(57)【要約】多因子疾患等の多数遺伝子の関与する２型糖尿病の２型糖尿病感受性遺伝子の同定方法を利用した、日本人における２型糖尿病の発症リスクの判定方法等を提供するものである。第２０番染色体長腕領域のｄｂＳＮＰ ＩＤにおけるｒｓ２２００７９、ｒｓ２２００７６や、第１５番染色体長腕領域のｄｂＳＮＰ ＩＤにおけるｒｓ２４１２７４７、ｒｓ１０３７９９０、ｒｓ８０２７７３３、ｒｓ４５７３９０８、ｒｓ１１０７０３８７、及び第３番染色体短腕領域のｄｂＳＮＰ ＩＤにおけるｒｓ２０５１２１１、ｒｓ６５９９２１０、ｒｓ１７０３７８０４、ｒｓ２０７０４９０、ｒｓ７６４９９８４、ｒｓ７６４７６５７で表される塩基、及びＥＮＧＬ２４で表される塩基から選択される１又は２以上の塩基を２型糖尿病易罹患性判定ＳＮＰｓマーカーとして使用する。また、検体中のヒトゲノムＤＮＡ、好ましくは日本人のヒトゲノムＤＮＡを末梢血等から抽出し、前記ＳＮＰｓマーカーをＴａｑＭａｎシステムを利用してＳＮＰｓタイピングすることにより、２型糖尿病の発症リスクを判定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトゲノム配列中の配列番号１記載の塩基配列と配列番号２記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号７記載の塩基配列と配列番号８記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号９記載の塩基配列と配列番号１０記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１１記載の塩基配列と配列番号１２記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１３記載の塩基配列と配列番号１４記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１７記載の塩基配列と配列番号１８記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号２１記載の塩基配列と配列番号２２記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号２３記載の塩基配列と配列番号２４記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号２５記載の塩基配列と配列番号２６記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号２７記載の塩基配列と配列番号２８記載の塩基配列により挟まれた塩基から選択される１又は２以上の塩基を２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法。
【請求項２】
ヒトゲノム配列中の配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は／及びヒトゲノム配列中の配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列により挟まれた塩基を２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法。
【請求項３】
米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいて、ｒｓ２２００７９、ｒｓ２２００７６、ｒｓ２４１２７４７、ｒｓ１０３７９９０、ｒｓ８０２７７３３、ｒｓ４５７３９０８、ｒｓ１１０７０３８７、ｒｓ２０５１２１１、ｒｓ６５９９２１０、ｒｓ１７０３７８０４、ｒｓ２０７０４９０、ｒｓ７６４９９８４、ｒｓ７６４７６５７で表される塩基、及びＥＮＧＬ２４から選択される１又は２以上の塩基を２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法。
【請求項４】
米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいて、ｒｓ２２００７６、ｒｓ２４１２７４７、ｒｓ２０５１２１１、又は／及びｒｓ１７０３７８０４で表される塩基を２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法。
【請求項５】
以下の工程を含む２型糖尿病の発症リスクを判定する方法：
（Ａ）検体中のヒトゲノムＤＮＡを抽出する工程、及び
（Ｂ）抽出したヒトゲノムＤＮＡの配列において、配列番号１記載の塩基配列と配列番号２記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号７記載の塩基配列と配列番号８記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号９記載の塩基配列と配列番号１０記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１１記載の塩基配列と配列番号１２記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１３記載の塩基配列と配列番号１４記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１７記載の塩基配列と配列番号１８記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号２１記載の塩基配列と配列番号２２記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号２３記載の塩基配列と配列番号２４記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号２５記載の塩基配列と配列番号２６記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号２７記載の塩基配列と配列番号２８記載の塩基配列により挟まれた塩基から選択される１又は２以上の塩基を同定・評価する工程。
【請求項６】
以下の工程を含む２型糖尿病の発症リスクを判定する方法：
（Ａ）検体中のヒトゲノムＤＮＡを抽出する工程、及び
（Ｂ）抽出したヒトゲノムＤＮＡの配列において、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいて、ｒｓ２２００７９、ｒｓ２２００７６、ｒｓ２４１２７４７、ｒｓ１０３７９９０、ｒｓ８０２７７３３、ｒｓ４５７３９０８、ｒｓ１１０７０３８７、ｒｓ２０５１２１１、ｒｓ６５９９２１０、ｒｓ１７０３７８０４、ｒｓ２０７０４９０、ｒｓ７６４９９８４、ｒｓ７６４７６５７で表される塩基、及びＥＮＧＬ２４から選択される１又は２以上の塩基を同定・評価する工程。
【請求項７】
配列番号１記載の塩基配列と配列番号２記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２２００７９で表される塩基が、Ｇ若しくはＡであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項８】
配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２２００７６で表される塩基が、Ｃ若しくはＡであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項９】
配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２４１２７４７（ＳＮＰ２１４０）で表される塩基が、Ｃ若しくはＴであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１０】
配列番号７記載の塩基配列と配列番号８記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ１０３７９９０（ＳＮＰ１１６４）で表される塩基が、Ｃ若しくはＴであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１１】
配列番号９記載の塩基配列と配列番号１０記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ８０２７７３３（ＳＮＰ１１６５）で表される塩基が、Ａ若しくはＧであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１２】
配列番号１１記載の塩基配列と配列番号１２記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ４５７３９０８（ＳＮＰ２１４１）で表される塩基が、Ｃ若しくはＴであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１３】
配列番号１３記載の塩基配列と配列番号１４記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ１１０７０３８７（ＳＮＰ１１６７）で表される塩基が、Ｇ若しくはＴであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１４】
配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２０５１２１１（ＳＮＰ３７５）で表される塩基が、Ｇ若しくはＡであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１５】
配列番号１７記載の塩基配列と配列番号１８記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ６５９９２１０（ＥＮＧＬ１２）で表される塩基が、Ａ若しくはＧであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１６】
配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ１７０３７８０４（ＥＮＧＬ１５）で表される塩基が、Ｇ若しくはＡであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１７】
配列番号２１記載の塩基配列と配列番号２２記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２０７０４９０（ＥＮＧＬ１８）で表される塩基が、Ｔ若しくはＡであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１８】
配列番号２３記載の塩基配列と配列番号２４記載の塩基配列により挟まれたＥＮＧＬ２４で表される塩基が、Ｔ若しくはＣであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項１９】
配列番号２５記載の塩基配列と配列番号２６記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ７６４９９８４（ＥＮＧＬ２５）で表される塩基が、Ｔ若しくはＣであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項２０】
配列番号２７記載の塩基配列と配列番号２８記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ７６４７６５７（ＥＮＧＬ２６）で表される塩基が、Ｇ若しくはＡであることを特徴とする請求項５又は６記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項２１】
