(57)【要約】本発明は、グラム陰性菌関連疾患治療薬または予防薬のスクリーニング方法、グラム陰性菌検出方法、グラム陰性菌収集方法、および、ＬＰＳショックの治療剤または予防剤を提供することを目的とする。  本発明は、ＲＡＧＥポリペプチドとリポポリサッカライドとの結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質のグラム陰性菌関連疾患治療薬または予防薬としての効果を評価する方法；ＲＡＧＥポリペプチドと被検試料とを接触させ、ＲＡＧＥポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法；ＲＡＧＥポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をＲＡＧＥポリペプチドと結合させることにより試料中のグラム陰性菌を収集する方法；ならびにＲＡＧＥポリペプチドを含有するＬＰＳショックの治療剤または予防剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｙｌｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＲＡＧＥ）ポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する方法。
【請求項２】
ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する増強的効果に基づいて該被検物質を評価することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
下記の工程を含む請求項１または２記載の方法：
１）ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と、被検物質とを混合し、該混合物中における、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量（Ａ）を測定する、
２）ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌とを混合し、該混合物中における、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量（Ｂ）を測定する、
３）結合量（Ａ）と結合量（Ｂ）との相違に基づき、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する。
【請求項４】
被検試料中のグラム陰性菌を検出する方法であって、
ＲＡＧＥポリペプチドと被検試料とを接触させ、ＲＡＧＥポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法。
【請求項５】
ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用試薬。
【請求項６】
ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用キット。
【請求項７】
試料中のグラム陰性菌を収集する方法であって、
ＲＡＧＥポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をＲＡＧＥポリペプチドと結合させる工程を含む方法。
【請求項８】
ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用試薬。
【請求項９】
ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用キット。
【請求項１０】
ＲＡＧＥポリペプチドを含有する、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法、グラム陰性菌の検出方法、グラム陰性菌の収集方法、および、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜結合型ＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｙｌｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、Ｓｔｅｒｎらのグループにより、ＡＧＥ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｙｌｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ，後期糖化反応生成物）の細胞表面特異受容体として分離されその一次構造が決定された（非特許文献１）。膜結合型ＲＡＧＥは、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する１回膜貫通型の受容体で、Ｖ，Ｃ１，Ｃ２の３つのイムノグロブリンドメインからなる細胞外領域と短い細胞内領域とを有する。膜結合型ＲＡＧＥにＡＧＥが結合すると、活性酸素種の産生を経て転写因子ＮＦκＢの活性化を引き起こし、血管障害性の遺伝子群の活性化をおこすと考えられている。
本発明者らのグループは、ヒトの生体内に、膜結合型ＲＡＧＥのスプライシングバリアントで膜貫通領域を有しない可溶性ＲＡＧＥが天然に存在することを見出し、特許出願している（特許文献１）。当該可溶性ＲＡＧＥは内在性分泌型ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）と称される。
一方、リポポリサッカライドはグラム陰性菌の外表面における主要な成分として知られている（非特許文献２）。
これまでにＲＡＧＥポリペプチドの機能に関しては種々の報告がある（非特許文献３および４）。しかしながら、ＲＡＧＥポリペプチドとリポポリサッカライドとの結合に関する報告はなされていない。
【特許文献１】特開２００３−１２５８６号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４９９８−１５００４（１９９２）
【非特許文献２】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３８：２４３１−２４４７（２００３）
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：１６４１−１６５０（２００４）
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１２６７−１２７４（２００５）
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法、グラム陰性菌の検出方法、グラム陰性菌の収集方法、および、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤を提供することを目的とする。
