(57)【要約】任意の蛋白質を生理的条件下に近い条件で維持することのできる蛋白質チップを提供する。ＰＤＺドメイン蛋白質を基板上に結合させ、当該蛋白質に結合する蛋白質のＣ末端にＳＬＶのアミノ酸配列を有する任意の蛋白質を結合可能とし、当該任意の蛋白質が基板上に配置することによる当該蛋白質の立体構造の変化を抑制すること、又は当該蛋白質の配向を揃えることを特徴とする、基板上にＰＤＺドメイン蛋白質を結合させた蛋白質チップとする。
2007126101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板；
アフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質；及び、
Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質；
を含み、
当該コンセンサス配列を介して当該他の蛋白質が当該ＰＤＺドメインに結合した蛋白質チップ。
【請求項２】
前記基板が、オリゴヌクレオチドが表面に固定化された基板であり、
前記アフィニティタグに、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合しており、
当該オリゴヌクレオチド及びこれに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたものである、請求項１に記載の蛋白質チップ。
【請求項３】
前記アフィニティタグが、ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグである、請求項１又は２に記載の蛋白質チップ。
【請求項４】
前記ＰＤＺドメインが、ヒトのＦＡＰ１蛋白質のＰＤＺドメインである、請求項１〜３のいずれかに記載の蛋白質チップ。
【請求項５】
前記コンセンサス配列が、ＳＬＶからなる配列である、請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質チップ。
【請求項６】
蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法：
（Ａ）アフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、基板に固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｄ）の工程でＰＤＺドメインを有する蛋白質が固定された基板に、上記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を加えて、前記ＰＤＺドメインを有する蛋白質と前記他の蛋白質を結合させる工程。
【請求項７】
蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法。
（Ａ）アフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）基板にオリゴヌクレオチドを固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質に、当該ＰＤＺドメインを介して前記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を結合させ、さらに、前記アフィニティタグを介して前記オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させて、蛋白オリゴヌクレオチド複合体を作製する工程； 
（Ｆ）上記（Ｄ）の工程により得られた基板に、上記（Ｅ）の工程により得られた蛋白オリゴヌクレオチド複合体を加えて、基板上のオリゴヌクレオチド及び複合体のヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程；
【請求項８】
請求項７に記載の蛋白質チップの製造方法であって、
前記（Ｂ）の工程において、前記他の蛋白質が、複数種の他の蛋白質であり、
前記（Ｄ）の工程において、前記オリゴヌクレオチドが、配列の異なる複数種のオリゴヌクレオチドであり、
前記（Ｅ）の工程において、前記ＰＤＺドメインに結合させる他の蛋白質の種類に応じて、前記アフィニティタグを介して結合させるヌクレオチドの種類を異ならせることを特徴とする、蛋白質チップの製造方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが固定された基板、及び、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合したＰＤＺドメインを有する蛋白質を含むキット。
【請求項１０】
ＰＤＺドメイン蛋白質を基板上に結合させ、当該蛋白質に結合する蛋白質のＣ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する任意の蛋白質を結合可能とし、当該任意の蛋白質が基板上に配置することによる当該蛋白質の立体構造の変化を抑制すること、又は当該蛋白質の配向を揃えることを特徴とする、基板上にＰＤＺドメイン蛋白質を結合させた蛋白質チップ。
【請求項１１】
ＰＤＺドメイン蛋白質を基板上に結合させ、重鎖不変領域Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体を、当該ＰＤＺドメイン蛋白質に結合させ、当該抗体に任意の蛋白質を結合可能とし、当該抗体の蛋白質結合部位が当該基板に接触することを抑制することにより、当該抗体と任意の蛋白質との結合能力を向上させたことを特徴とする、重鎖不変領域Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体がＰＤＺドメイン蛋白質に結合させ、当該複合体を基板上に結合させた蛋白質チップ。
【請求項１２】
蛋白質のＣ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する任意の蛋白質に対して、任意のオリゴヌクレオチドを連結したＰＤＺドメイン蛋白質を結合させ、当該オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを配置させたマイクロアレイであって、任意の蛋白質−ＰＤＺドメイン蛋白質−オリゴヌクレオチドを配置させる蛋白質チップ。
【請求項１３】
ＰＤＺドメイン蛋白質にアビジン標識若しくはビオチン標識をし、オリゴヌクレオチドにビオチン標識若しくはアビジン標識を結合させることにより、アビジン標識及びビオチン標識が結合することを利用した前記ＰＤＺドメイン蛋白質と前記オリゴヌクレオチドとを結合させることを特徴とする請求項１２に記載の蛋白質チップ。
【請求項１４】
前記Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列が、ＳＬＶからなる配列であることを特徴とする、請求項１０乃至１３のいずれかに記載の蛋白質チップ。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤＺドメイン蛋白質と、ＰＤＺドメインに特異的に結合するＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する蛋白質を利用した蛋白質チップ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質チップとは、ガラス基板等の基板上に、種々の蛋白質を結合させたものである。そして蛋白質チップ上に固定化されたそれぞれの蛋白質の機能を利用して、各種診断、検査や、当該他の蛋白質と結合する分子の探索などに供されるものである。【０００３】
基板へ蛋白質を固定する方法には、蛋白質を基板表面へ受動的吸着により固定化する方法、カップリング試薬を用いて蛋白質を基板に結合させる方法、蛋白のタグを用いた生物学的な捕捉方法等がある。理想的には、固定化に再現性があり、蛋白質の性質（サイズ、親水性、疎水性）が異なっても同等の効率で固定化でき、尚且つ大量処理と自動化に対応可能であること、更に固定化された蛋白質の活性が完全に保持されるものであることが望まれる。
蛋白質を基板表面へ受動的吸着により固定化する方法としては、ナイロン、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ポリアクリルアミドゲル、ポリ−Ｌ−リジンやアミノプロピルシラン等で基板をコートし、その表面に蛋白質を吸着させる方法がある（非特許文献１：Hui Ge, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(2), e3、非特許文献２：Lucy J. Holt et al., 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(15), e72、非特許文献３：Dmitry Guschin, 1997, Analytical Biochemistry, vol.250(2), pp.203-211）。しかし、これらの方法は操作が容易であるものの、定量性及び蛋白質分子の固定の方向性の制御が不可能である。また、固定化する蛋白質の活性保持が困難であり、再現性と効率も変動するため好ましくない。
次に、カップリング試薬を用いて蛋白質を基板に結合させる方法としては、アルデヒド修飾ガラスを利用して、タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖との間の反応性を利用する方法（非特許文献４：Gavin MacBeath, 2000, Science, vol.289(5485), pp.1760-1763）や、ガラス表面をエポキシ基で修飾して、これに蛋白質を固定化する方法がある。これらの方法は、蛋白質を基板へ安定に固定化することができ、様々な蛋白質にも適応でき、更に再現性が良いものの、固定化の方向性を完全に制御することはできず、カップリングに使用する化合物の誘導体が蛋白質の機能を変えてしまうこともある。そのためこの方法を利用する場合には、固定化する蛋白質の機能を変化・消失させないカップリング剤と担体（基板）表面との組み合わせを検討することが必要である。
