(57)【要約】  真核生物、特に哺乳動物細胞を用いる組み換えＤＮＡ法において産生するタンパク質を増加させることを目的とする。この目的は、ヌクレオチド配列：                      ｘ1ｃｃｃｘ5ｘ6ｘ7（式中、ｘ１は、c、ｔ、またはａを表し、ｘ5は、ｇ、c、a、またはtを表し、ｘ6は、ｃ、t、ａ、またはgを表し、ｘ7は、ｃ、a、g、またはtを表す。）またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む軽度低温転写制御エレメント、または軽度低温転写制御エレメントを連結してなる軽度低温転写制御エンハンサーを用いることによって達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列：
ｘ１ｃｃｃｘ５ｘ６ｘ７
（式中、ｘ１は、ｃ、ｔ、またはａを表し、ｘ５は、ｇ、ｃ、ａ、またはｔを表し、ｘ６は、ｃ、ｔ、ａ、またはｇを表し、ｘ７は、ｃ、ａ、ｇ、またはｔを表す。）、
またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列よりなる軽度低温転写制御エレメント。
【請求項２】
ヌクレオチド配列がccccgcc、ccccgca、ccccgcg、ccccgct、ccccgtc、ccccgta、ccccgtg、ccccgtt、ccccgac、ccccgaa、ccccgag、ccccgat、ccccggc、ccccgga、ccccggg、ccccggt、ccccccc、cccccca、ccccccg、cccccct、ccccctc、cccccta、ccccctg、ccccctt、cccccac、cccccaa、cccccag、cccccat、cccccgc、cccccga、cccccgg、cccccgt、ccccacc、ccccaca、ccccacg、ccccact、ccccatc、ccccata、ccccatg、ccccatt、ccccaac、ccccaaa、ccccaag、ccccaat、ccccagc、ccccaga、ccccagg、ccccagt、cccctac、cccctcc、tcccgcc、tcccgca、tcccgcg、tcccgct、tcccgtc、tcccgta、tcccgtg、tcccgtt、tcccgac、tcccgaa、tcccgag、tcccgat、tcccggc、tcccgga、tcccggg、tcccccc、tccccca、tcccccg、tccccct、tcccctc、tccccta、tcccctg、tcccctt、tccccac、tccccaa、tccccag、tccccat、tccccgc、tcccacc、tcccaca、tcccacg、tcccact、tcccatc、tcccata、tcccatg、tcccatt、tcccaac、tcccaaa、tcccaag、tcccaat、tcccagc、tcccaga、tccctcc、acccgcc、acccgca、acccgcg、acccgct、acccgtc、acccgta、acccgtg、acccgtt、acccgac、acccgaa、acccgag、acccgat、acccggc、acccgga、acccggg、acccggt、acccccc、accccca、acccccg、accccct、acccctc、accccta、acccctg、acccctt、accccac、accccaa、accccga、acccacc、acccaca、acccacg、acccact、acccatc、acccata、acccatg、acccatt、acccaac、acccaaa、acccaag、acccaat、gcccccc、ggcgggg、agcgggg、gacgggg、ttcgggg、ggggggg、ggcggga、tgcggga、gacggga、tggggga、およびggcgggtよりなる群から選択される、請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメント。
【請求項３】
同一または異なる、請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメントが連結されている軽度低温転写制御エンハンサー（但し、軽度低温転写制御エレメントとして、ｔの３’側に続くヌクレオチド配列：ccccgcc、ccccgtc、ccccgct、またはccccgaa；ｇの３’側に続くヌクレオチド配列：ccccgcc；ａの３’側に続くヌクレオチド配列ccccgcc、３’末端のａに先行するggcgggg、またはgggggggのみを含むものを除く）。
【請求項４】
同一または異なる、請求項１に記載の軽度低温転写制御エレメントが他のヌクレオチド残基を介して結合されている軽度低温転写制御エンハンサー（但し、軽度低温転写制御エレメントとして、ｔの３’側に続くヌクレオチド配列：ccccgcc、ccccgtc、ccccgct、またはccccgaa；ｇの３’側に続くヌクレオチド配列：ccccgcc；ａの３’側に続くヌクレオチド配列ccccgcc、３’末端のａに先行するggcgggg、またはgggggggのみを含むものを除く）。
【請求項５】
ヌクレオチド配列：
ttccccgccg  caggacaaac  gggtcgggaa  cgcggaagtg  ggtcagctcc  gcctccaaat  cagctgtccc  cgcctcctag  tcgctag
（配列番号３）
を有する請求項４に記載の軽度低温転写制御エンハンサー。
【請求項６】
