(57)【要約】  本発明の目的は、ａ）コムギ品種で普遍的に存在し、ｂ）コムギ品種により存在量（検出量）が偏らず、ｃ）他の穀物が存在しても交差性なくパンコムギのみ検出可能であり、ｄ）ＰＣＲ反応で定量的に増幅される、という条件を満たすコムギ内在性配列を見出し、被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によってより正確に検出又は定量する方法を提供することを目的とする。  本発明は、被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量する方法であって、前記被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域に含まれる増幅可能なプライマーペアを用いて前記領域の核酸を増幅する工程、及び前記増幅された核酸を検出又は定量する工程を含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量する方法であって、
前記被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を増幅可能なプライマーペアを用いて該領域の核酸を増幅する工程と、
前記増幅された核酸を検出又は定量する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記配列番号：２に記載の塩基配列の部分配列からなる領域が、配列番号：１１から１８のいずれか１つに記載の塩基配列からなる領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーペアが、
(i)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：４に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、
(ii)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：４に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、
(iii)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：６に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、
(iv)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：６に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、
(v)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、
(vi)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：８に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、
(vii)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：８に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、
(viii)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、及び
(ix)前記(i)〜(viii)のプライマーペアのそれぞれにおいて、各核酸が有する塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸のペアからなるプライマーペア、からなる群から選択されるプライマーペアである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーペアに含まれる各プライマーが１５〜４０塩基長の核酸である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された領域を、配列番号：９又は１０に記載のプローブを用いて検出する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項３に記載のプライマーペアのうち少なくとも１つのプライマーペアを含む、被検試料からポリメラーゼ連鎖反応によってコムギ内在性ＤＮＡを検出又は定量するためのキット。
【請求項７】
遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性ＤＮＡとして、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなるＤＮＡと、
遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡと、を含む複製可能なＤＮＡ。
【請求項８】
遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性ＤＮＡとして、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなるＤＮＡと少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、
遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡと、を含む複製可能なＤＮＡ。
【請求項９】
前記配列番号：２に記載の塩基配列の部分配列からなるＤＮＡが、配列番号：１１から１８のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性ＤＮＡとして、請求項３に記載のプライマーペアのいずれかを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅可能な配列からなるＤＮＡと、
遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡと、を含む複製可能なＤＮＡ。
【請求項１１】
被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率を決定する方法であって、
請求項７から１０のいずれか１項に記載の複製可能なＤＮＡを含む溶液を用いて２種類以上の濃度希釈系列を作り、それぞれについて定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行って、前記コムギ内在性ＤＮＡと、少なくとも一種類の前記遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡとを増幅し、各部分領域について検量線を求める工程と、
前記被検試料について、前記検量線を求める工程と同一の条件で定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記検量線を用いて、被検試料中に存在した、前記コムギ内在性ＤＮＡの分子数と前記遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡの分子数とを求める工程と、を含む方法。
【請求項１２】
前記被検試料中に存在した、前記遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡの分子数を、前記コムギ内在性ＤＮＡの分子数で除して得られる比Ａと、
遺伝子組換えコムギの各系統の標準種子を用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行って求められる、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的なＤＮＡの分子数を、コムギ内在性ＤＮＡの分子数で除して得られる比Ｂと、を用い、
式１００×Ａ／Ｂを計算して、前記被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定する工程、をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記コムギ内在性ＤＮＡの増幅を、請求項３に記載のプライマーペアから選択される少なくとも１つのプライマーペアを用いて行う、請求項１１又は１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中のコムギ内在性遺伝子を検出、定量する方法に関する。特に食品素材、加工食品中に含まれる遺伝子組換えコムギの混入率を決定する際に用いるコムギ内在性ＤＮＡの検出又は定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、現在までにトウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ等について５０種以上の遺伝子組換え農作物（以下「ＧＭＯ」という）が安全性審査を経て輸入や販売を認められている。これに伴って、ＧＭＯ含有食品は、「遺伝子組換えに関する表示に係る加工食品品質表示基準第７条第１項及び生鮮食品品質表示基準第７条第１項の規定に基づく農林水産大臣の定める基準」（平成１２年３月３１日農林水産省告示第５１７号）、及び「食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について」（平成１３年３月１５日厚生労働省食発第７９号）に基づき、その表示が義務化されている。【０００３】