最後に、蛋白質をタグとして用いた生物学的な捕捉法としては、ビオチン／ストレプトアビジンやヘキサヒスチジン／ニッケル相互作用を利用する方法等がある。これらの方法は、蛋白質と担体（基板）表面との間に安定且つ特異的な結合を形成する方法であり、尚且つ結合の方向性を制御することが可能である。【０００４】
本発明者らは、以前に、ユニークな生物学的補足法を利用した蛋白質チップとして、ＰＤＺドメインとＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列の相互作用により蛋白質を基板に固定化する方法を開発した（特許文献１：米国特許第６，７４３，６３０号公報）。すなわち、基板上にＰＤＺドメインを有する蛋白質を固定し、Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を加えることにより、該コンセンサス配列を介して当該他の蛋白質が当該ＰＤＺドメインに結合し、目的の蛋白質が基板上に固定化されたチップを作成することができる。
尚、ＰＤＺドメインとＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列の相互作用を利用した蛋白質チップの製造方法は、ＦＡＰ−１（Fas-associated phosphatase-1）が、アポトーシスシグナルを細胞内に伝達するため細胞表面に存在するＦａｓ受容体のＣ末端に相互作用するという、本発明者らの発見（非特許文献５：Sato, T., et al. Science 268, 411-415, 1995）に基づく技術であり、その後の研究（非特許文献６：Yanagisawa, J. et al., The Journal of Biolgical Chemistry, 272, pp.8539-8545, 1997）により、蛋白質のＣ末端のＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列がＦＡＰ−１のＰＤＺドメインに結合することを見出したことから発案されたものである。
【特許文献１】米国特許第６，７４３，６３０号公報
【特許文献２】特開２００２−０８２１１６号公報
【特許文献３】特開２００３−０１４７４７号公報
【特許文献４】特開２００３−１５３６９８号公報
【特許文献５】特開２００４−５７１１３号公報
【特許文献６】特開２００４−２３０５４５号公報
【特許文献７】特開２００４−３４７３１７号公報
【特許文献８】特開２００４−５７１１３号公報
【特許文献９】特表２００２−５２０６１８号公報
【特許文献１０】特表２００２−５２０６２０号公報
【特許文献１１】特表２００６−５１１７９７号公報
【特許文献１２】国際公開第９５／０４０６９号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第９８／０５３４７号パンフレット
【非特許文献１】Hui Ge, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(2), e3
【非特許文献２】Lucy J. Holt et al., 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(15), e72
【非特許文献３】Dmitry Guschin, 1997, Analytical Biochemistry, vol.250(2), pp.203-211
【非特許文献４】Gavin MacBeath, 2000, Science, vol.289(5485), pp.1760-1763
【非特許文献５】Sato, T., et al. Science 268, pp.411-415, 1995
【非特許文献６】Yanagisawa, J. et al., The Journal of Biolgical Chemistry, 272, pp.8539-8545, 1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＤＺドメインとＳＬＶ配列の相互作用を利用した蛋白質チップは、従来にないユニークな固定化方法に基づくものであり、その実用化が期待されるものであった。しかし、ＦＡＰ−１の全長蛋白質ではなく、ＰＤＺドメインを含む部分長からなる蛋白質を基板に固定すると、ＰＤＺドメインとＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列との結合力が十分でないという問題があった。その理由は明らかではないが、ＰＤＺドメインを含む部分長からなる蛋白質を基板に固定した場合に、高次構造が不安定となって機能が損なわれることが一つの理由として考えられる。
また、実用的な蛋白質チップを製造するためには、バックグラウンドノイズの低減とチップの低コスト化が最大の解決すべき課題となる。バックグラウンドノイズは、蛋白質の非特異的な結合に由来するものであるが、その最大の理由は、基板に固定する蛋白質の精製が十分でないことによるものと考えられる。しかし、高純度の蛋白質を得ようとすると、多大な時間と資材を要し、チップの低コスト化と両立できないという難題が存在していた。純度の高い蛋白質を得る効率的な方法としては、タグと融合した蛋白質を細胞内で発現させて、タグにより蛋白質を精製する方法があるが、蛋白質によってはタグによりその機能が損なわれるものもあるため、高品質の蛋白質チップを製造するためには好ましいものではなかった。
さらに、従来の蛋白質チップは、基板上に蛋白質を微細にスポットするにあたって、インクジェット印刷装置又はキャピラリーを備えた分注ロボット等を必要とするものであった。そこで、特別な装置を必要とせずに、研究室内で蛋白質を任意の配列にアレイすることができる蛋白質チップの開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討し試行錯誤を重ねた結果、ＰＤＺドメインを有する蛋白質にアフィニティタグを連結させると、基板に固定してもＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列との結合力が大きく損なわれないことを見出し、本発明の蛋白質チップを発明するに至った。
また、ＰＤＺドメインを有する蛋白質に連結させたアフィニティタグを、蛋白質の精製に使用するとともに、ＰＤＺドメインとＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列の強固な結合力を利用することによって、夾雑蛋白質が基板へ結合することを防ぎ、バックグラウンドノイズが低く、低コストで、高品質な蛋白質チップを製造することができることを見出し、本発明の蛋白質チップの製造方法を発明するに至った。
さらに、本発明者らは、オリゴヌクレオチドが固定された基板を用意し、基板上の任意の位置のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、ＰＤＺドメインを有する蛋白質及びＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する任意の蛋白質の複合体を作製し、当該任意の位置のオリゴヌクレオチドと複合体のヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、基板上の任意の位置に任意の蛋白質をアレイすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（１４）の蛋白質チップ、その製造方法及びキットを提供するものである。
（１）  基板；
アフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質；及び、
Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質；
を含み、
当該コンセンサス配列を介して当該他の蛋白質が当該ＰＤＺドメインに結合した蛋白質チップ。
（２）  前記基板が、オリゴヌクレオチドが表面に固定化された基板であり、
前記アフィニティタグに、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合しており、
当該オリゴヌクレオチド及びこれに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたものである、（１）に記載の蛋白質チップ。
（３）  前記アフィニティタグが、ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグである、（１）又は（２）に記載の蛋白質チップ。
（４）  前記ＰＤＺドメインが、ヒトのＦＡＰ１蛋白質のＰＤＺドメインである、（１）〜（３）のいずれかに記載の蛋白質チップ。
（５）  前記コンセンサス配列が、ＳＬＶからなる配列である、（１）〜（４）のいずれかに記載の蛋白質チップ。
（６）  蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法：
