(57)【要約】  日常的に連用可能で、安全性に優れ、筋肉痛の発生を緩和、予防することが可能であり、特に、遅発性筋肉痛の抑制に有効な筋肉痛抑制剤又は機能性食品を提供する。本発明は、ラクトバチルス・ヘルベティカスを含む菌体により乳を発酵して得た、好ましくは抗酸化酵素発現作用、熱ショックタンパク質発現作用、好中球の走化性及び組織浸潤抑制作用の少なくとも１つ以上の作用を示す発酵乳を有効成分として含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ヘルベティカスを含む菌体により乳を発酵して得た発酵乳を有効成分として含む筋肉痛抑制剤。
【請求項２】
ラクトバチルス・ヘルベティカスが、ラクトバチルス・ヘルベティカス CM４株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６０)を含む請求項１記載の抑制剤。
【請求項３】
菌体が、ラクトバチルス・ヘルベティカス以外の他の乳酸菌及び／又は酵母を更に含む請求項１記載の抑制剤。
【請求項４】
発酵乳が、抗酸化酵素発現作用、熱ショックタンパク質発現作用、好中球の走化性及び組織浸潤抑制作用の少なくとも１つの作用を示す発酵乳である請求項１記載の抑制剤。
【請求項５】
ラクトバチルス・ヘルベティカスを含む菌体により乳を発酵して得た発酵乳を有効成分として含む筋肉痛抑制用機能性食品。
【請求項６】
筋肉痛抑制のための効能を表示した請求項５記載の機能性食品。
【請求項７】
筋肉痛が、遅発性筋肉痛である請求項５記載の機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肉痛の発生を緩和、予防等することが可能な筋肉痛抑制剤及び筋肉痛抑制用機能性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
運動等により生じる筋肉痛のメカニズムについては現状明らかにはなっていない。一般的には、運動による筋繊維の機械的損傷と、該損傷に続く炎症反応が筋肉痛を引き起こす原因に大きく関与しているものと考えられている。この炎症反応は、筋肉組織において、好中球やマクロファージ等の白血球が浸潤し、これらが活性酸素やリソソーム酵素を放出して組織障害を拡大すること、更に、種々のサイトカインが産生・分泌し、炎症が促進されることに基づくものと考えられる。
このような浸潤白血球由来の活性酸素が、骨格筋の炎症や組織障害に重要であることは、好中球の遊走を阻害するコルヒチンを運動直後に投与すると、好中球浸潤が抑制され、脂質過酸化が防止されることが知られていることから類推できる。【０００３】
従来、抗炎症作用、筋肉疲労改善作用、筋強化作用を有する物質や食品の開発がいくつかなされている。例えば、特許文献１には、ラクトバチルス・ヘルベティカス ＭＩＫＩ−０２０(FERM P-13678)により発酵した発酵乳から分離精製した多糖物質ＮＰＳが、抗炎症作用を示すことが記載されている。また、特許文献２には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グルタミン及びホエータンパク質成分が、持続性筋肉疲労改善作用を示すことが記載されている。特許文献３には、乳ホエータンパク、クレアチン及びグルタミンを含む組成物が筋肉及び筋力を増強することが記載されている。
しかし、これらの文献には、筋肉痛を抑制する作用については記載されていない。
【特許文献１】特開平７−７０２０９号公報
【特許文献２】特開２００４−１８２６３０号公報
【特許文献３】特開２００２−６５２１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、日常的に連用可能で、安全性に優れ、筋肉痛の発生を緩和、予防することが可能であり、特に、遅発性筋肉痛の抑制に有効な筋肉痛抑制剤又は筋肉痛抑制用機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、ラクトバチルス・ヘルベティカスを含む菌体により発酵して得た発酵乳を有効成分として含む筋肉痛抑制剤又は筋肉痛抑制用機能性食品が提供される。
また本発明によれば、筋肉痛抑制剤、特に遅延性筋肉痛抑制剤又は筋肉痛抑制用機能性食品を製造するための、ラクトバチルス・ヘルベティカスを含む菌体により発酵して得た発酵乳の使用が提供される。
