(57)【要約】要約  疎水性が高いリン脂質抗原を不溶性担体へ固定化する効率を従来法よりもさらに高め、臨床から強く求められている、より高感度な測定法を実現する、抗リン脂質抗体測定用試薬が開示されている。抗リン脂質抗体測定用試薬は、少なくとも１種の表面修飾物質が表面に結合した不溶性担体に、リン脂質が固定化されている抗リン脂質抗体測定用試薬であって、(1)表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミンであり、不溶性担体がラテックス粒子であるか、又は(2)表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が１〜３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸並びにこれらの２種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも１種であり、不溶性担体がゼラチン粒子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の表面修飾物質が表面に結合した不溶性担体に、リン脂質が固定化されている抗リン脂質抗体測定用試薬であって、(1)前記表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミンであり、前記不溶性担体がラテックス粒子であるか、又は(2) 前記表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が１〜３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸並びにこれらの２種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも１種であり、前記不溶性担体がゼラチン粒子である、抗リン脂質抗体測定用試薬。
【請求項２】
前記表面修飾物質がオクタデシルアミンであり、前記不溶性担体がラテックス粒子である請求項１記載の抗リン脂質抗体測定用試薬。
【請求項３】
前記表面修飾物質がオクタデシルアミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びポリアミノエチルメタクリル酸並びにこれらの２種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の抗リン脂質抗体測定用試薬。
【請求項４】
前記リン脂質は、前記表面修飾物質が表面に結合した前記不溶性担体に物理吸着により結合している請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗リン脂質抗体測定用試薬。
【請求項５】
前記不溶性担体が、磁性を有する粒子である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗リン脂質抗体測定用試薬。
【請求項６】
前記リン脂質が、カルジオリピン、レシチン及びリポタンパクと複合化したコレステロールから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗リン脂質抗体測定用試薬。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗リン脂質抗体測定用試薬に含まれる前記リン脂質と、検体中のリン脂質抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法により前記検体中のリン脂質抗体を測定することを含む、検体中のリン脂質抗体の免疫測定法。
【請求項８】
サンドイッチ法による請求項７記載の免疫測定法。
【請求項９】
発光酵素免疫測定による請求項８記載の免疫測定法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載されたリン脂質固定化表面修飾不溶性担体の、抗リン脂質抗体測定用試薬の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗リン脂質抗体を測定するための、リン脂質固定化修飾不溶性担体試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の診断のため、カルジオリピン、リポタンパクと複合化したコレステロール等のリン脂質に対する血液・髄液中の抗体を測定することは臨床診断上不可欠となっている。特に梅毒検査法で用いられる抗リン脂質抗体測定は、梅毒の診断に不可欠である。【０００３】
