【手続補正書】
【提出日】令和1年9月13日(2019.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐病性形質、非生物的ストレス耐性形質、および形態学的形質からなる群から選択された植物の形質を改変または修飾するための植物の遺伝子材料への挿入に適応した１つ以上の核酸断片を含む組換え遺伝子構築物であって、前記１つ以上の核酸断片の各々が、１つ以上の植物に由来する少なくとも１５のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、植物の遺伝子材料に前記１つ以上の核酸断片が挿入されると、前記植物の前記遺伝子材料に挿入されたヌクレオチド配列が、前記植物由来のヌクレオチド配列からなる、組換え遺伝子構築物。
【請求項２】
１つ以上の植物に由来する前記ヌクレオチド配列が１つの植物に由来する、請求項１に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項３】
１つ以上の植物に由来する前記ヌクレオチド配列が、同じ種の複数の植物に由来する、請求項１に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項４】
植物の遺伝子材料に挿入可能である前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片の全長が、少なくとも１００塩基対；少なくとも５００塩基対；少なくとも１０００；少なくとも２０００塩基対；または少なくとも３０００塩基対である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項５】
植物の遺伝子材料に挿入可能である前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片が、植物における１つ以上の発現用のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項６】
植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列が、前記植物の形質を改変または修飾するための前記植物における発現に適応されている、請求項５に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項７】
植物における発現用の前記ヌクレオチド配列が、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５または請求項６に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項８】
前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３８〜４６、７６、もしくは７８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項７に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項９】
植物における発現に適した前記１つ以上のヌクレオチド配列が、非タンパク質コードヌクレオチド配列である、請求項５または請求項６に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１０】
前記非タンパク質コードヌクレオチド配列が、１つ以上のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１１】
発現用の前記非タンパク質コードヌクレオチド配列が、配列番号１２〜２６、６４〜６６、８０〜８１、８３〜９２、９４、もしくは９６〜９７で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１０に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１２】
植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列が、１つ以上の選択可能マーカヌクレオチド配列を含む、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１３】
前記選択可能マーカヌクレオチド配列が、配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号１１５で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１２に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１４】
植物の遺伝子材料に挿入可能である前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片が、１つ以上の制御ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１５】
前記制御ヌクレオチド配列が、１つ以上のプロモータ配列を含む、請求項１４に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記プロモータが、配列番号４〜７、６７、７３、７４、７６、もしくは７８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１５に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１７】
前記制御配列が、１つ以上のターミネータ配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１８】
前記ターミネータが、配列番号８〜１１、１０２、１０４、１０７、もしくは１０８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１７に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１９】
植物の遺伝子材料に挿入可能な前記１つ以上の核酸断片のフランキング配列またはそれらを囲むフランキング配列をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２０】
前記フランキング配列が制限消化部位を含む、請求項１９に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２１】
前記フランキング配列が、配列番号９８、９９、１０５、１０６、１１１、１１２、１１３、１１４、１１６、もしくは１１７で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２０に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２２】
第１の境界ヌクレオチド配列；
第２の境界ヌクレオチド配列；および
前記第１の境界ヌクレオチド配列と前記第２の境界ヌクレオチド配列との間に位置する１つ以上の追加的ヌクレオチド配列を含み、ここで前記追加的ヌクレオチド配列、および前記追加的ヌクレオチド配列に隣接した前記第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が、１つ以上の植物に由来する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２３】
前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列に隣接した前記第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が、１つ以上の植物に由来し、ここで前記１つ以上の植物が、前記追加的ヌクレオチド配列および前記第１の境界ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部が由来する同じ１つ以上の植物である、請求項２２に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２４】
１つ以上の植物に由来する少なくとも１５のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる、植物の遺伝子材料に挿入可能な前記１つ以上の核酸断片が、
（ｉ）１つ以上の植物に由来する前記第１の境界ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部；
（ｉｉ）前記１つ以上の植物に由来する前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列；および任意選択的には、
（ｉｉｉ）１つ以上の植物に由来する前記第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部からなる、請求項２２または請求項２３に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２５】
前記第１の境界配列が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性Ｔ−ＤＮＡ植物形質転換において機能的な右境界ヌクレオチド配列に属する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２６】
前記第２の境界ヌクレオチド配列が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性Ｔ−ＤＮＡ植物形質転換において機能的な左境界ヌクレオチド配列に属する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
【請求項２７】
配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、もしくは９４〜９７で示されるヌクレオチド配列、または配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードする核酸、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２８】
組換え遺伝子構築物を作製するための方法であって、耐病性形質、非生物的ストレス耐性形質、および形態学的形質からなる群から選択された植物の形質を改変または修飾するための植物の遺伝子材料への挿入に適応した１つ以上の核酸断片を１つ以上の植物から誘導するステップを含み、ここで前記１つ以上の核酸断片が少なくとも１５のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、それにより前記組換え遺伝子構築物を作製し、植物の遺伝子材料に前記１つ以上の核酸断片が挿入されると、前記植物の前記遺伝子材料に挿入されたヌクレオチド配列が、前記植物由来のヌクレオチド配列からなる、方法。
【請求項２９】
第１の境界ヌクレオチド配列および第２の境界ヌクレオチド配列を１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の各末端に付加するステップを含み、ここで前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列および前記第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が１つ以上の植物に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２８または請求項２９に記載の方法によって作製される組換え遺伝子構築物。
