【手続補正書】
【提出日】令和1年6月6日(2019.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】ウォールナットオリゴペプチド粉、その調製方法と使用
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド含有量が80wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットオリゴペプチドが95%以上である高純度、低分子量を有するウォールナットオリゴペプチド製品に関する。さらに、本発明はウォールナットタンパク質を調製し、触媒酵素分解を行うことによりオリゴペプチド粉を形成させる調製方法にも関する。当該ペプチド粉は薬物、食品、保健品または化粧品に用いられる。本願は中国特許出願CN201610043952.0に基づく優先権を主張し、当該中国特許出願の内容のすべてを参考として本願に援用する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
ウォールナット（Juglans regia L）は、胡桃とも呼ばれ、有名な4種ナットの一つとして、高い栄養価値や薬用価値を有する。中国の古い医学書類には、明確に記載されている。李時珍「本草綱目」によると、「補気養血、潤燥化痰、益命門、利三焦、温肺潤腸。治虚寒喘咳、腰脚重疼，心腹疝痛，血痢腸風，散腫毒」と記載され、宋の劉翰の「開寶本草」において、「胡桃（すなわちウォールナット）味甘、平、無毒。食べると肥健し、潤肌黒髮、実を黒く焼き、未斷煙時に松脂と混合し、研傅瘰癧(るいれき)瘡」と記載されている。唐のMeng Shenの「食療本草」によると，ウォールナット実が「通經脈、黒鬚髮、常に食べると肌潤い」と記載されている。崔禹錫の「食經」には、「多く食べると小便に利し、五痔も去る」と記載され、「醫林纂要」により“補腎、潤命門、固精，潤大腸、通熱秘、止寒瀉虚瀉」と評価された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の目的は下記の発明により達成される。
ウォールナットオリゴペプチド粉であって、GB/T 22492-2008、付録Aと付録Bに記載された検出方法により得られたペプチド含有量が80wt%以上であり、そのうち95%以上のウォールナットペプチドは、分子量が1500Dalton未満であり、下記の分子量分布を有し、
【数１】
2019506451.tif 000001
好ましくは、ペプチド含有量が81wt%以上であり、97％以上のオリゴペプチドが1500Dalton未満の分子量を有し、より好ましくは、ペプチド含有量が81.3wt%以上であり、96％以上のオリゴペプチドが1500Dalton未満の分子量を有し、さらに好ましくは、ペプチド含有量が85wt%以上であり、97％以上のオリゴペプチドが1500Dalton未満の分子量を有し、最も好ましくは、ペプチド含有量が85wt%以上であり、96％以上のオリゴペプチドが1500Dalton未満の分子量を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
前記ウォールナットオリゴペプチド粉は下記の方法により調製されるものである。
（1）ウォールナット粕の前処理
ウォールナットのシェルを除去し、コールドプレスで脱油し、脱脂されたウォールナット粕を得る。
（2）向流抽出法によるタンパク質抽出
一定量の脱脂されたウォールナット粕（Aで表記される）と水とを質量比1:5~1:15で混合し、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出する。抽出終了後、濾過し、残渣を2回抽出し、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Bで表記される）、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出する。Bの一回目の抽出が終了した後、濾液を一旦置き、残渣を二回目の抽出に供する。Aの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Cで表記される）、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出する。Bの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を、Cの一回目抽出後の残渣に注ぎ、1〜2時間抽出し、Cの一回目抽出後の濾液を一旦置く。Cの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を一旦置く。最後に、上記置かれた各濾液を合わせ、pHを3〜5に調製して0.5〜2時間静置し、上澄み液を捨てる。最後に、沈殿物に体積比1:10~1:20で水を注ぎ、均一に攪拌する。
（3）タンパクの酵素分解
前記ウォールナットタンパク液を40〜55℃まで加熱し、pHを中性とし、ウォールナット粕の質量の0.5〜2％の生物酵素を添加し、攪拌しながら酵素分解を3〜6時間行い、沸騰まで加熱し、30分間不活性化させ、遠心分離し、上澄液としてタンパク質酵素分解液を得る。
（4）分離精製
タンパク質酵素分解液を細孔径が0.1〜0.5μmの精密濾過膜で濾過し、得られた濾液を2000〜20000 Daltonの限外濾過膜で処理した後、分画液を50〜80℃で固体含有量3〜5wt%に濃縮し、入口温度140〜160℃且つ出口温度55〜65℃の噴霧乾燥を行い、高純度、低分子量を有する淡黄色のウォールナットペプチド粉を得る。収率は20〜30wt%であり得る。
