(57)【要約】  本発明により、循環調節活性を有する新規なペプチドが提供される。該ペプチドは、循環調節活性を有するので、循環調節剤、昇圧剤として有用であり、また心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩：
（ａ）配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含むペプチド（ただし、配列番号９、３０、３１、３２または３３のアミノ酸配列からなるペプチドは除く）；
（ｂ）配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）下記式（Ｉ）で表されるペプチド（ただし、配列番号１４〜１６の配列からなるペプチドを除く）
[化１３]
Ｚ１−Ａ−Ｚ２    （Ｉ）
（式中、Ｚ１は水素原子または１〜１１個のアミノ酸からなる任意の配列のペプチド残基を表し、Ａは配列番号１７のアミノ酸配列からなるペプチド残基を表し、Ｚ２は、アミノ基または１〜３８個のアミノ酸からなる任意の配列のペプチド残基を表す）；および
（ｅ）下記式（II）で表されるペプチド
[化１４]
Ｒ1−Ｂ−Ｒ2    （II）
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ2はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｂは上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
【請求項２】
ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドである、請求項１記載のペプチドまたはその薬理学的に許容される塩：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｅ）請求項１の式（II）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｂが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド残基であり、かつＲ２が非置換のアミノであるペプチド；および
（ｆ）請求項１の式（II）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｂが配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド残基であり、かつＲ２が非置換のアミノであるペプチド。
【請求項３】
請求項１の（ａ）〜（ｃ）に記載のぺプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ペプチドを採取することを特徴とする該ペプチドの製造方法。
【請求項７】
配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列のＣ末端がアミド化した配列に存在するエピトープと結合する抗体。
【請求項８】
請求項７記載の抗体を用いて、請求項１または２に記載のペプチドを検出または定量する方法。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｆ）から選ばれる少なくとも１つのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む循環調節剤：
（ａ）配列番号１〜５のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜５のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；および
（ｄ）請求項１の式（Ｉ）で表されるペプチド；
（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号２３のアミノ酸配列のＮ末端に１〜３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列が付加したアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）下記式（III）で表されるペプチド
[化１５]
Ｒ３−Ｃ−Ｒ４    （III）
（式中、Ｒ３は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ４はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｃは上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
【請求項１０】
請求項９記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を心臓または血管の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が抑制される場合の試験物質を該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項９記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を心臓または血管の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が促進される場合の試験物質を該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項９記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を心臓もしくは血管の細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合の該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量と比較して、結合量が低下する場合の試験物質を該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定することを特徴とする、該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチド、該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ペプチドと特異的に結合する抗体、該ペプチドの製造方法、該ペプチドを含む医薬、該ペプチドを利用するスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＧＦ遺伝子は、ラットＰＣ１２細胞の神経成長因子刺激により増加する遺伝子として同定され（非特許文献１参照）、その後、ヒトＶＧＦ遺伝子が単離された（非特許文献２参照）。ＶＧＦ遺伝子破壊マウスでは、摂食量は不変、体重減少、体脂肪減少、酸素消費増加、運動量増加が認められ、また生殖機能にも異常が見られた。特に、エネルギー代謝亢進が認められている（非特許文献３参照）。【０００３】
ＶＧＦ遺伝子は中枢、末梢神経系、内分泌、神経内分泌細胞に発現し、発現や分布は、摂食行動や消化管の運動を制御するニューロペプチドＹ、ペプチドＹＹ、グレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）、コレシストキニン等の発現パターンと類似し、エネルギー代謝に関連する部分に存在する（非特許文献４参照）。
ＶＧＦ遺伝子がコードする蛋白質（以下、ＶＧＦとよぶ）は、ヒトで６１５アミノ酸、ラット/マウスで６１７アミノ酸である。ＶＧＦの１〜２２番目のアミノ酸はシグナルペプチドであり、またプロホルモンコンベルターゼによる切断やアミド化等のプロセッシングを受ける配列が存在する。ＶＧＦのプロセッシングについて、ラットを中心に調べられており、ラットの脳より、ラットＶＧＦ（５９８−６１７）（かっこ内の数字は、ＶＧＦのアミノ酸配列におけるペプチドの配列の位置を表す。以下のペプチドについても同様）、ラットＶＧＦ（５９９−６１７）、ラットＶＧＦ（６０１−６１７）、ラットＶＧＦ（６０２−６１７）、ラットＶＧＦ（５８７−６１７）、ラットＶＧＦ（５８８−６１７）、ラットＶＧＦ（５６７−６１７）、ラットＶＧＦ（５５６−６１７）、ラットＶＧＦ（４８９−６１７）、ラットＶＧＦ１８（１８ｋＤａ：配列未確認）のＶＧＦに由来するペプチドの存在が確認されている（非特許文献５参照）。ラットＶＧＦ（５５６−６１７）の部分ペプチドである、ラットＶＧＦ（５７７−６１７）、ラットＶＧＦ（５８８−６１７）、ラットＶＧＦ（５９９−６１７）は、オスのラットの視床下部室傍核（ＰＶＮ）に直接投与することにより、勃起を引き起こす活性を示したが、ラットＶＧＦ（５５６−５７６）にはこの活性は確認されなかった（非特許文献６参照）。また、ＶＧＦ（５８８−５９６）をＶＧＦ遺伝子破壊マウスに腹腔内投与したところ、１０％〜１５％程度の体重上昇があったことが報告されている（特許文献１参照）。【０００４】
ヒトＶＧＦに由来するペプチドについては、ヒト脳脊髄液においてヒトＶＧＦ（２３−６２）、ヒトＶＧＦ（２３−５９）、ヒトＶＧＦ（２６−６２）（非特許文献７参照）、さらに、ヒトＶＧＦ（２３−５８）、ヒトＶＧＦ（２４−５９）、ヒトＶＧＦ（２４−６２）、ヒトＶＧＦ（２６−５７）、ヒトＶＧＦ（２６−５８）、ヒトＶＧＦ（２６−５９）、ヒトＶＧＦ（２６−６１）、ヒトＶＧＦ（２６−６４）、ヒトＶＧＦ（４９−６２）、ヒトＶＧＦ（９０−１１４）、ヒトＶＧＦ（３５０−３６７）、ヒトＶＧＦ（３５０−３７０）、ヒトＶＧＦ（３７３−４０４）、ヒトＶＧＦ（３７３−４１７）、ヒトＶＧＦ（４２０−４７１）、ヒトＶＧＦ（４２０−４７８）の存在が報告されている（特許文献２参照）。また、ウシの脳下垂体後葉から、ラットＶＧＦ（５８８−６１７）に相当し、ヒトＶＧＦの５８６−６１５番目の配列と同一の配列のペプチドが単離されている（非特許文献８参照）。しかし、これらのヒトまたはウシのＶＧＦに由来するペプチドの生理活性については、報告されていない。【０００５】
ＶＧＦまたはＶＧＦに由来するペプチドを特異的に認識する抗体としては、ラットＶＧＦのＣ末端に相当する５７３〜６１７番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたポリクローナル抗体（非特許文献９参照）、ヒトＶＧＦの５５６〜５６５番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたポリクローナル抗体（非特許文献４参照）、ラットＶＧＦの４４３〜５８８番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたポリクローナル抗体（非特許文献１０参照）等が報告されている。
【特許文献１】ＷＯ０１／０７４７７
【特許文献２】ＷＯ０２／８２０７５
【非特許文献１】サイエンス(Science)，（米国），１９８５年，第２２９巻，第４７１１号，ｐ．３９３−３９５
【非特許文献２】ジェノミクス(Genomics)，（米国），１９９７年，第４５巻、第２号，ｐ．４４３−４４６
【非特許文献３】ニューロン(Neuron)，（米国），１９９９年，第２３巻，第３号，ｐ．５３７−５４８
【非特許文献４】セリュラー・アンド・モレキュラー・ニューロバイオロジー（Cellular and Molecular Neurobiology），（米国），２００４年，第２４巻，第４号，ｐ．５１７−５３３
【非特許文献５】ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（Journal of Neurochemistry），（イギリス），２００２年，第８１巻，第３号，ｐ．５６５−５７４
【非特許文献６】ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（European Journal of Neuroscience），（フランス），２００４年，第２０巻，第１１号，ｐ．３０３５−３０４０
【非特許文献７】ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＢ：バイオメディカル・サイエンシズ・アンド・アプリケーションズ（Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications）,（オランダ），２００１年，第７５４巻，第２号，ｐ．３５７−３６７
【非特許文献８】エンドクリノロジー（Endocrinology），（米国），１９９４年，第１３５巻，第６号，ｐ．２７４２−２７４８
【非特許文献９】エンドクリノロジー（Endocrinology），（米国），１９９９年，第１４０巻，第８号，ｐ．３７２７−３７３５
【非特許文献１０】ザ・エンボ・ジャーナル（The EMBO Journal），（イギリス），１９８９年，第８巻，第８号，ｐ．２２１７−２２２３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、循環調節活性を有する新規なペプチドを提供すること、さらに該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ペプチドと特異的に結合する抗体、該ペプチドの製造方法、該ペプチドを含む医薬、および該ペプチドを利用するスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の（１）〜（１２）に関する。
（１）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩：
（ａ）配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含むペプチド（ただし、配列番号９、３０、３１、３２または３３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは除く）；
（ｂ）配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）下記式（Ｉ）で表されるペプチド（ただし、配列番号１４〜１６の配列からなるペプチドを除く）【０００８】
[化１]
Ｚ１−Ａ−Ｚ２    （Ｉ）【０００９】
（式中、Ｚ１は水素原子または１〜１１個のアミノ酸からなる任意の配列のペプチド残基を表し、Ａは配列番号１７のアミノ酸配列からなるペプチド残基を表し、Ｚ２は、アミノ基または１〜３８個のアミノ酸からなる任意の配列のペプチド残基を表す）；および
（ｅ）下記式（II）で表されるペプチド【００１０】
[化２]
Ｒ１−Ｂ−Ｒ２    （II）【００１１】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ2はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｂは上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。【００１２】
（２）ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのペプチドである、（１）記載のペプチドまたはその薬理学的に許容される塩：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｅ）（１）の式（II）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｂが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド残基であり、かつＲ２が非置換のアミノであるペプチド；および
