(57)【要約】  本発明は、スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするアミロイドβクリアランス促進剤である。該促進剤は、アルツハイマー病等において脳に蓄積するアミロイドβをクリアランスするのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするアミロイドβクリアランス促進剤。
【請求項２】
有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一、又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の促進剤。
【請求項３】
有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の促進剤。
【請求項４】
有効成分が、（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の促進剤。
【請求項５】
ＤＮＡが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター及び免疫不全症ウイルスベクターから選択される少なくとも１種のベクターに組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第１、２又は４項のいずれかに記載の促進剤。
【請求項６】
アミロイドβが脳内アミロイドβであることを特徴とする請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の促進剤。
【請求項７】
アミロイドβの蓄積部位へ局所投与されることを特徴とする請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の促進剤。
【請求項８】
髄腔内に投与されることを特徴とする請求の範囲第４又は５項記載の促進剤。
【請求項９】
請求の範囲第５項記載の促進剤でトランスフェクトされた細胞を含有することを特徴とする注射剤。
【請求項１０】
スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするアミロイドβの蓄積に起因する疾患の予防又は治療剤。
【請求項１１】
有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一、又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の予防又は治療剤。
【請求項１２】
疾患がアルツハイマー病であることを特徴とする請求の範囲第１０または１１項記載の予防又は治療剤。
【請求項１３】
アミロイドβクリアランス促進を必要とする患者に、治療的に有効量のスカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として投与することを特徴とするアミロイドβクリアランス促進方法。
【請求項１４】
有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一、又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１３項記載のアミロイドβクリアランス促進方法。
【請求項１５】
アミロイドβクリアランス促進剤を製造するための、スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの有効成分としての使用。
【請求項１６】
有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一、又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアミロイドβクリアランス促進剤に関し、更に詳しくはスカベンジャー受容体蛋白質又はそれをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とするアミロイドβクリアランス促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、脳においてアミロイドβの蓄積を特徴とする進行性神経変性疾患で、その蓄積はアルツハイマー病の発病の重要な役割を果たすと考えられている（非特許文献１）。また、アミロイドβ関連疾患の原因は、ミクログリア、アストロサイト又は脈管系によるアミロイドβの不十分なクリアランスに起因するかもしれないと考えられている（非特許文献２〜４）。ミクログリアとアストロサイトはアミロイドβをクリアランスする能力を有することが知られており（非特許文献５〜８）、例えば、培養された野生型マウスのアストロサイトは、アルツハイマー病の遺伝子導入マウスモデルのアミロイドβ蓄積新鮮脳において、アミロイドβの結合とクリアランスに寄与することが知られている（非特許文献８）。
また、ミクログリア、アストロサイト及び脈管系によるアミロイドβのクリアランスは、アミロイドβに対する抗体、ＴＧＦ（トランスフォーミング成長因子）β１、熱ショック蛋白、アポリポプロテインＥ（ａｐｏＥ）、アミロイドβに対するモノクロナール抗体、及びＧＭ１（ガングリオシド）等を含むさまざまな物質によって調節されている（非特許文献９〜１４）。
アミロイドβに対する抗体は、Ｆｃ（免疫グロブリン）受容体介在ファゴサイトーシスやその後のペプチド分解を介してミクログリアによるアミロイドβ斑のクリアランスを誘発する。（非特許文献９）。これらのデータは、アミロイドβが直接グリア細胞によって、又は血管細胞によって直接血液中に、或いは間接的に血管周囲の間質液のドレイナージチャンネルに従って脳から除去され得ることを立証している。また、これらのデータは、アミロイドβクリアランスの効果を調節し得ることを立証している。これらのことから、アミロイドβクリアランスの増加は、アルツハイマー病において、アミロイドβが介在する発症原因を減少させるための有望な治療的アプローチとなり得ると考えられた。細胞表面の受容体、例えばスカベンジャー受容体や関連分子は、アミロイドβの結合とクリアランスに重大な役割を担っているかもしれない。しかし、アミロイドβのクリアランスに関与すると想定される受容体は、未だ明確に確認されていない（非特許文献１５〜１７）。【０００３】
Ｃ−タイプレクチンを有するスカベンジャー受容体（ＳＲＣＬ；非特許文献１８、１９）は、コイルドコイル、コラーゲン様ドメイン、及びＣ−タイプレクチン／糖認識ドメイン（ＣＲＤ）を含むスカベンジャー受容体ファミリーの一つである（非特許文献２０）。ヒトにおける主要型ＳＲＣＬはヒトＳＲＣＬタイプＩ（以下、ｈＳＲＣＬ−Ｉと略記する）と名づけられている。一方、ＣＲＤを除くコイルドコイルとコラーゲン様ドメインを含むＳＲＣＬは、ヒトＳＲＣＬタイプＩＩ（以下、ｈＳＲＣＬ−ＩＩと略記する）と称されている（非特許文献１８）。構造的類似性のため、ＳＲＣＬはコイルドコイル、コラーゲン様ドメイン、及びシステインリッチドメインを含むクラスＡのスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）と密接な関係があるとみなされている（非特許文献２１）。酵母と同様にグラム陰性及びグラム陽性細菌と結合するＳＲＣＬの能力はホスト防衛におけるＳＲＣＬの役割を強く示唆している（非特許文献１８、１９）。
【非特許文献１】タンジ・アール・イー（Tanzi RE）ら、セル（Cell）、２００５年、第１２０巻（第４号）、ｐ．５４５−５５５
【非特許文献２】ニコル・ジェー・エー（Nicoll JA）ら、トレンズ・イン・モレキュラー・メディシン（Trends Mol．Med．）、２００３年、第９巻（第７号）、ｐ．２８１−２８２
【非特許文献３】タンジ・アール・イー（Tanzi RE）ら、ニューロン（Neuron）、２００４年、第４３巻（第５号）、ｐ．６０５−６０８．
【非特許文献４】ツロコビック・ビー・ブイ（Zlokovic BV）ら、ジャーナル・オブ・ ニューロケミストリー（J．Neurochem．）、２００４年、第８９巻（第４号）、ｐ．８０７−８１１
【非特許文献５】ゲネッテ・エス・ワイ（Guenette SY）ら、トレンズ・イン・モレキュラー・メディシン（Trends Mol．Med．）、２００３年、第９巻（第７号）、ｐ．２７９−２８０
【非特許文献６】ゲネッテ・エス・ワイ（Guenette SY）、ニューロモレキュラー・メディシン（Neuromolecular Med．）、２００３年、第４巻（第３号）、ｐ．１４７−１６０
【非特許文献７】パレッセ・ディー・エム（Paresce DM）ら、ニューロン（Neuron）、１９９６年、第１７巻（第３号）、ｐ．５５３−５６５
【非特許文献８】ワイス・コーレイ・ティー（Wyss-Coray T）ら、ネイチャー・メディシン（Nat．Med．）、２００３年、第９巻（第４号）、ｐ．４５３−４５７
【非特許文献９】バード・エフ（Bard F）ら、ネイチャー・メディシン（Nat．Med．）、２０００年、第６巻（第８号）、ｐ．９１６−９１９
【非特許文献１０】デ・マットス・アール・ビー（DeMattos RB）ら、サイエンス（Science）、２００２年、第２９５巻（第５５６３号）、ｐ．２２６４−２２６７
【非特許文献１１】カキムラ・ジェイ（Kakimura J）ら、ザ・エフエーエスエービー・ジャーナル（FASEB J．）、２００２年、第１６巻（第６号）、ｐ．６０１−６０３
【非特許文献１２】コイスティナホ・エム（Koistinaho M）ら、ネイチャー・メディシン（Nat．Med．）、２００４年、第１０巻（第７号）、ｐ．７１９−７２６
【非特許文献１３】マツオカ・ワイ（Matsuoka Y）ら、ザ・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（J．Neurosci．）、２００３年、第２３巻（第１号）、ｐ．２９−３３
【非特許文献１４】ワイス・コーレイ・ティー（Wyss-Coray T）ら、ネイチャー・メディシン（Nat．Med．）、２００１年、第７巻（第５号）、ｐ．６１２−６１８
【非特許文献１５】アラルコン・アール（Alarcon R）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem．）、２００５年、第２８０巻（第３４号）、ｐ．３０４０６−３０４１５
【非特許文献１６】エイ・コーリ・ジェイ・ビー（El Khoury JB）ら、ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J．Exp．Med．）、２００３年、第１９７巻（第１２号）、ｐ．１６５７−１６６６
【非特許文献１７】シバタ・エム（Shibata M）ら、ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（J．Clin．Invest．）、２０００年、第１０６巻（第１２号）、ｐ．１４８９−１４９９
【非特許文献１８】ナカムラ・ケー（Nakamura K）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem．Biophys．Res．Commun．）、２００１年、第２８０巻（第４号）、ｐ．１０２８−１０３５
【非特許文献１９】ナカムラ・ケー（Nakamura K）ら、バイオチミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochim．Biophys．Acta．）、２００１年、第１５２２巻（第１号）、ｐ．５３−５８
【非特許文献２０】ムルヒィー・ジェイ・イー（Murphy JE）ら、アテロスクレローシス（Atherosclerosis）、２００５年、第１８２巻（第１号）、ｐ．１−１５
【非特許文献２１】コダマ・ティー（Kodama T）ら、ネイチャー（Nature）、１９９０年、第３４３巻（第６２５８号）、ｐ．５３１−５３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はアルツハイマー病や老年性痴呆症、初老期痴呆症等において脳に蓄積するアミロイドβをクリアランスする薬剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、アルツハイマー病の脳において、アミロイドβの結合とクリアランスにおけるＳＲＣＬの関与を検討した。本発明者らは、アルツハイマー病の二重遺伝子導入マウス（Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウス）及びアルツハイマー病患者の死体からのサンプルの両方で、アストロサイト、ミクログリア及び血管／血管周囲細胞において、ＳＲＣＬがアミロイドβに依存して発現することを見出した。本発明者らはさらに研究を進め、ＳＲＣＬが繊維状のアミロイドβ１−４２と結合できること、かつ前記結合がアルツハイマー病患者の脳で上昇することを見出した。また、本発明者らは、アルツハイマー病に冒された脳のグリア細胞及び血管／血管周囲細胞から、ＳＲＣＬがアミロイドβと用量依存的に作用してアミロイドβと結合すること、及びＳＲＣＬがアミロイドβのクリアランスにおいて重要な役割を果たしていることを知見した。本発明者らはこれら知見に基づきさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするアミロイドβクリアランス促進剤、
［２］有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一、又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする前記［１］記載の促進剤、
［３］有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする前記［１］又は［２］記載の促進剤、
［４］有効成分が、（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする前記［１］又は［２］記載の促進剤、