本発明者らは膜結合型または可溶型のＲＡＧＥポリペプチドが、リポポリサッカライドと結合することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の発明を包含する。
（１）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｙｌｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＲＡＧＥ）ポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する方法。
（２）ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する増強的効果に基づいて該被検物質を評価することを特徴とする、（１）記載の方法。
（３）下記の工程を含む（１）または（２）記載の方法：
１）ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と、被検物質とを混合し、該混合物中における、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量（Ａ）を測定する、
２）ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌とを混合し、該混合物中における、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量（Ｂ）を測定する、
３）結合量（Ａ）と結合量（Ｂ）との相違に基づき、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する。
（４）被検試料中のグラム陰性菌を検出する方法であって、
ＲＡＧＥポリペプチドと被検試料とを接触させ、ＲＡＧＥポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法。
（５）ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用試薬。
（６）ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用キット。
（７）試料中のグラム陰性菌を収集する方法であって、
ＲＡＧＥポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をＲＡＧＥポリペプチドと結合させる工程を含む方法。
（８）ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用試薬。
（９）ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用キット。
（１０）ＲＡＧＥポリペプチドを含有する、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−４９３１２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＬＰＳとＲＡＧＥの結合曲線（ビアコア法）を示す。ＬＰＳの濃度は、図１の上から順に２０、１０、５、２．５、１．２５ｎｇ／ｍｌである。ＬＰＳの平均分子量を５０，０００と想定した。
図２は、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ結合阻害曲線（プレート法）を示す。
図３は、ＬＰＳ−ＲＡＧＥ相互作用を示す。
図４は、ＲＡＧＥ＋／＋野生型マウス、ＲＡＧＥ−／−ノックアウトマウスにおけるＬＰＳ投与時の生存率の、マウスｓＲＡＧＥ処置の有無による相違を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（ＲＡＧＥポリペプチド）
本発明において「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｙｌｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＲＡＧＥ）ポリペプチド」とは、ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｙｌｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＡＧＥ，後期糖化反応生成物）の受容体として機能しうるすべてのポリペプチドを意味し、天然物であっても、天然物の変異体であっても、人為的に合成されたものであってもよい。
天然に存在するＲＡＧＥポリペプチドとしては、ヒト、マウス、ラット、ウシなどの哺乳動物に由来するものが挙げられる。天然に存在するＲＡＧＥポリペプチドには膜結合型のものと可溶型のものが存在するが、本発明には両者とも好適に使用できる。天然に存在する可溶型ＲＡＧＥポリペプチドには、内在性分泌型ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）と呼ばれるポリペプチドが包含される。また、天然に存在する膜結合型ＲＡＧＥポリペプチドを人為的に可溶性に改変したものもまた同様に使用できる。本発明には、ＡＧＥを受容しうるポリペプチドである限り、天然に存在するＲＡＧＥポリペプチドの変異体や、天然に存在するＲＡＧＥポリペプチドの部分ポリペプチドや、当該部分ポリペプチドの変異体などもまた好適に使用できる。
本発明においてＲＡＧＥポリペプチドとして好適に使用可能な、天然に存在するＲＡＧＥポリペプチドとしては、配列番号１のアミノ酸配列で表されるヒト由来膜結合型ＲＡＧＥポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列で表されるヒト由来ｅｓＲＡＧＥポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列で表されるマウス由来膜結合型ＲＡＧＥポリペプチド、配列番号４のアミノ酸配列で表されるマウス由来ｅｓＲＡＧＥポリペプチド、配列番号５のアミノ酸配列で表されるラット由来膜結合型ＲＡＧＥポリペプチド、および、配列番号６のアミノ酸配列で表されるウシ由来膜結合型ＲＡＧＥポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。本発明には、配列番号１，２，３，４，５，および６からなる群から選択される１つにより表されるアミノ酸配列において１〜数個（例えば、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個）のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＧＥを受容しうるポリペプチドもまたＲＡＧＥポリペプチドとして好適に使用可能である。