検体として末梢血を用いることを特徴とする請求項５〜２０のいずれか記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【請求項２２】
日本人のヒトゲノムを用いることを特徴とする請求項５〜２１のいずれか記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphism：一塩基多型）を利用して２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、ＳＮＰｓを２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００３年４月にヒトゲノムの解読完了が宣言されて、ゲノム研究はいよいよ本格的な機能解析、応用研究に入った。これに伴い、疾患関連治療と予防法の開発への貢献が期待され、疾患に関与する疾患感受性遺伝子の同定が重要となってきている。【０００３】
これまで１つの遺伝子の異常によって疾患が引き起こされる単一遺伝性疾患の原因遺伝子の解明に対して、多数の遺伝要因と環境要因が複雑に関与して発症する糖尿病、高血圧、関節リウマチ、がん、神経疾患や免疫・アレルギー性疾患などのcommon disease（ありふれた病気）は解析が難しいと考えられてきた。しかし、近年ヒトゲノムの全塩基配列情報が入手可能となり、これらの多遺伝子性疾患に着目してその疾患感受性遺伝子を同定する研究が多数行われている。
多遺伝子性疾患の疾患感受性遺伝子は１つを有するだけで発症することはなく、複数の疾患感受性遺伝子に環境因子が加わり発症することにより、これらの疾患感受性遺伝子の変異は致死的なものではなく、進化の過程で温存されている多型、つまり体質の違いといった個人差を決定する多型であり、これが発症を左右する要因と考えられる。【０００４】
したがって、疾患感受性遺伝子を探索するためには、こうした多型マーカーとして用いる。おもなものとしてＲＦＬＰ(restriction fragment length polymorphism)マーカー、マイクロサテライトマーカー、ＳＮＰマーカーの３種類が知られている（例えば、非特許文献１参照）。近年注目されているＳＮＰは、ゲノム上で約３００〜５００ｂｐに１つという割合で存在し、マイクロサテライトマーカーの数十〜数百ｋｂｐに１つという割合よりも約１００〜５００倍の密度で存在しているので、common diseaseをもつ大家系や罹患同胞対、及び両親を含む多数の患者家系を対象とした、マイクロサテライトマーカーを用いた全ゲノム解析でゲノム上の座位を絞り込んだのち、遺伝子性疾患の疾患感受性遺伝子同定を行うための有力なツールとして考えられている。ＳＮＰｓに関する知見は、いくつかのデータベースに蓄積されており、例えば、米国のｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ作成のＳＮＰデータベースＵＲＬ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html）には、重複を除いたユニークな約２７０万個のＳＮＰｓが登録されている。【０００５】
２型糖尿病などの「ありふれた病気」について、その罹患者数の点からも重要疾患であるにもかかわらず、疾患感受性遺伝子を見出せない大きな理由としては、多因子疾患であり、また多数遺伝子が関与していることが想定されるため、疾患感受性遺伝子の同定が困難であったためである。そこで、従来にない新しい疾患感受性遺伝子の同定方法、特に「ありふれた病気」のような多数遺伝子の関与することが想定される疾患の疾患感受性遺伝子の同定方法の開発が望まれていた。【０００６】
本発明者らは、疾患感受性遺伝子の候補領域内に、該候補領域全体にわたって偏在しない複数のＳＮＰｓマーカーを選定し、選定したＳＮＰｓマーカーについて、健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを選択し、先と異なる健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして特定し、該疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域を特定することにより、遺伝子を同定することを含む疾患感受性遺伝子の同定方法について提案（例えば、特許文献１参照）している。【０００７】
その他、ヒトゲノムＤＮＡのＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型ＳＮＰ６３のアレルを測定することよりなる２型糖尿病のリスク判定方法が提案（例えば、特許文献２参照）されており、この２型糖尿病のリスク判定方法は、ＳＮＰ６３のＴアレルの存在を２型糖尿病のリスクを有意に上昇すると判断する、日本人の２型糖尿病のリスクの判定に有用であるとされている。また、Ｎａ+／グルコーストランスポーター活性を有するタンパク質（ＳＧＬＴホモログ）は、糖尿病等の判定マーカー等として有用であり、その一塩基多型（ＳＮＰｓ）体を解析することを特徴とする糖尿病または高脂血症の判定方法も提案（例えば、特許文献３参照）されている。また、ヒト２０番染色体長腕領域は２型糖尿病の有意な連鎖を示す領域であるとの報告もなされている（例えば、非特許文献２参照）。【０００８】
また、第１５番染色体に関しても、罹患同胞対解析による疾患感受性座位の報告が複数なされている。米国のBellらは、１９９６年にメキシコ系アメリカ人集団で、マイクロサテライトマーカーＤ１５Ｓ１１９座位にロッド値１．５を認め、日本人集団での追加実験で、Ｄ１５Ｓ１１２座位にロッド値１．３９を見出した（例えば、非特許文献３参照。）。１９９９年にBellらは第二報として、前述のＮＩＤＤＭ１と第１５番染色体の相互作用を報告し、１５ｑ２１．１領域のＣＹＰ１９に疾患感受性座位を同定(相互作用によりロッド値１．２７→４と上昇)している(例えば、非特許文献４参照)。１９９８年には、Pratleyらがピマインディアン集団のゲノム解析を行い、ｇａｔａ５０ｃ０３座位にロッド値１．５、Ｄ１５Ｓ６５９にロッド値１．４６を認めている(例えば、非特許文献５参照)。２０００年には、Froguelらが、フランス系白色人種で、Ｄ１５Ｓ１００７にロッド値１．５を報告した(例えば、非特許文献６参照)。【０００９】
日本人集団については、２００２年に門脇らがＤ１５Ｓ９９４にロッド値１．５７、４５歳以下で２型糖尿病を発症する集団でロッド値３．９１、ＢＭＩ値３０以下の痩せ型集団では２．４４を見出した(例えば、非特許文献７参照)。さらに、ＢＭＩを指標とした２００３年の岩崎らの解析で、ＢＭＩ値２２以下の集団で、セントロメアより４５．８ｃＭの領域にロッド値２．４１が報告された(例えば、非特許文献２参照)。これらの領域は、ＣＹＰ１９内であり、単独でこの領域に関する連鎖が示唆されている。しかし、日本人においてはＮＩＤＤＭ１との相互作用は肯定的ではなかった。【００１０】
さらに、第３番染色体に関しても、罹患同胞対解析による疾患感受性座位の報告がメキシコ系アメリカ人（例えば、非特許文献３、８参照）、ピマインディアン、フィンランド人家系（例えば、非特許文献５参照）、メキシコ系アメリカ人（例えば、非特許文献９参照）、および日本人（例えば、非特許文献２参照）について、民族・人種を超えて繰り返し連鎖が複数報告されていたが、日本人の２型糖尿病の発症に関わる疾患感受性遺伝子多型を特定するには至っていなかった。【００１１】
【特許文献１】特開２００４−１７３５０５号公報
【特許文献２】特開２００４−３４４０３９号公報
【特許文献３】特開２００３−７９３８１号公報
【非特許文献１】「蛋白質 核酸 酵素」Vol.49,No.11,1834-1840(2004)
【非特許文献２】DIABETES,VOL,52，JANUARY,209-213,2003
【非特許文献３】Nat Genet. 13:161-166, 1996
【非特許文献４】Nat Genet. 21:213-215. 1999
【非特許文献５】J Clin Invest. 101:1757-1764, 1998
【非特許文献６】Am J Hum Genet. 67:1470-1480, 2000
【非特許文献７】Diabetes. 51:1247-1255, 2002
【非特許文献８】Diabet Rev 5: 277-283
【非特許文献９】Am. J. Hum. Genet. 66(6): 1871-1881
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、上記特許文献１記載の、多因子疾患等の多数遺伝子の関与する２型糖尿病の２型糖尿病感受性遺伝子の同定方法を利用した、日本人における２型糖尿病の発症リスクの判定方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み、２型糖尿病疾患感受性遺伝子の探索を目的とし、日本人２型糖尿病を対象とした網羅的関連解析による疾患感受性遺伝子の同定を試みた。候補領域には、２型糖尿病の疾患感受性領域として日本人を含む複数人種を対象とする複数の報告において有意な連鎖を示す領域であると報告されている２０番染色体長腕領域（非特許文献２参照）、ヒト２型糖尿病の罹患同胞対解析で、メキシコ系アメリカ人(非特許文献３、非特許文献４参照。)、ピマインディアン(非特許文献５参照。)、フランス系白色人種(非特許文献６参照。)、および日本人(非特許文献７、非特許文献２参照。)について、繰り返し連鎖が報告されている第１５番染色体長腕領域１５ｑ１４-ｑ２１(１８．６ｃＭ)、ヒト２型糖尿病の罹患同胞対解析で、メキシコ系アメリカ人、ピマインディアン、フィンランド人家系、メキシコ系アメリカ人、および日本人について、繰り返し連鎖が報告されている第３番染色体短腕領域３ｐ２４．３−２２．１ (２０．４ｃＭ)を、疾患感受性候補座位として選定した。。そこで、本発明者らはＳＮＰｓを活用し独自に開発したＥｖｅｎ−Ｓｐａｃｉｎｇ  Ｃｏｍｍｏｎ  ＳＮＰｓマーカーをスクリーニングし、そのＳＮＰｓを２段階スクリーニングすることによって、疾患感受性遺伝子と連鎖不平衡状態にあるＳＮＰｓを効果的に選択した（非特許文献１参照）。また選択したＳＮＰｓを用いて網羅的関連解析を行うことにより、当該領域上に推定される２型糖尿病の疾患感受性遺伝子を詳細に解析した。【００１４】
具体的には、第２０番染色体長腕領域については、１７Ｍｂ領域を対象として平均１６ｋｂ間隔（遺伝子領域限定では平均１０ｋｂ間隔）で１１４７個のＳＮＰｓマーカーを配置し、健常者８９３名、２型糖尿病患者９２５名のＤＮＡサンプルをＴａｑＭａｎ法にてジェノタイピングを行って２型糖尿病との関連を検定した。関連が認められた領域に関しては組み換え値と種々の連鎖不平衡値を算出し、更にハプロタイプによる検定を実施し遺伝統計学的に詳細な解析を行った。【００１５】
また、第１５番染色体長腕領域については、１８．６Ｍｂ領域を対象として日本人の２型糖尿病の発症にかかわる可能性を持つ疾患感受性遺伝子多型を特定し、連鎖不平衡ブロック内に存在する疾患感受性候補遺伝子を探索した。候補領域内に存在する２１４遺伝子の内１６０の遺伝子領域 (第１Ｅｘｏｎ開始点より上流１０ｋｂｐから最終Ｅｘｏｎの下流１０ｋｂｐまでと定義)および遺伝子間領域に対し、日本人でマイナーアレル頻度(Minor Allele Frequency :ＭＡＦ) が１５％以上、且つ、ハーディーワインバーグ平衡 (P＞０．０５)を満たすＳＮＰを用いた。遺伝子領域では、約５ｋｂｐの間隔で設計した９３１ＳＮＰｓを使用、遺伝子間領域は、４２５ＳＮＰｓ、合計１３５６ＳＮＰｓを用いた。２型糖尿病患者／健常対照者は２段階のサンプルセット (第１ステージ；３７２／３６０人、第２ステージ；５３２／５３０人、合計９０４／８９０人) を用い、ＴａｑＭａｎアッセイ方法で、段階的絞込み(第１ステージ；Ｐ＜０．１、第２ステージ；Ｐ＜０．０５、Combinedステージ；Ｐ＜０．０５) による網羅的関連解析を行い、連鎖不平衡ブロックを検討、更にハプロタイプによる検定を実施し遺伝統計学的に詳細な解析を行った。【００１６】
