【手続補正書】
【提出日】令和1年5月27日(2019.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオールグリコシドを産生する方法であって、
（ａ）第１の培地中で第１のｐＨにて、１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生可能な遺伝子操作酵母を増殖させることと、
（ｂ）前記第１の培地に組成物を添加して、前記第１のｐＨよりも高い第２のｐＨを有する第２の培地を用意することと、
（ｃ）前記遺伝子操作酵母を用いて第２の培地を発酵させて、前記第２の培地中で前記第２のｐＨにて、前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生することと、を含む前記方法。
【請求項２】
前記第１のｐＨが５．８未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のｐＨが４．０〜５．５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のｐＨが５．８〜８の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２のｐＨが５．８〜７．５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のｐＨが６．５〜７．５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２のｐＨが５．８〜６．５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のｐＨが５．８〜６．２の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が第２のｐＨに調整する塩基を含み、前記塩基が水酸化アンモニウム、酵母抽出物、尿素、及び硫酸アンモニウムからなる群から選択される窒素含有化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
水酸化アンモニウム、酵母抽出物、尿素、または硫酸アンモニウムが、前記培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための主要窒素源であり、水酸化アンモニウムまたは尿素が、前記第２の培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための窒素源の９０％（ｗｔ）以上、または９５％（ｗｔ）以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）において、前記組成物が非窒素塩基を含み、前記非窒素塩基が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カルシウムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の培地が２５ｇ／Ｌ以下の濃度でグルコースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の培地が４００ｇ／Ｌ〜７５０ｇ／Ｌの範囲の濃度でグルコースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から２時間以降に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から１０時間以降または最長９６時間までに実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から２４時間以降または最長７２時間までに実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子操作酵母がステップ（ｂ）において前記第２のｐＨにて産生する、前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）は、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が前記第１のｐＨにて維持された場合に産生する前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）の量よりも１０％以上多い、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子操作酵母がステップ（ｂ）において前記第２のｐＨにて産生するレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率は、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が前記第１のｐＨにて維持された場合に産生するレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率よりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）における前記レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が１：２０以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）における前記レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が１：２０〜１：１の範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子操作酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子操作酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子操作酵母が、前記酵母に対して異種である以下のタンパク質のうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法：ＧＧＰＰＳポリペプチド、ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド、カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド、シトクロムＰ４５０リダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ９１−Ｄ２ポリペプチド、及びＥＵＧＴ１１ポリペプチド。
【請求項２４】
前記遺伝子操作酵母が、前記酵母に対して異種である以下のタンパク質のうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する、請求項２２または２３に記載の方法：ＧＧＰＰＳポリペプチド（配列番号６）、切断型Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＣＤＰＳポリペプチド（配列番号７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＫＳポリペプチド（配列番号８）、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＫＯポリペプチド（配列番号９）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＲ２ポリペプチド（配列番号１１）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＥＵＧＴ  １１ポリペプチド（配列番号１３）、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチド（配列番号１４）、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＣＰＲ８ポリペプチド（配列番号１６）、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２）ポリペプチド、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（配列番号１）、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（配列番号３）、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）、変異体または機能的ホモログ、及びＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド（配列番号５）。
【請求項２５】
遺伝子操作酵母において、第１の低分子量ステビオールグリコシドの産生を、第２の高分子量ステビオールグリコシドに対して増加させる方法であって、１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生できる遺伝子操作酵母を、発酵培地中で５．８以上のｐＨにて発酵させるステップを含み、前記遺伝子操作酵母が、５．８未満のｐＨにて産生される前記第１及び第２ステビオールグリコシドの比率よりも大きい比率の前記第１及び第２のステビオールグリコシドを５．８以上のｐＨにて産生する、前記方法。
【請求項２６】
前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生するために遺伝子操作酵母を使用する発酵方法に由来する液体組成物であって、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：２０以上の比率で含む、前記液体組成物。
【請求項２７】
レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：１０〜１：１の範囲の比率で含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：５〜１：１の範囲の比率で含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：１.７５〜１：１の範囲の比率で含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：１．５〜１：１の範囲の比率で含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
発酵培地である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記発酵培地が、１ｇ／Ｌ以上、１．２５ｇ／Ｌ以上、１．５ｇ／Ｌ以上、１．７５ｇ／Ｌ以上、または２．０ｇ／Ｌ以上のレバウジオシドＤ濃度を有する、請求項３０に記載の組成物。