(57)【要約】  0.85〜100ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む，内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導するための培地，ならびにこの培地を用いて内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導する方法が開示される。本発明の分化誘導系を用いれば，合成分化誘導剤や高濃度のインスリンを添加せずに，脂肪細胞の十分な分化誘導が可能である。本発明の分化誘導系を用いて得られる成熟脂肪細胞は，脂肪細胞の生化学的および生理学的研究に，ならびに肥満や２型糖尿病などの生活習慣病の治療に有効な薬剤のスクリーニングや診断薬の開発に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.85〜100ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含み，インドメタシン，デキサメタゾンおよびIBMXを実質的に含まないことを特徴とする，内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導するための培地。
【請求項２】
0.85〜30ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む，請求項１記載の培地。
【請求項３】
0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む，請求項１記載の培地。
【請求項４】
請求項１−3のいずれかに記載の培地中で内臓脂肪前駆細胞を培養することを特徴とする，内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導する方法。
【請求項５】
試験物質のインスリン抵抗性改善薬としての効果を検定する方法であって，
0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地を用いて誘導することにより得られた成熟内臓脂肪細胞を，インスリン抵抗性惹起条件下で培養してインスリン抵抗性モデル内臓脂肪細胞を誘導し，
試験物質の存在下で，前記成熟内臓脂肪細胞および前記インスリン抵抗性モデル内臓脂肪細胞を培養して，両者の脂肪細胞機能を比較する，
の各工程を含む方法。
【請求項６】
試験物質の高インスリン血漿治療薬としての効果を検定する方法であって，
成熟内臓脂肪細胞を，試験物質の存在下で，0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地で培養したときと，70〜100ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地で培養したときの，細胞内におけるインスリンレセプターの発現量を比較する，
ことを含む方法。
【請求項７】
試験物質のアディポネクチン分泌促進剤としての効果を検定する方法であって，
試験物質の存在下で，0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地を用いて成熟内臓脂肪細胞を培養し，細胞におけるアディポネクチンの産生量または分泌量を測定する，ことを含む方法。
【請求項８】
試験物質のインスリン抵抗性状態におけるアディポネクチン分泌促進剤の効果を検定する方法であって，
試験物質の存在下で，0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地中で培養した成熟内臓脂肪細胞と，70〜100ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地中で培養した成熟内臓脂肪細胞とについて，細胞におけるアディポネクチンの産生量または分泌量を比較する，
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，内臓脂肪細胞の培養および分化誘導のための培地，およびこの培地を用いる内臓脂肪細胞の培養および分化方法，ならびに本発明の方法により得られた成熟内臓脂肪細胞を用いる種々の薬剤候補物質の効果を検定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管から吸収された栄養成分は門脈やリンパ管を通って肝臓へ運ばれ，全身組織に分配される。門脈，リンパ管が分布する腸間膜には年齢と共に脂肪組織が増生するが，近年この腸間膜脂肪の過剰蓄積は，糖尿病，高脂血漿，動脈硬化等の生活習慣病を引き起こすことが検証されてきている。したがって，内蔵脂肪細胞の性質について知ることは，これらの生活習慣病の病態像を理解する上で重要な位置を占める。これまで，本発明者らは世界に先駆けて，ラット腸間膜脂肪組織から調製した前駆脂肪細胞（visceral  stromal  cells:  VSC）を成熟脂肪細胞（visceral  adipocytes:  VAC）にまで分化誘導する新規な培養法を確立した。本分化誘導系は，デキサメタゾンやイソブチルメチルキサンチンなどを必要とせず，天然物である脂肪酸，ビタミンおよびインスリンのみでVSCからVACへの分化を可能にするという特徴を持っている（Kyoko  Shimizu,  Masato  Sakai,  Mamiko  Ando,  Hideyuki  Chiji,  Teruo  Kawada,  Hitoshi  Mineo,  Toshio  Taira,  Cell  Biol.  Int.  XX  (2006)  1-8）。【０００３】
この分化系におけるインスリン濃度に関しては，従来の初代培養細胞の分化系と同様に10μg/mlに設定していた。しかしながら，このインスリン濃度はインビボの血中濃度（ラットにおいては0.5〜3ng/ml）に比較して，数千倍の非生理的な高濃度である。従って，従来から用いられてきた分化条件では，異常な高濃度インスリンによるインスリン抵抗性などの機能異常を腸間膜脂肪細胞に引き起こしていることが予想される。したがって，本培養系をメタボリックシンドロームの研究，特に生活習慣病の治療薬のスクリーニングや診断薬の開発に応用するためには，インスリン濃度を可能な限り，インビボの生理的発現レベルに近づけることが重要な課題であった。【０００４】
これまでに，脂肪細胞への分化において，インスリンおよびインスリン様成長因子１（IGF-1：insulin-like  growth  factor-1）が重要な因子であるという報告が数多くあるが（Boney,  C.  M.,  Moats-Staats,  B.  M.,  Stiles,  A.  D.,  and  D'Ercole,  A.  J.  (1994)  Endocrinology  135(5),  1863-1868；Chen,  N.  X.,  Hausman,  G.  J.,  and  Wright,  J.  T.  (1996)  J  Anim  Sci  74(10),  2369-2375；Kim,  H.  S.,  Richardson,  R.  L.,  and  Hausman,  G.  J.  (1998)  Gen  Comp  Endocrinol  112(1),  38-45；Gerfault,  V.,  Louveau,  I.,  and  Mourot,  J.  (1999)  Gen  Comp  Endocrinol  114(3),  396-404；Grohmann,  M.,  Sabin,  M.,  Holly,  J.,  Shield,  J.,  Crowne,  E.,  and  Stewart,  C.  (2005)  J  Lipid  Res  46(1),  93-103.  