（5）ペプチド含有量と分子量分布の測定
GB/T 22492-2008、付録Aと付録Bに記載された方法を適用したところ、ペプチド含有量が80wt%以上であり、そのうち95%のウォールナットペプチドが、1500Dalton未満の分子量を有する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明はウォールナットオリゴペプチド粉と、薬物、食品、保健品又は化粧品において許容される助剤とを含む組成物を提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
従来技術によれば、前記組成物を任意な剤型、例えば、裸錠、フィルムコーティング錠、糖衣錠、腸衣錠、分散錠、カプセル、顆粒剤、経口溶液、経口懸濁液、又は液体、エマルション、クリーム、粉、塊などの化粧品の剤型に調製できる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
従来の技術に比べて、本発明には以下のメリットがある。
（1）本発明において、ウォールナットのコールドプレスにより脱脂されたウォールナット粕を調製する。本発明者らは、この点について試験を行った。熱間プレスに比べて、コールドプレス後、タンパク質の抽出率は5wt%程度、含有量は20wt%程度向上する。
（2）本発明において、高効率向流抽出法でウォールナットタンパク質を抽出する。一般のアルカリ抽出酸沈殿の方法に比べて、タンパク質の抽出率は10％以上増加するとともに、水の使用量が低減され、生産コストも低減される。
（3）本発明において、タンパクを乾燥することなく、タンパク複性溶液のみを用いて酵素分解を行う。このようにして、タンパク質が乾燥する際の損失を減少するだけではなく、プロセスも簡単にする。
（4）本発明に用いられた生物酵素は含有量、分子量、収率、活性の上で保証を与え、酵素分解プロセスは安定し、二種の酵素はいずれも、入手源が広くかつコストが低い食用酵素であり、酵素分解を行う際の添加量はウォールナット粕の質量の0.5〜2％のみである。
（5）本発明は精密濾過膜で濾過し、酵素分解液中の不溶物を一応除去してから2000〜20000Daltonの限外濾過膜で高分子のタンパクを除去する。
（6）本発明は冷凍乾燥や真空乾燥の代わりに噴霧乾燥を用いて製品を調製する。よって、乾燥時間を節約するだけではなく、製品のプラスミドも均一である。
（7）本発明において、GB/T 22492-2008、付録Aの方法によりポリペプチドの分子量分布を測定し、付録Bにより酸可溶性のタンパクと遊離アミノ酸を測定し、両方の差がペプチド含有量である。当該分子量とペプチド含有量の測定方法は高く認識されている。
【数２】
2019506451.tif 000002
（8）本発明で測定されたペプチド含有量は80wt％以上であり、そのうち95％以上のウォールナットペプチドは、1500Dalton未満の分子量を有し、高純度、低分子量のオリゴペプチドである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
【図１】調製実施例1におけるウォールナットオリゴペプチドの液相クロマトグラムである。
【図２】調製実施例2におけるウォールナットオリゴペプチドの液相クロマトグラムである。
【図３】ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュマクロファージ抑制へ改善作用図である。
【図４】ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュマクロファージの食作用への促進作用図である。
【図５】ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュ中枢神経への影響の典型図である。
【図６】ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュの胎児神経突起生長への促進作用図である。
【図７】ウォールナットオリゴペプチドによりヒト野生型タウ蛋白のゼブラフィッシュ胎児神経細胞に対する毒性を低減する作用図である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
調製実施例1
コールドプレスにより脱脂したウォールナット粕（Aで表記される）100kgと水とを質量比1：10で混合し、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。抽出終了後、濾過し、残渣を2回抽出し、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Bで表記される）、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。Bの一回目の抽出が終了した後、濾液を一旦置き、残渣を二回目の抽出に供した。Aの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Cで表記される）、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。Bの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液をCの一回目抽出後の残渣に注ぎ、2時間抽出し、Cの一回目抽出後の濾液を一旦置いた。Cの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を一旦置いた。