請求項１または２のいずれかに記載の軽度低温転写制御エレメント、または請求項３〜５のいずれかに記載の軽度低温転写制御エンハンサーを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターで形質転換された真核生物細胞。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターで形質転換された真核生物。
【請求項９】
軽度低温転写制御因子およびその制御物質のアッセイ方法であって、請求項１または２に記載の軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖ＤＮＡプローブとアッセイ対象のタンパク質溶液とを接触させ、特異的に軽度低温転写制御エレメントに結合した軽度低温転写制御因子の量を、結合している二本鎖ＤＮＡプローブを検出することによって測定することを含む方法。
【請求項１０】
軽度低温転写制御因子の精製方法であって、請求項１または２に記載の軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖ＤＮＡプローブとタンパク質溶液とを接触させ、特異的に軽度低温転写制御エレメントに結合した軽度低温転写制御因子を得、その後軽度低温転写制御因子を単離することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は軽度の低温において遺伝子の転写を促進させる軽度低温転写制御エレメント（オリゴヌクレオチド）、該軽度低温転写制御エレメントを含むエンハンサーに関する。本発明は該軽度低温転写制御エレメントを利用した軽度低温転写制御因子（タンパク質）のアッセイ方法、精製方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体、成長因子、凝固因子など多くの医薬品や検査試薬がバイオテクノロジーにより産生されるようになってきた。
一般に１０−１５℃という低温においては、リコンビナントタンパク質の正しいフォールディングが促進され、そのタンパク質分解酵素による分解も抑制されることから（Baneyx, F., In vivo folding of recombinant proteins in Escherichia coli. In Manual of industrial microbiology and biotechnology, 2nd ed. （Demain, A.L., Davies, J.E., Altas, R.M., et al., eds.）, ASM Press, Washingtonm D.C., pp.551-565, 1999）、組換えタンパク質をバクテリアに産生させる場合には、３７℃ではなく２０℃以下の低温での培養が利用されている。この際、低温ではタンパク質合成が一般に低下するために、目的タンパク質の収量が悪くなる可能性がある。そこで、目的タンパク質の発現プロモーターとして低温ショックタンパク質ＣｓｐＡのプロモーターと５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を利用し、この問題を解決している。（Baneyx, F. and Mujacic, M., Cold-inducible promoters for heterologous protein expression. Methods in Molecular Biology, 205, 1-18, 2001.）【０００３】
しかし、バクテリアと哺乳動物細胞では、タンパク質の翻訳後修飾に大きな違いがあり、特に医薬品の場合にはグリコシル化の状態が治療効果に重要である。そこで、組換えタンパク質医薬品の産生には、哺乳動物細胞（特にチャイニーズハムスターの細胞株）が利用されている。この細胞培養を利用した製造のコストを減らすためには、タンパク質の収量を上げる必要がある。３７℃で通常の培養を行った場合、細胞は急激に増殖した後死滅するために、細胞が生存して目的タンパク質を生産する期間が短いという欠点がある。そこで、細胞増殖を抑制し、長期間細胞を生存させることが、細胞増殖阻害剤添加、増殖阻害遺伝子ｐ２７の発現、軽い低温（３０−３２℃）での培養、その他の方法により試みられている。（Schatz SM et al, Biotechnol Bioeng 2003 Nov 20;84（4）:433-438参照）【０００４】
なかでも軽い低温での培養では、１）培養温度が３７℃の場合よりも細胞が長い期間生存してタンパク質合成を行う。２）タンパク質分解酵素の活性が低下して目的タンパク質の分解が減少する。３）タンパク質のグリコシル化や異性体の産生は３７℃培養の時と同程度である。また、シアル酸付加はかえって３７℃でよりも良好である。４）バクテリアでの場合と同様に目的タンパク質の正しいフォールディングが起きやすい可能性があるという特徴がある（Kaufmann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72（6）:592-602；Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82（3）:289-98）。【０００５】
肝心のリコンビナントタンパク質収量に関しては、細胞の生存期間が延びるために総収量が増える場合が多い。しかし、細胞あたりの単位時間でのタンパク質産生量（specific productivity）をみた場合には、ばらつき（細胞の種類や目的タンパク質の種類によるのか、未知の要因による）があり、３７℃でのspecific productivityよりもかえって低下する例が多く問題点となっている（Kaufmann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72（6）:592-602；Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82（3）:289-98）。なお、遺伝子発現制御機構が異なるために、バクテリアの低温ショックタンパク質ＣｓｐＡのプロモーターと５’非翻訳領域 （ＵＴＲ）を哺乳動物に利用することはできない。
