【手続補正書】
【提出日】令和1年6月24日(2019.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【図１−１】緑膿菌シデロフォアの構造を示す図である。図１Ａ〜Ｃは、３つの緑膿菌ピオベルジンの構造を示す。図１Ａ：Ｐｖｄ  Ｉ型の構造（Ｂｉｒｓｋｏｔら、１９８９参照）；図１Ｂ：Ｐｖｄ  ＩＩ型の構造（Ｂｉｒｓｋｏｔら、１９８９参照）；図１Ｃ：Ｐｖｄ  ＩＩＩ型の構造（Ｇｉｐｐら、１９９１）；図１Ｄ：クロモフォア部分に付着したＲは、スクシニル、スクシンアミド、またはα−ケトグルタリル（ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｙｌ）側鎖であってもよい；および図１Ｅ：ピオケリンの構造（Ｂｒａｎｄｅｌら、２０１１）。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】配列番号１６のリポカリンムテインに結合しているＰｖｄ  Ｉ  ｓ（＋Ｆｅ）（Ａ）、配列番号３６のリポカリンムテインに結合しているＰｖｄ  ＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ）（Ｂ）、配列番号５３のリポカリンムテインに結合しているＰｖｄ  ＩＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ）（Ｃ）、および配列番号６２に結合しているピオケリン（＋Ｆｅ）（Ｄ）の表面プラズモン共鳴による会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）および解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の典型的な測定値を示す図である。さらに、１２００ｎＭの各シデロフォア（ピオケリンについては２００ｎＭ））が配列番号６４の陰性対照に結合しないことが図２Ｅ〜Ｈに示されている。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３】表面プラズモン共鳴により決定した配列番号３５のリポカリンムテインの例示的特異性および交差反応性プロフィールを示す図である。ピオベルジンＩＩスクシニル、スクシンアミド、およびα−ケトグルタリルへの特異的結合が示され、一方、Ｉ型およびＩＩＩ型のピオベルジン、ピオケリン、エンテロバクチン、ならびにデフェロキサミンへの結合がないことが示されている。全ての分析物に対して２μＭの高濃度が使用されている。
【図４Ａ】増殖阻害アッセイからの例示的データを示す図である。図４Ａ：配列番号１６のＰｖｄ  Ｉ特異的ムテインは、ムテインなし増殖対照培養物と比べてＰｖｄ  Ｉ特異的緑膿菌株（ＡＴＣＣ１５６９２）の増殖阻害を示す。
【図４Ｂ】増殖阻害アッセイからの例示的データを示す図である。図４Ｂ：配列番号１９および３６のＰｖｄ  ＩＩ特異的ムテインは、ムテインなし増殖対照培養物と比べてＰｖｄ  ＩＩ特異的緑膿菌株（ＡＴＣＣ２７８５３）の増殖阻害を示す。配列番号３６は、配列番号１９と比べてより高い結合親和性を有し、より大きな増殖阻害を示す。
【図４Ｃ】増殖阻害アッセイからの例示的データを示す図である。図４Ｃ：配列番号５３のＰｖｄ  ＩＩＩ特異的ムテインは、ムテインなし増殖対照培養物と比べてＰｖｄ  ＩＩＩ特異的緑膿菌株（ＡＴＣＣ３３３６０）の増殖阻害を示す。
【図４Ｄ】増殖阻害アッセイからの例示的データを示す図である。図４Ｄ：配列番号６２のＰｃｈ特異的ムテインは、ムテインなし増殖対照培養物と比べて鉄取り込みをＰｃｈに依存するＰｖｄ  Ｉノックアウト緑膿菌株（ＡＴＣＣ１５６９２  ΔｐｖｄＡ）の増殖阻害を示す。１０μＭリポカリンムテインを該アッセイに適用した。
【図５】細菌チャレンジの１時間前および細菌チャレンジ時点の配列番号１９の投与が、マウスにおける感染の発生を用量依存的に防ぐことをマウスにおける緑膿菌誘発肺感染モデルで示す図である。２００μｇ／マウスの配列番号１９から開始し、有意な予防効果が観察された。最大効果は２０００μｇ／マウスであった。
【図６】１位の開始メチオニン、２位のリジン、３〜８位のヘキサヒスチジンタグ、９〜１５位のアミノ酸ＤＹＤＩＰＴＴのリンカー領域（配列番号１３２）、１６〜２２位のタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１３３）と、これに続く２３位以降の目的とするムテインのアミノ酸配列を含む、結晶化発現アミノ酸配列（配列番号１２９）を示す図である。
