(57)【要約】  本発明は、自己組織化の性質を用いてタンパク質のネットワークを形成し、安定でかつサイズ制御可能なナノ構造体を構築するための新規な方法を提供する。当該方法は、１種又は２種以上の人工融合タンパク質を用いてナノ構造体を構築する方法であって、（ａ）多量体を形成する骨格素子タンパク質と１種又は２種以上の結合素子とを含む融合タンパク質を調製する工程、ここで、融合タンパク質に含まれる１つの結合素子は、同種、又は異種融合タンパク質の他の結合素子と結合することができ、及び（ｂ）前記１種又は２種以上の融合タンパク質を接触させてそれらを会合させる工程、を含む。
2007037315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種又は２種以上の人工融合タンパク質を用いたナノ構造体の構築方法であって、
（ａ）多量体を形成する骨格素子タンパク質と１種又は２種以上の結合素子とを含む融合タンパク質を調製する工程、ここで、融合タンパク質に含まれる１つの結合素子は、同種、又は異種融合タンパク質の他の結合素子と結合することができ、及び
（ｂ）前記１種又は２種以上の融合タンパク質を接触させてそれらを会合させる工程、
を含むことを特徴とするナノ構造体の構築方法。
【請求項２】
前記骨格素子タンパク質が２量体以上の多量体を形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨格素子タンパク質が好熱性微生物由来のタンパク質である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記骨格素子タンパク質がPyrococcus属細菌由来のタンパク質である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記骨格素子タンパク質がスーパーオキシド還元酵素（ＳＯＲ）又はＣｕｔＡタンパク質である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記結合素子が、ＰＤＺドメイン、ＷＷドメイン、ＳＨ２ドメイン、及びＳＨ３ドメイン又はその何れかのドメインを含むタンパク質、並びに前記各ドメインと結合するペプチド又はタンパク質から選択されることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記融合タンパク質を接触させる工程は、融合タンパク質を含む水溶液中において、又は当該水溶液と気体若しくは固体との界面において行われることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記融合タンパク質が、タンパク質相互作用に基づく自己組織化により直鎖状、平面状、又は三次元立体状の規則構造を形成することを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記規則構造は、前記融合タンパク質を含む水溶液のｐＨ、温度、塩濃度、金属濃度、若しくはキレート剤濃度、前記融合タンパク質のリン酸化の程度、接触させる時間、又は会合時の紫外線若しくは負荷電位の変化により制御可能であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも２種の人工融合タンパク質を単層又は複数層に形成したナノ構造体の構築方法であって、
（ａ）多量体を形成する骨格素子タンパク質と、１種又は２種以上の結合素子と、タグペプチドと、を含む融合タンパク質を調製する工程、ここで、前記タグペプチドは金属イオンをキレートした親水性物質との親和性を有し、前記１つの結合素子は、異なる種類の融合タンパク質の他の結合素子と結合することができ、
（ｂ）前記親水性物質と脂質とからなる両親媒性の分子によって形成される単分子膜を用意する工程、
（ｃ）前記夫々の融合タンパク質と前記単分子膜とを接触させる工程、及び
（ｄ）前記単分子膜上に整列化した夫々の融合タンパク質を当該単分子膜上において会合させ、単層又は複数層に再整列させる工程、
を含むことを特徴とするナノ構造体の構築方法。
【請求項１１】
前記タグペプチドがヒスチジンタグであり、前記金属イオンをキレートした親水性物質がニッケル−ＮＴＡ、又は重合度が１０〜２０のポリエチレングリコールとニッケル−ＮＴＡとの複合体であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記単分子膜が気液界面に形成されることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記他の１種の結合素子がＰＤＺドメイン、ＷＷドメイン、ＳＨ２ドメイン、及びＳＨ３ドメイン又はそれらを含むタンパク質、並びに前記各ドメインと結合するペプチド又はタンパク質から選択される請求項１０〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記骨格素子タンパク質がＣｕｔＡタンパク質である請求項１０〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２種の人工融合タンパク質を含むナノ構造体であって、
前記夫々の融合タンパク質は、多量体を形成する骨格素子タンパク質と１種又は２種以上の結合素子とを含み、前記１種の融合タンパク質に含まれる１つの結合素子は、異なる種類の融合タンパク質に含まれる他の結合素子と結合し、
前記少なくとも２種の融合タンパク質が会合して直鎖状、平面状、又は三次元立体状の規則構造を形成することを特徴とするナノ構造体。
【請求項１６】
前記融合タンパク質の少なくとも１種を蛍光色素で標識することにより、当該融合タンパク質の凝集物を可視化し得ることを特徴とする請求項１５に記載のナノ構造体。
【請求項１７】
前記蛍光色素がアレクサ４８８である請求項１６に記載のナノ構造体。
【請求項１８】
請求項１０〜１４の何れかに記載の方法により構築され、単層状の規則構造を有することを特徴とするナノ構造体。
【請求項１９】
シリコン又は金属等の基板と、当該基板上に吸着した請求項１５〜１８の何れかに記載のナノ構造体とを含み、当該ナノ構造体が、前記基板上で任意の長さ離れた２つの位置を直鎖状の規則構造で連結したことを特徴とするナノマテリアル。
【請求項２０】
前記規則構造は、前記各位置に１つの融合タンパク質を固定し、そして各位置から他の位置へ前記融合タンパク質の直鎖状構造を伸長させることにより形成されることを特徴とする請求項１９に記載のナノマテリアル。
【請求項２１】
シリコン又は金属等の基板と、当該基板上に吸着した請求項１５〜１８の何れかに記載のナノ構造体とを含むナノマテリアルであって、
当該ナノ構造体の規則構造に、天然タンパク質、人工タンパク質、機能性タンパク質、ペプチド、核酸、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される何れかの目的分子を再配列させたことを特徴とするナノマテリアル。
