(57)【要約】保存していた温度による測定値の変化が極力少なく、保存安定性の高いバイオセンサ及びその製造方法を提供することを目的とする。【課題】【解決手段】反応部形成ステップを含むバイオセンサ１０の製造方法において、反応部形成ステップが、作用電極１４及び対電極１６上に、酸化還元酵素を有する第一の反応部用塗布液を塗布し乾燥させて第一層２８を形成する第一層形成ステップと、第一層２８上に、親水性高分子化合物及び電子受容体を有する第二の反応部用塗布液を塗布し乾燥させて第二層３０を形成する第二層形成ステップとを含む製造方法とした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気絶縁基板上に設けられた作用電極及び対電極上に酸化還元酵素を有する反応部を形成する反応部形成ステップを含むバイオセンサの製造方法において、
前記反応部形成ステップが、
前記作用電極及び対電極上に、酸化還元酵素を有する第一の反応部用塗布液を塗布し乾燥させて第一層を形成する第一層形成ステップと、
前記第一層上に、親水性高分子化合物及び電子受容体を有する第二の反応部用塗布液を塗布し乾燥させて第二層を形成する第二層形成ステップと、
を含むバイオセンサの製造方法。
【請求項２】
前記酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである請求項１に記載するバイオセンサの製造方法。
【請求項３】
前記親水性高分子化合物がポリビニルピロリドンである請求項１又は請求項２に記載するバイオセンサの製造方法。
【請求項４】
前記電子受容体がフェリシアン化カリウムである請求項１〜請求項３のいずれかに記載するバイオセンサの製造方法。
【請求項５】
前記親水性高分子化合物がポリビニルピロリドンであり、前記電子受容体がフェリシアン化カリウムであり、該フェリシアン化カリウムに対する該ポリビニルピロリドンの重量比が０．５〜５０％である請求項１又は請求項２に記載するバイオセンサの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載するバイオセンサの製造方法により製造するバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖値の測定等を行うためのバイオセンサの製造方法、及びその製造方法によって製造したバイオセンサに関する。【０００２】
従来から、検体の血糖値等を測定するバイオセンサ及びその製造方法が案出されている（例えば、特許文献１〜特許文献４参照。）。図４に従来のバイオセンサ１を示す。このバイオセンサ１は、電極絶縁基板２上に作用電極３及び対電極４を平行近接して設け、電極絶縁基板２、作用電極３及び対電極４上に、反応部セル５を有するマスクシート６を熱接着し、反応部セル５内の作用電極３及び対電極４上に酸化還元酵素を含む反応部用塗布液を塗布し乾燥して反応部７を形成することにより製造されていた。なお、マスクシート６上には電気絶縁性のスペーサシート８及び透明のカバーシート９が積層される。このバイオセンサ１によれば、血糖値計測表示器に取り付けて検体を取り込み、血糖値計測表示器が血糖値を計測表示することにより、血糖値を認識できる。【０００３】
ここで、一般に、バイオセンサによる測定値は、その温度依存性により、保存していた温度により測定値が変化することが知られている。例えば、常温よりも高い温度で保存した後に血糖値等を測定した場合、実際よりも高く検知することが知られている。このため、バイオセンサの保存には、特別の配慮や保存装置が必要であった。【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００４／０１７０５７号パンフレット
【特許文献２】特公平７−１１４７０５号公報
【特許文献３】特許第３０６３４４２号公報
【特許文献４】特許第３４８３３１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者は、このような課題の原因を究明してこのような課題を解決するべく、鋭意研究を重ねた結果、本発明に至ったのである。【０００６】
すなわち、本発明は、保存していた温度による測定値の変化が極力少なく、保存安定性の高いバイオセンサ及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のバイオセンサの製造方法は、電気絶縁基板上に設けられた作用電極及び対電極上に酸化還元酵素を有する反応部を形成する反応部形成ステップを含むバイオセンサの製造方法において、前記反応部形成ステップが、前記作用電極及び対電極上に、酸化還元酵素を有する第一の反応部用塗布液を塗布し乾燥させて第一層を形成する第一層形成ステップと、前記第一層上に、親水性高分子化合物及び電子受容体を有する第二の反応部用塗布液を塗布し乾燥させて第二層を形成する第二層形成ステップと、を含むことを特徴とする。【０００８】
また、本発明のバイオセンサの製造方法は、前記バイオセンサの製造方法において、前記酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼであることを特徴とする。【０００９】
また、本発明のバイオセンサの製造方法は、前記バイオセンサの製造方法において、前記親水性高分子化合物がポリビニルピロリドンであることを特徴とする。【００１０】
また、本発明のバイオセンサの製造方法は、前記バイオセンサの製造方法において、前記電子受容体がフェリシアン化カリウムであることを特徴とする。【００１１】
