【手続補正書】
【提出日】平成20年5月15日(2008.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、Ｆｒａｎｋ  Ｊ．Ｓｌａｃｋ、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｋｒｉｓｔｙ  Ｌ．Ｒｅｉｎｅｒｔ、およびＨｅｌｇｅ  Ｇｒｏｓｓｈａｎｓによる発明の名称「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ」である米国特許出願第６０／６０６，８５５号（２００４年９月２日出願）に基づく優先権を主張する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」といわれる）は、非翻訳の低分子ＲＮＡであり、マイクロＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物上の相補部位に結合することによって遺伝子発現を制御することが植物および動物において見出される、調節性分子のクラスに属する。ｍｉＲＮＡは、核において約７０ヌクレオチドのプレｍｉＲＮＡにプロセスされる大きいＲＮＡ前駆体（プリｍｉＲＮＡと称される）から産生され、ｍｉＲＮＡは、不完全なステム−ループ構造（非特許文献１）（図１）（配列番号１、２および３）にフォールディングされる。プレｍｉＲＮＡは、１８ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長の成熟ｍｉＲＮＡがＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素（Ｄｉｃｅｒ）によってプレｍｉＲＮＡヘアピンの一方から切り出される細胞質内で、さらなるプロセシング工程を受ける（非特許文献２および非特許文献３）。ｍｉＲＮＡは、２つの方法で遺伝子発現を調節することが示されている。第１に、そのｍｉＲＮＡに厳密に相補的であるタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ媒介性の干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する。メッセンジャーＲＮＡ標的は、ＲＩＳＣ複合体においてリボヌクレアーゼによって切断される。ｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシングのこの機構は、主に植物において観察されている（非特許文献４および非特許文献５）が、動物からの例も知られている（非特許文献６）。第２の機構において、メッセンジャーＲＮＡ転写物上の不完全な相補部位に結合するｍｉＲＮＡは、転写後のレベルにおける遺伝子制御を指揮するが、そのｍＲＮＡ標的を切断しない。植物および動物の両方において同定されたｍｉＲＮＡはこの機構を使用して、それらの遺伝子標的の翻訳の制御を発揮する（非特許文献７）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
これらの２１ヌクレオチド〜２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡは、それらの標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の不完全な相補部位に結合することによって効果を発揮し、そして翻訳のレベルにおいてこれらの遺伝子の発現を抑制する（Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ、（１９９３）、７５（５）：８４３−８５４；Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０３：９０１−９０６；Ｍｏｓｓら、Ｃｅｌｌ（１９９７）、８８（５）：６３７−４６；Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００３）、４（５）：６３９−５０；Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、（２０００）、５：６５９−６６９；Ａｂｒａｈａｎｔｅ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００３）、４（５）：６２５−３７；ならびにＯｌｓｅｎ，Ｐ．Ｈ．およびＶ．Ａｍｂｒｏｓ、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、（１９９９）、２１６（２）：６７１−８０）。ｌｉｎ−４１  ３’ＵＴＲからのｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ相補部位（ＬＣＳ）（配列番号４および５）の欠失（図２）は、Ｌ４段階および成虫段階の間の、ｌｉｎ−４１の正常なダウンレギュレーションの抑止を示し、そして最近の研究は、これらの相補部位が、単独で、ｌｉｎ−４１の調節に十分であることを示した（Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０３：９０１−９０６；Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、（２０００）、５：６５９−６６９；Ｖｅｌｌａ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、（２００４）、１８（２）：１３２−７）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