一方、最も単純な真核生物である分裂酵母は、そのゲノムサイズが1300万塩基対と小さいが真核細胞の基本的な機能を備えていること、30％以上の遺伝子がイントロンを持つこと、ヒトの既知相同遺伝子とのアミノ酸配列保存性が高く、ヒトの遺伝子が酵母内で正常に発現すること、機能解析が容易であること、などから、ヒトのモデルとして生物科学研究で利用されている（Molecular Biology of the Cell. 第4版、Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P著、Garland Science社、ニューヨーク、2002）。そこで、酵母を含む菌類、及びそれよりもヒトに近い真核生物、例えば植物、線形動物、昆虫、魚類、両生類、鳥類等由来の細胞は、必要に応じ適切な遺伝子を補うことにより、哺乳動物細胞と同様にタンパク質の翻訳後修飾を行わせ低温でタンパク質産生のために培養することも可能であると考えられる。さらに遺伝子工学的技術を利用すれば、これら遺伝子改変を行った真核生物細胞を含む真核生物個体を得て、タンパク質産生を行わせることも可能であると考えられる。
【非特許文献１】Kaufmann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotechnol. Bioeng. 2001 Mar 20;72（6）:592-602
【非特許文献２】Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol. Bioeng. 2003 May 5;82（3）:289-98
【非特許文献３】Fujita J., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999 Nov;1（2）:243-55
【非特許文献４】Molecular Biology of the Cell. 第4版、Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P著、Garland Science社、ニューヨーク、2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は低温において細胞あたりの単位時間でのタンパク質産生量を高め、総収量を上げる方法を提供することを目的とする。
本発明は軽度低温転写制御因子（タンパク質）の同定方法および精製方法を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、出願中の国際特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３３８５）に開示したように、軽い低温温度下において転写を促進させるエンハンサーとして作用する遺伝子発現制御配列（以下、「軽度低温転写制御エレメント」という）を発見した。その配列の例は、ヌクレオチド配列：
ｔｃｃｃｃｇｃｃ
またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列である。【０００８】
本発明者は軽度低温転写制御エレメントについてさらに研究をすすめた結果、
ヌクレオチド配列：
ｘ1ｃｃｃｘ5ｘ6ｘ7
（式中、ｘ１は、c、ｔ、またはａを表し、ｘ5は、ｇ、c、a、またはtを表し、ｘ6は、ｃ、t、ａ、またはgを表し、ｘ7は、ｃ、a、g、またはtを表す。）
が軽度低温において特異的に遺伝子の転写を促進させることを見出した。【０００９】
即ち本発明は、ヌクレオチド配列：
ｘ1ｃｃｃｘ5ｘ6ｘ7
（式中、ｘ１は、c、ｔ、またはａを表し、ｘ5は、ｇ、c、a、またはtを表し、ｘ6は、ｃ、t、ａ、またはgを表し、ｘ7は、ｃ、a、g、またはtを表す。）
またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列よりなる軽度低温転写制御エレメントに関する。【００１０】
本明細書において「軽度低温転写制御エレメント」とは、軽度低温において特異的に遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列の単位をいう。
本明細書において、「軽度低温」とは１５〜３６℃、好ましくは３０〜３４℃、特に好ましくは３２℃の温度をいう。本発明の軽度低温転写制御エレメントは遺伝子の転写に軽度低温特異的なエンハンサーとして作用する。【００１１】
本発明の軽度低温転写制御エレメントは単独で用いてもその機能を発揮し得るが、同一または異なる該配列を２〜３５０個、好ましくは２〜１００個結合して用いるのが好ましい。結合させて用いる場合、同一または異なる該ヌクレオチド配列を相互に直接連結してもよいが、該配列間に任意の種類および数のヌクレオチド残基を介在させて結合させてもよい。軽度低温転写制御エレメントを結合させたものを本明細書では「軽度低温転写制御エンハンサー」または単に「エンハンサー」と呼ぶ。但し、本発明の軽度低温転写制御エンハンサーは、軽度低温転写制御エレメントとして、ｔの３’側に続くヌクレオチド配列：ccccgcc、ccccgtc、ccccgct、またはccccgaa；ｇの３’側に続くヌクレオチド配列：ccccgcc；ａの３’側に続くヌクレオチド配列ccccgcc、３’末端のａに先行するggcgggg、またはgggggggのみを含むものを除かれる。本発明の軽度低温転写制御エレメントおよび軽度低温転写制御エンハンサーはプロモーターからの距離、方向には無関係である。
