【手続補正書】
【提出日】令和1年5月10日(2019.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム分析の方法であって、
１つ以上の試料内の１つ以上の複対立遺伝子マーカーに対するシグナルを取得することと、
各複対立遺伝子マーカーについて、前記１つ以上の試料からの複数の対立遺伝子対における各対立遺伝子対に対する前記シグナルをクラスタ化して、各対立遺伝子対を表すクラスタをもたらすことと、
ホモ接合性対立遺伝子対を表す各ホモ接合性クラスタについて、代替対立遺伝子に対するシグナルを、前記代替対立遺伝子に対するバックグラウンドシグナルの算出のために収集して、各々がそれぞれの対立遺伝子を表す複数のバックグラウンドシグナルをもたらすことと、
前記シグナル及び前記バックグラウンドシグナルに基づいて、各対立遺伝子対について最初の遺伝子型コールを各試料に割り当てることと、
前記最初の遺伝子型コール及び前のクラスタパラメータを使用して、各クラスタの多変量正規分布を算出することと、
各クラスタの各多変量正規分布について、各試料のメンバーシップの対数尤度を算出することと、
前記メンバーシップの対数尤度に基づいて、各試料について、各クラスタにおけるメンバーシップの確率を算出することと、
前記メンバーシップの確率に基づいて、最終の遺伝子型コールを各試料に割り当てることと、を含む、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の複対立遺伝子マーカーが、一塩基多型（ＳＮＰ）及び３つ以上の可能な対立遺伝子を有するインデルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記最初の遺伝子型コールの割り当てが、
各対立遺伝子対について、いずれの代替対立遺伝子においても前記バックグラウンドシグナルを超えるシグナルを有しない試料のサブセットを特定することと、
各対立遺伝子対について、前記試料のサブセットにおける試料の数が、既定の最小値を超えることを判別することと、
各対立遺伝子対について、対応する対立遺伝子対において表される２つの対立遺伝子に対して、前記試料のサブセットにおける各試料を遺伝子型決定することと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記最初の遺伝子型コールの、各試料への割り当てが、
各試料において最も頻繁に発生するコールを選択するために、各試料のコールを比較することを更に含み、前記コール間に同点がある場合、「ノーコール」値が、前記試料に割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
各試料の前記メンバーシップの対数尤度の算出が、以下を使用して算出され、
【数１】
2019500706.tif 000001
式中、｜Σ｜が、共分散の決定因子であり、
ｘが、プローブセットの試料に対する前記シグナルを含むｋ次元列ベクトルであり、
ｋが、プローブセットに対するシグナルの数である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記最終の遺伝子型コールの割り当てが、
前記試料が、最高のメンバーシップの確率を有する特定のクラスタに各試料を割り当て、各試料に対するクラスタ割り当てをもたらすことと、
前記クラスタ割り当てに基づいて、前記最終の遺伝子型コールを各試料に割り当てることと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
各試料の信頼値を算出することであって、前記信頼値が、任意の他のクラスタにおける前記試料のメンバーシップの確率を含む、算出することと、
各試料の前記信頼値を、既定の閾値と比較することと、
前記既定の閾値を超える信頼値を有する各試料に「ノーコール」値を割り当てることと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
それぞれの各対立遺伝子について、前記バックグラウンドシグナルの平均、分散、及び標準偏差を算出することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対立遺伝子について、前記バックグラウンドシグナルの前記平均、分散、及び標準偏差を算出するために利用可能な値がない場合、大域的推定バックグラウンドシグナルが、対立遺伝子に使用され、前記大域的推定バックグラウンドシグナルが、前記複数のバックグラウンドシグナルの平均である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１０】
それぞれの各対立遺伝子についての、前記バックグラウンドシグナルの前記平均、分散、及び標準偏差の算出が、以下の等式を使用して算出することを更に含み、
【数２】
