(57)【要約】本発明は、定量性があり、感度および再現性が高く、迅速に且つ低コストで行うことができる核酸の一次構造変化の解析方法を提供することをもく亭としている。本発明の核酸の一次構造変化の解析方法は、基準核酸および解析対象核酸中の標準配列と標的配列に、核酸の種類ごとに異なる第一のリガンド、および第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、担体上に担持された受容体に第一のリガンドを特異的に結合させて標準配列および標的配列を担体に固定化する工程と、固定化された前記核酸中の第二のリガンドに、標識化された受容体を特異的に結合させる工程と、標識を検出して標準配列および標的配列を検出する工程と、基準核酸および解析対象核酸中の標準配列の比を求めて標的配列の検出値を補正する係数を算出し補正する工程と、基準核酸中の標的配列に対する解析対象核酸中の標的配列の量の増減を確認する工程と、を有することを特徴とする。
2007063807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の一次構造の変化を解析する方法であって、
（１）標準配列と存在の有無または増減を検出すべき標的配列を有する基準核酸の標準配列と標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと、同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、
（２）標準配列を有し、標的配列の存在の有無または量が不明の解析対象核酸に、第一のリガンドと第二のリガンドを添加して、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを標準配列に結合させ、解析対象核酸中に標的配列が存在する場合には、標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、
（３）前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた担体を用意し、第一のリガンドを該受容体に結合させて、前記標準配列および標的配列を担体に固定化する工程と、
（４）前記固定化標準配列および固定化標的配列中の第二のリガンドに、標識物質で修飾された、該第二のリガンドと特異的に結合する受容体を結合させる工程と、
（５）前記標識物質を検出することにより、標準配列および標的配列を検出する工程と、
（６）基準核酸および解析対象核酸中の標準配列の比を求めて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する係数を算出し、該補正係数を用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する工程と、
（７）解析対象核酸中の標的配列の補正検出値と、基準核酸中の標的配列の検出値を比較することにより、基準核酸中の標的配列に対する解析対象核酸中の標的配列の量の増減を確認する工程と、
を有することを特徴とする核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項２】
核酸の一次構造の変化を解析する方法であって、
（１）標準配列と存在の有無または増減を検出すべき標的配列を有する基準核酸の標準配列と標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと、同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、
（２）標準配列を有し、標的配列の存在の有無または量が不明の解析対象核酸に、第一のリガンドと第二のリガンドを添加して、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを標準配列に結合させ、解析対象核酸中に標的配列が存在する場合には、標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、
（３）前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた担体を用意し、第二のリガンドを該受容体に結合させて、前記標準配列および標的配列を担体に固定化する工程と、
（４）前記固定化標準配列および固定化標的配列中の第一のリガンドに、標識物質で修飾された、該第一のリガンドと特異的に結合する受容体を結合させる工程と、
（５）前記標識物質を検出することにより、標準配列および標的配列を検出する工程と、
（６）基準核酸および解析対象核酸中の標準配列の比を求めて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する係数を算出し、該補正係数を用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する工程と、
（７）解析対象核酸中の標的配列の補正検出値と、基準核酸中の標的配列の検出値を比較することにより、基準核酸中の標的配列に対する解析対象核酸中の標的配列の量の増減を確認する工程と、
を有することを特徴とする核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項３】
核酸の一次構造の変化を解析する方法であって、
（１）標準配列と存在の有無または増減を検出すべき標的配列を有する基準核酸の標準配列と標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと、同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、
（２）標準配列を有し、標的配列の存在の有無または量が不明の解析対象核酸に、第一のリガンドと第二のリガンドを添加して、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを標準配列に結合させ、解析対象核酸中に標的配列が存在する場合には、標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、
（３）前記第一のリガンドまたは第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた担体を用意し、第一のリガンドまたは第二のリガンドを該受容体に結合させて、前記標準配列および標的配列を担体に固定化して、該固定化標準配列および固定化標的配列を担体の凝集反応により凝集させる工程と、
（４）前記凝集物を検出することにより、標準配列および標的配列を検出する工程と、
（５）基準核酸および解析対象核酸中の標準配列の比を求めて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する係数を算出し、該補正係数を用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する工程と、
（６）解析対象核酸中の標的配列の補正検出値と、基準核酸中の標的配列の検出値を比較することにより、基準核酸中の標的配列に対する解析対象核酸中の標的配列の量の増減を確認する工程と、
を有することを特徴とする核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項４】
前記第二のリガンドがすべて共通のものである請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項５】
ヘテロ接合の欠失（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）を検出することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項６】
前記標的配列が複数であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項７】
前記標準配列および／または標的配列が、マーカーとして染色体上の位置が特定されている塩基配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項８】
前記のマーカーとして染色体上の位置が特定されている塩基配列が、マイクロサテライトマーカー、ＳＮＰマーカー、ＳＴＳマーカー、ＥＳＴマーカー、ｃＤＮＡマーカーからなる群より選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項７に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項９】
前記第一または第二のリガンドのいずれか一方が、ポリメラーゼ反応によって前記標準配列および標的配列を増幅することができるプライマーを含むものであり、前記第一または第二のリガンドの残りの一方が、前記標準配列および標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを含むものであって、前記標準配列および標的配列を、該プライマーを用いてポリメラーゼ反応によって増幅し、増幅された標準配列および標的配列を、該プローブをハイブリダイゼーションさせてから検出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼ反応が、恒温増幅反応であることを特徴とする請求項９に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１１】
前記第一および第二のリガンドが、ポリメラーゼ連鎖反応によって前記標準配列および標的配列を増幅することができるプライマーを含むものであり、前記標準配列および標的配列を、該プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅してから検出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１２】
前記第一および第二のリガンドが、前記標準配列および標的配列の一部と相補的な塩基配列を有するプローブを含むものであり、該プローブを前記標準配列および標的配列にハイブリダイゼーションさせて、ライゲーションしてから、ライゲーション産物である前記標準配列および標的配列を検出することを特徴する請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１３】
前記標準配列および標的配列をポリメラーゼ反応によって増幅してから、前記プローブをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項１２に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１４】
前記第一および第二のリガンドが、アミノ酸残基が二残基以上のポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１５】
前記担体が磁性を帯びた粒子状のものである工程を有することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１６】
前記第一のリガンドおよび／または第二のリガンドと受容体の組み合わせが、抗原と抗体の組み合わせであることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１６に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１８】
前記抗体が、ファージディスプレイ法によって得られた抗体であることを特徴とする請求項１６に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項１９】
前記基準核酸の標準配列と標的配列の検出値をデータベースに登録し、該データベースを用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値の補正、および解析対象核酸中の標的配列の補正検出値と基準核酸中の標的配列の検出値との比較を行うことを特徴とする請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法により得られた、解析対象核酸中の標的配列の補正検出値が、閾値より大きい場合に、染色体上において標的配列の増幅が生じたと判定することを特徴とする核酸の変異の判定方法。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法により得られた、解析対象核酸中の標的配列の補正検出値が、閾値より小さい場合に、染色体上において標的配列の欠失が生じたと判定することを特徴とする核酸の変異の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の変異の判定に好適な、核酸の一次構造変化の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの塩基配列の解読完了に伴い、その解読情報に基づいた染色体上における遺伝子の位置情報が明らかとなってきている。また、その位置情報から、癌発症の原因となる様々な染色体構造の変化、すなわち、核酸の一次構造の変化に関する診断の実用化に向けた研究が盛んに行われている。核酸の一次構造の変化を網羅的に解析するため、染色体上にマップされたｃＤＮＡクローンやＢＡＣクローンを数百から数千、時には数万個スポットしたマイクロアレイを用い、細胞から核酸を抽出し、核酸全体を増幅してまたは増幅せずに蛍光標識し、ハイブリダイゼーションによってヘテロ接合の欠失（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ、以下、ＬＯＨと略記）を解析するアレイＣＧＨ法がある。【０００３】
