(57)【要約】本発明は、優れた標的指向性を有する癌治療用製剤を提供する。アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素を含有する本発明の糖鎖修飾リポソームなどは、優れた標的指向性を有する癌治療用製剤などとして使用することができる。
2007089043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２】
リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される一種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される一種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、請求項１記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３】
ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質がリポソーム表面上で集合しラフトを形成している請求項２記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項４】
糖鎖の種類および密度が制御されて結合されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項５】
リポソームの粒径が３０〜５００ｎｍである、請求項１から４のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項６】
リポソームの粒径が５０〜３５０ｎｍである、請求項５記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項７】
リポソームのゼータ電位が−５０〜１０ｍＶである、請求項１から６のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項８】
リポソームのゼータ電位が−４０〜０ｍＶである、請求項７記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項９】
リポソームのゼータ電位が−３０〜−１０ｍＶである、請求項８記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１０】
糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されている、請求項１から９のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１１】
リンカー蛋白質が生体由来蛋白質である請求項１０記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１２】
リンカー蛋白質がヒト由来蛋白質である請求項１１記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１３】
リンカー蛋白質がヒト由来血清蛋白質である請求項１２記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１４】
リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである請求項１１記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１５】
リンカー蛋白質がリポソーム表面上に形成されているガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質からなるラフト上に結合している請求項１から１４のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１６】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、請求項１から１５のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１７】
親水性化合物が低分子化合物である、請求項１６記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１８】
親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、請求項１６または１７記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項１９】
親水性化合物が水酸基を有する請求項１６から１８のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２０】
親水性化合物がアミノアルコール類である請求項１６から１９のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２１】
親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している請求項１６から２０のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２２】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ    式（１）
で表される請求項１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２３】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ    式（２）
で示される請求項１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、ｎは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２４】
親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ    式（３）
で示される請求項１６記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、ｎは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２５】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項１６記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２６】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項２５記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２７】
糖鎖修飾リポソームが、各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチンおよびマンノース結合レクチンを含むＣ−タイプレクチン、シグレックを含むＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体を含むＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンからなる群から選択されるレクチンを標的とする請求項１から２６のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２８】
糖鎖修飾リポソームがＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを標的とする請求項２７記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項２９】
糖鎖の結合密度が、リンカー蛋白質を用いる場合は、リポソーム１粒子当り１〜３００００個であり、リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り１〜５０００００個である、請求項１から２８のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３０】
リンカー蛋白質を含み、糖鎖の結合密度が前記リンカー蛋白質１分子当り１〜６０個である、請求項１から２８のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３１】
リポソームが腸管吸収機能を有するものである請求項１から３０のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３２】
血中、血液細胞、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織およびリンパ節からなる群から選択される組織または器官に指向性の高い、請求項１から３１のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３３】
糖鎖が、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖、オリゴマンノース５七糖鎖、オリゴマンノース６八糖鎖、オリゴマンノース７九糖鎖、オリゴマンノース８十糖鎖、オリゴマンノース９十一糖鎖、３’−シアリルラクトース三糖鎖、６’−シアリルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖、ルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、ラクトース二糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖鎖および３−フコシルラクトース三糖鎖からなる群から選択される、請求項１から３２のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれか１項に記載のリポソームを含有してなる、リポソーム製剤。
【請求項３５】
経口投与製剤である、請求項３４記載のリポソーム製剤。
【請求項３６】
非経口投与製剤である、請求項３４記載のリポソーム製剤。
【請求項３７】
アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソーム。
【請求項３８】
リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、請求項３７記載のリポソーム。
【請求項３９】
さらに、蛋白質を含む請求項３７または３８記載のリポソーム。
【請求項４０】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、請求項３７から３９のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項４１】
親水性化合物が低分子物質である、請求項４０記載のリポソーム。
【請求項４２】
親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、請求項４０または４１記載のリポソーム。
【請求項４３】
親水性化合物が水酸基を有する請求項４０から４２のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項４４】
親水性化合物がアミノアルコール類である請求項４０から４３のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項４５】
親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している請求項４０から４４のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項４６】
低分子の親水性化合物が少なくとも１つの水酸基を有する化合物である、請求項４０記載のリポソーム。
【請求項４７】
親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ    式（１）
で表される請求項４０記載のリポソームであって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、リポソーム。
【請求項４８】
親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ    式（２）
で示される請求項４０記載のリポソームであって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、ｎは自然数を示す、リポソーム。
【請求項４９】
親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ    式（３）
で示される請求項４０記載のリポソームであって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、ｎは自然数を示す、リポソーム。
【請求項５０】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項４０記載のリポソーム。
【請求項５１】
リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、請求項５０記載のリポソーム。
【請求項５２】
請求項３７から５１のいずれか１項に記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤。
【請求項５３】
経口投与製剤である、請求項５２記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤。
【請求項５４】
非経口投与製剤である、請求項５２記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性を有する薬剤を含有するリポソーム、該リポソームを含有するリポソーム製剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
米国の国家ナノテク戦略（ＮＮＩ）によって実現を目指す具体的目標の一例として、「癌細胞や標的組織を狙い撃ちする薬物や遺伝子送達システム（ＤＤＳ：ドラッグデリバリーシステム）」を掲げた。日本の総合科学技術会議のナノテクノロジー・材料分野推進戦略でも、重点領域として「医療用極小システム・材料、生物のメカニズムを活用し制御するナノバイオロジー」があり、その５年間の研究開発目標の１つとして「健康寿命延伸のための生体機能材料・ピンポイント治療等技術の基本シーズ確立」が掲げられている。一方、高齢化社会となるに伴い癌の罹患率・死亡率は年々増えており、新規な治療材料である標的指向ＤＤＳの開発が待望されている。その他の病気においても副作用のない標的指向ＤＤＳナノ材料の重要性が注目されており、その市場規模は近い将来に１０兆円を超えると予測されている。また、これらの材料は治療とともに診断への利用においても期待されている。
