【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年2月29日(2008.2.29)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】  Ｒｅｌタンパク質とステロイド受容体による調節因子の相乗活性
【特許請求の範囲】
【請求項１】  調節因子に対するステロイド受容体とＲｅｌタンパク質の相乗効果を調節することが可能な化合物の同定方法であって、
−ステロイド受容体とＲｅｌタンパク質により相乗的に活性化されることが可能な調節因子を含む細胞であって、更に調節因子の相乗的活性化を可能にするのに十分量の前記ステロイド受容体と前記Ｒｅｌタンパク質又はその機能的等価物を含む細胞を提供する段階と、
−前記細胞を少なくとも１種の化合物と接触させる段階と、
−調節因子の活性化が前記化合物によって調節されるかどうか判定することを含む、前記方法。
【請求項２】  前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β及び鉱質コルチコイド受容体又はその機能的等価物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】  Ｒｅｌタンパク質がＮＦ−κＢ１、Ｌｙｔ−１０、ｃＲｅｌ、ＲｅｌＡ及びＲｅｌＢ又はその機能的等価物からなる群から選択される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】  調節因子が５ＨＴ１−Ａ受容体遺伝子のプロモーター又はその機能的等価物である請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】  調節因子がＥセレクチン遺伝子のプロモーター又はその機能的等価物である請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】  前記細胞が、調節因子の活性化を指示することが可能なレポーター遺伝子でトランスフェクトされている請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】  ５ＨＴ１Ａ受容体遺伝子のプロモーター又はその機能的等価物を含む核酸でトランスフェクトされた細胞であって、
−ステロイド受容体又はその機能的等価物を前記細胞内で機能的に発現することが可能な前記ステロイド受容体をコードする核酸と、
−Ｒｅｌタンパク質を前記細胞内で機能的に発現することが可能な前記Ｒｅｌタンパク質又はその機能的等価物をコードする核酸を更に含む、前記細胞。
【請求項８】  前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β及び／又は鉱質コルチコイド受容体又はその機能的等価物からなる群から選択される請求項７に記載の細胞。
【請求項９】  Ｒｅｌタンパク質がＮＦ−κＢ１、Ｌｙｔ−１０、ｃＲｅｌ、ＲｅｌＡ及びＲｅｌＢ又はその機能的等価物からなる群から選択される請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１０】  前記細胞が、５ＨＴ１Ａ受容体遺伝子のプロモーターの活性化を指示することが可能なレポーター遺伝子でトランスフェクトされている請求項７から９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】  ５ＨＴ１Ａ受容体遺伝子のプロモーターを含む核酸及び／又はステロイド受容体をコードする核酸及び／又はＲｅｌタンパク質又はその機能的等価物をコードする核酸が前記細胞にトランスフェクトされている請求項７から１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】  Ｅ−セレクチン遺伝子のプロモーター又はその機能的等価物を含む核酸でトランスフェクトされた細胞であって、
−ステロイド受容体又はその機能的等価物を前記細胞内で機能的に発現することが可能な前記ステロイド受容体をコードする核酸と、
−Ｒｅｌタンパク質を前記細胞内で機能的に発現することが可能な前記Ｒｅｌタンパク質又はその機能的等価物をコードする核酸を更に含む、前記細胞。
【請求項１３】  前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β及び／又は鉱質コルチコイド受容体又はその機能的等価物からなる群から選択される請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】  Ｒｅｌタンパク質がＮＦ−κＢ１、Ｌｙｔ−１０、ｃＲｅｌ、ＲｅｌＡ及びＲｅｌＢ又はその機能的等価物からなる群から選択される請求項１２又は１３に記載の細胞。
【請求項１５】  前記細胞が、Ｅ−セレクチン遺伝子のプロモーターの活性化を指示することが可能なレポーター遺伝子でトランスフェクトされている請求項１２から１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】  Ｅ−セレクチン遺伝子のプロモーターを含む核酸及び／又はステロイド受容体をコードする核酸及び／又はＲｅｌタンパク質又はその機能的等価物をコードする核酸が前記細胞にトランスフェクトされている請求項１２から１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】  セロトニン受容体の脳中濃度を調節する化合物の同定における請求項７から１６のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項１８】  医薬として使用されるための、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法で同定された化合物。
【請求項１９】  中枢神経系疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１から４及び６のいずれか一項に記載の方法で同定された化合物の使用。
【請求項２０】  循環系疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１から３、５又は６のいずれか一項に記載の方法で同定された化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はステロイド受容体とＲｅｌタンパク質の相乗作用により調節因子を活性化する新規に発見されたメカニズムを調節することが可能な化合物の同定方法に関する。本発明は核酸をトランスフェクトした細胞と、調節因子の制御下に遺伝子発現レベルを調節する化合物の同定アッセイにおける前記細胞の使用と、このようなアッセイで同定された化合物の医薬的使用にも関する。
【０００２】
核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）／Ｒｅｌファミリーの転写アクチベータータンパク質のメンバーはその阻害タンパク質（Ｉ−κＢ）に密接な関係があり、細胞質に存在する。これらのメンバーは前炎症性サイトカインにより誘導することができ、化学誘引物質、サイトカイン（ＮＦ−κＢにより誘導されるサイトカイン自体を含む）、サイトカイン受容体及び細胞接着分子の転写を誘導するので免疫作用と炎症作用に重要である。誘導後、ｒｅｌタンパク質は二量化して核に移動し、その標的遺伝子のプロモーター中のＮＦ−κＢ結合モチーフを介して標的遺伝子を活性化する。種々のＮＦκＢ二量体により認識されるＤＮＡ配列を試験した結果、好ましい標的部位は既存のｒｅｌタンパク質の二量体の組合せにより多少異なり（Ｃｈｅｎら，−Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６７−７３，１９９８；Ｋｕｎｓｃｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１２−４４２１，１９９２；ＰａｒｒｙとＭａｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０８２３−２０８２５，’９４）、種々のプロモーターで同定されたＮＦκＢ応答因子が幅広く変動することが裏付けられた。
【０００３】
Ｒｅｌタンパク質の二量化と核内移動は細菌及びウイルス病原体、免疫及び炎症性サイトカイン並びに各種細胞傷害物質を含む多数の物質により誘導される。このファミリーの転写因子はエストロゲン受容体や糖質コルチコイド受容体等のステロイド受容体と相互作用して標的遺伝子を抑制することが判明したので、Ｒｅｌタンパク質による活性化の標的となる遺伝子は更に多いと思われる。
【０００４】
エストロゲンと他のステロイドは中枢神経系に強い作用がある（１）。特に、エストロゲンは脳セロトニン系を調節できるため、鬱病とその治療に関連するメカニズムに関与していると思われる（２，３）。しかし、ＥＲ発現は広く分布しているので、エストロゲンがアテローム硬化症、アルツハイマー病及び骨粗鬆症に対する保護を含む数種の他の有益な効果をもつことも意外ではない。エストロゲン治療による乳癌や子宮内膜癌の危険の増加といった副作用の危険を減らすために、組織選択的ＥＲ結合化合物の研究に多大な労力が費やされている。
【０００５】
