【手続補正書】
【提出日】平成31年3月14日(2019.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸１〜６１４をコードするヌクレオチド配列を欠いており、かつ（ｉｉ）内因性ＤＲ６転写調節配列に操作可能に連結された、配列番号１７に記述された核酸配列またはその縮重変異型を含むように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に操作可能に連結されたＲＯＲ１膜貫通ドメインコード配列を含む異種ポリヌクレオチドによる、エキソン２の一部からエキソン６の全体までを含む内因性ゲノム配列の置換を含む、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座をゲノム内に含む、遺伝子組み換えされたマウスであって、
前記マウスは、前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座についてホモ接合型であり、
前記マウスは、前記核酸配列を発現し、（ａ）１つ又は２つ以上のＡＬＳに似た症状として現れる運動ニューロンの機能障害、（ｂ）脊髄内の運動ニューロン喪失、（ｄ）対照マウスと比較しての侵害受容の減少、または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の任意の組み合わせを現す、マウス。
【請求項２】
前記マウスが、１つ又は２つ以上のＡＬＳに似た症状として現れる運動ニューロンの機能障害を示す、請求項１に記載の遺伝子修飾されたマウス。
【請求項３】
前記運動ニューロンが上位運動ニューロン又は下位運動ニューロンを含む、請求項２に記載の遺伝子修飾されたマウス。
【請求項４】
前記げっ歯類が４週齢を超えるまで、前記運動ニューロンの機能障害が、盲検化主観的神経学的スコアリングアッセイ、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、及び体重測定において現れない、請求項３に記載の遺伝子修飾されたマウス。
【請求項５】
前記げっ歯類が、対照マウスと比較して侵害受容の減少を示す、請求項１に記載の遺伝子修飾されたマウス。
【請求項６】
前記マウスが、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、及び混合型Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統からなる群から選択される系統由来であり、前記マウスが、８〜２０週齢の間に対照野生型動物と比較して体重増加の低下を示す、請求項１に記載の遺伝子修飾されたマウス。
【請求項７】
修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸１〜６１４をコードするヌクレオチド配列を欠いており、かつ（ｉｉ）内因性ＤＲ６転写調節配列に操作可能に連結された、配列番号１７に記述された核酸配列またはその縮重変異型を含むように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に操作可能に連結されたＲＯＲ１膜貫通ドメインコード配列を含む異種ポリヌクレオチドによる、エキソン２の一部からエキソン６までを含む内因性ゲノム配列の置換を含む、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座を含むマウス細胞又は組織であって、前記マウス細胞又は組織が、前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座についてホモ接合型である、細胞又は組織。
【請求項８】
前記細胞が運動ニューロン又は胚幹細胞である、請求項７に記載の細胞又は組織。
【請求項９】
請求項１に記載の遺伝子修飾されたマウスを作製する方法であって、
前記マウスの内因性ＤＲ６遺伝子座において、前記遺伝子座が、（ｉ）成熟ＤＲ６タンパク質をコードする内因子ヌクレオチド配列の欠失であって、前記内因性ヌクレオチド配列が配列番号１５のアミノ酸１〜６１４をコードする、欠失、および（ｉｉ）内因性ＤＲ６転写調節配列に操作可能に連結された、配列番号１７に記述された核酸配列またはその縮重変異型を含むように、エキソン２の一部からエキソン６までを含むゲノム配列を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に操作可能に連結されたＲＯＲ１膜貫通ドメインコード配列を含む異種ポリヌクレオチドによって置換する工程と、
前記マウスを育種して、前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座についてホモ接合にする工程と
を含む、方法。
【請求項１０】
運動ニューロン機能障害を調節するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のマウスに、候補薬剤を投与することであって、前記マウスが運動ニューロン機能障害を現す、ことと、
（ｂ）試験対照マウスと比較して、前記マウスにおける前記運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状に対する、前記候補薬剤の何らかの調節効果を決定することと、を含み、
前記試験対照マウスと比較して、前記マウスにおける前記運動ニューロン機能障害の前記少なくとも１つの症状に対する調節効果の存在が、前記候補薬剤が運動ニューロン機能障害を調節するのに有益であることを示す、方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、盲検化主観的ＡＬＳ−ＴＤＩ神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定による、前記症状の検知の前に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が、盲検化主観的ＡＬＳ−ＴＤＩ神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定のうちの１つ又は２つ以上による、前記症状の検知の後に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤が２回以上の異なる時点で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの症状が、前記マウスと同一の系統を有するが、