(57)【要約】  本発明の課題は、PCR法によりコクシジオイデス属真菌遺伝子を特異的に検出し、C. immitisおよびC. posadasiiを区別するためのプライマーを提供することである。本発明によれば、配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー。
【請求項２】
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー。
【請求項３】
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー。
【請求項４】
配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー。
【請求項５】
配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー。
【請求項６】
配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー。
【請求項７】
配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
【請求項８】
配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
【請求項９】
配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
【請求項１０】
配列番号７に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
【請求項１１】
請求項７から１０の何れかに記載のプライマーセットを含む、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのキット。
【請求項１２】
請求項７から１０の何れかに記載のプライマーセットを用いて、コクシジオイデス属真菌のＤＮＡ断片を増幅することを含む、コクシジオイデス属真菌を検出する方法、又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別する方法。
【請求項１３】
配列番号１０に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプライマーセットを含む、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのキット。
【請求項１５】
請求項１３に記載のプライマーセットを用いて、コクシジオイデス属真菌のＤＮＡ断片を増幅することを含む、コクシジオイデス属真菌を検出する方法、又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コクシジオイデス症病原体検出に用いるＰＣＲプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
コクシジオイデス症は感染症法第四類感染症全数把握疾患に規定された唯一の真菌症である。本症は米国西南部（カリフォルニア州、ネバダ州、ユタ州、テキサス州、ニューメキシコ州、アリゾナ州）、メキシコ北部、アルゼンチンのパンパ地域、ベネズエラのファルコン州の半乾燥地域の風土病で、土壌中に生息するCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiが原因真菌である。真菌としては最も感染力が強く危険である。日本国内ではこれまで45例あまりが発症し、約85％がアメリカ合衆国での感染例である。近年は増加が著しく、毎年3〜4名の発病が確認されている。コクシジオイデス属は感染力が強いため健常者でも感染する例が多く、検査中の感染事故が起こりやすい。【０００３】
コクシジオイデス症は特異的抗体の検出によって診断がなされる場合が多い。しかし、深在性真菌感染症のリスクが特に高い免疫不全患者においては感染しても抗体が産生されない可能性があるので、診断できないという問題点がある。また、臨床検体から真菌を培養・同定することによって感染症の診断がなされる場合、培養はバイオセーフティーレベル３実験室に限られており、さらに、培養に数週間を要するため、真菌の培養を介さない診断検査法の開発が強く望まれている。近年、感染症の検査方法として遺伝子診断が広く導入されるようになり、コクシジオイデス症においてもITS(internal transcribed spacer)領域やproline rich antigenを標的としたPCR検出法が報告されているが、非特異的検出の問題により実用化には到っていない。そのため、コクシジオイデス属真菌を特異的に検出するPCR法プライマーの設計とその評価が必要であった。【０００４】
C. posadasiiは、以前は非カリフォルニア型C. immitisとして認識されていた菌種である。臨床症状、表現型にほとんど差が無いにも関わらず、その一塩基多型の多さからC. immitisとは別菌種として認識される経緯となった。これらの2つの種はマイクロサテライトを含む領域の長さや真菌酵素をコードする遺伝子内の変異によって識別される。現在のところ、臨床上、2菌種を識別する重要性は低いが、生息地域によって異なる遺伝子多型が存在している点で進化生物学的に興味深い対象として研究が行われている。【０００５】
【非特許文献１】FEMS Immunology and Medical Microbiology 45(2005) 355-360
