【手続補正書】
【提出日】平成19年12月7日(2007.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
“検出可能部分”なる用語は、ヒトに投与した後の外部イメージングに適し、放射性核種を放出でき、ここで放射性核種が軟組織に浸透できるガンマ照射を放射するガンマ−エミッター、ベータ−エミッターまたは低エネルギーＸ線エミッターを照射するものである、物質である。１１Ｃおよび１８Ｆのような陽電子エミッターである放射性核種は、本発明の範囲外である。３Ｈおよび１４Ｃは、外部イメージングまたは放射線療法のいずれにも適さない放射性同位体であり、したがってまた本発明の範囲外である。検出可能な部分はまた：ＭＲＩイメージングのための１３Ｃ−富化化合物の１３Ｃ炭素原子のような１個以上の過分極化原子；ＭＲＩのための造影剤のような常磁性部分(例えばガドリニウム(III)、またはマンガン(II)のようなある種の金属イオン)；Ｘ線造影イメージングのためのイオパミドールのような放射線不透過性部分(コンピューター処理断層撮影法)または超音波造影剤。好ましくは、検出可能な部分は、１２３Ｉ、９９mＴc、１１１Ｉn、１１３mＩnまたは−６７Ｇaのような放射性核種γ−エミッターまたは過分極化物質である。最も好ましい放射性核種γ−エミッターは、１２３Ｉおよび９９mＴc、特に９９mＴcである。ある種の放射性核種が標識アスコルビン酸に有用な放射線治療特性を付与することも考えられる。したがって、例えば９０Ｙ、８９Ｓr、１８６Ｒe、１８８Ｒe、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐまたは３３Ｐ標識アスコルビン酸は、転移性骨疾患の処置に使用される。このような適用において、治療効果は、アスコルビン酸による薬理学的効果とは逆に、特異的細胞に送達される局所標的化放射活性線量による効果であろう。どの検出可能部分を選択しても、容易な代謝(インビボまたはインビトロのいずれかで)に付されないような方法でアスコルビン酸に結合するのが強く好ましい。なぜなら、このような代謝は、アスコルビン酸のものをもはや反映しない、検出可能な部分の体内分布をもたらすからである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
検出可能な部分が放射活性または常磁性金属イオンである場合、キレート化剤をアスコルベートに結合し、キレート−アスコルビン酸共役体を得る。このようなキレート−アスコルビン酸共役体は、２官能性キレートアプローチを使用して製造できる。したがって、結合した官能基を有するキレート化剤の製造は既知である(“２官能性キレート”)。キレート化剤に結合している官能基は：アミン、チオシアネート、マレイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような活性エステルを含む。このような２官能性キレートは、アスコルビン酸上の適当な官能基と反応し、望む共役体を形成する。ジアミンジオキシムリガンドのキレート−アミン共役体の例は、ＷＯ９５／１９１８７に記載されている。アスコルビン酸の特定の場合、キレート化剤は、下記のように６−位に結合できる。アスコルビン酸はキレート−カルボン酸共役体と反応し、エステル結合を介して結合したキレート−アスコルビン酸誘導体を得ることができる。６−ＣＯＯＨ−６−デオキシ−Ｌ−アスコルビン酸[Stuber et al, Carbohyd.Res., 60, 25(1978)]は、キレート−アミン共役体と反応でき、またはキレート−活性エステルまたはキレート−カルボン酸共役体と反応した６−ＮＨ２−６−デオキシ−Ｌ−アスコルビン酸は、アミド結合を介して結合したキレート−アスコルビン酸誘導体となる。６−Ｂr−６−デオキシ−Ｌ−アスコルビン酸は、キレート−アミンまたはキレート−チオール共役体と反応し、アミンまたはチオエーテル結合のいずれかとなる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
(Ｎ−スクシンイミジル)３,３−ビス(ビスイソプロポキシホスフィニル)プロピオネート(４)
