(57)【要約】本発明は、迅速かつ簡便でしかも精確な、莢膜ｂ型以外の各有莢膜型インフルエンザ菌の検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キットを提供する。  本発明の莢膜ａ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆ型のインフルエンザ菌の検出方法は、それぞれ、莢膜ａ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆ型のインフルエンザ菌に由来する莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
莢膜ａ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項２】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号２７で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＬＡＭＰプライマーセットが、さらにループプライマーとしてＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーを含むものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＦＩＰプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３２１６番目から第３２８８番目の領域から設計されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
ＢＩＰプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３３０５番目から第３３８７番目の領域から設計されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
Ｆ３プライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３１９７番目から第３２１４番目の領域から設計されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項７】
Ｂ３プライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３４０８番目から第３４２９番目の領域から設計されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項８】
ＬＦプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３２３９番目から第３２６３番目の領域から設計されるものである、請求項３記載の方法。
【請求項９】
ＬＢプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３３４０番目から第３３６４番目、又は第３３３９番目から第３３６２番目の領域から設計されるものである、請求項３記載の方法。
【請求項１０】
ＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号７で表される塩基配列の組み合わせ
【請求項１１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号７で表される塩基配列の組み合わせ
【請求項１２】
請求項１１記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項１３】
莢膜ｃ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項１４】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号２９で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＦＩＰプライマーは、配列番号２９で表される塩基配列のうち第６４番目から第１４０番目の領域から設計されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＢＩＰプライマーは、配列番号２９で表される塩基配列のうち第１４１番目から第２１９番目の領域から設計されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
Ｆ３プライマーは、配列番号２９で表される塩基配列のうち第４２番目から第６１番目の領域から設計されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
Ｂ３プライマーは、配列番号２９で表される塩基配列のうち第２２９番目から第２５２番目の領域から設計されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
ＬＡＭＰプライマーセットが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列の組み合わせである、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項２１】
請求項２０記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項２２】
莢膜ｄ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一または相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項２３】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３０で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーＦ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＦＩＰプライマーは、配列番号３０で表される塩基配列のうち第３４６番目から第４１０番目の領域から設計されるものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＢＩＰプライマーは、配列番号３０で表される塩基配列のうち第４４５番目から第５１９番目の領域から設計されるものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
Ｆ３プライマーは、配列番号３０で表される塩基配列のうち第３２０番目から第３４２番目の領域から設計されるものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
Ｂ３プライマーは、配列番号３０で表される塩基配列のうち第５２７番目から第５５０番目の領域から設計されるものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
ＬＡＭＰプライマーセットが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で表される塩基配列の組み合わせである、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で表される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項３０】
請求項２９記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項３１】
莢膜ｅ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項３２】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３１で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ＦＩＰプライマーは、配列番号３１で表される塩基配列のうち第６０８番目から第６６７番目の領域から設計されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ＢＩＰプライマーは、配列番号３１で表される塩基配列のうち第６８７番目から第７７０番目の領域から設計されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
Ｆ３プライマーは、配列番号３１で表される塩基配列のうち第５８２番目から第５９９番目の領域から設計されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
Ｂ３プライマーは、配列番号３１で表される塩基配列のうち第７８１番目から第７９８番目の領域から設計されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
ＬＡＭＰプライマーセットが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される塩基配列の組み合わせである、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項３９】
請求項３８記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項４０】
莢膜ｆ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項４１】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３３で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
ＬＡＭＰプライマーセットが、さらにループプライマーとしてＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーを含むものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＦＩＰプライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２０８６番目から第１２１６９番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
ＢＩＰプライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２１８４番目から第１２２６６番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
Ｆ３プライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２０６３番目から第１２０８４番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
Ｂ３プライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２２８１番目から第１２３０４番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
ＬＦプライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２１１６番目から第１２１３９番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
ＬＢプライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２２１０番目から第１２２３４番目、又は第１２１１７番目から第１２１３９番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
ＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせである、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２６で表される塩基配列の組み合わせ
【請求項５０】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
（ａ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２６で表される塩基配列の組み合わせ
