【手続補正書】
【提出日】令和1年6月26日(2019.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養された浮遊ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、
ＣＨＯ細胞の浮遊培養物を得ることであって、前記ＣＨＯ細胞が、高密度培養条件下での成長に適応している、得ることと、
浮遊ＣＨＯ細胞の成長を可能にするように適応した高密度成長培地中で、約２×１０６〜約２×１０７細胞／ｍｌの間の細胞密度で、前記ＣＨＯ細胞を培養することと、
トランスフェクション試薬の存在下で前記ＣＨＯ細胞を発現ベクターでトランスフェクトすることであって、前記発現ベクターが、発現されたタンパク質を産生することができる核酸配列を含む、トランスフェクトすることと、
第１の期間にわたって、前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞をインキュベートすることと、
前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、少なくとも１つの発現エンハンサー組成物及び少なくとも１つの成長調節因子組成物と接触させることと、
前記発現ベクターが前記タンパク質を発現するような条件下で、第２の期間にわたって、前記トランスフェクションエンハンサー及び成長調節因子の存在下で前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞をインキュベートすることと、
前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を採取し、前記発現されたタンパク質を単離することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記第２の期間後に、前記トランスフェクトされた細胞を、再度、前記成長調節因子組成物と接触させ、前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を採取し、前記発現されたタンパク質を単離する前に、第３の期間にわたって、前記トランスフェクトされた細胞をインキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第３の期間が、最大約２０日間である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスフェクトされた細胞が前記発現エンハンサー組成物及び前記成長調節因子組成物と接触させられた後に、前記トランスフェクトされた細胞が、３７℃未満かつ３０℃超の温度で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記浮遊ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｓ細胞、高密度培養条件下での成長に適応したＣＨＯ−Ｓ細胞の誘導体、ＣＨＯ−Ｓ−２Ｈ２細胞またはＣＨＯ−Ｓ−クローン１４細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記浮遊ＣＨＯ細胞が、約３×１０６〜約１５×１０６細胞／ｍｌの間の細胞密度で、トランスフェクション前に培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスフェクション試薬が、カチオン性脂質または高分子アミン系トランスフェクション試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記トランスフェクション試薬が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはその誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＥＩが、直鎖状ＰＥＩである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランスフェクション試薬が、カチオン性脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記浮遊ＣＨＯ細胞をトランスフェクトする前に、カチオン性脂質が、前記発現ベクターと接触させられて、トランスフェクション複合体を形成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランスフェクション複合体が、０℃超かつ２０℃未満の温度で形成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
トランスフェクション前の前記浮遊培養物の体積が、約２０ｍＬ〜約１５００ｍｌの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトース、アミノ酸、または前述の任意の組み合わせのうちの少なくとも２つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトース、アミノ酸、または前述の任意の組み合わせのうちの少なくとも３つ以上を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、及び酪酸ナトリウムを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現エンハンサー組成物が、浮遊細胞の集塊を少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％低減する組成物をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
浮遊細胞の集塊を低減する前記組成物が、硫酸デキストランを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現エンハンサー組成物中の硫酸デキストランの濃度が、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸（ＶＰＡ）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現エンハンサー組成物が、プロピオン酸ナトリウムを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養物中のプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約０．２ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養物中のプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記発現エンハンサー組成物中のプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記発現組成物が、酪酸ナトリウムを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養物中の酪酸ナトリウムの最終濃度が、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭの範囲である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記浮遊培養物の体積が、約２５ｍＬμｌ〜約５０Ｌの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記トランスフェクションステップの細胞密度が、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍｌの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、前記トランスフェクションステップ後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補足を必要としない、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記高密度培養培地が、前記トランスフェクションステップ後に、交換、補充、または補足されない、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記高密度成長培地が、７５％を上回ったままの細胞生存率で、２．