(57)【要約】  嫌気性細菌を用いるエタノール連続発酵において、不純物の多い基質においても、発酵液の基質濃度を低いレベルで一定に保ち、基質ロスが少ない連続培養装置を提供する。アルコール生産細菌を培養する発酵槽（１）と、発酵槽に基質液を供給する供給ポンプ（１２）と、発酵槽から排出される炭酸ガス流量値を検出する流量計（４）と、流量計の出力に基づき供給ポンプを制御する制御部（５）とを備え、制御部は、炭酸ガス流量値が所定範囲を下回ったとき、それをトリガとして供給手段に基質液を発酵槽へ供給させる。供給手段が基質液を供給する時間と、発酵槽に基質液を供給する時間当たりのレートとは、一定である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール生産細菌を培養する発酵槽と、
前記発酵槽に基質液を供給する供給手段と、
前記発酵槽から排出される炭酸ガス流量値又はその関数値を検出する計測器と、
前記計測器の出力に基づいて前記供給手段を制御する制御部とを備え、
前記制御部は、前記発酵槽から排出される炭酸ガス流量値が所定範囲を下回ったことを示すとき、それをトリガとして前記供給手段に基質液を前記発酵槽へ供給させることを特徴とするアルコール生産細菌の連続培養装置。
【請求項２】
前記供給手段が前記発酵槽に基質液を供給する時間と、前記供給手段が前記発酵槽に基質液を供給する時間当たりのレートとは、一定である請求の範囲第１項記載のアルコール生産細菌の連続培養装置。
【請求項３】
前記所定範囲は、炭酸ガス流量値の閾値により定められる請求の範囲第１項記載のアルコール生産細菌の連続培養装置。
【請求項４】
前記発酵槽から発酵液を引き抜く引抜手段をさらに備え、
前記制御部は、前記供給手段が前記発酵槽に基質液を供給する供給量にあわせた量の発酵液を前記引抜手段が前記発酵槽から引き抜くように、前記引抜手段を制御する請求の範囲第１項記載のアルコール生産細菌の連続培養装置。
【請求項５】
アルコール生産細菌を培養する発酵槽に、基質液を供給するとともに、前記基質液の供給量にあわせた量の発酵液を前記発酵槽から引き抜くアルコール生産細菌の連続培養方法であって、
前記発酵槽から排出される炭酸ガス流量値が所定範囲を下回るとき、それをトリガとして前記発酵槽に基質液を供給することを特徴とするアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項６】
前記発酵槽に基質液を供給する時間と、前記発酵槽に基質液を供給する時間当たりのレートとは、一定である請求の範囲第５項記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項７】
前記所定範囲は、炭酸ガス流量値の閾値により定められる請求の範囲第５項記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項８】
βラクタム系抗生物質を添加するステップをさらに含む請求の範囲第５項記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項９】
前記βラクタム系抗生物質は、ペニシリンである請求の範囲第８項記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項１０】
前記βラクタム系抗生物質は、前記発酵槽を含む連続培養装置の全部又は一部を洗浄する際に添加される請求の範囲第８項記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項１１】
前記βラクタム系抗生物質は、前記発酵槽を含む連続培養装置の運転中に添加される請求の範囲第８項記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール生産細菌（Zymomonas mobillis等の嫌気性菌及びアルコール発酵能が付与された大腸菌を含むが、酵母は除く。）の連続培養装置及びその方法に関する。更に詳しくは、本発明は、基質供給液を連続的もしくは断続的に発酵槽に供給するにあたり、排気としての炭酸ガスの流量変化を指標にして発酵内の基質の消費を予測し、発酵槽内の基質濃度が低濃度一定の値となるよう、基質液の供給と発酵液の引抜を制御する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵産業では、微生物による各種アミノ酸、有機酸、エタノール、アセトン・ブタノール、核酸関連物質等の発酵また微生物菌体そのものの生産（例えば、酵母菌体の生産）のために、微生物による発酵が利用される。そして、これら工業生産では、糖などの基質を主原料として、ほとんどすべて回分発酵法によって行われている。したがって、発酵そのもの以外に仕込み、装置の準備、種発酵、発酵が終わった後の後始末・洗浄を繰り返さなければならず、発酵槽の正味稼働時間は非常に短く、生産性が低い。【０００３】
この問題を解決するため、発酵槽を数基直列に並べて発酵生産を行うカスケード法が酵母を用いるエタノール発酵に用いられているが、これは抜本的な解決策とは言えない。また回分発酵では、発酵経過の監視のために、手作業によって頻繁な糖濃度分析などが必要で、このための人手確保も工場運転管理の負担となる。【０００４】
ところで、すべての発酵方法において、高濃度基質による阻害を防ぎ、基質を有効に利用し、発酵液の残糖濃度を可能な限り低く抑えて、基質ロスを少なくすることが必要である。又、発酵を終了した液からの生産物の分離を容易にし、廃液処理工程のコスト負担を可能な限り小さくするために、生産物分離工程への、菌の食べ残しの基質の流出を極小化する必要がある。【０００５】
残基質濃度を低く一定に制御して基質供給と発酵液の抜き出しを行い、長時間安定した連続発酵を行うことが可能であれば、発酵工程の装置生産性が飛躍的に向上する。またこのようなプロセスでは糖濃度管理のための分析作業をほとんど皆無にすることができるので、無駄な人手を省き、労賃を大幅低減できる上、夜間作業を皆無にすることができる。【０００６】
本発明者らは、特許文献１（特開２００３−２７４９３４号公報）において、Zymomonas mobillisなど嫌気性細菌を用いるエタノール連続発酵に関する方法を提案した。この方法は、菌の代謝にともなう発酵液のｐＨ変化量が基質消費量とエタノール生産量に対応するという原理を用いて連続発酵を可能にするものである。【０００７】
すなわち、発酵液ｐＨの変化を修正するため、アルカリ（アンモニア、苛性ソーダ、その他）添加量の積算値に対応する一定量の基質を供給し、それに対応する発酵液を引き抜き、発酵槽の発酵液量を一定に保ちながら連続発酵を行う。しかしながら、この方法をモラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料に適用しようとすると、ｐＨ変化量は必ずしも基質消費とは対応せず、この方法での連続発酵が困難になる場合があることがわかった。
【特許文献１】特開２００３−２７４９３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明は、Zymomonas mobillisなど嫌気性細菌を用いるエタノール連続発酵において、モラセスや食品廃棄物、食品工場廃液など安価であるが不純物の多い基質においても、正確に糖消費量と残糖濃度を予測し、発酵液の基質濃度を低いレベルで一定に保つことができ、基質ロスが少ないアルコール生産細菌の連続培養装置及びその関連技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題の解決を目指して鋭意研究の結果、モラセスなどの工業用原料を用いる嫌気性細菌によるエタノール連続発酵において、排気として発酵槽外に流出する炭酸ガス量の変化を正確に捉えれば発酵槽内の基質消費量を正確に把握できるという点に着目した。さらに、発酵液中の基質が枯渇するときに生ずる炭酸ガス発生の減少を炭酸ガス流量低下として検出し、これを指標として、制御部によって基質供給と発酵液の引き抜きを制御し、発酵槽の基質濃度を低い一定のレベルに保ちながら、長時間安定的に連続発酵が可能な連続培養方法を完成した。【００１０】
第１の発明に係るアルコール生産細菌の連続培養方法は、アルコール生産細菌を培養する発酵槽に、基質液を供給するとともに、基質液の供給量にあわせた量の発酵液を発酵槽から引き抜く方法であって、発酵槽から排出される炭酸ガス流量値が所定範囲を下回るとき、それをトリガとして発酵槽に基質液を供給する。【００１１】
この構成によれば、発酵槽内の基質がほとんど枯渇する状態で、基質液の供給と発酵液の引き抜きが実施されるので、細菌の食べ残しによる基質ロスはほとんど生じない。また、後述する実施例により明らかなように、モラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料を基質とする場合においても、発酵槽の基質濃度を低い一定のレベルに保ちながら、長時間安定に連続発酵できる。【００１２】
さらには、発酵槽に基質液を供給する時間と、発酵槽に基質液を供給する時間当たりのレートとは、一定であることが望ましい。【００１３】
即ち、１回の基質液の供給量は、供給開始直前の数時間前の基質消費速度を予め計算し、それに基づき添加された基質を微生物が食べ尽くして発酵槽内にほとんど残らないようにする供給レートと供給時間を与えるのが望ましい。【００１４】
所定範囲は、炭酸ガス流量値の閾値により定められることが望ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細菌の食べ残しによる基質ロスはほとんどなく、しかも、モラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料を基質とする場合においても、発酵槽の基質濃度を低い一定のレベルに保ちながら、長時間安定に連続発酵できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施の形態における連続培養装置のブロック図
【図２】本発明の一実施の形態における供給制御処理を示すフローチャート
【図３】本発明の一実施の形態における菌濃度、残糖、炭酸ガス流量値及び基質供給状態の変化を示すグラフ