【請求項３１】
前記ヌクレオチド配列が由来するかまたは由来し得る元の前記１つ以上の植物が、ベシタブリア（Ｖｅｇｅｔａｂｉｌｉａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）、または有胚植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）という分類の生物であるかまたはそれを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物、または請求項２８もしくは請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記植物が単子葉植物または双子葉植物である、請求項３１に記載の組換え遺伝子構築物または方法。
【請求項３３】
前記植物が、サトウキビなどのイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；綿などのワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種；イチゴなどのベリー；リンゴおよびオレンジなどの果樹ならびにアーモンドなどの堅果類を含む樹種；バラなどのバラ科植物を含む、観賞顕花植物などの観賞植物；ブドウなどのブドウ果実を含むブドウ；ソルガム、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；大豆などのマメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ属の種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタス、チコリー、およびヒマワリを含むキク科植物、または前述の植物のいずれかの近縁種であるかまたはそれを含む、請求項３２に記載の組換え遺伝子構築物または方法。
【請求項３４】
前記植物が、トマト、イネ、およびソルガム、ならびにそれらの近縁種からなる群から選択される、請求項３３に記載の組換え遺伝子構築物または方法。
【請求項３５】
請求項１〜２８または３０〜３４のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物、および骨格ヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３６】
前記骨格ヌクレオチド配列が、骨格挿入マーカヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記骨格挿入マーカヌクレオチド配列が、配列番号３６もしくは配列番号３７、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項１〜２８もしくは３０〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３９】
植物を遺伝的に改善する方法であって、請求項１〜２８または３０〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片を植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入するステップを含み、ここで遺伝的に改善される前記植物が、前記遺伝子構築物の前記核酸断片の前記１つ以上のヌクレオチド配列が由来する前記１つ以上の植物の同じ種に属する、方法。
【請求項４０】
前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片が、前記植物細胞または植物組織のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を介して、前記植物細胞または植物組織の前記遺伝子材料に挿入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片が、直接形質転換を介して前記植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記植物細胞または植物組織の遺伝子材料に導入される前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片が、植物の遺伝子材料に挿入可能な前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片からなる、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
遺伝的に改善された植物を選択するさらなるステップを含み、ここで前記植物の１つ以上の形質が、前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片の前記植物の遺伝子材料への挿入の結果として改変または修飾される、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記形質が、前記植物の形質を改変または修飾するための植物における発現に適した前記遺伝子構築物の１つ以上のヌクレオチド配列の発現に従って修飾される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記植物の前記形質が、１つ以上のスモールＲＮＡ配列を含む前記植物における１つ以上の核酸の発現により、比較的に改善され、増強され、あるいは陽性に改変され、前記核酸が、植物病原体の１つ以上の核酸および／または内因性植物核酸の発現および／または複製を改変する能力がある、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記植物の前記形質が、１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子の発現により、比較的に改善され、増強され、あるいは陽性に改変される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記形質が耐病性である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記耐病性が、植物ウイルス；線虫；昆虫；および細菌植物病原体から選択される病原体に対する耐性である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記形質が非生物的ストレス耐性である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記非生物的ストレス耐性が耐塩性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記形質が栄養的および／または嗜好性形質である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記形質が形態学的形質である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の方法に従って作製される植物または植物部分。
【請求項５４】
植物であって、組換え遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片が前記植物の遺伝子材料に挿入されており、前記組換え遺伝子構築物が、耐病性形質、非生物的ストレス耐性形質、および形態学的形質からなる群から選択された植物の形質を改変または修飾するための植物の遺伝子材料への挿入に適応した１つ以上の核酸断片を含み、前記１つ以上の核酸断片が、１つ以上の植物に由来する少なくとも１５のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、植物の遺伝子材料に前記１つ以上の核酸断片が挿入されると、前記植物の前記遺伝子材料に挿入されたヌクレオチド配列が、前記植物由来のヌクレオチド配列からなる、植物。
【請求項５５】
前記植物が、ベシタブリア（Ｖｅｇｅｔａｂｉｌｉａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）、または有胚植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）という分類の生物である、請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の方法、または請求項５３もしくは請求項５４に記載の植物。
【請求項５６】
前記植物が単子葉植物または双子葉植物である、請求項５５に記載の方法または植物。
【請求項５７】
前記植物が、サトウキビなどのイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；綿などのワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種；イチゴなどのベリー；リンゴおよびオレンジなどの果樹ならびにアーモンドなどの堅果類を含む樹種；バラなどのバラ科植物を含む、観賞顕花植物などの観賞植物；ブドウなどのブドウ果実を含むブドウ；ソルガム、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；大豆などのマメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ科種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタス、チコリー、およびヒマワリを含むキク科植物、または前述の植物のいずれかの近縁種であるかまたはそれを含む、請求項５６に記載の方法または植物。
【請求項５８】
前記植物が、トマト、イネ、およびソルガム、およびそれらの近縁種からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法または植物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
好ましくは、植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列は、植物における発現に適応し、植物の形質を改変または修飾する。
特定の好ましい実施形態では、植物における発現用の前記ヌクレオチド配列の１つ以上は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい一実施形態では、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８〜４６、７６、もしくは７８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
特定の好ましい実施形態では、植物における発現に適した前記ヌクレオチド配列の１つ以上は、非タンパク質コードヌクレオチド配列である。好ましくは、前記非タンパク質コードヌクレオチド配列は、１つ以上のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む。好ましい一実施形態では、１つ以上のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む、発現用の前記ヌクレオチド配列は、配列番号１２〜２６、６４〜６６、８０〜８１、８３〜９２、９４、もしくは９６〜９７で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