アレイＣＧＨ法による解析では、２０ｑ１３に存在する遺伝子のクローンを配置したアレイを用いた乳癌の診断に関する解析法（特許文献１参照）が開示されており、この方法によって特定の染色体部位の変化すなわち核酸の一次構造の変化を見て、癌の診断等に応用することができる。また、ＳＮＰマーカーを用いて、マイクロアレイで染色体構造の解析を行い、膀胱癌の診断を行う方法（非特許文献１参照）が開示されている。【０００４】
一方、電気泳動を利用して、染色体上のより絞り込んだ領域を解析する方法として、数個から数十個の多型性を示すＤＮＡマーカー、すなわち、ＳＮＰマーカーやマイクロサテライトマーカーを用いた解析法が開発されている。このような解析法として、マイクロサテライトマーカーの不安定性解析による癌の診断法（特許文献２参照）、ＳＳＣＰマーカーの消失解析による癌の診断法（特許文献３参照）が開示されている。これらの方法は、ＰＣＲ法によって得られたマーカーのマーカー長または構造の差を電気泳動で測定することによって解析するものであり、マーカーがヘテロ接合である時には、二つの断片が電気泳動像として現れる。例えば、癌では、あるマーカーが患者の正常組織でヘテロ接合性であり、腫瘍組織でヘテロ接合のマーカーのうち、染色体の構造異常によって一方が消失するＬＯＨが生じる。【０００５】
このような方法を用いることで、多型マーカーそのものが欠失することによって、その位置の染色体構造に異常が生じているという報告が多くなされている。また、このような解析を行うにあたり、各種ＤＮＡマーカーは、公共のデータベースに登録され、マーカーを解析する時に用いられるプライマー配列等も公開されており、これらを利用することでデータの精度をより高めて解析することが可能である。
【特許文献１】米国特許第６，２６８，１８４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２９１，１６３号明細書
【特許文献３】特開平９−２０１１９９号公報
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３，２２１６−２２２２（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１および非特許文献１に記載のアレイＣＧＨ法による解析は、アレイの作成に時間と費用を要し、実験操作も複雑であるため、臨床現場で用いる方法としては実用的ではないという問題点がある。また、細胞から抽出した核酸全体を標識化し、ハイブリダイゼーションを行うため、クロスハイブリダイゼーションなどによってノイズが現れることがあり、定量的に正確なデータを得ることが難しいという問題点がある。
また、多型マーカーを用いて電気泳動を利用する解析法は、患者の遺伝子型によってホモ接合になり、定性解析が不可能になる場合があるほか、実験操作が複雑で時間を要し、さらに、標的とする遺伝子を正確に定量することが困難であるため、臨床現場で用いる方法としては実用的ではないという問題点がある。【０００７】
したがって、ＤＮＡマーカーが患者の遺伝子型に関係なく定量的に見ることが可能であれば、検出感度を向上させることができ、また、多型性を持たずとも、染色体上にマップされた核酸配列であれば、核酸配列の一次構造変化を定量的に解析することができる。さらに、ＰＣＲ等による核酸増幅工程のばらつきを補正することができれば、核酸の一次構造の変化を、より簡単な操作で高精度に且つ迅速に解析することができ、臨床現場で用いる方法として有用である。【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、定量性があり、感度および再現性が高く、迅速に且つ低コストで行うことができる核酸の一次構造変化の解析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明は下記の通り構成されている。
（I）核酸の一次構造の変化を解析する方法であって、（１）標準配列と存在の有無または増減を検出すべき標的配列を有する基準核酸の標準配列と標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと、同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、（２）標準配列を有し、標的配列の存在の有無または量が不明の解析対象核酸に、第一のリガンドと第二のリガンドを添加して、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを標準配列に結合させ、解析対象核酸中に標的配列が存在する場合には、標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、（３）前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた担体を用意し、第一のリガンドを該受容体に結合させて、前記標準配列および標的配列を担体に固定化する工程と、（４）前記固定化標準配列および固定化標的配列中の第二のリガンドに、標識物質で修飾された、該第二のリガンドと特異的に結合する受容体を結合させる工程と、（５）前記標識物質を検出することにより、標準配列および標的配列を検出する工程と、（６）基準核酸および解析対象核酸中の標準配列の比を求めて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する係数を算出し、該補正係数を用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する工程と、（７）解析対象核酸中の標的配列の補正検出値と、基準核酸中の標的配列の検出値を比較することにより、基準核酸中の標的配列に対する解析対象核酸中の標的配列の量の増減を確認する工程と、を有することを特徴とする核酸の一次構造変化の解析方法。【００１０】
（II）核酸の一次構造の変化を解析する方法であって、（１）標準配列と存在の有無または増減を検出すべき標的配列を有する基準核酸の標準配列と標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと、同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、（２）標準配列を有し、標的配列の存在の有無または量が不明の解析対象核酸に、第一のリガンドと第二のリガンドを添加して、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを標準配列に結合させ、解析対象核酸中に標的配列が存在する場合には、標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、（３）前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた担体を用意し、第二のリガンドを該受容体に結合させて、前記標準配列および標的配列を担体に固定化する工程と、（４）前記固定化標準配列および固定化標的配列中の第一のリガンドに、標識物質で修飾された、該第一のリガンドと特異的に結合する受容体を結合させる工程と、（５）前記標識物質を検出することにより、標準配列および標的配列を検出する工程と、（６）基準核酸および解析対象核酸中の標準配列の比を求めて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する係数を算出し、該補正係数を用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する工程と、（７）解析対象核酸中の標的配列の補正検出値と、基準核酸中の標的配列の検出値を比較することにより、基準核酸中の標的配列に対する解析対象核酸中の標的配列の量の増減を確認する工程と、を有することを特徴とする核酸の一次構造変化の解析方法。【００１１】
（III）核酸の一次構造の変化を解析する方法であって、
（１）標準配列と存在の有無または増減を検出すべき標的配列を有する基準核酸の標準配列と標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと、同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、（２）標準配列を有し、標的配列の存在の有無または量が不明の解析対象核酸に、第一のリガンドと第二のリガンドを添加して、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを標準配列に結合させ、解析対象核酸中に標的配列が存在する場合には、標的配列に、配列の種類ごとに異なる第一のリガンドと同一でも異なっても良い第二のリガンドを結合させた構造の核酸を得る工程と、（３）前記第一のリガンドまたは第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた担体を用意し、第一のリガンドまたは第二のリガンドを該受容体に結合させて、前記標準配列および標的配列を担体に固定化して、該固定化標準配列および固定化標的配列を担体の凝集反応により凝集させる工程と、（４）前記凝集物を検出することにより、標準配列および標的配列を検出する工程と、（５）基準核酸および解析対象核酸中の標準配列の比を求めて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する係数を算出し、該補正係数を用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する工程と、（６）解析対象核酸中の標的配列の補正検出値と、基準核酸中の標的配列の検出値を比較することにより、基準核酸中の標的配列に対する解析対象核酸中の標的配列の量の増減を確認する工程と、を有することを特徴とする核酸の一次構造変化の解析方法。【００１２】
（IV）前記第二のリガンドがすべて共通のものである前記（I）〜（III）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００１３】
（V）ヘテロ接合の欠失（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）を検出することを特徴とする前記（I）〜（IＶ）のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００１４】
（VI）前記標的配列が複数であることを特徴とする前記（I）〜（V）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００１５】
（VII）前記標準配列および／または標的配列が、マーカーとして染色体上の位置が特定されている塩基配列を有するものであることを特徴とする前記（I）〜（VI）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００１６】
（VIII）前記のマーカーとして染色体上の位置が特定されている塩基配列が、マイクロサテライトマーカー、ＳＮＰマーカー、ＳＴＳマーカー、ＥＳＴマーカー、ｃＤＮＡマーカーからなる群より選ばれる一種以上であることを特徴とする前記（VII）に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００１７】
（IX）前記第一または第二のリガンドのいずれか一方が、ポリメラーゼ反応によって前記標準配列および標的配列を増幅することができるプライマーを含むものであり、前記第一または第二のリガンドの残りの一方が、前記標準配列および標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを含むものであって、前記標準配列および標的配列を、該プライマーを用いてポリメラーゼ反応によって増幅し、増幅された標準配列および標的配列を、該プローブをハイブリダイゼーションさせてから検出することを特徴とする前記（I）〜（VIII）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００１８】
（X）前記ポリメラーゼ反応が、恒温増幅反応であることを特徴とする前記（IX）に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００１９】
