【手続補正書】
【提出日】令和1年5月21日(2019.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞の生成につながる骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程、ならびに
（b）CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を、（i）IL-34を含む第1のミクログリア分化培地、または（ii）M-CSFを含む第2のミクログリア分化培地のいずれかにおいて、培養する工程
を含み、それによってヒトミクログリア細胞を生成する、ミクログリア細胞を生成するための方法。
【請求項２】
工程（b）においてCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を培養する前に、工程（a）において産生されたCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を単離する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程（a）が、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化を誘導することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
骨髄系前駆細胞のCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
工程（a）が、細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることを含み、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せを含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せを含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せを含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
工程（a）が、
a）細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることであって、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、接触させること、
b）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、およびVEGF-Aを含む第2の組成物と接触させること、
c）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、およびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させること、ならびに
d）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させること
を逐次的に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
第1のミクログリア分化培地がGM-CSFをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-β、CCL2およびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-βおよびCCL2をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞が、第1または第2のミクログリア分化培地においておよそ15日間にわたって培養される、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト多能性幹細胞が、骨髄系分化を誘導する条件下でおよそ25〜50日間培養される、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
細胞培養物を、およそ4日間、第1の組成物と接触させることを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項２０】
細胞培養物を、およそ2日間、第2の組成物と接触させることを含む、請求項7または請求項8に記載の方法。
【請求項２１】
細胞培養物を、およそ8日間、第3の組成物と接触させることを含む、請求項9または請求項10に記載の方法。
【請求項２２】
細胞培養物を、およそ11〜36日間、第4の組成物と接触させることを含む、請求項11または請求項12に記載の方法。
【請求項２３】
多能性幹細胞の分化に適した培地が多能性因子を含まない、請求項6に記載の方法。
【請求項２４】
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まない、請求項6に記載の方法。
【請求項２５】
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まないmTeSR1培地である、請求項6に記載の方法。
【請求項２６】
前記造血細胞培地がStemPro-34である、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を単離する工程が、細胞を抗CD14＋抗体および/またはCX3CR1＋抗体と接触させることを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項２８】
抗体が結合した細胞を、抗体が結合していない細胞から分離することを含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
蛍光活性化細胞選別（FACS）を行うことを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
細胞を、抗体に直接的または間接的に結合する磁気ビーズと接触させること、および磁石を使って、抗体が結合した細胞を抗体が結合していない細胞から分離することを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
培地を交換するときに培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３２】
工程（a）中に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３３】
工程（a）の約10日目より後に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３４】
細胞が第3の組成物または第4の組成物と接触しているときに行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項３５】
多能性幹細胞が誘導多能性幹（iPS）細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項３６】
多能性幹細胞が胚性幹（ES）細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項３７】
（a）骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程、
（b）工程（a）において生成したCD14＋および/またはCX3CR1＋細胞を単離する工程
を含み、該CD14＋および/またはCX3CR1＋細胞がミクログリア前駆細胞である、ミクログリア前駆細胞を生成するための方法。
【請求項３８】
工程（a）が、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化を誘導することを含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