さらに、第３番染色体短腕についても同様に、２０．４Ｍｂ領域を対象として日本人の２型糖尿病の発症にかかわる可能性を持つ疾患感受性遺伝子多型を特定し、連鎖不平衡ブロック内に存在する疾患感受性候補遺伝子を探索した。候補領域内の約１２５遺伝子を含む遺伝子間領域（第１Ｅｘｏｎ開始点より上流１０ｋｂｐから最終Ｅｘｏｎの下流１０ｋｂｐまでと定義する）に対し、約１０Ｋｂｐの等間隔で、日本人でマイナーアレル頻度が１５％以上の高頻度を示し、ハーディーワインバーク平衡を満たす(Ｐ＞０．０５)５０８種類のＳＮＰｓを用いた。２型糖尿病患者／健常対照者は２段階のサンプルセット (第１ステージ；３０４／３６１人、第２ステージ；５６０／５３７人、合計８６４／８９８人) を用い、ＴａｑＭａｎアッセイ方法で、段階的絞込み(第１ステージ；Ｐ＜０．１、第２ステージ；Ｐ＜０．０５、Combinedステージ；Ｐ＜０．０５) による網羅的関連解析を行い、連鎖不平衡ブロックを検討、更にハプロタイプによる検定を実施し遺伝統計学的に詳細な解析を行った。【００１７】
第２０番染色体長腕領域に関するカイ二乗検定による解析では、アレル頻度でｐ＝０．００２３１を示すＳＮＰを検出した。このＳＮＰに隣接するＳＮＰｓにも統計学的有意性を認め、２ＳＮＰｓで構成される候補領域を検出した。検出した候補領域に組み換えはほぼ認めず、２ＳＮＰｓは強い連鎖不平衡値を示した。２ＳＮＰｓによるハプロタイプ検定において健常者群と患者群の間で有意な頻度差を認めた。解析領域内に存在し候補遺伝子と推定されるＨＮＦ４α遺伝子には８ＳＮＰマーカーを配置し検定して、統計学的に弱いながらも２型糖尿病と有意な関連は認めた。ＳＮＰによる網羅的探索により第２０番染色体長腕から統計学的に強い候補領域を１ヵ所検出した。また、高密度に配置したＳＮＰｓを用いて関連解析と詳細な遺伝統計学的解析を行い、検出した遺伝子が２型糖尿病疾患感受性を示すことを見出した。【００１８】
また、第１５番染色体長腕領域については、２型糖尿病患者と健常対照者で、第１ステージ、第２ステージ、およびCombinedステージにおいて統計学的有意水準を満たす疾患感受性候補５ＳＮＰｓを同定し、最小Ｐ値（Ｐ＝０．００４３）を示すＳＮＰ２１４０(ｒｓ２４１２７４７、第１ステージ；Ｐ＝０．０４９、第２ステージ;Ｐ＝０．０３８、Combinedステージ;Ｐ＝０．００４３)を見出した。さらに、連鎖不平衡解析の結果、疾患感受性候補ＳＮＰｓ周辺に、３８ＳＮＰｓからなる全長３５５ｋｂｐ、６遺伝子が存在する連鎖不平衡ブロックを特定し、上記５候補ＳＮＰｓは全てＵＢＲ１(ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 1)遺伝子内に存在することを見出した。【００１９】
さらに、第３番染色体短腕についても、２型糖尿病患者と健常対照者で、第１ステージ、第２ステージ、およびCombinedステージにおいて統計学的有意水準を満たす疾患感受性候補２ＳＮＰｓを同定し、最小Ｐ値（Ｐ=０．００００４６）を示し、更にBonferroniの多重検定をクリアするＳＮＰ３７５(ｒｓ２０５１２１１、第１ステージ；Ｐ＝０．０００７３７、第２ステージ;Ｐ＝０．０１４、Combinedステージ;Ｐ＝０．００００４６)を見出した。さらに、連鎖不平衡解析の結果、疾患感受性候補ＳＮＰ３７５周辺に、新たな６有意ＳＮＰｓを含む全長１２１．６ｋｂｐ、３遺伝子が存在する連鎖不平衡ブロックを特定した。更に、その３遺伝子のうち、最小Ｐ値を示す候補ＳＮＰ３７５が含まれるＥｎｄｏｇｌ１(Endonuclease G Like Protein1)遺伝子を２型糖尿病の疾患感受性遺伝子と特定した。【００２０】
本発明者らは、上記の点を見い出したことにより、本発明を完成するに至った。【００２１】
すなわち本発明は、（１）ヒトゲノム配列中の配列番号１記載の塩基配列と配列番号２記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号７記載の塩基配列と配列番号８記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号９記載の塩基配列と配列番号１０記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１１記載の塩基配列と配列番号１２記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１３記載の塩基配列と配列番号１４記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１７記載の塩基配列と配列番号１８記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号２１記載の塩基配列と配列番号２２記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号２３記載の塩基配列と配列番号２４記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号２５記載の塩基配列と配列番号２６記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号２７記載の塩基配列と配列番号２８記載の塩基配列により挟まれた塩基から選択される１又は２以上の塩基を２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法や、（２）ヒトゲノム配列中の配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は／及びヒトゲノム配列中の配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列により挟まれた塩基を２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法や、（３）米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいて、ｒｓ２２００７９、ｒｓ２２００７６、ｒｓ２４１２７４７、ｒｓ１０３７９９０、ｒｓ８０２７７３３、ｒｓ４５７３９０８、ｒｓ１１０７０３８７、ｒｓ２０５１２１１、ｒｓ６５９９２１０、ｒｓ１７０３７８０４、ｒｓ２０７０４９０、ｒｓ７６４９９８４、ｒｓ７６４７６５７で表される塩基、及びＥＮＧＬ２４から選択される１又は２以上の塩基を２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法や、（４）米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいて、ｒｓ２２００７６、ｒｓ２４１２７４７、ｒｓ２０５１２１１、又は／及びｒｓ１７０３７８０４で表される塩基を２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法に関する。【００２２】
また本発明は、（５）以下の工程を含む２型糖尿病の発症リスクを判定する方法：（Ａ）検体中のヒトゲノムＤＮＡを抽出する工程、及び（Ｂ）抽出したヒトゲノムＤＮＡの配列において、配列番号１記載の塩基配列と配列番号２記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号７記載の塩基配列と配列番号８記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号９記載の塩基配列と配列番号１０記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１１記載の塩基配列と配列番号１２記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１３記載の塩基配列と配列番号１４記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１７記載の塩基配列と配列番号１８記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号２１記載の塩基配列と配列番号２２記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号２３記載の塩基配列と配列番号２４記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号２５記載の塩基配列と配列番号２６記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号２７記載の塩基配列と配列番号２８記載の塩基配列により挟まれた塩基から選択される１又は２以上の塩基を同定・評価する工程や、（６）以下の工程を含む２型糖尿病の発症リスクを判定する方法：（Ａ）検体中のヒトゲノムＤＮＡを抽出する工程、及び（Ｂ）抽出したヒトゲノムＤＮＡの配列において、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいて、ｒｓ２２００７９、ｒｓ２２００７６、ｒｓ２４１２７４７、ｒｓ１０３７９９０、ｒｓ８０２７７３３、ｒｓ４５７３９０８、ｒｓ１１０７０３８７、ｒｓ２０５１２１１、ｒｓ６５９９２１０、ｒｓ１７０３７８０４、ｒｓ２０７０４９０、ｒｓ７６４９９８４、ｒｓ７６４７６５７で表される塩基、及びＥＮＧＬ２４から選択される１又は２以上の塩基を同定・評価する工程、に関する。【００２３】
さらに本発明は、（７）配列番号１記載の塩基配列と配列番号２記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２２００７９で表される塩基が、Ｇ若しくはＡであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（８）配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２２００７６で表される塩基が、Ｃ若しくはＡであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（９）配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２４１２７４７（ＳＮＰ２１４０）で表される塩基が、Ｃ若しくはＴであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１０）配列番号７記載の塩基配列と配列番号８記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ１０３７９９０（ＳＮＰ１１６４）で表される塩基が、Ｃ若しくはＴであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１１）配列番号９記載の塩基配列と配列番号１０記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ８０２７７３３（ＳＮＰ１１６５）で表される塩基が、Ａ若しくはＧであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１２）配列番号１１記載の塩基配列と配列番号１２記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ４５７３９０８（ＳＮＰ２１４１）で表される塩基が、Ｃ若しくはＴであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１３）配列番号１３記載の塩基配列と配列番号１４記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ１１０７０３８７（ＳＮＰ１１６７