また本発明において「軽度低温転写制御因子（タンパク質）」とは、軽度の低温により活性化されて軽度低温転写制御エレメントに結合し、エレメントの近傍にある遺伝子の転写を制御、多くの場合は促進、するタンパク質である。【００１２】
本発明は、上に記載の軽度低温転写制御エレメントまたは軽度低温転写制御エンハンサーを含むベクターにも関する。【００１３】
本発明は該ベクターで形質転換された真核生物細胞にも関する。
本発明は該ベクターで形質転換された真核生物にも関する。後の実施例で示すように低温転写制御エンハンサーは細胞染色体に安定に組み込まれ得る。【００１４】
本発明は、軽度低温転写制御因子およびその制御物質のアッセイ法にも関する。その方法は、軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖ＤＮＡプローブとアッセイ対象のタンパク質溶液とを接触させ、特異的に軽度低温転写制御エレメントに結合した軽度低温転写制御因子の量を、結合している二本鎖ＤＮＡプローブを検出することにより測定することを含む。制御物質の活性は、ＤＮＡプローブに結合する軽度低温転写制御因子の量の変化を定量することによりアッセイされる。【００１５】
本発明は、軽度低温転写制御因子の精製方法にも関する。その方法は、軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖ＤＮＡプローブとタンパク質溶液とを接触させ、軽度低温転写制御エレメントに特異的に結合した軽度低温転写制御因子（タンパク質）を得、次に軽度低温転写制御因子を単離することを含む。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の軽度低温転写制御エレメントによれば、軽度低温において遺伝子の転写を促進させることができる。本発明によれば、軽度低温転写制御因子（タンパク質）およびその制御物質を同定または精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｐＣＡＴ３プロモーターベクターを表わす模式図である。ＭＣＳはマルチクローニングサイトを表わし、ＳＶ４０プロモーターはＳＶ４０ウイルス由来のプロモーターを表わし、ＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのコード配列を表わし、ＰＡはＳＶ４０ウイルス由来のポリアデニル化シグナルを表わし、Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を表わす。
【００１８】
【図２】ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン社）を表わす模式図である。ＭＣＳはマルチクローニングサイトを表わす。このマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＶとＸｂａＩの間にホタルルシフェラーゼのコード配列を挿入し、ＣＭＶプロモーターの５’側に軽度低温転写制御エンハンサーを組み込んだ。ＮｅｏｒはＧ４１８耐性遺伝子を表わす。
【００１９】
【図３】マウスＢａｌｂ／３Ｔ３細胞を３７℃（１レーン）または３２℃（２レーン）で８時間培養したときの核タンパク質を、３２Ｐ−ＡＴＰで標識した5’-ttccccgccgacggatccag-3’をプローブとしてゲルシフトアッセイし、軽度低温転写制御エレメントに結合する軽度低温転写制御因子の検出をした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
軽度低温転写制御エレメントの例は、限定するものではないがccccgcc、ccccgca、ccccgcg、ccccgct、ccccgtc、ccccgta、ccccgtg、ccccgtt、ccccgac、ccccgaa、ccccgag、ccccgat、ccccggc、ccccgga、ccccggg、ccccggt、ccccccc、cccccca、ccccccg、cccccct、ccccctc、cccccta、ccccctg、ccccctt、cccccac、cccccaa、cccccag、cccccat、cccccgc、cccccga、cccccgg、cccccgt、ccccacc、ccccaca、ccccacg、ccccact、ccccatc、ccccata、ccccatg、ccccatt、ccccaac、ccccaaa、ccccaag、ccccaat、ccccagc、ccccaga、ccccagg、ccccagt、cccctac、cccctcc、tcccgcc、tcccgca、tcccgcg、tcccgct、tcccgtc、tcccgta、tcccgtg、tcccgtt、tcccgac、tcccgaa、tcccgag、tcccgat、tcccggc、tcccgga、tcccggg、tcccccc、tccccca、tcccccg、tccccct、tcccctc、tccccta、tcccctg、tcccctt、tccccac、tccccaa、tccccag、tccccat、tccccgc、tcccacc、tcccaca、tcccacg、tcccact、tcccatc、tcccata、tcccatg、tcccatt、tcccaac、tcccaaa、tcccaag、tcccaat、tcccagc、tcccaga、tccctcc、acccgcc、acccgca、acccgcg、acccgct、acccgtc、acccgta、acccgtg、acccgtt、acccgac、acccgaa、acccgag、acccgat、acccggc、acccgga、acccggg、acccggt、acccccc、accccca、acccccg、accccct、acccctc、accccta、acccctg、acccctt、accccac、accccaa、accccga、acccacc、acccaca、acccacg、acccact、acccatc、acccata、acccatg、acccatt、acccaac、acccaaa、acccaag、acccaat、gcccccc、ggcgggg、agcgggg、gacgggg、ttcgggg、ggggggg、ggcggga、tgcggga、gacggga、tggggga、およびggcgggtを含む。【００２１】
