(57)【要約】  本願発明は、全ての家禽類ウイルス性疾病の予防に有効な卵内接種用ワクチンを提供することを目的とする。これまで卵内接種用ワクチンとして実用化が困難であったウイルスを、ウイルス吸着剤に吸着・保持させることで、接種後の卵内におけるウイルス増殖が緩慢になり、胚に対する病原性を低下させ、孵化率低下の改善および孵化後の臨床症状の重篤化を軽減することを可能とした、安全性の面からも有効性の高い卵内接種用家禽ワクチン。ウイルス吸着剤としては、水酸化アルミニウムゲル、カリミョウバン等のアルミニウム化合物が用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原として生ウイルスを含有する卵内接種用家禽ワクチンにおいて、ウイルス吸着剤を含有することを特徴とする卵内接種用家禽ワクチン。
【請求項２】
前記ウイルス吸着剤がアルミニウム化合物、ハイドロキシアパタイト、またはシリカゲルのいずれかから選択される請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
前記アルミニウム化合物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸三ナトリウム塩化アルミニウムおよびカリミョウバンよりなる群から選択される請求項２記載のワクチン。
【請求項４】
前記生ウイルスが、マレック病ウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏貧血ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、トリレオウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリアデノウイルス、トリニューモウイルスおよび鳩痘ウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種である請求項１ないし３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
前記家禽類がニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ウズラ、ダチョウおよびハトよりなる群から選択される請求項１ないし４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載のワクチンを免疫生成有効量だけ家禽に対し卵内で投与することを含む家禽の免疫方法。
【請求項７】
前記ワクチンが胚孵卵期間の最終四半期中に投与される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
生ウイルスの溶液とウイルス吸着剤とを混合し、得られた混合液を攪拌して該生ウイルスを該ウイルス吸着剤に吸着・保持させることを含む、卵内接種用家禽ワクチンの製造方法。
【請求項９】
前記ウイルス吸着剤がアルミニウム化合物、ハイドロキシアパタイト、またはシリカゲルのいずれかから選択される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記アルミニウム化合物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸三ナトリウム塩化アルミニウムおよびカリミョウバンよりなる群から選択される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記生ウイルスが、マレック病ウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏貧血ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、トリレオウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリアデノウイルス、トリニューモウイルスおよび鳩痘ウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種である請求項８ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記家禽類がニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ウズラ、ダチョウおよびハトよりなる群から選択される請求項８ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
抗原として生ウイルスを含有する卵内接種用家禽ワクチンにおけるウイルス吸着剤の使用。
【請求項１４】
前記ウイルス吸着剤がアルミニウム化合物、ハイドロキシアパタイト、またはシリカゲルのいずれかから選択される請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記アルミニウム化合物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸三ナトリウム塩化アルミニウムおよびカリミョウバンよりなる群から選択される請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記生ウイルスが、マレック病ウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏貧血ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、トリレオウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリアデノウイルス、トリニューモウイルスおよび鳩痘ウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種である請求項１３ないし１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記家禽類がニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ウズラ、ダチョウおよびハトよりなる群から選択される請求項１３ないし１６のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は卵内接種用家禽ワクチンに関する。具体的には、生ウイルスをウイルス吸着剤に吸着・保持させることを特徴とする卵内接種用家禽ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で飼育されている商業用家禽は、種々の病原体からの感染又は発症を予防するためにワクチンが接種される。家禽で疾病を発生させる一般的なウイルスとしては、マレック病ウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏貧血ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、トリレオウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリアデノウイルス、トリニューモウイルスおよび鳩痘ウイルスなどが挙げられる。これらの疾病が家禽産業に及ぼす影響は甚大である。現在、これら多くの疾病に対してワクチンが利用されている。【０００３】
一般に、ワクチンは生ワクチンと不活化ワクチンとに分けられる。生ワクチンは、通常、人為的な操作により弱毒化した株あるいは自然弱毒株を用いたワクチンであり、一方、不活化ワクチンは、物理・化学的処理によりウイルスの感染性をなくしたワクチンである。生ワクチンは自然感染ルートからの投与も可能であるため早期に局所免疫効果を期待することができ、液性免疫および細胞性免疫がともに成立し、免疫持続期間は一般に長い。これに対し、不活化ワクチンでは主に液性免疫が成立するが、免疫の成立は一般に遅く免疫持続時間は短いため、免疫持続期間を長くする目的でアジュバントを添加する場合が多い。【０００４】
生ワクチンの使用においては移行抗体の影響を受けるために通常移行抗体のばらつきも考慮して複数回接種されることが一般的である。また、移行抗体のレベルは種卵の導入先により様々であることから、それぞれの移行抗体に応じた適切なワクチンプログラムの組み立てが必要となる。それぞれのワクチンにおいて様々な病原性を有する株があるが、これらは野外の汚染状況および移行抗体のレベルに応じて選択がなされている。このような諸事情により最適なワクチンプログラムを考案することは、相当な知識と経験が必要とされるため一般に容易ではない。【０００５】
上述したように各疾病が家禽産業に及ぼす影響は甚大である。例えば、家禽類がワクチン接種による適切な防御免疫を獲得する前に、野外病原性株による感染を受けた場合には、充分なワクチン効果が得られないことが多い。そのため、疾病の発生を予防する解決手段の一つとしてできるだけ早期に確実に免疫を獲得させる手段の開発が急務であった。そのような状況においてSharmaらにより卵内接種法が報告され（特許文献１）、マレック病（MD）生ワクチンを卵内に接種することで従来の孵化後のワクチン接種に比べて早期免疫を獲得できることが示された（非特許文献１）。卵内接種用ワクチンの特徴としては、早期免疫が期待されること、孵化後に実施されていたワクチン接種作業に較べて省力化されること、接種の機械化・自動化が可能なこと、より均一で確実な接種が可能なこと、およびヒナへのストレスが軽減されることなどが挙げられる。【０００６】
しかしながら、これまでに卵内接種用として普及しているものは、MD生ワクチンおよび伝染性ファブリキウス嚢病（IBD）生ワクチンの２種類に止まっており、その他の孵化後に用いられてきた多くのワクチンは卵内接種用として実用化されるには至っていない。その理由は、多くの鶏用生ワクチンに用いられるウイルスは鶏胚初代細胞や発育鶏卵で培養されるので、卵内に接種すると胚にとって致死的な影響を与えるからである。伝染性気管支炎（IB）ウイルス、ニューカッスル病（ND）ウイルスなどのワクチン株も同様であり、これらのウイルスを卵内接種用として使用するためには何らかの手段を講じて胚に対する病原性を低下させる必要がある。【０００７】
現在のところ、卵内接種用として商業的に入手可能な適当なND生ワクチン又はIB生ワクチンは知られていない。卵内接種用のND生ワクチンとしては、後期胚に対して非病原性であるHitchner B1株のNDウイルス突然変異株を産生させるための化学的突然変異誘発剤の使用（特許文献２）およびVタンパク質を低レベルで発現するNDウイルス突然変異株の使用（特許文献３）が開示されている。しかしながら、これら突然変異株をワクチンとして使用した場合、家禽およびその家禽を摂食した人体に対して悪影響を及ぼす可能性を完全には否定できない。そのため未だ広く普及しておらず、その評価には非常に膨大な期間を要することが予想される。【０００８】
【特許文献１】米国特許第４４５８６３０号公報
【特許文献２】米国特許第５４２７７９１号公報
【特許文献３】特開２００１―０６９９７０号公報
