(57)【要約】  本発明に係るマイクロバッチ法における結晶化方法は、微量のタンパク質溶液の液滴に、タンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加してサンプル液滴を生成し、該サンプル液滴を所定の環境下においてサンプル液滴内のタンパク質を結晶化させるマイクロバッチ法おいて、各サンプル液滴の上方または下方に一対の電極を並べて配置し、前記電極によりサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加することを特徴とする。【選択図】    図１
2007063898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量のタンパク質溶液の液滴に、タンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加してサンプル液滴を生成し、該サンプル液滴を所定の環境下においてサンプル液滴内のタンパク質を結晶化させるマイクロバッチ法おいて、
各サンプル液滴の上方または下方に一対の電極を並べて配置し、前記電極によりサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加する
ことを特徴とするマイクロバッチ法における結晶化方法。
【請求項２】
前記結晶化のための電場を印加する前に、前記電極により800V/mmより高い電場を瞬間的にサンプル液滴に付加し、液滴が電極面に接触する面積を拡大させる
ことを特徴とする請求項１に記載の結晶化方法。
【請求項３】
前記電場が直流電場又は交流電場である
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の結晶化方法。
【請求項４】
前記電極を透明な材料で構成し、サンプル液滴の上方または下方に電極を配置したまま前記サンプル液滴の観察を行えるようにした
ことを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の結晶化方法。
【請求項５】
微量のタンパク質溶液の液滴にタンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加して生成されたサンプル液滴を保持する保持手段と、
前記保持手段の上方または下方であって、各サンプル液滴の上方または下方に並べて配置された一対の電極と
を有し、
前記電極により、保持手段で保持されたサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加するように構成した
ことを特徴とするマイクロバッチ法において用いられる結晶化装置。
【請求項６】
前記電極の上方又は下方に電気絶縁疎水性層が設けられ、
該電気絶縁疎水性層に隣接してサンプル液滴と混じりあわない溶液層から成る保持手段が配置され、
前記サンプル液滴と混じりあわない溶液層内でサンプル液滴が保持される
ことを特徴とする請求項５に記載の結晶化装置。
【請求項７】
前記結晶化のための電場を印加する前に、前記電極により800V/mmより高い電場を瞬間的にサンプル液滴に付加し、液滴が電極面に接触する面積を拡大させる
ことを特徴とする請求項５又は６に記載の結晶化装置。
【請求項８】
前記電場が直流電場又は交流電場である
ことを特徴とする請求項５〜７の何れか一項に記載の結晶化装置。
【請求項９】
前記電極を透明な材料で構成し、サンプル液滴の上方または下方に電極を配置したまま前記サンプル液滴の観察を行えるようにした
ことを特徴とする請求項５〜８の何れか一項に記載の結晶化装置。
【請求項１０】
進行波電場発生用電極及び、
該進行波電場発生用電極の上に配置されるサンプル液滴と混じりあわない溶液層を有する液滴保持手段とを備え、
前記進行波電場発生用電極に所定の周波数で電圧を印加することにより、前記液滴保持手段中に供給されたタンパク質の結晶化のために必要な試薬の液滴とタンパク質溶液の液滴とを移動して合体させてサンプル液滴を生成し、次いで、前記サンプル液滴を前記液滴保持手段内で保持するように構成された溶液処理手段と、
前記溶液処理手段における液滴保持手段に、前記液滴を供給する液滴供給手段と、
前記サンプル液滴を保持した液滴保持手段における各サンプル液滴に上方又は下方から結晶化のための電場を付与できるように電極が配置された結晶化手段と、
結晶化手段において結晶化がなされている液滴保持手段中のサンプル液滴の結晶化成長を監視するための結晶化成長監視手段と、
前記液滴保持手段をサンプル液滴保持後に結晶化手段へ移送し、結晶化手段と結晶化成長監視手段との間で液滴保持手段を移送することができる移送手段と
を有することを特徴とするタンパク質結晶化処理装置。
【請求項１１】
前記溶液処理手段の進行波電場発生用電極と前記結晶化手段の電極とが別々の電極である
ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質結晶化処理装置。
【請求項１２】
前記溶液処理手段の進行波電場発生用電極と前記結晶化手段の電極とが同一の電極である
ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質結晶化処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を結晶化する方法及び装置並びに前記タンパク質を結晶化する方法を適用したタンパク質結晶化処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学や医学の見地からタンパク質の構造や機能を知るためにタンパク質の構造解析の研究が盛んに行われている。
タンパク質の三次元構造を解析するための最も一般的な手法はＸ線構造解析法である。そして、このＸ線構造解析法によりタンパク質の三次元構造を解析するためには、タンパク質の良質な単結晶が必要になる。
このためタンパク質の構造解析のためには、タンパク質の結晶化が不可欠である。
タンパク質の結晶は、タンパク質の結晶化のために必要な試薬とタンパク質溶液とを適当な濃度で混合し、混合した溶液を適当な環境下に置くことで析出して成長する。
