(57)【要約】  薬剤のCYP1A2又はCYP1A1とCYP1A2の両方に対する誘導能を評価することが可能なレポーターベクター、及びそのレポーターベクターを用いたCYP1A2又はCYP１A1とCYP1A2の両方に対する誘導能を評価する方法を提供する。CYP1A1とCYP1A2の間の領域の3'末端にレポーター遺伝子を連結したレポーターベクター、又は、該領域を挟んで、その両末端に異なるレポーター遺伝子を連結したレポーターベクター、及びその領域に欠失変異を有するレポーターベクターを構築し、該レポーターベクターを用いたレポーター系で、CYP1A2又はCYP1A1とCYP1A2の両方に対して誘導能のある薬剤によりレポーター分子の発現の上昇が見られることを確認して、CYP1A2又はCYP1A1とCYP1A2の両方に対する誘導能を評価できるレポーター系を完成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)〜(e)のいずれかのDNAの3'端にレポーター遺伝子が機能的に連結された発現ベクター。
(a)配列番号１の塩基番号1925〜2867の塩基配列を含むDNA。
(b)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列から１又は複数の塩基を欠失、置換あるいは付加した塩基配列を含むDNAであって、CYP1A2を誘導する薬剤により、その3'端に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現を上昇させるDNA。
(c)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列を含むDNAであって、CYP1A2を誘導する薬剤により、その3'端に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現を上昇させるDNA。
(d)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを含むDNAであって、CYP1A2を誘導する薬剤により、その3'端に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現を上昇させるDNA。
(e)配列番号１の塩基番号5659〜9181の塩基配列を含むDNA。
【請求項２】
DNAが、下記(1)〜(9)のいずれかの塩基配列を含むDNAである請求項１記載の発現ベクター。
(1)配列番号１の塩基番号1242〜2867の塩基配列
(2)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列
(3)配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列
(4)配列番号１の塩基番号1〜9691の塩基配列
(5)配列番号１の塩基番号1〜19947の塩基配列
(6)配列番号１の塩基番号1925〜6118の塩基配列
(7)配列番号１の塩基番号1925〜24448の塩基配列
(8)配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列から、塩基番号1535〜1541の塩基配列、塩基番号1930〜1936の塩基配列、塩基番号2018〜2024の塩基配列、塩基番号2093〜2099の塩基配列、塩基番号2411〜2417の塩基配列のいずれかを欠失させた塩基配列
(9)配列番号１の塩基番号5659〜24448の塩基配列
【請求項３】
DNAが、更に下記(10)〜(15)のいずれかの塩基配列を含むDNAである請求項２に記載の発現ベクター。
(10) 配列番号１の塩基番号23697〜24448の塩基配列
(11)配列番号１の塩基番号23030〜24448の塩基配列
(12)配列番号１の塩基番号22167〜24448の塩基配列
(13)配列番号１の塩基番号19134〜24448の塩基配列
(14)配列番号１の塩基番号1925〜24448の塩基配列
(15)配列番号１の塩基番号19134〜24448の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列
【請求項４】
DNAが配列番号１の塩基番号1242〜2867の塩基配列及び塩基番号23697〜24448の塩基配列からなるDNAである請求項１記載の発現ベクター
【請求項５】
DNAが配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結したDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項６】
DNAが配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列及び塩基番号22167〜24448の塩基配列が連結したDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項７】
DNAが配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結したDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項８】
DNAが配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列及び19134〜24448の塩基配列が連結したDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項９】
DNAが配列番号１の塩基番号1〜9691の塩基配列及び塩基番号19134〜24448の塩基配列が連結したDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１０】
DNAが配列番号１の塩基番号1〜19947の塩基配列及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結したDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１１】
DNAが配列番号１の塩基番号1〜24448の塩基配列からなるDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１２】
DNAが配列番号１の塩基番号1925〜6118及び塩基番号19134〜24448の塩基配列が連結したDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
DNAが配列番号１の塩基番号1925〜24448の塩基配列からなるDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１４】
DNAが配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列から、塩基番号1535〜1541の塩基配列、塩基番号1930〜1936の塩基配列、塩基番号2018〜2024の塩基配列、塩基番号2093〜2099の塩基配列又は塩基番号2411〜2417の塩基配列のいずれかを欠失させた塩基配列、及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結したDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１５】
DNAが配列番号１の塩基番号1〜1242及び塩基番号5659〜24448の塩基配列が連結したDNAである請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１７】