［５］ＤＮＡが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター及び免疫不全症ウイルスベクターから選択される少なくとも１種のベクターに組み込まれていることを特徴とする前記［１］、［２］又は［４］のいずれかに記載の促進剤、
［６］アミロイドβが脳内アミロイドβであることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の促進剤、
［７］アミロイドβの蓄積部位へ局所投与されることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の促進剤、
［８］髄腔内に投与されることを特徴とする前記［４］又は［５］記載の促進剤、
［９］前記［５］記載の促進剤でトランスフェクトされた細胞を含有することを特徴とする注射剤、
［１０］スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするアミロイドβの蓄積に起因する疾患の予防又は治療剤、
［１１］有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一、又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする前記［１０］記載の予防又は治療剤、
［１２］疾患がアルツハイマー病であることを特徴とする前記［１０］または［１１］記載の予防又は治療剤、
［１３］  アミロイドβクリアランス促進を必要とする患者に、治療的に有効量のスカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として投与することを特徴とするアミロイドβクリアランス促進方法、
［１４］  有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一、又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする前記［１３］記載のアミロイドβクリアランス促進方法、
［１５］  アミロイドβクリアランス促進剤を製造するための、スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの有効成分としての使用、及び
［１６］  有効成分が、（ａ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一、又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする前記［１５］記載の使用、
に関する。【０００７】
また、本発明はスカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与することを特徴とするアミロイドβのクリアランスを促進する方法又はアルツハイマー病等のアミロイドβの蓄積に起因する疾患の予防もしくは治療方法に関する。さらに、本発明は、アミロイドβのクリアランスを促進、あるいはアルツハイマー病等のアミロイドβの蓄積に起因する疾患を予防又は治療する医薬を製造するためのスカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの使用に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に使用されるスカベンジャー受容体蛋白質は、アミロイドβをクリアランスする効果を有する。本発明のアミロイドβクリアランス促進剤は、アルツハイマー病等における所謂老人斑といわれるアミロイドβが蓄積、凝集して形成されたアミロイド線維を分解、代謝し得るので、アミロイドβが蓄積する疾患（例えばアルツハイマー病）の予防又は治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、ラット組織のラットＳＲＣＬ  ｍＲＮＡのノザンブロット分析の結果を示す。上図：種々の組織でラットＳＲＣＬが単一の３．０ｋｂの転写物として発現したことを示す。
下図：ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対するＳＲＣＬ  ｍＲＮＡのデンシトメトリー分析結果を示す。
図２は、Ａ：培養１５分後のラット新生児ミクログリアの代表的な顕微鏡写真（高拡大挿入図）像を示す。
Ｂ：初代培養２日後の代表的な顕微鏡写真（高拡大挿入図）像を示す。
Ｃ：培養した神経細胞のＲＴ−ＰＣＲを示す。図中、ＡＳＴＲＯはマウス新生児アストロサイトを示し、ＭＧはマウス新生児ミクログリアを示し、２ｄは培養２日後を示し、Ｃ６はヒトＣ６グリオーマを示し、ＰＣ１２はラット褐色細胞腫細胞を示す。
Ｄ：培養開始後異なる時点における培養新生児ミクログリアのラットＳＲＣＬ  ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示す。Ｐ７は生後７日齢マウスを示し、ＭＧはマウス新生児ミクログリアを示し、Ｂｒは脳を示し、１ｄは培養開始１日後を示し、２ｄは培養開始２日後を示す。
Ｅ：上図は培養アストロサイトを異なる時間ｆアミロイドβ１−４２で処置した後のアストロサイトを半定量的ＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示す。下図は培養アストロサイトを異なる時間ｆアミロイドβ１−４２で処置した後のアストロサイトに対するコントロールのアストロサイトに対するＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの比率を示す。ｃｏｎｔはコントロールを示し、Ａβはアミロイドβ処置を示す。
図３は、Ａ：ｆアミロイドβ１−４２で処置されたｍＳＲ−ＡＩ−Ｍｙｃ又はｈＳＲＣＬ−Ｉ−ＭｙｃをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞の免疫染色像を示す図である。ｆＡβ１−４２はｆアミロイドβ１−４２の染色像を示し、ｍｅｒｇｅはｍＳＲ−ＡＩ又はｈＳＲＣＬ−Ｉの染色像とｆアミロイドβ１−４２の染色像の二重染色像を示し、magnified  viewは高拡大図を示す。ｆＡβ１−４２＋Fucoidanはフコイダン存在下で培養した時の染色像を示す。
Ｂ：ｍＳＲ−ＡＩ−Ｍｙｃ、ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ，ｈＳＲＣＬ−ＩＩ−Ｍｙｃ又はＭｏｃｋでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞をｆアミロイドβ１−４２及び過剰量のポリ（Ｃ）又はポリ（Ｇ）を含むＰＢＳと共にインキュベートした時の免疫染色像を示す図である。
図４は、Ａ：ｈＳＲＣＬ−Ｉ、ｈＳＲＣＬ−ＩＩ及びｍＳＲＣＬのドメイン構造の概略を示す図である。
Ｂ：ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ、ｈＳＲＣＬ−ＩＩ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ、ｍＳＲＣＬ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ及びＭｏｃｋ／ＥＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞のウエスタンブロットの結果を示す図である。
Ｃ：ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ、ｈＳＲＣＬ−ＩＩ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ、ｍＳＲＣＬ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ及びＭｏｃｋ／ＥＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の免疫染色像を示す。上段においてＥＧＦＰは緑色の蛍光色を示し、下段においてＭｙｃは赤色に染色される。
図５は、Ａ：９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと野生型同腹子の大脳皮質と海馬のパラフィン切片の免疫染色像を示す。挿入は高拡大図を示し、ＧＦＡＰはアストロサイトマーカーを示し、矢印はＧＦＡＰのみに陽性の細胞を示し、矢じりはＳＲＣＬとＧＦＡＰの両方に陽性の細胞を示し、ｍｅｒｇｅはＳＲＣＬ像とＧＦＡＰ像を重ねた像を示し、ＣＡ１及びＣＡ３は海馬の領域を示す。
Ｂ：９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと野生型同腹子の、皮質凍結切片の組織の免疫染色像を示す。ｍｅｒｇｅはＳＲＣＬ像とＭａｃ−１像を重ねた像を示し、挿入は高拡大図を示し、アスタリスクはアミロイドβ斑を示し、矢印はＭａｃ−１にのみ免疫陽性細胞を示し、矢じりはＳＲＣＬとＭａｃ−１に免疫陽性細胞を示す。
図６は、髄膜血管におけるＳＲＣＬとアミロイドβの二重免疫染色像を示す。矢じりはアミロイドβ−免疫陽性とＳＲＣＬ−免疫陽性の髄膜血管を示し、矢印はアミロイドβ／ＳＲＣＬ−二重陽性血管を示し、挿入は高拡大図を示し、最下段図は抗ＳＲＣＬ不存在で免疫染色しているコントロールを示し、ｍ．ｖ．は髄膜血管を示し、ｍｅｒｇｅはアミロイドβ染色像とＳＲＣＬ染色像を重ねた像を示す。
図７は、Ａ：９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウス髄膜血管（ｍ．ｖ．）の血管/血管周囲細胞の略図を示す。ＭＡＴＯはＭＡＴＯ細胞を示し、ＳＭＣは平滑筋細胞を示し、ＥＣは血管内皮細胞を示し、Ｍφはマクロファージを示し、Ａβは、細胞外マトリックスにおけるアミロイドβ凝集と細胞内に取り込まれたアミロイドβ粒子を示す。
Ｂ：９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウス髄膜血管 におけるＳＲＣＬ及び、ＣＤ３１、αＳＭＡ又はＧＦＡＰの二重染色の代表像を示す。ｍ．ｖ．は髄膜血管を示し、矢印はＣＤ３１陽性ＥＣｓを示し、ｍｅｒｇｅは左２つの像を重ねた像を示す。
Ｃ：９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウス髄膜血管におけるＳＲＣＬ及びＣＤ３１又はαＳＭＡを二重免疫染色した高拡大像を示す。
Ｄ：９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド斑（アスタリスク）及び皮質アミロイド血管症と関係する大脳皮質組織におけるＳＲＣＬ及びＧＦＡＰの二重染色像を示す
図８は、アルツハイマー病患者の脳におけるｈＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。ｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対する比率として表わされ、バーは標準誤差を示す。
図９は、Ａ：ホルマリン固定したコントロール及びアルツハイマー病患者の脳組織をｈＳＲＣＬを認識する抗ＳＲＣＬ抗体で免疫染色した像を示す。
Ｂ：ホルマリン固定したアルツハイマー病患者の脳組織のＳＲＣＬとＧＦＡＰとを二重染色した像を示す。矢じりはｈＳＲＣＬ−免疫陽性アストロサイを取り囲んでいるアミロイドβ沈着物（黒色アスタリスク）を示す。
Ｃ：ホルマリン固定したアルツハイマー病患者の脳組織のＳＲＣＬとＩｂａ１とを二重染色した像を示す。矢印はｈＳＲＣＬ−免疫陽性ミクログリア細胞を示し、矢じりはｈＳＲＣＬ−免疫陽性−ＭＡＴＯ細胞を示す。
図１０は、Ａ：ホルマリン固定したコントロール及びアルツハイマー病患者の脳組織をＣＡＡと関連する血管のＳＲＣＬとアミロイドβ１−４２とを二重染色した像を示す。アスタリスクは血管を示し、矢じりはＳＲＣＬ／アミロイドβ二重陽性顆粒を示す。
Ｂ：“図１０Ａ”の第２図で示される矩形領域の高拡大図を示す。矢じりはＳＲＣＬ／アミロイドβ二重染色粒子を示し、アスタリスクは髄膜血管の血管内空間を示す。
Ｃ：吸収テストの結果を示す。矢印はｈＳＲＣＬ−免疫陽性を有する細胞を示し、矢じりは免疫原での前吸収によりｈＳＲＣＬ−免疫陽性が消失したことを示す。
図１１は、ｆアミロイドβ１−４２で１時間処置したミクログリア細胞を免疫染色した像を示す。ｆＡβ１−４２はｆアミロイドβ１−４２で処置された細胞を示し、ｍｅｒｇｅはＭａｃ−１染色像とｆＡβ１−４２染色像の二重染色像を示し、Magnifiedは高拡大図を示す。
図１２は、フコイダン存在又は非存在下でｍＳＲＣＬを安定に発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に使用されるスカベンジャー受容体（scavenger receptor；以下、ＳＲと略記することもある。）蛋白質は酸化修飾低比重リポ蛋白質（酸化ＬＤＬ）等の異物を認識し、該異物を取り込む機構に関与する膜蛋白質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。ＳＲ蛋白質としては、例えばＳＲ−ＡＩ／ＩＩ（scavenger receptor-A I/II）、ＳＲ−Ｂ１（scavenger receptor class B type 1）、ＳＲＣＬ（scavenger receptor with C-type lectin）−Ｉ、ＳＲＣＬ−ＩＩ、ＬＯＸ−１（lectin-like oxidized LDL）、ＣＤ３６、ＳＲ−ＰＳＯＸ／ＸＸＣＬ１６又はＣＬ−Ｐ１等が挙げられるが、ＳＲ蛋白質の活性を有するものであればこれらに限定されない。また、ＳＲ蛋白質には、ＳＲ蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、前記ＳＲ蛋白質のアミノ酸配列中の１若しくは複数個（例えば、約２〜２０個、好ましくは約２〜１０個；以下同様である。）のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的手段により、又は天然に生じうる程度の数（１〜複数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加したＳＲ蛋白質としては、例えば天然のＳＲ蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させたＳＲ蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等が挙げられる。