（ｆ）（１）の式（II）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｂが配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド残基であり、かつＲ２が非置換のアミノであるペプチド。【００１３】
（３）（１）の（ａ）〜（ｃ）に記載のぺプチドをコードするＤＮＡ。
（４）（３）記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
（５）（４）記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（６）（５）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ペプチドを採取することを特徴とする該ペプチドの製造方法。【００１４】
（７）配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列のＣ末端がアミド化した配列中に存在するエピトープと結合する抗体。
（８）（７）記載の抗体を用いて、（１）または（２）に記載のペプチドを検出または定量する方法。【００１５】
（９）以下の（ａ）〜（ｆ）から選ばれる少なくとも１つのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む循環調節剤：
（ａ）配列番号１〜５のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜５のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；および
（ｄ）（１）の式（Ｉ）で表されるペプチド；
（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号２３のアミノ酸配列のＮ末端に１〜３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列が付加したアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）下記式（III）で表されるペプチド【００１６】
[化３]
Ｒ３−Ｃ−Ｒ４    （III）【００１７】
（式中、Ｒ３は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ４はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｃは上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。【００１８】
（１０）（９）記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を心臓または血管の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が抑制される場合の試験物質を該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質のスクリーニング方法。
（１１）（９）記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を心臓または血管の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が促進される場合の試験物質を該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質のスクリーニング方法。
（１２）（９）記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を心臓もしくは血管の細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合の該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量と比較して、結合量が低下する場合の試験物質を該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定することを特徴とする、該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、循環調節活性を有する新規ペプチド、該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ペプチドと特異的に結合する抗体、該ペプチドの製造方法、該ペプチドを含む医薬、該ペプチドを利用する、該ペプチドの活性を促進または抑制する物質あるいは該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法が提供される。本発明のペプチドは、心筋梗塞、虚血性心疾患、脳梗塞等の循環器系疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、１μｍｏｌ／Ｌのペプチド１（配列番号２７）による、アポエクオリン発現マウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（ＲＬＵ）である。２５秒でペプチド１を添加した。
【図２】図２は、５μｍｏｌ／Ｌのペプチド２（配列番号２６）による、アポエクオリン発現マウスの血管の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（ＲＬＵ）である。２５秒でペプチド２を添加した。
【図３】図３は、１μｍｏｌ／Ｌのペプチド２による、アポエクオリン発現マウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（ＲＬＵ）である。２５秒でペプチド２を添加した。
【図４】図４は、１μｍｏｌ／Ｌのペプチド３（配列番号２）による、アポエクオリン発現マウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（ＲＬＵ）である。２５秒でペプチド３を添加した。
【図５】図５は、５μｍｏｌ／Ｌのペプチド４（配列番号５）による、アポエクオリン発現マウスの血管の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（ＲＬＵ）である。２５秒でペプチド４を添加した。
【図６】図６は、５μｍｏｌ／Ｌのペプチド５（配列番号１）による、アポエクオリン発現マウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（ＲＬＵ）である。２５秒でペプチド５を添加した。
【図７】図７は、５μｍｏｌ／Ｌのペプチド９（配列番号２８）による、アポエクオリン発現マウスの血管の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（ＲＬＵ）である。２５秒でペプチド９を添加した。
【図８】図８は、１μｍｏｌ／Ｌのペプチド１０（配列番号２９）による、アポエクオリン発現マウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（ＲＬＵ）である。２５秒でペプチド１０を添加した。
【図９】図７は、５μｍｏｌ／Ｌのペプチド１０による、アポエクオリン発現マウスの血管の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（ＲＬＵ）である。２５秒でペプチド１０を添加した。
【図１０】図１０は、ペプチド２によるラットの血圧上昇を示す。横軸はペプチド２投与後の時間（分）、縦軸は平均動脈圧の変動である。
【図１１】図１１は、抗血清のＶＧＦに由来する各種ペプチドに対する結合の特異性を示す。●はペプチド１、◇はペプチド２、□はペプチド３、◆はペプチド８（配列番号８）添加時における、抗血清の特異的結合の最大結合量に対する割合を示す。横軸は各ペプチドの添加量（ｆｍｏｌ）、縦軸は最大結合量に対する特異的結合の割合Ｂ／Ｂ０（％）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
１．本発明のペプチド
本発明のペプチドは、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩である。【００２２】
（ａ）配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含むペプチド（ただし、配列番号９、３０、３１、３２、３３のアミノ酸配列からなるペプチドは除く）。
配列番号９のアミノ酸配列は、ヒトＶＧＦのアミノ酸配列である。（ａ）のペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表される配列を含んでいれば、アミノ酸数はいくつでもよいが、８０以下が好ましく、６０以下がさらに好ましく、４０以下が特に好ましい。
（ｂ）配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド。
（ｃ）配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるのいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド。
（ｄ）下記式（Ｉ）で表されるペプチド（ただし、配列番号１４〜１６の配列からなるペプチドを除く）【００２３】
[化４]
Ｚ１−Ａ−Ｚ２    （Ｉ）【００２４】
（式中、Ｚ１は水素原子または１〜８個のアミノ酸からなる任意の配列のペプチド残基を表し、Ａは配列番号１７のアミノ酸配列からなるペプチド残基を表し、Ｚ２は、アミノ基または１〜３２個のアミノ酸からなる任意の配列のペプチド残基を表す）。
配列番号１４〜１６のアミノ酸配列は、それぞれラットＶＧＦ（５６７−５８５）、ラットＶＧＦ（５６７−６１７）、ラットＶＧＦ（５５６−６１７）のアミノ酸配列である。
（ｅ）下記式（II）で表されるペプチド。【００２５】
[化５]
Ｒ１−Ｂ−Ｒ２    （II）【００２６】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ2はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｂは上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）【００２７】
配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ一もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１以上５以下のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加があることを意味し、置換、欠失もしくは付加が同時に生じてもよい。置換または付加されるアミノ酸としては、例えば、必須アミノ酸として知られる２０種類のＬ-アミノ酸、すなわちＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンおよびＬ−システインがあげられるが、これに限定されるものではなく、例えば、ｔｅｒｔ-ロイシン、ノルロイシン、ノルバリン、２−アミノブタン酸、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、ホモセリン等の他のアミノ酸でもよく、またＤ−アミノ酸あるいはβ−アミノ酸でもよい。【００２８】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、ｔｅｒｔ-ロイシン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群： セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン【００２９】
配列番号１〜４のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列とは、相同性解析プログラムBLAST 2 Sequences〔FEMS Microbiol Lett. 174, 247 (1999)〕を用いてデフォルトの条件（program: blastp、matrix: BLOSUM62、open gap: 11 penalties、extension gap: 1 penalty、gap x_dropoff: 50、expect: 10.0、word size: 3）で計算し、アラインメントをしたときに、相同性（対象の配列と配列番号１〜４のいずれか、２８または２９のうちの相同性解析を行った配列との間で同一のアミノ酸数／配列番号１〜４のいずれか、２８または２９のうちの相同性解析を行った配列の全体のアミノ酸数＋アラインメント時に挿入されたギャップの数）が９０％以上、好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列をいう。【００３０】
式（Ｉ）において、Ａは配列番号１７のアミノ酸配列、すなわち下記の式（IV）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド残基である。【００３１】
[化６]
His−Ｘ１−His−His−Ala−Leu−Pro−Pro−Ｘ２−Arg−His−Ｘ３−Pro    (IV)【００３２】
（式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す）
式（IV）において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表すが、好ましくはＸ１はチロシンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ２はセリン、スレオニン、ホモセリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニンまたはｔｅｒｔ-ロイシンであり、Ｘ３はチロシン、フェニルアラニンまたはヒスチジンであり、より好ましくはＸ２はセリンまたはアラニンであり、Ｘ３はチロシンまたはヒスチジンであり、さらに好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれチロシン、セリン、チロシンであるか、またはそれぞれフェニルアラニン、アラニン、ヒスチジンである。【００３３】
式（Ｉ）において、Ｚ１は水素原子または１〜１１個のアミノ酸からなる任意の配列のペプチド残基であるが、好ましくは水素原子または、下記式（Ｖ）で表されるアミノ酸配列（配列番号１８）からなるペプチド残基である。【００３４】
[化７]
Thr−Leu−Gln−Pro−Pro−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Arg−Arg−Arg    （Ｖ）【００３５】
（式中、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す）
式（Ｖ）において、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は好ましくはセリン、スレオニン、ホモセリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニンまたはｔｅｒｔ-ロイシンであり、より好ましくはＸ４およびＸ５はセリンまたはアラニンであり、Ｘ６はセリンまたはロイシンであり、さらに好ましくはＸ４、Ｘ５およびＸ６がそれぞれセリン、アラニン、ロイシンであるか、またはそれぞれアラニン、セリン、セリンである。【００３６】
式（Ｉ）において、Ｚ２はアミノ基または１〜３８個のアミノ酸からなる任意の配列のペプチド残基であるが、好ましくはアミノ基、下記式（VI）で表されるアミノ酸配列（配列番号１９）からなるペプチド残基、または、下記式（VII）で表されるアミノ酸配列（配列番号２０）からなるペプチド残基である。【００３７】
