【手続補正書】
【提出日】平成31年4月26日(2019.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のラムノリピッドを含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
（ａ）グルコース、脂肪アルコール、脂肪酸、または植物油、例えばオリーブ油、菜種油、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、キャノーラ油および大豆油などの少なくとも１つの炭素源、ＮａＮＯ３、尿素およびＮＨ４Ｃｌなどの少なくとも１つの窒素源、Ｈ３ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４などの少なくとも１つのリン源、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２ＯおよびＭｇＣｌ２などの少なくとも１つのマグネシウム源、ＫＣｌおよびＫＯＨなどの少なくとも１つのカリウム源、Ｈ２ＳＯ４などの少なくとも１つの硫黄源、ＫＣｌおよびＮａＣｌなどの少なくとも１つの塩化物源、ならびにＮａＣｌ、ＮａＮＯ３、およびＮａＯＨなどの少なくとも１つのナトリウム源、ならびに場合によりアラビアゴム、グアーゴムおよびラムノリピッドなどの乳化剤を含む培養培地で、約２から約５日間、ラムノリピッドを生産する、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）などのシュードモナス属（Pseudomonas）微生物を培養して、ラムノリピッドを含む第１の発酵培地を得ること、
（ｂ）（ａ）で得られた１つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地の少なくとも約７０％を除去すること、
（ｃ）（ｂ）で除去された１つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地を、ステップ（ａ）に記載の組成を有する培養培地で置き換えること、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回反復し、ラムノリピッドを含む次の発酵物を得ること
を含み、
少なくとも約４５ｇ／Ｌのラムノリピッドが生産される、
半連続方法。
【請求項２】
前記方法が、ステップ（ａ）の前記培養培地に、（１）１日あたり全発酵物体積の０．１％ｖ／ｖで、微量栄養素溶液において２０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で１つまたは複数の微量栄養素を含む組成物を添加すること、および／または（２）炭素ベースまたはシリコンベースの消泡剤などの消泡剤を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記乳化剤が約０．１〜２０重量％の量で存在し、前記炭素源が約６〜１２重量％の濃度で存在し、前記窒素源が約１〜４ｇ／Ｌの量で存在し、前記リン源が約１〜３ｇ／Ｌの量で存在し、前記マグネシウムイオンが約０．００１〜０．２ｇ／Ｌの量で存在し、前記カリウムイオンが約０．１から約１ｇ／Ｌの量で存在し、前記ナトリウムイオンが約１〜１０ｇ／Ｌの量で存在し、前記塩化物イオンが約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在し、前記硫黄イオンが約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微量栄養素が、ＦｅＣｌ３＊６Ｈ２ＯもしくはＦｅＳＯ４などのＦｅ塩、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２ＯおよびＭｎＣｌ２・４Ｈ２ＯなどのＭｎ塩、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２ＯもしくはＺｎＣｌ２などのＺｎ、Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７＊２Ｈ２Ｏ、ＮａＣ６Ｈ７Ｏ７およびＮａ２Ｃ６Ｈ６Ｏ７などのＮａ塩、またはＣｕＣｌ２＊２Ｈ２ＯおよびＣｕＳＯ４＊５Ｈ２ＯなどのＣｕ塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃｕ塩が微量栄養素溶液において約０．５〜３ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｍｎが微量栄養素溶液において約０．１〜１．５ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｚｎ塩が微量栄養素溶液において約０．５ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｆｅ塩が微量栄養素溶液において約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在し、および／または前記ナトリウム塩が微量栄養素溶液において約１〜５ｇ／Ｌの量で存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記微量栄養素組成物を連続的に添加する、請求項２、４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記微量栄養素組成物を毎日添加する、請求項２、４又は５に記載の方法。
【請求項８】
前記シュードモナス属（Pseudomonas）を約３０〜３７℃の温度および／または約６〜８．６のｐＨで培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）を少なくとも約３０日間反復する、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
