【手続補正書】
【提出日】平成20年8月12日(2008.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
上記の疾患における炎症プロセスを調節するのに重要なサイトカインの刺激後に、例えばＧＭ−ＣＳＦにより、ＥＸ２０の発現がアップレギュレートされることが見出された。さまざまな白血球サブセット(leukocyte subsets)におけるＥＸ２０の観察される炎症疾患関連過剰発現の見地において、ＥＸ２０およびそれによりコードされるタンパク質は上記の炎症疾患の診断において有用であり、そして、コードされるタンパク質はそれらの疾患の処置に適した医薬の同定のための治療的標的として有用である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本明細書で使用する用語は、以下の意味を有する：
“単離”は、その本来の環境から取り出された物質を意味する。
“ハイブリダイゼーション”または“ハイブリダイズ”は、ポリヌクレオチド鎖が、塩基対形成を介してその相補鎖と結合する任意の工程を意味する。
“ストリンジェントな条件”は、２０％までの塩基対ミスマッチを可能にする実験条件を意味し、典型的に６５℃で０.１ＸＳＳＣ(１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１.５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ  ７.０)の２回、１５分洗浄である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本明細書で使用する“変異体”は、アミノ酸配列に関して、１個以上のアミノ酸により変えられているアミノ酸配列を意味する。変化は、アミノ酸置換、欠失または挿入を含み得る。ヌクレオチド配列に関して、本明細書で使用する“変異体”なる用語は、１個以上のヌクレオチドにより変えられているヌクレオチド配列を意味する；変化は、ヌクレオチド置換、欠失または挿入を含み得る。好ましいアミノ酸配列番号２または配列番号１６の機能的等価変異体は、配列番号２または配列番号１６と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてとりわけ９５％を超えるアミノ酸配列同一性を有するものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
ポリヌクレオチド・プローブは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１または配列番号１５の配列を有するポリヌクレオチド・フラグメントを有するポリヌクレオチド・フラグメントと選択的にハイブリダイズできる。該プローブは、このようなハイブリダイゼーション条件下で、その同族配列にのみハイブリダイズする配列を有する。上記のＤＮＡプローブは、ノーザンおよびサザン・ブロット分析、ドット・ブロットおよびスロット・ブロット分析、および蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を含む多くのスクリーニングの適用に有用である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明のポリヌクレオチド・プローブと相補的ポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、インサイチュ(例えばＦＩＳＨ)ハイブリダイゼーション、ノーザンまたはサザン・ブロット分析、ドット・ブロットまたはスロット・ブロット分析を使用して検出し得る。異常性は、また、例えば配列感受性ゲル電気泳動(ＣＳＧＥ)およびＤＮＡ配列決定により検出し得る。遺伝的異常性は、個体のＥＸ２０タンパク質の、正常ＥＸ２０タンパク質のアミノ酸配列と比較したアミノ酸配列における変化、あるいはタンパク質の欠失をもたらし得る。あるいは、変化はアミノ酸配列を変えないが、代わりに、遺伝子の５'−もしくは３'−末端のいずれかでの制御エレメントの配列を変えることにより、または遺伝子のイントロン配列領域内の制御エレメントの配列を変えることにより、ＥＸ２０遺伝子の発現を変え得る。変化は、また、遺伝子の転写が処理されるまたは翻訳される方法に影響し得る。本発明は、また、個体のＥＸ２０遺伝子のポリヌクレオチド配列における異常性を検出するため、または個体の細胞におけるＥＸ２０の発現のレベルを測定するためのキットを含む。このような使用のためのハイブリダイゼーション・キットは、検出可能な、例えば化学ルミネッセンス、放射性または蛍光性の標識をその中に包含させることにより修飾し得る、前記のプローブを含み、そして標識試薬、すなわち、放射性同位体、化学ルミネッセンスまたは蛍光基をハイブリダイズ産物に包含させる試薬のような他の試薬、および緩衝液を含み得る。ＰＣＲ増幅キットは、上記のようなプライマー対を、ＴａｑポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼと共に含み得、そして増幅用緩衝液等のような付加的な試薬を含み得る。ＰＣＲ増幅キットの特定の実施態様には、ＣＳＧＥおよびＤＮＡ配列決定を含む、ポリヌクレオチド変化を検出する多くの技術に特異的な付加的な試薬が含まれ得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
ポリヌクレオチド(Ｂ)の発現のレベルの測定は、前記のような炎症性疾患の診断において使用され得る。したがって、本発明は、対象が炎症性疾患、例えば、上昇したＧＭ−ＣＳＦレベルと連関する炎症性疾患を有するか否かを測定する方法を含み、ここで該方法は、該対象からの細胞サンプルにおいて、前記のポリヌクレオチド(Ｂ)、特に配列番号１または配列番号１５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド(Ｂ)、またはストリンジェント条件でそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の発現レベルを測定すること、および当該レベルを、健康対象からの細胞サンプル中の該ポリヌクレオチドの発現レベルと比較することを含む。ポリヌクレオチド(Ｂ)の上昇した発現レベルは、炎症性疾患を示唆する。測定されたレベルは、該炎症性疾患の性質を示唆する。