【手続補正書】
【提出日】平成20年10月16日(2008.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤の同定方法であって、化合物の存在下及び化合物の非存在下で、単離されたp27、E1、E2、E3、Cks1、サイクリンE、Cdk2とユビキチンを組合わせて形成されたユビキチン化p27の量を決定することを含み、該化合物の存在下で形成されたユビキチン化p27の量が、該化合物の非存在下で形成されたユビキチン化p27の量と異なる場合、該化合物は抗癌剤として同定される、前記方法。
【請求項２】
上記p27が上記E1、E2、E3、Cdk2及びユビキチンと組合わせる前に、Cdk2及びサイクリンEでリン酸化される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記リン酸化p27の濃度が約4 ng/μLであり; 上記E1の濃度が約5 ng/μLであり; 上記E2の濃度が約150 ng/μLであり;又は上記E3の濃度が約7.5 ng/μLである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記化合物の存在下で形成されたユビキチン化p27の量が、上記化合物の非存在下で形成されたユビキチン化p27の量よりも少ない、請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記E1、E2、E3又はCks1が組換え的に産生される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記E1、E2、E3及びCks1が細胞抽出物から精製される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
上記ユビキチンが標識で標識される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記標識がビオチンである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
上記標識されたユビキチンが、ユーロピウムで標識されたストレプトアビジンを用いて可視化される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
上記同定がハイスループットスクリーニングの一部としてマルチウェルプレート上で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
p27のユビキチン化アッセイのためのキットであって、p27、Cdk2/サイクリンE、及びp27を共にユビキチン化することができる複数のポリペプチド、該ポリペプチドを発現する組換え細胞又は該ポリペプチドをコードする配列を包含する組換えベクターを含む、前記キット。
【請求項１２】
p27及びCdk2/サイクリンEが複合体として提供される、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
上記複数のポリペプチドがE1、E2、E3、Cks1及びユビキチンを含む、請求項１１記載のキット。
【請求項１４】
上記ユビキチンが標識により標識される、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
上記標識がビオチンである、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
任意でプロテインA又はGで被覆されたプレート；緩衝液；可視化剤;又は上記ポリペプチドの発現と精製に必要な器具若しくは試薬をさらに1以上含む、請求項１１記載のキット。
【請求項１７】
サンプル中のp27のユビキチン化を調節する化合物を同定する方法であって：
a) p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、若しくはいずれかのそれらの組合せを化合物と組合わせて、該化合物と該p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せとの混合物を形成させることにより、第１のサンプルを調製し;
b) p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せを組合わせ、該p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せの混合物を形成させることにより、該化合物を含まない第２のサンプルを調製し；
c) 任意で該p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せを使ったステップ(a)及び(b)における混合物では、p27をユビキチン化するには十分でない場合、第１及び第２のサンプルをそれぞれ複数のポリペプチドと接触させ、該複数のポリペプチド及び該p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せでp27を共にユビキチン化することができ；
d) ユビキチン化p27を形成させ；
e) 該第１及び第２のサンプル中の該ユビキチン化p27を表面上でそれぞれ捕捉し；及び
f) 該第１及び第２のサンプル中で、該表面上で捕捉された該p27中に存在するユビキチン量をそれぞれ決定すること
を含み、該第１及び第２のサンプルから得られるユビキチン量が異なる場合、該化合物はp27のユビキチン化を調節する化合物として同定される、前記方法。
【請求項１８】
抗癌化合物を同定する方法であって：
a) p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せを化合物と組合わせ、該化合物と該p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せとの混合物を形成させることにより、第１のサンプルを調製し;
b) p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せを組合わせ、該p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せの混合物を形成させることにより、該化合物を含まない第２のサンプルを調製し；
c) 任意で該p27、E1、E2、E3、Cks1及びユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せを使ったステップ(a)及び(b)における混合物では、p27をユビキチン化するには十分でない場合、第１及び第２のサンプルをそれぞれ複数のポリペプチドと接触させ、該複数のポリペプチド及び該p27、E1、E2、E3、Cks1、ユビキチン、又はいずれかのそれらの組合せでp27を共にユビキチン化することができ；
d) ユビキチン化p27を形成させ；
e) 第１及び第２のサンプル中の該ユビキチン化p27を表面上でそれぞれ捕捉し；及び
f) 第１及び第２のサンプル中で、該表面上で捕捉された該p27中に存在するユビキチン量をそれぞれ決定すること
を含み、該第１及び第２のサンプルから得られるユビキチン量が異なる場合、該化合物は抗癌化合物として同定される、前記方法。
【請求項１９】
p27のユビキチン化量を決定する方法であって：
a) ユビキチン化の前後いずれかで、第１の標識で標識されたユビキチンでp27をユビキチン化し、ユビキチン化p27を形成させ;
b) 該p27を該第１の蛍光又は発光標識と区別できる第２の蛍光又は発光標識で標識し;及び
c) 該第１の蛍光標識から生じた第１の蛍光又は発光シグナルの、該第２の蛍光標識から生じた第２の蛍光シグナルに対する割合を決定すること
を含み、割合が高くなるほどp27のユビキチン化量が多くなることを示す、前記方法。
【請求項２０】
上記第１の蛍光標識及び上記第２の蛍光標識が、蛍光共鳴エネルギー転移又は発光共鳴エネルギー転移アッセイでの使用に適している、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
上記第１の蛍光又は発光標識が供与体であり、上記第２の蛍光又は発光標識が受容体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
抗癌剤の同定方法であって、
第１の標識でp27を標識すること、
第２の標識でユビキチンを標識すること、及び
該第２の標識の該第１の標識に対する割合を決定すること、
を含み、化合物の存在下での該割合が該化合物の非存在下での該割合と異なる場合、該化合物はp27のユビキチン化を調節するものである、前記方法。
【請求項２３】
上記第１の標識及び上記第２の標識が蛍光標識である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
上記割合の決定に、第１の蛍光値を生じさせる上記第１の標識からの蛍光を検出すること;第２の蛍光値を生じさせる上記第２の標識からの蛍光を検出すること;及び該第１の蛍光値の該第２の蛍光値に対する割合を決定することを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
上記第１の蛍光標識が励起されると、上記第２の標識が検出可能な蛍光シグナルを放つ、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
上記第１の標識及び上記第２の標識が同一のユビキチン化p27上に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
上記第２の蛍光標識が励起されると、上記第１の標識が検出可能な蛍光シグナルを放つ、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
上記第１の標識及び上記第２の標識が同一のユビキチン化p27上に存在する、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
上記第１の標識及び上記第２の標識が蛍光共鳴エネルギー転移アッセイでの使用に適している、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
上記第１の標識がユーロピウム、Cy5、トリスビピリジン・ユーロピウム・クリプテート、Dylight(商標)547、Dylight(商標)647、又はアロフィコシアニン(XL665)である、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
上記第２の標識がユーロピウム、Cy5、トリスビピリジン・ユーロピウム・クリプテート、Dylight(商標)547、Dylight(商標)647、又はアロフィコシアニン(XL665)である、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
上記第１の標識がユーロピウムであり、上記第２の標識がCy5である、請求項２２記載の方法。
【請求項３３】
上記ユーロピウムを340 nmの照射で励起し、第１の蛍光値を生じさせる620 nmで該ユーロピウムの蛍光を決定し、第２の蛍光値を生じさせる665 nmで上記Cy5の蛍光を決定し、さらに該第２の蛍光値の該第１の蛍光値に対する割合を決定し、割合が高くなるほどp27のユビキチン化量が多くなることを示す、請求項２２記載の方法。