医薬品の治療効果は、薬物が特定の標的部位に到達し、そこで作用することにより発現される。その一方で、医薬品による副作用とは、薬物が不必要な部位に作用してしまうことである。従って、薬物を有効かつ安全に使用するためにもドラッグデリバリーシステムの開発が求められている。その中でも特に標的指向（ターゲティング）ＤＤＳとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。そのための代表的な材料としての微粒子性キャリアーであるリポソームが注目されている。この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法が試みられているが、いまだ本法は不十分であり更なる改良が求められている。
一方、高機能のターゲティングを可能にするために、能動的ターゲティング法も試みられている。これは”ミサイルドラッグ”ともよばれ理想的なターゲティング法であるが、国内外においていまだ完成されたものはなく今後の発展が大いに期待されているものである。本法は、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法である。この能動的ターゲティング法での標的となる細胞膜面上に存在するレセプターのリガンドとしては、抗原、抗体、ペプチド、糖脂質や糖蛋白質などが考えられる。これらのうち、糖脂質や糖蛋白質の糖鎖は、生体組織の発生や形態形成、細胞の増殖や分化、生体防御や受精機構、癌化とその転移機構などの様々な細胞間コミュニケーションにおいて情報分子としての重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。
また、その標的となる各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチン、マンノース結合蛋白質等のＣ−タイプレクチン、シグレック等のＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体などのＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン（糖鎖認識蛋白質）についての研究も進んできたことから、各種の分子構造を有する糖鎖は新しいＤＤＳリガンドとして注目されてきている（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４３巻、２２５−２４４頁、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３巻、３１９−３２９頁、２００１年）。
外膜表面に糖鎖を結合したリポソームについて以下が知られている。糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されており、糖鎖が、ルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖から選ばれたものであり、リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが任意に結合しており親水性化されていることを特徴とする糖鎖修飾リポソーム（特開２００３−２２６６３８号公報、米国特許出願公開第２００３／０１４３２６７号明細書）、シアリルルイスＸ糖鎖またはこれと同様にＥ−セクレチン、Ｐ−セクレチン等に反応することができる糖鎖が糖鎖の種類と密度が制御されて結合しているリポソームであって、炎症性疾患の病巣部位に標的指向性を有し、病巣部位に特異的に取り込まれ、病巣部位で封入された薬剤を放出し、病巣を治療しうる標的指向性リポソーム（国際公開第２００５／０１１６３３号パンフレット）が報告されている。さらに、各種組織の細胞表面上に存在する各種のレクチン（糖鎖認識蛋白質）に対して特異的な結合活性を有する糖鎖を結合したリポソームであって、実際の生体内の細胞、組織を識別して薬剤あるいは遺伝子を効率的に輸送しうるリポソーム、抗癌剤ドキソルビシンを封入した糖鎖修飾リポソームも報告されている（ＷＯ  ２００５／０１１６３２号公報）。
さらに、新しいタイプのＤＤＳ材料研究として、投与が最も簡便・安価に行える経口投与で使用可能なＤＤＳ材料開発も重要課題である。たとえば、ペプチド性および蛋白質性医薬品などは一般的に水溶性で高分子量であり消化管の小腸粘膜透過性が低いため酵素分解を受けるなどにより経口投与してもほとんど腸管吸収されない。そこでこれらの高分子量の医薬品や遺伝子などを腸管から血液中へ送達するためのＤＤＳ材料としてリガンド結合リポソームの研究が注目されつつある（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６５巻、１９−２９頁、２０００年）。
リガンドとして糖鎖を用いた腸管吸収制御性リポソームについて以下が知られている。ラクトース二糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖類および３−フコシルラクトース三糖鎖から選ばれた糖鎖により修飾されたリポソームであって、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソームに結合していてもよい、腸管吸収制御性リポソーム（米国特許出願公開第２００３／０１４３２６７号明細書、特開２００３−２２６６４７号公報）、糖鎖がリポソーム膜に結合されている糖鎖結合リポソームであって、使用する糖鎖の種類とリポソーム上の糖鎖結合量を適宜設定することにより、腸管吸収性が制御されたリポソーム（ＷＯ  ２００５／０１１６３２号公報）が報告されている。
【発明の開示】
【０００３】
アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素などの抗癌活性を有する薬剤について、優れた標的指向性を有する製剤、腸管吸収性制御性を有する製剤などが望まれている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、上記薬剤を含有させた糖鎖修飾リポソームが、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に対する優れた指向性、腸管吸収性制御性などを示すことを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕  アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム、
〔１ａ〕  ドセタキセル水和物を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム、
〔２〕  リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される一種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される一種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、上記〔１〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔３〕  ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質がリポソーム表面上で集合しラフトを形成している上記〔２〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔４〕  糖鎖の種類および密度が制御されて結合されている、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔５〕  リポソームの粒径が３０〜５００ｎｍである、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔６〕  リポソームの粒径が５０〜３５０ｎｍである、上記〔５〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔７〕  リポソームのゼータ電位が−５０〜１０ｍＶである、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔８〕  リポソームのゼータ電位が−４０〜０ｍＶである、上記〔７〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔９〕  リポソームのゼータ電位が−３０〜−１０ｍＶである、上記〔８〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１０〕  糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合されている、上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１１〕  リンカー蛋白質が生体由来蛋白質である上記〔１０〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１２〕  リンカー蛋白質がヒト由来蛋白質である上記〔１１〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１３〕  リンカー蛋白質がヒト由来血清蛋白質である上記〔１２〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１４〕  リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである上記〔１１〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１５〕  リンカー蛋白質がリポソーム表面上に形成されているガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも一種の脂質からなるラフト上に結合している上記〔１〕から〔１４〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１６〕  リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、上記〔１〕から〔１５〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１７〕  親水性化合物が低分子化合物である、上記〔１６〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１８〕  親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、上記〔１６〕または〔１７〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔１９〕  親水性化合物が水酸基を有する上記〔１６〕から〔１８〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔２０〕  親水性化合物がアミノアルコール類である上記〔１６〕から〔１９〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔２１〕  親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している上記〔１６〕から〔２０〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔２２〕  親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ    式（１）
で表される上記〔１６〕記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム、
〔２３〕  親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ    式（２）
で示される上記〔１６〕記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、ｎは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム、
〔２４〕  親水性化合物により親水性化され、該親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ    式（３）
で示される上記〔１６〕記載の糖鎖修飾リポソームであって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、ｎは自然数を示す、糖鎖修飾リポソーム、
〔２５〕  リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔１６〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔２６〕  リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔２５〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔２７〕  糖鎖修飾リポソームが、各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチンおよびマンノース結合レクチンを含むＣ−タイプレクチン、シグレックを含むＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体を含むＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンからなる群から選択されるレクチンを標的とする上記〔１〕から〔２６〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔２８〕  糖鎖修飾リポソームがＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを標的とする上記〔２７〕記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔２９〕  糖鎖の結合密度が、リンカー蛋白質を用いる場合は、リポソーム１粒子当り１〜３００００個であり、リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り１〜５０００００個である、上記〔１〕から〔２８〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔３０〕  リンカー蛋白質を含み、糖鎖の結合密度が前記リンカー蛋白質１分子当り１〜６０個である、上記〔１〕から〔２８〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔３１〕  リポソームが腸管吸収機能を有するものである上記〔１〕から〔３０〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔３２〕  血中、血液細胞、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織およびリンパ節からなる群から選択される組織または器官に指向性の高い、上記〔１〕から〔３１〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔３３〕  糖鎖が、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖、オリゴマンノース５七糖鎖、オリゴマンノース６八糖鎖、オリゴマンノース７九糖鎖、オリゴマンノース８十糖鎖、オリゴマンノース９十一糖鎖、３’−シアリルラクトース三糖鎖、６’−シアリルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖、ルイスＸ型三糖鎖、シアリルルイスＸ型四糖鎖、ラクトース二糖鎖、２’−フコシルラクトース三糖鎖、ジフコシルラクトース四糖鎖および３−フコシルラクトース三糖鎖からなる群から選択される、上記〔１〕から〔３２〕のいずれか１項に記載の糖鎖修飾リポソーム、