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、PCR法によりコクシジオイデス属真菌遺伝子を特異的に検出し、C. immitisおよびC. posadasiiを区別するためのプライマーを提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記プライマーを用いてコクシジオイデス属真菌遺伝子を検出する方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、コクシジオイデス症真菌に特異的な遺伝子領域に対してPCR用のプライマーを設計することにより、特異性に優れたコクシジオイデス症病原体遺伝子検出系を完成するに至った。さらに、その検出系がC. immitisとC. posadasiiを容易に区別できることを明らかにした。【０００８】
これまで開発されている遺伝子診断法では、近縁種との交差増幅が頻繁に認められるなど、特異性に問題があった。この問題を解消するために、Coccidioides属のDNAを検出可能、かつ、Coccidioides属以外の真菌由来のDNAでは陰性になるようなプライマーの開発が必要となる。そのために、米国Broad Instituteにおいて既に公開されているC. immitisのゲノム配列より、PCRで720bpを増幅できる領域を数ヶ所選別した。その領域を増幅するための20merのプライマーを設計し、C. immitisのゲノムDNAに対してDNA増幅を行った。その結果、プライマーセットCoi9-1が最も高い特異性を示し、コクシジオイデス属真菌以外の病原真菌を検出しないことが判明した。【０００９】
プライマーセットCoi9-1を用いたPCR検出系により、5株のC. immitis由来のDNAより720bp、14株のC. posadasii由来のDNAより630bpのDNA断片を増幅することが示された。塩基配列の解析により、その増幅産物の長さの違いは90bpの欠失によることが判明した。従来、2菌種の識別には数塩基の違いを検出するフラグメント解析や1塩基変異を検出するための塩基配列解析が必要であったが、本発明によるPCR検出法によりアガロースゲル電気泳動による解析のみで識別が可能になった。【００１０】
以上の通り、本発明は、配列番号７および８に表されるプライマーセットをPCRによる検出系に用いた場合、コクシジオイデス属真菌を特異的に検出し、分類学上非常に近い2菌種C. immitisとC. posadasiiを容易に識別できることを初めて明らかにしたものである。【００１１】
さらに本発明者らは、上記した配列番号７および８に表されるプライマーセットの増幅範囲の内側に新たにプライマーを設計し、LUXプライマー（配列番号１１）とプライマー（配列番号１０）を合成した。LUXプライマーにおいては、DNAプライマーに蛍光基を修飾し、そのままでは蛍光を発しないが、二本鎖DNAにアニールして伸長反応を行うと蛍光を発する現象を利用して、リアルタイムPCR装置で増幅量を測定することができる。LUXプライマーの詳細は、例えば、http://www.invitrogen.co.jp/qpcr/11742100.shtmlを参照することができる。LUXプライマーの使用により、realtime PCR装置で増幅を容易に検出できる。また、蛍光を含む増幅断片の融解曲線解析により、アガロースゲル電気泳動を行わなくても、Coccidioides immitisおよびCoccidioides posadasiiを見分けることが可能になった。【００１２】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー。
（２）配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー。
（３）配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー。【００１３】
（４）配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー。
（５）配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー。
（６）配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー。【００１４】
（７）配列番号１に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
（８）配列番号２に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。【００１５】
（９）配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
（１０）配列番号７に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。【００１６】
（１１）請求項７から１０の何れかに記載のプライマーセットを含む、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのキット。【００１７】
（１２）請求項７から１０の何れかに記載のプライマーセットを用いて、コクシジオイデス属真菌のＤＮＡ断片を増幅することを含む、コクシジオイデス属真菌を検出する方法、又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別する方法。【００１８】
（１３）  配列番号１０に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。【００１９】
（１４）  （１３）に記載のプライマーセットを含む、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのキット。【００２０】
