【手続補正書】
【提出日】平成18年11月20日(2006.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を無機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を無機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子。
【化２】
2006007204.tif 000001
（１）
【請求項２】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を無機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを無機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子。
【化３】
2006007204.tif 000002
（１）
【請求項３】
前記無機粒子が、シリカ、酸化チタン、亜鉛華、アルミナ、酸化鉄、タルク、マイカ、セリサイト、金コロイドからなる群から選ばれた一種又は二種以上の無機粒子であって、その平均粒子径が２０nm〜５００μm、比重が１．０ｇ/cm3以上であることを特徴とする請求項１または２記載のアフィニティー粒子。
【請求項４】
前記リガンドが各種抗体、抗原、酵素、基質、レセプター、レクチン、ペプチド、DNA、RNA、アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ビオチン、キレート化合物、各種金属イオンからなる群から選ばれた一種又は二種以上のリガンドであることを特徴とする請求項１〜３記載のアフィニティー粒子。
【請求項５】
（１）請求項１記載のアフィニティー粒子に任意のリガンドを結合させる第１工程、（２）第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む溶液試料に分散させる第２工程、（３）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程を含むことを特徴とする無機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法。
【請求項６】
（１）請求項２記載のアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む溶液試料に分散させる第１工程、（２）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第２工程を含むことを特徴とする無機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、本発明は、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を無機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を無機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子を提供するものである。
【化５】
2006007204.tif 000003
（１）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
また、本発明は、（１）請求項１記載のアフィニティー粒子に任意のリガンドを結合させる第１工程、（２）第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程、（３）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程を含むことを特徴とする無機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法を提供するものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
さらに、本発明は、（１）請求項２記載のアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第１工程、（２）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第２工程を含むことを特徴とする無機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法を提供するものである。なお、本発明のアフィニティー粒子を、免疫沈降法やラテックス凝集法等の抗体や蛋白の検出に用いる場合には、（２）の回収工程は不要であり、その分散状態の変化により目視で容易に確認できる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基について」
上記反応においては、すべてのアミノ基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するアミノ基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。この粒子が請求項１記載のアフィニティー粒子であり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが無機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。そして、この残存するアミノ基にリガンドを結合させたものが、請求項２記載のアフィニティー粒子となり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとが無機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。
請求項１記載のアフィニティー粒子は、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが可能となる製品態様である。請求項２記載のアフィニティー粒子はあらかじめリガンドを結合させた製品態様である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基について」
上記反応においては、すべての水酸基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存する水酸基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。この粒子が請求項１記載のアフィニティー粒子であり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが無機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。そして、この残存する水酸基にリガンドを結合させたものが、請求項２記載のアフィニティー粒子となり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとが無機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。
