(57)【要約】本発明は、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質のアゴニスト（例えば、Ｉｍｅｔｉｔ）を抗肥満や摂食抑制のための使用を提供する。また、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質を創薬標的とする化合物の評価方法及び当該評価方法によって得られた化合物を提供する。本発明により、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質のアゴニストを抗肥満や摂食抑制のために使用する新規用途を提供することが可能となる。また、当該タンパク質を創薬標的とする化合物の評価方法及び当該評価方法によって得られた化合物を提供することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質・糖代謝性疾患の治療剤であることを特徴とするヒスタミンＨ３アゴニスト。
【請求項２】
前記ヒスタミンＨ３アゴニストが、下記式（Ｉ）
【化１】
2007032536.tif 000007
［式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子若しくは低級アルキル基を示すか、ｍ及びｎが共に０である場合には、Ｒ１及びＲ２は以下の（ｉ）又は（ｉｉ）、
（ｉ）Ｒ１及びＲ２が一緒になって形成する５乃至６員の脂肪族
（ｉｉ）Ｒ１及び式（Ｉ）中のＮＨ２の窒素原子が一緒になって形成する５乃至６員環
を示し、
Ｘは、ＣＨ２又はＳを示し、
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０又は１を示す］で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする請求項１に記載のヒスタミンＨ３アゴニスト。
【請求項３】
ｍ及びｎが共に０である請求項２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするヒスタミンＨ３アゴニスト。
【請求項４】
ｍ及びｎが共に１である請求項に２記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするヒスタミンＨ３アゴニスト。
【請求項５】
式（Ｉ）で表される化合物が、
１−アミノ−２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）シクロペンタン、
３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−ブタンアミン、
２−メチル−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）ピロリジン、
１−メチル−２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）シクロヘキシルアミン、
１Ｈ−イミダゾール−４−ブタンイミドアミド、
α−メチルヒスタミン又は
カルバミミドチオイックアシッド  ２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルエステル（Ｉｍｅｔｉｔ）である化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするヒスタミンＨ３アゴニスト。
【請求項６】
前記脂質代謝性疾患が、肥満、摂食障害、糖尿病、高脂血症、高コレステロール血症又は脂肪肝であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒスタミンＨ３アゴニスト。
【請求項７】
脂質代謝性疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
ヒスタミンＨ３受容体遺伝子を導入し、ヒスタミンＨ３受容体を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該ヒスタミンＨ３受容体に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項８】
脂質代謝性疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
ヒスタミンＨ３受容体遺伝子を導入し、ヒスタミンＨ３受容体を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項９】
脂質代謝性疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
ヒスタミンＨ３受容体遺伝子を導入し、ヒスタミンＨ３受容体を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該ヒスタミンＨ３受容体又はヒスタミンＨ３受容体を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、
被検化合物を接触させていない場合と比較して、該ヒスタミンＨ３受容体又はヒスタミンＨ３受容体を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項１０】
脂質代謝性疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
被検化合物を、ヒスタミンＨ３受容体に接触させる工程と、
該接触によるヒスタミンＨ３受容体の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項１１】
前記化合物がヒスタミンＨ３アゴニストであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の化合物の評価方法により単離されたことを特徴とするヒスタミンＨ３アゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒスタミンＨ３アゴニストの、脂質代謝性疾患の治療剤としての新規用途に関する。また、ヒスタミンＨ３を標的分子とした脂質代謝性疾患に有効な化合物の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのホルモンや神経伝達物質は、細胞膜に存在する特異的な受容体タンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらの受容体タンパク質の多くは共役しているグアノシン三リン酸結合タンパク質（Ｇタンパク質）の活性化を介して細胞内のシグナル伝達を行っている。このため、この受容体タンパク質はＧタンパク質共役型受容体タンパク質と総称される。
Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝達物質又は生理活性物質等の標的として非常に重要な役割を担っている。このため、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質は医薬品開発の標的分子として注目されている。
ヒスタミンは、炎症に係わることが知られているのみならず、摂食行動やエネルギー維持のような種々の生体機能を司っていることが知られている（非特許文献１）。
一方、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質の一種であり（非特許文献２）、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質のアンタゴニスト投与により、被検動物における摂食量が減少することが報告されている（非特許文献３及び特許文献１）。その他、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質と睡眠との関連（非特許文献４）等、多くの生理機能との関連が示唆されている。
【特許文献１】ＷＯ９５１１８９４号公報
【非特許文献１】Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、第６３巻、６３７頁、２００１年
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５５巻、１１０１頁、１９９９年
【非特許文献３】Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、第６２８巻、２３５頁、１９９３年
【非特許文献４】Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第２７巻、１１１頁、１９８８年
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質のアゴニストが抗肥満や摂食抑制作用を有することについては全く知られていないのが現状であった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質のアゴニストを抗肥満や摂食抑制のために使用する新規用途を提供することを目的とする。また、当該タンパク質を創薬標的とする化合物の評価方法及び当該評価方法によって得られた化合物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質のアゴニストが抗肥満及び摂食抑制作用を有することを見出すとともに、当該タンパク質を創薬標的とする化合物の評価（例えば、化合物のスクリーニング）を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明のヒスタミンＨ３アゴニストは、脂質・糖代謝性疾患の治療剤であることを特徴とする。
ここで、前記ヒスタミンＨ３アゴニストとして、下記式（Ｉ）
【化１】
2007032536.tif 000002
［式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子若しくは低級アルキル基を示すか、ｍ及びｎが共に０である場合には、Ｒ１及びＲ２は以下の（ｉ）又は（ｉｉ）、
（ｉ）Ｒ１及びＲ２が一緒になって形成する５乃至６員の脂肪族
（ｉｉ）Ｒ１及び式（Ｉ）中のＮＨ２の窒素原子が一緒になって形成する５乃至６員環
を示し、
Ｘは、ＣＨ２又はＳを示し、
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０又は１を示す］で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするものが好適に用いられる。
また、本発明のヒスタミンＨ３アゴニストは、式（Ｉ）で表される化合物において、ｍ及びｎが共に０である化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることが好ましい。
また、本発明のヒスタミンＨ３アゴニストは、式（Ｉ）で表される化合物において、ｍ及びｎが共に１である化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることが好ましい。
さらに、本発明のヒスタミンＨ３アゴニストは、式（Ｉ）で表される化合物が、
１−アミノ−２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）シクロペンタン、
３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−ブタンアミン、
２−メチル−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）ピロリジン、
１−メチル−２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）シクロヘキシルアミン、
１Ｈ−イミダゾール−４−ブタンイミドアミド、
α−メチルヒスタミン又はカルバミミドチオイックアシッド  ２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルエステル（Ｉｍｅｔｉｔ）である化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることが好ましい。
