(57)【要約】  ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株のようなトランスバクセン酸生成能を有する微生物、及びビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株のようなトランスバクセン酸取り込み能を有する微生物とを含有することを特徴とする家畜用飼料添加物を提供する。この家畜用飼料添加物は、ルーメン内でのトランスバクセン酸の更なる水素添加を妨げ、トランスバクセン酸の蓄積量を増大させ、家畜の肉及び乳中の共役リノール酸量を増大させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不飽和化合物又は不飽和化合物生成能を有する微生物、及び不飽和化合物取り込み能を有する微生物を含有することを特徴とする家畜用飼料添加物。
【請求項２】
不飽和化合物生成能を有する微生物がトランスバクセン酸生成能を有する微生物であり、不飽和化合物取り込み能を有する微生物がトランスバクセン酸取り込み能を有する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の家畜用飼料添加物。
【請求項３】
トランスバクセン酸生成能を有する微生物が、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株又はその変異株であることを特徴とする請求項２に記載の家畜用飼料添加物。
【請求項４】
トランスバクセン酸取り込み能を有する微生物が、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株又はその変異株であることを特徴とする請求項２又は３に記載の家畜用飼料添加物。
【請求項５】
家畜が、反芻動物であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の家畜用飼料添加物。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の家畜用飼料添加物を含む家畜用飼料。
【請求項７】
不飽和化合物を還元する微生物が存在する環境で、不飽和化合物生成能を有する微生物と不飽和化合物取り込み能を有する微生物を培養し、培養物から不飽和化合物を採取することを特徴とする不飽和化合物の生産方法。
【請求項８】
不飽和化合物が、トランスバクセン酸であることを特徴とする請求項７に記載の不飽和化合物の生産方法。
【請求項９】
トランスバクセン酸生成能を有するブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株。
【請求項１０】
トランスバクセン酸取り込み能を有するビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、家畜用飼料添加物、家畜用飼料、不飽和化合物の生産方法、及びこれらに利用可能な新規菌株に関する。本発明の家畜用飼料添加物を牛などに与えることにより、牛乳及び牛肉中の共役リノール酸量を増大させることができる。また、本発明の不飽和化合物の生産方法を利用することにより、不飽和化合物を還元する微生物が存在する環境下であっても、不飽和化合物を効率的に生産することができる。
【背景技術】
【０００２】
リノール酸(LA; cis9, cis12-C18:2)の異性体である共役リノール酸(CLA)は生理活性物質として多大な注目を集めているが、特にcis9, trans11-CLA (c9, t11-C18:2)は、抗癌作用 (Pariza and Hargraves, 1985; Chin et al., 1992)、抗腫瘍形成作用 (Ha et al., 1990; Ip et al., 1991)、抗動脈硬化作用(Lee et al., 1994)、免疫機能賦活化(Cook et al., 1993; Miller et al., 1994)、高インスリン血症の改善(Houseknecht et al., 1998)など、種々の健康増進作用を持つことが明らかにされている(Pariza, 2004; Wahle et al., 2004)。CLAには体脂肪低減効果もあると報告されているが(Nicolosi et al., 1997)、最近の報告では、このような作用はc10, t12-CLAでは確認されているけれども、c9, t11-CLAではあまり顕著ではないようである（Perfield et al., 2004; Wang and Jones, 2004）。最近、c10, t12-CLAは健康にとって好ましくない影響を与える可能性があると指摘されている(Rajakangas et al., 2003; Wahle et al., 2004)。【０００３】
CLA含量が高い食品としては、牛乳と牛肉があるが、その中の主要なCLA異性体は c9, t11-CLAであり、これは反芻動物の第一胃（ルーメン）内微生物によるLAの異性化反応により生成される(Harfoot and Hazlewood, 1997)。反芻動物ではこのCLAの一部がそのまま小腸に流下して吸収されるが、ルーメン内ではCLAの大半が微生物による還元（水素添加）反応を受けてトランスバクセン酸(t-VA;t11-C18:1)になり、更にその大半が更なる水素添加を受けてステアリン酸(SA; C18:0)になる。しかし、t-VAの段階で小腸に流下すれば、体内に吸収された後、Δ9不飽和化酵素によってCLAに再合成される(Griinari et al., 2000)。【０００４】
最近、牛乳中のc9, t11-CLA の78〜93％が体組織中のΔ9不飽和化酵素によってt-VAから生成されると報告された(Corl et al., 2001; Piperova et al., 2002)。また、肉中のCLA含量も、t-VAの吸収量を増加させれば増加するものと考えられている(Daniel et al., 2004)。従って、ルーメン内でのt-VA生成を増加させ、しかもそれが更なる水素添加を受けないようにすれば、乳・肉中のc9, t11-CLA 含量を増加させ得るであろう。【０００５】
