【誤訳訂正書】
【提出日】平成31年2月5日(2019.2.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトールを調製する方法であって、
（１）デンプン又はデンプン誘導体を基質として用い、α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼを添加してインビトロ多酵素反応システムを確立し、酵素触媒反応を行うステップ；及び
（２）反応生成物を分離及び精製してイノシトールを得るステップ
を含み、前記酵素触媒反応が４０℃から１００℃で行われる、方法。
【請求項２】
該多酵素反応システムが更にデンプン脱分枝酵素、マルトースホスホリラーゼ及びα−アミラーゼ、又はデンプン脱分枝酵素、グルカノトランスフェラーゼ及びα−アミラーゼを含み、デンプン脱分枝酵素がイソアミラーゼ又はプルラナーゼのいずれか一方又は両方である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該多酵素反応システムが更に、ポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリホスファートを含み、ポリホスファートがポリリン酸ナトリウムである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（１）のデンプン誘導体が１以上の部分的に加水分解されたデンプン、デンプンデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖又はマルトースを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
イノシトールを調製する方法であって、
（１）セルロース又はセルロース誘導体を基質として用い、セルラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼを添加してインビトロ多酵素反応システムを確立し、酵素触媒反応を行うステップ；及び
（２）反応生成物を分離及び精製してイノシトールを得るステップ
を含み、前記酵素触媒反応が４０℃から１００℃で行われる、方法。
【請求項６】
ステップ（１）が：
セルロース又はセルロース誘導体をセルラーゼと混合し、遠心分離し、上澄みを除去してセルラーゼとセルロースの混合物を得るステップを含み；
セルラーゼとセルロースの混合物中のセルラーゼがグルコシダーゼを含有せず；
セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼをセルラーゼとセルロースの混合物に添加して多酵素反応システムを確立するステップを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該多酵素反応システムが更に、ポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリホスファートを含み、ポリホスファートがポリリン酸ナトリウムである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ステップ（１）のセルロース誘導体が、セルロース前処理後の生成物、セロデキストリン又はセロビオースのうち任意の１つを含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
該多酵素反応システムが更に、以下の成分：緩衝液、無機リン酸基、二価マグネシウムイオン、亜鉛イオン又はマンガンイオンを含む、請求項１又は５記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
多酵素反応システムは更に下記成分を含む：緩衝液、無機リン酸基、二価のマグネシウムイオン及び亜鉛イオン又はマンガンイオン。好ましくは各成分の量は：緩衝液が１００ｍＭ、無機リン酸基が１０ｍＭ、二価のマグネシウムイオンが５ｍＭ、亜鉛イオン又はマンガンイオンが０．５ｍＭであり；緩衝液は好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液であり、更に好ましくは、ＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨは７．２である。
反応終了後、残ったデンプン残渣は純粋なアミロースであろう。この時点において、デンプン残渣の加水分解を促進し、イノシトールの生産を更に増加させるために、少量のα−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）を添加することができる。好ましくは、α−アミラーゼの量は０．１Ｕ／ｍｌである。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
更にイノシトールの収率を増加させるため、ポリリン酸−グルコキナーゼ（EC 2.7.1.63）とポリホスファートをステップ（１）の多酵素反応システムに添加する。好ましくは、ポリリン酸−グルコキナーゼの量は５Ｕ／ｍＬ；ポリホスファートの量は１０ｍＭであり；この場合において、ポリホスファートは好ましくはポリリン酸ナトリウムである。
酵素触媒反応の効率と生成物の収率を改善するため、多酵素反応システムは更に以下の成分を含む：緩衝液、無機リン酸基、二価のマグネシウムイオン及び亜鉛イオン又はマンガンイオン。好ましくは各成分の量は：緩衝液が１００ｍＭ、無機リン酸基が１０ｍＭ、二価のマグネシウムイオンが５ｍＭ、亜鉛イオン又はマンガンイオンが０．５ｍＭであり；この場合において、緩衝液は好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液であり、更に好ましくは、ＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨは７．２である。
ポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリホスファートを更に本件開示の多酵素反応システムに添加し、セルロース加水分解の最終生成物であるグルコースをグルコース−６−リン酸に転換し：次いでグルコース−６−リン酸をイノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼによってイノシトールに転換する。最終的には、セルロース及びその誘導体中の全てのグルコース単位がイノシトールに転換される。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、０．０５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、０．０５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを６０℃で４０時間、触媒反応に供した。