【図４】本発明の一実施の形態における濁度、エタノール蓄積量、炭酸ガス流量値及び残糖の変化を示すグラフ
【図５】比較例１による培養結果を示すグラフ
【図６】本発明の実施例５による培養結果を示すグラフ
【図７】本発明の実施例６による培養結果を示すグラフ
【符号の説明】
【００１７】
１  発酵槽
２  攪拌機
３  泡トラップ
４  流量計
５  制御部
６  インターフェイス
７  ＣＰＵ
８  ＲＯＭ
９  濁度計
１０  ｐＨ計
１１  基質液槽
１２  基質液供給ポンプ
１３  中和剤槽
１４  中和剤供給ポンプ
１５  循環ポンプ
１６  クロスフローろ過器
１７  切替弁
１８  引抜ポンプ
１９  引抜液槽
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。まず、具体的構成の説明に先立ち、本形態の要点をまとめると次のとおりである。【００１９】
本形態は、資化可能なあらゆる発酵資源を基質液として用いることができるZymomonas mobillisなど嫌気性細菌のエタノール連続発酵法に関する。連続発酵の開始は、基質液を初回添加し、発酵初期に予め求めておいた供給レートで基質液を一定時間添加することによる。予め求めておいた供給レートは、菌株、培地組成、発酵条件を特定し、回分発酵による発酵試験によって、菌濃度と糖消費速度を測定し、その関係から求められる。それ以降の基質液の供給は、発酵槽内の基質が枯渇するときに生ずる炭酸ガス発生の減少をマスフローセンサーなどで検出し、細菌が基質飢餓状態にならないように実施され、発酵槽内の基質濃度は、常に低レベルの一定範囲内に保たれる。【００２０】
以上をふまえて、次に図１を参照しながら、本形態における連続培養装置について説明する。発酵槽１は、その内部でZymomonas mobillisなど嫌気性細菌を培養する。本形態の発酵槽１は、容積３リッターの小型の槽であり、圧力容器ではないため、内圧の制御を行うのは難しく実施していない。しかしながら、圧力容器である発酵槽を使用することもできるし、そのときは内圧の制御もあわせて実施するのが好ましい。発酵槽１内の温度は、所定値になるように管理されており、発酵槽１に設けられた攪拌器２により発酵槽１内の内容物は、一定の速度でゆっくりと撹拌される。【００２１】
発酵槽１からの排出管は、泡を除去する泡トラップ３を介して流量計４に接続される。流量計４は、発酵槽１から排出される炭酸ガスの流量値を計測し、例えば、マスフローセンサ、排気ガス流量計、圧力計等から構成される。流量計４が計測した炭酸ガス流量値は、制御部５のインターフェイス６へ出力される。勿論、炭酸ガスの流量値に一意に対応する他の物理量を計測してもよい。【００２２】
制御部５は、図１に示す連続培養装置全体を制御する。制御部５のインターフェイス６には、流量計４からの炭酸ガス流量値の他、発酵槽１の内部の濁度を計測する濁度計９（レーザ濁度計が望ましい）からの濁度値と、発酵槽１の内部のｐＨ値を計測するｐＨ計１０からのｐＨ値とが入力される。ＣＰＵ７は、制御部５の中核をなし、ＲＯＭ８に記憶されている制御プログラムを実行する。この制御プログラムには、図２のフローチャートに従う供給制御プログラムが含まれる。また、ＣＰＵ７は、適宜インターフェイス６を介し、基質液供給ポンプ１２、中和剤供給ポンプ１４、循環ポンプ１５、切替弁１７、引抜ポンプ１８に制御信号を出力し、これにより連続培養装置全体を制御する。【００２３】
基質液槽１１は、後記実施例に示すような基質液を貯蔵する。基質液供給ポンプ１２にインターフェイス６から基質供給信号が入力されると、所定のレートで所定の時間、基質液槽１１から基質液が発酵槽１内へ供給される。その結果、発酵槽１内の残糖量は上昇する。【００２４】
中和剤槽１３は、例えばアンモニア等の中和剤を貯蔵する。発酵槽１内で発酵が進行すると、細菌の増殖に伴い、発酵槽１内のｐＨが低下する。本形態では、ｐＨ値が常に４．５乃至６程度の一定値（条件により異なる）になるように、ＣＰＵ７は、中和剤供給ポンプ１４に中和剤供給信号を出力し、発酵槽１内のｐＨ値を制御する。【００２５】
発酵槽１には、インターフェイス６からの循環指示信号にしたがって、クロスフローろ過器１６に発酵槽１内の発酵液を引き抜いて圧送する循環ポンプ１５が接続されている。クロスフローろ過器１６は、引き抜かれた発酵液の一部を発酵槽１内へ戻すとともに、ろ液を切替弁１７の一方の入力ポートへ接続する。また、切替弁１７の他方の入力ポートには、発酵槽１内の発酵液が連通する。【００２６】
切替弁１７は、インターフェイス６からの切替信号にしたがって、一方／他方の入力ポートのいずれかを出力ポートへ接続する。引抜ポンプ１８は、インターフェイス６からの引抜指示信号にしたがい、切替弁１７の出力ポートからろ液／発酵液のいずれかを引抜液槽１９へ圧送する。これにより、引抜液槽１９には、エタノールを含む発酵液が取り出される。なお、クロスフローろ過器１６に替えて、遠心分離器により構成しても良い。【００２７】
次に、図２を参照しながら、制御部５による基質液の供給制御の各プロセスを説明する。このプロセスでは、制御部５が、発酵槽１から排出される炭酸ガス流量値が所定範囲を下回ったとき、それをトリガとして基質液供給ポンプ１２（供給手段）に基質供給信号を出力し、基質液を発酵槽１へ供給させる点が重要である。【００２８】
そして、循環ポンプ１５、クロスフローろ過器１６、切替弁１７及び引抜ポンプ１８は、発酵槽１から発酵液を引き抜く引抜手段に相当し、制御部５は、基質液供給ポンプ１２が発酵槽１に基質液を供給する供給量にあわせた量の発酵液をこの引抜手段が発酵槽１から引き抜くように、この引抜手段を制御する。なお、ＣＰＵ７は、濁度計９からの濁度値を参照し、発酵槽１内の発酵液菌濃度が低ければクロスフローろ過器１６からろ液を引き抜き（切替弁１７は図１の状態）、菌濃度が高ければ発酵槽１から（切替弁１７は図１とは反対の状態）発酵液を引き抜いて、発酵槽１内の発酵液菌濃度が一定に保たれる。【００２９】
図２、図３を参照しながら説明する。まず図２のステップ１に示すように、発酵槽１への種菌及び基質液の調整・投入が行われ、ステップ２にて、待ち時間Ｔ０、炭酸ガスの流量値閾値Ｔｈ、供給時間Ｔ１及び供給レートＲ１がセットされる。これらの所値は条件に応じて予め設定されており、必要に応じて適宜修正される。図３の時刻ｔ＝ｔ０において、発酵が開始される。【００３０】
供給レートＲ１は、発酵液の基質濃度が枯渇直前の低いレベルが維持できるように、予め求めておいた菌体濃度と糖消費速度との関係式によって与えられる値を設定し、ＲＯＭ８に格納しておく。【００３１】
発酵開始当初は、発酵槽１内において、菌濃度が低く（図３（ａ））、基質は豊富に存在する（図３（ｂ））。その後、アルコール生産細菌の特徴として、基質が残っていても増殖は停止する。そこで、菌濃度を増加させるために、培養液を循環し、ろ液を引き抜きその分の培地を補充しながら濃縮培養を行い、菌濃度を上昇させる。菌濃度が設定値に達したら、濁度制御を開始し連続発酵に入る。【００３２】
細菌の増殖が活発化するにつれ、細菌の濃度が上昇し、発酵槽１内の残糖量は低下する。また、発酵が進むと、炭酸ガスの流量値は上昇する（図３（ｃ））。この際、ＣＰＵ７は、待ち時間Ｔ０が経過したかチェックしており（ステップ３）、経過するまで基質供給を行わない。【００３３】
図３（ｃ）に示すように、時刻ｔ０における初回基質液添加終了後、待ち時間Ｔ０を経過すると、ＣＰＵ７は、ステップ４にて、炭酸ガスの流量値が閾値Ｔｈを下回ったかどうかチェックする。例えば、時刻ｔ＝ｔ０＋Ｔ０のとき、炭酸ガスの流量値は、閾値Ｔｈを上回っており、このときは、ＣＰＵ７は、ステップ８にて処理が終了すべきでないことを確認した上で、ステップ４へ処理を戻し、再度上記チェックを行う。【００３４】
時刻ｔ＝ｔ１において、発酵槽１内の基質が枯渇すると、炭酸ガスの発生量が急に減少し、閾値Ｔｈを下回る。これをトリガとして、ステップ４からステップ５へ処理が移る。即ち、ＣＰＵ７は、基質供給信号をインターフェイス６を介して基質液供給ポンプ１２へ出力し、基質液供給ポンプ１２は、基質液槽１１から基質液を供給レートＲ１にしたがって発酵槽１へ供給し始め（ステップ５）、所定時間Ｔ１だけこの状態が継続する（ステップ６）。その結果、図３（ｂ）に示すように、殆どゼロであった発酵槽１内の残糖量が増加に転じる。即ち、時刻ｔ＝ｔ１の時点で、基質供給を再開してやれば制限基質濃度に近い低い残基質濃度で運転を継続できる。【００３５】
さて、グルコースを基質とするエタノール発酵における炭酸ガス発生量と発酵との関係式は、周知のごとく以下の理論式で与えられる。【００３６】
Ｃ6Ｈ12Ｏ6→２Ｃ2Ｈ5ＯＨ＋２ＣＯ2          （１）
すなわち、グルコース１モルに対し２モルのエタノールを生成するとき２モルの炭酸ガスを発生するので、糖が枯渇してエタノール生成が停止すれば炭酸ガスの発生は起こらない。したがって炭酸ガス排出量の減少を指標にすることによって、基質の枯渇を信頼性高く検出することができる。【００３７】
この連続発酵の発酵系で菌濃度は濁度計９によって一定に制御されているが、実際に供給を行って、基質消費が制御部にインプットした予測値より早くなったり遅くなったりする場合もあるので、供給のタイミングは微妙に調整するのが好ましい。【００３８】
そして、時刻ｔ１から所定時間Ｔ１が経過したら、ＣＰＵ７は、基質液供給ポンプ１２に基質供給を停止せよとの信号を出力し（ステップ７）、基質液供給ポンプ１２は、基質の供給を停止する。そのため、図３（ｂ）に示すように、残糖量は、再び減少へ転じ、時刻ｔ２にて、再度炭酸ガスの流量値が閾値Ｔｈを下回る結果となる。【００３９】
以降、時刻ｔ２，ｔ３，ｔ４・・・において、同様の処理が繰り返される（ステップ３〜８）。【００４０】
かくして、第２回以降（時刻ｔ１以降）の基質供給は、発酵槽１内の基質が枯渇するときに生ずる炭酸ガス発生の急激な減少を流量計４が検出し、閾値Ｔｈに達したとき開始される。【００４１】
