【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年11月16日(2006.11.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】コンパニオン動物のグルコース代謝、飽満、及び栄養吸収を改善する方法
【特許請求の範囲】
１．  糞バクテリアによって２４時間発酵させた場合、１５〜６０％の有機物消滅を持っている発酵性繊維であって、この発酵性繊維が補足の総食物繊維の約１〜１１重量％の量で存在する発酵性繊維を含有する組成物から実質的になる食餌をコンパニオン動物に与える工程、及び
上記発酵性繊維が上記コンパニオン動物の胃腸管（ＧＩＴ）内で発酵するのに十分な時間、上記食餌を上記コンパニオン動物に与えることを持続する工程：
を含むグルコース代謝を改善するためにコンパニオン動物の胃腸管（ＧＩＴ）の機能及び組織を変える方法。
２．  上記組成物は上記発酵性繊維を補足の総食物繊維の２〜１０重量％の量で含有する請求の範囲１、１４、１５、１６、１７または１８の方法。
３．  上記組成物は上記発酵性繊維を補足の総食物繊維の３〜９重量％の量で含有する請求の範囲１、１４、１５、１６、１７または１８の方法。
４．  上記組成物は上記発酵性繊維を補足の総食物繊維の４〜７重量％の量で含有する請求の範囲１、１４、１５、１６、１７または１８の方法。
５．  上記発酵性繊維は２０〜５０％の有機物消滅を持っている請求の範囲１、１４、１５、１６、１７または１８の方法。
６．  上記発酵性繊維は３０〜４０％の有機物消滅を持っている請求の範囲１、１４、１５、１６、１７または１８の方法。
７．  上記発酵性繊維はビートパルプ、アラビアゴム、タルハゴム、オオバコ、米糠、イナゴマメゴム、カンキツ属パルプ、ペクチン、フラクトオリゴ糖、マンナオリゴ糖、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求の範囲１、１４、１５、１６、１７または１８の方法。
８．  上記発酵性繊維はビートパルプ、アラビアゴム、及びフラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる請求の範囲１、１４、１５、１６、１７または１８の方法。
９．  上記発酵性繊維はビートパルプ、タルハゴム、及びフラクトオリゴ糖の混合物を含む請求の範囲１、１４、１５、１６、１７または１８の方法。
１０．  上記フラクトオリゴ糖に対する上記ビートパルプの比は約３：１〜６：１である請求の範囲９の方法。
１１．  上記フラクトオリゴ糖に対する上記ビートパルプの比は約４：１である請求の範囲９の方法。
１２．  上記タルハゴム、上記フラクトオリゴ糖に対する上記ビートパルプの比は約６：２：１．５である請求の範囲９の方法。
１３．  上記コンパニオン動物は犬である請求の範囲１、１４、１５、１６、１７または１８の方法。
１４．  糞バクテリアによって２４時間発酵させた場合、１５〜６０％の有機物消滅を持っている発酵性繊維であって、この発酵性繊維が補足の総食物繊維の約１〜１１重量％の量で存在する発酵性繊維を含有する組成物から実質的になる食餌をコンパニオン動物に与える工程、及び
動物の胃腸管（ＧＩＴ）内のグルカゴンのようなペプチド−１（ＧＬＰ−１）の分泌を増大させるために、上記発酵性繊維が上記コンパニオン動物の胃腸管（ＧＩＴ）内で発酵するのに十分な時間、上記食餌を上記コンパニオン動物に与えることを持続する工程：
を含むコンパニオン動物のグルコース代謝を改善しそしてコンパニオン動物の飽満を増進するためにコンパニオン動物の胃腸管（ＧＩＴ）内のグルカゴンのようなペプチド−１（ＧＬＰ−１）の分泌を増大させる方法。
１５．  糞バクテリアによって２４時間発酵させた場合、１５〜６０％の有機物消滅を持っている発酵性繊維であって、この発酵性繊維が補足の総食物繊維の約１〜１１重量％の量で存在する発酵性繊維を含有する組成物から実質的になる食餌をコンパニオン動物に与える工程、及び
コンパニオン動物の胃腸管（ＧＩＴ）内の栄養分の吸収を増大させ、そしてＤ−グルコース及びラウリン酸の輸送を増大させるために、上記発酵性繊維が上記コンパニオン動物の胃腸管（ＧＩＴ）内で発酵するのに十分な時間、上記食餌を上記コンパニオン動物に与えることを持続する工程：
を含むコンパニオン動物の胃腸管（ＧＩＴ）内の栄養分の吸収を改善する方法。
１６．  糞バクテリアによって２４時間発酵させた場合、１５〜６０％の有機物消滅を持っている発酵性繊維であって、この発酵性繊維が補足の総食物繊維の約１〜１１重量％の量で存在する発酵性繊維を含有する組成物から実質的になる食餌をコンパニオン動物に与える工程、及び
コンパニオン動物の胃腸管（ＧＩＴ）内の栄養分の吸収を増大させ、そしてＤ−グルコース及びラウリン酸の輸送を増大させるために、上記発酵性繊維が上記コンパニオン動物の胃腸管（ＧＩＴ）内で発酵するのに十分な時間、上記食餌を上記コンパニオン動物に与えることを持続する工程：
を含む外分泌性膵臓機能不全症に罹っている動物を治療する方法。
１７．  糞バクテリアによって２４時間発酵させた場合、１５〜６０％の有機物消滅を持っている発酵性繊維であって、この発酵性繊維が補足の総食物繊維の約１〜１１重量％の量で存在する発酵性繊維を含有する組成物から実質的になる食餌をコンパニオン動物に与える工程、及び
コンパニオン動物におけるＧＬＰ−１のレベルを向上させそれによって飽満感を与えるのに十分な時間、上記食餌を上記コンパニオン動物に与えることを持続する工程：
を含むコンパニオン動物において飽満を増進する方法。
１８．  糞バクテリアによって２４時間発酵させた場合、１５〜６０％の有機物消滅を持っている発酵性繊維であって、この発酵性繊維が補足の総食物繊維の約１〜１１重量％の量で存在する発酵性繊維を含有する組成物から実質的になる食餌をコンパニオン動物に与える工程、及び
コンパニオン動物におけるＧＬＰ−１のレベルを向上させそれによってその動物の過食傾向を低減させるのに十分な時間、上記食餌を上記コンパニオン動物に与えることを持続する工程：
を含むコンパニオン動物において過食傾向を低減させる方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は例えば、犬や猫のようなコンパニオン動物のグルコース代謝、飽満及び栄養分の吸収を改善する発酵性繊維を含有するペットフード組成物の使用を含む方法に関する。
最近の調査は食物繊維は犬及び猫の大腸内の発酵特性に重要であることを示している。例えば、Ｒｅｉｎｈａｒｔ、米国特許Ｎｏ．５，６１６，５６９は動物の正常な胃腸機能を維持し、そして慢性の下痢を改善するために、ペットフード組成物に発酵性食物繊維を添加することを開示する。Ｈｏｗａｒｄ等、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９６）１０：Ａ２５７、は発酵性繊維を犬に投与すると、排泄物窒素が尿から糞に分配され、この動物の糞を通じて窒素の排出が増大することを示す。Ｓｕｎｖｏｌｄ等、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．（１９９５）７３：１０９９−１１０９、は発酵性繊維を適度に犬に与えると、この動物の腸内で短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の生成が最大限に利用されて、胃腸管の健康が増進されることを発見した。
犬のような動物ならびに人間はときどき糖尿病に罹るか、又は正常な血糖レベルの能力を損なう。糖尿病には多くの原因がある。糖尿病又は血液グルコース調節が損なわれたと診断された場合、動物への投薬又は食餌が密接に制御される。最近は、高濃度の非発酵性繊維を有する食餌が糖尿病を治療するために使用される。しかしながら、これらの非発酵性繊維を含有する食餌はしばしば動物による栄養物の吸収を損ない、その結果、動物の健康に害を与える。
ある動物はまた動物の糖尿病又は他の慢性病の危険を増大させる過剰のカロリー摂取の傾向を有する。動物が過剰のカロリーの摂取なしに食事の後で満腹になるように食物手段を介してカロリー摂取を管理できることが望まれている。
他の動物は食事からの栄養分の消化及び吸収が困難な場合がある。例えば、外分泌性膵臓機能不全症（ＥＰＩ）、即ち、膵臓による酵素の分泌が不十分である状態、を示す動物は彼等の食餌中の栄養分、特に脂肪を正常に消化しようと努力する。このような動物の栄養分の吸収能力を改善できることが望ましい。従って非発酵性繊維を含む食餌に悪影響を与えることなく、コンパニオン動物のグルコース代謝、飽満及び栄養分の吸収を改善できるその他の食餌手段が必要とされている。
発明の概要
本発明は動物の健康に有益になるように、胃腸管（ＧＩＴ）、大リンパ系臓器の機能及び組織を変える食餌を動物に与える方法を提供することにより上記要望を満たす。この方法は例えば、犬や猫のようなコンパニオン動物に糞バクテリアによって２４時間発酵させた場合、１５〜６０％の有機物消滅（ＯＭＤ）を持っている発酵性繊維であって、この発酵性繊維が補足の総食物繊維の約１〜１１重量％の量で存在する発酵性繊維を含有するペットフード組成物の食餌を与えることを含む。この動物は上記発酵性繊維が動物のＧＩＴ内で発酵するのに十分な時間、上記食餌を与えられる。グルコースのホメオスタシスを改善し、そして動物の飽満を増進するＧＬＰ−１の分泌が上記発酵により高められる。またこの食餌はそれぞれ炭水化物と脂肪の吸収の指標であるＤ−グルコース及びラウリン酸の輸送を増大させることにより動物による栄養分の吸収を高める。
