【手続補正書】
【提出日】令和1年8月8日(2019.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の光開裂可能標識の存在を検出する工程を含む、第1抗原に特異的に結合することができる第1抗原結合性複合体を含むサンプル上または中の少なくとも第1抗原の存在を検出するための方法であって、
光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第1抗原結合性複合体へコンジュゲートされており、
第1抗原結合性複合体が、第1抗原へ非共有結合されて、式(I)： 
2018523826.tif 000001
の抗原結合された抗原結合性複合体を形成しており、
光開裂可能標識の存在が、第1抗原の存在を示し、かつ、
官能性リンカーが、一本鎖オリゴヌクレオチド、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはアルカンジイル(C≦16)である、
方法。
【請求項２】
（ｉ）光開裂可能標識を光開裂する工程をさらに含み、好ましくは、光開裂する工程が、サンプルを紫外線に曝露することを含む、または、
（ｉｉ）光開裂可能標識が、光開裂可能部分へ共有結合されたレポーター部分を含み、好ましくは、光開裂可能部分が、2-ニトロベンジル基、ベンゾイン基、クマリニル基、およびp-ヒドロキシフェナシル基からなる群より選択され、より好ましくは、光開裂可能部分が2-ニトロベンジル基であり、より一層好ましくは、2-ニトロベンジル基が、α炭素上および／もしくはベンゼン環上に置換を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、完全に二本鎖のオリゴヌクレオチドである、または、
（ｉｉ）少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、ヘアピンオリゴヌクレオチドである、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第1抗原結合性複合体が、式(II)：
2018523826.tif 000002
によって定義され、
第1抗原結合性複合体が、コンジュゲーション部分へ結合された一次抗体を含み、
抗原結合された抗原結合性複合体が、式(III)：
2018523826.tif 000003
によってさらに定義され、
好ましくは、
（ｉ）一次抗体が、少なくとも1つの還元剤によって修飾されており、
より好ましくは、少なくとも1つの還元剤がTCEPまたは2-MEAである、または、
（ｉｉ）コンジュゲーション部分がヘテロ二官能性リンカーであり、
より好ましくは、ヘテロ二官能性リンカーがSulfo-SMCCまたはSM(PEG)nである、または、
（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分が一次抗体へ共有結合されている、または、
（ｉｖ）コンジュゲーション部分が官能性リンカーへ共有結合されている、または、
（ｖ）官能性リンカーが、5'末端にC6アミノ修飾および3'末端に光開裂可能標識を有する部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第1抗原結合性複合体が、式(IV)：
2018523826.tif 000004
によって定義され
第1抗原結合性複合体が、第1リガンドへ共有結合された一次抗体を含み、
第1リガンドが、第1抗-リガンドへ非共有結合されており、
抗原結合された抗原結合性複合体が、式(V)：
2018523826.tif 000005
によってさらに定義され、
好ましくは、
（ｉ）サンプルを一次抗体および第1抗-リガンドと連続的に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉ）サンプルを一次抗体および第1抗-リガンドと同時に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉｉ）第1リガンドが、ビオチン、アビジンもしくはストレプトアビジン、または第1の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
より好ましくは、第1抗-リガンドが、アビジンもしくはストレプトアビジン、ビオチン、もしくは第1の一本鎖オリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的な第2の一本鎖オリゴヌクレオチドである、または、
（ｉｖ）光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第1抗-リガンドへ共有結合されており、より好ましくは、
（ａ）同じ光開裂可能標識の2つの事象(occurrence)が、官能性リンカーを通して第1抗-リガンドへ共有結合されている、または、
（ｂ）2つの異なる光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第1抗-リガンドへ共有結合されている、または、
（ｃ）官能性リンカーが、一本鎖オリゴヌクレオチド、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはアルカンジイル(C≦16)であり、より一層好ましくは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、完全に二本鎖のオリゴヌクレオチドであるか、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、ヘアピンオリゴヌクレオチドである、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第1抗原結合性複合体が、式(VI)：
