(57)【要約】要約  従来の遺伝子ワクチンよりも免疫付与効果の大きい新規な遺伝子ワクチンが開示されている。抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワクチンは、抗原遺伝子と、Toll様受容体のアダプター分子の遺伝子を含み、細胞内で前記抗原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することができる組換えベクターから成る。この遺伝子ワクチンを投与すると、免疫を付与する対象となる抗原分子とともに、Toll様受容体のアダプター分子が同一細胞内で産生され、該アダプター分子がアジュバント効果を発揮して、抗原に対する免疫応答が増強され、ひいては該抗原を含む病原体に対する免疫力付与効果が高められる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原遺伝子と、Toll様受容体のアダプター分子の遺伝子を含み、細胞内で前記抗原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することができる組換えベクターから成る、前記抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワクチン。
【請求項２】
前記アダプター分子が、MyD88、TRIF、TIRAP、TRAM、IRAK1、IRAK4、TRAF6、RIP1、IKK-i、TBK1 及びRIG-I並びにこれらの天然のアダプター分子のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、遺伝子ワクチン内にコードされる前記抗原と共に細胞内で発現された際に該ワクチンのアジュバント効果を発揮する変異型のアダプター分子から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の遺伝子ワクチン。
【請求項３】
前記アダプター分子が、MyD88、TRIF、TIRAP、TRAM、IRAK1、IRAK4、TRAF6、RIP1、IKK-i、TBK1 及びRIG-Iから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項２記載の遺伝子ワクチン。
【請求項４】
前記アダプター分子が、MyD88及び／若しくはTRIF又はその前記変異型である請求項２記載の遺伝子ワクチン。
【請求項５】
前記アダプター分子が、MyD88及び／又はTRIFである請求項４記載の遺伝子ワクチン。
【請求項６】
前記抗原遺伝子は、該抗原遺伝子の転写を制御するプロモーターの下流に位置し、前記アダプター分子遺伝子は、該アダプター分子遺伝子の転写を制御する、前記抗原遺伝子のプロモーターとは異なるプロモーターの下流に位置する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の遺伝子ワクチン。
【請求項７】
前記抗原遺伝子のプロモーターと、前記アダプター分子遺伝子のプロモーターが同一種類のプロモーターである請求項６記載の遺伝子ワクチン。
【請求項８】
前記ベクターがプラスミドベクターである請求項１ないし７のいずれか１項に記載の遺伝子ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の抗原に対する免疫応答を強く誘起することができる遺伝子ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ワクチンは種々の感染症に対する免疫を付与するために広く用いられている。従来から用いられているワクチンは、弱毒化生ワクチン、不活化生物ワクチン、不活化毒素ワクチン等である。しかしながら、これらのワクチンは、免疫不全患者に対して投与することができない。また、生体外で培養することが困難な病原体も少なくなく、これらの病原体に対する不活化ワクチンや弱毒化ワクチンを開発することは困難である。さらに、全細胞を用いる従来の不活化ワクチンでは、細胞が、例えば内毒素のような、有害な副作用を引き起こす物質を含んでおり、それによって副作用が起きる危険性もある。【０００３】
これらの問題を解決するワクチンとして近年、遺伝子ワクチンが注目されている（非特許文献１）。遺伝子ワクチンは、免疫を付与したい病原体が持つ抗原遺伝子を含む組換えベクターであり、これをヒトに投与すると、ヒトの細胞内で持続的に抗原が生産され、該抗原に対する抗体産生が誘起され、該病原体に対する免疫が付与される。遺伝子ワクチンでは、抗原遺伝子をベクターに組み込めば、細胞内で該抗原が生産されるため、生体外で培養できない病原体に対するワクチンを作ることができる。また、病原体の抗原としては、単独では無毒なものを採用することができるので、副作用の危険がなく、免疫不全患者に対して投与することも可能である。【０００４】
しかしながら、遺伝子ワクチンは、一般に、病原体の抗原に対する免疫応答が弱く、病原体に対して強い免疫力を付与することが困難であるという問題がある。強い免疫応答を誘起するために、アジュバント（免疫応答を増強する物質）を用いることが知られており、抗体医薬等に用いる特異抗体を動物に生産させる場合等には、免疫原と共に、結核菌から調製したフロインドのアジュバント等のアジュバントを投与することが広く行なわれている。公知のアジュバントとしては、病原菌由来のリポ多糖(LPS)やその誘導体、テタヌストキソイド等の毒素が知られている。しかしながら、このようなアジュバントをヒトに適用することは危険が大きく、用いられていない。【０００５】
遺伝子ワクチンに用いるベクターとして、ウイルスベクターを用いた場合には、ウイルス由来の部分に対する免疫応答が起きるので、ウイルス部分が多少なりともアジュバントとして機能する。しかし、ウイルスによる毒性が発揮されて副作用が生じる危険性がある。また、ウイルス部分に対するアジュバント効果も、アレルギー反応により効果が持続しないという問題がある。遺伝子ワクチンのベクターとして、ウイルスによる毒性の危険性がない、プラスミドベクターを用いることも広く知られているが、プラスミドベクターを用いた場合には、ウイルスベクターを用いた場合のようにウイルス部分によるアジュバント効果が得られないため、免疫力付与効果はさらに小さくなる。【０００６】
遺伝子ワクチンによる免疫力付与効果を高めるために、遺伝子ワクチン内に、インターロイキンやインターフェロン等のサイトカインの遺伝子を組み込んでおき、細胞内で抗原と共にサイトカインを生産させることも知られている（非特許文献２、３）。しかしながら、これらの方法によっても必ずしも満足できる免疫付与効果は得られていない。【０００７】
【非特許文献１】Tang D. et al., Nature 356, 152-154, 1992
【非特許文献２】Kenji Okuda et al., Methods in Molecular Medicine, 1999, vol.29, pp.197-204
【非特許文献３】Hildegund C. et al., Methods in Molecular Medicine, 1999, vol.29, pp.251-260