×１０６細胞／ｍｌ〜約２×１０７細胞／ｍｌを上回る密度で、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の成長を促進する無血清／無タンパク質既知組成培養培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記発現されたタンパク質を精製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＨＯ細胞が、１つ以上の発現増強タンパク質を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記発現増強タンパク質が、ＡＫＴ、Ｐ１８、Ｐ２１、Ｂｃｌ−ＸＬ、及びＰＫＢａからなるリストから選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の期間が、約１２時間〜約２日間の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の期間が、最大約２０日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記成長調節因子組成物が、複数のアミノ酸を含み、各アミノ酸は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記成長調節因子組成物が、グルコースをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記成長調節因子組成物中の前記グルコースの浸透圧が、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約７００ｍＯｓｍ／ｋｇの間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記成長調節因子組成物中の前記グルコースの濃度が、約８５ｍｇ／ｍｌ〜約１１５ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記成長調節因子組成物が、約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧を有する、請求項３９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されてきたが、かかる実施形態が単に例として提供されることは、当業者には明らかであろう。多くの変化形、変更、及び置換が本発明から逸脱することなく当業者に生じるだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の種々の代替物が本発明の実施に用いられ得ることを理解されたい。以下の請求項は、本発明の範囲を定義し、これらの請求項の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物がそれにより網羅されることが意図される。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
培養された浮遊ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質の産生方法であって、
ＣＨＯ細胞の浮遊培養物を得ることであって、前記ＣＨＯ細胞が、高密度培養条件下での成長に適応している、得ることと、
浮遊ＣＨＯ細胞の成長を可能にするように適応した高密度成長培地中で、約２×１０６〜約２×１０７細胞／ｍｌの間の細胞密度で、前記ＣＨＯ細胞を培養することと、
トランスフェクション試薬の存在下で前記ＣＨＯ細胞を発現ベクターでトランスフェクトすることであって、前記発現ベクターが、発現されたタンパク質を産生することができる核酸配列を含む、トランスフェクトすることと、
第１の期間にわたって、前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞をインキュベートすることと、
前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、少なくとも１つの発現エンハンサー組成物及び少なくとも１つの成長調節因子組成物と接触させることと、
前記発現ベクターが前記タンパク質を発現するような条件下で、第２の期間にわたって、前記トランスフェクションエンハンサー及び成長調節因子の存在下で前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞をインキュベートすることと、
前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を採取し、前記発現されたタンパク質を単離することと、を含む、方法。
（項目２）
前記第２の期間後に、前記トランスフェクトされた細胞を、再度、前記成長調節因子組成物と接触させ、前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を採取し、前記発現されたタンパク質を単離する前に、第３の期間にわたって、前記トランスフェクトされた細胞をインキュベートする、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第３の期間が、最大約２０日間、最大約１５日間、最大約１４日間、最大約１３日間、最大約１２日間、最大約１１日間、最大約１０日間、最大約９日間、最大約８日間、最大約７日間、最大約６日間、最大約５日間、最大約４日間、約２０日間、約１５日間、約１４日間、約１３日間、約１２日間、約１１日間、約１０日間、約９日間、約８日間、約７日間、約６日間、約５日間、約４日間である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記トランスフェクトされた細胞が前記発現エンハンサー組成物及び前記成長調節因子組成物と接触させられた後に、前記トランスフェクトされた細胞が、３７℃未満かつ３０℃超の温度で培養される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記トランスフェクトされた細胞が、３５℃未満かつ３１℃超の温度で培養される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記トランスフェクトされた細胞が、約３２℃の温度で培養される、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記浮遊ＣＨＯ細胞が、高密度培養条件下での成長に適応したＣＨＯ−Ｓ細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞の誘導体である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記浮遊ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｓ−２Ｈ２細胞またはＣＨＯ−Ｓ−クローン１４細胞である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記浮遊ＣＨＯ細胞が、約３×１０６〜約１５×１０６細胞／ｍｌ、約３．５×１０６〜約１２×１０６細胞／ｍｌ、約４×１０６〜約１０×１０６細胞／ｍｌ、約４．５×１０６〜約９×１０６細胞／ｍｌ、約５×１０６〜約８×１０６細胞／ｍｌ、約５．