2018523826.tif 000006
によって定義され、
第1抗原結合性複合体が、第1リガンドへ共有結合された一次抗体を含み、
第1リガンドが、第1抗-リガンドへ非共有結合されており、
第2リガンドが、第1抗-リガンドへ非共有結合されており、
抗原結合された抗原結合性複合体が、式(VII)：
2018523826.tif 000007
によってさらに定義され、
好ましくは、
（ｉ）サンプルを一次抗体、第1抗-リガンド、および／もしくは第2リガンドと連続的に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉ）サンプルを一次抗体、第1抗-リガンド、および／もしくは第2リガンドと同時に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉｉ）光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第2リガンドへ共有結合されており、より好ましくは、
（ａ）同じ光開裂可能標識の2つの事象が、官能性リンカーを通して第2リガンドへ共有結合されている、または、
（ｂ）2つの異なる光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第2リガンドへ共有結合されている、または、
（ｃ）官能性リンカーが、一本鎖オリゴヌクレオチド、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはアルカンジイル(C≦16)であり、より一層好ましくは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、完全に二本鎖のオリゴヌクレオチドであるか、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、ヘアピンオリゴヌクレオチドである、または、
（ｉｖ）第1リガンドが、ビオチン、もしくはアビジンもしくはストレプトアビジンである、または、
（ｖ）第1抗-リガンドが、アビジンもしくはストレプトアビジン、もしくはビオチンである、または、
（ｖｉ）第2リガンドが、ビオチン、もしくはアビジンもしくはストレプトアビジンである、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第1抗原結合性複合体が、式(VIII)：
2018523826.tif 000008
によって定義され、
第1抗原結合性複合体が、二次抗体によって結合された一次抗体を含み、
二次抗体が、第1リガンドへ共有結合されており、
第1リガンドが、第1抗-リガンドへ非共有結合されており、
抗原結合された抗原結合性複合体が、式(IX)：
2018523826.tif 000009
によってさらに定義され、
好ましくは、
（ｉ）サンプルを一次抗体、二次抗体、および／もしくは第1抗-リガンドと連続的に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉ）サンプルを一次抗体、二次抗体、および／もしくは第1抗-リガンドと同時に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉｉ）第1リガンドが、ビオチン、アビジンもしくはストレプトアビジン、または第1の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、第1抗-リガンドが、アビジンもしくはストレプトアビジン、ビオチン、もしくは第1の一本鎖オリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的な第2の一本鎖オリゴヌクレオチドである、または、
（ｉｖ）光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第1抗-リガンドへ共有結合されており、より好ましくは、
（ａ）同じ光開裂可能標識の2つの事象が、官能性リンカーを通して第1抗-リガンドへ共有結合されている、または、
（ｂ）2つの異なる光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第1抗-リガンドへ共有結合されている、または、
（ｃ）官能性リンカーが、一本鎖オリゴヌクレオチド、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはアルカンジイル(C≦16)であり、より一層好ましくは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、完全に二本鎖のオリゴヌクレオチドであるか、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、ヘアピンオリゴヌクレオチドである、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第1抗原結合性複合体が、式(X)：
2018523826.tif 000010
によって定義され、
第1抗原結合性複合体が、二次抗体によって結合された一次抗体を含み、
二次抗体が、第1リガンドへ共有結合されており、