【請求項５１】
請求項５０記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有莢膜型インフルエンザ菌の検出方法に関する。詳しくは、莢膜ｂ型以外（莢膜ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ型）の各有莢膜型インフルエンザ菌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；以下「Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ」と略すこともある。）は、中耳炎、肺炎、髄膜炎及び菌血症などの原因菌の一つであり、近年様々な耐性菌が出現して問題となっている。このインフルエンザ菌には、有莢膜型と無莢膜型が存在し、有莢膜型は莢膜の相違によってさらに莢膜ａ〜ｆ型に分類される。
従来、このようなインフルエンザ菌の型別法としては、培養法と生化学的検査との併用によりインフルエンザ菌と認められる菌株を選択し、その後、この菌株に対してスライド凝集法などの血清学的方法により莢膜の型別を行うのが一般的であった。しかし、培養法及び生化学的検査においては、感染が判明するまでに３日以上を要することに加え、コロニーの形状や色の相違などから精確にインフルエンザ菌を選別するためには熟練した技術が必要であった。また、その後の血清学的方法では、交差反応や自己凝集などにより非感染を陽性と誤診断したり、あるいは検出感度の低さから感染を陰性と誤診断してしまうことがあった。そのため、確度が不十分な型別結果しか得られず、臨床診断及びその後の処置等に支障をきたすおそれがあった。
このような問題に鑑み、近年においては、分子生物学的手法としてのＰＣＲ法を利用した型別法が知られている（Ｔ．Ｊ．Ｆａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４  Ｏｃｔ，３２（１０），ｐ．２３８２−２３８６）。しかし、通常、ＰＣＲ法による型別法は、コスト、手技及び時間を要し、さらにサーマルサイクラー等の特別な設備が必要なため、人材や設備が不十分な病院の検査室等では容易に実施することができない。また、この方法（Ｔ．Ｊ．Ｆａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４  Ｏｃｔ，３２（１０），ｐ．２３８２−２３８６）では、３種類のプライマーを用いて２回のＰＣＲを行わなければならず、煩雑であり迅速性に欠けるものであった。
インフルエンザ菌には、前述の通り、無莢膜型及び複数の有莢膜型が存在し、これらの中でも有莢膜型インフルエンザ菌が、特に小児において髄膜炎、喉頭蓋炎、菌血症及び肺炎等の深刻な病気をもたらす病原の１つとなっている。また、各莢膜型間においてもその病原性及び発症後の重篤度については微妙な相違が存在し、このため、臨床現場においては感染の早期発見という本来の目的に加えて、ワクチン接種後の効果の確認という要請からも、簡便で感度に優れた莢膜型インフルエンザ菌の型別法が求められている。さらに、開発途上国においても、インフルエンザ菌感染症モニタリングやワクチン応用等の観点から、簡便かつ迅速に行える型別法が求められている。従って、当該型別法に対する社会的要請度はきわめて高いと言える。
ところで、ＰＣＲ法以外の分子生物学的手法の一つとして、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法が知られている（Ｋ．Ｎａｇａｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，２００２  Ｊｕｎ，１６（３），ｐ．２２３−２２９；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３）。ＬＡＭＰ法では、偶然による非特異的な相補鎖合成に伴う増幅反応を効果的に防止し、かつ、高効率の増幅メカニズムを実現するために、標的ＤＮＡ中から選択した６箇所（最大８箇所）の領域に基づく少なくとも４種（最大６種）ものプライマー（ＬＡＭＰプライマーセット）が厳密に設計される必要がある。
【発明の開示】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、迅速かつ簡便でしかも精確な、莢膜ｂ型以外（莢膜ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ型）の各有莢膜型インフルエンザ菌の検出方法、各有莢膜型インフルエンザ菌検出用プライマーセット、及び各有莢膜型インフルエンザ菌検出用キットを提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ＰＣＲ法による増幅反応よりも特異性に優れ、かつ迅速性および簡便性の高いＬＡＭＰ法に着目し、各有莢膜型インフルエンザ菌をそれぞれ特異的に型別し得るＬＡＭＰプライマーセットを設計し使用すれば、前述した課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１Ａ）莢膜ａ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出方法。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号２７で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものが挙げられる。また、上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、さらにループプライマーとしてＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーを含むものが挙げられる。
上記ＦＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３２１６番目から第３２８８番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＢＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３３０５番目から第３３８７番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｆ３プライマーとしては、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３１９７番目から第３２１４番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｂ３プライマーとしては、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３４０８番目から第３４２９番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＬＦプライマーとしては、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３２３９番目から第３２６３番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＬＢプライマーとしては、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３３４０番目から第３３６４番目、又は第３３３９番目から第３３６２番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせのものが挙げられる。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号７で表される塩基配列の組み合わせ
（２Ａ）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号７で表される塩基配列の組み合わせ
（３Ａ）上記（２Ａ）に記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出用キット。
（１Ｂ）莢膜ｃ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出方法。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号２９で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものが挙げられる。
上記ＦＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号２９で表される塩基配列のうち第６４番目から第１４０番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＢＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号２９で表される塩基配列のうち第１４１番目から第２１９番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｆ３プライマーとしては、例えば、配列番号２９で表される塩基配列のうち第４２番目から第６１番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｂ３プライマーとしては、例えば、配列番号２９で表される塩基配列のうち第２２９番目から第２５２番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列の組み合わせのものが挙げられる。
（２Ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
（３Ｂ）上記（２Ｂ）に記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出用キット。
（１Ｃ）莢膜ｄ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出方法。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３０で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものが挙げられる。
上記ＦＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号３０で表される塩基配列のうち第３４６番目から第４１０番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＢＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号３０で表される塩基配列のうち第４４５番目から第５１９番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｆ３プライマーとしては、例えば、配列番号３０で表される塩基配列のうち第３２０番目から第３４２番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｂ３プライマーとしては、例えば、配列番号３０で表される塩基配列のうち第５２７番目から第５５０番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で表される塩基配列の組み合わせのものが挙げられる。
（２Ｃ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で表される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
（３Ｃ）上記（２Ｃ）に記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出用キット。
（１Ｄ）莢膜ｅ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出方法。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３１で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものが挙げられる。