５×１０６〜約７×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６〜約６．５×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６〜約６．２５×１０６細胞／ｍｌの間、または約６×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、トランスフェクション前に培養される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記トランスフェクション試薬が、カチオン性脂質または高分子アミン系トランスフェクション試薬を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記トランスフェクション試薬が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはその誘導体を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＰＥＩが、直鎖状ＰＥＩである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記トランスフェクション試薬が、カチオン性脂質を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記浮遊ＣＨＯ細胞をトランスフェクトする前に、カチオン性脂質が、前記発現と接触させられて、トランスフェクション複合体を形成する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記トランスフェクション複合体が、０℃超かつ２０℃未満、１５℃未満、１０℃未満、８℃未満、または５℃未満の温度で形成される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
トランスフェクション前の前記浮遊培養物の体積が、約２０ｍＬ〜約１５００ｍｌ、約２５ｍｌ〜約１０００ｍｌ、約３０ｍｌ〜約７５０ｍｌ、約５０ｍｌ〜約５００ｍｌ、約７５ｍｌ〜約４００ｍｌ、約１００ｍｌ〜約２００ｍｌの範囲、またはそれらの間の任意の範囲である、項目１に記載の方法。
（項目１７）
トランスフェクション前の前記浮遊培養物の体積が、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、約５０ｍｌ、約５５ｍｌ、約６０ｍｌ、約６５ｍｌ、約７０ｍｌ、約７５ｍｌ、約８０ｍｌ、約１００ｍｌ、約１２５ｍｌ、約１５０ｍｌ、約１７５ｍｌ、約２００ｍｌ、約２５０ｍｌ、約３００ｍｌ、約４００ｍｌ、約５００ｍｌ、約７５０ｍｌ、１０００ｍｌ、もしくは約１５００ｍｌ、またはそれらの間の任意の体積である、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトース、アミノ酸、または前述の任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトース、アミノ酸、または前述の任意の組み合わせのうちの少なくとも２つ以上を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトース、アミノ酸、または前述の任意の組み合わせのうちの少なくとも３つ以上を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸、プロピオン酸ナトリウム、及び酪酸ナトリウムを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記発現エンハンサー組成物が、浮遊細胞の集塊を少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％低減する組成物をさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
浮遊細胞の集塊を低減する前記組成物が、硫酸デキストランを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記発現エンハンサー組成物中の硫酸デキストランの濃度が、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約１７５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌ〜約１２５ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ〜約１１０ｍｇ／ｍｌの間、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度範囲である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記発現エンハンサー組成物が、バルプロ酸（ＶＰＡ）を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約８０ｍＭの範囲である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約１００ｍＭである、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記発現エンハンサー組成物中のバルプロ酸の濃度が、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ〜約１６ｍｇ／ｍｌ、またはそれらの間の任意の濃度である、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
バルプロ酸の濃度が、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１０．５ｍｇ／ｍｌ、約１１ｍｇ／ｍｌ、約１１．５ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１２．５ｍｇ／ｍｌ、約１３ｍｇ／ｍｌ、約１３．５ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１４．５ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、約１５．５ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１６．５ｍｇ／ｍｌ、約１７ｍｇ／ｍｌ、約１７．５ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約１８．５ｍｇ／ｍｌ、約１９ｍｇ／ｍｌ、約１９．５ｍｇ／ｍｌ、もしくは約２０ｍｇ／ｍｌ、またはそれらの間の任意の濃度である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記発現エンハンサー組成物が、プロピオン酸ナトリウムを含む、項目１８に記載の方法。
（項目３２）
前記培養物中のプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約０．２ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．７５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１．２５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約ｂ０．７５ｍＭ  約０．８ｍＭ、約１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．７ｍＭ、約２．０ｍＭの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記培養物中のプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記発現エンハンサー組成物中のプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、またはそれらの間の任意の濃度である、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記発現組成物が、酪酸ナトリウムを含む、項目１８に記載の方法。