（１）請求項１６に記載の宿主細胞を被検薬剤の存在下で培養する工程、（２）レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、（３）被検薬剤の非存在下と比較して発現量に影響を与えた場合に、被検薬剤がCYP1A2の誘導能を有すると判定する工程を含む、被検薬剤のCYP1A2の誘導能を測定する方法。
【請求項１８】
DNAが、CYP1A1を誘導する薬剤により、その5'端に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現を上昇させるDNAであって、その5'端に、更に3'端とは異なるレポーター遺伝子が機能的に連結された請求項１〜１５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
【請求項２０】
（１）請求項１９に記載の宿主細胞を被検薬剤の存在下で培養する工程、（２）レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、（３）被検薬剤の非存在下と比較して発現量に影響を与えた場合に、被検薬剤がCYP1A1及びCYP1A2の誘導能を有すると判定する工程を含む、被検薬剤のCYP1A1及びCYP1A2の誘導能を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤のヒトCYP1A2に対する誘導能を評価することが可能な発現ベクター、並びに当該発現ベクターを用いたヒトCYP1A2に対する誘導能の評価方法に関する。【０００２】
更に本発明は、CYP1A2に加えCYP１A1に対する誘導能も同時に評価することが可能な発現ベクター、並びに当該発現ベクターを用いたヒトCYP１A1及びCYP1A2に対する誘導能の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
薬物相互作用の原因の一つとして、薬物代謝酵素の誘導が挙げられる。一般的に、酵素誘導は薬物代謝酵素遺伝子の転写が増加することにより引き起こされ、酵素誘導を評価するために、レポーター遺伝子の5'上流に薬物代謝酵素遺伝子の調節領域の一部を組み込んだ組み換えレポーターベクターを用いたスクリーニングが行われる。【０００４】
代表的な薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)は遺伝子スーパーファミリーを形成しており、基質特異性の異なる多くの分子種が存在する（非特許文献１）。このうち、CYP1Aファミリーは薬物の代謝のみならず、多環式炭化水素や芳香族アミンなどの癌原性物質の代謝活性化にも関与している。【０００５】
ヒトCYP1A1及びCYP1A2遺伝子は、第15番染色体上で逆向きに隣接して存在していることが知られている（非特許文献２）。CYP1A1については、その薬物による誘導に関与する領域が知られており（非特許文献３）、薬物誘導を評価できるレポーター系も構築されている（非特許文献４〜６）。しかし、CYP1A2については、その誘導がCYP1A2遺伝子の近傍の領域のみでは説明できないことは知られていたが（非特許文献７）、具体的にどの領域がCYP1A2の誘導に関与するかは知られていなかった。
【非特許文献１】Pharmacogenetics, 6: 1-42 (1996)
【非特許文献２】Pharmacogenetics, 11: 1-6 (2001)
【非特許文献３】Ann Rev Pharmacol Toxicol 39:103-125 (1999)
【非特許文献４】Toxicol Appl Pharmacol 118:255-262 (1993)
【非特許文献５】Fundam Appl Toxicol 30:194-203 (1996)
【非特許文献６】Drug Metab Dispos 33:312-320 (2005)
【非特許文献７】Pharmacogenetics 5:259-274 (1995)
【発明の開示】
【０００６】
本発明の課題は、薬剤によるCYP1A2の誘導に関与する転写制御領域を同定すること、その領域を用いて薬剤のCYP1A2に対する誘導能を評価することが可能なレポーターベクターを構築すること、及びそのレポーターベクターを用いたCYP1A2に対する誘導能を評価する方法を提供することにある。
【０００７】
更に本発明の課題は、CYP1A2に加えCYP1A1に対する誘導能も同時に評価することが可能な発現ベクターを構築すること、並びに当該発現ベクターを用いたヒトCYP１A1及びCYP1A2に対する誘導能を同時に評価する方法を提供することにある。
【０００８】
本発明者らは先ず、CYP1A1及びCYP1A2遺伝子の発現調節を生体に近い形でレポーター系に反映させるため、両遺伝子の間の23 kbにわたる領域を挟んで両末端に異なるレポーター遺伝子を付加させた発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターと称する場合がある）を構築した。そして、該発現ベクターを用いたレポーター系を用いた実験により、CYP1A1とCYP1A2に対して誘導能を有するとして知られている薬剤がレポーター分子の発現を上昇させることを確認した。
【０００９】
次いで本発明者らは、CYP1A2上流の転写制御領域のみでは薬剤によるCYP1A2の誘導が観察されないこと、両遺伝子の間の領域からCYP1A1近傍の領域を欠失させるとCYP1A1の誘導のみならずCYP1A2の誘導も失われることを見出した。そして、CYP1A2の誘導にはCYP1A1近傍の領域が必須であり、CYP1A1近傍の多数のXRE（Xenobiotic responsive element）が分布する領域を含む本発明の発現ベクターの構成により、CYP1A1及びCYP1A2に対する誘導能を反映するレポーター系を構築することが可能なことを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１０】
該レポーター系は、本発明の発現ベクターを導入した細胞でCYP1A1とCYP1A2の両方の誘導評価が可能であり、さらにCYP1A1とCYP1A2の両方の誘導評価を同時に行うことが可能であることから作業効率の向上が期待できるという利点も有していた。
【００１１】
すなわち本発明は、以下に係るものである。
［１］
下記(a)〜(e)のいずれかのDNAの3'端にレポーター遺伝子が機能的に連結された発現ベクター。
(a)配列番号１の塩基番号1925〜2867の塩基配列を含むDNA。
(b)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列から１又は複数の塩基を欠失、置換あるいは付加した塩基配列を含むDNAであって、CYP1A2を誘導する薬剤により、その3'端に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現を上昇させるDNA。
(c)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列を含むDNAであって、CYP1A2を誘導する薬剤により、その3'端に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現を上昇させるDNA。
(d)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを含むDNAであって、CYP1A2を誘導する薬剤により、その3'端に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現を上昇させるDNA。
(e)配列番号１の塩基番号5659〜9181の塩基配列を含むDNA。
［２］
DNAが、下記(1)〜(9)のいずれかの塩基配列を含むDNAである項１記載の発現ベクター。
(1)配列番号１の塩基番号1242〜2867の塩基配列
(2)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列
