【手続補正書】
【提出日】平成31年1月16日(2019.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化１】
2018512377.tif 000001
式中：
R, R2-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも１つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りはそれぞれ水素であり：
またはR8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；
yは1-8、好ましくは2-5であり； 
PCはリガンドであり；Lはリンカーである。
【請求項２】
式（PC-L-D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化２】
2018512377.tif 000002
（式中、R2-R14は請求項１で定義した通りである。）
である、請求項１に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項３】
式（PC-L’-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化３】
2018512377.tif 000003
（式中：
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
nは2-6、好ましくは2-5であり；
mは0-5、好ましくは1-3であり；
PC, y, n, R, R2-R14は、請求項１で定義した通りである。）
である、請求項１に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項４】
式（PC-L’-D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化４】
2018512377.tif 000004
（式中：
R15, R16, mは、請求項３で定義した通りであり；
PC, y, n, R2-R14は、請求項１で定義した通りである。）
である、請求項１に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項５】
式（PC-L’-D1）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物：
【化５】
2018512377.tif 000005
（式中、PC, y, n, m, R2-R16は、請求項２で定義した通りである。）
である、請求項２に記載の式（PC-L’-D）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項６】
化合物が、
【化６】
2018512377.tif 000006
（式中、PC、ｙは、請求項１で定義した通りである。）
から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項７】
【化７】
2018512377.tif 000007
（式中、PC、ｙは、請求項１で定義した通りである。）
から成る群から選択される、リガンド‐細胞傷害性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項８】
PCが抗体、好ましくはペルツズマブ、ニモツズマブまたはトラスツズマブである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項９】
化合物が、
【化８】
2018512377.tif 000008
（式中、ｙは、請求項１で定義した通りである。）
から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の式（PC-L-Dr）の化合物またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１０】
【化９】
2018512377.tif 000009
2018512377.tif 000010
（式中、ｙは、請求項１で定義した通りである。）
から成る群から選択される、リガンド‐細胞傷害性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１１】
式（Dr）の化合物：
【化１０】
2018512377.tif 000011
（式中:
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも１つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり：
またはR8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択される。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
式（D）の化合物：
【化１１】
2018512377.tif 000012
（式中、R1-R14は、請求項１１で定義した通りである。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項１１に記載の式（Dr）の化合物。
【請求項１３】
式（D1）の化合物：
【化１２】
2018512377.tif 000013
（式中、R1-R14は、請求項１１で定義した通りである。）
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項１１に記載の式（Dr）の化合物。
【請求項１４】
化合物が、
【化１３】
2018512377.tif 000014
2018512377.tif 000015
から成る群から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の式（Dr）の化合物。
【請求項１５】
【化１４】
2018512377.tif 000016
から成る群から選択される化合物。
【請求項１６】
式（L1-Dr）の化合物：
【化１５】
2018512377.tif 000017
式中:
nは2-6、好ましくは2-5であり；
R, R1-R7は、それぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R8-R11の少なくとも１つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され、R8-R11の残りは水素であり：
またはR8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つが、それぞれ水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択され；
R12-R13は、それぞれ水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
R14はアリール及びヘテロアリールから選択され、該アリールまたはヘテロアリールは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよい。
【請求項１７】
式（L1-D）の化合物：
【化１６】
2018512377.tif 000018
（式中、n, R2-R14は、請求項１６で定義した通りである。）
である、請求項１６に記載の式（L1-Dr）の化合物。
【請求項１８】
化合物が、
【化１７】
2018512377.tif 000019
から成る群から選択される、請求項１６または１７に記載の式（L1-D）の化合物。
【請求項１９】
【化１８】
2018512377.tif 000020
から成る群から選択される、リガンド‐細胞傷害性薬物複合体の製造のための中間体。
【請求項２０】
式（PC-L2）の化合物：
【化１９】
2018512377.tif 000021
式中、
PCは、リガンドであり、好ましくは抗体、より好ましくはペルツズマブ、ニモツズマブまたはトラスツズマブであり；
R15は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アルコキシ及びシクロアルキルから成る群から選択され;
R16は、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ及びヘテロシクリルから成る群から選択され;
mは、0-5、好ましくは1-3であり；
Xは、0-5、好ましくは1-3である。
【請求項２１】
化合物が、
【化２０】
2018512377.tif 000022
から成る群から選択される、請求項２０に記載の式（PC-L2）の化合物。
【請求項２２】
ステップ：
【化２１】
2018512377.tif 000023
１）PCと式（(PC-L2-A）の化合物を還元剤RAの存在下で反応させて式（PC-L2-B）の化合物を得る；ここでRAは、好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドである；