さらに、ＳＲ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＳＲ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も本発明に使用されるＳＲ蛋白質に含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。【００１１】
本発明において、「ＳＲ蛋白質の活性」としては、細胞膜上で例えば酸化ＬＤＬと結合し、細胞内に取り込む活性等が挙げられる。【００１２】
ＳＲ蛋白質の具体例としては、例えばGeneBank/EMBL/DDBJ等でアクセッション番号（Accession No.）が付けられ登録されているＳＲ蛋白質活性を有する蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＲ蛋白質としては、ヒト由来のＳＲ蛋白質が好ましい。ヒト由来のＳＲ蛋白質としては、例えばＳＲ−ＡＩ／ＩＩ（例えばAccession No．ＮＰ＿６１９７２９、ＮＰ＿００２４３６等）、ＳＲ−Ｂ１（例えばAccession No．ＡＡＩ１２０３８、ＮＰ＿００５４９６等）、ＳＲＣＬ−Ｉ［例えばAccession No．ＢＡＢ３９１４７（配列番号２）等］、ＳＲＣＬ−ＩＩ［例えばAccession No．ＢＡＢ３９１４８（配列番号４）等］、ＬＯＸ−１（例えばAccession No．ＮＰ＿００２５３４等）、又はＣＤ３６等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ＳＲＣＬ−Ｉ又はＳＲＣＬ−ＩＩである。【００１３】
ＳＲ蛋白質と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、例えばＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）等による相同性検索等により、ＳＲ蛋白質のアミノ酸配列と相同性が高いアミノ酸配列を有する蛋白質であって、かつＳＲ蛋白質活性を有する蛋白質等が挙げられる。例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であって、ＳＲ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列から、１〜複数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜複数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列又は１〜複数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白質であって、ＳＲ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が挙げられる。配列番号２と実質的に同質の活性を有する蛋白質としては、具体的には例えば配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質又はAccession No．ＢＡＢ８３５９２として登録されているヒト由来の蛋白質、あるいはマウスＳＲＣＬ（Accession No．ＢＡＢ８２４９７；配列番号６）、ヒトＳＲＣＬ（Accession No．ＡＡＨ６０８７９）、マウスＳＲＣＬ（Accession No．ＮＰ５６９７１６）、マウスＳＲＣＬ（Accession No．ＢＡＣ０５５２３）、ラットＳＲＣＬ（Accession No．ＸＰ３４１５７５）、ニワトリＳＲＣＬ（ＵＤ．ＧＧ．Ｃｏｎｔｉｇ２３６１７）等が挙げられる。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。【００１４】
本発明に用いられるＳＲ蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、ピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明で用いられるＳＲ蛋白質が、Ｃ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるＳＲ蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられるＳＲ蛋白質には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。【００１５】
本発明に用いられるＳＲ蛋白質の塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。【００１６】
ＳＲ蛋白質は、例えば遺伝子工学的手法によりＳＲ蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養細胞から目的とする組換えＳＲ蛋白質を分離すること等により得ることができる（例えば、Biochem．Biophys．Res．Commun．2001年、第280巻，p．1028-1035等を参照）。また上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることができる。【００１７】
本発明において「ＳＲ蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、ＳＲ蛋白質を発現し得るＤＮＡをいう。ＳＲ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、例えば、Proc．Natl．Acad．Sci．USA．，1990年，第87巻，p．9133-9137；J．Biol．Chem．，1997年，第272巻，p．17551-17557；Nature，1997年，第386巻，p．73-77；Biochem．Biophys．Res．Commun．，2001年，第280巻，p．1028-1035等に記載され、例えば、GeneBank／EMBL／DDBJにAccession No．ＮＭ＿１３８７１５（ＳＲ−Ａ１をコードするＤＮＡ）、ＮＭ＿００２４４５（ＳＲ−Ａ２をコードするＤＮＡ）、ＢＣ１１２０３７、ＮＭ＿００５５０５（ＳＲ−Ｂ１をコードするＤＮＡ）、ＡＢＯ３８５１８（配列番号１;ＳＲＣＬ−IをコードするＤＮＡ）、ＡＢＯ５２１０３（配列番号３；ＳＲＣＬ−ＩＩをコードするＤＮＡ等）又はＮＭ＿００２５４３（ＬＯＸ−１をコードするＤＮＡ）等として登録されているヒト由来のＳＲ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ等が好ましく挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明のＳＲ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡには、前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＳＲ蛋白質と実質的に同質の活性、例えば、細胞膜上で例えば酸化ＬＤＬと結合し、細胞内に取り込む活性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が包含される。【００１８】
前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば上記ＤＮＡの部分配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡが挙げられる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。【００１９】
前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、例えばＤＤＢＪ等による相同性検索等により、前記ＤＮＡと約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡであって、かつＳＲ蛋白質活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ等が挙げられる。具体的には、例えば配列番号１（Accession No．ＡＢ０３８５１８）で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えばAccession No．ＡＢ０５２１０３（配列番号３）、Accession No．ＡＢ０３８５１９（配列番号５）又はAccession No．ＡＢ０３４２５１として登録されているＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular  Cloning，A  laboratory  Manual，Third  Edition（J．Sambrook  et  al．，Cold  Spring  Harbor  Lab．Press，2001：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。【００２０】
さらに、本発明のＳＲ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡは上記に限定されず、発現する蛋白質がＳＲ蛋白質と実質的に同じ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡである限り、本発明のＳＲ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡとして使用できる。【００２１】
ＳＲ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡは、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法等により容易に得ることができ、該ＤＮＡの取得は具体的には例えば前記モレキュラー・クローニング第３版等の基本書等を参考にして行うことができる。【００２２】
なお、本発明で用いられるＳＲ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞もしくは組織由来のｃＤＮＡライブラリー又は合成ＤＮＡ等が好ましく挙げられる。前記ライブラリーにゲノムＤＮＡ断片がクローニングされるベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド又はファージミド等が挙げられる。
また、本発明で用いられるＳＲ蛋白質をコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＳＲ蛋白質又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることができる。該ＲＮＡとしては、例えば細胞又は組織よりｍＲＮＡ画分を調製して、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅したＲＮＡ等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。【００２３】
なお、本発明で用いられるＳＲ蛋白質又はそれをコードするＤＮＡを含むＤＮＡは、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、トリ等）に由来するＳＲ蛋白質又はそれをコードするＤＮＡであってもよい。例えば、マウス由来のＳＲ蛋白質としては、例えばマウスＳＲＣＬ（Accession No．ＢＡＢ８２４９７；配列番号６；以下、ｍＳＲＣＬと略記する）等が挙げられ、該ｍＳＲＣＬをコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ（Accession No．ＡＢ０３８５１９；配列番号５）等が挙げられる。【００２４】
本発明における、「アミロイドβクリアランス」とは、アミロイドβを取り除くことをいい、アミロイドβの分解やアミロイドβを細胞内に取り込み分解する貪食（エンドサイトーシス又はファゴサイトーシスを含む）等を包含する。アミロイドβは、神経細胞に対して毒性を持ち、細胞死を引き起こす、例えば、アミロイドβ１−４２やアミロイドβ１−４０等が含まれ、さらにそれらがアポＥ又はプレセニリン１・２等により修飾を受けた蛋白質等も含まれる。アミロイドβ１−４２又はアミロイドβ１−４０は、β−及びγ−セクレターゼの働きにより前駆体蛋白質(β‐amyloid protein precursor；以下、ＡＰＰと略記する)から産生され得るアミノ酸が約４０〜４２からなるペプチドである。γ−セクレターゼはＡＰＰを４０番目もしくは４２番目のアミノ酸で切断し、アミロイドβ１−４２又はアミロイドβ１−４０を産生し得る。アミロイドβは疎水性が高く、凝集や、修飾を受けて線維を形成し得る。
本発明における、「アミロイドβの蓄積」とは、アミロイドβが、分解されないか、分解抑制され、体内にアミロイドβが蓄積されることをいい、アミロイドβが凝集して不溶性の線維形成することも包含される。
なお、アミロイドβは、体内いずれの部位に存在するアミロイドβも含まれるが、好ましくは脳内アミロイドβである。【００２５】
アミロイドβの蓄積に起因する疾患としては、特に脳にアミロイドβが蓄積、凝集して不溶性の線維形成がなされるアルツハイマー病等が挙げられる。該アルツハイマー病にはアルツハイマー型老年痴呆が包含される。アルツハイマー病の主要な病理変化は、老人斑と神経原線維変化が含まれるが、前記老人斑は発症の早期から認められ、その主要構成成分がアミロイドβである。【００２６】
