(57)【要約】  偶数糖又は奇数糖の含量比を調節したＣＨ画分を簡便かつ安価に工業的スケールで製造することができる、グルクロン酸供与体、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で０.０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で０．５分間〜４時間反応させるステップを少なくとも含む下記一般式（１）で示されるコンドロイチンを５０％超含有する画分の製造方法。同様の条件で１０時間以上反応させるステップを少なくとも含む下記一般式（２）で示されるコンドロイチンを５０％超含有する画分の製造方法が提供される。(GalNAc−GlcA)ｎ        ・・・（１）GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ・・・（２）（式中、GlcAはグルクロン酸残基、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基、−はグリコシド結合、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルクロン酸供与体、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、０．５分間〜４時間反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（１）で示されるコンドロイチンを５０％超含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)ｎ    ・・・・（１）
（式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
【請求項２】
反応が、２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、１０分間〜３時間行われることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
反応が、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、１０分間〜２時間行われることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
反応が、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、１０分間〜２時間行われることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
反応が、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１０分間〜２時間行われることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
反応が、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１０分間〜１時間行われることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
グルクロン酸供与体、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件１〜３を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（１）で示されるコンドロイチンを５０％超含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件１：グルクロン酸供与体、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、５時間反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比をＸとする。ここで「コンドロイチン含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるコンドロイチンの分子数」／「上記一般式（２）で示されるコンドロイチンの分子数」の比を意味するものとする。
条件２：条件１における「３０℃かつｐＨ７．２」を、「大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比がＸとなる反応時間をＹとする。
条件３：条件２と同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも短い時間で反応させる。
【請求項８】
グルクロン酸供与体、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、１０時間以上反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（２）で示されるコンドロイチンを５０％超含有する画分の製造方法。
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（式中、GlcAはＤ−グルクロン酸残基を、GalNAcはＤ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
【請求項９】
反応が、２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、１０時間〜３０時間行われることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
反応が、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、１２時間〜２４時間行われることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１１】
反応が、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、１２時間〜２４時間行われることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１２】
反応が、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１２時間〜２４時間行われることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１３】
反応が、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１５時間〜２０時間行われることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１４】
グルクロン酸供与体、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件４〜６を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（２）で示されるコンドロイチンを５０％超含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件４：グルクロン酸供与体、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、８時間反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比をＸとする。ここで「コンドロイチン含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるコンドロイチンの分子数」／「上記一般式（２）で示されるコンドロイチンの分子数」の比を意味するものとする。
条件５：条件４における「３０℃かつｐＨ７．２」を、「大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比がＸとなる反応時間をＹとする。
条件６：条件５と同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。
【請求項１５】
グルクロン酸供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件Ａ〜Ｃを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（１）で示されるコンドロイチンを実質的に１００％含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件Ａ：グルクロン酸供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、０．５時間反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比をＸとする。ここで「コンドロイチン含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるコンドロイチンの分子数」／「上記一般式（２）で示されるコンドロイチンの分子数」の比を意味するものとする。
条件Ｂ：条件Ａにおける「３０℃かつｐＨ７．２」を、「大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比がＸとなる反応時間をＹとする。
条件Ｃ：条件Ｂと同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。
【請求項１６】
Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件Ｄ〜Ｆを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（２）で示されるコンドロイチンを実質的に１００％含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件Ｄ：Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、０．５時間反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比をＸとする。ここで「コンドロイチン含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるコンドロイチンの分子数」／「上記一般式（２）で示されるコンドロイチンの分子数」の比を意味するものとする。
