(57)【要約】抗体感作粒子を用いた免疫測定方法において、偽陽性の発生を防止する。  本発明の免疫測定方法は、検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子と検体とを混合し、抗原抗体反応による前記抗体感作粒子の凝集を測定することにより前記検体中の測定対象物質を検出または定量する免疫測定方法であって、前記混合に先立ち、陽イオン交換物質を用いて前記検体を前処理することを含む。前記陽イオン交換物質としては、例えば、官能基としてスルホン酸基又はカルボキシル基を有する陽イオン交換物質が使用でき、その形態は、特に制限されず、例えば、陽イオン交換フィルターおよび陽イオン交換カラム等であってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の測定対象物質を検出または定量する免疫測定方法であって、
検体と、前記検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子とを混合する工程、および、
抗原抗体反応による前記抗体感作粒子の凝集を測定する工程を含み、
前記混合工程に先立ち、陽イオン交換物質を用いて前記検体を前処理する工程を含む免疫測定方法。
【請求項２】
前記陽イオン交換物質が、陽イオン交換樹脂である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
【請求項３】
前記陽イオン交換物質が、強酸性陽イオン交換物質および弱酸性陽イオン交換物質の少なくとも一方である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
【請求項４】
前記陽イオン交換物質が、官能基としてスルホン酸基又はカルボキシル基を有する陽イオン交換物質である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
【請求項５】
前記陽イオン交換樹脂が、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体にスルホン酸基又はカルボキシル基を導入した樹脂、および、親水性メタクリレート系ポリマーにスルホン酸基又はカルボキシル基を導入した樹脂から選択される少なくとも１つである請求の範囲２記載の免疫測定方法。
【請求項６】
前記陽イオン交換物質の形態が、陽イオン交換フィルターおよび陽イオン交換カラムの少なくとも一方である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
【請求項７】
前記陽イオン交換フィルターが、球状の陽イオン交換樹脂を担体に担持させたフィルターまたは繊維状の陽イオン交換樹脂を含むフィルターである請求の範囲６記載の免疫測定方法。
【請求項８】
前記抗体が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
【請求項９】
前記抗体感作粒子が、不溶性担体粒子に抗体を感作させた抗体感作粒子である請求の範囲１記載の免疫測定方法。
【請求項１０】
前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である請求の範囲９記載の免疫測定方法。
【請求項１１】
前記測定対象物質が、菌またはウイルスである請求の範囲１記載の免疫測定方法。
【請求項１２】
前記測定対象物質が、溶血性連鎖球菌、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、百日咳菌、クラミジア・トラコマティス、コロナウイルスおよびマイコプラズマからなる群から選択される少なくとも１つである請求の範囲１記載の免疫測定方法。
【請求項１３】
請求の範囲１記載の免疫測定方法に使用する免疫測定用キットであって、検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子と、陽イオン交換物質とを含む免疫測定用キット。
【請求項１４】
前記陽イオン交換物質が、陽イオン交換樹脂である請求の範囲１３記載の測定用キット。
【請求項１５】
前記陽イオン交換物質が、官能基としてスルホン酸基又はカルボキシル基を有する陽イオン交換物質である請求の範囲１４記載の測定用キット。
【請求項１６】
前記陽イオン交換樹脂が、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体にスルホン酸基又はカルボキシル基を導入した樹脂、および、親水性メタクリレート系ポリマーにスルホン酸基又はカルボキシル基を導入した樹脂から選択される少なくとも１つである請求の範囲１４記載の測定用キット。
【請求項１７】
前記陽イオン交換物質の形態が、陽イオン交換フィルターおよび陽イオン交換カラムの少なくとも一方である請求の範囲１３記載の測定用キット。
【請求項１８】
前記抗体感作粒子が、不溶性担体粒子に抗体を感作させた抗体感作粒子である請求の範囲１３記載の測定用キット。
【請求項１９】