（１５）  （１３）に記載のプライマーセットを用いて、コクシジオイデス属真菌のＤＮＡ断片を増幅することを含む、コクシジオイデス属真菌を検出する方法、又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別する方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（１）本発明のプライマーの設計
経験上、診断プライマーの構築は、リボソームＲＮＡの保存された酵素をコードする塩基配列に基づいている。しかし、本発明では以下に示す新たな戦略を採用して、診断ＰＣＲのための領域を選択した。【００２２】
工程１：
C. immitisゲノム配列のテキストファイルを入手した（http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/coccidioides_immitis/）。２４０−７２０ｂｐ長に対応する塩基配列をゲノムデータベースファイルからランダムに選択した。ランダムに選択した領域を増幅するための２０ｍｅｒのフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計した。【００２３】
工程２：
これらの２種のプライマーがCoccidioides属由来の予想されるサイズのＤＮＡ断片を増幅できるかどうかを調べた。【００２４】
工程３：
工程２でCoccidioidesのＤＮＡを増幅できたプライマーについて、Candida albicans及びAspergillus fumigatus ＤＮＡからＤＮＡを増幅することができないかどうかを試験した。【００２５】
６４個の選択された領域についてこれらの工程を繰り返すことによって、１対のプライマーをさらに詳細な試験のために選択した。上記したプライマー設計により好適なプライマーを得ることができたことから、この設計方法は診断プライマーの開発のための有効な戦略である。【００２６】
（２）本発明のプライマーの具体例
本明細書の実施例では、配列番号７に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせて用いてＰＣＲを行うことにより、コクシジオイデス属真菌の検出、並びにCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別することに成功した。【００２７】
配列番号７に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８に記載の塩基配列からなるリバースプライマーにより増幅されるコクシジオイデス属真菌のＤＮＡ断片並びにその周辺の塩基配列（配列表の配列番号９）を以下に示す。配列番号９に記載の塩基配列は、http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/coccidioides_immitis/よりダウンロードしたゲノム配列より抽出した配列であり、具体的には、C. immitis contig2.2 (GenBankaccession number AAEC02000002)の660113番目から661232番目に相当する配列である。下線部分は、配列番号７に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８に記載の塩基配列からなるリバースプライマーに対応する塩基配列を示す。【００２８】
2007072903.tif 000002
【００２９】
本発明では、配列番号７に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８に記載の塩基配列からなるリバースプライマーのみならず、上記プライマー配列の周辺の配列をプライマーとして選択することもできる。【００３０】
また、図２にも示す通り、コクシジオイデス属真菌4株（C. posadasii IFM45809, IFM45810、C. immitis IFM45815, IFM45816）のPCR増幅DNAの塩基配列を比較した結果、図２の配列番号122〜207において、C. posadasiiには遺伝子の欠損が認められた。従って、少なくとも図２の配列番号122〜207を含む領域をＰＣＲにより増幅できるようにプライマーを設計すれば、増幅産物の大きさを比較することにより、Coccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別することが可能になる。【００３１】
上記した条件を満たす本発明のプライマーの具体例としては、以下のものが挙げられる。
配列番号１、配列番号２又は配列番号３に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー；及び
配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列のうちの連続する１５から３０塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー：【００３２】
さらに本発明においては、上記の配列番号７および８に表されるプライマーセットの増幅範囲の内側に新たにプライマーを設計し、LUXプライマー（配列番号１１）とプライマー（配列番号１０）を合成した。これらのプライマーを用いて標的ＤＮＡ配列を増幅し、蛍光を含む増幅断片の融解曲線解析を行うことににより、アガロースゲル電気泳動を行わなくても、Coccidioides immitisおよびCoccidioides posadasiiを見分けることが可能になった。【００３３】
上記した本発明のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとから構成されるプライマーセットとしてＰＣＲ反応などの核酸増幅反応において用いることができる。【００３４】