条件Ｅ：条件Ｄにおける「３０℃かつｐＨ７．２」を、「大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比がＸとなる反応時間をＹとする。
条件Ｆ：条件Ｅと同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。
【請求項１７】
Ｍｎ２＋の濃度が１０〜３０ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
Ｍｎ２＋の濃度が１５〜２５ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
Ｍｎ２＋の濃度が２０ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２０】
グルクロン酸供与体、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で０．０２〜２ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で５時間以上反応させるステップを少なくとも含む下記一般式（１）及び（２）で示されるコンドロイチンが含有比（（１）：（２））として４５：５５〜５５：４５で含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
【請求項２１】
反応が、２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、１０〜３０時間反応させることを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
反応が、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、１２〜２４時間反応させることを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２３】
反応が、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、１２〜２４時間反応させることを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２４】
反応が、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１２〜２４時間反応させることを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２５】
反応が、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１５〜１８時間反応させることを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２６】
Ｍｎ２＋の濃度が０．１〜１ ｍＭであることを特徴とする、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２７】
Ｍｎ２＋の濃度が０．２ｍＭであることを特徴とする、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２８】
グルクロン酸供与体及び／又はＮ−アセチルガラクトサミン供与体、並びに糖受容体、大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及びＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で反応させるステップを少なくとも含む下記一般式（１）及び（２）で示されるコンドロイチンを所望の含有比で含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン骨格を有する偶数糖画分又は奇数糖画分の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書において用いる略号を説明する。
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＧｌｃＡ：グルクロン酸
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＨＡ：ヒアルロン酸
Ｋ４ＣＰ：大腸菌Ｋ４株由来コンドロイチンポリメラーゼ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ: Matrix Assisted Laser
Desorption−飛行時間型−質量分析
ＵＤＰ：ウリジン５’−ジリン酸
ＣＨは、ＧｌｃＡ及びＧａｌＮＡｃがそれぞれβ１−３結合及びβ１−４結合で交互に直線上に結合したグリコサミノグリカンの１種である。ＣＨは、動物生体内において軟骨や多くの結合組織にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして存在しており、細胞接着、発生、分化、神経細胞伸展、軟骨・骨形成、組織再生などに重要な役割を担っている。ＣＳは、医薬品や健康食品等に有用な物質として市販されている。【０００３】
ＣＨの還元末端は、通常、プロテオグリカンのコア蛋白質に結合しており、蛋白質のセリン残基からキシロース−ガラクトース−ガラクトース−ＧｌｃＡからなるいわゆる結合領域４糖を介して、ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃの繰り返し二糖単位が連なっている。しかし、その非還元末端は未だ確定されてはいない。市販のＣＳも、酸処理や酵素処理等によって還元末端がＧａｌＮＡｃ残基、非還元末端がＧｌｃＡ残基である場合が多いと考えられるが、製造過程のロットによっても異なり、混在した構造のものが市販されているのが現状である。【０００４】
動物由来のＣＨポリメラーゼはクローニングされてはいるが、この酵素単独ではＣＨの合成活性を有さず、また活性も弱いため、工業的にＣＨ糖鎖を効率よく製造するには十分とはいえない。一方、Ｋ４ＣＰもクローニングされており、この酵素は単独でＣＨの合成活性を有し、この酵素を使って効率よくＣＨが製造できることが知られている（特許文献１、非特許文献１）。しかし、Ｋ４ＣＰを用いてＣＨの非還元末端糖残基を調節したり、生産物中の偶数糖と奇数糖との含量比を調節すること等については記載も示唆もない。【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１９９５８３号公報
【非特許文献１】ニノミヤ、Ｔ（Ninomiya, T.）ら、２００２年、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第２７７巻、第２４号、ｐ．２１５６７−２１５７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＣＨにおける非還元末端糖残基を合成過程で極めて簡便な方法で調節することにより、偶数糖（非還元末端糖残基がＧｌｃＡ残基であるＣＨ）又は奇数糖（非還元末端糖残基がＧａｌＮＡｃ残基であるＣＨ）の含量比を調節したＣＨ画分を簡便かつ安価に工業的スケールで製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｋ４ＣＰを用い、その酵素反応時間を調節することによって、ＧｌｃＡ残基又はＧａｌＮＡｃ残基のいずれか一方を非還元末端糖残基として多く含有するＣＨ画分を製造することができること並びに反応時におけるＭｎ２＋の濃度を調節することによりＧｌｃＡ残基及びＧａｌＮＡｃ残基を同等程度含む画分を製造することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、０．５分間〜４時間反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有する画分の製造方法（以下「本発明方法１」という。）を提供する。
(GlcA−GalNAc)ｎ    ・・・・（１）
（式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
なかでも、上記の反応が２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、１０分間〜３時間行われることが好ましく、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、１０分間〜２時間行われることがより好ましく、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、１０分間〜２時間行われることがさらに好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１０分間〜２時間行われることが特に好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１０分間〜１時間行われることが極めて好ましい。【０００９】
そのなかでも、上記の反応が２０℃〜３７℃かつｐＨ６〜８の条件で、０．５時間〜４時間行われることが好ましく、２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、０．５時間〜３時間行われることが好ましく、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、０．５時間〜２時間行われることがより好ましく、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、０．５時間〜２時間行われることがさらに好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、０．５時間〜２時間行われることが特に好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、０．５時間〜１時間行われることが極めて好ましい。【００１０】
またＭｎ２＋濃度は、上記条件において、０．０２〜３５ｍＭであることが好ましく、０．２〜３５ｍＭであることがより好ましい。【００１１】
そのなかでも５〜３５ｍＭであることが好ましく、１０〜３０ ｍＭであることがより好ましく、１５〜２５ ｍＭであることがさらに好ましく、２０ｍＭであることが極めて好ましい。【００１２】