【請求項２２】
前記目的分子からの応答を電気的信号として取り出すことを特徴とする請求項２１に記載のナノマテリアル。
【請求項２３】
前記目的分子が機能性タンパク質であり、当該機能に基づくバイオセンサーとして用いることを特徴とする請求項２２に記載のナノマテリアル。
【請求項２４】
前記規則構造に光を照射、又は電圧を負荷することにより前記目的分子の活性を制御することを特徴とする請求項２１に記載のナノマテリアル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なナノ構造体に関し、より詳細には、自己組織化により形成され、安定かつサイズ制御可能な規則構造からなるナノ構造体（ナノレベル構造体、又はナノレゴ構造体）及びその構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質の構造をナノメートルレベルで制御したナノ構造材料は、情報通信、環境・エネルギー、バイオテクノロジーなど広範な分野での技術革新を先導する基盤技術と認識されている。近年、その化学的構造や合成手段に関する研究開発が活発に行われているが、ナノ構造材料としては、無機又は有機合成材料を用いるものがほとんどである。一方、タンパク質等の生物学的な分子は自己組織化し得る性質を有するため、極めて特徴的なナノ構造材料を提供できる可能性がある。これまで知られている種々のナノ構造体としては、フラーレン（非特許文献１参照）、カーボンナノチューブ（非特許文献２参照）、ヒトエラスチン及び他の線維状タンパク質で設計された自己整列ペプチド（特許文献１参照）及び自己組織化タンパク質を用いたナノスケール材料の構築方法（特許文献２参照）等が挙げられる。【０００３】
自己組織化の性質を用いてタンパク質のネットワークを形成する１つの方法として、４量体酵素であるアルドラーゼに、ビオチンとストレプトアビシジンによる連結器を導入し、鎖状構造又は平面状のネットワークを構築する方法が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。また、２つのオリゴマー形成するタンパク質ドメインを、αヘリックスを介して融合させた融合タンパクを用いて、その自己組織能によるケージ（かご）構造やフィラメント構造等の構築が報告されている（例えば、特許文献３参照）。【０００４】
【特許文献１】国際公開第０１／００６６６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５７１２３６６号公報
【特許文献３】米国特許第６７５６０３９号公報
【非特許文献１】Kroto, H.W. et al., Nature, 318, 162 (1985)
【非特許文献２】Iijima, S., Nature, 354, 56 (1991)
【非特許文献３】Ringler, P. and Schulz, G.E., Science, 302, 106-109, (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記ビオチンとストレプトアビシジンによる連結では構築単位同士の結合が強すぎるため（Ｋｄ＝１０−１５Ｍ）、誤って形成された不規則な構造を修復することが難しいという問題点が指摘されている（上記非特許文献３参照）。また、タンパク質ドメイン間のオリゴマー形成能のみを利用した自己組織化では所望の構造を形成することが難しく構造設計の自由度が少ないという問題点もある（上記特許文献３参照）。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであって、非常に安定な骨格素子タンパク質と、様々な強度及び着脱制御可能な接着素子とを用いて、自己組織化する融合タンパクを作成し、安定でサイズ制御可能かつ非常に微小なナノ構造体の作成に成功した。さらに、界面上に融合タンパクを自己組織化により整列させ、サイズ制御可能な単層・複数層の構築も可能であることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。【０００７】
すなわち、第一の視点において、本発明は１種又は２種以上の人工融合タンパク質を用いたナノ構造体の構築方法であって以下の工程を含むことを特徴とする。
（ａ）多量体を形成する骨格素子タンパク質と１種又は２種以上の結合素子とを含む融合タンパク質を調製する工程、ここで、融合タンパク質に含まれる１つの結合素子は、同種、又は異種融合タンパク質の他の結合素子と結合することができ、及び
（ｂ）前記１種又は２種以上の融合タンパク質を接触させてそれらを会合させる工程。【０００８】
好ましい実施形態において、前記骨格素子タンパク質は２量体以上の多量体を形成する。また、前記骨格素子タンパク質が好熱性微生物由来のタンパク質、特に、パイロコッカス(Pyrococcus)属古細菌由来のタンパク質であることが好ましい。１つの実施形態において、前記骨格素子タンパク質がスーパーオキシド還元酵素（ＳＯＲ）又はＣｕｔＡタンパク質であることを特徴とする。【０００９】
他の好ましい実施形態において、前記結合素子は、ＰＤＺドメイン、ＷＷドメイン、ＳＨ２ドメイン、及びＳＨ３ドメイン又はその何れかのドメインを含むタンパク質、並びに前記各ドメインと結合するペプチド又はタンパク質から選択されることを特徴とする。これらの結合素子を有する融合タンパク質は、水溶液中において又は当該水溶液と気体若しくは固体との界面において接触させることが好ましい。前記融合タンパク質が、タンパク質相互作用に基づく自己組織化により直鎖状、平面状、又は三次元立体状の規則構造を形成することを特徴とする。前記規則構造は、前記融合タンパク質を含む水溶液のｐＨ、温度、塩濃度、金属濃度、若しくはキレート剤濃度、前記融合タンパク質のリン酸化の程度、接触させる時間、又は会合時の紫外線若しくは負荷電位の変化により制御可能である。【００１０】
本発明の第二の視点において、少なくとも２種の人工融合タンパク質を単層又は複数層に形成したナノ構造体の構築方法であって、
（ａ）多量体を形成する骨格素子タンパク質と、１種又は２種以上の結合素子と、タグペプチドと、を含む融合タンパク質を調製する工程、ここで、前記タグペプチドは金属イオンをキレートした親水性物質との親和性を有し、前記１つの結合素子は、異なる種類の融合タンパク質の他の結合素子と結合することができ、
（ｂ）前記親水性物質と脂質とからなる両親媒性の分子によって形成される単分子膜を用意する工程、
（ｃ）前記夫々の融合タンパク質と前記単分子膜とを接触させる工程、及び
（ｄ）前記単分子膜上に整列化した夫々の融合タンパク質を当該単分子膜上において会合させ、単層又は複数層に再整列させる工程、
を含むことを特徴とするナノ構造体の構築方法が提供される。【００１１】