好ましい実施形態では、植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列は、１つ以上の選択可能マーカヌクレオチド配列を含む。好ましい一実施形態では、前記選択可能マーカヌクレオチド配列は、配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号１１５で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
好ましくは、前記制御ヌクレオチド配列は、１つ以上のプロモータ配列を含む。好ましい一実施形態では、前記プロモータヌクレオチド配列は、配列番号４〜７、６７、７３、７４、７６、もしくは７８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
好ましくは、前記制御配列は、１つ以上のターミネータ配列を含む。好ましい一実施形態では、前記ターミネータヌクレオチド配列は、配列番号８〜１１、１０２、１０４、１０７、もしくは１０８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
一部の好ましい実施形態では、フランキング配列は、制限消化部位を含む。特定の特に好ましい実施形態では、フランキング配列の１つ以上は、配列番号９８、９９、１０５、１０６、１１１、１１２、１１３、１１４、１１６、もしくは１１７で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
特定の特に好ましい実施形態では、この態様の組換え遺伝子構築物は、配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、もしくは９４〜９７で示されるヌクレオチド配列、または配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードする核酸、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
組換え遺伝子構築物が境界配列を含む一部の特に好ましい実施形態では、該遺伝子構築物は、配列番号１〜３５、４９、５１〜６６、８１、９４、または９７で示されるヌクレオチド配列、および／または配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の方法に従って作製される遺伝子構築物を提供する。特に好ましい実施形態では、前記遺伝子構築物は、配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、または９４〜９７で示されるヌクレオチド配列、または配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードする核酸、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【図１】本発明の遺伝子構築物、および前記遺伝子構築物を含む本発明のベクター（ｐＩｎｔＲ  ２）の概略図を示す図。この遺伝子構築物のヌクレオチド配列は、配列番号１で示される。
【図２】本発明の遺伝子構築物、および前記遺伝子構築物を含む本発明のベクターの概略図を示す図。
【図３】本発明の遺伝子構築物、および前記遺伝子構築物を含む本発明のベクターの概略図を示す図。
【図４】ｐＲｂｃＳ３Ｃ：ｓＧＦＰ：ｔＲｂｃＳ３Ｃ構築物および対照としてのｐ３５Ｓ：ｓＧＦＰ：ｔＮＯＳを用いるトマト葉肉プロトプラストの一過性形質転換の結果を示す図。
【図５】脈管組織および気孔におけるトマト葉でのｐＲｂｃＳ３Ｃ：ｓＧＦＰ：ｔＲｂｃＳ３Ｃの発現の結果を示す図。
【図６−１】アグロ浸潤されたベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉における一過性発現による、トマトＡＣＴＩＮ（Ａｃｔ７）、ＣＹＣＬＯＰＨＩＬＩＮ（ＣｙＰ４０）およびＵＢＩＱＵＩＴＩＮ（Ｕｂｉ３）遺伝子に属するプロモータ−ターミネータ対によって駆動されるＧＦＰ発現の比較を示す図。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図７】アグロ浸潤されたベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉における一過性発現による、トマトＡＣＴＩＮ（Ａｃｔ７；左カラム）、ＣａＭＶ  ３５Ｓ（中カラム）およびＲＵＢＩＳＣＯサブユニット３Ｃ（ＲｂｃＳ３Ｃ）遺伝子（右カラム）に属するプロモータ−ターミネータ対によって駆動されるＧＦＰ発現の比較を示す図。
【図８】選択的な１ｍｇ／ＬのＧＡ培地上で２週間、遺伝子内ｐＲｂｃＳ３Ｃ：ＧＳ１Ｇ２４５Ｃ：ｔＲｂｃＳ３Ｃ構築物を用いて形質転換されたトマト子葉からの再生の結果を示す図であり；左側の２つのプレートは、構築物を宿すアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）とともに同時インキュベートされなかった同時対照子葉である。
【図９】選択的な１ｍｇ／ＬのＧＡ培地上で４週間、遺伝子内ｐＲｂｃＳ３Ｃ：ＧＳ１Ｇ２４５Ｃ：ｔＲｂｃＳ３Ｃ構築物を用いて形質転換されたトマト子葉からの初期再生の結果を示す図。
【図１０−１】キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）配列を標的にするためのトマト由来ａｍｉＲＮＡ構築物の使用の結果を示す図。ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉のアグロインフィルトレーション後の二重ＬＵＣアッセイが示される。Ｎ＝６；エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図１０−２】同上。
【図１１】５つの野生型対５つのａｍｉ１０（配列番号１５）の発現植物におけるＣＭＶ病徴発現を示す図。Ａ：ＣＭＶ接種後３週目の野生型（上パネル）対ａｍｉ１０（下パネル）植物におけるＣＭＶ病徴発現。Ｂ：ＣＭＶ接種後３週目の野生型（左）対ａｍｉ１０（右）におけるＣＭＶ病徴発現。
【図１２−１】５つの野生型対５つのａｍｉ１０（配列番号１５）の発現植物におけるＣＭＶウイルス負荷のｑＲＴ−ＰＣＲによる定量化を示す図。相対的発現比は、２つの参照遺伝子ＡＣＴＩＮおよびＧＡＰＤＨの相対比の幾何平均に基づいて計算された。
【図１２−２】同上。
【図１３−１】配列番号１８を作成するためにバイオインフォマティクスにより共に用いられ、導かれた、トマト（栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）配列を用いて、配列番号１８で示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡｉ構築物を設計する過程を示し、ここで各植物由来配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長である図。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１３−４】同上。
【図１４】キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）配列を標的にするためのトマト由来ＲＮＡｉ構築物の使用の結果を示す図。ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉のアグロインフィルトレーション後の二重ＬＵＣアッセイの結果が示される。Ｎ＝６；エラーバーは平均値の標準誤差を表す；ｔ検定は高度な有意差を示した。
【図１５】図１に図示される、基本的な遺伝子内クローニングベクターｐＩｎｔＲ  ２内に含まれる遺伝子構築物の配列（配列番号１）を示し、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＢおよびＬＢを含む第１および第２の境界ヌクレオチド配列（太字）；トマトＲｂｃＳ３Ｃプロモータおよびターミネータ（下線部）；ならびに遺伝子および追加的な遺伝子内発現カセットの挿入用に用いられる制限酵素部位（太字）を示す図。第１の境界ヌクレオチド配列（ＲＢ配列）は該配列の５’末端に表され、第２の境界ヌクレオチド配列（ＬＢ配列）は該配列の３’末端に表されることに注意のこと。
【図１６−１】アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異体植物（ｍｅｄ１８）のウイルス耐性（Ａ）；およびトマト由来ａｍｉＲＮＡ配列を用いたトマトＭＥＤ１８の抑制を示す図。
【図１６−２】同上。
【図１７−１】配列番号１〜６６、６８、７１〜７２、７５、７７、８０、８３〜８９、９３、および９５をＦＡＳＴＡ形式で示す図。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１７−５】同上。
【図１７−６】同上。
【図１７−７】同上。
【図１７−８】同上。
【図１７−９】同上。
【図１７−１０】同上。
【図１７−１１】同上。
【図１７−１２】同上。
【図１７−１３】同上。
【図１７−１４】同上。
【図１７−１５】同上。
【図１７−１６】同上。
【図１７−１７】同上。
【図１７−１８】同上。
【図１７−１９】同上。
【図１７−２０】同上。
【図１７−２１】同上。
【図１７−２２】同上。
【図１７−２３】同上。
【図１７−２４】同上。
【図１７−２５】同上。
【図１７−２６】同上。
【図１７−２７】同上。
【図１７−２８】同上。
【図１７−２９】同上。
【図１７−３０】同上。
【図１７−３１】同上。
【図１７−３２】同上。
【図１７−３３】同上。
【図１７−３４】同上。
【図１７−３５】同上。
【図１７−３６】同上。
【図１７−３７】同上。
【図１７−３８】同上。
【図１７−３９】同上。
【図１７−４０】同上。
【図１７−４１】同上。
【図１７−４２】同上。
【図１７−４３】同上。
【図１７−４４】同上。
【図１７−４５】同上。
【図１７−４６】同上。
【図１７−４７】同上。
【図１７−４８】同上。
【図１７−４９】同上。
【図１８】本発明の好ましいクローニング構築物である、ｐＩｎｔｒＡのヌクレオチド配列および構造（配列番号６７）を示す図。ＢｂｖＣＩ制限酵素部位（配列番号９８）；ＳｐｈＩ制限酵素部位（配列番号９９）；ＲＢ（配列番号１００）；ＬＢ（配列番号１０１）；ＨｐａＩ制限酵素部位；ＰｍｌＩ制限酵素部位；クローニング部位を作成するために付加されるヌクレオチド；部分的アクチン７（ＰＡＲＴＩＡＬ  ＡＣＴＩＮ７）プロモータ（配列番号１０２）および部分的アクチン７（ＰＡＲＴＩＡＬ  ＡＣＴＩＮ７）ターミネータ（配列番号１０３）は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図１９−１】本発明の遺伝子構築物を併せた同時形質転換に用いるための、植物に属しないかまたは由来しない選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含む構築物のヌクレオチド配列（配列番号６９）および構造を示す図。ＲＢ；ＬＢ、ｎｐｔＩＩ選択マーカ；二重３５Ｓプロモータ；ｎｏｓターミネータ、ＡＮＴ１ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）アントシアニン遺伝子；トマトＡＣＴＩＮ７プロモータ；およびトマトＲｂｃＳ３Ｃターミネータは、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図１９−２】同上。