本発明のアミロイドβクリアランス促進剤又はアミロイドβの蓄積に起因する疾患の予防又は治療剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等）にも適用できる。【００２７】
本発明のアミロイドβクリアランス促進剤又はアミロイドβの蓄積に起因する疾患の予防又は治療剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投与量等は、有効成分がＳＲ蛋白質もしくはＳＲ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩（以下、ＳＲ蛋白質等という。）の場合と、ＳＲ蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＳＲ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ（以下、ＳＲ遺伝子という。）の場合と若干異なってもよい。
たとえば、有効成分がＳＲ蛋白質等である場合は、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤等をとりうるが、一般的にはＳＲ蛋白質等のみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、噴射剤、リポソームまたは徐放性製剤（例えば、デポ剤）等とされるのが好ましい。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）等を適宜添加した溶液に、ＳＲ蛋白質等を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤中のＳＲ蛋白質等含量は、通常約０．０００２〜０．２ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００１〜０．１ｗ／ｖ％に調整され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。【００２８】
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）又は不溶性ガス（窒素ガス等）等が挙げられる。【００２９】
リポソームとしては、リン脂質を主成分とする人工の脂質膜を有するカプセル状の構造を持つ小胞であれば特に制限されないが、陽電荷をもつ脂質を構成成分とする脂質二重膜小胞（カチオニックリポソーム）、温度感受性リポソーム又はｐＨ感受性リポソーム等が好ましく挙げられる。なかでもカチオニックリポソームが好ましい。リポソームは、その内部に、色々な化合物を封入できるため、化学物質のキャリアー、マイクロカプセルとして食品、医薬品材料としても利用されている。リポソームに本発明に係るＳＲ蛋白質等を内包し、体内に注入することにより、ＳＲ蛋白質等の効果を持続させたり、特定の器官にだけにＳＲ蛋白質等の効果をもたらすことが可能となる。リポソームはその調製法や材料により、その大きさが異なるが、直径約５０ｎｍ〜１０μｍが好ましい。カチオニックリポソームとしては、例えば、細胞融合蛋白を表面に持つリポソーム（ＨＶＪ−リポソーム）、ＨＶＪ−Ｅ（センダイウイルス・エンベロープ）ベクター（Neuroscience Letters 378 (2005)18-21）等が挙げられる。カチオニックリポソームに本発明に係るＳＲ蛋白質等を封入又は結合させる方法としては、例えば、約１〜５００μＬ、好ましくは約１０〜１００μＬのＨＶＪ−Ｅベクター（HVJ-liposome：GenomONE，石原産業株式会社製）にエンハンサーを約０．１〜１００μＬ添加し、約１〜５℃で約２〜３０分間静置後、約０．１〜１００μＬのＳＲ蛋白質等溶液（０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ，望ましくは０．２〜２ｍｇ／ｍＬ）と約０．１〜１００μＬの封入因子（enclosing factor）を添加し、混和後約２０００〜１００００×ｇで約１〜３０分間、約１〜５℃で遠心し、沈殿を集める。これを約１０〜１０００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で溶解することにより、ＳＲＣＬ蛋白質−ＨＶＪ−Ｅリポソーム溶液を調製できる。【００３０】
また、本発明で用いられるＳＲ蛋白質等は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。ＳＲ蛋白質等は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類、コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチオニン等のポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル、ポリオルソエステル又はポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸、ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸・グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０乃至５０／５０が好ましい。該乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００乃至２０，０００が好ましい。ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子とＳＲ蛋白質等の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、ＳＲ蛋白質等が約０．０１〜３０質量％が好ましい。【００３１】
投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤をアミロイドβの蓄積部位に直接注射（髄腔内投与又は脊髄実質投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与等）もしくは噴霧するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）をアミロイドβの蓄積部位の組織に近い部位に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、1回当たり１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜５０ｍｇ、さらに好ましくは１〜２５ｍｇである。また、投与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、１回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でよく、例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与や徐放性ポンプによる髄腔内持続投与の場合は、数ヶ月に１回でもよい。【００３２】
一方、ＳＲ遺伝子を患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６年、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７年、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９年等に記載の方法に従って、行うことが好ましい。
具体的な投与方法としては、例えば、ＳＲ遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクター等をアミロイドβの蓄積部位の組織（例えば脳等）へ局所注射する方法、又は、患者の病変部位の組織又は脊髄や血液・骨髄等から細胞を体外に取り出して、該細胞にＳＲ遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを導入しトランスフェクトさせた後に、トランスフェクトされた前記細胞を、患者に例えば静脈注射等により移植する方法や、患者の病変部位もしくは脊髄に移植する方法、又はＳＲＣＬ遺伝子（ＳＲＣＬ−Ｉ、ＳＲＣＬ−ＩＩ等）などのＳＲ遺伝子をｅｘ  ｖｉｖｏでミクログリア等の貪食細胞に遺伝子導入し細胞を血液中に戻すことで脳内等にsrclなどのＳＲ蛋白質発現貪食細胞を供給する方法等が挙げられる。前記細胞としては、例えばアストロサイトやミクログリア等のグリア細胞やマクロファージ等の血液骨髄系細胞が好ましく挙げられる。【００３３】
発現ベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（Ｉ型単純ヘルペスウイルス等）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０又は免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。前記発現ベクターに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることにより、細胞内にＳＲ遺伝子を導入することが可能である。中でも、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等が好ましい。
前記ＨＳＶ−１ベクターは神経向性を有するベクターである。ＨＳＶ−１ベクターとしては、多重遺伝子（３０ｋｂまで）が組み込まれている大きな（１５２ｋｂ）ゲノムを有し、かつ生涯にわたり潜在的に脳の大脳皮質や海馬等に対して感染を樹立する能力を有するものが好ましい。具体的なＨＳＶ−１ベクターとしては、ウイルス複製のためのＩＣＲ４、ＩＣＰ３４．５及びＶＰ１６（ｖｍｗ６５）をエンコードする３つの遺伝子の欠失により、重篤な障害状態にある複製能力のないＨＳＶ−１（ＨＳＶ１７６４／４−／ｐＲ１９）ベクター（Coffin RS，et al．，J．Gen．Virol．１９９８年，第79巻，ｐ．3019-3026；Palmer JA，et al．，J．Virol．，2000年，第74巻，ｐ．5604-5618；Lilley CE，et al．，J．Virol．，2001年，第75巻，ｐ．4343-4356）、或いは上記したリポソーム（例えば、ＨＶＪ−リポソーム、ＨＶＪ−Ｅベクター等）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、ＡＡＶベクターは、非病原性ウイルスに属し、安全性が高く、また神経細胞等の非分裂細胞に効率よく遺伝子導入ができるベクターである。ＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５等が挙げられる。これらＨＳＶ−１ベクターやＡＡＶベクターは目的遺伝子を脳の大脳皮質や海馬等において長期間発現させ得る。アルツハイマー病等のアミロイドβが蓄積して引き起こされる疾患は長期間を経て病態を完成するので、本発明に使用されるベクターとしては、特に制限されないが、長期発現を可能とするＨＳＶ−１ベクターやＡＡＶベクター、あるいはＨＶＪ−リポソーム又はＨＶＪ−Ｅベクターがとりわけ好ましい。【００３４】
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態［例えば、注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤、リポソーム剤等］をとり得る。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）またはリポソーム剤はＳＲ蛋白質等の場合と同様にして調製できる。また、例えばＳＲ遺伝子を含む発現プラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを自体公知の方法（例えばコアセルベーション法、界面重合法又は二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約１〜５００μｍ、好ましくは約１００〜４００μｍの微粒子を含有するマイクロカプセル剤を製造することができる。被膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）アンモニウムクロライド、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩等の膜形成性高分子等が挙げられる。
製剤中のＤＮＡの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる。また投与量は、ＳＲ遺伝子導入ベクターの種類により異なるが、ＳＲ遺伝子導入ベクターに換算して、通常１×１０６ｐｆｕ〜１×１０１２ｐｆｕ、好ましくは１×１０７ｐｆｕ〜２×１０１１ｐｆｕ、さらに好ましくは１．５×１０７ｐｆｕ〜１．５×１０１１ｐｆｕを単回投与、あるいは数日ないし数ヶ月もしくは数年に１回投与するのが好ましい。【００３５】
本発明の剤は、アミロイドβの蓄積に起因する疾患、例えばアルツハイマー病やアルツハイマー型老年痴呆等に用いることができる。【００３６】
ＳＲ蛋白質等によるアミロイドβのクリアランスは、例えば、発現ベクターを使用してＳＲ遺伝子をアミロイドβの蓄積部位、例えば大脳皮質や海馬等へトランスフェクトする方法や、後述する試験例等に記載されている方法等を用いて測定し、評価することができる。
【実施例】
【００３７】
以下に試験例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の試験例において％は特に明記しない限り質量％を示す。【００３８】
〔試験例１〕
Ｉ．試験方法
１．実験動物
