【手続補正書】
【提出日】平成20年1月23日(2008.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
さらに、Ｚｍａｘ１の細胞外ドメインは、５つのＹＷＴモチーフとその後のＥＦＧモチーフからなる４つの反復を含む。この５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復は、明白に折りたたまれたタンパク質ドメインを形成するようである。この反復はまたＬＤＬ受容体および他のＬＤＬ受容体関連タンパク質で見出される。第１の３つの５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復は、その構造が非常に類似しており、４番目は非常に異なる。グリシン１７１は、Ｚｍａｘ１中の第１の５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復の中央のＹＷＴモチーフ中に存在する。５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復がＬＤＬ受容体タンパク質中に含まれるように、Ｚｍａｘ１の他の２つの類似の５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復はまた、対応する位置にグリシンを含む。しかし、Ｚｍａｘ１中の第１の３つの５ＹＷＴ＋ＥＧＦ反復およびＬＤＬ受容体中の１つの反復の間で１７．６％のアミノ酸のみが同一である。これらの所見により、グリシン１７１はこの反復の機能に不可欠であり、グリシン１７１の変異によりＺｍａｘ１の機能が変化することが示される。ｃＤＮＡおよびペプチド配列を、図６Ａ〜６Ｊに示す。ヌクレオチド第５８２位の重要な塩基を、太字で示し、下線を引いている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０８】
＜実施例２＞
本発明は、以下の表６で証明したこれらのクローンの集合体であるＨＢＭ遺伝子領域由来のＢＡＣクローン由来のＤＮＡ配列を記載する。クローンｂ２００ｅ２１−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８６２８；配列番号１０〜１１）を、１９９７年１０月３０日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した。クローンｂ５２７ｄ１２−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８９０７；配列番号５〜９）を、１９９８年１０月２日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した。これらの配列は、当業者がＺｍａｘ１遺伝子のＤＮＡプローブ、遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー、Ｚｍａｘ１遺伝子のヌクレオチド多型、またはＺｍａｘ１遺伝子の調節エレメントを同定するために使用することができる固有の試薬である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０９】
【表６】
2004523724.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａおよび１Ｂ】
遺伝子連鎖研究で使用した個体の血統を示す図である。各個体の下はＩＤ番号、脊椎ＢＭＤのｚスコアであり、対立遺伝子は第１１染色体上の重要なマーカーを示す。黒塗りの印は、「罹患」個体を示す。「Ｎ」を含む印は、「非罹患」個体である。３７人の個体由来のＤＮＡの遺伝子型を分類した。クエスチョンマークは、未知の遺伝子型または遺伝子型分類を行っていない個体を示す。
【図２Ａおよび２Ｂ】