(3)配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列
(4)配列番号１の塩基番号1〜9691の塩基配列
(5)配列番号１の塩基番号1〜19947の塩基配列
(6)配列番号１の塩基番号1925〜6118の塩基配列
(7)配列番号１の塩基番号1925〜24448の塩基配列
(8)配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列から、塩基番号1535〜1541の塩基配列、塩基番号1930〜1936の塩基配列、塩基番号2018〜2024の塩基配列、塩基番号2093〜2099の塩基配列、塩基番号2411〜2417の塩基配列のいずれかを欠失させた塩基配列
(9)配列番号１の塩基番号5659〜24448の塩基配列
［３］
DNAが、更に下記(10)〜(15)のいずれかの塩基配列を含むDNAである項２に記載の発現ベクター。
(10) 配列番号１の塩基番号23697〜24448の塩基配列
(11)配列番号１の塩基番号23030〜24448の塩基配列
(12)配列番号１の塩基番号22167〜24448の塩基配列
(13)配列番号１の塩基番号19134〜24448の塩基配列
(14)配列番号１の塩基番号1925〜24448の塩基配列
(15)配列番号１の塩基番号19134〜24448の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列
［４］
DNAが配列番号１の塩基番号1242〜2867の塩基配列及び塩基番号23697〜24448の塩基配列からなるDNAである項１記載の発現ベクター
［５］
DNAが配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結したDNAである項１記載の発現ベクター。
［６］
DNAが配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列及び塩基番号22167〜24448の塩基配列が連結したDNAである項１記載の発現ベクター。
［７］
DNAが配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結したDNAである項１記載の発現ベクター。
［８］
DNAが配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列及び19134〜24448の塩基配列が連結したDNAである項１記載の発現ベクター。
［９］
DNAが配列番号１の塩基番号1〜9691の塩基配列及び塩基番号19134〜24448の塩基配列が連結したDNAである項１記載の発現ベクター。
［１０］
DNAが配列番号１の塩基番号1〜19947の塩基配列及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結したDNAである項１記載の発現ベクター。
［１１］
DNAが配列番号１の塩基番号1〜24448の塩基配列からなるDNAである項１記載の発現ベクター。
［１２］
DNAが配列番号１の塩基番号1925〜6118及び塩基番号19134〜24448の塩基配列が連結したDNAである項１記載の発現ベクター。
［１３］
DNAが配列番号１の塩基番号1925〜24448の塩基配列からなるDNAである項１記載の発現ベクター。
［１４］
DNAが配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列から、塩基番号1535〜1541の塩基配列、塩基番号1930〜1936の塩基配列、塩基番号2018〜2024の塩基配列、塩基番号2093〜2099の塩基配列又は塩基番号2411〜2417の塩基配列のいずれかを欠失させた塩基配列、及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結したDNAである項１記載の発現ベクター。
［１５］
DNAが配列番号１の塩基番号1〜1242及び塩基番号5659〜24448の塩基配列が連結したDNAである項１記載の発現ベクター。
［１６］
項１〜１５のいずれか１項に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
［１７］
（１）項１６に記載の宿主細胞を被検薬剤の存在下で培養する工程、（２）レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、（３）被検薬剤の非存在下と比較して発現量に影響を与えた場合に、被検薬剤がCYP1A2の誘導能を有すると判定する工程を含む、被検薬剤のCYP1A2の誘導能を測定する方法。
［１８］
DNAが、CYP1A1を誘導する薬剤により、その5'端に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現を上昇させるDNAであって、その5'端に、更に3'端とは異なるレポーター遺伝子が機能的に連結された項１〜１５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
［１９］
項１８に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
［２０］
（１）項１９に記載の宿主細胞を被検薬剤の存在下で培養する工程、（２）レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、（３）被検薬剤の非存在下と比較して発現量に影響を与えた場合に、被検薬剤がCYP1A1及びCYP1A2の誘導能を有すると判定する工程を含む、被検薬剤のCYP1A1及びCYP1A2の誘導能を測定する方法。
【００１２】
本発明により、薬剤のCYP1A2に対する誘導能の評価が容易となり、更に5'端にもレポーター遺伝子を連結する場合には、CYP1A1とCYP1A2に対する誘導能の同時評価が可能となって、作業効率の向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒトCYP1A1及びCYP1A2の転写制御領域のクローニングに用いたFragment 1（F1)、Fragment 2（F2)、Fragment 3（F3)を図示した図である。
【図２】ヒトCYP1A1及びCYP1A2の転写制御領域の一部を欠失したＢ〜Ｊの各レポーターベクターの欠失領域を図示した図である。
【図３】Ａ〜Ｊ，Ｎ，Ｏ，Ｔ，Ｕの各レポーターベクターの発現が、3-メチルコラントレン（3-MC, 1μM）（上図）及びβ-ナフトフラボン（BNF, 10μM）（下図）の添加により、何倍に増強したかを示した図である。
【図４】ヒトCYP1A1及びCYP1A2の転写制御領域の一部を欠失したＫ〜Ｍ，Ｐ〜Ｓの各レポーターベクターの欠失領域を図示した図である。
【図５】Ｋ〜Ｍ，Ｐ〜Ｓの各レポーターベクターの発現が、3-メチルコラントレン（3-MC, 1μM）（上図）及びβ-ナフトフラボン（BNF, 10μM）（下図）の添加により、何倍に増強したかを示した図である。
【図６】Ａ〜Ｊ，Ｎ，Ｏ，Ｔ，Ｕの各レポーターベクターの発現が、オメプラゾールの添加により、何倍に増強したかを示した図である。
【図７】Ｅ１〜Ｅ５の各レポーターベクターの発現が、BNFの添加により、何倍に増強したかを示した図である。
【図８】Ｅ１〜Ｅ５の各レポーターベクターの発現が、3-MCの添加により、何倍に増強したかを示した図である。
【図９】Ｅ１〜Ｅ５の各レポーターベクターの発現が、オメプラゾールの添加により、何倍に増強したかを示した図である。
【図１０】本発明の各レポーターベクターの作製に用いた制限酵素の切断部位である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、CYP1A2に対する薬剤の誘導能を反映するために、転写制御領域としてCYP1A1近傍の領域を含むように構成した発現ベクター、該発現ベクターを導入した宿主細胞、該宿主細胞を用いた被験薬剤のCYP1A2の誘導能の試験方法に関する。【００１５】
