(57)【要約】ポリマーを含んで成る、リポ蛋白中のコレステロールの測定方法及び測定用試薬を提供することを目的とし、本発明は、（ｉｖ）一般式［１］2007007443.tif 000063（式中、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、（ｖ）一般式［２］2007007443.tif 000064（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位及び（ｖｉ）一般式［３］2007007443.tif 000065〔式中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ３は一般式［４］2007007443.tif 000066（式中、Ｒ４はアルキル基、ハロアルキル基又はボルニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、アラルキル基又はアルキルカルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマーを用いたリポ蛋白中コレステロールの測定用試薬、測定方法、及びを新規ポリマーの発明である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)一般式［１］
2007007443.tif 000034
（式中、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(ii)一般式［２］
2007007443.tif 000035
（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び
(iii)メタクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸2-エチルヘキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ジ（トリフルオロメチル）メチル、メタクリル酸2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル、メタクリル酸ヘプタデカフルオロオクチルエチル、シクロヘキシルメタクリルアミド、アクリル酸シクロヘキシル、ビニルシクロヘキシル、アリルシクロヘキシル、シクロヘキシルビニルエーテル又はアリルベンゼン由来の第３モノマー単位からなるポリマー。
【請求項２】
ポリエチレングリコールセグメントが、一般式［５］
2007007443.tif 000036
（式中、Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ６はシアノ基又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｅ１は炭素数１〜６のアルキレン基を表し、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示されるものである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
重合平均分子量が１０，０００〜１２０，０００である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項４】
一般式［５］で示されるポリエチレングリコールセグメントを１〜７０重量％含有する、請求項２に記載のポリマー。
【請求項５】
一般式［２］で示されるモノマー単位を２０〜８５重量％含有する、請求項１に記載のポリマー。
【請求項６】
第３モノマー単位を２０〜８５重量％含有する、請求項１に記載のポリマー。
【請求項７】
一般式［２］で示されるモノマー単位がメタクリル酸由来のものであり、第３モノマー単位がメタクリル酸シクロヘキシル由来のものである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項８】
(iv)一般式［１］
2007007443.tif 000037
（式中、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(v)一般式［２］
2007007443.tif 000038
（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び
(vi)一般式［３］
2007007443.tif 000039
〔式中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ３は一般式［４］
2007007443.tif 000040
（式中、Ｒ４はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、アラルキル基又はアルキルカルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマーの共存下で測定を行うことを特徴とする、特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定法。
【請求項９】
ポリエチレングリコールセグメントが、一般式［５］
2007007443.tif 000041
（式中、Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ６はシアノ基又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｅ１は炭素数１〜６のアルキレン基を表し、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示されるものである、請求項８に記載の測定法。
【請求項１０】
ポリマーが、一般式［６］
2007007443.tif 000042
（式中、Ｒ５及びＲ７は夫々独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ６及びＲ８は夫々独立してシアノ基又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｅ１及びＥ２は夫々独立して炭素数１〜６のアルキレン基を表し、ｋは１０〜２５０の整数を表し、ｎは５０〜９００の整数を表し、ｐは５０〜９００の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、Ｒ１〜Ｒ３は前記に同じ。）で示されるものである、請求項８に記載の測定法。
【請求項１１】
一般式［３］で示されるモノマー単位が、メタクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸2-エチルヘキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ジ（トリフルオロメチル）メチル、メタクリル酸2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル、メタクリル酸ヘプタデカフルオロオクチルエチル、シクロヘキシルメタクリルアミド、アクリル酸シクロヘキシル、ビニルシクロヘキシル、アリルシクロヘキシル、シクロヘキシルビニルエーテル又はアリルベンゼン由来のものである、請求項８に記載の測定法。
【請求項１２】
ポリマーの重合平均分子量が１０，０００〜１２０，０００である、請求項８に記載の測定法。
【請求項１３】
一般式［５］で示されるポリエチレングリコールセグメントが１〜７０重量％である、請求項９に記載の測定法。
【請求項１４】
一般式［２］で示されるモノマー単位が２０〜８５重量％である、請求項８に記載の測定法。
【請求項１５】
一般式［３］で示されるモノマー単位が２０〜８５重量％である、請求項８に記載の測定法。
【請求項１６】
一般式［２］で示されるモノマー単位がメタクリル酸由来のものであり、一般式［３］で示されるモノマー単位がメタクリル酸シクロヘキシル由来のものである、請求項８に記載の測定法。
【請求項１７】
(a)当該ポリマーの共存下、生体由来試料を(1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ、又は(2)コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）と反応させ、
(b)生成する過酸化水素量又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定することを特徴とする、請求項８に記載の測定法。
【請求項１８】
生体試料と当該ポリマーとを接触させた後、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する、請求項８に記載の測定法。
【請求項１９】
相異なる二つの時点が、(1)生体由来試料と当該ポリマーとを接触させ、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点と、(2)特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点である、請求項１８に記載の測定法。
【請求項２０】
(a)当該ポリマー共存下、生体由来試料と特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬とを接触させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、
(b)次いで、(1)特定のリポ蛋白中のコレステロールと、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとの反応によって生成する過酸化水素量、又は(2)特定のリポ蛋白中のコレステロールと、コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）との反応によって生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量に基づいて生体試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定する、請求項８に記載の測定法。
【請求項２１】
特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬が、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼとカップラー又はデベロッパー、或いはカタラーゼである、請求項２０に記載の測定法。
【請求項２２】
リポ蛋白が高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）又は超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）である、請求項８、１７、１８及び２０の何れかに記載の測定法。
【請求項２３】
生体由来試料を(1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ、又は(2)コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）と反応させ、生成する過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに基づいてコレステロールを測定するための試薬に、下記(iv)〜(vi)を構成成分として含んで成るポリマーを含有させた、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(iv)一般式［１］
2007007443.tif 000043
（式中、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(v)一般式［２］
2007007443.tif 000044
（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び
(vi)一般式［３］
2007007443.tif 000045
〔式中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ３は一般式［４］
2007007443.tif 000046
（式中、Ｒ４はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、アラルキル基又はアルキルカルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位
【請求項２４】
生体由来試料を特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬と接触させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、特定のリポ蛋白中のコレステロールと、(1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ、又は(2)コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）と反応させ、生成する過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに基づいてコレステロールを測定するための試薬に、下記(iv)〜(vi)を構成成分として含んで成るポリマーを含有させた、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(iv)一般式［１］
2007007443.tif 000047
（式中、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(v)一般式［２］
2007007443.tif 000048
（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び
(vi)一般式［３］
2007007443.tif 000049
〔式中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ３は一般式［４］
2007007443.tif 000050
（式中、Ｒ４はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、アラルキル基又はアルキルカルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位
【請求項２５】
特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬が、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼとカップラー又はデベロッパー、或いはカタラーゼである、請求項２４記載の試薬。
【請求項２６】
リポ蛋白が高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）又は超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）である、請求項２３又は２４に記載の測定用試薬。
【請求項２７】
(1)下記(iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、(2)コレステロールエステラーゼ、(3)コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及びカップラー又は／及びデベロッパー、及び(4)水性媒体を含んでなる第一試液と、(5)コレステロールエステラーゼ、(6)コレステロールオキシダーゼ及び(7)水性媒体を含んでなる第二試液とからなるものであって、ペルオキシダーゼ、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
(iv)一般式［１］
2007007443.tif 000051
（式中、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(v)一般式［２］
2007007443.tif 000052
（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び
(vi)一般式［３］
2007007443.tif 000053
〔式中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ３は一般式［４］
2007007443.tif 000054
（式中、Ｒ４はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、アラルキル基又はアルキルカルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位
【請求項２８】
(1)下記(iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、(2)コレステロールエステラーゼ、(3)コレステロールオキシダーゼ、(4)ペルオキシダーゼ、(5)カップラー、(6)デベロッパー及び(7)水性媒体を含んでなる第一試液と、(8)界面活性剤及び(9)水性媒体を含んでなる第二試液とからなる、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
(iv)一般式［１］
2007007443.tif 000055
（式中、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(v)一般式［２］
2007007443.tif 000056
（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び
(vi)一般式［３］
2007007443.tif 000057
〔式中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ３は一般式［４］
2007007443.tif 000058
（式中、Ｒ４はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、アラルキル基又はアルキルカルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位
【請求項２９】
(1)下記(iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、(2)コレステロールエステラーゼ、(3)コレステロールオキシダーゼ、(4)カタラーゼ及び(5)水性媒体を含んでなる第一試液と、(6)カタラーゼ阻害剤、(7)水性媒体及び要すれば(8)界面活性剤とを含んでなる第二試液とからなるものであって、ペルオキシダーゼ、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定用キット。
(iv)一般式［１］
2007007443.tif 000059
（式中、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(v)一般式［２］
2007007443.tif 000060
（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び
(vi)一般式［３］
2007007443.tif 000061
〔式中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ３は一般式［４］
2007007443.tif 000062
（式中、Ｒ４はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、アラルキル基又はアルキルカルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位
【請求項３０】
リポ蛋白が高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）又は超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）である、請求項２７〜２９の何れかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式［２］で示されるモノマー単位及び一般式［３］で示されるモノマー単位を構成成分として含んでなるポリマーを用いた、例えば高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）等のリポ蛋白中コレステロールの測定用試薬、キット及び測定方法、詳しくは、試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ中のコレステロールの直接的な測定に於いて、当該ポリマーを含有させたリポ蛋白中のコレステロールの測定用試薬、キット及び該測定試薬を用いて特定のリポ蛋白中のコレステロール濃度を測定する方法、並びに一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式［２］で示されるモノマー単位及び第３モノマー単位からなるポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
血清及び血漿中リポ蛋白中コレステロールの測定は、主に動脈硬化、心筋症、脂質異常解析等の診断に利用されており、臨床検査の分野に於いては重要な測定項目の１つである。特にＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）及びＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）に於いては、動脈硬化学会に於いてもガイドラインが設定され、測定頻度が高い項目の１つでもある。遠心分離操作等を行うことなく、自動分析装置等を用いて実施できるＨＤＬ−Ｃの直接的測定方法としては、例えば、抗βリポ蛋白抗体を用いてＨＤＬ以外のリポ蛋白を保護しＨＤＬ−Ｃのみを検出する方法（特許文献１）、シクロデキストリン誘導体等の糖化合物及び修飾した酵素を用いて同様にＨＤＬ−Ｃのみを検出する方法（特許文献２）、リポ蛋白を溶解しない界面活性剤を使用する方法（特許文献３）、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去した後にＨＤＬ−Ｃを特異的に検出する方法（特許文献４）、カリクスアレン類を用いてＨＤＬ以外のリポ蛋白と複合体を形成させて保護し、ＨＤＬ−Ｃを検出する方法（特許文献５）などがある。【０００３】
一方、遠心分離操作等を行うことなく、自動分析装置等を用いて実施できるＬＤＬ−Ｃの直接的測定法としては、ポリアニオンと両性界面活性剤でＬＤＬを保護し、ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去した後、ＬＤＬ−Ｃを測定する方法（特許文献６）界面活性剤を用いてＬＤＬ以外のリポ蛋白のみ可溶化して消去した後、ＬＤＬ−Ｃを検出する方法（特許文献７、特許文献８）、カリクスアレン類を用いてＬＤＬ以外のリポ蛋白を保護し、ＬＤＬ−Ｃを検出する方法（特許文献９）などが挙げられる。【０００４】
しかしながら、これらの試薬の測定精度は、脂質濃度が正常範囲である検体（正脂検体）に於いては満足できるものの、例えば高トリグリセライド（ＴＧ）検体等の脂質異常検体に於いては、標準的測定法で、超遠心による分画と組み合わせたＵＣＨＭ法（Ultracentrifugation-heparin-MnCl2-method）、ＢＱ法（Beta-Quantification method）での測定値を比べると必ずしも精度の面で十分とはいえないのが現状である。
また、特許文献１０には、ポリエチレングリコールを主鎖に有するブロック共重合体及びこれを化粧料として使用することが開示されている。【０００５】
【特許文献１】特許第3446486号公報
【特許文献２】特許第2600065号公報
【特許文献３】特許第2799835号公報
【特許文献４】特許第3164829号公報
【特許文献５】国際公開WO98/59068号公報
【特許文献６】特開2000-60600号公報
【特許文献７】特許第3193634号公報
【特許文献８】特許第3058602号公報
【特許文献９】国際公開WO98/59068号公報
【特許文献１０】特開2001-288233号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ポリマーを含んで成る、リポ蛋白中のコレステロールの測定方法及び測定用試薬、並びに新規なポリマーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（１）(i)一般式［１］
2007007443.tif 000002
【０００８】
（式中、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(ii)一般式［２］
2007007443.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び
(iii)メタクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸2-エチルヘキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ジ（トリフルオロメチル）メチル、メタクリル酸2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル、メタクリル酸ヘプタデカフルオロオクチルエチル、シクロヘキシルメタクリルアミド、アクリル酸シクロヘキシル、ビニルシクロヘキシル、アリルシクロヘキシル、シクロヘキシルビニルエーテル又はアリルベンゼン由来の第３モノマー単位からなるポリマー（以下、「本発明のポリマー（ａ）」と略記する場合がある。）、【００１０】
（２）(iv)一般式［１］
2007007443.tif 000004
【００１１】
（式中、ｋは前記に同じ。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(v)一般式［２］
2007007443.tif 000005
【００１２】
（式中、Ｒ１は前記に同じ。）で示されるモノマー単位、及び
(vi)一般式［３］
2007007443.tif 000006
【００１３】
〔式中、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ３は一般式［４］
2007007443.tif 000007
【００１４】
（式中、Ｒ４はアルキル基、ハロアルキル基又はボルニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、アラルキル基又はアルキルカルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマー（以下、「本発明に係るポリマー」と略記する場合がある。）
の共存下で測定を行うことを特徴とする、特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定方法、【００１５】
（３）生体由来試料を(1)コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ）及びコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）、又は(2)ＣＨＥ、コレステロールデヒドロゲナーゼ（ＣＨＤ）及びＮＡＤ（Ｐ）〔ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕と反応させ、生成する過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ〔還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕に基づいてコレステロールを測定するための試薬に、上記(iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマーを含有させた、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用試薬、【００１６】
（４）生体由来試料を特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬と接触させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、特定のリポ蛋白中のコレステロールと、(1)ＣＨＥ及びＣＯ、又は(2)ＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）と反応させ、生成する過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに基づいてコレステロールを測定するための試薬に、上記(iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマーを含有させた、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用試薬、【００１７】
（５）(1) 上記（iv）〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、及びカップラー又は／及びデベロッパー、及び(4)水性媒体を含んでなる第一試液と、(5)ＣＨＥ、(6)ＣＯ及び(7)水性媒体を含んでなる第二試液とからなるものであって、ＰＯＤ、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット、【００１８】
（６）(1) 上記（iv）〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、(4)ＰＯＤ、(5)カップラー、(6)デベロッパー及び(7)水性媒体を含んでなる第一試液と、(8)界面活性剤及び(9)水性媒体を含んでなる第二試液とからなる、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット、及び【００１９】
（７）(1) 上記（iv）〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、(4)カタラーゼ（ＣＡＴ）及び(5)水性媒体を含んでなる第一試液と、(6)ＣＡＴ阻害剤、(7)水性媒体及び要すれば(8)界面活性剤とを含んでなる第二試液とからなるものであって、ＰＯＤ、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット、の発明である。
【発明の効果】
【００２０】
リポ蛋白中のコレステロールの直接的測定法に於いて、上記(iv)一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、(v)一般式［２］で示されるモノマー単位及び(vi)一般式［３］で示されるモノマー単位を構成成分として含んでなるポリマー（以下、「本発明に係るポリマー」と略記する場合がある。）、特に上記(i)一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、(ii)一般式［２］で示されるモノマー及び(iii)第３モノマーからなるポリマー（以下、「本発明のポリマー（ａ）」と略記する場合がある。）を共存させることにより、特定のリポ蛋白を保護し、当該特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を先行させて、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定することができる。また、反応を先行させた当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定することができる。これにより、測定対象となる目的のリポ蛋白以外のリポ蛋白を分離分別することなく、目的のリポ蛋白中のコレステロールを測定することが可能となる。更に、本発明によれば、これまで問題となっていた脂質異常検体の測定値に於いても標準的測定法での測定値と一致する測定精度に優れたリポ蛋白中コレステロール測定方法及び測定試薬を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
１．本発明に係るポリマー
１−１．ポリマー
一般式［１］に於いて、ｋは通常１０〜２５０、好ましくは２０〜２００、より好ましくは４０〜１５０の整数である。【００２２】
一般式［２］及び［３］に於いて、Ｒ１及びＲ２で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、直鎖状或いは分枝状でもよく、通常炭素数１〜３、好ましくは炭素数１のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。【００２３】
一般式［３］に於いて、Ｒ３で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１５、好ましくは３〜８のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、ネオノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、n-ウンデシル基、イソウンデシル基、sec-ウンデシル基、tert-ウンデシル基、ネオウンデシル基、n-ドデシル基、イソドデシル基、sec-ドデシル基、tert-ドデシル基、ネオドデシル基、n-トリデシル基、イソトリデシル基、sec-トリデシル基、tert-トリデシル基、ネオトリデシル基、n-テトラデシル基、イソテトラデシル基、sec-テトラデシル基、tert-テトラデシル基、ネオテトラデシル基、n-ペンタデシル基、イソペンタデシル基、sec-ペンタデシル基、tert-ペンタデシル基、ネオペンタデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、シクロウンデシル基、シクロドデシル基、シクロトリデシル基、シクロテトラデシル基、シクロペンタデシル基等が挙げられ、中でも、シクロヘキシル基又はシクロヘキシルメチル基が好ましい。【００２４】
Ｒ３で示されるアルコキシ基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばメトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、n-ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、sec-ペンチルオキシ基、tert-ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、n-ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、sec-ヘキシルオキシ基、tert-ヘキシルオキシ基、ネオヘキシルオキシ基、n-ヘプチルオキシ基、イソヘプチルオキシ基、sec-ヘプチルオキシ基、tert-ヘプチルオキシ基、ネオヘプチルオキシ基、n-オクチルオキシ基、イソオクチルオキシ基、sec-オクチルオキシ基、tert-オクチルオキシ基、ネオオクチルオキシ基、n-ノニルオキシ基、イソノニルオキシ基、sec-ノニルオキシ基、tert-ノニルオキシ基、ネオノニルオキシ基、n-デシルオキシ基、イソデシルオキシ基、sec-デシルオキシ基、tert-デシルオキシ基、ネオデシルオキシ基、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロヘプチルオキシ基、シクロオクチルオキシ基、シクロノニルオキシ基、シクロデシルオキシ基等が挙げられ、中でもシクロヘキシルオキシ基が好ましい。【００２５】
Ｒ３で示されるアラルキル基としては、通常炭素数７〜１２のものが挙げられ、具体的には、例えばベンジル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基等が挙げられ、中でもベンジル基が好ましい。【００２６】
Ｒ３で示されるアルキルカルバモイル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数２〜１１、好ましくは２〜７のものが挙げられ、具体的には、例えばメチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、n-プロピルカルバモイル基、イソプロピルカルバモイル基、n-ブチルカルバモイル基、イソブチルカルバモイル基、sec-ブチルカルバモイル基、tert-ブチルカルバモイル基、n-ペンチルカルバモイル基、イソペンチルカルバモイル基、sec-ペンチルカルバモイル基、tert-ペンチルカルバモイル基、ネオペンチルカルバモイル基、n-ヘキシルカルバモイル基、イソヘキシルカルバモイル基、sec-ヘキシルカルバモイル基、tert-ヘキシルカルバモイル基、ネオヘキシルカルバモイル基、n-ヘプチルカルバモイル基、イソヘプチルカルバモイル基、sec-ヘプチルカルバモイル基、tert-ヘプチルカルバモイル基、ネオヘプチルカルバモイル基、n-オクチルカルバモイル基、イソオクチルカルバモイル基、sec-オクチルカルバモイル基、tert-オクチルカルバモイル基、ネオオクチルカルバモイル基、n-ノニルカルバモイル基、イソノニルカルバモイル基、sec-ノニルカルバモイル基、tert-ノニルカルバモイル基、ネオノニルカルバモイル基、n-デシルカルバモイル基、イソデシルカルバモイル基、sec-デシルカルバモイル基、tert-デシルカルバモイル基、ネオデシルカルバモイル基、シクロプロピルカルバモイル基、シクロブチルカルバモイル基、シクロペンチルカルバモイル基、シクロヘキシルカルバモイル基、シクロヘキシルメチルカルバモイル基、シクロヘプチルカルバモイル基、シクロオクチルカルバモイル基、シクロノニルカルバモイル基、シクロデシルカルバモイル基等が挙げられ、中でもシクロヘキシルカルバモイル基が好ましい。【００２７】
一般式［４］に於いて、Ｒ４で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１５、好ましくは３〜１２のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、3-メチルペンチル基、2-メチルペンチル基、1,2-ジメチルブチル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、2-エチルヘキシル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、シクロドデシル基、シクロウンデシル基、シクロトリデシル基、シクロテトラデシル基、シクロペンタデシル基等が挙げられ、中でも、例えばtert-ブチル基、シクロヘキシル基、2-エチルヘキシル基、n-ドデシル基等が好ましい。【００２８】
Ｒ４で示されるハロアルキル基としては、炭素数１〜１２のアルキル基中の水素原子の一部又は全部がハロゲン原子（例えばフッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、中でもフッ素原子が好ましい。）で置換されたものが挙げられ、通常炭素数１〜１２、好ましくは１〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフルオロメチル基、クロロメチル基、ブロモメチル基、ヨードメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、トリブロモメチル基、2-フルオロエチル基、2-クロロエチル基、2-ブロモエチル基、3-フルオロプロピル基、3-クロロプロピル基、3-ブロモプロピル基、トリフルオロプロピル基、トリクロロプロピル基、トリブロモプロピル基、ジ（トリフルオロメチル）メチル基、ジ（トリクロロメチル）メチル基、ジ（トリブロモメチル）メチル基、ヘプタフルオロプロピル基、ヘプタクロロプロピル基、4-フルオロブチル基、4-クロロブチル基、4-ブロモブチル基、ノナフルオロブチル基、ノナクロロブチル基、ノナブロモブチル基、5-フルオロペンチル基、5-クロロペンチル基、5-ブロモペンチル基、2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル基（−ＣＨ２(ＣＦ２)４Ｈ）、2,2,3,3,4,4,5,5-オクタクロロペンチル基（−ＣＨ２(ＣＣｌ２)４Ｈ）、2,2,3,3,4,4,5,5-オクタブロモペンチル基（−ＣＨ２(ＣＢｒ２)４Ｈ）、パーフルオロペンチル基、パークロロペンチル基、パーブロモペンチル基、6-フルオロヘキシル基、6-クロロヘキシル基、6-ブロモヘキシル基、パーフルオロヘキシル基、パークロロヘキシル基、パーブロモヘキシル基、パーフルオロへプチル基、パークロロヘプチル基、パーブロモヘプチル基、パーフルオロオクチル基、パークロロオクチル基、パーブロモオクチル基、パーフルオロノニル基、パークロロノニル基、パーブロモノニル基、ヘプタデカフルオロオクチルエチル基（−(ＣＨ２)２(ＣＦ２)７ＣＦ３基）、ヘプタデカクロロオクチルエチル基（−(ＣＨ２)２(ＣＣｌ２)７ＣＣｌ３基）、ヘプタデカブロモオクチルエチル基（−(ＣＨ２)２(ＣＢｒ２)７ＣＢｒ３基）、パーフルオロデシル基、パークロロデシル基、パーブロモデシル基、パーフルオロウンデシル基、パークロロウンデシル基、パーブロモウンデシル基、パーフルオロドデシル基、パークロロドデシル基、パーブロモドデシル基等が挙げられ、中でも、例えばジ（トリフルオロメチル）メチル基、2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル基、ヘプタデカフルオロオクチルエチル基等が好ましい。【００２９】
一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメントとしては、例えば一般式［５］
2007007443.tif 000008
【００３０】
（式中、Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ６はシアノ基又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｅ１は炭素数１〜６のアルキレン基を表し、ｋは１０〜２５０の整数を表す。）で示されるもの等が挙げられる。【００３１】
一般式［５］に於いて、Ｒ５及びＲ６で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、直鎖状或いは分枝状でもよく、通常炭素数１〜３、好ましくは炭素数１のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。【００３２】
Ｒ５及びＲ６は、中でも、何れか一方がシアノ基であるのが好ましい。【００３３】
Ｅ１で示される炭素数１〜６のアルキレン基としては、直鎖状又は分枝状でもよく、通常炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数２のものが挙げられ、具体的には、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等の直鎖状アルキレン基、例えばエチリデン基、プロピレン基、イソプロピリデン基、エチルエチレン基、1-メチルトリメチレン基、2-メチルトリメチレン基、1-メチルテトラメチレン基、2-メチルテトラメチレン基、1-メチルペンタメチレン基、2-メチルペンタメチレン基、3-メチルペンタメチレン基等の分枝状アルキレン基等が挙げられ、中でも、エチレン基が好ましい。【００３４】
ｋは通常１０〜２５０、好ましくは２０〜２００、より好ましくは４０〜１５０の整数である。【００３５】
一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式［２］で示されるモノマー単位及び一般式［３］で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマー（本発明に係るポリマー）としては、例えば一般式［６］
2007007443.tif 000009
【００３６】
（式中、Ｒ７は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ８はシアノ基又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｅ２は炭素数１〜６のアルキレン基を表し、ｎは５０〜９００の整数を表し、ｐは５０〜９００の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、Ｒ１〜Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｅ１及びｋは前記に同じ。）で示されるもの等が挙げられる。【００３７】
一般式［６］に於いて、Ｒ７及びＲ８で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、直鎖状或いは分枝状でもよく、通常炭素数１〜３、好ましくは炭素数１のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。【００３８】
Ｒ７及びＲ８は、中でも、何れか一方がシアノ基であるのが好ましい。【００３９】
Ｅ２で示される炭素数１〜６のアルキレン基としては、直鎖状又は分枝状でもよく、通常炭素数１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは２のものが挙げられ、具体的には、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等の直鎖状アルキレン基、例えばエチリデン基、プロピレン基、イソプロピリデン基、エチルエチレン基、1-メチルトリメチレン基、2-メチルトリメチレン基、1-メチルテトラメチレン基、2-メチルテトラメチレン基、1-メチルペンタメチレン基、2-メチルペンタメチレン基、3-メチルペンタメチレン基等の分枝状アルキレン基等が挙げられ、中でも、エチレン基が好ましい。【００４０】
ｎ及びｐは、夫々独立して通常２０〜１０００、好ましくは５０〜９００、より好ましくは７５〜６００の整数である。【００４１】
ｍは、通常１〜１０、好ましくは２〜６の整数である。【００４２】
本発明に係るポリマーの重合平均分子量は、通常10,000〜120,000、好ましくは30,000〜100,000である。【００４３】
また、本発明に係るポリマーに於ける一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメントの含有量は、通常１〜７０重量％、好ましくは１０〜５０重量％である。【００４４】
更に、本発明に係るポリマーに於ける一般式［２］及び［３］で示されるモノマー単位の含有量は、夫々通常２０〜８５重量％、好ましくは５０〜８５重量％である。【００４５】
１−２．製造法
一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式［２］で示されるモノマー単位及び一般式［３］で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマー（本発明に係るポリマー）は、例えば一般式［１０］
2007007443.tif 000010
【００４６】
（式中、Ｒ５〜Ｒ８、Ｅ１、Ｅ２及びｋは前記に同じ。）で示されるモノマー単位を有するアゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントの共存下に、一般式［１１］
2007007443.tif 000011
【００４７】
（式中、Ｒ１は前記に同じ。）で示される化合物及び一般式［１２］
2007007443.tif 000012
【００４８】
（式中、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。）で示される化合物を共重合することにより得られる。【００４９】
一般式［１１］で示される化合物の具体例としては、例えばアクリル酸、メタクリル酸等が挙げられる。【００５０】
一般式［１２］で示される化合物の具体例としては、例えばメタクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸2-エチルヘキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ヘプタデカフルオロオクチルエチル、メタクリル酸2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル等のメタクリル酸エステル類、例えばアクリル酸シクロヘキシル等のアクリル酸エステル類等のα,β-不飽和カルボン酸エステル類、例えばシクロヘキシルメタクリルアミド等のα,β-不飽和カルボン酸アミド類、例えばシクロヘキシルビニルエーテル等のビニルエーテル類、例えばビニルシクロヘキシル、アリルシクロヘキシル等のα,β-不飽和脂肪族炭化水素類、例えばアリルベンゼン等のα,β-不飽和芳香族炭化水素類等が挙げられる。【００５１】
一般式［１０］で示されるモノマー単位を有するアゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントは、市販品を用いても常法により適宜合成したものを用いてもよい。市販品を使用する場合の具体例としては、例えばＶＰＥ−０２０１、ＶＰＥ−０４０１、ＶＰＥ−０６０１等の高分子アゾ重合開始剤（和光純薬工業（株）製）等が挙げられる。【００５２】
また、常法により適宜合成したものを使用する場合の具体例としては、例えば特開平4-372675号公報等に記載の製造法に従って容易に製造することができる。即ち、例えば一般式［１３］
2007007443.tif 000013
【００５３】
（式中、ｋは前記に同じ。）で示されるポリエチレングリコールと、例えば一般式［１４］
2007007443.tif 000014
【００５４】
（式中、Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ５〜Ｒ８、Ｅ１及びＥ２は前記に同じ。）で示されるアゾ基含有ニ塩基酸ジハライドとを適当な溶媒中、要すれば塩基性触媒の存在下で反応させることにより得ることができる。【００５５】
また、一般式［１０］で示されるモノマー単位を有するアゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントは、例えば特開平6-93100号公報、特開平6-322089号公報等に記載の製造法に従って製造したものを用いてもよい。即ち、例えば上記一般式［１３］で示されるポリエチレングリコールと、一般式［１５］
2007007443.tif 000015
【００５６】
（式中、Ｒ５〜Ｒ８、Ｅ１及びＥ２は前記に同じ。）で示されるアゾ基含有二塩基酸とを適当な溶媒中、要すれば塩基性触媒の存在下、脱水剤を用いて反応させることによっても得ることができる。【００５７】
一般式［１４］に於いて、Ｘで示されるハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。【００５８】
上記製造法は、何れも塩基性触媒の存在下で行うのが好ましく、使用する塩基性触媒の具体例としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピペリジン、ピリジン、4-ジメチルアミノピリジン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、トリ-ｎ-ブチルアミン、Ｎ-メチルモルホリン等の有機アミン類、例えば水素化ナトリウム等の金属水素化物類、例えばn-ブチルリチウム、tert-ブチルリチウム等の塩基性アルカリ金属化合物類等が挙げられる。【００５９】
塩基性触媒の使用量としては特に限定されるものではないが、一般式［１４］で示されるアゾ基含有二塩基酸ジハライド、［１５］で示されるアゾ基含有二塩基酸或いは脱水剤に対して通常0.5〜５倍モル、好ましくは0.5〜1.5倍モルの範囲から適宜選択される。【００６０】
また、当該ポリエチレングリコールと一般式［１５］で示されるアゾ基含有二塩基酸とを反応させる方法に於いて使用される脱水剤の具体例としては、脱水縮合剤として用いられるものであれば特に限定されないが、例えば濃硫酸、五酸化二リン、無水塩化亜鉛等の無機脱水剤類、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド)塩酸塩等のカルボジイミド類、ポリリン酸、無水酢酸、カルボニルジイミダゾール、p-トルエンスルホニルクロライド等が挙げられる。【００６１】
脱水剤の使用量としては特に限定されるものではないが、少ないと反応が遅くなり、且つ到達分子量も小さくなり、多すぎると短時間で高分子量になるが分子量の制御が困難となり、且つ、経済的でないため、相当するアゾ基含有二塩基酸に対して通常１〜５倍モル、好ましくは２〜３倍モルの範囲から適宜選択される。【００６２】
反応溶媒としては、どちらの方法に於いても例えばジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン等のエーテル類、例えば四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素類、例えばｎ-ヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン等の炭化水素類、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等のエステル類、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド等が挙げられる。これらは夫々単独で用いても、二種以上適宜組み合わせて用いてもよい。【００６３】
一般式［１３］で示されるポリエチレングリコールと、一般式［１４］で示されるアゾ基含有二塩基酸ジハライド或いは一般式［１５］で示されるアゾ基含有二塩基酸との使用割合は特に限定されず必要に応じて適宜決定されるが、高分子量のアゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントを得るには両者をほぼ等モル量用いることが好ましい。【００６４】
反応温度は、特に限定されないが、あまり高いとアゾ基が分解し、低すぎると反応速度が遅くなり製造に時間を要し、且つ高分子量のアゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントが得られ難くなるため、通常−10〜60℃の範囲から適宜選択される。また、反応温度は低温から段階的に温度を上昇させる方法をとってもよい。【００６５】
反応時間は製造方法により異なるが、通常１〜60時間の範囲から適宜選択される。【００６６】
目的物の単離は、使用した原料、塩基性触媒、脱水剤、溶媒等の種類や量並びに反応液の状態等に応じて適宜行えばよく、例えば粘稠な反応液の場合には、反応液を適当な溶媒で希釈した後、濾過或いは水洗等の操作により副生する第四級アンモニウム塩等の不純物を除いた後、溶媒を除去することにより目的のアゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントを得ることができる。また、得られた該アゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントは精製及び／又は単離することなく、そのまま重合反応に付してもよい。【００６７】
尚、原料として用いられる、上記一般式［１３］で示されるポリエチレングリコール、一般式［１４］で示されるアゾ基含有二塩基酸ジハライド又は一般式［１５］で示されるアゾ基含有二塩基酸は、市販品を用いても或いは常法により適宜製造したものを用いてもよい。【００６８】
本発明に係るポリマー、即ち、一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式［２］で示されるモノマー単位及び一般式［３］で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマーは、例えば親水性有機溶媒中、一般式［１０］で示されるアゾ基含有ポリエチレングリコールセグメント、一般式［１１］で示される化合物及び一般式［１２］で示される化合物を、得られるポリマーの主たる構成単位である一般式［１］で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式［２］で示されるモノマー単位及び一般式［３］で示されるモノマー単位の組成比が目的とする組成となるように夫々の使用量を選択設定して重合反応させ、得られる溶液から、不溶性有機溶剤を沈殿剤として用いて晶析、単離することにより得られる。【００６９】
重合溶媒としては、例えばアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、例えばメタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール等のアルコール類、例えばテトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン等の環状エーテル類、例えばN-メチルピロリドン、N,N'-ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の親水性有機溶媒が挙げられる。これらは単独で用いても２種類以上適宜組み合わせて用いてもよい。また、反応に影響が出ない範囲であれば、含水溶媒であってもよい。【００７０】
上記重合反応の方法としては、例えば懸濁重合、溶液重合、バルク重合、乳化重合等が挙げられる。この際アゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントと通常のラジカル重合開始剤（例えばアゾビスイソブチロニトリル、2,2'-アゾビスイソ酪酸ジメチル等）を併用してもよい。【００７１】
この共重合反応を行う際、必要に応じて連鎖移動剤（例えばラウリルメルカプタン、オクチルメルカプタン、ブチルメルカプタン、2-メルカプトエタノール、チオグリコール酸ブチル等）を添加し、分子量の調節を行ってもよい。【００７２】
重合反応時の濃度としては、当該アゾ基含有ポリシロキサンセグメント、一般式［２］及び一般式［３］で示される化合物の合計が通常５〜100重量％（無溶媒）、好ましくは５〜80重量％、より好ましくは10〜70重量％、更に好ましくは20〜50重量％の範囲となるよう適宜選択される。【００７３】
重合反応は、不活性ガス雰囲気下で行うことが望ましい。不活性ガスとしては、例えば窒素ガス、アルゴンガス等が挙げられる。【００７４】
重合温度は、高すぎると反応の制御が困難になり、低すぎると反応速度が遅くなり反応に時間を要するため、通常３０〜１２０℃、好ましくは６０〜１００℃である。また、重合反応の進行に合わせて重合温度を変化させ、反応の制御を行ってもよい。【００７５】
重合時間は、通常３〜２４時間、好ましくは５〜１５時間である。【００７６】
沈殿剤として用いる有機溶媒としては、生成したポリマーが不溶物として析出するものであれば特に限定されないが、例えばヘキサン、酢酸エチル、ジエチルエーテル等が挙げられる。これらは単独で用いても２種類以上適宜組み合わせて用いてもよい。更に、溶媒の使用量は、少なすぎると、得られる共重合体に含まれる残存重合溶媒の量や未反応の残存モノマーの量が多くなるため、通常重合溶媒の２倍容量以上、好ましくは３〜２０倍容量、より好ましくは５〜１０倍容量である。
尚、反応後の後処理等はこの分野に於いて通常行われる後処理法に準じてこれを行えばよい。【００７７】
１−３．ポリマーの性質
このようにして得られた本発明に係るポリマーは、例えば塗料用樹脂組成物、被覆用樹脂組成物等の樹脂組成物、例えば頭髪化粧料用基材（例えばセット剤、トリートメント剤等）、基礎化粧料用基材等の化粧料用基材等として、或いは、離型剤、コーティング剤、表面改質剤、医療材料等としての用途が期待されているが、中でも、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用添加剤として有用である。【００７８】
例えば本発明に係るポリマーは、当該ポリマーを構成するモノマー単位の組成比を適宜選択することにより、特定のリポ蛋白を保護し、当該特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害することができる。この性質を利用することにより、後述するように、特定のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することが可能となる。
尚、本発明に於いて「阻害」とは、保護された特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を、遅延ないしは一時的に停止させることを意味する。【００７９】
このような目的に使用可能なポリマーの好ましい具体例としては、 例えば下記(i)〜(iii)のみからなるポリマー（本発明のポリマー（ａ））が挙げられる。
(i)一般式［１］
2007007443.tif 000016
【００８０】
（式中、ｋは前記に同じ。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、
(ii)一般式［２］
2007007443.tif 000017
【００８１】
（式中、Ｒ１は前記に同じ。）で示されるモノマー単位、及び
(iii)メタクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸2-エチルヘキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ジ（トリフルオロメチル）メチル、メタクリル酸2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル、メタクリル酸ヘプタデカフルオロオクチルエチル、シクロヘキシルメタクリルアミド、アクリル酸シクロヘキシル、ビニルシクロヘキシル、アリルシクロヘキシル、シクロヘキシルビニルエーテル及びアリルベンゼンから選ばれる第３モノマー単位【００８２】
（１）ＨＤＬ保護ポリマー
例えば、ＨＤＬを保護し、ＨＤＬ中のコレステロールの反応を阻害するポリマーとしては、一般式［２］で示されるモノマー単位（モノマーＡ）と一般式［３］で示されるモノマー単位（モノマーＢ）との組成比が、通常２≦モノマーＢ／モノマーＡ、好ましくは２≦モノマーＢ／モノマーＡ≦３であって、一般式［２］で示されるモノマー単位と一般式［３］で示されるモノマー単位の合計(ＡＢ)と一般式［１］で示されるポリエチレングリコールセグメント（ＰＥＧ）との組成比は、通常１≦ＡＢ／ＰＥＧ≦１０、好ましくは２≦ＡＢ／ＰＥＧ≦５であるポリマーが好ましい。【００８３】
また、このようなポリマーとしては、例えば一般式［２］で示されるモノマー単位がアクリル酸又はメタクリル酸由来のものであり、一般式［３］で示されるモノマー単位が、一般式［７］
2007007443.tif 000018
【００８４】
（式中、Ｒ９は炭素数６〜１２のアルキル基、アルコキシ基、炭素数４〜１６のアルコキシカルボニル基、ハロアルコキシカルボニル基、アルキルカルバモイル基、アラルキル基又はボルニルオキシカルボニル基を表す。）で示されるものを構成成分として含んで成るポリマーが好ましい。【００８５】
一般式［７］に於いて、Ｒ９で示される炭素数６〜１２のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、具体的には、例えば上記一般式［３］に於けるＲ３で示されるアルキル基中の炭素数６〜１２のものの例示と同様のものが挙げられ、中でも、例えばシクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基等が好ましい。【００８６】
Ｒ９で示されるアルコキシ基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えば上記一般式［３］に於けるＲ３で示されるアルコキシ基の例示と同様のものが挙げられ、中でも、シクロヘキシルオキシ基が好ましい。【００８７】
Ｒ９で示される炭素数４〜１６のアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、具体的には、例えばn-プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、n-ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、sec-ブトキシカルボニル基、tert-ブトキシカルボニル基、ネオブトキシカルボニル基、n-ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、sec-ペンチルオキシカルボニル基、tert-ペンチルオキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、n-ヘキシルオキシカルボニル基、イソヘキシルオキシカルボニル基、sec-ヘキシルオキシカルボニル基、tert-ヘキシルオキシカルボニル基、ネオヘキシルオキシカルボニル基、n-ヘプチルオキシカルボニル基、イソヘプチルオキシカルボニル基、sec-ヘプチルオキシカルボニル基、tert-ヘプチルオキシカルボニル基、ネオヘプチルオキシカルボニル基、n-オクチルオキシカルボニル基、イソオクチルオキシカルボニル基、sec-オクチルオキシカルボニル基、tert-オクチルオキシカルボニル基、ネオオクチルオキシカルボニル基、2-エチルヘキシルオキシカルボニル基、n-ノニルオキシカルボニル基、イソノニルオキシカルボニル基、sec-ノニルオキシカルボニル基、tert-ノニルオキシカルボニル基、ネオノニルオキシカルボニル基、n-デシルオキシカルボニル基、イソデシルオキシカルボニル基、sec-デシルオキシカルボニル基、tert-デシルオキシカルボニル基、ネオデシルオキシカルボニル基、n-ウンデシルオキシカルボニル基、イソウンデシルオキシカルボニル基、sec-ウンデシルオキシカルボニル基、tert-ウンデシルオキシカルボニル基、ネオウンデシルオキシカルボニル基、n-ドデシルオキシカルボニル基、イソドデシルオキシカルボニル基、sec-ドデシルオキシカルボニル基、tert-ドデシルオキシカルボニル基、ネオドデシルオキシカルボニル基、n-トリデシルオキシカルボニル基、イソトリデシルオキシカルボニル基、sec-トリデシルオキシカルボニル基、tert-トリデシルオキシカルボニル基、ネオトリデシルオキシカルボニル基、n-テトラデシルオキシカルボニル基、イソテトラデシルオキシカルボニル基、sec-テトラデシルオキシカルボニル基、tert-テトラデシルオキシカルボニル基、ネオテトラデシルオキシカルボニル基、n-ペンタデシルオキシカルボニル基、イソペンタデシルオキシカルボニル基、sec-ペンタデシルオキシカルボニル基、tert-ペンタデシルオキシカルボニル基、ネオペンタデシルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、シクロヘキシルメトキシカルボニル基、シクロヘプチルオキシカルボニル基、シクロオクチルオキシカルボニル基、シクロノニルオキシカルボニル基、シクロデシルオキシカルボニル基、シクロウンデシルオキシカルボニル基、シクロドデシルオキシカルボニル基、シクロトリデシルオキシカルボニル基、シクロテトラデシルオキシカルボニル基、シクロペンタデシルオキシカルボニル基等が挙げられ、中でも、例えばtert-ブトキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、2-エチルヘキシルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基等が好ましい。【００８８】
Ｒ９で示されるハロアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数２〜１３のアルコキシカルボニル基の水素原子の一部又は全部がハロゲン原子（例えばフッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、中でもフッ素原子が好ましい。）で置換されたものが挙げられ、通常炭素数２〜１３、好ましくは２〜１１のものが挙げられ、具体的には、例えばフルオロメトキシカルボニル基、クロロメトキシカルボニル基、ブロモメトキシカルボニル基、ヨードメトキシカルボニル基、トリフルオロメトキシカルボニル基、トリクロロメトキシカルボニル基、トリブロモメトキシカルボニル基、2-フルオロエトキシカルボニル基、2-クロロエトキシカルボニル基、2-ブロモエトキシカルボニル基、3-フルオロプロポキシカルボニル基、3-クロロプロポキシカルボニル基、3-ブロモプロポキシカルボニル基、トリフルオロプロポキシカルボニル基、トリクロロプロポキシカルボニル基、トリブロモプロポキシカルボニル基、ジ（トリフルオロメチル）メトキシカルボニル基、ジ（トリクロロメチル）メトキシカルボニル基、ジ（トリブロモメチル）メトキシカルボニル基、ヘプタフルオロプロポキシカルボニル基、ヘプタクロロプロポキシカルボニル基、4-フルオロブトキシカルボニル基、4-クロロブトキシカルボニル基、4-ブロモブトキシカルボニル基、ノナフルオロブトキシカルボニル基、ノナクロロブトキシカルボニル基、ノナブロモブトキシカルボニル基、5-フルオロペンチルオキシカルボニル基、5-クロロペンチルオキシカルボニル基、5-ブロモペンチルオキシカルボニル基、2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチルオキシカルボニル基（−ＣＯＯＣＨ２(ＣＦ２)４Ｈ）、2,2,3,3,4,4,5,5-オクタクロロペンチルオキシカルボニル基（−ＣＯＯＣＨ２(ＣＣｌ２) ４Ｈ）、2,2,3,3,4,4,5,5-オクタブロモペンチルオキシカルボニル基（−ＣＯＯＣＨ２(ＣＢｒ２) ４Ｈ）、パーフルオロペンチルオキシカルボニル基、パークロロペンチルオキシカルボニル基、パーブロモペンチルオキシカルボニル基、6-フルオロヘキシルオキシカルボニル基、6-クロロヘキシルオキシカルボニル基、6-ブロモヘキシルオキシカルボニル基、パーフルオロヘキシルオキシカルボニル基、パークロロヘキシルオキシカルボニル基、パーブロモヘキシルオキシカルボニル基、パーフルオロへプチルオキシカルボニル基、パークロロヘプチルオキシカルボニル基、パーブロモヘプチルオキシカルボニル基、パーフルオロオクチルオキシカルボニル基、パークロロオクチルオキシカルボニル基、パーブロモオクチルオキシカルボニル基、パーフルオロノニルオキシカルボニル基、パークロロノニルオキシカルボニル基、パーブロモノニルオキシカルボニル基、ヘプタデカフルオロオクチルエトキシカルボニル基（−ＣＯＯ(ＣＨ２)２(ＣＦ２)７ＣＦ３基）、ヘプタデカクロロオクチルエトキシカルボニル基（−ＣＯＯ(ＣＨ２)２(ＣＣｌ２)７ＣＣｌ３基）、ヘプタデカブロモオクチルエトキシカルボニル基（−ＣＯＯ(ＣＨ２)２(ＣＢｒ２)７ＣＢｒ３基）、パーフルオロデシルオキシカルボニル基、パークロロデシルオキシカルボニル基、パーブロモデシルオキシカルボニル基、パーフルオロウンデシルオキシカルボニル基、パークロロウ���デシルオキシカルボニル基、パーブロモウンデシルオキシカルボニル基、パーフルオロドデシルオキシカルボニル基、パークロロドデシルオキシカルボニル基、パーブロモドデシルオキシカルボニル基等が挙げられ、中でも、例えばジ（トリフルオロメチル）メトキシカルボニル基、2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチルオキシカルボニル基、ヘプタデカフルオロオクチルエトキシカルボニル基が好ましい。【００８９】
Ｒ９で示されるアルキルカルバモイル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数２〜１１、好ましくは２〜７のものが挙げられ、具体的には、例えば上記一般式［３］に於けるＲ３で示されるアルキルカルバモイル基の例示と同様のものが挙げられ、中でもシクロヘキシルカルバモイル基が好ましい。【００９０】
Ｒ９で示されるアラルキル基としては、通常炭素数７〜１２のものが挙げられ、具体的には、例えば上記一般式［３］に於けるＲ３で示されるアラルキル基の例示と同様なものが挙げられ、中でもベンジル基が好ましい。【００９１】
一般式［７］で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えばメタクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸2-エチルヘキシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ジ（トリフルオロメチル）メチル、メタクリル酸ヘプタデカフルオロオクチルエチル、メタクリル酸2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル、シクロヘキシルメタクリルアミド、シクロヘキシルビニルエーテル、ビニルシクロヘキシル、アリルシクロヘキシル、アリルベンゼン等由来のものが挙げられる。【００９２】
（２）ＬＤＬ保護ポリマー
例えば、ＬＤＬを保護し、ＬＤＬ中のコレステロールの反応を阻害するポリマーとしては、一般式［２］で示されるモノマー単位（Ａ）と一般式［３］で示されるモノマー単位（Ｂ）との組成比が、通常Ｂ／Ａ≦１、好ましくは０．５≦Ｂ／Ａ≦１であって、一般式［２］で示されるモノマー単位と一般式［３］で示されるモノマー単位から成るコポリマー(ＡＢ)と一般式［１］で示されるポリエチレングリコールセグメント（PEG）との組成比は、通常１≦ＡＢ／PEG≦１０、好ましくは２≦ＡＢ／PEG≦５であるポリマーが好ましい。【００９３】
また、このようなポリマーとしては、例えば一般式［２］で示されるモノマー単位がメタクリル酸又はアクリル酸由来のものであり、一般式［３］で示されるモノマー単位が、一般式［８］
2007007443.tif 000019
【００９４】
（式中、Ｒ１０が炭素数１〜８のアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ２は前記に同じ。）で示されるものを構成成分として含んで成るポリマーが好ましい。【００９５】
一般式［８］に於いて、Ｒ１０で示される炭素数１〜８のアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜８のものが挙げられ、具体的には、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、n-プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、が挙げられ、中でも、例えばtert-ブトキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基等が好ましい。【００９６】
Ｒ１０で示される炭素数６〜１２のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、具体的には、例えば上記一般式［３］に於けるＲ３で示されるアルキル基中の炭素数６〜１２のものの例示と同様のものが挙げられ、中でもシクロヘキシル基が好ましい。【００９７】
Ｒ１０で示されるアルキルカルバモイル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数２〜１１、好ましくは２〜７のものが挙げられ、例えば上記一般式［３］に於けるＲ３で示されるアルキルカルバモイル基の例示と同様のものが挙げられ、中でもシクロヘキシルカルバモイル基が好ましい。【００９８】
一般式［８］で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えばメタクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル、シクロヘキシルメタクリルアミド、アクリル酸シクロヘキシル、ビニルシクロヘキシル等由来のものが挙げられ、中でも、例えばビニルシクロヘキシル、メタクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル、シクロヘキシルメタクリルアミド等がより好ましい。【００９９】
（３）ＨＤＬ・ＬＤＬ保護ポリマー
例えば、ＬＤＬとＨＤＬとを保護し、ＨＤＬ中のコレステロール及びＬＤＬ中のコレステロールの反応を阻害するポリマーとしては、一般式［２］で示されるモノマー単位（Ａ）と一般式［３］で示されるモノマー単位（Ｂ）との組成比が、通常１＜Ｂ／Ａ＜２であって、一般式［２］で示されるモノマー単位と一般式［３］で示されるモノマー単位から成るコポリマー(ＡＢ)と一般式［１］で示されるポリエチレングリコールセグメント（PEG）との組成比（ＡＢ／Ｃ）は、通常１≦ＡＢ／Ｃ≦１０、好ましくは２≦ＡＢ／Ｃ≦５であるポリマーが好ましい。【０１００】
また、このようなポリマーとしては、例えば一般式［２］で示されるモノマー単位がメタクリル酸由来のものであり、一般式［３］で示されるモノマー単位が、一般式［９］
2007007443.tif 000020
【０１０１】
（式中、Ｒ１１は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ２は前記に同じ。）で示されるものを構成成分として含んで成るポリマーが好ましい。【０１０２】
一般式［９］に於いて、Ｒ１１で示される炭素数１〜６のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、具体的には、例えば上記一般式［３］に於けるＲ３で示されるアルキル基中の炭素数１〜６のものの例示と同様なものが挙げられ、中でも、例えばtert-ブチル基、シクロヘキシル基等が好ましい。【０１０３】
一般式［９］で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えばメタクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル等由来のものが挙げられ、中でもメタクリル酸シクロヘキシル由来のものが好ましい。【０１０４】
２．本発明のリポ蛋白中のコレステロールの測定法
本発明のリポ蛋白中のコレステロールの測定法は、上記した如き本発明に係るポリマー（以下、単に「ポリマー」と略記する場合がある。）の存在下で、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定すればよい。【０１０５】
このような生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法としては、原理的には、生体由来試料中のコレステロールをＣＨＥと反応させて遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、次いで(a)ＣＯを反応させて生成する過酸化水素を測定するか、或いは(b)ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）を反応させて生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法が挙げられる。【０１０６】
より具体的には、酵素反応を利用する、(1)例えば生体由来試料中のコレステロールエステルをＣＨＥによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレステロールと共に、ＣＯによって酸化して、コレステ−４−エン−３−オンと過酸化水素とにし、ＰＯＤの存在下、生成した過酸化水素で被酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を酸化発色させて、生じた酸化色素を比色定量する酸化呈色法、(2)例えば生体由来試料中のコレステロールをＣＨＥによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレステロールと共にＣＨＤの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）と反応させて、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを340nmで測定する紫外部測定法等が挙げられる。【０１０７】
即ち、本発明の測定法は、これらの方法を行うに際して、反応系に、本発明に係るポリマーを存在（共存）させればよい。【０１０８】
尚、本発明の方法は、本発明に係るのポリマーを使用する以外は上記した如き方法に準じて実施すれば良く、また、上記した如き方法において使用される試薬類も使用可能である。【０１０９】
本発明の測定法は、より具体的には以下の２つの方法に大別される。【０１１０】
(1)本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法（直接法）
生体由来試料と本発明に係るポリマーとを接触させて、当該試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させ、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応によって生成される前記生成物を測定する。【０１１１】
(2)本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法（消去法）
先ず、生体由来試料と本発明に係るポリマーとを接触させて、当該試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させ、その結果として当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を先行させてこれらを消去（消費）し、しかる後、特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応によって生成される前記生成物を測定する。【０１１２】
２−１．直接法
上記した如き直接法としては、例えば以下の如き方法が挙げられる。【０１１３】
直接法(1)
本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料にＣＨＥとＣＯを作用させて過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素にＰＯＤと被酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を作用させて酸化色素を生じさせ、次いで吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。【０１１４】
直接法(2)
本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料にＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）を作用させてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じさせ、次いで吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。【０１１５】
上記直接法(1)及び直接法(2)において、吸光度を測定する時期は、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ＯＤnb）である。尚、当該吸光度を測定する時期は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。【０１１６】
また、上記直接法(1)及び直接法(2)において、本発明に係るポリマーを適宜選択して用いることにより、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することができる。例えば(1)前述した如きＨＤＬを保護するポリマーを用いることにより、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの量（ＬＤＬ―コレステロール及びＶＬＤＬ−コレステロールの量）を、(2)前述した如きＬＤＬを保護するポリマーを用いることにより、ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの量（ＨＤＬ―コレステロール及びＶＬＤＬ−コレステロールの量）を、また、(3)前述した如きＨＤＬ及びＬＤＬを保護するポリマーを用いることにより、ＨＤＬ及びＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの量（ＶＬＤＬ―コレステロールの量）を、それぞれ求めることができる。尚、これら本発明に係るポリマーの具体例、好ましい態様は前述した通りである。【０１１７】
２−２．消去法
上記した如き消去法としては、以下のように更に２つに大別される。【０１１８】
消去法(1)：生体由来試料と本発明に係るポリマーとを接触させた後、相異なる二つの時点での吸光度を測定する方法。【０１１９】
消去法(2)：本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを、本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白中のコレステロールの反応に関与しない別の反応に導いて消去（消費）する方法。【０１２０】
（１）消去法(1)
上記した如き消去法(1)としては、例えば以下の如き方法が挙げられる。【０１２１】
消去法(1)-a
本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料にＣＨＥとＣＯを作用させて過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素にＰＯＤと被酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を作用させて酸化色素を生じさせ、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。【０１２２】
消去法(1)-b
本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料にＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）を作用させてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じさせ、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。【０１２３】
上記消去法(1)-a及び(1)-bにおいて、相異なる二つの時点とは、(i)本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ＯＤnb）と、(ii)本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点（ＯＤt）、の二つの時点である。尚、これら二つの時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。【０１２４】
また、上記消去法(1)-a及び消去法(1)-bにおいて、本発明に係るポリマーを適宜選択して用いることにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することができる。例えば(1)前述した如きＨＤＬを保護するポリマーを用いることにより、ＨＤＬ―コレステロールの量を、(2)前述した如きＬＤＬを保護するポリマーを用いることにより、LＤＬ―コレステロールの量を、また、(3)前述した如きＨＤＬ及びＬＤＬを保護するポリマーを用いることにより、ＨＤＬ−コレステロール及びＬＤＬ―コレステロールの量を、それぞれ求めることができる。尚、これら本発明に係るポリマーの具体例、好ましい態様は前述した通りである。【０１２５】
上記消去法(1)-a及び消去法(1)-bにおいては、(i)本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した後、好ましくは本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ＯＤnb）の後に、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を復活（復帰）或いは促進し得る物質を反応系に共存させるのが好ましい。これにより阻害されていた特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応が復活（復帰）或いは促進されるので、より短時間に目的とする特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定を完了（終了）することができる。【０１２６】
また、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ＯＤnb）の後に、反応系のpHを変化させることによっても、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活（復帰）或いは促進し得る。【０１２７】
（２）消去法(2)
本発明の消去法(2)を実施するには、本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬の存在下、当該試薬と本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールとを反応させて、本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを、本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白中のコレステロールの反応に関与しない別の反応に導いて消去（消費）した後、本発明に係るポリマーにより保護された特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を実施すればよい。【０１２８】
例えば、このような本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬としては、(i)生体由来試料中のコレステロールをＣＨＥと反応させて遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、次いでＣＯを反応させて生成する過酸化水素を消去するための過酸化水素消去試薬、(ii)生体由来試料中のコレステロールをＣＨＥと反応させて遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）を反応させて生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消去するためのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消去試薬等が挙げられる。【０１２９】
過酸化水素消去試薬としては、例えばＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤ及びカップラーとの組合せ、ＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤ及びデベロッパーとの組合せ、ＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤ、カップラー及びデベロッパーの組合せ、ＣＨＥ、ＣＯ及びＣＡＴ等が挙げられ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消去試薬としては、ＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）の組合せが挙げられる。【０１３０】
このような本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬を用いる、本発明の消去法(2)は、例えば以下のように実施することができる。【０１３１】
消去法(2)-a
本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料にＣＨＥとＣＯを作用させて過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素にＰＯＤとカップラー（又はデベロッパー）、又はＣＡＴを作用させて、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去（消費）し、次いでデベロッパー（又はカップラー）、又はＣＡＴ阻害剤及び被酸化性呈色試薬を作用させて酸化色素を生じさせ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。【０１３２】
消去法(2)-b
本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料にＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）（或いはＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤ及びカップラー又は／及びデベロッパー）を作用させてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（或いは過酸化水素）を生じさせる反応系に導いて、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去（消費）した後、次いで、ＣＯ、ＰＯＤ、被酸化性呈色試薬及びＣＨＤ阻害剤（或いはＣＨＤ、ＮＡＤ（Ｐ）及びＣＯ阻害剤）を作用させて酸化色素（或いはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を生じさせ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。【０１３３】
上記消去法(2)-a及び(2)-bにおいては、一つの時点、即ち、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点（ＯＤb）のみの吸光度の測定によっても生体由来試料中の特定リポ蛋白中のコレステロール量を測定し得るが、より測定精度を上げるために、上記消去法(1)-a及び(1)-bと同様の相異なる二つの時点、即ち、(i)生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ＯＤbl）と、(ii)本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点（ＯＤb）での吸光度を測定するのが好ましい。尚、これら二つの時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。【０１３４】
また、上記消去法(2)-a及び消去法(2)-bにおいて、本発明に係るポリマーを適宜選択して用いることにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することができる。例えば(1)前述した如きＨＤＬを保護するポリマーを用いることにより、ＨＤＬ―コレステロールの量を、(2)前述した如きＬＤＬを保護するポリマーを用いることにより、LＤＬ―コレステロールの量を、また、(3)前述した如きＨＤＬ及びＬＤＬを保護するポリマーを用いることにより、ＨＤＬ−コレステロール及びＬＤＬ―コレステロールの量を、それぞれ求めることができる。尚、これら本発明に係るポリマーの具体例、好ましい態様は前述した通りである。【０１３５】
上記消去法(2)-a及び消去法(2)-bにおいては、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）された後、好ましくは生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ使用する本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前（ＯＤbl）に、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活（復帰）或いは促進し得る物質を反応系に共存させるのが好ましい。これにより阻害されていた特定のリポ蛋白の反応が復活（復帰）或いは促進されるので、より短時間に測定を完了（終了）することができる。【０１３６】
また、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ使用する本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ＯＤbl）の後に、反応系のpHを変化させることによっても、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活（復帰）或いは促進し得る。【０１３７】
２−３．具体的な測定法
（１）直接法〔直接法(1)及び(2)〕
本発明の直接法〔直接法(1)及び(2)〕は、１液法でも２液法でも或いはそれ以上の試液を用いる方法の何れでもよく、２液以上の試液を用いる方法においては、本発明に係るポリマーを、生体由来試料と直接混合させる試薬中に含有させればよい。尚、１液法の場合には、本発明に係るポリマー及びコレステロール測定用の試薬類の全てが当該試液に含まれることは言うまでもない。【０１３８】
以下に本発明の直接法〔直接法(1)及び(2)〕の具体例を示すが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。【０１３９】
１液法で行う場合は、例えば以下の如くである。【０１４０】
生体由来試料と、(1)本発明に係るポリマー、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、ＰＯＤ及び被酸化性呈色試薬〔又は(3)ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）〕及び(4)水性媒体を含んでなる試液とを混合した後に吸光度（ＯＤnb）を測定し、この吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）量を算出すればよい。【０１４１】
２液法で行う場合は、例えば以下の如くである。【０１４２】
生体由来試料と、(1)本発明に係るポリマー及び(2)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合し、その後、要すれば吸光度（ＯＤbl）を測定し、次いで、当該混合液と、(3)ＣＨＥ、(4)ＣＯ〔又は(4)ＣＨＤ〕及び(5)水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ＯＤnb）を測定し、この吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）量を算出すればよい。尚、第二試液にＣＯを含有させる場合には、ＰＯＤ及びカップラー、デベロッパーを、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させ、また、第二試液にＣＨＤを含有させる場合には、ＮＡＤ（Ｐ）を第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。【０１４３】
上記において、ＯＤnbを測定する時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。【０１４４】
また、上記の１液法において、生体由来試料と試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常15〜40℃、好ましくは25〜40℃、より好ましくは30℃〜40℃の範囲、反応時間は１〜20分、好ましくは２〜15分、より好ましくは３〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時のpHについても同様に、通常５〜11、好ましくは５〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは６〜８、特に好ましくは７付近の範囲から適宜設定すればよい。【０１４５】
上記の２液法において、生体由来試料と第一試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常15〜40℃、好ましくは25〜40℃、より好ましくは30℃〜40℃の範囲、反応時間は１〜20分、好ましくは２〜15分、より好ましくは３〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時のpHについても同様に、通常５〜11、好ましくは５〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは６〜８、特に好ましくは７付近の範囲から適宜設定すればよい。また、生体由来試料と第一試液との混合液と第二試液との反応条件についても同様であり、反応温度としては、通常15〜40℃、好ましくは25  〜40℃、より好ましくは30℃〜40℃の範囲、反応時間は１〜20分、好ましくは２〜15分、より好ましくは３〜10分の範囲から、また、反応時のpHについても同様に、通常５〜11、好ましくは５〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは６〜８、特に好ましくは７付近の範囲から例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。【０１４６】
（２）消去法(1)〔消去法(1)-a及び(1)-b〕
本発明の消去法(1)〔消去法(1)-a及び(1)-b〕は、１液法でも２液法でも或いはそれ以上の試液を用いる方法の何れでもよい。２液以上の試液を用いる方法においては、本発明に係るポリマーを、生体由来試料と直接混合させる試薬中に含有させればよく、また、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質を使用する場合には、当該物質を、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した後の時点で添加する試液中（例えば２液法の場合には第二試液）に含有させればよい。尚、１液法の場合には、本発明に係るポリマー及びコレステロール測定用の試薬類の全てが当該試液に含まれることは言うまでもない。【０１４７】
以下に本発明の消去法(1)〔消去法(1)-a及び(1)-b〕の具体例を示すが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。【０１４８】
１液法で行う場合は、例えば以下の如くである。【０１４９】
生体由来試料と、(1)本発明に係るポリマー、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、ＰＯＤ及び被酸化性呈色試薬〔又は(3)ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）〕及び(4)水性媒体を含んでなる試液とを混合し、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ使用する本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点で吸光度（ＯＤnb）を測定し、次いで、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点で吸光度（ＯＤt）を再度測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）量を算出すればよい。【０１５０】
２液法で行う場合は、例えば以下の如くである。【０１５１】
生体由来試料と、(1)本発明に係るポリマー及び(2)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合し、その後、要すれば吸光度（ＯＤbl）を測定し、次いで、当該混合液と、(3)ＣＨＥ、(4)ＣＯ〔又は(4)ＣＨＤ〕及び(5)水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ使用する本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点で吸光度（ＯＤnb）を測定し、次いで、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点で吸光度（ＯＤt）を再度測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）量を算出すればよい。尚、第二試液にＣＯを含有させる場合には、ＰＯＤ及びカップラー、デベロッパーを、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させ、また、第二試液にＣＨＤを含有させる場合には、ＮＡＤ（Ｐ）を第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。【０１５２】
また、例えば以下のようにしても２液法で本発明を実施することができる。【０１５３】
生体由来試料と、(1)本発明に係るポリマー、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、ＰＯＤ及び被酸化性呈色試薬〔又は(3)ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）〕及び(4)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合した後に吸光度（ＯＤnb）を測定し、次いで、当該混合液と、(4)特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質及び(5)水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ＯＤt）を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量）を算出すればよい。【０１５４】
上記において、ＯＤnbとＯＤtを測定する時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。【０１５５】
また、上記の１液法において、生体由来試料と試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常15〜40℃、好ましくは25〜40℃、より好ましくは30℃〜40℃の範囲、反応時間は１〜20分、好ましくは２〜15分、より好ましくは３〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時のpHについても同様に、通常５〜11、好ましくは５〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは６〜８、特に好ましくは７付近の範囲から適宜設定すればよい。【０１５６】
上記の２液法において、生体由来試料と第一試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常15〜40℃、好ましくは25〜40℃、より好ましくは30℃〜40℃の範囲、反応時間は１〜20分、好ましくは２〜15分、より好ましくは３〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時のpHについても同様に、通常５〜11、好ましくは５〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは６〜８、特に好ましくは７付近の範囲から適宜設定すればよい。また、生体由来試料と第一試液との混合液と第二試液との反応条件についても同様であり、反応温度としては、通常15〜40℃、好ましくは25〜40℃、より好ましくは30℃〜40℃の範囲、反応時間は１〜20分、好ましくは２〜15分、より好ましくは３〜10分の範囲から、また、反応時のpHについても同様に、通常５〜11、好ましくは５〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは６〜８、特に好ましくは７付近の範囲から例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。【０１５７】
（３）消去法(2)〔消去法(2)-a及び(2)-b〕
本発明の消去法(2)〔消去法(2)-a及び(2)-b〕は、通常２液法又はそれ以上の試液を用いる方法で行われる。２液以上の試液を用いる方法においては、本発明に係るポリマーを、生体由来試料と直接混合させる試薬中に含有させればよい。また、上記消去法(2)-aにおいては、ＰＯＤとカップラー、ＰＯＤとデベロッパー、又はＣＡＴを、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始するより前の時点で添加する試液中に含有させればよく、上記消去法(2)-bにおいては、ＰＯＤとカップラー又は／及びデベロッパー、又はＮＡＤ（Ｐ）を、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始するより前の時点で添加する試液中に含有させればよい。特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質を使用する場合には、当該物質を、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールが実質的に消去（消費）された後の時点で添加する試液中（例えば２液法の場合には第二試液）に含有させればよい。【０１５８】
以下に本発明の消去法(2)〔消去法(2)-a及び(2)-b〕の具体例を示すが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。【０１５９】
例えば以下のようにして、消去法(2)-aを実施することができる。【０１６０】
生体由来試料と、(1)本発明に係るポリマー、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、(4)ＰＯＤとカップラー（又はデベロッパー）〔或いは(4)ＣＡＴ〕、及び(5)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合し、その後、要すれば吸光度（ＯＤbl）を測定し、次いで、当該混合液と、(6)デベロッパー（又はカップラー）〔或いは(6)ＣＡＴ阻害剤〕、(7)水性媒体及び要すれば(8)特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ＯＤb）を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）量を算出すればよい。尚、第一試液にＣＡＴを含有させる場合には、ＰＯＤ、カップラー、デベロッパーは、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。また、ＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。【０１６１】
例えば以下のようにして、消去法(2)-bを実施することができる。【０１６２】
生体由来試料と、(1)本発明に係るポリマー、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、ＰＯＤ、及びカップラー又は／及びデベロッパー〔或いは(3)ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）〕、及び(5)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合し、その後、要すれば吸光度（ＯＤbl）を測定し、次いで、当該混合液と、(6)ＣＨＤ、ＮＡＤ（Ｐ）及びＣＯ阻害剤〔或いは(6)ＣＯ、ＰＯＤ、被酸化性呈色試薬及びＣＨＤ阻害剤〕及び(7)水性媒体、要すれば(8)特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ＯＤb）を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量）を算出すればよい。【０１６３】
上記において、ＯＤbを測定する時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。【０１６４】
また、上記において、生体由来試料と第一試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常15〜40℃、好ましくは25〜40℃、より好ましくは30℃〜40℃の範囲、反応時間は１〜20分、好ましくは２〜15分、より好ましくは３〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時のpHについても同様に、通常５〜11、好ましくは５〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは６〜８、特に好ましくは７付近の範囲から適宜設定すればよい。また、生体由来試料と第一試液との混合液と第二試液との反応条件についても同様であり、反応温度としては、通常15〜40℃、好ましくは25〜40℃、より好ましくは30℃〜40℃の範囲、反応時間は１〜20分、好ましくは２〜15分、より好ましくは３〜10分の範囲から、また、反応時のpHについても同様に、通常５〜11、好ましくは５〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは６〜８、特に好ましくは７付近の範囲から例えば各リポ蛋白分画に対する反応性（反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。【０１６５】
（４）リポ蛋白中のコレステロール量の算出
上記した如き本発明の方法において、得られた吸光度に基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量を算出するには、例えば以下の如くして行えばよい。【０１６６】
直接法〔直接法(1)及び(2)〕
(1)ＯＤnbを、例えば予め、濃度既知の、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール（本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度とＯＤnbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。【０１６７】
(2)ＯＤnbからＯＤbl〔又はＯＤblに由来する値（例えばＯＤblに液量補正係数を掛けて求めた値）〕を差し引いた吸光度（ＯＤtv）を求め、得られたＯＤtvを、例えば予め、濃度既知の、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール（本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度とＯＤtvとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。【０１６８】
消去法(1)〔直接法(1)-a及び(1)-b〕
(1)ＯＤtからＯＤnb〔又はＯＤnbに由来する値（例えばＯＤnbに液量補正係数を掛けて求めた値）〕を差し引いた吸光度（ＯＤcb）を求め、得られたＯＤcbを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール（本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ中のコレステロール）を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度とＯＤcbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。【０１６９】
(2)ＯＤnbからＯＤbl〔又はＯＤblに由来する値（例えばＯＤblに液量補正係数を掛けて求めた値）〕を差し引いた吸光度（ＯＤcnb）と、ＯＤtからＯＤbl〔又はＯＤblに由来する値（例えばＯＤblに液量補正係数を掛けて求めた値）〕を差し引いた吸光度（ＯＤct）を求め、更にＯＤctからＯＤcnbを差し引いた吸光度（ＯＤcb）を求める。得られたＯＤcbを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール（本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白中のコレステロール）を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度とＯＤcbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。【０１７０】
消去法(2)〔直接法(2)-a及び(2)-b〕
(1)ＯＤbを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール（本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ中のコレステロール）を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度とＯＤbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。【０１７１】
(2)ＯＤbからＯＤbl〔又はＯＤblに由来する値（例えばＯＤblに液量補正係数を掛けて求めた値）〕を差し引いた吸光度（ＯＤcb）を求め、得られたＯＤcbを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール（本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白中のコレステロール）を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度とＯＤcbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。【０１７２】
２−４．各構成要件の態様及び使用濃度
以下に本発明における各構成要件の好ましい態様、具体例及びその使用濃度等について説明する。【０１７３】
（１）本発明に係るポリマー
本発明のポリマーの好ましい態様、具体例は前述した通りである。【０１７４】
また、本発明に係るポリマーの使用濃度としては、特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害させて、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を先行させ得る濃度であればよく、生体由来試料と直接混合させる試液中の濃度として、通常0.001％〜10％（W/V）、好ましくは0.05％〜２％（W/V）である。尚、これら本発明のポリマーは単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせて用いてもよい。【０１７５】
（２）ＣＯ
本発明において用いられるＣＯとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来するもの等が挙げられる。ＣＯの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.03〜330u／ml、好ましくは0.07〜130u／ml、より好ましくは0.13〜65u／mlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常0.02〜250u／ml、好ましくは0.05〜100u／ml、より好ましくは0.1〜50u／mlである。
尚、一液法の場合は、上記最終の反応液中の濃度範囲から適宜選択される。（以下、同様。）【０１７６】
（３）ＣＨＥ
本発明において用いられるＣＨＥとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、キャンディダ属、シュードモナス属等の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来するもの等が挙げられる。ＣＨＥの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.03〜330u／ml、好ましくは0.07〜130u／ml、より好ましくは0.13〜65u／mlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常0.02〜250u／ml、好ましくは0.05〜100u／ml、より好ましくは0.1〜50u／mlである。【０１７７】
（４）ＰＯＤ
本発明において用いられるＰＯＤとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、西洋ワサビ、大豆、大根等の植物に由来するもの、カビ、酵母等の微生物に由来するもの、動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が挙げられる。ＰＯＤの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.1〜1000u／ml、好ましくは0.25〜400u／ml、より好ましくは0.5〜200u／mlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常0.1〜250u／ml、好ましくは0.25〜100u／ml、より好ましくは0.5〜50u／mlである。【０１７８】
（５）被酸化性呈色試薬
本発明において用いられる被酸化性呈色試薬としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して呈色するものであればよく、例えば4-アミノアンチピリン（以下、４−ＡＡと略記する。）等のカップラー及び、該カップラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合せ、即ち、例えば４−ＡＡとフェノール系化合物、ナフトール系化合物若しくはアニリン系化合物の組合せ、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物の組合せ等や、例えば2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、o-フェニレンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する発色剤等が挙げられる。【０１７９】
デベロッパーとしてのフェノール系化合物の具体例としては、例えばフェノール、p-クロロフェノール、2,4-ジクロロフェノール等が挙げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば1-ナフトール、1-ナフトール-2-スルホン酸、1-ナフトール-2-カルボン酸等が挙げられ、また、アニリン系化合物の具体例としては、例えばN,N-ジエチルアニリン、N-エチル-N-(β-ヒドロキシエチル)-m-トルイジン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシ-4-フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジン（ＴＯＯＳ）、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N'-サクシニル-エチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、N-(3-スルホプルピル)-3-メトキシ-5-メチルアニリン（ＨＭＭＰＳ）等が挙げられる。【０１８０】
カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場合、カップラーの使用量としては、用いるカップラーの種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なるが、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.01〜400mM、好ましくは0.1〜40mM、より好ましくは0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.01〜100mM、好ましくは0.1〜10mMの範囲である。また、カップラーとして４−ＡＡを使用する場合の使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.01〜200mM、好ましくは0.1〜40mM、より好ましくは0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜５mMである。【０１８１】
また、デベロッパーの使用量としては、用いるデベロッパーの種類や組み合わせるカップラーの種類等により異なるため一概には言えないが、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.01〜200mM、好ましくは0.1〜40mM、より好ましくは0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜５mMである。【０１８２】
トリフェニルメタン系ロイコ色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリーン、ビス(p-ジエチルアミノフェニル)-2-スルホフェニルメタン、ビス(p-ジエチルアミノフェニル)-3,4-ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナトリウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体例としては、例えばビス〔4-ジ(2-ブトキシエチル)アミノ-2-メチルフェニル〕アミン、N,N-ビス(4-ジエチルアミノ-2-メチルフェニル)-N'-p-トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば10-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン・ナトリウム塩、10-〔3-(メトキシカルボニルアミノメチル)フェニルメチルアミノカルボニル〕-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン等が挙げられる。更に、ベンジジン誘導体の具体例としては、例えばベンジジン、o-トリジン、o-ジアニシジン、3,3'-ジアミノベンジジン、3,3',5,5'-テトラアミノベンジジン等が挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例としては、例えば2-(4-カルボキシフェニル)-3-N-メチルカルバモイル-4,5-ビス(4-ジエチルアミノフェニル)イミダゾール、2-(3-メトキシ-4-ジエチルアミノフェニル)3-N-メチルカルバモイル-4,5-ビス(2-メチル-4-ジエチルアミノフェニル)イミダゾール等が挙げられる。【０１８３】
これら発色剤の使用量としては、通常この分野で用いられる濃度範囲である。【０１８４】
（６）ＣＡＴ
本発明において用いられるＣＡＴとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、牛肝臓等の動物臓器に由来するもの、クロロプラスト等の植物に由来するもの、ミクロコッカス属、ロドシュードモナス属等の微生物に由来するもの等が挙げられる。ＣＡＴの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常10〜50000u／ml、好ましくは100〜5000u／ml、より好ましくは50〜2000u／mlである。【０１８５】
（７）ＣＨＤ
本発明において用いられるＣＨＤは、通常この分野で使用されているもの、例えば、ノカルディア属に由来するもの等が挙げられる。ＣＨＤの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.1〜150u／ml、好ましくは0.3〜100u／ml、より好ましくは0.5〜60u／mlであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.1〜100u／ml、好ましくは0.5〜50u／mlである。【０１８６】
（８）ＮＡＤ（Ｐ）
本発明において用いられるＮＡＤ（Ｐ）は、通常この分野で使用されているもの、例えば、酵母に由来するもの等が挙げられる。ＮＡＤ（Ｐ）の使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.2〜70mM、好ましくは0.5〜50mM、より好ましくは１〜20mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.2〜50mM、好ましくは１〜10mMである。【０１８７】
（９）ＣＡＴ阻害剤
本発明において用いられるＣＡＴ阻害剤としては、通常この分野で使用されているもの、例えばＮａＮ3、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール等が挙げられる。これらＣＡＴ阻害剤の使用量としては、用いるＣＡＴ阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例えば２液法に於ける第二試液中の濃度として、通常0.01〜10％（W/V）、好ましくは0.02〜５％（W/V）、より好ましくは0.03〜３％（W/V）である。【０１８８】
（１０）ＣＯ阻害剤
本発明において用いられるＣＯ阻害剤としては、通常この分野で使用されているもの、例えばＡｇ＋イオン、Ｚｎ２＋イオン、グルタチオン等が挙げられる。これらＣＯ阻害剤の使用量としては、用いるＣＯ阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例えば２液法に於ける第二試液中の濃度として、通常0.00002〜40％（W/V）、好ましくは0.0002〜４％（W/V）、より好ましくは0.002〜0.4％（W/V）である。【０１８９】
（１１）ＣＨＤ阻害剤
本発明において用いられるＣＨＤ阻害剤としては、通常この分野で使用されているもの、例えばＡｇ＋イオン、Ｚｎ２＋イオン等が挙げられる。これらＣＨＤ阻害剤の使用量としては、用いるＣＨＤ阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例えば２液法に於ける第二試液中の濃度として、通常0.00001〜70％（W/V）、好ましくは0.0001〜７％（W/V）、より好ましくは0.001〜0.7％（W/V）である。【０１９０】
（１２）水性媒体
本発明において用いられる水性媒体としては、水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液を構成する緩衝剤としては、pH５〜11の範囲で緩衝作用を有し、コレステロール測定反応を阻害しないものであればよく、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩衝剤（ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等）、リン酸塩、ホウ酸塩、イミダゾール等、通常この分野で用いられるものが挙げられ、その使用濃度としては、通常１mM〜２Ｍ、好ましくは10mM〜１Ｍの範囲であり、また、pHは、通常５〜11、好ましくは５〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは６〜８、特に好ましくは７付近である。【０１９１】
また、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ使用する本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ＯＤbl）の後に、反応系のpHを変化させることによって、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活（復帰）或いは促進させる場合には、生体由来試料と直接混合させる本発明に係るポリマーを含む試液（例えば第一試液）のpHを、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した後の時点で添加する試液（例えば第二試液）のpHよりも、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る程度高く、または低くすればよい。具体的には、使用する本発明に係るポリマーの種類や濃度等によって異なるため一概には言えないが、これら試液間でのpHの差は、通常0.5〜３、好ましくは１〜３である。【０１９２】
（１３）特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質
本発明において用いられる、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質としては、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応を復活（復帰）或いは促進し得る性質を有するものであればよい。【０１９３】
このような性質を有する物質としては、例えば、上記した如き性質を有するものであって、自体公知の総コレステロール測定方法（試薬）で使用される非イオン性界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤が使用できる。【０１９４】
非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル〔ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル等〕、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル〔ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等〕、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル〔ポリエチレングリコールモノラウレート、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールジステアレート、ポリエチレングリコールモノオレエート等〕、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル〔ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等〕、ソルビタン脂肪酸エステル〔ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等〕、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル〔テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット等〕、ポリオキシエチレンアルキルアミン〔ポリオキシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等〕、グリセリン脂肪酸エステル〔ステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等〕等が挙げられる。【０１９５】
陰イオン性界面活性剤としては、例えばコール酸およびその誘導体〔コール酸、デオキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル硫酸塩、ラウロイルサルコシン等〕等が挙げられる。【０１９６】
両性界面活性剤としては、例えばアルキルベタイン誘導体〔ラウリルベタイン、ステアリルベタイン、ラウリルジメチルアンモニウムベタイン、ココナットベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミドプロピルベタイン等〕、イミダゾリニウムベタイン誘導体〔2-ラウリル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、2-ウンデシル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等の2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン；2-アルキル-N-カルボキシエチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等〕、スルホベタイン誘導体〔N-オクチル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸、N-デシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸、N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸、N-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸等〕等のベタイン誘導体；例えばアルキルグリシン、アルキルビス(アミノエチル)グリシン、ジオクチルポリアミノエチルグリシン、N-アルキルポリアミノエチルグリシン、β-アラニン誘導体等のアミノカルボン酸誘導体；例えばビス(2-ウンデシル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリン)クロル酢酸錯体、アルキルイミダゾリン誘導体等のイミダゾリン誘導体；例えばラウリルジメチルアミンオキサイド等のアミンオキサイド誘導体等が挙げられる。【０１９７】
上記した如き界面活性剤の中でも、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤が好ましい。【０１９８】
上記した如き界面活性剤の使用濃度としては、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応を復活（復帰）或いは促進し得る濃度であればよく、使用する本発明のポリマーの種類やその使用濃度、界面活性剤の種類等により異なる為一概には言えないが、２液法で用いる場合、第一試液と第二試液の液量比等により異なるが、第二試液中の濃度としては、通常0.01〜20％（W/V）、好ましくは0.05〜５％（W/V）である。
尚、これら界面活性剤は単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせて用いてもよい。【０１９９】
（１４）その他の試薬類
本発明においては、上記した如き試薬類（構成要件）以外にも、通常この分野で用いられている試薬類が使用可能である。【０２００】
このような試薬類としては、例えばアスコルビン酸、溶血、ビリルビン等の共存物質の影響回避（例えばアスコルビン酸オキシダーゼ、銅イオン等の金属イオン、フェロシアン化カリウム等）、高トリグリセライド検体等による乳びの影響回避剤（例えば界面活性剤、NaCl、KCl等の塩類、例えばLPL等の酵素等）及び反応促進剤（例えば界面活性剤、金属イオン等）、酵素等の安定化剤（例えば牛アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質、例えばグルタミン酸等の各種アミノ酸類、例えばブドウ糖等の各種糖類等）、各種塩類（例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム等）、抗酸化性物質（例えばマンニトール等）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ等）、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム等）、吸着防止剤〔例えばＰＭＰＣ、ＰＭＢ８２、ＰＭＢ８２−１Ｍ、ＰＭＢ３７、ＰＭＣ１８９１、ＰＭＣ１８８２、ＰＭＢｚ８２等の特開2003-344413号公報記載のＭＰＣポリマー〕等が挙げられる。
尚、上記した如きその他の試薬類の使用濃度は、自体公知の方法に従い適宜選択すればよい。【０２０１】
（１５）生体由来試料
本発明が適用される生体由来試料としては、例えば血清、血漿等の生体由来試料、及びこれらを水、生理食塩水や通常この分野で用いられている例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液等に適宜溶解させて再構成して得られた処理物等が挙げられる。【０２０２】
３．本発明のリポ蛋白中のコレステロールの測定用試薬及びキット
本発明の試薬及びキットは、上記した如き本発明の測定法を実施するために使用されるものであり、本発明に係るポリマーを用いる以外は、上記した如き生体由来試料中のコレステロールを測定する方法に使用される試薬類（構成要件）を、通常この分野で使用される濃度範囲で含有するように調製されたものでよく、構成要件の好ましい態様や使用濃度等は、前述した通りである。【０２０３】
より具体的には、本発明の試薬及びキットは、例えば以下の如き試薬類（構成要件）を主成分として含むものであり、これら以外にその他の試薬類を含有していてもよい。【０２０４】
（１）直接法用試薬・キット
上記した如き本発明の直接法用の試薬・キットとしては、例えば以下の如き試薬類（構成要件）を主成分として含むものが挙げられる。【０２０５】
直接法(1)用試薬・キット（一液法）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＯ
・ＰＯＤ
・被酸化性呈色試薬（カップラー及びデベロッパー）
・水性媒体【０２０６】
直接法(1)用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・水性媒体
（第二試液）
・ＣＨＥ
・ＣＯ
・水性媒体
尚、上記の場合には、ＰＯＤ、カップラー及びデベロッパーは、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。【０２０７】
直接法(2)用試薬・キット（一液法）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＨＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）
・水性媒体【０２０８】
直接法(2)用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・水性媒体
（第二試液）
・ＣＨＥ
・ＣＨＤ
・水性媒体
尚、上記の場合には、ＮＡＤ（Ｐ）は、第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。【０２０９】
（２）消去法(1)用試薬・キット
上記した如き本発明の消去法(1)用の試薬・キットとしては、例えば以下の如き試薬類（構成要件）を主成分として含むものが挙げられる。【０２１０】
消去法(1)-a用試薬・キット（一液法）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＯ
・ＰＯＤ
・被酸化性呈色試薬（カップラー及びデベロッパー）
・水性媒体【０２１１】
消去法(1)-b用試薬・キット（一液法）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＨＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）
・水性媒体【０２１２】
消去法(1)-a用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・水性媒体
（第二試液）
・ＣＨＥ
・ＣＯ
・水性媒体
尚、上記の場合には、ＰＯＤ、カップラー及びデベロッパーは、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。【０２１３】
消去法(1)-a用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＯ
・ＰＯＤ
・カップラー
・デベロッパー
・水性媒体
（第二試液）
・特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質（例えば界面活性剤）
・水性媒体【０２１４】
消去法(1)-b用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・水性媒体
（第二試液）
・ＣＨＥ
・ＣＨＤ
・水性媒体
尚、上記の場合には、ＮＡＤ（Ｐ）は、第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。【０２１５】
消去法(1)-b用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＨＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）
・水性媒体
（第二試液）
・特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質（例えば界面活性剤）
・水性媒体【０２１６】
（３）消去法(2)用試薬・キット
上記した如き本発明の消去法(2)用の試薬・キットとしては、例えば以下の如き試薬類（構成要件）を主成分として含むものが挙げられる。【０２１７】
消去法(2)-a用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＯ
・ＰＯＤ
・カップラー又はデベロッパー
・水性媒体
（第二試液）
・デベロッパー又はカップラー
・水性媒体
・要すれば、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質（例えば界面活性剤）
上記の場合には、ＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。【０２１８】
消去法(2)-a用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＯ
・ＣＡＴ
・水性媒体
（第二試液）
・ＣＡＴ阻害剤
・水性媒体
・要すれば、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質（例えば界面活性剤）
上記の場合には、ＰＯＤ、カップラー、デベロッパーは、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させ、また、ＣＨＥ、ＣＯは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。【０２１９】
消去法(2)-b用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＯ
・ＰＯＤ
・カップラー又は／及びデベロッパー
・水性媒体
（第二試液）
・ＣＨＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）
・ＣＯ阻害剤
・水性媒体
・要すれば、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質（例えば界面活性剤）
上記の場合には、ＣＨＥは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。【０２２０】
消去法(2)-b用試薬・キット（２液法）
（第一試液）
・本発明に係るポリマー
・ＣＨＥ
・ＣＨＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）
・水性媒体
（第二試液）
・ＣＯ
・ＰＯＤ
・ＣＨＤ阻害剤
・被酸化性呈色試薬（カップラー及びデベロッパー）
・水性媒体
・要すれば、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質（例えば界面活性剤）
上記の場合には、ＣＨＥは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。【０２２１】
また、当該キットには、必要に応じて、測定対象となるリポ蛋白中のコレステロール標準品等が組み合わされていてもよい。当該標準品は、例えばヒトや動物等の血清等を用いて調製された標準血清やこれらに由来する測定対象となるリポ蛋白分画を含有するもの等を使用することができる。尚、ここで、測定対象となるリポ蛋白質とは、例えば利用する測定法が本発明の直接法の場合には、本発明に係るポリマーによって保護されるリポ蛋白以外のリポ蛋白（本発明に係るポリマーによって反応が阻害される特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）を意味し、利用する測定法が本発明の消去法の場合には、本発明に係るポリマーによって保護されるリポ蛋白（本発明に係るポリマーによって反応が阻害される特定のリポ蛋白）を意味する。【０２２２】
更に、前述した如き本発明の測定法での使用のための説明書等を含ませておいても良い。当該「説明書」とは、本発明の方法における特徴・原理・操作手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取り扱い説明書、添付文書、或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。【０２２３】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０２２４】
以下に表記される「化合物(1)〜(16)」とは、下記表１に示される化合物のことを意味する。【０２２５】
【表１】
2007007443.tif 000021
【０２２６】
実施例１．本発明のポリマーの製造方法
実施例１−１．
メタクリル酸（和光純薬工業（株）社製）23g〔以下、「モノマーＡ」と略記する。〕とメタクリル酸シクロヘキシル（和光純薬工業（株）社製） 23g〔以下、「モノマーＢ」と略記する。〕とをイソプロパノール 180g中に溶解し、重合開始剤（アゾ基含有ポリエチレングリコール）（以下、「ＰＥＧ」と略記する。）（商品名：VPE-0201，和光純薬工業（株）社製） 15gを添加した後、アルゴンガス置換下、78℃で６時間攪拌した。反応終了後、得られた反応液をヘキサン 500mLに投入し、上澄みを除去した。残渣を減圧乾燥することにより、本発明に係るポリマーを得た。
得られたポリマーは、1H-NMRスペクトル分析により、ポリメタクリル酸セグメント(0.88ppm〜1.96ppm)及びポリエチレングリコールセグメント(3.58ppm)を有していること、IRスペクトル分析により、カルボニル基（-C=O）(1725cm-1)の存在を確認した。その結果を表２に示す。【０２２７】
実施例１−２〜１−２４．
本発明のポリマーに於けるモノマーＡ及びモノマーＢとして、表２に示す各種モノマーを所定の割合で用いる以外は、実施例１−１と同様の操作を行い、本発明に係るポリマーを得た。その結果を表２に併せて示す。【０２２８】
【表２】
2007007443.tif 000022
【０２２９】
実施例１−２５〜１−４７
本発明に於けるモノマーＡ及びモノマーＢとして、表３に示す各種モノマーを所定の割合で用いる以外は、実施例１−１と同様の操作を行い、本発明のポリマーを得た。その結果を表３に示す。【０２３０】
【表３】
2007007443.tif 000023
【０２３１】
実施例２−１
本発明のポリマーを含有するコレステロール測定用試薬と、超遠心法で分画した各種リポ蛋白との反応曲線を測定し、本発明のポリマーの各リポ蛋白中のコレステロールの反応性への影響について確認した。
〔試料〕
自体公知の超遠心法によりヒト血清より分画して得た、HDL分画（コレステロール：200mg/dL）、LDL分画（コレステロール：300mg/dL）及びVLDL分画（コレステロール：100mg/dL）をそれぞれ試料とした。
〔試薬〕
下記の組成の試薬を使用した。
2007007443.tif 000024
尚、本発明のポリマーとしては、実施例１−１〜１−４７で合成したポリマーを使用した。また、対照として、本発明のポリマーを含有しない試薬を用いた。
〔測定条件〕
日立7170形自動分析装置（（株）日立製作所製）を用い、測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。
・測定方法：１ポイントエンド[15]-[0]
・試料量  ：2.0μL
・試液量  ：180μL
・測定波長：700/600nm
・測定温度：37℃【０２３２】
〔結果〕
図１に、本発明のポリマーを含有しない試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図２に、実施例１−１で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図３に、実施例１−３で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図４に、実施例１−８で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図５に、実施例１−１１で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図６に、実施例１−１６で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、また、図７に、実施例１−２２で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースをそれぞれ示す。
尚、各図中、−●−はＨＤＬ分画試料（コレステロール：200mg/dL）について得られた結果を、−◆−はＬＤＬ分画試料（コレステロール：300mg/dL）について得られた結果を、−■−はＶＬＤＬ分画試料（コレステロール：100mg/dL）について得られた結果を、また、−△−は生理食塩水を試料として得られた結果をそれぞれ示す。【０２３３】
図１〜図４の結果から、実施例１−１、１−３及び１−８で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合、ＬＤＬ中のコレステロールの反応が阻害されていることが、図１及び図５の結果から、実施例１−１１で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合、ＬＤＬ及びＨＤＬ中のコレステロールの反応が阻害されていることが、また、図１及び図６〜７の結果から、実施例１−１６及び１−２２で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合、ＨＤＬ中のコレステロールの反応が阻害されていることが、それぞれ判る。【０２３４】
尚、図示はしていないが、実施例１−２、１−４〜１−７、１−３６〜１−３８、１−４０及び１−４５〜１−４７で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合には、ＬＤＬ中のコレステロールの反応が阻害されることが、実施例１−９〜１−１２で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合には、ＬＤＬ及びＨＤＬ中のコレステロールの反応が阻害されることが、また、実施例１−１３〜１−１５、１−１７〜２１、１−２３〜１−２６、１−２７〜１−３５、１−３９及び１−４１〜１−４４で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合には、ＨＤＬ中のコレステロールの反応が阻害されることが、それぞれ確認された。【０２３５】
以上の結果と表２及び３から、本発明のポリマーのうち、一般式［２］で示されるモノマー単位（Ａ）と一般式［３］で示されるモノマー単位（Ｂ）との組成比が、Ｂ／Ａ≦１であるポリマー（実施例１−１〜１−８、１−３６〜１−３８、１−４０及び１−４５〜１−４７）は、ＬＤＬを保護し、ＬＤＬ中のコレステロールの反応を阻害する性質を有することが、本発明のポリマーのうち、これらの組成比が、１＜Ｂ／Ａ＜２であるポリマー（実施例１−９〜１−１２）は、ＬＤＬとＨＤＬとを保護し、ＨＤＬ中のコレステロール及びＬＤＬ中のコレステロールの反応を阻害する性質を、また、これらの組成比が、２≦Ｂ／Ａであるポリマー（実施例１−１３〜１−３５、１−３９及び１−４１〜１−４４）は、ＨＤＬを保護し、ＨＤＬ中のコレステロールの反応を阻害する性質を有することが示唆される。【０２３６】
更に、本発明のポリマーが有するこれらの性質を適宜選択することによって、例えば本発明のポリマーによって保護された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを直接測定することや、本発明のポリマーによって保護された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去法によって消去した後に、本発明のポリマーによって保護された特定のリポ蛋白質中のコレステロールを測定することが可能となることが示唆される。【０２３７】
実施例３−１  消去法によるＨＤＬ−コレステロールの測定
ＨＤＬ中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する、本発明のポリマー（実施例１−２２のポリマー）を用いて、消去法により試料中のＨＤＬ−コレステロールを測定し、基準的測定法であるＵＣＨＭ法での測定値と比較した。
〔試料〕
人血清２０検体
尚、各人血清中のトリグリセライド（ＴＧ）値は、ＬタイプワコーTG-M（和光純薬工業（株）製）によって測定した。
〔ＵＣＨＭ法〕
Recommendations on Lipoprotein Measurement From the Working Group on Lipoprotein Measurement (NIH Publication No.95-3044 September 1995 page63-124)に記載の方法に従い測定した。
〔本発明によるＨＤＬ−コレステロールの測定〕
（試薬）
以下の試薬を用い、本発明の消去法により各試料中のＨＤＬ−コレステロールを測定した。
・第一試液
2007007443.tif 000025
・第二試液
2007007443.tif 000026
（測定条件）
オリンパスＡＵ−６４０自動分析装置（オリンパス（株）製）を用い、測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。
尚、キャリブレーターとしてマルチキャリブレーターリピッド（和光純薬工業（株）製）を用いた。
・条件    ：２ポイントエンド法  （測光ポイント１０−２７）
・試料    ：２μL
・試薬１  ：１８０μL
・試薬２  ：６０μL
・測定波長：主波長 600nm、副波長700nm【０２３８】
〔結果〕
測定結果及び各試料中のＴＧ値を表４に、また、本発明の方法とＵＣＨＭ法との相関図を図８にそれぞれ示す。
尚、相関式及び相関係数は以下の通りであった。
相関式：y＝1.03ｘ−1.3444；相関係数：R2＝0.9742【０２３９】
【表４】
2007007443.tif 000027
【０２４０】
表４と図８の結果から明らかなように、本発明の消去法によるＨＤＬ−コレステロール測定法（試薬）は、基準的測定法であるＵＣＨＭ法と良好な相関を示すことが判る。特に、高トリグリセライド検体においても、本発明の消去法によるＨＤＬ−コレステロール測定法（試薬）で得られた値は、ＵＣＨＭ法の値から解離することなく、その測定値は両者で一致していることが判る。【０２４１】
実施例３−２  消去法によるＬＤＬ−コレステロールの測定
ＬＤＬ中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する、本発明のポリマー（実施例１−８のポリマー）を用いて、消去法により試料中のＬＤＬ−コレステロールを測定し、基準的測定法であるBQ法での測定値と比較した。
〔試料〕
人血清２０検体
尚、各人血清中のトリグリセライド（ＴＧ）値は、ＬタイプワコーTG-M（和光純薬工業（株）製）によって測定した。
〔ＢＱ法〕
Recommendations on Lipoprotein Measurement From the Working Group on Lipoprotein Measurement (NIH Publication No.95-3044 September 1995 page 1-62)に記載の方法に従い測定した。
〔本発明によるＬＤＬ−コレステロールの測定〕
（試薬）
以下の試薬を用い、本発明の消去法により各試料中のＬＤＬ−コレステロールを測定した。
・第一試液
2007007443.tif 000028
・第二試液
2007007443.tif 000029
（測定条件）
オリンパスＡＵ−６４０自動分析装置（オリンパス（株）製）を用い、測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。
尚、キャリブレーターとしてマルチキャリブレーターリピッド（和光純薬工業（株）製）を用いた。
・条件    ：２ポイントエンド法  （測光ポイント１０−２７）
・試料    ：２μL
・試薬１  ：１８０μL
・試薬２  ：６０μL
・測定波長：主波長 600nm、副波長700nm【０２４２】
〔結果〕
測定結果及び各試料中のＴＧ値を表５に、また、本発明の方法とＢＱ法との相関図を図９にそれぞれ示す。
尚、相関式及び相関係数は以下の通りであった。
相関式：y＝0.987ｘ−1.1931；相関係数：R2＝0.9862【０２４３】
【表５】
2007007443.tif 000030
【０２４４】
表５と図９の結果から明らかなように、本発明の消去法によるＬＤＬ−コレステロール測定法（試薬）は、基準的測定法であるＢＱ法と良好な相関を示すことが判る。特に、高トリグリセライド検体においても、本発明の消去法によるＬＤＬ−コレステロール測定法（試薬）で得られた値は、ＢＱ法の値から解離することなく、その測定値は両者で一致していることが判る。
尚、上記第１試液に更にPMB37 0.25%を添加して同様の操作を行った場合でもＢＱ測定値と良好な相関を示すＬＤＬ−コレステロール値が得られ、このような試薬は本発明の測定法に影響がないことが判った。【０２４５】
実施例３−３  直接法によるＶＬＤＬ−コレステロールの測定
ＬＤＬ及びＨＤＬ中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する、本発明のポリマー（実施例１−１１のポリマー）を用いて、直接法により試料中のＶＬＤＬ−コレステロールを測定し、基準的測定法である超遠心法での測定値と比較した。
〔試料〕
人血清２０検体
尚、各人血清中のトリグリセライド（ＴＧ）値は、ＬタイプワコーTG-M（和光純薬工業（株）製）によって測定した。
〔超遠心法〕
（１）超遠心分離法によるＶＬＤＬ分画の採取
「新生化学実験講座、第４巻  脂質Ｉ  197ページ（東京化学同人編）」に記載された方法により、ＶＬＤＬ分画を採取した。即ち、血清試料（４ｍL）に比重d=1.006の塩化ナトリウム溶液を２ｍL重層し、１６℃、20,000rpmで30分間遠心して上層にあるキロミクロンを分離除去して残った下層に、さらに比重d=1.006の塩化ナトリウム溶液を２ｍL重層し、１６℃、40,000rpmで１８時間遠心した後の上層部を採取してＶＬＤＬ分画とした。
（２）ＶＬＤＬ−コレステロールの測定
上記（１）の操作により得たＶＬＤＬ分画に生理食塩水を加えて元の血清量４ｍLにしたものを試料として、その中に含まれているコレステロール濃度を総コレステロール測定試薬（Lタイプワコー ＣＨＯ・Ｈ：和光純薬工業（株）製）を用いて、日立自動分析装置７１７０S形自動分析装置（（株）日立製作所製）を用い、下記の測定条件で測定した。
尚、キャリブレーターとしてマルチキャリブレーターリピッド（和光純薬工業（株）製）を用いた。
・条件    ：２ポイントエンド法  （測光ポイント１６−３４）
・試料    ：２μL
・試薬１  ：１８０μL
・試薬２  ：６０μL
・測定波長：主波長 600nm、副波長700nm
〔本発明によるＶＬＤＬ−コレステロールの測定〕
（試薬）
以下の試薬を用い、本発明の直接法により各試料中のＶＬＤＬ−コレステロールを測定した。
・第一試液
2007007443.tif 000031
・第二試液
2007007443.tif 000032
（測定条件）
オリンパスＡＵ−６４０自動分析装置（オリンパス（株）製）を用い、測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。
尚、キャリブレーターとしてマルチキャリブレーターリピッド（和光純薬工業（株）製）を用いた。
・条件    ：２ポイントエンド法  （測光ポイント１０−２７）
・試料    ：３μL
・試薬１  ：１８０μL
・試薬２  ：６０μL
・測定波長：主波長 600nm、副波長700nm【０２４６】
〔結果〕
測定結果及び各試料中のＴＧ値を表６に、また、本発明の方法とＵＣＨＭ法との相関図を図１０にそれぞれ示す。
尚、相関式及び相関係数は以下の通りであった。
相関式：y＝1.0065ｘ−1.1194；相関係数：R2＝0.9909【０２４７】
【表６】
2007007443.tif 000033
【０２４８】
表６と図１０の結果から明らかなように、本発明の消去法によるＶＬＤＬ−コレステロール測定法（試薬）は、基準的測定法である超遠心法と良好な相関を示すことが判る。高トリグリセライド検体においても、本発明の直接法によるＶＬＤＬ−コレステロール測定法（試薬）で得られた値は、超遠心法の値から解離することなく、その測定値は両者で一致していることが判る。
【産業上の利用可能性】
【０２４９】
リポ蛋白中のコレステロールの直接的測定法に於いて、本発明のポリマーを共存させることにより、特定のリポ蛋白を保護し、当該特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を先行させて、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定することができる。また、反応を先行させた当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定することができる。これにより、測定対象となる目的のリポ蛋白以外のリポ蛋白を分離分別することなく、目的のリポ蛋白中のコレステロールを測定することが可能となる。更に、本発明によれば、これまで問題となっていた脂質異常検体の測定値に於いても標準的測定法での測定値と一致する測定精度に優れたリポ蛋白中コレステロール測定方法及び測定試薬を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】実施例２−１で得られた、本発明のポリマーを含有しない試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
【図２】実施例２−１で得られた、実施例１−１のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
【図３】実施例２−１で得られた、実施例１−３のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
【図４】実施例２−１で得られた、実施例１−８のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
【図５】実施例２−１で得られた、実施例１−１１のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
【図６】実施例２−１で得られた、実施例１−１６のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
【図７】実施例２−１で得られた、実施例１−２２のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。
【図８】実施例３−１で得られた、本発明の方法によるＨＤＬ−コレステロール測定値とＵＣＨＭ法によるＨＤＬ−コレステロール測定値との相関図である。
【図９】実施例３−２で得られた、本発明の方法によるＬＤＬ−コレステロール測定値とＢＱ法によるＬＤＬ−コレステロール測定値との相関図である。
【図１０】実施例３−３で得られた、本発明の方法によるＶＬＤＬ−コレステロール測定値と超遠心法によるＶＬＤＬ−コレステロール測定値との相関図である。
【符号の説明】
【０２５１】
図１〜７中、−●−はＨＤＬ分画試料（コレステロール：200mg/dL）について得られた結果を、−◆−はＬＤＬ分画試料（コレステロール：300mg/dL）について得られた結果を、−■−はＶＬＤＬ分画試料（コレステロール：100mg/dL）について得られた結果を、また、−△−は生理食塩水を試料として得られた結果をそれぞれ示す。
【図１】
2007007443.tif 000067
【図２】
2007007443.tif 000068
【図３】
2007007443.tif 000069
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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