また本発明は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件１〜３を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有する画分の製造方法（以下「本発明方法２」という。）を提供する。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件１：ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、５時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「上記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００１３】
条件２：条件１における「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００１４】
条件３：条件２と同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも短い時間で反応させる。【００１５】
また本発明は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、１０時間以上反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有する画分の製造方法（以下「本発明方法３」という。）を提供する。
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
なかでも、上記の反応が、２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、１０時間〜３０時間行われることが好ましく、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、１２時間〜２４時間行われることがより好ましく、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、１２時間〜２４時間行われることがさらに好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１２時間〜２４時間行われることが特に好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１５時間〜２０時間行われることが極めて好ましい。【００１６】
またＭｎ２＋濃度は、上記条件において５〜３５ｍＭであることが好ましく、１０〜３０ｍＭであることがより好ましく、１５〜２５ｍＭであることがさらに好ましく、２０ｍＭであることが極めて好ましい。【００１７】
また本発明は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件４〜６を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有する画分の製造方法（以下「本発明方法４」という。）を提供する。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件４：ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、８時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「上記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００１８】
条件５：条件４における「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００１９】
条件６：条件５と同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。【００２０】
また本発明は、ＧｌｃＡ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件Ａ〜Ｃを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（１）で示されるＣＨを実質的に１００％含有する画分の製造方法（以下「本発明方法５」という。）を提供する。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件Ａ：ＧｌｃＡ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、０．５時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「上記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００２１】
条件Ｂ：条件Ａにおける「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００２２】
条件Ｃ：条件Ｂと同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。【００２３】
また本発明は、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件Ｄ〜Ｆを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（２）で示されるＣＨを実質的に１００％含有する画分の製造方法（以下「本発明方法６」という。）を提供する。
(GlcA−GalNAc)ｎ      ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件Ｄ：ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、０．５時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「上記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００２４】
条件Ｅ：条件Ｄにおける「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００２５】
条件Ｆ：条件Ｅと同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。【００２６】
また本発明は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜２ ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で５時間以上反応させるステップを少なくとも含む下記一般式（１）及び（２）で示されるＣＨが含有比（（１）：（２））として４５：５５〜５５：４５で含有する画分の製造方法（以下、「本発明方法７」という。）を提供する。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
なかでも、上記の反応が２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、１０〜３０時間行われることが好ましく、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、１２〜２４時間行われることがより好ましく、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、１２〜２４時間行われることがさらに好ましく、さらに２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１２時間〜２４時間行われることがより好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１５時間〜１８時間行われることが極めて好ましい。【００２７】
またＭｎ２＋濃度は、上記条件において０．１〜１ｍＭであることがより好ましく、０．２ ｍＭであることがさらに好ましい。【００２８】
また本発明は、ＧｌｃＡ供与体及び／又はＧａｌＮＡｃ供与体、並びに糖受容体、Ｋ４ＣＰ及びＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で反応させるステップを少なくとも含む下記一般式（１）及び（２）で示されるコンドロイチンを所望の含有比で含有する画分の製造方法（以下、「本発明方法８」という。）を提供する。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）【００２９】
以下、本発明方法１〜８をまとめて単に「本発明方法」という。
【発明の効果】
【００３０】
本発明方法は、偶数糖（非還元末端糖残基がＧｌｃＡ残基であるＣＨ）又は奇数糖（非還元末端糖残基がＧａｌＮＡｃ残基であるＣＨ）を多く含むＣＨ画分、偶数糖及び奇数糖の含量比が同等量であるＣＨ画分、並びに偶数糖及び奇数糖を所望の比率で含むＣＨ画分を簡便かつ安価に工業的スケールで製造できることから極めて有用である。【００３１】
本発明方法により製造される画分中のＣＨの還元末端糖が異なる糖鎖は、硫酸基転移酵素などの修飾反応性が異なったり、生理活性が異なることが期待されることから、医薬品の製造等に有用であり、特定の還元末端糖を有するＣＨを優勢に、あるいは所望の比率で含むＣＨ画分を製造し得る本発明方法は医薬品の製造等に利用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。なお、本出願書類における「％」は、特に断らない限り「モル％」を意味する。また本出願書類において示す諸性質は、特に断らない限り、本明細書中の実施例に記載した分析方法によって決定されるものである。【００３３】
以下、本発明方法１〜８に分けて説明する。
＜１＞本発明方法１
本発明方法１は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、０．５分間〜４時間反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)ｎ    ・・・・（１）
（式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数（本明細書において「整数」は正の整数を意味する）をそれぞれ示す。）
