【手続補正書】
【提出日】令和1年5月17日(2019.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つのサブユニットを任意の順序で含み、第1サブユニットはCD137に特異的であり、かつ第2サブユニットはGPC3に特異的である、CD137とグリピカン-3（GPC3）との両方に結合する能力を有する融合ポリペプチドであって、
(i)第1サブユニットがCD137に対する結合特異性を有する完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含み、かつ第2サブユニットがGPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、または
(ii)第1サブユニットがCD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含み、かつ第2サブユニットがGPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、または
(iii)第1サブユニットがCD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含み、かつ第2サブユニットがGPC3に対する結合特異性を有する完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む、
融合ポリペプチド。
【請求項２】
免疫グロブリン-Fcフラグメント、CD137に特異的なサブユニット、またはCD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインである第3サブユニットをさらに含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
KDが約5nM以下である親和性でCD137に結合することができる、および／またはKDが約5nM以下である親和性でGPC3に結合することができる、請求項1または2記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
CD137およびGPC3に同時に結合することができる、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
T細胞応答を共刺激する能力を有する、T細胞刺激の存在下でIL-2生産を誘発する能力を有する、および／またはGPC3依存的にT細胞活性化を共刺激する能力を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
GPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、76、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175に、
Leu 36 → ValまたはArg; Ala 40 → Leu, ValまたはGly; Ile 41 → Leu, Arg, Met, GlyまたはAla; Gln 49 → ProまたはLeu; Tyr 52 → ArgまたはTrp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Val, Gly, AsnまたはAla; Leu 70 → Arg, Ser, AlaまたはVal; Arg 72 → Asp, Trp, AlaまたはGly; Lys 73 → Met, Gly, Arg, Asn, GluまたはSer; Cys 76 → ValまたはIle; Asp 77 → His, Met, Val, Leu, ThrまたはLys; Trp 79 → Lys, SerまたはThr; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg, Asp, GlnまたはPro; Tyr 100 → Gly, Glu, ProまたはGln; Leu 103 → Glu, Gln, Asn, Gly, Ser, AspまたはTyr; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn, SerまたはThr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → ArgまたはTyr; Tyr 132 → TrpまたはIle; Lys 134 → AlaまたはPhe; Thr 136 → Ile;およびCys 175 → Ala
から選択される少なくとも1個の変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
GPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28に突然変異を含まない、および／またはN-グリコシル化部位を含まない、請求項1〜6のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
GPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）との比較において、以下の組の変異アミノ酸残基
(a)Leu 36 → Val; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Val; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Trp; Lys 73 → Arg; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Gln; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Ala; 
(b)Leu 36 → Val; Ala 40 → Val; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Lys 73 → Gly; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Phe; 
(c)Leu 36 → Val; Ala 40 → Gly; Ile 41 → Met; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Leu 70 → Ala; Lys 73 → Asn; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Phe; 
(d)Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;
(e)Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Gly; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;
(f)Leu 36 → Arg; Ala 40 → Gly; Ile 41→ Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Val; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Pro; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; 
(g)Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Tyr; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; 
(h)Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Val; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Pro; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;
(i)Leu 36 → Arg; Ala 40 → Leu; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Ser; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; 
(j)Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Cys 76 → Val; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Thr; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Cys 175 → Ala;
(k)Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Gly; Lys 73 → Glu; Cys 76 → Ile; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gln; Leu 103 → Asp; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; Cys 175 → Ala; および
(l)Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Ser; Cys 76 → Val; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; Cys 175 → Ala
のうちの1つを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
GPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインが、SEQ ID NO:4〜17からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントまたは変異体は請求項6〜8のいずれか一項記載のアミノ酸残基を含む、またはGPC3特異的リポカリンムテインが、SEQ ID NO:4〜17からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも85％の配列同一性を有する、
請求項1〜8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