抗リン脂質抗体の測定方法としてはRPR(Rapid Plasma Regain)カード試験法、VDRL(Venereal Disease Research Lab)法、RST(Reagin Screening Test)法等が広く知られている。【０００４】
現在用いられている最も代表的な梅毒検査法は、抗梅毒トレポネーマ(TP)抗体測定およびRPR法（Rapid Plasma Regain、凝集法）に代表される抗リン脂質抗体検査法であり、診断にはこれら2種類の検査法を組み合わせて用いられるのが一般的である。これら2種類の検査を組み合わせるのは、これらの検査結果が検査の時期や感染の経過によって必ずしも一致しないからである。例えば、TP抗体陰性で抗リン脂質抗体陽性の場合は、梅毒初期感染である可能性が高い。また、ＴＰ抗体陽性でかつ抗リン脂質抗体も陽性ならば、梅毒陽性と判断されるが、ＴＰ抗体は陽性で抗リン脂質抗体が陰性ならば、梅毒治癒後で抗体価が高い場合が考えられる。従って、抗リン脂質抗体測定が十分な感度で行われないと、感染初期及び予後の経過観察において誤った臨床判定が下される可能性がある。【０００５】
近年、抗リン脂質抗体の測定方法において、リン脂質をラテックス粒子等の不活性担体に固定化し（リン脂質固定化担体）、これを緩衝液中に懸濁させた試薬が考案されている。この試薬を用いた方法では、粒子上に固定化されたリン脂質抗原に検体中の抗体が結合し、その結合抗体にさらに標識二次抗体が結合し、最終的には間接的に担体に結合した標識量が信号として感知される。この方法は臨床検査の自動化を目的としたもので、現在広く用いられている。【０００６】
一方、リン脂質は疎水性が高く、ラテックスやゼラチンのような負に荷電した担体には接近、吸着がしにくい傾向がみられ、リン脂質をこれらの担体にいかに効率よく固定化するかについて、これまで様々な工夫がなされた。【０００７】
その一例として、ラテックスをポリリジンで修飾し、VDRL法の感度を改良したデータが示されている（例えば特許文献１）。この感度上昇は、ラテックス表面のマイナス電荷をカチオンポリマーであるポリリジンで中和して疎水性を上昇させることにより、同じく疎水性のリン脂質をより接近・固定化しやすくした結果、固定されたリン脂質量が増加したためと考えられる。しかしポリリジンは使用条件がpH11以下に限定される等の欠点がある。また、特許文献１の実施例の表で示されている当該発明の効果は検体によって異なり、感度の上昇率も十分とは言いがたい。【０００８】
また、例えば、４級アミノ基を有するポリアミンスルホンでプラスチック性のマイクロタイタープレートを処理して梅毒抗原を固定化し、梅毒陽性家兎の血清を測定したところ、処理を行わなかったプレートに比べ約６〜１７倍の吸光度が得られたことが示された（特許文献２  表１）。しかしながら、同じ文献中のHBs抗原を用いて比較したデータでは、感度の上昇はいずれの希釈率においても約２倍またはそれ以下である。【０００９】
不活性担体は、一般に負に荷電している。従って、タンパク質（一般に負に荷電）やリン脂質（疎水性）との結合効率を上げるためには、カチオン基や疎水性ポリマーで修飾して担体を中和させることが有効であることは当然に推定される。しかし上記の実施例データは、問題がそれほど単純ではなく実際には他の要素が複雑に関与して、なかなか推定どおりの効果が得られないことを示している。【００１０】
例えば、担体の疎水性を上げることを目的として使用されるポリマーは、担体への吸着を可能とするために一端が正に荷電し、もう一端はリン脂質との結合を可能にするために疎水性であるような構造のものが選択される。その場合、そのポリマーの吸着／結合効率及び免疫反応効率への影響はそれぞれのポリマーの分子量や、結合している官能基により微妙に異なってくる。例えばポリマーの長さが十分でない場合、担体への吸着／結合効率が低く、結果的に、期待するような免疫反応の感度上昇は見られない。しかしポリマー両端の距離を十分取るためにポリマーの分子量を上げ過ぎると、ポリマーの粘度が上がり、効果的な反応が困難となる（特許文献３）。また、ポリマーの構造によっては、測定対象となるタンパク質や脂質が担体上の抗原や抗体へ近づく際の物理的な障害となって、逆に反応効率を下げる場合もあり得る。【００１１】
これまでのような比較的穏やかな修飾の効果は、従来のプレートによる免疫測定法においては、プレート法自体が特に高感度とはいえないため、それほど問題にしてはこなかった。【００１２】
