(57)【要約】  本発明は、ＦＧＦを含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法を提供する。本発明の方法を用いれば、動物種の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となる。また、本発明の方法を用いれば、精巣細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となり、特に出生前動物の精巣細胞から高効率で雄性生殖系列幹細胞を樹立することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法。
【請求項２】
ＦＧＦがＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー又はＦＧＦ１９サブファミリーのメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＦＧＦがＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２０からなる群から選択されるいずれかである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＦＧＦがＦＧＦ９である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法により増幅された雄性生殖系列幹細胞。
【請求項１１】
ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤。
【請求項１２】
ＦＧＦがＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー又はＦＧＦ１９サブファミリーのメンバーである、請求項１１記載の剤。
【請求項１３】
ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、請求項１２記載の剤。
【請求項１４】
ＦＧＦがＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２０からなる群から選択されるいずれかである、請求項１１記載の剤。
【請求項１５】
ＦＧＦがＦＧＦ９である、請求項１４記載の剤。
【請求項１６】
更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項１１記載の剤。
【請求項１７】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項１６記載の剤。
【請求項１８】
更にＦＧＦ２を含む、請求項１１記載の剤。
【請求項１９】
更にＥＧＦを含む、請求項１１記載の剤。
【請求項２０】
ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。
【請求項２１】
以下の工程を含む、不妊治療剤の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；及び
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を医薬として許容される担体と混合し、不妊治療剤を製造する工程。
【請求項２２】
以下の工程を含む、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；及び
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。
【請求項２３】
以下の工程を含む、精子の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；及び
ｃ）該非ヒト動物から精子を単離する工程。
【請求項２４】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する胚の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）該非ヒト動物から精子を得る工程；及び
ｄ）該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。
【請求項２５】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）該精子を卵に受精させ、胚を得る工程；及び
ｅ）該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項２６】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；及び
ｃ）該非ヒト動物を雌と交配し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項２７】
以下の工程を含む、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；及び
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞に外来遺伝子を導入し、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞を得る工程。
【請求項２８】
ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、雄性生殖系列幹細胞を得ることを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。
【請求項２９】
ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＦＧＦがＦＧＦ９である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
前駆体が始原生殖細胞である、請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
請求項２８〜３５のいずれかに記載の方法により製造された雄性生殖系列幹細胞。
【請求項３７】
ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞の分化誘導剤。
【請求項３８】
ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、請求項３７記載の剤。
【請求項３９】
ＦＧＦがＦＧＦ９である、請求項３７記載の剤。
【請求項４０】
培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項３７記載の剤。
【請求項４１】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項４０記載の剤。
【請求項４２】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項３７記載の剤。
【請求項４３】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項３７記載の剤。
【請求項４４】
ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、多能性幹細胞を得ることを含む、多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４５】
ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
ＦＧＦがＦＧＦ９である、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項５１】
前駆体が始原生殖細胞である、請求項４４記載の方法。
【請求項５２】
請求項４４〜５１のいずれかに記載の方法により製造された多能性幹細胞。
【請求項５３】
ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する多能性幹細胞の製造用組成物。
【請求項５４】
ＦＧＦがＦＧＦ９である、請求項５３記載の組成物。
【請求項５５】
更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項５３記載の組成物。
【請求項５６】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項５３記載の組成物。
【請求項５８】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項５３記載の組成物。
【請求項５９】
前駆体が始原生殖細胞である、請求項５３記載の組成物。
【請求項６０】
雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤を製造するための、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）の使用。
【請求項６１】
雄性生殖系列幹細胞の分化誘導剤を製造するための、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＧＦを用いる雄性生殖系列幹細胞の増殖方法、該方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞、該細胞を含む不妊治療剤、雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤、雄性生殖系列幹細胞の製造方法、精子の製造方法、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞の製造方法等に関する。更に、本発明はＦＧＦを用いる多能性幹細胞の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類精巣の雄性生殖系列幹細胞(male germline stem cell)、例えば精原幹細胞(spermatogonial stem cell)は、成体で無限に増殖し続け、減数分裂を経て精子形成に至る源となる細胞である。雄性生殖系列幹細胞は、次世代へ遺伝子を引き継ぐために分配される成体における唯一の幹細胞であるため、生体実験、医学的研究、バイオテクノロジー等に有用である。【０００３】
Brinsterらは、１９９４年にin vivoで精原幹細胞を移植することに成功した（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.91, No.24, p.11298-11302, 1994：非特許文献１）。この方法では精巣を形成する精細管内に幹細胞を移植するとコロニーをつくり、ドナー細胞由来の精子形成を起こし、仔をつくることができるというものである。これによって、ＥＳ細胞以外にも生殖系列細胞を操作する新しい可能性が切り開かれ、雄性生殖系列幹細胞を用いた発生工学という新しい分野が確立された。【０００４】
一方、精原幹細胞の生体内における自己増殖や分化は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）等のサイトカインによって制御されていることが明らかにされた（Cellular and Molecular Life Sciences, vol.58, No.8, p.1061-1066, 2001：非特許文献２、Science, vol.287, No.5457, p.1489-1493, 2000：非特許文献３参照）。【０００５】
本願発明者らは、精原幹細胞等の雄性生殖系列幹細胞のインビトロ長期培養方法を開発した（国際公開第２００４／０９２３５７号パンフレット：特許文献１、Biology of Reproduction, vol.69, No.2, p.612-616, 2003：非特許文献４）。新生児の精巣細胞をグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）等の存在下で培養すると、生殖細胞が固有の形状のコロニーを形成し、幹細胞が５ヶ月以上にわたり増殖した。不妊マウスの精細管に移植すると、培養した細胞は精子形成コロニーをつくり、正常な精子及び子孫を産出した。これにより、雄性生殖系列幹細胞を実用可能な程度にまで増殖させ、操作し、バイオテクノロジー等へ応用することが可能となった。【０００６】
本願発明者らは、この方法を更に改良し、培養の安定が多数種類のサイトカイン等の因子に依存していない、より安定で効率的な雄性生殖系列幹細胞の増殖方法（国際公開第２００６／０２８２７８号パンフレット：特許文献５）、血清やフィーダー細胞を用いない雄性生殖系列幹細胞の増殖方法（Biol. Reprod., vol.72, p.985-991, 2005：非特許文献５、特開２００６−１１５７６７号明細書：特許文献６）を開発した。【０００７】
しかしながら、これらの雄性生殖系列幹細胞の増殖方法は、主にマウスの細胞を用いて開発されたものであるため、同一の方法で他の動物種由来の雄性生殖系列幹細胞を培養した場合に、その増殖スピードが緩やかになる場合があった。また、特に単離されたばかりの精巣細胞から雄性生殖系列幹細胞の培養を樹立する段階において、精巣細胞が由来する動物の齢により、雄性生殖系列幹細胞の誘導効率が変動し、特に出生前の動物の精巣細胞を用いた場合に該誘導効率が低下する場合があった。【０００８】
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p.17430-17435, 2005（非特許文献６）には、上述の特許文献１及び非特許文献５に開示された培養条件と類似の条件を用いたラット精原幹細胞の増殖方法が記載されている。また、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p.14302-14307, 2005（非特許文献７）には、ＧＤＮＦ、可溶性ＧＤＮＦ受容体α−１（ＧＦＲα−１）及びｂＦＧＦの組み合わせがラット精原幹細胞の増殖を支持したことが開示されている。しかしながら、これらの方法を用いても、なお十分満足な雄性生殖系列幹細胞の増殖効率を達成することはできない。【０００９】
そこで、動物種の差異や、精巣細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能な方法を開発することが望まれる。【００１０】
また、本願発明者らは、上述の雄性生殖系列幹細胞のインビトロ長期培養方法と類似の条件下で精巣細胞を培養すると、ＧＳ細胞のコロニーに加えて、ＥＳ細胞コロニーと識別がつかない形態を呈する多能性幹細胞のコロニーが派生することを見い出した（国際公開第２００５／１００５４８号パンフレット：特許文献４、Cell, vol.119, p.1001-1012, 2004：非特許文献８）。この方法は、出生後の個体から多能性幹細胞を製造し得る画期的な方法であるが、その製造効率が精巣細胞が由来する動物の齢により左右され、特に出生前の精巣細胞（例えば始原生殖細胞等）から多能性幹細胞を誘導する場合にその製造効率が低下することが見られる場合があった。【００１１】
出生前の精巣細胞から多能性幹細胞を誘導する方法としては、始原生殖細胞をＳＣＦ、ＬＩＦ及びＦＧＦ２を含む培地中で培養することによりＥＧ細胞を製造する方法が報告されている（Cell, vol.70, p.841-847, 1992：非特許文献９、Nature, vol.359, 550-551, 1992：非特許文献１８）。しかし、この方法も、始原生殖細胞を採取する胚の発生時期によりＥＧ細胞の誘導効率が大きく変動し、例えばマウスの場合では14.5dpc以降の発生段階の始原生殖細胞からはＥＧ細胞を誘導することが出来ないことが知られている（Development, vol.120, 3197-3204, 1994：非特許文献１０）。【００１２】
そこで、精巣細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく多能性幹細胞を製造する方法を開発することが望まれる。【００１３】
一方、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、多様な生物学的活性を有するポリペプチド成長因子として知られている（TRENDS in Genetics, Vol.20, No.11, p.563-569, 2004：非特許文献１１）。ヒト及びマウスにおいては、ＦＧＦ１〜ＦＧＦ２３が確認されている。ヒトＦＧＦ１９はマウスＦＧＦ１５のオルソログであるので、ヒト及びマウスのＦＧＦファミリーは２２のメンバーで構成される（Genome Biol., vol.2, 3005.1-3005.12, 2001：非特許文献１２）。系統発生学的解析により、ＦＧＦ遺伝子ファミリーは７つのサブファミリー（ＦＧＦ１サブファミリー、ＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー、ＦＧＦ１１サブファミリー及びＦＧＦ１９サブファミリー）に分類される。ヒトＦＧＦは約１５０〜３００アミノ酸からなり、約３０〜６０％アミノ酸同一性を有する保存された約１２０アミノ酸残基コアを含む。【００１４】
ＦＧＦは多様な生物学的活性を有し、様々な細胞の培養に有用であることが報告されている。
例えば、特許文献１及び非特許文献５には、ＦＧＦ２を用いた精原幹細胞の増殖方法が記載されている。Cell, vol.104, p.875-889, 2001（非特許文献１３）には、ＦＧＦ９欠損マウスにおいて雄から雌への性転換が起こり、ＦＧＦ９が精巣の発生に関与していることが報告されている。国際公開第９６／４１５２３号パンフレット（特許文献２）には、ＦＧＦ９がＦＧＦＲ３の高親和性リガンドであり、骨及び軟骨の修復に関与していることが開示されている。国際公開第９６／４１６２０号パンフレット（特許文献３）には、ＦＧＦＲ３が間葉性骨格前駆細胞のマーカーであること、ＦＧＦＲ３のリガンドであるＦＧＦ９を用いて間葉性骨格前駆細胞を分離できることが開示されている。【００１５】
また、Molecular Reproduction and Development, vol.68, p.5-16, 2004（非特許文献１４）には、ＦＧＦ４が始原生殖細胞（ＰＧＣ）の増殖を促進することが記載されている。Experimental Cell Research, vol.294, p.77-85, 2004（非特許文献１５）には、ＦＧＦ４が雄性生殖細胞をアポトーシスから保護することが記載されている。Development, vol.132, p.5399-5409, 2005（非特許文献１６）には、ＦＧＦ７が生殖細胞の数に影響を与えることが示されている。Oncogene, vol.21, p.899-908, 2002（非特許文献１７）には、ＦＧＦ４を精巣において過剰発現すると、精子形成が増進されることが記載されている。【００１６】