請求項１記載のアフィニティー粒子は、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが可能となる製品態様である。請求項２記載のアフィニティー粒子はあらかじめリガンドを結合させた製品態様である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基について」
上記反応においては、すべてのカルボキシル基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するカルボキシル基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。この粒子が請求項１記載のアフィニティー粒子であり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが無機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。そして、このリガンドが結合可能な反応基又は吸着基にリガンドを結合させたものが、請求項２記載のアフィニティー粒子となり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとが無機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。
請求項１記載のアフィニティー粒子は、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが可能となる製品態様である。請求項２記載のアフィニティー粒子はあらかじめリガンドを結合させた製品態様である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
「目的物質のアフィニティー分離方法」
上記で得られる本発明のアフィニティー粒子を用いて、本発明の目的物質のアフィニティー分離方法が行われる。
本発明の方法は、無機粒子を利用して、高精度な分離が簡便に行われるという点で画期的な目的物質の分離精製方法である。
本発明の方法は、下記の３つの工程を含むものである。なお、あらかじめリガンドが結合されているアフィニティー粒子の場合は（請求項１）、第１工程はすでに行われているので省略される。
１．式（１）で示されるホスホリルコリン基を無機粒子の表面に共有結合で有するアフィニティー粒子又は式（１）で示されるホスホリルコリン基を無機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを無機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子に、任意のリガンドを化学結合させる第１工程。
例えば、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とを無機粒子の表面に、前者は共有結合で後者は共有結合又は吸着で有するアフィニティー粒子と任意のリガンドＰＢＳ溶液１ｍｌを２ｍｌエッペンチューブに入れて、３０分間４℃で緩やかに振る。５０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を捨てる。洗浄のため、ＰＢＳ溶液１ｍｌを加えて、緩やかに振り、５０００ｒｐｍ、５分間遠心して、上清を捨てる。この洗浄操作を３回繰り返す。
２．第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程。
例えば、第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させ、３０分間４℃で緩やかに振る。５０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を捨てる。洗浄のため、ＰＢＳ溶液１ｍｌを加えて、緩やかに振り、５０００ｒｐｍ、５分間遠心して、上清を捨てる。この洗浄操作を３回繰り返す。
３．分離したアフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程。
例えば、アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収するため、溶出バッファー１ｍｌを加え、３０分間４℃で緩やかに振り、粒子から目的物質を溶出させ、上清を回収する。溶出バッファー１ｍｌを加えて、緩やかに振り、５０００ｒｐｍ、５分間遠心して、上清を回収する。この操作を２回繰り返す。
図１は、本発明のアフィニティー粒子と従来のアフィニティー粒子による目的物質捕捉の選択性の違いを示す模式図である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
「参考例１」
「ホスホリルコリン基を無機粒子の表面に共有結合で有するホスホリルコリン粒子（ＰＣ粒子（Ａ））」
合成例３で製造した式（１０）の化合物５０μｍｏｌを含むメタノール溶液９７．７μｌをとり、メタノール４７．５ｍｌ、蒸留水２．５ｍｌを加え、さらに平均粒子径１．５μｍ、比表面積が６ｍ2／ｇのシリカゲルを５ｇ添加した。この粒子分散溶液を８０℃で一晩還流させ、カップリングさせた。還流の後メタノールで遠心洗浄し、ＰＣ粒子を得た(以後、ＰＣ粒子（Ａ）と呼ぶ。)。以上の手順で、合成例３の表面改質剤でＰＣ処理した粒子（Ａ）のＰ定量測定を図４に示す。そこから求めたＰＣ導入量は３．１μｍｏｌ／ｇ粒子になりＰＣ基が粒子表面に導入されていることを確認した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
「参考例２」
「ホスホリルコリン基を無機粒子の表面に共有結合で有するホスホリルコリン粒子（ＰＣ粒子（Ｂ））」
合成例４で製造した式（１１）の化合物５０μｍｏｌを含むジメチルホルムアミド溶液２７８μｌをとり、ジメチルホルムアミド５０ｍｌを加え、さらに平均粒子径１．５μｍ、比表面積が６ｍ2／ｇのシリカゲルを５ｇ添加した。この粒子分散溶液を１６０℃で一晩還流させ、カップリングさせた。還流の後メタノールで遠心洗浄し、ＰＣ粒子を得た(以後、ＰＣ粒子（Ｂ）と呼ぶ。)。以上の手順で、合成例４の表面改質剤で処理したＰＣ粒子（Ｂ）のＰ定量測定を図４に示す。そこから求めたＰＣ導入量は３．４μｍｏｌ／ｇ粒子になりＰＣ基が粒子表面に導入されていることを確認した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