[化８]
Ｘ７−Ｘ８−Glu−Ala−Gln−Ala    （VI）【００３８】
（式中、Ｘ７およびＸ８は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す）【００３９】
[化９]
Ｘ９−Ｘ１０−Glu−Ala−Gln−Ala−Arg−Arg−Ala−Gln−Glu−Glu−Ala−Ｘ１１−Ala−Glu−Glu−Arg−Arg−Leu−Gln−Glu−Gln−Glu−Glu−Leu−Glu−Asn−Tyr−Ile−Glu−His−Val−Leu−Leu−Ｘ１２−Arg−Pro    （VII）【００４０】
（式中、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す）
式（VI）および（VII）において、好ましくは、Ｘ７およびＸ９はグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸または２−アミノスベリン酸であり、Ｘ８およびＸ１０はアルギニン、リジン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニンまたはｔｅｒｔ-ロイシンであり、Ｘ１１はアスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸または２−アミノスベリン酸であり、Ｘ１２はアルギニン、リジン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸またはヒスチジンであり、より好ましくはＸ７およびＸ９はグリシンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ８およびＸ１０はアルギニンまたはロイシンであり、Ｘ１１はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘ１２はアルギニンまたはヒスチジンであり、さらに好ましくは、Ｘ７およびＸ８はそれぞれグリシンおよびアルギニンであるか、またはそれぞれアスパラギン酸およびロイシンであり、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２はそれぞれグリシン、アルギニン、グルタミン酸およびアルギニンであるか、またはそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、アスパラギン酸およびヒスチジンである。【００４１】
上記式（II）の各基の定義において、アルカノイルとしては、例えば直鎖または分枝状の炭素数１〜２０の、例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、ラウロイル、エイコサノイル等があげられる。
アロイルおよびアリールオキシカルボニルのアリール部分としては、例えば炭素数６〜１５の、例えばフェニル、ナフチル等があげられる。【００４２】
ヘテロアリールカルボニルおよびヘテロアリールオキシカルボニルのヘテロアリール部分としては、例えばフリル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル等があげられる。【００４３】
アルコキシカルボニルおよびアルコキシのアルキル部分としては、例えば直鎖または分枝状の炭素数１〜２０の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、デシル、ドデシル、エイコシル等があげられる。
置換アルカノイル、置換アルコキシカルボニルおよび置換アルコキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えばヒドロキシ、カルボキシ、炭素数３〜８の、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等の脂環式アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、フルオレニル等があげられる。置換フェニルの置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えばアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、スルホ、シアノ、ハロゲン等があげられ、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。置換フェニルの置換基としてのアルキル、アルコキシのアルキル部分は、前記アルコキシカルボニルおよびアルコキシのアルキル部分と同義である。【００４４】
置換アロイル、置換アリールオキシカルボニル、置換ヘテロアリールカルボニルおよび置換ヘテロアリールオキシカルボニルにおける置換基は、同一または異なって置換数１〜３であり、上記の置換フェニルの置換基と同義である。
置換アミノにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜２の、例えば置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール等があげられる。アルキルは、前記アルコキシ等のアルキル部分と同義であり、置換アルキルの置換基は、前記置換アルコキシ等の置換基と同義である。アリールは、前記アロイルまたはアリールオキシカルボニルのアリール部分と同義であり、置換アリールの置換基は、前記アロイルまたはアリールオキシカルボニルの置換基と同義である。【００４５】
また、Ｂを構成するアミノ酸残基の側鎖の官能基が化学的に修飾または保護されたものであってもかまわない。そのように側鎖官能基が化学的に修飾または保護されたアミノ酸残基としては、例えば、側鎖カルボキシ基がベンジルエステルで保護されたアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基、側鎖チオール基がカルボキシメチル化されたシステイン残基等があげられる。【００４６】
薬理学的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩、金属塩、有機塩基付加塩等があげられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。有機塩基付加塩としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、アニリン等の一級アミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン等の二級アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン等の三級アミン等とで形成される塩、アンモニウム塩等があげられる。【００４７】
本発明のペプチドの具体的な例として、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、（ii）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、（iii）式（II）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｂが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド残基であり、かつＲ２が非置換のアミノであるペプチド、すなわち配列番号３のアミノ酸配列において、Ｃ末端のプロリン残基がアミド化している配列（配列番号２６のアミノ酸配列）からなるペプチド、（iv）式（II）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｂが配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド残基であり、かつＲ２が非置換のアミノであるペプチド、すなわち配列番号４のアミノ酸配列において、Ｃ末端のプロリン残基がアミド化している配列（配列番号２７のアミノ酸配列）からなるペプチド、（v）配列番号２８のアミノ酸からなるペプチド、（vi）配列番号２９のアミノ酸からなるペプチド、（vii）配列番号６のアミノ酸配列からなるペプチド、（viii）配列番号２１のアミノ酸配列からなるペプチド、（ix）配列番号２２のアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。（vii）〜（ix）のペプチドは、（ii）〜（iv）のペプチドにそれぞれ対応する、ラットＶＧＦの配列に基づくペプチドである。【００４８】
２．本発明のペプチドの製造方法
（１）化学的合成による製造方法
本発明のペプチドは、例えば泉屋信夫、加藤哲夫ら，「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，（１９８５年）、相本三郎ら，「実験化学講座」，第４版，第２２巻，「有機合成IV 酸・アミノ酸・ペプチド」，丸善，（１９９９年）、Int. J. Pept. Protein Res. 35, 161-214 (1990)、Fields, G. B., Solid-Phase Peptide Synthesis, Methods in Enzymology, vol. 289, Academic Press, (1997)、Pennington, M. W. and Dunn, B. M., Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 35, Humana Press, (1994) 等に記載の通常のペプチド合成法により合成後、精製することによって得ることができる。具体的な合成法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ジクロロメタン法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等があげられる。また、その合成は、固相合成法および液相合成法のいずれをも適用することができる。すなわち、本発明のペプチドを構成するアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチドを合成することができる。【００４９】
さらに、本発明のペプチドが、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖および／またはペプチドのアミノ末端および／またはペプチドのカルボキシ末端が化学修飾や保護がなされているものである場合には、ペプチド合成後に化学修飾する方法、化学修飾されたアミノ酸を用いてペプチド合成する方法、またはペプチド合成の最終脱保護の反応条件を適当に選ぶ方法等、ペプチド合成化学の分野において従来公知の方法〔泉屋信夫ら，「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，（１９８５年）、矢島治明監修，「続医薬品の開発」，第１４巻，「ペプチド合成」，広川書店，（１９９１年）、日本生化学会編「生化学実験講座」，第１巻，「タンパク質の化学IV―化学修飾とペプチド合成」，東京化学同人、大野素徳ら，「生物化学実験法」，第１２，１３巻，「蛋白質の化学修飾（上）（下）」，学会出版センター，（１９８１年）〕によって製造することができる。【００５０】
また、本発明のぺプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社（Advanced ChemTech, Inc.）製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮα−Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−アミノ酸あるいはＮα−Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）、島津製作所、国産化学株式会社、ＥＭＤバイオサイエンシズ社（EMD Biosienses, Inc.）、渡辺化学株式会社、アドバンスト・ケムテック社、アナスペック社（AnaSpec, Inc.）またはペプチド研究所株式会社等から入手することができる。【００５１】
本発明のペプチドの精製は、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶等を組み合わせて行なうことができる。【００５２】
（２）遺伝子工学的手法による製造方法
本発明のペプチドが前述の２０種類の必須アミノ酸からなり、側鎖、Ｎ末端またはＣ末端の修飾を受けていない場合は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。【００５３】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、本発明のペプチドのアミノ酸配列から、コードする塩基配列を設計し、ＤＮＡ合成機により合成することができる。また、本発明のペプチドが配列番号１〜４のいずれかの配列を含むヒトＶＧＦの部分ペプチドの場合は、ヒトの脳または膵臓の細胞のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、単離することもできる。本発明のペプチドをコードするＤＮＡを、本発明のペプチドの製造に用いる場合は、本発明のペプチドをコードする領域の末端は終止コドンになるようにする。例えば、本発明のペプチドである配列番号１、２、３、４、２８および２９のそれぞれのアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡの例として、配列番号１０、１１、１２、１３、３４および３５のそれぞれの塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。【００５４】
以下に、本発明のペプチドがＮ末端がメチオニンである場合の製造方法を記載する。
上記で得られた本発明のペプチドをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製し、該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、例えば細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。【００５５】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００５６】