また、本発明のバイオセンサの製造方法は、前記バイオセンサの製造方法において、前記親水性高分子化合物がポリビニルピロリドンであり、前記電子受容体がフェリシアン化カリウムであり、該フェリシアン化カリウムに対する該ポリビニルピロリドンの重量比が０．５〜５０％であることを特徴とする。【００１２】
本発明のバイオセンサは、上記本発明のバイオセンサの製造方法により製造することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のバイオセンサの製造方法及びバイオセンサによれば、酸化還元酵素を有する第一の反応部用塗布液を塗布し乾燥して第一層を形成し、親水性高分子化合物及び電子受容体を有する第二の反応部用塗布液を塗布し乾燥して第二層を形成するため、製造したバイオセンサにおいて、酸化還元酵素が第一層内に存在し、電子受容体が第二層内に存在する。これにより、酸化還元酵素と電子受容体が分離して存在するため、乾燥状態での長期保存性を高めることができる。また、酸化還元酵素を有する第一層を第二層でカバーする形態となるため、酸化還元酵素が無用に反応することなく、保存性を高めることができる。実際に、バイオセンサを製造して、高温で保存したものと室温（２５℃）で保存したものとの測定値の差を求めたところ、第一層を溶解しない溶媒を用いて第二層を形成した場合の方が、第一層を溶解する溶媒を用いて第二層を形成した場合よりも、その差が小さく保存温度による影響が少ないことが判明した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
次に、本発明に係るバイオセンサの製造方法及びバイオセンサについて、図面に基づいて詳しく説明する。【００１５】
図１及び図２において、符号１０は本発明のバイオセンサである。このバイオセンサ１０の製造方法は、電気絶縁基板１２上に作用電極１４及び対電極１６を平行近接して設ける電極部形成ステップと、反応部セル１８を有するマスクシート２０を熱接着するマスクステップと、反応部セル１８内の作用電極１４及び対電極１６上に酸化還元酵素を有する反応部２２を形成する反応部形成ステップと、マスクシート２０上に電気絶縁性のスペーサシート２４及び透明のカバーシート２６を積層する積層ステップとを含む。【００１６】
反応部形成ステップは、作用電極１４及び対電極１６上に、酸化還元酵素を有する第一の反応部用塗布液を塗布し乾燥させて第一層２８を形成する第一層形成ステップと、第一層２８上に、親水性高分子化合物及び電子受容体を有する第二の反応部用塗布液を塗布し乾燥させて第二層３０を形成する第二層形成ステップとを含む。第一層形成ステップにおいては、例えば、酸化還元酵素を水に溶かして塗布する。第二層形成ステップにおいて、第一層２８が溶けないように、親水性高分子化合物は、第一層２８が溶けない溶媒で溶解される。この溶媒として、例えば、エチルセロソルブやエタノールが挙げられる。このような反応部形成ステップにより、図１に示すように、第一層２８及び第二層３０から成る反応部２２が形成される。【００１７】
電気絶縁基板１２の材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート、脂肪族ユニット及び芳香族ユニットからなる生分解性ポリエステル樹脂等のポリエステル系樹脂シート、より耐熱性、耐薬品性、強度等に優れるポリアミドイミドシート、ポリイミドフィルムシート等のプラスチックシート、セラミック等の無機系基板が挙げられる。【００１８】
作用電極１４及び対電極１６は、電気絶縁基板１２上に、例えば白金、金、パラジウム、インジウム−スズ酸化物等の良電導体によって形成される。形成方法としては、ホットスタンピングが考えられる、真空蒸着又はスパッタリングによる方が微細な電極パターンを精度良く、迅速に形成できるので好ましい。スパッタリングの場合は、両極形成外をマスキングすることで一挙に形成できる。【００１９】
酸化還元酵素は、例えば、グルコースを測定する場合には、グルコースオキシダーゼが挙げられる。グルコースオキシダーゼは、グルコースと反応して、グルコン酸及び過酸化水素が生成する。また、アルコール値を測定する場合には、アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼを使用する。また、乳酸を測定する場合には、乳酸オキシダーゼ又は乳酸デヒドロゲナーゼを使用する。また、尿酸を測定する場合には、ウリカーゼを使用する。酸化還元酵素の塗布は水に溶かして行う。【００２０】
親水性高分子化合物は、水、アルコール及びこれらの混合溶媒に可溶な高分子化合物である。親水性高分子化合物の一例としてポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられる。親水性高分子化合物としてのポリビニルピロリドンは、エチルセロソルブ等の溶剤に溶解されて使用される。その他、親水性高分子化合物としては、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシルビニルポリマー等が挙げられる。親水性高分子化合物を第二層３０に含むことにより、電子受容体を固定することができる。【００２１】