しかしながら、これらの細胞が精子幹細胞としての活性を有しているかは不明であるため、ＦＧＦ２以外のＦＧＦの雄性生殖系列幹細胞増殖に対する作用や、多能性幹細胞誘導に対する効果は知られていない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０９２３５７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９６／４１５２３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９６／４１６２０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００５／１００５４８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００６／０２８２７８号パンフレット
【特許文献６】特開２００６−１１５７６７号明細書
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.91, No.24, p.11298-11302, 1994
【非特許文献２】Cellular and Molecular Life Sciences, vol.58, No.8, p.1061-1066, 2001
【非特許文献３】Science, vol.287, No.5457, p.1489-1493, 2000
【非特許文献４】Biology of Reproduction, vol.69, No.2, p.612-616, 2003
【非特許文献５】Biol. Reprod., vol.72, p.985-991, 2005
【非特許文献６】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p.17430-17435, 2005
【非特許文献７】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p.14302-14307, 2005
【非特許文献８】Cell, vol.119, p.1001-1012, 2004
【非特許文献９】Cell, vol.70, p.841-847, 1992
【非特許文献１０】Development, vol.120, 3197-3204, 1994
【非特許文献１１】TRENDS in Genetics, Vol.20, No.11, p.563-569, 2004
【非特許文献１２】Genome Biol., vol.2, 3005.1-3005.12, 2001
【非特許文献１３】Cell, vol.104, p.875-889, 2001
【非特許文献１４】Molecular Reproduction and Development, vol.68, p.5-16, 2004
【非特許文献１５】Experimental Cell Research, vol.294, p.77-85, 2004
【非特許文献１６】Development, vol.132, p.5399-5409, 2005
【非特許文献１７】Oncogene, vol.21, p.899-908, 2002
【非特許文献１８】Nature, vol.359, 550-551, 1992
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の第１の目的は、動物種の差異や、雄性生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異による影響を最小限に抑えつつ、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を製造し、増殖させることが可能な方法を提供することである。
本発明の第２の目的は、雄性生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異による影響を最小限に抑えつつ、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞から多能性幹細胞を誘導することが可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ＦＧＦ９の存在下でラットの雄性生殖系列幹細胞を培養すると、従来法と比較して著しく高い細胞数の増加が確認された。この培養細胞を、不妊ヌードマウスの精細管内へ移植すると、精子形成コロニー形成が確認され、この培養細胞が雄性生殖系列幹細胞を含むことが証明された。同様の活性が他のＦＧＦにおいても確認されたことから、広くＦＧＦが雄性生殖系列幹細胞の増殖促進効果を有することを見出した。
また、ＦＧＦ９の存在下でマウス始原生殖細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞が高い効率で誘導されることを見出した。
更に、ＦＧＦ９の存在下でマウス始原生殖細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞のみならず多能性幹細胞も誘導され、従来ＥＧ細胞を誘導させることが出来なかった14.5dpc以降の段階のマウス始原生殖細胞からでも多能性幹細胞を誘導することが可能であることを見出した。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。【００１９】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法。
［２］ＦＧＦがＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー又はＦＧＦ１９サブファミリーのメンバーである、［１］記載の方法。
［３］ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、［２］記載の方法。
［４］ＦＧＦがＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２０からなる群から選択されるいずれかである、［１］記載の方法。
［５］ＦＧＦがＦＧＦ９である、［４］記載の方法。
［６］培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、［１］記載の方法。
［７］ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、［６］記載の方法。
［８］培地が更にＦＧＦ２を含む、［１］記載の方法。
［９］培地が更にＥＧＦを含む、［１］記載の方法。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の方法により増幅された雄性生殖系列幹細胞。
［１１］ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤。
［１２］ＦＧＦがＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー又はＦＧＦ１９サブファミリーのメンバーである、［１１］記載の剤。
［１３］ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、［１２］記載の剤。
［１４］ＦＧＦがＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２０からなる群から選択されるいずれかである、［１１］記載の剤。
［１５］ＦＧＦがＦＧＦ９である、［１４］記載の剤。
［１６］更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、［１１］記載の剤。
［１７］ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、［１６］記載の剤。
［１８］更にＦＧＦ２を含む、［１１］記載の剤。
［１９］更にＥＧＦを含む、［１１］記載の剤。
［２０］ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。
［２１］以下の工程を含む、不妊治療剤の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；及び
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を医薬として許容される担体と混合し、不妊治療剤を製造する工程。
［２２］以下の工程を含む、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；及び
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。
［２３］以下の工程を含む、精子の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；及び
ｃ）該非ヒト動物から精子を単離する工程。
［２４］以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する胚の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）該非ヒト動物から精子を得る工程；及び
ｄ）該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。
［２５］以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）該精子を卵に受精させ、胚を得る工程；及び
ｅ）該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。
［２６］以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；及び
ｃ）該非ヒト動物を雌と交配し、非ヒト子孫を得る工程。
［２７］以下の工程を含む、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞の製造方法：
ａ）ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；及び
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞に外来遺伝子を導入し、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞を得る工程。
［２８］ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、雄性生殖系列幹細胞を得ることを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。
［２９］ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、［２８］記載の方法。
［３０］ＦＧＦがＦＧＦ９である、［２８］記載の方法。
［３１］培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、［２８］記載の方法。
［３２］ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、［３１］記載の方法。
［３３］培地が更にＦＧＦ２を含む、［２８］記載の方法。
［３４］培地が更にＥＧＦを含む、［２８］記載の方法。
［３５］前駆体が始原生殖細胞である、［２８］記載の方法。
［３６］［２８］〜［３５］のいずれかに記載の方法により製造された雄性生殖系列幹細胞。
［３７］ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞の分化誘導剤。
［３８］ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、［３７］記載の剤。
［３９］ＦＧＦがＦＧＦ９である、［３７］記載の剤。
［４０］培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、［３７］記載の剤。
［４１］ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、［４０］記載の剤。
［４２］培地が更にＦＧＦ２を含む、［３７］記載の剤。
［４３］培地が更にＥＧＦを含む、［３７］記載の剤。
［４４］ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、多能性幹細胞を得ることを含む、多能性幹細胞の製造方法。
［４５］ＦＧＦがＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである、［４４］記載の方法。
［４６］ＦＧＦがＦＧＦ９である、［４４］記載の方法。
［４７］培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、［４４］記載の方法。
［４８］ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、［４７］記載の方法。
［４９］培地が更にＦＧＦ２を含む、［４４］記載の方法。
［５０］培地が更にＥＧＦを含む、［４４］記載の方法。
［５１］前駆体が始原生殖細胞である、［４４］記載の方法。
［５２］［４４］〜［５１］のいずれかに記載の方法により製造された多能性幹細胞。
［５３］ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する多能性幹細胞の製造用組成物。
［５４］ＦＧＦがＦＧＦ９である、［５３］記載の組成物。
［５５］更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、［５３］記載の組成物。
［５６］ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、［５５］記載の組成物。
［５７］培地が更にＦＧＦ２を含む、［５３］記載の組成物。
［５８］培地が更にＥＧＦを含む、［５３］記載の組成物。
［５９］前駆体が始原生殖細胞である、［５３］記載の組成物。
［６０］雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤を製造するための、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）の使用。
［６１］雄性生殖系列幹細胞の分化誘導剤を製造するための、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）の使用。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法を用いれば、動物種の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となる。また、本発明の方法を用いれば、始原生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となり、特に出生前動物の精巣細胞から高効率で雄性生殖系列幹細胞を樹立することが可能となる。本発明の方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、遺伝子改変動物（遺伝子導入動物、遺伝子欠損動物等）の作製、雄性不妊の治療、雄性不妊の治療剤の開発、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療のための研究および薬剤の開発などに用いることが出来るので、本発明はバイオテクノロジー及び医学の分野において有用である。
更に、本発明の方法を用いれば、始原生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞から多能性幹細胞を誘導することが可能となる。本発明の方法により得られた多能性幹細胞を用いれば、自家移植のための組織適合性を有する多様な組織を構築することが可能であり、再生医療、遺伝子治療等の医学分野において有用である。また、当該多能性幹細胞はトランスジェニック動物やノックアウト動物等の遺伝子改変動物の作製に用いることが出来るので、バイオテクノロジー分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ラット精原幹細胞の増殖に対するＦＧＦ９の効果を示したグラフである。
【図２】ラット精原幹細胞の増殖に対するＦＧＦ９の効果を示したグラフである。独立した３回の試験の結果を示す。黒印はＦＧＦ９非添加群を、白印はＦＧＦ９添加群を示す。
【図３】ラットＧＳ細胞の増殖に対する種々の組み合わせのサイトカインの効果を示すグラフである。全ての培養にはＦＧＦ９が添加されている。Ｅ：ＥＧＦ、Ｆ：ＦＧＦ２、Ｇ：ＧＤＮＦ。
【図４】ラット精巣細胞からのＧＳ細胞コロニーの樹立に対するＦＧＦ９の効果を顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図５】ＧＦＰ標識されたラットＧＳ細胞が移植されたレシピエントマウス精巣をＵＶ光下で観察した結果を示す図である。ドナー細胞由来の広大なＧＦＰ陽性精子形成コロニーが認められる。
【図６】顕微受精に用いた精子形成細胞を可視光及びUV下で観察した結果を示す写真である。写真中央にドナー細胞由来のＧＦＰ陽性円形精細胞（round spermatid）が認められる。
【図７】ＦＧＦ９を含む培地中で増殖されたラットＧＳ細胞由来の子孫を可視光及びUV下で観察した結果を示す写真である。ＧＳ細胞がＧＦＰラット由来であるため、その子孫（右のラット）はＵＶ下で蛍光を示す。
【図８】ＥＧＦＰ遺伝子のトランスフェクションから３日後のラットＧＳ細胞を可視光及びUV下で観察した結果を示す写真である。バー：２００μｍ
【図９】Ｇ４１８選択により樹立された、安定なＥＧＦＰ遺伝子導入ＧＳ細胞を、UV下で観察した結果を示す写真である。トランスフェクションから９９日後の細胞の様子を示す。
【図１０】マウス始原生殖細胞をＦＧＦ９を含む培地で培養することにより得られた雄性生殖系列幹細胞を示す写真である。
【図１１】１２．５ｄｐｃのマウス始原生殖細胞をＦＧＦ９を含む培地で培養することにより誘導された多能性幹細胞のコロニーを示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．雄性生殖系列幹細胞の増殖方法（方法Ｉ）
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法は、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを特徴とする。ＦＧＦを用いることによって、雄性生殖系列幹細胞の増殖効率が飛躍的に上昇する。【００２３】
本発明の方法Ｉによれば、雄性生殖系列幹細胞を雄性生殖系列幹細胞としての能力を保持したまま、高い効率で増殖させることが可能となる。本明細書において、雄性生殖系列幹細胞としての能力を保持したままの雄性生殖系列幹細胞の増殖を「増幅」という。【００２４】
本発明の方法Ｉは、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、既存の雄性生殖系列幹細胞から新たな雄性生殖系列幹細胞を製造する方法でもある。【００２５】
本明細書において、雄性生殖系列幹細胞とは、自己複製し、精子又はその前駆細胞（例えば精原細胞、精細胞、精祖細胞、精母細胞、精娘細胞等）へ分化し得る能力（雄性生殖系列幹細胞としての能力）を有する生殖系列細胞をいう。雄性生殖系列幹細胞としては、例えば、精原幹細胞、ＧＳ細胞等が挙げられる。【００２６】
ＧＳ細胞とは、インビトロでＧＤＮＦレセプター作動性化合物（ＧＤＮＦ等）に依存的に増殖された精原幹細胞、例えば、Biol. Reprod., vol.69, p612-616, 2003に記載された方法により増殖された精原幹細胞をいう。【００２７】
