(57)【要約】  本発明は、フェロケラターゼを用いる、糖尿病または神経系疾患の治療薬のスクリーニング方法、ならびに式：2008010511.tif 000016 ［式中、環Aはさらに置換基を有していてもよい、2個以上の窒素原子を含む5員芳香族複素環を；Bは置換されていてもよい炭化水素基または置換されていてもよい複素環基を；Xは2価の非環状炭化水素基を；Zは-O-、-S-、-NR2-、-CONR2-または-NR2CO-（R2は水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す）を；Yは結合手または2価の非環状炭化水素基を；R1は置換されていてもよい環状基、置換されていてもよいアミノ基または置換されていてもよいアシル基を示す。］で表される化合物またはその塩を含む、フェロケラターゼ活性化剤を提供する。
2008010511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェロケラターゼを用いる、糖尿病または神経系疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
フェロケラターゼを活性化する物質を選択することを含む、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
式：
【化１】
2008010511.tif 000015
［式中、環Ａは、さらに置換基を有していてもよい、２個以上の窒素原子を含む５員芳香族複素環を；
Ｂは、置換されていてもよい炭化水素基または置換されていてもよい複素環基を；
Ｘは、２価の非環状炭化水素基を；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ２−、−ＣＯＮＲ２−または−ＮＲ２ＣＯ−（Ｒ２は、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す）を；
Ｙは、結合手または２価の非環状炭化水素基を；
Ｒ１は、置換されていてもよい環状基、置換されていてもよいアミノ基または置換されていてもよいアシル基を示す。］で表される化合物またはその塩を含む、フェロケラターゼ活性化剤。
【請求項４】
フェロケラターゼ活性化剤を含有してなる、組織のミトコンドリア機能が低下している糖尿病もしくは神経系疾患、ミトコンドリア脳筋症、線維筋痛症、膵疲弊または脂肪肝炎の予防・治療剤。
【請求項５】
フェロケラターゼ活性化剤を含有してなる、貧血の予防・治療剤。
【請求項６】
哺乳動物に、フェロケラターゼ活性化剤の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における、組織のミトコンドリア機能が低下している糖尿病もしくは神経系疾患、ミトコンドリア脳筋症、線維筋痛症、膵疲弊または脂肪肝炎の予防・治療方法。
【請求項７】
哺乳動物に、フェロケラターゼ活性化剤の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における、貧血の予防・治療方法。
【請求項８】
組織のミトコンドリア機能が低下している糖尿病もしくは神経系疾患、ミトコンドリア脳筋症、線維筋痛症、膵疲弊または脂肪肝炎の予防・治療剤の製造のための、フェロケラターゼ活性化剤の使用。
【請求項９】
貧血の予防・治療剤の製造のための、フェロケラターゼ活性化剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病や神経系疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法に関する。具体的には、本発明は、フェロケラターゼを用いることを特徴とする、糖尿病や神経系疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、フェロケラターゼ活性化剤、およびフェロケラターゼ活性化剤を含有してなる医薬に関する。【０００２】
（発明の背景）
糖尿病や神経系疾患の原因の１つとして、ミトコンドリアの異常が知られている。例えば、非特許文献１（Science (2005) 307, 384-387）には、ミトコンドリアの異常が、２型糖尿病におけるインスリン抵抗性や膵β細胞の機能障害の要因となり得ることが記載されている。また、非特許文献２（The Journal of Biological Chemistry (2001) 276(51), 48410-48416）および非特許文献３（PNAS (2002) 99(23), 14807-14812）は、ミトコンドリアにおけるヘムの欠乏が、加齢やアルツハイマー病による神経変性プロセスにおける重要な要素になり得ることを実験的に示している。【０００３】
フェロケラターゼはミトコンドリアに存在し、鉄がプロトポルフィリンＩＸへ配位するのを触媒することにより、各種蛋白質にヘム（即ち、鉄−ポルフィリン錯体）を供給する酵素である（Cellular Molecular Life Sciences、57巻、1909-26頁、2000年）。ミトコンドリア内では、シトクロムｃオキシダーゼなどの電子伝達系のタンパク質やラジカル処理に働くカタラーゼなどがヘムを要求するため、フェロケラターゼはミトコンドリア機能や細胞内レドックス制御にとって重要な役割を果たすと考えられている。
しかしながら、糖尿病や神経変性疾患とフェロケラターゼとの関係は明らかではなく、また、フェロケラターゼを活性化することにより糖尿病や神経系疾患を治療するというアプローチは知られていない。【０００４】
一方、本明細書中、式（Ｉ）で表される化合物は、神経栄養因子産生・分泌促進作用を有する化合物として特許文献１（WO2004/039365）に記載されている。しかし、この化合物がフェロケラターゼ活性化作用を有することは知られていない。【０００５】
【特許文献１】国際公開第WO2004/039365号パンフレット
【非特許文献１】サイエンス（Science）、307巻、384-387頁、2005年
【非特許文献２】ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）、276巻、51号、48410-48416頁、2001年
【非特許文献３】プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシイズ オブ ザ ユナイテド ステイツ オブ アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、99巻、23号、14807-14812頁、2002年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ミトコンドリアの異常（例、機能低下）に起因する疾患の予防・治療剤、およびこのような予防・治療剤を開発する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意検討した結果、フェロケラターゼ活性の低下によるミトコンドリア機能の低下と糖尿病との間に関連性があることを見出し、さらに鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明は以下に関する。
１）フェロケラターゼを用いる、糖尿病または神経系疾患の治療薬のスクリーニング方法。
２）フェロケラターゼを活性化する物質を選択することを含む、上記１）記載のスクリーニング方法。
３）式：【０００９】
【化１】
2008010511.tif 000003
【００１０】
［式中、環Ａは、さらに置換基を有していてもよい、２個以上の窒素原子を含む５員芳香族複素環を；
Ｂは、置換されていてもよい炭化水素基または置換されていてもよい複素環基を；
Ｘは、２価の非環状炭化水素基を；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ２−、−ＣＯＮＲ２−または−ＮＲ２ＣＯ−（Ｒ２は、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す）を；
Ｙは、結合手または２価の非環状炭化水素基を；
Ｒ１は、置換されていてもよい環状基、置換されていてもよいアミノ基または置換されていてもよいアシル基を示す。］で表される化合物またはその塩を含む、フェロケラターゼ活性化剤。
４）フェロケラターゼ活性化剤を含有してなる、組織のミトコンドリア機能が低下している糖尿病もしくは神経系疾患、ミトコンドリア脳筋症、線維筋痛症、膵疲弊または脂肪肝炎の予防・治療剤。
５）フェロケラターゼ活性化剤を含有してなる、貧血の予防・治療剤。
６）哺乳動物に、フェロケラターゼ活性化剤の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における、組織のミトコンドリア機能が低下している糖尿病もしくは神経系疾患、ミトコンドリア脳筋症、線維筋痛症、膵疲弊または脂肪肝炎の予防・治療方法。
７）哺乳動物に、フェロケラターゼ活性化剤の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における、貧血の予防・治療方法。
８）組織のミトコンドリア機能が低下している糖尿病もしくは神経系疾患、ミトコンドリア脳筋症、線維筋痛症、膵疲弊または脂肪肝炎の予防・治療剤の製造のための、フェロケラターゼ活性化剤の使用。
９）貧血の予防・治療剤の製造のための、フェロケラターゼ活性化剤の使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のスクリーニング方法を用いれば、ミトコンドリアの異常に起因する疾患を予防・治療する医薬を開発することができる。具体的には、本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、ミトコンドリア内に存在するフェロケラターゼを活性化してヘムの産生を亢進することにより、ミトコンドリアの機能を向上させることができるので、組織のミトコンドリア機能が低下した状態にある疾患、および生体内のヘムの減少に伴う疾患を予防または治療するために有用である。【００１２】
（発明の詳細な説明）
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
本発明は、糖尿病または神経系疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法（以下、本発明のスクリーニング方法と略記することがある）を提供する。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、フェロケラターゼを活性化する物質を選択することを含む。より具体的には、本発明のスクリーニング方法は、
ａ）試験物質の存在下および非存在下で、それぞれ、フェロケラターゼを、その基質であるポルフィリン類及び２価金属イオンと共に緩衝液中でインキュベートし；
ｂ）試験物質の存在下でのフェロケラターゼ活性と、試験物質の非存在下でのフェロケラターゼ活性とを比較し；
ｃ）試験物質の非存在下でのフェロケラターゼ活性と比較して、フェロケラターゼの活性を上昇させる試験物質を、フェロケラターゼを活性化する物質として選択することを含む。【００１３】
上記スクリーニング方法に用いるポルフィリン類としては、例えば、プロトポルフィリンＩＸ、デューテロポルフィリン、メソポルフィリンなどが挙げられ、なかでも、プロトポルフィリンＩＸが好ましい。
上記スクリーニング方法に用いる２価金属イオンとしては、例えば、２価鉄、亜鉛イオン、コバルトイオンなどが挙げられ、なかでも、２価鉄または亜鉛イオンが好ましい。これらの２価金属イオンは、必要に応じて、放射性同位体を用いてもよい。
上記スクリーニング方法に用いる緩衝液としては、例えば、トリス塩酸（Tris-HCl）緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液のｐＨは、通常、７．０〜８．０、好ましくは、７．５〜８．０である。
インキュベーションは、通常、約２０℃〜４０℃で、約０．１〜１２時間（好ましくは約０．１〜２時間）行なわれる。【００１４】
本明細書において、フェロケラターゼの活性とは、フェロケラターゼが、ポルフィリン類と２価金属からポルフィリン錯体を生成する活性（例えば、プロトポルフィリンＩＸと２価鉄よりプロトヘムを生成する活性）のことをいう。
フェロケラターゼの活性は、例えば、２価金属イオンのポルフィリン類への組込み量、ポルフィリン錯体の産生量等を指標に測定することができる。
各指標の定量は、自体公知の方法に従って行うことができる（例えば、The Journal of Biological Chemistry、259巻、9号、5678-5682頁、1984年；および続生化学実験講座、８、血液（上）、388-390頁、東京化学同人参照のこと）。例えば、２価金属イオンのポルフィリン類への組み込み量を指標とする場合、２価金属イオンとして放射性同位体（例えば、５９Ｆｅ２＋）を用い、該放射性同位体のポルフィリン類への組み込み量を定量する方法が挙げられる。また、フェロケラターゼがヘムを生成する場合、ピリジンヘモクローム法を用いてヘムの量を定量してもよい。また、２価金属イオンとして亜鉛イオンを用いる場合、亜鉛ポルフィリン錯体形成による特異的な蛍光の増加を測定する方法が挙げられる。例えば、亜鉛プロトポルフィリンＩＸの場合は、励起波長４０５〜４２０ｎｍおよび蛍光波長５９０ｎｍを用いることができる。ポルフィリン錯体の産生量を指標とする場合、ポルフィリン錯体形成によるポルフィリン蛍光の減少を測定すればよい。励起波長及び蛍光波長は、用いるポルフィリンの種類に応じて適当な波長を選択し得、例えば、プロトポルフィリンＩＸの場合は、励起波長４０５〜４２０ｎｍおよび蛍光波長６２０〜６４０ｎｍを用いることができる。
上記スクリーニング方法において、試験物質の非存在下でのフェロケラターゼ活性と比較して、活性を、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上、上昇させる試験物質を、フェロケラターゼを活性化する物質として選択することができる。【００１５】
本発明に用いられるフェロケラターゼは、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー）の細胞［例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞］に由来する蛋白質であっても、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋、腹膜］に由来する蛋白質であってよい。また、本発明に用いられるフェロケラターゼは、化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成された蛋白質であってもよい。あるいは、本発明に用いられるフェロケラターゼは、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を導入された形質転換体から産生された組換え蛋白質であってもよい。【００１６】
具体例としては、本発明に用いられるフェロケラターゼは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列（GenBank登録番号：NM_000140に示されるヒトフェロケラターゼのアミノ酸配列）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。【００１７】
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。【００１８】
より好ましくは、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。【００１９】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」とは、前記の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をいう。
「実質的に同質の活性」における「活性」とは、前述のポルフィリン類と２価金属からポルフィリン錯体を生成する活性をいう。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に同様であることを示す。
従って、「実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」は、「配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質」とポルフィリン錯体を生成する活性が同等であることが好ましいが、その活性の程度は異なっていてもよい（例えば、「配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質」の活性と比較して、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍の範囲内が挙げられる）。【００２０】
また、本発明で用いられるフェロケラターゼには、例えば、
(1) 配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
(2) 配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列；
(3) 配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列；
(4) 配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；または
(5) それらを組み合わせたアミノ酸配列；
を含有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も含まれる。ここで、「実質的に同質の活性」とは、前述と同意義であり、従って、上記のアミノ酸の欠失、付加、挿入、置換、およびそれらの組合せは、フェロケラターゼの活性に質的な影響を与えないものである必要がある。【００２１】