Epub  2004  Oct  2016），高い分化効率を確保するためには，強力な分化誘導剤であるデキサメタゾンやイソブチルメチルキサンチンなどが必要であった。これらの合成化合物は，強制的に分化の方向を決定することができるが，生理的な分化条件とは異なるものである。また，通常は，脂肪細胞への分化を誘導するためにはインスリンが用いられているが，多くの場合に用いられるインスリンの濃度は，生理的濃度を遥かに超えているものである（Mackall,  J.  C.,  Student,  A.  K.,  Polakis,  S.  E.,  and  Lane,  M.  D.  (1976)  J  Biol  Chem  251(20),  6462-6464；Student,  A.  K.,  Hsu,  R.  Y.,  and  Lane,  M.  D.  (1980)  J  Biol  Chem  255(10),  4745-4750；Doi,  H.,  Masaki,  N.,  Takahashi,  H.,  Komatsu,  H.,  Fujimori,  K.,  and  Satomi,  S.  (2005)  Tohoku  J  Exp  Med  207(3),  209-216）。【０００５】
また，脂肪細胞のモデルとして広く活用されてきた株化3T3-L1脂肪細胞において，インスリンの代わりにIGF-1を用いても，脂肪細胞へ分化するとの報告がある（Smith,  P.  J.,Wise,  L.  S.,  Berkowitz,  R.,  Wan,  C.,  and  Rubin,  C.  S.  (1988)  J  Biol  Chem  263(19),  9402-9408；Boney,  C.  M.,  Gruppuso,  P.  A.,  Faris,  R.  A.,  and  Frackelton,  A.  R.,  Jr.  (2000)  Mol  Endocrinol  14(6),  805-813；Sekimoto,  H.,  and  Boney,  C.  M.  (2003)  Endocrinology  144(6),  2546-2552；Entingh-Pearsall,  A.,  and  Kahn,  C.  R.  (2004)  J  Biol  Chem  279(36),  38016-38024.  Epub  32004  Jul  38017）。一方，別の前駆脂肪細胞株であるMC3T3-G2/PA6を脂肪細胞へ分化誘導する場合，インスリンおよびIGF-1を添加しなくても上述のデキサメタゾンやイソブチルメチルキサンチンのみで脂肪滴の形成が認められるという報告がある（Morito,  S.,  Yaguchi,  K.,  Imada,  M.,  Tachikawa,  C.,  Nomura,  M.,  Moritani,  S.,  Igarashi,  M.,  Yokogawa,  K.,  and  Miyamoto,  K.  (2005)  Biol  Pharm  Bull  28(11),  2040-2045）。このように，インスリンおよびIGF-1の分化誘導における役割に対する統一的見解は得られておらず，これらの生理的役割を評価するのは困難であった。【０００６】
初代培養脂肪の細胞分化誘導において，インスリンのみならず，IGF-1が脂肪細胞への分化に関与しているという報告があるが，これらの分化系においても，デキサメタゾンやイソブチルメチルキサンチンなどを同時に添加することが必要であると報告されている（Entingh-Pearsall,  A.,  and  Kahn,  C.  R.  (2004)  J  Biol  Chem  279(36),  38016-38024.  Epub  32004  Jul  38017）。例えば，間葉細胞系においてIGF-1だけでは，脂肪細胞への分化がほとんど起らず，同時にデキサメタゾンやイソブチルメチルキサンチンを加えることで脂肪細胞への分化がおこることが報告されている（Scavo,  L.  M.,  Karas,  M.,  Murray,  M.,  and  Leroith,  D.  (2004)  J  Clin  Endocrinol  Metab  89(7),  3543-3553）。【０００７】
このように，これまで，脂肪細胞の分化誘導におけるインスリンおよびIGF-1の役割は，非生理的で強力な合成分化誘導剤を含んだ分化誘導培地でのみ評価されており，これらの合成分化誘導剤が含まれていない生理的な条件下でのそれらの役割を評価する分化誘導条件は確立されていなかった。従って，これらの過去の研究では生理的条件下における脂肪細胞の分化誘導法は未だ開発されておらず，このことが脂肪細胞の生理状態の理解に混乱を生じ，脂肪細胞を用いた薬剤のスクリーニングや診断薬の開発の大きな障害であった。【０００８】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれかが，本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【非特許文献１】Kyoko  Shimizu,  Masato  Sakai,  Mamiko  Ando,  Hideyuki  Chiji,  Teruo  Kawada,  Hitoshi  Mineo,  Toshio  Taira,  Cell  Biol.  Int.  XX  (2006)  1-8
【非特許文献２】Mackall,  J.  C.,  Student,  A.  K.,  Polakis,  S.  E.,  and  Lane,  M.  D.  (1976)  J  Biol  Chem  251(20),  6462-6464
【非特許文献３】Student,  A.  K.,  Hsu,  R.  Y.,  and  Lane,  M.  D.  (1980)  J  Biol  Chem  255(10),  4745-4750
【非特許文献４】Smith,  P.  J.,  Wise,  L.  S.,  Berkowitz,  R.,  Wan,  C.,  and  Rubin,  C.  S.  (1988)  J  Biol  Chem  263(19),  9402-9408
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は，生理学的条件に近い条件下で腸間膜脂肪前駆細胞から成熟脂肪細胞への分化誘導を可能とする分化誘導系を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは，特定の濃度範囲のインスリンと特定の濃度範囲のIGF-1とを含有する培地を用いることにより，腸間膜脂肪前駆細胞の成熟脂肪細胞への分化誘導が可能であることを見いだした。【００１１】
本発明は，0.85〜100ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含み，インドメタシン，デキサメタゾンおよびIBMXを実質的に含まないことを特徴とする，内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導するための培地を提供する。好ましくは，本発明の培地中のインスリンの濃度は，0.85〜30ng/mlであり，より好ましくは1〜5ng/mlである。【００１２】
別の観点においては，本発明は，上述の本発明にしたがう培地中で内臓脂肪前駆細胞を培養することを特徴とする，内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導する方法を提供する。【００１３】
