【手続補正書】
【提出日】令和1年11月1日(2019.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料の起源を特定する方法であって、
（ａ）単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料と、独特の５’バーコードを各構築物が含む１つ以上の５’核酸構築物および独特の３’バーコードを各構築物が含む１つ以上の３’核酸構築物を含むバーコードのセットとを含む反応混合物を形成する工程と、
（ｂ）前記試料の前記核酸分子にバーコードの前記セットを組み込む工程と、
（ｃ）前記単一細胞の前記核酸分子に組み込まれたバーコードの前記セットを特定し、それによって前記核酸試料の起源を特定する工程であって、前記核酸試料における５’バーコードと３’バーコードとの組み合わせが、前記核酸試料の起源を特定する、工程
とを含む、前記方法。
【請求項２】
前記反応混合物を形成する工程が、バーコードの前記セットに前記単一細胞を接触させることと、前記単一細胞に由来する前記核酸試料を提供するために、前記細胞を溶解することとを含む、または
前記反応混合物を形成する工程が、懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、前記単一細胞とバーコードの前記セットとを含む前記反応混合物を形成するための条件下で、バーコードの前記セットを含むバーコーディング緩衝液に、前記細胞を含む前記懸濁緩衝液を接触させることとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記構築物が、独特の分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
各５’核酸構築物が、固体表面に結合された複数コピーで提供され、かつ各３’核酸構築物が、固体表面に結合された複数コピーで提供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記反応混合物が、前記単一細胞に由来する前記核酸試料と、複数コピーの前記５’核酸構築物を含む少なくとも１つのビーズと、複数コピーの前記３’核酸構築物を含む少なくとも１つのビーズとを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
各５’核酸構築物及び３’核酸構築物が、光切断可能なリンカーまたは制限酵素部位をさらに含み、前記反応混合物を制限酵素に接触させる工程および／または前記反応混合物をＵＶ光に曝露して、前記固体表面から前記５’核酸構築物及び前記３’核酸構築物を遊離させる工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記５’核酸構築物が、プロモータを含む二本鎖核酸構築物であり、且つ前記５’核酸構築物が、複数コピーの前記５’核酸構築物を作り出すための鋳型として役立つ、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
バーコードの前記セットが、１、２、３、４、５、６、７、または８個の５’核酸構築物と、１、２、３、４、５、６、７、または８個の３’核酸構築物とを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記３’核酸構築物が結合配列をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合配列がポリ−Ｔ配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリ−Ｔ配列が、前記試料の前記核酸分子におけるポリ−Ａ配列に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記３’核酸構築物における前記バーコードが、逆転写によって組み込まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記逆転写により、前記試料の前記核酸分子の末端に２〜５個のシステイン残基が付加される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記２〜５個のシステイン残基が、前記５’核酸構築物における結合配列に相補性の結合配列を提供する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記５’核酸構築物における前記結合配列が、ポリ−Ｇ配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記５’核酸構築物における前記結合配列が、前記試料の前記核酸分子におけるポリ−Ｃ配列に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記５’核酸構築物が、逆転写酵素を用いて前記核酸試料に組み込まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記逆転写酵素がＭ−ＭＬＶ酵素である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記逆転写酵素がＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
５’バーコード及び３’バーコードを各配列が含む複数の核酸配列の複数コピーを作り出すために、前記核酸試料がさらに増幅される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子がｍＲＮＡを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸試料における前記バーコードが、配列決定によって特定される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸分子の１つ以上が、２つ以上の独特のバーコードを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記独特のバーコードが、前記核酸分子の５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の双方に位置する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
複数の反応混合物を形成する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
２つ以上の独特のバーコードが、前記反応混合物の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％に存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の反応混合物を形成する工程が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０または５．０より大きいラムダで複数の反応混合物にバーコードの前記セットを加えることを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記反応混合物が液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
