(57)【要約】  本発明は、被検物質が、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質であるかをスクリーニングする方法であって、被検物質と、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩を用いることを特徴とする方法に関する。本発明によれば、インスリン分泌に関与する物質をスクリーニングすることができる。また本発明によれば、糖尿病、糖尿病性の合併症や変性疾患、高血糖、多尿、ケトン血症、アシドーシス、インスリン抵抗性、耐糖能障害、神経変性疾患、インスリノーマ、癌、高インスリン血症、高グリセリド血症、脂肪肝、インスリン過剰分泌による低血糖、動脈硬化、高脂血症、脳卒中、肥満、糖尿病や肥満によって引き起こされる各種疾患等の予防または治療に有用な物質をスクリーニングすることができる。
2007052466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質が、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質であるかをスクリーニングする方法であって、
被検物質と、
ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、
ホスホリパーゼまたはその塩
を用いることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ１、またはホスホリパーゼＡ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ホスホリパーゼが、グループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＡ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＣ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＤ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＥ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＦ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIII分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＶ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸIIＡ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ホスホリパーゼが、グループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とを比較する工程を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合との間で、結果に相違が出た場合に、その物質をＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質の候補であると決定する工程をさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
被検物質存在下の場合が、被検物質の非存在下の場合と比べて細胞刺激活性が上昇している場合、その被検物質をＧＰＲ４０アゴニストと決定する工程をさらに含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
被検物質存在下の場合が、被検物質の非存在下の場合と比べて細胞刺激活性が抑制される場合、その被検物質をＧＰＲ４０アンタゴニストと決定する工程をさらに含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞刺激活性の測定を、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化を検出するレポーターアッセイ系により測定するか、または、細胞内カルシウムイオン遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性およびインスリン分泌活性からなる群より選択されるパラメータを測定することによって行う、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＰＲ４０が、下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド、
（ｃ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（ｄ）  配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｅ）  配列番号１で表される塩基配列に対して７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１２】
ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、
ホスホリパーゼまたはその塩と
を少なくとも含んでなる、スクリーニング用キット。
【請求項１３】
ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングするためのものである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ＧＰＲ４０が、下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる、請求項１２または１３に記載のキット：
（ａ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド、
（ｃ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｄ）  配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｅ）  配列番号１で表される塩基配列に対して７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１５】
ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＡ２である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
ホスホリパーゼが、グループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＡ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＣ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＤ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＥ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIIＦ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループIII分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＶ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸIIＡ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
ホスホリパーゼが、グループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングするための、
ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、
ホスホリパーゼまたはその塩
の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国特許出願である、特願２００５−３２１１０８号（出願日：２００５年１１月４日）に基づくものであって、それらの優先権の利益を主張するものであり、それらの開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質であるＧＰＲ４０と、ホスホリパーゼまたはその塩との細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングする方法、およびそのようなスクリーニングを実施するためのスクリーニング用キットに関する。
【０００３】
関連技術
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を介して、生体の機能を調節している。これらのレセプターの多くは、細胞膜を７回貫通する構造を有しており、細胞内で三量体のＧタンパク質 (guanine nucleotide-binding protein) と共役していることから、Ｇタンパク質共役型受容体 (ＧＰＣＲ： G-protein coupled receptor) と呼ばれている。
【０００４】
ＧＰＣＲは、各種の細胞、臓器、および器官の機能細胞表面に存在し、それらの機能を調節する分子との結合を介してシグナルを細胞内に伝達して、細胞の賦活化や抑制化をする。このため、ＧＰＣＲは各種臓器および器官において重要な役割を担っている。このような生理活性物質とＧＰＣＲとの関係を明らかにすることは、生体の機能を解明し、それと密接に関連した医薬品開発をする上で重要である。医薬品を開発するためには、ＧＰＣＲのアゴニストやアンタゴニストを効率良くスクリーニングして、生体内で発現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を解析し、それらを適当な発現系で発現させる必要がある。
【０００５】
近年、ＥＳＴデータベース等のｃＤＮＡ配列のランダム解析や、ゲノムＤＮＡの網羅的解析により、多くの新規遺伝子の存在が明らかとなってきている。ＧＰＣＲは、７個の膜貫通領域を有し、さらにそれ以外にも多くの共通配列を有している。このため、このような多くの新規遺伝子の中から新規ＧＰＣＲが見出されている。このようにして見出された新規ＧＰＣＲは通常そのリガンドは未同定である。リガンドが未同定のＧＰＣＲ、すなわちオーファンＧＰＣＲ、に対してリガンドを見出したり、その機能を解析したりすることは、新たな治療薬の開発につながる可能性があり、重要視されている。
【０００６】
そしてほとんどの場合、オーファンＧＰＣＲのリガンドの予測は困難である。ＧＰＣＲのリガンドは、生体アミン、アミノ酸、核酸とその代謝物、ペプチド、タンパク質（ホルモン、ケモカイン）、脂質など多様である。リガンドを抽出物などから精製を行う場合、それぞれの物質の種類に適した抽出方法が必要となる。また、細胞に発現させたオーファンＧＰＣＲが、リガンドに応答した後にいかなる２次情報伝達系を作動させるかは一般的に不明であり、様々な系について検討する必要がある。リガンドの存在する組織の予想は容易でないため、種々の組織抽出物を用意しなければならない。このように、オーファンＧＰＣＲのリガンド探索は多くの困難さを伴う。新たなＧＰＣＲのリガンドを見出して、該リガンドを直接利用するか、または該リガンドを用いた医薬のスクリーニング系を利用することによって、今までにない新規な作用機序を有する医薬の開発が期待できる。
【０００７】
ＧＰＲ４０は、ＧＰＣＲの一つとして知られている（Biochemical and Biophysiological Research Communications, Vol.239, pp543-547, (1997)）。ＧＰＲ４０のリガンドは完全には解明されているとは言えないが、リガンドの一つとして脂肪酸が報告されている（ＷＯ２００２／０５７７８３、およびＷＯ２００３／０６８９５９）。
【０００８】
ＧＰＲ４０は、膵臓細胞ランゲルハンス島β細胞において発現していることが知られている。マウス膵臓由来細胞株ＭＩＮ６におけるグルコース依存的インスリン分泌にＧＰＲ４０が関与していることが知られている（ＷＯ２００３／０６８９５９）。また、膵島の初代培養細胞におけるインスリン分泌にＧＰＲ４０が関与していることが報告されている（Ito Y et al., Nature, 422 (6928):173-6, 2003）。また、ＧＰＲ４０は、乳がんの増殖に関与していることが報告されている（Hardy S et al., Journal of Biological Chemistry, 280(14):13285-91, 2005）。さらに、ＧＰＲ４０の発現を低下させたマウスにおいては、肥満によって引き起される高インスリン血症や、脂肪肝、高グリセリド血症などが緩和されることが報告されている（Steneberg P et al., Cell Metabolism, 1(4):245-58, 2005）。これらのことから、ＧＰＲ４０のアゴニスト、アンタゴニストは、I型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）、II型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）、糖尿病性の合併症や変性疾患（例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症等）、高血糖、多尿、ケトン血症、アシドーシス、インスリン抵抗性、耐糖能障害、神経変性疾患、インスリノーマ、癌、高インスリン血症、高グリセリド血症、脂肪肝、インスリン過剰分泌による低血糖、動脈硬化、高脂血症、脳卒中、肥満、糖尿病や肥満によって引き起こされる各種疾患等の治療への応用が期待される。
【０００９】
上述のとおり、ＧＰＲ４０のリガンドの一つとして脂肪酸が報告されているが、脂肪酸は、水系の溶媒への溶解度が低いため、リガンド溶液の調製が困難となることが多い。また脂肪酸は、スクリーニングに用いるプラスチックやガラスへの吸着が大きく、さらに、不飽和脂肪酸は酸化され易い。さらに、脂肪酸は、アルブミンとの結合率が高いことが知られている。脂肪酸は、生理的には、遊離脂肪酸として存在するのはごくわずか（１％程度）であり、ほとんどは血中のアルブミンに結合した状態で存在する。このため、脂肪酸を用いたＧＰＲ４０のスクリーングにおいて、実際に、牛血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）による、脂肪酸とレセプターとの反応性の阻害が観察されており、スクリーニングを血清やアルブミン非存在下で行う必要性があることが報告されている（例えば、Ito Y et al., Nature, 422 (6928):173-6, 2003）。一方、一般的に細胞やタンパク質を用いた医薬品のスクリーニングは、より生理的条件に近いことが求められるため、血清またはアルブミン（ＢＳＡ等）の存在下で行われることが多い。血清非存在下でスクリーニングを行うと、血清非存在の条件では細胞が損傷を受けるため、長時間の培養は通常困難である。このため、血清入り培地等で細胞を予め培養した後、スクリーニングをする時に血清除去培地と置換することが必要となるが、作業が繁雑になる。
【００１０】
このため、脂肪酸を直接使用しない、ＧＰＲ４０のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング系の開発が望まれている。
【００１１】
ホスホリパーゼは、グリセロリン脂質のエステル結合を加水分解する酵素群の総称であり、その加水分解するエステル結合の位置により、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂ、ＣおよびＤ等に分類される。ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）はさらに、分泌型（ｓＰＬＡ２）、細胞質型（ｃＰＬＡ２）、およびカルシウム非依存型（ｉＰＬＡ２）に分類でき、このうちｓＰＬＡ２は１０種類が知られている。
【００１２】
一方、ホスホリパーゼＡ２で加水分解され酸化したホスファチジルコリン（１−パルミトイル−２−リノレノイル）がＧＰＣＲの一つであるＧ２Ａ発現細胞内のカルシウム誘導すること、および、ホスファチジルコリンもしくはコレステリルリノール酸の酸化および加水分解によって生産された、酸化遊離脂肪酸によってＧ２Ａが活性化されることが報告さている（J. Biol. Chem., Vol. 280, Issue 49, 40676-40683, December 9, 2005）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは今般、驚くべきことに、ホスホリパーゼ、特に分泌型のホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、および、ヘビ毒のホスホリパーゼＡ２が、Ｇタンパク質共役型受容体であるＧＰＲ４０を介する細胞刺激活性を活性化すること見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１４】
よって本発明は、ホスホリパーゼによるＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングする方法、およびそのような方法に使用されるキット等を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明によれば、被検物質が、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質であるかをスクリーニングする方法であって、被検物質と、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩を用いることを特徴とする方法が提供される。ここでいう「生体膜」には、細胞膜や細胞を構成するオルガネラ等の膜、脂質二重膜などを含む。また、リポソームなどの再構成膜も含む。本発明において、好ましくは、ＧＰＲ４０を含む生体膜は、ＧＰＲ４０を含む細胞膜と言うことができる。
【００１６】