乳・肉中のCLAを増加させる試みとして、飼料に大豆油、コーン油、ピーナッツ油、ひまわり油、亜麻仁油、魚油などを添加したところ、ルーメン内でのt-VA生成量が増加し、その結果乳・肉中のc9, t11-CLA 含量が増加したという報告がある (Dhiman et al., 2000; Chouinard et al., 2001; Duckett et al., 2002) 。このような作用については、多価不飽和脂肪酸は微生物の増殖を抑制するため(Harfoot and Hazlewood, 1997)、油脂の添加がルーメン内の水素添加菌の活性や増殖を阻害した可能性がある。モネンシンなどのイオノフォア（Fellner et al., 1997; Sauer et al., 1998）や銅（Morales et al., 2000）などの添加によっても同様の効果が観察されているが、これも結局は水素添加菌が阻害された結果であろうと考えられる。このような、菌の増殖を抑えるような手段を用いると、繊維消化率の低下などの悪影響が生じる可能性もあるので、好ましくない（Hino and Asanuma, 2003）。【０００６】
LAをt-VAに水素添加する菌として、現在までに種々の菌が報告されているが、その中でも特にその能力が高いのはブチリビブリオ・フィブリソルベンス(Butyrivibrio fibrisolvens)である(Kepler et al., 1966; Eyssen and Verhulst, 1984; Jiang et al., 1998; Kim et al., 2002)。本菌はLA異性化酵素(LA-I)によりLAをc9, t11-CLAへと異性化し、続いてCLA還元酵素(CLA-R)によりCLAをt-VAに還元する(Kepler et al., 1966)。本発明者はLA-I活性とCLA-R活性の両方が高い、つまりt-VA生成能の高いブチリビブリオ・フィブリソルベンスの新菌株(TH1株)を発見している（非特許文献１）。上述のように、c10, t12-CLAは健康にとって好ましくない影響を与える可能性があるし(Wahle et al. 2004)、乳牛の場合は乳脂肪を低下させるので（Peterson et al., 2004）、t-VA生成能の高いブチリビブリオ・フィブリソルベンスはc9, t11-CLAのみの生成を増加させるという目的には貴重な菌である。【０００７】
【非特許文献１】Fukuda, S., H. Furuya, Y. Suzuki, N. Asanuma, and T. Hino. 2005. A new strain of Butyrivibrio fibrisolvens that has high ability to isomerize linoleic acid to conjugated linoleic acid. J. Gen. Appl. Microbiol. 51:105-113.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したようにt-VA生成能の高い菌株は幾つか知られている。しかし、生成したt-VAはルーメン内の水素添加菌によってステアリン酸に還元されてしまうため、t-VA生成能の高い菌株を牛に与えるだけでは、牛肉及び牛乳中のCLA量を増大させることはできない。【０００９】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、t-VAのルーメン内での更なる水素添加を妨げ、t-VAの蓄積量を増大させる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、t-VA生成菌と共にt-VA取り込み能を持つ菌をルーメン内に投与することにより、t-VAのステアリン酸への還元を防止し、ルーメン内のt-VAの蓄積量を増大させ得ることを見出した。また、従来知られているt-VA生成菌よりも更に生成能の高い微生物も見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。【００１１】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１０）を提供するものである。【００１２】
（１）不飽和化合物又は不飽和化合物生成能を有する微生物、及び不飽和化合物取り込み能を有する微生物を含有することを特徴とする家畜用飼料添加物。【００１３】
（２）不飽和化合物生成能を有する微生物がトランスバクセン酸生成能を有する微生物であり、不飽和化合物取り込み能を有する微生物がトランスバクセン酸取り込み能を有する微生物であることを特徴とする（１）に記載の家畜用飼料添加物。【００１４】
（３）トランスバクセン酸生成能を有する微生物が、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株又はその変異株であることを特徴とする（２）に記載の家畜用飼料添加物。【００１５】
（４）トランスバクセン酸取り込み能を有する微生物が、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株又はその変異株であることを特徴とする（２）又は（３）に記載の家畜用飼料添加物。【００１６】
（５）家畜が、反芻動物であることを特徴とする（１）乃至（４）のいずれかに記載の家畜用飼料添加物。【００１７】
（６）（１）乃至（５）のいずれかに記載の家畜用飼料添加物を含む家畜用飼料。【００１８】
（７）不飽和化合物を還元する微生物が存在する環境で、不飽和化合物生成能を有する微生物と不飽和化合物取り込み能を有する微生物を培養し、培養物から不飽和化合物を採取することを特徴とする不飽和化合物の生産方法。【００１９】
（８）不飽和化合物が、トランスバクセン酸であることを特徴とする（７）に記載の不飽和化合物の生産方法。【００２０】
（９）トランスバクセン酸生成能を有するブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株。【００２１】
（１０）トランスバクセン酸取り込み能を有するビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の家畜用飼料添加物及び家畜飼料を牛などに与えることにより、牛乳及び牛肉中のCLA量を増大させることができる。また、本発明の不飽和化合物の生産方法により、不飽和化合物を還元する微生物が存在する環境であっても、不飽和化合物を効率的に生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】混合ルーメン微生物（総生菌数、2 x 1011 cfu/ml）のバッチ法培養におけるt-VAの水素添加の抑制に及ぼすブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株およびビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株の添加の影響を示した図。Aは無添加区(対照区)、Bはブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株(2 x 109 cfu/ml) 添加区、Cは ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株 (2 x 109 cfu/ml) およびビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株 (2 x 109 cfu/ml) 添加区をそれぞれ示す。また、○はLA、◇はCLA、▲はt-VA、□はSAをそれぞれ示す。