ジシクロヘキシルカルボジイミド(２.０g、９.７１mmol)のジクロロメタン(１０ml)溶液を、一度に３,３−ビス(ビスイソプロポキシ−ホスフィニル)プロピオン酸(３)(３.５７g、８.８８mmol)およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(１.１５g、１０mmol)の乾燥ジクロロメタン(３５ml)の撹拌溶液に添加した。約１０分後、ジシクロヘキシルウレアの白色沈殿が見え始めた。混合物を１６時間撹拌し、形成した固体を濾取し、ジクロロメタン(１５ml)で洗浄した。溶媒を減圧下合わせたジクロロメタン溶液から除去し、粘性残渣を残し、それはＮＭＲからから良好な純度の表題化合物であることが示された。この残渣の最終精製は、シリカクロマトグラフィーで、ジクロロメタン：メタノール混合物(１９：１)を溶離剤として使用して行なった。生成物(４.０g、９１％)(Ｒf  ０.２)を粘性油状物として単離した。
δP(CDCl3)20.0
δH(CDCl3)1.25-1.31(24H, m, CH3×8)、2.77(4H, s, CH2×2)、2.83(1H, m, CH)、2.7-3.1(2H, m, CH2)、4.37(4H, dq, JHH=6 Hz, JPH=13.5 Hz, CH x4)
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例２：化合物１１から１５の合成。
全てアスコルビン酸のエステルである化合物１１から１５を、直接アスコルビン酸および対応するカルボン酸から、Gan et al [J. Carbohyd. Chem., 17, 397-404(1998)]に記載の方法を使用して合成した。化合物１１および１３から１５は全て、下記の６−Ｏ−(４−ヨードベンゾイル)−Ｌ−アスコルビン酸(化合物１２)に関して示すものと同様の方法を使用して合成した：
４−ヨード安息香酸(０.５g、２.４８mmol)、およびＬ−アスコルビン酸(２g、１１.３mmol)を混合し、濃硫酸(１０ml)中で２４時間室温で撹拌した。反応物を氷および固体塩化ナトリウムの添加によりクエンチした。混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。表題化合物を、減圧下での蒸発、続くクロロホルム／ヘキサン混合物からの結晶化および真空下での乾燥により単離した(２００mg、５.６mmol)。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
方法：
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウス前−骨芽細胞を、２４−ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルで、１ml最少必須培地＋１０％ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン中に蒔いた。細胞を一晩、３７℃、５％ＣＯ２で生育させた。アッセイ緩衝液および溶液をアッセイの日の朝に調製した。細胞を顕微鏡下でコンフルエンスおよび生存能に関して試験した。生育培地をLiquipippetteを使用して除去し、各ウェルを２×２００μlアッセイ緩衝液で洗浄した。適当なアッセイ溶液を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で必要な時間インキュベートした。反応を停止するために、０.５ml冷却停止緩衝液を各ウェルに添加した。各ウェルを次いで０.５ml停止緩衝液で洗浄した。細胞を０.１％ＳＤＳ溶液中で約１０分間融解し、溶液をシンチレーションバイアルに移した。各ウェルを次いでアッセイ緩衝液で洗浄し、この洗液も適当なシンチレーションバイアルに移した。シンチレーション液(５ml)を各バイアルに添加し、バイアルをボルテックス処理し、Ｒackbetaカウンター上で計数した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
ＨＰＬＣ分析
ＤＨＡＡ、ＡＡ、化合物７およびベンジルメルカプタンの分離は、以下のＨＰＬＣプロフィールを使用して十分に完了した：
移動相：ＡおよびＢ＝５０％アセトニトリル：５０％５０mＭ  ＫＨ２ＰＯ４
ディテクター：ＵＶ(２３５nm)／フローシンチレーションアナライザー(β−放射)
流速：１ml／分
カラム：Waters Spherisorb Ｓ５ＮＨ２−５μm−４.６×２５０mm
【表１１】
2003518512.tif 000001