反応溶液中のイノシトール、グルコース、グルコース−１−リン酸又はグルコース−６−リン酸を、保持時間によって、ＨＰＬＣを用いて識別することができる（図３ａ）；図３ｂに示すとおり、イノシトールはＨＰＬＣによって定量することができ、イノシトールの濃度は、ＨＰＬＣにおけるイノシトール特性ピークの強度に比例する。ＨＰＬＣの移動相は、５ｍＭの希硫酸であった。
反応終了後、最終的なイノシトールの最終濃度は１．６ｇ／Ｌであり（図４）、転換率は１６％であった。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
実施例２．インビトロでの多酵素触媒によるデンプンからイノシトールへの転換
α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、０．０５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、０．０５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを４０℃で４０時間、触媒反応に供した。
反応終了後、最終的なイノシトールの最終濃度（図４）は、０．９ｇ／Ｌであり転換率は９％であった。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
実施例３．インビトロでの多酵素触媒によるデンプンからイノシトールへの転換
α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、０．０５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、０．０５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを８０℃で４０時間、触媒反応に供した。
反応終了後、最終的なイノシトールの最終濃度は、３．６ｇ／Ｌであり転換率は３６％であった。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ、１Ｕ／ｍＬのイソアミラーゼ、１Ｕ／ｍＬのマルトースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのポリリン酸−グルコキナーゼ、１０ｍＭのポリリン酸ナトリウム及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを８０℃で４０時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトールの最終濃度は７．２ｇ／Ｌであり（図４）、転換率は７２％に達した。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
実施例５．プロセス最適化及びデンプン加水分解を促進する酵素の添加を通じたインビトロ多酵素触媒によるデンプンからイノシトールへの転換
α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。ポリリン酸−グルコキナーゼの調製は、実施例４と同じである。プルラナーゼ（EC 3.2.1.41）はシグマ社から購入した（Cat No. P1067）；マルトースホスホリラーゼはシグマ社から購入した（Cat No. M8284）。
シグマ社から購入したプルラナーゼは高温（８０℃）で反応しないため、可溶性デンプンをプルラナーゼとともに３７℃で最初に処置し、続いて他の酵素を添加した。反応は８０℃で実施された。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、１Ｕ／ｍＬのプルラナーゼ、１０ｍＭのポリリン酸ナトリウム及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを３７℃で触媒反応に供した。１０時間後、５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ、１Ｕ／ｍＬのマルトースホスホリラーゼ及び１Ｕ／ｍＬのポリリン酸−グルコキナーゼを添加し、触媒反応を８０℃で４０時間実施した。最終的なイノシトールの最終濃度は７．３ｇ／Ｌであり（図４）、転換率は７３％に達した。
続いて、デンプン残渣の加水分解を促進しイノシトール生成量を増加させるため、少量のα−アミラーゼを反応システムに添加した。α−アミラーゼの量は０．１Ｕ／ｍｌであり、反応は３７℃で６時間、次いで８０℃で２４時間実施された。最終的なイノシトール（図４）の最終濃度は８．８ｇ／Ｌであり転換率は８８％に達した。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２３】
実施例６．インビトロでの多酵素触媒による、マルトデキストリンからイノシトールへの転換
α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。イソアミラーゼ及びポリリン酸−グルコキナーゼの調製は実施例４と同じである。マルトースホスホリラーゼはシグマ社から購入した（Cat No. M8284）。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ、１Ｕ／ｍＬのイソアミラーゼ、１Ｕ／ｍＬのマルトースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのポリリン酸−グルコキナーゼ、１０ｍＭのポリリン酸ナトリウム及び１０ｇ／Ｌのマルトデキストリン（アルドリッチ社製、Cat No. 419672）を含む０．７５ｍｌの反応システムを８０℃で４０時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトール（図５）の最終濃度は７．８ｇ／Ｌであり、転換率は７８％に達した。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
実施例７．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換
インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換の概略図を図６に示す。
セルラーゼはシグマ社から（Cat No. C2730）；ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。
セロデキストリンホスホリラーゼ（Cthe_2989）及びセロビオースホスホリラーゼ（Cthe_0275）は両方ともクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）由来である。これら二つの遺伝子は対応するゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡはＡＴＣＣの公式ウェブサイト(www.atcc.org)から入手できる)からＰＣＲによって異なるプライマーを用いて得られ、対応する発現ベクター（pET20b-CthCDP及びpET20b-CthCBP）を得るためシンプルクローニング（You, C., 他 (2012)）によりｐＥＴ２０ｂベクターにクローンされた。