エストロゲン以外に、他のステロイド受容体の組織選択的効果も大きな注目を集めている。これらのステロイド受容体についても、大半種のステロイド受容体は組織分布が広いため、１組の組織又は臓器（例えば精神病の脳）のみを標的とする化合物の開発を阻んでいる。このため、ステロイド受容体に媒介される効果を組織選択的にスクリーニングできるようなアッセイが大きな関心を集めている。
【０００６】
エストロゲンの効果は核ホルモン受容体のサブファミリーに属する２種のエストロゲン受容体（ＥＲα及びβ）により媒介されることが知られている（１５〜１８）。これらの２種のＥＲは十分に保存されたモジュール構造を共有する。ＤＮＡ結合ドメインはＥＲα及びβ間で高度に保存されており（一致度９６％）、リガンド結合ドメインも比較的十分に保存されている（一致度５８％）が、Ａ／Ｂ領域は２種の受容体間で保存度が低い（一致度２０％）。リガンド結合後、活性化された受容体は二量化し、標的遺伝子の調節領域に位置するエストロゲン応答因子（ＥＲＥ）と呼ばれる特定ＤＮＡ配列と相互作用する。その後、ＤＮＡに結合した受容体は転写を正又は負に調節することができる。ＥＲαについては、Ａ／Ｂドメインに位置するＡＦ−１とリガンド結合ドメインに位置するＡＦ−２の２種のトランス活性化領域により転写調節を媒介することが知られている。これらの２種のトランス活性化領域は細胞やプロモーターの状況に応じて独立して機能する場合と協同する場合がある（１９，２０）。最近、エストロゲンが標的遺伝子を調節する他のメカニズムも発見された。これらはＥＲ作用の標的配列として調節因子を利用する遺伝子（２１）や、ＡＰ−１やＳｐ１のように夫々のＤＮＡ結合部位に結合した他の転写因子との相互作用を介してＥＲにより調節される遺伝子（２２〜２３，３６〜３８）である。
【０００７】
本発明者らはＮＦ−κＢとステロイド受容体ファミリーのメンバーが相乗的に作用して種々の調節因子との相互作用により遺伝子発現を活性化するメカニズムを発見したことを今般報告する。Ｒｅｌタンパク質とステロイド受容体の相互阻害については多くの報告があるが、このような相乗活性化はまだ報告されていない。新規に発見されたメカニズムは調節因子の発現を調節する化合物を開発するために必要な手段を提供する。調節因子によってはこのような化合物が局在ステロイド受容体を介して作用するにも拘らず組織選択的応答を生じる場合もある。
【０００８】
第１の例として、本発明者らはエストロゲンがセロトニン系を調節する分子メカニズムを検討した。具体的には、５−ＨＴ１Ａ受容体遺伝子に対するエストロゲンの効果を検討した。セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン，５−ＨＴ）は種々の行動プロセスの制御に関与している（４）。セロトニン系の調節障害は鬱病や不安等の神経精神障害に重要な役割を果たすと考えられる（５，６）。セロトニンの複雑な作用は大きいファミリーの関連受容体により媒介される（７）。アデニル酸シクラーゼを負に調節するＧタンパク質結合受容体である５−ＨＴ１Ａ受容体が特に注目されている（８）。５−ＨＴ１Ａ受容体は制限されたパターンで脳で発現され、辺縁領域、大脳皮質及び脳縫線核に高レベルの受容体が検出された（９〜１１）。本発明者らはＥＲαがＮＦ−κＢと相乗的に作用して５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターを活性化することを今般報告する。この活性化はホルモンの不在下でも生じたが、１７β−エストラジオール（Ｅ２）又は４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨ−Ｔ）の添加のみならずＩＣＩ１６４３８４によっても誘導することができた。ＥＲβもこの効果を媒介することができたが、この場合にはＥＲαの効果のほうが著しく強かった。更に、本発明者らはこの相乗活性化がＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットのトランス活性化ドメインとＡＦ−１を含むＥＲαのＡ／Ｂドメインの両者に依存することを見出した。本発明者らの知見によると、エストロゲンはＮＦ−κＢとＥＲによる相乗活性化を介する新規メカニズムにより５−ＨＴ１Ａ受容体の発現を調節すると思われる。
【０００９】
同一相乗効果がＮＦ−κＢと鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）等のステロイド受容体によりＥ−セレクチンプロモーターの活性化にも関与していることが意外にも判明した。これについては図７と明細書の後欄で詳細に説明する。調節因子を介するＮＦ−κＢとの相乗効果はＥＲに限定されず、ＭＲでも認められることが分かったので、他のステロイド受容体にも同様の結果が期待される。
【００１０】
本発明によると、新規に発見されたメカニズムを調節することが可能な化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを設計することが可能になる。例えば、５ＨＴ１Ａ受容体は脳組織のみに存在し、Ｅ−セレクチンは内皮細胞のみにより発現されるので、このようなアッセイで検出されるリガンドはＣＮＳ疾患及び／又は循環系疾患を治療するために特異的に使用することができ、従って、組織特異的に作用する化合物を同定することができる。このようなリガンドから他の組織を標的とするものを排除するアッセイは標準手法であり、当業者に公知である。
【００１１】
本発明において、本発明者らは５−ＨＴ１Ａ受容体のシス調節領域が２個の推定ＮＦ−κＢ結合部位を含み、ＮＦ−κＢタンパク質の存在がＥＲによる相乗誘導に不可欠であることも報告する。これは、ＮＦ−κＢ複合体がＥＲと協同して５−ＨＴ１Ａ受容体遺伝子発現を相乗的に調節することを示す。従来検討されている大半の系では、エストロゲンとＮＦ−κＢのシグナル伝達経路は相互に拮抗している。例えば、ＩＬ−６プロモーターの調節は広く研究されており、ＮＦ−κＢにより誘導されるこの遺伝子の活性化はエストロゲンにより明白に阻害することができた（３３，３４）。これらの知見と同様に、本発明者らは人工ＮＦ−κＢレポーター構築物とＥ−セレクチンプロモーター（図７）でエストロゲンがＮＦ−κＢ活性を阻害することを立証した。しかし、５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターではエストロゲンはＮＦ−κＢにより誘導される活性を更に増し、エストロゲンによる正又は負の調節がプロモーターの状況に依存することが予想された。
【００１２】
ＥＲαとＥＲβはＤＮＡ結合ドメインにおいて高度の相同性を示し、リガンド結合ドメインで中度の相同を示すが、Ａ／Ｂ領域は２種の受容体間の保存度が低い。数種の異なるアプローチに基づき、ＮＦ−κＢとＥＲによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化はＡＦ−１を含むＥＲαのＮ末端領域に依存することが判明した。第１に、ＥＲβのＡ／Ｂ領域をＥＲαのＡ／Ｂ領域で置換すると（ＥＲα／β）、５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの活性化に関して野生型ＥＲαよりも更に強力なキメラ受容体が得られた。他方、ＥＲαのＡ／Ｂ領域をＥＲβのＡ／Ｂ領域で置換すると（ＥＲβ／α）、受容体はプロモーターを相乗的に活性化することが全くできなくなった。第２に、ＡＦ−２欠損突然変異体であるＥＲα１−３３９による相乗活性化は野生型ＥＲαと同等であったが、ＡＦ−１欠損突然変異体であるＥＲα１２１−５９９の効果は野生型ＥＲβと同等であった。第３に、ＥＲβがこの相乗効果を媒介する効果はＥＲαに比較して著しく弱かった。第４に、ＡＦ−２のみを阻害する部分抗エストロゲンＯＨ−Ｔは５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの活性化に関してＥ２と同程度に強力であった。抗エストロゲンのＡＦ−１に媒介されるアゴニスト効果はＥＲβのＡ／Ｂ領域ではなくＥＲαのＡ／Ｂ領域を介することが最近報告されている（２８）。ＥＲαとＥＲβのこれらの相違は２種のＥＲサブタイプの調節機能が異なることを示唆している。これらのデータをまとめると、ＥＲαＡＦ−１は５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーター調節に明白に関与している。
【００１３】