ポリヌクレオチド(Ｂ)の発現レベルは、例えば、ノーザン・ブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)、インサイチュ・ハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウェスタン・ブロット・ハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学法(immunohistochemistry)によって、決定され得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用する診断試験において、ｍＲＮＡを、所望の細胞、例えば、ＢＡＬ液細胞(BAL fluid cell)または末梢血細胞から単離する。２種のプライマーであって、一方は、配列番号１のヌクレオチド７６５と７８３の間の領域の配列と同一の配列を有し、他方は、配列番号１のヌクレオチド８１５−８３５の逆相補物であるヌクレオチド配列を有する、プライマーを設計する。適当に修飾されそして標識されたプローブを、次いで、配列番号１のヌクレオチド７８７−８１３の間の配列に対応して作製する。適当なコントロール遺伝子を使用して、これらの２種のプライマーおよびプローブを、ＴａｑＭａｎ(PE Applied Biosystems)装置において使用して、調査中の患者および健康対象から採取したサンプル中のＥＸ２０のｍＲＮＡ量を測定する。診断目的でインサイチュ・ハイブリダイゼーションを使用するとき、配列番号１に示す配列の任意の部分に対応する約２００〜１２００ｂｐのプローブを使用できる。種々の長さのいくつかのオーバーラップ・プローブをそのような試験、例えば実施例３に記載のものにおいて使用することができる。サンプルを、患者から収集し、そしてパラフィンに包埋することができる。そのようなサンプルは、例えば、末梢血細胞、気管支肺胞洗浄(ＢＡＬ)液細胞、または種々の組織切片であり得る。実施例３において記載したように調製された標識リボプローブを、次いで使用し、これらのサンプル中のＥＸ２０の発現レベルを測定し、そしてそれによって炎症性状態を同定することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
炎症性状態、例えば炎症性気道疾患の阻害または回復における本発明の薬物の有効性は、動物モデル、例えば、気道炎症または他の炎症性状態の、マウスまたはラットモデル、例えば、Szarka et al., J. Immunol. Methods (1997) 202:49-57; Renzi et al., Am. Rev. Respir. Dis. (1993) 148:932-939; Tsuyuki et al., J. Clin. Invest. (1995) 96:2924-2931; Cernadas et al (1999) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20:1-8; Durie et al., Clin. Immunol. Immunopathol. (1994) 73:11-18;およびWilliams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:9784-9788に記載されるように実証され得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例１
血液(２００ｍｌ)を、クエン酸ナトリウムを含む試験管に、滅菌条件下で呼吸器疾患の病歴のない正常ドナーから集める。好中球を確立された方法で精製する。ＰＢＭＣを、末梢血細胞から、Ficoll Hypaque(Pharmacia)遠心により分離する。主に顆粒球および赤血球である残りの細胞集団を、赤血球溶解溶液(１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０.１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＨ  ７.３)で処理する。純度を測定するために、顆粒球をHansel染料(Difco Laboratories Ltd)で染色し、高倍率の光顕微鏡で区別する。好酸球の汚染は２％未満であることが分かる。刺激のために、好中球を５００万細胞／ｍｌの濃度で、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ中に再懸濁する。細胞を、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ(R&D System)の存在下または非存在下で５時間培養する。総ＲＮＡを、製造者の記載の通りＴＲＩＺＯＬ試薬(Gibco/BRL)を使用して抽出する。１ｍｌのＴＲＩＺＯＬを、各５００万個のペレット化好中球の再懸濁のために使用する。ｍＲＮＡを、ＭＥＳＳＡＧＥＭＡＫＥＲ  ｍＲＮＡ単離キット(Gibco/BRL)を使用して、製造者が推奨する条件で精製する。３００ｎｇのｍＲＮＡを使用して、第１鎖合成のためにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ(Gibco/BRL)およびオリゴ(ｄＴ)を用いてｃＤＮＡを合成する。二本鎖ｃＤＮＡを、等体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで一回抽出し、そして０．５容量部の７．５Ｍ  酢酸アンモニウムおよび２．５容量部のエタノールで沈降させる。遠心分離の後、得られたペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして１６μｌの滅菌水中に再懸濁する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