（XI）前記第一および第二のリガンドが、ポリメラーゼ連鎖反応によって前記標準配列および標的配列を増幅することができるプライマーを含むものであり、前記標準配列および標的配列を、該プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅してから検出することを特徴とする前記（I）〜（VIII）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００２０】
（XII）前記第一および第二のリガンドが、前記標準配列および標的配列の一部と相補的な塩基配列を有するプローブを含むものであり、該プローブを前記標準配列および標的配列にハイブリダイゼーションさせて、ライゲーションしてから、ライゲーション産物である前記標準配列および標的配列を検出することを特徴する前記（I）〜（VIII）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００２１】
（XIII）前記標準配列および標的配列をポリメラーゼ反応によって増幅してから、前記プローブをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする前記（XII）に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００２２】
（XIV）前記第一および第二のリガンドが、アミノ酸残基が二残基以上のポリペプチドであることを特徴とする前記（I）〜（XIII）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００２３】
（XV）前記担体が磁性を帯びた粒子状のものである工程を有することを特徴とする前記（I）〜（XIV）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００２４】
（XVI）前記第一のリガンドおよび／または第二のリガンドと受容体の組み合わせが、抗原と抗体の組み合わせであることを特徴とする前記（I）〜（XV）のいずれか一項に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００２５】
（XVII）前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（XVI）に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００２６】
（XVIII）前記抗体が、ファージディスプレイ法によって得られた抗体であることを特徴とする前記（XVI）に記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００２７】
（XIX）前記基準核酸の標準配列と標的配列の検出値をデータベースに登録し、該データベースを用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値の補正、および解析対象核酸中の標的配列の補正検出値と基準核酸中の標的配列の検出値との比較を行うことを特徴とする前記（I）〜（XVIII）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法。【００２８】
（XX）前記（I）〜（XIX）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法により得られた、解析対象核酸中の標的配列の補正検出値が、閾値より大きい場合に、染色体上において標的配列の増幅が生じたと判定することを特徴とする核酸の変異の判定方法。【００２９】
（XXI）前記（I）〜（XIX）のいずれか一つに記載の核酸の一次構造変化の解析方法により得られた、解析対象核酸中の標的配列の補正検出値が、閾値より小さい場合に、染色体上において標的配列の欠失が生じたと判定することを特徴とする核酸の変異の判定方法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、塩基多型および変異に関係なく、標的とする核酸を定量することができ、検出に際しては、担体上における固体と液体の界面での反応に、従来の核酸同士のハイブリダイゼーションに代わり、免疫反応等のリガンドとレセプターとの反応を利用するため、特異性が高く、高感度で、定量性に優れる。さらに、操作も簡便で高温条件を必要としないので、低コスト化で解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明におけるリガンドが結合された配列を得る工程の一例を示す概略図である。
【図２】本発明におけるリガンドが結合された複数の配列を同時に得る工程の一例を示す概略図である。
【図３】本発明における、リガンドが結合された、多型サイトを含む複数の配列を同時に得る工程の一例を示す概略図である。
【図４】本発明における、リガンドが結合された、ＳＮＰマーカーを含む配列を得る工程の一例を示す概略図である。
【図５】本発明における、リガンドが結合された、多型サイトを含む複数の配列を同時に得る工程の一例を示す概略図である。
【図６】本発明における、リガンドが結合された、多型サイトを含む複数の配列を同時に得る工程の一例を示す概略図である。
【図７】本発明における、リガンドが結合された配列を検出する工程の一例を示す概略図である。
【図８】本発明におけるリガンドが結合された標準配列および標的配列を同時に得る工程の一例を示す概略図である。
【図９】本発明における標的配列の検出値を補正する方法の一例を示す概略図である。
【図１０】本発明における、複数の標的配列の検出値の補正結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例２における核酸の一次構造変化の解析結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明について、詳しく説明する。
１．リガンドで修飾された標準配列および標的配列を得る工程
本発明において解析対象核酸とは、一次構造の変化を解析する対象の核酸のことである。また、基準核酸とは、解析対象核酸と同じ種類で、少なくとも以下に述べる標準配列に包含される塩基配列に変異がない核酸のことであり、解析対象核酸の一次構造の変化の度合いを相対比較する際の基準となる核酸のことである。
基準核酸および解析対象核酸は、その中に含まれる核酸配列についてＰＣＲ法等による増幅反応やライゲーションによる連結反応を行える長さを持っているものであれば、特に限定されない。このようなものとして、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、合成ＲＮＡ等、全ての種類のＤＮＡおよびＲＮＡを挙げることができる。なかでも、生体試料中に存在する核酸が好適である。【００３３】
また、標的配列とは、前記基準核酸中には少なくとも一つ存在し、解析対象核酸中においては存在の有無または量が不明の、解析対象の塩基配列を含む配列のことである。
一方、標準配列とは、基準核酸および解析対象核酸中に少なくとも一つ存在し、塩基配列に変異がなく、解析に用いた基準核酸と解析対象核酸の量の相対比較をおこなうための配列のことである。
本発明においては、基準核酸および解析対象核酸中の標準配列および標的配列を検出し、基準核酸および解析対象核酸中の標準配列の比を求めて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する係数を算出し、該補正係数を用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正する。そして解析対象核酸中の標的配列の補正検出値と、基準核酸中の標的配列の検出値を比較することにより、基準核酸中の標的配列に対する解析対象核酸中の標的配列の量の増減を確認する。これにより、解析対象の配列が、解析対象核酸中の標的配列に含まれているか否か、含まれている場合には、増幅あるいは欠失等の変異の度合いを、基準核酸中の同じ塩基配列と比較することができる。
補正係数は、具体的には、例えば、基準核酸中の標的配列の検出値を解析対象核酸中の標的配列の検出値で割って算出すればよく、該補正係数を、解析対象核酸中の標的配列の検出値に乗じることで、解析対象核酸中の標的配列の補正検出値が得られる。【００３４】
標準配列および標的配列としては、マーカーとして染色体上の位置が特定されている塩基配列を含むものを用い、これらマーカーを解析対象とすることが好ましい。このようなマーカーとしては、遺伝子、マイクロサテライトマーカー、ＳＮＰマーカー、ＳＴＳマーカー、ＥＳＴマーカー、ｃＤＮＡマーカーや、染色体上に複数存在しない他の配列と区別可能なユニーク配列からなる群より選ばれる一種以上を好ましいものとして挙げることができる。【００３５】
本発明では、複数の標的配列を同時に解析することもできる。
本発明では、基準核酸および解析対象核酸中の標準配列および標的配列そのものに、それぞれ第一のリガンドおよび第二のリガンドを結合させ、これらリガンドを用いて担体に標準配列および標的配列を固定化して、解析に供することは困難なので、標準配列および標的配列と同じ配列のものに前記リガンドが結合された構造のものを別途調製し、これを解析に供する。【００３６】
本発明で用いる第一のリガンドおよび第二のリガンドとしては、後に述べる担体上の受容体に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ハプテン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、フルオロセイン、アレクサ、ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＤＮＰ、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ダンシル、ルシファーイエロー、糖鎖、ペプチド、蛋白質、ポリヒスチジン、抗原／抗体物質、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｔａｐ、Ｆｌａｇ等を挙げることができる。なかでもビオチン、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、フルオロセイン、アレクサ等は安価な市販品の入手が容易で好適である。【００３７】
糖鎖やペプチドは化学構造のデザインに自由度が高く、複数種類のハプテンをそろえることが容易であるので、場合に応じて種々のものを適宜選択することができる。ハプテンとしては親水性有機化合物が好ましく、糖鎖としては二つ以上の単糖が結合したものが好ましい。また、ペプチドとしてはアミノ酸残基数が６以上のものが好ましく、アミノ酸残基数が２以上のものが特に好ましい。
免疫反応を利用して核酸の検出を行うために、第一のリガンドおよび／または第二のリガンドと受容体の組み合わせを、抗原と抗体の組み合わせとしてもよく、リガンドと受容体との間の特異的結合を抗原抗体反応によって形成することができる。また、リガンドとして抗体を用いる場合は、抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体や、ファージディスプレイ法によって得られた抗体が好ましい。【００３８】
ここで、この方法の基本となる、第一のリガンドおよび第二のリガンドが結合した標準配列または標的配列を得る方法は特に限定されないが、好ましい方法として、例えば、図１に示すように、前記リガンドで修飾されたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記）により標準配列または標的配列を増幅する方法（図１（ａ））、リガンドで修飾された核酸プローブを用いて標準配列または標的配列上でライゲーション反応を行う方法（図１（ｂ））、ポリメラーゼ反応を用いるサイクルエロンゲーション法後にリガンドで修飾された核酸プローブをハイブリダイズさせる方法（図１（ｃ））が挙げられる。
ＰＣＲ法を用いると、標準配列または標的配列をリガンドで修飾するとともにその数を増幅させることができる。また、サイクルエロンゲーション法を用いることにより、標準配列または標的配列のより定量的な増幅が可能となるが、リバース側のプライマーを用いないため、一方のリガンド（例えば、第一のリガンドで修飾されたプライマーを用いた場合には、第二のリガンド）が標準配列および標的配列に結合されない。そこで、サイクルエロンゲーション後、一方のリガンドで修飾されたプローブを、増幅された標準配列および標的配列にハイブリダイズさせる。なお、前記ポリメラーゼ反応は、恒温増幅反応であるが好ましい。ライゲーション反応を行う場合は、標準配列および標的配列をＰＣＲ法やサイクルエロンゲーション法、ＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法によって増幅してから、プローブをハイブリダイゼーションさせることが好ましい。すなわち、基準核酸または解析対象核酸中のライゲーション反応を行う領域を予め増幅させておくことで、基準核酸または解析対象核酸中の他の領域にある類似塩基配列への核酸プローブの結合を予め防ぐことができ、増幅された核酸をライゲーションして、反応生成物を変性させることによって、より高い精度で、リガンドで修飾された標準配列または標的配列を得ることができる。【００３９】
