【手続補正書】
【提出日】平成31年4月11日(2019.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、細胞における標的ゲノムDNA領域の部位特異的な配列改変のための方法：
該細胞を活性化組成物と接触させる工程；
該細胞に、
（a）ドナーDNAまたはプラスミドと（b）TALEN、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、ヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼCas9から選択されるDNA消化剤であって、1つまたは複数のRNA上にコードされているDNA消化剤と(c) ガイドRNAとを含むトランスフェクション組成物をトランスフェクトする工程であって、
該ドナーDNAまたはプラスミドが、
（i）該標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と；
（ii）配列改変領域と
を含み；かつ
ゲノムDNA配列が、該標的ゲノムDNA領域において特異的に改変され、
前記細胞のトランスフェクションが、該細胞のエレクトロポレーションまたはフローエレクトロポレーションデバイスを用いるフローエレクトロポレーションを含む、工程。
【請求項２】
前記細胞が、該細胞を前記活性化組成物と接触させた後7日未満、3日未満、2日もしくはそれ未満の期間に、または2日後にトランスフェクトされる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ドナーDNAまたはプラスミドが導入遺伝子を含む、またはオリゴもしくは一本鎖オリゴである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスフェクション組成物中の前記ドナーDNAまたはプラスミドの濃度が10〜500μg/mLである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が哺乳動物細胞、哺乳動物初代細胞、ヒト細胞、線維芽細胞、哺乳動物末梢血リンパ球、哺乳動物初代T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、幹細胞、造血幹細胞もしくは間葉系幹細胞であり、ならびに／または前記活性化組成物が、抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
標的ゲノムDNA配列が疾患関連遺伝子を含む、ならびに／または
前記ドナーDNAもしくはプラスミドが疾患関連遺伝子を含む、ならびに／または
前記ドナーDNAもしくはプラスミドがキメラ抗原受容体（CAR）を含む、ならびに／または
前記ドナーDNAもしくはプラスミドがキメラ抗原受容体（CAR）を含み、かつ、前記ドナーDNAもしくはプラスミドの配列改変領域がCARを含む、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ドナーDNAまたはプラスミドが、核酸少なくとも10個、核酸少なくとも20個、または核酸少なくとも30個の相同配列を含む相同領域を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記DNA配列改変が、1つまたは複数の終止コドンであり、
前記配列改変によって、前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が変化する、
前記配列改変によって、前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が付加される、
前記配列改変によって、前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が欠失する、または
前記DNA配列改変が、導入遺伝子の部位特異的な標的組込みである、
請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（i）前記DNA配列改変を有するクローン細胞を作製するために、および／または
（ii）大規模製造のために、および／または
（iii）1 L超の容積でまたは3 Lもしくはそれ以上の容積で、
単離および選択されたクローン細胞を増殖させる工程をさらに含む、
請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞を前記配列改変についてスクリーニングする工程をさらに含む、および／または
トランスフェクトされた細胞を凍結させる工程をさらに含む、および／または
以前に凍結させたトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程をさらに含む、
請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、標的ゲノムDNA配列のゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を作製するための方法：
細胞を活性化組成物と接触させる工程；
該細胞に、（a）ドナーDNAと（b）DNA消化剤とを含むトランスフェクション組成物をトランスフェクトする工程であって、
該ドナーDNAが、
（i）標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と；
（ii）配列改変領域と
を含む、工程；および
トランスフェクトされた細胞を、該標的ゲノムDNA領域における該ゲノムDNA配列改変についてスクリーニングする工程；
クローン細胞を得るために、スクリーニングしたトランスフェクトされた細胞を限界希釈により単離する工程；
該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を作製するために、単離したトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法により作製された細胞または細胞株。
【請求項１３】
請求項12に記載の細胞または細胞株の有効量を含む、がんを有するまたは有することが疑われる対象を処置するための組成物。
【請求項１４】
細胞、自己由来の細胞、または自己由来のT細胞もしくはNK細胞を含む、それを必要とする対象におけるがん、白血病、B細胞悪性腫瘍、または急性リンパ芽球性白血病を処置するための組成物であって、該細胞が以下の工程を含む方法によって作製される、前記組成物；
患者より単離された細胞を活性化組成物と接触させる工程；
該細胞に、（a）ドナーDNAと（b）DNA消化剤とを含むトランスフェクション組成物または非ウイルス性トランスフェクション組成物をトランスフェクトする工程であって、
該ドナーDNAが、
（i）標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と；
（ii）キメラ抗原受容体（CAR）と
を含み；かつ
ゲノムDNA配列が、該CARを組み込むように該標的ゲノムDNA領域において特異的に改変される、工程。
【請求項１５】
前記細胞が前記患者の血液から単離されたものである、および／または前記細胞がアフェレーシスにより単離される、請求項14に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
[本発明1001]
以下の工程を含む、細胞における標的ゲノムDNA領域の部位特異的な配列改変のための方法：
該細胞を活性化組成物と接触させる工程；
該細胞に、（a）ドナーDNAと（b）DNA消化剤とを含む非ウイルス性トランスフェクション組成物をトランスフェクトする工程であって、
該ドナーDNAが、
（i）該標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と；
（ii）配列改変領域と
を含み；かつ
ゲノムDNA配列が、該標的ゲノムDNA領域において特異的に改変される、工程。