しかしながら、結晶化条件が確認できているタンパク質は非常に少ない。結晶化条件が確認できていないタンパク質の結晶化条件を確認するためには、試薬の種類、試薬濃度及び温度条件等を試行錯誤的に変化させ、数千種類を超える結晶化条件をスクリーニングする必要がある。
タンパク質の結晶化条件のスクリーニングを非常に多くの種類の結晶化条件に対して行うためには、非常に多くのサンプル溶液が必要になる。このため、非常に多くのサンプル溶液を確保して、保管しておく必要がある。また、同様の理由で、タンパク質の結晶化のために必要な試薬も多数保管しておく必要がある。その結果、非常に大きな保管設備が必要になる。
発明者等は、上記した問題を解決し、サンプル溶液に微小液滴を使ったマイクロバッチ法を既に提案している（特許文献１〜５参照）。これにより、大きな保管設備を必要とせずに多数のサンプル溶液のスクリーニングを行うことができるようになる。
一方、タンパク質等の生体高分子は非常に大きな分子量を有し、サンプル溶液中での自己拡散係数が小さいため、結晶核形成に必要な分子同士の集合又は会合が起こりにくく、このため、多数のサンプル溶液を用意しても結晶化が得られないサンプル溶液も多い。
このように結晶化が困難なタンパク質等の生体高分子の結晶化を促進するためにサンプル溶液に電圧を印加することが既に提案されている（特許文献６参照）。【０００３】
【特許文献１】特願２００５−１７６３３９
【特許文献２】特願２００５−１７６３４４
【特許文献３】特願２００５−１７６３５１
【特許文献４】特願２００５−１７６３５４
【特許文献５】特願２００５−１７６３５９
【特許文献６】特開２０００−６３１９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記したように、サンプル溶液に電圧を印加することにより、溶液中の結晶化させるべき分子を電気泳動させることができ、分子の移動量が増大し、溶液中における分子同士の衝突が起こりやすくなり、結晶核の形成が促進される。
しかし、上記した従来の結晶化方法は、一対の電極でサンプル溶液を挟んでサンプル溶液に電圧を印加するように構成されているため装置自体が非常に特殊で複雑な構造になる。
特に、この従来の結晶化方法を、発明者等が提案する微小液滴を用いたマイクロバッチ法に適用しようとすると、生成した微小サンプル液滴を所定の保管位置に静電搬送した後、一対の電極を有する結晶化装置へ微小サンプル液滴を移動して電圧を印加しなければならないため装置の構造が複雑になるばかりでなく、当然装置全体の大きさも大きくなるため小型化の目的に反することになる。
また、Ｘ線構造解析を行う際に、得られた結晶にＸ線を照射して、Ｘ線の反射像又は透過像を撮影する。しかし、得られた結晶の質が良くないと、撮影した結晶の解像度が低くなり、正確な三次元構造の解析が行えないないという問題もある。
本発明は、上記した従来の問題点を解決し、微小液滴を用いたマイクロバッチ法において、装置構造を複雑化することなく、かつ、装置自体を大きくすることなく、結晶化の促進を可能すると共に、X線回折の解像度が高くなる質の高い結晶を得ることができる結晶化方法及び装置並びに同結晶化方法を適用したタンパク質結晶化処理装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記した目的を達成するために本発明に係るマイクロバッチ法における結晶化方法は、微量のタンパク質溶液の液滴に、タンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加してサンプル液滴を生成し、該サンプル液滴を所定の環境下においてサンプル液滴内のタンパク質を結晶化させるマイクロバッチ法おいて、各サンプル液滴の上方または下方に一対の電極を並べて配置し、前記電極によりサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加することを特徴とする。
また、本発明に係るマイクロバッチ法において用いられる結晶化装置は、微量のタンパク質溶液の液滴にタンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加して生成されたサンプル液滴を保持する保持手段と、前記保持手段の上方または下方であって、各サンプル液滴の上方または下方に並べて配置された一対の電極とを有し、前記電極により、保持手段で保持されたサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加するように構成したことを特徴とする。
さらに、本発明に係るタンパク質結晶化処理装置は、進行波電場発生用電極並びに、該進行波電場発生用電極の上に配置されるサンプル液滴と混じりあわない溶液層を有する液滴保持手段とを備え、前記進行波電場発生用電極に所定の周波数で電圧を印加することにより、前記液滴保持手段中に供給されたタンパク質の結晶化のために必要な試薬の液滴と、タンパク質溶液の液滴とを移動して合体させてサンプル液滴を生成し、次いで、前記サンプル液滴を前記液滴保持手段内で保持するように構成された溶液処理手段と、前記溶液処理手段における液滴保持手段に、前記液滴を供給する液滴供給手段と、前記サンプル液滴を保持した液滴保持手段における各サンプル液滴に上方又は下方から結晶化のための電場を付与できるように電極が配置された結晶化手段と、結晶化手段において結晶化がなされている液滴保持手段中のサンプル液滴の結晶化成長を監視するための結晶化成長監視手段と、前記液滴保持手段をサンプル液滴保持後に結晶化手段へ移送し、結晶化手段と結晶化成長監視手段との間で液滴保持手段を移送することができる移送手段とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明に係る結晶化方法は、マイクロバッチ法において、各サンプル液滴の上方又は下方に一対の電極を並べて配置し、前記電極によりサンプル液滴に上方又は下方から結晶化のための電場を印加することにより、サンプル液滴中の結晶化を促進することができ、及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶を得ることができるので、一対の電極でサンプル液滴を挟んで結晶化の促進を行う従来の促進方法に比べて簡単な構造で結晶化の促進及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶の析出を行うことが可能になるという効果を奏する。
