【手続補正書】
【提出日】平成19年12月5日(2007.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
初代肝細胞を培養するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および１つまたは複数のポリカチオン性ポリマーが結合したＣＡＲ材料を含み、これによって細胞接着促進表面を形成しているポリマー表面を提供すること、
（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える培地中で前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすること
を含み、それにより前記肝細胞が前記表面に付着して機能状態に維持されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＣＭがエラスチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、およびコラーゲンＶＩからなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリカチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）およびポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が、前記ＣＡＲ材料に非共有結合していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＣＭタンパク質および活性因子が、前記ＣＡＲ材料に共有結合していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＣＭタンパク質がエラスチンおよびコラーゲンＶＩであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＣＭタンパク質がコラーゲンＩＶであり、前記活性因子がポリ−Ｌ−オルニチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＡＲ材料がヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸（ＡＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、およびポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＡＲ材料がＨＡであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
１つまたは複数のＥＣＭタンパク質が三次元（３Ｄ）足場の形であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記修飾されたポリマー表面がフレキシブル材料の形であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記フレキシブル材料がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または他のシリコーンベースのポリマーであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記肝細胞が細胞療法に適した装置または足場の中または上に収容されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法によって成長されたヒト初代肝細胞培養物。
【請求項１７】
被験薬剤を、肝細胞の細胞機能に及ぼす被験薬剤の影響についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＣＡＲ材料および前記ＣＡＲ材料に結合した１つまたは複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含み、これによって前記ＣＡＲ材料と前記１つまたは複数のＥＣＭタンパク質が細胞接着促進表面を形成している、ポリマー組成物を提供する段階と、
（ｂ）培地中の前記表面上で前記肝細胞を培養する段階であって、前記表面は前記細胞の成長および／または維持を支え、被験薬剤は前記培地に含まれるか、または前記表面に結合している段階と、
（ｃ）前記培養の開始後の時間ｔで特異的細胞機能を定量して値を得る段階と、
（ｄ）段階ｃで得られた値を前記被験薬剤の不在下の同一の培養における値と比較する段階と
を含み、前記被験薬剤の存在下での値の増加は前記薬剤が細胞機能を促進／増強することを示し、減少は前記薬剤が細胞機能を減速／阻害することを示すことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記細胞機能が酵素活性、タンパク質の増加または減少した産生、ＲＮＡの増加または減少した産生、増加または減少したビリルビン分泌、増加または減少したアルブミン分泌、および増加または減少した薬物輸送からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞機能が増加または減少したＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
選択的な細胞の付着および機能に有用なＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させるための方法であって、
（ａ）ポリマー表面を提供する段階と、
（ｂ）前記表面を処理してＣＡＲ表面を生成させる段階と、
（ｃ）前記ＣＡＲ表面に、細胞の付着および機能を促進する少なくとも１つのＥＣＭタンパク質およびポリカチオン性ポリマーを共有結合し、それにより細胞接着促進表面を形成し、前記ＥＣＭ修飾ポリマー組成物を生成させる段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