また別の観点においては，本発明は，試験物質のインスリン抵抗性改善薬としての効果を検定する方法であって，0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地を用いて誘導することにより得られた成熟内臓脂肪細胞を，インスリン抵抗性惹起条件下で培養してインスリン抵抗性モデル内臓脂肪細胞を誘導し，試験物質の存在下で，前記成熟内臓脂肪細胞および前記インスリン抵抗性モデル内臓脂肪細胞を培養して，両者の脂肪細胞機能を比較する，の各工程を含む方法を提供する。【００１４】
さらに別の観点においては，本発明は，試験物質の高インスリン血漿治療薬としての効果を検定する方法であって，成熟内臓脂肪細胞を，試験物質の存在下で，0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地で培養したときと，70〜100ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地で培養したときの，細胞内におけるインスリンレセプターの発現量を比較する，ことを含む方法を提供する。【００１５】
また別の観点においては，本発明は，試験物質のアディポネクチン分泌促進剤としての効果を検定する方法であって，試験物質の存在下で，0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地を用いて成熟内臓脂肪細胞を培養し，細胞におけるアディポネクチンの産生量または分泌量を測定する，ことを含む方法を提供する。【００１６】
さらに別の観点においては，本発明は，試験物質のインスリン抵抗性状態におけるアディポネクチン分泌促進剤の効果を検定する方法であって，試験物質の存在下で，0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地中で培養した成熟内臓脂肪細胞と，70〜100ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地中で培養した成熟内臓脂肪細胞とについて，細胞におけるアディポネクチンの産生量または分泌量を比較する，ことを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の分化誘導系を用いれば，強力な合成分化誘導剤（インドメタシン，デキサメタゾン，イソメチルブチルキサンテン，PPARγアゴニスト等）やインスリン抵抗性の原因となる高濃度のインスリンを添加せずに，脂肪細胞の十分な分化誘導が可能である。本発明の分化誘導系を用いて得られる成熟脂肪細胞は，脂肪細胞の生化学的および生理学的研究に，ならびに肥満や２型糖尿病などの生活習慣病の治療に有効な薬剤のスクリーニングや診断薬の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は，VACの機能に及ぼすデキサメタゾンの影響を示す。
【図２Ａ】図２Ａは，VSCからVACへの分化誘導におけるインスリン濃度の影響を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは，VSCからVACへの分化誘導におけるインスリン濃度の影響を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは，VSCからVACへの分化誘導におけるインスリン濃度の影響を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは，VSCからVACへの分化誘導におけるインスリン濃度の影響を示す。
【図３】図３は，VACにおけるアディポネクチンの発現レベルに及ぼすインスリン濃度の影響を示す。
【図４】図４は，VACの成熟過程におけるインスリンレセプターの発現量を示す。
【図５】図５は，VSCからVACへの分化誘導に及ぼすIGF-1濃度の影響を示す。
【図６】図６は，IGF-1とインスリンの種々の組み合わせを用いたVSCからVACへの分化誘導を示す。
【図７】図７は，IGF-1とインスリンの種々の組み合わせを用いたVSCからVACへの分化誘導を示す。
【図８】図８は，高濃度のインスリンによりVACを分化誘導したときのインスリンレセプターの発現を示す。
【図９】図９は，200ng/mlのIGF-1存在下における，アディポネクチン産生量に及ぼすインスリン濃度の影響を示す。
【図１０】図１０は，インスリンレセプターの発現に及ぼすトログリタゾンの影響を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は，内臓脂肪前駆細胞の生理的条件下における分化誘導法に関する新知見を提供するものである。これまで，脂肪細胞の分化誘導には，生理学的濃度の数千倍という高濃度のインスリンを用いる方法が一般に行われており，分化過程のどの時期にどの程度の濃度のインスリンが必要かについて詳細に調べた研究はなかった。したがって，本発明においてはまず，種々の濃度のインスリンの存在下で前駆脂肪細胞を培養し，インスリンの濃度と処理時間が脂肪細胞の分化および成熟に及ぼす影響を調べた。その結果，以下のことが明らかになった（実施例３）。１）VSCの初期の３日間の分化誘導は10μg/mlインスリンでは達成されたが，0.2μg/mlインスリンでは達成されなかった。0.2μg/mlというインスリン濃度は，生理的濃度の１００倍近い高濃度であることから，VSC初期分化誘導には他の生理的因子の存在が強く示唆された。２）一方，VSCの初期分化誘導後のVACの成熟過程は生理的濃度の約10倍程度のインスリンが必要であることが判明した。３）VSCの初期分化誘導後に高濃度のインスリンが存在すると，インスリンレセプターの発現が減少し，インスリン抵抗性状態を誘導していることが判明した。【００２０】
次に，VACへの分化に他の分化誘導因子が関与している可能性について調べたところ，生理的濃度のIGF-1を添加することにより初期分化が誘導されることがわかった（実施例４）。さらに，初期分化誘導にはIGF-1のみで十分な役割を示すが，成熟過程にはIGF-1とインスリンの両者が必要であり，生理的濃度のインスリンはIGF-1と協調して脂肪滴の形成を促進していることが判明した（実施例５）。すなわち，IGF-1とインスリンの両者を共存させることで，初めて生理的濃度の範囲内で十分な脂肪細胞への分化・成熟を引き起こすことに成功した。このようにして得られた成熟脂肪細胞は，脂肪滴の形成，インスリンレセプターの発現，アディポネクチンの産生などに関して，正常な細胞機能を有していることがわかった。【００２１】
本発明は，特定の範囲の濃度のインスリンおよび特定の範囲の濃度のIGF-1を含み，インドメタシン，デキサメタゾンおよびIBMXを実質的に含まないことを特徴とする，内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導するための培地を提供する。本発明の培地中のインスリンおよびIGF-1の濃度は，健康なまたは疾患を有するヒトの生体内濃度に近いものである。本発明の培地中のインスリンの濃度は0.85〜100ng/mlであり，好ましくは0.85〜30ng/mlであり，より好ましくは健康なヒトにおける生理的濃度範囲（0.85〜5ng/ml）である。特に好ましくは約0.85ng/mlである。また，後述するように，高インスリン血症モデル系として用いる場合には，インスリン濃度を50-100ng/ml，より好ましくは60-80ng/ml，特に好ましくは約70ng/mlとすることができる。発明の培地中のIGF-1の濃度は50〜250ng/mlであり，好ましくは190〜210ng/mlであり，より好ましくは約200ng/mlである。例えば，内臓脂肪前駆細胞に200ng/ml  IGF-1および0.85ng/ml  インスリンを共存させることによって正常な機能を有する成熟脂肪細胞を得ることができる。【００２２】
好ましくは，本発明の培地は，従来の脂肪細胞分化誘導法において用いられている分化誘導剤であるインドメタシン，デキサメタゾン，IBMX，ＰＰＡＲ−γアゴニストを含まない。これらの物質が培地中に存在すると，脂肪細胞の分化の過程の研究，ならびに分化阻害剤または分化誘導剤の効果の研究の妨げとなりうるからである。【００２３】