本発明においてＲＡＧＥポリペプチドとして好適に使用可能な、天然に存在するＲＡＧＥポリペプチドの部分配列としては、配列番号１のＣｙｓ３８〜Ｃｙｓ９９のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号１のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド（好ましくはアミノ酸残基数１００以下、より好ましくは８０以下、更に好ましくは７０以下、最も好ましくは６２であるポリペプチド）、配列番号２のＣｙｓ３８〜Ｃｙｓ９９のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号２のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド（好ましくはアミノ酸残基数１００以下、より好ましくは８０以下、更に好ましくは７０以下、最も好ましくは６２であるポリペプチド）、配列番号３のＣｙｓ３８〜Ｃｙｓ９８のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号３のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド（好ましくはアミノ酸残基数１００以下、より好ましくは８０以下、更に好ましくは７０以下、最も好ましくは６１であるポリペプチド）、配列番号４のＣｙｓ３８〜Ｃｙｓ９８のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号４のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド（好ましくはアミノ酸残基数１００以下、より好ましくは８０以下、更に好ましくは７０以下、最も好ましくは６１であるポリペプチド）、配列番号５のＣｙｓ３８〜Ｃｙｓ９８のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号５のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド（好ましくはアミノ酸残基数１００以下、より好ましくは８０以下、更に好ましくは７０以下、最も好ましくは６１であるポリペプチド）、および、配列番号６のＣｙｓ３８〜Ｃｙｓ９８のアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、配列番号６のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド（好ましくはアミノ酸残基数１００以下、より好ましくは８０以下、更に好ましくは７０以下、最も好ましくは６１であるポリペプチド）からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
本発明には、前段落で言及した部分ポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個（例えば、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個）のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＧＥを受容しうるポリペプチドもまたＲＡＧＥポリペプチドとして好適に使用可能である。
本発明に用いるＲＡＧＥポリペプチドの調製方法は特に限定されず、例えば、通常のクローニング法を用いた発現法により調製してもよいし、天然物から単離することにより調製してもよいし、市販品を購入して使用してもよい。
本明細書において、「ＲＡＧＥポリペプチド」を「ＲＡＧＥ」と、「ｅｓＲＡＧＥポリペプチド」を「ｅｓＲＡＧＥ」とそれぞれ称する場合があるが、同義である。
（グラム陰性菌）
本発明における「グラム陰性菌」としては、具体的には、腸内細菌科（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ等）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ等）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等），Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等）、Ｐｒｏｔｅｕｓ属（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ等）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ等）、Ｓｅｒｒａｔｉａ属（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ等）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ等）、Ｙｅｒｓｉｎａ属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ等）等）、クラミジア科（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ等）等）、コクシエラ科（Ｃｏｘｉｅｌｌａ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ等）等）、レジオネラ科（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ等）等）、パスツレラ科（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ等）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ等）等）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ科（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ等）等）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ科、Ｂｒｕｃｅｌｌａ科、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ等）、Ｏｒｉｅｎｔｉａ属（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ等）等）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ科（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ等）、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属等）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等）等），Ｖｉｂｒｉｏ科（Ｖｉｂｒｉｏ属（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ等）等）、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等）、Ｋｉｎｇｅｌｌａ属（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ等）等）、スピロヘータ科（Ｂｏｒｒｅｌｉａ属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ等）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ等）等）が挙げられるが、これらには限定されない。
（グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法）
実施例に記載の通り、ＲＡＧＥポリペプチドとリポポリサッカライドとは結合することができる。したがって、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価することが可能である。ここで「グラム陰性菌関連疾患」とは、グラム陰性菌の感染により引き起こされる疾患を意味する。
細胞膜上に存在する膜結合型ＲＡＧＥポリペプチドと異なり、可溶型ＲＡＧＥポリペプチドは細胞外に存在する。可溶型ＲＡＧＥポリペプチドは細胞外でリガンドを捕捉することにより、リガンドと膜結合型ＲＡＧＥポリペプチドとの結合を阻害するデコイ型レセプターとしての役割を持つと考えられる。つまり、可溶型ＲＡＧＥポリペプチドは、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と膜結合型ＲＡＧＥとの結合により生じる強い炎症反応を軽減させる働きがあると考えられる。さらに、それに加えて可溶型ＲＡＧＥポリペプチドは、理論的には、膜結合型ＲＡＧＥ以外のレセプターを介する炎症反応をも軽減させうる可能性がある。ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合を増強する作用を有する物質が、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌が存在する体内に投与されると、可溶型ＲＡＧＥポリペプチドがリポポリサッカライドまたはグラム陰性菌に結合し、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌による炎症反応は生じにくくなるものと考えられる。従って、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合を増強する作用を有する物質は、グラム陰性菌が細胞膜上に存在する膜結合型ＲＡＧＥポリペプチドに結合することにより生じる疾患のみならずリポポリサッカライドまたはグラム陰性菌によって引き起こされるあらゆる疾患の治療薬または予防薬として有用であると考えられる。
本発明のこの実施形態においてリポポリサッカライドを使用する場合は、当該リポポリサッカライドは、スクリーニングされるべき治療薬または予防薬が対象とする疾患の原因となるグラム陰性菌から単離されたものであることが好ましいが、それには限定されない。リポポリサッカライドとしては市販品を使用することもでき、市販品としては例えば大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５、大腸菌Ｏ１２７：Ｂ８，大腸菌Ｏ１２８：Ｂ１２，大腸菌Ｏ２６：Ｂ６，大腸菌Ｋ−２３５，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  １０，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｏｓａ，またはＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓに由来するリポポリサッカライド（以上すべてシグマ社）が挙げられる。
本発明のこの実施形態においてグラム陰性菌を使用する場合は、当該グラム陰性菌は、スクリーニングされるべき治療薬または予防薬が対象とする疾患の原因となるグラム陰性菌であることが好ましいが、それには限定されない。グラム陰性菌の具体例は上述の通りである。
本発明に係る、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法は、典型的には次の３つの工程を含む。
１）ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と、被検物質とを混合し、該混合物中における、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量（Ａ）を測定する、
２）ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌とを混合し、該混合物中における、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量（Ｂ）を測定する、
３）結合量（Ａ）と結合量（Ｂ）との相違に基づき、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する。
結合量（Ａ）または（Ｂ）の測定方法は、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に伴う物理量の変化を検出することができる方法であればいずれの方法であってもよい。例えば、表面プラズモン共鳴センサーを用いる方法、イムノアッセイ、細胞膜上のＲＡＧＥポリペプチドへのリガンド結合により生じるシグナル伝達を検出する方法（例えば実施例に示すＮＦκＢ−ルシフェラーゼアッセイ）など種々の方法が利用できる。
この方法において、ＲＡＧＥポリペプチド、またはリポポリサッカライドもしくはグラム陰性菌は、必要に応じて、固相担体に固定化された形態で用いることができる。このとき、使用できる固相担体とは、結合させる反応系で溶媒に不溶な担体であれば、その材質及び形状は特に制限されず、公知の固相担体が使用できる。固相担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すれば良く、例えば、テストプレート状、ビーズ状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が挙げられる。また、その材質としては、通常のイムノアッセイ用担体として用いられるもの、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等の合成樹脂、または、これらに公知の方法によりスルホン酸基、アミノ基などの反応性官能基を導入したもの、ガラス、多糖類、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等が例示できる。