最後に、上記置かれた各濾液を合わせ、pHを5に調整して6時間静置し、上澄み液を捨てた。最後に、沈殿物に体積比1:10で水を注ぎ、均一に攪拌した。上記ウォールナットタンパク液を45℃まで加熱し、pHを中性とし、中性プロティナーゼ（酵素活性30万u/g）1kgを添加し、攪拌しながら酵素分解を6時間行った後、沸騰まで加熱し、30分間不活性化させ、遠心分離し、上澄み液としてタンパク質酵素分解液が得られた。このタンパク質酵素分解液を細孔径0.1μmの精密濾過膜で濾過し、透過液を5000Daltonの限外濾過膜で処理した後、透過液を80℃で固体含有量3.4wt%に濃縮し、入口温度140℃且つ出口温度55〜65℃の噴霧乾燥を行い、高純度と低分子量を有する淡黄色のウォールナットペプチド粉を得た。収率は21wt%であった。GB/T 22492-2008付録Aと付録Bに記載された検出方法により測定したところ、ペプチド含有量が81wt%であり、そのうち97%が1500Dalton未満の分子量を有することが分かった。分子量分布は前記のとおりであり、ペプチド含有量の結果は下表に示されている。
【数３】
2019506451.tif 000003
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
調製実施例2
コールドプレスにより脱脂したウォールナット粕（Aで表記される）100kgと水とを質量比1：10で混合し、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。抽出終了後、濾過し、残渣を2回抽出し、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Bで表記される）、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。Bの一回目の抽出の後、濾液を一旦置き、残渣を二回目の抽出に供した。Aの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Cで表記される）、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。Bの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液をCの一回目抽出後の残渣に注き、2時間抽出し、Cの一回目抽出後の濾液を一旦置いた。Cの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を一旦置いた。最後に、上記置かれた各濾液を合わせて、pHを5に調整して6時間静置して、上澄み液を捨てた。最後に、沈殿物に体積比1:10で水を注ぎ、均一に攪拌した。上記ウォールナットタンパク液を45℃まで加熱し、pHを中性とし、中性プロティナーゼとパパインとの複合酵素（中性プロティナーゼとパパインとの質量比が1：1であり、中性プロティナーゼの酵素活性は30万u/gであり、パパインの酵素活性は50万u/gである）1kgを添加し、攪拌しながら酵素分解を6時間行った後、沸騰まで加熱し30分間不活性化させ、遠心分離し、上澄み液としてタンパク質酵素分解液が得られた。当該タンパク質酵素分解液を細孔径が0.1μmである精密濾過膜で濾過し、透過液を5000Daltonの限外濾過膜で処理した後、透過液を80℃で固体含有量4.1wt%に濃縮し、入口温度140℃且つ出口温度55〜65℃の噴霧乾燥を行い、高純度と低分子量を有する淡黄色のウォールナットペプチド粉を得た。収率は21wt%であった。GB/T 22492-2008、付録Aと付録Bに記載された方法を適用したところ、ペプチド含有量が81.3wt%であり、そのうち96%が1500Dalton未満の分子量を有することが分かった。分子量分布は前記のとおりであり、中性プロティナーゼとパパインとの複合酵素による酵素分解後のペプチド含有量の結果は下表に示されている。
【数４】
2019506451.tif 000004
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
調製実施例3  組成物の調製
薬物または食品において許容される助剤は、米国薬品・食品管理機関に認可された、人類又は動物に用いられる、任意な補助剤、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料/着色剤、香味強化剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、乳化剤など、薬物組成物に対する副作用がない様々な担体を含むが、これらに限られない。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
当業者は従来技術における任意な既知の方法及び従来技術における既知の任意な剤型に基づいて、本発明のウォールナットオリゴペプチド粉と上記助剤を容易に混合することができる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
生物活性実施例1
1．DPPHラジカルの除去実験
1.1  DPPHエタノール溶液の調製
DPPH4mgを正確に秤量し、100mLの褐色メスフラスコに入れ、エタノール50mLを加え、超音波で30s処理し、エタノールで目盛りまで希釈し、均一になるまで振って一旦置いた。当該溶液は調製直後に新たに使用しなければならない。
1.2  サンプル溶液の調製
ウォールナットオリゴペプチド粉10mgを正確に秤量し、50mLの褐色メスフラスコに入れ、エタノール30mLを加え、超音波で5分処理し、エタノールで目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