本発明の別の一つの態様によれば、ＧＰＲ４０、それを含む細胞膜、またはそれらを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩と、を用いることを特徴とする、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質のスクリーニング方法が提供される。
【００１７】
本発明の好ましい態様によれば、この方法は、被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とを比較する工程を含んでなる。
【００１８】
さらに本発明によれば、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを少なくとも含んでなる、スクリーニング用キットが提供される。また本発明によれば、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングするための、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩の使用が提供される。
【００１９】
本発明によるスクリーニング方法によれば、インスリン分泌に関与する物質をスクリーニングすることができる。また、ＧＰＲ４０は、がんの増殖に関与する物質もスクリーニングすることができる。このため、本発明によれば、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）、II型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）、糖尿病性の合併症や変性疾患（例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症等）、高血糖、多尿、ケトン血症、アシドーシス、インスリン抵抗性、耐糖能障害、神経変性疾患、インスリノーマ、癌、高インスリン血症、高グリセリド血症、脂肪肝、インスリン過剰分泌による低血糖、動脈硬化、高脂血症、脳卒中、肥満、糖尿病や肥満によって引き起こされる各種疾患等の予防または治療に有用な物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ４０）ＩＨの構築図を示す。
【図２】ＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の構築図を示す。
【図３】ｐＢａｂｅＣＬＸの構築図を示す。
【図４】ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮの構築図を示す。
【図５】市販ブタ膵臓由来ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞おけるＰＬＡＰ活性を、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞と比較した結果を示す。
【図６Ａ】ニッケルカラムで精製したＣ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞と比較した結果を示す。図６ＡはｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓを用いた場合の結果を示す。
【図６Ｂ】ニッケルカラムで精製したＣ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞と比較した結果を示す。図６Ｂは、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓを用いた場合の結果を示す。
【図７】市販ハチ毒ＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞と比較した結果を示す。
【図８】市販ヘビ毒ＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞と比較した結果を示す。
【図９】市販ハチ毒ＰＬＡ２添加による、ＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞における細胞内カルシウム濃度変化（Ａ）および、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞における細胞内カルシウム濃度変化（Ｂ）を示す。
【図１０】Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞と比較した結果を示す。
【図１１】末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｍＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞と比較した結果を示す。
【発明の具体的説明】
【００２１】
ホスホリパーゼ
本発明のスクリーニング方法には、ホスホリパーゼを使用する。ホスホリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂ、ＣおよびＤが挙げられるが、本発明においては、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２が好ましく、ホスホリパーゼＡ２がより好ましい。ホスホリパーゼＡ２は、性質により、分泌型（ｓＰＬＡ２）、細胞質型（ｃＰＬＡ２）、およびカルシウム非依存型（ｉＰＬＡ２）に分類できる。ヘビ毒やハチ毒に含まれるＰＬＡ２は分泌型ＰＬＡ２に分類される。本発明においては、分泌型が好ましい。また、ハチ毒およびヘビ毒など毒素のホスホリパーゼＡ２を用いることもできる。本発明によれば、ホスホリパーゼは、分泌型のホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、および、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２がより好ましいものとして挙げられる。
【００２２】
分泌型ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）は、ＩＢ、IIＡ、IIＣ、IIＤ、IIＥ、IIＦ、III、Ｖ、Ｘ、ＸIIＡの１０種類のグループに分類することができ、本発明においては、好ましくは、グループＩＢ、IIＡ、Ｖ、Ｘであり、より好ましくは、グループＩＢ、Ｘであり、さらに好ましくはグループＸである。
【００２３】
ホスホリパーゼは、公知の酵素であるため、当業者であれば容易に入手することが出来る。例えば、所望するホスホリパーゼを含む生物から、常法にしたがって、抽出または精製の工程を経て調製することができる。また、ホスホリパーゼは、その市販品を購入して、使用することができる。さらにこれらのシグナル配列、プレプロ配列、およびマチュア体の配列は、これらのデータベースの配列や公知文献から容易に知ることができるのでそれに従って、所望のホスホリパーゼを発現し得るポリヌクレオチドを入手し、これを遺伝子工学的手段により発現可能なように組み込んだ細胞等を調製し、これを利用しても良い。
【００２４】
ホスホリパーゼは、そのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されている。例えば、分泌型ホスホリパーゼＡ２の場合、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０４０５４（ヒト型グループＩＢ）、Ｑ９Ｚ０Ｙ２（マウス型グループＩＢ）、Ｐ０４０５５（ラット型グループＩＢ）、Ｐ００５９２（ブタ型グループＩＢ）、Ｐ１４５５５（ヒト型グループIIＡ）、Ｐ３１４８２（マウス型グループIIＡ）、Ｐ４８０７６（マウス型グループIIＣ）、Ｑ９ＵＮＫ４（ヒト型グループIIＤ）、Ｑ９ＮＺＫ７（ヒト型グループIIＥ）、Ｑ９ＢＺＭ２（ヒト型グループIIＦ）、Ｑ９ＮＺ２０（ヒト型グループIII）、Ｐ３９８７７（ヒト型グループＶ）、Ｐ９７３９１（マウス型グループＶ）、Ｏ１５４９６（ヒト型グループＸ）、Ｑ９ＱＸＸ３（マウス型グループＧＸ）、Ｑ９ＱＺＴ３（ラット型グループＧＸ）、および、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０３０８２１（ヒト型グループIIＡ）などが報告されている。また、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２の場合、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ００６３０などが報告されている。さらに、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２の場合、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ６２０２２、Ｐ００６０２などが報告されている。本発明において用いるホスホリパーゼは、このような公知の情報に基づいてそのアミノ酸配列またはそれをコードするＤＮＡを具体的に特定することができる。
【００２５】
また、ホスホリパーゼの中には、前駆体ホスホリパーゼからプロセシングを受けて活性型となるものが存在する（例えば、分泌型ホスホリパーゼＡ２や、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２など）。また、前駆体からシグナル配列がとれたプレプロ体から、さらに、プレプロ配列がとれて活性体となるものも存在する（例えばグループＩＢ分泌型ホスホリパーゼＡ２、グループＸ分泌型ホスホリパーゼＡ２、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２など）。本発明において用いるホスホリパーゼは、前駆体ホスホリパーゼ、プレプロホスホリパーゼ、および活性型ホスホリパーゼのいずれであってもよいが、活性型ホスホリパーゼがより好ましい。なお、実験的には、活性型ホスホリパーゼを単にホスホリパーゼということもある。これらの本発明において用いる前駆体、プレプロ体および活性型ホスホリパーゼは、公知の情報に基づいてそのアミノ酸配列またはそれをコードするＤＮＡを具体的に特定することができる。
【００２６】
具体的には、本発明におけるホスホリパーゼは下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる：
（Ａ）  前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号７〜１２で表されるいずれかのアミノ酸配列）を含む、ポリペプチド；
（Ｂ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；
（Ｃ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（Ｄ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；および、
（Ｅ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド。
【００２７】
本発明に使用するホスホリパーゼとしては、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。なお、前記ポリペプチドには、ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。本発明において用いるこれらのホスホリパーゼは、公知の情報に基づいてそのアミノ酸配列またはそれをコードするＤＮＡを具体的に特定することができる。
なお前記「ジスルフィド結合をしたもの」とは、ホスホリパーゼの分子内において、特定箇所アミノ酸（例えば、システイン等）と、別の特定箇所のアミノ酸（例えば、システイン等）とが−Ｓ−Ｓ−結合により架橋されている状態をいう。
【００２８】
ここで、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列」とは前記に列記したアクセッション番号により所定の公知のデータベースより特定されるアミノ酸配列のことであり、好ましくは、配列番号７〜１２で表されるいずれかのアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号７で表されるアミノ酸配列である。
【００２９】
ここで、ポリペプチドが「ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する」とは、そのポリペプチドが、ＧＰＲ４０に直接的または間接的に活性化作用を有し、ＧＰＲ４０を介したシグナル情報伝達作用、より詳しくは、ＧＰＲ４０発現細胞の細胞刺激活性（例えば、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出するレポーターアッセイ系により測定するか、細胞内のカルシウムイオンの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、インスリン分泌活性、細胞増殖活性など）を有することを意味する。また実質的に同じとは、活性が性質的に同質であることを意味する。すなわち、「ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する」ためには、前記活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは０．０５〜２０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましい。これらの活性については、慣用の方法にしたがってと測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって測定することができる。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、前記（Ｂ）のポリペプチド（以下において「改変ポリペプチド」と言うことがある）は、そのアミノ酸配列が、前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号７〜１２で表されるいずれかのアミノ酸配列）を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であって、しかもホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチドであることができる。
【００３１】
本明細書において「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個（好ましくは数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３２】
ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。
【００３３】
この改変ポリペプチドには、さらにそのＮ末端（アミノ末端）およびＣ末端（カルボキシル末端）が改変または修飾されているものも包含されてよい。例えば、Ｃ末端のカルボキシルが、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）とされていてもよい。なおここで前記Ｒは、例えば直鎖、分岐鎖もしくは環状のＣ１−６アルキル基、Ｃ６−１２アリール基等が挙げられる。またＮ末端のアミノ基が慣用の保護基により保護されたもの等も改変ポリペプチドに包含され得る。
【００３４】
前記（Ｂ）のポリペプチドの例としては、ヒト由来、ラット由来、マウス由来、ブタ由来、ハチ由来、ヘビ由来のものが挙げられ、またそれら生物以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のホスホリパーゼもしくはその変異体も具体例として挙げられる。
【００３５】
前記（Ｃ）のポリペプチド（以下において「相同ポリペプチド」と言うことがある）は、ホスホリパーゼのアミノ酸配列に関して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは、ホスホリパーゼに関して、８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチドである。
【００３６】
本明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。なお、前記相同ポリペプチドには、相同ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記相同ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のホスホリパーゼもしくはその変異体が含まれる。
【００３７】
例えば、前記（Ａ）のポリペプチドが配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むものである場合には、前記（Ｃ）の相同ポリペプチドは、配列番号８〜１２で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができる。具体的には、前記（Ｃ）の相同ポリペプチドとしては、例えば、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０４０５４（ヒト由来グループＩＢ）、Ｑ９Ｚ０Ｙ２（マウス由来グループＩＢ）、Ｐ０４０５５（ラット由来グループＩＢ）、Ｐ００６０２（ヘビ由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００３８】
なお、本明細書において、変異体とは、「ｖａｒｉａｔｉｏｎ」、すなわち、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
【００３９】
さらに、本発明に使用するホスホリパーゼ（すなわち、ホスホリパーゼ、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の部分ポリペプチドも、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する限り使用することができる。この場合、部分ポリヌクレオチドを構成するアミノ酸数は、ホスホリパーゼのアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
【００４０】
ホスホリパーゼの調製方法