【非特許文献１】Sharma, J. M., et al., Avian Diseases, 26(1), p.134-149, 1982
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように現在卵内接種用として普及している生ワクチンはMDワクチンおよびIBDワクチンの２種類のみである。孵化後に使用される多くの従来型ワクチンはワクチンウイルス自体が胚にとって病原性を示すことから、卵内接種による孵化率低下および孵化後の臨床症状の重篤化を引き起こし安全性に問題があるため卵内接種用ワクチンとして実用化されるに至っていない。そのため卵内接種用にウイルス自体の弱毒化を図るなど何らかの手段により胚に対するウイルスの病原性を低下させる必要があるが、困難な状況である。しかしながら、MDおよびIBD以外の疾病に対しても卵内接種が可能なワクチンが開発できれば、種々の疾病の原因ウイルスに対して広く防御免疫を獲得することが可能となることから、家禽産業の衛生対策に大きく貢献できることが期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、このような状況から鋭意研究を進めた結果、生ウイルスをウイルス吸着剤に吸着・保持させることにより、卵内接種後の発育鶏卵内におけるウイルスの増殖が緩慢になり、その結果、胚に対する病原性を低下させることができること、しかも生ウイルスをウイルス吸着剤に吸着・保持した状態でも有効に防御免疫を惹起しうることを見出し、本願発明を完成するに至った。【００１１】
したがって、本願発明は、以下に示す、卵内接種用家禽ワクチンを提供するものである。【００１２】
１）抗原として生ウイルスを含有する卵内接種用家禽ワクチンにおいて、ウイルス吸着剤を含有することを特徴とする卵内接種用家禽ワクチン。【００１３】
２）前記ウイルス吸着剤がアルミニウム化合物、ハイドロキシアパタイト、またはシリカゲルのいずれかから選択される上記ワクチン。【００１４】
３）前記アルミニウム化合物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸三ナトリウム塩化アルミニウムおよびカリミョウバンよりなる群から選択される上記ワクチン。【００１５】
４）前記生ウイルスが、マレック病ウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏貧血ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、トリレオウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリアデノウイルス、トリニューモウイルスおよび鳩痘ウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種である上記ワクチン。【００１６】
５）前記家禽類がニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ウズラ、ダチョウおよびハトよりなる群から選択される上記ワクチン。【００１７】
６）上記１）ないし５）のいずれかに記載のワクチンを免疫生成有効量だけ家禽に対し卵内で投与することを含む家禽の免疫方法。【００１８】
７）前記ワクチンが胚孵卵期間の最終四半期中に投与される、上記方法。【００１９】
８）生ウイルスの溶液とウイルス吸着剤とを混合し、得られた混合液を攪拌して該生ウイルスを該ウイルス吸着剤に吸着・保持させることを含む、卵内接種用家禽ワクチンの製造方法。【００２０】
９）前記ウイルス吸着剤がアルミニウム化合物、ハイドロキシアパタイト、またはシリカゲルのいずれかから選択される上記方法。【００２１】
１０）前記アルミニウム化合物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸三ナトリウム塩化アルミニウムおよびカリミョウバンよりなる群から選択される上記方法。【００２２】
１１）前記生ウイルスが、マレック病ウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏貧血ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、トリレオウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリアデノウイルス、トリニューモウイルスおよび鳩痘ウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種である上記方法。【００２３】
１２）前記家禽類がニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ウズラ、ダチョウおよびハトよりなる群から選択される上記方法。【００２４】
１３）抗原として生ウイルスを含有する卵内接種用家禽ワクチンにおけるウイルス吸着剤の使用。【００２５】
１４）前記ウイルス吸着剤がアルミニウム化合物、ハイドロキシアパタイト、またはシリカゲルのいずれかから選択される上記使用。【００２６】
１５）前記アルミニウム化合物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸三ナトリウム塩化アルミニウムおよびカリミョウバンよりなる群から選択される上記使用。【００２７】
