(57)【要約】［課題］微生物触媒を用いて（メタ）アクリルアミドを製造する場合に、製造工程が簡略化できるとともに、製造コストが削減される（メタ）アクリルアミドの製造方法を提供すること。［解決手段］本発明の（メタ）アクリルアミドの製造方法は、（ａ）水性媒体中で（メタ）アクリロニトリルをニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒により水和反応させて、（メタ）アクリルアミド反応液（Ｉ）を得る工程と、（ｂ）前記反応液（Ｉ）から不純物を除去させて、（メタ）アクリルアミド水溶液（II）を得る工程とを含み、工程（ａ）で得られる反応液（Ｉ）中の（メタ）アクリルアミドの濃度が、工程（ｂ）で得られる水溶液（II）中の（メタ）アクリルアミドの濃度より、２〜２０重量％高いことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水性媒体中で（メタ）アクリロニトリルをニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒により水和反応させて、（メタ）アクリルアミド反応液（Ｉ）を得る工程と、
（ｂ）前記反応液（Ｉ）から不純物を除去させて、（メタ）アクリルアミド水溶液（II）を得る工程とを含み、
工程（ａ）で得られる反応液（Ｉ）中の（メタ）アクリルアミドの濃度が、工程（ｂ）で得られる水溶液（II）中の（メタ）アクリルアミドの濃度より、２〜２０重量％高いことを特徴とする（メタ）アクリルアミドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（メタ）アクリルアミドの製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、水性媒体中で（メタ）アクリロニトリルをニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒により水和反応させる（メタ）アクリルアミドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（メタ）アクリルアミドは、（メタ）アクリルアミド系重合体の原料として有用な化合物であり、特にアクリルアミド系重合体は、紙力増強剤、凝集剤などに幅広く利用されている。【０００３】
また、近年、（メタ）アクリルアミドを製造する方法として、反応条件が温和であり、副生成物も極めて少ないなどの利点を有するため、銅触媒に代えて微生物触媒を用いる方法が注目されている（特許文献１参照）。この方法では、微生物に含まれる酵素ニトリルヒドラターゼにより、（メタ）アクリロニトリルが水和されて（メタ）アクリルアミドに変換される。これにより、アクリルアミドでは４０〜８０重量％、メタクリルアミドでは１０〜４０重量％の水溶液として得られ、得られた（メタ）アクリルアミドを（メタ）アクリルアミド系重合体の原料とする場合は、アクリルアミドでは４０〜６０重量％の水溶液若しくは結晶品、メタクリルアミドでは１０〜２０重量％の水溶液若しくは結晶品として供給することが好ましい。【０００４】
従来、生物触媒を用いて、上記のような（メタ）アクリルアミドの水溶液を製造する場合は、（メタ）アクリルアミドが最終製品中での濃度よりも低濃度の状態で、微生物触媒などの不純物の分離を行う後工程に導入されると、後工程により、（メタ）アクリルアミドの濃度がさらに低下するという問題があった。したがって、上記不純物の分離を行う後工程の後に、（メタ）アクリルアミドを最終製品中での濃度にするための工程、たとえば、水の蒸留などによる除去工程を行う必要が生ずる。また、このような除去工程を行うと、製造コストの増加にもつながるという問題もあった。【０００５】
また、上記のような（メタ）アクリルアミドの結晶品を製造する場合も、晶析に必要な濃度差を得るため、濃縮率を大きくする、あるいは晶析温度を低減する必要があり、コストが増加するという問題があった。
【特許文献１】国際公開第２００３／０３３７１６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒を用いて、製造工程が簡略化できるとともに、製造コストが削減される（メタ）アクリルアミドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、微生物触媒を用いて特定の濃度の（メタ）アクリルアミドを含む反応液を得ることにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明に係る（メタ）アクリルアミドの製造方法は、
（ａ）水性媒体中で（メタ）アクリロニトリルをニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒により水和反応させて、（メタ）アクリルアミド反応液（Ｉ）を得る工程と、
