【手続補正書】
【提出日】平成19年3月7日(2007.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】          明細書
【発明の名称】  免疫測定方法及び試薬キット
【特許請求の範囲】
【請求項１】  被検物質を免疫学的に測定する方法において、夾雑する交差反応物質の反応性を低減させる物質の存在下で測定のための免疫反応を行うことを特徴とする免疫測定方法。
【請求項２】  被検物質がトロンビン−トロンビン阻害物質複合体であり、夾雑する交差反応物質がトロンビン阻害物質及び／またはプロトロンビンである請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項３】  反応性を低減させる物質が、夾雑する交差反応物質のジスルフィド結合を開裂する物質である請求項１または請求項２に記載の免疫測定方法。
【請求項４】  夾雑する交差反応物質の反応性を低減させる物質が、少なくとも界面活性剤、ジチオスレイトール、メルカプトエチルアミン、グルタチオン、メルカプトエタノール、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウム、ジチオエリスリトール、チオグリコール酸、亜二チオン酸塩、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、亜硫酸塩、α―チオグリセロール、及び臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム臭化水素塩から選ばれた１種または２種以上である請求項３記載の免疫測定方法。
【請求項５】  請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫測定方法において用いる測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】 
本発明は、臨床検査分野において生体試料中の被検物質の免疫測定方法および測定用試薬キットに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
免疫学的反応を利用する試料中の被検物質の測定は日常的に行なわれている。また該測定は、被検物質の濃度に応じて種々の測定原理で実施されている。その中でも免疫比濁法、ラテックス比濁法、酵素免疫測定法等が代表的な方法である。免疫学的反応に用いる抗体は、被検物質を抗原として調製され、一般にその抗原の類似物質に対して交差反応を示す。そのため、試料中に被検物質とその類似物質、すなわち交差反応物質、が共存している場合、免疫学的測定に使用する抗体の交差反応性が高いと正確な測定結果が得られない。従って一般に、交差反応性の低い抗体を選択して適切な測定系を構築する。
【０００３】
トロンビンとアンチトロンビン−ＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）濃度を測定する場合、複合体を構成しているトロンビン及びアンチトロンビン−ＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）それぞれに特異的な抗体を用いてサンドイッチ酵素免疫測定法により測定する方法が知られている。このＴＡＴをラテックス免疫比濁法で測定しようとすると、ＴＡＴに特異的で、かつトロンビン、プロトロンビン及びＡＴ−ＩＩＩと交差反応しない抗体を調製する必要がある。しかしながら、通常血漿中のＴＡＴ濃度が約１〜５０ｎｇ／ｍＬ程度であるのに対して、ＡＴ−ＩＩＩの濃度は約２５０μｇ／ｍＬと５，０００〜２５０，０００倍も高い。従って、ＴＡＴ特異的でかつＡＴ−ＩＩＩとの交差反応性が２５万分の１以下のモノクローナル抗体を調製しなければならないが、そのようなモノクローナル抗体の調製は困難であり、現在ラテックス免疫比濁法によるＴＡＴの測定試薬は実用化されていない。
【０００４】
