【手続補正書】
【提出日】令和1年9月13日(2019.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞に遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＤＮＡ切断剤とＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むＧＲＯＮとに曝露させることを含む、方法。
【請求項２】
前記ＧＲＯＮが修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはタンパク質を含むＤＮＡ切断剤を含む、植物細胞。
【請求項４】
修飾ＧＲＯＮをさらに含む、請求項３に記載の植物細胞。
【請求項５】
前記ＤＮＡ切断剤が、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシン、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、および亜鉛フィンガー、メガヌクレアーゼから選択される１つまたは複数のものである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＲＯＮが一本鎖であり、任意選択で化学保護オリゴヌクレオチドであってもよい、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＲＯＮが、５’末端で保護された化学保護オリゴヌクレオチドを含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端で保護された化学保護オリゴヌクレオチドを含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端および３’末端で保護された化学保護オリゴヌクレオチドを含む、または
前記ＧＲＯＮが、Ｃｙ３基、３ＰＳ基および２’−Ｏ−メチル基から選択される１つまたは複数のものを含む、または
前記ＧＲＯＮがＣｙ３基を有する、または
前記ＧＲＯＮが、２つ以上のＣｙ３基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目（最後）の塩基にＣｙ３基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目（最後）の塩基にｉｄＣ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基にＣｙ３基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基にｉｄＣ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが２つ以上の３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目（最後）の塩基に３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の２番目（最後から２番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の３番目（最後から３番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基に３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の２番目（最後から２番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の３番目（最後から３番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端および３’末端の両方の１番目（最後）の塩基に３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端および３’末端の両方の最初の２つ（最後および最後から２番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端および３’末端の両方の最初の３つ（最後、最後から２番目および最後から３番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、または
前記ＧＲＯＮが２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが２つ以上の２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目（最後）の塩基に２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目の塩基に２’−Ｏ−メチル基を有するが、他には２’−Ｏ−メチル基を有さない、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の２つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の３つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の４つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の５つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の６つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の７つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の８つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の９つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の１０以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、５’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＲＮＡ塩基を含む、
請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＲＯＮが、前記遺伝子変化の標的配列に対してゆらぎ塩基対を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＲＯＮが１５〜６０ヌクレオチド長である、または
前記ＧＲＯＮが４１ヌクレオチド長である、または
前記ＧＲＯＮが５０〜１１０ヌクレオチド長である、または
前記ＧＲＯＮが１０１ヌクレオチド長である、または
前記ＧＲＯＮが１５０〜２１０ヌクレオチド長である、または
前記ＧＲＯＮが２０１ヌクレオチド長である、または
前記ＧＲＯＮが７０〜２１０ヌクレオチド長である、または
前記ＧＲＯＮが７０ヌクレオチドより長い、または
前記ＧＲＯＮが１６５ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが１７５ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが１８５ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが１９５ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２００ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２１０ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２２０ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２３０ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２４０ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２５０ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２６０ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２７０ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２８０ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが２９０ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが３００ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが４００ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが５００ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが６００ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが７００ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが８００ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが９００ヌクレオチド長より長い、または
前記ＧＲＯＮが１０００ヌクレオチド長より長い、
請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記植物が、カノーラ、ヒマワリ、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、タバコ、サトウダイコン、ワタ、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、ソルガム、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ類、サトウキビ、エンドウマメ、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、ルタバガ、メキャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、フィールドビーンズ、ポプラ、マツ、ユーカリ、ブドウ、カンキツ類、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、エンバク、芝草および飼料草、アマ、アブラナ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサムモミ、コショウ、ナス、マリーゴールド、ハス、キャベツ、デイジー、カーネーション、チューリップ、アヤメ、キャッサバならびにユリからなる群より選択され、好ましくはカノーラ、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、イネ、ソルガム、ジャガイモ、ダイズ、アマ、アブラナ、キャッサバまたはヒマワリである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
