(57)【要約】  有効かつ安価な抗HIV薬を提供する。  アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとの組み合せからなることを特徴とする抗HIV薬。
2007102326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとの組み合せからなることを特徴とする抗HIV薬。
【請求項２】
アデノウイルス5型及び修飾ワクシニアウイルスアンカラが非増殖型である請求項１記載の抗HIV薬。
【請求項３】
HIVの構造遺伝子がenv遺伝子及び/又はgag遺伝子である請求項１又は２に記載の抗HIV薬。
【請求項４】
組換えウイルスベクターの少なくとも１つに、さらに、HIVの複製制御遺伝子が挿入されている請求項１〜３のいずれかに記載の抗HIV薬。
【請求項５】
HIVの複製制御遺伝子がrev遺伝子である請求項４記載の抗HIV薬。
【請求項６】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとからなるキットである請求項１〜５のいずれかに記載の抗HIV薬。
【請求項７】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクター又は修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターのいずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追加免疫する請求項６記載の抗HIV薬。
【請求項８】
さらに、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を含む請求項１〜７のいずれかに記載の抗HIV薬。
【請求項９】
組換えウイルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも１回、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤が被験者に投与される請求項８記載の抗HIV薬。
【請求項１０】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとを治療及び/又は予防に有効な量で被験者に投与することを含む、HIV感染の治療及び/又は予防方法。
【請求項１１】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクター又は修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターのいずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追加免疫する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
初回免疫と追加免疫の間隔が１〜３か月程度である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
初回免疫と追加免疫の間隔が２か月程度である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
抗HIV薬の製造における、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとの組み合せの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノキメラウイルス５型／３５型ベクターを利用した組換えウイルスベクターワクチンとワクシニアウイルスＭＶＡベクターを利用した組換えウイルスベクターワクチンとを併用することを特徴とする抗HIV薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)が同定されてから２０年余りが経過しているが、未だに完全なる治療法は確立されていない。
初の抗HIV薬としてアジドチミジン（AZT）が開発された後、次々に新しい抗HIV薬が開発され、1995年、複数の抗HIV薬を併用するHAART(Highly Active Anti-retrovial Therapy)が開始され、先進国ではエイズによる死亡者は激減した。【０００３】
しかし、この治療法では、抗HIV薬の投与を中止すると、２〜３週間後にはHIVが再増殖してくる。また、薬剤耐性ウイルスも次々と現れ、これらに対応するために更に新しい抗HIV薬が必要になってくる。さらに、患者は、生涯、薬剤の投与を続けなくてはならず、それにかかる医療費も莫大なものである。
従って、有効かつ安価な治療法が求められている。【０００４】
一方で、エイズに対するワクチンが開発されてきた。現在、世界で知られているワクチンの中で、アデノウイルス5型ベクターを利用したワクチンは免疫原性が非常に強いワクチンであるが、アデノウイルス5型に対する中和抗体を持つ患者が多く、このような患者においてはあまり強い免疫誘導能ができないこと、アデノウイルス5型は肝障害性が非常に強いため、大量に投与することができないなどの問題があった（非特許文献１）。本発明者らは、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換することによって、アデノウイルス5型に対する中和抗体を持つ患者にも有効で、かつ肝障害性が低いワクチンを作製することに成功した（特許文献１、非特許文献２）。【０００５】
他のウイルスベクターとして、修飾ワクシニアウイルスアンカラ(MVA （modified vaccinia virus Ankara））を利用したワクチンの有効性が報告されている（非特許文献３〜５）。
しかし、異なる組換えウイルスベクターワクチンの併用に関する報告はない。【０００６】
【非特許文献１】Vogels R et al. Replication-deficient human adenovirus type 35 vectors for gene transfer and vaccination: efficient human cell infection and bypass of preexisting adenovirus immunity. J Virol 2003; 77: 8263-8271.