上記ＦＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号３１で表される塩基配列のうち第６０８番目から第６６７番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＢＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号３１で表される塩基配列のうち第６８７番目から第７７０番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｆ３プライマーとしては、例えば、配列番号３１で表される塩基配列のうち第５８２番目から第５９９番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｂ３プライマーとしては、例えば、配列番号３１で表される塩基配列のうち第７８１番目から第７９８番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される塩基配列の組み合わせのものが挙げられる。
（２Ｄ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
（３Ｄ）上記（２Ｄ）に記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出用キット。
（１Ｅ）莢膜ｆ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出方法。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３３で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものが挙げられる。また、上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、さらにループプライマーとしてＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーを含むものが挙げられる。
上記ＦＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２０８６番目から第１２１６９番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＢＩＰプライマーとしては、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２１８４番目から第１２２６６番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｆ３プライマーとしては、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２０６３番目から第１２０８４番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記Ｂ３プライマーとしては、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２２８１番目から第１２３０４番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＬＦプライマーとしては、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２１１６番目から第１２１３９番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＬＢプライマーとしては、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２２１０番目から第１２２３４番目、又は第１２１１７番目から第１２１３９番目の領域から設計されるものが挙げられる。
上記ＬＡＭＰプライマーセットとしては、例えば、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせのものが挙げられる。
（ａ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２６で表される塩基配列の組み合わせ
（２Ｅ）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
（ａ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２６で表される塩基配列の組み合わせ
（３Ｅ）上記（２Ｅ）に記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出用キット
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、莢膜ａ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例（配列番号２７）の一部（配列番号２８）、及び、本発明の第１態様における各ＬＡＭＰプライマーの設計のための標的領域の一例を示す図である。
図２は、莢膜ｃ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例（配列番号２９）、及び、本発明の第２態様における各ＬＡＭＰプライマーの設計のための標的領域の一例を示す図である。
図３は、莢膜ｄ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例（配列番号３０）、及び、本発明の第３態様における各ＬＡＭＰプライマーの設計のための標的領域の一例を示す図である。
図４は、莢膜ｅ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例（配列番号３１）の一部（配列番号３２）、及び、本発明の第４態様における各ＬＡＭＰプライマーの設計のための標的領域の一例を示す図である。
図５は、莢膜ｆ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例（配列番号３３）の一部（配列番号３４）、及び、本発明の第５態様における各ＬＡＭＰプライマーの設計のための標的領域の一例を示す図である。
図６は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＡ１を使用した場合のリアルタイム濁度測定の結果を示す図である。
図７は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＡ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と、当初鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示すグラフである。
図８は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＣ１を使用した場合のリアルタイム濁度測定の結果を示す図である。
図９は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＣ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と、当初鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示すグラフである。
図１０は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＤ１を使用した場合のリアルタイム濁度測定の結果を示す図である。
図１１は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＤ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と、当初鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示すグラフである。
図１２は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＥ１を使用した場合のリアルタイム濁度測定の結果を示す図である。
図１３は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＥ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と、当初鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示すグラフである。
図１４は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＦ１を使用した場合のリアルタイム濁度測定の結果を示す図である。
図１５は、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＦ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と、当初鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００６−１１６１０４号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
本発明は、莢膜ｂ型以外（莢膜ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ型）の有莢膜型インフルエンザ菌由来の染色体ＤＮＡにおける、各莢膜型に特異的な塩基配列領域に着目してＬＡＭＰプライマーセットを設計することにより、莢膜ｂ型以外のインフルエンザ菌をそれぞれ特異的に検出する（型別する）ことを可能としたものである。ここで、「ＬＡＭＰプライマーセット」とは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅に用いられる少なくとも４種（最大６種）のプライマーのセットを意味する（本明細書において同様）。
ＬＡＭＰプライマーセットは、各莢膜型に特異的な塩基配列領域中における異なる６領域（５’末端側から順にＦ３，Ｆ２，Ｆ１，Ｂ１ｃ，Ｂ２ｃ，Ｂ３ｃ）及びこれに相補的な領域（５’末端側から順にＢ３，Ｂ２，Ｂ１，Ｆ１ｃ，Ｆ２ｃ，Ｆ３ｃ）から設計されるプライマーを組み合わせて構成される。具体的には、ＬＡＭＰプライマーセットは、各莢膜型に特異的な塩基配列領域の５’末端側から、Ｆ１ｃ領域及びＦ２領域のヌクレオチドを連結してなるＦｏｒｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＦＩＰ」と略すこともある。）と、５’末端側からＢ１ｃ領域及びＢ２領域のヌクレオチドを連結してなるＢａｃｋｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＢＩＰ」と略すこともある。）と、Ｆ３領域のヌクレオチドからなるＦ３プライマーと、Ｂ３領域のヌクレオチドからなるＢ３プライマーとを組み合わせてなるものである。なお、所望によりさらにループプライマーを設計し、これらを用いてＤＮＡの増幅を行い、増幅産物を検出してもよい。ループプライマーを使用すると、検出までの時間をさらに短縮することが可能であるため、より一層検出の効率化を図ることができる。ループプライマーとしては、Ｆ１ｃ領域及びＦ２ｃ領域の間の領域のヌクレオチドからなるＬｏｏｐ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｏｒｗａｒｄ（以下、「ＬＦ」と略すこともある。）と、Ｂ２領域及びＢ１領域の間の領域のヌクレオチドからなるＬｏｏｐ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂａｃｋｗａｒｄ（以下、「ＬＢ」と略すこともある。）が使用できる。
ＬＡＭＰ法では、酵素活性を維持し得る一定温度のままインキュベートするだけで、増幅反応を進行させることが可能である。このため、ＰＣＲ法で必要となる各温度調節のための設備が不要であり、低コストでかつ簡便に検出を行うことができるとともに、温度変化に伴う時間ロスもないので迅速に検出が可能である。
２．各莢膜型のインフルエンザ菌の検出
（１）莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出
本発明の第１の態様においては、莢膜ａ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域に着目してＬＡＭＰプライマーセットを設計することにより、莢膜ａ型インフルエンザ菌を特異的に検出することができる。