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、従来の遺伝子ワクチンよりも免疫付与効果の大きい新規な遺伝子ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子ワクチンにToll様受容体のアダプター分子の遺伝子を組み込み、目的とする抗原と共に該アダプター分子を細胞内で生産することにより、該アダプター分子がアジュバントとして機能して、遺伝子ワクチンの免疫付与力が向上することを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、抗原遺伝子と、Toll様受容体のアダプター分子の遺伝子を含み、細胞内で前記抗原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することができる組換えベクターから成る、前記抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワクチンを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来の遺伝子ワクチンよりも免疫付与効果が高い遺伝子ワクチンが提供された。本発明の遺伝子ワクチンを投与すると、免疫を付与する対象となる抗原分子とともに、Toll様受容体のアダプター分子が同一細胞内で産生され、該アダプター分子がアジュバント効果を発揮して、抗原に対する免疫応答が増強され、ひいては該抗原を含む病原体に対する免疫力付与効果が高められる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の遺伝子ワクチンの構築方法を説明するための模式図である。
【図２】本発明の遺伝子ワクチンの構築に用いたpGAベクターの遺伝子地図である。
【図３】NF-kB及びIFN-βプロモーターの活性化因子としてのTLRアダプターの特性を決定した結果を示す図である。25ngのpTK-RL、25 ngの5×NF-κB-luc、又はpGLhIFNβ-lucと合わせて、250 ngのpFLAG-CMV-4 (CMV4), pGA-LacZ, pFLAG-CMV-4-MyD88, pFLAG-CMV-4-TRIF, pFLAG-CMV-4-TIRAP, pFLAG-CMV-4-TOLLIP, pFLAG-CMV-4-IRAK1, 又はpFLAG-CMV-4-TRAF6でHEK293細胞 (4×105個) を共トランスフェクトした。トランスフェクト48時間後にホタルルシフェラーゼ活性を定量し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対し標準化した。独立した3回の実験の内の1回で得られたデータの値を示している。
【図４Ａ】MyD88又はTRIF遺伝子アジュバントを組み込んだ又は組み込まないDNAワクチンの構造を示す図である。単一抗原のみ（pGA-LacZ, pGA-GFP, 及びCMV9-HA）又は抗原及びアジュバント分子の両方（pDX-LacZ-MyD88, pDX-GFP-MyD88, CMV9-HA-MyD88, pDX-LacZ-TRIF, pDX-GFP-TRIF, 及びCMV9-HA-TRIF）を発現するDNAワクチンの模式図。
【図４Ｂ】ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターと、本発明のDNAワクチン又は比較のためのDNAワクチンとを共トランスフェクトした細胞のLacZ活性及びホタルルシフェラーゼ活性を示す図である。25 ngのpTK-RL, 25 ngの5×NF-κB-luc又はpGLhIFNβ-lucと合わせて、250 ngのpGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, 又はpDX-LacZ-TRIFでHEK293細胞(4×105個)を共トランスフェクトした。トランスフェクト48時間後にLacZ活性及びホタルルシフェラーゼ活性を定量し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対し標準化した。独立した3回の実験の平均値±SDの値を示している。c及びd, p < 0.01; e及びf, p < 0.001; a及びb, p < 0.0001。
【図５】MyD88遺伝子アジュバントによる体液性免疫反応の促進を示す図である。0週及び4週でimEPTによりpGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, 又はpDX-LacZ-TRIFでマウス（5個体／群）を免疫した。4週及び6週で採血し、次いでA) 抗LacZ IgG血清、B) IgG1 (□)、及びIgG2a (■)の力価をELISAにより調べた。Bb, p < 0.05; Aa, p < 0.01。
【図６Ａ】MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントによる細胞性免疫反応の促進を示す図である。図５の説明文中に記載したとおりにマウスを免疫した。A) 個々のマウスより脾臓細胞を調製し、1μg/mlのクラスI (H-2d) ペプチド (■) 又はクラスI (H-2b) ペプチド (□)で24時間インビトロで刺激した。mRNAの抽出及び逆転写は材料及び方法中に記載したとおりに行なった。反応の一定分量についてIFN-γ, IL-4, 及び18S rRNAレベルを調べた。IFN-γ及びIL-4のmRNA発現レベルを18S rRNAレベルに対して標準化し、相対mRNA発現レベルとして記載した。グラフは平均値±SDを示す。a及びc, p < 0.05; b, p < 0.01。
【図６Ｂ】FACSによる解析結果を示す図である。脾臓細胞を調製し、12μg/mlのrLacZで22時間インビトロで刺激した。次いで1μg/mlのGolgiPlugを添加し、該細胞をさらに2時間培養した。固定後、細胞をPE融合抗CD4又はCD8抗体及びFITC融合抗IFN-γ抗体で染色、洗浄し、FACSにより解析した。細胞は初めはリンパ球、次いでCD4又はCD8陽性細胞に篩い分けされる。頻度はそれぞれ全CD4+又はCD8+細胞に対するIFN-γ+ CD4+又はCD8+細胞のパーセントである。
【図６Ｃ】CTL系統（エフェクター細胞）は材料及び方法中に記載したとおりに調製した。MHCハプロタイプ適合（H-2Kd）P815細胞を1μg/mlのクラスI（H-2d）ペプチド（■）又はクラスI（H-2b）ペプチド（□）と共に1時間パルス刺激し、標的細胞として用いた。該エフェクター細胞及び標的細胞を6, 12.5, 25, 及び50 (E/T比)の比率で混合し、4時間培養し、次いで培養上清のLDH活性を定量した。グラフは材料及び方法中に記載した通りに算出した％特異的溶解の平均値±SDを示す。c及びf, p < 0.01; b及びe, p < 0.001; a, d, 及びg, p < 0.0001。
【図７】TRIFを介するアジュバント効果の基礎をなす機構を説明する図である。50μgのpGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, 又はpDX-LacZ-TRIFをimEPTによりマウス（3／群）の大腿四頭筋中に投与した。投与3日後又は7日後、注入された筋肉を取り出してホモジナイズし、遠心した。上清のLacZ活性及びタンパク質濃度を定量した。グラフはタンパク質濃度に対して標準化したLacZ活性の平均値±SDを示す。a, c, 及びd, p < 0.05; b, p < 0.01。
【図８Ａ】MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントでのimEPT後における流入領域LN中に存在する細胞の活性化を示す図である。50μgのpGA-GFP, pDX-GFP-MyD88, 又はpGA-GFP-TRIFでのimEPTによる2回目の免疫から72時間後、流入領域LN（鼠径部LN）を取り出しホモジナイズした。LNの単一細胞懸濁液をPE融合抗CD11c又はCD40抗体で表面染色、洗浄し、次いでFACSにより解析した。頻度は全細胞に対するCD11c+又はCD40+細胞のパーセントである。10個の独立したLNから調整したサンプルの平均値±SD値を示す。
