【手続補正書】
【提出日】平成19年7月30日(2007.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
地域特有の植物であるＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ｇｌａｂｅｌｌａ  Ｋａｒ．  ｅｔ  Ｋｉｒ．から得られる凍結乾燥ハイドロクロライド−１β，１０β−エポキシ−１３−ジメチルアミノ−グアヤ−３（４）−エン−６，１２−オリドの生成方法であって、前記天然材料から樹脂を抽出すること、これを価値のない物質（脂質、タンパク質、クロロフィル）から精製すること、カラムクロマトグラフィ法によってこの精製樹脂を別々の成分に分離して残余の溶剤を含むアルグラビンを生成し、これをさらに再結晶化、アミノ化及びハイドロクロライド化してアミノアルグラビンハイドロクロライドを生成すること、並びにこれをさらに再結晶化、乾燥、凍結乾燥および高定性同定することを含み、
前記アミノ化が、結晶性アルグラビンをアルコールに溶解し、該溶液のｐＨが１２．３〜１２．４に達するまでジメチルアミンを前記溶液に添加することによりなされるものであり、アミノアルグラビンを含むアミノアルグラビンハイドロクロライドを抽出する前の段階において、アルコールを蒸留してクロロホルムを充填し、残った水を除去し、前記溶液を濾過し、前記クロロホルムを蒸発させてアルコールを加え、次いでこの溶液のｐＨが５．０〜５．５に達するまで前記溶液を塩化水素によって液内通気し、前記アルコールを蒸発させて酢酸エチルを添加することを特徴とする方法。
【請求項２】
凍結乾燥アルグラビンの高定性同定をＩＲ分光法によって行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】凍結乾燥ハイドロクロライド−１β，１０β−エポキシ−１３−ジメチルアミノ−グアヤ−３（４）−エン−６，１２−オリドの生成方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は製薬産業すなわちセスキテルペンラクトンに関し、特に、以下の式
【化１】
2007137890.tif 000001
で表され、抗腫瘍活性を有し、悪性腫瘍に対する化学治療用の新規な製剤の開発に用いることが可能な凍結乾燥ハイドロクロライド−１β，１０β−エポキシ−１３−ジメチルアミノ−グアヤ−３（４）−エン−６，１２−オリドの生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗腫瘍活性を有する凍結乾燥アルグラビン（ａｒｇｌａｂｉｎ）を、天然材料すなわち、地域特有の植物であるＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ｇｌａｂｅｌｌａ  Ｋａｒ．  ｅｔ  Ｋｉｒ．の花および葉から生成する方法が、カザフスタン共和国の仮特許第５２７７号、国際分類Ｃ０７Ｄ  ３０７／９３、Ａ６１Ｋ  ３１／３６５（１９９７）に記載されていた。
【０００３】
この方法によれば、まず乾式粉砕した天然材料を抽出器にて溶剤で処理し、次いでこの抽出した物質（樹脂）を、エチルアルコールの６０％水溶液によって処理することで価値のない生成物（脂質、タンパク質、クロロフィル）から精製する。精製段階において生成した樹脂を、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィ法によって別々の成分に分ける。前記カラムをベンゼンで溶出し、アルグラビンを含有する画分を分離する。ベンゼンを蒸留し、残余の溶剤を含むアルグラビンを生成する。これをさらに結晶化し、アミノ化し、ハイドロクロライド化する。この方法では、アミノ化はジメチルアミンによって行われ、このときアルグラビン含有溶液が生成される。次いでアミノアルグラビンのアルコール溶液を塩化水素によって液内通気し、目標生成物であるアミノアルグラビンハイドロクロライドを生成する。アミノ化反応およびハイドロクロライド化反応は、薄層クロマトグラフィ法によって制御される。結晶化によってアミノアルグラビンの技術的なハイドロクロライドを精製し、続いて乾燥させて凍結乾燥させる。
【０００４】