第1サブユニットがCD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含み、かつ第2サブユニットがGPC3に対する結合特異性を有する完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
CD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインが、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に、
Ala 5 → ValまたはThr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Argまたは Asn; Thr 71 → Ala; Val 85 → Asp; Lys 94 → Argまたは Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ileおよび Cys 153 → Ser
から選択される少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜5または10記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
CD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）との比較において、以下の組の変異アミノ酸残基
(a) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 
(b)Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Cys 153 → Ser; 
(c)Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Asn; Lys 94 → Arg; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Cys 153 → Ser; 
(d)Ala 5 → Val; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Lys 94 → Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Cys 153 → Ser; 
(e)Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; Cys 153 → Ser; 
(f)Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; Cys 153 → Ser; または
(g)Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; Cys 153 → Ser
のうちの1つを含む、請求項1〜5または11のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
CD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に、
Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → ArgまたはLys; Gln 49 → Val, Ile, His, SerまたはAsn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met, AlaまたはGly; Leu 70 → Ala, Lys, SerまたはThr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met, Arg, ThrまたはAsn; Trp 79 → AlaまたはAsp; Arg 81 → Met, TrpまたはSer; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Gluおよび Lys 134 → Tyr
から選択される少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜5または10のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
CD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）との比較において、以下の組の変異アミノ酸残基
(a)Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; 
(b)Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; 
(c)Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; 
(d)Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; 
(e)Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Met; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; 
(f)Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Val; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Arg; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; 
(g)Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → His; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; 
(h)Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; または
(i)Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr
のうちの1つを含む、請求項1〜5または13記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
CD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:18〜33からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントまたは変異体は請求項11〜14のいずれか一項記載のアミノ酸残基を含む、または、
該ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:18〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項1〜14のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
1つのサブユニットが、(Gly4Ser)3、SEQ ID NO: 48、またはSEQ ID NO: 49から選択されるペプチドリンカーを介して別のサブユニットに連結される、請求項1〜15のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
免疫グロブリンが、BMS-663513、PF-05082566、GC33、SEQ ID NO:34および35によって与えられる重鎖および軽鎖を有するモノクローナル抗体、またはSEQ ID NO:51および52によって与えられる重鎖および軽鎖を有するモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体である、請求項1〜16のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
免疫グロブリンがIgG4またはIg2バックボーンを有するモノクローナル抗体である、請求項1〜16のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
IgG4バックボーンが、S228P、N297A、F234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のいずれか1つを有する、または、
IgG2バックボーンが、N297A、F234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のいずれか1つを有する、請求項18記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
SEQ ID NO:36および37に示すアミノ酸、SEQ ID NO:38および39に示すアミノ酸、SEQ ID NO:40および41に示すアミノ酸、SEQ ID NO:42および43に示すアミノ酸、SEQ ID NO:44に示すアミノ酸、SEQ ID NO:45に示すアミノ酸、SEQ ID NO:46に示すアミノ酸、SEQ ID NO:47に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:53および54に示すアミノ酸を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２２】
請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを生産する方法であって、融合ポリペプチドが、該融合ポリペプチドをコードする核酸から出発して、生産される、方法。
【請求項２３】
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合（engage）するのに使用するための、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
【請求項２４】
T細胞を共刺激し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合するのに使用するための、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
【請求項２５】
Tリンパ球増殖を誘発し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合するのに使用するための、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