第一のリガンドは、結合している核酸の種類ごとに、異なる種類のものを用いる必要がある。また、第二のリガンドは、第一のリガンドとは異なる種類のものを用いる必要があるが、必ずしも結合している核酸の種類ごとに異なる種類のものを用いる必要はない。しかし、第二のリガンドをすべて共通のものとすることで、例えば、第二のリガンドを介して担体に固定化された標準配列または標的配列を容易にＢＦ分離することができ、本発明の解析をより容易にかつ低コストで行うことができる。
また、第一および第二のリガンドは、必ずしも一分子からなるものである必要はなく、二分子以上で構成されたものでもよい。【００４０】
本発明においては、複数種類の標準配列および／または標的配列を、リガンドと受容体との特異的結合を介して検出するためには、複数種類の標準配列および／または標的配列をそれぞれ異なる組合せのリガンドで修飾する必要がある。このような核酸とリガンドとの関連づけには様々な方法が想起されるが、ここでは、マルチプレックッス反応により、複数種類の標準配列および／または標的配列を、リガンドと受容体との特異的結合を介して検出する方法について説明する。【００４１】
まず、図２を用いて、マルチプレックッスＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって、同一反応系で、異なるリガンドが結合された二種類の核酸を同時に増幅して得る方法の一例について説明する。【００４２】
図２に示すように、リガンド１〜４で修飾された４種類のプライマーを用意する（以下、それぞれ第一〜第四のプライマーという）。第一のプライマーと第二のプライマーは、配列Ａを増幅することができる。一方、第三のプライマーと第四のプライマーは、配列Ｂを増幅することができる。ここで、増幅部位には一塩基多型やマイクロサテライト多型等が含まれていても良い。また、配列Ａおよび配列Ｂは、標準配列および標的配列のいずれでも良い。各プライマーに対するリガンドの結合場所や数は限定されないが、５’末端に結合することが好ましい。また、リガンド２とリガンド４を共通のものとしても良い。また、一つのプライマーに異なる種類の複数のリガンドを結合させても良い。また、リガンドは、必ずしも一分子からなるものである必要はなく、二分子以上で構成されたものでもよい。
このような二つの増幅部位に対して各プライマーをハイブリダイゼーションさせると、一定の効率で、各増幅部位ごとに、プライマーが対となって核酸に結合し、ポリメラーゼによる伸長反応を行うことができる。このような同時反応条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、配列とリガンドとの関連付けをより定量的に行うことができる。【００４３】
その後、ＰＣＲ法によって配列を増幅し、リガンドで修飾された配列Ａおよび配列Ｂを得る。配列Ａはリガンド１および２で修飾された配列として、配列Ｂはリガンド３および４で修飾された配列として、それぞれ関連付けが行われる。この関連付けは同一反応条件下で行っているために極めて反応効率比の精度が高い。
またここで、配列Ａが標準配列、配列Ｂが標的配列であれば、リガンド１および３が第一のリガンド、リガンド２および４が第二のリガンドに相当する。【００４４】
一方、ここでは核酸増幅法としてＰＣＲ法を挙げたが、ＬＡＭＰ法等の等温増幅法でもマルチプレックス増幅を行うことができる。リガンドが結合された、等温増幅法で必要なプライマーを用いることで、ＰＣＲ法と同様に、これらリガンドで修飾された標準配列および標的配列を得ることができる。【００４５】
さらに、前記のように増幅する配列について、図３を用いて詳細に説明する。本発明では、増幅する配列が多型性を示すマーカーを含むものであっても、その多型情報は拾わず、位置情報を得ることができる。
リガンドで修飾されたプライマーを作製し、解析対象サンプルに対してマイクロサテライト多型解析法で増幅反応を行う。この時、サンプルのマイクロサテライト多型部位においてマイクロサテライト繰り返し数のタイプが複数存在している。サンプルのマイクロサテライト多型サイトのアリルタイプを含んだ形で、フォワードプライマーaがマイクロサテライト多型サイトの上流とマッチングし、リバースプライマーｃとともにＰＣＲによって増幅が行われる。増幅産物は、両５’末端にそれぞれリガンドａとリガンドｃが結合した２本鎖ＤＮＡとなる。同様に、コントロールとしておいた核酸配列の変化のおきない領域に対しても、フォワードプライマーｂが配列の上流にマッチングし、リバースプライマーｃ’とともにＰＣＲによって、サンプルの増幅が行われる（図示略）。ＰＣＲ産物は両５’末端にそれぞれリガンドｂとリガンドｃ’が結合した２本鎖ＤＮＡとなる。
なお、ここでは、リガンドａおよびｂが第一のリガンド、リガンドｃおよびｃ’が第二のリガンドに相当する。【００４６】
このように、マイクロサテライト多型サイトを含む複数の配列から、リガンドで修飾されたマイクロサテライト多型サイトを含む複数の配列を得ることができる。【００４７】
また、１塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下、ＳＮＰと略記）を含む核酸の一次構造解析においては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  −  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）が好適に用いられる。ＰＣＲ−ＳＳＰ法は二種類のプライマーの片方の３’末端が検出対象の配列のＳＮＰサイトと重なるように配列を設計することで、ＳＮＰサイトとプライマーの３’末端とのマッチングの有無によってＰＣＲによる増幅を制御する方法である。【００４８】
本発明は、ＳＮＰサイトのアリルタイプに関係なくこうしたマーカーの存在する配列の欠損や増幅を観察することができる。具体的には、ＳＮＰ検出法であるＰＣＲ−ＳＳＰ法を改良し、複数の異なるリガンドで修飾された、ＳＮＰマーカーを含む配列を得る方法を用いる。一例として、サンプルのＳＮＰサイトが塩基Ａ（アデニン）と塩基Ｇ（グアニン）の２タイプがアリルとして存在している場合について、図４を用いて説明する。また、ＰＣＲ−ＳＳＰ法以外のプライマーの設定法もあわせて示した。
図４Ｉは、ＰＣＲ−ＳＳＰ法において使用されるプライマーで、リガンドで修飾された一種類のフォワードプライマーの３’末端が、検出対象の配列のＳＮＰサイトと重なって終結している様子を示す。
図４IIは、リガンドで修飾された一種類のフォワードプライマーの３’末端が、検出対象の配列のＳＮＰサイトより一塩基上流で終結している様子を示す。
また、図４IIIは、ＳＮＰを挟み込んだ領域を増幅するための、ＰＣＲ−ＳＳＰ用ではなく通常のＰＣＲ用プライマーセットのうち、リガンドで修飾されたフォワードプライマーを示す。この時、リガンドで修飾する場所やリガンドの数に制限はないが、リガンドで修飾する場所は５’末端が好ましく用いられる。また、リバースプライマー（図示略）はフォワードプライマーとは異なった種類のリガンドで修飾する。修飾するリガンドは、異なってさえいれば複数種類を用いても良い。また、リガンドは、必ずしも一分子からなるものである必要はなく、二分子以上で構成されたものでもよい。【００４９】
図５は、図３のシングル反応を元にしたマルチプレックス反応の例を示すものである。
ａ、ｂ、ｃのリガンドで修飾された４種類のプライマーを用意する（プライマーａはリガンドａで修飾され、プライマーｂはリガンドｂで修飾され、プライマーｃおよびプライマーｄはリガンドｃで修飾されている）。サンプルの配列Ａは標的配列であり、その多型サイトの上流にフォワードプライマーａがマッチングし、リバースプライマーｃとともにＰＣＲによって配列Ａの増幅が行われる。増幅産物は、両５’末端がそれぞれリガンドａとリガンドｃで修飾された２本鎖ＤＮＡとなる。一方、塩基配列の変化のおきない領域の多型サイトを含む配列Ｂは標準配列であり、同様に、サンプルの多型サイトのアリルタイプに関係なく、フォワードプライマーｂが多型サイトの上流とマッチングし、リバースプライマーｄとともにＰＣＲによって配列Ｂの増幅が行われる。増幅産物は、両５’末端がそれぞれリガンドｂとリガンドｃで修飾された２本鎖ＤＮＡとなる。
上記の方法によって、リガンドで修飾された、多型サイトを含む複数の配列を得ることが可能となる。
なお、ここでは、リガンドａおよびｂが第一のリガンド、リガンドｃが第二のリガンドに相当する。【００５０】
上述の方法によって、検出したい配列を、その配列の種類に対応して異なるリガンドで修飾した配列として得ることが可能となる。【００５１】
次に、マルチプレックスライゲーション反応によって、異なるリガンドが結合された二種類の配列を同時に得る方法の一例について説明する
上記ＰＣＲ法と同様、ライゲーション反応によっても配列とリガンドとの関連づけが可能である。図６に示すように、ａ、ｂ、ｃのリガンドで修飾された４種類のプローブを用意する（プローブａはリガンドａで修飾され、プローブｂはリガンドｂで修飾され、プローブｃおよびプローブｄはリガンドｃで修飾されている）。プローブａおよびプローブｃは配列Ａに対応し、プローブｂおよびプローブｄは配列Ｂに対応している。なお、配列Ａおよび配列Ｂは、標準配列および標的配列のいずれでも良い。このマルチプレックスライゲーション反応もマルチプレックスＰＣＲ法と同様に、各プローブを含む条件下で各配列部位においてハイブリダイゼーションを行うと、一定の効率で、プローブ対が配列に結合し、ライゲースによる連結反応を行うことができる。このような同時反応条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、配列とリガンドとの関連付けをより定量的に行うことができる。また、反応後に、ハイブリダイゼーションを行う際に用いた緩衝液のｐＨをアルカリ性にするなどの方法によって、二本鎖核酸を一本鎖に変性すると、反応物は、５’末端と３’末端の両端がそれぞれリガンドａとリガンドｃまたはリガンドｂとリガンドｃで修飾された一本鎖ＤＮＡが混合したものとなる。
マルチプレックスライゲーション反応を用いる方法は、ＰＣＲ法同様、検出対象の配列が多型サイトを含むものでも適用することができる。
なお、ここでは、リガンドａおよびｂが第一のリガンド、リガンドｃが第二のリガンドに相当する。【００５２】
ライゲーション反応では、サンプルを増幅させる工程がないので、より解析工程を簡略化することができ、コスト低減と解析時間の短縮が可能である。ただし、感度が悪くなることと、配列の相同性が高い領域では、プローブ設計の選択の自由度が高くなく、目的とするリガンド修飾配列を精度良く得られないことがある。したがって、感度向上と精度向上のために、検出対象の配列を含む領域をＰＣＲ法やサイクルエロンゲーション法、ＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法などの恒温増幅法により、ポリメラーゼ反応を用いて増幅してからライゲーション反応を行うことが好ましい。【００５３】
この時、リガンドで修飾するプローブの場所やリガンドの数は特に限定されないが、ライゲースの反応を阻害しないように多型サイトの近傍以外の位置、例えば多型サイトを３’末端に設定しているプローブでは５’末端を、もう片方のプローブでは３’末端を修飾することが好ましい。また、修飾するリガンドは、異なってさえいれば複数種類を用いても良い。また、リガンドは、必ずしも一分子からなるものである必要はなく、二分子以上で構成されたものでもよい。【００５４】
本発明で用いるライゲースは、特に限定されず、従来公知のものを用いることができる。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ライゲース、Ｔ４  ＤＮＡ  ライゲース等を挙げることができる。【００５５】
上述の方法によって、検出したい配列を、その配列の種類に対応して異なるリガンドで修飾した配列として得ることが可能となる。【００５６】
本発明で用いるプライマーおよびプローブの塩基数は特に限定されないが、３〜６０塩基からなるものが好ましい。【００５７】
ここまで、二種類の配列を検出する方法について説明してきたが、本発明によって三種類以上の配列を検出することもできる。三種類以上の配列に対しては、各配列の種類ごとにマルチプレックス反応を行うため、プライマーまたはプローブの種類は、検出対象の配列の種類に応じて多くなる。例えば、検出対象の配列が三種類であれば、少なくとも六種類のプライマーまたはプローブが必要であり、少なくとも四種類のリガンドが必要である。
また、配列の検出は別々の容器で行ってもよいし、同一の容器で同時に行ってもよい。【００５８】
