【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年9月16日(2008.9.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
機能性融合タンパク質の構築は、最大限の柔軟性を与えるために拡大したコンフォメーションを採用する目的で、二つの融合断片間にリンカー配列を必要とすることがよくある。我々は、LINKER というプログラムを使用した｛Chiquita J. Crasto C.J. and  Feng, J. Protein Engineering 13:309-312  (2000), このプログラムは以下のサイトに公開されている：chutney.med.yale.edu/linker/linker.html（２００３年４月１６日に閲覧した）｝。このプログラムは、自動的にリンカー配列のセットを作り出すものであり、このリンカー配列のセットは、Ｘ線による結晶構造解析及びNMR による測定により、拡大したコンフォメーションを採用するのに知られている。多様なeM2-NP およびNP-eM2融合タンパク質において使用できる適切なリンカーの例を、以下に挙げる。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
SEQ ID NO:１５のヌクレオチド1から1680によりコードされる、IBV B/LEE/40のＮＰタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:16として参照する。
【化１２】
2008505660.tif 000001
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８７】
多種多様な動物、植物及び微生物の種について利用できる多数の遺伝子配列を考慮に入れると、コドンの使用の相対的頻度を計算することが可能である。コドンの使用頻度表が入手可能であり、その入手経路には例えば、「コドンの使用頻度データベース["Codon Usage Database"] であり、そのURLはwww.kazusa.or.jp/codon/（２００２年７月9日に閲覧した）である。さらに、これらの表は多様な目的に適合させることができる（Nakamura, Y., et al. 「国際ＤＮＡ配列データベースに基づき表にまとめたコドンの使用頻度：2000年の状況」["Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000"] Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照せよ；この参考文献は、本明細書に参考により組み入れる）。例として、GenBank データ公開１２８．０（２００２年２月１５日）に基づいて計算されたヒト、ネズミ、飼いネコ及びウシについてのコドンの使用頻度が下記に表２−５として再現されている。これらの表では、ｍＲＮＡの名称が使われており、それに合わせてＤＮＡに存在するチミン（Ｔ）の代わりに、当該の表では、ＲＮＡに存在するウラシル（Ｕ）が使われている。当該の表は、６４個のコドンすべてについてではなく、それぞれのアミノ酸について、頻度が計算されるように適合されている。
【表２−１】
2008505660.tif 000002
【表２−２】
2008505660.tif 000003
【表２−３】
2008505660.tif 000004
【表３−１】
2008505660.tif 000005
【表３−２】
2008505660.tif 000006
【表３−３】
2008505660.tif 000007
【表４−１】
2008505660.tif 000008
【表４−２】
2008505660.tif 000009
【表４−３】
2008505660.tif 000010
【表５−１】
2008505660.tif 000011
【表５−２】
2008505660.tif 000012
【表５−３】
2008505660.tif 000013
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４０】
「完全最適化」又は「最小最適化」方法を用いて、所与のポリペプチド配列をコードするコドンを、最適化した頻度で無作為に割り当てることは、それぞれのアミノ酸についてコドン頻度を計算し、次いで当該コドンを当該ポリペプチド配列に無作為に割り当てることにより、手作業で行うことができる。さらに、多様なアルゴリズム及びコンピュータソフトウェアプログラムが当業者には入手可能であり、その例としては、ウィソコンシン州マディソン市にあるDNAstar, Inc.社製のLasergene Package プログラムに含まれている「EditSeq」機能、メリーランド州のベセスダにあるInforMax, Inc.製のVectorNTI Suiteプログラムに含まれている逆翻訳機能、およびカリフォルニア州サンディエゴ市にあるAccelrys, Inc.製のGCG--Wisconsin Package プログラムに含まれている逆翻訳機能などがある。さらに、コドン最適化コード領域配列について、多様な資源が公的に利用可能であり、その例としては、www.entelechon.com/eng/backtranslation.html（２００２年７月９日に閲覧した）のサイトにある「逆翻訳」機能、およびbioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html（２００２年１０月１５日に閲覧した） のサイトにある「backtranseq」機能などがある。所与の頻度に基づきコドンを割り当てる基本的なアルゴリズムは、基本的な数学的関数を用いて、当業者が簡単に作製することができる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４３】
コンセンサス配列