発現ベクターとしては、例えば、pSE420（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社）、pTrs30〔形質転換大腸菌株（FERM BP-5407）より調製〕、pTrs32〔形質転換大腸菌株（FERM BP-5408）より調製〕、pGHA2〔形質転換大腸菌株（FERM BP-400）より調製〕、pGKA2〔形質転換大腸菌株（FERM P-6798）より調製〕、pTerm2（特開平3-22979）、pGEX-2T（ＧＥヘルスケア社製）、pET（ノバジェン社製）、pKK223-2（ＧＥヘルスケア社製）、pMAL-c2X（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）等をあげることができる。【００５７】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００５８】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichiacoli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coliMC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coliW1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichiacoli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coliTB1、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratialiquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillusamyloliquefacines、Brevibacterium ammoniagenes、BrevibacteriumimmariophilumATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacteriumflavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacteriumglutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacteriumacetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonasputida 、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。【００５９】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。【００６０】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEP13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等をあげることができる。【００６１】
宿主細胞としては、サッカロミセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シュワニオミセス（Schwanniomyces）属、ピキア（Pichia）属、カンディダ（Candida）属等に属する微生物、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomycesalluvius、Candida utilis等をあげることができる。【００６２】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。【００６３】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNA3.1(+)（インビチロジェン社製）、pAGE107〔特開平3-22979、Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8〔Nature, 329, 840 (1987)〕、pREP4（Invitrogen社製）、pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕等をあげることができる。【００６４】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００６５】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)等をあげることができる。【００６６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、ペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよび欠損型バキュロウイルスゲノムを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ペプチドを発現させることができる。【００６７】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393（ベクトン・ディッキンソン社製）、pBlueBac4.5（インビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。【００６８】
昆虫細胞としては、例えば、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕、Trichoplusianiの卵巣細胞であるHigh 5（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。【００６９】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。【００７０】
宿主細胞としては、例えばタバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。【００７１】
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。【００７２】
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。【００７３】
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。【００７４】
無機塩としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は１５〜４０℃が好ましく、培養時間は、通常１６時間〜７日間が好ましい。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。【００７５】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加するのが好ましい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００７６】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばＲＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、Eagleのミニマル・エッセンシャル培地（ＭＥＭ）〔Science, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ改変イーグル培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等があげられる。【００７７】
培養は、通常、５％ＣＯ2存在下で行うのが好ましく、ｐＨは６〜８、温度は３０〜４０℃が好ましく、１〜７日間行うのが好ましい。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【００７８】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ベクトン・ディッキンソン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビチトロジェン社製）、ExCell400、ExCell405（いずれもＪＲＨバイオサイエンシズ社製）、グレース（Grace）の昆虫培地〔Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
培養は、通常、ｐＨは６〜７、温度は２５〜３０℃が好ましく、１〜５日間行うのが好ましい。【００７９】
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００８０】
培養は、通常、ｐＨは５〜９、温度は２０〜４０℃が好ましく、３〜６０日間行うのが好ましい。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ペプチドを採取することにより、該ペプチドを製造することができる。【００８１】
本発明のペプチドは、宿主細胞内での分解を避けるため、任意のポリペプチド（以下、ポリペプチドＸよぶ）と本発明のペプチドとの融合蛋白質を製造した後、本発明のペプチドを融合蛋白質から単離して製造してもよい。融合蛋白質を発現する発現ベクターは、上記の本発明のペプチドをコードするＤＮＡを作製する際に、その５’末端に特定のプロテアーゼの認識配列またはメチオニンをコードするＤＮＡを付加して作製し、ポリペプチドＸの発現ベクターの、ポリペプチドＸをコードするＤＮＡとフレームを合わせて連結して作製することができる。ただし、メチオニンをコードするＤＮＡを付加するのは、本発明のペプチドがメチオニンを含んでいない場合に限る。ポリペプチドＸとしては任意のポリペプチドを用いることができるが、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合蛋白質、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、プロテインＡ等があげられる。特定のプロテアーゼの認識配列としては、ファクターＸａ認識配列（Ile-Glu-Gly-Arg）、エンテロキナーゼ認識配列（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）等があげられる。ポリペプチドＸの発現ベクターは、上記の本発明のペプチドの発現ベクターに準じて、本発明のペプチドをコードするＤＮＡの代わりにポリペプチドＸをコードするＤＮＡを挿入して作製できる。また、市販の融合蛋白質発現用ベクター、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質発現用ベクターpGEX-3（ＧＥヘルスケア社製）、マルトース結合蛋白質との融合蛋白質発現ベクターpMAL-c2X、pMAL-p2E（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）、ＤｓｂＡとの融合蛋白質発現ベクターpET-39b(+)（ＥＭＤバイオサイエンシズ社製）等を利用してもよい。ポリペプチドＸに特定のプロテアーゼの認識配列を介して本発明のペプチドが融合している場合は、認識配列に対応するプロテアーゼ処理により、本発明のペプチドを融合蛋白質から切断することができる。ポリペプチドＸのＣ末端にメチオニンを介して本発明のペプチドが融合している場合は、特開平１−１０２０９６に記載の方法に準じて、臭化シアン処理することにより、本発明のペプチドを融合蛋白質から切断することができる。プロテアーゼまたは臭化シアンで処理した後、ゲルろ過、逆相ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー等を組み合わせることにより、本発明のペプチドを単離精製することができる。【００８２】
文献〔J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989); Genes Develop., 4, 1288（1990); 特開平5-336963; WO94/23021〕の記載に準じて、上記の本発明のペプチドをコードするＤＮＡを作製する際に、その５’末端に分泌蛋白質のシグナルペプチドをコードするＤＮＡを付加して作製し、該ＤＮＡを用いて、上記と同様にして組換えベクターを作製し、宿主細胞に導入することにより、本発明のペプチドを培地中に分泌させて製造することができる。【００８３】
本発明のペプチドのＮ末端がメチオニンでない場合は、上記の融合蛋白質を製造した後に単離する方法または培地中に分泌させる方法で製造することができる。例えば、配列番号２のアミノ酸配列からなる本発明のペプチドは、以下のようにして製造できる。まず、配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡおよび配列番号１１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをＤＮＡ合成機で化学合成した後、両者をアニーリングして２本鎖ＤＮＡを調製する。該２本鎖ＤＮＡとXmnIで切断したpMAL-c2Xを連結させて、pMAL-c2XのXmnIサイトに該２本鎖ＤＮＡを挿入したプラスミドを作製する。得られたプラスミドは、マルトース結合蛋白質のＣ末端に、ファクターＸａ認識配列（Ile-Glu-Gly-Arg）および配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが融合した融合蛋白質をコードする。得られたプラスミドでEscherichiacoliを形質転換する。得られた形質転換体を培地中に培養して、形質転換体の細胞内に融合蛋白質を発現させる。培養後の菌体を遠心分離により単離した後、菌体を破砕して、融合蛋白質を含む溶液を得る。得られた溶液から、マルトースを固定化したカラムによるアフィニティークロマトグラフィーにより、融合蛋白質を単離した後、ファクターＸａで融合蛋白質を処理し、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを融合蛋白質から切り離す。ゲルろ過あるいは逆相ＨＰＬＣ等で配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを単離、精製することができる。【００８４】
本発明の形質転換体により製造されたペプチドを単離精製するためには、通常の蛋白質の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明のペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００８５】
また、該ペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてペプチドの不溶体を回収する。回収したペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ペプチドの精製標品を得ることができる。【００８６】
本発明のペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ペプチドを回収することができる。すなわち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００８７】
３．本発明のペプチドと特異的に結合する抗体
本発明の抗体は、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列のＣ末端がアミド化した配列（配列番号２７）中に存在するエピトープと結合する抗体であり、１．に記載した本発明のペプチドに特異的に結合することができる。本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、本発明の抗体には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体から調製されるFab、Fab’、F(ab’)2等の抗体断片も含まれる。また、モノクローナル抗体には、非ヒト動物で作製したモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域からなるヒト型キメラ抗体、非ヒト動物で作製したモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体のフレームワーク領域に挿入した可変領域と、ヒト抗体の定常領域からなるヒト型ＣＤＲ移植抗体も含まれる。【００８８】
（１）ポリクローナル抗体の作製