好ましい実施形態において、前記タグペプチドがヒスチジンタグであり、前記金属イオンをキレートした親水性物質がニッケル−ＮＴＡ、又は重合度が１０〜２０のポリエチレングリコールとニッケル−ＮＴＡとの複合体であることを特徴とする。前記単分子膜は、気液界面に形成されることが好ましい。また、前記他の１種の結合素子がＰＤＺドメイン、ＷＷドメイン、ＳＨ２ドメイン、及びＳＨ３ドメイン又はその何れかのドメインを含むタンパク質、並びに前記各ドメインと結合するペプチド又はタンパク質であることがさらに好ましい。【００１２】
さらに異なる視点において、本発明のナノ構造体は、少なくとも２種の融合タンパク質を含むナノ構造体であって、前記夫々の融合タンパク質は、多量体を形成する骨格素子タンパク質と１種又は２種以上の結合素子とを含み、前記１種の融合タンパク質に含まれる１つの結合素子は、異なる種類の融合タンパク質に含まれる他の結合素子と結合し、前記少なくとも２種の融合タンパク質が会合して直鎖状、平面状、又は三次元立体状の規則構造を形成することを特徴とする。【００１３】
１つの実施形態として、前記融合タンパク質の少なくとも１種を蛍光色素で標識することにより、当該融合タンパク質の凝集物を可視化し得ることを特徴とする。前記蛍光色素は、アレクサ４８８であることが好ましい。【００１４】
さらになお異なる視点において、本発明のナノマテリアルは、シリコン又は金属等の基板と、当該基板上に吸着した上記何れかの方法により構築されたナノ構造体とを含み、当該ナノ構造体が、前記基板上で任意の長さ離れた２つの位置を直鎖状の規則構造で連結したことを特徴とする。前記規則構造は、前記各位置に１つの融合タンパク質を固定し、そして各位置から他の位置へ前記融合タンパク質の直鎖状構造を伸長させることにより形成されることが好ましい。あるいは、当該ナノ構造体の規則構造に、天然タンパク質、人工タンパク質、機能性タンパク質、ペプチド、核酸、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される何れかの目的分子を再配列させたことを特徴とする。【００１５】
本発明のナノマテリアルは、前記目的分子からの応答を電気的信号として取り出すことができ、１つの具体的な実施形態としては、前記目的分子が機能性タンパク質であり、当該機能に基づくバイオセンサーとして用いることを特徴とする。また、本発明のナノマテリアルは、前記規則構造に光を照射、又は電圧を負荷することにより前記目的分子の活性を制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のナノ構造体の構築スキームを表した概念図である。
【図２】本発明のナノ構造体の鎖状、平面状及び三次元立体状の形状を示す模式図である。
【図３】本発明の方法により、ＣｕｔＡ融合タンパク質を単分子膜上で会合させる方法を示す模式図である。
【図４】ＣｕｔＡ融合タンパク質の発現ベクターの構築方法を示す模式図である。
【図５】ＳＯＲ融合タンパク質の発現ベクターの構築方法を示す模式図である。
【図６】ＣｕｔＡ融合タンパク質をコードする遺伝子及びアミノ酸配列を表す。
【図７】ＳＯＲ融合タンパク質をコードする遺伝子及びアミノ酸配列を表す。
【図８】ＳＯＲ融合タンパク質を発現する組み換え大腸菌から回収した２種類の融合タンパク質の抽出及び精製結果を示す。
【図９】ＳＯＲ融合タンパク質の混合アッセイ結果を示す。
【図１０】蛍光標識ＳＯＲ融合タンパク質ナノレゴ集合体の微弱光検出ＣＣＤカメラによる直接観察と原子間力顕微鏡による観察結果を示す。
【図１１】ＳＯＲ融合タンパク質集合体の微細構造の電子顕微鏡観察によるＴＥＭ写真を示す。
【図１２】種々の量比で混合したＳＯＲ融合タンパク質の形成した白濁沈殿物を解析した結果を示す。
【図１３】種々の濃度のＮａＣｌ存在下におけるＳＯＲ融合タンパク質の白濁形成を観察した結果を示す。
【図１４】ＣｕｔＡ融合タンパク質の組み換え大腸菌による発現及び精製結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（本発明のナノ構造体）
本発明のナノ構造体について、以下に図面を参照しながら説明する。図１は本発明のナノ構造体の作製方法を示した概略図である。ここで、用語「ナノ構造体」とは、ナノメートル範囲（約１〜１００ｎｍ）の特徴的な寸法を有する個々の成分を有する構造体であり、「ナノレベル構造体」や「ナノブロック構造体」と称する場合もある。本発明のナノ構造体の構築に用いられる融合タンパク質は、骨格素子タンパク質と１種又は２種以上の結合素子とから構成される。「骨格素子タンパク質」とは、対称性を有するホモ重合体からなる多量体を形成しうるタンパク質を意味し、多量体とは２量体、３量体及び４量体以上のホモ重合体である。自然界に存在するタンパク質には、細胞や組織の構造を維持するために会合したり、酵素タンパク質の機能を調節するためにいくつかのサブユニットが集合して多量体を形成しているものが知られている。本発明に係る骨格素子タンパク質は、このようなホモ重合体を形成するものであれば特に限定されないが、好ましくは、熱安定性の高い好熱性微生物由来のタンパク質が用いられる。さらに好ましくは、超好熱古細菌であるパイロコッカス(Pyrococcus)由来のタンパク質である。１つの実施形態として、骨格素子タンパク質としては、Pyrococcus horikoshii OT3由来のスーパーオキシド還元酵素（Superoxide reductase；ＳＯＲ）及びＣｕｔＡ（divalent cation tolerance protein）タンパク質が挙げられる。ＳＯＲは、青色非ヘム鉄タンパク質であって、活性酸素を還元して過酸化水素を生成する触媒作用により、嫌気性細菌における活性酸素に対する防御機構として働く。相同性を有するいくつかのＳＯＲが知られているが、何れもホモ４量体を形成する。本発明の以下の実施例では、Pyrococcus horikoshii OT3由来のＳＯＲ（ＰＨ１０８３、GenBank Acc. No. NC_000961、配列番号２）を用いるが、類縁菌であるPyrococcus abyssi、及びPyrococcus furiosus由来のＳＯＲ相同体を用いても良い。【００１８】
