【誤訳訂正書】
【提出日】令和1年8月26日(2019.8.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０７８５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０７８５】
リボヌクレアーゼＲＮアーゼＩＩＩは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系中のｔｒａｃｒＲＮＡへの結合後にｃｒＲＮＡのプロセシングおよび成熟に必要であると示されている。しかしながら、５’末端におけるプロセシングは、微生物および真核生物コンテクストの両方において大部分は不明のままである。ネイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．）ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡプロセシングのプロセシングを調査する近年の報告は、個々のｃｒＲＮＡ単位の転写をドライブするそれぞれのスペーサー配列に先行するダイレクトリピート中に局在する転写プロモーターを同定した。本出願人らは、３０ｎｔへのスペーサー配列の伸びがより長いｓｇＲＮＡをもたらさないことを既に観察している。ノザンブロット分析は、２０ｎｔガイド配列を有するｓｇＲＮＡと依然として同一の長さの転写物を示す。さらに、たとえ低レベルにおいてもｔｓｇＲＮＡの第２の位置からｓｇＲＮＡ単位が完全にプロセシングされ得るという本出願人らの観察は、ｓｇＲＮＡの末端成熟に関与する潜在的なエンドヌクレアーゼの存在を指摘し得る。
ＲＮＡシーケンシング分析は、ＣＲＩＳＰＲアレイのプロモーター近位末端において局在するスペーサーが、より遠位に局在するものよりも多く存在する傾向にあることを示しており、転写プロセシング性が成熟ｃｒＲＮＡ単位の相対効率の決定における重要なパラメータであり得ることを示唆する。本出願人らの知見と一致して、この試験は、隣接ＲＮＡと二次相互作用を形成すると予測されるあるスペーサー配列が不足していることが多いことも報告する。したがって、合成ＣＲＩＳＰＲアレイを開発する間、スペーサー配列の考慮の重要性はますます増加していく可能性が高い。
類似したＲＮＡｉライブラリーよりも大きい再現性および感度を示している、ゲノムワイドノックアウトスクリーンのためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９レンチウイルスライブラリーを使用する多数の近年の研究が存在している。２つ以上の単一ガイドＲＮＡを単一ベクター上で同時に送達する能力は、レンチウイルススクリーニング法のコンテクストにおいて特に興味深く、それは高スループット欠失およびペアワイズスクリーンの両方を可能とする。一般に使用されるｓｈＲＮＡライブラリーのコンテクストにおいて、組み換わるレンチウイルスの傾向は、単一ベクターからの複数のショートＲＮＡの発現をドライブする本発明者らの能力を制限し、複数のユニークプロモーターの利用が要求された。依然として、いかに多くのｓｇＲＮＡを効率的にタンデムでアレイさせることができるかを把握すべきであるが、このアプローチは、単一プロモーターが少なくとも２つのｓｇＲＮＡの発現をドライブすることを可能とする。さらに、配列多様性を示すが構造的に類似したｓｇＲＮＡ足場が活性のままであり得るという知識は、構造的エレメント間の組換えが制限されてきた種々の用途において有用である。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の目的ゲノム遺伝子座の改変に使用するための天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．タンデムガイドＲＮＡまたはタンデムガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドであって、前記タンデムガイドＲＮＡは、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第１の標的配列に対する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第１のｔｒａｃｒメイト配列、
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列、
（ｄ）第２の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第２の標的配列に対する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第２のガイド配列、
（ｅ）第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第２のｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｆ）第２のｔｒａｃｒ配列
を含み、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は５’から３’配向で配置されており、かつ（ｃ）および（ｄ）はヌクレオチドリンカーにより結合している、タンデムガイドＲＮＡまたはタンデムガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣａｓ９、または前記Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ゲノム遺伝子座の前記改変がインデルおよび／または微小欠失の誘導を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記微小欠失が前記第１および第２の標的配列間の配列の欠失を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヌクレオチドリンカーが少なくとも５ヌクレオチドを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヌクレオチドリンカーが少なくとも１０ヌクレオチドを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ヌクレオチドリンカーが少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ヌクレオチドリンカーが８または１２ヌクレオチドを有する、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１もしくは第２のガイド配列、前記第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列および／または前記第１もしくは第２のｔｒａｃｒメイト配列が改変される、請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記改変が、最適化された第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列ならびに／または最適化された第１もしくは第２のガイド配列、ならびに／または第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列および／または第１もしくは第２のｔｒａｃｒメイト配列それぞれの同時折り畳み構造、ならびに／または第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列の二次構造の安定化ならびに／または短縮された塩基対形成の領域を有する第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１から９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチドがＲＮＡであり、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、または遺伝子銃によって送達される、請求項１から９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１および第２のｔｒａｃｒメイト配列が１００％の同一性を共有する、請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１および第２のｔｒａｃｒ配列が１００％の同一性を共有する、請求項１から１２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｃａｓ９がヌクレアーゼまたはニッカーゼである、請求項１から１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｃａｓ９がＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
１つ以上のベクターを含むベクター系を含む、細胞中の目的ゲノム遺伝子座の改変に使用するための天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、前記１つ以上のベクターを含むベクター系は、
Ｉ．タンデムガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記タンデムガイドＲＮＡは、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第１の標的配列に対する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第１のｔｒａｃｒメイト配列、
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列、
（ｄ）第２の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第２の標的配列に対する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第２のガイド配列、
（ｅ）第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第２のｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｆ）第２のｔｒａｃｒ配列
を含み、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は５’から３’配向で配置されており、かつ（ｃ）および（ｄ）はヌクレオチドリンカーにより結合している、第１の調節エレメント、および
ＩＩ．Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合している第２の調節エレメントであって、前記Ｃａｓ９は１つ以上のＮＬＳを含む、第２の調節エレメント
を含み、成分ＩおよびＩＩは前記系の同じまたは異なるベクター上に局在している、組成物。
【請求項１７】
前記ゲノム遺伝子座の前記改変がインデルおよび／または微小欠失の誘導を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記微小欠失が前記第１および第２の標的配列間の配列の欠失を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヌクレオチドリンカーが少なくとも５ヌクレオチドを含む、請求項１６から１８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ヌクレオチドリンカーが少なくとも１０ヌクレオチドを含む、請求項１６から１８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ヌクレオチドリンカーが少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項１６から１８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ヌクレオチドリンカーが８または１２ヌクレオチドを有する、請求項１６から１８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１もしくは第２のガイド配列、前記第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列および／または前記第１もしくは第２のｔｒａｃｒメイト配列が改変される、請求項１６から２２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記改変が、最適化された第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列ならびに／または最適化された第１もしくは第２のガイド配列、ならびに／または第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列および／または第１もしくは第２のｔｒａｃｒメイト配列それぞれの同時折り畳み構造、ならびに／または第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列の二次構造の安定化ならびに／または短縮された塩基対形成の領域を有する第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記１つ以上のベクターがウイルスベクターである、請求項１６から２４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記１つ以上のベクターがＡＡＶベクターである、請求項１６から２４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記第１および第２のｔｒａｃｒメイト配列が１００％の同一性を共有する、請求項１６から２６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第１および第２のｔｒａｃｒ配列が１００％の同一性を共有する、請求項１６から２７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記Ｃａｓ９がヌクレアーゼまたはニッカーゼである、請求項１６から２８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記１つ以上のベクターがＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
細胞中の目的ゲノム遺伝子座中のＤＮＡ二重鎖の逆鎖上の第１および第２の標的配列の改変に使用するための天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．タンデムガイドＲＮＡまたはタンデムガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドであって、前記タンデムガイドＲＮＡは、
（ａ）前記第１の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第１の標的配列に対する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第１のｔｒａｃｒメイト配列、
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列、
（ｄ）前記第２の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第２の標的配列に対する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第２のガイド配列、
（ｅ）第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第２のｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｆ）第２のｔｒａｃｒ配列
を含み、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は５’から３’配向で配置されており、かつ（ｃ）および（ｄ）はヌクレオチドリンカーにより結合している、タンデムガイドＲＮＡまたはタンデムガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および
ＩＩ．ニッカーゼであり且つ１つ以上のＮＬＳを含むＣａｓ９、又は前記Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチドを含み、
前記第１のガイド配列が前記第１の標的配列近傍で前記Ｃａｓ９により前記ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し得るものであり、かつ前記第２のガイド配列が前記第２の標的配列近傍で前記Ｃａｓ９により前記ＤＮＡ二重鎖の他方の鎖の開裂を指向し得るものであり、それにより二本鎖切断が誘導される、組成物。
【請求項３２】
前記第１の標的配列近傍で前記ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の開裂を指向する前記第１のガイド配列および前記第２の標的配列近傍で前記ＤＮＡ二重鎖の他方の鎖の開裂を指向する前記第２のガイド配列が５’オーバーハングをもたらす、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記５’オーバーハングが高々２００ヌクレオチドである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記５’オーバーハングが高々１００ヌクレオチドである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記５’オーバーハングが高々５０ヌクレオチドである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
前記５’オーバーハングが少なくとも２６ヌクレオチドである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記５’オーバーハングが少なくとも３０ヌクレオチドである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
前記５’オーバーハングが３４〜５０ヌクレオチドである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３９】
前記Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３１から３８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第１および第２のｔｒａｃｒメイト配列が１００％の同一性を共有する、請求項３１から３９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第１および第２のｔｒａｃｒ配列が１００％の同一性を共有する、請求項３１から４０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記Ｃａｓ９がＳａＣａｓ９である、請求項３１から４１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記Ｃａｓ９がＳｐＣａｓ９である、請求項３１から４１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記Ｃａｓ９が触媒ドメイン中の１つ以上の突然変異を含む、請求項３１から４１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記Ｃａｓ９がＳｐＣａｓ９であり、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡおよびＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＳｐＣａｓ９が前記Ｄ１０Ａ突然変異を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記第１もしくは第２のガイド配列、前記第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列、および／または前記第１もしくは第２のｔｒａｃｒメイト配列が、最適化された第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列ならびに／または最適化された第１もしくは第２のガイド配列、ならびに／または第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列および／または第１もしくは第２のｔｒａｃｒメイト配列それぞれの同時折り畳み構造、ならびに／または第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列の二次構造の安定化、ならびに／または短縮された塩基対形成の領域を有する第１もしくは第２のｔｒａｃｒ配列により改変される、請求項３１から４６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
１つ以上のベクターを含むベクター系を含む、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中のＤＮＡ二重鎖の逆鎖上の第１および第２の標的配列の改変に使用するための天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、前記１つ以上のベクターを含むベクター系は、
Ｉ．タンデムガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記タンデムガイドＲＮＡは、
（ａ）前記第１の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第１の標的配列に対する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第１のｔｒａｃｒメイト配列、
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列、
（ｄ）前記第２の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第２の標的配列に対する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第２のガイド配列、
（ｅ）第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第２のｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｆ）第２のｔｒａｃｒ配列
を含み、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は５’から３’配向で配置されており、かつ（ｃ）および（ｄ）はヌクレオチドリンカーにより結合している、第１の調節エレメント、および
ＩＩ．Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合している第２の調節エレメントであって、Ｃａｓ９はニッカーゼであり且つ１つ以上のＮＬＳを含む、第２の調節エレメント
を含み、
成分ＩおよびＩＩは前記系の同じまたは異なるベクター上に局在しており、
前記第１のガイド配列が前記第１の標的配列近傍で前記Ｃａｓ９により前記ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し得るものであり、かつ前記第２のガイド配列が前記第２の標的配列近傍で前記Ｃａｓ９により前記ＤＮＡ二重鎖の他方の鎖の開裂を指向し得るものであり、それにより二本鎖切断が誘導される、組成物。
【請求項４９】
前記第１の標的配列近傍で前記ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の開裂を指向する前記第１のガイド配列および前記第２の標的配列近傍で前記ＤＮＡ二重鎖の他方の鎖の開裂を指向する前記第２のガイド配列が５’オーバーハングをもたらす、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記５’オーバーハングが高々２００ヌクレオチドである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記５’オーバーハングが高々１００ヌクレオチドである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記５’オーバーハングが高々５０ヌクレオチドである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５３】
前記５’オーバーハングが少なくとも２６ヌクレオチドである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５４】
前記５’オーバーハングが少なくとも３０ヌクレオチドである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５５】
前記５’オーバーハングが３４〜５０ヌクレオチドである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５６】
前記１つ以上のベクターがウイルスベクターである、請求項４８から５５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記第１および第２のｔｒａｃｒメイト配列が１００％の同一性を共有する、請求項４８から５６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記第１および第２のｔｒａｃｒ配列が１００％の同一性を共有する、請求項４８から５７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記Ｃａｓ９がＳａＣａｓ９である、請求項４８から５８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記Ｃａｓ９がＳｐＣａｓ９である、請求項４８から５８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記Ｃａｓ９が触媒ドメイン中の１つ以上の突然変異を含む、請求項４８から５８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記Ｃａｓ９がＳｐＣａｓ９であり、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡおよびＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ＳｐＣａｓ９が前記Ｄ１０Ａ突然変異を含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６５】
前記ヌクレオチドリンカーが少なくとも５ヌクレオチドを含む、請求項３１から６４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ヌクレオチドリンカーが少なくとも１０ヌクレオチドを含む、請求項３１から６４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ヌクレオチドリンカーが少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項３１から６４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ヌクレオチドリンカーが８ヌクレオチドを有する、請求項３１から６４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
請求項３１から６８の何れか一項に記載の組成物において、
−  前記二本鎖切断によって生じる前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを含む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）であって、前記ｄｓＯＤＮが前記目的の遺伝子座にインテグレートされ得る、ｄｓＯＤＮ；または
−  一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であって、前記ｓｓＯＤＮが前記二本鎖切断の相同性組換え修復のテンプレートとして働き得る、ｓｓＯＤＮ
をさらに含む組成物。
【請求項７０】
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第１の標的配列に対する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第１のｔｒａｃｒメイト配列、
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列、
（ｄ）第２の標的配列にハイブリダイズし得るおよび前記第２の標的配列に対する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し得る第２のガイド配列、
（ｅ）第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る第２のｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｆ）第２のｔｒａｃｒ配列
を含み、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は５’から３’配向で配置されており、かつ（ｃ）および（ｄ）はヌクレオチドリンカーにより結合している、タンデムガイドＲＮＡ。
【請求項７１】
請求項７０に記載のタンデムガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。