本発明はさらに、インフルエンザウィルスタンパク質、並びにその断片、誘導体及び変異体の特定のコンセンサス配列に関する。「コンセンサス配列」は、例えば、相互比較された２つ以上の配列の各々の位置で存在頻度が最も高いアミノ酸を表す理想化配列(idealized sequence)である。コンセンサス配列は、理論上の代表的アミノ酸配列であり、この配列では、それぞれのアミノ酸は、自然に発生する異なった配列内の当該部位で、最も発生頻度の高いアミノ酸である。この語はまた、理論上のコンセンサスに近似した実際の配列をも意味する。コンセンサス配列は、例えば、共通の機能的若しくは構造的目的を持った配列に由来するものであってよい。コンセンサス配列という語は、同種を最大限にするため、できるだけ多くの特定の構造的若しくは機能的ドメインの例をアライメントすることにより、定義することができる。それぞれの特定のアミノ酸がその位置において合理的に優勢であり、比較の基礎を形成するほとんどの配列が少数の置換（０個から１００個の置換）によりコンセンサスと関連性を持つ場合に、配列は一般的にコンセンサスとして受け入れられる。一般的に、野生型比較配列は、少なくとも約５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の割合で、コンセンサス配列と一致する。従って、本発明のポリペプチドは、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の割合で、コンセンサス配列と一致する。コンセンサスアミノ酸配列は、いかなるインフルエンザ抗原についても作製することができる。１９９０年以来配列が解明されたＡ型インフルエンザ菌株を分析することにより、コンセンサスアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザＮＰ(SEQ ID NO: 76)、Ｍ１(SEQ ID NO:77)およびＭ２(SEQ ID NO:78)タンパク質（実施例３）より、見出された。Ｍ１(SEQ ID NO:77)およびＭ２(SEQ ID NO:78)のコンセンサス配列は、インフルエンザ株 A/Niigata/137/96に由来するＭ１およびＭ２のアミノ酸配列に一致する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２７０】
ＮＰ遺伝子を、VR4758から、プライマー5'-GCCGAATTCGCCACCATGGCCAGCCAGGGCACCAAG-3' (SEQ ID NO:73) およびプライマー 5'-GCCGTCGACTGATCAGTTGTCGTACTCC-3' (SEQ ID NO:74)を使って、ＰＣＲで増幅し、EcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、ＮＰ（出願人によりコドン最適化されたもの）（VR4762由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:75として言及されている：
【化５８】
2008505660.tif 000014
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２７８】
ＮＰコンセンサスアミノ酸配列
インフルエンザＮＰ（Ａ菌株）に対するアミノ酸配列を選択する方法を以下に記す。各セグメントにつきインフルエンザ配列情報を記載しているデータベース（ＵＲＬ：www.flu.lanl.gov）で、Ａ型インフルエンザ菌株、ヒト、ＮＰ、アミノ酸を検索した。検索結果には、約４００個の配列があり、その大部分は単なる部分列であった。得られた配列を、約８５個の全長配列に絞った。同一菌株の異なったパッセージが見つかった場合は、最も初期のパッセージを選択した。得られた配列をさらに、１９９０年から２０００年に単離された２８個の全長ＮＰ配列に絞った（２００１年から２００３年の期間には全長配列は単離されなかった）。同年に単離された他の配列と同じである5個の配列をさらに除外した。これは、単離年が同じでアミノ酸配列が同じである配列は、同じウィルス菌株である可能性が高いという仮定に基づいて行った（二重に加重価値を与えことを避けるため）。同じ年に由来していてもアミノ酸配列が異なっていれば、双方の配列を含めた。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２８３】
Ｍ１およびＭ２コンセンサスアミノ酸配列
Ｍ１およびＭ２のコンセンサス配列を、以下に示した類似した方法で決定した。www.flu.lanl.gov/のウェブサイトで使用した検索パラメータは、Ａ型インフルエンザ菌株、ヒト、セグメント７、ヌクレオチド（Ｍ１およびＭ２の双方がセグメント７に由来する）であった。１９９０年から１９９９年の期間から、全長配列を選択した（２０００年以降の配列は入手不能であった）。同じ年および同じ都市から出た配列群については、最も時期の早いもののみを使用した。同じ年から出た記載事項については、同年に単離された他の配列と同じである配列を除外した(異なった都市から出たものであっても)。２１つの配列（１９９３年から１９９９年の期間から出たＭ１およびＭ２の全長配列）を比較した。各部位において、多い方のアミノ酸を使用した。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２８４】
Ｍ１アミノ酸コンセンサス配列は、インフルエンザ株 A/Niigata/137/96に由来するＭ１のアミノ酸配列に一致し、本明細書ではSEQ ID NO:77と呼ぶ：
【化６０】
2008505660.tif 000015
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２８５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２８５】
Ｍ２アミノ酸コンセンサス配列は、インフルエンザ株 A/Niigata/137/96に由来するＭ２のアミノ酸配列に一致し、本明細書ではSEQ ID NO:78と呼ぶ：
【化６１】
2008505660.tif 000016