固相担体へのＲＡＧＥポリペプチド等の固定化方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用できる。
イムノアッセイに用いる標識物質としては、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、補酵素、あるいはラジオアイソトープ等が挙げられる。なかでも、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼのような酵素標識は、安全性や経済性に優れ、しかも必要な感度を比較的容易に達成できる上で好ましい。標識物質は、ＲＡＧＥポリペプチドや、抗ＲＡＧＥポリペプチド抗体や、該抗体に対する二次抗体に直接結合して標識することができる。あるいは標識物質を認識する抗体やアビジン−ビオチン系などを利用して間接標識することもできる。
本発明のこの形態において「被検物質」は特に限定されず、天然化合物であっても、合成化合物であっても、それらの混合物であってもよい。
（グラム陰性菌の検出方法）
本発明の第二の形態は、被検試料中のグラム陰性菌を検出する方法であって、ＲＡＧＥポリペプチドと被検試料とを接触させ、ＲＡＧＥポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法に関する。この方法は、例えば、食品試料中に、食中毒の原因となる大腸菌などのグラム陰性菌が含まれるか否かを定性的に判別したり、食品試料中のグラム陰性菌の存在量を定量的に測定したりする目的で使用できる。
ＲＡＧＥポリペプチドとグラム陰性菌との結合は、上記と同様にして測定できる。
本発明はまた、ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用試薬に関する。
当該試薬は、必要な他の試薬とともにキット化することもできる。例えばイムノアッセイ用の試薬キットの場合は、構成試薬として、例えばＲＡＧＥポリペプチド、蛍光標識した抗ＲＡＧＥポリペプチド抗体などを含有する。ＲＡＧＥポリペプチドは予め固相担体に固定化されていてもよく、あるいは使用時に固相担体に固定化する形態であってもよい。この場合、試薬キットに、ＲＡＧＥポリペプチドを固定化するための固相担体が含まれていてもよい。また、凝集反応用の試薬キットの場合は、ＲＡＧＥポリペプチドを固定化した担体粒子を含有することができる。
上記の構成試薬の他に、標準試料、緩衝液、溶解液、洗浄液、反応停止液、使用説明書などが含まれていてもよい。上記各構成試薬は、懸濁液、溶液、または凍結乾燥品の形態とすることができる。
また、ＲＡＧＥポリペプチドは、それを高密度に貼り付けたプロテインチップ（プロテインアレイ）としてよく、このようなプロテインチップも本発明のキットに含まれる。この場合、キットには、質量分析計、測定・解析に必要なソフト、該ソフトを導入したコンピューターなどが含まれていてよい。
（グラム陰性菌の収集方法）
本発明の第三の形態は、試料中のグラム陰性菌を収集する方法であって、ＲＡＧＥポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をＲＡＧＥポリペプチドと結合させる工程を含む方法に関する。本方法は試料中のグラム陰性菌を単離または濃縮する目的で使用することができる。
本発明のこの形態では、ＲＡＧＥポリペプチドは予め固相担体に固定化されていているか、あるいは使用時に固相担体に固定化する形態であることが好ましい。このとき、使用できる固相担体とは、結合させる反応系で溶媒に不溶な担体であれば、その材質及び形状は特に制限されず、公知の固相担体が使用できる。固相担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すれば良く、例えば、テストプレート状、ビーズ状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が挙げられる。また、その材質としては、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等の合成樹脂、または、これらに公知の方法によりスルホン酸基、アミノ基などの反応性官能基を導入したもの、ガラス、多糖類、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等が例示できる。固相担体へのＲＡＧＥポリペプチド等の固定化方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用できる。
典型的な実施形態としては、例えばＲＡＧＥポリペプチドを表面に固定化したビーズをカラムに充填し、充填後のカラムにグラム陰性菌を含有する試料を流し、試料中のグラム陰性菌をビーズ上のポリペプチドに捕捉する方法が挙げられるがこれには限定されない。
本発明はまた、ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用試薬に関する。
当該試薬は、必要な他の試薬とともにキット化することもできる。当該試薬またはキットにおいて、ＲＡＧＥポリペプチドは予め固相担体に固定化されているか、あるいは使用時に固相担体に固定化する形態であることが好ましいことは上記の通りである。試薬キットには、ＲＡＧＥポリペプチドを固定化するための固相担体が含まれていてもよい。
上記の構成試薬の他に、緩衝液、溶解液、洗浄液、反応停止液、使用説明書などが含まれていてもよい。上記各構成試薬は、懸濁液、溶液、または凍結乾燥品の形態とすることができる。
また、ＲＡＧＥポリペプチドは、それを高密度に貼り付けたプロテインチップ（プロテインアレイ）としてよく、このようなプロテインチップも本発明のキットに含まれる。この場合、キットには、質量分析計、測定・解析に必要なソフト、該ソフトを導入したコンピューターなどが含まれていてよい。
（リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤）
グラム陰性菌が有するリポポリサッカライドは、ヒトなどの哺乳動物の体内で急激な炎症（ショック症状）を惹起することが知られている。本発明者らは、ＲＡＧＥポリペプチドを投与することにより、この症状が緩和できることを見出した。すなわち、本発明の第四の形態は、ＲＡＧＥポリペプチドを含有する、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤に関する。本発明はまた、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療または予防方法であって、当該炎症の治療または予防を必要とする対象（典型的にはヒト）に、有効量のＲＡＧＥポリペプチドを投与する工程を含む前記方法に関する。本発明はまた、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤の製造におけるＲＡＧＥポリペプチドの使用に関する。