（ｉ）軽度低温転写制御エレメントの製造
軽度低温転写制御エレメント、及び軽度低温転写制御エンハンサーは保護基のついた４種類のデオキシリボヌクレオチドを用いホスホロアミダイドを用いる固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる（例えば、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 35-81,83-115 （1984）; J. Org. Chem., 49,2139 （1984）; Tetrahedron Lett., 27,469 （1986）; Tetrahedron Lett.,22,1859-1862; Tetrahedron Lett.,21,719-722（1980）; J. Am. Chem. Soc.,103,3185-3191（1981） を参照）。今日では市販のＤＮＡ合成装置（例えばApplied Biosystem社製など）によって容易に合成できる。【００２２】
（ｉｉ）使用するプロモーター
プロモーターとしては、原核生物、真核生物、ウイルスのプロモーターを使用できる。好ましくは哺乳動物プロモーター、およびウイルスプロモーターである。好ましいプロモーターの例は、限定されるものではないがマウスチミジンキナーゼ（ＴＫ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ４０のプロモーターを含む。【００２３】
（ｉｉｉ）コード配列
発現させるべき遺伝子には制限がなくいずれのタンパク質をコードする配列も用いることができる。なお、タンパク質をコードしないＲＮＡを発現させることも可能である。【００２４】
（ｉｖ）使用するベクター
本発明の軽度低温転写制御エレメントまたは軽度低温転写制御エンハンサー、プロモーターおよび、発現させるべきタンパク質をコードするコード配列またはタンパク質をコードしない目的配列を連結してベクターに挿入する。ベクターとしては原核細胞及び真核細胞発現用ベクターである。哺乳動物細胞の場合、好ましいベクターの例は、限定されるものではないがｐＣＭＶ（インビトロジェン社）、ｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）、ｐＳＶ２−ネオベクターを含む。【００２５】
（ｖ）使用する宿主細胞
該ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする。宿主細胞としては真核生物細胞、特に哺乳動物細胞を用いるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株２９３、２９３Ｔ，Ｕ−２ ＯＳ，Ｈｕｈ−７、ＨｅLａ等、サル細胞株ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ等、マウス細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３，Ｂａｌｂ／３Ｔ３，Ｂ−６，Ｈｅｐａｌ−６、チャイニーズハムスター細胞株ＣＨＯ等である。
トランスフェクションの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロウイルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液にＤＮＡ（ベクター）を含む塩化カルシウム溶液を攪拌しながら１滴ずつ加える。ＤＮＡ−リン酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞に加えるとＤＮＡ−リン酸カルシウムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、ＤＮＡが細胞内に取りこまれることになる。【００２６】
（ｖｉ）培養条件
宿主細胞は軽度低温において培養する。培地は特別のものを使用する必要はなく、それぞれの細胞に通常使われるもので良い。哺乳動物細胞培養用の典型的な培地の例は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（インビトロジェン社）である。【００２７】
本発明は、軽度低温転写制御因子（タンパク質）およびその制御物質のアッセイ法にも関する。その方法は、軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖ＤＮＡプローブとアッセイ対象のタンパク質溶液とを接触させ、特異的に軽度低温転写制御エレメントに結合した軽度低温転写制御因子の量を、結合している二本鎖ＤＮＡプローブを検出することにより測定することを含む。制御物質の活性は、ＤＮＡプローブに結合する軽度低温転写制御因子の量の変化を定量することによりアッセイされる。【００２８】