本発明のプライマーの塩基配列の長さは特に限定されるものではないが、好ましくは１５塩基以上３０塩基以下、さらに好ましくは１５塩基以上２５塩基以下であり、特に好ましくは１７塩基以上２３塩基以下である。【００３５】
本発明のプライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であることが好ましく、また、オリゴヌクレオチド中に修飾ヌクレオチドがあってもよい。本発明のプライマーは、ホスホアミダイト法等で合成することができる。合成にあっては、ＤＮＡ合成機を利用すれば便利である。【００３６】
なお、本発明においては、ＰＣＲによる増幅産物を、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン染色によらずに、ラジオアイソトープや蛍光プローブを使ったドットブロット法等によっても解析することが可能である。この場合についても増幅産物の量が多いことは解析の容易性の観点から見て有利である。このような解析を行う場合、本発明のプライマーは標識して使用することもできる。
上記したように、本発明のプライマーは標識して使用することもできる。このような標識されたプライマーは全て本発明の範囲内に属する。【００３７】
本発明の標識プライマーは、本発明のプライマーに標識を結合したものである。標識物としては放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体、ビオチン・アビジン系標識などの公知の標識を用いることができる。標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよい。また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。【００３８】
（３）キット
本発明のプライマーを用いたプライマーセットはキットとして供給することにより、コクシジオイデス属真菌の検出、並びにCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別を簡便に行うことができる。本発明のコクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのキットは、本発明のプライマー（又はその標識プライマー）を含むものである。また、本発明のキット中には、ＰＣＲ用試薬、電気泳動試薬、ＤＮＡ抽出用試薬などを含めておくことにより、試料中のコクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別をより迅速・簡便・高感度に行うことができる。なおキット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でもよい。【００３９】
ＰＣＲ用試薬としては、例えば、Tris-HCl、KCl、MgCl2、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（dATP, dCTP, dGTP, およびdTTPもしくはdUTP）、Taq DNAポリメラーゼ、水等が挙げられる。電気泳動用試薬としては、例えば、アガロース又はポリアクリルアミドゲル、ローディング緩衝液、エチジウムブロマイド染色用試薬等が挙げられる。ＤＮＡ抽出用試薬としては、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋなどが挙げられる。しかし、キットに含めることができる試薬はこれらに限定されるものではない。【００４０】
（４）本発明のプライマーを用いたコクシジオイデス属真菌の検出
本発明のプライマーを用いてコクシジオイデス属真菌を検出する方法としては、本発明のフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことによりコクシジオイデス属真菌のＤＮＡの一部を増幅して検出する方法が挙げられる。本発明の好ましい態様によれば、本発明のフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、コクシジオイデス属真菌のＤＮＡを特異的に増幅し、これによりコクシジオイデス属真菌を検出することができる。【００４１】
ＰＣＲの増幅反応に際しては反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により分画して特異なバンドを検出することにより、コクシジオイデス属真菌に由来するＤＮＡ断片を容易に検出することができる。【００４２】
また、上記したように図２に記載の塩基配列のうちの配列番号122〜207を含む領域をＰＣＲにより増幅できるようにプライマーを設計すれば、増幅産物の大きさを比較することにより、Coccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別することが可能になる。【００４３】
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅は、当業者に公知の方法（例えば、Sambrook,Jら、Molecular Cloning, ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)に記載の方法）に従って行うことができる。ＰＣＲ法により、少量のサンプルから目的のＤＮＡ断片を特異的に増幅することができる。ＰＣＲ法では、目的のDNA配列の一方の鎖の５'側に相補的な５'側プライマー、及び他方の鎖の３'側に相補的な３'側プライマー、鋳型として用いるDNA配列、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（dATP, dCTP, dGTP, およびdTTP又はdUTP）及びDNAポリメラーゼを含有する反応系を用いる。先ず、ＤＮＡサンプルを変性して一本鎖にし（変性工程）、次いで、鋳型DNAに上記２種のプライマーをアニーリングさせ（アニーリング工程）、最後にDNAポリメラーゼと４種のデオキシヌクレオシド三リン酸によって鋳型上に相補鎖を合成させる（伸長工程）。以下、生成した二本鎖を用いて、変性工程、アニーリング工程及び伸長工程から成るサイクルを繰り返すことにより、プライマーに挟まれた領域を指数関数的に増幅させることができる。なお、ＰＣＲ法で用いるDNAポリメラーゼは耐熱性ポリメラーゼが好ましく、例えば、Taq, Tthポリメラーゼなどを用いることができる。【００４４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
