【手続補正書】
【提出日】平成20年8月8日(2008.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価カチオンの解離方法であって、
多価カチオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに導入する工程と、
前記イオン封じ込めデバイスに気相電子移動試薬アニオンを導入する工程と、
解離生成物カチオンを得るために、試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンから多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンへの電子移動を促進するために、導入された前記試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンおよび多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンを混合する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記多価カチオンがポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＦ電場イオン封じ込めデバイスがＲＦイオンガイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＦ電場イオン封じ込めデバイスがＲＦイオントラップである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＦイオントラップがＲＦ線形多重極イオントラップである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＦイオントラップがＲＦ三次元多重極イオントラップである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記混合工程中、導入された前記試薬アニオンまたはその誘導体試薬イオンおよび多価カチオンまたはその誘導体多価カチオンの運動エネルギーが１電子ボルト未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アニオンおよび前記多価カチオンの運動エネルギーを前記混合工程のための熱レベル付近に減少させるために、バックグラウンドガス分子との衝突を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アニオンをＲＦ線形多重極イオントラップの線形軸に沿って注入する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記気相アニオンが、多環芳香族炭化水素または置換多環芳香族炭化水素から生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記気相アニオンが、アントラセン、９，１０ジフェニルアントラセン、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン、２，２’ジピリジル、２，２’ジキノリン、９−アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、１，１０’−フェナントロリン、９’アントラセンカルボニトリル、およびアントラキノンからなる群から選択される低電子親和力基質から生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
質量（ｍ／ｚ）を分析して、前記解離生成物カチオンに由来するイオンを検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イオントラップが、セグメント化された線形ＲＦ多重極イオントラップである、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記気相アニオンが、多環芳香族炭化水素化合物または置換多環芳香族炭化水素化合物から生成されたラジカル気相アニオンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記多価ポリペプチドおよび前記気相アニオンが、前記混合工程までイオントラップ内で空間的に分離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記多価ポリペプチドカチオンおよび前記気相アニオンが、前記混合工程までイオントラップ内で空間的に分離されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
非解離電荷減少電子伝達生成物カチオンの電子移動型解離経路を介した解離を促進するように、十分なエネルギーを前記非解離電荷減少電子移動生成物カチオンに供給し、従来の衝突活性化解離生成物の生成は２０％未満である、さらなる活性化工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
