【手続補正書】
【提出日】平成19年8月14日(2007.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】生体骨組織再生用細胞を得る方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体骨組織の再生に用いられる骨組織再生用細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を採取すること、
採取した細胞浮遊液を少なくとも夾雑細胞を通過させ骨組織再生用細胞を捕捉する細胞分離フィルターに通液すること、
該細胞分離フィルターに流体を導入して細胞分離フィルターにいったん捕捉された骨組織再生用細胞を回収すること、および
前記回収された骨組織再生用細胞を培養すること、
を含む、生体骨組織再生用細胞を得る方法。
【請求項２】
生体骨組織の再生に用いられる骨組織再生用細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を個体から採取すること、
採取した細胞浮遊液を少なくとも赤血球を通過させ生体骨組織再生用細胞を捕捉する細胞分離フィルターに通液すること、
細胞分離フィルターから通過流出した赤血球を回収すること、
該細胞分離フィルターに流体を導入して細胞分離フィルターにいったん捕捉された骨組織再生用細胞を回収すること、
前記回収された赤血球を同一個体または別の個体用の輸血用血液とすること、および
前記回収された骨組織再生用細胞を培養すること、
を含む生体骨組織再生用細胞と輸血用赤血球を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体骨組織の再生に用いられる骨組織再生用細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液から骨組織再生用細胞を分離して、生体骨組織の再生に使用する細胞を得る方法に関する。さらに詳細には、本発明は、いわゆる組織工学を用いて生体骨組織の病変および／または欠損を修復再生するために用いる細胞の取得方法に関する。得られた細胞は生体骨組織再生用細胞を用いて行う各種生体骨組織病変および／または欠損の治療及び免疫学や細胞生物学等の基礎科学分野で用いることが可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体の組織または臓器（以下、単に組織という）の幹および／または前駆細胞を用いて、同組織をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで形成することで組織の病変および／または欠損を治療する、いわゆる組織工学（Ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。再生医学とも言う）が大変注目を集めており、世界各国で研究開発が盛んに行われている（例えば、「月刊組織培養工学」Ｖｏｌ．２４、Ｎｏ．４、特集：組織工学Ｉ（１９９８年４月）；同、Ｖｏｌ．２４、Ｎｏ．５、特集：組織工学ＩＩ（１９９８年５月））。
【０００３】
骨髄や血液（末梢血、臍帯／胎盤血）中には骨や軟骨、血管などを形成する細胞の幹／前駆細胞である間葉系幹／前駆細胞が含まれていることが明らかにされた（例えば、国際公開特許ＷＯ９５／２５１６４号公報、ＷＯ９７／２６３２６号公報、英国公開特許ＧＢ２３０１１１４Ａ号公報）。これらの細胞が存在する部位には、しばしば赤血球などの夾雑細胞が混在しており、夾雑細胞を除去し組織再生用細胞を濃縮分離する必要がある。国際公開特許ＷＯ９５／２５１６４号公報にはＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ比重遠心法を用いて、末梢血から、組織再生用細胞を濃縮分離する方法が開示されている。また、英国公開特許ＧＢ２３０１１１４Ａ号公報にはＰｅｒｃｏｌｌ比重遠心法を用いて骨髄から組織再生用細胞を濃縮分離する方法が開示されている。これら、比重遠心法がベースとなる方法は、免疫学や細胞生物学、あるいは臨床検査医学などの実験室レベルでは汎用される方法ではあるが、操作が煩雑で、しかもクリーンベンチ内で行われるものの完全開放系の操作のため無菌性に難があり、臨床行為としては到底受け入れられる方法ではなかった。組織工学が実験室レベルの実験医療から脱皮し、ルーチンの医療行為として発展するには、本分離濃縮操作の簡便化と非完全開放系での処理が待望されていた。
【０００４】
さらに、骨髄を患者から採取して骨髄の中の骨系前駆細胞を用いて骨欠損の治療に用いる場合、患者が貧血を起こすため骨髄は大量に採取できないという問題がある。この問題に対しては、同種血輸血あるいは貯血自己血による輸血という解決法もあるが、前者はウイルス感染の危険を否定できず、後者は骨髄採取とは別に自己血採血、保存という手間が追加されることになり、別の問題を生むことになる。