（ｂ）前記反応液（Ｉ）から不純物を除去させて、（メタ）アクリルアミド水溶液（II）を得る工程とを含み、
工程（ａ）で得られる反応液（Ｉ）中の（メタ）アクリルアミドの濃度が、工程（ｂ）で得られる水溶液（II）中の（メタ）アクリルアミドの濃度より、２〜２０重量％高いことを特徴とする（メタ）アクリルアミドの製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒を用いて、製造工程が簡略化できるとともに、製造コストが削減される（メタ）アクリルアミドの製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について具体的に説明する。
［（メタ）アクリルアミドの製造］
工程（ａ）では、水性媒体中で（メタ）アクリロニトリルをニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒により水和反応させて、（メタ）アクリルアミド反応液（Ｉ）を得る。【００１１】
本発明に用いられる水性媒体とは、水；または、リン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩、炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、アミド化合物などを適当な濃度で溶解させた水溶液を意味する。また、上記水性媒体には、後述するように、アクリロニトリルおよび微生物触媒が水溶液などの状態で添加されるときは、これら水溶液中の水性媒体も含む。【００１２】
本発明においては、市販されている（メタ）アクリロニトリルを適宜用いればよいが、不純物を取り除いた（メタ）アクリロニトリルを用いることが好ましい。【００１３】
（メタ）アクリロニトリルから不純物を取り除く方法としては、たとえば、蒸留精製、アルカリ水溶液による洗浄、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂等のイオン交換樹脂で不純物を除去する方法、活性炭により不純物を除去する方法などが挙げられる。このような（メタ）アクリロニトリルを用いると、より効率よく（メタ）アクリルアミドが得られる。【００１４】
（メタ）アクリロニトリルは、そのまま用いても、あらかじめ水に溶解もしくは混合して上記水和反応に用いてもよい。【００１５】
本発明に用いられるニトリルヒドラターゼを含む微生物は、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物であれば特に制限されない。ここで、ニトリルヒドラターゼとは、アクリロニトリルなどのニトリル化合物を水和させてアクリルアミドなどの対応するアミド化合物を生成する能力を有する酵素である。【００１６】
上記微生物としては、たとえば、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、サーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物などが挙げられる。これらの微生物は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。【００１７】
また、上記微生物には、該微生物からクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も含まれる。なお、ここでいう任意の宿主としては、大腸菌(Escherichia coli)；枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌；酵母、放線菌等の他の微生物菌株などが挙げられる。上記菌株としては、具体的には、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現：独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。【００１８】
また、組換えＤＮＡ技術を用いて、酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除または挿入し、アクリルアミド耐性、アクリロニトリル耐性および温度耐性を向上した変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も、本発明でいう微生物に含まれる。【００１９】