（Ａ）アフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、基板に固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｄ）の工程でＰＤＺドメインを有する蛋白質が固定された基板に、上記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を加えて、前記ＰＤＺドメインを有する蛋白質と前記他の蛋白質を結合させる工程。
（７）  蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法。
（Ａ）アフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）基板にオリゴヌクレオチドを固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質に、当該ＰＤＺドメインを介して前記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を結合させ、さらに、前記アフィニティタグを介して前記オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させて、蛋白オリゴヌクレオチド複合体を作製する工程；
（Ｆ）上記（Ｄ）の工程により得られた基板に、上記（Ｅ）の工程により得られた蛋白オリゴヌクレオチド複合体を加えて、基板上のオリゴヌクレオチド及び複合体のヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程；
（８）  請求項７に記載の蛋白質チップの製造方法であって、
前記（Ｂ）の工程において、前記他の蛋白質が、複数種の他の蛋白質であり、
前記（Ｄ）の工程において、前記オリゴヌクレオチドが、配列の異なる複数種のオリゴヌクレオチドであり、
前記（Ｅ）の工程において、前記ＰＤＺドメインに結合させる他の蛋白質の種類に応じて、アフィニティタグを介して結合させるヌクレオチドの種類を異ならせることを特徴とする、蛋白質チップの製造方法。
（９）  オリゴヌクレオチドが固定された基板、及び、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合したＰＤＺドメインを有する蛋白質を含むキット。
（１０）  ＰＤＺドメイン蛋白質を基板上に結合させ、当該蛋白質に結合する蛋白質のＣ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する任意の蛋白質を結合可能とし、当該任意の蛋白質が基板上に配置することによる当該蛋白質の立体構造の変化を抑制すること、又は当該蛋白質の配向を揃えることを特徴とする、基板上にＰＤＺドメイン蛋白質を結合させた蛋白質チップ。
（１１）  ＰＤＺドメイン蛋白質を基板上に結合させ、重鎖不変領域Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体を、当該ＰＤＺドメイン蛋白質に結合させ、当該抗体に任意の蛋白質を結合可能とし、当該抗体の蛋白質結合部位が当該基板に接触することを抑制することにより、当該抗体と任意の蛋白質との結合能力を向上させたことを特徴とする、重鎖不変領域Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体がＰＤＺドメイン蛋白質に結合させ、当該複合体を基板上に結合させた蛋白質チップ。
（１２）  蛋白質のＣ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する任意の蛋白質に対して、任意のオリゴヌクレオチドを連結したＰＤＺドメイン蛋白質を結合させ、当該オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを配置させたマイクロアレイであって、任意の蛋白質−ＰＤＺドメイン蛋白質−オリゴヌクレオチドを配置させる蛋白質チップ。
（１３）  ＰＤＺドメイン蛋白質にアビジン標識若しくはビオチン標識をし、オリゴヌクレオチドにビオチン標識若しくはアビジン標識を結合させることにより、アビジン標識及びビオチン標識が結合することを利用した前記ＰＤＺドメイン蛋白質と前記オリゴヌクレオチドとを結合させることを特徴とする（１２）に記載の蛋白質チップ。
（１４）  前記Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列が、ＳＬＶからなる配列であることを特徴とする、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の蛋白質チップ。【０００８】
ここで、Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉの各文字及び記号の意味は、Ｓはセリンを、Ｔはスレオニンを、Ｖはバリンを、Ｌはロイシンを、Ｉはイソロイシンを、それぞれ示し、Ｘは、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンから選ばれる任意のアミノ酸を示す。また、−（ハイフン）はペプチド結合を示し、選択肢として示されているアミノ酸は／（スラッシュ）により隔てられている。すなわち、Ｓ／Ｔとは、セリン又はスレオニンのいずれかであることを示す。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、少なくともＰＤＺドメインを介して蛋白質が基板に固定されることになるため、蛋白質が基板に直接結合することによって生じる、当該蛋白質の立体構造の変化、機能の喪失・変化等、更に当該蛋白質の機能部位が基板表面に露出しないことが抑制されることから、感度の高い蛋白質チップを提供することができる。
また、ＰＤＺドメインを含む蛋白質を基板に固定すると、ＰＤＺドメインとＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列との結合力が損なわれてしまうという問題があったが、本発明によれば、ＰＤＺドメインを含む蛋白質にアフィニティタグを連結することにより、ＰＤＺドメインを安定化させて、Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列との結合力を強固に保つことができる。ＰＤＺドメインとコンセンサス配列との結合力が強固に保たれる理由は明らかではないが、アフィニティタグと結合することにより、ＰＤＺドメインの立体構造が安定すること、あるいは、ＰＤＺドメインが基板と直接結合しないことにより、その機能が安定すること等が理由として考えられる。
そして、本発明の蛋白質チップの製造方法によれば、ＰＤＺドメインを有する蛋白質にアフィニティタグを連結させ、そのアフィニティタグを指標としてＰＤＺドメインを有する蛋白質を精製するため、基板上に高純度のＰＤＺドメインを有する蛋白質を固定することができる。そして、Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を添加すれば、当該他の蛋白質の純度が低く、夾雑蛋白質を多く含む場合であったとしても、ＰＤＺドメインとＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列との高い結合力により、Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する蛋白質のみがＰＤＺドメインを介して基板に固定されることになるため、夾雑蛋白質が基板に固定されることを防ぐことができる。すなわち、バックグラウンドノイズの低い蛋白質チップを、複雑な精製工程を必要とせずに低コストで製造することが可能となる。さらには、検体と反応する他の蛋白質には、わずか３アミノ酸残基からなるＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉコンセンサス配列を付加するだけでよいため、検体と反応する他の蛋白質の機能を損なう恐れがなく、高品質の蛋白質チップを製造することが可能となる。
さらに、本発明によれば、オリゴヌクレオチドが固定された基板、並びに、当該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、ＰＤＺドメインを有する蛋白質及びＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する任意の蛋白質の複合体を用意することにより、特別な装置を備えていない研究室内においても、基板上のオリゴヌクレオチドとそれに相補的な複合体のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、任意の蛋白質を任意の基板上の位置にアレイすることを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＤＺドメイン蛋白質に結合した解析対象蛋白質の配向が揃うことを模式的に示す説明図である。
【図２】アフィニティタグを連結したＰＤＺドメインを有する蛋白質を基板に固定させた蛋白質チップを示す模式図である。
【図３】ＰＤＺドメイン蛋白質を基板上に結合させ、重鎖不変領域Ｃ末端にＳＬＶのアミノ酸配列が付加された任意の抗体を、当該ＰＤＺドメイン蛋白質に結合させ、当該抗体に解析対象の蛋白質を結合可能とし、当該抗体の蛋白質結合部位が当該基板に接触することを抑制することにより、当該抗体と解析対象の蛋白質との結合能力を向上させたことを模式的に示す説明図である。
【図４】ＳＬＶ蛋白質−ＰＤＺドメイン蛋白質−オリゴヌクレオチドを配置させる蛋白質チップを模式的に示す説明図である。
【図５】抗体の抗原結合部位が基板に接触することにより、当該抗体と解析対象である蛋白質（抗原）との結合能力が低下したことを模式的に示す説明図である。
【図６】蛋白質が基板上に配置することによる当該蛋白質の立体構造の変化を起こし、結合すべき分子等との感受性が低下をしていることを模式的に示す説明図である。
