(57)【要約】本発明は、トウモロコシ由来のストレス誘導性転写因子及びこれをコードする遺伝子並びにこれらの利用方法に関する。すなわち、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子：（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするトウモロコシ由来のＤＮＡ、の提供。さらに、該遺伝子を導入され、高温、乾燥などの環境ストレスに対する耐性が向上したトランスジェニック植物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするトウモロコシ由来のＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御するトウモロコシ由来のタンパク質
【請求項３】
前記ストレスが乾燥ストレス、低温ストレス、高温ストレス、又は塩ストレスである請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項４】
以下の（ｃ）又は（ｄ）の組換えタンパク質。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御するトウモロコシ由来のタンパク質
【請求項５】
前記ストレスが乾燥ストレス、低温ストレス、高温ストレス、又は塩ストレスである請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項６記載の組換えベクターで形質転換されたトランスジェニック植物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物のストレス耐性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トウモロコシ由来のストレス誘導性転写因子及びこれをコードする遺伝子並びにこれらの利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、乾燥、高温、凍結、塩など、自然界における様々な環境ストレスに対応するための耐性機構を有している。こうした様々な環境ストレスに応答する遺伝子は重複しており、互いに密接に関連した細胞内応答の結果、各ストレスに対する耐性が獲得されるものと考えられている（非特許文献１）。一方で、温度、乾燥、塩ストレスに応答する遺伝子群は一部では異なっており、各々のストレスが別個のストレスとして認識されるシステムが備わっていることも示唆されている。
発明者らは、これまでにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からストレス応答性シスエレメントに結合し、その下流に存在する遺伝子の転写を特異的に活性化し、植物に環境ストレス耐性を付与する転写因子、ＤＲＥＢ遺伝子（ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ１Ｂ、ＤＲＥＢ１Ｃ、ＤＲＥＢ２Ａ、ＤＲＥＢ２Ｂ等）を単離同定した（特許文献１）。そして、これらの遺伝子を植物に導入し過剰発現させることにより、植物を矮化させることなく、ストレス耐性を付与できることを報告した（特許文献２）。
ＤＲＥＢタンパク質はＤＲＥＢ１タイプとＤＲＥＢ２タイプに大別され、いずれもＤＲＥ配列を認識して結合するＤＮＡ結合ドメイン（ＡＰ２／ＥＲＦドメイン）を有している。ＤＲＥＢ遺伝子のオーソログは、ＤＲＥＢ１タイプについては、イネ、トウモロコシ（非特許文献３）など様々な植物で研究されているが、ＤＲＥＢ２タイプについては研究が少なく、ニチニチソウのＯＲＣＡ１やイネのＯｓＤＲＥＢ２Ａが知られている程度である。
ＤＲＥＢ１タイプの遺伝子群はＡＰ２／ＥＲＦドメイン内にＣ／ＳＥＶ／ＬＲの保存配列を持つが、ＤＲＥＢ２タイプの遺伝子群はＡＥＩＲ配列を有し、この違いが両者のＤＮＡの結合特性に違いを与えていると考えられている（非特許文献２）。
ＤＲＥＢ１タイプであるＤＲＥＢ１Ａを過剰発現させた植物では乾燥、塩、低温ストレスに対する耐性の向上が観察されるのに対し、ＤＲＥＢ２タイプであるＤＲＥＢ２ＡやそのイネオーソログＯｓＤＲＥＢ２Ａを過剰発現させた植物では明確な表現型は現れず、ストレス耐性の向上も見られない（非特許文献２）。つまり、これまで知られているＤＲＥＢ２タイプの活性化には、特定領域を欠失させるなど、何らかの修飾を必要とした。
【特許文献１】特開平１０−２２８４５７号公報
【特許文献２】特開平１０−２９２３４８号公報
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１５：３２７−３３４（１９９７）
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１０：１−１７（１９９８）
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，４５：１０４２−１０５２（２００４）
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、トウモロコシ由来のＤＲＥＢ２タイプの遺伝子を同定し、その機能を解析することで、新たな環境ストレス耐性植物の提供を可能にすることを目的とする。
本発明者らは、トウモロコシよりＤＲＥＢ２Ａ類似遺伝子の同定に成功し、ＺｍＤＲＥＢ２Ａと命名した。ＺｍＤＲＥＢ２Ａは、ＤＲＥＢ２Ａとは異なり、修飾を加えることなく転写因子活性を示し、植物の環境ストレス耐性を向上させる。さらに、高温耐性をも向上させることが確認された。
すなわち、本発明はトウモロコシ由来の転写因子ＺｍＤＲＥＢ２Ａをコードする遺伝子に関する。前記遺伝子は、具体的には以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするトウモロコシ由来のＤＮＡ
本発明の遺伝子は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御するトウモロコシ由来のタンパク質
本発明の遺伝子は、乾燥ストレス、高温ストレス、又は塩ストレスといった植物の環境ストレス耐性を制御しうる。
本発明はまた、前記（ｃ）又は（ｄ）の組換えタンパク質を提供する。
この組換えタンパク質は、本発明の遺伝子を適当な宿主細胞に導入して発現させ、その培養液等から回収することによって得ることができる。
本発明はまた、本発明の遺伝子を含有する組換えベクター、当該ベクターで形質転換された宿主細胞やトランスジェニック植物も提供する。
本発明の遺伝子を導入し、高発現させたトランスジェニック植物では、乾燥ストレス、高温ストレス、又は塩ストレスといった環境ストレス耐性の向上がみられる。すなわち、本発明は、本発明の遺伝子を植物に導入することにより、該植物のストレス耐性を向上させる方法も提供する。
本発明のＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子は、公知のＤＲＥＢ２Ａやそのオーソログ（ＯｓＤＲＥＢ２Ａ等）とは異なり、修飾を加えることなく転写因子活性を示し、植物の環境ストレス耐性を向上させることができる。さらに、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子は植物の高温耐性も向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａは、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ  Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍのｃＤＮＡの全長塩基配列を示す。イントロンと考えられる部分を含むＺｍＤＲＥＢ２Ａの全長ｃＤＮＡ配列を示した。下線部はイントロンを示している。
図１Ｂは、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ  Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのｃＤＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。ＡＰ２ドメインを下線及び赤文字、核移行シグナルを二重下線で示す。Ｃ末端は酸性アミノ酸が多く、転写活性領域であると考えられる。
図２（Ａ）は、トウモロコシにおけるＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子のノーザン解析の結果を示す。（Ｂ）はＲＴ−ＰＣＲにより、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍとＬｏｎｇ  ｆｏｒｍを同時に増幅した結果を示した。各ストレス処理時（低温２４時間、高温１０分、乾燥１時間、ＮａＣｌ２４時間）において２本のバンドが確認できる。Ｄ：Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｂ：Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｎ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ
図３は、ＲＴ−ＰＣＲによるＬｏｎｇ  ｆｏｒｍとＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ  ｍＲＮＡ発現解析の結果を示す（◆：Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ  ｍＲＮＡ、■：Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ  ｍＲＮＡ  Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍの無処理の値を１として表示）。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲによるＬｏｎｇ  ｆｏｒｍとＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ  ｍＲＮＡ発現解析（Ｂ）Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍとＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのｍＲＮＡの変化量：ストレスなしの状況下からの変化量をグラフ化したもの。
図４は、トウモロコシにおけるＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子のサザン解析の結果を示す。左：Ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ条件（０．５％  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５０℃）  右：Ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ条件（０．１％  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃）
図５Ａは、Ｔ８７プロトプラストを用いたＺｍＤＲＥＢ２Ａの活性解析（ＺｍＤＲＥＢ２Ａの２つの形態のタンパク活性）の結果を示す。実験値はＧＵＳ活性をＬＵＣ活性で割り、コントロールとしてベクターのみの値を１として示した。ＤＲＥＢ２Ａ  ＦＬ：全長ＤＲＥＢ２Ａ、ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡ：改変型ＤＲＥＢ２Ａ
図５Ｂは、Ｔ８７プロトプラストを用いたＺｍＤＲＥＢ２Ａの活性ドメイン解析（ＺｍＤＲＥＢ２Ａの内部欠失変異体）の結果を示す。実験値はＧＵＳ活性をＬＵＣ活性で割り、コントロールとして空ベクターの値を１として示した。
図６は、ＺｍＤＲＥＢ２Ａの部分アミノ酸配列の相同性検索結果を示す。トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ：ＰｇＤＲＥＢ２Ａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅ：ＨｖＤＲＦ１）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ：ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ）図中赤字は相同性がある部分＝＊：４つの配列で保存されているアミノ酸  ．：３つの配列で保存されているアミノ酸。
図７は、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナにおけるＺｍＤＲＥＢ２Ａとｒｄ２９Ａ発現量を示す。
図８は、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナの特徴を示す。（Ａ）ＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナの表現型：通常生育条件下での形態を観察した。寒天培地上で２１日間育成させた植物（上段）、及び寒天培地上で２週間育成させた後、土に移植した播種後３５日（移植後１５日目）の植物（下段）。空ベクター導入株を野生型として用いた。（Ｂ）各ストレス処理によるＺｍＤＲＥＢ２Ａ及び誘導性遺伝子の発現：低温処理は４℃、乾燥処理は培地から抜いた植物を室温でシャーレの上に置いて、塩処理は２５０ｍＭのＮａＣｌで、それぞれ５時間処理することでおこなった。
図９は、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナのストレス耐性試験結果を示す。（Ａ）凍結耐性：上段  無処理、下段  凍結処理後（Ｂ）乾燥耐性  括弧内の数字は生存数／サンプル数