肝細胞の付着または機能の維持を促進するために有用な細胞接着促進（ＣＡＰ）ＥＣＭ修飾組成物であって、１つまたは複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が共有結合して修飾ＣＡＰ表面を形成している、細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料でできたポリマー表面／細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料を用いて作られたポリマー表面を含み、前記タンパク質／表面が、
（ａ）細胞の付着であって、細胞が前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面に実質的に付着しない、細胞の付着、および
（ｂ）任意選択で、ＥＣＭ修飾表面に付着している細胞の機能の維持であって、細胞が前記ペプチドの不在下で前記ＣＡＲ表面上で実質的に機能を維持しない、細胞の機能の維持
を促進することを特徴とする組成物。
【請求項２２】
ポリカチオン性ポリマーが前記ＣＡＲ表面に付着／結合していることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
適切な培養培地を配合するための組成物および／または使用説明書を任意選択で含む、請求項２１に記載の組成物を含むことを特徴とするキット。
【請求項２４】
培養物中の細胞の付着を変調する被験薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）培養培地中で細胞を、（ｉ）ＣＡＲ材料および前記ＣＡＲ材料に結合した１つまたは複数のＥＣＭタンパク質を含み、これによって前記ＣＡＲ材料および１つまたは複数のＥＣＭタンパク質が細胞接着促進表面を形成しているポリマー組成物および（ｉｉ）前記被験薬剤と接触させること、
（ｂ）前記細胞の付着を、前記被験薬剤の不在下での類似した培養物中の細胞の付着と比較して測定すること
を含み、
（ｉ）前記被験薬剤の存在下での増加した付着は、前記被験試料中に前記細胞の付着を刺激する因子が存在することを示し、かつ
（ｉｉ）前記被験薬剤の存在下での減少した付着は、前記試料中に前記細胞の付着を阻害する因子が存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記細胞が初代肝細胞であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地が無血清であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記表面がＣＡＲ  ＡまたはＣＡＲ  Ｂを含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
被験薬剤を、肝細胞の細胞機能に及ぼす被験薬剤の影響についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合し、これによって細胞接着促進表面を形成している、ＣＡＲ材料を含むポリマー組成物を提供する段階と、
（ｂ）前記細胞の成長／維持を支える、培地中の前記表面上で肝細胞を培養し、さらにそれに試験薬剤を提供する段階であって、前記試験薬剤が前記培地中に存在するか、または前記ポリマー表面に結合している段階と、
（ｃ）前記被験薬剤の不在下で前記細胞の成長／維持を支える、培地中の前記表面上で肝細胞を培養する段階と、
（ｄ）段階（ｂ）における培養の開始後の所定時点で特異的細胞機能の値を測定する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られた特異的細胞機能の値を、段階（ｃ）の培養物から定量された同一の特異的細胞機能の値と比較する段階と
を含み、段階（ｅ）の細胞特異的機能の値の相対的な増加は、前記薬剤が細胞機能を促進／増強することを示し、段階（ｅ）の細胞特異的機能の値の相対的な減少は、前記薬剤が細胞機能を減速／阻害することを示すことを特徴とする方法。
【請求項２９】
前記細胞機能が酵素活性、タンパク質の増加または減少した産生、ＲＮＡの増加または減少した産生、増加または減少したビリルビン分泌、増加または減少したアルブミン分泌、および増加または減少した薬物輸送からなる群から選択されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞機能が増加または減少したＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４活性であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
好ましい実施形態では、本方法は、ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合しているＣＡＲ材料を含むことによって細胞接着促進表面を形成しているポリマー表面を提供すること、および（ｂ）前記細胞の成長および／または維持を支える、培地中の前記表面の存在下で前記肝細胞をインキュベートすることを含み、それにより肝細胞が表面に付着して機能状態に維持されることを含む。特に好ましい一実施形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
一実施形態では、本方法は、（ａ）１つまたは複数のＥＣＭタンパク質および任意選択で１つまたは複数の活性因子が結合しているＣＡＲ材料を含むことによって細胞接着促進表面を形成しているポリマー表面を提供する段階、（ｂ）前記肝細胞を培地中の前記表面上で培養する段階であって、前記表面は前記細胞の成長／維持を支え、被験薬剤はその培地に含まれるか、またはその表面に結合している段階、（ｃ）培養の開始後の時間ｔで特異的細胞機能を定量する段階、および（ｄ）段階ｃで得られた値を前記被験薬剤の非存在下で実施された同一の培養における値と比較する段階であって、被験薬剤存在下での値の増加は前記薬剤が細胞機能を促進／増強することを示し、減少は前記薬剤が細胞機能を減速／阻害することを示す段階を含む。培養物中の酵素活性の総レベル、その特徴（例えば形態または染色）を表す細胞数のように当業者に公知の任意の手段によって特異的細胞機能を定量できる。培養を開始後の一定時間での一時点を測定でき、また変化速度を決定するために２つ以上の時点を測定できる。