ＣｕｔＡタンパク質は、細菌、植物及びヒトを含む動物に広く存在する約１２ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質は、最初に大腸菌において二価の重金属に対する耐性を付与する遺伝子産物として見出されたものである。Ｘ線構造解析による大腸菌及びラット由来のＣｕｔＡ１タンパク質の立体構造は、サブユニット間におけるβ-シートの形成によって結晶及び溶液中において３量体構造を有することが明らかになった。本発明の以下の実施例では、Pyrococcus horikoshii OT3由来のＣｕｔＡ（ＰＨ０９９２、GenBank Acc. No. NC_000961、配列番号４）を用いるが、他の生物由来の相同体タンパク質を用いてもよいことは当然である。ＳＯＲ又はＣｕｔＡタンパク質の相同体は、夫々配列番号２又は４に示したアミノ酸配列からなるタンパク質と少なくとも５０％、好ましくは７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％以上の相同性を有するタンパク質であり、かつ夫々４量体又は３量体からなる多量体形成能を有するタンパク質をいう。タンパク質の相同性（ホモロジー）の程度は、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、当該配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定することができる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403-10）。【００１９】
「結合素子」とは、分子間を接着する接着剤として働く成分を意味し、「接着素子」と称する場合もある。結合素子にはタンパク質、ペプチド、及び低分子化合物などを含む。天然に存在するタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用によりその機能を発現または調節しているものが多く、また転写因子とＤＮＡ間の相互作用や低分子リガンドとその受容体等の特異的な相互作用などが存在する。様々な強度の接着素子が存在し、アビジン−ビオチン間のような強度な結合から、比較的緩やかな結合まで目的に応じて選択することができる。また、これらの結合は溶液中のｐＨ、及び塩濃度などの環境条件、若しくは結合素子タンパク質へのリン酸化の有無、又は紫外線照射などの条件によって制御することも可能である。本発明の１つの実施形態として、ＰＤＺドメイン、ＷＷドメイン、ＳＨ２ドメイン、及びＳＨ３ドメイン又はこれらのドメインを含むタンパク質と、前記各ドメインと結合するペプチド又はタンパク質との間の相互作用が挙げられる。【００２０】
ＰＤＺドメインは細菌から高等植物、動物にまで広く保存されたドメインであり、多くの場合、ＰＤＺドメインが認識するのは標的タンパク質のＣ末端の短いアミノ酸配列で、これらの標的タンパク質は膜貫通型受容体やチャンネルであることが多い。ＰＤＺドメインを有するタンパク質としては、これまでＰＳＤ−９５、ＤＬＧ、ＺＯ−１、ｐ５５、Ｄｓｈ、ＬＩＮ−７、ＩｎａＤ、ＰＴＰＬ１／ＦＡＰ１などが知られ、これらはＰＤＺファミリーと呼ばれている。最初、９５ＫＤａ後シナプス膜タンパク質（post-synaptic density protein）ＰＳＤ−９５において、保存された「Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＧＬＧＦ）」の４アミノ酸のモチーフを含む約８０〜９０アミノ酸からなる３回の繰り返し構造が存在することが同定された（Neuron 9,929-942(1992)）。その後、このドメイン構造がショウジョウバエの致死（１）ディスクス ラージ−１ 癌抑制タンパク質ＤｌｇＡ（Drosophila lethal(1)discs large-1 tumor suppressor protein DlgA）（Cell 66,451-464(1991)）、密着結合タンパク質ＺＯ−１（tight junction protein ZO-1）（J.Cell Biol.121,491-502(1993)）のタンパク質にも見い出され、この繰り返し配列は、ＰＳＤ９５、ＤｌｇＡ、ＺＯ−１の頭文字をとって「ＰＤＺドメイン」と名付けられた。ＰＤＺドメインを有するタンパク質群は、いくつかの例外はあるが、共通して、Ｃ末に存在する「Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｖａｌ」（Ｘａａは任意のアミノ酸残基）に代表される３アミノ酸からなる疎水性アミノ酸の領域を持った他のタンパク質と結合していることが知られている。本発明の好ましい結合素子として、ＰＤＺドメインを含むＴＩＰ−１(Tax-Interacting Protein-1；配列番号６)を用いることができ、このＴＩＰ−１はβ-カテニン又はそのＣ末端の少なくとも４つのアミノ酸、好ましくはＣ末端から９個のアミノ酸からなるペプチド（ＮＨ２−ＱＬＡＷＦＤＴＤＬ−ＣＯＯＨ；配列番号７）と結合する。なお、本明細書において、ＰＤＺドメインと結合し得るこれらのペプチドを「ＰＤＺペプチド」と称する。【００２１】
一方、ＷＷドメインは、酵母から哺乳類までよく保存された約４０アミノ酸から成るドメインであり、プロリンに富むＰＹモチーフと呼ばれる比較的短いアミノ酸配列を認識して結合する。ＷＷドメインを持つタンパク質としては、ユビキチンタンパク質リガーゼ、ジストロフィン、ホルミン結合タンパク質などがある。【００２２】
ＳＨドメインとは、Ｓｒｃ相同領域のことである。プロトオンコジーンの一つｓｒｃ遺伝子産物（Ｓｒｃ）は、チロシンキナーゼ活性をもち、Ｓｒｃ自体のチロシンもリン酸化される。他のチロシンキナーゼ活性をもつがん遺伝子産物やシグナル伝達経路にかかわる因子の研究過程で、Ｓｒｃタンパク質と構造が類似していて、タンパク質分子間の相互作用に重要な働きをする領域（ドメイン）が発見され、Ｓｒｃ相同領域（ＳＨ１〜３）と呼ばれるようになった。そのうちＳＨ１ドメインはチロシンキナーゼ領域である。ＳＨ２ドメインは近隣のタンパク質のリン酸化されたチロシンを認識して結合する。また、ＳＨ３ドメインはプロリンに富むペプチドを認識して相互作用することが知られている。【００２３】
従って、本発明における「融合タンパク質」とは、１つの骨格素子タンパク質と１種又は２種以上の結合素子とを含む。前記１種の融合タンパク質に含まれる１つの結合素子は、同種又は異種融合タンパク質に含まれる他の１種の結合素子と結合することができ、これらの結合素子間の接着によって自己組織化して会合し種々の規則構造からなるナノ構造体を形成する。本明細書で用いられる「自己組織化」とは、ある種の条件で、ナノメートルスケールの構造が自発的に生成される現象をいう。【００２４】
前記融合タンパク質が、タンパク質相互作用に基づく自己組織化により形成する規則構造は、例えば、図２Ａに示すような直鎖状、又は平面状の構造を含む。これらの基本的な規則構造は、図２Ｂに示したようにさらに集合して段階的な高次構造が形成されると考えられる。【００２５】
これらのナノ構造体の微細構造は、電子顕微鏡や、試料からの力を受けて試料表面を測定する原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）等の走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）を用いて観察することができる。ＡＦＭは、試料表面を原子スケールで直接観察することができ、材料表面に原子、分子レベルで点在して機能を発揮する局所領域の構造を明らかにし、その微小領域における物理的、化学的性質などを評価するための有力な手段として活用されている(Binnig, G., et al. Phys. Rev. Lett., 49, 57, (1982))。【００２６】