核酸試料の起源を特定する方法であって、
（ａ）独特の３’バーコード配列と結合配列とバーコード関連配列とを各構築物が含む３’核酸構築物のセットを提供する工程と、
（ｂ）単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料を提供する工程と、
（ｃ）前記核酸試料を３’核酸構築物の前記セットに接触させる工程と、
（ｄ）前記バーコード関連配列から前記３’バーコード配列及び結合配列を分離する工程と、
（ｅ）前記３’核酸構築物に由来する前記３’バーコード配列を前記核酸分子に組み込む工程と、
（ｆ）前記バーコード関連配列を用いて３’バーコード配列の前記セットを特定し、それによって前記単一細胞に由来する前記核酸試料の起源を特定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項３０】
３’核酸構築物の前記セットが、２、３、４、５、６、７または８個の３’核酸構築物を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記３’核酸構築物が、独特の分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記３’バーコード配列及び結合配列が、制限酵素配列または光切断可能なリンカーによって前記バーコード関連セグメントから分離される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記３’核酸構築物の複数コピーが、固体表面に結合される、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記３’核酸構築物における前記結合配列が、ポリ−Ｔ配列を含む、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記３’核酸構築物の前記結合配列が、前記試料の前記核酸分子におけるポリ−Ａ配列に結合する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記３’核酸構築物における前記バーコード配列が、逆転写によって組み込まれる、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記バーコード関連セグメントがプライミング配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記プライミング配列が回文配列である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
一方のバーコード関連セグメントの前記プライミング配列が、前記核酸試料における他の任意のバーコード関連セグメントのプライミング配列と結合することができる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
双方のバーコード関連セグメントを単一核酸に組み込むために、互いに接触している前記バーコード関連セグメントが、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸分子に組み込まれた前記バーコード配列を特定する工程をさらに含む、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸試料における前記バーコード配列が、配列決定によって特定される、請求項４１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本明細書で提供されるのは、核酸試料の起源を特定する方法である。該方法は、単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料とバーコードのセットとを含む反応混合物を形成する工程と、バーコードのセットを試料の核酸分子に組み込む工程と、単一細胞の核酸分子に組み込まれたバーコードのセットを特定し、それによって核酸試料の起源を特定する工程とを含む。提供されるのはまた、各構築物がそれぞれ独特の５’バーコード配列または３’バーコード配列を含む５’核酸構築物及び３’核酸構築物のセットを提供する工程と、単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料を提供する工程と、核酸試料を５’核酸構築物及び３’核酸構築物のセットに接触させる工程と、それぞれ５’核酸構築物及び３’核酸構築物に由来する５’バーコード配列及び３’バーコード配列を核酸分子に組み込む工程と、５’バーコード配列及び３’のバーコード配列のセットを特定し、それによって単一細胞に由来する核酸試料の起源を特定する工程とを含む、核酸試料の起源を特定する方法である。
[本発明1001]
核酸試料の起源を特定する方法であって、
（ａ）単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料とバーコードのセットとを含む反応混合物を形成する工程と、
（ｂ）前記試料の前記核酸分子にバーコードの前記セットを組み込む工程と、
（ｃ）前記単一細胞の前記核酸分子に組み込まれたバーコードの前記セットを特定し、それによって前記核酸試料の起源を特定する工程と
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記反応混合物を形成する工程が、
バーコードの前記セットに前記単一細胞を接触させることと、
前記単一細胞に由来する前記核酸試料を提供するために、前記細胞を溶解することと
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記反応混合物を形成する工程が、
懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、
前記単一細胞とバーコードの前記セットとを含む前記反応混合物を形成するための条件下で、バーコードの前記セットを含むバーコーディング緩衝液に、前記細胞を含む前記懸濁緩衝液を接触させることと
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
バーコードの前記セットが、独特の5’バーコードを各構築物が含む1つ以上の5’核酸構築物と、独特の3’バーコードを各構築物が含む1つ以上の3’核酸構築物とを含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記反応混合物を形成する工程が、
懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、
前記単一細胞と少なくとも1つの5’核酸構築物と少なくとも1つの3’核酸構築物とを含む前記反応混合物を形成するための条件下で、前記5’核酸構築物と前記3’核酸構築物とを含むバーコーディング緩衝液に、前記懸濁緩衝液を接触させることと