これら本発明に使用するホスホリパーゼ（すなわち、ホスホリパーゼ、その改変ポリペプチド、その相同ポリペプチド）およびその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、ホスホリパーゼまたはその部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、適当なタンパク質分解酵素で切断することによって所望の部分ポリペプチドを調製することができる。
【００４１】
以下、本発明に使用するホスホリパーゼの調製方法のうち、遺伝子工学的手法について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
【００４２】
ホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチド
本発明に使用するホスホリパーゼ（すなわち、ホスホリパーゼ、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、前記ホスホリパーゼ、前記改変ポリペプチド、前記相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、具体的には下記の（Ｉ）〜（VI）からなる群より選択されるものが挙げられる：
（Ｉ）  前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（好ましくは、配列番号１３〜１８で表されるいずれかの塩基配列）からなる、ポリヌクレオチド；
（II）  「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号７〜１２で表されるいずれかのアミノ酸配列）からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
(III)  「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号７〜１２で表されるいずれかのアミノ酸配列）を含み、しかも、前記のホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（IV）  「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号７〜１２で表されるいずれかのアミノ酸配列）の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド； 
（Ｖ）  前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（好ましくは、配列番号１３〜１８で表されるいずれかの塩基配列）からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；および
（VI）  前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（好ましくは、配列番号１３〜１８で表されるいずれかの塩基配列）に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、しかも、前記のホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００４３】
ここで、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列」とは前記に列記したアクセッション番号により所定の公知のデータベースより特定される塩基配列（または、それより特定されるアミノ酸配列をコードしてなる塩基配列）のことであり、好ましくは配列番号１３〜１８で表されるいずれかの塩基配列、より好ましくは、配列番号１３で表される塩基酸配列である。
【００４４】
本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号７〜１２で表されるいずれかのアミノ酸配列）の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【００４５】
アミノ酸の付加、欠失および／または置換による変異体は、例えばそれをコードするＤＮＡに例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）を施すことにより作成できる。本明細書において「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失、挿入および／または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
【００４６】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
【００４７】
尚、ホスホリパーゼの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または挿入を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、挿入および／または置換し、次いで連結する方法もある。
【００４８】
本明細書において、「欠失」には、アミノ酸配列の端からアミノ酸残基を欠失したものおよびアミノ酸は配列の途中のアミノ酸残基が欠失したものも含まれる。
【００４９】
「付加」には、アミノ酸配列の端にアミノ酸残基を付加したものおよびアミノ酸残基の途中にアミノ酸残基を欠失したものも含まれる。
【００５０】
１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在する。従って、前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号７〜１２で表されるアミノ酸配列）またはその酵素活性部分をコードするいずれのＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
【００５１】
本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（好ましくは、配列番号１３〜１８で表されるいずれかの塩基配列）からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。具体的には、前記アクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列以外の配列からなるポリヌクレオチドであって、配列番号１３〜１８で表される塩基配列（ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ブタ由来、ハチ由来、およびヘビ由来）からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５２】
本明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、例えば配列番号１３〜１８で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにス
トリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ホスホリパーゼのアイソフォーム、アレリック変異体、及び対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。
【００５３】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995);条件については特にSection2.10)等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１３〜１８の塩基を含む塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、上述の相同性の決定と同様にBLASTアルゴリズム(Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。上述の塩基配列についてのプログラムBLASTNの他に、このアルゴリズムに基づいたアミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしてBLASTX(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)等が開発されており、利用可能である。具体的な解析方法については先に挙げたように、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等を参照することができる。
【００５４】
その他、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)により、ホスホリパーゼのアイソフォームやアレリック変異体等を、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ヘビ、ハチ等のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから、配列番号１３〜１８に表される塩基配列を基に設計したプライマーを利用して得ることができる。
【００５５】
ポリヌクレオチドの塩基配列は、慣用の方法により配列決定して確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等による確認が可能である。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００５６】
本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分ポリヌクレオチド配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
【００５７】
本発明に使用するホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（例えば、配列番号１３で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチド」が好ましい。配列番号１３で表される塩基配列は、４４１番目〜４４３番目のＡＴＧで始まり、９３６番目〜９３８番目のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、配列番号１４〜１８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５８】
プラスミド
プラスミドに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、「Sambrook, J.ら,モレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual, second edition）、Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53(1989)」に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドは、宿主細胞（例えば、E.coli TB1，LE392またはXL-1Bluc等）に導入する。形質転換に使用するプラスミドは、上記のようなホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知のベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。例えば、ホスホリパーゼ単独でもよいし、ホスホリパーゼとタグとなるようなタンパク質（例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））との融合タンパク質を発現ベクターに組み込んでもよい。
【００５９】
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドDNA）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターとしては、具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322などが例示されるがこれらに限定されない。
【００６０】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現ベクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
【００６１】
形質転換体
形質転換体は、所望の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞、または人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００６２】
特に、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。
【００６３】
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ，ＴＧＡなど）が例示される。
【００６４】
発現ベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、所望の遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリクションサイトなど）を用いることができる。
【００６５】
本発明に用いた発現ベクターの宿主細胞への導入[形質転換（形質移入）]は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（E．coli，Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法[Proc．Natl．Acad．Sci．USA，69，2110（1972）]、プロトプラスト法[Mol．Gen．Genet．，168，111（1979）]やコンピテント法[J．Mol．Biol．，56，209（1971）]によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法[Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75，1927（1978）]やリチウム法[J．Bacteriol．，153，163（1983）]によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法[Virology，52，456（1973）]、昆虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法[Mol．Cell．Biol．，3，2156-2165（1983）]によってそれぞれ形質転換することができる。植物細胞の場合は、アグロバクテリウムを用いる方法（Horsch et al., Science, 227, 129(1985)、Hiei et al., Plant J., 6, 271-282(1994)）、エレクトロポレーション法（Fromm et al., Nature, 319, 791(1986)）、PEG法（Paszkowski et al., EMBO J., 3, 2717(1984)）、マイクロインジェクション法（Crossway et al., Mol. Gen. Genet., 202, 179(1986)）、微小物衝突法（McCabe et al., Bio/Technology, 6, 923(1988)）によって形質転換することができる。
【００６６】
本発明において、ホスホリパーゼは、例えば、上記の如く調整された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパクが大量に生産されるように適宜選択される。
【００６７】
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地及び培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐHが５〜８である培地としてLB培地、M9培地（ミラー（Miller）ら、Exp. Mol. Genet.、Cold Spring Harbor Laboratory、第431頁、1972年）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、攪拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行なうことができる。宿主が、Bacillus属菌の場合、必要により通気、攪拌しながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行なうことができる。
【００６８】
宿主が酵母である場合、培地として、例えばBurkholder最小培地（ボスチアン（Bostian）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第77巻、第4505頁、1980年）が挙げることができ、ｐHは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われ、必要により通気や攪拌を行なうこともできる。宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（サイエンス（Science）、第122巻、第501頁、1952年）、ＤＭＥＭ培地（バイロロジー（Virology）、第８巻、第396頁、1959年）、ＲＰＭＩ１６４０培地（J. Am. Med. Assoc.、第１９９巻、第519頁、1967年）、１９９培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med.、第73巻、第１頁、1950年）などを用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であることが好ましく、培地は通常３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われ、必要により通気や攪拌を行なうこともできる。
【００６９】
