【手続補正書】
【提出日】平成20年9月1日(2008.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  ＰＡＲリガンドドメイン；
ｂ）  クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｃ）  クロストリジウム毒素転移ドメイン；及び
ｄ）  クロストリジウム毒素結合ドメイン、
を含む修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２】
ＰＡＲリガンドドメインが、クロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端に作動的に連結されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項３】
修飾クロストリジウム毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項２に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項４】
修飾クロストリジウム毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項２に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５】
ＰＡＲリガンドドメインがクロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端に対し作動的に連結されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項６】
修飾クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項５に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項７】
修飾クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項５に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項８】
ＰＡＲリガンドドメインがクロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端に作動的に連結されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項９】
修飾クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項８に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１０】
修飾クロストリジウム毒素が、プロテアーゼ切断部位をさらに含み；プロテアーゼ切断部位がＰＡＲリガンドドメインをアンマスクする、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１１】
ＰＡＲリガンドドメインがＰＡＲ１リガンドドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１２】
ＰＡＲ１リガンドドメインが配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号１３３を含む、請求項１１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１３】
ＰＡＲリガンドドメインがＰＡＲ２リガンドドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１４】
ＰＡＲ２リガンドドメインが配列番号２４又は配列番号２５を含む、請求項１３に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１５】
ＰＡＲリガンドドメインがＰＡＲ３リガンドドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１６】
ＰＡＲ３リガンドドメインが配列番号２６、配列番号２７又は配列番号１３４を含む、請求項１５に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１７】
ＰＡＲリガンドドメインがＰＡＲ４リガンドドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１８】
ＰＡＲ４リガンドドメインが配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号１３５又は配列番号１６０を含む、請求項１７に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１９】
修飾クロストリジウム毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ボツリヌス毒素酵素ドメイン、ボツリヌス毒素転移ドメイン及びボツリヌス毒素結合ドメインを含む修飾ボツリヌス毒素である、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２０】
修飾ボツリヌス毒素がＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ａである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２１】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン、及びＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｂである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２２】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１である、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２３】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン、及びＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｄである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２４】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｅである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２５】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン、及びＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｆである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２６】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｇである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２７】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、破傷風毒素酵素ドメイン、破傷風毒素転移ドメイン及び破傷風毒素結合ドメインを含む修飾破傷風毒素である、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２８】
修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子であって、請求項１−２７に記載の修飾されたクロストリジウム毒素のいずれか1つをコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾されたクロストリジウム毒素を細胞内で発現させる工程を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の製造方法。
【請求項３０】
ａ．請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子を細胞内に導入する工程、及び
ｂ．前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾されたクロストリジウム毒素を発現させる工程、
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の製造方法。
【請求項３１】
ａ）  ＰＡＲリガンドドメイン；
ｂ）  クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｃ）  クロストリジウム毒素転移ドメイン；及び
ｄ）  非クロストリジウム毒素結合ドメイン、
を含む修飾クロストリジウム毒素。
【請求項３２】
非クロストリジウム毒素結合ドメインが、神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、多頭活性化ペプチド（ＨＨＡＰ）、形質転換成長因子１（ＴＧＦ−１）、形質転換成長因子２（ＴＧＦ−２）、形質転換成長因子３（ＴＧＦ−３）、上皮成長因子（ＥＧＦ）又は毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）からなる群から選択される、請求項３１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項３３】
