【手続補正書】
【提出日】平成31年3月12日(2019.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列またはその変異配列から選ばれる少なくとも1つのCDR領域を含む、c-Metに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
抗体の重鎖可変領域HCDR配列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7またはSEQ ID NO：8、および、
抗体の軽鎖可変領域LCDR配列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10またはSEQ ID NO：11
【請求項２】
抗体の重鎖可変領域が、下記の配列またはその変異配列から選ばれる少なくとも1つのHCDR領域配列を含む、請求項１に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7およびSEQ ID NO：8
【請求項３】
抗体の軽鎖可変領域が、下記の配列またはその変異配列から選ばれる少なくとも1つのLCDR領域配列を含む、請求項１に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：11
【請求項４】
抗体が、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7およびSEQ ID NO：8の配列として示される重鎖可変領域配列またはその変異配列、ならびにSEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：11の配列として示される軽鎖可変領域配列またはその変異配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
CDR領域の変異配列が、抗体活性を最適化する1〜3個のアミノ酸変異を有する配列であり、HCDR2領域の変異配列は、好ましくはSEQ ID NO：12である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
c-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
マウス抗体の重鎖可変領域配列がSEQ ID NO：4として示される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
マウス抗体の軽鎖可変領域配列がSEQ ID NO：5として示される、請求項６に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
マウス抗体の重鎖可変領域配列がSEQ ID NO：4として示され、マウス抗体の軽鎖可変領域配列がSEQ ID NO：5として示される、請求項６〜８のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ヒト化抗体重鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系列重鎖の、好ましくは、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV 3-33*01に由来する重鎖FR領域を含み、該重鎖FR領域が、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV 3-33*01のFR1、FR2、FR3およびFR4領域のフレームワーク配列またはその変異配列を含む、請求項１０に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ヒト化抗体が、SEQ ID NO：13〜15から選ばれる重鎖可変領域配列またはそれらの変異体を含む、請求項１１に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
ヒト化抗体軽鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系列軽鎖配列に、好ましくは、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV085またはIGKV4-1*01に由来する軽鎖FR領域を含み、該軽鎖FR領域は、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV085またはIGKV4-1*01のFR1、FR2、FR3およびFR4領域のフレームワーク配列またはそれらの変異配列を含み、好ましくは、変異配列が0〜10個のアミノ酸の逆突然変異を含む、請求項１０に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒト化抗体が、SEQ ID NO：16〜18から選ばれる軽鎖可変領域配列またはそれらの変異体を含む、請求項１３に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
ヒト化抗体が、SEQ ID NO：13〜15から選ばれる重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：16〜18から選ばれる軽鎖可変領域配列を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選ばれる重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列との組み合わせを含む、請求項１〜５および１０〜１５のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
（ａ）SEQ ID NO：13の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：16の軽鎖可変領域配列、
（ｂ）SEQ ID NO：14の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：17の軽鎖可変領域配列、または、
（ｃ）SEQ ID NO：15の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：18の軽鎖可変領域配列。
【請求項１７】
ヒト化抗体の重鎖定常領域が、ヒトIgG1もしくはその変異体、ヒトIgG2もしくはその変異体、ヒトIgG3もしくはその変異体、またはヒトIgG4もしくはその変異体に由来する定常領域、好ましくは、ヒトIgG1もしくはその変異体、ヒトIgG2もしくはその変異体、またはヒトIgG4もしくはその変異体に由来する定常領域、最も好ましくは、ヒトIgG2またはその変異体に由来する定常領域を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
SEQ ID NO：23〜25またはSEQ ID NO：23〜25に対して少なくとも90％の同一性を有する配列から選ばれる全長の重鎖配列を含む、請求項１７に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