本発明にしたがう分化誘導系を用いることにより，従来の脂肪細胞分化誘導法において用いられている化学合成分化誘導剤であるデキサメサゾンやIBMXを含まず，脂肪細胞の分化マーカーであるC/EBPaおよびaP2を発現し，インスリンレセプターの発現およびアディポネクチンの産生が障害されていない正常な機能を有する成熟脂肪細胞を得ることができる。【００２４】
別の観点においては，本発明は，上述の本発明にしたがう培地中で内臓脂肪前駆細胞を培養することを特徴とする，内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導する方法を提供する。【００２５】
本発明の脂肪細胞分化誘導方法は，生理学的条件に近い条件下で行うため，この方法により得られる成熟脂肪細胞は，脂肪細胞を利用する種々の研究に有用である。例えば，脂肪の取り込みと放出，アディポネクチンの産生と分泌，インスリンレセプターの発現などの脂肪細胞の代謝と機能の研究に，脂肪細胞の生理的な分化機構および成熟維持機構の解明に，および生理的状態における脂肪細胞の分化・成熟過程におけるシグナル伝達機構の解明に有用である。【００２６】
別の観点においては，本発明は，正常な機能を有する成熟脂肪細胞を用いて，インスリン抵抗性改善薬，アディポネクチン分泌促進剤，インスリン模倣剤などの効果を判定する方法，ならびに多様な試験物質からこれらの薬剤候補物質をスクリーニングする方法を提供するものである。【００２７】
試験物質は，種々の合成又は天然の化合物ライブラリー，コンビナトリアルライブラリー，オリゴヌクレオチドライブラリー，ペプチドライブラリー等のライブラリーから得ることができる。また，細菌，真菌類，藻類，植物，動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。【００２８】
薬剤の効果の判定およびスクリーニング方法の１つの態様は，試験物質のインスリン抵抗性改善薬としての効果を検定する方法である。この方法は，上述の本発明の培地を用いて誘導することにより得られた成熟内臓脂肪細胞を，インスリン抵抗性惹起条件下で培養してインスリン抵抗性モデル内臓脂肪細胞を誘導し，試験物質の存在下で，前記成熟内臓脂肪細胞および前記インスリン抵抗性モデル内臓脂肪細胞を培養して，両者の脂肪細胞機能を比較することにより行うことができる。【００２９】
インスリン抵抗性を惹起しうる条件としては，脂肪酸，グルコサミンや炎症性サイトカイン（TNFa,  IL-1,  IL-6など）を本発明の生理的分化誘導培地に添加すること等が挙げられる。インスリン抵抗性改善薬の探索および効果判定の指標として用いることができる脂肪細胞機能としては，インスリンレセプターの発現，アディポネクチン産生能，グルコース取り込み能等が挙げられる。これらの脂肪細胞機能を，本発明により得られた正常な機能を有する成熟脂肪細胞と比較することにより，インスリン抵抗性改善薬の候補物質を同定することができる。【００３０】
薬剤候補物質を評価する方法の例は次のとおりである。本発明の分化誘導系を用いて得られたVACを用いて，高脂血症治療薬の候補物質がVACのアディポネクチン分泌に及ぼす影響について調べることができる。試験化合物としては，HMG−CoA還元酵素阻害活性を有する化合物を用い，最初の５日間200ng/mlのIGF-1と2.5ng/mlインスリンで培養後，次の４日間，同様の条件で培養中に各試験化合物を添加し，培地に含まれるアディポネクチン量を測定する。試験化合物がアディポネクチン分泌を抑制すれば，その化合物は生体内で脂肪細胞に対する選択毒性を有する可能性がある。このように，本発明において見いだされたVACの生理的分化条件を利用することにより，薬剤の効果の判定および安全性スクリーニングを行うことができる。【００３１】
また，下記の実施例７において示されるように，本発明においては，70ng/ml以上のインスリンで培養することによりアディポネクチン分泌が抑制されること，成熟過程における70ng/ml以上のインスリン暴露によってもアディポネクチン分泌が抑制されることが明らかとなった。すなわち，本発明にしたがう薬剤の効果の判定およびスクリーニング方法の別の態様は，試験物質の高インスリン血漿治療薬としての効果を検定する方法である。この方法は，成熟内臓脂肪細胞を，試験物質の存在下で，0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地で培養したときと，または70〜100ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地で培養したときの，細胞内におけるインスリンレセプターの発現量を比較することにより行う。例えば，２型糖尿病の初期病変である高インスリン血漿のモデルとして，70ng/mlインスリンを本分化誘導培地に加えた際に，インスリンレセプター発現量の低下を防止することができる物質は，高インスリン血漿治療薬の候補物質であると考えられる。【００３２】
薬剤の効果の判定およびスクリーニング方法のまた別の態様は，試験物質のアディポネクチン分泌促進剤としての効果を検定する方法である。この方法は，試験物質の存在下で，本発明の培地を用いて成熟内臓脂肪細胞を培養し，細胞におけるアディポネクチンの産生量または分泌量を測定することにより行うことができる。アディポネクチン分泌を抑制することができる物質は，インスリン抵抗性改善薬の候補物質であると考えられる。逆に，試験物質がアディポネクチン分泌を抑制すれば，その化合物は生体内で脂肪細胞に対する選択毒性を有する可能性がある。【００３３】
薬剤の効果の判定およびスクリーニング方法のさらに別の態様は，試験物質のインスリン抵抗性状態におけるアディポネクチン分泌促進剤の効果を検定する方法であって，試験物質の存在下で，0.85〜5ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地中で培養した成熟内臓脂肪細胞と，70〜100ng/mlのインスリンおよび50〜250ng/mlのIGF-1を含む培地中で培養した成熟内臓脂肪細胞とについて，細胞におけるアディポネクチンの産生量または分泌量を比較することにより行うことができる。また，非生理的条件，例えば，200ng/ml  IGF-1および70ng/mlインスリンを共存させることによって得られたアディポネクチン産生が低下した成熟脂肪細胞に対して候補物質を与えてアディポネクチン産生，分泌を測定することによってインスリン抵抗性状態におけるアディポネクチン分泌促進剤の効果判定に用いることができる。【００３４】
本発明にしたがう内臓脂肪細胞分化誘導用の培地は，細胞培養用基本培地に，本発明において特定される濃度範囲のインスリンおよびIGF-1を加えることにより作成することができる。細胞培養用基本培地としては，一般に細胞培養用に用いられている培地，例えば，αＭＥＭ，Ｆ−１２，ＳＦ０２，ＰＲＭＩ１６４０，ｏｐｔｉ−ＭＥＭなどの任意のものを用いることができる。好ましくは血清としてはヘパリンで処理してヘパリン吸着成分を除去した血清を用いる。本発明の培地には，さらに油脂を添加してもよい。油脂としては，大豆油，ヤシ油などの植物油脂，豚脂，牛脂などの動物油脂，およびパラフィンなどの鉱物油のいずれを用いてもよいが，好ましくは植物由来の油脂を用いる。特に好ましくは，細胞培養用基本培地として，10%  NCSを含む(DMEM)/F12に，17mM  パントテン酸，33mM  ビオチン，100mM  アスコルビン酸，1mM  オクタン酸，50nM  トリヨードチロニン，100ユニット/ml  ペニシリンおよび100mg/ml  ストレプトマイシンを加えた培地（Shimizu,  K.,  et  al.  Cell  Biol.  Int.  XX  (2006)  1-8）を用いる。【００３５】