このようにして、微生物の発生する炭酸ガスを逐次チェックしながら糖などの基質を枯渇させることなく基質液を連続的に添加することが可能となり、発酵槽内基質濃度を容易に５ｇ／リッター以下の低レベルに抑えることが可能となる。モラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料を基質としｐＨ変化量に依存したのでは連続発酵が困難になりうる場合においても、この点は妥当するため、従来技術よりもより広汎で材料費が低廉な発酵を行える。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。勿論、以下の実施例により本発明が限定されるわけではない。【００４３】
（実施例１）
種菌は、ＹＭブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）を培地とし、規定濃度に調整後、試験管に１０ミリリッターを分注し１１５℃で１０分間加熱滅菌したもので調製した。これにZymomonas mobillis  ＮＲＲＬ  Ｂ−１４０２３を接種し、３０℃にて１８時間静置発酵したものを用いた。【００４４】
主発酵は、ブラジル産モラセスを水道水で５．３倍に希釈し、１２０℃、１０分間オートクレーブ滅菌したものを用いた。この培地２リッターを予め滅菌した小型の（容積３リッター）発酵槽に入れ、先に述べたように調製した種発酵液１００ミリリッターを添加し、温度３０℃、攪拌１００ｒｐｍにて発酵を開始した。菌増殖とともに発酵液ｐＨが低下するので、ｐＨ計によってオンラインでｐＨをモニターしながら１Ｎアンモニア水によってｐＨを５．５に保つようにした。【００４５】
発酵開始後１５時間で菌増殖が頭打ちとなったので、発酵液の循環濃縮を行い、菌濃度を上昇させた。発酵槽外に設置したクロスフローろ過器（日本ポール製、０．４５ｍμ，０．１ｍ2カートリッジ）に発酵液を循環し、ろ液を発酵槽外に抜き出して発酵開始時と同じ培地を補充して発酵槽液量を一定に維持しながら菌濃度の上昇を図った。【００４６】
このようにして、発酵開始約２４時間で菌濃度約４ｇ／リッターに達した。以後連続発酵の全時間２５５時間にわたりレーザー濁度計（ＡＳＲ社製Ｍｏｄｅｌ  ＬＡ−３０１型）によって、図４に示すように、菌濃度は４．０±０．２ｇ／リッターに制御できた。菌濃度が一定となったところで、グルコース／スクロース  アナライザーによって発酵液中の残基質濃度を測定したところ、グルコース／スクロース合計として１０ｇ／リッターであったので、発酵開始時と同じブラジル産モラセスを水道水で５．７倍に希釈し、１２０℃、１０分間オートクレーブ滅菌したものを基質液として９５０ｇ／ｈの供給レートで４時間連続供給した。【００４７】
４時間の供給を行った後供給を停止したところ、細菌は発酵液中に残っていたわずかな基質をたちまち食べ尽くし、供給停止後約１５分で排気炭酸ガスの急激な低下が認められた。排気炭酸ガスの発生量が設定値の０．０８リッター／ｍｉｎに達したとき、基質が枯渇したものと判断し供給を再開した。実際炭酸ガス発生が設定下限に達したときの残糖濃度はアナライザーによればほとんど０ｇ／リッターである。この操作は制御プログラムによって自動的に行われる。【００４８】
以後１，０００ｇ／ｈの供給レートで４時間の供給を行い、一時供給を停止して排気炭酸ガスの急激な減少を確認し、排気炭酸ガス流量が閾値に達したとき供給を再開するプログラムを働かせて連続運転を行った。供給を停止した後炭酸ガス発生の急激な減少が起こるまでの時間によって、供給中の発酵液残糖濃度を推測することができる。この時間の長さから、残糖濃度が高いと判断したときは供給レートを少し小さく、逆ならば速度を大きくして微調整を行う。【００４９】
ただし、ここで基質供給の設定値は、発酵の方式や基質の種類などの発酵条件、使用菌株の性能などにより異なる場合もある。又、本実施例では毎回の基質液の添加時間を４時間にしたが、前述のごとく、菌の活性が大きく変らない時間内であれば、この添加時間を一定にする必要はなく時間ロスを少なくするために徐々に長く取った方が望ましい。【００５０】
図４において、この発酵の経過を濁度制御の状態（上段）、マスフローセンサーによる排気炭酸ガスの発生（下段）を示し、発酵槽内エタノール濃度、発酵槽内残糖濃度を併せて示す。上述した供給プログラムにより安定した連続運転が２５５時間継続した。この間、供給中の発酵液残糖濃度はにグルコース／スゥロース合量として約１０．０±５ｇ／リッターに維持された。また、発酵液の平均エタノール濃度は約６８ｇ／リッターであった。正味連続運転２３０時間でエタノール６８ｇ／リッターを含む発酵液２２０リッターを得た。【００５１】
（実施例２）
シード（種）に用いた菌、培地、発酵法、発酵条件、及び主発酵に用いた装置は、実施例１と同一である。【００５２】
主発酵培地及び基質液はコーンスターチ糖化液にＣＳＬ（コーン・スティープ・リカー）を添加したものを用いた。【００５３】
コーンスターチ２００ｇ／リッターを水に懸濁しスラリーとした後、攪拌しながらｐＨを６．０に調整し、Ｔｅｒｍａｍｙｌ  １２０Ｌ（Ｎｏｖｏ）０．５μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加えｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ上で９０℃，１ｈ液化処理を行う。これを冷却後ｐＨを４．５に調整し、Ｄｅｘｔｒｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏ）０．６μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加え恒温槽内で６０℃，２４ｈ糖化処理を行った。その結果グルコース濃度１７８ｇ／リッターの糖液を得た。【００５４】
これを水にてグルコース濃度１３０ｇ／リッターとなるよう希釈し、予め遠心分離によって固形分を除いたＣＳＬ（サンエイ糖化ＫＫ）５ｇ／リッターを加え、ｐＨ調整後オートクレーブ滅菌処理したものを培地・基質液として用いた。【００５５】
発酵の手順及び制御プログラムは実施例１と全く同じである。【００５６】
供給レートは９５０ｇ／ｈ、１回の供給継続時間は実施例１と同じ４ｈ、排気炭酸ガスの閾値は実施例１と同じ０．０８リッター／ｍｉｎである。【００５７】
発酵は安定して長時間継続し、２００ｈの連続運転で５８ｇ／リッターのエタノールを含む発酵液１８０リッターを得た。【００５８】
（実施例３）
シード（種）に用いた菌、培地、発酵法、発酵条件、及び主発酵に用いた装置は、実施例１と同一である。【００５９】
主発酵培地及び基質液はキャッサバデンプン糖化液にモラセスを添加したものを用いた。【００６０】
キャッサバデンプン（タイ国産）２００ｇ／リッターを水に懸濁しスラリーとした後、攪拌しながらｐＨを６．０に調整し、Ｔｅｒｍａｍｙｌ  １２０Ｌ（Ｎｏｖｏ）０．５μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加えｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ上で９０℃，１ｈ液化処理を行う。これを冷却後ｐＨを４．５に調整し、Ｄｅｘｔｒｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏ）０．６μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加え恒温槽内で６０℃，２４ｈ糖化処理を行った。その結果グルコース濃度１７５ｇ／リッターの糖液を得た。これを水にてグルコース濃度１３０ｇ／リッターとなるよう希釈し、実施例１において用いたモラセス５．７．倍希釈液を１：１に混合し、ｐＨ調整後オートクレーブ滅菌処理したものを培地・基質液として用いた。【００６１】
発酵の手順及び制御プログラムは実施例１と全く同じである。【００６２】
供給レートは１，０００ｇ／ｈ、１回の供給継続時間は実施例１と同じ４ｈ、排気炭酸ガスの閾値は実施例１と同じ０．０８リッター／ｍｉｎである。【００６３】
発酵は安定して長時間継続し、２００ｈの連続運転で５８ｇ／リッターのエタノールを含む発酵液１７５リッターを得た。【００６４】
（実施例４）
シード（種）に用いた菌、培地、発酵法、発酵条件、及び主発酵に用いた装置は、実施例１と同一である。【００６５】
主発酵培地及び基質液は生ゴミを原料とする発酵想定したモデル生ゴミ糖化液である。【００６６】
ご飯（白米）２５０ｇ、キャベツ５９ｇ、ゆでたにんじん５０ｇ、バナナ（可食部）５０ｇ、サシミ５０ｇ、を適量の水を加えてジューサーミキサーで粉砕ジュース化した後、全量１リッターの水を加えて希釈する。攪拌しながらｐＨを４．５に調整し、Ｄｅｘｔｒｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏ）０．６μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加え恒温槽内で６０℃，２４ｈ糖化処理を行った。糖化後のグルコース濃度８５ｇ／リッターの糖液を得た。これをそのままオートクレーブ滅菌処理して、培地・基質液として用いた。【００６７】
発酵の手順及び制御プログラムは実施例１と全く同じである。【００６８】
供給レートは１，２００ｇ／ｈ、１回の供給継続時間は実施例１と同じ４ｈ、排気炭酸ガスの閾値は実施例１と同じ０．０８リッター／ｍｉｎである。【００６９】
発酵は安定して長時間継続し、１５０ｈの連続運転で４１ｇ／リッターのエタノールを含む発酵液１５０リッターを得た。【００７０】
以上の実施例により、モラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料を基質とする場合においても、発酵槽の基質濃度を低い一定のレベルに保ちながら、長時間安定に連続発酵できる点は明らかであり、本発明は従来技術に比べ顕著な利点がある。【００７１】
以下、βラクタム系抗生物質に関する比較例１及び実施例５、６を説明する。実施例５、６に共通する事項は次のとおりである。【００７２】
Zymomonas mobilisを用いるエタノール発酵を連続させエタノール生産を行うにあたり、最初に発酵槽に仕込む培地を加熱蒸気殺菌した後冷却し、初発培地とする。また、滅菌した冷水にペニシリンＧカリウムを溶解させたものを、初発培地に最終濃度５−２０ＩＵ／ミリリッターになるように添加し、種菌（シード）を加えて発酵開始する。【００７３】