【非特許文献２】K-Q Xin et al., Gene Therapy (2005) 12, 1769-1777
【非特許文献３】Robinson, H. et al., Nat. Med. 5:526-534, 1999
【非特許文献４】Amara, R.R.et al., Science 292:69-74, 2001
【非特許文献５】Amara, R.R. et al., Virology 343 (2005) 246-255
【特許文献１】国際公開第WO 2005/052165号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、有効かつ安価な抗HIV薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アデノウイルス（Ad）5型のファイバーをAd35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと修飾ワクチニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターを組み合わせて免疫することにより、これまでにない強力な免疫反応を誘導できることを見出した。異なるウイルスベクターを用いることにより、各々のウイルスに対する抗体産生を軽減でき、副反応が少なく、免疫原性の極めて高いワクチンを作製できる。【０００９】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとの組み合せからなることを特徴とする抗HIV薬。
（２）アデノウイルス5型及び修飾ワクシニアウイルスアンカラが非増殖型である（１）記載の抗HIV薬。
（３）HIVの構造遺伝子がenv遺伝子及び/又はgag遺伝子である請求項１又は２に記載の抗HIV薬。【００１０】
（４）組換えウイルスベクターの少なくとも１つに、さらに、HIVの複製制御遺伝子が挿入されている（１）〜（３）のいずれかに記載の抗HIV薬。
（５）HIVの複製制御遺伝子がrev遺伝子である（４）記載の抗HIV薬。
（６）アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとからなるキットである請求項１〜５のいずれかに記載の抗HIV薬。【００１１】
（７）アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクター又は修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターのいずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追加免疫する請求項６記載の抗HIV薬。
（８）さらに、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を含む（１）〜（７）のいずれかに記載の抗HIV薬。
（９）組換えウイルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも１回、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤が被験者に投与される（８）記載の抗HIV薬。
（１０）アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとを治療及び/又は予防に有効な量で被験者に投与することを含む、HIV感染の治療及び/又は予防方法。
（１１）アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクター又は修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターのいずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追加免疫する（１０）記載の方法。
（１２）初回免疫と追加免疫の間隔が１〜３か月程度である（１１）記載の方法。
（１３）初回免疫と追加免疫の間隔が２か月程度である（１２）記載の方法。
（１４）抗HIV薬の製造における、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとの組み合せの使用。
【発明の効果】
【００１２】
２種類の組換えウイルスベクターを組み合わせて免疫することにより、各々の組換えウイルスベクター単独で免疫した場合と比較して、著しく高い免疫反応を誘導させることができた。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2006‐061007の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】組換えウイルスベクターでマウスを免疫するスケジュールを示す。
【図２】ペンタマーアッセイの結果を示す。特異的TCRを有するCD8+T細胞の割合を測定することにより、ワクチンスケジュールごとの細胞性免疫誘導能の強さを検討した結果である。
【図３】ICCSアッセイの結果を示す。抗原ペプチドの刺激によってIFN-γを産生するCD8+T細胞の割合を測定することにより、ワクチンスケジュールごとの細胞性免疫誘導能の強さを検討した結果である。
【図４】in vivo CTLアッセイの結果を示す。移入した抗原ペプチドを提示する標的細胞の生存率を測定することにより、ワクチンスケジュールごとの細胞性免疫誘導能の強さを検討した結果である。
【図５】組換えウイルスベクターでサルを免疫するスケジュールを示す。
【図６】MVAワクチンの初回免疫及びAd5/35ワクチンの追加免疫後の細胞性免疫応答を示す。アカゲザルをMVAワクチンで初回免疫した。２ヵ月後Ad5/35ワクチンで追加免疫した。IFN-γ-ELISpotアッセイは初回と追加免疫後２週間後に行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとの組み合せからなることを特徴とする抗HIV薬を提供する。