しかし、海外では、一度安全性評価が終了するとＧＭＯと非ＧＭＯが混在する形で栽培されることもあり、収穫後の流通の過程でも混入の可能性を否定できない。また、食品メーカ等は、加工食品の製造を製造業者に委託することも多く、仮に非ＧＭＯを使用するように指定して委託しても、製造業者の工場でＧＭＯも使用している場合は、このＧＭＯが加工食品に微量混入してしまうことがある。従って、表示の義務を遵守するためには、食品メーカ等は、完成した加工食品中にもＧＭＯが混入していないかどうか検査分析して確認することが求められる。【０００４】
加工食品及びその原料等の被検試料中のＧＭＯ検出方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）によって組換えＤＮＡを検出する方法、ＥＬＩＳＡ法によって組換え蛋白質を検出する方法等がある。加工食品の場合、加熱や加圧によって蛋白質が変性していることが多いため、ＥＬＩＳＡ法では正確な検出ができないことも多く、ＰＣＲ法による検出が一般的に行われる。【０００５】
検査分析する方法として、ＪＡＳ分析試験ハンドブック 遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル改訂第２版（非特許文献１）に記載される方法や、『組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（一部改正）』（平成１５年６月１８日厚生労働省食発第０６１８００２号）に記載される方法がある。これらによれば、ＧＭＯの検査分析においては、被検試料から抽出したＤＮＡでＰＣＲ増幅が可能かどうかを確認する目的で、各農産物の内在性ＤＮＡを検知するプライマーペアを用いてＰＣＲ法を行い、予想される長さのＰＣＲ産物が得られることにより確認する必要があることが記載されている。また、被検試料中に含まれるＧＭＯを定量する場合には、その農産物が必ず持っている内在性ＤＮＡに対する組換えＤＮＡの存在比率から、組換え体の混入率を相対的に測定する方法が用いられる。【０００６】
例えばトウモロコシでは、５系統の承認ＧＭＯ品種それぞれに対して特異的な検知プライマーペアのほか、トウモロコシの内在性ＤＮＡとしてＳＳＩＩＢ遺伝子の領域を検知するプライマーペアが開発されている（非特許文献１）。【０００７】
『組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（一部改正）』（平成１５年１１月１３日食安発第１１１３００１号）では、定量ＰＣＲ法を行う際、トウモロコシ又はダイズの内在性ＤＮＡ及び組換えＤＮＡを標的とした特異的プライマー対により増幅された増幅産物をプラスミド上に連結したものを標準物質として使用している。かかる標準物質を用いて定量ＰＣＲ法を行うことにより、被検試料について一定時間定量ＰＣＲを行った場合に組換えＤＮＡのコピー数と内在性ＤＮＡのコピー数との比を正確に求めることができる。【０００８】
トウモロコシのように複数の系統のＧＭＯ品種が存在する場合には、各系統に特異的なＤＮＡと内在性ＤＮＡとを一つの環状ＤＮＡに組み込んだ標準物質を用いれば、各系統の混入率の測定において共通の標準物質を用いることができ、特に有用である。【０００９】
また、一般に、各系統に特異的な遺伝子は入手が困難であるが、一度これらを組み込んで複製可能なＤＮＡを作製すれば、このＤＮＡ自体を複製することによって、系統特異的なＤＮＡを安定して供給することも可能となる。【００１０】
一方、パンコムギについて、現在のところ安全性審査を経た遺伝子組換え品はないが、近い将来の上市が予想される。このため、コムギのＧＭＯが流通した場合に備えて、コムギの内在性ＤＮＡを検出及び定量する方法及びこれに用いるＰＣＲ用プライマーペアの開発が求められている。【００１１】
コムギは他の穀物に比べ、遺伝子の存在形態に様々なバリエーションが存在する。これはコムギ品種により６倍体、４倍体、２倍体の遺伝子型が存在するからである。例えば、一般的なパンコムギの場合６倍体（ＡＡ、ＢＢ、ＤＤ）であるが、それぞれの遺伝子は類似しているものの、転座などにより部分的な相違が認められている。一方、デュラムコムギは４倍体であり、ゲノムＤＤを有していない。【００１２】
また、コムギの場合には、同じ穀物の中にゲノム構造やコードされる遺伝子の塩基配列について相同性の高い麦類、例えばオオムギ、ライムギ、オーツムギなどがある。これら麦類はパンコムギとの相同性が高く、誤検出される可能性が高い。【００１３】
このような事情から、コムギについては、ａ）コムギ品種で普遍的に存在し、ｂ）コムギ品種により存在量（検出量）が偏らず、ｃ）他の穀物が存在しても交差性なくコムギのみ検出可能であり、ｄ）ＰＣＲ反応で定量的に増幅される、という条件を満たすＤＮＡ配列の発見が困難となっている。【００１４】
国際公開パンフレットＷＯ２００５／０９７９８９号（特許文献１）は、このような条件を満たすコムギ内在性ＤＮＡとして、Ｗａｘｙ遺伝子（非特許文献２を参照）の部分配列等を用いることができることを開示している。
【特許文献１】国際公開パンフレットＷＯ２００５／０９７９８９号
【非特許文献１】ＡＳ分析試験ハンドブック 遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル改訂第２版
【非特許文献２】Ainsworth C, et al., Plant Mol Biol. 1993 Apr;22(1):67-82
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、Ｗａｘｙ遺伝子を欠損した変異体であるモチコムギが知られており、モチコムギを含む被検試料においては、上記特許文献１に開示されたＷａｘｙ遺伝子の部分配列を検出しても、コムギ内在性ＤＮＡを正確に測定することができない。また、Ｗａｘｙ遺伝子はコムギのＤゲノム上に存在すると考えられるため、Ｄゲノムを有しないデュラムコムギのゲノム上には存在しない。従って、特許文献１に開示された方法は、デュラムコムギとパンコムギを識別することを目的としている場合には有用であるが、デュラムコムギとパンコムギとを併せて「コムギ」として検出することが要請される場合も多く、かかる状況では別途デュラムコムギの内在性ＤＮＡを見出し、検出・測定しなければならない。【００１６】
そこで、本発明は、上記ａ）〜ｄ）の条件を満たす、さらなるコムギ内在性配列を見出し、被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によってより正確に検出又は定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、コムギのゲノムＤＮＡにおいて、Proline rich protein（ＰＲＰ）遺伝子（C. A. Raines et al., Plant Molecular Biology 16: 663-670, 1991）の一部の領域はコムギ品種で普遍的に存在し、かつＰＣＲ反応において他の植物との交差性が無く、当該領域を増幅することによってコムギ内在性ＤＮＡ配列を特異的に検出又は定量できることを見出し、本発明を完成させた。【００１８】
即ち、本発明は、
〔１〕被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量する方法であって、前記被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を増幅可能なプライマーペアを用いて該領域の核酸を増幅する工程と、前記増幅された核酸を検出又は定量する工程と、を含む方法；