図１０は、３５Ｓプロモーターを利用したＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナの高温ストレス耐性を示す。
図１１は、高温ストレス負荷後の植物とその生存率（平均と標準偏差
2007032111.tif 000002
Ａ，Ｂ，ＣはそれぞれＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した植物（３ライン）を示す。
図１２は、通常の生育条件、高温ストレス条件、塩ストレス条件、乾燥ストレス条件で生育後の植物におけるノーザン解析結果を示す。図中、ＷＴはＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入していないコントロール植物、３５Ｓ：ＺｍＤＲＥＢ２Ａ−ａ，３５Ｓ：ＺｍＤＲＥＢ２Ａ−ｂ，３５Ｓ：ＺｍＤＲＥＢ２Ａ−ｃはそれぞれＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した植物（３ライン）を示す。
図１３は、ストレス誘導性ｒｄ２９Ａプロモーターを用いたＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナのストレス耐性を示す。図中、ｒｄ２９Ａ：ＺｍＤＲＥＢ２Ａ−ａ，ｒｄ２９Ａ：ＺｍＤＲＥＢ２Ａ−ｂ，ｒｄ２９Ａ：ＺｍＤＲＥＢ２Ａ−ｃはそれぞれＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した植物（３ライン）を示す。
図１４は、３５Ｓプロモーターを利用した活性型ＤＲＥＢ２Ａ（修飾ＤＲＥＢ２Ａ）過剰発現シロイヌナズナの高温ストレス耐性を示す。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００５−２７０９７０号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の遺伝子は、温度、乾燥、塩などの環境ストレスによって発現されるストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子の上流に存在するシスエレメントに結合して、転写を活性化する転写因子をコードするトウモロコシ由来の遺伝子である。前記シスエレメントには、乾燥ストレス応答性エレメント（ＤＲＥ；ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、アブシジン酸応答性エレメント（ＡＢＲＥ；ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、低温ストレス応答性エレメントなどがある。本発明の遺伝子がコードするタンパク質は、前記ストレス応答性エレメント（ＤＲＥ等）下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有するものである。
本発明の遺伝子は、例えば以下のようにして同定することができる。
１．本発明の遺伝子の同定
本発明の遺伝子は、類似の機能を有する公知の遺伝子、すなわち植物のストレス耐性遺伝子に特異的な転写因子をコードする遺伝子との相同性に基づいてスクリーニングすることができる。スクリーニングはトウモロコシのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーを調製してこれを対象に行うこともできるし、既存のトウモロコシＤＮＡデータベースを対象に行ってもよい。
スクリーニングされた遺伝子は、適宜クローニングを行った後、公知の方法により全塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定法としては、マキサム−ギルバートの化学修飾法又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法などを挙げることができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７７ＤＮＡシークエンサーなど）を用いて行われる。
こうして、トウモロコシ由来のＤＲＥＢ２Ａオーソログとして、２種のｃＤＮＡ（ＺｍＤＲＥＢ２Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｆｏｒｍ：配列番号１、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ  Ｌｏｎｇ  Ｆｏｒｍ：配列番号３）が単離された。そして、そのＯＲＦを解析することにより該遺伝子がコードするタンパク質、ＺｍＤＲＥＢ２Ａタンパク質（Ｓｈｏｒｔ  Ｆｏｒｍ：配列番号２、Ｌｏｎｇ  Ｆｏｒｍ：配列番号４）が同定された。同定された２種のｃＤＮＡのうち長いほう（Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）は、５３塩基のイントロンを含んでおり、もう一方の短いほう（Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）は含んでいなかった。Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍではイントロンの存在によるフレームシフトが起こっており、コードされているアミノ酸配列は極端に短いものと推定された。一方、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍにコードされているアミノ酸配列はＤＲＥＢ２タイプのものであると推定された。
図１ＡにＬｏｎｇ  ｆｏｒｍのｃＤＮＡの塩基配列を、ＢにＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのｃＤＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。後述するように、このＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍがＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の活性型として機能する。そしてこの活性型ＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子（配列番号１）を本発明の遺伝子と呼ぶ。
しかし、本発明の遺伝子は配列番号１で示される塩基配列に限定されるものではない。配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡからなる遺伝子も、ストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子である。ここで、ストリンジェントな条件とは、ホルムアミド濃度が３０〜５０％、３７〜５０℃、６×ＳＳＣの条件、好ましくはホルムアミド濃度が５０％、４２℃、６×ＳＳＣの条件をいう。
本発明の遺伝子は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする。ただし、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、該タンパク質がストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御する機能を有する限り、これをコードする遺伝子も本発明の遺伝子に含まれる。なお、前記数個とは好ましくは２０個以下、さらに好ましくは５個以下を意味する。
なお、本発明の遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法などの公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）など）を用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のｃＤＮＡないしゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
２．本発明のタンパク質のＤＲＥ結合能及び転写活性化能の解析
（１）ＤＲＥ結合能の解析
本発明のタンパク質のＤＲＥへの結合能は、該タンパク質とＧＳＴ等との融合タンパク質を用い、ゲルシフトアッセイ［Ｕｒａｏ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ５：１５２９−１５３９（１９９３）］を行うことにより確かめることができる。本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子をコードするプラスミド（例えば、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）など）のＧＳＴコード領域の下流にフレー厶を合わせて連結し、該プラスミドにより形質転換した大腸菌を誘導条件下で培養し、この大腸菌から精製して得ることができる。
ゲルシフトアッセイは、ＤＮＡとタンパク質との相互作用を調べる方法であり、３２Ｐなどで標識したＤＲＥを含むＤＮＡ断片と前記融合タンパク質とを混合してインキュベーションした後、該混合物を電気泳動し、ゲルを乾燥後、オートラジオグラムをとり、ＤＮＡ断片とタンパク質との結合に起因する遅れて泳動されたバンドを検出する方法である。本発明のタンパク質がＤＲＥ配列に特異的に結合していることは、ＤＲＥ配列に変異を加えたＤＮＡ断片を用いた場合に、前記のバンドが検出されないことにより確認することができる。
（２）転写活性化能の解析
本発明のタンパク質の転写活性化能は、トウモロコシのプロトプラストの系を用いるトランスアクチベーション実験法を用いることにより解析することができる。例えば、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ  ｃＤＮＡをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含むｐＢＩ２２１プラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）に連結し、エフェクタープラスミドを構築する。一方、ＤＲＥを含むＤＮＡ断片を、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子上流のＴＡＴＡプロモーターのさらに上流に連結し、レポータープラスミドを構築する。次いでこの２種のプラスミドをトウモロコシのプロトプラストに導入した後、ＧＵＳ活性を測定する。ＺｍＤＲＥＢ２Ａタンパク質を同時に発現させることにより、ＧＵＳ活性の上昇が見られれば、プロトプラスト内で発現したＺｍＤＲＥＢ２Ａタンパク質が、ＤＲＥの配列を介して転写を活性化していることがわかる。
本発明において、プロトプラストの調製及び該プロトプラストへのプラスミドＤＮＡの導入は、Ａｂｅｌらの方法［Ａｂｅｌ，Ｓ．：Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：４２１−４２７（１９９４）］により行うことができる。また、実験ごとのプラスミドＤＮＡの導入効率の差による実験誤差を最小限にするため、上記２種のプラスミドとともに、ＣＡＭＶ３５Ｓプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したプラスミドをプロトプラストに導入し、ルシフェラーゼ活性に対するβ−グルクロニダーゼ活性を測定し、得られた測定値を転写活性化能の値とすることができる。β−グルクロニダーゼ活性は、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法［Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．：ＥＭＢＯ  Ｊ．８３：８４４７−８４５１（１９８６）］により、ルシフェラーゼ活性はＰｉｃａＧｅｎｅルシフェラーゼアッセイキット（Ｔｏｙｏ−Ｉｎｋ社製）を用いることにより測定することができる。
３．組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などの大腸菌宿主用プラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５などの枯草菌用プラスミド、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０などの酵母宿主用プラスミド、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などの植物細胞宿主用プラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージなどが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
（２）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）などのシュードモナス属、リゾビウ厶・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）などのリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベなどの酵母が挙げられ、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジンなどから株化した植物細胞や該植物から調製したプロトプラストが挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が挙げられ、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１などの昆虫細胞が挙げられる。