前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である請求の範囲１８記載の測定用キット。
【請求項２０】
さらに、試薬を含む試薬パックを含み、前記試薬が前記抗体感作粒子を含む請求の範囲１３記載の測定用キット。
【請求項２１】
前記試薬パックが、使い捨て可能なカートリッジ形状である請求の範囲２０記載の測定用キット。
【請求項２２】
さらに、検体希釈液、反応用緩衝液、検体採取器具および検体抽出液からなる群から選択される少なくとも１つを含む請求の範囲１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、抗原抗体反応を利用し、測定開始から数分〜数十分で測定項目を検出または定量可能な簡易検査試薬およびキットが開発されている。測定項目が感染症である場合、患者から採取した検体の感染の有無がその場で判明すれば、症状が早期のうちに患者を治療できる。このため、このような簡易検査試薬およびキットの重要性は、医療の現場において年々高まっている。【０００３】  現在、簡易検査方法の１つとして、ラテックス凝集法（ｌａｔｅｘ  ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）等の免疫測定方法が広く用いられている。ラテックス凝集法は、抗体感作されたラテックス粒子と検体中の標的抗原とを抗原抗体反応によって結合・凝集させ、その凝集の度合いにより感染の有無を検出する方法である。この方法は、検体の濃度によっては、目視による凝集塊の判定や自動分析装置を用いた吸光度の測定による定量検査もできる。【０００４】  しかしながら、ラテックス凝集法等の免疫測定方法を用いて検体（例えば、咽頭拭い液等）を分析する場合、偽陽性が生じる問題がある。すなわち、測定対象物質が検体中に存在しないにも係わらず、非特異的な反応により粒子が結合・凝集するため、陽性と判定してしまう問題である。このように、病原体の感染を特定する際に偽陽性が生じると、罹患に関して誤った情報を与えることになる。その結果、原因特定の遅延や不適切な治療を施すことになり、病状がより重篤になる等の重大な問題を引き起こすこともあり得る。したがって、偽陽性の発生の抑制は、極めて重要な課題である。【０００５】  従来、この問題を解決するために、予め、ろ過フィルター等を用い、その孔径の大きさによって検体を篩い分けることにより、偽陽性の発生を抑制する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。しかしながら、この方法は、メンブレン固相を用いたＥＩＡ（酵素標識免疫測定方法）ではその効果を発揮するが、ラテックス凝集法のように抗体感作粒子を用いた免疫測定方法では充分な効果が得られなかった。
【特許文献１】特開２００４−２８８７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  そこで、本発明は、抗体感作粒子を用いた免疫測定方法において、偽陽性の発生を防止し、検出精度および定量精度の高い免疫測定方法、およびそれに用いる測定用キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  前記目的を達成するために、本発明の免疫測定方法は、検体中の測定対象物質を検出または定量する免疫測定方法であって、検体と、前記検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子とを混合する工程、および、抗原抗体反応による前記抗体感作粒子の凝集を測定する工程を含み、前記混合工程に先立ち、陽イオン交換物質を用いて前記検体を前処理する工程を含むことを特徴とする。【０００８】  また、本発明の免疫測定用キットは、本発明の免疫測定方法に使用する免疫測定用キットであって、検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子と、陽イオン交換物質とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】  このように、陽イオン交換物質を用いて検体を前処理すれば、非特異的な反応を防止できる。このため、偽陽性の発生を抑制することができ、検出精度および定量精度の高い免疫測定方法を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  つぎに、本発明について、詳しく説明する。【００１１】  前記陽イオン交換物質は、特に制限されないが、例えば、強酸性陽イオン交換物質および弱酸性陽イオン交換物質があげられ、中でも、官能基としてスルホン酸基又はカルボキシル基を有する陽イオン交換物質が好ましい。また、前記陽イオン交換物質は、官能基としてスルホン酸基およびカルボキシル基の双方を有してもよい。【００１２】  前記陽イオン交換物質としては、例えば、陽イオン交換樹脂があげられ、中でも官能基としてスルホン酸基およびカルボキシル基の少なくとも一方を有する樹脂が好ましい。