【手続補正書】
【提出日】平成19年12月14日(2007.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  イントラボディーフレームワークまたはイントラボディーの同定方法であって、好適な宿主細胞をライブラリーで形質転換し、前記ライブラリーはイントラボディーとマーカータンパク質との融合産物であり、前記マーカータンパク質は可溶性かつ安定性であるイントラボディー部分をコードする融合タンパク質の一部分としてのみ活性があり、次に前記細胞を、マーカータンパク質の検出による可溶性かつ安定性であるイントラボディーフレームワークを発現している細胞の同定および選択を許容する条件下で培養する方法。
【請求項２】  前記マーカータンパク質が選択可能な活性、特に酵素活性または蛍光活性を有する請求項１記載の方法。
【請求項３】  イントラボディーまたはイントラボディーフレームワークの同定方法であって、
イントラボディーライブラリーと転写を活性化できるＤＮＡ結合タンパク質との融合産物であるライブラリー及びマーカーシステムによる好適な宿主細胞の形質転換、ここにおいて前記マーカーシステムは前記ＤＮＡ結合タンパク質の転写制御下にあり、前記転写を活性化できるＤＮＡ結合タンパク質は可溶性且つ安定であるイントラボディー部分をコードする融合タンパク質の部分のみを活性化する；、及び
可溶性かつ安定性であるイントラボディーを発現している細胞の、前記マーカーシステムの読み出しの検出による同定および選択を許容する条件下における前記細胞の培養；
を含む方法。
【請求項４】  イントラボディーフレームワークまたはイントラボディーの同定方法であって、好適な宿主細胞をイントラボディーおよび転写活性化システムの一部分を含むタンパク質をコードするライブラリーで形質転換し、ここにおいて、前記転写活性化システムの一部分は可溶性かつ安定性であるイントラボディー部分をコードする融合タンパク質の部分のみを活性化し、
かつ前記細胞はさらに、前記転写活性化システムの少なくとも第２の部分を含む第２のタンパク質を発現し、それによって前記転写活性化システムが生存許容マーカーに連結され、かつ前記細胞が、前記２つのタンパク質間の相互作用の存在下における選択的条件下においてのみ生存する方法。
【請求項５】  前記ライブラリーにコードされるタンパク質が転写活性化ドメインを含み、かつ前記第２タンパク質がＤＮＡ結合ドメインを含むか、または前記ライブラリーにコードされるタンパク質がＤＮＡ結合ドメインを含み、かつ前記第２タンパク質が転写活性化ドメインを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】  前記第２タンパク質が、ＤＮＡ結合ドメインまたは転写活性化ドメインのそれぞれと、前記第１のライブラリーにコードされるタンパク質の定常領域と相互作用するタンパク質とを含む、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】  前記第２のタンパク質がGAL4及びGal11Pの転写活性化ドメインを含み、及び、前記第２のタンパク質がGal4のＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項４ないし６記載の方法。
【請求項８】  前記宿主細胞が真核細胞であり、好ましくは酵母細胞である請求項１ないし７記載の方法。
【請求項９】  還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖを同定するための方法であって、
（ａ）請求項１ないし８記載の方法に従ってｓｃＦｖを単離すること、
（ｂ）工程（ａ）のｓｃＦｖのＤＮＡ配列の少なくとも１つのフレームワークコード領域の突然変異、および前記突然変異体の好適な発現ベクターへの導入により、種々のフレームワークおよび定常的なＣＤＲｓを含むｓｃＦｖライブラリーを産生すること、
（ｃ）特異的な既知の抗原を発現可能であり、かつ抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存する宿主細胞を前記ｓｃＦｖライブラリーで形質転換し、
（ｄ）前記形質転換した宿主細胞を、前記抗原および前記ｓｃＦｖを発現するのに好適な条件下で培養して、前記抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下においてのみ細胞を生存させること、
（ｅ）生存細胞内で発現され、また還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する前記ｓｃＦｖを単離すること
を含む方法。
【請求項１０】  前記宿主細胞が真核細胞である請求項９記載の方法。
【請求項１１】  前記宿主細胞が酵母細胞である請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】  還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖを単離するための方法であって、
（ａ）既知の抗原に対するｓｃＦｖのＤＮＡ配列の少なくとも１つのフレームワークコード領域の突然変異、および前記突然変異体の好適な発現ベクターへの導入により、種々のフレームワークおよび定常的なＣＤＲｓを含むｓｃＦｖライブラリーを産生し、
（ｂ）特異的な既知の抗原を発現可能であり、かつ抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存する宿主細胞を前記ｓｃＦｖライブラリーで形質転換し、
（ｃ）前記形質転換した宿主細胞を、前記抗原および前記ｓｃＦｖを発現するのに好適な条件下で培養して、前記抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下においてのみ細胞を生存させ、