ｌｉｎ−４  ｍｉＲＮＡおよびｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡは、ヒトを含む高等動物において進化的に保存され（図３）（配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５）、そして時間的に発現され（下の実施例を参照のこと）、このことは、動物の発生の間のこれらのｍｉＲＮＡの普遍的な役割を暗示する（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、Ｍｏｕｓｅ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、（２００２）、１２（９）：７３５−９およびＰａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０８（６８０８）：８６−９）。ｌｅｔ−７オルソログは、ヒトを含む哺乳動物において同定されており、そしてｌｅｔ−７は、ノーザンブロットによって判断されるように、ヒトの肺組織中で発現される（Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．ら）。配列決定されたヒトゲノム中の成熟ｌｅｔ−７配列の３つの正確なコピー（別個のプロモーターの制御下において、ｌｅｔ−７ａ１、ｌｅｔ−７ａ２、ｌｅｔ−７ａ３と称される）、および特定のヌクレオチド位置においてｌｅｔ−７と異なる種々の近いホモログ（例えば、ｌｅｔ−７ｃ（配列番号１６）、図３を参照のこと）が存在する。線虫、ハエおよびヒトのｌｅｔ−７遺伝子は、ステムループ構造を形成すると予想される前駆体形態（プレｌｅｔ−７）からプロセシングされ、このステムループ構造はまた、保存される（図１）。同様に、ｍｉｒ−１２５ａ（配列番号２２）、（配列番号２５）およびｍｉｒ−１２５ｂ（配列番号２３）と命名される、ｌｉｎ−４の２つのヒトホモログおよびマウスホモログが存在する（図３）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
（結果）
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡのｌｅｔ−６０／ＲＡＳを含むさらなる標的。上記ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡは、それが少なくとも２つの標的遺伝子（ｌｉｎ−４１（Ｓｌａｃｋら、（２０００）、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ、５、６５９−６６９）およびｈｂｌ−１（Ａｂｒａｈａｎｔｅら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、４、６２５−６３７；Ｌｉｎら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、４、６３９−６５０））をダウンレギュレートする場合（シーム細胞の早発性の末端への分化を生じる変異）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて時間的に発現される（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ、４２６、８４５−８４９；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０８、８６−８９；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのシーム細胞分化におけるｌｅｔ−７の役割およびヒトにおけるその潜在的な役割を十分に理解するために、ｌｅｔ−７のさらなる標的を同定した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子についてのコンピューターによるスクリーニングを、ｌｅｔ−７ファミリーの３’ＵＴＲにおけるｌｅｔ−７ファミリー相補部位（ＬＣＳ）（Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ，Ｈ．ら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００５）、８（３）：３２１−３０）を用いて行った。最高スコアの遺伝子の１つは、ヒトのオンコジーンＲＡＳのＣ．ｅｌｅｇａｎｓオルソログをコードするｌｅｔ−６０であった。８種のＬＣＳを、確認されたＬＣＳのような特徴（Ｌｉｎら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、４、６３９−６５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６；Ｓｌａｃｋら、（２０００）、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ、５、６５９−６６９；Ｖｅｌｌａら、（２００４）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１８、１３２−１３７）を有するｌｅｔ−６０の３’ＵＴＲにおいて同定した（図４Ａ）（配列番号２６、２７、２８、２９、３２、３３、３４および３５）。