〔２〕前記配列番号：２に記載の塩基配列の部分配列からなる領域が、配列番号：１１から１８のいずれか１つに記載の塩基配列からなる領域である、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記プライマーペアが、(i)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：４に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(ii)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：４に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(iii)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：６に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(iv)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：６に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(v)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(vi)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：８に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(vii)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：８に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(viii)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、及び(ix)前記(i)〜(viii)のプライマーペアのそれぞれにおいて、各核酸が有する塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸のペアからなるプライマーペア、からなる群から選択されるプライマーペアである上記〔１〕に記載の方法；
〔４〕前記プライマーペアに含まれる各プライマーが１５〜４０塩基長の核酸である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔５〕前記ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された領域を、配列番号：９又は１０に記載のプローブを用いて検出する、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の方法；
〔６〕上記〔３〕に記載のプライマーペアのうち少なくとも１つのプライマーペアを含む、被検試料からポリメラーゼ連鎖反応によってコムギ内在性ＤＮＡを検出又は定量するためのキット；
〔７〕遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性ＤＮＡとして、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなるＤＮＡと、遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡと、を含む複製可能なＤＮＡ；
〔８〕遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性ＤＮＡとして、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなるＤＮＡと少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡと、を含む複製可能なＤＮＡ；
〔９〕前記配列番号：２に記載の塩基配列の部分配列からなるＤＮＡが、配列番号：１１から１８のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡである、上記〔７〕又は〔８〕に記載の方法；
〔１０〕遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性ＤＮＡとして、上記〔３〕に記載のプライマーペアのいずれかを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅可能な配列からなるＤＮＡと、遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡと、を含む複製可能なＤＮＡ；
〔１１〕被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率を決定する方法であって、上記〔７〕から〔１０〕のいずれか１項に記載の複製可能なＤＮＡを含む溶液を用いて２種類以上の濃度希釈系列を作り、それぞれについて定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行って、前記コムギ内在性ＤＮＡと、少なくとも一種類の前記遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡとを増幅し、各部分領域について検量線を求める工程と、前記被検試料について、前記検量線を求める工程と同一の条件で定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記検量線を用いて、被検試料中に存在した、前記コムギ内在性ＤＮＡの分子数と前記遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡの分子数とを求める工程と、を含む方法；
〔１２〕前記被検試料中に存在した、前記遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡの分子数を、前記コムギ内在性ＤＮＡの分子数で除して得られる比Ａと、遺伝子組換えコムギの各系統の標準種子を用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行って求められる、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的なＤＮＡの分子数を、コムギ内在性ＤＮＡの分子数で除して得られる比Ｂと、を用い、式１００×Ａ／Ｂを計算して、前記被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定する工程、をさらに含む、上記〔１１〕に記載の方法；及び、
〔１３〕前記コムギ内在性ＤＮＡの増幅を、請求項３に記載のプライマーペアから選択される少なくとも１つのプライマーペアを用いて行う、上記〔１１〕又は〔１２〕に記載の方法、に関するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ＰＲＰ遺伝子の一部領域をＰＣＲ法により増幅することによって、食品素材及び加工食品等の被検試料から、他の作物と交差することなくコムギ内在性ＤＮＡを特異的に検出又は定量することができる。
さらに、該方法により提供される遺伝子組換えコムギ（以下「ＧＭコムギ」という場合もある）検知のための標準物質を用いることにより、定量ＰＣＲ法で、被検試料中のＧＭコムギの混入率をＧＭＯ系統別に精度良く求めることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本明細書において用いる用語の意味等を示し、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、用語「コムギ」は特にことわりがない限りパンコムギ、デュラムコムギ、及びモチコムギを意味する。【００２１】
本発明の方法は、コムギの内在性ＤＮＡ配列として、コムギゲノム上のＰＲＰ遺伝子（GeneBank Accession No. X52472、配列番号：１）の特定部分、即ち、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を検出するものである。【００２２】
各種のコムギ品種において、特許文献１に開示されたＷｘ０１２領域と、ＰＲＰ遺伝子の複数の部分領域をＰＣＲにより増幅したところ、Ｗｘ０１２領域の増幅産物と、ＰＲＰ遺伝子の各領域の増幅産物との比は、１：１〜１：３の間で変動することがわかった。１：１以外の比となるのは、ＰＲＰ遺伝子上に同一のプライマーで増幅される領域が複数存在することによるものと考えられるので、かかる領域は本発明に用いられるコムギ内在性配列としては適当でない。そこで、本発明者らは、さらに検討を重ねた結果、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域（ただし８０塩基以上の領域）を増幅すれば、当該増幅産物と、Ｗｘ０１２増幅産物とが、１：１の割合で得られることを見出した。【００２３】