本発明に用いられるニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒には、上記のような微生物を培養して得られた微生物菌体のほか、上記微生物菌体の抽出物、上記微生物菌体の磨砕物、該抽出物または該磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られる後分離物、該微生物菌体、該菌体の抽出物、該菌体の磨砕物、該後分離物等を適当な担体に固定化した固定化物などの菌体処理物も含まれる。このように、上記微生物触媒は、水溶液に溶解する微生物触媒であっても、担体に固定化した固形物であってもよい。これらは、１種類を用いてもよく、２種類以上を同時に用いてもよく、また、交互に用いてもよい。さらに、上記ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒には、これらのうち少なくとも１つを含む混合溶液、緩衝液等の溶液、これらのうち少なくとも１つを含む懸濁液なども含まれる。これら微生物触媒の使用形態は、ニトリルヒドラターゼの安定性、生産規模などにより適宜選択すればよい。【００２０】
上記のような微生物は、公知の方法によって調製すればよい。たとえば、ＬＢ培地、Ｍ９培地などの液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（通常２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上であってもよい）で生育させ、次いで、該微生物を遠心分離によって培養液より分離、回収して得られる。【００２１】
工程（ａ）では、上記水性媒体中で上記（メタ）アクリロニトリルを上記微生物触媒により水和反応させて、所望の濃度の（メタ）アクリルアミド反応液（Ｉ）を得る。この水和反応は常法により行われるが、たとえば、以下のように実施できる。【００２２】
本発明において、（メタ）アクリロニトリルの濃度は、所望の濃度の（メタ）アクリルアミド反応液（Ｉ）が得られれば特に制限されず、その濃度の上限は特に制限されないが、大過剰の（メタ）アクリロニトリルの供給は、反応を完結させるために多くの触媒量、過大な容積を有する反応器、および除熱のための過大な熱交換器などが必要となり、設備面での経済的負担が大きくなる。【００２３】
このため、（メタ）アクリロニトリルの供給量としては、アクリロニトリルの場合には、そのアクリロニトリルが全て対応するアクリルアミドとなった場合に、反応器中での反応液（Ｉ）中のアクリルアミドの理論的な生成液濃度が、４２〜８０重量％の範囲となるように添加することが好ましく、より具体的には、上記水性媒体１重量部に対しアクリロニトリル０．４〜１．５重量部の範囲で添加することが好ましい。【００２４】
また、メタクリロニトリルの場合には、そのメタクリロニトリルが全て対応するメタクリルアミドにとなった場合に、反応器中での反応液（Ｉ）中のメタクリルアミドの理論的生成液濃度が１２〜４０重量％の範囲となるように添加することが好ましく、より具体的には、上記水性媒体１重量部に対しメタクリロニトリル０．０９〜０．５重量部の範囲で添加することが好ましい。【００２５】
上記微生物触媒の使用量は、所望の濃度の（メタ）アクリルアミド反応液（Ｉ）が得られればよく、また、反応条件、触媒の種類、その形態により適宜決定すればよいが、該乾燥菌体重量換算で、水性媒体に対し通常１０〜５００００重量ｐｐｍ、好ましくは５０〜３００００重量ｐｐｍである。【００２６】
また、上記水和反応での反応時間も、所望の濃度の（メタ）アクリルアミド反応液（Ｉ）が得られればよく、特に制限されない。具体的には、上記反応時間は、触媒の使用量および温度などの条件にも依存するが、１つの反応器当たり、通常１〜８０時間の範囲であり、好ましくは２〜４０時間の範囲である。【００２７】
上記水和反応は、通常、常圧で行われるが、水性媒体への（メタ）アクリロニトリルの溶解度を高めるために加圧下で行ってもよい。反応温度は、水性媒体の氷点以上であれば特に制限されないが、通常０〜５０℃の範囲で、好ましくは１０〜４０℃の範囲行うことが望ましい。また、上記水和反応での水性媒体のｐＨは特に制限されず、ニトリルヒドラターゼの活性が維持されていればよく、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲であり、より好ましくはｐＨ７〜９の範囲であることが望ましい。なお、上記水和反応は、回分式、連続式のいずれで行ってもよく、触媒形態に合わせて、懸濁床、固定床、流動床等の反応方式から選択しても、あるいは異なる形式の反応方式を組み合わせてもよい。【００２８】
このような水和反応によって（メタ）アクリルアミド反応液（Ｉ）が得られる。この反応液（Ｉ）には、（メタ）アクリルアミド、水性媒体、溶解している上記微生物触媒の他、場合によっては、担体に固定された上記微生物触媒、菌体の死がい等の固形物が含まれる。【００２９】
工程（ａ）で得られた反応液（Ｉ）中の（メタ）アクリルアミドの濃度は、アクリルアミドで通常４２〜８０重量％、メタクリルアミドで通常１２〜４０重量％である。【００３０】