〔３４〕  上記〔１〕から〔３３〕のいずれか１項に記載のリポソームを含有してなる、リポソーム製剤、
〔３５〕  経口投与製剤である、上記〔３４〕記載のリポソーム製剤、
〔３６〕  非経口投与製剤である、上記〔３４〕記載のリポソーム製剤、
〔３７〕  アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソーム、
〔３７ａ〕  ドセタキセル水和物を含有してなる、リポソーム膜が親水性化されており、表面に糖鎖が結合していないリポソーム、
〔３８〕  リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、上記〔３７〕記載のリポソーム、
〔３９〕  さらに、蛋白質を含む上記〔３７〕または〔３８〕記載のリポソーム、
〔４０〕  リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質に親水性化合物が結合することにより親水性化されている、上記〔３７〕から〔３９〕のいずれか１項に記載のリポソーム、
〔４１〕  親水性化合物が低分子物質である、上記〔４０〕記載のリポソーム、
〔４２〕  親水性化合物が糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げない、上記〔４０〕または〔４１〕記載のリポソーム、
〔４３〕  親水性化合物が水酸基を有する上記〔４０〕から〔４２〕のいずれか１項に記載のリポソーム、
〔４４〕  親水性化合物がアミノアルコール類である上記〔４０〕から〔４３〕のいずれか１項に記載のリポソーム、
〔４５〕  親水性化合物がリポソーム膜表面に直接結合している上記〔４０〕から〔４４〕のいずれか１項に記載のリポソーム、
〔４６〕  低分子の親水性化合物が少なくとも１つの水酸基を有する化合物である、上記〔４０〕記載のリポソーム、
〔４７〕  親水性化合物が、一般式（１）
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ    式（１）
で表される上記〔４０〕記載のリポソームであって、Ｒ１は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｘはリポソーム脂質またはリンカー蛋白質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、ｎは自然数を示す、リポソーム、
〔４８〕  親水性化合物が、一般式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ    式（２）
で示される上記〔４０〕記載のリポソームであって、Ｒ３は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、ｎは自然数を示す、リポソーム、
〔４９〕  親水性化合物が、一般式（３）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ    式（３）
で示される上記〔４０〕記載のリポソームであって、Ｒ５は、Ｃ１からＣ４０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、ｎは自然数を示す、リポソーム、
〔５０〕  リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンである親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔４０〕記載のリポソーム、
〔５１〕  リポソーム膜および／またはリンカー蛋白質にトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパンからなる群から選択される親水性化合物を共有結合により結合させることによりリポソーム膜および／またはリンカー蛋白質が親水性化されている、上記〔５０〕記載のリポソーム、
〔５２〕  上記〔３７〕から〔５１〕のいずれか１項に記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤、
〔５３〕  経口投与製剤である、上記〔５２〕記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤、
〔５４〕  非経口投与製剤である、上記〔５２〕記載のリポソームを含有してなるリポソーム製剤などを提供する。
アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素を含有する糖鎖修飾リポソームは、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に対し、優れた指向性を有するので、標的とする組織または器官に対して上記薬剤を効率的に輸送しうる製剤などとして利用することができる。このように、本発明の糖鎖修飾リポソームは、高い標的指向性を有するので、上記薬剤を癌組織など標的とする組織または器官に効果的に集積させることができる。したがって、薬剤の全身投与量を増加させることなく病巣部の薬剤濃度を上げることができ、癌の成長を効率的に抑制することができる。また、癌組織など標的とする組織または器官における薬剤濃度を低下させることなく全身への投与薬剤量を減らすこともできるので、治療効果を減少させることなく薬剤による副作用を減らすことができる。
また、本発明の上記糖鎖修飾リポソームは、腸管吸収性を制御することができるので、上記薬剤を腸管経由で生体組織に移行させる製剤などとして利用することができる。
さらに、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーまたは三酸化砒素を含有するリポソームは、該リポソームに糖鎖が結合していない場合であっても、体内で非常に安定であるため、上記薬剤の体内での半減期が長くなり、標的とする組織または器官に上記薬剤を効果的に到達させることができる。したがって、本発明のリポソームは、標的とする組織または器官に対して上記薬剤を効果的に到達させうる製剤などとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２は、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図３は、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図４は、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図５は、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図６は、オリゴマンノース３五糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図７は、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図８は、オリゴマンノース５七糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図９は、オリゴマンノース６八糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１０は、オリゴマンノース７九糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１１は、オリゴマンノース８十糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１２は、オリゴマンノース９十一糖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図１３は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の血中への分布量を示す図である。
図１４は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の肝臓への分布量を示す図である。
図１５は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の脾臓への分布量を示す図である。
図１６は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の肺への分布量を示す図である。
図１７は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の脳への分布量を示す図である。
図１８は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の癌組織への分布量を示す図である。
図１９は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後のリンパ節への分布量を示す図である。
図２０は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の胸腺への分布量を示す図である。
図２１は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の心臓への分布量を示す図である。
図２２は、１３種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の小腸への分布量を示す図である。
図２３は、３’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２４は、６’−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２５は、３’’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２６は、６’−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図２７は、４種のリポソーム複合体の腸管内投与１０分後の血中への移行量を示す図である。
図２８は、４種のリポソーム複合体の腸管内投与１０分後の血中への移行量を示す図である。
図２９は、４種のリポソーム複合体の腸管内投与１０分後の血中への移行量を示す図である。
図３０は、４種のリポソーム複合体の腸管内投与１０分後の血中への移行量を示す図である。
図３１は、４種のリポソーム複合体の腸管内投与１０分後の血中への移行量を示す図である。
図３２は、比較試料としてのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅを結合したリポソームの模式図である。
図３３は、ルイスＸ型三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図３４は、シアリルルイスＸ型四糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
図３５は、ラクトース二糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図３６は、２’−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図３７は、ジフコシルラクトース四糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
図３８は、３−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマー、三酸化砒素などの抗癌活性を有する薬剤を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソーム（「本発明の糖鎖修飾リポソーム」と略記することがある）に関する。ここで、癌は、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。
上記「アロマターゼ阻害薬」としては、例えばアナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、レトロゾール（（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、ファドロゾール（ｆａｄｒｏｚｏｌｅ）、エクセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）などが挙げられる。
上記「抗アンドロゲン薬」としては、例えばビカルタミド（ｂｉｃａｌｔａｍｉｄｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）などが挙げられる。
上記「リアーゼ阻害薬」としては、例えばケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）などが挙げられる。
上記「ＧｎＲＨ作動薬」としては、例えば？
酢酸ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ  ａｃｅｔａｔｅ）、酢酸リュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ  ａｃｅｔａｔｅ）などが挙げられる。
上記「ＧｎＲＨ拮抗薬」としては、例えばセトロレリクス（ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）、ガニレリックス（ｇａｎｉｒｅｌｉｘ）、アバレリックス（ａｂａｒｅｌｉｘ）、オザレリックス（ｏｚａｒｅｌｉｘ）などが挙げられる。
上記「血管新生阻害薬」としては、例えばフマギリン（ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）などが挙げられる。
上記「チロシンキナーゼ阻害剤」としては、例えばゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）エルロチニブ（ｅｒｕｌｏｔｉｎｉｂ）、メシル酸イマチニブ（（ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｍｅｓｉｌａｔｅ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）などが挙げられる。
上記「セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤」としては、例えばソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）などが挙げられる。
上記「抗癌活性を有する抗体」としては、例えばリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、パーツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）などが挙げられる。
本発明の糖鎖修飾リポソームは、表面に種々の糖鎖を有する標的指向性リポソームおよび腸管吸収制御性リポソームを含む。本発明において、標的指向性とは生体内に投与したときに特定の組織や器官または癌等の疾患部位等の標的部位に特異的に到達し取り込まれ得る性質をいう。また、腸管吸収制御性とは、腸管経由で生体内に取り込まれる性質、すなわち腸管吸収性を有し、さらに取り込まれる速度、程度等を制御し得る性質をいう。
リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。本発明の糖鎖修飾リポソームは、図１〜１２、２３〜２６および３２〜３８に示されるように、その表面、すなわち脂質層、に糖鎖が結合している。糖鎖は直接リポソームの脂質層に結合していてもよいし、リンカー蛋白質を介して結合していてもよい。糖鎖は、その種類と密度が制御されて結合している。
糖鎖は、本発明の腸管吸収制御性リポソームおよび本発明の標的指向性リポソームの標的組織や器官または癌などに応じて種々のものを用いることができる。
病変部の血管内皮細胞に発現するＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンと白血球の細胞膜上に発現している糖鎖であるシアリルルイスＸが強く結合することが知られている。本リポソ−ムはこのシアリルルイスＸ糖鎖またはこれと同様にＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等のレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質に反応することができる糖鎖が糖鎖の種類と密度が制御されて結合しているリポソームであり、血管内皮細胞がＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等を発現している癌等の病巣部位に特異的に集積すると考えられる。またＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等を発現している部位は炎症や血管新生が生じている部位であり、そのような部位の血管は内皮細胞の細胞間隙が拡大しており、集積したリポソームがその隙間から病巣部位およびその周囲に拡散するものと考えられる。拡散したリポソームは病巣部位およびその周囲の各種細胞に取り込まれ（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、細胞内で内包している薬剤を放出する。このようなメカニズムで癌などに効果を発揮する。
以下、本発明で用いられる糖鎖、リポソームなど各要素について、より具体的に説明する。
（糖鎖）
本発明のリポソームに結合させる糖鎖として、上述のようにＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等のレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質に反応することができる糖鎖が挙げられる。ここで、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等とは、セレクチン（例、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン）、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＧＮＲ、コレクチン、マンノース結合蛋白質等のＣ−タイプレクチン、シグレック等のＩタイプレクチン、マンノース−６−リン酸受容体などのＰタイプレクチン、Ｒタイプレクチン、Ｌタイプレクチン、Ｍタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン（糖鎖認識蛋白質）をいう。本発明のリポソームが標的とする細胞は、細胞により発現するレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質の種類が異なるので、該蛋白質の種類に応じて糖鎖を選択することにより特定の細胞に特異的に指向性を有するリポソームを得ることができる。
例えば、腸管吸収制御性リポソームに用いられる糖鎖として、３’−シアリルラクトース三糖鎖（図２３に構造式を示す。以下、同様）、６’−シアリルラクトース三糖鎖（図２４）、３’−シアリルラクトサミン糖鎖（図２５）および６’−シアリルラクトサミン糖鎖（図２６）が挙げられる。標的指向性リポソームに用いられる糖鎖として、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖（図１）、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖（図２）、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖（図３）、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖（図４）、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖（図５）、オリゴマンノース３五糖鎖（図６）、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖（図７）、オリゴマンノース５七糖鎖（図８）、オリゴマンノース６八糖鎖（図９）、オリゴマンノース７九糖鎖（図１０）、オリゴマンノース８十糖鎖（図１１）、オリゴマンノース９十一糖鎖（図１２）、ルイスＸ型三糖鎖（図３３）、シアリルルイスＸ型四糖鎖（図３４）、ラクトース二糖鎖（図３５）、２’−フコシルラクトース三糖鎖（図３６）、ジフコシルラクトース四糖鎖（図３７）、３−フコシルラクトース三糖鎖（図３８）が挙げられる。
（リポソーム）
本発明に用いられるリポソームについては、膜安定性をよくすること、封入される薬物などのもれをなくすこと、膜面の親水性化処理をできるようにすること、蛋白質を各種密度で結合できるようにすること、糖鎖を各種密度で結合できるようにすること、などを可能にするために、鋭意努力をして、以下のような各種の脂質と糖脂質などを構成成分とするリポソームを作製した。本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ジセチルリン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が、また、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が、ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＴ１ｂ等が、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好ましい。このうち、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類もしくは糖脂質類、コレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。
例えば、本発明のリポソームを構成する脂質として、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含むものが挙げられる。リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。
また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。本発明で用いられるリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製することができる。
リポソームを負に荷電させるためには、フォスファチジン酸類もしくはジセチルホスフェート等の長鎖アルキルリン酸塩類を配合するのが好ましい。親水性化反応部位を提供するためには、フォスファチジルエタノールアミン類を配合するのが好ましい。リンカー蛋白質の結合部位を提供するためには、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類を配合するのが好ましい。
ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質はリポソーム中で集合し、リンカー蛋白質を結合させる足場（ラフト）として機能する。本発明のリポソームは、このような蛋白質を結合させうるラフトが形成されることによりさらに安定化される。すなわち、本発明のリポソームは、リンカー蛋白質を結合させるためのガングリオシド、糖脂質、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質のラフトが形成されたリポソームを含む。
本発明において使用するリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。上述のようにしてリポソームを作製した後にリポソーム表面を親水性化する。リポソーム表面の親水性化は、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることにより行う。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも１つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも２つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも１つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも１つのＯＨ基と少なくとも１つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。このような親水性化合物は、低分子なので、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げることはない。また、親水性化合物には、本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、レクチン等の特定の標的を指向するために用いられるレクチンが結合し得る糖鎖は含まれない。このような親水性化合物として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどを含むトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパン等が挙げられる。さらに、ＯＨ基を有する低分子化合物にアミノ基を導入した化合物も本発明の親水性化合物として用いることができる。該化合物は限定されないが、例えば、セロビオース等のレクチンが結合しない糖鎖にアミノ基を導入した化合物が挙げられる。例えば、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。親水性化合物の一般式は、下記式（１）、式（２）、式（３）等で示される。
Ｘ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ            式（１）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ      式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ            式（３）
ここで、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、Ｃ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Ｘはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、ＣＯＯＨ、ＮＨ、ＮＨ２、ＣＨＯ、ＳＨ、ＮＨＳ−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、ＥＤＣ、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。ｎは自然数を示す。
このような親水性化合物で親水性化を行ったリポソームの表面は、薄く親水性化合物で覆われている。但し、その親水性化合物の覆いの厚みは小さいので、リポソームに糖鎖を結合させた場合であっても、糖鎖等の反応性を抑制することはない。
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作成する方法（特開２０００−３０２６８５号）等の方法を採用することによっても行うことができる。
このうち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。
本発明のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが低分子量物質であるので、従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン（糖鎖認識蛋白質）による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。すなわち、本明細書において、親水性化に用いられる低分子量物質または低分子化合物とは、リポソーム表面に結合させた場合に、ポリエチレングリコールなどの高分子量物質に比べて糖鎖に対する立体障害となりにくく、標的細胞膜面上のレクチン（糖鎖認識蛋白質）による糖鎖分子認識反応の進行を妨げない物質を意味する。
また、本発明によるリポソームは該親水化処理後においても粒径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体内安定性も優れているのでリポソーム製剤化して利用するために好ましい。
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質に２価試薬を結合させ、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、該２価試薬の一方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを結合せしめる。
このように、リポソームを親水性化処理したリポソームは、生体内で極めて安定であり、後述のように標的指向性を有する糖鎖を結合しなくても、生体内での半減期が長いためドラッグデリバリーシステムにおけるドラッグ担体として好適に用いることができる。本発明は、表面を低分子化合物で親水性化したリポソームをも包含する。
本発明は、上記の親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームそのものをも包含する。このような親水性化したリポソームは、リポソーム自体の安定性が高まり、また糖鎖を結合したときに糖鎖の認識性が高まるという利点がある。
本発明で用いられるリポソームは、例えば、リポソームの構成脂質が、フォスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、フォスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩およびジセチルリン酸類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含む、リポソームである。
本発明は、さらにリポソームに上記に親水性化化合物を結合させて、リポソームを親水性化する方法をも包含する。また、糖鎖の結合していない親水性化したリポソームをも包含する（「糖鎖の結合していない親水性化したリポソーム」を「本発明のリポソーム」と略記することがある。また、「糖鎖の結合していない親水性化したリポソーム」と「本発明の糖鎖結合リポソーム」とをまとめて、「本発明のリポソーム」と略記することもある）。糖鎖の結合していないリポソームに糖鎖を結合することにより、本発明の標的指向性リポソームまたは腸管吸収性リポソームを製造することができる。
