【手続補正書】
【提出日】平成19年6月5日(2007.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】  下記に示す、ローヤルゼリー中の蛋白質からなるアポトーシス抑制剤。
１）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が５７キロダルトンである。
２）配列番号１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】肝炎が劇症肝炎であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝炎などに起因するアポトーシスを抑制するアポトーシス抑制剤及びそれを含有する医薬や食品などの肝炎用の組成物に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
一方、ローヤルゼリー中に、１）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が５７キロダルトンであり、２）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含むという性質を有するタンパク質が存在することは、本発明者らにより見いだされたことであるが、かかるタンパク質の性質については全く知られていないのが現状であった。従って、この様なタンパク質に、細胞のアポトーシスを抑制し、臓器の構成細胞の一斉死を防ぐ作用があることは全く知られていなかった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【課題の解決手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、ウィルス感染などによって誘導されるアポトーシスを抑制する手段を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、ローヤルゼリー中に存在する、「１）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が５７キロダルトンであり、２）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。」と言う性質を有するタンパク質にその様な作用があることを見いだし、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示す技術に関するものである。
（１）下記に示す、ローヤルゼリー中のタンパク質からなるアポトーシス抑制剤。１）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が５７キロダルトンである。２）配列番号１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。
（２）アポトーシスの抑制が、肝細胞のアポトーシスであることを特徴とする、（１）に記載のアポトーシス抑制剤。
（３）肝細胞のアポトーシスが、肝細胞の肝炎ウィルス感染によるものである、（１）又は（２）に記載のアポトーシス抑制剤。
（４）（１）〜（３）何れか１項に記載のアポトーシス抑制剤を含有する、肝炎用の組成物。
（５）肝炎が劇症肝炎であることを特徴とする、（４）に記載の組成物。
（６）医薬又は食品であることを特徴とする、（４）又は（５）に記載の組成物。
以下、本発明について、実施の形態を中心に更に詳細に説明を加える。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
（１）本発明のアポトーシス抑制剤であるタンパク質
本発明のアポトーシス抑制剤であるタンパク質は、ローヤルゼリー中に存在し、以下の性質を有することを特徴とする。尚、このタンパク質について、以後、単に５７キロダルトンのタンパク質と表現することがある。
１）ゲル電気泳動において単一バンドを形成する。
２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が５７キロダルトンである。
３）配列番号１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。この様な本発明のアポトーシス抑制剤であるタンパク質は、次に示す手段によってその存在或いは含有量を確認したり、分離精製したりすることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
１．本発明のアポトーシス抑制剤であるタンパク質の分離
凍結乾燥したローヤルゼリーを０．７重量％で１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ＵＦ１０万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ１００；限外濾過）で６倍濃縮、７回脱塩を行い、その濾液をさらにＵＦ３万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ３０；限外濾過）で８倍濃縮、１回脱塩を行い、分子量１０万〜３万の分画を得た。上記の分子量１０万〜３万のサン
プルを、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画することで、分子量５７キロダルトンタンパク質を分離できる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、通常に知られている方法に従って行えば良く、例えば東ソー株式会社製ＤＥＡＥーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍをカラムとして用いて、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液Ａ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）と１ＭＮａＣｌを展開液Ｂとしてグラジェントにより、流速を５ｍｌ／ｍｉｎ、２８０ｎｍの吸光度で検出し、２．５ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮｏ．１１９〜１２７に分子量５７キロダルトンのタンパク質画分を検出することができる。