本明細書に記載される蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
本発明のスクリーニング方法に用いられるフェロケラターゼは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここで上記エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
フェロケラターゼがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも、本発明に用いられるフェロケラターゼに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。【００２２】
さらに、本発明に用いられるフェロケラターゼには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した、いわゆる、糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。【００２３】
本発明で用いられるフェロケラターゼは、上記したフェロケラターゼの部分アミノ酸配列を有し、且つフェロケラターゼと実質的に同質の活性を有する限り、部分ペプチドであってもよい。このような部分ペプチドとしては、例えば、配列番号２の55番目〜423番目のアミノ酸配列（即ち、ヒトフェロケラターゼのMature 領域）を有するペプチドが挙げられる。ここで「実質的に同質の活性」とは、前述と同意義である。【００２４】
本発明で用いられるフェロケラターゼは遊離体であってもよいし、塩であってもよい。このような塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。該酸付加塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。【００２５】
フェロケラターゼは、前述した温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。具体的には、温血動物の組織または細胞をホモジナイズし、可溶性画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等で分離精製することによって、フェロケラターゼを調製することができる。【００２６】
フェロケラターゼは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。フェロケラターゼを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)〜(5)に記載された方法に従って行われる：
(1) M. Bodanszky および M.A. Ondetti、Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) SchroederおよびLuebke、The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
(3) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
(4) 矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白質の化学IV、205、(1977年)
(5) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店【００２７】
このようにして得られたフェロケラターゼは、公知の精製法により単離・精製することができる。【００２８】
さらに、フェロケラターゼは、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からフェロケラターゼを分離精製することによって製造することもできる。
フェロケラターゼをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。【００２９】
フェロケラターゼをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー）のあらゆる細胞［例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞などや血球系の細胞］、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋、腹膜］由来のｃＤＮＡ、あるいは合成ＤＮＡなどが挙げられる。
フェロケラターゼをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、自体公知の方法にしたがって、例えば、Polymerase Chain Reaction（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）またはReverse Transcriptase-PCR（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって、直接増幅することもできる。あるいは、フェロケラターゼをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、自体公知の方法にしたがって、例えば、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられるが、それらのいずれを用いてもよい。【００３０】
フェロケラターゼをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列（配列番号２に示されるヒトフェロケラターゼのアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列）を有するＤＮＡ、あるいは配列番号：１で表される塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（即ち、プロトポルフィリンＩＸと２価鉄よりプロトヘムを生成する活性）を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：１で表される塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。【００３１】
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。【００３２】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning、第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。【００３３】
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が、約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。【００３４】
フェロケラターゼをコードするＤＮＡは、好ましくは、配列番号：１で表される塩基配列を含有するヒトフェロケラターゼＤＮＡもしくはそのアレル変異体、または他の温血動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー）におけるそのオルソログ（ortholog）等である。【００３５】
フェロケラターゼまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、フェロケラターゼ蛋白質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning、第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。【００３６】
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することもできる。【００３７】
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。【００３８】
フェロケラターゼは、自体公知の方法にしたがって、上記のフェロケラターゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによっても調製することができる。【００３９】
本発明のスクリーニング方法に用いられる試験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらは新規物質または公知物質のいずれであってもよい。【００４０】
本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、ポルフィリン類と２価金属からポルフィリン錯体を生成する活性（例えば、プロトポルフィリンＩＸと２価鉄よりプロトヘムを生成する活性）を促進することができるので、フェロケラターゼ活性化剤として用いることができる。以下、「本発明のスクリーニング方法により得られる物質」および「化合物（Ｉ）を含むフェロケラターゼ活性化剤」を総称して、本発明のフェロケラターゼ活性化剤と略記することがある。
フェロケラターゼはミトコンドリア内においてヘムを産生して、各種タンパク質（例えば、シトクロムｃオキシダーゼなどの電子伝達系のタンパク質、ラジカル処理に働くカタラーゼ）にヘムを供給する。従って、フェロケラターゼ活性化剤は、電子伝達系のタンパク質へのヘム供給を促進し、該タンパク質を活性化すること等によりミトコンドリア機能を向上させ、他方でカタラーゼへのヘム供給を促進し、細胞内レドックス制御能を向上させることができる。ここで、ミトコンドリア機能としては、例えば、基質チャンネル機能、糖脂質代謝、エネルギー産生（例、ＡＴＰ産生）、アポトーシス調節、Ｃａ緩衝機能などが挙げられる。【００４１】
本発明のフェロケラターゼ活性化剤は、その作用が神経組織に及ぶと病態で損なわれた神経機能を改善し、またその作用が肝臓などの末梢組織に及ぶと糖脂質代謝を改善し得る。従って、本発明のフェロケラターゼ活性化剤は、組織のミトコンドリア機能が低下した状態にある疾患の予防・治療に効果的である。ここで、組織としては、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などが挙げられる。また、ミトコンドリア機能が低下した状態とは、上記ミトコンドリア機能が健常対照と比較して約８０％以下、好ましくは約７０％以下、より好ましくは約６０％以下である状態をいう。【００４２】
具体的には、本発明のフェロケラターゼ活性化剤は、組織のミトコンドリア機能が低下した状態にある疾患（例、糖尿病、神経系疾患、ミトコンドリア脳筋症、線維筋痛症、慢性疲労症候群）の予防・治療に用いることができる。ここで、糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病などが含まれる。また、神経系疾患とは、脳、脊髄、自律神経節、中枢部、末梢部、脳神経、脊髄神経、叢などの異常、障害または損傷を意味し、その具体例としては筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、糖尿病性神経障害、神経因性疼痛、多発性硬化症、アルツハイマー型老年性痴呆症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、統合失調症、ダウン症候群などが挙げられる。また、神経系疾患の具体例としては、ガン治療による神経障害なども挙げられる。
また、本発明のフェロケラターゼ活性化剤は、組織のミトコンドリア機能の低下した状態にある臓器の障害（例えば、膵疲弊、脂肪肝炎）の予防・治療にも用いることができる。
さらに、フェロケラターゼはヘモグロビンにヘムを供給することから、本発明のフェロケラターゼ活性化剤は、生体内のヘムの減少に伴う疾患（例えば、貧血）の予防・治療に有用である。【００４３】
本発明のスクリーニング方法により得られ得る物質の具体例としては、例えば
式：【００４４】
【化２】
2008010511.tif 000004
【００４５】
［式中、環Ａは、さらに置換基を有していてもよい、２個以上の窒素原子を含む５員芳香族複素環を；
Ｂは、置換されていてもよい炭化水素基または置換されていてもよい複素環基を；
Ｘは、２価の非環状炭化水素基を；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ２−、−ＣＯＮＲ２−または−ＮＲ２ＣＯ−（Ｒ２は、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す）を；
Ｙは、結合手または２価の非環状炭化水素基を；
Ｒ１は、置換されていてもよい環状基、置換されていてもよいアミノ基または置換されていてもよいアシル基を示す。］で表される化合物またはその塩が挙げられる。【００４６】
式（Ｉ）中、環Ａで示される「さらに置換基を有していてもよい、２個以上の窒素原子を含む５員芳香族複素環」において、「２個以上の窒素原子を含む５員芳香族複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に２個以上の窒素原子を含み、さらに酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１ないし２個含有していてもよい５員の芳香族複素環が挙げられる。
「２個以上の窒素原子を含む５員芳香族複素環」の具体例としては、イミダゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、トリアゾール、テトラゾール環などが挙げられる。なかでも、ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、トリアゾールおよびテトラゾール環が好ましく、特にピラゾール環が好ましい。
該「２個以上の窒素原子を含む５員芳香族複素環」は、置換可能な位置に１ないし２個の置換基をさらに有していてもよい。このような置換基としては、例えば、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭化水素基、置換されていてもよい複素環基、置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいメルカプト基または置換されていてもよいアミノ基などが挙げられる。【００４７】
本明細書中、「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子が挙げられる。
前記「置換されていてもよい炭化水素基」における「炭化水素基」としては、例えば、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、芳香脂肪族炭化水素基、脂環脂肪族炭化水素基などが挙げられる。
脂肪族炭化水素基としては、例えば、直鎖状または分枝状のＣ１−１５脂肪族炭化水素基、具体的には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられる。
アルキル基の好適な例としては、Ｃ１−１０アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが挙げられる。
アルケニル基の好適な例としては、Ｃ２−１０アルケニル基、例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−ヘプテニル、１−オクテニルなどが挙げられる。
アルキニル基の好適な例としては、Ｃ２−１０アルキニル基、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−ヘプチニル、１−オクチニルなどが挙げられる。【００４８】
脂環式炭化水素基としては、例えば、飽和または不飽和のＣ３−１２脂環式炭化水素基、具体的には、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルカジエニル基などが挙げられる。
シクロアルキル基の好適な例としては、Ｃ３−１０シクロアルキル基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、ビシクロ［３．２．２］ノニル、ビシクロ［３．３．１］ノニル、ビシクロ［４．２．１］ノニル、ビシクロ［４．３．１］デシルなどが挙げられる。
シクロアルケニル基の好適な例としては、Ｃ３−１０シクロアルケニル基、例えば、２−シクロペンテン−１−イル、３−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル、３−シクロヘキセン−１−イルなどが挙げられる。
シクロアルカジエニル基の好適な例としては、Ｃ４−１０シクロアルカジエニル基、例えば、２，４−シクロペンタジエン−１−イル、２，４−シクロヘキサジエン−１−イル、２，５−シクロヘキサジエン−１−イルなどが挙げられる。【００４９】
芳香族炭化水素基としては、例えば、Ｃ６−１４アリール基が挙げられる。該アリール基の好適な例としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、アセナフチレニル、ビフェニリル、インデニルなどが挙げられる。なかでもフェニル、ナフチルなどが好ましい。該アリール基は、部分的に飽和されていてもよく、部分的に飽和されたアリール基としては、例えば、ジヒドロインデニルなどが挙げられる。
芳香脂肪族炭化水素基としては、例えば、Ｃ７−１３芳香脂肪族炭化水素基、具体的には、アラルキル基、アリールアルケニル基などが挙げられる。
アラルキル基の好適な例としては、Ｃ７−１３アラルキル基、例えば、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、ナフチルメチル、ベンズヒドリルなどが挙げられる。
アリールアルケニル基の好適な例としては、Ｃ８−１３アリールアルケニル基、例えば、スチリルなどが挙げられる。