内臓脂肪細胞の前駆細胞は，腸間膜脂肪，大網膜脂肪，精巣上体周囲脂肪，腎周囲脂肪などの組織から取得することができる。一例としては，ラットから腹腔内腸間膜脂肪を摘出し，洗浄し，鋏で細断して緩衝液中に分散させた後，コラゲナーゼで処理する。これを遠心分離して浮遊細胞を除去し，沈殿物を回収することにより，内臓脂肪前駆細胞を得ることができる。この前駆細胞を，細胞培養用の容器中で，上述のヘパリン吸着成分を除去した血清を含む本発明の培地に播種して培養することにより，内臓脂肪細胞への分化を誘導することができる。細胞培養用の容器としては，慣用の細胞培養用ディッシュ，フラスコ，ローラーボトルなどを用いることができる。培養は，通常の哺乳動物細胞の培養条件下で，例えば，３７℃，５％ＣＯ2下で行うことができる。培地は毎日または数日に１回交換する。このようにして，内臓脂肪細胞の初代培養物を得ることができる。【００３６】
内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化は，細胞を肉眼または顕微鏡下で観察して，脂肪球の存在を調べることによりモニターすることができる。また，細胞質のトリグリセリドの定量，脂肪合成活性（ＧＰＤＨ）の測定，PPARγのmRNA量の測定などによりモニターすることもできる。C/EBPαはインスリン感受性の獲得に関与し，脂肪細胞への分化に必須である。また脂肪細胞の分化マーカーとして用いられる。C/EBPβは，分化過程早期において，C/EBPαやPPARγの遺伝子発現を誘導する。その発現は一過性であり，成熟脂肪細胞では発現量が低下するため，未分化または未成熟脂肪細胞のマーカーとして用いられる。aP2は脂肪酸の輸送に関与しており，脂肪細胞への分化と伴にその発現量が増加し，C/EBPαと同じく脂肪細胞の分化マーカーとして用いられる。これらの測定方法は当該技術分野において確立されている。【００３７】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００６−１１９７４９号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお，実施例の記載においては以下の略号を使用する：VSC（前駆脂肪細胞），VAC（成熟脂肪細胞），IGF-1（インスリン様成長因子１），C/EBPα（CCAAT  エンハンサー結合蛋白質（enhancer  binding  protein）α），C/EBPβ（CCAAT  エンハンサー結合蛋白質（enhancer  binding  protein）β），aP2（脂肪細胞油脂結合蛋白質（adipocyte  lipid-binding  protein）），IR（インスリンレセプター）。【００３９】
実施例１
前駆脂肪細胞および培地の調製
３−５週齢の雄スプラグドーリーラット（平均体重１００ｇ）から腹腔内腸間膜脂肪組織を摘出し，ハンクス平衡塩溶液で３回洗浄した。脂肪を鋏で細断し，０．２％コラゲナーゼ，１．０％ウシアルブミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で，３７℃で４０分間インキュベートした。次に，このコラゲナーゼ処理組織懸濁液を６００μｍのメッシュを通して濾過し，ハンクス平衡塩溶液を加えた。これを８００ｘｇで１０分間遠心分離し，沈殿物をハンクス平衡塩溶液で３回，ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で１回洗浄し，１００μｍのメッシュを通して濾過した。【００４０】
上述のようにして腹腔内腸間膜脂肪から調製した細胞懸濁液を，０．５ｘ１０5細胞／ｃｍ2でディッシュに播種し，示される組成の培地中で，３７℃，５％ＣＯ2で培養した。培地は毎日または２日に１回交換した。【００４１】
培地としては，基本培地として10%  NCSを含む(DMEM)/F12に，17mM  パントテン酸，33mM  ビオチン，100mM  アスコルビン酸，1mM  オクタン酸，50nM  トリヨードチロニン，100ユニット/ml  ペニシリンおよび100mg/ml  ストレプトマイシンを加えた培地を調製し，インスリンおよびIGF-1を所定の濃度で加えて，以下の実験に用いた。【００４２】
実施例２
VACの機能に及ぼすデキサメタゾンの影響
まず，従来用いられているデキサメタゾンによる分化誘導系を評価した。10μg/mlのインスリンまたは10μg/mlのインスリンと2.5μMのデキサメタゾンを添加し，７日間VSCを分化・成熟させた。高濃度インスリン（10μg/ml）を添加した分化誘導系では，図１Aに示したように，正常な脂肪の蓄積が起こる。この分化誘導培地にさらにデキサメタゾンを添加すると，分化効率には差が無いものの，単胞化が促進されていた（図１B）。また，ノルエピネフリンに対するトリグリセリド分解反応が低下した（データ示さず）。さらに７日間培養後に培地に含まれるアディポネクチン量を測定したところ，デキサメタゾン投与による明らかな低下が認められた（図１C）。以上のことから，デキサメタゾンを用いて分化誘導した脂肪細胞ではその生理機能が低下していることが確認された。【００４３】
実施例３
VSCからVACへの分化誘導におけるインスリンの影響の検討
VSCのVACへの分化におけるインスリンの影響について，図２Aに示す種々の条件での検討を行った。図２Aに示した分化条件の1〜12は，図２B，CおよびDの1〜12に対応している（B:７日間の培養後の写真。C:７日間の培養後，mRNAを回収し，リアルタイムPCRによりC/EBPαのmRNA発現量を測定した。培養０日目の値を１とした。D:リアルタイムPCRによりaP2のmRNA発現量を測定した。条件１での培養７日目の値を１とした）。【００４４】
生理的濃度の数千倍の高濃度インスリン（10μg/ml）を含む培地（条件２）では，明らかな脂肪滴の蓄積が認められ脂肪細胞に分化し（図２B-2），インスリンを全く添加しない場合（条件１）では分化が起らなかった（図２B-1）。そこで，この分化誘導培地のインスリン濃度を1/50である0.2μg/mlにしたところ（条件３），全く脂肪滴の形成が認められず，VACへの分化誘導には10μg/mlという高濃度のインスリンを添加させる必要があることがわかった（図２B-3）。【００４５】
次に10μg/mlインスリンの処理時間の検討を行った。分化誘導時に10μg/mlインスリンを２日間（条件５），３日間（条件7），および４日間（条件９）処理し，それに続く0.2μg/mlインスリンで計７日間培養したところ，２日間の10μg/mlインスリン処理では，脂肪滴の蓄積は顕著に低下し，少なくとも３日間の処理が必要であることが判明した（図２B-7）。同様に10μg/mlインスリンで３日間処理をし，その後0.2μg/mlのインスリンを含まない場合は，脂肪滴の蓄積が0.2μg/mlインスリンを加えた場合と比べて著しく低下していることから，初期分化誘導後の脂肪滴形成中の成熟過程にもインスリンは必要であることが判明した（図２B-4，6，8）。株化された3T3-L1前駆脂肪細胞を脂肪細胞へ分化誘導する場合，インスリンを添加しなくても脂肪滴の形成が認められるという報告がある（Entingh-Pearsall,  A.,  and  Kahn,  C.  R.  (2004)  J  Biol  Chem  279(36),  38016-38024.  Epub  32004  Jul  38017）。VSCのVACへの分化には，3T3-L1前駆脂肪細胞の場合とは異なり，インスリン必要であることが今回の検討により明らかとなった。インスリンによる脂肪細胞への分化誘導には，３日間の10μg/mlのインスリンによる分化誘導が必要であり，それに続く成熟過程は0.2μg/mlのインスリンで達成されることが判った。【００４６】
次に，VSCのVACへ分化誘導後の脂肪細胞の成熟期間に必要なインスリンの濃度について検討した。すなわち，VSCを３日間の10μg/mlインスリンによる分化誘導後，10μg/ml，0.2μg/ml，70ng/ml，22ng/ml，7.4ng/mlの各濃度のインスリンで処理した（条件2，７，10，11および12）。その結果，インスリンを22ng/mlまで低下させても，同程度の脂肪滴の形成が認められた（図２B-11）。22ng/mlというインスリン濃度は生理的濃度の約10倍であった。【００４７】