本発明は、更にCYP1A1とCYP1A2に対する薬剤の誘導能を同時に反映するために、CYP1A1近傍の領域を含むDNAから、反対方向にレポーター分子を転写するよう構成した発現ベクター、該発現ベクターを導入した宿主細胞、該宿主細胞を用いた被験薬剤のCYP1A1とCYP1A2の誘導能の試験方法に関する。【００１６】
以下に１．発現ベクターの構築方法、２．宿主への導入方法、３．CYP1A1とCYP1A2の誘導能の試験方法について順次説明する。【００１７】
１．発現ベクターの構築方法
CYP1A1とCYP1A2遺伝子の間の領域の塩基配列は、GenBank Acc. No. AF253322から入手できる。また、CYP1A1とCYP1A2遺伝子の間の領域を含むDNAは、BACクローン（Genome Systems社、BACクローン番号：RP11-195A1あるいはRP11-414J4）、あるいはヒトゲノムDNA（Novagen：カタログ番号69237、BDバイオサイエンス：カタログ番号636401）から入手できる。【００１８】
以下に記載する操作は適当なマニュアル、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY等に記載の方法に従って行うことができる。【００１９】
CYP1A1近傍の領域を含むDNAのCYP1A2遺伝子につながる側（配列番号１の3'端側）にレポーター遺伝子を機能的に連結することによりCYP1A2の発現を反映する発現ベクターを作製することができる。レポーター遺伝子は、レポーター分子をコードする遺伝子であり、レポーター分子発現量の直接的または間接的な測定により発現量が測定できる遺伝子を意味する。レポーター遺伝子としては、分泌型アルカリフォスファターゼ（GenBank#U89937）、ホタルルシフェラーゼ（GenBank#U47295）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（GenBank#U57024）等が挙げられるが、これらには限られない。【００２０】
機能的に連結するとは、レポーター遺伝子の発現が、連結したDNAにより制御されるように連結することを意味する。【００２１】
CYP1A1近傍の領域を含むDNAとしてはCYP1A1とCYP1A2遺伝子の間の領域全領域を用いても良く、この領域は、前述したBACクローンを鋳型としてGenBankの塩基配列の情報を基にプライマーを設定してPCRにより得ることができる。この領域は20 kbp以上に及び、全領域を１度のPCRにより増幅するのが困難であれば、GenBankの塩基配列の情報を基に、この領域中の適当な制限酵素切断部位の間をPCRで増幅し、得られたPCR産物を、制限酵素切断部位を使って連結することにより、この領域の全域を得ることができる。【００２２】
また図２に示す通り、CYP1A1遺伝子とCYP1A2遺伝子の間には、多数のXRE（Xenobiotic responsive element）が分布しており、この分布を参考にして適当な転写制御領域を選択して組合せて、発現ベクターの転写制御領域として使用することができる。特に配列番号１の塩基番号1925〜2867（好ましくは1535〜2867、さらに好ましくは1〜2867）の塩基配列の領域を含むことが好ましく、この領域に加えて、どの様な薬剤を試験するかに合わせて適当な領域を選択して連結することが好ましい。ここでXREとはtngcgtg（nはa、g、tまたはc）で示される配列である。このn は更に、tまたはcであることが好ましい。また、配列番号１の塩基番号5659〜24448の塩基配列からなる領域を用いることも可能である。【００２３】
このようなXREを含む転写制御領域としては、例えば以下に挙げるCYP1A1の近傍の転写制御領域を含むことが好ましい。
(1)配列番号１の塩基番号1242〜2867の塩基配列
(2)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列からなる領域。
(3)配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列からなる領域。
(4)配列番号１の塩基番号1〜9691の塩基配列からなる領域。
(5)配列番号１の塩基番号1〜19947の塩基配列からなる領域。
(6)配列番号１の塩基番号1925〜6118の塩基配列からなる領域。
(7)配列番号１の塩基番号1925〜24448の塩基配列からなる領域。
(8)配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列から、塩基番号1535〜1541の塩基配列、塩基番号1930〜1936の塩基配列、塩基番号2018〜2024の塩基配列、塩基番号2093〜2099の塩基配列、塩基番号2411〜2417の塩基配列のいずれかを欠失させた塩基配列からなる領域。
(9)配列番号１の塩基番号5659〜24448の塩基配列からなる領域。【００２４】
実施例の４及び５に示す通り、CYP1A2近傍の転写制御領域のみでは、レポーター分子の転写を起こすことができた場合でも薬剤による誘導は観察されず、薬剤による誘導を反映させるためには、CYP1A1近傍のこれら領域が必要である。ここでCYP1A1近傍とは、CYP1A1遺伝子の5'上流（CYP1A1遺伝子は配列番号１では逆向きに転写されるので、配列番号１の下流方向）10 kb、好ましくは6 kb、さらに好ましくは3 kbの領域である。【００２５】
場合によっては、更に大きな領域、例えば配列番号１の塩基番号1〜19947の塩基配列からなる領域を用いることも許される。【００２６】
また、薬剤のCYP1A2に対する誘導能を評価することが可能なレポーターベクターには、上記に加え、例えば以下に挙げるCYP1A2近傍の転写制御領域を含むことが好ましい。CYP1A2近傍の転写制御領域は、上記のCYP1A1近傍の転写制御領域と一部または全部が重複していてもよい。
(10) 配列番号１の塩基番号23697〜24448の塩基配列
(11)配列番号１の塩基番号23030〜24448の塩基配列からなる領域。
(12)配列番号１の塩基番号22167〜24448の塩基配列からなる領域。
(13)配列番号１の塩基番号19134〜24448の塩基配列からなる領域。
(14)配列番号１の塩基番号1925〜24448の塩基配列からなる領域。
(15)配列番号１の塩基番号19134〜24448の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列からなる領域。【００２７】
本発明は、薬剤のCYP1A2に対する誘導能を評価するためには、XREがかたまって存在する配列番号１の塩基番号1925〜2867（好ましくは1535〜2867、更に好ましくは1〜2867）を含むこと（図２におけるＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉの発現ベクター）が必要であり、この領域が欠けると（図２におけるＧ，Ｊ，Ｎ，Ｏの発現ベクター）誘導能が著しく低下することを見出したものである。従って転写制御配列が、配列番号１の塩基番号1925〜2867（好ましくは1535〜2867）、あるいは類似の配列を含み、その3'端に機能的に連結されたレポーター分子の発現がCYP1A2を誘導する薬剤により上昇する限りにおいて本発明に含まれる。【００２８】
本願の転写制御配列としては、XREが近接して配置された領域を有することが必要であって、取り扱いやすいように適度に短くすることが許され、例えば25 kb以下、20 kb以下、15 kb以下、10 kb以下といった長さの転写制御配列とすることが許される。【００２９】
