【手続補正書】
【提出日】平成20年7月28日(2008.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
下記の略語を使用する：
ＦＡＣＳバッファー  ＰＢＳ、２％  ＦＣＳおよび０．２％  ＮａＮ３
ＦＣＳ              ウシ胎仔血清
ＦＩＴＣ            フルオレセインイソチオシアネート
ＩＣ５０             阻害濃度
ＫＬＨ              キーホールリンペットヘモシアニン
ｍＡｂ              モノクローナル抗体
ＭＴＸ              メトトレキサート
ＰＢＳ              リン酸緩衝化生理食塩水
ｓＩｇＤ            表面免疫グロブリンＤ
ｒｍＩＬ−３        組換えマウスインターロイキン−３
ｒｈＩＬ−４        組換えヒトインターロイキン−４
ｒｈＩＬ−１３      組換えヒトインターロイキン−１３
ｒｐｍ              １分間当たりの回転数
ＲＰＭＩ            Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地
ＲＴ                室温
ＴＦ−バッファー    ２７２ｍＭ  スクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７ｍＭ  リン酸
バッファーｐＨ７．４
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
実施例１：
ａ）抗体製造
抗体の配列番号５または７（＝重鎖）の配列および配列番号６または８（＝軽鎖）の配列の可変領域をコードするプラスミドを、ヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ１重鎖の発現カセットにクローン化する。
特異性決定領域を、完全なモノクローナル抗体を生成するために必要な因子、すなわちプロモーター、リーダー配列および機能的免疫グロブリンタンパク質の発現に必要である抗体定常領域エクソンにスプライシングするためのスプライスドナー部位と結合させる。リーダー配列、可変領域および定常領域エクソンＣＨ１−ＣＨ４およびκをスプライシングするための３’スプライスドナー部位をコードする、重鎖および軽鎖抗体の可変領域カセットを哺乳動物の発現ベクターＨＣ（重鎖ベクター、ヒトＩｇＧ１）およびＬＣ（軽鎖ベクター、ヒトκ）に導入する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
軽鎖を含むプラスミドおよび重鎖を含むプラスミドを、共トランスフェクションアプローチでＳｐ２／０細胞に導入する。例えばトランスフェクションのために、約９５％が生存力のある指数増殖期の細胞を使用する。細胞を冷ＴＦ−バッファーで２回洗浄し、細胞濃度を２×１０７細胞／ｍｌにＴＦ−バッファーで調節する。得られた０．８ｍｌの細胞懸濁液をそれぞれ１５μｇの重鎖および軽鎖プラスミドと混合し、氷上に１０分間置く。トランスフェクションをＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（２８０Ｖおよび２５μＦ）を使用してエレクトロポレーションにより行う。エレクトロポレーション後、細胞を氷上に１５分間置き、５０ｍｌの冷培養培地に移し、１日３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションする。クローン増幅のために、得られたＧ４１８抵抗細胞を２００ｎＭ  ＭＴＸの存在下で培養する。異種細胞プールのアリコートを、９６ウェルプレートに１生存細胞／ウェルのクローン密度で２００ｎＭ含有培養培地にまき、増幅細胞のクローン集団の選択を可能にする。限界希釈クローニングを利用し、増幅および血清非含有培養条件への適応後、クローン細胞系を生成する。細胞を２個の９６ウェルプレートに濃度０．５細胞／ウェルでまく。播種１日後、ウェルをクローン分析のために顕微鏡でスクリーニングする。モノクローナル抗体のみをさらなる試験のために使用する。
得られた抗体は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
ｂ）親和性測定