莢膜ａ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例を、図１及び配列番号２７に示す。ここで、当該塩基配列領域は、莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の全部に対応する領域であってもよいし、一部に対応する領域であってもよく、限定はされない。なお、図１では、配列番号２７で表される塩基配列中の一部（第３００１番目〜第３６００番目）の塩基配列（配列番号２８）のみを示す。配列番号２７の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）においてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ（アクセッション番号）：Ｚ３７５１６として公表されている。
図１中、「番号」と付された行は塩基の位置を表し、具体的には、各行に一つ記載された数字が、直下の塩基の行の塩基配列の一番右端の塩基の位置を示す。「プライマー」と付された行はＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ及びＬＢプライマーを設計するための標的領域の位置の一例を示す。また、「塩基」と付された行は、配列表での表示方法と同様に、塩基配列を左側から右側に向かって５’→３’方向となるように示しており、各行の右端の塩基はその一段下の塩基配列の行の左端の塩基につながる。なお、図１の「プライマー」行中の矢印は、プライマーの塩基配列の５’→３’方向を示す。従って、左向きの矢印で領域指定している場合は、当該領域の塩基配列に相補的な配列がプライマーの塩基配列に含まれることを示し、右向きの矢印で領域指定している場合は、当該領域の塩基配列がプライマーの塩基配列に含まれることを示す。図１に関するこれらの定義説明は、本発明の第２〜５の態様において例示する図２〜５においても同様である。
本発明の第１態様では、ＬＡＭＰプライマーセットのうち少なくとも１種（好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも４種、さらに好ましくは６種）のＬＡＭＰプライマーが、上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の一部の配列（部分配列）と同一又は相補的な塩基配列からなっている。本発明の第１態様においては、さらに、ＬＡＭＰプライマーセットが、上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号２７で表される塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものであることが好ましく、より好ましくは、配列番号２７で表される塩基配列中の第３００１番目〜第３６００番目の塩基配列領域、特に好ましくは、配列番号２７で表される塩基配列中の第３１００番目〜第３５００番目の塩基配列領域、最も好ましくは、配列番号２７で表される塩基配列中の第３１９７番目〜第３４２９番目の塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものである。このようなＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合には、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出において、特異性に優れるのみでなく、検出感度及び検出の迅速性に優れると共に、さらに、増幅曲線に線形性が認められ、定量性も良好となる。
本発明の第１態様において、ＦＩＰプライマーは、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３２１６番目から第３２８８番目（以下、「３２１６−３２８８」のように表示することもある。他のプライマーについても同様。）の領域から設計することができ、その内訳は、例えばＦ２として３２１６−３２３８の領域（Ｆ２ｃはその相補鎖領域）、Ｆ１として３２６７−３２８８の領域（Ｆ１ｃはその相補鎖領域）から設計したもの（配列番号１）が好ましい。
ＢＩＰプライマーは、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち３３０５−３３８７の領域から設計することができ、その内訳は、例えばＢ１ｃとして３３０５−３３２７（Ｂ１の３３０５−３３２７の相補鎖）、Ｂ２として３３６５−３３８７の領域から設計したもの（配列番号２）が好ましい。
Ｆ３プライマーは、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち３１９７−３２１４の領域から設計したもの（配列番号３）が好ましく、Ｂ３プライマーは、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち３４０８−３４２９の領域から設計したもの（配列番号４）が好ましい。
本発明においては、さらにループプライマーを使用することもできる。
ＬＦプライマーは、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち３２３９−３２６３の領域から設計したもの（配列番号５）が好ましく、ＬＢプライマーは、例えば、配列番号２７で表される塩基配列のうち３３４０−３３６４の領域から設計したもの（配列番号６）が好ましい。また、ＬＢプライマーとしては、配列番号２７で表される塩基配列のうち３３３９−３３６２の領域から設計したもの（配列番号７）を使用することもできる。
ここで、上述した配列番号１〜６で表される塩基配列のプライマーから構成されるＬＡＭＰプライマーセット（以下、ＨｉＡ１と称することがある。）について、各プライマーの塩基配列を表１に示す。なお、配列番号６で表される塩基配列のＬＢプライマーと同様に使用できる、配列番号７で表される塩基配列のＬＢプライマーについても、表１に併記した。さらに、これら各プライマーを設計するために選択した８箇所の標的領域（Ｆ１，Ｆ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｆ３，Ｂ３，ＬＦ，ＬＢ）の位置を、表２Ａ及び表２Ｂに示す。
【表１】
2007123265.tif 000002
【表２Ａ】
2007123265.tif 000003
【表２Ｂ】
2007123265.tif 000004
（２）莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出
本発明の第２の態様においては、莢膜ｃ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域に着目してＬＡＭＰプライマーセットを設計することにより、莢膜ｃ型インフルエンザ菌を特異的に検出することができる。
莢膜ｃ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例を、図２及び配列番号２９に示す。ここで、当該塩基配列領域は、莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の全部に対応する領域であってもよいし、一部に対応する領域であってもよく、限定はされない。なお、配列番号２９で表される塩基配列領域は、莢膜ｃ型インフルエンザ菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎＢａｎｋに公表されている公知のＰＣＲプライマー（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ（アクセッション番号）：Ｚ３３３８７、Ｚ３３３８８）を用いてＰＣＲにより得られた増幅産物をシークエンスして得られた塩基配列に基づく領域である。
本発明の第２態様では、ＬＡＭＰプライマーセットのうち少なくとも１種（好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも４種）のＬＡＭＰプライマーが、上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の一部の配列と同一又は相補的な塩基配列からなっている。本発明の第２態様においては、さらに、ＬＡＭＰプライマーセットが、上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号２９で表される塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものであることが好ましく、より好ましくは、配列番号２９で表される塩基配列中の第５番目〜第２８０番目の塩基配列領域、特に好ましくは、配列番号２９で表される塩基配列中の第３０番目〜第２７０番目の塩基配列領域、最も好ましくは、配列番号２９で表される塩基配列中の第４２番目〜第２５２番目の塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものである。このようなＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合には、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出において、特異性に優れるのみでなく、検出感度及び検出の迅速性に優れると共に、さらに、増幅曲線に線形性が認められ、定量性も良好となる。
本発明の第２態様において、ＦＩＰプライマーは、例えば、配列番号２９で表される塩基配列のうち６４−１４０の領域から設計することができ、その内訳は、例えばＦ２として６４−８８の領域（Ｆ２ｃはその相補鎖領域）、Ｆ１として１１８−１４０の領域（Ｆ１ｃはその相補鎖領域）から設計したもの（配列番号８）が好ましい。
ＢＩＰプライマーは、例えば、配列番号２９で表される塩基配列のうち１４１−２１９の領域から設計することができ、その内訳は、例えばＢ１ｃとして１４１−１６５（Ｂ１の１４１−１６５の相補鎖）、Ｂ２として１９５−２１９の領域から設計したもの（配列番号９）が好ましい。
Ｆ３プライマーは、例えば、配列番号２９で表される塩基配列のうち４２−６１の領域から設計したもの（配列番号１０）が好ましく、Ｂ３プライマーは、例えば、配列番号２９で表される塩基配列のうち２２９−２５２の領域から設計したもの（配列番号１１）が好ましい。
本発明においては、さらにループプライマーとしてＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーを設計して使用してもよい。
ここで、上述した配列番号８〜１１で表される各プライマーから構成されるＬＡＭＰプライマーセット（以下、ＨｉＣ１と称することがある。）について、各プライマーの塩基配列を表３に示す。また、これら各プライマーを設計するために選択した６箇所の標的領域（Ｆ１，Ｆ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｆ３，Ｂ３）の位置を、表４に示す。
【表３】
2007123265.tif 000005
【表４】
2007123265.tif 000006
（３）莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出
本発明の第３の態様においては、莢膜ｄ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域に着目してＬＡＭＰプライマーセットを設計することにより、莢膜ｄ型インフルエンザ菌を特異的に検出することができる。
莢膜ｄ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例を、図３及び配列番号３０に示す。ここで、当該塩基配列領域は、莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の全部に対応する領域であってもよいし、一部に対応する領域であってもよく、限定はされない。なお、配列番号３０で表される塩基配列領域中、第４９１番目〜第６４５番目の塩基配列領域については、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ（アクセッション番号）：Ｚ３３３８９として公表されている。