本発明方法において用いる「ＧｌｃＡ供与体」は、ある糖鎖分子に対してＧｌｃＡ残基を供与する能力を有する分子である限りにおいて限定されないが、ＧｌｃＡヌクレオチドが好ましい。ＧｌｃＡヌクレオチドとしては、ＵＤＰ-ＧｌｃＡや、ｄＴＤＰ（デオキシチミジン５'−ジリン酸）−ＧｌｃＡ等が例示されるが、ＵＤＰ−ＧｌｃＡが好ましい。【００３４】
また本発明方法において用いる「ＧａｌＮＡｃ供与体」は、ある糖鎖分子に対してＧａｌＮＡｃ残基を供与する能力を有する分子である限りにおいて限定されないが、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドが好ましい。ＧａｌＮＡｃヌクレオチドとしては、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃや、ｄＴＤＰ（デオキシチミジン５'−ジリン酸）−ＧａｌＮＡｃ等が例示されるが、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが好ましい。【００３５】
これらの糖ヌクレオチドは、公知の方法で製造しても良く、市販のものを用いても良い。【００３６】
また、本発明方法において用いる「糖受容体」は、下記一般式（３）又は（４）で示される糖鎖である限りにおいて限定されない。
GlcA−GalNAc−R1    ・・・・（３）
GalNAc−GlcA−R2    ・・・・（４）
（各式中、−はグリコシド結合を、Ｒ１及びＲ２は、同一でも異なっていてもよい任意の基をそれぞれ示す。）
「Ｒ１」や「Ｒ２」としては、例えば、ＣＨ骨格を有する糖鎖の残基や、ＨＡ骨格を有する糖鎖の残基等が例示される。ＣＨ骨格を有する糖鎖の残基としては、ＣＨ残基やＣＳ残基等が例示される。そのサイズも特に限定されない。【００３７】
一般式（３）又は（４）で示される糖受容体中のＲ１及びＲ２としては、具体的には、ＣＨの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などのＣＨオリゴ糖から高分子のＣＨまで、ＣＳの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などのＣＳオリゴ糖から高分子のＣＳまで、ＨＡの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などのＨＡオリゴ糖から高分子のＨＡまで、幅広く用いることができる。【００３８】
このような糖受容体は、公知の方法で製造することもでき、市販のものを用いることもできる。
なお、本発明方法により製造される画分中の一般式（１）又は（２）で示されるＣＨは、上記糖受容体に由来するＲ１又はＲ２を鎖端に有するＣＨ分子も包含するものとする。【００３９】
また、本発明方法において用いる「Ｍｎ２＋」とは溶液においてＭｎ２＋として存在しかつＫ４ＣＰ酵素反応を阻害することが無ければ特には限定されず、例えばＭｎＣｌ２を用いることができる。【００４０】
また、本発明方法において用いる「Ｋ４ＣＰ」は、前記の非特許文献１及び特許文献１に記載された方法によって取得することができる。このＫ４ＣＰは、ＣＨを受容体基質とし、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ等）及びＧｌｃＡヌクレオチド（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ等）を供与体基質として反応させると、受容体基質の非還元末端がＧｌｃＡ残基の場合には当該末端にＧａｌＮＡｃを、非還元末端がＧａｌＮＡｃ残基の場合には当該末端にＧｌｃＡを結合させることによりＧａｌＮＡｃとＧｌｃＡを交互に結合させて、ＣＨを伸長させるポリメラーゼである（非特許文献１、特許文献１）。【００４１】
Ｋ４ＣＰの濃度としては、Ｋ４ＣＰの活性が十分に得られる限り特に限定されないが、反応系中のＫ４ＣＰの終濃度として、例えば０．０１〜５０００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌ程度である。【００４２】
本発明方法１は、これらのＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて反応させるステップを少なくとも含んでいる。【００４３】
ここにいう「共存」とは、これらの供与体分子、糖受容体分子、Ｍｎ２＋及びＫ４ＣＰ分子が相互に接触する状態である限りにおいて特に限定されない。例えば、これらを溶液中で共存させてもよく、Ｋ４ＣＰを適当な固相（ビーズ、限外濾過膜、透析膜等）に固着させこれに前記の供与体及び受容体を含有する溶液を連続的に接触させることにより共存させてもよい。したがって、例えばカラム型のリアクターや、膜型リアクター等を採用することもできる。また、ＰＣＴ国際公開パンフレットＷＯ００／２７４３７号に記載された方法と同様に、受容体を固相に固着させて酵素反応させることもできる。さらに、供与体を再生（合成）するバイオリアクター等を組み合わせてもよい。【００４４】
これらを共存させて行う「反応」は、Ｋ４ＣＰによる酵素反応を意味する。この反応は、２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、０．５分間〜４時間行われる限りにおいて特に限定されない。【００４５】
なかでも、上記の反応が２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、１０分間〜３時間行われることが好ましく、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、１０分間〜２時間行われることがより好ましく、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、１０分間〜２時間行われることがさらに好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１０分間〜２時間行われることが特に好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１０分間〜１時間行われることが極めて好ましい。【００４６】
また、そのなかでも２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、０．５時間〜４時間行われることが好ましく、２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、０．５時間〜３時間行われることが好ましく、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、０．５時間〜２時間行われることがより好ましく、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、０．５時間〜２時間行われることがさらに好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、０．５時間〜２時間行われることが特に好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、０．５時間〜１時間行われることが極めて好ましい。【００４７】
またＭｎ２＋濃度は、上記条件において、０．０２〜３５ｍＭであることが好ましく、０．２〜３５ｍＭであることがより好ましい。【００４８】
そのなかでも５〜３５ｍＭであることが好ましく、１０〜３０ｍＭであることがより好ましく、１５〜２５ｍＭであることがさらに好ましく、２０ｍＭであることが極めて好ましい。【００４９】
この反応は、温度及びｐＨを一定に保持して行うことが好ましい。ｐＨを一定に保持するために、この反応は当該ｐＨ領域において緩衝作用を有する緩衝溶液中で行うことが好ましい。【００５０】
このような条件の下で前記の供与体、受容体、Ｍｎ２＋及びＫ４ＣＰを共存させて反応させるステップを経ることにより、下記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有する画分が得られる。
(GlcA−GalNAc)ｎ    ・・・・（１）
（式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
ここで「上記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有する」とは、上記一般式（１）で示されるＣＨと下記一般式（２）で示されるＣＨの分子数の総和に対して、上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数が５０％を超えて含有されていることを意味する。すなわち、画分中における上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数が、下記一般式（２）で示されるＣＨの分子数よりも多く含有されていることを意味する。
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）【００５１】
上記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有するか否かは、得られた画分をＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ―ＭＳを用いて分析し、上記一般式（１）で示されるＣＨと上記一般式（２）で示されるＣＨのそれぞれのスペクトルのピーク強度に基づいて確認することができる。この具体的な方法については後述の実施例を参照されたい。【００５２】
また本発明方法によって製造される「画分」は、その状態も特に限定されず、溶液状態であっても、固体の状態（粉末等や、溶液が凍結した状態等）等であってもよい。【００５３】
また本発明方法においては、それぞれの本発明方法に示されている各ステップをそれぞれ少なくとも含んでいればよく、他のステップをさらに含んでいてもよい。例えば、前記一般式（１）で示されるＣＨと前記一般式（２）で示されるＣＨとを分離するステップや、上記一般式（１）で示されるＣＨのみを精製するステップ等をさらに含んでいてもよい。【００５４】
また本発明方法は、ＧｌｃＡ供与体及び／又はＧａｌＮＡｃ供与体、並びに糖受容体、Ｋ４ＣＰ及びＭｎ２＋を共存させ、これを所定の温度、ｐＨ条件および反応時間で反応させるステップの後に、さらにＧｌｃＡ供与体及び／又はＧａｌＮＡｃ供与体を添加し、同様の条件で反応させるステップを含んでいてもよい。これにより所望の比率で一般式（１）及び（２）で示されるＣＨを含有する画分をより効率的に製造し得る。【００５５】