妊娠日の確定したＳＤ（Sprague-Dawley）ラット及びＣ５７／ＢＬ６マウスはＳＬＣ(Shizuoka，Japan)から購入した。二重遺伝子導入マウス（Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウス）及び野生型同腹子（ＷＴ）は、ＰＳ１‘ノックイン’マウス［Nakano Yら，Eur．J．Neurosci．，1999年，第11巻（第7号）：p．2577-2581］とヒトアミロイド前駆蛋白質のスウェーデン変異を過剰発現する遺伝子導入マウス（Ｔｇ２５７６；Hsiao Kら， Science，1996年，第274巻(第5284号）：p．99-102）とを交配して作製した。動物は、個別ケージに入れ、温度管理された部屋で１２時間照明／１２時間暗黒サイクル下に飼育した。全ての実験は大阪大学動物倫理委員会のガイドラインに従って行なった。すべての取り組みはできるだけ動物の負担を少なくし、できるだけ少ない数の動物を使用した。【００３９】
２．ヒト試料
ヒト試料は、メリーランド大学の脳及び組織バンクから入手した。アルツハイマー病患者の４死体から得た側頭皮質組織（平均死亡年齢：８４．２±２．８）及び非アルツハイマー病の３人の皮質試料（平均死亡年齢５６．７±２６．１）を使用した。全ての試料の取り扱いは、ヒューマン・サブジェクト・リサーチ（Human Subject Research）に関する治験審査委員会（Institutional Review Board）により承認された手続きに従った。【００４０】
３．ラットＳＲＣＬコイルドコイル領域のｃＤＮＡクローニング
ラットＳＲＣＬコイルドコイル領域のシークエンスは、表１のプライマーを使用して、ラットミクログリアのトータルＲＮＡのヘキサオリゴヌクレオチド−プライムドｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲによってクローン化された。【００４１】
【表１】
2007139120.tif 000002
【００４２】
上記フォワードプライマーは、ｍＳＲＣＬ  ＯＲＦ（Open Reading Frame）の想定される残基（配列番号６の第４９３−５１０位の塩基配列）に相当し、リバースプライマーは、ｍＳＲＣＬの想定される残基（配列番号６の第１１２９−１１４６位の塩基配列）に相当する。
得られたＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングした。コンピテント細胞（大腸菌）に形質転換し、発現させたＤＮＡを精製し、シークエンスすることによりベクターの信頼性を確認した。【００４３】
４．ノザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
（１）トータルＲＮＡ
トータルＲＮＡは、ISOGEN Kit （ニッポンジーン社製）又はRNeasy Micro Kit (QIAGEN社製)を使用し、キットの使用説明書に従い、成ラット及び生後７日齢（Ｐ７）のラットの細胞及び組織からそれぞれを調製された。ヒト病理解剖サンプルの側頭皮質からの組織も同様に調製した。【００４４】
（２）ノザンブロッティング
ノザンブロッティングのために、ポリＡ＋ＲＮＡを成ラットのトータルＲＮＡから調製した。調製したポリＡ＋ＲＮＡ  ２μｇを、１％アガロース／０．７％ホルムアミドゲルで電気泳動に付し、ハイボンドＮ＋ナイロン膜（以下、フィルター膜ともいう）にブロットした。次いで、フィルター膜に転写したＲＮＡを、３２Ｐ−ラベルｃＤＮＡフラグメント（ｈＳＲＣＬの第４９３−１１４６位のヌクレオチド）でハイブリダイズした。その後、フィルター膜を洗浄し、Nakamuraらの方法(Biochem．Biophys．Res．Commun．2001年，第280巻（第4号)，p．1028-1035；Biochim．Biophys．Acta．2001年，第1522巻（第1号)，p．53-58）により可視化した。ラットＧＡＰＤＨプローブをローディングコントロールとして用いた。【００４５】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-PCR）
上記（１）で調製したトータルＲＮＡを、RNase-free DNase（Quiagen社製）で前処置し、ＲＮＡ  １μｇをSuperScript（登録商標）II（Invitrogen社製）を用いて使用説明書に従って逆転写反応を行った。
ラットのＲＴ−ＰＣＲは、GeneAmp Gold PCR Reagent Kit（Perkin-Elmer社製）を用いて、まず９５℃で５分変性反応を行った後、９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分を３２サイクル施行し、その後７２℃で７分の伸張反応を行った。各反応に使用した増幅サイクルの回数及びｃＤＮＡの量を、ＲＮＡの定量化のために事前に予備試験で最適化した。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動で分離した。分離後のゲルを、エチジウムブロマイドで染色した。ラットＳＲＣＬプライマーは表２に記載のプライマーを使用した。【００４６】
【表２】
2007139120.tif 000003
実験データの正規化（Normalization）には、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを使用した。【００４７】
マウスのＲＴ−ＰＣＲには、上記GeneAmp Gold PCR Reagent Kitを使用して行った。ＰＣＲ反応は、まず９４℃で５分変性反応を行った後、９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、及び７２℃で３分を３２サイクル施行し、その後７２℃で５分の伸張反応を行った。ｍＳＲＣＬのプライマー及びマウスＧＡＰＤＨは以下の表３を用いた。【００４８】
【表３】
2007139120.tif 000004
【００４９】
（４）定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムRT-PCRによる定量のため、２．５μｇの各ＲＮＡをSuperScriptTMII（Invitrogen社製）を用いて製品の使用説明書に従い、逆転写した。ヒトサンプルのｍＲＮＡレベルの定量評価には、High-capacity cDNA Archiveキット（アプライドバイオシステム社製）を使用しABI PRISM 7900シーケンス検出システム（アプライドバイオシステム社製）を用いて定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（TaqMan法）にて解析した。反応にはUniversal PCRマスター混合液（アプライドバイオシステム社製）を用い、プローブにはTaqMan MGB（蛍光ラベル（ＦＡＭ）付加）を用いた。ｈＳＲＣＬ用プローブとしては、エクソン5-6，Hs00560477m1（アプライドバイオシステム社製）を用いた。ヒトＧＡＰＤＨプローブにはTaqMan VICTM Probe;4326317E（アプライドバイオシステム社製）を使用した。ＰＣＲ反応は、まず５０℃で２分間、引き続き９５℃で１０分間変性した後、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４０サイクル施行した。【００５０】
（５）統計処理
ＰＣＲ反応は各サンプル全て３回反応を行ない、サンプル間でバラツキなく定量化するために、ＳＲＣＬ  ｍＲＮＡ値はＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ値に対する相対的な値として示した。表記は平均±標準誤差（ＳＥ）で行ない、統計的有意性は、スチューデントｔ検定により評価した。Ｐ＜０．０５のレベルを、有意差の基準とした。有意差は少なくとも２つの別々の実験により評価した。【００５１】
５．細胞株の培養
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、Ｃ６神経膠腫細胞（以下、Ｃ６と略記する。）、マウスマクロファージＪ７７４Ａ.１細胞株及びラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞（以下、ＰＣ１２と略記する。）はFunakoshi Hら，J．Biol．Chem．，1991年，第266巻，p．15614-15620；Nakamura Kら，Biochem．Biophys．Res．Commun．，2001年，第280巻，p．1028-1035；Nakamura Kら，Biochim．Biophys．Acta．，2001 年，第1522巻，p．53-58；又はNaveilhan Pら，Brain Res．Mol．Brain Res．，1996年，第41巻，p．259-268に記載の方法で培養した。【００５２】
６．ミクログリアの培養
生後１〜３日齢のＣ５７／ＢＬ６マウス及びＳＤラットから分離した混合グリア細胞を予備培養し、船越らの方法によりミクログリアを分離した(J．Neurosci．Res．， 2002年，第68巻，p．150-160)。つまり、大脳皮質は、髄膜を完全に除去した組織とした。次いで該組織を細かく切り刻み、細切片を０．０５％トリプシン（GIBCO社製）を含むＰＢＳに懸濁し、３７°Ｃで１０分間、細胞をトリプシン処理した。トリプシン処理した細胞を、０．０１％ＤＮase  Ｉ（Sigma社製）を含むＰＢＳで室温にて５分間インキュベートした。インキュベート後、遠心分離し細胞を沈殿させた。細胞沈殿物を３回洗浄した。細胞を７５μｍナイロンメッシュでろ過し、遠心分離して細胞を沈殿させた。前記遠心分離した細胞を混合グリア細胞とした。混合グリア細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ(ウシ胎児血清；JRH Bioscience社製)、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む低グルコース含有ダルベッコ改良イーグル培地（低濃度ＤＭＥＭ；ナカライテスク社製）に懸濁し、培養皿へ移した。細胞がコンフルエントになった時点で、混合グリア細胞をＰＢＳで洗浄処理し、トリプシンを含むＰＢＳに懸濁した。懸濁した混合グリア細胞を６穴プレートに入れ、１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で継代培養した。３日後、ミクログリアを分離するため培養プレートを室温で２時間強く揺り動かした。培養プレートから剥がれ、培養液中に浮遊してくる細胞を採取し、ミクログリアとした。マウスのミクログリアは、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（JRH Bioscience社製）を含むＤＭＥＭ（ナカライテスク社製）で継代した。ラットミクログリアはトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン及び亜セレン酸ナトリウムを含む高濃度グルコースＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地からなる血清フリーの改良Ｎ３培地で継代した(J．Neurosci．Res．， 2002年，第68巻，p．150-160)。ミクログリアの純度はＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）免疫染色で解析（検定）して約９５％であった。【００５３】
７．マウスアストロサイトの調製
アストロサイトは上記６．と同様に生後１日齢のＣ５７／ＢＬ６マウスから分離した混合グリア細胞から調製した［Funakoshi Hら，J Neurosci Res，2002年，68(2)：150-160］。混合グリア細胞を上記６と同様に分離し、培養した。培養３日後、ミクログリアを除去するため培養プレートを室温で２時間強く揺り動かし浮遊してくる細胞を除去した。３日培養後のアストロサイトの純度は、抗ＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク質；Chemicon International社製）及び抗イオンカルシウム結合アダプター分子−１（ionized calcium-binding adapter molecule-1；以下、ＩｂａＩと略記する）抗体（和光純薬工業株式会社製）を用いた二重染色で解析（検定）して約９５％以上であった。【００５４】
８．繊維状アミロイドβの結合とコンペティションアッセイ
ヒト繊維状合成アミロイドβ１−４２ペプチド（以下、ｆアミロイドβ１−４２と略記する；生化学工業株式会社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１ｍｇ／ｍＬとなるよう製品の使用説明書に従って滅菌水で希釈し、使用直前に線維化した。混合グリア細胞の培養から単離したマウスミクログリアを、単離２０時間後に、２．５μｇ／ｍＬのｆアミロイドβ１−４２と共に１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中で、３７℃で１時間処理した。前記処理したマウスミクログリアを氷冷ＰＢＳで十分に洗浄し、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳで固定した。次いで固定したマウスミクログリアを一次抗体の抗ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ１）と抗アミロイドβ（６Ｅ１０）と共にインキュベートし、引き続きＡｌｅｘａ５４６（赤色に染色される）もしくはＡｌｅｘａ４８８（緑色に染色される）でコンジュゲートされた抗ＩｇＧ抗体（モレキュラープローブ社製；二次抗体）と共にインキュベートした。核を、Hoechst 33342(Molecular Probes；Invitrogen社製)で対比染色した。染色したマウスミクログリアをＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡下で観察した。【００５５】
