【手続補正書】
【提出日】平成19年10月17日(2007.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
（２）工程２
得られた化合物を塩基の存在下、ω−メルカプトアルキルカルボン酸と反応させて１−（２−カルボキシアルキルチオチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３，５−ジメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（ｃ）を得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
（３）工程３
得られた化合物を酸の存在下、必要により触媒の存在下反応させることにより１−（２−カルボキシアルキルチオチアゾール−５−イルメチル）−２−メチル−３−ニトログアニジン（ｄ）を得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
抗体には、一般に免疫したウサギやヤギなどから血液を採取後その中に含まれる抗体を分離・精製するいわゆるポリクローナル抗体や、抗体産生能を持つクローン化ハイブリドーマの分泌する抗体を分離・精製するいわゆるモノクローナル抗体がある。本発明においては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が包含される。モノクローナル抗体が有する高感度性および高選択性、さらには、複数のモノクローナル抗体の組み合わせによる複数成分との分離可能な反応性など適用の汎用性の広さから、特にモノクローナル抗体が好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
前記モノクローナル抗体は、クロチアニジンおよびジノテフランに対する特異性と他の物質に対する交差反応性とを明確にするため、下記のようなＩＣ５０値を有することが好ましい。ここでＩＣ５０値とは、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡにより標準阻害曲線を求めて、５０％阻害を示す検体の濃度をいう。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
すなわち、本抗体は、クロチアニジンまたはジノテフランを測定対象とする場合は、直接競合ＥＬＩＳＡによるクロチアニジンまたはジノテフランに対するＩＣ５０が５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
前記抗体は、通常の製造方法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology、Chapter 11.12〜11.13（2000））。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従ってクロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物と高分子化合物との複合体を形成させた後、当該複合体を家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、前記複合体を常法に従ってマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 〜11.11 ）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。以下、マウスでのハイブリドーマの作製方法についてより詳細に説明する。
前記のように調製した抗原を２ｍｇ／ｍＬ程度になるように生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与する。その後、約２週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出し、無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、組織片等を取り除いた後に新しい培地中に移し、脾細胞を完全に培地中に浮遊させる。遠心、上清除去を数回繰り返し、細胞を洗った後、マウスのミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と細胞数の比５：１〜１０：１（脾細胞：ミエローマ）で混合する。細胞を沈殿させ上清を取り除いたあと、攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）をゆっくり加え細胞融合を行う。細胞融合後、遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が５×１０５個／ｍＬになるようにＨＡＴ培地を加えて懸濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに２５０μＬ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。１週間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換して、１０日から１４日間培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、抗クロチアニジンおよび抗ジノテフラン抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
実施例１で製造した１−［２−（２−カルボキシエチルチオ）−５−イルメチル］−２−メチル−３−ニトログアニジン（クロチアニジンハプテン）１．５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．２ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩１．９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００μＬに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に１．５時間放置しクロチアニジンハプテン溶液とした。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
クロチアニジンハプテン１．５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．２ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩１．９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００μＬに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に１．５時間放置しクロチアニジンハプテン溶液とした。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
＜実施例４＞（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例２で調製した免疫源を２ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＦに溶解し、これに等量の完全アジュバント（商品名：フロイント完全アジュバント；ＦＣＡ）を等量混合しエマルジョン化し、その１００μＬを６〜７週齢のメスのＢａｌｂ／Ｃマウスに腹腔投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント（商品名：フロイント不完全アジュバント；ＦＩＣＡ）を等量混合した０．５ｍｇ／ｍＬの免疫原１００μＬを２週間毎に追加免疫した。４回の免疫後、眼底から採血し、血清中の抗体力価を間接競合法で確認した。十分に力価が高くなったことを確認し、１週間後に最終免疫として免疫原１０μｇ／１００μＬ・ＰＢＳを尾静脈から投与した。その３日後に当該マウスから脾臓を摘出し細胞融合に供した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
＜実施例５＞（モノクローナル抗体の作製）
実施例４で得られたハイブリドーマ株を１０％牛胎児血清入りＤＭＥＭで培養し、約２×１０６個の細胞をＢａｌｂ／ＣメスＲｅｔｉｒｅ マウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。得られた腹水はプロテインＧカラムによりＩｇＧ精製を行った。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
（５）ＨＲＰ基質溶液（１００μｇ／ｍＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンおよび０．００６％過酸化水素を添加した０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５））１００μＬをウェルに加え、２５℃で１０分間インキュベーションした後、１Ｎ硫酸１００μＬをウェルに加えて酵素反応を止め、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
モノクローナル抗体ＣＴＮ−１６Ａ３−１３溶液についての直接競合阻害法によるクロチアニジンおよびジノテフランの標準阻害曲線を図１および図２に示す。モノクローナル抗体ＣＴＮ−１６Ａ３−１３溶液を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法によるクロチアニジンの測定可能な範囲は１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ５０値）は４．５ｎｇ／ｍＬであった。また、ジノテフランの測定可能な範囲は２ｎｇ／ｍＬ〜１２ｎｇ／ｍＬであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ５０値）は６．０ｎｇ／ｍＬであった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
＜実施例８＞（抗体のクロチアニジン構造類似化合物に対する交差反応性）
クロチアニジンと化学構造が類似している農薬について抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５の交差反応性を調べた。交差反応性は、実施例６に記載の方法と同様にして試験化合物のＩＣ５０値を求め、次式により計算し交差反応率を算出した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
交差反応率（％）＝（クロチアニジンのＩＣ５０値／試験化合物のＩＣ５０値）×１００
その結果、殺虫剤ジノテフランに対しては交差反応率７５％の高い値を示したのに対し、殺虫剤のアセタミプリド、イミダクロプリド、ニテンピラム、チアクロプリド、チアメトキサム、硫酸ニコチンおよび殺菌剤のピリフェノックスに対しいずれも交差反応性は０．１％以下であり、抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５はクロチアニジンおよびジノテフランに特異的な抗体であった。