実施例１：
（１）材料及び方法
（ｉ）菌株及びＤＮＡの単離
本実施例で使用した１９種のCoccidioides株を表１に示す。【００４６】
【表１】
2007072903.tif 000003
【００４７】
これらの菌株の情報は、GeneBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.figi?CMD=search&DB=nucleotide&term=coccid ioides+IFM) から入手可能である。培養物は、コロニー形態及び典型的な分節胞子の顕微鏡観察により同定した。菌株は、スラントチューブ中でポテトデキストロース寒天で37℃，2週間まで培養した。C. immitis及びC. posadasiiの同定は、Fisher et al., 2001, Proc,Natl.Acad.Sci. USA, 98: 4558-4562に記載された方法に従って酵素をコードする複数の遺伝子の塩基配列を比較することによって行った。特異性試験のために使用したCoccidioides以外の菌株を表２に示す。【００４８】
【表２】
2007072903.tif 000004
【００４９】
菌の同定は通常の菌類学的方法により行った。ＤＮＡの単離は、DEXPAT DNA抽出キット（Takara BIO Inc）を取扱説明書に従って使用することによって行った。【００５０】
（ｉｉ）ＰＣＲ増幅及び塩基配列の決定
本実施例で設計したプライマーは、
Coi9-1F：5'-TACGGTGTAATCCCGATACA-3'（配列番号７)
Coi9-1R：5'-GGTCTGAATGATCTGACGCA-3'（配列番号８）
である。ＰＣＲ反応液の組成は以下の通りである。【００５１】
【表３】
2007072903.tif 000005
【００５２】
ＰＣＲは、Ｂio-Rad社DNA Engine PTC-200を用いて行った。96℃で３分間処理した後、96℃で３０秒間（変性）、60℃で３０秒間（アニーリング）及び72℃で45秒間（伸長）からなるサイクルを３５サイクル繰り返し、最後に72℃で3分間反応させた。【００５３】
10μlのＰＣＲ産物をＴＡＥ緩衝液（40mM Tris酢酸、2mM EDTA）に溶解した２％アガロースゲルで電気泳動した。バンドは、エチジウムブロミド又はＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（Invitrogen）で染色後、ＵＶトランスイルミネーターで可視化した。【００５４】
ＰＣＲによる増幅産物は、NucleoSpin Extract II Kit (Macherey-Nagel, Germany)を用いてゲルから精製した。シークエンス反応を、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いて行った。塩基配列は、ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いて決定した。【００５５】
（２）結果
（ｉ）Coccidioides属の特異的検出
選択したプライマーセットは、C. immitis由来の７２０ｂｐの産物を増幅するように構築されている。５種のC. immitis及び１４種のC. posadasiiについてプライマーを用いて試験した（表１）。Coi9-1F及びCoi9-1Rと命名したプライマーを用いたＰＣＲ系により、C. immitisのＤＮＡから予測されるサイズのＤＮＡ断片を増幅することができた（図１）。特異性試験のために、４９種の菌の１２５株について試験した（表２）。上記プライマーを用いた場合、これらの株からバンドは検出されなかった。これらの菌からのＤＮＡを用いたＰＣＲの結果、本発明のプライマーは、主要な病原菌及びArthrographis kalrae, Chrysosporium spp., Geotrichum candidum, Malbranchea spp., Paracoccidioides brasiliensis, 及びTrichosporon asahiiなどの関連菌については交差増幅しないことが示された。【００５６】
上記の通り、本発明のプライマーは、Coccidioides属から予想されるサイズのＤＮＡ断片を増幅できるが、他の多くの病原菌からは増幅産物は検出されなかった。従って、本発明のＰＣＲ系は非常に高い特異性を有している。【００５７】
（ｉｉ）本発明のプライマーによる増幅ＤＮＡ断片のサイズに基づいたC. immitisとC. posadasiiとの識別
日本で入手可能な全てのCoccidioides属のＤＮＡについて本発明のプライマーを試験した場合、意外なことに、ＤＮＡ断片の移動度に２つの異なるパターンが見られた(図１)。C. posadasiiから増幅したＤＮＡ断片は、C. immitisから増幅したものより明らかに短く、C. immitis由来のＤＮＡ断片は予想通りの長さであった。増幅ＤＮＡ断片の塩基配列の分析の結果、C. posadasii由来のアンプリコンは８６ｂｐの欠失を有していることが判明した（図２）。以上の結果より、従来は困難であった分類学上非常に近い2菌種であるC. immitisとC. posadasiiとの識別が可能になった。特に、本発明のプライマーを用いたＰＣＲによれば、1回のＰＣＲとアガロースゲル電気泳動により上記2菌種を容易に識別することができるので、簡便な操作でハイスループットな取り扱いが可能である。【００５８】