）で表される塩基が、Ｇ若しくはＴであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１４）配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２０５１２１１（ＳＮＰ３７５）で表される塩基が、Ｇ若しくはＡであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１５）配列番号１７記載の塩基配列と配列番号１８記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ６５９９２１０（ＥＮＧＬ１２）で表される塩基が、Ａ若しくはＧであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１６）配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ１７０３７８０４（ＥＮＧＬ１５）で表される塩基が、Ｇ若しくはＡであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１７）配列番号２１記載の塩基配列と配列番号２２記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２０７０４９０（ＥＮＧＬ１８）で表される塩基が、Ｔ若しくはＡであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１８）配列番号２３記載の塩基配列と配列番号２４記載の塩基配列により挟まれたＥＮＧＬ２４で表される塩基が、Ｔ若しくはＣであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（１９）配列番号２５記載の塩基配列と配列番号２６記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ７６４９９８４（ＥＮＧＬ２５）で表される塩基が、Ｔ若しくはＣであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（２０）配列番号２７記載の塩基配列と配列番号２８記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ７６４７６５７（ＥＮＧＬ２６）で表される塩基が、Ｇ若しくはＡであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法に関する。【００２４】
また本発明は、（２１）検体として末梢血を用いることを特徴とする上記（５）〜（２０）のいずれか記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（２２）日本人のヒトゲノムを用いることを特徴とする上記（５）〜（２１）のいずれか記載の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】（Ａ）第２０番染色体地図、塩基配列タグ部位（ＳＴＳ：sequence-tagged site）、及び品質管理基準を満たした１０４４ＳＮＰｓマーカーを示す図である。ＳＮＰｓを示す上段の青いバーは、５８１のＳＮＰｓマーカー（TaqMan ＳＮＰｓ Genotyping Assays）の位置を示している。ＳＮＰｓを示す上段の赤いバーは、赤いバーは本研究のために、特別に追加注文した４６３ＳＮＰｓマーカーの位置を示している。黒いバーは２つのＳＴＳマーカーの位置を示している。  （Ｂ）９２５名の罹患者と、８９３人の健常対照者を用いた１４２のＳＮＰｓに関するアレル頻度のχ２検定によるＰ値を示す図である。アスタリスクは、有意ＳＮＰｓとして最も有意なＰ値を有するＳＮＰｓ１１４６（ｒｓ２００７６）を示す。Ｐ  ｖａｌｕｅ［−ｌｏｇＰ］が１及び２である、赤い横線は、基準となるＰ値を示している（ぞれぞれＰ＝０．１と０．０１）。  （Ａ）と（Ｂ）は、同じ物理的スケールを使用した。横軸はＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３３ヒトゲノムを基にした第２０番染色体上の物理的位置を示している。
【図２】全候補領域の関連解析結果を示す図である。赤枠で示した第１５番染色体候補領域の解析に使用した全１３５６ＳＮＰｓの内、１０ｋｂ領域で用いたＳＮＰｓを青で、５ｋｂ領域で用いたＳＮＰｓを赤で、Intergenic領域で用いたＳＮＰｓを黒で上段に示す。CombinedステージにおけるAllele頻度モデル／χ２検定（ＦＧＤＳ v2.0） 結果 を示す。縦軸は−logP、横軸に第１５番染色体上の物理位置を示す。第１ステージの有意水準Ｐ＜０．１、第２ステージの有意水準Ｐ＜０．０５およびCombinedステージの有意水準Ｐ＜０．０５をクリアした６ＳＮＰｓ を緑の枠で囲んだ。緑の枠で囲んだ有意ＳＮＰ２１４０周辺に対して連鎖不平衡解析を行った。
【図３】有意ＳＮＰｓ周辺の連鎖不平衡ブロック：上段は、ＬＤＵ値グラフ(縦軸：ＬＤＵ値／横軸:物理位置、ＬＤＭＡＰ version 1.0)とCombinedステージにおけるＡｌｌｅｌｅ頻度モデルχ２検定関連解析結果(縦軸: −ｌｏｇＰ値/横軸:物理位置、SNP Alyzev5.0)、中段は、|Ｄ'|値による連鎖不平衡マップ (赤：|Ｄ'|＞０．９、ピンク：０．９＞|Ｄ'|＞０．８、SNP Alyze v5.0)、下段には、r-square値による連鎖不平衡マップ(赤：r-square＞０．９、ピンク：０．９＞r-square＞０．８、SNP Alyze v5.0)を示す。連鎖不平衡マップの青線内に示す３８ＳＮＰｓ、３５５ｋｂｐのブロックを連鎖不平衡ブロックに特定した。データは、第１ステージ(Case／Control=３７２人／３６０人サンプル)の結果を用いた。
【図４】マウス(Ａ)およびヒト(Ｂ)組織におけるＵＢＲ１遺伝子の発現量を示す図である。(Ａ)マウス８組織(腎臓、肝臓、脂肪、骨格筋、肺、脳、心臓、膵臓)におけるＵＢＲ１遺伝子の発現量を示す。図中、野生型マウスを白のカラム、ｄｂマウスを黒のカラムで示した。縦軸は相対発現量、横軸に８種類の各組織を示す。解析は、ｎ＝５匹を用い、３回の独立した解析結果からデータを得た。(Ｂ)ヒト１２組織 (脳、肝臓、心臓、腎臓、肺、骨格筋、脾臓、胸腺、骨髄、胎盤、小腸、膵臓) におけるＵＢＲ１遺伝子の発現量を示す。縦軸は相対発現量、横軸に１２種類の各組織を示す。３回の独立した解析結果からデータを得た。
【図５】全候補領域の関連解析結果を示す図である。第３番染色体候補領域の解析に使用した全５０８ＳＮＰｓに対する、Allele頻度モデルχ２検定関連解析結果を示す。縦軸：−logP値／横軸：物理位置、横軸は第３番染色体上の物理位置を示す。２次に進んだ２３ＳＮＰｓ、および他の１次におけるχ２解析結果を示す。
【図６】有意ＳＮＰｓ周辺の連鎖不平衡ブロック：上段にHaplovirw3.2ソフトでの連鎖不平衡マップ、下段は、|Ｄ'|値による連鎖不平衡マップ(赤；|Ｄ'|＞０．９、ピンク；０．９＞|Ｄ'|＞０．８、SNP Alyze v5.0)、を示す。連鎖不平衡マップ内に示す４０ＳＮＰｓ、１２１．６ｋｂｐのブロックを連鎖不平衡ブロックに特定した。データは、第一ステージ(Case／Control=３７２／３６０サンプル)の結果を用いた。
【図７】ヒト(Ａ)およびマウス(Ｂ)組織、および膵β細胞株（Ｃ）におけるＥｎｄｏｇｌ１遺伝子の発現量を示す図である。Ａ)ヒト１２組織（脳、肝臓、心臓、腎臓、肺、骨格筋、脾臓、胸腺、骨髄、胎盤、小腸、膵臓）におけるＥｎｄｏｇｌ１遺伝子の発現量を示す。縦軸は相対発現量、横軸に１２種類の各組織を示す。３回の独立した解析結果からデータを得た。Ｂ)マウス８組織 (腎臓、肝臓、脂肪、骨格筋、肺、脳、心臓、膵臓)におけるＥｎｄｏｇｌ１遺伝子の発現量を示す。図中、野生型マウスを白のカラム、ｄｂマウス（９週齢）を黒のカラム、斜線はｄｂマウス（１２週齢）を示した。縦軸は相対発現量、横軸に８種類の各組織を示す。解析は、ｎ＝５匹を用い、３回の独立した解析結果からデータを得た。Ｃ)繊維芽細胞および膵β細胞株におけるＥｎｄｏｇｌ１遺伝子の発現量を示す。３回の独立した解析結果からデータを得た。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明において、「２型糖尿病感受性遺伝子」とは、多遺伝子性疾患の２型糖尿病に罹りやすい体質を決める複数の遺伝子のことをいい、「遺伝子頻度」とは、一つの遺伝子の座位について、集団中に存在する全遺伝子数のうちその対立遺伝子が占める割合をいい、「連鎖不平衡解析」とは、ゲノム領域における連鎖不平衡の強さの度合いを解析することをいい、「マイナーアレル」とは、一つの遺伝子の座位について、２つの対立遺伝子が存在する場合の、遺伝子頻度の低い対立遺伝子（アレル）をいい、また「多型」とは、２つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合、それらの対立遺伝子を指し、さらに「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引き起こされる多型であって、多型は選択された集団の１％より大きな頻度、好ましくは、１０％以上の頻度で存在する。【００２７】
また、本明細書における「連鎖不平衡」とは、集団における任意の対立遺伝子の組み合わせの頻度について、偶然によって期待されるよりも、より、頻繁に近傍の特定対立遺伝子と出現する関係のことをいう。例えば、遺伝子座Ｘが対立遺伝子ａ及びｂ（これらは等しい頻度で存在する）を有し、近傍の遺伝子座Ｙが対立遺伝子ｃ及びｄ（これらは等しい頻度で存在する）を有する場合、別の遺伝子多型の組み合わせであるハプロタイプａｃは、集団において０．２５の頻度で存在することが期待される。ハプロタイプａｃがこうした期待値よりも大きい場合、つまり、ａｃという特定の遺伝子型がより頻繁に出現する場合、対立遺伝子ａｃは連鎖不平衡にあるという。連鎖不平衡は、対立遺伝子の特定の組み合わせの自然選択又は、集団に導入された時期が進化的に見て最近であることにより生じたもので、連鎖する対立遺伝子同士が平衡に達していないことから生じ得る。従って、民族や人種などのように、別の集団においては、連鎖不平衡の様式は異なり、ある集団においてａｃが連鎖不平衡である場合でも、別の集団でａｄが連鎖不平衡の関係であり得る。連鎖不平衡における多型は、該多型が疾患を引き起こさないにも関わらず、疾患に対する感受性を検出することにおいて有効であり得る。例えば、ある遺伝子座Ｘの対立遺伝子ａが疾患の原因遺伝子要素ではないが、遺伝子座Ｙの対立遺伝子ｃとの連鎖不平衡により、疾患感受性を示し得ることがある。【００２８】