骨髄系前駆細胞のCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
工程（a）が、細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることを含み、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、請求項37に記載の方法。
【請求項４２】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せを含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSFおよびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４６】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４７】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４８】
工程（a）が、
a）細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることであって、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、接触させること、
b）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、およびVEGF-Aを含む第2の組成物と接触させること、
c）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、およびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させること、ならびに
d）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させること
を逐次的に含む、請求項37に記載の方法。
【請求項４９】
ヒト多能性幹細胞が、骨髄系分化を誘導する条件下でおよそ25〜50日間培養される、請求項37に記載の方法。
【請求項５０】
細胞培養物を、およそ4日間、第1の組成物と接触させることを含む、請求項41または請求項47に記載の方法。
【請求項５１】
細胞培養物を、およそ2日間、第2の組成物と接触させることを含む、請求項43または請求項48に記載の方法。
【請求項５２】
細胞培養物を、およそ8日間、第3の組成物と接触させることを含む、請求項44、請求項45、または請求項48に記載の方法。
【請求項５３】
細胞培養物を、およそ11〜36日間、第4の組成物と接触させることを含む、請求項46、請求項47、または請求項48に記載の方法。
【請求項５４】
多能性幹細胞の分化に適した培地が多能性因子を含まない、請求項41に記載の方法。
【請求項５５】
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まない、請求項41に記載の方法。
【請求項５６】
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まないmTeSR1培地である、請求項41に記載の方法。
【請求項５７】
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を単離する工程が、細胞を抗CD14＋抗体および/またはCX3CR1＋抗体と接触させることを含む、請求項37に記載の方法。
【請求項５８】
抗体が結合した細胞を、抗体が結合していない細胞から分離することを含む、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
蛍光活性化細胞選別（FACS）を行うことを含む、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
細胞を、抗体に直接的または間接的に結合する磁気ビーズと接触させること、および磁石を使って、抗体が結合した細胞を抗体が結合していない細胞から分離することを含む、請求項58に記載の方法。
【請求項６１】
培地を交換するときに培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項37に記載の方法。
【請求項６２】
工程（a）の約10日目より後に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項37に記載の方法。
【請求項６３】
細胞が第3の組成物または第4の組成物と接触しているときに行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項44〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
多能性幹細胞が誘導多能性幹（iPS）細胞である、請求項37に記載の方法。
【請求項６５】
多能性幹細胞が胚性幹（ES）細胞である、請求項37に記載の方法。
【請求項６６】
（i）IL-34を含む第1のミクログリア分化培地、または（ii）M-CSFを含む第2のミクログリア分化培地のいずれかにおいて、CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を培養する工程を含み、それによってヒトミクログリア細胞を生成する、CD14＋および/またはCX3CR1＋ヒトミクログリア前駆細胞からミクログリア細胞を生成するための方法。
【請求項６７】
第1のミクログリア分化培地がGM-CSFをさらに含む、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-β、CCL2およびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子をさらに含む、請求項66に記載の方法。
【請求項６９】
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-βおよびCCL2をさらに含む、請求項66に記載の方法。
【請求項７０】
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞が、第1または第2のミクログリア分化培地においておよそ15日間にわたって培養される、請求項66に記載の方法。
【請求項７１】
処置を必要とする対象に、請求項1〜36または66〜70のいずれか一項に記載の方法を使って生成したミクログリア細胞または請求項37〜65のいずれか一項に記載の方法を使って生成したミクログリア前駆細胞を投与する工程を含み、それによって対象を処置する、処置の方法。
【請求項７２】
対象が、ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害を有する、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
対象が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病（AD）、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病、レット症候群、スフェロイド形成を伴うびまん性白質脳症、軸索スフェロイド形成を伴う遺伝性びまん性白質脳症、前頭側頭葉変性症（FTLD）、家族性FTLD、統合失調症および自閉症スペクトラム障害からなる群より選択される疾患または障害を有する、請求項71に記載の方法。
【請求項７４】
ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞が、前記対象から得られる体細胞に由来する誘導多能性幹（iPS）細胞から生成される、請求項71に記載の方法。
【請求項７５】
a）対象から得られた体細胞から誘導多能性幹（iPS）細胞を生成する工程、