ヒト化抗体の軽鎖定常領域が、ヒトκもしくはλ鎖またはそれらの変異体から選ばれる定常領域を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
SEQ ID NO：26〜28またはSEQ ID NO：26〜28に対して少なくとも90％の同一性を有する配列から選ばれる全長の軽鎖配列を含む、請求項１９に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
ヒト化抗体が、以下のいずれかから選ばれる全長の軽鎖配列と全長の重鎖配列との組み合わせを含む、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
Ab-9：SEQ ID NO：23の重鎖配列およびSEQ ID NO：26の軽鎖配列、
Ab-10：SEQ ID NO：24の重鎖配列およびSEQ ID NO：27の軽鎖配列、または、
Ab-11：SEQ ID NO：25の重鎖配列およびSEQ ID NO：28の軽鎖配列。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするDNA分子。
【請求項２３】
請求項２２に記載のDNA分子を含む発現ベクター。
【請求項２４】
宿主細胞が、好ましくは哺乳類細胞であり、好ましくはCHO細胞である、請求項２３に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の、c-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、および1種以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項２６】
Dは薬物ユニットであり；
L1およびL2はリンカーユニットであり；
tは0または1であり、好ましくは1であり；
yは1〜8の範囲で変動し、好ましくは2〜5であり；
Abは、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである；
式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
Ab-[(L2)t-L1-D)]y  （I）
【請求項２７】
-L2-は式（-L2-）として示され、
2018516539.tif 000001
X1は、水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
X2は、アルキル基、シクロアルキル基およびヘテロシクリル基からなる群より選ばれ；
mは0〜5であり、好ましくは1〜3であり；
Sは硫黄原子である；
請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
【請求項２８】
Dの薬物ユニットが、毒素、化学療法薬、抗生物質、放射性同位元素および核酸分解酵素から選ばれる細胞毒である、請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
【請求項２９】
Dが式（D）として示され、もしくはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマーもしくはこれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩であり、
2018516539.tif 000002
R1〜R7は、それぞれ水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
R8〜R11は、それぞれ水素原子、ハロゲン基、アルケニル基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より任意に選ばれ、好ましくは、R8〜R11の少なくとも1つは、ハロゲン基、アルケニル基、アルキル基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ、残りのR8〜R11は水素原子であり；
または、R8〜R11のいずれかの2つはシクロアルキル基を形成し、残りの2つは、それぞれ水素原子、アルキル基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
R12〜R13は、それぞれ水素原子、アルキル基およびハロゲン基からなる群より選ばれ；
R14はアリール基およびヘテロアリール基より選ばれ、アリール基またはヘテロアリール基は、さらに水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれる置換基により任意に置換され；
R15は、ハロゲン基、アルケニル基、アルキル基、シクロアルキル基およびCOOR17から選ばれ；
R16は、水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基から選ばれ；
R17は、水素原子、アルキル基およびアルコキシ基から選ばれる；
請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
【請求項３０】
L2が、Val-Cit、MC、PABおよびMC-PABから選ばれるリンカーであり、好ましくはMCである、請求項２９に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
【請求項３１】
Dがマイタンシノイドアルカロイドであり、好ましくはDM1、DM3またはDM4であり、より好ましくはDM1である、請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
【請求項３２】
L2が、N-サクシニミジル4-（2-ピリジルチオ）吉草酸エステル（SPP）、N-サクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル（SMCC）およびN-サクシニミジル（4-ヨード-アセチル）アミノ安息香酸エステル（SIAB）からなる群より選ばれ、好ましくはSPPまたはSMCCである、請求項３１に記載の抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
【請求項３３】
Dはカンプトテシンアルカロイドであり、好ましくはCPT、10-ヒドロキシ-CPT、CPT-11（イリノテカン）、SN-38およびトポテカンから選ばれ、より好ましくはSN-38である、請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
【請求項３４】
前記リンカーL2が、Val-Cit、MC、PABおよびMC-PABから選ばれる構造、好ましくはMCまたはMC-vc-PABの構造を含む、請求項３３に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
【請求項３５】
R2〜R16は請求項２７で定義され；
Ab、t、y、L1、L2は請求項２４で定義され；
請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む、式（II）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
2018516539.tif 000003