前記結晶化のために印加される電場は200V/mm以上であり得る。印加する電場を200V/mm以上にすることにより、サンプル液滴中の結晶化が促進される。
また、前記結晶化のために印加する電場を1000V/mm以上にすることで、サンプル溶液中にX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶が析出される。
また、本発明に係る結晶化装置は、微量のタンパク質溶液の液滴にタンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加して生成されたサンプル液滴を保持する保持手段と、前記保持手段の上方または下方であって、各サンプル液滴の上方または下方に並べて配置された一対の電極とを有し、前記電極により、保持手段で保持されたサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加するように構成しているので、単に並べて配置された電極の上方又は下方にサンプル液滴を配置できるように構成するだけで結晶化の促進及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶の析出を図ることが可能になる。従来の一対の電極でサンプル液滴を挟んで結晶化の促進を行う装置の場合には、一対の電極間にサンプル液滴を配置しなければならないので、構造が複雑になり、また、各サンプル液滴を一対の電極で挟むため装置が大型化してしまうという問題があるが、本発明に係る結晶化装置は、単に並べて配置された電極の上方又は下方にサンプル液滴を配置できるように構成するだけでよいので、装置の構造が簡単であり、また、装置自体も従来の装置に比べて小型化することが可能になる。
さらに、本発明に係るタンパク質結晶化装置は、進行波電場発生用電極並びに、該進行波電場発生用電極の上に配置されるサンプル液滴と混じりあわない溶液層を有する液滴保持手段とを備え、前記進行波電場発生用電極に所定の周波数で電圧を印加することにより、前記液滴保持手段中に供給されたタンパク質の結晶化のために必要な試薬の液滴と、タンパク質溶液の液滴とを移動して合体させてサンプル液滴を生成し、次いで、前記サンプル液滴を前記液滴保持手段内で保持するように構成された溶液処理手段と、前記溶液処理手段における液滴保持手段に、前記液滴を供給する液滴供給手段と、前記サンプル液滴を保持した液滴保持手段における各サンプル液滴に上方又は下方から結晶化のための電場を付与できるように電極が配置された結晶化手段と、結晶化手段において結晶化がなされている液滴保持手段中のサンプル液滴の結晶化成長を監視するための結晶化成長監視手段と、前記液滴保持手段をサンプル液滴保持後に結晶化手段へ移送し、結晶化手段と結晶化成長監視手段との間で液滴保持手段を移送することができる移送手段とを備えているためサンプル液滴の生成から結晶化及び観察迄の一連の作業を自動的に行うことが可能になる。また、サンプル液滴の生成から結晶化及び結晶化観察の作業を、共通の液滴保持手段を用いて行うことができるので、サンプル液滴の移動等を非常に簡単に行うことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、添付図面に示した一実施例を参照して、本発明に係る結晶化方法及び装置並びに同結晶化方法を適用した結晶化処理装置の実施の形態を説明していく。【０００８】
図１（ａ）及び（ｂ）は、本発明に係る結晶化方法の原理を説明するための結晶化装置の概略斜視図及び概略横断面図である。
図面に示すように、この結晶化装置は、
基板１上に一対の電極２ａ及び２ｂを複数列配置した電極板６と、
サンプル液滴５を保持するためのサンプル液滴と混じりあわない溶液４からなる液滴保持手段と
を有する。前記電極２ａ及び２ｂは絶縁体３で覆われている。
沈殿剤、塩及び界面活性剤等のような様々なタンパク質結晶化のための試薬とタンパク質溶液との混合物から成るサンプル液滴５は、絶縁体３の上に配置され、各サンプル液滴５が一対の電極の中間に位置するように配置される。
サンプル液滴５は、蒸発を防止するために油等のようなサンプル液滴と混じりあわない溶液４で囲まれている。このサンプル液滴と混じりあわない溶液４によってサンプル液滴５を囲むセットアップは、いわゆる、マイクロバッチ方法に対応している。
電極２ａ及び２ｂ間に電位差を与えると、サンプル液滴５が置かれている電極２ａ及び２ｂ上に電場が生じる。継続的な電場を作り出すために不図示の高圧電源が用いられる。また、図示していないが、例えば、増幅器に接続された信号発生器を用いることにより交流電場を生成することも可能である。
前記サンプル液滴５は、例えば、疎水性の表面上に親水化スポットを作ることによって位置決めすることができる。親水化スポットにより位置決めされた液滴は、しっかりと固定される。【０００９】
図２及び図３は、上記したタンパク質結晶化装置を用いて、実際にサンプル液滴５に所定の電場を付与して、タンパク質（卵白リゾチーム）の結晶化を経時的に観察した結果を示すグラフである。
この実験では、卵白リゾチームを0.2 Mリン酸緩衝液（pH 4.6）に溶解し、40 mg/mLに調製したものをタンパク溶液とし、沈殿剤としてNaCl、0.2 Mリン酸緩衝液（pH 4.6）を用い、それぞれ0.5 μl（直径1 mm ）を混合したサンプル液滴（1 μl、直径1.2mm）を60個生成して、パラフィンオイルから成るサンプル液滴と混じりあわない溶液中で前記サンプル液滴を保持したサンプルホルダーを３つ準備し、
第１のサンプルホルダーには電場を付与せず、
第２のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流200V/mm(60V)の電場を付与し、
第３のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流400V/mm(120V)の電場を付与し、