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace’s培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第82巻、第8404頁、1985年）などが挙げることができ、そのｐHは約５〜８であることが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５時間〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行なうこともできる。
【００７０】
ホスホリパーゼの発現、精製方法に関しては、公知の文献が数多く存在する（例えば、Kohji Hanasaki,et al., The Journal of Biological Chemistry 274(48), 34203-34211, 1999など）。
【００７１】
形質転換体の培養物（発現細胞や培養上清）から所望のポリペプチドを精製する方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、適当なタンパク質分解酵素で切断することによって所望の部分ポリペプチドを調製することができる。
【００７２】
本発明において使用されるホスホリパーゼは、その塩の形態であってもよい。ここで、「塩」は、薬学的に許容される塩を示し、ホスホリパーゼと薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えばハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。
【００７３】
また、本発明で使用するホスホリパーゼは、ＧＰＲ４０の細胞刺激活性を有するものであって、実質的にホスホリパーゼと同様の活性を有するものであれば断片であってもよい。
【００７４】
ここで、上記断片が「ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する」とは、その断片が、ＧＰＲ４０を介したシグナル情報伝達作用、より詳しくは、ＧＰＲ４０発現細胞の細胞刺激活性（例えば、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出するレポーターアッセイ系により測定するか、細胞内のカルシウムイオンの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、インスリン分泌活性、細胞増殖活性など）を有することを意味する。また実質的に同じとは、活性が性質的に同質であることを意味する。すなわち、「ホスホリパーゼと実質的に同じ活性を有する」ためには、前記活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは０．０５〜２０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましい。これらの活性については、慣用の方法にしたがってと測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって測定することができる。
【００７５】
ＧＰＲ４０
本発明のスクリーニング方法に使用するＧＰＲ４０は、ホスホリパーゼ（例えば、ｓＰＬＡ２）による活性化作用を有し、ＧＰＲ４０発現細胞の細胞刺激活性（例えば、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出するレポーターアッセイ系により測定するか、細胞内のカルシウムイオンの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、インスリン分泌活性、細胞増殖活性など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばＧＰＲ４０を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、ＧＰＲ４０の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えばホスホリパーゼによる細胞刺激活性化作用を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。
【００７６】
具体的には、本発明のスクリーニング方法に使用するＧＰＲ４０は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質の一種であり、そのアミノ酸配列（ヒト、マウスおよびラット由来のもの）およびそれをコードするＤＮＡが報告されている［例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５２９４（ヒト型）、ＮＰ＿９１８９４６（マウス型）、ＮＰ＿６９５２１６（ラット型）］ポリペプチドである。具体的には、ＧＰＲ４０は下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる：
（ａ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（ｄ）  配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；および、
（ｅ）  配列番号１で表される塩基配列に対して８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド。
【００７７】
本発明に使用するＧＰＲ４０としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。なお、前記ポリペプチドには、ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。
【００７８】
ここで、ポリペプチドが「ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する」とは、そのポリペプチドが、ホスホリパーゼ（例えば、ｓＰＬＡ２）による活性化作用を有し、ＧＰＲ４０を介したシグナル伝達情報作用、より詳しくは、ＧＰＲ４０発現細胞の細胞刺激活性（例えば、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出するレポーターアッセイ系により測定するか、細胞内のカルシウムイオンの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、インスリン分泌活性、細胞増殖活性など）を有することを意味する。また実質的に同じとは、活性が性質的に同質であることを意味する。すなわち、「ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する」ためには、前記活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは０．０５〜２０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましい。これらの活性については、慣用の方法にしたがってと測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって測定することができる。
【００７９】
本発明の好ましい態様によれば、前記（ｂ）のポリペプチド（以下において「改変ポリペプチド」と言うことがある）は、そのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有するポリペプチドであることができる。
【００８０】
本明細書において「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個（このましくは数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００８１】
ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。
【００８２】
改変ポリペプチドには、さらにそのＮ末端（アミノ末端）およびＣ末端（カルボキシル末端）が改変または修飾されているものも包含されてよい。例えば、Ｃ末端のカルボキシルが、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）とされていてもよい。なおここで前記Ｒは、例えば直鎖、分岐鎖もしくは環状のＣ１−６アルキル基、Ｃ６−１２アリール基等が挙げられる。またＮ末端のアミノ基が慣用の保護基により保護されたもの等も改変ポリペプチドに包含され得る。
【００８３】
前記（ｂ）のポリペプチドの例としては、ヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のＧＰＲ４０もしくはその変異体が挙げられる。具体的には配列番号４および配列番号６で表されるアミノ酸配列（マウス由来およびラット由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００８４】
前記（ｃ）のポリペプチド（以下において「相同ポリペプチド」と言うことがある）は、ＧＰＲ４０のアミノ酸配列に関して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは、ＧＰＲ４０に関して、同一性が８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有するポリペプチドである。
【００８５】
本明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。なお、前記相同ポリペプチドには、相同ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものとを有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記相同ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のＧＰＲ４０もしくはその変異体が含まれる。具体的には配列番号４および配列番号６で表されるアミノ酸配列（マウス由来およびラット由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００８６】
さらに、本発明に使用するＧＰＲ４０（すなわち、ＧＰＲ４０、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の部分ポリペプチドも、ホスホリパーゼ（例えば、ｓＰＬＡ２）による活性化作用を有し、ＧＰＲ４０を介したシグナル伝達情報作用、より詳しくは、ＧＰＲ４０発現細胞の細胞刺激活性実質的に同じ活性を有するものをいう。ここで、活性細胞刺激活性とは、例えば、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出するレポーターアッセイ系により測定するか、細胞内のカルシウムイオンの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、インスリン分泌活性、細胞増殖活性などをいい、これらの活性を有するものであれば本発明に包含される。また実質的に同じとは、活性が性質的に同質であることを意味する。すなわち、「ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有する」ためには、前記活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは０．０５〜２０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましい。これらの活性については、慣用の方法にしたがってと測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって測定することができる。
【００８７】
ＧＰＲ４０の調製方法
これら本発明に使用するＧＰＲ４０（すなわち、ＧＰＲ４０、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）およびその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、ＧＰＲ４０またはその部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、適当なタンパク質分解酵素で切断することによって所望の部分ポリペプチドを調製することができる。
【００８８】
以下、本発明に使用するＧＰＲ４０の調製方法のうち、遺伝子工学的手法について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
【００８９】
ＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチド
本発明に使用するＧＰＲ４０（すなわち、ＧＰＲ４０、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、前記ＧＰＲ４０、前記改変ポリペプチド、前記相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明に使用するＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドは、具体的には下記の（ｉ）〜（vi）からなる群より選択されるものが挙げられる：
（ｉ）  配列番号１で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ii）  「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
(iii)  「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（iv）  「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド； 
（ｖ）  配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；および
（vi）  配列番号１で表される塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、しかも、前記のＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００９０】
本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【００９１】
アミノ酸の付加、欠失および／または置換による変異体は、例えばそれをコードするＤＮＡに例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）を施すことにより作成できる。本明細書において「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失、挿入および／または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
【００９２】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
【００９３】
尚、ＧＰＲ４０のアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または挿入を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、挿入および／または置換し、次いで連結する方法もある。
「欠失」には、アミノ酸配列の端からアミノ酸残基を欠失したものおよびアミノ酸は配列の途中のアミノ酸残基が欠失したものも含まれる。
【００９４】
「付加」には、アミノ酸配列の端にアミノ酸残基を付加したものおよびアミノ酸残基の途中にアミノ酸残基を欠失したものも含まれる。
１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在する。従って、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるアミノ酸配列またはその活性部分をコードするいずれのＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
【００９５】
本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドは、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のＧＰＲ４０と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。具体的には配列番号３および配列番号５で表される塩基配列（マウス由来およびラット由来）からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００９６】
本明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件としては、前記したホスホリパーゼの場合と同様であることができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については上記ホスホリパーゼの項を参照することができる。
【００９７】
その他、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)により、ホスホリパーゼのアイソフォームやアレリック変異体等を、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の動物のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから、配列番号１、３、または５に記載の塩基配列を基に設計したプライマーを利用して得ることができる。
【００９８】
ポリヌクレオチドの塩基配列は、慣用の方法により配列決定して確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)等による確認が可能である。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００９９】
本発明に使用するＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明に使用するＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分ポリヌクレオチド配列（例えば配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
【０１００】
