【手続補正書】
【提出日】令和1年10月3日(2019.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化する方法であって、
（ａ）第１のプライマーの延長によって環状標的ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーを生成するステップであって、前記第１のプライマーが、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端と、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端とを含むステップと、
（ｂ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端と、配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端とを含む第２のプライマーの延長によって前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物を生成するステップであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であるステップと、
（ｃ）複数のアンプリコンを生成する条件下でステップ（ｂ）の前記複数の延長産生物を増幅するステップであって、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化されるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）の前記増幅が第３のプライマーのプライマー延長を含み、前記第３のプライマーが、配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）の前記増幅するステップによって、前記標的ポリヌクレオチドの２つより少ないコピーを有するアンプリコンの百分率よりも大きな、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記延長産生物が、（ｉ）前記第１の共通配列と前記第２の共通配列の相補体との間、または（ｉｉ）前記第２の共通配列と前記第１の共通配列の相補体との間の分子内ハイブリダイゼーションを含むステムループ構造を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記環状標的ポリヌクレオチドが環状化された無細胞ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記環状標的ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの環状化された断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記環状標的ポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）で産生された前記複数のアンプリコンをシーケンシングするステップさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
同じ反応混合物中で複数の異なる標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するための反応混合物であって、
（ａ）環状標的ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、ならびに
（ｃ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列は、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一である、第２のプライマー
を含む反応混合物。
【請求項１２】
配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマーをさらに含む、請求項１１に記載の反応混合物。
【請求項１３】
前記環状標的ポリヌクレオチドが環状化された無細胞ＤＮＡである、請求項１１に記載の反応混合物。
【請求項１４】
前記環状標的ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの環状化された断片である、請求項１１に記載の反応混合物。
【請求項１５】
前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、請求項１１に記載の反応混合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の新規な特徴を、特に添付した特許請求の範囲において説明する。本発明の原理を用いた実例的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および付随する図面（図）を参照することによって、本発明の特徴および利点をより良く理解することができる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化する方法であって、
（ａ）第１のプライマーの延長によって環状標的ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーを生成するステップであって、前記第１のプライマーが、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端と、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端とを含むステップと、
（ｂ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端と、配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端とを含む第２のプライマーの延長によって前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物を生成するステップであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であるステップと、
（ｃ）複数のアンプリコンを生成する条件下でステップ（ｂ）の前記複数の延長産生物を増幅するステップであって、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化されるステップと
を含む方法。
（項目２）
ステップ（ａ）が鎖置換活性を有するポリメラーゼによって達成される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、項目１に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ｃ）の前記増幅が第３のプライマーのプライマー延長を含み、前記第３のプライマーが、配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
（ｃ）の前記増幅するステップによって、前記標的ポリヌクレオチドの２つより少ないコピーを有するアンプリコンの百分率よりも大きな、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が得られる、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの前記百分率が少なくとも９０％である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの前記百分率が少なくとも８０％である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの前記百分率が少なくとも６０％である、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記延長産生物が、（ｉ）前記第１の共通配列と前記第２の共通配列の相補体との間、または（ｉｉ）前記第２の共通配列と前記第１の共通配列の相補体との間の分子内ハイブリダイゼーションを含むステムループ構造を形成する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを前記第３のプライマーの融解温度の±５℃以内の温度に保ってステップ（ｃ）の前記増幅を実施することによって達成される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを７０℃未満の温度に保ってステップ（ｃ）の前記増幅を実施することによって達成される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ステムループ構造が少なくとも９塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記ステムループ構造が少なくとも１５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記ステムループ構造が少なくとも２０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記ステムループ構造が少なくとも２５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記ステムループ構造が少なくとも３０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９に記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ｂ）が６サイクル以下の前記第２のプライマーの延長を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
ステップ（ｂ）が８サイクル以下の前記第２のプライマーの延長を含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
ステップ（ｂ）が１０サイクル以下の前記第２のプライマーの延長を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、項目４に記載の方法。
（項目２１）
前記環状標的ポリヌクレオチドが環状化された無細胞ＤＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記環状標的ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの環状化された断片である、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記環状標的ポリヌクレオチドが染色体再配列の結果生じた配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記染色体再配列が、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、項目１または２３に記載の方法。