非解離電荷減少電子伝達生成物カチオンの電子移動型解離経路を介した解離を促進するように、十分なエネルギーを前記非解離電荷減少電子移動生成物カチオンに供給し、従来の衝突活性化解離生成物の生成は５％未満である、さらなる活性化工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記さらなる活性化工程が、前記アニオンと前記正電荷の多価ポリペプチドイオンとを混合する前記工程後に行なわれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記さらなる活性化工程が、前記アニオンと前記正電荷の多価ポリペプチドイオンとを混合する前記工程後に行なわれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記さらなる活性化工程が、前記アニオンと前記正電荷の多価ポリペプチドイオンとを混合する前記工程中に行なわれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記活性化エネルギーを、光活性化形態または衝突活性化形態で供給する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
線形イオントラップ内の電子移動生成物カチオンを保持しながらＲＦイオントラップ由来の残存アニオンを放出する工程と、
従来の衝突活性化解離生成物の２０％未満が生成される衝突活性化を起こすために、電子移動生成物イオンを低エネルギーのオフ共鳴運動励起に供する工程と、
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２４】
第２のアニオン型を線形イオントラップに導入する工程と、
前記第２のアニオン型をカチオンと混合して反応させる工程と、
をさらに含み、
前記第２のアニオン型がプロトンを実質的に排他的にカチオンに移動させる、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のアニオン型が、カルボン酸、フェノール酸、およびアルコキシドを含有する化合物からなる群から選択される化合物に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のアニオン型が、安息香酸、ＰＤＣＨ、ＳＦ６、およびＰＦＴＢＡからなる群から選択される化合物のアニオンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
質量（ｍ／ｚ）を分析して、前記電子移動解離生成物イオン、または前記電子移動解離生成物イオンの誘導体イオンの検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドのアミノ酸配列を分析する方法であって、
多価ポリペプチドポリペプチドカチオンをＲＦイオントラップに導入する工程と、
気相アニオンをＲＦイオントラップに導入する工程と、
アニオンから多価ポリペプチドカチオンへの電子移動を促進するために前記気相アニオンと多価ポリペプチドカチオンとを混合し、それにより、電子移動解離生成物イオンの生成を誘導する工程と、
前記電子移動生成物カチオンから残存する気相アニオンを物理的に分離することによって反応を停止させる工程と、
前記トラップ中に残存するカチオンのｍ／ｚ分析を行う工程と、
を含む方法。
【請求項２９】
前記電子移動解離生成物カチオンが、前記ＲＦイオントラップからイオン検出器にｍ／ｚに応じて連続的に排出される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記イオントラップが線形ＲＦ多価イオントラップである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記気相アニオンを前記線形イオントラップの線形軸に沿って注入する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ラジカル気相アニオンが、アントラセン、９，１０ジフェニルアントラセン、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン、２，２’ジピリジル、２，２’ジキノリン、９−アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、１，１０’−フェナントロリン、９’アントラセンカルボニトリル、およびアントラキノンからなる群から選択される低電子親和力基質から生成される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
電子移動解離によってポリペプチドを解離する方法であって、
多価ポリペプチドアニオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに導入する工程と、
気相カチオンをＲＦ電場イオン封じ込めデバイスに導入する工程と、
アニオンからカチオンへの電子移動を促進するためにラジカル気相イオンとイオン化ポリペプチドとを混合し、それにより、陰電子移動解離生成物イオンの生成を誘導する工程と、
