【手続補正書】
【提出日】平成20年8月13日(2008.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変型リボヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子であって、該ｓｉＲＮＡは、
（ａ）その３’末端に２塩基デオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含み、
（ｂ）ＲＮアーゼに対して耐性であり、
（ｃ）ウイルス複製を阻害し得る、
ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡ分子が２’改変されている、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記２’改変が、フルオロ改変、メチル改変、メトキシエチル改変、およびプロピル改変からなる群より選択される、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記フルオロ改変が、２’−フルオロ改変または２’，２’−フルオロ改変である、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンが改変されており、該ピリミジンは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、またはウラシルの誘導体である、請求項４に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡ中のピリミジンすべてが改変されている、請求項５に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記ｓｉＲＮＡの両方の鎖が、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡが、約１０個〜約３０個のリボヌクレオチドからなる、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記ｓｉＲＮＡが、約１９個〜約２３個のリボヌクレオチドからなる、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１０】
ＨＣＶの複製を阻害する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡ５、ｓｉＲＮＡＣ１、ｓｉＲＮＡＣ２、ｓｉＲＮＡ５Ｂ１、ｓｉＲＮＡ５Ｂ２、またはｓｉＲＮＡ５Ｂ４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１２】
少なくとも１つのレセプター結合リガンドに連結されている、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記レセプター結合リガンドが、前記ｓｉＲＮＡ分子の５’末端または３’末端に結合されている、請求項１２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記レセプター結合リガンドが前記ｓｉＲＮＡ分子の複数の末端に結合されている、請求項１３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記レセプター結合リガンドが、コレステロール、ＨＢＶ表面抗原、および低密度リポタンパク質からなる群より選択される、請求項１２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記レセプター結合リガンドがコレステロールである、請求項１５に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１７】
少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位改変
をさらに含み、該少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位改変によって前記ｓｉＲＮＡが分解に対して耐性になっている、
請求項１２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位改変が、２’−フルオロ改変または２’，２’−フルオロ改変である、請求項１７に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
２つの例示的な改変型ｓｉＲＮＡ（順に、配列番号５および配列番号６）を以下に示す：
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
【図１】図１は、ＨＣＶゲノム由来の５’ＵＴＲの配列および二次構造を示す（配列番号２）。肝細胞中のＨＣＶに対してＲＮＡｉを誘導するためのｓｉＲＮＡの特異的配列（出現する順序で、それぞれ、配列番号３〜配列番号１０）も提供する。
【図２】図２は、肝細胞中のＨＣＶに対するＲＮＡｉの誘導に有用ないくつかのＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡの配列を提供する。各ＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡを、第１のカラム中に示す記号表示によって特定する。左に示される配列は、出現する順序で、それぞれ、配列番号１１〜配列番号２９であり、右に示される配列は、出現する順序で、それぞれ、配列番号３０〜配列番号６７である。
【図３】図３は、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【図４】図４は、ＳＡＲＳコロナウイルスのオープンリーディングフレームの略図である（配列番号１の塩基２７２６３〜塩基２７２７２が示される）。
【図５】図５は、ヒト肝臓細胞中でのｓｉＲＮＡの有効性を試験するために使用した肝細胞癌細胞株Ｈｕｈ７中に含まれるサブゲノムＨＣＶレプリコンを示す。