【請求項２６】
CD137クラスター化で誘発された活性化T細胞をGPC3陽性腫瘍細胞へ方向づけるのに使用するための、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
【請求項２７】
請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本開示の融合ポリペプチドが含みうる「リンカー」は、本明細書に記載する融合ポリペプチドの2つまたはそれ以上のサブユニットを連結する。この連結は共有結合的または非共有結合的であることができる。好ましい共有結合的連結は、アミノ酸間のペプチド結合などといったペプチド結合によるものである。したがって好ましい一態様において該リンカーは、1つまたは複数のアミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個またはそれ以上のアミノ酸で構成される。好ましいリンカーを本明細書に記載する。他の好ましいリンカーは化学リンカーである。
[本発明1001]
少なくとも2つのサブユニットを任意の順序で含み、第1サブユニットはCD137に特異的であり、かつ第2サブユニットはGPC3に特異的である、CD137とGPC3との両方に結合する能力を有する融合ポリペプチド。
[本発明1002]
第1サブユニットがCD137に対する結合特異性を有する完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含み、かつ第2サブユニットがGPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1003]
第1サブユニットがCD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含み、かつ第2サブユニットがGPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1004]
免疫グロブリン-Fcフラグメントをさらに含む、本発明1003の融合ポリペプチド。
[本発明1005]
CD137に特異的な第3サブユニットをさらに含む、本発明1003の融合ポリペプチド。
[本発明1006]
第3サブユニットが、CD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、本発明1005の融合ポリペプチド。
[本発明1007]
本質的に実施例3、実施例8または実施例15に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約5nMのEC50値でCD137に結合することができる、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1008]
本質的に実施例8または実施例15に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、融合ポリペプチドに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテインまたは抗体のEC50値と少なくとも同じかそれより優れたEC50値でCD137に結合することができる、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1009]
本質的に実施例6、実施例11、または実施例18に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）分析によって測定した場合に、KDが少なくとも約5nMの親和性でCD137に結合することができる、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1010]
本質的に実施例2、実施例7、実施例12または実施例14に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約5nMのEC50値でGPC3に結合することができる、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1011]
本質的に実施例7、実施例12または実施例14に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、融合ポリペプチドに含まれるGPC3に特異的なリポカリンムテインのEC50値に匹敵するEC50値でGPC3に結合することができる、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1012]
本質的に実施例5、実施例10、または実施例17に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）分析によって測定した場合に、KDが少なくとも約5nMである親和性でGPC3に結合することができる、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1013]
本質的に実施例4、実施例9、実施例13または実施例16に記載するELISAアッセイにおいて測定した場合に、CD137およびGPC3に同時に結合する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1014]
本質的に実施例4、実施例9、実施例13または実施例16に記載するELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約10nMのEC50値でCD137およびGPC3に同時に結合する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1015]
本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいてT細胞応答を共刺激する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1016]
本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞刺激の存在下でIL-2生産を誘発することができる、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1017]
本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞の抗CD3刺激の非存在下ではIL-2生産を誘発しない、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1018]
本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、最適未満（suboptimal）の濃度の抗CD3抗体および抗CD28抗体で刺激されたT細胞の活性化を共刺激する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1019]
本質的に実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいてT細胞応答を共刺激する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1020]
本質的に実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいてIL-2生産を誘発することができる、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1021]
本質的に実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、GPC3標的依存的にT細胞活性化を共刺激する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1022]
GPC3特異的リポカリンムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175に、少なくとも20個の変異アミノ酸残基を含む、本発明1001〜1021のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1023]
GPC3特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）との比較において、以下の変異アミノ酸残基
2018519803.tif 000001
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1021のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1024]
GPC3特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28に対応する配列位置に突然変異を含まない、本発明1001〜1023のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1025]
GPC3特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列に関して、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置65にある天然N-グリコシル化部位Asnが、該ムテインの対応する配列位置では除去されている、本発明1001〜1024のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1026]
GPC3特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、以下の組のアミノ酸置換
2018519803.tif 000002
2018519803.tif 000003
2018519803.tif 000004
のうちの1つを含む、本発明1001〜1025のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1027]
GPC3特異的リポカリンムテインがN-グリコシル化部位を有しない、本発明1001〜1026のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1028]