本発明のリポソームは、非常に安定であり、リポソームを形成した後に蛋白質を結合させたり、リンカー蛋白質を結合させたり、糖鎖を結合させるという後処理が可能である。従って、リポソームを大量に製造した後に、目的に応じてそれぞれ異なる蛋白質を結合させたり、リンカー蛋白質や糖鎖を結合させることにより、目的に応じた種々のリポソームを製造することが可能である。
本発明のリポソームには、糖鎖がリンカー蛋白質を介して、あるいはリポソームを構成する脂質に直接結合している。本発明のリポソームは、好ましくは、糖脂質や糖タンパク質等の複合糖質型リガンドを有し、低分子化合物で親水化処理されているリポソームである。
本発明のリポソーム、糖鎖等結合リポソームの粒径は、３０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜３５０ｎｍである。また、本発明のリポソームは、負に荷電していることが望ましい。負に荷電していることにより、生体中の負に荷電している細胞との相互作用を防ぐことができる。本発明のリポソーム表面のゼータ電位は、生理食塩水中において、３７℃で、−５０〜１０ｍＶ、好ましくは−４０〜０ｍＶ、さらに好ましくは−３０〜−１０ｍＶである。上述のように、フォスファチジン酸類もしくはジセチルホスフェート等の長鎖アルキルリン酸塩類を配合することにより、リポソームを負に荷電させることができる。
粒径、ゼータ電位は、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）を用いて測定することができる。
（リポソームへの糖鎖の結合）
本発明においては、上記のようにして作製したリポソームに、上記の糖鎖のいずれかを直接結合させてもよいし、さらに、糖鎖をリンカー蛋白質を介して結合させてもよい。この際、リポソームに結合させる糖鎖の種類は１種類に限らず、複数の糖鎖を結合させてもよい。この場合の複数の糖鎖は同じ組織または器官の細胞表面に共通して存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する複数の糖鎖であってもよいし、異なる組織または器官の細胞表面に存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する糖鎖であってもよい。前者のような複数の糖鎖を選択することにより、特定の標的組織または器官を確実に指向することができ、後者のような複数の糖鎖を選択することにより、１種類のリポソームに複数の標的を指向させることができ、マルチパーパスな標的指向性リポソームを得ることができる。
なお、糖鎖をリポソームに結合させるには、リポソームの製造時にリンカー蛋白質および／または糖鎖を混合し、リポソームを製造させつつ糖鎖をその表面に結合させることも可能であるが、あらかじめリポソーム、リンカー蛋白質および糖鎖を別途準備し、製造が完了したリポソームにリンカー蛋白質および／または糖鎖を結合させたほうが望ましい。これは、リポソームにリンカー蛋白質および／または糖鎖を結合させることにより、結合させる糖鎖の密度を制御できるからである。
糖鎖のリポソームへの直接結合は、以下に述べるような方法で行うことができる。
糖鎖を糖脂質として混合してリポソームを製造するか、製造後のリポソームのリン脂質に糖鎖を結合するとともに糖鎖密度を制御する。
リンカー蛋白質を用いて糖鎖を結合させる場合、リンカー蛋白質としては、生体由来の蛋白質、特にヒト由来蛋白質を用いるのが好ましい。生体由来の蛋白質は限定されないが、アルブミン等の血液中に存在する蛋白質、その他生体に存在する生理活性物質等が挙げられる。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。なお、リンカー蛋白質として、抗癌活性を有する蛋白質を用いてもよい。この場合、蛋白質がリポソームと糖鎖を結合させるためのリンカー蛋白質および抗癌活性を有する蛋白質を兼ねることもある。抗癌活性を有する蛋白質としては、抗癌活性を有する抗体等が挙げられる。
リンカー蛋白質は、好ましくは、リポソーム表面上に形成されている、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも１種の脂質からなる足場（ラフト）上に結合される。
糖鎖をリンカー蛋白質を介してリポソームへ結合させるには以下に述べる方法で行えばよい。
まずリポソーム表面に蛋白質を結合させる。リポソームを、ＮａＩＯ４、Ｐｂ（Ｏ２ＣＣＨ３）４、ＮａＢｉＯ３等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ４等の試薬を用いて、リンカー蛋白質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカー蛋白質も、親水性化するのが好ましく、これにはリンカー蛋白質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物をリポソーム上のリンカー蛋白質と結合させればよい。
これを具体的に述べると、まず、リンカー蛋白質の全てのアミノ基に架橋用２価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋２価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。
糖鎖および／または親水性化合物とリポソームとの共有結合、または糖鎖および／または親水性化合物とリンカー蛋白質との共有結合は、リポソームが細胞内に取り込まれたときに切断することも可能である。例えば、リンカー蛋白質と糖鎖がジスルフィド結合を介して共有結合されている場合、細胞内で還元されて糖鎖が切断される。糖鎖が切断されることによりリポソーム表面が疎水性になり、生体膜と結合し膜安定性が乱れリポソーム中に含まれる薬剤が放出される。
次に、このようにして得られる糖鎖結合リポソーム膜面上蛋白質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の２価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上蛋白質に結合している２価試薬の未反応末端とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物との結合反応を行い、リポソーム表面全体を親水性化する。
リポソーム表面およびリンカー蛋白質の親水性化は、各種組織への移行性、および血中における滞留性および各種組織への移行性を向上させる。これは、リポソーム表面およびリンカー蛋白質表面が親水性化されることによって、糖鎖以外の部分が、各組織等においてはあたかも生体内水分であるかのようにみえ、これにより、標的以外の組織等に認識されず、糖鎖のみがその標的組織のレクチン（糖鎖認識蛋白質）により認識されることに起因するものと思われる。
次いで、糖鎖をリポソーム上のリンカー蛋白質に結合させる。これには、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＮＨ２ＣＯＯＮＨ４等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３’−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカー蛋白質と、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、図１〜１２、２３〜２６および３３〜３８に示されるようなリポソームを得る。なお、これらの糖鎖は市販されている。
さらに、糖鎖を結合させた場合の糖鎖の結合密度は、リポソームに結合させるリンカー蛋白質１分子当り１〜６０個、好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個である。また、リポソーム１粒子当りは、リンカー蛋白質を用いる場合は、１〜３００００個、好ましくは１〜２００００個、さらに好ましくは１〜１００００個、あるいは１００〜３００００個、好ましくは１００〜２００００個、さらに好ましくは１００〜１００００個、あるいは５００〜３００００個、好ましくは５００〜２００００個、さらに好ましくは５００〜１００００個である。リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り最高１〜５０００００個、好ましくは１〜３０００００個、さらに好ましくは１〜１０００００個以上の糖鎖を結合させることができる。
本発明においては、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量を種々選択することにより、各標的細胞、組織に対する指向性を制御することができる。
また、糖鎖の種類と糖鎖結合量によっては腸管での吸収制御性を高めることもできる。腸管吸収制御性を高める糖鎖と特定の組織または器官への指向性を有する糖鎖の両方をリポソームに結合させることにより、特定組織または器官への指向性と腸管吸収制御性の両方の特性を併せ持ったリポソームを作製することができる。
上述のように、本発明の標的指向性リポソームは糖鎖の種類と糖鎖結合量により特異的に結合するレクチンが決まり、特定の組織または器官に特異的に到達する。また、糖鎖構造と糖鎖結合量を選択することにより癌組織等の疾患部位に到達させることも可能である。
本発明においては、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量を種々選択することにより、各標的細胞、組織に対する指向性を制御することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、糖鎖により、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織およびリンパ節等の組織または器官を指向する。例えば、図１３、１６、１７、１８、２１および２２が示すように、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖、オリゴマンノース５七糖鎖、オリゴマンノース６八糖鎖、オリゴマンノース７九糖鎖、オリゴマンノース８十糖鎖およびオリゴマンノース９十一糖鎖を結合したリポソームはすべて血中、肺、脳、癌組織、心臓および小腸への指向性が高い。また、図１４が示すように、アルファ１，２マンノビオース二糖鎖、オリゴマンノース３五糖鎖、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖を結合したリポソームは肝臓への指向性が高い。また、図１５が示すようにアルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３マンノビオース二糖鎖、アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームは脾臓への指向性が高い。また、図１９が示すようにアルファ１，２マンノビオース二糖鎖、アルファ１，４マンノビオース二糖鎖、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームはリンパ節への指向性が高い。さらに、オリゴマンノース６八糖鎖を結合したリポソームは胸腺への指向性が高い。
また、本発明の図２３〜２６に示されるリポソームは、全般的に腸管吸収性は極めて高いものの、さらに、リポソーム上の糖鎖の密度の調節を行うことにより、腸管吸収性を制御し、より効率的に標的部位へ薬剤を移行させることが可能となり、副作用の軽減化を図ることができる。例えば、図２７〜３０においては、上記４種の糖鎖修飾リポソームにおける糖鎖結合量を３段階に変更した場合における、腸管から血中への移行性（すなわち腸管吸収性）を示す。
なお、この糖鎖結合量の変更は、リンカー蛋白質結合リポソームに対して糖鎖を３段階の濃度（１）５０μｇ、２）２００μｇ、３）１ｍｇ）で結合せしめることにより行ったものである。これによれば、６’−シアリルラクトース三糖鎖、６’−シアリルラクトサミン糖鎖の場合、糖鎖密度を高くするにつれ、腸管吸収性が順次低下するが、３’−シアリルラクトース三糖鎖、３’−シアリルラクトサミン糖鎖の場合は腸管吸収性が逆に上昇する。これらのことは、腸管吸収性は、リポソーム上の糖鎖の結合量により、糖鎖の種類毎に異なることを示す。したがって、糖鎖の種類毎にリポソーム上の糖鎖結合量を適宜設定することにより、腸管吸収性を制御することが可能となる．
（薬剤を含有するリポソーム、リポソーム製剤など）
本発明のリポソームには、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマー、三酸化砒素などの抗癌活性を有する薬剤が含有されており、特定の組織または器官にリポソームが到達し、その組織または器官の細胞にリポソームが取り込まれ、前記抗癌活性を有する薬剤を放出し、抗癌作用を奏し、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、網膜肉腫、甲状腺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、十二指腸癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、原発不明癌など）の予防・治療作用を有する。糖鎖結合リポソームの場合は、糖鎖の有する標的指向性により特定の組織または器官にリポソームが到達する。また、糖鎖が結合していない場合であっても、本発明のリポソームは、体内で非常に安定なため、前記抗癌活性を有する薬剤の体内での半減期が長くなるので、特定の組織または器官に効果的に到達し得る。なお、前記抗癌活性を有する抗体は、直接または間接の抗癌活性を有していればよい。
本発明の糖鎖修飾リポソームに上記薬剤を含有させて投与した場合、薬剤を単独で投与した場合に比較し、薬剤が癌組織等の標的部位に集積する。単独投与の場合に比べ、２倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、特に好ましくは５０倍以上集積し得る。
なお、抗癌活性を有する薬剤は、リポソームの中に封入させてもよいし、リポソーム表面に結合させてもよい。リポソーム表面に結合させる場合には、例えば、抗体などの蛋白質は上記のリンカー蛋白質の結合方法と同じ方法で表面に結合させることが可能であり、他の化合物もその化合物が有する官能基を利用することにより、公知の方法で、結合させることができる。リポソーム内部への封入は、以下の方法により行う。リポソームへ薬剤等を封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、薬剤等の含有溶液とフォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類およびコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。
したがって、本発明で用いられるリポソームに抗癌活性を有する薬剤を含有させることによって得られるリポソーム製剤は、癌組織などの各種組織への移行性が選択的に制御されたものであり、治療薬剤の標的細胞、組織への集中による効力の増強あるいは他の細胞、組織に対する薬剤の取り込みの減少による副作用の軽減化等を図ることができるものである。
