【手続補正書】
【提出日】平成31年4月1日(2019.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中のタンパク質構造を決定するための方法であって、
（ａ）第１のセットの実験条件下で表面にタンパク質分子を繋ぎ止めるステップであって、前記タンパク質分子は、１つまたは複数の既知の位置において１種または複数の非線形活性標識で標識される、ステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記繋ぎ止められたタンパク質分子を少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射するステップであって、前記励起光は、少なくとも１つの光源によって提供される、ステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記照射の結果として前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップと；
（ｄ）少なくとも第２のセットの実験条件下で表面に前記タンパク質分子を繋ぎ止めるステップと；
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記繋ぎ止められたタンパク質分子を少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射するステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）の前記照射の結果として前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される光の少なくとも第２の物理的性質を検出するステップと；
（ｇ）ステップ（ｆ）で検出された前記光の前記少なくとも第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）で検出された前記光の前記第１の物理的性質と比較して、前記繋ぎ止められたタンパク質分子中の前記１種または複数の非線形活性標識の相対的配向を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記１種または複数の非線形活性標識の前記相対的配向のデータを、前記タンパク質分子の構造モデルに包括的にフィッティングするステップをさらに含み、前記構造モデルは、前記タンパク質分子内の前記１種または複数の非線形活性標識の既知の位置に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも２種の異なる非線形活性標識−タンパク質コンジュゲートについてステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップをさらに含み、前記非線形活性標識は、前記タンパク質分子上の少なくとも２つの異なる部位に付着されている、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも２種の異なる非線形活性標識−タンパク質コンジュゲートがそれぞれ、単一部位システインを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記非線形活性標識が、非線形活性非天然アミノ酸である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
光の前記少なくとも第２の物理的性質が、光の前記第１の物理的性質と異なる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記非線形活性非天然アミノ酸が、アラダン、またはナフタレンの誘導体である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質のＸ線結晶学的データを前記タンパク質分子の前記構造モデルに組み込むステップをさらに含む、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のセットの実験条件が、Ｎ末端に付着したＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、Ｃ末端に付着したＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のセットの実験条件が、２×Ｈｉｓ、４×Ｈｉｓ、６×Ｈｉｓ、８×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、１２×Ｈｉｓ、および１４×Ｈｉｓからなる群より選択される第１のＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、前記第１のＨｉｓ−タグと長さが異なる少なくとも第２のＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のセットの実験条件と前記少なくとも第２のセットの実験条件との間の差異が、前記繋ぎ止められたタンパク質分子を、前記タンパク質分子に結合し、前記タンパク質分子においてコンホメーション変化を誘導することが分かっている少なくとも第１のリガンドと接触させることを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種または複数の既知の位置に位置した前記１種または複数の非線形活性標識が同じである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）および（ｅ）の前記検出するステップが、検出器に到達する前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される前記光の偏光を調整することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記１種または複数の非線形活性標識が、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）、ＰｙＭＰＯスクシンイミジルエステルおよびＰｙＭＰＯマレイミドからなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の新規特徴が、添付の特許請求の範囲における独自性とともに示されている。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られることになる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
溶液中のタンパク質構造を決定するための方法であって、
（ａ）第１のセットの実験条件下で表面にタンパク質分子を繋ぎ止めるステップであって、前記タンパク質分子は、１つまたは複数の既知の位置において１種または複数の非線形活性標識で標識される、ステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記繋ぎ止められたタンパク質分子を少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射するステップであって、前記励起光は、少なくとも１つの光源によって提供される、ステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記照射の結果として前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップと；
（ｄ）少なくとも第２のセットの実験条件下で表面に前記タンパク質分子を繋ぎ止めるステップと；
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記繋ぎ止められたタンパク質分子を少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射するステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）の前記照射の結果として前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される光の少なくとも第２の物理的性質を検出するステップと；