好ましくは、上記ペットフード組成物は上記発酵性繊維の補足の総食物繊維を２〜１０重量％の量で含有する。より好ましくは、上記ペットフード組成物は上記発酵性繊維の補足の総食物繊維を３〜９重量％の量で含有する。最も好ましくは、上記ペットフード組成物は上記発酵性繊維の補足の総食物繊維を４〜７重量％の量で含有する。
好ましくは、上記発酵性繊維は２０〜５０％の有機物消滅を持っている。より好ましくは、上記発酵性繊維は３０〜４０％の有機物消滅を持っている。
また、上記発酵性繊維は好ましくはビートパルプ、アラビアゴム、タルハゴム（アラビヤゴムの一種）、オオバコ、米糠、イナゴマメゴム、カンキツ属パルプ、ペクチン、フラクトオリゴ糖、又はイヌリン、マンナオリゴ糖、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる。より好ましくは、上記発酵性繊維はビートパルプ、アラビアゴム、及びフラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる。最も好ましくは、上記発酵性繊維はビートパルプ、タルハゴム、及びフラクトオリゴ糖の混合物である。上記発酵性繊維混合物中のフラクトオリゴ糖に対するビートパルプの好ましい重量比は約３：１〜６：１、そして最も好ましくは４：１である。タルハゴム、フラクトオリゴ糖に対するビートパルプの好ましい重量比は６：２：１．５である。
従って、本発明の特徴は動物の胃腸管の機能及び組織を変えてグルコース代謝を改善し、そしてグルコースのホメオスタシスを高め、飽満を増進させ、そして栄養分の吸収を高める。
この、そして他の本発明の特徴及び利点は以下の詳細な説明、添付の図面、及び請求の範囲から明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｃは“＊”で示されたかなり異なった時点（ｐ＜０．０５）を有する経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）の実施後の血漿ＧＬＰ−１（Ａ）、インスリン（Ｂ）、及びグルコース濃度（Ｃ）に対する発酵性繊維の効果を示す。
図２Ａ−２Ｃは経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）の実施後の血漿ＧＬＰ−１（Ａ）、インスリン（Ｂ）、及びグルコース濃度（Ｃ）の曲線下の増分面積を示す。
図３は腸プログルカゴンｍＲＮＡに対する発酵性繊維の効果を示すグラフである。
図４Ａ−４Ｂは犬の腸の切片内の絨毛の高さ（Ａ）及び陰か（ｃｒｙｐｔ）の深さ（Ｂ）に対する発酵性繊維の効果を示すグラフである。
図５Ａ−５Ｂは犬の空腸（Ａ）及び回腸（Ｂ）中へのＤ−グルコースの生体外摂取に対する発酵性繊維の効果を示すグラフである。
図６は腸のＳＧＬＴ−１輸送物ｍＲＮＡに対する発酵性繊維の効果を示すグラフである。
図７Ａ−７Ｂは犬の空腸（Ａ）及び回腸（Ｂ）の多量のＳＧＬＴ−１輸送物に対する発酵性繊維の効果を示す。
図８Ａ−８Ｂは犬の空腸（Ａ）及び回腸（Ｂ）の多量の腸ＧＬＵＴ２輪送物に対する発酵性繊維の効果を示す。
図９は隣接（Ｐ）、中央（Ｍ）、及び遠位（Ｄ）の腸内で摂取されたグルコース（ＧＬＣ）及びプロリン（ＰＲＯ）の割合のグラフである。
図１０はグルコース濃度の関数として上記隣接の腸による摂取を示す。
図１１はプロリン濃度の関数として上記隣接の腸による摂取を示す。
図１２は隣接（Ｐ）、中央（Ｍ）、及び遠位（Ｄ）の腸内においてグルコース（ＧＬＣ）及びプロリン（ＰＲＯ）を吸収する犬の腸の能力を示すグラフである。
好ましい態様の記述
本発明は動物の胃腸管の機能及び組織を変えるために、発酵性繊維を含有するペットフード組成物を使用する。これは多くの利益を動物に与える。第一に、グルコース代謝が改善され、そしてグルコースホメオスタシスが動物内で高められる。特定の理論に縛られることは望まないが、動物内のグルコースの調節の改善は少なくとも一部が、胃腸管内で分泌されるＧＬＰ−１のようなインスリン向性の消化管ホルモンのレベルが向上することに起因すると考えられる。ＧＬＰ−１は強いインスリン向性のホルモンであり、そして潜在的な抗糖尿病剤である。このＧＬＰ−１のレベルの向上は腸のグルコース輸送能力を増大させ、そして動物内のグルコースホメオスタシスを改善する。また動物のＧＩＴ内のＧＬＰ−１のレベルが向上すると動物の飽満を改善し、そして動物の過食の傾向を減少させる。これらの結果は動物の食餌に極めて高繊維濃度の動物の食餌を使用し、そしてセルロースのような低発酵性繊維を使用して上記結果を得ようと試みている従来の方法と比べて驚くべきことである。
更に、食餌内に発酵性繊維を存在させると、小腸の空腸（中央部）内のＤ−グルコース及びラウリン酸の輸送が増大する。Ｄ−グルコース及びラウリン酸はそれぞれ動物内において、炭水化物と脂肪の吸収の指標である。従って、栄養分の吸収を改善する本発明の方法から健康な動物は恩恵を受けられる。しかし外分泌性膵臓機能不全症（ＥＰＩ）のような病気に罹っている動物はより多く恩恵を受けられる。ＥＰＩは膵臓による酵素の不十分な分泌により生じ、この酵素は正常な栄養分の消化に動物が必要としている。ＥＰＩに罹っている動物は食物栄養分、特に脂肪を消化しようと努める。本発明のペットフード組成物を与えられたＥＰＩに罹っている動物は食物栄養分を吸収する能力が高められる恩恵を受けることができる。
本発明は有機物を特定のパーセンテージで消滅させる発酵性繊維を含有するペットフード組成物を使用する。本発明で使用される発酵性繊維は糞バクテリアによって生体外で２４時間発酵させた場合、約１５〜６０％の有機物消滅（ＯＭＤ）を持っている。即ち、初めに存在する有機物の合計量の約１５〜６０％が糞バクテリアにより発酵し、転換する。上記発酵性繊維の有機物消滅は好ましくは２０〜５０％、そして最も好ましくは３０〜４０％である。
従って、生体外のＯＭＤパーセンテージは以下のように計算できる。
｛１−［（ＯＭ残余−ＯＭブランク）／ＯＭ初期］｝×１００
但し、ＯＭ残余は発酵の２４時間後に回収された有機物であり、ＯＭブランクは対応のブランク管（即ち、媒質と希釈された糞を含むが、基質を含まない管）内で回収された有機物であり、ＯＭ初期は発酵前に上記管内に入れられた有機物である。この計算方法の詳細はＳｕｎｖｏｌｄ等、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．１９９５，巻．７３：１０９９−１１０９に記載されている。
上記ペットフード組成物は動物に適切な栄養分を与えることのできる組成を有する。例えば、本発明で用いられる代表的な犬の食餌は約３０％の粗蛋白質、約２０％の脂肪、約１０％の合計食物繊維を含んでもよい。しかしながら、これら又はその他の栄養分の特定の比又は百分率は必要ではない。
本発明に有用な発酵性繊維は代謝エネルギー（ＭＥ）の１０００カロリー（キロカロリー）当たり約２８〜８５ミリモルＳＣＦＡの範囲の、そしてより好ましくは１０００ＭＥキロカロリー当たり約４２〜７１ミリモルＳＣＦＡの範囲の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡｓ）を生じる。これは約１００〜約３５０ミリモルＳＣＦＡ／ｋｇの食餌を生じる発酵性繊維総量を有する組成物に等しい。
代謝エネルギーの１０００キロカロリー当たりのＳＣＦＡｓのミリモルは上記組成物キログラム当たり与えられた食餌組成物中の代謝エネルギー（ＭＥ）の総カロリーを最初に計算することにより計算される。１０００キロカロリーＭＥ当たりのグラム数は上記最初の計算から得られる。次いで上記組成物の発酵性繊維成分のグラム及びミリモルが計算される。
本発明の発酵性繊維は動物の腸内バクテリアが発酵してかなりの量のＳＣＦＡｓを生成できる繊維源である。“かなりの量”のＳＣＦＡｓは、本発明の目的のために、２４時間内に基質の総ＳＣＦＡｓ／グラムの０．５ミリモルを超える量である。好ましい発酵性繊維はビートパルプ、アラビアゴム（タルハゴムを含む）、オオバコ、米糠、イナゴマメゴム、カンキツ属パルプ、ペクチン、フラクトオリゴ糖、又はイヌリン、マンナオリゴ糖、及びこれらの繊維の混合物を含む。より好ましくは、上記発酵性繊維はビートパルプ、アラビアゴム、及びフラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる。最も好ましくは、上記発酵性繊維はビートパルプ、タルハゴム、及びフラクトオリゴ糖の混合物である。発酵性繊維混合物中のフラクトオリゴ糖に対するビートパルプの好ましい重量比は約３：１〜６：１、であり、そして最も好ましくは４：１である。タルハゴム、フラクトオリゴ糖に対するビートパルプの好ましい重量比は６：２：１．５である。
上記発酵性繊維はペットフード組成物中において補足の総食物繊維の１〜１１重量％、好ましくは２〜１０重量％、最も好ましくは３〜７重量％の量で使用される。
“補足の総食物繊維”の定義には、先ず“総食物繊維”の説明が必要である。“総食物繊維”は動物の消化酵素による加水分解に抵抗する植物食品の残留物として定義される。総食物繊維の主成分はセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、リグニン及びゴムである（ある形状のセルロース及びリグニンのみを含む“天然繊維”とは対照的である）。“補足の総食物繊維”は食物製品のその他の成分中に天然に存在する食物繊維に加えて、食物製品に添加される食物繊維である。また“繊維源”は主に繊維から構成されるものと考えられる。