第４のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流600V/mm(180V)の電場を付与し、
第５のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流800V/mm(240V)の電場を付与し、
結晶化の状態を1週間観察した。
尚、実験に使用したタンパク質結晶化装置における電極板の電極間の間隔は０．３ｍｍであり、上記括弧内に記載した電圧は実際に印加した電圧値を示している。
図２は、最終的に各サンプルの各サンプル液滴に生成された最大結晶の大きさと、結晶の数との関係を示すグラフである。
図３は、最終的に各サンプルの各サンプル液滴に生成された結晶の数と、液滴中に占める結晶の割合を示したグラフである。
さらに、図４は、第１〜５のサンプルから一つずつピックアップして上方から撮影したサンプル液滴の概略上面写真である。
図２〜図４の実験結果から明らかなように、電場を全く付与しない第１のサンプルに比べて電場を付与した場合に、電場強度を上げるにつれて１つの液滴中に生成する結晶数が1-3になる割合が増加することを表している。一方、結晶サイズでは、400 V/mmの電場を付与した場合に0.3mm以上の結晶が得られたが、他の条件ではすべて0.3mm未満であった。このことより、電場を付与した場合、結晶化が促進され、析出される結晶のサイズが増加することが分かる。特に、卵白リゾチームにおいては、200 V/mmから600 V/mmの電場を付与すると、結晶化が促進され、結晶サイズが増加する効果が顕著に現れていることが分かる。
電場を付与しない第１のサンプルのように各サンプル液滴中に生成される結晶の数が多いと、大きな結晶に成長しないため必要な結晶が得られないが、前記条件の電場を与えると、各サンプル液滴中に生成される結晶の数が少なくなり、その分、結晶の大きさが大きくなるため必要な結晶が得られる。
尚、液滴の直径は、典型的には、１ｍｍ以下（容積１μｌ以下）であるため、非常に多くの数の液滴を小さい表面上にセットすることが可能になる。例えば、容積が１μｌの液滴であれば、３×４．５ｃｍの表面上に、８×１２の列に配置して９６個の液滴を簡単に乗せることができる。【００１０】
図５は、上記したタンパク質結晶化装置を用いて、実際にサンプル液滴５に所定の電場を付与して、別のタンパク質（ソーマチン）の結晶化を観察した結果を示すグラフである。
この実験では、ソーマチンを0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6.25）に溶解し、100 mg/mL に調製したものをタンパク溶液とし、沈殿剤として1.0 M酒石酸ナトリウム溶液を0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6.25）に溶解したものを用い、それぞれ1.0 μL （直径1.2 mm ）を混合したサンプル液滴（2 μL ）を60個生成して、パラフィンオイルから成る不活性溶液中で前記サンプル液滴を保持したサンプルホルダーを４つ準備し、
第１のサンプルホルダーには電場を付与せず、
第２のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流500V/mm(100V)の電場を付与し、
第３のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流1000V/mm(200V)の電場を付与し、
第４のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流1350 V/mm(270V)の電場を付与し、結晶化の状態を観察した。
尚、実験に使用したタンパク質結晶化装置における電極板の電極間の間隔は０．２ｍｍであり、上記括弧内に記載した電圧は実際に印加した電圧値を示している。
図５は、最終的に各サンプルの各サンプル液滴に生成された結晶数の平均値を示したグラフである。
図５の実験結果から明らかなように、電場を全く付与しない第１のサンプルに比べて電場を付与した場合に、電場強度を上げるにつれて１つの液滴中に生成する結晶数が減少することを表している。このことより、電場を付与した場合、結晶化が促進され、析出される結晶のサイズが増加することが分かる。特に、ソーマチンの場合、1000 V/mm から1350 V/mm の電場を付与した場合に電場により結晶数が減少する効果が顕著に現れていることが分かる。
電場を付与しない第１のサンプルのように各サンプル液滴中に生成される結晶の数が多いと、大きな結晶に成長しないため必要な結晶が得られないが、前記条件の電場を与えると、各サンプル液滴中に生成される結晶の数が少なくなり、その分、結晶の大きさが大きくなるため十分なX線回折の解像度を得るために必要な結晶が得られる。
図６は、第１〜４のサンプルから一つずつピックアップした結晶に対してＸ線回折装置（超高輝度Ｘ線発生装置 FR-E SuperBright（リガク））を用いてＸ線を照射し、検出器（高速イメージングプレートＸ線検出器 R-AXIS VII（リガク））により検出した回折像である。その解像度を表１に示す。
【表１】
2007063898.tif 000003
図６及び表１から、電場を付与しない場合の解像度及び500V/mmの電場を付与した場合の解像度は共に1.54Åであるが、1000V/mmの電場を付与すると解像度が1.37Åに上がり、1350 V/mmの電場を付与すると解像度が1.35Åに向上することが確認できた。このように、電場により得られる結晶の質が向上することが確認された。【００１１】
次に、図７を参照して、本発明に係る結晶化装置のさらに好ましい実施例を説明してく。
図７（ａ）及び（ｂ）は、結晶化装置の第２実施例の概略横断面図を各々示しており、（ａ）は、電極２を有する基板１にサンプル液滴保持手段がセットされた状態を示しており、（ｂ）は、電極２を有する基板１からサンプル液滴保持手段が分離された状態を示している。
尚、本実施例では、図１に示した要素と同一又は同等の要素には、図１に用いた符号を同じ符号を付して、詳細な説明は省略する。
電極板６は、基板１上に一対の電極２ａ及び２ｂを複数列配置して成る。