本発明に使用するＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドとしては、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が好ましい。配列番号１で表される塩基配列は、１番目〜３番目のＡＴＧで始まり、９０１番目〜９０３番目のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、配列番号３および配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１０１】
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
【０１０２】
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のようなＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、ＧＰＲ４０を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【０１０３】
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばEscherichia coli JM109株）または酵母（例えばSaccharomyces cerevisiae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞、Ｓｆ−９細胞）を挙げることができる。
【０１０４】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
【０１０５】
ＧＰＲ４０を含有する細胞は、ＧＰＲ４０を細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体（すなわち、ＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＧＰＲ４０の発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＧＰＲ４０をコードするＲＮＡを注入し、ＧＰＲ４０の発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
【０１０６】
細胞膜断片
また、ＧＰＲ４０を含有する本発明に使用する細胞膜断片は、例えば前記のＧＰＲ４０を発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Kinematica社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
【０１０７】
スクリーニング方法
前記したように、本発明によれば、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを用いることを特徴とする、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質のスクリーニング方法が提供される。この方法は、被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とにおける測定結果を比較することを含んでなる。
【０１０８】
本発明のより好ましい態様によれば、前記方法は、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合との間で、結果に相違が出た場合に、その物質をＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質の候補であると決定する工程をさらに含んでなる。
【０１０９】
このスクリーニング方法によれば、ＧＰＲ４０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して被検物質（または被検化合物）をスクリーニングすることができる。すなわち、このスクリーニング方法では、ホスホリパーゼのＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングすることができ、具体的には、ＧＰＲ４０の活性化に影響を与える化合物、より具体的にはＧＰＲ４０の機能を促進する物質（アゴニスト）あるいはＧＰＲ４０の機能を阻害する物質（アンタゴニスト）を、スクリーニングすることができる。
【０１１０】
したがって、被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が上昇する場合には、その被検物質は、ＧＰＲ４０の機能を促進する物質（ＧＰＲ４０アゴニスト）と決定することができる。被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が低下する場合には、その被検物質は、ＧＰＲ４０の機能を阻害する物質（ＧＰＲ４０アンタゴニスト）と決定することができる。
【０１１１】
本発明の好ましい態様によれば、細胞刺激活性の測定は、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化の検出するレポーターアッセイ系により測定するか、細胞内のカルシウムイオンの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変化、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、インスリン分泌活性、および細胞増殖活性からなる群より選択されるパラメータを測定することによって行うことができる。より好ましくは、レポーターアッセイ系や細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を測定することができる。
【０１１２】
本発明においては、例えばＧＰＲ４０を介する細胞内カルシウムイオン濃度の上昇やレポーター遺伝子の転写量の増加を公知の手法で測定すればよく、ＧＰＲ４０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＧＰＲ４０にホスホリパーゼが作用することにより生じる細胞内シグナル伝達、例えば、細胞内カルシウム濃度の上昇作用を利用するものである。
【０１１３】
例えばＧＰＲ４０を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ４０を含む発現ベクターを導入し過剰に発現）した哺乳動物由来細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞）にホスホリパーゼを作用すると細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。
【０１１４】
ＧＰＲ４０の機能を促進する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＧＰＲ４０を介して細胞刺激活性を惹起しうる物質（例えばホスホリパーゼ）に代わり、被検物質を単独で接触させて細胞内の細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する化合物を選択すると良い。
【０１１５】
ＧＰＲ４０の機能を阻害する化合物をスクリーニングする場合には、ホスホリパーゼまたはその塩、および被検物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。ホスホリパーゼの作用で細胞内カルシウムの濃度が上昇するが、被検物質がホスホリパーゼの作用に拮抗する場合には、細胞内カルシウムの濃度の上昇が抑制され。このときには、前記被検物質はＧＰＲ４０の機能を阻害する化合物として選択できる。また、いくつかの報告例にあるように（Kalindjian S.B. et al., Journal of Medicinal Chemistry, vol44 (8), 1125-1133, 2001、 Sharma S. K. et al., Journal of Medicinal Chemistry, vol44, 2073-2079, 2001など）、アンタゴニストとして見出された化合物を基に構造式の変換、合成展開などを行うことにより、アゴニストに変換することも可能である。
【０１１６】
細胞内カルシウム濃度は、例えば、カルシウム蛍光プローブ（例えば、Ｆｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−３など）を用いて測定することができる。また、市販のカルシウム測定キットを使用することもできる。
【０１１７】
本発明においては、また、ＧＰＲ４０を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ４０を含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、またはＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＧＰＲ４０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この場合は、細胞内に種々のシグナルが伝わると前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が促進されることを利用している。
【０１１８】
以下、ＧＰＲ４０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
前記ＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子を導入されている細胞においては、例えば、細胞内のｃＡＭＰの濃度上昇や細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇により、レポーター遺伝子の発現量が増加する。また、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばフォルスコリンなど）で細胞の基礎的なｃＡＭＰ量を増大させておいて活性を測定することもできる。レポーター遺伝子産物の発現量は、細胞培養上清や細胞抽出物に含まれるレポーター遺伝子産物と反応した基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定する方法、もしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定する方法などにより容易に測定することが可能である。
【０１１９】
また、ホスホリパーゼまたはその塩を加えると、細胞内のシグナル伝達の活性化が生じ（例えば細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇）、結果として、レポーター遺伝子産物の発現量が増加する。したがって、ＧＰＲ４０の機能を促進する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＧＰＲ４０を介して細胞刺激活性を惹起しうる物質に代わり被検物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を上昇させる化合物を選択すると良い。
【０１２０】
ＧＰＲ４０の機能を阻害する化合物をスクリーニングする場合には、ホスホリパーゼまたはその塩、および被検物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。また、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばフォルスコリンなど）で細胞の基礎的なｃＡＭＰ量を増大させておいてから活性を測定することもできる。ホスホリパーゼの作用で培養上清中や細胞内のレポーター遺伝子産物の発現量は上昇するが、被検物質がホスホリパーゼの作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現を抑制する。このときには、前記被検物質はＧＰＲ４０の機能を阻害する化合物として選択できる。また、いくつかの報告例にあるように（Kalindjian S.B. et al., Journal of Medicinal Chemistry, vol44 (8), 1125-1133, 2001、 Sharma S. K. et al., Journal of Medicinal Chemistry, vol44, 2073-2079, 2001など）、アンタゴニストとして見出された化合物を基に構造式の変換、合成展開などを行うことにより、アゴニストに変換することも可能である。
【０１２１】
被検物質による作用が、ＧＰＲ４０を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＧＰＲ４０を細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＧＰＲ４０を細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被検物質による作用が、ＧＰＲ４０に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被検物質による作用が、ＧＰＲ４０に対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
【０１２２】
本発明の別の態様によれば、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質として、ホスホリパーゼのＧＰＲ４０への結合性を変化させる物質をスクリーニングすることができる。この場合、本発明によるスクリーニング方法は、被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを接触させ、次いで、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞へのホスホリパーゼまたはその塩の結合量を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とを比較することを含んでなる。このスクリーニング方法によれば、ＧＰＲ４０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに被検化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、この態様の方法が適用可能な場合、この方法により、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングすることができ、具体的には、ホスホリパーゼのＧＰＲ４０への結合性を変化させる化合物を、より具体的には、ＧＰＲ４０の機能を促進もしくは阻害する能力を有する化合物を、スクリーニングすることができる。
【０１２３】
具体的には、被検物質非存在下および被検物質存在下の各条件下において、ＧＰＲ４０と、標識したホスホリパーゼとを接触させ、前記条件下におけるＧＰＲ４０へのホスホリパーゼの特異的結合量を比較することにより、ＧＰＲ４０の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、被検物質非存在下におけるＧＰＲ４０へのホスホリパーゼの特異的結合量に対して、被検物質存在下における前記特異的結合量が低下する場合には、その被検物質は、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質であると、具体的には、ホスホリパーゼのＧＰＲ４０への結合性を変化させる化合物であると、より具体的には、ＧＰＲ４０アゴニストあるいはＧＰＲ４０アンタゴニストであると、決定することができる。
【０１２４】
結合量を測定する場合、ホスホリパーゼまたはその塩は、標識することができる。前記標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［３Ｈ］、［１４Ｃ］、［１２５Ｉ］、［３５Ｓ］などを用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。また、遺伝子工学的手法により、ホスホリパーゼと標識蛋白（例えばＧＦＰなど）のキメラ蛋白を作製し用いることもできる。
【０１２５】
また、ＧＰＲ４０は、インスリン分泌との関連が示唆されていることから、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物をヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、膵臓ランゲルハンス島からのインスリン分泌を指標として解析したり、または、投与後の血中インスリン量、血糖値などを測定することにより、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）、II型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）、糖尿病性の合併症や変性疾患（例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症等）、高血糖、多尿、ケトン血症、アシドーシス、インスリン抵抗性、耐糖能障害、神経変性疾患、インスリノーマ、癌、高インスリン血症、高グリセリド血症、脂肪肝、インスリン過剰分泌による低血糖、動脈硬化、高脂血症、脳卒中、肥満、糖尿病や肥満によって引き起こされる各種疾患などに影響を与える化合物であるか否かを確認および決定することができる。スクリーニングなどの指標としては、例えば、インスリン分泌、血糖値、血中脂質量などを測定する試験などを行うことも有効である。被検物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被検物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。
【０１２６】
本発明に使用する被検物質は、どのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸（オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。
【０１２７】
スクリーニング用キット
