【手続補正書】
【提出日】平成20年9月30日(2008.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を明らかにする方法であって、
ａ）レポータータンパク質をコードする遺伝子がフレーム単位で連結された上記難発現性タンパク質をコードする遺伝子を含む自動選別ベクターを製造する段階と、
ｂ）上記自動選別ベクターに複数の遺伝子断片を連結して、ライブラリーを製造する段階と、
ｃ）上記ライブラリーで上記レポータータンパク質の活性がない細胞を形質転換する段階と、
ｄ）上記細胞を培養する段階と、
ｅ）一個以上の上記細胞から分泌されたレポータータンパク質の活性を検出することでタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を明らかにする段階とを含む方法。
【請求項２】
さらに、明らかにされたタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を分離する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記難発現性タンパク質が、サイトカイン、血清タンパク質、免疫グロブリン、サイトカインレセプター、ラクトフェリン、インターフェロン、コロニー刺激因子、幹細胞刺激因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質、インスリン、腫瘍怪死因子、成長因子、ホルモン、酵素、抗癌ペプチド、及び抗生ペプチドから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記難発現性タンパク質がヒトインターロイキン−２、ヒトコロニー刺激因子、又はＣａｌＢ１４である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記複数の遺伝子断片が、ゲノム性ＤＮＡに由来する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記複数の遺伝子断片が、ｃＤＮＡに由来する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記複数の遺伝子断片が、動物、植物、又は微生物のＤＮＡに由来する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記複数の遺伝子断片が、酵母ＤＮＡに由来する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記複数の遺伝子断片が、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)のＤＮＡに由来する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
上記細胞が真核細胞、又は細菌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)の細胞である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記レポータータンパク質が細胞外部に分泌されるタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記レポータータンパク質がインベルターゼ、スクラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マルターゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びガラクトシダーゼから成る群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記レポータータンパク質がインベルターゼであり、上記細胞が単一炭素源としてスクロースを含む培地で培養される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記自動選別ベクターに、さらにプロモータ遺伝子が含まれる請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
上記プロモータ遺伝子がＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、ＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０より成る群から選択される遺伝子に由来する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記自動選別ベクターに、さらに切断認識部位が含まれる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
上記切断認識部位がＫｅｘ２ｐによって認識される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記自動選別ベクターは、プロモータ遺伝子と、翻訳開始及び終結コドンが除去された難発現性タンパク質をコードする遺伝子と、上記難発現性タンパク質をコードする遺伝子にレーム単位で融合されたレポータータンパク質をコードする遺伝子とを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を明らかにする方法であって、
ａ）インベルターゼをコードする遺伝子がフレーム単位で連結された難発現性タンパク質をコードする遺伝子を含む自動選別ベクターを製造する段階と、
ｂ）上記自動選別ベクターに複数の遺伝子断片を連結して、ライブラリーを製造する段階と、
ｃ）上記ライブラリーで内在性インベルターゼ遺伝子が欠失している酵母変異株を形質転換する段階と、
ｄ）上記形質転換された酵母を単一炭素源としてスクロースを含む培地で培養する段階と、
ｅ）一個以上の上記形質転換された酵母から分泌されたインベルターゼの活性を検出することでタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を明らかにする段階とを含む方法。
【請求項２１】
タンパク質融合因子（ＴＦＰ）ライブラリーを製造する方法であって、
ａ）レポータータンパク質をコードする遺伝子がフレーム単位で連結された上記難発現性タンパク質をコードする遺伝子を含む自動選別ベクターを製造する段階と、
ｂ）上記自動選別ベクターに複数の遺伝子断片を連結して、ライブラリーを製造する段階と、
ｃ）上記ライブラリーで上記レポータータンパク質の活性がない細胞を形質転換する段階と、
ｄ）上記細胞を培養する段階と、
ｅ）レポータータンパク質の活性を分泌する細胞を明らかにする段階と、
ｆ）レポータータンパク質の活性を分泌する上記細胞を回収する段階とを含み、これによって、タンパク質融合因子（ＴＦＰ）ライブラリーを製造する方法。
【請求項２２】
さらに回収された各細胞から上記タンパク質融合因子（ＴＦＰ）をコードする遺伝子を分離する段階を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記難発現性タンパク質が、サイトカイン、血清タンパク質、免疫グロブリン、サイトカインレセプター、ラクトフェリン、インターフェロン、コロニー刺激因子、幹細胞刺激因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質、インスリン、腫瘍怪死因子、成長因子、ホルモン、酵素、抗癌ペプチド、及び抗生ペプチドから成る群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
上記難発現性タンパク質がヒトインターロイキン−２、ヒトコロニー刺激因子、又はＣａｌＢ１４である請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
上記複数の遺伝子断片が、ゲノム性ＤＮＡに由来する請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
上記複数の遺伝子断片が、ｃＤＮＡに由来する請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
上記複数の遺伝子断片が、動物、植物、又は微生物のＤＮＡに由来する請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
上記複数の遺伝子断片が、酵母ＤＮＡに由来する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記複数の遺伝子断片が、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)のＤＮＡに由来する請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
上記細胞が真核細胞、又は細菌細胞である請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
上記細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、
カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)の細胞である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上記レポータータンパク質が細胞外部に分泌されるタンパク質である請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