１１ｑ１３．３中のＨＢＭ領域のＢＡＣ／ＳＴＳ成分の物理的地図を示す図である。遺伝子、ＥＳＴ、マイクロサテライト、ランダム配列、およびＢＡＣ末端配列由来のＳＴＳマーカーを、長い横線の上に示す。ＧＤＢ中に存在するマーカーについては、同一の名前を使用した。遺伝子座名（Ｄ１１Ｓ＃＃＃＃）を、利用可能ならば最初の名称の後に括括弧中に示す。ＢＡＣ末端配列由来のＳＴＳを最初にＢＡＣ名と共に示し、その後にそれぞれクローンの左および右についてＬまたはＲで示す。２つの大きな矢印は、ＨＢＭの重要な領域を定義する遺伝子マーカーを示す。ＳＴＳの下の横線は、４倍の範囲のＢＡＣライブラリーのＰＣＲベースのスクリーニングによって同定されたＢＡＣクローンを示す。白抜きの円は、マーカーがライブラリースクリーニングの際に対応するＢＡＣライブラリーアドレスを増幅しなかったことを示す。クローン名は以下の慣習に従って使用する：ＢＡＣはＢ、プレート、列、およびカラムアドレス、その後のＨＢＭプロジェクトを示す−Ｈ（すなわち、Ｂ３６Ｆ１６−Ｈ）。
【図３Ａ〜３Ｆ】
隣接するイントロン配列を有するＺｍａｘ１のゲノム構造を示す。エクソン１中の下線の「ＡＴＧ」によって翻訳を開始する。ＨＢＭ遺伝子中の多型部位はエクソン３中に存在し、これを下線の「Ｇ」で示し、これによりこのヌクレオチドはＨＢＭ遺伝子中の「Ｔ」である。ｍＲＮＡの３’非翻訳領域を、エクソン２３（エクソン１、配列番号４０；エクソン２、配列番号４１；エクソン３、配列番号４２；エクソン４、配列番号４３；エクソン５、配列番号４４；エクソン６、配列番号４５；エクソン７、配列番号４６；エクソン８、配列番号４７；エクソン９、配列番号４８；エクソン１０、配列番号４９；エクソン１１、配列番号５０；エクソン１２、配列番号５１；エクソン１３、配列番号５２；エクソン１４、配列番号５３；エクソン１５、配列番号５４；エクソン１６、配列番号５５；エクソン１７、配列番号５６；エクソン１８、配列番号５７；エクソン１９、配列番号５８；エクソン２０、配列番号５９；エクソン２１、配列番号６０；エクソン２２、配列番号６１；ａｎｄ エクソン２３；配列番号６２）中に下線を引いた。
【図４】
ＹＷＴＤスペーサー、細胞外結合部位、ＬＤＬおよびカルシウム結合部位、システインリッチ成長因子反復、膜貫通領域、ＣＫ−ＩＩリン酸化部位を有する理想的なＰＥＳＴ領域、ならびに内在化ドメインを含むＺｍａｘ１のドメイン構成を示す図である。ＨＢＭタンパク質を生じるグリシン→バリン変化部位も示す。シグナルペプチドは、アミノ酸１〜２２に存在し、細胞外ドメインはアミノ酸２３〜１３８５に存在し、膜貫通セグメントはアミノ酸１３８６〜１４１３に存在し、細胞質ドメインはアミノ酸１４１４〜１６１５に存在する。
【図５】
ＨＢＭ遺伝子に関するＢＡＣコンティーグＢ５２７Ｄ１２およびＢ２００Ｅ２１の略図である。
【図６Ａ〜６Ｊ】
野生型遺伝子Ｚｍａｘ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。ヌクレオチド５８２でのグアニン→チミンの塩基対置換の位置に下線を引いている。この対立遺伝子変異体は、ＨＢＭ遺伝子である。ＨＢＭ遺伝子は、第１７１位でグリシン→バリンのアミノ酸が置換されたタンパク質をコードする。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）境界は塩基１〜７０であり、３’ＵＴＲ境界は塩基４９１６〜５１２０である。
【図７Ａおよび７Ｂ】
種々の組織におけるＺｍａｘ１の発現を示すノーザンブロット分析を示す図である。
【図８】
ＰＣＲ産物分析を示す図である。
【図９】
Ｚｍａｘ１エクソン３変異の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド欠失を示す図である。
【図１０Ａおよび１０Ｂ】
センスおよびアンチセンスプローブを使用した１００倍のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成によるマウスＺｍａｘ１の細胞位置決定を示す図である。
【図１１Ａおよび１１Ｂ】
センスおよびアンチセンスプローブを使用した４００倍のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成によるマウスＺｍａｘ１の細胞位置決定を示す図である。
【図１２Ａおよび１２Ｂ】
センスおよびアンチセンスプローブを使用した４００倍の骨内膜中の骨芽細胞のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成によるマウスＺｍａｘ１の細胞位置決定を示す図である。
【図１３】
ＭＣ−３Ｔ３細胞でのＺｍａｘ１発現のアンチセンス阻害を示す図である。