１６）前記生ウイルスが、マレック病ウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏貧血ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、トリレオウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリアデノウイルス、トリニューモウイルスおよび鳩痘ウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種である上記使用。【００２８】
１７）前記家禽類がニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ウズラ、ダチョウおよびハトよりなる群から選択される上記使用。
【発明の効果】
【００２９】
本願発明に従ってウイルス吸着剤をワクチンに使用することにより、これまで卵内接種用としては接種後の孵化率低下および孵化後の臨床症状が重篤化するという安全性の問題により使用できなかったNDウイルス、IBウイルスなどのワクチン株をはじめ発育鶏卵に致死的な病原性を有する多くのウイルスにおいても、安全かつ有効に、卵内接種用ワクチンとしての使用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本願発明に使用するウイルス吸着剤は、物理的あるいは化学的作用によりウイルスを吸着・保持させる性質を有するものであればいかなるものであってもよいが、好適な例は、コロイド状（ある媒体中に１nmから１μmの範囲の微粒子分散している状態）のアルミニウム化合物である。当該アルミニウム化合物としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸三ナトリウム塩化アルミニウム、カリミョウバンなどが挙げられ、いずれも常法により作製して使用することができる（柚木弘之，アジュバントとワクチン，動生協会会報，22(6)，1-6，1989）。【００３１】
本願発明に使用する生ウイルスとしては、マレック病ウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鶏脳脊髄炎ウイルス、鶏貧血ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、トリレオウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリアデノウイルス、トリニューモウイルスおよび鳩痘ウイルスなど、家禽での疾病を予防するのに一般的に使用される生ワクチンウイルスが挙げられる。これらは単独もしくは２種以上を混合して使用できる。【００３２】
これら生ウイルスは、当技術分野で公知の通常の方法により調製することができる（国立予防衛生研究所学友会編、ウイルス実験学総論、丸善株式会社、1964）。簡単に説明すると、感受性基質にウイルスを接種し、所望のウイルス量に複製されるまで増殖させた後にウイルス含有物質を回収すればよい。感受性基質としては、発育鶏卵、初代鶏胚細胞培養、例えば鶏胚線維芽細胞（CEF）もしくは鶏腎細胞（CK）、又は哺乳類細胞系、例えばVERO細胞系、ハムスター肺（HmLu-1）細胞系もしくは乳児ハムスター腎（BHK）細胞系を含む、ウイルス複製が可能な各種基質を使用することができる。【００３３】
本願発明の卵内接種用ワクチンは、ウイルス吸着剤を用い、ワクチン製造のための当技術分野で公知の通常の方法に従って製造することができる（Derek T. O'Hagan, et al.編、Vaccine Adjuvants, Humana Press, 2002参照）。例えば、ウイルスとあらかじめ調製したウイルス吸着剤とを混合する方法、ウイルス液中でウイルス吸着剤を作製する方法などにより製造できる。【００３４】
本願発明の卵内接種用ワクチンは、常法に従い（前述の特許文献１参照）卵内に接種することができる。ワクチンの卵内接種は、卵内に含有されている胚へのワクチン接種を含む。通常、胚形成の後期、一般には、孵卵の最後の四半期（15〜21日齢発育鶏卵）にワクチンを接種するが、好ましくは18〜19日齢発育鶏卵に接種する。【００３５】
本願発明の卵内接種用ワクチンはニワトリにおいて好適に使用できるが、他の家禽、例えば、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ウズラ、ダチョウ、ハトなどにも有効に接種することができる。【００３６】
本願発明の卵内接種用ワクチンはまた、他の不活化ワクチンと混合して使用することも可能である。混合法としては、本願発明による卵内接種用生ワクチンと不活化ワクチンとをあらかじめ混合する場合と、個別に調製した本願発明による卵内接種用生ワクチンと不活化ワクチンとを用時に混合する場合とのいずれであってもよい。【００３７】
以下に、実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
《実施例１：ウイルス吸着剤添加卵内接種用NDワクチンの作製》
ウイルス吸着剤としてカリミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、ハイドロキシアパタイトおよびシリカゲル添加卵内接種用ニューカッスル病（ND）ワクチンの作製を行った。カリミョウバンおよび水酸化アルミニウムゲルは常法によりアルミニウム含量2mg/ml、ハイドロキシアパタイトは200mg/mlとなるように生理食塩水を用いて調製した。カリミョウバン、水酸化アルミニウムゲルおよびハイドロキシアパタイト液10mlと105.3EID50/mlとなるように生理食塩水を用いて調製したNDウイルス弱毒株D26株ウイルス液10mlを混合し、4℃条件下で一晩スターラーを用いて攪拌した。また、粉末状のシリカゲル1gを106.3EID50/mlとなるように生理食塩水を用いて調整したNDウイルス弱毒株D26株ウイルス液1mlと混合し、総量が20mlとなるように生理食塩水を添加し、4℃条件下で一晩スターラーを用いて攪拌した。【００３９】
