【手続補正書】
【提出日】平成31年2月27日(2019.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物であって、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、を含み、
前記植物の種子、前記植物の根又は前記植物の周囲の土壌への当該組成物の適用は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす、
組成物。
【請求項２】
前記組成物は、液体の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、粉剤、乾燥水和性粉末剤、展延性粒剤又は乾燥水和性粒剤の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、１．０×１０８ＣＦＵ／ｇから１．０×１０１２ＣＦＵ／ｇの量で存在する、
請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、油分散体の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
植物の成長に利益をもたらす及び／又は植物における病原体感染に対する保護を与えるのに適切な量で存在する、微生物学的、生物学的又は化学的な、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺細菌剤、除草剤、植物抽出物、植物成長調整剤又は肥料のうちの１つ又は組み合わせを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物で被覆された植物種子であって、
前記組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、を含む、
植物種子。
【請求項７】
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法であって、
当該方法は、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、
を含む組成物を、植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌に送達することを含み、
前記組成物の送達は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす、
方法。
【請求項８】
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法であって、
当該方法は、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第１の組成物、及び、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第２の組成物、
を、植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌に送達することを含み、
前記組成物の送達は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす、
方法。
【請求項９】
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法であって、
当該方法は、適切な成長培地中に植物種子を植え付けることを含み、
前記植物種子は、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、
を含む組成物で被覆されており、
前記バチルス・ベレゼンシスＲＴＩ３０１及び前記バチルス・サブチリスＲＴＩ４７７は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすために適切な量で存在する、
方法。
【請求項１０】
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物で被覆された植物種子であって、
前記組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及びビフェントリン殺虫剤を含む、
植物種子。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第１の組成物、
微生物学的、生物学的又は化学的な、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺細菌剤、除草剤、植物抽出物、植物成長調整剤又は肥料のうちの１つ又は組み合わせを含む第２の組成物、並びに、
植物の枝葉、植物の樹皮、植物の果実、植物の花、植物の種子、植物の根、植物の切断片、植物の移植片、植物のカルス組織、植物の周囲の土壌若しくは成長培地、土壌若しくは成長培地中に植物の種子を播種する前の土壌若しくは成長培地、又は、土壌若しくは成長培地中に植物、植物切断片、植物移植片若しくは植物カルス組織を植え付ける前の土壌若しくは成長培地に、前記第１の組成物及び前記第２の組成物の組み合わせを、植物の成長に利益をもたらすのに適切な量で送達するための説明書、を含み、
前記第１の組成物及び前記第２の組成物は、別々に包装されている、
製品。
【請求項１２】
前記殺虫剤は、チアメトキサム、ピレスロイド、ビフェントリン、テフルトリン、ゼータ−シペルメトリン、有機リン酸塩、クロルエトキシホス、クロルピリホス、テブピリンホス、シフルトリン、フィプロール、フィプロニル、ニコチノイド又はクロチアニジンのうちの１つ又は組み合わせである、請求項１１に記載の製品。
【請求項１３】
前記第１の組成物は、液体の形態であり、
前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及び前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の各々は、１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
請求項１１に記載の製品。
【請求項１４】
前記第１の組成物は、粉剤、乾燥水和性粉末剤、展延性粒剤又は乾燥水和性粒剤の形態であり、
前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及び前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の各々は、１．０×１０８ＣＦＵ／ｇから１．０×１０１２ＣＦＵ／ｇの量で存在する、
請求項１１に記載の製品。
【請求項１５】
前記第１の組成物は、油分散体の形態であり、
前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及び前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の各々は、１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
請求項１１に記載の製品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物が提供される。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、を含み、植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌への組成物の適用は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法が提供される。方法は、植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌に組成物を送達すること（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）を含み、組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、を含み、組成物の送達は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法が提供される。方法は、植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌に、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第１の組成物、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第２の組成物の組み合わせを送達することを含み、組み合わせの送達は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物で被覆された植物種子が提供される。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物で被覆された植物種子が提供される。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、ビフェントリン殺虫剤、を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法が提供される。方法は、適切な成長培地中に植物の種子を植え付けることを含み、種子は組成物で被覆されており、組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、を含み、それらは、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすために適切な量で存在する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
１つの実施の形態では、植物の成長に利益をもたらすための組成物が提供される。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ビフェントリン殺虫剤、を含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
１つの実施の形態では、植物の成長に利益をもたらすための組成物が提供される。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ビフェントリン殺虫剤、を含み、組成物は、液体肥料と相溶性を有する（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）製剤中にある。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
１つの実施の形態では、植物の成長に利益をもたらすための組成物が提供される。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ルピナス・アルブス・ドーセ（Lupinus albus doce）由来の抽出物、ＢＬＡＤポリペプチド又はＢＬＡＤポリペプチドの断片のうちの１つ又は組み合わせを含む殺真菌剤、を含む。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
１つの実施の形態では、製品が提供される。製品は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第１の組成物、微生物学的、生物学的又は化学的な殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺細菌剤、除草剤、植物抽出物、植物成長調整剤又は肥料のうちの１つ又は組み合わせを含む第２の組成物、並びに、任意にて、植物の枝葉、植物の樹皮、植物の果実、植物の花、植物の種子、植物の根、植物の切断片、植物の移植片、植物のカルス組織、植物の周囲の土壌若しくは成長培地、土壌若しくは成長培地中に植物の種子を播種する前の土壌若しくは成長培地、又は、土壌若しくは成長培地中に植物、植物切断片、植物移植片若しくは植物カルス組織を植え付ける前の土壌若しくは成長培地に、第１の組成物及び第２の組成物の組み合わせを、植物の成長に利益をもたらすために適切な量において送達するための説明書、を含み、第１の組成物及び第２の組成物は、別々に包装されている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１】本発明の１以上の実施の形態による、２つのバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）参照株であるバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＦＺＢ４２及びバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＴｒｉｇｏＣｏｒ１４４８についての対応領域と比較した、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株に見られる独特なランチビオティック生合成オペロンを取り囲む及び含むゲノム機構の模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、１３日間の成長後の抽出された小麦植物の画像であり、コントロール植物を示す図である。この画像は、本発明の１以上の実施の形態による、小麦における早期植物成長についてのバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株のプラスの効果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１３日間の成長後の抽出された小麦植物の画像であり、ＲＴＩ４７７株を接種した植物を示す図である。この画像は、本発明の１以上の実施の形態による、小麦における早期植物成長についてのバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株のプラスの効果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＲＴＩ４７２株の成育箇所（ｌａｗｎ）上にスポットされたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株を示す画像である。この画像は、本発明の１以上の実施の形態による、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株とバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株との間の調和性を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株の成育箇所上にスポットされたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株を示す画像である。この画像は、本発明の１以上の実施の形態による、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株とバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株との間の調和性を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の１以上の実施の形態による、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の形態を示す画像である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の１以上の実施の形態による、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株の形態を示す画像である。