を含む方法。
【請求項３４】
前記カチオンが、不活性ガスカチオンからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
質量（ｍ／ｚ）を分析して、前記陰電子移動解離生成物イオンまたは前記陰電子移動解離生成物イオン由来のイオンを検出する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
しかし、ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙの技術は、多数の欠点があり、以下が含まれる。
１．ＥＣＤ反応を起こすのに必要な熱運動エネルギー付近で陽イオンおよび電子を同時に閉じ込めることが非常に困難である。これは、つい最近まで、ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計の高磁場内に位置づけられたＩＣＲセル中のみで行われていた。これらのＥＣＤ  ＩＣＲ装置は、典型的には、約４．７〜９Ｔｅｓｌａの磁場を得るために超伝導磁石を使用し、それにより、毎回５０〜１５０万ドルかかる。ほとんどのタンパク質配列分析は、現在、ＲＦ四重極イオントラップ、ＲＦ四重極線形トラップ、Ｑ−ＴＯＦ（四重極飛行時間型）、またはＴＯＦ−ＴＯＦ装置で行われている。ＣＡＤ中にイオンを含めるために従来から使用されている不均一なＲＦ場デバイス（ＲＦトラップおよびイオンガイド）が電子を閉じ込めないことが、ＦＴＩＣＲ以外の任意の質量分析計によるＥＣＤの実施を主に困難にしている。これは、電子の質量が非常に小さいことによる。これらのデバイスに注入された電子も、任意の効率でＥＣＤ反応が起こるのに十分な時間間隔で熱エネルギー付近で保持することができない。したがって、いくつかのグループが最近ＲＦイオントラップでのＥＣＤの実施を報告しているにもかかわらず、これらの実験の感度／フラグメントイオン収率は、一般的なＥＣＤを使用して得られた結果よりも実質的に低い。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
４．ＥＣＤのさらなる欠点は、前駆体イオンが巨大なペプチドイオンまたはタンパク質イオンである場合、所与の前駆体の生成物イオンは、しばしば、恐らく非共有結合（水素結合）によって互いに結合したままになり、ＥＣＤ実験条件下で解離できないことである。第２の活性化（例えば、光または衝突−活性化）解離工程は、これらの水素結合を破壊する必要があり、ＥＣＤ生成物イオン（ｃ型およびｚ型生成物イオン）が認められる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
種々の実施形態の要旨
本開示は、質量分析計におけるイオンの新規の断片化方法および質量分析計によるペプチドおよびタンパク質の配列分析方法に関する。１つの実施形態によれば、ポリペプチドを、電子移動解離事象によってペプチド骨格に沿って無作為に断片化し、ここで標的ポリペプチドをイオン化し、四重極線形イオントラップに注入する。次いで、イオン化ポリペプチドと反対の電荷を有する１価または多価の気相イオンを、四重極線形イオントラップに導入し、気相試薬イオンおよびイオン化ポリペプチドを制御された条件下で混合してアニオンからカチオンへの電子移動を促進し、それにより、電子移動解離生成物イオンの生成を誘導する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
１つの実施形態によれば、多価ポリペプチドイオンからの電子の移動（引き抜き）を含むイオン−イオン反応を使用して、ＲＦ電場イオン封じ込めデバイス内でポリペプチド分析イオンの陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）を行う。ＥＴＤプロセスでは、多価ポリペプチド分析イオンは、カチオン（陽イオン）である。ＮＥＴＤプロセスでは、多価ポリペプチド分析イオンはアニオン（陰イオン）である。このプロセスをＥＴＤと区別するために、用語「陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）」を使用する。ＥＴＤおよびＮＥＴＤは、関与する分析イオンの反対の極性および分析物に対して反対の電子移動方向の両方によって示唆されるように、２つの個別の異なる解離促進イオン−イオン反応型を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
用語「多環芳香族炭化水素」は、２つまたはそれ以上の芳香環を含む多環式炭素環系をいい、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン、２，２’ジピリジル、２，２’ジキノリン、９−アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、１，１０’−フェナントロリン、９’アントラセンカルボニトリル、およびアントラキノンが含まれるが、これらに限定されない。置換多環芳香族炭化水素には、１つまたは３つの置換基を有する置換多環芳香族炭化水素化合物であって、置換基には、アリール、ヘテロアリル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ハロ、−ＣＮ、またはアミノ置換基が含まれる、置換多環芳香族炭化水素化合物が含まれる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