【図２０−１】本発明に従う同時形質転換に用いるための、植物に属しないかまたは由来しない選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含むさらなる遺伝子構築物と一緒に本発明の好ましい遺伝子構築物を含む本発明のベクターのヌクレオチド配列（配列番号７０）および構造を示す図。ＨｐａＩ制限酵素部位；ＰｍｌＩ制限酵素部位；ＲＢ；ＬＢ、ｎｐｔＩＩ選択マーカ；視覚的選択ＡＮＴ１マーカ、ならびにｐａｒｔｉａｌ  ＡＣＴＩＮプロモータおよびターミネータは、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【図２０−４】同上。
【図２０−５】同上。
【図２１−１】モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）に由来するＵｂｉ１プロモータおよびターミネータ；ＣＴＧＣＡＧ  ＰｓｔＩ制限酵素部位；ならびにｇｇｃＧＣＣ  ＳｆｏＩ制限酵素部位を含む本発明の好ましいクローニング構築物である、ｐＳｂｉＵｂｉ１（配列番号７３）を示す図。Ｓｏｂｉｃ  ００４Ｇ０５００００に由来するＵｂｉ１プロモータおよびターミネータ（配列番号１０４）；ＣＴＧＣＡＧ  ＰｓｔＩ制限酵素部位（配列番号１０５）；およびｇｇｃＧＣＣ  ＳｆｏＩ制限酵素部位（配列番号１０６）は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２１−２】同上。
【図２２−１】モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）に由来するＵｂｉ２プロモータ；モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）に由来するＵｂｉ１ターミネータ；ＣＴＧＣＡＧ  ＰｓｔＩ制限酵素部位；およびｇｇｃＧＣＣ  ＳｆｏＩ制限酵素部位を含む本発明の好ましいクローニング構築物である、ｐＳｂｉＵｂｉ２（配列番号７４）を示す図。Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０４９９００に由来するＵｂｉ２プロモータ（配列番号１０７）およびＳｏｂｉｃ．００４Ｇ０５００００に由来するＵｂｉ１ターミネータ；およびＣＴＧＣＡＧ  ＰｓｔＩ制限酵素部位；ｇｇｃＧＣＣ  ＳｆｏＩ制限酵素部位は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２２−２】同上。
【図２３】アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＡＰＸプロモータおよびターミネータ；ならびにＳａｃＩまたはＥｃｏ５３ｋＩおよびブラントカッターＰｓｉＩからなるｇａｇｃＴＣＣＧＧＡＴＴＡｔａａの多重クローニング部位；ＧＡＡＣＧｔおよびｃＧＡＴＴＣ：ＸｍｎＩ制限酵素部位を含む本発明の好ましいクローニング構築物である、ｐＯｓａＡＰＸ（配列番号７６）を示す図。ＡＰＸプロモータ（配列番号１０８）；ＡＰＸターミネータ（配列番号１０９）；ＳａｃＩまたはＥｃｏ５３ｋＩおよびブラントカッターＰｓｉＩからなるｇａｇｃＴＣＣＧＧＡＴＴＡｔａａ多重クローニング部位（配列番号１１０）；ＧＡＡＣＧｔ（配列番号１１１）およびｃＧＡＴＴＣ（配列番号１１２）：ならびにＸｍｎＩ制限酵素部位は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２４】アントシアニンレベルの上昇を示す（紫茎、根、葉脈および葉の一部）、配列番号６９を発現するトマト植物を示す図。
【図２５】対照トマト植物（右）と比べての強力なアントシアニン産生を示す、配列番号６９で示される本発明のベクターで同時形質転換されたトマト植物（左）を示す図。
【図２６】アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子；アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＡＣＴＩＮ１プロモータ、およびアジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＤＲＥＢ１Ａターミネータのヌクレオチド配列を含む本発明のＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子構築物（配列番号７８）を示す図。遺伝子構築物は、切除およびクローニング用のＮｈｅＩおよびＰｍｌＩ制限消化部位をさらに含む。ＮｈｅＩ（配列番号１１３）およびＰｍｌＩ（配列番号１１４）制限部位；ＤＲＥＢ１Ａコード配列（配列番号１１５）；およびＤＲＥＢ１Ａコード配列の３’末端に付加されるＧＴＧＴＴ配列は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２７】アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子；ならびにアジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＮＣＥＤ３プロモータおよびターミネータのヌクレオチド配列を含む本発明のＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３遺伝子構築物（配列番号７９）を示す図。追加的なＴＧＣ（配列番号１１６）およびＧＣＡ（配列番号１１７）ヌクレオチド；ＮＣＥＤ３プロモータ（配列番号１１８）；およびＮＣＥＤ３ターミネータ（配列番号１１９）；およびＤＲＥＢ１Ａコード配列は、強調および／または下線の使用により表される。
【図２８】１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する培地上でのＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａ（左）またはＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３（右）で形質転換されたイネカルスの再生を示す図。
【図２９】ＣＭＶを接種したａｍｉ１１−Ｉ  Ｔ１植物およびＣＭＶを接種した野生型対照トマト植物を示す図。すべての野生型植物が新たな成長において「わずかな」症状を呈する（右側）。大部分のａｍｉ１１−Ｉ植物が無症状を呈する（左側）。
【図３０】野生型、Ｔ１不対性、およびａｍｉ１１−Ｉ  Ｔ１トマト植物におけるＣＭＶ負荷のＥＬＩＳＡ評価を示す図。
【図３１】野生型、Ｔ１不対性、およびａｍｉ１１−ＩＩ  Ｔ１トマト植物におけるＣＭＶ負荷のＥＬＩＳＡ評価を示す図。
【図３２】ａｍｉ１１−Ｉおよびａｍｉ１１−ＩＩトマト植物におけるＣＭＶの重症度および植物の丈の評価を示す図。
【図３３】ＣＭＶに感染したａｍｉ１１−Ｉおよびａｍｉ１１−ＩＩ系統からの果実数および例示的な果実形態を示す図。
【図３４】トマト由来抗ＣＭＶ  ａｍｉ１０およびａｍｉ１１を伴う「二重」抗ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡインサートのヌクレオチド配列、ならびにインサートのＲＮＡ標的化の評価を示す図。
【図３５】ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡ１０およびａｍｉＲＮＡ１１を含む本発明の好ましい遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号８１）および構造を示す図。ＬＢ；Ａｃｔｉｎプロモータ；Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ｂ内のＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡ１０；Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ａ内のａｍｉＲＮＡ１１；Ａｃｔｉｎターミネータ；ならびにＲＢは、強調／テキストカラーにより表される。
【図３６−１】図１９に示される選択可能マーカを有する遺伝子構築物と併せて図３５に示される遺伝子構築物を含む本発明の好ましいベクターのヌクレオチド配列（配列番号８２）および構造を示す図。ベクターの成分は、強調／テキストカラーにより表される。
【図３６−２】同上。
【図３６−３】同上。
【図３６−４】同上。
【図３６−５】同上。
【図３７】遺伝子内ＴＳＷＶ標的化ａｍｉＲＮＡ７配列（配列番号８３）；ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉のアグロインフィルトレーション後の二重ＬＵＣアッセイを用いてのこの配列によるＲＮＡ標的化の評価（エラーバーは平均値の標準誤差を表す）；およびこの配列を発現するように形質転換されたトマト植物の例示的形態を示す図。
【図３８】ＭＤＭＶおよびＳＣＭＶの保存領域を標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ３およびａｍｉＲＮＡ６）のヌクレオチド配列（配列番号８４〜８５）、これらの配列によるＲＮＡ標的化の評価、およびソルガム植物の再生を示す図。成功した形質転換体が、ＭＤＭＶ／ＳＣＭＶ耐性表現型を有することが予想される。
【図３９】ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ２、ａｍｉＲＮＡ４、ａｍｉＲＮＡ５、およびａｍｉＲＮＡ７）のヌクレオチド配列（配列番号８６〜８９）、これらの配列によるＲＮＡ標的化の評価、およびソルガム植物の再生を示す図。成功した形質転換体が、ＪＧＭＶ耐性表現型を有することが予想される。
【図４０−１】ソルガムＵｂｉ１プロモータおよびターミネータ、ならびにＪＧＭＶを標的化する３つのソルガム由来ａｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ４、ａｍｉＲＮＡ５、およびａｍｉＲＮＡ２）を含む本発明の遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号９０）および構造を示す図。構築物の成分は、テキストカラーにより表される。
【図４０−２】同上。
【図４０−３】同上。
【図４１−１】ソルガムＵｂｉ２プロモータおよびソルガムＵｂｉ１ターミネータ、ならびにＪＧＭＶを標的化する３つのソルガム由来ａｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ４、ａｍｉＲＮＡ５、およびａｍｉＲＮＡ２）を含む本発明の好ましい遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号９１）および構造を示す図。構築物の成分は、テキストカラーにより表される。
【図４１−２】同上。
【図４２】イネ由来ＲＴＳＶ  ａｍｉＲＮＡ１のヌクレオチド配列（配列番号９２）を示す図。
【図４３−１】ＴＳＷＶを標的化するトマト由来ヘアピンＲＮＡｉ構築物（配列番号９４）の設計を示す図。ＲＮＡｉベクターの完全ヌクレオチド配列は、配列番号９５で示される。