【図２】t-VA 添加区(レーン 2) および無添加区(レーン1) のブチリビブリオ・フィブリソルベンスHF-11株の菌体脂質の薄層クロマトグラム。t-VA添加区の脂質を弱アルカリ加水分解 (0.1N NaOH, 100℃, 1 時間) したものを レーン3に着点した。展開溶媒は、Aについてはクロロホルム＋アセトン (96:4)を使用し、Bについてはクロロホルム＋メタノール (95:5)を使用した。標準物質 (Std)はトリオレイン (TG)、オレイン酸 (遊離FA)、ジオレイン (DG; 1,3-DG および 1,2-DGの混合物)、1-モノオレイン (1-MG)、2-モノオレイン (2-MG)、および ホスファチジルコリン (PL) を含み、それぞれシグマ社から購入した。
【図３】混合ルーメン微生物の連続培養における流出液中のt-VA量に及ぼすブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10 株およびビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株の添加効果を示す図(開始当初の生菌総数, 1 x 1011 cfu/ml)。Aは両菌とも無添加の区 (対照区)、Bはブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10 株 (1 x 109 cfu/ml) の添加区、Cはブチリビブリオ・フィブリソルベンス(1 x 109 cfu/ml) および ビフィドバクテリウム・アドレセンティス (1 x 109 cfu/ml)の添加区をそれぞれ示す。  LA、炭水化物、および タンパク質を 6 時間ごとに添加し、LA添加後0-1, 2-3, および5-6 時間の間に流出したLA (○), t-VA(▲), および SA(□) の量をプロットした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。【００２５】
本発明の家畜用飼料添加物は、不飽和化合物生成能を有する微生物、及び不飽和化合物取り込み能を有する微生物を含有することを特徴とするものである。また、不飽和化合物生成能を有する微生物の代わりに、不飽和化合物自体を含んでいてもよい。【００２６】
不飽和化合物としては、まずt-VAを挙げることができる。【００２７】
使用するt-VA生成能を有する微生物は特に限定されず、例えば、ブチリビブリオ属の微生物を使用でき、また、ユウバクテリウム（Eubacterium）属（Eyssen et al., 1984）、フソバクテリウム（Fusobacterium）属（Harfoot et al., 1997）、メガスフェラ（Megasphaera）属（Kim et al., 2002 ）の微生物なども使用できる。ブチリビブリオ属の微生物としては、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスに属する微生物を使用できる。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスに属する菌株としては、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスTH1株（Fukuda et al., 2005）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスATCC19171株（Fukuda et al., 2005）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスATCC51255株（Fukuda et al., 2005）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスA38株（Fukuda et al., 2005）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスOB156株（Fukuda et al., 2005）などを例示でき、それらの中でもブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株を使用することが好ましい。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株は、本発明者によって分離された菌株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-10540として寄託されている（受託日：2005年7月8日）。また、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株の代わりに、この菌株の変異株を用いてもよい。ここで「変異株」とは、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株を起源とする菌株であって、一つ以上の菌学的性質において前記菌株と異なる菌株をいう。【００２８】