本発明によるスクリーニング用キットは、ＧＰＲ４０を含む生体膜、またはそれを含む細胞と、ホスホリパーゼまたはその塩とを少なくとも含んでなる。好ましくは、このキットは、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を変化させる物質をスクリーニングするためのものである。前記スクリーニング用キットは、所望により、本発明によるスクリーニング方法を実施するための種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。
【０１２８】
本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、ホスホリパーゼまたはその塩、およびＧＰＲ４０を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ４０を含む発現ベクターを導入して過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）を含有する細胞とを少なくとも含有する。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばレポーター遺伝子産物（例えば、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼなど）の基質、アデニル酸シクラーゼ活性化剤（例えばフォルスコリン）、結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、コントロールとして、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＧＰＲ４０を細胞膜上に発現していない細胞を含んでいてもよい。
【０１２９】
本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、ホスホリパーゼまたはその塩、およびＧＰＲ４０を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ４０を含む発現ベクターを導入して過剰に発現）した細胞を少なくとも含有する。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばカルシウム蛍光プローブ（例えばＦｕｒａ−２など）、反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、コントロールとしてＧＰＲ４０を細胞膜上に発現していない細胞を含んでいてもよい。
【０１３０】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬
ＧＰＲ４０は、膵臓のβ細胞での高い発現が報告されており、マウス膵臓β細胞由来細胞株ＭＩＮ６や、すい臓の初代培養細胞のからのインスリン分泌促進作用との関連が報告されている（国際公開ＷＯ２００３／０６８９５９号パンフレット, Ito Y et al., Nature, 422 (6928):173-6, 2003）。インスリンは、血糖値の調節や、トリグリセリドの貯蔵、血中脂肪酸の調節などの作用を有する。また、ＧＰＲ４０は、乳がんの増殖に関与していることが報告されている（Hardy S et al., The Journal of Biological Chemistry, 280(14):13285-91, 2005）。さらに、ＧＰＲ４０の発現を低下させたマウスにおいては、肥満によって引き起される高インスリン血症や、脂肪肝、高グリセリド血症などが緩和することが報告されている（Steneberg P et al., Cell Metabolism, 1(4):245-58, 2005）。これらのことから、ＧＰＲ４０が、I型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）、II型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）、糖尿病性の合併症や変性疾患（例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症等）、高血糖、多尿、ケトン血症、アシドーシス、インスリン抵抗性、耐糖能障害、神経変性疾患、インスリノーマ、癌、高インスリン血症、高グリセリド血症、脂肪肝、インスリン過剰分泌による低血糖、動脈硬化、高脂血症、脳卒中、肥満、糖尿病や肥満によって引き起こされる各種疾患などと関連していることが予想される。
【０１３１】
したがって、本発明によるスクリーニング方法により得られる化合物は、I型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）、II型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）、糖尿病性の合併症や変性疾患（例えば、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症等）、高血糖、多尿、ケトン血症、アシドーシス、インスリン抵抗性、耐糖能障害、神経変性疾患、インスリノーマ、癌、高インスリン血症、高グリセリド血症、脂肪肝、インスリン過剰分泌による低血糖、動脈硬化、高脂血症、脳卒中、肥満、糖尿病や肥満によって引き起こされる各種疾患などの治療用の医薬として用いることができる。
【０１３２】
当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は溶媒和物（例えば、水和物、アルコール和物、エーテル和物）を形成していてもよい。ここで「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば好ましくはハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。
【０１３３】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。したがって、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；例えば流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；例えばミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；例えばセトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース等の水溶性高分子；例えばエタノール、イソプロパノール等の低級アルコール；例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；例えばグルコース、ショ糖等の糖；例えば無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどの無機塩；精製水等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記賦形剤としては、例えば乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が挙げられる。結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン���ブロックポリマー、メグルミン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられる。着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが挙げられる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が挙げられる。上記の成分は、その塩またはその水和物であってもよい。
【０１３４】
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約１．０〜１，５００μｇ、好ましくは約１０〜５００μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【０１３５】
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば
（1A）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
（1B）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
（1C）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと等を含む。
【実施例】
【０１３６】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。【０１３７】
実施例１：  ＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドの調製
ヒトＧＰＲ４０（以下、ヒトＧＰＲ４０を、単にＧＰＲ４０またはｈＧＰＲ４０と称することもある。）をコードするポリヌクレオチドの単離のため、配列番号１で表される９０３ｂｐの核酸配列を基にして、常法にしたがって、５’側プライマー（5'-ttgatatcgccgccaccatggacctgcccccgcagct-3'）（配列番号１９）と３’側プライマー（5' -ttacttctgggacttgccccctt-3'）（配列番号２０）とで表されるＰＣＲプライマーを設計した。Human Pancreas QUICK-CloneTM cDNA (クロンテック社)を鋳型にして、配列番号１９と配列番号２０との組合せからなるＰＣＲプライマーと、Expand High Fidelity PCR System（Roche Diagnostics社）とを用い、９４℃５分の後、９４℃１分、５８℃２分、７２℃１分のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃７分の伸張反応を行った。増幅したＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（インビトロジェン社（Invitrogen社））に挿入し、ABI prism DNA sequencing kit（パーキンエルマーアプライドサイエンス社（Perkin-Elmer Applied Biosystems社））により配列を確認した。その結果、ｐＣＲ２．１に挿入された９０３塩基対の配列は、配列番号１における１番目から９０３番目と同一配列であり、ＧＰＲ４０−ｐＣＲ２．１を得ることができた。【０１３８】
実施例２：  レトロウイルスベクタープラスミドの調製
ｐＢａｂｅ  Ｐｕｒｏ(Morgenstern J.P. and Land H. Nucleic Acids Res. 18(12):3587-96, 1990)（配列番号２１）をＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）領域を除いた後、末端をクレノー断片（Klenow fragment）（宝酒造株式会社）により平滑化した。ここへ、ｐＩＲＥＳｈｙｇ（クロンテック社（Clontech社））をＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することにより切り出し、Ｔ４ポリメラーゼ（宝酒造株式会社）により末端を平滑化したＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）領域を挿入し、ｐＢａｂｅＸＩＨを得た。【０１３９】
このｐＢａｂｅＸＩＨをＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより、５’−ＬＴＲ−packaging signalを除いた。ここへ、ｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ社）をＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶ promoter-packaging signalを挿入して、ｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを得た。【０１４０】
実施例３：  ＧＰＲ４０遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
実施例２で得たレトロウイルス発現用プラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを、制限酵素ＨｐａＩで切断した。ここへ実施例１で得たＧＰＲ４０−ｐＣＲ２．１を、ＥｃｏＲＶで切断することにより切り出したＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡを挿入することにより、ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ４０）ＩＨを得た（図１）【０１４１】
実施例４：  ＧＰＲ４０遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製
２×１０６個の２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社（Invitrogen社））を、ＤＭＥＭ培地（シグマ社（Ｓｉｇｍａ社））（１０％ fetal bovine serum（ＦＢＳ）、ペニシリン １００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含む）（以下、「ＥＢＮＡ培養液」と称する）１０ｍｌを用いて、１０ｃｍ径コラーゲンコートディッシュ（旭テクノグラス社）で培養した。翌日、pV−gp（pVpack−GP（ストラタジーン社（Stratagene社））をＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｉｓＤを除きＴ４ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの）、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（ストラタジーン社（Stratagene社））、および実施例３で得た遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ４０）ＩＨ）それぞれ３．３μｇを、リポフェクション試薬であるFuGENE 6 Transfection Reagent（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用い、２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培養液を回収し、１，２００×ｇで１０分間遠心した。その上清を０．４５μｍのフィルター（ミリポア（Millipore）社）でろ過し、ＧＰＲ４０遺伝子導入用レトロウイルスベクターを得た。【０１４２】
実施例５：  サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の構築
（１）  サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーターＤＮＡの作成
Durocher Y et al. Anal Biochem 284(2):316-26, 2000 を参考にサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に応じた転写が見られるユニットを以下のように構築した。
ｃＡＭＰ responsive element（ＣＲＥ）を含むユニットの作成のために、ＣＲＥｘ２ｈｂ用として、配列番号２２（5'-cccaagcttgatatcgaattcgacgtcacagtatgacggcca tgggaattcgacgtcacagtatgacggccatggggatcccg-3'）および，配列番号２３（5'-cgggatccccatggccgtcatactgtgacgtcgaattcccatggccgtcatactgtgacgtcgaattcgatatcaagcttggg-3'）で表されるオリゴＤＮＡを、ＣＲＥｘ２ｂｐ用として配列番号２４（5'-tgcactgcaggaattcccatggccgtcatactgtgacgtcgaattcccatggccgtcata ctgtgacgtcggatcccg-3'）および、配列番号２５（5'-cgggatccgacgtcacagtatgacggccatgggaattcgacgtcacagtatgacggccatgggaattcctgcagtgca-3'）で表されるオリゴＤＮＡを常法に従い作成した。それぞれの組合せから成るオリゴＤＮＡを９５℃に熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖ＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ，およびＣＲＥｘ２ｂｐ）を形成させた。ＣＲＥｘ２ｈｂをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ、ＣＲＥｘ２ｂｐをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化するとともに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ストラタジーン社（Stratagene社））をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化した。消化したＤＮＡを電気泳動して両端に制限酵素部位をもつＤＮＡを精製した後、これら３つのＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋））を一度に連結し（ligation）、得られたプラスミドの配列を解析して、ＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を作成した。【０１４３】
次にＶＩＰ（vasoactive intestinal peptide）プロモーターを含むＤＮＡを得るために、５’側プライマー（5'-tcgactgcagcccatggccgtcatactgtg-3'）（配列番号２６）および、３’側プライマー（5'-tgcactgcaggtcggagctgactgttctgg-3'）（配列番号２７）で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作成した。