そのゲノム内に前記核酸を含まない対照マウスと比較した、体重減少、及び知覚欠失から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの症状が上位運動ニューロン機能障害の結果である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの症状が、振戦、痙性麻痺（硬直）、異常反射、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの症状が下位運動ニューロン機能障害の結果である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの症状が、筋力低下及び衰弱、線維束性収縮、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状が、体重増加の低下である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状が、侵害受容の減少である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記マウスが、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、及び混合型Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統からなる群から選択される系統由来のマウスである、請求項１０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
また、本明細書には、本明細書に記載されるような標的化ベクター、例えば、胚幹細胞、例えば、マウス胚幹細胞、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ胚幹細胞などを含む、げっ歯類細胞が提供される。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ＤＲ６タンパク質の細胞質ドメイン全体をコードする第１のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座をゲノム内に含む、遺伝子組み換えされたげっ歯類。
（項目２）
前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、成熟ＤＲ６タンパク質全体をコードする、第２のヌクレオチド配列を更に欠いている、項目１に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
（項目３）
前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、膜貫通ドメイン及びレポータータンパク質のうちの少なくとも１つに操作可能に融合された機能性ＤＲ６シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目１又は項目２に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
（項目４）
前記核酸配列が、前記膜貫通ドメインに操作可能に融合された前記機能性ＤＲ６シグナルペプチドをコードし、かつ、前記膜貫通が前記レポータータンパク質に操作可能に融合されている、項目３に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目５）
前記機能性ＤＲ６シグナルペプチドが内因性ＤＲ６シグナルペプチドである、項目３又は項目４に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目６）
前記膜貫通ドメインが内因性ＤＲ６膜貫通ドメインではない、項目３〜５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目７）
前記膜貫通ドメインがＲＯＲ１膜貫通ドメインである、項目３〜６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目８）
前記レポータータンパク質がβガラクトシダーゼである、項目３〜７のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目９）
前記核酸配列が、内因性ＤＲ６転写制御配列に操作可能に連結される、項目３〜８のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１０）
前記遺伝子修飾されたげっ歯類が、前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座に関してヘテロ接合型である、項目１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１１）
前記げっ歯類が運動ニューロンの機能障害を示す、項目１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１２）
前記運動ニューロンが上位運動ニューロン又は下位運動ニューロンである、項目１１に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１３）
前記げっ歯類が４週齢を超えるまで、前記運動ニューロンの機能障害が、盲検化主観的スコアリングアッセイ、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、及び体重測定において現れない、項目１２に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１４）
前記げっ歯類が、対照げっ歯類と比較して侵害受容の減少を示す、項目１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１５）
前記げっ歯類がラット又はマウスである、項目１に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１６）
前記げっ歯類が、成熟したＤＲ６タンパク質全体をコードする第１のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座を含むマウスであり、