【図７】配列番号３１−Ｐｖｄ−Ｆｅ複合体構造を示す図である。２つの配列番号３１の分子、すなわち非対称ユニットからのＡ鎖およびＢ鎖のオーバーレイが示されている。
【図８】配列番号３１とＰｖｄ−Ｆｅの相互作用を示す図である。非対称ユニットからの２つの分子がオーバーレイされている。Ｐｖｄ−Ｆｅと相互作用する側鎖が描かれている。
【図９】Ｐｖｄ組成を示す図である。鉄結合に関与する酸素原子が四角で囲まれている。
【図１０Ａ】本発明による融合分子の構造を示す図である。リポカリンムテイン１、２、３、および４（ＬＭ１、２、３、４）を、リンカー分子（ここでは配列（Ｇ４Ｓ）２のペプチドリンカー；配列番号１４１参照）を介して遺伝子的に融合させた。ＬＭ１（配列番号３４または３６）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ２（配列番号１６または１７）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ３（配列番号５０または５３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ４（配列番号６２または６３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオケリンシデロフォアに結合した。融合分子構築物（配列番号１３４または１３５）は、１個の分子に全ての緑膿菌シデロフォアに対する結合能を含み、各Ｐｖｄ群に対する１つの結合部分およびピオケリンに対する１つの結合部分を有した。
【図１０Ｂ】本発明によるＦｃ融合分子構築物の構造を示す図である。リポカリンムテイン１、２、３、および４（ＬＭ１、２、３、４）を、リンカー分子（ここでは配列（Ｇ４Ｓ）２のペプチドリンカー；配列番号１４１参照）を介してヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメイン（ｈｕ  ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１４０）のＮ末端に遺伝子的に融合した。ＬＭ１（配列番号３４または３６）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ２（配列番号１６または１７）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ３（配列番号５０または５３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ４（配列番号６２または６３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオケリンシデロフォアに結合した。Ｆｃ融合分子構築物（配列番号１３６または１３７）は、１個の分子に全ての緑膿菌シデロフォアに対する結合能を含み、各Ｐｖｄ群およびピオケリンに対する２つの結合部分を有した。
【図１０Ｃ】本発明によるＦｃ融合分子構築物の構造を示す図である。リポカリンムテイン１、２、３、および４（ＬＭ１、２、３、４）を、リンカー分子（ここでは配列（Ｇ４Ｓ）２のペプチドリンカー；配列番号１４１参照）を介してヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメイン（ｈｕ  ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１４０）のＣ末端に遺伝子的に融合させた。ＬＭ１（配列番号３４）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ２（配列番号１７）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ３（配列番号５０）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ４（配列番号６３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオケリンシデロフォアに結合した。Ｆｃ融合分子構築物（配列番号１３８）は、１個の分子に全ての緑膿菌シデロフォアに対する結合能を含み、各Ｐｖｄ群およびピオケリンに対する２つの結合部分を有した。