本発明のヒトｍＡｂｓの親和性測定を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標登録）２０００装置で行う。抗−ヒトＩｇＧをＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ  ＣＭ−５（ＢＩＡｃｏｒｅ）でコーティングし、それにより一定量のヒトｍＡｂｓの適用がこの準備された表面上に捕獲され、したがって測定する不応特性（refractory property）を変化させるようにする。ｒｈＩＬ−４のその後の適用が不応特性のさらなる変化をもたらし、それによりＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアによる会合速度（Ｋｏｎ、近づく速度）および解離速度（Ｋｏｆｆ、離れる速度）ならびにこれら２個の積である親和性（Ｋｄ、解離定数、ｐＭで得られる）の測定ができる。ＢＩＡバッファーにおける各濃度のｒｈＩＬ−４を使用して、請求項２ａ）に記載のとおりのＣＤＲにより定義されるｍＡｂの４３ｐＭの親和性を測定する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
力価測定シリーズのために、抗体を、ＥＬＩＳＡで濃度測定した細胞培養上清物としてまたは同じ培地中、所望の最終濃度の４倍で精製した物質からのいずれかを使用する。サイトカインの前希釈物および抗体を等用量で混合し、１００μｌの前混合物を細胞で調製したウェルに移す。対照を背景増殖（サイトカイン非含有および抗体非含有培地＝１００％阻害）および最大増殖（サイトカインのみ含有する培地＝０％阻害）のために設定する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
Ｆｌｏｒｏｃｈｒｏｍｅ標識ｍＡｂｓ［ＨＬＡ−ＤＲ  ＦＩＴＣ（Ｃａｌｔａｇ＃ＭＨＬＤＲ０１  １：８００）、ＣＤ１９  ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ＃ＭＨＣＤ１９０４  １：２００）およびＣＤ２３  ＡＰＣ（Ｃａｌｔａｇ＃ＭＨＣＤ２３０５  １：２００）］をＦＡＣＳバッファー中で生成し、５０μｌ／ウェルで分配する。室温で３０−６０分インキュベーション後、ウェルをＦＡＣＳバッファーで満たし、遠心分離し、得られた残渣をＦＡＣＳバッファーで洗浄する。細胞をＦＡＣＳバッファー中、２μｇ／ｍｌプロピジウムアイオダイドと共に再懸濁し、デュアルレーザーＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。細胞をこれらの前方散乱および側方散乱特性ならびにプロピジウムアイオダイド排除能およびこれらのＣＤ１９発現にしたがって通過させる。ＣＤ２３発現における、任意の基準値（非誘導性細胞に対して設定）を超える細胞の平均蛍光強度およびパーセントを測定する。基準発現（１００％阻害）をサイトカインなしの細胞で測定し、一方０％阻害をサイトカインはあるがｍＡｂなしでインキュベーションした細胞で測定する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
７０ｐＭ組換えヒトＩＬ−４の存在下、この抗体の３３４ｐＭのＩＣ５０が、上記のとおりの細胞におけるＩＬ−４誘導ＣＤ２３発現について測定される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
ｃ５）未感作Ｂ細胞によるＩＬ−４誘導ＩｇＥ製造
磁気で分類された未感作Ｂ細胞をＸＶ１５中、３×１０５細胞／ｍｌに調節し、９６ウェルプレートのウェルあたり１００μｌで、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で１０日間培養中、ＰＢＳで満たされたウェルに囲まれたプレートの中央部の６×６アレイにまく。各３ウェルの非誘導および誘導対照、ならびに、最初７μｇ／ｍｌから出発し、２９ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで３倍希釈する、５０μｌ４倍濃縮前希釈溶液に添加された、ｍＡｂ力価測定の５回繰り返しからなる、各１プレートを試験すべきｍＡｂごとに調製する。誘導条件は、ｒｈＩＬ−４に加えて、５０μｌの４倍濃縮前希釈溶液に添加された最終濃度２０ｎｇ／ｍｌの０．５μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４０ｍＡｂ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。ＩｇＥ濃度を標準サンドウィッチＥＬＩＳＡ法により培養後に測定する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
この抗体の２８０６ｐＭのＩＣ５０が、上記のとおりの細胞におけるＩＬ−４誘導ＩｇＥについて測定される。