【図４３−２】同上。
【図４３−３】同上。
【図４３−４】同上。
【図４３−５】同上。
【図４３−６】同上。
【図４４】図４３に示される構築物によるＲＮＡ標的化の評価；図４３に示される構築物を用いて形質転換されたトマト植物の例示的な表現型；およびＴＳＷＶが負荷されるときの、野生型トマト植物と比べての図４３に示される構築物を用いて形質転換されたトマト植物におけるＴＳＷＶ負荷を示す図。
【図４５−１】トマト由来ａｍｉＲＮＡ２７によるＭＥＤ１８の標的化；野生型対照と比べての形質転換トマト植物におけるａｍｉＲＮＡ２７およびＭＥＤ１８の発現；ならびにａｍｉＲＮＡ２７形質転換植物（標識されたｍｅｄ１８）と比べての野生型におけるＣＭＶ負荷を示す図。
【図４５−２】同上。
【図４６−１】ａｍｉＲＮＡ２７形質転換（標識されたＡまたはＭＥＤ１８）トマト植物と比べての対照（標識されたＷまたはＷＴ）における葉脱落シュードモナス・シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）アッセイの結果；およびシュードモナス・シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）ＧｙｒａｓｅのｑＰＣＲにより測定された、ａｍｉＲＮＡ２７形質転換系統と比べての対照におけるシュードモナス・シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）の存在量を示す図。
【図４６−２】同上。
【図４７】１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する培地上でＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａを用いて形質転換されたイネ植物の再生および成長を示す図。
【図４８】１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する培地上でＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３を用いて形質転換されたイネ植物の再生および成長を示す図。
【図４９】野生型対照系統と比べてのトマト由来ａｍｉＲＮＡ２７を用いて形質転換されたトマト植物の形態の比較を示す図。
【図５０】ＭＥＤ２５を標的化するトマト由来ａｍｉＲＮＡ６のヌクレオチド配列；ａｍｉＲＮＡ６によるＭＥＤ２５の標的化の評価；ならびに野生型対照系統と比べてのａｍｉＲＮＡ６を用いて形質転換されたトマト系統におけるａｍｉＲＮＡ６およびＭＥＤ２５の発現を示す図。
【図５１】配列番号６９で示される構築物を用いて形質転換されたトマト系統におけるアントシアニンの発現（左）；およびイネ由来構築物を用いて形質転換された再生イネ植物におけるアントシアニンの発現（右）を示す図。
【図５２】タイプＢヘテロ三量体Ｇタンパク質のγサブユニット（ＧＧＢ１）をコードするトマト遺伝子を標的化するトマト由来ヘアピンＲＮＡｉ構築物のヌクレオチド配列（配列番号９７）および構造；ならびに前記構築物および配列番号６９で示されかつアントシアニンを発現する構築物を用いて同時形質転換された例示的な形質転換トマト植物を示す図。
【図５３】イネＢＡＤＨ２を標的化するイネ由来ＲＮＡｉ構築物を用いた微粒子銃により作製された発生中のイネ植物を示す図。成功した形質転換体が、香り高い表現型を有することが予想される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
配列番号１８  ＣＭＶを標的化するトマト由来ＲＮＡｉ構築物のヌクレオチド配列
配列番号１９  ＣＭＶ  Ｋセグメント１レプリカーゼのヌクレオチド７５１〜８９６に高度に類似した配列番号１８の断片のヌクレオチド配列
配列番号２０  ＣＭＶ  Ｋセグメント１レプリカーゼのヌクレオチド１２３５〜１３５８に高度に類似した配列番号１８の断片のヌクレオチド配列
配列番号２１  ＣＭＶ  Ｋセグメント３  ｏｒｆ２（コートタンパク質）のヌクレオチド２５０〜３７５に高度に類似した配列番号１８の断片のヌクレオチド配列
配列番号２２  トマト黄化えそ病ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ
ｖｉｒｕｓ）（ＴＳＷＶ）を標的化するトマト由来ＲＮＡｉ構築物のヌクレオチド配列
配列番号２３  ＴＳＷＶ  ＱＬＤ１セグメントＬ  ＲＤＲＰのヌクレオチド１９１８〜２１５５に高度に類似した配列番号２２の断片のヌクレオチド配列
配列番号２４  ＴＳＷＶ  ＱＬＤ１セグメントＬ  ＲＤＲＰのヌクレオチド８４２９〜８６３９に高度に類似した配列番号２２の断片のヌクレオチド配列
配列番号２５  ＴＳＷＶ  ＱＬＤ１セグメントＭ  ｏｒｆ１のヌクレオチド１８７〜３６０に高度に類似した配列番号２２の断片のヌクレオチド配列
配列番号２６  ＴＳＷＶ  ＱＬＤ１セグメントＭ  ｏｒｆ２のヌクレオチド２９７〜５１０に高度に類似した配列番号２２の断片のヌクレオチド配列
配列番号２７  トマトベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）ｃＤＮＡ（ｇｉ２０９３６２３４２）のヌクレオチド配列
配列番号２８  トマトソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）ｃＤＮＡ（ｇｉ７８１８３４１５）のヌクレオチド配列
配列番号２９  トマトオスモチンＣＤＳ（ｇｉ４６０４００２１０）のヌクレオチド配列
配列番号３０  トマトグルタミンシンテターゼ（ＧＴＳ）ｃＤＮＡ（ｇｉ４６０４０９５３５）のヌクレオチド配列
配列番号３１  トマトフィトエンデサチュラーゼｃＤＮＡ（ｇｉ５１２７７２５３２）のヌクレオチド配列
配列番号３２  トマト５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸ｃＤＮＡ（ｇｉ８２２０９２６６８）のヌクレオチド配列
配列番号３３  トマトアセト乳酸シンターゼｃＤＮＡ（ｇｉ７２３６８０７７１）のヌクレオチド配列
配列番号３４  トマトプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼｃＤＮＡ（ｇｉ７２３６５８５４９）のヌクレオチド配列
配列番号３５  ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）アントシアニン１（ＡＮＴ１）ｃＤＮＡ（ｇｉ１２６６５３９３４）のヌクレオチド配列
配列番号３６  トマトクロロフィルシンターゼｃＤＮＡ（ｇｉ４６０４０１６２４）のヌクレオチド配列
配列番号３７  ジャガイモＳＴ−ＬＳ１遺伝子由来のイントロンを有する、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）の発現用にコドン最適化されたバルナーゼ自殺構築物のヌクレオチド配列
配列番号３８  配列番号２７によってコードされるベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列
配列番号３９  配列番号２８によってコードされるトマトソルビトールデヒドロゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４０  配列番号２９によってコードされるトマトオスモチンタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４１  配列番号３０によってコードされるトマトグルタミンシンテターゼタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４２  配列番号３１によってコードされるトマトフィトエンデサチュラーゼタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３  配列番号３２によってコードされるトマト５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４４  配列番号３３によってコードされるトマトアセト乳酸シンターゼタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５  配列番号３４によってコードされるトマトＰｒｏｔＯｘタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４６  配列番号３５によってコードされるソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）アントシアニン１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７  図１に図示される基本的な遺伝子内クローニングベクターｐＩｎｔＲ２のヌクレオチド配列
配列番号４８  本発明のベクター「ｐＩｎｔＲ２  ＧＳ１  Ｇ２４５Ｃ  ＣＭＬ１８」のヌクレオチド配列
配列番号４９  天然ＧＳ１プロモータおよびターミネータ配列に作動可能に連結されたグルタミンシンテターゼ１（ＧＳ１）Ｇ２４５Ｃマーカ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号５０  本発明の修飾ｐＡｒｔ２７骨格のヌクレオチド配列
配列番号５１  Ｇ２４５Ｃタンパク質をコードするトマトＧＳ１  Ｇ７３３Ｔ遺伝子のＣＤＳのヌクレオチド配列
配列番号５２  Ｈ２４９Ｙタンパク質をコードするトマトＧＳ１  Ｃ７４５Ｔ  ＣＤＳのＣＤＳヌクレオチド配列
配列番号５３  トマトＧＳ１プロモータのヌクレオチド配列
配列番号５４  トマトＧＳ１ターミネータのヌクレオチド配列
配列番号５５  トマトフィトエンデサチュラーゼプロモータのヌクレオチド配列
配列番号５６  トマトフィトエンデサチュラーゼターミネータのヌクレオチド配列
配列番号５７  トマトアセト乳酸シンターゼプロモータのヌクレオチド配列
配列番号５８  トマトアセト乳酸シンターゼターミネータのヌクレオチド配列
配列番号５９  トマト５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼプロモータのヌクレオチド配列
配列番号６０  トマト５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼターミネータのヌクレオチド配列
配列番号６１  トマトＰｒｏｔＯｘプロモータのヌクレオチド配列
配列番号６２  トマトＰｒｏｔＯｘターミネータのヌクレオチド配列
配列番号６３  ＰｍｌＩおよびＰｃｉＩ制限酵素による消化時に除去され、ヌクレオチド配列のｐＩｎｔＲ  ２へのライゲーションを促進する、遺伝子内クローニングベクターｐＩｎｔＲ  ２（配列番号１）のヌクレオチド配列
配列番号６４  トマト由来のＭＥＤ１８遺伝子のヌクレオチド配列（ｇｉ｜７２３７０４０９４｜ｒｅｆ｜ＸＭ＿０１０３２３５０２．１）
配列番号６５  トマトＭＥＤ１８を標的化するａｍｉＲＮＡ配列（ＭＥＤ１８ａｍｉ３）のヌクレオチド配列
配列番号６６  トマトＭＥＤ１８を標的化するａｍｉＲＮＡ配列（ＭＥＤ１８ａｍｉ２７）のヌクレオチド配列
配列番号６７  ｐＩｎｔｒＡの基本的な遺伝子内クローニング構築物のヌクレオチド配列
配列番号６８  ｐＩｎｔｒＡの制限消化部位を有する除去可能配列のヌクレオチド配列