電子受容体は、一般には酵素の酸化還元を促進させる無機又は有機の微細粉末状化合物である。例えば、フェリシアン化アルカリ金属塩（特にフェリシアン化カリウム金属塩が好ましい。）、フェロセン又はそのアルキル置換体、ｐ−ベンゾキノン、メチレンブルー、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェナジンメトサルフェート、２、６−ジクロロフェノール−インドフェノール等が挙げられる。フェリシアン化アルカリ金属塩、フェロセン系が、電子移動媒体としての働きが安定しており、水、アルコール類、又はこれら混合溶媒等の水性溶媒に良く溶けるため、電子受容体として有効に作用する。親水性高分子化合物としてポリビニルピロリドンを選択し、電子受容体としてフェリシアン化カリウムを選択した場合、フェリシアン化カリウムに対するポリビニルピロリドンの重量比は０．５〜５０％（０．００５〜０．５）が好ましい。０．５％未満で少なすぎる場合には、電子受容体を固定することができない。一方、５０％より多いと、血液への溶解速度が遅くなりすぎる。【００２２】
以上、本発明のバイオセンサ１０の製造方法について説明したが、このようにして製造されたバイオセンサ１０は、乾燥状態で保存された後、適宜使用される。バイオセンサ１０の製造方法によれば、酸化還元酵素を有する第一の反応部用塗布液を塗布し乾燥して第一層２８を形成し、親水性高分子化合物及び電子受容体を有する第二の反応部用塗布液を塗布し乾燥して第二層３０を形成するため、製造したバイオセンサ１０において、酸化還元酵素が第一層２８内に存在し、電子受容体が第二層３０内に存在する。これにより、酸化還元酵素と電子受容体が分離して存在するため、乾燥状態での長期保存性を高めることができる。【００２３】
なお、このバイオセンサ１０による血糖値の測定について以下に説明する。血糖値の測定は、バイオセンサ１０をセンサカバー３４に挿入固定した状態で、図２に示すように、血糖値計測表示器３６に取り付けて、バイオセンサ１０の先端部を血液３８に接触させることによって行う。バイオセンサ１０の先端部に接触した血液３８は、図３（ａ）に示すように、反応層２２の第二層３０に接触する。血液３８が第二層３０に接触すると、第二層３０及び第一層２８に浸透しながら酵素反応し、その際の電気化学変化が作用電極１４及び対電極１６で検出されて血糖値が測定される。【００２４】
以上、本発明の実施形態について図面に基づいて説明したが、本発明は図示したものには限定されない。例えば、本発明の用途は、血糖値の測定に限定されず、広く、医学的、生物学的、化学的な検査又は試験等であっても良い。また、血糖値以外の血液検査であっても良い。また、バイオセンサの形状は、本発明の作用効果が生じれば特に限定されない。【００２５】
その他、本発明の技術的範囲には、その趣旨を逸脱しない範囲で当業者の知識に基づき種々なる改良、修正、変形を加えた態様も含まれる。また、同一の作用又は効果が生じる範囲内で、いずれかの発明特定事項を他の技術に置換した形態で実施しても良い。
【実施例】
【００２６】
以下のように、実際に本発明のバイオセンサ１０を製造して血糖値を測定し、保存温度による測定値の差を評価した。【００２７】
（実施例１）
グルコースオキシダーゼ７４ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水４．９ｇに溶解した液を、電極系表面に１μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層２８を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）２．１６ｇに、分子量約４万のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を２４０ｍｇ溶解した後、微粒子化したフェリシアン化カリウム０．８ｇを混合した液を、第一層２８上に０．８μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層３０を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するＰＶＰの重量比は３０％である。【００２８】
（実施例２）
グルコースオキシダーゼ５０ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水３．３ｇに溶解した液を、電極系表面に１μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層２８を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）１．７７ｇに、分子量約４万のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を２２ｍｇ溶解した後、微粒子化したフェリシアン化カリウム０．６ｇを混合した液を、第一層２８上に０．８μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層３０を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するＰＶＰの重量比は３．７％である。【００２９】
（実施例３）
グルコースオキシダーゼ５０ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水３．３ｇに溶解した液を、電極系表面に１μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層２８を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）１．７５ｇに、分子量約４万のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を４５ｍｇ溶解した後、微粒子化したフェリシアン化カリウム０．６ｇを混合した液を、第一層２８上に０．８μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層３０を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するＰＶＰの重量比は７．５％である。【００３０】