細胞が雄性生殖系列幹細胞であるか否かは、例えば、Brinster, RL et al., Proc Natl Acad Sci USA, vol.91, No.24, p.11298-11302, 1994等に記載された方法に従って、不妊の雄性動物の精細管内に対象の細胞を移入し、該細胞が精細管内で精子形成コロニーを形成する能力を有するか否かを試験することにより判別することができる。該試験の結果、精子形成コロニーを形成する能力を有する細胞は雄性生殖系列幹細胞であると判別される。【００２８】
また、細胞が雄性生殖系列幹細胞であるか否かは、例えば、フローサイトメーター等を用いて、細胞表面マーカー等の発現を解析することによっても判別し得る。有用な細胞表面マーカーとしては、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥＥ２、ＥｐＣＡＭ、ＳＳＥＡ−１、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９、フォルスマン抗原等が挙げられる（例えば、WO2004/092357等を参照）。【００２９】
本発明の方法Ｉにおいて用いられる雄性生殖系列幹細胞は、脊椎動物由来の細胞であれば特に限定されない。該脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生動物および爬虫類動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、オーストリッチ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物である。【００３０】
当該哺乳動物は、本発明の方法Ｉにより雄性生殖系列幹細胞を増殖し得る限り、出生前であっても、出生後であってもよい。【００３１】
出生後の雄性生殖系列幹細胞を用いる場合、該細胞が由来する動物の齢は、本発明の方法Ｉにより雄性生殖系列幹細胞を増殖し得る限り特に限定されず、新生仔、幼仔、成体、老体のいずれであってもよいが、若齢の動物ほど精巣に含まれる幹細胞（精原幹細胞等）の頻度が高いこと等から、製造効率の観点からはより若齢の動物を用いることが好ましい。【００３２】
本発明の方法Ｉにおいて用いられる雄性生殖系列幹細胞は、単離・精製されたものであってもよく、あるいは、雄性生殖系列幹細胞を含む精巣細胞として本発明に用いられてもよい。精巣細胞は、上記脊椎動物の精巣より自体公知の方法で調製することができる。例えば精巣を摘出し、摘出された精巣をコラゲナーゼ、トリプシン、ＤＮａｓｅなどの分解酵素で消化することにより、精巣細胞を分散させる（例えば、WO2004/092357等を参照）。分散された精巣細胞は培養液により洗浄され、回収される。【００３３】
雄性生殖系列幹細胞の単離・精製は、例えば雄性生殖系列幹細胞に特異的に発現する細胞表面抗原を認識する抗体を用いて、セルソーターや、抗体磁性マイクロビーズ等を用いる方法などにより行うことができる。例えば、精原幹細胞は、α６−インテグリン、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９等の細胞表面抗原を指標に濃縮することができる(例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 8346-8351, 2001等を参照)。あるいはヘキスト等のｄｙｅを用いて精原幹細胞を濃縮することも可能である（例えば、Development, 131, 479-487, 2004等を参照）。また、接着性の低い培養プレート（例えば、ultoralow attachment plate (Nunc)等）上で、精巣細胞を７〜１０日間培養後、プレート上に接着したコロニー形成細胞を採取することによっても精原幹細胞を濃縮することが出来る。【００３４】
雄性生殖系列幹細胞は、本発明の方法Ｉに用いられる前にインビトロで培養されていてもよい。この前培養の条件は、特に限定されないが、例えば、WO2004/092357やBiol. Reprod., vol.72, p.985-991, 2005に記載されているように、上述の酵素処理で得られた精巣細胞をＧＤＮＦ、ＬＩＦ、ＥＧＦ及びＦＧＦ２等の存在下で培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖させることができる。【００３５】
ＦＧＦは、公知のサイトカインであり、ヒト及びマウスにおいては、ＦＧＦ１〜ＦＧＦ２３が確認されている。ヒトＦＧＦ１９はマウスＦＧＦ１５のオルソログであるので、ヒト及びマウスのＦＧＦファミリーは２２のメンバーで構成される（TRENDS in Genetics, Vol.20, No.11, p.563-569, 2004、Genome Biol., vol.2, 3005.1-3005.12, 2001）。本明細書において、ＦＧＦの呼称はヒトＦＧＦのノメンクラチャに従うものとする。【００３６】
ＦＧＦとしては、例えば、表１に示されるような、ヒト及びマウスのＦＧＦを挙げることが出来る。表１は、ヒト及びマウスの野生型ＦＧＦのアミノ酸配列のGenbankアクセッション番号を示す。【００３７】
【表１】
2007108393.tif 000002
【００３８】
ＦＧＦは、系統発生学的解析に基づき７つのサブファミリー（ＦＧＦ１サブファミリー、ＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー、ＦＧＦ１１サブファミリー及びＦＧＦ１９サブファミリー）に分類される。ＦＧＦ１サブファミリーは、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）及びＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）からなる。ＦＧＦ４サブファミリーは、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５及びＦＧＦ６からなる。ＦＧＦ７サブファミリーは、ＦＧＦ３、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ１０及びＦＧＦ２２からなる。ＦＧＦ８サブファミリーは、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８からなる。ＦＧＦ９サブファミリーは、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６及びＦＧＦ２０からなる。ＦＧＦ１１サブファミリーは、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３及びＦＧＦ１４からなる。ＦＧＦ１９サブファミリーは、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２３からなる。【００３９】
本発明の方法Ｉに用いられるＦＧＦは、好ましくは、ＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー又はＦＧＦ１９サブファミリーのメンバーであり、より好ましくは、ＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである。【００４０】
本発明の方法Ｉに用いられるＦＧＦは、好ましくは、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２０からなる群から選択されるいずれかであり、より好ましくは、ＦＧＦ９である。【００４１】
培地中に含まれるＦＧＦの濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を促進し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。【００４２】
本発明の方法Ｉにおいて用いられる培地は、更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含むことが好ましい。ＧＤＮＦレセプターリガンドとは、ＧＤＮＦレセプター又は該レセプターの補助レセプターに結合して、該レセプターを介して細胞や生体を活性化し得る化合物を意味する。例えば、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられたときに、ＧＤＮＦレセプターを介して雄性生殖系列幹細胞の増殖を促進し、該細胞の増殖を達成し得る物質をいう。【００４３】
ＧＤＮＦレセプターリガンドとしては、例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ノルトリン（Neurturin）、ペルセフィン（Persephin）、アルテミン(Artemin)等が挙げられる。ＧＤＮＦレセプターリガンドは、好ましくはＧＤＮＦである。【００４４】
ＧＤＮＦとしては、例えば、ヒト及びラット（ＷＯ９３／０６１１６号パンフレット）、マウス（例えばGene 203, 2, 149-157, 1997参照)等のＧＤＮＦが例示される。【００４５】
ＧＤＮＦレセプターとは、ＧＤＮＦの結合物質であって、ＧＤＮＦのシグナルを細胞内や生体内へ伝達可能な化合物を意味する。ＧＤＮＦレセプターとしては、ＧＤＮＦのシグナル媒介性レセプターであるｃＲｅｔレセプターチロシンキナーゼを挙げることができる。【００４６】
ＧＤＮＦの補助レセプターとは、ＧＤＮＦレセプターリガンドのシグナルを直接は細胞内や生体内へ伝達しないが、ＧＤＮＦレセプターリガンドのシグナルを伝達するレセプターを活性化する化合物を意味する。このような化合物は、特に、そのメンバーがＧＤＮＦファミリーレセプターα類（ＧＦＲαｓ）と称されるレセプターである。これらはまた、ＧＤＮＦ、ペルセフィン、アルテミンおよびノルトリンのシグナル伝達レセプター複合体(signaling receptor complex)と関係する。該ファミリーのレセプターとしては４メンバー（ＧＦＲα１〜４）(Jing, S., et al., Cell, 85, 9-10 (1996); Jing, S. Q., et al., J. Biol. Chem., 272, 33111-33117 (1997); Trean or, J. J., et al., Nature, 382, 80-83 (1996); Subanto, P., et al., Human Molecular Genetics, 6, 1267-1273 (1997))が既知である。これらは独立してシグナルを伝達することができるが、すべてがリガンド結合およびｃＲｅｔ活性化に不可欠である。【００４７】
また、ＧＤＮＦレセプターリガンドとしては、ＧＤＮＦレセプター又は該レセプターの補助レセプターを特異的に認識する抗体やその結合性フラグメント等も含まれる。【００４８】
本発明の方法Ｉにおいて、ＧＤＮＦレセプターリガンドが培地中に含まれる場合、その濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を促進し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。【００４９】
本発明の方法Ｉにおいて用いられる培地は、更にＦＧＦ２を含むことが好ましい。ＦＧＦ２は、雄性生殖系列幹細胞の増殖の補助、特に増殖の誘導又は増強に有用であり、ＦＧＦ２を培地に添加することで、より安定且つ効率的に雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが出来る。【００５０】
ＦＧＦ２としては、例えば、ヒトＦＧＦ２（例えばEndocrine Rev., 8, 95, 1987参照)、ウシＦＧＦ２（例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6963, 1984参照)、マウスＦＧＦ２（例えばDev. Biol., 138, 454-463, 1990参照）、ラットＦＧＦ２（例えばBiochem. Biophys. Res. Commun., 157, 256-263, 1988参照）等が例示される。【００５１】
本発明の方法Ｉにおいて、ＦＧＦ２が培地中に含まれる場合、その濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成し得る濃度であれば特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。【００５２】
本発明の方法Ｉにおいて用いられる培地は、更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を含んでいてもよい。ＥＧＦは、雄性生殖系列幹細胞の増殖の補助、特に増殖の誘導又は増強に有用であり、ＥＧＦを培地に添加することで、より安定且つ効率的に雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが出来る。【００５３】
ＥＧＦとしては、例えば、マウス（例えばNature, 257, 325-327, 1975参照）、ヒト（例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 415, 1991参照）等のＥＧＦが例示される。【００５４】
本発明の方法Ｉにおいて、ＥＧＦが培地中に含まれる場合、その濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜３０ｎｇ／ｍｌである。【００５５】
本発明の方法Ｉにおいて用いられる培地は、更に白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含んでいてもよい。ＬＩＦとしては、例えば、ヒト（特開平1-502985）、マウス（特開平1-502985）、ヒツジ（特開平4-502554）、ブタ（特開平4-502554）、ウシ（特開平8-154681）等のＬＩＦが例示される。本発明の方法において、ＬＩＦが培地中に含まれる場合、その濃度は、通常１０〜１０６units／ｍｌ、例えば１０〜１０５units／ｍｌ、好ましくは１０２〜１０４ units／ｍｌ、より好ましくは３×１０２〜５×１０３units／ｍｌである。【００５６】
本発明の方法Ｉにおいて培地に含まれ得るサイトカイン（ＦＧＦ、ＧＤＮＦレセプターリガンド、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＬＩＦ等）は、動物由来のもの、好ましくは上述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されない。【００５７】
また、当該サイトカインは、本発明の方法Ｉにおいて用いられた際に、対応する野生型のサイトカインと同程度の雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性を有する限り、精製された天然、合成又は組換えタンパク質、変異体タンパク質（挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。【００５８】
「同程度の雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性」とは、雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性が約０．１〜１０倍の範囲内、好ましくは約０．５〜２倍の範囲内であることをいう。雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性は、雄性生殖系列幹細胞の増殖倍率を、注目するサイトカインを含む培地中で一定期間雄性生殖系列幹細胞を培養した場合と、該サイトカインを含まないコントロール培地中で同一期間雄性生殖系列幹細胞を培養した場合とで比較することにより決定することが出来る。【００５９】
また、本発明の方法Ｉにおいて培地に含まれ得るサイトカインは、対応する野生型のサイトカインと同程度の雄性生殖系列幹細胞の増殖促進活性を有する限り、各サイトカインの野生型のアミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。【００６０】
「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度が、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、最も好ましくは98%以上であることを意味する。【００６１】
「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。【００６２】
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。アミノ酸配列の相同性は、上記プログラムにより、そのデフォルトパラメータを用いて適宜算出され得る。例えばアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST-2（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（マトリックス＝BLOSUM62；ギャップオープン＝11；ギャップエクステンション＝1；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝10；フィルタリング＝ON）にて計算することができる。【００６３】
本発明の方法Ｉにおいて用いられる培地の基礎培地は、自体公知のものを用いることができ、特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＨＡＭ、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＤＭ−１６０、ＤＭ−２０１、ＢＭＥ、ＳＦＭ−１０１、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  、ＲＩＴＣ８０−７、ＨＦ−Ｃ１、ＭＣＤＢ１０７、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ７５２／１、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＦＭ等が挙げられる。また、ＥＳ細胞培養用等に改変された培地を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。【００６４】
本発明の方法Ｉにおいて用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、特に限定されないが、例えば成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、ステロイド（例えばβ−エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）、栄養添加物（例えばStemPro-Nutrient Supplement等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。【００６５】