アデノウイルス5型は非増殖型であることが好ましい。組換えウイルスベクターが非増殖型であると、投与後に生体内で増殖せず、安全性が高い。非増殖型アデノウイルス5型としては、初期遺伝子E1が除去されたもの、初期遺伝子E1及びE3が除去されたものを挙げることができる。【００１５】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換するには、アデノウイルス35型由来のファイバー蛋白をコードする遺伝子を用いるとよい。アデノウイルス35型由来のファイバー蛋白をコードする遺伝子及びそのアミノ酸配列は公知である（Mei, Y.F. et al., Virology 206(1), 686-689, 1995; Dmitry M. et al., J. Virology, Mar.2000, vol.74, 2567-2583; NCBI U10272; NCBI AAA66361.1; Stone, D. et al., Virology, 2003, Vol.309, 152-156）。ファイバー蛋白は、shaftとknobから構成される。アデノウイルス35型由来のファイバー蛋白は野生型であっても変異体であってもよい。このような変異体としては、アデノウイルス35型由来のファイバー蛋白（野生型）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個（好ましくは、１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって、アデノウイルス35型由来のファイバー蛋白と同様の標的細胞への接着性を有する蛋白質を挙げることができる。また、アデノウイルス35型由来のファイバー蛋白（野生型）をコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつアデノウイルス35型由来のファイバー蛋白と同様の標的細胞への接着性を有する蛋白質であってもよい。ハイブリダイゼーションは公知の方法、例えば、Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)などの基本書に従い、当業者であれば容易に行うことができる。また、ストリンジェントな条件は当業者であれば決定できる。ストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSPE、2×デンハルト溶液、0.5%SDS、0.1 mg/mlサケ精巣DNAを含む溶液中で65℃、12時間反応させるという条件を挙げることができる。変異体をコードする遺伝子は、例えば、部位特異的突然変異誘発法などにより得ることができる。【００１６】
アデノウイルス35型由来のファイバー蛋白をコードする遺伝子（以下、「ファイバー遺伝子」と言うこともある）は、公知の遺伝子情報に基づいて、PCR法などを利用する公知の方法により得ることができる。【００１７】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換するには、例えば、アデノウイルス35型由来のファイバー遺伝子の両端にアデノウイルス5型のファイバー遺伝子近傍の遺伝子断片を接続したDNAをアデノウイルス5型とともに宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞由来の293細胞（HEK293））にトランスフェクションすると、相同組換えにより、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスが生成する。このようなキメラウイルスは、市販されており（Avior Therapeutics Incが販売するAd generation kit中のpRHSP 5/35）、入手可能である。【００１８】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスに挿入するHIVの構造遺伝子としては、gag遺伝子、pol遺伝子、env遺伝子を挙げることができる。さらに、必要に応じて、キメラウイルスにHIVの複製制御遺伝子を挿入してもよく、HIVの複製制御遺伝子としては、rev遺伝子、tat遺伝子を挙げることができる。HIVには、HIV-1と-2の２種類が知られており、HIV-1は全世界的な規模で伝播しているが、HIV-2は西アフリカに偏在している。HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子は、いずれのHIVのものであってもよいが、HIV-1のものであることが好ましい。キメラウイルスに挿入されたHIVの構造遺伝子（必要に応じて、HIVの複製制御遺伝子）は、宿主細胞中で発現するように挿入されるとよい。【００１９】
gag遺伝子は、HIVのコアタンパク質をコードする遺伝子である。
pol遺伝子は、HIVの逆転写酵素をコードする遺伝子である。
env遺伝子は、HIVのエンベロープ蛋白をコードする遺伝子である。HIV-1と-2ではエンベロープ蛋白に違いが見られるが、いずれのタイプのHIVのエンベロープ蛋白であってもよい。また、HIV-1は、エンベロープ蛋白のアミノ酸配列の違いより、サブタイプA〜J、Kなどに分類されるが、いずれのサブタイプのエンベロープ蛋白であってもよい。【００２０】
rev遺伝子は、ウイルスmRNAのうちスプライシングされていないものを安定化し、ウイルス構造タンパク質をコードするmRNAを細胞質に移送する作用を持つrevタンパク質をコードする遺伝子である。
tat遺伝子は、トランス活性化因子としてウイルスの転写活性化を起すtatタンパク質をコードする遺伝子である。【００２１】
HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子の配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知である（Goa, F., et al., J. Virol.70(3), 1651-1667(1996); Ratner, L., et al., Nature 313(6000), 277-284(1985); Jounai, N. et al., J. Gene Med., 5, 609-617(2003); Kim, F.M., et al., J. Virol.69(3), 1775-1761(1995); Rodenburg, C.M., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 17(2), 161-168(2001); Gao, F., et al., J. Virol. 72(7), 5680-5698(1998); Gao, F. et al., J. Virology 70(10), 7013-7029(1996)）。また、NCBIなどのジーンバンクからも遺伝子情報を入手できる（U51190, K03455, U39362, AF286224, U88822, U51188）。【００２２】
HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子は野生型であっても変異型であってもよい。変異型遺伝子としては、野生型遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは数個（好ましくは、１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって、野生型遺伝子がコードするタンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、野生型遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ野生型遺伝子がコードするタンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードするDNAなどを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは公知の方法、例えば、Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)などの基本書に従い、当業者であれば容易に行うことができる。また、ストリンジェントな条件は当業者であれば決定できる。ストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSPE、2×デンハルト溶液、0.5%SDS、0.1 mg/mlサケ精巣DNAを含む溶液中で65℃、12時間反応させるという条件を挙げることができる。変異型遺伝子は、例えば、部位特異的突然変異誘発法などにより得ることができる。【００２３】
HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子は、公知の遺伝子情報に基づいて、PCR法などを利用する公知の方法により得ることができる。
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスに挿入されるHIVの構造遺伝子（必要に応じて、複製制御遺伝子）は、キメラウイルスに挿入されたときに抗HIV薬としての効果が得られる限り、その領域の全部であっても、一部であってもよい。【００２４】
HIVの構造遺伝子（必要に応じて、HIVの複製制御遺伝子）は、キメラウイルスのライフサイクルに悪影響を及ぼさない限り、キメラウイルスのいかなる部位に挿入されてもよいが、例えば、アデノウイルス5型の22〜5790部位に相当するいずれかの部位に挿入されるとよい。HIVの構造遺伝子（必要に応じて、HIVの複製制御遺伝子）をキメラウイルスに挿入するには、例えば、CMVプロモーター、CAGプロモーターなどのプロモーターの下流に、これらの遺伝子、次いでポリA遺伝子を含む発現カセットを用意し、その両端にアデノウイルス5型と同じ遺伝子（例えば、アデノウイルス5型の22-342部位に相当するDNAと3523-5790部位に相当するDNA）を接続し、これをキメラウイルスとともに宿主細胞（例えば、HEK293細胞）にトランスフェクトすると、相同組換えにより、HIVの構造遺伝子（必要に応じて、HIVの複製制御遺伝子）が挿入されたキメラウイルスが生成する。発現カセットには、さらに、複製起点、アンピシリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子（目的の遺伝子が導入されたことを示すマーカー）などが含まれているとよい。【００２５】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターは、市販されているキットを用いて作製することもできる。例えば、後述の実施例１には、Avior Therapeutics, Incが販売するAd generation kitを用いて組換えウイルスベクターを作製する手順が説明されているので参照されたい。【００２６】
アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターは、非常に強いHIV特異的細胞性免疫反応を惹起することができる。また、肝臓に対する毒性が軽減され、樹状細胞への親和性も向上する。
修飾ワクシニアウイルスアンカラは非増殖型であることが好ましい。組換えウイルスベクターが非増殖型であると、投与後に生体内で増殖せず、安全性が高い。非増殖型ワクシニアウイルスアンカラは、継代・選択を多数回繰り返すことで得られた株であり、例えば、Amara, R.R. et al., Science 292:69-74 (2001); Amara, R.R. et al., J.Viol.76:7625-7631 (2002); Robinson, H. et al., Nat. Med. 5:526-534 (1999)などに記載されている。【００２７】
修飾ワクシニアウイルスアンカラに挿入するHIVの構造遺伝子としては、前述したものを挙げることができる。さらに、必要に応じて、HIVの複製制御遺伝子を挿入してもよく、HIVの複製制御遺伝子としては、前述したものを挙げることができる。HIVの構造遺伝子（必要に応じて、複製制御遺伝子）は、宿主細胞中で発現するように修飾ワクシニアウイルスアンカラに挿入されるとよい。修飾ワクシニアウイルスアンカラに挿入されるHIVの構造遺伝子（必要に応じて、複製制御遺伝子）は、修飾ワクシニアウイルスアンカラに挿入されたときに抗HIV薬としての効果が得られる限り、その領域の全部であっても、一部であってもよい。【００２８】
HIVの構造遺伝子は、修飾ワクシニアウイルスアンカラのライフサイクルに悪影響を及ぼさない限り、修飾ワクシニアウイルスアンカラのいかなる部位に挿入されてもよいが、例えば、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子部位に挿入されるとよい。
修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターは公知であり、Amara, R.R. et al., Science 292:69-74 (2001); Amara, R.R. et al., J.Viol.76:7625-7631 (2002); Robinson, H. et al., Nat. Med. 5:526-534 (1999)などの文献に記載の方法により調製することができる。【００２９】