本発明のリポソームまたは糖鎖修飾リポソームは、医薬組成物として、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、点眼剤等による点眼投与、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ゲル化剤、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、本発明の糖鎖結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
本発明の医薬組成物の哺乳動物に対する投与経路は、限定されず、点眼、経口投与、静脈注射、筋肉注射等がある。投与量は、疾患の重篤度等により適宜決定できるが、本発明の組成物の医薬的に有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、各種疾患を治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することをいう。本発明の医薬組成物の投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。
表面に糖鎖を有するリポソームは、非経口投与（静注投与）および経口投与に適し、投与量は、標的指向性を有さない従来のリポソーム製剤に対して、数分の１から数千分の１でよい。例えば、体重１ｋｇ当り、リポソームに含ませる薬剤の量で０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇ、さらに好ましくは、０．０００１〜０．１ｍｇなどが用いられる。また、本発明のリポソームは、標的指向性を有する糖鎖を含まず親水性化合物を結合させたリポソームも含むが、該リポソームの場合も親水性処理により生体内での安定性が高く、半減期も長いので、低用量で充分な効果を有する。
【実施例】
【０００５】
本発明を以下の参考例、実施例および実験例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
参考例１  リポソームの調製
リポソームは既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合の合計脂質量４５．６ｍｇにコール酸ナトリウムを４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム（平均粒径１００ｎｍ）１０ｍｌを調製した。
参考例２  リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
参考例１で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  ４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。
参考例３  リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、参考例２で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮ  １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。
参考例４  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，２マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，２マンノビオース二糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，２マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，２マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，２マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図１で示されるアルファ１，２マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ２）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例５  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，３マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，３マンノビオース二糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，３マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  ＣＯ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，３マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，３マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図２で示されるアルファ１，３マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ３）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例６  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，４マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，４マンノビオース二糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，４マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，４マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，４マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図３で示されるアルファ１，４マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ４）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例７  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，６マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，６マンノビオース二糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，６マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，６マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，６マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図４で示されるアルファ１，６マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ６）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例８  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖の結合
アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖の結合を行った。その結果、図５で示されるアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ３６）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例９  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース３五糖鎖の結合
オリゴマンノース３五糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース３五糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース３五糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース３五糖鎖の結合を行った。その結果、図６で示されるオリゴマンノース３五糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ３）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例１０  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース４ｂ六糖鎖の結合
オリゴマンノース４ｂ六糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース４ｂ六糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース４ｂ六糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース４ｂ六糖鎖の結合を行った。その結果、図７で示されるオリゴマンノース４ｂ六糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ４ｂ）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例１１  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース５七糖鎖の結合
オリゴマンノース５七糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース５七糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース５七糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース５七糖鎖の結合を行った。その結果、図８で示されるオリゴマンノース５七糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ５）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例１２  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース６八糖鎖の結合
オリゴマンノース６八糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース６八糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース６八糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース６八糖鎖の結合を行った。その結果、図９で示されるオリゴマンノース６八糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ６）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例１３  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース７九糖鎖の結合
オリゴマンノース７九糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース７九糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース７九糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース７九糖鎖の結合を行った。その結果、図１０で示されるオリゴマンノース７九糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ７）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例１４  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース８十糖鎖の結合
オリゴマンノース８十糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース８十糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース８十糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース８十糖鎖の結合を行った。その結果、図１１で示されるオリゴマンノース８十糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ８）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例１５  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース９十一糖鎖の結合
オリゴマンノース９十一糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース９十一糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース９十一糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース９十一糖鎖の結合を行った。その結果、図１２で示されるオリゴマンノース９十一糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ９）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例１６  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合
比較試料としてのリポソームを調製するために、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、図３１で示されるｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム（略称：ＴＲＩＳ）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例１７  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理
