【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年7月30日(2008.7.30)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  瘢痕の形成を減少するためのベータグリカンの使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】  瘢痕の減少をともなって創傷の治癒を促進するための医薬の製造における、ＴＧＦβ２を阻害するのに十分な薬理学的有効量での、可溶性ベータグリカンの使用であって、可溶性ベータグリカンが、創傷におけるＴＧＦβ３の濃度を増加するのに十分な量で提供される使用。
【請求項２】  可溶性ベータグリカンが、組換え可溶性ベータグリカンである請求項１に記載の使用。
【請求項３】  医薬が、創傷のセンチメートル当たり１μｇ〜１０μｇの可溶性ベータグリカンを提供する量で投与するための医薬である請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】  医薬が、０．０１〜１μＭの濃度で可溶性ベータグリカンを含む請求項１〜３のいずれかひとつに記載の使用。
【請求項５】  医薬が、０．１μＭの濃度で可溶性ベータグリカンを含む請求項４に記載の使用。
【請求項６】  可溶性ベータグリカンが、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３よりもＴＧＦβ２に対する結合親和性が大きい請求項１〜５のいずれかひとつに記載の使用。
【請求項７】  可溶性ベータグリカンが、それぞれ２：７：２の比率でＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】  可溶性ベータグリカンが、細胞表面レセプターに結合するＴＧＦβ２の量を減少させる、請求項１〜７のいずれかひとつに記載の使用。
【請求項９】  可溶性ベータグリカンが、ＴＧＦβ２による細胞表面レセプターの活性化を減少させる、請求項１〜８のいずれかひとつに記載の使用。
【請求項１０】  可溶性ベータグリカンが、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに用いられる、請求項１〜９のいずれかひとつに記載の使用。
【請求項１１】  可溶性ベータグリカンが、請求項１に記載の医薬以外の、瘢痕の減少をともなって創傷の治癒を促進するためのさらなる組成物とともに用いられる、上記請求項１〜１０のいずれかひとつに記載の使用。
【請求項１２】  可溶性ベータグリカンが、慢性の創傷の治癒を促進するための組成物とともに用いられる、上記請求項１〜１１のいずれかひとつに記載の使用。
【請求項１３】  上記請求項１〜１２のいずれかに記載の可溶性ベータグリカンを含む、瘢痕の減少をともなって創傷の治癒を促進するための医薬組成物。
【請求項１４】  創傷部位へアリコートで投与するための請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】  創傷生成の直前または直後のいずれかに投与するための請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】  創傷生成後の１２０時間以内に投与するための請求項１３〜１５のいずれかひとつに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、創傷または線維性疾患の治癒、特に瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するための医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
“創傷または線維性疾患”とは、結果的に瘢痕組織が形成されうる状態のいずれをも意味する。特に、皮膚創傷の治癒、腱損傷の回復、挫傷の治癒、角膜創傷などの眼創傷の治癒、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷の治癒、中枢神経系に瘢痕組織が形成される状態、打撃による瘢痕組織の形成、および損傷または外科手術の結果として起こる組織の癒着（これには、腱治癒および腹部狭窄および癒着などを含めてもよい）が包含される。線維性疾患の例としては、肺線維症、糸球体腎炎、肝硬変および増殖性硝子体網膜症が挙げられる。
【０００３】
“瘢痕の形成の減少”とは、非処置の創傷または線維性疾患と比較した場合の瘢痕の減少のレベルを意味する。
【０００４】
特に、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するための組成物が欠如している。瘢痕組織の形成は、治癒した創傷に機械的強度を与えるものではあるが、醜いものとなりえるものであり、かつ組織の機能を損なう可能性もある。
【０００５】
このことは、特にＣＮＳにおける瘢痕組織が形成される創傷が該当し、該瘢痕組織は損傷を受けるかまたは再成長した神経末端を阻害し、その機能に非常に重大な影響を及ぼす。
【０００６】