更に本発明によれば、ラクトバチルス・ヘルベティカスを含む菌体により発酵して得た発酵乳を有効成分として投与する筋肉痛、特に遅延性筋肉痛の抑制方法が提供される。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の筋肉痛抑制剤及び筋肉痛抑制用機能性食品は、ラクトバチルス・ヘルベティカスを含む菌体により乳を発酵して得た発酵乳を有効成分とするので、筋肉痛の発生を緩和、予防することが可能であり、特に、遅発性筋肉痛の抑制に有効である。従って、筋肉痛発生の原因となる運動等を行う前に、好ましくは継続的に本発明の筋肉痛抑制剤又は機能性食品を摂取することにより、筋肉痛の発生を有効に抑制することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明につき更に詳細に説明する。
本発明においては、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)を含む菌体により乳を発酵して得た発酵乳を、筋肉痛抑制作用を示す有効成分として含む。
前記ラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株としては、菌体外プロテイナーゼ活性の高いものが好ましい。例えば、Twiningらの方法(Twining, S. Anal. Biochem. 143 3410(1984))をもとにしたYamamotoらの方法(Yamamoto, N.ら J.Biochem. (1993) 114, 740)に準じて測定したU／OD590の値が４００以上を示す菌株が好ましい。また、下記の菌学的性質を有するラクトバチルス・ヘルベティカス菌株を用いることができる。【０００８】
菌学的性質
１．形態学的性質：１）細胞の形状；桿菌、２）運動性；なし、３）胞子の有無；なし、４）グラム染色性；陽性。
２．生理学的性質：１）カタラーゼ；陰性、２）インドール生成；陰性、３）硝酸塩の還元；陰性、４）酸素に対する態度；通性嫌気性菌、５）グルコースによりホモ乳酸発酵によりＤＬ（−）乳酸を生成し、ガスの産生はない。
６）各種炭水化物の分解性：グルコース；＋、ラクトース；＋、マンノース；＋、フラクトース；＋、ガラクトース；＋、シュークロース；−、マルトース；−、キシロース；−、ラムノース；−、セルビオース；−、トレハロース；−、メルビオース；−、ラフィノース；−、スタキオース；−、マンニトール；−、ソルビトール；−、エスクリン；−、サリシン；−。【０００９】
前記好ましいラクトバチルス・ヘルベティカスとしては、例えば、ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター 日本国茨城県つくば市東1-1-1中央第6 寄託番号：FERM BP-6060、寄託日1997.8.15)(以下、CM4株と称す)が挙げられる。このCM4株は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に上記寄託番号で登録されており、この株は既に特許されている。【００１０】
前記菌体としては、ラクトバチルス・ヘルベティカス以外の他の乳酸菌及び／又は酵素を含んでいても良い。
他の乳酸菌としては、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ヘルベティカス以外のラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属等に属する乳酸菌が挙げられるが、ラクトバチルス属が好ましい。具体的には、例えば、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)等が挙げられ、発酵に際しては２種以上組合せて加えても良い。
前記乳酸菌は、予め前培養しておいた十分に活性の高いスターターとして用いるのが好ましい。初発菌数は、好ましくは１０5〜１０9個／ｍｌ程度である。【００１１】
前記酵母は、得られる発酵乳の風味を良好にし、嗜好性を良好にする作用もあり、酵母の菌種は特に限定されないが、例えば、サッカロマイセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)等のサッカロマイセス属酵母が好ましく挙げられる。酵母の含有割合は、その目的に応じて適宜選択することができる。【００１２】
原料の乳としては、例えば、牛乳、馬乳、羊乳、山羊乳等の動物乳、及び豆乳等の植物乳、これらの加工乳である脱脂乳、還元乳、粉乳、コンデンスミルク等が挙げられ、牛乳、豆乳、これらの加工乳が好ましく、牛乳又はその加工乳が特に好ましい。
乳の固形分濃度は特に限定されないが、例えば、脱脂乳を用いる場合の無脂乳固形分濃度は、通常３〜１５重量％程度であり、生産性の点からは６〜１５重量％が好ましい。【００１３】
前記発酵は、通常静置若しくは撹拌培養により、例えば、発酵温度２５〜４５℃、好ましくは３０〜４５℃、発酵時間３〜７２時間、好ましくは１２〜３６時間で、乳酸酸度が１．５以上になった時点で発酵を停止する方法等により行なうことができる。【００１４】