b）請求項1〜36または66〜70のいずれか一項に記載の方法を使ってiPS細胞からミクログリア細胞を生成する工程、または請求項37〜65のいずれか一項に記載の方法を使ってiPS細胞からミクログリア前駆細胞を生成する工程、および
c）前記対象に前記ミクログリア細胞または前記ミクログリア前駆細胞を投与する工程、
d）それによって対象を処置する工程
を含む、処置を必要とする対象を処置する方法。
【請求項７６】
対象が、ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害を有する、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
対象が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病（AD）、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病、レット症候群、スフェロイド形成を伴うびまん性白質脳症、軸索スフェロイド形成を伴う遺伝性びまん性白質脳症、前頭側頭葉変性症（FTLD）、家族性FTLD、統合失調症および自閉症スペクトラム障害からなる群より選択される疾患または障害を有する、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
ミクログリア細胞またはミクログリア先駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害の処置または予防に有用な化合物を同定する方法であって、請求項1〜36または66〜70のいずれか一項に記載の方法によって生成したミクログリア細胞、または請求項37〜65のいずれか一項に記載の方法によって生成したミクログリア前駆細胞を、候補化合物と接触させる工程、および該候補化合物がミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の前記欠陥または欠乏を改善するかどうかを決定する工程を含む、方法。
【請求項７９】
ハイスループット法である、請求項77に記載の方法。
【請求項８０】
請求項1〜36または66〜70のいずれか一項に記載の方法によって生成したミクログリア細胞を候補化合物と接触させる工程、および該候補化合物が、P2RY12 Gタンパク質共役受容体の活性を調節するかどうかを決定する工程を含む、P2RY12 Gタンパク質共役受容体の調節物質を同定する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
別の態様において本発明は、この特許開示の詳細な説明の項においてさらに説明するとおり、本明細書に記載するさまざまな方法を行う際に有用な組織培養培地、組織培養培地添加物、およびさまざまなキットも提供する。
[本発明1001]
（a）CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞の生成につながる骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程、ならびに
（b）CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を、（i）IL-34を含む第1のミクログリア分化培地、または（ii）M-CSFを含む第2のミクログリア分化培地のいずれかにおいて、培養する工程
を含み、それによってヒトミクログリア細胞を生成する、ミクログリア細胞を生成するための方法。
[本発明1002]
工程（b）においてCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を培養する前に、工程（a）において産生されたCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を単離する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
工程（a）が、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化を誘導することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
骨髄系前駆細胞のCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
工程（a）が、細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることを含み、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せを含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1009]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せを含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1011]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1012]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せを含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1013]
工程（a）が、
a）細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることであって、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、接触させること、
b）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、およびVEGF-Aを含む第2の組成物と接触させること、
c）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、およびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させること、ならびに
d）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させること
を逐次的に含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
第1のミクログリア分化培地がGM-CSFをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-β、CCL2およびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-βおよびCCL2をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞が、第1または第2のミクログリア分化培地においておよそ15日間にわたって培養される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
ヒト多能性幹細胞が、骨髄系分化を誘導する条件下でおよそ25〜50日間培養される、本発明1001の方法。
[本発明1019]
細胞培養物を、およそ4日間、第1の組成物と接触させることを含む、本発明1006の方法。
[本発明1020]
細胞培養物を、およそ2日間、第2の組成物と接触させることを含む、本発明1007または本発明1008の方法。
[本発明1021]
細胞培養物を、およそ8日間、第3の組成物と接触させることを含む、本発明1009または本発明1010の方法。
[本発明1022]
細胞培養物を、およそ11〜36日間、第4の組成物と接触させることを含む、本発明1011または本発明1012の方法。
[本発明1023]
多能性幹細胞の分化に適した培地が多能性因子を含まない、本発明1006の方法。
[本発明1024]
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まない、本発明1006の方法。