【図５Ａ】図５Ａは、コントロール植物を示す。図５Ａは、本発明の１以上の実施の形態による、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の組み合わせでの大豆種子の接種及び８日間の成長後の抽出からもたらされる早期植物成長についてのプラスの効果を示す画像である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、１０６ｃｆｕ／ｍｌでＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７（比率３：１）を接種した植物を示す。図５Ｂは、本発明の１以上の実施の形態による、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の組み合わせでの大豆種子の接種及び８日間の成長後の抽出からもたらされる早期植物成長についてのプラスの効果を示す画像である。
【図６】本発明の１以上の実施の形態による、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）を含む微生物種により産生される従来に報告されたフェンギシン型及びデヒドロキシフェンギシン型環状リポペプチドと、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１分離株及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７分離株の１つ又は両方により産生される新しく同定された（太字で示す）フェンギシン型及びデヒドロキシフェンギシン型分子との両方を示す模式図である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本明細書及び特許請求の範囲では、用語“代謝物”及び“化合物”は、ＲＴＩ３０１株又は他のバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）株により産生される抗菌活性を有する化合物に関連して使用される時、互換的に使用される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明の組成物及び方法における使用のための抗菌特性を有する第１の微生物及び植物の成長及び／又は植物の健康に有益な特性を有する第２の微生物は、バチルス属種（Bacillus spp.）の微生物であり得る。用語“拮抗性”及び“抗菌性”は、本明細書及び特許請求の範囲の目的のためにここでは互換的に使用される。第１の微生物はバチルス属種（Bacillus spp.）株であり得、バチルス属種（Bacillus spp.）株はバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）であり得る。植物の成長及び／又は植物の健康に有益な特性を有する第２の微生物は、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）であり得る。植物の成長及び／又は植物の健康に有益な特性は、植物の病原体感染に対する保護を与える及び／又は植物の病原体感染の治療又は防除をするための、成長促進特性及び拮抗特性のうちの１つ又は両方であり得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
配列分析によるバチルス・ベレゼンシスとしての最近分離株の同定
抗菌特性を有する第１の微生物の例として、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）種に属すると同定された植物関連細菌が、ニューヨークのブドウ園で生育するブドウのつるの根圏土壌から単離されて、続いて植物病原体の拮抗特性について試験された。より具体的には、単離された細菌株は、高度に保存された１６Ｓ  ｒＲＮＡ及びｒｐｏＢ遺伝子の配列分析により、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）の新しい株であると同定された（実施例２参照）。新しい細菌分離株（“バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１”と称する）の１６Ｓ  ＲＮＡ配列は、３つの他の既知の菌株である、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＮＳ６株（ＫＦ１７７１７５）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＦＺＢ４２株（ＮＲ＿０７５００５）、及びバチルス・サブチリス亜種サブチリス（Bacillus subtilis subsp. subtilis）ＤＳＭ  １０株（ＮＲ＿０２７５５２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列と同一であると判定された。ＲＴＩ３０１株のｒｐｏＢ遺伝子配列（配列番号４）は、バチルス・アミロリケファシエンス亜種プランタルム（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum）ＴｒｉｇｏＣｏｒ１４４８（ＣＰ００７２４４）（９９％配列同一性；３塩基対の差異）、バチルス・アミロリケファシエンス亜種プランタルム（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum）ＡＳ４３．３（ＣＰ００３８３８）（９９％配列同一性；７塩基対の差異）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＣＣ１７８（ＣＰ００６８４５）（９９％配列同一性；８塩基対の差異）、及びバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＦＺＢ４２（ＣＰ０００５６０）（９９％配列同一性；８塩基対の差異）における同一遺伝子と配列類似性を有することも決定された。ＲＴＩ３０１株は、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）として同定された。ＤＮＡレベルでのｒｐｏＢ遺伝子の配列の相違は、ＲＴＩ３０１がバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）の新しい株であることを示している。バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株は、米国バージニア州マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）における特許手続きのための微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件の下、２０１４年４月１７日に寄託され、特許受託番号ＰＴＡ−１２１１６５を有する。［この株は当初「バチルス・アミロリケファシエンスＲＴＩ３０１」という名称で寄託されたが、２０１７年８月１０日に「バチルス・ベレゼンシスＲＴＩ３０１」として再分類された。］
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株のゲノムの更なる配列分析では、この株が、ランチビオティック生合成に関連する遺伝子を有しており、該生合成のための相同器官（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）が、密接に関連する他のバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１には欠けていることが明らかとなった（実施例３参照）。これは、図１に示される。図１は、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１に見られる独特なランチビオティック生合成クラスターのゲノム機構と、ＲＴＩ３０１株の下に示されている２つの既知のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）参照株であるＦＺＢ４２株（中央）及びＴｒｉｇｏＣｏｒ１４４８株（下部）についての対応領域の概略図を示す。ＦＺＢ４２株及びＴｒｉｇｏＣｏｒ１４４８株はこのクラスターに存在する多くの遺伝子を欠いており、存在する多くの遺伝子内において低い程度の配列同一性を有することが図１から観察することができる。ＮＣＢＩにおける非重複（ｎｒ）ヌクレオチドデータベースに対するこのクラスターのＢＬＡＳＴ分析は、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）株に対する５’及び３’フランキング領域と高い相同性（図１の高い％類似性と類似）を示した。しかしながら、ランチペプチド生合成クラスターはＲＴＩ３０１株に独特であり、ＮＣＢＩｎｒデータベース中の任意の従前に配列決定されたＤＮＡと有意な相同性は観察されなかった。このデータは、新たに同定されたＲＴＩ３０１株が独特のランチビオティック生合成経路を有することを示している。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
更に、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株のゲノムの更なる配列分析では、この株が抗菌特性を有する分子の産生のための多数の生合成経路に関連する遺伝子を有することが明らかになった。これらには、サブチロシン、サーファクチン、イツリン、フェンギシン、アミロサイクリシン、ジフィシジン、バシリシン、バシロマイシン及びバシラエンについての生合成経路が含まれる。広範囲の抗菌生合成経路を有するＲＴＩ３０１株とは対照的に、ＲＴＩ４７７株の更なる配列分析では、この株が抗菌特性を有する更に限定された分子群についての生合成経路に関連する遺伝子を有することが明らかになった。ＲＴＩ４７７株は、サブチロシン、フェンギシン、サーファクチン、ジフィシジン、バシラエン、バシリシン及びバシロマイシンについての生合成経路を有するが、イツリン、ランチビオティック及びアミロサイクリシンについての完全な生合成経路は観察されなかった。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
ＲＴＩ４７７株と同様に、種々の条件下での様々な植物におけるベレゼンシス（velezensis）ＲＴＩ３０１株の成長促進及び拮抗活性を決定するために実験を行った。これらの実験は、ここでは実施例４−５に記載されている。実施例４には、プレートアッセイで測定した主要な植物病原体に対するベレゼンシス（velezensis）ＲＴＩ３０１分離株の拮抗活性を記載する。ＲＴＩ３０１株は、ＲＴＩ４７７株と比較して、広範囲の植物病原体微生物に対して優れた拮抗特性を示した。実施例５には、ベレゼンシス（velezensis）ＲＴＩ３０１分離株の種々の表現型形質の測定を記載する。注目すべきことに、ＲＴＩ３０１株と比較して、ＲＴＩ４７７株はより速く増殖し、強力なスウォーミングの表現型を有する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株と他のバチルス（Bacillus）分離株との調和性は、様々な他の株の成育箇所（ｌａｗｎ）にＲＴＩ３０１株をスポットすることによって試験した。これらのデータは実施例７に記載されている。この実験の結果は、図３Ａ−３Ｂに示される。図３Ａ−３Ｂは、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株とバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株との間の増殖調和性、及びＲＴＩ３０１株と別のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株であるアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）でＰＴＡ−１２１１６６として寄託されているバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＲＴＩ４７２株との間の調和性の欠如を示す画像である。ＲＴＩ３０１株をＲＴＩ４７２株の成育箇所にスポットした場合（図３Ａ）、ＲＴＩ４７２株の増殖について一掃された阻害領域が観察された。対照的に、ＲＴＩ３０１株をＲＴＩ４７７株の成育箇所にスポットした場合（図３Ｂ）、ＲＴＩ４７７株について、最小限の阻害のみであり細胞成育箇所の一掃は観察されなかった。従って、ＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株の増殖は調和性があると結論付けられた。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