【請求項３６】
R2〜R16は請求項２７で定義され；
Ab、t、y、L1、L2は請求項２４で定義され；
nは3〜6であり、好ましくは5であり；
請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む、式（III）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
2018516539.tif 000004
【請求項３７】
R2〜R16は請求項２７で定義され；
Ab、yは請求項２４で定義され；
nは請求項３４で定義され；
X1、X2、mは請求項２５で定義され；
請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む、式（IV）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
2018516539.tif 000005
【請求項３８】
Ab、D、yは請求項２４で定義され；
nは請求項３４で定義され；
X1、X2、mは請求項２５ｓｗ定義され；
請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む、式（V）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
2018516539.tif 000006
【請求項３９】
抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が以下からなる群より選ばれ、Ab-9、Ab-10およびAb-11は請求項２１で定義され、yは1〜8であり、好ましくは2〜5である、請求項２６〜３８のいずれか１項に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
2018516539.tif 000007
2018516539.tif 000008
2018516539.tif 000009
【請求項４０】
請求項３８に記載の、式（V）で表される複合体薬物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物の製造方法であって、以下の工程を含む方法。
2018516539.tif 000010
一般式（Ab-L2）の化合物を、有機溶媒中で一般式（L1-D）の化合物と反応させ、一般式（V）の化合物を得る；前記有機溶媒は、好ましくはアセトニトリルまたはエタノールであり；
Abは、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
X1は、水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
X2は、アルキル基、シクロアルキル基およびヘテロシクリル基からなる群より選ばれ；
Xは0〜5、好ましくは1〜3であり；
mは0〜5、好ましくは1〜3である。
【請求項４１】
請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物、および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項４２】
c-Met介在性の疾患または疾病の治療のための薬物の製造における以下のいずれかの使用；
すなわち、
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、もしくは請求項２５に記載の医薬組成物、もしくは請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体もしくはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物、または請求項４１に記載の医薬組成物、である；
ここで、前記疾患または疾病は、好ましくはがんであり、より好ましくはc-Metを発現するがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、肺がん、腸がん、腎がん、メラノーマおよび非小細胞肺がんから選ばれるがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、非小細胞肺がんおよび腎がんである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
本発明による抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物は、以下を含むがこれらに限定されない。
2018516539.tif 000011
2018516539.tif 000012
2018516539.tif 000013
ここで、Ab-9、Ab-10およびAb-11は上記にように定義され、yは1〜8であり、好ましくは2〜5である。yには1〜8の幅があり、好ましくは1〜4である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
式DEのアウリスタチンの実施例として、MMAEが例示される。ここで、波線は、リンカー（L）が抗体‐薬物複合体に共有結合していることを示す。
2018516539.tif 000014
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
式DFのアウリスタチンの実施例として、MMAFが例示される。ここで、波線は、リンカー（L）が抗体‐薬物複合体に共有結合していることを示す
（US2005/0238649およびDoroninaら、(2006) Bioconjugate Chem. 17：114〜124を参照のこと）。
2018516539.tif 000015
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素MC-MMAF〕
本発明の抗c-Met抗体は、アゴニスト活性なしに受容体結合の阻害活性を有し、標的細胞におけるエンドサイトーシス活性および物理的安定性を示す。これらの特性は、本発明の抗体を、c-Metを発現したがんの治療のために毒素と結合させた場合、ADC薬の製造に特に適したものにする。結合過程を以下に示す。
2018516539.tif 000016
（手順１）
チオ酢酸S-(3カルボニルプロピル)エステル（0.7 mg、5.3 μmol）を、0.9 mLアセトニトリル溶液に溶解した。上記で調製したチオ酢酸S-(3カルボニルプロピル)エステルのアセトニトリル溶液を、Ab-10モノクローナル抗体を含む酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液pH4.3（10.35 mg/mL、9.0 mL、0.97 mmol）に添加し、1.0 mLの水素化ホウ素ナトリウム水溶液（14.1 mg、224 μmol）を、25℃で2時間振り混ぜながら加えた。反応終了時に、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH6.5）により脱塩および精製を行い、生成物1b溶液を回収し、次の反応のために直接10 mg/mLに濃縮した。
（手順２）
