【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年2月27日(2008.2.27)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物が発酵基質を発酵させ、特定の酸素取り込み速度が、発酵プロセスの生産期の間モニタリングされ、そして、少なくとも１つの作動パラメータが、前記測定された酸素取り込み速度に応じて制御される、発酵プロセス。
【請求項２】
前記溶存酸素濃度が、飽和量の１％未満である、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
前記作動パラメータが、通気速度、攪拌速度および通気ガス組成から選択された１以上のパラメータである、請求項２記載のプロセス。
【請求項４】
前記微生物が、破壊された固有のＰＤＣ経路を有する、遺伝子工学で設計された酵母である、請求項２記載のプロセス。
【請求項５】
前記微生物が、細胞に所望の発酵産物を生産させることを可能にする、少なくとも１つの機能性外来遺伝子を有する、請求項４記載のプロセス。
【請求項６】
前記外来遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項５記載のプロセス。
【請求項７】
前記微生物が、Ｃａｎｄｉｄａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属である、請求項６記載のプロセス。
【請求項８】
発酵微生物、微生物により発酵可能な基質を含む発酵培地において発酵プロセスを行う方法であって、
前記発酵培地が、多量の溶存酸素（ＤＯ）を有し、前記発酵が、特定の酸素取り込み（ＯＵＲ）を示し、
ａ）発酵の生産期の間、前記ＯＵＲを測定する工程、
ｂ）発酵の前記生産期の間、飽和の１％未満にＤＯを維持しながら、所定の範囲内に前記ＯＵＲが維持されるような通気条件に調整する工程を含む、発酵プロセスを行う方法。
【請求項９】
前記工程ｂ）におけるＯＵＲが、約０．８〜約３．０ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈの範囲に維持され、ＤＯが、１０μｍｏｌ  Ｏ2／Ｌ未満に維持される、請求項８記載のプロセス。
【請求項１０】
前記微生物が、クラブトリー陰性表現型を示す酵母細胞である、請求項９記載のプロセス。
【請求項１１】
前記酵母細胞が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属またはＣａｎｄｉｄａ属である、請求項１０記載のプロセス。
【請求項１２】
前記酵母細胞が、破壊されたＰＤＣ経路、および、前記細胞に所望の発酵産物を生産させることを可能にする少なくとも１つの機能性外来遺伝子を有する、請求項１１記載のプロセス。
【請求項１３】
前記外来遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項１２記載のプロセス。
【請求項１４】
前記基質が、ヘキソース糖を含む、請求項８記載のプロセス。
【請求項１５】
前記ヘキソース糖が、グルコースを含む、請求項１４記載のプロセス。
【請求項１６】
以下の工程を含むプロセス。
ａ）微生物が炭水化物を所望の発酵産物に発酵させる、ＯＵＲ値の至的範囲を決定する工程、
ｂ）細胞が生育および繁殖（ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ）しているときに、培地の溶存酸素濃度を飽和の１％未満に減少させ、細胞が少なくとも１０  ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇ（細胞の乾燥重量）／ｈ（ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈ）である特定の酸素取り込み速度を示すように、前記培地に通気しながら、前記工学酵母細胞を、前記微生物が代謝可能である炭水化物および１以上の栄養素を含む培地で生育させる工程、および、それから
ｃ）前記至的範囲内の特定の酸素取り込み速度（ＯＵＲ）での培養を提供するのに十分な微好気条件を含む発酵条件下、緩衝培地で細胞を培養する工程。
【請求項１７】
前記微生物が、クラブトリー陰性表現型（Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を示す酵母細胞である、請求項９記載のプロセス。
【請求項１８】
前記酵母細胞が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属またはＣａｎｄｉｄａ属である、請求項１７記載のプロセス。
【請求項１９】
前記酵母細胞が、破壊されたＰＤＣ経路、および、前記細胞に所望の発酵産物を生産されることを可能にする少なくとも１つの機能性外来遺伝子を有する、請求項１８記載のプロセス。
【請求項２０】
前記外来遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項１９記載のプロセス。
【請求項２１】
工程ａ）における前記ＯＵＲが、少なくとも１８  ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈである、請求項１６記載のプロセス。
【請求項２２】
前記炭水化物が、ヘキソース糖を含む、請求項２１記載のプロセス。
【請求項２３】
前記ヘキソース糖が、グルコースを含む、請求項２２記載のプロセス。
【請求項２４】
以下の工程を含む発酵プロセス。
ａ）  細胞が生育および繁殖（ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ）しているときに、培地の溶存酸素濃度をゼロに減少させ、細胞が少なくとも１０  ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇ（細胞の乾燥重量）／ｈ（ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈ）である特定の酸素取り込み速度を示すように、前記培地に通気しながら、破壊されたＰＤＣ経路および細胞に所望の発酵産物を生産させることを可能にする外来遺伝子を有する遺伝子工学で設計された酵母細胞を、前記細胞が代謝可能である炭水化物を含む培地で生育させる工程、および
ｂ）約０．８〜約３．０ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈの特定の酸素取り込み速度（ＯＵＲ）での培養を提供するのに十分な微好気条件を含む発酵条件下、緩衝培地で細胞を培養する工程。
【請求項２５】
