(57)【要約】本発明は、マウスモノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２９）の抗原決定基と同一のアミノ酸配列を特異的に認識し得る抗体、及びマウスモノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２８）の抗原決定基と同一のアミノ酸配列を特異的に認識し得る抗体、並びに上記２種の抗体を用いて、生体試料中のＭＥＰＥ由来分子を検出することによる、骨折のリスク予測及び／又は骨粗鬆症の診断方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の抗体。
（ａ）マウスモノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２９）
（ｂ）上記（ａ）の抗体の抗原決定基と同一のアミノ酸配列を特異的に認識し得る抗体
【請求項２】
抗原決定基が配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２５３−２６１で示されるアミノ酸配列中に存在する請求項１記載の抗体。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の抗体。
（ａ）マウスモノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２８）
（ｂ）上記（ａ）の抗体の抗原決定基と同一のアミノ酸配列を特異的に認識し得る抗体
【請求項４】
抗原決定基が配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２９８−３０６で示されるアミノ酸配列中に存在する請求項３記載の抗体。
【請求項５】
請求項１記載の抗体と、請求項３記載の抗体とを用いることを特徴とする、骨折のリスク予測及び／又は骨粗鬆症の診断方法。
【請求項６】
生体試料中の、請求項１記載の抗体及び請求項３記載の抗体により認識される物質を測定することを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
サンドイッチ法により該物質を測定することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
生体試料が血液、血清又は血漿である請求項６記載の方法。
【請求項９】
請求項１記載の抗体及び請求項３記載の抗体を含む、骨折のリスク予測及び／又は骨粗鬆症の診断用キット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原決定基の異なる複数の、Ｍａｔｒｉｘ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（以下、「ＭＥＰＥ」と略記する）に対する新規抗体及びそれらの用途、具体的には、骨粗鬆症診断薬としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＥＰＥは腫瘍性骨軟化症（以下、「ＯＨＯ」と略記する場合がある）患者の原因腫瘍中で高発現しており、そこから遺伝子クローニングされた糖蛋白質（ヒトでは全長５２５アミノ酸からなる；配列番号：２）で、低リン血症を引き起こすリン利尿因子（Ｐｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎ）の候補の１つと考えられている。ここ数年の研究から、（１）骨組織で強く発現している（Ａ．Ｎａｍｐｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｍｅｔａｂ．，２２：１７６−８４（２００４））、（２）骨芽細胞が分化・石灰化するにつれ発現上昇する、（３）ＭＥＰＥノックアウトマウスは骨量が増加し、骨芽細胞分化が促進されている（Ｌ．Ｃ．Ｇｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：１９９８−２００７（２００３））などの知見が得られており、骨形成抑制因子として機能することが示唆されている。しかし、最近、ＭＥＰＥのフラグメントが全長タンパク質とは異なる作用を示すことが示唆されている。
ＭＥＰＥあるいはＭＥＰＥ分解産物の血中濃度を測定することは、ＭＥＰＥの病態との因果関係を明らかにする上で重要であり、血中ＭＥＰＥ濃度が骨・関節疾患の病態マーカーとして有用である可能性が期待される。これまで、Ａ．Ｊａｉｎら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８９：４１５８−６１（２００４））が、抗ＭＥＰＥポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡにより正常人の血中ＭＥＰＥ濃度を測定し、ＭＥＰＥと血清リン酸値、ＰＴＨ値、大腿骨ＢＭＤ、全股関節ＢＭＤとが正相関すると報告している。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、血中のＭＥＰＥ由来分子を検出するための種々の新規抗ＭＥＰＥ抗体を提供すること、及び該抗体を利用して、骨・関節疾患の血中病態マーカーとなり得るＭＥＰＥ由来分子を検出する方法を提供することである。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、８種の抗ヒトＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体とウサギポリクローナル抗体とを作製し、それらの組み合わせを変えた複数のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。これらのアッセイ系を用いて、閉経後女性から採取した血漿中のＭＥＰＥ濃度を測定したところ、抗体の組み合わせによって測定結果が顕著に異なる場合があった。このうち、２種のモノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３及びＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２を用いた場合には、調べた血漿の約７割で検出限界以下を示した。さらに意外なことに、当該アッセイ系においてＭＥＰＥが検出限界以下であった血漿の提供者は、ＭＥＰＥが検出された血漿の提供者に比べて骨折頻度が有意に高いことが明らかとなった。そこで、本発明者らは、モノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３及びＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２がそれぞれ認識するＭＥＰＥの領域を調べ、これらの領域の両方を含むＭＥＰＥ由来分子を血漿中に含むか否かを調べることにより、骨粗鬆症の診断や骨折のリスク予測が可能であることを明らかにした。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］以下の（ａ）又は（ｂ）の抗体；
（ａ）マウスモノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２９）
（ｂ）上記（ａ）の抗体の抗原決定基と同一のアミノ酸配列を特異的に認識し得る抗体
［２］抗原決定基が配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２５３−２６１で示されるアミノ酸配列中に存在する上記［１］記載の抗体；
［３］以下の（ａ）又は（ｂ）の抗体；
（ａ）マウスモノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２８）
（ｂ）上記（ａ）の抗体の抗原決定基と同一のアミノ酸配列を特異的に認識し得る抗体
［４］抗原決定基が配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２９８−３０６で示されるアミノ酸配列中に存在する上記［３］記載の抗体；
［５］上記［１］記載の抗体と、上記［３］記載の抗体とを用いることを特徴とする、骨折のリスク予測及び／又は骨粗鬆症の診断方法；
［６］生体試料中の、上記［１］記載の抗体及び上記［３］記載の抗体により認識される物質を測定することを特徴とする、上記［５］記載の方法；
［７］サンドイッチ法により該物質を測定することを特徴とする、上記［６］記載の方法；
［８］生体試料が血液、血清又は血漿である上記［６］記載の方法；及び
［９］上記［１］記載の抗体及び上記［３］記載の抗体を含む、骨折のリスク予測及び／又は骨粗鬆症の診断用キット；
などを提供する。
本発明の２種の抗ＭＥＰＥ抗体は、それらを用いて生体試料中のＭＥＰＥ由来分子を測定することにより、該試料を採取した動物の骨折リスクを予測し、骨粗鬆症の診断を行うことができるという有利な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、フォスファトニン（ＭＥＰＥ）−ＦＬＡＧ付加体の動物細胞発現用プラスミドの構造を示す。図中、Ｐｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎ−ＦＬＡＧはフォスファトニン（ＭＥＰＥ）−ＦＬＡＧ付加体のコード配列を、Ｔ７ＰはＴ７プロモーターを、ｆ１  ｏｒｉはｆ１複製起点を、Ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子を、Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ示す。
図２は、実施例３で得られた昆虫細胞発現ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像を示す。泳動はＭｕｌｔｉ  ｇｅｌ  ４／２０を用い、１００ｍＭ  ＤＴＴで１００℃、２分間処理した還元条件下で行った。レーン１：昆虫細胞培養上清；レーン２：精製ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ標品（１μｇ）
図３は、実施例４記載の８種類の抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体の固相化ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧに対する結合親和性を示す。縦軸は４５０ｎｍでの吸光度を、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ示す。−●−：ＭＥ−２Ｄ１１．９；−▲−：ＭＥ−４Ａ２．２；−■−：ＭＥ−９Ｄ２．１５；−○−：ＭＥ−９Ｈ６．８；−＊−；ＭＥ−１０Ｅ４．２；−△−：ＭＥ−１２Ｃ９．２；−□−：ＭＥ−１２Ｅ２．１；−◆−：ＭＥ−１６Ｆ４．３
図４は、実施例５記載の血漿中ＭＥＰＥ由来抗原濃度の測定用酵素免疫測定法の検量線を示す。縦軸は４５０ｎｍでの吸光度を、横軸は抗原濃度（ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ示す。
図５は、ビスフォスフォネート投与を受けていない閉経後女性の血漿中ＭＥＰＥ由来抗原濃度と椎骨骨折数との相関を示す。縦軸は椎骨骨折数を示し、横軸は左から血漿中ＭＥＰＥ由来抗原濃度が検出限界以下（＜０．５９ｎｇ／ｍｌ；有効数：５４サンプル）及び検出限界以上（＜０．５９ｎｇ／ｍｌ；有効数：１５サンプル）を示す。グラフ中の記号（＊及び○）はエラーバーからはみ出したサンプルのプロットを示し、各プロットの右下にサンプル番号を付記する。