２）式（PC-L2-B）の化合物に脱保護剤を加えて、チオール基の保護基Tを除去し、式（PC-L2）の化合物を得る、
（ここで、Tは水素、tert-ブチル、アセチル、n-プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル及び2-(トリメチルシリル)エトキシメチルから成る群から、好ましくは水素またはアセチルから選択され、
PC, R15, R16, m及びxは、請求項２０で定義した通りである。）
を含む、式（PC-L2）の化合物の製造方法。
【請求項２３】
ステップ：
【化２２】
2018512377.tif 000024
（式中、PC, m, n, y, R2〜R16は請求項３で定義した通りである。）
式（PC-L2）の化合物を式（L1-D1）の化合物と反応させて式（PC-L’-D）の化合物を得る；
を含む、請求項４に記載の式（PC-L’-D）の化合物の製造方法。
【請求項２４】
式（D-Aa）の化合物：
【化２３】
2018512377.tif 000025
（式中:
R8-R11のいずれか２つが結合してシクロアルキルを形成し、残りの２つは水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から任意に選択され；
R12は、水素、アルキル及びハロゲンから成る群から選択され；
Pは、水素原子または保護基であり、保護基は、好ましくはBoc, BnまたはCbz、最も好ましくはBocであり；
Raは、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、シクロアルコキシまたはアルキルアミノから成る群から選択される。）、
またはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２５】
式（D-A）の化合物；
【化２４】
2018512377.tif 000026
（式中、P、R8-R12は、請求項２４で定義した通りであり；
R’は、水素、アルキル及びシクロアルキルから成る群から選択される。）、
またはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、または混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項２４に記載の式（D-A a）の化合物。
【請求項２６】
化合物が、
【化２５】
2018512377.tif 000027
から成る群から選択される、請求項２４に記載の式（D-A）の化合物。
【請求項２７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の薬物、またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物の治療有効量、及び１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項２８】
癌がHER2, HER3またはEGFRの発現と関連している、該癌の治療薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の薬物またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２９】
哺乳動物がヒトであり、癌が乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び再発未分化大細胞リンパ腫から成る群から、好ましくは乳癌、ホジキンリンパ腫または再発未分化大細胞リンパ腫から、より好ましくは乳癌から選択される、該癌の治療薬の製造における使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体、または請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の薬物またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または請求項２７に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体としては、これらに限定されないが、
2018512377.tif 000028
2018512377.tif 000029
またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物が挙げられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の代表的なリガンド‐細胞傷害性薬物複合体としては、これらに限定されないが：
2018512377.tif 000030
2018512377.tif 000031
2018512377.tif 000032
またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物が挙げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体の製造のための代表的化合物としては、これらに限定されないが：
2018512377.tif 000033
2018512377.tif 000034
2018512377.tif 000035
2018512377.tif 000036
2018512377.tif 000037
が挙げられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体の製造のための代表的なプロドラッグ（リンカーを有する）及び中間体としては、これらに限定されないが：
2018512377.tif 000038
2018512377.tif 000039
2018512377.tif 000040
が挙げられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-(S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
2018512377.tif 000041
2018512377.tif 000042
工程1
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b(0.992 g, 4.2 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。反応混合物にトリエチルアミン(0.69 mL, 4.96 mmol)を加えた後、ジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(4.4 mL, 4.4 mmol)を滴下した。この混合物を0℃で50分間攪拌した。反応溶液を-75℃まで冷却し、(2S,5S)-tert-ブチル2-ホルミル-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3a(900 mg, 4.2 mmol, 既知の方法“US 20120195857”に従って調製)の塩化メチレン溶液5 mLを加えた。そして、-75℃で1.5時間、0℃で1.5時間、更に室温で1時間それぞれ攪拌した。その後、室温で反応混合物にリン酸塩緩衝液(pH = 7.0)及びメタノールの混合物(V/V = 1: 3)36 mLを加えた。反応混合物を0℃まで冷却し、メタノール及び(30%)過酸化水素の混合物(V/V = 2: 1)36 mLを加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、有機層を減圧下で濃縮し、水15 mLを加えた。水層をエーテル(30 mL × 3)で抽出し、合わせたエーテル層を5%重炭酸ナトリウム溶液、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液(150 mL)で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3b(600 mg, 白色固体)を収率33%で得た。
工程2
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3b(600 mg, 1.34 mmol)を塩化メチレン15 mLに溶解し、粉砕した分子篩1 gを加えた。アルゴン雰囲気下及び0oCでこの混合物に1,8-ビスジメチルアミノナフタレン(740 mg, 3.45 mmol)及びトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート(500 mg, 3.38 mmol)を加えた。反応混合物を錫箔で包み、室温で38時間撹拌した。反応終了後、得られた混合物をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。ろ液を合わせ、有機層を塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL × 3)で洗浄し、過剰の1,8-ビス-ジメチルアミノナフタレンを除去した後、塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3c(200 mg, 白色固体)を収率32%で得た。