前記内因性マウスＤＲ６遺伝子座が、少なくとも１つの内因性ＤＲ６転写制御配列に操作可能に連結され、β−ガラクトシダーゼに操作可能に融合されたＲＯＲ１膜貫通ドメインに、操作可能に融合された内因性ＤＲ６シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目１５に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１７）
前記マウスが、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、及び混合型Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統からなる群から選択される系統由来であり、前記マウスが、８〜２０週齢の間に対照野生型動物と比較して体重増加の低下を示す、項目１６に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
（項目１８）
項目１〜１７のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類由来の細胞又は組織。
（項目１９）
前記細胞が運動ニューロン又は胚幹細胞である、項目１８に記載の細胞又は組織。
（項目２０）
項目１に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類を作製する方法であって、前記げっ歯類の内因性ＤＲ６遺伝子座から、ＤＲ６細胞質ドメイン全体をコードする第１の内因性ヌクレオチド配列を欠失させる工程を含む、方法。
（項目２１）
前記欠失させる工程が、全長かつ内因性の成熟したＤＲ６タンパク質をコードする第２の内因性ヌクレオチド配列を、膜貫通ドメイン及び／又はレポーター遺伝子をコードする核酸配列に置き換えることを含み、前記核酸が、内因性ＤＲ６転写制御配列及びシグナルペプチド配列と操作可能に連結する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
対照運動ニューロン細胞と比較して酸化的ストレスの増加を示す、運動ニューロンの集団を作製する方法であって、項目１〜１７のいずれか一項に記載の前記げっ歯類から単離された内部細胞塊の胚幹細胞から胚様体を確立することと、前記胚様体を前記運動ニューロンの集団に分化させることと、を含む、方法。
（項目２３）
運動ニューロン機能障害を調節するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）そのゲノム内に、ＤＲ６細胞質ドメイン全体をコードする第１のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座を含むげっ歯類に、候補薬剤を投与することであって、前記げっ歯類が運動ニューロン機能障害を発現する、ことと、
（ｂ）試験対照げっ歯類と比較して、前記げっ歯類における前記運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状に対する、前記候補薬剤の何らかの調節効果を決定することと、を含み、
前記試験対照げっ歯類と比較して、前記げっ歯類における前記運動ニューロン機能障害の前記少なくとも１つの症状に対する調節効果の存在が、前記候補薬剤が運動ニューロン機能障害を調節するのに有益であることを示す、方法。
（項目２４）
前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、成熟した内因性ＤＲ６タンパク質全体をコードする第２のヌクレオチド配列を更に欠いている、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座が、膜貫通ドメイン及びレポータータンパク質のうちの少なくとも１つに操作可能に融合された機能性ＤＲ６シグナルペプチドをコードす
る核酸配列を含む、項目２３又は項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記薬剤が、盲検化主観的ＡＬＳ−ＴＤＩ神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定による、前記症状の検知の前に投与される、項目２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記薬剤が、盲検化主観的ＡＬＳ−ＴＤＩ神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定のうちの１つ又は２つ以上による、前記症状の検知の後に投与される、項目２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記薬剤が２回以上の異なる時点で投与される、項目２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記少なくとも１つの症状が、前記げっ歯類と同一の系統を有するが、そのゲノム内に前記核酸を含まない対照げっ歯類と比較した、後弯症、異常後肢クラスピング、運動調整欠失、運動学習能力欠失、体重減少、及び知覚欠失から選択される、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記少なくとも１つの症状が上位運動ニューロン機能障害の結果である、項目２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記少なくとも１つの症状が、振戦、痙性麻痺（硬直）、異常反射、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記少なくとも１つの症状が下位運動ニューロン機能障害の結果である、項目２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記少なくとも１つの症状が、筋力低下及び衰弱、線維束性収縮、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状が、体重増加の低下である、項目２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記運動ニューロン機能障害の少なくとも１つの症状が、侵害受容の減少である、項目２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記げっ歯類が、成熟したＤＲ６タンパク質全体をコードする第１のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性ＤＲ６遺伝子座を含むマウスであり、
