【手続補正書】
【提出日】平成20年9月8日(2008.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在しないバクテリア細胞であって：
ｉ）発現が調節されるべきタンパク質をコードし、且つ動作可能にこれに結合されたＤＮＡ配列と、
ｉｉ）ＲＮＡＩＩ配列またはその一部を模倣し、且つＣｏｌＥ１複製開始点を備えたプラスミドから転写可能なＲＮＡＩ配列に対して相補的なＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列と
を含んだバクテリア細胞。
【請求項２】
請求項１に記載のバクテリア細胞であって、そのゲノムに組み込まれた前記ＤＮＡ配列ｉ）およびｉｉ）を含むバクテリア細胞。
【請求項３】
請求項１または２に記載のバクテリア細胞であって、前記ＤＮＡ配列ｉ）は、前記細胞に対して外来のＤＮＡ配列であるバクテリア細胞。
【請求項４】
請求項３に記載のバクテリア細胞であって、前記外来ＤＮＡ配列ｉ）が、前記細胞に対して致死的または毒性であるタンパク質をコードするバクテリア細胞。
【請求項５】
請求項４に記載のバクテリア細胞であって、前記外来ＤＮＡ配列ｉ）が、誘導性プロモータの制御下にあるバクテリア細胞。
【請求項６】
請求項４に記載のバクテリア細胞であって、前記外来ＤＮＡ配列ｉ）は、それ自身が、または毒性物質を発生させることによって、前記細胞に対して致死的または毒性であるタンパク質をコードするバクテリア細胞。
【請求項７】
請求項４に記載のバクテリア細胞であって、前記外来ＤＮＡ配列ｉ）は、前記細胞の増殖に不可欠な必須遺伝子の転写を抑制することによって、前記バクテリア細胞に対して致死的または毒性であるリプレッサタンパク質をコードするバクテリア細胞。
【請求項８】
請求項７に記載のバクテリア細胞であって、前記必須遺伝子がプロモータに対して動作可能に連結されるように操作され、該プロモータは、前記リプレッサタンパク質によって認識され且つ特異的に結合されるＤＮＡ配列を含んだバクテリア細胞。
【請求項９】
請求項８に記載のバクテリア細胞であって、前記必須遺伝子に連結された前記プロモータが誘導性であるバクテリア細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載のバクテリア細胞であって、前記誘導性プロモータは、請求項５の誘導性プロモータとは独立に誘導可能であるバクテリア細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載のバクテリア細胞であって、前記ＤＮＡ配列ｉｉ）が、前記ＤＮＡ配列ｉ）のリボゾーム結合部位と開始コドンの間に挿入されるバクテリア細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載のバクテリア細胞であって、前記ＤＮＡ配列ｉ）および前記ＤＮＡ配列ｉｉ）は、それらが融合タンパク質をコードするように連結されるバクテリア細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載のバクテリア細胞であって、前記ＤＮＡ配列ｉ）および前記ＤＮＡ配列ｉｉ）が翻訳によって結合されるバクテリア細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載のバクテリア細胞であって、ＣｏｌＥ１複製開始点を備えたプラスミドを複製する能力を有するバクテリア細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載のバクテリア細胞であって、それが大腸菌細胞であるバクテリア細胞。
【請求項１６】
宿主ベクター系であって、
ａ）ＣｏｌＥ１複製開始点を備えたプラスミドと；
ｂ）その中で前記プラスミドａ）を複製することができるバクテリア宿主細胞と
を含んでなり、
該宿主細胞は、
ｉ）その発現が調節されるべきタンパク質をコードし、且つ動作可能にこれに結合されたＤＮＡ配列；および
ｉｉ）ＲＮＡＩＩ配列またはその一部を模倣し、且つ前記プラスミドａ）から転写可能なＲＮＡＩ配列に対して相補的なＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列
を含み、
前記ｉｉ）に定義されたＲＮＡ配列は、前記プラスミドａ）の不存在下で前記タンパク質の発現を可能にし、
また前記プラスミドａ）が前記宿主細胞ｂ）の中に存在するときに、前記プラスミドから転写された前記ＲＮＡＩ分子は、ｉｉ）で定義されたＲＮＡ配列とハイブリダイズし、それによって前記タンパク質の発現が抑制される宿主ベクター系。
