【手続補正書】
【提出日】平成31年3月25日(2019.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸（ＲＮＡ）の無細胞生産のための細胞溶解物を生産する方法であって、該方法が
（ａ）所望の細胞密度へ細胞を培養すること、ここで、細胞が、プロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結された、ヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸を含み、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが、遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、
（ｂ）ステップ（ａ）で生産された細胞を溶解し、それによって第１の細胞溶解物を生産すること、および
（ｃ）ＲＮＡ解重合を生じる条件下で第１の細胞溶解物をインキュベートし、それによってヌクレオチド５’−一リン酸を含む第１の細胞溶解物を生産すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターが誘導性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）（ｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、少なくとも１つの操作された核酸、ここで、同族のプロテアーゼがペリプラズム標的化配列に連結されている、（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｖ）ＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、
を含む細胞を培養すること；および
（ｅ）ステップ（ｄ）で生産された培養細胞を溶解し、第２の細胞溶解物を生産すること、
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＮｕｃＡ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅＩＩ、ＲＮａｓｅＩＩＩおよびＲＮａｓｅＲからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、少なくとも１つのプロテアーゼ標的化内因性リボヌクレアーゼおよび／または内因性リボヌクレアーゼをコードする遺伝子において少なくとも１つの染色体欠失を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＲ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅＩＩ、ＲＮａｓｅＴ、ＲＮａｓｅＥおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヌクレオチドキナーゼが、ヌクレオチド一リン酸キナーゼまたはヌクレオチド二リン酸キナーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ヌクレオチド一リン酸キナーゼが、ウリジル酸キナーゼ、シチジル酸キナーゼ、グアニル酸キナーゼ、およびアデニル酸キナーゼからなる群から選択される、ならびに／または、ヌクレオチド二リン酸キナーゼが、ヌクレオシドリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびポリリン酸キナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ポリリン酸を分解する少なくとも１つの内因性酵素が、細胞内で遺伝的に不活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリリン酸を分解する内因性酵素の少なくとも１つが、ヌクレオシドモノホスファターゼ（別名５’−ヌクレオチダーゼ）、ヌクレオシドジホスファターゼ、ヌクレオシドトリホスファターゼ、ヌクレオシド三リン酸ホスホヒドロラーゼ、およびエキソポリホスファターゼからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、ポリリン酸を分解する少なくとも１つのプロテアーゼ標的化酵素および／またはポリリン酸を分解する酵素をコードする遺伝子において少なくとも１つの染色体欠失を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｄ）の細胞が、ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターをそれぞれ含む、少なくとも２つの操作された核酸を含み、操作された核酸の１つがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、操作された核酸の１つがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
操作されたＤＮＡテンプレートが、エンドヌクレアーゼ切断部位を含む発現ベクター上に位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
エンドヌクレアーゼ切断部位が、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ切断部位である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）で生産された第１の細胞溶解物、ステップ（ｅ）で生産された第２の細胞溶解物、およびポリリン酸を組み合わせ、それにより混合物を生産すること；および
ＲＮＡの生産を生じる条件下で混合物をインキュベートすること
をさらに含む、請求項３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
リボ核酸（ＲＮＡ）の無細胞生産のための細胞溶解物を生産する方法であって、該方法が