を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記反応混合物を形成する工程が、
懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、
前記単一細胞と少なくとも1つの5’核酸構築物と少なくとも1つの3’核酸構築物とを含む前記反応混合物を形成するための条件下で、前記5’核酸構築物を含む第1のバーコーディング緩衝液及び前記3’核酸構築物を含む第2のバーコーディング緩衝液に、前記懸濁緩衝液を接触させることと
を含む、本発明1004の方法。
[本発明1007]
前記構築物が、独特の分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む、本発明1004〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
各5’核酸構築物が、固体表面に結合された複数コピーで提供される、本発明1004〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
各3’核酸構築物が、固体表面に結合された複数コピーで提供される、本発明1004〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記固体表面が、ビーズ、マイクロビーズ、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノビーズまたはヒドロゲルである、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
前記反応混合物が、前記単一細胞に由来する前記核酸試料と、複数コピーの前記5’核酸構築物を含む少なくとも1つのビーズと、複数コピーの前記3’核酸構築物を含む少なくとも1つのビーズとを含む、本発明1004〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
各5’核酸構築物及び3’核酸構築物が、光切断可能なリンカーまたは制限酵素部位をさらに含む、本発明1004〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
各5’核酸構築物が光切断可能なリンカーをさらに含み、且つ各3’核酸構築物が制限酵素部位をさらに含む、本発明1004〜1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
各5’核酸構築物が制限酵素部位をさらに含み、且つ各3’核酸構築物が光切断可能なリンカーをさらに含む、本発明1004〜1011のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記反応混合物を制限酵素に接触させる工程と、
前記固体表面から前記5’核酸構築物及び前記3’核酸構築物を遊離させるために、前記反応混合物をＵＶ光に曝露する工程と
をさらに含む、本発明1013または1014の方法。
[本発明1016]
前記5’核酸構築物及び前記3’核酸構築物が制限酵素部位をさらに含み、
前記方法が、
前記固体表面から前記5’核酸構築物及び前記3’核酸構築物を遊離させるために、前記反応混合物を制限酵素に接触させる工程
をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1017]
前記5’核酸構築物及び前記3’核酸構築物が光切断可能なリンカーをさらに含み、
前記方法が、
前記固体表面から前記5’核酸構築物及び前記3’核酸構築物を遊離させるために、前記反応混合物をＵＶ光に曝露する工程
をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1018]
前記5’核酸構築物が、プロモータを含む二本鎖核酸構築物であり、且つ前記5’核酸構築物が、複数コピーの前記5’核酸構築物を作り出すための鋳型として役立つ、本発明1004〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
バーコードの前記セットが、1、2、3、4、5、6、7、または8個の5’核酸構築物と、1、2、3、4、5、6、7、または8個の3’核酸構築物とを含む、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記核酸試料における5’バーコードと3’バーコードとの組み合わせが、前記核酸試料の起源を特定する、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記3’核酸構築物が結合配列をさらに含む、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記結合配列がポリ−Ｔ配列を含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記ポリ−Ｔ配列が、前記試料の前記核酸分子におけるポリ−Ａ配列に結合する、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記3’核酸構築物における前記バーコードが、逆転写によって組み込まれる、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記逆転写が、前記3’バーコード配列を含む核酸分子を作り出す、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記逆転写酵素が、前記試料の前記核酸分子の末端に2〜5個のシステイン残基を付加する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記2〜5個のシステイン残基が、前記5’核酸構築物における結合配列に相補性の結合配列を提供する、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記5’核酸構築物における前記結合配列が、ポリ−Ｇ配列を含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記5’核酸構築物における前記結合配列が、前記試料の前記核酸分子におけるポリ−Ｃ配列に結合する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記5’核酸構築物が、逆転写酵素を用いて前記核酸試料に組み込まれる、本発明1001〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記逆転写酵素がＭ−ＭＬＶ酵素である、本発明1024〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記逆転写酵素がＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