組換えウイルスベクターは、例えば、PBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水などに溶解し、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌した後、注射により被験者に投与されるとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、不活化剤、保存剤、アジュバント、乳化剤など）などを添加してもよい。組換えウイルスベクターは、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内などに投与することができ、また、経鼻、経口投与してもよい。【００３０】
組換えウイルスベクターの投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり109〜1013ウイルス粒子、好ましくは1011〜1012ウイルス粒子のアデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、成人一人当たり108〜1010 pfu、好ましくは109〜1010 pfuの修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターを、少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。【００３１】
本発明の一態様において、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクター又は修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターのいずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追加免疫する。初回免疫は、組換えアデノキメラウイルスベクター又は組換えワクシニアウイルスアンカラのいずれでしてもよいが、組換えアデノキメラウイルスベクターですることが好ましい。初回免疫と追加免疫の間隔は、１〜３か月程度が適当であり、２か月程度が好ましい。また、１回の追加免疫で十分な効果が得られなかった場合には、さらに、１〜３か月程度、好ましくは２か月程度の間隔をあけて、１回以上の追加免疫をするとよい。追加免疫を２回以上行う場合には、同じ種類の組換えウイルスベクターを用いてもよいし、異なる種類組換えウイルスベクターを用いてもよい。本発明はこの投与方法に限定されるわけではなく、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとを同時に投与してもよい。【００３２】
組換えウイルスベクターは、さらに、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて用いてもよい。逆転写酵素阻害剤としては、アジドチミジン(AZT)、ジダノシン(ddl)、ラブミジン(3TC)、ネビラピン(NVP)などを挙げることができる。プロテアーゼ阻害剤としては、インジナビル(IDV)、サキナビル(SQV)、リトナビル(RTV)、ネルフィナビル(NFV)、テノフォビル(PMPA)などを挙げることができる。高活性抗レトロウイルス療法（Highly Active Anti-retroviral Therapy(HAART)）に用いられているものが好ましい。逆転写酵素阻害剤としては、アジドチミジン(AZT)、ジダノシン(ddl)、ラブミジン(3TC)、ネビラピン(NVP)などを挙げることができる。プロテアーゼ阻害剤としては、インジナビル(IDV)、サキナビル(SQV)、リトナビル(RTV)、ネルフィナビル(NFV)などを挙げることができる。高活性抗レトロウイルス療法（Highly Active Anti-retroviral Therapy(HAART)）に用いられているものが好ましい。組換えウイルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも１回、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を被験者に投与するとよい。例えば、組換えウイルスベクター投与の１〜３か月程度、好ましくは２か月程度前に、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を投与する。逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤の投与量は、「抗HIV治療ガイドライン」（平成15年度厚生労働省科学研究費補助金エイズ対策研究事業HIV感染症の医療体制の整備に関する研究班  2004年3月）の記載に準じるものであるとよい。具体的な投与スケジュールの一例として、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤の投与（例えば、テノフォビル20〜30mg/kg/dayを１日１回）開始１か月後に、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターを投与し（例えば、109〜1013ウイルス粒子を１回）、その２か月後に、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターを投与する（例えば、108〜1010 pfuを１回）。効果が不十分であると判定された場合には、組換えウイルスベクターの投与を繰り返す。【００３３】
また、組換えウイルスベクターは、DNAワクチンなどの他のワクチンと組み合せて用いてもよい。例えば、組換えウイルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも１回、他のワクチンを被験者に投与する。他のワクチンとしては、サブタイプBのHIV株であるHIVIIIBのrev遺伝子とenv遺伝子を含むDNAワクチン（pCAGrev/env, Jounai N. et al., J. Gene Med. 2003; 5: 609-617）などを挙げることができる。DNAワクチンの投与量は、5〜30 mgが適当であり、10〜20 mgが好ましい。具体的な投与スケジュールの一例として、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤の投与（例えば、テノフォビル20〜30 mg/kg/dayを１日１回）開始０、１か月、２か月後に、DNAワクチンを筋肉内注射にて投与し（例えば、pCAGrev/envを5〜30 mg）、DNAワクチン投与終了から１か月後に、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターを投与し（例えば、109〜1013ウイルス粒子の量で１回）、さらにその１か月後に、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターを投与する（例えば、108〜1010 pfuの量で１回）。効果が不十分であると判定された場合には、組換えウイルスベクターの投与を繰り返す。【００３４】