複数の遺伝子変化が生じる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
２種以上のガイドＲＮＡが使用され、任意選択で前記２種以上のガイドＲＮＡがそれぞれ、異なる遺伝子変化の標的に対して相補的であってもよい、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＲＩＳＰＲがニッカーゼを含み、
任意選択で前記ＤＮＡ切断剤が２つ以上のニッカーゼを含んでもよく、任意選択で、２つ以上のニッカーゼが標的核酸配列の反対側の鎖を切断してもよい、および／または２つ以上のニッカーゼが前記標的核酸配列の同じ鎖を切断してもよい、
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基に２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基に２’−Ｏ−メチル基を含み、他には２’−Ｏ−メチル基を有さない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の２つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の３つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の４つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の５つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の６つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の７つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の８つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の９つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の１０以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＲＯＮが、３’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＲＮＡ塩基を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基に２’−Ｏ−メチル基を含まない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の２つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の３つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の４つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の５つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の６つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の７つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の８つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の９つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、または
前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の１０以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＲＯＮが、３’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＲＮＡ塩基を含まない、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法により作製される、非トランスジェニック除草剤抵抗性または耐性植物。
【請求項１９】
前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）に遺伝子変化または変異を有し、オオムギ、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、キビ、エンバク、ライムギ、イネ、ソルガム、サトウキビ、芝草およびコムギからなる群より選択され、
任意選択で、前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）に遺伝子変化または変異を有し、且つ１つまたは複数の除草剤に対して抵抗性または耐性であってもよい、あるいは前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）に遺伝子変化または変異を有し、１つまたは複数のＡＣＣアーゼ阻害除草剤に対して抵抗性であってもよい、あるいは前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）に遺伝子変化または変異を有し、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップＰ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップＰ、ハロキシホップ、ハロキシホップＰ、イソキサピリホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップＰ、トリホップ、ピノキサデン、上記のいずれかの除草剤の農学的に許容される塩およびエステルならびにそれらの組合せからなる群より選択される１つまたは複数の除草剤に対して抵抗性であってもよい、
請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】
前記植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、前記植物細胞が、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、コムギ、イネ、オオムギ、ソルガム、エンバク、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、アブラナ、カノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、レンズマメ、ブドウおよび芝草からなる群より選択され、
任意選択で、前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、且つ植物または植物細胞が、少なくとも１つの除草剤に対して抵抗性であってもよい、あるいは前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、且つ植物または植物細胞が、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対して抵抗性であってもよい、あるいは前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、且つ植物または植物細胞が、グリホサートに対して抵抗性であってもよい、あるいは前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、且つ植物または植物細胞が、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、コムギ、イネ、オオムギ、ソルガム、エンバク、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、アブラナ、カノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、レンズマメ、ブドウおよび芝草からなる群より選択されてもよい、
請求項１８に記載の植物。
【請求項２１】
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルに起こる、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の２つのアレルに起こる、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の３つのアレルに起こる、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の４つのアレルに起こる、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアレルに起こる、
請求項１８〜２０のいずれかに記載の植物。
【請求項２２】
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の２つのアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の３つのアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の４つのアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、
請求項１８〜２０のいずれかに記載の植物。
【請求項２３】
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルに起こり、前記遺伝子の第二のアレルが、前記第二のアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルに起こり、前記遺伝子の第二のアレルおよび第三のアレルが、前記遺伝子の第二のアレルおよび第三のアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルに起こり、前記遺伝子の第二のアレル、第三のアレルおよび第四のアレルが、前記遺伝子の第二のアレル、第三のアレルおよび第四のアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、
請求項１８〜２０のいずれかに記載の植物。
【請求項２４】
前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、別のアレルの少なくとも１つのノックアウトとを含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、少なくとも１つの他のアレルの少なくとも１つのノックアウトとを含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、少なくとも２つの他のアレルの少なくとも１つのノックアウトとを含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、少なくとも３つの他のアレルの少なくとも１つのノックアウトとを含む、または
前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、他のすべてのアレルのノックアウトとを含む、
請求項１８〜２０のいずれかに記載の植物。