【手続補正書】
【提出日】平成19年7月13日(2007.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
次に、外来性BCRP遺伝子を有する癌細胞について説明する。
癌細胞に導入すべきBCRP遺伝子は、DDBJのaccession number AB056867に登録されており、Doyle, L.A., Yang, W., Abruzzo, L. V., Krogmann, T., Gao, Y., Rishi, A.K. and Ross, D. D. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(26), 15665-15670(1998)などに記載されている。当該BCRP遺伝子としては、BCRPを発現し得るものであればよく、例えばレトロウイルスベクターに挿入したプラスミド、pHaBCRP、pHa-BCRP-IRES-DHFR等として用いることができる。より具体的には、Mycエピトープを付したBCRPをレトロウイルスベクターに挿入したプラスミドが特に好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
実施例１（内因性BCRPの発現抑制）
もともとBCRPを高発現しているMCF-7、A549、JEG-3細胞のBCRP発現量に及ぼすステロイドホルモン、女性ホルモンの効果をウエスタンブロットで調べた。活性炭処理してステロイドを除いたウシ胎児血清を７％添加したフェノールレッドフリーのDMEM培地にエストロン又はエストラジオールを添加して４日間培養し、BCRP発現量を抗BCRP抗体を用いたウエスタンブロットで調べた。各レーンには各々30μgの蛋白質を電気泳動した。
エストロン又はエストラジオールの存在下でMCF-7細胞での内因性BCRP発現量はコントロールの10〜20％に減少したが、他の細胞では変化は見られなかった（図１）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
（２）BCRP発現プラスミドの作成
次に、このBCRP cDNAにMycエピトープを付けてレトロウイルスベクターに挿入するために、末端の修飾を目的とした２度目のPCRを行った。Mycエピトープタグを付加するためのPCRでは、上記のPCR反応で得られたヒトBCRP cDNAを鋳型とし、Mycエピトープタグを含む５’側のプライマー5Myc-204Ｓ（CCC CGC GGC ATG GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG TCT TCC AGT AAT GTC GAA GTT TTT ATC CCA GTG TC）（配列番号５）及び３’側のプライマー8AS（CGC CTC GTG GAT GGC AAG GGA ACA GAA AAC AAC A）（配列番号６）の２本のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。PCRはClontech社のAdvantage cDNA PCR kitを用いて、94℃で１分の反応を１回行った後、94℃で30秒、68℃で３分の反応を20回繰り返し、最後に94℃で30秒、68℃で15分の反応を１回行い、約2200bpの増幅されたcDNAを得た。増幅されたcDNAをサブクローニングして塩基配列を決定し、PCRによる変異が起きていないことを確認した。HAエピトープタグを付加するためのPCRでは、上記のPCR反応で得られたヒトBCRP cDNAを鋳型とし、HAエピトープタグを含む５’側のプライマー5HA-204S（CCC CGC GGC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT ATG TCT TCC AGT AAT GTC GAA GTT TTT ATC CCA GTG TC）（配列番号７）及び３’側のプライマー8AS（CGC CTC GTG GAT GGC AAG GGA ACA GAA AAC AAC A）（配列番号６）の２本のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。PCRはClontech社のAdvantage cDNA PCRキットを用いて、94℃で１分の反応を１回行った後、94℃で30秒、68℃で３分の反応を20回繰り返し、最後に94℃で30秒、68℃で15分の反応を1回行い、約2200bpの増幅されたcDNAを得た。増幅されたcDNAをサブクローニングして塩基配列を決定し、PCRによる変異が起きていないことを確認した。
これらのcDNAの両末端をSstIIとXhoIの２種の制限酵素で切断後、SstIIとXhoIで切断したpHaプラスミドベクターとT4 DNAリガーゼを用いてライゲーションした。このライゲーション反応液をE.coli OH5αに導入し、pHaプラスミドベクターのSstIIサイトとXhoIサイトの間にBCRP cDNAが挿入されたクローンpHaMycBCRP及びpHaHABCRPを得た。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
（４）MCF-7／MycBCRP細胞の作成
MycBCRPレトロウイルス液をヒト乳癌MCF-7細胞の培養液に加えて遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を20ng／mLのSN-38（7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン：塩酸イリノテカンの活性体）で選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をMCF-7／MycBCRPと名付けた。MCF-7細胞及びMCF-7／MycBCRP細胞は７％のウシ胎児血清を添加したDMEM培地で培養した。MCF-7／MycBCRP細胞にBCRP蛋白が発現していることは、抗Myc抗体を用いたウエスタンブロットにて確認した（図２）。各レーンには各々20μgの蛋白質を電気泳動した。MCF-7細胞はヒトの乳癌細胞であるが、もともと女性ホルモン受容体を発現していること、培養が容易であること、ミトキサントロン、塩酸イリノテカンなどのBCRPによって輸送される抗癌剤に感受性を示すことから、BCRP遺伝子導入細胞の親株として適している。また、MCF-7細胞及びMCF-7／MycBCRP細胞を免疫不全マウスに移植してBCRP阻害剤などの動物実験が可能である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
（５）T-47D／MycBCRP細胞の作成
MycBCRPレトロウイルス液をヒト乳癌T-47D細胞の培養液に加えて遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を10ng／mLのSN-38で選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をT-47D／MycBCRP細胞と名付けた。T-47D細胞及びT-47D／MycBCRP細胞は７％のウシ胎児血清を添加したDMEM培地で培養した。T-47D／MycBCRP細胞にBCRP蛋白が発現していることは、抗BCRP抗体を用いたウエスタンブロットにて確認した（図２）。T-47D細胞はヒトの乳癌細胞であるが、もともとBCRPを発現していないこと、女性ホルモン受容体を発現していること、培養が容易であること、ミトキサントロン、塩酸イリノテカンなどのBCRPによって輸送される抗癌剤に感受性を示すことから、BCRP遺伝子導入細胞の親株として適している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
（３）MDR1レトロウイルスの作成
本発明に用いた野性型MDR1発現レトロウイルスHaMDRのレトロウイルス液は、pHaMDRプラスミドをマウスのamphotropic retrovirus packaging cell lineであるPA317細胞にリン酸カルシウム法を用いて導入したのちに35ng/mlのビンクリスチンで選択し、さらに得られたビンクリスチン耐性細胞を限界希釈法でクローニングすることによって得られたレトロウイルス産生細胞3P26の培養上清を用いた。3P26細胞については、Suzuki,M., Sigimoto,Y., Tsukahara,S., Okochi,E., Gottesman.M.M., and Tsuruo,T. Retroviral co-expression of two different types of drug-resistant genes for the chemoprotection of normal cells from combinaton chemotherapy., Clin.Cancer Res.,3: 947-954(1997)に記載されている。
3P26細胞の培養上清を集めて、これを0.45マイクロメーターのフィルターでろ過してレトロウイルス液とした。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
（４）MCF-7／MDR1細胞の作成
HaMDRレトロウイルス液をヒト乳癌細胞MCF-7の培養液に加えることにより遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を６ng/mlのビンクリスチンで選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をMCF-7/MDR1と名付けた。