また、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列は、デュラムコムギでも検出されることを確認した。このことから、ＰＲＰ遺伝子は、コムギゲノムのＡ又はＢ上に存在すると推定される。現在市場に流通するコムギにはパンコムギ、デュラムコムギ、モチコムギなどが含まれるので、検出するコムギ内在性遺伝子としては、これらのコムギ品種に共通して存在し、品種により存在量が変化しない遺伝子が好ましいところ、これらのコムギ品種にはゲノムＡ、Ｂが必ず存在するので、この点でも配列番号：２に記載の塩基配列からなる領域がコムギ内在性遺伝子として好ましい。【００２４】
一方、ＰＲＰ遺伝子には非常に類似したシュード遺伝子が存在することが確認されている。このため、加工食品中のコムギゲノムを増幅する際、ＰＲＰ遺伝子の全長から無作為に選択した部分配列を増幅するプライマーを使用すると、シュード遺伝子の部分配列も同時に増幅される可能性がある。すなわちコムギ品種によっては単位コムギあたりのＤＮＡ増幅量が一定にならない場合が想定される。しかしながら、本発明者らは、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行えば、シュード遺伝子とも交差することなくＰＲＰ遺伝子の当該領域のみを増幅できることを確認した。【００２５】
さらに、配列番号：２に記載された塩基配列からなる領域は、３３０ｂｐとゲノム全長に比べ極端に短いため、ＤＮＡが断片化されている可能性のある加工食品等の試料からもコムギ内在性ＤＮＡの検出及び定量が可能である。【００２６】
配列番号：２に記載された塩基配列の部分配列は特に限定されないが、８０塩基長以上の配列が好ましく、特に、配列番号：１１〜１８のいずれか１つに記載の塩基配列が好ましい。これらの配列は、配列番号：３〜８に記載の塩基配列を含む核酸からなるプライマーを適宜組合せることによってＰＣＲにより増幅することができる。
図１に、配列番号：２における、配列番号３〜８に記載のプライマーの結合領域を示す。【００２７】
尚、配列番号：３〜８に記載のプライマーの塩基長を変更したり、プライマーが結合する領域をわずかに変更したりすることにより、増幅される配列も、配列番号：１１〜１８に記載の塩基配列からなる領域とわずかにずれた領域となるが、それらの領域も本発明における「配列番号：２に記載された塩基配列の部分配列」に含まれる。このような領域としては、例えば、配列番号：３〜８に記載の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上共通の領域を有する領域が挙げられる。【００２８】
本発明においてＰＣＲ法に用いられるプライマーペアは、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を増幅できるプライマーペアであれば特に限定されず、増幅しようとする領域の塩基配列に基づいて、プライマー作成上の基本ルールを遵守して設計することができる。その際、各プライマーのＴｍ値の統一を図ることに留意する。また、各プライマーの長さは、通常は１５〜４０ｂｐ、好ましくは１５〜３０ｂｐである。【００２９】
本発明にかかる方法では、使用するプライマーペアがコムギ以外の作物と交差反応すると、コムギ検出の偽陽性の可能性が生じるばかりでなく、被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡ配列の正確な定量は困難となる。また、本発明の方法は、食品素材及び加工食品等の被検試料中のコムギの存在及びその量の正確な情報を与えるものである。従って、本発明の方法に用いるＰＣＲ用プライマーペアは、コムギを特異的に検出し、コムギ以外の作物、例えばコメ、オオムギ、ライムギ、オーツムギ、ナタネ、トウモロコシ、アワ、キビ、ソバ等とは交差反応しないことが必要である。【００３０】
このようなプライマーペアとしては、例えば、(i)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：４に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(ii)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：４に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(iii)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：６に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(iv)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：６に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(v)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(vi)配列番号：３に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：８に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(vii)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：８に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、(viii)配列番号：５に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号：７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、及び、(ix)前記(i)〜(viii)のプライマーペアのそれぞれにおいて、各核酸が有する塩基配列の少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは８５％の連続した塩基配列を含む核酸のペアからなるプライマーペア等が挙げられる。これらのプライマーペアは配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を、コムギ以外の作物と交差性なく、特異的に増幅することができる。【００３１】
また、本発明に係る方法においては、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅された領域を検出するプローブは、増幅産物を定量的に検出できる限り特に限定されないが、配列番号９又は１０に記載の塩基配列からなるプローブを用いて検出することが好ましい。これらのプローブは、増幅産物、即ち配列番号：１１〜１８のいずれかに記載の塩基配列からなる領域の一部に高い特異性をもって結合するので、増幅産物を定量的に検出することが可能である。図１には、配列番号：９又は１０に記載の塩基配列からなるプローブが結合する領域も示されている。【００３２】
本発明で用いられる被検試料は、コムギを含む又は含む可能性のある食品素材及び加工食品であり、例えばコムギの生の種子、乾燥種子、小麦粉やミックス粉などの食品原料やその加工中間原料、パン類や麺類などの加工食品が含まれる。また、食品素材又は食品はヒトの食品のみならず、ペットフードや飼料を含む。さらに、コムギ以外の作物は、食品素材、食品原料として用いられる全ての作物を意味し、例えば上述した作物である。【００３３】
このような試料は、例えばそのまま、又は粉砕して核酸抽出に供してもよく、洗浄して乾燥させてから破砕して核酸抽出に供してもよい。被検試料から抽出して分析に用いる核酸は通常はＤＮＡである。ＤＮＡは公知の任意の方法によって抽出してもよいが、現在は多数のＤＮＡ抽出キットが市販されており、これらを用いて抽出することができる。例えばＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてKopellらの方法（Kopell, E. et al., Mitt. Gebiete Levensm, Hyg., 88, 164）に従って被検試料からＤＮＡを抽出する。抽出したＤＮＡは、吸光度の測定などにより濃度を求め、ＰＣＲに好適な濃度まで希釈して用いることが好ましい。【００３４】
本発明の方法において、ＰＣＲは、使用するプライマーやＤＮＡポリメラーゼを考慮して常法に従って行うことができる。その際に、ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ，ＭｇＣｌ２等の試薬は調製してもよいし、市販のＰＣＲキットを用いてもよい。ＰＣＲには、上記プライマーペアを一組又は二組を以上用いてもよい。また、ＰＣＲ条件は、例えば９５℃３０秒、６３℃３０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４０サイクル行い、最後に終了反応として７２℃７分間という条件が挙げられるが、用いるプライマーのＴｍや増幅すべき領域の長さ、鋳型ＤＮＡの濃度などを考慮して適宜変更することができる。【００３５】