（項目２６）
コンカテマーの少なくとも５０％が少なくとも７５ヌクレオチドの長さの標的ポリヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記環状標的ポリヌクレオチドが一本鎖である、項目１に記載の方法。
（項目２８）
ステップ（ｃ）で産生された前記複数のアンプリコンをシーケンシングするステップさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記シーケンシングするステップが、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンを、前記標的ポリヌクレオチドのただ１つのコピーを含むアンプリコンから選択的に精製することなく実施される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含む、ステップ（ｃ）で産生された前記複数のアンプリコンの中のアンプリコンを精製するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記精製されたアンプリコンをシーケンシングするステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
同じ反応混合物中で複数の異なる標的ポリヌクレオチドが増幅される、項目１に記載の方法。
（項目３３）
標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するための反応混合物であって、
（ａ）環状標的ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、ならびに
（ｃ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列は、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一である、第２のプライマー
を含む反応混合物。
（項目３４）
前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、項目３３に記載の反応混合物。
（項目３５）
前記反応混合物が容器に入れられている、項目３３に記載の反応混合物。
（項目３６）
前記容器が、ウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセル、またはチップである、項目３５に記載の反応混合物。
（項目３７）
配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマーをさらに含む、項目３３に記載の反応混合物。
（項目３８）
前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、項目３７に記載の反応混合物。
（項目３９）
前記第１の共通配列および前記第２の共通配列がそれぞれ少なくとも１５ヌクレオチドを含む、項目３３に記載の反応混合物。
（項目４０）
前記環状標的ポリヌクレオチドが環状化された無細胞ＤＮＡである、項目３３に記載の反応混合物。
（項目４１）
前記環状標的ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの環状化された断片である、項目３３に記載の反応混合物。
（項目４２）
前記環状標的ポリヌクレオチドが染色体再配列の結果生じた配列を含む、項目３３に記載の反応混合物。
（項目４３）
前記染色体再配列が、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである、項目４２に記載の反応混合物。
（項目４４）
前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、項目３３または４２に記載の反応混合物。
（項目４５）
前記環状標的ポリヌクレオチドが一本鎖である、項目３３に記載の反応混合物。
（項目４６）
標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するためのキットであって、
（ａ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、
（ｂ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であり、前記コンカテマーが前記第１のプライマーの延長産生物である、第２のプライマー、ならびに
（ｃ）配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマー
を含むキット。
（項目４７）
前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、項目４６に記載のキット。
（項目４８）
前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、項目４６に記載のキット。
（項目４９）
前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、項目４６に記載のキット。
（項目５０）
標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するのに使用するためのプライマーを設計するためのシステムであって、
（ａ）特定の標的配列を増幅するためのプライマーを設計するための利用者の要求を受けるように構成されたコンピュータ、
（ｂ）１つまたは複数のプロセッサによる実行によって前記標的配列の増幅のための少なくとも３つのプライマーを設計するコードを含むコンピュータ読み込み可能な媒体であって、前記少なくとも３つのプライマーが、
（ｉ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、
（ｉｉ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であり、前記コンカテマーが前記第１のプライマーの延長産生物である、第２のプライマー、ならびに
（ｉｉｉ）配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマー
を含む、コンピュータ読み込み可能な媒体、ならびに
（ｃ）受容者にレポートを送るレポートジェネレータであって、前記レポートが前記少なくとも３つのプライマーの配列を含む、レポートジェネレータ
を含むシステム。
（項目５１）
前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、項目５０に記載のシステム。
（項目５２）
前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、項目５０に記載のシステム。
（項目５３）
前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、項目５０に記載のシステム。
（項目５４）
ローリングサークル増幅を実施する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含む環状ポリヌクレオチドを準備するステップ、
（ｂ）増幅反応混合物を複数サイクルのローリングサークル増幅に供してコンカテマーを含む複数の増幅産生物を生成するステップ
を含み、前記増幅反応混合物が、（ｉ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）プライマーを含み、前記複数サイクルのローリングサークル増幅の各サイクルが、前記複数の増幅産生物を生成するように、変性温度における変性、アニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および所与の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマーの伸長を含み、
生成した前記複数の増幅産生物が、変性およびプライマーアニーリングについて同等の条件下であるが前記複数サイクルの伸長時間の合計と同等の伸長時間である１サイクルの増幅を用いることによって生成する複数の増幅産生物と比較した場合に、より高い割合で前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーを含むことで特徴付けられる、方法。
（項目５５）
ローリングサークル増幅によって生成される標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合を増加させる方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含む環状ポリヌクレオチドを準備するステップ、
（ｂ）増幅反応混合物を複数サイクルのローリングサークル増幅に供してコンカテマーを含む複数の増幅産生物を生成するステップ
を含み、前記増幅反応混合物が（ｉ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）プライマーを含み、前記複数サイクルのローリングサークル増幅の各サイクルが、前記複数の増幅産生物を生成するように、変性温度における変性、アニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および所与の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマーの伸長を含み、
それにより前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合を増加させる、方法。
（項目５６）
前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有する前記複数の増幅産生物におけるコンカテマーの割合が、変性およびプライマーアニーリングについて同等の条件下であるが前記複数サイクルの伸長時間の合計と同等の伸長時間である１サイクルの増幅を用いることによって生成する複数の増幅産生物と比較した場合に増加している、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ポリメラーゼが、ＢｓｕＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ３１７３ポリメラーゼ、これらの任意のバリアント、およびこれらの任意の断片からなる群から選択される、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５８）