さらに，図２Aに示したインスリン濃度の異なる処理条件に対して脂肪細胞特異的分化マーカーであるC/EBPα（脂肪細胞の分化マーカー）およびaP2（脂肪細胞の分化マーカー）のmRNA発現レベルについて検討をおこなった（図２CおよびD）。その結果，インスリンを添加しない場合（条件１），0.2μg/mlのインスリンを添加し続けた場合（条件３），10μg/mlのインスリンを２日間添加した場合では（条件4，5），C/EBPαのmRNA発現レベルが上昇せず，10μg/mlのインスリンを３日間のみ添加し，その後の４日間はインスリンを加えない時はC/EBPαのmRNA発現レベルは上昇し，初期分化誘導が引き起こされていることが確認された（図２C-6）。一方，aP2のmRNA発現レベルに関して，インスリンを添加しない場合（条件1），0.2μg/mlのインスリンを添加し続けた場合（条件2），10μg/mlのインスリンを２日間のみ添加した場合（条件5），そして３日間の10μg/mlのインスリン添加後に7.4ng/ml以下のインスリンで維持した場合では（条件12），10μg/mlのインスリンを常に添加している場合（条件2）と比較して，aP2の発現が低下していることが確認された。これに対して10μg/mlのインスリンを３日間添加し，22ng/ml以上のインスリンで維持した場合では（条件11），10μg/mlのインスリンを常に添加している場合（条件2）と同程度のaP2のmRNA発現が認められた（図２D）。したがって，これらの分化マーカーの検討結果からも，10μg/mlインスリンは最初３日間の分化誘導時のみ必要で，その後は22ng/mlのインスリン濃度が必要であることが判明した。【００４８】
次にVACの機能に及ぼすインスリン濃度の影響を検討する目的で，アディポネクチンのmRNA発現レベルについて調べた（図３）。VSCを３日間の10μg/mlのインスリンによる分化後，４日間10μg/ml（レーン2），0.2μg/ml（レーン3），70ng/ml（レーン4），22ng/ml（レーン5），および7.4ng/ml（レーン6）のインスリンの存在下で培養した。７日間の培養後，mRNAを回収し，リアルタイムPCRによりアディポネクチンのmRNA発現量を測定した。インスリンを添加せずに７日間培養した場合の値を１とした。結果を図３に示す（1:７日間インスリンを添加せずに培養した。2:７日間10μg/mlのインスリンを添加し，培養した。3:10μg/mlのインスリンによる３日間の分化誘導後，４日間0.2μg/mlのインスリンで培養した。4:10μg/mlのインスリンによる３日間の分化誘導後，４日間70ng/mlのインスリンで培養した。5:10μg/mlのインスリンによる３日間の分化誘導後，４日間22ng/mlのインスリンで培養した。6:10μg/mlのインスリンによる３日間の分化誘導後，４日間7.4ng/mlのインスリンで培養した）。【００４９】
10μg/mlのインスリンで７日間培養した場合（レーン2）は，３日間の10μg/mlのインスリンによる分化後，0.2μg/ml〜22ng/mlで４日間培養した場合（レーン3〜5）と比較して，アディポネクチンのmRNA発現レベルが低下していた。また7.4ng/mlのインスリン（レーン6）ではアディポネクチンのmRNA発現レベルが低下していた。【００５０】
次に成熟過程におけるインスリンレセプターの発現量を調べた（図４）。VSCを７日間，８日間および９日間培養後，全セルライセート（20μgタンパク質）をSDS-PAGEで分離し，抗IR抗体によるイムノブロッティングによりIRを検出した。また，ローディングコントロールとして抗アクチン抗体によるイムノブロッティングによりアクチンを検出した。結果を図４に示す（1:10μg/mlのインスリンによる３日間の分化誘導後，22ng/mlのインスリンで２日間成熟させてから，残りの期間10μg/mlのインスリンで培養した。2:10μg/mlのインスリンによる３日間の分化誘導後，22ng/mlのインスリンで２日間成熟させてから，残りの期間0.2μg/mlのインスリンで培養した。3:10μg/mlのインスリンによる３日間の分化誘導後，22ng/mlのインスリンで２日間成熟させてから，残りの期間70ng/mlのインスリンで培養した。4:10μg/mlのインスリンによる３日間の分化誘導後，22ng/mlのインスリンで２日間成熟させてから，残りの期間22ng/mlのインスリンで培養した）。【００５１】
VSCを３日間の10μg/mlのインスリンによる分化後，22ng/mlのインスリンで成熟させてから，再び10μg/ml（レーン1），0.2μg/ml（レーン2），70ng/ml（レーン3），22ng/ml（レーン4）のインスリンで培養したところ，70ng/ml以上のインスリンで培養した場合は，22ng/mlのそれと比較して，インスリンレセプターの顕著な発現低下が認められた（図４）。すなわち，脂肪滴形成後の高濃度インスリン処理により，インスリンレセプターの発現量が低下することがわかった。【００５２】
以上の結果を総合すると，１）VSCの初期の３日間の分化誘導は10μg/mlインスリンでは達成されたが，0.2μg/mlインスリンでは達成されなかった。0.2μg/mlというインスリン濃度は，生理的濃度の１００倍近い高濃度であることから，VSC初期分化誘導には他の生理的因子の存在が強く示唆された。２）一方，VSCの初期分化誘導後のVACの成熟過程は生理的濃度の約10倍程度のインスリンが必要であることが判明した。３）VSCの初期分化誘導後に高濃度のインスリンが存在すると，インスリンレセプターの発現が減少し，インスリン抵抗性状態を誘導していることが判明した。したがって，VACへの分化・成熟過程において，常に10μg/mlのインスリンを添加するというこれまでの培養法には細胞内において非生理的な問題が生じていると考えられた。それと同時に初期分化誘導にはインビボレベルの100倍以上，成熟過程においても10倍以上のインスリンが必要であることを考慮すると，VACへの分化にはインスリンのみでは不十分であり，生体内では他の分化誘導因子が関与している可能性が考えられた。【００５３】
実施例４
VSCからVACへの分化誘導に及ぼすIGF-1の影響の検討
VSCの初期分化誘導における生理的因子の同定を目的としてIGF-1の影響について検討を行った。まずコントロールとしては，図２で確認した10μg/mlインスリンの初期分化誘導後，22ng/mlインスリンで成熟させたVACを用いた。【００５４】
200ng/ml（ヒト血中の正常濃度150〜250ng/ml）のIGF-1を添加した培地で，継続して７日間培養し，C/EBPα（脂肪細胞の分化マーカー），aP2（脂肪細胞の分化マーカー）およびC/EBPβ（未分化脂肪細胞の分化マーカー）のmRNA発現量を測定した。結果を図５に示す（A:７日間培養後の写真。1:  ３日間200ng/mlのIGF-1を添加し，次の４日間22ng/mlのインスリンを添加して培養した。2:  ７日間200ng/mlのIGF-1と22ng/mlのインスリンを添加して培養した。3:  ７日間200ng/mlのIGF-1を添加して培養した。１から３は，図BからDのレーン１から３に対応している。B:  ７日間の培養後，mRNAを回収し，リアルタイムPCRによりC/EBPαのmRNA発現量を測定した。３日間10μg/mlのインスリンを添加し，次の４日間22ng/mlのインスリンを添加して培養した場合の値を１とした。C:  ７日間の培養後，mRNAを回収し，リアルタイムPCRによりaP2のmRNA発現量を測定した。３日間10μg/mlのインスリンを添加し，次の４日間22ng/mlのインスリンを添加して培養した場合の値を１とした。D:  ７日間の培養後，mRNAを回収し，リアルタイムPCRによりC/EBPβのmRNA発現量を測定した。３日間10μg/mlのインスリンを添加し，次の４日間22ng/mlのインスリンを添加して培養した場合の値を１とした）。【００５５】