2019500706.tif 000002
【数３】
2019500706.tif 000003
【数４】
2019500706.tif 000004
【数５】
2019500706.tif 000005
【数６】
2019500706.tif 000006
【数７】
2019500706.tif 000007
【数８】
2019500706.tif 000008
式中、ａｖｇＳｉｇａｌｌｅｌｅが、対立遺伝子の平均シグナルであり、ａｌｌｅｌｅｈｏｍが、当該対立遺伝子のホモ接合性コールのシグナルであり、ｎｓｉｇａｌｌｅｌｅが、前記シグナルに寄与した試料の総数であり、
ｂｇｎｄａｌｌｅｌｅが、対立遺伝子のバックグラウンド値であり、Σａｌｌｅｌｅｉｎ  ｈｏｍ  ｃａｌｌ  ｎｏｔ＝ａｌｌｅｌｅ）が、前記コールが、前記対立遺伝子に一致しないとき、ホモ接合性コール中の当該対立遺伝子のシグナルであり、
ａｖｇＢｇｎｄａｌｌｅｌｅが、対立遺伝子の前記バックグラウンドの平均であり、
ｗｅｉｇｈｔｅｄＡｖｇＢｇｎｄが、前記バックグラウンドの加重平均であり、
ｖａｒｉａｎｃｅＢｇｎｄａｌｌｅＬｅが、前記バックグラウンドの分散であり、
ｓｔｄｅｖＢｇｎｄａｌｌｅｌｅ＝が、前記バックグラウンドの標準偏差であり、
ｗｅｉｇｈｔｅｄＡｖｇＳｔＤｅｖＢｇｎｄが、前記バックグラウンドの加重平均標準偏差である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の試料における前記１つ以上の複対立遺伝子マーカーに対する前記シグナルを取得することが、前記複対立遺伝子マーカーを測定するための、アレイ上の複数のプローブとの前記試料のハイブリダイゼーションに基づいている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ゲノム分析の方法であって、
ゲノムＤＮＡ試料を入手することと、
前記ゲノムＤＮＡ試料を、ゲノムＤＮＡの少なくとも第１の部分及び第２の部分に分割することと、 前記ゲノムＤＮＡの第１の部分上で遺伝子座特異的増幅を行って、標的配列に対する第１のアンプリコンのプールを生成することと、
全ゲノム増幅を、少なくとも前記ゲノムＤＮＡの第２の部分上で行って、第２のアンプリコンのプールを生成することと、
前記第１及び第２のアンプリコンのプールを断片化して、断片化アンプリコンを生成することと、
前記断片化アンプリコンを、アレイにハイブリダイズすることと、を含む、方法。
【請求項１３】
前記第１のアンプリコンのプールが、全ゲノム増幅が行われる前に前記ゲノムＤＮＡの第２の部分に付加され、前記全ゲノム増幅が、前記第１のアンプリコンのプール及び前記ゲノムＤＮＡの第２の部分上で行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記全ゲノム増幅が、前記ゲノムＤＮＡの第２の部分上のみで行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１及び第２のアンプリコンのプールが、断片化前に複合される、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
これら及び追加の態様は、下で更に詳細に論じられる開示の利益により高く評価されるであろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
コンピュータシステムを使用して、１つ以上の複対立遺伝子マーカーを遺伝子型決定するための方法であって、
１つ以上の試料内の１つ以上の複対立遺伝子マーカーに対するシグナルを取得することと、
各複対立遺伝子マーカーについて、前記１つ以上の試料からの複数の対立遺伝子対における各対立遺伝子対に対する前記シグナルをクラスタ化して、各対立遺伝子対を表すクラスタをもたらすことと、
ホモ接合性対立遺伝子対を表す各ホモ接合性クラスタについて、代替対立遺伝子に対するシグナルを、前記代替対立遺伝子に対するバックグラウンドシグナルの算出のために収集して、各々がそれぞれの対立遺伝子を表す複数のバックグラウンドシグナルをもたらすことと、
前記シグナル及び前記バックグラウンドシグナルに基づいて、各対立遺伝子対について最初の遺伝子型コールを各試料に割り当てることと、
前記最初の遺伝子型コール及び前のクラスタパラメータを使用して、各クラスタの多変量正規分布を算出することと、
各クラスタの各多変量正規分布について、各試料のメンバーシップの対数尤度を算出することと、
前記メンバーシップの対数尤度に基づいて、各試料について、各クラスタにおけるメンバーシップの確率を算出することと、
前記メンバーシップの確率に基づいて、最終の遺伝子型コールを各試料に割り当てることと、を含む、方法。
（項目２）