（本発明のナノ構造体の構築方法）
１  融合タンパク質の調製
本発明のナノ構造体の構築に用いる融合タンパク質は、タンパク質化学及び組み換えＤＮＡ技術を使用して、当業者に周知の方法により合成することができる。例えば、骨格素子タンパク質をコードするＤＮＡと、結合素子タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡとを連結した組み換えＤＮＡを用いて、適当な宿主細胞で発現させた融合タンパク質を回収、精製して用いる。【００２７】
１つの実施形態として、骨格素子タンパク質をコードする遺伝子の供給源、例えば、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞からＤＮＡを抽出し、目的とする配列を制限酵素で切り出すか、あるいは適当なプライマーを用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅する。これに結合素子をコードするＤＮＡを連結して適当な発現ベクターにクローン化して夫々の融合タンパク質を発現する組み換えベクターを作製する。発現ベクターには、宿主細胞内で融合タンパク質を発現させるための種々の発現制御配列が提供される。これらの発現制御配列には、プロモーター、ターミネーターの他、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが含まれる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。これらの発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、得られた形質転換細胞を培養することによって所望の融合タンパク質を製造することができる。ここで、宿主としては、上記発現ベクターを複製及び維持できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）等の細菌や、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、或いはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることができる。【００２８】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、融合タンパク質をコードするＤＮＡを導入した組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００２９】
これらの形質転換細胞を培養後、所望の融合タンパク質が細胞内に生産される場合には細胞を破砕することにより当該融合タンパク質を抽出する。また、所望の融合タンパク質が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、当該融合タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることにより、上記培養物中から当該融合タンパク質を単離精製することができる。【００３０】
他の１つの実施形態として、細胞抽出液を用いて試験管内で融合タンパク質を合成する系があり、このような合成系としてはｍＲＮＡの情報を読み取ってリボゾーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、又はＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系の何れでも良い。ＤＮＡを鋳型として用いる場合には、ＰＣＲ等の試験管内での増幅反応により、従来必要とされたクローニングという煩雑な操作を経ることなく、多数の鋳型ＤＮＡを同時並行的に迅速に調製することができる。上記細胞抽出液としては、リボゾーム、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に必要な成分を含む真核細胞又は原核細胞の抽出液が使用可能である。前記真核細胞及び原核細胞としては従来公知のものが何れも使用可能であり、具体的に例示すれば、大腸菌、好熱性細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母などが挙げられ、特に大腸菌由来のもの（例えば大腸菌Ｓ３０細胞抽出液）又は高度好熱菌(Thermus thermophilus)由来のものが高い合成量を得る点において望ましい。該大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌A19（rna, met）, BL21, BL21 star, BL21 codon plus株等から公知の方法（Pratt, J.M. et al., Transcription and translation - a practical approach, (1984), pp.179-209, Henes, B.D.とHiggins, S.J.編、IRL Press,  Oxford参照）に従って調製できるし、あるいはPromega社やNovagen社から市販されるものを使用してもよい。【００３１】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第3版（Sambrook & Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）；Current Protocols in Molecular biology（Ausubelら編、John Wiley & Sons、1987）；Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press）；PCR Protocols: Methods in Molecular Biology（Bartlett & Striling編、Humana Press、2003）を参照することができる。また、本明細書において参照される組み換えＤＮＡ実験のための試薬及びキット類はSigma社やAldrich社、Novagen社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社、Qiagen社、Promega社、Roche Diagnostics社、Becton-Dickinson社、TaKaRa（タカラバイオ株式会社）等の市販業者から入手可能である。【００３２】
２  自己組織化による会合