本発明の第３の態様では、ＬＡＭＰプライマーセットのうち少なくとも１種（好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも４種）のＬＡＭＰプライマーが、上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の一部の配列と同一又は相補的な塩基配列からなっている。本発明の第３の態様においては、さらに、ＬＡＭＰプライマーセットが、上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の配列番号３０で表される塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものであることが好ましく、より好ましくは、配列番号３０で表される塩基配列中の第１番目〜第６４０番目の塩基配列領域、特に好ましくは、配列番号３０で表される塩基配列中の第１６０番目〜第６００番目の塩基配列領域、最も好ましくは配列番号３０で表される塩基配列中の第３２０番目〜第５５０番目の塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものである。このようなＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合には、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出において、特異性に優れるのみならず、検出感度及び検出の迅速性に優れると共に、さらに、増幅曲線に線形性が認められ、定量性も良好となる。
本発明の第３の態様において、ＦＩＰプライマーは、例えば、配列番号３０で表される塩基配列のうち３４６−４１０の領域で設計することができ、その内訳は、例えばＦ２として３４６−３６７の領域（Ｆ２ｃはその相補鎖領域）、Ｆ１は３８６−４１０の領域（Ｆ１ｃはその相補鎖領域）から設計したもの（配列番号１２）が好ましい。
ＢＩＰプライマーは、例えば、配列番号３０で表される塩基配列のうち４４５−５１９の領域で設計することができ、その内訳は、例えばＢ１ｃとして４４５−４６９の領域（Ｂ１の４４５−４６９の相補鎖）、Ｂ２は４９８−５１９の領域から設計したもの（配列番号１３）が好ましい。
Ｆ３プライマーは、例えば、配列番号３０で表される塩基配列のうち３２０−３４２の領域から設計したもの（配列番号１４）が好ましく、Ｂ３プライマーは、例えば、配列番号３０で表される塩基配列のうち５２７−５５０の領域から設計したもの（配列番号１５）が好ましい。
本発明においては、さらにループプライマーとして、ＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーを設計して使用してもよい。
ここで、上述した配列番号１２〜１５で表される各プライマーから構成されるＬＡＭＰプライマーセット（以下、ＨｉＤ１と称することがある）について、各プライマーの塩基配列を表５に示す。また、これらの各プライマーを設計するために選択した６箇所の標的領域（Ｆ１，Ｆ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｆ３，Ｂ３）の位置を、表６に示す。
【表５】
2007123265.tif 000007
【表６】
2007123265.tif 000008
（４）莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出
本発明の第４の態様においては、莢膜ｅ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域に着目してＬＡＭＰプライマーセットを設計することにより、莢膜ｅ型インフルエンザ菌を特異的に検出することができる。
莢膜ｅ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例を、図４及び配列番号３１に示す。ここで、当該塩基配列領域は、莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の全部に対応する領域であってもよいし、一部に対応する領域であってもよく、限定はされない。なお、図４では、配列番号３１で表される塩基配列領域の一部（第３９１番目〜１０９０番目）の塩基配列（配列番号３２）のみを示す。配列番号３１で表される塩基配列領域は、莢膜ｅ型インフルエンザ菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎＢａｎｋに公表されている公知のＰＣＲプライマー（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ（アクセッション番号）：Ｚ３３３９０、Ｚ３３３９１、Ｚ３３３９２）を用いてＰＣＲにより得られた増幅産物をシークエンスして得られた塩基配列に基づく領域である。
本発明の第４態様では、ＬＡＭＰプライマーセットのうち少なくとも１種（好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも４種）のＬＡＭＰプライマーが上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の一部の配列と同一又は相補的な塩基配列からなっている。本発明の第４態様においては、さらに、ＬＡＭＰプライマーセットが、上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３１で表される塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものであることが好ましく、より好ましくは、配列番号３１で表される塩基配列中の第４００番目〜第１０００番目の塩基配列領域、特に好ましくは、配列番号３１で表される塩基配列中の第５００番目〜第９００番目の塩基配列領域、最も好ましくは、配列番号３１で表される塩基配列中の第５８２番目〜第７９８番目の塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものである。このようなＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合には、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出において、特異性に優れるのみでなく、検出感度及び検出の迅速性に優れると共に、さらに、増幅曲線に線形性が認められ、定量性も良好となる。
本発明の第４態様において、ＦＩＰプライマーは、例えば、配列番号３１で表される塩基配列のうち６０８−６６７の領域から設計することができ、その内訳は、例えばＦ２として６０８−６２８の領域（Ｆ２ｃはその相補鎖領域）、Ｆ１として６４８−６６７の領域（Ｆ１ｃはその相補鎖領域）から設計したもの（配列番号１６）が好ましい。
ＢＩＰプライマーは、例えば、配列番号３１で表される塩基配列のうち６８７−７７０の領域から設計することができ、その内訳は、例えばＢ１ｃとして６８７−７１１（Ｂ１の６８７−７１１の相補鎖）、Ｂ２として７５２−７７０の領域から設計したもの（配列番号１７）が好ましい。
Ｆ３プライマーは、例えば、配列番号３１で表される塩基配列のうち５８２−５９９の領域から設計したもの（配列番号１８）が好ましく、Ｂ３プライマーは、例えば、配列番号３１で表される塩基配列のうち７８１−７９８の領域から設計したもの（配列番号１９）が好ましい。
本発明においては、さらにループプライマーとしてＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーを設計して使用してもよい。
ここで、上述した配列番号１６〜１９で表される各プライマーから構成されるＬＡＭＰプライマーセット（以下、ＨｉＥ１と称することがある。）について、各プライマーの塩基配列を表７に示す。また、これら各プライマーを設計するために選択した６箇所の標的領域（Ｆ１，Ｆ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｆ３，Ｂ３）の位置を、表８に示す。
【表７】
2007123265.tif 000009
【表８】
2007123265.tif 000010
（４）莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出
本発明の第５の態様においては、莢膜ｆ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域に着目してＬＡＭＰプライマーセットを設計することにより、莢膜ｆ型インフルエンザ菌を特異的に検出することができる。
莢膜ｆ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域の一例を、図５及び配列番号３３に示す。ここで、当該塩基配列領域は、莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の全部に対応する領域であってもよいし、一部に対応する領域であってもよく、限定はされない。なお、図５では、配列番号３３で表される塩基配列領域の一部（第１１８６１番目〜第１２６００番目）の塩基配列（配列番号３４）のみを示す。配列番号３３の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ（アクセッション番号）：ＡＦ５４９２１１として公表されている。
本発明の第５態様では、ＬＡＭＰプライマーセットのうち少なくとも１種（好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも４種、さらに好ましくは６種）のＬＡＭＰプライマーが上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の一部の配列と同一又は相補的な塩基配列からなっている。本発明の第５態様においては、さらに、ＬＡＭＰプライマーセットが、上記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３３で表される塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものであることが好ましく、より好ましくは、配列番号３３で表される塩基配列中の第１１９００番目〜第１２５００番目の塩基配列領域、特に好ましくは、配列番号３３で表される塩基配列中の第１２０００番目〜第１２４００番目の塩基配列領域、最も好ましくは、配列番号３３で表される塩基配列中の第１２０６３番目〜第１２３０４番目の塩基配列領域から設計される各ＬＡＭＰプライマーからなるものである。このようなＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合には、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出において、特異性に優れるのみでなく、検出感度及び検出の迅速性に優れると共に、さらに、増幅曲線に線形性が認められ、定量性も良好となる。
本発明の第５態様において、ＦＩＰプライマーは、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち１２０８６−１２１６９の領域から設計することができ、その内訳は、例えばＦ２として１２０８６−１２１０６の領域（Ｆ２ｃはその相補鎖領域）、Ｆ１として１２１４５−１２１６９の領域（Ｆ１ｃはその相補鎖領域）から設計したもの（配列番号２０）が好ましい。
ＢＩＰプライマーは、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち１２１８４−１２２６６の領域から設計することができ、その内訳は、例えばＢ１ｃとして１２１８４−１２２０８（Ｂ１の１２１８４−１２２０８の相補鎖）、Ｂ２として１２２４４−１２２６６の領域から設計したもの（配列番号２１）が好ましい。
Ｆ３プライマーは、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち１２０６３−１２０８４の領域から設計したもの（配列番号２２）が好ましく、Ｂ３プライマーは、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち１２２８１−１２３０４の領域から設計したもの（配列番号２３）が好ましい。
本発明においては、さらにループプライマーを使用することもできる。