工程（ｂ）では、工程（ａ）で得られた混合物から不純物を除去させて、（メタ）アクリルアミド水溶液（II）を得る。【００３１】
上記不純物としては、溶解している上記微生物触媒；担体に固定された上記微生物触媒、菌体の死がい等の固形物が挙げられる。【００３２】
溶解している上記微生物触媒の除去方法としては、特開２００１−２７０８５７号公報に記載されているように、酸性下で反応液（Ｉ）と活性炭とを接触させ、次いで活性炭を除去する方法が好適に用いられる。上記接触においてｐＨ調整のための水溶液が（メタ）アクリルアミド反応液に加えられたり、また、ろ過によって活性炭を除去する場合は、洗浄水が（メタ）アクリルアミド反応液に加えられるため、工程（ｂ）では（メタ）アクリルアミドの濃度が低下する。【００３３】
また、上記固形物を除去するためには、ろ過、遠心分離、膜分離、イオン交換樹脂などを用いてもよい。たとえば、ろ過の場合は、洗浄水が（メタ）アクリルアミド反応液に加わるため、工程（ｂ）では（メタ）アクリルアミドの濃度が低下する。【００３４】
上記のようにして、工程（ａ）で得られた反応液（Ｉ）から不純物を除去した（メタ）アクリルアミド水溶液（II）が得られる。この工程（ｂ）で得られた水溶液（II）を（メタ）アクリルアミド系重合体の原料として用いるためには、工程（ｂ）で得られる水溶液（II）中の（メタ）アクリルアミドの濃度は、アクリルアミドで通常４０〜６０重量％、メタクリルアミドで通常１０〜２０重量％である。【００３５】
ここで、（メタ）アクリルアミドの反応液中や水溶液中の濃度は、高速液体クロマトグラフ法、ガスクロマトグラフ法、屈折率計などの常法を用いて測定することができるが、本明細書では実施例のように高速液体クロマトグラフ法で測定される。【００３６】
このように、本発明では、工程（ａ）で得られる反応液（Ｉ）中の（メタ）アクリルアミドの濃度が、工程（ｂ）で得られる水溶液（II）中の（メタ）アクリルアミドの濃度よりも、２〜２０重量％多いことを特徴とする。すなわち、工程（ａ）で、（メタ）アクリルアミドを上記の量多く含む反応液（Ｉ）を製造する。このため、工程（ｂ）では、ろ過などによって、上記反応液中での（メタ）アクリルアミドの濃度は低下するが、工程（ｂ）で得られた水溶液（II）は、さらに、水の蒸留などによる水の除去工程を行わなくても、水溶液の最終製品として、また、結晶品の場合は、晶析用原液として好適に用いられる。【００３７】
したがって、本発明の（メタ）アクリルアミドの製造方法では、製造工程の簡略化が図れるとともに、製造コストも低減できる。【００３８】
なお、製造された（メタ）アクリルアミド水溶液（II）に対して、さらに、たとえば、濃縮、イオン交換、晶析、活性炭処理などの工程を行って精製してもよい。
［（メタ）アクリルアミド系重合体の製造］
本発明で得られた（メタ）アクリルアミドを用いて、（メタ）アクリルアミドを単独重合もしくは共重合、または該（メタ）アクリルアミドをその他の単量体と共重合できる。【００３９】
（メタ）アクリルアミドと共重合可能な不飽和単量体としては、
アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などの不飽和カルボン酸およびそれらの塩；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸およびそれらの塩；
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレートアクリル酸などの（メタ）アクリル酸のアルキルアミノアルキルエステル、またはそれらの第４級アンモニウム誘導体；
Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドなどのN−N−ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、またはそれらの４級アンモニウム誘導体；
アセトンアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミドなどの親水性アクリルアミド；
Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン；
ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート；
メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン；
Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルメタクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ドデシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ドデシルメタクリルアミドなどのＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド誘導体；