配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号４のアミノ酸配列において、Ｃ末端のプロリン残基がアミド化している配列（配列番号２７）からなるペプチドを抗原として、非ヒト動物の皮内、静脈内、腹腔内または筋肉内等に投与することにより、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列のＣ末端がアミド化した配列（配列番号２７）中に存在するエピトープと結合するポリクローナル抗体を作製することができる。このポリクローナル抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合することができる。この場合、抗原とするペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニン、ウシチログロブリン、オボアルブミン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを、アジュバントと共に投与するのが望ましい。抗原とするペプチドのキャリア蛋白への共有結合は、マレイミド、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いた反応により行うことができる。マレイミドの反応を行う場合は、抗原とするペプチドのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にシステイン残基を付加したペプチドを上記２に記載の方法で作製し、システインを介して共有結合させる。アジュバントとしては、例えばフロイントの完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等があげられる。抗原を投与する非ヒト動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができ、投与量は動物１匹に１回当たり、抗原とするペプチドを５０〜２００μｇ含有する量が好ましい。【００８９】
該抗原の投与は、例えば１回目の投与の後１〜３週間おきに、血清の抗体価が十分に上昇するまで３〜１０回行うのが好ましい。血清の抗体価は、各投与後３〜７日目に採血して血清を調製し、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ法等により測定できる。酵素免疫測定法は、文献〔酵素免疫測定法、医学書院 (1976); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕に基づき、（ｉ）抗原としたペプチドを抗原に用いたものとは別のキャリア蛋白質と共有結合させたものを適当なプレートに固定化し、（ii）ブロッキングを行って洗浄し、（iii）免疫した動物から調製した血清を反応させた後、洗浄し、(iv)免疫に用いた動物のＩｇＧに対する酵素標識した抗体と反応させて洗浄し、（ｖ）標識酵素により発色または発光する基質を用いた反応を行い、発色量または発光量を測定して抗体価の指標とする、という手順で行うことができる。【００９０】
その血清が抗原としたペプチドに対して十分な抗体価を示した非ヒト動物より、血液を採取して血清を調製する。この血清、すなわち抗血清をポリクローナル抗体として使用することもできるし、該抗血清からポリクローナル抗体を精製することもできる。
抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法としては、例えば遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。【００９１】
（２）モノクローナル抗体の作製
以下に示す方法より、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列のＣ末端がアミド化した配列（配列番号２７）中に存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体を作製することができる。このモノクローナル抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合することができる。【００９２】
（ａ）抗体産生細胞の調製
マウスまたはラットを抗原を投与する動物として用い、（１）のポリクローナル抗体の作製と同様の抗原の投与を行い、その血清が抗原としたペプチドに対して十分な抗体価を示したマウスまたはラットを、抗体産生細胞の供給源とすることができる。抗体産生細胞としては、脾細胞を用いることができる。抗体産生細胞は、十分な抗体価を示したマウスまたはラットから、例えば以下のようにして調製することができる。【００９３】
該抗体価を示したマウスまたはラットに抗原を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。脾臓をＭＥＭ中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離した後、上清を捨て、沈殿の脾細胞を回収する。得られた脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭで３回洗浄したものを抗体産生細胞として用いることができる。【００９４】
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットの骨髄腫細胞から樹立した株化細胞を用いることができる。株化骨髄腫細胞としては、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978); Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４〔Nature, 276, 269 (1978)〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８〔Nature, 256, 495 (1975)〕等があげられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）およびウシ胎児血清（１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地〕で継代するのが好ましく、また細胞融合の３〜４日前には正常培地で培養するのが好ましい。融合には該細胞を２×１０7個以上用いるのが好ましい。【００９５】
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞を、例えば、以下のようにしてポリエチレングリコールを用いて細胞融合させるにより、ハイブリドーマを作製できる。（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞を、ＭＥＭまたはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０8抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００  ２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、さらに１〜２分間ごとにＭＥＭ  １〜２ｍＬを数回添加する。添加後、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。【００９６】
細胞融合後の細胞は、例えば、以下のように培養し、抗体の生産量の高いハイブリドーマを選択することができる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養するのが好ましい。培養後、培養上清の一部を採取し、血清の代わりに該培養上清を用いて（１）で上述した抗体価の測定を行い、抗体価の高い培養上清に対応するハイブリドーマを、抗体の生産量の高いハイブリドーマとして選択することができる。【００９７】
該ハイブリドーマは、クローニングを行い、得られた各ハイブリドーマのクローンから、抗体を高生産するものを選択することにより、安定して抗体を高生産するハイブリドーマ細胞を得ることができる。クローニングは、例えば、限界希釈法等により行うことができ、２回繰り返す〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕のが好ましい。クローニングにより得られた各クローンの培養上清を用いて、上述の抗体価の測定を行い、強い抗体価の認められた培養上清に対応するハイブリドーマのクローンを、安定して抗体を高生産するハイブリドーマ細胞として選択することができる。【００９８】
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、以下のように（ｃ）で選択されたハイブリドーマをヌードマウス内で腹水癌として増殖させた後、腹水から調製することができる。２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞５〜２０×１０6細胞／匹を腹腔内に注射するのが好ましい。１０〜２１日後に、ハイブリドーマが腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた腹水の上清より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。【００９９】
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行うことができる。ペプチド量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。【０１００】
（３）本発明の抗体を用いた本発明のペプチドの測定方法
本発明の抗体を用いて、本発明のペプチドを免疫学的に検出または定量することができる。免疫学的な検出または定量方法としては、競合法、サンドイッチ法、免疫組織化学、ウェスタンブロット、凝集法（単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、1987；続生化学実験講座5、免疫生化学研究法、東京化学同人、1986）等があげられる。【０１０１】
競合法は、本発明の抗体に、試料溶液および一定量の競合物質（測定対象の本発明のペプチドを酵素、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質等で標識したもの）を反応させて、試料溶液中の本発明のペプチドおよび競合物質を競合的に抗体と結合させた後、抗体と結合した競合物質の量を標識を利用して測定し、その結合量から本発明のペプチドを定量する方法である。例えば抗体をプレートやビーズ等の固相に固定化し、本発明のペプチドおよび競合物質を競合的に抗体と結合させた後、固相を洗浄し、固相上の抗体への競合物質の結合量を測定する方法、本発明のペプチドおよび競合物質を競合的に抗体と結合させた後、γ−グロブリンおよびポリエチレングリコールにより免疫複合体を沈殿させて抗体と結合していない競合物質と分離し、抗体と結合した競合物質の量を測定する方法等があげられる。例えば、５〜１０点の濃度を決めた本発明のペプチドの溶液を調製し、この溶液を試料溶液とした場合の競合物質の抗体への結合量を測定して、ペプチドの濃度と競合物質の結合量をプロットした検量線を作成し、本発明のペプチドを定量する試料溶液についての、競合物質の結合量を検量線にあてはめることにより、試料溶液の本発明のペプチドを定量することができる。【０１０２】
サンドイッチ法は本発明のペプチドと特異的に結合する２種類の抗体を使用する方法であり、例えば、片方の抗体をプレートやビーズ等の固相に固定化したものに試料溶液を反応させ、試料中の本発明のペプチドを固相上の抗体と結合させた後、酵素、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質等で標識したもう一方の抗体を反応させて、固相上の抗体と結合した本発明のペプチドにさらに該標識抗体を結合させ、該標識抗体の結合量を標識物質を利用して測定し、その結合量から本発明のペプチドを定量する方法があげられる。例えば、５〜１０点の濃度を決めた本発明のペプチドの溶液を調製し、この溶液を試料溶液とした場合の、標識抗体への結合量を測定して、ペプチドの濃度と標識の結合量をプロットした検量線を作成し、本発明のペプチドを定量する試料溶液についての、標識抗体の結合量を検量線にあてはめることにより、試料溶液の本発明のペプチドを定量することができる。【０１０３】
酵素免疫測定法は、上記の競合法、サンドイッチ法において、競合物質あるいは抗体をアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識し、該標識酵素により発色または発光する試薬を反応させ、その発色または発光量から競合物質または標識抗体の結合量を測定する定量方法である。また、ラジオイムノアッセイは、上記の競合法、サンドイッチ法において、競合物質あるいは抗体を放射性同位元素で標識し、その放射活性から競合物質または標識抗体の結合量を測定する定量方法である。【０１０４】
免疫組織化学は、組織や細胞を凍結またはパラフィンに包埋して作製した切片に対し、酵素、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質、金コロイド等で標識した本発明の抗体を反応させた後、本発明の抗体を標識物質を利用して検出し、組織または細胞における本発明のペプチドを検出する方法である。
ウェスタンブロットは、試料に含まれる蛋白質およびペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離した後、ゲルからポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜等に蛋白質およびペプチドをブロットし、酵素、ビオチン、放射性同位元素等で標識した本発明の抗体を反応させた後、標識物質を利用して本発明の抗体を検出し、膜上の本発明のペプチドを検出する方法である。【０１０５】
凝集法は、本発明の抗体を固定化したラテックス等の粒子と、試料溶液とを反応させて、試料中の本発明のペプチドに粒子上の抗体が結合することにより生ずる粒子の凝集を、吸光度の測定により検出または定量する方法である。【０１０６】
４．ＶＧＦＣ末由来ペプチドを含有する医薬製剤
本発明において、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドを「ＶＧＦＣ末由来ペプチド」とよぶ。１．に記載した本発明のペプチドは、ＶＧＦＣ末由来ペプチドに含まれる。
（ａ）配列番号１〜５のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含むペプチド（ただし、配列番号９、３０、３１、３２または３３のアミノ酸配列を含むペプチドは除く）；
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜５のいずれか、２８または２９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）１．の式（Ｉ）で表されるペプチド；
（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号２３のアミノ酸配列のＮ末端に１〜３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列が付加したアミノ酸配列からなるペプチド；および
（ｆ）下記式（III）で表されるペプチド【０１０７】
[化１０]
Ｒ３−Ｃ−Ｒ４    （III）【０１０８】
（式中、Ｒ３は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ４はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｃは上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチド残基を表す）。【０１０９】