前記酵母細胞が、クラブトリー陰性表現型（Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を示す酵母細胞である、請求項２４記載のプロセス。
【請求項２６】
前記外来遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子である、請求項２５記載のプロセス。
【請求項２７】
前記酵母細胞が、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属またはＣａｎｄｉｄａ属である、請求項２６記載のプロセス。
【請求項２８】
工程ａ）における前記ＯＵＲが、少なくとも１８ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈである、請求項２４記載のプロセス。
【請求項２９】
前記炭水化物が、ヘキソース糖を含む、請求項２４記載のプロセス。
【請求項３０】
ヘキソース糖が、グルコースを含む、請求項２８記載のプロセス。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
Ｐｏｒｒｏらは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｃ、Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉおよびＺ．ｂａｉｌｉｉ等の酵母細胞に外来ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子を挿入し、前記細胞固有の乳酸経路を破壊することによって、乳酸生産酵母の設計を試みた。非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照。Ｐｏｒｒｏらは、乳酸を生産する組換え酵母を作製することができたが、その株は、商業上プロセスにおける手段として十分な程は、ほとんど機能しなかった。産業環境において使用できるためには、株は、優れた乳酸収率（例えば、乳酸への基質の高い変換）ならびに高い生産力（例えば、乳酸への基質の迅速な代謝）を示さなければならない。酵母は、高い乳酸滴定を示す培地に耐性であることが好ましい。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
しかしながら、我々は、ある株が、厳密な嫌気条件下で、望まれるように十分な発酵を行わないことを見出した。これは事実であり、例えば、ピルビンデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）経路が欠損もしくは破壊された工学酵母株においてである。しかしながら、ＰＤＣ経路の破壊は、生産されるエタノール量を減少させるため、このような工学設計された種の利用は、乳酸発酵において強く望まれている（所望の産物がエタノール以外のものも同様）。したがって、厳密な嫌気条件下で十分に発酵しない株に、経済的に望まれる発酵産物を生産させることができる、改良された発酵プロセスの提供が望まれている。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
本発明は、他の形態において、発酵プロセスであり、以下の工程を含む。
ａ）  細胞が生育および繁殖（ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ）し、培地の溶存酸素濃度を飽和の１％未満に減少させ、細胞が少なくとも１０  ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇ（細胞の乾燥重量）／ｈ（ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈ）である特定の酸素取り込み速度を示すように、前記培地に通気しながら、破壊されたＰＤＣ経路および前記細胞に所望の発酵産物を生産させることを可能にする外来遺伝子を有する工学酵母細胞を、前記細胞が代謝可能である炭水化物を含む培地で生育させる工程、および、
ｂ）  約０．８〜約３．０ｍｍｏｌ  Ｏ２／ｇｄｗ／ｈの特定の酸素取り込み速度（ＯＵＲ）での培養を提供するのに十分な微好気条件を含む発酵条件下、緩衝培地で細胞を培養する工程。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
驚くことに、プロセス制御パラメータとして酸素取り込み速度を用いた微好気条件の使用は、所望の発酵産物の高収率と良好な生産速度とをバランス化して発酵プロセスを最適化することを可能にする。ＯＵＲ測定は、発酵プロセスの生産期において、最適な条件を維持するために、発酵プロセスのあるパラメータを確立し制御するために使用できる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
本発明の好ましい形態において、発酵細胞は、特定の種類の細胞について至適範囲のＯＵＲを実験的に確立するために様々な通気条件下で培養される。至適ＯＵＲの範囲は、一般的に、様々なファクターを考慮に入れる。例えば、発酵基質からの所望の発酵産物の収率（通常、「ｇ（産物）／ｇ（消費基質）」で表される）、所望の発酵産物の特定の生産力（通常、「産物の重量／乾燥細胞の重量／単位時間」で表される）、および、基質消費速度（通常、「消費基質重量／単位時間」で表される）の３つが、主要なファクターである。これらのファクターは、通常、同じ通気条件下において、全てが最適化されているわけではない。例えば、基質消費速度は、時々、ＯＵＲの増加に伴って増加するが、収率は落ちる傾向にある。そのため、より向上した生産速度を相殺して収率損失がより増大し、全面的にプロセスの経済が痛手をうける。ＯＵＲ値の至適範囲の確立は、一般に、全面的なプロセス経済を最適化するため速度と収率のバランスを取ることを必要とする。一度ＯＵＲ値の所望の範囲が確立されると、その範囲にＯＵＲを確立し維持するために、発酵条件は発酵の生産期において選択される。すでに述べたように、ＯＵＲはプロセスの間で測定され、１以上の発酵パラメータがＯＵＲを前記範囲に維持するように制御される。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