【０００５】
一方、血液医学の分野においては、造血組織、すなわち骨髄の再生である造血幹細胞移植は、すでに通常の医療行為として確立されている。同分野で用いる造血幹細胞の濃縮分離には、たとえば特開平８−１０４６４３号公報で提案されている、簡便操作が特徴であるフィルター法が利用されている。また、造血組織以外の生体組織再生用細胞についても、生体組織の病変および／または欠損の治療への応用や基礎科学分野での利用を目指して、本発明者らは、フィルター法による生体組織再生用細胞の分離方法を開発し、特許出願した（特願平１１−３４５５１５号）。これらの方法では、造血組織あるいは造血組織以外の生体組織再生用細胞を分離回収する方法は提供できたものの、分離回収した生体組織再生用細胞を生体組織再生に有効に利用できるまでには至っていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は簡便な操作かつ非開放系で骨組織再生用細胞を分離濃縮し、分離濃縮した骨組織再生用細胞を培養して生体骨組織再生用の細胞を得る方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる課題を解決すべく、鋭意検討を進めた。その結果、造血幹細胞の濃縮分離に用いるフィルターを用いると、造血組織以外の骨組織再生用細胞の濃縮分離も可能であるという驚くべき発見を行い、さらに分離濃縮した造血組織以外の骨組織再生用細胞を培養すれば生体骨組織の再生への実用も可能であることを見出した。さらに検討を進めた結果、本発明者らは、分離濃縮した生体骨組織再生用細胞から生体骨組織の再生に適する培養方法の具体的な条件を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）生体骨組織の再生に用いられる骨組織再生用細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を採取すること、採取した細胞浮遊液を少なくとも夾雑細胞は通過し骨組織再生用細胞は捕捉する細胞分離フィルターに通液すること、細胞分離フィルターに流体を導入して細胞分離フィルターにいったん捕捉された骨組織再生用細胞を回収すること、回収された骨組織再生用細胞を培養することを含む生体骨組織再生用細胞を得る方法、および（２）生体組織の再生に用いられる骨組織再生用細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を個体から採取すること、採取した細胞浮遊液を少なくとも赤血球は通過し骨組織再生用細胞は捕捉する細胞分離フィルターに通液すること、細胞分離フィルターから通過流出した赤血球を回収すること、細胞分離フィルターに流体を導入して細胞分離フィルターにいったん捕捉された骨組織再生用細胞を回収すること、前記回収された赤血球を同一個体または別の個体用の輸血用血液とすること、および前記回収された骨組織再生用細胞を培養することを含む、生体骨組織再生用細胞を得る方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明で言う生体骨組織とは、骨、軟骨などの結合組織のことを言う。本発明で言う生体骨組織再生用細胞とは、前述の組織を再生するために用いられる、前述の組織の幹および／または前駆細胞のことを言い、例えば造血幹細胞および／または造血前駆細胞、間葉系前駆細胞、血管内皮前駆細胞、神経幹細胞などがあげられるが、これらに限定されるものではない。また、生体骨組織の再生は、当該組織の病変、欠損、傷害などで必要になるが、これらに限定されるものではない。夾雑細胞とは、これらの細胞が存在する部位にしばしば混在する、赤血球など本発明の組織の再生機能を有していない細胞のことを言う。
【００１０】
これらを含む細胞浮遊液とは、赤血球と生体骨組織再生用細胞とを含むものならいずれでも良い．具体的には、骨髄液、臍帯血（臍帯血管から採血されたものだけでなく、胎盤血管から採血されたものも含む）、末梢血、リンパ液及びこれらに遠心分離等何らかの処理を施したもの、あるいは各種臓器や組織から抽出した細胞を何らかの液体に再浮遊したものがあげられる。たとえば骨髄液、臍帯血などは造血組織の再生に用いられる造血幹細胞と、造血組織を除く生体組織の再生に用いられる組織再生用細胞とを含み本発明で好適に用いられる細胞浮遊液である。
【００１１】
本発明で言う夾雑細胞は通過して生体組織再生用細胞は捕捉する細胞分離フィルターとは、濾材を液体導入口と液体導出口を有する容器に充填したものである。濾材としては通常用いられている有核細胞捕捉材であればいかなる材料も使用できるが、成形性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニム等の金属があげられる。
【００１２】