また、本発明のヒスタミンＨ３アゴニストは、前記脂質代謝性疾患が、肥満、摂食障害、糖尿病、高脂血症、高コレステロール血症又は脂肪肝であることを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、脂質代謝性疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、ヒスタミンＨ３受容体遺伝子を導入し、ヒスタミンＨ３受容体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ヒスタミンＨ３受容体に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のヒスタミンＨ３アゴニストは、脂質代謝性疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、ヒスタミンＨ３受容体遺伝子を導入し、ヒスタミンＨ３受容体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、脂質代謝性疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、ヒスタミンＨ３受容体遺伝子を導入し、ヒスタミンＨ３受容体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ヒスタミンＨ３受容体又はヒスタミンＨ３受容体を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該ヒスタミンＨ３受容体の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、脂質代謝性疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、被検化合物を、ヒスタミンＨ３受容体に接触させる工程と、当該接触によるヒスタミンＨ３受容体の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、上述した４態様の化合物の評価方法において、前記化合物がヒスタミンＨ３アゴニストであることが好ましい。
本発明によれば、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質のアゴニストを抗肥満や摂食抑制等の各種脂質代謝性疾患の治療のために使用することが可能となる。また、当該タンパク質を創薬標的とする化合物の評価方法及び当該評価方法によって得られた化合物を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、野生型マウスにおけるＩｍｅｔｉｔ投与と摂食量との関係を示す図である。
●は溶媒投与のコントロールマウスの結果を示し、○はＩｍｅｔｉｔ投与マウスの結果を示す。
図２は、Ｈ３ＲＫＯマウスにおけるＩｍｅｔｉｔ投与と摂食量との関係を示す図である。●は溶媒投与のコントロールマウスの結果を示し、○はＩｍｅｔｉｔ投与マウスの結果を示す。
図３は、野生型マウスにおけるＩｍｅｔｉｔ投与と体重の変化を示す図である。●は溶媒投与のコントロールマウスの結果を示し、○はＩｍｅｔｉｔ投与マウスの結果を示す。
図４は、Ｈ３ＲＫＯマウスにおけるＩｍｅｔｉｔ投与と体重の変化を示す図である。●は溶媒投与のコントロールマウスの結果を示し、○はＩｍｅｔｉｔ投与マウスの結果を示す。
図５は、野生型マウス及びＨ３ＲＫＯマウスにおいて体重当たりのＩｍｅｔｉｔ投与量を変化させた場合の摂食量の変化を示す図である。
図６は、野生型マウス及びＨ３ＲＫＯマウスにおけるＴｈｉｏｐｅｒａｍｉｄｅ投与と摂食量との関係を示す図である。
図７は、野生型マウス及びＨ３ＲＫＯマウスにおいてＩｍｅｔｉｔ投与濃度を変化させた場合の摂食量の変化を示す図である。
図８は、Ｉｍｅｔｉｔ（Ｖｅｈｉｃｌｅ、５ｍｐｋ及び２０ｍｐｋ）投与後のＶＯ２の変化を示す図である。
図９は、Ｉｍｅｔｉｔ（Ｖｅｈｉｃｌｅ、５ｍｐｋ及び２０ｍｐｋ）投与後のＶＣＯ２の変化を示す図である。
図１０は、Ｉｍｅｔｉｔ（Ｖｅｈｉｃｌｅ、５ｍｐｋ及び２０ｍｐｋ）投与後のＲＱの変化を示す図である。
図１１は、ＶＯ２、ＶＣＯ２及びＲＱの平均値を示す。グラフはそれぞれ左からコントロールマウス、５ｍｐｋ  Ｉｍｅｔｉｔ投与したマウス、２０ｍｐｋ  Ｉｍｅｔｉｔ投与したマウスの結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明にかかる「ヒスタミン受容体Ｈ３」とは、ヒスタミンＨ３の受容体として機能する７回膜貫通構造の分子をいう。ヒスタミン受容体Ｈ３の由来となる生物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ又はウサギが挙げられる。中でも、本発明のヒスタミン受容体Ｈ３アゴニストの投与対象や、化合物の評価における評価対象がヒトであることから、ヒトヒスタミン受容体Ｈ３であることが好ましい。
また、本発明に係るヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子には、ヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子と同等の生理機能を有し、ヒスタミンＨ３受容体として機能するタンパク質をコードするものであれば１又は２以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては、かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相同性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％以上）であることが特に好ましい。
また、本発明に係るヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子には、ヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０ｘＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで上昇させることができる。
また、本発明における「脂質・糖代謝性疾患」とは、脂質代謝の異常によって生じる疾患全般を意味する。かかる疾患としては、具体的には、例えば、肥満症、摂食障害、糖尿病、高脂血症、高コレステロール血症、脂肪肝が挙げられる。
（１）ヒスタミン受容体Ｈ３アゴニスト