２．リガンドで修飾された標準配列および標的配列を検出する工程
前記のようなリガンドで修飾された標準配列および標的配列の検出は、リガンドに特異的に結合する受容体を担持させた担体に、標準配列および標的配列を、該受容体を介して固定化して行う。例えば、標準配列および標的配列を、異なる第一のリガンドおよび共通の第二のリガンドで修飾した場合、第一のリガンドに特異的に結合する受容体を担持させた担体を第一のリガンドの種類ごとに用意し、受容体に第一のリガンドを結合させて、標準配列および標的配列を担体に固定化してこれらを検出する。配列の検出方法は特に限定されず、従来公知の方法を適用することができるが、蛍光色素で検出する方法が好ましい。【００５９】
例えば、図７に示すように、第二のリガンドと特異的に結合する受容体を予め担持させた担体を第一の容器および第二の容器に設ける。さらに、標準配列の第一のリガンドと特異的に結合する受容体および標的配列の第一のリガンドと特異的に結合する受容体を、蛍光色素で予め修飾しておく。リガンドで修飾された標準配列および標的配列を、第一の容器および第二の容器中で、第二のリガンドを介して担体に結合させる。次に、第一の容器中で標準配列の第一のリガンドに、蛍光色素で修飾された受容体を結合させる。また、第二の容器中で、標的配列の第一のリガンドに、蛍光色素で修飾された受容体を結合させる。その後、この蛍光色素を、光学装置を用いて検出することにより標準配列および標的配列を検出することができる。以上の操作を基準核酸および解析対象核酸の双方で行う。
なお、標識化合物としては、蛍光色素以外のものを用いても良い。また、第二のリガンドは、標準配列と標的配列で異なるものでも良く、共通のものでも良い。さらに、標準配列と標的配列の検出は、標識物質を変えれば、一つの容器中で行うこともできる。【００６０】
また、ここでは図示しないが以下の方法を適用することもできる。すなわち、標準配列の第一のリガンドと特異的に結合する受容体を予め担持させた担体を第一の容器に、標的配列の第一のリガンドと特異的に結合する受容体を予め担持させた担体を第二の容器にそれぞれ設ける。さらに、第二のリガンドと特異的に結合する受容体を、蛍光色素で予め修飾しておく。リガンドで修飾された標準配列を第一の容器中で、リガンドで修飾された標的配列を第二の容器中で、それぞれ第一のリガンドを介して担体に結合させる。次に、第一の容器および第二の容器中で、第二のリガンドに、蛍光色素で修飾された受容体を結合させる。その後、この蛍光色素を、光学装置を用いて検出することにより標準配列および標的配列を検出することができる。以上の操作を基準核酸および解析対象核酸の双方で行う。
ここでも、標識化合物としては、蛍光色素以外のものを用いても良い。また、第二のリガンドは、標準配列と標的配列で異なるものでも良く、共通のものでも良い。さらに、標準配列と標的配列双方の第一のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた担体を用いる場合には、第二のリガンドおよび標識物質として、標準配列と標的配列で異なるものを用いれば、一つの容器中で標準配列と標的配列の検出を行うこともできる。【００６１】
一方、標準配列の第一のリガンドおよび／または標的配列の第一のリガンドと同じリガンドを、予め担体に担持させておいてもよい。この場合、担持された前記リガンドに対し、これらと特異的に結合する受容体を結合させる。次に、リガンドで修飾された標準配列および／または標的配列の第一のリガンドを前記受容体に結合させる。
リガンドを担持させた担体は、受容体を担持させた担体と比べて保存性に優れており、検査方法の実用化に際して大きな利点を有する。
なお、予め担体に担持させるリガンドは第二のリガンドでも良い。【００６２】
標準配列および標的配列の検出は、酵素反応で行うこともできる。この場合用いる酵素は特に限定されず、従来公知のものを用いることができ、このような酵素としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等を挙げることができる。この場合、例えば、前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体を予め酵素で修飾しておき、この酵素に基質を反応させることによって生じる化学発光を検出する。
なお、予め酵素で修飾する受容体は、第一のリガンドと特異的に結合するものでも良い。【００６３】
化学発光による検出工程について、一例を挙げて、より詳細に説明する。先ず、担体に受容体を担持させる。代わりに受容体を予め担持させた担体を用いてもよい。次に、リガンドで修飾された標準配列および／または標的配列を、受容体と第二のリガンドとの間の特異的結合を介して前記担体に結合させる。この時、担体に未結合の遊離の標準配列および／または標的配列をＢＦ分離によって取り除く。その後、前記酵素で修飾された抗体を、担体に結合された標準配列および／または標的配列の第一のリガンドに結合させる。この時、未結合の遊離の標識抗体をＢＦ分離によって取り除く。最後に酵素−基質反応によって化学発光を生じさせ、これを検出することによって検出対象の核酸を特定する。この方法は、前記のリガンドを担体に担持させた配列の検出方法についても、適用することができる。【００６４】
また、標準配列および標的配列の第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた担体を使用して、標準配列および標的配列を同時に検出することもできる。第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた担体には、特に第二のリガンドを共通のものとした場合には容易に、標準配列および標的配列双方を結合させることができる。担体に結合された標準配列および標的配列は、いずれも第一のリガンドが未結合の状態にある。
従って、第一のリガンドと特異的に結合する受容体を、標準配列および標的配列とで異なる種類の標識物質で予め修飾しておき、この標識物質を使用することによって標準配列および標的配列を同時に検出することができる。【００６５】
一方、リガンドで修飾された標準配列および標的配列を検出する他の方法として、凝集反応を利用する方法を挙げることもできる。
具体的には、例えば、第一のリガンドに対する受容体と第二のリガンドに対する受容体を別々もしくは同一の、ポリスチレンラテックスビーズ等の分散性微粒子の表面に予め担持させておき、この担体の凝集反応で、標準配列および標的配列を検出することが可能である。【００６６】
本発明において凝集とは、標準配列または標的配列と分散性微粒子との架橋反応によって生じるものを指す。例えば、異なる種類の第一のリガンドおよび共通でも良い第二のリガンドが結合した標準配列または標的配列、前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の微粒子、および前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の微粒子をそれぞれ反応させると、一つの標準配列または標的配列が、第一の微粒子および第二の微粒子と結合することによって、第一の微粒子および第二の微粒子が連結される。さらに、一つの微粒子に複数の標準配列または標的配列が結合し、これら標準配列または標的配列が他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結されて凝集を生じる。本発明では、このようにして生じた凝集物を分光光度法によって測定する。【００６７】
また、検出対象の標準配列および標的配列に対応する各リガンドの組み合わせに対応した受容体を担持させた担体を、複数の容器に分配しておき、検出対象の標準配列および標的配列を含むサンプルを各容器に分注することによって、各容器で特定の配列を凝集させて検出することが可能である。【００６８】
本発明で用いる微粒子とは分散性微粒子であり、例えば、コロイド粒子のように溶液中で分散する粒子のことを指し、ラテックス粒子が好適に用いられるが、これに限定されない。免疫比濁法装置で比濁を測定するにあたり、分散性微粒子の粒径は８０〜３００nmであることがより好ましい。【００６９】
本発明で用いるラテックス粒子は主にポリスチレンから成り、親水性と分散性とを高めるためメタクリル酸が共重合されている。ラテックス粒子には、表面に官能基がないプレーンタイプと官能基を有する官能基タイプがある。プレーンタイプの表面の荷電はメタクリル酸の存在のため、負の電荷を有しており、タンパク質の正の電荷を持つ領域とイオン結合することができる。また、疎水結合させることも可能である。プレーンタイプのラテックス粒子はタンパク質と混合するだけで、タンパク質が吸着するので、タンパク質の固定操作が容易である。【００７０】
官能基を有するラテックス粒子は、表面にカルボキル基やアミノ基等が露出するように設計されており、様々なタイプの官能基タイプラテックス粒子が利用可能である。官能基タイプラテックス粒子に受容体を結合させる方法としては、例えば、水溶性カルボジイミドでカルボン酸とアミノ基を結合させるＥＤＡＣ法、ＥＤＣとＮＨＳとをあらかじめ混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる方法、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する方法、活性化したアルデヒド基やトシル基でタンパク質を結合する方法等が挙げられる。本発明においては前記方法をはじめ、従来公知のいかなる方法を用いてもよいが、なかでもＥＤＡＣ法が好ましく、例えば、Ｓｉｇｍａ社製ＥＤＡＣを用いることができる。なお、ラテックス粒子以外の微粒子であっても、従来公知の方法によって受容体を該微粒子に結合させることができる。【００７１】
分散性微粒子に結合させる受容体としては、検出対象の標準配列および標的配列に結合されたリガンドと特異的に結合する受容体を用いる。このような受容体としては、例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジン、Ｎｉ等を用いることができるが、これらに限定されず、後述する種々のものを用いることができる。なかでも、タンパク質、特に抗体が好適に用いられる。前記の方法以外に、これら受容体を微粒子に結合させる方法は特に限定されず、微粒子の種類に応じてに適宜従来公知の方法を適用すればよい。また、予め受容体を結合させた分散性微粒子を用いても良い。【００７２】
凝集物を検出する方法としては、例えば、一つの分散性微粒子に、単一種類の受容体を結合させたものを用いる方法が挙げられる。本発明においては、標準配列および標的配列には少なくとも二種類のリガンドが結合されているため、一種類の標準配列または標的配列に対して少なくとも二種類の分散性微粒子を準備できる。即ち、第一のリガンドに対応する受容体のみが結合された第一の微粒子および第二のリガンドに対応する受容体のみが結合された第二の微粒子を用いることができる。【００７３】
また、他の方法としては、一つの分散性微粒子に二種類以上の受容体を結合させたものを用いる方法が挙げられる。この方法では、一つの標準配列または標的配列に結合された二種類のリガンドのうち、一方のリガンドに対応する受容体と、他方のリガンドに対応する受容体以外の受容体を、一つの分散性微粒子に結合させることが好ましい。即ち、標準配列または標的配列の二種類のリガンドの双方が、一つの分散性微粒子に結合しないように設計することが好ましい。【００７４】
リガンドが結合された標準配列および／または標的配列と、受容体が結合された第一および第二の微粒子を反応させて結合し、凝集物を得ることができるが、この反応は、標準配列および／または標的配列が含まれる溶液と、第一および第二の微粒子が別々に含まれる二つの溶液を同時に混合することで行ってもよく、あるいは、第一および第二の微粒子が別々に含まれる二つの溶液を順に混合することで、逐次的に行ってもよい。また、第一および第二の微粒子が両方含まれる溶液を、標準配列および／または標的配列が含まれる溶液と混合しても良い。【００７５】
標準配列または標的配列に結合している第一のリガンドが第一の微粒子と結合し、第二のリガンドが第二の微粒子と結合すると、一つの標準配列または標的配列が第一および第二の微粒子と結合することによって、第一および第二の微粒子が連結される。さらに、一つの微粒子に複数の標準配列または標的配列が結合し、これら標準配列または標的配列が他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結された結果、微粒子の凝集が生じる。【００７６】
これにより、標準配列または標的配列が試料中に存在すると、微粒子の凝集が生じ、標準配列または標的配列を検出することができる。ここで、微粒子の凝集の有無は、分光光度法で吸光度を測定することによって判定できる。