また、本発明の方法Ｉにおいて用いられる培地は、血清を含んでいてもよい。血清としては、動物由来の血清であれば特に限定されないが、好ましくは上記哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎児血清、ヒト血清等）である。また血清の代替添加物（例えばKnockout Serum Replacement (KSR)（Invitrogen社製）等）を用いてもよい。血清の濃度は特に限定されないが、通常、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲である。採取されたばかりの精巣細胞から、雄性生殖系列幹細胞の培養を樹立する場合に、雄性生殖系列幹細胞以外の体細胞の増殖を抑制するため、血清の濃度を低く（例えば、０．１〜５（ｖ／ｖ）％）設定してもよい。【００６６】
本発明の方法Ｉにおいて用いられる培地は、Ｂ２７（J. Neurosci. Res., vol. 35, p.567-576, 1993、Brain Res., vol. 494, p. 65-74, 1989）を含んでいてもよい。特に、雄性生殖系列幹細胞を無血清培地中で培養する場合、Ｂ２７は雄性生殖系列幹細胞の増殖を増強し得る（Biol. Reprod., vol.72, p.985-991, 2005）。Ｂ２７としては、B-27 Supplement（商品名）、B-27 Supplement Minus AO（商品名）、B-27 Supplement Minus Vitamin A（商品名）（以上、Invitrogen社製）等の市販品を用いてもよい。Ｂ２７の培地への添加量は、本発明の方法において、雄性生殖系列幹細胞の増殖を増強させうる範囲で、特に限定されないが、例えばB-27 Supplement （Invitrogen社製）であれば、１〜１００μｌ／ｍｌ、好ましくは５〜４０μｌ／ｍｌ程度、培地に添加される。【００６７】
本発明の方法Ｉにおいては、雄性生殖系列幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞とは、雄性生殖系列幹細胞と共に培養された際に、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持した状態での雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助する環境を提供する、非雄性生殖系列幹細胞をいう。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、自体公知のものを用いることができ、例えば、線維芽細胞（哺乳動物の胎児線維芽細胞、マウス線維芽細胞株ＳＴＯ等）が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。フィーダー細胞を用いる場合には、通常例えば６穴プレートの１穴あたり、１０５〜１０６個程度の細胞数が用いられる。雄性生殖系列幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することにより、雄性生殖系列幹細胞がフィーダー細胞に接着し、より効率的に増殖コロニーを形成することができる。【００６８】
あるいは、フィーダー細胞を用いる代わりに、雄性生殖系列幹細胞をラミニンなどの細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養してもよい（Biol. Reprod., vol.72, p.985-991, 2005）。この場合、雄性生殖系列幹細胞は、不溶性担体の表面に被覆された細胞外マトリクスに付着することにより、間接的に不溶性担体に接着する。【００６９】
不溶性担体としては、本発明の方法Ｉにおいて用いられた際に、雄性生殖系列幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されず、通常、細胞毒性がなく、滅菌可能で、タンパク質に親和性を有する部材を用いることができる。一般的にプラスチック系、ガラス系の部材が好ましい。しかし、不溶性担体は、金属やセラミックでもよく、一定の素材に限定されるものではない。不溶性担体は、通常、シャーレ、プレート、フラスコ、ボトル、ビーズ、中空糸などの培養器材（培養に用いるための器具または材料）に成形して培養に提供される。【００７０】
細胞外マトリクスとは、細胞の外側の空間を構成する生体高分子をいう。細胞外マトリクスとしては、コラーゲン、エラスチン等の繊維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカンやプロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質等が挙げられ、雄性生殖系列幹細胞の不溶性担体への接着を媒介し、雄性生殖系列幹細胞の増殖を達成し得る範囲において特に限定されないが、好ましくは細胞接着性タンパク質であり、より好ましくはラミニンである。【００７１】
細胞外マトリクスを不溶性担体に被覆する方法としては、一般的に、非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水結合等）、共有結合等を使用した方法を用いることができる。例えば、細胞外マトリクスを含む適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液等）中に不溶性担体を静置することにより、細胞外マトリクスを非共有結合により不溶性担体に結合させることが出来る。【００７２】
本発明の方法Ｉにおける細胞培養条件は、細胞培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ２濃度は通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％が例示される。湿度は通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％が例示される。【００７３】
本発明の方法Ｉにおいて、雄性生殖系列幹細胞の継代間隔、希釈率は、培養条件により適宜設定されるが、通常、２〜１０日間隔で、１／２〜１／１０倍希釈で細胞が継代される。【００７４】
本発明の方法Ｉにより増殖された雄性生殖系列幹細胞は、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。当該雄性生殖系列幹細胞は凍結保存・融解後も、自己複製し、精子又はその前駆細胞へ分化し得る能力（雄性生殖系列幹細胞としての能力）を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとウシ胎児血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA-IATRON社製）等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で細胞を保存する。【００７５】
本発明の方法Ｉにより増殖された雄性生殖系列幹細胞を凍結保存後起眠させる際には、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。融解の方法も特に限定されないが、例えば、３７℃の恒温槽中で、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）を用いて行うことができる。具体的には、恒温槽に凍結チューブを浮かべ、凍結させた細胞へＤＭＥＭ／ＦＣＳを滴下して融解する。細胞を遠心して洗浄した後、培地に再度懸濁する。【００７６】
一度起眠した雄性生殖系列幹細胞を、培養後、再度凍結しても、雄性生殖系列幹細胞としての能力は維持される。【００７７】
本発明の方法Ｉにより増殖された雄性生殖系列幹細胞は、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持しているので、該細胞を不妊動物の精細管の中に移植することにより、該移植された細胞に由来する精子形成を起こした動物を製造することが出来る。雄性生殖系列幹細胞の移植方法としては、例えば、精細管内への直接注入、輸出管からの注入、精巣網からの注入等が挙げられ、注入対象である動物の種類や、操作の容易性等を考慮して適宜選択できる。例えばマウス、ラット等のげっ歯類においては、輸出管からの注入が好ましく用いられ、ウシ等の家畜においては精巣網からの注入が好ましく用いられる。移植された雄性生殖系列幹細胞は、精細管内において増殖し、精子形成コロニーを形成する。【００７８】
レシピエント動物の動物種は、上述と同様である。【００７９】
不妊動物としては、ブスルファン等の抗癌剤投与によって不妊化された雄性動物や、遺伝的に精子形成能力を欠損している雄性動物（例えばＷマウスなど）等が挙げられる（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.91, No.24, p.11298-11302, 1994、Cellular and Molecular Life Sciences, vol.58, No.8, p.1061-1066, 2001等を参照）。【００８０】
移植された雄性生殖系列幹細胞を高い効率で生着させる観点から、該不妊動物の動物種は、移植される雄性生殖系列幹細胞の動物種と同一であることが好ましい。また、該不妊動物の系統も、移植される雄性生殖系列幹細胞の系統と同一であることが更に好ましい。【００８１】
動物種及び／又は系統が不妊動物と移植される雄性生殖系列幹細胞との間で異なっている場合は、移植された細胞が拒絶される可能性を減弱する目的で、不妊動物は免疫不全動物であることが好ましい。該免疫不全動物としては、遺伝的に免疫機能を欠損している動物（例えばヌードマウス等）や、Ｔ細胞等の免疫担当細胞の細胞表面抗原（例えばＣＤ４等）に対する抗体を投与すること等により免疫寛容を誘導した動物等が挙げられる。【００８２】
また、上述の方法によって得られた、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する動物から精子を採取（単離）することにより、本発明の方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の精子を製造することが出来る。【００８３】
更に、上述の方法により得られた精子を卵に受精させ、胚を得ることにより、本発明の増殖方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の胚を製造することが出来る。卵とは精子が受精可能な雌性配偶子をいう。卵としては、例えば、卵細胞、卵母細胞等が挙げられる。精子と卵の受精は、顕微受精、ＩＶＦ等の周知の方法により行うことができる。【００８４】
また、上述の方法により得られた胚を、宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、子孫を得ることにより、本発明の方法Ｉによって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の子孫を製造することが出来る。【００８５】
宿主雌動物は、好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。【００８６】
胚が移入された宿主雌動物は、妊娠し、本発明の方法Ｉによって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の子孫を出産する。【００８７】
また、上述の方法により得られた、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした動物と雌とを自然交配し、子孫を得ることによっても、本発明の方法Ｉによって増殖された雄性生殖系列幹細胞に由来する子孫を製造することが出来る。該自然交配に用いられる雌は、通常、野生型雌動物である。【００８８】
本発明の方法Ｉを用いれば、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持した状態で長期間にわたって、安定に、雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能であるので、自体公知の方法で、本発明の方法Ｉにより増殖された雄性生殖系列幹細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞や、特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞等の遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞を製造することができる。【００８９】
雄性生殖系列幹細胞への遺伝子導入の方法としては、例えば、特定の遺伝子が機能的に発現できるように構築されたベクターを雄性生殖系列幹細胞に導入する。ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。また、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス等が挙げられる。【００９０】
ベクターを雄性生殖系列幹細胞に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法が挙げられる。ウイルスをベクターに用いる場合には、上述の一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを細胞に導入してもよいし、ウイルス粒子を、細胞へ感染させることによっても、該ウイルスのゲノムを細胞に導入することができる。【００９１】
また、本発明の方法Ｉを用いれば、外来遺伝子が安定に導入された安定な遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞を選択することが出来る。例えば、ベクターと同時にマーカー遺伝子を細胞へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、ベクターが導入された細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせなどをあげることができる。【００９２】
また、同様の方法を用いて、特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を得ることも可能である。特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を得る方法としては、例えばターゲッティングベクターを用いた相同的組換え（ジーンターゲッティング法）が挙げられる。即ち、特定の遺伝子の染色体ＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすること等によって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（ターゲッティングベクター）を、相同組換え法により雄性生殖系列幹細胞の染色体に導入する。マーカー遺伝子として薬剤耐性を付与する遺伝子を用いる場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、ベクターが導入された細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせなどを挙げることができる。得られた細胞を用いた薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加した培地を用いて培養することにより、ターゲッティングベクターが安定に導入された細胞を選択することが出来る。また、ターゲッティングベクター中の相同的組換え領域の外側にチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子などの細胞に対して毒性に作用し得るマーカー遺伝子を配置し、該マーカー遺伝子が細胞に対して毒性を発揮し得る条件（例えばＴＫ遺伝子を用いる場合には、ガンシクロビル添加培地中で細胞が培養される）にて細胞を培養することにより、ランダムにターゲッティングベクターが導入された細胞を選択的に排除し、適切な相同的組換えを起こした細胞を高い効率で選択することが出来る（ポジティブ−ネガティブセレクション）。得られた細胞について当該特定の遺伝子のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した特定の遺伝子のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を選択することにより得ることができる。或いは、組織特異的又は発達段階特異的な様式で特定の遺伝子を欠失させるＣｒｅ−ｌｏｘＰ系等を用いてもよい（Ｍａｒｔｈ，Ｊ．Ｄ．（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１９９９−２００２；Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｕ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４３２３−４３３０）。【００９３】
また、ジーントラップ法を用いても、遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を得ることが可能である。ジーントラップ法とは、レポーター遺伝子を含むトラップベクターを細胞に導入したとき、染色体上の内在性遺伝子座内にランダムに組み込まれることを利用して未知の遺伝子を探索したり、内在性遺伝子を破壊したりする方法をいう。トラップベクターは、通常、レポーター遺伝子（lacZ遺伝子等）、プラスミド配列（プラスミドレスキュー法による内在性遺伝子の回収に必要な配列であって、複製開始点などを含む）及び選択マーカー遺伝子（neo遺伝子等）を含む。レポーター遺伝子は、通常、プロモーターを有しておらず、スプライスアクセプターのみを有するので、内在性遺伝子の下流に組み込まれたときにのみレポーター遺伝子は発現する。トラップベクターの組み込みは、ほとんどの場合、内在性遺伝子の破壊を生ずる。したがって、トラップベクターを雄性生殖系列幹細胞へ導入することによって、内在性遺伝子が破壊された雄性生殖系列幹細胞を得ることが出来る。【００９４】
このようにして得られた、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞を用いて、上述と同様の方法によって、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子（遺伝子改変精子）、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する胚（遺伝子改変胚）、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫（遺伝子改変非ヒト子孫あるいは遺伝子改変非ヒト動物）等を製造することが出来る。【００９５】
また、本発明の方法Ｉ、及び該方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、雄の不妊治療に有用である。【００９６】