参考例４〜１５において調製された１２種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のＨＳＡ蛋白質表面の水和性化処理を行った。１２種の糖鎖結合リポソーム２ｍｌに、別々に、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  １３ｍｇを加えて、２５℃で２時間、その後７℃で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である水和性化処理された１２種類の糖鎖結合リポソーム複合体（略称：Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ａ３６、Ｍａｎ３、Ｍａｎ４、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、Ｍａｎ９）を各２ｍｌを得た。
参考例１８  各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定
参考例４〜１５および参考例１７で調製した１２種の糖鎖結合リポソーム複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのレクチン結合活性は、常法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．（１９９９）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，１４，４９８−５０５）に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン（ＣｏｎＡ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を９６穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフェチュイン０．１μｇとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体（蛋白質量として、０．０１μｇ、０．０４μｇ、０．１１μｇ、０．３３μｇ、１μｇ）を加え、４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄した後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰＯ）結合ストレプトアビジンを添加し、さらに４℃で１時間インキュベート、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）で測定した。フェチュインのビオチン化は、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）処理後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）により精製した。ＨＲＰＯ結合ストレプトアビジンは、ＨＲＰＯの酸化とＮａＢＨ３ＣＮを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表１に示す。
【表１】
2007089043.tif 000003
2007089043.tif 000004
参考例１９  クロラミンＴ法による各種糖鎖結合リポソームの１２５Ｉ標識
クロラミンＴ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ３ｍｇ／ｍｌ並びに５ｍｇ／ｍｌとなるように用時調製して用いた。参考例４から１６において調製した１２種の糖鎖結合リポソーム並びにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ結合リポソームとを５０μｌずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて１２５Ｉ−ＮａＩ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を１５μｌ、クロラミンＴ溶液を１０μｌ加え反応させた。５分ごとにクロラミンＴ溶液１０μｌを加え、この操作を２回繰り返した後１５分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム１００μｌ加え、反応を停止させた。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ｐｈｒａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｓｗｅｄｅｎ）カラムクロマト上に乗せ、ＰＢＳで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性（４ｘ１０６Ｂｑ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を調製して１３種類の１２５Ｉ標識リポソーム液を得た。
参考例２０  各種の糖鎖結合リポソーム複合体の担癌マウスでの各組織への分布量の測定
Ｅｈｒｌｉｃｈ  ａｓｃｉｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ（ＥＡＴ）細胞（約２×１０７個）を雄性ｄｄＹマウス（７週齢）大腿部皮下に移植し、癌組織が０．３〜０．６ｇに発育（６〜８日後）したものを本実験に用いた。この担癌マウスに参考例１９により１２５Ｉ標識した１２種の糖鎖並びにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ結合リポソーム複合体０．２ｍｌを蛋白質量として３μｇ／一匹の割合となるように尾静脈に注入投与し、６０分後に組織（血液、肝臓、脾臓、肺、脳、癌組織、癌の周囲の炎症組織、リンパ節）を摘出、各組織の放射能をガンマカウンタ（Ａｌｏｋａ  ＡＲＣ  ３００）で測定した。なお、各組織への放射能分布量は、投与全放射能に対する各組織１ｇ当たりの放射能の割合（％投与量／ｇ組織）で表示した。この結果を図１３〜図２２に示す。
参考例２１  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への３’−シアリルラクトース三糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
３’−シアリルラクトース三糖鎖（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、又は、２）２００μｇ、又は、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して３’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の３’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに３’−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図２２で示される３’−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）３ＳＬ−１、２）３ＳＬ−２，３）３ＳＬ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例２２  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への６’−シアリルラクトース三糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
６’−シアリルラクトース三糖鎖（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、又は、２）２００μｇ、又は、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して６’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の６’−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに６’−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図２３で示される６’−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）６ＳＬ−１、２）６ＳＬ−２，３）６ＳＬ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例２３  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への３’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
３’−シアリルラクトサミン糖鎖（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、又は、２）２００μｇ、又は、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して３’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の３’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに３’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図２４で示される３’−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）３ＳＬＮ−１、２）３ＳＬＮ−２，３）３ＳＬＮ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例２４  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への６’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
６’−シアリルラクトサミン糖鎖（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、又は、２）２００μｇ、又は、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して６’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、参考例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の６’−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに６’−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図２５で示される６’−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）６ＳＬＮ−１、２）６ＳＬＮ−２，３）６ＳＬＮ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
参考例２５  リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理
参考例２１〜２４の手段により調製された各１２種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のＨＳＡ蛋白質表面の親水性化処理を行った。１２種の糖鎖結合リポソーム２ｍｌに、別々に、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  １３ｍｇを加えて、２５℃で２時間、その後７℃で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された１２種類の糖鎖結合リポソーム複合体（略称：３ＳＬ−２、３ＳＬ−２、３ＳＬ−３、６ＳＬ−１、６ＳＬ−２、６ＳＬ−３、３ＳＬＮ−１、３ＳＬＮ−２、３ＳＬＮ−３、６ＳＬＮ−１、６ＳＬＮ−２、６ＳＬＮ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）を得た。
参考例２６  各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定
参考例２１〜２４および参考例１６の手段により調製した各１２種の糖鎖結合リポソーム複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのレクチン結合活性は、常法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．（１９９９）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，１４，４９８−５０５）に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を９６穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン０．１μｇとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体（蛋白質量として、０．０１μｇ、０．０４μｇ、０．１１μｇ、０．３３μｇ、１μｇ）を加え、４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄した後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰＯ）結合ストレプトアビジンを添加し、さらに４℃で１時間インキュベート、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）処理後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）により精製した。ＨＲＰＯ結合ストレプトアビジンは、ＨＲＰＯの酸化とＮａＢＨ３ＣＮを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表２に示す。
【表２】
2007089043.tif 000005
2007089043.tif 000006
参考例２７  クロラミンＴ法による各種糖鎖結合リポソームの１２５Ｉ標識
クロラミンＴ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ３ｍｇ／ｍｌ並びに５ｍｇ／ｍｌとなるように用時調製して用いた。参考例２１から２４および参考例１６により調製した１３種の糖鎖結合リポソーム並びにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ結合リポソームとを５０μｌずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて１２５Ｉ−ＮａＩ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を１５μｌ、クロラミンＴ溶液を１０μｌ加え反応させた。５分ごとにクロラミンＴ溶液１０μｌを加え、この操作を２回繰り返した後１５分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム１００μｌ加え、反応を停止させた。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ｐｈｒａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｓｗｅｄｅｎ）カラムクロマト上に乗せ、ＰＢＳで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性（４ｘ１０６Ｂｑ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を調製して１３種類の１２５Ｉ標識リポソーム液を得た。