200ng/mlのIGF-1のみでは，脂肪滴の蓄積は認められず，VACへの分化成熟は起こらなかった（図５A-3）。これは今までのIGF-1のみで脂肪滴が引き起こされるという報告とは異なる結果であった（Boone,  C.,  Gregoire,  F.,  and  Remacle,  C.  (2000)  J  Anim  Sci  78(4),  885-895）。一方，３日間の200ng/mlのIGF-1による分化誘導後，22ng/mlインスリンで４日間成熟させたところ，これまでの培養法と同程度の脂肪滴の形成が認められた（図５A-1）。また７日間200ng/mlのIGF-1と22ng/mlのインスリンを添加して培養した場合もこれまでの培養法と同程度の脂肪滴の形成が認められた（図５A-2）。すなわち，生理的濃度のIGF-1により初期分化が誘導されることがわかった。【００５６】
C/EBPαおよびaP2のmRNA発現レベルについて検討をおこなったところ，３日間の200ng/mlのIGF-1による分化誘導後，22ng/mlインスリンで４日間成熟させた場合，C/EBPαおよびaP2のmRNA発現が認められ（図５BおよびC），これは，10μg/mlのインスリンによる分化誘導後，22ng/mlのインスリンで４日間成熟させた場合（図2の11）と同程度であった。IGF-1のみを添加し，７日間培養した場合では，10μg/mlのインスリンによる分化誘導後，22ng/mlのインスリンで４日間成熟させた場合と比較して，C/EBPαおよびaP2のmRNA発現が増加しており，生理的濃度のIGF-1がこれらの転写因子を十分に誘導していることが示唆された（図５B，Cおよび図2の11）。しかしながら，成熟によって発現量が低下するC/EBPβのmRNA量を比較すると，形態的な結果と一致して，IGF-1のみの場合では，C/EBPβのmRNA量は維持されたままであった（図５Dレーン3）。従って，初期分化誘導にはIGF-1のみで十分な役割を示すが，成熟過程にはIGF-1とインスリンの両者が必要である可能性が示唆された。【００５７】
実施例５
IGF-1とインスリンの組み合わせを用いたVSCからVACへの分化誘導
IGF-1とインスリンとを種々に組み合わせて，VACの分化誘導・成熟におよぼす影響を調べた。結果を図６に示す（A:  ７日間の培養後の写真。1:３日間200ng/mlのIGF-1を添加し，次の４日間2.5ng/mlのインスリンを添加して培養した。2:  ７日間200ng/mlのIGF-1と2.5ng/mlのインスリンを添加して培養した。3:  ３日間200ng/mlのIGF-1を添加し，次の４日間0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した。4:  ７日間200ng/mlのIGF-1  0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した。B:  ７日間の培養後，mRNAを回収し，リアルタイムPCRによりC/EBPβのmRNA発現量を測定した。３日間10μg/mlのインスリンを添加し，次の４日間22ng/mlのインスリンを添加して培養した場合の値を１とした。C:  ７日間の培養後，mRNAを回収し，リアルタイムPCRによりaP2のmRNA発現量を測定した。３日間10μg/mlのインスリンを添加し，次の４日間22ng/mlのインスリンを添加して培養した場合の値を１とした）。【００５８】
200ng/mlのIGF-1による３日間の初期分化誘導後，生理的濃度の範囲内にあたる2.5ng/ml（図６A-1）および0.85ng/ml（図６A-3）のインスリンで４日間処理したところ，十分な脂肪滴の形成が起きなかった。しかしながら，200ng/mlのIGF-1と2.5ng/ml（図６A-2）および0.85ng/ml（図６A-4）のインスリンを常に添加して７日間培養した場合は，十分な脂肪滴の形成が認められた。この結果より，IGF-1のみでは脂肪滴の形成が引き起こされないものの，生理的濃度のインスリンはIGF-1と協調して脂肪滴の形成を促進していることが判明した。従って，IGF-1とインスリンの両者を共存させることで，初めて生理的濃度の範囲内で十分な脂肪細胞への分化・成熟を引き起こすことに成功した。【００５９】
さらに，図５Cの結果と一致して，全ての場合でaP2のmRNA発現が増加しており，生理的濃度のIGF-1がこれらの転写因子を十分に誘導していることが示唆された（図６C）。しかしながら，成熟によって発現量が低下するC/EBPβのmRNA量を比較すると，３日間200ng/mlのIGF-1を添加し，次の４日間2.5ng/mlまたは0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した場合では，C/EBPβのmRNA量は維持されたままであったが，７日間200ng/mlのIGF-1と2.5ng/mlまたは0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した場合では，C/EBPβのmRNA量が十分に減少していた。（図５Dレーン3）。従って，IGF-1とインスリンの両者を常に添加することで，生理的濃度のインスリンで十分な脂肪細胞分化誘導を導ける可能性が示唆された。【００６０】
次に，分化に必要とされるIGF-1の濃度についてさらに検討を行った。上述と同様にして，VSCを種々の濃度のIGF-1と0.85ng/mlのインスリンの存在下で，7日間培養した。培養後，mRNAを回収しリアルタイムPCRによりC/EBPαのmRNA発現量を測定した。７日間の培養後，mRNAを回収し，リアルタイムPCRによりC/EBPαのmRNA発現量およびC/EBPβのmRNA発現量を測定した。mRNA発現量は，３日間10μg/mlのインスリンを添加し，次の４日間22ng/mlのインスリンを添加して培養した場合の値を１として表した。【００６１】
図7Aに７日間培養後の写真を，図7BにC/EBPαのmRNA発現量を，図7CにC/EBPβのmRNA発現量をそれぞれ示す。なお，図7Aの１から６は，図7Bおよび図7Cのレーン１から６に対応している。
1:  ７日間10ng/mlのIGF-1と0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した。
2:  ７日間50ng/mlのIGF-1と0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した。
3:  ７日間100ng/mlのIGF-1と0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した。
4:  ７日間200ng/mlのIGF-1と0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した。
5:  ７日間400ng/mlのIGF-1と0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した。
6:  ７日間800ng/mlのIGF-1と0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した。【００６２】
その結果，50ng/ml以下のIGF-1では，分化効率が低下した。C/EBPαのmRNA発現量に関しては，IGF-1の濃度により変化が認められなかったが，C/EBPβのmRNAに関しては，見た目の分化率に一致して，50ng/ml以下のIGF-1では，200ng/mlのIGF-1を添加した場合と比較して発現量が増加した。【００６３】
実施例６
高濃度のインスリンによる分化誘導との比較