本発明において、２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用することができるヒトゲノム配列中の塩基としては、配列番号１記載の塩基配列と配列番号２記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２２００７９で表される塩基（以下「ＳＮＰ１１４５」ということがある）や、配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２２００７６で表される塩基（以下「ＳＮＰ１１４６」ということがある）や、配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２４１２７４７で表される塩基（以下「ＳＮＰ２１４０」ということがある）や、配列番号７記載の塩基配列と配列番号８記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ１０３７９９０で表される塩基（以下「ＳＮＰ１１６４」ということがある）や、配列番号９記載の塩基配列と配列番号１０記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ８０２７７３３で表される塩基（以下「ＳＮＰ１１６５」ということがある）や、配列番号１１記載の塩基配列と配列番号１２記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ４５７３９０８で表される塩基（以下「ＳＮＰ２１４１」ということがある）や、配列番号１３記載の塩基配列と配列番号１４記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ１１０７０３８７で表される塩基（以下「ＳＮＰ１１６７」ということがある）や、配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２０５１２１１で表される塩基（以下「ＳＮＰ３７５」ということがある）や、配列番号１７記載の塩基配列と配列番号１８記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ６５９９２１０で表される塩基（以下「ＥＮＧＬ１２」ということがある）や、配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ１７０３７８０４で表される塩基（以下「ＥＮＧＬ１５」ということがある）や、配列番号２１記載の塩基配列と配列番号２２記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ２０７０４９０で表される塩基（以下「ＥＮＧＬ１８」ということがある）や、配列番号２３記載の塩基配列と配列番号２４記載の塩基配列により挟まれた塩基であって、米国のｄｂＳＮＰデータベースに登録されていない新規ＳＮＰ（以下「ＥＮＧＬ２４」ということがある）や、配列番号２５記載の塩基配列と配列番号２６記���の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ７６４９９８４で表される塩基（以下「ＥＮＧＬ２５」ということがある）や、配列番号２７記載の塩基配列と配列番号２８記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国のｄｂＳＮＰデータベースにおけるｄｂＳＮＰ ＩＤにおいてｒｓ７６４７６５７で表される塩基（以下「ＥＮＧＬ２６」ということがある）を挙げることができ、これらは単独又は２種以上併用して用いることができる。かかる２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用することができるヒトゲノム配列中の塩基は、本発明の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法において同定・評価の対象となっている。【００２９】
上記２型糖尿病易罹患性判定マーカーのなかでも、２型糖尿病の発症リスクを好適に判定する上で、ＳＮＰ１１４６、ＳＮＰ２１４０、ＳＮＰ３７５又はＥＮＧＬ１５の単独使用や、ＳＮＰ１１４６、ＳＮＰ２１４０、ＳＮＰ３７５又はＥＮＧＬ１５の２つ以上の併用、中でもこれら４つの全部を併用することが好ましい。ＳＮＰ１１４６は、配列番号２９で示される塩基配列からなるミオシン ライト ポリペプチド ９（myosin light polypeptide ９）遺伝子の３６６０位の塩基（イントロン１の中に位置し、翻訳開始部位の−７３１位）、ＳＮＰ２１４０は、配列番号３０で示される塩基配列からなるＵＢＲ１（ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 1)遺伝子の、イントロン３３の中に位置し、翻訳開始部位の１１１，４１５位、ＳＮＰ３７５は、配列番号３１で示される塩基配列からなるＥｎｄｏｇｌ１（Endonuclease G Like Protein 1）遺伝子のイントロン５中の＋１１，２９０位（翻訳開始部位の２１，８８８位）、ＥＮＧＬ１５は、イントロン５中の＋１０，７５６位に位置（翻訳開始部位の２１，３５４位）に位置する。【００３０】
ＳＮＰ１１４５をはじめとした上記ＳＮＰｓを、２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法としては、これらＳＮＰｓを含む領域をＳＮＰｓタイピングする方法を挙げることができる。ＳＮＰｓタイピングの方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯ、ＰＣＲ−ＡＳＰ、ダイレクトシークエンス法、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ｄＨＰＬＣ、Ｓｎｉｐｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法等の当業者に周知の方法（例えば、「ゲノム創薬の最前線」ｐ４４−ｐ５４、野島 博 編、羊土社、参照）を用いることができるが、特に、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標；アプライドバイオシステムズ製）を利用し、ＴａｑＭａｎシステムを利用したＳＮＰｓタイピング法を採用することが効果的である。例えば、ＳＮＰ１１４５マーカーの場合、Ｇ／Ｇ，Ｇ／Ａ若しくはＡ／Ａのいずれに属するかで、ＳＮＰ１１４６マーカーの場合、Ｃ／Ｃ，Ｃ／Ａ若しくはＡ／Ａのいずれに属するかで判定される。【００３１】
本発明の２型糖尿病の発症リスクを判定する方法としては、（Ａ）検体中のヒトゲノムＤＮＡ、好ましくは日本人のヒトゲノムＤＮＡを抽出する工程、（Ｂ）抽出したヒトゲノムＤＮＡの配列において、ＳＮＰ１１４５、ＳＮＰ１１４６、ＳＮＰ２１４０、ＳＮＰ１１６４、ＳＮＰ１１６５、ＳＮＰ２１４１、ＳＮＰ１１６７、ＳＮＰ３７５、ＥＮＧＬ１２、ＥＮＧＬ１５、ＥＮＧＬ１８、ＥＮＧＬ２４、ＥＮＧＬ２５、ＥＮＧＬ２６から選択される１又は２以上の塩基（ＳＮＰｓ）を同定・評価する工程を備えていれば特に制限されず、上記検体としては、末梢血などの血液、唾液、汗等の体液、体細胞及びそれを含む組織又は器官等を挙げることができるが、末梢血を用いることが好ましい。塩基（ＳＮＰ）の同定方法としては、上記のように、ＳＮＰ１１４５、ＳＮＰ１１４６、ＳＮＰ２１４０、ＳＮＰ１１６４、ＳＮＰ１１６５、ＳＮＰ２１４１、ＳＮＰ１１６７、ＳＮＰ３７５、ＥＮＧＬ１２、ＥＮＧＬ１５、ＥＮＧＬ１８、ＥＮＧＬ２４、ＥＮＧＬ２５、ＥＮＧＬ２６から選択される１又は２以上の塩基（ＳＮＰｓ）を含む領域をＳＮＰｓタイピングする方法を挙げることができる。また、判定としては、ＳＮＰ１１４５の同定結果がＡ／Ａのとき、ＳＮＰ１１４６の同定結果がＡ／Ａのとき、ＳＮＰ２１４０の同定結果がＣ／Ｃのとき、ＳＮＰ１１６４の同定結果がＣ／Ｃのとき、ＳＮＰ１１６５の同定結果がＡ／Ａのとき、ＳＮＰ２１４１の同定結果がＣ／Ｃのとき、ＳＮＰ１１６７の同定結果がＧ／Ｇのとき、ＳＮＰ３７５の同定結果がＧ／Ｇのとき、ＥＮＧＬ１２の同定結果がＧ／Ｇのとき、ＥＮＧＬ１５の同定結果がＧ／Ｇのとき、ＥＮＧＬ１８の同定結果がＴ／Ｔのとき、ＥＮＧＬ２４の同定結果がＴ／Ｔのとき、ＥＮＧＬ２５の同定結果がＴ／Ｔのとき、ＥＮＧＬ２６の同定結果がＧ／Ｇのとき、２型糖尿病に罹患しやすいと判定され、ＳＮＰ１１４５の同定結果がＧ／Ａのとき、ＳＮＰ１１４６の同定結果がＣ／Ａのとき、ＳＮＰ２１４０の同定結果がＴ／Ｃのとき、ＳＮＰ１１６４の同定結果がＴ／Ｃのとき、ＳＮＰ１１６５の同定結果がＧ／Ａのとき、ＳＮＰ２１４１の同定結果がＴ／Ｃのとき、ＳＮＰ１１６７の同定結果がＴ／Ｇのとき、ＳＮＰ３７５の同定結果がＧ／Ａのとき、ＥＮＧＬ１２の同定結果がＡ／Ｇのとき、ＥＮＧＬ１５の同定結果がＧ／Ａのとき、ＥＮＧＬ１８の同定結果がＴ／Ａのとき、ＥＮＧＬ２４の同定結果がＴ／Ｃのとき、ＥＮＧＬ２５の同定結果がＴ／Ｃのとき、ＥＮＧＬ２６の同定結果がＧ／Ａのとき、２型糖尿病にやや罹患しやすいと判定され、ＳＮＰ１１４５の同定結果がＧ／Ｇのとき、ＳＮＰ１１４６の同定結果がＣ／Ｃのとき、ＳＮＰ２１４０の同定結果がＴ／Ｔのとき、ＳＮＰ１１６４の同定結果がＴ／Ｔのとき、ＳＮＰ１１６５の同定結果がＧ／Ｇのとき、ＳＮＰ２１４１の同定結果がＴ／Ｔのとき、ＳＮＰ１１６７の同定結果がＴ／Ｔのとき、ＳＮＰ３７５の同定結果がＡ／Ａのとき、ＥＮＧＬ１２の同定結果がＡ／Ａのとき、ＥＮＧＬ１５の同定結果がＡ／Ａのとき、ＥＮＧＬ１８の同定結果がＡ／Ａのとき、ＥＮＧＬ２４の同定結果がＣ／Ｃのとき、ＥＮＧＬ２５の同定結果がＣ／Ｃのとき、ＥＮＧＬ２６の同定結果がＡ／Ａのとき、２型糖尿病に罹患しにくいと判定することができる。【００３２】
以下に、本発明を実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
［第２０番染色体長腕領域］
１．検体
ＳＮＰｓマーカーの選択には、日本人非血縁健常対照者４６名から末梢血を採取し、常法により、全ゲノムＤＮＡを抽出したものを検体とした。また、選定したＳＮＰｓマーカーの評価には、日本人非血縁２型糖尿病患者９２５名、及び日本人非血縁健常対照者８９３名から末梢血を採取し、常法により、全ゲノムＤＮＡを抽出したものを検体とした。上記２型糖尿病患者９２５名の検体のうち、３６７名の検体を１次サンプルとし、５５８名の検体を２次サンプルとした。また、上記健常対照者８９３名の検体のうち、３５８名の検体を１次サンプルとし、５３５名の検体を２次サンプルとした。検体提供者の臨床的特徴等を表１に示す。【００３４】
【表１】
2007032496.tif 000002
【００３５】
２．ＳＮＰｓマーカーの選択
前記のように、２型糖尿病の疾患感受性領域として日本人を含む複数人種を対象とする複数の報告において、２０番染色体長腕領域は有意な連鎖を示す領域であると報告されている（非特許文献２参照）。そこで、非血縁健常対照者４６名由来の検体を用いて、２０番染色体長腕の１７Ｍｂ領域を対象として、平均１６ｋｂ間隔（遺伝子領域限定では平均１０ｋｂ間隔）で、マイナーアレルの遺伝子頻度１５％以上の条件で、ＳＮＰｓタイピングを行なった。ＳＮＰｓタイピングは、一部Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標；アプライドバイオシステムズ製）を利用し、ＴａｑＭａｎ法により行なった。また、Ｄｕａｌ３８４−ｗｅｌｌ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドシステムズ製）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドシステムズ製）の機器を用いた。なお、反応条件は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴに添付の説明書に従った。即ち、反応系組成（表２）及びＰＣＲ条件（表３）は次のとおりである。【００３６】
【表２】
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【００３７】
【表３】
2007032496.tif 000004
【００３８】
ＳＮＰｓタイピングの結果、対象候補領域内に、マイナーアレルの遺伝子頻度が１５％以上である１１４７個の日本人共通ＳＮＰｓ（Ｃｏｍｍｏｎ ＳＮＰｓ）マーカーを選定することができた。この１１４７ＳＮＰｓは、対象候補領域内に広く分散し、およそ１０ｋｂあたり１ＳＮＰの割合で分布していた。 【００３９】
３．関連解析（第１ステージ）