１つの実施形態によれば、多価ポリペプチドアニオンを四重極線形イオントラップに導入し、第１の定義したイオントラップ領域中に閉じ込める。次いで、１価または多価の、ポリペプチドイオンと逆の電荷を有する、ラジカル気相カチオンを、四重極線形イオントラップの線形軸に沿って四重極線形イオントラップに導入する。次いで、２つのイオン種または最初に導入された種由来のイオンを線形イオントラップ内で混合して、アニオンからカチオンへの電子移動を促進し、それにより、陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）生成物アニオンの生成を誘導する。１つの実施形態によれば、ポリペプチドポリペプチドは、多価脱プロトン化されており、気相イオンはカチオンである。１つの実施形態では、カチオンは、ポリペプチドアニオンから電子を引き抜くポリペプチドアニオンから電子を引き抜く任意の不活性ガスカチオン（例えば、Ｈｅ、Ｎｅ、Ｘｅ、Ａｒ、Ｎ２＋、Ｏ２＋、ＣＯ＋）または任意の他のラジカルカチオン（多価プロトン化多環芳香族炭化水素または置換多環芳香族炭化水素など）である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
電子移動解離生成物イオンの質量（ｍ／ｚ）分析および検出の前に、１つの実施形態では、第１のアニオンをイオントラップから放出させ、そして、第２のアニオン型を線形イオントラップに導入し、ここで、第２のアニオン型がその後排他的にプロトンを実質的に排他的にカチオンに移動させ、第２のアニオン型がカチオンと混合して反応する。１つの実施形態によれば、第２のアニオン型は、カルボン酸、フェノール酸、およびアルコキシドを含有する化合物に由来する。１つの実施形態では、第２のアニオンは、安息香酸、ＰＤＣＨ、ＳＦ６、およびＰＦＴＢＡからなる群から選択される化合物のアニオンである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
電子移動解離（ＥＴＤ）により、ペプチド骨格に沿ってポリペプチドが無作為に断片化され、質量分析法によってポリペプチドの配列が分析される。電子移動解離（ＥＴＤ）は、２つの既存の方法（衝突誘起解離（ＣＩＤ）および電子捕獲解離（ＥＣＤ））の強度を組み合わせる。ＥＣＤは、現在、（分析目的では）質量分析器として超伝導磁石においてＰｅｎｎｉｎｇトラップを使用する高価なフーリエ変換装置に制限される。対照的に、ＣＩＤのようなＥＴＤを、Ｑ−ＴＯＦ型装置と同様に、種々のＲＦ四重極イオントラップ質量分析計および最後の質量分析計より前にイオン蓄積のためのＲＦ多重極線形トラップを利用する（または利用するために適合させることができる）他のハイブリッド型装置に適合させることができる。ＥＴＤにより、ＥＣＤと同一のフラグメントイオン型が生成され、それにより、複数の塩基性アミノ酸および翻訳後修飾を含むペプチドの特徴付けに適切である。本明細書中に示すように、ＥＴＤ技術により、クロマトグラフ時間尺度（約２００〜５００ｍ秒／スペクトル）で得られる高品質のスペクトル（前駆体−生成物変換効率が約５〜２０％）が得られる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
装置類
１つの実施形態によれば、これらの実験を行うために使用した装置は、２−Ｄ−多重極イオントラップにおける改良されたペプチド断片化方法のために必要な工程を実施するように改変された市販のシステム（改変ＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．））である。他の代わりの装置の構成を、他の市販または特注の構成要素に組み込んで使用することができる。イオン通路の機構またはＥＳＩ源の間のイオン経路成分からＲＦ  ＱＬＴへの印加電圧を変化させなかった。図２は、装置に合わせた修正の概要を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
ＱＬＴにおけるＣＡＤ、ＥＴＤ、およびプロトン移動（電荷減少）を実施するためのタイムスケールが短いので（数十ｍ秒）、複数のイオン反応工程を、各ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎ実験に組み込むことができる。「ボトムアップ」プロテオミクス型実験（タンパク質混合物の酵素消化によって生成されたペプチドのデータ依存ＨＰＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析）の文脈では、本発明者らは、ＥＴＤは平均の長さが２０〜２５残基のペプチドを生成するＬｙｓ−ＣまたはＡｓｎ−Ｎなどのタンパク質分解酵素の使用を促進すると予想している。ＥＳＩを使用して、このようなペプチドを、３個〜６個の電荷を有し、それによりＥＴＤの理想的な候補であえる前駆体イオンに変換する。ＥＴＤ後、本発明者らは、質量分析前にｃ型およびｚ型のフラグメントイオンが主に＋１の荷電状態であることを確実にするためのイオン／イオン、プロトン引き抜き反応（電荷減少）の使用を予想する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