使用するt-VA取り込み能を有する微生物も特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、エシェリキア（Escherichia）属、ラクトバチルス属（Lactobacillus）などの腸内細菌を使用することができる。腸内細菌の中では、ビフィドバクテリウム属に属する微生物を使用するのが好ましく、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）に属する微生物を使用するのが特に好ましい。ビフィドバクテリウム・アドレセンティスの微生物の中では、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株を使用することが好ましい。ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株は、本発明者によって分離された菌株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-10539として寄託されている（受託日：2005年7月8日）。また、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株の代わりに、この菌株の変異株を用いてもよい。「変異株」の意味は、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株の場合と同様である。【００２９】
t-VA以外の不飽和化合物としては、共役リノール酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸などの不飽和脂肪酸やビタミンA、β-カロチン、キサントフィルなどのカロチノイド類などを挙げることができる。これらの化合物の生成菌や取り込み菌は、幾つか知られている。例えば、共役リノール酸生成能を有する微生物としては、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスに属する菌株（MDT-5株）が本発明者によって単離されている。また、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸の生成能を有する微生物としては、ビブリオ（Vibrio）属 T3615株（Yano et al., 1994）、モリテラ・マリナ（Moritella marina）（Morita et al., 2005）、シュワネラ・マリニンテスティナ（Shewanella marinintestina）（Morita et al., 2005）などの深海微生物やラビリンチュラと総称される藻類様海洋微生物（秋庸裕・小埜和久. 2005. 海洋微生物による有用脂質の生産と応用, Foods Food Ingredients J. Jpn., 210: 758-764.）などが知られている。また、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸の取り込み能を有する微生物としては、シュワネラ・ベンティカ（Shewanella benthica）、シュワネラ・ビオラセア（Shewanella violacea）、モリテラ・ヤヤノシ（Moritella yayanosii）などがそのような能力を持つと考えられている（Fang et al., 2004）。【００３０】
本発明の家畜用飼料添加物に使用する微生物は、生菌であればよいが、特に凍結乾燥した生菌であることが好ましい。また、本発明の家畜用飼料添加物は、前述した微生物以外の成分を含んでいてもよい。【００３１】
不飽和化合物生成能を有する微生物と不飽和化合物取り込み能を有する微生物の混合比は特に限定されないが、例えば、不飽和化合物がt-VAの場合、前者と後者の重量比が１：３〜１：５の範囲内であることが好ましい。【００３２】
本発明の家畜用飼料添加物は、家畜一般に対して使用可能であるが、特にルーメンを持つ動物、即ち、ウシ、ヒツジ、ヤギなどの反芻動物に使用するのが好ましい。【００３３】
本発明の家畜用飼料添加物の飼料への添加量は特に限定されないが、例えば、不飽和化合物がt-VAの場合、一般的な配合飼料100gに対し、両微生物の菌体重量が0.5〜1ｇ程度になるように添加することが好ましい。【００３４】
本発明の飼料添加物は、不飽和化合物を微生物に取り込ませ、それ以上の還元反応を防止することにより、家畜の消化管内の不飽和化合物の量を増大させるものである。このような不飽和化合物を微生物に取り込ませ、還元を防止するという手法は、不飽和化合物を還元する微生物が存在する環境（例えば、ルーメン内容物の搾汁液など）で、不飽和化合物を生産する方法にも応用できる。即ち、不飽和化合物を還元する微生物が存在する環境で、不飽和化合物生成能を有する微生物と不飽和化合物取り込み能を有する微生物の両者を培養することにより、効率的に不飽和化合物を生産することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。【００３６】
最初に実験に用いた材料及び方法について説明する。【００３７】
（１）供試菌および培養条件
ブチリビブリオ・フィブリソルベンスTH1株 の由来については、Fukudaらが報告している(Fukuda et al., 2005)。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株は、新たにヤギ（日本在来種）のルーメンからロールチューブ法(Ogimoto and Imai, 1981)で分離し、Bryantの基準に従って同定した(Bryant, 1986)。同様に、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株（Scardovi, 1986）、エシェリキア・コリ(Escherichia coli) HF-23株（Orskov, 1986）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve) HF-31株（Scardovi, 1986）、およびラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum) HF-3株（Kandler and Weiss, 1986）は成人の糞便から新しく分離・同定した。ビフィドバクテリウム・ブレーベTH1 株の由来については、Fukudaらが報告している(Fukuda et al., 2004)。ビフィドバクテリウム・アドレセンティス JCM1275、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum) JCM1255、ビフィドバクテリウム・インファンティス (Bifidobacterium infantis) JCM1222、 ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum) JCM1217、エシェリキア・コリJCM 1649およびラクトバチルス・ファーメンタムJCM 1137 は理研・微生物系統保存施設 (JCM)から購入した。【００３８】