上記で調製した融合タンパク質は、所望の形態が形成されるように自己組織化するための条件下において接触させ、それらを会合させる。一般的に、自己組織化を促進する条件とは当該タンパク質が形成される生理的条件、例えば、水溶液中におけるか、又は融合タンパク質を含む水溶液と気体若しくは固体（例えば脂質膜）との界面において行われる。融合タンパク質の濃度は所望の形態が形成されるために十分な程度高いことが必要である。一方、融合タンパク質を接触させる際、自由に分散しながら結合と解離を繰り返すような条件を用いることが好ましく、通常１．０μＭ以下の濃度で使用する。好ましくは０．１μＭ程度である。本発明に係る融合タンパク質が自己組織化して会合する条件とは、個々の融合タンパク質が生体内において合成され、安定に存在する条件と同じであり、例えば、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜８の範囲の水溶性溶媒中、０℃〜７５℃、好ましくは４℃〜３５℃の範囲の温度である。しかしながら、本発明に係る好ましい融合タンパク質は好熱性細菌由来のタンパク質であるため、通常の生理的条件下で極めて安定であり、高濃度の塩や金属イオン、キレート剤、及び変性剤が共存していても問題ない。さらに、紫外線照射や高電圧が負荷された条件下においても十分安定であり、これらの種々の条件を調節することによって、自己組織化により形成される規則構造の大きさ、形状、又はその形成速度等を制御することができる。【００３３】
本発明の１つの特徴的な実施形態において、少なくとも２種の人工融合タンパク質を用いた単層又は複数層の規則構造を形成したナノ構造体が構築される。この方法では、まず、多量体を形成する骨格素子タンパク質と、１種又は２種以上の結合素子と、タグペプチドと、を含む融合タンパク質を調製する。図３に示したように、ここでは骨格素子タンパク質として例えばＣｕｔＡタンパク質を用いることができる。図３ＢはＣｕｔＡ３量体の立体構造をリボンモデルで示した図である。ＣｕｔＡタンパク質の夫々のＮ末端は３量体によって形成される平面の片側に位置することから、このＮ末端にタグペプチドを導入することでＣｕｔＡ融合タンパク質の方向性（裏表）を制御することができる。タグペプチドとは、発現させる融合タンパク質の一部、例えば、Ｎ末端及び／又はＣ末端に付加されたアミノ酸配列であって、該融合タンパク質をアフィニティー精製する場合の手がかりとなる配列である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴｒｘＡ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、ストレプトアビジン結合ペプチド、及びヒスチジンタグ等が挙げられる。好ましい実施形態において、連続した少なくとも６個のヒスチジンを含むペプチド配列からなるヒスチジンタグを使用することができる。ヒスチジンタグは、二価の金属原子、特にニッケル原子と親和性が高い。そのためヒスチジンタグを有するタンパク質はニッケルアフィニティーマトリックスにしっかりと結合する。すなわち、ＣｕｔＡタンパク質のＮ末端にヒスチジンタグを導入し、さらにＣ末端にＴＩＰ−１またはＰＤＺペプチドを導入することで２種類の融合タンパク質Ｈｉｓ−ＣｕｔＡ−ＴＩＰ−１及びＨｉｓ−ＣｕｔＡ−ＰＤＺｐｅｐ４を調製する。これらの２種類の融合タンパク質は互いにＴＩＰ−１ドメインとＰＤＺペプチドとの相互作用により結合することができる。次に、ヒスチジンタグと結合することができる金属イオンをキレートした親水性物質、例えば、図３Ａに示すＮｉ２＋−ＮＴＡ（nickel-nitrotriacetic acid）と脂質とからなる両親媒性の分子によって形成される単分子膜を用意する。例えば、ニトロトリ酢酸基と２−（１，３−ジ−Ｏ−オレイルグリセロキシ）酢酸とを連結して２−（ビスカルボキシメチルアミノ）−６−[２−（１，３−ジ−Ｏ−オレイルグリセロキシ）アセチルアミノ]ヘキサン酸（ＮＴＡ−ＤＯＧＡ）等の両親媒性分子を合成することができる（Bischler, N. et al., Biophysical Journal, vol. 74, pp.1522-1532, (1998)）。【００３４】
非特異的吸着の極めて少ない単分子膜としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ゼラチン等の合成又は天然の親水性化合物を用いることができる。ＰＥＧアルカンチオールを用いた混合自己組織化膜の有用性が報告されている（Joydeep Lahiri et al., Anal. Chem. 1999, 71, 777-790）。単分子膜の構成成分は、種々の鎖長のＰＥＧを１種又は２種以上、任意の比率で混合して用いることができるが、エチレングリコールの鎖長が１０〜２０であることが好ましい。これに疎水性を付与するために適当な鎖長のアルキル基を付加する。長鎖アルカンチオールに代表されるチオール系化合物では、金−チオレート結合（Ａｕ−Ｓ）の形成とファンデルワールス力に基づくアルキル鎖の疎水性相互作用により、高配向で高密度な自己集合単分子膜が形成される。しかも、基板を吸着分子を含む溶液中に浸漬するという極めて簡単な操作で単分子膜を作製することができ、シリコンやガラス、金属等の表面に容易に単分子膜を形成することができる。【００３５】
続いて、図３Ｃに示すように、前記夫々の融合タンパク質と前記単分子膜とを接触させることによって、ヒスチジンタグとＮｉ２＋−ＮＴＡとの親和性により、Ｈｉｓ−ＣｕｔＡ−ＴＩＰ−１と、Ｈｉｓ−ＣｕｔＡ−ＰＤＺｐｅｐ４とを別々に単分子膜の表面に結合させる。例えば、別々の容器を用いてもよいし、１つの容器内に仕切りを設けてもよい。これによって、２つの融合タンパク質が縦方向に２量体を形成することが防止される。さらに、前記単分子膜上に夫々別々に整列化した２種類の融合タンパク質を、例えば両者の仕切りを除去することによって当該単分子膜上において会合させる。気液界面に形成された前記単分子膜は流動性を有するから、膜上において２種類の融合タンパク質が２次的に会合し平面状の規則構造を形成することができる。融合タンパク質として、Ｈｉｓ−ＣｕｔＡ−ＴＩＰ−１のみを使用し、結合素子としてＰＤＺｐｅｐ４の直列に複数個つながったペプチドを用いてもよい。【００３６】
３  ナノマテリアルとしての応用
本発明の方法により構築されたナノ構造体は、ナノメートルスケールにおける規則的構造を有するため種々の異なる用途に使用することができる。これらの用途には、医薬品や遺伝子をその規則構造内に安定に維持し、生体内の所望の部位へ送達することの他、天然タンパク質、人工タンパク質、機能性タンパク質、ペプチド、核酸、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される何れかの目的分子を、上記規則構造内又はその周囲にに再配列し、整列化させたナノマテリアル（ナノ構造材料）として使用することも可能である。例えば、基板上の１つの位置に人工融合タンパク質を光ピンセットなどで固定し、当該位置と任意の長さ離れた他の位置との間を本発明の方法により融合タンパク質を自己組織化させて直鎖状の規則構造からなるナノ構造体で連結することができる。さらに、固定した２点から人工融合タンパク質を連結し伸長させることによって、直鎖状の構造体を形成することができる。融合タンパク質の大きさや種類を変えることによって、分子レベルで連結される距離を自由に制御することも可能である。例えば、構成単位である融合タンパク質の１つの長さは数ナノメートルであるから、この程度の精度で制御することができ、例えば、数ナノメートル〜数百ナノメートルの距離を、好ましくは数ナノメートル〜数十ナノメートルの距離を極めて精密に連結することができる。このようなナノマテリアルを用いて作製されたナノ装置は、電子的、半導体的、機械的、ナノ電子機械的、磁性的、音響学的、光学的、電子光学的、生物医学的装置を含む。【００３７】
