【手続補正書】
【提出日】令和1年8月26日(2019.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法であって、
ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；
ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー−ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；
ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；
ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程であって、前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー−ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端または３’末端にあり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端または３’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを含んでもよく、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー−二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である、工程と；
ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程であって、ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される、工程と；
ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ−ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；
ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、前記第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；
ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；
ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記異なるｇＲＮＡのさらなる侵入のエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ塩基対合を切断すること、（ＩＩ）ＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対を形成すること、（ＩＩＩ）侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のｇＲＮＡの、前記プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列への再アニーリングのエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ塩基対合を形成すること、（ＩＩ）ＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対を切断すること、（ＩＩＩ）新たに侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（Ｖ）ミスマッチにわたる塩基対合、（ＶＩ）Ｃａｓ９タンパク質との相互作用、および／または（ＶＩＩ）追加のヒューリスティクスであって、結合寿命、侵入の程度、侵入するガイドＲＮＡの安定性、またはＣａｓ９切断活性に対するｇＲＮＡ侵入の、他の算出される／シミュレーションされる特性に関する追加のヒューリスティクスのうちの少なくとも１つから、エネルギー的考察を決定することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記完全長ｇＲＮＡが約１５から２０個のヌクレオチドを含む、Ｍが１から２０である、前記ＲＮＡセグメントがプロトスペーサー−ターゲティング配列を補完する２から１５個のヌクレオチドを含む、Ｎが１から２０である、あるいは、前記ＲＮＡセグメントおよび／またはプロトスペーサー−ターゲティング配列が二次構造を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記最適化されたｇＲＮＡが、細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と共に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１〜２０個のヌクレオチドがリンカー内でランダム化される、
１〜２０個のヌクレオチドがＲＮＡセグメント内でランダム化される、
ステップ（ｇ）がＸ回繰り返され、それによって、Ｘ個のｇＲＮＡが産生され、それぞれのＸ個のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）が繰り返され、ここで、Ｘは、０から２０である、
前記侵入速度論および寿命が動的モンテカルロ法またはＧｉｌｌｅｓｐｉｅアルゴリズムを使用して算出される、
前記侵入速度論が、前記ガイドＲＮＡが、前記プロトスペーサー二重鎖に、前記プロトスペーサーが完全に侵入されるような完全な侵入まで侵入する速度、および／または、ｇＲＮＡに結合されたプロトスペーサーＤＮＡのセグメントが、その相補鎖から置き換えられ、そのＰＡＭ近位領域から、完全な侵入まで、ヌクレオチドごとにｇＲＮＡに結合するにつれて伸長する速度である、あるいは、
前記設計基準が、特異性、結合寿命の調節、および／または推定される切断特異性を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法によって産生された最適化されたｇＲＮＡ。
【請求項９】
前記ｇＲＮＡがオンターゲット部位とオフターゲット部位とをこれらの部位間の最小熱力学的エネルギー差を用いて識別することができる、前記最適化されたｇＲＮＡがプロトスペーサーへのストランド侵入を調節する、あるいは、前記最適化されたｇＲＮＡが配列番号１４９〜３１５、３２１〜３２３、および３２６〜３２９のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の最適化されたｇＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の最適化されたｇＲＮＡをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項１１に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１３】
請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１１に記載のベクター、または請求項１２に記載の細胞を含むキット。
【請求項１４】
標的細胞または対象におけるエピゲノム編集または遺伝子発現調節の方法であって、細胞または対象を、有効量の請求項８または９に記載の最適化されたｇＲＮＡ分子および融合タンパク質と接触させる工程を含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む方法。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が、ｄＣａｓ９ドメインおよび転写活性化因子、ｄＣａｓ９ドメインおよび転写抑制因子、あるいは、ｄＣａｓ９ドメインおよび部位特異的ヌクレアーゼを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１４９〜３１５、３２１〜３２３、および３２６〜３２９のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、最適化されたｇＲＮＡ。