前記陽イオン交換樹脂の具体例としては、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体にスルホン酸基およびカルボキシル基の少なくとも一方を導入した樹脂、親水性メタクリレート系ポリマーにスルホン酸基およびカルボキシル基の少なくとも一方を導入した樹脂等があげられる。中でも、ポリエーテルスルホン、および、親水性メタクリレート系ポリマーにスルホン酸基およびカルボキシル基の少なくとも一方を導入した樹脂が好ましい。前記陽イオン交換樹脂の形状は、特に制限されず、例えば、球状、膜および繊維等があげられる。【００１３】  前記陽イオン交換物質の形態は、特に制限されないが、例えば、陽イオン交換フィルターや陽イオン交換カラム等が好ましい。前記陽イオン交換フィルターとしては、例えば、球状の陽イオン交換樹脂を担体に担持させたフィルター、繊維状の陽イオン交換樹脂を含むフィルター等があげられる。前記担体の材質は、例えば、綿等の陽イオン交換樹脂以外の材質が好ましく、その形状は、繊維状が好ましい。前記担体に陽イオン交換樹脂を担持させたフィルターとしては、例えば、粉末状のポリエーテルスルホンを脱脂綿等に担持させたフィルター等があげられる。また、前記繊維状の陽イオン交換樹脂を含むフィルターは、例えば、ポリエーテルスルホン繊維で編まれたフィルター等があげられる。前記陽イオン交換カラムとしては、例えば、前記陽イオン交換樹脂を管に充填したもの等があげられる。【００１４】  前記測定対象物質と反応する抗体は、特に制限されないが、例えば、測定対象物質に特異的に反応して結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体等があげられる。【００１５】  前記抗体感作粒子は、例えば、粒子に前記抗体を感作させたものが使用できる。前記粒子は、特に制限されないが、不溶性担体粒子があげられ、前記不溶性担体粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子等のラテックス粒子、ポリプロピレン粒子、ポリエチレン粒子、ゼラチン粒子、金属コロイド等があげられ、中でも、ポリスチレンラテックス粒子が好ましい。前記抗体感作粒子は、前記ポリスチレンラテックス粒子に抗体を感作させた抗体感作ラテックス粒子が好ましい。なお、粒子への抗体の感作は、従来公知の方法により行うことができる。【００１６】  また、本発明の免疫測定方法において、前記抗体感作粒子を備えたアセンブリを使用してもよい。前記アセンブリとしては、例えば、試薬を含む試薬パック等があげられ、前記試薬が前記抗体感作粒子を含むことが好ましい。前記試薬パックは、例えば、使い捨て可���なカートリッジ形状が好ましく、より好ましくは２つ以上の槽を備え、前記槽の少なくとも１つとして前記試薬を含む試薬槽を備える。前記試薬パックは、前記試薬槽に加えて、例えば、反応を行う反応槽、検体を入れる検体槽、廃液を入れる廃棄槽および分注チップ等を含むことが好ましい。このような槽を備えた試薬パックを使用することにより、例えば、試薬の調製等が不要となるため、検体の前処理と測定とを連続して行うことができる。その結果、測定がより一層簡便になり、また、自動化装置への適用も極めて容易になる。前記試薬パックとして、例えば、特開２００１−３１８１０１号公報に記載の免疫測定用カートリッジが使用できる。前記カートリッジは、例えば、前記試薬槽および反応槽を含み、さらに、検体槽、廃棄槽および分注チップ等を含んでもよい。前記試薬槽および反応槽の個数は、特に制限されず、１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。これらの槽の配置は、特に制限されないが、例えば、試薬槽および反応槽を複数備え、これらが直列に配置されている場合、前記試薬槽と前記反応槽とが交互に配置されていることが好ましい。また、前記試薬槽および前記反応槽の上部は、例えば、アルミ箔や高分子フィルム等でシールされていることが好ましい。前記試薬としては、例えば、後述する反応用緩衝液等が使用できる。【００１７】  本発明において使用する免疫測定方法としては、例えば、ラテックス凝集法があげられる。本発明は、ラテックス凝集法において適用することが好ましい。【００１８】  前記測定対象物質は、例えば、菌またはウイルス等があげられる。本発明の免疫測定方法において、前記菌または前記ウイルスの特定の抗原を検出若しくは定量することにより、前記菌または前記ウイルスを検出若しくは定量できる。前記菌および前記ウイルスの具体例としては、溶血性連鎖球菌、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、百日咳菌、クラミジア・トラコマティス、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）およびマイコプラズマ等があげられる。中でも、本発明の免疫測定方法は、溶血性連鎖球菌およびインフルエンザウイルスに有用である。【００１９】  前記検体は、特に制限されないが、例えば、鼻汁由来検体および咽頭由来検体等があげられる。前記鼻汁由来検体は、例えば、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液および鼻腔洗浄液等があげられる。