【図７】ＰＤＺドメインを有する蛋白質の分解性を示す図である。
【図８】プレートに固定したＰＤＺドメインによる細胞溶解液中のリボゾーム蛋白質−ＳＬＶの捕捉能を示す図である。
【図９】プレートに固定したＰＤＺドメインによる細胞溶解液中のリボゾーム蛋白質-SLVの捕捉能を示す図である。
【図１０】プレートに固定したＰＤＺドメインによるＧＦＰ−ＳＬＶの捕捉能のＳＬＶ特異性を示す図である。
【図１１】ビオチン化したオリゴヌクレオチドを介したＧＦＰ−ＳＬＶの捕獲を示す図である。
【符号の説明】
【００１１】
１・・・基板
２・・・解析対象蛋白質
３・・・解析対象蛋白質に結合する抗体
４・・・解析対象蛋白質に結合する分子
５・・・ＰＤＺドメイン蛋白質
５’・・・アフィニティタグ
６・・・ＳＬＶの配列であるペプチド
６’・・・ＳＬＶの配列であるペプチドを重鎖不変領域C末端に有する抗体
７・・・アビジン標識
８・・・ビオチン標識
９・・・オリゴヌクレオチド１
１０・・・オリゴヌクレオチド１に相補的なオリゴヌクレオチド２
１１・・・オリゴヌクレオチドを固定した基板
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明はこの形態に限られるものではない。
本発明の蛋白質チップは、ＰＤＺドメインを有する蛋白質を、任意の蛋白質の基板上への固定化用捕捉剤として、基板上に直接的に又はヌクレオチド等を介して結合させ、Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列が結合した任意の蛋白質を、当該ＰＤＺドメインを介して結合させることにより、当該任意の蛋白質が基板上に直接的に配置することによる当該任意の蛋白質の立体構造変化を抑制し、又は当該任意の蛋白質の基板上における配向を揃えることを可能にした、蛋白質チップを提供するものである。
さらに、本発明の蛋白質チップは、ＰＤＺドメインを含む蛋白質を基板に固定すると、ＰＤＺドメインとＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列との結合力が損なわれるという問題を、ＰＤＺドメインを有する蛋白質にアフィニティタグを連結させて、ＰＤＺドメインを安定化させることにより解決したものである。【００１３】
ここで、本発明で用いるＰＤＺドメインとしては、Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列と結合することができるＰＤＺドメインであれば特に限定されないが、例えば、ヒトのＦＡＰ１（Fas associated phosphatase-1）のＰＤＺドメインを用いることができる。ヒトのＦＡＰ１蛋白質は６つのＰＤＺドメインを有するが、これらのうちＮ末端から数えて３，４，５番目のＰＤＺドメインを使用するのが好ましく、より好ましくは３番目のＰＤＺドメインを使用するのがよい。
また、本発明の蛋白質チップで用いるＰＤＺドメインとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＰＤＺドメイン、又は、当該アミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性のあるアミノ酸配列を有するＰＤＺドメインを用いることができる。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。
本発明における、ＰＤＺドメインを有する蛋白質とは、ＰＤＺドメインに他の蛋白質若しくはペプチドを融合した蛋白質であってもよく、また、ＰＤＺドメインが含まれるようにヒトのＦＡＰ１蛋白質を短くした蛋白質であってもよい。また、複数のＰＤＺドメインを含む蛋白質を使用することもできるが、蛋白質が分解されにくく、アレイごとに一定の結合能を有する蛋白質チップを作成するためには、１つのＰＤＺドメインを有する蛋白質を用いることが好ましい。【００１４】
本発明で用いる、Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列とは、３アミノ酸からなる配列であって、Ｓはセリンを、Ｔはスレオニンを、Ｖはバリンを、Ｌはロイシンを、Ｉはイソロイシンを、それぞれ示す。Ｘは、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンから選ばれる任意のアミノ酸を示す。また、−（ハイフン）はペプチド結合を示し、選択肢として示されているアミノ酸は／（スラッシュ）により隔てられている。すなわち、Ｓ／Ｔとは、セリン又はスレオニンのいずれかであることを示す。Ｖ／Ｌ／Ｉは蛋白質のＣ末端のアミノ酸となる。
尚、Ｃ末端は、カルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよいが、カルボキシル基（-COOH）であることが好ましい。【００１５】
Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列のうち、ＳＬＶからなる配列が、ＰＤＺドメインと最も強固に結合するため、特に好ましいものである。ここでＳＬＶのアミノ酸配列とは、セリン−ロイシン−バリン（COOH）である。
本発明者らは、アポトーシス情報伝達系に関わるFas/FAP-1相互作用の解析から、Ｆａｓのカルボキシル基(Ｃ)末端部の３アミノ酸（ＳＬＶ）がＦＡＰ１のＰＤＺドメインと強固に結合することを明らかにし、その蛋白質−蛋白質結合のコンセンサスモチーフ（Ｓ/Ｔ-Ｘ-Ｖ/Ｌ/Ｉ-ＰＤＺドメイン）を見出した（非特許文献６：Yanagisawa, J. et al., The Journal of Biolgical Chemistry, 272, pp.8539-8545, 1997)。現在ヒトゲノムにおいてＰＤＺドメインを持つ蛋白質は約５００種類あると考えられているが、その中でもＳＬＶ−ＰＤＺドメイン (ＦＡＰ１)の結合特性が最も強い事が判明している。この３アミノ酸の配列と同じ配列が任意の蛋白質のＣ末端にある確率は、理論的には全ゲノム蛋白質数約300,000当たり、約４０以下である（約300,000／20×20×20）。従って、この結合特異性を用いれば、次世代プロテインチップの開発のみならず、蛋白質結合阻害剤のターゲットドラッグスクリーニングのアッセイ系を構築することが可能である。【００１６】
本発明で用いる、ＰＤＺドメインに連結させるアフィニティタグとしては、他の物質との親和性を有する物質であれば特に限定されないが、２０アミノ酸残基以上のペプチドタグが好ましく、ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）、アビジン、マルトース結合ペプチド、ビオチン化ペプチド、セルロースバインディングプロテイン、Ｓｔｒｅｐタグ含有ペプチド 、チオレドキシン等が挙げられる。また、これらのタグを二つ２以上融合させたポリペプチドをアフィニティタグとして用いることもできる。本発明で用いられるアフィニティタグとして特に好ましいものとしては、ＧＳＴとアビジンとの融合蛋白質からなるアフィニティタグが挙げられる。ここで、アビジンとしては、非特異的結合の少ないストレプトアビジンを用いることが特に好ましい。【００１７】
本発明の蛋白質チップにおいて使用可能な基板としては、ガラス、金属、樹脂、繊維、石英、半透性膜、又は、コラーゲン若しくはキチンなどの生物性材料を用いた基板が挙げられる。
そして、基板の表面には、必要により、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、３次元ポリアクリルアミドゲル等の蛋白質と親和性を有する物質をコートすることができる。また、基板の表面を、蛋白質と反応するアルデヒド基、エポキシ基等で修飾することもできる。
基板の形状としては、特に限定されず、表面が滑らかなプレート状であっても、縦横に凹部を配列したマルチウェルプレート又はマイクロウェルプレートであってもよい。また、球状のような特殊な形状のものであってもよい。【００１８】
基板にＰＤＺドメインを含む蛋白質を固定する方法としては、直接基板に結合させる方法と、オリゴヌクレオチド等を介して結合させる方法がある。
まず、基板にＰＤＺドメインを有する蛋白質を直接固定する方法について以下に記載する。この方法には、共有結合による固定化と非共有結合による固定化がある。
非共有結合による固定化としては、例えば、ニトロセルロース（非特許文献１：Hui Ge, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(2), e3）又はＰＶＤＦ膜（非特許文献２：Lucy J. Holt et al., 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(15), e72）に、ＰＤＺドメインを含む蛋白質をドットブロットの要領でスポットする物理吸着法が挙げられる。また、スライドガラス上に厚さ１０〜１００μｍのポリアクリルアミドのパッドを接合して、これに蛋白をスポットする方法も挙げられる（非特許文献３：Dmitry Guschin, 1997, Analytical Biochemistry, vol.250(2), pp.203-211）。３次元のポリアクリルアミドゲルに基づくHydroGelTM（パーキンエルマー社）の多孔質内で固定化を行うこともできる。また、生物学的な結合法として、修飾蛋白質を用いるビオチン／ストレプトアビジンやヘキサヒスチジン／ニッケル相互作用を利用することもできる。【００１９】