その同定した部位の多くを、近縁の線虫Ｃ．ｂｒｉｇｇｓａｅ由来のｌｅｔ−６０の３’ＵＴＲ（Ｓｔｅｉｎら、（２００３）、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、１、Ｅ４５）において見出した（図４Ａ、図１１および図１２）。このことは、それらの部位が生物学的に重要であるらしいことを示唆する。さらなる３つの部位を、ｌｅｔ−６０／ＲＡＳをコードする配列、およびｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡも結合し得る１０個の他の適合しない３’ＵＴＲ部位に見出した（図１１）（配列番号６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９および８０）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
ヒトのＲＡＳ  ３’ＵＴＲ中のｌｅｔ−７相補部位。多くのｍｉＲＮＡは、ヒトの癌において変更され（Ｃａｌｉｎら、（２００２）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９、１５５２４−１５５２９；Ｃａｌｉｎら、（２００４）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１、２９９９−３００４；Ｍｉｃｈａｅｌら、（２００３）、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１、８８２−８９１；Ｔａｍら、（２００２）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６、４２７５−４２８６）、そして３種の最もよく認識されれいるｍｉＲＮＡ、ｌｉｎ−４（Ｌｅｅら、（１９９３）、Ｃｅｌｌ、７５、８４３−８５４）、ｌｅｔ−７（Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６）およびｂａｎｔａｍ（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら、（２００３）、Ｃｅｌｌ、１１３、２５−３６）の全ては、細胞増殖および細胞分化を調節する。ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４の最も近縁のヒトホモログは、Ｈ．ｓ．ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、（２００２）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、１２、７３５−７３９；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０８、８６−８９）である。ｌｅｔ−６０／ＲＡＳ（配列番号８７）は、ヒトＨＲＡＳ（配列番号８４）、ヒトＫＲＡＳ（配列番号８６）、およびヒトＮＲＡＳ（配列番号８５）（肺癌を含むヒトの癌において一般的に変異される（ＭａｌｕｍｂｒｅｓおよびＢａｒｂａｃｉｄ、（２００３）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、３、４５９−４６５））のＣ．ｅｌｅｇａｎｓオルソログである（図１３Ａ〜図１３Ｂ）。３種全てのヒトのＲＡＳ  ３’ＵＴＲが、確認されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＬＣＳ（配列番号３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、５５）の特徴を有する、複数の推定ｌｅｔ−７相補部位を含むことを見出した（図４Ｂ〜図４Ｄ）。これらの多くは、げっ歯類、両生類および魚類において保存され（図１４および図１５（配列番号９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３））、このことは、機能的な関連性を示唆する。ヒトのＲＡＳ  ３’ＵＴＲにおける推定ＬＣＳの存在は、哺乳動物のｌｅｔ−７ファミリーメンバーが、ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてｌｅｔ−６０／ＲＡＳを調節するのと同様の様式で、ヒトＲＡＳを調節し得ることを示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
【図１】図１は、種々の生物体由来のｌｅｔ−７  プレｍｉＲＮＡ（配列番号１、２および３）の予想される二次構造を示す。網掛けされた残基は、Ｄｉｃｅｒによって切り出される成熟ｍｉＲＮＡ転写物を示す。
【図２】図２は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７）（配列番号６）と、その標的ｍＲＮＡ（ｌｉｎ−４１）（配列番号４および５）との間の可能なＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の模式図である。ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡについての機能喪失型変異の部分（ｌｅｔ−７（ｎ２８５３））は、その二重鎖の下方の矢印によって示される。