GPC3特異的リポカリンムテインが、SEQ ID NO:4〜17からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントまたは変異体は本発明1022〜1028のいずれかのアミノ酸残基を含む、本発明1001〜1027のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1029]
GPC3特異的リポカリンムテインが、SEQ ID NO:4〜17からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも85％の配列同一性を有する、本発明1001〜1027のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1030]
CD137特異的リポカリンムテインが、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に、少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、本発明1001〜1021のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1031]
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）との比較において、以下の変異アミノ酸残基
2018519803.tif 000005
2018519803.tif 000006
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1030の融合ポリペプチド。
[本発明1032]
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）との比較において、以下の組のアミノ酸置換
2018519803.tif 000007
2018519803.tif 000008
のうちの1つを含む、本発明1030または1031のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1033]
CD137特異的リポカリンムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、本発明1001〜1021のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1034]
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）との比較において、以下の変異アミノ酸残基
2018519803.tif 000009
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1033の融合ポリペプチド。
[本発明1035]
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が以下の組のアミノ酸置換
2018519803.tif 000010
2018519803.tif 000011
2018519803.tif 000012
のうちの1つを含む、本発明1033または1034のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1036]
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:18〜33からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントまたは変異体は本発明1030〜1035のいずれかのアミノ酸残基を含む、本発明1030〜1035のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1037]
前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:18〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する、本発明1030〜1035のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1038]
1つのサブユニットが、本質的に図1に記載するように、リンカーを介して別のサブユニットに連結されていてよい、本発明1001〜1037のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1039]
リンカーがペプチド結合である、本発明1038の融合ポリペプチド。
[本発明1040]
ペプチド結合が、構造化されていない（G4S）3リンカーである、本発明1039の融合ポリペプチド。
[本発明1041]
SEQ ID NO:48に示すアミノ酸またはSEQ ID NO:49に示すアミノ酸を含む、本発明1001〜1040のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1042]
免疫グロブリンがモノクローナル抗体である、本発明1001〜1041のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1043]
モノクローナル抗体がBMS-663513またはPF-05082566である、本発明1001〜1042のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1044]
モノクローナル抗体が、SEQ ID NO:34および35によって与えられる重鎖および軽鎖を有する、本発明1001〜1042のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1045]
モノクローナル抗体が、SEQ ID NO:51および52によって与えられる重鎖および軽鎖を有する、本発明1001〜1042のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1046]
モノクローナル抗体がIgG4バックボーンを有する、本発明1001〜1045のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1047]
IgG4バックボーンが、S228P、N297A、F234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のいずれか1つを有する、本発明1046の融合ポリペプチド。
[本発明1048]
モノクローナル抗体がIgG2バックボーンを有する、本発明1001〜1045のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1049]
IgG2バックボーンが、N297A、F234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のいずれか1つを有する、本発明1046の融合ポリペプチド。
[本発明1050]
SEQ ID NO:36および37に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:38および39に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:40および41に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:42および43に示すアミノ酸、SEQ ID NO:44に示すアミノ酸、SEQ ID NO:45に示すアミノ酸、SEQ ID NO:46に示すアミノ酸、SEQ ID NO:47に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:53および54に示すアミノ酸を含む、本発明1001〜1045のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1051]
本発明1001〜1050のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
[本発明1052]
核酸分子の発現を可能にするための制御配列に機能的に連結されている、本発明1051の核酸分子。
[本発明1053]
ベクターまたはファージミドベクターに含まれている、本発明1051または1052の核酸分子。
[本発明1054]
本発明1051〜1053のいずれかの核酸分子を含有する宿主細胞。
[本発明1055]
本発明1001〜1050のいずれかの融合ポリペプチドを生産する方法であって、融合ポリペプチドが、前記ムテインをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的方法を使って生産される、方法。
[本発明1056]
融合ポリペプチドが細菌宿主生物または真核宿主生物中で生産され、かつこの宿主生物またはその培養物から単離される、本発明1055の方法。
[本発明1057]
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合（engage）するための、本発明1001〜1050のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
[本発明1058]
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合するための、本発明1001〜1050のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
[本発明1059]
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、本発明1001〜1050のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
[本発明1060]
T細胞を共刺激し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、本発明1001〜1050のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
[本発明1061]
Tリンパ球増殖を誘発し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、本発明1001〜1050のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
[本発明1062]
T細胞でのCD137クラスター化および活性化をGPC3陽性腫瘍細胞へ方向づける方法であって、本発明1001〜1050のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。