上記の「ＶＧＦＣ末由来ペプチド」における、アミノ酸の置換、欠失および付加、ならびにアミノ酸配列の相同性の定義は、１．の本発明のペプチドにおけるアミノ酸の置換、欠失および付加ならびにアミノ酸配列の相同性の定義と同じものである。また、式（III）における各基の定義は、１．の式（II）における各基の定義と同じものである。
配列番号２３のアミノ酸配列は、下記の式（VIII）で表されるアミノ酸配列である。【０１１０】
[化１１]
Ala−Gln−Glu−Glu−Ala−Ｘ１３−Ala−Glu−Glu−Arg−Arg−Leu−Gln−Glu−Gln−Glu−Glu−Leu−Glu−Asn−Tyr−Ile−Glu−His−Val−Leu−Leu−Ｘ１４−Arg−Pro    （VIII）【０１１１】
（式中、Ｘ１３およびＸ１４は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す）
式（VIII）において、好ましくは、Ｘ１３はアスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸または２−アミノスベリン酸であり、Ｘ１４はアルギニン、リジン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸またはヒスチジンであり、より好ましくは、Ｘ１３はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘ１４はアルギニンまたはヒスチジンであり、Ｘ１３およびＸ１４はそれぞれグルタミン酸およびアルギニンであるか、またはそれぞれアスパラギン酸およびヒスチジンである。【０１１２】
配列番号２３のＮ末端に付加する１〜３２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は、いかなる配列でもよいが、好ましくは下記式(IX)で表されるアミノ酸配列（配列番号２４）である。【０１１３】
[化１２]
Thr−Leu−Gln−Pro−Pro−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Arg−Arg−Arg−His−Ｘ１８−His−His−Ala−Leu−Pro−Pro−Ｘ１９−Arg−His−Ｘ２０−Pro−Ｘ２１−Ｘ２２−Glu−Ala−Gln−Ala−Arg−Arg    （IX）【０１１４】
（式中、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１およびＸ２２は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す）
式（IX）において、好ましくは、Ｘ１５、Ｘ１６およびＸ１７はセリン、スレオニン、ホモセリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニンまたはｔｅｒｔ-ロイシンであり、Ｘ１８はチロシンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ１９はセリン、スレオニン、ホモセリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニンまたはｔｅｒｔ-ロイシンであり、Ｘ２０はチロシン、フェニルアラニンまたはヒスチジンであり、Ｘ２１はグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸または２−アミノスベリン酸であり、Ｘ２２はアルギニン、リジン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニンまたはｔｅｒｔ-ロイシンであり、より好ましくはＸ１５およびＸ１６はセリンまたはアラニンであり、Ｘ１７はセリンまたはロイシンであり、Ｘ１８はチロシンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ１９はセリンまたはアラニンであり、Ｘ２０はチロシンまたはヒスチジンであり、Ｘ２１はグリシンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ２２はアルギニンまたはロイシンであり、さらに好ましくは、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１およびＸ２２がそれぞれセリン、アラニン、ロイシン、チロシン、セリン、チロシン、グリシンおよびアルギニンであるか、またはそれぞれアラニン、セリン、セリン、フェニルアラニン、アラニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびロイシンである。【０１１５】
ＶＧＦＣ末由来ペプチドの具体例としては、１．に記載した本発明のペプチドの具体例である（ｉ）〜（ix）のペプチドの他、（x）配列番号５のアミノ酸からなるペプチド、（xi）配列番号２５のアミノ酸配列からなるペプチド、（xii）配列番号１６のアミノ酸配列からなるペプチドをあげることができる。（x）のペプチドは、ヒトＶＧＦのＣ末端５８６〜６１５番目の配列に相当するペプチド、（xi）のペプチドは、（x）のペプチドに対応するラットＶＧＦに由来するペプチド、（xii）のペプチドは、本発明の（ｉ）のペプチドに対応するラットＶＧＦに由来するペプチドである。【０１１６】
ＶＧＦＣ末由来ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は、血管または心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するので、血圧や血流量を調節する循環調節活性を有する。したがって、ＶＧＦＣ末由来ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は循環調節剤、昇圧剤、あるいは心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療薬の有効成分として用いることができる。ＶＧＦＣ末由来ペプチドの薬理学的に許容される塩としては、１．の本発明のペプチドの薬理学的に許容される塩としてあげた塩があげられる。【０１１７】
ＶＧＦＣ末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含有する医薬製剤は、活性成分として該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。【０１１８】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内等の非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤等がある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。【０１１９】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。【０１２０】
本発明のペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人一人当り０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．０５〜５０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与等の非経口投与の場合、成人一人当り０．００１  〜１００ｍｇ  、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。【０１２１】
５．ＶＧＦＣ末由来ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩の循環調節活性の測定
ＶＧＦＣ末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が循環調節活性を有していることは、以下の測定法により細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性、あるいは血圧を上昇させる活性を有していることで確認できる。【０１２２】
（ａ）細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性の測定
（ｉ）アポエクオリン発現トランスジェニックマウスの利用
アポエクオリン遺伝子の発現ベクターを受精卵に導入して作製した、全身にアポエクオリンを発現するトランスジェニックマウス（ＷＯ０２／０１０３７１）から、心臓または血管を採取する。得られた心臓または血管を細断し、セレンテラジンを含む培地に懸濁して培養し、細胞内にセレンテラジンを取り込ませてエクオリン（アポエクオリンとセレンテラジンの複合体）を形成させる。エクオリンは、細胞内カルシウムイオンと結合して発光するので、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含む培地を添加する前と添加後の細胞の毎秒の相対発光量をルミノメーターで経時的に測定し、細胞内カルシウムイオン濃度の指標とする。ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の添加により、相対発光量が増加する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有することが確認できる。【０１２３】
（ii）カルシウム結合性蛍光試薬の利用
動物個体から採取した心臓または血管を細断したもの、あるいは心臓または血管に由来する細胞株を、カルシウムイオンの有無で、励起波長、蛍光波長あるいは蛍光強度が変化するようなＦｕｒａ−２、Ｉｎｄｏ−１等のカルシウムイオン結合性の蛍光試薬を含む緩衝液に懸濁して培養し、細胞内に取り込ませる。Ｆｕｒａ−２はカルシウムイオンと結合することにより、蛍光励起波長のピークが３８０ｎｍから３４０ｎｍにシフトするので、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含む緩衝液を添加する前と添加後に、３８０ｎｍの波長で励起した時の蛍光強度に対する３４０ｎｍの波長で励起した時の蛍光強度の比を蛍光測定装置で測定し、細胞内カルシウムイオン濃度の指標とする。ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の添加により、蛍光強度の比が増加する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有することが確認できる。Ｉｎｄｏ−１はカルシウムイオンと結合することにより、蛍光波長が４８０ｎｍから４００ｎｍにシフトするので、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含む緩衝液を添加する前と添加後に、４８０ｎｍの波長の蛍光強度に対する４００ｎｍの波長の蛍光強度の比を蛍光測定装置で測定し、細胞内カルシウムイオン濃度の指標とする。ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の添加により、蛍光強度の比が増加する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有することが確認できる。【０１２４】
（ｂ）血圧を上昇させる活性
麻酔下にあるラット等の動物の外頸静脈と内頸動脈にカテーテルを挿入し、内頸動脈のカテーテルを圧モニターに接続して動脈圧を連続的に測定する。外頸静脈から生理食塩水に溶解したペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を投与し、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の投与前と投与後の動脈圧を比較して、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の投与により、動脈圧が上昇する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が血圧を上昇させる活性を有することが確認できる。【０１２５】
６．ＶＧＦＣ末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害または促進する物質のスクリーニング方法
ＶＧＦＣ末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質は、（ｉ）心臓または血管の細胞に、該ＶＧＦＣ末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を接触させた場合の細胞応答を測定し、（ii）同じ細胞に試験物質の非存在下で、該ＶＧＦＣ末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を接触させた場合の細胞応答と比較し、（iii）試験物質の存在下で細胞応答が抑制される場合にその試験物質を該ＶＧＦＣ末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質として特定すること、によりスクリーニングできる。【０１２６】
また同様に、（ｉ）心臓または血管の細胞に、該ＶＧＦＣ末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を接触させた場合の細胞応答を測定し、（ii）同じ細胞に試験物質の非存在下で、該ＶＧＦＣ末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を接触させた場合の細胞応答と比較し、（iii）試験物質の存在下で細胞応答が促進される場合にその試験物質を該ＶＧＦＣ末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質として特定すること、により該ＶＧＦＣ末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質をスクリーニングできる。【０１２７】
細胞応答としては、心臓または血管の細胞に該ＶＧＦＣ末由来ペプチドを接触させたときに起こる、測定可能な細胞応答であれば、いかなる細胞応答でもかまわないが、例えば、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇があげられる。
上記のスクリーニング方法で用いる心臓または血管の細胞は、ＶＧＦＣ末由来ペプチドと接触させたときに細胞応答を示す細胞であれば、心臓または血管に由来する細胞株でもよいし、動物から採取した心臓または血管を細断したものでもよい。アポエクオリン遺伝子を導入して作製した全身にアポエクオリンを発現するトランスジェニックマウス（ＷＯ０２／０１０３７１）の心臓または血管を採取し、細断して得られる細胞は、セレンテラジンの存在下で発光量をルミノメーターで測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度を簡便に測定できるので、好ましい。【０１２８】
上記のスクリーニング方法で得られるＶＧＦＣ末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質は、ＶＧＦＣ末由来ペプチドと同様に、循環調節活性を有するので、循環調節剤、昇圧剤、あるいは心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療薬に用いることができる。また、ＶＧＦＣ末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質は、ＶＧＦＣ末由来ペプチドが有する、例えば血圧を上昇させる活性を阻害するので、降圧剤として用いることができる。【０１２９】