以下に実施例を示すが、これらは本発明を説明するためであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
食餌、表１を参照、をイソニトロを含有し、等エネルギーであり、そして炭水化物からのエネルギー３５％と、脂肪からのエネルギー３０％と、蛋白質からのエネルギー３５％とを有する約１９．５ＭＪ／ｋｇの食餌を提供できるように調製した。この低発酵性繊維（ＬＦＦ）食餌は木材セルロースを繊維源として含有し、そして高発酵性繊維（ＨＦＦ）食餌はより発酵性の植物繊維（ビートパルプ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｕｇａｒ，Ｓａｇｉｎａｗ，Ｍｌ；アラビアゴム，ＴＩＣ  Ｇｕｍ，Ｂｅｌｃａｍｐ，ＭＤ；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ），Ｇｏｌｄｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）の混合物を含有した。アラビアゴム、ＦＯＳに対するビートパルプの比は約６：２：１．５であった。ＦＯＳに対するビートパルプの比は約４：１であった。
雑種の成犬（ｎ＝１６）を利用した。到着後ただちに、動物を７日間順化し、そして栄養学的に完全な食餌（Ｃａｎ−Ｐｒｏ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ，ＡＢ）を与えた。毎日、全ての犬の目方を量り、そして式：エネルギー摂取量（ＭＪ）＝０．５５３×ｋｇ（体重）０．６７を用いて、エネルギー必要量を満たすように別々に餌を与えた。食餌を毎日一回０９００−１０００時間の間に与え、そして水は無制限に与えた。交差の実験計画が使用され、これにより犬に無作為に１４日間上記ＨＦＦ又はＬＦＦ食餌を与え、引き続いて更に１４日間交互に食餌を与えた。１６匹の犬を一時に収容できないため、犬を実験を通じて一対にした。
経口グルコース耐性試験：
食餌を１３及び２７日間に１６００時間で取り除いた。１４及び２８日間に０８４５−０９００時間で、犬をテーブルの鎖で緩く束縛し、そして経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を７０％（ｗ／ｗ）右旋回糖を使用して行って、２ｇグルコース／ｋｇ体重を得た。末梢血液を伏在静脈に入れられた“Ｉｎｓｙｔｅ−Ｗ２０ＧＡ２”カテーテル（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｃｃｅｓｓ，Ｓａｎｄｙ，ＵＴ）を通じて０、１５、３０、４５、６０、９０及び１２０分で採取した。
末梢血液サンプル：
一般の化学スクリーン及び全血球計算値（２ｍｌ）のための血液サンプルを３ｍｌのヘパリン化ヴァキュテーナー管（商標、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）内に入れて分析まで氷上に貯蔵した。血液学分析をカウンターＳＴＫＳ器具（Ｃｏｕｒｔｅｒエレクトロニクス会社．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて実施し、そして手動の白血球分画を行った。インスリン及びＧＬＰ−１分析用の血液サンプルをアプロチニン（５００ＫＩＵ／ｍｌ血液、シグマ化学、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ）を有する１０ｍｌＥＤＴＡヘパリン化ヴァキュテーナー管中に採取し、そして−７０℃（ＧＬＰ−１）又は−３５℃（インスリン）で貯蔵した。血清グルコース測定用の血液サンプルを２５０μＬのマイクロ遠心機管に入れて、室温で１０分間２９００×ｇで遠心分離した。この血清をパイプで取り出して−３５℃で貯蔵した。
腸のサンプル：
２８日に、犬を上記ＯＧＴＴに続いて、伏在カテーテルを介して１ｍｌ／２．２７ｋｇ体重の量で睡眠薬（ｓｏｍｎｉｔｏｌ）（ＭＴＣ製薬，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＯＮ）の静脈注射により麻酔した。腸のサンプルをノザンプロット分析のために取り出し、そして直ちに液体窒素中に置いた。栄養摂取分析評価のための空腸と回腸のサンプルを氷で冷やされた食塩水に入れて、サンプルの分析評価を３０分間実施した．空腸と回腸の切片をウエスタンブロット分析用の粘膜サンプルを得るために削り取った。組織構造サンプルを直接にホルマリン中に入れてスライド（ｓｌｉｄｅｓ）を調製した。
グルコース：
血清グルコースをグルコース酵素測定用のシグマ診断グルコース（Ｔｒｉｎｄｅｒ）試薬を用いて５０５ｎｍ（Ｃａｔ＃３１５−１００、シグマ化学、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）で決定した。
インスリン：
血清インスリン濃度をＣｏａｔ−Ａ−Ｃｏｕｎｔ（商標）Ｉ１２５診断放射免疫定量法（Ｃａｔ＃ＴＫＩＮＩ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ会社、ロサンゼルスＣＡ）を用いて決定した。
血漿ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２抽出：
ＧＬＰ−１免疫反応性のペプチドを２．５ｍｌの血漿からＲｅｉｍｅｒ及びＭｃＢｕｒｎｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３７：３９４８−３９５６（１９９６）に記載されているように抽出した。緩衝剤Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）（Ｃａｔ＃ＲＩＫ−ＢＡ−１）及び緩衝剤Ｂ（６０％アセトニトリル）（Ｃａｔ＃ＲＩＫ−ＢＢ−１）を有する２００ｍｌのＣ１８（Ｃａｔ＃ＲＩＫ−ＳＥＰＣＯＬ１，Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ−研究所，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）を含有するＡＳＥＰ−ＣＯＬＵＭＮを溶出溶媒として使用した。サンプルをＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ（商標，Ｓａｖａｎｔ会社，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）を使用して一昼夜凍結乾燥し、そして−７０℃で保存した。
腸のＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２抽出：
腸切片からＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を抽出する方法がブリティッシュコロンビアの大学、バンクーバーのＸｉｏｙａｎの博士号論文（１９９６）に記載されており、この方法を修正した方法を実施した。４００−５００ｍｇの各切片（空腸、回腸、及び結腸）を０．５ｍｌの２Ｍ酢酸を有する１２×７５ｍｍのシンポート（Ｓｉｍｐｏｒｔ）ポリプロピレン管（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，ＡＢ）に添加し、そして１時間沸騰させた。この管を４５００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を集め、新しい管に移し、そして１ＮのＮａＯＨで中和した。ＲＩＡの目的のために、上澄み液のサンプルをＲＩＡ緩衝剤（１００ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．２ｇ／Ｌアジ化Ｎａ、ｐＨ８．５）で１：１０に希釈して１００μＬの最終サンプル容量を得た。
ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２放射免疫定量法：
ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の濃度をＸｉａｏｙａｎ（１９９６）により記述された放射免疫定量法を修正した方法を用いて測定した。凍結乾燥された血漿サンプルを２５０μＬのＲＩＡ分析物緩衝剤（１００ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．２ｇ／Ｌアジ化Ｎａ、ｐＨ８．５）中で再構成した。ポリプロピレン管（１２ｍｍ×７５ｍｍ）を対照物、標準物、及びサンプルのために使用し、そして全工程を氷上で実施した。系列希釈法で調製されたＧＬＰ−１（７−３６ＮＨ２）標準物（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  研究所，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）は４０００ｐｇ／ｍｌ〜１５ｐｇ／ｍｌの範囲であった。これらの管を混合して４℃で２４時間培養した。培養に続いて、５０Ｂｑの１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（７３６）ＮＨ２トレーサーを上記管に加え、この管を渦流で混合し、４℃で４８時間培養した。デキストラン−炭の懸濁液（分析物緩衝剤中、４ｇ／ＬデキストランＴ７０、８０ｇ／Ｌ炭）をＴＣ管を除く全ての管（１００μＬ）に加えた。これらの管を渦流で混合し、そして１５分間氷上に置き、２２００×ｇで３０分間遠心分離し、そして６００μＬの上澄み液を新しい管に移し、Ｃｏｂｒａ（商標）Ａｕｔｏ−ガンマ計数管（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を用いて計算した。
ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２ヨウ素化法：
ＧＬＰ−１（７−３６ＮＨ２）をＸｉａｏｙａｎ（１９９６）により記述されたクロラミン−Ｔ法を用いてヨウ素化した。カートリッジに０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を有する１０ｍｌのアセトニトリルを流し、続いて０．１％ＴＦＡを有する１０ｍｌのｄｄＨ２Ｏを流すことにより抗原を接種した。カートリッジに注入器により空気を１０ｍｌ圧入してカートリッジを乾燥した。最初に３０−４０μＬのｄｄＨ２Ｏに３０−４０μｇのＧＬＰ−１を溶解することによりヨウ素化を実施し、次いで１０μＬを新しいエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に移した。これに１０μＬの０．５Ｍ  ＰＯ４（ｐＨ７．０）を、続いて０．５ｍ  Ｃｉ１２５Ｉを加えた。クロラミン−Ｔ（１０μＬ）を加え、そしてこの管を正確に３０秒間軽くたたいた。メタ重亜硫酸ナトリウム（５ｍｇ／ｍｌ）を加え、続いて１ｍｌの０．１％ＴＦＡを加えた後、上記抗原を接種したカラムに移した。このカラムに１０ｃｃ注入器を用いて軽く圧力を加えた。五つの画分を得るために、０．１％ＴＦＡを有するアセトニトリルを溶離液として用いた。アセトニトリル（５ｍｌ、１０％＋０．１％ＴＦＡ）とアセトニトリル（５ｍｌ、２０％＋０．１％ＴＦＡ）がこの順序で用いられた最初の二つの溶離液であり、そしてこの溶離液は１４ｍＬの丸い有底管に集められた。次いで３０％アセトニトリル（１ｍｌ＋０．１％ＴＦＡ、４回）、３８％アセトニトリル（１ｍｌ＋０．１％ＴＦＡ、１回）、及び４０％アセトニトリル（１ｍｌ＋０．１％ＴＦＡ、５回）がこの順で次の溶離液として使用され、そして画分が小さなポリプロピレン管に集められた。各溶離された画分を十分に混合し、そして各画分からの１０μＬをＣｏｂｒａ（商標）Ａｕｔｏ−ガンマ計数管を用いて計算した。標識物が上記４０％アセトニトリルの画分１、２及び／又は３中で溶離された。標識を付けられたＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む画分が溜まり、そして−３５℃で貯蔵された。上記１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は約２週間の貯蔵寿命を有する。
総ＲＮＡの単離：
総ＲＮＡを製造者から提供されたプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ（商標）（Ｇｉｂｃｏｌ  ＢＲＬ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を用いて各腸切片から単離した。４００−５００ｍｇの組織を前もって冷やされた減菌した乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。粉砕した組織（２００ｍｇ、２部）を秤量し、２部をそれぞれポリプロピレン管（１２ｒｎｍ×７５ｍｒｎ）に移し、２ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（商標）溶液を加え、そしてサンプルをポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）均質化装置を用いて目盛り１０で３０秒間均質化した。均質化したサンプルを１４ｍｌの減菌したポリプロピレンＦａｌｃｏｎ（商標）管に移し、そして室温で５分間培養した。各サンプルに、４００μＬのクロロホルムを加え、上記管を１５秒間激しく手で振動させ、そして室温で更に２−５分間培養した。次に、サンプルを４℃において１２，０００×ｇで１５分間遠心分離した。水相を新しいエッペンドルフ管に移し、そして１ｍｌのイソプロパノールをこの管に加えた。この管を撹拌し、次いで上記ＲＮＡを−２０℃で一昼夜沈殿させた。サンプルを４℃で１０分間、１０，０００−１２，０００×ｇで遠心分離し、上澄み液を除去し、そしてペレットを７５％エタノール（少なくとも１ｍｌ）で２度洗浄した。このサンプルを混合し、４℃において７，５００×ｇで１０分間遠心分離した。このＲＮＡペレットを短く空気乾燥した（１０分以内）。上記ペレットをＲＮＡｓｅのない水（１００ｍｇの組織当たり５０−１００μＬ）中に軽くかき混ぜることにより溶解し、５５−６０℃で５−１０分間培養し、そして７０℃で貯蔵した。ＲＮＡの量及び純度を紫外線分光光度法により２６０、２８０及び２３０ｎｍで決定した。
ノザンブロット法分析：
メッセンジャーＲＮＡをＺｈａｏ等、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ．２５：１８９７−１９０３（１９９３）に述べられているようなノザンブロット法分析により測定した。等分した１５μｇの総ＲＮＡをそれぞれ１０μＬの負荷ゲル緩衝剤｛５０％脱イオン化ホルムアミド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２Ｍホルムアルデヒド、１．３％グリセリン（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、０．０２Ｍモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％ブロモフェノールブルー（ｗｔ／ｖｏｌ）｝に溶解した。この溶解し、等分されたＲＮＡを２分間沸騰してＲＮＡを変性し、次いで１％アガロース（ｗｔ／ｖｏｌ）ゲル含有（０．６６Ｍ）ホルムアルデヒドＲＮＡを上記変性したＲＮＡに投与し、そして０．０２Ｍ  ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する再循環緩衝剤の存在下で電気泳動（１００Ｖで５時間）によりサイズに従って分別した。電気泳動後、上記ゲルを２種類の１０Ｘ標準食塩水クエン酸塩（ＳＳＣ）（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸トリナトリウム、ｐＨ７．０）に浸漬し、そしてｚｅｔａ−プローブＧＴゲノミ（Ｇｅｎｏｍｉ）試験されたブロット膜（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）上にブロットした。上記ＲＮＡを真空中８０℃で２時間焼成することにより膜上に固定した。［３２Ｐ］ＣＰＴ−標識のリボプローブ（ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ）を用いた交雑（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の前に、各膜組織を２０ｍｌのプレ交雑（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）緩衝剤｛脱イオン化ホルムアミド（６０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２０ＸＳＳＰＥ（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０％ブロット（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２０％ＳＤＳ（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、及び１０ｍｇ／ｍｌのせん断された鮭のＤＮＡ（熱水浴中で１０分間変性された、５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）｝中で２時間５０℃でプレ交雑した。交雑を等容量の新しい交雑溶液｛脱イオン化ホルムアミド（５５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２０ＸＳＳＰＥ（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０％ブロット（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２０％ＳＤＳ（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、及び１０ｍｇ／ｍｌのせん断された鮭のＤＮＡ（脱イオン化ホルムアミドと混合された５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）｝中で１２−１６時間実施した。この溶液に上記予備加温された交雑溶液を添加する前に、１６．７ＫＢｑ（１×１０６ｃｐｍ）の標識されたリボプローブ（ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ）を加え、そして５分間７０℃の水浴中で予備加温した。上記膜組織を５分間室温で２Ｘ  ＳＳＣで洗浄し、次いで１０分間（ＧＬＵＴ２）又は１５分間（プログルカゴン，ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ，ＳＧＬＴ−１）の間、２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄した。この膜組織を以下のような０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの浴、即ち：プログルカゴン（７０℃で１０分）、ＳＧＬＴ−１（７０℃で２０分）、及びＧＬＵＴ２（６０℃で２−３分）に移した。最後に上記膜組織を室温で２−３分間、０．２Ｘ  ＳＳＣ中で洗浄した。この膜組織をプラスチックバッグ内に熱シールし、そしてコダックＸＲＡ５フィルム（イーストマン  コダック，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に増感板（デュポンカナダ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を用いて−７０℃で露光した。統計分析のために、信号をレーザー濃度計（モデルＧＳ−６７０映像濃度計，ＢｉｏＲａｄ研究所（カナダ）株式会社、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を用いて定量した。２８Ｓ及び１８Ｓリボソームのバンドが上記膜組織の写真のネガから定量された。これらのバンドを上記ＲＮＡの完全無欠を確認し、そして少しの負荷投与量の相違を補償するために使用した。