非クロストリジウム毒素結合ドメインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）又はインタロイキン−８（ＩＬ−８）からなる群から選択される、請求項３１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項３４】
非クロストリジウム毒素結合ドメインがブラジキニン、ダイノルフィン、β−エンドルフィン、エトルフィン、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、Leu−エンケファリン、Met−エンケファリン、ガラニン、ロフェンタニル又はノシセプチンからなる群から選択される、請求項３１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項３５】
非クロストリジウム毒素結合ドメインが、後根神経節ニューロンの表面上に見出されるラクト系炭水化物エピトープに対する抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ２及びＬＡ４）、上述の結合ドメインについてのレセプターのいずれかに対する抗体又は表面発現抗原Ｔｈｙ１に対する抗体（例えばモノクローナル抗体ＭＲＣＯＸ７）からなる群から選択される請求項３１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
毒素分子が、その毒素の天然の標的細胞でない細胞に再ターゲティングされ得るということは、充分に立証されている。このように再度ターゲティングされた場合、これらの毒素は、所望の標的細胞に結合する能力を有し、かつ、細胞質ゾル内への後続する転移の後、標的細胞に対するその効果を及ぼす能力をもつ。この点において、結合ドメインは、それが所望の標的細胞に結合し、その後標的細胞内で修飾クロストリジウム毒素からエンドソームへの移行を可能にするような形で選択される。これに制限されないが、非クロストリジウム結合ドメインが修飾クロストリジウム毒素のクロストリジウム結合ドメインにより使用されるもの以外の細胞表面レセプター系に結合することを条件として、リガンド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト及び逆アゴニストを含めあらゆる非クロストリジウム結合ドメインを使用することができるものと予測されている。非クロストリジウム結合ドメインの制限的意味のない例としては、成長因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、多頭活性化ペプチド（ＨＨＡＰ）、形質転換成長因子１（ＴＧＦ−１）、形質転換成長因子２（ＴＧＦ−２）、形質転換成長因子３（ＴＧＦ−３）、上皮成長因子（ＥＧＦ）又は毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）及びインタロイキン−８（ＩＬ−８）；アゴニスト、例えば非クロストリジウム毒素結合ドメインがブラジキニン、ダイノルフィン、β−エンドルフィン、エトルフィン、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、Leu−エンケファリン、Met−エンケファリン、ガラニン、ロフェンタニル又はノシセプチン及びオピオイド；そして抗体、例えば後根神経節ニューロンの表面上に見出されるラクト系炭水化物エピトープ（lactoseries carbohydrate epitope）に対する抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ２及びＬＡ４）、上述のリガンドについてのレセプターのいずれかに対する抗体及び表面発現抗原Ｔｈｙ１に対する抗体（例えばモノクローナル抗体ＭＲＣＯＸ７）が含まれる。クロストリジウム毒素キメラ変異体を作製し使用する方法は、結合ドメインが非クロストリジウム毒素結合ドメインを含む場合、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素を含むことができ、これらの方法は、例えばクリフォード・Ｃ・ショーンら、上掲書（２００２年）；キース・Ａ・フォスターら、上掲書（２００２年）；ウェイ・ジン・リンら、上掲書（２００２年）；キース・Ａ・フォスターら、上掲書（２００３年）；Ｊ．オリバー・ドリーら、上掲書（２００１年）；クリフォード・Ｃ・ショーンら、上掲書（２００４年）；及びキース・Ａ・フォスターら、上掲書（２００５年）の中で記載されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
かくして、一実施形態においては、クロストリジウム毒素キメラ変異体は、結合ドメインが非クロストリジウム毒素結合ドメインを含む場合、本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素を含むことができる。この実施形態の態様においては、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、例えば、リガンド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗体、オピオイド、アンタゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストであり得る。この実施形態のその他の態様においては、前記非クロストリジウム毒素結合ドメインは、神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、多頭活性化ペプチド（ＨＨＡＰ）、形質転換成長因子１（ＴＧＦ−１）、形質転換成長因子２（ＴＧＦ−２）、形質転換成長因子３（ＴＧＦ−３）、上皮成長因子（ＥＧＦ）又は毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である。さらに、本実施形態のその他の態様においては、前記非クロストリジウム毒素結合ドメインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）又はインタロイキン−８（ＩＬ−８）である。本実施形態のさらにもう1つの態様においては、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、ブラジキニン、ダイノルフィン、β−エンドルフィン、エトルフィン、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、Leu−エンケファリン、Met−エンケファリン、ガラニン、ロフェンタニル又はノシセプチンである。本実施形態のさらにその他の形態においては、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、後根神経節ニューロンの表面上に見出されるラクト系炭水化物エピトープに対する抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ２及びＬＡ４）、上述の結合ドメインについてのレセプターのいずれかに対する抗体又は表面発現抗原Ｔｈｙ１に対する抗体（例えばモノクローナル抗体ＭＲＣＯＸ７）である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
かくして、一実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ここでＰＡＲリガンドドメインはクロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端に位置設定されている。この実施形態の１態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形構成が酵素ドメイン、転移ドメインそして結合ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを酵素ドメインのアミノ末端に位置設定することができる。本実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形構成が酵素ドメイン、結合ドメインそして転移ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを酵素ドメインのアミノ末端に位置設定することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
かくして、一実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ここでＰＡＲリガンドドメインはクロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端に位置設定されている。この実施形態の１態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形構成が結合ドメイン、酵素ドメインそして転移ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを同じく転移ドメインのアミノ末端に位置設定することもできる。本実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形構成が酵素ドメイン、転移ドメインそして結合ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを転移ドメインのアミノ末端に位置設定することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