このような類似の配列を含む転写制御領域の好ましい一例は、配列番号１の塩基番号1925〜2867（好ましくは1535〜2867、更に好ましくは1〜2867）の塩基配列から１又は複数の塩基を欠失、置換及び／又は付加した塩基配列を含むDNAであって、CYP1A2を誘導する薬剤により、その3'端に機能的に連結されたレポーター分子の発現を上昇させるDNAである。またそのDNAは、CYP1A1を誘導する薬剤により、5'端に機能的に連結されたレポーター分子の発現を上昇させることが好ましい。複数とは特に限定されないが、２〜１００、好ましくは２〜５０、好ましくは２〜２０、好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜７である。本発明の実施例の７で示したとおり、転写制御に最も重要であると考えられるXRE領域の一部欠失させても薬剤による発現誘導活性は保たれており、転写制御領域の塩基配列には配列番号１の塩基番号1925〜2867（好ましくは1535〜2867、更に好ましくは1〜2867）の塩基配列から変異していても、薬剤による発現誘導活性を示す限り本発明に含まれる。変異は、例えばSite-directed mutagenesis法等を用いて導入することが可能である。【００３０】
このような類似の配列を含む転写制御領域の別の一例は、配列番号１の塩基番号1925〜2867（好ましくは1535〜2867、更に好ましくは1〜2867）の塩基配列と90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは97%以上のホモロジーを有する塩基配列を含むDNAであって、CYP1A2を誘導する薬剤により、その3'端に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現を上昇させるDNAである。またそのDNAは、CYP1A1を誘導する薬剤により、5'端に機能的に連結されたレポーター分子の発現を上昇させることが好ましい。ホモロジーの算出は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる。[例えば日本DNAデータバンク(DDBJ)において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、およびSSEARCH等の相同性検索が利用できる[例えば日本DNAデータバンク(DDBJ)のウェブサイトの相同性検索(Search and Analysis)のページ；http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html]。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI)においてBLASTを用いた検索を行うことができる(例えばNCBIのホームページのウェブサイトのBLASTのページ；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402)]【００３１】
このような類似の配列を含む転写制御領域の更に別の一例は、配列番号１の塩基番号1925〜2867（好ましくは1535〜2867、更に好ましくは1〜2867）の塩基配列のDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを含むDNAであって、CYP1A2を誘導する薬剤により、その3'端に機能的に連結されたレポーター分子の発現を上昇させるDNAである。またそのDNAは、CYP1A1を誘導する薬剤により、5'端に機能的に連結されたレポーター分子の発現を上昇させることが好ましい。【００３２】
配列番号１の塩基番号5659〜9181の類似配列についても、配列番号１の塩基番号1925〜2867に関して上記に説明したのと同様である。【００３３】
また、薬剤のCYP1A2に対する誘導能を評価するレポーターベクターは、更に配列番号１の塩基番号19134〜24448、あるいは類似の転写制御配列を含むことが好ましい。この類似配列についても、配列番号１の塩基番号1925〜2867に関して上記に説明したのと同様である。このような類似の配列の好ましい一例は、配列番号１の塩基番号19134〜24448（好ましくは22167〜24448、更に好ましくは23030〜24448）の塩基配列のDNAともストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであることが好ましい。【００３４】
ここでストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」及び「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpressHyb Hybridization Solution(CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC,0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行ってもよい。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び2度目の洗浄の際の温度をより高く(例えば、60℃、68℃等)設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。当業者であれば、バッファーの塩濃度、温度に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他のハイブリダイゼーション条件を加味して条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Press(1989))、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons(1987-1997))、DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.(Oxford University(1995))等を実験手引きとすることができる。【００３５】
このような配列番号１の塩基番号1925〜2867（好ましくは1535〜2867、さらに好ましくは1〜2867）、あるいは類似の配列を含む転写制御領域は、前述したBACクローンを鋳型としてGenBankの塩基配列の情報を基にプライマーを設定してPCRにより増幅して得られたクローンを適宜組合せ、あるいは周知の方法によって塩基配列に改変を加えることにより得ることができる。【００３６】
本発明の転写制御配列として好ましい例は、以下の塩基配列を含む配列である。
(1)配列番号１の塩基番号1242〜2867の塩基配列及び塩基番号23697〜24448の塩基配列からなる配列（図４におけるＳの発現ベクター）
(2)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結した配列（図２におけるＩの発現ベクター）
(3)配列番号１の塩基番号1〜2867の塩基配列及び塩基番号22167〜24448の塩基配列が連結した配列（図２におけるＨの発現ベクター）
(4)配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結した配列（図２におけるＥの発現ベクター）
(5)配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列及び19134〜24448の塩基配列が連結した塩基配列（図２におけるＦの発現ベクター）
(6)配列番号１の塩基番号1〜9691の塩基配列及び塩基番号19134〜24448の塩基配列が連結した配列（図２におけるＢの発現ベクター）