共有結合による固定化としては、例えば、アルデヒド修飾ガラスを利用して、タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖との間の反応性を利用する方法（非特許文献４：Gavin MacBeath, 2000, Science, vol.289(5485), pp.1760-1763）や、ガラス表面をエポキシ基で修飾して、これに蛋白質を固定化する方法がある。また、スライドガラス表面上に、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム等の炭化物、あるいはこれら炭化物と金属やセラミックス等との混合体、積層体からなる表面処理層をスパッタ法などにより形成し、さらに、炭化水素基の末端に活性化エステル基が結合した基を、アミド結合を介して固定化することによりこの表面処理層を活性化し、この活性化エステル基に蛋白質末端のアミノ基を共有結合させることもできる（特許文献２：特開２００２−０８２１１６号公報、特許文献３：特開２００３−０１４７４７号公報）。【００２０】
本発明で用いる、Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質としては、特に限定されず、転写因子、シグナル伝達因子、リセプター、酵素等の蛋白質を、ＰＤＺドメインを介して基板に固定して蛋白質チップを製造することができる。この蛋白質チップの利用方法としては、例えば、アッセイしたい蛋白質を放射性同位体又は蛍光色素などで標識し、この標識した蛋白質を蛋白質チップにスポットすることにより、アッセイしたい蛋白質と蛋白質チップ上の蛋白質との結合性を、放射線又は蛍光により測定することができる。【００２１】
図１は、上記の方法により、基板上に固定されたＰＤＺドメイン蛋白質に任意の蛋白質を結合させた蛋白質チップを模式的に示す説明図である。
図１に示すように、この蛋白質チップ上では、図６に示す従来の蛋白質チップとは異なり、結合した任意の蛋白質の立体構造が保たれ、配向が揃うので、感度の高い結合解析を行うことが可能となる。
図２は、ＰＤＺドメインを安定化させるために、さらに、アフィニティタグをＰＤＺドメインを有する蛋白質に連結した蛋白質チップを模式的に示す説明図である。アフィニティタグを連結させるとＰＤＺドメインとコンセンサス配列との結合力が強固に保たれる理由は明らかではないが、アフィニティタグと結合することにより、ＰＤＺドメインの立体構造が安定すること、あるいは、ＰＤＺドメインが基板と直接結合しないことにより、その機能が安定すること等が理由として考えられる。【００２２】
本発明の蛋白質チップにおいてはまた、ＰＤＺドメイン蛋白質を基板上に結合させ、重鎖不変領域Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体を、当該ＰＤＺドメイン蛋白質に結合させることにより、抗体がアレイされた蛋白質チップを製造することができる。
この抗体が固定化された蛋白質チップを用いれば、例えば、サンプル中に含まれる物質を、チップ上の他種類の抗体により検出・定量することが可能となる。【００２３】
図３は、ＰＤＺドメイン蛋白質を基板上に結合させ、重鎖不変領域Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体を、当該ＰＤＺドメイン蛋白質に結合させ、当該抗体に任意の蛋白質を結合可能とした蛋白質チップを示すものである。この蛋白質チップにおいては、当該抗体の蛋白質結合部位が当該基板に接触することを抑制することにより、当該抗体と任意の蛋白質との結合能力が向上している。
図３に示すように、この蛋白質チップ上では、図５に示す従来の蛋白質チップとは異なり、抗体と任意の蛋白質との結合能が低下することはないので、感度の高い結合解析を行うことが可能となる。【００２４】
ここで、抗体の重鎖不変領域Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を付加する方法としては、抗体産生細胞内で遺伝子工学的手法により重鎖不変領域Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を導入する方法や、トランスジェニックマウス（ノックインマウス含む）を用いた蛋白質の生産・修飾技術を利用する方法などが挙げられる。
ここで、抗体としては、いわゆる免疫グロブリンの代わりに、抗体の抗原認識部位の一部に相当するポリペプチドからなる抗体を用いてもよい。このポリペプチドは、目的の物質に結合することができるポリペプチドであって、例えば、ファージディスプレイ法を使用したスクリーニングにより得ることができる。【００２５】
基板にＰＤＺドメインを含む蛋白質を固定する方法としては、基板に直接固定する方法の他に、オリゴヌクレオチドを介して結合させる方法がある。
すなわち、本発明は、オリゴヌクレオチドが固定された基板、並びに、当該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、ＰＤＺドメインを有する蛋白質及びＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質の複合体を調整し、当該基板上のオリゴヌクレオチドと当該複合体のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、基板上にオリゴヌクレオチドを介してＰＤＺドメインを有する蛋白質を固定し、さらにＰＤＺドメインとＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列との結合を介して他の蛋白質を固定した、蛋白質チップを提供するものである。【００２６】
図４は、上記した任意のSLV蛋白質−PDZドメイン蛋白質−オリゴヌクレオチドを配置させる蛋白質チップの作成方法を模式的に説明する図である。
ここで、任意のオリゴヌクレオチドを基板上に結合させるには、上記した共有結合もしくは非共有結合による蛋白質の固定化方法と同様の手法を用いることができる。また、オリゴヌクレオチドの長さは、相補的なオリゴヌクレオチドと十分に結合ができるものでよく、十分に結合ができれば数塩基の誤差等があってもよい。任意のSLV蛋白質−PDZドメイン蛋白質−オリゴヌクレオチドを配置させる蛋白質チップでは、基板上に直接蛋白質を配置する場合と異なり、既に基板上に高密度にオリゴヌクレオチドを集積させる技術があるので、これを利用して、任意の蛋白質を高密度に基板上に集積させるという利点がある。【００２７】
以下、本発明の蛋白質チップの製造方法について、詳細に説明する。
本発明の蛋白質チップの製造方法は以下の工程を含む。
（Ａ）アフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、基板に固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｄ）の工程でＰＤＺドメインを有する蛋白質が固定された基板に、上記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を加えて、前記ＰＤＺドメインを有する蛋白質と前記他の蛋白質を結合させる工程。【００２８】
上記（Ａ）及び（Ｂ）の工程において、蛋白質を細胞内で発現させ又は酵素的に合成する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。すなわち、細胞内で発現させることにより蛋白質を得る方法としては、目的の蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、目的の蛋白質を製造する方法が挙げられる。また、酵素的に合成する方法としては、目的の蛋白質をコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成する方法が挙げられる。
上記方法において、目的の蛋白質をコードするＤＮＡに、Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡを用いれば、Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を容易に得ることができる。【００２９】
上記（Ｃ）の工程において、（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する方法としては、例えば、アフィニティタグに親和性を有する物質が結合したビーズ又はカラムを用いて精製する方法が挙げられる。
尚、上記（Ｄ）の工程において、ＰＤＺドメインを有する蛋白質を基板に固定する方法については、上記に詳述したとおりである。
また、上記（Ｅ）の工程において、ＰＤＺドメインを有する蛋白質と他の蛋白質を結合させるためには、ＰＤＺドメインが固定された基板に、Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列をＣ末端に有する他の蛋白質を含む溶液を添加すればよく、当該溶液には他の蛋白質以外の不純物が混合していてもよい。このように、本発明の製造方法においては、必ずしも他の蛋白質を精製する必要がないため、コスト低減にすぐれ、また、他の蛋白質にはわずか３アミノ酸配列を付加するのみでよいので、他の蛋白質の機能を損なうことなく、品質の高い蛋白質チップを提供することを可能とする。【００３０】
次に、オリゴヌクレオチドを介してＰＤＺドメインが基板に連結した、本発明の蛋白質チップの製造方法について説明する。当該製造方法は、以下の工程を含む。
（Ａ）アフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）基板にオリゴヌクレオチドを固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質に、当該ＰＤＺドメインを介して前記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を結合させ、さらに、前記アフィニティタグを介して前記オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させて、蛋白オリゴヌクレオチド複合体を作製する工程；