大腸菌などの細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ  １１４、２０７−２１などが挙げられる。
プロモーターとしては、大腸菌などの宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、特に限定されず、例えばカルシウ厶イオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０−２１１４（１９７２）］、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなどが挙げられる。
酵母への組換えベクターの導入方法は、特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：  ｌ８２−１８７（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：１９２９−１９３３（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ，Ｈ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３−１６８（１９８３）］などが挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合は、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジンなどから株化した細胞や該植物から調製したプロトプラストが用いられる。この場合、プロモーターとしては植物中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーターなどが挙げられる。
植物への組換えベクターの導入方法としては、Ａｂｅｌらのポリエチレングリコールを用いる方法［Ａｂｅｌ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：４２１−４２７（１９９４）］やエレクトロポレーション法などが挙げられる。動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしては、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどを用いることができる。また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーターなどを用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
４．本発明の組換えタンパク質の生産
本発明の組換えタンパク質は、本発明の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、又は該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有し、かつストレス応答性エレメント下流の転写を制御する機能を有するものである。
本発明のタンパク質は、前記形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌などの微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。また植物細胞を宿主として用いている場合には、必要に応じて、培地にチアミン、ピリドキシンなどのビタミン類を添加し、動物細胞を宿主として用いている場合には、ＲＰＭＩ１６４０などの血清を添加する。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３０〜３７℃位で６時間〜３日間程度行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５程度に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）などを培地に添加してもよい。
培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３０〜３７℃位で６時間〜３日間程度行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
５．本発明の遺伝子を導入したトランスジェニック植物の作製
遺伝子工学的手法を用いて本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを植物宿主に導入することにより、環境ストレス、特に、高温ストレス、乾燥ストレスなどに対して抵抗性を有するトランスジェニック植物を作製することができる。本発明の遺伝子の植物宿主への導入方法としては、アグロバクテリウム感染法などの間接導入法や、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リポソーム法、マイクロインジェクション法などの直接導入法などが挙げられる。アグロバクテリウム感染法を用いる場合、以下のようにして本発明の遺伝子導入植物を作製ことができる。
（１）植物導入用組換えベクターの作製及びアグロバクテリウムの形質転換
植物導入用組換えベクターは、本発明の遺伝子を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、植物細胞用のクローニングベクターに挿入することにより得ることができる。クローニング用ベクターとしては、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・チュメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質導入用に用いる。
上記の方法以外にも、本発明においては、三者接合法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１（１９８４）］によって本発明の遺伝子を含む植物感染用アグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えばｐＲＫ２０１３など）を保有する大腸菌、及びアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシリン及びカナマイシンを含む培地上で培養することにより植物感染用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。
植物体内で外来遺伝子などを発現させるためには、構造遺伝子の前後に、それぞれ植物用のプロモーターやターミネーターなどを配置させる必要がある。本発明において利用可能なプロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓ転写物［Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ６：３９０１−３９０７（１９８７）］、トウモロコシのユビキチン［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９（１９９２）］、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成酵素遺伝子のプロモーターなどが挙げられ、ターミネーター配列としては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターなどが挙げられる。但し、植物体内で機能することが知られているプロモーターやターミネーターであればこれらのものに限定されるものではない。
ここで、用いるプロモーターが目的遺伝子の構成的発現を担うプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなど）で、これによって、遺伝子導入植物に生長の遅れや矮化が生じる場合は、目的遺伝子の一過性の発現をもたらすようなプロモーター（例えば、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーターなど）を用いることができる。また、必要に応じてプロモーター配列と本発明の遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）のイントロン［Ｇｅｎｅｓ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １：１１８３−１２００（１９８７）］を導入することができる。
さらに、効率的に目的の形質転換細胞を選択するために、有効な選択マーカー遺伝子を本発明の遺伝子と併用することが好ましい。その際に使用する選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子及びビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができる。本発明の遺伝子及び選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
（２）宿主への本発明の遺伝子の導入
本発明の形質転換体の宿主は特に限定されないが、植物であることが好ましい。該植物は、植物培養細胞、栽培植物の植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、又は植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のいずれであってもよい。植物はイネ、トウモロコシ、コムギ等の単子葉植物であることがより好ましい。植物培養細胞、植物体、植物器官又は植物組織を宿主とする場合、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、採取した植物切片にベクターをアグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法又はポリエチレングリコール法などで導入し、植物宿主を形質転換することができる。あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で導入して形質転換植物を作製することもできる。
たとえばアグロバクテリウム感染法によりシロイヌナズナに遺伝子を導入する場合、目的の遺伝子を含むプラスミドを保有するアグロバクテリウムを植物に感染させる工程が必須であるが、これは、バキュームインフィルトレーション法［ＣＲ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ，ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，３１６：１１９４（１９９３）］により行うことができる。すなわち、シロイヌナズナをバーミキュライトとパーライトを等量ずつ合わせた土で生育させ、生育させたトウモロコシを本発明の遺伝子を含むプラスミドを含むアグロバクテリウムの培養液に直接浸し、これをデシケーターに入れバキュームポンプで６５〜７０ｍｍＨｇになるまで吸引後、５〜１０分間、室温に放置する。鉢をトレーに移しラップで覆い湿度を保つ。翌日ラップを取り、植物をそのまま生育させ種子を収穫する。
次いで、種子を目的の遺伝子を保有する個体を選択するために、適切な抗生物質を加えたＭＳ寒天培地に播種する。この培地で生育したシロイヌナズナを鉢に移し、生育させることにより、本発明の遺伝子が導入されたトランスジェニネック植物の種子を得ることができる。一般に、導入遺伝子は宿主植物のゲノム中に同様に導入されるが、その導入場所が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られる。プローブとして導入遺伝子のＤＮＡ断片を用いたノーザン法で検定することによって、より導入遺伝子が強く発現している形質転換体を選抜することができる。
本発明の遺伝子を導入したトランスジェニック植物及びその次世代に目的の遺伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ法又はサザン分析を用いて導入した遺伝子を検出することにより行うことができる。
（３）本発明の遺伝子の植物組織での発現レベル及び発現部位の分析
本発明の遺伝子を導入したトランスジェニック植物における該遺伝子の発現レベル及び発現部位の分析は、これらの細胞及び組織から常法に従ってＲＮＡを抽出し、公知のＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザン分析を用いて導入した遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行うことができる。また、本発明の遺伝子産物を、該遺伝子産物に対する抗体を用いたウエスタン分析等により直接、分析することによっても行うことができる。
（４）本発明の遺伝子が導入されたトランスジェニック植物体内における各種遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化
本発明の遺伝子が導入されたトランスジェニック植物体内において、本発明の転写因子の作用により、発現レベルが変化したと考えられる遺伝子はノーザンハイブリダイゼーションによって同定することができる。
例えば、水耕栽培などで育てた植物に、所定期間（例えば１〜２週間）の環境ストレスを与える。環境ストレスとしては、高温、乾燥、塩等が挙げられる。例えば乾燥ストレスの負荷は、水耕栽培から植物体を、抜き取り濾紙上で１０分〜２４時間乾燥させることにより与えることができる。高温ストレスの負荷は、３０〜５０℃に１０分〜２４時間保持することにより与えることができる。また、塩ストレスの負荷は、例えば培地を５０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に変更し、１０分〜２４時間保持することによって与えることができる。
