【手続補正書】
【提出日】令和1年7月29日(2019.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児における異数性をスクリーニングするための方法であって、
ａ）母体血液試料から単離した核酸試料を得ることと、
ｂ）分子反転プローブ（ＭＩＰ）の１つまたは複数の集団を用いることにより、工程ａ）で得た前記核酸試料中における複数の目的の標的配列を捕捉して、複数のレプリコンを作製することと、
前記ＭＩＰ集団内の前記ＭＩＰのそれぞれは、
i）一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームであって、前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームの対は、同一であり、且つ、前記複数の目的の標的配列におけるそれぞれの配列に隣接する、前記核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的である、前記一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアーム；
ii）１つまたは複数の固有分子タグ及びポリヌクレオチドリンカー、好ましくは、前記配列内に少なくとも２つの固有分子タグ及びポリヌクレオチドリンカー：
第１の標的ポリヌクレオチドアーム−第１の固有分子タグ−ポリヌクレオチドリンカー−第２の固有分子タグ−第２の標的ポリヌクレオチドアーム；
を含み、
前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の固有分子タグの組み合わせは、前記ＭＩＰのそれぞれにおいて異なっており、
ｃ）工程ｂ）で得た前記レプリコンから増幅した複数のＭＩＰアンプリコンをシークエンスすることと、
ｄ）レプリコンを増幅したそれぞれのＭＩＰにおける前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｃ）で得た前記複数のアンプリコンにおける第１のアンプリコン集団のそれぞれの捕捉現象の数を測定することと、前記第１のアンプリコン集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
ｅ）レプリコンを増幅したそれぞれのＭＩＰにおける前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｃ）で得た前記複数のアンプリコンにおける第２のアンプリコン集団のそれぞれの捕捉現象の数を測定することと、前記第２のアンプリコン集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
ｆ）工程ｄ）で測定した捕捉現象の数の少なくとも一部に基づいて、そこから前記第１のアンプリコン集団を作製した、それぞれの目的の標的配列の部位捕捉基準を決定することと、
ｇ）少なくとも１つの判定基準を満たす、工程ｆ）で決定した前記部位捕捉基準の第１のサブセットを同定することと、
ｈ）工程ｅ）で測定した捕捉現象の数の少なくとも一部に基づいて、そこから前記第２のアンプリコン集団を作製した、それぞれの目的の標的配列の部位捕捉基準を決定することと、
ｉ）前記少なくとも１つの判定基準を満たす、工程ｈ）で決定した前記部位捕捉基準の第２のサブセットを同定することと、
ｊ）工程ｇ）で同定した部位捕捉基準の前記第１のサブセットから求めた第１の指標を、工程ｉ）で同定した部位捕捉基準の前記第２のサブセットから求めた第２の指標で正規化して、検査比率を得ることと、
ｋ）前記検査比率を、正倍数性または異数性を示すことが既知である参照対象から単離した参照核酸試料に基づいて計算した、複数の参照比率と比較し、前記胎児における異数性を示す検査比率の有無を判定することと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記核酸試料はＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記部位捕捉基準は、部位捕捉性能指標（ＳＣＥ）または部位捕捉密度指標（ＳＣＣ）である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）で提供した前記ＭＩＰレプリコンのそれぞれは、
ｉｉｉ）前記第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームをそれぞれ、前記核酸試料中の対応する前記第１及び第２の領域にそれぞれハイブリダイズすることと、前記第１及び第２の領域は目的の標的配列に隣接し、
ｉｖ）前記ハイブリダイゼーション後、ライゲーション／伸長用混合液を用いて、前記２つの標的ポリヌクレオチドアーム間に存在するギャップ領域を伸長及びライゲートし、一本鎖環状核酸分子を作製することと、
により作製される、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、ｃ）の前記シークエンシング工程の前に、インデックスＰＣＲ反応を含み、前記インデックスＰＣＲ反応は、以下の構成要素、一対のインデックスプライマー、固有試料バーコード、及び、一対のシークエンシングアダプターを、前記ＭＩＰアンプリコンのそれぞれに導入し、好ましくは、前記バーコード化ＭＩＰアンプリコンは、以下の構成要素、第１のシークエンシングアダプター−第１のシークエンシングプライマー−前記第１の固有分子タグ−前記第１の標的ポリヌクレオチドアーム−捕捉核酸−前記第２の標的ポリヌクレオチドアーム−前記第２の固有分子タグ−固有試料バーコード−第２のシークエンシングプライマー−第２のシークエンシングアダプター、を配列内に含む、前記方法。
【請求項６】
前記検査比率及び前記参照比率は、染色体比率であり、好ましくは、前記染色体比率は、目的の染色体由来の全固有捕捉現象の合計（Ｓ１）と、全ての染色体由来の全固有捕捉現象の合計（Ｓ１＋Ｓ２）との比率により定義される、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
胎児における異数性をスクリーニングするための方法であって、
ａ）母体血液試料由来のゲノムＤＮＡ試料を得ることと、
ｂ）前記ゲノムＤＮＡ試料を、マルチウェルプレートのそれぞれのウェルへと加えることと、前記マルチウェルプレートのそれぞれのウェルはプローブ混合液を含み、前記プローブ混合液は分子反転プローブ（ＭＩＰ）集団及び緩衝液を含み、
前記ＭＩＰ集団内のそれぞれのＭＩＰは、
i）一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームであって、前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームの対は、同一であり、且つ、前記複数の目的の標的配列におけるそれぞれの配列に隣接する、前記核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的である、前記一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアーム；