（ａ）細胞を所望の細胞密度へ培養すること、ここで、細胞が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結されたヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸を含み、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、
（ｂ）ステップ（ａ）で生産された細胞を溶解し、それによって第１の細胞溶解物を生産すること、および
（ｃ）ＲＮＡ解重合を生じる条件下でポリリン酸の存在下で第１の細胞溶解物をインキュベートし、それによってヌクレオチド５’−三リン酸の混合物を含む第１の細胞溶解物を生産すること
を含む、前記方法。
【請求項２０】
（ｄ）（ｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識配列を切断する同族のプロテアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、ここで、同族のプロテアーゼが、ペリプラズム標的化配列に連結されている、（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｉｉ）ヒンジドメインによって連結された相補的ドメインを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、を含む細胞を培養すること；および
（ｅ）ステップ（ｄ）で生産された培養細胞を溶解し、第２の細胞溶解物を生産すること
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）で生産された第１の細胞溶解物、ステップ（ｅ）で生産された第２の細胞溶解物、および任意にポリリン酸を組み合わせ、それにより混合物を生産すること；および
ＲＮＡの生産を生じる条件下で混合物をインキュベートすること
をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
リボ核酸（ＲＮＡ）を生産する無細胞の方法であって、該方法が
（ａ）第１の細胞溶解物を第２の細胞溶解物と組み合わせ、それによって反応混合物を形成すること、ここで、
第１の細胞溶解物が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ、および（ｉｉ）ヌクレオチド５’−一リン酸を含み、および
第２の細胞溶解物が、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼ、（ｉｖ）ヌクレオチドキナーゼ、（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｖｉ）目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含む、および
（ｂ）目的のＲＮＡの生産を生じる条件下で反応混合物をインキュベートすること
を含む、前記方法。
【請求項２４】
リボ核酸（ＲＮＡ）を生産する無細胞の方法であって、該方法が、
（ａ）第１の細胞溶解物を第２の細胞溶解物と組み合わせ、それによって反応混合物を形成すること、ここで、
第１の細胞溶解物が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ、（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼ、および（ｉｉｉ）ヌクレオチド５’−三リン酸含み、および
第２の細胞溶解物が、（ｉｖ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼ、（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｖｉ）目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含む、および
（ｂ）目的のＲＮＡの生産を生じる条件下で反応混合物をインキュベートすること
を含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明は、一態様においては、以下に関する。
［項目１］
リボ核酸（ＲＮＡ）の無細胞生産のための細胞溶解物の生産方法であって、該方法が
（ａ）所望の細胞密度へ細胞を培養すること、ここで、細胞が、プロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結された、ヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸を含み、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが、遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、
（ｂ）ステップ（ａ）で生産された細胞を溶解し、それによって第１の細胞溶解物を生産すること、および
（ｃ）ＲＮＡ解重合を生じる条件下で第１の細胞溶解物をインキュベートし、それによってヌクレオチド５’−一リン酸を含む第１の細胞溶解物を生産すること、
を含む、前記方法。
［項目２］
ヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターが誘導性である、項目１に記載の方法。
［項目３］
（ｄ）（ｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、少なくとも１つの操作された核酸、ここで、同族のプロテアーゼがペリプラズム標的化配列に連結されている、（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｖ）ＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、
を含む細胞を培養すること；および
（ｅ）ステップ（ｄ）で生産された培養細胞を溶解し、第２の細胞溶解物を生産すること、
をさらに含む、項目１または２に記載の方法。
［項目４］
（ｄ）（ｉ）、（ｄ）（ｉｉ）または（ｄ）（ｉｉｉ）のプロモーターの少なくとも１つが誘導性である、項目３に記載の方法。
［項目５］
ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＮｕｃＡ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅＩＩ、ＲＮａｓｅＩＩＩおよびＲＮａｓｅＲからなる群から選択される、項目１〜４のいずれか一つに記載の方法。
