMBEC4のBBBモデルでの透過実験に使用した。【００９６】
〔実施例３〕  酵母の発現誘導
T2J004V3LYEAST、コントロール株について、誘導前の前培養として、YNB-CAA、2%グルコース培地（0.17% アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まないYeast nitrogen base （BD Difco Co. Ltd., USA）、0.5% 硫酸アンモニウム（Wako Co. Ltd., Japan）、0.5% カザミノ酸（Nippon seiyaku Co. Ltd., Japan）、2% グルコース）で30℃において一晩液体培養を行った。一晩培養後、生理食塩水で酵母を洗浄し、YNB-CAA、2%ガラクトース液体培地（0.17% アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まないYeast nitrogen base （BD Difco Co. Ltd., USA）、0.5% 硫酸アンモニウム（Wako Co. Ltd., Japan）、0.5% カザミノ酸（Nippon seiyaku Co. Ltd., Japan）、2% ガラクトース）に、OD = 0.5〜1.0（0.5 x 107-1.0 x 107 cells/ml）となるように植菌して、24〜36時間、今度は20℃で液体培養を行った。YNB-CAA、2%ガラクトースによる培養により、Aga2タンパク質と融合した脳移行活性を有するポリペプチドであるBT-tag（以下、BT-004V3Lと呼ぶ）が発現誘導され、細胞表層に局在している、Aga1とジスルフィド結合することで、酵母細胞表層に提示された。コントロールの場合は、Aga2タンパク質のみが発現誘導され酵母細胞表層に提示された。また図２右のベクター導入されていないEBY-100株では細胞表層への提示は見られない。（図２）。【００９７】
〔実施例４〕  マウス脳毛細血管内皮細胞（Mouse Brain Capillary Endothelial Cell；MBEC4）のBBB（Blood Brain Barrier）モデルの構築
BBBモデルを以下のようにして構築した。まず、セルカルチャーインサートは、pore size 8.0μmの6wellあるいは12wellのものを使用した（BD Falcon Co. Ltd., USA）。また、6wellあるいは12well用のセルカルチャーインサートコンパニオンプレート（BD Falcon Co. Ltd., USA）も使用した。【００９８】
セルカルチャーインサートのナイロン膜上に、10倍希釈したcollagen I-A（新田ゼラチン製）を塗布し、collagenの薄膜を形成させた。その上にMBEC Medium（DMEM （Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、10％ FBS（Fatal bovine serum；ウシ胎児血清(BD GIBCO Co. Ltd., USA)）、2.7μg/ml ECGS（Endothelial Cell Growth Supplements；血管内皮細胞グロースサプリメント（Wako Co. Ltd., Japan））、0.2% 25 mg/ml Heparin（ヘパリン（Sigma Co. Ltd., USA）））に、MBEC4細胞を5.0 x 104 Cells/mlとなるように懸濁した培養液（MBEC Medium）を、1.0 ml（6well）もしくは0.25 ml（12well）添加し、37℃ 5% CO2存在下で培養を行った。12時間培養後、MBEC Mediumをさらに2.0 ml（6well）もしくは1.0 ml（12well）加え培養した。さらに48時間培養後、上面のMBEC Mediumを1.0 ml（6well）もしくは0.5 ml（12well）に調節し、下面に2.5 ml（6well）もしくは1.5 ml（12well）のMBEC Mediumを新たに加え、12時間培養を続けた。【００９９】
上面にそれぞれ、2.5 x 107 Cells（6well）もしくは1.5 x 107 Cells（12well）の酵母（T2J004V3LYEAST株あるいはコントロール株）を添加し、4〜6時間37℃ 5％ CO2でインキュベートした。インキュベート後、下面の培地を回収し、12,000 rpm 5分遠心分離して上清を除去した後、200μlの生理食塩水を加えて懸濁し、全量をYPD寒天培地（5% YPD培地（BD Difco Co. Ltd. USA）、細菌培養のための1.5%寒天（Wako Co. Ltd., Japan））に塗布した。塗布した寒天培地は、30℃で36〜48時間インキュベートし、生じたコロニー数を計測した。【０１００】
本発明者らは、BT-004V3Lを発現するT2J004V3LYEAST株について16回、コントロール株について17回の透過実験を行った。【０１０１】
その結果、平均酵母透過数は、T2J004V3LYEAST株では176個、コントロール株では平均37個となった。また最大数のものと最小数のものを各１つづつ取り除いた場合は、T2J004V3LYEAST株では121個、コントロール株では29個となった。以上の結果を、T2J004V3LYEAST株については表２に、コントロール株については表３に示す。【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
また、各株のコロニー形成の様子を図３に示す。【０１０５】
以上のように、それぞれの実験でかなりばらつきが生じたが、酵母の代わりに、脳移行性を示すミクログリア細胞を用いた、同様のMBEC4  BBBモデル透過実験においても、ミクログリア細胞の透過量にはかなりのばらつきが生じることが報告されている。【０１０６】
上述の実験結果から、本発明者らによって同定された脳移行活性を有するポリペプチドが細胞表層へ発現（提示）した酵母は、脳移行活性を有することが分かった。即ち、該ポリペプチドには、酵母のような非常に大きな分子までも、脳へ移行させる活性を付与し得ることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の脳移行性細胞を用いることにより、脳内へ効果的に薬物等を運ぶことが可能となった。これまでに代謝分解により使いにくかった薬物が使用でき、また、高濃度で使用しなければならなかった薬物の投与量を削減することも可能である。
また本発明は、脳内で薬効を奏することが必要な疾患の治療に非常に有用である。
本発明は薬効を最大限に引き出すことのできる医薬品の開発、使用法の確立につながるものである。本発明によって、脳腫瘍などの脳疾患に対して、新規な治療薬の開発も可能と考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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