いかなる特定の作用機序に限定されるものではないが、観察される菌株調和性の差異を説明するために、次のような１つの作用様式が提案される。試験した３つの菌株（即ち、ＲＴＩ３０１、ＲＴＩ４７２及びＲＴＩ４７７）のゲノム配列に基づき、これらの株は全て、拮抗化合物であるバシリシン、バシラエン、ジフィシジン及びバシロマイシンを産生することが予測された。しかしながら、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株の両方はサブチロシンの合成のための遺伝子を有するが、この遺伝子はバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＲＴＩ４７２のゲノムには存在しない。サブチロシンは、類似又は密接に関連する細菌株の増殖を阻害するために細菌によって産生されるタンパク質性毒素の１種であるバクテリオシンである。従って、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１により合成されたサブチロシンは、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＲＴＩ４７２の増殖の阻害剤であり得ると仮定された。対照的に、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株は、ＲＴＩ４７７株が自身でサブチロシンを産生し、従って化合物に対して耐性であるため、ＲＴＩ３０１によって阻害されない。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株とバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株との間の菌株形態の差異も分析した。これらの菌株の各々の形態を示す画像を、図４において、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１（図４Ａ）及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７（図４Ｂ）として示す。図４Ａ−図４Ｂにおいて示されるバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株のコロニー形態は、運動性となる場合の菌株の挙動における潜在的差異を示す。運動性は、植物関連細菌による根圏コロニー形成にとって重要な特質である。バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１は、輪郭のはっきりした円形のコロニーとして増殖する。対照的に、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７は、ふんわりとしたコロニーとして増殖し、スウォーミング及び運動性を示す形態である。スウォーミング及び運動性は、根圏及び植物根の表面の急速なコロニー形成に関連する表現型である。また、いかなる特定の作用機序に限定されるものではないが、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株の形態に関連した強いスウォーミングの表現型により、この株がバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１よりも根圏でのより効率的なコロニー形成体（ｃｏｌｏｎｉｚｅｒ）となることが仮定された。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
増殖調和性及び表現型に観察される差異に照らして、ＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株の組み合わせを、植物の成長及び健康を促進するその能力について試験した。大豆種子に対する発芽、根の発達及び早期植物成長において、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の単独及び組み合わせにおける適用の効果を決定するために、実験を行った。ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の胞子を用いて実施例８に記載のように実験を行った。１：３、１：１及び３：１の比率におけるＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の胞子の組み合わせを種子に添加した。データを表Ｖに示す。１×１０６、１×１０７及び１×１０８の濃度におけるバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１での大豆種子の接種は、植物成長並びに根の発達及び構造に影響を与えなかった。同じ濃度におけるバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７での大豆種子の接種は、最も低い濃度で根の発達及び構造においてほんのわずかな改善をもたらした。しかしながら、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の両方の組み合わせ（１：３の比率）での大豆種子の接種は、試験された全ての濃度において、根の発達及び早期植物成長に改善が生じた。根の発達における最良の結果は、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７を３：１の比率において１×１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度で適用した時に観察された。この３：１の比率におけるＲＴＩ３０１とＲＴＩ４７７の胞子での種子の接種のプラスの効果の画像を、図５Ａ及び図５Ｂに示す（Ａ−コントロール植物；Ｂ−１０６ｃｆｕ／ｍｌにおいてＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７（比率３：１）で接種した植物）。図５Ａ−５Ｂに示すように、効果は根の形成及び構造に関して特にプラスであった。細根は、水、栄養分の摂取及び根圏の他の微生物との植物相互作用において重要である。これらの結果は、個々の株の適用はコントロール植物と比較して全く又はほとんど効果を示さなかった一方で、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の組み合わせの適用での種子処理は、大豆の早期成長及び樹立について期待される有益性よりも大きな有益性をもたらしたということを示す。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の組み合わせの相乗効果が観察され、植物成長に予期せぬ利益をもたらした。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
収量におけるＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株の組み合わせでの種子処理の効果を試験するために、大豆において更なる実験を実施した。実験は次のように設定した。１）未処理の種子。２）典型的な大豆種子処理であるＣＲＵＩＳＥＲＭＡＸＸ（チアメトキサム、フルジオキソニル＋メタラキシル−Ｍ；ＳＹＮＧＥＮＴＡ  ＣＲＯＰ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ，ＩＮＣ）及びチオファネートメチルの組み合わせで処理した種子（ＣＲＵＩＳＥＲＭＡＸＸ及びチオファネートメチルの組み合わせは“ＣＨＥＭコントロール”として示す）。３）ＣＨＥＭコントロールで処理し、５．０×１０＋５ｃｆｕ／種子でＲＴＩ３０１株を接種した種子。４）ＣＨＥＭコントロールで処理し、５．０×１０＋５ｃｆｕ／種子でＲＴＩ４７７株を接種した種子。５）ＣＨＥＭコントロールで処理し、５．０×１０＋５ｃｆｕ／種子で両方の株の組み合わせを接種した種子。１０回の試験を１０の独立したプロットとして実施し、大豆収量の結果（エーカー当たりのブッシェル）を表ＶＩに示す。表ＶＩの結果は、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７のいずれか単独での接種は、ＣＨＥＭコントロール単独で処理した種子と比較した時、大豆の全収量に影響を及ぼさなかったことを示す。先の実験で観察されたように、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の組み合わせでの接種は相乗効果をもたらし、大豆収量の５％増加の結果となった（エーカー当たり５８．２から６１．１ブッシェル）。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の組み合わせは、大豆収量に予期せぬ利益をもたらした。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
実施例９は、コーンにおけるバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の組み合わせでの種子処理の利益を記載する。コーンの実験については、データを表ＶＩＩに要約し、設定は次の通りであった。１）未処理の種子（“ＵＴＣ”）。２）“ＣＨＥＭコントロール”又は“ＣＣ”として示される一般的に使用される化学活性剤の３つの組み合わせで処理した種子。３）ＣＨＥＭコントロール＋ＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株を各々５．０×１０＋５ｃｆｕ／種子で組み合わせて処理した種子（“ＣＣ＋ＲＴＩ３０１／４７７  １：１”）。自然の病気圧力又はリゾクトニア（Rhizoctonia）での土壌の接種の条件下の２つの試験を行った。注目すべきことに、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の１：１の組み合わせ＋化学コントロールは、化学コントロール単独よりも、自然病原体圧力及びリゾクトニア（Rhizoctonia）接種野外試験の各々について、エーカー当たり１０．７ブッシェル及びエーカー当たり５９．８ブッシェルの収量増加が観察された。これらのデータは、これらの株の組み合わせでの種子の処理が、コーン収量において非常に大きな増強をもたらし得ることを示す。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
実施例１０は、病原体防除のための化学活性剤に加えて、ＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株の組み合わせで種子を処理した時の大豆における出芽及び収量についての影響を示す実験を記載する。具体的には、大豆における実験は次のように設定された。１）未処理の種子（ＵＴＣ）。２）“ＣＨＥＭコントロール”として示される一般的に使用される化学活性剤の３つの組み合わせで処理した種子。３）ＶＩＢＲＡＮＣＥ（活性成分セダキサン；ＳＹＮＧＥＮＴＡ  ＣＲＯＰ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ，ＩＮＣ）で処理した種子。４）ＣＨＥＭコントロール＋ＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株を各々５．０×１０＋５ｃｆｕ／種子で処理した種子。植え付け時にリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を植物種子に接種したものについて２つの試験を行った。表ＶＩＩＩの結果は、ＣＨＥＭコントロールに加えてバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の組み合わせで処理すると、ＣＨＥＭコントロール単独の収量よりも、平均でエーカー当たり１３．３ブッシェルの収量における増加をもたらすことを示す（エーカー当たり５９．４から７２．７ブッシェル）。従って、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の組み合わせでの種子処理は、重大な病原体圧力の条件下でさえも、大豆における収量の有意な改善をもたらす。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
実施例１１は、スカッシュ、トマト及びペッパーにおけるバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の組み合わせでの点滴灌漑の有益性を記載する。土壌菌によって引き起こされる病害は、いずれの試験でも記録されなかった。スカッシュの試験では、植え付け時に根域のドレンチを介して、点滴灌漑による更なる適用をすることなく、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１については３．７５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタール、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７については０．６２５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタールの割合で胞子を適用した。ＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨ  ＬＭ（ＬＯＶＥＬＡＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）を商業用コントロールとして使用して、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７の組み合わせについて記載したのと同じ方法で２３４０ｍｌ／Ｈａの割合で適用した。この製品は、アシドボラックス・ファシリス（Acidovorax facilis）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・オレロニウス（Bacillus oleronius）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・マリヌス（Bacillus marinus）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）及びロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）の混合を含有する。ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７胞子の添加は、細菌胞子がドレンチに含まれていない未処理のコントロール植物と比較して、並びに商業用コントロール植物と比較して、スカッシュについての総収量及び市場性収量 （ｍａｒｋｅｔａｂｌｅ  ｙｉｅｌｄ）の両方において増加をもたらした。具体的には、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７で処理した植物は合計８７３．４ｋｇ／Ｈａのスカッシュをもたらし、未処理のコントロール植物及びＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨで処理した植物について、各々の８３８．３ｋｇ／Ｈａ及び８３６．１ｋｇ／Ｈａで比較すると、総スカッシュの重量において各々４．２％及び４．５％の増加を示す。未処理コントロール植物及び商業的基準で処理された植物と比較した、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７胞子で処理した植物の総スカッシュ重量の増加は、この処理によってもたらされるプラスの成長効果を示している。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