例えば、不妊患者の精巣からバイオプシーで雄性生殖系列幹細胞を採取し、該細胞を本発明の方法Ｉによって試験管中で培養する。そして、当該不妊患者の精細管中に増殖された雄性生殖系列幹細胞を注入（マイクロインジェクション）して、患者の精巣の精細管の中に培養細胞由来の精子形成を起させるという手法によって、不妊治療を実施することができる。この手法は、例えば、化学療法や放射線治療による不妊に対して、特に効果的である。
このように、本発明の方法Ｉにより増殖された雄性生殖系列幹細胞は雄性動物の不妊治療に利用可能であるため、上記雄性生殖系列幹細胞を含む特に男性を対象とした不妊治療剤も本発明の範囲内である。【００９７】
本発明の不妊治療剤は、常套手段に従って、有効量の上記雄性生殖系列幹細胞を医薬として許容される担体と混合することにより製造することが出来る。本発明の不妊治療剤は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることが出来る。本発明の免疫調節剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。【００９８】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト等の上述の哺乳動物に対して投与することができる。【００９９】
また、本発明の方法Ｉ、該方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療に有用である。【０１００】
例えば、特定の遺伝子に変異を有する患者から、バイオプシーで雄性生殖系列幹細胞を採取し、本発明の方法によって試験管中で培養させる。そして、上述の遺伝子改変方法等により、該変異遺伝子を正常に機能する遺伝子と置換した雄性生殖系列幹細胞を作製し、その変異が子孫に伝わらないようにするという治療方法である。このような治療方法においても、雄性生殖系列幹細胞の維持および増殖が必要となるが、この場合に、本発明の方法を有効に利用することができる。【０１０１】
また、本発明は、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤に関する。本発明の剤を含む培地を用いて、上記本発明の方法Ｉにより雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞の増殖効率が飛躍的に上昇する。また、本発明の剤を、従来行われている雄性生殖系列幹細胞の培養培地に添加することにより、雄性生殖系列幹細胞の増殖効率が飛躍的に上昇する。【０１０２】
本発明の剤に用いられるＦＧＦは、好ましくは、ＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー又はＦＧＦ１９サブファミリーのメンバーであり、より好ましくは、ＦＧＦ９サブファミリーのメンバーである。【０１０３】
本発明の剤に用いられるＦＧＦは、好ましくは、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２０からなる群から選択されるいずれかであり、より好ましくは、ＦＧＦ９である。【０１０４】
本発明の剤は、更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含んでいてもよい。ＧＤＮＦレセプターリガンドは、好ましくは、ＧＤＮＦである。【０１０５】
本発明の剤は、更にＦＧＦ２を含んでいてもよい。【０１０６】
本発明の剤は、更にＥＧＦを含んでいてもよい。【０１０７】
本発明の剤は、更にＬＩＦを含んでいてもよい。【０１０８】
本発明の剤は、更に生理学的に許容される担体（例えば、生理的な等張液（生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液等）、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物など）を含むことができる。【０１０９】
本発明の剤に含まれる上記各構成成分の混合割合は、本発明の剤が本発明の方法Ｉに用いられる培地に添加されるなどして用いられた場合に、各構成成分の培地中の濃度が、上述の好適な範囲に入るように構成されていることが好ましい。【０１１０】
本発明の剤は、等張な水溶液、あるいは粉末等の状態で、上記本発明の方法Ｉに用いる培地に添加されるなどして用いられる。あるいは本発明の剤は、上記本発明の方法Ｉに用いられる培地であってもよい。【０１１１】
２．雄性生殖系列幹細胞の製造方法（方法ＩＩ）
本発明の雄性生殖系列幹細胞の製造方法は、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、雄性生殖系列幹細胞を得ることを特徴とする。ＦＧＦを用いることによって、雄性生殖系列幹細胞としての活性が誘導され、雄性生殖系列幹細胞の前駆体から雄性生殖系列幹細胞への分化が強力に誘導され、雄性生殖系列幹細胞の製造効率が飛躍的に上昇する。特に、本発明の方法ＩＩを用いることにより、従来法では困難であった、始原生殖細胞から雄性生殖系列幹細胞をインビトロで誘導することが出来る。【０１１２】
雄性生殖系列幹細胞の前駆体とは、雄性生殖系列幹細胞に分化し得る能力を有する、未分化な細胞をいう。雄性生殖系列幹細胞の前駆体としては、エピブラスト、始原生殖細胞（primordial germ cell）、雄性生殖細胞（gonocyte）等が挙げられる。前駆体は、好ましくは、始原生殖細胞である。【０１１３】
本発明の方法ＩＩにおいて用いられる雄性生殖系列幹細胞の前駆体は、脊椎動物由来の動物であれば特に限定されない。脊椎動物としては、上記方法Ｉと同様のものを挙げることが出来る。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物である。【０１１４】
当該哺乳動物は、本発明の方法ＩＩにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る限り、出生前であっても、出生後であってもよい。【０１１５】
出生前の雄性生殖系列幹細胞の前駆体を用いる場合、該細胞が由来する胎仔（胚）の発生段階は、本発明の方法ＩＩにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えば胚中において始原生殖細胞が出現した以降、好ましくは雄性生殖堤（genital ridge）の形成以降の胚に由来する雄性生殖系列幹細胞が用いられる。例えば、マウスにおいては、通常８．５ｄｐｃ以降、好ましくは１１．５ｄｐｃ以降の雄性生殖系列幹細胞の前駆体が用いられる。【０１１６】
出生後の雄性生殖系列幹細胞の前駆体を用いる場合、該細胞が由来する動物の齢は、本発明の方法ＩＩにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る限り特に限定されず、新生仔、幼仔、成体、老体のいずれであってもよいが、例えば、精巣内においてgonocyteが精原幹細胞へと分化する前の段階の個体が用いられる。例えば、マウスにおいては、出生後５日までにはgonocyteが精原幹細胞へ分化するので、出生後５日より若い雄性生殖系列幹細胞の前駆体が用いられる。【０１１７】
本発明の方法ＩＩにおいて用いられる雄性生殖系列幹細胞の前駆体は、単離・精製されたものであってもよく、あるいは、雄性生殖系列幹細胞の前駆体を含む精巣細胞として本発明に用いられてもよい。精巣細胞は、上記脊椎動物の精巣より自体公知の方法で調製することができる。例えば精巣を摘出し、摘出された精巣をコラゲナーゼ、トリプシン、ＤＮａｓｅなどの分解酵素で消化することにより、精巣細胞を分散させる（例えば、WO2004/092357等を参照）。分散された精巣細胞は培養液により洗浄され、回収される。【０１１８】
雄性生殖系列幹細胞の前駆体として、エピブラストや始原生殖細胞を用いる場合には、調製に先立って、胚の性別を判定して、雄性胚由来のエピブラスト細胞又は始原生殖細胞を分離することが好ましい。胚の性別は、例えばＰＣＲ法に基づくジェノタイピング等により、Ｙ染色体の存在を確認することにより決定できる。胚がマウスの場合であれば、例えばＵｂｅ１  ＰＣＲ法（Dev. Biol., vol. 229, p. 468-479, 2001）等を用いることが出来る。【０１１９】
始原生殖細胞は、胚の各発生段階において始原生殖細胞を豊富に含む組織（尿膜底部、胚後端部、後腸、腸間膜、尿生殖堤、生殖堤等）をトリプシンなどの分解酵素で消化することにより採取することが出来る。例えばマウスにおいては、８．５ｄｐｃ胚では胚の後部三分の一、１０．５ｄｐｃ胚では腸間膜及び尿生殖堤、１１．５〜１６．５ｄｐｃ胚においては生殖堤に始原生殖細胞が豊富に含まれる。【０１２０】
本発明の方法ＩＩに用いられるＦＧＦは、好ましくは、ＦＧＦ９サブファミリーのメンバーであり、より好ましくはＦＧＦ９である。【０１２１】
培地中に含まれるＦＧＦの濃度は、本発明の方法ＩＩにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。【０１２２】
本発明の方法ＩＩにおいて用いられる培地は、更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含むことが好ましい。ＧＤＮＦレセプターリガンドは、好ましくはＧＤＮＦである。【０１２３】
本発明の方法ＩＩにおいて、ＧＤＮＦレセプターリガンドが培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法ＩＩにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。【０１２４】
本発明の方法ＩＩにおいて用いられる培地は、更にＦＧＦ２を含むことが好ましい。【０１２５】
本発明の方法ＩＩにおいて、ＦＧＦ２が培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法ＩＩにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。【０１２６】
本発明の方法ＩＩにおいて用いられる培地は、更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を含んでいてもよい。【０１２７】
本発明の方法ＩＩにおいて、ＥＧＦが培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法ＩＩにより雄性生殖系列幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜３０ｎｇ／ｍｌである。【０１２８】
本発明の方法ＩＩにおいて用いられる培地は、更にＬＩＦを含んでいてもよい。本発明の方法ＩＩにおいて、ＬＩＦが培地中に含まれる場合、その濃度は、通常１０〜１０６units／ｍｌ、例えば１０〜１０５units／ｍｌ、好ましくは１０２〜１０４ units／ｍｌ、より好ましくは３×１０２〜５×１０３units／ｍｌである。【０１２９】
本発明の方法ＩＩにおいて培地に含まれ得るサイトカイン（ＦＧＦ、ＧＤＮＦレセプターリガンド、ＦＧＦ２、ＥＧＦ等）は、動物由来のもの、好ましくは上述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されない。【０１３０】
また、当該サイトカインは、本発明の方法ＩＩにおいて用いられた際に、当該多能性幹細胞の獲得を達成し得る限り、精製された天然、合成又は組換えタンパク質、変異体タンパク質（挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。【０１３１】
また、本発明の方法ＩＩにおいて培地に含まれ得るサイトカインは、本発明の方法ＩＩにおいて用いられた際に、当該多能性幹細胞の獲得を達成し得る限り、各サイトカインの野生型のアミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。【０１３２】
「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度が、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、最も好ましくは98%以上であることを意味する。【０１３３】
本発明の方法ＩＩにおいて用いられる培地の基礎培地は、上述の方法Ｉと同様のものを用いることができる。【０１３４】
本発明の方法ＩＩにおいて用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、上述の方法Ｉと同様のものを用いることができる。添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。【０１３５】
また、本発明の方法ＩＩにおいて用いられる培地は、血清を含んでいてもよい。血清としては、上述の方法Ｉと同様のものを用いることができる。血清の濃度範囲は、上述の方法Ｉと同様である。【０１３６】
本発明の方法ＩＩにおいては、雄性生殖系列幹細胞の前駆体をフィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞としては、上述の方法Ｉと同様のものを用いることができる。フィーダー細胞を用いる場合には、通常例えば６穴プレートの１穴あたり、１０５〜１０６個程度の細胞数が用いられる。【０１３７】
あるいは、上述の方法Ｉと同様に、フィーダー細胞を用いる代わりに、雄性生殖系列幹細胞の前駆体をラミニンなどの細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養してもよい。【０１３８】
本発明の方法ＩＩにおける細胞培養条件は、上述の方法Ｉと同様である。【０１３９】
本発明の方法ＩＩにおいて、細胞の継代間隔、希釈率は、培養条件により適宜設定されるが、通常、２〜１０日間隔で、１／２〜１／１０倍希釈で細胞が継代される。【０１４０】
本発明の方法ＩＩを用いて雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養すると、培養された細胞は培養開始後約３〜６週間までには、２種類の形態のコロニーを形成する。一方のコロニーは、細胞間架橋(intercellular bridge)と桑実胚(morula)様構造により特徴付けられる形態を有しており、これは雄性生殖系列幹細胞のコロニーである。他方のコロニーは、より硬く詰め込まれ(packed)、ＥＳ細胞のコロニーの形態と極めて類似した形態を有しており、これは多能性幹細胞（後述）のコロニーである。従って、雄性生殖系列幹細胞のコロニーと、多能性幹細胞のコロニーとは、明確に視覚的に識別することができる。【０１４１】
上述の形態を指標に、例えば、顕微鏡下で雄性生殖系列幹細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレーター等を用いて選択的にピックアップするか、限界希釈等により、雄性生殖系列幹細胞を単離・精製し得る。【０１４２】
本発明の方法ＩＩにより得られた細胞が雄性生殖系列幹細胞であるか否かは、上記方法Ｉの項で記載した方法（例えば、精細管内へ移入し、精子形成コロニーの有無を確認する方法等）により判別することが出来る。【０１４３】
本発明の方法ＩＩにより得られた雄性生殖系列幹細胞は、上述の本発明の方法Ｉ等を用いることにより、引き続き長期間にわたり、増殖させることが出来る。【０１４４】
本発明の方法ＩＩにより得られた雄性生殖系列幹細胞は、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。当該雄性生殖系列幹細胞は凍結保存・融解後も、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとウシ胎児血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA-IATRON社製）等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で細胞を保存する。【０１４５】
本発明の方法ＩＩにより得られた雄性生殖系列幹細胞を凍結保存後起眠させる際には、上述の方法Ｉと同様に、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。【０１４６】
一度起眠した雄性生殖系列幹細胞を、培養後、再度凍結しても、雄性生殖系列幹細胞としての能力は維持される。【０１４７】
本発明の方法ＩＩにより得られた雄性生殖系列幹細胞を用いることにより、上記方法Ｉにより増殖された雄性生殖系列幹細胞と同様に、例えば以下の用途等に用いることが出来る：
・雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成をおこした動物の製造；
・雄性生殖系列幹細胞に由来する精子、胚、子孫等の製造；
・遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞の製造；
・遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成をおこした動物の製造；
・遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子、胚、子孫等の製造；
・雄の不妊治療；
・生殖細胞レベルにおける遺伝子治療。【０１４８】
また、本発明は、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞の分化誘導剤（本発明の剤ＩＩ）に関する。本発明の剤ＩＩを含む培地を用いて、上記の方法ＩＩにより雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養することにより、該前駆体から雄性生殖系列幹細胞への分化を誘導し、或いは該分化誘導を促進し、雄性生殖系列幹細胞を製造することが出来る。【０１４９】
本発明の剤ＩＩに用いられるＦＧＦは、好ましくは、ＦＧＦ９サブファミリーのメンバーであり、より好ましくはＦＧＦ９である。【０１５０】
本発明の剤ＩＩは、更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含んでいてもよい。ＧＤＮＦレセプターリガンドは、好ましくは、ＧＤＮＦである。【０１５１】
本発明の剤ＩＩは、更にＦＧＦ２を含んでいてもよい。【０１５２】
本発明の剤ＩＩは、更にＥＧＦを含んでいてもよい。【０１５３】
本発明の剤ＩＩは、更に生理学的に許容される担体（例えば、生理的な等張液（生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液等）、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物などを含むことができる。【０１５４】
本発明の剤ＩＩに含まれる上記各構成成分の混合割合は、本発明の剤ＩＩが本発明の方法ＩＩに用いられる培地に添加されるなどして用いられた場合に、各構成成分の培地中の濃度が、上述の好適な範囲に入るように構成されていることが好ましい。【０１５５】
本発明の剤ＩＩは、等張な水溶液、あるいは粉末等の状態で、上記本発明の方法ＩＩに用いる培地に添加されるなどして用いられる。あるいは本発明の剤ＩＩは、上記本発明の方法ＩＩに用いられる培地であってもよい。【０１５６】
尚、本項において用いられる単語の定義は、特に断りのない限り、適宜上記方法Ｉの項の記載に従うものとする。【０１５７】
３．多能性幹細胞の製造方法（方法ＩＩＩ）