本発明における「ヒスタミン受容体Ｈ３アゴニスト」とは、ヒスタミン受容体Ｈ３を介して細胞内シグナル伝達を引き起こす物質をいい、ヒスタミン受容体Ｈ３作動剤ともいう。また、本発明にかかるヒスタミン受容体Ｈ３アゴニストは、ヒスタミン受容体Ｈ３に親和性を示し、アゴニストとして機能する分子であればその分子種は特に制限されない。このような分子種としては、例えば、低分子化合物、タンパク質、ペプチドを挙げることができる。前記低分子化合物としてもその種類は特に制限されず、具体的には、例えば、天然化合物、有機化合物又は無機化合物が挙げられる。本発明で用いられるヒスタミンＨ３受容体アゴニストとしては、具体的には、例えば、ヒスタミン、Ｎ−メチルヒスタミン、Ｎ−，Ｎ−メチルヒスタミン、Ｎ−エチルヒスタミン、Ｎ−プロピルヒスタミン、Ｎ−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］−ピロリジン、（Ｓ），（Ｓ）−シクロプロピルヒスタミン、（Ｒ），（Ｒ）−シクロプロピルヒスタミン、ＳＣＨ４９６４７（２Ｓ，３Ｒ）、ＳＣＨ４９６４８（２Ｒ，３Ｓ）、ＳＣＨ５０９７１（３Ｒ，４Ｒ）、ｉｍｍｅｐｉｐ、ＶＵＦ８６２１、ＶＵＦ８９７３、ＳＫＦ９１６０６、ＶＵＦ４８５８が挙げられる。
また、本発明のヒスタミンＨ３アゴニストのその他の具体例として、下記式（Ｉ）
【化１】
2007032536.tif 000003
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子若しくは低級アルキル基を示すか、ｍ及びｎが共に０である場合には、Ｒ１及びＲ２は以下の（ｉ）又は（ｉｉ）、
（ｉ）Ｒ１及びＲ２が一緒になって形成する脂肪族５乃至６員環
（ｉｉ）Ｒ１及び式（Ｉ）中のＮＨ２の窒素原子とが一緒になって形成する５乃至６員環を示し、
Ｘは、ＣＨ２又はＳを示し、
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０又は１を示す］で表される化合物又はその薬学的に許容される塩が挙げられる。
以下、式（Ｉ）で表される化合物について説明する。
Ｒ１及びＲ２が示す低級アルキル基とは、炭素数１乃至６の直鎖又は分岐を有するアルキル基を意味し、具体的には、例えば、炭素数１乃至６の直鎖又は分岐を有するアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。
ｍ及びｎが共に０である場合に、Ｒ１及びＲ２が形成する一緒になって脂肪族５乃至６員環としては、具体的には、例えば、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基が挙げられる。
また、ｍ及びｎが共に０である場合に、Ｒ１及びＮＨ２の窒素原子とが一緒になって形成する５乃至６員環とは、具体的には、例えば、ピロリジニル基又はピペリジニル基が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２が一緒になって５乃至６員の脂肪族環を形成する場合、Ｒ１及びＲ２は、Ｒ１及びＲ２の鎖の末端、途中又は付け根のいずれの炭素原子とも結合して、当該５乃至６員の脂肪族環を形成することができる。
また、Ｒ１と式（Ｉ）中のＮＨ２窒素原子とが一緒になって５乃至６員環を形成する場合、Ｒ１の鎖の末端、途中又は付け根のいずれの炭素原子と窒素原子とが結合して、当該５乃至６員環を形成することができる。
また、ｍが０である場合には、式（ＩＩ）
【化２】
2007032536.tif 000004
は、単結合を示す。
また、ｎが０である場合には、式（ＩＩＩ）
【化３】
2007032536.tif 000005
は、単結合を示す。
式（Ｉ）で表される化合物のうち、ｍ及びｎが共に０である化合物又はその薬学的に許容される塩、或いは、ｍ及びｎが、共に１である化合物又はその薬学的に許容される塩が好ましい。
なお、式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、Ｘ、ｍ及びｎの好ましい態様は、いずれを組み合わせてもよい。
式（Ｉ）で表される化合物としては、より具体的には、例えば、
１−アミノ−２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）シクロペンタン、
３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−ブタンアミン、
２−メチル−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）ピロリジン、
１−メチル−２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）シクロヘキシルアミン、
１Ｈ−イミダゾール−４−ブタンイミドアミド、
α−メチルヒスタミン又はカルバミミドチオイックアシッド  ２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルエステル（Ｉｍｅｔｉｔ）である化合物又はその薬学的に許容される塩が挙げられる。
式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩は、例えば、ＥＰ０４２０３９６；ＥＰ０５３１２１９；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第３８巻、１５９３頁、１９９５年又はＵＳ３，７５９，９４４に記載の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより製造することができる。
また、式（Ｉ）で表される化合物は、常法により医薬として許容されうる塩又はエステルとすることができ、また、逆に塩又はエステルから遊離化合物への変換も常法に従って行うことができる。
具体的には、上記（Ｉ）で表される化合物が、当該分子内に例えばアミノ基、ピリジル基等に由来する塩基性基を有している場合には、当該化合物を酸で処理することにより、相当する薬学的に許容される塩に変換することができる。
当該酸付加塩としては、例えば塩酸塩、フッ化水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、炭酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩等の低級アルキルスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のアリールスルホン酸塩；フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等のアミノ酸等の有機酸である酸付加塩を挙げることができる。