実施例１と同様に、回分培養で菌濃度を上昇させ、菌濃縮を行って細胞濃度を目標値まで上昇させる。細胞濃度が目標に達したら初発培地同様の手順でペニシリンＧカリウムを溶解し、最終濃度５−２０ＩＵ／ミリリッターになるように添加した基質液を連続的に添加して連続発酵を行う。【００７４】
また、菌濃縮に用いるクロスフローろ過器１６についても、ペニシリンＧカリウムを最終濃度５−２０ＩＵ／ミリリッターとなるように添加して温度３０℃で２時間インキュベートし、クロスフローろ過器１６の膜内や配管細部に残存するコンタミ菌を死滅させる。【００７５】
これらの点が、実施例１から４までと、実施例５，６との相違点である。以下、実施例５、６により詳細に説明するように、これらの処置により、Zymomonas mobilisによるエタノール連続発酵は、３５０時間の長期に亘り全くコンタミ菌の侵入・増殖を受けることなく、常時最大速度でエタノールを発酵生産できた。もちろんこの方法はZymomonas mobilisに限らずアルコール発酵能の付与された遺伝子組み換え大腸菌を用いる発酵においても有効である。【００７６】
ここで、抗生物質は、ペニシリンに限定されるものではなく、アンピシリンを初めグラム陽性細菌に有効な全てのβラクタム系抗生物質を用いても同様の効果を得ることが出来る。【００７７】
次に、実施例５、６に先立ち、比較例１を説明する。【００７８】
（比較例１）
種菌はＹＭブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）を培地とし、規定濃度に調整後、試験管に１０ミリリッターを分注し１１５℃で１０分間加熱滅菌したもので調製した。これにZymomonas mobilis  ＮＲＲＬ  Ｂ−１４０２３を接種し、３０℃にて１８時間静置発酵したものを用いた。【００７９】
主発酵は、結晶ブドウ糖１４０ｇ／リッター，酵母エキス５ｇ／リッター，味液（大豆フレーク酸加水分解液）０．５ｖｏｌ％からなる組成の培地を、ｐＨ５．５に調整し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌したものを用いた。この培地２リッターを予め滅菌した３リッター容小型発酵槽に入れ、先に述べたように調製した種発酵液１００ミリリッターを添加し、温度３０℃、攪拌１００ｒｐｍにて発酵を開始した。菌増殖とともに発酵液ｐＨが低下するので、ｐＨ計１０によってｐＨをモニターしながら１Ｎアンモニア水によってｐＨを５．５に保つようにした。【００８０】
図５は、比較例１における発酵過程を示すグラフである。シード後、回分培養によって菌増殖が開始され、細胞濃度が１ｇ／リッターを超えた時点でクロスフローろ過器による菌濃縮を開始し、基質液によって基質を追加すると共に除菌液の培養系からの抜き出しを行い、細胞濃度の上昇を行った。【００８１】
培養開始約４０時間で細胞濃度が約５ｇ／リッターの目標値に達したので、図１のシステムを用いて連続発酵モードに入った。図５に示されているように、培養開始後８０時間（連続発酵に入って４０時間）までは、菌濃度はほぼ６ｇ／リッターを維持し、エタノール濃度も漸減ではあるものの６０ｇ／リッター以上を維持できており、炭酸ガス発生量も減少傾向にはあるものの２５０ミリリッター／ｍｉｎ（約１０ｍｍｏｌ／ｍｉｎ）程度であり、エタノール生産速度は約３０ｇ／ｈ程度を維持できている。【００８２】
しかしながら、連続発酵開始４０時間目以降、急激に炭酸ガスの発生速度が低下し、エタノール濃度も急落し、アンモニア消費速度が急上昇する異常発酵となっている。培養１２０時間目に至り、発酵は全く制御不可能となったために、培養を打ち切った。これは培養４０時間（連続発酵開始とほとんど同時に）乳酸菌がコンタミし、これが８０時間目以降急激に増殖したためであると考えられる。因みに、実際培養１００時間目の培養液を寒天プレート培地で培養したところ、多数の乳酸菌のコロニーが確認された。【００８３】
（実施例５）
種菌はＹＭブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）を培地とし、規定濃度に調整後、試験管に１０ミリリッターを分注し、１１５℃で１０分間加熱滅菌したもので調製した。これにZymomonas mobilis  ＮＲＲＬ  Ｂ−１４０２３を接種し、３０℃にて１８時間静置発酵したものを用いた。【００８４】
主発酵は、結晶ブドウ糖１４０ｇ／リッター，酵母エキス５ｇ／リッター，味液（大豆フレーク酸加水分解液）０．５ｖｏｌ％からなる組成の培地をｐＨ５．５．に調整し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌したものである。培養に用いた初発培地・菌の濃縮に用いた基質液・連続発酵基質液はすべて熱殺菌したものを冷却しそこに最終濃度５ＩＵ／ミリリッターになるようにペニシリンＧカリウムを加えたものを用いた。【００８５】
この培地２リッターを予め滅菌した３リッター容小型発酵槽に入れ、先に述べたように調製した種発酵液１００ミリリッターを添加し、温度３０℃、攪拌１００ｒｐｍにて発酵を開始した。菌増殖とともに発酵液ｐＨが低下するのでｐＨ計１０によってｐＨをモニターしながら１Ｎアンモニア水によってｐＨを５．５に保つようにした。【００８６】
システムは、実施例１に係る図１に示したものと同じである。比較例１でのべたように過去の培養においてコンタミネーションの被害が発生したので、ろ過器１６の内部等にコンタミ菌が残留している可能性がある。このため、培養に先立ち残存するコンタミ菌を徹底的に駆除すべく、先にコンタミした培養に用いたフィルターカートリッジを、発酵終了後完全に分解洗浄し、アルカリ液に数日浸漬し、徹底的に滅菌した。しかる後、ペニシリン洗浄によって残存コンタミ菌の撲滅を試みた。すなわち、図１のシステムの隅々まで、ペニシリンにより洗浄し、また上述のように、ペニシリン洗浄したフィルターカートリッジを、発酵槽１に取り付け、菌濃縮循環に使用した。【００８７】
図６は、培養結果を示す。シード後、回分培養によって菌増殖が開始され、細胞濃度が１ｇ／リッターを超えた時点でクロスフローろ過器１６による菌濃縮を開始し、ペニシリンＧカリウムを最終濃度５ＩＵ／ミリリッターを添加した基質液を供給して基質を追加する。また、除菌液の培養系からの抜き出しを行い、細胞濃度の上昇を行った。【００８８】
培養開始約３０時間で細胞濃度が約５ｇ／リッターの目標値に達したので、図１のシステムを用いて連続発酵モードに入った。【００８９】
連続発酵の基質液は、三温糖１４０ｇ／リッター，酵母エキス（ＹＥ）５ｇ／リッター，味液５ミリリッター／リッターをｐＨ５．５に調整後１２０℃２０分オートクレーブ滅菌後冷却し、ペニシリンＧカリウムを５ＩＵ／ミリリッターになるように添加したものとした。【００９０】
図６は、実施例５による連続発酵の結果を示す。１５０時間の長期にわたり全くコンタミネーションに犯されることなく終始健全な発酵でエタノールを連続生産できた。全ての連続運転期間中菌濃度は５±０．５ｇ／リッターに維持され、ＣＯ２発生量は３５０ミリリッター／ｍｉｎ（約１５ｍｍｏｌ／ｍｉｎ）程度、エタノール生産速度は約４２ｇ／ｈ程度であり、高い生産速度を維持できた。基質液の供給速度と培養液の引き抜き速度は、図６に示すように安定しており、培養中変化なく、連続発酵が定常状態を維持し長時間連続運転できた。培養液のエタノール濃度は、全期間に亘り６５±５ｇ／リッター（約８．２％）であった。このようにろ過器１６のペニシリン洗浄と培地へのペニシリン添加の効果は顕著であり、エタノール連続発酵を長時間にわたりコンタミネーションの被害を受けず実施することが可能となった。【００９１】
（実施例６）
シード（種）に用いた菌、培地、発酵法、発酵条件は実施例５と同一である。【００９２】
初発培地・菌濃縮時基質液・連続発酵基質液は同一組成、同じ調整法によった。すなわち、糖液はコーンスターチ酵素糖化液を水で希釈し、これにＣＳＬ（コーン・スティープ・リカー）５ミリリッター／リッターの濃度に添加して、ｐＨ５．５とした後、糖濃度１４０ｇ／リッターに最終調整し、１２０℃２０分オートクレーブ滅菌した。殺菌後冷却し、培地が十分冷えたところでペニシリンＧカリウムを５ＩＵ／ミリリッターになるように添加して培養に用いた。クロスフローろ過器１６のペニシリン洗浄・コンタミ菌除去の要領は、実施例５と同一である。【００９３】
図７は、実施例６による培養結果を示す。システムは、実施例１と同一である。シード後、回分培養によって菌増殖が開始され、細胞濃度が１ｇ／リッターを超えた時点でクロスフローろ過器による菌濃縮を開始し、ペニシリンＧカリウムを最終濃度５ＩＵ／ミリリッターを添加した基質液を供給して基質を追加する。また、除菌液の培養系からの抜き出しを行い、細胞濃度を上昇させた。【００９４】
培養開始約２７時間で細胞濃度が約６ｇ／リッターの目標値に達したので、図１のシステムを用いて連続発酵モードに入った。連続発酵の基質液は、前述のコーンスターチ酵素糖化液（糖濃度１４０ｇ／リッター）−ＣＳＬ（コーン・スティープ・リカー）５ミリリッター／リッターをｐＨ５．５に調整後、１２０℃２０分オートクレーブ滅菌後冷却し、ペニシリンＧカリウムを５ＩＵ／ミリリッターになるように添加したものである。【００９５】
図７に示すように、全３５０時間の長期にわたり全くコンタミネーションに犯されることなく終始健全な発酵でエタノールを連続生産できた。全ての連続運転期間中菌濃度は６±０．５ｇ／リッターに維持され、炭酸ガス発生量は５００ミリリッター／ｍｉｎ（約２１ｍｍｏｌ／ｍｉｎ）、エタノール生産速度は約５８ｇ／ｈであり、高い生産速度を全培養時間にわたって維持できた。【００９６】
基質液の供給速度と培養液の引き抜き速度は、図７下段に示すように安定しており、培養中変化なく、連続発酵が定常状態を維持し長時間連続運転できた。培養液のエタノール濃度は、全期間に亘り６５±５ｇ／リッター（約８．２％）であった。このようにろ過器１６のペニシリン洗浄と培地へのペニシリン添加の効果は顕著で、エタノール連続発酵を長時間にわたりコンタミネーションの被害を受けず実施できた。