（ｇ）ステップ（ｆ）で検出された前記光の前記少なくとも第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）で検出された前記光の前記第１の物理的性質と比較して、前記繋ぎ止められたタンパク質分子中の前記１種または複数の非線形活性標識の相対的配向を決定するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記１種または複数の非線形活性標識の前記相対的配向のデータを、前記タンパク質分子の構造モデルに包括的にフィッティングするステップをさらに含み、前記構造モデルは、前記タンパク質分子内の前記１種または複数の非線形活性標識の既知の位置に基づく、項目１に記載の方法。
（項目３）
少なくとも２種の異なる非線形活性標識−タンパク質コンジュゲートについてステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップをさらに含み、前記非線形活性標識は、前記タンパク質分子上の少なくとも２つの異なる部位に付着されている、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記少なくとも２種の異なる非線形活性標識−タンパク質コンジュゲートがそれぞれ、単一部位システインを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記非線形活性標識が、非線形活性非天然アミノ酸である、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
光の前記少なくとも第２の物理的性質が、光の前記第１の物理的性質と異なる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
光の前記第１の物理的性質および前記少なくとも第２の物理的性質が、同じ偏光を有するが、異なる規模または強度のものである、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
光の前記第１の物理的性質および前記少なくとも第２の物理的性質が、異なる偏光を有する、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記非線形活性非天然アミノ酸が、アラダン、またはナフタレンの誘導体である、項目５から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記タンパク質のＸ線結晶学的データを前記タンパク質分子の前記構造モデルに組み込むステップをさらに含む、項目２から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記タンパク質分子が、２つまたはそれ超の既知の位置で標識される、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記タンパク質分子が、３つまたはそれ超の既知の位置で標識される、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｄ）から（ｆ）が、少なくとも第３のセットの実験条件について繰り返される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ｄ）から（ｆ）が、少なくとも第４のセットの実験条件について繰り返される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記第１のセットの実験条件が、第１の電場強度の第１の電場を前記繋ぎ止められたタンパク質分子に印加することを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、少なくとも第２の電場強度の少なくとも第２の電場を前記繋ぎ止められたタンパク質分子に印加することを含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の電場および前記少なくとも第２の電場が、直流（ＤＣ）場である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第１の電場および前記少なくとも第２の電場が、交流（ＡＣ）場である、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の電場が、直流（ＤＣ）場であり、前記少なくとも第２の電場が、交流（ＡＣ）場である、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の電場が、交流（ＡＣ）場であり、前記少なくとも第２の電場が、直流（ＤＣ）場である、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の電場および前記少なくとも第２の電場が、前記表面上に製作された電極のアレイを使用して印加される、項目１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記電極のアレイが、図９に例示した環状アレイである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記第１のセットの実験条件が、Ｎ末端に付着したＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、Ｃ末端に付着したＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記第１のセットの実験条件が、２×Ｈｉｓ、４×Ｈｉｓ、６×Ｈｉｓ、８×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、１２×Ｈｉｓ、および１４×Ｈｉｓからなる群より選択される第１のＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、前記第１のＨｉｓ−タグと長さが異なる少なくとも第２のＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のセットの実験条件が、第１のアッセイ緩衝液を使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、前記第１のアッセイ緩衝液と異なる少なくとも第２のアッセイ緩衝液を使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記第１のアッセイ緩衝液と前記少なくとも第２のアッセイ緩衝液との間の差異が、イオン強度、ｐＨ、界面活性剤濃度、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）濃度、ポリエチレングリコール濃度、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記第１のセットの実験条件と前記少なくとも第２のセットの実験条件との間の差異が、前記繋ぎ止められたタンパク質分子を、前記タンパク質分子に結合し、前記タンパク質分子においてコンホメーション変化を誘導することが分かっている少なくとも第１のリガンドと接触させることを含む、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記１種または複数の既知の位置に位置した前記１種または複数の非線形活性標識が同じである、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記１種または複数の既知の位置に位置した前記１種または複数の非線形活性標識が異なる、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記１種または複数の非線形活性標識が、第２高調波（ＳＨ）活性標識である、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記１種または複数の非線形活性標識が、和周波（ＳＦ）活性標識である、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記１種または複数の非線形活性標識が、差周波（ＤＦ）活性標識である、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記照射するステップが、少なくとも１つの基本周波数の励起光の偏光を調整することを含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