[本発明1025]
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まないmTeSR1培地である、本発明1006の方法。
[本発明1026]
前記造血細胞培地がStemPro-34である、本発明1007〜1012のいずれかの方法。
[本発明1027]
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を単離する工程が、細胞を抗CD14＋抗体および/またはCX3CR1＋抗体と接触させることを含む、本発明1002の方法。
[本発明1028]
抗体が結合した細胞を、抗体が結合していない細胞から分離することを含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
蛍光活性化細胞選別（FACS）を行うことを含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
細胞を、抗体に直接的または間接的に結合する磁気ビーズと接触させること、および磁石を使って、抗体が結合した細胞を抗体が結合していない細胞から分離することを含む、本発明1028の方法。
[本発明1031]
培地を交換するときに培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1032]
工程（a）中に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1033]
工程（a）の約10日目より後に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1034]
細胞が第3の組成物または第4の組成物と接触しているときに行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1013の方法。
[本発明1035]
多能性幹細胞が誘導多能性幹（iPS）細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1036]
多能性幹細胞が胚性幹（ES）細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1037]
（a）骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程、
（b）工程（a）において生成したCD14＋および/またはCX3CR1＋細胞を単離する工程
を含み、該CD14＋および/またはCX3CR1＋細胞がミクログリア前駆細胞である、ミクログリア前駆細胞を生成するための方法。
[本発明1038]
工程（a）が、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化を誘導することを含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
骨髄系前駆細胞のCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
工程（a）が、細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることを含み、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、本発明1037の方法。
[本発明1042]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せを含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1041の方法。
[本発明1044]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1045]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSFおよびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1046]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1048]
工程（a）が、
a）細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることであって、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、接触させること、
b）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、およびVEGF-Aを含む第2の組成物と接触させること、
c）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、およびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させること、ならびに
d）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させること
を逐次的に含む、本発明1037の方法。
[本発明1049]
ヒト多能性幹細胞が、骨髄系分化を誘導する条件下でおよそ25〜50日間培養される、本発明1037の方法。
[本発明1050]
細胞培養物を、およそ4日間、第1の組成物と接触させることを含む、本発明1041または本発明1047の方法。
[本発明1051]
細胞培養物を、およそ2日間、第2の組成物と接触させることを含む、本発明1043、本発明1043、または本発明1048の方法。
[本発明1052]
細胞培養物を、およそ8日間、第3の組成物と接触させることを含む、本発明1044、本発明1045、または本発明1048の方法。
[本発明1053]
細胞培養物を、およそ11〜36日間、第4の組成物と接触させることを含む、本発明1046、本発明1047、または本発明1048の方法。
[本発明1054]
多能性幹細胞の分化に適した培地が多能性因子を含まない、本発明1041の方法。
[本発明1055]
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まない、本発明1041の方法。
[本発明1056]
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まないmTeSR1培地である、本発明1041の方法。
[本発明1057]
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を単離する工程が、細胞を抗CD14＋抗体および/またはCX3CR1＋抗体と接触させることを含む、本発明1037の方法。
[本発明1058]
抗体が結合した細胞を、抗体が結合していない細胞から分離することを含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
蛍光活性化細胞選別（FACS）を行うことを含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
細胞を、抗体に直接的または間接的に結合する磁気ビーズと接触させること、および磁石を使って、抗体が結合した細胞を抗体が結合していない細胞から分離することを含む、本発明1058の方法。
[本発明1061]
培地を交換するときに培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1037の方法。
[本発明1062]
工程（a）の約10日目より後に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1037の方法。
[本発明1063]
細胞が第3の組成物または第4の組成物と接触しているときに行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1044〜1048のいずれかの方法。