【図３】図３は、ヒトおよびマウスを含む多様な種に由来するｌｅｔ−７ホモログ（配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５）を示す。ｌｉｎ−４（配列番号２２）の２種のヒトホモログ、ｍｉｒ−１２５ａ（配列番号２５）およびｍｉｒ−１２５ｂ（配列番号２３）が存在する。ｍｉｒ−２３７（配列番号２４）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｉｎ−４ホモログである。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−６０／ＲＡＳ遺伝子および哺乳動物のＲＡＳ遺伝子中の可能性のあるＬＣＳを示す。図４Ａ：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−６０／ＲＡＳ  ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲ、黒い矢印は、Ｃ  ｅｌｅｇａｎｓとＣ．ｂｒｉｇｇｓａｅとの間の類似性を有する部位を示し、そして白い矢印は、非類似部位を示す。ＬＣＳ（配列番号２６、２７、２８、２９、３２、３３、３４、および３５）（一番上）およびｍｉＲ−８４（配列番号３０および３１）（一番下）によって形成される予想される二重鎖は、下に示され、ｌｅｔ−７およびｍｉＲ−８４は、類似するので、大部分のｌｅｔ−７部位がまた、可能性のあるｍｉＲ−８４部位である。図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、Ｈ．ｓ．ＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲ、ＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲおよびＨＲＡＳ  ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲｓが、それぞれ、９個（配列番号３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、および４５）、８個（配列番号３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、および４５）および３個（配列番号５４、５５および５６）の可能なＬＣＳを有することを示す。黒い矢印は、哺乳動物種の間（ほとんどの場合において、ヒト、ラット、マウス、ハムスターおよびモルモット）で保存される部位を示す。ＬＣＳ（一番上）およびｌｅｔ−７ａ  ｍｉＲＮＡ（配列番号３９）（一番下）によって形成される仮定された二重鎖は、下に示される。
【図５】図５Ａは、２０℃にて成長させた５つの独立した野生型トランスジェニック系から得た発現パターンの定量的分析のグラフである。少なくとも２５％の抑制が、全ての株において観察された。ＬＣＳ（ｐＦＳ  １０３１）を欠く非調節のｌｉｎ−４１  ３’ＵＴＲ（二つ組で試験された）は、コントロールとして示される。図５Ｂは、レポーター遺伝子発現のダウンレギュレーションが許容温度（１５℃）にて成長させたｌｅｔ−７（ｎ２８５３）変異体の虫において喪失することを示すグラフである。その親（Ｎ２）の系は、三つ組で試験された；４つの同遺伝子系のｌｅｔ−７（ｎ２８５３）変異体系が、試験された。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図６−１】図６Ａ〜図６Ｃは、発現データの定量化のグラフである。ｇｆｐ５４は、ｌｉｎ−３１プロモーターによって駆動される、ｇｆｐのｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲへの融合体である。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図６−２】図６Ａ〜図６Ｃは、発現データの定量化のグラフである。ｇｆｐ５４は、ｌｉｎ−３１プロモーターによって駆動される、ｇｆｐのｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲへの融合体である。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ｌｅｔ−７の存在が、ヒト細胞においてＲＡＳの発現に影響することを示すグラフ。ＨＥＰＧ２細胞は、１０ｎＭおよび３０ｎＭのｌｅｔ−７またはネガティブコントロールの前駆体ｍｉＲＮＡによってトランスフェクトされた。ＮＲＡＳ、ＶＲＡＳ、およびＫＲＡＳに特異的な抗体を使用した免疫蛍光は、ｌｅｔ−７のトランスフェクト細胞がＲＡＳタンパク質のずっと低いレベルを有することを示した。図７Ａは、トランスフェクト体の複製物から得たＲＡＳ抗体の蛍光の定量化のグラフである。あるいは、ＨｅＬａ細胞は、１００ｎＭのｌｅｔ−７インヒビターまたは１００ｎＭのネガティブコントロールインヒビターによってトランスフェクトされた。ＲＡＳの免疫蛍光は、ｌｅｔ−７インヒビターによってトランスフェクトされた細胞が、ネガティブコントロールのトランスフェクト細胞と比較して、ＲＡＳタンパク質の増加したレベルを有することを示した。