基板１の材料は、ガラスやプラスチック板のような任意の非導電性材料であり得る。電極２の加工には、例えば、銅、金、ITO（イソジウムスズ酸化物）等の任意の導電性材料が用いられ得る。
上記した電極板６の上には、サンプル液滴保持手段９が着脱可能に設けられる。
分離可能なサンプル液滴保持手段９は、ホルダー８にプラスチックフィルム７を固定することにより形成され、その内部にサンプル液滴と混じりあわない溶液４が収容されている。サンプル液滴５は、上記したサンプル液滴保持手段９におけるサンプル液滴と混じりあわない溶液４内に配置される。この実施例では、プラスチックフィルム７が絶縁体として機能するため、電極板６に絶縁体（図１の実施例における絶縁体３）を設ける必要がない。
プラスチックフィルム７の厚さは、５μｍ〜１００μｍの間の範囲であり、好ましくは、５μｍ〜４０μｍの間の範囲である。フィルム材料は、任意の絶縁性材料、好ましくは、サンプル液滴と混じりあわない溶液が油の場合には、油に対して非浸透性の材料であり得る。
上記したように構成されたタンパク質結晶化装置は、電極２ａ及び２ｂ間に電位差を与えることにより、サンプル液滴５が置かれている電極２ａ及び２ｂ上に電場を生じさせる。【００１２】
最後に、上記したように構成された結晶化装置を備えたタンパク質結晶化処理装置の実施例を説明する。【００１３】
図８は、本発明に係るタンパク質結晶化装置を備えたタンパク質結晶化処理装置（以下、単に結晶化処理装置と称する。）の概略ブロック図である。
図面に示すように、このタンパク質結晶化処理装置は、
試薬及びタンパク質溶液の液体微粒子を供給する液体微粒子供給部Ａ、
液体微粒子供給部Ａから供給された試薬及びタンパク質溶液を混合してサンプル液滴保持手段９上に保持させる溶液処理部Ｂと、
サンプル液滴保持手段９上に保持されたサンプル液滴５に電場を印加してタンパク質の結晶化を促進させるタンパク質結晶化装置Ｃと、
前記タンパク質結晶化装置Ｃにおいて結晶化の促進がなされているサンプル液滴におけるタンパク質の結晶化成長を定期的に監視する結晶化成長監視部Ｄと、
サンプル液滴保持手段９を溶液処理部Ｂから結晶化装置Ｃへ移送すると共に、必要に応じて、結晶化装置Ｃから結晶化成長監視部Ｄへ、また、結晶化成長監視部Ｄから結晶化装置Ｃへ移送する移送手段Ｅと
を有する。【００１４】
始めに、溶液処理部Ｂについて説明する。
図９は溶液処理部Ｂの回路構成を示す概略図であり、図１０は溶液処理部Ｂの図１０におけるＡ−Ａ断面に相当する概略断面図である。
溶液処理部Ｂは、基板１１上に複数の静電気発生用の電極線を配置した回路部１３と、回路部１３に着脱可能に構成されたサンプル液滴保持手段９とを有する。
前記回路部１１は、図９に示すように、
１８本の電極線を同芯状に９０度の扇型に配置した第１電極郡１３ａと、
第１電極郡１３ａにおける中心に位置する電極線と平行に配置された２６本の電極線から成る第２電極郡１３ｂと、
第２電極郡１３ｂに隣接するように配置され、第２電極郡１３ｂの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第３電極郡１３ｃと、
第３電極郡１３ｃに隣接するように配置され、第３電極郡１３ｃの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された２６本の電極線から成る第４電極郡１３ｄと、
第４電極郡１３ｄに隣接するように配置され、第４電極郡１３ｄの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第５電極郡１３ｅと、
第５電極郡１３ｅに隣接するように配置され、第５電極郡１３ｅの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された２６本の電極線から成る第６電極郡１３ｆと、
第６電極郡１３ｆに隣接するように配置され、第６電極郡１３ｆの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第７電極郡１３ｇと、
第７電極郡１３ｇに隣接するように配置され、第７電極郡１３ｇの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された２６本の電極線から成る第８電極郡１３ｈと、
第８電極郡１３ｈに隣接するように配置され、第８電極郡１３ｈの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第９電極郡１３ｉと、
第９電極郡１３ｉに隣接するように配置され、第９電極郡１３ｉの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された２６本の電極線から成る第１０電極郡１３ｊと、
第１０電極郡１３ｊに隣接するように配置され、第１０電極郡１３ｊの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第１１電極郡１３ｋと
を有する。
溶液処理部Ｂは、各電極郡１３ａ〜１３ｋの電極線の電圧を制御する一つ又は複数の制御装置（図示せず）を有する。
サンプル液滴保持手段９は、図１０に示すように、電気絶縁性材料から成る基部１６を備えている。この基部１６は、回路部１３に着脱可能に構成された下側部分１６ａと、サンプル液滴と混じりあわない溶液（例えば、油）を収容する上側部分１６ｂとから成る。尚、図１０はサンプル液滴保持手段９が回路部１３に取り付けられている状態を、図１１はサンプル液滴保持手段９を回路部１３から取り外した状態を各々示している。
上側部分１６ｂの内部の底面には親水性膜１７が形成されており、この親水性膜７の上面にはさらに疎水性膜８が形成されている。
前記疎水性膜８における第４電極郡１３ｄ、第６電極郡１３ｆ、第８電極郡１３ｈ及び第１０電極郡１３ｊに対応する位置には、複数の親水化スポット１９が形成されている。
これらの親水化スポット１９は、例えば、親水性膜１７上に疎水性膜１８を堆積させる前に、予めレジストを所定のパターンで形成しておき、疎水性膜１８を堆積させた後に、レジスト部分を除去して親水性膜１７を部分的に露出させることにより形成される。