【図１０Ｄ】本発明によるＦｃ融合分子構築物の構造を示す図である。リポカリンムテイン１および２および３および４（ＬＭ１、２、３、４）を、リンカー分子（ここでは配列（Ｇ４Ｓ）２のペプチドリンカー；配列番号１４１参照）を介して遺伝子的に融合させた。ＬＭ１およびＬＭ２は、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメイン（ｈｕ  ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１４０）のＮ末端に遺伝子的に融合させ、ＬＭ３およびＬＭ４は、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメイン（ｈｕ  ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１４０）のＣ末端に遺伝子的に融合させた。ＬＭ１（配列番号３４）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ２（配列番号１７）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ３（配列番号５０）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ４（配列番号６３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオケリンシデロフォアに結合した。Ｆｃ融合分子構築物（配列番号１３９）は、１個の分子に全ての緑膿菌シデロフォアに対する結合能を含み、各Ｐｖｄ群およびピオケリンに対する２つの結合部分を有した。
【図１１】精製融合分子（ここでは配列番号１３４）のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図１２】ＥＬＩＳＡベースのアッセイで決定した、溶液中の異なるピオベルジン群の鉄負荷スクシニルバリアントおよび鉄負荷ピオケリンへの、配列番号１３７、１３８、および１３９の異なるＦｃ融合分子構築物ならびに配列番号１７、３４、５０、および６３の各単一リポカリンムテインの結合を示す図である。全てのＦｃ融合分子フォーマットが単一標的への結合において活性であり、単一リポカリンムテインのＩＣ５０値に匹敵するＩＣ５０値を有した。
【図１３】融合分子（ここでは配列番号１３４）が、ピオベルジンおよびピオケリンの同時会合の能力があることを示す図である。スクシニル残基を有する各群（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）のそれぞれからのビオチン化ピオベルジンは、ニュートラアビジン被覆ＭＳＤプレートで捕捉し、融合分子を結合させた。結合融合分子は、スルホ−タグ標識ピオケリンにより検出した。
【図１４−１】融合分子（ここでは配列番号１３４）が、鉄制限培地におけるＰｖｄ  Ｉ（Ａ）、Ｐｖｄ  ＩＩ（Ｂ）、もしくはＰｖｄ  ＩＩＩ（Ｃ）を産生する株、またはΔｐｖｄＡ  Ｐｖｄ  ＩＩノックアウト株（Ｄ）のどちらかの増殖を阻害できることを示す図である。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１５】融合分子（ここでは配列番号１３４、ＲＡ１０６８０５５０と呼ばれる）が、３日目の単回投与後の感染慢性モデルにおける緑膿菌肺負荷量（肺組織のＣＦＵ／グラム）を有意に低減すること、および１５日目まで再発が起こらないことを示す図である。図１５はさらに、融合分子がトブラマイシン活性に拮抗しないこと、および併用療法では２つの活性がシナジーを生むことを示している。各処置の幾何平均負荷が水平バーにより示されている。各列の上にビヒクルと比べたその処置群のＬｏｇ１０減少（ＬｏｇＲ）が記録されている（ＬＯＤ＝検出限界）。
【図１６】融合分子（ここでは配列番号１３４、ＲＡ１０６８０５５０とも呼ばれる）が、感染ラットの肺における総白血球数の増加をブロックし、それにより感染のクリアランスを増加させることを示す図である。トブラマイシン／融合分子併用は、それぞれの単一処置と対比して明らかな利点を示す。感染３、５、７、９、および１５日後の絶対ＢＡＬ白血球（単球および好中球）数平均＋ＳＤ（ＢＡＬ  １ｍｌあたりの細胞）（Ｌｏｇスケール）。