【図８Ｂ】MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントでのimEPT後における流入領域LN中に存在する細胞中の各種サイトカイン等の発現量を示す図である。50μgのpGA-GFP, pDX-GFP-MyD88, 又はpGA-GFP-TRIFでのimEPTによる追加免疫から24又は72時間後、流入領域LN（鼠径部LN）を取り出し、ホモジナイズしてTRIzol試薬中に懸濁した。mRNAを抽出し逆転写した。cDNAの一定分量中におけるIFN-γ, IL-12 p40, IL-18, IL-4, IL-6, IFN-β, TNF-α, IP-10, JE/MCP-1, MHCクラスI, MFCクラスII, CD40, CD80, 及びCD86の発現レベルをリアルタイムPCRにより解析した。グラフは10個の独立したLNから調整したサンプルの平均値±SD値を示す。縦軸は、無処置の群を1とした相対mRNA発現量を示す。Af, Ba, Bb, Bc, Be, Bf, Bg, Bh, Bj, Bk, Bn, Bo, Bp, Bq, Br, Bs, Bt, Bu, Bv, Bx, By, Bz, 及びBA, p < 0.05; Aa, Ac, Ad, Ae, Ag, Bd, Bi, Bl, Bm, 及びBw, p < 0.01; Ab, p < 0.001。
【図９Ａ】MyD88又はTRIF遺伝子アジュバントを組み込んだインフルエンザDNAワクチンはマウスを致死量のインフルエンザウイルス感染から効果的に防御することを示す図である。0週及び4週の時点においてimEPTにより2μgのpGA-GFP, CMV9-HA, CMV9-HA-MyD88, 又はCMV9-HA-TRIFでマウス（10個体／群）を免疫した。2回目の免疫の2週間後、マウスに4 LD50又は20 LD50量のインフルエンザウイルスA/PR/8/34を接種した。以後12日間の体重をモニターした。グラフは0日における体重に対する体重のパーセントを示す。死亡した個体は†で示す。
【図９Ｂ】図９Ａの以後12日間の生存率をモニターした結果を示す図である。○, pGA-GFP; ▲, CMV9-HA; ■, CMV9-HA-MyD88; ●, CMV9-HA-TRIF
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸を意味し、必ずしも親から子へ伝えられる天然の遺伝子に限定されるものではなく、合成された核酸等であってもよい。核酸としては、安定性の点からDNAが好ましい。【００１４】
本発明の遺伝子ワクチンは、Toll様受容体(Toll-like receptor、以下「TLR」ということがある)のアダプター分子の遺伝子を含んでおり、この点が本発明の遺伝子ワクチンの特徴である。TLRは、微生物やウイルス等の病原体を感知し、進入する病原体に対して初期の免疫応答を引き起こす重要な役割を担うものである。TLRの遺伝子は、ショウジョウバエのToll遺伝子と相同性を有することからToll様受容体と呼ばれる。TLRは、病原体により発現される高度に保存された構造モチーフを認識するものであり、このような構造モチーフとしては、フラジェリン（細菌の鞭毛を構成するタンパク質）、細菌DNA、二本鎖ウイルスRNAやLPS、ペプチドグリカン、リポペプチド等の細胞壁構成因子が包含される。ヒトおよびマウスでは約11種類のTLRが知られている。【００１５】
TLRに病原体由来の上記構造モチーフ（リガンド）が結合することによりTLRが刺激されると、適切な免疫応答を指揮するサイトカイン、ケモカインの分泌を誘導する転写因子NF-κBの活性化やI型インターフェロン（IFN）の産生を誘導するシグナルカスケードが始動される。TLRの活性化から、NF-κBの活性化またはI型IFNの産生誘導に至るまでのカスケードにおけるシグナル伝達に係るタンパク質がTLRアダプター分子と呼ばれ、種々のものが知られている。本願発明者らは、このTLRアダプター分子をコードする遺伝子を、遺伝子ワクチンに組み込んでおき、対象となる抗原と共に同一細胞内で発現させることにより、アジュバント効果が発揮され、免疫付与効果が高まるという新知見を得、本発明に至ったものである。【００１６】
TLRのアダプター分子は、公知のいずれのTLRのいずれのアダプター分子であってもよいが、好ましいアダプター分子の例として、MyD88、TRIF(TICAM1とも呼ばれる）、TIRAP、TRAM、IRAK1、IRAK4、TRAF6、RIP1、IKK-i、TBK1 及びRIG-Iを挙げることができる。これらのうち、MyD88及びTRIFが特に好ましい。これらのアダプター分子自体は周知であり、その遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列も知られている。例えば、MyD88遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は、GenBank Accession No. NM_002468に記載されている。同様に、TRIF/TICAM1 の配列は、GenBank Accession No. （以下同じ）AB093555、TIRAPはAF406652、TRAM はAY232653、IRAK1はL76191、IRAK4はAY283670、TRAF6はU78798、RIP1はNM_003804、IKK-iはAB016590、TBK1はAF191838、RIG-I はAY180973に記載されている（以上のGenBank Accession No.に記載されているアダプター分子は全てヒト由来）。なお、ヒトMyD88の配列を配列表の配列番号１に、ヒトTRIFの配列を配列表の配列番号３に示す。【００１７】
これらのアダプター分子遺伝子は、その塩基配列が公知であるので、例えばTLRを発現しているヒトマクロファージ等から抽出したRNAを鋳型とする逆転写PCR等の常法により作製することができるし、市販のヒト脾臓cDNAライブラリーを鋳型としてPCR等の常法により作製することもできる（下記実施例参照）。また、本発明において好ましく用いられるMyD88やTRIF等のアダプター分子の遺伝子は市販もされているので、市販品を用いることもできる。【００１８】
上記したアダプター分子には、天然の変異体が知られているものもあり、その場合には、その天然のアダプター分子の変異体遺伝子を用いることもできる。また、一般に、生理活性を有するポリペプチドは、そのアミノ酸配列を構成するアミノ酸のうち少数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、又は少数のアミノ酸が挿入されたり付加された場合でもその生理活性が維持される場合があることは周知である。したがって、上記した天然のアダプター分子のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、遺伝子ワクチン内にコードされる前記抗原と共に細胞内で発現された際に該ワクチンのアジュバント効果を発揮する変異型のアダプター分子もまた本発明において用いることができる。このような変異型のアダプター分子のアミノ酸配列の、天然型のアミノ酸配列に対する相同性は、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。なお、ここで、二者のアミノ酸配列の相同性は、一致するアミノ酸の数が最も多くなるように配列を整列し、一致しているアミノ酸の数を全体のアミノ酸の数（全体のアミノ酸の数が異なる場合には短い方のアミノ酸の数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出できる。なお、変異型のアダプター分子の長さが天然型と異なる場合、その長さは天然型の７０％以上が好ましく、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。また、変異型のアダプター分子のアミノ酸配列は、天然型のアダプター分子のアミノ酸配列において、１個ないし数個のアミノ酸が置換し及び／若しくは欠失し、並びに／又は１個ないし数個のアミノ酸が挿入され及び／若しくは付加されたものである場合がさらに好ましい。アミノ酸が置換する場合、類似した性質のアミノ酸に置換しても生理活性が維持される場合が多いので、置換の場合は、類似した性質のアミノ酸に置換したものが好ましい。すなわち、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多い。もっとも、上記したような変異型を用いる必要は特になく、天然型のアダプター分子を用いることが好ましい。【００１９】