リボプローブ：
３．８ｋｂの放射性同位元素を使って標識されたＧＬＵＴ２アンチセンスのリボプローブがＸｂａＩ−線状のプラスミドＤＮＡ［ｐＧＥＭ４Ｚ−ＨＴＬ−３］及びＴ７ポリメラーゼから生成した。３５０ｋｂプログルカゴン感覚のリボプローブがＲｓａＩ−線状のプラスミドＤＮＡ［ｐＧＥＭ４Ｚ−ＨＴＬ−３］及びＳｐ６ポリメラーゼから生成した。最後に２．１ｋｂ  ＳＧＬＴ−１アンチセンスリボプローブがラムの腸のＳＧＬＴ−１クローンの１．４Ｋｂ断片から生成した（ａａ２０７−６６４）（Ｗｏｏｄ等、Ｂｉｏｃｈ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：２６６ｓ  １９９４）。
ＢＢＭ及びＢＬＭの単離、調製及び強化：
全ての方法を前述した方法（Ｍａｅｎｚ及びＣｈｅｅｓｅｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓｙ．Ａｃｔａ８６０（２）：２７７−２８５（１９８６））を用いて氷上で実施した。約５ｇｍの粘膜の検体を１５ｍｌの膜組織の懸濁液（ＭＳＳ緩衝剤、１２５ｍＭ／ｌ蔗糖、１ｍＭ／ｌトリス−ＨＣｌ、０．０５ｍＭ／Ｌ  ＰＭＳＦ，ｐＨ７．４）に加え、そしてポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）均質化装置で３０秒間目盛り８で均質化した。次いでこの均等質を強化分析評価のために二等分した。このサンプルを二つの３０ｍｌエッペンドルフ管に分割し、そして２０ｍｌのＭＳＳ緩衝剤を各管に加えた。各管を二回以上３０秒間目盛り８で均質化した。次いでサンプルを１５分間、２４００×ｇで遠心分離し、上澄み液を集め、そして２０分間、４３，７００×ｇで遠心分離した。残りのペレットを２画分から構成した。外側の白いふわふわした層は基底外側膜（ＢＬＭ）を含み、そして内側の濃い褐色のペレットは刷子縁膜（ＢＢＭ）を含む。ＢＬＭを少量のＭＳＳ緩衝剤中に穏やかに再懸濁化させ、そして１４ｍｌのエッペンドルフ管に移した。ＢＢＭをＭＳＳ緩衝剤中に再懸濁化させ、そして同じ動物からのサンプルを一つの管に入れて、２０ｍｌのＭＳＳ緩衝剤中で調製した。ＢＢＭを次いで２０分間、４３，７００×ｇで遠心分離した。再度、上記ふわふわした白いペレットをＭＳＳ緩衝剤で穏やかに再懸濁化させ、そして１４ｍｌのエッペンドルフ管に加え、そしてこの濃いペレットを３０ｍｌのＭＳＳ緩衝剤中で再懸濁させた。単離したＢＬＭを目盛り８で１５秒間均質化した。各サンプルを２５ｍｌの２０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）に加えて４６，０００×ｇで３０分間遠心分離した。Ｐｅｒｃｏｌｌ中の得られたふわふわしたバンドを集めて、２５ｍｍ×８９ｍｍポリカーボネート超遠心分離管（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）に移し、次いでＭＳＳ緩衝剤で容量（約３８ｍｌ）に調製し、そして１１５，０００×ｇで３０分間遠心分離した。この膜層を除去し、２０ｍｌのＭＳＳ緩衝剤で希釈し、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎ（商標）で１５秒間目盛り８で均質化したＣａＣｌ２（１Ｍ、１００μＬ）を加え、そして１０分間穏やかに氷上で撹拌した。サンプルを７７００×ｇで１０分間遠心分離し、このペレットを２０ｍｌのＭＳＳ緩衝剤中で再懸濁し、そして目盛り８で１５秒間均質化した。サンプルを４６，０００×ｇで２０分間遠心分離し、そしてこのペレットを１ｍｌのＭＳＳ緩衝剤中で再懸濁した。標識強化分析評価のために二等分した。ＢＢＭサンプルをＰｏｌｙｔｒｏｎで１５秒間目盛り８で均質化し、そして１９００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄み液を新しい管に移し、そして１５分間、１４，６００×ｇで遠心分離した。再び、この上澄み液を３００μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２を含有する新しい管に移し、そして２０分間穏やかに氷上で撹拌した。サンプルを３，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄み液を集め、そして３０分間、４６，０００×ｇで遠心分離した。このペレットを１ｍｌのｄｄＨ２Ｏ中で再懸濁し、そして強化分析評価のために二等分した。Ｅｓｍａｎｎ、酵素学の方法１５６：７２−７９（１９８８）に記載された強化分析評価が���ＬＭ酵素Ｎａ−Ｋ＋−ＡＴＰアーゼのために使用された。総ＡＴＰアーゼ活性がＡＴＰ及びＭｇ２＋の存在下で粘膜の均等質及び膜組織標本を培養し、そして標準的なモリブデン反応を用いて遊離の無機燐酸塩を測定することにより評価された。ウアバイン−感受性のＡＴＰアーゼ活性がウアバインの存在下で上述のように評価された。Ｎａ−Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ活性はウアバイン感受性であるため、全体とウアバイン−感受性ＡＴＰアーゼ活性との間の差はＮａ−Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ活性である。結果は百分率−倍の強化として示される。ＢＢＭ酵素アルカリホスファターゼのための強化分析評価はＳｉｇｍａ（Ｃａｔ＃２４５−１０，Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から提供されるアルカリホスファターゼキットを用いて測定された。この方法はアルカリホスファターゼによるｐ−ニトロフェノール及び無機燐酸塩への燐酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解に基づいている。生成したｐ−ニトロフェノールは黄色であり、そして４０５ｎｍにおいて最大の吸光度を示す。
ウエスタンブロット法分析：
Ａｌｂｅｒｔａの大学、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、カナダ（１９９７）のＴａｐｐｅｎｄｅｎの博士号論文に記載されているウエスタンブロット法分析のプロトコルをＢＢＭ及びＢＬＭグルコースのトランスポータ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）の定量化のために使用した。ＢＬＭ（６０μｇの単離された蛋白質）サンプルを１Ｘサンプル緩衝剤｛０．５Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８（１３．２％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、グリセロール（１０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、０．０５％（ｗ／ｖｏｌ）ブロモフェノールブルー及び１０％ＳＤＳ（０．２１％ｗ／ｖｏｌ）｝で１：４に希釈した。ＢＢＭ（６０μｇの単離された蛋白質）サンプルを４Ｘサンプル緩衝剤｛０．２４Ｍトリス−ＨＣＬ、４０％グリセロール、１０％ｗ／ｖｏｌ  ＳＤＳの８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、０．５ｍＬのブロモフェノールブルー｝で３：１に希釈した。ＢＢＭサンプルを１０分間沸騰させたが、ＢＬＭサンプルは沸騰させなかった。堆積ゲル｛４．１Ｍアクリルアミド／２１ｍＭ  Ｎ′Ｎ−ビスメチレン−アクリル（１０．７％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、０．５Ｍトリス−ＨＣＬ、ｐＨ６．８（０．２４％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０％（ｗ／ｖｏｌ）ＳＤＳ（０．９７％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０％ＡＰＳ  ｗ／ｖ（４．