1.3  操作手順
サンプル溶液2mLとDPPH溶液2mLとを正確に取って均一に混合し、サンプル溶液2mLとエタノール2mLとを正確に取って均一に混合し、DPPH溶液2mLとエタノール2mLとを正確に取って均一に混合し、室温で30分置き、515nm波長において吸光度を測定し、下記の式によりラジカルの除去率を算出した。
IR%=[1-(Ai-Aj)/A0]*100%
式中、Aiはサンプル溶液とDPPHとの混合物の吸光度を示し、Ajはサンプル溶液と溶媒との混合物の吸光度を示し、A0はDPPHと溶媒との混合物の吸光度を示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
2．ABTS+ラジカルの除去実験
2.1  PBS緩衝液の調製
塩化ナトリウム8gと、塩化カリウム0.2gと、リン酸二水素カリウム0.24gと、リン酸水素二ナトリウム十二水和物3.62gとを秤量し、それらを1000mLのビーカーに置き、蒸留水800mLを加え、攪拌しながら溶解させ、塩酸または水酸化ナトリウムでpHを7.4とし、1000mLのメスフラスコに移し、蒸留水を加えて目盛りまで希釈し、均一になるまで振って、一旦置いた。
2.2  ABTS+貯蔵溶液の調製
ABTS+78mg程度を正確に秤量し、20mLの褐色メスフラスコに入れ、蒸留水15mLを加え、超音波で5分処理し、蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振った。過硫酸カリウム76mg程度を正確に秤量し、2mLの褐色メスフラスコに入れ、蒸留水1mLを加え、超音波で溶解させ、蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振った。過硫酸カリウム溶液352μLをABTS溶液に加え、均一になるまで振って一晩静置した。
2.3  ABTS+標準溶液の調製
貯蔵溶液1mLを正確に取って65mL程度のPBS緩衝液を加え、均一になるまで振った。
2.4  サンプル溶液の調製
ウォールナットオリゴペプチド粉20mgを正確に秤量し、20mLの褐色メスフラスコに置き、PBS緩衝液15mLを加え、超音波で5分処理し、PBS緩衝液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
2.5  操作手順
サンプル溶液0.5mLとABTS標準溶液5mLとを正確に取って均一に混合し、サンプル溶液0.5mLとPBS緩衝液5mLとを正確に取って均一に混合し、ABTS標準溶液5mLとPBS緩衝液0.5mLとを正確に取って均一に混合し、直ちに734nmにおいて吸光度を測定し、下記の公式によりラジカルの除去率を算出した。
IR%=[1-(Ai-Aj)/A0]*100%
式中、Aiはサンプル溶液とABTSとの混合物の吸光度を示し、Ajはサンプル溶液と溶媒との混合物の吸光度を示し、A0はABTSと溶媒との混合物の吸光度を示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
3．SRSAスーパーオキシドアニオンラジカルの除去実験
3.1  0.1moL/L PBS緩衝液（pH7.4）の調製
塩化ナトリウム80gと、塩化カリウム2gと、リン酸二水素カリウム2.4gと、リン酸水素二カリウム三水和物23.1gとを秤量し、1000mLのビーカーに置き、蒸留水600mLを加え、攪拌しながら溶解させ、塩酸または水酸化ナトリウムでpHを7.2とし、1000mLのメスフラスコに移し、蒸留水を加えて目盛りまで希釈し、均一になるまで振って一旦置いた。
3.2  150μmoL/L NBT溶液の調製
NBT 12.5mgを正確に秤量し、100mLの褐色メスフラスコに置き、蒸留水を加え、超音波で溶解させ、かつ蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
3.3  60μmoL/L PMS溶液の調製
PMS 18.8mgを正確に秤量し、1000mLのメスフラスコに置き、蒸留水を加え、超音波で溶解させ、蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
3.4  468μmoL/L NADH溶液の調製
NADH 33.9mgを正確に秤量し、100mLのメスフラスコに置き、蒸留水を加え、超音波で溶解させ、蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
3.5  サンプル溶液の調製
1mg/mLのウォールナットオリゴペプチド粉を調製し、測定に供した。
3.6  標準液の調製
0.1moL/L PBS緩衝液（pH7.4）1mLを取ってメスフラスコに入れ、150μmoL/L NBT溶液を1mL、468μmoL/L NADHを2mL、及び60μmoL/L PMS溶液を1mL加え、均一に攪拌し、25℃で5分反応させ、560nmにおいて吸光度を測定した。
3.7 操作手順
サンプル溶液0.5mLと上記標準溶液5mLとを正確に取って均一に混合し、サンプル溶液0.5mLと蒸留水5mLとを正確に取って均一にし、前記標準溶液5mLと0.5mL蒸留水とを正確に取って均一に混合し、直ちに560nmにおいて吸光度を測定し、下記の公式によりラジカルの除去率を算出した。
IR%=[1-(Ai-Aj)/A0]*100%
式中、Aiはサンプル溶液とSRSAとの混合物の吸光度を示し、Ajはサンプル溶液と溶媒との混合物の吸光度を示し、A0はSRSAと溶媒との混合物の吸光度を示す。