しかし、抗体測定化学発光酵素免疫測定法においては、本来高感度であった放射性免疫測定法の流れにより、高感度性が強く求められており、抗リン脂質抗体の検出も例外ではない。また、前述のように、梅毒の診断の正確性を担保するためにも、できるだけ感度のよい測定系が望ましい。しかしそれらの要求に対し、これまでの行われた工夫や改良は必ずしも十分とは言えず、新たな工夫が求められている。【００１３】
一方、上述のように、修飾の効果はごくわずかな条件の違いで大きく変わるため、一般論で規定される修飾方法を広く適用して、常に高感度を得ることができるとは考えにくく、再現性よく感度を上昇させるためには、担体や修飾物質の種類を設定する必要がある。しかしわずか数種の担体と修飾物質であっても、それらを組合せることにより、膨大な実験数が必要となるため、最適な組合せを見出すこと自体が困難である。
【特許文献１】特表昭６３−５０１９０２
【特許文献２】特公平７−５０１１１
【特許文献３】特開平２−１６８１６３
【特許文献４】特公昭６３−２９２２３
【特許文献５】特開昭５９−１９５１６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明が解決しようとする課題は、疎水性が高いリン脂質抗原を不溶性担体へ固定化する効率を従来法よりもさらに高め、臨床から強く求められている、より高感度な測定法を実現する、抗リン脂質抗体測定用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の不溶性担体の表面を特定の修飾物質で修飾した表面修飾不溶性担体にリン脂質を固定化した抗リン脂質抗体測定用試薬を用いて抗リン脂質抗体の免疫測定を行なうことにより、より高感度に抗リン脂質抗体を免疫測定できることを見出し、本発明を完成した。【００１６】
すなわち、本発明は、少なくとも１種の表面修飾物質が表面に結合した不溶性担体に、リン脂質が固定化されている抗リン脂質抗体測定用試薬であって、(1)前記表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミンであり、前記不溶性担体がラテックス粒子であるか、又は(2) 前記表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が１〜３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸並びにこれらの２種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも１種であり、前記不溶性担体がゼラチン粒子である、抗リン脂質抗体測定用試薬を提供する。また、本発明は、上記本発明の抗リン脂質抗体測定用試薬に含まれる前記リン脂質と、検体中のリン脂質抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法により前記検体中のリン脂質抗体を測定することを含む、検体中のリン脂質抗体の免疫測定法を提供する。さらに、本発明は、上記したリン脂質固定化表面修飾不溶性担体の、抗リン脂質抗体測定用試薬の製造のための使用を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、現在用いられているラテックス粒子、ゼラチン粒子を担体とする抗リン脂質抗体免疫測定方法において、感度が大幅に改善され、臨床の求める高感度測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明に用いる不溶性担体は、ラテックス粒子又はゼラチン粒子であり、その大きさ、形状、磁性の有無は、免疫反応に用いられるものであれば、特に制限はない。これらの粒子は数多く市販されており、例えばラテックス粒子としてはJSR社のIMMUTEX（登録商標）やmicromod社のmicromer（登録商標）等を挙げることができ、また、ゼラチン粒子はメドジェル社等から容易に入手できる。また、自家製の粒子を作製して使用することも可能である（特許文献４）。粒子の大きさは、好ましくは粒径0.5nm〜30μmで、より好ましくは2nm〜10μmである。形状は必ずしも球体とは限らず、立方体やペレット状等、その製法によって様々な形をとる可能性があり、それらのいずれも使用することができる。また、それらの形状で、孔や突起等を持つものを、粒子の表面積を増加する等の目的により用いることが可能である。抗リン脂質抗体の自動測定においては、特に後述の磁性粒子等を好ましく用いることができる。磁性粒子は、非磁性粒子と同様に、容易に市販のものを入手できるが、自家製のものを使用してもよい。なお、磁性粒子は、不溶性担体粒子にフェライト等の磁性物質を配合したものであり、免疫測定の分野において広く用いられているものであり、市販されているものである。【００１９】