本発明の多能性幹細胞の製造方法は、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、多能性幹細胞を得ることを特徴とする。ＦＧＦを用いることによって、多能性幹細胞の製造効率が飛躍的に上昇する。【０１５８】
多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養可能で、長期間にわたって増殖することができ、自己複製能を持ち、生体を構成する全ての細胞やその前駆細胞に分化しうる能力を有する細胞をいう。【０１５９】
本発明の方法ＩＩＩにおいては、上述の方法ＩＩと同様の雄性生殖系列幹細胞の前駆体を用いることが出来る。【０１６０】
本発明の方法ＩＩＩにおいて、始原生殖細胞が用いられる場合、その細胞が由来する胚の発生段階は特に限定されないが、例えば胚中において始原生殖細胞が出現した以降、好ましくは雄性生殖堤（genital ridge）の形成以降の胚に由来する始原生殖細胞が用いられる。例えば、マウスにおいては、通常８．５ｄｐｃ以降、好ましくは１１．５ｄｐｃ以降の始原生殖細胞が用いられる。従来法においては、１４．５ｄｐｃ以降のマウスの始原生殖細胞からＥＧ細胞を誘導することが出来ないが、本発明の方法ＩＩＩによれば、１４．５ｄｐｃ以降の始原生殖細胞からでも多能性幹細胞を誘導することが可能である。【０１６１】
本発明の方法ＩＩＩに用いられるＦＧＦは、好ましくは、ＦＧＦ９サブファミリーのメンバーであり、より好ましくはＦＧＦ９である。【０１６２】
培地中に含まれるＦＧＦの濃度は、本発明の方法ＩＩＩにより多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。【０１６３】
本発明の方法ＩＩＩにおいて用いられる培地は、更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含むことが好ましい。ＧＤＮＦレセプターリガンドは、好ましくはＧＤＮＦである。【０１６４】
本発明の方法ＩＩＩにおいて、ＧＤＮＦレセプターリガンドが培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法ＩＩＩにより多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。【０１６５】
本発明の方法ＩＩＩにおいて用いられる培地は、更にＦＧＦ２を含むことが好ましい。【０１６６】
本発明の方法ＩＩＩにおいて、ＦＧＦ２が培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法ＩＩＩにより多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。【０１６７】
本発明の方法ＩＩＩにおいて用いられる培地は、更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を含んでいてもよい。【０１６８】
本発明の方法ＩＩＩにおいて、ＥＧＦが培地中に含まれる場合、その濃度は、本発明の方法ＩＩＩにより多能性幹細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜３０ｎｇ／ｍｌである。【０１６９】
本発明の方法ＩＩＩにおいて用いられる培地は、従来法において、始原生殖細胞からＥＧ細胞を誘導する際に必須であったＳＣＦやＬＩＦを実質的に含まなくてもよいが、これらの因子を含んでいても悪影響はない。【０１７０】
本発明の方法ＩＩＩにおいて培地に含まれ得るサイトカイン（ＦＧＦ、ＧＤＮＦレセプターリガンド、ＦＧＦ２、ＥＧＦ等）は、動物由来のもの、好ましくは上述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されない。【０１７１】
また、当該サイトカインは、本発明の方法ＩＩＩにおいて用いられた際に、当該多能性幹細胞の獲得を達成し得る限り、精製された天然、合成又は組換えタンパク質、変異体タンパク質（挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。【０１７２】
また、本発明の方法ＩＩＩにおいて培地に含まれ得るサイトカインは、本発明の方法ＩＩＩにおいて用いられた際に、当該多能性幹細胞の獲得を達成し得る限り、各サイトカインの野生型のアミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。【０１７３】
「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度が、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、最も好ましくは98%以上であることを意味する。【０１７４】
本発明の方法ＩＩＩにおいて用いられる培地の基礎培地は、上述の方法Ｉと同様のものを用いることができる。【０１７５】
本発明の方法ＩＩＩにおいて用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、上述の方法Ｉと同様のものを用いることができる。添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。【０１７６】
また、本発明の方法ＩＩＩにおいて用いられる培地は、血清を含んでいてもよい。血清としては、上述の方法Ｉと同様のものを用いることができる。血清の濃度範囲は、上述の方法Ｉと同様である。【０１７７】
本発明の方法ＩＩＩにおいては、雄性生殖系列幹細胞の前駆体をフィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞としては、上述の方法Ｉと同様のものを用いることができる。フィーダー細胞を用いる場合には、通常例えば６穴プレートの１穴あたり、１０５〜１０６個程度の細胞数が用いられる。【０１７８】
あるいは、上述の方法Ｉと同様に、フィーダー細胞を用いる代わりに、雄性生殖系列幹細胞の前駆体をラミニンなどの細胞外マトリクスを介して不溶性担体に接着した状態で培養してもよい。【０１７９】
本発明の方法ＩＩＩにおける細胞培養条件は、上述の方法Ｉと同様である。【０１８０】
本発明の方法ＩＩＩにおいて、細胞の継代間隔、希釈率は、培養条件により適宜設定されるが、通常、２〜１０日間隔で、１／２〜１／１０倍希釈で細胞が継代される。【０１８１】
上記方法ＩＩの項に述べたように、本発明の方法ＩＩＩを用いて雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養すると、培養された細胞は培養開始後約３〜６週間までには、２種類の形態のコロニーを形成する。一方のコロニーは、細胞間架橋(intercellular bridge)と桑実胚(morula)様構造により特徴付けられる形態を有しており、これは雄性生殖系列幹細胞のコロニーである。他方のコロニーは、より硬く詰め込まれ(packed)、ＥＳ細胞のコロニーの形態と極めて類似した形態を有しており、これは多能性幹細胞のコロニーである。従って、雄性生殖系列幹細胞のコロニーと、多能性幹細胞のコロニーとは、明確に視覚的に識別することができる。【０１８２】
上述の形態を指標に、例えば、顕微鏡下で多能性幹細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレーター等を用いて選択的にピックアップするか、限界希釈等により、多能性幹細胞を単離・精製し得る。【０１８３】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた細胞が多能性を保持しているか否かは、以下に例示する自体公知の方法により確認することができる。【０１８４】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた細胞を、免疫不全動物や免疫寛容を誘導した動物の皮下又は精細管内等へ注入し、テラトーマの形成の有無を解析することによって、当該細胞の多能性を確認できる。本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞はテラトーマを形成することができ、当該テラトーマ内には３つの胚葉系に分化した多様な細胞（例えば神経、表皮、筋肉、気管支上皮、軟骨、骨、扁平上皮、神経上皮等）が確認される。一方、雄性生殖系列幹細胞は精細管内へ注入されると、精子形成コロニーを形成し、テラトーマを形成しない。従って、本発明の方法ＩＩＩにより得られる多能性幹細胞は雄性生殖系列幹細胞と明確に識別される。【０１８５】
また、フローサイトメーター等を用いて、得られた細胞の細胞表面マーカー等の発現を解析することによっても、本発明の方法ＩＩＩにより得られた細胞が多能性を保持しているか否かを確認することが出来る。【０１８６】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた細胞を宿主胚に導入し、キメラ動物の誕生の有無を解析することによっても、当該細胞が多能性を保持しているか否かを確認することができる。【０１８７】
また、インビトロにおいてＥＳ又はＥＧ細胞を各種の機能細胞へ分化させる自体公知の方法を適用し、本発明の方法ＩＩＩにより得られた細胞のインビトロにおける分化能力を解析することによっても、当該細胞の多能性を確認できる。【０１８８】
また、本発明の方法ＩＩＩにより得られた細胞の細胞内のアルカリフォスファターゼの活性を自体公知の方法により測定することによっても、当該細胞が多能性を保持しているか否かを確認することができる。本発明の方法ＩＩＩにより得られる多能性幹細胞は、通常ＥＳ細胞と同様にアルカリフォスファターゼが陽性である。【０１８９】
細胞の多能性の確認方法の詳細については、例えば国際公開第２００５／１００５４８号パンフレット等を参照のこと。【０１９０】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞は、長期間（例えば、通常２ヶ月以上）にわたり、多能性を維持しながら増殖させることが出来る。【０１９１】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞の維持、増殖、培養においては、上述の方法ＩＩＩにおいて用いられた培地を用いてもよいが、多能性幹細胞の長期培養により適した培地（維持培地）を用いてもよい。【０１９２】
維持培地は、上述のサイトカイン（ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ等）を含まなくてもよいが、好ましくはＬＩＦを含む。この場合、ＬＩＦの濃度は、通常１０〜１０６units／ｍｌ、例えば１０〜１０５units／ｍｌ、好ましくは１０２〜１０４ units／ｍｌ、より好ましくは３×１０２〜５×１０３units／ｍｌである。【０１９３】
維持培地は血清を含んでいてもよい。維持培地中の血清濃度は、通常２〜３０（ｖ／ｖ）％、好ましくは１０〜２０（ｖ／ｖ）％である。【０１９４】
維持培地の基礎培地は、上記方法ＩＩＩに用いられる培地と同様のものを用いることが出来るが、好ましくは、ＥＳ細胞の培養に好適に用いられる基礎培地（例えばＤＭＥＭ等）である。【０１９５】
維持培地は、上記方法ＩＩＩに用いられる培地と同様の添加物を含むことが出来る。【０１９６】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞は、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。当該多能性幹細胞は凍結保存・融解後も、多能性を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとウシ胎児血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA-IATRON社製）等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で細胞を保存する。【０１９７】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞を凍結保存後起眠させる際には、上述の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法と同様に、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。【０１９８】
一度起眠した多能性幹細胞を、培養後、再度凍結しても、多能性は維持される。【０１９９】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞は、長期間にわたって、多能性を維持した状態で増殖することができるので、自体公知の方法で、当該多能性幹細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入された多能性幹細胞や、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞等の遺伝子改変多能性幹細胞を製造することができる。【０２００】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞への遺伝子導入の方法としては、上記方法Ｉの項で述べた雄性生殖系列幹細胞への遺伝子導入の方法と同様のものを挙げることが出来る。【０２０１】
また、上記方法Ｉの項で述べたものと同様の方法により、外来遺伝子が安定に導入された安定な遺伝子改変多能性幹細胞を選択したり、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞を得ることも可能である。【０２０２】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞は、生体を構成する全ての体細胞へ分化する能力を有しており、ＥＳ細胞やＥＧ細胞に適用される全ての試験技術、方法を当該多様性幹細胞に適用することができ、当該多能性幹細胞を用いて多様な機能細胞、組織、動物（ヒトを除く）等を製造することができる。また遺伝子を改変した多能性幹細胞を用いれば、遺伝子が改変された多様な機能細胞、組織、動物（ヒトを除く）等を製造することができる。【０２０３】
例えば、本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞を中胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、中胚葉系細胞を製造することができる。中胚葉系細胞分化条件としては、ＥＳ又はＥＧ細胞を中胚葉系細胞へ分化させ得る、自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えばタイプＩＶコラーゲンコートしたプレート中における培養（例えばBlood, vol.93, p1253-1263, 1999等参照）、メチルセルロース培地中での培養(Development, vol 125, p1747-1757, 1998)、中胚葉系細胞分化誘導用フィーダー細胞（例えばＯＰ９細胞などのストローマ細胞）との共培養（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.100, p4018-4023, 2003; Exp. Hematol., vol.22, p979-984; Science, vol.272, 722-724, 1996; Blood, vol.93, p1253-1263, 1999; Development, vol 125, p1747-1757, 1998等参照）などが挙げられる。【０２０４】
本発明の方法ＩＩＩにより得られる多能性幹細胞を、自体公知の外胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、外胚葉系細胞を製造することが出来る。外胚葉系細胞分化条件としては、ＥＳ又はＥＧ細胞を外胚葉細胞へ分化させ得る自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えば、神経細胞分化誘導培地（例えばN2B27培地）を用いたゼラチンコートプレート上での培養等が挙げられる（例えばNature Biotechnology, vol.21, 183-186, 2003等参照）。【０２０５】
また、本発明の方法ＩＩＩにより得られる多能性幹細胞は、自体公知の内胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、内胚葉系細胞を製造することが出来る。内胚葉系細胞分化条件としては、ＥＳ又はＥＧ細胞を内胚葉系細胞へ分化させ得る自体公知の条件が挙げられ、特に限定されないが、例えば、インスリン産生細胞への分化条件（Proc Natl Acad Sci USA, 97, 11307-11312）等が挙げられる。【０２０６】
その他、本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞を、例えば、ＥＳ細胞を脈管細胞（血管内皮細胞等）へ分化させる方法（Development, vol.125, 1747-1757, 1998）、ＥＳ細胞を神経細胞へ分化させる方法(Neuron, vol.28, 31-40, 2000)、ＥＳ細胞を色素細胞へ分化させる方法(Development, vol.125, 2915-2923, 1998)、ＥＳ細胞をインスリン産生細胞へ分化させる方法（Proc Natl Acad Sci USA, 97, 11307-11312, 2000）、ＥＳ細胞を外胚葉系細胞へ分化させる方法（ＷＯ０１／０８８１００号パンフレット）、ＥＳ細胞の細胞塊（エンブリオイドボディ）を形成させることにより内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイトを製造する方法(Reprod.Fertil.Dev.,10,31,1998) 等を用いて、多様な機能細胞へと分化誘導することにより、多様な機能細胞を製造することができる。或いは、Proc Natl Acad Sci USA, vol.100, p11457-11462, 2003や、Nature, vol.427, p148-154, 2004に記載された方法により、本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞より精子等の生殖細胞を製造し、これを交配に用いることにより該多能性幹細胞の子孫動物を得ることも可能であり得る。【０２０７】
また、本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞をヌードマウス等の免疫不全動物や、免疫寛容を誘導した動物に移入することによりテラトーマを形成させ、当該テラトーマ中から多様な機能細胞を単離することもできる。【０２０８】
更に、本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞の遺伝子を改変し、得られた遺伝子改変多能性幹細胞に上述の分化方法を適用することにより、遺伝子改変機能細胞を得ることが可能である。【０２０９】
本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞を用いた動物の製造は、例えばキメラ胚を用いる方法等の自体公知の方法に準じて行うことができる。【０２１０】