また、基部１６の上側部分１６ｂの上壁における第１電極郡１３ａに対応する位置には、液体微粒子供給部１からの液体微粒子を導入するための開口１６ｃが必要数設けられている（この実施例では２つ）。
図１２は、回路部１３の電極郡と、サンプル液滴保持手段９の親水化スポット１９及び開口１６ｃとの位置関係を示す図である。
上記したように構成されたサンプル液滴保持手段９は、サンプル液滴の生成時には回路部１３に取り付けて使用され、必要数のサンプル液滴が生成保持された後は、回路部１３から取り外されて、移送手段Ｅにより結晶化装置Ｃ及び結晶化成長監視部Ｄへ移送される。【００１５】
ここで、上記したように複数の電極線に電圧を印加して液滴を移動させる原理について説明する。
始めに、同方向に並べられた電極線に印加する電圧と液滴の移動との関係について図１３を参照しながら説明する。これは、各電極郡内において液滴の移動させる時の原理である。
電極線には、図１３（ａ）〜（ｄ）に示すように、適当なサイクル時間で電極線を一本づつ移動するように６相の電圧（＋＋＋―――）が順次印加される。電圧を移動する方向が液滴の進行方向になる（尚、電圧の印加パターンは本実施例に限定されるものではない。）
上記したように、適当なサイクル時間で６相の電圧（＋＋＋―――）が移動している電極線上に液滴が載ると、マイナスに帯電している液滴は、負の電圧が印加されている電極とは反発し、正の電圧が印加されている電極には引き寄せられるため、電圧が移動する方向に移動することになる。そして、電圧を移動を止めると、液滴はその位置で止まる。
各電極郡内においては、上記した原理で液滴は移動する。
次に、異なる方向に並べられた電極線に印加する電圧と液滴の移動との関係を図１４（ａ）及び（ｂ）を参照して説明する。これは、電極線の方向が異なる電極郡間で液滴を移動させる原理である。
図１４において、電極郡Ｘと電極郡Ｙとは、その電極線の方向が異なっている。図１４（ａ）においては、電極郡Ｘには、６相の電圧（＋＋＋―――）が印加されているが、電極郡Ｘ内において電圧の移動がないため液滴は、正の電圧が印加された電極と負の電圧が印加された電圧との間で停止している。
そして、図１４（ａ）に示す状態から、図１４（ｂ）に示すように、電極郡Ｘの全電極線に負の電圧を印加し、電極郡Ｙにおける電極郡Ｘと隣接している電極線（全ての電極線でもよい）に正の電圧を印加することにより、マイナスに帯電している液滴は、電極部Ｘの電極線とは反発し、電極部Ｙの電極線には引き寄せられるため電極部Ｘから電極部Ｙに移り変わる。
電極線の方向が異なる電極部間においては、上記した原理で液滴は移動する。【００１６】
開口１６ｃを介して、第１電極郡１３ａに供給されたタンパク質溶液の液滴５ａと結晶化のために必要な試薬の液滴５ｂとは、上記した原理により第１電極郡１３ａにおいて静電搬送された結果、第１電極郡１３ａの中心において衝突して合体し、サンプル液滴５となる（図１５参照）。
次いで、サンプル液滴５は、上記した原理により、第２電極郡１３ｂから所定の電極郡の親水化スポット１９まで静電搬送される。
親水化スポット１９は、親水性膜が露出しているため、サンプル液滴は、親水化スポットに到達した時に、露出された親水性膜に接触する。サンプル液滴は、親水性膜に接触すると、その球状形状が崩れるため電極線に印加した電圧の作用ではそれ以上移動しなくなり、結果的に、親水化スポット上で保持される。したがって、一度、親水化スポット上で保持されると電極線に電圧を印加しなくてもサンプル液滴５は移動しない。
図１６は、サンプル液滴が親水化スポットに保持される状態を概念的に示す図である。
以上説明した処理を、必要回数連続して繰り返して親水化スポット上に必要数のサンプル液滴を保持させた状態を図１７に示す。
前記したように、一度、親水化スポット上で保持されると電極に電圧を印加しなくてもサンプル液滴は動かないので、この状態で、サンプル液滴保持手段９は、回路部１３から取り外され（図１１参照）、移送手段４０によりタンパク質結晶化装置Ｃへ運ばれる。
尚、上記した実施例では、ある電極群から、その電極群の電極線と電極線の方向が異なる他の電極群へ液滴を移動させる時に、乗せかえ前の電極群の全ての電極線に正の電圧を印加すると共に、乗せかえ後の電極群の全ての電極線に負の電圧を印加しているが、これは本実施例に限定されることなく、乗せかえ前の電極群と乗せかえ後の電極群に逆相の電圧を印加すればよい。【００１７】
タンパク質結晶化装置Ｃは、サンプル液滴保持手段９を装着可能な電極板６を備えている。
図１８は、タンパク質結晶化装置Ｃにおいて電極板６にサンプル液滴保持手段９を装着した状態を示す概略横断面図、図１９は、電極板６からサンプル液滴保持手段９を取り外した状態示す概略横断面図である。
図面に示すように、電極板６は基板１に一対の電極２を複数列配置して成り、電極板６にサンプル液滴保持手段９を装着した状態において、親水化スポット１９上に保持されたサンプル液滴５が、一対の電極２ａ及び２ｂの中間に位置するように構成されている。
この状態において、不図示の制御装置を用いて電極２ａ及び２ｂ間に電位差を与えてサンプル液滴５が置かれている電極２ａ及び２ｂ上に電場を生じさせ、サンプル液滴における結晶化を促進させ、及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶の析出を図る。【００１８】
ここで、上記したように構成された溶液処理部Ｂに、液滴を供給する液滴供給部Ａについて簡単に説明する。
液滴供給部Ａは、溶液処理部Ｂにタンパク質溶液の液滴と試薬の液滴とを供給するよう構成されている。
好ましくは、この液滴供給部Ａから供給される液滴は、合体したサンプル液滴が１ｍｍ以下（容積１μｌ以下）になるように調整される。【００１９】
最後に、結晶化成長監視部Ｄの構成について説明する。
移送手段Ｅは、定期的に結晶化部Ｃからサンプル液滴保持手段９を取り出し、結晶化成長監視部Ｄに移送する。
結晶化成長監視部Ｄは、移送手段Ｅにより移送されてきたサンプル液滴保持手段９のサンプル液滴の結晶化を光学的又は電気的に監視し、その結果を記録及び／又は表示する。
結晶化成長監視部Ｄとしては、様々な構成が考えられるが、ここで、幾つかの例を説明する。