5’バーコード及び3’バーコードを各配列が含む複数の核酸配列の複数コピーを作り出すために、前記核酸試料がさらに増幅される、本発明1001〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記核酸分子がｍＲＮＡを含む、本発明1001〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記ｍＲＮＡが、少なくとも1、3、10、30、100、300、1，000、3，000、10，000、30，000、100，000、300，000、または1，000，000個のｍＲＮＡを含む、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記核酸試料における前記バーコードが、配列決定によって特定される、本発明1001〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
バーコードの前記セットが、独特の5’バーコードを各構築物が含む少なくとも2つの5’核酸構築物を含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1038]
バーコードの前記セットが、独特の3’バーコードを各構築物が含む少なくとも2つの3’核酸構築物を含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記核酸分子の1つ以上が、2つ以上の独特のバーコードを含む、本発明1001の方法。
[本発明1040]
前記独特のバーコードが、前記核酸分子の5’末端、3’末端、または5’末端と3’末端の双方に位置する、本発明1039の方法。
[本発明1041]
複数の反応混合物を形成する工程を含む、本発明1001〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
2つ以上の独特のバーコードが、前記反応混合物の30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または100％に存在する、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記複数の反応混合物を形成する工程が、0．5、0．6、0．7、0．8、0．9、1．0、2．0、3．0、4．0または5．0より大きいラムダで複数の反応混合物にバーコードの前記セットを加えることを含む、本発明1041の方法。
[本発明1044]
前記反応混合物が液滴である、本発明1001〜1040のいずれかの方法。
[本発明1045]
核酸試料の起源を特定する方法であって、
（ａ）独特の3’バーコード配列と結合配列とバーコード関連配列とを各構築物が含む3’核酸構築物のセットを提供する工程と、
（ｂ）単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料を提供する工程と、
（ｃ）前記核酸試料を3’核酸構築物の前記セットに接触させる工程と、
（ｄ）前記バーコード関連配列から前記3’バーコード配列及び結合配列を分離する工程と、
（ｅ）前記3’核酸構築物に由来する前記3’バーコード配列を前記核酸分子に組み込む工程と、
（ｆ）前記バーコード関連配列を用いて3’バーコード配列の前記セットを特定し、それによって前記単一細胞に由来する前記核酸試料の起源を特定する工程と
を含む、前記方法。
[本発明1046]
3’核酸構築物の前記セットが、2、3、4、5、6、7または8個の3’核酸構築物を含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記3’核酸構築物が、独特の分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む、本発明1045または1046の方法。
[本発明1048]
前記3’核酸構築物が、ヘアピンを形成することができる、本発明1045〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記3’バーコード配列及び結合配列が、制限酵素配列または光切断可能なリンカーによって前記バーコード関連セグメントから分離される、本発明1045〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記3’核酸構築物の複数コピーが、固体表面に結合される、本発明1045〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記固体表面が、ビーズ、マイクロビーズ、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノビーズまたはヒドロゲルである、本発明1050の方法。
[本発明1052]
制限酵素が、前記3’バーコード配列を前記固体表面から遊離させ、且つ前記結合配列を前記バーコード関連セグメントから分離する、本発明1051の方法。
[本発明1053]
ＵＶ光が、前記3’ バーコード配列を前記固体表面から遊離させ、且つ前記結合配列を前記バーコード関連セグメントから分離する、本発明1051の方法。
[本発明1054]
前記3’核酸構築物における前記結合配列が、ポリ−Ｔ配列を含む、本発明1045〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記3’核酸構築物の前記結合配列が、前記試料の前記核酸分子におけるポリ−Ａ配列に結合する、本発明1054の方法。
[本発明1056]
前記3’核酸構築物における前記バーコード配列が、逆転写によって組み込まれる、本発明1045〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記逆転写が、前記3’バーコード配列を含む核酸分子を作り出す、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記バーコード関連セグメントがプライミング配列を含む、本発明1045〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記プライミング配列が回文配列である、本発明1058の方法。
[本発明1060]
一方のバーコード関連セグメントの前記プライミング配列が、前記核酸試料における他の任意のバーコード関連セグメントのプライミング配列と結合することができる、本発明1058の方法。
[本発明1061]
双方のバーコード関連セグメントを単一核酸に組み込むために、互いに接触している前記バーコード関連セグメントが、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、本発明1059の方法。
[本発明1062]
前記核酸分子に組み込まれた前記バーコード配列を特定する工程をさらに含む、本発明1045〜1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記核酸試料における前記バーコード配列が、配列決定によって特定される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記バーコード関連セグメントが、配列決定によって特定される、本発明1062の方法。