上記不溶性担体粒子の表面には、表面修飾物質が結合されている。表面修飾物質は、不溶性担体粒子の表面を修飾して、疎水性が高いリン脂質抗原を不溶性担体へ固定化する効率を高めることに役立つ。【００２０】
不溶性担体粒子がラテックス粒子の場合には、表面修飾物質は、炭素数１４〜２２のアルキルアミン、好ましくはオクタデシルアミンである。なお、炭素数１４〜２２のアルキルアミンは、複数種類のものを混合して用いることもできる。【００２１】
不溶性担体粒子がゼラチン粒子の場合には、表面修飾物質は、炭素数１４〜２２のアルキルアミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が１〜３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸並びにこれらの２種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも１種である。ここで、炭素数１４〜２２のアルキルアミンとしては、オクタデシルアミンが好ましい。ポリリジンの平均分子量（粘度平均分子量）は、通常、4,000〜300,000程度、好ましくは10,000〜100,000程度である。ベタインは、トリアルキルアミノ酸（アルキル基の炭素数は好ましくは１〜３）であり、好ましくはトリメチルグリシンである。また、「（メタ）アクリル酸」は、メタクリル酸及びアクリル酸を意味する。アルキル基の炭素数が１〜３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸としては、ポリアミノエチルメタクリル酸が好ましい。ポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸の平均分子量（数平均分子量）は、通常10,000〜150,000程度、好ましくは10,000〜50,000程度である。【００２２】
上記表面修飾物質は市販されているので、市販のものを用いてもよく、あるいは合成してもよい。例えばポリアミノエチルメタクリル酸は２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩とジメチルホルムアミドを重合して作製することができる。重合の方法はこの分野においては周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。【００２３】
ベタインをポリリジンに修飾する手段としてはカルボジイミド(Ｒ-Ｎ=Ｃ=Ｎ-Ｒ)を持つ水溶性架橋剤（水溶性カルボジイミド；ＷＳＣ）例えば1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩やN−シクロヘキシル−N'−(2−モルフォリノエチル)カルボジイミド・メト−p−トルエンスルホン酸塩などによる反応を用いることができる。WSCを用いる結合はこの分野において周知であり、下記実施例にも記載されているように、市販の試薬を用いて簡便に行うことができる。【００２４】
粒子の修飾は、従来から用いられている物理的吸着や、WSCを用いた共有結合によって行うことができる。これら吸着や共有結合による修飾方法は、この分野において周知であり、下記実施例にもWSCを用いた共有結合の例が記載されている。共有結合による修飾は、結合が安定で、その後の反応条件にほとんど制限がないため、望ましい。【００２５】
上記表面修飾不溶性担体粒子には、リン脂質が固定化される。固定化されるリン脂質は、測定しようとする抗リン脂質抗体の対応抗原である。測定すべき抗リン脂質抗体は、リン脂質に対する抗体であればいずれのものでもよく、従来から免疫測定されている抗リン脂質抗体のいずれのものでもよい。リン脂質の好ましい例としては、カルジオリピン、レシチン及びリポタンパクと複合化したコレステロール（LDLコレステロール、HDLコレステロール、VLDLコレステロール、CMコレステロール等）から成る群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができ、これらの２種又は３種以上の混合物も好ましい。【００２６】
リン脂質は、通常、従来と同様、物理吸着により固定化される。リン脂質の物理吸着の条件は周知であり、例えば、不溶性担体粒子の懸濁液にリン脂質溶液を加え、室温〜３７℃で0.5時間〜２時間転倒混和又は撹拌することにより行なうことができる（下記実施例参照）。【００２７】