本発明において、筋肉痛抑制用の有効成分として用いる発酵乳は、前記ラクトバチルス・ヘルベティカスを含む菌体により発酵させて得た発酵乳であり、該発酵乳は、筋肉痛抑制作用の指標として、筋肉における、(a)抗酸化酵素発現作用、(b)熱ショックタンパク質発現作用、(c)好中球の走化性及び組織浸潤抑制作用の少なくとも１つ以上の作用、好ましくは(a)と(b)の作用、(a)と(c)の作用又は(b)と(c)の作用を示し、特に好ましくは(a)〜(c)の全ての作用を示す。
前記(a)抗酸化酵素発現作用は、筋肉における抗酸化酵素量、例えば、CAT(Catalase)、SOD2(Superoxide dismutase-2)、GST(Glutathione S- transferase)等をRT-PCR法により測定することによって得られる。
前記(b)熱ショックタンパク質発現作用は、筋肉における生態保護タンパク質量、例えば、HSP70(Heat shock protein 70)等をWestern blotting法により測定することによって得られる。
前記(c)好中球の走化性及び組織浸潤抑制作用は、筋肉における好中球走化性因子量、例えば、CINC-1(Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractants-1)をELISA法により、また、MPO(Myeloperoxidase)量を酵素法により測定することによって得られる。【００１５】
本発明に用いる有効成分としての発酵乳は、上記(a)〜(c)の作用に加えて、運動後の生体酸化傷害の指標として、筋肉におけるTBARS(Thiobarbituric acid reactive substances)量の抑制作用をTBA法により測定することができ、また、筋肉損傷の指標として、血中CPK(Creatine phosphokinase)量の抑制作用を酵素法により測定することができる。【００１６】
本発明は、必須の有効成分が前記発酵乳であるので、その経口摂取量は、投与期間やその継続性等に応じて所望の効果が得られるよう適宜選択できるが、通常、筋肉痛が生じる運動等を行う、少なくとも３日以上前から、通常１週間以上前から、好ましくは２週間以上前から、特に好ましくは３週間以上前から、前記発酵乳量で、１日あたり１〜１０００ｍｌ／ヒト程度、好ましくは１０〜２００ｍｌ／ヒト程度の継続摂取をすることが望ましい。この際、必ずしも毎日連続摂取を継続しなければ、所望の効果が得られないというものではない。また、筋肉痛が生じる運動等を行った後も継続若しくは断続摂取することがより好ましい。【００１７】
本発明の機能性食品は、本発明の筋肉痛抑制に関する作用効果等を訴求した、例えば、特定保健用食品、筋肉痛抑制のための効能を表示した機能性食品等とすることができる。
前記機能性食品には、糖類、タンパク質、脂質、ビタミン、ミネラル、フレーバー、またはこれらの混合物等の添加物を添加することもできる。
本発明の機能性食品は、例えば、ヨーグルト、乳酸菌飲料等の発酵乳製品、発酵乳又はその濃縮物等を配合した各種加工飲食品、乾燥粉末、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等が挙げられる。
【実施例】
【００１８】
以下実施例により、更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１及び比較例１
市販の脱脂粉乳を固形率９％(w／w)となるように蒸留水で溶解し、オートクレーブで１０５℃、１０分間、高温加熱殺菌した後、室温まで冷却し、ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株とサッカロマイセス・セレビシェIFO0725とを予め前培養した共生スターター発酵液を３％(v／w)接種し、３７℃、２４時間培養を行なって発酵乳を得た。
得られた発酵乳を８０℃達温殺菌後、脱脂粉乳と同量のマルトデキストリン(登録商標パインデックス＃２、松谷化学工業(株)製)を添加し、凍結乾燥により粉末を得た。この粉末を市販の粉末飼料(商品名CE-2、日本クレア(株)製)を重量比で２０：８０で混合して共生発酵乳飼料(実施例１)を調製した。
また、マルトデキストリン(登録商標パインデックス＃２、松谷化学工業(株)製)と、市販の粉末飼料(商品名CE-2、日本クレア(株)製)とを重量比１０：９０で混合して対照飼料(比較例１)を調製した。
得られた各飼料を用いて以下の試験を行った。【００１９】
Wistar系ラット(５週齢、雄)３２匹を１週間予備飼育した後、１６匹ずつに分けて共生発酵乳飼料又は対照飼料を自由摂取させ、蒸留水の自由飲水下で３週間飼育した。その間、全てのラットにトレッドミル装置に慣れさせるため軽い運動(数分間／日)を負荷した。