８６％ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び０．４％ＴＥＭＥＤ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）｝を分離ゲル｛４．１Ｍアクリルアミド／２１ｍＭ  Ｎ′Ｎ−ビスメチレン−アクリル（３２．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１．５Ｍトリス−ＨＣＬ、ｐＨ８．８（３２．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０％（ｗ／ｖｏｌ）ＳＤＳ（１．３％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０％（ｗ／ｖｏｌ）ＡＰＳ（０．６６％ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び０．１６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＴＥＭＥＤ｝の頂部に置いた。電気泳動を上記色素の最前部（ｄｙｅ  ｆｒｏｎｔ）が上記ゲルの末端に達するまで１−２時間１００−２００Ｖでランニング（ｒｕｎｎｉｎｇ）緩衝剤｛０．３％トリス（ｗ／ｖｏｌ）、１．４４％グリシン（ｗ／ｖｏｌ）及び０．１％ＳＤＳ）｝中で実施した。蛋白質を転移緩衝剤｛トリス−塩基（０．１８９％ｗ／ｖｏｌ）、グリシン（０．９％ｗ／ｖｏｌ）、メタノール（２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、ＳＤＳ（０．０２％ｗ／ｖｏｌ）｝を有する転移装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を用いてニトロセルロース膜（ＭＳＩ研究所、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）上に１．５−２時間、２００Ｖで転移した。転移に続いて、上記膜を直ちにＴＢＳＴ｛１ＭトリスｐＨ７．５（２％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、ＮａＣｌ（０．８８％ｗ／ｖｏｌ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（０．０５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）｝中に置いた。膜をＴＢＳＴＭ（５％（ｗ／ｖｏｌ）の粉末ミルクを添加したＴＢＳＴ）中で少なくとも１時間穏やかに撹拌してブロックし、次いでＳＧＬＴ−１（Ｃａｔ＃ＡＢ１３５２，Ｃｈｅｒｎｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）に対しては１：１０００の希釈率で、又はＧＬＵＴ２（Ｃａｔ＃ＡＢ１３４２）に対しては１：５００の希釈率で、一次抗体に一昼夜４℃で培養した。膜をＴＢＳＴ中で３×１０分間穏やかに撹拌して洗浄し、次いで二次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ−抱合体、Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ＰＤＩＢ���ｏｓｃｉｅｎｃｅ，社Ａｕｒｏｎａ，ＯＮ）に１：４０００の希釈率で少なくとも２時間穏やかに撹拌して培養した。ブロットをＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ＣＬ−ＨＲＰ（商標）（Ｃａｔ＃３４０８０，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）使用液で完全にカバーし、そしてコダックＸＲＡ５フィルムに露光する前に５分間培養した。負荷硬度（Ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）及び蛋白質転移を上記ブロットをポンソーＳ（０．１％ｗ／ｖｏｌＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ（ＢＤＨ）、５％酢酸）で染色することにより確認した。統計分析を上記バンドの相対強度について実施した。統計分析のために、信号をレーザー濃度計を用いて定量した。
輸送速度の測定：
輸送速度をＴｈｏｍｓｏｎ及びＲｊｏｔｔｅ、Ａｍ．Ｊ．．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．３８：３９４−４０３（１９８３）に述べられているように測定した。腸の１２ｃｍ部分を各動物から取り出し、腸間膜縁に沿って開き、そして注意して氷で冷やされた食塩水で洗って、目視の粘液と破片を除去した。腸片（１ｃｍ２）を切り取って、この組織を酸素化されたクレブス重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ７．４）を含有する培養室内に３７℃で平らなシートとして設置した。円盤状の組織をこの緩衝剤中で１５分間予備培養し、この温度で平衡にした。予備培養後、この室を酸素化されたクレブス重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ７．４）中で［３Ｈ］インスリン及び種々の［１４Ｃ］−プローブ分子を含有するビーカーに３７℃で移した。溶質の濃度はＤ−グルコース、Ｄ−フラクトースについて、４、８、１６、３２及び６４ｍＭであり、Ｌ−グルコースについて１６ｍであり、そしてラウリン酸について０．１ｍＭであった。予備培養及び培養の溶液をストロボ光を出すように構成された円形の磁気棒を用いて混合して、６００ｒｐｍの撹拌速度と腸の未撹拌水層の抵抗を低くした。上記室を取り除くことにより実験を終了し、冷たい食塩水中の上記組織を約５秒間急速にリンスし、そして上記室からの露出した粘性の組織を円形のスチールパンチで切断した。この組織を一昼夜５５℃の炉で乾燥して、この組織の乾燥重量を決定し、次いで０．７５ＮのＮａＯＨで鹸化した。シンチレーション液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｌｖ  ＨＰ、Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を上記サンプルに加え、そして上記二つの同位元素（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｅｔａ  ＬＳ−５８０１，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の可変急冷のために、放射能を外部標準化技術を使用して決定した。栄養分の摂取をｎモル／１００ｍｇ乾燥組織／分として表した。
繊毛高さ及び腺か深さ測定
長断片を節片に切り出した。腸繊毛の高さ及び腺がの深さをＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（オンタリオ州ミッシサウガのＥｍｏｉｘ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．）を用いて光学顕微鏡下で測定した。各動物及び各節片について合計１０の記録を作り、その平均値を統計的分析のために用いた。
統計的分析
全ての統計的分折はＳｔａｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）統計用パッケージ（バージョン６．１０、ノースカロライナ州カリー、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて実施した。プロクルカゴン及びＳＧＬＴ−１ｍＲＮＡ発生量及び、ＳＧＬＴ−１及びＧＬＵＴ２トランスポーター発生量データは、一般線型操作（ｐｒｏｃ  ＧＬＭ）を用いて分析した、顕著な差がワン−ウエイＡＮＯＶＡによって同定された。このモデルは、餌、ゲル、ピリオド，対及び餌ピリオドを含んでいた。ピリオド及び餌ピリオドの両方は、顕著でなかったので、次に排除された。繊毛高さ、腺か深さ及び腸ＧＬＰ−１濃度をｐｒｏｃ  ＧＬＭ及び餌及び対を含むワン−ウエイＡＮＯＶＡで分析した。再びピリオド及び餌ピリオドの両方は、顕著でなくモデルから排除された。ＧＬＰ−１，インスリン及びグルコースのためのプラズマＡＵＣハ、ｐｒｏｃ  ＧＬＭ内の対Ｔ−テストを用いて分析した。繰り返し測定ＡＮＯＶＡを動物重量の間での差を分析するために用いた。給餌期間の効果を試験したが、顕著ではなかった（ｐ＞０．０５）。Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−フルクトース及び脂肪酸１２についての腸移送率は、ｐｒｏｃ  ＧＬＭないの対Ｔ−テストを用いて分析した。示されたデータは、平均±ＳＥＭで示されている。ｐ＜０．０５のときに顕著な差が同定された。
体重に対する餌の効果
必要エネルギー量を個別に計算し、それにより餌の割合を調節し、イヌの重さが実験餌によって変わらないようにした（予備試験、ＨＦＦ及びＬＦＦについてそれぞれ、２３．４±１．８ｋｇ、２２．９±１．８ｋｇ、２３．５±１．８ｋｇ）またはピリオド（期間）によって変わらないようにした（予備実験「第７日」、ピリオド１「第２１日」、及びピリオド３「第３５日」についてそれぞれ、２３．４±１．８ｋｇ、２３．４±１．８ｋｇ、２３．４±１．８ｋｇ、）。
プラズマＧＬＰ−１，インスリン及びグルコースに対するＯＧＴＴの効果