本発明の遺伝子ワクチンは、上記したアダプター分子の遺伝子が組み込まれていることを特徴とし、他の部分は、従来から周知の遺伝子ワクチンと同様であってよい。【００２０】
遺伝子ワクチンに組み込む抗原遺伝子としては、免疫力を付与したい病原体が有する抗原であって、それに対する抗体により該病原体による発症が防止又は緩和されるものであればよく、何ら限定されるものではなく、公知の遺伝子ワクチンに用いられている抗原遺伝子はいずれも用いることができる。本発明に用いることができる抗原遺伝子の例としては、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)及び核タンパク（NP）、エイズウイルスの外被タンパク（gag、pol、env）並びに緑膿菌の構成成分（OprF/I、PilA、PcrV、FliC）等の公知の遺伝子を例示することができるが、これらに限定されるものではない。【００２１】
本発明の遺伝子ワクチンは、上記抗原遺伝子及びアダプター分子遺伝子を哺乳動物細胞用のベクター中に組み込んだものである。哺乳動物細胞用ベクター自体は、この分野において周知であり、市販もされており、公知のベクターや市販品をそのまま用いることができる。例えば、Invitrogen社から市販されているpcDNA3.1(+)(catalog No. V790-20)やpcDNA3.1(-)(catalog No. V795-20)等を好ましく用いることができるがこれらに限定されるものではない。周知のとおり、これらの哺乳動物細胞用ベクターは、哺乳動物細胞内での複製を可能にする複製開始点、外来遺伝子の発現を可能にするプロモーター領域、外来遺伝子を挿入するためのマルチクローニング部位等を有する。なお、ベクターは、レトロウイルスやアデノウイルスのような哺乳動物細胞用のベクターとして用いられているウイルス由来のベクターであってもよい。【００２２】
本発明の遺伝子ワクチンは、哺乳動物細胞用のベクターに上記抗原遺伝子と上記アダプター分子遺伝子を組み込むことにより得ることができるが、前記抗原遺伝子は、該抗原遺伝子の転写を制御するプロモーターの下流に位置し、前記アダプター分子遺伝子は、該アダプター分子遺伝子の転写を制御する、前記抗原遺伝子のプロモーターとは異なるプロモーターの下流に位置することが好ましい。すなわち、抗原遺伝子及びアダプター遺伝子は、それぞれ別のプロモーターにより制御されることが好ましい。もっとも、同一細胞内で抗原とアダプター分子の両方が生産されることを確保するために、各プロモーターとしては同じ種類のプロモーターを用いることが好ましいが、異なる種類のプロモーターであってもよい。【００２３】
本発明の遺伝子ワクチンは、哺乳動物細胞用のベクターのマルチクローニング部位に、抗原遺伝子又はアダプター分子遺伝子を挿入し、次いで、マルチクローニング部位のターミネーター領域(polyA等）の下流にある制限酵素部位を切断し、この切断部位に、プロモーター＋アダプター分子遺伝子（先にアダプター遺伝子を挿入した場合には抗原遺伝子）＋ターミネーターのカセット配列を挿入することにより構築することができる。あるいは、哺乳動物細胞用のベクターのマルチクローニング部位に、抗原（又はアダプター分子遺伝子）＋ターミネーターのカセットを挿入し、該ターミネーターの下流にプロモーター＋アダプター分子（又は抗原遺伝子）のカセットを挿入することによっても構築することができる。【００２４】
遺伝子ワクチンに組み込まれる抗原遺伝子やアダプター遺伝子は、必ずしも１つずつに限定されるものではなく、異なる２種類以上の抗原遺伝子や異なる２種類以上のアダプター分子遺伝子を組み込んでもよい。もっとも、遺伝子の数が多くなりすぎると遺伝子ワクチンのサイズが大きくなりすぎて細胞に入りにくくなるので、抗原遺伝子とアダプター分子遺伝子の合計は４個以下が好ましい。このように、抗原遺伝子やアダプター分子遺伝子を複数組み込む場合でも、プロモーター＋抗原（アダプター分子）遺伝子＋ターミネーターのカセットをベクター内の制限酵素部位に挿入することにより、所望の遺伝子ワクチンを構築することができる。【００２５】
哺乳動物への遺伝子ワクチンの投与自体は、周知の方法により行うことができる。すなわち、好ましくは、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、静脈内投与等の非経口投与により投与することができる。遺伝子ワクチンをリン酸緩衝液(PBS)等の緩衝液に懸濁したものを投与することができる。投与に際し、細胞内への遺伝子ワクチンの侵入を容易にするために、注射部位に電界パルスを与えることが好ましい。この場合、電界の強さは、特に限定されないが、通常、10V/cm〜60V/cm程度、好ましくは25V/cm〜35V/cm程度、パルスの持続時間は、通常、20ミリ秒〜100ミリ秒、好ましくは、40ミリ秒〜60ミリ秒程度であり、パルスを通常、１回〜６回、好ましくは２回〜４回程度当てることができる。また、皮内投与は、市販の遺伝子銃を用いて周知の方法により行うことができる。すなわち、遺伝子ワクチンを、金粒子上に固定し、この金粒子を、ポリビニルピロリドンのような接着剤と共に遺伝子銃で動物の体表から皮内に打ち込むことにより投与することができる。投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で１μg〜１０００μg程度、好ましくは１００μg〜２００μg程度である。【００２６】
下記実施例において具体的に示されるように、本発明の遺伝子ワクチンを投与すると、アダプター分子遺伝子を含まない公知の遺伝子ワクチンと比較して、抗原に対する免疫応答がより強く起き、該抗原を有する病原体に対する免疫力をより強力に付与することができる。すなわち、抗原に対する特異抗体の生産がより増大し（体液性免疫反応の増大）、インターフェロン等のサイトカインの生産量が増大し、CTL（細胞障害性Ｔ細胞）活性化反応がより強く誘導される。【００２７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
方法
発現プラスミド
抗原及びＴＬＲアダプター分子をコードするcDNA断片を親プラスミドからPCRにより増幅し、後述する方法により遺伝子ワクチンに組み込んだ。ＦＬＡＧタグを施した発現ベクターCMV4-MyD88, CMV4-TRIF, CMV4-TIRAP, CMV4-TOLLIP, CMV4-IRAK1, 及びCMV4-TRAF6は公知の方法（Eur J Immunol, vol. 35, 2477-2485, 2005）により作製した。LacZ又はEGFPのcDNAはそれぞれpSV-β-ガラクトシダーゼ（Promega, ウィスコンシン州Madison）又はpEGFP-N1 (BD Biosciences, カリフォルニア州San Jose) から増幅した。インフルエンザウイルスA/PR/8/34株(H1N1型) のHA (アミノ酸18番-566番、配列番号５、６）はpJW4303/H1（J Virol, vol. 76, 6652-6659, 2002）から増幅しpFLAG-CMV9ベクター (Sigma, ミズーリ州St Louis) に導入した。クローニングしたPCR産物の配列はABI PRISM Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, カリフォルニア州Foster City) を用いて確認した。【００２９】