選定された１１４７個のＳＮＰｓを対象に、日本人非血縁健常対照者由来の検体３５８例及び日本人非血縁２型糖尿病患者由来の検体３６７例を対象に関連解析（第１ステージ：遺伝子頻度でのχ２検定）を行なった。対象候補領域における１，１４７のＳＮＰは遺伝子型を決定されたが、１０３のＳＮＰは品質管理基準により除外された。除外の主な原因は、度数や、遺伝子型の集団の数、及びハーディ−ワインベルグ平衡検定（ｐ＜０．０５）との一貫性を含む品質管理基準のうち、ハーディ−ワインベルグ平衡検定からの逸脱によるものである。対象候補領域における２９１遺伝子のうち、２１９遺伝子（７５．３％）については、少なくとも１つのＳＮＰマーカーを配置した。１１４７ＳＮＰｓ中の１０４４ＳＮＰｓの結果を表４に、該マーカーの第１ステージ関連解析におけるＰ値の分布を表５に、該ＳＮＰｓマーカー、第２０番染色体地図、及び塩基配列タグ部位（ＳＴＳ：sequence-tagged site）を図１（Ａ）に示す。健常対照者と２型糖尿病患者との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差が認められたのは、有意水準α＝０．１で２６８ＳＮＰｓ（全体の２３．４％）であった。これらのＳＮＰｓを含め、Ｐ値が０．１０未満（Ｐ＜０．０１）を示した２６８ＳＮＰｓ（２３．４％）について次の関連解析（第２ステージ）の対象候補ＳＮＰｓとした。なお、各ＳＮＰｓのタイピングにおけるＰＣＲプライマーやＴａｑＭａｎプローブは、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標；アプライドバイオシステムズ製）の市販品や特注品を用いた。【００４０】
＜遺伝子型特定のためのデータの確認及び品質管理基準＞
ＴａｑＭａｎアレル識別アッセイにおいて、遺伝子型の判定は、それぞれのＳＮＰに対する蛍光強度測定結果の集積性により同定した。従って、品質管理は、強度測定結果の信憑性により評価を行った。
まず初めに、観察された遺伝子型の集団の数を確認し、集積していないものや、度数が９８％より低いＳＮＰを除外した。遺伝子特定の正確性に関する期待値は、ＳＤＳバージョン２．１プログラム（アプライド  バイオシステムズ社製）で使用されている品質スコアアルゴリズムを用いて推定した。２人の独立した研究員により、強度測定結果の正確性が注意深く確認された。さらに、遺伝子型分布の逸脱は、ハーディ−ワインベルグ平衡検定により確認した。ハーディ−ワインベルグ平衡からの逸脱の確認は、人為的なものによる結果を同定するのに非常に効果的であり、データの品質を向上させるものである。
品質管理の評価の後、アレル同定の成功率は９９％以上であり、以前に報告したように（Hamada et al.2005, Kato et al. 2006）、遺伝子型特定の結果と直接配列を確認した結果が、完全に一致する。【００４１】
【表４】
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【００４２】
【表５】
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【００４３】
４．関連解析（第２ステージ）
対象候補ＳＮＰｓとした２６８ＳＮＰｓについて、上記３で用いた検体と別に用意した日本人非血縁健常対照者由来の試料５３５例及び日本人非血縁２型糖尿病患者由来の試料５５８例を対象に関連解析（第２ステージ）を行なった。Ｐ値は４つのχ２検定（アレル・遺伝子型・アレル２優性・アレル２劣性のそれぞれのモデル）により算出された。２６８ＳＮＰｓのうち、有意水準α＝０．０２で２個のＳＮＰｓ（ＳＮＰ１１４５、ＳＮＰ１１４６）についてヒト２型糖尿病との関連が検出された（表４及び表６）。また、これら２ＳＮＰｓは、ハーディ−ワインベルグ平衡状態を満たし、ヒト２型糖尿病との関連が確かめられた。なお、表６は、ｑ１１．２３における２０ＳＮＰｓマーカー及びｑ１３．１２における１７ＳＮＰｓマーカーにおける関連解析結果を示し、表７は上記２個のＳＮＰｓ（ＳＮＰ１１４５、ＳＮＰ１１４６）におけるタイピングデータを示す。【００４４】
また、上記４つのχ２検定（アレル・遺伝子型・アレル２優性・アレル２劣性のそれぞれのモデル）のうち少なくとも１つにおいて、顕著な関連が見られる（Ｐ＜０．０５）ものとして選択された１４２ＳＮＰｓマーカー（１３．６％）について、同様に上記３で用いた検体と別に用意した日本人非血縁健常対照者由来の試料５３５例及び日本人非血縁２型糖尿病患者由来の試料５５８例を対象に関連解析を行い、有意ＳＮＰを同定した。その結果、ＳＮＰ１１４６（ｒｓ２２００７６）が最も２型糖尿病と関連があることが明らかになった（Ｐ＝０．００２３１，０．０１０１０，０．０１１５７，０．０１５０７；アレルモデル：図１（Ｂ）、表６）。また、ＳＮＰ１１４６（ｒｓ２２００７６）の調整していないオッズ比は、１．２３であった（９５％信頼区間は１．０７７〜１．３９９）。【００４５】
【表６】
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【００４６】
【表７】
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【００４７】
６．連鎖不平衡とハプロタイプに基づく関連解析
連鎖不平衡（ＬＤ：linkage disequilibrium）は、２つあるいはそれより多くの場所での、アレル間の統計学的関連性として定義される（Nat Rev Genet 4:587-597）。本願においては、|Ｄ'|及びｒ２を標準的なアプローチとして使用した。これらの値は、FGDS 及び SNPAlyer ver 3.2.2 Pro software（ＤＹＮＡＣＯＭ社製）で算出した。以下に|Ｄ'|及びｒ２を定義する。
（１）古典統計学的|Ｄ'|閾値法（Genetics 49:49-67）：連鎖不平衡が、３つあるいはそれより多い一連のマーカーの間で、全ての|Ｄ'|の対が０．９を常に上回ると定義される。|Ｄ'|の対の係数は、simple sliding window assessmentにより算出される。
（２）ｒ２の値の定義（Genetics 60:615-628）：ｒ２はマーカー間の相関係数の平方で、０から１の間の値である。最大の起こりうる値は、２つのマーカーのマイナーアレル頻度に依存する。２つのＳＮＰが遺伝子系図の同じ枝上に生じている場合、ｒ２は１であり、組換えによって壊れていないまま残っている。しかしながら、２つのＳＮＰが遺伝子系図の異なる枝上に生じている場合には、ｒ２は１より小さくなる。【００４８】
ＨＮＦ４α遺伝子座周辺のＳＮＰの連鎖不平衡値を求めた。結果を表８（Ａ）に示す。Ｐ２プロモーター領域における４つのＳＮＰｓは、|Ｄ'|＞０．９９、ｒ２＞０．８９といった、高い値を示した。ｒ２の解釈の結果、コード領域は短い連鎖不平衡ブロックに分割された。この解釈に基づくと、ＨＮＦ４α遺伝子の周りに２つの異なるハプロタイプブロックがあり、１つはＰ２プロモーター領域、もう一つは別のコード領域に存在していることになる。さらに、これら２つのハプロタイプに基づく関連解析を行ったところ、Ｐ２プロモーター領域において疾患に関連しているハプロタイプは見られなかった（データなし）。さらに、イントロン７〜９を網羅的に含み、かつ３つのＳＮＰｓを有する１つのハプロタイプを調べた。結果を表９（Ａ）に示す。健常対象者と罹患者に弱く関連が見られたが、この関連性は、Ｐ値がボンフェローニ調整を満たさなかったため、偽の値である可能性が示唆された。【００４９】
また、前記有意ＳＮＰ（ＳＮＰ１１４６）の周辺において、２つの対の連鎖不平衡値を求めることにより、連鎖不平衡の性質を調べた。結果を表８（Ｂ）に示す。ｒ２の解釈の結果、有意ＳＮＰを含む３つの共通ＳＮＰｓの間に、０．９１９〜０．９４３という範囲の、非常に高い相関がある連鎖不平衡ブロックの存在が明らかになった。ｒ２の解釈の結果、連鎖不平衡はその領域の外には伸展しなかったため、１つのハプロタイプブロックは、ＳＮＰ１１４５（ｒｓ２２００７９）、ＳＮＰ１１４６（ｒｓ２２００７６）、及びｒｓ６９４３７９の３つの共通ＳＮＰｓで構成されていると予想された。さらに、有意ＳＮＰを含むハプロタイプに基づく関連解析を行った。結果を表９（Ｂ）に示す。ｒ２の解釈の結果、１つのハプロタイプブロックは明らかな推移帯を示し、それは、有意ＳＮＰを含む全長２３ｋｂの領域であった。ハプロタイプ頻度がBaysian method及びEM algorithmの両方で予想された場合、２つで共通するハプロタイプは、９５％を超えるデータを保証する。表に示すように、２つの手法により求められたハプロタイプ頻度は大きく異ならないことから、ハプロタイプのフェーズは明らかである。それぞれのハプロタイプ解析において、＃１ハプロタイプは保護的ハプロタイプと推測され、＃２ハプロタイプはリスクハプロタイプと推定された。しかしながら、ボンフェローニ調整後のそれぞれのＰ値が０．００４４、０．００２３と弱いことから、それぞれのハプロタイプにおいて顕著な差はないと思われる。【００５０】
【表８】
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【表９】
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【実施例２】
【００５１】
［第１５番染色体長腕領域］
１．検体
上記実施例と同様に、効率よく疾患感受性遺伝子を抽出するために、独立した別集団による２段階の関連解析を実施した。具体的には、２型糖尿病患者(Case)３７２人／健常対照者 (Control)サンプル３６０人での解析(第１ステージ)、さらに、Case５３２人／Control５３０人での解析 (第２ステージ) 、計Case９０４人／Control８９０人についてスクリーニングを行なった。CaseおよびControlサンプルの末梢血より樹立した不死化Ｂリンパ球細胞株よりＤＮＡを抽出しＤＮＡサンプルとした。ＤＮＡサンプルは、糖尿病の型、性別、発症年齢、家族歴の有無、ＨｂＡ１ｃ値、ＢＭＩ等の臨床情報を得た（表１０）。検体の採取は、全国の糖尿病専門医の協力をもとに、臨床症状の明らかな患者より採取されたもので、インフォームドコンセントに基づいて収集されたものである。使用サンプルは、徳島大学医学部ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会の審査を経て承認済みであり、全て連結可能匿名化を行い、個人情報の保護に努めた取り扱いを行っている。検体提供者の臨床的特徴等を表１０に示す。【００５２】
【表１０】
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【００５３】
２．ＳＮＰｓマーカーの選択
等間隔・高アレル頻度ＳＮＰｓマーカーは、以下の基準により定めた。
１）５ｋｂｐごとの等間隔にＳＮＰｓを設定(この間隔にＳＮＰｓマーカーを設置することで、疾患感受性遺伝子領域を見落とす可能性が少ない)。
２）日本人でＭＡＦが１５％以上を示す。
３）ハーディーワインバーグ平衡(Ｐ＞０．０５) を満たす。
４）複数の人種で共通に認められるマーカーである。【００５４】
遺伝子領域で１０ｋｂｐ間隔で設定したマーカーセット(１０ｋｂ)４９７ＳＮＰｓ、１０ｋｂの間隔が５ｋｂｐになるように設置したマーカーセット(５ｋｂ)４３４ＳＮＰｓ、遺伝子間領域のマーカー(Intergenic／ＩＧ)４２５ＳＮＰｓの、計１３５６個のＳＮＰマーカーを用いた。【００５５】
３．ＴａｑＭａｎプローブを用いたＳＮＰｓタイピング法
まず、ＳＮＰ部位を挟むＰＣＲ増幅領域内の数十ｂｐのＤＮＡ塩基配列に対して、相補的に結合するＴａｑＭａｎプローブを設計した。ＴａｑＭａｎプローブは５'末端にレポーター色素が、３'末端にクエンチャー色素がそれぞれ結合している。ＴａｑＭａｎプローブは、通常は蛍光を発しないが、ＰＣＲ反応によりＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応に伴ってＴａｑＭａｎプローブが分解され、レポーター蛍光が検出可能となる。【００５６】