２種類の組換えウイルスベクターからなる本発明の抗HIV薬は、HIV治療用、さらには予防用ワクチンとしての有効性が期待できる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３６】
〔実施例1〕
実験方法及び材料
組換えベクター
E1, E3欠損非増殖型アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換し、かつサブタイプBのHIV株であるHIVIIIBのrev遺伝子及びenv遺伝子を導入した組換えウイルスをAd generation kit (Avior Therapeutics Inc., Seattle, WA, USA)(Shayakhmetov D.M., et al., J. Virol. 2000; 74: 2567-2583)を用いて構築した。簡単に説明すると、CAGプロモーター-HIVIIIBrev/env gp160-polyAを含む、5.2k bpのSalI/PstI断片をpCAGrev/envから単離した（Jounai N. et al., J. Gene Med. 2003; 5:609-617）。アデノウイルス5型（Ad5）の22-342部位、3523-5790部位、E.coli ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むシャトルプラスミド(pLHSP)をAvior Therapeutics Inc.(Seattle, WA, USA)から得た。pLHSPの平滑末端化したEcoRI部位に平滑末端化した5.2k bp断片をサブクローニングし、pLHSP-HIVシャトルプラスミドを生成した。このpLHSP-HIVシャトルプラスミドをPacIで直鎖状にし、E1, E3欠損キメラAd5/35ゲノムとともにカルシウム沈殿法でヒト胎児腎(HEK293)細胞にトランスフェクトし、組換えウイルスAd5/35IIIBenvを生成した。
なお、E1, E3欠損キメラAd5/35ゲノムは、アデノウイルス5型のファイバー遺伝子がアデノウイルス35型由来のファイバー遺伝子に置換されたキメラシャトルプラスミド(pRHSP 5/35)であり、Ad generation kit (Avior Therapeutics Inc., Seattle, WA, USA)中に用意されている。組換えウイルスAd5/35IIIBenvはHEK293細胞中で増殖させ、CsCl法（Lieber A. et al., J. Virol. 1996; 70:8944-8960）を２回繰り返して精製した。ウイルスの全濃度を260 nm(OD260)の光学濃度から、式1 OD260=1x1012 vp/mlを用いて計算した。
HIV envを発現する非増殖型ワクチニアウイルスアンカラ(MVAIIIBenv)（Amara, R.R. et al., Science 292:69-74 (2001); Amara, R.R. et al., J.Viol.76:7625-7631 (2002); Robinson, H. et al., Nat. Med. 5:526-534 (1999)）はDr. Moss(Laboratory of Viral Diseases, National Institutes of Health, MD)から提供された。【００３７】
動物の免疫
メスBALB/cマウス（８週令; H-2Dd)はJapan SLC Inc., Shizuoka, Shizuoka-ken, Japanから購入した。5x109 vp/匹のAd5/35IIIBenv（PBS中）でi.m.投与にてマウスを初回免疫した後、４週目に5x109 vp/匹のAd5/35IIIBenv（PBS中）又は1x106 pfu/匹のMVAIIIBenv（PBS中）でi.m.投与にて追加免疫した（図１）。初回免疫後６週目にマウスから採血し、後述のペンタマーアッセイ（Anjali N. et al., J. Virol. 2005, Vol.79, No.22, p.14161-14168）、ICCSアッセイ（Elzbieta T. et al., The Journal of Immunology, 2002, 169:5347-5357）、in vivo CTLアッセイ（Michael S. et al., The Journal of Immunology, 2005, 174:7986-7994）を行った（図１）。また、初回免疫も追加免疫もしない群（Negative Control）、初回免疫無でAd5/35IIIBenvで免疫した群、初回免疫無でMVAIIIBenvで免疫した群、MVAIIIBenvで初回及び追加免疫した群も用意した。【００３８】
ペンタマーアッセイ
ペンタマーとは、目的の抗原ペプチドと主要組織適合性抗原（MHC）の複合体の５量体である。このペンタマーをマウスの脾臓から分離した白血球と反応させると、抗原特異的なレセプターを有するT細胞のみと結合するため、抗原特異的なT細胞を検出することができる。本実験では、リンパ球細胞表面上のHIV特異的T細胞レセプターをフィコエリスリン（PE）標識ペンタマーで染色し、次にフルオレセインイソチオシアネート(FTIC)標識CD8抗体によって染色しFACSを行うことで、ペンタマー陽性かつCD8陽性細胞を検出し、白血球中における抗原特異的キラーT細胞の割合を測定又は推定する。詳細な手順は以下の通りである。