工程3
(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(2S、5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3c(200 mg, 0.43 mmol)をテトラヒドロフラン22 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。この混合物に過酸化水素(186 mg, 1.6 mmol)及び水酸化リチウム一水和物(58 mg, 1.37 mmol)をゆっくり滴下した。0℃で反応混合物を10分間攪拌した後、氷浴を除き、室温で更に44時間攪拌した。反応終了後、反応溶液に亜硫酸ナトリウム固体(220 mg, 1.74 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した後、水15 mLを加えた。有機層を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタン(20 mL × 2)で抽出した。水層に2N 塩酸を滴下し、pHを3〜4にした。その後、酢酸エチル(20 mL × 3)で抽出し、酢酸エチル層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸3dの粗製品(120 mg, 白色固体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程4
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((2S,5S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸3dの粗製品(106 mg, 0.35 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)4.8 mLに溶解した後、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-フェニルプロパノエート1f(80 mg, 0.36 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.30 mL, 1.74 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(160 mg, 0.42 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応終了後、反応混合物にジクロロメタン10 mLを加え、水(5 mL × 2)及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3e(138 mg, 無色の粘稠性液体)を収率78%で得た。
工程5
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((2S,5S)-5-メチルピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(2S,5S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-tert-ブトキシ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)-5-メチルピロリジン-1-カルボキシレート3e(150 mg, 0.267 mmol)をジオキサン2.2 mLに溶解した後、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.160 mL, 0.896 mmol)を加えた。反応系を密封し、室温で7時間撹拌した後、4℃の冷蔵庫に16時間放置した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣にジクロロメタン15 mLを加え、0℃まで冷却し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8に調整した。水層をジクロロメタン(8 mL × 2)で抽出し、有機層を合わせた。有機層を塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((2S,5S)-5-メチルピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3f(80 mg, 無色の粘稠性固体)を収率74%で得た。
工程6
(S)-tert-ブチル2((2R,3R)-3-((2S、5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン)-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((2S,5S)-5-メチルピロリジン-2-イル)プロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3f(80 mg, 0.198 mmol)及び(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(136 mg, 0.213 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 5: 1)4.8 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.170 mL, 0.98 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(100 mg, 0.263 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応混合物にジクロロメタン15 mLを加え、水(6 mL × 2)で洗浄した。水層をジクロロメタン(5 mL)で抽出し、合わせたジクロロメタン層を塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン)-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3g(168 mg, 白色の泡沫状固体)を収率81%で得た。
工程7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-sec-ブチル-1-(9H-フルオレン)-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3g(167 mg, 0.16 mmol)をジクロロメタン2 mLに溶解し、ジエチルアミン2 mLを加えた。アルゴン雰囲気下で反応混合物を室温で3時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S、5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3hの粗製品(180 mg, 黄色の液体)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 802.6 [M+1]
工程8
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-(S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート3hの粗製品(130 mg, 0.16 mmol)をジオキサン1 mLに溶解し、5.6 M塩酸のジオキサン溶液3 mLを加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((2S,5S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-5-メチルピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸3(28 mg, 白色固体)を収率23%で得た。
MS m/z (ESI): 746.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.31-7.14(m, 5H), 4.79-4.67(m, 2H), 4.25-4.13 (m, 1H), 4.10-3.97(m, 2H), 3.77-3.66(m, 1H), 3.60-3.52(m, 1H), 3.51-3.42(m, 1H), 3.41-3.12(m, 7H), 2.97-2.85(m, 1H), 2.67(d, 3H), 2.48-2.40(m, 2H), 2.30-2.02(m, 4H), 1.93-1.73(m, 2H), 1.70-1.55(m, 1H), 1.53-1.28(m, 5H),1.26-1.11(m, 7H), 1.10-0.99(m, 14H), 0.98-0.83(m, 4H).