１０  発酵槽
２０  滅菌タンク
本発明は次の実施態様を含む。
［１］１つまたは複数のラムノリピッドを含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
（ａ）グルコース、脂肪アルコール、脂肪酸、または植物油、例えばオリーブ油、菜種油、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、キャノーラ油および大豆油などの少なくとも１つの炭素源、ＮａＮＯ３、尿素およびＮＨ４Ｃｌなどの少なくとも１つの窒素源、Ｈ３ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４などの少なくとも１つのリン源、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２ＯおよびＭｇＣｌ２などの少なくとも１つのマグネシウム源、ＫＣｌおよびＫＯＨなどの少なくとも１つのカリウム源、Ｈ２ＳＯ４などの少なくとも１つの硫黄源、ＫＣｌおよびＮａＣｌなどの少なくとも１つの塩化物源、ならびにＮａＣｌ、ＮａＮＯ３、およびＮａＯＨなどの少なくとも１つのナトリウム源、ならびに場合によりアラビアゴム、グアーゴムおよびラムノリピッドなどの乳化剤を含む培養培地で、約２から約５日間、ラムノリピッド生産微生物を培養して、ラムノリピッドを含む第１の発酵培地を得ること、
（ｂ）（ａ）で得られた１つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地の少なくとも約７０％を除去すること、
（ｃ）（ｂ）で除去された１つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地を、ステップ（ａ）に記載の組成を有する培養培地で置き換えること、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回反復し、ラムノリピッドを含む次の発酵物を得ること
を含み、
前記ステップ（ａ）〜（ｃ）は、少なくとも約３０日間反復可能であり、
前記方法が、ステップ（ａ）の前記培養培地に、（１）１日あたり全発酵物体積の０．１％ｖ／ｖで、微量栄養素溶液において２０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で１つまたは複数の微量栄養素を含む組成物を添加すること、および／または（２）炭素ベースまたはシリコンベースの消泡剤などの消泡剤を場合により添加することをさらに含む、半連続方法。
［２］前記ラムノリピッド生産微生物が、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）などのシュードモナス属（Pseudomonas）微生物である、上記［１］に記載の方法。
［３］前記乳化剤が約０．１〜２０重量％の量で存在し、前記炭素源が約６〜１２重量％の濃度で存在し、前記窒素源が約１〜４ｇ／Ｌの量で存在し、前記リン源が約１〜３ｇ／Ｌの量で存在し、前記マグネシウムイオンが約０．００１〜０．２ｇ／Ｌの量で存在し、前記カリウムイオンが約０．１から約１ｇ／Ｌの量で存在し、前記ナトリウムイオンが約１〜１０ｇ／Ｌの量で存在し、前記塩化物イオンが約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在し、前記硫黄イオンが約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在する、上記［１］〜［２］に記載の方法。
［４］前記微量栄養素が、ＦｅＣｌ３＊６Ｈ２ＯもしくはＦｅＳＯ４などのＦｅ塩、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２ＯおよびＭｎＣｌ２・４Ｈ２ＯなどのＭｎ塩、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２ＯもしくはＺｎＣｌ２などのＺｎ、Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７＊２Ｈ２Ｏ、ＮａＣ６Ｈ７Ｏ７およびＮａ２Ｃ６Ｈ６Ｏ７などのＮａ塩、またはＣｕＣｌ２＊２Ｈ２ＯおよびＣｕＳＯ４＊５Ｈ２ＯなどのＣｕ塩である、上記［１］〜［３］に記載の方法。
［５］前記Ｃｕ塩が微量栄養素溶液において約０．５〜３ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｍｎが微量栄養素溶液において約０．１〜１．５ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｚｎ塩が微量栄養素溶液において約０．５ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｆｅ塩が微量栄養素溶液において約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在し、および／または前記ナトリウム塩が微量栄養素溶液において約１〜５ｇ／Ｌの量で存在する、上記［４］に記載の方法。
［６］前記微量栄養素組成物を連続的に添加する、上記［１］〜［５］に記載の方法。
［７］前記微量栄養素組成物を毎日添加する、上記［１］〜［６］に記載の方法。
［８］前記シュードモナス属（Pseudomonas）を約３０〜３７℃の温度および／または約６〜８．６のｐＨで培養する、上記［１］〜［７］に記載の方法。
［９］ステップ（ｄ）を少なくとも約３０日間反復する、上記［１］〜［８］に記載の方法。