脂環脂肪族炭化水素基としては、例えば、Ｃ４−１３脂環脂肪族炭化水素基、具体的にはシクロアルキルアルキル基、シクロアルキルアルケニル基などが挙げられる。
シクロアルキルアルキル基の好適な例としては、Ｃ４−１３シクロアルキルアルキル基、例えば、シクロプロピルメチル、シクロプロピルエチル、シクロペンチルメチル、シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチルなどが挙げられる。
シクロアルキルアルケニル基の好適な例としては、Ｃ５−１３シクロアルキルアルケニル基、例えば、シクロプロピルエテニル、シクロペンチルエテニル、シクロヘキシルエテニルなどが挙げられる。【００５０】
上記「炭化水素基」は、置換可能な位置に１ないし３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、ハロゲン原子、ニトロ、オキソ、Ｃ１−３アルキレンジオキシ、置換されていてもよい芳香族複素環基、置換されていてもよい非芳香族複素環基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいメルカプト基、置換されていてもよいアシル基などが挙げられる。
Ｃ１−３アルキレンジオキシとしては、例えば、メチレンジオキシ、エチレンジオキシなどが挙げられる。
「置換されていてもよい芳香族複素環基」における「芳香族複素環基」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１ないし４個含有する５ないし７員の単環式芳香族複素環基または縮合芳香族複素環基が挙げられる。該縮合芳香族複素環基としては、例えば、これら５ないし７員の単環式芳香族複素環基と、１ないし２個の窒素原子を含む６員環、ベンゼン環、または１個の硫黄原子を含む５員環とが縮合した基等が挙げられる。
「芳香族複素環基」の好適な例としては、フリル（例、２−フリル、３−フリル）、チエニル（例、２−チエニル、３−チエニル）、ピリジル（例、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリミジニル（例、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル）、ピリダジニル（例、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピラジニル（例、２−ピラジニル）、ピロリル（例、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例、１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、５−イミダゾリル）、ピラゾリル（例、１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、オキサゾリル（例、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソオキサゾリル、チアゾリル（例、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、イソチアゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル、１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、チアジアゾリル（例、１，３，４−チアジアゾール−２−イル）、トリアゾリル（例、１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−５−イル、１，２，３−トリアゾール−１−イル、１，２，３−トリアゾール−２−イル、１，２，３−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例、テトラゾール−１−イル、テトラゾール−５−イル）、キノリル（例、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル）、キナゾリル（例、２−キナゾリル、４−キナゾリル）、キノキサリル（例、２−キノキサリル）、ベンゾフリル（例、２−ベンゾフリル、３−ベンゾフリル）、ベンゾチエニル（例、２−ベンゾチエニル、３−ベンゾチエニル）、ベンズオキサゾリル（例、２−ベンズオキサゾリル）、ベンゾチアゾリル（例、２−ベンゾチアゾリル）、ベンズイミダゾリル（例、ベンズイミダゾール−１−イル、ベンズイミダゾール−２−イル）、インドリル（例、インドール−１−イル、インドール−３−イル）、１Ｈ−インダゾリル（例、１Ｈ−インダゾール−３−イル）、１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピラジニル（例、１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン−２−イル）、１Ｈ−ピロロピリジニル（例、１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−６−イル）、１Ｈ−イミダゾピリジニル（例、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−イル、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）、１Ｈ−イミダゾピラジニル（例、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピラジン−２−イル）、トリアジニル、イソキノリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンズトリアゾリルなどが挙げられる。【００５１】
「置換されていてもよい非芳香族複素環基」における「非芳香族複素環基」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１ないし４個含有する５ないし７員の単環式非芳香族複素環基または縮合非芳香族複素環基が挙げられる。該縮合非芳香族複素環基としては、例えば、これら５ないし７員の単環式非芳香族複素環基と、１ないし２個の窒素原子を含む６員環、ベンゼン環、または１個の硫黄原子を含む５員環とが縮合した基等が挙げられる。
「非芳香族複素環基」の好適な例としては、ピロリジニル（例、１−ピロリジニル）、ピペリジニル（例、ピペリジノ）、モルホリニル（例、モルホリノ）、チオモルホリニル（例、チオモルホリノ）、ピペラジニル（例、１−ピペラジニル）、ヘキサメチレンイミニル（例、ヘキサメチレンイミン−１−イル）、オキサゾリジニル（例、オキサゾリジン−３−イル）、チアゾリジニル（例、チアゾリジン−３−イル）、イミダゾリジニル（例、イミダゾリジン−３−イル）、イミダゾリニル（例、イミダゾリン−１−イル、イミダゾリン−２−イル）、オキサゾリニル（例、オキサゾリン−２−イル）、チアゾリニル（例、チアゾリン−２−イル）、オキサジニル（例、オキサジン−２−イル）、テトラヒドロフラニル、アゼパニル、テトラヒドロピリジニル（例、１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−１−イル）、ジヒドロベンゾフラニル、ジオキソラニル、ジチオラニル、ジオキソチアゾリジニル、ジオキソオキサゾリジニルなどが挙げられる。
上記した芳香族複素環基および非芳香族複素環基は、置換可能な位置に１ないし３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、ニトロ、ヒドロキシ、アミノ、オキソ、ハロゲン原子、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、Ｃ６−１４アリール（例、フェニル）等が挙げられる。【００５２】
「置換されていてもよいアミノ基」としては、例えば、それぞれ置換基を有していてもよいＣ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ３−１０シクロアルケニル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１３アラルキル基、Ｃ１−１３アシル基またはヘテロアリール基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基が挙げられる。
ここで、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ３−１０シクロアルケニル基、Ｃ６−１４アリール基およびＣ７−１３アラルキル基としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における「炭化水素基」として例示したものが挙げられる。
前記Ｃ１−１３アシル基としては、後述の「置換されていてもよいアシル基」におけるアシル基として例示するものが挙げられる。該アシル基は、好ましくはホルミル、Ｃ１−１０アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ７−１３アラルキル−カルボニル、５ないし６員芳香族複素環−カルボニル、５ないし６員非芳香族複素環−カルボニル等である。
ここで、Ｃ１−１０アルキル−カルボニルの好適な例としては、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイルなどが挙げられる。
Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルの好適な例としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルなどが挙げられる。
Ｃ６−１４アリール−カルボニルの好適な例としては、ベンゾイルなどが挙げられる。
Ｃ７−１３アラルキル−カルボニルの好適な例としては、ベンジルカルボニル、フェネチルカルボニルなどが挙げられる。
５ないし６員芳香族複素環−カルボニルの好適な例としては、フリルカルボニル、ピロリルカルボニル、チエニルカルボニル、ピリジルカルボニルなどが挙げられる。
５ないし６員非芳香族複素環−カルボニルの好適な例としては、テトラヒドロフリルカルボニルなどが挙げられる。
前記ヘテロアリール基としては、例えば、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における置換基として例示した芳香族複素環基が挙げられる。なかでも、ピリジル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピリミジニルなどが好ましい。
これらＣ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ３−１０シクロアルケニル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１３アラルキル基、Ｃ１−１３アシル基およびヘテロアリール基は、置換可能な位置に１〜６個、好ましくは１〜２個の置換基を有していてもよく、このような置換基としては、例えば、ハロゲン原子、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニル基等が挙げられる。【００５３】
「置換されていてもよいヒドロキシ基」に関して、「置換されたヒドロキシ基」としては、例えば、それぞれ置換されていてもよいアルコキシ基、アルケニルオキシ基、シクロアルキルオキシ基、シクロアルケニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アシルオキシ基、ヘテロアリールオキシ基等が挙げられる。
アルコキシ基の好適な例としては、Ｃ１−１０アルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、ノニルオキシなどが挙げられる。
アルケニルオキシ基の好適な例としては、Ｃ２−１０アルケニルオキシ基、例えば、アリル（ａｌｌｙｌ）オキシ、クロチルオキシ、２−ペンテニルオキシ、３−ヘキセニルオキシなどが挙げられる。
シクロアルキルオキシ基の好適な例としては、Ｃ３−１０シクロアルキルオキシ基、例えば、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシなどが挙げられる。
シクロアルケニルオキシ基の好適な例としては、Ｃ３−１０シクロアルケニルオキシ基、例えば、２−シクロペンテニルオキシ、２−シクロヘキセニルオキシなどが挙げられる。
アリールオキシ基の好適な例としては、Ｃ６−１４アリールオキシ基、例えば、フェノキシ、ナフチルオキシ等が挙げられる。
アラルキルオキシ基の好適な例としては、Ｃ７−１３アラルキルオキシ基、例えば、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、ナフチルメチルオキシ等が挙げられる。
アシルオキシ基の好適な例としては、Ｃ２−１３アシルオキシ基、例えば、Ｃ１−６アルキル−カルボニルオキシ基（例、アセチルオキシ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、イソブチリルオキシ）等が挙げられる。
ヘテロアリールオキシ基の好適な例としては、５ないし７員の単環式ヘテロアリールオキシ基、例えば、２−ピリジルオキシ、３−ピリジルオキシ、２−イミダゾリルオキシ、２−ピリミジニルオキシ、１，２，４−トリアゾール−５−イルオキシ等が挙げられる。【００５４】
上記したアルコキシ基、アルケニルオキシ基、シクロアルキルオキシ基、シクロアルケニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アシルオキシ基およびヘテロアリールオキシ基は、置換可能な位置に１〜３個、好ましくは１ないし２個の置換基を有していてもよく、このような置換基としては、例えば、ハロゲン原子、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニル基等が挙げられる。【００５５】
「置換されていてもよいメルカプト基」に関して、「置換されたメルカプト基」としては、例えば、それぞれ置換されていてもよいアルキルチオ基、アルケニルチオ基、シクロアルキルチオ基、シクロアルケニルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、アシルチオ基、ヘテロアリールチオ基などが挙げられる。
アルキルチオ基の好適な例としては、Ｃ１−１０アルキルチオ基、例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ネオペンチルチオ、ヘキシルチオ、ヘプチルチオ、ノニルチオ等が挙げられる。
アルケニルチオ基の好適な例としては、Ｃ２−１０アルケニルチオ基、例えば、アリル（ａｌｌｙｌ）チオ、クロチルチオ、２−ペンテニルチオ、３−ヘキセニルチオなどが挙げられる。
シクロアルキルチオ基の好適な例としては、Ｃ３−１０シクロアルキルチオ基、例えば、シクロブチルチオ、シクロペンチルチオ、シクロヘキシルチオ等が挙げられる。
シクロアルケニルチオ基の好適な例としては、Ｃ３−１０シクロアルケニルチオ基、例えば、２−シクロペンテニルチオ、２−シクロヘキセニルチオなどが挙げられる。
アリールチオ基の好適な例としては、Ｃ６−１４アリールチオ基、例えば、フェニルチオ、ナフチルチオ等が挙げられる。
アラルキルチオ基の好適な例としては、Ｃ７−１３アラルキルチオ基、例えば、ベンジルチオ、フェネチルチオ、ナフチルメチルチオ等が挙げられる。
アシルチオ基の好適な例としては、Ｃ２−１３アシルチオ基、例えば、Ｃ１−６アルキル−カルボニルチオ基（例、アセチルチオ、プロピオニルチオ、ブチリルチオ、イソブチリルチオ）等が挙げられる。
ヘテロアリールチオ基の好適な例としては、５ないし７員の単環式ヘテロアリールチオ基、例えば、２−ピリジルチオ、３−ピリジルチオ、２−イミダゾリルチオ、２−ピリミジニルチオ、１，２，４−トリアゾール−５−イルチオ等が挙げられる。
上記したアルキルチオ基、アルケニルチオ基、シクロアルキルチオ基、シクロアルケニルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、アシルチオ基およびヘテロアリールチオ基は、置換可能な位置に１ないし２個の置換基を有していてもよく、このような置換基としては、例えば、ハロゲン原子、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、オキソ等が挙げられる。【００５６】
「置換されていてもよいアシル基」におけるアシル基としては、例えば、式：−ＣＯＲ４、−ＣＯ−ＯＲ４、−ＳＯ２Ｒ４、−ＳＯＲ４、−ＰＯ３Ｒ４Ｒ５［即ち、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ４）（ＯＲ５）］、−ＣＯ−ＮＲ４ａＲ５ａ、−ＣＳ−ＮＲ４ａＲ５ａ、  −ＳＯ２−ＮＲ４ａＲ５ａ［式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素原子、炭化水素基または複素環基を示す。また、Ｒ４およびＲ５は、隣接するオキソ置換リン原子および２個の酸素原子とともに複素環を形成していてもよい。Ｒ４ａおよびＲ５ａは、同一または異なって、水素原子、炭化水素基または複素環基を示すか、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、隣接する窒素原子とともに含窒素複素環を形成していてもよい］で表される基などが挙げられる。
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ４ａまたはＲ５ａで示される「炭化水素基」としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における「炭化水素基」として例示したものが挙げられる。