図６は、抗ＭＥＰＥウサギポリクローナル抗体（図６Ａ、左パネル）及び実施例４で得られた２種類の抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２（図６Ａ、中パネル）、ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３（図６Ａ、右パネル））の各種ＭＥＰＥ  Ｃ末欠失ムテインに対する結合特異性（ウェスタンブロット）を示す。図中、ＷＴは野生型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ（成熟型ＭＥＰＥの全長＋ＦＬＡＧタグ）を、Δ２４１−５２５、Δ３３１−５２５およびΔ５０７−５２５は、成熟型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧの２４１−５２５位、３３１−５２５位および５０７−５２５位がそれぞれ欠失したＣ末欠失ムテインを示す。また、図６Ｂ中、「＋」は結合性を有することを、「−」は結合性を有しないことをそれぞれ示す。
図７は、実施例４で得られた２種類の抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２、ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３）のＭＥＰＥ部分合成ペプチドに対する結合特異性を示す。図７Ａは、イムノドットブロットのスポットの配置、並びに各スポット番号の位置で固相合成されたＭＥＰＥ部分合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。図７Ｂは、得られたイムノドットブロット結果を示す（上パネル：ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２；下パネル：ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３）。図中の数字はスポット番号を示す。図７Ｃは、各抗体（上段：ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２；下段：ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３）と結合性を示したＭＥＰＥ部分合成ペプチドのアミノ酸配列と対応するＭＥＰＥアミノ酸配列とのアラインメントを示す。それぞれにつき、最上段の配列はＭＥＰＥの部分アミノ酸配列を示し、該配列の上に付記される数字はアミノ酸番号を示す。また、丸付き数字はスポット番号を示す。アラインメントの結果から、ボックスで囲んだ部分配列内に各抗体の抗原決定基があると判定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の第１の抗ＭＥＰＥ抗体（以下、「本発明の第１抗体」という場合もある）は、抗ヒトＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３（以下、単に「ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３」という場合もある）、あるいは該抗体の抗原決定基（エピトープ１；Ｅ１）と同一のアミノ酸配列を特異的に認識し得る抗体である。該抗体は、Ｅ１を特異的に認識し得る限り、モノクローナル抗体であっても、あるいはポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ、特に好ましくはＩｇＧが挙げられる。また、免疫原や免疫動物にも特に制限はなく、例えば、非ヒト哺乳動物（例：サル、チンパンジー、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギなど）由来のＭＥＰＥオルソログにおけるＥ１に相当する領域（Ｅ１’；例えばカニクイザルの場合、Ｅ１’は、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号ＢＡＢ１７０１０．１を付されて登録されているアミノ酸配列中アミノ酸番号２８４−２９２で示されるアミノ酸配列中に存在する）を免疫原として得られる抗体や、非ヒト温血動物（例：ウサギ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）やヒト培養細胞等にＭＥＰＥもしくはそのフラグメントを免疫して得られる抗体、あるいは非ヒト温血動物（例：ウサギ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）やヒトの抗体遺伝子ライブラリーを用いたファージディスプレー法等の抗体ディスプレー法により得られる抗体なども、本発明の第１抗体に包含され得る。
ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３の抗原決定基（Ｅ１）は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２５３−２６１で示されるアミノ酸配列中に存在する。ある抗ＭＥＰＥ抗体がＥ１と同一のアミノ酸配列を認識し得るか否かは、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄ．（１９９８）に記載されるような通常のクロスブロッキングアッセイを用いて、ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３のＭＥＰＥに対する結合阻害を調べることにより検定することができる。あるいは、ペプチドアレイやファージディスプレー等を用いたエピトープマッピングにより、ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３と同様にＥ１を含むペプチドに結合するか否かを調べることによって、より直接的に検定することもできる。ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３は、２００５年４月２６日から、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２９の受託番号を付されて寄託されている。
本発明の第２の抗ＭＥＰＥ抗体（以下、「本発明の第２抗体」という場合もある）は、抗ヒトＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２（以下、単に「ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２」という場合もある）、あるいは該抗体の抗原決定基（エピトープ２；Ｅ２）と同一のアミノ酸配列を認識し得る抗体である。該抗体は、Ｅ２を特異的に認識し得る限り、モノクローナル抗体であっても、あるいはポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡ、特に好ましくはＩｇＧが挙げられる。また、免疫原や免疫動物にも特に制限はなく、例えば、非ヒト哺乳動物（例：サル、チンパンジー、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギなど）由来のＭＥＰＥオルソログにおけるＥ２に相当する領域（Ｅ２’；例えばカニクイザルの場合、Ｅ２’は、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号ＢＡＢ１７０１０．１を付されて登録されているアミノ酸配列中アミノ酸番号３２９−３３７で示されるアミノ酸配列中に存在する）を免疫原として得られる抗体や、非ヒト温血動物（例：ウサギ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）やヒト培養細胞等にＭＥＰＥもしくはそのフラグメントを免疫して得られる抗体、あるいは非ヒト温血動物（例：ウサギ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）やヒトの抗体遺伝子ライブラリーを用いたファージディスプレー法等の抗体ディスプレー法により得られる抗体なども、本発明の第２抗体に包含され得る。
ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２の抗原決定基（Ｅ２）は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２９８−３０６で示されるアミノ酸配列中に存在する。ある抗ＭＥＰＥ抗体がＥ２と同一のアミノ酸配列を認識し得るか否かは、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄ．（１９９８）に記載されるような通常のクロスブロッキングアッセイを用いて、ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２のＭＥＰＥに対する結合阻害を調べることにより検定することができる。あるいは、ペプチドアレイやファージディスプレー等を用いたエピトープマッピングにより、ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２と同様にＥ２を含むペプチドに結合するか否かを調べることによって、より直接的に検定することもできる。ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２は、２００５年４月２６日から、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２８の受託番号を付されて寄託されている。
本発明の第１及び第２抗体は、それぞれの抗原決定基を特異的に認識し、結合するための相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも有するものであれば、分子の形態に特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等のフラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の蛋白質安定化作用を有する分子などで修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
本発明の抗体がモノクローナル抗体である場合、例えば、以下の方法によって調製することができる。
（１）免疫原の調製
免疫原としては、ヒトＭＥＰＥもしくはＥ１（もしくはＥ２）を含むそのフラグメント、又は他の哺乳動物由来のＭＥＰＥオルソログもしくはそのＥ１（もしくはＥ２）に相当する領域（Ｅ１’（もしくはＥ２’））を含むフラグメント、あるいはＥ１（もしくはＥ２）又はＥ１’（もしくはＥ２’）を含む合成ペプチドなどを使用することができる。
本明細書においてアミノ酸配列にて示されるペプチドもしくは蛋白質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明におけるＭＥＰＥもしくはそのフラグメント又は本発明の抗体が認識する抗原決定基のアミノ酸配列を含有する合成ペプチド（以下、包括的に「抗原ペプチド」という）は、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミド又はエステルの何れであってもよい。また、抗原ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されていてもよい。さらに、抗原ペプチドは、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が、例えばホルミル基、アセチル基などで置換されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が他の置換基（例えば、ホルミル基、アセチル基など）で置換されたものであってもよい。
