【手続補正書】
【提出日】平成19年12月12日(2007.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  十分な条件下で核酸基質と接触させた場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非特異的にＲＮＡ合成を行う能力を有する単離されたポリメラーゼタンパク質を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法であって、該タンパク質が、
（ａ）少なくとも配列番号１の部分的核酸配列を有する核酸配列；
（ｂ）少なくとも配列番号８の部分的アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）遺伝子コードの縮退により（ａ）または（ｂ）の核酸配列とは異なる核酸配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列；および
（ｅ）（ｂ）の配列に対して少なくとも２０％同一性、好ましくは少なくとも５０％同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択される核酸配列によりコードされる方法。
【請求項２】  タンパク質が、ｄｓＲＮＡウィルスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  タンパク質が、Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅウィルス、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅウィルス、ＢｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅウィルスまたはＴｏｔｉｖｉｒｉｄａｅウィルスに由来し、好ましくはφ６、φ７、φ８、φ９、φ１０、φ１１、φ１２、φ１３またはφ１４などのＣｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ科のφ６関連バクテリオファージ群に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】  タンパク質が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅのバクテリオファージであるφ６のＰ２タンパク質であるか、或いはＰ２の改変体または遺伝的に改変されたものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】  配列番号８のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項６】  請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項７】  請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸配列または請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】  （ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞をインキュベーションしてタンパク質を発現させるステップ；
（ｂ）宿主または培地からタンパク質を回収するステップ；
（ｃ）タンパク質を精製するステップ；および、場合によっては
（ｄ）そのタンパク質のＲＮＡ合成活性をアッセイするステップ
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する方法。
【請求項９】  請求項８に記載のタンパク質を単離して精製する方法であって、該方法が：
（ａ）緩衝液中で宿主細胞を破壊して細胞溶解物を得るステップ；
（ｂ）その溶解物を遠心分離により清澄化するステップ；
（ｃ）少なくとも１回、より好ましくは２回のアフィニティー・クロマトグラフィを用いてタンパク質を精製するステップ；
（ｄ）少なくとも１ステップのイオン交換クロマトグラフィを用いてタンパク質をさらに精製して本質的にヌクレアーゼ活性およびプロテアーゼ活性のないフラクションを得るステップ
を含む請求項８に記載のタンパク質を単離、精製する方法。
【請求項１０】  （ａ）ｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ；
（ｂ）そのｓｓＲＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；および
（ｃ）反応混合物から新たにつくられたＲＮＡ種を回収するステップ
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
【請求項１１】  新たにつくられたそのＲＮＡ種がｄｓＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】  （ａ）ｄｓＲＮＡ基質を用意するステップ；
（ｂ）そのｄｓＲＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；および
（ｃ）反応混合物から新たにつくられたＲＮＡ種を回収するステップ
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
【請求項１３】  （ａ）ＲＮＡ基質を用意するステップ；
（ｂ）そのＲＮＡ基質を、ＲＮＡ複製およびＲＮＡ転写の双方に十分な条件下で請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；および
（ｃ）反応混合物から新たにつくれられた増幅ＲＮＡの混合物を回収するステップ
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを増幅させる方法。
【請求項１４】  （ａ）ｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ；
（ｂ）そのｓｓＲＮＡ基質を、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質により複製してｄｓＲＮＡを形成するステップ；
（ｃ）そのｄｓＲＮＡを、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質により転写してｓｓＲＮＡを得るステップ；および
（ｄ）ＲＮＡ合成生成物の十分な量が得られるまで増幅ステップを反復するステップ
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】  （ａ）ＤＮＡテンプレートをＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにより転写することにより、ｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ；および
（ｂ）そのｓｓＲＮＡ基質を請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質により複製してｄｓＲＮＡを形成するステップ
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
【請求項１６】  （ａ）ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡテンプレートを転写することによりｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ；
（ｂ）そのｓｓＲＮＡ基質を請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質により複製してｄｓＲＮＡを形成するステップ；