本発明のこの実施形態ではＲＡＧＥポリペプチドは血中に可溶性のものであることが好ましく、例えばヒト等に由来する内在性分泌型ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）ポリペプチドが好ましい。
投与形態は経口投与または非経口投与のいずれであってもよいが、急激なショック症状を迅速に緩和するためには非経口投与が好ましい。
製剤形態への調製は、常法に従って行うことができ、その際に利用できる担体や賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、希釈剤も、慣用されている各種のものから適宜選択することができる。形態には、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、経鼻剤、経腸剤、貼付剤、軟膏剤等の非経口剤として製剤化される。
ＲＡＧＥポリペプチドの投与量は有効量であれば特に限定されないが、１日当たり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重が好適といえる。
【実施例１】
【０００６】
表面プラズモン共鳴センサーを用いたアッセイ
方法
リポポリサッカライド（以下「ＬＰＳ」と称する）とＲＡＧＥの結合を表面プラズモン共鳴センサーであるビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ２０００）を用いて直接検出した。リガンド結合ドメインはＲＡＧＥ細胞外領域に存在するという想定で、ＬＰＳとｅｓＲＡＧＥとの結合が確認できれば、ＬＰＳとＲＡＧＥとの結合も可能と考えた。ＬＰＳはシグマ社の大腸菌由来Ｏ１１１：Ｂ４を使用した。ヒト由来内在性分泌型ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）は、ＣＭ５センサーチップ表面のカルボキシメチルデキストランにアミンカップリング法によって５，５００ＲＵ（１１０ｆｍｏｌ／ｍｍ２）固定した。ランニング緩衝液は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ  ａｎｄ  ０．００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ−２０を使用し、２５℃、流速２０ｍＬ／ｍｉｎでＬＰＳをセンサーチップ表面に流した。センサーチップ表面にＬＰＳが結合し停留すると、チップ上の質量増加により表面プラズモン共鳴が変化しＲＵ値として検出される。結合はリアルタイムに観測され、その反応速度及び親和性が算出できる。
結果
ＬＰＳは固定化したｅｓＲＡＧＥと結合し、センサーグラム上でＲＵ値の上昇が観測された。１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌによってセンサーグラム（図１）を解析したところ、３．５ｘ１０−８Ｍ程度の解離定数が得られた。
【実施例２】
【０００７】
プレートアッセイ
方法
ＢＳＡとｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅを３７℃で１週間反応させて生成したＡＧＥ−ＢＳＡを９６穴プレートに吸着させて、ＡＧＥ固相化プレートを作製した。そこに濃度を変えたＬＰＳとヒト由来内在性分泌型ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）を添加した。ＬＰＳはシグマ社の大腸菌由来Ｏ１１１：Ｂ４を使用した。２５℃で１時間静置した後プレートを洗浄し、蛍光標識したｅｓＲＡＧＥ抗体を添加した。１時間静置した後洗浄し、蛍光測定をおこなった。蛍光強度は固相化されたＡＧＥと結合したｅｓＲＡＧＥの量に比例するため、ＬＰＳがＡＧＥとｅｓＲＡＧＥとの結合を阻害した場合、蛍光強度の減少として検出される。
結果
ＬＰＳを加えた場合、蛍光強度は濃度依存的に減少し、ＡＧＥ−ＢＳＡとｅｓＲＡＧＥとの結合を阻害していることが示された（図２）。ＡＧＥが結合するＲＡＧＥの領域と同じ箇所にＬＰＳが結合するものと考えた。
【実施例３】
【０００８】
ＮＦκＢ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ
方法
アッセイに用いたＣ６−ＲＡＧＥ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ細胞は、Ｃ６  ｇｌｉｏｍａにレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ（ＮＦκＢ応答配列の下流にｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を含む）とヒト由来膜結合型ＲＡＧＥ  ｃＤＮＡ発現ベクターをＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（ＴａＫａＲａ，リポソーム型導入試薬）を用いて同時に導入することで樹立した安定発現細胞株である。ＲＡＧＥへのリガンド結合により、下流のシグナル伝達が起こりＮＦκＢが活性化することは既に知られている。従って本系を用いれば、ＲＡＧＥとリガンドとの相互作用をｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の上昇として検出することができる。樹立したクローン株を９６穴プレートにてサブコンフルエントにまで培養し、ＲＡＧＥ  ｓｉＲＮＡ（ＲＡＧＥの発現を抑制）あるいはｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＲＡＧＥ（ｄｎＲＡＧＥ，細胞内ドメインを欠失し細胞内シグナルを生じないもの）発現ベクターを導入（ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ−ｎｅｏ）した。２日後コンフルエントの状態で、０．１％ウシ血清培地に置換し、ＬＰＳ  ５０ｎｇ／ｍｌ（シグマ社の大腸菌由来Ｏ１１１：Ｂ４）で刺激した。刺激開始４時間後にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性をＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ，Ｌａｂｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて測定した。
結果