該炭化水素基は、好ましくは、Ｃ１−１０アルキル基；Ｃ２−１０アルキニル基；ベンゼン環と縮合していてもよいＣ３−１０シクロアルキル基；Ｃ３−１０シクロアルカンと縮合していてもよいＣ６−１４アリール基（好ましくはフェニル、ジヒドロインデニル、ビフェニリル）；Ｃ７−１３アラルキル基などである。【００５７】
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ４ａまたはＲ５ａで示される「複素環基」としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における置換基として例示した芳香族複素環基および非芳香族複素環基が挙げられる。
該複素環基は、好ましくは、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、キノリル、イソキノリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニルなどである。【００５８】
Ｒ４およびＲ５が隣接するオキソ置換リン原子および２個の酸素原子とともに形成する複素環としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外にオキソ置換リン原子および２個の酸素原子を含み、さらに酸素原子、窒素原子および硫黄原子から選ばれるヘテロ原子を１ないし２個含有していてもよい４ないし７員の複素環などが挙げられる。このような複素環の具体例としては、２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナン、２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフォラン、２−オキシド−４，７−ジヒドロ−１，３，２−ジオキサホスフェピンなどが挙げられる。
Ｒ４ａおよびＲ５ａが隣接する窒素原子とともに形成する「含窒素複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に少なくとも１個の窒素原子を含み、さらに酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１ないし２個含有していてもよい５ないし７員の含窒素複素環が挙げられる。該含窒素複素環の好適な例としては、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリンなどが挙げられる。【００５９】
該アシル基は、置換可能な位置に１〜３個の置換基を有していてもよく、このような置換基としては、例えば、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ、ハロゲン原子、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルでモノ−またはジ−置換されていてもよいアミノ等が挙げられる。【００６０】
アシル基の好適な例としては、ホルミル、カルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、Ｃ１−１０アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル）、Ｃ２−１０アルケニル−カルボニル（例、クロトノイル）、Ｃ３−１０シクロアルキル−カルボニル（例、シクロブタンカルボニル、シクロペンタンカルボニル、シクロヘキサンカルボニル、シクロヘプタンカルボニル）、Ｃ３−１０シクロアルケニル−カルボニル（例、２−シクロヘキセンカルボニル）、Ｃ６−１４アリール−カルボニル（例、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル）、Ｃ７−１３アラルキル−カルボニル（例、ベンジルカルボニル、フェネチルカルボニル）、芳香族複素環カルボニル（例、ニコチノイル、イソニコチノイル）、非芳香族複素環カルボニル（例、ピロリジニルカルボニル、ピペリジノカルボニル）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル（例、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニル）、Ｃ７−１３アラルキルオキシ−カルボニル（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル）、モノ−またはジ−（ハロゲン原子およびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル）−カルバモイル（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル、プロピルカルバモイル、トリフルオロエチルカルバモイル）、モノ−またはジ−（１ないし３個のハロゲンで置換されていてもよいＣ１−６アルキル）−チオカルバモイル（例、メチルチオカルバモイル、エチルチオカルバモイル）、Ｃ６−１４アリール−カルバモイル（例、フェニルカルバモイル）、Ｃ３−１０シクロアルキル−カルバモイル（例、シクロプロピルカルバモイル）、Ｃ７−１３アラルキル−カルバモイル（例、ベンジルカルバモイル）、Ｃ１−６アルコキシ−カルバモイル（例、メトキシカルバモイル）、Ｃ１−１０アルキルスルフィニル基（例、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル）、Ｃ１−１０アルキルスルホニル基（例、メチルスルホニル、エチルスルホニル）、Ｃ６−１４アリールスルホニル（例、フェニルスルホニル）、環を形成していてもよい（モノ−もしくはジ−Ｃ１−１０アルキル）ホスホノ基（例、ジメチルホスホノ；ジエチルホスホノ；ジイソプロピルホスホノ；ジブチルホスホノ；２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナニル）、モノ−またはジ−（１ないし３個のハロゲンで置換されていてもよいＣ１−６アルキル）−スルファモイル（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル）などが挙げられる。【００６１】
環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい複素環基」における「複素環基」としては、前記Ｒ４で示される「複素環基」として例示したものが挙げられる。
該複素環基は、好ましくはベンゼン環と縮合していてもよいアゾリル基（例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル）などである。【００６２】
上記複素環基は、置換可能な位置に１ないし３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、置換されていてもよい脂肪族炭化水素基、置換されていてもよい脂環式炭化水素基、置換されていてもよい芳香族炭化水素基、置換されていてもよい芳香族複素環基、置換されていてもよい非芳香族複素環基、ハロゲン原子、ニトロ、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいメルカプト基、置換されていてもよいアシル基、Ｃ１−３アルキレンジオキシ、オキソなどが挙げられる。
ここで、「置換されていてもよい脂肪族炭化水素基」、「置換されていてもよい脂環式炭化水素基」および「置換されていてもよい芳香族炭化水素基」における「脂肪族炭化水素基」、「脂環式炭化水素基」および「芳香族炭化水素基」としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における「炭化水素基」として例示したものが挙げられる。
「脂肪族炭化水素基」、「脂環式炭化水素基」および「芳香族炭化水素基」の置換基としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における「置換基」として例示したものが挙げられる。置換位置および置換数は特に限定されない。置換数は好ましくは１〜３である。
また、「置換されていてもよい芳香族複素環基」および「置換されていてもよい非芳香族複素環基」としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における置換基として例示したものが挙げられる。
さらに、「ハロゲン原子」、「置換されていてもよいアミノ基」、「置換されていてもよいヒドロキシ基」、「置換されていてもよいメルカプト基」、「置換されていてもよいアシル基」および「Ｃ１−３アルキレンジオキシ」としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における置換基として例示したものが挙げられる。【００６３】
環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよいヒドロキシ基」、「置換されていてもよいメルカプト基」および「置換されていてもよいアミノ基」としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における置換基として例示したものが挙げられる。【００６４】
環Ａにおける置換基は、好ましくは置換されていてもよい炭化水素基であり、さらに好ましくはＣ１−１０アルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１３アラルキル基などである。環Ａにおける置換基は、特に好ましくはＣ１−６アルキル基（好ましくはメチルなど）である。
環Ａは、好ましくはＣ１−１０アルキル基、Ｃ６−１４アリール基およびＣ７−１３アラルキル基から選ばれる１ないし２個の置換基（好ましくはＣ１−６アルキル基）をそれぞれ有していてもよいイミダゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、トリアゾールまたはテトラゾール環（好ましくはピラゾール環）である。【００６５】
Ｂで示される「置換されていてもよい炭化水素基」および「置換されていてもよい複素環基」としては、それぞれ環Ａにおける置換基として例示したものが用いられる。ここで、「置換されていてもよい炭化水素基」における炭化水素基は、好ましくは脂環式炭化水素基または芳香族炭化水素基である。また、「置換されていてもよい複素環基」における複素環基は、好ましくは芳香族複素環基である。
Ｂは、好ましくは置換されていてもよい芳香族炭化水素基または置換されていてもよい芳香族複素環基である。
Ｂは、さらに好ましくは置換されていてもよいＣ６−１４アリール基、置換されていてもよい５ないし７員の単環式芳香族複素環基などである。Ｂの好適な具体例としては、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシおよびハロゲン原子から選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよいＣ６−１４アリール基（好ましくはフェニル）または５ないし７員の単環式芳香族複素環基（好ましくはフリル、チエニル、ピリジル、ピリミジニル）が挙げられる。
Ｂは、特に好ましくはハロゲン原子（好ましくはフッ素原子）を有していてもよいＣ６−１４アリール基（好ましくはフェニル）である。【００６６】
Ｘで示される「２価の非環状炭化水素基」は、非環状の２価の炭化水素基であれば、直鎖状または分枝状のいずれでもよく、また飽和または不飽和のいずれであってもよい。
「２価の非環状炭化水素基」としては、例えば、「２価の脂肪族炭化水素基」が挙げられ、なかでも以下に例示される２価のＣ１−８脂肪族炭化水素基が好ましい。
（１）Ｃ１−８アルキレン（例、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）７−、−（ＣＨ２）８−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−（ＣＨ（ＣＨ３））２−、−（ＣＨ２）２Ｃ（ＣＨ３）２−、−（ＣＨ２）３Ｃ（ＣＨ３）２−など）；
（２）Ｃ２−８アルケニレン（例、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−など）など。
Ｃ２−８アルケニレンにはそのＥ体およびＺ体のいずれもが包含される。
「２価の非環状炭化水素基」は、好ましくはＣ１−４アルキレン、Ｃ２−４アルケニレン、さらに好ましくは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ＝ＣＨ−などである。Ｘは、特に好ましくは−ＣＨ＝ＣＨ−などである。【００６７】
Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ２−、−ＣＯＮＲ２−または−ＮＲ２ＣＯ−（Ｒ２は水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す。）を示す。
Ｒ２で示される置換されていてもよいアルキル基において、アルキル基としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基が挙げられる。該アルキル基は、１ないし３個の置換基を有していてもよく、このような置換基としては、例えば、ハロゲン原子、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノなどが挙げられる。
Ｒ２は好ましくは水素原子またはＣ１−６アルキル基、さらに好ましくは水素原子である。
Ｚは好ましくは−ＣＯＮＲ２−（Ｒ２は前記と同意義）、さらに好ましくは−ＣＯＮＨ−である（ただし、本発明において、−ＣＯＮＲ２−の炭素原子（Ｃ）がＸと結合し、窒素原子（Ｎ）がＹと結合する。）。【００６８】
Ｙで示される２価の非環状炭化水素基としては、前記Ｘとして例示したものが挙げられる。
Ｙは、好ましくは結合手またはＣ１−４アルキレン、さらに好ましくは結合手、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−などである。Ｙは、特に好ましくは結合手である。【００６９】
Ｒ１で示される「置換されていてもよい環状基」における「環状基」としては、例えば、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、芳香族複素環基、非芳香族複素環基などが挙げられる。
ここで、「脂環式炭化水素基」および「芳香族炭化水素基」としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における「炭化水素基」として例示したものが挙げられる。
「芳香族複素環基」および「非芳香族複素環基」としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における置換基として例示したものが挙げられる。
環状基は、好ましくは部分的に飽和されていてもよいＣ６−１４アリール基（好ましくはフェニル、ジヒドロインデニル）、Ｃ３−１０シクロアルキル基（好ましくはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、Ｃ３−１０シクロアルケニル基（好ましくはシクロヘキセニル）、ベンゼン環と縮合していてもよい５ないし６員芳香族複素環基（好ましくはフリル、チエニル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾチアジアゾリル）、ベンゼン環と縮合していてもよい５ないし６員非芳香族複素環基（好ましくはピロリジニル、テトラヒドロフラニル、チアゾリニル、オキサゾリニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、ジオキソラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、オキソジヒドロベンゾオキサゾリル）などである。環状基は、さらに好ましくはＣ６−１４アリール基であり、なかでもフェニルが好ましい。【００７０】
Ｒ１で示される「環状基」は、置換可能な位置に１ないし４個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、
（1）ニトロ；
（2）オキソ；
（3）ヒドロキシ；
（4）シアノ；
（5）ハロゲン原子；
（6）Ｃ１−６アルキレンジオキシ（例、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ)；
（7）カルボキシル；