[本発明1002]
前記細胞が免疫細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記免疫細胞がT細胞である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記T細胞が初代T細胞である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記活性化組成物が抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記細胞のトランスフェクションが、該細胞のフローエレクトロポレーションを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
以下の工程を含む、細胞における標的ゲノムDNA領域の部位特異的な配列改変のための方法：
該細胞を活性化組成物と接触させる工程；
該細胞に、（a）ドナーDNAと（b）DNA消化剤とを含むトランスフェクション組成物をトランスフェクトする工程であって、
該ドナーDNAが、
（i）該標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と；
（ii）配列改変領域と
を含み；かつ
ゲノムDNA配列が、該標的ゲノムDNA領域において特異的に改変される、工程。
[本発明1008]
前記細胞のトランスフェクションが、該細胞のエレクトロポレーションを含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記エレクトロポレーションが、フローエレクトロポレーションデバイスを用いるフローエレクトロポレーションである、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記細胞が、該細胞を前記活性化組成物と接触させた後7日未満の期間にトランスフェクトされる、本発明1007〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記細胞が、該細胞を前記活性化組成物と接触させた後3日未満の期間にトランスフェクトされる、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記細胞が、該細胞を前記活性化組成物と接触させた後2日またはそれ未満の期間にトランスフェクトされる、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記細胞が、該細胞を前記活性化組成物と接触させた2日後にトランスフェクトされる、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記DNA消化剤が、TALEN、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、およびヌクレアーゼより選択される、本発明1007〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記DNA消化剤が、1つまたは複数のRNA上にコードされている、本発明1007〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記DNA消化剤がヌクレアーゼである、本発明1007〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記DNA消化剤がCas9である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記トランスフェクション組成物がガイドRNAをさらに含む、本発明1007〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記ヌクレアーゼが部位特異的ヌクレアーゼである、本発明1016の方法。
[本発明1020]
前記ドナーDNAがプラスミドである、本発明1007〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記ドナーDNAが導入遺伝子を含む、本発明1007〜1019のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記ドナーDNAがオリゴである、本発明1007〜1019のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記ドナーDNAが一本鎖オリゴである、本発明1007〜1019のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記トランスフェクション組成物中の前記ドナーDNAの濃度が約10〜約500μg/mLである、本発明1007〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記細胞が哺乳動物細胞である、本発明1007〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記細胞がヒト細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記細胞が線維芽細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1028]
前記哺乳動物細胞が末梢血リンパ球である、本発明1025の方法。
[本発明1029]
前記哺乳動物細胞が初代T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1030]
前記細胞がナチュラルキラー（NK）細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1031]
前記活性化組成物が、抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む、本発明1029または1030の方法。
[本発明1032]
前記哺乳動物細胞が幹細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1033]
前記幹細胞が造血幹細胞である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記細胞が間葉系幹細胞である、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記哺乳動物細胞が初代細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1036]
標的ゲノムDNA配列が疾患関連遺伝子を含む、本発明1007〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記ドナーDNAが疾患関連遺伝子を含む、本発明1007〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記ドナーDNAがキメラ抗原受容体（CAR）を含む、本発明1007〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記ドナーDNAの配列改変領域がCARを含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記ドナーDNAが、核酸少なくとも10個の相同配列を含む相同領域を含む、本発明1007〜1036のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記ドナーDNAが、核酸少なくとも20個の相同配列を含む相同領域を含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記ドナーDNAが、核酸少なくとも30個の相同配列を含む相同領域を含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記配列改変の効率が0.2%超である、本発明1007〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記配列改変の効率が1%超である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記配列改変の効率が5%超である、本発明1044の方法。