また、たとえば、静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍および床ずれ（褥瘡性潰瘍）（特に高齢かつ車椅子使用患者におけるもの）といったような慢性創傷の治療および治癒を促進する組成物が欠如している。このような組成物は、創傷の治癒が遅いかまたは創傷の治癒過程がまだ開始していない患者において極めて有用である。このような組成物を用いて、創傷の治癒を“キックスタート”させ、次いで本発明組成物と組み合わせて用いることができる。したがって、慢性創傷が治癒されるのみならず、瘢痕の形成も減少して治癒されうることになる。
【０００７】
別称ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）レセプターＩＩＩ（Ｒ ＩＩＩ）として知られているベータグリカン（ＢＧ）は、１００ｋＤａのコアタンパク質ならびにそれに結合するヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸側鎖を特徴とする広範囲に分散している膜プロテオグリカンである（Lopez-Casillasら、1991、Cell,67:785-795を参照）。ＴＧＦ−βは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖を必要とせずにＢＧコアタンパク質と相互作用して結合するが、一方、ＦＧＦ−２は、ヘパラン硫酸側鎖を介してＢＧに結合する（Cheifetz,Sら、1988、J.Biol.Chem.,263:16984-16991）。
【０００８】
ＢＧコアタンパク質は、
ｉ）細胞外ドメイン；
ii）膜貫通ドメイン；および
iii）認識可能なシグナリング構造をもたない細胞内ドメイン
からなる。
【０００９】
細胞は、膜貫通ドメインの近傍にある切断サイトを介して細胞外ドメインを放出することができるが、このことは、血清中に発見された可溶性ＢＧ（solＢＧ）においてインビボで起きているとみなされている（Andres,J.L.ら、1989,J.Biol.Chem.,109:3137-3145）。
【００１０】
ＴＧＦ−βは、種々の膜タンパク質に結合するが（Massague,J.ら、1994、Trends in Cell Biol.,4:172-178を参照）、そのうちの２つ、ＴＧＦ−βレセプターＩとＩＩ（ＲＩおよびＲＩＩ）は、シグナリングレセプター複合体を形成する。ＲＩは、ＲＩＩの存在を必要としてリガンドに結合し、ＲＩＩはＲＩの存在を必要としてシグナリングする（リガンド結合ではない）ようである（Wrana,I.J.ら、1992、Cell,71:1003-1014を参照）。ＲＩとＲＩＩは、ＴＧＦβ２よりもＴＧＦβ１とＴＧＦβ３を、より大きい親和性をもって結合するので、ＴＧＦβレセプターのイソ体の特異性は、３つの異なるレセプタータイプによって付与されており、この差異は、ＢＧの欠けた細胞において最も顕著である。ＢＧの発現は、ＲＩＩに対する結合がすべてのＴＧＦβ群において上昇することに相関しており、この相関関係は、ＢＧがない条件下でＲＩおよびＲＩＩに対する親和性の低いイソ体であるＴＧＦβ２の場合に特に明白である（Lopez-Casillas,F.ら、1993、Cell,73:1435-1444を参照）。膜に係留されたＢＧの重要な機能は、ＲＩＩにＴＧＦ−βを提示して、三重複合体を形成し、ＴＧＦβに対するレセプター結合親和性および細胞応答性を増強することである。
【００１１】
逆に、可溶性形態のＢＧは、膜係留ＢＧとは全くことなる役割をもっている。可溶性ＢＧは、ＴＧＦ−βに結合し、ＴＧＦ−β分子が、細胞表面レセプターに結合するのを阻害することによって、ＴＧＦ−βアンタゴニストとして作用する（Lopez-Casillas,F.ら、1994、J.Cell Biol.,124:557-568を参照）。
【００１２】
したがって、その異なる形態のＢＧは、ＴＧＦ−βがシグナリングレセプターへ接近する際に二元モジュレーターとして作用する。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
創傷の治癒における線維性および非線維性成長因子の影響に関するこれまでの研究（Shah,M.ら、1994、J.Cell Sci.,107:1137-1157；Shah,M.ら、1995、J.Cell Sci.,108:985-1002；WO92/17206およびその参考文献）は、瘢痕の形成の減少をともなって効果的に治癒を促進するためには、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の両方が同程度に阻害されなければならないことを示しており、実験から、ＴＧＦβ２単独を阻害しても瘢痕の形成における有意な改善はみられないことが示されている。ところが本発明者らは、驚くべきことに、可溶性ＢＧを部位（“部位”とは、創傷または線維性疾患の部位を意味する）、特に創傷部位に適用すると、瘢痕の減少をともなう治癒効果があることを見いだした。
【００１４】