先ず、軽度低温転写制御エレメントを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を標準的な方法に従って作製する。作製したオリゴヌクレオチドの末端を、例えばビオチンで標識し、アニーリングさせて二本鎖とする。あるいは、オリゴヌクレオチドを二本鎖にしてから標識することも、標識せずに二本鎖として最後に検出することも可能である。これ以下は市販のゲルシフトアッセイ（EMSA : electrophoretic mobility shift assay ）キット（PIERCE社、Molecular Probes社等）の利用が可能である。次に、二本鎖オリゴヌクレオチドと、軽度低温転写制御因子、さらに場合によりその制御物質を含むと考えられるタンパク質溶液、例えば核抽出物とを混合し、二本鎖オリゴヌクレオチドと軽度低温転写制御因子とを反応させる。次にゲル電気泳動、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動でオリゴヌクレオチド、タンパク質、および両者の結合物を分離する。遊離のオリゴヌクオチドは早く流れるため下部にくるが、タンパク質が結合したオリゴヌクオチドはゆっくり流れるため上部にあらわれる。特異的にオリゴヌクレオチドに結合しているタンパク質として軽度低温転写制御因子を検出する。例えば、オリゴヌクオチドがビオチン標識してあれば、電気泳動の後、ポリアクリルアミドゲルをナイロンメンブレンへブロッティングし、紫外線を用いてメンブレンへクロスリンクさせる。メンブレン上のビオチン標識とペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンとを特異的に結合させ、化学発光基質との反応で発光させ、Ｘ線フィルムへ感光させ検出する。上記の Molecular Probes社のキットであれば、標識無しのオリゴヌクレオチドを用いて反応、電気泳動させ、ゲルをそのまま色素で染色することによりタンパク質が結合したオリゴヌクオチドを検出することが出来る。この特異的にタンパク質が結合したオリゴヌクオチドの量から、軽度低温転写制御因子がアッセイされる。さらに、この軽度低温転写制御因子の量に与える影響を定量することにより、その制御物質の活性をアッセイすることができる。【００２９】
本発明は、軽度低温転写制御因子の精製方法にも関する。その方法は、軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖ＤＮＡプローブとタンパク質溶液とを接触させ、特異的に軽度低温転写制御エレメントに結合した軽度低温転写制御因子を得、次に軽度低温転写制御因子を単離することを含む。【００３０】
まず軽度低温転写制御エレメントを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を標準的な方法に従って作製する。次に、例えば、作製したオリゴヌクレオチドを担体に結合させ固相化する。例えば、オリゴヌクレオチドをビオチン化し、相補鎖をアニーリングさせて二本鎖としてアビジン化磁気ビーズに結合させる。次に固相化した二本鎖オリゴヌクレオチドと、軽度低温転写制御因子を含むと考えられるタンパク質溶液、例えば核抽出タンパク質をサイズで分けた分画、とを混合し、二本鎖オリゴヌクレオチドと軽度低温転写制御因子とを接触させる。次に、軽度低温転写制御因子と結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを、例えば磁気ビーズを担体として用いていればマグネットで、回収する。よく洗浄した後に、特異的に結合したタンパク質、即ち軽度低温転写制御因子を溶出させれば、軽度低温転写制御因子が精製される。なお必要に応じ、ゲル電気泳動やカラムクロマトグラフィー等でさらに精製できる。精製したタンパク質から、軽度低温転写制御因子のアミノ酸配列、遺伝子を同定することも出来る。【００３１】
以下に本発明を実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことは勿論である。【００３２】
実施例１
tccccgccを含む８塩基を直列に３個つないで連続させたもの（tccccgcctccccgcctccccgcc）（配列番号１）、あるいは、tccccgccの５’末端のｔを他の塩基に変異させた変異体を同様に直列に３個つないで連続させたものをｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。このベクターはＳＶ４０のプロモーターを有する。レポータータンパク質としてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を有する。陰性コントロールとしてなにもいれていないｐＣＡＴ３プロモーターベクターを用いた。【００３３】
これらのプラスミド各２．５〜５．０μｇ／３５ｍｍディッシュを、ＣＤＭ８−ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ発現ベクターであり、各トランスフェクションの効率を補正するために使用した。ＡＴＣＣ社）０．５〜１．０μｇ／３５ｍｍディッシュとともに、３７℃で１日培養したヒト細胞株２９３にコトランスフェクションした。
トランスフェクションした細胞を２つに分け、１方を３２℃で、他方を３７℃でそれぞれ培養した。培地は１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭである。【００３４】
