【手続補正書】
【提出日】令和1年9月3日(2019.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
様々な局面において、方法は、試料液体を選択的通気要素と接触させる工程、および、それにより、選択的通気要素を流体不浸透性にする工程を含む。また、望むならば、方法は、試料を改変試薬と反応させる工程、および、反応生成物を生成する工程を含む。さらに、いくつかの例において、方法は、反応生成物の特性を検出する工程を含み、そのような検出はヒトの裸眼によって実施されることができる。
[本発明1001]
a.試料入口と、該試料入口に動作的に接続された試料受け入れ開口をそれぞれが含む1つまたは複数の反応チャンバと、1つまたは複数の通気開口と、改変試薬とを含む試料受け入れカートリッジ；および
b.受動的に調整可能な気孔率を有し、該通気開口の1つまたは複数を覆う選択的通気要素
を含む、選択的に通気される生物学的アッセイ装置。
[本発明1002]
試料受け入れカートリッジに動作的に結合され加熱要素を含む基板をさらに含む、本発明1001の装置。
[本発明1003]
試料受け入れカートリッジが5つ以上の反応チャンバを含む、本発明1001または1002の装置。
[本発明1004]
改変試薬が光学的性質改変試薬を含む、本発明1001〜1003のいずれかの装置。
[本発明1005]
改変試薬が核酸増幅試薬を含む、本発明1001〜1004のいずれかの装置。
[本発明1006]
ハンドヘルド型装置である、本発明1001〜1005のいずれかの装置。
[本発明1007]
試料受け入れカートリッジ、選択的通気要素、および基板を収容するハウジングを含む、本発明1002の装置。
[本発明1008]
選択的通気要素が、ボディと、該ボディから延びて1つまたは複数の第二の開口それぞれを覆う1つまたは複数の突出部とを含む、本発明1001〜1007のいずれかの装置。
[本発明1009]
各突出部が円柱として成形されている、本発明1008の装置。
[本発明1010]
試料受け入れカートリッジが、1つまたは複数の反応チャンバそれぞれと入口とを動作的に接続する1つまたは複数の試料受け入れ導管を含む、本発明1001〜1009のいずれかの装置。
[本発明1011]
1つまたは複数の反応チャンバそれぞれが、50マイクロリットル以下の容積を有するマイクロ流体反応チャンバである、本発明1001〜1010のいずれかの装置。
[本発明1012]
選択的通気要素が、多孔質ポリマーマトリックスと、受動的に調整可能な気孔率を有するヒドロゲルとを含む、本発明1001〜1011のいずれかの装置。
[本発明1013]
基板と試料受け入れカートリッジとを動作的に結合する接着層をさらに含む、本発明1002の装置。
[本発明1014]
各反応チャンバが補助的な開口をさらに含み、通気開口のそれぞれが試料受け入れカートリッジの第一の面にあり、1つまたは複数の補助的な開口のそれぞれが該試料受け入れカートリッジの第二の面にあり、該第一の面が該第二の面とは反対側であり、接着層が、1つまたは複数の反応チャンバそれぞれの壁を形成し、各補助的な開口を封止する、本発明1013の装置。
[本発明1015]
加熱要素が1つまたは複数の反応チャンバに近接している、本発明1002の装置。
[本発明1016]
基板がプリント回路基板を含む、本発明1002の装置。
[本発明1017]
基板が、加熱要素に動作的に結合された電源をさらに含む、本発明1002の装置。
[本発明1018]
基板が制御ユニットを含む、本発明1002の装置。
[本発明1019]
基板がセンサを含む、本発明1018の装置。
[本発明1020]
センサが試料を検出すると、制御ユニットが加熱要素をアクティブ化して1つまたは複数の反応チャンバ中の試料を加熱する、本発明1019の装置。
[本発明1021]
基板が、センサが試料受け入れカートリッジ中の試料を検出したときに光を放出する光源を含む、本発明1019の装置。
[本発明1022]
制御ユニットが、1つまたは複数の反応チャンバ中の試料の比色分析を実行するように構成されている、本発明1018の装置。
[本発明1023]
試料受け入れカートリッジ、選択的通気要素、および基板を封入するための、第一の部分と、該第一の部分と嵌合可能な第二の部分とを含むハウジングをさらに含む、本発明1002の装置。
[本発明1024]
ハウジングが300cm3以下の容積を有する、本発明1023の装置。
[本発明1025]
試料受け入れカートリッジが透明である、本発明1001〜1024のいずれかの装置。
[本発明1026]
試料受け入れカートリッジがポリマー材料を含む、本発明1001〜1025のいずれかの装置。
[本発明1027]
多孔質ポリマーマトリックスがポリエチレンを含む、本発明1012の装置。
[本発明1028]
接着層が透明である、本発明1013の装置。
[本発明1029]
接着層が反射性である、本発明1013の装置。
[本発明1030]
光学的性質改変試薬がハロクロミック試薬である、本発明1004の装置。
[本発明1031]
接着層が乳白色である、本発明1013の装置。