本発明者らの知見は、ＮＦ−κＢ複合体とＮＦ−κＢ結合部位がＥＲによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化に重要な役割を果たすことを明示している。しかし、−９０１ｌｕｃ構築物で２種のＮＦ−κＢ分子を突然変異させると、ＥＲ効果は維持されたが、ＮＦ−κＢ効果は失われた。１つの仮説として、ＮＦ−κＢタンパク質はモノマーとしてこれらの突然変異κＢ因子に結合すると考えられる。このＮＦ−κＢ−ＤＮＡ複合体はこの構成では転写活性できず、ＥＲにより安定化されると予想されるため、５−ＨＴ１Ａ受容体遺伝子のプロモーター中の他の応答配列に対応して活性化される。更に、ＥＲαの機能的ＤＮＡ結合ドメインは必要であるが、ＥＲＥレポーターと５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターのＥＲα活性に明白な相関がないことはＥＲα突然変異体とキメラの使用から明らかである。従って、５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化を説明する最も有望な仮説は、ＥＲがＤＮＡとの直接結合ではなくタンパク質−タンパク質相互作用によりこのプロモーターを活性化すると説明できる。ＥＲαはＥＲαのＤＮＡ結合ドメインとｐ６５のＲＨＤを介してｐ６５と直接相互作用することが記載されている（３４）ので、ＥＲαのＤＮＡ結合ドメインとｐ６５の無傷ＲＨＤの両方が相乗活性化に必要であるという事実によりこのモデルは裏付けられる。更に、この応答にはｐ６５とＥＲαのＡＦ−１両者のトランス活性化ドメインが必須である。従って、本発明の結果はＮＦ−κＢ複合体がＥＲと協同してＡＦ−１を介してコアクチベーターを複合体に補充し、それにより５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターを相乗的に活性化することを示唆している。
【００１４】
古典的ホルモン活性化経路に加え、他のシグナル伝達経路がＥＲαを含む多数のステロイド受容体をホルモンリガンドから独立して調節することも記載されている。核受容体はリン酸化を介してドーパミン、成長因子及びＰＫＡアクチベーター等の非ステロイド物質により活性化されることが示されている（３９）。ＥＲαのリン酸化は受容体活性を増すことが示されており、主要リン酸化部位は受容体のＡ／Ｂ領域に位置する（４０，４１）。最近、ＥＲβＡＦ−１のリン酸化は補因子の補充と非ステロイドアクチベーターによる遺伝子活性化を調節し（４２）、ペルオキシソームプロリフィレーター活性化受容体γのＡ／Ｂドメインのリン酸化はその転写活性を低下させる（４３）ことが報告された。ＥＲαとＥＲβのＡ／Ｂ領域内に数個のキナーゼ部位が存在することからＡＦ−１ドメインのリン酸化が変動し、その結果、種々のアクチベーターにより受容体の種々の応答を生じるのではないかと思われる。この別経路の存在はホルモン非依存性受容体活性化におけるＡＦ−１の重要性を強く裏付けている。
【００１５】
いくつかの証拠から、エストロゲンはＣＮＳにおける５−ＨＴ１Ａ受容体発現も調節すると思われる。例えば、出産前と閉経開始時のエストロゲン低下は負の効果と相関しているが（４４）、エストロゲン添加療法により女性の鬱病又は不安を緩和できる場合がある（４５，４６）。更に、卵巣摘出により５−ＨＴ結合部位と５−ＨＴ輸送体結合部位が減少した（１２〜１４）が、卵巣摘出したラットにエストロゲンを添加するとこの減少は食止められた。ＥＲαとＥＲβのいずれも皮質、海馬及び縫線核を含む脳の複数の領域で同定されている（４７）。更に、ＮＦ−κＢが脳、特に皮質と海馬で活性であることも記載されている（４８）。同時に、ＮＦ−κＢが免疫細胞で機能するだけでなく、ニューロン柔軟性、神経変性及びニューロン発生等のプロセスに固有の役割をもつことが立証されつつある（４９）。即ち、これらの転写因子及び経路は脳における５−ＨＴ１Ａ受容体遺伝子発現の調節に重要な役割を果たすと思われる。エストロゲンが気分や精神状態に著しく強い作用をもつことに対する一因はこのホルモンがセロトニン作動性受容体機能を調節できるためであると思われる。
【００１６】
ステロイド受容体とＲｅｌタンパク質の相乗活性化はＥ−セレクチンプロモーターでも見られた。Ｅ−セレクチンプロモーター活性に対する鉱質コルチコイドの効果を調べるために、ＭＲをコードする発現ベクターと共にＥ−セレクチンプロモーターの部分を含むルシフェラーゼレポーター構築物をＵ−２ＯＳ細胞に一過的にトランスフェクトした。図７Ａに示すように、ＩＬ−１βにより誘導したプロモーター活性はＭＲにより相乗的に刺激された。ＭＲの存在下にＮＦ−κＢにより誘導したＥ−セレクチンプロモーターのこの活性はアルドステロンを加えると更に増強することができた。Ｅ−セレクチンプロモーターを含まないルシフェラーゼベクターで実験を繰返すことによりこのメカニズムの選択性が判明した。ＩＬ−１β及び／又のＭＲに対する効果は認められなかった（図７Ｂ）。
【００１７】
興味深いことに、ＭＲの代わりにＥＲαをコトランスフェクトすると、Ｅ−セレクチンプロモーター活性に対する相乗効果は認められなかった。その代わりに、これらの条件下ではＩＬ−１βにより誘導されるプロモーター活性はリガンドがなければＥＲαにより抑制されず、この効果は１７β−エストラジオールを加えると更に増した（図７Ｃ）。これらの結果もリガンドで活性化した受容体とＮＦ−κＢの相乗効果が特定プロモーターの状況と特定ステロイド受容体−プロモーター組合せの選択性に依存することを示している。
【００１８】
Ｅ−セレクチンプロモーターは、Ｅ−セレクチンプロモーターに対する鉱質コルチコイドの相乗効果に関与している可能性が最も高い多重ＮＦ−κＢコンセンサス部位を含む（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｇ．Ｉ．，Ｋｉｍ，Ｊ．，Ｅｄｄｙ，Ｒ．，Ｓｈｏｗｓ，Ｔ．，Ｇｉｍｂｒｏｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．Ｐ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２４６６−２４７３）。ＭＲとの上記相乗効果におけるＮＦ−κＢの役割はＴＫプロモーターの前にコンセンサスＮＦ−κＢ結合部位３コピーを含む合成レポーター構築物である３＊ＮＦ−κＢ−ＴＫレポーターで鉱質コルチコイドの効果を調べる試験で確認された（図７Ｄ）。図７Ｄに使用した目盛に示すように、合成３＊ＮＦ−κＢ−ＴＫレポーターはＩＬ−１βによる刺激とＭＲの相乗効果の両者に著しく感受性である。このことは、このレポーターがＮＦ−κＢ応答因子の多重反復を含むので、意外ではない。アルドステロンを加えてもｒｅｌタンパク質とＭＲの相乗効果がそれ以上増加しないのは、アルドステロンの不在下でＩＬ−１βとＭＲの相乗効果が大きいためであると思われる。ＭＲとＥＲがＩＬ−１βがなければプロモーター活性を誘導又は抑制できるという知見（図７Ａ、Ｃ及びＤ、３番目と４番目の棒参照）は、Ｕ−２ＯＳ細胞がサイトカインがなければＮＦ−κＢ活性を構成的に含むことを示唆している。あるいは、Ｕ−２ＯＳ細胞自体がサイトカインを生産しているか、細胞を培養した血清からサイトカイン活性が誘導されるとも考えられる。Ｅ−セレクチンプロモーターと３＊ＮＦ−κＢ−ｔｋレポーターの調節に他種転写因子も関与している可能性（Ｋａｓｚｕｂｓｋａ，Ｗ．，Ｈｏｏｆｔ  ｖａｎ  Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ，Ｒ．，Ｇｈｅｒｓａ，Ｐ．，ＤｅＲａｅｍｙ−Ｓｃｈｅｎｋ，Ａ．−Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｐ．，Ｈａｉ，Ｔ．，Ｄｅｌａｍａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｗｈｅｌａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７１８０−７１９０）もあるが、上記結果は、少くともＮＦ−κＢが鉱質コルチコイドによる該プロモーター−レポーターの刺激に重要な役割を果たしていることを示している。ＩＬ−１βにより誘導したＲｅｌタンパク質との相乗作用又は拮抗作用におけるＥＲαとＭＲの上記相違はＥＲα又はＭＲと種々のＮＦ−κＢを含む複合体の活性差に起因すると思われる。更に、本発明は、種々の核受容体がＮＦ−κＢ応答性プロモーターに対してＮＦ−κＢと相乗効果をもつことも報告する。効果の厳密な性質はステロイド受容体種の組合せとプロモーターの種類に明白に依存する。
【００１９】
以上、本発明の数種の特定態様について記載したが、当然のことながら当業者はＲｅｌタンパク質とステロイド受容体により相乗的に活性化される他の調節因子を選択できる。要約すると、これはＲｅｌタンパク質とステロイド受容体をコードする発現ベクターと共にレポーター遺伝子に機能的に結合した特定調節因子をコトランスフェクトすることにより最良に実施することができる。特に、ＮＦ−κＢとステロイド受容体をコードする発現ベクターがこの目的に適している。ステロイド受容体はＥＲαでもＭＲでもよいし、ＥＲβでもＥＲαとＥＲβの併用でもよい。これらの例は本発明により相乗的に活性化することが可能な調節因子を更に選択するために必要な手段を提供する。
【００２０】
Ｒｅｌタンパク質とステロイド受容体が相互作用して調節因子を相乗的に活性化する新規メカニズムの発見に伴い、この新規メカニズムに特異的に相互作用する化合物をスクリーニングすることが可能性になる。従って、本発明の一態様として調節因子に対するステロイド受容体とＲｅｌタンパク質の相乗効果を調節することが可能な化合物の同定方法として、
−ステロイド受容体とＲｅｌタンパク質により相乗的に活性化することが可能な調節因子を含み、更に調節因子の相乗活性化を可能にするために十分な量の前記ステロイド受容体と前記Ｒｅｌタンパク質又はその機能的等価物を含む細胞を提供する段階と、