【図１】
2007032265.tif 000002
【図２】
2007032265.tif 000003
【図３】
2007032265.tif 000004
【図４】
2007032265.tif 000005
【図５】
2007032265.tif 000006
【図６】
2007032265.tif 000007
【図７】
2007032265.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月6日(2008.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール生産細菌を培養する発酵槽と、
前記発酵槽に基質液を供給する供給手段と、
前記発酵槽から排出される炭酸ガス流量値又はその関数値を検出する計測器と、
前記計測器の出力に基づいて前記供給手段を制御する制御部とを備え、
前記制御部は、前記発酵槽から排出される炭酸ガス流量値が所定範囲を下回ったことを示すとき、それをトリガとして前記供給手段に基質液を前記発酵槽へ供給させることを特徴とするアルコール生産細菌の連続培養装置。
【請求項２】
前記供給手段が前記発酵槽に基質液を供給する時間と、前記供給手段が前記発酵槽に基質液を供給する時間当たりのレートとは、一定である請求項１記載のアルコール生産細菌の連続培養装置。
【請求項３】
前記所定範囲は、炭酸ガス流量値の閾値により定められる請求項１記載のアルコール生産細菌の連続培養装置。
【請求項４】
前記発酵槽から発酵液を引き抜く引抜手段をさらに備え、
前記制御部は、前記供給手段が前記発酵槽に基質液を供給する供給量にあわせた量の発酵液を前記引抜手段が前記発酵槽から引き抜くように、前記引抜手段を制御する請求項１記載のアルコール生産細菌の連続培養装置。
【請求項５】
アルコール生産細菌を培養する発酵槽に、基質液を供給するとともに、前記基質液の供給量にあわせた量の発酵液を前記発酵槽から引き抜くアルコール生産細菌の連続培養方法であって、
前記発酵槽から排出される炭酸ガス流量値が所定範囲を下回るとき、それをトリガとして前記発酵槽に基質液を供給することを特徴とするアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項６】
前記発酵槽に基質液を供給する時間と、前記発酵槽に基質液を供給する時間当たりのレートとは、一定である請求項５記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項７】
前記所定範囲は、炭酸ガス流量値の閾値により定められる請求項５記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項８】
βラクタム系抗生物質を添加するステップをさらに含む請求項５記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項９】
前記βラクタム系抗生物質は、ペニシリンである請求項８記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項１０】
前記βラクタム系抗生物質は、前記発酵槽を含む連続培養装置の全部又は一部を洗浄する際に添加される請求項８記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【請求項１１】
前記βラクタム系抗生物質は、前記発酵槽を含む連続培養装置の運転中に添加される請求項８記載のアルコール生産細菌の連続培養方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール生産細菌（Zymomonas mobillis等の嫌気性菌及びアルコール発酵能が付与された大腸菌を含む。）の連続培養装置及びその方法に関する。更に詳しくは、本発明は、基質供給液を連続的もしくは断続的に発酵槽に供給するにあたり、排気としての炭酸ガスの流量変化を指標にして発酵内の基質の消費を予測し、発酵槽内の基質濃度が低濃度一定の値となるよう、基質液の供給と発酵液の引抜を制御する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵産業では、微生物による各種アミノ酸、有機酸、エタノール、アセトン・ブタノール、核酸関連物質等の発酵また微生物菌体そのものの生産（例えば、酵母菌体の生産）のために、微生物による発酵が利用される。そして、これら工業生産では、糖などの基質を主原料として、ほとんどすべて回分発酵法によって行われている。したがって、発酵そのもの以外に仕込み、装置の準備、種発酵、発酵が終わった後の後始末・洗浄を繰り返さなければならず、発酵槽の正味稼働時間は非常に短く、生産性が低い。
【０００３】
この問題を解決するため、発酵槽を数基直列に並べて発酵生産を行うカスケード法が酵母を用いるエタノール発酵に用いられているが、これは抜本的な解決策とは言えない。また回分発酵では、発酵経過の監視のために、手作業によって頻繁な糖濃度分析などが必要で、このための人手確保も工場運転管理の負担となる。
【０００４】
ところで、すべての発酵方法において、高濃度基質による阻害を防ぎ、基質を有効に利用し、発酵液の残糖濃度を可能な限り低く抑えて、基質ロスを少なくすることが必要である。又、発酵を終了した液からの生産物の分離を容易にし、廃液処理工程のコスト負担を可能な限り小さくするために、生産物分離工程への、菌の食べ残しの基質の流出を極小化する必要がある。
【０００５】
残基質濃度を低く一定に制御して基質供給と発酵液の抜き出しを行い、長時間安定した連続発酵を行うことが可能であれば、発酵工程の装置生産性が飛躍的に向上する。またこのようなプロセスでは糖濃度管理のための分析作業をほとんど皆無にすることができるので、無駄な人手を省き、労賃を大幅低減できる上、夜間作業を皆無にすることができる。
【０００６】
本発明者らは、特許文献１（特開２００３−２７４９３４号公報）において、Zymomonas mobillisなど嫌気性細菌を用いるエタノール連続発酵に関する方法を提案した。この方法は、菌の代謝にともなう発酵液のｐＨ変化量が基質消費量とエタノール生産量に対応するという原理を用いて連続発酵を可能にするものである。
【０００７】
すなわち、発酵液ｐＨの変化を修正するため、アルカリ（アンモニア、苛性ソーダ、その他）添加量の積算値に対応する一定量の基質を供給し、それに対応する発酵液を引き抜き、発酵槽の発酵液量を一定に保ちながら連続発酵を行う。しかしながら、この方法をモラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料に適用しようとすると、ｐＨ変化量は必ずしも基質消費とは対応せず、この方法での連続発酵が困難になる場合があることがわかった。
【特許文献１】特開２００３−２７４９３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明は、Zymomonas mobillisなど嫌気性細菌を用いるエタノール連続発酵において、モラセスや食品廃棄物、食品工場廃液など安価であるが不純物の多い基質においても、正確に糖消費量と残糖濃度を予測し、発酵液の基質濃度を低いレベルで一定に保つことができ、基質ロスが少ないアルコール生産細菌の連続培養装置及びその関連技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題の解決を目指して鋭意研究の結果、モラセスなどの工業用原料を用いる嫌気性細菌によるエタノール連続発酵において、排気として発酵槽外に流出する炭酸ガス量の変化を正確に捉えれば発酵槽内の基質消費量を正確に把握できるという点に着目した。さらに、発酵液中の基質が枯渇するときに生ずる炭酸ガス発生の減少を炭酸ガス流量低下として検出し、これを指標として、制御部によって基質供給と発酵液の引き抜きを制御し、発酵槽の基質濃度を低い一定のレベルに保ちながら、長時間安定的に連続発酵が可能な連続培養方法を完成した。
【００１０】
第１の発明に係るアルコール生産細菌の連続培養方法は、アルコール生産細菌を培養する発酵槽に、基質液を供給するとともに、基質液の供給量にあわせた量の発酵液を発酵槽から引き抜く方法であって、発酵槽から排出される炭酸ガス流量値が所定範囲を下回るとき、それをトリガとして発酵槽に基質液を供給する。
【００１１】
この構成によれば、発酵槽内の基質がほとんど枯渇する状態で、基質液の供給と発酵液の引き抜きが実施されるので、細菌の食べ残しによる基質ロスはほとんど生じない。また、後述する実施例により明らかなように、モラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料を基質とする場合においても、発酵槽の基質濃度を低い一定のレベルに保ちながら、長時間安定に連続発酵できる。
【００１２】
さらには、発酵槽に基質液を供給する時間と、発酵槽に基質液を供給する時間当たりのレートとは、一定であることが望ましい。
【００１３】
即ち、１回の基質液の供給量は、供給開始直前の数時間前の基質消費速度を予め計算し、それに基づき添加された基質を微生物が食べ尽くして発酵槽内にほとんど残らないようにする供給レートと供給時間を与えるのが望ましい。
【００１４】
所定範囲は、炭酸ガス流量値の閾値により定められることが望ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細菌の食べ残しによる基質ロスはほとんどなく、しかも、モラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料を基質とする場合においても、発酵槽の基質濃度を低い一定のレベルに保ちながら、長時間安定に連続発酵できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施の形態における連続培養装置のブロック図
【図２】本発明の一実施の形態における供給制御処理を示すフローチャート
【図３】本発明の一実施の形態における菌濃度、残糖、炭酸ガス流量値及び基質供給状態の変化を示すグラフ
【図４】本発明の一実施の形態における濁度、エタノール蓄積量、炭酸ガス流量値及び残糖の変化を示すグラフ