【図１７】融合分子が、定着の初期段階（Ａ）または定着の確立（Ｂ）中に毒性因子発現を減少させることを示す図である。配列番号１３４のテスト融合分子は、緑膿菌のｒｈＩＩの毒性遺伝子発現に対する有意な効果を示す。ｒｈｌＩは、Ｎ−ブタノイルホモセリンラクトン（ＢＨＬ）を産生してクオラムセンシングに関与する。ＢＨＬはその受容体ＲｈＩＲに結合し、それにより遺伝子の相補体（自身の遺伝子座を含む）の発現を誘導する（自己誘導性回路（ａｕｔｏｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｉｔ）を補完する）。
【図１８】融合分子の結合能が、４つのリポカリンムテインを分けるリンカー分子の長さに影響されないことを示す図である。テストしたリンカー分子は、グリシン、ＧＳＧＧＳＧ（配列番号１４２）、および（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１４１）であった。
【図１９−１】Ｆｃ融合分子が、鉄欠乏培地において細菌を指数関数的に増殖させてピオベルジンの産生を防ぐことを示す図である。Ｆｃ融合分子（配列番号１３６）または対照Ｆｃ融合分子による処置時のｃｆｕ／ｍｌの平均およびｓ．ｅ．ｍ．ならびに蛍光任意単位値が、緑膿菌株ＡＴＣＣ２７８５３（ＡおよびＢ）、株ＡＴＣＣ１５６９２（ＣおよびＤ）および株ＡＴＣＣ３３３６０（ＥおよびＦ）について示されている。
【図１９−２】図１９−１の続き。
【図１９−３】図１９−２の続き。
【図２０−１】Ｆｃ融合分子が、鉄欠乏培地において細菌を指数関数的に増殖させてピオベルジンの産生を防ぐことを示す図である（図１９も参照のこと）。Ｆｃ融合分子（配列番号１３６）または対照Ｆｃ融合分子による処置時のピオベルジン蛍光の正規化相対量が、株ＡＴＣＣ２７８５３（Ａ）、ＡＴＣＣ１５６９２（Ｂ）、およびＡＴＣＣ３３３６０（Ｃ）について示されている。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２１】図１９および２０に示された効果がピオベルジン特異的であることを示す図である。株ＡＴＣＣ２７８５３およびＡＴＣＣ２７８５３のｐｖｄＡ／ｐｃｈＤ二重変異体株の培養物における蛍光の平均値は、これらのシデロフォアを合成することができない変異体株が蛍光シグナルを全く示さないことを示している。
【図２２】図１９および２０に示された効果がピオベルジン特異的であることを示す図である（図２１も参照のこと）。蛍光シグナルを正規化するために、野生型ＡＴＣＣ２７８５３の上清から得られた精製ピオベルジンＩＩを使用して蛍光シグナルの収集前に培養物をスパイクし、検量線を得た。
【図２３】Ｆｃ融合分子存在下の蛍光シグナルの低下は、該化合物によるピオベルジン結合時の蛍光クエンチングによるものではなかったことを示す図である。Ｆｃ融合分子（配列番号１３６）はピオベルジンを含有する培養上清（ＡＴＣＣ２７８５３の濾過した２４時間培養物で得られた）にその場で添加し、蛍光を即座におよび２４時間後に読み取った。この実験で観察された蛍光の平均値に示されているように、蛍光クエンチングは検出されなかった。
【図２４】Ｆｃ融合分子が細菌増殖の動態に影響することを示す図である。株ＡＴＣＣ１５６９２およびＡＴＣＣ３３３６０に対するＦｃ融合分子（配列番号１３６）による１ｍｇ／ｍＬ処置の影響は、それぞれ（Ａ）および（Ｂ）にｃｆｕ／ｍＬの平均およびｓ．ｅ．ｍ．として示されている。
【図２５】Ｐｐｃｈｄ転写活性に対する鉄濃度の影響を示す図である。観察された発光の平均およびｓ．ｅ．ｍ．は、ｐｃｈＤプロモーター発現が鉄を添加しないとＣ−ＭＳ培地で誘導され、鉄添加により抑制され、それによりレポーター融合の機能性を実証したことを示している。
【図２６】様々な量の補充鉄の存在下、Ｐｐｃｈｄ転写活性に対するＦｃ融合分子（配列番号１３６）による処置の影響を示す図である。観察された発光の平均およびｓ．ｅ．ｍ．は、補充した鉄の量に関わらずＦｃ融合分子の存在下でプロモーター活性が消失したのに対し、対照Ｆｃ融合分子は影響がなかったことを示している。
【図２７】鉄補充せずにテストしたＰｐｃｈＤ転写活性に対する、一連の用量のＦｃ融合分子（配列番号１３６）の影響を示す図である。観察された発光の平均およびｓ．ｅ．ｍ．の点を標準用量反応曲線にフィットさせ、Ｆｃ融合分子についてＩＣ５０値０．０３ｍｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ：０．０２〜０．０５）を得たのに対し、アイソタイプ対照Ｆｃ融合分子については不明確であった。