抗原ペプチドは酸又は塩基との塩であってもよく、特に酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
抗原ペプチドは、（ａ）例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の抗原産生組織又は細胞から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて単離・精製する、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化学的に合成する、（ｃ）抗原ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養する、あるいは（ｄ）抗原ペプチドをコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって取得することができる。
（ａ）哺乳動物の組織又は細胞から抗原を調製する場合、該組織又は細胞をホモジナイズした後、酸、又はアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を自体公知の蛋白質分離技術（例：塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等）に付すことにより単離・精製することができる。得られた抗原ペプチドをそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
（ｂ）化学的に抗原ペプチドを合成する場合、該合成ペプチドとしては、例えば、上述した天然より精製される抗原ペプチドと同一の構造を有するもの、具体的には、該天然抗原ペプチドのアミノ酸配列において、本発明の第１又は第２抗体の抗原決定基であるＥ１（もしくはＥ１’）又はＥ２（もしくはＥ２’）のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むペプチドが用いられる。
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて抗原ペプチドを製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法［例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法など］に従って作製することができる。該クローニング方法としては、例えば、（ｉ）抗原ペプチドをコードする遺伝子配列（例えばヒトＭＥＰＥの場合、Ｅ１をコードする塩基配列を含む配列としては、配列番号：１に示される塩基配列中塩基番号７５７−７８３で示される塩基配列が、Ｅ２をコードする塩基配列を含む配列としては、配列番号：１に示される塩基配列中塩基番号８９２−９１８で示される塩基配列が、それぞれ挙げられる）に基づきデザインしたＤＮＡプローブを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするＤＮＡを単離するか、（ｉｉ）抗原ペプチドをコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により該抗原ペプチドをコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを宿主に適合する発現ベクターに挿入した後、該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養する方法などが挙げられる。
（ｄ）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（ｃ）と同様の方法により調製した抗原ペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼ及び基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。
免疫原としてＭＥＰＥ全長タンパク質などのポリペプチド（例えば、２１アミノ酸残基以上）を用いる場合は、クロスブロッキングアッセイやエピトープマッピングにより、Ｅ１又はＥ２への結合能を指標として選抜を行うこととなる。
一方、２０アミノ酸以下のオリゴペプチドを免疫原として用いる場合、例えば、Ｅ１（もしくはＥ１’）又はＥ２（もしくはＥ２’）のアミノ酸配列を含む３個以上、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上、いっそう好ましくは６個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該オリゴペプチドとしては、例えば、Ｅ１（もしくはＥ１’）又はＥ２（もしくはＥ２’）のアミノ酸配列を含む２０個以下、好ましくは１８個以下、より好ましくは１５個以下、いっそう好ましくは１２個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。
このようなオリゴペプチドは、上記（ｂ）〜（ｄ）の方法に従って、又は上記（ａ）〜（ｄ）の方法により調製した抗原ペプチドを適当なペプチダーゼ等で切断することによって製造することができるが、公知のペプチド合成法を用いるのが好ましい。
ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の１）又は２）に記載された方法等が挙げられる。
１）Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６）
２）Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｅｂｋｅ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５）
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体又は他の塩に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、さらに常套手段で保護基を除去し、目的のペプチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、又は、対称酸無水物又はＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸又はアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護及び保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ７−１４アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル）、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル及びベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリン及びスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化又はエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えばアセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、たとえばＴｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（例：ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（又はアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
抗原ペプチドは、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約３，０００以下）の抗原（例えば、上記のオリゴペプチドなど）を用いる場合には、これらの抗原ペプチドは通常、免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体（キャリア）に結合又は吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物又は共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。該キャリアとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。
ハプテンとキャリア蛋白質のカップリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデヒドなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。またハプテン（ペプチド）のＮ末端又はＣ末端にシステイン残基を付与し、キャリア蛋白質のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
（２）モノクローナル抗体の作製
抗原ペプチドは、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入，皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温血動物としては、例えばウサギ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラクダ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなどが挙げられるが、モノクローナル抗体作製には一般にマウス及びラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された哺乳動物、例えば、マウスから血清抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓又はリンパ節を摘出し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、固相化した抗原ペプチドと抗血清とを反応させた後、固相に結合した抗原ペプチド特異的抗体を、放射性物質や酵素で標識した免疫動物種の抗体に対する抗体により検出することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