例えば、結晶化成長監視部Ｄは、光源と光電子増倍管を備え、前記光源によりサンプル液滴保持手段上のサンプル液滴に光を照射し、光電子増倍管によりサンプル液滴の屈折率を検出し、検出した屈折率の変化に基づいてサンプル液滴中のタンパク質の結晶化成長度合いを判断し得る。この場合、例えば、検出した屈折率の増加に伴ってサンプル液滴中のタンパク質の結晶化が進んでいると判断することができる。検出結果は、適当な記録装置に記録することができ、また、必要に応じて、ディスプレイ、プリンタ、ランプ及び／又はスピーカー等により視覚的及び／又は聴覚的に、タンパク質の結晶化成長度合いを使用者に表示することができる。
別の例としては、例えば、結晶化成長監視装置Ｄは、自動焦点合わせ機能を有する光学測定手段を備え、自動焦点合わせ機能によりサンプル液滴保持手段上のサンプル液滴中の焦点位置を検出し、焦点位置の検出によりタンパク質の結晶化成長度合いを判断し得る。この場合、例えば、焦点位置が検出できない場合は結晶化成長が進んでいないが、焦点位置が検出できた場合には結晶化成長が進んでいると判断することができる。検出結果は、適当な記録装置に記録することができ、また、必要に応じて、ディスプレイ、プリンタ、ランプ及び／又はスピーカー等により視覚的及び／又は聴覚的に、タンパク質の結晶化成長度合いを使用者に表示することができる。
さらに別の例としては、例えば、結晶化成長監視装置Ｄは、光源と受光手段を備え、光源によりサンプル液滴保持手段上のサンプル液滴に光を照射した後、受光手段で照射した光を受光し、受光手段で受光した光量に基づいて、サンプル液滴の吸光量を検出し、検出した吸光量に基づいてタンパク質の結晶化成長度合いを判断し得る。この場合、例えば、吸光量の増加に伴ってサンプル液滴中のタンパク質の結晶化が進んでいると判断することができる。検出結果は、適当な記録装置に記録することができ、また、必要に応じて、ディスプレイ、プリンタ、ランプ及び／又はスピーカー等により視覚的及び／又は聴覚的に、タンパク質の結晶化成長度合いを使用者に表示することができる。【００２０】
尚、上記した結晶化処理装置の実施例では、構成が分かりやすいように一つのサンプル液滴保持手段に８つの液滴を保持する例を示しているが、サンプル液滴保持手段に保持すべき液滴の数は本実施例に限定されるものではない。
前述したが、液滴の直径は、典型的には、3ｍｍ以下（容積１0μｌ以下）であるため、非常に多くの数の液滴を小さい表面上にセットすることが可能になる。例えば、容積が１0μｌの液滴であれば、３×４．５ｃｍの表面上に、８×１２の列に配置して９６個の液滴を簡単に乗せることが可能である。
また、上記した実施例では、液滴保持手段の下方に電極を配置し、サンプル液滴に対して下方から結晶化のための電場を印加しているが、これは本実施例に限定されることなく、例えば、電極を液滴保持手段の上方に配置して、サンプル液滴に対して上方から電場を印加するように構成してもよい。
さらにまた、上記したタンパク質結晶化処理装置の実施例では、溶液処理部Ｂとタンパク質結晶化装置Ｃとが個々に異なる電極を有するように構成しているが、この構成は本実施例に限定されることなく、溶液処理部Ｂの進行波電場発生用電極とタンパク質結晶化装置Ｃの結晶化のための電場発生用電極とを共通化して、溶液処理部Ｂの電極を用いてサンプル液滴に結晶化のための電圧を印加するように構成してもよい。
また、上記した実施例では、結晶化装置においてサンプル液滴に始めから結晶化のための電圧を印加しているが、好ましくは、結晶化のための電圧を印加する前に、サンプル液滴に対して瞬間的（好ましくは、1秒以下）に少なくとも800V/mmより高い電場を印加するように構成され得る。このようにサンプル液滴に瞬間的に高い電場を印加することにより、高電場下でサンプル液滴が電極に強く引き付けられて変形し、液滴が電極面に接触する面積が増加し、その後の電場付与による結晶化促進効果及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶の析出の増大を図ることができる。また、液滴を電極面に多く接触するように変形させることで、液滴周辺の影（黒い部分）が少なくなる。サンプル液滴における結晶化の観察を画像処理によって行う場合、液滴周辺の影の部分が多いと、その影の部分に重なる結晶が、影なのか結晶なのか判別し難くなるが、このように液滴を電極面に多く接触するように変形させることで液滴周辺の影の部分を少なくすることができ、結果として、結晶化の観察が行いやすくなる。
図２０（ａ）及び（ｂ）は、同じ条件のサンプル液滴に対して800V/mmの電圧を１週間印加した後のサンプル液滴の状態と、880V/mmの電圧を１秒印加した後のサンプル液滴の状態を示す写真である。この実験結果から、800V/mmの電圧では１週間印加してもサンプル液滴の形状が変形していないのに対して、880V/mmの電圧を印加すると１秒間でサンプル液滴を変形できることが分かる。よって、少なくとも800V/mmより高い電圧（好ましくは、880V/mm以上の電圧）を瞬間的に印加することにより、サンプル液滴を変形させることができることがわかる。
さらにまた、前述したが、電極には、例えば、銅、金、ITO（イソジウムスズ酸化物）等の任意の導電性材料を用いることができる。尚、先に説明した図４の写真は、銅電極を用いて実験を行った結果のサンプル液滴の上面写真である。銅電極を用いる場合は、銅に透光性がないため反射光を用いた写真しか撮影することができない。このため図４に示すように、写真に電極が写りこんでしまう。しかし、電極にITO膜を用いると、ITO膜が透明であるため図２１に示すように、電極板３０の上に、サンプル液滴保持手段３５を搭載したまま、透過光の偏光を使って顕微鏡４０等で結晶の観察を行うことができる。
尚、図２１は、電極板３０の上にサンプル液滴保持手段３５を搭載したまま顕微鏡４０等で結晶の観察を行う場合の結晶化装置の概略横断面図であり、図中、符号３１はITO電極、符号３２はITO電極を配したガラス基板、符号３６はプラスチックフィルム等の絶縁膜、符号３７はホルダー、符号３８はサンプル液滴と混じりあわない溶液（例えば、油等）、符号３９は液滴、符号４１及び４２は偏向板、符号４３は光源を各々示している。