（Ｆ）上記（Ｄ）の工程により得られた基板に、上記（Ｅ）の工程により得られた蛋白オリゴヌクレオチド複合体を加えて、基板上のオリゴヌクレオチド及び複合体のヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程。【００３１】
上記（Ａ）〜（Ｃ）の工程については、前述した方法により実施することができる。
また、上記（Ｄ）の工程において、基板にオリゴヌクレオチドを固定する方法としては、公知のＤＮＡアレイの製造方法を使用することができる。公知のＤＮＡアレイの製造方法としては、ＤＮＡをフォトリソグラフィー技術やインクジェット技術により基材上で一塩基ずつ、プローブＤＮＡを合成させながら固定化する方法と、あらかじめ別途合成させておいたプローブＤＮＡをメカニカルマイクロスポッティング技術やインクジェット技術で基材上に固定化する方法が挙げられる。
上記（Ｅ）の工程において、ＰＤＺドメインを有する蛋白質に、オリゴヌクレオチドを結合させる方法としては、例えば、アフィニティータグとしてアビジンを使用し、該アビジンを介して、ビオチン標識したオリゴヌクレオチドを連結する方法が挙げられる。
オリゴヌクレオチドにビオチンを結合させる方法としては、酵素を使用する方法などがある（特許文献１２：国際公開第９５／０４０６９号パンフレット、特許文献４：特開２００３−１５３６９８号公報、特許文献６：特開２００４−２３０５４５号公報）。【００３２】
本発明の一つの実施形態として、上記（Ｄ）の工程において、互いに配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを基板上に配列させ、上記（Ｅ）の工程において複合体を作製するにあたり、基板上の任意の場所のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを使用することにより、任意の蛋白質を基板上の任意の場所に固定させることが可能となる。
また、本発明は、オリゴヌクレオチドが固定された基板、及び、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合したＰＤＺドメインを有する蛋白質を含むキットを提供する。このキットにより、特別な装置を備えていない研究室内においても、任意の蛋白質を任意の基板上の位置にアレイした蛋白質チップを作製することが可能となる。【００３３】
以上、本発明の蛋白質チップについて、具体的な実施の形態を示して説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、上記した蛋白質チップの各実施形態に様々な変更・改良を加えることが可能である。
【実施例１】
【００３４】
PDZドメイン蛋白質、及びPDZドメイン-ストレプトアビジン蛋白質融合体産生系の構築
FAP-1 （非特許文献２：Sato, T., et al. Science 268, pp.411-415, 1995）由来のcDNA、HFAPD（FAP-1の3,898〜5,712（開始コドンは+64位））(配列番号２)を含むpGEXプラスミドを鋳型に、PCRによってPDZドメインを含むDNA断片を調製した。ストレプトアビジン領域（Stv）は、Streptomyces avidiniiのゲノムDNA（ATCCF＃27149）を鋳型にPCRで調製した。PDZ及びStvは一旦pBluescript II SK（ストラタジーン社）にサブクローン化後pSK[KpnI/XhoI/HindIII]-Stv-PDZ、作製したプラスミドを鋳型にpGEX- 6P-1[BamHI/SmaI] （アマシャムバイオサイエンス社）への挿入用のPCR断片を調製し繋ぎ変えた。以下にPCRに使用したプライマーを記す。【００３５】
pSK[KpnI/XhoI/HindIII]-Stv-PDZ作製用
Stv-PDZのStv部分（Forward）： 5’-GGGGTACCACCATGGGCATCACCGGCACCTGG -3’(配列番号３)
Stv-PDZのStv部分（Reverse）： 5’-CCGCTCGAGAGCACCTTGGTGAAGGTGTC -3（配列番号４）
Stv-PDZのPDZ部分（Forward）： 5’-CCGCTCGAGAAGATGAATTTTAAAACT -3’（配列番号５）
Stv-PDZのPDZ部分（Reverse）： 5’-CCCAAGCTTATCATCACTGTGGGGTTACCGGGAC -3’（配列番号６）
pGEX-6P-1[BamHI/SmaI]-Stv-PDZ
（Forward）：5’-CGGGATCCGGCGAATTGGGTACCACCATG-3’（配列番号７）
（Reverse：M13 reverse）：5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’（配列番号８）【００３６】
得られたプラスミドで形質転換した大腸菌BL21を培養し（37℃、3.5時間，0.1mM IPTG添加後25℃で4.5時間）、PBSに懸濁後、リゾチーム処理（終濃度1mg/mL），超音波破砕後、Triton X-100（終濃度1%）を加え４℃にて30分放置後、遠心分離し上清を細胞溶解液として調製した。これにグルタチオンセファロース 4B（アマシャムバイオサイエンス社）を加え４℃にて１晩混合後、遠心分離にてビーズを沈殿、PBSにて洗浄し（５回）、50mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 5mM DTT, 10% Glycerolに懸濁し（50% slurry）、これを各GST融合蛋白質が結合したグルタチオンビーズとした。一部をサンプルバッファーに懸濁・加熱後、10% SDS-PAGEで分画し、CBB染色（Quick-CBB, 和光純薬工業社）により融合蛋白質の産生を確認した。図７に示すように、GST-HFAPDは一部分解が認められたが、GST-Stv-PDZは比較的分子量が保たれていた。
【実施例２】
【００３７】
・  C末端にSLV配列を有するヒトリボゾーム蛋白質の産生系構築
C末端にSLV配列を有する任意の蛋白質としてヒトリボゾーム蛋白質の培養細胞用発現プラスミドを作製した。ヒトリボゾーム蛋白質-SLVは、5’側に制限酵素認識部位、3’側にSLVのコドン、終始コドン及び制限酵素認識部位を含むプライマーセットを用い、Human Reference Total RNA（ストラタジーン社）から逆転写酵素により調製したcDNAを鋳型にPCR断片を調製し、発現ベクターpCMV-Tag-2B（ストラタジーン社）のEcoRI〜XhoI若しくはBamHI〜XhoIに挿入した。以下にPCRに使用したプライマーを記す。【００３８】
Sa
Forward：5’-GGGAATTCACCATGTCCGGAGCCCTTGATG-3’（配列番号９）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATTACACCAGAGACCAGTCAGTGGTTGCTC-3’ （配列番号１０）
S4X
Forward：5’-GGGAATTCACCATGGCTCGTGGTCCCAAG-3’ （配列番号１１）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATCACACCAGAGACCCACTGCTCTGTTTGGCCG-3’ （配列番号１２）
S12
Forward：5’-CGGGATCCACCATGGCCGAGGAAGGCATTG-3’ （配列番号１３）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATCACACCAGAGATTTCTTGCATTTGAAATACT-3’ （配列番号１４）
S14
Forward：5’-GGGAATTCACCATGGCACCTCGAAAGGGG-3’ （配列番号１５）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATCACACCAGAGACAGACGGCGACCACGGCGAC-3’ （配列番号１６）
S15
Forward：5’-GGGAATTCACCATGGCAGAAGTAGAGCAG-3’ （配列番号１７）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATTACACCAGAGACTTGAGAGGGATGAAGCGGG-3’ （配列番号１８）
L5
Forward：5’-GGGAATTCACCATGGGGTTGTTAAAGTTG-3’ （配列番号１９）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATTACACCAGGCTCTCAGCAGCCCGCTCCT-3’ （配列番号２０）
L9  
Forward：5’-GGGAATTCACCATGAAGACTATTCTCAGC-3’ （配列番号２１）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATTACACCAGAGATTCATCAGCCTGCTGAACAG-3’ （配列番号２２）
L13a
Forward：5’-GGGAATTCACCATGGCGGAGGTGCAGGTCC-3’ （配列番号２３）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATCACACCAGAGAGACCAGGAGTCCGTGGGTCT-3’ （配列番号２４）