配列番号６９  本発明の遺伝子構築物と併せた同時形質転換において用いられる、植物に属しないかまたは由来しない選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含む構築物のヌクレオチド配列
配列番号７０  本発明に従う同時形質転換において用いられる、植物に属しないかまたは由来しない選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含むさらなる遺伝子構築物と一緒に本発明の好ましい遺伝子構築物を含む本発明のベクターのヌクレオチド配列
配列番号７１  本発明の特定の好ましい遺伝子構築物中の第１の境界配列の一部のヌクレオチド配列
配列番号７２  本発明の特定の好ましい遺伝子構築物中の第２の境界配列の一部のヌクレオチド配列
配列番号７３  ｐＳｂｉＵｂｉ１のヌクレオチド配列
配列番号７４  ｐＳｂｉＵｂｉ２のヌクレオチド配列
配列番号７５  ｐＳｂｉＵｂｉ１およびｐＳｂｉＵｂｉ２クローニング部位のスペーサのヌクレオチド配列
配列番号７６  ｐＯｓａＡＰＸ構築物のヌクレオチド配列
配列番号７７  ｐＯｓａＡＰＸクローニング部位のスペーサのヌクレオチド配列
配列番号７８  イネＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａ構築物のヌクレオチド配列
配列番号７９  イネＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３構築物のヌクレオチド配列
配列番号８０  トマト由来の二重抗ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡインサートのヌクレオチド配列
配列番号８１  配列番号８０を含む遺伝子内トマト由来構築物のヌクレオチド配列
配列番号８２  配列番号８１を含むベクターのヌクレオチド配列
配列番号８３  トマト由来の抗ＴＳＷＶ  ａｍｉＲＮＡ７のヌクレオチド配列
配列番号８４  ＭＤＭＶおよびＳＣＭＶの保存領域を標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ３のヌクレオチド配列
配列番号８５  ＭＤＭＶおよびＳＣＭＶの保存領域を標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ６のヌクレオチド配列
配列番号８６  ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ２のヌクレオチド配列
配列番号８７  ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ４のヌクレオチド配列
配列番号８８  ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ５のヌクレオチド配列
配列番号８９  ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ７のヌクレオチド配列
配列番号９０  ｐＳｂｉＵｂｉ１内のソルガム由来三重抗ＪＧＭＶ  ａｍｉＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列
配列番号９１  ｐＳｂｉＵｂｉ２内のソルガム由来三重抗ＪＧＭＶ  ａｍｉＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列
配列番号９２  ＲＴＳＶを標的化するイネ由来ａｍｉＲＮＡ１のヌクレオチド配列
配列番号９３  配列番号９２を含むベクターのヌクレオチド配列
配列番号９４  ＴＳＷＶを標的化するトマト由来ヘアピンＲＮＡｉのヌクレオチド配列
配列番号９５  配列番号９４を含むベクターのヌクレオチド配列
配列番号９６  ＭＥＤ２５を標的化するトマト由来ａｍｉＲＮＡ６のヌクレオチド配列
配列番号９７  タイプＢヘテロ三量体Ｇタンパク質のγサブユニット（ＧＧＢ１）をコードするトマト遺伝子を標的化するトマト由来ヘアピンＲＮＡｉ構築物のヌクレオチド配列
配列番号９８  ＢｂｖＣＩ制限酵素部位のヌクレオチド配列
配列番号９９  ＳｐｈＩ制限酵素部位のヌクレオチド配列
配列番号１００  ＲＢ配列のヌクレオチド配列
配列番号１０１  ＬＢ配列のヌクレオチド配列
配列番号１０２  部分的アクチン７（ｐａｒｔｉａｌ  ＡＣＴＩＮ７）プロモータのヌクレオチド配列
配列番号１０３  部分的アクチン７（ｐａｒｔｉａｌ  ＡＣＴＩＮ７）ターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１０４  ソルガムＵｂｉ１プロモータおよびターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１０５  ＰｓｔＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１０６  ＳｆｏＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１０７  ソルガムＵｂｉ２プロモータのヌクレオチド配列
配列番号１０８  イネＡＰＸプロモータのヌクレオチド配列
配列番号１０９  イネＡＰＸターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１１０  ｐＯｓａＡＰＸの多重クローニング部位のヌクレオチド配列
配列番号１１１  ＸｍｎＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１２  ＸｍｎＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１３  ＮｈｅＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１４  ＰｍｌＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１５  ３’ＧＴＧＴＴの付加を伴うイネＤＲＥＢ１Ａコード配列のヌクレオチド配列
配列番号１１６  ＦｓｐＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１７  ＦｓｐＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１８  イネＮＣＥＤ３プロモータのヌクレオチド配列
配列番号１１９  イネＮＣＥＤ３ターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１２０  Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ｂ内のトマト由来抗ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡ１０のヌクレオチド配列
配列番号１２１  Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ａ内のトマト由来抗ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡ１１のヌクレオチド配列
配列番号１２２〜１４９  本明細書中に示されるプライマーのヌクレオチド配列
（詳細な説明）
本発明は、少なくとも部分的には、植物の遺伝的改善に対する需要があるという認識に基づいて予測され、ここで植物に由来しないかまたは由来し得ないヌクレオチド配列の植物の遺伝子材料への導入は回避される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
特定の実施形態では、核酸「断片」は、配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、または９４〜９７で示されるヌクレオチド配列の１００％未満であるが、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも８０％またはさらにより好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を構成するヌクレオチド配列を含む。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子構築物の断片は、配列番号１、６７、７３〜７４、７６、８１、９５、または９７で示されるヌクレオチド配列の１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、または３０００連続ヌクレオチド以下を含む。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
一部の実施形態では、核酸変異体は、配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、または９４〜９７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有する単離された核酸を含む。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
実施例を参照すると、この態様の好ましい組換え遺伝子構築物ｐＩｎｔＲ  ２が、植物の遺伝子材料への挿入に適応する１１１０塩基対を含み、かつこの構築物が、植物の遺伝子材料への挿入または組み込みのためにさらなる植物由来のヌクレオチド配列を受けるように設計されたクローニング構築物であることは理解されるであろう。同様に、この態様の好ましい組換え遺伝子構築物ｐＩｎｔＲＡは、植物の遺伝子材料への挿入に適応する１７８７塩基対を含み、その上、この構築物は、植物の遺伝子材料への挿入または組み込みのためにさらなる植物由来のヌクレオチド配列を受けるように設計されたクローニング構築物である。さらに、配列番号７８、７９、８１、および９７で示される好ましい組換え遺伝子構築物は各々、植物の遺伝子材料への挿入に適応する２３８７、３３６９、２０８４、および３０７１塩基対を含む。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
特定の特に好ましい実施形態では、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８〜４６、７６、または７８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
特に好ましい実施形態では、スモールＲＮＡ配列を含む、発現における前記非コードヌクレオチド配列は、配列番号１２〜２６、８０、８１、８３〜９２、または９４〜９７で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
特に好ましい実施形態では、前記１つ以上の選択可能マーカヌクレオチド配列は、配列番号２７〜３５または１１５の１つ以上、またはその断片もしくは変異体、または配列番号３８〜４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を各々コードする１つ以上のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
好ましい実施形態では、制御配列は、配列番号４〜７、５３、５５、５７、５９、６１、６７、７３、７４、７６、または７８で示されるヌクレオチド配列またはその断片もしくは変異体を含むプロモータを含む。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