７．ＶＧＦＣ末由来ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法
ＶＧＦＣ末由来ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、（ｉ）心臓もしくは血管の細胞または該細胞の膜画分に、該ＶＧＦＣ末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を接触させた場合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量を測定し、（ii）同じ細胞または膜画分に試験物質の非存在下で、該ＶＧＦＣ末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を接触させた場合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量と比較し、（iii）試験物質の存在下で該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量が低下する場合にその試験物質を該ＶＧＦＣ末由来ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定すること、によりスクリーニングできる。【０１３０】
心臓または血管の細胞は、上記５．に記載の細胞を用いることができる。該細胞または該細胞の細胞膜画分は、適当な緩衝液に懸濁する。緩衝液は、ＶＧＦＣ末由来ペプチドと該細胞または該細胞の細胞膜画分との結合を阻害しない緩衝液であればいずれでもよく、例えばｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸緩衝液やＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が用いられる。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０、ジギトニン、デオキシコール酸等の界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチン等の各種蛋白質を緩衝液に加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明のポリペプチドやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４、ペプスタチン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。【０１３１】
１０μＬ〜１０ｍＬの該細胞または該細胞の細胞膜画分の懸濁液に、１２５Ｉ、３Ｈ等の放射性同位元素で標識した一定の放射能量を有するＶＧＦＣ末由来ペプチドを共存させて結合実験を行う。反応は０〜５０℃、好ましくは４〜３７℃で、２０分〜２４時間、好ましくは３０分〜３時間行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性をγ−カウンターまたは液体シンチレーションカウンターで計測する。この時の結合量を全結合量（Ａ）とする。大過剰の非標識の同化合物を加えた条件で同様の反応を行い、その時の結合量を非特異的結合量（Ｂ）とする。試験物質を加えた条件で同様の反応を行い、その時の結合量をＣとする。試験物質の結合阻害率は下記の式で求めることができる。
阻害率（％）＝［１−｛（Ｃ−Ｂ）／（Ａ−Ｂ）｝］×１００【０１３２】
上記のスクリーニング方法で得られるＶＧＦＣ末由来ペプチドの受容体に対するアゴニストは、ＶＧＦＣ末由来ペプチドと同様に、循環調節活性を有するので、循環調節剤、昇圧剤あるいは心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療薬に用いることができる。また、ＶＧＦＣ末由来ペプチドの受容体に対するアンタゴニストは、ＶＧＦＣ末由来ペプチドが有する、例えば血圧を上昇させる活性を阻害するので、降圧剤として用いることができる。【０１３３】
以下に、本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【０１３４】
ＶＧＦに由来するペプチドの単離と構造決定
コンフルエントになるまで増殖させたヒト膵臓由来細胞株（１０８個）を、フェノールレッドおよび血清を含まないＲＰＭＩ培地中で６時間培養後に培地を回収した。培地を回収し遠心した後の上清に１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１／５０容量加えた後に、セップ−パック（Sep-Pak）Ｃ１８カートリッジ〔ウォーターズ（Waters）社製〕を用いて試料を抽出した。カートリッジは０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略する）で洗浄し、６０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡで試料を溶出させた。溶出液を凍結乾燥の後に６０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡに溶解させ、同液で平衡化したゲル濾過ＨＰＬＣカラム〔ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷＸＬ、２１．５ｍｍ×３０ｃｍ（東ソー株式会社製）〕を用いたＨＰＬＣ〔ＨＰＬＣポンプ  Ｌ−２１００（日立製）〕により、流速１．５ｍｌ／分で分離し、ペプチド画分を回収した。凍結乾燥した同試料を１ｍｏｌ／Ｌ酢酸に溶解の後、１ｍｏｌ／Ｌトリス（ｐＨ１１）で中和させ、還元反応液（１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、２５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール、０．５ｍｏｌ／ｌトリス、ｐＨ８．５）中で３７℃１時間加温した。引き続きヨードアセトアミドを終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌになるように加え、遮光して室温で１５分間反応させた。氷酢酸で反応を停止させ、セップ−パックＣ１８カートリッジを用いて脱塩した。脱塩後、凍結乾燥した試料を０．１％ＴＦＡに溶解し、逆相ＨＰＬＣカラム〔バイダック（Vydac）Protein & Peptide Ｃ１８、１ｍｍ×１５ｍｍ（グレース・バイダック（Grace Vydac）社製）〕を用いたＨＰＬＣ〔ＨＰＬＣポンプＬ−６０００（日立製）〕により、流速５０μＬ／分で分離し、３０秒ごとに分取した。各画分は減圧乾燥の後、５０％メタノール−２％酢酸に溶解させ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法とエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法の２種類の質量分析法で分析した。ＭＡＬＤＩ法では、ターゲットプレートに上記試料を塗布後に、５０％ＡＣＮ−０．１％ＴＦＡに溶解させた２．５ｍｇ／ｍＬ  α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸溶液を０．５μＬ添加した。プレートは、タンデム飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計〔４７００プロテオミクス・アナライザー、アプライド・バイオシステムズ社製〕で質量分析し、検出されるペプチドを逐次同定した。ＥＳＩ法による質量分析は、四重極飛行時間型質量分析計〔Ｑ−Ｔｏｆ２、マイクロマス（Micromass）社製〕を用いて実施した。獲得したタンデムマススペクトルは、解析ソフトウエア  マスコットＭＳ／ＭＳイオン・サーチ〔Mascot MS/MS Ion Search、マトリックス・サイエンス（Matrix Science）社製〕を用い、ＮＣＢＩおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔのアミノ酸配列データベースを基に同定した。その結果、ヒトＶＧＦの一部のアミノ酸配列を有する６種類のペプチド、すなわちペプチド１（配列番号２７）、ペプチド２（配列番号２６）、ペプチド３（配列番号２）、ペプチド４（配列番号５）、ペプチド９（配列番号２８）およびペプチド１０（配列番号２９）を見出した。ペプチド１およびペプチド２は、Ｎ末端は修飾されていなかったが、Ｃ末端がアミド化されていた。ペプチド３、ペプチド４、ペプチド９およびペプチド１０は、Ｎ末端、Ｃ末端とも修飾されてい���かった。配列番号２７の配列のＣ末端のアミドを除いたアミノ酸配列（配列番号４）は、ヒトＶＧＦのアミノ酸配列（配列番号９）の５６５〜５７７番目、配列番号２６の配列のＣ末端のアミドを除いたアミノ酸配列（配列番号３）は５５４〜５７７番目、配列番号２は５５４〜５８３番目、配列番号５は５８６〜６１５番目、配列番号２８は４８５〜５０３番目、配列番号２９は５３３〜５５２番目にそれぞれ相当した。ペプチド４のアミノ酸配列（配列番号５）はウシのＶＧＦに由来するペプチドＶ〔Endocrinology, 135, 2742-2748 (1994)〕と同じアミノ酸配列であった。
【実施例２】
【０１３５】
ＶＧＦに由来するペプチドの調製
実施例１で見出されたペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド９およびペプチド１０ならびにこれらのペプチドと関連するペプチドとして、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド５、配列番号６のアミノ酸配列からなるペプチド６をそれぞれ、シグマ−ジェノシス（Sigma-Genosys）社（ペプチド２〜６）およびアメリカン・ペプチド・カンパニー社（American Peptide Company Inc.）（ペプチド１）に依頼して化学合成した。配列番号１のアミノ酸配列はヒトＶＧＦのアミノ酸配列の５５４〜６１５番目の配列に相当し、配列番号２〜５の全てのアミノ酸配列を含む。配列番号６のアミノ酸配列は、ラットＶＧＦのアミノ酸配列の５５６〜５８５番目の配列に相当し、ペプチド３に対応するラットの配列である。化学合成は、ペプチド合成機を用い、Ｎα−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を用いた固相合成法により行い、合成後のペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製した。【０１３６】
ペプチド２〜６（シグマ−ジェノシス社）については、アバカス・ペプチド・シンセサイザー（Abacus peptide synthesizer）を用い、ラップ・ポリマー社（Rapp Polymere GmBH）製のＣ末端アミドペプチド用樹脂テンタゲルＳ  ＲＡＭ（TentaGel S RAM、ペプチド２）またはＣ末端フリーペプチド用樹脂テンタゲルＳ  ＰＨＢ（TentaGel S PHB）にＮα−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を結合させたもの（ペプチド３および６：テンタゲルＳ  ＰＨＢ−Ｆｍｏｃ−アラニン、ペプチド４および５：テンタゲルＳ  ＰＨＢ−Ｆｍｏｃ−プロリン）、Ｎα−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（ＥＭＤバイオサイエンシズ社製）を用いて化学合成を行った。以下に、使用したアスパラギン酸、セリン、スレオニン、グルタミン酸、チロシン、リジン、ヒスチジン、アルギニンおよびシステインの各側鎖保護アミノ酸を示した。
アスパラギン酸：Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル）
セリン：Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン）
スレオニン：Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン）
グルタミン酸：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル）
チロシン：Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−チロシン）
リジン：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−ε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン）
ヒスチジン：Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン）
アルギニン：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−ＮＧ−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルフォニル−Ｌ−アルギニン）
システイン：Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン【０１３７】
脱保護用のクリベージカクテルは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：脱イオン水：ジチオスレイトール（粉末）：トリイソプロピルシラン＝８８：５：５：２の混合物を用いた。また、逆相ＨＰＬＣは、ディスカバリー（Discovery）ＨＳ  Ｃ１８カラム（１０μｍ、２５ｃｍ×２１．２ｃｍ、シグマ−アルドリッチ社製）を用い、０．１％  ＴＦＡ水溶液（Ａ液）および０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液（Ｂ液）の溶媒系で行った。【０１３８】
合成後のペプチドの構造を、ペプチド２〜６（シグマ−ジェノシス社）については、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計オートフレックス〔Autoflex、ブルカー（Brucker）社製〕を用いたＭＡＬＤＩ法による質量分析で確認した。マトリックスは、５０％ＡＣＮ−０．１％ＴＦＡで調製したα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シグマーアルドリッチ社製）飽和溶液を用いた。また、ペプチド１（アメリカン・ペプチド・カンパニー社）については、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計ボイジャーＤＥプロ（Voyager DE Pro、アプライド・バイオシステムズ社）を用いたＭＡＬＤＩ法による質量分析で確認した。マトリックスは、５０％ＡＣＮ−０．１％ＴＦＡで調製したα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シグマーアルドリッチ社製）飽和溶液を２倍希釈した溶液を用いた。さらに、アミノ酸分析〔Anal. Biochem., 222, 19 (1994)〕によっても、ペプチドの構造の確認を行った。加水分解はピコタグ用ワークステーション（ウォーターズ社製）を使用し、塩酸蒸気中１１０℃で２２時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はアミノ酸分析機Ｌ−８５００（日立製）を用いて行った。
【実施例３】
【０１３９】
ＶＧＦに由来するペプチドの細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性