（ｄ）生存細胞内で発現され、また還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する前記ｓｃＦｖを単離する方法。
【請求項１３】  前記宿主細胞が真核細胞である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】  前記宿主細胞が酵母細胞である請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】  請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の方法により得られる規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
【請求項１６】  少なくとも１つのＣＤＲの選択的な交換を可能にする制限酵素認識部位を含む請求項１５記載のｓｃＦｖ。
【請求項１７】  前記制限酵素認識部位がＣＤＲに隣接する前記フレームワーク内に位置する請求項１６に記載のｓｃＦｖ。
【請求項１８】  ＣＤＲ領域における選択的な変更に好適なフレームワークを含むｓｃＦｖをコードするＤＮＡの産生方法であって、特異的な制限酵素認識部位を、部位特異的変異誘発により、規定された安定性かつ可溶性であるｓｃＦｖをコードするＤＮＡの配列に導入する方法。
【請求項１９】  前記制限酵素認識部位がフレームワーク内に位置し、それによって前記制限酵素認識部位を発生させるための前記ヌクレオチドの置換がアミノ酸配列に影響しない請求項１８記載の方法。
【請求項２０】  還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを含むｓｃＦｖの産生方法であって、還元環境において安定性かつ可溶性である少なくとも２つの異なるフレームワーク、好ましくは請求項１５ないし１７のうちいずれか１項記載のフレームワークまたは請求項１２ないし１４のいずれか１項に従って単離されるフレームワークのうち少なくとも２つの変異体が、規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖを製造するために組み合わされる方法。
【請求項２１】  請求項２０の方法により得られる規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
【請求項２２】  前記変異が前記可変軽鎖のＣＤＲ１の上流に存在する請求項２１記載のｓｃＦｖ。
【請求項２３】  前記変異が前記可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する請求項２１記載のｓｃＦｖ。
【請求項２４】  少なくとも１つの変異がＣＤＲ１の上流に存在し、かつ少なくとも１つの変異が前記可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する請求項２１記載のｓｃＦｖ。
【請求項２５】  少なくとも２つの変異がＣＤＲ１の上流に存在し、かつ少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つの変異が前記可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する請求項２１記載のｓｃＦｖ。
【請求項２６】  ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １において規定されたフレームワークを含むｓｃＦｖ。
【請求項２７】  還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを含むＣＤＲライブラリーの産生方法であって、請求項１ないし２６のいずれか１項記載のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列が、配列当たり少なくとも１つのＣＤＲを修飾されたＣＤＲで置換するために消化される方法。
【請求項２８】  前記修飾されたＣＤＲが無作為な変更により産生される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】  少なくとも１つの無作為化されたＣＤＲおよび、還元環境下において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するイントラボディーのライブラリー。
【請求項３０】  特異的な抗原と相互作用するＣＤＲのスクリーニング方法であって、既知の抗原をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列で形質転換させた宿主細胞をさらに、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する無作為化したＣＤＲライブラリーで形質転換し、それによって抗原および／またはｓｃＦｖをマーカーシステムまたはマーカーシステムの一部に連結させ、したがって選択的な条件下において培養した細胞は抗原／ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存し、このように形質転換させた細胞を選択的な条件下において培養し、残存している細胞を培養してイントラボディーを収集する方法。