第1リガンドが、第1抗-リガンドへ非共有結合されており、
第2リガンドが、第1抗-リガンドへ非共有結合されており、
抗原結合された抗原結合性複合体が、式(XI)：
2018523826.tif 000011
によってさらに定義され、
好ましくは、
（ｉ）サンプルを一次抗体、二次抗体、第1抗-リガンド、および／もしくは第2リガンドと連続的に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉ）サンプルを一次抗体、二次抗体、第1抗-リガンド、および／もしくは第2リガンドと同時に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉｉ）光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第2リガンドへ共有結合されており、より好ましくは、
（ａ）同じ光開裂可能標識の2つの事象が、官能性リンカーを通して第2リガンドへ共有結合されている、または、
（ｂ）2つの異なる光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第2リガンドへ共有結合されている、または、
（ｃ）官能性リンカーが、一本鎖オリゴヌクレオチド、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはアルカンジイル(C≦16)であり、より一層好ましくは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、完全に二本鎖のオリゴヌクレオチドであるか、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、ヘアピンオリゴヌクレオチドである、または、
（ｉｖ）第1リガンドが、ビオチン、もしくはアビジンもしくはストレプトアビジンである、または、
（ｖ）第1抗-リガンドが、アビジンもしくはストレプトアビジン、もしくはビオチンである、または、
（ｖｉ）第2リガンドが、ビオチン、もしくはアビジンもしくはストレプトアビジンである、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第1抗原結合性複合体が、式(XII)：
2018523826.tif 000012
によって定義され、
第1抗原結合性複合体が、二次抗体によって結合された一次抗体を含み、
二次抗体が、官能性リンカーを通して光開裂可能標識へ共有結合されており、
抗原結合された抗原結合性複合体が、式(XIII)：
2018523826.tif 000013
によってさらに定義され、
好ましくは、
（ｉ）サンプルを一次抗体および二次抗体と連続的に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉ）サンプルを一次抗体および二次抗体と同時に接触させる工程をさらに含む、または、
（ｉｉｉ）同じ光開裂可能標識の2つの事象が、官能性リンカーを通して二次抗体へ共有結合されている、または、
（ｉｖ） 2つの異なる光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して二次抗体へ共有結合されている、または、
（ｖ） 官能性リンカーが、一本鎖オリゴヌクレオチド、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはアルカンジイル(C≦16)であり、より一層好ましくは、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、完全に二本鎖のオリゴヌクレオチドであるか、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、ヘアピンオリゴヌクレオチドである、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第1抗原結合性複合体が、アプタマーを含み、
アプタマーが、官能性リンカーを通して光開裂可能標識へ共有結合されており、
抗原結合された抗原結合性複合体が、式(XIV)：
2018523826.tif 000014
によってさらに定義され、
好ましくは、サンプルをアプタマーと接触させる工程をさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
方法が、サンプル中の少なくとも2つの抗原の存在を検出する方法と定義され、方法が、サンプル中の少なくとも第2光開裂可能標識の存在を検出する工程をさらに含み、
第2光開裂可能標識が、官能性リンカーを通して第2抗原結合性複合体へコンジュゲートされており、
第2抗原結合性複合体が、第2抗原へ結合されており、
第2光開裂可能標識の存在が、第2抗原の存在を示し、
好ましくは、
（ｉ）第1光開裂可能標識を検出する工程および第2光開裂可能標識を検出する工程が、同時に行われる、または、
（ｉｉ）第1抗原結合性複合体および第2抗原結合性複合体が、各々、ユニークな光開裂可能標識を含む、または、
（ｉｉｉ）第1抗原結合性複合体および第2抗原結合性複合体が、各々、同じ光開裂可能標識を含む、または、
（ｉｖ）第1光開裂可能標識を検出する工程および第2光開裂可能標識を検出する工程が、連続的に行われ、より好ましくは、
（ａ）第2光開裂可能標識を検出する工程の前に、第1光開裂可能標識を光開裂する工程をさらに含み、より一層好ましくは、光開裂する工程が、サンプルを紫外線に曝露することを含む、または