調製実施例1における中性プロティナーゼによる酵素分解製品濃度が100μg/mLとなるようにそれぞれ調製し、ビタミンCを陽性対照（濃度が100μg/mLである）とし、テスト結果は表1に示される。
【表１】
2019506451.tif 000005
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
表1から分かるように、本発明の方法により調製されたウォールナットオリゴペプチド粉はDPPHとABTSラジカルに対して強い除去活性及びスーパーオキシドアニオンに対して中等強度の除去活性を有する。したがって、抗酸化活性はより良好である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
生物活性実施例2
PC12  神経細胞保護モデル
これは神経細胞の生理、病理及び薬理を研究する好適なモデルであり、パーキンソン病と神経疲労の研究に最も使用される体外薬物選別モデルでもある。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
4  薬物の過酸化水素により損傷されるPC12細胞に対する保護作用の調べ（細胞生長を促進するために薬物が細胞中のラジカルを除去できるか否かを測定する）
A   空白群（1％血清のDMEM）
B   モデル群（1%血清DMEM培地で6時間培養してからH2O2を加えて最終濃度を100μMとし、12時間刺激した）
C  陽性薬物群（NAC）
一定の濃度の陽性薬物NACを含む1%血清DMEMを加えて6時間培養してからH2O2100μMを加えて12時間刺激した。
D  投与群
各濃度勾配のウォールナットオリゴペプチドの1％血清のDMEMを加えて6時間培養してからH2O2100μMを加えて12時間刺激した。
前記各群を同じ条件で培養してから後続実験を行った。96ウェルプレート中でMMT法により細胞生存率を測定した。測定結果は表3に示される。
【表３】
2019506451.tif 000006
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
表2から分かるように、本発明で調製されたウォールナットオリゴペプチド粉はPC12細胞の増殖活性を低減することなく、濃度の向上に伴って、PC12細胞数が著しく増加した。表3から分かるように、モデル群の細胞生存率は、H2O2の刺激の後57.2%である。陽性対照薬NAC80μg/mLを加えて培養した後、細胞生存率は88.0%まで高められ、著しい保護作用を達成した。ウォールナットオリゴペプチドを加えて培養した後、細胞生存率はペプチド粉の濃度向上に伴って高められ、濃度依存性を示し、著しい保護作用が現れた。濃度が500μg/mLである場合、細胞生存率は72.0%であり、モデル群に比べて細胞生存率は30％高められる。これによって、当該ペプチド粉はニューロン細胞に対して強い保護作用を有するため、パーキンソン病とアルツハイマー病、同様な疾病の予防又は治療に用いられ、脳疲労を緩和する薬品又は保健食品にも用いられる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
表4から分かるように、正常対照群におけるゼブラフィッシュマクロファージ数は平均で27個である。モデル対照群（15個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージ抑制モデルを成功に構築すると証明する。陽性薬物であるベルバミンの濃度が1.9μg/mLである場合、ゼブラフィッシュマクロファージ数は平均で20個であり、モデル対照群（15個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージ抑制への改善作用は41.67％である。ベルバミンの濃度が1.9μg/mLである場合、ゼブラフィッシュマクロファージ抑制に対して著しい改善作用があることが証明された。ウォールナットオリゴペプチド粉の濃度は500μg/mLである場合、ゼブラフィッシュマクロファージ数は平均で25個であり、モデル対照群（15個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージ抑制への改善作用は83.33％であり、これは、本発明に調製されたウォールナットオリゴペプチド粉はゼブラフィッシュマクロファージ抑制に対して著しい改善作用があることを証明した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
表5から分かるように、陽性薬物であるピドチモドの濃度が200μg/mLである場合、墨汁を食したマクロファージ数は平均で3.5個である。モデル対照群（1.5個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージの食作用に対する促進作用は2.3倍であった。ピドチモドの濃度が200μg/mLである場合、ゼブラフィッシュマクロファージの食作用に対して著しい促進作用があることが証明された。ウォールナットオリゴペプチドが2000μg/mLである場合、墨汁を食したマクロファージの数は平均で5.1個である。モデル対照群（1.5個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージの食作用に対する促進作用は3.4倍であった。これは、ウォールナットオリゴペプチド粉はゼブラフィッシュマクロファージの食作用に対して著しい促進作用があることが証明された。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