【図５】比較例１による培養結果を示すグラフ
【図６】本発明の実施例５による培養結果を示すグラフ
【図７】本発明の実施例６による培養結果を示すグラフ
【符号の説明】
【００１７】
１  発酵槽
２  攪拌機
３  泡トラップ
４  流量計
５  制御部
６  インターフェイス
７  ＣＰＵ
８  ＲＯＭ
９  濁度計
１０  ｐＨ計
１１  基質液槽
１２  基質液供給ポンプ
１３  中和剤槽
１４  中和剤供給ポンプ
１５  循環ポンプ
１６  クロスフローろ過器
１７  切替弁
１８  引抜ポンプ
１９  引抜液槽
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。まず、具体的構成の説明に先立ち、本形態の要点をまとめると次のとおりである。
【００１９】
本形態は、資化可能なあらゆる発酵資源を基質液として用いることができるZymomonas mobillisなど嫌気性細菌のエタノール連続発酵法に関する。連続発酵の開始は、基質液を初回添加し、発酵初期に予め求めておいた供給レートで基質液を一定時間添加することによる。予め求めておいた供給レートは、菌株、培地組成、発酵条件を特定し、回分発酵による発酵試験によって、菌濃度と糖消費速度を測定し、その関係から求められる。それ以降の基質液の供給は、発酵槽内の基質が枯渇するときに生ずる炭酸ガス発生の減少をマスフローセンサーなどで検出し、細菌が基質飢餓状態にならないように実施され、発酵槽内の基質濃度は、常に低レベルの一定範囲内に保たれる。
【００２０】
以上をふまえて、次に図１を参照しながら、本形態における連続培養装置について説明する。発酵槽１は、その内部でZymomonas mobillisなど嫌気性細菌を培養する。本形態の発酵槽１は、容積３リッターの小型の槽であり、圧力容器ではないため、内圧の制御を行うのは難しく実施していない。しかしながら、圧力容器である発酵槽を使用することもできるし、そのときは内圧の制御もあわせて実施するのが好ましい。発酵槽１内の温度は、所定値になるように管理されており、発酵槽１に設けられた攪拌器２により発酵槽１内の内容物は、一定の速度でゆっくりと撹拌される。
【００２１】
発酵槽１からの排出管は、泡を除去する泡トラップ３を介して流量計４に接続される。流量計４は、発酵槽１から排出される炭酸ガスの流量値を計測し、例えば、マスフローセンサ、排気ガス流量計、圧力計等から構成される。流量計４が計測した炭酸ガス流量値は、制御部５のインターフェイス６へ出力される。勿論、炭酸ガスの流量値に一意に対応する他の物理量を計測してもよい。
【００２２】
制御部５は、図１に示す連続培養装置全体を制御する。制御部５のインターフェイス６には、流量計４からの炭酸ガス流量値の他、発酵槽１の内部の濁度を計測する濁度計９（レーザ濁度計が望ましい）からの濁度値と、発酵槽１の内部のｐＨ値を計測するｐＨ計１０からのｐＨ値とが入力される。ＣＰＵ７は、制御部５の中核をなし、ＲＯＭ８に記憶されている制御プログラムを実行する。この制御プログラムには、図２のフローチャートに従う供給制御プログラムが含まれる。また、ＣＰＵ７は、適宜インターフェイス６を介し、基質液供給ポンプ１２、中和剤供給ポンプ１４、循環ポンプ１５、切替弁１７、引抜ポンプ１８に制御信号を出力し、これにより連続培養装置全体を制御する。
【００２３】
基質液槽１１は、後記実施例に示すような基質液を貯蔵する。基質液供給ポンプ１２にインターフェイス６から基質供給信号が入力されると、所定のレートで所定の時間、基質液槽１１から基質液が発酵槽１内へ供給される。その結果、発酵槽１内の残糖量は上昇する。
【００２４】
中和剤槽１３は、例えばアンモニア等の中和剤を貯蔵する。発酵槽１内で発酵が進行すると、細菌の増殖に伴い、発酵槽１内のｐＨが低下する。本形態では、ｐＨ値が常に４．５乃至６程度の一定値（条件により異なる）になるように、ＣＰＵ７は、中和剤供給ポンプ１４に中和剤供給信号を出力し、発酵槽１内のｐＨ値を制御する。
【００２５】
発酵槽１には、インターフェイス６からの循環指示信号にしたがって、クロスフローろ過器１６に発酵槽１内の発酵液を引き抜いて圧送する循環ポンプ１５が接続されている。クロスフローろ過器１６は、引き抜かれた発酵液の一部を発酵槽１内へ戻すとともに、ろ液を切替弁１７の一方の入力ポートへ接続する。また、切替弁１７の他方の入力ポートには、発酵槽１内の発酵液が連通する。
【００２６】
切替弁１７は、インターフェイス６からの切替信号にしたがって、一方／他方の入力ポートのいずれかを出力ポートへ接続する。引抜ポンプ１８は、インターフェイス６からの引抜指示信号にしたがい、切替弁１７の出力ポートからろ液／発酵液のいずれかを引抜液槽１９へ圧送する。これにより、引抜液槽１９には、エタノールを含む発酵液が取り出される。なお、クロスフローろ過器１６に替えて、遠心分離器により構成しても良い。
【００２７】
次に、図２を参照しながら、制御部５による基質液の供給制御の各プロセスを説明する。このプロセスでは、制御部５が、発酵槽１から排出される炭酸ガス流量値が所定範囲を下回ったとき、それをトリガとして基質液供給ポンプ１２（供給手段）に基質供給信号を出力し、基質液を発酵槽１へ供給させる点が重要である。
【００２８】
そして、循環ポンプ１５、クロスフローろ過器１６、切替弁１７及び引抜ポンプ１８は、発酵槽１から発酵液を引き抜く引抜手段に相当し、制御部５は、基質液供給ポンプ１２が発酵槽１に基質液を供給する供給量にあわせた量の発酵液をこの引抜手段が発酵槽１から引き抜くように、この引抜手段を制御する。なお、ＣＰＵ７は、濁度計９からの濁度値を参照し、発酵槽１内の発酵液菌濃度が低ければクロスフローろ過器１６からろ液を引き抜き（切替弁１７は図１の状態）、菌濃度が高ければ発酵槽１から（切替弁１７は図１とは反対の状態）発酵液を引き抜いて、発酵槽１内の発酵液菌濃度が一定に保たれる。
【００２９】
図２、図３を参照しながら説明する。まず図２のステップ１に示すように、発酵槽１への種菌及び基質液の調整・投入が行われ、ステップ２にて、待ち時間Ｔ０、炭酸ガスの流量値閾値Ｔｈ、供給時間Ｔ１及び供給レートＲ１がセットされる。これらの所値は条件に応じて予め設定されており、必要に応じて適宜修正される。図３の時刻ｔ＝ｔ０において、発酵が開始される。
【００３０】
供給レートＲ１は、発酵液の基質濃度が枯渇直前の低いレベルが維持できるように、予め求めておいた菌体濃度と糖消費速度との関係式によって与えられる値を設定し、ＲＯＭ８に格納しておく。
【００３１】
発酵開始当初は、発酵槽１内において、菌濃度が低く（図３（ａ））、基質は豊富に存在する（図３（ｂ））。その後、アルコール生産細菌の特徴として、基質が残っていても増殖は停止する。そこで、菌濃度を増加させるために、培養液を循環し、ろ液を引き抜きその分の培地を補充しながら濃縮培養を行い、菌濃度を上昇させる。菌濃度が設定値に達したら、濁度制御を開始し連続発酵に入る。
【００３２】
細菌の増殖が活発化するにつれ、細菌の濃度が上昇し、発酵槽１内の残糖量は低下する。また、発酵が進むと、炭酸ガスの流量値は上昇する（図３（ｃ））。この際、ＣＰＵ７は、待ち時間Ｔ０が経過したかチェックしており（ステップ３）、経過するまで基質供給を行わない。
【００３３】
図３（ｃ）に示すように、時刻ｔ０における初回基質液添加終了後、待ち時間Ｔ０を経過すると、ＣＰＵ７は、ステップ４にて、炭酸ガスの流量値が閾値Ｔｈを下回ったかどうかチェックする。例えば、時刻ｔ＝ｔ０＋Ｔ０のとき、炭酸ガスの流量値は、閾値Ｔｈを上回っており、このときは、ＣＰＵ７は、ステップ８にて処理が終了すべきでないことを確認した上で、ステップ４へ処理を戻し、再度上記チェックを行う。
【００３４】
時刻ｔ＝ｔ１において、発酵槽１内の基質が枯渇すると、炭酸ガスの発生量が急に減少し、閾値Ｔｈを下回る。これをトリガとして、ステップ４からステップ５へ処理が移る。即ち、ＣＰＵ７は、基質供給信号をインターフェイス６を介して基質液供給ポンプ１２へ出力し、基質液供給ポンプ１２は、基質液槽１１から基質液を供給レートＲ１にしたがって発酵槽１へ供給し始め（ステップ５）、所定時間Ｔ１だけこの状態が継続する（ステップ６）。その結果、図３（ｂ）に示すように、殆どゼロであった発酵槽１内の残糖量が増加に転じる。即ち、時刻ｔ＝ｔ１の時点で、基質供給を再開してやれば制限基質濃度に近い低い残基質濃度で運転を継続できる。
【００３５】
さて、グルコースを基質とするエタノール発酵における炭酸ガス発生量と発酵との関係式は、周知のごとく以下の理論式で与えられる。
【００３６】
Ｃ6Ｈ12Ｏ6→２Ｃ2Ｈ5ＯＨ＋２ＣＯ2          （１）
すなわち、グルコース１モルに対し２モルのエタノールを生成するとき２モルの炭酸ガスを発生するので、糖が枯渇してエタノール生成が停止すれば炭酸ガスの発生は起こらない。したがって炭酸ガス排出量の減少を指標にすることによって、基質の枯渇を信頼性高く検出することができる。
【００３７】
この連続発酵の発酵系で菌濃度は濁度計９によって一定に制御されているが、実際に供給を行って、基質消費が制御部にインプットした予測値より早くなったり遅くなったりする場合もあるので、供給のタイミングは微妙に調整するのが好ましい。
【００３８】
そして、時刻ｔ１から所定時間Ｔ１が経過したら、ＣＰＵ７は、基質液供給ポンプ１２に基質供給を停止せよとの信号を出力し（ステップ７）、基質液供給ポンプ１２は、基質の供給を停止する。そのため、図３（ｂ）に示すように、残糖量は、再び減少へ転じ、時刻ｔ２にて、再度炭酸ガスの流量値が閾値Ｔｈを下回る結果となる。
【００３９】
以降、時刻ｔ２，ｔ３，ｔ４・・・において、同様の処理が繰り返される（ステップ３〜８）。
【００４０】
かくして、第２回以降（時刻ｔ１以降）の基質供給は、発酵槽１内の基質が枯渇するときに生ずる炭酸ガス発生の急激な減少を流量計４が検出し、閾値Ｔｈに達したとき開始される。
【００４１】
