【手続補正書】
【提出日】平成19年5月21日(2007.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
しば漬けから分離した、免疫調節作用を有するラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）に属する乳酸菌。
【請求項２】
上記ラクトバチルス・ペントーサスに属する乳酸菌は、グリセロールの資化性が無いまたは弱いことを特徴とする請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
上記ラクトバチルス・ペントーサスに属する乳酸菌は、細胞外多糖産生株であることを特徴とする請求項２に記載の乳酸菌。
【請求項４】
上記ラクトバチルス・ペントーサスに属する乳酸菌は、ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１００２８）である請求項３に記載の乳酸菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
乳酸菌は整腸作用や免疫賦活作用といった有益な生理活性を有することが知られている。このような有益な生理活性を有する乳酸菌の多くは動物性の発酵乳製品や腸管から分離された乳酸菌であるが、植物性乳酸菌においても免疫賦活作用を有する株が見出されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明に係る乳酸菌は、ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株であることが好ましい。本ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株は、本発明者らがしば漬けから分離し、高い免疫調節作用を有することを見出した株である。本菌は、ＤＳ８４Ｃ株とも称される。本菌は独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されており（Lactobacillus pentosus SAM 2336）、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８であり、受領番号はＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１００２８である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明に係る乳酸菌は、細胞外多糖（Extracelluler Polysaccharide：以下「ＥＰＳ」と略記する。）産生株であることが好ましい。ＥＰＳは、菌の属、種、株によって様々な性質や化学構造をしているが、本乳酸菌のＥＰＳは、菌体表面に留まる莢膜多糖であり、墨汁染色により容易に確認できる。ＥＰＳ産生株は非産生株と比較すると親水性が高いため、食品に応用しやすいという利点を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明に係る乳酸菌の代表的なものとして、ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株を挙げることができる。本菌は独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８であり、受領番号はＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１００２８である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
〔使用乳酸菌株〕
京都の伝統的な漬物であるしば漬けから、Lactobacillus plantarum を４種、Lactobacillus pentosus を１２種分離し、Ｔｈ１型免疫賦活能の高い菌株を選択するためインターロイキン１２（ＩＬ−１２）誘導能を比較する実験に供した。使用菌株については、表２に株名、種名およびＥＰＳの有無を示した。ＩＬ−１２誘導能を比較した結果、ＤＳ８４Ｃ株（Ｓ−ＰＴ８４）に特に強い活性を見出したため、以後の実験はＳ−ＰＴ８４のみを用いて行った。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
〔Ｓ−ＰＴ８４がリンパ球に及ぼす影響〕
BALB/cマウス（７週齢・雄）から脾臓を摘出し、常法に従い脾細胞を調製した。上記Ｓ−ＰＴ８４の加熱死菌（1μｇ/mL）を含む培地で２４時間培養した。対照として、培地に何も添加せずに培養したもの（ｃｏｎｔｒｏｌ）と、コンカナバリンＡ（2.5μｇ/mL）を添加して培養したもの（ＣｏｎＡ）とを設けた。Ｓ−ＰＴ８４死菌の刺激により、どのようなサイトカインが産生されるかを調べるため、各培養上清中のサイトカイン濃度をCBAkit（BD Pharmingen社製）を用いて測定した。また、脾細胞を回収し、蛍光ラベルされた抗CD4抗体（CY-CHCROMETMラベル、BD bioscience社製)、抗CD8抗体（FITCラベル、Immunotech社製）、抗CD69抗体（PEラベル、BD bioscience社製）を用いて細胞を標識し、CD4、CD8およびCD69陽性細胞の割合をフローサイトメトリー（Beckman Coulter社製）を用いて測定した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
サイトカイン産生の結果を図４に示した。図４（ａ）は培地に何も添加していないもの（ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示し、図４（ｂ）はＳ−ＰＴ８４の死菌を培地に添加したもの（Ｓ−ＰＴ８４）の結果を示し、図４（ｃ）はコンカナバリンＡを培地に添加したもの（ＣｏｎＡ）の結果を示している。図４から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４の刺激により、ｃｏｎｔｒｏｌでは産生が認められないＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）およびＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）の産生が認められた。これらのサイトカインはＴｈ１型サイトカインであり、Ｓ−ＰＴ８４はＴｈ１型サイトカインを特異的に誘導するものと考えられた。一方、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４やＩＬ−５は全く産生されなかった。なお、コンカナバリンＡで刺激した場合は、別のＴｈ１型サイトカインのＩＬ−２（インターロイキン２）の産生が認められた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ６９＋細胞に及ぼす影響の結果を図５に示した。図５（ａ）は培地に何も添加していないもの（ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示し、図５（ｂ）はＳ−ＰＴ８４の死菌（１μｇ／ｍＬ）を培地に添加したもの（Ｓ−ＰＴ８４）の結果を示し、図５（ｃ）はコンカナバリンＡを培地に添加したもの（ＣｏｎＡ）の結果を示している。また、図５中、矢印は上または右に行くほど各表面抗原の陽性細胞が多いことを表す。図５から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４によりヘルパーＴ細胞やキラーＴ細胞が活性化することが分かった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