マウスの脾臓から分離した白血球をバッファー（3％FCS（ウシ胎児血清）、0.1％アジ化ナトリウム含有PBS）に懸濁し、正常マウス血清(終濃度4%)を加え4oCにて15分間ブロッキングを行なった。次にFITCラベル抗マウスCD8a抗体(Ly-2)(PharMingen)を添加し、4℃で30分間静置した。バッファーで洗浄した後、PEラベルペンタマー（H-2Dd/p18(RGPGRAFVTI) - MHC複合体五量体）(ProImmune, オックスフォード)を添加し、37℃で15分間インキュベートした。洗浄後、固定液（4％ホルムアルデヒド含有PBS）に懸濁し4℃で10分間静置し、その後フローサイトメトリーによる解析を行なった。【００３９】
ICCSアッセイ
抗原特異的な細胞内サイトカイン産生細胞を調べるため、細胞内サイトカインを染色する(intracellular cytokine staining (ICCS))アッセイ方法である。まず、免疫マウスの脾臓から白血球を分離し、抗原ペプチド（例えば、HIVのp18ペプチド）存在下で24時間培養する。その後、産生されたサイトカインを蛍光標識抗体と結合させ、FACSで検出する。本実験では、CD8陽性かつIFN-γ産生細胞を検出し、抗原ペプチドに反応してIFN-γを産生する抗原特異的キラーT細胞の出現率を推定した。詳細な手順は以下の通りである。
マウスの脾臓から分離した白血球を、10μg/ml HIV V3ペプチド（NNTRKRIQRGPGRAFVTIGKIGN）添加RPMI培地に懸濁し、37℃で24時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をバッファー（3％FCS（ウシ胎児血清）、0.1％アジ化ナトリウム含有PBS）で洗浄し、正常マウス血清(終濃度4%)を加え4℃にて15分間ブロッキングを行なった。次にPEラベル抗マウスCD8抗体（Ly-2）(PharMingen）を添加し4℃にて20分間静置した。洗浄後、Cytofix/ CytoPerm Plusキット（PharMingen）を用いて膜透過処理を行い、その後FITCラベル抗マウスIFN-γ抗体（PharMingen）を添加し、4℃にて30分間静置した。洗浄後、フローサイトメトリーによる解析を行なった。【００４０】
in vivo CTLアッセイ
正常マウスの脾細胞にHIVのp18ペプチドをパルスして、CFSE(5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'-diacetylfluorescein)で染めた。また、パルスしていない脾細胞を1/10の濃度のCFSEで染め、２つを混ぜ、免疫したマウスの尾静脈に注入した。24時間後、マウスの血液又は脾細胞をフローサイトメトリーで流し、p18ペプチドのついた細胞をどれだけ殺したかを調べた。詳細な手順は以下の通りである。
非免疫マウスの脾臓から分離した白血球をCTL標的細胞とした。白血球の一部を10μg/ml HIV V3ペプチド（RGPGRAFVTI）を含む培地にて37℃で1時間インキュベートし、ペプチドパルスされた標的細胞とした。また一部は無処理のままペプチドパルスしていない標的細胞とした。次に、ペプチドパルスされた標的細胞を5μM CSFE、非パルス標的細胞を0.5μM CFSEでラベルした。PBSで洗浄した後これら２種類の標的細胞を混合し、あらかじめワクチンを投与し免疫したマウスに5 x 106細胞静脈投与した。標的細胞投与から24時間後に投与マウスから脾臓を摘出し、白血球を分離した。この白血球をフローサイトメトリーによって解析し、標的細胞の生存率を測定した。最終的な値の算出方法は、
%=[1-(非免疫マウス脾臓内非パルス標的細胞数/ペプチドパルス標的細胞数)/(免疫マウス脾臓内非パルス標的細胞数/ペプチドパルス標的細胞数)]x100
である。【００４１】
結果
ペンタマーアッセイの結果を図２に示す。図１に示したスケジュールで免疫し、それぞれの投与スケジュールにおいて誘導される免疫能の強さを、抗原特異的CD8+T細胞の数を測定することによって解析した。図中の値は、(HIVペプチドp18特異的なCD8+T細胞)/(全CD8+T細胞) x100 (%)を示す。【００４２】
上段左； Negative Controlの脾細胞中では、全CD8+T細胞中のp18特異的CD8+T細胞の割合は0.07％であった。上段中; Ad5/35IIIBenvを単回投与した群では8.64％であった。上段右； MVAIIIBenvを単回投与した群では2.79％であった。下段左； MVAIIIBenvを２度免疫した群では5.84％であった。下段中； Ad5/35IIIBenvを２度免疫した群では、10.66％であった。下段右； 0週目にMVAIIIBenv，4週目にAd5/35IIIBenvを免疫した群では、21.26％であった。【００４３】
以上より、Ad5/35IIIBenvはMVAIIIBenvと比べHIVペプチド特異的免疫誘導能が強く、またAd5/35IIIBenv、MVAIIIBenvいずれも２回免疫により単回投与と比べより強い特異的免疫反応が誘導されることが明らかになった。さらに、今回行なった中では初回免疫にAd5/35IIIBenv、追加免疫にMVAIIIBenvを用いる免疫スケジュールにより最も高い割合のHIVペプチドp18特異的なCD8+T細胞が得られ、このスケジュールがワクチンとして最も有効性が高いことが示唆された。【００４４】
ICCSアッセイの結果を図３に示す。図１に示したスケジュールで免疫し、それぞれの投与スケジュールにおいて誘導される免疫能の強さを、HIV V3ペプチド（NNTRKRIQRGPGRAFVTIGKIGN）刺激によりIFN-γ産生するCD8+T細胞の割合を測定することによって解析した。図中の値は、(HIV V3ペプチド刺激によりIFN-γを産生するCD8+T細胞)/(全CD8+T細胞) x100を示す。【００４５】
上段左；Negative Controlの脾細胞中では、全CD8+T細胞中のHIV V3ペプチド刺激によりIFN-γを産生するCD8+T細胞の割合は0.75±0.07％であった。上段中； Ad5/35IIIBenvを単回投与した群では2.87±0.52％であった。上段右；MVAIIIBenvを単回投与した群では0.99±0.25％であった。下段左；MVAIIIBenvを２度免疫した群では1.86±0.14％であった。下段中；Ad5/35IIIBenvを２度免疫した群では5.00±1.46％であった。下段右；0週目にMVAIIIBenv，4週目にAd5/35IIIBenvを免疫した群では8.86±1.77％であった。【００４６】