（ｂ）第2光開裂可能標識の検出後に、第2光開裂可能標識を光開裂する工程をさらに含み、より一層好ましくは、光開裂が、サンプルを紫外線に曝露することを含む、または、
（ｖ）自動化された方法としてさらに定義される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）光開裂可能標識が、比色色素、蛍光色素、放射性標識、化学発光基、または生物発光基である、または、
（ｉｉ）サンプルが、組織切片、生検サンプル、細胞培養サンプル、細胞スミア、またはタンパク質溶解物である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
段階１〜９の方法のいずれかを行うように構成された装置であって、
サンプルを画像化するように構成されたイメージングシステム；
流体入口および流体出口を含むサンプルチャンバ；ならびに
複数のリザーバーを含む流体制御システムであって、サンプルチャンバの流体入口および流体出口と流体連結されており、かつ、前記複数のリザーバーが、
イメージング溶液を含有する第1リザーバー；
洗浄溶液を含有する第2リザーバー；
開裂溶液を含有する第3リザーバー；
バッファー溶液を含有する第4リザーバー；
ハイブリダイゼーション洗浄溶液を含有する第5リザーバー；および
ハイブリダイゼーション溶液を含有する第6リザーバーを含む、流体制御システム
を含む、装置。
【請求項１４】
（ｉ）流体制御システムが、サンプルの自動連続染色を提供するように構成されている、または、
（ｉｉ）流体制御システムが、サンプルチャンバとおよび複数のリザーバーと流体連結されているバルブをさらに含み、より好ましくは、バルブがロータリーバルブである、または、
（ｉｉｉ）第1抗原から第1抗原結合性複合体を光開裂するように構成された光源をさらに含む、または、
（ｉｖ）複数のリザーバーが、イメージング溶液を含有する第1リザーバーを含む、または、
（ｖ）複数のリザーバーが、洗浄溶液を含有する第2リザーバーを含む、または、
（ｖｉ）複数のリザーバーが、開裂溶液を含有する第3リザーバーを含む、または、
（ｖｉｉ）複数のリザーバーが、バッファー溶液を含有する第4リザーバーを含む、または、
（ｖｉｉｉ）複数のリザーバーが、ハイブリダイゼーション洗浄溶液を含有する第5リザーバーを含む、または、
（ｉｘ）複数のリザーバーが、ハイブリダイゼーション溶液を含有する第6リザーバーを含む、または、
（ｘ）流体制御システムが、サンプルチャンバとならびに第1、第2、第3、第4、第5および第6リザーバーと流体連結されているバルブをさらに含む、または、
（ｘｉ）サンプルチャンバが、
顕微鏡用スライド；
カバーガラス；および
顕微鏡用スライドとカバーガラスとの間に配置されたガスケット
を含み、より好ましくは、サンプルチャンバの流体入口および流体出口が、カバーガラスへ接続されている、または、
（ｘｉｉ）サンプルチャンバが、X-Y面で動くように構成されたプラットフォームへ接続されている、または、
（ｘｉｉｉ）サンプルチャンバの流体出口が、流体輸送デバイスへ接続されており、より好ましくは、前記流体輸送デバイスがシリンジポンプである、または、
（ｘｉｖ）イメージングシステムが、
顕微鏡；
光源；
ライトガイドアダプター；および
カメラ
を含む、または、
（ｘｖ）サンプルチャンバの流体出口が、流体輸送デバイスへ接続されている、より好ましくは、 流体輸送デバイスがシリンジポンプである、
請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
流体入口および流体出口を含むサンプルチャンバ；
サンプルチャンバ中のサンプルを画像化するように構成されたイメージングシステム；
サンプル上または中の第1抗原から第1抗原結合性複合体を光開裂するように構成された光源；ならびに
サンプルチャンバの流体入口および流体出口と流体連結されている流体制御システムであって、サンプルチャンバと流体連結されている複数のリザーバーを含む、流体制御システム
を含み、かつ、
前記複数のリザーバーが、
イメージング溶液を含有する第1リザーバー；
洗浄溶液を含有する第2リザーバー；
開裂溶液を含有する第3リザーバー；
バッファー溶液を含有する第4リザーバー；
ハイブリダイゼーション洗浄溶液を含有する第5リザーバー；および
ハイブリダイゼーション溶液を含有する第6リザーバー
を含み、好ましくは、
（ｉ）流体制御システムが、サンプルの自動連続染色を提供するように構成されており、より好ましくは、イメージングシステムが、サンプルの自動画像化を提供するように構成されている、または、
（ｉｉ）流体制御システムが、サンプルチャンバとならびに第1、第2、第3、第4、第5および第6リザーバーと流体連結されているバルブをさらに含み、より好ましくは、バルブがロータリーバルブである、または、
（ｉｉｉ）サンプルチャンバが、
顕微鏡用スライド；
カバーガラス；および
顕微鏡用スライドとカバーガラスとの間に配置されたガスケット
を含み、より好ましくは、サンプルチャンバの流体入口および流体出口が、カバーガラスへ接続されている、または、
（ｉｖ）サンプルチャンバが、X-Y面で動くように構成されたプラットフォームへ接続されている、または、
（ｖ）イメージングシステムが、
顕微鏡；
光源；
ライトガイドアダプター；および
カメラ
を含む、または、同時にまたはランダムアクセスによって複数のサンプルチャンバを染色および画像化するように構成されている、
サンプル上または中の少なくとも第1抗原の存在を検出するための装置。