また、濾材の形状としては、織布、不織布、スポンジ状構造体、膜等があげられる。不織布の場合、後述する抗体等の特定の細胞に特異的に結合するいわゆるバイオリガンド類を表面に固定しない場合は、通常、繊維径は１．０μｍ以上３０μｍ以下であり、好ましくは１．０μｍ以上２０μｍ以下であり、さらにより好ましくは１．５μｍ以上１０μｍ以下である。１．０μｍ未満では回収必要細胞が強固に捕捉されてしまい回収困難となる可能性がある。また、３０μｍを超えると回収必要細胞が繊維に捕捉されず素通りする可能性が高くなる。いずれの場合も回収率の低下につながるおそれがあるので好ましくない。
【００１３】
また、スポンジ状構造体を用いる場合、孔径は通常２．０μｍ以上２５μｍ以下であり、好ましくは３．０μｍ以上２０μｍ以下であり、さらにより好ましくは４．０μｍ以上１５μｍ以下である。２．０μｍ未満では流れ性が著しく劣り、通液自体が困難になるおそれがあり、また２５μｍを超えると回収必要細胞の捕捉率が低下し、回収率の低下を招くので好ましくない。
【００１４】
この濾材を充填する、液体導入口と液体導出口を有する容器の材質としては成形性や滅菌性に優れ、細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の合成高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられるが、これらに限定されるものではない。容器の構造としては、形状は直方体、立方体、円柱形、楕円柱形などがあげられるが、いずれの形状でもよい。また、液体導入口と液体導出口の位置としては、液体導入口は濾材の最上層に液体を導入できる位置であればよく、また液体導出口は濾材の最下層から液体を導出できる位置であれば良い。
【００１５】
本発明による生体骨組織再生用細胞の分離方法は前述の生体骨組織再生用細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、前述の細胞分離フィルターに通液した後、流体を該フィルターに導入して捕捉されている生体骨組織再生用細胞を回収するものであるが、回収用の流体を導入する前に、該フィルターに微量残存する夾雑細胞を洗い流す目的でリンスを行っても良い。リンス液としては細胞に悪影響を及ぼさない液体であればいかなる液体も使用可能であるが、いくつか例示すると生理食塩水、ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）やハンクス液（ＨＢＳＳ）などの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０などの培地があげられる。リンス液の導入方向としては生体骨組織再生用細胞と夾雑細胞を含む細胞浮遊液の通液方向と同一方向あるいは逆方向が考えられるが、同一方向の方が捕捉された細胞が漏出する可能性が低い傾向にあるのでより好ましい。
【００１６】
捕捉した細胞を回収するために該フィルターに導入する流体としては細胞に悪影響を及ぼさない流体であればいかなる流体も使用できるが、いくつか例示すると、生理食塩水、Ｄ−ＰＢＳ（ダルベッコリン酸塩緩衝液）、ＨＢＳＳ（ハンクス液）などの緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０などの培地があげられる。これらの液体に、細胞保護、栄養補給、抗凝固性付与、凍結保存時の凍害防止、粘度向上（回収率向上に有効な場合がある）等の目的で必要に応じ、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース、クエン酸化合物、ＥＤＴＡ、ジメチルスルホキシド、デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリセリン、キチン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチン等を添加してもよい。また、ここで言う流体とは、液体単体のみならず、空気、アルゴン、窒素など細胞に悪影響を及ぼさない気体を混合したものも含まれる。流体の導入方向としては生体骨組織再生用細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液の通液方向と同一方向あるいは逆方向が考えられるが、逆方向の方が高い回収率が得られる傾向にあるのでより好ましい。
【００１７】
本発明による生体骨組織用細胞の分離方法においては、夾雑細胞は細胞分離フィルターを通過するが、この通過した夾雑細胞を回収して何らかの目的に利用することもできる。たとえば、細胞浮遊液が骨欠損患者から得られた骨髄で、生体骨組織の再生に用いられる細胞が骨系前駆細胞で、同細胞を用いて骨欠損の治療（骨の再生）を行う場合、夾雑細胞は赤血球であり、この細胞分離フィルターから通過流出した赤血球を血液バッグ等に回収・保存し、基礎科学実験用赤血球検体としての利用や人工赤血球の原料となるヘモグロビンの採取目的に用いることができる。また、輸血用血液として患者に輸血することもでき、骨髄採取による貧血を防止することができ好ましい。