なお本発明方法における「ＧｌｃＡ」及び「ＧａｌＮＡｃ」は、それぞれＤ−グルクロン酸及びＤ−Ｎ−アセチルガラクトサミンであることが好ましい。また、本発明方法の一般式において示されるＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃとの間のグリコシド結合（GlcA−GalNAc）はβ１−３結合であることが好ましく、ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＡとの間のグリコシド結合（GalNAc−GlcA）はβ１−４結合であることが好ましい。
また、本発明方法における「ＧｌｃＡ供与体」、「ＧａｌＮＡｃ供与体」、「糖受容体」、「Ｍｎ２＋」及び「Ｋ４ＣＰ」について、並びに「共存」、「反応」及び「画分」等の用語の意味は上記と同じである。【００５６】
＜２＞本発明方法２
本発明方法２は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件１：ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、５時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「上記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００５７】
条件２：条件１における「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００５８】
条件３：条件２と同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも短い時間で反応させる。【００５９】
なお、本発明方法２で用いることができる「ＧｌｃＡ供与体」、「ＧａｌＮＡｃ供与体」、「糖受容体」、「Ｍｎ２＋」及び「Ｋ４ＣＰ」について、並びに「共存」、「反応」及び「画分」等の用語の意義は、前記の本発明方法１における説明と同じである。【００６０】
本発明方法２においては、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件１〜３を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含むことを特徴とする。以下、各条件ごとに説明する。【００６１】
条件１：ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、５時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「前記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「前記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００６２】
ここにいう「前記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」及び「前記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」は、生成した画分についてＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ―ＭＳを用いて分析し、前記一般式（１）で示されるＣＨと前記一般式（２）で示されるＣＨのそれぞれのスペクトルのピーク強度に基づいて分析することができる。この具体的な方法については後述の実施例を参照されたい。【００６３】
条件２：条件１における「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００６４】
例えば、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」を「３５℃かつｐＨ７．０」に設定し、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で２０ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、５時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比（Ｘ）が０．５であったとする。この場合、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で２０ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３５℃かつｐＨ７．０の条件で反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比（Ｘ）が０．５となる反応時間（Ｙ）を求めればよい。【００６５】
条件３：条件２と同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも短い時間で反応させる。【００６６】
例えば前記の例において、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で２０ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．０の条件で反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比（Ｘ）が０．５となる反応時間（Ｙ）が２．５時間であった場合には、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で２０ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．０の条件で２．５時間よりも短い時間で反応させることにより、前記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有する画分を製造することができる。【００６７】
より具体的には、Ｙよりも、例えば１０分〜２．４時間、好ましくは３０分〜２．２時間、より好ましくは１時間〜２時間、短い時間で反応させる。【００６８】
なお、「前記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有する」の意義、及び、前記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有するか否かの確認の方法も、前記の本発明方法１における説明と同じである。【００６９】
またＭｎ２＋濃度は、上記条件において５〜１００ｍＭであることが好ましく、１０〜３０ｍＭであることがより好ましく、１５〜２５ｍＭであることがさらに好ましく、２０ｍＭであることが極めて好ましい。【００７０】
＜３＞本発明方法３
本発明方法３は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、１０時間以上反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有する画分の製造方法である。
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
なお、本発明方法３で用いることができる「ＧｌｃＡ供与体」、「ＧａｌＮＡｃ供与体」、「糖受容体」、「Ｍｎ２＋」及び「Ｋ４ＣＰ」について、並びに「共存」、「反応」及び「画分」等の用語の意義は、前記の本発明方法１における説明と同じである。【００７１】
また、「前記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有する」とは、前記一般式（２）で示されるＣＨと下記一般式（１）で示されるＣＨの分子数の総和に対して、前記一般式（２）で示されるＣＨの分子数が５０％を超えて含有されていることを意味する。すなわち、画分中における前記一般式（２）で示されるＣＨの分子数が、下記一般式（１）で示されるＣＨの分子数よりも多く含有されていることを意味する。
(GlcA−GalNAc)ｎ    ・・・・（１）
（式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
なお、前記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有するか否かの確認の方法も、前記の本発明方法１における説明と同様である。【００７２】
本発明方法３における反応は、２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、１０時間以上行われる限りにおいて特に限定されない。なかでも、２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、１０時間〜３０時間行われることが好ましく、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、１２時間〜２４時間行われることがより好ましく、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、１２時間〜２４時間行われることがさらに好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１２時間〜２４時間行われることが特に好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１５時間〜２０時間行われることが極めて好ましい。【００７３】
またＭｎ２＋濃度は、上記条件において５〜３５ｍＭであることが好ましく、１０〜３０ｍＭであることがより好ましく、１５〜２５ｍＭであることがさらに好ましく、２０ｍＭであることが極めて好ましい。【００７４】
またこの反応は、温度及びｐＨを一定に保持して行うことが好ましい。ｐＨを一定に保持するために、この反応は当該ｐＨ領域において緩衝作用を有する緩衝溶液中で行うことが好ましい点も、前記の本発明方法１と同様である。【００７５】
＜４＞本発明方法４
本発明方法４は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件４〜６を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件４：ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、８時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「上記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００７６】