また、前記咽頭由来検体は、例えば、咽頭拭い液および唾液等があげられる。【００２０】  つぎに、本発明の測定用キットは、前述のとおり、本発明の免疫測定方法に使用する免疫測定用キットであって、検体中の測定対象物質と反応する抗体を感作させた抗体感作粒子および陽イオン交換物質を含む。【００２１】  本発明の測定用キットは、さらに、試薬を含む試薬パックを含んでもよく、前記試薬が前記抗体感作粒子を含むことが好ましい。前記試薬パックは、例えば、使い捨て可能なカートリッジ形状が好ましく、より好ましくは２つ以上の槽を備え、前記槽として前記試薬を含む試薬槽を備えることである。さらに、前記試薬パックは、反応槽、検体槽、分注チップおよび廃棄槽等を含むことが好ましい。本発明の測定用キットが複数の槽を備えた���薬パックを含む場合、本発明の免疫測定方法をより一層簡便に実施でき、また、自動化装置への適用も極めて容易になる。【００２２】  本発明の測定用キットは、その利便性をより一層向上させるために、さらに、例えば、検体希釈液、反応用緩衝液、検体採取器具および検体抽出液等のうち少なくとも１つを含むことが好ましい。【００２３】  本発明の測定用キットとしては、例えば、前記免疫測定用カートリッジに、前記抗体感作粒子および陽イオン交換物質、並びに、検体希釈液、反応用緩衝液、検体採取器具および検体抽出液の少なくとも１つを適宜封入したものがあげられる。【００２４】  前記検体希釈液は、測定前に検体を希釈するための試薬であって、例えば、測定対象物質や検体等に応じて適宜決定できる。前記検体希釈液は、特に制限されないが、例えば、ＢＳＡやＮａＮ３等を含むＰＢＳ等があげられる。なお、検体の種類や量等によって、前記検体希釈液は省略してもよい。【００２５】  前記反応用緩衝液は、例えば、測定対象物質等に応じて適宜決定でき特に制限されないが、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液およびリン酸緩衝液等があげられる。前記反応用緩衝液は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００等）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＮａＣｌおよびＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＮａＮ３等を含んでもよい。【００２６】  前記検体採取器具は、例えば、前記分注チップを兼用してもよいし、綿棒等であってもよい。【００２７】  前記検体抽出液は、例えば、核蛋白等の抽出に使用する試薬であって、測定対象物質や検体等に応じて適宜決定でき特に制限されないが、例えば、緩衝液等が使用できる。前記緩衝液は、例えば、ＣＨＥＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液およびＣＡＰＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液等があげられる。前記検体抽出液は、例えば、セミアルカリプロテアーゼ、ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ、ＢＳＡ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＥＤＴＡ・２ＮａおよびＮａＮ３等を含んでもよい。【００２８】  以下に、本発明の測定方法の一例について説明するが、以下の方法には制限されない。まず、検体として咽頭由来検体を使用し、測定対象物質が溶血性連鎖球菌である場合を例にあげて説明する。【００２９】  まず、陽イオン交換物質を準備する。前記陽イオン交換物質としては、前述のものが使用できるが、例えば、ガラスフィルターの間に前記陽イオン交換フィルターを配置し、それをポリエチレンで形成されたノズル内に装填したもの等が好ましい。また、前記陽イオン交換物質として、市販の陽イオン交換フィルターおよび陽イオン交換カラムを使用してもよい。【００３０】  つぎに、咽頭から採取した咽頭由来検体を、例えば、２Ｍ亜硝酸ナトリウム液および１Ｍ酢酸液と混合した後、中和して検体液を調製する。検体量が微量である場合は、例えば、１重量％ＢＳＡおよび０．１重量％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）等の検体希釈液で検体を予め懸濁してもよい。【００３１】  そして、前記検体液を、前記陽イオン交換物質を���いて陽イオン交換処理する。ついで、処理後の検体液、抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬および反応用緩衝液を混合し、その凝集度合いを検出する。凝集度合いの検出は、例えば、分光光度計等の自動的に制御された光学測定装置を用いた濁度測定により行ってもよいし、凝集の有無をスライドガラス上等で目視確認してもよい。