また、本発明の化合物が酸性基を当該基内に有している場合、例えばカルボキシル基等を有している場合には、当該化合物を塩基で処理することによっても、相当する薬学的に許容される塩に変換することができる。当該塩基付加塩としては、例えば例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、グアニジン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基による塩が挙げられる。
さらに本発明の化合物は、遊離化合物又はその塩の任意の水和物又は溶媒和物として存在してもよい。また逆に塩又はエステルから遊離化合物への変換も常法に従って行うことができる。
また、本発明に係る化合物は、その置換基の態様によって、光学異性体、ジアステレオ異性体、幾何異性体等の立体異性体又は互変異性体が存在する場合がある。これらの異性体は、すべて本発明に係る化合物に包含されることは言うまでもない。更にこれらの異性体の任意の混合物も本発明に係る化合物に包含されることは言うまでもない。
本発明のヒスタミン受容体Ｈ３アゴニストをヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
これらの製剤は、本発明の化合物を１．０〜１００重量％、好ましくは１．０〜６０重量％の割合で含有することができる。
本発明の化合物の製剤化は、例えば、下記の製剤例に従って行うことができる。
（製剤例１）
後述の実施例の化合物１０部、重質酸化マグネシウム１５部及び乳糖７５部を均一に混合して、３５０μｍ以下の粉末状又は細粒状の散剤とする。この散剤をカプセル容器に入れてカプセル剤とする。
（製剤例２）
後述の実施例の化合物４５部、澱粉１５部、乳糖１６部、結晶性セルロース２１部、ポリビニルアルコール３部及び蒸留水３０部を均一に混合した後、破砕造粒して乾燥し、次いで篩別して直径１４１０乃至１７７μｍの大きさの顆粒剤とする。
（製剤例３）
製剤例２と同様の方法で顆粒剤を作製した後、この顆粒剤９６部に対して、ステアリン酸カルシウム３部を加えて圧縮成形し、直径１０ｍｍの錠剤を作製する。
（製剤例４）
製剤例２の方法で得られた顆粒剤９０部に対して、結晶性セルロース１０部及びステアリン酸カルシウム３部を加えて圧縮成形し、直径８ｍｍの錠剤とした後、これにシロップゼラチン、沈降性炭酸カルシウム混合懸濁液を加えて糖衣錠を作製する。
本発明の化合物を臨床の場で使用する場合、その投与量及び投与回数は患者の性別、年齢、体重、症状の程度、目的とする処置効果の種類・範囲等により異なる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該アゴニストがＤＮＡによりコードされうるものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
ヒスタミン受容体Ｈ３アゴニストの投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人においては、１日あたり約０．０１から１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０３から１ｍｇ／ｋｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人においては、通常、１日当り約０．００１から１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００１から０．１ｍｇ／ｋｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
通常の内科医、獣医又は臨床医は病状進行を阻止し、抑制し又は停止させるに必要な有効薬物量を容易に決定することができる。
（２）化合物の評価
ヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子又はタンパク質を用いて、ヒスタミン受容体Ｈ３に作用する化合物の評価を行うことができる。ヒスタミン受容体Ｈ３に対する作用を検出する方法として、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じたヒスタミン受容体Ｈ３を介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。
先ず、本発明の第１の化合物の評価方法について説明する。
本発明の第１の化合物の評価方法は、ヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子を導入し、ヒスタミン受容体Ｈ３を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ヒスタミン受容体Ｈ３に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被検化合物に加えて、これらの被検化合物を複数種混合した混合物も含まれる。
また、ヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、ヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
次に、ヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃が挙げられる。