表6から分かるように、モデル対照群では、ゼブラフィッシュの中枢神経におけるアポトーシス細胞の蛍光強度（565783画素）を正常対照群（161976画素）と比べて、モデルを成功に構築すると見え得る。陽性対照薬GSHの濃度が154μg/mLである群において、ゼブラフィッシュの中枢神経におけるアポトーシス細胞の蛍光強度は193900画素である。モデル対照群に比べて、ゼブラフィッシュ中枢神経に対する保護作用は92％であり、GSHはゼブラフィッシュ中枢神経に対して著しい保護作用があると証明された。オリゴペプチドの濃度がそれぞれ222μg/mLと667μg/mLである群において、ゼブラフィッシュの中枢神経におけるアポトーシス細胞の蛍光強度はそれぞれ395025画素と451259画素であり、中枢神経に対する保護作用はそれぞれ42％と28％であった。モデル対照群に比べて、ウォールナットオリゴペプチドはゼブラフィッシュの中枢神経に対して著しい保護作用があると証明した。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
生物活性実施例6
ウォールナットオリゴペプチドによるAβ1-42アミロイド凝集への抑制作用
DMSOでAβ1−42 アミロイドを2.5mg/mLに調合し、ウォールナットオリゴペプチドを適切な濃度に希釈した。その後、Aβ1−42アミロイド液（1μL）とウォールナットオリゴペプチド溶液（9μL）とを混合し、Aβ1−42アミロイドの最終濃度を0.25mg/mL、ウォールナットオリゴペプチの最終濃度をそれぞれ10μg/mL、100μg/mLとした。37℃で混合液を30分反応させた後、Thioflavin T 標準液200μLを加えて十分に混合し、200μLを取って、底が透明である黒い96ウェルプレートに置き、Aβ1−42アミロイド液の重合度合いを決定するためにプレートの底からThT蛍光強度（Ex440/Em482）を測定した。陰性対照群には薬物を加えない。
【表９】
2019506451.tif 000007
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
表9から分かるように、ウォールナットオリゴペプチドの濃度が10μg/mLである場合には、Aβ1−42 アミロイド凝集に対する抑制作用が著しくない。濃度が200μg/mLである場合には、Aβ1−42 アミロイド凝集に対して一定の抑制作用がある。これにより、ウォールナットオリゴペプチドは脳神経に対して保護作用を有し、記憶力を改善する潜在的な効果を有することが結論付けられる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
表10から分かるように、ウォールナットオリゴペプチドはIL-10の含有量を著しく低減させ、IL-17Aの含有量を高めることができた。これによって、ウォールナットオリゴペプチドは炎症因子を調節し、生体の免疫力を上げることができることが見え得る。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
生物活性実施例8
1 ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュ胎児神経突起の成長への促進作用
神経特異性HuCプロモーターを利用し、緑色蛍光融合タンパク（GFP）を検出シグナルとして使用した。まず、プラスミッドpHuC-GFPの緑色蛍光融合タンパクを1-細胞期に発育したゼブラフィッシュ胎児細胞に注射した。DMSOでウォールナットオリゴペプチド粉（調製実施例1）を溶解させ、水で一定の濃度まで希釈した。8時間後、それとDMSO（対照陰性）をゼブラフィッシュ胚細胞に注射し、40時間後、ゼブラフィッシュの神経突起の成長数に基づいて、ゼブラフィッシュ胎児の神経突起の成長に対するサンプルの促進作用を決定した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
実験の結果から分かるように、対照陰性DMSO群では、ゼブラフィッシュ胎児神経突起の成長への促進率は23％のみであるのに対して、濃度が1mg／mLのウォールナットオリゴペプチドを注射した後、神経突起の成長への促進率は51%に達した。これは、ウォールナットオリゴペプチドはゼブラフィッシュ胎児神経突起の成長を著しく促進できることは著しいものである。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
2 ウォールナットオリゴペプチドによるヒト野生型タウ蛋白のゼブラフィッシュ胎児内神経細胞に対する毒性作用への低減
神経組織特異性Hucプロモーターを利用し、hTau緑色蛍光融合タンパク（GFP）を用いて、野生型ヒトタウ蛋白で誘導するゼブラフィッシュ胎児内神経細胞のアポトーシスの状況を測定した。表現作成物は、1-細胞期に発育したゼブラフィッシュ胎児細胞に注射された。DMSOでウォールナットオリゴペプチド粉（調製実施例1）を溶解させ、水で一定の濃度まで希釈した。8時間後、それとDMSO（対照陰性）をゼブラフィッシュ胎児細胞に注射した。蛍光顕微鏡を用いてGFPでマークされた24hpfと48hpfの細胞を観察した。ゼブラフィッシュ24hpfのニューロン細胞の中では、GFPシグナルの一部が観察されたのに対して、ゼブラフィッシュ48hpfのニューロン細胞の中では、一部が既に分解し、消失に至った。ゼブラフィッシュ48hpfのGFPニューロン細胞の百分率を3〜5個算出した。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