[本発明1032]
接着層が、第二の層と貼り合わされた第一の層を含む、本発明1013の装置。
[本発明1033]
第一の層が酸を含まない、本発明1032の装置。
[本発明1034]
第二の層が乳白色である、本発明1032の装置。
[本発明1035]
以下の工程を含む、選択的に通気される生物学的アッセイ装置によって生物学的アッセイを実施する方法：
a.液体を含む生物学的試料を1つまたは複数の試料受け入れ開口を介して生物学的アッセイ装置の試料受け入れカートリッジの1つまたは複数の反応チャンバに流し込むことにより、該試料を該装置に導入する工程であって、
i.該試料を該1つまたは複数の反応チャンバに流し込むことが、気体を該装置の選択的通気要素を通じて流すことを含み、該選択的通気要素が、該1つまたは複数の反応チャンバそれぞれの壁を形成し、該1つまたは複数の反応チャンバそれぞれが改変試薬を含む、工程；
b.該試料液体を該選択的通気要素と接触させる工程、および、それにより、該選択的通気要素の透過性を流体不浸透性に低下させる工程；
c.該試料を該改変試薬と反応させる工程、および、反応生成物を生成する工程；ならびに
d.該反応生成物の特性を検出する工程。
[本発明1036]
改変試薬が光学的性質改変試薬を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
改変試薬が核酸増幅試薬を含む、本発明1035または1036の方法。
[本発明1038]
試料を改変試薬と反応させる工程が、該試料を、該試料中に核酸が存在するならば該核酸の増幅を生じさせる条件下、1つまたは複数の反応チャンバ中の核酸増幅組成物と接触させる工程を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
反応生成物の特性を検出する工程が、増幅の存在または非存在を検出する工程を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
装置がハンドヘルド型装置である、本発明1035〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
選択的通気要素が、ボディと、該ボディから延びて1つまたは複数の反応チャンバそれぞれの壁を形成する1つまたは複数の突出部とを含む、本発明1035〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
試料受け入れカートリッジが、1つまたは複数の反応チャンバそれぞれと入口とを動作的に接続する1つまたは複数の試料受け入れ導管を含む、本発明1035〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
1つまたは複数の反応チャンバそれぞれが、50マイクロリットル以下の容積を有するマイクロ流体反応チャンバである、本発明1035〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
選択的通気要素が、多孔質ポリマーマトリックスと、受動的に調整可能な気孔率を有するヒドロゲルとを含む、本発明1035〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
装置がセンサを含み、前記方法が、試料受け入れカートリッジ中の試料の存在または非存在をセンサによって検出する工程を含む、本発明1035〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
装置が加熱要素をさらに含み、前記方法が、センサが試料を検出したときに1つまたは複数の反応チャンバ中の試料を加熱する工程をさらに含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
装置が光源をさらに含み、前記方法が、センサが試料を検出したときに該光源によって光を放出する工程をさらに含む、本発明1045の方法。
[本発明1048]
試料受け入れカートリッジおよび選択的通気要素を封入するための、第一の部分と、該第一の部分と嵌合可能な第二の部分とを含むハウジングをさらに含む、本発明1035〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
ハウジングが300cm3以下の容積を有する、本発明1048の方法。
[本発明1050]
試料受け入れカートリッジが透明である、本発明1035〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
試料受け入れカートリッジがポリマー材料を含む、本発明1035〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
ポリマー材料がポリエチレンである、本発明1051の方法。
[本発明1053]
光学的性質改変試薬がハロクロミック試薬を含む、本発明1035〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