次に、このようにして調製したヒスタミン受容体Ｈ３を発現する細胞に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、ヒスタミン受容体Ｈ３が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内（細胞膜上を含む）に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または当該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ヒスタミン受容体Ｈ３が発現している細胞へ導入する、または当該ベクターをヒスタミン受容体Ｈ３が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度による検出）のほか、被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合によって生じた細胞内へのシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の活性化、ｃＡＭＰ、またはＣａ２＋の濃度変化（ＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）等が使用できる）、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、受容体のインターナリゼーション）を指標に検出することができる。
次に、本発明の第２及び第３の化合物の評価方法について説明する。
本発明の第２の化合物の評価方法は、ヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子を導入し、ヒスタミン受容体Ｈ３を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の第３の化合物の評価方法は、ヒスタミンＨ３受容体遺伝子を導入し、ヒスタミンＨ３受容体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ヒスタミンＨ３受容体又はヒスタミンＨ３受容体を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該ヒスタミンＨ３受容体又はヒスタミンＨ３受容体を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする。
第２及び第３の化合物の評価方法において、ヒスタミン受容体Ｈ３遺伝子を発現する細胞の調製方法と、当該細胞に被検化合物を接触させる方法は、第１の化合物の評価方法と同様である。
第２及び第３の化合物の評価方法においては、ヒスタミンＨ３受容体を発現した細胞に被検化合物を接触させることによって生じた細胞内情報伝達経路上の分子（ヒスタミン受容体Ｈ３も含む）の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング又はＤＮＡチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、ヒスタミン受容体Ｈ３を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子にはＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれもが含まれる。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ヒスタミン受容体Ｈ３を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。また、細胞内情報伝達経路上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
次に、本発明の第４の化合物の評価方法について説明する。
本発明の第４の化合物の評価方法は、被検化合物を、ヒスタミンＨ３受容体に接触させる工程と、当該接触によるヒスタミンＨ３受容体の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
被検化合物とヒスタミンＨ３受容体との接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
次に、接触によって生じたヒスタミン受容体Ｈ３の活性の変化を検出する。
タンパク質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよく、具体的には、例えば、ヒスタミン受容体Ｈ３に対するリガンドの結合活性を指標にする方法が挙げられる。
前記のリガンドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ヒスタミン受容体Ｈ３が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる被検化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、放射性同位体で標識したリガンドと競合してヒスタミン受容体Ｈ３へ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、かかる方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である。
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物の活性・薬理効果を検出した結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るヒスタミン受容体Ｈ３とリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）及び当該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）等が含まれる。アゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明に係るヒスタミン受容体Ｈ３を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法により、ヒスタミン受容体Ｈ３への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンド及びそのアナログを作用させた場合の細胞内シグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、ヒスタミン受容体Ｈ３への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、ヒスタミン受容体Ｈ３への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、脂質代謝性疾患の治療又は症状の緩和に有効であり、中でも、ヒスタミン受容体Ｈ３アゴニストとして機能する化合物は、特に脂質代謝性疾患の治療又は症状の緩和に有効である。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