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000043
工程 1
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(4R,5S)-4-メチル-5-フェニル-3-プロピオニルオキサゾリジン-2-オン1b (4.6 g, 20.1 mmol)をジクロロメタン80 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で0℃まで冷却した。0℃でこの反応溶液にトリエチルアミン(3.2 mL, 23.1 mmol)及びジブチルボロントリフルオロメタンスルホネート(20 mL, 20.7 mmol)を滴下し、0℃で50分間撹拌した後、-75℃で(S)-tert-ブチル2-ホルミルピロリジン-1-カルボキシレート25a(4 g, 20.1 mmol, 既知の方法“Journal of the American Chemical Society, 2011, 133(42), 16901-16910”に従って調製)のジクロロメタン溶液5 mLを滴下し、-75℃で1時間撹拌した。その後、0℃で2時間、室温で1時間それぞれ撹拌した。リン酸塩緩衝液(pH = 7.0)及びメタノールの混合物(V/V = 1: 3) 60 mLを反応溶液に加えた。0℃でメタノール及び30%過酸化水素の混合物(V/V = 2: 1)60 mLを加えた。室温で1時間撹拌した。反応終了後、有機層を減圧下で濃縮し、水15 mLを加えた。水層をエーテル(30 mL × 3)で抽出し、エーテル層を合わせ、5%重炭酸ナトリウム溶液、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25b(2.26 g, 白色の泡沫状固体)を収率24.9%で得た。
MS m/z (ESI): 333.3 [M-100+1]
工程 2
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-ヒドロキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25b(2 g, 4.62 mmol)をジクロロメタン20 mLに溶解し、粉砕した分子篩2 gを加えた。0oC及びアルゴン雰囲気下でこの混合物に1,8-ビスジメチルアミノナフタレン(2.57 g, 12 mmol)及びトリメチルオキソニウムテトラフルオロボレート(1.71 g, 11.5 mmol) を加え、室温で17時間撹拌した。この反応混合物をろ過し、ろ過ケーキをジクロロメタンで洗浄した。ろ液を合わせ、有機層を塩化アンモニウムの飽和溶液(20 mL x 3)及び塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25c(1.3 g, 白色の泡沫状固体)を収率63%で得た。
MS m/z (ESI): 447.3 [M+1]
工程 3
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-1-メトキシ-2-メチル-3-((4R,5S)-4-メチル-2-オキソ-5-フェニルオキサゾリジン-3-イル)-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25c(1.3 g, 2.9 mmol)をテトラヒドロフラン80 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液を0℃まで冷却し、30%過酸化水素(1.25 g, 11 mmol)を滴下し、水酸化リチウム一水和物(207 mg, 4.95 mmol)を加えた。室温で反応混合物を12時間撹拌した。反応終了後、亜硫酸ナトリウム固体(1.47 g, 11.6 mmol)を反応溶液に加え、室温でこの混合物を1時間撹拌した。その後、少量の水を加え、有機層を減圧下で濃縮した。少量の水を加え、残渣を溶解し、ジクロロメタン(50 mL × 2)で抽出した。水層に塩酸を加え、pHを3とし、ジクロロメタン(40 mL × 3)で抽出した。有機層を水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25dの粗製品(870 mg, 無色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
工程4
(S)-tert-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート
(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d(100 mg, 0.368 mmol)をジクロロメタン6 mL及びジメチルホルムアミド1.8 mLに溶解し、(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート7b(97 mg, 0.405mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(237.8 mg, 2.844 mmol)及び2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(168.2 mg, 0.442 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。そして、反応混合物にジクロロメタン10 mLを加え、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25e(157 mg, 無色の油)を収率83.9%で得た。
MS m/z (ESI): 509.3 [M+1]
工程 5
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(tert-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-カルボキシレート25e(157 mg, 0.308 mmol)をジオキサン2 mLに溶解し、4 M塩酸のジオキサン溶液(0.193 mL, 1.08 mmol)を加えた。反応系を密封し、室温で1時間撹拌した後、4℃の冷蔵庫に12時間放置した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶解し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液で洗浄した。水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、塩化ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエート25fの粗製品(100 mg, 淡黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 407.2 [M-1]
工程 6
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル3-(2-フルオロフェニル)-2-((2R,3R)-3-メトキシ-2-メチル-3-((S)-ピロリジン-2-イル)プロパンアミド)プロパノエート25f(100 mg, 0.244 mmol)及び(5S、8S、11S、12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-カルボン酸1i(156.1 mg, 0.244 mmol)をジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合溶媒(V/V = 4: 1)7.5 mLに溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(158 mg, 1.224 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物に2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(121 mg, 0.318 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。そして、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Bを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25g(242 mg, pale 黄色の油)を収率96.5%で得た。
MS m/z (ESI): 1028.4 [M+1]
工程 7
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート
(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリオキソ-2-オキサ-4,7,10-トリアザテトラデカン-14-オイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25g(242 mg, 0.235 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解し、ジエチルアミン3 mLを加えた。この混合物を室温で3時間撹拌した後、減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25hの粗製品(250 mg, 黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 806.7[M+1]
工程 8 
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-tert-ブチル 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ -(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパノエート25hの粗製品(262 mg, 0.325mmol)を反応フラスコに入れ、4 M塩酸のジオキサン溶液7 mLを加えた。反応系を密封し、室温で12時間撹拌した後、この反応溶液を減圧下で濃縮し、高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸25(50 mg, 白色固体)を収率28.4%で得た。
MS m/z (ESI): 750.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.35-7.30(m, 1H), 7.20-7.15(m, 1H), 7.09-6.09(m, 2H), 4.81-4.75(m, 1H), 4.70-4.64(m, 1H), 4.15-4.13(m, 1H), 4.05-4.03(m, 1H), 3.84-3.81 (m, 1H), 3.69-3.64(m, 1H), 3.55-3.51(m, 1H), 3.48-3.13(m, 13H),  3.03-2.91(m, 2H), 2.66-2.53(m, 3H), 2.47-2.45(m, 1H), 2.40-2.33(m, 2H), 2.27-2.23 (m, 1H), 2.17-2.11 (m, 2H), 1.96-1.85(m, 3H), 1.63-1.40(m, 4H), 1.21-1.14(m, 3H), 1.09-0.94(m, 12H), 0.87-0.84(m, 3H).
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000044
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸25(20 mg, 0.026 mmol)をジクロロメタン3 mLに溶解した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(13.7 mg, 0.106 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下でこの混合物を0℃まで冷却した後、用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(10.1 mg, 0.0443 mmol) のジクロロメタン溶液を滴下し、室温で2時間撹拌した。メタノールで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸26(7 mg, 白色固体)を収率28.5%で得た。
MS m/z (ESI): 941.6 [M-1]
1HNMR (400 MHz, CD3OD) d 7.32-7.21(m, 2H), 7.10-7.00(m, 2H), 6.80-6.78(m, 2H), 4.75-4.55(m, 3H), 4.12-4.06(m, 2H), 3.93-3.89(m, 1H), 3.87-3.78(m, 2H), 3.69-3.63(m, 1H), 3.52-3.47(m, 3H), 3.44-3.28(m, 3H), 3.21-3.10(m, 4H), 3.04-2.96 (m, 4H), 2.53-2.40(m, 4H), 2.35-2.18(m, 2H), 2.13-2.00(m, 2H), 1.94-1.75(m, 4H), 1.68-1.56(m, 5H), 1.37-1.27(m, 4H), 1.20-1.13(m, 3H), 1.05-0.81(m, 18H).