ステップ（ｃ）および（ｅ）の前記検出するステップが、検出器に到達する前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される前記光の偏光を調整することを含む、項目１から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
光の前記第１の物理的性質および前記少なくとも第２の物理的性質が、強度または偏光である、項目１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
繋ぎ止められたタンパク質に付着した非線形活性標識の絶対配向を決定するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射する結果として非線形活性表面によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、検出は、前記励起光の２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと；
（ｂ）非標識表面上に配向様式で繋ぎ止められた非線形活性標識タンパク質によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、前記光は、前記少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射する結果として生成され、検出は、前記励起光の２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと；
（ｃ）非線形活性標識表面上に配向様式で繋ぎ止められた非線形活性標識タンパク質によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、前記光は、前記少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射する結果として生成され、検出は、前記励起光の前記２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと；
（ｄ）ステップ（ａ）における前記光の前記物理的性質、ステップ（ｂ）で検出された前記光の前記物理的性質、およびステップ（ｃ）で検出された前記光の前記物理的性質を比較することによって、前記繋ぎ止められたタンパク質に付着した前記非線形活性標識の絶対配向を決定するステップと
を含む、方法。
（項目３６）
前記励起光が、それが前記表面から全反射される方式で、前記表面に向けられる、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記励起光の第１の偏光状態が、その入射面に対してｐ偏光を含み、前記励起光の第２の偏光状態が、その入射面に対してｓ偏光を含む、項目３５から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
２つを超える異なる偏光状態の励起光を使用して、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）で生成された前記光の物理的性質を検出するステップをさらに含む、項目３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記非線形活性標識表面が、カルボキシル化非線形活性標識のアミノシラン官能化ガラス基板表面への共有結合性カルボジイミドカップリングを使用して調製される、項目３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記非線形活性標識表面が、支持脂質二重層を含み、前記支持脂質二重層が、非線形活性標識が共有結合的にカップリングされるアミンまたはチオール含有脂質をさらに含む、項目３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記非線形活性標識タンパク質が、前記タンパク質のＣ末端のアミノシラン官能化ガラス基板表面への共有結合性カルボジイミドカップリングを使用して前記非標識表面または前記非線形活性標識表面上に配向様式で繋ぎ止められる、項目３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記非線形活性標識タンパク質が、支持脂質二重層を含む非標識表面または非線形活性標識表面上に配向様式で繋ぎ止められ、前記非線形活性標識タンパク質が、前記支持脂質二重層中に挿入され、または前記支持脂質二重層中に挿入されたアンカー分子に付着される、項目３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記非線形活性標識が、第２高調波（ＳＨ）活性標識である、項目３５から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記非線形活性標識が、和周波（ＳＦ）活性標識である、項目３５から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記非線形活性標識が、差周波（ＤＦ）活性標識である、項目３５から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
（ａ）複数の別個の領域をさらに含む第１の表面を含む基板であって、各別個の領域は、支持脂質二重層および電極のパターン形成されたアレイをさらに含む、基板；ならびに
（ｂ）各別個の領域が単一ウェル内に含有されるように、前記基板の前記第１の表面に結合し、またはそれと一体化したウェル形成コンポーネント
を備える、デバイス。
（項目４７）
複数の支持脂質二重層が、非線形活性標識タンパク質をさらに含む、項目４６に記載のデバイス。
（項目４８）
前記複数の支持脂質二重層が、それぞれについて同じである非線形活性タンパク質をさらに含む、項目４６に記載のデバイス。
（項目４９）
前記複数の支持脂質二重層が、支持脂質二重層の２つまたはそれ超のサブセットをさらに含み、支持脂質二重層の各サブセットが、異なる非線形活性タンパク質を含む、項目４７に記載のデバイス。
（項目５０）
前記基板が、ガラス、石英ガラス、ポリマー、またはこれらの任意の組合せからなる群より選択される光学的に透明な材料から製作される、項目４６から４９のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目５１）
前記電極のパターン形成されたアレイが、前記支持脂質二重層を囲繞する前記基板表面上にパターン形成された２つまたはそれ超の電極のアレイを含む、項目４６から５０のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目５２）
前記電極のパターン形成されたアレイが、ウェル形成ユニットの各ウェルの壁上にパターン形成された２つまたはそれ超の電極のアレイを含む、項目４６から５０のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目５３）
前記電極のパターン形成されたアレイが、各ウェルを密閉する蓋上にパターン形成された少なくとも１つの電極を含む、項目４６から５１のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目５４）
ウェル形成ユニットが９６ウェルを含む、項目４６から５３のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目５５）
ウェル形成ユニットが、３８４ウェルを含む、項目４６から５３のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目５６）
ウェル形成ユニットが、１，５３６ウェルを含む、項目４６から５３のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目５７）
前記基板の第２の表面と一体化され、励起光を、それが前記第１の表面から全反射されるように前記基板の前記第１の表面に送達するように構成されたプリズムのアレイをさらに備える、項目４６から５６のいずれか一項に記載のデバイス。