(7)配列番号１の塩基番号1〜19947の塩基配列及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結した配列（図２におけるＤの発現ベクター）
(8)配列番号１の塩基番号1〜24448の塩基配列からなる配列（図２におけるＡの発現ベクター）
(9)配列番号１の塩基番号1925〜6118及び塩基番号19134〜24448の塩基配列が連結した配列（図４におけるＱの発現ベクター）
(10)配列番号１の塩基番号1925〜24448の塩基配列からなる配列（図４におけるＲの発現ベクター）
(11)配列番号１の塩基番号1〜5659の塩基配列から、塩基番号1535〜1541の塩基配列（Ｅ１）、塩基番号1930〜1936の塩基配列（Ｅ２）、塩基番号2018〜2024の塩基配列（Ｅ３）、塩基番号2093〜2099の塩基配列（Ｅ４）又は塩基番号2411〜2417の塩基配列（Ｅ５）のいずれかを欠失させた塩基配列、及び塩基番号23030〜24448の塩基配列が連結した配列。
(12)配列番号１の塩基番号1〜1242及び塩基番号5659〜24448の塩基配列が連結した配列（図２におけるＴの発現ベクター）【００３７】
作製した発現ベクターがCYP1A2の誘導を反映したレポーター系として使用可能であるか否かは、該発現ベクターを使用したレポーター分子の発現が、CYP1A2を誘導することが知られている薬剤、例えば3-メチルコラントレン(3-methylchoranthrene)やβ-ナフトフラボン(β-naphthoflavone)により増強するか否かにより検証することができる。【００３８】
CYP1A1の近傍を含むDNAに、CYP1A2遺伝子につながる側（配列番号１の3'端側）に加え、更にCYP1A1遺伝子につながる側（配列番号１の5'端側）にもレポーター遺伝子を機能的に連結することができ、レポーター遺伝子を両側に連結することにより、CYP1A１とCYP1A2の両方の遺伝子の発現を反映する発現ベクターを作製することができる。好ましくはCYP1A1遺伝子につながる側に連結するレポーター遺伝子は、互いの発現を独立に測定することが可能なように、CYP1A2遺伝子につながる側に連結するレポーター遺伝子とは異なることが望ましい。【００３９】
CYP1A1の近傍を含むDNAの両側に異なるレポーター遺伝子を連結したレポーター系により、薬剤のCYP1A1とCYP1A2に対する誘導を同時に測定できるようになり、実験の手間を大幅に軽減することができる。【００４０】
２．宿主への導入方法
構築した発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。既に多くの細胞株が宿主細胞株として確立されており、それらの宿主細胞株に適した形質転換法も種々確立されている。本発明のレポーター系の宿主細胞として、これら公知のいずれの宿主細胞株を用いてもよく、当業者であれば選択した宿主に適した導入法を適宜採用して効率良く形質転換を行うことができる。例えば、これらの方法に限定されるわけではないが、リポフェクタミン法(GIBCO BRL)を例示できる。その他、リン酸カルシウム沈降法、核マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、DEAE-デキストラン法、細胞融合、電気パルス穿孔法、FuGENE6試薬(Roche)を使用する方法等も知られている。哺乳動物細胞の形質転換の詳細については、Keown et al.(1990)Methods in Enzymol.185:527-537及びMansour et al. (1988)Nature 336:348-352等の文献を参照することができる。【００４１】
哺乳動物細胞株を使用することができ、HepG2、HuH-7、Hela、COS-1、ヒト不死化肝細胞を含む多数の細胞が知られており、これらの細胞をレポーター系の宿主細胞として使用することができる。好ましくは肝臓細胞由来の株であることが好ましく、更にHepG2、HuH-7、ヒト不死化肝細胞が好ましい。宿主細胞としては、導入した発現ベクターを一過性に発現させた細胞を使用してもよく、また選択マーカーを入れた発現ベクターを導入し、マーカーに対応した薬剤により選択をかけて、恒常的に発現ベクターを含有するようになった細胞株を使用してもよい。【００４２】
３．CYP1A2又はCYP1A1とCYP1A2の誘導能の試験方法
CYP1A2の誘導能の試験は、以下のステップで行うことができる。
（１）発現ベクターを導入した宿主細胞を、薬剤の存在下、及び非存在下で適当な時間培養する。
（２）導入したレポーター遺伝子に対応した方法でレポーター遺伝子の発現量を測定する。例えば、レポーター遺伝子にコードされるレポーター分子が、分泌型酵素であれば培養上清中の酵素活性を測定し、細胞内に発現する酵素であれば細胞抽出液の酵素活性を測定し、蛍光を発する分子であれば蛍光を測定して、レポーター分子の量を測定することによりレポーター遺伝子の発現量を測定する。
（３）薬剤が存在した場合と存在しない場合とを比較して、薬剤が存在した場合にレポーター遺伝子の発現量が増加していれば、その薬剤はCYP1A2の誘導能が有ると判断される。【００４３】
またCYP1A2につながる側に加え、CYP1A1につながる側にもレポーター遺伝子を連結した発現ベクターを導入した宿主を使えば、CYP1A1に対する誘導能とCYP1A2に対する誘導能を同時に評価することが可能である。【００４４】
本発明のレポーター系によれば、例えばアリルハイドロカーボンレセプターと結合したのち、XREに結合することによって誘導がかかる薬物や環境ホルモン等（Denison, M.S et al., Annual Review of Pharmacology & Toxicology., 2003. 43: p. 309-34）による誘導の評価が可能である。
【実施例１】
【００４５】
＜１．ヒトCYP1A1及びCYP1A2遺伝子の転写制御領域フラグメントのクローニング＞
ヒトCYP1A1及びCYP1A2遺伝子の転写制御領域を含むDNAを、BACクローン（Genome Systems社）をテンプレートとし、LA Taq（TaKaRa社）を用いたPCR法により、CYP1A1およびCYP1A2遺伝子上流間を三カ所（Fragment 1〜3）に分けて増幅した（図１）。使用したプライマーは以下の通りで、NCBI DBのaccession No.: AF253322を元に設計した。【００４６】
Fragment 1：
フォワードプライマー
5'-GCGGTCGACGGCCGGCCGGATCTCATTCTTTTTACAGCTGAATAGCACTCC-3'（配列番号２）
リバースプライマー
5'-GCGGAATTCATCTTGGAGGTGGCTGCTGAGAGAAGGTGC-3'（配列番号３）
Fragment 2：
フォワードプライマー
5'-GCGCTCGAGAGAATACCAGGCAGAAGATGGCAGAGG-3' （配列番号４）
リバースプライマー
5'-GCGACGCGTGGCCGGCCATATAGTGCATATACACAATGGAGTGCTATTCAGCTGT-3' （配列番号５）
Fragment 3：
フォワードプライマー
5'-TCCCAGCTACTCGAGAGGTTGACACACAAGAA-3' （配列番号６）
リバースプライマー
5'-CGACGCGTCCCGCTCGAGGATCCTCATAAATGGTTTAGCACCATCC-3' （配列番号７）【００４７】
得られたPCR産物は、それぞれpCR-XL-TOPO（Invitrogen社）へサブクローニングした（それぞれF1、F2、F3とする）。【００４８】
＜２．レポーターベクターの構築＞
pGL3-Basic（Promega社）とpSEAP2-Basic (CLONTECH)を使用し（それぞれV1とV2とする）、以下の手順でレポーターベクターを構築した。各ステップで得られたクローンは、制限酵素処理を行った後に、アガロースゲル電気泳動を行って目的物であることを確認した。
