【手続補正書】
【提出日】平成20年3月5日(2008.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、イソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を大腸菌(Escherichia coli)におけるメバロン酸経路を介して産生する方法：
(i) 異種ヒドロキシメチルグルタリル-CoA(HMG-CoA)合成酵素(HMGS)および異種HMG-CoA還元酵素(HMGR)を産生するように遺伝的に修飾された大腸菌細胞を適した培地で培養する段階であって、遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されるHMGRの相対活性レベルが、遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されるHMGSの相対活性レベルよりも高く、遺伝的に修飾された大腸菌細胞が、
(a) アセトアセチル-CoAチオラーゼ；
(b) メバロン酸キナーゼ；
(c) ホスホメバロン酸キナーゼ；および、
(d) メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ；
から選択される1つまたは複数のさらなるメバロン酸経路の異種酵素を産生するようにさらに遺伝的に修飾され、遺伝的に修飾された大腸菌細胞が、SEQ ID NO：2に示されたpBAD33MevT配列を発現する対照大腸菌株において産生されるレベルと少なくとも同じ高さのレベルでイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を産生し、遺伝的に修飾された大腸菌細胞が、対照大腸菌株と比較してより低いHMG-CoA誘導性成長阻害を示す、段階；ならびに
(ii) 産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を回収する段階。
【請求項２】
アセトアセチル-CoAチオラーゼが、遺伝的に修飾された大腸菌細胞に対して異種である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞が、HMGRをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸の2つまたはそれ以上のコピーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約50％高い、請求項1記載の方法。
【請求項５】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約2倍高い、請求項1記載の方法。
【請求項６】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約5倍高い、請求項1記載の方法。
【請求項７】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約10倍高い、請求項1記載の方法。
【請求項８】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約50倍高い、請求項1記載の方法。
【請求項９】
以下の段階を含む、イソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を大腸菌におけるメバロン酸経路を介して産生する方法：
(i) 異種ヒドロキシメチルグルタリル-CoA(HMG-CoA)合成酵素(HMGS)および異種HMG-CoA還元酵素(HMGR)を産生するように遺伝的に修飾された大腸菌細胞を適した培地で培養する段階であって、遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されるHMGRの相対活性レベルが、遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されるHMGSの相対活性レベルよりも高く、遺伝的に修飾された大腸菌細胞が、
(a) アセトアセチル-CoAチオラーゼ；
(b) メバロン酸キナーゼ；
(c) ホスホメバロン酸キナーゼ；および、
(d) メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ；
から選択される1つまたは複数のさらなるメバロン酸経路の異種酵素を産生するようにさらに遺伝的に修飾され、遺伝的に修飾された大腸菌細胞が、SEQ ID NO：1に示されたpBAD24MevT配列を発現する対照大腸菌株において産生されるレベルと少なくとも同じ高さのレベルでイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を産生し、遺伝的に修飾された大腸菌細胞が、対照大腸菌株と比較してより低いHMG-CoA誘導性成長阻害を示す、段階；ならびに
(ii) 産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を回収する段階。
【請求項１０】
アセトアセチル-CoAチオラーゼが、遺伝的に修飾された大腸菌細胞に対して異種である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞が、HMGRをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸の2つまたはそれ以上のコピーを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約50％高い、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約2倍高い、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約5倍高い、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約10倍高い、請求項9記載の方法。
【請求項１６】
遺伝的に修飾された大腸菌細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照大腸菌株内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約50倍高い、請求項9記載の方法。
【請求項１７】
イソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を産生する遺伝的に修飾された宿主細胞であって、
遺伝的に修飾された宿主細胞が、メバロン酸経路を介してイソペンテニルピロリン酸を正常に産生しない原核宿主細胞であり、遺伝的に修飾された宿主細胞が、異種ヒドロキシメチルグルタリル-CoA(HMG-CoA)合成酵素(HMGS)および異種HMG-CoA還元酵素(HMGR)を産生するように遺伝的に修飾されており、遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されるHMGRの相対活性レベルが、遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されるHMGSの相対活性レベルよりも高く、遺伝的に修飾された宿主細胞が、
(a) アセトアセチル-CoAチオラーゼ；
(b) メバロン酸キナーゼ；
(c) ホスホメバロン酸キナーゼ；および、
(d) メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ；
から選択される1つまたは複数のさらなるメバロン酸経路の異種酵素を産生するようにさらに遺伝的に修飾され、遺伝的に修飾された宿主細胞が、SEQ ID NO：2に示されたpBAD33MevT配列を発現する対照宿主細胞において産生されるレベルと少なくとも同じ高さのレベルでイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を産生し、遺伝的に修飾された宿主細胞が、対照宿主細胞と比較してより低いHMG-CoA誘導性成長阻害を示す、遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１８】
大腸菌株である、請求項17記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項１９】
アセトアセチル-CoAチオラーゼが、遺伝的に修飾された宿主細胞に対して異種である、請求項17記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２０】
遺伝的に修飾された宿主細胞が、HMGRをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸の2つまたはそれ以上のコピーを含む、請求項17記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２１】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約50％高い、請求項17記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２２】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルの少なくとも約2倍である、請求項17記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２３】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルの少なくとも約5倍である、請求項17記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２４】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルの少なくとも約10倍である、請求項17記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２５】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルの少なくとも約50倍である、請求項17記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２６】
イソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を産生する遺伝的に修飾された宿主細胞であって、
遺伝的に修飾された宿主細胞が、メバロン酸経路を介してイソペンテニルピロリン酸を正常に産生しない原核宿主細胞であり、遺伝的に修飾された宿主細胞が、異種ヒドロキシメチルグルタリル-CoA(HMG-CoA)合成酵素(HMGS)および異種HMG-CoA還元酵素(HMGR)を産生するように遺伝的に修飾されており、遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されるHMGRの相対活性レベルが、遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されるHMGSの相対活性レベルよりも高く、遺伝的に修飾された宿主細胞が、
(a) アセトアセチル-CoAチオラーゼ；
(b) メバロン酸キナーゼ；
(c) ホスホメバロン酸キナーゼ；および、
(d) メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ；
から選択される1つまたは複数のさらなるメバロン酸経路の異種酵素を産生するようにさらに遺伝的に修飾され、遺伝的に修飾された宿主細胞が、SEQ ID NO：1に示されたpBAD24MevT配列を発現する対照宿主細胞において産生されるレベルと少なくとも同じ高さのレベルでイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を産生し、遺伝的に修飾された宿主細胞が、対照宿主細胞と比較してより低いHMG-CoA誘導性成長阻害を示す、遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２７】
大腸菌株である、請求項26記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２８】
アセトアセチル-CoAチオラーゼが、遺伝的に修飾された宿主細胞に対して異種である、請求項26記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項２９】
遺伝的に修飾された宿主細胞が、HMGRをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸の2つまたはそれ以上のコピーを含む、請求項26記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項３０】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルより少なくとも約50％高い、請求項26記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項３１】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルの少なくとも約2倍である、請求項26記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項３２】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルの少なくとも約5倍である、請求項26記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項３３】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルの少なくとも約10倍である、請求項26記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。
【請求項３４】
遺伝的に修飾された宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルが、対照宿主細胞内で産生されたイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体のレベルの少なくとも約50倍である、請求項26記載の遺伝的に修飾された宿主細胞。