実験食飼育の最終日、安静群と運動群の各８匹に分け、運動群には２６ｍ／分で６０分間のトレッドミル走を負荷した。２４時間後、腓腹筋と血液を採取して以下項目の測定試料(Ｎ＝８)とした。但し、解剖前１２時間は絶食させた。
腓腹筋におけるCAT(Catalase)をRT-PCR法により、腓腹筋におけるSOD2 (Superoxide dismutase-2)をRT-PCR法により、腓腹筋におけるGST (Glutathione S-transferase)をRT-PCR法により、腓腹筋におけるHSP70(Heat shock protein 70)をWestern blotting法により、腓腹筋におけるCINC-1(Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractants-1)をELISA法により、腓腹筋におけるMPO(Myeloperoxidase)を酵素法により、腓腹筋におけるTBARS(Thiobarbituric acid reactive substances)をTBA法により、並びに血中におけるCPK(Creatine phosphokinase)を酵素法によりそれぞれ測定した。結果を表１に示す。【００２０】
また、対照飼料摂取の安静群に対する共生発酵飼料摂取の安静群の有意差検定、並びに対照飼料摂取の運動群に対する共生発酵飼料摂取の運動群の有意差検定を、Fisher's PLSD法に従って行った。Ｐ＜０．０５の有意差が認められたものについては、表１に＊を付す。【００２１】
【表１】
2007023896.tif 000002
【００２２】
表１より、共生発酵乳は、運動後に生ずる活性酸素の消去能力(CAT、SOD2、GST)を高めること、生体保護タンパク質(HSP70)の発現を高めること、好中球の活性化(CINC-1)と組織浸潤(MPO)を抑制すること、並びに筋肉の酸化障害(TBARS)と損傷(CPK)を抑制する作用を示すことがわかる。
従って、共生発酵乳の摂取は、運動後の遅発性筋肉痛(筋障害)の抑制又は予防に効果的であると考えられる。【００２３】
実施例２及び比較例２
市販の脱脂粉乳を固形率９％(w／w)となるように蒸留水で溶解し、オートクレーブで１０５℃、１０分間、高温加熱殺菌した後、室温まで冷却し、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株のスターターを３％(v／w)接種し、３７℃、２４時間培養を行って発酵乳を得た。
発酵乳を８０℃達温殺菌後、脱脂粉乳と同量のマルトデキストリン(登録商標パインデックス＃２、松谷化学工業(株)製)を添加し、凍結乾燥により粉末を得た。この粉末を市販の粉末飼料(商品名CE-2、日本クレア(株)製)を重量比で２０：８０で混合してCM4発酵乳飼料(実施例２)を調製した。
また、市販の脱脂粉乳を固形率９%(w／w)となるように蒸留水で溶解し、オートクレーブで１０５℃、１０分間、高温加熱殺菌高温加熱殺菌した後、室温まで冷却し、酸度が発酵乳と同程度となるように乳酸を加えた。次いで、８０℃達温殺菌後、脱脂粉乳と同量のマルトデキストリン(登録商標パインデックス＃２、松谷化学工業(株)製)を添加し、凍結乾燥により粉末を得た。この粉末を市販の粉末飼料(商品名CE-2、日本クレア(株)製)を重量比で２０：８０で混合して未発酵乳飼料(比較例２)を調製した。
得られたCM4発酵乳、未発酵乳飼料及び比較例１で調製した対照飼料を用いて以下の試験を行った。結果を表２に示す。【００２４】
Wistar系ラット(５週齢、雄)１６匹を１週間予備飼育した後、対照飼料(８匹)、未発酵乳飼料(４匹)、CM4発酵乳飼料(４匹)を自由摂取させ、蒸留水の自由飲水下で３週間飼育した。その間、全てのラットにトレッドミル装置に慣れさせるため軽い運動(数分間／日)を負荷した。実験食飼育の最終日、対照飼料摂取の８匹を２つに分けて安静群と運動群とし、また、未発酵乳飼料摂取群及びCM4発酵乳飼料摂取群を運動群とし、それぞれの運動群には２６ｍ／分で６０分間のトレッドミル走を負荷した。２４時間後、腓腹筋を採取してCINC-1をELISA法によりを測定した。但し、解剖前１２時間は絶食させた。【００２５】
【表２】
2007023896.tif 000003
【００２６】
表２より、CM4発酵乳は、好中球の活性化(CINC-1)を抑制する傾向がみられた。このことから、ラクトバチルス・ヘルベティカス発酵乳の摂取により、運動後の筋肉痛抑制に効果的である可能性が見出された。また、未発酵乳でCINC-1抑制がみられなかったことより、共生発酵乳とCM4発酵乳による効果は、乳成分由来のものでないことがわかる。
【国際調査報告】
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