さらにこの画分をゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製することができ、これは通常に知られている方法に従って行えば良く、この様な好ましい例としては、例えば、ファルマシア株式会社製ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００をカラムとして用いて、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０を展開液とし、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出し、２．０ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮｏ．３５〜４３に分子量５７キロダルトンのタンパク質を検出することが出来る（電気泳動にて同一タンパク質を確認）。また、既知分子量のゲル濾過分析の結果より、上記タンパク質は、分子量５７キロダルトンモノマータンパク質であると確定された。又、このタンパク質は、Ｎ−グルコシダーゼＦによって消化され、消化後の分子量が４８キロダルトンになるため糖タンパク質であることを本発明者は見出している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
２．高速液体クロマトグラフィーによるローヤルゼリー中の分子量５７キロダルトンタンパク質の分析
上記の分子量５７キロダルトンタンパク質は、高速液体クロマトグラフィーによるゲル濾過でも識別・定量することが出来る。従って、この様な分析結果をもって、品質管理や効果の鑑別・評価に使用することもできる。かかるゲル濾過分析は、通常に知られている方法に従って行えば良く、この様な好ましい例としては、例えば、ト−ソー株式会社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷをカラムとして用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液とし、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出した結果、このタンパク質を求めることが挙げられる。この分析条件下では、上記分子量５７キロダルトンタンパク質は、保持時間２５分〜３０分にピークとして現れる（電気泳動にて同一タンパク質を確認）。また、既知分子量のゲル濾過分析の結果より、５７キロダルトンと確定された。従って、本発明の細胞増殖促進剤である、この５７キロダルトンのタンパク質について定性或いは定量分析を行う場合には、この様な高速液体クロマトグラフィーを用いれば良い。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
３．電気泳動によるローヤルゼリー中の分子量５７キロダルトンのタンパク質の定性方法
本発明のローヤルゼリー中の分子量５７キロダルトンのタンパク質の定性方法としては、電気泳動によりタンパク質の構成を分析し、有効成分であるタンパク質の分子量を特定することを特徴とする。電気泳動の方法としては、該有効タンパク質が特定できれば特段の限定は受けないが、好ましい方法は、水溶性ローヤルゼリータンパク質（１０％ローヤ
ルゼリー水溶液（Ｗ／Ｖ））をポリアクリルアミドゲル（１０％均一）にて、電流２０ｍＡで電気泳動し、クマシーブリリアントブルーにより染色して、タンパク質を特定する方法である。この様な電気泳動に於ける本発明のタンパク質の分子量は、その精製タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、５７キロダルトンと決定された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明のアポトーシス抑制剤である５７キロダルトンのタンパク質は、上記のような性質を有し、ローヤルゼリーそれも新鮮なローヤルゼリー中に含まれているが、このものを後記に示す組成物に含有させる場合には、ローヤルゼリー中より、上記のゲル濾過の手法に従って分離し、純粋なタンパク質として含有させることもできるし、ローヤルゼリーの形態で含有させることもできる。通常は単離コストが高いため、ローヤルゼリーそのままの形で、或いは水可溶分を限外濾過などの精製を加えた画分として含有させることが好ましく、この様な場合においては、該タンパク質の含有量がローヤルゼリー全タンパク質当たり９重量％以上であるローヤルゼリーを用いることが好ましい。これは、このような５７キロダルトンのタンパク質が分解しやすいため、この量を充分に含んだ新鮮なものを用いることが、効果の安定性の維持に好ましいからである。後記本発明の組成物に於ける、本発明のアポトーシス抑制剤の好ましい含有量は、このものが１日あたり、１〜１０００ｍｇ、更に好ましくは、１〜１００ｍｇ摂取するように設計するのが好ましい。かかる本発明のアポトーシス抑制剤は、肝細胞が短時間にアポトーシスを起こして死滅し、肝不全を起こすのを防ぐ作用を有する。この様なアポトーシスにより、急速に、構成細胞が死滅し臓器不全を起こすような症状であれば、肝臓のみならず臓器不全を防ぐことが出来る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（メディウムＩＩ）
Ｌ−１５培地
５％新生ウシ血清
１００ｍｇ／ｌペニシリンＧ
１００ｍｇ／ｌストレプトマイシン
１×１０-6（１０のマイナス６乗）Ｍインスリン
１×１０-5（１０のマイナス５乗）Ｍデキサメタゾン
２ｇ／ｌ炭酸ナトリウム
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
（アポトーシス培地）
インスリン           １０-7（１０のマイナス７乗）Ｍ
デキサメタゾン       １０-7（１０のマイナス７乗）Ｍ
アプロチニン         ０．７μｇ／ｍｌ
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
<210>  1
<211>  25
<212>  PRT
<213>  Apis mellifera
<220>
<221>  UNSURE
<222>  (24)
<223>  Xaa=unknown
<400>  1
Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Leu Lys Lys Leu Pro Ile Leu His
1               5                   10                  15
Glu Met Lys Phe Phe Asp Tyr Xaa Asp
20                  25
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】  アガロース電気泳動の結果を示す図である（図面代用写真）。