例えば、まず本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞を宿主胚に導入し、キメラ胚を得る。「宿主」の動物種は、導入される多能性幹細胞の動物種と同一であることが好ましい。「胚」としては、特に限定されないが、例えば胚盤胞、８細胞期胚等が挙げられる。【０２１１】
「胚」はホルモン剤（例えば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）等により過排卵処理を施した雌動物を、雄動物と交配させること等により得ることができる。多能性幹細胞を宿主胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法等が知られているが、いずれの方法を用いることも可能である。【０２１２】
次に、当該キメラ胚を宿主動物の子宮又は卵管に移入し、キメラ動物を得る。宿主動物は好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。キメラ胚が移入された宿主動物は、妊娠し、キメラ動物を出産する。【０２１３】
更に、当該キメラ動物を正常動物又は当該キメラ動物同士と交配し、次世代（Ｆ１）個体の中から当該多能性幹細胞由来遺伝子を保有する個体を選択することにより、当該多能性幹細胞由来遺伝子を保有する動物（当該多能性幹細胞に由来する動物）を得ることができる。多能性幹細胞由来遺伝子を保有する動物の選択は、様々な形質を指標として用いることができるが、例えば体色や被毛色が指標として用いられる。また、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行うことにより、選択を行うこともまた可能である。【０２１４】
また、本発明の方法ＩＩＩにより得られた多能性幹細胞を４倍体胚に導入し、４倍体キメラ胚を得て、当該４倍体キメラ胚を宿主動物の子宮又は卵管に移入することによって、該多能性幹細胞に由来する動物を直接得ることも出来る（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90, p8424-8428, 1993）。４倍体胚は自体公知の方法により胚盤胞を電気融合させることにより得ることが出来るが、２細胞胚盤胞をマンニトール溶液中で電気パルスを適用することによって電気融合させてもよい。【０２１５】
上述の方法を用いることにより、例えば特定の外来遺伝子が導入された多能性幹細胞から、当該導入された外来遺伝子を保有する動物（トランスジェニック動物）を得ることができる。また、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞から、遺伝子欠損ヘテロ接合体動物を得ることができる。更に得られた遺伝子欠損ヘテロ接合体動物を繁殖させることで、遺伝子欠損ホモ接合体動物を得ることができる。【０２１６】
また、本発明は、ＦＧＦ（ＦＧＦ２を除く）を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する多能性幹細胞の製造用組成物（剤）に関する。本発明の組成物を含む培地を用いて、上記の方法ＩＩＩにより雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞の前駆体（例えば始原生殖細胞等）に由来する多能性幹細胞を得ることが出来る。【０２１７】
本発明の組成物に用いられるＦＧＦは、好ましくは、ＦＧＦ９サブファミリーのメンバーであり、より好ましくはＦＧＦ９である。【０２１８】
本発明の組成物は、更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含んでいてもよい。ＧＤＮＦレセプターリガンドは、好ましくは、ＧＤＮＦである。【０２１９】
本発明の組成物は、更にＦＧＦ２を含んでいてもよい。【０２２０】
本発明の組成物は、更にＥＧＦを含んでいてもよい。【０２２１】
本発明の組成物は、更に生理学的に許容される担体（例えば、生理的な等張液（生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液等）、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物など）を含むことができる。【０２２２】
本発明の組成物に含まれる上記各構成成分の混合割合は、本発明の組成物が本発明の方法ＩＩＩに用いられる培地に添加されるなどして用いられた場合に、各構成成分の培地中の濃度が、上述の好適な範囲に入るように構成されていることが好ましい。【０２２３】
本発明の組成物は、等張な水溶液、あるいは粉末等の状態で、上記本発明の方法ＩＩＩに用いる培地に添加されるなどして用いられる。あるいは本発明の組成物は、上記本発明の方法ＩＩＩに用いられる培地であってもよい。【０２２４】
尚、本項において用いられる単語の定義は、特に断りのない限り、適宜上記方法Ｉ又はＩＩの項の記載に従うものとする。【０２２５】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０２２６】
（ラット精原幹細胞の増殖及びその機能解析）
実験材料及び方法
（１）細胞培養
精巣細胞が、ＳＤラット、ＢＮラット、Ｌｅｗｉｓラット、Ｄｏｎｒｙｕラット、Ｆ３４４ラット、ＢＮ（雌）とＳＤ（雄）とのＦ１ラット、あるいはＳＤバックグラウンドへ戻し交配したＧＦＰトランスジェニックラット（以下 GFP ratと呼ぶことがある）（大阪大学、岡部勝博士より提供）（生後７〜２１日齢）から採集された。このGFP ratはＥＧＦＰ遺伝子を実質的に全ての細胞型において発現しているので、ＥＧＦＰの蛍光を指標に当該ラット由来の細胞を追跡することが可能である。【０２２７】
精巣細胞は、Biology of Reproduction, vol.69, No.2, p.612-616, 2003に記載された方法に準じ、コラゲナーゼ（タイプＩＶ、シグマ社製）およびトリプシン（インビトロゲン社製）を用いた２段階酵素分解によって採集された。【０２２８】
精巣細胞の懸濁液を２０〜３０μｍのナイロンメッシュに通して未消化細胞塊を除去し、６００×ｇで５分間遠心して精巣細胞を回収し、更に、該精巣細胞から抗ＣＤ９抗体を用いて磁気ビーズ法により、ＣＤ９陽性細胞として精原幹細胞を濃縮した。濃縮操作は(Proc Natl Acad Sci USA、1999年、96巻、5504-5509頁)の記載に準じて実施した。【０２２９】
回収された精原幹細胞は培地中に分散され、ラミニンコートされた培養用ディッシュ上で培養された。ラミニンコートプレートは、培養ディッシュを２０μｇ／ｍｌの濃度でラミニン（BD Biosciences）を含むＰＢＳにより３７℃で一晩処理した後、該溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄することにより調製した。【０２３０】
基礎培養培地は、StemPro  サプリメント（Invitrogen）、２５μｇ／ｍｌ  インシュリン、１００μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、６０μＭ  プトレシン、３０ｎＭ  セレン酸ナトリウム、３０μｇ／ｍｌ  ピルビン酸、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸（Sigma）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、ＭＥＭビタミン溶液（Invitrogen）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen）、１０−４Ｍ  アスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、３０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌ  プロゲステロン（Sigma）及び１μｇ／ｍｌ  ヘパリンが補充されたStemPro-34 SFM（Invitrogen）であった。所望により、適宜所望の濃度のサイトカインが培地に添加された。基礎培養培地１ｍｌあたり０．６２５ｍｌのＦＣＳが添加された。なお、本実施例において使用されたサイトカインは下表の通りである。【０２３１】
【表２】
2007108393.tif 000003
【０２３２】
細胞は５％の二酸化炭素を含む空気中で、３７℃にて維持され、適宜新たなラミニンコートディッシュ上へ継代された。【０２３３】
（２）培養されたラット精原幹細胞の移植及び解析
約５×１０４個のGFP ratの精原幹細胞懸濁液がＫＳＮ系統ヌードマウス(１０週齢；Japan SLCより購入した)精巣の精細管内へ輸出管を通して注入された。内因性の精子形成を抑制するために、ヌードマウスは、生後４週間の時期にブスルファン（４４ｍｇ／ｋｇ）で処理され、続いて、死亡率を抑えるために対応する骨髄細胞が注射された。各レシピエントの精巣では、注入物が細管の７５〜８０％を占めた。
コロニーをカウントするために、レシピエントマウス精巣は、ドナー細胞移植後２ヶ月で回収されＵＶ光下にて蛍光を観察することにより解析された（Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. ‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 1997; 407: 313-319）。宿主精巣細胞は内在性の蛍光を有さないので、ドナー生殖細胞は特異的に見分けられた。生殖細胞のクラスターは、細管の全周囲を占め、少なくとも０．１ｍｍの長さを有する場合に、コロニーと定義された（Nagano M, Avarbock M R, Brinster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod 1999; 60: 1429-1436）。全ての動物実験のプロトコルは、京都大学の動物保護および使用制度委員会によって承認されたものである。【０２３４】
（３）顕微受精
レシピエント精巣の精細管が慎重に解剖され、生殖細胞が機械的に回収された。顕微受精が既述のように行われた（Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52: 709-720）。２４時間培養後に４細胞期に達した胚がday-1偽妊娠Ｗｉｓｔａｒ系統雌ラットの卵管に移入された。２１日目に取り出された生育胎仔は、Ｗｉｓｔａｒ系統里親ラットの授乳によって育てられた。【０２３５】
結果
（１）ラット精原幹細胞の増殖に及ぼすＦＧＦの効果
２週齢のＧＦＰラット（ＳＤ系統）の精巣細胞をultralow attachment plate (Nunc)上、１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を含む培地中で１週間〜１０日間培養し、プレート上に接着しているコロニー形成細胞を採取することにより精原幹細胞を濃縮した。得られた精原幹細胞を、ラミニンコートディッシュ上、上記培地中で培養することによりラットＧＳ細胞を樹立した。１．８×１０５個／ｗｅｌｌのラットＧＳ細胞をラミニンコートした６穴プレートへ播種し、種々のＦＧＦが更に添加された上記培地中で更に７〜１３日間培養した。培養後、ウェル内のＧＳ細胞数を計測し、培養開始時からの増殖倍率を算出した。複数回の試験結果を表３〜１０に示す。【０２３６】
【表３】
2007108393.tif 000004
【０２３７】
【表４】
2007108393.tif 000005
【０２３８】
【表５】
2007108393.tif 000006
【０２３９】
【表６】
2007108393.tif 000007
【０２４０】
【表７】
2007108393.tif 000008
【０２４１】
【表８】
2007108393.tif 000009
【０２４２】
【表９】
2007108393.tif 000010
【０２４３】
【表１０】
2007108393.tif 000011
【０２４４】
表３〜１０に示すように、ＦＧＦを培地へ添加することにより、ラットＧＳ細胞の増殖効率が有意に増加した。この効果は、試験したいずれの種類のＦＧＦ（ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２０）についても確認された。特にＦＧＦ９は比較的低濃度においても強力にＧＳ細胞の増殖を促進した。【０２４５】
（２）ラット精原幹細胞の増殖に及ぼすＦＧＦ９の効果（Ｉ）
２週齢のＳＤ系統ラットの精巣細胞をultralow attachment plate (Nunc)上、１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を含む培地中で１週間〜１０日間培養し、プレート上に接着しているコロニー形成細胞を採取することにより精原幹細胞を濃縮した。得られた精原幹細胞を、ラミニンコートディッシュ上、上記培地中で培養することによりラットＧＳ細胞を樹立した。培養開始６１日後から１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を培地に更に添加し、引き続きＧＳ細胞を培養した。細胞数を経時的に計測し、培養開始時からの増殖倍率を算出した。結果を図１に示す。【０２４６】
図１に示すように、ＦＧＦ９を添加しない場合、ラットＧＳ細胞の増殖は比較的緩慢であったが、ＦＧＦ９の添加によりＧＳ細胞の増殖率が大幅に上昇した。ＦＧＦ９添加から５０日後のＧＳ細胞の細胞数は、コントロール（ＦＧＦ９非添加）と比較して約５７２倍の増加を示した。同様の効果が、ＢＮ、Ｌｅｗｉｓ、Ｄｏｎｒｙｕ、Ｆ３４４等の系統のラット由来のＧＳ細胞においても認められた。【０２４７】
（３）ラット精原幹細胞の増殖に及ぼすＦＧＦ９の効果（ＩＩ）
２週齢のＳＤ系統ラットの精巣細胞をultralow attachment plate (Nunc)上、１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を含む培地中で１週間〜１０日間培養し、プレート上に接着しているコロニー形成細胞を採取することにより精原幹細胞を濃縮した。得られた精原幹細胞を、ラミニンコートディッシュ上、上記培地中で培養することによりラットＧＳ細胞を樹立した。培養開始２９日後から１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を培地に更に添加し、引き続きＧＳ細胞を培養した。細胞数を経時的に計測し、培養開始時からの増殖倍率を算出した。独立した３回の試験の結果を図２に示す。【０２４８】
図２に示すように、ＦＧＦ９を添加しない場合、ラットＧＳ細胞の増殖は比較的緩慢であったが、ＦＧＦ９の添加によりＧＳ細胞の増殖率が大幅に上昇した。【０２４９】
（４）ラット精原幹細胞の増殖に及ぼすＦＧＦ９の効果（ＩＩＩ）
２週齢のＳＤ系統ラットの精巣細胞をultralow attachment plate (Nunc)上、１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を含む培地中で１週間〜１０日間培養し、プレート上に接着しているコロニー形成細胞を採取することにより精原幹細胞を濃縮した。得られた精原幹細胞を、ラミニンコートディッシュ上、上記培地中で培養することによりラットＧＳ細胞を樹立した。１．８×１０５個／ｗｅｌｌのラットＧＳ細胞をラミニンコートした６穴プレートへ播種し、以下の組み合わせのサイトカインが添加された培地中で更に６〜１０日間培養した。培養後、ウェル内のＧＳ細胞数を計測し、培養開始時からの増殖倍率を算出した。結果を表１１に示す。【０２５０】
【表１１】
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【０２５１】
表１１に示すように、ＦＧＦ９を培地へ添加することにより、ラットＧＳ細胞の増殖効率が有意に増加した。【０２５２】
（５）ラット精原幹細胞の増殖に及ぼすＦＧＦ９の効果（ＩＶ）
上記（４）と同様にＳＤ系統ラットの精巣細胞からＧＳ細胞培養を樹立した。
１．８×１０５個／ｗｅｌｌのラットＧＳ細胞をラミニンコートした６穴プレートへ播種し、以下の組み合わせのサイトカインが添加された培地中で更に７日間培養した。培養後、ウェル内のＧＳ細胞数を計測し、培養開始時からの増殖倍率を算出した。結果を表１２及び図３に示す。【０２５３】
【表１２】
2007108393.tif 000013
【０２５４】
表１２及び図３に示すように、いずれの培養条件においても、ラットＧＳ細胞の有意な増殖が確認された。【０２５５】
以上（２）〜（５）の結果から、ＦＧＦ９は雄性生殖系列幹細胞の増殖を強力に促進することが示された。【０２５６】
（６）ラットＧＳ細胞培養の樹立時におけるＦＧＦ９の効果
２週齢のＢＮ（雌）とＳＤ（雄）とのＦ１ラット精巣細胞からultralow attachment plate (Nunc)により濃縮された精原幹細胞を、ラミニンコートした６穴プレート上、１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を含む培地、又は該培地に更に１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ９を含む培地中で培養することによりＧＳ細胞培養を樹立した。
培養開始２６日後のＧＳ細胞の様子を図４に示す。ＦＧＦ９（＋）培地を用いると、ＦＧＦ９（−）培地を用いた場合と比較してＧＳ細胞の増殖が早く、ＧＳ細胞コロニーがより大きく発達した。この結果から、ＦＧＦ９は、単離されたばかりの精巣細胞からのＧＳ細胞培養の樹立を促進することが示された。【０２５７】
（７）ラットＧＳ細胞の幹細胞活性の確認
２週齢のＳＤバックグラウンドへ戻し交配したＧＦＰトランスジェニックラット（GFP rat）の精巣細胞からultralow attachment plate (Nunc)により濃縮された精原幹細胞を、ラミニンコートディッシュ上、１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を含む培地中で培養することによりラットＧＳ細胞を樹立した。培養開始１２２日後に１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ９を培地に添加し、更に培養を続けた。培養後の細胞が雄性生殖系列幹細胞としての活性を維持し、インビトロで幹細胞が増殖しているか否かを確認するために、異なる２つの時点で不妊マウスの精細管の中に培養細胞を移植し、形成されるコロニー数を測定した。
具体的には、１００日の培養期間経過後、ＧＳ細胞を採集し、ブスルファン処理されたヌードマウスの精細管へ移植した。ＦＧＦ９添加時（day 122）から更に５０日後（day 172）に、ＧＳ細胞を移植のために再び回収し、この期間中の幹細胞数の増加の測定を行った。移植実験におけるコロニーは、移植から７〜８週間後にＵＶ照射下で測定された。
結果を表１３に示す。【０２５８】
【表１３】
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【０２５９】