本発明の特に好ましい形態において、微生物は異なる生育条件および生産条件下において培養される。生育期において、微生物は好気的に生育する。細胞は、水、生育期および生産期の両方において細胞が代謝できる炭水化物、および以下に示すような様々な栄養素を含む培地で生育させる。通気条件は、（１）細胞が少なくとも１０  ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈである特定の酸素取り込み速度（ＯＵＲ）を示し、かつ、（２）生育期の最後に、ＯＵＲを少なくとも１０  ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈに維持しながら、培地中の溶解酸素（ＤＯ）濃度を飽和量の１％未満に減少させるように選択される。前記ＯＵＲは、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１８  ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈである。生育期の間、ＯＵＲは細胞が発生できる程度に高いことが最も好ましい。そのため、最大ＯＵＲは使用される特定の工学酵母細胞に幾分か依存する。一般的に、最大ＯＵＲは、約２０−３０  ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈと推測される。ＰＤＣ破壊および外来ＬＤＨ遺伝子を有するＫ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ細胞は、約２０−２２  ｍｍｏｌ  Ｏ2／ｇｄｗ／ｈの範囲に最大ＯＵＲを示す傾向にある。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
培養は、通気条件の変化によって生産期に切り替わる。生産期において、微好気条件は、上述のように、ＯＵＲが所定の範囲内で維持されるように選択される。数種の微生物は、
生産期において、一般的な細胞の生命力および健康を促進するために、少ない酸素量を代謝することが必要と思われる。このような生物の実験は、一般的にＰＤＣ破壊を有し、特に、特定の発酵産物を生産することを可能とする外来遺伝子を有する、工学設計された酵母を含む。完全な嫌気条件において、これらの細胞が示す基質消費速度と発酵産物生産速度は、通常非常に低い。加えて、所望の発酵産物の収率も悪い。微好気条件下、特に特定の株に依存するあるＯＵＲ値において、細胞はより迅速に基質を代謝することができる。これは、基質消費速度および所望の発酵産物生産速度が増加する結果となる。しかしながら、酸素消費がある値を超えて増加すると、基質が二酸化炭素に変換されて所望の産物の収率が減少する。これに加えて、ある値を超えてＯＵＲが増加すると生産速度は横ばいの傾向もしくは減少の傾向となり、収率のロスが速度上昇により補償されなくなる。したがって、生産期の間ある範囲にＯＵＲを維持することは、収率と生産速度との経済的に最適なバランスを達成することとなる。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
本発明のプロセスで使用される微生物は、（１）炭水化物を所望の発酵産物に発酵し、（２）厳密に嫌気的な条件下よりも微好気性条件下でより効率よく発酵する。特に重要な細胞は、（１）破壊されたＰＤＣ経路、および（２）所望の発酵産物を細胞に生産させることができる、少なくとも１つの機能性外来遺伝子、を有することにより特徴付けられた、遺伝的に工学設計されたある酵母細胞である。このような設計された酵母細胞は、例えば、Ｐｏｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏ
ｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＳａｃｃｈａｒｏ７ｎｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ"，  ＢｉｏｔｅｃｈｉｉｏＬ  Ｐｒｏｇ．  １９９５  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；  １１  
（３）：  ２９４−８、  Ｐｏｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  ，"Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏ
ｆ  ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｙｅａｓｔｓ"，  Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｉｚ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９９  Ｓ
ｅｐ：  ６５  （９）：  ４２１１−５、およびＢｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ，"Ｅ
ｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｏｍｏｌａｃｔｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｋｌｕｙｖｅｒｉｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｕｔｉｌａｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｏｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ＬＤＨ  ｇｅｎｅ"，  Ａｐｐ．  Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００１  Ｄｅｃ；  ６７（１２）５６２１−５、ＷＯ  ００／７１７３８、ＷＯ０２／４２４７１、ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６２２３、および２００２年５月２０日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／３８４，３３３等に開示されている。前記細胞は、また、クラブトリー陰性表現型を示すことが好ましい。これは、高濃度グルコースの存在下や高い生育速度の通気条件において呼吸および生育できるためである。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
「破壊された（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）」は、ＰＤＣ経路の機能が少なくとも９０％減少するように変化していることを意味する。その機能を弱めもしくは取り除くように、経路（経路と関連する１以上の遺伝子）を変化させることにより、または経路が機能するために必要な１以上の遺伝子を取り除くことにより、破壊を達成できる。ＰＤＣ遺伝子を欠損している細胞が好ましい。