L17
Forward：5’-GGGAATTCACCATGGTTCGCTATTCACTTG-3’ （配列番号２５）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATAACACCAGAGACTCCCGTGCCATAAGTTTTT-3’ （配列番号２６）
L18
Forward：5’-GGGAATTCACCATGGGAGTGGACATCCGCC-3’ （配列番号２７）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATTACACCAGAGAGTTTTTGTAGCCTCGGCTGG-3’ （配列番号２８）
L28
Forward：5’-GGGAATTCACCATGTCTGCGCATCTGCAATG-3’ （配列番号２９）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCATCACACCAGGGAGCTCTTGGTGGGGCGGG-3’ （配列番号３０）
L32
Forward：5’-GGGAATTCACCATGGCCGCCCTCAGAC-3’ （配列番号３１）
Reverse：5’-CCGCTCGAGTCACTACACCAGAGACTCATTTTCTTCACTGCGCA-3’ （配列番号３２）【００３９】
得られたヒトリボゾーム蛋白質-SLVの発現プラスミドはFuGENE HD（ロシュ社）を用いてヒト腎臓由来293T細胞にトランスフェクションし、回収した細胞をプロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ社）を含む150m NaCｌ, 20mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA, 1% Triton X-100  に懸濁・遠心分離により細胞溶解液を調製した。各ヒトリボゾーム蛋白質-SLVは、15%SDS-PAGEによる分画後、ウェスタンブロッティングし、ベクター由来のFLAGペプチドを認識する抗FLAG抗体（シグマ社，M2）、及び２次抗体として抗マウスIgG-HRP（バイオ・ラッド社）に浸漬後、ECLにて検出した。リボゾーム蛋白質の種類によって発現の差があるものの発現が検出された。【００４０】
（２）C末端にSLVを有するGFP蛋白質の産生系構築
GFP（Green Fluorescent Protein）の発現は、大腸菌にて発現するプラスミドpGLO（バイオ・ラッド社）を鋳型に以下のプライマーで増幅したGFPのC末端にSLVを付加したアミノ酸配列をコードするPCR断片をXhoI，EcoRIで処理し、pGLOのXhoI〜EcoRI断片と入れ替えた。【００４１】
Forward：5’-ACAAACTCGAGTACAACTATA-3’ （配列番号３３）
Reverse：5’-CGAATTCATTACACCAGAGATTTGTAGAGCTCATCCAT-3’ （配列番号３４）【００４２】
GFP蛋白質は、pGLO（野生型GFPを発現）及び構築したプラスミド（GFP-SLV）を大腸菌BL21でアラビノース含有培地にて発現誘導させ、疎水クロマトグラフィー（バイオ・ラッド社Macro-Prep HIC担体）により簡易精製した。取得した粗蛋白質はGFP，GFP-SLVいずれも蛍光を発していた。
【実施例３】
【００４３】
プルダウンアッセイによるPDZドメインのFas分子の捕捉
C末端にSLVを有するFas分子を発現するJurkat細胞を細胞溶解バッファー（150mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail tablet  [ロシュ社]）で懸濁後、遠心分離により上清を調製し、この細胞溶解液を入れたチューブに、実施例１にて調製したグルタチオンビーズ懸濁物を加え、チューブを４℃にて１晩回転混合した。遠心分離により回収したビーズを、細胞溶解バッファーにて懸濁後遠心分離することにより洗浄を繰返した後、残存したバッファーとビーズが入ったチューブを加熱し、溶液を10% SDS-PAGEにて分画後、ニトロセルロース膜（Hybond C super，アマシャムバイオサイエンス社）に転写した。フィルターをブロッキング（5% スキムミルク，若しくはBSAに浸漬）後、１次抗体（抗Fas抗体，sc-715, サンタクルズ社）に浸漬し、HRP標識した２次抗体（抗ウサギIgG, BD ファーミンジェン社）に浸漬後、ECLにて検出した。GST-HFAPDと共にGST-Stv-PDZにおいてもFas分子が確認され、PDZドメインにFas分子が捕捉されプルダウンされることが確認された。
【実施例４】
【００４４】
プルダウンアッセイによるPDZドメインのリボゾーム蛋白質-SLVの捕捉
任意の蛋白質に対しSLVを付加させ、蛋白質-SLVがPDZに捕捉されるかどうかを確かめるため、リボゾーム蛋白質を例として、リボゾーム蛋白質のcDNAにPCRでC末端部にSLVをコードする配列を有するプライマーで増幅させることによりSLVを付加し、PCR産物を発現ベクターに組込み、構築したプラスミドで培養細胞に形質転換にて発現させ粗蛋白質として調製し、粗蛋白質中の各リボゾーム蛋白質-SLVがPDZによる捕捉されるかを検討した。なお、SLVが付加された各リボゾーム蛋白質の培養細胞内での発現は、実施例２（１）に示したように、予めウェスタンブロッティングにて確認した。発現が確認された各細胞の溶解液にGST-Stv-PDZビーズ若しくはGST-PDZ (HFAPD)ビーズ を添加しプルダウンさせ、ウェスタンブロッティングし、フィルター上のリボゾーム蛋白質-SLVを抗FLAG抗体によって検出した。その結果、各種リボゾーム蛋白質-SLVとPDZドメインとの結合が確認された。
【実施例５】
【００４５】
マイクロプレート上に固定したPDZドメインによる各種蛋白質-SLVの捕捉能試験
実施例１にて調製したGST融合蛋白質が結合したグルタチオンビーズに、50mM Tris-HCl pH8.0、10m 還元型グルタチオンを加え溶出・回収した溶液をPBS-Tにて透析し、各GST融合蛋白質を調製後、96穴マイクロプレートに１ウェル当たり1 ug/100uL添加し４℃一晩インキュベートし、GST融合蛋白質を固相化した。溶液を除去し、PBS-Tで洗浄，ブロッキング後、C末端にSLVを有する任意の蛋白質を添加し固定した（室温にて２時間）。検出は捕捉した抗原を認識する１次抗体を結合・洗浄後、HRP標識した２次抗体を結合し洗浄後、ABTS Peroxidase Substrate（KPL社）にて発色させ、0.1% SDSにて反応を停止後、プレートリーダー（infinite M200，テカン社）にて405nmの吸収を測定した。なお、GFPの検出には、抗GFP抗体-HRP（Miltenyi Biotec社）を使用し、２次抗体は使用しなかった。【００４６】
（１）プレートに固定したPDZドメインによる細胞溶解液中のリボゾーム蛋白質-SLVの捕捉能
GST-Stv-PDZを発現させた大腸菌BL21から調製した細胞溶解液をグルタチオンビーズに結合させ、溶出・透析したGST-Stv-PDZを96穴マイクロプレートに固定し、段階希釈したリボゾーム蛋白質-SLVを発現する293T溶解液を添加した。捕捉されたリボゾーム蛋白質を抗FLAG抗体で検出した。図８に示すように、発現量が高く、プルダウンされる量が多く認められるリボゾーム蛋白質Sa-SLVにおいてプレートに捕捉されることを確認した。また、同様に調製したGST-HFAPΔを固相化したプレートでもS14, S15, L9-SLVがPDZ固相化プレートに捕捉されることを確認した（図９）。【００４７】
・  プレートに固定したPDZドメインによるGFP-SLVの捕捉能のSLV特異性
GST-Stv-PDZを発現させた大腸菌BL21から調製した細胞溶解液をグルタチオンビーズに結合させ、溶出したGST-Stv-PDZを96穴マイクロプレートに固定し、精製したGFP及びGFP-SLVを段階希釈して加え、捕捉されたGFPを抗GFP抗体で検出した。図１０に示すように、GST固相化プレートにおいて100ugの蛋白量添加で若干非特異的な結合が認められたものの、GST-Stv-PDZプレートではGFPは殆ど結合せず、GFP-SLVにおいて特異的に結合することが確認された。
【実施例６】
【００４８】
GST-Stv-PDZのビオチンオリゴヌクレオチドを介した固定
ポリスチレンマイクロプレートの各ウェルに２本鎖DNA溶液（リボゾーム蛋白質S8, S12, S30をコードするDNA各50ngにssDNAを450ngを混合した溶液，95℃５分加熱後急冷）50uLと50uLの固定化バッファー（1.5N NaCl, 0.3M Tris-HCl pH7.5, 0.3M MgCl2）を加え、37℃にて１晩インキュベートした。溶液を除去後、37℃にて30分風乾し、UV固定（UV Stratalinker, Stratagene社）後、各ウェルを0.1M NaCl, 0.1M Tris-HCl pH9.3, 2mM MgCl2, 0.1% Tween20にて３回洗浄した。
各ウェルにプレハイブリダイズ溶液（6x SSPE, 0.05% Tween, 20mM EDTA, 5x Denhaltz, 100ng /uL ssDNA, 0.05% SDS）100uLを加え、45℃30分保持後5% BSAに室温にて１時間浸漬した。GST-Stv-PDZ 50ug（10nmole）にS12の配列を有する5’末端にビオチンを標識したオリゴヌクレオチド：
5’-TTTTTTTACGTGGAATTCGCGAAGCTGCCAAAGCCTTAGACA-3’ （配列番号３５）