条件５：条件４における「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００７７】
条件６：条件５と同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。【００７８】
なお、本発明方法４で用いることができる「ＧｌｃＡ供与体」、「ＧａｌＮＡｃ供与体」、「糖受容体」、「Ｍｎ２＋」及び「Ｋ４ＣＰ」について、並びに「共存」、「反応」及び「画分」等の用語の意義は、前記の本発明方法１における説明と同じである。【００７９】
本発明方法４においては、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含むことを特徴とする。以下、各条件ごとに説明する。【００８０】
条件４：ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で５〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、８時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「上記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００８１】
ここにいう「前記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」及び「前記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」は、前記の本発明方法２と同様に分析することができる。【００８２】
条件５：条件４における「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００８３】
例えば、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」を「３５℃かつｐＨ７．０」に設定し、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で２０ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、８時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比（Ｘ）が０．５であったとする。この場合、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で２０ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３５℃かつｐＨ７．０の条件で反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比（Ｘ）が０．５となる反応時間（Ｙ）を求めればよい。【００８４】
条件６：条件５と同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。【００８５】
例えば前記の例において、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で２０ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３５℃かつｐＨ７．０の条件で反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比（Ｘ）が０．５となる反応時間（Ｙ）が６時間であった場合には、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で２０ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３５℃かつｐＨ７．０の条件で６時間よりも長い時間で反応させることにより、前記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有する画分を製造することができる。【００８６】
より具体的には、Ｙよりも、例えば４時間〜２４時間、好ましくは５時間〜２１時間、より好ましくは６時間〜１８時間、長い時間で反応させる。【００８７】
なお、「前記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有する」の意義、及び、前記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有するか否かの確認の方法は、前記の本発明方法３における説明と同じである。【００８８】
またＭｎ２＋濃度は、上記条件において５〜３５ｍＭであることが好ましく、１０〜３０ｍＭであることがより好ましく、１５〜２５ｍＭであることがさらに好ましく、２０ｍＭであることが極めて好ましい。【００８９】
＜５＞本発明方法５
本発明方法５は、ＧｌｃＡ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件Ａ〜Ｃを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（１）で示されるＣＨを実質的に１００％含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件Ａ：ＧｌｃＡ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、０．５時間反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「上記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００９０】
条件Ｂ：条件Ａにおける「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００９１】
条件Ｃ：条件Ｂと同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。
Ｍｎ２＋濃度は、上記条件において５〜１００ｍＭであることが好ましく、１０〜３０ｍＭであることがより好ましく、１５〜２５ｍＭであることがさらに好ましく、２０ｍＭであることが極めて好ましい。【００９２】
なお、本出願書類において用いる「実質的に１００％含有する」とは、当該画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて分析してスペクトルを得たときに、所定のＣＨに相当するピークのみが観測され、他のＣＨに相当するピークが観測されないことを意味する。例えば「上記一般式（１）で示されるＣＨを実質的に１００％含有する」とは、上記一般式（１）で示されるＣＨのピークのみが観測され、上記一般式（２）で示されるＣＨのピークが観測されないことをいう【００９３】
なお、本発明方法５で用いることができる「ＧｌｃＡ供与体」、「糖受容体」、「Ｍｎ２＋」及び「Ｋ４ＣＰ」について、並びに「共存」、「反応」及び「画分」等の用語の意義は、前記の本発明方法１における説明と同じである。ただし、本発明方法５における「糖受容体」は、前記一般式（３）又は（４）で示される糖鎖の混合物であることが好ましい。このような混合物としては、例えば、非還元末端構造が不揃いなＣＨの画分や、非還元末端構造が不揃いなＣＳの画分を化学的に脱硫酸化したＣＨの画分、Ｋ４ＣＰなどのＣＨ合成酵素により製造された非還元末端構造が不揃いなＣＨの画分等が例示される。【００９４】
なお、条件Ａ〜Ｃにおける用語の意義等は、前記と同様である。
また本発明方法５において、「Ｙよりも長い時間」とは、具体的には、Ｙよりも、例えば１０分〜２４時間、好ましくは３０分〜１８時間、より好ましくは３０分〜５時間、長い時間である。【００９５】
＜６＞本発明方法６
本発明方法６は、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、下記条件Ｄ〜Ｆを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式（２）で示されるＣＨを実質的に１００％含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
（条件）
条件Ｄ：ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜１００ｍＭのＭｎ２＋を共存させて３０℃かつｐＨ７．２の条件で、０．５時間反応させたときに生成するＣＨ含量比をＸとする。ここで「ＣＨ含量比」とは、「上記一般式（１）で示されるＣＨの分子数」／「上記一般式（２）で示されるＣＨの分子数」の比を意味するものとする。【００９６】
条件Ｅ：条件Ｄにおける「３０℃かつｐＨ７．２」を、「Ｋ４ＣＰが作用する任意の温度かつｐＨ」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のＣＨ含量比がＸとなる反応時間をＹとする。【００９７】
条件Ｆ：条件Ｅと同一の温度かつｐＨにおいて、Ｙよりも長い時間で反応させる。
Ｍｎ２＋濃度は、上記条件において５〜１００ｍＭであることが好ましく、１０〜３０ｍＭであることがより好ましく、１５〜２５ｍＭであることがさらに好ましく、２０ｍＭであることが極めて好ましい。【００９８】
なお、本発明方法６で用いることができる「ＧａｌＮＡｃ供与体」、「糖受容体」、「Ｍｎ２＋」及び「Ｋ４ＣＰ」について、並びに「共存」、「反応」及び「画分」等の用語の意義は、前記の本発明方法１における説明と同じである。ただし、本発明方法６における「糖受容体」は、本発明方法５と同様に、前記一般式（３）又は（４）で示される糖鎖の混合物であることが好ましい。このような混合物としては、例えば、非還元末端構造が不揃いなＣＨの画分や、非還元末端構造が不揃いなＣＳの画分を化学的に脱硫酸化したＣＨの画分、Ｋ４ＣＰなどのＣＨ合成酵素により製造された非還元末端構造が不揃いなＣＨの画分等が例示される。【００９９】
なお、条件Ｄ〜Ｆにおける用語の意義等は、前記と同様である。
また本発明方法６において、「Ｙよりも長い時間」とは、具体的には、Ｙよりも、例えば１０分〜２４時間、好ましくは３０分〜１８時間、より好ましくは３０分〜５時間、長い時間である。【０１００】
＜７＞本発明方法７