［項目６］
細胞が、少なくとも１つのプロテアーゼ標的化内因性リボヌクレアーゼおよび／または内因性リボヌクレアーゼをコードする遺伝子において少なくとも１つの染色体欠失を含む、項目１〜５のいずれか一つに記載の方法。
［項目７］
少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＲ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅＩＩ、ＲＮａｓｅＴ、ＲＮａｓｅＥおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目６に記載の方法。
［項目８］
ヌクレオチドキナーゼが、ヌクレオチド一リン酸キナーゼである、項目１〜７のいずれか一つに記載の方法。
［項目９］
ヌクレオチド一リン酸キナーゼが、ウリジル酸キナーゼ、シチジル酸キナーゼ、グアニル酸キナーゼ、およびアデニル酸キナーゼからなる群から選択される、項目８に記載の方法。
［項目１０］
ヌクレオチドキナーゼが、ヌクレオチド二リン酸キナーゼである、項目１〜７のいずれか一つに記載の方法。
［項目１１］
ヌクレオチド二リン酸キナーゼが、ヌクレオシドリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼおよびポリリン酸キナーゼからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
［項目１２］
ポリリン酸を分解する少なくとも１つの内因性酵素が、細胞内で遺伝的に不活性化される、項目１に記載の方法。
［項目１３］
ポリリン酸を分解する内因性酵素の少なくとも１つが、ヌクレオシドモノホスファターゼ（別名５’−ヌクレオチダーゼ）、ヌクレオシドジホスファターゼ、ヌクレオシドトリホスファターゼ、ヌクレオシド三リン酸ホスホヒドロラーゼ、およびエキソポリホスファターゼからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
［項目１４］
細胞が、ポリリン酸を分解する少なくとも１つのプロテアーゼ標的化酵素および／またはポリリン酸を分解する酵素をコードする遺伝子において少なくとも１つの染色体欠失を含む、項目１２または１３に記載の方法。
［項目１５］
ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、項目１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
［項目１６］
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである、項目１５に記載の方法。
［項目１７］
操作されたＤＮＡテンプレートの配列が、ヒンジドメインによって連結された相補的ドメインを含むｍＲＮＡをコードする、項目１５または１６に記載の方法。
［項目１８］
プロモーターが、Ｔ７プロモーターであり、Ｔ７転写ターミネーターが、ヒンジドメインによって連結された相補的ドメインを含むｍＲＮＡをコードする配列の３’末端に位置する、項目１７に記載の方法。
［項目１９］
ステップ（ｄ）の細胞が、ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターをそれぞれ含む、少なくとも２つの操作された核酸を含み、操作された核酸の１つがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、操作された核酸の１つがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする、項目３〜１４のいずれか一つに記載の方法。
［項目２０］
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがΦ６ＲｄＲＰである、項目１９に記載の方法。
［項目２１］
操作されたＤＮＡテンプレートの配列が、単一の標的ドメインを含むｍＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、項目２０に記載の方法。
［項目２２］
プロモーターが、Ｔ７プロモーターであり、Ｔ７転写ターミネーターが、単一の標的ドメインを含むｍＲＮＡをコードする配列の３’末端に位置する、項目２１に記載の方法。
［項目２３］
操作されたＤＮＡテンプレートが、エンドヌクレアーゼ切断部位を含む発現ベクター上に位置する、項目１８〜２２のいずれか一つに記載の方法。
［項目２４］
エンドヌクレアーゼ切断部位が、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ切断部位である、項目２３に記載の方法。
［項目２５］
ステップ（ｄ）の細胞が、エンドヌクレアーゼ切断部位を切断するエンドヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む、項目２３または２４に記載の方法。
［項目２６］
細胞が、少なくとも１つのプロテアーゼ標的化内因性ＲＮＡポリメラーゼおよび／または内因性ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子において少なくとも１つの染色体欠失を含む、項目１〜２５のいずれか一つに記載の方法。
［項目２７］
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｄ）の細胞が、Ｔ７ファージＧｐ２タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む操作された核酸をさらに含む、項目１〜２５のいずれか一つに記載の方法。
［項目２８］
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｄ）の細胞が、糖の存在下で培養される、項目１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
［項目２９］
糖が、グルコースである、項目２８に記載の方法。
［項目３０］
ステップ（ｂ）で生産された第１の細胞溶解物、ステップ（ｅ）で生産された第２の細胞溶解物、およびポリリン酸を組み合わせ、それにより混合物を生産すること；および