一方、生体試料中に生成している病原体等に対する抗体価を血球凝集等の免疫凝集反応で測定する場合、その抗体がＩｇＧ型であるかＩｇＭ型であるかを調べるために、試料をジチオスレイトール等の還元剤で処理することによりＩｇＭ型の抗体の抗体活性を低下させ、得られる凝集の低下度合いからＩｇＭ型の存在を確認する方法が知られている。しかしながら、抗原を測定する方法においては、夾雑する交差反応物質を化学的に処理することにより被検物質を特異的に測定することは考えも及ばないことであった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、被検物質を免疫学的に測定する方法において、試料中に交差反応物質が共存していても、被検物質を特異的に測定する方法及び測定用試薬キットを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、試料中に夾雑する交差反応物質の反応性を低減させる物質を免疫反応系に存在させることにより、従来不可能であった、目的とする被検物質を免疫学的に測定できることを見出し本発明を完成させるに至った。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、被検物質を免疫学的に測定する方法において、夾雑する交差反応物質の反応性を低減させる手段を導入する、詳しくは夾雑する交差反応物質の反応性を低減させる物質を存在させることを特徴とする免疫測定方法である。
【０００８】
本発明において、交差反応性を低減できる物質としては、ジスルフィド結合を開裂する物質または界面活性剤が有効である。具体的には、ジチオスレイトール、メルカプトエチルアミン、グルタチオン、メルカプトエタノール、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウム、ジチオエリスリトール、チオグリコール酸、亜二チオン酸塩、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、亜硫酸塩、α―チオグリセロール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム臭化水素塩等のジスルフィド結合を開裂させる物質の他、酸、アルカリ、カオトロピック化合物、水溶性有機溶媒、界面活性剤等を例示できるが、これらに限定されない。また、さらにＥＤＴＡ等のキレート剤を用いてこれらジスルフィド結合開裂物質を安定化させてもよい。これらの物質は、１種または２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。その使用濃度は、被検物質の測定に用いる抗体を使用して、これら物質の存在下でその交差反応を被検物質と交差反応物質とで比較実験することにより容易に決定できる。
【０００９】
また、夾雑する交差反応物質の反応性を低減させる手段は、上記のように好適には特定物質の添加により達成されるが、免疫学的反応性の知識に基づき、例えば反応液のイオン強度の調整、ｐＨの調整、反応温度の調整等によっても可能である。すなわち、試料中の交差反応物質が既知であれば、当業者は該物質の免疫学的反応性（抗原抗体反応性）を低下させるために、免疫学的反応性に影響をもつ公知手段について簡単な実験的繰り返しにより、その物質の特異性のレベルを指標に容易に本発明への適用を可能とする。
【００１０】
本発明の免疫測定方法で測定しうる物質としては、試料中に夾雑する交差反応物質により測定が正確に行えない物質、例えば、トロンビン−トロンビン阻害物質複合体、プラスミン−プラスミンインヒビター複合体、トロンビンとヒルジン複合体、エラスターゼとα１−アンチトリプシン複合体、トリプシンとトリプシンインヒビター複合体、活性型Ｘ因子とＡＴ−ＩＩＩ複合体、プロテインＣとプロテインＣインヒビター複合体、組織プラスミノゲンアクチベーターとプラスミノゲンアクチベーターインヒビター複合体、活性型ＶＩＩ因子と組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、組織因子と凝固第ＶＩＩ因子複合体、プラスミノゲンとプラスミノゲンアクチベーター複合体、ヘモグロビンとハプトグロビン複合体、プロテインＡまたはプロテインＧと免疫グロブリン複合体等の複合体が例示できる。
【００１１】
また被検物質はこれらに限定されるものではなく、被験物質の免疫測定方法において試料中に交差反応物質が共存するあらゆる物質に利用できる。すなわち本発明の免疫測定方法は、これら複合体の測定に有用である他、交差反応により本来の測定目的とする物質の測定が正確に行えない場合に、交差反応を低減しうる物質を共存させる方法を採用できる物質に適用できる。
【００１２】
具体的には、被検物質としてトロンビン−トロンビン阻害物質複合体が好適に例示され、この場合、夾雑する交差反応物質はトロンビン阻害物質及び／またはプロトロンビンである。トロンビン阻害物質の代表的なものとしては、ＡＴ−ＩＩＩが挙げられる。
【００１３】
下記実施例に詳述するように、ラテックス粒子にＡＴ−ＩＩＩとの交差反応性が１０００分の１程度のモノクロナール抗体を吸着させたラテックス試薬を調製し、該調製したラテックス試薬と血漿試料を混合してラテックスの凝集過程を光学的に測定する。血漿試料中には、ＡＴ−ＩＩＩが被検物質ＴＡＴの５，０００〜２５０，０００倍も多く存在するので、この試薬はＡＴ−ＩＩＩとも反応し、ＴＡＴ分子が存在しなくても、異常値上限（５０ｎｇ／ｍＬ）の約５倍（２５０ｎｇ／ｍＬ）ものシグナルを与える。しかし本発明の夾雑する交差反応物質の免疫学的反応性を低減させる物質を添加することにより、その反応性を約１００分の１以下に低減すれば、２．５ｎｇ／ｍＬ以下の測定値が得られ、臨床的に有用な検査測定方法を提供できる。
【００１４】
実施例にはトロンビン−トロンビン阻害物質複合体の測定において、ＡＴ−ＩＩＩの反応性を低減させる物質の一例としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いているが、無論、上記の物質も適宜使用することができる。
【００１５】
本発明を適用することのできる免疫学的測定方法の例としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、担体を用いる比濁法または担体を用いない免疫比濁法、イムノクロマト法、血球凝集等公知の免疫測定法が挙げられる。
【００１６】
またさらに本発明は、上記の免疫測定方法において用いる測定試薬キットを提供する。
【００１７】
【実施例】
【実施例１】
ＡＴ−ＩＩＩとの交差反応が約０．１％確認されているＴＡＴに対するモノクロナール抗体（クローンＮＯ．ＴＡＴ１１６１）をＥＩＡ用チューブに１０μｇ／ｍＬの濃度で固定化した後、１ｗ／ｖ％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）でブロッキングした抗ＴＡＴ抗体固定チューブを調製した。標識抗体には、市販キットの西洋わさび由来ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＡＴ−ＩＩＩ抗体（ＰＯＤ標識抗ＡＴ−ＩＩＩ抗体）を用いて、サンドイッチＥＩＡ法によりＴＡＴを測定した。測定試料はヒトＡＴ−ＩＩＩとヒトトロンビンを混合して調製したＴＡＴ及びＡＴ−ＩＩＩを２００μｇ／ｍＬの濃度で加えた試料を用いた。通常のＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群）患者血漿中においては、ＴＡＴが形成されても過剰のＡＴ−ＩＩＩが残存していることからこの人為的に調製したＴＡＴとＡＴ−ＩＩＩの混合物は、ＤＩＣ患者血漿の代わりとみなすことができる。
【００１８】
測定手順はすべて市販キットの取り扱い説明書に従って操作し、測定機器はエルジアＦ−３００（国際試薬株式会社）を用いて、測定により得られたシグナルは相対蛍光強度として求めた。すなわち測定試料と反応用緩衝液を固相チューブに分注し、室温で９分間反応させた後、未反応物を吸引除去、洗浄後、ＰＯＤ標識抗ＡＴ−ＩＩＩ抗体液を添加し９分間反応させる。その後、ＰＯＤ標識抗ＡＴ−ＩＩＩ抗体液を吸引除去し洗浄後、基質液を分注し９分間反応後、酵素反応停止液を分注して蛍光強度を測定した。
【００１９】
一方本発明の効果を確かめるために、反応用緩衝液及びＰＯＤ標識抗ＡＴ−ＩＩＩ抗体液にそれぞれ１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加した試薬を用いて、上記の方法と同様操作しＴＡＴを測定した。その結果を表１に示した。
【００２０】
【表１】  ＴＡＴ測定結果
┌───────┬────────────┬────────────┐
│   TAT濃度    │      DTT無添加試薬     │   10ｍＭ  DTT添加試薬  │
│   (ng/mL)    ├─────┬──────┼─────┬──────┤
│              │  TATのみ │ TAT+AT-III │  TATのみ │ TAT+AT-III │
├───────┼─────┼──────┼─────┼──────┤
│      0       │    3.2   │    350.8   │    2.9   │      3.4   │
│      5       │   12.3   │    352.2   │   13.7   │     14.1   │
│     10       │   22.5   │    348.3   │   24.3   │     25.9   │