より具体的には、本発明の遺伝子ワクチンであるpDX-LacZ-MyD88、pDX-LacZ-TRIF、CMV-HA-MyD88及びCMV9-HA-TRIFは次のようにして構築した（図１参照）。【００３０】
図１に示す受容体プラスミドは、公知のpGAベクター（Ross et al., Nat. Immunol. 1, 127-131(2000))又は市販のpFLAG CMV9ベクター(Sigma社製）を基本とするものである。pGAの遺伝子地図を図２に示す。図２に示されるように、pGAベクターは、真核生物由来の挿入遺伝子の転写を開始するためのサイトメガロウイルス(CMV)のimmediate-earlyプロモーター＋イントロンＡと、転写終結のためのウシ成長ホルモン(BGH)のポリアデニレーションシグナル(polyA)と、原核生物細胞内での複製を可能にするためのCol E1 originと、カナマイシン耐性遺伝子と、真核生物由来の挿入遺伝子の安定性を高めるλT0ターミネーターとを含むプラスミドである。pFLAG CMV9ベクター(Sigma社製）もpGAベクターと類似した構造（ただしカナマイシン耐性遺伝子ではなくアンピシリン耐性遺伝子を有する）を有する。LacZ遺伝子は、pGAベクターのHindIII-XhoI部位、GFP遺伝子は、pGAベクターのBamHI-AvrII部位、HA遺伝子は、pFLAG CMV9ベクター(Sigma社製）のNotI-BamHI部位に挿入し、図１に示す受容体プラスミドを構築した（それぞれ、「pGA recipient LacZ」、「pGA recipient GFP」、「pFLAG CMV9 recipient HA」）。【００３１】
なお、挿入したLacZ遺伝子、GFP遺伝子、HA遺伝子は次のようにして調製した。LacZ遺伝子は、市販のpSV-β-ガラクトシダーゼ（Promega, ウィスコンシン州Madison）中に含まれているLacZ遺伝子をPCRにより増幅して調製した。PCRに用いたプライマーセットは、5'-GGG AAG CTT ACC ATG TCG TTT ACT TTG ACC AAC AAG-3'と5'-GGG CTC GAG TTA TTT TTG ACA CCA GAC CAA CTG G-3'であった。GFP遺伝子は、市販のpEGFP-N1 (BD Biosciences, カリフォルニア州San Jose) 中に含まれているGFP遺伝子をPCRにより増幅して調製した。PCRに用いたプライマーセットは、5'-CCC GGA TCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG C-3'と5'-TTT CCT AGG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3'であった。HA遺伝子は、公知のpJW4303/H1ベクター（J Virol, vol. 76, 6652-6659, 2002）に含まれるHA遺伝子（配列番号５、６）の、アミノ酸18番-566番をコードする領域をPCRにより増幅して調製した。PCRに用いたプライマーセットは、5'-AGC TGC GGC CGC AGA CAC AAT ATG TAT AGG-3'と5'-CGG GAT CCT CAG ATG CAT ATT CTG CAC TGC-3'であった。【００３２】
一方、図１に示す供与体プラスミドは、上記したpGAベクター又はpBluescript SK(+)ベクター（Stratagene社より市販されている周知のクローニングベクター）を基本とするものである。pGAベクターのHindIII-EcoRI部位に、MyD88遺伝子又はTRIF遺伝子を挿入して図１の供与体プラスミドを構築した(「pGA donor MyD88」及び「pGA donor TRIF」)（LacZ又はGFP含有遺伝子ワクチン調製用）。得られた供与体プラスミドpGA donor MyD88及びpGA donor TRIFから、NotIにより、CMV promoter-IntronA-MyD88断片及びTRIF cDNA-polyA断片をそれぞれ切り出し、pBluescript SK(+)ベクターのNotI部位に挿入して供与体プラスミド「pBluescript SK(+) MyD88」及び「pBluescript SK(+) TRIF」を構築した（HA含有遺伝子ワクチン調製用）。【００３３】
なお、挿入したMyD88遺伝子及びTRIF遺伝子は、ヒト脾臓cDNAライブラリー（クローンテック社より市販）を鋳型とし、それぞれ次のプライマーセットを用いたPCRにより増幅して調製した。MyD88: 5'-GGA ATT CAC CAT GGC TGC AGG AGG TCC CGG-3'と5'-CCC AAG CTT CAG GGC AGG GAC AAG GCC TTG-3'、TRIF: 5'-GGA ATT CAC CAT GGC CTG CAC AGG CCC ATC-3'と5'-CCC AAG CTT CAT TCT GCC TCC TGC GTC TTG-3'【００３４】
pGA donor MyD88及びpGA donor TRIFからNotIにより、それぞれCMV promoter-IntronA-MyD88及びTRIF cDNA-polyA断片を切り出し、それぞれpGA recipient LacZまたはpGA recipient GFPのNotI 部位に挿入してそれぞれpDX-LacZ-MyD88、pDX-GFP-MyD88、pDX-LacZ-TRIF及びpDX-GFP-TRIFをそれぞれ作製した。また、pBluescript SK (+) MyD88及びpBluescript SK (+) TRIFからSalIにより、CMV promoter-IntronA-MyD88断片及びTRIF cDNA-polyA-SalI断片をそれぞれ切り出し、pFLAG CMV9 recipient HAのSalI部位に挿入してCMV9-HA-MyD88及びCMV9-HA-TRIFをそれぞれ作製した。【００３５】
細胞のトランスフェクション及びレポーター遺伝子アッセイ
製造者のプロトコールに従い、FuGene 6 (Roche Diagnostics, インディアナ州Indianapolis) を用いて一過的トランスフェクションを行った。HEK293細胞 (3 × 104)を、各発現プラスミド(CMV4, CMV4-MyD88, CMV4-TRIF, CMV4-TIRAP, CMV4-TOLLIP, CMV4-IRAK1, CMV4-TRAF6, pGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, 又はpDX-LacZ-TRIF, 200 ng)、レポータープラスミド(p5xNF-κB-luc又はpGL3 hIFNβ, 25 ng)、及びコントロールのウミシイタケルシフェラーゼプラスミド(pTK-RL, 25 ng, Promega, ウィスコンシン州Madison)で共トランスフェクトした。トランスフェクション後細胞を48時間インキュベートし、製造者のプロトコールに従いDual Luciferase Reporter Assay System (Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。あるいは、β-Gal Reporter Gene Assay kit (Roche Diagnostics)を用いてLacZ活性を測定した。最後に、個々の細胞溶解物のホタルルシフェラーゼ活性又はLacZ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。【００３６】