参考例２８  各種の糖鎖結合リポソーム複合体のマウスでの腸管から血中への移行量の測定
一昼夜水分以外絶食した雄性ｄｄＹマウス（７週齢）に、参考例２７により１２５Ｉ標識された１３種の糖鎖結合並びにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ結合リポソーム複合体０．２ｍｌを蛋白質量として３μｇ／一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、１０分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液１ｍｌを採血した。そして、血中の１２５Ｉ放射能をガンマーカウンター（Ａｌｏｌａ  ＡＲＣ３００）で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液１ｍｌ当たりの放射能の割合（％投与量／ｍｌ血液）で表示した。この結果を図２７から図３１に示す。
実施例１
（１）ドセタキセル水和物封入リポソームの調製
コール酸透析法を用いてドセタキセル水和物封入リポソームを調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝生理食塩液（ＴＡＰＳ，ｐＨ８．４）８ｍｌに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液８ｍｌを得た。このミセル懸濁液にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で２０ｍｇ／２ｍｌになるよう完全に溶解したドセタキセル水和物を攪拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドセタキセル水和物入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（ＡｍｉｃｏｎＣｏ．，ＵＳＡ）とＰＢＳ緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）を用いた限外濾過にかけ均一なドセタキセル水和物封入リポソーム粒子懸濁液１０ｍｌ（以下、ＤＣ−１液と略す）を調製した。
（２）抗癌剤ドセタキセル封入リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
ＤＣ−１液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸水素ナトリウム緩衝生理食塩液（ＣＢＳ，ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、更に７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  ４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、ドセタキセル水和物封入リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。以下、これをＤＣ−２液とよぶ。
（３）ドセタキセル水和物封入リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）の結合
ＤＣ−２液に、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５記載の方法に従いカップリング反応法を用い、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を結合した。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずＤＣ−２液１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮ  １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。次に、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合ドセタキセル水和物封入リポソーム液１０ｍｌ（以下、ＤＣ−３液と略す）を得た。
（４）ドセタキセル水和物封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）上へのアルファ１，６マンノビオース二糖鎖の結合とリンカー蛋白質
（ＨＳＡ）の親水性化処理
アルファ１，６マンノビオース二糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１５０μｇを０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，６マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物１５０μｇを得た。次にＤＣ−３液１０ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，６マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物１５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１２０ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，６マンノビオース二糖鎖の結合と親水性化処理を行った。その結果、アルファ１，６マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をしたドセタキセル水和物封入リポソーム（以下、ＤＣ−Ａ６と略す）１０ｍｌ（総脂質量２０ｍｇ、総蛋白量２ｍｇ）が得られた。
（５）ドセタキセル水和物封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）上へのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合によるリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理
ＤＣ−３液１０ｍｌに架橋試薬３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム液にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｗａｋｏ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）１２０ｍｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの結合を行った。その結果、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質（ＨＳＡ）の親水性化処理をした抗癌剤ドセタキセル封入リポソーム（以下、ＤＣ−ＴＲＩＳと略す）１０ｍｌ（総脂質量２０ｍｇ、総蛋白量２ｍｇ）が得られた。
実験例１
（１）化合物定量法
実施例１で得られたＤＣ−Ａ６およびＤＣ−ＴＲＩＳに含まれるドセタキセル水和物量、およびＤＣ−Ａ６およびＤＣ−ＴＲＩＳ投与後の動物組織に含まれるドセタキセル水和物量をＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５年，７７巻，４６７７−４６８３頁記載の方法に従い、以下のように測定した。
ＨＰＬＣシステムはＬＣ−１０ＡＤｖｐシステム（島津製作所）を、ＭＳ／ＭＳシステムはＡＰＩ４０００（ＡＢ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ）を使用した。
無投与群の血漿（コントロール）５０μＬにドセタキセル水和物希釈標準５μＬおよび内部標準液５μＬを加えて同様に処理した試料を標準検量線用試料とした。
ＤＣ−Ａ６、ＤＣ−ＴＲＩＳ、血漿試料、組織抽出液または標準検量線用試料５０μＬに０．２％蟻酸含有メタノール５μＬ、パクリタキセルの０．２％蟻酸含有メタノール溶液（内部標準液，Ｉ．Ｓ．）５μＬおよびアセトニトリル０．１５ｍＬを添加し、攪拌した後、４℃で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。遠心上清１００μＬを採取し、ＨＰＬＣ移動相（Ａ）を０．１ｍＬ加え攪拌、４℃で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した試料溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
標準検量線用試料は以下の終濃度となるように調製した；５０００、２０００、１０００、５００、１００、５０および２０μｇ／ｍＬ。
ＨＰＬＣによるクロマト分離には分離カラムとしてＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧＩＩ（粒子径；５μｍ、内径；２．０ｍｍ，長さ；２０ｍｍ、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ）を用い、グラジエントモードで実施した。移動相（Ａ）には１０ｍｍｏｌ／Ｌ蟻酸アンモニウム／蟻酸（５００：１、ｖ／ｖ）を、移動相（Ｂ）にはメタノール／蟻酸（５００：１、ｖ／ｖ）を用い、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ．で送液した。グラジエントプログラムは移動相（Ｂ）濃度を０分（分析開始時）から１分まで５０％、その後３分までに９０％に直線的に上昇させた。その後５分まで９０％で送液し、５．１分後に５０％まで低下させ、分析終了時間（８分）まで同条件で送液させた。なお、スイッチングバルブを用い、分析時間３．０−６分の溶出液をＭＳ／ＭＳに導入させた。カラム温度は４０℃、サンプル注入量は１５μＬで分析を実施した。
ＭＳ／ＭＳ分析はイオン化モードとしてターボイオンスプレーを用い、陽イオンモードでのｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＲＭ）によりイオンを検出した。イオンスプレーにはゼロエアーを用い、電圧は４．２ｋＶで実施した。イオンの衝突誘起分解には窒素を用いた。モニターイオンとしてプリカーサーイオン、フラグメントイオンをそれぞれドセタキセル；８０８．４Ｄａ→５２６．９Ｄａ、パクリタキセル（Ｉ．Ｓ．：内部標準）；８５４．５Ｄａ→５６９．４Ｄａに設定した。
ドセタキセルとＩ．Ｓ．であるパクリタキセルとのピーク面積比を用い、標準検量線の回帰式（１／濃度の重み付け）から各試料のドセタキセル水和物の濃度を算出した。
（２）動物実験および検体調製法
ＤＣ−Ａ６およびＤＣ−ＴＲＩＳに含まれるドセタキセル水和物の組織（腫瘍を含む）動態は、ヒト癌細胞ヌードマウス移植系を用いて測定した。５００万個のヒト乳癌細胞ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣより購入）を、マトリゲル溶液に懸濁してＢＡＬＢ／ｃ系雌ヌードマウス（６週齢）の胸部皮下に移植した（Ｐｒｏｃ．ＮＡＳ，ｖｏｌ．８７，６６９８−６７２０，１９９０）。移植直後および移植後７日目に、腫瘍の生着率を高める目的で、ジプロピオン酸エストラジオール（５ｍｇ／ｍＬ溶液）５０μＬを、後足に筋肉内投与した。移植後２１−２８日目まで腫瘍径を測定し、腫瘍サイズを揃えたマウスを一群当たり３匹実験に使用した。
実施例１で得られたＤＣ−Ａ６、実施例１で得られたＤＣ−ＴＲＩＳ、生理食塩水（溶媒対照）、および製剤対照〔タキソテール注（商品名）、ドセタキセル水和物注射液、サノフィ・アベンティスより購入、添付文書に従い調製〕を、各々０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、マウス尾静脈から投与した。投与後、０．５，１，２，４，８および２４時間後にマウスを屠殺し、血液、肝臓、腎臓、筋肉および腫瘍を採取した。血液は採取後、速やかに遠心分離（４℃、１０，０００  ｘ  ｇ）し、血漿成分を分離した。これを血漿試料とした。他臓器は速やかに４倍量（重量比）の生理食塩水を加え、４℃、３分間のポリトロン処理で完全なホモジネートとした。これらを組織抽出液としドセタキセル水和物量の測定に供した。
（３）結果
ＤＣ−Ａ６およびＤＣ−ＴＲＩＳに含まれるドセタキセル水和物の含有量を定量した。結果、ＤＣ−Ａ６およびＤＣ−ＴＲＩＳに含まれるドセタキセル水和物は、いずれも６３μｇ／ｍＬであった。
次に、ＤＣ−Ａ６またはＤＣ−ＴＲＩＳを投薬した動物の、腫瘍を含む組織内のドセタキセル水和物含有量を測定した。ＤＣ−Ａ６投薬群およびＤＣ−ＴＲＩＳ投薬群のいずれも０．５時間目以降の腫瘍試料からドセタキセル水和物が検出され、血液中から腫瘍へと速やかに移行することが明らかとなった。
これより本発明のリポソームは、優れた標的指向性を有する癌治療用製剤などとして使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなる、糖鎖がリポソーム膜に結合している糖鎖修飾リポソームは、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量により、各標的組織または器官の細胞表面に存在するレクチンまたはレクチン様の糖鎖結合部位を有する蛋白質に対する結合活性が異なるので、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に対して優れた指向性を有し、標的とする組織または器官に対して上記薬剤を効率的に輸送しうる抗癌剤などとして利用することができる。
また、本発明の上記糖鎖修飾リポソームは、使用する糖鎖の構造と糖鎖結合量により腸管吸収性が異なるので、糖鎖の種類毎にリポソーム上の糖鎖結合量を適宜設定することにより腸管吸収性を制御することができ、上記薬剤を腸管経由で生体組織に移行させる製剤などとして利用することができる。
さらに、アロマターゼ阻害薬、抗アンドロゲン薬、リアーゼ阻害薬、ＧｎＲＨ作動薬、ＧｎＲＨ拮抗薬、血管新生阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、抗癌活性を有する抗体、アンサマイトシン、カペシタビン、セルモロイキン、ドセタキセル水和物、塩酸ゲムシタビン、オキサリプラチン、プレドニゾロン、テガフール・ウラシル配合剤、ジノスタチンスチラマーおよび三酸化砒素から選ばれる少なくとも一種を含有してなるリポソームは、該リポソームに糖鎖が結合していない場合であっても、体内で非常に安定であるため、上記薬剤の体内での半減期が長くなり、血中、肝臓、脾臓、肺、脳、小腸、心臓、胸腺、腎臓、膵臓、筋肉、大腸、骨、骨髄、眼、卵巣、胎盤、前立腺、下垂体、乳腺、血管、皮膚、胆のう、胆管、膀胱、脂肪組織、癌組織、炎症組織、リンパ節などの組織または器官に上記薬剤を効果的に到達させることができる。したがって、本発明のリポソームは、上記の組織または器官に対して上記薬剤を効果的に到達させうる抗癌剤などとして利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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