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２８７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２８７】
逆翻訳
アミノ酸配列からスタートし、（ａ）www.kazusa.or.jp/codon/のウェブサイトにあるヒトコドン使用頻度表を用いて手動で逆翻訳する。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３０２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３０２】
スプライスドナー およびアクセプター部位の検索
(1) Berkeley Drosophila Genome Project ウェブサイトにログオンする（ＵＲＬ：www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html\）＊。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０４３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０４３８】
【図１】図１Ａ−Ｈは、SEQ ID NO:1（天然ＮＰコード領域）のヌクレオチド46-1542のアライメントを、ヒトに使用するためにコード領域を完全にコドン最適化した状態で(SEQ ID NO:23)、示している。
【図２】図２は、３．６ｍLの最終量において、０．３ｍＭ  ＢＡＫ、７．５ｍｇ／ｍＬ  ＣＲＬ  １００５および５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡから成る製剤をサーマルサイクルを使用して調整するためのプロトコルを示している。
【図３】図３は、４．０ｍLの最終量において、０．３ｍＭ  ＢＡＫ、３４ｍｇ／ｍＬあるいは５０ｍｇ／ｍＬ  ＣＲＬ  １００５および２．５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡから成る製剤をサーマルサイクルを使用して調整するためのプロトコルを示している。
【図４】図４は、０．３ｍＭ  ＢＡＫ、７．５ｍｇ／ｍＬ  ＣＲＬ  １００５および５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡから成る製剤の簡易調製法（サーマルサイクルなし）を示している。
【図５】図５は、インフルエンザウィルスＮＰタンパク質に対し、組み合わせプライム−ブーストワクチン製剤を単回投与した後３週間目の抗ＮＰ抗体応答を示している。
【図６】図６は、インフルエンザウィルスＮＰタンパク質に対し、組み合わせプライム−ブーストワクチン製剤を二回目に投与した後１２日目の抗ＮＰ抗体応答を示している。
【図７】図７は、インフルエンザウィルスＮＰタンパク質に対し、組み合わせプライム−ブーストワクチン製剤を投与した場合のＣＤ８＋Ｔ−細胞性応答を示している。
【図８】図８は、インフルエンザウィルスＮＰタンパク質に対し、組み合わせプライム−ブーストワクチン製剤を投与した場合のＣＤ４＋Ｔ−細胞性応答を示している。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ＬＡＶ  ＨＡ（Ｈ３）をコードするプラスミドを用いた２投与量ネズミ予防接種投与計画研究の結果を示している。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、セグメント７由来のＭ１およびＭ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現、およびＭ１Ｍ２融合を示している。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ｅＭ２−ＮＰおよびコドン最適化インフルエンザウィルスNPタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を示している。
【図１２】図１２は、２２全長ＮＰ配列とアライメントしたＡ型インフルエンザＮＰタンパク質コンセンサスアミノ酸配列を示している。点線は、同じアミノ酸配列を示し、破線は、配列が利用不能であることを示している。２２の全長又は略全長のＮＰ配列は、ＵＲＬ flu. lanl.gov.のWorld Wide Webでの比較のために利用した。コンセンサス配列のためのアミノ酸は、試験された２２の配列で多数を占めるもの(majority)に基づいて選択した。ある関係の場合(In cases of a tie)、２０００年の株で見られるアミノ酸が望まれた。
【図１３】図１３は、本明細書で説明しているインフルエンザタンパク質をコードする多様なベクターの概略図である。
【図１４】図１４は、実施例１３の実験３で説明しているウェスタンブロット実験の結果である。ブロットは、異なる発現ベクター由来のインフルエンザタンパク質の発現を比較するために、Ｍ２あるいはＮＰを発現するプラスミドを用いて形質移入したＶＭ９２細胞の溶解産物を示している。
【図１５】図１５は、実施例１３の実験３で説明しているウェスタンブロット実験の結果である。異なる発現ベクター由来のインフルエンザタンパク質の発現を比較するために、Ｍ１，Ｍ２，あるいはＮＰを発現するプラスミドを用いて形質移入したVM92細胞の溶解産物を示している。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１Ｇ−１
【訂正方法】削除
【訂正の内容】
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１Ｈ
【訂正方法】追加
【訂正の内容】
【図１Ｈ】
2008505660.tif 000017
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１２−４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１２−４】
2008505660.tif 000018