各遺伝子にＭｙｃタグを付加したｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ、ｈＳＲＣＬ−ＩＩ−Ｍｙｃ、ｍＳＲ−ＡＩ−Ｍｙｃを導入した発現ベクター又はＭｏｃｋ発現ベクター（コントロールベクター）で、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクトした。前記発現ベクターでのトランスフェクトの２４時間後、トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｆアミロイドβ１−４２  ２．５μｇ/ｍＬと共に、フコイダン  ５００μｇ／ｍＬ、ポリグアニン（以下、ポリ（Ｇ）と略記する。）２００μｇ/ｍＬ又はポリシトシン（以下、ポリ（Ｃ）と略記する。）２００μｇ/ｍＬ添加又は非添加の１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加ハムＦ１２（F12 Nutrient Mixture）培地（ＧＩＢＣＯ社製）で、３７℃で３０分間処理した。細胞を抗Ｍｙｃ（１２Ａ５）及び下記する抗β１−４２−アミロイド抗体を用いて可視化し、それぞれ抗体をコンジュゲートされたＡｌｅｘａ５４６（赤色に染色される）とＡｌｅｘａ４８８（緑色に染色される）で検出した。【００５６】
９．初代培養マウスアストロサイト用fアミロイドβ１−４２の処理
ｆアミロイドβ1-42をＤＭＳＯに溶解し、３００μＭ（１．３５ｍｇ／ｍＬに相当）となるようＰＢＳで希釈し、３７℃で３日間培養した。調製したｆアミロイドβ1-42は、必要時には超音波で分解した。【００５７】
１０．抗体の調製
合成ペプチドＱＰＤ（KAGQPDNWGHGHGPGEDC；配列表の配列番号１５（配列番号２の第６９１−７０８位）；ｈＳＲＣＬのＣＲＤ領域の部分に相当；Biochem．Biophys．Res．Commun．，２００１年、第２８０巻（第４号）、ｐ．１０２８−１０３５；Biochim．Biophys．Acta．、２００１年、第１５２２巻（第１号）、ｐ．５３−５８）は、ＭＢＬ社から入手した(図４Ａ)。ウサギに、ｍ−マレイミドベンゾール−Ｎ−ヒドキシスクシンイミドエステル（maleimidobenzol-N-hydroxysuccinimide ester）によってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合しているＳＲＣＬ／ＱＰＤペプチドで免疫を与えた。免疫後に、ウサギから採血し、定法に従って血清を分離した。抗血清を、抗原のみ（ＫＬＨ配列を除く）に結合させたＣＮＢｒ活性化Sepharose4B(Amersham社製)アフィニティーカラムで精製し、抗体を得た（得られた抗体を以下、抗ＳＲＣＬ抗体と呼ぶ。）。血清の抗ＳＲＣＬ抗体価はｈＳＲＣＬのＣＲＤでＱＰＤシークエンスを含むペプチドに対して上昇した。【００５８】
１１．ウエスタンブロット
ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ、ｈＳＲＣＬ−ＩＩ−Ｍｙｃ、ｍＳＲＣＬ−Ｍｙｃ又はＭｏｃｋでのトランスフェクト２４時間後に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びマウスマクロファージＪ７７４Ａ.１細胞を溶解した。そして、溶解物の等蛋白質量の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に付した。次いで抗ＳＲＣＬ抗体でイムノブロットを行った。得られたイムノブロットを可視化するため、ＥＣＬシステムを使用した。【００５９】
１２．免疫組織化学
マウスに深く麻酔し、心臓から冷ＰＢＳを注入してマウスの全身を灌流し、次いで冷４％（ｖ／ｖ）ＰＦＡ含有ＰＢＳでマウスを灌流固定した。脳を取り出し、４℃で１．５時間冷４％（ｖ／ｖ）ＰＦＡ含有ＰＢＳで固定後、半分にするため脳を正中線上で２つに分けた。その片側半分を、一連のサッカロース（１０％、２０％）含有ＰＢＳ溶液につけ、凍結切片を調製するためＣＯ２ガスで凍結した。
他の半分を、公知の一般的操作手法により脱水し、パラフィン包埋して切片とした。ヒト材料に関して、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン固定された脳組織をパラフィン包埋して切片を作成した。作成したパラフィン切片を、再水和するため、１００％（ｖ／ｖ）、９５％（ｖ／ｖ）、及び７５％（ｖ／ｖ）エタノール中でそれぞれ順次５分間インキュベートして脱パラフィンした。それから脱パラフィンした切片を、水で２回、ＰＢＳで２回洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするため３％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳで５分間インキュベートした。抗原を活性化するため、０．４ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼＫを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に室温で１０分間切片を浸し、ＰＢＳで洗浄した。前記洗浄後切片を、５％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清及び０．３％トリトンＸ−１００を添加したブロッキング緩衝液を用い室温で３０分間ブロックした。アミロイドペプチド(アミロイドβ)の免疫染色のために、切片を７０％ギ酸で１分間前処置し、ブロッキング緩衝液でブロックし、室温で１．５時間第１抗体と共にインキュベートした。
抗体としては、以下の抗体を使用した。
アフィニティー精製ウサギ抗ＳＲＣＬ／ＱＰＤ（ＯＴ６６７，３μｇ／ｍＬ）、マウス抗ＧＦＡＰ（１：４００；ＭＡＢ３４０２, Chemicon社製；アストロサイト用)、ラット 抗Ｍａｃ−１（１：１００； Chemicon社製；ＭＡＴＯ細胞を含むミクログリアおよびマクロファージ用)、ウサギ抗Ｉｂａ−１（１：１，０００；和光純薬工業社製；MATO細胞を含むミクログリアおよびマクロファージ用)、抗ＣＤ−３１（１：２００；ＰＥＣＡＭ−１，Pharmingen社製；活性化ルイスラットミクログリアを免疫原とする抗体；活性化されたミクログリア／マクロファージ、ＭＡＴＯ細胞および内皮細胞用)、抗αＳＭＡ（１：５００；DAKO社製、平滑筋細胞用)、ウサギ抗アミロイドβ40（１：１，５００；ＦＣＡ３３４０）及びウサギ抗アミロイドβ４２（１：１，５００；ＦＣＡ３５４２）抗体（ＦＣＡ３３４０及びＦＣＡ３５４２はDr. F. Checlerに供与して頂いた。)。【００６０】
切片を、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８（緑色に染色される）又はＡｌｅｘａ５４６（赤色に染色される）でコンジュゲートされた二次抗体と共に室温で２０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳで洗浄し、標本とした。ヒト組織の切片はEnVision+システム（Ｋ４００１マウス抗体／Ｋ４００３ウサギ抗体; Dako社製）と色原体としての３,３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ；和光純薬工業株式会社製）とでインキュベートすることによって茶色シグナルとして可視化した。二重標識免疫組織化学のため、ＤＡＢを用いて一次抗体で可視化後、切片をクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に入れ５分間電子レンジで加熱した。切片を洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした。サンプルを、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ(Vector社製）とVector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit（Vector社製）を使用説明書に従って用いて赤いシグナルとして可視化し、メイヤーのヘマトキシリン（和光純薬工業株式会社製）で対比染色した。切片を過剰量のＳＲＣＬ／ＱＰＤ免疫原で前処置されたウサギ抗ＳＲＣＬ／ＱＰＤ抗体（ＯＴ６６７）と共にインキュベートすることにより前吸収を行った。
アミロイドβ１−４２／アミロイドβ１−４０とＳＲＣＬの二重免疫染色のために、ウサギ抗アミロイドβ１−４２／アミロイドβ１−４０抗体とアフィニティー精製ウサギ抗ＳＲＣＬ抗体は、Zenon Alexa Fluor Rabbit IgG Labeling Kit (Molecular Probes)を用い、それぞれ使用説明書に従って、直接Ａｌｅｘａ５４６及びＡｌｅｘａ４８８で標識し、免疫蛍光染色に利用した。【００６１】
ＩＩ．試験結果
１．ラットＳＲＣＬコイルドコイル領域のｃＤＮＡクローニング
コイルドコイル領域をコードするラットＳＲＣＬのｃＤＮＡ領域のシークエンスとヒトとマウスのシークエンスをまず比較した。比較のために、ｍＳＲＣＬのｃＤＮＡに基づくプライマーと共に増幅されたラットミクログリアから作り出されたｃＤＮＡを使いＲＴ−ＰＣＲを行なった。ラットＳＲＣＬコイルドコイル領域に対応するクローン化されたｃＤＮＡは、ｈＳＲＣＬ−Ｉ及びｍＳＲＣＬのそれに対し、ヌクレオチドレベルでそれぞれ８８％及び９５％の同一性、及びアミノ酸レベルでそれぞれ９１．７％及び９５．９％の同一性を持ち、極めて類似性が高く、かつ８つの想定されるＮ−糖鎖付加部位を含む。前記Ｎ−糖鎖付加部位が保存されていたことから、前記Ｎ−糖鎖付加部位がＳＲＣＬタンパク質の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）、成熟、及び／又は機能にとって重要であると考えられる。【００６２】
２．ラットＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの発現
ヒトＳＲＣＬは二つの異なるアイソフォーム（イソ型）、すなわちｈＳＲＣＬ−Ｉ及びｈＳＲＣＬ−ＩＩとして転写される。ＣタイプＣＲＤ（carbohydrate recognition domain；糖認識ドメイン）を含むｈＳＲＣＬ−Ｉはヒト組織で発見された主な転写物である。ｈＳＲＣＬ−Ｉは、ノザンブロットによって３．０キロベース（ｋｂ）のバンドに分離される。一方、ＣタイプＣＲＤを欠くｈＳＲＣＬ−ＩＩは、ノザンブロットで４．５ｋｂのバンドを示す。ｍＳＲＣＬは、ｈＳＲＣＬ−Ｉに対応する１本の３．０ｋｂの転写物に分離され、他の転写物は認められなかった。この結果は、マウスのＳＲＣＬでは一つのアイソフォームのみ発現することを示す。ラットでは、ＳＲＣＬのコイルドコイル領域をターゲットとするプローブを用いると、ラットＳＲＣＬ  ｍＲＮＡが単一の３．０ｋｂのバンドとして分離されることが判明した。ラットＳＲＣＬ  ｍＲＮＡは、広範囲（脳、肺、心臓、脾臓、胃、小腸、大腸、腎臓、筋肉）に発現した（図１）。ＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの発現は、肺で最も高く、脾臓、小腸、大腸、胃、そして脳がそれに続いた。一方、ラットＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの肝臓、副腎及び胸腺における発現は検出限界以下であった。このように、同じげっ歯類のマウス、ラットでは、ｈＳＲＣＬ−Ｉに対応するＳＲＣＬ転写物のみを発現した。
ＧＡＰＤＨはローディングコントロールとしての役割を果たす。【００６３】
３．げっ歯類のミクログリアとアストロサイトにおけるＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの発現
アルツハイマー患者の脳において、ミクログリア及びアストロサイトが、老人斑と関係があり、該老人斑から繊維状のアミロイドβ（ｆアミロイドβ）を認識して取り込み、消去させることに寄与すると想定されている。これは、細胞表面のスカベンジャー受容体で容易に行われ得る。これらの細胞がＳＲＣＬを発現するかどうかを決定するために、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して培養したげっ歯類のミクログリア (図２Ａ，Ｂ)及び アストロサイトでのＳＲＣＬのｍＲＮＡ発現を検討した。２４時間培養後(ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１日, 1DIV)、ＳＲＣＬ  ｍＲＮＡはアストロサイトで検出され、４８時間培養後（2DIV）ではミクログリア（ＭＧ）で検出された（図２Ｃ)。その一方、ラット褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）とヒトＣ６グリオーマ細胞（Ｃ６）におけるＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの発現は、検出限界以下であった（図２Ｃ）。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＲＣＬ  ｍＲＮＡは神経系細胞のうちグリア細胞で最初に発現されるがニューロンでは発現されないことを示している。さらに、ＳＲＣＬ  ｍＲＮＡのレベルは、培養時間依存的に増加する（ＭＧ）か、アミロイドβ−ペプチド（ＡＳＴＲＯ）の使用によって調整されることを見出した。ミクログリアにおいて、ＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの発現レベルは培養時間に応じて増加し、培養開始１日後と比べて２日後に増加した。そして培養２日でのそのレベルは生後７日の脳におけるそれより高く、活性化されたことを示した(図２Ｄ)。この結果から、ミクログリアにおけるＳＲＣＬ  ｍＲＮＡのレベルがミクログリアの活性状態と相関しているように考えられた。fアミロイドβ１−４２がＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの発現を変えることができるかどうか判断するために、培養マウス新生児アストロサイトを図２Ｅで示される時間fアミロイドβ１−４２で処置し、ＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの発現を分析した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した分析において、ＳＲＣＬ  ｍＲＮＡレベルは対応するコントロールのアストロサイトのそれと比較してアミロイドβ１−４２処置後の時間に比例して増加した(図２Ｅ；ＧＡＰＤＨはローディングコントロールとしての役目を果たす。）。ＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの他のプライマーセットを使用して分析した結果も、同様の結果であった。ミクログリアにおけるＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの誘導レベルはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアストロサイトのそれとほとんど同程度であった(1.9vs.2.4)。ＳＲＣＬはスカベンジャー受容体として作用するというNakamuraらの報告(Biochem．Biophys．Res．Commun．，２００１年、第２８０巻（第４号）、ｐ．１０２８−１０３５；Biochim．Biophys．Acta．、２００１年、第１５２２巻（第１号）、ｐ．５３−５８)と、これらの結果を総合的にみると、ＳＲＣＬを発現している活性化グリア細胞は、アルツハイマー疾患が影響を及ぼす脳において神経変性の組織に存在する様々な物質、例えばfアミロイドβ等を認識すると考えられる。【００６４】