それぞれの菌株は、原則として30または50 ml容バイアルに15 または30 mlの増殖培地を入れて培養した。増殖培地は、基礎培地をルーメン液の遠沈上清液と3:1で混合したものである(Miyazaki et al., 1992)。基礎培地の組成(g/L)は次の通りであった。すなわち、K2HPO4, 0.45 ;KH2PO4, 0.45; (NH4)2SO4, 0.9; NaCl, 0.9; CaCl2・2H2O, 0.12; MgSO4・7H2O, 0.19; グルコース, 2.0; セロビオース, 2.0; トリプチケース・ペプトン(BBL; Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA), 1.0; 酵母エキス (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA), 1.0; およびシステイン・HCl, 0.6。培地のpHは、7.0に調整した(Miyazaki et al., 1992)。LAおよびt-VAは、特にことわらない限り、牛血清アルブミン(BSA)と1:3の割合で混合した後（それぞれLA/BSA およびt-VA/BSAと略記）、培養液に添加した(Fukuda et al., 2005)。培養は嫌気的に39℃で行い、原則として3連で行った。【００３９】
菌の増殖は、OD600値で見積もった。脂肪酸(FA)を培養液に加えた場合には、菌体窒素(N)量の測定により増殖を見積もった。菌体N量は、ケルダール法により定量した。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスおよびマウスの腸内細菌の生菌数の計測には、2%(wt/vol)寒天を添加した増殖培地を用い、ロールチューブ法で行なった。各試料につき試験管を5本用い、それぞれのコロニー数を数えた(Fukuda et al., 2005)。【００４０】
（２）混合ルーメン微生物の培養
ヤギ（日本在来種）のルーメンから採取した内容物を4重ガーゼで搾った搾汁液をCO2気相下で30分インキュベートした後、浮上した飼料片を吸引除去した中・下層の液を混合ルーメン微生物として用いた(Hino et al., 1993)。バッチ法培養は、原則として上述の培地と方法で行なった。【００４１】
連続培養にはoverflowタイプの発酵槽３基をもつ装置を用いたが、その構造および操作法についてはHinoとHamanoの報告(Hino and Hamano, 1993)に従った。CO2 気流下で、ルーメン内容物の搾汁液と修正基礎培地（上記基礎培地から糖とトリプチケース・ペプトンを除いた液）を1:2で混合し、発酵槽(300 ml容)に注入した。CO2を常時通気しながら連続的に修正基礎培地を送液した。希釈率は、0.1/hに設定した。炭水化物およびタンパクを６時間ごとに発酵槽に投入した。すなわち、デンプン50 g、フルクトオリゴ糖（明治製菓、東京）10 g、セルロースパウダー（アドバンテック、東京）10 g、カゼイン20 g、およびトリプチケース・ペプトン(BBL)5 gを混合したものを3 g添加した。これらの基質は、前もってCO2で置換したバイアル内に24時間入れることによりほとんどのO2を除去しておいた。LAは、これらの基質に吸着させた状態で、6時間ごとに20 mg (70 μmol)添加した。培養は39℃で24時間行い、pHは6.8前後に維持した。培養中、1時間ごとに蓄積した流出液を回収し、流出液中のLA、t-VA、およびSAを定量した。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株およびビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株を添加した場合には、培養開始時に混合ルーメン細菌の総生菌数(1 x 1011 cfu/ml)の1 ％(1 x 109 cfu/ml)となるように発酵槽に注入した。連続培養は、３試験区を発酵槽３基で同時に行い、同様の試験を2回繰り返した。【００４２】
（３）t-VA取り込み能の高い菌の検索
上記のロールチューブ法によって、ヤギのルーメンおよび成人の糞便からそれぞれ500個以上のコロニーから菌を分離した。5μmolのt-VA/BSAを添加した増殖培地(15 ml)で各単離菌を一晩培養した後、遠沈 (20,000 ｘ g, 10 分, 4 ℃)した。沈殿した菌体の表面に付着したt-VAを除去するために、0.1% (vol/vol) Triton X-100を添加した50 mMリン酸カリウム(KPi)緩衝液15 mlで2度ペレットを洗浄・遠沈した。同様に、そのペレットをKPi 緩衝液15 mlで洗浄・遠沈してTriton X-100を除去した。次いで、ペレットにクロロホルム＋メタノール(2:1)を10 ml添加し、30分間激しく攪拌することで菌体総脂質を抽出した。水を5 ml加え、5分間攪拌し、遠沈(20,000 ｘ g, 10 分, 4 ℃)した。下層をサンプルバイアルに移し、N2ガスの通気によりクロロホルムを揮発させた後、後述のようにガスクロマトグラフィー（GLC）によりt-VAを定量した。【００４３】
次に、t-VA取り込み能が高いと認められた菌、上位４種について同定を行った後、t-VA取り込み速度と水素添加能の有無を調べた。t-VA取り込み速度については、各菌をOD600値1.0まで培養した後、15mlの培地に5μmolの t-VA/BSAを添加してOD600値1.5（対数増殖後期）まで再培養した（2-3時間）。培養後、同上の方法で菌体中のt-VAを定量した。取り込み速度は、この間に取り込まれたt-VA量を再培養前後の菌体N量の平均値で割り、その数値を1時間あたりで表した。一方、水素添加能については、別途通常の方法で培養した菌体を用いて、LA-IおよびCLA-Rの活性を測定した（後述）。【００４４】
（４）ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株の菌体内に取り込まれたt-VAの分子種の分析