融合細胞（ハイブリドーマ）の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別及び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））又はハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、抗原ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例：マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる抗体産生細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）又はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した抗原ペプチド等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
（３）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、上記抗原決定基（Ｅ１（Ｅ１’）又はＥ２（Ｅ２’））からなるペプチドとキャリアー蛋白質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から該ハプテンに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられるハプテンとキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類及びキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ＫＬＨ等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で結合させる方法が用いられる。
又、ハプテンとキャリアー蛋白質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水、母乳、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
上記のようにして得られる本発明の第１抗体と、本発明の第２抗体とを用いることにより、被験動物（例えば、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ等）における骨折リスクの予測及び／又は骨粗鬆症の診断が可能となる。より具体的には、本発明は、生体試料中の、本発明の第１及び第２抗体により認識される物質（即ち、ＭＥＰＥ由来分子）を測定することによる、骨折のリスク予測及び／又は骨粗鬆症の診断方法を提供する。ここで「診断」とは、発症の有無を判定することだけでなく、将来発症する可能性が高いか否かを予測することや、既に発症が判明している被験動物における病態の進行度の評価なども含む意味で用いられる。該ＭＥＰＥ由来分子は、本発明の第１及び第２抗体により認識されるので、少なくとも本発明における両抗体の抗原決定基Ｅ１（Ｅ１’）及びＥ２（Ｅ２’）を含んでいる。
本発明の方法に用いられる生体試料としては、被験動物由来のものであればいかなるものであってもよく、例えば、体液（例：血液、血漿、血清、リンパ液、関節液、精液、尿、汗、涙など）、種々の細胞・組織片（例：関節軟骨など）等が挙げられるが、被験動物への侵襲が少ないこと等から、血液、血漿、血清などが好ましい。
本発明の方法は、サンドイッチ法により上記ＭＥＰＥ由来分子を測定することを特徴とする。本発明におけるサンドイッチ法とは、標的であるＭＥＰＥ由来分子を本発明の第１抗体と第２抗体とでサンドイッチして第１抗体−ＭＥＰＥ由来分子−第２抗体複合体を形成させることを含むいかなる方法をも包含する意味で用いられる。従って、本発明のサンドイッチ法は、（１）生体試料と、担体上に固相化した本発明の第１抗体（もしくは第２抗体）及び遊離の本発明の第２抗体（もしくは第１抗体）とを、同時あるいは連続的に反応させた後、担体上に形成された第１抗体−ＭＥＰＥ由来分子−第２抗体複合体の量を測定する方法（ヘテロジニアス法）と、（２）溶液中で、生体試料、本発明の第１及び第２抗体を、同時あるいは連続的に反応させ、溶液中に形成された第１抗体−ＭＥＰＥ由来分子−第２抗体複合体の量を測定する方法（ホモジニアス法）とを含む。
ヘテロジニアス法（狭義のサンドイッチ法）においては、通常、遊離の抗体（以下、液相抗体という場合がある）は適当な標識剤により標識されている。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、液相抗体と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗体の固相化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては固相化した本発明の第１抗体（もしくは第２抗体）（以下、固相抗体という場合がある）に生体試料を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明の第２抗体（もしくは第１抗体）（液相抗体）を反応させた（２次反応）後、固相と液相を分離（Ｂ／Ｆ分離）して未反応の標識化液相抗体等を除去し、不溶化担体上の標識量を測定することにより生体試料中のＭＥＰＥ由来分子を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なってもよく、また、同時に行なっても、時間をずらして行なってもよい。
本発明のより好ましい態様においては、固相抗体として本発明の第１抗体が、液相抗体として本発明の第２抗体が選択される。
担体として、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）チップなどを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により、あるいはプロテインチップ（サイファージェン社製）などを用いて質量分析法によりサンドイッチ複合体を検出することもできるが、これらの場合には、遊離抗体を標識する必要はない。
一方、ホモジニアス法としては、例えば、（ｉ）本発明の第１及び第２抗体のうちの一方を蛍光物質で標識し、他方を消光物質で標識して、生体試料とこれら標識化抗体とを液相中で反応させ、該蛍光物質が放出する蛍光の減少を測定する方法や、あるいは（ｉｉ）本発明の第１及び第２抗体のうちの一方を第１蛍光物質（励起光波長λ０；蛍光波長λ１）で標識し、他方を第２蛍光物質（励起光波長λ１；蛍光波長λ２）で標識して、生体試料とこれら標識化抗体とを液相中で反応させ、反応液を波長λ０の光で励起して波長λ２の蛍光を検出する方法等が挙げられる。
上記（ｉ）の方法で用いられる蛍光物質としては、例えばＦＡＭ、ＶＩＣなどが、消光物質としてはＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉなどが挙げられる。
また、上記（ｉｉ）の方法における第１及び第２蛍光物質のペアとしては、例えば、フルオレスカミンとジクロロトリアジニンフルオレセイン、フルオレセインとローダミンＢ、Ｒ−フィコトリエンとアロフィコシアニン、フルオレセインとローダミンＸ、フルオレセインとテキサスレッド又はマラカイトグリーン等が挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法をＭＥＰＥ由来分子の定量に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＭＥＰＥ由来分子の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書  Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書  Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書  Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書  Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書  Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）など参照〕。
以上のように、本発明の第１及び第２抗体を用いることによって、ＭＥＰＥ由来分子を高感度に定量することができる。
本発明の第１及び第２抗体を用いた場合には、被験動物個体によって生体試料中のＭＥＰＥ由来分子の量が大きく相違し、中には検出限界以下を示す個体もある。意外なことに、当該アッセイ系においてＭＥＰＥ由来分子が検出限界以下である生体試料が由来する個体群は、該ＭＥＰＥ由来分子が検出された生体試料が由来する個体群に比べて骨折頻度が有意に高い。
従って、本発明の方法によりＭＥＰＥ由来分子が検出されないか、あるいはその量が低値であることが示された被験動物は、将来の骨折リスクが高い、及び／又は骨粗鬆症に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと判定することができる。また、既に骨粗鬆症を発症していると診断された被験動物において、ＭＥＰＥ由来分子濃度の変動をモニタリングすることにより、骨粗鬆症の進行度を評価することもできる。
本発明はまた、本発明の第１及び第２抗体を含む骨折のリスク予測及び／又は骨粗鬆症の診断用キットを提供する。該キットは、上記した本発明の方法を実施するのに好ましい他の構成要素、例えば、反応用緩衝液、洗浄液、不溶化用担体、標識剤、ＭＥＰＥ標品などをさらに含んでいてもよい。
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ        ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ      ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ        ：リボ核酸
ｍＲＮＡ      ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ      ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ      ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ      ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ      ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ        ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ      ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ        ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ        ：グリシン
Ａｌａ        ：アラニン
Ｖａｌ        ：バリン
Ｌｅｕ        ：ロイシン
Ｉｌｅ        ：イソロイシン
Ｓｅｒ        ：セリン
Ｔｈｒ        ：スレオニン
Ｃｙｓ        ：システイン
Ｍｅｔ        ：メチオニン
Ｇｌｕ        ：グルタミン酸
Ａｓｐ        ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ        ：リジン