−前記細胞を少なくとも１種の化合物と接触させる段階と、
−調節因子の活性化が化合物により調節されるか否かを決定する段階を含む方法に関する。
【００２１】
Ｒｅｌタンパク質とステロイド受容体の相乗効果を調節することが可能な化合物としては相乗効果を刺激又は抑制する化合物が挙げられる。セロトニン１Ａ受容体のプロモーター又はＥ−セレクチンプロモーターに対する所定のステロイド受容体とＲｅｌタンパク質の相乗効果を刺激することが可能な公知化合物の例は実施例の項に示す。
【００２２】
この点でＲｅｌタンパク質の機能的等価物とはＲｅｌドメインに相同があり、遺伝子調節に関与するＲｅｌファミリーのタンパク質複合体と解釈すべきであり（ＬｉｏｕとＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：４７７−４８７，１９９３）、例えばＮＦ−κＢ１、Ｌｙｔ−１０、ｃＲｅｌ、ＲｅｌＡ及びＲｅｌＢが挙げられるが、これらに限定されない。所定生物機能を維持するＮＦ−κＢの機能的等価物でもよく、少なくともＮＦ−κＢのトランス活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインを含むフラグメントが好ましい。
【００２３】
「調節因子」又は「プロモーター」とは細胞内でＲＮＡポリメラーゼと直接又は間接的に結合し、下流（３’側）コーディング配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ配列を意味する。
【００２４】
調節因子の活性化を指示することが可能な異種レポーター遺伝子にプロモーターを結合してもよい。このような構築物では、プロモーターは異種遺伝子からの転写に作用する。適切なレポーター遺伝子は例えばルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び分泌胎盤アルカリホスファターゼである。
【００２５】
この点でＥＲの機能的等価物とは少なくともＥＲαのＡＦ−１トランス活性化領域とＥＲαのＤＮＡ結合ドメインを含むＥＲ断片と解釈すべきである。
【００２６】
「機能的等価物」なる用語は一般に元の分子と同一生物機能を発揮することが可能な分子と解釈すべきである。
【００２７】
細胞中のステロイド受容体とＲｅｌタンパク質の量は調節因子の相乗活性化を生じるために十分な量でなければならない。これは十分な量のステロイド受容体とＲｅｌタンパク質を構成的に合成する適切な細胞又は適当な因子を加えてステロイド受容体とＲｅｌタンパク質の発現を誘導することが可能な適切な細胞を選択することにより得られる。あるいは、適当な組換えＤＮＡベクターと当分野で公知のトランスフェクション法を使用してステロイド受容体とＲｅｌタンパク質を細胞にトランスフェクトしてもよい。
【００２８】
好適な態様としては、本発明は前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β及び／又は鉱質コルチコイド受容体又はその機能的等価物から構成される群から選択される上記方法に関する。
【００２９】
別の好適態様では、本発明はＲｅｌタンパク質がＮＦ−κＢ、Ｌｙｔ−１０、ｃＲｅｌ、ＲｅｌＡ及びＲｅｌＢ又はその機能的等価物から構成される群から選択される上記方法に関する。
【００３０】
別の好適態様では、本発明は調節因子が５ＨＴ１−Ａ受容体遺伝子のプロモーター又はその機能的等価物である上記方法に関する。
【００３１】
別の好適態様では、本発明は調節因子がＥセレクチン遺伝子のプロモーター又はその機能的等価物である上記方法に関する。
【００３２】
別の好適態様では、本発明は調節因子の活性化を指示することが可能なレポーター遺伝子を前記細胞にトランスフェクトする上記方法に関する。
【００３３】
本発明は更に５ＨＴ１Ａ受容体遺伝子のプロモーター又はその機能的等価物を含む核酸をトランスフェクトした細胞にも関し、前記細胞は該当ステロイド受容体又はその機能的等価物を前記細胞内で機能的に発現することが可能なステロイド受容体をコードする核酸と、該当Ｒｅｌタンパク質を前記細胞内で機能的に発現することが可能なＲｅｌタンパク質又はその機能的等価物をコードする核酸を更に含む。
【００３４】
本発明は更に前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β及び／又は鉱質コルチコイド受容体又はその機能的等価物から構成される群から選択される本発明の細胞に関する。
【００３５】
本発明は更にＲｅｌタンパク質がＮＦ−κＢ、Ｌｙｔ−１０、ｃＲｅｌ、ＲｅｌＡ及びＲｅｌＢ又はその機能的等価物から構成される群から選択される本発明の細胞に関する。
【００３６】
本発明は更に５ＨＴ１Ａ受容体遺伝子のプロモーターの活性化を指示することが可能なレポーター遺伝子を前記細胞にトランスフェクトした本発明の細胞に関する。
【００３７】
本発明は更に５ＨＴ１Ａ受容体遺伝子のプロモーターを含む核酸及び／又はステロイド受容体をコードする核酸及び／又はＲｅｌタンパク質又はその機能的等価物をコードする核酸を前記細胞にトランスフェクトした本発明の細胞に関する。
【００３８】
本発明は更にＥ−セレクチン遺伝子のプロモーター又はその機能的等価物を含む核酸をトランスフェクトした細胞に関し、前記細胞は該当ステロイド受容体又はその機能的等価物を前記細胞内で機能的に発現することが可能なステロイド受容体をコードする核酸と、該当Ｒｅｌタンパク質を前記細胞内で機能的に発現することが可能なＲｅｌタンパク質又はその機能的等価物をコードする核酸を更に含む。
【００３９】
本発明は更に前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β及び／又は鉱質コルチコイド受容体又はその機能的等価物から構成される群から選択される本発明の細胞に関する。
【００４０】
本発明は更にＲｅｌタンパク質がＮＦ−κＢ、Ｌｙｔ−１０、ｃＲｅｌ、ＲｅｌＡ及びＲｅｌＢ又はその機能的等価物から構成される群から選択される本発明の細胞に関する。
【００４１】
本発明は更にＥ−セレクチン遺伝子のプロモーターの活性化を指示することが可能なレポーター遺伝子を前記細胞にトランスフェクトした本発明の細胞に関する。
【００４２】
本発明は更にＥ−セレクチン遺伝子のプロモーターを含む核酸及び／又はステロイド受容体をコードする核酸及び／又はＲｅｌタンパク質又はその機能的等価物をコードする核酸を前記細胞にトランスフェクトした本発明の細胞に関する。
【００４３】
本発明は更にセロトニン受容体の脳濃度を調節する化合物の同定における上記細胞の使用に関する。
【００４４】
本発明は上記方法で同定された医薬用化合物にも関する。
【００４５】
本発明は中枢神経系疾患治療用医薬の製造における上記方法で同定された化合物の使用にも関する。
【００４６】
好適態様において、ステロイド受容体とＲｅｌタンパク質の相乗効果を調節する化合物はＲｅｌタンパク質又はステロイド受容体が個々に調節因子に作用するメカニズムには作用しない。これらの化合物は化合物の臨床使用に最も望ましい選択性を提供する。
【００４７】
図面の説明
図１。ＮＦ−κＢとヒトＥＲαによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化。（Ａ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクター（白棒）とＥＲαもしくはＥＲβをコードする発現ベクター（線影棒）と共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトし、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクターとＥＲαもしくはＥＲβをコードする発現ベクターと共に４×ＮＦ−κＢ（ＨＩＶ）ｔｋｌｕｃをＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（白棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【００４８】
図２。ＮＦ−κＢとヒトＥＲαによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーター調節におけるκＢ因子の重要性。（Ａ）使用したルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーター構築物の模式図であり、ラット５−ＨＴ１Ａ受容体（５−ＨＴ１ＡＲ）プロモーター欠失を含む。２個の白丸（○）はＮＦ−κＢ結合部位を示す。（Ｂ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクター（白棒）とＥＲαをコードする発現ベクター（線影棒）と共に各種指定レポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトし、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【００４９】