ヒトゲノムＤＮＡ（Roche Diagnostics社）を鋳型として、上述の配列番号２６および配列番号２７の組合せからなるＰＣＲプライマーと、組換えＴａｑポリメラーゼ（Takara社）を用いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３５回繰り返すことによりＰＣＲしたところ、２６４ｂｐのＤＮＡ（配列番号２８）が得られた。この２６４ｂｐのＤＮＡをＰｓｔＩで消化するとともにＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＰｓｔＩサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認してＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を作成した（図２）。このＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を、ＨｉｎｄIIIとＳｍａＩで消化した後、得られたＣＲＥ４ＶＩＰプロモーター断片の末端平滑化を行った。【０１４４】
実施例２で得たｐＢａｂｅＣＬＸＩＨよりＩＲＥＳ〜ｈｙｇ（ｒ）領域を除去したｐＢａｂｅＣＬＸを作成した（図３）。ＰＢａｂｅＣＬＸよりレトロウイルス本来のエンハンサー活性（ＬＴＲ）中のＮｈｅＩ〜ＮａｒＩ領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、末端平滑化した上述のＣＲＥ４ＶＩＰプロモーター断片と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ(Placental Alkaline Phosphatase：ＰＬＡＰ)（Goto M et al., Mol. Pharmacol. 49(5):860-73, 1996）を導入し、ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを得た（図４）。【０１４５】
（２）  サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の樹立
サイクリックＡＭＰ応答配列によりレポーター遺伝子ＰＬＡＰが誘導されるレトロウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを用い、実施例４に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローン化して、ＰＬＡＰ誘導の反応性が最も良かったクローン（以下、「ＳＥ３０２」と称する）を以下の実験に供した。【０１４６】
実施例６：  ＧＰＲ４０遺伝子導入ＳＥ３０２細胞の作製
実施例５で構築したＳＥ３０２細胞を、コラーゲンコート６穴プレート（旭テクノグラス社）に１穴当たり１．２×１０５個になるように播種した。培地はＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社））（１０％  ＦＢＳ、ペニシリン １００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含む）を用いた。翌日、実施例４で得たＧＰＲ４０含有ウイルスベクター液、および、最終濃度８μｇ／ｍｌのpolybrene（別名 hexadimethrine bromide, Ｓｉｇｍａ社）をＳＥ３０２細胞に加えた。３５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（インビトロジェン社（Invitrogen社））含有の培養液で培養し、この条件で増殖してきた細胞をＧＰＲ４０遺伝子導入ＳＥ３０２細胞（以下、「ＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞」と称する）として実験に供した。【０１４７】
実施例７：  ＧＰＲ４３遺伝子導入ＳＥ３０２細胞の作製
（１）ＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドの調製
ヒトＧＰＲ４３（以下、ヒトＧＰＲ４３を、単にＧＰＲ４３と称することもある。）をコードするポリヌクレオチドの単離のため、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００５３０６を参考にして、配列番号２９で表される９９３ｂｐの核酸配列を基にして、常法にしたがって、５’側プライマー（5'-ttaagcttgccgccaccatgctgccggactggaagagct-3'）（配列番号３０）と３’側プライマー（5'-ctactctgtagtgaagtccgaa-3'）（配列番号３１）とで表されるＰＣＲプライマーを設計した。Human Lung QUICK-CloneTM cDNA (クロンテック社)を鋳型にして、配列番号３０と配列番号３１との組合せからなるＰＣＲプライマーと、Expand High Fidelity PCR System（ロシュ ジアグノスティックス社（Roche Diagnostics社））とを用い、９４℃５分の後、９４℃１分、５８℃２分、７２℃１分のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃７分の伸張反応を行った。増幅したＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（インビトロジェン社（Invitrogen社））に挿入し、ABI prism DNA sequencing kit（パーキンエルマーアプライドサイエンス社（Perkin-Elmer Applied Biosystems社））により配列を確認した。その結果、ｐＣＲ２．１に挿入された９９３塩基対の配列は、配列番号２９における１番目から９９３番目と同一配列であり、ＧＰＲ４３−ｐＣＲ２．１を得ることができた。【０１４８】
（２）ＧＰＲ４３遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
実施例２で得たレトロウイルス発現用プラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを、制限酵素ＨｐａＩで切断した。ここへ上記（１）で得たＧＰＲ４３−ｐＣＲ２．１を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、末端を平滑化することにより得たＧＰＲ４３をコードするｃＤＮＡを挿入することにより、ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ４３）ＩＨを得た。【０１４９】
（３）ＧＰＲ４３遺伝子導入ＳＥ３０２細胞の作製
上記（２）で得られたｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ４３）ＩＨプラスミドを、実施例４記載の方法に従い、ｐＶ−ｇｐ、および、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Stratagene社）と共に２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社（Invitrogen社））にトランスフェクションした。２４時間後に培養上清を回収し、得たＧＰＲ４３遺伝子導入用レトロウイルスベクター液を、実施例６記載と同様の方法でＳＥ３０２細胞に感染させた。３５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（インビトロジェン社（Invitrogen社））含有の培養液で培養し、この条件で増殖してきた細胞をＧＰＲ４３遺伝子導入ＳＥ３０２細胞（以下、「ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞」と称する）として実験に供した。【０１５０】
実施例８：  遺伝子導入ＳＥ３０２細胞における転写活性の測定
前記実施例６、７で構築したＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞を、転写活性測定用培地（ＤＭＥＭに、６５℃にて３０分熱処理したＦＢＳを最終濃度１０％になるように加えたもの）にて懸濁した後、９６穴プレート（ベクトンディッキンソン社）に、１×１０４細胞／ｗｅｌｌで播種した。また、コントロール細胞としては、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ、インビトロジェン社（Invitrogen社））を発現させたＳＥ３０２細胞（以下、「ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞」）を用いた。具体的には、実施例３、４に示す方法にＧＦＰ発現用ウイルス得た後、実施例６に示す方法でＳＥ３０２に感染させてＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞を作製した。細胞播種２４時間後、最終濃度０．３μＭとなるように調製したフォルスコリンおよび試料を添加した。更に２４時間培養後、細胞上清を５μｌ回収してポリプロピレン製３８４穴ホワイトプレート（ナルジェヌンクインターナショナル株式会社）に移し、２０μｌのアッセイ用緩衝液（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３、８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ１０）および２５μｌのＬｕｍｉｐｈｏｓ５３０（ルミジェン社（Lumigen社））を添加した。室温で２時間反応させた後、各穴の化学発光をＦｕｓｉｏｎプレートリーダー（パーキンエルマー社（Perkin Elmer社））にて測定し、転写活性量とした。この測定値をもとにして、転写活性量促進／抑制を以下に示した式（Ｉ）で計算し、［％ of control］で表した。試料添加群の活性は、それぞれのプレート毎に設置した対照の値を用いて算出した。【０１５１】
［％ of control］  ＝  （Ｘ−Ｃ）／（Ｆ−Ｃ）ｘ１００        （Ｉ）
ここで、上記式中、
Ｘ：  試料添加群のＰＬＡＰ転写活性
Ｆ：  ポジティブコントロール（試料無添加、フォルスコリン刺激あり）の２穴のＰＬＡＰ転写活性の平均値
Ｃ：  ネガティブコントロール（試料無添加、フォルスコリン刺激なし）の２穴のＰＬＡＰ転写活性の平均値
である。【０１５２】
実施例９：  市販ブタ膵臓由来ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
ブタ膵臓由来ｓＰＬＡ２（Phospholipase A2 from porcine pancreas (ammonium sulfate suspension using soybean L-α-phosphatidylcholine) ６００ユニット／ｍｇ protein，シグマ社（Ｓｉｇｍａ社））を遠心後、ペレットを水に溶かし、実施例８に記載する方法にしたがってＰＬＡＰ活性を測定した。図５に示すように、ＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞において濃度依存的なＰＬＡＰ活性の上昇が検出されたが、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２細胞、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞ではＰＬＡＰ活性の上昇が検出されなかった。このブタ膵臓由来ｓＰＬＡ２は、主に Group IB secretory phospholipase A2（ＧＩＢ−ｓＰＬＡ２）（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５９２）であることが確認されていることから（Ta-min Chang et al., J. Biol. Chem. 274(16):10758-10764, 1999）、ＧＰＲ４０がＧＩＢ−ｓＰＬＡ２によって活性化されることが示された。【０１５３】
実施例１０：  ヒトおよびマウスのＧＸ−ｓＰＬＡ２の前駆体をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒト、およびマウスGroup X secretory Phospholipase A2（ＧＸ−ｓＰＬＡ２）の前駆体をコードするｃＤＮＡを以下に示す方法にしたがって行った。【０１５４】
（１）  ヒトＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２）の前駆体をコードするｃＤＮＡのクローニング
ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２の前駆体をコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号１３（GenBank アクセッション番号ＮＭ＿００３５６１）であらわされる核酸配列を基にして、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２のコード領域４４１番目から９３８番目に対してｇｋプライマーを設計し５’側プライマー（5'-atggggccgctacctgtgtgcctgcc-3'）（配列番号３２）、および、３’側プライマー（5'-tcagtcacacttgggcgagtccggc-3'）（配列番号３３）、Human Lung QUICK-Clone cDNA（クロンテック社）を鋳型として、ＰＣＲを行った。FastStart High Fidelity PCR System（ロシュ・ジアグノスティックス社（Roche Diagnostics社））を用い、９４℃５分の後、９４℃１分、６１℃１分、７２℃３分のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃７分の伸張反応を行った。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（インビトロジェン社（Invitrogen社））に挿入し配列を確認したところ、挿入された４９８塩基対の配列は、配列番号１３における４４１番目から９３８番目と同一配列であり、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を得ることができた。【０１５５】
（２）  マウスＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２）をコードするｃＤＮＡのクローニング
ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２をコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＮＭ＿０１１９８７）であらわされる核酸配列を基にして、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２のコード領域１７５番目から６３０番目に対してプライマー５’側プライマー（5'-atgctgctgctactgctgctgttgc-3'）（配列番号３４）、および、３’側プライマー（5'-tcaattgcacttgggagagtccttc-3'）（配列番号３５）を設計した。鋳型なるｃＤＮＡは、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊマウス（日本チャールズリバー株式会社）から摘出した大腸より、RNeasy Mini kit （キアゲン社（QIAGEN社））を用いて抽出したＲＮＡを、TaqMan Reverse Transcription Reagents（アプライドバイオシステムズ社）を用い２５℃１０分、４８℃６０分、９５℃１０分逆転写することにより得た。FastStart High Fidelity PCR System（Roche Diagnostics社）を用い、９４℃５分の後、９４℃１分、５８℃１分、７２℃３分のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃７分の伸張反応を行った。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（インビトロジェン社（Invitrogen社））に挿入し配列を確認したところ、挿入された４５６塩基対の配列は、配列番号１４における１７５番目から６３０番目と同一配列であり、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を得ることができた。【０１５６】
実施例１１：  Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２（ＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６）のクローニング
Ｃ末Ｈｉｓタグ付きヒトＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６）は、実施例１０で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を鋳型として５’側プライマー（5'-gatatcgccgccaccatggggccgctacctgtg-3'）（配列番号３６）および３’側プライマー（5'-gatatctcaatggtgatggtgatgatggtcacacttgggcgagtc-3'）（配列番号３７）を用いてＰＣＲを行った。同様に、Ｃ末Ｈｉｓタグ付きマウスＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６）は、実施例１０で得たｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を鋳型として、５’側プライマー（5'-gatatcgccgccaccatgctgctgctactgctg-3'）（配列番号３８）および３’側プライマー（5'-gatatctcaatggtgatggtgatga tgattgcacttgggagagtc-3'）（配列番号３９）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、FastStart High Fidelity PCR System（ロシュ ジアグノスティックス社（Roche Diagnostics社））を用い、９４℃５分の後、９４℃１分、６１℃１分（ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２の場合）もしくは５８℃１分（ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２の場合）、７２℃３分のサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃７分の伸張反応を行った。得られたＰＣＲ産物をそれぞれｐＣＲ２．１（インビトロジェン社（Invitrogen社））に挿入し、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＣＲ２．１およびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＣＲ２．１を得た。【０１５７】