（項目３６）
前記培養物中の酪酸ナトリウムの最終濃度が、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．５ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．２５ｍＭ、約５ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ〜約１５ｍ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ〜約１４ｍｇ／Ｌの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記浮遊培養物の体積が、約２５ｍＬμｌ〜約５０Ｌの範囲、またはそれらの間の任意の濃度である、項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記浮遊培養物の体積が、約１００ｍＬμｌ〜約１Ｌの範囲である、項目１に記載の方法。
（項目３９）
前記浮遊培養物の体積が、約２００ｍＬμｌ〜約５００ｍｌの範囲である、項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記トランスフェクションステップの細胞密度が、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍｌの間である、項目１に記載の方法。
（項目４１）
前記トランスフェクションステップの細胞密度が、約２×１０６〜約６×１０６の範囲である、項目１に記載の方法。
（項目４２）
前記方法が、前記トランスフェクションステップ後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補足を必要としない、項目１に記載の方法。
（項目４３）
前記高密度培養培地が、前記トランスフェクションステップ後に、交換、補充、または補足されない、項目１に記載の方法。
（項目４４）
前記高密度成長培地が、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％を上回ったままの細胞生存率で、２．×１０６細胞／ｍｌ〜約２×１０７細胞／ｍｌを上回る密度で、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の成長を促進する無血清／無タンパク質既知組成培養培地である、項目１に記載の方法。
（項目４５）
前記高密度成長培地が、前記発現ベクターでのそのトランスフェクション後に、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％を上回ったままの細胞生存率で、２×１０６細胞／ｍｌ〜約２×１０７細胞／ｍｌを上回る密度で、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の成長を促進する無血清／無タンパク質既知組成培養培地である、項目１に記載の方法。
（項目４６）
前記高密度成長培地が、前記トランスフェクションステップ後に、前記培地の補足、交換、または補充を必要としない、項目１に記載の方法。
（項目４７）
前記高密度成長培地が、前記トランスフェクションステップ後に、補足、交換、または補充されない、項目１に記載の方法。
（項目４８）
前記発現されたタンパク質を精製することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４９）
前記ＣＨＯ細胞が、１つ以上の発現増強タンパク質を発現する、項目１に記載の方法。
（項目５０）
前記発現増強タンパク質が、ＡＫＴ、Ｐ１８、Ｐ２１、Ｂｃｌ−ＸＬ、及びＰＫＢａからなるリストから選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ＣＨＯ細胞が、１つ以上の発現増強タンパク質を一過的に発現する、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記ＣＨＯ細胞が、１つ以上の発現増強タンパク質を安定して発現する、項目４９に記載の方法。
（項目５３）
前記第１の期間が、約１２時間〜約２日間、約１５〜約３６時間、約１６時間〜約３０時間、約１８〜約２８時間、約１９〜約２６時間、約１９〜約２５時間、約２０〜約２４時間の範囲、またはそれらの間の任意の時間である、項目１に記載の方法。
（項目５４）
前記第１の期間が、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、最大４８時間、またはそれらの間の任意の時間である、項目１に記載の方法。
（項目５５）
前記第２の期間が、最大約２０日間、最大約１９日間、最大約１８日間、最大約１７日間、最大約１６日間、最大約１５日間、最大約１４日間、最大約１３日間、最大約１２日間、最大約１１日間、最大約１０日間、最大約９日間、最大約８日間、最大約７日間、最大約６日間、最大約５日間、最大約４日間、最大約３日間、またはそれらの間の任意の時間である、項目１に記載の方法。
（項目５６）
前記成長調節因子組成物が、複数のアミノ酸を含み、各アミノ酸は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する、項目１に記載の方法。
（項目５７）
前記成長調節因子組成物が、グルコースをさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記成長調節因子組成物中の前記グルコースの浸透圧が、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約６２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記グルコースの濃度が、約８５ｍｇ／ｍｌ〜約１１５ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ〜約１１０ｍｇ／ｍｌ、約９５ｍｇ／ｍｌ〜約１０５ｍｇ／ｍｌの範囲である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記成長調節因子組成物が、約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧、またはそれらの間の任意の浸透圧もしくは範囲を有する、項目５６に記載の方法。
（項目６１）
前記成長調節因子組成物が、約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、項目５６に記載の方法。
（項目６２）
前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が採取されたときの前記培養物の体積が、前記浮遊細胞がトランスフェクトされたときの前記培養物の体積の約１５０％未満、約１４５％未満、約１４０％未満、約１３５％未満、約１３０％未満、約１２５％未満、約１２０％未満であり、体積の増加は、成長培地の添加、補足、または交換に起因しない、項目１に記載の方法。
（項目６３）
前記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が採取されたときの前記培養物の体積が、前記浮遊細胞がトランスフェクトされたときの前記培養物の体積の約１５０％未満、約１４５％未満、約１４０％未満、約１３５％未満、約１３０％未満、約１２５％未満、約１２０％未満であり、体積の増加は、前記成長エンハンサー組成物及び前記発現エンハンサー組成物の添加に起因する、項目１に記載の方法。