ＴＧＦ−β１に対して特異的な中和作用の組成物と組み合わせてのＢＧの使用よりもむしろＴ、ＧＦβ２に対して主として特異的である可溶性ＢＧ単独の使用によってこのような効能に到達しえたという結果は、特に驚くべきことであり、このような使用は従来の技術において明らかに必要とされているものである。実験例（後記）もまた、驚くべきことに、特定の濃度のsolＢＧにおいて、創傷中のＴＧＦβ３の濃度が増加することを示している。solＢＧの濃度がそれよりも低いと、ＴＧＦβ３の濃度関してに効果がなく、逆にその濃度が高すぎると、ＴＧＦβ３の濃度に関して逆効果を与える。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２とは異なって、ＴＧＦβ３は、瘢痕の減少をともなって創傷および線維性疾患の治癒を促進するので、このことは特に重要であり、これによってsolＢＧの抗瘢痕効果を説明することができる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明にしたがって、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するのに使用する可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもしくは一部修飾体が提供される。
【００１６】
可溶性ベータグリカンは、たとえば組換え可溶性ベータグリカンである。
【００１７】
“フラグメント”または“一部修飾体”とは、ＴＧＦβ２に結合する能力をもち、先に述べたsolＢＧの役割を果す分子を意味する。一部修飾としては、アミノ酸残基の置換、欠失または付加などによるものが挙げられる。たとえば、置換は、保存された置換である。したがって、solＢＧの一部修飾体は、solＢＧの相同体である。たとえば、solＢＧと少なくとも４０％の相同性をもつことができる。たとえば、solＢＧと少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％の相同性をもつことができる。
【００１８】
たとえば、solＢＧは、少なくともsolＢＧのＴＧＦ−β結合フラグメントを含む。
【００１９】
solＢＧは、創傷または線維性疾患の早められた治癒を促進することができる。“早められた治癒”とは、非処置のコントロール創傷の治癒よりも早くに創傷が治癒することを意味する。
【００２０】
solＢＧの濃度は約０．０１〜１μＭ、たとえば約０．１μＭである。実験例（後記）から、創傷の治癒の促進におけるsolＢＧの効能が用量依存性であることが示される。実験例（後記）は、ラットのみに関するものであり、ラットおよび他の動物における瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するためのsolＢＧの最適濃度は、実験によって容易に決定することができる。
【００２１】
solＢＧは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対するよりも、ＴＧＦβ２に対して、より大きい結合親和を有している。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に対して、それぞれ２：７：２の比率で結合することができる。
【００２２】
solＢＧは、細胞表面レセプターに結合するＴＧＦβ２の量を減少させることができる。
【００２３】
solＢＧは、細胞表面レセプターのＴＧＦβ２による活性化を減少させることができる。
【００２４】
solＢＧは、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに用いることができる。
【００２５】
solＢＧは、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するための組成物とともに用いることができる。
【００２６】
solＢＧは、慢性の創傷の治癒を促進するための組成物とともに用いることができる。
【００２７】
また本発明にしたがって、solＢＧまたはそのフラグメントもしくは一部修飾体の使用を特徴とする、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進する方法が提供される。
【００２８】
solＢＧは、創傷または線維症の部位に投与することができる。
【００２９】
solＢＧは、約１００μｌのアリコートにて投与することができる。
【００３０】
solＢＧは、創傷形成または発症の直前または直後のいずれかに投与することができる。“発症”とは、線維性疾患の発症を意味する。solＢＧは、創傷形成または発症の約１２０時間以内、たとえば創傷形成または発症後約４８時間または２４時間に投与することができる。
【００３１】
solＢＧは、少なくとも２回投与することができる。たとえば、３回投与することもできる。たとえば、創傷形成または発症の直前、もしくは創傷形成または発症後約２４時間および約４８時間に投与することができる。
【００３２】
本発明を次の記載によりさらに詳しく説明するが、これは例示のみにすぎず、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するために用いるsolＢＧおよびそれを用いる促進方法の一形態にすぎない。
【００３３】
【実施例】
実験動物を用いて、実験動物に創傷を形成し、それを種々の濃度のsolＢＧで治療し、創傷を分析することにより、創傷治癒における可溶性ＢＧ（solＢＧ）の効果をテストした（“材料および方法”を参照）。結果から、特に約０．０１〜１μＭの濃度、より特定には約０．１μＭの濃度において、可溶性ＢＧが抗瘢痕形成剤として効果が高いことが示される。創傷形成後（post-wounding:ｐｗ）７、４０および８０日の時点で創傷を分析すると、コントロール創傷と比較した場合、瘢痕形成が有意に改善されていること（すなわち瘢痕形成の減少）および創傷の治癒が増強されていること（すなわち促進されていること）の両方が明らかである。