（8）ハロゲン原子；ヒドロキシ；シアノ；Ｃ１−６アルコキシ；Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−６アルキル−カルボニルから選ばれる置換基でモノ−またはジ−置換されていてもよいアミノ（例、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、アセチルアミノ、ブチリルアミノ、イソブチリルアミノ、イソバレリルアミノ）；Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）；Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい芳香族縮合複素環基（例、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、インダゾリル）；Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい５ないし６員非芳香族複素環基（例、テトラヒドロフリル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジオキソチアゾリジニル、ジオキソオキサゾリジニル、オキソジヒドロオキサジアゾリル、ジオキソイミダゾリジニル、ジオキソピペラジニル、ジオキシドチオモルホリニル）；Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい非芳香族縮合複素環基（例、オキソジヒドロベンゾオキサゾリル、テトラヒドロベンゾチアゾリル）；カルボキシル基；Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル；環を形成していてもよい（モノ−もしくはジ−Ｃ１−１０アルキル）ホスホノ基（例、ジメチルホスホノ；ジエチルホスホノ；ジイソプロピルホスホノ；ジブチルホスホノ；２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナニル）；アミノで置換されていてもよいカルバモイル；ハロゲン原子、ヒドロキシおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル、プロピルカルバモイル、トリフルオロエチルカルバモイル、メトキシカルボニルエチルカルバモイル、２−ヒドロキシ−１−メトキシカルボニル−エチルカルバモイル、２−ヒドロキシ−１−メトキシカルボニル−プロピルカルバモイル）；ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルおよびＣ１−６アルコキシから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルバモイル（例、フェニルカルバモイル、メトキシフェニルカルバモイル、トリフルオロメチルフェニルカルバモイル）；Ｃ１−６アルキルでモノ−また��ジ−置換されていてもよいアミノ、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル、ヒドロキシおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ７−１３アラルキル−カルバモイル（例、ベンジルカルバモイル、フェネチルカルバモイル、ジメチルアミノベンジルカルバモイル、メトキシカルボニルフェネチルカルバモイル、トリフルオロメチルベンジルカルバモイル）；スルファモイル；ハロゲン化されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルスルファモイル；Ｃ１−６アルキルチオ；Ｃ１−６アルキルスルフィニル；Ｃ１−６アルキルスルホニル；Ｃ１−６アルキル−カルボニル；モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルボキサミド（例、フェニルカルボキサミド）；Ｃ６−１４アリールチオ（例、フェニルチオ）；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環チオ（例、トリアゾリルチオ、テトラゾリルチオ）；Ｃ６−１４アリールスルフィニル（例、フェニルスルフィニル）；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環スルフィニル（例、トリアゾリルスルフィニル、テトラゾリルスルフィニル）；Ｃ６−１４アリールスルホニル（例、フェニルスルホニル）；およびＣ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環スルホニル（例、トリアゾリルスルホニル、テトラゾリルスルホニル）；
から選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；
（9）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ３−１０シクロアルキル基；
（10）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ６−１４アリール（例、フェニル）；
（11）ハロゲン原子およびヒドロキシから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ７−１３アラルキル；
（12）ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、および１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ６−１４アリール（例、フェニル）から選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアジアゾリル、イミダゾリル）；
（13）ハロゲン原子；Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）；Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい芳香族縮合複素環基（例、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、インダゾリル）；Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい５ないし６員非芳香族複素環基（例、テトラヒドロフリル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジオキソチアゾリジニル、ジオキソオキサゾリジニル、オキソジヒドロオキサジアゾリル、ジオキソイミダゾリジニル、ジオキソピペラジニル、ジオキシドチオモルホリニル）；およびＣ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい非芳香族縮合複素環基（例、オキソジヒドロベンゾオキサゾリル、テトラヒドロベンゾチアゾリル）；
から選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；
（14）Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）、ハロゲン原子から選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキルチオ；
（15）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ６−１４アリールオキシ（例、フェノキシ）；
（16）Ｃ１−６アルキルでモノ−またはジ−置換されていてもよいアミノ（例、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、プロピルアミノ、ジブチルアミノ）；
（17）Ｃ１−１０アルキルでモノ−もしくはジ−置換されていてもよいホスホノ−Ｃ１−６アルキルアミノ（例、ホスホノメチルアミノ、ジエチルホスホノメチルアミノ）；
（18）ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし６個、好ましくは１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルボキサミド（例、アセチルアミノ、ヘキサノイルアミノ、トリフルオロアセチルアミノ、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルアミノ、ペンタフルオロプロピオニルアミノ、エトキシカルボニルプロピオニルアミノ）；
（19）環を形成していてもよい（モノ−もしくはジ−Ｃ１−１０アルキル）ホスホノ基（例、ジメチルホスホノ；ジエチルホスホノ；ジイソプロピルホスホノ；ジブチルホスホノ；２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナニル）；
（20）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル；
（21）Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）で置換されていてもよいＣ１−６アルキル−スルフィニル；
（22）Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）で置換されていてもよいＣ１−６アルキル−スルホニル；
（23）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ３−１０シクロアルキル−カルボニル；
（24）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ６−１４アリール−カルボニル（例、ベンゾイル）；
（25）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ７−１３アラルキル−カルボニル；
（26）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ６−１４アリール−Ｃ２−６アルケニル−カルボニル（例、スチリルカルボニル）；
（27）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ−カルボニル；
（28）Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環−カルボニル（例、フロイル、ピロリルカルボニル、ピリジルカルボニル）；
（29）Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員非芳香族複素環−カルボニル（例、テトラヒドロフロイル）；
（30）Ｃ１−６アルキルでモノ−またはジ−置換されていてもよいカルバモイル（例、カルバモイル、ジメチルカルバモイル）；
（31）Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）、Ｃ１−６アルキルから選ばれる１ないし２個の置換基で置換されていてもよいスルファモイル（例、スルファモイル、ジメチルスルファモイル）；
（32）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ７−１３アラルキルオキシ−カルボニルチオ（例、ベンジルオキシカルボニルチオ、フェネチルオキシカルボニルチオ）；
（33）Ｃ１−６アルコキシ−カルボキサミド（例、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボキサミド）；
（34）１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ６−１４アリール−スルホニル（例、フェニルスルホニル）；
などが挙げられる。【００７１】
上記「環状基」における置換基は、好ましくは、
Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい芳香族縮合複素環基（例、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、インダゾリル）；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員非芳香族複素環基（例、テトラヒドロフリル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジオキソチアゾリジニル、ジオキソオキサゾリジニル、オキソジヒドロオキサジアゾリル、ジオキソイミダゾリジニル、ジオキソピペラジニル、ジオキシドチオモルホリニル）；環を形成していてもよい（モノ−もしくはジ−Ｃ１−１０アルキル）ホスホノ基（例、ジメチルホスホノ；ジエチルホスホノ；ジイソプロピルホスホノ；ジブチルホスホノ；２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナニル）；Ｃ１−６アルキルスルフィニル；およびＣ１−６アルキルスルホニル；
から選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基である。【００７２】
Ｒ１で示される「置換されていてもよいアミノ基」および「置換されていてもよいアシル基」としては、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における置換基として例示したものが用いられる。【００７３】
Ｒ１は好ましくは置換されていてもよい環状基であり、さらに好ましくは、
Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい芳香族縮合複素環基（例、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、インダゾリル）；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員非芳香族複素環基（例、テトラヒドロフリル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジオキソチアゾリジニル、ジオキソオキサゾリジニル、オキソジヒドロオキサジアゾリル、ジオキソイミダゾリジニル、ジオキソピペラジニル、ジオキシドチオモルホリニル）；環を形成していてもよい（モノ−もしくはジ−Ｃ１−１０アルキル）ホスホノ基（例、ジメチルホスホノ；ジエチルホスホノ；ジイソプロピルホスホノ；ジブチルホスホノ；２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナニル）；Ｃ１−６アルキルスルフィニル；およびＣ１−６アルキルスルホニル；
から選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１４アリール基（好ましくはフェニル）である。【００７４】
Ｒ１で示される、置換されていてもよい環状基としては、式：【００７５】
【化３】
2008010511.tif 000005
【００７６】
［式中、Ｄは、さらに置換基を有していてもよい環を；Ｙ１は、結合手または２価の非環状炭化水素基を；Ｒ３は、置換されていてもよいアシル基または置換されていてもよい複素環基を示す。］で表される基が好ましい。【００７７】
Ｙ１で示される２価の非環状炭化水素基としては、前記Ｘとして例示したものが挙げられる。
Ｙ１は好ましくは、結合手またはＣ１−４アルキレン、さらに好ましくは結合手、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−などである。
Ｄで示される「さらに置換基を有していてもよい環」における環としては、例えば、前記Ｒ１で示される「環状基」に対応する環が挙げられる。
Ｄで示される環は、好ましくは部分的に飽和されていてもよいＣ６−１４芳香族炭化水素環（好ましくはベンゼン、ジヒドロインデン）、Ｃ３−１０シクロアルカン（好ましくはシクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン）、Ｃ３−１０シクロアルケン（好ましくはシクロヘキセン）、ベンゼン環と縮合していてもよい５ないし６員芳香族複素環（好ましくはフラン、チオフェン、オキサゾール、チアゾール、イソオキサゾール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、インドール、キノリン、イソキノリン、ベンゾチアジアゾール）、ベンゼン環と縮合していてもよい５ないし６員非芳香族複素環（好ましくはピロリジン、テトラヒドロフラン、チアゾリン、オキサゾリン、チアゾリジン、オキサゾリジン、ジオキソラン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ジヒドロベンゾフラン、オキソジヒドロベンゾオキサゾール）などである。上記した環は、さらに好ましくはＣ６−１４芳香族炭化水素であり、なかでもベンゼンが好ましい。
上記した環は、置換可能な位置に１ないし３個の置換基を有していてもよく、このような置換基としては、例えば、ハロゲン原子、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基などが挙げられる。【００７８】
Ｒ３で示される「置換されていてもよいアシル基」としては、例えば、環Ａにおける置換基として例示した「置換されていてもよい炭化水素基」における置換基として例示したものが挙げられ、Ｒ３で示される「置換されていてもよい複素環基」としては、例えば、環Ａにおける置換基として例示したものが挙げられる。
Ｒ３で示される「置換されていてもよいアシル基」の好適な例としては、カルボキシル基；Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル；環を形成していてもよい（モノ−もしくはジ−Ｃ１−１０アルキル）ホスホノ基（例、ジメチルホスホノ；ジエチルホスホノ；ジイソプロピルホスホノ；ジブチルホスホノ；２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナニル）；アミノで置換されていてもよいカルバモイル；ハロゲン原子、ヒドロキシおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル、プロピルカルバモイル、トリフルオロエチルカルバモイル、メトキシカルボニルエチルカルバモイル、２−ヒドロキシ−１−メトキシカルボニル−エチルカルバモイル、２−ヒドロキシ−１−メトキシカルボニル−プロピルカルバモイル）；ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルおよびＣ１−６アルコキシから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルバモイル（例、フェニルカルバモイル、メトキシフェニルカルバモイル、トリフルオロメチルフェニルカルバモイル）；Ｃ１−６アルキルでモノ−またはジ−置換されていてもよいアミノ、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル、ヒドロキシおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ７−１３アラルキル−カルバモイル（例、ベンジルカルバモイル、フェネチルカルバモイル、ジメチルアミノベンジルカルバモイル、メトキシカルボニルフェネチルカルバモイル、トリフルオロメチルベンジルカルバモイル）；スルファモイル；ハロゲン化されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルスルファモイル；Ｃ１−６アルキルスルフィニル；Ｃ１−６アルキルスルホニル；Ｃ１−６アルキル−カルボニル；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環スルフィニル（例、トリアゾリルスルフィニル、テトラゾリルスルフィニル）；Ｃ６−１４アリールスルホニル（例、フェニルスルホニル）；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環スルホニル（例、トリアゾリルスルホニル、テトラゾリルスルホニル）；などが挙げられる。