上述した方法の欠点は、アミノ化反応およびハイドロクロライド化反応における目標生成物の収率が低めであることである。
【０００５】
例えば、廃棄材料を熱保持剤と接触させる機能と、抽出剤と熱保持剤とを分離するための分離器と、抽出剤蒸気用の凝縮器とを備える、固体物質からの溶剤の除去方法および装置など、廃棄材料から溶剤を除去するための特別な装置もある（欧州特許出願公開第０３５６３３８号明細書、国際分類Ｂ０１Ｄ  １１／００（１９９０））。
【０００６】
このような装置は複雑かつエネルギー消費量が多い上、廃棄材料を抽出装置から他の装置に再装填する場合、抽出剤の損失を防止することが不可能であるか、あるいは再装填用の複雑な密閉装置を使用する必要がある。
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３５６３３８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、高収率で目標生成物を生成し、原料から抽出物を完全に抽出する方法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、上記の課題は請求の範囲における請求項１によって解決される。本発明の好ましい実施例については、従属請求項において挙げてある。
【０００９】
地域特有の植物であるＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ｇｌａｂｅｌｌａ  Ｋａｒ．  ｅｔ  Ｋｉｒ．から凍結乾燥させた凍結乾燥ハイドロクロライド−１β，１０β−エポキシ−１３−ジメチルアミノ−グアヤ−３（４）−エン−６，１２−オリド、すなわち抗腫瘍製剤アルグラビンの生成方法は、前記天然原料から樹脂を抽出することと、抽出物を価値のない副物質（脂質、タンパク質、クロロフィル）から精製することと、カラムクロマトグラフィによって前記樹脂を別々の成分に分離して残余の溶剤を含むアルグラビンを生成することとを含み、この残余の溶剤を含むアルグラビンをさらに、再結晶化、アミノ化およびハイドロクロライド化してアミノアルグラビンハイドロクロライドを生成し、これをさらに再結晶化、乾燥、凍結乾燥および高定性同定する。ここで、好ましいアミノ化は、結晶性アルグラビンのアルコール溶液を用いて、前記アルコール溶液にそのｐＨが１２．３〜１２．４に達するまでジメチルアミンを添加することによって行われ、アミノアルグラビンを含有している前記溶液からアミノアルグラビンハイドロクロライドを抽出するためには、アルコールを蒸留してクロロホルムを充填し、残った水を除去し、前記溶液を濾過し、前記クロロホルムを蒸発させてアルコールを加え、次いでこの溶液を塩化水素でｐＨ５．０〜５．５の溶液になるまで液内通気し、アルコールを蒸発させて酢酸エチルを添加する。
【００１０】
アルグラビンの好ましい高定性同定や定量はＩＲ分光法によって実施される。
【００１１】
請求の範囲に記載の方法において、所与のｐＨ−溶液の操作パラメータ下でのアミノ化段階およびハイドロクロライド化段階によって、高い収率の１３−ジメチルアミノアルグラビンおよび１３−ジメチルアミノアルグラビンハイドロクロライド反応物が得られる。したがって、目標生成物が高生成量で得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下にこの発明の実施例を詳細に説明する。
【００１３】
第Ｉ段階で、乾式粉砕した天然原料（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｇｌａｂｅｌｌａ  Ｋａｒ．  ｅｔ  Ｋｉｒ．の花および葉）を抽出剤と混合する。抽出物を分離し、新たに作成された溶剤で原料を洗浄し、目標生成物の残渣から取り出し、そして抽出物をもう一度分離する。その抽出物を濾過し、浮遊粒子と分離する。そして、ビルトイン式の蒸気発生装置を備えているフィルムタイプのエバポレーターに入れ、濃縮する。濃縮した抽出物を、周期的に濃縮器から可変容器に注出する。
【００１４】
作業日の間に、乾燥原料の７％に相当する樹脂０．５３９ｋｇ（抽出した物質の全量）が生成する。生成した樹脂をさらに第ＩＩ段階に送り、ここで副物質（脂質、タンパク質、クロロフィル）を除去して精製する。