ストレスを与えないコントロール植物と環境ストレスを与えた植物から全ＲＮＡを調製して電気泳動を行い、発現をみたい遺伝子のプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行えば、その発現パターンが解析できる。
（５）トランスジェニック植物の環境ストレスに対する耐性の評価
本発明の遺伝子を導入したトランスジェニック植物の環境ストレスに対する耐性は、例えばバーミキュライト、パーライトなどを含む土を入れた植木鉢にトランスジェニック植物を植え、各種環境ストレスを負荷した場合の生存を調べることによって評価することができる。環境ストレスとしては、高温、乾燥、塩等が挙げられる。例えば、乾燥ストレスに対する耐性は、２〜４週間、水を与えずその生存を調べることにより評価することができる。また高温ストレスに対する耐性は、３０〜５０℃に、３０分〜１０日間おいた後、２日〜３週間、２０〜３５℃で生育させその生存率を調べることにより評価することができる。また、塩ストレスは例えば１００〜６００ｍＭ  ＮａＣｌで１時間〜７日間おいた後、１〜３週間、２０〜３５℃で生育させその生存率を調べることにより評価することができる。
６．植物のストレスレベルの測定
本発明の遺伝子は、低温ストレス、乾燥ストレス、塩ストレス，高温ストレスにより転写が活性化されるため、本発明の遺伝子の転写レベルを調べることにより、植物の受けている低温・乾燥・塩・高温などによるストレスのレベルを調べることができる。
本発明の遺伝子の転写レベルは、ＲＮＡゲルブロット分析、定量的ＰＣＲなどにより行うことができる。ＲＮＡゲルブロット分析に用いるプローブは、本発明の遺伝子及び／又は該遺伝子に隣接する特異的な配列を含む１００〜１０００ｂｐの領域を基に、公知の方法を用いて作製することができる。また定量的ＰＣＲに用いるプライマーは、本発明の遺伝子のコード領域内又はそれに隣接する領域の配列を基に、公知の方法を用いて調整することができる。
上記のプローブ又はプライマーは、本発明の遺伝子の転写レベルを測定するためのキットとして使用することもできる。
７．その他
以上述べたほか、本発明のタンパク質はこれに対する抗体を作製して利用することもできる。該抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。抗体の作製方法は、特に限定されず、公知の方法［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照］を用いて行うことができる。該抗体はウェスタンブロッティング法や、免疫沈降法による該タンパク質の検出等に利用することができる。
【実施例】
【０００６】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕ＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の単離
１．データベースのホモロジー検索
ＡＰ２／ＥＲＦドメインの配列をもとに、「ＧｅｎＢａｎｋ」のトウモロコシのＤＮＡデータベースを、Ｂｌａｓｔを用いてホモロジー検索を行い、いくつかのＥＳＴ配列を得た。最も長いＥＳＴ配列をもとに、下記のＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを設計しトウモロコシＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲにより、２種のｃＤＮＡを得た。
ＺｍＤＲＥＢ２Ａ単離用プライマー
ＡＹ１０８１９８  Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＴＣＴＴＡＴＣＧＡＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号５）
ＡＹ１０８１９８  Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号６）
得られたＺｍＤＲＥＢ２Ａ全長遺伝子のｃＤＮＡは、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７７ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列の決定を行った。さらにＯＲＦを解析して、全てのアミノ酸配列を決定した。
以上の結果、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の塩基配列（Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ：配列番号１、Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ：配列番号３）及び対応するＺｍＤＲＥＢ２Ａタンパク質のアミノ酸配列（Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ：配列番号２、Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ：配列番号４）が同定された。同定された２種のｃＤＮＡのうち長いほう（Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）は、５３塩基のイントロンを含んでおり、もう一方の短いほう（Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）は含んでいなかった。Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍはイントロン中でフレームシフトを起こしており、ＯＲＦが極端に短くなっていた。Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍはＤＲＥＢタイプの構造を示していた。図１ＡにＬｏｎｇ  ｆｏｒｍの塩基配列を、ＢにＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのｃＤＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。後述するように、このＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍがＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の活性型として機能する。
〔実施例２〕非形質転換体におけるＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現解析
トウモロコシ中におけるＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現特性をノーザン解析、ＲＴ−ＰＣＲ、サザン解析により解析した。
１．材料と方法
（１）トウモロコシの栽培条件
トウモロコシ（品種名：ゴールデンクロスバンタム）の種子を５分間、７０％エタノール処理した後、水でよく洗浄し、ステンレスメッシュの上に種子を置き、水を入れたバットに入れ、１２時間の日長で２６℃のインキュベーター内で生育させた。
（２）ストレス処理
１週間水耕栽培で生育させた植物体を以下のストレス処理で処理した。
低温処理：あらかじめ４℃に冷却しておいた水に種子を置いていたステンレスメッシュごと移した。この状態で４℃の培養器で処理した。
高温処理：あらかじめ４２℃に保温していた水に種子を置いていたステンレスメッシュごと移した。この状態で３７℃の培養器で処理した。
塩処理  ：２５０ｍＭのＮａＣｌの溶液で処理し、２６℃の培養器で処理した。
乾燥処理：根の水をよく切った状態でキムタオルの上に置いて乾燥させた。
これらの植物をそれぞれ、０分、１０分、２０分、４０分、１時間、２時間、５時間、２４時間処理した後回収し、直ちに液体窒素で凍結、−８０℃で保存した。
（３）ＲＮＡ抽出
それぞれストレス処理した植物体を凍結状態を保ちながら、ｓｈａｋｅ  ｍａｓｔｅｒ（トミー、ＢＭＳ−１２）を利用して破砕し、Ｔｒｉｚｏｌ液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて常法によりＲＮＡを抽出した。
（４）ノーザン解析
抽出したＲＮＡを６μｇとり、これを１９μｌのＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｄｙｅ［０．１％ＢＰＢ、１×ＲＮＡ泳動ｂｕｆｆｅｒ、２０％ホルムアルデヒド、６０％ホルムアミド、０．０３３μｇ／μｌＥｔＢｒ］を加え、６５℃で１５分間処理し、急冷して変性させた。
調製したＲＮＡをゲルにアプライし、１×ＲＮＡ泳動ｂｕｆｆｅｒ［０．０２Ｍ  ＭＯＰＳ、８ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］中で９０Ｖ、２時間半泳動した。これを２０×ＳＳＣを用いて、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ：ａｍａｓｈａｍ社）に一晩かけて転写し、１時間風乾した後、８０℃で２時間、減圧下で処理した。
ＺｍＤＲＥＢ２Ａに特異的なＣ末端の約５００ｂｐがプローブとなるようにプライマーを作成した。プライマーの配列は表１に示すとおりである。このプライマーを使用して、ＰＣＲによりプローブを作成した。ＰＣＲ反応液の組成（総量２０μｌ）は以下のとおりでＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）のプロトコルにしたがった。
2007032111.tif 000003
2007032111.tif 000004
電気泳動でバンドを確認した後、切り出して精製したものを、ＴａＫａＲａのＢｃａＢＥＳＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔでラベルし、プローブとして用いた。Ｒａｎｄａｍ  Ｐｒｉｍｅｒ２μｌとプローブ用鋳型ＤＮＡ溶液２５ｎｇとＲａｎｄａｍ  Ｐｒｉｍｅｒ２μｌに蒸留水を加えて全量を１４μｌにし、９５℃で３分間加熱した後、氷中で５分間急冷し変性した。これに１０×ｂｕｆｆｅｒとｄＮＴＰをそれぞれ２．５μｌ、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１μｌ、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを５μｌ加え、５５℃で１０分間処理した。反応後、セファデックスＧ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラムに通し、標識プローブと遊離の［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを分離した。
ガラスチューブにＲＮＡを転写したメンブレンを入れ、蒸留水と５×ＳＳＣ［ＮａＣｌ８０ｍＭ，クエン酸ナトリウム８０ｍＭ］溶液で洗浄した後、３０ｍｌのハイブリダイゼーションｂｕｆｆｅｒ［０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、７％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ］を加えて６５℃で３０分間以上プレハイブリダイゼーションをおこなった。ついで液を捨て新たなハイブリダイゼーションバッファー３０ｍｌに、標識したプローブを１．０×１０６ｄｐｍ／ｍｌになるように加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションをおこなった。
メンブレンの洗浄は洗浄液１［１×ＳＳＣ，１×ＳＤＳ］で６５℃、５分間洗浄した後、洗浄液２［０．１×ＳＳＣ，０．１×ＳＤＳ］で３０分を２回、５分を１回おこなった。１時間以上風乾させたあと、シグナルの検出をおこなった。シグナル解析はＢＡＳ２０００Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＦＵＪＩフィルム）を用いた。
（５）定量ＲＴ−ＰＣＲによる解析
Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍとＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍは５３塩基対しか長さが違わないので、ノーザン解析ではシグナルの区別ができない。そこで、それぞれの発現を個別に解析するために、Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍとＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍそれぞれに特異的なプライマーを作成し、定量ＲＴ−ＰＣＲで解析をおこなった。
ｃＤＮＡ合成はＴＯＹＯＢＯ社のＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｋｉｔを用いておこなった。Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ特異的プライマーの配列は表１に記した。
定量ＲＴ−ＰＣＲ装置はＲｏｃｈｅ社のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒを使用し、反応試薬はＴａＫａＲａ社のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｅｘ  ｔａｑを使用した。２×ＳＹＢＲ  ５μｌ、フォワード・リバースプライマーを各２ｐｍｏｌ、ＭｉｌｌｉＱ水３．５μｌをテンプレートｃＤＮＡ（ＺｍＤＲＥＢ２Ａ  １μｌ、１８ＳｒＲＮＡ  ０．００１μｌ）に加え反応させた。なお、内部標準としては１８ＳｒＲＮＡをもちいた。使用したプライマーの配列は表１に示した。
【表１】
2007032111.tif 000005