前記抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬は、自家調製したものを使用してもよいし、市販のものを使用してもよい。【００３２】  つぎに、測定対象物質がインフルエンザウイルスである場合を例にあげて説明する。【００３３】  インフルエンザウイルスについては、本発明の免疫測定方法により、例えば、Ａ型とＢ型の鑑別を行うことが好ましい。前記鑑別に使用する抗体は、例えば、核蛋白に対して特異的な抗体が好ましい。インフルエンザウイルス表面蛋白のヘマグルチニン等は抗原性が次々と変異するために、一定の抗ヘマグルチニン抗体を用いると、流行したウイルスの亜型によって反応性が相違し、場合によっては反応しなくなる可能性がある。しかしながら、核蛋白はＡ型やＢ型を分類する際の基本となる抗原性を維持しており亜型の種類に関わらず一定の反応性を示すため、Ａ型とＢ型の鑑別に適しているからである。核蛋白はウイルス粒子の脂質二層膜からなるエンベロープの内部に局在し、ウイルス表面には存在しないため、まず、例えば、超音波処理や凍結融解等の繰り返しによるウイルス粒子の物理的な破壊や、界面活性剤等による化学的な処理方法等により核蛋白を抽出することが好ましい。前記化学的な処理方法としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名、一般名称：Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）やｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（例えば、商品名：ＭＥＧＡ−８）等の非イオン性界面活性剤等で抽出する方法がある。ＥＩＡ法やイムノクロマト法等では、前記界面活性剤として、通常、Ｔｗｅｅｎ２０等が用いられるが、本発明のように抗体感作粒子の凝集を用いて抗原抗体反応を行う場合、粒子の凝集反応の反応性に及ぼす影響が少なく且つ抽出効果が高いことから、ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（例えば、商品名：ＭＥＧＡ−８）が好ましい。ついで、このようにして抽出した核蛋白を用いて、本発明の免疫測定方法により鑑別を行うことが好ましい。【００３４】  つぎに、本発明の実施例について比較例とあわせて説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】  １．抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬の調製
抗溶血性連鎖球菌ウサギポリクローナル抗体および５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて抗体液（抗体濃度０．７ｍｇ／ｍＬ）を調製した。前記抗体液０．５ｍＬと１％（ｗ／ｖ）ポリスチレンラテックス粒子（積水化学社製、平均粒子径０．５μｍ）０．５ｍＬとを混合し、３７℃で１時間インキュベートすることによって、前記抗溶血性連鎖球菌ウサギポリクローナル抗体を前記ポリスチレンラテックス粒子に感作させた。ついで、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を１重量％となるように添加し、３７℃で１時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキングした抗体感作ラテックス粒子をリン酸緩衝液で洗浄した後、前記ラテックス粒子をラテックス分散緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）、０．１重量％ＢＳＡ、０．１重量％ＮａＮ３）に分散させて、抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬（粒子濃度０．１％（ｗ／ｖ））を調製した。【００３６】  ２．ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌抗原の測定
抗原は、ストレプトコックス・ピオゲネス（Ａ群３型）Ｓｕ株をペニシリン処理したピシバニール（中外製薬社製）を用いた。検体希釈液（１重量％ＢＳＡおよび０．１重量％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））を用いて前記抗原を希釈し、２種類の抗原濃度の抗原液（１０ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ）を調製した。ついで、測定の直前に、前記各濃度の抗原液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和して検体液を調製した。なお、抗原の濃度が０ｎｇ／ｍＬの検体液は、前記検体希釈液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和することにより調製した。【００３７】  前記抗体感作ラテックス試薬６３μＬ、前記検体液１４μＬおよび反応用緩衝液６３μＬをキュベット内で混合し、免疫反応装置（商品名：スポットケム−ＩＭ、アークレイ社製）を用いて、３７℃で５分間、吸光度（測定波長６６０ｎｍ）の変化を測定した。その結果を、５分間の吸光度変化量（測定開始５分後の吸光度−測定開始直後の吸光度）として下記表１に示す。なお、前記反応用緩衝液は、下記組成のものを使用した。【００３８】  （反応用緩衝液）