リン脂質を固定化した不溶性担体粒子は、非特異吸着を防止するため、マスキング（ブロッキング）を行なうことが好ましい。マスキング（ブロッキング）は、表面修飾不溶性担体粒子上の、リン脂質抗原で被覆されていない部位をタンパク質等でマスキングすることであり、この免疫測定用の抗原固定化担体に対して通常行なわれている。マスキングに用いるタンパク質は、従来と同様でよく、通常、アルブミン（ウシ血清アルブミン(BSA)等）、スキムミルク、カゼイン等が用いられる。マスキングは、従来と全く同様に行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。【００２８】
リン脂質を固定化した粒子は、抗リン脂質抗体を免疫測定するための抗原感作粒子として従来と全く同様にして用いられる。抗リン脂質抗体の測定方法は、担体を用いる免疫測定方法であればいずれの方法でもよい。例えば下記実施例に記載されている、サンドイッチ法の１種である化学発光酵素免疫測定法や、フローメトリーによる免疫測定法など、シグナル検出の方法に限定されずに広く用いることができる。また、本発明は、抗リン脂質抗体の定量的測定における高感度化を課題としたものであるが、定性試験（検出）においても同じく高感度化を目的として使用することができる。従って、本発明における「測定」は定量と検出の両者を包含する。【００２９】
免疫測定自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、上記したリン脂質固定化粒子を検体と接触させ、洗浄後、抗リン脂質抗体と抗原抗体反応する抗体を反応させ、洗浄後、粒子に結合した抗体を測定する。抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ビオチン等で標識しておくことにより粒子に結合した抗体を測定することができる。それぞれ異なる濃度の抗リン脂質抗体を含む、濃度既知の複数の標準試料について上記方法により抗リン脂質抗体を測定し、測定された標識量と標準試料中の抗リン脂質抗体の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の検体についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、検体中の抗リン脂質抗体を定量することができる。標識として、化学発光物質を生成する反応を触媒する酵素を用い、基質として化学発光物質を生成する物質を用いるサンドイッチ法が化学発光酵素免疫測定法であり、この方法によれば、酵素免疫測定の中でも特に高感度な免疫測定が可能になる。粒子として磁性粒子を用いる化学発光酵素免疫測定法は、自動化装置が市販されており、市販の自動化装置を用いて簡便、高感度に免疫測定を行なうことができる（下記実施例参照）。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づき本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００３１】
I. リン脂質固定化表面修飾不溶性担体粒子の調製
１．  表面修飾物質の調製
(1)  500 mLのナスフラスコに2-アミノエチルメタクリレート塩酸塩（ポリサイエンス社）16.6 g（500 mM）、200 mLのジメチルホルムアミド（和光純薬工業（株））を入れ、更に重合開始剤であるAIBN(2, 2'-アゾイソブチロニトリル）（和光純薬工業（株）（株））100 mgを加えた。これに、冷却管とアルゴンガスで満たしたバルーンを三方コックを用いて接続し、三方コックの残されたラインに真空ポンプを接続した。真空ポンプでフラスコを１分以上吸引して減圧した後、三方コックを切り替えてアルゴンガスをフラスコに導いた。この操作を３回行い、十分にフラスコ内をアルゴンガスに置換した。置換終了後、フラスコをオイルバスに浸け65℃に加温し、３時間激しく攪拌した。【００３２】
反応終了後、反応液をエバポレーターで1/10量まで濃縮し、濃縮終了後、分画分子量10000の透析チューブで２日間超純水に対して透析を行った。【００３３】
透析終了後、目的物を凍結乾燥し、約12 gを得た。平均分子量は45000であった。なお、平均分子量は、以下の条件により測定した。
カラム：G4000PWXL（東ソー社製）
溶媒：臭化リチウム10mMを含有するアセトニトリル溶液
検出装置：示差屈折計【００３４】