実施例２：LUXプライマーによる検出
（１）方法
Invitrogen社にて下記のプライマーを合成した。
87FU (5'- CATCCAGAGAGCAAACATCCAAA)（配列番号１０）（配列番号９の265から288塩基の配列を参照。ただし、2番目のＡはなし）。
166RL (5'-CACTTTGCGGCTAGTCAACGAAAGT*G)（配列番号１１）（配列番号９の453から472塩基の配列を参照）（３’側から２塩基目のＴを蛍光色素FAM (6-carboxy-fluorescein)で修飾した。また、下線は、ヘアピンループを形成させるために付加した配列を示す）。【００５９】
反応組成を以下に示す。
サンプルDNA                      1μl
Takara ExTaq                   0.1μl
87FU (100 pmol/μl)            0.04μl
166RL (100 pmol/μl)           0.04μl
ROX dye                          0.4μl
Takara LATaqBuffer (Mg plus)      2 μl
dNTP (2.5 mM each)              1.6μl
水                            14.82 μl
計                             20 μl   【００６０】
反応条件は、95℃で30秒インキュベーション後、95℃で5 秒/60℃で31 秒を40 サイクル行い、ABI PRISM 7000 を用いて融解曲線を作成した。【００６１】
（２）結果
（ｉ）増幅の確認
図３に示すように、加えた鋳型DNAのコピー数の対数（Y軸）に比例した増幅が確認できた。また、上記の表１に示す19種類のCoccidioides属のDNAに対し、全ての増幅を確認した。【００６２】
（ii）融解曲線解析によるCoccidioides immitisおよびC. posadasiiの区別
融解曲線解析は、プライマーダイマーのアーティファクトやコンタミネーションの有無をチェックし、反応の特異性と定量の正確さを確認するための、簡単で直接的な方法である。蛍光分子を含んだ二本鎖DNAの増幅産物に対して、徐々に温度を上げると、ある温度に達したときに二本鎖から一本鎖に融解し、蛍光強度が弱まる。その蛍光強度のプロットの微分曲線のピーク温度は、増幅したDNAの長さや塩基配列によって決定される。【００６３】
増幅PCR実験に引き続き融解曲線を作製した結果、図４に示すように、そのピークがC. immitis（45815）では80.8℃、C. posadasii(45809)では78.1〜78.8℃を示す。19種類全てのCoccidioides属DNAに関して、融解曲線のピークの温度で２種を区別することが可能であった。上記の通り、realtimePCRを用いた融解曲線解析により、アガロースゲルで流す必要がなく、反応終了後に即時に区別できることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明により、真菌培養を介さない簡便かつ迅速なコクシジオイデス症診断が、臨床現場で可能となる。それにより、検査室事故の危険性を軽減させることができる。本発明によるプライマーセットを用いたPCR検出系は、コクシジオイデス症の体外診断薬としての実用化が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、PCR検出系によるC. immitisとC. posadasiiの識別を示す。即ち、図１は、コクシジオイデス属真菌DNAを用いて、プライマーセットCoi9-1によるPCR増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果を示す。C. immitisおよびC. posadasii由来DNAからの増幅産物はそれぞれ720bpおよび630bpを示し、DNA断片のサイズの違いで識別が可能であることが示された。
【図２】図２は、PCR増幅産物の塩基配列の比較を示す。コクシジオイデス属真菌4株（C. posadasii IFM45809, IFM45810、C. immitis IFM45815, IFM45816）のPCR増幅DNAの塩基配列を比較した。配列番号122〜207において、C. posadasiiには遺伝子の欠損が認められた。さらに、増幅DNA内にはC. immitisとC. posadasiiとの間に異なる塩基もしくは挿入・欠失塩基の存在が7ヶ所（配列番号94〜96、102、218、233、464）確認された。
【図３】図３は、LUXプライマーによる増幅PCR実験の結果を示す。
【図４】図４は、LUXプライマーによるCoccidioides immitisおよびC. posadasiiのＤＮＡの増幅産物の融解曲線解析を示す。
【図２】
2007072903.tif 000006
【図１】
2007072903.tif 000007
【図３】
2007072903.tif 000008
【図４】
2007072903.tif 000009
【配列表】
2007072903000001.app
【国際調査報告】
2007072903.tif 000010
2007072903.tif 000011
2007072903.tif 000012
2007072903.tif 000013