【００１８】
本発明の生体骨組織用細胞の取得方法においては少なくとも骨組織再生用細胞を含む細胞浮遊液を個体から採取するが、その採取方法は、たとえば骨髄であれば骨髄穿刺針を用いるなど適宜選択する。本発明では細胞分離フィルターにいったん捕捉させ回収した生体骨組織再生用細胞を前述の個体に移植できるのみならず、別の個体への移植、あるいは生体外で生体骨組織の再生に利用することができる。細胞分離フィルターから通過流出した赤血球は、基礎科学実験用赤血球検体としての利用や人工赤血球の原料となるヘモグロビンの採取目的に用いることができる。また、輸血用血液として患者に輸血することもでき、特に前述の個体に輸血した場合は、個体の貧血予防になるためより好ましい。
【００１９】
本発明で得られた生体骨組織再生用細胞は、そのまま、あるいは必要に応じさらなる分離精製、培養、活性化、分化誘導、増幅、遺伝子導入、凍結保存、ＷＯ９７／２６３２６号公報で提案されているハイドロキシアパタイトなどの骨補填材との複合化などの各種処理が施された後、各種生体骨組織の病変および／または欠損の治療や基礎科学分野の研究に用いられる。具体的には、本発明では、細胞分離フィルターから５％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）で回収した生体骨組織再生用細胞分離液を５％ＣＯ2雰囲気で２週間培養した後、Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを添加した１５％ＦＢＳ含有ＭＥＭでさらに２週間培養したところ、ｉｎ ｖｉｔｏｒｏで骨を形成させることができた。本発明は、このような細胞分離フィルターから回収した骨組織再生用細胞から生体骨組織再生を行うために必要な条件を初めて見出したものである。
【００２０】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
１．細胞分離フィルター    平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布（目付約６０ｇ／ｍ2、嵩高約０．３ｍｍ）１８枚と平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布（目付約１００ｇ／ｍ2、嵩高約０．４７ｍｍ）１６枚を重ね、押し切りカッターで３５ｍｍ角に切断し細胞分離フィルター材とした。この細胞分離フィルター材を容器外寸（縦×横×厚み）４１×４１×１８ｍｍで液体流出口と液体流入口を対角線上に持つポリカーボネート製容器の出口側に平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布がくるように充填して細胞分離フィルターとした。この細胞分離フィルターの入口側には
1187063631593_0
に示すように先端がスパイク２で、途中に細胞回収バッグ６への分岐を有する三方活栓４を有するチューブを接続した。また、細胞分離回収フィルター１の出口側には途中に三方活栓５を有し、末端が赤血球バッグ３に接続されるチューブを接続し
1187063631593_1
に示す細胞分離回収装置とした。
【００２１】
２．原料細胞浮遊液    常法によりヒト骨髄液３ｍｌを採取し、ただちに６単位／ｍｌヘパリン添加Ｄ−ＰＢＳ３ｍｌと混和し、細胞分離操作直前に１５％Ｆｅｔａｌ ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（ＦＢＳ、ギブコ社製）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ ＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、シグマ社製）６０ｍｌで希釈して原料細胞浮遊液とした。
【００２２】
３．細胞分離回収操作    １．で作製した細胞分離回収装置のスパイク２に２．の原料細胞浮遊液入り血液バッグ（以下、血液バッグ）を接続した。三方活栓４は血液バッグと細胞分離フィルター１のみが連通する方向に、三方活栓５は細胞分離フィルター１と赤血球バッグのみが連通する方向にして原料細胞浮遊液を細胞分離フィルターに落差で通液濾過し、フィルターから流出した赤血球を赤血球バッグに回収した。空になった血液バッグを生理食塩水入りバッグと交換し、フィルターに１００ｍｌの生理食塩水を通液し、フィルター内に微量残存する赤血球を洗い流し、この洗液も赤血球バッグに回収した。次に三方活栓５に１５％ＦＢＳ含ＭＥＭ３０ｍｌを入れた３０ｍｌ注射器（ルアーロック口）を接続し、三方活栓５は注射器と細胞分離フィルター１のみが連通する方向にし、三方活栓４は細胞分離フィルター１と細胞回収バッグ６のみが連通する方向にした。次に注射器のプランジャーを手で押すことで細胞分離回収フィルター１に捕捉されている細胞（以下、骨組織再生用細胞）を回収バッグ６に回収した。