上記方法と同様に重合を行い、ポリ[２−アミノエチルメタクリル-ビニルピリジン]、ポリ[２-アミノエチルメタクリル-ビニルイミダゾール]、ポリ[２-アミノエチルメタクリル-メタクリロキシエチル  トリメチルアンモニウム塩酸]を作製した。製造物質、開始材料、重合剤、収量、及び平均分子量を以下にまとめた。【００３５】
【表１】
2007126051.tif 000002
【００３６】
(2)  ポリリジン・臭化水素酸塩（(株)ペプチド研究所）200 mgとベタイン（トリメチルグリシン、和光純薬工業（株））224mgを水10mLに溶解し、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩（同仁化学）552 mgを加え室温で一夜撹拌した。反応液に1-エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩272 mgを追加し、さらに約5時間撹拌した。反応液を透析用セルロースチューブ（三光純薬（株））に移して、はじめ水に対して透析し、続いて6 mM塩酸に対して一夜透析した。その後透析チューブ内の液を凍結乾燥し、収量118.9 mgを得た。【００３７】
２．  担体の修飾
(1)  ポリアミノエチルメタクリル酸(Poly(AEM))によるゼラチン粒子の修飾
5％磁性ゼラチン粒子(自家製、特許文献５) 1mLを蒸留水1mLで3回すすぎ、10mM MES (pH 5.5) 1mLに置換した。これに、上記で作製したポリ(2-アミノエチルメタクリル酸）25mgを加えて溶解し、更に水溶性カルボジイミド(1-エチル-3-(3-[11]ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸）（同仁化学社製）100mgを加えて3時間激しく攪拌した。これを蒸留水1mLで３回すすぎ、蒸留水1 mLに置換して、5%塩基性ポリマー修飾粒子懸濁液とした。この液0.15 mLを蒸留水1 mLで3回、44％エタノールで2回濯いだ後、蒸留水0.45 mLに置換し、修飾粒子懸濁液とした。【００３８】
(2)  その他の修飾
上記と同様の工程で、理論的に可能性のある様々な物質（下記ａ〜ｇ）で、磁性ラテックス粒子と磁性ゼラチン粒子を修飾した。表面修飾物質は、上記１（表１参照）で作製したもの、および市販品を用いた。粒子と表面修飾物質の割合は粒子を1.5から2.0倍（重量比）とした。【００３９】
ａ  ポリ-L-リジン(PL)((株)ペプチド研究所製)  
ｂ  ベタイン化ポリリジン(BPL)（上記１(2)）  
ｃ  オクタデシルアミン(ODA)(和光純薬工業（株）製)
ｄ  ポリ[2-アミノエチルメタクリル酸](Poly(AEM))（上記１(1)）
ｅ  ポリ[2-アミノエチルメタクリル-ビニルピリジン]（Poly(2-aminoethylmethacryl-co-vinyl pyridine)）（上記１(1)、表１）
ｆ  ポリ[2-アミノエチルメタクリル-ビニルイミダゾール]（Poly(2-aminoethylmethacryl-co-vinyl imidazole)）（上記１(1)、表１）
ｇ  ポリ[2-アミノエチルメタクリル−メタクリロキシエチルトリメチルアンモニウム塩酸]（Poly(2-aminoethylmethacryl-co-methacryloxyethyl trimethylammonium-HCl) （上記１(1)、表１）【００４０】
３．  担体の抗原感作及びマスキング
(1)  抗原感作
5 mg/mLカルジオリピン−エタノール溶液(SIGMA) を0.041 mL、10 mg/mLに作製したレシチン(卵黄製)(ナカライテスク株式会社)‐エタノール溶液を 0.206 mL、10 mg/mLに作成したコレステロール(ナカライテスク株式会社)−エタノール溶液 0.062 mLを混合し、計0.35 mLの混合リン脂質抗原液とした。【００４１】
上記２で調製した修飾粒子懸濁液１４種類（修飾物質７種類×担体２種類）の各液粒子に抗原を吸着させた。すなわち、各修飾粒子懸濁液（0.45mL)を攪拌しながら、混合リン脂質抗原液を加え、水浴型超音波処理機にて約３０秒間超音波処理した後、37℃で1時間転倒混和し、粒子にリン脂質抗原を吸着させ、感作粒子懸濁液とした。また、比較のため、非修飾粒子（ラテックス、ゼラチン）もそれぞれ修飾粒子と同様に感作した（「感作粒子懸濁液」と呼ぶ）。【００４２】
(2)  マスキング