３６時間後、遠心分離によって細胞を回収し、全細胞溶解液を作成した。それぞれの温度で生成したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）タンパク質の量をＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（ロシュ・ダイアグノステック社）を用いて測定し、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性をβ−ガラクトシダーゼアッセイキット（ストラタジーン社）を用いて測定した。【００３５】
３６時間でのデータを下表に示す。転写活性としてはＣＡＴタンパク質量をβ−ガラクトシダーゼ活性で割った値を用いた。コントロールとしてなにもいれていないｐＣＡＴ３プロモーターベクターを用いときの３２℃／３７℃の比を１として、それぞれの変異体の低温転写促進（エンハンサー）活性を示した。
【表１】
2007029641.tif 000002
【００３６】
最初の塩基のＣ、Ａ、またはＧへの変異体は、野生型とほぼ同様の低温転写促進活性を示した。このことは、軽度低温転写制御エレメントは、７つのヌクレオチドよりなるccccgccで十分であることを示す。
上記軽度低温転写制御エンハンサーtccccgcctccccgcctccccgcc（配列番号１）に変えて、ttccccgccgttccccgccgttccccgccgを（配列番号２）を用いた場合にも同様な結果が得られた。【００３７】
実施例２
実施例１で８塩基中の最初の塩基がＴ、Ｃ、Ａ、Ｇのいずれであっても活性には関係ないことが示されたので、tcccgcc、acccgcc、gcccgcc、ccccgctという塩基配列それぞれの５’側にＴ、Ｃ、Ａ、またはＧを付けた８塩基を直列に３個つないで連続させたものを実施例１と同様にｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）のマルチクローニングサイトに組み込み、低温転写促進（エンハンサー）活性を測定し、表２の結果を得た。転写活性としてはＣＡＴタンパク質量をβ−ガラクトシダーゼ活性で割った値を用いた。陰性コントロールとしてなにもいれていないｐＣＡＴ３プロモーターベクターを用いときの３２℃／３７℃の比を１とし、さらに陽性コントロールとして野生型tccccgccを直列に３個つないで連続させたものを用いときの３２℃／３７℃の比を５として補正し、それぞれの変異体の低温転写促進（エンハンサー）活性を示した。【００３８】
【表２】
2007029641.tif 000003
【００３９】
低温転写促進活性を示す軽度低温転写制御エレメント８塩基、例えばtccccgcc、のうち１番目の塩基がＴ、Ｃ、Ａ、Ｇのいずれであってもその活性には影響しないことが再確認され、従って８塩基ではなく７塩基、例えばccccgcc、を基に軽度低温転写制御エンハンサーを作製できる。
上記軽度低温転写制御エンハンサーtccccgcctccccgcctccccgcc（配列番号１）に変えて、ccccgccccccgccccccgccを（配列番号４）を用いた場合にも同様な結果がえられた。【００４０】
実施例３
ccccgccという７塩基配列の５’末端から１番目、２番目、３番目あるいは４番目の１塩基ｃを他の塩基に変異させ、５’側に tt を、３’側にｇまたはｔ  を付加して１０塩基としたものをそれぞれ直列に３個つないで連続させたものをｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。その後は実施例２と同様に行って以下のような結果を得た。結果を表３に示す。【００４１】
【表３】
2007029641.tif 000004
【００４２】
１番目の塩基のＴへの変異体は野生型と同等の低温転写促進活性を示す。Ａへの変異体は野生型よりやや低い低温転写促進活性を示すが、Ｇへの変異体は活性が低い。２番目、３番目あるいは４番目の塩基のＡ、Ｇ、Ｔへの変異体は活性が低い。【００４３】
実施例４
ccccgcc塩基配列の１番目の塩基のＴへの変異に加え、１塩基の変異が存在する場合の低温転写促進活性を調べた。即ち
１番目の塩基のＴへの変異に加え５番目の塩基のＡ、Ｃ、またはＴへの変異した変異体、
１番目の塩基のＴへの変異に加え６番目の塩基のＡ、Ｇ、またはＴへの変異した変異体、および
１番目の塩基のＴへの変異に加え７番目の塩基のＡ、Ｇ、またはＴへの変異した変異体
をそれぞれ直列に３個含むオリゴヌクレオチドを実施例３と同様にｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）のマルチクローニングサイトに組み込んで、以下のような結果を得た。結果を表４に示す。
【表４】
2007029641.tif 000005
【００４４】
１番目の塩基のＴへの変異に加え１塩基の変異が存在する場合、５番目の塩基のＣ、Ａ、またはＴへの変異、６番目の塩基のＴ、Ａ、またはＧへの変異、７番目の塩基のＡ、Ｇ、またはＴへの変異は低温転写促進活性が野生型に比べ低下するものの、有意な活性が認められる。【００４５】
実施例５
以上の結果より、ヌクレオチド配列：ｘ1ｃｃｃｘ5ｘ6ｘ7（式中、ｘ１は、c、ｔ、またはａを表し、ｘ5は、ｇ、c、a、またはtを表し、ｘ6は、ｃ、t、ａ、またはgを表し、ｘ7は、ｃ、a、g、またはtを表す。）は軽度低温転写制御エレメントであり、これらを連結したオリゴヌクレオチド配列はエンハンサーであることから、これらの配列に相補的なヌクレオチド配列であれば低温転写促進活性が認められることが考えられる。そこでこれに適合する配列、あるいは適合しない単一の配列をそれぞれ直列に３個含むオリゴヌクレオチドを実施例３と同様にｐＣＡＴ３プロモーターベクター（プロメガ社）に組み込んで、以下のような結果を得た。結果を表５に示す。
【表５】
2007029641.tif 000006
【００４６】