（実施例４）
グルコースオキシダーゼ５０ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水３．３ｇに溶解した液を、電極系表面に１μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層２８を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）１．６８ｇに、分子量約４万のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を１１２ｍｇ溶解した後、微粒子化したフェリシアン化カリウム０．６ｇを混合した液を、第一層２８上に０．８μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層３０を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するＰＶＰの重量比は１８．７％である。【００３１】
（実施例５）
グルコースオキシダーゼ５０ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水３．３ｇに溶解した液を、電極系表面に１μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層２８を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）１．５７ｇに、分子量約４万のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を２２５ｍｇ溶解した後、微粒子化したフェリシアン化カリウム０．６ｇを混合した液を、第一層２８上に０．８μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層３０を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するＰＶＰの重量比は３７．５％である。【００３２】
（実施例６）
グルコースオキシダーゼ７７ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水５．１ｇに溶解した液を、電極系表面に１μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層２８を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）５．３８ｇに、分子量約３６万のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を７１ｍｇ溶解した後、微粒子化したフェリシアン化カリウム２．０５ｇを混合した液を、第一層２８上に０．８μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層３０を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するＰＶＰの重量比は３．５％である。【００３３】
（実施例７）
グルコースオキシダーゼ５２ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水３．２ｇに溶解した液を、電極系表面に１μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層２８を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）９．３０ｇに、分子量約１０２５０のポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）−ポリプロピレンオキサイド（ＰＰＯ）ブロック共重合体（商品名：ニューポールＰＥ−７８）を７５０ｍｇ溶解した後、微粒子化したフェリシアン化カリウム０．８１ｇを混合した液を、第一層２８上に１．０μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層３０を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するニューポールの重量比は９２．６％である。【００３４】
（実施例８）
グルコースオキシダーゼ４９ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水３．１ｇに溶解した液を、電極系表面に１μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層２８を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）２．４０ｇに、分子量約４１００のポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）−ポリプロピレンオキサイド（ＰＰＯ）ブロック共重合体（商品名：ニューポールＰＥ−７５）を６００ｍｇ溶解した後、微粒子化したフェリシアン化カリウム０．８０ｇを混合した液を、第一層２８上に０．８μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層３０を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するニューポールの重量比は７５％である。【００３５】