ＲＮＡの生産を生じる条件下で混合物をインキュベートすること
をさらに含む、項目３〜２９のいずれか一つに記載の方法。
［項目３１］
ＲＮＡが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、項目１〜３０のいずれか一つに記載の方法。
［項目３２］
リボ核酸（ＲＮＡ）の無細胞生産のための細胞溶解物の生産の方法であって、該方法が
（ａ）細胞を所望の細胞密度へ培養すること、ここで、細胞が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含み、ペリプラズム標的化配列に連結されたヌクレアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸を含み、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、
（ｂ）ステップ（ａ）で生産された細胞を溶解し、それによって第１の細胞溶解物を生産すること、および
（ｃ）ＲＮＡ解重合を生じる条件下でポリリン酸の存在下で第１の細胞溶解物をインキュベートし、それによってヌクレオチド５’−三リン酸の混合物を含む第１の細胞溶解物を生産すること
を含む、前記方法。
［項目３３］
（ｄ）（ｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識配列を切断する同族のプロテアーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、ここで、同族のプロテアーゼが、ペリプラズム標的化配列に連結されている、（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの操作された核酸、および（ｉｉｉ）ヒンジドメインによって連結された相補的ドメインを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、ここで、少なくとも１つの内因性リボヌクレアーゼが遺伝的に不活性化または細胞内で標的化タンパク質分解を介して不活性化される、を含む細胞を培養すること；および
（ｅ）ステップ（ｄ）で生産された培養細胞を溶解し、第２の細胞溶解物を生産すること
をさらに含む、項目３２に記載の方法。
［項目３４］
ステップ（ｂ）で生産された第１の細胞溶解物、ステップ（ｅ）で生産された第２の細胞溶解物、および任意にポリリン酸を組み合わせ、それにより混合物を生産すること；およびＲＮＡの生産を生じる条件下で混合物をインキュベートすること
をさらに含む、項目３３に記載の方法。
［項目３５］
ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、項目３２〜３４のいずれか一つに記載の方法。
［項目３６］
項目１〜３５のいずれか一つに記載の方法によって生産される、細胞溶解物。
［項目３７］
プロテアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ；
ヌクレオチドキナーゼ；および
ヌクレオチド５’−一リン酸
を含む、細胞溶解物。
［項目３８］
ＲＮＡポリメラーゼ；および
ＲＮＡをコードする操作されたＤＮＡテンプレート；
を含む、細胞溶解物。
［項目３９］
項目３７に記載の細胞溶解物および項目３８に記載の細胞溶解物を含む、組成物。
［項目４０］
細胞溶解物がヌクレアーゼ活性を有さない、項目３７または３８に記載の細胞溶解物。
［項目４１］
リボ核酸（ＲＮＡ）を生産する無細胞の方法であって、該方法が
（ａ）第１の細胞溶解物を第２の細胞溶解物と組み合わせ、それによって反応混合物を形成すること、ここで、
第１の細胞溶解物が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ、および（ｉｉ）ヌクレオチド５’−一リン酸を含み、および
第２の細胞溶解物が、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼ、（ｉｖ）ヌクレオチドキナーゼ、（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｖｉ）目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含む、および
（ｂ）目的のＲＮＡの生産を生じる条件下で反応混合物をインキュベートすること
を含む、前記方法。
［項目４２］
目的のＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、項目４１に記載の方法。
［項目４３］
リボ核酸（ＲＮＡ）を生産する無細胞の方法であって、該方法が、
（ａ）第１の細胞溶解物を第２の細胞溶解物と組み合わせ、それによって反応混合物を形成すること、ここで、
第１の細胞溶解物が、（ｉ）プロテアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ、（ｉｉ）ヌクレオチドキナーゼ、および（ｉｉｉ）ヌクレオチド５’−三リン酸含み、および
第２の細胞溶解物が、（ｉｖ）ヌクレアーゼのプロテアーゼ認識部位を切断する同族のプロテアーゼ、（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｖｉ）目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む操作されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを含む、および
（ｂ）目的のＲＮＡの生産を生じる条件下で反応混合物をインキュベートすること
を含む、前記方法。
［項目４４］
目的のＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、項目４３に記載の方法。
［項目４５］
第１の細胞溶解物および／または第２の細胞溶解物がヌクレアーゼ活性を有さない、項目４１〜４４のいずれか一つに記載の方法。
本発明のいくつかの態様の詳細は、添付の図面および詳細な説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかになるであろう。