【手続補正書】
【提出日】平成19年10月11日(2007.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】  抗体がヒト化抗体である請求項１２、１３又は１４記載の抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチド産生能を有するヒト及びヒト以外の温血動物由来の細胞から得ることができると共に、遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。好適には、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒトＴ細胞、殊に、ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４３０）を栄養培地中で培養することにより得ることができる。又、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖法として、ヒト以外の温血動物の栄養分を含んだ体液（以下、「体液」と言う。）の供給を受けながら増殖させ、その培養液及び／又は増殖細胞から容易に得ることができる。前記ヒト以外の温血動物を用いる増殖方法は、マウス、ヌードマウス、ラット、ヌードラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類の新生児を使用し、これら温血動物に、例えば、ウサギ由来の抗胸腺抗体などを注射して免疫反応を減弱させた後、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト細胞を、動物１匹当たり約１×１０５乃至１×１０８個皮下又は腹腔内に注射して移植するか、あるいは、これら温血動物の成長個体の体外又は体内に設けられ、温血動物の体液が環流可能な拡散チャンバーなどの容器内に本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト細胞を収容し、その後、通常一般の方法により動物を約２乃至１０週間飼育する。この飼育期間、移植したヒト細胞は温血動物の体液を利用しながら増殖させる。本発明のポリペプチドが増殖細胞中に含まれている場合、増殖細胞を細胞塊、腹水又は細胞浮遊液として採取し、必要に応じて、これを適宜分散溶媒を用いて分散・洗浄した後、増殖細胞を以下に述べる機械的破壊又は化学的破壊処理して、得られる破壊物から目的とする本発明のポリペプチドを採取する。ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖法は、栄養培地を用いる生体外の増殖方法と比較して、より低コストと低労力でより短時間に所望量の増殖細胞が得られるとの利点がある。なお、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖方法は、例えば、特公昭５６−５４１５８号公報などに詳述されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【実験２−２】
＜５′ＲＡＣＥ法＞
アンチセンスプライマー２（ａ２）として、配列表における配列番号１の塩基配列に於ける第１０３〜８６番目に相当する５′−ＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＣＣ−３′、アンチセンスプライマー３（ａ３）として、配列表における配列番号１の塩基配列の８３〜６５番目に相当する５′−ＡＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧ−３′、アンチセンスプライマー４（ａ４）として、配列表における配列番号１の塩基配列の６１〜４２番目に相当する５′−ＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧ−３′を作出した。先ず、５×ｃＤＮＡ合成溶液（２５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、１５０ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭジチオトレイトール）を４μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓを２μｌ、ａ２プライマー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ、ヒトＨＰＢ−ＭＬＴ細胞ｍＲＮＡを２４０ｎｇ、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）由来逆転写酵素（２０Ｕ／μｌ）を１μｌ加え、ＤＥＰＣ処理水を入れ全量を２０μｌとした。これを５５℃で１時間、６５℃で１０分間反応させてｃＤＮＡを得た。これをスピンカラムを用いて精製した。即ち、合成産物に１００μｌの反応溶液（３Ｍグアニジンチオシアネート、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．６）、５％エタノール）を加え、スピンカラムに前記産物を入れ、１５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心処理した。次に洗浄溶液（２０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）／エタノール）を５００μｌ加え、１５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心処理して洗浄し、再度同洗浄溶液２００μｌを加えて同様の操作を繰り返した。次いで、洗浄処理して得られた沈殿物に、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）及び１ｍＭＥＤＴＡを含む抽出溶液を５０μｌ加え、１５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離してｃＤＮＡ精製物を得た。精製物１９μｌに、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ塩化マグネシウム、及び５００ｍＭ塩化カリウムを含む１０×反応液を２．５μｌ、２ｍＭｄＡＴＰを２．５μｌ加えて、全量を２４μｌとした。これを９４℃で３分間加熱後、直ちに急冷し、ターミナルトランスフェラーゼ（１０Ｕ／μｌ）を１μｌ加え、３７℃で３０分間、７２℃で１０分間保温した。次に合成産物５μｌ、３７．５μＭ  オリゴｄＴ−アンカープライマー（５′−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３′、ＶはＡ、Ｃ又はＧを示す）を１μｌ、ａ３プライマー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓを１μｌ、Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／ｍｌ）を１μｌ、１０×Ｐｆｕ反応液を５μｌ加えて滅菌蒸留水で５０μｌとし、９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間処理する一連の処理を３５サイクル行って合成産物を増幅させた。更に増幅産物を１μｌ採取し、同様の条件で増幅を行った（但し、再増幅時には、１２．５μＭ  ＰＣＲアンカープライマー（５′−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣ−３′）と９０ｎｇ／μｌのａ４プライマーを使用）。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ったところ、約５５０ｂｐのバンドが検出された。その後、検出された断片を、前述と同様に抽出用キッ���（商品名『ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』、キアゲン社製）を用いて精製を行い、クローニングキット（『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ』、ストラタジーン社製）を用いてクローニングを行った。次いで、常法に従い大腸菌株（商品名『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ′  Ｋａｎｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ』、ストラタジーン社製）を用いて形質転換を行った。得られた形質転換体を栄養培地中で培養してコロニーを形成させ、コロニーＰＣＲにより目的のバンドが検出されたコロニーを選択してＬＢ−液体培地に植菌し、３７℃で１６時間で振盪培養した。菌体培養液２ｍｌから、常法に従ってプラスミドを調製し、得られたプラスミド『ｐＣＲＩＬＬ−５』をジデオキシ法により、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列解析を行った結果、配列表における配列番号２に示す５′末端側ｃＤＮＡ部分に約５７５ｂｐ相当の塩基配列が得られた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
【実施例１】
＜組換えＤＮＡ及び形質転換体の調製＞
本発明のポリペプチドとして、配列表における配列番号５に示す本発明のポリペプチドのｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列の５２番目のバリン残基からＣ−末端アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基までの１６７個のアミノ酸配列からなるポリペプチドを大腸菌を用いる系で発現させる目的で、下記の組換えＤＮＡを調製した。即ち、０．５ｍｌ容反応チューブに１０×Ｐｆｕ反応液（ストラタジーン社製）を１０μｌ、Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／ｍｌ）を１μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓを１μｌ、上記で得られたプラスミドｐＣＲＩＬＬ−ｆｕｌｌを１ｎｇ、５′−ＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＡＣＣＣＧ−３′（無作為な４塩基に引き続き、ＮｄｅＩサイト及び配列表における配列番号４に於ける２７４番目から２９１番目の塩基配列に相当）及び５′−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＡＴＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣ−３′（無作為な４塩基に引き続き、ＢａｍＨＩサイトと終始コドン及び配列表における配列番号４に於ける７７７番目から７６３番目の塩基配列に相当）で表わされる塩基配列のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーをそれぞれ適量加え、滅菌蒸留水で５０μｌとした。その後、常法により、得られた混合物を９４℃で０．５分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間、この順序でインキュベートする一連の処理を３０サイクル繰り返してＰＣＲ反応させた。得られたＰＣＲ産物を、常法に従って、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにて３７℃で２時間消化後、７０℃で１５分間熱処理し、両制限酵素を失活させた。一方、プラスミド（商品名『ｐＥＴ−３ａ』、ノバジェン社製）も同様に制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにて３７℃で２時間消化後、７０℃で１５分間熱処理を行なった。制限酵素消化後のベクター『ｐＥＴ−３ａ』１００ｎｇと同様の制限酵素処理後のＰＣＲ産物２００ｎｇとをライゲーションキット（商品名『ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２』、宝酒造株式会社製）を用いてライゲーション反応を行ない、発現用プラスミドｐＥＴＩＬＬ−ＥＸを構築した。ｐＥＴＩＬＬ−ＥＸを常法に従って、ノバジェン製大腸菌『ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ』を形質転換して形質転換体を得た。この形質転換体を形質転換体『ＩＬＬ−ＥＸ−１』と命名した。尚、本実験で用いた、配列表における配列番号５に示す本発明のポリペプチドのｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列の５２番目のバリン残基からＣ−末端アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基までの１６７個のアミノ酸配列は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、及びＩＬ−１Ｒａβとの相同性は図２に示すように２０％程度に過ぎなかった。図２中、アルファベットはアミノ酸の１文字略記号を示す。