前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約１８０塩基対の平均断片長さを示す、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５９）
前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約１７０塩基対の平均断片長さを示す、項目５４または５５に記載の方法。
（項目６０）
前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約４０塩基〜約４５０塩基の断片長さ分布を示す、項目５４または５５に記載の方法。
（項目６１）
前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約１００塩基〜約２００塩基の断片長さ分布を示す、項目５４または５５に記載の方法。
（項目６２）
前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合が少なくとも約１％増加する、項目５６に記載の方法。
（項目６３）
前記複数サイクルのローリングサークル増幅の少なくとも１つのサイクルの後に前記反応混合物に前記ポリメラーゼを補充するステップをさらに含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目６４）
前記環状ポリヌクレオチドが約４０塩基〜約５００塩基の長さを有する、項目５４または５５に記載の方法。
（項目６５）
前記環状ポリヌクレオチドが無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目６６）
前記環状ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの断片を含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目６７）
前記環状ポリヌクレオチドが染色体再配列の結果生じた配列を含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目６８）
前記染色体再配列が、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記環状ポリヌクレオチドが二本鎖である、項目５４または５５に記載の方法。
（項目７０）
前記環状ポリヌクレオチドが一本鎖である、項目５４または５５に記載の方法。
（項目７１）
複数の異なる環状ポリヌクレオチドが前記増幅反応混合物中で増幅される、項目５４または５５に記載の方法。
（項目７２）
前記複数サイクルが少なくとも２つのサイクルを含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目７３）
前記複数サイクルの各サイクルが、（ｉ）約７５℃〜約９５℃の変性温度における約５秒〜約６０秒間の変性、（ｉｉ）約４５℃〜約６５℃のアニーリング温度における約５秒〜約６０秒間のプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）約６５℃〜約７５℃の伸長温度における約３０秒〜約１０分間の伸長時間のプライマー伸長を含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目７４）
前記複数サイクルの各サイクルが、（ｉ）約８０℃の変性温度における約１５秒〜約３０秒間の変性、（ｉｉ）約５０℃のアニーリング温度における約１５秒〜約４５秒間のプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）約７０℃の伸長温度における約３分〜約１０分間の伸長時間のプライマー伸長を含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目７５）
前記プライマーがランダム配列を含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目７６）
前記プライマーが遺伝子特異的配列を含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目７７）
前記プライマーが、（ｉ）配列相補性によって前記環状ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および（ｉｉ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマーを含み、前記環状ポリヌクレオチドを鋳型として用いる前記第１のプライマーの延長によって前記複数サイクルのローリングサークル増幅の間に一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーが生成される、項目５４または５５に記載の方法。
（項目７８）
前記プライマーが、（ｉ）配列相補性によって前記一本鎖ポリヌクレオチドを含む前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および（ｉｉ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーを含み、前記コンカテマーを鋳型として用いる前記第２のプライマーの延長によって前記複数サイクルのローリングサークル増幅の間に前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物が生成される、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
複数のアンプリコンを生成する条件下で前記複数の延長産生物を増幅するステップをさらに含み、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化される、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
増幅するステップが第３のプライマーのプライマー延長を含み、前記第３のプライマーが、配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
増幅するステップによって、前記標的ポリヌクレオチドの２つより少ないコピーを有するアンプリコンの百分率よりも大きな、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が得られる、項目８１に記載の方法。
（項目８４）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも５％である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも１０％である、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも２０％である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも３０％である、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも４０％である、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも６０％である、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも８０％である、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも９０％である、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記複数の延長産生物が、（ｉ）前記第１の共通配列と前記第２の共通配列の相補体との間、または（ｉｉ）前記第２の共通配列と前記第１の共通配列の相補体との間の分子内ハイブリダイゼーションを含むステムループ構造を形成する、項目７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
（項目９３）
前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを前記第３のプライマーの融解温度の±５℃以内の温度に保って前記増幅を実施することによって達成される、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを約７０℃未満の温度に保って前記増幅を実施することによって達成される、項目９２に記載の方法。
（項目９５）
前記ステムループ構造が少なくとも９塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９２に記載の方法。
（項目９６）
前記ステムループ構造が少なくとも１５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記ステムループ構造が少なくとも２０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記ステムループ構造が少なくとも２５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記ステムループ構造が少なくとも３０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、項目８２に記載の方法。
（項目１０１）
前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、項目７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０２）
コンカテマーを含む前記複数の増幅産生物をシーケンシングするステップをさらに含む、項目５４から１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０３）
前記シーケンシングするステップが、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーを、前記標的ポリヌクレオチドの２つ未満のコピーを含むコンカテマーから選択的に分離することなく実施される、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを含むコンカテマーを、前記標的ポリヌクレオチドの２つ未満のコピーを含むコンカテマーから分離するステップをさらに含む、項目５４から１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０５）
前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを含む前記コンカテマーをシーケンシングするステップをさらに含む、項目１０４に記載の方法。