図７Ｂは、トランスフェクト体の複製物から得たＲＡＳ抗体の蛍光の定量化のグラフである。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、ＫＲＡＳおよびＫＲＡＳの３’ＵＴＲが、ｌｅｔ−７の調節を可能にすることを示す。図８Ａは、短いＮＲＡＳ（ＮＲＡＳ  Ｓ）３’ＵＴＲ、長いＮＲＡＳ（ＮＲＡＳ  Ｌ）３’ＵＴＲおよびＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲを示す模式図である。矢印は、ＬＣＳを示す。黒塗りの領域は、レポーターの後方にクローニングされた配列を示す。図８Ｂは、トランスフェクションのコントロール（ウミシイタケルシフェラーゼ）に対して正規化された、ホタルルシフェラーゼ発現の相対的抑制のグラフである。ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔは、空ベクターである。図８Ｃは、ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳに対応する３’ＵＴＲドメインを有するレポータープラスミドがｌｅｔ−７のインヒビターによって同時トランスフェクトされる場合に、コントロールインヒビターと比較した、ホタルルシフェラーゼ発現の誘導のグラフである。
【図９】図９Ａは、付随する隣接正常組織（ＮＡＴ）と比較した、２１種の乳房、結腸、および肺の腫瘍におけるｌｅｔ−７の発現のグラフである。蛍光標識したｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｃに特異的なプローブを含んだマイクロアレイにハイブリダイズされた。腫瘍およびＮＡＴについての蛍光強度は、全てのエレメントについての合計の蛍光シグナルによって正規化された。腫瘍サンプルおよび隣接正常サンプルにおけるｌｅｔ−７プローブからの相対的な平均シグナルを、対数比として表す。図９Ｂは、３つの肺の有棘細胞癌由来の腫瘍組織サンプルおよび隣接組織サンプルにおける、ＲＡＳタンパク質とｌｅｔ−７ｃ発現との間の相関関係のグラフである。ＧＡＰＤＨタンパク質およびＲＡＳタンパク質は、ウェスタン分析を使用して、腫瘍組織および隣接正常組織の粗抽出物から測定された。上記２つのタンパク質は、検出のために使用される抗体を混合することによって同時に評価された。小さいＲＮＡのノーザンブロットは、ｌｅｔ−７ｃおよびＵ６  ｓｎＲＮＡに特異的な放射標識プローブを用いて連続的にアッセイされた。ｉｎ  ｔｈｅ腫瘍組織サンプルおよび隣接組織サンプル中のＮＲＡＳ  ｍＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲによって測定された。リアルタイムデータは、種々のサンプルにおける１８Ｓ  ｒＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ検出に基づいて正規化された。隣接正常組織におけるＮＲＡＳの相対的な発現は、１００％として採用され、そして腫瘍サンプル中のＮＲＡＳのＣｔ値は、腫瘍サンプルにおけるＮＲＡＳの相対的な発現を割り当てるために使用された。
【図１０】図１０Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡ（配列番号１９、２１、５７、５８および５９）の配列比較である。図１０Ｂは、ｌｅｔ−７ファミリーメンバーのデンドログラムである。
【図１１】図１１は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｍＲＮＡにおけるｌｅｔ−６０／ＲＡＳ中の可能であるＬＣＳ（配列番号６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９および８０）を示す。
【図１２】図１２は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−６０／ＲＡＳ  ｍＲＮＡ（配列番号８１）（一番上）およびＣ．ｂｒｉｇｇｓａｅのｌｅｔ−６０／ＲＡＳ  ｍＲＮＡ（配列番号）８２（一番下）の配列アライメントである（コンセンサス配列は、中段に示される（配列番号８３））。ＬＣＳは、黒枠として示される。
【図１３−１】図１３Ａ〜図１３Ｃは、Ｌｅｔ−６０が、ヒトＨＲＡＳタンパク質、ヒトＫＲＡＳタンパク質、およびヒトＮＲＡＳタンパク質の、オルソログであることを示す。図１３Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬＥＴ−６０（配列番号８７）と、ヒト（配列番号８４、８５および８６）およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（配列番号８８、８９、９０および９１）由来の他のＲＡＳタンパク質ならびにＲＡＳ関連タンパク質との配列アライメントである。図１３Ｂは、他のＲＡＳ関連タンパク質に対するＬＥＴ−６０の相関関係を示すデンドログラムである。図１３Ｃは、ｌｅｔ−６０（ｇｆ）対立遺伝子の部分的な抑制の定量化を示すグラフである。ｏ８４−Ｘは、ｍｉｒ−８４を過剰発現する系であり、そしてＴＯＰＯ−Ｘは、空ベクターのコントロールを有する系である。３つの実験系およびコントロール系の各々の平均が、示される。
