【手続補正書】
【提出日】平成30年12月18日(2018.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
別の態様において、本発明は、代謝疾患を処置する方法であって、本明細書中で定義される組換えデルマトポンチンを含む方法に言及する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
図６は、高脂肪食を出した場合に、全身デルマトポンチンノックアウトマウス系統の体重が増加し、かつエネルギー消費が低下したことを示すデータを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、野生型（ＷＴ）マウス対デルマトポンチンノックアウト（ＫＯ）マウスの体重を示す折れ線グラフを示し、ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、より大きな体重増加を示したことを示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、野生型マウス対デルマトポンチンノックアウト（ＤＰＴ  ＫＯ）マウスの除脂肪量および脂肪量の分布を示す棒グラフを示す。このグラフは、マウスに存在する除脂肪量が、ＤＰＴ  ＫＯマウスとＷＴマウスとの間で類似しているが、ＤＰＴ  ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、より高い脂肪量を示すことを示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、野生型（ＷＴ）マウス対デルマトポンチンノックアウト（ＤＰＴ  ＫＯ）マウスの、明期間（ｘ軸上の白色の水平バー）および暗期間（ｘ軸上の黒色の水平バー）におけるエネルギー消費を示す折れ線グラフを示す。このグラフは、ＤＰＴ  ＫＯマウスの全体的なエネルギー消費が、ＷＴマウスのエネルギー消費よりも低かったことを示している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、先に図６Ｃで示したマウスの平均エネルギー消費を示す棒グラフを示し、これは、図６Ｃで提供したデータの定量化である。図６について、以下の基準を用いる：１群あたりｎ＝４、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図７】図７は、ヒト、ネズミ、ウシ、およびブタのデルマトポンチンのアライメント分析を示し、タンパク質配列が互いにいかに密接に関連しているかを示している。マウス、ウシ、ヒト、およびブタのデルマトポンチン配列を、標準的なタンパク質アライメントプログラムを用いて比較したところ、当該配列が様々な種にわたって高度に保存されていることを示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
また、本明細書に記載されるのは、付加的な分泌シグナルまたはシグナル伝達ペプチドの添加によってＣ末端またはＮ末端が修飾されている組換えデルマトポンチンである。当該技術において知られている一例が、新生タンパク質を細胞質から細胞の核中に導入するように向ける核局在化配列（ＮＬＳ）の付加である。核局在化配列には多くの異なるバージョンがあり、それらの長さおよび組成は、それらが単離されたセル型に依存する。例えば、ヌクレオプラスミンの核局在化配列は、「ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ」（配列番号９）であり、ｃ−ｍｙｃの核局在化配列は、「ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ」（配列番号１０）である。当該技術において知られているシグナル伝達ペプチドの別の例が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）であり、これは、細胞核から細胞質中に輸送されることになる新生タンパク質上にタグ付けされている。当該核外輸送シグナル（ＮＥＳ）は、通常、４つの疎水性残基の短いアミノ酸配列である。したがって、一例において、組換えデルマトポンチンは、そのＮ末端に、高度に保存された分泌シグナルからなる。別の例において、分泌シグナルは、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される配列を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本開示はまた、併用療法および組成物を記載する。すなわち、本明細書中に記載されるペプチドは、更なる治療化合物または治療剤と同時に、これに引き続いて、もしくはこれとは別に、またはそれらを組み合わせて、投与され得る。ゆえに、一例において、投与は同時である。すなわち、組換えデルマトポンチンおよび更なる治療剤の双方が、同時に投与されることになる。別の例において、組換えデルマトポンチンおよび更なる治療剤は、別々に投与されることになる。さらに別の例において、組換えデルマトポンチンおよび更なる治療剤は、連続して投与される。すなわち、例えば、組換えデルマトポンチンが最初に投与されてから、更なる治療化合物が投与されてよい。代替で、別の例において、更なる治療剤が最初に投与されてから、組換えデルマトポンチンが投与されてよい。さらに別の例において、第１の治療剤が投与されることになり、その後、組換えデルマトポンチンが投与されてから、第２の治療剤が投与される。更なる例において、ある治療剤が投与されてから、組換えデルマトポンチンが第２の治療剤と同時に投与されることになる。