【００１５】
この目的のため、６０℃に加熱したエチルアルコール１．０７８リットルで樹脂を処理し、この樹脂を前記アルコールに混合しながら溶解する。次いで加熱された蒸留水を、エチルアルコールと水との容量比２：１で注ぐ。混合物を３０分間慎重に混合した後、混合せずに室温にて２４時間保持する。副物質はこの間に沈殿する。２４時間の間に、ミキサによって沈降物を混合し、アルコール−水の溶液を真空にて濾過する。アルコール含量６８〜７０％の、水との共沸混合物であるアルコールを、得られた濾過物質から真空下にて温度５０〜５２℃で蒸留する。樹脂の収量は２８６ｇである。
【００１６】
第ＩＩＩ段階では、第ＩＩ段階で生成した樹脂をカラムクロマトグラフィによって成分ごとに分離する。加圧下でカラムにベンゼンを入れ、アルグラビン含有ベンゼン画分を分離する。ベンゼン画分中のアルグラビンの存在は、Ｓｉｌｕｆｏｌ板上での薄層クロマトグラフィ法によって判断する。画分からベンゼンを蒸留すると、黄色の油との混合物を含む、残余の溶剤を含むアルグラビン３３．１ｇが残る。これは処理した樹脂の１１．７％に等しい。
【００１７】
第ＩＶ段階は、アルグラビン再結晶化プロセスである。このために、湯浴にて加熱しながら生成物（ｋｇ）−溶剤（ｌ）比１：１０で残余の溶剤を含むアルグラビンをヘキサンに溶解し、真空下にて濾過する。室温まで冷却する間に、アルグラビンの結晶が濾液から単離しはじめる。ヘキサンを完全に除去した後、アルグラビン収量は２１ｇ（６３％）となる。
【００１８】
第Ｖ段階および第ＶＩ段階では、アルグラビンをアミノ化およびハイドロクロライド化する。アミノアルグラビンを生成するために、結晶性アルグラビンをアルコールに溶解する。次に、ｐＨが１２．３〜１２．４になるまでアルコール溶液にジメチルアミンを添加する。次いでアミノアルグラビン含有溶液からアルコールを蒸留し、クロロホルムを注ぐ。水の大部分を分液漏斗によって分離する。残った少量の水については、完全になくなるまでいずれか１つの乾燥剤（ＭｇＳＯ4またはＮａ2ＳＯ4）によって除去する。処理時間は約１２〜１４時間である。溶液を濾過し、クロロホルムを蒸発させ、アルコールを加える。次に、ｐＨが５．０〜５．５になるまで前記溶液を塩化水素で液内通気する。アルコールを溶液から蒸発させて酢酸エチルを加える。１３−ジメチルアミノアルグラビンハイドロクロライドの結晶を沈殿させる。その収率は１０５％である。乾燥するまで溶液を蒸発させ、粉末状の技術的なアミノアルグラビンハイドロクロライドを生成する。
【００１９】
第ＶＩＩ段階では、画分再結晶によってアミノアルグラビンハイドロクロライド（技術的な生成物）を精製する。この生成物をクロロホルムに溶解し、次いで前記クロロホルムをロータリーエバポレーターにて除去する。強く攪拌しながら、残りの樹脂に酢酸エチルを添加する。沈殿したアミノアルグラビンハイドロクロライド沈降物を真空−ピストンによって濾過し、アルグラビン凍結乾燥製剤の生成に使用する。アルグラビン−凍結乾燥物（目標生成物）の収量は２０ｇ（この段階で９５％）である。
【００２０】
最終のＶＩＩＩ段階では、生成した目標生成物を真空下でアンヒドロン（ａｎｈｉｄｒｏｎｅ）上にて乾燥させ、水１００ｍｌあたり乾燥物質２ｇの比率で無熱性蒸留水に溶解する。生成された溶液を以下の方法のうちいずれか１つを用いて凍結乾燥させる。
【００２１】
方法１  生成された水溶液を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒフィルタを備えたタンクにて綿ガーゼタンポンに通す。この溶液を濾過用プレートでトリミングした滅菌Ｍｉｌｌｉｐｏｒによって濾過し、滅菌したガラス容器に入れる。次に、溶液を真空によってガラス容器から計量ビュレットにポンプ送出し、このビュレットから２ｍｌのボトルに注いで凍結乾燥装置ＫＳ−３０にて乾燥させる。これを行うために、ボトルをトレー上に載せておく。トレーの上がボトルで一杯になった時点でこれを滅菌シートで包み、凍結カウンタ（ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｅｒ）に載せて２４時間以上−４０℃で固める。この手順の後、乾燥を開始する。乾燥開始から２時間以内に、棚の加熱部分をオンにする。棚を徐々に＋５０±５℃まで加熱する。生成物は乾燥開始から１２〜１３時間で氷点下から０℃より高い温度になる。生成物の最終温度は＋６０℃を超えないようにする。