(a).F1をBamHI処理して約10 kbpを切り出し、V1のBglIIサイトに組み込んだ。
(b).F2をXhoIおよびBamHI処理し、約5.3 kbpを切り出しV2のXhoIおよびBglIIサイト間に組み込んだ。
(c).(a)で得られたベクターをXhoIおよびSalI処理して約12 kbpを切り出し、(b)で得られたベクターのXhoIサイトに組み込んだ。
(d).F3をXhoI処理して約9.5 kbpを切り出し、(c)で得られたベクターのXhoIサイトに組み込んだ。【００４９】
＜３．ヒトCYP1A1及びCYP1A2の転写制御領域の一部を欠失したレポーターベクターの作製＞
図２に示すヒトCYP1A1及びCYP1A2の転写制御領域の一部を欠失したＢ〜Ｊ，Ｎ，Ｏ，Ｔ，Ｕの各レポーターベクターを作製した。
Ａ：欠失していない上記２で作製したベクターである。【００５０】
Ｂ：以下の手順で作製した。
(e).F1をBamHI処理して約10 kbpを切り出し、V1のBglIIサイトに組み込んだ。
(f).F2をXhoIおよびBamHI処理して約5.3 kbpを切り出し、V2のXhoIおよびBglIIサイト間に組み込んだ。
(g).(e)で得られたベクターをXhoIおよびSalI処理して約12 kbpを切り出し、(f)で得られたベクターのXhoIサイトに組み込んだ。【００５１】
Ｃ：BをBst1107I処理し、セルフライゲーションして作製した。【００５２】
Ｄ：BをBst1107I処理して約21 kbpと6.9 kbpのフラグメントを切り出し、精製後、21 kbpのフラグメントは脱リン酸処理し、6.9 kbpのフラグメントとライゲーションさせて作製した。【００５３】
Ｅ：BをSse8387IおよびBst1107I処理して約13.7 kbpのフラグメントを切り出し、精製後、平滑末端処理してセルフライゲーションして作製した。【００５４】
Ｆ：BをSse8387IおよびXhoI処理して約17.6 kbpのフラグメントを切り出し、精製後、平滑末端処理してセルフライゲーションして作製した。【００５５】
Ｇ：以下の手順で作製した。
(h).BをNheI処理して約4 kbpのフラグメントを切り出した。
(i).(b)で得られたベクターをNheI処理し、(h)で得られたフラグメントを挿入した。【００５６】
Ｈ：BをEcoRV処理し、セルフライゲーションして作製した。【００５７】
Ｉ：BをBst1107I処理して約18.5 kbpのフラグメントを切り出し、精製後、EcoRV処理し、セルフライゲーションして作製した。【００５８】
J：以下の手順で作製した。
(j).BをXhoIおよびSalI処理して約14.5 kbpのフラグメントを切り出し、精製後、セルフライゲーションした。
(k).(j)で得られたベクターをSacIIおよびEcoRV処理して約13.2 kbpのフラグメントを切り出し、平滑末端処理後、セルフライゲーションさせた。
(l).(k)で得られたベクターをSse8387IおよびMluI処理して約6.3 kbpのフラグメントを切り出し、精製後、ＡのSse8387IおよびMluIサイト間に組み込んだ。【００５９】
N：FをHindIII処理し、約11 kbpのフラグメントを切り出した。これをpRL-SV40 (Promega)のHindIIIサイトに組み込んだ後、EcoO65IおよびXhoI処理し、平滑末端処理後にセルフライゲーションさせた。これをHindIII処理しインサートを切り出して、V3とライゲーションさせた。【００６０】
O：HをHindIII処理し、約5 kbp と6 kbpのフラグメントを切り出した。6 kbpのフラグメントをV1のHindIIIサイトに組み込んだ後、EcoO65IおよびBst1107I処理し、平滑末端処理後にセルフライゲーションさせた。これをHindIII処理しインサートを切り出して、HをHindIII処理した際の約5 kbpのフラグメント（V3とする）とライゲーションさせた。【００６１】
Ｔ：以下の手順で作製した。
(t1).F1をBamHI処理し、約9.7 kbのフラグメントを切り出し、これをV2のBgl IIサイトに組み込んだ。
(t2).(t1)をHindIII処理し、約9.1 kbのフラグメントを切り出した。これをV2のHindIIIサイトへ組み込んだ。
(t3).(t2)をSse8387IとBsp1407Iで処理し、約9.3kbのフラグメントを切り出した。平滑末端処理後、セルフライゲーションさせた。
(t4).F1をBamHI処理し、約9.7 kbのフラグメントを切り出し、これをV1のBglIIサイトに組み込んだ。これをHindIII処理し、約5.5 kbのフラグメントを切り出した。
(t5).(t3)をHindIIIおよびBamHI処理して約4.6 kbのフラグメントを得た。これと(t4)をライゲーションさせた。
(t6).(t5)をXhoIおよびSalI処理し、LのXhoIサイトに組み込んだ。
(t7).F3をXhoI処理して約9.5 kbを切り出し、(t6)のXhoIサイトに組み込んだ。【００６２】
Ｕ：以下の手順で作製した。
(u1).(t1)をBsp1407I処理し、6.4 kbをセルフライゲーションさせた。これをMluIとHindIII処理したのち、約1.8 kbのフラグメントを切り出した。これをV1のMluIとHindIIIサイト間に挿入した。
(u2).LをXhoIおよびSalI処理し、約7.1 kbのフラグメントを得た。これを(u1)のXhoIサイトに組み込んだ。
(u3).F3をXhoI処理して約9.5 kbを切り出し、(u2)のXho Iサイトに組み込んだ。【００６３】
各ステップで得られたクローンは、制限酵素処理を行った後にアガロースゲル電気泳動を行って目的物であることを確認した。【００６４】
＜４．Ａ〜Ｊ，Ｎ，Ｏ，Ｔ，Ｕの各発現ベクターを用いたレポーターアッセイ＞
得られたヒトCYP1A1及びCYP1A2の転写制御領域を含むレポーターベクター及び転写制御領域の一部を欠失したレポーターベクターを遺伝子導入試薬（FuGene6, Roche社）を用いてHepG2細胞（RIKENより購入）に一過性発現させ、DMSOに溶かした化合物、あるいはDMSOのみを添加後約40時間後にCYP1A2を反映する分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）、およびCYP1A1を反映するルシフェラーゼ（Luc）活性を測定した。SEAP活性の測定には、LumiPhos 530（Lumigen Inc.）を基質として使用した。また、Luc活性はLuciferase Assay System（Promega社）を用いて測定した。（図３）【００６５】
図３には、DMSOのみを添加した場合と比較して、化合物を添加した場合にレポーター活性が何倍に上昇するかを示した。CYP1A1およびCYP1A2を誘導することで知られている3-メチルコラントレン（3-MC, 1μM）やβ-ナフトフラボン（BNF, 10μM）を添加すると、DMSOのみを添加した群と比較してSEAP活性及びLuc活性の増加が認められた。【００６６】
特に図２に示すようにXREがかたまって存在する配列番号１の塩基番号1535〜2867の塩基配列の領域を含むレポーターベクターでは、3-MC、BNFによる発現増強が強く見られ、薬剤によるCYP1A1およびCYP1A2の誘導には、この領域が関わっていることが予想された。【００６７】
＜５．CYP1A2レポーターベクターの作製とレポーターアッセイ＞
図４に示すヒトCYP1A2の転写制御領域を含むと考えられるＫ〜Ｍ，Ｐ〜Ｓの各レポーターベクターを作製した。【００６８】
Ｋ：以下の手順で作製した。
(m).F2をKpnI処理し、約3.2 kbpを切り出した。