プラズマＧＬＰ−１の濃度は、ＨＦＦ対ＬＦＦ餌を与えられた時に、イヌに付いては３０および９０分で増加した（図１ａ参照）。インスリン濃度は、ＨＦＦ対ＬＦＦ餌を与えられた時に、イヌについては９０分で増加した（図１Ｂ）。食物繊維の種類は、ＯＧＴＴのあいだのどの時点においても、血中グルコース濃度に影響を与えなかった（図１Ｃ）。曲線下増加領域は、イヌにＨＦＦ対ＬＦＦ餌が与えられた時に、ＧＬＰ−１について（図２Ａ、９８８±９２対６４８±
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量が発酵性繊維の食餌によって増加すること、ならびにグルコースホメエスタシスが改善されることが示される。
腸プログルカゴン及びＧＬＰ−１濃度に対する餌の効果
ＨＦＦ対ＬＦＦ餌を摂取すると、結果として、回腸において（１．１３±０．０４対０．８３±０．０４濃度単位）、そして結腸において（１．４５±０．０５対０．７８±０．０５濃度単位）、プログルカゴンｍＲＮＡの量がより多くなった（図３）。プログルカゴンｍＲＮＡ発現は、十二指腸においては検出されなかった。ＧＬＰ−１濃度は、ＨＦＦ対ＬＦＦ餌を与えたイヌから得た粘膜かきとり物において顕著に多かった（４１±４ｐｍｏｌＧＬＰ−１／ｍｇタンパク質対２５±４ｐｍｏｌＧＬＰ−１／ｍｇタンパク質）。このことから、発酵性繊維の食餌は、試験された動物におけるＧＬＰ−１濃度を増大させた。
組織構造
腸管絨毛の高さおよび陰かの深さに対する食餌の影響は、図４に提示される。十二指腸の絨毛の高さは、ＬＦＦ餌を与えたイヌの場合と比較して、ＨＦＦ餌を与えたイヌにおいてより高い傾向があった（１５０５±８３対１２９４±８３μｍ、ｐ＝０．１）。しかしながら、十二指腸の陰かの深さには、相違が無かった（それぞれ、２８９±２８対２６２±２８μｍ）。空腸の絨毛の高さは、ＨＦＦ対ＬＦＦ餌を与えたイヌにおいて、顕著に高かった（それぞれ、１５１７±４３対１３４３±４３μｍ）。しかしながら、陰かの深さには相違がなかった（それぞれ、２７７±１９対２３４±１９μｍ）。回腸の絨毛の高さおよび陰かの深さは、ＨＦＦ対ＬＦＦ餌を与えたイヌにおいて、顕著な相違は無かった（それぞれ、１０３５±４５対９９３±４５μｍ、および２５１±４６対３５７±４６μｍ）。結腸の陰かの深さにおいては、ＨＦＦ対ＬＦＦ餌を与えたイヌにおいて、顕著な相違は無かった（７２４±３３対７２７±３３μｍ）。
栄養吸収
食物繊維の発酵性の栄養素吸収に対する作用は、表２に示される。ＨＦＦ餌の消費の結果、空腸において、Ｄ−グルコースについての顕著に高い最大グルコース吸収能（Ｖｍａｘ）が得られた（図５）。非攪拌水層（ｕｎｓｔｉｒｒｅｄ  ｗａｔｅｒ  ｌａｙｅｒ）耐性の測定値である、空腸における脂肪酸１２の吸収において、顕著な食餌の作用が注目された。ミカエリス親和性定数（Ｋｍ）は、食餌により影響を受けなかった。傍細胞Ｄ−グルコース吸収の推定、または原点を介して１６ｍＭでのＬ−グルコースの吸収から外挿し１ｍＭに対して正規化することにより決定されるＤ−グルコースについてのＫｄは、食餌によって顕著な影響を受けなかった。Ｄ−フルクトースについてのＫｄは、食餌によって影響を受けなかった。
グルコーストランスポーター
食餌は、測定した腸管部分のいずれにおいても、ＳＧＬＴ−１ｍＲＮＡに影響を与えなかった（図６）。ＨＦＦ対ＬＦＦ餌を消費することにより、空腸のＳＧＬＴ−１トランスポータータンパク質の量が多くなることと関連していた（２２．２±３．７対６．６±３．７濃度単位）。ＳＧＬＴ−１トランスポータータンパク質の量は、ＨＦＦ餌を消費した場合の回腸においてより高いという傾向があった（１３．４±０．７対１０．４±０．７濃度単位、ｐ＝０．０９、図７）。食餌による顕著な相違は、空腸および回腸の両方におけるＧＬＵＴ２トランスポータータンパク質の量においても見られた（図８）。このことから、ＨＦＦ対ＬＦＦ餌を消費することによる増加が示された（それぞれ、１．９±０．２対０．９±０．１濃度単位、および４．２±０．２対１．５±０．２濃度単位）。
【表１】
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【表２】
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１数値はｍｅａｎｓ±ＳＥＭ、食餌当たりｎ＝８である。異なる上付き文字はｐ＜０．０５における腸部位内部の食餌間の重大な差異を示す。
２ＫＤはＬ−グルコースの受動摂取を説明する線の勾配であり、またＤ−グルコース摂取の受動成分を示す。Ｋｄは１ｍＭに標準化された１６ｍＭのＬ−グルコースの摂取に相当する。
３脂肪酸１２（ラウリン酸）摂取は未撹拌水層抵抗の基準である。
実施例２
ビーグル成犬雌雄５匹の２つの群に、繊維源のみが異なる２種の餌を与えた（表３参照）。イヌの胃腸管（ＧＩＴ）を通過中に極微に分解されるセルロースを、３．６％の水準で対照餌（Ａ）に添加した。第２の餌（Ｂ）は、イヌのＧＩＴバクテリアによって発酵されるビートパルプ（４．２％）及びフラクトオリゴ糖類（ＦＯＳ）（１％）を含んでいた。化学分析は、両方の餌が、２５．９％の蛋白質、１１．８％の脂肪と、６．２％の水分、５．７％の灰分、１．２３％のカルシウム、及び０．７９％のリンを有することを明らかにした。餌Ｂは、イヌの腸バクテリアによる繊維発酵速度の差異のために、ビートパルプ及びＦＯＳのブレンドを用いた。ＳＣＦＡのようなＦＯＳのバクテリア代謝生成物は、より遅く発酵されるビートパルプからのバクテリア発酵生成物と比較して、ＧＩＴ内でより中央に近いところで利用されるであろう。さらにはその二つの繊維源は、異なる濃度及び割合のＳＣＦＡを産生するように設計された。セルロース（Ｓｏｌｋａ  Ｆｌｏｃ）は、ファイバー・アンド・セールス・デヴェロップ・コーポレイション（ミズリーイ州セント・ルイス）から、ビートパルプはミシガン・シュガー（ミシシッピイ州サジナウ）から、そしてＦＯＳは、ゴールデン・テクノロジィズ・カンパニィ（コロラド州ゴールデン）から得た。
【表３】
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ａ  餌Ａは３．６％のセルロースを含み、そして餌Ｂは４．２％のビートパルプ及び１．０％のＦＯＳを用いて作った。
イヌは、二つの群として別々の開放犬舎に収容された。餌は、手術が実施される前、少なくとも６週間にわたり与えられた。手術の直後に，小腸を取り出し、付随する腸間膜を剥ぎ取り、小腸を水平な表面上に真っ直ぐにして、長さを静止状態で測定できるようにした。長さ２５−３０ｃｍの三つの断片を取り出し、直ちに、予めＯ２及びＣＯ２（９５％及び５％）の混合物で曝気してあった冷たい（２−４℃）リンゲルに入れた。第１の断片は、幽門へ３０ｃｍ末端からのものであり、基部腸（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）と考えられた。第２のものは、小腸の中間位置から採取され、中間腸（ｍｉｄ  ｉｎｓｔｉｎｅ）と指示された。第３の断片は、回盲腸結合部から３０ｃｍ始まり基部に繋がるものであり、末端腸（ｄｉｓｔａｌ  ｉｎｓｔｉｎｅ）を代表するものと考えられた。
小腸の三つの断片のそれぞれからの１０ｃｍのものを用いて、ｃｍ当たりの湿潤重量、周囲及び乾燥物質基準の粘膜の割合を測定した。局所湿潤重量及び名目表面積（繊毛及び微繊毛による面積拡大を算入しない）は、ｃｍ当たりの重量及び周囲に局所長さを乗じた積として推定した。局所粘膜重量は、粘膜の割合に局所湿潤重量を掛けることにより推定した。腸全体に付いての数値は、三つの局所のものを合計することにより計算した。
外翻スリーブ法の改変法（Ｋａｒａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂ１５２：１０５−１１６（１９８３））を用いて、栄養吸収率を測定した。ビーグル成犬は、大きな径の小腸（＞１ｃｍ）を有するので、栄養吸収を測定するのにスリーブ全体を使用するのは実用的でなかった。代わりに、約０．５ｃｍ２の組織を、露出粘膜を付けた５ｍｍのロッドの側面及び端部近くに絹結糸で固定した。予備確認研究は、吸収率が無傷の腸スリーブを用いて測定したものと比肩し得ることを明らかにした（数値は固定技法の間で＜１０％の差であった）。組織は、ロッドへの固定の前、間及び後に冷たい、通気リンゲル中に保持された。
吸収の測定は、３７℃で実施され、腸の取り出し後４５分に開始された。Ｐｕｃｈａｌ及びＢｕｄｄｉｎｇｔｏｎのプロトコール、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６２：Ｇ８９５−９０２（１９９２）に従って、インキュベーシオン液は、リンゲルとグルコースまたはプロリンとからなっていた。組織による栄養の蓄積は、標識付きＬ−プロリン（３Ｈ）またはＤ−グルコース（１４Ｃ）を添加することにより定量した。プロリンは、「自己の」キャリアー（イミノ酸トランスポーター）を有するが、他のアミノ酸キャリヤーは多様な親和性で幾つかの異なる種類のアミノ酸を運搬し得るので、プロリンを一つの代表アミノ酸として選択した。ポリエチレングリコール（１４Ｃ）をプロリン溶液に添加して、粘着性液体によって会合され実際には吸収されないプロリンを補正した。グリコース溶液については、受動的に吸収されるイソマーＬ−グルコース（３Ｈ）を添加して、粘着性液体中に存在するＤ−グルコース及び受動的に吸収される独立のキャリヤーを同時に補正させた。組織が栄養液に露出された後に、それらをロッドから取り外し（グルコースに露出された組織は、まず冷たいリンゲル中で２０秒間洗浄され、）重量を測ってあるガラスビンに入れた。湿潤重量を記録した後、組織を可溶化し、放射能物質を添加し、関連する放射能を液体放射能計数により測定した。グルコース及びプロリンの吸収率を組織の重量の関数として計算し、表した。
