【手続補正書】
【提出日】平成20年5月12日(2008.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
【図１】サンプル中のタンパク質の絶対濃度を求める方法の種々の実施形態の概略図である。
【図２】実施例１および２で使用された質量分析システムの簡略化した概略図である。
【図３】実施例１および２の各標識化された合成特徴的ペプチドのオンカラムで３．２  ｆｍｏｌのＭＲＭクロマトグラムである。
【図４】実施例１および２のシトクロムＰ４５０アイソフォームについて標識化した特徴的ペプチドに対して作成された濃度曲線４００を提供する。
【図５】実施例１のコントロールおよびフェノバルビタール誘導サンプルの両方のＩＣＬＧＥＳＩＡＲ（配列番号６）ペプチド（Ｐ４５０のＣｙｐ２ｂ１０アイソフォームに対して選択された特徴的ペプチド）の識別用娘イオンに対するＭＲＭクロマトグラムである。
【図６】同じサブファミリー内のＰ４５０タンパク質の定量のためのＭＲＭスキャンデータを示す。
【図７】Ｐ４５０タンパク質のサブファミリーのうちの４つのサブファミリー：Ｃｙｐ１ａ１、Ｃｙｐ１ａ２、Ｃｙｐ２ｅ１、およびＣｙｐ３ａ４のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
各特徴的ペプチドに対するＭＲＭのパラメータは、その特徴的ペプチドに関連する選択された識別用娘イオン（または複数のイオン）に対する信号を最適化しやすいように選択した。本実験において、前記質量分析器に対して用いられたドウェル時間（２５〜１００ミリ秒）とＭＲＭトランジションを急速に変化させる能力とにより、１回のＬＣ−ＭＳ操作で混合物中の複数の成分をモニターすることができた。これらの実験においては、ドウェル時間を約２５ミリ秒ないし１００ミリ秒としたが、実験条件に応じて約１０ミリ秒ないし約２００ミリ秒とすることができる。例えば、１回のＬＣ／ＭＳ操作で５０ないし１００の異なる成分をモニターすることができる。各特徴的ペプチドに対するＭＲＭ設定、すなわち親イオンのｍ／ｚおよび娘イオンのｍ／ｚ（これらの設定は１価のイオンの通過は想定しない）を表１の第３列目に列挙する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
濃度曲線は、軽いＩＣＡＴ（商標）試薬により標識化された各合成ペプチドに対して測定した。当該濃度曲線は、重いＩＣＡＴ（商標）試薬により標識化されたミクロソームタンパク質の存在下で作成し、バックグラウンドとイオン抑制を制御した。図４に、本実験で作成された濃度曲線の例を、特徴的ペプチド濃度（フェトモル  オンカラム）（ｘ軸）の関数としての識別用娘イオン信号の面積（ｙ軸）のグラフとして示す。図４は、本実験において、種々のＰ４５０アイソフォームに対して選択された種々の特徴的ペプチドの識別用娘イオンに対する濃度曲線４００を示しており、そこに記入された記号４０４は、実測値を示している。種々のアイソフォームに対する濃度曲線の例として、Ｃｙｐ２ｄ９  ４０６、Ｃｙｐｌａｌ  ４０８、Ｃｙｐ２ｂ１０  ４１０、Ｃｙｐ２ｊ５  ４１２、Ｃｙｐ２ｄ２２／Ｃｙｐ２ｄ２６  ４１４、Ｃｙｐ３ａｌｌ  ４１６、Ｃｙｐ１ｂ１  ４１８、Ｃｙｐ２ｆ２  ４２０、Ｃｙｐ２ａ１２  ４２２、Ｃｙｐ２ｃ２９／Ｃｙｐ２ｃ３７  ４２４、Ｃｙｐ４ａ１０／Ｃｙｐ４ａ１４  ４２６、Ｃｙｐ２ｃ３９  ４２８、Ｃｙｐｌａ２  ４３０、およびＣｙｐ２ａ４  ４３２を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
【表２】
2007538262.tif 000001
（実施例２）  Ｐ４５０アイソフォーム
本実施例においては、一連の１６個のＰ４５０アイソフォームの絶対定量を示し、コントロールサンプルと誘導サンプルとを混合し（特徴的ペプチド内部標準試料は添加しない）、クロマトグラフィカラムにかけた。また、本実施例は、例えば、１回の実験操作で実施可能な多数のＰ４５０アイソフォームに対するアッセイも提供する。本実施例は、標識化する前の実施例１と同じコントロールサンプルおよび誘導サンプルの一部を使用した。実施例２で使用した標識化された特徴的ペプチド試料は、実施例１で使用したものと同じであった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