全身にアポエクオリンを発現しているアポエクオリン遺伝子のトランスジェニックマウス（以下、アポエクオリン発現マウスとよぶ）の各臓器を利用して、実施例２で合成したペプチド１〜５、９および１０が、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するかどうかを調べた。アポエクオリン発現マウスの細胞は、アポエクオリンが発光基質セレンテラジンの存在下でカルシウムイオンと結合し発光するため、細胞内カルシウムイオン濃度をモニターできる。なお、特許文献（ＷＯ０２／０１０３７１）には、アポエクオリン発現マウスの作製法、該マウス由来の生体試料を使用した生理活性物質の評価方法および、以下に示すような生理活性ペプチドを該マウスの臓器を使用して評価した実験結果が開示されている。すなわち、アポエクオリン発現マウスより得られた各臓器に、アンジオテンシンIIを終濃度１μｍｏｌ／Ｌで添加したところ、血管、子宮、副腎において強い発光が観察され、またブラジキニンを終濃度１０μｍｏｌ／Ｌで添加したところ、血管、子宮、副腎において強い発光が観察されたとの記載があり、アポエクオリン発現マウスは新規なペプチドの生理活性評価に使用可能である。【０１４０】
アポエクオリン発現マウスは特許文献（ＷＯ０２／０１０３７１）の参考例４で開示されている方法に従い作製した。アポエクオリン発現マウスを屠殺後、胸腺、脾臓、骨、血管、心臓、腎臓、副腎、膵臓、下垂体、子宮の各臓器を摘出し、それぞれの臓器を約１〜２ｍｍ３の立方体に細断した。次に、５ｍＬチューブ（Rohren-Tubes；ザルスタット（Sarstedt）社製、Ｎｏ．５５．４７６）中で、ＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した１０μｍｏｌ／Ｌセレンテラジン〔モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes社）製〕溶液５０μＬに、調製した各種臓器試料を３個づつ加え３７℃で３時間培養した。３時間後、ＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、２５秒後にＲＰＭＩ１６４０培地に溶解したペプチド１〜５それぞれを終濃度１μｍｏｌ／Ｌおよび５μｍｏｌ／Ｌになるように添加し、ルミノメーター〔オートルーマット（AutoLumat）ＬＢ９５３、ベルトルード（Berthold）社製〕を用いて、ＲＰＭＩ１６４０培地の添加直後から１秒ごとに相対発光量を測定した。【０１４１】
その結果、その結果、ペプチド１は胸腺、心臓（図１）、下垂体、子宮で、ペプチド２は、胸腺、脾臓、骨、血管（図２）、心臓（図３）、子宮で、ペプチド３は胸腺、脾臓、骨、血管、心臓（図４）、腎臓、副腎、下垂体、子宮で、ペプチド４は、胸腺、脾臓、血管（図５）、下垂体で、ペプチド５は、心臓（図６）で、ペプチド９は血管（図７）で、ペプチド１０は心臓（図８）、血管（図９）でそれぞれ発光が観察された。以上から、ペプチド１〜５及びペプチド９、１０は、循環器系に関与する臓器である心臓または血管の細胞において細胞内のカルシウムイオンの濃度を上昇させる活性を有していることがわかった。
【実施例４】
【０１４２】
ペプチド２のラットの血圧に対する作用
ウィスター（Wistar）ラット（雄、１０週齢、２５０〜３００ｇ）に、５０ｍｇ／体重ｋｇのペントバルビタールを腹腔内投与し、麻酔した。麻酔下にあるラットの外頸静脈と内頸動脈にカテーテルを挿入し、内頸動脈のカテーテルを圧モニターに接続し、外頸静脈から生理食塩水に溶解した３００ｎｍｏｌのペプチド２（１００μＬ）をボーラス投与し、連続的に血圧を測定した。ペプチド投与後の平均動脈圧の変動を図１０に示した。図１０に見られるように、ペプチド２の投与により、明らかな血圧上昇が認められた。
【実施例５】
【０１４３】
ペプチド１を抗原とする抗体の作製
（１）動物の免疫と抗血清の調製
ペプチド１をキャリア蛋白質と結合させるため、ペプチド１のＮ末端にシステイン残基を付加した配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチド７を実施例１と同様にアメリカン・ペプチド・カンパニー社に依頼して化学合成した。ペプチド７  ４．９ｍｇを、システイン残基を介して、マレイミドで活性化したキーホール・リンペット・ヘモシアニン〔Inject Activated mcKLH; ピアース（Pierce）社製〕１０ｍｇと共有結合させた。共有結合の反応はピアース社のマニュアルに従って行った。得られたペプチド７とＫＬＨとのコンジュゲートを生理食塩水で透析したものを抗原とした。抗原は分注し、使用時まで−３５℃で保存した。得られた抗原の生理食塩溶液１ｍＬ（ペプチド７約２００μｇに相当）を当容のフロイントの完全アジュバントと混合して安定なエマルジョンを作成し、３週間毎に９回雄のウサギ（New Zealand white rabbit）に皮内投与して、免疫した。投与後に抗体価を測定し、抗体価の上昇が見られたウサギから血清を調製し、抗血清とした。【０１４４】
（２）抗体価の測定
抗体価の測定は、以下に示すようなラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により行った。すなわち、ポリスチレンチューブ内で、ＲＩＡ緩衝液〔２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム、０．５％Ｎ−エチルマレイミド処理ＢＳＡ、０．５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）〕で段階的に希釈した抗血清１００μＬに、一定量の［１２５Ｉ］標識したペプチド１（約２００００ｃｐｍ、５００〜５５０Ｂｑ、ペプチド量として約１０ｆｍｏｌ）を含むＲＩＡ緩衝液１００μＬを添加し、４℃で４０時間インキュベートし、抗血清中の抗体と標識したペプチド１を結合させた。対照として、非特異結合を測定するため、抗血清の代わりに、抗血清を含まないＲＩＡ緩衝液を用いた反応も行った。インキュベート後、１％ウシγ−グロブリン（シグマ−アルドリッチ社製）溶液〔８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）〕１００μＬを添加して混合し、さらに２３％ポリエチレングリコール＃６０００（ナカライテスク社製）溶液〔８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）〕５００μＬを添加して混合し、氷上で１０分以上静置した後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、免疫複合体を沈殿させた。抗体と結合していない［１２５Ｉ］標識したペプチド１が含まれる上清を吸引して除き、γ−カウンターで沈殿の放射活性Ａ（ｃｐｍ）を測定した。非特異結合の反応チューブについても同様にして放射活性Ｎ（非特異結合量；ｃｐｍ）を測定し、沈殿の放射活性の値Ａから非特異結合量Ｎの値を差し引いた値を抗血清の特異的結合量とした。反応に用いた［１２５Ｉ］標識したペプチド１を含むＲＩＡ緩衝液１００μＬの放射活性Ｔ（ｃｐｍ）をγ−カウンターで測定し、添加した抗原ペプチドの放射活性に対する特異的結合量の割合Ｘ（％）を以下の式で求めた。抗血清の希釈率とＸとをプロットし、Ｘが３０％になる希釈率の逆数を抗体価の指標とした。
Ｘ（％）＝｛（Ａ−Ｎ）／Ｔ｝×１００【０１４５】
抗原ペプチドの［１２５Ｉ］標識は、ラクトペルオキシダーゼ法により、抗原ペプチドのＮ末側のチロシン残基を標識した。すなわち、ペプチド１  １０μｇを０．４ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）２５μＬに溶解させ、２００ｎｇのラクトペルオキシダーゼを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）溶液１０μＬ、３．７ＭＢｑ／μＬ  Ｎａ１２５Ｉ  ５μＬ（１８．５ＭＢｑ）、０．００２％過酸化水素５μＬを添加して撹拌し、３０℃で１０分間反応させた。さらに０．００２％過酸化水素５μＬを添加して撹拌し、３０℃で１０分間反応させた。水５００μＬを添加し、ＡＣＮ勾配１０−６０％／０．１％ＴＦＡの溶媒系を用いたＣ１８系の逆相ＨＰＬＣにより、標識ペプチドを分取した。ペプチド溶液は６０％ＡＣＮ−０．１％ＴＦＡで希釈し、分注して−８５℃で保存した。【０１４６】
（３）抗血清の結合特異性
得られた抗血清のうち、上記の抗体価が９×１０５を示した抗血清、すなわち上記のＲＩＡにおいて、９×１０５倍に希釈しても、添加した抗原ペプチドの３０％が結合を示した抗血清を用いて、ＲＩＡによりＶＧＦに由来する６種類のペプチドに対する結合特異性を調べた。すなわち、ＲＩＡ緩衝液で９×１０５倍に希釈した抗血清１００μＬに、一定量の［１２５Ｉ］標識したペプチド１（約２００００ｃｐｍ、５００〜５５０Ｂｑ、ペプチド量として約１０ｆｍｏｌ）を含むＲＩＡ緩衝液１００μＬ、段階的に希釈した各ＶＧＦ由来ペプチドを含むＲＩＡ緩衝液１００μＬを添加し、４℃で４０時間インキュベートし、抗血清中の抗体に標識ペプチド１とＶＧＦ由来ペプチドを競合的に結合させた。対照として、非特異結合を測定するため、抗血清を添加せず、代わりにＲＩＡ緩衝液を用いた反応、最大結合量を測定するため、ＶＧＦ由来ペプチド溶液を添加せず、代わりにＲＩＡ緩衝液を用いた反応も行った。非特異結合の反応は４連、その他の反応は２連で行い、それぞれの反応物に対し、上記の抗体価の測定と同様にして免疫複合体を沈殿させ、その放射活性（ｃｐｍ）を測定した。非特異結合の反応の放射活性の平均を非特異結合量Ｎ、各ＶＧＦ由来ペプチドの添加反応の放射活性の値をＹ、最大結合の反応の放射活性の値をＺとしたとき、最大結合量Ｂ０に対するペプチド添加時の抗血清の特異的結合量Ｂの割合Ｂ／Ｂ０（％）を以下の式により求めた。
Ｂ／Ｂ０（％）＝｛（Ｙ−Ｎ）／（Ｚ−Ｎ）｝×１００
抗血清が添加したペプチドにも結合する場合は、添加したペプチドが、量の増加と共に、抗血清の抗原ペプチドへの結合を競合的に阻害するので、ペプチド添加時の抗血清の特異的結合量が減少する。したがって、Ｂ／Ｂ０が５０％になる、つまり最大結合量を５０％阻害するペプチドの量を、そのペプチドに対する抗血清の結合の強さの指標とした。５０％阻害するペプチドの量が低いほど、結合の強さが強いことになる。【０１４７】
ＶＧＦに由来するペプチドとしては、実施例２で調製したペプチド１〜３、および配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチド８を用いた。配列番号８はヒトＶＧＦのアミノ酸配列の６０６〜６１５番目の配列であり、ペプチド１のアミノ酸配列は含まない。ペプチド１は０．５、１、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４ｆｍｏｌ、ペプチド２は１、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４ｆｍｏｌ、ペプチド３は１、３．３、１０、３３、１００、３３３、１０００、３３００、１００００、３３０００、１０００００、３３３０００、１００００００ｆｍｏｌ、ペプチド８は１０００、１００００、１０００００、１００００００ｆｍｏｌの各量のペプチド／チューブで測定を行った。【０１４８】
図１１に示すように、ペプチド１および２は量依存的に同程度に抗血清の結合を阻害し、ペプチド１の５０％阻害の量は７．５ｆｍｏｌであった。ペプチド３も量依存的に抗血清の結合を阻害したが、その阻害は弱く、ペプチド１および２と同程度の阻害を示すには、約１００００倍の量が必要であった。ペプチド８は全く阻害を示さなかった。したがって、この抗血清は、抗原であるペプチド１に非常に強い結合をするとともに、ペプチド１を含む構造を有するペプチド２にも同程度に強い結合をするが、ペプチド３に対してはペプチド１の１／１００００の弱い結合しかせず、ペプチド８に対しては、全く結合をしない結合特異性を示す、ペプチド１および２に特異的に結合する抗体であった。なお、ＶＧＦ以外のペプチドとして、アンジオテンシンII、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、Leu−エンケファリン、ニューロメジンＵ−８、サブスタンスＫ、バソプレッシン、Met−エンケファリン−Arg−Gly−Leu、アドレノメジュリン、カルシトニン、ＰＨＩ−２７、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ＰＡＭＰ−２０、カルシトニン受容体刺激ペプチドに対する結合を、上記と同様にして１、１０、１００ｐｍｏｌの各量のペプチドで調べたが、どのペプチドも１、１０および１００ｐｍｏｌいずれも阻害を示さず、ペプチド１および２に特異的に結合する抗体であることが確認された。【０１４９】
ペプチド３はペプチド１のアミノ酸配列を含むが、ペプチド１のＣ末端のアミドを有さない構造であり、ペプチド８はペプチド１のアミノ酸配列は含まない構造であるので、この抗血清は、ペプチド１の配列番号４のアミノ酸配列のＣ末端がアミド化した配列（配列番号２７）中に存在するエピトープと結合する抗体、特に該配列のＣ末端のアミドを含む領域に存在するエピトープと結合する抗体であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明により、循環調節活性を有する新規なペプチドが提供される。該ペプチドは、循環調節活性を有するので、循環調節剤、昇圧剤として有用であり、また心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療に用いることができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１−発明者：山崎基生；高橋憲行；南野直人；
発明者：佐々木一樹；高尾敏文；里見佳典
配列番号７−合成ペプチド７
配列番号１０−配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列番号１１−配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列番号１２−配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列番号１３−配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列番号１７−ＶＧＦ由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号１８−ＶＧＦ由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号１９−ＶＧＦ由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号２０−ＶＧＦ由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号２１−ペプチド２に対応するラットＶＧＦ配列に基づくペプチド
配列番号２２−ペプチド１に対応するラットＶＧＦ配列に基づくペプチド
配列番号２３−ＶＧＦ由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号２４−ＶＧＦ由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号３４−配列番号２８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列番号３５−配列番号２９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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