2007032111.tif 000006
このあと、増幅産物の融解温度を解析する事により想定される塩基配列が増幅されている事を確認した。
それぞれの発現量を定量化するために、濃度のわかっているＬｏｎｇ  ｆｏｒｍとＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍを組み込んだｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターを用いて検量線を作成した。この検量線より算出した濃度を、内部標準で除した値を用いて、それぞれの相対発現量を求めた。
（６）サザン解析
トウモロコシゲノム上のＺｍＤＲＥＢ２Ａのコピー数を確認するためにＧｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎをおこなった。
プライマー及びキットは（４）で使用したものと同様である。ゲノムＤＮＡはトウモロコシの葉より、ＣＴＡＢ法に従って抽出した。
抽出したＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＤｒａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）１０μｌでそれぞれ３７℃、一晩処理した。この溶液よりエタノール沈殿でＤＮＡを回収し、ＴＥ溶液３００μｌに溶解した。１×ＴＢＥの１％アガロースゲルに７０Ｖで６時間半泳動した。これを酸性溶液［０．２５Ｎ  ＨＣｌ］、変性液［０．５Ｎ  ＮａＯＨ，１．５Ｍ  ＮａＣｌ］、中和液［０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１．５Ｍ  ＮａＣｌ］の順で変性処理し、ナイロンメンブレン（Ａｍａｒｓｈａｍ社）に一晩かけて転写した。
転写したメンブレンをプローブとハイブリダイズさせた。プローブはノーザン解析と同じものを用いた。これはノーザン解析の手法に準ずる。ただしＷａｓｈｉｎｇについては以下の２通りでおこなった。
Ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ０．５×ＳＳＣ、０．５×ＳＤＳ  ５０℃（３０分で２回）
Ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ０．１×ＳＳＣ、０．１×ＳＤＳ  ６５℃（３０分で２回）
２．結果
（１）ノーザン解析
播種後１週間水耕栽培した植物体に種々のストレス処理をおこない、この植物より抽出したＲＮＡを用いて実験をおこなった。ＺｍＤＲＥＢ２Ａ特異的領域をプローブとしてノーザン法による発現解析をおこなった（図２Ａ）。ＺｍＤＲＥＢ２Ａは低温ストレス処理をおこなったとき、２時間後に発現の誘導が観察され、５時間後ではかなり強い発現が見られた。高温処理としては４２℃で処理したときに誘導が見られた。高温による発現誘導は１０分から２０分の処理で強く発現した後、徐々に減少していくことが確認された。乾燥処理では恒常的な弱い発現は見られるものの、発現誘導はそれほど見られなかった。塩処理では処理後１０分という早い時間帯からやや強めの発現が根で見られ、時間が経つにつれさらに強まっていく様子が確認できた。
またＺｍＤＲＥＢ２Ａは各ストレス下で主に根で発現しており、茎、葉での発現はあまり見られなかった。しかし、低温及び高温処理では葉での発現誘導が確認できた。
このことより、ＺｍＤＲＥＢ２Ａはストレスにより発現が誘導され、かつストレスの種類によってその発現パターンが異なることが明らかになった。
（２）定量ＲＴ−ＰＣＲによる解析
Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのフォワードプライマーは一部Ｌｏｎｇ  ｐｒｉｍｅｒと相同性を持つ配列を含む。それぞれのプライマーが配列特異的に機能していることを確認した。Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ  ｃＤＮＡそれぞれをテンプレートとし、これらのプライマーを加えてＰＣＲをおこない、反応溶液を２％のアガロースゲルで泳動した。その結果、それぞれのプライマーが各テンプレート特異的に配列を増幅していることが確認された。
イントロンの外側に同一のプライマー（ＡＹ１０８１９８  ｃＤＮＡ  ＢａｍＨＩ、ＡＹ１０８１９８  ｓｈｏｒｔｅｒ  Ｒ９０）を設定し、長さの異なる２本の断片を同時に増幅することにより、２種類のｍＲＮＡが実際に蓄積しているかどうかを確認した（図２Ｂ）。無処理状態を除き、各ストレスをかけたときに泳動のバンドが二本生じていることが確認できた。Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍとＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍそれぞれのポジティブコントロールと同じ位置にバンドが出ていることから、このバンドがＬｏｎｇとＳｈｏｒｔのもので、２種類のクローンが実際に存在していることが示された。
さらに、それぞれのｍＲＮＡの蓄積がどのように経時的な変化をするかを解析した（図３Ａ、Ｂ）。無処理の時点では双方ともほとんど発現が認められないものの、Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍとＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ同士の比較ではＬｏｎｇ  ｆｏｒｍがＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍの１０００倍ほどの量であった。しかし双方ともストレス処理をおこなうことで発現が誘導された。全体的にはＬｏｎｇ  ｆｏｒｍのほうが多く発現しているが、ストレス時にはＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍの発現率が非常に高くなり、高温処理１０分のように、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍの蓄積量のほうが多い時間帯も存在した。
（３）サザン解析
トウモロコシゲノム上のＺｍＤＲＥＢ２Ａのコピー数を確認するためにＧｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ解析をおこなった（図４）。ノーザン解析と同様にＺｍＤＲＥＢ２ＡのＣ末端部位をプローブとした。なお、相同性の高い遺伝子が存在するかを調べるために、メンブレン洗浄を強い条件（Ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）と弱い条件（Ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の２種類でおこなった。Ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ処理によるバンドはそれぞれひとつだけなので、トウモロコシにおけるＺｍＤＲＥＢ２Ａのコピー数はひとつだけであると考えられる。しかし、Ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ条件ではいくつかのバンドが検出されたことから、相同性が高い遺伝子もいくつか存在するものと考えられる。
３．考察
シロイヌナズナのＤＲＥＢ２Ａは乾燥、塩、高温ストレスにより誘導される。ＺｍＤＲＥＢ２ＡはＤＲＥＢ２Ａと同様に塩、高温ストレス処理による発現誘導がよく観察された（図２Ａ）。一方、乾燥ではほとんど誘導が見られず、低温ではかなり時間が遅くなってからの発現が見られた。これはＤＲＥＢ２Ａの発現パターンと異なる。シロイヌナズナの場合、乾燥ストレス処理時には２０分から２時間まで弱い発現が続いた後、５時間でかなり強い発現となり、約１０時間でピークに達し、２４時間では５時間後と同程度の発現量が見られる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０  １３９１−１４０６，１９９８、Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４２  ６５７−６５，２０００）。一方、イネのＯｓＤＲＥＢ２Ａの乾燥時における発現は、一過的ではなく恒常的にやや強めの発現が見られる（Ｄｕｂｏｕｚｅｔ  ｅｔ  ａｌ．前掲）。ＺｍＤＲＥＢ２Ａの発現パターンはイネに似ているが、発現量はさらに弱い。乾燥処理すると、シロイヌナズナやイネが５時間を過ぎるとほとんどの水分を失った状態になるのに対し、トウモロコシは５時間の処理ではまだ充分水分を失っておらず、乾燥に対して強い植物であると考えられる。したがって、ＺｍＤＲＥＢ２Ａは乾燥応答性も持つが、２４時間以内の乾燥状態では充分な乾燥ストレスと認識しないために、発現がみられなかったと考えられた。
ＺｍＤＲＥＢ２Ａは主に根での誘導が見られたが、温度を変化させたときは葉、茎での発現も見られた。塩ストレス処理は地下部を塩化ナトリウム溶液に浸すことでおこない、乾燥処理は水耕栽培している植物を一度ステンレスメッシュから引き抜くことでおこなった。このため、これらの処理は地下部により強くストレスを与えたと考えられる。一方、温度の場合は、葉や茎でもそのストレスを受けるために発現が誘導されるものと考えられる。したがって、ＺｍＤＲＥＢ２Ａは根での発現が強いものの植物体全身でその発現が観察され、ストレスを受けるとすぐに発現誘導されるものと考えられる。
ＺｍＤＲＥＢ２ＡのＬｏｎｇ  ｆｏｒｍ、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのｍＲＮＡがどのように蓄積されるかを検討した（図３）。双方ともにストレスによる誘導が見られるが、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのほうがその割合が大きい。Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍはイントロンを有し、イントロン部位にストップコドンが存在するためタンパク合成が止まると考えられる。したがって、ストレス時に必要であるのはＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのｍＲＮＡである。また、活性型と考えられる（実施例３で検討）Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍはストレスが強いほど多く蓄積していた。無処理の時点ではＬｏｎｇ  ｆｏｒｍに比べて１０００分の１程度しか存在しないが、ストレス時にはその割合は増大していく（図３Ｂ）。このことより、活性型のＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍは、ストレスの度合いが強いときに必要とされる遺伝子であることが示唆される。しかしながら、低温ストレスにおいては非活性型のＬｏｎｇ  ｆｏｒｍの蓄積が時間とともにかなり増大するものの、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍはそれほど大きな割合での蓄積は見られない。これはＬｏｎｇ  ｆｏｒｍからＳｈｏｒｔ  ｆｏｒｍが形成されるにあたって必要な酵素が、低温により活性が低下している可能性が考えられた（図３Ａ）。
〔実施例３〕プロトプラストを用いた転写活性化機構の検討
１．材料と方法
（１）培養細胞
シロイヌナズナＴ８７培養細胞を利用した。この細胞は理化学研究所のバイオリソースセンターに保存されているものを提供していただいた。
（２）継代方法及び培地
生育培地（ＪＰＬ培地）の組成は以下のとおり。２２℃、白色連続照射下、軽度の振とう条件下で培養、継代した。実験には継代して５〜６日目のものを用いた。
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以上のストック及び他の試薬を以下のように混合して作成した。
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（３）コンストラクション（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ）の作成
ベクターとしては、ｐＧｒｅｅｎＩＩＥｌ３５Ωを用いた。ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔの作成は常法に従い２組のプライマー（プライマーＡとプライマーＢ、プライマーＣとプライマーＤ）を用いた２段階ＰＣＲにより作製した。Ｃ末端ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔは削除する部分からプライマーを作成して通常通りのＰＣＲをおこなった。ｐＧｒｅｅｎＩＩＶｅｃｔｏｒをＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩで３０℃、一晩処理し、ここに目的断片を挿入した。目的の断片はそれぞれプライマーを用いてＰＣＲで増幅後、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩで３０℃、一晩処理し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションした。このプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入し、カナマイシン耐性株を得た。大腸菌の形質転換はヒートショックによる方法を用いた。それを２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシン入りＬＢ培地で一晩培養し、耐性株を選抜した。これをＤＮＡ自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯ社；ＰＩ−１００）でプラスミド抽出した。さらにＲＮａｓｅで３７℃、１時間処理し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製をおこなったものをシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社  ＡＢＩ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）で配列確認した。使用したプライマーは表２〜４に記した。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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（４）プラスミドの調製とプロトプラストへの導入