さらにもう１つの実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ここでＰＡＲリガンドドメインはクロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端に位置設定されている。この実施形態の１態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形構成が酵素ドメイン、結合ドメインそして転移ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを同じく結合ドメインのアミノ末端に位置設定することもできる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５６】
【図１】活性化されたＰＡＲが分解のためリソソームに向かって主にターゲティングされていることを示している。ＰＡＲは不可逆的な機序により活性化され、ひとたび分割された時点で、大部分の活性化されたＰＡＲは、エンドサイトーシスを受け、細胞内トラフィッキング経路により、分解のためにリソソームへと導かれる。ステップ１は、連結リガンドをアンマスクするためのプロテアーゼによる不活性化ＰＡＲの分割を例示している（太線囲み）。ステップ２は、活性化ＰＡＲの連結リガンド結合及び立体配座変化を例示する。ステップ３は、活性化ＰＡＲのエンドサイトーシスを例示する。ステップ４は、リソソームに対するレセプターのトラフィッキングを結果としてもたらす内在化された活性化ＰＡＲの早期及び晩期エンドソーム選別を例示している。ステップ５は、リソソーム内部のプロテアーゼによる内在化された活性化ＰＡＲの分解を例示している。
【図２】連結リガンドを含む修飾クロストリジウム毒素が、分解のためにリソソームに向かってターゲティングされていることを示している。循環系内に拡散するこのような修飾毒素は、不活性ＰＡＲに結合することができ、こうしてエンドサイトーシスそして分解のためのリソソームに対する細胞内トラフィッキングによる内在化毒素の誘導が開始されることになる。ステップ１は、ＰＡＲに対する連結リガンドドメイン（太線囲み）を含む修飾クロストリジウム毒素の結合を例示している。ステップ２は、毒素−ＰＡＲ複合体のエンドサイトーシスを例示する。ステップ３は、リソソームに対する複合体のトラフィッキングを結果としてもたらす内在化毒素−ＰＡＲ複合体の早期及び晩期エンドソーム選別を例示している。ステップ５は、リソソーム内でのプロテアーゼによる内在化毒素−ＰＡＲ−複合体の分解を例示している。
【図３】中枢及び末梢ニューロンにおける神経伝達物質放出及びクロストリジウム毒素中毒の現行のパラダイムの概略図を示す。図３ａは、中枢及び末梢ニューロンの神経伝達物質放出の機序についての概略図を示す。放出プロセスは、次の２つのステップを含むものとして記載可能である；１）神経伝達物質分子を含有する小胞の小胞結合型ＳＮＡＲＥタンパク質が原形質膜にある膜結合型ＳＮＡＲＥタンパク質と会合する小胞ドッキングステップ；及び２）小胞が原形質膜と融合し、神経伝達物質分子がエキソサイトーシスを受ける、神経伝達物質の放出ステップ。図３ｂは、中枢及び末梢ニューロンにおける破傷風及びボツリヌス毒素活性についての中毒機序の概略図を示す。この中毒プロセスは、以下の４つのステップを含むものとして記載できる；１）クロストリジウム毒素がクロストリジウムレセプター系に結合し、中毒プロセスを開始させる、レセプター結合ステップ；２）毒素結合の後、毒素／レセプター系複合体を含有する小胞が細胞内にエンドサイトーシスされる、複合体内在化ステップ；３）例えば小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャンネル孔の形成、重鎖からのクロストリジウム毒素軽鎖の分離及び活性軽鎖の放出を含めた、多数の事象が発生すると考えられている軽鎖転移ステップ、及び４）クロストリジウム毒素の活性化軽鎖がＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ又はＳｙｎｔａｘｉｎといったようなその標的ＳＮＡＲＥ基質をタンパク質分解により分割し、かくして小胞ドッキング及び神経伝達物質の放出を防止するステップ。
【図４】酵素ドメインのアミノ末端にあるＰＡＲリガンドドメインを伴う修飾クロストリジウム毒素を示す。図４Ａは、２重ＳＳカッコにより描かれている２鎖ループ領域及び２鎖ループ分割後の結果として得られる２鎖形態と共に、ＰＡＲリガンドドメイン、酵素ドメイン、転移ドメイン及び結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形構成をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）がＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスクされた状態となる。Ｐ２は、毒素の１本鎖形態を２鎖形態に転換させるために使用されるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１もＰ２の両方共、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得、同じプロテアーゼ又は異なるプロテアーゼにより分割され得る。図４Ｂは、２鎖ループ部域が２重ＳＳカッコで描かれている状態で、ＰＡＲリガンドドメイン、酵素ドメイン、結合ドメイン及び転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形構成をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）が、ＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスク状態になる。Ｐ２は、毒素の１本鎖形態から２鎖形態へと転換するために用いられるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１もＰ２も両方共、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得、同じプロテアーゼ又は異なるプロテアーゼにより分割され得る。図４Ｃは、２鎖ループ領域が２重ＳＳカッコで描かれている状態で、ＰＡＲリガンドドメイン、酵素ドメイン、転移ドメイン及び結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形構成をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、アンマスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定されている。Ｐ２は、毒素の１本鎖形態から２鎖形態へと転換するために用いられるプロテアーゼ切断部位であり、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。図４Ｄは、２鎖ループ領域が２重ＳＳカッコで描かれている状態で、ＰＡＲリガンドドメイン、酵素ドメイン、結合ドメイン及び転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形構成をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、アンマスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定されている。Ｐ２は、毒素の１本鎖形態から２鎖形態へと転換するために用いられるプロテアーゼ切断部位であり、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。
【図５】転移ドメインのアミノ末端にあるＰＡＲリガンドドメインを伴う修飾クロストリジウム毒素を示す。図５Ａは、２重ＳＳカッコにより描かれている２鎖ループ領域及び２鎖ループ分割後の結果として得られる２鎖形態と共に、結合ドメイン、酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン及び転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形構成をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）がＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスクされた状態となる。Ｐ１は、同様に、毒素の１本鎖形態を２鎖形態に転換させるために使用されるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１は、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。図５Ｂは、２鎖ループ部域が２重ＳＳカッコで描かれている状態で、酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、転移ドメイン及び結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形構成をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが転移ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）が、ＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスク状態になる。Ｐ１は同様に毒素の１本鎖形態から２鎖形態へと転換するために用いられるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１は、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。