【請求項１７】
請求項１６に記載の宿主ベクター系であって、前記バクテリア宿主細胞ｂ）は、請求項２〜１３および請求項１５の何れか１項に定義したバックテリア細胞である宿主ベクター系。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の宿主ベクター系であって、前記外来ＤＮＡ配列ｉ）は、前記バクテリア細胞に対して致死的または毒性であるタンパク質をコードし、またｉｉ）に定義された前記ＲＮＡ配列は、前記プラスミドａ）の不存在下において、前記宿主細胞の増殖が完全にまたは部分的に阻害されるように前記致死的または毒性のタンパク質の発現を可能にし、また前記プラスミドａ）が前記宿主細胞の内部に存在するときは、前記プラスミドから転写されたＲＮＡＩ分子が、ｉｉ）で定義した前記ＲＮＡ配列とハイブリダイズし、それにより前記致死的または毒性のタンパク質の発現が抑制されて、前記プラスミドを有する細胞において前記完全なまたは部分的な増殖阻害が抑制される宿主ベクター系。
【請求項１９】
請求項１６に記載の宿主ベクター系であって、前記プラスミドａ）が、更に興味ある遺伝子を含んでいる宿主ベクター系。
【請求項２０】
請求項１９に記載の宿主ベクター系であって、前記興味ある遺伝子が治療用遺伝子である宿主ベクター系。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の宿主ベクター系であって、前記プラスミドがｐＵＣプラスミドである宿主ベクター系。
【請求項２２】
プラスミドＤＮＡを製造する方法であって：
ｉ）請求項４のバクテリア宿主細胞の集団を、ＣｏｌＥ１複製開始点を有し、且つ前記バクテリア宿主細胞内で前記プラスミドから発現されない興味ある遺伝子を含んだプラスミドを用いて形質転換する工程と、
ｉｉ）前記バクテリア宿主細胞ポピュレーションを、前記致死的または毒性のタンパク質が前記細胞内で発現される条件下において増殖させ、それによって前記タンパク質の発現は、前記プラスミドを含む細胞が前記プラスミドフリーの細胞よりも速く増殖するように、前記プラスミドフリーの細胞の増殖を完全にまたは部分的に阻害する工程と、
ｉｉｉ）プラスミドを含む細胞を回収する工程と、
ｉｖ）前記プラスミドＤＮＡを単離および精製する工程と
を含んでなる方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記興味ある遺伝子が、哺乳類における発現を可能にする真核細胞プロモーターに動作可能に結合された治療用遺伝子である方法。
【請求項２４】
興味あるタンパク質を製造する方法であって：
ｉ）請求項４のバクテリア宿主細胞の集団を、ＣｏｌＥ１複製開始点を有し、且つ前記バクテリア宿主内で前記タンパク質の発現を可能にする原核性プロモータの制御下にある興味あるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んだプラスミドを用いて形質転換する工程と、
ｉｉ）前記バクテリア宿主細胞ポピュレーションを、前記致死的または毒性のタンパク質が前記細胞内で発現される条件下において増殖させ、それによって前記タンパク質の発現は、前記プラスミドを含む細胞が前記プラスミドフリーの細胞よりも速く増殖するように、前記プラスミドフリーの細胞の増殖を完全にまたは部分的に阻害する工程と、
ｉｉｉ）前記興味あるタンパク質を回収する工程と、
ｉｖ）それを単離および精製する工程と
を含んでなる方法。
【請求項２５】
請求項２２または２４に記載の方法であって、前記プラスミドがｐＵＣプラスミドである方法。
【請求項２６】
バクテリア宿主細胞内で興味あるタンパク質を発現するプラスミドであって、前記プラスミドはマーカー遺伝子を持たず、且つ
ａ）ＣｏｌＥ１複製開始点；および
ｂ）原核性プロモータの制御下にある興味あるタンパク質をコードするＤＮＡ配列
を含んでなるプラスミド。
【請求項２７】
マーカー遺伝子を持たず、且つ
ａ）ＣｏｌＥ１複製開始点；および
ｂ）プロモーターの制御下にある興味あるタンパク質をコードするＤＮＡ配列（前記プロモーターはバクテリア宿主細胞内で前記タンパク質を発現させない）
を含んでなるプラスミド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のプラスミドであって、前記興味あるタンパク質が治療用タンパク質であり、且つ前記プロモーターは哺乳類における発現を可能にする真核細胞プロモーターであるプラスミド。