前記内因性マウスＤＲ６遺伝子座が、少なくとも１つの内因性ＤＲ６転写制御配列に操作可能に連結され、β−ガラクトシダーゼに操作可能に融合されたＲＯＲ１膜貫通ドメインに、操作可能に融合された内因性ＤＲ６シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記マウスが、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、及び混合型Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統からなる群から選択される系統由来のマウスである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）薬剤の存在下又は非存在下で、項目１に記載のげっ歯類由来の運動ニューロンを培養することと、
（ｂ）前記薬剤が、前記げっ歯類由来であるが、前記薬剤非存在下で培養された対照運動ニューロンと比較したときに、前記運動ニューロンにおける酸化的ストレスを防止、抑制、及び／又は軽減するかどうかを決定することと、を含み、前記運動ニューロンにおける酸化的ストレスの防止、抑制、及び／又は軽減が、運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤を示す、方法。
（項目３９）
操作可能に連結され、５’から３’へ、ＤＲ６シグナルペプチドをコードする第１の核酸配列、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸、レポーター遺伝子をコードする第３の核酸、及び／又は薬剤選択カセットをコードする第４の核酸を含む、核酸。
（項目４０）
前記第１の核酸配列が、配列番号６に記述され、前記第２の核酸配列が配列番号７に記述され、前記第３の核酸配列が配列番号８に記述され、かつ／又は前記第４の核酸が配列番号３に記述される、項目３９に記載の核酸配列。
（項目４１）
第１の標的化アーム及び第２の標的化アームを更に含み、前記第１の標的化アームが前記第１、第２、及び／又は第３の核酸配列の５’であり、そこに操作可能に連結しており、前記第２の標的化アームが前記第１、第２、及び／又は第３の核酸配列の３’であり、そこに操作可能に連結しており、前記第１及び第２の標的化アームが、少なくとも１つの内因性非ヒト動物制御要素に操作可能に連結する、内因性非ヒト動物ＤＲ６遺伝子座への挿入用として前記核酸を標的化するものである、項目３９又は項目４０に記載の核酸。
（項目４２）
前記非ヒト動物がげっ歯類である、項目４１に記載の核酸。
（項目４３）
前記げっ歯類がマウスである、項目４２に記載の核酸配列。
（項目４４）
前記核酸が配列番号５又は配列番号１７に記述された配列を含む、項目４３に記載の核酸配列。
（項目４５）
項目３９〜４４のいずれか一項に記載の前記核酸を含む、げっ歯類細胞。
（項目４６）
前記げっ歯類細胞が胚幹細胞である、項目４５に記載のげっ歯類細胞。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
【図１】ＤＲ６遺伝子座の標的破壊の方法を示す。野生型マウスＤＲ６遺伝子座は、５’から３’へ、５’ＵＲＴ（白いボックス）、開始コドン（ＡＴＧ）、エキソン１〜６（点付きボックス）、終止コドン（ＴＡＧ）、及び３’ＵＲＴを示す上部線として示されている（縮尺通りではない）。示されているように、内因性マウスシグナル配列は、エキソン１及びエキソン２の一部分（開始コドンから４１０３塩基まで）によってコードされ、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、下部線として示されている（縮尺通りではない）Ｚｅｎ−Ｕｂ１カセットと組み換えた後に残存する。図１に示すように、Ｚｅｎ−Ｕｂ１標的化ベクター（配列番号５）は、（５’から３’への）５’ホモロジーアーム（５’アーム；配列番号１）、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ；配列番号９）に操作可能に連結された、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬａｃＺレポーター遺伝子（ＬａｃＺ；配列番号８）に操作可能に連結されたＲＯＲ１膜貫通ドメインコード配列（ＴＭ；配列番号７）を含む。Ｚｅｎ−Ｕｂ１カセットはまた、ポリＡシグナル（ｐＡ；配列番号１３）に操作可能に連結された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子（Ｎｅｏ；配列番号１２）に操作可能に連結された、ヒトユビキチンＣ遺伝子（ｈＵＢ；配列番号１１）からのプロモーターを含む選択カセットを含み、選択カセットは、同一のｌｏｘＰ核酸配列（配列番号１０）に隣接している。Ｚｅｎ−ＵＢ１カセットの３’ホモロジーアーム（３’アーム）は、配列番号４と記述されている。相同組み換え時に、結果として生じる対立遺伝子は、ＲＯＲ１膜貫通ドメインコード配列及びＬａｃＺレポーター遺伝子に操作可能に連結された内因性ＤＲ６シグナル配列をコードする核酸配列を含み（核酸配列は、配列番号１７と記述されている）、エキソン２内の塩基４１０３からエキソン６の終止コドンまでの内因性ゲノム配列全体を欠いている、例えば、内因性細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を欠いている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
マウスＤＲ６受容体遺伝子座は、染色体１７で発見され、６つのエキソンを有する。この遺伝子座は、推定シグナル配列（アミノ酸１〜４１；配列番号１５のアミノ酸−４１〜−１）、細胞外ドメイン（アミノ酸４２〜３４９；配列番号１５のアミノ酸１〜３０８）、膜貫通ドメイン（アミノ酸３５０〜３７０；配列番号１５のアミノ酸３０９〜３２９）、次いで細胞質ドメイン（アミノ酸３７１〜６５５；配列番号１５のアミノ酸３３０〜６１４）を有する、６５５アミノ酸タンパク質（配列番号１５）をコードする。成熟したＤＲ６タンパク質は、そのシグナルタンパク質の開裂後に翻訳されたポリペプチドを指し、例えば、成熟したマウスＤＲ６タンパク質は、アミノ酸４２〜６５５；配列番号１５のアミノ酸１〜６１４を指す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
【表１】
2018512842.tif 000001
Ｉ．少なくとも１つのＤＲ６遺伝子座の遺伝子修飾を含む組成物