トマトの試験では、植え付け時における根域のドレンチを介して、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１については０．６２５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタール、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７については３．７５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタールの割合で胞子を適用し、続いて移植後１７日及び３５日において同じ割合で２回滴下適用した。ＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨ  ＬＭを商業用コントロールとして使用して、２３４０ｍｌ／Ｈａの割合でＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７の組み合わせについて記載したのと同じ方法で適用した。ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７胞子の添加は、細菌胞子がドレンチ及び灌漑に含まれていない未処理のコントロール植物と比較して、並びに商業用コントロール植物と比較して、トマトについての総収量及び市場性収量の両方において増加をもたらした。具体的には、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７で処理した植物は合計２１８２４ｋｇ／Ｈａの市場性のあるトマトをもたらし、未処理のコントロール植物及びＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨで処理した植物について、各々の１６７６５ｋｇ／Ｈａ及び２１４２０ｋｇ／Ｈａで比較すると、市場性のあるトマトの重量において各々３０．２％及び１．９％の増加を示す。バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７胞子で処理した植物の市場性のあるトマト重量の実質的な増加は、特に未処理のコントロール植物と比較して、この処理によりもたらされるプラスの成長効果を示している。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
ペッパー（ジャラペノペッパー）の試験では、植え付け時における根域のドレンチを介して、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の両方の株毎に１．２５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタールの割合で胞子を適用し、続いて移植後１７日及び３５日において同じ割合で２回滴下適用した。ＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨ  ＬＭを商業用コントロールとして使用して、２３４０ｍｌ／Ｈａの割合でＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７の組み合わせについて記載したのと同じ方法で適用した。ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７胞子の添加は、細菌胞子が適用されていない未処理のコントロール植物と比較して、並びに商業用コントロール植物と比較して、ペッパーについての収量の増加をもたらした。具体的には、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７で処理した植物は合計４１５４ｋｇ／Ｈａの市場性のあるペッパーをもたらし、未処理のコントロール植物及びＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨで処理した植物について、各々の３４５５ｋｇ／Ｈａ及び３９３０ｋｇ／Ｈａで比較すると、市場性のあるジャラペノペッパーの重量において各々２０％及び５．７％の増加を示す。未処理コントロール植物及び商業的基準で処理された植物と比較した、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７胞子で処理した植物の市場性のあるペッパーの重量の実質的な増加は、この処理によりもたらされるプラスの成長効果を示している。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
実施例１２ではＲＴＩ３０１株及びＦＴＩ４７７株によって産生される抗菌代謝物が同定され、図６において示されている。実施例１２は、ＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株によって産生される環状リポペプチド、フェンギシン及びデヒドロキシフェンギシンの研究、並びに驚くべきことにこれらの分子のいくつかの従来に報告されていない種類の同定を記載する。バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１は、従来に報告されたフェンギシンＡ、Ｂ及びＣ化合物、並びにデヒドロキシフェンギシンＡ、Ｂ及びＣ化合物を産生することが決定された。予想外にも、これらの既知の化合物に加えて、ＲＴＩ３０１株は、環状ペプチド鎖の８位のＬ−イソロイシン（図６においてＸ３として示す）がＬ−メチオニンで置換された従来に同定されていないこれらの化合物の誘導体も産生するということが決定された。新しい種類のフェンギシン及びデヒドロキシフェンギシンはここではＭＡ、ＭＢ及びＭＣとして示され、図６のＸ３のＬ−イソロイシンがＬ−メチオニンで置換されたＡ、Ｂ及びＣの種類の誘導体を指す。新たに同定された分子を太字において図６及び表ＩＸに示す。新しく同定されたフェンギシンＭＡ、ＭＢ及びＭＣ化合物はＲＴＩ４７７株でも観察されたが、対応するデヒドロキシフェンギシンＭＡ、ＭＢ及びＭＣ化合物はＲＴＩ４７７株には観察されなかった（表ＩＸ参照）。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
従って、本発明の組成物及び方法では、抗菌特性を有するバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体であり得る。同様に、植物の成長及び／又は健康に有益な特性を有するバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体であり得る。本発明の組成物及び方法では、植物は、大豆又はコーンを含み得、植物の成長の利益は、収量の増加により示され得る。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物が提供される。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすのに適切な量で存在する、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む。植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌への組成物の適用は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
１つの実施の形態では、植物の成長に利益をもたらすための組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ビフェントリン殺虫剤を含む。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
１つの実施の形態では、植物の成長に利益をもたらすための組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ビフェントリン殺虫剤を含み、組成物は液体肥料と相溶性を有する製剤中にある。液体肥料と相溶性を有する製剤は、水和ケイ酸アルミニウム−マグネシウム及び少なくとも１つの分散剤を含み得る。ビフェントリン殺虫剤は、０．１ｇ／ｍｌから０．２ｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し得る。ビフェントリン殺虫剤は、約０．１７１５ｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。本明細書及び特許請求の範囲を通して使用される“液体肥料と相溶性を有する製剤中”との語句は、液体製剤において植物に送達される肥料との混合を可能にするために、製剤が水溶液中に溶解、分散又は乳化できることを意味する。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法が提供される。方法は、植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌に組成物を送達することを含む。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含み、組成物の送達は植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法が提供される。方法は、植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌に、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第１の組成物、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第２の組成物の組み合わせを送達することを含み、組み合わせの送達は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
微生物を含む組成物は、液体、油分散体、粉剤、乾燥水和性粉末剤、展延性（ｓｐｒｅａｄａｂｌｅ）粒剤又は乾燥水和性粒剤の形態であり得る。微生物は、胞子又は栄養細胞の形態で存在し得る。組成物は、液体の形態であり得、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在し得る。組成物は、粉剤、乾燥水和性粉末剤、展延性粒剤又は乾燥水和性粒剤の形態であり得、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｇから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｇの量で存在し得る。組成物は、油分散体の形態であり得、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物で被覆された植物種子を提供する。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすのに適切な量で存在する、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子を含む。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
１つの実施の形態では、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１は、各々約１．０×１０２ＣＦＵ／種子から約１．０×１０９ＣＦＵ／種子の範囲の量で存在する。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
１つの実施の形態では、植物種子が提供され、植物種子は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物で被覆されている。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、ビフェントリン殺虫剤を含む。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法が提供される。方法は、適切な成長培地中に植物の種子を植え付けることを含み、種子は組成物で被覆されており、組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子を含み、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の胞子を含む被覆は植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
植物種子を被覆する組成物の第１の微生物及び第２の微生物は、バチルス属種（Bacillus spp.）の微生物であり得る。第２の微生物の増殖は第１の微生物の増殖よりも速くなり得、第２の微生物はスウォーミング及び高運動性の表現型により特徴づけられ得る。第２の微生物は、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）であり得る。第１の微生物はバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）であり得、第２の微生物はバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）であり得る。バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体であり得る。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体であり得る。植物種子に被覆された組成物は、各々約１．０×１０２ＣＦＵ／種子から約１．０×１０９ＣＦＵ／種子の量で第１の微生物及び第２の微生物の各々の胞子を含み得る。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
１つの実施の形態では、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法が提供される。方法は、適切な成長培地中に植物の種子を植え付けることを含み、種子は組成物で被覆されており、組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすのに適切な量で存在する、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子を含む。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
１つの実施の形態では、植物の成長に利益をもたらすための組成物が提供される。組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、殺虫剤を含み、組成物は液体肥料と相溶性を有する製剤中にある。殺虫剤は、ピレスロイド、ビフェントリン、テフルトリン、ゼータ−シペルメトリン、有機リン酸塩、クロルエトキシホス、クロルピリホス、テブピリンホス、シフルトリン、フィプロール、フィプロニル、ニコチノイド又はクロチアニジンのうちの１つ又は組み合わせであり得る。殺虫剤は、ビフェントリンを含み得る。組成物は、ビフェントリン殺虫剤、水和ケイ酸アルミニウム−マグネシウム及び少なくとも１つの分散剤を含み得る。ビフェントリン殺虫剤は、０．１ｇ／ｍｌから０．２ｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し得る。ビフェントリン殺虫剤は、約０．１７１５ｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