以上よりペンタマーアッセイの結果と同様、Ad5/35IIIBenvはMVAIIIBenvと比べHIVペプチド特異的免疫誘導能が強く、またAd5/35IIIBenv、MVAIIIBenvいずれも２回免疫により単回投与と比べより強い特異的免疫反応が誘導されることが明らかになった。今回行なった中では、初回免疫にAd5/35IIIBenv、追加免疫にMVAIIIBenvを用いる免疫スケジュールにより、最も高い割合でHIV V3ペプチド刺激によるIFN-γ産生CD8+T細胞が出現し、このスケジュールがワクチンとして最も有効性が高いことが示唆された。【００４７】
in vivo CTLアッセイの結果を図４に示す。図１に示したスケジュールで免疫し、それぞれの投与スケジュールにおいて誘導される免疫能の強さを、HIV V3ペプチド（RGPGRAFVTI）提示標的細胞の生存率を測定することにより解析した。図中M1は非パルス標的細胞、M2はペプチドパルス標的細胞を示している。図中の値は、CTL活性=[1-(非免疫マウス脾臓内非パルス標的細胞数/ペプチドパルス標的細胞数)/(免疫マウス脾臓内非パルス標的細胞数/ペプチドパルス標的細胞数)]x100 (%)を示す。【００４８】
上段左；Negative ControlのCTL活性は0％である。上段中； Ad5/35IIIBenvを単回投与した群ではCTL活性は61.1±5.4％であった。上段右；MVAIIIBenvを単回投与した群では46.0±3.0％であった。下段左；MVAIIIBenvを２度免疫した群では47.7±2.6％であった。下段中；Ad5/35IIIBenvを２度免疫した群では73.1±6.0％であった。下段右；0週目にMVAIIIBenv，4週目にAd5/35IIIBenvを免疫した群では84.5±1.4％であった。【００４９】
以上よりペンタマーアッセイ、ICCSアッセイの結果と同様、Ad5/35IIIBenvはMVAIIIBenvと比べHIVペプチド特異的免疫誘導能が強いことが明らかになった。今回行なった中では、初回免疫にAd5/35IIIBenv、追加免疫にMVAIIIBenvを用いる免疫スケジュールにより、最も高いCTL活性が誘導され、このスケジュールがワクチンとして最も有効性が高いことが示唆された。【００５０】
〔実施例２〕
組換えベクター
SIVenvとSIVgagを発現するMVAワクチンの作成法：SIVenv(GenBank No. AAA47632.1)とSIVgag遺伝子（GenBank No.AAA47637.1）(Dr. Thomas C Friedrich, Wisconsin national Primate Research Center, Madison, WI 53706 USAから提供された)をMVAウイルスのシャットルベクター（ｐLW44）（Dr.Bernard Moss, LVD, NIAID, NIH, Bethesda, MD 20892-0445 USAから提供された。PNAS 101:6641-46, 2004）のSalI/PstIサイトに挿入した。できたベクタ−を野生株MVA（Dr. Bernard Mossから手供された）に感染させたBHK21細胞（American Type culture Collection, The Global Bioresource Center, Manassas, VA20108, USA ）にlipofectamin（Invitrogen, Carisbad, CA92008, USA）で導入した。組み換えMVAウイルスをSucrose（Wako, 東京、日本）で精製した。
SIVenvとSIVgagを発現するAd5/35ベクターの作成法：SIVenv（GenBank No. AAA47632.1）とSIVgag遺伝子（GenBank No.AAA47637.1）(Dr. Thomas C Friedrich, Wisconsin national Primate Research Center, Madison, WI 53706 USAから提供された)を用い、実施例１と同様の方法（段落[0036]）でSIVenvとSIVgag遺伝子を発現するAd5/35ベクタ−をHEK293細胞（American Type culture Collection, The Global Bioresource Center, Manassas, VA20108, USA ）で作成及び精製した。
SIVはサルの免疫不全ウイルスであり、SIVウイルスの分類、性質、感染経路、発症などはHIVと同じなので、HIVのサルモデルとして使われている。【００５１】
動物の免疫（図５）
109pfuのSIVenvとSIVgagを発現するMVAワクチン（上述）で5匹アカゲサル（中国軍事医学科学院実験動物センタ−から購入）を初回免疫した。２ヶ月後、1012粒子のSIVenvとSIVgagを発現するAd5/35ワクチン（上述）で追加免疫した。細胞性免疫（IFN-γ-ELISpot）をMVAワクチンとAd5/35ワクチンでの免疫2週間後に測定した。【００５２】
細胞性免疫(IFN-γ-ELISpot)の測定
免疫したサルのリンパ球をSIVenvとSIVgag プ−ルペプチド（AIDS research and Reference Reagent Program, National Institutes of Health, Rockville, MD20850, USA）で２４時間刺激した。IFN-γ分泌する細胞数をELISpot法で測定した（Xin et al, Gene Ther. 2005, 12:1769-1777.）。【００５３】
結果
IFN-γ-ELISpotの結果を図６に示す。MVAワクチンでの免疫により、SIV特異的なIFN-γ-分泌リンパ球は470個/106細胞であったのに対して、Ad5/35ワクチンでのブ−ストによりその細胞数は三倍以上に増えた（1708個/106細胞）。以上のことから、MVAワクチンとAd5/35ワクチンとを組合せて投与することにより、単独のワクチン投与では得られない高い免疫効果が得られることがSIVおよびHIVに対する予防効果と治療効果が期待できた。【００５４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
２種類の組換えウイルスベクターを併用することにより、HIVに対して強力な免疫反応を誘導することができる。本発明の抗HIV薬は、HIV撲滅のために有効な治療を可能とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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