本発明方法７は、ＧｌｃＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、糖受容体、Ｋ４ＣＰ及び終濃度で０．０２〜２ ｍＭのＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で、５時間以上反応させるステップを少なくとも含む下記一般式（１）及び（２）で示されるＣＨが含有比（（１）：（２））として４５：５５〜５５：４５で含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）
本発明方法７における反応は、２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で５時間以上反応させるステップが含まれている限りにおいて特に限定されない。【０１０１】
なかでも、上記の反応が２２℃〜３７℃かつｐＨ６．２〜７．８の条件で、１０〜３０時間行われることが好ましく、２４℃〜３５℃かつｐＨ６．５〜７．８の条件で、１２〜２４時間行われることがより好ましく、２６℃〜３５℃かつｐＨ６．８〜７．６の条件で、１２〜２４時間行われることがさらに好ましく、さらに２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１２時間〜２４時間行われることがより好ましく、２８℃〜３２℃かつｐＨ７〜７．５の条件で、１５時間〜１８時間行われることが極めて好ましい。【０１０２】
またＭｎ２＋濃度は、上記条件において０．１〜１ｍＭであることがより好ましく、０．２ ｍＭであることがさらに好ましい。【０１０３】
またこの反応は、温度及びｐＨを一定に保持して行うことが好ましい。ｐＨを一定に保持するために、この反応は当該ｐＨ領域において緩衝作用を有する緩衝溶液中で行うことが好ましい点も、前記の本発明方法１と同様である。【０１０４】
なお、本発明方法７で用いることができる「ＧｌｃＡ供与体」、「ＧａｌＮＡｃ供与体」、「糖受容体」、「Ｍｎ２＋」及び「Ｋ４ＣＰ」について、並びに「共存」、「反応」及び「画分」等の用語の意義は、前記の本発明方法１における説明と同じである。【０１０５】
＜８＞本発明方法８
本発明方法８は、ＧｌｃＡ供与体及び／又はＧａｌＮＡｃ供与体、並びに糖受容体、Ｋ４ＣＰ及びＭｎ２＋を共存させ、これを２０℃〜４０℃かつｐＨ６〜８の条件で反応させるステップを少なくとも含む下記一般式（１）及び（２）で示されるコンドロイチンを所望の含有比で含有する画分の製造方法であるを提供する。
(GlcA−GalNAc)ｎ          ・・・・（１）
GalNAc−(GlcA−GalNAc)ｎ  ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、ｎは任意の整数をそれぞれ示す。）【０１０６】
上記本発明方法１〜７で示したとおり、一定の反応温度、ｐＨとしたＧｌｃＡ供与体及び／又はＧａｌＮＡｃ供与体、並びに糖受容体、Ｋ４ＣＰ及びＭｎ２＋を共存させた反応において、反応時間を変化させると、生成される画分中の一般式（１）及び（２）で示されるＣＨの比率が変化する。これにより、反応時間を適宜調整することにより一般式（１）及び（２）で示されるＣＨを所望の比率で含有する画分が得られるものである。【０１０７】
具体的な反応温度、ｐＨ、Ｋ４ＣＰ及びＭｎ２＋濃度については、本発明方法１〜７で示した範囲から適宜選択できる。
本発明方法８の具体的な実施方法としては、反応温度、ｐＨ、Ｍｎ２＋濃度などを一定としてＧｌｃＡ供与体及び／又はＧａｌＮＡｃ供与体、並びに糖受容体を種々の反応時間で反応させ、生成された画分中の一般式（１）及び（２）で示されるＣＨの比率を測定し、所望の比率が得られる反応時間で反応を行うことができる。
【実施例】
【０１０８】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
（１）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ検体用ＣＨ画分の製造
以下の［Ａ］は、反応時間を０．５時間または１時間としたときの、非還元末端が偶数糖である前記一般式（１）で示されるＣＨを５０％超含有するＣＨ画分の製造例である。また以下の［Ｂ］は、反応時間を１８時間としたときの、非還元末端が奇数糖である前記一般式（２）で示されるＣＨを５０％超含有するＣＨ画分の製造例である。
（ＣＨ６糖（CH６）の調製）
ＣＳを化学的に脱硫酸化したＣＨ（生化学工業株式会社製）を羊睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社）で限定分解することによって、非還元末端がＧｌｃＡ残基である偶数糖のオリゴ糖を得た。それらをゲル濾過及びイオン交換カラムにより精製して、ＣＨ６糖(CH6)に相当する画分の集めて、凍結乾燥した。このＣＨ６は使用したヒアルロニダーゼの性質からして明らかに還元末端がＧａｌＮＡｃ残基で非還元末端がＧｌｃＡ残基である６糖である。【０１０９】
［A］上記で調製したＣＨ６（１０ ｎmol）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＡ（それぞれ３００ｎmol） 、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液, ｐＨ７.２、２０ ｍＭ ＭｎＣｌ２並びに０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する酵素反応液（２００ μl）中にK4CP酵素液（特開2003-199583号公報の実施例にしたがって得られた組換え酵素）（３．７５μg 蛋白質相当）を添加した。３０℃で０．５時間又は１時間反応を行い、沸騰水中で１分間熱失活させ、エタノール沈殿後、残渣を蒸留水５０μlに再溶解させた。その溶液を、０．２ Ｍ 酢酸アンモニウムを展開緩衝液とするSuperdex Peptide HR10/30 カラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行い、１ ｍｌ/分の流速で流し、１分間（１ ｍｌ）毎に分画した。得られた画分を凍結乾燥し、各１０μlの蒸留水に再溶解した。過剰のＮａ＋などの陽イオンを除くために少量のDowex ５０ XW８ (H+ form)ゲルに通し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの検体とした。【０１１０】
［B］同様な反応を１８時間掛けて行い、反応液を同様に処理した。
（２）分析
（１）で得られたＣＨに対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ブルカー社製 AutoFlex）による構造解析を行った。分析には発生した陰イオンを検出するネガティブモードを用い、低分子領域（１〜４ｋＤａ）ではリフレクションモードで、高分子領域（３〜１０ｋＤａおよび ５〜２０ｋＤａ）ではリニヤモードで解析した。
（ターゲットの調整）
得られた検体 1 μｌ（２０〜１００ ｐmole ＣＨ 含有）と１０ ｍｇ/ｍｌのＤＨＢ（2,5-dihydroxy-benzoic acid）５０% アセトニトリル−水溶液１ μｌを混合し、その１μl をターゲットプレートにスポットし、速やかに窒素ガスを吹き付け乾燥させた。【０１１１】
(a)０．５時間又は１時間の酵素反応を行った標品のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析
解析結果をそれぞれ図１、図２に示す。ＣＨ６を受容体基質とした０．５時間や１時間の短時間の反応では、生成される糖鎖は比較低分子であることから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析ではリフレクション・ネガティブモードで測定を行いて低分子領域（分子量範囲 1,000−4,000）をスキャンした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳでは１糖ずつ付加した糖鎖生成物がそれぞれしっかり分離されたイオンピークとして検出されＣＨ１０糖：CH10（m/z- = 1912.56）に相当するイオンピークが最も高かった。その前後の糖鎖ピークを比較すると、反応時間が１時間のものの方が０．５時間のものよりも高分子側にシフトしていることが分かる。すなわち、酵素反応の時間経過で糖鎖が伸長されていることが分かる。【０１１２】
また、非還元末端がＧａｌＮＡｃ残基である奇数糖に比べ、非還元末端がＧｌｃＡ残基である偶数糖のイオンピークの方が高かった。また、非還元末端がＧｌｃＡ残基である偶数糖及び非還元末端がＧａｌＮＡｃである奇数糖のそれぞれのイオンピーク強度の値の合計を比較した相対強度は、０．５時間の反応では偶数糖と奇数糖の比は（７７．７：２２．３）となり、一時間の反応では（７５．７：２４．７）であった。ピーク強度と各分子の存在比は相関すると考えられる。したがって、３０℃かつｐＨ７．２の条件で０．５時間若しくは１時間反応させた場合又はこれと同等の条件で反応させた場合には、生成する糖鎖画分は、非還元末端がＧｌｃＡ残基である偶数糖の方が優勢である（分子数が多い）ことがわかった。【０１１３】
(b)１８時間酵素反応を行った標品のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析
解析結果を図３〜図７に示す。Superdex Peptide カラムによる酵素生成物の溶出画分のうち、画分番号１７から画分番号２１までのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析を行った。画分番号２１および画分番号２０ の検体は比較的低分子であったので、分子量範囲1, 000−6,000のリフレクション・ネガティブモードで測定した。画分番号１９および画分番号１８ではリニア・ネガティブモードで高分子領域（3,000−10,000）を測定した。画分番号１７はより高分子の領域（5,000−20,000）をリニア・ネガティブモードで測定した。【０１１４】
それぞれ該当する糖が１糖ずつ付加したＣＨ糖鎖の連続したイオンピークを示し、画分番号２１は１３糖（m/z- = 2494.7）、画分番号２０では１５糖（m/z- =2873.9）、画分番号１９では１９糖（m/z- = 3634.0）、画分番号１８では２７糖（m/z- = 5151.3）、画分番号１７では３７糖（m/z- =7047.9）がそれぞれの最も高いイオンピークであった。画分番号１７のMSスペクトルからは、より高分子のイオンピークが識別でき、最高７１糖（m/z- = 13,000以上）のイオンピークまでが判別可能であった。また、偶数糖及び奇数糖のそれぞれのイオンピーク強度の値の合計を比較すると、溶出時間が１７〜１８分の画分では偶数糖と奇数糖の比が（１４．６：８５．４）となり、溶出時間が１５〜１６分の画分では（２９．１：７０．９）であった。【０１１５】