すなわち、単独の微粒子は近赤外光を殆ど散乱しないが、凝集した微粒子は単独の微粒子に比べて見かけ上の径が大きく、近赤外光の散乱を生じさせる。従って、近赤外領域の入射光に対する透過光の光度を光度計で測定することにより、微粒子の凝集度を測定することができる。このとき、粒径３００ｎｍ以下の微粒子は、凝集すると近赤外光を好適に散乱させるため、本発明においては、粒径３００ｎｍ以下の微粒子を用いることが好ましく、粒径８０〜３００ｎｍの微粒子を用いることがより好ましい。【００７７】
微粒子を含む溶液は、混合後に凝集が起こっていないと仮定した場合の最終濃度が、ＯＤ値で０．０１〜１の範囲となるようにすることが好ましい。さらに、凝集後のＯＤ値が３以下となるようにすることが好ましい。標準配列および／または標的配列を含む溶液と、微粒子を含む溶液を混合する際は、リガンドと受容体との結合が偏って生じることを避けるため、一方の溶液の容量が他方の溶液の容量の２０％を下回らないようにすることが好ましく、混合ルテックスミキサーやピペッティングですばやく攪拌することが好ましい。また、混合の際に用いる緩衝液は特に限定されないが、凝集を促進する緩衝液を用いることが好ましい。【００７８】
その他の混合条件は、用いるリガンド−受容体の組み合わせにより適宜選定すれば良いが、例えば、リガンド−受容体の組み合わせとして抗原−抗体を用いる場合には、３０℃程度で、約５分混合撹拌することが好ましい。【００７９】
なお、混合後の反応溶液を分光光度測定に供する際、凝集していない微粒子は近赤外光を散乱しないため、Ｂ／Ｆ分離する必要がなく、反応系を直接測定に供することができる。また、標準配列および／または標的配列をＰＣＲ法によって調製した時は、リガンドが結合した未反応のプライマーや未反応のヌクレオチド等によって測定誤差を生じるおそれがある場合、これらを分離することが好ましい。分離する方法は、例えば、リガンドにビオチンを結合し、アビジン又はストレプトアビジンを結合した磁性粒子を用いてＢ／Ｆ分離する方法が挙げられる。【００８０】
次に、本発明の方法を用いて標準配列および標的配列を定量する方法を説明する。定量を行う際には、前記のリガンドを結合した標準配列および標的配列を用い、これら配列を各種濃度で含む溶液を調製する。各濃度の配列溶液を、前記方法に従って微粒子と反応させて凝集物を生じさせ、分光光度法により吸光度を測定する。該測定結果に基づいて、標準配列および標的配列の濃度と吸光度との関係から検量線を作成する。この検量線に基づいて、検出対象の標準配列および標的配列の吸光度測定結果から、これら配列濃度を算出する。これによって、標準配列および標的配列の定量を行うことができる。【００８１】
また、複数種類の標準配列および／または標的配列が含まれる試料を用いる場合、これら配列の種類ごとに異なる第一のリガンドおよび共通でも良い第二のリガンドをこれら配列に結合させ、検出すべき標準配列および／または標的配列に結合されたリガンドと特異的に結合する受容体が結合された分散性微粒子のみを反応に供することによって、複数種類の標準配列および／または標的配列を含む試料から、所望の配列を同時に検出することができる。【００８２】
なお、一つの標準配列または標的配列に対して用いるリガンドは二種類だけではなく、三種類以上を用いてもよく、各種類のリガンドに特異的に結合する受容体が結合された分散性微粒子を用いてもよい。【００８３】
次に、本発明で使用される受容体と担体について説明する。
本発明において受容体とは、第一および第二のリガンドが特異的に結合する物質を指す。例えば、リガンドとしてビオチンを選択した場合、アビジンが受容体となり、リガンドとしてハプテンを選択した場合、抗ハプテン抗体が受容体となる。抗ハプテン抗体としては、特に限定されないが、特異性および検出精度が向上するので、アフィニティー精製を行った抗体、モノクローナル抗体およびファージディスプレイ法によって得られた抗体であることが好ましい。また、リガンドと受容体の組み合わせが抗原と抗体の組み合わせであって、前記リガンドと受容体との特異的結合が抗原抗体反応によって形成されてもよい。このように免疫反応を用いて標準配列または標的配列を検出することにより、高精度の検出が可能となる。【００８４】
本発明において担体とは、前記受容体を担持可能な任意の支持体を意味する。担体の材質、形状は特に限定されない。材質としては、例えば、ガラス、シリコン、金属、金属酸化物、樹脂、ゴム、セラミックス等が挙げられる。受容体を結合させるためにリンカーを用いる場合には、リンカー剤と反応させるために、担体表面に水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基等の活性基があることが好ましい。また、金表面であればチオール基との配位結合が可能であるので活性基が無くても良い場合もある。形状としては、例えば、基板状、粒子状のものを挙げることができ、具体的には、高感度に蛍光測定が可能なＤＮＡマイクロアレイスキャナーを利用する場合であれば、スライドガラス形状（約２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ）が好ましく、化学発光のプレートリーダーを利用する場合であれば、マイクロプレート形状（約８６ｍｍ×１２８ｍｍ）が好ましい。さらに担体は液透過性であっても液不透過性であってもかまわない。液透過性担体は多くの場合多孔質体であるので、表面積が大きく、抗体等の受容体の固定化量を増やすことができ、液の移動方向に自由度が高まるので、反応を自動化しやすいなどの利点がある。しかし、材質の選択の幅が狭まることがあり、場合によっては検出装置の改良が必要になることもあるので、場合に応じて適宜選定することが必要となる。【００８５】
受容体を基板状の担体に担持させる方法は特に限定されず、従来公知の方法を適用すれば良く、例えば、物理吸着、化学結合等で担持させる方法を挙げることができる。ここで物理吸着とは、ファンデルワールス力、疎水結合等、分子間引力による結合のことであり、化学結合とは、担体上の官能基と受容体上の官能基との間で形成される共有結合を指す。化学結合は、担体と受容体との間にリンカーを介して形成させても良い。用いるリンカーは、担体の材質や表面状態、抗体の種類によって最適な種類を選択することができる。
物理吸着で担持させる方法は、工程が単純であるという利点がある。化学結合で担持させる方法は、受容体をより安定して担体に担持でき、例えば、受容体として抗ハプテン抗体を用いる場合には、その活性を維持するのに有利であるという利点がある。いずれの方法を採用するかは、用いる受容体および担体を考慮して適宜選定すれば良い。【００８６】
ここで、受容体として抗ハプテン抗体を担持させた担体の調製法の一例を示す。ただし本発明では、下記内容に限らず、上述の内容を満たせばいずれの担体も用いることができる。
担体として低蛍光シリカガラスを使用する場合は、該ガラスはアルコールでよく脱脂した後、純水で洗浄する。次にエタノール中のアミノプロピルトリメトキシシラン（信越シリコーン社製）の濃度が３質量%となるように溶液を調製する。この溶液中にガラスを室温で浸漬し、攪拌しながら1時間反応させ、エタノールと純水で順に洗浄した後、１３０℃で２０分間乾燥させる。【００８７】
次にＥＤＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を、濃度が５質量%となるようにＭＥＳ緩衝液に溶解させ、この溶液に処理済のガラスを室温で浸漬し、攪拌しながら1時間反応させる。反応後、ＭＥＳ緩衝液と純水で順に洗浄し、スピンドライ法により室温で乾燥させる。【００８８】
抗ハプテン抗体は、ハプテンａとしてＦＩＴＣ、ハプテンｂとしてＤＩＧを用い、これらに対応した抗ハプテン抗体として、抗ＦＩＴＣ抗体とＤＩＧ抗体をアフィニティー精製したものをＭＥＳ緩衝液に、濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液を調製し、この溶液をガラス上の異なる位置に点着する。点着には、例えば、触針式の点着装置ＳＰＢＩＯ（日立ソフトウェア社製）を用いる。点着後、室温にて1時間反応させ、その後ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を０．１質量%の濃度で溶解させたＰＢＳ緩衝液に室温で1時間浸漬させる。浸漬後、ＰＢＳ緩衝液と１／１０濃度のＰＢＳ緩衝液で順に洗浄した後、スピンドライ法で乾燥させ、冷暗所に乾燥状態で保管する。【００８９】
このようにして、受容体を担持させた担体を作製することができる。また、抗ハプテン抗体は二種類ではなく三種類以上を固定化することもできるので、検出対象の標準配列または標的配列の種類をさらに増加させることもできる。【００９０】
本発明では、担体として粒子状のものを使用し、これに前記受容体を担持させることもできる。
粒子状担体の材質は特に限定されないが、樹脂製のものが多く用いられる。例えば、天然ゴム、スチレン、スチレン共重合体、ポリウレタン、アクリル樹脂等を挙げることができる。また、粒子状担体に磁性を有する物質を混入させることもできる。粒子状担体に磁性を持たせることで粒子状担体の取り扱いが容易になる。粒子状担体に磁性を有する物質を混入させる方法は、従来公知の方法を適用すれば良い。【００９１】
受容体を粒子状担体に担持させる方法は、受容体を基板状の担体に担持させる方法を適用すれば良い。【００９２】
また、リガンドとしてビオチン、その受容体としてアビジンまたはストレプトアビジンを用いる場合には、アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した磁性ビーズが市販されており、これを用いることもできる。【００９３】
本発明においては、前記担体に受容体を担持させた後、リガンドで修飾された標準配列または標的配列の少なくとも一つのリガンドを前記受容体に結合させることで、標準配列または標的配列を担体に固定化することができる。【００９４】
以下、具体的なリガンド、プライマー、プローブおよび検出対象の配列を示しながら、担体に受容体を担持させる方法を示す。
リガンドとしてハプテンを用い、ハプテンで修飾した標準配列および標的配列を基板状の担体に結合させて解析する方法の一例を以下に示す。
第一のリガンドとしてハプテンａ、第二のリガンドとしてハプテンｃで修飾された標準配列、および、第一のリガンドとしてハプテンｂ、第二のリガンドとしてハプテンｃで修飾された標的配列をそれぞれＭＥＳ緩衝液に溶解し、これを基板状の担体上に滴下して、３７℃で２時間反応させた後、ＭＥＳ緩衝液で担体を洗浄する。担体には抗ハプテンａ抗体および抗ハプテンｂ抗体が担持されている。この時、担体上に滴下した溶液中のハプテンａで修飾された標準配列は、担体上の抗ハプテンａ抗体と結合し、ハプテンｂで修飾された標的配列は、担体上の抗ハプテンｂ抗体と結合する。その結果、担体上に固定化された標準配列および標的配列には、未結合の第二のリガンドであるハプテンｃが存在する。【００９５】
蛍光色素であるＣｙ５で標識した抗ハプテンｃ抗体溶液をＭＥＳ緩衝液に１０μｇ／ｍｌの濃度となるように溶解させ、この溶液を、標準配列および標的配列を固定化した担体上に滴下し、３７℃で２時間反応させる。その後、ＭＥＳ緩衝液と１／１０濃度のＭＥＳ緩衝液で順に反応後の担体を洗浄し、スピンドライで乾燥させる。これにより、担体に固定化された標準配列および標的配列中のハプテンｃには、抗ハプテンｃ抗体を介してＣｙ５が結合される。【００９６】
続いて、担体をＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（ＡＸＯＮ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットして、励起波長６３５ｎｍ、検出波長域６５０ｎｍ〜６９０ｎｍでスキャンして担体上の蛍光シグナルを測定する。スキャン画像において、蛍光強度と担体上での位置情報をあわせて解析することで、解析対象核酸のＳＮＰを検出することができる。【００９７】
また、前記Ｃｙ５で標識した抗ハプテンｃ抗体に代わり、酵素、例えば、アルカリフォスファターゼで標識した抗ハプテンｃ抗体を使用してもよい。この場合は、前記と同様の反応で、基準核酸および解析対象核酸中のハプテンｃとアルカリフォスファターゼ標識抗ハプテンｃ抗体との結合を行って担体を洗浄した後、基質、例えば、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｃａｌｂｉｏ．ｃｈｅｍ．社製）溶液を滴下し、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ（ＡＴＴＯ社製）で担体上の化学発光量を測定し、担体上での位置情報とあわせて解析することで、解析対象核酸のＳＮＰを検出することができる。【００９８】
また、抗ハプテンａ抗体および抗ハプテンｂ抗体を、ハプテンａおよびハプテンｂを介して担体に担持させてもよい。例えば、前記の方法に従って、ハプテンのＣ末端のカルボキシル基を担体上のリンカーに結合させることで、ハプテンを担体に結合させることでき、この担体上に抗ハプテンａ抗体および抗ハプテンｂ抗体の混合溶液を滴下して、３７℃で２時間反応させ、前記方法に従って洗浄すると、担体上に抗ハプテンａ抗体および抗ハプテンｂ抗体を担持させることができる。その後は前記と同様の方法で担体上に標準配列および標的配列を固定化して解析すれば良い。【００９９】