気体が空気である、本発明1035〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
反応生成物の特性を検出する工程が、1つまたは複数の反応チャンバを目視検査して、改変された光学的性質を検出する工程を含む、本発明1035〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
ヒドロゲルがカルボキシメチルセルロースを含む、本発明1012の装置。
[本発明1057]
光学的性質改変試薬が酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）試薬である、本発明1035〜1055のいずれかの方法。
[本発明1058]
ELISA試薬が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、BCIP/NBT（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）、TMB（3,3',5,5'テトラメチルベンジジン）、DAB（3,3',4,4'ジアミノベンジジン）、4CN（4-クロロ-1-ナフトール）、TMB（二重機能基質）、ABTS（2,2'-アジノ-ジ［3-エチルベンズチアゾリン］スルホネート）、OPD（o-フェニレンジアミン）、MUG（4-メチルウンベリフェリルガラクトシド）、HPA（ヒドロキシフェニル酢酸）およびHPPA（3-p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸）からなる群から選択される、本発明1057の装置。
[本発明1059]
透過性を低下させる工程が、選択的通気要素を液体不浸透性にするのに十分である、本発明1035〜1055または1057のいずれかの方法。
[本発明1060]
反応生成物の特性を検出する工程が、1つまたは複数の反応チャンバをモバイル電子装置によって検査して、改変された光学的性質を該装置によって検出する工程を含む、本発明1035〜1055、1057または1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
光学的性質改変試薬が酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）試薬である、本発明1004の装置。
[本発明1062]
ELISA試薬が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、BCIP/NBT（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）、TMB（3,3',5,5'テトラメチルベンジジン）、DAB（3,3',4,4'ジアミノベンジジン）、4CN（4-クロロ-1-ナフトール）、TMB（二重機能基質）、ABTS（2,2'-アジノ-ジ［3-エチルベンズチアゾリン］スルホネート）、OPD（o-フェニレンジアミン）、MUG（4-メチルウンベリフェリルガラクトシド）、HPA（ヒドロキシフェニル酢酸）およびHPPA（3-p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸）からなる群から選択される、本発明1061の装置。
[本発明1063]
検出する工程がヒトの裸眼によって実施される、本発明1035〜1055、1057、1059または1060のいずれかの方法。
[本発明1064]
液体が1つまたは複数の気泡を含み、気体を装置の選択的通気要素を通じて流すことが、該気泡を該液体から除去することを含む、本発明1035〜1055または1057、1059、1060または1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
加熱要素が、互いに混合されると熱を発生させる2つ以上の発熱性反応体を含む、本発明1002、1007または1015の装置。
[本発明1066]
選択的に通気される生物学的アッセイ装置が、互いにまたは試料液体と混合されると熱を発生させる1つまたは複数の発熱性反応体を含む加熱要素をさらに含み、反応生成物を生成する工程が、該1つまたは複数の発熱性反応体を互いにまたは該試料液体と混合することによって試料および改変試薬を該加熱要素によって加熱する工程を含む、本発明1035〜1055または1057、1059、1060、1063または1064のいずれかの方法。
[本発明1067]
接着層が不透明であり、反応開始色に対して補色である、本発明1013または1014の装置。
[本発明1068]
選択的通気要素が試料受け入れ開口の1つまたは複数を覆う、本発明1001〜1034、1056、1058、1061、1062、1065または1067のいずれかの装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【図１】本開示の態様による装置部品の斜視図を提供する。
【図２】本開示の変形態様による装置の斜視図を提供する。