0.35 mLの2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液を、25℃で30分間振り混ぜながら、11.0 mLの1b溶液に添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行い、標記生成物Ab-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液を回収した（6.17 mg/mL、14.7 mL）。
（手順３）
MC-MMAF（1.1 mg、1.2 μmol；PCT特許WO2005081711に掲載された方法により調製された。）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-1のPBS緩衝液溶液（3.7 mg/mL、4.7 mL）は、無菌条件下で0.2μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.2 (MAb＋0D)、149278.1 (MAb＋1D)、150308.1 (MAb＋2D)、151314.1 (MAb＋3D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy =1.7である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素MC-VC-PAB-MMAE〕
2018516539.tif 000017
MC-VC-PAB-MMAE（1.6 mg、1.2 μmol；PCT特許WO2004010957に開示された方法により調製された。）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。
次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH6.5）で行った。標記生成物ADC-2のPBS緩衝液溶液（3.6 mg/mL、4.8 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148118.4 (MAb＋0D)、149509.2 (MAb＋1D)、150903.1 (MAb＋2D)、152290.4 (MAb＋3D)、153680.7 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.8である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素MC-VC-PAB-MMAF〕
2018516539.tif 000018
MC-VC-PAB- MMAF（1.6 mg、1.2 μmol；PCT特許WO2005081711に開示された方法により調製された。）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0mLのAb-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-3のPBS緩衝液溶液（3.5 mg/mL、4.9 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.1 (MAb＋0D)、149525.3 (MAb＋1D)、150930.7 (MAb＋2D)、152335.2 (MAb＋3D)、153739.8 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.6である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素MC-MMAE〕
2018516539.tif 000019
MC-MMAE（1.2 mg、1.2 μmol；特許出願US7/750/116B1に開示された方法により調製された。）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-4のPBS緩衝液溶液（3.4 mg/mL、5.0 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：48118.6 (MAb＋0D)、149104.3 (MAb＋1D)、150090.1 (MAb＋2D)、151075.8 (MAb＋3D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy =1.6である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素MC-MMAE〕
2018516539.tif 000020
（手順１）
チオ酢酸S-(3カルボニルプロピル)エステル（0.7 mg、5.3 μmol）を、0.9 mLアセトニトリル溶液に溶解した。上記で調製したチオ酢酸S-(3カルボニルプロピル)エステルのアセトニトリル溶液を、Ab-9モノクローナル抗体を含む酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液pH4.3（10.85 mg/mL、9.0 mL、0.976 mmol）に添加し、1.0 mLの水素化ホウ素ナトリウム水溶液（14.1 mg、224 μmol）を、25℃で2時間振り混ぜながら加えた。反応終了時に、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH6.5）により脱塩および精製を行い、生成物5b溶液を回収し、次の反応のために直接10 mg/mLに濃縮した。
（手順２）
0.35 mLの2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液を、25℃で30分間振り混ぜながら、11.0 mLの5b溶液に添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行い、標記生成物Ab-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液を回収した（6.2 mg/mL、15.0 mL）。
（手順３）
MC-MMAE（1.1 mg、1.2 μmol）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液（6.2 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-5のPBS緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150530.9 (MAb＋0D)、151915.7 (MAb＋1D)、153333.6 (MAb＋2D)、154763.4 (MAb＋3D)、156271.9 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により53算出し、平均値はy = 1.5である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素MC-MMAF〕
2018516539.tif 000021