図３。ＯＨ−ＴはＮＦ−κＢとヒトＥＲαにより５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの活性を増すことができるが、ＩＣＩはできない。（Ａ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクターとＥＲαもしくはＥＲβをコードする発現ベクターと共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトし、Ｅ２、ＯＨ−Ｔ又はＩＣＩで２４時間指定通りに処理した。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【００５０】
図４。ＮＦ−κＢとヒトＥＲαによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化にはｐ６５のトランス活性化機能が必要である。空の発現ベクター又は指定通りにｐ５０、ｐ６５、ｐ６５ＲＨＤもしくはｐ６５Ｎｓｉをコードする発現ベクター（白棒）とＥＲαをコードする発現ベクター（線影棒）と共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトし、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢサブユニットにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【００５１】
図５。マウスＥＲαによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化はＡＦ−２非依存的に生じる。（Ａ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクターとマウスＥＲα、ＥＲβ、ＥＲα１２１−５９９、ＥＲα１−３３９もしくはＥＲαＣ２４１／２４４Ａをコードする発現ベクターと共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（線影棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）空の発現ベクター又はマウスＥＲα、ＥＲβ、ＥＲα１２１−５９９、ＥＲα１−３３９もしくはＥＲαＣ２４１／２４４Ａをコードする発現ベクターと共に３×ＥＲＥ−ＴＡＴＡｌｕｃをＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（線影棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＥＲにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【００５２】
図６。５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化にはＥＲαのＡ／Ｂドメインが必須である。（Ａ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクターとヒトＥＲα、ＥＲβ、ＥＲα／βもしくはＥＲβ／αをコードする発現ベクターと共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（線影棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）空の発現ベクター又はヒトＥＲα、ＥＲβ、ＥＲα／βもしくはＥＲβ／αをコードする発現ベクターと共に３×ＥＲＥ−ＴＡＴＡｌｕｃをＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（線影棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＥＲにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【００５３】
図７。ＮＦ−κＢと夫々ＭＲ又はＥＲαによるＥ−セレクチンプロモーターの相乗活性化又はトランス抑制。（Ａ）Ｅ−セレクチンプロモーター−レポーターをＵ−２ＯＳ細胞に一過的にコトランスフェクトし、０．１μＭアルドステロンの不在下又は存在下にＩＬ−１β、ＭＲのコトランスフェクション又はＩＬ−１βとＭＲの併用の効果を測定した。（Ｂ）ＥＬＡＭプロモーターを含まないルシフェラーゼ−レポーターをＵ−２ＯＳ細胞に一過的にコトランスフェクトし、０．１μＭアルドステロンの不在下又は存在下にＩＬ−１β、ＭＲの同時発現又はＩＬ−１βとＭＲの併用の効果を測定した。（Ｃ）Ｅ−セレクチンプロモーター−レポーターをＵ−２ＯＳ細胞に一過的にコトランスフェクトし、０．１μＭ１７β−エストラジオールの不在下又は存在下にＩＬ−１β、ＭＲのコトランスフェクション又はＩＬ−１βとＥＲαの併用の効果を測定した。（Ｄ）合成３＊ＮＦ−κＢ−ｔｋプロモーター−レポーターをＵ−２ＯＳ細胞に一過的にコトランスフェクトし、０．１μＭアルドステロンの不在下又は存在下にＩＬ−１β、ＭＲのコトランスフェクション又はＩＬ−１βとＭＲの併用の効果を測定した。未処理細胞（各図の最初の棒）に比較した誘導倍率として結果を表す。全値は２回測定値の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。Ａ、Ｂ、ＣとＤで目盛が異なることに留意されたい。
【００５４】
実施例
実施例１
使用した材料と方法
特定試薬。１７β−エストラジオールはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。４−ヒドロキシタモキシフェンとＩＣＩ１６４３８４は英国Ｚｅｎｅｃａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＡ．Ｗａｋｅｌｉｎｇ博士の寄贈品を用いた。
【００５５】
細胞培養。サルＣＯＳ−１細胞とヒト２９３胚性腎細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、ＤＭＥＭとＨａｍのＦ−１２培地（ＤＦ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）の１：１混合物を重炭酸塩で緩衝し、７．５％ＦＣＳを加えた中で培養した。従来記載されているように（２５）ＦＣＳをデキストラン被覆活性炭で処理してステロイドを除去することによりデキストラン被覆活性炭（ＤＣＣ）−ＦＣＳを調製した。
【００５６】
プラスミド。−９０１ｌｕｃはＯ．Ｍｅｉｊｅｒ博士（オランダ、ライデン）の寄贈品である−１５８８ｌｕｃをＳｔｙＩで部分消化し、平滑化し、ＳｍａＩで消化したｐＧＬ３に連結し、ＨｉｎｄＩＩＩで再消化して再連結することにより構築し、−８１ｌｕｃは−１５８８ｌｕｃをＳｔｙＩで部分消化し、平滑化してＢｇｌＩＩで消化し、ＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩで消化したｐＧＬ３に連結することにより構築し、−９０１  ３６５Ｍｌｕｃと−９０１  ６４Ｍｌｕｃは夫々オリゴヌクレオチド５’−ｇａｇｃｃｇａａｔｔｃｔａｃａｇａｃｔａａ−３’及び５’−ａａｃｔｇｃａａｇｇａｇａｔｃｔａｃａｔｃｇｃｃｃｃｔｃｇ−３’を使用して部位特異的突然変異誘発により元のプロモーター構築物に点突然変異を導入することにより構築した。−９０１  ３６５／６４Ｍｌｕｃは−９０１  ６４ＭｌｕｃをＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した−９０１  ３６５Ｍｌｕｃに連結することにより構築し、−８１  ６４Ｍｌｕｃは−９０１  ６４ＭｌｕｃをＳｔｙＩで部分消化して再連結することにより構築した。ヒトｐ６５（ＲｅｌＡ）、ｐ５０（ＮＦ−κＢ）及びｐ６５ＲＨＤ（１−３０５）、ｐ６５Ｎｓｉ（１−５５１Ｅ３９Ｉ）をコードする全長ｃＤＮＡを含むＣＭＶ４発現ベクターは従来記載されている（２６，２７）。ヒトＥＲα（ｐＳＧ５−ＨＥＧＯ）とヒトＥＲβ（ｐＳＧ５−ＥＲβ５３０）をコードする発現ベクターは夫々Ｃｈａｍｂｏｎ博士（フランス、ストラスブール）とＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ博士（スウェーデン、ストックホルム）の寄贈品を使用した。キメラヒトＥＲα／ＥＲβ及びＥＲβ／ＥＲα受容体は従来記載されており（２８）、ＥＲα／ＥＲβキメラはＥＲαのＡ／ＢドメインとＥＲβのＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆドメインを含み、ＥＲβ／ＥＲαキメラはＥＲβのＡ／ＢドメインとＥＲαのＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆドメインを含む。マウスＥＲα（ｐＭＴ２ＭＯＲ）、ＥＲα１−３３９、ＥＲα１２１−５９９及びＥＲαＣ２４１／２４４Ａ（２９）はＰａｒｋｅｒ博士（英国、ロンドン）から寄贈された。使用したレポータープラスミド４×ＮＦ−κＢ（ＨＩＶ）ｋｔｌｕｃ及び３×ＥＲＥ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃは従来記載されている（３０，３１）。
【００５７】