１つの実施の形態では、製品が提供される。製品は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第１の組成物、微生物学的、生物学的又は化学的な殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺細菌剤、除草剤、植物抽出物、植物成長調整剤又は肥料のうちの１つ又は組み合わせを含む第２の組成物、並びに、必要に応じて、植物の枝葉、植物の樹皮、植物の果実、植物の花、植物の種子、植物の根、植物の切断片、植物の移植片、植物のカルス組織、植物の周囲の土壌若しくは成長培地、土壌若しくは成長培地中に植物の種子を播種する前の土壌若しくは成長培地、又は、土壌若しくは成長培地中に植物、植物切断片、植物移植片若しくは植物カルス組織を植え付ける前の土壌若しくは成長培地に、第１の組成物及び第２の組成物の組み合わせを、植物の成長に利益をもたらすために適切な量において送達するための説明書、を含む。第１の組成物及び第２の組成物は、別々に包装されている。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
１つの実施の形態では、第１の組成物は、液体、粉剤、展延性粒剤、乾燥水和性粉末剤又は乾燥水和性粒剤の形態である。１つの実施の形態では、第１の組成物は、液体の形態であり、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する。１つの実施の形態では、第１の組成物は、粉剤、乾燥水和性粉末剤、展延性粒剤又は乾燥水和性粒剤の形態であり、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｇから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｇの量で存在する。１つの実施の形態では、第１の組成物は、油分散体の形態であり、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
実施例３
バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７における抗菌化合物の生合成関連遺伝子
バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株のゲノムの更なる配列分析では、この株が抗菌特性を有する分子の産生のための多数の生合成経路に関連する遺伝子を有することが明らかになった。これらには、サブチロシン、サーファクチン、イツリン、フェンギシン、アミロサイクリシン、ジフィシジン、バシリシン、バシロマイシン及びバシラエンについての生合成経路が含まれる。更に、ＲＴＩ３０１株においてランチビオティック生合成に関連する遺伝子が発見されたが、これは他の密接に関連したバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株に同族体は存在しない。これについては、図１に示され、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株に見られるランチビオティック生合成オペロンを取り囲む及び含むゲノム機構の模式図を示す。図１では、一番上の組の矢印は、示された転写の相対的な方向を有するＲＴＩ３０１株のタンパク質コード領域を表す。比較のために、２つのバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）参照株であるＦＺＢ４２及びＴｒｉｇｏＣｏｒ１４４８についての対応領域を、ＲＴＩ３０１株の下に示す。ＲＴＩ３０１株におけるランチビオティック合成オペロンの遺伝子は、ＲＡＳＴを用いて最初に同定され、次いでそれらの同定はＢＬＡＳＴｐを用いて精査された。２つの参照株と比較したＲＴＩ３０１株の遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸同一性の程度は、代表的な矢印の陰影の程度及び矢印内に示される同一性パーセントの両方によって示される。ランチビオティック合成オペロンを囲む領域の３つの異なる株由来の遺伝子には高い程度の配列同一性があるが、ランチビオティック合成オペロン内では低い程度の配列同一性しかない（即ち、ランチビオティック合成オペロン内では４０％未満であるが、周辺領域では９９％より大きい）ということが図１から観察され得る。ＮＣＢＩにおいて非重複（ｎｒ）ヌクレオチドデータベースに対するこのクラスターのＢＬＡＳＴｎ分析を行うと、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）株について５’及び３’フランキング領域中で高い程度の相同性（図１の高％相同性と類似）を示した。しかし、ランチペプチド生合成クラスターはＲＴＩ３０１に独特であり、ＮＣＢＩｎｒデータベースにおいて従来に配列決定された任意のＤＮＡに対して有意な相同性は観察されなかった。従って、このランチビオティック合成オペロンは、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の独特な特徴である。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
実施例４
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７分離株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１分離株の抗菌特性
主要な植物病原体に対するバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７分離株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１分離株の拮抗能力をプレートアッセイで測定した。植物真菌病原体に対する拮抗作用の評価のためのプレートアッセイは、４ｃｍの距離で８６９寒天プレート上に細菌分離株及び病原性真菌を並べて培養することによって実施した。プレートを室温でインキュベートし、増殖阻害、ニッチ占有又は効果無し等の増殖挙動について、２週間まで定期的にチェックした。細菌性病原体に対する拮抗特性をスクリーニングする時、病原体は最初に８６９寒天プレート上に成育箇所として広げられた。続いて、分離株の各々の培養物の２０μｌアリコートをプレート上にスポットした。プレートを室温でインキュベートし、ＲＴＩ４７７及びＲＴＩ３０１が適用された位置の周りの成育箇所の阻害領域について、２週間まで定期的にチェックした。拮抗活性の概要を、それぞれＲＴＩ４７７株及びＲＴＩ３０１株の各々について、以下の表Ｉ及びＩＩに示す。ＲＴＩ３０１株は、ＲＴＩ４７７株と比較して、広い範囲の植物病原性微生物に対する優れた拮抗特性を示した。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
表ＩＩ．主要な植物病原体に対するバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１分離株の拮抗特性
【表２】
2018508471.tif 000001
＋＋＋非常に強い活性有り、＋＋強い活性有り、＋活性有り、＋−弱い活性有り、−活性観察されず
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
実施例５
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７分離株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１分離株の表現型形質
拮抗特性に加えて、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株についての様々な表現型形質も測定し、そのデータを以下の表ＩＩＩ及びＩＶにそれぞれの菌株の各々について示す。分析は、表の下の文章に記載された手順に従って実施された。注目すべきことに、ＲＴＩ４７７はＲＴＩ３０１と比較してより速く増殖し、強力なスウォーミング表現型を有する。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
表ＩＶ．表現型分析：バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１分離株のアセトイン及びインドール酢酸（ＩＡＡ）の植物ホルモン生成、並びに栄養サイクル
【表４】
2018508471.tif 000002
＋＋＋非常に強い、＋＋強い、＋多少、＋−弱い、−観察されず
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
実施例７
バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の増殖調和性
バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株と他のバチルス（Bacillus）分離株との調和性は、様々な他の株の成育箇所にＲＴＩ３０１株をスポットすることによって試験した。この実験の結果は、図３Ａ−３Ｂに示される。図３Ａ−３Ｂは、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株とバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株との間の増殖調和性、及びＲＴＩ３０１株と別のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）株であるアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）でＰＴＡ−１２１１６６として寄託されているバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＲＴＩ４７２株との間の調和性の欠如を示す画像である。ＲＴＩ３０１株をＲＴＩ４７２株の成育箇所にスポットした場合（図３Ａ）、ＲＴＩ４７２株の増殖について一掃された阻害領域が観察された。対照的に、ＲＴＩ３０１株をＲＴＩ４７７株の成育箇所にスポットした場合（図３Ｂ）、ＲＴＩ４７７株について、最小限の阻害のみであり細胞成育箇所の一掃は観察されなかった。従って、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の増殖は調和性があると結論付けられた。
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
いかなる特定の作用機序に限定されるものではないが、観察される菌株調和性の差異を説明するために、次のような１つの作用様式が提案される。試験した３つの菌株（即ち、ＲＴＩ３０１、ＲＴＩ４７２及びＲＴＩ４７７）のゲノム配列に基づき、これらの株は全て、拮抗化合物であるバシリシン、バシラエン、ジフィシジン及びバシロマイシンを産生することが予測された。しかしながら、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の両方はサブチロシンの合成のための遺伝子を有するが、この遺伝子はバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＲＴＩ４７２のゲノムには存在しない。サブチロシンは、類似又は密接に関連する細菌株の増殖を阻害するために細菌によって産生されるタンパク質性毒素の１種であるバクテリオシンである。従って、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１により合成されたサブチロシンは、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＲＴＩ４７２の増殖の阻害剤であり得ると仮定された。対照的に、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株は、ＲＴＩ４７７株が自身でサブチロシンを産生し、従って化合物に対して耐性であるため、ＲＴＩ３０１によって阻害されない。
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株とバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株との間の菌株形態の差異も分析した。これらの菌株の各々の形態を示す画像を、図４において、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１（図４Ａ）及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７（図４Ｂ）として示す。図４Ａ−図４Ｂにおいて示されるバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株のコロニー形態は、運動性となる場合の菌株の挙動における潜在的差異を示す。運動性は、植物関連細菌による根圏コロニー形成にとって重要な形質である。バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１は、輪郭のはっきりした円形のコロニーとして増殖する。対照的に、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７は、ふんわりとしたコロニーとして増殖し、スウォーミング及び運動性を示す形態である。スウォーミング及び運動性は、根圏及び植物根の表面の急速なコロニー形成について潜在的に重要な表現型である。また、いかなる特定の作用機序に限定されるものではないが、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株の形態に示唆される強いスウォーミングの表現型は、この株がバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１よりも根圏のより効率的なコロニーとなり得ることが仮定された。
【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
実施例８
相乗的植物成長促進特性をもたらすバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の組み合わせ