このようにして、微生物の発生する炭酸ガスを逐次チェックしながら糖などの基質を枯渇させることなく基質液を連続的に添加することが可能となり、発酵槽内基質濃度を容易に５ｇ／リッター以下の低レベルに抑えることが可能となる。モラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料を基質としｐＨ変化量に依存したのでは連続発酵が困難になりうる場合においても、この点は妥当するため、従来技術よりもより広汎で材料費が低廉な発酵を行える。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。勿論、以下の実施例により本発明が限定されるわけではない。
【００４３】
（実施例１）
種菌は、ＹＭブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）を培地とし、規定濃度に調整後、試験管に１０ミリリッターを分注し１１５℃で１０分間加熱滅菌したもので調製した。これにZymomonas mobillis  ＮＲＲＬ  Ｂ−１４０２３を接種し、３０℃にて１８時間静置発酵したものを用いた。
【００４４】
主発酵は、ブラジル産モラセスを水道水で５．３倍に希釈し、１２０℃、１０分間オートクレーブ滅菌したものを用いた。この培地２リッターを予め滅菌した小型の（容積３リッター）発酵槽に入れ、先に述べたように調製した種発酵液１００ミリリッターを添加し、温度３０℃、攪拌１００ｒｐｍにて発酵を開始した。菌増殖とともに発酵液ｐＨが低下するので、ｐＨ計によってオンラインでｐＨをモニターしながら１Ｎアンモニア水によってｐＨを５．５に保つようにした。
【００４５】
発酵開始後１５時間で菌増殖が頭打ちとなったので、発酵液の循環濃縮を行い、菌濃度を上昇させた。発酵槽外に設置したクロスフローろ過器（日本ポール製、０．４５ｍμ，０．１ｍ2カートリッジ）に発酵液を循環し、ろ液を発酵槽外に抜き出して発酵開始時と同じ培地を補充して発酵槽液量を一定に維持しながら菌濃度の上昇を図った。
【００４６】
このようにして、発酵開始約２４時間で菌濃度約４ｇ／リッターに達した。以後連続発酵の全時間２５５時間にわたりレーザー濁度計（ＡＳＲ社製Ｍｏｄｅｌ  ＬＡ−３０１型）によって、図４に示すように、菌濃度は４．０±０．２ｇ／リッターに制御できた。菌濃度が一定となったところで、グルコース／スクロース  アナライザーによって発酵液中の残基質濃度を測定したところ、グルコース／スクロース合計として１０ｇ／リッターであったので、発酵開始時と同じブラジル産モラセスを水道水で５．７倍に希釈し、１２０℃、１０分間オートクレーブ滅菌したものを基質液として９５０ｇ／ｈの供給レートで４時間連続供給した。
【００４７】
４時間の供給を行った後供給を停止したところ、細菌は発酵液中に残っていたわずかな基質をたちまち食べ尽くし、供給停止後約１５分で排気炭酸ガスの急激な低下が認められた。排気炭酸ガスの発生量が設定値の０．０８リッター／ｍｉｎに達したとき、基質が枯渇したものと判断し供給を再開した。実際炭酸ガス発生が設定下限に達したときの残糖濃度はアナライザーによればほとんど０ｇ／リッターである。この操作は制御プログラムによって自動的に行われる。
【００４８】
以後１，０００ｇ／ｈの供給レートで４時間の供給を行い、一時供給を停止して排気炭酸ガスの急激な減少を確認し、排気炭酸ガス流量が閾値に達したとき供給を再開するプログラムを働かせて連続運転を行った。供給を停止した後炭酸ガス発生の急激な減少が起こるまでの時間によって、供給中の発酵液残糖濃度を推測することができる。この時間の長さから、残糖濃度が高いと判断したときは供給レートを少し小さく、逆ならば速度を大きくして微調整を行う。
【００４９】
ただし、ここで基質供給の設定値は、発酵の方式や基質の種類などの発酵条件、使用菌株の性能などにより異なる場合もある。又、本実施例では毎回の基質液の添加時間を４時間にしたが、前述のごとく、菌の活性が大きく変らない時間内であれば、この添加時間を一定にする必要はなく時間ロスを少なくするために徐々に長く取った方が望ましい。
【００５０】
図４において、この発酵の経過を濁度制御の状態（上段）、マスフローセンサーによる排気炭酸ガスの発生（下段）を示し、発酵槽内エタノール濃度、発酵槽内残糖濃度を併せて示す。上述した供給プログラムにより安定した連続運転が２５５時間継続した。この間、供給中の発酵液残糖濃度はにグルコース／スゥロース合量として約１０．０±５ｇ／リッターに維持された。また、発酵液の平均エタノール濃度は約６８ｇ／リッターであった。正味連続運転２３０時間でエタノール６８ｇ／リッターを含む発酵液２２０リッターを得た。
【００５１】
（実施例２）
シード（種）に用いた菌、培地、発酵法、発酵条件、及び主発酵に用いた装置は、実施例１と同一である。
【００５２】
主発酵培地及び基質液はコーンスターチ糖化液にＣＳＬ（コーン・スティープ・リカー）を添加したものを用いた。
【００５３】
コーンスターチ２００ｇ／リッターを水に懸濁しスラリーとした後、攪拌しながらｐＨを６．０に調整し、Ｔｅｒｍａｍｙｌ  １２０Ｌ（Ｎｏｖｏ）０．５μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加えｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ上で９０℃，１ｈ液化処理を行う。これを冷却後ｐＨを４．５に調整し、Ｄｅｘｔｒｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏ）０．６μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加え恒温槽内で６０℃，２４ｈ糖化処理を行った。その結果グルコース濃度１７８ｇ／リッターの糖液を得た。
【００５４】
これを水にてグルコース濃度１３０ｇ／リッターとなるよう希釈し、予め遠心分離によって固形分を除いたＣＳＬ（サンエイ糖化ＫＫ）５ｇ／リッターを加え、ｐＨ調整後オートクレーブ滅菌処理したものを培地・基質液として用いた。
【００５５】
発酵の手順及び制御プログラムは実施例１と全く同じである。
【００５６】
供給レートは９５０ｇ／ｈ、１回の供給継続時間は実施例１と同じ４ｈ、排気炭酸ガスの閾値は実施例１と同じ０．０８リッター／ｍｉｎである。
【００５７】
発酵は安定して長時間継続し、２００ｈの連続運転で５８ｇ／リッターのエタノールを含む発酵液１８０リッターを得た。
【００５８】
（実施例３）
シード（種）に用いた菌、培地、発酵法、発酵条件、及び主発酵に用いた装置は、実施例１と同一である。
【００５９】
主発酵培地及び基質液はキャッサバデンプン糖化液にモラセスを添加したものを用いた。
【００６０】
キャッサバデンプン（タイ国産）２００ｇ／リッターを水に懸濁しスラリーとした後、攪拌しながらｐＨを６．０に調整し、Ｔｅｒｍａｍｙｌ  １２０Ｌ（Ｎｏｖｏ）０．５μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加えｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ上で９０℃，１ｈ液化処理を行う。これを冷却後ｐＨを４．５に調整し、Ｄｅｘｔｒｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏ）０．６μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加え恒温槽内で６０℃，２４ｈ糖化処理を行った。その結果グルコース濃度１７５ｇ／リッターの糖液を得た。これを水にてグルコース濃度１３０ｇ／リッターとなるよう希釈し、実施例１において用いたモラセス５．７．倍希釈液を１：１に混合し、ｐＨ調整後オートクレーブ滅菌処理したものを培地・基質液として用いた。
【００６１】
発酵の手順及び制御プログラムは実施例１と全く同じである。
【００６２】
供給レートは１，０００ｇ／ｈ、１回の供給継続時間は実施例１と同じ４ｈ、排気炭酸ガスの閾値は実施例１と同じ０．０８リッター／ｍｉｎである。
【００６３】
発酵は安定して長時間継続し、２００ｈの連続運転で５８ｇ／リッターのエタノールを含む発酵液１７５リッターを得た。
【００６４】
（実施例４）
シード（種）に用いた菌、培地、発酵法、発酵条件、及び主発酵に用いた装置は、実施例１と同一である。
【００６５】
主発酵培地及び基質液は生ゴミを原料とする発酵想定したモデル生ゴミ糖化液である。
【００６６】
ご飯（白米）２５０ｇ、キャベツ５９ｇ、ゆでたにんじん５０ｇ、バナナ（可食部）５０ｇ、サシミ５０ｇ、を適量の水を加えてジューサーミキサーで粉砕ジュース化した後、全量１リッターの水を加えて希釈する。攪拌しながらｐＨを４．５に調整し、Ｄｅｘｔｒｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏ）０．６μリッター／ｇ  ｓｔａｒｃｈを加え恒温槽内で６０℃，２４ｈ糖化処理を行った。糖化後のグルコース濃度８５ｇ／リッターの糖液を得た。これをそのままオートクレーブ滅菌処理して、培地・基質液として用いた。
【００６７】
発酵の手順及び制御プログラムは実施例１と全く同じである。
【００６８】
供給レートは１，２００ｇ／ｈ、１回の供給継続時間は実施例１と同じ４ｈ、排気炭酸ガスの閾値は実施例１と同じ０．０８リッター／ｍｉｎである。
【００６９】
発酵は安定して長時間継続し、１５０ｈの連続運転で４１ｇ／リッターのエタノールを含む発酵液１５０リッターを得た。
【００７０】
以上の実施例により、モラセスのような不明の不純物を多く含む安価な工業原料を基質とする場合においても、発酵槽の基質濃度を低い一定のレベルに保ちながら、長時間安定に連続発酵できる点は明らかであり、本発明は従来技術に比べ顕著な利点がある。
【００７１】
以下、βラクタム系抗生物質に関する比較例１及び実施例５、６を説明する。実施例５、６に共通する事項は次のとおりである。
【００７２】
Zymomonas mobilisを用いるエタノール発酵を連続させエタノール生産を行うにあたり、最初に発酵槽に仕込む培地を加熱蒸気殺菌した後冷却し、初発培地とする。また、滅菌した冷水にペニシリンＧカリウムを溶解させたものを、初発培地に最終濃度５−２０ＩＵ／ミリリッターになるように添加し、種菌（シード）を加えて発酵開始する。
【００７３】