Ｒ３で示される「置換されていてもよいアシル基」としては、式：−ＳＯ２Ｒ４、−ＳＯＲ４または−ＰＯ３Ｒ４Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素原子、炭化水素基または複素環基を示す。また、Ｒ４およびＲ５は、隣接するオキソ置換リン原子および２個の酸素原子とともに複素環を形成していてもよい。）で表される基が好ましい。
Ｒ３で示される「置換されていてもよいアシル基」は、特に好ましくはＣ１−６アルキルスルホニル；および環を形成していてもよい（モノ−もしくはジ−Ｃ１−１０アルキル）ホスホノ基（例、ジメチルホスホノ；ジエチルホスホノ；ジイソプロピルホスホノ；ジブチルホスホノ；２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナニル）である。【００７９】
Ｒ３で示される「置換されていてもよい複素環基」の好適な例としては、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基でそれぞれ置換されていてもよい、５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）；芳香族縮合複素環基（例、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、インダゾリル）；５ないし６員非芳香族複素環基（例、テトラヒドロフリル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジオキソチアゾリジニル、ジオキソオキサゾリジニル、オキソジヒドロオキサジアゾリル、ジオキソイミダゾリジニル、ジオキソピペラジニル、ジオキシドチオモルホリニル）；非芳香族縮合複素環基（例、オキソジヒドロベンゾオキサゾリル、テトラヒドロベンゾチアゾリル）が挙げられる。
これらのなかでも、Ｃ１−６アルキルでそれぞれ置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）、芳香族縮合複素環基（例、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、インダゾリル）、または５ないし６員非芳香族複素環基（例、テトラヒドロフラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジオキソチアゾリジニル、ジオキソオキサゾリジニル、オキソジヒドロオキサジアゾリル、ジオキソイミダゾリジニル、ジオキソピペラジニル、ジオキシドチオモルホリニル）が好ましい。【００８０】
式（Ｉ）で表される化合物は、好ましくは下式（ＩＩ）：【００８１】
【化４】
2008010511.tif 000006
【００８２】
［式中、環Ａはさらに置換基を有していてもよい、２個以上の窒素原子を含む５員芳香族複素環を；
Ｂは置換されていてもよい炭化水素基または置換されていてもよい複素環基を；
Ｘは２価の非環状炭化水素基を；
Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ２−、−ＣＯＮＲ２−または−ＮＲ２ＣＯ−（Ｒ２は水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す）を；
ＹおよびＹ１は同一または異なって結合手または２価の非環状炭化水素基を；
Ｄはさらに置換基を有していてもよい環を；
Ｒ３は置換されていてもよいアシル基または置換されていてもよい複素環基を示す。］で表される化合物である。【００８３】
式（ＩＩ）で表される化合物の好適な例としては、以下の化合物が挙げられる。
［化合物Ａ］
環Ａが、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ６−１４アリール基およびＣ７−１３アラルキル基から選ばれる１ないし２個の置換基（好ましくはＣ１−６アルキル基）をそれぞれ有していてもよいイミダゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、トリアゾールまたはテトラゾール環（好ましくはピラゾール環）；
Ｂが１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ、ハロゲン原子から選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよいＣ６−１４アリール基（好ましくはフェニル）または５ないし７員の単環式芳香族複素環基（好ましくはフリル、チエニル、ピリジル、ピリミジニル）；より好ましくはハロゲン原子（好ましくはフッ素原子）を有していてもよいＣ６−１４アリール基（好ましくはフェニル）；
Ｘが、Ｃ１−４アルキレンまたはＣ２−４アルケニレン；より好ましくは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ＝ＣＨ−；特に好ましくは−ＣＨ＝ＣＨ−；
Ｚが−ＣＯＮＲ２−（式中、Ｒ２は前記と同意義である。ただし、−ＣＯＮＲ２−の炭素原子（Ｃ）がＸと結合し、窒素原子（Ｎ）がＹと結合する。）；より好ましくは−ＣＯＮＨ−；
Ｙが結合手またはＣ１−４アルキレン；より好ましくは結合手、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−；特に好ましくは結合手；
Ｙ１が結合手またはＣ１−４アルキレン；より好ましくは結合手、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−；
Ｄがハロゲン原子、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基から選ばれる１ないし３個の置換基を有していてもよいＣ６−１４芳香族炭化水素（好ましくは、ベンゼン）；
Ｒ３がカルボキシル基；Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル；環を形成していてもよい（モノ−もしくはジ−Ｃ１−１０アルキル）ホスホノ基（例、ジメチルホスホノ；ジエチルホスホノ；ジイソプロピルホスホノ；ジブチルホスホノ；２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナニル）；アミノで置換されていてもよいカルバモイル；ハロゲン原子、ヒドロキシおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル；ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルおよびＣ１−６アルコキシから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルバモイル；Ｃ１−６アルキルでモノ−またはジ−置換されていてもよいアミノ、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル、ヒドロキシおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ７−１３アラルキル−カルバモイル；スルファモイル；ハロゲン化されていてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルスルファモイル；Ｃ１−６アルキルスルフィニル；Ｃ１−６アルキルスルホニル；Ｃ１−６アルキル−カルボニル；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環スルフィニル（例、トリアゾリルスルフィニル、テトラゾリルスルフィニル）；Ｃ６−１４アリールスルホニル（例、フェニルスルホニル）；Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環スルホニル（例、トリアゾリルスルホニル、テトラゾリルスルホニル）；
より好ましくはＣ１−６アルキルスルホニル；環を形成していてもよい（モノ−もしくはジ−Ｃ１−１０アルキル）ホスホノ基（例、ジメチルホスホノ；ジエチルホスホノ；ジイソプロピルホスホノ；ジブチルホスホノ；２−オキシド−１，３，２−ジオキサホスフィナニル）；である化合物。【００８４】
［化合物Ｂ］
環Ａが、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ６−１４アリール基およびＣ７−１３アラルキル基から選ばれる１ないし２個の置換基（好ましくはＣ１−６アルキル基）をそれぞれ有していてもよいイミダゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、トリアゾールまたはテトラゾール環（好ましくはピラゾール環）；
Ｂが１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ、ハロゲン原子から選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよいＣ６−１４アリール基（好ましくはフェニル）または５ないし７員の単環式芳香族複素環基（好ましくはフリル、チエニル、ピリジル、ピリミジニル）；より好ましくはハロゲン原子（好ましくはフッ素原子）を有していてもよいＣ６−１４アリール基（好ましくはフェニル）；
Ｘが、Ｃ１−４アルキレンまたはＣ２−４アルケニレン；より好ましくは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ＝ＣＨ−；特に好ましくは−ＣＨ＝ＣＨ−；
Ｚが−ＣＯＮＲ２−（式中、Ｒ２は前記と同意義である。ただし、−ＣＯＮＲ２−の炭素原子（Ｃ）がＸと結合し、窒素原子（Ｎ）がＹと結合する。）；より好ましくは−ＣＯＮＨ−；
Ｙが結合手またはＣ１−４アルキレン；より好ましくは結合手、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−；特に好ましくは結合手；
Ｙ１が結合手またはＣ１−４アルキレン；より好ましくは結合手、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−；
Ｄがハロゲン原子、１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および１〜３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基から選ばれる１ないし３個の置換基を有していてもよいＣ６−１４芳香族炭化水素（好ましくは、ベンゼン）；
Ｒ３がＣ１−６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、カルボキシル、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる１ないし３個の置換基でそれぞれ置換されていてもよい、５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）；芳香族縮合複素環基（例、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、インダゾリル）；５ないし６員非芳香族複素環基（例、テトラヒドロフリル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジオキソチアゾリジニル、ジオキソオキサゾリジニル、オキソジヒドロオキサジアゾリル、ジオキソイミダゾリジニル、ジオキソピペラジニル、ジオキシドチオモルホリニル）；非芳香族縮合複素環基（例、オキソジヒドロベンゾオキサゾリル、テトラヒドロベンゾチアゾリル）；より好ましくはＣ１−６アルキルでそれぞれ置換されていてもよい５ないし６員芳香族複素環基（例、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル）、芳香族縮合複素環基（例、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、インダゾリル）、または５ないし６員非芳香族複素環基（例、テトラヒドロフラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジオキソチアゾリジニル、ジオキソオキサゾリジニル、オキソジヒドロオキサジアゾリル、ジオキソイミダゾリジニル、ジオキソピペラジニル、ジオキシドチオモルホリニル）；である化合物。【００８５】
［化合物Ｃ］
［４−({(２Ｅ)−３−[５−(４−フルオロフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル]プロパ−２−エノイル}アミノ)ベンジル］ホスホン酸ジエチル  ［以下、「化合物(a)」と略記することがある］；
(２Ｅ)−Ｎ−{４−[(２，４−ジオキソ−１，３−チアゾリジン−５−イル)メチル]フェニル}−３−[５−(４−フルオロフェニル)−１−メチル−１H−ピラゾール−４−イル]アクリルアミド  ［以下、「化合物(b)」と略記することがある］；
(２Ｅ)−３−[５−(４−フルオロフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル]−Ｎ−[４−(１Ｈ−イミダゾール−１−イルメチル)フェニル]アクリルアミド  ［以下、「化合物(c)」と略記することがある］；
(２Ｅ)−３−[５−(４−フルオロフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル]−Ｎ−[４−（１Ｈ−ピラゾール−１−イルメチル）フェニル]アクリルアミド  ［以下、「化合物(d)」と略記することがある］；
［４−（{（２Ｅ）−３−[１−メチル−５−（２−チエニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル]プロパ−２−エノイル}アミノ）ベンジル］ホスホン酸ジエチル  ［以下、「化合物(e)」と略記することがある］；
（２Ｅ）−３−［５−（４−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−Ｎ−｛４−［（３−メチル−２,４−ジオキソ−１,３−チアゾリジン−５−イル）メチル］フェニル｝アクリルアミド  ［以下、「化合物(f)」と略記することがある］；
（２Ｅ）−Ｎ−[４−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イルメチル）フェニル]−３−[５−（４−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル]アクリルアミド  ［以下、「化合物(g)」と略記することがある］；
（２Ｅ）−３−[５−（４−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル]−Ｎ−{４−[（メチルスルホニル）メチル]フェニル}アクリルアミド  ［以下、「化合物(h)」と略記することがある］；
(２Ｅ)−３−[５−(４−フルオロフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル]−Ｎ−{４−[ヒドロキシ(２−ピリジニル)メチル]フェニル}アクリルアミド  ［以下、「化合物(i)」と略記することがある］；
（２Ｅ）−３−[５−（４−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル]−Ｎ−[４−（４−モルホリニルメチル）フェニル]アクリルアミド  ［以下、「化合物(j)」と略記することがある］；
（２Ｅ）−Ｎ−{４−[（エチルスルホニル）メチル]フェニル}−３−[５−（４−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル]アクリルアミド  ［以下、「化合物(k)」と略記することがある］；および
（２Ｅ）−３−［５−（４−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−Ｎ−｛４−［２−（１,３,４−オキサジアゾール−２−イル）エチル］フェニル｝アクリルアミド  ［以下、「化合物(l)」と略記することがある］。【００８６】
式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、薬理学的に許容される塩が好ましく、このような塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。
有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられる。
酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。【００８７】
式（Ｉ）で表される化合物またはその塩［本明細書中、化合物（Ｉ）と略記することがある］は、自体公知の方法により製造することができる。このような方法としては、例えば、WO2004/039365に記載された方法あるいはこれに準ずる方法などが挙げられる。【００８８】