5μmolのt-VA/BSAを添加した増殖培地（30 ml）でビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株を5時間（対数増殖後期まで）培養し、上述のように、0.1% Triton X-100溶液で洗浄した後の菌体からクロロホルム＋メタノール(2:1)で総脂質を抽出した。この総脂質を薄層クロマトグラフィー(TLC)で分離し、t-VAがどのような分子種に取り込まれるかを調べた。TLCの展開溶媒としてクロロホルム＋アセトン(96:4)を用い、スポットの発色のために50％ (vol/vol) H2SO4を噴霧して加熱した(Fukuda et al., 2002)。リン脂質（PL）の検出のため、Dittmer-Lester試薬での呈色も行った (Dittmer and Lester, 1964)。すなわち、25 N-硫酸100mlに4 gのMoO3を加え、緩やかに沸騰させながら溶解したものをA液とした。A液50 mlに0.18 gの粉末Moを加え、15分間ゆっくりと沸騰させ溶解したものをB液とし、A液＋B液＋H2O (1:1:2)を混合したものをDittmer-Lester試薬とした。各スポット中のt-VA量を調べた時には、スポットの発色は省き、Rf値に基づいてスポットをかきとり、クロロホルム＋メタノール(2:1)で脂質を抽出した後、GLCで分析した。【００４５】
TLCとGLCの結果から、t-VAがモノグリセリド(MG)およびジグリセリド(DG)と推測されるスポットに取り込まれていたので、その確認のために以下の方法で加水分解した後、FAとグリセロールの比率を測定した。すなわち、MGおよびDGのスポットを掻き取った後、クロロホルム＋メタノール(2:1)で数回抽出した。抽出液を2等分し、一方を脂肪酸(FA)定量（下述）、他方をグリセロール定量に用いた。グリセロールの定量には、溶媒溜去後、血中トリグリセリド定量用キット（トリグリセライド E-テストワコー、和光純薬、東京）を用いた。すなわち、リポプロテインリパーゼによりMGとDGを加水分解し、生成されたグリセロールをグリセロールキナーゼによりリン酸化した。生成されたグリセロール-3-リン酸をグリセロール-3-リン酸オキシダーゼにより酸化し、その反応で生じたH2O2をペルオキシダーゼにより4-アミノアンチピリンと酸化縮合させ、青色に発色させた。この青色の吸光度を波長600nmで測定することによりグリセロール量を求めた。【００４６】
（６）FAおよび有機酸の定量
上記の総脂質または各種脂質については、下記のようにトランスメチル化した。一方、混合ルーメン微生物のバッチ培養の場合は培養バイアルを氷冷することにより反応を停止させた後、また連続培養の場合は流出液を氷水中で回収した後、クロロホルム＋メタノール(2:1)混液を等量加え、更に内部標準としてラウリン酸を添加して5分間激しく撹拌した。遠沈(5,000 x g, 5 分)後クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム量と等量のクロロホルムを再び添加して撹拌した後、同様にしてクロロホルム層を回収し、両回収液を合わせて総脂質とした。次に、溶媒溜去した総脂質に5 ％塩酸-メタノールを加えて60 ℃で20分間トランスメチル化した後、GLCおよびGLC-マススペクトル分析により各FAの同定と定量を行った（Fukuda et al., 2002）。単離菌の同定のため、および混合ルーメン微生物培養系における発酵の様相を知るために、生成された有機酸をHPLCにより分析した（Fukuda et al., 2002）。【００４７】
（７）LA-IおよびCLA-R活性の測定
LA-IおよびCLA-R活性は、生菌を用いて測定した。すなわち、対数増殖後期まで培養した菌を遠沈（20,000 ｘ g、10 分、4 ℃）により集め、50  mM  KPi緩衝液（pH 7.0）に懸濁して直ちに供試した。LA-I活性測定の場合は、KPi緩衝液（2.7 ml）にLAのジメチルスルフォキシド（DMSO）溶液（1.0μmol/ml 反応混液）0.1 mlを加えた後、菌細胞懸濁液 (0.2 ml)を添加して反応を開始し、30 ℃で3分間インキュベートした(Hunter et al., 1976)。その後、反応混液を氷冷し、上記の脂質抽出溶媒3 mlを加えて、反応を停止させた。次に、内部標準としてラウリン酸0.5 mgを添加した後に、上述のようにして脂質の抽出とFAの定量を行い、LA減少量とCLA生成量を求めた。LA異性化反応は3分間は直線的であったので、この数値から酵素活性を求めた。【００４８】
CLA-R活性測定の場合は、上記のKPi緩衝液、CLAのDMSO 溶液（1.0μmol/ml）、30 mMメチルバイオロジェン、および90 mM 亜ジチオン酸ナトリウム溶液を含む反応混液（2.8 ml）に菌体懸濁液(0.2 ml)を加え、反応を開始した。反応は、嫌気的に40 ℃で5分間インキュベートすることにより行った。上記と同様に反応を停止させ、CLAの減少量とt-VAの生成量を測定した。【００４９】
（８）データの評価
データは、Sigma Stat Statistical Analysis System (Jandel Scientific, San Rafael, CA)を用いて、Tukeyの検定法 またはStudentの t 検定法で解析した。【００５０】
〔実施例１〕  t-VA生成能の高いブチリビブリオ・フィブリソルベンスの新菌株(MDT-10)の分離、および混合ルーメン微生物のバッチ培養系へのMDT-10株の添加効果
Fukudaらはt-VA生成能の高いブチリビブリオ・フィブリソルベンスの新菌株(TH1)を見つけたことを報告したが(Fukuda et al., 2005)、今回新たに分離した菌株(MDT-10)は、TH1株よりもt-VA生成速度が約30％高かった(1.2に対して1.6μmol/h/mg 菌体-N)。MDT-10株のLA-I活性は、TH1株と大差がなかったが(0.45に対して0.53μmol/min/mg 菌体-N)、CLA-R活性が40％近く高かった(0.19に対して0.26μmol/min/mg 菌体-N)。従って、本菌株はCLAをほとんど蓄積することなく、LAを速やかにt-VAに転換した。【００５１】
混合ルーメン微生物のバッチ培養系に、混合細菌の総生菌数の1％(2 x 109 cfu/ml)となるようにMDT-10株を添加し、LA添加培地で培養したところ、LAからt-VA への転換速度が著しく速くなり、t-VAのピーク量がMDT-10株無添加の場合の2倍以上に増加した(図１-AとB)。しかし、10時間後には生成されたt-VAのほとんどがSAに還元された。【００５２】
〔実施例２〕  t-VA取り込み能の高い菌の単離