【図３】本開示の態様による装置の例示的な断面図を提供する。
【図４】ある態様による、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）からの鋳型核酸分子標的領域のDNA配列（SEQ ID NO: 5）を示す。
【図５】ある態様による、陽性および陰性の等温増幅反応についてのpH測定値を示すグラフである。
【図６】ある態様による、陽性および陰性の等温増幅反応の反応終点での色（色相）の検出を示すグラフである。
【図７】ある態様による、陽性および陰性の等温増幅反応産物のゲル電気泳動アッセイの結果を示す。
【図８】ある態様による、種々のトリス緩衝液濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図９】ある態様による、様々な量の追加のヒドロニウムイオン等価物を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図１０Ａ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図１０Ｂ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図１０Ｃ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図１０Ｄ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図１１】ある態様による、様々なポリメラーゼと、LAMP増幅の視覚的検出との適合性を示す。
【図１２】図12Aおよび12Bは、ある態様による、様々なチャネル深さを用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図１３】ある態様による、SDAについての経時的な正規化された色相値を示す。
【図１４】ある態様による、PCRについての経時的な正規化された色相値を示す。
【図１５】図15Aおよび15Bは、ある態様による、造塩発色剤の組み合わせを用いた増幅反応についての正規化された対比変化を示す。
【図１６】ある態様による、様々なDNA鋳型濃度についての経時的な正規化された対比変化を示す。
【図１７】選択的通気要素を有する装置中の増幅からのLAMP増幅データを提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
（表２）使用した配列
2019509740.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
実施例5：視覚的造塩発色剤を用いた鎖置換増幅（SDA）の検出
SDA反応を、以下を含む反応ミックスを用いて行った：1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度（pH 8.8に配合した緩衝液）、10 mM (NH4)2SO4、50 mM KCl（pH 8.5に調節）、8 mM MgSO4、各々4.4 mMのdATP、dGTP、dTTP、0.8 mM dCTP-αS（TriLink Biotechnologies）、0.1％ v/v Tween-20、0.8 Mベタイン、0.32 U/μl Bst DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）、0.2U/uL BSoBI（New England Biolabs）、および0.2 mMニュートラルレッド造塩発色剤。ヒトBRCA1用に設計したプライマー（SDAf、SDAr、BF、BR）を、各々0.5μMの最終濃度で反応物に添加した。5 ngのHeLa gDNAを25μLの最終反応物体積に添加して、65℃で様々なインキュベーション時間の間保持した。経時的な正規化された色相値における変化（図13）により、この視覚的検出ケミストリーがSDAで機能することが示される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
実施例6：視覚的造塩発色剤を用いたPCR増幅の検出
PCR反応を、以下を含む反応ミックスを用いて行った：50 mM KClおよび2 mM MgCl2（8.5に調節したpH）、各々0.5 mMのdNTP、5U Taq DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）、および0.2 mMニュートラルレッド造塩発色剤。酵素保存緩衝液およびプライマーからの持ち越し総トリス-HCl濃度は、最終反応ミックスにおいて1.15 mMであった。プライマーを、大腸菌（Escherichia coli）16s rRNA遺伝子用に設計し、各々0.5μMの最終濃度で反応物に添加した。10 ngの大腸菌gDNAを25μLの最終反応物体積に添加して、最初に95℃ホールドで2分間保持し、その後、95℃で10秒間、55℃で30秒間、68℃で30秒間の50サイクルを行った。経時的な正規化された色相値における変化（図14）により、この視覚的検出ケミストリーがPCRで機能することが示される。