[本発明1064]
多能性幹細胞が誘導多能性幹（iPS）細胞である、本発明1037の方法。
[本発明1065]
多能性幹細胞が胚性幹（ES）細胞である、本発明1037の方法。
[本発明1066]
（i）IL-34を含む第1のミクログリア分化培地、または（ii）M-CSFを含む第2のミクログリア分化培地のいずれかにおいて、CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を培養する工程を含み、それによってヒトミクログリア細胞を生成する、CD14＋および/またはCX3CR1＋ヒトミクログリア前駆細胞からミクログリア細胞を生成するための方法。
[本発明1067]
第1のミクログリア分化培地がGM-CSFをさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-β、CCL2およびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子をさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1069]
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-βおよびCCL2をさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1070]
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞が、第1または第2のミクログリア分化培地においておよそ15日間にわたって培養される、本発明1066の方法。
[本発明1071]
処置を必要とする対象に、本発明1001〜1036または1066〜1070のいずれかの方法を使って生成したミクログリア細胞または本発明1037〜1065のいずれかの方法を使って生成したミクログリア前駆細胞を投与する工程を含み、それによって対象を処置する、処置の方法。
[本発明1072]
対象が、ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害を有する、本発明1071の方法。
[本発明1073]
対象が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病（AD）、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病、レット症候群、スフェロイド形成を伴うびまん性白質脳症、軸索スフェロイド形成を伴う遺伝性びまん性白質脳症、前頭側頭葉変性症（FTLD）、家族性FTLD、統合失調症および自閉症スペクトラム障害からなる群より選択される疾患または障害を有する、本発明1071の方法。
[本発明1074]
ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞が、前記対象から得られる体細胞に由来する誘導多能性幹（iPS）細胞から生成される、本発明1071の方法。
[本発明1075]
a）対象から得られた体細胞から誘導多能性幹（iPS）細胞を生成する工程、
b）本発明1001〜1036または1066〜1070のいずれかの方法を使ってiPS細胞からミクログリア細胞を生成する工程、または本発明1037〜1065のいずれかの方法を使ってiPS細胞からミクログリア前駆細胞を生成する工程、および
c）前記対象に前記ミクログリア細胞または前記ミクログリア前駆細胞を投与する工程、
d）それによって対象を処置する工程
を含む、処置を必要とする対象を処置する方法。
[本発明1076]
対象が、ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害を有する、本発明1075の方法。
[本発明1077]
対象が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病（AD）、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病、レット症候群、スフェロイド形成を伴うびまん性白質脳症、軸索スフェロイド形成を伴う遺伝性びまん性白質脳症、前頭側頭葉変性症（FTLD）、家族性FTLD、統合失調症および自閉症スペクトラム障害からなる群より選択される疾患または障害を有する、本発明1076の方法。
[本発明1078]
ミクログリア細胞またはミクログリア先駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害の処置または予防に有用な化合物を同定する方法であって、本発明1001〜1036または1066〜1070のいずれかの方法によって生成したミクログリア細胞、または本発明1037〜1065のいずれかの方法によって生成したミクログリア前駆細胞を、候補化合物と接触させる工程、および該候補化合物がミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の前記欠陥または欠乏を改善するかどうかを決定する工程を含む、方法。
[本発明1079]
ハイスループット法である、本発明1077の方法。
[本発明1080]
本発明1001〜1036または1066〜1070のいずれかの方法によって生成したミクログリア細胞を候補化合物と接触させる工程、および該候補化合物が、P2RY12 Gタンパク質共役受容体の活性を調節するかどうかを決定する工程を含む、P2RY12 Gタンパク質共役受容体の調節物質を同定する方法。
[本発明1081]
ハイスループット法である、本発明1079の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
（表１）
2019512221.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
（表２）
2019512221.tif 000002
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2019512221.tif 000003
【図１Ｂ】
2019512221.tif 000004
【図２Ａ】
2019512221.tif 000005
【図２Ｂ】
2019512221.tif 000006
【図２Ｃ】
2019512221.tif 000007
【図３Ａ】
2019512221.tif 000008
【図３Ｂ】
2019512221.tif 000009
【図３Ｃ】
2019512221.tif 000010
【図３Ｄ−１】
2019512221.tif 000011
【図３Ｄ−２】
2019512221.tif 000012
【図３Ｅ】
2019512221.tif 000013
【図４Ａ】
2019512221.tif 000014
【図４Ｂ】
2019512221.tif 000015
【図４Ｃ】
2019512221.tif 000016
【図４Ｄ】
2019512221.tif 000017
【図４Ｅ】
2019512221.tif 000018
【図４Ｆ】
2019512221.tif 000019
【図５Ａ】
2019512221.tif 000020
【図５Ｂ】
2019512221.tif 000021
【図５Ｃ】
2019512221.tif 000022
【図５Ｄ】
2019512221.tif 000023
【図６】
2019512221.tif 000024
【図７】
2019512221.tif 000025
【図８Ａ】
2019512221.tif 000026
【図８Ｂ】
2019512221.tif 000027
【図８Ｃ】
2019512221.tif 000028
【図８Ｄ】
2019512221.tif 000029
【図９】
2019512221.tif 000030
【図１０】
2019512221.tif 000031
【図１１】
2019512221.tif 000032
【図１２】
2019512221.tif 000033