今回のＳＮＰｓタイピングでは、ゲノム上のＳＮＰ部位に対して２種類の異なる蛍光色素で標識したプローブを使用した。具体的には、ＤＮＡ塩基配列上に存在するＳＮＰ部位にＡ／ＧアレルのＳＮＰをもつ場合、Ａアレルを認識するプローブ蛍光色素としてＦＡＭ、Ｇアレルを認識するプローブ蛍光色素としてＶＩＣで標識した２種類のプローブを作製する。これらをゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせＰＣＲ反応を行う。アレルがＡ／Ａホモの場合はＦＡＭ、Ｇ／Ｇホモの場合はＶＩＣ、Ａ／Ｇへテロの場合はＦＡＭとＶＩＣ両方の蛍光がそれぞれに増幅され検出される。【００５７】
一度に大量サンプルを処理するために、３８４ｗｅｌｌを使用した。３８４ｗｅｌｌの１ｗｅｌｌ内に、ＤＮＡ鋳型５ｎｇ、ＴａｑＭａｎ(Ｒ) ＳＮＰ Genotyping Assays (２０ｘプローブ、プライマーを含む) ０．１２５μｌ、ＴａｑＭａｎ(R) Universal PCR Master Mix ２．５μｌを５μｌの系で分注後、９５℃１０分、９２℃１５秒・６０℃６０秒を４０〜４５サイクルのプログラムでＰＣＲ反応を行なった後に蛍光を測定した。測定にはABI PRISM(R) 7900HT Sequence Detection Systems (ＡＢＩ社)を用いた。反応の正確性を確認するために、３８４ｗｅｌｌ中４位置にNegative Controlを設置した。タイピングデータはSequence Detection Systems 2.1 (ＳＤＳ２．１) ソフトウェア (ＡＢＩ社) により解析した。なお、各ＳＮＰｓのタイピングにおけるＰＣＲプライマーやＴａｑＭａｎプローブは、実施例１と同様にＡｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標；アプライドバイオシステムズ製）の市販品や特注品を用いた。【００５８】
４．関連解析（第１ステージ）
選定された１３５６個のＳＮＰｓを対象に、日本人非血縁健常対照者由来の検体３６０例及び日本人非血縁２型糖尿病患者由来の検体３７２例を対象に関連解析（第１ステージ：遺伝子頻度でのχ２検定）を行なった（表１１）。健常対照者と２型糖尿病患者との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差が認められたのは、有意水準α＝０．１で１７４ＳＮＰｓ（全体の１３．０％）であった。これらのＳＮＰｓを含め、Ｐ値が０．１０未満を示した１７４ＳＮＰｓ（全体の１３．０％）について次の関連解析（第２ステージ）の対象候補ＳＮＰｓとした。【００５９】
【表１１】
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【００６０】
５．関連解析（第２ステージ）
実施例１と同様に、対象候補ＳＮＰｓとした１７４ＳＮＰｓについて、関連解析（第１ステージ）で用いた検体と別に用意した日本人非血縁健常対照者由来の試料５３０例及び日本人非血縁２型糖尿病患者由来の試料５３２例を対象に関連解析（第２ステージ）を行なった（表１２）。１７４ＳＮＰｓのうち、有意水準α＝０．０５及びで８個のＳＮＰｓについてヒト２型糖尿病との関連が検出され、全体の０．６％であった（図２）。また、第１ステージのＰ値が０．１０未満、第２ステージのＰ値が０．０５未満、第１及び第２ステージのCombinedステージにおいて、Ｐ値が０．０５未満の全てをクリアしたＳＮＰｓは、６ＳＮＰｓ（ＳＮＰ２１３１、ＳＮＰ２１４０、ＳＮＰ１１６４、ＳＮＰ１１６５、ＳＮＰ２１４１、ＳＮＰ１１６７）であった（表１３）。また、これら６ＳＮＰｓは、ハーディ−ワインベルグ平衡状態を満たし、ヒト２型糖尿病との関連が確かめられた。【００６１】
【表１２】
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【００６２】
【表１３】
2007032496.tif 000052
【００６３】
上記６ＳＮＰのうち、全てのＰ値が０．０５未満である有意ＳＮＰに該当したのはＳＮＰ２１４０のみであった。即ち、ＳＮＰ２１４０は第１ステージ:Ｐ＝０．０４９８、第２ステージ:Ｐ＝０．０３８６、Combinedステージ:Ｐ＝０．００４３、オッズ比:Ｐ＝１．２５、９５％信頼区間:ＣＩ＝１．０７−１．４６を示した。また、有意ＳＮＰであるＳＮＰ２１４０、および近傍の第１ステージ(Ｐ＜０．１)、２ｎｄ Ｓｔａｇｅ(Ｐ＜０．０５)、およびCombined ステージ(Ｐ＜０．０５)の有意水準を全てクリアしたＳＮＰであって、かつ最も有意差を示したＳＮＰ２１４０と同一の連鎖不平衡ブロック内に存在する４ＳＮＰｓの、計５ＳＮＰｓを疾患感受性候補ＳＮＰｓと特定した。【００６４】
上記χ２解析は、富士通株式会社との共同研究により開発した疾患感受性遺伝子同定システムＦＧＤＳ(Fujitsu Gene Discovery System)、およびデータの信憑性を検討するソフトＱＣＳ(Quality Control System) を用いた。データの信憑性は、１）タイピングデータの視覚的チェックによる妥当性、２）第１ステージおよび第２ステージのアレル頻度差の一致性確認、３）ハーディーワインバーグ平衡が基準を満たしているか否かの確認、４）３８４ｗｅｌｌのタイピングデータ中解析できなかったサンプル数の確認 (２％以上は再解析)を、常に二人の研究者で判定した。信憑性の低いデータは再解析・再タイピングを行った。【００６５】
６．有意ＳＮＰ周辺の連鎖不平衡解析およびハプロタイプ解析
関連解析（第１ステージ）の解析サンプルのタイピング結果を基に、疾患感受性候補領域における連鎖不平衡ブロックの解析を行った。
先ず、有意ＳＮＰ周辺（ＳＮＰ２１４０）について、ＦＧＤＳソフトウェアを用いて連鎖不平衡解析を行い、連鎖不平衡ブロックを推定した。連鎖不平衡ブロックはＥＭアルゴリズムにより算定され、遺伝子多型結果から、２ＳＮＰｓ間の連鎖不平衡の指標|Ｄ'|を全ＳＮＰｓに対して算出し、ブロックを決定した。有意ＳＮＰを含むブロックの境界を正確に判定するため、さらにＳＮＰを追加し解析を行った。追加ＳＮＰの選択は、HapMapDatabase (http://www.hapmap.org/thehapmap.html.)に登録された、日本人でのＭＡＦ（Minor Allele Frequency：マイナーアレル頻度)が１０％以上を示すＳＮＰプローブで、且つ、Ａｓｓａｙ-Ｏｎ-Ｄｅｍａｎｄ(ＡＢＩ社)で入手可能なプローブを選択した。追加７ＳＮＰｓを含む有意ＳＮＰ周辺に対して、SNP Alyze version 5.0 (ＤＹＮＡＣＯＭ社)とHaploview version 3.2(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/index.php) を用いた連鎖不平衡解析により|Ｄ'|値を算出し連鎖不平衡地図を作成した。さらに、LDMAP version 1.0 (http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/helpld.html) を用いて組み換え値を算出した。以上の２方法により、連鎖不平衡ブロックを特定した。連鎖不平衡ブロックに関して、SNP Alyze version 5.0を用いてハプロタイプ頻度を用いた関連解析 (permutation検定) を行った。【００６６】
当初設計したＳＮＰｓを用いる解析で、疾患感受性候補ＳＮＰｓを含む領域の第１次連鎖不平衡解析より、２５ＳＮＰｓからなる全長２６４ｋｂの連鎖不平衡ブロックを特定した。さらに、連鎖不平衡ブロックの両端の境界領域部を詳細に決定するため、セントロメア側境界部分に５ＳＮＰｓ(セントロメア側よりｒｓ１６９５７１６８、ｒｓ１０４６７９７５、ｒｓ１１０７０３８０、ｒｓ１０５１８７７９、およびｒｓ６４９３０６８)、テロメア側境界部分に２ＳＮＰｓ(テロメア側よりｒｓ１１０７０３９２、およびｒｓ７１６６４６７) を追加し、タイピングを行った。当初設計したＳＮＰｓにこれら７ＳＮＰｓを追加した第２次連鎖不平衡解析 (|Ｄ'|＞０．９、ＬＤＵ)の結果、３８ＳＮＰｓから成る３５５ｋｂｐのブロックを特定した(図３)。この巨大ブロックには６遺伝子が認められ、５個の疾患感受性候補ＳＮＰｓは全て１遺伝子上に存在することを確認した。r-square値による連鎖不平衡解析 (r-square＞０．９) では、疾患感受性候補５ＳＮＰｓ全てを含む４０．６ｋｂｐの連鎖不平衡ブロックが認められた(SNP Alyze version 5.0)。【００６７】
r-square値より得られた連鎖不平衡ブロック内疾患感受性候補５ＳＮＰｓ(ＳＮＰ２１４０−ＳＮＰ１１６４−ＳＮＰ１１６５−ＳＮＰ２１４１−ＳＮＰ１１６７)で構成されるハプロタイプに関してpermutation検定を行った。Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−ＧとＴ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔの２ハプロタイプがすべてのハプロタイプを説明することを確認した(表１４)。ハプロタイプ頻度はＣ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ；Case/Control=７９．９％／７５．９％ (disease at risk Haplotype)、Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ；Case/Control=２０．１％／２４．１％( disease protective Haplotype)、permutation検定P値は両ハプロタイプともＰ＝０．００３９で有意な値を示した。データは疾患感受性候補５ＳＮＰＳのCombined ステージ (Case/Control=９０４／８９０サンプル) の結果を用いた。【００６８】
【表１４】
2007032496.tif 000053
1: disease at risk Haplotype、2: disease protective Haplotype【００６９】
７．ＵＢＲ１遺伝子の発現解析
糖尿病モデルマウス野生型マウス、およびヒト臓器でＵＢＲ１遺伝子の発現を比較した。
１）Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
２型糖尿病モデルマウス (db；BKS.Cg-+ Leprdb /+Leprdb/Jcl)の８種類の臓器 (腎臓・脂肪・筋肉・肺・脳・心臓・膵臓) からRNeasy Mini Kit (QIAGEN社) を用いてtotal ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ ０．１μｇを鋳型として、SuperScriptTMIII First Strand Synthesis System (Invitrogen社) を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。１２種類のヒト臓器（脳・肝臓・心臓・腎臓・肺・筋肉・脾臓・胸腺・骨髄・胎盤・小腸・膵臓)から抽出したtotal RNA Panel、Human total RNA Master Panel II (BD Biosciences社) を用い、ＲＮＡ１μｇを鋳型として、同様にｃＤＮＡを合成した。【００７０】
２）Ｐｒｉｍｅｒ
マウスおよびヒトＵＢＲ１遺伝子、マウスおよびヒトβ-actin遺伝子のプライマーを作製した(表１５)。プライマーの設計はABI PRISM(R) Primer Express 2.0ソフトウェア(ABI社)を用い、ゲノムＤＮＡによる増幅バンドと区別するために、プライマーは複数のIntronを挟んだExon上に設計した。【００７１】
【表１５】
2007032496.tif 000054
【００７２】
３）リアルタイムＰＣＲ法