結果を図３に示す。Ｃ６−ＲＡＧＥ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ細胞においては、ウエスタンブロッティング法により導入したＲＡＧＥ遺伝子の過剰発現が認められた。またＲＡＧＥ  ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉によってその発現は抑制された。ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＲＡＧＥ発現ベクターを導入した細胞においてその発現を確認した。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイにおいて、無刺激の対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較してＬＰＳ  ５０ｎｇ／ｍｌで刺激した細胞においては顕著なｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の上昇が認められた（ＬＰＳ）。またこの活性上昇は、ＲＡＧＥ  ｓｉＲＮＡあるいはｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＲＡＧＥによって部分的にではあるが、しかし有意に抑制した。ＬＰＳがＲＡＧＥと結合する作用によるものであると結論した（ｓｉＲＮＡ，ｄｎＲＡＧＥ）。これは分泌型ＲＡＧＥ２００μｇ／ｍｌの添加によってｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性が有意に抑制されることからも確認できた（ｓＲＡＧＥ２００μｇ／ｍｌ）。ｓＲＡＧＥはマウスのＲＡＧＥ  ｃＤＮＡの細胞外領域だけをｖａｃｕｌｏｃｉｒｕｓを用いて昆虫細胞で発現させ、精製したものである。完全抑制されない原因としては、ＲＡＧＥ以外にもｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４などの他のＬＰＳをリガンドとする受容体が存在し、ＮＦκＢシグナルを生じさせていることが考えられる。
【実施例４】
【０００９】
マウスＬＰＳショックにおけるＲＡＧＥの役割
方法
ＲＡＧＥ欠損マウスとその対照の野生型マウスを用いて、ＬＰＳを腹腔に投与した後の生存率を検討した。ＬＰＳはシグマ社の大腸菌由来Ｏ５５：Ｂ５を使用し、２ｍｇ／４０ｇで投与した。マウスｓＲＡＧＥ（実施例３参照）はＬＰＳ投与３０分前に、３５μｇ／ｍｏｕｓｅで処置した。
結果
結果を図４に示す。ＲＡＧＥ＋／＋野生型マウスとＲＡＧＥ−／−ノックアウトマウスとの比較では、ＲＡＧＥ＋／＋野生型マウスの方が有意にＬＰＳショックでの生存が悪かった（ｐ＜０．０００１）。ｓＲＡＧＥを処置しておくことで、両者の生存率はともに有意に改善した。ＬＰＳが直接ＲＡＧＥを介して激しい炎症反応を引き起こしているものと考えた。ｓＲＡＧＥはＬＰＳと結合し、ＲＡＧＥとの結合を阻害し炎症を和らげている可能性がある。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明によれば、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明によればまた、グラム陰性菌の検出方法が提供される。
本発明によればまた、グラム陰性菌の収集方法が提供される。
本発明によればまた、リポポリサッカライドにより惹起される炎症の治療剤または予防剤が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
2007102410.tif 000002
2007102410.tif 000003
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2007102410.tif 000013
【図１】
2007102410.tif 000014
【図２】
2007102410.tif 000015
【図４】
2007102410.tif 000016
【図３】
2007102410.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月26日(2007.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｙｌｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＲＡＧＥ）ポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する被検物質の作用に基づいて、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する方法。
【請求項２】
ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合に対する増強的効果に基づいて該被検物質を評価することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
下記の工程を含む請求項１または２記載の方法：
１）ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌と、被検物質とを混合し、該混合物中における、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量（Ａ）を測定する、
２）ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌とを混合し、該混合物中における、ＲＡＧＥポリペプチドと、リポポリサッカライドまたはグラム陰性菌との結合量（Ｂ）を測定する、
３）結合量（Ａ）と結合量（Ｂ）との相違に基づき、該被検物質の、グラム陰性菌関連疾患に対する治療薬または予防薬としての効果を評価する。
【請求項４】
被検試料中のグラム陰性菌を検出する方法であって、
ＲＡＧＥポリペプチドと被検試料とを接触させ、ＲＡＧＥポリペプチドと結合した細菌をグラム陰性菌として検出する方法。
【請求項５】
ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用試薬。
【請求項６】
ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌検出用キット。
【請求項７】
試料中のグラム陰性菌を収集する方法であって、
ＲＡＧＥポリペプチドと試料とを接触させ、該試料中のグラム陰性菌をＲＡＧＥポリペプチドと結合させる工程を含む方法。
【請求項８】
ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用試薬。
【請求項９】
ＲＡＧＥポリペプチドを含有するグラム陰性菌収集用キット。
【国際調査報告】
2007102410.tif 000018
2007102410.tif 000019
2007102410.tif 000020
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2007102410.tif 000023
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