プラスミドＤＮＡの大量調製はＱＩＡＧＥＮのＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  ｋｉｔ又はＭａｘｉ  ｋｉｔを用いたアルカリ−ＳＤＳ法に準じた。組み換えプラスミドを、抗生物質を添加した２ｍｌのＬＢ培地で３７℃、８時間プレ培養した後、５００ｍｌのＬＢ培地［１Ｌあたりの組成ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ，ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ，ＮａＣｌ  １０ｇ，１Ｎ  ＮａＯＨ  １．５ｍｌに移し変え、更に一晩培養した。これを集菌し、Ｐ１溶液５０ｍｌに懸濁して激しく攪拌したあと、５０ｍｌのＰ２溶液を加え、転倒混和し、室温で５分間静置した。これにＰ３溶液を加え、上下に撹拌した後、５０ｍｌのＦＷＢ溶液を加えフィルターで濾した液を取り出した。この濾液にＱＢＴ  ｂｕｆｆｅｒを加えてカラムに流し、ＱＦ  ｂｕｆｆｅｒでプラスミドＤＮＡを溶出した。これをイソプロパノール沈殿したあと、適当量のＴＥ  ｂｕｆｆｅｒに溶かして濃度を測定した。
５〜６日間培養したＴ８７細胞を５ｇ回収し、酵素液［０．４Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，０．５ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ５．６），０．１％  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚａｕｋａ  Ｒ−１０，０．０５％  Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ］１００ｍｌに懸濁し暗条件下で８０ｒｐｍで撹拌しながら２時間処理することでプロトプラスト化した。ＳｏｌｕａｔｉｏｎＡ［０．４Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，０．５ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ５．６），７０ｍＭ  ＣａＣｌ２］で洗浄後、プロトプラストを約５．０×１０６個／ｍｌになるようにＭａＭｇ溶液［０．４Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ５．６）］に懸濁した。１０μｇのレポータープラスミド及びエフェクタープラスミドを加えた後、ＰＥＧ−ＣＭＳ溶液［４００ｍＭ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，１００ｍＭ  ＣａＮＯ３、４０％ＰＥＧ］１００μｌを加え穏やかに撹拌した後、氷上に３０分静置した。希釈溶液［０．４Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，１２５ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ，１．５ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ５．７）］で希釈後、遠心して上澄を除去し、プロトプラストをＭＳ−Ｍａｎｎｉｔｏｌ培地［ショ糖を除いたＭＳ培地に０．４Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌを加えたもの］に懸濁し２２℃暗黒下で２０時間静置培養した。
実験に用いたエフェクターコンストラクトはＺｍＤＲＥＢ２Ａの全長及び欠失変異を加えたｃＤＮＡとＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＴＭＶΩ配列を結合して作製した。レポーターコンストラクトはｒｄ２９ＡプロモーターのＤＲＥを含む７５ｂｐ断片を３つ並べたもの（ＤＲＥ×３）にＴＡＴＡ最小プロモーターとＧＵＳ配列を結合して作製した。内部標準プラスミドはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を結合して作製した。エフェクター及びレポーター、内部標準プラスミドのプロトプラストへの導入はＰＥＧ法によりおこなった。
（５）ルシフェレース活性測定
プロトプラストを５００ｒｐｍ、室温、５分間の遠心分離で回収し、破砕バッファー［５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ］１５０μｌに懸濁し、ホモジェナイザーで破砕した後、１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心して不溶画分を除き、細胞抽出液とした。ルシフェレース活性の測定にはＬｕｃｉｆｅｒａｃｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ・ピッカジーン（東洋インキ製造）を用い、使用説明書に従っておこなった。細胞抽出液１０μｌとピッカジーン５０μｌを反応させてルミノメーターによって測定した。
（６）ＧＵＳ活性測定
細胞抽出液１０μｌに１００μｌの基質溶液［破砕バッファーに２．５ｍＭの４−ＭＵＧ（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｉｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）］に混合し、３７℃で一時間反応させた後、１ｍｌの反応停止液［２Ｍ  Ｎａ２Ｃｏ３］に加えて反応を停止した。この溶液１００μｌを測定に用いた。
２．結果
単離されたＬｏｎｇ  ｆｏｒｍ、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍそれぞれのｃＤＮＡの全長及び、そのなかからＯＲＦと考えられる領域を取り出したものを２種類、計４種類の活性を調べた。
ただし、Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ  ｃＤＮＡのＯＲＦについてはデータベースに登録されている配列の部分を参考に作成した（図１Ｂ，７２番目のアミノ酸であるメチオニンから開始する）。Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ  ｃＤＮＡを用いた場合は全長でもＯＲＦでもＧＵＳの転写活性化はほとんど見られなかった（図５Ａ）。これに対し、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのｃＤＮＡを導入した細胞ではＧＵＳ／ＬＵＣ活性が４０〜１００倍に達していた。また、シロイヌナズナのＤＲＥＢ２Ａ（活性型）と比較しても、約２倍の活性が示された。欠失変異を加えたｃＤＮＡを用いた実験ではＣ末端から２７２番目のアミノ酸（２７２ａａ、以下同様に記述）まで削るだけでかなり活性が低くなる。更に２３６ａａまで削るとほとんど活性が見られなくなった（図５Ｂ）。また、ＺｍＤＲＥＢ２Ａタンパク質の内部である２３５ａａ−２７２ａａを削ったときに極端に活性が減少することが示された。以上の結果から、２３５ａａ−Ｃ末端までの領域にＺｍＤＲＥＢ２Ａの転写活性化ドメインが含まれると考えられた。
３．考察
Ｔ８７細胞のプロトプラストを用いたトランジェント発現系で、ＺｍＤＲＥＢ２Ａによる高い転写活性化が見られたことから、ＺｍＤＲＥＢ２ＡはＤＲＥに結合し、転写活性因子として機能することが示された。また、Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍはほとんど活性が見られなかったが、Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍは非常に高い転写活性能を持つことが示された（図５Ａ）。Ｌｏｎｇ  ｃＤＮＡでは、配列の途中にありイントロンと考えられる５３塩基の配列（Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍには存在しない）がフレームシフトを起こし、途中にストップコドンが入ってしまうために、活性を持つタンパクがコードできないと考えられる。データベースにはＥＳＴとしてＬｏｎｇ  ｆｏｒｍ  ｃＤＮＡが登録され、７２ａａのメチオニンを開始コドンとしているが、実際にはこのＬｏｎｇ  ｆｏｒｍ  ＯＲＦをエフェクターとして用いてもまったく転写活性化は見られなかった。
シロイヌナズナのＤＲＥＢ２Ａは完全長のｃＤＮＡをエフェクターとして用いたときの転写活性は低く、ＤＮＡ結合ドメインの下流３０アミノ酸を削ると高い活性を示した（Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．未発表）。これに対して、ＺｍＤＲＥＢ２Ａは完全長のｃＤＮＡで高い転写活性能が示され、内部領域（１４１ａａ−２０８ａａ）を削ってもそれほど大きな活性の変化は見られなかった（図５Ｂ）。Ｃ末端は酸性アミノ酸の割合が多く、酸性アミノ酸は転写活性ドメインに多く存在していることが知られている。また、Ｃ末端の２３６ａａ−２７２ａａを削ったときに転写活性が著しく減少することから、この付近に転写活性化ドメインが存在すると考えられる。２３６ａａ−２７２ａａ付近をデータベースで検索したところ、コムギのＨｖＤＲＦ１とイネのＯｓＤＲＥＢ２Ｂ及びトウジンビエのＤＲＥＢ２Ａ相同性タンパク質において、この領域と高い相同性を持つ配列が存在していた（図６）。一方、削ることで完全長よりも活性を示す領域が見られなかったことから、ＤＲＥＢ２Ａのネガティブドメインに相当する領域は存在しないものと考えられた。
シロイヌナズナのＤＲＥＢ２Ａを導入した植物は野生株との間に明確な表現型の差が観察されず、環境ストレスに対して耐性を示さない。したがってＤＲＥＢ２Ａタンパク質は合成されただけでは活性を持たないと考えられた。この原因として、ＤＲＥＢ２Ａにはセリン（Ｓｅｒ）／スレオニン（Ｔｈｒ）リッチドメインが存在していることから、この部分のリン酸化が活性に必要である可能性が示唆されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。またＤＲＥＢ２Ａの１３５ａａ−１６５ａａを削除したときにＤＲＥＢ２Ａは活性型となる（Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．未発表）。ＺｍＤＲＥＢ２Ａのアミノ酸配列には、９９ａａから１１８ａａにかけてＳｅｒ／Ｔｈｒに富んだ領域が存在する。ＺｍＤＲＥＢ２Ａが常に活性型である原因のひとつとして、この領域がリン酸化を受けやすい立体構造的メカニズムが存在している可能性が考えられる。
またＤＲＥＢ２Ａの１３５ａａ−１６５ａａにはＰＥＳＴ配列が存在する。これは塩基性アミノ酸で区切られた１０塩基以上の配列でプロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）に富む領域をさす。この領域は短寿命タンパク質の多くに含まれており、酵素により認識され、分解される。ＤＲＥＢ２ＡとＺｍＤＲＥＢ２ＡにこのＰＥＳＴ配列が存在するのか、ＥＭＢＮｅｔ  ＡＵＳＴＲＩＡのＷＷＷ  ＰＥＳＴ  ｆｉｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｅｍｂｎｅｔ／ｔｏｏｌｓ／ｂｉｏ／ＰＥＳＴｆｉｎｄ／）を用いて検索したところ、ＺｍＤＲＥＢ２Ａには候補となる配列が検索されなかった。このことからも、ＤＲＥＢ２ＡがこのＰＥＳＴ配列によって分解されているために、通常では活性を示さない可能性も考えられる。しかし、ＯｓＤＲＥＢ２Ａも転写活性を示さないことが報告されている（Ｄｕｂｏｕｚｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３３，７５１−７６３）。
このＯｓＤＲＥＢ２Ａも同様にＰＥＳＴ配列の検索をおこなったところ、それに相当すると思われる領域は存在しなかった。このため、この配列だけが非活性化の原因とは考えにくい。
〔実施例４〕形質転換体を用いたＺｍＤＲＥＢ２Ａの機能解析（１）
ＺｍＤＲＥＢ２Ａの植物中での機能を詳細に調べることを目的にＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した形質転換シロイヌナズナを作製し、標的遺伝子や形質転換植物の低温、乾燥ストレス耐性を解析した。
１．材料と方法
（１）サンプル植物と生育条件
完全長のＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した形質転換体の作製をおこなった。乾燥種子を１％ＮａＣｌＯ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の溶液に１０分間浸し、滅菌処理をおこなった。これをＧＭＫ寒天培地に撒いて、２日間４℃で低温処理した後、２２℃、１６時間の日長で１４日間生育させた。植物体を４個体取り出し、ＺｍＤＲＥＢ２Ａの発現量の解析をおこなった。さらに残りの植物体を鉢に移し替えて１週間生育させた後、ストレス耐性処理等に用いた。なお鉢植えはプロフェッショナル培土（カキウチ）を入れた丸型プラントポットでおこなった。