前記１つ以上の複対立遺伝子マーカーが、一塩基多型（ＳＮＰ）及び３つ以上の可能な対立遺伝子を有するインデルを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記１つ以上の複対立遺伝子マーカーに対して取得された前記シグナルが、前記１つ以上の試料における各対立遺伝子の対立遺伝子強度データを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記シグナルのクラスタ化が、アルゴリズムを、定義された一塩基多型（ＳＮＰ）及び定義されたアルゴリズムパラメータと共に使用することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記最初の遺伝子型コールの割り当てが、
各対立遺伝子対について、いずれの代替対立遺伝子においても前記バックグラウンドシグナルを超えるシグナルを有しない試料のサブセットを特定することと、
各対立遺伝子対について、前記試料のサブセットにおける試料の数が、既定の最小値を超えることを判別することと、
各対立遺伝子対について、対応する対立遺伝子対において表される２つの対立遺伝子に対して、前記試料のサブセットにおける各試料を遺伝子型決定することと、を更に含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記最初の遺伝子型コールの、各試料への割り当てが、
各試料において最も頻繁に発生するコールを選択するために、各試料のコールを比較することを更に含み、前記コール間に同点がある場合、「ノーコール」値が、前記試料に割り当てられる、項目１に記載の方法。
（項目７）
各クラスタの前記多変量正規分布が、対数シグナル空間において算出される、項目１に記載の方法。
（項目８）
各試料の前記メンバーシップの対数尤度の算出が、以下を使用して算出され、
【数１】
2019500706.tif 000009
式中、｜Σ｜が、共分散の決定因子であり、
ｘが、プローブセットの試料に対する前記シグナルを含むｋ次元列ベクトルであり、
ｋが、プローブセットに対するシグナルの数である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記最終の遺伝子型コールの割り当てが、
前記試料が、最高のメンバーシップの確率を有する特定のクラスタに各試料を割り当て、各試料に対するクラスタ割り当てをもたらすことと、
前記クラスタ割り当てに基づいて、前記最終の遺伝子型コールを各試料に割り当てることと、を更に含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
各試料の信頼値を算出することであって、前記信頼値が、任意の他のクラスタにおける前記試料のメンバーシップの確率を含む、算出することと、
各試料の前記信頼値を、既定の閾値と比較することと、
前記既定の閾値を超える信頼値を有する各試料に「ノーコール」値を割り当てることと、を更に含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
それぞれの各対立遺伝子について、前記バックグラウンドシグナルの平均、分散、及び標準偏差を算出することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記対立遺伝子について、前記バックグラウンドシグナルの前記平均、分散、及び標準偏差を算出するために利用可能な値がない場合、大域的推定バックグラウンドシグナルが、対立遺伝子に使用され、前記大域的推定バックグラウンドシグナルが、前記複数のバックグラウンドシグナルの平均である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
それぞれの各対立遺伝子についての、前記バックグラウンドシグナルの前記平均、分散、及び標準偏差の算出が、以下の等式を使用して算出することを更に含み、
【数２】
2019500706.tif 000010
【数３】
2019500706.tif 000011
【数４】
2019500706.tif 000012
【数５】
2019500706.tif 000013
【数６】
2019500706.tif 000014
【数７】
2019500706.tif 000015
【数８】
2019500706.tif 000016
式中、ａｖｇＳｉｇａｌｌｅｌｅが、対立遺伝子の平均シグナルであり、ａｌｌｅｌｅｈｏｍが、当該対立遺伝子のホモ接合性コールのシグナルであり、ｎｓｉｇａｌｌｅｌｅが、前記シグナルに寄与した試料の総数であり、
ｂｇｎｄａｌｌｅｌｅが、対立遺伝子のバックグラウンド値であり、Σａｌｌｅｌｅｉｎ  ｈｏｍ  ｃａｌｌ  ｎｏｔ＝ａｌｌｅｌｅ）が、前記コールが、前記対立遺伝子に一致しないとき、ホモ接合性コール中の当該対立遺伝子のシグナルであり、
ａｖｇＢｇｎｄａｌｌｅｌｅが、対立遺伝子の前記バックグラウンドの平均であり、