治療剤として、小分子、生物製剤、化学療法剤、サプリメント、またはバイオテクノロジー由来製品；オルリスタット、ロカセリン、シブトラミン、リモナバン、メトホルミン、エクセナチド、プラムリンチド、フェンテルミン、トピラメート；インスリン、アセチルサリチル酸、アカルボース、ミグリトール、アログリプチン、リナグリプチン、ピオグリタゾン、サクサグリプチン、シタグリプチン、シンバスタチン、アルビグルチド、デュラグルチド、リラグルチド、ナテグリニド、レパグリニド、ダパグリフロジン、カナグリフロジン、エンパグリフロジン、グリメピリド、ロシグリタゾン、グリクラジド、グリピジド、グリブリド、クロルプロパミド、トラザミド、トルブタミド、およびそれらの組合せがあり得るが、これらに限定されない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
デルマトポンチンが脂肪組織から分泌され、かつ循環系において見出されることを考えれば、次のステップは、デルマトポンチンをマウスに注射することによって、デルマトポンチンの役割を判定し、かつその効果を判定することであった。組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ；図２Ａ）またはビヒクルコントロールを、標準的なＣＨＯＷ食のＣ５７ＢＬ６マウスに、２ｍｇ／体重ｋｇにて週３回、２週間注射した。これを２週間行ってから、脂肪が高い食事（高脂肪食；ＨＦＤ）に食事を変えて、注射レジメンを継続した。注射後６週目に、組換えデルマトポンチン注射群において、体重増加の有意な減少が観察された（図２Ｂ）。この体重減少は主に、脂肪量の減少によるものである。グルコース耐性試験（ＧＴＴ）は、組換えデルマトポンチン注射群がグルコースクリアランスを向上させたことを明らかにした（図２Ｄおよび図２Ｅ）。グルコースクリアランスのこの増大は、インスリン耐性試験（ＩＴＴ；図２Ｆおよび図２Ｇ）の結果に基づけば、末梢組織のインスリン感受性の増大に起因する。間接熱量測定分析により、組換えデルマトポンチン注射マウスは、例えば食物および水の摂取量、ならびに運動等のパラメータに影響を及ぼすことなく（図８）、昼と夜の双方のサイクルの間に、エネルギー消費が増大していることが明らかとなった（図２Ｈおよび図２Ｉ）。まとめると、このデータは、組換えデルマトポンチン注射が、対象の代謝に、全体的に有益な効果を及ぼすことを示している。具体的には、組換えデルマトポンチンは、グルコース接種の間に、グルコースクリアランスを向上させることができる。これは、より高い安静時（昼間）エネルギー消費、そしてまた、活動的（夜間）エネルギー消費の増大に起因しており、これが、周辺組織のインスリン感受性の向上に寄与する。また、全身デルマトポンチンノックアウトマウス系統は、食事起因性体重増加に対して、より感受性であることも示される（図６Ａ）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、標準的なＣＨＯＷ食または高脂肪（６０％ｋｃａｌ脂肪）食を８週間与えた。体重測定を毎週実行した。食事の９週目に、高脂肪食のマウスを２つの群に分けた：第１の群は高脂肪食を続けたが、第２の群は、１日の摂取量の１６．５％を朝に１回、そして夕方に１回与えた（通常の摂取量の合計３３％；摂取量の制限）。１０日後、３つ全ての群（標準的なＣＨＯＷマウス、ＨＦＤマウス、および制限ＨＦＤマウス）由来のマウスを、頚椎脱臼を介して屠殺した。心穿刺を介して血液を採取して、血液を氷上で１時間凝固させた後に、血清を得た。別個のマウスコホートにＣＨＯＷ食または高脂肪食（ＨＦＤ）を与えて、尾出血を介して血液を２週毎に得て、デルマトポンチンを検出した。内臓脂肪を、副睾丸蓄積物から得、皮下脂肪を、背面側の脂肪蓄積物から得た。ウェスタンブロット分析を以下のように実行した：組織を、プロテアーゼ阻害剤を有する放射線免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファ中でホモジナイズして、生じたタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いて定量化した。当該技術において知られている類似の単離法およびタンパク質濃度判定法を利用してもよい。組織溶解物２０μｇまたは血清１μｌをサンプルローディングバッファと混合して、ポリアクリルアミドゲル上にロードして、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜に移した後、膜をブロックし（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中５％スキムミルク）、続いてデルマトポンチンに対する抗体またはヒートショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）で、４℃にて一晩、イムノブロットした。抗体を、２％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１：１０００の比率に希釈した。インキュベーション後、膜を洗浄して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体とインキュベートしてから、化学発光基質のインキュベーションに続く、フィルムの露光によって、検出した。生じたウェスタンブロットを、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて定量化した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて、相関グラフおよびＲ２をプロットし、かつ算出した。