４．マウスミクログリアはｆアミロイドβ１−４２微小凝集塊を結合し、取り込む
ｆアミロイドβ１−４２の評価での活性化グリア細胞で発現したＳＲＣＬの役割を検討するため、繊維状のβ１−４２−アミロイドが認識され、取り込まれる陽性コントロールの条件を、ミクログリアを用いて構築した。３７℃で３日間のインキュベートによって合成アミロイドβ１−４２−ペプチドから調製したｆアミロイドβ１−４２とミクログリアとをインキュベートした時、ｆアミロイドβ１−４２微小凝集塊(緑色に染色される）が特にミクログリア（赤色に染色される）と結合して取り込まれることが分かった（図１１）。【００６５】
５．ＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現したｈＳＲＣＬ−ＩとｈＳＲＣＬ−ＩＩはｆアミロイドβ１−４２を結合する
ＳＲＣＬがｆアミロイドβ１−４２を結合する活性を有するかどうかを調べるため、スカベンジャー受容体にとってのメジャーリガンドの一つであるフコイダンの存在または非存在下で、ｈＳＲＣＬ−Ｉを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合するｆアミロイドβ１−４２を調べた。マウスクラスＡタイプＩスカベンジャー受容体（ｍＳＲ−ＡＩ）を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞は陽性コントロールとしての役割を果たす。ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳで洗浄後、固定し、ｍＳＲ−ＡＩ−Ｍｙｃ又はｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃを可視化するためにｆアミロイドβ１−４２とＭｙｃに対する抗体と共に免疫染色した。ｆアミロイドβ１−４２結合（緑色に染色される）はｍＳＲ−ＡＩ−Ｍｙｃ又はｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ（赤色に染色される）を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞に明確に見られた。一方、前記ｆアミロイドβ１−４２結合は過度な量のフコイダンの存在下で著しく競合した（図３Ａ）。
ｆアミロイドβ１−４２を結合するＳＲＣＬの活性をさらに確認するために、フラグタグをｍＳＲＣＬの細胞質側の末端部に融合させたｍＳＲＣＬ−Ｆｌａを安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１を作成した。同様の結果が、ｍＳＲＣＬを安定して発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合しているシアニン３（Ｃｙ３）で蛍光ラベルしたｆアミロイドβ１−４２（Ｃｙ３−ｆアミロイドβ１−４２）を試験した時にも得られた（図１２）。
Ｃｙ３−ｆアミロイドβ１−４２と結合する親細胞のＣＨＯ−Ｋ１細胞の不作為に比較して、ｍＳＲＣＬを安定的に発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞はＣｙ３−ｆアミロイドβ１−４２（赤色に染色される）との強い結合能力を示した。そしてこの結合はフコイダンによって競合した（図１２）。これらの結果は、ＳＲＣＬがフコイダンのような他のスカベンジャー受容体リガンドと相互に作用する同じ残基を使用することによって特にｆアミロイドβ１−４２に束縛されることを証明している。さらにＳＲＣＬのＣＲＤ領域がＳＲＣＬに対するｆアミロイドβ１−４２の結合に必須であるかどうかを調べるために、ｍＳＲ−ＡＩ−Ｍｙｃ−、ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ−、ｈＳＲＣＬ−ＩＩ−Ｍｙｃ−又はＭｏｃｋ−発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞とｆアミロイドβ１−４２との結合を検討した。細胞は、抗Ｍｙｃ及び抗アミロイドβ抗体とＡｌｅｘａ５４６（赤色に染色される）及びＡｌｅｘａ４８８（緑色に染色される）でコンジュゲートされた抗体で検出され、可視化された。ｆアミロイドβ１−４２微小凝集塊（緑色に染色される）はｍＳＲ−ＡＩ−Ｍｙｃ−、ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ−及びｈＳＲＣＬ−ＩＩ−Ｍｙｃ−発現細胞（赤色に染色される）に特異的に結合したが、Ｍｏｃｋをトランスフェクトした細胞では結合しなかった。ｍＳＲ−ＡＩを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に加えて、ｈＳＲＣＬの各イソフォームを発現するこれら細胞は、効率よくｆアミロイドβ１−４２を結合するが、Ｍｏｃｋ−形質転換細胞はｆアミロイドβ１−４２を結合しなかった。ｈＳＲＣＬ−Ｉと−ＩＩとの間のドメインの構成に違いがあるなら、アミロイドβ1-42結合は最初ＳＲＣＬコラーゲン様ドメインによって介在され、ｈＳＲＣＬ−ＩのＣＲＤは相対的にほとんど結合に寄与しなかったことは明白である。
最後に、ポリ（Ｇ）の存在下でこれら細胞と結合するｆアミロイドβ１−４２を検討した。スカベンジャー受容体のリガンドは、ＳＲ−ＡＩのコラーゲン様ドメインのポリカチオン性領域と結合するfアミロイドβ１−４２を抑制する。ポリ（Ｃ）はネガティブコントロールとしての役目をする。ｍＳＲ−ＡＩを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞へのｆアミロイドβ１−４２の結合は、２００μｇ／ｍＬのポリ（Ｃ）によって抑制されなかったが、２００μｇ／ｍＬのポリ（Ｇ）で抑制された。ｆアミロイドβ１−４２に対するｈＳＲＣＬ結合が機構的にｍＳＲ−ＡＩによる結合と類似するかどうかをみるため、ｈＳＲＣＬ−Ｉ−又は−ＩＩを発現している細胞で同じ分析を行った。ｍＳＲ−ＡＩの結果と対照をなして、各イソフォームを発現する細胞によるｆアミロイドβ１−４２との結合は、２００μｇ／ｍＬのポリ（Ｇ）に敏感に反応しなかった（図３Ｃ)。ｈＳＲＣＬ−Ｉ及び−ＩＩはｍＳＲ−ＡＩと違った方法でfアミロイドβ１−４２と結合するという可能性を排除できなかったけれども、最も可能性の高い差異は、ＳＲ−ＡＩの単一ドメインに対して、ＳＲＣＬ（３つのドメイン）のコラーゲン様ドメインに存在する多くの数のポリカチオン性領域にあると考えられる。そしてfアミロイドβ１−４２に対するＳＲＣＬの結合親和力は、ＳＲ−ＡＩのそれより高いと考えられる。なお、ｈＳＲＣＬ−Ｉ、ｈＳＲＣＬ−ＩＩ及びｍＳＲＣＬのドメイン構造におけるコイルドコイル領域、コラーゲン様ドメイン及びＣＲＤ領域の位置を示す概略を図４Ａに示す。【００６６】
６．Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるｍＳＲＣＬの免疫組織化学的局在
アルツハイマー疾患を発症した脳のＳＲＣＬタンパク質の免疫学的局在解析のために、ｈＳＲＣＬのＣＲＤ領域のＱＰＤシークエンスに対して特異的なウサギ抗−ｈＳＲＣＬポリクロナール抗血清を作り出した。免疫性ペプチドを担持しているアフィニティーカラムを使って抗血清を精製した。得られた精製抗体を以後、抗ＳＲＣＬ抗体と称する。ｈＳＲＣＬ−ＩＩを除くｈＳＲＣＬ−ＩとｍＳＲＣＬは、ＱＰＤシークエンスを含むＣＲＤ領域を有するので、抗ＳＲＣＬ抗体は、ｈＳＲＣＬ−ＩとｍＳＲＣＬを特異的に認識すると予想された。抗ＳＲＣＬ抗体を使用するウエスタンブロット分析から、この抗体がヒトＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰで形質転換された細胞（ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ）、マウスＳＲＣＬ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰで形質転換された細胞（ｍＳＲＣＬ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ）、及びマウスマクロファージＪ７７４Ａ.１で予期された分子の大きさでＳＲＣＬ蛋白質を認識するが、Ｍｏｃｋ／ＥＧＦＰで形質転換された細胞やｈＳＲＣＬ−ＩＩ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰで形質転換された細胞では認識しないことが分かった(図４Ｂ)。反応型タンパク質の分子量のわずかな違いは、糖鎖形成パターンの違いを反映しているのかもしれない。さらに、この抗体の特異性を確かめるために、ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ、ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰ及びＳＲＣＬ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰで形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を抗ＳＲＣＬ抗体で免疫染色した（図４Ｃ）。形質転換された細胞の免疫染色により、この抗体が一時的にｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰやｍＳＲＣＬ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を認識するが、Ｍｏｃｋ／ＥＧＦＰやｈＳＲＣＬ−ＩＩ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を認識しないことが分かった。その上、免疫源での抗ＳＲＣＬ抗体の前吸収により、ｈＳＲＣＬ−Ｉ−Ｍｙｃ／ＥＧＦＰを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞を認識するこの抗体の免疫反応性がなくなった。
これらの観察結果は、ｈＳＲＣＬ−ＩとｍＳＲＣＬに対するウサギ抗ＳＲＣＬ抗体の特異性を明白に示している。【００６７】
この抗体を用いて、Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（変異型アミロイドβ前駆タンパク質と変異型ヒトプレセニリン１を共発現する家族性アルツハイマー病の２重遺伝子導入マウスモデル）でのＳＲＣＬの免疫学的局在を検討した。野生型同腹子において、血管周囲マクロファージに存在するＳＲＣＬの特異的染色（データを示していない）を除き、大脳皮質に位置するミクログリアとアストロサイトの特異ＳＲＣＬ−免疫陽性は観測されなかった(図５Ａ，上段図，矢印)。それとは対照的に、大量のＳＲＣＬ−免疫陽性が、９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質と海馬の両方において、ＧＦＡＰ−陽性のプラーク周囲で反応するアストロサイトで可視化された(図５Ａ)。ＳＲＣＬ免疫活性の強度は、アミロイドβプラークの近くにあるＧＦＡＰ陽性アストロサイトで強かったが（図５Ａ，矢じり）、そのようなアミロイドβプラークの遠位に局在するアストロサイトでは弱かった（図５Ａ，矢印）。これらのデータはアミロイドβがｉｎ  ｖｉｔｒｏでアストロサイトのＳＲＣＬレベルを増加させたことと一致している（図２Ｅ）。その一方、ＳＲＣＬ−免疫陽性は野生型マウスでは検出されず、９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイドβプラークとの関連において海馬のアミロイドＣＡ１領域の神経細胞でほんのはずかに検出された（図５Ａ，最下段図）。ミクログリアにおいて、ＳＲＣＬ−免疫性は、野生型マウスで検出限界以下であった（図５Ｂ，上段図）。一方、Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１では、ミクログリアのＳＲＣＬ−免疫陽性のわずかなアップレギュレーション（上昇）がｉｎ  ｖｉｖｏでアミロイドβプラークに伴ってみられた。これらの結果から、ＳＲＣＬが、アルツハイマー患者のアストロサイトとミクログリアのようなグリア細胞で重要な役割を果たしていることが分かる。【００６８】