次に、上述の基板状の担体を用いた例で記載したものと同じ標準配列および標的配列を、磁性を帯びた粒子状の担体に結合させて解析する方法の一例を以下に示す。【０１００】
磁性を帯びた粒子状の担体に、従来公知の方法に従って、抗ハプテンｃ抗体を担持させ、この担体をリン酸緩衝液中に分散させておき、これに標準配列および標的配列を混合し、これら配列を粒子状の担体に結合させる。粒子状の担体は磁性を帯びているので、外部から磁力を印加することにより、容器内で担体を移動させることができ、溶液中の一箇所に集めておくことができる。例えば、磁石を用いて担体を容器壁面に固定させた状態で溶液を取り除き、新たなリン酸緩衝液を加え、続いて磁石をはずして、この新たに加えたリン酸緩衝液中に担体を分散させる。この工程を数回繰り返すことで、溶液中の未反応配列や副生成物などを除去することができる（ＢＦ分離工程）。ＢＦ分離工程後、リン酸緩衝液中に担体が均一に分散している溶液を二つに分けて別々の容器に分注する。分注する数は、測定対象である標準配列および標的配列の数と使用するハプテンの数に応じて決まる。標準配列および標的配列は、ハプテンｃを介して担体に結合しているため、標準配列の場合にはハプテンａ、標的配列の場合にはハプテンｂが未結合の状態にある。従って、標識化された抗ハプテンａ抗体および抗ハプテンｂ抗体を使用することによって標準配列および標的配列を検出することができる。【０１０１】
前記の二つに分注した担体を含む溶液のそれぞれに対し、酵素標識抗ハプテンａ抗体と酵素標識抗ハプテンｂ抗体を別々に投入し、反応させる。反応後、前記のＢＦ分離工程を行い、未反応の酵素標識抗ハプテン抗体を除去する。この時、酵素としてはアルカリフォスファターゼ、ペルオキシターゼ等が好適に用いられるが、本発明はこれらに限定されない。【０１０２】
最後に、酵素の基質となる化合物をそれぞれの容器に混合させ、一定時間反応させた後にその発光強度、吸光度変化等を測定することで、検出対象の標準配列および標的配列を同時に検出することができる。【０１０３】
また、酵素に代わり、蛍光色素で標識化された抗ハプテンａ抗体および抗ハプテンｂ抗体を用い、蛍光強度を測定することにより、検出対象の標準配列および標的配列を同時に検出することもできる。【０１０４】
また、抗ハプテンａ抗体を担持させた担体と抗ハプテンｂ抗体を担持させた担体をそれぞれ別々に容器に準備しておき、ハプテンで修飾した標準配列および標的配列を二つに分けてこれら容器へ分注して混合することによっても、検出対象の標準配列および標的配列を検出することができる。【０１０５】
なお、磁性を帯びた粒子状の担体に代わり、磁性を帯びていない粒子状の担体を用いる場合には、ＢＦ分離工程では、（ｉ）フィルターで担体を捕捉する、（ｉｉ）静置、遠心分離等で担体を沈殿させて、上清を取り除く、（ｉｉｉ）大きな粒子径を持つ担体を用いる場合はピペットで吸引できないので、そのまま溶液交換を行う、等の方法が挙げられる。【０１０６】
３．測定データの解析
次に、基準核酸および解析対象核酸中の標準配列および標的配列の検出データから、解析対象核酸の一次構造の変化（ここではＬＯＨ）を解析する方法について説明する。本発明の、核酸の一次構造の変化を解析する方法は、基準核酸および解析対象核酸中の標準配列の比を求めて補正係数を算出し、該補正係数を用いて、解析対象核酸中の標的配列の検出値を補正することで行う。その方法について図８を用いて説明する。
図８で、Ａは標準領域、Ｂは標的領域を示す。基準核酸Ｎは標準領域Ａおよび標的領域Ｂにおいて塩基配列が正常な核酸であり、解析対象核酸Ｎ’は、標準領域Ａは正常であるが標的領域ＢにおいてＬＯＨが生じている。まず基準核酸Ｎについて、標準領域Ａを含む塩基配列を標準配列とし、標的領域Ｂを含む塩基配列を標的配列として、標準配列および標的配列を同一の反応系で、これまでに述べた方法に従ってＰＣＲ法により増幅する。
標準領域Ａと標的領域Ｂの変換効率の差、すなわち標準配列と標的配列のＰＣＲ法による変換効率の差は一定で、最初の存在比に依存する。
同様に、解析対象核酸Ｎ’についても、同一の反応系で、標準配列および標的配列をＰＣＲ法により増幅する。【０１０７】
得られた増幅産物のシグナルを測定すると、標的領域ＢにおいてＬＯＨが生じている解析対象核酸Ｎ’では、標準領域Ａの増幅産物量に対する標的領域Ｂの増幅産物量の比は、基準核酸Ｎの場合よりも低くなる。【０１０８】
ここで、測定結果の判定法を、図９を用いてさらに詳細に説明する。図９では、測定に用いた解析対象核酸Ｎ’の量が、基準核酸Ｎの量の二倍である場合を示している。
測定の結果、基準核酸Ｎの標準配列のシグナル強度（ＮＡ）は２ａ、標的配列のシグナル強度（ＮＢ）は３ｂ、解析対象核酸Ｎ’の標準配列のシグナル強度（Ｎ’Ａ）は４ａ、核酸のシグナル強度（Ｎ’Ｂ）は３ｂであったとする。
補正係数は、ＮＡをＮ’Ａで割って算出すればよく、ここでは０．５となる。この係数をＮ’Ｂに乗じると、Ｎ’Ｂの補正値は１．５ｂとなる。基準核酸Ｎと解析対象核酸Ｎ’との間で、標的配列のシグナル強度を比較すると、ＮＢ：補正Ｎ’Ｂ＝２：１となる。すなわち、ＬＯＨ閾値を１．５ｂとして、解析対象核酸Ｎ’では、正常型の基準核酸Ｎよりも標的配列の増幅産物が半減しており、標的領域ＢにおいてＬＯＨが生じていることが判る。
なお、補正係数の算出方法および補正方法は上記に限定されず、図９中に示すように、基準核酸Ｎと解析対象核酸Ｎ’とで、ＮＡとＮ’Ａを同じ値に補正して、その時得られるＮＢとＮ’Ｂを比較しても良い。【０１０９】
ここでは、解析対象核酸Ｎ’の標的領域ＢにおいてＬＯＨが生じている場合について説明したが、標的領域Ｂにおいて増幅が生じている場合は、同様の解析により、ＮＢ＜補正Ｎ’Ｂとなることで、その事実を確認できる。【０１１０】
また、ここでは、標準配列および標的配列をＰＣＲ法によって増幅させて得る方法を示したが、前述の通り、標準配列および標的配列をサイクルエロンゲーション法やＬＡＭＰ法やライゲーション法によって得る方法を適用しても良い。【０１１１】
さらに、ここでは一つの標準配列および一つの標的配列を解析する例について述べたが、標準領域、標的領域が複数の場合は、リガンドおよび受容体の種類を増やすことで、対応する複数の標準配列および標的配列を解析すれば良い。例えば、図１０に示すように、一つの標準領域Ａと五つの標的領域Ｂ〜Ｆを同時に解析することもできる。【０１１２】
また、ここで述べた方法は、ＳＮＰマーカーやマイクロサテライトマーカーを含む領域を測定するものであったが、本発明はこれらに限定されず、その他マーカー、例えば、ＳＴＳマーカー、ＥＳＴマーカー、ｃＤＮＡマーカー等を含む領域の検出にも適用することができ、その量の変化から、染色体などの核酸の一次構造の変化を解析することができる。すなわち、プライマーを、これらマーカーを含む領域を増幅できるものに設定するか、プローブを、これらマーカーを含む領域の塩基配列に設定することで、その他の工程は、前記の方法をそのまま適用することができる。また、既にデータベースに登録されているプライマー配列を用いなくても、新たにプライマーを設計し用いてもよい。【０１１３】
また、ここまで述べたように、基準核酸および解析対象核酸中の標準配列および標的配列の検出は必ずしも連続的に行う必要はない。例えば、同じ条件で複数回繰り返して解析対象核酸中の標準配列および標的配列の検出を行う場合、本発明の核酸の一次構造変化の解析方法においては、基準核酸の標準配列と標的配列の検出は一回行えば良く、該検出値をデータベースに登録して、二回目以降の解析対象核酸の解析には、該データベースを用いて、標的配列の検出値の補正および該補正検出値と標準核酸中の標的配列の検出値との比較を行えば良い。【０１１４】
ここまでに説明した、本発明の解析方法により得られた核酸の一次構造変化の解析結果を用いて、染色体上における標的配列の異常を判定することができる。すなわち、解析対象核酸中の標的配列の量が、基準核酸中の標的配列の量よりも多ければ、染色体上において標的配列の増幅が生じたと判定することができ、基準核酸中の標的配列の量よりも少なければ、染色体上において標的配列の欠失が生じたと判定することができる。具体的には、例えば、前記の解析対象核酸中の標的配列の補正検出値が、閾値より大きいか少ないかを判定すれば良い。ここで、閾値としては、基準核酸中の標的配列の検出値を用いればよい。
【実施例】
【０１１５】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
また、本実施例で用いているモデルサンプルとなる各配列番号の核酸配列は、２重鎖および１重鎖のいずれでも良い。
[実施例１]１．試薬調製
以下の試薬を調製した。
（サンプル１、基準核酸溶液１）：配列番号５および配列番号６で表される配列を各２ｎＭ含むサンプルで、正常型の染色体構造を持つサンプル（サンプル２、解析対象核酸溶液２）：配列番号５で表される配列を２ｎＭ、配列番号６で表される配列を１ｎＭ含むサンプルで、配列番号６の領域がＬＯＨを起こしている異常型の染色体構造を持つサンプル（ＰＣＲ試薬）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｓｕｐｅｒ  ＭｉｘＩＩ」カタログＮｏ．１２３４１−０１２（ＰＣＲプライマー）：以下に示すプライマーの組み合わせ
・配列番号１で表されるプライマーａの５’末端をＦＩＴＣで修飾したもの
・配列番号２で表されるプライマーｂの５’末端をビオチンで修飾したもの
・配列番号３で表されるプライマーｃの５’末端をジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）で修飾したもの
・配列番号４で表されるプライマーｄの５’末端をビオチンで修飾したもの
プライマーａおよびｂで標準配列を増幅し、プライマーｃおよびｄで標的配列を増幅した。
（磁性化粒子状担体１）：ＤＹＮＡＬ社製「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」カタログＮｏ．１１２．０６にストレプトアビジンを結合させたもの
（磁性化粒子状担体２）：ＤＹＮＡＬ社製「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」カタログＮｏ．１１２．０６に抗ＦＩＴＣ抗体を結合させたもの
（酵素標識抗体）：ＤＡＫＯ社製「Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ＡＬＰ）」カタログＮｏ．Ｄ５１０５を結合させたもの
（発光基質）：Ｗａｋｏ社製「ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」カタログＮｏ．６９０８６【０１１６】
２．反応
サンプルの組み合わせ三種類ごとに上記試薬を用いて以下の手順で反応を行った。
サンプル１または２          ：1ul
ＰＣＲ試薬                  ：１０ｕｌ
１ｕＭに調製したプライマー  ：各１ｕｌ（計４ｕｌ）
純水                        ：５ｕｌ
合計                        ：２０ｕｌ
上記内容でＰＣＲ溶液を調製し、サーマルサイクラーで下記反応を行った。
（１）９４℃、３０分間（２）５５℃、３０秒間（３）７２℃、３０分間（４）上記（１）〜（３）を３５回繰り返し
反応後、サンプル１について、プライマーａおよびｂで増幅された標準配列、プライマーｃおよびｄで増幅された標的配列の測定を行うため、反応液を２つのマイクロチューブに５ｕｌずつ分注した。一方のチューブには磁性化粒子状担体１を５ｕｌ加え、室温で５分反応させた。もう一方のチューブには磁性化粒子状担体２を５ｕｌ加え、室温で５分反応させた。反応後、各チューブについてリン酸緩衝液で２回ＢＦ分離を行い、それぞれに１００倍に希釈した酵素標識抗体を２０ｕｌ加え、室温で６０分反応させた。続いて、リン酸緩衝液でそれぞれ３回ＢＦ分離を行った後、それぞれに発光基質１００ｕｌを加え、室温で１分間反応させた。反応後の担体を、測定用９６ｗｅｌｌブラックプレートに移し変え、発光量測定器（ＡＴＴＯ社製、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲＩＩ）中で１０秒間積算測定を行った。
サンプル２についても、同様の操作を行い、プライマーａおよびｂ、プライマーｃおよびｄで増幅された二つの配列の測定を行った。【０１１７】
３．測定結果と判定
サンプル１の二つの増幅産物のうち、プライマーａおよびｂで増幅した標準配列の発光量の測定値は４０００００であり、プライマーｃおよびｄで増幅した標的配列の測定値は３２００００であった。一方、サンプル２の二つの増幅産物のうち、プライマーａおよびｂで増幅した標準配列の測定値は８４００００であり、プライマーｃおよびｄで増幅した標的配列の測定値は３３００００であった。サンプル１の標準配列の測定値を1とした時、サンプル２の標準配列の測定値は２．１となった。また、プライマーａおよびｂでの標準配列の増幅と、プライマーｃおよびｄでの標的配列の増幅は、その効率を一定とし、この値をもとに、サンプル２のプライマーｃおよびｄで増幅した標的配列の測定値を２．１で割って補正すると、測定補正値は１５７１４となり、これはサンプル1の標的配列の測定値の半分であり、標的配列の存在量を反映していることが判った。すなわち、本実施例から、本発明によるＬＯＨ解析が可能であることを示している。