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株の栄養細胞を接種又は胞子を被覆した様々な植物種子について、種子の発芽並びに根の発達及び構造におけるプラスの効果を観察した。これは、例えばここでは上記の実施例６での小麦において記載されている。更に、大豆種子に対する発芽、根の発達及び構造、並びに早期植物成長及び／又は植物健康において、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の適用の効果を決定するために、実験を行った。ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の胞子を用いて次に記載するように実験を行った。実験では、菌株を１４Ｌ発酵槽中の２ＸＳＧ中に胞子形成させた。胞子は洗浄されずに回収され、その後、１．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬの濃度とされた。実験において胞子濃度を１０倍又はそれより大きく希釈した。滅菌濾紙を個々の滅菌プラスチック成長チャンバーの底に置き、６つの種子を各容器内に置いた。ＲＴＩ３０１又はＲＴＩ４７７の胞子の各希釈液３ｍＬを成長チャンバーに加え、これを密封し、１９℃で８日間インキュベートし、その後の苗木を画像化した。更に、１：３、１：１及び３：１の比率において添加されたＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の胞子の組み合わせも試験した。データを以下の表Ｖに示す。単独で適用した時、２つの菌株のいずれについても非接種のコントロールと比較して種子の発芽を阻害しなかった。
【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
１×１０６、１×１０７及び１×１０８の濃度におけるバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１での大豆種子の接種は、根の発達及び構造に影響を与えなかった。同様の濃度におけるバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７での大豆種子の接種は、最も低い濃度で根の発達及び構造においてほんのわずかな改善をもたらした。予想外に、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の両方の組み合わせ（比率１：３）での大豆種子の接種は、試験された全ての濃度において、根の発達に改善が生じた。ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の組み合わせ（比率１：１）での大豆種子の接種は、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ及び１×１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度で根の発達に改善をもたらし、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度で最も一貫した結果が観察された。根の発達における最良の結果は、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７を３：１の比率において１×１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度で適用した時に観察された。
【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
更に、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７の胞子（比率３：１）での種子の接種のプラスの効果の画像を、図５Ａ及び図５Ｂに示す（Ａ−コントロール植物；Ｂ−１０６ｃｆｕ／ｍｌにおいてＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７（比率３：１）で接種した植物）。図５Ａ−５Ｂに示すように、効果は根の形成及び構造に関して特にプラスとなっていた。細根は、水、栄養分の摂取及び根圏の他の微生物との植物相互作用において重要である。これらの結果は、個々の株の適用はコントロール植物と比較して全く又はほとんど効果を示さなかった一方で、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株の組み合わせの適用での種子処理は、大豆の早期成長及び樹立について有意な利益を有し得ることを示す。
【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
表Ｖ．ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の胞子での処理についての大豆種子発芽分析
【表５】
2018508471.tif 000003
＋＋＋非常に顕著な成長有益性有り、＋＋強い成長有益性有り、＋成長有益性有り、＋−弱い成長有益性有り、＝影響は観察されず、−弱い阻害有り、−−強い阻害有り、ｎ．ｄ．測定せず
【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
表ＶＩの結果は、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７のいずれか単独の接種は、ＣＨＥＭコントロール単独で処理した種子と比較した時、大豆の全体の平均収量に影響を及ぼさなかったことを示す。先の実験で観察されたように、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の組み合わせでの接種は相乗効果をもたらし、１０回の野外試験での平均において、大豆収量の５％増加の結果となった（エーカー当たり５８．２から６１．１ブッシェル、表ＶＩ参照）。特に、非接種野外試験（Ｎ＝２試験）の野外についてＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の組み合わせ＋化学コントロールでは化学コントロールよりもエーカー当たり３．７ブッシェルの収量利益が観察され、リゾクトニア（Rhizoctonia）を接種した試験（Ｎ＝４試験）について２つの菌株＋化学コントロールでは化学コントロールよりもエーカー当たり４．３ブッシェル増加しており、フザリウム（Fusarium）を接種した試験（Ｎ＝３試験）について２つの菌株＋化学コントロールでは化学コントロールよりもエーカー当たり１．５ブッシェル増加しており、フィトフトラ（Phytophthora）を接種した試験（Ｎ＝１試験）について２つの菌株＋化学コントロールでは化学コントロールよりもエーカー当たり１．０ブッシェル増加しており、このように、病害接種及び化学的殺真菌剤での種子処理とは無関係に収量応答が起こった。
【手続補正５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
表ＶＩ．バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び両方の株の組み合わせでの大豆種子の接種の平均結果
【表６】
2018508471.tif 000004
【手続補正６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
いかなる特定の作用機序に限定されるものではないが、大豆収量における２つの菌株の組み合わせで観察される相乗的結果の１つの説明は次の通りである。バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１は、密接に関連するバチルス（Bacillus）種を含む真菌及び細菌の両方の競合する菌株の増殖及び発育を阻害することができるサブチロシン等の広範な拮抗代謝物を産生する。そうすることによって、植物に単独で適用された時のＲＴＩ３０１株は、根圏においてその確立のためのニッチ／スペースを開くことができる。しかし、データは、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１について強い植物成長促進特性を支持していない。従って、ＲＴＩ３０１株が導入され根圏においてニッチを開いた後、定着され得るが、植物の成長及び／又は植物の健康を有意に促進することはできない。これは、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１単独での種子処理後の大豆について収量増加が観察されないことによって確認される。
【手続補正６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
対照的に、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７は、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１よりも狭い範囲の拮抗作用を有するように見え、従って、植物種子に単独で適用された時に定着するようにニッチを開くことにおいて低効率と予想され得る。結果として、その株はより簡単には大豆の根圏において確立され得ず、植物の成長に有益な効果をもたらし得ないことになる。これは、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７単独での種子処理後の大豆について収量増加が観察されないことによって確認される。
【手続補正６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７株の増殖は、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１と調和性を有することが実験により示されている。更に、ＲＴＩ４７７の表現型はこの株が強力なスウォーミング表現型であり得ることを示し、そのため、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１よりも根圏でのより効率的なコロニー形成種となることが仮説される。従って、両株の組み合わせは大豆における有益な効果を有することが期待できる。具体的には、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１が大豆の根圏内に確立のためのニッチを開いた後、そのスウォーミング表現型のためにバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７によって、菌株が外へと競合され（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅｄ）得る。ＲＴＩ４７７株は、その後、その植物宿主に有益な効果を提供することができる大豆の根圏内に自身を確立し得る。これは、両方の菌株の組み合わせでの植物種子の接種後に観察された大豆の収量増加によって確認された。
【手続補正６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
実施例９
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の胞子の組み合わせでの種子処理のコーンの収量増加
ＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株の組み合わせでの植物種子接種後の植物の成長、発達及び収量における効果を調べるために、更なる実験を行った。
【手続補正６４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
表ＶＩＩの結果は、ＣＨＥＭコントロール単独で処理した種子と比較した場合、ＣＨＥＭコントロール＋バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の１対１の組み合わせを接種すると、平均コーン収量を有意に増加させたことを示している。特に、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の１：１の組み合わせ＋化学コントロールは、化学コントロール単独よりも、自然病原体圧力及びリゾクトニア（Rhizoctonia）接種野外試験の各々について、エーカー当たり１０．７ブッシェル及びエーカー当たり５９．８ブッシェルの収量増加が観察された。これらのデータは、これらの株の組み合わせでの種子の処理が、コーン収量を有意に増強することを示す。
【手続補正６５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
表ＶＩＩ．自然の病気圧力及びリゾクトニア（Rhizoctonia）の人工接種の両方における条件下での、未処理のコーン種子（ＵＴＣ）、化学コントロールでの処理のコーン種子（ＣＣ）及びＣＣ＋バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の組み合わせでの処理のコーン種子についての収量増加。統計的関連性（文字としての）は、Ｐ＝０．１に基づく。
【表７】
2018508471.tif 000005
【手続補正６６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
実施例１０
リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を人工的に接種した大豆におけるバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の組み合わせでの種子処理による収量増加
病原体防除のために化学活性剤に加えてＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株の組み合わせで種子を処理した場合の大豆における出芽及び収量の効果を調べるために、実験を行った。具体的には、大豆における実験は次のように設定した。１）未処理の種子（ＵＴＣ）。２）典型的な大豆種子処理であるＣＲＵＩＳＥＲＭＡＸＸ（チアメトキサム、フルジオキソニル＋メタラキシル−Ｍを含む殺虫剤＋殺真菌剤；ＳＹＮＧＥＮＴＡ  ＣＲＯＰ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ，ＩＮＣ）及びチオファネートメチル殺真菌剤の組み合わせで処理した種子（ＣＲＵＩＳＥＲＭＡＸＸ及びチオファネートメチルの組み合わせは“ＣＨＥＭコントロール”として示す）。３）ＶＩＢＲＡＮＣＥ（活性成分セダキサン；ＳＹＮＧＥＮＴＡ  ＣＲＯＰ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ，ＩＮＣ）で処理した種子。４）ＣＨＥＭコントロール＋ＲＴＩ３０１株及びＲＴＩ４７７株を各々５．０×１０＋５ｃｆｕ／種子で処理した種子。１回の試験毎の１回の処理当たり４回反復して、ホワイトウォーター、ＷＩにおいて、２回の試験を実施した。試験は、オートクレーブ処理され湿らせた穀物種子に別々に病原体を最初に増殖させることによりリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を接種し、続いて乾燥させた接種材料を、種子が成長し始めた時に感染がなされるように所定の割合で植え付け時において種子と混合した。試験での平均大豆出芽及び収量の結果を、以下の表ＶＩＩＩに示す。表ＶＩＩＩの結果は、ＣＨＥＭコントロールに加えてバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の組み合わせで処理すると、化学活性剤単独の収量よりも、エーカー当たり１３．３ブッシェルの収量における平均増加をもたらすことを示す（エーカー当たり５９．４から７２．７ブッシェル）。従って、ＲＴＩ３０１及びＲＴＩ４７７の組み合わせでの種子処理は、重大な病原体圧力の条件下でさえも、大豆の収量において有意な改善をもたらすことができる。