Ａｒｇ        ：アルギニン
Ｈｉｓ        ：ヒスチジン
Ｐｈｅ        ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ        ：チロシン
Ｔｒｐ        ：トリプトファン
Ｐｒｏ        ：プロリン
Ａｓｎ        ：アスパラギン
Ｇｌｎ        ：グルタミン
ｐＧｌｕ      ：ピログルタミン酸
Ｍｅ          ：メチル基
Ｅｔ          ：エチル基
Ｂｕ          ：ブチル基
Ｐｈ          ：フェニル基
ＴＣ          ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基及び試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ        ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ        ：ホルミル
ＢＺｌ        ：ベンジル
Ｃｌ２Ｂｚｌ  ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ        ：ベンジルオキシメチル
Ｚ            ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ      ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ      ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ        ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ        ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ        ：トリチル
Ｂｕｍ        ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ      ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ      ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ    ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ      ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ        ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いた遺伝子組換え操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法に従って行った。
なお、後述の実施例で得られた抗ＭＥＰＥ抗体産生ハイブリドーマは、２００５年４月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）；〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６に以下の受託番号で寄託されている。
ハイブリドーマ細胞
ＭＥ−１２Ｃ９．２：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２８
ＭＥ−１６Ｆ４．３：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２９
【実施例１】
【０００６】
Ｍａｔｒｉｘ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＥＰＥ）をコードするｃＤＮＡのクローニング
ＯＨＯ患者腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリーは以下のようにして調製した。すなわち、ＯＨＯ患者の副鼻腔腫瘍組織より、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール、ＬｉＣｌ沈澱法（ＰＬＡＮＴ  ＣＥＬＬ  ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ  ３６：８５−９３（１９９５））に準じｔｏｔａｌ  ＲＮＡを取得した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ約４８０μｇから、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ｄＴ）３０−Ｓｕｐｅｒ（宝酒造（株））を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ約６μｇを取得した。
ｃＤＮＡライブラリーはＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎの方法に従って作製した。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（２．５μｇ）、Ｘｈｏ  Ｉサイトを含むＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１８−リンカープライマー（（ＧＡ）１０ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＣＧ（Ｔ）１８）（配列番号：４）、５−ｍｅｔｈｙｌｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＲＡＶ−２リバーストランスクリプターゼおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩリバーストランスクリプターゼを用いてｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを合成した。これにＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを反応させ、ｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを合成した。Ｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡの末端を平滑化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉアダプター（宝酒造（株））をライゲーションした。これを制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで切断後スピンカラムを用いて低分子量ＤＮＡを除去し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてλ  ＺＡＰＩＩ（ＥｃｏＲ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉ切断）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）とベクターライゲーションした。こうして得られたλファージベクターをインビトロパッケージングキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてλファージ前駆体タンパク質に組み込み、λファージライブラリーを作製した。ライブラリーのタイターは宿主として大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’を用いて測定した。プライマリーλファージライブラリーのタイターは１．０×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。
宿主として大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’を用いてプライマリーλファージライブラリーを４℃、終夜増幅した。シャーレ（直径１５０ｍｍ）１枚あたり約５×１０４個のプラークを形成させ、これにＳＭバッファー１０ｍｌを重層した。回収したＳＭバッファーにジメチルスルホキシドを終濃度７％となるよう加え、−８０℃で保存した。増幅したλファージライブラリーのタイターは１．０×１０９ｐｆｕ／ｍｌ以上であった。
ＭＥＰＥ  ｃＤＮＡのクローニングは、ＰＣＲ法によって行なった。Ｒｏｗｅ  Ｐ．Ｓ．Ｎ．の国際特許出願の国際公開公報（ＷＯ  ９９／６００１７号）に記載のフォスファトニン遺伝子配列はＮ末端メチオニン残基および分泌シグナル配列を含んでおらず、フォスファトニン（ＭＥＰＥ）の完全長ｃＤＮＡが得られていないと考え、上記で作製したＯＨＯ患者腫瘍由来のλファージライブラリーを鋳型とし、プライマーとして、ｃＤＮＡライブラリーに用いたホストベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋／−）のマルチクローニングサイトの５’側にある配列番号：５の合成オリゴＤＮＡをフォワードプライマー、Ｒｏｗｅ  Ｐ．Ｓ．Ｎ．の国際特許出願の国際公開公報（ＷＯ  ９９／６００１７号）に記載されているフォスファトニン遺伝子配列の終止コドンの３’側にある配列番号：６の合成オリゴＤＮＡをリバースプライマーとして用いた。
５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’                            （配列番号：５）
５’−ＴＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＡＣＡ−３’      （配列番号：６）
ＰＣＲ反応は、上記鋳型とプライマーにＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株））を添加し、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＰＥアプライドバイオシステムズ社）を用いて９５℃，３分を１サイクル、９５℃，４５秒、５８℃，４５秒、７２℃，３分を３０サイクル、７２℃，５分を１サイクル、４℃放置の条件で行なった。
得られた増幅断片を１％アガロースゲル電気泳動に供しメインバンドを抽出精製した後、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）を用いてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社）に挿入し、大腸菌ＴＯＰ１０株に導入した。
得られた形質転換菌からプラスミドＤＮＡを抽出し、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンスレディリアクションキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）によりｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
