【手続補正書】
【提出日】平成20年8月25日(2008.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよびｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質と接触させるステップであって、該基質が核酸であり、該核酸がバルジ−ヘリックス−バルジ構造内のｔＲＮＡイントロンまたは前駆体ｔＲＮＡの成熟ドメインを含む、上記ステップ；
（ｂ）切断された基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における切断基質の量が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における切断基質の量と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
化合物の存在下における切断基質の量が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における切断基質の量と比較して低減する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減する化合物が同定される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物の存在下における切断基質の量が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における切断基質の量と比較して増大する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大する化合物が同定される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
核酸がレポーター遺伝子を含み、該レポーター遺伝子内にバルジ−ヘリックス−バルジ構造内のｔＲＮＡイントロンまたは前駆体ｔＲＮＡの成熟ドメインが含まれる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する真菌細胞と接触させるステップ；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を検出することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する真菌無細胞抽出物と接触させるステップ；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を検出することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
化合物の存在下におけるレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における該タンパク質の発現と比較して低減する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減する化合物が同定される、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
化合物の存在下におけるレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における該タンパク質の発現と比較して増大する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大する化合物が同定される、請求項５または６記載の方法。
【請求項９】
核酸の５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されている、または核酸の５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されている、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する真菌無細胞抽出物と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する真菌細胞と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
化合物の存在下における基質により生成される蛍光シグナルが、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下において生成される蛍光シグナルよりも低く検出される場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減する化合物が同定される、請求項１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
化合物の存在下における基質により生成される蛍光シグナルが、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下において生成される蛍光シグナルよりも高く検出される場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大する化合物が同定される、請求項１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１５】
核酸の５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されている、または核酸の５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されている、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する真菌無細胞抽出物と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）化合物または化合物ライブラリのメンバーを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼおよび基質を含有する真菌細胞と接触させるステップ；
（ｂ）基質の蛍光を測定することにより切断基質の量を検出するステップであって、化合物の存在下における基質の蛍光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における基質の蛍光と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における蛍光発光と比較して増大する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減する化合物が同定される、請求項１６、１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長での蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における蛍光発光と比較して低減する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増大する化合物が同定される、請求項１６、１７または１８記載の方法。
【請求項２１】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼからなる群の少なくとも１つをコードする、請求項４記載の方法。
【請求項２２】
真菌細胞が酵母細胞である、請求項５、１２または１８記載の方法。
【請求項２３】
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ細胞、シゾサッカロミセス・ポンベ細胞、ピヒア・パアストリス細胞、およびハンセヌラ・ポリモルファ細胞からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
真菌無細胞抽出物が酵母抽出物である、請求項６、１０または１６記載の方法。
【請求項２５】
酵母抽出物が、サッカロミセス・セレビシエ抽出物、シゾサッカロミセス・ポンベ抽出物、ピヒア・パアストリス抽出物、およびハンセヌラ・ポリモルファ抽出物からなる群より選択される、請求項２４記載の方法。