ＬＦプライマーは、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち１２１１６−１２１３９の領域から設計したもの（配列番号２４）が好ましく、ＬＢプライマーは、例えば、配列番号３３で表される塩基配列のうち１２２１０−１２２３４の領域から設計したもの（配列番号２５）が好ましい。また、ＬＢプライマーとしては、配列番号３３で表される塩基配列のうち１２１１７−１２１３９の領域から設計したもの（配列番号２６）を使用することもできる。
ここで、上述した配列番号２０〜２５で表される各プライマーから構成されるＬＡＭＰプライマーセット（以下、ＨｉＦ１と称することがある。）について、各プライマーの塩基配列を表９に示す。なお、配列番号２５で表される塩基配列のＬＢプライマーと同様に使用できる、配列番号２６で表される塩基配列のＬＢプライマーについても、表９に併記した。さらに、これら各プライマーを設計するために選択した８箇所の標的領域（Ｆ１，Ｆ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｆ３，Ｂ３，ＬＦ，ＬＢ）の位置を、表１０Ａ及び表１０Ｂに示す。
【表９】
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【表１０Ａ】
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【表１０Ｂ】
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（５）ＬＡＭＰプライマーの調製及び検出操作等
本発明の第１〜第５の態様で使用する各ＬＡＭＰプライマーは、例えば、ＤＮＡ自動合成機を用いて化学的に合成することで調製することができる。なお、本発明において、各ＬＡＭＰプライマーは、それぞれ、前述したような所定の塩基配列を有し、他の塩基と塩基対形成が可能なオリゴヌクレオチドであって、その３’末端において相補鎖合成の基点となる−ＯＨ基を備えるものを意味する。したがって、この条件を満たす限り、そのバックボーンは必ずしもホスホジエステル結合によるものに限定されず、例えばＰでなくＳをバックボーンとしたホスホチオエート体やペプチド結合に基づくペプチド核酸からなるものであってもよい。
本発明の第１〜第５の態様において、ＬＡＭＰ法に使用できる鋳型依存性核酸合成酵素としては、鎖置換活性を有するものであればよく、特に限定はされない。このような酵素としては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）およびＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６０〜６５℃付近で反応を行うのが望ましい。
また、増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば増幅された遺伝子配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いたり、あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロース電気泳動にかけても容易に検出することができる。また、本発明で用いるＬＡＭＰプライマーは、例えばＤＮＡチップのようにそれ自身を固相に結合させておくこともできる。固相化プライマーを合成開始点とする場合には、核酸の合成反応生成物が固相に捕捉されることから、分離および検出が容易となる。
さらに、ＬＡＭＰ法による増幅反応は加速度的かつ効率的に行なわれるので、反応液中にあらかじめ二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカレーターであるエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等を添加することにより増幅を確認できる。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、肉眼でも確認できる程に白濁する。この白濁を反応終了後に観察して、あるいは、反応開始時から経時的に（リアルタイムに）濁度上昇を観察して、増幅確認を行うことができる。経時的に確認する場合は、光学的な測定機器（分光光度計など）を使用して、例えば６５０ｎｍの吸光度の変化を観察すればよい。また、経時的に確認する方法によれば、被験試料中の各莢膜型インフルエンザ菌由来の染色体ＤＮＡ量（鋳型ＤＮＡ量）を定量することも可能である。
３．検出用キット
ＬＡＭＰ法による増幅反応に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングして、各種莢膜型インフルエンザ菌の検出用キットとして供給することができる。具体的には、本発明のキットは、前述した各種有莢膜型インフルエンザ菌検出用のＬＡＭＰプライマーセットを含むものであるが、その他に、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液など、さらに必要に応じて合成反応生成物の検出のために必要な試薬類を含めることができる。また、核酸の２重鎖を不安定にするための試薬（ベタインなど）を含めることもできる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
＜特異性確認試験＞
本発明の検出方法を実施し、その特異性を確認したので、以下に説明する。
（１）染色体ＤＮＡの準備
まず、試験に供する各種の菌から染色体ＤＮＡを精製し、増幅反応の鋳型となるＤＮＡを準備した。
染色体ＤＮＡは、酵母用のＤｒ．ＧｅｎＴＬＥ（登録商標；タカラバイオ株式会社製）を用いて各種の菌体から抽出し、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（キアゲン社製）を用いて精製することで得た。抽出及び精製の操作は、添付のマニュアルに従って行った。
本試験では、７種のインフルエンザ菌、及び２１種のインフルエンザ菌以外の菌に分類される計２８種の菌株から染色体ＤＮＡを抽出して用いた。これら２８種の菌株を下記表１１に示す。
【表１１】
2007123265.tif 000014
（２）ＬＡＭＰ反応について
次に、前記表１、３、５、７及び９に記載の各ＬＡＭＰプライマーセット（ＨｉＡ１、ＨｉＣ１、ＨｉＤ１、ＨｉＥ１及びＨｉＦ１）を用い、（１）で精製した各種の菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型にＬＡＭＰ反応を行った。
ＬＡＭＰ反応液（２５μｌ）は、ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー各１．６μＭ、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー各０．２μＭ、ＬＦプライマー及びＬＢプライマー各０．４μＭ（ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＡ１及びＨｉＦ１の場合のみ）、８ＵのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、デオキシヌクレオシド  トリフォスフェート各１．４ｍＭ、ベタイン０．８Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）２０ｍＭ、ＫＣｌ  １０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ８ｍＭ、ツイーン２０を０．１％、及び上記（１）で精製した鋳型ＤＮＡ溶液２μｌ（鋳型ＤＮＡ濃度：約１０６コピー）を添加して調製した。
そして、このＬＡＭＰ反応液を、６３℃で６０分間インキュベートすることでＬＡＭＰ反応を進行させ、最後に８０℃で２分間加温することで反応を終了させた。
（３）増幅の有無の確認について
増幅の有無は、反応チューブを直接目視し、ＬＡＭＰ反応液の白濁の有無を観察することで検出した。すなわち、複製配列が存在する場合には反応の副産物として複製配列の量に比例した量のピロリン酸マグネシウムが産生されるのでＬＡＭＰ反応液が白濁し、一方存在しない場合にはＬＡＭＰ反応液は透明のままであるため、その白濁を指標として増幅産物の検出を行った。
また、増幅の有無は、増幅産物のアガロースゲル電気泳動（３％のアガロースゲル、エチジウムブロマイド染色）によっても確認した。その結果、複製配列はＬＡＭＰ反応に特徴的なラダー状のパターンとして現われた（図示せず）。
（４）試験結果について
上述の試験の結果を表１１（前記）に示した。結果は、６０分間のインキュベーションにより目視によって増幅（白濁）が確認された場合を「＋」とし、６０分間のインキュベーションでも増幅が確認できなかった場合を「−」とした。
この結果、ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＡ１を使用した場合は、莢膜ａ型インフルエンザ菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたときのみ多量の増幅産物が確認され、対照的に、他の菌種では増幅産物は確認されなかった。
ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＣ１を使用した場合は、莢膜ｃ型インフルエンザ菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたときのみ多量の増幅産物が確認され、対照的に、他の菌種では増幅産物は確認されなかった。
ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＤ１を使用した場合は、莢膜ｄ型インフルエンザ菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたときのみ多量の増幅産物が確認され、対照的に、他の菌種では増幅産物は確認されなかった。
ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＥ１を使用した場合は、莢膜ｅ型インフルエンザ菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたときのみ多量の増幅産物が確認され、対照的に、他の菌種では増幅産物は確認されなかった。
ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＦ１を使用した場合は、莢膜ｆ型インフルエンザ菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたときのみ多量の増幅産物が確認され、対照的に、他の菌種では増幅産物は確認されなかった。
以上のことから、本発明に係る各莢膜型インフルエンザ菌の検出方法は、特異性に優れ、型別法として有用であることが確認された。
【実施例２】
【０００７】
＜感度確認試験＞
各ＬＡＭＰプライマーセット（ＨｉＡ１、ＨｉＣ１、Ｈｉｄ１、ＨｉＥ１及びＨｉＦ１）を用いた場合の検出感度を確認したので、以下に説明する。
（１）染色体ＤＮＡの調製
本試験では、各莢膜型のインフルエンザ菌（莢膜ａ型（ＩＩＤ９８３）、莢膜ｃ型（ＩＩＤ９８５）、莢膜ｄ型（ＩＩＤ９８６）、莢膜ｅ型（ＩＩＤ９８７）及び莢膜ｆ型（ＩＩＤ９８８））から、実施例１（１）と同様の方法で染色体ＤＮＡを精製し、鋳型とした。反応液中の鋳型ＤＮＡの濃度（コピー数）は、Ｕｌｔｏｓｐｅｃ  ３３００  ｐｒｏ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、分子サイズを１．９Ｍｂｐとして定量した。
（２）ＬＡＭＰ法及びＰＣＲ法について
上記（１）で定量した鋳型ＤＮＡ溶液を１０倍ずつ希釈して１〜１，０００，０００倍の溶液を調製し、これをＬＡＭＰ反応の鋳型ＤＮＡ溶液として用いることで、検出限界を確認した。また、ネガティブコントロールとして鋳型ＤＮＡ濃度が０のものについても確認した。ＬＡＭＰ反応液は、鋳型ＤＮＡ溶液の濃度が異なる以外、鋳型ＤＮＡ溶液の添加量及びその他の添加物の添加量に関して、実施例１の特異性確認試験と同様とした。また、ＬＡＭＰ反応は、６３℃で３５分間又は６０分間インキュベートすることで反応を進行させ、最後に８０℃で２分間加温することで反応を終了させた。
（３）増幅の有無の確認について
ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社製、型番：ＬＡ−２００）を用いて経時的に濁度を測定し、濁度が０．１以上となった場合に増幅したと判定した。