したがって、３０℃かつｐＨ７．２の条件で長時間（１８時間）反応させた場合又はこれと同等の条件で反応させた場合には、長鎖領域になるほど非還元末端がＧａｌＮＡｃである奇数糖の方が優勢となる（分子数が多い）ことがわかった。【０１１６】
以上のことから、前記条件において反応時間が短いほど、偶数糖が優勢なＣＨ画分が、反応時間が長いほど奇数糖が優勢なＣＨ画分が得られることが明らかになった。【０１１７】
（３）
（Ａ） 非還元末端がＧａｌＮＡｃ残基であるＣＨ画分の製造
ＣＳを化学的に脱硫酸化することにより得られた非還元末端が不揃いなＣＨ（生化学工業株式会社製、平均分子量１万）（1ｍｇ）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（３μmol） 、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液, ｐＨ７.２、２０ ｍＭ ＭｎＣｌ２及び０．１５ Ｍ ＮａＣｌを含有する酵素反応液（５００ μl）中にＫ４ＣＰ酵素液（特開2003-199583号公報の実施例にしたがって得られた組換え酵素）（３７.５μg 蛋白質相当）を添加した。３０℃で１８時間反応を行い、沸騰水中で１分間熱失活させ、エタノール沈殿後、残渣を蒸留水２００μlに再溶解させた。その溶液を、０．２ Ｍ 酢酸アンモニウムを展開緩衝液とするSuperdex ７５ HR10/30 カラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行い、１ｍｌ/分の流速で流し、１分間（１ｍｌ）毎に分画した。得られた画分を凍結乾燥し、各１０μlの蒸留水に再溶解した。その一部を採取し、１ｎmole/μｌ相当の溶液１０μl を調製し、少量のDowex 50 XW8 (H+ form)ゲルに通し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの検体とした。【０１１８】
（Ｂ）非還元末端がＧｌｃＡであるＣＨ画分の製造
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに代えてＵＤＰ−ＧｌｃＡを用いた他は（Ａ）と同じ操作を行って糖鎖画分を調製し、ＭＳ検体液を作製した。
（Ｃ）分析
（Ａ）、（Ｂ）の検体について、前記（２）と同様に質量分析を行った。その結果、イオンピークのm/zから、（Ａ）によって得られた画分中のＣＨは、実質的に全てＧａｌＮＡｃが非還元末端に存在する奇数糖であり、（Ｂ）によって得られた画分中のＣＨは、実質的に全てＧｌｃＡが非還元末端に存在する偶数糖であることが分かった（図８、９）。【０１１９】
（４）
（Ａ） 非還元末端がＧａｌＮＡｃであるＣＨ画分の製造
前記（１）と同様にＣＨ６、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＡを基質とし、Ｋ４ＣＰ酵素を添加して３０℃かつｐＨ７．２の条件で８時間反応を行った後、再度ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを３００ｎmole添加し、再び３０℃で５時間反応させた。沸騰水中で１分間熱失活させ、エタノール沈殿後、残渣を蒸留水２００μlに再溶解させた。その溶液を、０．２ Ｍ 酢酸アンモニウムを展開緩衝液とするSuperdex Peptide HR10/30 カラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行い、１ ｍｌ/分の流速で流し、１分間（１ ｍｌ）毎に分画した。得られた画分を凍結乾燥し、各１０μlの蒸留水に再溶解し、少量のDowex 50 XW8 (H+ form)ゲルに通し、MALDI-TOF-MSの検体とした。
（Ｂ） 非還元末端がＧｌｃＡであるＣＨ画分の製造
再添加する糖ヌクレオチドをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧｌｃＡに代えた他は（Ａ）と同じ操作を行って糖鎖画分を調製し、ＭＳ検体液を作製した。【０１２０】
（Ｃ） 分析
（Ａ）、（Ｂ）の検体について前記（２）と同様に質量分析を行った。その結果、イオンピークのm/zから、（Ａ）によって得られた画分中のＣＨは実質的に全てＧａｌＮＡｃが非還元末端に存在する奇数糖であり、（Ｂ）によって得られた画分中のＣＨは、実質的に全てＧｌｃＡが非還元末端に存在する偶数糖であることが分かった（図１０、１１）。【０１２１】
（５）Ｍｎ２＋濃度の影響
Ｋ４ＣＰ酵素反応におけるＭｎ２＋の影響を検討した。実施例１で調製したＣＨ６（１０
ｎmol）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＡ（それぞれ３００ ｎmol）、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液, ｐＨ７.２並びに０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む溶液に、それぞれＭｎＣｌ２を終濃度が０．００２、０．０２、０．２、２、２０ｍＭとなるように添加し、酵素反応液とした。この各酵素反応液（２００ μl）中にそれぞれK4CP酵素液（３．７５μg 蛋白質相当）を添加した。０．５時間の酵素反応ではＭｎ２＋の濃度が低下するほど酵素活性（産生されるＣＨ量）が低下した（図１２）。次に１８時間後のＭｎ２＋濃度依存性を調べた。ＭｎＣｌ２の濃度が０．００２ｍＭではかなり活性が低い結果になったが、０．２ｍＭの濃度では２０ｍＭの時に比べ１．８倍程度の酵素活性がみられた（図１３）。【０１２２】
次いで、この０．２ｍＭ ＭｎＣｌ２を含む反応液で１８時間反応を行い、得られた生成物を、０．２Ｍ 酢酸アンモニウムを展開緩衝液とするSuperdex ７５ HR10/30カラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行い、１ ｍｌ/分の流速で流し、１分間（１ｍｌ）毎に分画した。得られた画分を凍結乾燥し、各１０μlの蒸留水に再溶解した。その一部を採取し、１ｎmole/μｌ相当の溶液１０μl を調製し、少量のDowex 50 XW8 (H+ form)ゲルに通し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの検体とした。図１４（Ａ）は溶出時間が１７〜１８分の画分におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの解析結果であり（Ｂ）は溶出時間が１５〜１６分の画分におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの解析結果である。これらの結果からわかるようにＭｎＣｌ２の濃度を低下させることにより、偶数糖と奇数糖の割合がほぼ同等となり、より高分子のＣＨ鎖が製造できることがわかる（最高８８糖（m/z- = 16,752）のイオンピークまでが判別可能であった）。また、偶数糖及び奇数糖のそれぞれのイオンピーク強度の値の合計を比較すると、溶出時間が１７〜１８分の画分では偶数糖と奇数糖の比が（４８．５：５１．５）となり、溶出時間が１５〜１６分の画分では（４９．０：５１．０）であった。したがって、Ｍｎ２＋の濃度を調節するとことにより、偶数糖と奇数糖が同等量の画分が製造できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明方法は、ＣＨの非還元末端が調節されたＣＨ画分を製造する方法として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】０．５時間反応後の生成物のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図２】１時間反応後の生成物のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図３】１８時間反応後の生成物の溶出画分（画分番号２１）のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図４】１８時間反応後の生成物の溶出画分（画分番号２０）のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図５】１８時間反応後の生成物の溶出画分（画分番号１９）のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図６】１８時間反応後の生成物の溶出画分（画分番号１８）のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図７】１８時間反応後の生成物の溶出画分（画分番号１７）のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図８】ＣＳを脱硫化したものとＧａｌＮＡｃ供与体とを反応させたときの生成物のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図９】ＣＳを脱硫化したものとＧｌｃＡ供与体とを反応させたときの生成物のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図１０】ＣＨ６から合成したＣＨに対し、ＧａｌＮＡｃ供与体を再度添加して反応させたときの生成物のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図１１】ＣＨ６から合成したＣＨに対し、ＧｌｃＡ供与体を再度添加して反応させたときの生成物のMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図１２】０．５時間反応後のＭｎ２＋濃度を変えたときの酵素活性を示す図である。
【図１３】１８時間反応後のＭｎ２＋濃度を変えたときの酵素活性を示す図である。
【図１４】Ｍｎ２＋濃度が０．２ｍＭで１８時間反応させたときのMALDI-TOF-MSのスペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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