（２）生育培地
植物培地の組成は以下のとおりである。
・ＧＭＫ寒天培地・・・ムラシゲ・スクーグ塩（和光）、０．４ｇ／ｌ  Ｔｉａｉｎｅ−ＨＣｌ、０．１ｇ／ｌ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、３％（ｗ／ｖ）ｓｕｃｒｏｓｅ、１ｎＭ  ｉｎｄｏｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、１０ｎＭ  ６−ｂｅｎｚｉｌ  ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ、０．８３％ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ、３０ｍｇ／ｌ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ
・ＧＭＫＶ寒天培地・・・ＧＭＫ寒天培地、１００ｍｇ／ｌ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ
（３）形質転換シロイヌナズナの作製
シロイヌナズナの形質転換には、プロトプラストを用いた実験で使用した、ｐＧｒｅｅｎ  Ｅｌ２  ３５ＳΩ−ＺｍＤＲＥＢ２Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍを用いた。１μｌ（約７０μｇ）のプラスミドと４０μｌのエレクトロポレーション用コンピテントセル（ヘルパープラスミドｐＳｏｕｐをあらかじめ導入したアグロバクテリウムＧＶ３１０１）を混ぜ、４℃に冷却したキュベットに入れ、２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶでエレクトロポレーションをおこなった。１ｍｌのＳＯＣ培地［ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ２０ｇ，ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ，ＮａＣｌ  ０．５ｇ，０．０２Ｍ  ｇｌｕｃｏｓｅ，０．０１Ｍ  ＭｇＳＯ４，０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ２］を加え、２８℃で１時間培養した後、カナマイシンを加えたＬＢ寒天培地で２日間培養し、耐性株を選抜した。
形質転換したアグロバクテリウムを常法に従いシロイヌナズナに感染させた。感染後のシロイヌナズナから得た種子をＧＭＫＶ培地に撒いて生育したカナマイシン耐性植物を選抜した。選抜した植物を新たなＧＭＫＶ培地に移植し、適当な大きさになったら土へ植え替えた。
（４）ノーザン解析及び定量ＲＴ−ＰＣＲによる解析
実施例２に従い、ノーザン解析及び定量ＲＴ−ＰＣＲによる解析をおこなった。ただし、使用したＲＮＡの量は５μｇである。
（５）ストレス処理
低温、乾燥ストレスによるＺｍＤＲＥＢ２Ａ及びストレス誘導性遺伝子ｒｄ２９Ａの発現量を調べるために、ＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入したもの４ライン、ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ２Ａ（野生型及び活性型）を導入したもの、ｐＢＩ１２１ベクターコントロールを導入したものにそれぞれ低温、乾燥ストレス、塩ストレス処理を行った。低温ストレス処理は４℃にプレートごと５時間静置して行った。乾燥ストレス処理は、根に培地が残らないよう引き抜いたシロイヌナズナをプレート上においてクリーンベンチの中で５時間処理する事で行った。塩ストレス処理は、根に培地が残らないよう引き抜いたシロイヌナズナを、２５０ｍＭのＮａＣｌ溶液に浸す事で行った。
（６）ストレス耐性試験
凍結処理はＧＭＫ培地で生育後２１日目の植物を土ポットへ移し、１週間育成した植物体を−６℃のインキュベーターに移して３０時間処理し、その後１週間の生育させた後評価した。
乾燥処理は播種後２１日目の植物を土ポットへ移し一週間育成した後、水供給を停止し、約１０日間後、ふたたび水を与えた。その後の植物体の回復状態を観察することで耐性を評価した。
（７）マイクロアレイによる誘導性遺伝子の解析
Ａｇｉｌｅｎｔ社のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ２オリゴＤＮＡマイクロアレイキット（２１５００遺伝子がスポット）を用いて実験をおこなった。なお、以下のすべての試薬、装置について、特記しない限り、Ａｇｉｌｅｎｔ社のものを使用した。
実施例２と同様にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴｒｉｚｏｌ法によりＲＮＡを抽出した。１試料あたり植物体を４個体用いた。抽出したＲＮＡはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、ｒＲＮＡのバンドが明瞭であり、それぞれのｒＲＮＡの量比が理論値と矛盾していないことを確認した。
１試料あたり８００ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用し、これを４００ｎｇずつＣｙ３，Ｃｙ５により標識した。これにＴ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒを加え、６５℃で１０分間熱変性をした後、氷中で５分間急冷した。これにｃＤＮＡ合成Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ［５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ２．０μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １．０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ０．５μｌ、ＭＭＬＶ−ＲＴ  ０．５μｌ、ＲＮａｓｅＯＵＴ  ０．２５μｌ］を加え、４０℃で２時間処理した。その後６５℃で１５分間処理し、反応を停止させた後、氷中で５分間急冷した。それぞれの反応液に１０ｍＭ  Ｃｙａｎｉｎｅ３  ＣＴＰ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、１０ｍＭのＣｙａｎｉｎｅ５  ＣＴＰを１．２μｌずつ加え、これにＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｉｘ［Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ７．６５μｌ，４×Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １０．０μｌ，０．１Ｍ  ＤＴＴ  ３．０μｌ，ＮＴＰ  Ｍｉｘ  ４．０μｌ，５０％ＰＥＧ（ｐｒｅ−ｗａｒｍ，４０℃）３．２μｌ，ＲＮａｓｅＯＵＴ  ０．２５μｌ，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ０．３μｌ，Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．４μｌ］を加え、激しく撹拌して遮光状態で４０℃、１２０分間反応させた。これに６０μｌのｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ、３５０μｌのＲＬＴ−ｂｕｆｆｅｒ、２５０μｌのＥｔＯＨを加え、ピペットで混合した。この溶液を２ｍｌのコレクションチューブをつけたＲＮｅａｓｙｍｉｎｉカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。新しいコレクションチューブにカラムを移し、５００μｌのＲＰＲ−Ｂｕｆｆｅｒを加え、１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。この作業をもう一度繰りかえし、カラムを１．５ｍｌのコレクションチューブに移したあと３０μｌのＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを加え、１分間静置し、１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心しｃＲＮＡを回収した。もう一度この作業を繰り返し、２６０ｎｍの吸光度を測定し濃度を決定した。
ｃＲＮＡターゲット溶液［Ｃｙ３ラベル化ｃＲＮＡ  １μｇ，Ｃｙ５ラベル化ｃＲＮＡ  １μｇ、１０×コントロールターゲット５０μｌ、ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ｕｐ  ｔｏ  ２５０μｌ］を作成し、これに２５×ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌを加え、激しく撹拌しターゲットの断片化をおこなった。この溶液を遮光状態で６０℃、３０分間処理した。この溶液に２５０μｌの２×ハイブリダイゼーションバッファーを加え、泡立てないように撹拌し、マイクロアレイスライドへ充填した。そして６０℃で約１７時間ハイブリダイゼーションをおこなった。ハイブリダイゼーションの終了したスライドを洗浄バッファー１［６×ＳＳＣ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２］で室温、１０分間洗浄した。次に洗浄バッファー２［０．１×ＳＳＣ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２］で４℃、５分間洗浄した。それをフィルターエアガンによる窒素ガスで乾燥させた。最後にスライドをアジレントマイクロアレイスキャナスライドのフォルダにセッティングしてスキャニングし、スポット数値化とデータ解析をおこなった。
２．結果
（１）ＺｍＤＲＥＢ２Ａ形質転換シロイヌナズナの形質及び導入遺伝子の発現解析
ＺｍＤＲＥＢ２Ａ形質転換体は５１ライン得られたが、このうちＴ２種子が以後の解析に用いるのに十分取れた３２ラインについて定量ＲＴ−ＰＣＲによって導入遺伝子の発現量を解析した。一部の結果を図７に示した。ＧＭＫ寒天培地で生育させ、播種後２１日目の植物の形態を観察した（図８Ａ上段）。過剰発現植物体はコントロール株と比較して矮化する傾向が見られた。２週間ＧＭＫ培地で生育させ植物を土に移植し、形態を観察した。図８Ａに３５日目（移植後２１日目）の植物体を示した。この植物も、寒天プレートと同様に生育の遅れが観察された。ＺｍＤＲＥＢ２Ａがシロイヌナズナ中で制御する標的遺伝子は不明であるが、実施例３で、ＺｍＤＲＥＢ２Ａはｒｄ２９ＡプロモーターのＤＲＥ配列の下流に結合したレポーター遺伝子の発現を誘導した。したがって、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナ中でもｒｄ２９Ａ遺伝子の発現が上昇していると予想される。ＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナにおける導入遺伝子およびｒｄ２９Ａ遺伝子のノーザン解析の結果を図８Ｂに示した。導入遺伝子及びｒｄ２９Ａ発現量が多く、形質に変化の見られた４ライン（Ｒ６、Ｒ１４、Ｒ２１、Ｒ２５）を後の解析に用いた。
（２）ＺｍＤＲＥＢ２Ａ形質転換シロイヌナズナのストレス耐性評価
上記で選抜した４ラインの形質転換シロイヌナズナについて、凍結及び乾燥ストレス時における耐性評価をおこなった。ベクター導入株（ｐＢＩ１２１コントロール）を比較対照とした。凍結耐性は２回繰り返し、乾燥耐性は４回繰り返し実験をおこなった。凍結ストレス処理をおこなうとＲ１４ラインの２５個体の植物中１０個体生存したものの、ほかの形質転換植物はすべての個体が枯死した（図９Ａ）。乾燥処理は２１日目の植物を土ポットへ移し一週間通常条件下で生育させた後、１０日間灌水を停止した。その後１〜２週間にかけて形質を観察することで耐性を評価した。Ｒ６において特に強い耐性の向上が示された。他の３ラインについてもコントロールに比べて比較的強い耐性が見られた（図９Ｂ）。以上のとおり、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナは、乾燥耐性は見られたものの、凍結耐性の向上はほとんど見られなかった。
（３）マイクロアレイによる標的遺伝子の解析
ＺｍＤＲＥＢ２Ａの過剰発現により、発現量が変化する遺伝子を特定するためにＡｇｉｌｅｎｔ社のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ２  オリゴＤＮＡ  マイクロアレイキットを用いて、網羅的に発現解析をおこなった（表５）。マイクロアレイ解析にはＲ６、Ｒ１４の２ラインを用いた。Ｒ６のほうが導入遺伝子の発現の強いラインである。各ラインとも２回繰り返し実験をおこなったが、２回の相関係数は非常に高かった。コントロールと比較してどちらか片方で５倍以上発現が見られた遺伝子は８８個あった。これらの遺伝子を機能で分類すると、ＬＥＡタンパク質関連遺伝子が１１個、ヒートショック関連遺伝子が７個、酸化ストレス関連遺伝子が５個、オレオシン関連遺伝子が７個、糖代謝関連遺伝子が５個、膜輸送関連遺伝子が２個、発芽に関与する遺伝子が６個であった。
【表５】
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Ｒａｔｉｏ：ノーマライズ後の野生株と過剰発現植物のシグナルの強さをとり、２回のハイブリダイズの値を平均したものを平均したもの。
ＤＲＥ：ＲＩＫＥＮのシロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡデータベースを参照にした。転写開始点の上流１０００塩基内に存在しているＤＲＥ配列（ＡＣＣＧＡＣ）の数を示している。