上述のように、ルーメン微生物混合系では、t-VA生成が増加してもやがては水素添加を受けてしまうので、生成されたt-VAを細菌に取り込ませることによって、t-VAを水素添加菌の作用から保護することを試みた。ルーメン菌は全般にFAの取り込み能が低いが（Hino et al., 1993）、ルーメン細菌からt-VA取り込み能の高い菌を見つけることはできなかった。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株もt-VA生成能が非常に高いにも拘わらず、t-VAを菌体内にほとんど取り込まなかった(表１)。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスの他菌株でも同様であった(データ省略)。【００５３】
しかし、成人の糞便からt-VA取り込み能の高い菌がいくつか分離された。そのうち能力の高い上位4つの菌について、同定を行なった。その結果、t-VAの取り込み能が極めて高い菌として、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株を見出した(表１)。また、本菌株はt-VAだけでなくCLAの取り込み能も他菌よりもはるかに高く、例えばエシェリキア・コリHF-23の3倍も多くのCLAを取り込んだ（データ省略）。HF-11株は、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス JCM1275株(標準菌株)よりも10％程度多くのt-VAを取り込んだ（データ省略）。【００５４】
しかし、ビフィドバクテリウム・ビフィダムJCM1255株(標準菌株)、ビフィドバクテリウム・インファンティスJCM1222株(標準菌株)、および ビフィドバクテリウム ロンガムJCM1217株(標準菌株)のt-VAの取り込み能は、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株の半分以下であったので（データ省略）、ビフィドバクテリウム属が全般的にt-VAの取り込み能が高いのではなさそうである。エシェリキア・コリJCM 1649株(標準菌株)、ビフィドバクテリウム・ブレーベTH1 株、およびラクトバチルス・ファーメンタムJCM 1137株(標準菌株)のt-VA取り込み能は、今回分離したそれぞれの同一種の菌株と大差はなかった。以上より、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株は特にt-VAの取り込み能が高い腸内細菌であると言えるであろう。【００５５】
HF-11株を培養した後、菌体および培養液上清から回収されたt-VAの量は、培地に添加した量とほぼ等しかった（データ省略）。後述するように、本菌株は自身でt-VAを合成しない(表２)。従って、HF-11株はt-VAを水素添加しないと考えられる。すなわち、本菌株はt-VAを水素添加することなく、菌体内に取り込む能力が高いという貴重な特性を持つ菌と言える。なお、HF-11株はLA-IもCLA-Rも持っていなかった（表１）。【００５６】
5μmolのt-VA を添加した増殖培地（30 ml）で、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11を8時間（増殖停止まで）培養したところ、4.5μmol以上のt-VAが菌体内に取り込まれていた。HF-11株に取り込まれたt-VAは、遊離FA、DG (1,2-DG + 1,3-DG)、MG (1-MG + 2-MG)、および PLにそれぞれ62、3、19、および15％取り込まれていた(図２、表２)。また、上記の各脂質分子種における総FA中のt-VAの割合は、それぞれ89、78、84、および89％であった。t-VA無添加の培地で培養した場合には、菌体内だけでなく（表２）、培養液上清中からも（データ省略）、t-VAは検出されなかった。従って、HF-11株はt-VAを合成しないと考えられる。【００５７】
なお、TLCのスポットがDGとMGであることは、リポプロテインリパーゼによる加水分解後のFAとグリセロールの比率からも確認された。また、弱アルカリ加水分解(0.1 N NaOH、95℃、1時間)の結果から、PLの大部分がグリセロPLであろうと考えられた(図２)。以上のグリセロ脂質は小腸で消化され得るので、HF-11 細胞内のt-VAは大部分が宿主に吸収されると考えられる。【００５８】
HF-11株はt-VAとオレイン酸(c9-C18:1)を同程度の速度で菌体に取り込んだが、SA (18:0)の取り込み速度はC18:1の1/3程度であった。また、C18：2（LAとCLA）の取り込み速度はC18：1の1/10程度であり、C18：3（リノレン酸と共役リノレン酸）の取り込みは更に遅かった。このように、C18:1の取り込み能が非常に高く、2重結合の数と必ずしも平行関係がないという点が興味深い。また、HF-11株は外部からのFAの供給が多い場合には、FAのde novo合成を抑制するようであった(表２)。これは、FA合成の調節という観点からも非常に興味深い。【００５９】
【表１】
2007023588.tif 000002
【００６０】
【表２】
2007023588.tif 000003
〔実施例３〕  ブチリビブリオ・フィブリソルベンスとビフィドバクテリウム・アドレセンティスの共存性
ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株とビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株をそれぞれ単培養した場合は、OD600値で見た増殖速度はほぼ等しかった。しかし、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスの細胞長はビフィドバクテリウム・アドレセンティスよりもかなり短いため、鏡検により菌数を測定したところ、OD600値が等しい時の菌数はブチリビブリオ・フィブリソルベンスの方がビフィドバクテリウム・アドレセンティスよりも約2.5倍多かった。両菌をOD600値で1:1の割合で混合して共培養したところ、鏡検による両菌数の割合は常に約2.5であり、これは増殖停止時まで変化しなかった（データ省略）。従って、両菌の増殖速度はほぼ等しく、また両菌間に拮抗作用はなく共存可能と考えられる。【００６１】
〔実施例４〕  ブチリビブリオ・フィブリソルベンスが生成したt-VAの、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスによる取り込み
ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株とビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株を別々にLAの存在下で単培養した場合には、洗浄後の菌体内にt-VAは検出されなかった(表３)。これは、前者の菌がt-VAを菌体内に取り込む能力がないこと、および後者の菌がt-VAを生成する能力がないことによると考えられる。しかし、両菌を共培養した場合には、両菌を合わせた菌体内の総FAの51％がt-VAであった。培養終了時（16時間）には、添加したLA（18μmol/30 ml 培地）の約80％がt-VAに転換されて菌体内に存在していた。また、別の実験で5μmol/30 mlのLAの存在下で両菌を5時間（対数増殖後期まで）培養したところ、その95％以上がt-VAの形で菌体内から回収された（データ省略）。これらの結果は、MDT-10株が生成したt-VAをHF-11株が効率よく菌体内に取り込んだことを示す。【００６２】
【表３】
2007023588.tif 000004
〔実施例５〕  混合ルーメン微生物培養系におけるt-VAの生成・蓄積に及ぼすブチリビブリオ・フィブリソルベンスとビフィドバクテリウム・アドレセンティスの同時添加の効果
混合ルーメン微生物のバッチ培養系にブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株およびビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株を混合ルーメン細菌の総生菌数(2 x 1011 cfu/ml)の1 ％となるように添加し、LA添加培地で培養したところ、一旦蓄積したt-VAの減少速度がMDT-10株のみの添加区より小さくなり(図１-B  vs. C)、10時間後のt-VA蓄積量は10倍以上に増加した(0.02 mM vs. 0.23 mM)。実際のルーメンでは内容物は常時流下するので、各時点でのルーメン内のt-VA量が多いほどt-VAの流下量が多いと考えられる。従って、HF-11株の添加によってt-VAの流下量が増加することは明らかであり、いずれの菌も添加していない対照区と比べると、両菌の添加効果は極めて大きいと思われる（図１-A vs. C）。【００６３】
混合ルーメン微生物の連続培養系に混合ルーメン細菌の総生菌数の1％のMDT-10株生菌を添加したところ、24時間で流出した液中のt-VA総量は約30％増加した(図３-A、B)。また、後の時期にLAを添加した場合ほど、流出液中のLAの減少が速やかとなった（図３-BのLAのグラフの勾配が大きくなった）が、これはLAからt-VAへの転換速度が後になるほど増加したことを示す。その理由は、MDT-10株の菌数が増加していったためと考えられる。つまり、MDT-10株が希釈率よりも大きい速度で増殖したことを示唆する。このことは、t-VAの流出量が後の時期に増加したことと呼応する。SA量の増加よりもt-VA量の増加の方がはるかに大きかったことから（図３-A vs. B）、混合ルーメン微生物によるt-VAの水素添加能に比べて、MDT-10株によるt-VA生成の増大の方が大きかったと考えられる。【００６４】
MDT-10株の他に、混合ルーメン細菌の総生菌数の1％のHF-11株生菌を添加したところ、24時間に流出したt-VAの量がMDT-10株だけの場合の約2倍に増加した(図３-C)。また、SAの流出量が顕著に減少したが、t-VAが増加したにも拘わらずSAが減少したということは、HF-11株がt-VAを取り込んだために、t-VAを水素添加する菌の作用を受けにくくなった結果と考えられる。両菌株を添加した場合のt-VA流出量は、どちらも添加しなかった対照区の2.5倍であった。両菌株を添加した場合には、MDT-10株だけの場合以上に、時期が後になるにつれてt-VAの流出量が大きく増加したことから、HF-11株も希釈率より大きい速度で増殖したと推測される。この実験では両菌を総生菌数の1％となるように添加したが、たとえ添加菌数が少なくても、時間と共に菌数が増加し、効果を発揮することはあり得るであろう。【００６５】
なお、連続培養中、発酵産物（有機酸）生成の様相はあまり変化せず、また両菌の添加による大きな変化も認められなかった(データ省略)。また鏡検によるプロトゾア数もそれほど減少しなかった(データ省略)。従って、この培養条件で24時間程度培養した場合には、添加した菌以外は、それほど微生物相が大きく変化しなかったと考えられる。【００６６】
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本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2005-239274号）の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2007023588.tif 000005
【図３】
2007023588.tif 000006
【図２】
2007023588.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月11日(2008.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスバクセン酸生成能を有する微生物、及びトランスバクセン酸取り込み能を有する微生物を含有することを特徴とする家畜用飼料添加物。
【請求項２】
トランスバクセン酸生成能を有する微生物が、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスMDT-10株又はその変異株であることを特徴とする請求項１に記載の家畜用飼料添加物。
【請求項３】
トランスバクセン酸取り込み能を有する微生物が、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスHF-11株又はその変異株であることを特徴とする請求項１又は２に記載の家畜用飼料添加物。
【請求項４】
家畜が、反芻動物であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の家畜用飼料添加物。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の家畜用飼料添加物を含む家畜用飼料。
【請求項６】
トランスバクセン酸を還元する微生物が存在する環境で、トランスバクセン酸生成能を有する微生物とトランスバクセン酸取り込み能を有する微生物を培養し、培養物からトランスバクセン酸を採取することを特徴とするトランスバクセン酸の生産方法。
【国際調査報告】
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