増幅された核酸（ＰＣＲ産物）の検出は、特定のＤＮＡ断片を同定しうる任意の方法、具体的にはアガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイブリダイゼーション、免疫学的方法などを用いて実施することができる。一般的には、ＰＣＲ産物を電気泳動し、その泳動パターンにより確認するが、例えばエチジウムブロミドを含む０．８％のアガロースゲルによる電気泳動を行い、バンドを確認することによって検出することができる。【００３６】
本発明は、上述の検出又は定量方法で用いるプライマーペア、及びそれらのプライマーペアを含むキットを含む。プライマーは常法に従って製造することができる。また、キットはプライマーペアのほか、他の試薬、例えばｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ）、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、蒸留水等を包含してもよい。これらの試薬はキットの中で、それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、２種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。キット中のそれぞれの試薬濃度に特に制限はなく、本発明のＰＣＲを実施するについて可能な範囲であればよい。また、キットには、好適なＰＣＲ条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、プライマー試薬のみであってもよい。【００３７】
また、本発明は、ＧＭコムギの混入率を定量ＰＣＲ法によって測定する際に有用な、標準物質を提供する。この標準物質は、Ｎｏｎ-ＧＭコムギとＧＭコムギとが共通して有する内在性ＤＮＡと、１以上のＧＭコムギ特異的ＤＮＡとを、１つの複製可能なＤＮＡ上に連結したものである。  尚、上記部分配列としては、配列番号：１１〜１８のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡを用いることができる。【００３８】
本発明に係る標準物質は、例えば、内在性ＤＮＡとして、配列番号：２に記載の塩基配列またはその部分配列からなるＤＮＡと少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む複製可能なＤＮＡであってもよい。【００３９】
標準物質として用いられる複製可能なＤＮＡは、内在性ＤＮＡ及びＧＭコムギの系統特異的ＤＮＡを挿入できるものであれば特に限定されず、例えば、ｐＢＲ系ベクター（例；ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２８等）、ｐＵＣ系ベクター（ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８等）、λファージ系ベクター（λｇｔ１０、λｇｔ１１等）、これらに改変を加えた市販のベクター等を用いることができる。【００４０】
ＧＭコムギを検出する場合は、遺伝子組換えにより普通コムギゲノムに挿入された外来ＤＮＡ配列のみを増幅して検出するのではなく、外来ＤＮＡ配列の上流及び下流の内在性配列を含む領域を増幅する必要がある。他の作物にも、同一の外来ＤＮＡ配列を挿入してＧＭＯを作製する場合があるため、外来ＤＮＡ配列のみ検出すると、ＧＭコムギ由来なのか、他の作物の遺伝子組換え体なのかが判別できないからである。従って、ＧＭＯ系統特異的配列を検出するためのプライマーは、各系統のＧＭコムギに挿入された外来ＤＮＡ配列とその上流及び下流の内在性配列を含む領域を増幅できるプライマーである必要がある。かかるプライマーは、例えばダイズについて報告された上記Kopellらの方法、及びWurzらの方法（Wurz, A. et al.; 2nd Status report. BgVV, BgVV-Heft, 1/199797,118）、又はそれに準じた方法に従って、作製される。上記標準物質に挿入されるＧＭコムギの各系統に特異的な配列は、それらのプライマーで増幅できるＤＮＡ配列が選択される。【００４１】
標準物質に挿入するコムギ内在性ＤＮＡと、ＧＭコムギ特異的ＤＮＡとが決定されたら、普通コムギゲノム又はＧＭコムギゲノムを鋳型としたＰＣＲを行って、内在性ＤＮＡ及びＧＭコムギ特異的ＤＮＡをクローニングし、クローニングしたＤＮＡ断片と上記複製可能なＤＮＡのクローニングサイトとを同一の制限酵素で切断することにより、ＤＮＡ断片を複製可能なＤＮＡの切断された部位に連結することができる。制限酵素は、自体公知のものを適宜選択して使用することができ、例えば、EcoRI、SpeI、EcoRV、SmaI、SacI、NotI、HindIII、XhoI等が用いられる。【００４２】
こうして作製された標準物質を含む溶液について、２種以上の希釈系列を作り、それぞれについて定量的ＰＣＲを行うと、コムギ内在性ＤＮＡ配列、ＧＭＯ特異的ＤＮＡ配列の部分領域のそれぞれについて、検量線を求めることができる。さらに、本発明に係る標準物質は、定性ＰＣＲにおけるコムギ内在性ＤＮＡ配列又はＧＭＯ特異的ＤＮＡ配列のポジティブコントロールとしても利用することができる。【００４３】
本発明は、上述の標準物質を用いたポリメラーゼ連鎖反応により、被検試料中におけるＧＭコムギの混入率を決定する方法を包含する。該方法は、上述の標準物質を用いて、特定の配列の検量線を求める工程と、被検試料について、検量線を求めるときと同一の条件で定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行って、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域及びＧＭコムギ特異的ＤＮＡ配列の部分領域を増幅し、検量線を用いて、被検試料中に存在したコムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域、及びＧＭコムギ特異的ＤＮＡ配列の部分領域の分子数を求める工程と、を含む。【００４４】
被検試料におけるＧＭコムギの混入率を計算する場合は、まず、被検試料中のＧＭコムギ特異的ＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ａを求める。また、遺伝子組換えコムギの標準種子を用いた定量的ＰＣＲを行って求められる、ＧＭコムギの各系統に特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ｂを求める。そして、式１００×Ａ／Ｂを計算して、被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定する工程と、を行うことによって求めることができる。上記比Ｂは、非特許文献１において「内標比」と呼ばれるものであり、純粋なＧＭ系統毎の種子から抽出したＤＮＡ中の（組換え遺伝子）／（内在性遺伝子）の比率である。内標比は、各組換え系統種子中で一定の比率を示す。【００４５】
本発明に係るＧＭコムギ混入率の決定方法において行われる各ＰＣＲ工程は別々に実施することができるが、同時に実施してもよい。なお、各ＰＣＲ工程は、検量線を作成するために行ったＰＣＲと、略同一の速度で核酸の増幅反応が起こる条件で行うことが好ましい。かかる条件としては、例えば、検量線を作成するために行ったＰＣＲと温度及びサイクルを同一とする条件が挙げられる。また、ＧＭコムギの混入率の算出は、内在性ＤＮＡと組換えＤＮＡの量を別個に測定して、その測定結果から算出してもよいが、非特許文献１の方法に従ってリアルタイムＰＣＲ装置により増幅し、ＧＭコムギの混入率を算出することが可能である。尚、本発明において「組換えＤＮＡ」とは、人為的にコムギに導入した任意の外来性ＤＮＡであり、例えば外来性遺伝子をコードする領域、未転写もしくは未翻訳領域、リンカー領域、ベクター部分のＤＮＡを意味する。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されず、様々な実施形態が可能であり、本発明は本明細書及び図面に開示の思想に従ったものであるかぎり、すべての実施形態を包含することは理解されるべきである。【００４７】
なお、以下の実施例においては、次に示す試料、試薬及び装置を使用した。
（１）試料