１つの実施形態として、前記目的分子、例えば機能性タンパク質からの応答を電気的信号として取り出すことにより、当該機能に基づくバイオセンサーとして用いることができる。機能性タンパク質としては、例えば、血液中の微量成分を測定するための酵素やモノクローナル抗体であり、インビトロ診断用の酵素センサーや免疫センサーとして使用される。食品や空気中に含まれる有害物質や河川の水に含まれる環境ホルモンなどの測定を目的としてペルオキシダーゼやチロシナーゼなどの酵素が使用されている。他の実施形態において、前記規則構造に光を照射、又は電圧を負荷することにより前記目的分子の活性を制御することができる。【００３８】
以下に、本発明に関する具体的な実施例を示すが、これらは本発明を限定するためのものではなく、本発明の説明のために例示するものである。
【実施例】
【００３９】
［実施例１］種々の融合タンパク質発現ベクターの構築
超好熱古細菌であるPyrococcus horikoshii OT3から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、図４に示した方法に従ってＣｕｔＡ遺伝子をクローン化し、２種類の融合タンパク質発現ベクターを作製した。すなわち、ゲノムＤＮＡと、下記表１に示したプライマー１及び２を用いてＰＣＲを行い、増幅されたＣｕｔＡ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位へクローン化した。形質転換大腸菌から得られたプラスミドｐＣＵＴＡｖＨのＮｄｅＩ部位に、表１のプライマー３と４をアニールして作製したヒスチジンタグ配列を導入し、大腸菌を形質転換してプラスミドｐＨＣＵＴＡｖＨを得た。一方、マウス完全長ｃＤＮＡ（GenBank Acc. No. NM_029564）を鋳型として、表１に示したプライマー７及び８を用いてＰＣＲを行いＴＩＰ−１遺伝子を増幅した。これをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断して、上記で作製したプラスミドｐＣＵＴＡｖＨのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位にクローン化し、６個のヒスチジンタグの後ろにＣｕｔＡとＴＩＰ−１とを含む融合タンパク質の発現ベクターｐＨＣｕｔＡＴＩＰ１を作製した。【００４０】
β−カテニンのＣ末端の９個のペプチドをコードするＤＮＡは、表１のプライマー５と６をアニールして調製し、上記で作製したプラスミドｐＨＣＵＴＡｖＨのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位へクローン化し、６個のヒスチジンタグの後ろにＣｕｔＡとＰＤＺペプチドを連結した発現ベクターｐＨＣｕｔＡｐｅｐ４を作製した。これら２種類の発現ベクターにコードされる融合タンパク質の遺伝子及びアミノ酸配列を図６に示した。【００４１】
【表１】
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【００４２】
同様に、超好熱古細菌であるPyrococcus horikoshii OT3から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、図５に示した方法に従ってＳＯＲ遺伝子をクローン化し、２種類の融合タンパク質発現ベクターを作製した。すなわち、ゲノムＤＮＡと、上記表１に示したプライマー９及び１０を用いてＰＣＲを行い、増幅されたＳＯＲ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位へクローン化した。形質転換大腸菌から得られたプラスミドｐＳＯＲ２ｖＨのＮｄｅＩ部位に、表１のプライマー３と４をアニールして作製したヒスチジンタグ配列を導入し、大腸菌を形質転換してプラスミドｐＨＳＯＲ２ｖＨを得た。一方、マウス完全長ｃＤＮＡ（GenBank Acc. No. NM_029564）を鋳型として、表１に示したプライマー７及び８を用いてＰＣＲを行いＴＩＰ−１遺伝子を増幅した。これをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断して、上記で作製したプラスミドｐＳＯＲ２ｖＨのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位にクローン化し、ＳＯＲとＴＩＰ−１と６個のヒスチジンタグを含む融合タンパク質の発現ベクターｐＳＯＲ２ＴＩＰ１Ｈを作製した。【００４３】
β−カテニンのＣ末端の９個のペプチドをコードするＤＮＡは、表１のプライマー５と６をアニールして調製し、上記で作製したプラスミドｐＨＳＯＲ２ｖＨのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位へクローン化し、６個のヒスチジンタグの後ろにＳＯＲとＰＤＺペプチドを連結した発現ベクターｐＨＳＯＲ２ｐｅｐ４を作製した。これら２種類の発現ベクターにコードされる融合タンパク質の遺伝子及びアミノ酸配列を図７に示した。なお、これらの発現ベクターにコードされたＳＯＲはＮ末端から２２個のアミノ酸を欠失したものである。【００４４】
［実施例２］ＳＯＲ融合タンパク質を用いたナノレゴ構造体の構築
図８は、完全長のＳＯＲを含む融合タンパク質（ＳＯＲ１−ＴＩＰ１−Ｈｉｓ及びＨｉｓ−ＳＯＲ１−ＰＤＺｐｅｐ４）とＮ末端から２２個のアミノ酸を欠失したＳＲＯを含む融合タンパク質（ＳＯＲ２−ＴＩＰ１−Ｈｉｓ及びＨｉｓ−ＳＯＲ２−ＰＤＺｐｅｐ４）とを大腸菌で発現させ、ＩＰＴＧ添加又は無添加の可溶性画分及び不溶性画分を回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現量を解析した結果である。図８Ａに示したように、ＩＰＴＧの添加によって夫々の分子量に対応するタンパク量が増加するが、Ｎ末端から２２個のアミノ酸を欠失したＳＯＲを含む融合タンパク質の方が発現量が高いことが分かる。図８Ｂは、精製した２種類の融合タンパク質ＳＯＲ２−ＴＩＰ１−Ｈｉｓ及びＨｉｓ−ＳＯＲ２−ＰＤＺｐｅｐ４の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。【００４５】