化合物（Ｉ）は、プロドラッグとして用いてもよい。ここで、化合物（Ｉ）のプロドラッグとは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により化合物（Ｉ）に変換する化合物、すなわち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして化合物（Ｉ）に変化する化合物、胃酸等により加水分解などを起こして化合物（Ｉ）に変化する化合物をいう。化合物（Ｉ）のプロドラッグとしては、化合物（Ｉ）のアミノ基がアシル化、アルキル化、りん酸化された化合物（例、化合物（Ｉ）のアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、tert−ブチル化された化合物）；化合物（Ｉ）の水酸基がアシル化、アルキル化、りん酸化、ほう酸化された化合物（例、化合物（Ｉ）の水酸基がアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、サクシニル化、フマリル化、アラニル化、ジメチルアミノメチルカルボニル化された化合物）；化合物（Ｉ）のカルボキシル基がエステル化、アミド化された化合物（例、化合物（Ｉ）のカルボキシル基がエチルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化、メチルアミド化された化合物）；等が挙げられる。これらの化合物は自体公知の方法によって化合物（Ｉ）から製造することができる。
また、化合物（Ｉ）のプロドラッグは、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような、生理的条件で化合物（Ｉ）に変化するものであってもよい。
また、化合物（Ｉ）は、同位元素（例、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉなど）などで標識されていてもよい。
さらに、化合物（Ｉ）は、無水物であっても、水和物であってもよい。【００８９】
本発明のフェロケラターゼ活性化剤は、通常、「本発明のスクリーニング方法により得られる物質」または「化合物（Ｉ）」と薬理学的に許容し得る担体とを、自体公知の方法（例、日本薬局方に記載の方法）に従って製剤化して得られる医薬組成物として用いられる。【００９０】
薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、その具体例としては、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。製剤化の際には、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いてもよい。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ、ポリエチレングリコール６０００などが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、軽質無水ケイ酸、炭酸カルシウムなどが挙げられる。【００９１】
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、キシリトール、果糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、プロピレングリコール、塩酸リドカイン、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
着色剤の好適な例としては、水溶性着色タール色素（例、食用赤色２号および３号、食用黄色４号および５号、食用青色１号および２号などの食用色素）、不溶性レーキ色素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミウム塩）、天然色素（例、β−カロチン、クロロフィル、ベンガラ）などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。【００９２】
前記医薬組成物の剤形としては、例えば、錠剤（舌下錠、口腔内崩壊錠を含む）、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの経口剤；および注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、点滴剤）、外用剤（例、経皮製剤、軟膏剤など）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤）、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤が挙げられる。これらの製剤は、速放性製剤または徐放性製剤などの放出制御製剤（例、徐放性マイクロカプセル）であってもよい。
上記医薬組成物中の「本発明のスクリーニング方法により得られる物質」または「化合物（Ｉ）」の含量は、例えば、０．１〜１００重量％である。【００９３】
以下に、経口剤および非経口剤の製造法について具体的に説明する。経口剤は、活性成分に、例えば、賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプン、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸）、崩壊剤（例、炭酸カルシウム、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸）、結合剤（例、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、メチルセルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、コロイドシリカ、ポリエチレングリコール６０００）などを添加して圧縮成形することにより製造される。【００９４】
さらに、味のマスキング、腸溶化あるいは徐放化を目的として、自体公知の方法により、経口剤にコーティングを行ってもよい。コーティング剤としては、例えば、腸溶性ポリマー（例、酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマーＬ、メタアクリル酸コポリマーＬＤ、メタアクリル酸コポリマーＳ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース）、胃溶性ポリマー（例、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＥ）、水溶性ポリマー（例、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、水不溶性ポリマー（例、エチルセルロース、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＲＳ、アクリル酸エチル・メタアクリル酸メチル共重合体）、ワックスなどが用いられる。コーティングを行う場合、上記コーティング剤とともに、ポリエチレングリコール等の可塑剤；酸化チタン、三二酸化鉄等の遮光剤を用いてもよい。【００９５】
注射剤は、活性成分を分散剤（例、ツイーン(Tween)８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ブドウ糖、果糖）などと共に、水性溶剤（例、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液）あるいは油性溶剤（例、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油；プロピレングリコール、マクロゴール、トリカプリリン）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により、溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム）、懸濁化剤（例、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子）、緩衝化剤（例、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例、プロピレングリコール、塩酸リドカイン、ベンジルアルコール）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸）等の添加物を用いてもよい。【００９６】
外用剤は、活性成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造される。例えば、上記固状の組成物は、活性成分をそのまま、あるいは賦形剤（例、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、白糖）、増粘剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体）などを添加、混合して粉状とすることにより製造される。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造される。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれもｐＨ調節剤（例、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸）などを含んでいてもよい。坐剤は、活性成分を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造される。該組成物の製造の際に用いられる油性基剤としては、例えば、高級脂肪酸のグリセリド〔例、カカオ脂、ウイテプゾル類〕、中級脂肪酸トリグリセライド〔例、ミグリオール類〕、植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油）などが挙げられる。水性基剤としては、例えば、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールなどが挙げられる。また、水性ゲル基剤としては、例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体などが挙げられる。【００９７】
本発明のフェロケラターゼ活性化剤の投与量は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状などによって適宜選択することができる。本発明のフェロケラターゼ活性化剤を成人患者に経口投与する場合の投与量は、活性成分である「本発明のスクリーニング方法により得られる物質」または「化合物（Ｉ）」の１回量として、通常約０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。この量を１日１回〜３回投与するのが望ましい。
例えば、本発明のフェロケラターゼ活性化剤を組織のミトコンドリア機能が低下している糖尿病もしくは神経系疾患、ミトコンドリア脳筋症、線維筋痛症、慢性疲労症候群、膵疲弊、脂肪肝炎または貧血の成人患者に経口投与する場合の投与量は、活性成分である「本発明のスクリーニング方法により得られる物質」または「化合物（Ｉ）」の１回量として、通常約０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．２〜４ｍｇ／ｋｇ体重である。この量を１日１回〜３回投与するのが望ましい。
【実施例】
【００９８】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００９９】
実施例１：ストレプトゾトシン投与糖尿病ラットにおけるフェロケラターゼ活性およびシトクロムｃオキシダーゼ活性の評価
（１）雄性SDラット（日本クレア）にストレプトゾトシン（Sigma  S-0130）溶液を尾静注することにより糖尿病を誘発させた。以下の実験では、ストレプトゾトシン投与の１ヶ月または２ヶ月後のラットを使用した。また、ストレプトゾトシン投与を行わずに同様の実験を行い、これを対照群とした。
（２）ラットを、ペントバルビタール麻酔下で開胸し、心臓より生理食塩水を還流することにより放血させた。ついで、ラットの脊髄L4-5領域を採取して、組織抽出液を調製し、フェロケラターゼ活性、シトクロムｃオキシダーゼ活性および蛋白質濃度を検討した。
（３）フェロケラターゼ活性の測定は、RONG GUOらの方法（Journal of Chromatography、566巻、2号、383-396頁、1991年）を参考として行った。脊髄ライセートを、0.001% Tween 80、及び50又は100nmol/L酢酸亜鉛を含むトリス塩酸緩衝液（pH7.6）に希釈し180μL/ウェルの容量を蛍光測定用96ウェルプレート（フルオロBプレート  大日本製薬）に添加した。ついで、ウェルプレートに、0.5又は1μmol/LのプロトポルフィリンIX（ICN社カタログ番号：ICN102757）を、20μL/ウェルの容量で添加することにより反応を開始した。反応開始直後あるいは経時的に励起波長405nm、蛍光波長590nmを測定することにより亜鉛-プロトポルフィリンIXの産生を測定した。反応開始時より20分間の反応により得られる蛍光の変化を、添加した組織抽出液の蛋白質量で補正し、組織あたりのフェロケラターゼ活性として算出した。
（４）シトクロムｃオキシダーゼ活性の測定は、Cytochrome c Oxidase Assay Kit（Sigma  CYTO-OX1）を用いて、キットのマニュアルに従って実施した。測定値を、反応液に添加した組織抽出液の蛋白質量で補正し、組織あたりのシトクロムｃオキシダーゼ活性として算出した。
表１にストレプトゾトシン投与１ヶ月後のラット由来脊髄組織抽出液のフェロケラターゼ活性およびシトクロムｃオキシダーゼ活性を示す。表中の数値はｎ＝５の平均値±標準偏差を示す（ｎはラット数を示す）。
表２にストレプトゾトシン投与２ヶ月後のラット由来脊髄組織抽出液のフェロケラターゼ活性およびシトクロムｃオキシダーゼ活性を示す。表中の数値はｎ＝８の平均値±標準偏差を示す（ｎはラット数を示す）。【０１００】
【表１】
2008010511.tif 000007
【０１０１】
【表２】
2008010511.tif 000008
【０１０２】
表１から明らかなように、ストレプトゾトシン投与１ヵ月後の糖尿病ラット由来の脊髄は、有意なフェロケラターゼ活性の低下を示したが、シトクロムｃオキシダーゼ活性は低下傾向を示すに留まった。
また、表２から明らかなように、ストレプトゾトシン投与２ヶ月後の糖尿病ラット由来の脊髄は、有意なフェロケラターゼ活性およびシトクロムｃオキシダーゼ活性の低下を示した。
以上の結果より、ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットでは、糖尿病誘発により低下するシトクロムｃオキシダーゼ活性に先行してフェロケラターゼ活性が低下することが示された。このことは、フェロケラターゼ活性の低下が、ストレプトゾトシン投与糖尿病ラットにおける糖尿病合併症の発症に関与する可能性を示す。【０１０３】
実施例２：Wistar Fattyラットにおけるフェロケラターゼ活性、シトクロムｃオキシダーゼ活性およびミトコンドリアＡＴＰ産生活性の評価
（１）Wistar Fatty ラットあるいはLeanラット（武田ラビックス）７ヶ月齢を使用し、肝粗ミトコンドリア画分を調製した。
（２）肝粗ミトコンドリア画分の調製は、Rolf Wibomらの方法（American Journal of Physiology、259巻、E204-209頁、1990年）を基に実施した。ラットを断頭放血後、肝臓約100mgを切り取り、２ｍLの緩衝液A（100mmol/L  塩化カリウム、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液pH7.5、5mmol/L 塩化マグネシウム、1.8mmol/Lアデノシン-5’-3リン酸  2ナトリウム、1mmol/L EDTA）中で肝総ホモジネートを調製した。肝総ホモジネート0.2mLを分取し、600g×3分間遠心分離した上清を1.5mL採取し、更に、15000g×3分間の遠心分離で得られた沈殿を緩衝液B（180mmol/L  シュークロース、35mmol/Lリン酸カリウム緩衝液pH7.5、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L EDTA）0.5mLで懸濁の後、再度、15000g×3分間の遠心分離で得られた沈殿を緩衝液B  0.5mLで懸濁し、粗ミトコンドリア画分とした。この粗ミトコンドリア画分を用いて、フェロケラターゼ活性、シトクロムｃオキシダーゼ活性、アトラクチロシド感受性ミトコンドリアATP産生活性および蛋白質濃度を検討した。
（３）フェロケラターゼ活性の測定は、RONG  GUOらの方法（上記）を参考にして行った。上記した粗ミトコンドリア画分を、0.01% Tween80、100μmol/L酢酸亜鉛を含むTris-HCl緩衝液pH7.6に希釈し、180μL/ウェルの容量を、蛍光測定用96ウェルプレートに添加した。ついで、ウェルプレートに、1μmol/LのプロトポルフィリンIXを、20μL/ウェルの容量で添加することにより反応を開始した。反応開始直後あるいは経時的に、励起波長405nm、蛍光波長590nmを測定することにより亜鉛-プロトポルフィリンIXの産生を測定した。反応開始時より20分間の反応により得られる蛍光の変化を、添加した粗ミトコンドリア画分の蛋白質量で補正し、ミトコンドリアあたりのフェロケラターゼ活性として算出した。
（４）シトクロムｃオキシダーゼ活性の測定は、Cytochrome c Oxidase Assay Kitを用いてキットのマニュアルにしたがって実施した。測定値を、反応液に添加した粗ミトコンドリア画分の蛋白質量で補正し、ミトコンドリアあたりのシトクロムｃオキシダーゼ活性として算出した。