コムギ（Triticum aestivum）は、次の品種の乾燥種子を用いた：Hank、Scarlet、Tara、YearaRojo、Finch、Lewjain、Rod、Wheatherford、Estica、 Buchanan、Finley、Garland、TAM107、Declo、Hatton、Morgan、Neely、Ramp、Amidon、Ernest、Mcneal、AC-Barrie、AC-Splender、CDC-Teal、Laura、ニシカゼ、ニシホナミ、チクゴイズミ、ツガルHDC、シロガネ、シラサギ、ビホロHDN、ホクシン、バンドウワ、キタHDI、農林61号、はつもち、もち乙女、関東107、白火。
デュラムコムギ（Triticum durum）は、次の品種の乾燥種子を用いた：AC Navigator種。
トウモロコシ（Zea mays）は、次の品種の乾燥種子を用いた：デントコーン。
ダイズ（Glycine max）は、次の乾燥種子を用いた：遺伝子組換えダイズ Roundup Ready Soy系統後代品種。
コメ（Oryza sativa）は、次の品種の乾燥種子を用いた：コシヒカリ種。
オオムギ（Hordeum vulgare）は、次の品種の乾燥種子を用いた：ベンケイ種。
オーツムギ（Avena sativa）は、次の品種の乾燥種子を用いた：市販品種。
ライムギ（Secale cereale）は、次の品種の乾燥種子を用いた：市販品種。
ナタネ（Brassica napus）は、次の品種の乾燥種子を用いた：canola種。
アワ（Setaria italica Beauvois）は、次の品種の乾燥種子を用いた：モチアワ種。
キビ（Panicum miliaceum Panicum）は、次の品種の乾燥種子を用いた：モチキビ種。
マイロ（Sorghum subglabrescens）は、次の品種の乾燥種子を用いた：市販品。
ソバ（Fagopyrum esculentum）は、次の品種の乾燥種子を用いた：在来品種。【００４８】
（２）試薬
（２−１）試料からのDNA抽出には以下の試薬を使用した。
ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）（試薬特級）（Sigma Chemical Co.）
QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit（QIAGEN GmbH）
QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN GmbH）
DNAの電気泳動には以下の試薬を使用した。
酢酸（試薬特級）（和光純薬：Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）
トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Tris）（試薬特級）（Sigma Chemical Co.）
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（試薬特級）（Sigma Chemical Co.）
アガロース粉末”LO3「TaKaRa」”（TaKaRa Shuzo Co.,Ltd.）
エチジウムブロミド（Sigma Chemical Co.）
ブロムフェノールブルー（Sigma Chemical Co.）
キシレンシアノール（Sigma Chemical Co.）
DNAマーカー”1kbラダー”（New England Biolabs Inc.）
DNAマーカー”100bpラダー”（New England Biolabs Inc.）【００４９】
（２−２）定性的PCRには以下の試薬を使用した。
DNAポリメラーゼ”AmpliTaq Gold”（Applied Biosystems）
×10 PCR バッファーII（Applied Biosystems）【００５０】
（２−３）プラスミド作製・精製には以下の試薬を使用した。
ＤＮＡポリメラーゼ”AmpliTaq Gold"（Applied Biosystems）
×10 PCR バッファーII（Applied Biosystems）
ＤＮＡポリメラーゼ”KOD”（TOYOBO Co.,Ltd.）
×10 PCR バッファーII（TOYOBO Co.,Ltd.）
TOPO TA Cloning Kit with TOP10F’ Cells（Invitrogen Co.）
酵母エキストラクト（Difco Laboratories）
トリプトン  ペプトン（Difco Laboratories）
NaCl（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）
アガー粉末（TAKARA BIO）
D[-]-α-Aminobenzylpenicillin(Ampicilin)Sodium Salt(Sigma Chemical Co.）
QIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN GmbH）
エタノール（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）
２−プロパノール（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）
トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Tris）（試薬特級）（Sigma Chemical Co.）
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（試薬特級）（Sigma Chemical Co.）
制限酵素”EcoRI”（TaKaRa Shuzo Co.,Ltd.）
制限酵素”SacI”（New England Biolabs Inc.）
制限酵素”XbaI”（New England Biolabs Inc.）
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase（Invitrogen）
フェノール（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）
クロロホルム（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）
イソアミルアルコール（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）【００５１】
（２−４）定量的PCRには、以下の試薬を使用した。
TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）【００５２】
（３）装置
（３−１）試料からのDNA抽出には以下の装置を使用した。
粉砕器”Multi Beads Shocker MB301”（Yasui Kikai Co.）【００５３】
（３−２）DNAの電気泳動には以下の装置を使用した。
電気泳動装置”Mupid 2”（Advance Co.,Ltd.）【００５４】
（３−３）定性的PCRには以下の装置を使用した。
サーマルサイクラー”PTC-200”（MJ Research Inc.）【００５５】
（３−４）定量的PCRには以下の装置を使用した。
定量的PCR装置”ABI PRISM 7700 Sequence Detector System”（Applied Biosystems)
尚、プライマー、及びプローブの合成はOperon社に委託した。【００５６】
［実施例１］プラスミドの構築
Ernest品種コムギ種子よりGenomic DNAを抽出し、このDNAを鋳型にPCRを行った。増幅対象は表１に示すとおり、コムギ内在性遺伝子候補2種類（PRP遺伝子及びWaxy遺伝子）と、仮想GMコムギ遺伝子としてRRS遺伝子について実施した。使用したPrimerを表２に示す。尚、RRS遺伝子とは、後述するように、ラウンドアップ耐性遺伝子である。【００５７】
【表１】
2007132760.tif 000002
【００５８】
【表２】
2007132760.tif 000003
次に、得られた増幅DNAを鋳型に制限酵素付加Primerを用い再度PCRを行った。
そして、得られた増幅DNAは制限酵素消化後、精製断片をpUC19ベクターにライゲーションし、これを大腸菌に形質転
換した。あるいはベクターpCR4にTAクローニングした。
得られたクローンは制限酵素マッピングにより挿入断片を確認後、シーケンシングにより全配列の確認を行った。【００５９】
TAクローニングした各クローンを制限酵素消化後、精製断片をpUC19ベクターにライゲーションし、これを大腸菌に形質転換した。
形質転換体よりプラスミドを抽出精製し、配列の確認を行った。【００６０】
以上の流れによりプラスミドを構築した。具体的には制限酵素付加プライマーを用い増幅したWaxyD1領域をXbaIで消化後、これを同じくXbaIで消化後脱リン酸化したpUC19にライゲーションし、pWIG01を構築した。【００６１】