また、実施例１の特異性確認試験と同様に、目視、及び３％アガロースゲル電気泳動（図示せず）による確認も行った。
（４）試験結果について
試験結果は、上記のように増幅産物が確認された場合には「＋」とし、増幅産物が確認されなかった場合は「−」とした。試験結果を、下記表１２に示す。
【表１２】
2007123265.tif 000015
表１２に示すように、ＨｉＡ１、ＨｉＣ１、ＨｉＤ１、ＨｉＥ１及びＨｉＦ１のいずれのＬＡＭＰプライマーセットを使用した場合も、ＬＡＭＰ反応を６０分間行うことで１０３コピーの鋳型ＤＮＡを検出することができた。なかでも、ＨｉＥ１及びＨｉＡ１は１０２コピーの鋳型ＤＮＡを、ＨｉＤ１及びＨｉＦ１は１０コピーの鋳型ＤＮＡを検出することができ、特に感度が高かった。
また、ＨｉＡ１及びＨｉＦ１については、ＬＡＭＰ反応が３５分間であっても、１０２コピーの鋳型ＤＮＡを検出することができ、感度及び迅速性のいずれにも優れることが確認された。ＨｉＡ１及びＨｉＦ１はループプライマーも含むものであるため、ＨｉＣ１やＨｉＥ１に比べ、上記の優れた結果が得られたものと考えられる。
【実施例３】
【０００８】
＜リアルタイム濁度測定試験＞
各ＬＡＭＰプライマーセット（ＨｉＡ１、ＨｉＣ１、ＨｉＤ１、ＨｉＥ１及びＨｉＦ１）を用いたＬＡＭＰ反応についてリアルタイム濁度測定を行い、鋳型ＤＮＡの定量性について検討した。
本試験では、反応チューブ１本当たりの鋳型ＤＮＡ濃度を０〜１０６コピーに調製し、上記各ＬＡＭＰプライマーセットを用いてＬＡＭＰ反応を行い、この反応中に、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社製、型番：ＬＡ−２００）を用いて６秒毎に６５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＡ１を使用した場合について、リアルタイム濁度測定の結果を図６に示す。図６に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１０２コピー以上であれば、６０分以内に濁度が０．１以上になることが確認され、この結果は実施例２の感度試験における目視及び電気泳動による増幅の有無の判別結果と一致した。また、最初に用いた鋳型ＤＮＡ濃度の増加に伴い、スレッシュホールドタイム（濁度が０．１を超えるまでの時間）が短くなることが確認された。
図７のグラフは、ＨｉＡ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と、当初の鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示す。これらの間には線形性が認められ、相関係数ｒ２＝０．９７４３と高い相関を示した。これは、鋳型ＤＮＡの初期濃度が未知の場合に、その存在の有無のみでなくその濃度も定量可能であることを意味する。すなわち、例えば、濃度未知のサンプルについても、同様に希釈倍率の異なる希釈液を調製し、各希釈液を用いてＬＡＭＰ反応を行った場合のスレッシュホールドタイムを測定することで回帰直線を作成すれば、この回帰直線から、未知の鋳型ＤＮＡの初期濃度を特定することができる。
ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＣ１を使用した場合について、リアルタイム濁度測定の結果を図８に示す。図８に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１０３コピー以上であれば、６０分以内に濁度が０．１以上になることが確認され、この結果は実施例２の感度試験における目視及び電気泳動による増幅の有無の判別結果と一致した。また、最初に用いた鋳型ＤＮＡ濃度の増加に伴い、スレッシュホールドタイム（濁度が０．１を超えるまでの時間）が短くなることが確認された。
図９のグラフは、ＨｉＣ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と、当初の鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示す。これらの間には線形性が認められ、相関係数ｒ２＝０．９８７と高い相関を示した。これは、鋳型ＤＮＡの初期濃度が未知の場合に、その存在の有無のみでなくその濃度も定量可能であることを意味する。
ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＤ１を使用した場合について、リアルタイム濁度測定の結果を図１０に示す。図１０に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１０コピー以上であれば、６０分以内に濁度が０．１以上になることが確認され、この結果は実施例２の感度試験における目視及び電気泳動による増幅の有無の判別結果と一致した。また、最初に用いた鋳型ＤＮＡ濃度の増加に伴い、スレッシュホールドタイム（濁度が０．１を超えるまでの時間）が短くなることが確認された。
図１１のグラフはＨｉＤ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と当初の鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示す。これらの間には線形性が認められ、相関係数ｒ２＝０．９９９と高い相関を示した。これは、鋳型ＤＮＡ濃度の初期濃度が未知の場合に、その存在の有無のみでなくその濃度も定量可能であることを意味する。
ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＥ１を使用した場合について、リアルタイム濁度測定の結果を図１２に示す。図１２に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１０２コピー以上であれば、６０分以内に濁度が０．１以上になることが確認され、この結果は実施例２の感度試験における目視及び電気泳動による増幅の有無の判別結果と一致した。また、最初に用いた鋳型ＤＮＡ濃度の増加に伴い、スレッシュホールドタイム（濁度が０．１を超えるまでの時間）が短くなることが確認された。
図１３のグラフは、ＨｉＥ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と、当初の鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示す。これらの間には線形性が認められ、相関係数ｒ２＝０．９８７５と高い相関を示した。これは、鋳型ＤＮＡの初期濃度が未知の場合に、その存在の有無のみでなくその濃度も定量可能であることを意味する。
ＬＡＭＰプライマーセットＨｉＦ１を使用した場合について、リアルタイム濁度測定の結果を図１４に示す。図１４に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１０コピー以上であれば、６０分以内に濁度が０．１以上になることが確認され、この結果は実施例２の感度試験における目視及び電気泳動による増幅の有無の判別結果と一致した。また、最初に用いた鋳型ＤＮＡ濃度の増加に伴い、スレッシュホールドタイム（濁度が０．１を超えるまでの時間）が短くなることが確認された。
図１５のグラフは、ＨｉＦ１を使用した場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と、当初の鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数との関係を示す。これらの間には線形性が認められ、相関係数ｒ２＝０．９６２５と高い相関を示した。これは、鋳型ＤＮＡの初期濃度が未知の場合に、その存在の有無のみでなくその濃度も定量可能であることを意味する。
以上のことから、ＨｉＡ１、ＨｉＣ１、ＨｉＤ１、ＨｉＥ１及びＨｉＦ１のいずれのＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合でも、各莢膜型インフルエンザ菌のリアルタイム検出が可能であり、定量性に優れていた。中でも、ＨｉＡ１及びＨｉＦ１のＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合は、スレッシュホールドタイムが極めて短く、検出の迅速性にも優れていた。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明によれば、莢膜ｂ型以外（すなわち莢膜ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ型）の各有莢膜型インフルエンザ菌の検出方法、並びに当該方法に用い得る検出用プライマーセット、及び検出用キットを提供することができる。
本発明の検出方法は、ＬＡＭＰ法により、莢膜ｂ型以外の各有莢膜型インフルエンザ菌を、迅速、簡便かつ精確に型別することができる点で、臨床診断及びその後の処置において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００１０】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２６：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007123265.tif 000054
【図８】
2007123265.tif 000055
【図９】
2007123265.tif 000056
【図１０】
2007123265.tif 000057
【図１１】
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【図１２】
2007123265.tif 000059
【図１３】
2007123265.tif 000060
【図１４】
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【図１５】
2007123265.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月19日(2008.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
莢膜ａ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項２】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号２７で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＬＡＭＰプライマーセットが、さらにループプライマーとしてＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーを含むものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＦＩＰプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３２１６番目から第３２８８番目の領域から設計されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
ＢＩＰプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３３０５番目から第３３８７番目の領域から設計されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
Ｆ３プライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３１９７番目から第３２１４番目の領域から設計されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項７】
Ｂ３プライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３４０８番目から第３４２９番目の領域から設計されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項８】
ＬＦプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３２３９番目から第３２６３番目の領域から設計されるものである、請求項３記載の方法。
【請求項９】
ＬＢプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列のうち第３３４０番目から第３３６４番目、又は第３３３９番目から第３３６２番目の領域から設計されるものである、請求項３記載の方法。
【請求項１０】
ＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号７で表される塩基配列の組み合わせ
【請求項１１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号７で表される塩基配列の組み合わせ
【請求項１２】
請求項１１記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項１３】
莢膜ｃ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項１４】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号２９で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＦＩＰプライマーは、配列番号２９で表される塩基配列のうち第６４番目から第１４０番目の領域から設計されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＢＩＰプライマーは、配列番号２９で表される塩基配列のうち第１４１番目から第２１９番目の領域から設計されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
Ｆ３プライマーは、配列番号２９で表される塩基配列のうち第４２番目から第６１番目の領域から設計されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
Ｂ３プライマーは、配列番号２９で表される塩基配列のうち第２２９番目から第２５２番目の領域から設計されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
ＬＡＭＰプライマーセットが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列の組み合わせである、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項２１】
請求項２０記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｃ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項２２】
莢膜ｄ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一または相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項２３】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３０で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＦＩＰプライマーは、配列番号３０で表される塩基配列のうち第３４６番目から第４１０番目の領域から設計されるものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＢＩＰプライマーは、配列番号３０で表される塩基配列のうち第４４５番目から第５１９番目の領域から設計されるものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
Ｆ３プライマーは、配列番号３０で表される塩基配列のうち第３２０番目から第３４２番目の領域から設計されるものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
Ｂ３プライマーは、配列番号３０で表される塩基配列のうち第５２７番目から第５５０番目の領域から設計されるものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
ＬＡＭＰプライマーセットが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で表される塩基配列の組み合わせである、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で表される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項３０】
請求項２９記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｄ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項３１】
莢膜ｅ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項３２】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３１で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ＦＩＰプライマーは、配列番号３１で表される塩基配列のうち第６０８番目から第６６７番目の領域から設計されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ＢＩＰプライマーは、配列番号３１で表される塩基配列のうち第６８７番目から第７７０番目の領域から設計されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
Ｆ３プライマーは、配列番号３１で表される塩基配列のうち第５８２番目から第５９９番目の領域から設計されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
Ｂ３プライマーは、配列番号３１で表される塩基配列のうち第７８１番目から第７９８番目の領域から設計されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
ＬＡＭＰプライマーセットが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される塩基配列の組み合わせである、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で表される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項３９】
請求項３８記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｅ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項４０】
莢膜ｆ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域の塩基配列領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項４１】
ＬＡＭＰプライマーセットが、前記莢膜遺伝子座第ＩＩ領域中の配列番号３３で表される塩基配列領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものである、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
ＬＡＭＰプライマーセットが、さらにループプライマーとしてＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーを含むものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＦＩＰプライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２０８６番目から第１２１６９番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
ＢＩＰプライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２１８４番目から第１２２６６番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
Ｆ３プライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２０６３番目から第１２０８４番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
Ｂ３プライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２２８１番目から第１２３０４番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
ＬＦプライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２１１６番目から第１２１３９番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
ＬＢプライマーは、配列番号３３で表される塩基配列のうち第１２２１０番目から第１２２３４番目、又は第１２１１７番目から第１２１３９番目の領域から設計されるものである、請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
ＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせである、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２６で表される塩基配列の組み合わせ
【請求項５０】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示される塩基配列の組み合わせを含む、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
（ａ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２６で表される塩基配列の組み合わせ
【請求項５１】
請求項５０記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項５２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列からなる６種のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて莢膜ａ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項５３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列を含む、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項５４】
請求項５３記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ａ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【請求項５５】
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５で表される塩基配列からなる６種のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて莢膜ｆ型インフルエンザ菌由来の莢膜遺伝子座第ＩＩ領域を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項５６】
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５で表される塩基配列を含む、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項５７】
請求項５６記載のＬＡＭＰプライマーセットを含む、莢膜ｆ型インフルエンザ菌の検出用キット。
【国際調査報告】
2007123265.tif 000063
2007123265.tif 000064
2007123265.tif 000065
2007123265.tif 000066