【００２２】
乾燥時間は２４時間である。凍結乾燥後、製剤の入ったボトルに速やかにコルクの栓をし、キャップで覆って回転させる。各ボトルには製剤０．０４ｇ（０．００００４ｋｇ）が入っている。
【００２３】
方法２  水溶液を綿ガーゼタンポンまたは８枚重ねのガーゼで濾過し、２ｍｌのボトルまたはアンプルに注ぎ、上記の条件下で凍結乾燥させる。乾燥製剤の入ったこれらのボトルに速やかにコルクの栓をし、キャップで覆って回転させる。アンプル同士を密着させる。製剤の入ったボトルまたはアンプルを容器または二層にした袋で梱包し、オートクレーブにて圧力１．２Ａｔｍおよび温度１２０℃で２０分間滅菌する。各ボトル（アンプル）には製剤０．４ｇ（０．００００４ｋｇ）が入っている。
【００２４】
方法３  調製した水溶液を綿ガーゼタンポンまたは８枚重ねのガーゼで濾過し、このうち２００ｍｌを容量５００ｍｌのフラスコに注ぎ、綿ガーゼタンポンで閉じて油紙を巻く。溶液の入ったフラスコをオートクレーブにて圧力１．２Ａｔｍおよび温度１２０℃で３０分間滅菌する。滅菌後の溶液を室温まで冷却し、このうち２ｍｌを容量１０ｍｌのボトルに滅菌状態で注ぎ、上述したようにして凍結乾燥装置にて乾燥させる。凍結乾燥後、各ボトルには製剤０．０４ｇ（０．００００４ｋｇ）が入っている。
【００２５】
製剤の収量は１７ｇであり、これはこの段階での８８．２％、空気乾燥天然材料に対して０．２２％に相当する。アルグラビン凍結乾燥製剤は、麦藁白色で苦味のある化合物である。
【００２６】
本発明によれば、ＩＲ分光法によって凍結乾燥アルグラビンの高定性同定を行う。標準的なアルグラビン試料のクロロホルム溶液１％のスペクトルをＩＲ分光計によって分析する。スペクトルは、２８００、１７７５、１６５０ｃｍ-1で特徴的な吸収線を有する。
【００２７】
１７７５ｃｍ-1の線はγ−ラクトンのカルボニル基の特性であり、他のスペクトル線とは重ならないため、これを用いて標準的なアルグラビン試料の溶液の吸収係数を算出する。
【００２８】
吸収係数は以下の式によって算出される。
【００２９】
【数１】
2007137890.tif 000002
【００３０】
式中、Ａは光学密度であり、
ｃ1は被検化合物の試料中の割合（％）であり、
ｃ2は、分析対象となる溶液の試料濃度（％）であり、
ｂはキュベットの厚さ（ｍｍ）である。
【００３１】
標準的な試料のアルグラビン含量は１００％に等しい。分析対象となる溶液の試料濃度は１％、キュベット厚は０．４ｍｍである。
【００３２】
【数２】
2007137890.tif 000003
【００３３】
定量的な推測を行うために、濃度の分かったクロロホルム中のアルグラビン溶液のＩＲスペクトルを測定する。１７７５ｃｍ-1でのＴ％の帯域幅を光学密度に換算し、アルグラビン濃度を以下の式によって算出する。
【００３４】
【数３】
2007137890.tif 000004
【００３５】
分光光度計によってアルグラビンのパーセント濃度を求めたところ、９９.９％以上である。
【００３６】
製剤の品質の制御は、薄層クロマトグラフィ法、製剤の硫酸溶液との相互作用の定性反応、溶融温度の判定、比旋光によっても行うことができる。
【００３７】
ジメチルアミノアルグラビンハイドロクロライドの本製剤の物質および薬用剤形の抗腫瘍活性および毒性を、常法によって判断した。
【００３８】
このように、本方法によって、高い抗腫瘍活性および免疫安定活性を有し、かつ毒性が比較的低い、天然由来の凍結乾燥アルグラビンの極めて有効な抗腫瘍製剤を生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】抽出器の長手方向断面図
【図２】原料から凍結乾燥アルグラビンを抽出するための装置のスキームを示す図
【符号の説明】
【００４０】
１  本体
２  垂直隔壁
３  垂直隔壁
４  隔壁
５  分離室
６  湿度室
７  回転軸
８  再装填用取鍋
９  ブレードミキサ