１／２０に希釈したｃＤＮＡ１μｌを鋳型ＤＮＡとし、AmpliTaq Goldを含む2x SYBR(R) Green PCR Master Mix (ＡＢＩ社）、５ｎＭ／each Primerの５μｌの反応系でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分熱変性後、９５℃で１５秒・６０℃１分のサイクルを４０サイクルのプログラムで増幅した。リアルタイム定量ＰＣＲ解析装置はABI PRISM(R) 7900HT Sequence Detection Systems 384タイプ(ＡＢＩ社) 、およびＳＤＳ２．１ソフトウェア(ＡＢＩ社) を使用した。ＰＣＲ産物は、対数増殖期の値から、目的とするｍＲＮＡ量を求めた。ＵＢＲ１遺伝子、β-actin遺伝子について、既知濃度の検量線から換算したサンプルのQuantity値から各臓器の相対発現量を算出し、β-actin遺伝子を内部標準遺伝子として、ＵＢＲ１遺伝子の発現量を補正し、各臓器の相対発現量を比較検討した。【００７３】
４）結果
マウスおよびヒト各種臓器におけるＵＢＲ１遺伝子の発現量の比較をそれぞれ図４に示す。ＵＢＲ１遺伝子はマウス・ヒトともに、筋肉、心臓、膵臓で高発現が認められたが、糖尿病マウスと野生型マウス間で、発現量に差は認められなかった。【００７４】
８．考察
本研究で検出された疾患感受性候補５ＳＮＰｓは、Ｐ値が第１ステージ(Ｐ＜０．１)、第２ステージ(Ｐ＜０．０５)、およびCombinedステージ(Ｐ＜０．０５)の有意水準を全てクリアし、且つ、第１ステージ＜第２ステージ＜Combinedステージと再現性を示しており、疾患感受性との関連が示唆された。また、疾患感受性候補ＳＮＰｓ周辺の連鎖不平衡ブロックは、Gabriel’s Method、LD Unitの結果より特定した(図３)。CaseとControlを合わせて特定した連鎖不平衡ブロックは、Caseのみの結果、およびControlのみの結果でもほぼ一致したブロックを示し、サンプル集団に関わらず強い連鎖不平衡状態にあることが確認された。r-square値による連鎖不平衡解析では疾患感受性候補ＳＮＰｓ全ておよび１ＳＮＰ(ＳＮＰ１１６６／ｒｓ３７３６０５４) を含むr-square＞０．９の強い連鎖不平衡ブロックが認められ、５ＳＮＰｓは２ハプロタイプを示した。これらの結果より、疾患感受性候補ＳＮＰｓは２型糖尿病と強い関連を示すと考えられる。
【実施例３】
【００７５】
［第３番染色体短腕領域］
１．検体
上記実施例と同様に検体を調整し、２段階の関連解析を実施した。具体的には、２型糖尿病患者(Case)３０４人／健常者 (Control)サンプル３６１人での解析(第１ステージ)、さらに、Case５６０人／Control５３７人での解析(第２ステージ)、計Case８６４人／Control８９８人についてスクリーニングを行なった。検体提供者の臨床的特徴等を表１６に示す。
ＳＮＰｓマーカーは実施例２と同様の基準により定められた５０８種類を選択した。また、ＴａｑＭａｎプローブを用いたＳＮＰｓタイピング法についても実施例２と同様の手法を使用した。【００７６】
【表１６】
2007032496.tif 000055
【００７７】
２．関連解析（第１ステージ）
選定された５０８個のＳＮＰｓを対象に、日本人非血縁健常対照者由来の検体３６１例及び日本人非血縁２型糖尿病患者由来の検体３０４例を対象に関連解析（第１ステージ：遺伝子頻度でのχ２検定）を行なった（表１７）。健常対照者と２型糖尿病患者との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差が認められたのは、有意水準α＝０．０５で２３ＳＮＰｓ（全体の４．５％）であった。これらを次の関連解析（第２ステージ）の対象候補ＳＮＰｓとした。【００７８】
【表１７】
2007032496.tif 000056
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【００７９】
３．関連解析（第２ステージ）
対象候補ＳＮＰｓとした２３ＳＮＰｓについて、関連解析（第１ステージ）で用いた検体と別に用意した日本人非血縁健常対照者由来の試料５３７例及び日本人非血縁２型糖尿病患者由来の試料５６０例を対象に関連解析（第２ステージ）を行なった。選択された上記２３ＳＮＰｓのうち、第２ステージの検体を用いた関連解析では、有意水準α＝０．０５で２個のＳＮＰｓについてヒト２型糖尿病との関連が検出された（全体の０．４％）。また、第１ステージのＰ値が０．１０未満、第２ステージのＰ値が０．０５未満、第１及び第２ステージのCombinedステージにおいて、Ｐ値が０．０５未満の全てをクリアしたＳＮＰｓは、２ＳＮＰｓ（ＳＮＰ３７５、ＳＮＰ１５８）であった（表１８）。【００８０】
【表１８】
2007032496.tif 000074
【００８１】
上記２ＳＮＰのうち、第１ステージ:Ｐ＝０．０００７３７、第２ステージ:Ｐ＝０．０１４、Combinedステージ:Ｐ＝０．００００４６、オッズ比:Ｐ＝１．３３、９５％信頼区間: ＣＩ＝１．１６−１．５３を示し、Bonferroniの多重検定をクリアするＳＮＰ３７５を疾患感受性候補ＳＮＰと特定した（図５）。
また、上記χ２解析及びデータの信憑性は、上記実施例２と同様に行った。  【００８２】
４．有意ＳＮＰ周辺の連鎖不平衡解析
１次解析で、疾患感受性候補ＳＮＰ３７５を含む領域の連鎖不平衡解析より、１３ＳＮＰｓからなる全長７１．８ｋｂの連鎖不平衡ブロック(ＳＮＰ３６７−ＳＮＰ３７９)を特定した。【００８３】
次に、連鎖不平衡ブロックの両端の境界領域部を詳細に決定するためＳＮＰ３６７よりテロメア側境界部分に４ＳＮＰｓ(テロメア側よりＡＯＤ１／ｒｓ１９６３７７、ＡＯＤ２／ｒｓ２０７０４８８、ＡＯＤ３／ｒｓ７３７３９３０、ＡＯＤ４／ｒｓ７３７３９１６)、セントロメア側境界部分に５ＳＮＰｓ(テロメア側よりＡＯＤ５／ｒｓ６８１０３６１、ＨＡＰ４／ｒｓ１２０５３９０３、ＨＡＰ５／ｒｓ６７９３２４５、ＡＯＤ６／ｒｓ６７９９８６８、ＡＯＤ７／ｒｓ９８７３２１３) を追加し、タイピングを行った。追加９ＳＮＰｓを含む有意ＳＮＰ周辺に対して、SNP Alyze version 5.0 (ＤＹＮＡＣＯＭ社)とHaploview version 3.2 (http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/index.php) を用いた連鎖不平衡解析により|Ｄ'|値を算出し連鎖不平衡地図を作成した。さらに、LDMAP version 1.0 (http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/helpld.html) を用いて組み換え値を算出した。以上の２方法により、連鎖不平衡ブロックを特定した。
これら９ＳＮＰｓを追加した２次連鎖不平衡解析 (|Ｄ'|＞０．９、ＬＤＵ解析)の結果、連鎖不平衡ブロックは、１５ＳＮＰｓから成る１２１．６ｋｂｐのブロックを特定した（図６）。【００８４】
これらの領域の内、ＳＮＰ３７４からＳＮＰＡＯＤ５間は、連鎖不平衡計数|Ｄ'|＝１を示す強固な連鎖不平衡ブロックを示した。そこで、ＳＮＰ３７４からＳＮＰＡＯＤ５迄の２６．９ ｋｂｐにわたる連鎖不平衡ブロック内の網羅的シークエンスを行い、抽出した複数のＳＮＰｓを加えた関連解析により、新たに６つの有意ＳＮＰｓを見出した（表１９）。本ＳＮＰｓを含む強い連鎖不平衡値(|Ｄ’|＝０．９５)を示す１２１．６ｋｂｐブロックを特定した。連鎖不平衡ブロックには３遺伝子が認められた（図６）。【００８５】
【表１９】
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【００８６】
５．ハプロタイプ解析
連鎖不平衡ブロックに関して、SNP Alyze version 5.0を用いてハプロタイプ頻度を用いた関連解析(permutation検定)を行った。疾患感受性候補ＳＮＰｓ全てを含む１２１．６ｂｐの連鎖不平衡ブロック内の６種類のＴａｇＳＮＰｓ(ＥＮＧＬ２,ＳＮＰ３７０,ＥＮＧＬ４,ＥＮＧＬ１２,ＥＮＧＬ１８,ＥＮＧＬ２４)を用いたpermutation検定の結果、disease at risk Haplotype G-G-C-G-T-T（permutation検定Ｐ値＝０．０００１３）およびdisease protectived HaplotypeG-G-C-A-A-C（permutation検定Ｐ値＝０．０００３）であった。【００８７】
６．Ｅｎｄｏｇｌ１遺伝子の発現解析
１）Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
２型糖尿病モデルマウス(ｄｂ；BKS.Cg-+ Leprdb /+Leprdb/Jcl)の８種類の臓器 (腎臓・脂肪・筋肉・肺・脳・心臓・膵臓) からRNeasy Mini Kit (QIAGEN社) を用いてtotal ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ０．１μｇを鋳型として、SuperScriptTMIII First Strand Synthesis System (Invitrogen社)を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。また、１２種類のヒト臓器（脳・肝臓・心臓・腎臓・肺・筋肉・脾臓・胸腺・骨髄・胎盤・小腸・膵臓)から抽出したtotal RNA Panel、Human total RNA Master Panel II (BD Biosciences社)を用い、ＲＮＡ１μｇを鋳型として、同様にｃＤＮＡを合成した。ｄｂマウス／野生型マウス、およびヒト臓器でＥｎｄｏｇｌ１遺伝子の発現量を比較検討した。さらに、マウス繊維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウス筋芽細胞（Ｃ３Ｃ１２）および膵β細胞株（ＭＩＮ６）のＲＮＡ１μｇを鋳型として、同様にｃＤＮＡを合成した。【００８８】
２）Ｐｒｉｍｅｒ
マウスおよびヒトＥｎｄｏｇｌ１遺伝子、マウスおよびヒトβ-actin遺伝子のプライマーを作製した。プライマーの設計はABI PRISM(R) Primer Express 2.0ソフトウェア (ＡＢＩ社) を用い、ゲノムＤＮＡによる増幅バンドと区別するために、プライマーは複数のIntronを挟んだExon上に設計した（表２０）。
【表２０】
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【００８９】
３）リアルタイムＰＣＲ法
リアルタイムＰＣＲは実施例２と同様の手法により行った。Ｅｎｄｏｇｌ１遺伝子、β-actin遺伝子について、既知濃度の検量線から換算したサンプルのQuantity値から各臓器の相対発現量を算出し、β-actin遺伝子を内部標準遺伝子として、Ｅｎｄｏｇｌ１遺伝子の発現量を補正し、各臓器の相対発現量を比較検討した。【００９０】
４）結果
糖尿病モデルマウス(ｄｂマウス)の膵島、脳、筋肉組織（図７Ｂ）、膵β細胞株（図７Ｃ）で、野生型マウスと比べ有意にＥｎｄｏｇｌ１遺伝子の発現量の変動が認められた。また、ヒト臓器でも脳での高発現が認められた（図７Ａ）。さらに、繊維芽細胞と比較して膵β細胞株での有意な発現の増加が認められた（図７Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、２型糖尿病感受性遺伝子が存在すると考えられる、第２０番染色体長腕の１７Ｍｂ領域における２個の２型糖尿病感受性ＳＮＰｓマーカー、第１５番染色体長腕の１８．６Ｍｂｐ領域の中の５個の２型糖尿病感受性ＳＮＰｓマーカー、第３番染色体短腕の２０．４Ｍｂｐ領域中の７個の２型糖尿病感受性ＳＮＰｓマーカーは、２型糖尿病の発症リスクを判定する上で有用であり、２型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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