「参考例３」
「ホスホリルコリン基を無機粒子の表面に共有結合で有するホスホリルコリン粒子（ＰＣ粒子（Ｃ））」
合成例４で製造した式（１１）の化合物５０μｍｏｌを含むジメチルホルムアミド溶液２７８μｌをとり、ジメチルホルムアミド４７．５ｍｌ、蒸留水２．５ｍｌを加え、さらに平均粒子径１．５μｍ、比表面積が６ｍ2／ｇのシリカゲルを５ｇ添加した。この粒子分散溶液を１６０℃で一晩還流させ、カップリングさせた。還流の後メタノールで遠心洗浄し、ＰＣ粒子を得た(以後、ＰＣ粒子（Ｃ）と呼ぶ。)。以上の手順で、合成例４の表面改質剤で処理したＰＣ粒子（Ｃ）のＰ定量測定を図４に示す。そこから求めたＰＣ導入量は７．３μｍｏｌ／ｇ粒子になりＰＣ基が粒子表面に導入されていることを確認した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
「実施例１」
「ホスホリルコリン基とアミノ基を無機粒子の表面に共有結合で有するアフィニティー粒子（Ａｆ粒子（Ａ））」
合成例３で製造した式（１０）の化合物４５μｍｏｌを含むメタノール溶液８７．９μｌと３−アミノプロピルトリメトキシシラン５μｍｏｌを含むメタノール溶液５０μｌをとり、メタノール４７．５ｍｌ、蒸留水２．５ｍｌを加え、さらに平均粒子径１．５μｍ、比表面積が６ｍ2／ｇのシリカゲルを５ｇ添加した。この粒子分散溶液を８０℃で一晩還流させ、カップリングさせた。還流の後メタノールで遠心洗浄し、アフィニティー粒子を得た(以後、Ａｆ粒子（Ａ）と呼ぶ。)。以上の手順で、合成例３の表面改質剤で処理したＡｆ粒子（Ａ）のＰ定量測定を図４に示す。そこから求めたＰＣ導入量は２．７μｍｏｌ／ｇ粒子になりＰＣ基が粒子表面に導入されていることを確認した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
「実施例２」
「ホスホリルコリン基とアミノ基を無機粒子の表面に共有結合で有するアフィニティー粒子（Ａｆ粒子（Ｂ））」
合成例４で製造した式（１１）の化合物４５μｍｏｌを含むジメチルホルムアミド溶液２５０μｌと３−アミノプロピルトリメトキシシラン５μｍｏｌを含むジメチルホルムアミド溶液５０μｌをとり、さらに平均粒子径１．５μｍ、比表面積が６ｍ2／ｇのシリカゲルを５ｇ添加した。この粒子分散溶液を１６０℃で一晩還流させ、カップリングさせた。還流の後メタノールで遠心洗浄し、アフィニティー粒子を得た(以後、Ａｆ粒子（Ｂ）と呼ぶ。)。以上の手順で、合成例４の表面改質剤で処理したＡｆ粒子（Ｂ）のＰ定量測定を図４に示す。そこから求めたＰＣ導入量は３．３μｍｏｌ／ｇ粒子になりＰＣ基が粒子表面に導入されていることを確認した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
「実施例３」
「ホスホリルコリン基とアミノ基を無機粒子の表面に共有結合で有するアフィニティー粒子（Ａｆ粒子（Ｃ））」
合成例４で製造した式（１１）の化合物４５μｍｏｌを含むジメチルホルムアミド溶液２５０μｌと３−アミノプロピルトリメトキシシラン５μｍｏｌを含むジメチルホルムアミド溶液５０μｌをとり、ジメチルホルムアミド４７．５ｍｌ、蒸留水２．５ｍｌを加え、さらに平均粒子径１．５μｍ、比表面積が６ｍ2／ｇのシリカゲルを５ｇ添加した。この粒子分散溶液を１６０℃で一晩還流させ、カップリングさせた。還流の後メタノールで遠心洗浄し、アフィニティー粒子を得た(以後、Ａｆ粒子（C）と呼ぶ。)。以上の手順で、合成例４の表面改質剤で処理したＡｆ粒子（Ｃ）のＰ定量測定を図４に示す。そこから求めたＰＣ導入量は６．３μｍｏｌ／ｇ粒子なりＰＣ基が粒子表面に導入されていることを確認した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
「アフィニティー粒子の選択性評価１」
次に、請求項５で示すアフィニティー分離法を示す。実施例１、２、３で作製したＡｆ粒子（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）２５mｇに蒸留水１ｍｌ加えて、超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、グルタルアルデヒド溶液（８％）１ｍｌとシッフ塩基の安定化のためシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で５時間反応させ、ＭＱ水で遠心・精製（５０００ｇ）５回で洗浄した。グルタルアルデヒドがリガンドが結合可能な反応基又は吸着基である請求項１のアフィニティー粒子を得た。次にウシアルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）或いはヒトヘモグロビン（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１日反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行った。このウシアルブミン或いはヒトヘモグロビンがリガンドである。ここから、請求項６で示すアフィニティー分離法である。残っているグルタルアルデヒド基を不活性化するためエタノ−ルアミン塩酸塩（０．５Ｍ、ｐＨ７．１）１ｍｌとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行い、請求項２のアフィニティー粒子を得た。次にＨＲＰ標識抗ウシアルブミン抗体（１０μｇ／ｍｌ）或いはＨＲＰ標識抗ヒトヘモグロビン抗体（１０μｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加えて、室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を５回行った。さらにＰＢＳを１ｍｌ加えて攪拌し、１０μｌを９６穴ウェルプレートに移して基質ＴＭＢＺを用いて発色試験を行い、４５０nmで測定を行った。その結果を図９、図１０、図１１に示す。Ａｆ粒子（Ａ）はヒトヘモグロビン−ＨＲＰ標識抗ヒトヘモグロビン抗体で選択性があった。またＡｆ粒子（Ｂ）、Ａｆ粒子（Ｃ）ではウシアルブミン−ＨＲＰ標識抗ウシアルブミン抗体、ヒトヘモグロビン−ＨＲＰ標識抗ヒトヘモグロビン抗体どちらでも選択性があった。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
「アフィニティー粒子の選択性評価２」