PCR増幅したRRS遺伝子を一旦TA Cloningし、得られたプラスミドpRRSをEcoRI、SacIで消化し、RRS断片を精製した。同じくpWIG01をEcoRI、SacIで消化し、プラスミドを精製後、ここにRRS断片をライゲーションし、pWIG02を構築した。【００６２】
PCRにより増幅したPRP領域を一旦TA Cloningし、得られたプラスミドpPRPをEcoRIで消化し、PRP断片を精製した。同じくpWIG02をEcoRI、で消化し、脱リン酸化後、ここにPRP断片をライゲーションし、pWIG03を構築した。【００６３】
構築したプラスミドはシーケンシングを行い、挿入配列の確認を行った。確認された配列は全て目的配列と一致した。【００６４】
尚、実施例１〜３において用いた各手法を、以下に具体的に示す。
(1)  制限酵素消化
各制限酵素マニュアルに従い実施した。すなわち、各DNA溶液と酵素に添付の×10バッファー、蒸留水、制限酵素を混合し、通常37℃２時間反応した。
(2)  消化後のDNA断片精製
Agaroseゲル電気泳動で分離した。ゲルからの精製はQIAGEN社製キットを使用した。すなわち、目的DNAを含んだゲルを加熱融解し、DNAをシリカ膜に結合させた。シリカ膜を、エタノールを含む溶液等で洗浄した後、蒸留水で溶出した。
(3)  制限酵素消化プラスミドの脱リン酸化
制限酵素消化後脱塩処理したプラスミドをCIAP（GIBCO社製）と専用バッファーを混合
し37℃30分間反応した。反応後フェノール処理によりCIAPを失活せしめ、エタノール沈殿で脱リン酸化プラスミドを回収した。
(4)  DNAライゲーション
TAKARA社製DNA ligationキットVer.2を使用した。すなわち、目的DNAを混合し、キットの反応混合液(soln I)を等量加え、16℃で30分間静置することによりDNAをライゲーションした。
(5)  形質転換
TOYOBO社製Competent Cell E. coli DH5αを使用した。融解した10〜50μlコンピテントセルを氷上でDNAと30分間混合静置し、42℃で50秒間ヒートショック後、氷上に戻し、2分後37℃に暖めておいたSOC培地を450μl添加、37℃で1時間インキュベートした。この溶液をサークルグロー培地Amp+プレートに100μl/plate展開し、37℃で16時間培養した。
(6)  培養
プラスミド精製の目的での培養は培地サークルグローを用いて実施した。プラスミド産生の選択圧にはAmp耐性を利用し、終濃度100μg/mlのアンピシリンを用いた。培養は試験管振盪器で、37℃、14から16時間行った。
(7)  PCR
アプライドバイオシステムズ社製AmpliTaq Gold polymeraseを使用した。反応組成としては表３の組成を用いた。反応条件は表４のように実施した。【００６５】
【表３】
2007132760.tif 000004
【００６６】
【表４】
2007132760.tif 000005
(8)  TAクローニング
TAクローニングは、インビトロジェン社製TOPO TAクローニングシステムを用い、同社マニュアルに従い実施した。
(9)  DNAシーケンシング
DNAのシーケンシングは、ベックマンコールター社製CEQ8000を用い、同社マニュアルに従い実施した。キットとして同社DTCS Quick Start Master Mixを用いた。
(10)  Real-Time PCR  SYBR法
TAKARA社製キット（TAKARA  SYBR Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)  Code No.：
RR041A）を用いて行った。
1) Template DNA (Plasmid)を表５に従って希釈した（希釈にはColE1 5ng/μl溶液を用た）。
2) Unknown DNAは、10倍から2倍の希釈列で各4点調製した（希釈にはColE1 5ng/μl溶液を用いた）。
3) MasterMixは、表５に従って、Primer毎に調製した。
4) MasterMixとTemplateDNAを混合した。
5) 表６に示す条件で反応を開始した。【００６７】
【表５】
2007132760.tif 000006
【００６８】
【表６】
2007132760.tif 000007
(11)  Real-Time PCR  TaqMan法
TAKARA社製キット（TAKARA  Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)  Code No.：RR039
A）を用いて行った。
1) 各種Genomic DNA濃度を希釈せずにTemplateとした。
2) Master Mixは、表７に従ってPremix、ROX、Primer、Probeを混合して調製した。
3) Master Mix 16μl/wellとTemplate DNA 4μl/wellを混合した。
4) 表８に示す条件で反応を開始した。【００６９】
【表７】
2007132760.tif 000008
【００７０】
【表８】
2007132760.tif 000009
Template DNA (Plasmid)は表９に従って希釈した（希釈にはColE1 5ng/μl溶液を用い
た）。【００７１】
【表９】
2007132760.tif 000010
(12)  種子の粉砕  少量の場合
上述した粉砕器Multi Beads Shocker MB301を使用した。
1) 2mlチューブに種子を1粒入れ、金属コーンを入れふたをした。
2) 2000rpmで10秒間の粉砕を2回行った。
3) 粉砕された粉末から直接DNAを抽出した。
(13)  種子の粉砕  大量の場合
ミルを用いて行った。
1) ミルに種子を30g入れ、ふたをした。
2) 30秒間の粉砕を2回行った。
3) 粉砕された粉末を保管した。
(14)  ゲノムDNAの調製
QIAGEN社製キット（QIAGEN Plant Mini Kit）を用いて行った。操作はキットマニュアルに従い実施した。
1) 粉砕種子に400μlのAP1溶液、4μlのRNaseAを添加し、攪拌した。
2) 65℃で10分間インキュベートし、インキュベート中2、3回ミックスした。
3) 130μlのAP2を添加し、攪拌後10分間氷上で放置した。
4) 遠心分離（15000rpm＝20000g、５min、RT）を行った。
5) 上清をQIAshredderに全量アプライし、遠心分離（15000rpm、2min、RT）を行った。
6) デカントでパススルー上清を別容器に移し1.5容積（675μl）のAP3/E添加攪拌した。
7) 半量をSpinカラムにアプライし、遠心分離（10000rpm、1min、RT）を行った。
8) フロースルーを捨て、残量を同処理した。
9) 新しいチューブにカラムをおき、500μlのAWを添加し、遠心分離（10000rpm、1min、RT）を行った。
10) 同処理後、フロースルーを捨て遠心分離（15000rpm,2min、RT）
1.5mlの新しいチューブにカラムをおき50μlのAEを添加し、室温放置5分間後、遠心分離（10000rpm、1min、RT）を行った。【００７２】
以下、上述した工程を繰り返した。
(15)  DNAの定量
機器はGeneSpecを使用し、マニュアルに従って実施した。【００７３】
セルは5mm、希釈率１倍、対照はKit溶出液（AE）とした。
［実施例２］PCR増幅効率の確認
PRP、Waxyの各遺伝子のそれぞれ増幅領域について標準プラスミドpWIG03を鋳型にSYBR
法によりReal-Time PCRを実施した。その結果全ての遺伝子、全てのPCR領域で同一条件下において、鋳型濃度依存的な増幅が確認された。増幅産物の融解曲線を確認したところいずれの産物も高融点のメインピークを持ち、プライマーダイマーの形成も観察されなかった。増幅曲線と融解曲線を図２に示す。また、実施例２以降において使用したプライマー配列の一覧を表１０に示す。【００７４】
【表１０】
2007132760.tif 000011
［実施例３］PRP遺伝子中の増幅領域の検索
PRP遺伝子の内、コムギ品種により検出量の変動が無い領域の検索を行った。陽性対照
としてWaxy遺伝子を用い、Wx012増幅領域の検出量に比較して同等の検出が得られる領域を検索した。プライマーペアとして、表１０に示されるPRP01-FとPRP01-R、PRP03-FとPRP03-R、PRP03-FとPRP07-Rそれぞれを用い、コムギ種子より抽出したDNAを鋳型にSYBR法によりReal-Time PCRを実施した。【００７５】