実験の結果から分かるように、対照陰性DMSO群では、17.2%のみのGFPニューロン細胞があるのに対して、濃度1mg／mLでウォールナットオリゴペプチドを注射した後、GFPニューロン細胞が37.6%と高くなった。これにより、ウォールナットオリゴペプチドはヒト野生型タウ蛋白によるゼブラフィッシュ胎児内神経細胞への毒性作用を著しく下げることが確認された。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
試験を行う時、マウスを飛び込み台に置くとともに、時間を計測した。マウスが一回目飛び下げる時間を感電潜伏期（つまり誤潜伏期）として記録し、5分内で飛び下げる回数（つまり誤回数）を観察指標として記録した。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
2.2 亜硝酸ナトリウムによるマウスの記憶固定障害に対する影響
組分け、投与及び訓練方法は上記2.1と同じである。訓練を終えた後、空白対照群において皮下注射で等量の生理食塩水を与えた以外に、他の各群において直ちに皮下注射により亜硝酸ナトリウム90mg／kgを与えた。24時間後試験を行った。試験方法は上記2.1と同じである。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
2.3  40%エタノールによるマウスの記憶再現障害に対する影響
組分け、投与及び訓練方法は上記2.1と同じである。試験の30分前に、モデル群と投与群におけるマウスに対して40%エタノール10mL／kgをカバージュして、空白対照群のマウスに対して等容積の蒸留水を与えた。試験方法は上記2.1と同じである。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
学習記憶機能は空間学習記憶機能と非空間学習記憶機能を含む。記憶障害モデルは薬物による記憶過程への影響を評価する有効な手段であり、薬物により老人性痴呆及びそのメカニズムを検討する際に常に採用されるモデルとして役立つ。スコポラミンは、アセチルコリンのMレセプターに対する激動作用を遮断することができ、アセチルコリン不足による学習記憶機能障害を模倣することができる、Mレセプター遮断薬である。亜硝酸ナトリウムはヘモグロビンの変性を起こし、脳組織の乏血と乏酸素を招き、学習と記憶過程を損ね得る。エタノールは大脳皮質の神経機能活動を抑制し、動物の条件反射を抑制し、脳内タンパク質とRNAとの合成を妨げ得る。コリンはドーパミンシステムにいくつかの変化をもたらし、それによって学習記憶機能を破壊し、学習記憶再現障害を引き起こし得る。本実験に採用されるモデルと投与量の範囲内において、ウォールナットオリゴペプチドの中投与量群と高投与量群は、いずれもある程度でスコポラミンによる学習記憶獲得障害モデルマウスの潜伏期を改善し、高投与量群はマウスが飛び込み台から飛び下げる誤った回数を減少することができる。亜硝酸ナトリウムによる記憶固定障害モデルについて、ウォールナットオリゴペプチドの各投与量はいずれも潜伏期を延長し、誤った回数を減少することができる。40％エタノールによるマウスの記憶獲得障害に係る飛び込み台実験について、ウォールナットオリゴペプチドの各投与群も誤った回数を著しく減少し、潜伏期を延長することができる。これから分かるように、ウォールナットオリゴペプチドの中投与量群と高投与量群はスコポラミンによる学習記憶獲得障害に罹るマウスの学習記憶能力に対して著しい改善作用を有する。その低投与量群、中投与量群及び高投与量群は、40%エタノールによるマウスの学習記憶再現障害及び亜硝酸ナトリウムによるマウスの学習記憶固定障害に罹るマウスの学習記憶能力に対して著しい改善作用を有する。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウォールナットオリゴペプチド粉であって、GB/T 22492-2008、付録Aと付録Bに記載された検出方法により得られたペプチド含有量が80wt%以上であり、そのうち95%以上のウォールナットペプチドは、分子量が1500Dalton未満であり、
下記の分子量分布を有し、
【数１】
2019506451.tif 000008
好ましくは、前記ペプチド含有量が81wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットペプチドが97％以上であり、より好ましくは、ペプチド含有量が81.3wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットペプチドが96％以上であり、さらに好ましくは、ペプチド含有量が85wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットペプチドが97％以上であり、最も好ましくは、ペプチド含有量が85wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットペプチドが96％以上であることを特徴とする、ウォールナットオリゴペプチド粉。
【請求項２】
コールドプレスにより脱脂されたウォールナット粕に対して高効率向流抽出法でそのタンパク質を抽出し、濾過及び酵素分解を行い、タンパク質の酵素分解液を順次に精密濾過膜と限外濾過膜を通じて高効率分離と精製を行い、その後、濃縮噴霧してウォールナットオリゴペプチド粉を得る工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載のウォールナットオリゴペプチド粉の調製方法。
【請求項３】