混合後に各ウイルス吸着剤へのウイルス吸着を確認するために、作製したワクチンを2500rpmで5分間遠心し、上清中に残存するウイルス量を特定病原体除去（Specific Pathogen Free、以下、「SPF」という）鶏由来11日齢発育鶏卵を用いて測定した。その結果、全てのウイルス吸着剤においてウイルスの十分な吸着が確認された。中でもカリミョウバンとハイドロキシアパタイトをウイルス吸着剤に用いた場合のウイルス量は検出限界以下であった（表１）。以上の結果から、各種ウイルス吸着剤が本願発明に利用できると評価された。【００４０】
【表１】
2007072916.tif 000002
【００４１】
《実施例２：SPF卵におけるウイルス吸着剤添加卵内接種用NDワクチンの安全性》
実施例１に記載の方法で作製したカリミョウバンおよび水酸化アルミニウムゲル添加卵内接種用NDワクチンを用い、Sharmaら（前述の非特許文献１参照）により報告された方法でSPF18日齢発育鶏卵に1個あたり0.1mlずつ卵内接種した（１群および２群）。対照としてウイルス吸着剤無添加のウイルスのみである試験群を設定した（３群）。その結果、表２に示すとおり、ウイルス吸着剤添加卵内接種用NDワクチン群は無添加群と比較して孵化率で有意差があった（Fisherの直接確率計算法による無添加群との有意差検定）。さらに、孵化後2週間目での生存率についても、ウイルス吸着剤添加卵内接種用NDワクチン群は無添加群と比較して有意差があった（表３）。【００４２】
【表２】
2007072916.tif 000003
*: P<0.05, ****: P<0.0001【００４３】
【表３】
2007072916.tif 000004
*: P<0.05, **: P<0.01【００４４】
《実施例３：SPF卵におけるウイルス吸着剤添加卵内接種用NDワクチンの有効性》
実施例２に供試した試験群の有効性を評価するため、孵化後3週目において血清を採取し、NDウイルス赤血球凝集素（財団法人化学及血清療法研究所）を用いて添付の使用説明書の記載に従い、赤血球凝集反応抑制試験（HI試験）を実施した。一般にNDウイルス強毒株佐藤株による攻撃に対してはHI抗体価が5倍以上で防御できることが知られていることから、ウイルス吸着剤添加卵内接種用NDワクチン群におけるHI抗体価は防御レベルを十分に上回っていた（表４）。【００４５】
【表４】
2007072916.tif 000005
1): 括弧内には抗体陽性率（%）を示した。5倍以上の場合を陽性とした。【００４６】
《実施例４：ウイルス吸着剤添加卵内接種用IBおよびFPワクチンの作製》
ウイルス吸着剤にカリミョウバンを用いて卵内接種用伝染性気管支炎（IB）および鶏痘（FP）ワクチンの作製を行った。カリミョウバンは常法によりアルミニウム含量2mg/mlとなるように生理食塩水を用いて作製した。カリミョウバン液10mlと105.8EID50/mlとなるように生理食塩水を用いて調製したIBウイルスTM-86w株ウイルス液あるいは104.3TCID50/mlとなるように生理食塩水を用いて調製した鳩痘（PP）ウイルス中野株由来KIII株ウイルス液10mlを混合し、4℃条件下で一晩スターラーを用いて攪拌した。混合後に各ウイルス吸着剤へのウイルス吸着を確認するため、作製したワクチンを2500rpmで5分間遠心し、上清中に残存するウイルス量をSPF鶏由来11日齢発育鶏卵を用いて測定した。その結果、IBおよびPPともにウイルスの十分な吸着が確認された（表５）。【００４７】
【表５】
2007072916.tif 000006
【００４８】
《実施例５：SPF卵におけるウイルス吸着剤添加卵内接種用IBワクチンの安全性》
実施例４に記載の方法で作製したカリミョウバン添加卵内接種用IBワクチンを用い、Sharmaらにより報告された方法でSPF18日齢発育鶏卵に1個あたり0.1mlずつ卵内接種した（１群）。対照としてウイルス吸着剤無添加のウイルスのみである試験群を設定した（２群）。その結果、表６に示すとおり、ウイルス吸着剤添加卵内接種用IBワクチン群は無添加群と比較して孵化率で有意差があった（Fisherの直接確率計算法による無添加群との有意差検定）。【００４９】
【表６】
2007072916.tif 000007
****: P<0.0001【００５０】
《実施例６：SPF卵におけるウイルス吸着剤添加卵内接種用IBワクチンの有効性》
実施例５に供試した試験群の有効性を評価するため、孵化後4週目において血清を採取し、中和抗体価の測定を実施した。また、孵化後4週目においてIBウイルスTM-86EC株を1羽あたり103.5EID50/0.1mlずつ気管内接種し、接種後4日目に気管を採材し、気管線毛運動の有無を観察した。その結果、表７に示すとおり、中和抗体価が2.0倍以上、気管線毛運動停止率も0%と十分な効果が確認された。【００５１】
【表７】
2007072916.tif 000008
1): 括弧内には抗体陽性率（%）を示した。中和指数2.0以上の場合を陽性とした。【００５２】
《実施例７：SPF卵におけるウイルス吸着剤添加卵内接種用FPワクチンの安全性》