一過性トランスフェクション。一過性トランスフェクションでは、２４穴プレートで５％ＤＣＣ−ＦＣＳを加えたＤＦ＋中でＣＯＳ−１細胞と２９３細胞を培養した。リン酸カルシウム共沈法を使用してルシフェラーゼレポーター０．４μｇ、ＰＤＭｌａｃＺ０．６μｇ及び指定発現プラスミド０．２μｇを細胞にトランスフェクトした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−を加えてＤＮＡ合計量１．８μｇ／ウェルとした。１６時間後に培地を交換し、指定ホルモンを加えた。２４時間後に細胞を回収し、Ｌｕｃｌｉｔｅルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＴ）とＴｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＴ）を製造業者のプロトコールに従って使用してルシフェラーゼ活性を定量した。β−ガラクトシダーゼ活性を測定することによりトランスフェクション効率値を補正した（３２）。
【００５８】
実施例２
ＮＦ−κＢとＥＲによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化
５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーター活性に対するエストロゲンの効果を調べるために、ＥＲα又はＥＲβをコードする発現ベクターと共に５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターを含むレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。図１Ａに示すように、ＥＲα又はＥＲβをコトランスフェクトし、細胞を１７β−エストラジオール（Ｅ２）で処理したが、５−ＨＴ１Ａプロモーター活性に殆ど効果がなかった。しかし、直接調節以外にＥＲと他の転写因子の相互作用により間接的にＥＲ標的遺伝子が調節される可能性もある。−９０１ｌｕｃ  ５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーター構築物には推定ＮＦ−κＢ結合部位が存在することが判明し（図２Ａ参照）、ＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクターと共にこのレポーター構築物をトランスフェクトすると、レポーターの誘導倍率は１０倍になった。興味深いことに、ＥＲαをＮＦ−κＢとコトランスフェクトすると、非常に大きいプロモーター活性が誘導され、Ｅ２を加えると更に増すことができた（図１Ａ）。ＥＲαに対してＥＲβはＮＦ−κＢとコトランスフェクトした場合の誘導倍率が著しく低く、Ｅ２の効果も認められなかった。２９３細胞でも同様の結果が得られた（結果は示さず）が、ＥＲαによる活性化レベルはＣＯＳ−１細胞よりも低かった。これらの結果は、５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターをＮＦ−κＢとＥＲにより相乗的に活性化できることを示している。
【００５９】
過去に数グループがＮＦ−κＢ活性に対するエストロゲンの阻害効果を報告している（３３〜３５）。従って、本発明者らもＥＲα又はＥＲβとＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現構築物と共にルシフェラーゼに結合したチミジンキナーゼプロモーターの前にＨＩＶ−ＬＴＲからの４種のＮＦ−κＢ因子を含むレポーター構築物に対するエストロゲンの効果を検討した。このレポーター構築物では、ＥＲαをコトランスフェクトするとホルモンがなくてもＮＦ−κＢの転写活性が抑制されたが、ホルモンを加えると更に抑制された（図１Ｂ）。ＥＲβをコトランスフェクトした場合にもＮＦ−κＢ活性は多少抑制された。２９３細胞でも同様の結果が得られた（結果は示さず）。これらの結果をまとめると、ＥＲはＩＣＡＭプロモーターからのコンセンサス応答因子に基づく合成ＮＦ−κＢレポーター構築物にＮＦ−κＢの転写リプレッサーとして作用すると共に、ＥＲはＮＦ−κＢと協同して転写アクチベーターとして５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターに作用する。
【００６０】
実施例３
ＮＦ−κＢとＥＲによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーター調節におけるＮＦ−κＢ因子の関与
５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターに対するＥＲの効果が何に起因するのかを調べるために、数種のプロモーター欠失構築物を使用した（図２Ａ）。両方のＮＦ−κＢ因子を突然変異させると（−９０１  ３５６／６４Ｍｌｕｃ）、５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターに対するＮＦ−κＢの効果は完全に失われた（図２Ｂ）。他方、ＥＲαをＮＦ−κＢと併用するだけで野生型プロモーター（−９０１ｌｕｃ）と同等の効率でプロモーター活性を誘導することができた。同様に、プロモーター構築物−８１ｌｕｃは１個のＮＦ−κＢ因子を含んでいたが、ＮＦ−κＢにより誘導することができなかった。しかし、このプロモーター構築物でもＥＲαとＮＦ−κＢの併用効果が認められた。−８１ｌｕｃ構築物に存在する単一ＮＦ−κＢ因子を突然変異させると（−８１  ６４Ｍｌｕｃ）、ＥＲα効果はほぼ完全に失われた。従って、５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化はＮＦ−κＢ結合部位を介するが、ＮＦ−κＢ自体によるプロモーターの活性化はＥＲの効果に必要ないと思われる。これらの結果は、ＥＲによるこの相乗プロモーター活性化がＤＮＡ結合に依存せず、タンパク質−タンパク質相互作用に起因することを示唆している。
【００６１】
実施例４
５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターに対する抗エストロゲンの効果
抗エストロゲンはプロモーターの状況と受容体サブタイプに応じて種々の効果をもつことが報告されている。トランス活性化実験においてＯＨ−Ｔは古典的ＥＲＥにより調節される遺伝子の転写を阻害し、Ｅ２と同様にＡＰ−１因子と−ＥＲαの制御下にある遺伝子の転写を活性化した（２２）。本発明者らはＡＦ−２を阻害する部分アンタゴニストＯＨ−ＴとＡＦ−１及びＡＦ−２を阻害する「純」アンタゴニストＩＣＩ１６４３８４（ＩＣＩ）を使用して５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターに対する抗エストロゲンの効果を試験した。図３に示すように、ＩＣＩで処理しても５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの活性はＥＲαとＮＦ−κＢにより増加せず、ＯＨ−Ｔは転写活性化においてＥ２と同等に強力であった。これらのデータをまとめると、ＡＦ−１活性能を保持する部分アンタゴニストＯＨ−Ｔは、ＥＲαによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性においてＥ２と同等に強力である。
【００６２】
実施例５
５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性に関与するＮＦ−κＢとＥＲのドメイン
ＮＦ−κＢのトランス活性化機能の重要性を調べるために、本発明者らは、一過性トランスフェクションアッセイで、５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターとＥＲの相乗活性能における、トランス活性化ドメインの欠失又はＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットのＤＮＡ結合機能の付与についての効果を検討した。ｐ５０とｐ６５又はｐ６５単独をＥＲα及びＥ２とコトランスフェクトするとプロモーターは強く活性化されたが、トランス活性化機能をもたないｐ５０単独をコトランスフェクトしてもほとんど効果がなかった。ｐ６５のトランス活性化ドメインを欠失させ、Ｒｅｌ相同ドメインのみを含む構築物を作製した（ｐ６５ＲＨＤ）。ｐ６５ＲＨＤはＤＮＡとの結合能を保持していた（２７）が、ＥＲαとＥ２の不在下又は存在下のいずれでもプロモーターを活性化することはできなかった。ＤＮＡ結合欠損突然変異体（ｐ６５Ｎｓｉ）はまだ無傷のトランス活性化ドメインを含んでいたが、やはりプロモーターを相乗的に活性化することはできなかった。これらのデータをまとめると、ＥＲによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化にはトランス活性化とｐ６５のＤＮＡ結合機能の両方が不可欠である。
【００６３】