好ましい実施形態では、制御配列は、配列番号８〜１１、：５４、５６、５８、６０、６２、１０２、１０４、１０７、または１０８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含むターミネータを含む。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
特定の特に好ましい実施形態では、この態様の組換え遺伝子構築物は、植物の遺伝子材料に挿入可能な核酸断片のフランキング配列またはそれを囲むフランキング配列を含む。一部の実施形態では、フランキング配列、またはその一部は、１つ以上の植物に由来する。好ましくは、フランキング配列は、制限消化部位を含む。特定の特に好ましい実施形態では、フランキング配列の１つ以上は、配列番号９８、９９、１０５、１０６、１１１、１１２、１１３、１１４、１１６、または１１７で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
好適には、制限消化部位を含むフランキング配列は、より大規模な構築物および／またはベクターからの植物由来配列からなるこの態様の組換え遺伝子構築物の１つ以上の断片の除去または切除を促進する。実施例を参照すると、例として、配列番号７３〜７４、７８、および７９で示される好ましい遺伝子構築物が、植物由来配列からなる組換え遺伝子構築物の断片の除去を促進するようなフランキング配列を含むことが理解されるであろう。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
特定の他の好ましい実施形態では、前記選択可能マーカ配列は、遺伝的に改善された植物に対して耐塩性を付与することにより、選択を容易にする。好ましい一実施形態では、前記選択可能マーカは、上記の通り、ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子に属する、配列番号１１５で示されるヌクレオチド配列を含む。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０５】
このベクターの骨格配列は、ベクターｐＫａｎｎｉｂａｌの骨格配列である。それは、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｏｃｏｌｏｒ）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ１遺伝子（Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０４９９００）のプロモータ配列およびモロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｏｃｏｌｏｒ）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ２遺伝子（Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０５００００）のターミネータを含む。それは、プライマーＦ  ５’Ｐｈｏｓ  ｃｃｔｃａｃＧＴＧＴＴＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣ（配列番号１２３）（直接遺伝子導入前に遺伝子内カセットの切除を可能にするためのブラントカッター部位ＰｍｌＩを作成するため、プロモータの開始部位（ｓｔａｒｔ）に３ヌクレオチドを付加する）およびＲ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＧＧＴ（配列番号１２２）を用いてソルガムｇＤＮＡから増幅したＵｂｉ１プロモータの３’末端の天然ＰｓｔＩ部位を利用することにより開発した。断片をＰｓｔＩで消化し、ＳｔｕＩおよびＰｓｔＩで切り出したベクターｐＫａｎｎｉｂａｌにライゲートした。ターミネータＵｂｉ１を、プライマーＦ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧｃｇｃｔａｇｇｃＧＣＣＡＴＡＧＧＴＣＧＴＴＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号１２４）（ブラントカッタークローニング部位ＳｆｏＩを作成するため、ターミネータの開始部位に３ヌクレオチドを付加する）およびＲ  ｔｃｃＣＡＣＴＡＧＴｃａｃＧＴＧＴＡＴＡＧＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＧＡＴＣＴＴＧＣＴ（配列番号１２５）（遺伝子内カセットの切除用のブラントカッター部位ＰｍｌＩ、および先行するベクターへの挿入用のＳｐｅＩ部位を作成するため、ターミネータの末端に３ヌクレオチドを付加する）を用いて増幅した。断片をＰｓｔＩおよびＳｐｅＩで消化し、同じ酵素で切り出した２つの先行的に得られた中間体ベクターにライゲートした。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０９】
別の好ましい遺伝子構築物（ｐＳｂｉＵｂｉ２）の模式図を図２２に示す。この遺伝子構築物の完全ヌクレオチド配列を配列番号７４で示す。
このベクターの骨格配列は、ベクターｐＫａｎｎｉｂａｌの骨格配列である。それは、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｏｃｏｌｏｒ）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ２遺伝子（Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０５００００）のプロモータおよびターミネータ配列を含む。それは、プライマーＦ  ５Ｐｈｏｓ／ｃｃｔｃａｃＧＴＧＡＧＧＣＣＣＧＴＡＴＡＧＡＴＧＴＡＧＴＴＡＡＡＴＡＧＣＴＡＡＡ（配列番号１２６）（遺伝子内カセットの切除を可能にするためのブラントカッター部位ＰｍｌＩを作成するため、プロモータの開始部位に３ヌクレオチドを付加する）およびＲ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＣＣＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧ（配列番号１２７）を用いてソルガムｇＤＮＡから増幅したＵｂｉ２プロモータの３’末端の天然ＰｓｔＩ部位を利用することにより開発した。断片をＰｓｔＩで消化し、ＳｔｕＩおよびＰｓｔＩで消化したベクターｐＫａｎｎｉｂａｌにライゲートした。ｐＳｂｉＵｂｉ１について上記の通り、ターミネータＵｂｉ１を増幅し、クローン化した。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
前記遺伝子構築物を含むかかる二重Ｔ−ＤＮＡベクターの模式図を図２０に示す。このベクターの配列を配列番号７０で示す。
選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）は別として、容易な外交配を可能にするため、アントシアニン生合成のための視覚的マーカ遺伝子（ＡＮＴ１）を含めている。ベクターの構成は、次の通りであった。すなわち、トマトＰＡＲＴＩＡＬ  ＡＣＴＩＮプロモータおよびターミネータを含むＴ−ＤＮＡを、ブランクｐＩｎｔｒＡクローニングベクターを鋳型として用いて、フォワードプライマー（ＢｓｉＷＩ）ＣＧＴＡＣＧＧＡＡＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号１２８）およびリバースプライマー（ＢｓｒＧＩ）ＴＧＴＡＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＣＧＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号１２９）を用いて増幅し、ＢｓｉＷＩ酵素を用いた消化により、単一のＴ−ＤＮＡプラスミドに挿入した（ｐＡｒｔ２７  ＲｂｃＳ３Ｃ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳ）。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７４】
植物を形質転換するため、両方の示されたａｍｉＲＮＡに基づく手法（ａｍｉＲＮＡ１０およびａｍｉＲＮＡ１１）が１つの完全に遺伝子内の構築物中で組み合わされた。図３５および配列番号８１で示すように、「２ベクター２アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株同時形質転換方法」のベクターを、別の選択可能マーカ構築物と併用可能である骨格としてｐＡｒｔ２７を用いて作製したが、それは商業化に先立つ後期の段階で外交配され得る。この目的のため、配列（配列番号８１）をｐＩｎｔｒＡ（図１８；配列番号６７）に挿入した。まず配列番号８１を合成し、次にＦプライマー５’Ｐｈｏｓ
ＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧ（配列番号１３０）およびＲプライマー５’Ｐｈｏｓ  ＣｃｇａａａｇａｇｇｔｇａａｇｇｔｇａＴＧＡＴＣＡ（配列番号１３１）を用いて増幅し、ＡＣＴＩＮプロモータおよびターミネータの欠損した末端を補完し、その後、ＨｐａＩおよびＰｍｌＩで切り出したｐＩｎｔｒＡとライゲートした。インサートの方向を、配列決定により試験した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７６】
あるいは、図２０および配列番号７０で示す二重カセット（２つのＴ−ＤＮＡカセットを含む１つのベクター）手法を用いた。この目的のため、二重ａｍｉＲＮＡ  Ｔ−ＤＮＡカセット（配列番号８１）を、ｐＡｒｔ２７  ＲｂｃＳ３Ｃ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳ（図１９；配列番号６９）に挿入した。最初に、二重ａｍｉＲＮＡ  Ｔ−ＤＮＡを、プライマー：フォワード（ＢｓｉＷＩ）ＣＧＴＡＣＧＧＡＡＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号１３２）およびリバース（ＢｓｒＧＩ）ＴＧＴＡＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＣＧＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号１３３）を用いて、図３５で示すベクターから増幅し、次に、ＢｓｉＷＩ酵素で切り出した単一のＴ−ＤＮＡプラスミドｐＡｒｔ２７  ＲｂｃＳ３Ｃ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳ（図１９；配列番号６９）に挿入した。この手法におけるトマト植物の形質転換、再生およびＣＭＶ負荷実験は、現在進行中である。耐久性のある遺伝子内ＣＭＶ耐性のためのこの二重Ｔ−ＤＮＡベクターの遺伝的構成および完全配列を図３６および配列番号８２で示す。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７９】