（動物）
ヒスタミンＨ３受容体ノックアウトマウス（以下、Ｈ３ＲＫＯマウスという。）は高橋ら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、第１１０巻、１７９１頁、２００２年）の方法に従って作製した。得られたノックアウトマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊと５世代に渡り戻し交配を行った。急性投薬試験には生後６〜９ヶ月の雄の同腹子を用いた。また、慢性投薬試験にはＨ３ＲＫＯマウス又は野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪのＮ５）を親とする、生後１８〜２０ヶ月のマウスを用いた。
全てのマウスは２５℃で個別に飼育し、１２時間毎の明暗を切り替えた。また、飼育時には水と飼料は自由に摂取させた。飼料は、痩せ型マウスについてはＣＥ２（クレア社）、ＤＩＯマウスについてはｍｅｄｉｕｍ  ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ（オリエンタルバイオサービス社）を与えた。
（化合物）
Ｉｍｅｔｉｔ（Ｔｏｃｒｉｓ社）及びＴｈｉｏｐｅｒａｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）は、経口投与用として０．５％メチルセルロースに溶解したものを準備した。化合物それぞれの濃度は５ｍＬ／ｋｇとした。
（摂食量の測定）
Ｉｍｅｔｉｔ又はＴｈｉｏｐｅｒａｍｉｄｅは１７時〜１８時の間に投与した。摂食量は１９時及び２３時の飼料重量から測定した。
図１に示すとおり、コントロールマウスと比較してＩｍｅｔｉｔを投与したマウスでは摂食量が低下することが確認できた。また、図２に示すとおり、Ｈ３ＲＫＯマウスを用いて同様の試験を行った場合には、Ｉｍｅｔｉｔを投与した場合でも摂食量の低下は見られなかった。このことより、ヒスタミンＨ３受容体を介したＩｍｅｔｉｔの作用が摂食抑制に働いていることが明らかとなった。また、これらのマウスについて、Ｉｍｅｔｉｔ投与による体重の変化を測定した。図３に示すとおり、野生型マウスにＩｍｅｔｉｔを投与した場合には、投与回数に依存した体重の減少が見られた。一方、図４に示すとおり、Ｈ３ＲＫＯマウスにＩｍｅｔｉｔを投与した場合には体重の変化を見られず、ＩｍｅｔｉｔがヒスタミンＨ３受容体を介して体重抑制に作用していることを確認することができた。
（抗肥満試験）
マウスは平均体重と化合物投与前の毎日の摂食量が揃うようにグループ分けした。体重と摂食量は毎日測定した。
Ｔｈｉｏｐｅｒａｍｉｄｅの試験の場合、９時にＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ＤｉＯマウスに溶媒を投与したグループと１０ｍｐｋのＴｈｉｏｐｅｒａｍｉｄｅを投与したグループ、１７時に溶媒を投与したグループと１０ｍｐｋのＴｈｉｏｐｅｒａｍｉｄｅを投与したグループを設けた。また、Ｉｍｅｔｉｔの試験の場合、１日に２回、野生型又はＨ３ＲＫＯマウスに溶媒又はｉｍｅｔｉｔを投与した。投与して１０日目に、マウスを２時間の飢餓状態に置いた後、眼窩から採血し、グルコース及びインシュリン濃度を測定した。
体重の変化は体重の減少を、試験開始０日目の体重で除して算出し、パーセント表示した。肥満度はＮＭＲアナライザー（Ｍｉｎｉｓｐｅｃ、Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて測定した。
図６に示すとおり、Ｔｈｉｏｐｅｒａｍｉｄｅの投与により肥満マウスの体重が投与回数依存的に上昇する傾向が認められた。また、図５及び図７に示すとおり、Ｉｍｅｔｉｔの投与により肥満マウスの体重が有意に低下した。また、表１に示すとおり、Ｉｍｅｔｉｔによる体重減少効果は脂肪組織に依存するものであり、Ｈ３ＲＫＯマウスでは認められなかったことから、Ｈ３選択的な効果であることが示された。また、脂肪減少効果に伴い、血中インスリン濃度が低下したことから、耐糖能異常も改善していることが示された。
【表１】
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表中、＊は溶媒投与コントロールに対するｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。
（エネルギー消費量の測定）
エネルギー消費量はＩｎｄｉｒｅｃｔ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を用いて測定した。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスはテストチャンバー内で一晩順応させ、１０分おきに１分間ＶＯ２（酸素消費）及びＶＣＯ２（糖産生）を測定した。サンプルエアーは１０分ごとに採取した。ＲＱ（呼吸商）はＶＯ２をＶＣＯ２で除することで算出した。試験は９：００〜１７：００にかけて行い、試験中、マウスには自由に飼料と水を摂取させた。
図８〜１１に示すとおり、Ｉｍｅｔｉｔ投与により、ＶＯ２（図８）及びＶＣＯ２（図９）の上昇、ＲＱ（図１０）の低下が観察された。このことより、Ｉｍｅｔｉｔはエネルギー代謝を亢進し、特に脂肪を燃焼させることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、ヒスタミン受容体Ｈ３タンパク質のアゴニストを抗肥満や摂食抑制等の各種脂質代謝性疾患の治療のために使用することが可能となる。また、当該タンパク質を創薬標的とする化合物の評価方法及び当該評価方法によって得られた化合物を提供することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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