５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの活性化に関与するＥＲαの領域を同定するために、ＡＦ−１を含むＡ／Ｂの部分を欠失するか又はＡＦ−２を含むリガンド結合領域の部分を欠失するマウスＥＲαの欠失構築物を使用した。Ａ／Ｂ領域（ＥＲα１２１−５９９）を欠失させるとプロモーターの相乗活性化は完全に失われたが、リガンド結合ドメイン（ＥＲα１−３３９）を欠失させた場合には野生型ＥＲαと少なくとも同等の活性を示す受容体が得られた（図５Ａ）。ＥＲαのＤＮＡ結合欠損突然変異体（ＥＲαＣ２４１／２４４Ａ）は５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターを活性化することができなかったが、これはＮＦ−κＢとの相互作用に機能的ＤＮＡ結合ドメインが必要であるためであると思われる（３４）。ヒトＥＲαに比較して、マウスＥＲαでは５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化にリガンド依存性が認められない。ＮＦ−κＢがなければＥＲα１−３３９ではプロモーターの活性は弱いけれども（結果は示さず）、ＥＲαによるプロモーターのこの相乗活性はＮＦ−κＢと併用した場合にのみ観察できた。対照実験でルシフェラーゼに結合したコンセンサスＥＲＥとＴＡＴＡボックス３コピーを含むレポーター構築物とＥＲα、ＥＲβ及び欠失突然変異体をコトランスフェクトし、古典的ＥＲＥから転写を活性化できるか否かを調べた。図５Ｂに示すように、ＥＲαとＥＲβはどちらも３×ＥＲＥ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃからの転写を刺激したが、従来記載されている通り（２８）、ＥＲβの転写活性はＥＲαよりも著しく弱かった。ＡＦ−１又はＡＦ−２を欠失する欠失突然変異体はどちらも転写を刺激したが、野生型ＥＲαよりも効率が著しく低く、トランス活性化ドメインはこのプロモーター構築物に相乗作用できると予想された。更に、ＥＲα１−３３９はリガンドがなくても最大限に活性化されており、ＡＦ−１のリガンド非依存性活性を明白に示している。予想通り、ＤＮＡ結合欠損突然変異体ＥＲαＣ２４１／２４４Ａはこのレポーター構築物を活性化することができなかった。５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの活性化能においてＥＲαとＥＲβには相違が認められたので、ＥＲα及びＥＲβとのキメラ構築物を使用してこの活性化に関与するＥＲαとＥＲβの領域を調べた。ＥＲβのＡ／Ｂ領域をＥＲαのＡ／Ｂ領域で置換すると（ＥＲα／β）、５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの活性化に関して野生型ＥＲαよりも更に強力なキメラ受容体が得られた（図６Ａ）。他方、ＥＲαのＡ／Ｂ領域をＥＲβのＡ／Ｂ領域で置換すると（ＥＲβ／α）、受容体のプロモーターに対する相乗活性能はほぼ完全に失われた。ＮＦ−κＢがなくてもＥＲα／βではプロモーターのリガンド非依存性活性は弱いが認められた（結果は示さず）が、この場合もＥＲαとＥＲα／βによるプロモーターのこの相乗活性はＮＦ−κＢと併用した場合にしか認められなかった。対照実験ではどちらのキメラ構築物も野生型ＥＲαと同等の効率で３×ＥＲＥ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃからの転写を活性化できたが、ＥＲα／βではわずかなリガンド非依存性活性しか認められなかった（図６Ｂ）。これらの結果は、ＥＲαとＮＦ−κＢによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性がＤＮＡ結合ドメインとＡＦ−１を含むＥＲαのＡ／Ｂ領域に依存すること��示唆している。要約すると、エストロゲンは気分や精神状態に強い作用がある。エストロゲンがセロトニン作動的機能を調節できるならば、鬱病とその治療に関するメカニズムに関与している可能性がある。エストロゲンが気分に作用する細胞メカニズムはセロトニン系の各種レベルに関与する遺伝子の調節を介すると思われる。本発明者らはエストロゲンがＮＦ−κＢとエストロゲン受容体による相乗活性化に関与する新規メカニズムを介してセロトニン−１Ａ受容体の発現を正に調節できることを今般報告する。部分抗エストロゲン４−ヒドロキシタモキシフェンもエストロゲンと同一効果があった。更に、突然変異分析の結果、この相乗調節にはｐ６５のトランス活性化とエストロゲン受容体αの活性化機能１の両方が不可欠であることが判明した。従って、ＮＦ−κＢ複合体がエストロゲン受容体と協同して補因子を複合体に補充し、ＤＮＡとの直接受容体結合を介さないメカニズムにより非古典的エストロゲン応答因子によりセロトニン−１Ａ受容体プロモーターを相乗的に活性化すると予想される。
【００６４】
実施例６
材料と方法
特定試薬。アルドステロン（Ｎ．Ｖ．Ｏｒｇａｎｏｎ）は濃度０．１μＭで使用した。組換えヒトＩＬ−１βはＧｅｎｚｙｍｅから購入し、濃度１００ｕ／ｍｌで使用した。
【００６５】
細胞培養。ヒト骨肉腫Ｕ−２ＯＳ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、無フェノールＤＭＥＭとＨａｍのＦ−１２培地（ＤＦ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）の１：１混合物であるＭ５０５を重炭酸塩で緩衝し、１０％ＦＣＳを加えた中で培養した。
【００６６】
プラスミド。ｐＧＬ３−ＥＬＡＭはＥ−セレクチンプロモーターをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳａｃＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより構築した。Ｅ−セレクチンプロモーター領域はオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｃｔｇｃａｇａｔｃｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａｃａｔｃａｔｔｇｔａ−３’及び５’−ａｔｃａｔｔｃｇａａｇａａｇｔｃａｇｃｃａａｇａａｃａｇｃｔ−３’を使用してヒトゲノムＤＮＡでＰＣＲにより得た。ＰＣＲ産物をｐＣＲ（登録商標）２．１（ＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、ＳａｃＩとＸｈｏＩで消化した後、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃに連結した。
【００６７】
ルシフェラーゼレポータープラスミド３＊ＮＦ−κＢ−ＴＫはＩＣＡＭプロモーター（ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｔｏｌｐｅ，Ａ．，Ｃａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ，Ｅ．，Ｓｔａｄｅ，Ｂ．Ｇ．，Ｋｏｅｎｄｅｒｍａｎｓ，Ｌ．，Ｒａａｉｊｍａｋｅｒｓ，Ｊ．Ａ．Ｍ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．＆  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓａａｇ，Ｐ．Ｔ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６１８５−６１９２）からのＮＦ−κＢ結合部位の３反復を単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーターの前に挿入することにより構築した。ＴＫプロモーターはｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。ＮＦ−κＢ結合部位の三重反復はオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｃａｔａｃｇｇｔａａｇｃｔｔｇｇｇｇｔｃａｔｃｇｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃｃｇｃｃｃｇａｔｔｇｃｔｔｔａｇｃｔｔｇｇａａａｔｔｃｃｇｇａ−３’及び５’−ｇｔａｔｇｃｃａａａｇｃｔｔｃｔｃｃｇｇａａｔｔｔｃｃａａｇｃｔｃｃｇｇａａｔｔｔｃｃａａｇｃｔｃｃｇｇａａｔｔｔｃｃａａｇｃｔａａａ−３’をアニールした後にＰＣＲ増幅してｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターにサブクローニングすることにより構築した。ＨｉｎｄＩＩＩを使用してインサートを切出し、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼで平滑にし、ｐＧＬ３−ｔｋ−ｌｕｃのＳｍａＩ部位に連結した。
【００６８】
ｐＮＧＶ１−ｈＭＲ発現ベクターはＳＶ４０プロモーターの制御下に野生型ヒトＭＲを含み、ＰＫＣＲＥ−ＥＲα発現ベクターはＳＶ４０プロモーターの制御下に野生型ヒトＥＲを含む。
【００６９】