〔Ｓ−ＰＴ８４の経口摂取によるＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節作用〕
BALB/cマウス（７週齢・雄）６匹に、Ｓ−ＰＴ８４（死菌体）を１週間飲水（２mg/day
相当）にて自由に摂取させた。また、Ｓ−ＰＴ８４を摂取させない対照群（６匹）を設けた。１週間後に心臓より採血し、さらに脾臓を摘出した。血液から遠心分離により血清を採取し、血清中のＩＬ−１２濃度をOptEIA mouse IL-12測定キット（BD Biosciences社製）を用いて測定した。また、摘出した脾臓から常法に従い脾細胞を調製し、脾リンパ球のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ３＋細胞数の計測（それぞれの標識抗体を用いてフローサイトメトリーにより計測した）、ＰＩＮＫ法によるＮＫ活性の測定、およびＴｈ１／Ｔｈ２の比を測定した（マウス脾細胞５×１０６個にコンカナバリンＡ２．５μｇ／ｍＬを２４時間作用させ、上清中に産生されるＩＬ−４およびＩＦＮ−γ濃度を測定した。Ｔｈ１／Ｔｈ２比はＩＦＮ−γ濃度をＩＬ−４濃度で除した値を用いた。）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
〔シクロフォスファミド投与マウスにおけるＩＬ−１２産生に及ぼす影響〕
BALB/c マウス（７週齢・雄）を５群に分けた。群構成は、無処置群（５匹）、Ｓ−ＰＴ８４非摂取・ＣＹ非投与群（１０匹）、Ｓ−ＰＴ８４非摂取・ＣＹ投与群（１０匹）、Ｓ−ＰＴ８４摂取・ＣＹ非投与群（１０匹）およびＳ−ＰＴ８４摂取・ＣＹ投与群（１１匹）とした。Ｓ−ＰＴ８４摂取の２群にはＳ−ＰＴ８４（死菌体）を１２日間飲水（２mg/day 相当）にて自由に摂取させた。摂取開始７日目に、ＣＹ投与群のマウスに制癌化学療法剤でアルキル化剤のシクロフォスファミド（Cyclophosphamide：ＣＹ）を200mg/kgの用量で腹腔内投与した。ＣＹ投与後５日目に、無処置群を除く４群のマウスにＳ−ＰＴ８４の加熱死菌（500μｇ/0.2mL/mouse）の懸濁液（溶媒：生理的食塩水）を腹腔内投与した。Ｓ−ＰＴ８４の死菌投与後６時間目に無処置群を含む全個体の心臓から採血した。採血後、遠心分離により血清を採取し、血清中のＩＬ−１２濃度をOptEIA mouse IL-12測定キット（BD Pharmingen社製）を用いて測定した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
〔抗アレルギー作用の検討〕
BALB/cマウス（７週齢・雄）３６匹を４群に分けた。群構成は、無処置群（５匹）、対照群（１０匹）、Ｓ−ＰＴ８４群（１１匹）、Ｄｅｘ投与群（１０匹）とし、Ｓ−ＰＴ８４群にはＳ−ＰＴ８４（死菌体）を７週間飲水（２mg/day 相当）にて自由に摂取させ、Ｄｅｘ投与群には、0.5mg/kgの用量で７週間強制経口投与を行った。無処置群および対照群には水道水を７週間自由に摂取させた。なお、Ｄｅｘは抗炎症、抗アレルギー作用を有するステロイド剤であり、陽性対照薬として用いた。Ｓ−ＰＴ８４摂取またはＤｅｘ投与開始から１週間後および２週間後に、20μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）と2ｍｇの水酸化アルミニウムゲルを混和して、無処置群を除く３群のマウスに腹腔内投与した。２回目の投与日（０週目）から１週間ごとに５週目まで全個体について合計６回の採血を行い、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度を測定した。ＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度の測定はOptEIA mouse IgE測定キット（BD Pharmingen社製）を改良し、補足用抗体の代わりにＯＶＡをコーティングしたELISA法にて測定した。また、３週目の血液サンプルを用いて、総ＩｇＥを測定した。総ＩｇＥの測定には、OptEIA mouse IgE測定キット（BD Pharmingen社製）を用いELISA法にて測定した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
【図１】１６種類の乳酸菌のin vitro 刺激によるマクロファージＩＬ−１２誘導実験の結果を示すグラフである。
【図２】Ｓ−ＰＴ８４を腹腔内投与した後の血清ＩＬ−１２濃度の推移を示すグラフである。
【図３】１６種類の乳酸菌をマウスに腹腔内投与した後の血清ＩＬ−１２濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図４】Ｓ−ＰＴ８４の刺激によりリンパ球が産生するサイトカインを調べた結果を示す、フローサイトメーターのチャートであり、（ａ）は培地に何も添加していないもの、（ｂ）はＳ−ＰＴ８４の死菌を培地に添加したもの、（ｃ）はコンカナバリンＡを培地に添加したものの結果を示すチャートである。
【図５】Ｓ−ＰＴ８４の刺激によりＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ６９＋細胞に及ぼす影響を調べた結果を示す、フローサイトメーターのチャートである。（ａ）は培地に何も添加していないもの、（ｂ）はＳ−ＰＴ８４の死菌を培地に添加したもの、（ｃ）はコンカナバリンＡを培地に添加したものの結果を示すチャートである。
【図６】Ｓ−ＰＴ８４腹腔内投与後の肝リンパ球のＮＫ活性を測定した結果を示すグラフである。
【図７】Ｓ−ＰＴ８４の腹腔内投与により肝リンパ球のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ６９＋細胞に及ぼす影響を調べた結果を示す、フローサイトメーターのチャートである。（ａ）は対照の結果を示すチャートであり、（ｂ）はＳ−ＰＴ８４を投与した場合の結果を示すチャートである。
【図８】Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスの血清ＩＬ−１２濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図９】Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスの脾細胞におけるＮＫ活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスの脾細胞におけるＴｈ１／Ｔｈ２の比を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるシクロフォスファミド投与後の体重変化を示すグラフである。
【図１２】Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるシクロフォスファミド投与後の血清ＩＬ−１２濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図１３】Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるＯＶＡ投与後のＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度の変化を示すグラフである。
【図１４】Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるＯＶＡ投与３週後の総ＩｇＥ濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図１５】Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるストレス負荷時の免疫低下抑制効果を示すグラフである。