取得したクローン＃１の保持するプラスミドＤＮＡのインサート配列は、Ｒｏｗｅ  Ｐ．Ｓ．Ｎ．の国際特許出願の国際公開公報（ＷＯ  ９９／６００１７号）に記載のフォスファトニン遺伝子配列のＶａｌ（１番目）からＡｓｐ（４３０番目）をコードする１，２９０個の塩基配列と本質的に同一の塩基配列を含む１，７１３個の塩基配列を有しており、５２５個のアミノ酸からなるＭＥＰＥタンパク質をコードしていたが、Ｒｏｗｅ  Ｐ．Ｓ．Ｎ．の国際特許出願の国際公開公報（ＷＯ  ９９／６００１７号）に記載のフォスファトニン遺伝子配列および同時に得られた他のクローンの保持するプラスミドＤＮＡのインサート配列と数塩基異なっていた。そこで真のＭＥＰＥ遺伝子配列を確定するため、増幅精度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）のより高いＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。上記で作製したＯＨＯ患者腫瘍由来のλファージライブラリーを鋳型とし、プライマーとして、先のクローン＃１における開始コドンＡＴＧの５’側から始まる配列番号：７の合成オリゴＤＮＡをフォワードプライマー、配列番号：６の合成オリゴＤＮＡをリバースプライマーとして用いた。
５’−ＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＣＧＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡ−３’      （配列番号：７）
ＰＣＲ反応はサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＰＥアプライドバイオシステムズ社）を用いて９８℃，１０秒、５６℃，４５秒、７２℃，３分を３０サイクル、４℃放置の条件で行なった。
得られた増幅断片を１％アガロースゲル電気泳動に供しメインバンドを抽出精製した後、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲクローニングキット（インビトロジェン社）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（インビトロジェン社）に挿入し、大腸菌コンピテントセルＴＯＰ１０株に導入した。
得られた形質転換菌からプラスミドＤＮＡを抽出し、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンスレディリアクションキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）によりｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。こうしてＭＥＰＥ全長タンパク質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＣＲ−ＰＨＯＳを含有する形質転換体：エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＰＨＯＳ（クローン＃９）を得た。
取得したＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＰＨＯＳ（クローン＃９）が保持するプラスミドＤＮＡは配列番号：１で表される１，５７５個の塩基配列を含む配列番号：３で表される１，６６２個の塩基配列を有しており、配列番号：２で表される５２５個のアミノ酸からなるフォスファトニン（ＭＥＰＥ）タンパク質をコードしていた。アミノ酸配列から推定される本発明のタンパク質の分子量（シグナルペプチドを含む）は５８．４ｋＤａであった。
配列番号：１で表される塩基配列はＲｏｗｅ  Ｐ．Ｓ．Ｎ．の国際特許出願の国際公開公報（ＷＯ  ０９９／６００１７号）に記載のフォスファトニンのＶａｌ（１番目）からＡｓｐ（４３０番目）をコードする１，２９０個の塩基配列と本質的に同一の塩基配列を含有し、さらにその５’領域にＭｅｔから始まる９５残基からなるアミノ酸配列をコードする２８５塩基からなる新規塩基配列を含有していた。配列番号：１で表される塩基配列とＲｏｗｅ  Ｐ．Ｓ．Ｎ．の国際特許出願の国際公開公報（ＷＯ  ９９／６００１７号）に記載のフォスファトニンの塩基配列との共通配列の中で、唯一２８６番目の塩基が異なっており（Ｒｏｗｅ  Ｐ．Ｓ．Ｎ．公開公報：Ｇ１→配列番号：１：Ｃ２８６）、それに伴い配列番号：１で表されるアミノ酸配列も１残基異なっていた（Ｒｏｗｅ  Ｐ．Ｓ．Ｎ．公開公報：Ｖａｌ１→配列番号：１：Ｌｅｕ９６）。配列番号：２で表される５２５個のアミノ酸からなるタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする配列番号：１で表される塩基配列は、Ｒｏｗｅ  Ｐ．Ｓ．Ｎ．の国際特許出願の国際公開公報（ＷＯ  ０１／３２８７８号）に記載のフォスファトニンのＭｅｔ（１番目）からＡｓｐ（５２５番目）のアミノ酸配列およびそれをコードする１，５７５個の塩基配列と完全に一致した。
【実施例２】
【０００７】
組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧの昆虫細胞における分泌発現
Ｙａｍａｄａ  Ｔ．の国際特許出願の国際公開公報（ＷＯ  ０１／９８４８５号）の実施例６に記載のフォスファトニン（ＭＥＰＥ）−ＦＬＡＧ付加体動物細胞発現ベクター（ｐＴ−ＰＨＯＳＦ−１１、図４）からＢａｍＨ  ＩおよびＳａｌ  Ｉで切り出したＭＥＰＥ（ｐｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎ）−ＦＬＡＧ構造遺伝子と、同じ制限酵素処理をしたｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターとをライゲートさせて作製したベクターを、ＪＭ１０９コンピテントセルに形質転換した。得られた形質転換体（ＪＭ１０９／ｐＦａｓｔＢａｃ−ＰＨＯＳＦ）からドナープラスミドＤＮＡ（ｐＦａｓｔＢａｃ−ＰＨＯＳＦ）を調製し、塩基配列を確認した。このドナープラスミドＤＮＡをＢａｃｍｉｄおよびｈｅｌｐｅｒを含有するコンピテントセル（ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ１０ＢａｃＴＭ）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加し、抗生物質選択により形質転換体を得た。さらに、その形質転換体から遺伝子組換えＢａｃｍｉｄ  ＤＮＡ（Ｂａｃｍｉｄ−ＰＨＯＳＦ）を調製し、ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ試薬存在下で昆虫細胞株（ＳＦ＋）に遺伝子導入し、組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ発現用のバキュロウイルスストック液を作製した。これを昆虫細胞株（ＳＦ＋）に感染させ、培養上清中に分子量６５ｋＤａの組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧタンパク質が分泌発現していることを、別途作製した抗ＭＥＰＥウサギポリクローナル抗体およびＨＲＰＯ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いたウェスタンブロットを行って確認した。
【実施例３】
【０００８】
昆虫細胞発現組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧの調製
昆虫細胞株（ＳＦ＋）を６Ｌスケールで培養し、実施例２で得たバキュロウイルスストック液を添加して組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧの分泌発現を誘導した。経時的に培養上清中の組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧタンパク質の量をウェスタンブロットでモニターし、その発現量が最大となるところで培養を停止した。
昆虫細胞発現組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧの精製は、Ｙａｍａｄａ  Ｔ．の国際特許出願の国際公開公報（ＷＯ  ０１／９８４８５号）の実施例７に記載の方法に準じて行った。昆虫細胞のバキュロウイルス感染後の培養上清各１Ｌを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した抗ＭＥＰＥウサギポリクローナル抗体カラム（５ｍｌ）に４．５ｍｌ／分の流速で吸着させた。このカラムを０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄した後、０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）でカラムに結合した組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧタンパク質を溶出させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和した。溶出液を限外濾過膜（ビバスピン２０：分画分子量１０ｋＤａ）（ザルトリウス（株））を用いてＰＢＳに濃縮置換し、これを最終標品とした。一連の操作を６回繰り返し、バキュロウイルス感染昆虫細胞の培養上清６Ｌから組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ標品１８ｍｇを取得した。このようにして得られた昆虫発現ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ標品の純度を測定する目的で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。本標品を１００ｍＭ  ＤＴＴを添加したサンプルバッファー［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０（１９７９）］と混合し、９５℃で１分間加熱した後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品）に供して電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルーで染色した結果、約７０ｋＤａにほぼ単一バンドの蛋白質が認められた（図２、レーン２）。
本ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ精製標品のＮ末端アミノ酸配列を、気相プロテインシークエンサー（アプライドバイオシステムモデル４９２）を用いて決定した。その結果、本標品のＮ末端アミノ酸配列は、塩基配列から推定されたＭＥＰＥのＮ末端アミノ酸配列からシグナルペプチド配列が除かれた配列（ＡＰＴＦＱＰＱＴＥ）と一致した。
【実施例４】
【０００９】
抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体の作製
実施例３で調製した昆虫細胞発現組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ標品（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液）とフロインド完全アジュバントとを等容量混合して調製したエマルションを、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、雌；日本クレア）８匹の皮下および皮内に４０μｇ／匹で免疫した。２回目以降は、同ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ標品とフロインド不完全アジュバントとから同様に調製したエマルションを、２週間毎に追加免疫した。