(n).(m)をV2のKpnIサイトに組み込んだ。【００６９】
Ｌ：以下の手順で作製した。
(o).F2をXhoIおよびBamHI処理し、約5.3 kbpを切り出した。
(p).(o)をV2のXhoI/BglIIサイトに組み込んだ。【００７０】
Ｍ：以下の手順で作製した。
(q).F2をMluIおよびHindIII処理し、約3 kbpを切り出し、V2のMluIおよびHindIIIサイト間に組み込んだ。
(r).V2をHindIII処理し、約9 kbpを切り出し、(q)のHindIIIサイトに組み込んだ。【００７１】
P：以下の手順で作製した。
(s). F3をXhoI処理し、約9.5 kbpを切り出し、LのXhoIサイト間へ組み込んだ。【００７２】
Q：以下の手順で作製した。
(t).F1をNheIおよびSpeI処理し、約4.2 kbpを切り出し、LのNheIサイト間へ組み込んだ。【００７３】
Ｒ：以下の手順で作製した。
(u).AをNheI処理し、セルフライゲーションさせた。【００７４】
Ｓ：以下の手順で作製した。
(v).F1をBsp1407IおよびEcoRV処理し、約1.6 kbのフラグメントを切り出した。これをV2のAsp718I / Nru Iサイトに組み込んだ。
(w).KをMunIおよびEcoRI処理して約790 bpのフラグメントを得た。これを(v)で得られたベクターのEcoRIサイトに組み込んだ。【００７５】
各ステップで得られたクローンは、制限酵素処理を行った後にアガロースゲル電気泳動を行って目的物であることを確認した。【００７６】
４と同様に、上記で得られたＫ〜Ｍ，Ｐ〜Ｓの各発現ベクターを遺伝子導入試薬を用いてHepG2細胞に一過性発現させ、DMSOに溶かした化合物、あるいはDMSOのみを添加後約40時間後に分泌型アルカリフォスファターゼを測定した。（図５）【００７７】
図５には、DMSOのみを添加した場合と比較して、化合物を添加した場合にレポーター活性が何倍に上昇するかを示した。K、LおよびPを用いた場合、BNFあるいは3-MC添加後のレポーター活性はDMSOを添加した場合とほぼ同じ（１倍）で、レポーター活性の上昇は認められなかった。また、Mを用いた場合、DMSOあるいは誘導剤添加によるレポーター活性はいずれもバックグラウンドレベルであった。【００７８】
これに対し、CYP1A1近傍の領域を含むQ、R及びSでは、BNFあるいは3-MC添加後のレポーター活性はDMSOを添加した場合と比較して５〜６倍のレポーター活性を示し、薬剤による誘導が認められた。【００７９】
図３の結果と合わせると、XREがかたまって存在する配列番号１の塩基番号1925〜2867の塩基配列の領域を含むレポーターベクターでは、3-MC、BNFによる発現増強が強く見られ、薬剤によるCYP1A2の誘導には、この領域が関わっていることが予想された。【００８０】
ヒトCYP1A2近傍の転写制御領域のみでは、転写は起こるものの薬剤による誘導は観察されないか、場合によっては（Ｍ）転写そのものが観察されなかった。CYP1A2転写活性の薬剤による誘導を反映させるためには、CYP1A1近傍の領域が必須であることが明らかとなった。【００８１】
＜６．Ａ〜Ｊ，Ｎ，Ｏ，Ｔ，Ｕの各発現ベクターを用いたオメプラゾールによる誘導の検討＞
４で、3-メチルコラントレン及びβ-ナフトフラボンで誘導がかかることを明らかにしたＡ〜Ｊ，Ｎ，Ｏ，Ｔ，Ｕの各レポーターを用い、同様に誘導活性があることが知られているオメプラゾールについて、レポーター酵素の転写誘導が起こるかを検討した。（図６）【００８２】
４と同様に、Ａ〜Ｊ，Ｎ，Ｏ，Ｔ，Ｕの各レポーターベクターを遺伝子導入試薬を用いてHepG2細胞に一過性発現させ、DMSOに溶かした化合物、あるいはDMSOのみを添加後約40時間後にCYP1A2を反映する分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）、およびCYP1A1を反映するルシフェラーゼ（Luc）活性を測定した。【００８３】
図６には、DMSOのみを添加した場合と比較して、化合物を添加した場合にレポーター活性が何倍に上昇するかを示した。3-メチルコラントレンやβ-ナフトフラボンと同様にオメプラゾールにおいてもレポーター酵素の発現誘導が認められ、本レポーター系が、薬剤によるCYP1A1及びCYP1A2の誘導を反映した系であることが確認された。【００８４】
＜７．XREを一つずつ欠失したレポーターベクターの作製とレポーターアッセイ＞
Eのレポーターベクターを元にCYP1A1遺伝子の転写開始点から近いほうから、XRE (5'- TNGCGTG -3') 5つについて、ひとつずつ欠失させたものをSite-directed mutagenesis法を用いて作成し、それぞれE1〜E5と命名した。【００８５】
Site-directed mutagenesis法には以下のDNAをテンプレートとして用いた。
1).E1：EをSac II処理した後セルフライゲーションさせ、これをさらにKpn I処理後にセルフライゲーションしたDNA。
2).E2〜E5：EをNhe I処理した後セルフライゲーションさせ、これをさらにNde I処理後にセルフライゲーションさせたDNA。【００８６】
また使用したプライマーを表１にまとめた。表中のカッコ内には、配列番号１におけるこれらXREの位置を示した。【００８７】
【表１】
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【００８８】
得られたベクターを用いてレポーターアッセイを実施した。結果を図７〜９に示す。３番目のXREを欠失させたE3で多少低いものの、BNF、3-MCあるいはオメプラゾール添加後のレポーター活性はDMSOを添加した場合と比較して数倍から１０倍以上の活性を示し、XREが部分的に欠失しても発現誘導能は保たれることが明らかとなった。薬剤による発現誘導には、XREがある程度固まって存在することが必要であると考えられた。【００８９】
図５で示したＭのレポーターベクターでは、CYP1A2側の４個のXRE（表２のE9、E10、E11およびE12）を含むにもかかわらず、薬物添加によるレポーター活性の増加が認められなかった。またこれらを欠失したＥ、Ｈ及びＩのレポーターベクターでもレポーター活性が大きく変動しなかったことから、これらのXREは薬物による誘導には必ずしも重要ではないと思われる。これらのXREの配列はいずれもTGGCGTG あるいは TAGCGTGであった。【００９０】
一方、両遺伝子の誘導に重要な役割を果たしていると思われるXREは、E1からE5であり、これらの配列はいずれも TCGCGTG（E1, E4）あるいはTTGCGTG（E2, E3, E5）であった。【００９１】
また、図２及び図３でＴとＵのレポーターベクターを比較すると、Ｔの配列はXREがかたまって存在する配列番号１の塩基番号1535〜2867の領域は含まれないものの、6642から始まるXRE（表２のE8、TTGCGTG）を含んでおり、3-MC、BNFによる発現増強が強く見られるのに対し、E8を含まないＵの配列では誘導が見られないことから、E8のXREも薬剤による誘導に重要な働きをしていると考えられた。【００９２】
これらのことから、CYP1A1およびCYP1A2の誘導に重要な役割を果たしているのは、TCGCGTGあるいはTTGCGTGではないかと予測された。【００９３】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明により、ヒトのCYP1A1又はCYP1A1及びCYP1A2の誘導を反映するレポーター系が確立され、これらを誘導する薬剤のスクリーニングが容易となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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