【００２３】
４．培養操作３．で回収した骨組織再生用細胞を１５ｍｌをＴ７５ティッシュカルチャーフラスコに入れ５％ＣＯ2インキュベータで２週間培養した後、付着細胞を公知のトリプシンを用いる方法で剥離、回収した。
【００２４】
５．評価赤血球バッグ３に回収された赤血球数を測定した。赤血球数は自動血球カウンターを用いて測定した。原料細胞浮遊液中の赤血球数、赤血球バッグ中の赤血球数とこれらから算出した赤血球回収率を表１に示す。
【表１】
2002080377.tif 000001
【００２５】
また、細胞回収バッグに回収された有核細胞数を自動血球カウンターを用いて測定した。原料細胞浮遊液中の有核細胞数、細胞回収バッグ中の有核細胞数、これらから算出した有核細胞回収率を表２に示す。なお、有核細胞の全てが骨組織再生用細胞ではないが、骨組織再生用細胞はこの有核細胞に含まれている。
【表２】
2002080377.tif 000002
【００２６】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏの骨形成は、以下の方法で評価した。すなわち、回収した５×１０4の細胞を直径３５ｍｍの培養用ディッシュに入れ、１０ｍＭのＧｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、８２μｇ／ｍｌのＶｉｔａｍｉｎ Ｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０ｎＭのＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（いずれも最終濃度）を添加した１５％ＦＢＳ含ＭＥＭで２週間培養を行った後、アリザリン染色およびアルカリフォスファターゼ染色で評価した。
【００２７】
６．結果本分離操作により骨組織再生用細胞を分離回収できること、及び、得られた組織再生細胞用細胞は
1187063631593_4
に示すごとくｉｎ ｖｉｔｒｏで骨を形成する能力を有することが明らかになった。
1187063631593_5
においては、矢印で囲んだ部分に石灰化が観察され、骨を形成していることが確認できる。また、赤血球バッグには原料細胞浮遊液の赤血球の９０％という高い回収率で赤血球が回収されていた。
【００２８】
【実施例２】
１．細胞分離フィルター実施例１のフィルターに通液性を高めるために以下の方法で親水性ポリマーをコートする以外は同様な操作を行った。すなわち、実施例１のフィルターにヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（モル比＝９７：３）の１％エタノール溶液１５ｍＬを該細胞分離フィルターの液体流入口から通エキし、窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした後、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥させ細胞分離フィルターとした。本フィルターを実施例１と同様な回路を接続し、細胞分離回収装置とした。
【００２９】
２．原料細胞浮遊液実施例１と同様の原料細胞浮遊液を用いた。
３．細胞分離回収操作実施例１と同様な細胞分離回収操作を行った。
【００３０】
４．培養操作実施例１と同様な培養操作を行った。
５．評価実施例１と同様に骨形成および回収した赤血球の評価を行った。原料細胞浮遊液中の赤血球数、赤血球バッグ中の赤血球数とこれらから算出した赤血球回収率を表３に示す。
【表３】
2002080377.tif 000003
６．結果実施例１と同様な骨形成像が得られた。また、赤血球バッグには原料細胞浮遊液の赤血球の９１％という高い回収率で赤血球が回収されていた。
【００３１】
【発明の効果】
以上示したように本発明によれば簡便な操作かつ非開放系で原料細胞浮遊液中の骨組織再生用細胞を機能を維持したまま分離濃縮でき、分離濃縮した骨組織再生用細胞が組織再生能力を有していることが分かった。また同時に赤血球も高率に回収できるので、組織工学が実験室レベルの実験医療から脱皮し、ルーチンの医療行為への発展に貢献すること極めて大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の生体組織再生用細胞分離装置の模式図である。
【図２】実施例１で分離された細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ骨形成の状態を示した写真である。
【符号の説明】
１ 細胞分離フィルター
２ スパイク
３ 赤血球バッグ
４ 三方活栓
５ 三方活栓
６ 細胞回収バッグ
７ 細胞回収用流体の注入手段