２つのプラスミドの両方を、発現用大腸菌バクテリアBL21(DE3)に形質転換し、タンパク質発現及び精製を行った。タンパク質精製の結果は図７に示す。
本実験において、微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）が基質として用いられた。最初に市販のセルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）及びセルロース（１０ｇ／Ｌ）を氷水浴中で混合し、５分間置いた；混合物を４℃で遠心分離し、上澄みを捨てた。ペレットは、セルロース及びセルロースに結合することができるセルラーゼの混合物であった。この処置は、ほとんど全てのグルコシダーゼを市販のセルラーゼから除去し、グルコシダーゼによるセロビオースの加水分解からの大量のグルコースの生成を避け、それにより主要な加水分解物はセロビオース及びセロデキストリンである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌのセルロース及びセルラーゼの混合物を含む０．７５ｍｌの反応システムを５０℃で７２時間、触媒反応に供した。図８に示すとおり、最終的なイノシトールの最終濃度は１．４ｇ／Ｌであり、転換率は１４％に達した。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
実施例８．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換
セルラーゼはシグマ社から（Cat No. C2730）；ホスホグルコムターゼ, イノシトール-3-リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである；セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼの調製は実施例７と同じである。
本実験では、再生アモルファスセルロース（ＲＡＣ）を基質として用いた。これは、Ａｖｉｃｅｌの製品を濃縮リン酸処置（Zhang, Y. H. P., et al. (2006), "A Transition from Cellulose Swelling to Cellulose Dissolution by o-Phosphoric Acid: Evidence from Enzymatic Hydrolysis and Supramolecular Structure." Biomacromolecules 7(2): 644-648.）したものである。最初に市販のセルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）及びセルロース（１０ｇ／Ｌ）を氷水浴中で混合し、氷水浴中に５分間置いた；混合物を４℃で遠心分離し、上澄みを除去した。ペレットは、セルロース及びセルロースに結合することができるセルラーゼの混合物であった。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌのセルロース及びセルラーゼの混合物を含む０．７５ｍｌの反応システムを５０℃で７２時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトールの最終濃度は４．８ｇ／Ｌであり、転換率は４８％に達した。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
実施例９．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換
セルラーゼはシグマ社から（Cat No. C2730）である。ホスホグルコムターゼ、イノシトール-3-リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである；セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼの調製は実施例７と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの実施例８のセルロース及びセルラーゼの混合物を含む０．７５ｍｌの反応システムを４０℃で７２時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトールの最終濃度は２．３ｇ／Ｌであり転換率は２３％に達した。
実施例１０．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換  セルラーゼはシグマ社からである（Cat No. C2730）；ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである；セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼの調製は実施例７と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの実施例８のセルロース及びセルラーゼの混合物を含む０．７５ｍｌの反応システムを８０℃で７２時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトールの最終濃度は１．９ｇ／Ｌであり転換率は１９％に達した。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
実施例１１．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換  セルロース加水分解の最終生成物はグルコースであるので、これをイノシトールに転換するためにポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリリン酸を添加する必要がある。
セルラーゼはシグマ社からのものである（Cat No. C2730）；ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである；ポリリン酸−グルコキナーゼの調製は実施例４と同じである；セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼの調製は実施例７と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸基、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ、１０ｇ／Ｌの実施例８のセルロース及びセルラーゼの混合物、５Ｕ／ｍＬのポリリン酸−グルコキナーゼ並びに１０ｍＭのポリリン酸ナトリウムを含む０．７５ｍｌの反応システムを５０℃で７２時間、触媒反応に供した最終的なイノシトールの最終濃度は６．５ｇ／Ｌであり（図８）、転換率は６５％に達した。