【手続補正書】
【提出日】令和1年11月12日(2019.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験ヌクレオチドが、プライマー結合鋳型核酸のプライマーのすぐ下流の鋳型鎖にある次の塩基と相補的な塩基を含む次の正しいヌクレオチドであるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記プライマー結合鋳型核酸を、機能欠損ＤＮＡポリメラーゼ及び前記試験ヌクレオチドを含む第１の反応混合物と接触させ、
それによって、前記試験ヌクレオチドが次の正しいヌクレオチドである場合は、前記プライマー結合鋳型核酸、前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼ、及び前記試験ヌクレオチドを含む複合体が形成され、かつ
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼが実質的にマグネシウム触媒ホスホジエステル結合を形成できない工程であって、
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼが、モチーフＡ中に配列番号１２を含むポリペプチド配列、またはモチーフＣ中に配列番号１４を含むポリペプチド配列のいずれかを含む工程；
（ｂ）前記プライマー結合鋳型核酸の前記プライマーへの前記試験ヌクレオチドの化学的取り込みを伴わずに、前記試験ヌクレオチドの存在下で、前記プライマー結合鋳型核酸と前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼとの結合を測定する工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の結果から、前記試験ヌクレオチドが次の正しいヌクレオチドであるかどうかを決定する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼが、２価マンガンイオンの存在下でホスホジエステル結合の形成を触媒し、前記第１の反応混合物が、ホスホジエステル結合の形成を促進する濃度の２価マンガンイオンを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験ヌクレオチドが外部標識を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験ヌクレオチドの外部標識が蛍光部分を有し、工程（ｂ）が、前記試験ヌクレオチドの前記蛍光部分が生成する蛍光シグナルを測定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼが外部標識を有し、工程（ｂ）が前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼの前記外部標識を検出することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼの前記外部標識が蛍光部分を有し、工程（ｂ）が、前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼの前記蛍光部分が生成する蛍光シグナルを測定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーが遊離３’ヒドロキシル部分を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）の後に、前記第１の反応混合物を、第２のポリメラーゼ及び第２の種類のヌクレオチドを含む第２の反応混合物に置き換え、次いで前記第２の種類のヌクレオチドを前記プライマー結合鋳型核酸の前記プライマーに取り込む工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の種類のヌクレオチドが、可逆的ターミネーター部分を含む可逆的ターミネーターヌクレオチドであり、前記可逆的ターミネーターヌクレオチドの取り込みにより、ブロックされたプライマー結合鋳型核酸分子が生成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ブロックされたプライマー結合鋳型核酸分子から前記可逆的ターミネーター部分を除去して、前記プライマー結合鋳型核酸分子を再生する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマー結合鋳型核酸の代わりに前記ブロックされたプライマー結合鋳型核酸分子を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列が、３８１アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号１であるか、または５５８アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列が、３６４アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号２であるか、または５５１アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列が、３５５アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号３であるか、または５３２アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号３である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の反応混合物が２価のマグネシウムイオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の反応混合物がＭｇ２＋イオンを含み、前記プライマーが３’ヒドロキシル部分を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
プライマー結合鋳型核酸分子に取り込まれるべき次の正しいヌクレオチドを同定するためのキットであって、前記キットは、
（ａ）前記プライマー結合鋳型核酸及び前記次の正しいヌクレオチドとの三元複合体を形成するが、実質的にマグネシウム触媒ホスホジエステル結合を形成できない機能欠損ＤＮＡポリメラーゼであって、前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼが、モチーフＡ中に配列番号１２を含むポリペプチド配列、またはモチーフＣ中に配列番号１４を含むポリペプチド配列のいずれかを含む機能欠損ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｂ）４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子；及び
（ｃ）４種類の可逆的ターミネーターヌクレオチドの１つ以上の容器をパッケージにした組み合わせを含む、キット。
【請求項１９】
前記４種の可逆的ターミネーターヌクレオチドが、４種の非蛍光性可逆的ターミネーターヌクレオチドである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼが検出可能な標識を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子のうち少なくとも１つが検出可能な標識を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼが、マンガンイオンの存在下でホスホジエステル結合形成を触媒する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
前記４種類の可逆的ターミネーターヌクレオチドから可逆的ターミネーター部分を除去する化学試薬をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２４】
前記４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子のそれぞれが、マグネシウム依存性ポリメラーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼによって取り込み可能である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２５】
前記プライマー結合鋳型核酸分子に前記次の正しいヌクレオチドを取り込む第２のＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２６】
前記第２のＤＮＡポリメラーゼが、前記４種類の可逆的ターミネーターヌクレオチドの１つを前記次の正しいヌクレオチドとして取り込む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
フローセルをさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２８】
前記４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰまたはｄＵＴＰのいずれかを含み、前記４種類の可逆的ターミネーターヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰまたはｄＵＴＰのいずれかの類似体を含み、各類似体は３’−ＯＮＨ２可逆的ターミネーター部分を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２９】
配列番号１２を含む前記ポリペプチド配列が、３５５アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号３を含む、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
配列番号１４を含む前記ポリペプチド配列が、５３２アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号３を含む、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
ポリペプチド配列を含む変異型ＤＮＡポリメラーゼであって、前記ポリペプチド配列がモチーフＡ中に配列番号１２を含み、
前記変異型ＤＮＡポリメラーゼが、プライマー結合鋳型核酸分子及び同種ヌクレオチドとの三元複合体を形成し、
前記変異型ＤＮＡポリメラーゼが、実質的にマグネシウム触媒ホスホジエステル結合を形成できない、変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３２】
前記機能欠損ＤＮＡポリメラーゼが、２価マンガンイオンの存在下でホスホジエステル結合形成を触媒する、請求項３１に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３３】
前記変異型ＤＮＡポリメラーゼの前記ポリペプチド配列が、
３８１アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号１、
３６４アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号２、及び
３５５アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号３からなる群から選択される、請求項３１に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３４】
それに結合したレポーター部分をさらに含む、請求項３３に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３５】
ポリペプチド配列を含む変異型ＤＮＡポリメラーゼであって、前記ポリペプチド配列がモチーフＣ中に配列番号１４を含み、
前記変異型ＤＮＡポリメラーゼが、プライマー結合鋳型核酸分子及び同種ヌクレオチドとの三元複合体を形成し、
前記変異型ＤＮＡポリメラーゼが、実質的にマグネシウム触媒ホスホジエステル結合を形成できない、変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３６】
前記変異型ＤＮＡポリメラーゼの前記ポリペプチド配列が、
５５８アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号１、
５４１アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号２、及び
５３２アミノ酸位がグルタミン酸で置換されている以外は配列番号３からなる群から選択される、請求項３５に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３７】
それに結合したレポーター部分をさらに含む、請求項３６に記載の単離された変異型ＤＮＡポリメラーゼ。