【図６】結合ドメインのアミノ末端にあるＰＡＲリガンドドメインを伴う修飾クロストリジウム毒素を示す。図６は、２重ＳＳカッコにより描かれている２鎖ループ領域及び２鎖ループ分割後の結果として得られる２鎖形態と共に、酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、結合ドメイン及び転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形構成をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）がＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスクされた状態となる。Ｐ１は同様に、毒素の１本鎖形態を２鎖形態に転換させるために使用されるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１は、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。
【図７】カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号８５の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１３６ポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構成体ｐＥＴ２９ｂ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位が、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾ＢｏＮＴ／Ａの間で作動的に連結されている。略号は以下の通りである。すなわちＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモータ領域；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；Ｔ７  ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終結領域；ｆ１  起点、バクテリオファージｆ１複製起点；カナマイシン、カナマイシン耐性を付与するアミノホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起点；ｌａｃ1、ラクトースＩをコードするポリヌクレオチド分子。
【図８】カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号９３の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１４４ポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構成体ｐＥＴ２９ｂ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位が、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾ＢｏＮＴ／Ａの間で作動的に連結されている。略号は以下の通りである。すなわちＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモータ領域；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；Ｔ７  ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終結領域；ｆ１  起点、バクテリオファージｆ１複製起点；カナマイシン、カナマイシン耐性を付与するアミノホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起点；Ｌａｃｌ、ラクトースＩをコードするポリヌクレオチド分子。
【図９】カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号１０１の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１５２ポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構成体ｐＥＴ２９ｂ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位が、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾ＢｏＮＴ／Ａの間で作動的に連結されている。略号は以下の通りである。すなわちＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモータ領域；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；Ｔ７  ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終結領域；ｆ１起点、バクテリオファージｆ１複製起点；カナマイシン、カナマイシン耐性を付与するアミノホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起点；Ｌａｃｌ、ラクトースＩをコードするポリヌクレオチド分子。
【図１０】カルボキシル末端ｃ−ｍｙｃ及びポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号８５の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１３６ポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構成体ｐＰＩＣＺ  Ａ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。略号は以下の通りである。すなわちＰＡＯＸ１、アルデヒドオキシダーゼ１プロモータ領域；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ＡＯＸ１ＴＴ、アルデヒドオキシダーゼ１転写終結領域；ゼオシン(商標)、ゼオシン（商標）耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＵＣ  ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＵＣ３２２起点。
【図１１】カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号８５の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１３６ポリヌクレオチド分子を含むバキュロウイルストランスファ構成体ｐＢＡＣｇｕｓ３／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。トロンビンプロテアーゼ切断部位が、修飾ＢｏＮＴ／Ａとポリヒスチジン結合ポリペプチドの間で作動的に連結されている。略号は以下の通りである。すなわちＰＰＨ、ポリヘドインプロモータ領域；ｇｐ６４、ｇｐ６４シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；Ｔｒｏｍｂｉｎ、トロンビンプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＵＣ  ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＵＣ起点；アンピシリン、アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド分子；ｆ１ｏｒｉ、バクテリオファージｆ１複製起点；ｇｕｓ、β−グルクロニダーゼをコードするポリヌクレオチド分子。
【図１２】カルボキシル末端ｃ−ｍｙｃ及びポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号８５の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１３６ポリヌクレオチド分子を含む哺乳動物発現構成体ｐＳｅｃＴａｇ２／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。略号は以下の通りである。すなわちＰＣＭＶ、サイトメガロウイルスプロモータ領域；Ｉｇｋ、免疫グロブリンＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＧＨｐＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位；ｆ１ｏｒｉ、バクテリオファージｆ１複製起点；ＰＳＶ４０、シミアンウイルス４０プロモータ領域；ゼオシン（商標）、ゼオシン（商標）耐性ポリペプチドをコードする領域；ｐＵＣ  ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＵＣ起点；アンピシリン；アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド分子。