実施例１２：  Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２の遺伝子導入用バキュロウイルスの作製
Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２の遺伝子導入用バキュロウイルスは、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ Baculovirus Expression Systems（インビトロジェン株式会社）を用いて、キットに含まれるマニュアルに従って作製した。具体的には、実施例１１で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６―ｐＣＲ２．１、および、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＣＲ２．１を、制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じくＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩで切断しておいたｐＦＡＳＴＢＡＣ１プラスミドに挿入することにより、それぞれｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＦＡＳＴＢＡＣおよび、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ６−ｐＦＡＳＴＢＡＣを得た。これらプラスミドを、キット付属のＤＨ１０ＢＡＣコンピテントセルにトランスポジションすることにより、バクミドＤＮＡを回収した。バクミドＤＮＡを、ＳＦ９００ ＩＩ ＳＦＭ（インビトロジェン社）で培養したＳｆ９細胞に、セルフェクチン試薬（インビトロジェン社）を用いてトランスフェクションし、３日後に培養上清を回収することにより、ヒトおよびマウスＣ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２遺伝子導入用バキュロウイルスを得た。【０１５８】
実施例１３：  Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２の精製
実施例１２で得たヒトおよびマウスＣ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２遺伝子導入用バキュロウイルスを、それぞれＳｆ９細胞に感染させ、三角フラスコ中で振とう培養を行った。６０時間後に培養液を遠心することにより培養上清を得た。培養上清に最終濃度 １０ ｍＭ イミダゾール（シグマ社（Ｓｉｇｍａ社））を加え、 Ni Sepharose 6 Fast Flow カラム（アマシャムバイオサイエンス社）に付した。カラムの５倍量のＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄した後、溶出バッファー（Elution Buffer）（５００ｍＭ イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で溶出した。溶出液を０．１％ ＴＦＡで５倍希釈した後、HF MEGA BOND ELUTE C18カラム（バリアン社）に付した。カラムを、０．１％ ＴＦＡを含む５０％ アセトニトリルで溶出し、凍結乾燥により、ヒトおよびマウスの精製Ｃ末Ｈｉｓタグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２（それぞれ、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ、および、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ）を得た。【０１５９】
実施例１４：  Ｃ末Ｈｉｓタグ付きマウスＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２におけるＰＬＡＰ活性の測定
実施例１３で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＨｉｓおよびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓの凍結乾燥粉末を、適量の０．１％ ＴＦＡ溶液に溶かした。これらを用いて、実施例８記載の方法によりＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。図６に示すように、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ（図６−Ａ）および、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−Ｈｉｓ（図６−Ｂ）の濃度に応じて、ＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞おけるＰＬＡＰ活性の上昇が観察されたが、ＧＦＰ−ＳＥ３０２細胞においては特異的なＰＬＡＰ活性の上昇は観察されなかった。このことから、ＧＰＲ４０がヒトおよびマウスのＧＸ−ｓＰＬＡ２によって活性化されることが明らかになった。  【０１６０】
実施例１５：  市販ハチ毒ＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
ハチ毒ＰＬＡ２（ｂｖＰＬＡ２）（Phospholipase A2 from honey bee venom (salt-free, lyophilized powder, 600〜1800ユニット／ｍｇ protein)、シグマ社（Ｓｉｇｍａ社））を水に溶かし、実施例８に記載する方法にしたがってＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。図７に示すように、ＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞において、濃度依存的にＰＬＡＰ活性の上昇が検出されたが、ＧＦＰ−ＳＥ３０２およびＧＰＲ４３−ＳＥ３０２においてはＰＬＡＰ活性の上昇は観察されなかった。このことから、ＧＩＢ−ｓＰＬＡ２、ＧＸ−ｓＰＬＡ２などの分泌型ＰＬＡ２のみではなく、ハチ毒由来のＰＬＡ２によってもＧＰＲ４０が活性化されることが示された。【０１６１】
実施例１６：  市販ヘビ毒ＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
ヘビ毒ＰＬＡ２（snake venom ＰＬＡ２）(Phospholipase A2 from Naja mossambica mossambica, lyophilized powder, 〜1,500 units/mg protein, pH 8.9, 25℃ (using soybean L-α-phosphatidylcholine)、シグマ社（Ｓｉｇｍａ社））を水に溶かし、実施例８に記載する方法にしたがってＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。図８に示すように、ＧＦＰ−ＳＥ３０２およびＧＰＲ４３−ＳＥ３０２と比較して、ＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞において、濃度依存的なＰＬＡＰ活性の顕著な上昇が検出された。このことから、ヘビ毒由来ＰＬＡ２によっても、ＧＰＲ４０が活性化されることが示された。【０１６２】
実施例１７：  市販ハチ毒ＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞における細胞内カルシウム濃度変化の測定
１ｍＭ  Ｆｕｒａ２-ＡＭ（Ｄｏｊｉｎ）２０μｌを、５ ｍＬのアッセイバッファー （Ｈａｎｋｓ液に、10 mM HEPES (pH 7.4), ０．０５％グルコース、２．５ ｍＭ プロベネシドを加えたもの）で希釈した。約５×１０７個のＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞をトリプシンで処理し、遠心した後、上記のＦｕｒａ−２含有アッセイバッファーに懸濁し、室温で２時間、振とう培養をおこなった。その後、遠心にて細胞を回収し、８×１０５個/１００μｌの細胞が含まれるようにアッセイバッファーに懸濁し、Blak walled ９６-well plate with half area (コーニング社)に、１穴あたり５０μｌずつ分注した。別の９６wellプラスチックプレート（ファルコン社）に、実施例１５で用いたハチ毒ＰＬＡ２（ｂｖＰＬＡ２）（Phospholipase A２ from honey bee venom、シグマ社（Ｓｉｇｍａ社））溶液を分注し、ＦＤＳＳ-６０００（浜松フォトニクス社）にセットした。ＦＤＳＳ-６０００で蛍光読み取り開始後１０秒後にリガンドが添加されるようにプログラムし、蛍光の経時変化を調べた。図９（Ａ）に示すように、ＧＰＲ４０発現細胞において、ハチ毒ＰＬＡ２添加後により蛍光の変化が観察されたことから、細胞内カルシウム濃度が変化していることが示唆された。また、０．１，０．３，１．０，３．０μｇ／ｍｌのハチ毒ＰＬＡ２によりＧＰＲ４０の蛍光は濃度依存的に変化した（図９（Ａ））。一方、ＧＰＲ４３発現細胞においては、０．１，０．３，１．０，３．０μｇ／ｍｌのハチ毒ＰＬＡ２いずれの濃度を存在させた場合にも、蛍光の変化は観察されなかったことから（図９（Ｂ））、ハチ毒ＰＬＡ２がＧＰＲ４０特異的に細胞内カルシウム濃度を変化させることが示唆された。【０１６３】
実施例１８：  Ｃ末ＦＬＡＧ タグ付きＧＸ−ｓＰＬＡ２のｃＤＮＡクローニング
Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きヒトＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ）は、実施例１０で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を鋳型として配列番号３６に示す５’側プライマー、および、３’側プライマー（5'-gatatctcacttgtcatcgtcgtccttgtagtcgtcacacttgggcga-3'）（配列番号４０）を用いてＰＣＲを行うことにより得た（配列番号４１）。同様に、Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きマウスＧＸ−ｓＰＬＡ２（ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ）は、実施例１０で得たｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ｐＣＲ２．１を鋳型として配列番号３８に示す５’側プライマー、および、３’側プライマー（5'-gatatctcacttgtcatcgtcgtccttgtagtcattgcacttgggaga-3'）（配列番号４２）のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得た（配列番号４３）。得られたＰＣＲ産物を再びｐＣＲ２．１（インビトロジェン社）に挿入して、それぞれ、ｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＣＲ２．１およびｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＣＲ２．１を得た。【０１６４】
実施例１９：  Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
実施例１８で得たｈＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＣＲ２．１を、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、切り出したフラグメントをｐＹＮＧベクター（片倉工業株式会社）のＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングした。タンパク質産生サービス（Superworm（商標） system）（片倉工業株式会社）に受託し、カイコサナギ抽出液を得た。カイコサナギ抽出液をＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（商標） M2 Agarose（シグマ社）に付し、付属のマニュアルに従い精製を行った。ｓＰＬＡ２酵素活性は、ｓＰＬＡ２アッセイ・キット（Cayman Chemical 社）を用いて付属のマニュアルに従い行った。活性分画をＶＹＤＡＣ（商標） Protein ＆ Peptide C18カラム（＃２１８ＴＰ５４、ＶＹＤＡＣ社）に付した後、０．１％  ＴＦＡを含む２４〜４２％アセトニトリルの濃度勾配により溶出した。得られたピークのうち、もっとも比活性の高かったシングルピークをレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２として、ＰＬＡＰアッセイに用いた。なお、レコンビナントの蛋白濃度は、Ｄｃプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ社）を用い測定した。得られたレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２を０．１％ＴＦＡに溶かし、実施例８に記載する方法にしたがってＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。
図１０に示すように、ＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞において濃度依存的にＰＬＡＰ活性の上昇が検出されたが、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２ではＰＬＡＰ活性の上昇が検出されなかった。このことから、Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きｈＧＸ−ｓＰＬＡ２によってもＧＰＲ４０が活性化されることが示された。【０１６５】
実施例２０：  Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きレコンビナントｍＧＸ−ｓＰＬＡ２を用いたＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞のＰＬＡＰ活性の測定
実施例１８で得たｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＣＲ２．１を、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで消化し、切り出したフラグメントをｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）のＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトにサブクローニングし、ｍＧＸ−ｓＰＬＡ２−ＦＬＡＧ−ｐＦＡＳＴ Ｂａｃを得た。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（商標）バキュロウイルス発現系（Bac-to-Bac Baculovirus Expression System）（インビトロジェン社）を用いてバキュロウイルスを得た後、昆虫細胞Ｓｆ−９感染させた。Ｓｆ−９細胞は、ＳＦ−９００II培地（インビトロジェン社）（ペニシリン／ストレプトマイシン、２．５％  ＦＣＳ）を用いて培養した。バキュロウイルス感染Ｓｆ−９細胞培養上清をＡＮＴＩ−ＦＬＡＧＲ M2 Agarose（シグマ社）に付し、付属のマニュアルに従い精製を行った。ｓＰＬＡ２酵素活性は、ｓＰＬＡ２アッセイ・キット（Cayman Chemical 社）を用いて付属のマニュアルに従い行った。活性分画をＶＹＤＡＣ（商標） Protein & Peptide C18カラム（＃２１８ＴＰ５４、ＶＹＤＡＣ社）に付した後、０．１％ ＴＦＡを含む２４〜５４％アセトニトリルの濃度勾配により溶出した。得られたピークのうち、もっとも比活性の高かったシングルピークをレコンビナントｈＧＸ−ｓＰＬＡ２として、ＰＬＡＰアッセイに用いた。なお、レコンビナントの蛋白濃度は、Ｄｃプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ社）を用い測定した。得られたレコンビナントｍＧＸ−ｓＰＬＡ２を０．０５％ ＴＦＡ、１％ ＢＳＡ（Fatty Acid Free、シグマ社））に溶かし、実施例８に記載する方法にしたがってＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞におけるＰＬＡＰ活性を測定した。
図１１に示すように、ＧＰＲ４０−ＳＥ３０２細胞において濃度依存的にＰＬＡＰ活性の上昇が検出されたが、ＧＰＲ４３−ＳＥ３０２、および、ＧＦＰ−ＳＥ３０２ではＰＬＡＰ活性の上昇が検出されなかった。このことから、Ｃ末ＦＬＡＧタグ付きｍＧＸ−ｓＰＬＡ２によってもＧＰＲ４０が活性化されることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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