（発現の定量）
ＣＴサンプルとＩＮＤサンプルとの両方に対する本実験のＰ４５０アイソフォームの絶対発現は、例えば、コントロールサンプルのＭＲＭピーク面積と対応する特徴的ペプチド−識別用娘イオントランジションに対する濃度曲線とを比較することにより求めることができる。例えば、図５は、コントロールサンプル５０４およびフェノバルビタール誘導サンプル５０２の両方からの信号を有する、実施例２のＩＣＬＧＥＳＩＡＲペプチド（Ｐ４５０のＣｙｐ２ｂ１０アイソフォームに対して選択された特徴的ペプチド）の識別用娘イオンのＭＲＭクロマトグラム５００を示す。ＣＴおよびＩＮＤサンプル中のＩＣＬＧＥＳＩＡＲペプチド、したがってＣＴおよびＩＮＤサンプル中の対応する特異的なＰ４５０アイソフォームの濃度は、例えば、コントロールサンプルの信号５０４のＭＲＭピーク面積を、合成ペプチドから作成した対応する濃度曲線（例えば、図４）に対して比較することにより求めることができる。例えば、本実験のコントロールの肝臓ミクロソーム中では、Ｃｙｐ２ｂ１０は、約２．４  ｆｍｏｌ／μｇミクロソームタンパク質にて発現した。また、誘導サンプル信号５０２およびコントロールサンプル信号５０４からのＩＣＬＧＥＳＩＡＲペプチドに対する濃度曲線から算出された濃度の比較、またはそれぞれのＭＲＭピーク面積の比較により、Ｐ４５０Ｃｙｐ２ｂ１０アイソフォームの発現は、フェノバルビタール処理により約７倍上昇することが示される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
種々の実施形態において、同じサブファミリー内の高度に相同なタンパク質の発現の変化を確認することができる。例えば、Ｃｙｐ２Ｃサブファミリーからの４つのアイソフォーム（Ｃｙｐ２ｃ４０、Ｃｙｐ２ｃ２９、Ｃｙｐ２ｃ３７、およびＣｙｐ２ｃ３９）は、約８０％の配列相同性を有している。種々の実施形態において、例えば、ＭＲＭ法の特定性を使用して個々の定量情報を得ることができる。図６を参照すると、コントロールサンプルおよびフェノバルビタール誘導サンプルのＭＲＭマイクログラム６００が示されており、それらのアイソフォームのうちの２つ（Ｃｙｐ２ｃ４０  ６０２  およびＣｙｐ２ｃ３９  ６０４）は、実質的にはフェノバルビタール誘導性ではなかった。しかしながら、Ｃｙｐ２ｃ２９／Ｃｙｐ２ｃ３７アイソフォームは、ＭＲＭピーク面積によれば、誘導サンプル６０６は、コントロールサンプル６０８に対し、約３倍の発現増加を示した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
【表３】
2007538262.tif 000002
図７は、Ｐ４５０タンパク質のサブファミリーのうちの４つのサブファミリー：Ｃｙｐｌａｌ  ７０２、Ｃｙｐｌａ２  ７０４、Ｃｙｐ２ｅｌ  ７０６、およびＣｙｐ３ａ４  ７０８のウェスタンブロット分析の結果７００を示す。Ｐ４５０タンパク質のサブファミリーのうちの４つのサブファミリーに対する市販の抗体を入手し使用することにより、コントロールサンプル７１０およびフェノバルビタール誘導サンプル７１２の両方のサンプル中の発現したタンパク質レベルを分析した。Ｃｙｐｌａｌタンパク質は、どちらのサンプルにおいてもほとんど観測されなかった。Ｃｙｐｌａ２、Ｃｙｐ２ｅｌ、およびＣｙｐ３ａ４タンパク質は、両方のサンプルにおいて、同等の発現レベルで観測された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
本教示を具体的な実施形態を参照して詳細に説明してきたが、形態および詳細について種々の変更が可能であることを理解されたい。例えば、開示した種々の標識化手法、ＰＤＩＴＭ手法、濃度曲線、および質量分析システムのいずれかを組み合わせることにより、１つのサンプルまたは複数のサンプル中の１つのタンパク質または複数のタンパク質の絶対濃度を求める方法を提供することができる。本教示の方法、システム、およびアッセイの説明および図は、その趣旨の記述がない限り、説明した構成要素の順序に限定されるように解釈されるべきではない。