免疫計画
8週齢の雌BALB/cマウスをSLC（静岡県）より購入し、特定の病原体フリーな環境下の動物施設で飼育した。ケタミン／キシラジン混合液で麻酔した後、該マウス（8匹／群）の大腿四頭筋に、pGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, pDX-LacZ-TRIF, pGA-GFP, pDX-GFP-MyD88, pDX-GFP-TRIF, CMV9-HA, CMV9-HA-MyD88, 又はCMV9-HA-TRIFのいずれかを含むプラスミド溶液(1μg/μl生理食塩水、50μl/筋)を注射した。CUY21EDIT (NepaGene,東京)を用いて、30 V/cm一定、50ミリ秒 × 3パルスの電界強度で注射部位をエレクトロポレーションした。2回目の免疫は1回目の免疫の4週間後に行なった。全ての動物実験は施設の動物管理・福祉委員会に承認され、マウスはNIH動物管理ガイドラインに従って取り扱われた。【００３７】
ELISA
ELISAによって以前記載したとおりに血清抗体価を測定した。免疫プレート(Nalge Nunc International, ニューヨーク州Rochester)を、0.1 M 重炭酸塩緩衝液（pH 9.0）中に1μg/mlに溶解した抗LacZ抗体(rLacZ、（TOYOBO)）で被覆した。該プレートをPBST + 1% BSAでブロッキングし、免疫したマウスから収集した血清の低減希釈液を該プレートに加え、プレートを37℃で2時間インキュベートした。結合したIgGをHRP標識した抗マウスIgG, IgG1, 又はIgG2a抗体（Southern Biotechnology Associates, アラバマ州Birmingham）と反応させ、次いでクエン酸緩衝液及びH2O2中で基質として作用する2-2-アジノ-ビスと反応させた。力価の高い抗血清を用いて作製した検量線と比較することによる比色アッセイで、相対的抗体濃度を得た。【００３８】
細胞内サイトカイン染色（Intracellular cytokine staining; ICCS）アッセイ
最後の免疫の2週間後に脾臓細胞を収集した。該細胞を12μg/mlのrLacZ（Sigma）と共に37℃にて24時間インキュベートし、インキュベート終了2時間前に1μg/mlのGolgiPlug (BD Biosciences)を添加した。該細胞を染色緩衝液（3% FCS及び0.1% NaN3を含むPBS）で洗浄し、4% 正常マウス血清でブロッキングして、フィコエリトリン結合抗マウスCD4抗体（L3T4, BD Biosciences）又はCD8抗体（Ly-2, BD Biosciences）で染色した。次いで該細胞を固定、浸透可能化し、FITC結合抗マウスIFN-γ抗体（XMG1.2, BD Biosciences）で4℃にて30分間染色後、フローサイトメトリー解析に付した。【００３９】
リアルタイムPCR
最後の免疫の2週間後に脾臓細胞を収集した。該細胞を1μg/mlのH-2d-制限LacZクラスIペプチド（TPHPARIGL）で24時間37℃にてインキュベートした。あるいは、最後の免疫の24時間後又は72時間後に鼠径部のLN細胞を収集した。これらの細胞を次いで800μlのTRIzol試薬 (Invitrogen, カリフォルニア州Carlsbad) 中に溶解し、全RNAを単離した。逆転写は、25 ng/mlのオリゴ(dT)12-18, 200 UのSuperScript III逆転写酵素 (Invitrogen), 2 mM dNTP, 10 mM DTT, 及び10 Uのリボヌクレアーゼ阻害剤を含む第一鎖緩衝液（50 mM Tris-HCl; pH 7.5, 75 mM KCl, 及び2.5 mM MgCl2）中で50℃にて1時間行なった。リアルタイムPCRは、IFN-γ, IL-12 p40, IL-18, IL-4, IL-6, IFN-β, TNF-α, IP-10, JE/MCP-1, MHC class I (D1), MHC class II (Ea), CD40, CD80, CD86, 又は18S rRNAに特異的なTaqManプローブ (Applied Biosystems, カリフォルニア州Foster City) 及びABI PRISM 7700 sequence detection system (Applied Biosystems) を用いて行なった。個々のサンプルにおけるIFN-γ, IL-12 p40, IL-18, IL-4, IL-6, IFN-β, TNF-α, IP-10, JE/MCP-1, MHCクラスI (D1), MHCクラスII (Ea), CD40, CD80, 及びCD86の相対mRNA発現レベルは、18S rRNAのレベルに対して正規化した。【００４０】
CTLアッセイ
最後の免疫の2週間後に脾臓細胞を収集した。1 μg/mlのH-2d-制限LacZクラスIペプチド及び20 U/mlのIL-2 (Sigma) と共に37℃にて4日間インキュベートした後、CTL分離株（エフェクター細胞）を調製した。標的細胞として、1 mg/mlのH-2b-制限LacZクラスIペプチド (DAPIYTNV, コントロールペプチド) 又はH-2d-制限LacZクラスIペプチドと共にパルス刺激したP815細胞を用いた。該標的細胞 (1 x 104個) を増殖したエフェクター細胞と共に4時間培養した。標的細胞から放出されたLDHの量は、Cytotox 96 (Promega) システムを用いて測定し、製造者のプロトコールに従い％特異的細胞溶解を算出した。【００４１】
インビボレポーター遺伝子アッセイ
筋肉内エレクトロポレーション（intramuscular electoroporation; imEPT）により50μgのpGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, 又はpDX-LacZ-TRIFのいずれかをBLAB/cマウス (3マウス/群) に投与した。投与3日後又は7日後に、注入された筋肉（6筋/群）を取り出し、細胞溶解試薬（Roche Diagnostics）中でホモジナイズし、凍結融解を3回行なった。遠心後、上清を回収し、LacZ活性又はタンパク質濃度をそれぞれβ-ガラクトシダーゼアッセイシステム（Roche）又はBCAタンパク質アッセイキット（Bio-Rad, カリフォルニア州Hercules）を用いて測定した。次いで、個々の細胞溶解物のLacZ活性をタンパク質濃度に対して正規化した。【００４２】
ライゲーション介在PCR（LM-PCR）によるアポトーシス細胞からのDNA断片の増幅
293T細胞を、pGA-GFP, pDX-GFP-MyD88, 又はpDX-GFP-TRIFのいずれかで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、製造者の指示書に従いNuclepspinキット (Macherey-Nagel, ペンシルバニア州Easton) を用いて該細胞からゲノムDNAを抽出した。各サンプルDNAから1μgを、ApoAlert LM-PCRキット (BD Biosciences) を用いたライゲーション介在PCR法に付した。すなわち、該ゲノムDNAの末端に12ヌクレオチド及び24ヌクレオチドのアダプターを、T4 DNAリガーゼを用いて16℃にて12時間ライゲーションした。次いで、12ヌクレオチド及び24ヌクレオチドをプライマーとして用いて、PCRを24サイクル行なった。PCR産物を1.5%アガロースゲルにて分離し臭化エチジウム染色後UV光下で確認した。【００４３】