免疫開始前および３回目の免疫１週間後に全てのマウスからエーテル麻酔下、眼底採血し抗血清を取得し、以下に述べるＥＬＩＳＡにより血清抗体価を調べた。すなわち、マウス抗血清を０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳで段階希釈したものを、組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧをコートし、２％  ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングしたイムノプレート（ヌンク社）に１００μｌ／ウェル添加し、室温で２時間反応させた。このプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄し、０．２％  ＢＳＡ含有ＰＢＳで３，０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を１００μｌ／ウェル添加し、さらに室温で２時間反応させた。プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで６回洗浄した後、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）溶液（ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＥＩＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μｌ／ウェル添加し、室温５分間発色させ、１Ｎ硫酸（和光純薬）を１００μｌ／ウェル添加し、酵素反応を停止させた。各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＣ；Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定し、横軸に血清希釈倍率、縦軸に吸光度をとったグラフを作成して、血清抗体価を比較した。
上記のようにして十分な血清抗体価上昇が確認された上位２匹のマウスに、組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧを１０μｇ／匹ずつ尾静脈注射し、３日後に放血死させて脾臓を摘出した。これらの脾臓をほぐして調製したマウス脾臓細胞と、あらかじめ無血清培地（エス・クロンＳＦ−Ｂ；三光純薬）に馴化培養しておいたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１）とを、５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１，５００（ロシュダアイアグノスティックス（株））を用いて融合させた。細胞融合は試薬に添付のマニュアルに従って行った。融合後の細胞をクローニング用無血清培地（エス・クロンＣＭ−Ｂ；三光純薬）に１×１０５脾細胞／１００μｌ／ウェルで９６ウェル培養プレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（５％  ＣＯ２、３７℃）内で１日間培養した後、０．１ｍＭヒポキサンチン−０．４μＭアミノプテリン−０．０１６ｍＭチミジン（ＨＡＴ）添加エス・クロンＣＭ−Ｂ培地を１００μｌ／ウェル添加し、ＣＯ２インキュベーター内で培養を継続し、３日毎に３／４ずつ２回、培養上清を新鮮な同ＨＡＴ添加培地に交換した。
培養７日目〜１４日目にかけてハイブリドーマコロニーの増殖が見られたウェルの培養上清を、上述の抗ＭＥＰＥマウス抗体測定用ＥＬＩＳＡに供し、多数の陽性ウェルを得た。これらの中から反応性の高いＩｇＧ抗体産生ハイブリドーマを選んで限界希釈法によりクローニングし、８種類の抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ［ＭＥ−２Ｄ１１．９（ＩｇＧ１／κ）、ＭＥ−４Ａ２．２（ＩｇＧ１／κ）、ＭＥ−９Ｄ２．１５（ＩｇＧ１／κ）、ＭＥ−９Ｈ６．８（ＩｇＧ１／κ）、ＭＥ−１０Ｅ４．２（ＩｇＧ１／κ）、ＭＥ−１２Ｃ９．２（ＩｇＧ２ａ／κ）、ＭＥ−１２Ｅ２．１（ＩｇＧ１／κ）、ＭＥ−１６Ｆ４．３（ＩｇＧ１／κ）］を樹立し、これらを凍結保存した。各ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体のサブクラスは、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（ロシュダイアグノスティックス）を用いて決定した。
上記８種類のハイブリドーマを無血清培地（エス・クロンＳＦ−Ｂ）で５００ｍｌ培養し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ×５分）した上澄液を、さらに０．２μｍフィルターろ過してモノクローナル抗体を含有する培養上清を調製した。これらの培養上清をプロテインＡ  ＭＡＰＳ  ＩＩバインディングバッファーと等量混合し、同緩衝液で平衡化させたプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（１６ｍｍ  ＩＤ×２５ｍｍ、５０μｍ、５ｍｌ）（アマシャムバイオサイエンス（株））に吸着させた。このカラムをプロテインＡ  ＭＡＰＳ  ＩＩバインディングバッファーで十分洗浄した後に、プロテインＡ  ＭＡＰＳＩＩエリューションバッファーにてＩｇＧ画分を溶出した。得られた画分を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて中和した後、ＰＢＳに対して４℃で一夜透析し、８種類の抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体精製標品を得た。これらの抗体のＭＥＰＥ結合活性を、上述のＥＬＩＳＡにより確認した（図３）。
【実施例５】
【００１０】
血漿ＭＥＰＥ由来抗原濃度測定用のＥＬＩＳＡ
実施例４で作製した８種類の抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体の様々な組み合わせを試み、結果としてＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３を固相抗体とし、ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２のビオチン標識体を液相抗体として、ヒト血漿中ＭＥＰＥ由来抗原濃度測定を目的としたサンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。
ビオチン標識ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２は実施例３で作製した抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２）ＰＢＳ溶液に対し２０倍モル量のＥＺ−ｌｉｎｋＴＭＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．；＃２１３３５）を室温で１時間反応させて、反応液をＰＢＳに対して終夜透析することにより調製した。
最適化されたサンドイッチＥＬＩＳＡの手順を以下に記す。ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３を０．０５％アジ化ナトリウム含有５０ｍＭ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、これを９６穴イムノプレート（ヌンク社）に１００μｌ／ウェルで添加して室温で５時間反応させた。反応液を除いた後、ブロックエース（大日本製薬（株））４倍希釈液を２００μｌ／ウェル添加し、４℃で終夜反応させＥＬＩＳＡ用プレートを調製した。実施例３で作製した昆虫細胞発現組換え型ＭＥＰＥ−ＦＬＡＧをアミノ酸組成分析により濃度決定し、これを１０％ブロックエース含有ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調整したものを小分け分注し、−８０℃に保存したものを標準ストック液とした。ＭＥＰＥ標準液は、この標準ストック液を要時融解し、１０％ブロックエース含有ＰＢＳでさらに希釈することにより調製した。ヒト血漿は正常人ボランティア及びインフォームドコンセントの得られた閉経後女性患者からエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）採血して−８０℃に分注保存したものを用いた。
上記で作製したＥＬＩＳＡ用プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄し、ＭＥＰＥ標準液および１０％ブロックエース含有ＰＢＳで希釈したヒト血漿サンプルを１００μｌ／ウェル添加して室温で２時間反応させた。このプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄した後、１０％ブロックエース含有ＰＢＳで１．２μｇ／ｍｌに希釈した上述のビオチン標識ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２溶液を１００μｌ／ウェルで添加して室温で２時間反応させた。このプレートをさらに０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄し、１０％ブロックエース含有ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰＯ−アビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μｌ／ウェルで添加して室温で２時間反応させた。さらにプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＥＩＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μｌ／ウェル添加して室温で３０分間発色させ、２Ｎ硫酸（和光純薬）を１００μｌ／ウェル添加して酵素反応を停止させた。各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＣ；Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定し、ＭＥＰＥ標準液で作成した検量線（図４）からヒト血漿中ＭＥＰＥ濃度を定量した。本ＥＬＩＳＡの日内変動係数及び日間変動係数はそれぞれ５．８−７．３％、７．０−８．０％と小さかった（表１）。
【表１】
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【実施例６】
【００１１】
閉経後骨粗鬆症患者の血漿中ＭＥＰＥ由来抗原測定による椎体骨折の危険度評価