ヒトヘモグロビンに対するヤギ抗血清を用いて選択性試験を行った。実施例１、３で作製したＡｆ粒子（Ａ）、（Ｃ）２５mｇに蒸留水１ｍｌ加えて、超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、グルタルアルデヒド溶液（８％）１ｍｌとシッフ塩基の安定化のためシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で５時間反応させ、ＭＱ水で遠心・精製（５０００ｇ）５回で洗浄した。グルタルアルデヒドがリガンドが結合可能な反応基又は吸着基である請求項１のアフィニティー粒子を得た。次にヒトヘモグロビン（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１日反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行った。このヒトヘモグロビンがリガンドである。ここから、請求項６で示すアフィニティー分離法である。残っているグルタルアルデヒド基を不活性化するためエタノ−ルアミン塩酸塩（０．５Ｍ、ｐＨ７．１）１ｍｌとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行い、請求項２のアフィニティー粒子を得た。次に１００倍希釈したヤギ抗血清を１ｍｌ加えて、室温で１時間反応させた。次に遠心（５０００ｇ）して上清を得た（上清画分）。ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を５回行った。次にＧｌｙ−ＨＣｌバッファー（０．２Ｍ、ｐＨ２．５）１ｍｌを加えて室温で１時間反応させて抗ヒトヘモグロビン抗体を溶出し、遠心（５０００ｇ）して上清を得た（溶出画分）。この上清画分と溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで流して、銀染色を行った結果を図１２に示す。Ａｆ粒子（Ａ）、（Ｃ）どちらとも、溶出画分では抗体の重鎖のバンドが濃く見られその他にバンドは見られないことから、高選択的に抗体を捕捉している粒子であることがわかった。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
「アフィニティー粒子の選択性評価３」
抗ヒトヘモグロビンを混合したヤギ抗血清を用いて選択性試験を行った。実施例１、３で作製したＡｆ粒子（Ａ）、（Ｃ）２５mｇに蒸留水１ｍｌ加えて、超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、グルタルアルデヒド溶液（８％）１ｍｌとシッフ塩基の安定化のためシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で５時間反応させ、ＭＱ水で遠心・精製（５０００ｇ）５回で洗浄した。グルタルアルデヒドがリガンドが結合可能な反応基又は吸着基である請求項１のアフィニティー粒子を得た。次にヒトヘモグロビン（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１日反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行った。このヒトヘモグロビンがリガンドである。ここから、請求項６で示すアフィニティー分離法である。残っているグルタルアルデヒド基を不活性化するためエタノ−ルアミン塩酸塩（０．５Ｍ、ｐＨ７．１）１ｍｌとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行い、請求項２のアフィニティー粒子を得た。次に抗ヒトヘモグロビン５０μｇを混合した１００倍希釈ヤギ血清を１ｍｌ加えて、室温で１時間反応させた。次に遠心（５０００ｇ）して上清を得た（上清画分）。ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を５回行った。次にＧｌｙ−ＨＣｌバッファー（０．２Ｍ、ｐＨ２．５）１ｍｌを加えて室温で１時間反応させて抗ヒトヘモグロビン抗体を溶出し、遠心（５０００ｇ）して上清を得た（溶出画分）。この上清画分と溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで流して、銀染色を行った結果を図１３に示す。Ａｆ粒子（Ａ）、（Ｃ）どちらとも、溶出画分では抗体の重鎖のバンドが濃く見られその他には薄いバンドしか見られないことから、高選択的に抗体を捕捉している粒子であることがわかった。またバンドの濃さから、抗体捕捉量は１０〜２０μｇ程度であった。また溶出画分の抗体活性をサンドイッチＥＬＩＳＡで確認したところ、Ａｆ粒子（Ａ）１３．０μｇ、Ａｆ粒子（Ｃ）では１０．１μｇ程度活性があった。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
「比較例１」
「アミノ基を無機粒子の表面に共有結合で有するアフィニティー粒子（アミノ粒子）」
３−アミノプロピルトリメトキシシラン５０μｍｏｌを含むメタノール溶液５００μｌをとり、メタノール４７．５ｍｌ、蒸留水２．５ｍｌを加え、さらに平均粒子径１．５μｍ、比表面積が６ｍ2／ｇのシリカゲルを５ｇ添加した。この粒子分散溶液を８０℃で一晩還流させ、カップリングさせた。還流の後メタノールで遠心洗浄し、アミノ粒子を得た。このアミノ粒子２５mｇに蒸留水１ｍｌ加えて、超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、グルタルアルデヒド溶液（８％）１ｍｌとシッフ塩基の安定化のためシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で５時間反応させ、ＭＱ水で遠心・精製（５０００ｇ）５回で洗浄した。グルタルアルデヒドがリガンドが結合可能な反応基又は吸着基である。次にウシアルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）或いはヒトヘモグロビン（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１日反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行った。このウシアルブミン或いはヒトヘモグロビンがリガンドである。残っているグルタルアルデヒド基を不活性化するためエタノ−ルアミン塩酸塩（０．５Ｍ、ｐＨ７．１）１ｍｌとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行い、請求項２のアフィニティー粒子を得た。次にＨＲＰ標識抗ウシアルブミン抗体（１０μｇ／ｍｌ）或いはＨＲＰ標識抗ヒトヘモグロビン抗体（１０μｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加えて、室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を５回行った。さらにＰＢＳを１ｍｌ加えて攪拌し、１０μｌを９６穴ウェルプレートに移して基質ＴＭＢＺを用いて発色試験を行い、４５０nmで測定を行った。その結果を図１４に示す。タンパクの非特異吸着が多く、選択性が低い。