【図６】種々の濃度のｓｉＲＮＡ５を投与したサブゲノムＨＣＶレプリコンを含むＨｕｈ−７細胞（５−２株）中での正規化ルシフェラーゼ活性の用量応答を示す。トランスフェクションから１、２、および３日後に測定したルシフェラーゼ活性は、ｓｉＲＮＡ用量の増加に伴って減少した。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されているルシフェラーゼアッセイシステムを製造者の説明書にしたがって使用してルシフェラーゼアッセイを行った。
【図７】図７は、Ｈｕｈ−７肝臓細胞中でＨＣＶ指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＲＮＡを誘導するためのｓｉＲＮＡ５の配列特異性示す。
【図８】図８は、ｓｉＲＮＡ５がＨｕｈ−７細胞に毒性を示さないことを証明する。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されているＡＴＰアーゼアッセイキットを製造者の説明書にしたがって使用してＡＴＰアーゼレベルをアッセイした。
【図９】図９は、ＲＮＡアッセイによって測定した、２１−５細胞（全長ＨＣＶを含むＨｕｈ−７細胞）中でのＨＣＶ複製に対するｓｉＲＮＡ５の効果を示す。ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡキット（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を製造者の説明書にしたがって使用してＲＮＡレベルをアッセイした。値を正規化する。
【図１０】図１０は、ｓｉＲＮＡ５がＨｕｈ５−２細胞の生存度に影響を与えないことを証明する。詳細には、ｓｉＲＮＡ５またはＧＡＰＤＨ特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｕｈ５−２細胞中のＧＡＰＤＨ（解糖に不可欠な酵素）をコードするｍＲＮＡを測定した。グラフは、ｓｉＲＮＡがＧＡＰＤＨのＲＮＡレベルに影響を与えなかったことを証明する。ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡキット（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を製造者の説明書にしたがって使用してＧＡＰＤＨを測定した。値を正規化する。
【図１１】図１１は、ショウジョウバエルシフェラーゼ遺伝子をターゲティングする異なる濃度の２’−フルオロ−ｓｉＲＮＡ（２’−Ｆ−ＧＬ２）を投与したサブゲノムＨＣＶレプリコンを含むＨｕｈ７細胞（５−２株）中での正規化ルシフェラーゼ活性の用量応答を示す。トランスフェクションから２日後に測定したルシフェラーゼ活性は、ｓｉＲＮＡ用量の増加に伴って減少した。ホタルルシフェラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造者の説明書にしたがって使用してルシフェラーゼアッセイを行った。
【図１２】図１２は、リポソームの非存在下でｓｉＲＮＡ  Ｃｈｏｌ−ＧＬ２を使用した５−２細胞中でのルシフェラーゼ活性の阻害を証明する。
【図１３】図１３は、ＰＡＧＥによって分離した５’標識ｓｉＲＮＡ二重鎖のオートラジオグラフを示し、１０日目までのヒト血清中でインキュベートした２’−フルオロ改変型ｓｉＲＮＡ（２’−Ｆ−ＧＬ２）の安定性を示す。ｓｉＲＮＡ二重鎖を、ヒト血清とのインキュベーションおよび２０％ＰＡＧＥによる分析に供した。レーンの組成は以下である：レーン１、１１、および２１：３２Ｐ末端標識ｓｉＲＮＡのみ；レーン２〜１０、１２〜２０、および２２〜２５：ヒト血清とインキュベートしたｓｉＲＮＡ。レーン２および１２、１分；レーン３および１３、５分；レーン４および１４、１５分；レーン５および１５、３０分；レーン６および１６、１時間；レーン７および１７、２時間；レーン８および１８、４時間；レーン９および１９、８時間；レーン１０および２０、２４時間；レーン２２、２４時間；レーン２３、４８時間；レーン２４、１２０時間；レーン２５、２４０時間のインキュベーション。
【図１４】図１４は、フッ素化ｄｓＲＮＡを２’Ｆ−ｓｉＲＮＡに変換するための組換えヒトダイサーの使用を証明する。レーンの組成は以下である：レーン１：サイズマーカー、λ＼ＨｉｎｄＩＩＩ＋φＸ１７４＼ＨａｅＩＩＩ；レーン２：ｒｉｂｏ／ｒｉｂｏホモ二重鎖ＲＮＡ；レーン３：ｒｉｂｏ／２’−Ｆヘテロ二重鎖ＲＮＡ；レーン４：２’−Ｆ／ｒｉｂｏヘテロ二重鎖ＲＮＡ；レーン６：サイズマーカー、１０ｂｐ  ＤＮＡラダー；レーン７：ｒｉｂｏ／ｒｉｂｏホモ二重鎖ｓｉＲＮＡ；レーン８：ｒｉｂｏ／２’−Ｆヘテロ二重鎖ｓｉＲＮＡ；レーン９：２’−Ｆ／ｒｉｂｏヘテロ二重鎖ｓｉＲＮＡ；レーン１０：２’−Ｆ／２’−Ｆホモ二重鎖ｓｉＲＮＡ。
【図１５】図１５は、ＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡに対するサブゲノムＨＣＶレプリコンを含むＨｕｈ−７細胞（５−２株）中での正規化ルシフェラーゼ活性の用量応答を示す。ルシフェラーゼ活性は、各ｓｉＲＮＡ用量の増加に伴って減少した。
【図１６】図１６は、コレステロールがコレステロール改変型ＧＬ２ｓｉＲＮＡに対するサブゲノムＨＣＶレプリコンを含むＨｕｈ−７細胞（５−２株）中での正規化ルシフェラーゼ活性の用量応答を示すことを示す。
【図１７】図１７は、全ピリミジンの２−フルオロピリミジン置換（２−Ｆ−ｓｉＲＮＡ）および全ピリミジンの２−フルオロピリミジン置換を含み、２−Ｆ−ｓｉＲＮＡ中に存在するリボヌクレオチド「ＵＵ」突出部に代わる分子の３’末端に添加した２塩基デオキシリボヌクレオチド「ＴＴ」配列も含むように改変されたｓｉＲＮＡで認められた安定性の増加を証明する。
【図１８】図１８は、２’−糖内のフッ素化によってｓｉＲＮＡ安定性を劇的に増加させることができることを示す。
【図１９】図１９は、インビボでのｓｉＲＮＡの評価を示す。
【図２０】図２０は、低圧ＩＶ注射によって結合体化２’−Ｆ−ｓｉＲＮＡがキメラマウスで有効であることを示す。
【図２１】図２１は、皮下投与した結合体化２’−Ｆ−ｓｉＲＮＡがキメラマウスで部分的に有効であることを示す。