2 nmole（100 uM溶液を20uL）を混合し室温にて１時間放置後、続いてGFP-SLVを50ug添加し室温にて１時間放置後、ハイブリダイズ溶液（6x SSC, 0.05% Tween, 20mM EDTA, 脱イオン化フォルムアミド, 100ng/uL ssDNA, 0.05% SDS）に添加し300uLとし、各ウェルに100uLずつ分注した。４５℃で３時間インキュベーション後、同温の6x SSPE, 0.05% Tweenにて洗浄後、PBSTにて洗浄し、抗GFP抗体-HRPを結合し呈色反応の後検出した。図１１に示すように、S12のウェルで高い結合性を示すことから、S12の配列を有するビオチン化オリゴを介したGFP-SLVの捕捉が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月31日(2008.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板；
ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質；及び、
Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質；
を含み、
当該アフィニティタグを介して当該ＰＤＺドメインを有する蛋白質が当該基板に結合し、
当該コンセンサス配列を介して当該他の蛋白質が当該ＰＤＺドメインに結合した蛋白質チップ。
【請求項２】
前記基板が、オリゴヌクレオチドが表面に固定化された基板であり、
前記アフィニティタグに、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合しており、
当該オリゴヌクレオチド及びこれに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたものである、請求項１に記載の蛋白質チップ。
【請求項３】
前記ＰＤＺドメインが、ヒトのＦＡＰ１蛋白質のＰＤＺドメインである、請求項１又は２に記載の蛋白質チップ。
【請求項４】
前記コンセンサス配列が、ＳＬＶからなる配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の蛋白質チップ。
【請求項５】
蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法：
（Ａ）ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、基板に固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｄ）の工程でＰＤＺドメインを有する蛋白質が固定された基板に、上記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を加えて、前記ＰＤＺドメインを有する蛋白質と前記他の蛋白質を結合させる工程。
【請求項６】
蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法。
（Ａ）ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）基板にオリゴヌクレオチドを固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質に、当該ＰＤＺドメインを介して前記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を結合させ、さらに、前記アフィニティタグを介して前記オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させて、蛋白オリゴヌクレオチド複合体を作製する工程；
（Ｆ）上記（Ｄ）の工程により得られた基板に、上記（Ｅ）の工程により得られた蛋白オリゴヌクレオチド複合体を加えて、基板上のオリゴヌクレオチド及び複合体のヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程。
【請求項７】
請求項６に記載の蛋白質チップの製造方法であって、
前記（Ｂ）の工程において、前記他の蛋白質が、複数種の他の蛋白質であり、
前記（Ｄ）の工程において、前記オリゴヌクレオチドが、配列の異なる複数種のオリゴヌクレオチドであり、
前記（Ｅ）の工程において、前記ＰＤＺドメインに結合させる他の蛋白質の種類に応じて、前記アフィニティタグを介して結合させるヌクレオチドの種類を異ならせることを特徴とする、蛋白質チップの製造方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが固定された基板、及び、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが、ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグを介して結合したＰＤＺドメインを有する蛋白質を含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（８）の蛋白質チップ、その製造方法及びキット
を提供するものである。
（１）  基板；
ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質；及び、
Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質；
を含み、
当該アフィニティタグを介して当該ＰＤＺドメインを有する蛋白質が当該基板に結合し、
当該コンセンサス配列を介して当該他の蛋白質が当該ＰＤＺドメインに結合した蛋白質チップ。
（２）  前記基板が、オリゴヌクレオチドが表面に固定化された基板であり、
前記アフィニティタグに、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合しており、
当該オリゴヌクレオチド及びこれに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたものである、（１）に記載の蛋白質チップ。
（３）  前記ＰＤＺドメインが、ヒトのＦＡＰ１蛋白質のＰＤＺドメインである、（１）又は（２）に記載の蛋白質チップ。
（４）  前記コンセンサス配列が、ＳＬＶからなる配列である、（１）〜（３）のいずれかに記載の蛋白質チップ。
（５）  蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法：
（Ａ）ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、基板に固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｄ）の工程でＰＤＺドメインを有する蛋白質が固定された基板に、上記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を加えて、前記ＰＤＺドメインを有する蛋白質と前記他の蛋白質を結合させる工程。
（６）  蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法。
（Ａ）ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグが連結されたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｂ）Ｃ末端にＳ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ／Ｉからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
（Ｃ）上記（Ａ）の工程で得られたＰＤＺドメインを有する蛋白質を、アフィニティタグを指標にして精製する工程；
（Ｄ）基板にオリゴヌクレオチドを固定する工程；
（Ｅ）上記（Ｃ）の工程で精製されたＰＤＺドメインを有する蛋白質に、当該ＰＤＺドメインを介して前記（Ｂ）の工程で得られた他の蛋白質を結合させ、さらに、前記アフィニティタグを介して前記オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させて、蛋白オリゴヌクレオチド複合体を作製する工程； 
（Ｆ）上記（Ｄ）の工程により得られた基板に、上記（Ｅ）の工程により得られた蛋白オリゴヌクレオチド複合体を加えて、基板上のオリゴヌクレオチド及び複合体のヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程。
（７）  （６）に記載の蛋白質チップの製造方法であって、
前記（Ｂ）の工程において、前記他の蛋白質が、複数種の他の蛋白質であり、
前記（Ｄ）の工程において、前記オリゴヌクレオチドが、配列の異なる複数種のオリゴヌクレオチドであり、
前記（Ｅ）の工程において、前記ＰＤＺドメインに結合させる他の蛋白質の種類に応じて、アフィニティタグを介して結合させるヌクレオチドの種類を異ならせることを特徴とする、蛋白質チップの製造方法。
（８）  オリゴヌクレオチドが固定された基板、及び、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが、ＧＳＴとアビジンの融合蛋白質からなるアフィニティタグを介して結合したＰＤＺドメインを有する蛋白質を含むキット。
【国際調査報告】
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2007126101.tif 000016
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