│     20       │   41.6   │    351.9   │   42.1   │     42.9   │
│     30       │   65.3   │    357.9   │   66.8   │     66.1   │
│     50       │  124.9   │    347.5   │  129.4   │    128.4   │
└───────┴─────┴──────┴─────┴──────┘
【００２１】
以上の結果、１０ｍＭのＤＴＴを無添加の試薬では試料にＡＴ−ＩＩＩが存在していると、ＡＴ−ＩＩＩとの交差反応によるシグナルのため、ＴＡＴ濃度依存性のＴＡＴ特異シグナルが得られないが、１０ｍＭのＤＴＴを添加した本発明の方法では、ＡＴ−ＩＩＩが存在している試料においてもＴＡＴ濃度依存性のＴＡＴ特異シグナルが得られ、ＴＡＴの測定が可能であることが判った。
【００２２】
【実施例２】
実施例１で用いたＴＡＴに対するモノクロナール抗体とＡＴ−ＩＩＩとの交差反応が約０．３％ある別のＴＡＴに対するモノクロナール抗体（クローンＮｏ．ＴＡＴ１８１２）の二種類を等量混合して、０．３５μｍのポリスチレンラテックス粒子に吸着させ、１ｗ／ｖ％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に分散させ、波長６６０ｎｍにおける吸光度が約２．５となるようにラテックス粒子の濃度を調整した。
【００２３】
上記ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液に１ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール６０００を加えたラテックス反応用緩衝液に２０ｍＭのＤＴＴを添加したものとしないものの二種類の反応用緩衝液を調製した。実施例１で用いたＴＡＴのみの試料とＴＡＴにＡＴ−ＩＩＩを添加した試料をそれぞれ測定した。測定は、コアグレックス８００型凝固自動分析器を用いて、試料２０μＬと反応用緩衝液１５０μＬを３７℃で５分間反応させて後、ラテックス試薬１５０μＬを添加して５分間の吸光度変化量を測定した。その結果を表２に示した。
【００２４】
【表２】ＴＡＴラテックス試薬によるＴＡＴ測定におけるＤＴＴの効果
┌──────┬────────────┬──────────────┐
│  TAT濃度   │DTT無添加(ΔA660／5分)  │20ｍＭ  DTT添加(ΔA660／5分)│
│  (ng/mL)   ├─────┬──────┼──────┬───────┤
│            │  TATのみ │ TAT+AT-III │    TATのみ │ TAT+AT-III   │
├──────┼─────┼──────┼──────┼───────┤
│      0     │   0.005  │     0.412  │     0.006  │     0.005    │
│      5     │   0.034  │     0.422  │     0.029  │     0.033    │
│     10     │   0.072  │     0.437  │     0.070  │     0.070    │
│     20     │   0.151  │     0.429  │     0.148  │     0.152    │
│     30     │   0.216  │     0.449  │     0.223  │     0.219    │
│     50     │   0.321  │     0.428  │     0.318  │     0.327    │
└──────┴─────┴──────┴──────┴───────┘
【００２５】
以上の結果より、ＤＴＴ無添加の場合にはＡＴ−ＩＩＩでは試料にＡＴ−ＩＩＩが存在しているとＴＡＴ濃度依存性のシグナルが得られず、ＡＴ−ＩＩＩによる凝集のため高値の吸光度変化が観測された。一方ＤＴＴを添加した場合にはいずれの試料もＴＡＴ濃度依存性の吸光度変化が求められ、ＴＡＴを特異的に測定できることが判った。
【００２６】
【発明の効果】
本発明は、被検物質を免疫学的に測定する方法において、交差反応を低減させる物質を存在させて測定することにより、被検物質を特異的に測定する方法及びこの方法に用いる測定用試薬キットを提供する。夾雑する交差反応物質の反応性を低減させる物質を免疫反応系に存在させることにより、従来不可能であった目的とする被検物質を免疫学的に測定できる。