予備段階の結果に基づいて、本発明者らは、ＭＳ３実験を使用したプロトコールは小タンパク質または巨大ペプチドからの配列情報の入手に理想的でありうると考える。典型的なＭＳ３実験は、以下の工程を含み得る：（ｉ）ＥＳＩによってイオン化されたタンパク質で認められる荷電状態の最初の不均一な混合物を単一の荷電状態（前駆体イオンｍ／ｚ）に変換するための気相集中（「イオンパーキング」を使用したプロトン移動による電荷の減少）、（ｉｉ）制限された巨大生成物イオン組を作製するための前駆体イオンのｍ／ｚ単離およびＣＡＤ（Ａｓｐ残基のＣ末端切断によって生成されたｂ型イオンまたはＰｒｏ残基のＮ末端の切断によって形成されたｙ型イオン）、（ｉｉｉ）単一のＣＡＤ生成物イオンのｍ／ｚ単離およびＥＴＤ、および（ｉｖ）第２世代の生成物イオンのｍ／ｚ分析。得られたＥＴＤ  ＭＳ３スペクトルにより、単一のｂ型またはｙ型の中間体生成イオン（ＭＳ２生成物イオン）由来の配列情報が得られるであろう。一連のこのようなＭＳ３実験により、全ての主な中間体タンパク質イオンについての配列情報が得られるであろう。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
上記のプロトコールでは、第１の解離工程（ＣＡＤ）は、従来のボトムアッププロテオミクス分析における酵素消化工程と類似する。ＭＳ３スペクトルは、トリプシンペプチドから得たＭＳ２スペクトルに対応する。しかし、提案されたＭＳ３プロトコールでは、ｂ型またはｙ型の生成物イオンの各ＭＳ３スペクトルにより、分子量が公知のタンパク質の一部についての配列情報が得られる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
図１０Ａおよび１０Ｂでは、本発明者らは、この場合のみＰＴＲアニオンとして六フッ化硫黄よりもむしろ安息香酸を使用した同一の実験を行った。本発明者らは最初のＥＴＤ反応の持続時間も減少させたことに留意のこと。さらに、ＥＴＤ実験後に生成された多価フラグメントイオンは、第２のＰＴＲ反応後に電荷が減少し、主に＋１荷電状態に集中する。反応時間が延長される場合、多価フラグメントは、より低い荷電状態に優先的に集中する（１５０ｍ秒の安息香酸との反応の場合、主に１価の生成物）（図１０Ｂ）。明らかに、ＥＴＤ反応後により高い分子量のｃ型およびｚ型のフラグメントイオンが生成され、不運なことに、プロトン移動反応の簡素化によってそのｍ／ｚ値が、装置のｍ／ｚ範囲の限度を超えて増加する。装置のｍ／ｚ分解能の上限と適合するほとんどの２価および１価のフラグメントイオンが得られるＰＴＲ反応時間の選択によって範囲を拡大することができる。質量分析器のｍ／ｚ分解能と釣り合った生成物の荷電状態が得られるようにＰＴＲ反応持続時間を調整することができる。あるいは、このイオン／イオンデバイスの他の質量分析器とのハイブリッドも、この質量範囲の限度を拡大する（例えば、ＴＯＦ、ＩＣＲ、ｏｒｂｉｔｒａｐなど）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
結果
ヒト核リンペプチド分析−ＥＴＤ
ＣＡＤタンデムＭＳによるヒト核抽出物由来のリンペプチドを同定する本発明者らの最初の試みにより、数百種のリン酸化ペプチドが検出されたが、不適切なペプチド骨格の断片化により約１０種のリンペプチド配列のみが解釈された。ヒト核抽出物由来の最も豊富なリンペプチドは、そのＣＡＤスペクトルがリン酸、水、およびメタノールのニュートラルロスによって特徴づけられる２リン酸化ペプチド（ｍ／ｚ４１２．６）であった（図１１Ａ）。別の分析では、本発明者らは、この同一サンプルの分析のためにＥＴＤタンデムＭＳを使用した。この同一ペプチドから得られたＥＴＤスペクトルは、これらのニュートラルロスを含まないが、むしろ、完全なｃ型およびｚ型のイオン系列が明らかとなり、それにより、ヒト核スプライシング因子（アルギニン／セリンリッチ３タンパク質）由来のｅＲｐＳＬｐＳＲｅＲ（配列番号１５）としてリンペプチドを同定することができる（図１１Ｂ）。小文字の「ｅ」は、グルタミン酸のメチルエステル変換を示し、「ｐ」はリン酸化セリン残基を示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
ＥＴＤによるヒト核リンペプチドの再分析後、１００以上のリンペプチドを同定した。表２は、ＥＴＤタンデムＭＳおよびその後のＳＥＱＵＥＳＴ（コンピュータスコアリングアルゴリズム）を使用した分析を使用して同定したこれらのリンペプチド配列の一部のリスト（５０の新規の配列にわたる）である。手作業で確証したペプチドにチェックマークを入れる。