吸収の局所分布は各断片からの組織をグルコースまたはプロリンの５０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液を含む溶液中でインキュベートすることにより測定した。予備研究で、この濃度がキャリヤーを飽和させまた吸収の最大率を生じさせるのに充分であることが示された。小腸の全長のグルコース及びプロリン吸収の最大容量は、局所吸収率に局所湿潤重量を掛け合わせた積を合計することにより推定した。
吸収の速度論は、グルコースについて基部腸において、またプロリンについて中間腸において画定された。これは、０．０４，０．２，１，５，２５，及び５０ｍｍｏｌ／Ｌの無標識のグルコース及びプロリンを含むリンゲルに組織を露出することにより行われた。結果の吸収値は、最大吸収率（Ｖｍａｘ）及び見掛新和力定数（Ｋｍ）を計算するために非線型回帰分析により検討された。プロリンデータの分析のために、受動浸透係数を、キャリヤーと無関係に受動的に吸収されたプロリンの理由説明のために含ませた。
表及び図面に示された数値は、平均及び標準誤差である。ＡＮＯＶＡを餌の効果、寸法の領域及びグルコース及びプロリンの吸収率の領域を調べるために用いた。顕著な局所効果が検出された時に、Ｄｕｎｃａｎの試験を用いて種差を同定した。データの分析は、有意臨界レベルとして認められるｐ＜０．０５で、統計分析システム（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１１，ノースカロナイナ州カリィ）を用いて実施した。
体重は、二つの餌を与えられたイヌの間で差異がなかった。いかし、発酵性繊維源としてビートパルプ及びＦＯＳのブレンドを用いた餌（餌Ｂ）を与えられた  イヌは、非発酵性繊維を含む餌（餌Ａ）を与えられたイヌよりも２０％長い腸を持っていた（ｐ＝０．０９；表４参照）。周囲長は、基部から末端へと減少した（ｐ＜０．０５）。いずれの局所においても、数値は、処置の間で変わりがなかったが、三つの局所を一緒にあわせた時には、発酵性繊維を含む餌Ｂを与えられたイヌは、吸収のために利用できる全腸表面積が２８％も大きかった。
ｃｍあたりの湿潤重量は、基部から末端にかけて減少し、全ての局所の間で顕著な差があった（ｐ＜０．０５）。発酵性繊維を与えられたイヌの腸は、主として基部腸のより大きな重量のために、より高いｃｍあたり平均湿潤重量を有した（１．１７体．０４；ｐ＜０．０５）。中間及び末端局所についての、ｃｍ当たり湿潤重量は、処置の間で著しくは変わらなかった。発酵性繊維を与えられたイヌのより高い全腸湿潤重量は、従ってより長い腸を有することと基部腸におけるｃｍあたりのより大きな重量とが合わさったためである。ｃｍ当たりの乾燥重量も、基部から末端へと減少したが（ｐ＜０．０５）、いずれの局所でも処置の間で差がなく、発酵性繊維を与えられたイヌのｃｍあたりのより重い基部腸が、より高い水含量に部分的に起因することを示している。たとえそうであっても、発酵性繊維を与えられたイヌは、より多くの全腸乾燥重量を有した。
粘膜の割合は、局所の間（ｐ＞０．５０）、またはいずれかの局所での処置の間（ｐ’ｓ＞０．５０）、で差がなかった。三つの局所全てについての平均は、発酵性繊維を含む餌及び含まない餌を与えられたイヌについて、それぞれ、３９％±０．０２及び３９％±０．０３であった。より大きな全腸重量のために、全腸粘膜重量は、発酵性繊維を与えられたイヌにおいてより大きかった。
【表４】
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＊星印は餌に基づく顕著な効果を示す。
グルコース吸収に付いての数値は、キャリヤー仲介の移送を表す。５０ｍｍｏｌ／Ｌの飽和濃度での吸収率は、基部腸において最高であったが（図９、局所効果に付いてｐ＜０．０５）、発酵性繊維入り餌を与えられたイヌにおいては顕著には高くなかった（処置効果に付いてｐ＞０．２０）。中間及び末端腸についての数値は、相互に、また処置の間で、差がなかった。グルコース濃度の関数としての基部腸による吸収の動力学的分析は（図１０）、両方の処置からのイヌについての飽和可能吸収を示した。５０ｍｍｏｌ／Ｌでの数値は、処置の間で著しくは差がないが、動力学的分析は、発酵性繊維入り餌を与えられたイヌがより高い最高吸収率を有したことを示した（１．２１±０．１１ｎｍｏｌ／ｍｇ−分対０．６０±０．１３，ｐ＜０．０５）見掛親和性定数は、処置の間での差がなく（６．２±２．１対３．９±３．３）、唯一つのタイプのトランスポーターが存在することを示唆している。
プロリン吸収率に付いての数値は、キャリヤー仲介吸収及び受動的キャリヤー無関係吸収の合計を表している。５０ｍｍｏｌ／Ｌでの数値は、処置または局所の間で差がなかった（図９）。
セルロース入り餌（餌Ａ）を与えられたイヌによるプロリン吸収は、プロリン濃度と共に単調に増加し（図１１）、キャリヤー仲介プロセスに典型的な飽和の動力学を全く示さず、そして線型関係に最良に適合した。追加の指示因子として、トレイサープロリンの蓄積についての比率を５０ｍｍｏｌ／Ｌに対比して０．０４ｍｍｏｌ／Ｌにおいて計算した。もしもキャリヤーが制限された数で存在すると、標識付き及び無標識プロリンは、キャリャーサイトのために競合しなければならないであろう。これによって、トレイサーの蓄積及び栄養濃度の間の反比例関係のゆえに、１．０を超える比がもたらされるであろう。セルロース入り餌を与えられたイヌについての比は、平均０．９６±０．１１であり、競合の欠如を示している。これらの知見は、動力学的分析からの知見と組合わせられると、受動的流入が１００％近くの全プロリン吸収を表すこと、存在ないしは機能するトランスポーターが殆どないこと、を明らかにする。
対照的に、イヌが発酵性繊維入りの餌（餌Ｂ）を与えられる場合、吸収と線型から偏るプロリン濃度の間の関係は、飽和可能プロセスと受動的流入を含む式と最良に適合した。これは、平均１．２１±０．１５のトレイサー蓄積比によって確証された。この値は、１．０から著しくは変わらず、グルコースに付いての比（発酵性繊維入り餌及び発酵性繊維無し餌を与えられたイヌについてそれぞれ９．１３±１．３６及び４．５８±０．８０、処置の間でかつ１．０と比較してｐ＜０．０５）よりも著しく低かった。しかし、イヌが発酵性繊維入り餌を与えられる時にプロリンのためのより多くのキャリヤーが中間腸内に存在することが示唆される。たとえそうであっても、５０ｍｍｏｌ／Ｌでの受動的流入は、なお全流入の９０％以上の寄与をなす。
その他の脊椎動物からの無傷の組織によるプロリン吸収についての親和性定数は、約１から５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。もしイヌのイミノトランスポーターが、他の哺乳動物について知られているものと類似であれば、キャリヤーの全ては、２５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で飽和されるであろう。従って、２５及び５０ｍｍｏｌ／Ｌの間でのプロリン吸収の何らかの増加は、受動的、キャリヤー無関係の流入を反映するであろう。２５及び５０ｍｍｏｌ／Ｌの間の線の勾配が比較される時、餌Ａ（０．０７４±０．０２２ｍｍｏｌ／ｍｇ−ｍｉｎ−ｍｍｏｌ／Ｌ）と餌Ｂ（０．０５４±０．０１１，ｐ＞０．２０）を与えられたイヌの間には差が検出され得ない。
吸収率を局所湿潤重量で積分すると、癸酵性繊維入り餌を与えられたイヌは、グルコース吸収のための、より高い全腸容量を有する（２７１±４２μｍｏｌ／ｍｉｎ対１３９±３７；ｐ＜０．０５）。これは、主に、基部腸におけるより高い値によって引き起こされる；中間及び末端腸についての値は、処置の間で差を示さなかった（図１２）。処置の効果は、いずれの局所においてもプロリン吸収容量に付いて検出されなかった（図１２）、あるいは小腸の全長に付いて検出されなかった（餌Ａ＝１２４６±１５５，餌Ｂ＝１０３１±１２４；ｐ＞０．４０）。
この実験は、イヌの腸構造及び機能が餌の中に存在する繊維のタイプによって変えられることを明らかにする。その結果は、イヌがＧＩＴバクテリアにより容易に発酵されうる繊維入りの餌を与えられた時に、より多くの表面積及び粘膜を有するより長い、より重い腸がもたらされることを示す。この応答は、二つの餌を与えられたイヌの間での基部重量及び粘膜量の差異から明らかなように、基部腸において更に強い。基部腸、または腸のいずれかの他の局所における粘膜の割合の差が無いことは（ｐ＞０．９）、全ての組織層における増加があることを示すものである。しかし、基部局所のより大きな量の故に、発酵性繊維入り餌を与えられたイヌは、基部局所ならびに小腸の全長においてより多くの粘膜を有した。推論されることは、発酵性繊維入り餌を与えられたイヌが、餌インプットを加水分解し、吸収するためにより大きな腸を持つことである。結果は、また、イヌの餌に発酵性繊維を含ませると、有利なＧＩＴバクテリアの増加に加えて、健康なイヌのためになることを示す。
ある種の代表的な具体例及び詳細が本発明説明する目的で示されたが、ここに開示された方法及び装置の種々の変更が、請求の範囲に定義の本発明の範囲を逸脱することなく行われうることは、当業者に明らかであろう。