以上より、ヌクレオチド配列：ｘ1ｃｃｃｘ5ｘ6ｘ7（式中、ｘ１は、cまたはｔが望ましいが、ａでもよい、ｘ5は、ｇが望ましいが、cまたはa、場合によってはtでもよい、ｘ6は、ｃが望ましいが、tまたはａ、場合によってはgでもよい、ｘ7は、ｃが望ましいが、t、ａ、またはgでもよい。）、およびこれらの配列に相補的なヌクレオチド配列に低温転写促進活性が認められる。【００４７】
実施例６
実施例５の結果より、ccccgcc を２個含むヌクレオチド配列は軽度低温転写制御エンハンサーであると予想される。そこで、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを持つｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン社）（図２）のマルチクローニングサイト（ＥｃｏＲＶとＸｂａＩの間）に、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社）から切り出したホタルルシフェラーゼｃＤＮＡを組み込み、ＣＭＶプロモーターの５’側に
ttccccgccg  caggacaaac  gggtcgggaa  cgcggaagtg  ggtcagctcc  gcctccaaat  cagctgtccc  cgcctcctag  tcgctag（配列番号３）
を直列に２個組み込んだ。【００４８】
次いで、このプラスミド５．０μｇ／６０ｍｍディッシュを、ヒト細胞株Ｕ−２ ＯＳにトランスフェクションして、３７℃でＧ４１８（インビトロジェン社）存在下に３週間培養し、このプラスミドを安定に染色体に組み込み発現する細胞クローンを得た。この培養細胞を２つに分け、ともに３７℃で２日間培養した後、１方を３２℃で、他方を３７℃でそれぞれさらに培養した。培地は１０％ＦＣＳ＋Ｄ−ＭＥＭである。温度変更４８時間後、遠心分離によって細胞を回収し、全細胞溶解液を作成した。それぞれの温度で生成したホタルルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase Reporter Assayキット（プロメガ社）を用いて測定した。結果を表６に示す。活性としては抽出タンパク質あたりのホタルルシフェラーゼ活性を示した。【００４９】
【表６】
2007029641.tif 000007
【００５０】
この結果は、低温転写制御エンハンサーが細胞染色体に安定に組み込まれた状態でも、また異なる軽度低温転写制御エレメントが他のヌクレオチド配列を介して結合されていても、３２℃での転写を促進し、タンパク質産生量を増やすことを示す。【００５１】
実施例７
哺乳類細胞にタンパク質を産生させる場合には、２つのタンパク質の遺伝子を同時に一つの発現ベクターに組み込む可能性が考えられる。そこで実施例６で使用したＣＭＶプロモーターによりホタルルシフェラーゼを発現するベクターの低温転写制御エンハンサーの５’上流側に、さらにＣＭＶプロモーターをもう１個ルシフェラーゼ発現とは逆の向き（３’から５’の向き）に追加して、ルシフェラーゼ発現に対する影響を調べた。実施例６と同様に、ヒト細胞株Ｕ−２ ＯＳにトランスフェクションして、１方を３２℃で、他方を３７℃でそれぞれさらに培養したところ、逆向きのＣＭＶプロモーターが５’上流に加わったことによる発現の低下はなく、かえって５−１０％程度３２℃での転写促進、タンパク質産生の増加が認められた。このことから、２つのタンパク質を逆向のプロモーターから同時に産生させるベクターにも低温転写制御エンハンサーが利用可能であると考えられた。【００５２】
実施例８
ゲルシフトアッセイ
マウスＢａｌｂ／３Ｔ３線維芽細胞を１０％ウシ血清（ＣＳ）添加のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（インビトロジェン社）で３７℃で２４時間培養し、一部を３２℃、残りを３７℃でさらに８時間培養した後、常法（John David Dignani, Russell M. Lebovitz, and Robert G. Roeder、Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res., 1983; 11: 1475-1489）により核タンパク質抽出液を作製した。
オリゴヌクレオチド、5’-ttccccgccgacggatccag-3’（配列番号５）、をT4 polynuclotide kinaseと gamma-32P-ATPで標識し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラム（アマシャムバイオサイエンス社）で精製した後、相補鎖ctggatccgtcggcggggaa（配列番号６）とアニーリングさせ５Ｘ１０５ cpm/ng のプローブを得た。
このプローブ０．１ナノグラムをpoly（dI-dC）０．５マイクログラムとともに核タンパク質抽出液に混ぜ、２０℃に置いた（この結合バッファーの組成は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロールである）。３０分経過後に４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、ゲルを８０℃で乾燥させ、Ｘ線フィルムを感光させ軽度低温転写制御エレメントに結合するタンパク質、軽度低温転写制御因子を検出した。（図３）
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明はタンパク質の生産に広く用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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