【手続補正６７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
表ＶＩＩＩ．大豆種子用化学活性剤に加えてＢ．ベレゼンシス（B. velezensis）ＲＴＩ３０１及びＢ．サブチリス（B. subtilis）ＲＴＩ４７７の組み合わせでの大豆種子処理による、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を人工的に接種した植物での野外試験の大豆出芽及び収量における平均結果
【表８】
2018508471.tif 000006
【手続補正６８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
実施例１１
果実及び野菜におけるバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１分離株＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７分離株での点滴灌漑の効果
スカッシュ、トマト及びペッパーにおけるバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の胞子での点滴灌漑の効果を調べるために、野外試験実験を行った。土壌菌によって引き起こされる病害圧は、いずれの試験でも記録されなかった。植物収量における効果は、下記の実験に従って決定した。
【手続補正６９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
ペッパー植物（ジャラペノペッパー）では、植え付け時における根域のドレンチを介して、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の両方の株毎に１．２５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタールの割合で胞子を適用し、続いて移植後１７日及び３５日において同じ割合で２回滴下適用して、野外試験を実施した。ＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨ  ＬＭ（ＬＯＶＥＬＡＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）を商業用コントロールとして使用して、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７の組み合わせについて記載したのと同じ方法で２３４０ｍｌ／Ｈａの割合で適用した。この製品は、アシドボラックス・ファシリス（Acidovorax facilis）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・オレロニウス（Bacillus oleronius）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・マリヌス（Bacillus marinus）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）及びロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）（１×１０３ｃｆｕ／ｍｌ）の混合を含有する。
【手続補正７０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７胞子の添加は、細菌胞子が適用されていない未処理のコントロール植物と比較して、並びに商業用コントロール植物と比較して、ジャラペノペッパーについての収量の増加をもたらした。具体的には、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７で処理した植物は合計４１５４ｋｇ／Ｈａの市場性のあるジャラペノペッパーをもたらし、未処理のコントロール植物及びＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨで処理した植物について、各々の３４５５ｋｇ／Ｈａ及び３９３０ｋｇ／Ｈａで比較すると、市場性のあるペッパーの重量において各々２０％及び５．７％の増加を示す。未処理コントロール植物及び商業的基準で処理された植物に対する、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７胞子で処理した植物の市場性のあるペッパーの重量の実質的な増加は、この処理によりもたらされるプラスの成長効果を示している。
【手続補正７１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
トマト植物では、植え付け時における根域のドレンチを介して、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１については０．６２５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタール、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７については３．７５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタールの割合で胞子を適用して、続いて移植後１７日及び３５日において同じ割合で２回滴下適用して、同様の野外試験を実施した。ＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨ  ＬＭを商業用コントロールとして使用して、２３４０ｍｌ／Ｈａの割合でＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７の組み合わせについて記載したのと同じ方法で適用した。
【手続補正７２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７胞子の添加は、細菌胞子がドレンチ及び灌漑に含まれていない未処理のコントロール植物と比較して、並びに商業用コントロール植物と比較して、トマトについての総収量及び市場性収量の両方において増加をもたらした。具体的には、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７で処理した植物は合計２１８２４ｋｇ／Ｈａの市場性のあるトマトをもたらし、未処理のコントロール植物及びＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨで処理した植物について、各々の１６７６５ｋｇ／Ｈａ及び２１４２０ｋｇ／Ｈａで比較すると、市場性のあるトマトの重量において各々３０．２％及び１．９％の増加を示す。バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７胞子で処理した植物の市場性のあるトマト重量の実質的な増加は、特に未処理のコントロール植物と比較して、この処理によりもたらされるプラスの成長効果を示している。
【手続補正７３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
スカッシュ植物では、植え付け時に根域のドレンチを介して、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１については３．７５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタール、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７については０．６２５×１０１２ＣＦＵ／ヘクタールの割合で胞子を適用して、点滴灌漑による更なる適用をすることなく、同様の野外試験を実施した。ＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨ  ＬＭを商業用コントロールとして使用して、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７の組み合わせについて記載したのと同じ方法で２３４０ｍｌ／Ｈａの割合で適用した。
【手続補正７４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７胞子の添加は、細菌胞子がドレンチに含まれていない未処理のコントロール植物と比較して、並びに商業用コントロール植物と比較して、スカッシュについての総収量及び市場性収量の両方において増加をもたらした。具体的には、ＲＴＩ３０１＋ＲＴＩ４７７で処理した植物は合計８７３．４ｋｇ／Ｈａのスカッシュをもたらし、未処理のコントロール植物及びＡＣＣＯＭＰＬＩＳＨで処理した植物について、各々の８３８．３ｋｇ／Ｈａ及び８３６．１ｋｇ／Ｈａで比較すると、総スカッシュの重量において各々４．２％及び４．５％の増加を示す。未処理コントロール植物及び商業的基準で処理された植物に対する、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１＋バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７胞子で処理した植物の総スカッシュ重量の増加は、この処理によってもたらされるプラスの成長効果を示している。
【手続補正７５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
実施例１２
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７分離株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１分離株により産生される新しい代謝物の同定
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）を含む微生物種によって５種類のフェンギシン型代謝物及びデヒドロキシフェンギシン型代謝物が産生されることがこれまでに報告されている（例えば、Li, Xing-Yuら、２０１３年、J. Microbiol. Biotechnol. 23（3）, 313-321頁；Pecci Yら、２０１０年、Mass Spectrom., 45（7）：772-77頁参照）。これらの代謝物は、脂肪酸基も含む環状ペプチド分子である。５種類のフェンギシン型及びデヒドロキシフェンギシン型代謝物は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＳと示される。これらの代謝物の骨格構造並びに５種類のそれぞれについての特定のアミノ酸配列を図６に示す。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）において、フェンギシン型化合物はプリパスタチンと示される。プリパスタチンＡ及びＢは分子量がフェンギシンＡ及びＢと同様であり、ペプチド環の３位のチロシン残基がフェンギシンではＤ体及びプリパスタチンではＬ体であり、ペプチド環の９位のチロシン残基がフェンギシンではＬ体及びプリパスタチンではＤ体であるという側面が異なるのみである（Marc Ongena and Philippe Jacques、２００７年、Trends in Microbiology Vol.16, No.3: 115-125頁）。本明細書及び特許請求の範囲では、用語“フェンギシン”は、プリパスタチン代謝物及びフェンギシン代謝物の両方を指すように使用される。同様に、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために、用語“デヒドロキシフェンギシン”は、デヒドロキシプリパスタチン代謝物及びデヒドロキシフェンギシン代謝物の両方を指すように使用される。
【手続補正７６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１により産生されるフェンギシン型及びデヒドロキシフェンギシン型代謝物を、ＵＨＰＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて分析した。３０℃で８６９培地又は２×ＳＧ培地で６日間増殖させた後のこれらの株により産生されるこれらの代謝物の分子量を、フェンギシン型及びデヒドロキシフェンギシン型代謝物について予想される理論的分子量と比較した。更に、これらの株により産生される種々のフェンギシン型代謝物のアミノ酸組成を決定するために、ＵＨＰＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳを介して従来に同定されたフェンギシン型代謝物の各々について、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳを用いたペプチド配列決定を行った。このようにして、これらの株がフェンギシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＳ、並びにデヒドロキシフェンギシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＳを産生することが決定された。驚くべきことに、これらの既知の化合物に加えて、これらの株は従来に同定されていないこれらの化合物の誘導体を産生することも決定された。
【手続補正７７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
例えば、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１株は、環状ペプチド鎖の８位のＬ−イソロイシン（図６においてＸ３として示す）がＬ−メチオニンで置換されたフェンギシン様及びデヒドロキシフェンギシン様化合物を産生することが判明した。新しい種類のフェンギシン及びデヒドロキシフェンギシンは、ここではＭＡ、ＭＢ及びＭＣとして示され、図６のＸ３のＬ−イソロイシンがＬ−メチオニンで置換されたＡ、Ｂ及びＣの種類の誘導体で示される。新たに同定された分子を、図６及び以下の表ＩＸに示す。新しく同定されたフェンギシンＭＡ、ＭＢ及びＭＣ化合物はＲＴＩ４７７株でも観察されたが、対応するデヒドロキシフェンギシンＭＡ、ＭＢ及びＭＣ化合物はＲＴＩ４７７株では観察されなかった（表ＩＸ）。
【手続補正７８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
従来に報告されたフェンギシン型及びデヒドロキシフェンギシン型代謝物と新たに同定された代謝物についてのアミノ酸配列の要約を以下の表ＩＸに示す。
表ＩＸ．バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７分離株及びバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１分離株のフェンギシン型代謝物のＭＳ／ＭＳ同定の概要
【表９】
2018508471.tif 000007
【手続補正７９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