１．９重量％  ポリエチレングリコール２００００（ナカライ社製）
１重量％      ＢＳＡ
２重量％      ＮａＣｌ
０．１重量％  ＥＤＴＡ・２Ｎａ
０．１重量％  ＮａＮ３
２００ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）【００３９】
【表１】
2007013401.tif 000002
【００４０】  前記表１に示すように、溶血性連鎖球菌抗原濃度に応じて吸光度変化量が増加していることから、ラテックス凝集法により定量的に溶血性連鎖球菌量を測定できることが確認できた。【００４１】  ３．溶血性連鎖球菌陰性検体の測定
症状から判断して明らかに溶血性連鎖球菌に感染していない人から咽頭拭い液を採取した。その咽頭拭い液が溶菌性連鎖球菌陰性であることを、市販の溶菌性連鎖球菌検出キット（商品名：ストレップＡテストパック；プラスボットジャパン社製）を用いて確認した。ついで、前記陰性が確認された人から綿棒を用いて咽頭拭い液を採取し、下記の条件１で溶菌性連鎖球菌量を測定した。また、比較例１として、前記検体について下記の条件２で溶菌性連鎖球菌量を測定した。【００４２】  （条件１）
前記咽頭拭い液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和して検体液を調製した。ついで、ポリエチレンで形成されたノズル内に、厚み１４０μｍのイオン交換メンブレンディスクフィルター（ＰＡＬＬ／日本ポール社製、商品名：Ｉ．Ｃ．Ｅ４５０（登録商標）（陽イオン交換樹脂：ポリエーテルスルホン、官能基：スルホン酸基、フィルターの孔径：０．４５μｍ））をガラスフィルターの間に配置した抽出ユニットを充填した。前記検体液をポリエチレンで形成された検体処理用チューブに入れた後、前記チューブに前記ノズルを装着した。ついで、前記検体液をノズルに通してろ過することにより陽イオン交換処理を行った。前記陽イオン交換処理後の検体液を用いて、前記「２．ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌抗原の測定」と同様にして、測定波長６６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。【００４３】  （比較例１：条件２）
前記咽頭拭い液、２Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液および１Ｍ酢酸溶液を混合した後、中和したものをそのまま使用して、前記条件１と同様にして吸光度の変化を測定した。【００４４】  前記実施例１（条件１）および比較例１（条件２）の測定結果を、下記表２に示す。なお、同表において、吸光度変化量が０．００５０以上を陽性（＋）とし、０．００５０未満を陰性（−）と判定した。【００４５】
【表２】
2007013401.tif 000003
【００４６】  前記表２に示すように、ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌の測定において、陽イオン交換処理を行わない比較例１（条件２）では、溶菌性連鎖球菌が陰性である検体を使用したにも関わらず、１４検体中１２検体で非特異的な凝集反応による偽陽性が生じた。一方、予め陽イオン交換処理を行った実施例１（条件１）では、１４検体すべてが本来の陰性結果となった。【００４７】  この結果より、ラテックス凝集法による免疫凝集法において検体に予め陽イオン交換処理を施すことにより、非特異的反応が充分に抑制できることがわかった。
【実施例２】
【００４８】  １．抗インフルエンザＡ型抗体感作ラテックス試薬の調製
抗インフルエンザＡ型マウスモノクローナル抗体および５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて抗体液（抗体濃度０．８ｍｇ／ｍＬ）を調製した。前記実施例１の抗溶血性連鎖球菌抗体感作ラテックス試薬と同様にして、前記抗体液を用いて抗インフルエンザＡ型抗体感作ラテックス試薬を調製した。【００４９】  ２．ラテックス凝集法によるインフルエンザＡ型抗原の測定
抗原は、精製インフルエンザＡ型ウイルスＡ／Ｋｉｅｖ／３０１／９４（Ｈ３Ｎ２）を用いた。実施例１で使用した検体希釈液を用いて前記抗原を希釈し、２種類の抗原濃度の抗原液（４μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬ）を調製した。ついで、測定の直前に、下記の組成の検体抽出液で前記各濃度の抗原液を１０倍希釈し、それを検体液として以下の測定に用いた。なお、抗原の濃度が０ｎｇ／ｍＬの検体液は、前記検体希釈液を前記検体抽出液で１０倍希釈することにより調製した。【００５０】  （検体抽出液）