実施例１と同様に、回分培養で菌濃度を上昇させ、菌濃縮を行って細胞濃度を目標値まで上昇させる。細胞濃度が目標に達したら初発培地同様の手順でペニシリンＧカリウムを溶解し、最終濃度５−２０ＩＵ／ミリリッターになるように添加した基質液を連続的に添加して連続発酵を行う。
【００７４】
また、菌濃縮に用いるクロスフローろ過器１６についても、ペニシリンＧカリウムを最終濃度５−２０ＩＵ／ミリリッターとなるように添加して温度３０℃で２時間インキュベートし、クロスフローろ過器１６の膜内や配管細部に残存するコンタミ菌を死滅させる。
【００７５】
これらの点が、実施例１から４までと、実施例５，６との相違点である。以下、実施例５、６により詳細に説明するように、これらの処置により、Zymomonas mobilisによるエタノール連続発酵は、３５０時間の長期に亘り全くコンタミ菌の侵入・増殖を受けることなく、常時最大速度でエタノールを発酵生産できた。もちろんこの方法はZymomonas mobilisに限らずアルコール発酵能の付与された遺伝子組み換え大腸菌を用いる発酵においても有効である。
【００７６】
ここで、抗生物質は、ペニシリンに限定されるものではなく、アンピシリンを初めグラム陽性細菌に有効な全てのβラクタム系抗生物質を用いても同様の効果を得ることが出来る。
【００７７】
次に、実施例５、６に先立ち、比較例１を説明する。
【００７８】
（比較例１）
種菌はＹＭブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）を培地とし、規定濃度に調整後、試験管に１０ミリリッターを分注し１１５℃で１０分間加熱滅菌したもので調製した。これにZymomonas mobilis  ＮＲＲＬ  Ｂ−１４０２３を接種し、３０℃にて１８時間静置発酵したものを用いた。
【００７９】
主発酵は、結晶ブドウ糖１４０ｇ／リッター，酵母エキス５ｇ／リッター，味液（大豆フレーク酸加水分解液）０．５ｖｏｌ％からなる組成の培地を、ｐＨ５．５に調整し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌したものを用いた。この培地２リッターを予め滅菌した３リッター容小型発酵槽に入れ、先に述べたように調製した種発酵液１００ミリリッターを添加し、温度３０℃、攪拌１００ｒｐｍにて発酵を開始した。菌増殖とともに発酵液ｐＨが低下するので、ｐＨ計１０によってｐＨをモニターしながら１Ｎアンモニア水によってｐＨを５．５に保つようにした。
【００８０】
図５は、比較例１における発酵過程を示すグラフである。シード後、回分培養によって菌増殖が開始され、細胞濃度が１ｇ／リッターを超えた時点でクロスフローろ過器による菌濃縮を開始し、基質液によって基質を追加すると共に除菌液の培養系からの抜き出しを行い、細胞濃度の上昇を行った。
【００８１】
培養開始約４０時間で細胞濃度が約５ｇ／リッターの目標値に達したので、図１のシステムを用いて連続発酵モードに入った。図５に示されているように、培養開始後８０時間（連続発酵に入って４０時間）までは、菌濃度はほぼ６ｇ／リッターを維持し、エタノール濃度も漸減ではあるものの６０ｇ／リッター以上を維持できており、炭酸ガス発生量も減少傾向にはあるものの２５０ミリリッター／ｍｉｎ（約１０ｍｍｏｌ／ｍｉｎ）程度であり、エタノール生産速度は約３０ｇ／ｈ程度を維持できている。
【００８２】
しかしながら、連続発酵開始４０時間目以降、急激に炭酸ガスの発生速度が低下し、エタノール濃度も急落し、アンモニア消費速度が急上昇する異常発酵となっている。培養１２０時間目に至り、発酵は全く制御不可能となったために、培養を打ち切った。これは培養４０時間（連続発酵開始とほとんど同時に）乳酸菌がコンタミし、これが８０時間目以降急激に増殖したためであると考えられる。因みに、実際培養１００時間目の培養液を寒天プレート培地で培養したところ、多数の乳酸菌のコロニーが確認された。
【００８３】
（実施例５）
種菌はＹＭブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ）を培地とし、規定濃度に調整後、試験管に１０ミリリッターを分注し、１１５℃で１０分間加熱滅菌したもので調製した。これにZymomonas mobilis  ＮＲＲＬ  Ｂ−１４０２３を接種し、３０℃にて１８時間静置発酵したものを用いた。
【００８４】
主発酵は、結晶ブドウ糖１４０ｇ／リッター，酵母エキス５ｇ／リッター，味液（大豆フレーク酸加水分解液）０．５ｖｏｌ％からなる組成の培地をｐＨ５．５．に調整し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌したものである。培養に用いた初発培地・菌の濃縮に用いた基質液・連続発酵基質液はすべて熱殺菌したものを冷却しそこに最終濃度５ＩＵ／ミリリッターになるようにペニシリンＧカリウムを加えたものを用いた。
【００８５】
この培地２リッターを予め滅菌した３リッター容小型発酵槽に入れ、先に述べたように調製した種発酵液１００ミリリッターを添加し、温度３０℃、攪拌１００ｒｐｍにて発酵を開始した。菌増殖とともに発酵液ｐＨが低下するのでｐＨ計１０によってｐＨをモニターしながら１Ｎアンモニア水によってｐＨを５．５に保つようにした。
【００８６】
システムは、実施例１に係る図１に示したものと同じである。比較例１でのべたように過去の培養においてコンタミネーションの被害が発生したので、ろ過器１６の内部等にコンタミ菌が残留している可能性がある。このため、培養に先立ち残存するコンタミ菌を徹底的に駆除すべく、先にコンタミした培養に用いたフィルターカートリッジを、発酵終了後完全に分解洗浄し、アルカリ液に数日浸漬し、徹底的に滅菌した。しかる後、ペニシリン洗浄によって残存コンタミ菌の撲滅を試みた。すなわち、図１のシステムの隅々まで、ペニシリンにより洗浄し、また上述のように、ペニシリン洗浄したフィルターカートリッジを、発酵槽１に取り付け、菌濃縮循環に使用した。
【００８７】
図６は、培養結果を示す。シード後、回分培養によって菌増殖が開始され、細胞濃度が１ｇ／リッターを超えた時点でクロスフローろ過器１６による菌濃縮を開始し、ペニシリンＧカリウムを最終濃度５ＩＵ／ミリリッターを添加した基質液を供給して基質を追加する。また、除菌液の培養系からの抜き出しを行い、細胞濃度の上昇を行った。
【００８８】
培養開始約３０時間で細胞濃度が約５ｇ／リッターの目標値に達したので、図１のシステムを用いて連続発酵モードに入った。
【００８９】
連続発酵の基質液は、三温糖１４０ｇ／リッター，酵母エキス（ＹＥ）５ｇ／リッター，味液５ミリリッター／リッターをｐＨ５．５に調整後１２０℃２０分オートクレーブ滅菌後冷却し、ペニシリンＧカリウムを５ＩＵ／ミリリッターになるように添加したものとした。
【００９０】
図６は、実施例５による連続発酵の結果を示す。１５０時間の長期にわたり全くコンタミネーションに犯されることなく終始健全な発酵でエタノールを連続生産できた。全ての連続運転期間中菌濃度は５±０．５ｇ／リッターに維持され、ＣＯ２発生量は３５０ミリリッター／ｍｉｎ（約１５ｍｍｏｌ／ｍｉｎ）程度、エタノール生産速度は約４２ｇ／ｈ程度であり、高い生産速度を維持できた。基質液の供給速度と培養液の引き抜き速度は、図６に示すように安定しており、培養中変化なく、連続発酵が定常状態を維持し長時間連続運転できた。培養液のエタノール濃度は、全期間に亘り６５±５ｇ／リッター（約８．２％）であった。このようにろ過器１６のペニシリン洗浄と培地へのペニシリン添加の効果は顕著であり、エタノール連続発酵を長時間にわたりコンタミネーションの被害を受けず実施することが可能となった。
【００９１】
（実施例６）
シード（種）に用いた菌、培地、発酵法、発酵条件は実施例５と同一である。
【００９２】
初発培地・菌濃縮時基質液・連続発酵基質液は同一組成、同じ調整法によった。すなわち、糖液はコーンスターチ酵素糖化液を水で希釈し、これにＣＳＬ（コーン・スティープ・リカー）５ミリリッター／リッターの濃度に添加して、ｐＨ５．５とした後、糖濃度１４０ｇ／リッターに最終調整し、１２０℃２０分オートクレーブ滅菌した。殺菌後冷却し、培地が十分冷えたところでペニシリンＧカリウムを５ＩＵ／ミリリッターになるように添加して培養に用いた。クロスフローろ過器１６のペニシリン洗浄・コンタミ菌除去の要領は、実施例５と同一である。
【００９３】
図７は、実施例６による培養結果を示す。システムは、実施例１と同一である。シード後、回分培養によって菌増殖が開始され、細胞濃度が１ｇ／リッターを超えた時点でクロスフローろ過器による菌濃縮を開始し、ペニシリンＧカリウムを最終濃度５ＩＵ／ミリリッターを添加した基質液を供給して基質を追加する。また、除菌液の培養系からの抜き出しを行い、細胞濃度を上昇させた。
【００９４】
培養開始約２７時間で細胞濃度が約６ｇ／リッターの目標値に達したので、図１のシステムを用いて連続発酵モードに入った。連続発酵の基質液は、前述のコーンスターチ酵素糖化液（糖濃度１４０ｇ／リッター）−ＣＳＬ（コーン・スティープ・リカー）５ミリリッター／リッターをｐＨ５．５に調整後、１２０℃２０分オートクレーブ滅菌後冷却し、ペニシリンＧカリウムを５ＩＵ／ミリリッターになるように添加したものである。
【００９５】
図７に示すように、全３５０時間の長期にわたり全くコンタミネーションに犯されることなく終始健全な発酵でエタノールを連続生産できた。全ての連続運転期間中菌濃度は６±０．５ｇ／リッターに維持され、炭酸ガス発生量は５００ミリリッター／ｍｉｎ（約２１ｍｍｏｌ／ｍｉｎ）、エタノール生産速度は約５８ｇ／ｈであり、高い生産速度を全培養時間にわたって維持できた。
【００９６】
基質液の供給速度と培養液の引き抜き速度は、図７下段に示すように安定しており、培養中変化なく、連続発酵が定常状態を維持し長時間連続運転できた。培養液のエタノール濃度は、全期間に亘り６５±５ｇ／リッター（約８．２％）であった。このようにろ過器１６のペニシリン洗浄と培地へのペニシリン添加の効果は顕著で、エタノール連続発酵を長時間にわたりコンタミネーションの被害を受けず実施できた。
【国際調査報告】
2007032265.tif 000009
2007032265.tif 000010