インフルエンザ接種
pGA-GFP, CMV9-HA, CMV9-HA-MyD88, 又はCMV9-HA-TRIFによる2回目の免疫の2週間後、1×104 PFU (4 LD50) 又は5×104 PFU (20 LD50) のインフルエンザウイルスA/PR/8/34をマウスの鼻内に接種した。以後10日間、被接種マウスの体重及び死亡率を観察した。【００４４】
統計的解析
全ての実験は2回以上反復した。0.05未満のp値を統計的有意としたスチューデントt検定により統計的有意性を評価した。【００４５】
結果
TLR又はTLRリガンド非存在下におけるTLRアダプター分子の過剰発現によるNF-κB及びIFN-βプロモーターの活性化
遺伝子アジュバントとして最適な候補分子を検索するため、本願発明者らは、MyD88, TRIF, TIRAP, TOLLIP, IRAK1, 及びTRAF6を含む公知のTLRアダプター分子について、HEK293細胞中においてNF-κB及びIFN-βプロモーターを活性化する能力を調べた。NF-κBは、サイトカイン、ケモカイン、及び共起刺激分子のような先天免疫活性化に関与する遺伝子の発現を調節する主要な転写因子である。IFN-α及びIFN-βの両者を含むタイプIのIFNは、先天免疫と同様、抗原提示に不可欠である。図３に示す通り、TLRアダプター分子のうち、MyD88がNF-κB活性化を最も強く誘導し、一方でTRIFはIFN-βプロモーターを最も高いレベルで活性化することができた。従って、遺伝子アジュバントの候補分子としてMyD88及びTRIFが選ばれた。【００４６】
MyD88又はTRIFのための発現カセットと共に組み込まれたワクチンプラスミドの力価
MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントの最大限の効果を得るため、抗原と共にMyD88又はTRIFを同一の抗原提示細胞（antigen presenting cell; APC）中に導入し（直接的な初回抗原刺激）、該細胞においてこれらの分子が有効な抗原提示作用を行なえるようにした。この目的に到達するため、図４Aに示す二重発現プラスミドを構築した。次いで、これらの構築物の抗原発現能及び内生細胞活性化能を調べた。HEK293T細胞をpGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, 又はpDX-LacZ-TRIFでトランスフェクトした場合、細胞溶解物中におけるLacZ活性レベルは同程度であった（図４B）。予想されたとおり、pDX-LacZ-MyD88でトランスフェクトした場合には、コントロールプラスミド（pGA-LacZ）でトランスフェクトした場合と比較して、NF-κB依存のルシフェラーゼ活性は7.8倍以上増加していた。pDX-LacZ-TRIFでトランスフェクトした場合は、IFN-βプロモーター依存のルシフェラーゼ活性はコントロールプラスミドの11.7倍以上に増加していた。従って、これらのデータは、MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントはワクチンプラスミドベクター中に組み込まれた際に抗原（LacZ）の発現レベルを変調させることなく内生細胞活性化因子として働く機能を保持するということを示している。【００４７】
MyD88遺伝子アジュバントと共に組み込まれたDNAワクチンにより起こる体液性免疫反応の促進
DNAワクチンプラスミドに組み込まれたMyD88及びTRIF遺伝子アジュバントの効果を調べるため、pGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, 又はpDX-LacZ-TRIFを筋肉内エレクトロポレーション（intramuscular electoroporation; imEPT）によりマウスに投与した。1回目の免疫後（4週）では、これらのプラスミドDNAワクチンは抗LacZ IgGを同程度の低レベルで誘導していた（図５A）。2回目の免疫後（6週）では、pDX-LacZ-MyD88は抗LacZ IgG血清をコントロールプラスミド（pGA-LacZ）よりも7.4倍以上高いレベルで誘導していた。pDX-LacZ-TRIFは抗LacZ IgG血清生産をコントロールプラスミドと同程度のレベルで誘導していた（図５A）。IgGサブタイプのレベルも調べた。pDX-LacZ-MyD88は、コントロールプラスミドと比較して、抗LacZ IgG2a血清を15.0倍以上の高レベルで誘導していたが、IgG1サブタイプは同レベルであった（図５B）。これらの結果は、MyD88遺伝子アジュバントはDNAワクチンにより起こる抗原特異的な体液性免疫反応を効果的に促進するということを示している。【００４８】
MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントにより変調される細胞性免疫反応
免疫されたマウスから調製された脾細胞において、IFN-γ及びIL-4の抗原特異的生産を調べた。2回目の免疫の2週間後、脾細胞を調製し、H-2d-制限MHCクラスIペプチドでインビトロにおいて再刺激した。該細胞から全RNAを抽出し、逆転写反応に付し、次いでIFN-γのcDNAレベルをリアルタイムPCRにより定量した。コントロール群から得られた細胞と比較して、pDX-LacZ-MyD88群から得られた脾細胞は2.4倍以上、pDX-LacZ-TRIF群から得られた脾細胞は6.6倍以上の高レベルでIFN-γのmRNAを生産していたが、一方で全ての群由来の細胞はクラスIペプチド刺激に対する反応においてIL-4を同程度の低レベルで生産していた（図６A）。あるいは、脾細胞をrLacZ全タンパク質で刺激し、次いでCD4+及びCD8+ Tリンパ球からのIFN-γの生産をICCS解析により調べた。pDX-LacZ-MyD88及びpDX-LacZ-TRIFワクチン接種両方において、CD4+及びCD8+ Tリンパ球によるIFN-γ生産の誘導が認められた（図６B）。最後に、クラスI LacZペプチドでパルス刺激したP815 (H-2Kd)細胞を標的としたCTLアッセイを行なった。pDX-LacZ-TRIFが最も強くCTL反応を誘発した（図６C）。pDX-LacZ-MyD88もまたコントロールプラスミドよりもCTL反応を強く誘導する能力があった（図６C）。これらの結果より、MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントはDNAワクチンにより引き起こされるTh-1支配の抗原特異的細胞性免疫反応の規模を増大することが明らかとなった。【００４９】
MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントの効果に関与する交差提示機構
これらの遺伝子アジュバントによるDNAワクチンの免疫原性の増強の基礎をなす機構を見極めるため、インビボでの抗原発現レベルを調べた。図７Aに示すとおりに、これらのプラスミドを用いてimEPTを行なった後の筋肉内LacZ発現レベルを調べた。pDX-LacZ-MyD88及びpDX-LacZ-TRIFでは筋肉内LacZタンパク質発現レベルがコントロールよりも有意に低く、遺伝子アジュバントカセットの挿入によりプラスミドのサイズが増すにつれてトランスフェクション効率が低下することがわかる。従って、この結果は少なくとも、これらの遺伝子アジュバントが単に抗原の発現レベルを増大し、それによって抗原の交差提示を増大しているという可能性を排除するものである。【００５０】
TRIF過剰発現によって誘発される細胞内での諸現象
MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントによって誘発される細胞内での諸現象を調べるため、GFP発現プラスミド系列を構築し（図４A）、HEK293細胞中にトランスフェクトした。次いで、蛍光顕微鏡下で細胞の外観を調べた。興味深いことに、pDX-GFP-TRIFでトランスフェクトした細胞は断片化を起こし、トランスフェクト後48時間以内に死滅するように見えた。pDX-GFP-TRIFでトランスフェクトした細胞内で起こる現象を確認するために、ゲノムDNAを抽出し、LM-PCR解析に付してDNAの断片化を検出した。図７Cに示すとおり、TRIFの過剰発現によりアポトーシスの典型的な特徴であるDNAの断片化が誘導された。この機構もまた、TRIF遺伝子アジュバントを組み込んだDNAワクチンによって起こる強い免疫原性に寄与しているものと考えられる。なお、蛍光顕微鏡観察は次のように行なった。すなわち、250 ngのpGA-GFP, pDX-GFP-MyD88, 又はpDX-GFP-TRIFでHEK293細胞 (4×104個)をトランスフェクトした。トランスフェクト48時間後、該細胞を蛍光顕微鏡で解析した。3回の独立した実験を行なった。また、電気泳動は次のようにして行なった。すなわち、250 ngのpGA-LacZ, pDX-LacZ-MyD88, 又はpDX-LacZ-TRIFと共に又はこれらを含めずにHEK293細胞 (4×104個)をトランスフェクトした。トランスフェクト48時間後、ゲノムDNAを回収し材料及び方法中に記載した通りにLM-PCRを行なった。反応の一定分量を1%アガロースゲルで泳動し臭化エチジウム染色して確認した。2回の独立した実験はを行なった。【００５１】
MyD88又はTRIF遺伝子アジュバントを組み込んだDNAワクチンによる免疫後の流入領域リンパ節（lymph node; LN）細胞集団
近年の免疫学の概念的枠組みは、APCは末梢で抗原を捕捉した後に流入領域LNに入り、そこで続いて起こる獲得免疫反応において重要な役割を果たしているということを明らかにしている。従って、鼠径部LNの単一細胞懸濁液を2回目の免疫の3日後に調製し、表面マーカー染色後、異なる細胞型数をFACS解析により見積もった。休止中のLNと比較して、CD11c+樹状細胞数は、いずれのプラスミドでimEPT処理を行なっても処理後72時間以内に増加していた（図８A）。興味あることに、pDX-GFP-MyD及びpDX-GFP-TRIFでimEPT処理すると、コントロールプラスミドと比較してCD40+細胞数が増加しており、このことより流入領域LNにおいてMyD88及びTRIF遺伝子アジュバントはCD40+成熟Bリンパ球及びCD40+活性化Tリンパ球の数を増加させることがわかった（図８A）。【００５２】
MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントを組み込んだDNAワクチンによる免疫後の流入領域LNにおけるサイトカイン、ケモカイン、IFN、及び細胞表面分子の変調
2回目の免疫の24時間後及び72時間後に鼠径部LNを取り出し、サイトカイン、ケモカイン、IFN、及び細胞表面分子のmRNA発現レベルをリアルタイムPCRを用いて定量した。IFN-γ, IL-12 p40, 及びIL-18のようなTh1サイトカインのレベルは、pDX-GFP-MyD88又はpDX-GFP-TRIFでの免疫72時間後ではコントロールに比べ顕著に上方制御されていた。IL-4及びIL-6のようなTh2サイトカインも両方の群において免疫72時間後で上方制御されていた。興味深いことに、IL-6のmRNAはpDX-GFP-TRIF群と比較するとpDX-GFP-MyD88群の方が顕著に増加していた。IFN-β及びTNF-αのようなAPCの機能を調節する因子、IP-10及びJE/MCP-1のようなケモカイン、並びにMHCクラスII, CD40, CD80, 及びCD86のようなAPCの機能に関連する要素もまた、コントロール群と比べてpDX-GFP-MyD88及びpDX-GFP-TRIF群の両方において免疫72時間後で上方制御されていた（図８B）。【００５３】
MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントのインフルエンザDNAワクチンへの適用
MyD88及びTRIF遺伝子アジュバントのインフルエンザDNAワクチンへの実用化を検討するため、HA抗原を標的とする一連のワクチンを構築した（図４A）。pGA-GFP（コントロールベクター）、CMV9-HA, CMV9-HA-MyD88, 又はCMV9-TRIFでマウスを2回ワクチン接種し、次いでLD50の4倍又は20倍量のインフルエンザウイルスA/PR/8/34を鼻内接種した。図９Aに示すとおり、CMV9-GFP, CMV9-HA, 及びCMV9-HA-MyD88でワクチン接種したマウスにおいては重篤なレベルの体重低下が観察された。CMV9-HA-TRIFでワクチン接種されたマウスでは、LD50の20倍量のインフルエンザを接種した後であっても体重低下は中度レベルであった。最後に、CMV9-HA-MyD88でワクチン接種した場合は、コントロールプラスミドCMV9-HA（生存率40%）と比較した際に4 LD50量のウイルス接種に対して中度レベルの防御効果（生存率60%）が見られた。CMV9-HA-TRIFでワクチン接種した場合は、致死レベル（4 LD50量）のインフルエンザウイルス感染に対し完全な防御効果が認められた。これらのマウスをその5倍量（20 LD50）のウイルスで接種した場合であっても、コントロール群では生存は20%以下であったが、CMV9-HA-TRIFでワクチン接種したマウスでは70%が生存した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月29日(2007.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原遺伝子と、Ｔｏｌｌ様受容体のアダプター分子の遺伝子を含み、細胞内で前記抗原遺伝子及び前記アダプター分子遺伝子を発現することができる組換えベクターから成る、前記抗原に対する免疫を付与するための遺伝子ワクチンであって、前記アダプター分子が、ＴＲＩＦ又は天然のＴＲＩＦのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、遺伝子ワクチン内にコードされる前記抗原と共に細胞内で発現された際に該ワクチンのアジュバント効果を発揮する変異型のＴＲＩＦである遺伝子ワクチン。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記アダプター分子がＴＲＩＦである請求項１記載の遺伝子ワクチン。
【請求項６】
前記抗原遺伝子は、該抗原遺伝子の転写を制御するプロモーターの下流に位置し、前記アダプター分子遺伝子は、該アダプター分子遺伝子の転写を制御する、前記抗原遺伝子のプロモーターとは異なるプロモーターの下流に位置する請求項１又は５記載の遺伝子ワクチン。
【請求項７】
前記抗原遺伝子のプロモーターと、前記アダプター分子遺伝子のプロモーターが同一種類のプロモーターである請求項６記載の遺伝子ワクチン。
【請求項８】
前記ベクターがプラスミドベクターである請求項１、５ないし７のいずれか１項に記載の遺伝子ワクチン。
【国際調査報告】
2007023725.tif 000016
2007023725.tif 000017
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2007023725.tif 000019
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