ウォールナットのシェルを除去し、コールドプレスで脱油し、脱脂されたウォールナット粕を得る、ウォールナット粕の前処理工程と、
Aで表記される一定量の脱脂されたウォールナット粕と、水とを質量比1:5~1:15で混合し、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出し、抽出終了後、濾過し、残渣を2回抽出し、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ、Bで表記し、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出し、Bの一回目の抽出が終了した後、濾液を一旦置き、残渣を2回抽出し、その後、Aの二回目の抽出が終了した後、濾過残渣を捨て、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ、Cで表記し、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出し、Bの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液をCの一回目抽出後の残渣に注ぎ1〜2時間抽出し、Cの一回目抽出後の濾液を一旦置き、Cの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を一旦置き、最後に、上記置かれた各濾液を合わせて、pHを3〜5に調整して0.5〜2時間静置して、上澄み液を捨て、その後、沈殿物に体積比1:10~1:20で水を注ぎ、均一に攪拌して、ウォールナットタンパク液を得る、高効率向流抽出法によるタンパク質抽出工程と、
前記ウォールナットタンパク液を40〜55℃まで加熱し、pHを中性とし、ウォールナット粕の質量の0.5〜2％の生物酵素を添加し、攪拌しながら酵素分解を3〜6時間行い、沸騰まで加熱し、30分不活性化させ、遠心分離し、上澄み液としてタンパク質酵素分解液を得る、タンパクの酵素分解工程と、
タンパク質酵素分解液を細孔径0.1〜0.5μmの精密濾過膜で濾過し、得られら濾液を2000〜20000 Daltonの限外濾過膜で処理した後、分画液を50〜80℃で固体含有量3〜5wt%に濃縮し、入口温度140〜160℃かつ出口温度55〜65℃の噴霧乾燥を行い、収率20〜30wt%でウォールナットペプチド粉を得る、分離精製工程と
を含むことを特徴とする、請求項2に記載の調製方法。
【請求項４】
前記生物酵素は食品グレードの中性プロティナーゼ（酵素活性≧30万u/g）、パパイン（酵素活性≧40万u/g）、ブロメライン（酵素活性≧30万u/g）、アルカリプロテアーゼ（酵素活性≧20万u/g）、ペプシン（酵素活性≧50万u/g）、トリプシン（酵素活性≧3000u/g）からなる群より選ばれた一種又はこれらの混合物であり、中性プロティナーゼ又は複合酵素を用いることが好ましく、前記複合酵素における中性プロティナーゼとパパインとの質量比が1:1であり、中性プロティナーゼの活性は30万u/gであり、パパインの活性は50万u/gであることを特徴とする、請求項3に記載の調製方法。
【請求項５】
請求項1に記載のウォールナットオリゴペプチド粉と、薬物、食品、保健品又は化粧品において許容される助剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
その剤型は、裸錠、フィルムコーティング錠、糖衣錠、腸衣錠、分散錠、カプセル、顆粒剤、経口溶液又は経口懸濁液、及び液体、エマルション、クリーム、粉、塊の化粧品の剤型であることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
ラジカルの過剰による症状を治療・予防する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、記憶力の衰退を改善又は治療する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、パーキンソン病とアルツハイマー病を治療又は予防し、脳疲労又は運動疲労を緩和する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、免疫力を強化する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、又は記憶力の衰退を改善又は治療する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用のための請求項1に記載のウォールナットオリゴペプチド粉。
【請求項８】
中枢神経を保護する薬物、食品又は保健品の調製における使用、運動能力を改善する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、体内乳酸代謝に対する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、Aβ1-42アミロイド凝集に対する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、細胞内炎症免疫因子を調節する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、神経突起成長の薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、又はタウ蛋白の神経細胞に対する毒性作用を低減する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用のための請求項1に記載のウォールナットオリゴペプチド粉。