Ｎ，Ｎ−ジグリシジルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジグリシジルメタクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）アクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）メタクリルアミド、Ｎ−（５−グリシドキシペンチル）アクリルアミド、Ｎ−（６−グリシドキシヘキシル）アクリルアミドなどのＮ−（ω−グリシドキシアルキル）（メタ）アクリルアミド誘導体；
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート誘導体；
アクリロニトリル、メタクリロニトリル、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、ブテン等のオレフィン類、スチレン、αメチルスチレン、ブタジエン、イソプレンなどが挙げられる。【００４０】
これら単量体は、１種単独で用いても、２種以上混合して用いてもよい。また、アクリルアミドおよびメタクリルアミドとこれら他の単量体とを共重合してもよい。【００４１】
（メタ）アクリルアミドとこれら単量体とを共重合する場合の混合比率については特に制限はないが、通常（メタ）アクリルアミド１００モルに対して、単量体が１００モル以下であり、好ましくは５０モル以下である。【００４２】
上記アクリルアミド系重合体の製造方法は特に限定されず、水溶液重合、乳化重合などの周知の方法で行われるが、ラジカル重合開始剤を用いた水溶液重合が好適に用いられる。水溶液重合の場合は、通常、（メタ）アクリルアミドと必要に応じて添加する単量体との合計濃度が５〜９０重量％とすることが好ましい。【００４３】
重合開始剤としては、例えば、ラジカル重合開始剤が用いられ、具体的には、
過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素、過酸化ベンゾイル等の過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル、２，２'−アゾビス（４−アミジノプロパン）２塩酸塩、４，４'−アゾビス（４−シアノバレリアン酸ナトリウム）等のアゾ系遊離基開始剤；上記過酸化物と、重亜硫酸ナトリウム、トリエタノールアミン、硫酸第一鉄アンモニウム等の還元剤とを併用するいわゆるレドックス系触媒などが挙げられる。【００４４】
上記した重合開始剤は１種単独で用いてもよいが、２種以上併用してもよい。重合開始剤の量は、通常、単量体の総重量に対し、０．００１〜５重量％の範囲である。【００４５】
重合温度は、通常−１０〜１２０℃の範囲であり、より好ましくは０〜９０℃の範囲である。また、重合温度は常に一定の温度に保つ必要はなく、重合の進行に伴い適宜変更してもよいが、通常は重合の進行に伴い、重合熱が発生して重合温度が上昇する傾向にあるため、必要に応じ、冷却する場合もある。【００４６】
重合時の雰囲気は特に限定はないが、重合を速やかに進行する観点からは、例えば窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気下で重合することが好ましい。【００４７】
重合時間は特に限定はないが、通常１〜２０時間の範囲である。【００４８】
また重合時の水溶液のｐＨも特に限定はないが、必要に応じｐＨを調整して重合してもよい。その場合使用可能なｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどのアルカリ；リン酸、硫酸、塩酸などの鉱酸；蟻酸、酢酸等の有機酸などが挙げられる。【００４９】
このようにして得られる重合体の分子量は特に制限はないが、通常１０万〜５０００万の範囲であり、好ましくは５０万〜３０００万の範囲である。【００５０】
このようにして得られた（メタ）アクリルアミド系重合体は、本発明で得られる（メタ）アクリルアミドが品質に優れるため、水溶性が格段に向上するとともに、充分に高い分子量が得られる。さらに、得られた重合体は色相にも優れる。したがって、この（メタ）アクリルアミド系重合体は、凝集剤、製紙用添加剤、石油回収剤などとして好適に使用できる。【００５１】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５２】
［実施例］
［ニトロリルヒドラターゼを含む菌体の培養］