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000045
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸27(18 mg, 0.023 mmol)をジクロロメタン5 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下でこの溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(12.19 mg, 0.29 mmol)を加えた後、0℃で用時調製された6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロリド4b(6.5 mg, 0.028 mmol)のジクロロメタン溶液を滴下し、室温で2時間撹拌した。メタノールで反応を急冷した後、減圧下で濃縮した。高速液体クロマトグラフィーで残渣を精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸28(4 mg, 白色固体)を収率18.2%で得た。
MS m/z (ESI): 955.5 [M+1]
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸
2018512377.tif 000046
本調製法は実施例25と類似するが、原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸 25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(p-トリル)プロパノエート15bを用い、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(p-トリル)プロパン酸29(20 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 746.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.17-7.05(m, 4H), 4.84-4.67(m, 2H), 4.27-4.15 (m, 1H), 4.12-4.05(m, 1H), 3.89-3.82(m, 1H), 3.78-3.63(m, 2H), 3.57-3.47(m, 1H), 3.43-3.11(m, 7H), 2.92-2.79(m, 1H), 2.67(d, 3H), 2.52-2.44(m, 1H), 2.40-2.15(m, 7H), 2.12-2.01(m, 1H), 1.95-1.69(m, 3H), 1.67-1.49(m, 2H), 1.48-1.27(m,4H),1.23-1.12(m, 5H), 1.11-0.95(m, 14H), 0.94-0.84(m, 3H).
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸
2018512377.tif 000047
2018512377.tif 000048
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパン酸31a(600 mg, 3 mmol)を酢酸tert-ブチル15 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下及び0℃でこの溶液に過塩素酸(450 mg(70%), 4.5 mmol)を滴下し、室温で12時間撹拌した。そして、反応混合物に水10 mLを加え、有機層を1N 塩酸20 mL及び重炭酸ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄した。水層を合わせ、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8〜9に調整し、ジクロロメタン(100 mL ×2)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパン酸ブチル31bの粗製品(500 mg, 油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパノエート31bを用い、標記生成物(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸31(4 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 766.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD): d 7.31-7.12(m, 4H), 4.73-4.51(m, 2H), 4.22-4.05(m, 1H), 3.92-3.83(m, 1H), 3.76-3.65(m, 1H), 3.62-3.51(m, 1H), 3.50-3.12(m, 9H), 3.09-2.98(m, 1H), 2.59-2.39(m, 4H), 2.38-2.24(m, 1H), 2.23-2.17(m, 1H), 2.16-2.01 (m, 3H), 2.00-1.85(m, 2H), 1.84-1.76(m, 1H), 1.73-1.57(m, 2H), 1.43-1.27(m, 5H), 1.25-1.14(m, 3H), 1.10-0.95(m, 13H), 0.94-0.83(m, 5H).
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸
2018512377.tif 000049
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(3-フルオロフェニル)プロパノエート17bを用い、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸32(33.5 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 750.7 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.31-7.28(m, 1H), 7.08-6.95(m, 3H),4.77-4.69(m, 2H), 4.09-3.94(m,3H), 3.69-3.66(m,2H),3.48-3.44(m, 2H), 3.38-3.36(m, 3H), 3.34-3.28(m, 6H), 3.26-3.19(m, 2H), 3.13(m,1H), 3.01-2.91(m, 2H), 2.67-2.65(m, 2H),2.54-2.47(m, 2H), 2.34-2.28(m, 2H), 2.18-2.00(m, 2H),1.98-1.77(m, 2H), 1.55-1.42(m, 2H), 1.08-0.98(m, 18H),0.88-0.83 (m, 3H).
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
(S)-3-(2,4-ジクロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸
2018512377.tif 000050
工程1
(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパノエート
(S)-2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパン酸33a(1.3 g, 5.57 mmol, 既知の方法“International Journal of Peptide & Protein Research, 1987, 30(1), 13-21”に従って調製)を酢酸tert-ブチル10 mLに溶解した。0℃及びアルゴン雰囲気下でこの溶液に過塩素酸(1.2 g(70%), 8.36 mmol)を滴下し、室温で12時間撹拌した。反応混合物を塩化メチレンで希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を滴下し、pHを8〜9に調整した。水層を塩化メチレンで抽出した。 有機層を合わせ、水及び塩化ナトリウムの飽和溶液で順次に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、標記生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパノエート33bの粗製品(3.4 g, 薄黄色の油)を得た。この生成物を更に精製せずに次の工程に用いた。
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2,4-ジクロロフェニル)プロパノエート33bを用い、標記生成物(S)-3-(2,4-ジクロロフェニル)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R, 4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)プロパン酸33(23 mg, 白色固体)を得た。
MS m/z (ESI): 800.6 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.43-7.42(m, 1H), 7.26-7.23(m,2H), 4.75-4.67(m, 2H), 4.14-4.04(m, 2H), 4.00-3.98(m, 1H), 3.91-3.89(m, 1H), 3.68-3.67(m, 3H), 3.39-3.26(m, 12H), 3.21-3.12(m, 3H), 2.67-2.64(m, 3H), 2.50-2.46(m, 3H), 2.31-2.28 (m, 2H), 2.17-2.15(m, 2H), 2.02-2.00(m, 4H), 1.90-1.88(m, 2H), 1.74-1.72(m, 2H), 1.39-1.37(m, 2H), 1.06-0.98(m, 12H).