＊：ＲＡＲＧＥに全長ｃＤＮＡが登録されていない遺伝子。ＤＲＥＢ２Ａ：改変型ＤＲＥＢ２Ａをアレイにかけたときに発現上昇（３倍以上）が見られた遺伝子を示す。数値はそのときのＲａｔｉｏである。
Ｓｔｒｅｓｓ：ストレスによって３倍以上の発現誘導される遺伝子を示した。（Ｎ：２５０ｍＭ  ＮａＣｌ  １０時間、Ｄ：乾燥１０時間、Ｃ：４℃１０時間、Ｈ：高温５時間）
３．考察
シロイヌナズナの過剰発現体３２ラインについて２週間生育した植物を用いてのＺｍＤＲＥＢ２Ａの発現量を調べたところ（図８Ｂ）、生育の遅れているものについては発現が多い傾向が見られた。この中からＺｍＤＲＥＢ２Ａの発現レベルの高い４ラインを選択した。選択したラインの中でもっともＺｍＤＲＥＢ２Ａの発現量が多かったのがＲ６ラインであるが、このラインは発芽率が低かった。また４ラインの形質転換体は野生型と比較して生育の遅れが見られた（図８Ａ）。ＤＲＥＢ／ＣＢＦタイプの遺伝子を、３５Ｓプロモーターを用いて過剰発現させた植物は生育の遅れが見られることがすでに報告されている。しかし、これまで報告されているのはＤＲＥＢ１タイプの遺伝子であり、ＤＲＥＢ２ＡやイネのＯｓＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナでは表現型の違いは観察されていない。今回はＤＲＥＢ２Ａタイプの遺伝子でこのような生育の遅れが生じたことから、ＺｍＤＲＥＢ２ＡはシロイヌナズナのＤＲＥＢ２Ａ、イネのＯｓＤＲＥＢ２Ａと異なり、植物中において修飾なしで転写活性能を持つものと考えられた。
ＤＲＥＢ２Ａの機能発現には何らかの翻訳後修飾が必要と考えられている。佐久間らは活性型ＤＲＥＢ２Ａを作製し、活性型ＤＲＥＢ２Ａ形質転換シロイヌナズナのマイクロアレイ解析をおこなっている（未発表）。ＺｍＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナのマイクロアレイ解析ではＤＲＥＢ２Ａの下流遺伝子及びＮａＣｌで誘導される遺伝子と共通の遺伝子が数多く検出された（表５）。ＲＩＫＥＮシロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡデータベースｈｔｔｐ：／／ｒａｒｇｅ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／で公開されている転写開始点から１０００ｂｐ上流までのプロモーター配列を調べたところ、同定された遺伝子にはＤＲＥ配列を含むものが３５個見られた。このなかで、改変型ＤＲＥＢ２Ａでも発現上昇の見られたものは２４個存在した。ＺｍＤＲＥＢ２ＡはＤＲＥ配列に結合し、下流遺伝子の発現を誘導すると考えられるので、これらのプロモーター配列を持つ遺伝子の発現量の増加はＺｍＤＲＥＢ２Ａタンパク質によって直接誘導されたものと思われる。これらのことよりＺｍＤＲＥＢ２Ａはシロイヌナズナ中でＤＲＥＢ２Ａと同様の働きを示すと考えられ、ＤＲＥＢ２タイプの遺伝子であることが確認された。
〔実施例５〕形質転換体を用いたＺｍＤＲＥＢ２Ａの機能解析（２）
ＺｍＤＲＥＢ２Ａの植物中での機能を詳細に調べることを目的に、実施例４に従ってＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した形質転換シロイヌナズナを作製し、標的遺伝子や形質転換植物の高温ストレス耐性を解析した。
材料と方法は基本的に実施例４に従った。ＺｍＤＲＥＢ過剰発現シロイヌナズナは２ライン（ライン６及びライン２５）を用い、それぞれ２個体を使用した。１８日間ＧＭ培地上で生育した幼植物体を培養土を入れたポットに移植した。１１日間生育した後、地上部を４４℃のウォーターバスに１０分間浸漬した（高温ストレス処理）。ストレス処理後通常条件で培養し、４日後と７日後に生育状況を観察した。結果を図１０に示す。
ストレス処理後７日でコントロール植物は枯死したが、ライン６の１個体が生存していた（図１０）。この結果からＺｍＤＲＥＢ２Ａは高温ストレス応答に寄与することが確認された。
〔実施例６〕形質転換体を用いたＺｍＤＲＥＢ２Ａの機能解析（３）
（１）高温ストレスに対する生存率
ＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した植物は、カナマイシンを含むＧＭ寒天培地に播種して６日間培養し、４ｍｌのＧＭ培地に浸したろ紙上（シャーレ内）に移した。植物は、まず２２℃で２日間生育させた後、２２℃、４４℃又は４５℃の環境（高温ストレス）に１時間置き、再度２２℃に戻して生育させた。コントロールとして、ＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入していないシロイヌナズナ（野生株）を同様に生育させた。
図１１に、試験後さらに２週間液体ＧＭ培地で生育させた植物とその生存率（平
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植物、Ａ，Ｂ，ＣはそれぞれＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した植物（３ライン）を示す。
図１１から明らかなように、ＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した植物は、野生株に比較して、有意に高い高温ストレス耐性を示した。
（２）ノーザン解析
ＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入した植物を、通常の生育条件、高温ストレス（３７℃で１時間又は５時間）、塩ストレス（２５０ｍＭ食塩水に５時間）、乾燥ストレス（乾燥５時間）に置き、特に高温によって誘導されることが既知の遺伝子（  Ａｔ５ｇ０３７２０（ＡｔＨＳＦＡ３）、  Ａｔ３ｇ１２５８０（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０）、Ａｔ１ｇ５２５６０（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｔ４ｇ２５２００（ＡｔＨＳＰ２３．６−ｍｉｔｏ）、Ａｔ４ｇ１０２５０（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２２．０）、Ａｔ５ｇ１２０３０（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １７．６Ａ））の発現をノーザン法により解析した。コントロールとして、ＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入していないシロイヌナズナ（野生株、ＷＴ）を同様に生育させて解析した。
結果を図１２に示す。前記の遺伝子は、コントロール（野生株）に比較して、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ導入した植物で有意に高い発現が認められた。
〔実施例７〕形質転換体を用いたＺｍＤＲＥＢ２Ａの機能解析（４）
実施例３と４にしたがい、ストレス誘導性プロモーターであるｒｄ２９ＡプロモーターにＺｍＤＲＥＢ２Ａを連結して導入した形質転換シロイヌナズナ（３ライン）を作製し、その乾燥、低温ストレス耐性を解析した。コントロールとして、ＺｍＤＲＥＢ２Ａを導入していないシロイヌナズナ（野生株）を同様に生育させた。
結果を図１３に示す。３５Ｓプロモーターで恒常的にＺｍＤＲＥＢ２Ａを過剰発現させたシロイヌナズナでは生育阻害が強く見られたが（図８Ａ）、ｒｄ２９Ａプロモーター支配下でＺｍＤＲＥＢ２Ａを高発現させた植物では野生型と比較して明確な生育の遅延は観察されなかった（図１３Ａ）。ＺｍＤＲＥＢ２Ａにより発現誘導を受けるｒｄ２９Ａ  ｍＲＮＡの蓄積は、ストレス処理により増加していた（図１３Ｂ）。１０日間の灌水停止による乾燥ストレス処理により、野生型シロイヌナズナは３０％しか生存できなかったが、ｒｄ２９Ａ：ＺｍＤＲＥＢ２Ａ植物３ラインはそれぞれ９６．３％、８８．８％、８１．３％の生存率を示した（図１３Ｃ）。ｒｄ２９ＡプロモーターによりＺｍＤＲＥＢ２Ａの発現を制御する事により、生育阻害を回避しつつ乾燥ストレス耐性を改善する事が可能であった。一方、３５Ｓプロモーターを用いた場合と同様に（図９Ａ）、凍結ストレスに対する耐性の改善は乾燥ストレスの場合ほど顕著ではなかった（図１３Ｃ）。
参考例：改変型ＤＲＥＢ２Ａ（修飾ＤＲＥＢ２Ａ）過剰発現シロイヌナズナの高温ストレス耐性
アミノ酸１３６番目から１６５番目の領域を削除した活性型ＤＲＥＢ２Ａ過剰発現シロイヌナズナ（ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡ  ＯＸ）の高温ストレス耐性を、コントロール植物と比較した。コントロール植物にはＤＲＥＢ２Ａ配列を挿入していない発現ベクターを導入したシロイヌナズナを用いた。播種後ＧＭ寒天培地上で５日間生育した植物を、ＧＭ培地で湿らせたロ紙の上に移植しさらに２日間生育させた。この、播種後７日目の植物を用いて高温ストレス耐性試験を行った。高温ストレス処理は、２２℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃で１時間行った。高温ストレス処理後、直ちに室温に戻し、１週間生育させた後、生存率を計数した。
４２℃、４３℃処理ではコントロール植物とＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡ  ＯＸの間に差は見られなかった（図１４）。しかしながら、コントロール植物では４４℃処理で生存率が７６％に低下し、４５℃処理における生存率はわずか２％であった。一方、ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡ  ＯＸでは４５℃処理においても生存率の低下は観察されなかった（図１４）。
本研究により、ＺｍＤＲＥＢ２Ａが乾燥、高温ストレス応答等の環境ストレスで機能していることが明らかにされた。さらに、ＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子を用いた乾燥、高温耐性作物の開発への可能性が示唆された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子を用いれば、特別な改変を加えることなく植物に乾燥、高温といった環境ストレスに対する耐性を付与することができる。したがって、本発明は、新たな環境ストレス耐性植物の作出等に利用価値が高い。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１−ＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子ｃＤＮＡ（Ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）
配列番号３−ＺｍＤＲＥＢ２Ａ遺伝子ｃＤＮＡ（Ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）
配列番号５〜４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
［配列表］
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月12日(2006.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を活性化し、植物の乾燥及び高温ストレス耐性を向上させるタンパク質をコードするトウモロコシ由来のＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を活性化し、植物の乾燥及び高温ストレス耐性を向上させるトウモロコシ由来のタンパク質
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
以下の（ｃ）又は（ｄ）の組換えタンパク質。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を活性化し、植物の乾燥及び高温ストレス耐性を向上させるトウモロコシ由来のタンパク質
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
請求項１または２に記載の遺伝子をストレス誘導性プロモーター支配下に連結して含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項６記載の組換えベクターで形質転換され、野生型に比較して乾燥及び高温ストレス耐性が向上していることを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項９】
請求項６記載の組換えベクターを植物に導入することにより、該植物の乾燥及び高温ストレス耐性を向上させる方法。
【請求項１０】
ストレス誘導性プロモーターがｒｄ２９Ａプロモーターである請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
ストレス誘導性プロモーターがｒｄ２９Ａプロモーターである請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ストレス誘導性プロモーターがｒｄ２９Ａプロモーターである請求項８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
ストレス誘導性プロモーターがｒｄ２９Ａプロモーターである請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
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