図９は、このようにして精製した２種類の融合タンパク質ＳＯＲ２−ＴＩＰ１−Ｈｉｓ、及びＨｉｓ−ＳＯＲ２−ＰＤＺｐｅｐ４の夫々２０μＭ水溶液を混合したときの写真である。図９に示したように、混合直後に白濁が生じ、室温にて２時間インキュベートしたところ遠心管の底に青色の沈殿が生ずることが分かった。この結果は、２種類の融合タンパク質が結合して凝集物が生成したためと考えられる。【００４６】
次に、このようにして作製したＳＯＲ融合タンパク質の凝集体の蛍光及び原子間力顕微鏡により観察した結果を図１０及び１１に示した。まず、ＳＯＲ融合タンパク質を蛍光可視化するために、結合部位にアミノ基を持たないＰＤＺペプチド側の融合タンパク質を蛍光分子アレクサ４８８（Alexa（登録商標）Fluor 488 5-TFP、インビトロジェン社）で蛍光標識した。２種類の融合タンパク質を夫々２．５μＭずつ混合した後、微弱光検出ＣＣＤカメラにより蛍光観察したところ、数分以内に１μＭ程度以下の蛍光輝点が多数出現し、５〜７分で凝集が進行していくことが認められた。図１０Ａは、１μｍ以下の粒子状集合体がさらに会合して数μｍ以上の凝集体を形成した写真である。さらに、特定した蛍光標識サンプルに対してＡＦＭイメージングを行うと、線状の基本会合構造が認められた（図１０Ｂ）。【００４７】
続いて、ＳＯＲ融合タンパク質集合体の微細構造を電子顕微鏡で観察した。上記と同様に、ＳＯＲ２−ＴＩＰ１−ＨｉｓとＨｉｓ−ＳＯＲ２−ＰＤＺｐｅｐ４を１：１の量比で、終濃度が０．５μＭとなるようにＨＢＳ緩衝液中で混合し、室温で１５分間インキュベートした。４％酢酸ウラシルでネガティブ染色して測定した結果を図１１Ａに示した。数十から数百ｎｍの粒状集合体の表面に、幅５ｎｍのラダーパターンの微細構造が見られ、ＳＯＲ融合タンパク質が線状会合構造を形成していると思われる。図１１Ｂは、０．５ＭのＮａＣｌ存在下、ＳＯＲ２−ＴＩＰ１−ＨｉｓとＨｉｓ−ＳＯＲ２−ＰＤＺｐｅｐ４を１：１の量比で、終濃度が０．１μＭとなるようにＨＢＳ緩衝液中で混合し、１分間インキュベートした後、１％酢酸ウラシルにて５秒間ネガティブ染色して測定した結果である。ＳＯＲ融合タンパク質の４量体が数個以上連結した鎖状構造が観察される。【００４８】
ＳＯＲ融合タンパク質を混合したときに生じる濁度を指標として、沈殿形成の速度と生じた沈殿中の夫々の融合タンパク質の量比を解析した。夫々の融合タンパク質を分光光度計のキュベット内で混合し（全量５０μｌ）、１分間混合した後、６６０ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定したのが図１２Ａである。１のプロットは２種類の融合タンパク質を夫々２．５μＭずつ用いた場合を示し、２のプロットはＨｉｓ−ＳＯＲ２−ＰＤＺｐｅｐ４を０．５μＭ、ＳＯＲ２−ＴＩＰ１−Ｈｉｓを２．５μＭ用いた場合を示し、３のプロットは２種類の融合タンパク質を夫々０．５μＭずつ用いた場合を示し、４のプロットはＨｉｓ−ＳＯＲ２−ＰＤＺｐｅｐ４を２．５μＭ、ＳＯＲ２−ＴＩＰ１−Ｈｉｓを０．５μＭ用いた場合を示す。この結果によれば、タンパク質濃度が高いほど濁度も大きいが、一方の融合タンパク質のみの濃度を上げても沈殿形成は促進されず、１：１の量比で結合していることが示唆される。続いて、同様の実験を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を図１２Ｂに示す。夫々の濃度のタンパク質溶液を全量で１００μｌとなるように混合し、２５℃で２０分間インキュベートした後１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清と沈殿を分離した。沈殿をＨＢＳ緩衝液に再懸濁した後、夫々をＳＤＳサンプルバッファーで溶解し、１０〜２０％グラジエントのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、沈殿画分には、ほぼ１：１の量比で夫々の融合タンパク質が認められ、余分のタンパク質は上清画分に残存することが分かる。【００４９】
図１３は、２種類のＳＯＲ融合タンパク質を混合した際に形成される白濁の塩濃度による影響を示した結果である。夫々１μＭのＨｉｓ−ＳＯＲ２−ＰＤＺｐｅｐ４とＳＯＲ２−ＴＩＰ１−Ｈｉｓとを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４の緩衝液中、０．１〜０．５ＭのＮａＣｌ存在下に形成される濁度を経時的に測定したものである。ＮａＣｌ濃度が高くなるに従って濁度は減少した。すなわち、２種類の融合タンパク質の結合速度は、塩濃度が上昇するに従って低下することが分かる。【００５０】
［実施例３］ＣｕｔＡ融合タンパク質の発現
図１４は、実施例１で作製した２種類の発現ベクターｐＨＣｕｔＡｐｅｐ４とｐＨＣｕｔＡＴＩＰ１とを大腸菌ＢＬ２１株CodonPlus株（ＤＥ３）に形質転換し、ＩＰＴＧ添加又は無添加で培養した細胞から回収したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果である。図１４Ａ及びＢに示したように、何れの融合タンパク質も単量体よりも３量体の状態で検出された。この結果は、大腸菌で発現したＣｕｔＡタンパク質が強固な３量体を形成することが示唆される。続いて、組み換え大腸菌から回収したＨｉｓ−ＣｕｔＡ−ＰＤＺｐｅｐ４タンパク質をニッケルＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した結果を図１４Ｃ及びＤに示した。ニッケルＮＴＡカラムに吸着した画分をイミダゾールの濃度勾配で溶出したピーク画分を１０〜２０％ポリアクリルアミドグラジエントのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、主として３量体のＣｕｔＡ融合タンパク質が得られることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の方法によれば、骨格素子タンパク質と種々の結合素子との組み合わせにより多様な構造を設計することができ、そのサイズや安定性の制御可能なナノ構造体を提供することができる。これらのナノ構造体を用いて、ナノスケールの機能性材料を開発することが可能であり、２次元平面状における結晶化を必要としないタンパク質Ｘ線構造解析技術や、ナノバイオセンサーなどへの応用が期待される。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１３】
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【図１】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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