上記レポータータンパク質がインベルターゼ、スクラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マルターゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びガラクトシダーゼから成る群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記レポータータンパク質がインベルターゼであり、上記細胞が単一炭素源としてスクロースを含む培地で培養される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記自動選別ベクターに、さらにプロモータ遺伝子が含まれる請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
上記プロモータ遺伝子がＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、ＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０より成る群から選択される遺伝子に由来する請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
上記自動選別ベクターに、さらに切断認識部位が含まれる請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
上記切断認識部位がＫｅｘ２ｐによって認識される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
上記自動選別ベクターは、プロモータ遺伝子と、翻訳開始及び終結コドンが除去された難発現性タンパク質をコードする遺伝子と、上記難発現性タンパク質をコードする遺伝子にフレーム単位で融合されたレポータータンパク質をコードする遺伝子とを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２１に記載の方法で製造されたタンパク質融合因子（ＴＦＰ）ライブラリー。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法によって明らかになった、難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質、
当該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導する類似体、又は、
当該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質の断片であって難発現性タンパク質の分泌を誘導する断片のアミノ酸配列と、少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導する類似体。
【請求項４２】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号４０又は配列番号４２で表されるアミノ酸配列の一つを含む、請求項４１に記載の難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質、
当該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導する類似体、又は、
当該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質の断片であって難発現性タンパク質の分泌を誘導する断片のアミノ酸配列と、少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導する類似体。
【請求項４３】
請求項４１に記載の難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質をコードする遺伝子、
当該遺伝子と少なくとも７５％のヌクレオチド相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質をコードする類似体、又は、
当該遺伝子の断片であって、難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質をコードする断片と、少なくとも７５％のヌクレオチド相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質をコードする類似体。
【請求項４４】
上記遺伝子が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号４０又は配列番号４２で表されるアミノ酸配列の一つを含み、難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質をコードするか、
当該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパクのアミノ酸配列と、少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導する類似体をコードするか、又は、
当該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパクの断片であって、難発現性タンパク質の分泌を誘導する断片のアミノ酸配列と、少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導する類似体をコードする、請求項４３に記載の遺伝子。
【請求項４５】
上記遺伝子が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号４１、又は配列番号４３で表されるヌクレオチド配列の一つを含む遺伝子であるか、
又は当該遺伝子若しくはその断片に少なくとも７５％のヌクレオチド相同性を有する類似体である、請求項４３に記載の遺伝子。
【請求項４６】
請求項４３に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項４７】
上記ベクターが、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＥＰ１(KCTC 10544BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＥＰ２(KCTC 10545BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＥＰ３(KCTC 10546BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＥＰ４(KCTC 10547BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３(KCTC 10548BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４(KCTC 10549BP)、ｐＹＧＴ３−１−１−ＧＣＳＦ(KCTC 10753BP)、及びｐＹＧＴ３−１−２−ＧＣＳＦ(KCTC 10754BP)から成る群から選択される請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
請求項４６に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項４９】
上記細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)から成る群から選択される請求項４８に記載の細胞。
【請求項５０】
難発現性タンパク質の組み換え的生産方法であって、上記組み換え的生産方法は、
ａ）請求項４１に記載のタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質をコードする遺伝子と融合された、上記難発現性タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを製作する段階と、
ｂ）上記発現ベクターで細胞を形質転換する段階と、
ｃ）上記細胞を培養する段階とを含み、上記難発現性タンパク質が生産される組み換え的生産方法。
【請求項５１】
上記タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質が、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号４０又は配列番号４２で表されるアミノ酸配列の一つを含み、難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質であるか、
当該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導する類似体であるか、又は、
当該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質の断片であって難発現性タンパク質の分泌を誘導する断片のアミノ酸配列と、少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、難発現性タンパク質の分泌を誘導する類似体である、請求項５０に記載の組み換え的生産方法。
【請求項５２】
上記タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号４１、又は配列番号４３で表されるヌクレオチド配列の一つを含む遺伝子、又は、当該遺伝子若しくはその断片に少なくとも７５％のヌクレオチド相同性を有する類似体によってコードされている請求項５０に記載の組み換え的生産方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を明らかにする方法、タンパク質融合因子（ＴＦＰ）ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法