なお、本実施例においては、サンプル１とサンプル２のシグナルの測定は連続的に行ったが、サンプル1の基準核酸中の標準配列および標的配列のデータは、同じ条件で測定する限り毎回同じデータが得られるため、前述の通り、一度このデータを取得してデータベースに登録することにより、例えば、同じ条件でサンプル２の測定を複数回行う場合、毎回そのデータベース中のデータを繰返し用いることができ、サンプル１とサンプル２のシグナルの測定を必ずしも連続的に行う必要はない。【０１１８】
[実施例２]
一塩基多型を含む核酸をライゲーション反応によって検出した。ライゲーション反応を行う前に、類似配列を除きかつ検出感度を高めるために、前記一塩基多型部位の前後の塩基配列をマルチプレックスＰＣＲ法によって増幅したあとを想定し、８０ｂｐと８５ｂｐの塩基配列を持つサンプルとした。担体には磁性を帯びた粒子を使用し、酵素基質反応によって配列を検出した。なお、鋳型ＤＮＡが十分な量存在し、ライゲーションのダイレクト検出が可能な場合には、ＰＣＲ法による増幅を行わずにダイレクト検出を行う方が、核酸の存在比をより正確に反映できる。【０１１９】
１．試薬調製
以下の試薬を調製した。
（サンプル１）：配列番号７および配列番号８で表される配列を各１００ｎＭ含むサンプルで、正常型の染色体構造を持つサンプル
（サンプル２）：配列番号７で表される配列を２００ｎＭ、配列番号８で表される配列を１００ｎＭ含むサンプルで、配列８の領域がＬＯＨを起こしている異常型の染色体構造を持つサンプル
なお、配列番号８の配列は、rの位置の塩基がＡまたはＧとなっているものである。さらに、配列番号７で表される配列の５’末端より２５番目〜６１番目の領域はプローブのハイブリダイゼーションサイトとなっており、配列番号８で表される配列の５’末端より１９番目〜５４番目の領域はプローブのハイブリダイゼーションサイトとなっている。
（プローブ）：以下に示すプローブの組み合わせ
・配列番号９で表されるプローブａの５’末端をジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）で修飾し、且つ配列番号１０で表されるプローブｂの３’末端をビオチンで修飾し、５’末端をリン酸化したプローブ
・配列番号１１で表されるプローブｃおよび配列番号１２で表されるプローブｄの５’末端をＦＩＴＣで修飾し、且つ配列番号１３で表されるプローブｅの３’末端をビオチンで修飾し、５’末端をリン酸化したプローブ
（ライゲース）：ＢｉｏＬａｂｓ社製「Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ」カタログＮｏ．Ｍ０２０８Ｓ
（磁性化粒子状担体）：ＤＹＮＡＬ社製「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」カタログＮｏ．１１２．０６
（酵素標識抗体）：ＤＡＫＯ社製「Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ＡＬＰ）」カタログＮｏ．Ｄ５１０５
（発光基質）：Ｗａｋｏ社製「ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」カタログＮｏ．６９０８６【０１２０】
２．反応
サンプルの組み合わせ三種類ごとに上記試薬を用いて以下の手順で反応を行った。
サンプル１またはサンプル２                ：１μｌ
Ｔａｑ  Ｌｉｇａｓｅ緩衝液（キット付属）  ：３μｌ
４０Ｕ／μｌのＴａｑ  Ｌｉｇａｓｅ        ：０．５μｌ
１０ｎＭに調整した各プローブ              ：各１μｌ（計5μｌ）
純水                                      ：２０．５μｌ
合計                                      ：３０μｌ
とそれぞれ調製し、インキュベーターで下記反応を行った。
（１）９５℃、５分間（２）５８℃、１５分間
反応後、磁性化粒子状担体５μｌを加え、室温で５分反応させた。反応後、リン酸バッファーで２回ＢＦ分離を行い、それぞれに１００倍に希釈した酵素標識抗体を２０μｌ加え、室温で６０分反応させた。リン酸バッファーでそれぞれ３回ＢＦ分離反応を行った後、それぞれに発光基質１００μｌを加え、室温で1分間反応させた。反応後の担体を、測定用９６ｗｅｌｌブラックプレートに移し変え、発光量測定器（ＡＴＴＯ社製、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＪＮＲＩＩ）中で１０秒間積算測定を行った。【０１２１】
３．測定結果
上記反応をそれぞれのサンプルに対して９回繰り返した結果を図１１に示す。図１１はそれぞれのサンプルとプローブの組み合わせにおいて発光量の平均値を示したグラフであり、サンプルの部位に対応した結果が発光量となって得られていることが分かる。なお、サンプル１が基準核酸に、サンプル２が解析対象核酸に該当し、さらに、配列番号７がプローブ標準配列に、配列番号８が標的配列に該当する。基準核酸では、発光量の平均値の比率が、標準配列Ａ：標的配列Ｂ＝１：１．２であり、解析対象核酸では、標準配列Ａ：標的配列Ｂ＝１：０．６となり、標的配列の発光量平均値が閾値１．２±１０％より有意に低く、解析対象核酸の標的配列Ｂ、すなわち配列番号８の領域がＬＯＨを起こしている異常型の染色体構造を持つモデルであるサンプル２を検出していることが明確に判る。
このように、特にサンプルの定量が明確にできて、従来の方法では難しいかったＬＯＨの区別ができる点で、本発明のライゲーション反応を利用した方法は非常に有用である。【０１２２】
[実施例３]
分散性微粒子を用い、該微粒子の凝集を測定することによって、実施例１で用いた核酸の検出を行った。
１．試薬調製
以下の試薬を調製した。
（実施例１のサンプル１およびサンプル２）
（ＰＣＲ試薬）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｓｕｐｅｒ  ＭｉｘＩＩ」カタログＮｏ．１２３４１−０１２
（ＰＣＲプライマー）：以下に示すプライマーの組み合わせ
・配列番号１で表されるプライマーａの５’末端を、配列番号１４で表されるハプテンａで修飾したもの
・配列番号２で表されるプライマーｂの５’末端を、配列番号１６で表されるハプテンｃで修飾したもの
・配列番号３で表されるプライマーｃの５’末端を、配列番号１５で表されるハプテンｂで修飾したもの
・配列番号４で表されるプライマーｄの５’末端を、配列番号１６で表されるハプテンｃで修飾したもの
プライマーａおよびｂで標準配列を増幅し、プライマーｃおよびｄで標的配列を増幅した。
また、ハプテンで修飾されたプライマーは、以下の手順で作製した。すなわち、５’末端をカルボキシル基で修飾した１００μＭのプライマー１００μｌに対して、５００ｕＭのハプテン溶液１００μｌを加え、３０℃で３０分間、混合することによって縮合反応させた。反応終了後、ゲルろ過カートリッジで精製し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌで、ハプテンで修飾されたプライマーを溶出した。【０１２３】
２．反応
サンプルの組み合わせ３種類ごとに上記試薬を用いて以下の手順で反応を行った。
サンプル１もしくは２          ：５ｕｌ
ＰＣＲ試薬                    ：５０ｕｌ
１ｕＭに調製したプライマー    ：各５ｕｌ（計２０ｕｌ）
純水                          ：２５ｕｌ
合計                          ：１００ｕｌ
上記内容でＰＣＲ溶液を調製し、サーマルサイクラーで下記反応を行った。
（１）９４℃、３０分間（２）５５℃、３０秒間（３）７２℃、３０分間（４）上記（１）〜（３）を４０回繰り返し【０１２４】
３．抗体結合ラテックスの作成
次に、分散性微粒子に、標準配列および標的配列に結合したリガンドと特異的に結合する受容体を結合し、以下に示す分散性微粒子状担体を得た。
（分散性微粒子状担体１）：ＪＳＲ社製「３００ｎｍカルボキシタイプラテックス粒子（ＣＭＰ）Ｇ０２０１（０．１０４ｍｅｑ  ＣＯＯ／ｇ）」にハプテンａに対するマウス抗体を結合させたもの（分散性微粒子状担体２）：ＪＳＲ社製「３００ｎｍカルボキシタイプラテックス粒子（ＣＭＰ）Ｇ０２０１（０．１０４ｍｅｑ  ＣＯＯ／ｇ）」にハプテンｂに対するマウス抗体を結合させたもの（分散性微粒子状担体３）：ＪＳＲ社製「３００ｎｍカルボキシタイプラテックス粒子（ＣＭＰ）Ｇ０２０１（０．１０４ｍｅｑ  ＣＯＯ／ｇ）」にハプテンｃに対するマウス抗体を結合させたもの
具体的作成法は以下の通りである。すなわち、マウス抗体（和光純薬工業社製）を６０μｇ／ｍｌの濃度で含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４００μｌを、平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１質量％、積水化学工業社製）１００μｌに添加し、４℃で１時間撹拌した。次いで、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を１質量％の濃度で含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌを添加し、２時間撹拌した。この液を１０℃で２０分間、１６０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈澱物に、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗体結合ラテックス液を調製した。【０１２５】
４．測定方法
凝集物の測定は、生化学自動分析装置（ＡＵ６４０、オリンパス社製）を用いて行った。測定条件は温度３７℃、波長６６０ｎｍとした。１５０μｌの０．２％（ｗ／ｖ）抗体結合ラテックス溶液に、検体液１０μｌ、ストレプトアビジン結合ラテックス液５０μｌの割合で添加・混合を行ない、前記ラテックス液添加後１２０秒から６００秒の間の吸光度変化量を測定した。【０１２６】
５．測定結果と判定
サンプル１の二つの増幅産物のうち、プライマーａおよびｂで増幅した標準配列の吸光度測定値は０．９であり、プライマーｃおよびｄで増幅した標的配列の測定値は０．７であった。一方、サンプル２の二つの増幅産物のうち、プライマーａおよびｂで増幅した標準配列の測定値は０．９であり、プライマーｃおよびｄで増幅した標的配列の測定値は０．３であった。サンプル１の標準配列の測定値を1とした時、サンプル２の標準配列の測定値も１となった。また、プライマーａおよびｂでの標準配列の増幅と、プライマーｃおよびｄでの標的配列の増幅は、その効率を一定とし、この値をもとに、サンプル２のプライマーｃおよびｄで増幅した標的配列の測定値を１で割って補正すると、測定補正値は０．３となり、これはサンプル1の標的配列の測定値の半分以下であり、標的配列の存在量を反映していることが判った。すなわち、本実施例から、本発明によるＬＯＨ解析が可能であることを示している。【０１２７】
以上により、本発明は、核酸の一次構造変化の解析に際し、定量性があり、感度および再現性が高く、迅速に且つ低コストで行うことができる解析方法であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明の方法によれば、解析対象核酸中の所望の標的配列を簡便で迅速、且つ精度良く検出することができるため、例えば、臨床検査の簡便化と迅速化に有効であり、さらに簡易検査から全自動分析に至るまで幅広く応用することが可能である。
【図１】
2007063807.tif 000003
【図２】
2007063807.tif 000004
【図３】
2007063807.tif 000005
【図４】
2007063807.tif 000006
【図５】
2007063807.tif 000007
【図６】
2007063807.tif 000008
【図７】
2007063807.tif 000009
【図８】
2007063807.tif 000010
【図９】
2007063807.tif 000011
【図１０】
2007063807.tif 000012
【図１１】
2007063807.tif 000013
【配列表】
2007063807000001.app
【国際調査報告】
2007063807.tif 000014
2007063807.tif 000015
2007063807.tif 000016
2007063807.tif 000017