次に、ＳＲＣＬが、アルツハイマー疾患の典型的な病理学的特徴である脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の発症後に、細胞で誘発され得るかどうかを、ＳＲＣＬと９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウス及びそれらの野生型同腹子の大脳皮質でのＳＲＣＬとアミロイドβ１−４２又はβ１−４０の２重免疫染色によって検討した。９ヶ月齢のＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと野生型同腹子の大脳皮質のパラフィン切片を、Zenon rabbit IgG Labeling Kit（Invitrogen社製）を用いてＡｌｅｘａ５４６（赤色に染色される）及びＡｌｅｘａ４８８（緑色に染色される）で前もってそれぞれ標識されたウサギ抗アミロイドβ１−４０／１−４２及びウサギ抗ＳＲＣＬ抗体とインキュベートした。また細胞核を可視化するためHoechst33342（青色に染色される）で対比染色した。同齢の野生型同腹子で、血管周囲マクロファージ（ｍ．ｖ．；図６上段図の矢じり）のＳＲＣＬの特異染色を除いて、アミロイドβ−免疫陽性又はＳＲＣＬ−免疫陽性の特異染色は髄膜の血管の内側では見られなかった。これとは対照的に、特にＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＡＡの特徴を示す髄膜の血管でＳＲＣＬ−免疫陽性とアミロイドβ１−４２／１−４０の共局在化が顕著であった（図６，矢印）。高い倍率で、ＳＲＣＬ−免疫陽性とアミロイドβ１−４０−免疫陽性は粒子として見えた。その多くは血管／血管周囲の細胞の血管壁の内側に共局在化していた（図６）。第１抗体なしでインキュベートした切片は染色がなかった(図６，最下段図)が、このことはＳＲＣＬ−免疫陽性の特異性を確認するものである。
図７Ａは、野生型マウスとＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１の髄膜血管（ｍ．ｖ．）の血管／血管周囲の細胞の略図を示す。野生型マウスにおいて、ｍ．ｖ．は平滑筋細胞（ＳＭＣｓ：オレンジ色に染色される）によって囲まれる血管内皮細胞（ＥＣｓ：明緑色に染色される）を含み、その血管壁は薄い。血管のそばには、血管周囲マクロファージ（ＭＡＴＯ細胞：黄色に染色される）が存在する。Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１のｍ．ｖ．では、大量のアミロイドβ（赤色に染色される）が血管壁内に局在する。多くのマクロファージ（Ｍφ：黄色に染色される）が血管壁の外側に付着し、かつ血管壁に浸透するので、ＳＭＣｓの数が増加し、血管壁は病気の進展の間に薄くなる。血管／血管周囲細胞は、おそらく貪食の結果として、細胞の内側に多数のアミロイドβ粒子（赤色に染色される）を含んでいる。これらのアミロイドβ含有細胞は、マクロファージ（Ｍφ）とＭＡＴＯ細胞だけでなく、ＳＭＣｓ及びＥＣｓも挙げられる。アミロイドβに局在が認識されても、アミロイドβの結合と摂取に関与する分子は特定されていない。
ＳＲＣＬ−免疫陽性がＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１−血管内のアミロイドβ１−４０／１−４２−免疫陽性と共局在化した（図６）ので、血管／血管周囲細胞特異的抗体〔抗ラットＣＤ３１（抗原としての活性ルイスラットミクログリア、ＭＡＴＯ細胞とＥＣｓを含むミクログリア／マクロファージとしてのマーカー）、抗αＳＭＡ（ＭＣｓとしてのマーカー）、及び抗ＧＦＡＰ抗体（アストロサイトとしてのマーカー）〕を使用して、いずれの血管／血管周囲細胞が血管／血管周囲細胞がＳＲＣＬを発現するかを検討した。野生型同腹子において、ＭＡＴＯ細胞（図７Ｂ，矢じり）を除いてＣＤ３１−免疫陽性（赤色に染色される；図７Ｂ，上段図）と共存するＳＲＣＬ−免疫陽性（緑色に染色される）は容易に観察できなかった。野生型同腹子のｍ．ｖ．において、ＳＲＣＬ−免疫陽性はαＳＭＡ陽性ＭＣｓでほんのわずかしか検出されなかったが、ＣＤ３１陽性ＥＣｓにかなり検出された（図７Ｂ，各々中央及び上段図）。野生型同腹子とは対照的に、Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスでは、血管／血管周囲細胞の小集団にＳＲＣＬ−免疫陽性（緑色に染色される）が強く検出された（図７Ｃ及び７Ｄ）。ＳＲＣＬ−免疫陽性の強さ（緑色に染色される）は、Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１において、ＭＡＴＯ細胞のＳＲＣＬ−免疫陽性と同様にＣＤ３１−免疫陽性に加えて、ＳＲＣＬ−免疫陽性は、浸潤性マクロファージが蓄積した髄膜血管壁の内側、並びにＥＣｓにおいて極めて強かった（図７Ｂ，上段図，矢印；赤色に染色される）。このことは、マクロファージにおけるＳＲＣＬの誘導を示唆している。高拡大図（図７Ｃ，上段図）で、ＳＲＣＬ−免疫陽性（緑色に染色される）は、血管壁内に蓄積したＣＤ３１−陽性マクロファージ（赤色に染色される）の内部に多数の粒子として現れた。このことはマクロファージによるＳＲＣＬの細胞内へ取り込まれていることを示している。ＳＲＣＬ−免疫陽性の強さ（緑色に染色される）は、Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳマウス（図７Ｂ，中央図）のαＳＭＡ−陽性ＳＭＣｓで著しく増加した。高倍率（図７Ｃ，下段図）で、ＳＲＣＬ−免疫染色性は、αＳＭＡ−陽性細胞において、多数の粒子として細胞内で共染色された。このことは、Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１のＳＭＣｓにおいてＳＲＣＬが細胞内へ取り込まれていたことを示している。Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１において、ＧＦＡＰ陽性アストロサイト細胞体（赤色に染色される）と脳アミロイド血管炎（ＣＡＡ）に関連する脳微小血管（ｃ．ｖ．）を取り巻く足部（赤色に染色される）の両方の内部でＳＲＣＬ−免疫陽性（緑色に染色される）の強い誘導が観察された。アミロイド斑（アスタリスク）に関連したアストロサイトはＳＲＣＬ−免疫陽性を顕著に細胞内で発現した。このことはアストロサイトにおいてＳＲＣＬによってアミロイドβが細胞内へ取り込まれていることを示している。アミロイド斑（アスタリスク）と脳微小血管（ｃ．ｖ．）の両方に向かって足を伸ばすアストロサイトが時々、観察された。この知見は、アミロイド斑からｃ．ｖ．を経て体循環への移動によってアミロイドβクリアランスが起きることに、アストロサイトのＳＲＣＬが役割を果たしていることを示している。【００６９】
以上の免疫染色の結果から、野生型同腹子において、ＳＲＣＬ−免疫染色性はＳＭＣｓではわずかであるもののＭＡＴＯ細胞に存在していた。一方、Ｔｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいては、血管壁の内側ではＳＲＣＬ−免疫陽性が著しく誘導され、粒子としてアミロイドβ１−４０／１−４２−免疫陽性と共局在化することが分かった。血管／血管周囲細胞内で、ＳＲＣＬが浸潤性のマクロファージ、ＭＡＴＯ細胞、ＳＭＣｓ、ＥＣｓおよびＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１のアストロサイトに誘導された。このことにより、血管／血管周囲細胞の亜集団においてアップレギュレート（誘導）されたＳＲＣＬはＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１脳内でのアミロイドβの結合およびクリアランスに重要な役割を果たしていることが分かった。
７．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるアルツハイマー病患者の脳におけるＳＲＣＬの発現の定量
アルツハイマー病患者の脳におけるＳＲＣＬの発現と局在性に関して、表４に記載したアルツハイマー病患者及び非アルツハイマー病（コントロール）からの病理解剖サンプルでのＳＲＣＬ  ｍＲＮＡの発現を検討した。
【表４】
2007139120.tif 000005
【００７０】
病理解剖サンプルの数が限定され、統計分析に不十分であるが、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、コントロールの被験者と比較してアルツハイマー疾患患者の皮質組織のＳＲＣＬ  ｍＲＮＡのレベルの増大傾向を示した(図８)。【００７１】
８．アルツハイマー病患者の脳におけるｈＳＲＣＬの発現
アルツハイマー病患者の側頭皮質におけるＳＲＣＬの免疫学的局在決定を詳細に調べた。免疫活性はＤＡＢ（茶色に染色される）を用いて可視化された。その結果、多数のＳＲＣＬ免疫活性細胞がアルツハイマー病の脳組織に存在するのが確認されたが、ＳＲＣＬ免疫活性細胞はコントロール被験者のサンプルでは僅かであった（図９Ａ）。ＳＲＣＬ／ＧＦＡＰ−二重免疫染色を使用して、濃いＳＲＣＬ−免疫陽性（桃色）が、プラーク（アスタリスク）を取り囲んでいる反応性アストロサイトと血管周囲のアストロサイトの終足（茶色）の中に、ＧＦＡＰ−（茶色）と共局在化していることを観察した（図９Ｂ）。高倍率で、ＳＲＣＬ−免疫染色性は、細胞内に粒子として観察された（図９Ｂ，右図）。さらに、ＳＲＣＬとＩｂａ−１（ＭＡＴＯ細胞を含むミクログリア／マクロファージ）とを共染色したとき、ＳＲＣＬ−免疫染色性（桃色に染色される）が、アルツハイマー疾患が影響を与えた脳のＩｂａ１−陽性反応型ミクログリア（矢印）又は血管マクロファージ及びＭＡＴＯ細胞（矢じり）に検出された（図９Ｃ）。その上、ＳＲＣＬ（桃色に染色される）とアミロイドβ１−４０／１−４２（茶色に染色される）の二重染色は、ＳＲＣＬ−免疫陽性がアルツハイマー患者の血管細胞、例えば浸潤性マクロファージ、ＳＭＣｓやある種のＥＣｓ等（図１０Ａ及び１０Ｂ，矢じり）の細胞内区画で多重粒子としてアミロイドβと共局在化することを明らかにした。この結果はＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１での結果と一致する（図６及び７Ｃ）。ＳＲＣＬ−免疫陽性の特異性はその抗原で抗体を前吸収することによって確かめられた。アルツハイマー疾患の脳で、ＳＲＣＬ−免疫陽性は、プラーク関連反応性アストロサイト、活性化したミクログリアや血管／血管周囲細胞の内側に多数の粒子、例えば血管壁内の浸潤性マクロファージや、ＣＡＡと関係がありＴｇ−ＡＰＰ／ＰＳ１マウスでの結果と一致したＳＭＣｓとＥＣｓなどとして出現した。この結果から、反応性アストロサイトのアップレギュレートしたＳＲＣＬ、活性化されたミクログリイアおよび血管／血管周囲細胞がアルツハイマー患者のアミロイドβ結合とクリアランスに関わっていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の治療剤又は発病抑制剤は、アルツハイマー病の予防又は治療のための薬剤として有用である。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月10日(2008.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするアミロイドβクリアランス促進剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
有効成分が、（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の促進剤。
【請求項４】
有効成分が、（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の促進剤。
【請求項５】
ＤＮＡが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター及び免疫不全症ウイルスベクターから選択される少なくとも１種のベクターに組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第１又は４項に記載の促進剤。
【請求項６】
アミロイドβが脳内アミロイドβであることを特徴とする請求の範囲第１、３〜５項のいずれかに記載の促進剤。
【請求項７】
アミロイドβの蓄積部位へ局所投与されることを特徴とする請求の範囲第１、３〜６項のいずれかに記載の促進剤。
【請求項８】
髄腔内に投与されることを特徴とする請求の範囲第４又は５項記載の促進剤。
【請求項９】
請求の範囲第５項記載の促進剤でトランスフェクトされた細胞を含有することを特徴とする注射剤。
【請求項１０】
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするアミロイドβの蓄積に起因する疾患の予防又は治療剤。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
疾患がアルツハイマー病であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の予防又は治療剤。
【請求項１３】
アミロイドβクリアランス促進を必要とする患者に、治療的に有効量の（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として投与することを特徴とするアミロイドβクリアランス促進方法。
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
アミロイドβクリアランス促進剤を製造するための、（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか、あるいは（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡの有効成分としての使用。
【国際調査報告】
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