実施例５に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ビスフォスフォネート投与を受けていない閉経後女性７３名（平均±標準偏差（ＳＤ）７１．６±１１．３歳、３８．０〜９４．４歳）の血漿中ＭＥＰＥ由来抗原を測定した。その結果、７３名中１８名の血漿中に有意なＭＥＰＥ由来抗原が検出されたが、５５名（７５．３％）の血漿中ＭＥＰＥ由来抗原濃度は本ＥＬＩＳＡの測定限界（ＥＬＩＳＡの実測値が０以下の検体における平均＋２ＳＤ（＝０．５９ｎｇ／ｍｌ）を検出限界と定義した）以下であった。この２群間の比較を行なったところ、これら２群の間には年齢、身長、ＢＭＩ、骨代謝マーカー［尿中ｄｅｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｏｌｉｎｅ（ＤＰＤ）および骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）（それぞれｏｓｔｅｏｌｉｎｋｓ  ＢＡＰおよびｏｓｔｅｏｌｉｎｋｓ  Ｄｐｄ（いずれもＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて測定］、腰椎・大腿骨・橈骨の骨密度［Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｍｅｔｒｙ（ＤＰＸ−Ｌ，Ｌｕｎａｒ  Ｃｏ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて測定］の有意差は見られなかった（表２）。一方、椎体骨折数に関しては、ＥＬＩＳＡで検出されるＭＥＰＥ由来抗原の血漿中濃度が検出限界以上の患者群は、同測定値が検出限界以下の患者群と比較して椎体骨折数が有意に少なかった（０．２７±０．５９  ｖｓ  １．３５±２．９１）（表２および図５）。
【表２】
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このように、本ＥＬＩＳＡで検出されるＭＥＰＥ由来抗原の血漿濃度で分けられた、骨密度と骨代謝マーカーに差のない二群間で、骨折数に有意な差がみられたという結果は、該ＭＥＰＥ由来抗原が、臨床的に骨強度に関与し椎体骨折と有意な関連を持ち、骨量とは独立して骨質を介して骨強度に寄与している可能性を示している。従って本ＥＬＩＳＡは、骨密度や骨代謝回転のマーカーとは異なる骨質、骨強度の指標、骨折の危険度評価系として利用できる可能性が考えられる。
【実施例７】
【００１２】
抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体の認識部位解析（１）
実施例５及び実施例６に示すＥＬＩＳＡに用いた２種類の抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２、ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３）の認識部位を明らかにすることを目的として、Ｃ末端側の配列を欠失させた３種のＭＥＰＥフラグメント（ＭＥＰＥ（Δ５０７−５２５）、ＭＥＰＥ（Δ３３１−５２５）及びＭＥＰＥ（Δ２４１−５２５）；配列番号：２に示されるアミノ酸配列の対応するアミノ酸番号で特定される範囲が欠失していることを意味する）のＣ末端にそれぞれＦＬＡＧペプチドが付加するような３種類の大腸菌発現ベクターを構築し、これらを大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォームしてそれぞれ形質転換体を得た。
得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）３０ｍｌを仕込んだ２５０ｍｌ枝付マイヤーフラスコ中で３７℃、３時間振とう培養した。培養液の濁度が約１５０クレット単位になった時点で、終濃度０．４ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時間培養を続けＭＥＰＥムテイン発現大腸菌株培養液を得た。これらの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシー・ブリリアント・ブルーによるタンパク染色及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットにより目的のＭＥＰＥムテインが発現していることを確認した。
成熟型組換えＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ及び上記３種類のＭＥＰＥムテイン発現大腸菌株の培養液２．５μｌを１００ｍＭ  ＤＴＴを添加したサンプルバッファーと等量混合し、９５℃、５分間加熱処理後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品）に供してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルから泳動蛋白質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２、ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３及び別途作製した抗ＭＥＰＥウサギポリクローナル抗体、並びにＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）及びＨＲＰＯ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を用いてウェスタンブロットを行った。各ムテインについて複数のバンドが検出されたが、アミノ酸配列から予想される分子サイズと合致し抗ＦＬＡＧ抗体によって染色される最上部のメインバンドを目的のＭＥＰＥムテイン、それより低分子側のバンドはその分解物と判断した。
抗ＭＥＰＥウサギポリクローナル抗体は成熟型組換えＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ及び上記３種類のＭＥＰＥムテインのいずれにも結合した。一方、ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２及びＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３は成熟型組換えＭＥＰＥ−ＦＬＡＧ、ＭＥＰＥ（Δ５０７−５２５）及びＭＥＰＥ（Δ３３１−５２５）に結合したが、ＭＥＰＥ（Δ２４１−５２５）には結合せず（図６）、これらのモノクローナル抗体のエピトープがＭＥＰＥ分子中のＴｙｒ２４１−Ｖａｌ３３０に存在することが示唆された。
【実施例８】
【００１３】
抗ＭＥＰＥマウスモノクローナル抗体の認識部位解析（２）
実施例７で同定したモノクローナル抗体のエピトープをより詳細に特定するために、エピトープスキャン法を試みた。以下にその概要を述べる。ＭＥＰＥ（Ｔｙｒ２４１−Ｖａｌ３３０）をオーバーラップするようにＮ末端側から３アミノ酸残基ずつずらせて選択した、１２アミノ酸残基からなる部分ペプチドをワットマン５０セルロースメンブレン上にスポット状に固相合成したものを作製した（図７Ａ）（Ｃｕｓｔｏｍ  ＳＰＯＴｓ、ＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社）。各合成ペプチドはリンカーを介してＣ末端側でメンブレンに固定化され、Ｎ末端アミノ基はアセチル化されている。このメンブレンをメタノールに５分間浸漬した後、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ  ＫＣｌ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝生理食塩水（ｐＨ８．０）（ＴＢＳ）で室温１０分間、３回洗浄した。このメンブレンをＴＢＳで１０倍希釈したブロッキング試薬（Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＵ−０７−２５０）中で室温、５時間振とうし、ブロッキングした。このメンブレンを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で２０倍希釈した同ブロッキング試薬で希釈した抗ＭＥＰＥモノクローナル抗体（ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３）溶液（０．５μｇ／ｍｌ）中で室温、３時間反応させ、ＴＴＢＳで室温、１０分間洗浄した後、さらにＴＴＢＳで２０倍希釈した同ブロッキング試薬で２０，０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗体（日本バイオラッド、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７０−６５１６）溶液中で室温、２時間反応させた。このメンブレンをＴＢＳで室温、５分間、３回洗浄した後、ＨＲＰＯの発光試薬、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（アマシャムバイオサイエンス、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮ２１３２）を添加し、ルミノイメージアナライザー（ＬＡＳ−１０００、フジフィルム）を用いて発光スポットを検出した（図７Ｂ）。
上記で用いたＳＰＯＴｓメンブレンを蒸留水で室温１０分間、３回洗浄した後、再生バッファー（２％  ＳＤＳ及び１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール含有６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７））で５０℃、３０分間、４回処理し、一次抗体及び二次抗体を剥離させた。これを１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）及びＴＴＢＳで順次室温２０分間、３回ずつ洗浄し、さらにＴＢＳで室温１０分間、３回洗浄した。こうして再生したメンブレンに上述と同様の方法によりもう一種の抗ＭＥＰＥモノクローナル抗体（ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２）を反応させ、発光スポットを検出した（図７Ｂ）。
こうして得られた主要な発光スポットに相当するペプチド配列を比較した結果、ＭＡＢ−ＭＥ−１６Ｆ４．３のエピトープはＳｅｒ２５３−Ｐｒｏ２６１、ＭＡＢ−ＭＥ−１２Ｃ９．２のエピトープはＴｒ２９８−Ｉｌｅ３０６のアミノ酸配列中にそれぞれ含まれるものと推定された（図７Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明の２種の抗ＭＥＰＥ抗体は、骨粗鬆症の診断マーカーとなり得る、生体試料中のＭＥＰＥ由来分子を特異的に検出することができるので、動物における骨折のリスク予測、及び骨粗鬆症の診断に極めて有用である。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願２００５−２６９０７２を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
［配列表］
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【図４】
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【図５】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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