VSCを10μg/mlインスリンまたは200ng/mlのIGF-1の存在下で３日間培養後，全セルライセート（20μgタンパク質）をSDS-PAGEで分離し，抗インスリンレセプター（IR）抗体によるイムノブロッティングによりインスリンレセプターを検出した。また，ローディングコントロールとして抗アクチン抗体によるイムノブロッティングによりアクチンを検出した。結果を図８に示す（1:  ３日間10μg/mlのインスリンを添加した。2:  ３日間200ng/mlのIGF-1を添加した。3:  ３日間200ng/mlのIGF-1と22ng/mlのインスリンを添加した）。【００６４】
10μg/mlインスリンまたは200ng/mlのIGF-1による３日間の初期分化誘導後のインスリンレセプターの発現量を比較したところ，10μg/mlインスリンで分化誘導したものでは，200ng/mlのIGF-1（レーン2）および200ng/mlのIGF-1と22ng/mlのインスリン（レーン3）によるそれと比較して，インスリンレセプターの減少が認められた。したがって，10μg/mlインスリンで分化誘導する系は，分化過程の研究を行う上で正常な脂肪細胞の状態の現象を十分反映していないと考えられる。【００６５】
実施例７
高インスリン血症のモデル系
次に，200ng/mlのIGF-1と各インスリン濃度で９日間培養後，培地を回収し，ELISA法を用いてアディポネクチンの含有量を測定した。200ng/mlのIGF-1および10μg/ml（レーン1），70ng/ml（レーン2），22ng/ml（レーン3）もしくは2.5ng/ml（レーン4）の濃度のインスリンを常に添加して9日間培養した場合，アディポネクチン分泌量は70ng/ml以上のインスリン濃度で低下した（図9A）。さらに，最初の4日間200ng/mlのIGF-1および2.5ng/mlのインスリンを添加して培養し，引き続き5日間は200ng/mlのIGF-1および10μg/ml（レーン1），70ng/ml（レーン2），22ng/ml（レーン3）もしくは2.5ng/ml（レーン4）の濃度のインスリンを添加して培養したところ，同様に70ng/ml以上のインスリン濃度でアディポネクチン分泌は低下した（図9B）。このことから，70ng/ml以上のインスリンで培養することによりアディポネックチン分泌が抑制されることならびに，成熟過程における70ng/ml以上のインスリン暴露によってもアディポネクチン分泌が抑制されることが明らかとなった。インスリン濃度70ng/mlとは，高インスリン血症の患者に見いだされるレベルである。すなわち，本発明の分化誘導系を用いて得られた成熟脂肪細胞を70ng/mlのインスリン濃度で培養することは，高インスリン血症のモデル系を表しており，高インスリン血症治療薬のスクリーニングおよび効果の判定に利用できることが判明した。【００６６】
実施例８
薬剤候補物質の評価
インスリン抵抗性改善薬として市販されているトログリタゾンを用いて，本願発明にしたがって分化誘導されたVACに対するトログリタゾンの影響について検討を行った。VSCを７日間200ng/mlのIGF-1と0.85ng/mlのインスリンを添加して培養し，さらに培養４日目から10μMのトログリタゾンを添加した。７日間の培養後，全セルライセート（20μgタンパク質）をSDS-PAGEで分離し，抗IR抗体によるイムノブロッティングによりIRを検出した。また，ローディングコントロールとして抗アクチン抗体によるイムノブロッティングによりアクチンを検出した。【００６７】
図10Aに７日間培養後の写真を，図10BにIR発現量を示す。なお，図10Aの１および２は，図10Bのレーン１および２に対応している。
1:  ７日間200ng/mlのIGF-1と0.85ng/mlのインスリンを添加して培養した。
2:  ７日間200ng/mlのIGF-1と0.85ng/mlのインスリンを添加して培養し，さらに培養４日目から10μMのトログリタゾンを添加した。【００６８】
その結果，トログリタゾンの添加により形態の変化は認められなかったが，インスリンレセプターの発現量が増加することが判った。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば，糖尿病，高脂血漿，動脈硬化等の生活習慣病との関連が深いとされる腸間膜脂肪細胞を生理的な条件に近い条件で分化誘導することができる。したがって，本発明の分化誘導系により得られる成熟脂肪細胞は，内臓脂肪蓄積および生活習慣病発症のメカニズムの解明および治療薬や診断薬評価および開発に有用である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月25日(2008.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．８５〜３０ｎｇ／ｍｌのインスリンおよび５０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含み，インドメタシン，デキサメタゾンおよびＩＢＭＸを実質的に含まないことを特徴とする，内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導するための培地。
【請求項２】
０．８５〜５ｎｇ／ｍｌのインスリンおよび５０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含む，請求項１記載の培地。
【請求項３】
請求項１または２に記載の培地中で内臓脂肪前駆細胞を培養することを特徴とする，内臓脂肪前駆細胞から成熟内臓脂肪細胞への分化を誘導する方法。
【請求項４】
試験物質のインスリン抵抗性改善薬としての効果を検定する方法であって，
０．８５〜５ｎｇ／ｍｌのインスリンおよび５０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含む培地を用いて誘導することにより得られた成熟内臓脂肪細胞を，インスリン抵抗性惹起条件下で培養してインスリン抵抗性モデル内臓脂肪細胞を誘導し，
試験物質の存在下で，前記成熟内臓脂肪細胞および前記インスリン抵抗性モデル内臓脂肪細胞を培養して，両者の脂肪細胞機能を比較する，
の各工程を含む方法。
【請求項５】
試験物質の高インスリン血漿治療薬としての効果を検定する方法であって，
成熟内臓脂肪細胞を，試験物質の存在下で，０．８５〜５ｎｇ／ｍｌのインスリンおよび５０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含む培地で培養したときと，７０〜１００ｎｇ／ｍｌのインスリンおよび５０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含む培地で培養したときの，細胞内におけるインスリンレセプターの発現量を比較する，
ことを含む方法。
【請求項６】
試験物質のアディポネクチン分泌促進剤としての効果を検定する方法であって，
試験物質の存在下で，０．８５〜５ｎｇ／ｍｌのインスリンおよび５０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含む培地を用いて成熟内臓脂肪細胞を培養し，細胞におけるアディポネクチンの産生量または分泌量を測定する，
ことを含む方法。
【請求項７】
試験物質のインスリン抵抗性状態におけるアディポネクチン分泌促進剤の効果を検定する方法であって，
試験物質の存在下で，０．８５〜５ｎｇ／ｍｌのインスリンおよび５０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含む培地中で培養した成熟内臓脂肪細胞と，７０〜１００ｎｇ／ｍｌのインスリンおよび５０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含む培地中で培養した成熟内臓脂肪細胞とについて，細胞におけるアディポネクチンの産生量または分泌量を比較する，
ことを含む方法。
【国際調査報告】
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