図２２は、ITO膜を利用した図２１の結晶化装置を用いて実際に結晶化させた結晶を透過光の偏光を使って撮影した写真である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、本発明に係る結晶化方法の原理を説明するための結晶化装置の概略斜視図及び概略横断面図である。
【図２】リゾチームを用いた各サンプルの各サンプル液滴に生成された最大結晶の大きさと、結晶の数との関係を示すグラフである。
【図３】各サンプルの各サンプル液滴に生成された結晶の数を示すグラフである。
【図４（ａ）】第１サンプルから一つピックアップしたサンプル液滴の概略上面写真である。
【図４（ｂ）】第２サンプルから一つピックアップしたサンプル液滴の概略上面写真である。
【図４（ｃ）】第３サンプルから一つピックアップしたサンプル液滴の概略上面写真である。
【図４（ｄ）】第４サンプルから一つピックアップしたサンプル液滴の概略上面写真である。
【図４（ｅ）】第５サンプルから一つピックアップしたサンプル液滴の概略上面写真である。
【図５】最終的にソーマチンを用いた各サンプルの各サンプル液滴に生成された結晶数の平均値を示したグラフである。
【図６】（ａ）〜（ｄ）は、０、５００、１０００，１３５０V/mmで電場付与した各サンプルから一つずつピックアップした結晶に対してＸ線回折装置（超高輝度Ｘ線発生装置 FR-E SuperBright（リガク））を用いてＸ線を照射し、検出器（高速イメージングプレートＸ線検出器 R-AXIS VII（リガク））により検出した回折像である。
【図７】（ａ）及び（ｂ）は、結晶化装置の第２実施例の概略横断面図を各々示しており、（ａ）は、電極２を有する基板１にサンプル液滴保持手段がセットされた状態を示しており、（ｂ）は、電極２を有する基板１からサンプル液滴保持手段が分離された状態を示している。
【図８】本発明に係る結晶化装置を備えたタンパク質結晶化処理装置の概略ブロック図である。
【図９】溶液処理部Ｂの回路構成を示す概略図である。
【図１０】溶液処理部Ｂの図９におけるＡ−Ａ断面に相当する概略断面図である。
【図１１】サンプル液滴保持手段を回路部１３から取り外した状態を示す図１０に相当する概略断面図である。
【図１２】回路部１３の電極郡と、サンプル液滴保持手段９の親水化スポット１９及び開口１６ｃとの位置関係を示す図である。
【図１３】同方向に並べられた電極線に印加する電圧と液滴の移動との関係を説明する図である。
【図１４】異なる方向に並べられた電極線に印加する電圧と液滴の移動との関係を説明する図である。
【図１５】タンパク質溶液の液滴５ａと結晶化のために必要な試薬の液滴５ｂと合体させてサンプル液滴５を生成する工程を説明する図である。
【図１６】サンプル液滴が親水化スポットに保持される状態を概念的に示す図である。
【図１７】親水化スポット上に必要数のサンプル液滴を保持させた状態を示す図である。
【図１８】タンパク質結晶化装置Ｃにおいて電極板６にサンプル液滴保持手段９を装着した状態を示す概略横断面図である。
【図１９】タンパク質結晶化装置Ｃにおいて電極板６からサンプル液滴保持手段９を取り外した状態を示す概略横断面図である。
【図２０（ａ）】サンプル液滴に対して800V/mmの電圧を１週間印加した後のサンプル液滴の状態を示す写真である。
【図２０（ｂ）】図２０（ａ）と同条件のサンプル液滴に対して880V/mmの電圧を１秒印加した後のサンプル液滴の状態を示す写真である。
【図２１】電極板３０の上にサンプル液滴保持手段３５を搭載したまま顕微鏡４０等で結晶の観察を行う場合の結晶化装置の概略横断面図である。
【図２２】ITO膜電極を用いて結晶化させた結晶を透過光の偏光を使って撮影した写真である。
【符号の説明】
【００２２】
１  基板
２  電極
３  絶縁体
４  サンプル液滴と混じりあわない溶液
５  サンプル液滴
６  電極板
７  プラスチックフィルム
８  ホルダー
９  サンプル液滴保持手段
Ａ  液体微粒子供給部
Ｂ  溶液処理部
１１  基板
１３  回路部
１３ａ〜１３ｋ  電極郡
１６  基部
１６ａ  下側部分
１６ｂ  上側部分
１６ｃ  開口（液滴導入部）
１７  親水性膜
１８  疎水性膜
１９  親水化スポット
Ｃ  タンパク質結晶化促進装置
Ｄ  結晶化成長監視部
Ｅ  移送手段
【図１】
2007063898.tif 000004
【図２】
2007063898.tif 000005
【図３】
2007063898.tif 000006
【図５】
2007063898.tif 000007
【図７】
2007063898.tif 000008
【図８】
2007063898.tif 000009
【図９】
2007063898.tif 000010
【図１０】
2007063898.tif 000011
【図１１】
2007063898.tif 000012
【図１２】
2007063898.tif 000013
【図１３】
2007063898.tif 000014
【図１４】
2007063898.tif 000015
【図１５】
2007063898.tif 000016
【図１６】
2007063898.tif 000017
【図１７】
2007063898.tif 000018
【図１８】
2007063898.tif 000019
【図１９】
2007063898.tif 000020
【図４（ａ）】
2007063898.tif 000021
【図４（ｂ）】
2007063898.tif 000022
【図４（ｃ）】
2007063898.tif 000023
【図４（ｄ）】
2007063898.tif 000024
【図４（ｅ）】
2007063898.tif 000025
【図６】
2007063898.tif 000026
【図２０（ａ）】
2007063898.tif 000027
【図２０（ｂ）】
2007063898.tif 000028
【図２１】
2007063898.tif 000029
【図２２】
2007063898.tif 000030
【国際調査報告】
2007063898.tif 000031
2007063898.tif 000032
2007063898.tif 000033
2007063898.tif 000034