実施例４に記載の方法で作製したカリミョウバン添加卵内接種用FPワクチンを用い、Sharmaらにより報告された方法でSPF18日齢発育鶏卵に1個あたり0.1mlずつ卵内接種した（１群）。対照としてウイルス吸着剤無添加のウイルスのみである試験群を設定した（２群）。その結果、表８に示すとおり、ウイルス吸着剤添加卵内接種用FPワクチン群は無添加群と比較して孵化率で有意差があった（Fisherの直接確率計算法による無添加群との有意差検定）。【００５３】
【表８】
2007072916.tif 000009
**: P<0.01【００５４】
《実施例８：SPF卵におけるウイルス吸着剤添加卵内接種用FPワクチンの有効性》
実施例７に供試した試験群の有効性を評価するため、孵化後3週目において血清を採取し、蛍光抗体（FA）価の測定を実施した。また、孵化後3週目においてFPウイルス西ヶ原株を1羽あたり104.0TCID50/0.1mlずつ大腿部の羽毛を抜いた後に滴下し、歯ブラシを用いて塗擦した。接種後3週間臨床症状を観察し、発痘、痂皮及び潰瘍の有無を確認した。その結果、FA陽性率及びFPウイルス強毒株攻撃による防御率ともにウイルス吸着剤添加卵内接種用FPワクチン群が無添加群に比べ良好であった（表９）。【００５５】
【表９】
2007072916.tif 000010
1): FA価20倍以上の場合を陽性とした。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本願発明による卵内接種用家禽ワクチンは、ウイルス吸着剤を使用して生ウイルスを吸着・保持しているため、卵内接種後の発育鶏卵内におけるウイルスの増殖が緩慢になり、その結果、胚に対する病原性を低下させることができ、それゆえ卵内接種による孵化率低下および孵化後の臨床症状の重篤化を引き起こすこともなく、安全性が高い。さらに、本願発明による卵内接種用家禽ワクチンは、抗原としての生ウイルスを含んでいるので、当該ウイルスが原因の疾病に対する防御効果も通常の生ワクチン同様に優れている。従って、かかる本願発明による卵内接種用家禽ワクチンは、現在普及しているMDワクチンおよびIBDワクチン等の特定の生ワクチンに限られることなく、あらゆる天然の生ウイルスを用いてワクチンを製造することができることから、種々の広範な疾病の致死性原因ウイルスに対しても広く防御免疫を獲得することを可能にする。そのため、家禽産業の衛生対策に大きく貢献できることが期待される。
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月17日(2007.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原としてニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルスおよび鳩痘ウイルスよりなる群から選択される生ウイルスを含有する卵内接種用家禽ワクチンにおいて、アルミニウム化合物、ハイドロキシアパタイト、またはシリカゲルのいずれかから選択されるウイルス吸着剤を含有することを特徴とする卵内接種用家禽ワクチン。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記アルミニウム化合物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸三ナトリウム塩化アルミニウムおよびカリミョウバンよりなる群から選択される請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記家禽類がニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ウズラ、ダチョウおよびハトよりなる群から選択される請求項１または３に記載のワクチン。
【請求項６】
請求項１、３または５のいずれかに記載のワクチンを免疫生成有効量だけ家禽に対し卵内で投与することを含む家禽の免疫方法。
【請求項７】
前記ワクチンが胚孵卵期間の最終四半期中に投与される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルスおよび鳩痘ウイルスよりなる群から選択される生ウイルスの溶液と、アルミニウム化合物、ハイドロキシアパタイト、またはシリカゲルのいずれかから選択されるウイルス吸着剤とを混合し、得られた混合液を攪拌して該生ウイルスを該ウイルス吸着剤に吸着・保持させることを含む、卵内接種用家禽ワクチンの製造方法。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
前記アルミニウム化合物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸三ナトリウム塩化アルミニウムおよびカリミョウバンよりなる群から選択される請求項８記載の方法。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
前記家禽類がニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ウズラ、ダチョウおよびハトよりなる群から選択される請求項８または１０に記載の方法。
【国際調査報告】
2007072916.tif 000011
2007072916.tif 000012
2007072916.tif 000013
2007072916.tif 000014
2007072916.tif 000015
2007072916.tif 000016