上記感作粒子懸濁液を50 mM Tris-HCl (pH 7.2)、150 mM NaCl溶液1 mLですすいだ後、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、150 mM NaCl、１% BSA(SIGMA)、0.1％ NaN3溶液1 mLに置換し、37℃で1晩転倒混和した。0.375 mLの同溶液に置換し、2wt%感作・マスキング粒子とした。【００４３】
II.  測定と結果
１．  測定
上記Iで調製した2wt%感作・マスキング粒子を、150 mM NaCl、0.1% NaN3、１% BSAで100倍希釈したもの0.25 mLを固相とした。また、0.1 mg/L抗ヒトIgG-アルカリフォスファターゼ標識体、0.1 mg/L抗ヒトIgM-アルカリフォスファターゼ標識体、100 mM NaCl、0.1% NaN3、1% BSA溶液0.35 mLを標識相とした。【００４４】
RPR陰性血清４例（Aries Diagnostics GmbH）、RPR陽性血清４例（ProMedDx社）、陽性コントロール血清（富士レビオ株式会社)を検体とし、検体中の抗リン脂質抗体を、市販の自動分析装置を用い、発光酵素免疫測定により定量した。すなわち、それぞれルミパルス検体希釈液(富士レビオ株式会社)で１０倍希釈したもの20μLを検体として、ルミパルスフォルテ(富士レビオ株式会社)において2ステップ20μLモードにて測定した。カットオフインデックスの算出は、検体測定発光カウントを陽性コントロール測定発光カウントにカットオフ係数0.22を乗じたもので除して求めた。【００４５】
２．  結果
(1)  ラテックス粒子
ラテックス粒子の結果の一部を下記表２にまとめた。Ｃはシグナルカウント数、S/N(signal/noise)は、各シグナルカウント(C)を陰性検体のシグナルカウントの平均値で割ったものでノイズの上昇による見かけの感度上昇を排除している。各修飾粒子の感度比較は陽性検体のS/Nの平均（「平均S/N値」）で行った。【００４６】
非修飾粒子（比較例）では陽性検体は陰性検体平均の17.4倍のシグナル値、即ち、S/N値は17.4であった。各修飾粒子の陽性サンプルS/N値をこの非修飾での値と比較すると、ポリリジン(PL)、ベタイン化ポリリジン(BPL)、ポリアミノエチルメタクリル酸(poly(AEM))ではシグナル上昇が見られたものの、非修飾粒子（比較例）の２倍程度の上昇にとどまった。特にポリリジンとベタイン化ポリリジンでは各検体のシグナル値がほとんど同じで、ポリリジンをベタイン化した効果はほとんど見出せなかった。同じベタイン化ポリリジンで修飾したゼラチン粒子はポリリジンのみで修飾したものより感度が上昇していたことから（下記）、ポリリジンへのベタイン化が失敗したのではなく、ラテックス粒子においてはベタインの効果が現れないことが示唆された。【００４７】
一方オクタデシルアミン(ODA)で修飾した粒子は、S/N値106.5で、非修飾（比較例）の約６倍を示し、明らかな効果が確認できた。【００４８】
その他の修飾粒子（上記I. 2(2)、ｅ〜ｇ）ではS/Nが非修飾粒子（比較例）とほとんど同じかむしろ低下しており、期待したような効果は得られなかった（表には示していない）。【００４９】
【表２】
2007126051.tif 000003
【００５０】
(3)  ゼラチン粒子
不溶性担体としてゼラチン粒子を用いた場合の結果を下記表３に示す。【００５１】
表３に示されるように、ゼラチン粒子では、ラテックス粒子に比べ、修飾の効果が顕著であった。非修飾粒子（比較例）の陽性検体S/Nの平均値3.2に対し、ポリリジン(PL)では33.7(10.5倍)、ベタイン化ポリリジン(BPL)では46.5(14.5倍)、ポリアミノエチルメタクリル酸(poly(AEM))では75.7(23.7倍)、オクタデシルアミン(ODA)では161.4(50.4倍）を示した。また、ポリリジンよりもベタイン化ポリリジンのほうが、S/N値が上昇しており、ラテックスではほとんど示されなかったベタイン化の効果が現れていた。【００５２】
その他の修飾粒子（上記I.2(2)、ｅ〜ｇ）ではラテックス粒子と同様、S/N値が非修飾粒子（比較例）とほとんど同じかむしろ低下しており、期待したような効果は得られなかった（データ示さず）。【００５３】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００５４】
本願発明による担体は、高密度にリン脂質を結合しているため、抗リン脂質抗体の高感度測定試薬として使用できる。
【国際調査報告】
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