一過性トランスフェクション。一過性トランスフェクションでは、Ｕ−２ＯＳ細胞を６穴プレートにまいた。２又は３日後にレポーター、発現ベクター及びβ−ガラクトシダーゼ対照ベクターを細胞にトランスフェクトした。２種の異なる実験条件を使用した。ＭＲとＩＬ−１βの相乗効果を試験するために、ｐＧＬ３−ＥＬＡＭ又は３＊ＮＦ−κＢ−ＴＫ１μｇ、ｐＮＧＶ１−ｈＭＲ１μｇ又はＰＫＣＲＥ−ＥＲα１μｇ及びβ−ガラクトシダーゼ対照プラスミド０．２５μｇを細胞にトランスフェクトした。種々の量の導入ＤＮＡをインサートなしの発現ベクターに相関させた。リポフェクチン試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して一過性トランスフェクションを行った。リポフェクチンによる一過性トランスフェクションは製造業者の指示を多少変更して実施した。トランスフェクトするＤＮＡ１μｇ当たりリポフェクチン５μｌを使用し、トランスフェクション混合物と共に細胞を５時間培養した後、トランスフェクション混合物を吸引し、Ｍ５０５＋１０％ＤＣＣ−ＦＣＳに交換した。トランスフェクトした細胞を試験化合物（例えばＩＬ−１β、デキサメタゾン及びアルドステロンの各種併用）と共に一晩培養した後、細胞溶解させた。夫々ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＧａｌａｃｔｏ−ｌｉｇｈｔ  ｐｌｕｓ（Ｔｒｏｐｉｘ）を製造業者のプロトコールに従って使用してルシフェラーゼ活性とβ−ガラクトシダーゼ活性の測定を実施し、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０マルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。β−ガラクトシダーゼ活性の検出はトランスフェクション効率の対照として使用した。
【００７０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＮＦ−κＢとヒトＥＲαによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性。（Ａ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクター（白棒）とＥＲαもしくはＥＲβをコードする発現ベクター（線影棒）と共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトし、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクターとＥＲαもしくはＥＲβをコードする発現ベクターと共に４×ＮＦ−κＢ（ＨＩＶ）ｔｋｌｕｃをＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（白棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図２】
ＮＦ−κＢとヒトＥＲαによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーター調節におけるκＢ因子の重要性。（Ａ）使用したルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーター構築物の模式図であり、ラット５−ＨＴ１Ａ受容体（５−ＨＴ１ＡＲ）プロモーター欠失を含む。２個の白丸（○）はＮＦ−κＢ結合部位を示す。（Ｂ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクター（白棒）とＥＲαをコードする発現ベクター（線影棒）と共に各種指定レポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトし、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図３】
ＯＨ−ＴはＮＦ−κＢとヒトＥＲαにより５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの活性を増すことができるが、ＩＣＩはできない。（Ａ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクターとＥＲαもしくはＥＲβをコードする発現ベクターと共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトし、Ｅ２、ＯＨ−Ｔ又はＩＣＩで２４時間指定通りに処理した。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図４】
ＮＦ−κＢとヒトＥＲαによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化にはｐ６５のトランス活性化機能が必要である。空の発現ベクター又は指定通りにｐ５０、ｐ６５、ｐ６５ＲＨＤもしくはｐ６５Ｎｓｉをコードする発現ベクター（白棒）とＥＲαをコードする発現ベクター（線影棒）と共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトし、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢサブユニットにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図５】
マウスＥＲαによる５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化はＡＦ−２非依存的に生じる。（Ａ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクターとマウスＥＲα、ＥＲβ、ＥＲα１２１−５９９、ＥＲα１−３３９もしくはＥＲαＣ２４１／２４４Ａをコードする発現ベクターと共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（線影棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）空の発現ベクター又はマウスＥＲα、ＥＲβ、ＥＲα１２１−５９９、ＥＲα１−３３９もしくはＥＲαＣ２４１／２４４Ａをコードする発現ベクターと共に３×ＥＲＥ−ＴＡＴＡｌｕｃをＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（線影棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＥＲにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図６】
５−ＨＴ１Ａ受容体プロモーターの相乗活性化にはＥＲαのＡ／Ｂドメインが必須である。（Ａ）空の発現ベクター又はＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットをコードする発現ベクターとヒトＥＲα、ＥＲβ、ＥＲα／βもしくはＥＲβ／αをコードする発現ベクターと共に−９０１ｌｕｃレポーター構築物をＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（線影棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＮＦ−κＢにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）空の発現ベクター又はヒトＥＲα、ＥＲβ、ＥＲα／βもしくはＥＲβ／αをコードする発現ベクターと共に３×ＥＲＥ−ＴＡＴＡｌｕｃをＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトした。細胞は処理しない（線影棒）か、１０−８Ｍ  Ｅ２で２４時間処理した（黒棒）。空の発現ベクターをトランスフェクトした細胞に比較してＥＲにより誘起されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。各棒は少なくとも３回の独立実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図７】
ＮＦ−κＢと夫々ＭＲ又はＥＲαによるＥ−セレクチンプロモーターの相乗活性化又はトランス抑制。（Ａ）Ｅ−セレクチンプロモーター−レポーターをＵ−２ＯＳ細胞に一過性コトランスフェクトし、０．１μＭアルドステロンの不在下又は存在下にＩＬ−１β、ＭＲのコトランスフェクション又はＩＬ−１βとＭＲの併用の効果を測定した。（Ｂ）ＥＬＡＭプロモーターを含まないルシフェラーゼ−レポーターをＵ−２ＯＳ細胞に一過的にコトランスフェクトし、０．１μＭアルドステロンの不在下又は存在下にＩＬ−１β、ＭＲの同時発現又はＩＬ−１βとＭＲの併用の効果を測定した。（Ｃ）Ｅ−セレクチンプロモーター−レポーターをＵ−２ＯＳ細胞に一過性コトランスフェクトし、０．１μＭ１７β−エストラジオールの不在下又は存在下にＩＬ−１β、ＭＲのコトランスフェクション又はＩＬ−１βとＥＲαの併用の効果を測定した。（Ｄ）合成３＊ＮＦ−κＢ−ｔｋプロモーター−レポーターをＵ−２ＯＳ細胞に一過性コトランスフェクトし、０．１μＭアルドステロンの不在下又は存在下にＩＬ−１β、ＭＲのコトランスフェクション又はＩＬ−１βとＭＲの併用の効果を測定した。未処理細胞（各図の最初の棒）に比較した誘導倍率として結果を表す。全値は２回測定値の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。Ａ、Ｂ、ＣとＤで目盛が異なることに留意されたい。