（実施例９）
グルコースオキシダーゼ７５ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水４．９ｇに溶解した液を、電極系表面に１μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層２８を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）３．２４ｇに、分子量約４１００のポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）−ポリプロピレンオキサイド（ＰＰＯ）ブロック共重合体（商品名：ニューポールＰＥ−７５）を３６０ｍｇ溶解した後、微粒子化したフェリシアン化カリウム１．２０ｇを混合した液を、第一層２８上に０．８μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層３０を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するニューポールの重量比は３０％である。【００３６】
（比較例）
グルコースオキシダーゼ５１ｍｇ（安定化剤５０％を含む）を、水３．２ｇに溶解した液を、電極系表面に1μｌ滴下し、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第一層を形成した。次に、エチルセロソルブ（２−エトキシエタノール）２．９８ｇに、分子量約４１００のポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）−ポリプロピレンオキサイド（ＰＰＯ）ブロック共重合体（商品名：ニューポールＰＥ−７５）を２４０ｍｇ溶解した後、結晶セルロース（商品名：セオラスクリーム、含水率９０％）１．１２ｇ及び、微粒子化したフェリシアン化カリウム０．８１ｇを混合した液を、第一層上に１．３μｌ滴下、４０℃のコンベア乾燥炉で６分間乾燥して第二層を形成した。上記の組成において、フェリシアン化カリウムに対するニューポールの重量比は２９．６％である。また、フェリシアン化カリウムに対する結晶セルロースの重量比は１３．８％である。なお、本比較例に用いた塗布液中には水を１９．６％含んでいる。そのため、フェリシアン化カリウムの一部が溶解しており、さらに第一層上に滴下した際には、第一層のＧＯＤの一部と溶解混合している。【００３７】
（評価方法）
乾燥剤（活性アルミナ）約２５ｍｇとともに、センサチップをアルミ個包装した後、熱安定性評価のために２５℃と４０℃で１ヶ月保存した。測定はグルコース濃度３０,５０,１３０ｍｇ／ｄｌに調整した全血を用い、４０℃保存したセンサの測定結果から２５℃保存したセンサの測定結果を差し引き、熱的安定性の指標とした。この測定結果の差について、実施例１〜６によって製造したバイオセンサ１０に関して表１に、実施例７〜９によって製造したバイオセンサ１０に関して表２に、比較例によって製造したバイオセンサに関して表３に示す。
【表１】
2007108388.tif 000003
【表２】
2007108388.tif 000004
【表３】
2007108388.tif 000005
実施例１〜６について、測定結果の差の絶対値の平均は、グルコース濃度３０ｍｇ／ｄｌの場合４．０ｇ／ｄｌ、グルコース濃度５０ｍｇ／ｄｌの場合４．７ｍｇ／ｄｌ、グルコース濃度１３０ｍｇ／ｄｌの場合４．２ｍｇ／ｄｌであった。実施例７〜９について、測定結果の差の平均値は、グルコース濃度３０ｍｇ／ｄｌの場合２１．３ｍｇ／ｄｌ、グルコース濃度５０ｍｇ／ｄｌの場合１８．７ｍｇ／ｄｌ、グルコース濃度１３０ｍｇ／ｄｌの場合１５．７ｍｇ／ｄｌであった。これに対して、比較例では、それぞれ９７、９６、７１ｍｇ／ｄｌであり、第一層２８を溶解しない溶媒を用いて第二層３０を塗布した方が測定結果の差が少なかった。特に、ポリビニルピロリドンを用いた場合が最も安定性が高かった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のバイオセンサの製造方法は、バイオセンサの保存温度の影響を少なくして保存性を高めることができる。このため、種々のバイオセンサの製造のために広く利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明のバイオセンサを示す図であり、同図（ａ）は平面図であり、同図（ｂ）はＡ−Ａ線切断部断面図である。
【図２】図１のバイオセンサの使用状態を示す正面図である。
【図３】図１のバイオセンサの使用状態を示す図であり、同図（ａ）は血液が接触した瞬間を示すＡ−Ａ線切断部断面図であり、同図（ｂ）は血液が反応した状態を示すＡ−Ａ線切断部断面図である。
【図４】従来のバイオセンサを示す図であり、同図（ａ）は平面図であり、同図（ｂ）はＡ−Ａ線切断部断面図である。
【符号の説明】
【００４０】
１０：バイオセンサ
１２：電気絶縁基板
１４：作用電極
１６：対電極
１８：反応部セル
２０：マスクシート
２２：反応部
２４：スペーサシート
２６：カバーシート
２８：第一層
３０：第二層
【図１】
2007108388.tif 000006
【図２】
2007108388.tif 000007
【図３】
2007108388.tif 000008
【図４】
2007108388.tif 000009
【国際調査報告】
2007108388.tif 000010
2007108388.tif 000011
2007108388.tif 000012
2007108388.tif 000013