【請求項３１】  前記フレームワークが請求項１ないし３０のいずれか１項において規定されるようなフレームワークである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】  前記細胞が真核細胞、特に酵母細胞である請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３３】  前記抗原をコードするＤＮＡ配列および前記ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列がいずれも、生存許容マーカーに連結された転写活性化システムの一部にいずれも連結された、前記抗原またはｓｃＦｖをそれぞれ含むキメラ分子をコードする、請求項３０ないし３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】  前記抗原がＤＮＡ結合ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖが転写活性化ドメインに融合されるか、または前記抗原が転写活性化ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖがＤＮＡ結合ドメインに融合される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】  ｓｃＦｖと相互作用している抗原のスクリーニング方法であって、興味のある少なくとも１つの抗原を発現する宿主細胞を、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する少なくとも一つのｓｃＦｖ、または還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する無作為化されたＣＤＲライブラリーで形質転換し、それによって抗原および／またはｓｃＦｖをマーカーシステムまたはマーカーシステムの一部に連結させ、したがって選択的な条件下において培養した細胞は抗原／ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存し、このように形質転換させた細胞を選択的な条件下で培養し、残存している細胞を培養してｓｃＦｖを収集する方法。
【請求項３６】  前記フレームワークが請求項１ないし３５のいずれか１項において規定されるようなフレームワークである請求項３５記載の方法。
【請求項３７】  前記細胞が真核細胞、特に酵母細胞である請求項３５または３６記載の方法。
【請求項３８】  前記抗原をコードするＤＮＡ配列およびｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列が両者共に、いずれも生存許容マーカーに連結された転写活性化システムの一部に連結された抗原またはｓｃＦｖをそれぞれ含むキメラ分子をコードする、請求項３５ないし３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】  前記抗原がＤＮＡ結合ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖが転写活性化ドメインに融合されるか、または前記抗原が転写活性化ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖがＤＮＡ結合ドメインに融合される、請求項２７記載の方法。
【請求項４０】  治療または診断または予防用薬剤として規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
【請求項４１】  細胞内スクリーニングのための規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖの使用。
【請求項４２】  イントラボディーフレームワークまたはイントラボディーの同定方法であって、好適な宿主細胞をライブラリー及びマーカーシステムで形質転換し、これにより前記ライブラリーはイントラボディーライブラリーと前記マーカーシステムの少なくとも一部との融合産物であり、前記マーカーシステムは可溶性かつ安定性であるイントラボディーフレームワークをコードする融合タンパク質の存在下でのみ活性化され、可溶性で安定性であるイントラボディーフレームワークを発現する細胞の同定及び選択を可能にする条件下で前記細胞を培養する方法。
【請求項４３】  前記ライブラリーがイントラボディーライブラリーとマーカータンパク質の融合産物である請求項３１記載の方法。
【請求項４４】  前記ライブラリーがイントラボディーライブラリーと転写を活性化できるＤＮＡ結合タンパク質との融合産物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】  請求項４２記載の方法であって、前記好適な宿主細胞をイントラボディーおよび転写活性化システムの一部分を含むタンパク質をコードするライブラリーで形質転換し、かつ前記細胞はさらに、前記転写活性化システムの少なくとも第２の部分を含む第２のタンパク質を発現し、それによって前記転写活性化システムが生存許容マーカーに連結され、かつ前記細胞が、前記２つのタンパク質間の相互作用の存在下における選択的条件下においてのみ生存する方法。
【請求項４６】  前記ライブラリーにコードされるタンパク質が転写活性化ドメインを含み、かつ前記第２タンパク質がＤＮＡ結合ドメインを含むか、または前記ライブラリーにコードされるタンパク質がＤＮＡ結合ドメインを含み、かつ前記第２タンパク質が転写活性化ドメインを含む請求項４５記載の方法。
【請求項４７】  前記第２タンパク質が、ＤＮＡ結合ドメインまたは転写活性化ドメインのそれぞれと、前記第１のライブラリーにコードされるタンパク質の定常領域と相互作用するタンパク質とを含む、請求項４５または４６記載の方法。
【請求項４８】  特に請求項１２記載の方法において使用するための、請求項４２ないし４７のいずれか１項に記載の方法によって得られる規定されたフレームワークを含むｓｃＦｖ。