ｗｅｉｇｈｔｅｄＡｖｇＢｇｎｄが、前記バックグラウンドの加重平均であり、
ｖａｒｉａｎｃｅＢｇｎｄａｌｌｅＬｅが、前記バックグラウンドの分散であり、
ｓｔｄｅｖＢｇｎｄａｌｌｅｌｅ＝が、前記バックグラウンドの標準偏差であり、
ｗｅｉｇｈｔｅｄＡｖｇＳｔＤｅｖＢｇｎｄが、前記バックグラウンドの加重平均標準偏差である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記１つ以上の試料における前記１つ以上の複対立遺伝子マーカーに対する前記シグナルを取得することが、前記複対立遺伝子マーカーを測定するための、アレイ上の複数のプローブとの前記試料のハイブリダイゼーションに基づいている、項目１に記載の方法。
（項目１５）
示差的に標識されたオリゴヌクレオチドを前記アレイ上の複数のプローブに結紮して、前記標識されたオリゴヌクレオチドの３’末端においてＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドで標識されたオリゴヌクレオチドの結紮を区別することによって、前記試料の標的配列に存在する対立遺伝子を判別することを更に含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
示差的に標識されたヌクレオチドによる前記アレイの前記複数のプローブの一塩基延長を使用して、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧヌクレオチドによる延長を区別することによって、前記試料の標的配列に存在する対立遺伝子を判別することを更に含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
アレイによるアンプリコンのハイブリダイゼーション前に、ゲノムＤＮＡ試料を、遺伝子座特異的増幅及び全ゲノム増幅で増幅するための方法であって、
ゲノムＤＮＡ試料を入手することと、
前記ゲノムＤＮＡ試料を、ゲノムＤＮＡの少なくとも第１の部分及び第２の部分に分割することと、 前記ゲノムＤＮＡの第１の部分上で遺伝子座特異的増幅を行って、標的配列に対する第１のアンプリコンのプールを生成することと、
全ゲノム増幅を、少なくとも前記ゲノムＤＮＡの第２の部分上で行って、第２のアンプリコンのプールを生成することと、
前記第１及び第２のアンプリコンのプールを断片化して、断片化アンプリコンを生成することと、
前記断片化アンプリコンを、アレイにハイブリダイズすることと、を含む、方法。
（項目１８）
前記遺伝子座特異的増幅が、多重ポリメラーゼ連鎖反応による前記標的配列の増幅を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記遺伝子座特異的増幅が、分子反転プローブによる前記標的配列の増幅を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記遺伝子座特異的増幅が、錠型プローブによる前記標的配列の増幅を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記第１のアンプリコンのプールが、全ゲノム増幅が行われる前に前記ゲノムＤＮＡの第２の部分に付加され、前記全ゲノム増幅が、前記第１のアンプリコンのプール及び前記ゲノムＤＮＡの第２の部分上で行われる、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
前記全ゲノム増幅が、前記ゲノムＤＮＡの第２の部分上のみで行われる、項目１７に記載の方法。
（項目２３）
前記第１及び第２のアンプリコンのプールが、断片化前に複合される、項目１７に記載の方法。
（項目２４）
前記標的配列が、複対立遺伝子マーカーを含む、項目１７に記載の方法。
（項目２５）
前記ゲノムＤＮＡ試料が、前記標的配列と、前記標的配列の偽遺伝子と、を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２６）
前記遺伝子座特異的増幅が、前記標的配列に対する前記第１のアンプリコンのプールを生成するが、前記偽遺伝子のアンプリコンを生成しない、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記断片化アンプリコンが、前記偽遺伝子のアンプリコンより多くの前記標的配列のアンプリコンを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記アレイが、１つ以上の複対立遺伝子マーカーを照合するための複数のプローブを含む、項目１７に記載の方法。
（項目２９）
前記試料中の前記１つ以上の複対立遺伝子マーカーに対するシグナルを取得することと、
ベイジアンＮ−対立遺伝子遺伝子型決定アルゴリズムを使用して、複対立遺伝子遺伝子型決定を行うことと、を更に含む、項目２６に記載の方法。