（ｃ）そのｄｓＲＮＡを請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質により転写してｓｓＲＮＡを得るステップ；および
（ｄ）ＲＮＡ合成産物の十分な量が得られるまで増幅ステップを反復するステップ
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを増幅する方法。
【請求項１７】  そのＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージ、好ましくはＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６バクテリオファージを含む群から選択されるバクテリオファージ由来である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】  ステップ（ａ）および（ｂ）が、同じ反応容器内で同時にまたは連続して実施される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】  （ａ）１本鎖核酸基質を用意するステップ；
（ｂ）その１本鎖核酸基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させて少なくとも１本鎖核酸基質の一部を２本鎖核酸体に変換するステップ；
（ｃ）反応混合物から全核酸を回収するステップ；および、場合によっては
（ｄ）その全核酸を、２本鎖核酸ではなく１本鎖核酸を選択的に分解するヌクレアーゼを含む製剤と接触させるステップ；および
（ｅ）ヌクレアーゼによる分解に対して安定性が増加した２本鎖核酸を回収するステップ
を含む核酸を安定化する方法。
【請求項２０】  （ａ）ｓｓＤＮＡ基質を用意するステップ；
（ｂ）そのｓｓＤＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；および
（ｃ）反応混合物から新たに生成した核酸種を回収するステップ
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
【請求項２１】  （ａ）ｄｓＤＮＡ基質を用意するステップ；
（ｂ）そのｄｓＤＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；および
（ｃ）反応混合物から新たに生成した核酸種を回収するステップ
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
【請求項２２】  新たに生成した核酸種が、テンプレートＤＮＡおよびＲＮＡ複製物から成る２本鎖を含む請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】  １本鎖または２本鎖の核酸基質が線状である、請求項１０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】  ＲＮＡ合成用の混合物が、放射活性同位元素で標識されているか、または化学的に修飾されている少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸を含有する、請求項１０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】  −ＲＮＡまたはＤＮＡ基質を用意するステップ；
−核酸基質、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質、ヌクレオシド三リン酸、および、場合によっては、緩衝剤、酢酸アンモニウム、ＤＴＴ、ＰＥＧ、Ｍｇ２＋イオン類、Ｍｎ２＋イオン類および／またはＢＳＡを含む混合物中、そのＲＮＡまたはＤＮＡ基質をＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；
−ＲＮＡ合成に十分な温度で反応混合物をインキュベートするステップ；
−反応混合物から新たに生成した核酸種を回収するステップ
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
【請求項２６】  ＲＮＡ合成が、核酸基質に相補的なプライマーの３’末端から開始される、請求項１０から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】  そのプライマーが、１本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】  （ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載のポリメラーゼタンパク質；および、場合によっては
（ｂ）検出可能な濃度のＲＮＡ合成に必要な添加物
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造するためのキット。
【請求項２９】  ＲＮＡ合成に十分な濃度のヌクレオシド三リン酸を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】  少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸が、放射性同位元素で標識されているか、または化学的に修飾されている、請求項２８または２９に記載のキット。
【請求項３１】  キットがさらに、ＲＮＡ合成のためのテンプレート（複数のテンプレート）として働くことのでできる標準的な核酸標品を含有する、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】  核酸分子を配列決定するために特に使用され、特定のヌクレオチド塩基でＲＮＡ合成を終結させる少なくとも１種のＲＮＡ合成終止剤を場合によっては含む、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】  そのＲＮＡ合成終止剤が、３’−デオキシヌクレオチド三リン酸またはその機能的誘導体である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】  （ａ）線状核酸分子を用意するステップ；
（ｂ）請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質；
４種のヌクレオシド三リン酸またはそれらの機能的類縁体；および
特定のヌクレオチド塩基でＲＮＡ合成を終結させる４種のＲＮＡ合成終止剤のうち少なくとも１種、ここでその終止剤は、それぞれ異なるヌクレオチド塩基においてＲＮＡ合成を終結させる；
を含む混合物中、ＲＮＡ合成に十分な条件下でその核酸分子をインキュベートするステップ；および
（ｃ）インキュベーション反応物の終結されたＲＮＡ生成物をサイズによって分離してその核酸分子の少なくとも一部のヌクレオチド塩基配列を決定するステップ
を含む線状核酸分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法。
【請求項３５】  その核酸分子が、１本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】  その核酸分子が、２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】  検出可能な標識を持つように修飾されたヌクレオシド三リン酸またはそれらの機能性類縁体を少なくとも１種使用することを含む、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】  検出可能な標識を持つように修飾されたＲＮＡ合成終止剤を少なくとも１種使用することを含む、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】  そのＲＮＡ合成終止剤が、３’−デオキシヌクレオシド三リン酸またはそれらの機能的誘導体である、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。