ＦＧＦ９非添加時において、培養開始後１００〜１７２日の間に、ＧＳ細胞は、全細胞数として２７．７倍、幹細胞数として６９．３倍に増殖した。一方、培養開始後１２２日後にＦＧＦ９を添加すると、ＧＳ細胞は、全細胞数として１６６１．２倍、幹細胞数として４１５５．９倍にも増殖した。即ち、ＦＧＦ９の添加により、全細胞数のみならず幹細胞数の増加率も上昇した。
従って、ＦＧＦ９は、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持したままでの雄性生殖系列幹細胞の増殖（即ち増幅）を強力に促進することが示された。【０２６０】
（８）増殖された雄性生殖系列幹細胞からの子孫動物の作成
本発明の方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞が正常な精子形成に寄与し得るかどうかを確認するために、培養細胞をブスルファン処置したＫＳＮ系統ヌードマウスの精細管内に移植し、培養細胞由来の精子を用いた顕微受精により、培養細胞由来の子孫動物の作成を試みた。
ＧＦＰラット由来のＧＳ細胞を、ラミニンコートディッシュ上、１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ９を含む培地中で１１６日間培養した。培養細胞をブスルファン処理したヌードマウスの精細管内に移植すると、外見上正常な精子形成細胞で満たされた多数のＧＦＰ陽性精細管を生じ、培養細胞由来の広大な精子形成コロニーが形成されることが示された（図５）。ヌードマウス（レシピエント）は内在性の蛍光を有していないので、移植実験でのホストマウスにおけるＧＦＰ陽性の精子形成は、培養されたドナー幹細胞由来のもののみである。
子孫動物を樹立するために、生きたＧＦＰ陽性精子又はＧＦＰ陽性精細胞（図６）が、ヌードマウスの精巣から集められ、卵母細胞へ注入された。
結果を表１４に示す。【０２６１】
【表１４】
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【０２６２】
構築された８７個の胚のうち、培養２４時間後において４８個が生存し、このうち５個は分割していた。３３個の胚が偽妊娠した雌の輸卵管へ移入された。全部で６個の胚が着床し、３匹の子が生まれた（生後母ラットに食べられたものは含まず）。このうち１匹がＧＦＰ陽性であり、培養されたＧＳ細胞由来であることが確認された（図７）。【０２６３】
これらの結果から、本発明の方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞から分化した生殖系列は正常な精子を形成することができ、正常な子孫を残すことができることが確認された。【０２６４】
（９）ラットＧＳ細胞への遺伝子導入
上記（６）と同様に樹立され、ＦＧＦ９を含有する培地中で増殖されたＳＤ系統ラットのＧＳ細胞が以下の実験に用いられた。
ネオマイシン耐性遺伝子とＣＡＧプロモーターに機能的に連結されたＥＧＦＰ構造遺伝子（ｐＣＡＧ−ＥＧＦＰ）を保持するｐＣＸＮを基礎とするプラスミドベクターが遺伝子導入に使用された。遺伝子導入に際しては、製造会社の指示書に従い、Cell Line Nucleofector Kit T(Amaxa社)により、ＧＳ細胞がトランスフェクトされた。分離されたＧＳ細胞 ５×１０６個をsolution T (Nucleofector Kit T, Amaxa社) １００μｌに懸濁し、５μｇのプラスミドＤＮＡを添加した後、エレクトロポレーションを行った。細胞は、４ｍｌの１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２、及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ９を含む培地中に懸濁され、ラミニンコートディッシュ（３０ｃｍ２）上に播種された。Ｇ４１８選択（４０μｇ／ｍｌ、ジェネチシン；インビトロゲン社製）がトランスフェクションから６日後に開始された。Ｇ４１８による１４日の選択後、培地からＧ４１８が除かれた。トランスフェクションから３４日後に細胞のクローニングが行われた。ＧＳ細胞の成長は密度により影響されるので、個々のコロニーは、５０００個のトランスフェクトされていないＧＳ細胞と混合され、９６穴ラミニンコート培養プレートに移された。改変された細胞は、Ｇ４１８選択を繰り返しながら、１０〜１４日おきに継代された。【０２６５】
トランスフェクションから３日後に、導入されたＥＧＦＰの発現がＵＶ光照射下、確認された（図８）。また、Ｇ４１８選択を行うことにより、トランスフェクションから９９日後までに、ＥＧＦＰ遺伝子が導入された、安定でクローナルな、遺伝子導入ラットＧＳ細胞が樹立された（図９）。【０２６６】
これらの結果から、本発明の方法を用いることにより、雄性生殖系列幹細胞に外来遺伝子を導入できること、及び外来遺伝子が安定に導入された雄性生殖系列幹細胞を選択できることが確認された。
【実施例２】
【０２６７】
（マウス始原生殖細胞のからのＧＳ細胞培養の樹立）
始原生殖細胞は、午前８時から午後８時の１２：１２  昼：夜サイクルを伴う管理された環境中で維持された妊娠ＩＣＲ系統マウスから採集された（ＳＬＣ、静岡、日本）。性交プラグが認められたときに、その日が０．５ｄｐｃとされた。胚の性別はＵｂｅ１ ＰＣＲ法（Dev. Biol., vol. 229, p. 468-479, 2001）に基づくジェノタイピングを用いて決定され、雄性の胚のみが本試験に用いられた。１２．５−１５．５ｄｐｃ胚の生殖堤の解剖により生殖細胞に富んだ組織を得て、該組織を１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含む０．２５％トリプシンを用いた１０分間の酵素分解に付すことにより、始原生殖細胞が回収された。【０２６８】
回収された細胞は培地中に分散され、ラミニンコートされた培養用ディッシュ上で培養された。ラミニンコートプレートは、培養ディッシュを２０μｇ／ｍｌの濃度でラミニン（BD Biosciences）を含むＰＢＳにより３７℃で一晩処理した後、該溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄することにより調製した。【０２６９】
基礎培養培地としては実施例１と同一のものを用いた。１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２が培地に添加され、所望により更に１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ９が培地に添加された。基礎培養培地１ｍｌあたり０．６２５ｍｌのＦＣＳが添加された。なお、実施例２において使用されたサイトカインは実施例１と同様である。細胞は５％の二酸化炭素を含む空気中で、３７℃にて維持され、適宜新たなラミニンコートディッシュ上へ継代された。【０２７０】
培養開始から１ヶ月後の細胞の様子を図１０に示す。ＦＧＦ９の存在下で始原生殖細胞を培養することによりその数が増大し、増殖した細胞のコロニーが形成されたが、ＦＧＦ９の非存在下では始原生殖細胞の増殖はほとんど認められなかった。【０２７１】
増殖した細胞を、精子幹細胞移植法により、Ｗマウスの精巣へ移植すると、精子形成コロニーが形成されたことから、この細胞は雄性生殖系列幹細胞としての能力を有していることが示された。【０２７２】
従って、ＦＧＦ９を含む培地中で始原生殖細胞を培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を得ることができることが示された。
【実施例３】
【０２７３】
（マウス始原生殖細胞からの多能性幹細胞の誘導）
実施例２と同様の方法で、１２．５ｄｐｃ及び１４．５ｄｐｃの胚の生殖堤の解剖により生殖細胞に富んだ組織を得て、該組織を１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含む０．２５％トリプシンを用いた１０分間の酵素分解に付すことにより、ＩＣＲ系統マウスの始原生殖細胞が採集された。【０２７４】
回収された細胞は培地中に分散され、ラミニンコートされた培養用ディッシュ上で培養され、その後マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養された。ラミニンコートプレートは、培養ディッシュを２０μｇ／ｍｌの濃度でラミニン（BD Biosciences）を含むＰＢＳにより３７℃で一晩処理した後、該溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄することにより調製した。【０２７５】
基礎培養培地としては実施例１と同一のものを用いた。１５ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２が培地に添加され、所望により更に１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ９が培地に添加された。基礎培養培地１ｍｌあたり０．６２５ｍｌのＦＣＳが添加された。なお、実施例３において使用されたサイトカインは実施例１と同様である。細胞は５％の二酸化炭素を含む空気中で、３７℃にて維持され、適宜新たなラミニンコートディッシュ上へ継代された。【０２７６】
始原生殖細胞を、ＦＧＦ９、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ２及びＥＧＦを含有する培地中で培養した際に、形成されるコロニーの大部分は、細胞間架橋(intercellular bridge)と桑実胚(morula)様構造により特徴付けられる、ＧＳ細胞の典型的な外観を有していた。しかしながら、少数（＜５％）のコロニーはＥＳ細胞への著しい類似を呈していた（図１１）。これらのコロニーはより硬く詰め込まれ(packed)、通常培養開始後１２０日以内に出現した。ＥＳ細胞様コロニーは、１２．５ｄｐｃ及び１４．５ｄｐｃのいずれの段階の始原生殖細胞からも発生した。ＦＧＦ９の非存在下では始原生殖細胞の増殖はほとんど認められなかった。【０２７７】
ＥＳ細胞様コロニーが分離され、更に同様の培養条件で増殖された。テラトーマ形成の解析のために、約２×１０６個のＥＳ様細胞がＫＳＮヌードマウス（日本ＳＬＣ）の皮下に注入され、移植から３週間後に解析された。形成された組織は１０％中性緩衝ホルマリンで固定され、パラフィン切片の処理がなされた。切片はヘマトキシリンおよびエオジンで染色され、顕微鏡下観察された。【０２７８】
その結果、移植後３乃至４週間で、移植されたＥＳ様細胞は典型的なテラトーマを生じた。当該癌（テラトーマ）には、３つの胚葉（embryonic germ layer）の派生物、例えば筋肉、神経、血管、気管支上皮等が含まれていた。【０２７９】
従って、ＦＧＦ９を含む培地中で始原生殖細胞を培養することによって誘導されたＥＳ様細胞は多能性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２８０】
本発明の方法を用いれば、動物種の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となる。また、本発明の方法を用いれば、精巣細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能となり、特に出生前動物の精巣細胞から高効率で雄性生殖系列幹細胞を樹立することが可能となる。本発明の方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、遺伝子改変動物（遺伝子導入動物、遺伝子欠損動物等）の作製、雄性不妊の治療、雄性不妊の治療剤の開発、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療のための研究および薬剤の開発などに用いることが出来るので、本発明はバイオテクノロジー及び医学の分野において有用である。
更に、本発明の方法を用いれば、始原生殖系列幹細胞が由来する動物の齢の差異に左右されず、安定して効率よく雄性生殖系列幹細胞から多能性幹細胞を誘導することが可能となる。本発明の方法により得られた多能性幹細胞を用いれば、自家移植のための組織適合性を有する多様な組織を構築することが可能であり、再生医療、遺伝子治療等の医学分野において有用である。また、当該多能性幹細胞はトランスジェニック動物やノックアウト動物等の遺伝子改変動物の作成に用いることが出来るので、バイオテクノロジー分野において有用である。
本出願は日本で出願された特願２００６−０７３４７１（出願日：２００６年３月１６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2007108393.tif 000016
【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月14日(2007.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
請求項１、及び６〜９のいずれかに記載の方法により増幅された雄性生殖系列幹細胞。
【請求項１１】
ＦＧＦ９を含む、雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項１１記載の剤。
【請求項１７】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項１６記載の剤。
【請求項１８】
更にＦＧＦ２を含む、請求項１１記載の剤。
【請求項１９】
更にＥＧＦを含む、請求項１１記載の剤。
【請求項２０】
ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。
【請求項２１】
以下の工程を含む、不妊治療剤の製造方法：
ａ）ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；及び
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を医薬として許容される担体と混合し、不妊治療剤を製造する工程。
【請求項２２】
以下の工程を含む、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：
ａ）ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；及び
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。
【請求項２３】
以下の工程を含む、精子の製造方法：
ａ）ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；及び
ｃ）該非ヒト動物から精子を単離する工程。
【請求項２４】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する胚の製造方法：
ａ）ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）該非ヒト動物から精子を得る工程；及び
ｄ）該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。
【請求項２５】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）該精子を卵に受精させ、胚を得る工程；及び
ｅ）該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項２６】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；及び
ｃ）該非ヒト動物を雌と交配し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項２７】
以下の工程を含む、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞の製造方法：
ａ）ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、雄性生殖系列幹細胞を増殖する工程；及び
ｂ）ａ）で増殖された雄性生殖系列幹細胞に外来遺伝子を導入し、外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞を得る工程。
【請求項２８】
ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、雄性生殖系列幹細胞を得ることを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。
【請求項２９】
（削除）
【請求項３０】
（削除）
【請求項３１】
培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
前駆体が始原生殖細胞である、請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
請求項２８、及び３１〜３５のいずれかに記載の方法により製造された雄性生殖系列幹細胞。
【請求項３７】
ＦＧＦ９を含む、雄性生殖系列幹細胞の分化誘導剤。
【請求項３８】
（削除）
【請求項３９】
（削除）
【請求項４０】
培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項３７記載の剤。
【請求項４１】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項４０記載の剤。
【請求項４２】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項３７記載の剤。
【請求項４３】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項３７記載の剤。
【請求項４４】
ＦＧＦ９を含む培地中で雄性生殖系列幹細胞の前駆体を培養し、多能性幹細胞を得ることを含む、多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４５】
（削除）
【請求項４６】
（削除）
【請求項４７】
培地が更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項５１】
前駆体が始原生殖細胞である、請求項４４記載の方法。
【請求項５２】
請求項４４、及び４７〜５１のいずれかに記載の方法により製造された多能性幹細胞。
【請求項５３】
ＦＧＦ９を含む、雄性生殖系列幹細胞の前駆体に由来する多能性幹細胞の製造用組成物。
【請求項５４】
（削除）
【請求項５５】
更にＧＤＮＦレセプターリガンドを含む、請求項５３記載の組成物。
【請求項５６】
ＧＤＮＦレセプターリガンドがＧＤＮＦである、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】
培地が更にＦＧＦ２を含む、請求項５３記載の組成物。
【請求項５８】
培地が更にＥＧＦを含む、請求項５３記載の組成物。
【請求項５９】
前駆体が始原生殖細胞である、請求項５３記載の組成物。
【請求項６０】
雄性生殖系列幹細胞増殖促進剤を製造するための、ＦＧＦ９の使用。
【請求項６１】
雄性生殖系列幹細胞の分化誘導剤を製造するための、ＦＧＦ９の使用。
【国際調査報告】
2007108393.tif 000027
2007108393.tif 000028
2007108393.tif 000029
2007108393.tif 000030