結果、図３に示す。PRP03-FとPRP03-R、PRP03-FとPRP07-Rのプライマーペアを用いた場合は、Wx012とほぼ同程度の検出量が確認された。しかし、PRP01-FとPRP01-Rをプライマーに用いた場合は、Wx012のおおよそ3倍量検出された。【００７６】
この事からPRP遺伝子の上流領域（翻訳後のタンパク配列としてアミノ末端側）に相同な遺伝子がコムギDNAに存在し、当該上流領域は内在性DNAとして好ましくないことが確認された。
［実施例４］プローブの検索
実施例１から３までの検討により内在性遺伝子のPCR増幅領域としてPRP04-FからPRP06-Rまでの領域が好ましい事が確認された。そこで、この領域に対して各種プライマーペアに適合するプローブを設計した。プローブの設計はプライマー設計支援ソフト、Primer Express、もしくはPrimer3（The development of Primer3 and the Primer3 web site was funded by Howard Hughes Medical Institute and by the National Institutes of Health, National Human Genome Research Institute. under grants R01-HG00257 (to David C. Page) and P50-HG00098 (to Eric S. Lander).：http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）を使用した。設計したプローブ配列から蛍光標識プローブを合成した。蛍光標識は5’末端にFAMを、3’末端にTAMRAを標識した。このプローブを用い、標準プラスミドを鋳型にTaqMan法によるReal-Time PCRの条件設定を行った。最適な条件を見出した後、各種プライマー（表１０参照）、各種プローブの組合せによる比較を行った。その結果いずれの組合せにおいても良好な増幅が得られ、各同程度の検出効率であった。【００７７】
設計したプローブ配列を表１１に示す。また、各種プライマーを用い得られた結果を図４に示す。【００７８】
【表１１】
2007132760.tif 000012
［実施例５］Real-TimePCRの条件設定
実施例１におけるReal-TimePCR法に従い、実施例４記載のプローブを用い、プライマー濃度、プローブ濃度、PCR反応温度、時間についての各パラメーターを可変させ、最適条件を見出した。選択された条件を表１２及び１３に示す。【００７９】
【表１２】
2007132760.tif 000013
【００８０】
【表１３】
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［実施例６］コムギ品種における普遍性の確認
コムギ品種40種について、TaqMan法によるReal-Time PCRにより、その検出量の比較を行った。比較対照はプライマーWx012-F及びWx012-Rの増幅産物Wx012（配列番号：３１）とした。用いたプライマーはPRP03-FとPRP03-R、プローブはPRPTaq-1を用いた。40種類全てでプライマーPRP03-FとPRP03-Rによる増幅産物PRP03（配列番号：１５）は検出された。Wx012はデュラム種、もちコムギ種を除く全てで検出された。Wx012の検出された品種でPRP03と比較した結果、全ての品種においてほぼWx012：PRP03=1:1の比率であった。【００８１】
PRP03が検出された40種類のうち20種類のコムギ品種における検出例を図５に示す。図５中、はつもち、もち乙女はもちコムギ品種を示し、AC-Naviはデュラムコムギ品種AC Navigatorを示す。これらはいずれも検出された。
［実施例７］仮想GMコムギによる混入率推定試験
現時点においてGMコムギはMonsanto社などにより作出されているが、いずれも入手困難である。そこでGMコムギの混入率推定が、本発明により見出されたコムギ内在性遺伝子定量により可能であるか確認する目的で、仮想GMコムギを用いて実験を行った。【００８２】
Monsanto社が作出したGMコムギはラウンドアップ耐性遺伝子を付与したものであることから、同じくラウンドアップ耐性遺伝子を付与したGMOであるGMダイズを使用することとした。すなわち、GMダイズ種子を粉砕し、これとAC Barrie品種コムギ種子を粉砕したものを混合し、これを仮想GMコムギとした。両者の混合率は予備試験により内標比が1に近づくように検討し、GMダイズ：コムギ＝６：９４で混合した。この仮想GMコムギより抽出したDNAを鋳型に実施例５に示した条件の下、TaqManプローブによるReal-Time PCR法（プローブとしてPRP-Taq2、プライマーとして表１４に記載のものを用いた。表中、RRSはラウンドアップ耐性遺伝子を示す。）でラウンドアップ耐性遺伝子及び内在性遺伝子（PRP領域）の定量を行った。このとき増幅される配列を、配列番号：３２に示す。得られたRRS定量値をコムギ内在性遺伝子定量値で割った数値を内標比（1.0）とした。【００８３】
【表１４】
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この仮想GMコムギと別に粉砕したコムギ（YearaRojo品種）を任意に混合した標品からDNAを抽出し、このDNAを鋳型に、本発明の方法に従って、コムギ内在性遺伝子とラウンドアップ耐性遺伝子の定量を行った。その結果を利用して、仮想GMコムギの混入率を求めた結果を図６に示す。現実の配合率と、本発明の方法に従って計算により求めた混入率が高い相関性を示すことが確認された。即ち、得られた鋳型液量あたりのGMコムギ検出量（Copy数濃度：Copy/μl）をコムギ内在性遺伝子の鋳型液量あたりの検出量（Copy数濃度：Copy/μl）で除し、その商を内標比1.0で除した商を100倍した値をGM混入率とした。
［実施例８］特異性の確認試験
本発明による方法が、他の作物と交差性を有しないことを確認する目的で、特性試験を実施した。他の作物としてはオオムギ、オーツムギ、ライムギ、コメ、マイロ、ナタネ、トウモロコシ、ソバ、アワ、キビを用いた。これらの作物からDNAを抽出し、実施例５に示す方法により確定した条件でこれらDNAを鋳型にReal-Time PCRを行った。【００８４】
プライマーペアとしてはPRP03-FとPRP03-R、PRP03-FとPRP07-Rの2種類を、プローブはPRP-Taq2を用いた。【００８５】
結果を図７に示す。PRP03-FとPRP07-Rをプライマーペアに用いた場合、コムギではDNA1μgあたり140Copy検出されるのに対し、これら作物では0.2Copy以下であった。すなわち、これら作物の非特異的検出率は0.05％以下であり、コムギ検出における標準誤差をはるかに下回ることから、これらの作物がコムギ内在性遺伝子の定量に影響を及ぼさないことが確認された。PRP04-FとPRP06-Rをプライマーペアに用いた場合はオオムギでコムギに対し0.3%の検出が見られたものの、その他の作物は0.05%以下であった。従って、このプライマーペアを用いた場合も、コムギ検出における標準誤差をはるかに下回り、これらの作物がコムギ内在性遺伝子の定量に影響を及ぼさないことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】配列番号：２における、配列番号３〜８に記載のプライマーの結合領域を示す。
【図２】PRP、Waxyの各遺伝子のそれぞれ増幅領域について標準プラスミドpWIG03を鋳型にSYBR法によりReal-Time PCRを実施した際の増幅曲線と融解曲線を示す。
【図３】表１０に示されるPRP01-FとPRP01-R、PRP03-FとPRP03-R、PRP03-FとPRP07-Rそれぞれを用い、コムギ種子より抽出したDNAを鋳型にSYBR法によりReal-Time PCRを実施した結果を示す。
【図４】表１１に示す各種プライマーの組合せを用いたReal-Time PCRの検出効率を示す。
【図５】PRP03が検出された40種類のうち20種類のコムギ品種における検出例を示す。
【図６】この仮想GMコムギと別に粉砕したコムギ（YearaRojo品種）を任意に混合した標品からDNAを抽出し、このDNAを鋳型に、本発明の方法に従って、コムギ内在性遺伝子とラウンドアップ耐性遺伝子の定量を行った結果を利用して、仮想GMコムギの混入率を求めた結果を示す。
【図７】プライマーペアとしてはPRP03-FとPRP03-R、PRP03-FとPRP07-Rの2種類を、プローブはPRP-Taq2を用いて行った、他の作物との交差性の確認試験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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