（５）ミトコンドリアATP産生活性の測定は、Rolf Wibomらの方法（上記）を基に実施した。上記した粗ミトコンドリア画分を緩衝液Bで100倍希釈して、その10μLを採取し、50μmol/Lのアトラクチロシドを含むあるいは含まない、80μLの緩衝液C（緩衝液B、0.001mmol/L ピロりん酸ナトリウム、0.1%ウシ血清アルブミン、1mmol/Lピルビン酸ナトリウム、0.005mmol/Lパルミトイル-L-カルニチン、10mmol/Lアルファ-ケトグルタル酸、1mmol/Lマレイン酸）を添加した。更に0.3mmol/LのADPを含む緩衝液C 10μLを添加することにより、ATP産生反応を開始した。20分間反応後に、反応液にATP測定試薬（CellTiter−GloTM Luminescent Cell Viability Assay、Promega社  G7571）を100μL添加することにより反応を停止し、ATP産生量を測定した。アトラクチロシド添加により低下したATP産生量を、アトラクチロシド感受性ミトコンドリアATP産生活性とし、別途測定を行った肝総ホモジネートで蛋白質量で補正し、組織あたりのアトラクチロシド感受性ミトコンドリアATP産生として算出した。【０１０４】
表３にWistar Fatty ラットあるいはLeanラット由来肝臓の粗ミトコンドリア画分のフェロケラターゼ活性、シトクロムｃオキシダーゼ活性およびアトラクチロシド感受性ミトコンドリアATP産生活性を示す。表中の数字はｎ＝５〜６の平均値±標準偏差を示す（ｎはラット数を示す）。【０１０５】
【表３】
2008010511.tif 000009
【０１０６】
表３から明らかなように、Wistar Fatty ラット由来の肝臓の粗ミトコンドリア画分は、有意なフェロケラターゼ活性およびアトラクチロシド感受性ミトコンドリアATP産生活性低下を示した。また、シトクロムｃオキシダーゼ活性についても低下傾向を示した。以上の結果は、Wistar Fattyラットにおいて、ミトコンドリア機能の低下があり、このミトコンドリア機能の低下にはフェロケラターゼ活性の低下が関与し、Wistar Fattyラットにおける糖尿病発症に繋がっている可能性を示す。【０１０７】
実施例３：フェロケラターゼ（FeCh）活性の評価
（Ａ．ヒト由来フェロケラターゼの調製）
（Ａ１．ヒト Ferrochelatase (FeCh) の Mature 領域をコードする発現ベクターの構築）
ヒト FeCh 遺伝子（Invitrogen 社）を鋳型として、下記プライマー 1（配列番号：３）及びプライマー 2（配列番号：４）を用いて PCR を行なった。PCR には Pyrobest DNA polymerase（宝酒造）を用い、（1）95℃ 1 分、次いで、（2）96℃ 15 秒、60℃ 30 秒、72℃ 90 秒を 30 回、次いで、（3）72℃ 7 分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物を pCR-Blunt II-TOPO（Invitrogen 社）に挿入してクローニングした。得られた Plasmid をBgl II 及びXho I で切断して挿入断片を回収し、これを pET43.1a（Novagen 社）の Bam HI/Xho I 部位に挿入して、ヒト FeCh の Mature 領域（55-423 番目のアミノ酸残基）の N 末端に Nus-Tag 及び His-Tag の付いた蛋白質をコードする発現ベクター pET43.1a-hFeCh を得た。
プライマー 1（配列番号：３）
5'- AATTTAGATCTggtgcaaaacctcaagttcaaccg -3'
プライマー 2（配列番号：４）
5'- AATAACTCGAGTCACAGCTGCTGGCTGGTGAAGAA -3'【０１０８】
（Ａ２．Nus-His-ｈFeCh(55-423) 蛋白質の大腸菌での発現）
上記Ａ１で構築した発現ベクター pET43.1a-hFeCh を大腸菌 BL21(DE3) Competent Cell（Stratagene 社）に導入して発現株を得た。これを 50μg/ml Ampicilin を含む LB 培地 200 ml 中、30℃ で一晩前培養を行なった後、50μg/ml Ampicilin 及び 15 g/L の Casamino acid を含む M9 培地 3 L に植菌した。植菌後の培地をジャー培養装置 DEX-2562（Able 社）を用いて 37℃ で 400 rpm、通気状態でクレット 500 KU まで培養し、さらに IPTG （Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を終濃度 1 mM となるように添加後、25℃ で 3 時間誘導培養を行なった。培養物を 6000 rpm、15 分間遠心分離して菌体を集め、-80℃ で保存した。【０１０９】
（Ａ３．ヒト FeCh の精製）
上記Ａ２で得た菌体を Protease Cocktail （Complete, EDTA-free；ロシュ社）を含むBlue カラム Buffer （10 mM Tris-HCl(pH8.1), 0.5 M NaCl, 10% Glycerol, 1% Triton X-100, 5 mM 2-Mercaptoethanol（2-ME）） 250 ml に懸濁した。懸濁液を3 分間（30 秒：ON、30 秒：OFF） 超音波破砕（Insonator 201M； クボタ社）した後、12000 rpm で20 分間遠心分離し、上清に (NH4)2SO4 を 40% 飽和となるように溶解した。得られた溶液を12000 rpm で 20 分間遠心分離後、沈澱を 50 ml の Blue カラム Buffer に溶解し、1 L の Blue カラムBuffer に対して一晩透析した。Blue Toyopearl による精製は AKTAprime （Pharmacia Bioscience 社）を用いて行なった。Toyopearl AF-Blue（Tosoh 社） 30 ml をカラムに充填し、 150 ml の Blue カラム Buffer で平衡化した後、透析後のサンプルをアプライした。150 ml の Blue カラムBuffer で洗浄後、10 mM Tris-HCl(pH8.1), 1.5 M NaCl, 10% Glycerol, 1% Sodium Cholate, 5 mM 2-ME で吸着物を溶出した。溶出画分を集めて限外濾過（VivaSpin-20； Vivascience 社）で 9 ml まで濃縮し、Biotinylated Thrombin （Novagen 社）を用いて室温で一晩反応して Nus-His-Tag を切断した。該Tagを切断後、Streptavidin-Agarose （Novagen 社）を加えて 30 分攪拌し、空カラムに通して Biotinylated Thrombin を除去した。次に HiTrap Chelating HP（5 ml；Amersham 社）を用いて切断された Tag を除去した。5 ml の0.1 M NiSO4を用いてNi を結合させた後、50 ml の Binding Buffer（10 mM Tris-HCl (pH7.4), 0.5 M NaCl, 10% Glycerol, 1% Triton X-100, 10 mM Imidazole, 5 mM 2-Mercaptoethanol）で平衡化し、サンプルをアプライして、さらに Binding Buffer で洗浄した。Through 画分と洗浄画分を集めて限外濾過（VivaSpin-20； Vivascience 社）で 10 ml まで濃縮し、NAP-25 （Amersham 社）を用いて最終 Buffer （10 mM Tris-HCl(pH8.1), 150 mM NaCl, 10% Glycerol, 1% Triton X-100, 5 mM 2-ME）に交換した。蛋白質定量（CBB 法；Pierce 社）の結果、総蛋白質量約 8 mg のヒトFeCh が得られた。ヒト FeCh 精製蛋白質（総蛋白質量1.15μg）を等量の SDS-Sample Buffer（2-ME を含む； 第一化学社）で希釈後、95℃ で 3 分加熱して SDS-PAGE（10-20%； DRC 社）を行ない、Coomassie 染色を行なった。SDS-PAGE の結果から、純度は約 70% 程度と見積もられた。【０１１０】
（Ｂ．フェロケラターゼ活性の測定）
フェロケラターゼ活性の測定は、RONG GUOらの方法（上記）を参考として行った。上記Ａにより調製したヒトリコンビナントフェロケラターゼを、0.01% Tween 80、100nmol/L酢酸亜鉛を含むトリス塩酸緩衝液（pH7.6）で500倍希釈し、160μL/ウェルの容量を蛍光測定用96ウェルプレート（フルオロBプレート; 大日本製薬）に添加した。化合物(a)および化合物(l)を各々、上記の緩衝液で30μmol/Lに調製し、20μL/ウェルの容量を各ウェルに添加した。ウェルプレートに、1μmol/LのプロトポルフィリンIXを、20μL/ウェルの容量で添加することにより反応を開始した。反応開始直後と、その後経時的に、励起波長405nm、蛍光波長590nmを測定することにより亜鉛-プロトポルフィリンIXの産生を測定した。また、化合物(a)および化合物(l)を用いずに上記と同様の実験を行い、これを対照群とした。結果を表４に示す。表中の数値はｎ＝８の平均値±標準偏差を示す（ｎは測定回数を示す）。【０１１１】
【表４】
2008010511.tif 000010
【０１１２】
表４から明らかなように、化合物(a)および化合物（l）は、FeCh活性化能を有することが示された。【０１１３】
実施例４：高グルコース負荷HepG2細胞におけるシトクロムｃオキシダーゼ活性の評価
（１）ヒト肝ガン細胞由来細胞株HepG2を、10%仔牛胎児血清 添加 低グルコース（1g/L）イーグル改変ダルベッコ培地で継代した。ついで、同培地を用いて３×10５/mLに調製した細胞を９６ウェルプレートに播種し1晩の前培養後、前記培地を5μg/mL トランスフェリン添加 高グルコース(4.5g/L)イーグル改変ダルベッコ培地に置換すると共に、化合物(a)または化合物(l)を添加し3日間培養を継続した。また、化合物(a)および化合物(l)を用いずに同様の実験を行い、これを対照群とした。
（２）ついで、培地を捨て、ウェルプレートに120μL/wellの細胞破砕バッファー(20mmol/L トリス塩酸緩衝液 pH7.6, 0.25mol/L シュークロース, 0.5mg/mL n-dodecyl-β-D-maltoside)を添加後、超音波破砕し、細胞破砕液を調製した。
（３）DNA含量はPicoGreen dsDNA Quantitation Kit(Molecular Probes P-7589)を用いて測定し、細胞数の指標とした。シトクロムｃオキシダーゼ活性はCytochrome c oxidase Assay kit(Sigma CYTOC-OX1)を96wellプレートの様式に改変して実施した。アッセイバッファー(20mmol/L トリス塩酸緩衝液 pH7.6, 120mmol/L 塩化カリウム) 185μLに前記した細胞破砕液40μLを加え、ボルテックスにより平衡化の後、還元型シトクロムｃ 0.4mMを25μL添加することにより反応を開始した。反応開始直後よりデルタソフトのカイネティックモードで550nmの吸光度を15秒に1回6分間測定することにより経時的な吸光度変化の測定を行った。シトクロムｃオキシダーゼ活性は1-6分の5分間の吸光度変化速度として算出した。各ウェルのシトクロムｃオキシダーゼ活性は細胞破砕液中のDNA含量で補正を行った。【０１１４】
表５および表６に化合物処理を行った高グルコース負荷HepG2細胞におけるシトクロムｃオキシダーゼ活性を示す。表中の数値はｎ＝４の平均値±標準偏差を示す（ｎは化合物を処理したウェル数を示す）。【０１１５】
【表５】
2008010511.tif 000011
【０１１６】
【表６】
2008010511.tif 000012
【０１１７】
表５および表６から明らかなように、化合物(a)および化合物(l)は、HepG2細胞におけるCytochrome c oxidase活性を上昇させた。以上の結果はフェロケラターゼ活性化能を有する化合物がCytochrome c oxidaseを活性化することを示す。【０１１８】
実施例５：Wistar Fatty ratにおける抗糖尿病作用の評価
雄性Wistar Fatty rat（26-27週齢；武田ラビックス、ロット0402）と同ロットのlean ratを使用した。Wistar Fatty ratは非絶食下で午前中に採血を行いグリコヘモグロビン％値（GHB%）と血漿成分の測定を行った。GHB%は東ソー自動グリコヘモグロビン分析計  HLC-723GHbV Alc2.2を用いて測定した。血漿成分はベックマンシンクロンシステムCX５デルタを用いて測定した。GHB%値が7.5%以上であり、更にPG値が高いラットを２群に分けた。１群には0.5%メチルセルロース水溶液に化合物(l)を懸濁して得られた懸濁液（化合物(l)の投与量：10mg/kg体重）を1日1回２０日間反復経口投与した。残りの１群には0.5%メチルセルロース水溶液を同様に経口投与し、これを対照群とした。投与終了日に再度採血しGHB%を測定した。結果を表７に示す。表中の数値はｎ＝５〜６の平均値±標準偏差を示す（ｎはラット数を示す）。【０１１９】
【表７】
2008010511.tif 000013
【０１２０】
表７から明らかなように、化合物(l)は明確なグリコヘモグロビン％値の低下作用を示し、FeCh活性化作用を有する化合物が優れた抗糖尿病作用を有することが確認された。【０１２１】
実施例６：ZDF ラットにおける抗糖尿病作用の評価
雄ZDF ラット（5週齡、Charles River Japan）を、餌、水ともに自由摂取下で飼育した。餌はStandard laboratory diet （MF; Oriental Yeast Co, Tokyo, Japan）および混餌飼料（0.03％の化合物(a)を含む前記Standard laboratory diet）を用いた。1週間の順化飼育の後、体重、糖化ヘモグロビンを測定し、8週齡時にそれらの測定値が均一になるようにZDF ラットを2群（8匹／群）に分けた。対照群には前記Standard laboratory dietを、化合物(a)投与群には前記混餌飼料を8週齢から19週齡まで投与した。
16週齡時に24時間の摂餌量を測定した。なお、ラットは4匹/ケージで飼育しており、ケージごとに設置してある餌缶の総減少量を4で割り、ラット当りの一日の摂餌量とした。また、化合物(a)の投与量は、摂餌量と混餌飼料中に含まれる化合物(a)の含有率より算出した。
また、16週齡時にラット尾静脈よりヘパリンを抗凝固剤として尾静脈採血を行った。血液サンプルは氷上で保管し、遠心後の血漿は測定時まで-20℃で保存した。血糖値は生化学自動分析装置（Beckman Coulter, シンクロンCX5Δ）を用いて測定した。
その結果、ZDFラットの16週齡時の血糖値（平均値±標準偏差）は、対照群では652.8±23.10 mg/dLであり、化合物(a)投与群（投与量：20.9 mg/kg体重）では271.7±36.5mg/dL（P <0.001）であった。化合物(a)投与群は、対照群よりも有意に低い血糖値を示した。
以上の結果から、FeCh活性化作用を有する化合物が優れた抗糖尿病作用を有することが確認された。【０１２２】
実施例７：ヘモグロビン増加作用の評価
（１）雌性Crj:CD(SD)IGS ラット（5週齢）を1週間の馴化飼育の後、２群（10匹/群）に分けた。
（２）１群には0.5%メチルセルロース水溶液に化合物(a)を懸濁して得られる懸濁液10ml/kg体重/day（化合物(a) の投与量：600mg/kg体重/day）を1日1回経口投与した。残りの１群には0.5%メチルセルロース水溶液10ml/kg体重/dayを同様に経口投与し、これを対照群とした。
（３）自由摂食下での4週間の投与後、20時間絶食を行った後、全血を腹部大動脈より採血管（SP-U0501EM, 積水化学）に採取し、ラット血液中の赤血球数、ヘマトクリット、ヘモグロビン濃度、及びMCH（平均赤血球ヘモグロビン）を測定した。結果を表８に示す。表中の数値は平均値±標準偏差を示す。【０１２３】
【表８】
2008010511.tif 000014
【０１２４】
表８から明らかなように、化合物(a)投与群ではヘマトクリット、ヘモグロビン濃度及びMCHが有意に増加した。なお、赤血球数に有意な増加は認められなかった。以上の結果は化合物(a)が造血組織におけるフェロケラターゼを活性化し、ヘム合成を賦活化した可能性を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明のスクリーニング方法を用いれば、ミトコンドリアの異常に起因する糖尿病や神経系疾患を予防・治療する薬剤を開発することができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、フェロケラターゼ活性化剤として、糖尿病や神経系疾患のみならず、その他の、組織のミトコンドリア機能の低下に伴う疾患（例えば、ミトコンドリア脳筋症、線維筋痛症、慢性疲労症候群）、ならびに組織のミトコンドリア機能の低下した状態にある臓器の障害（例えば、膵疲弊、脂肪肝炎）の予防・治療剤としても用いることができる。さらに、本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、フェロケラターゼ活性化剤として、ヘムの減少に伴う疾患（例えば、貧血）の予防・治療剤として用いることができる。
本出願は、日本で出願された特願2006-197483（出願日：2006年7月19日）を基礎としており、そこに開示される内容は、本明細書にすべて包含される。また、本明細書に記載される刊行物（特許文献を含む）は、その内容全てが本明細書中に参考として援用される。
【配列表】
2008010511000001.app
【国際調査報告】
2008010511.tif 000017
2008010511.tif 000018
2008010511.tif 000019
2008010511.tif 000020
2008010511.tif 000021
2008010511.tif 000022
2008010511.tif 000023
2008010511.tif 000024
2008010511.tif 000025