（付記）
（付記１）
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物であって、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、を含み、
前記植物の種子、前記植物の根又は前記植物の周囲の土壌への当該組成物の適用は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす、
組成物。
【手続補正８０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
（付記４）
前記組成物は、液体の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
付記１に記載の組成物。
【手続補正８１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
（付記５）
前記組成物は、粉剤、乾燥水和性粉末剤、展延性粒剤又は乾燥水和性粒剤の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｇから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｇの量で存在する、
付記１に記載の組成物。
【手続補正８２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
（付記６）
前記組成物は、油分散体の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
付記１に記載の組成物。
【手続補正８３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
（付記７）
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、胞子又は栄養細胞の形態で存在する、付記１に記載の組成物。
【手続補正８４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
（付記１７）
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物で被覆された植物種子であって、
前記組成物は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、を含む、
植物種子。
【手続補正８５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
（付記２１）
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０２ＣＦＵ／種子から約１．０×１０９ＣＦＵ／種子の範囲の量で存在する、付記１７に記載の植物種子。
【手続補正８６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
（付記２６）
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法であって、
当該方法は、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、
を含む組成物を、植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌に送達することを含み、
前記組成物の送達は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす、
方法。
【手続補正８７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
（付記３１）
前記組成物は、液体の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
付記２６に記載の方法。
【手続補正８８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
（付記３２）
前記組成物は、粉剤、乾燥水和性粉末剤、展延性粒剤又は乾燥水和性粒剤の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｇから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｇの量で存在する、
付記２６に記載の方法。
【手続補正８９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
（付記３３）
前記組成物は、油分散体の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
付記２６に記載の方法。
【手続補正９０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
（付記３４）
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１は、胞子又は栄養細胞の形態で存在する、付記２６に記載の方法。
【手続補正９１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
（付記４４）
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法であって、
当該方法は、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第１の組成物、及び、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第２の組成物、
の組み合わせを、植物の種子、植物の根又は植物の周囲の土壌に送達することを含み、
前記組み合わせの送達は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらす、
方法。
【手続補正９２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
（付記４９）
前記第１の組成物及び前記第２の組成物は、液体の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
付記４４に記載の方法。
【手続補正９３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
（付記５０）
前記第１の組成物及び前記第２の組成物は、粉剤、乾燥水和性粉末剤、展延性粒剤又は乾燥水和性粒剤の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｇから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｇの量で存在する、
付記４４に記載の方法。
【手続補正９４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
（付記５１）
前記第１の組成物及び前記第２の組成物は、油分散体の形態であり、
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
付記４４に記載の方法。
【手続補正９５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
（付記５２）
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、胞子又は栄養細胞の形態で存在する、付記４４に記載の方法。
【手続補正９６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
（付記６２）
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための方法であって、当該方法は、
適切な成長培地中に植物の種子を植え付けることを含み、
前記種子は、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、
を含む組成物で被覆されており、
前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及び前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７は、植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすのに適切な量で存在する、
方法。
【手続補正９７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
（付記６８）
前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７及び前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１の各々は、約１．０×１０２ＣＦＵ／種子から約１．０×１０９ＣＦＵ／種子の範囲の量で存在する、付記６２に記載の方法。
【手続補正９８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
（付記７１）
植物の成長に利益をもたらすための組成物であって、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、
ビフェントリン殺虫剤、を含む、
組成物。
【手続補正９９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２４】
（付記７２）
植物の成長に利益をもたらすための組成物であって、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、
ビフェントリン殺虫剤、を含み、
当該組成物は、液体肥料と相溶性を有する製剤中にある、
組成物。
【手続補正１００】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
（付記７６）
植物の成長に利益をもたらすための組成物であって、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、
ルピナス・アルブス・ドーセ（Lupinus albus doce）由来の抽出物、ＢＬＡＤポリペプチド又はＢＬＡＤポリペプチドの断片のうちの１つ又は組み合わせを含む殺真菌剤、を含む、
組成物。
【手続補正１０１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
（付記７８）
植物の成長及び／又は植物の健康に利益をもたらすための組成物で被覆された植物種子であって、
前記組成物は、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物の胞子、及び、
ビフェントリン殺虫剤、を含む、
植物種子。
【手続補正１０２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
（付記７９）
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６５として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物、及び、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２１１６７として寄託されたバチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）（Bacillus amyloliquefaciens）ＲＴＩ４７７又はその全ての同定特徴を有するその突然変異体の生物学的に純粋な培養物を含む第１の組成物、
微生物学的、生物学的又は化学的な、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺細菌剤、除草剤、植物抽出物、植物成長調整剤又は肥料のうちの１つ又は組み合わせを含む第２の組成物、並びに、
植物の枝葉、植物の樹皮、植物の果実、植物の花、植物の種子、植物の根、植物の切断片、植物の移植片、植物のカルス組織、植物の周囲の土壌若しくは成長培地、土壌若しくは成長培地中に植物の種子を播種する前の土壌若しくは成長培地、又は、土壌若しくは成長培地中に植物、植物切断片、植物移植片若しくは植物カルス組織を植え付ける前の土壌若しくは成長培地に、前記第１の組成物及び前記第２の組成物の組み合わせを、植物の成長に利益をもたらすのに適切な量で送達するための説明書、を含み、
前記第１の組成物及び前記第２の組成物は、別々に包装されている、
製品。
【手続補正１０３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
（付記８５）
前記第１の組成物は、液体の形態であり、
前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及び前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
付記７９に記載の製品。
【手続補正１０４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
（付記８６）
前記第１の組成物は、粉剤、乾燥水和性粉末剤、展延性粒剤又は乾燥水和性粒剤の形態であり、
前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及び前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｇから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｇの量で存在する、
付記７９に記載の製品。
【手続補正１０５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
（付記８７）
前記第１の組成物は、油分散液の形態であり、
前記バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）ＲＴＩ３０１及び前記バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＲＴＩ４７７の各々は、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌから約１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、
付記７９に記載の製品。
【手続補正１０６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2018508471000001.app
【手続補正１０７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2018508471.tif 000008