０．４ｍｇ／ｍＬ  セミアルカリプロテアーゼ
１重量％          ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ
０．５重量％      ＢＳＡ
０．９重量％      ＮａＣｌ
０．１重量％      ＥＤＴＡ・２Ｎａ
５０ｍＭ          Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）【００５１】  前記抗体感作ラテックス試薬５６μＬ、前記検体液２８μＬおよび反応用緩衝液５６μＬをキュベット内で混合し、前記実施例１と同様にして、測定波長６６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。その結果を下記表３に示す。なお、前記反応用緩衝液は、下記組成のものを使用した。【００５２】  （反応用緩衝液）
２．１重量％  ポリエチレングリコール２００００（ナカライ社製）
１重量％      ＢＳＡ
０．９重量％  ＮａＣｌ
０．１重量％  ＥＤＴＡ・２Ｎａ
０．１重量％  ＮａＮ３
２００ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）【００５３】
【表３】
2007013401.tif 000004
【００５４】  前記表３に示すように、インフルエンザＡ型ウイルス濃度に応じて、吸光度変化量が増加していることから、ラテックス凝集法により定量的にインフルエンザＡ型ウイルス量を測定できることが確認できた。【００５５】  ３．インフルエンザＡ型ウイルス陰性検体の測定
症状から判断して明らかにインフルエンザＡ型ウイルスに感染していない人から鼻腔吸引液を採取した。その鼻腔吸引液がインフルエンザＡ型ウイルス陰性であることを、市販のインフルエンザウイルス検出キット（商品名：キャピリアＦｌｕＡ／Ｂ；日本ベクトン・ディキンソン社製）を用いて確認した。陰性が確認された人から採取した鼻腔吸引液を綿棒にからませ、前記検体抽出液１ｍＬに懸濁した（以下、「懸濁液」という）。前記懸濁液を使用し、下記の条件１および２でインフルエンザＡ型ウイルス量を測定した。また、比較例２として、前記検体について下記の条件３でインフルエンザＡ型ウイルス量を測定した。【００５６】  （実施例２−１：条件１）
前記懸濁液を、ＣＯＳＭＯＧＥＬ（登録商標）３０ＳＰ（商品名）（陽イオン交換担体（官能基：スルホン酸基、粒子径：１０μｍ）；ナカライテスク製）に添加して２分間放置することによって陽イオン交換処理を施した。ついで、前記「２．ラテックス凝集法による溶血性連鎖球菌抗原の測定」と同様にして、測定波長６６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。【００５７】  （実施例２−２：条件２）
前記懸濁液を、ＣＯＳＭＯＧＥＬ（登録商標）３０ＣＭ（商品名）（陽イオン交換担体（官能基：カルボキシル基、粒子径：１０μｍ）；ナカライテスク製）に添加して２分間放置することによって陽イオン交換処理を施した。ついで、前記条件１と同様にして吸光度の変化を測定した。【００５８】  （比較例２：条件３）
前記懸濁液をそのまま使用して、前記条件１と同様にして吸光度の変化を測定した。【００５９】  前記条件１〜３の測定結果を下記表４に示す。同表の実施例において、検体番号１〜４が、条件１の方法で陽イオン交換処理を施した検体の測定結果であり（実施例２−１）、検体番号５〜７が、条件２の方法で陽イオン交換処理を施した検体の測定結果である（実施例２−２）。なお、同表において、吸光度変化量が０．００５０以上を陽性（＋）とし、０．００５０未満を陰性（−）と判定した。【００６０】
【表４】
2007013401.tif 000005
【００６１】  前記表４に示すように、ラテックス凝集法によるインフルエンザＡ型ウイルスの測定において、陽イオン交換処理を行わない比較例２（条件３）では、インフルエンザＡ型ウイルスが陰性である検体を使用したにも関わらず、７検体中すべての検体で非特異的な凝集反応による偽陽性が生じた。一方、陽イオン交換処理を行った実施例２（条件１および２）では、すべての検体が本来の陰性結果となった。【００６２】  この結果より、ラテックス凝集法による免疫凝集法において、検体に陽イオン交換処理を施すことにより、非特異的反応が充分に抑制できることがわかった。【００６３】  なお、以上の実施例１および２では、予め陰性を確認した検体を用いて本発明の測定方法を行った例を示したが、本発明の測定方法によれば、陽性の検体では、陽性反応が検出されることがわかっている。
【産業上の利用可能性】
【００６４】  以上説明したように、本発明の免疫測定方法および測定用キットによれば、非特異的な反応を防止できるため、偽陽性が発生することなく、検出および定量精度の高い免疫測定方法を実現できる。したがって、本発明の免疫測定方法は、例えば、医学および生物学等の広い分野に適用でき、中でも、臨床検査の分野に特に有用である。
【国際調査報告】
2007013401.tif 000006
2007013401.tif 000007