ii）１つまたは複数の固有分子タグ及びポリヌクレオチドリンカー、好ましくは、前記配列内に少なくとも２つの固有分子タグ及びポリヌクレオチドリンカー：
第１の標的ポリヌクレオチドアーム−第１の固有分子タグ−ポリヌクレオチドリンカー−第２の固有分子タグ−第２の標的ポリヌクレオチドアーム；
を含み、
前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の固有分子タグの組み合わせは、前記ＭＩＰのそれぞれにおいて異なっており、
ｃ）前記ＭＩＰの前記プローブ混合液を含む前記ゲノムＤＮＡ試料をインキュベートして、前記複数の目的の標的配列を捕捉することと、
ｄ）伸長／ライゲーション用混合液を、前記ＭＩＰ及び前記複数の目的の標的配列を含むｃ）の前記試料へと加えて、複数のＭＩＰアンプリコンを作製することと、前記伸長／ライゲーション用混合液は、ポリメラーゼ、複数のｄＮＴＰ、リガーゼ、及び、緩衝液を含み、
ｅ）エキソヌクレアーゼ混合液を、前記標的及び対照ＭＩＰアンプリコンへと加えて、過剰プローブまたは過剰ゲノムＤＮＡを除去することと、
ｆ）インデックスＰＣＲ用混合液をｅ）の前記試料へと加えて、一対のインデックスプライマー、固有試料バーコード、及び、一対のシークエンシングアダプターを、前記複数のアンプリコンへと加えることと、
ｇ）超並列シークエンシング法を用いて、前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｆ）で提供したバーコード化アンプリコンの第１の集団におけるシークエンシングリードの数を測定することと、バーコード化アンプリコンの前記第１の集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
ｈ）超並列シークエンシング法を用いて、前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｆ）で提供したバーコード化アンプリコンの第２の集団におけるシークエンシングリードの数を測定することと、バーコード化アンプリコンの前記第２の集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
ｉ）工程ｇ）で測定した第１のシークエンシングリードの数の少なくとも一部に基づいて、部位捕捉基準を計算し、工程ｈ）で測定した第２のシークエンシングリードの数の少なくとも一部に基づいて、複数の対照プローブ捕捉基準を計算することと、
ｊ）少なくとも１つの判定基準を満たす対照プローブ捕捉基準を有する前記ＭＩＰアンプリコンの前記集団における部位捕捉基準のサブセットを同定することと、
ｋ）前記部位捕捉基準を、前記少なくとも１つの判定基準を満たす対照プローブ捕捉基準の前記サブセットから計算した係数で正規化して、検査正規化部位捕捉基準を得ることと、
ｌ）工程ｂ）〜工程ｈ）における同一の標的部位及び対照部位、標的集団、対照集団のサブセットを用いて、前記検査正規化部位捕捉基準を、既知の遺伝子型を示す参照対象から得た参照ゲノムＤＮＡ試料に基づいて計算した複数の参照正規化部位捕捉基準と比較し、前記胎児における異数性を示す検査正規化部位捕捉基準の有無を判定することと、
を含む、前記方法。
【請求項８】
前記血液試料は、全血試料、血漿試料、または、血清試料であり、好ましくは、血漿試料である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）前記第１及び／または第２の標的ポリヌクレオチドアームの長さは、１４〜３０塩基対であり、及び／または、前記標的ポリヌクレオチドアームのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有し、及び／または、前記標的ポリヌクレオチドアームのそれぞれは、３０％〜８０％の、好ましくは、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する；及び／または
ｂ）前記第１及び／または第２の固有分子タグの長さは、４〜１５塩基対であり、及び／または、前記固有分子タグのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する；及び／または
ｃ）前記ポリヌクレオチドリンカーは、２０〜１，０００塩基対の長さを有し、及び／または、前記ポリヌクレオチドリンカーは、４５℃〜８０℃の融解温度を有し、及び／または、前記ポリヌクレオチドリンカーは、３０％〜８０％の、好ましくは、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）前記ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも１種の増幅用プライマー、好ましくは、増幅用フォワードプライマー及び増幅用リバースプライマーを含む、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅用フォワードプライマーの前記配列は、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧ−３´（配列番号：１）のヌクレオチド配列を含む；及び／または、
前記増幅用リバースプライマーの前記配列は、５´−ＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：２）のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドリンカーは、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）のヌクレオチド配列を含む、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の標的ポリヌクレオチドアームは、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ−３´（配列番号：４）のヌクレオチド配列を含む；及び／または、
前記第２の標的ポリヌクレオチドアームは、５´−ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：５）のヌクレオチド配列を含む、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＩＰは、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：６）のヌクレオチド配列を含み、（Ｎ１−６）は前記第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は前記第２の固有分子タグを表す、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記シークエンシング工程は、６〜８百万リードの読み取り深度を有する、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。