MC-MMAF（1.1 mg、1.2 μmol）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-6のPBS緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150537.8 (MAb＋0D)、152087.9 (MAb＋1D)、153486.5 (MAb＋2D)、154911.7 (MAb＋3D)、156499.9 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.7である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素MC-VC-PAB-MMAF〕
2018516539.tif 000022
MC-VC-PAB-MMAF（1.6 mg、1.2 μmol）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液（6.2 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-7のPBS緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150537.8 (MAb＋0D)、152087.9 (MAb＋1D)、153486.5 (MAb＋2D)、154911.7 (MAb＋3D)、156499.9 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.8である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素MC-VC-PAB-MMAE〕
2018516539.tif 000023
MC-VC-PAB-MMAE（1.6 mg、1.2 μmol）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液（6.2 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-8のPBS緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150508.6 (MAb＋0D)、151903.6 (MAb＋1D)、153314.5 (MAb＋2D)、154747.8 (MAb＋3D)、156039.5 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.6である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素SMCC-DM1〕
2018516539.tif 000024
（手順１）
SMCC（サクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル；1.65 mg、4.94 μmol、Shanghai Hanhong Biochemical Companyから購入、バッチ番号BH-4857-111203）を0.9 mLアセトニトリル溶液に溶解した。上記で調製したSMCCのアセトニトリル溶液を、Ab-10モノクローナル抗体を含むpH 6.5 PBS緩衝液（10.15 mg/mL、9.0 mL、0.62 mmol）に、25℃で2時間振り混ぜながら添加した。反応後、脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH6.5）により行った。生成物9b溶液を回収し、次の反応のために10 mg/mL（8.3mg/mL、11 mL）に濃縮した。
（手順２）
3.0 mgのL-DM1のエタノール溶液（3.0 mg L-DM1／1.1 mgエタノール）（Journal of Medicinal Chemistry. 2006, 49, 4392-4408に掲載された既知の方法により調製された。）を、25℃で4時間振り混ぜながら、9b溶液（11 mL）に添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。生成物ADC-9溶液を回収し（6.3 mg/mL、14.0 mL）、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.6 (MAb＋0D)、149078.1 (MAb＋1D)、149836.4 (MAb＋2D)、150593.7 (MAb＋3D)、151552.5 (MAb＋4D)。
平均値はy = 2.3である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素SMCC-DM1〕
2018516539.tif 000025
（手順１）
SMCC（サクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル；1.65 mg、4.94 μmol）を0.9 mLアセトニトリル溶液に溶解した。上記で調製したSMCCのアセトニトリル溶液を、Ab-9モノクローナル抗体を含むpH 6.5 PBS緩衝液（10.15 mg/mL、9.0 mL、0.62 mmol）に、25℃で2時間振り混ぜながら添加した。反応後、脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH6.5）により行った。生成物10b溶液を回収し、次の反応のために10 mg/mL（8.3mg/mL、11 mL）に濃縮した。
（手順２）
3.0 mgのL-DM1のエタノール溶液（3.0 mg L-DM1／1.1 mgエタノール）を、25℃で4時間振り混ぜながら、9b溶液（11.0 mL）に添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。生成物ADC-10溶液を回収し（6.3 mg/mL、14.0 mL）、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150534.2 (MAb＋0D)、151492.6 (MAb＋1D)、152451.7 (MAb＋2D)、153409.7 (MAb＋3D)、154368.1 (MAb＋4D)。
平均値はy = 2.2である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
３．抗体−毒素複合体の調製
2018516539.tif 000026
化合物12h（1.2 mg、1.2 μmol）を0.3 mLのアセトニトリルに溶解した。Ab-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）を25℃で4時間振り混ぜながら添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-12のPBS緩衝液溶液（3.3 mg/mL、5.0 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.6 (MAb＋0D)、149150.5 (MAb＋1D)、150221.1 (MAb＋2D)、151265.1 (MAb＋3D)、152314.3 (MAb＋4D)。
平均値：y = 1.6
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
実施例１３〜２４を参照すると、実施例２５〜２７のADC化合物が調製された。
2018516539.tif 000027