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸
2018512377.tif 000051
本調製法は実施例25と類似するが、工程4の原料の代替として(2R,3R)-3-((S)-1-(tert-ブトキシカルボニル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパン酸25d及び(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(チオフェン-2-イル)プロパノエート16bを用い、標記生成物 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-(5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(チオフェン-2-イル)プロパン酸35(2.6 mg, 白色固体)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.21-7.19(m, 1H), 6.91-6.90(m, 2H), 4.80-4.65(m, 2H), 4.16-4.08(m, 2H), 3.93-3.90(m, 1H), 3.70-3.66(m, 2H), 3.55-3.52(m, 1H), 3.48-3.45(m, 2H), 3.40-3.26(m, 6H), 3.25-3.13(m, 4H), 2.96-2.82(t, 1H), 2.69-2.65(d, 3H), 2.52-2.47(m, 2H), 2.39-2.29(m, 1H), 2.21-2.14(m, 2H), 1.92-(s, 3H), 1.63-1.61(m, 2H), 1.40-1.29(m, 3H), 1.23-1.14(m, 3H), 1.10-0.98(m, 13H), 0.88-0.85 (t, 3H).
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
2018512377.tif 000052
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸26(5.45 mg, 5.78 mmol)をアセトニトリル1.2 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(7.56 mg/mL, 12 mL)を加え、25℃で4時間撹拌した。そして、反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物36のPBS緩衝液(3.51 mg/mL, 27.5 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148094.39(MAb+0D), 149111.06(MAb+1D), 150167.12 (MAb+ 2D), 151188.93(MAb+3D), 152243.46(MAb+4D), 153272.96(MAb+5D).
平均値: y=1.9
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
2018512377.tif 000053
2018512377.tif 000054
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-メトキシフェニル)プロパン酸28(1.75 mg, 1.83 mmol)をアセトニトリル0.9 mLに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール溶液18c(2.31 mg/mL, 9.0 mL)を加え、25℃で6時間撹拌した。そして、反応混合物を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で精製し、無菌条件下で0.2 mmフィルターを通してろ過し、標記生成物37のPBS緩衝液(1.35 mg/mL, 13.0 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 148093.25(MAb+0D), 149281.78(MAb+1D), 150474.33 (MAb+ 2D), 151372.72(MAb+3D), 152373.24(MAb+4D), 153469.40(MAb+5D).
平均値: y=2.3.
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
2018512377.tif 000055
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸26(4.45 mg, 4.72 mmol)をアセトニトリル1.1 mLに溶解し、ニモツズマブ-プロパンチオール39cのPBS緩衝液(5.38 mg/mL, 11 mL)を加えた。25℃の水浴中で4時間振動した後、反応を止めた。得られた混合物をSephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物41のPBS緩衝液の粗製品(2.96 mg/mL, 20 mL)を得た。これを更に遠心し、約5.5 mLに濃縮し、再度Sephadex G25ゲルカラム(溶出液: 0.05 M PBS溶液, pH 6.5)で脱塩し、標記生成物41のPBS緩衝液(4.33 mg/mL, 11 mL)を得た。これを4℃で保管した。
Q-TOF LC/MS: 特徴ピーク: 150186.05(MAb+0D), 151362.44(MAb+1D), 152261.90 (MAb+ 2D), 153438.29(MAb+3D), 154339.30(MAb+4D), 155511.23(MAb+5D).
平均値: y=2.3.