特開２００１−３４００９１号の実施例１に記載の方法に従い、Ｎｏ．３クローン菌体を取得し、同じく、同実施例１の方法で培養してニトロリルヒドラターゼを含む湿菌体を得た。
［アクリルアミドの製造］
最終製品として、水溶液中のアクリルアミド濃度が５０重量％の製品を得るため、以下の条件で反応を行った。【００５３】
第１反応器として攪拌器を備えた１Ｌガラス製フラスコ、第２反応器として内径５ｍｍのテフロン（登録商標）製チューブ２０ｍを準備した。第１反応器には、予め４００ｇの水を仕込んだ。【００５４】
上記の培養方法で得られた湿菌体を純水に懸濁した。第１反応器内を撹拌しながら、この懸濁液を、１１ｇ／ｈの速度で連続的にフィードした。アクリロニトリルは、３２ｇ／ｈの速度で、また、純水は３７ｇ／ｈの速度で連続的にフィードした。さらに反応ｐＨが７．５〜８．５となるように、０．１Ｍ−ＮａＯＨ水溶液をフィードした。これらの原料は、各々の貯槽から単独のラインで供給され、反応器内にフィードされるまで、他の原料に接触することはなかった。さらに、第１反応器の液面レベルを一定に保つように、反応液を第１反応器から８０ｇ／ｈの速度で連続的に抜き出し、第２反応器に連続的にフィードして、第２反応器内でさらに反応を進行させた。【００５５】
第１反応器および第２反応器とも１０〜２０℃の温度の水浴中に浸漬し、各反応器内部の液温が１５℃となるように温度制御を行った。【００５６】
運転を開始してから２日目に各反応器の反応液（反応液（Ｉ））をサンプリングし、以下のＨＰＬＣ条件にて分析を行ったところ、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９０％、かつ第２反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下（１００重量ｐｐｍ以下）、アクリルアミド濃度が５３．５重量％となった。【００５７】
ここで分析条件は以下のとおりであった。
アクリルアミド分析条件：
高速液体クロマトグラフ装置：ＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）
（ＵＶ検出器波長250nm、カラム温度40℃）
分離カラム                ：SCR-101H (株式会社島津製作所製)
溶離液                    ：0.05 %（容積基準）−リン酸水溶液
アクリロニトリル分析条件：
高速液体クロマトグラフ装置：ＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）
（ＵＶ検出器波長200nm、カラム温度40℃）
分離カラム                ：Wakosil-II 5C18HG (和光純薬製)
溶離液                    ：7%（容積基準）−アセトニトリル、
0.1mＭ−酢酸、0.2mＭ−酢酸ナトリウムを
各濃度で含有する水溶液
アクリルアミド濃度は以下のようにして求めた。市販のアクリルアミドを、純水に溶解して、濃度既知のアクリルアミド水溶液を調製し、ＨＰＬＣにおけるアクリルアミド濃度分析用検量線を作成した。これを用いて、被験液のＨＰＬＣ分析時の面積値を、アクリルアミド濃度に換算した（絶対検量線法）。また、ＨＰＬＣ測定に用いる反応液の量は５μＬであった。なお、各反応液の密度の影響はほとんどないため、このようにしてアクリルアミド濃度（重量％）が得られた。【００５８】
この反応を２日目に分析を実施して以降さらに約４日間継続した。この約４日間で約７５００ｇの反応液（反応液（Ｉ））が得られた。これに対し、活性炭（三倉化成（株）製  粉状活性炭ＰＭ−ＳＸ）を３０ｇ添加し、０．５重量％−アクリル酸水溶液を１６０ｇを加えた後、１Ｍ−ＮａＯＨ水溶液でｐＨを５に調整した。これを２５℃で５時間撹拌を実施したあと、濾紙にて濾過を行い、活性炭を除去した。その後、活性炭に付着したアクリルアミドを回収するため、３００ｇの純水で活性炭を洗浄し、先の活性炭処理液と混合して、１Ｍ−ＮａＯＨ水溶液で中和し、ｐＨを７として約７９００ｇの製品（水溶液（II））を得た。この活性炭処理後の製品（水溶液（II））中の最終アクリルアミド濃度は、５０．６重量％であり、目標濃度である５０．０重量％を上まわった。【００５９】
［比較例１］
実施例１において、アクリロニトリルの供給量を３０ｇ／ｈ、純水の供給量を３９ｇ／ｈとした以外は、全て同様に実施した。その結果、得られた反応液中のアクリルアミド濃度は、５０．２重量％であった。これを活性炭処理した後の製品（水溶液）中の最終アクリルアミド濃度は４７．１重量％で、目標の５０．０重量％を下回った。このため、最終製品中での濃度にするための工程、たとえば、水の蒸留などによる除去工程を行う必要が生じた。
【国際調査報告】
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