【００３４】
材料および方法：
F.Lopez-Casillasによって作製された組換えsolＢＧ（Lopez-Casillasら、1991、Cell,67:785-795；Lopez-Casillas,F.ら、1993、Cell,73:1435-1444；およびLopez-Casillas,F.ら、1994、J.Cell Biol.,124:557-568を参照）をＭＥＭ（最少必須培地）（無血清）に溶解した。solＢＧ２５０ngは、ＴＧＦ−βに対する中和抗体（ＮＡＢ）５０μgに等価である。適当なsolＢＧの用量は、公知のＴＧＦ−βに対するＮＡＢの有効濃度から算出した（Shah,M.ら、1994、J.Cell Sci.,107:1137-1157；Shah,M.ら、1995、J.Cell Sci.,108:985-1002；およびLopez-Casillas,F.ら、1994、J.Cell Biol.,124:557-568を参照）。成体の雄性スプラーグドーリーラット（２００〜２５０ｇ）にハロタン、酸化窒素および酸素吸入によって麻酔を施した。４カ所の切開（長さ１ｃｍで皮筋層の深さのもの）を、背面の皮膚上に、正中線から等距離で四肢に隣接した部分で行った。創傷は、次の過程で治癒するための、最大の瘢痕を創成させるために縫合せずにおいた。各動物のひとつのコントロール創傷は、非処置のものであり、ビヒクルコントロールとして、ひとつの創傷に、ＭＥＭ単独を注入により浸透させた。残りの２つの創傷には、solＢＧを０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭおよび２μＭの濃度で、創傷形成の直前、創傷形成後１日目および２日目に注入した。solＢＧは、１００μｌのＭＥＭとともに皮内注入により、各創傷の縁の長さに沿って適用した。実験動物４匹／用量／時点において、それぞれ０．００１μＭおよび２μＭをテストし、実験動物２匹／用量／時点において、それぞれ０．００１μＭ、０．１μＭおよび１μＭを試験した（総ｎ＝４８）。創傷形成後それぞれ３、５、７および８０日間動物を飼育した。クロロホルムの過剰投与により、実験動物を屠殺し、周囲の組織から創傷を切除して取り出した。各創傷を２等分し、創傷の半分は、凍結薄切および免疫細胞化学用にＯＣＴ内で急速に凍結し、半分は、ワックス包埋および組織学用にホルムアルデヒド中で固定した。
【００３５】
結果：
組織学
創傷形成から５日後、低用量のsolＢＧ（０．００１〜０．１μＭ）で処置された創傷およびコントロールまたはビヒクルコントロール創傷の間には組織学的差異は少ししかなかった。しかし、１および２μＭのsolＢＧで処置した創傷は、コントロールよりも創傷が狭くなっていたが、炎症細胞浸潤の程度が高く、創傷の底部において新規血管がより多く見られた。創傷後７日に採取した創傷においても同様の知見が得られた。
【００３６】
瘢痕形成の程度を創傷後８０日において審査した。０．００１μＭまたは０．０１μＭの処置では、コントロールと比較した場合、明らかな改善は見られなかった。創傷内のコラーゲン線維は薄く、密度が濃く、方向性が強く、通常表皮と平行であり、典型的な瘢痕を形成していた。しかし、創傷に適用したsolＢＧの用量が０．１μＭの場合、瘢痕の形成は有意に改善された。処置された創傷内のコラーゲン線維は、非常に厚く、より間隔があいており、その方向性がコントロールの瘢痕よりも、よりランダムであり、正常な真皮に見られるコラーゲン線維の“篭の網目”状の方向性に、より類似していた。１μＭのsolＢＧの用量では、瘢痕の形成において明確な改善が得られず（処置された創傷の幾らかは改善されたが）、２μＭの用量では、改善が得られないかまたはコントロール創傷に見られる瘢痕と同程度の悪さの瘢痕が形成されるかのいずれかであった。
【００３７】
免疫細胞化学
創傷形成後３日目に採取した創傷を審査した。創傷形成後３日目の時点での創傷のフィブロネクチン含量においては、コントロール創傷および種々の濃度のsolＢＧで処置した創傷の間には確たる差異はなかった。処置創傷およびコントロール創傷において、単球／マクロファージにおいて顕在しているＴＧＦβ１に対する染色を行ったが、濃度１または２μＭのsolＢＧを適用したもの以外は、このサイトカインの量は類似していた。これらの創傷中のＴＧＦβ１濃度は、コントロールとくらべて増加されいるようであった。興味深いことには、これまた単球／マクロファージに顕在しているＴＧＦβ３に対する染色は、異なるパターンを示した。０．００１μＭのsolＢＧでは、ＴＧＦβ３の濃度において明らかな効果は見られなかったが、瘢痕の形成において最高の効果が得られた、０．０１μＭ、特に０．１μＭという用量では、創傷内のＴＧＦβ３染色が増加した。逆に、１μＭおよび２μＭのsolＢＧ用量では、創傷内のＴＧＦβ３の濃度は、コントロールよりも低かった。創傷内のＴＧＦβレセプターの濃度に関する初期の研究では、１および２μＭのsolＢＧで処置した創傷において、創傷縁および隣接真皮におけるＩ型レセプターの発現量の増加を示している。