【図１３−２】図１３Ａ〜図１３Ｃは、Ｌｅｔ−６０が、ヒトＨＲＡＳタンパク質、ヒトＫＲＡＳタンパク質、およびヒトＮＲＡＳタンパク質の、オルソログであることを示す。図１３Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬＥＴ−６０と、ヒトおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の他のＲＡＳタンパク質ならびにＲＡＳ関連タンパク質との配列アライメントである。図１３Ｂは、他のＲＡＳ関連タンパク質に対するＬＥＴ−６０の相関関係を示すデンドログラムである。図１３Ｃは、ｌｅｔ−６０（ｇｆ）対立遺伝子の部分的な抑制の定量化を示すグラフである。ｏ８４−Ｘは、ｍｉｒ−８４を過剰発現する系であり、そしてＴＯＰＯ−Ｘは、空ベクターのコントロールを有する系である。３つの実験系およびコントロール系の各々の平均が、示される。
【図１４−１】図１４は、げっ歯類（配列番号９４、９５および９６）およびヒト（配列番号９２および９３）のＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１４−２】図１４は、げっ歯類（配列番号９４、９５および９６）およびヒト（配列番号９２および９３）のＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１４−３】図１４は、げっ歯類（配列番号９４、９５および９６）およびヒト（配列番号９２および９３）のＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１４−４】図１４は、げっ歯類（配列番号９４、９５および９６）およびヒト（配列番号９２および９３）のＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１４−５】図１４は、げっ歯類（配列番号９４、９５および９６）およびヒト（配列番号９２および９３）のＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１５】図１５（配列番号９７、９８、９９、１００、１０１、１０２および１０３）は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲおよびＤａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏのＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲによって形成される、可能性のあるｌｅｔ−７：：ＬＣＳ二重鎖を示す。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ｌｅｔ−７の存在が、ヒト細胞において、コントロールタンパク質の発現に影響しないことを示す。図１６Ａは、ＧＡＰＤＨまたはｐ２１に特異的な抗体を使用する、ｌｅｔ−７  ｓｉＲＮＡまたはネガティブコントロールｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の複製物から得た抗体の蛍光の定量化のグラフである。図１６Ｂは、ＮＲＡＳ  ｓｉＲＮＡのトランスフェクト体およびネガティブコントロールｓｉＲＮＡのトランスフェクト体の両方についての、５０個〜１００個の細胞の単一の視野から得た蛍光シグナルの定量化のグラフである。
【図１７】図１７は、付随する隣接正常組織（ＮＡＴ）と比較した、肺腫瘍におけるｌｅｔ−７ｃおよびｌｅｔ−７ｇの発現のグラフである。
【図１８−１】図１８Ａは、コントロールのトランスフェクションおよびコントロール抗ｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−１９ａ）と比較してＡ５４９の細胞数の１００％の増加を生じるｌｅｔ−７の阻害のグラフである。図１８Ｂは、コントロールのｍｉＲＮＡ（ＮＣ）と比較したＡ５４９の細胞数の減少をもたらす余分なｌｅｔ−７のグラフである。
【図１８−２】図１８Ａは、コントロールのトランスフェクションおよびコントロール抗ｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−１９ａ）と比較してＡ５４９の細胞数の１００％の増加を生じるｌｅｔ−７の阻害のグラフである。図１８Ｂは、コントロールのｍｉＲＮＡ（ＮＣ）と比較したＡ５４９の細胞数の減少をもたらす余分なｌｅｔ−７のグラフである。
【図１９】図１９は、ヒトＭＹＣ（配列番号１０４）および他の脊椎動物（配列番号１０５、１０６および１０７）の３’ＵＴＲ、ならびにｌｅｔ−７（配列番号９９および１１０）とヒトＭＹＣ（配列番号１０８および１０９）との間の可能性のある二重鎖における、可能性のあるｌｅｔ−７相補部位（囲まれる）を示す。
【図２０】図２０Ａは、外因性ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡによって処理した細胞におけるＭＹＣおよびＢＣＬ−２タンパク質の減少した発現の、スクランブルｌｅｔ−７配列を有するコントロールｍｉＲＮＡと比較したグラフである。図２０Ｂは、抗ｌｅｔ−７分子によってトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＭＹＣおよびＢＣＬ−２の増加した発現のグラフである。