[本発明1046]
トランスフェクション後の細胞生存率が少なくとも30%である、本発明1007〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記トランスフェクション後の細胞生存率が少なくとも40%である、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記トランスフェクション後の細胞生存率が少なくとも50%である、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記DNA配列改変が、1つまたは複数の終止コドンである、本発明1007〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記配列改変によって、前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が変化する、本発明1007〜1048のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記配列改変によって、前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が付加される、本発明1007〜1048のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記配列改変によって、前記ゲノム配列の1塩基対または複数の塩基対が欠失する、本発明1007〜1048のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記DNA配列改変が、導入遺伝子の部位特異的な標的組込みである、本発明1007〜1048のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記トランスフェクション組成物が、異なる相補配列を有する2つまたはそれ以上のドナーDNAを含む、本発明1007〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記トランスフェクション組成物が、2つまたはそれ以上のDNA消化剤を含む、本発明1054の方法。
[本発明1056]
前記トランスフェクション組成物が、2つまたはそれ以上の部位特異的DNA消化剤を含み、該DNA消化剤が、異なるゲノム部位を標的とする、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記DNA配列改変を有するクローン細胞を作製するために、単離および選択されたクローン細胞を増殖させる工程をさらに含む、本発明1007〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
細胞を大規模製造のために増殖させる、本発明1057の方法。
[本発明1059]
細胞を1 L超の容積で増殖させる、本発明1057または1058の方法。
[本発明1060]
細胞を3 Lまたはそれ以上の容積で増殖させる、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記細胞が無血清培地中で培養される、本発明1007〜1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
前記細胞を前記配列改変についてスクリーニングする工程をさらに含む、本発明1007〜1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
トランスフェクトされた細胞を凍結させる工程をさらに含む、本発明1007〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
以前に凍結させたトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程をさらに含む、本発明1007〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
以下の工程を含む、標的ゲノムDNA配列のゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を作製するための方法：
細胞を活性化組成物と接触させる工程；
該細胞に、（a）ドナーDNAと（b）DNA消化剤とを含むトランスフェクション組成物をトランスフェクトする工程であって、
該ドナーDNAが、
（i）標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と；
（ii）配列改変領域と
を含む、工程；および
トランスフェクトされた細胞を、該標的ゲノムDNA領域における該ゲノムDNA配列改変についてスクリーニングする工程；
クローン細胞を得るために、スクリーニングしたトランスフェクトされた細胞を限界希釈により単離する工程；
該ゲノムDNA配列改変を含む安定な細胞株を作製するために、単離したトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程。
[本発明1066]
本発明1065の方法により作製された細胞株。
[本発明1067]
本発明1007〜1065のいずれかの方法を用いて作製された、トランスフェクトされた細胞。
[本発明1068]
本発明1067のトランスフェクトされた細胞または本発明1066の細胞株の有効量を投与する工程により、疾患もしくは状態を有する対象または疾患もしくは状態を有することが疑われる対象を処置する方法。
[本発明1069]
本発明1067のトランスフェクトされた細胞または本発明1066の細胞株の有効量を投与する工程を含む、臨床研究方法。
[本発明1070]
以下の工程を含む、それを必要とする対象においてがんを処置する方法：
細胞を活性化組成物と接触させる工程；
該細胞に、（a）ドナーDNAと（b）DNA消化剤とを含むトランスフェクション組成物をトランスフェクトする工程であって、
該ドナーDNAが、
（i）標的ゲノムDNA領域に相同な核酸配列を含む相同領域と；
（ii）キメラ抗原受容体（CAR）と
を含み；かつ
ゲノムDNA配列が、該CARを組み込むように該標的ゲノムDNA領域において特異的に改変される、工程；および
該細胞を患者に投与する工程。
[本発明1071]
前記トランスフェクション組成物が非ウイルス性である、本発明1070の方法。
[本発明1072]
前記細胞が自己由来である、本発明1070または1071の方法。
[本発明1073]
前記細胞がT細胞またはNK細胞である、本発明1070または1072の方法。
[本発明1074]
前記がんが、白血病、B細胞悪性腫瘍、または急性リンパ芽球性白血病である、本発明1070〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
前記細胞が、前記患者の血液から単離される、本発明1070〜1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
前記細胞がアフェレーシスにより単離される、本発明1075の方法。
[本発明1077]
細胞を前記患者から単離する工程をさらに含む、本発明1070〜1076のいずれかの方法。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、本詳細な説明から本発明の精神および範囲内での種々の変更および改変が当業者には明らかになるため、詳細な説明および具体的な実施例が、本発明の好ましい態様を示しているが、例示としてのみ提供されることを理解すべきである。