植物を形質転換するため、配列（配列番号８３）をｐＩｎｔｒＡ（図１８；配列番号６７）に挿入した。まず配列番号８３を合成し、次にＦプライマー５’Ｐｈｏｓ  ＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧ（配列番号１３４）およびＲプライマー５’Ｐｈｏｓ  ＣｃｇａａａｇａｇｇｔｇａａｇｇｔｇａＴＧＡＴＣＡ（配列番号１３５）を用いて増幅し、ＡＣＴＩＮプロモータおよびターミネータの欠損した末端を補完し、その後、ＨｐａＩおよびＰｍｌＩで切り出したｐＩｎｔｒＡとライゲートした。インサートの方向を、配列決定により試験した。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８２】
ソルガムにおける複数のウイルス耐性のためのこの手法を開発するため、ａｍｉＲＮＡは、複数のウイルスまたは同じウイルスの複数のウイルス単離物のいずれかを標的にするように設計した。最初に、保存領域内のＪＧＭＶ、ＳＣＭＶおよび／またはＭＤＭＶに一致する十分な長さの遺伝子内配列を同定した。次いで、天然ソルガムのマイクロＲＮＡ  Ｓｂｉ−ｍｉＲ１５６ｂにおけるヌクレオチドを様々な遺伝子内抗ウイルスａｍｉＲＮＡ配列と置換した。これらの一部を、図３８〜３９および配列番号８３〜８９で示す。ａｍｉＲＮＡは、プライマーＦ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧｇｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｇａａｇａｇａｇｇａｃｇ（配列番号１３６）およびＲ  ５’Ｐｈｏｓ  ｇｃｔｃｃａａａｔｃｇｇａｃａｇａｇａｇａｔｇａｇｃ（配列番号１３７）を用いて合成および増幅し、ＰｓｔＩで消化し、ＰｓｔＩおよびＳｆｏＩ酵素で切り出したベクターｐＳｂｉＵｂｉ１（図２１；配列番号７３）またはｐＳｂｉＵｂｉ２（図２２；配列番号７４）に挿入した。得られたプラスミドをＰｍｌＩで切断し、最小の遺伝子内形質転換カセットを得た。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８６】
これらの構築物のためのクローニング方法は以下の通りである。ａｍｉＲＮＡ４は、プライマーＦ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧｇｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｇａａｇａｇａｇｇａｃｇ（配列番号１３８）（ＰｓｔＩ部位を５’末端に付加）およびＲ  ｇｔｇｃａｃｔｃｃａａａｔｃｇｇａｃａｇａｇａｇａｔｇａｇｃｃ（配列番号１３９）（ＡｐａＬＩ部位を３’末端に付加）を用いて増幅した。ＡｍｉＲＮＡ５は、プライマーＦ  ｇｔｇｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｇａａｇａｇａｇｇａｃｇ（配列番号１４０）（ＡｐａＬＩ部位を５’末端に付加）およびＲ  ａａｃｃｃｃｔａｇｇｃｔｃｃａａａｔｃｇｇａｃａｇａｇａｇａｔｇａｇ（配列番号１４１）（ＡｖｒＩＩ部位を３’末端に付加）を用いて増幅した。ＡｍｉＲＮＡ２は、プライマーＦ  ｃｃｔａｇｇｇｇｔｔｔｔｇｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｇ（配列番号１４２）（ＡｖｒＩＩ部位を５’末端に付加）およびＲ  ５’Ｐｈｏｓ  ｇｃｔｃｃａａａｔｃｇｇａｃａｇａｇａｇａｔｇａｇｃ（配列番号１４３）を用いて増幅した。断片を、各々の酵素で消化し、１回の反応でＰｓｔＩおよびＳｆｏＩで切り出したベクターｐＳｂｉＵｂｉ１またはｐＳｂｉＵｂｉ２のいずれかにライゲートした。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８７】
イネにおけるウイルス耐性についてのイントラジェニックａｍｉＲＮＡ手法を開発するため、ａｍｉＲＮＡは、ＲＴＢＶによって引き起こされる症状の重症度を媒介するヘルパーウイルスであるイネツングロ球状ウイルス（Ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＴＳＶ）を標的にするように設計した。この目的のため、天然イネマイクロＲＮＡ  Ｏｓａ−ｍｉＲ１５６ａにおけるヌクレオチドを様々な遺伝子内抗ウイルスａｍｉＲＮＡ配列と置換した。これらの１つ（ａｍｉＲＮＡ１）を、図４２および配列番号９３で示す。遺伝子内イネ形質転換カセットを作製するため、ａｍｉＲＮＡ１配列を、プライマーＦ  ＧＡＧＣｔｃａａａｔｇｔａｔｇｔｃｔａａｃｃａｔｇｃａｃａｔａｔｇｇ（配列番号１４４）（完全ＳａｃＩ部位をその５’末端まで完成させるためにヌクレオチドを導入する）およびＲ  ５’Ｐｈｏｓ  ｔａｇｔｃａｇｇａａｔｔａｃｇａａｇｇｇｔｇｔａｇｔｔａｔｇｔｔａｔｔｃ（配列番号１４５）を用いて合成し、増幅した。それをＳａｃＩで制限し、ＳａｃＩおよび平滑末端カッターＰｓｉＩで切り出したｐＯｓａＡＰＸ（図２３；配列番号７６）に挿入したが、その３つの最終ヌクレオチドは、データベースにおけるその全配列と同一である天然Ｏｓａ−ｍｉＲ１５６ａの折り畳みの「継続性」に寄与する。イネ植物におけるさらなる試験は、現在進行中である。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２６】
トマトにおける他のＭｅｄｉａｔｏｒサブユニットの調節が望ましい植物の構造的形質をもたらし得るか否かを試験するため、推定上のＭＥＤ２５オルソログをトマトにおいて同定し、遺伝子内ａｍｉＲＮＡ（配列番号９６；図５０）をその下方制御に対して設計した。図５０に示すように、上記のベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）において二重ルシフェラーゼアッセイを用いるとき、ａｍｉＲＮＡ６はトマトＭＥＤ２５配列を有意に（Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定）下方制御することができた。ＡｍｉＲＮＡ９をｐＩｎｔｒＡに挿入し、トマト植物を上記のように形質転換した。９つのＰＣＲ陽性形質転換体（系統）を、ａｍｉＲＮＡ６の発現およびＭＥＤ２５のノックダウンについてｑＲＴ−ＰＣＲを用いて試験した。図５０に示すように、野生型植物と比べて、９つすべての系統がａｍｉＲＮＡ６を発現し、ＭＥＤ２５の発現は、作製したすべての系統において有意に（Ｐ＜０．０５）低下した。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３０】
さらに、市販の広く消費されている主要な食用作物の栄養価を改善するため、米粒中のアントシアニンレベルを上昇させるための完全に遺伝子内のカセットを宿す新しいＲｅｉｚｉｑイネ栽培品種の植物を作製した。イネ栽培品種Ｒｅｉｚｉｑ植物は、ＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａカセットに加えて天然Ｒ１Ｇ１ＢプロモータおよびターミネータによってフランキングされたイネＯＳＢ２遺伝子を含む遺伝子内構築物を用いて上記のように形質転換した。微粒子銃に先立ち、遺伝子内ＯＳＢ２カセットを、ＦｓｐＩおよびＡｐａｌＩ制限酵素により切断することにより、切除および精製した。イネＲ１Ｇ１Ｂプロモータおよびターミネータカセットは、対応する遺伝子が成熟した米粒の胚乳中で最も強力に発現することから選択した。植物は、図５１に示すように巧みに作製したが、現在、米粒中のアントシアニンレベルを測定するだけの成熟度に至るまで生育している。これらの植物の消費者受容性は、これらの植物が直接的な消費者の利益をもたらし、完全にイントラジェニックであることから、高くなるものと予想される。さらに、それらは、この変種の栽培者に利益を与え得る、遺伝子内ＤＲＥＢ１Ａカセットによって媒介される改善された非生物的ストレス耐性を提示する可能性が高い。将来的な他の変種との交雑については、これらの植物が育種プログラムに組み込まれるものと予測することができる。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３５】
ＡＣＴＩＮプロモータ−ターミネータ発現カセット（ｐＩｎｔｒａＡ）内に遺伝子内ＲＮＡｉ構築物を作製するため、最初に長い「フォワード」断片を、ＡＣＴＩＮプロモータの末端を補完するＦプライマー  ５’ＰｈｏｓＧＡＴＴＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣ（配列番号１４６）および一時的なＭｆｅＩ制限酵素部位を作成するために３つのヌクレオチドを付加するＲプライマー  ｔｃｃｃａａＴＴＧＴＣＡＡＧＴＴＧＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＴＡＴＡＡＣ（配列番号１４７）を用いて増幅した。より短い「リバース」断片は、一時的なＭｆｅＩ制限酵素部位を作成するために３つのヌクレオチドを付加するＦプライマー  ｔｃｃｃａａＴＴＧＧＧＡＡＧＴＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＴＡＣＴＴＡＣＣＴ（配列番号１４８）およびＡＣＴＩＮターミネータの開始部位を補完するＲプライマー  ５’ＰｈｏｓＣＴＡＣＡＡＡＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣ（配列番号１４９）を用いて増幅した。断片はＭｆｅＩを用いて制限し、ＨｐａＩおよびＰｍｌＩで切り出したｐＩｎｔｒＡを用いる１回のライゲーションで構築した。ＭｆｅＩ部位を長い断片と短い断片との間にライゲートするとき、その半分は長い断片に属し、残り半分は短い断片に属する。インサートの方向は、プロモータおよびターミネータの相補性について検証した。ＬＢおよびＲＢ断片を包含する完全な遺伝子内構築物は、配列番号９７および図５２で示す。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３６】
トマト形質転換（ｃｖ．Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）は、配列番号９７の構築物を、上の例に記載の通り、形質転換植物の選択用のＡＮＴ１およびＮＰＴＩＩ遺伝子双方を含むマーカ遺伝子カセットと同時形質転換することにより実施した。紫色の植物（その陽性形質転換状態を示す）を選択し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、遺伝子発現についてさらに試験した。ＡＮＴ１遺伝子の発現を伴わない他の植物もまた選択した。これらの植物により作製したトマト果実は、各々、紫色または赤色いずれかの果実色の、先がとがり、心臓形状の外観であることが予想される。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３８】
高収量の可能性を有する栽培品種ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）Ｒｅｉｚｉｑは、栽培者間で人気があるが、典型的にはジャスミン（香り）米において見出される香りが欠如する。米における香りは、米におけるＢＡＤＨ２遺伝子の発現を破壊することにより、得ることができる。したがって、イネ胚乳において発現する、内因性Ｒ１Ｇ１Ｂプロモータおよびターミネータを有するＢＡＤＨ２  ＲＮＡｉカセットを構築した。イネカルスの微粒子銃に先立つこのＤＮＡカセットの切除は、ＦｓｐＩ制限酵素およびアガロースゲル電気泳動サイズ断片化を用いて達成している。潜在的な香りを有する開発中の遺伝子内イネ植物を図５３で示す。