ｃＤＮＡ−ＲＡＤを、Hubank, M., and D.G. Schatz. Nucleic Acids Res. 22:5640-5648;および、O'Neill, M.J., and A. H. Sinclair. Nucleic Acids Res. 25:2681-2682によって本質的に記載されているように実行する。非刺激および刺激された好中球から単離されたｍＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡサンプルを、ＤｐｎＩＩ制限酵素で消化し、そして２４マー(配列番号７)を１２マー(配列番号８)オリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって得られるＲ−アダプターにライゲートする。両方の「テスター」(刺激された好中球のｃＤＮＡ)および「ドライバー」(非刺激の好中球のｃＤＮＡ)を、Expand Long Template PCR SystemおよびExpand Buffer 1(Roche Diagnostics)を使用して生成する。５種の１００μｌ  ＰＣＲをそれぞれのテスターについて、および１０種をそれぞれのドライバーについて、実施する。ＤｐｎＩＩ消化を使用し、ドライバーおよびテスターアンプリコンの両方からＲ−アダプターを除去する。２４マー(配列番号９)を１２マー(配列番号１０)にアニーリングすることによって得られたＪ−アダプターを、次いで、テスター集団にライゲートさせる。サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションを、５μｌの反応物中で、６７℃で２０時間実施する。異なる産物１(ＤＰ１)を作成するため、２５０ｎｇのテスターｃＤＮＡを、２５μｇのドライバーｃＤＮＡと、１００：１の比率で混合する。ＤＰ１  ｃＤＮＡを、次いで、ＤｐｎＩＩで消化し、Ｊ−アダプターを除去し、その後、Ｎ−アダプターをライゲートし、これは２４マー(配列番号１１)を１２マー(配列番号１２)オリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって得られたものである。異なる産物２(ＤＰ２)を作成するため、３１．２５ｎｇのテスターを、２５μｇのドライバーｃＤＮＡと、８００：１の比率で混合する。消化され、そして過剰のアダプターを、該ｃＤＮＡをMicrocon30フィルター(Amicon)上で洗浄することによって除去する。サブトラクションされたライブラリーをアガロースゲル電気泳動で分画化する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
実施例３
この実施例は、インサイチュ・ハイブリダイゼーションによるＥＸ２０遺伝子の発現および組織分布の分析を記載する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
標識リボプローブを生成するために、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド(Life Technologies)のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位の間に１１６１ｂｐ挿入物を含むサブクローンを構築する。このサブクローンの挿入物は、下記実施例４の挿入物と同一であり、同じ方法で製造される。この構築物中に、ベクター中のＳＰ６プロモーターを使用して、インサイチュ・ハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用できる挿入物のアンチセンス鎖を転写する。ベクター中のＴ７プロモーターは、ネガティブ・コントロールとして使用するセンス鎖を転写するのに使用する。パラフィン包埋サンプルからの連続組織切片を、１.２ｋｂ挿入物から合成した放射標識ｃＲＮＡプローブとハイブリダイズする。リボプローブを、３３Ｐ−ウリジン ５'−トリホスフェートと、ＳＰ６(アンチセンス)およびＴ７(センス)ＲＮＡポリメラーゼの存在下、インビトロで転写する。プローブを次いでカラム精製し、次いで５％ＴＢＥ−尿素アクリルアミドゲルでの電気泳動に付し、サイズおよび純度を確認する。組織切片をプロテイナーゼＫで消化し、次いで、プローブと約８.０ｘ１０８ｄｐｍ／ｍｌで、６５℃にて１８時間ハイブリダイズする。スライドをＲＮＡｓｅ  Ａで処理し、ストリンジェント条件下で２時間、０.１ｘＳＳＣ中で６５℃にて洗浄する。スライドを、次いでKodak NTB-2エマルジョンで被覆し、４℃で７日間曝し、Kodak D-19現像液および定着液を使用して現像する。スライドをヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、Nikonマイクロスコープに接続したSony Digital Photo Cameraを使用して写す。アンチセンス・プローブとのハイブリダイゼーションに加えて、別のセクションを二つのタイプのコントロール・プローブとハイブリダイズする。全ての組織を、最初に、ベータ−アクチンｍＲＮＡに対するプローブとスクリーニングし、ＲＮＡがサンプル内に保存されていることを確認する。隣接連続セクションは、また、アンチセンス・プローブとして、遺伝子の同じ領域由来のセンス・コントロール・リボプローブとハイブリダイズをする。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
粗溶解物の調製
細胞(１ｘ１０９)を、１００ｍｌの溶解緩衝液(２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ  ７.９、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ  Ｅ−メルカプトエタノール、０.５ｍＭ  イミダゾール、０.１％Nonidet P-40、４０ｐｇ／ｍｌ  ＡＥＢＳＦ、０.５ｐｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１ｐｇ／ｍｌ  アプロチニンおよび０.７ｐｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ)に再懸濁する。細胞を、氷上で１５分インキュベートし、次いで３９,０００ｘｇで３０分、４℃で遠心する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
金属キレート親和性クロマトグラフィー
金属キレート親和性クロマトグラフィーを、室温にてＢｉｏＣＡＤクロマトグラフィー・ワークステーションに接続したカラムで行なう。２０ｍｌ  Ｐｏｒｏｓ  ＭＣ／Ｍ(１６ｍｍＤ×１００ｍｍＬ)カラムをＮｉ２＋で、使用前および各注入後に満たす。Ｎｉ２＋で満たすために、カラムを１０カラム容量(ＣＶ)の５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８、１Ｍ  ＮａＣｌ、続いて１０ＣＶの水で洗浄する。カラムを、５００ｍｌの０.１Ｍ  ＮｉＳＯ４  ｐＨ  ４.５−５で満たし、１０ＣＶの水で洗浄し、次いで任意の非結合Ｎｉ２＋を、５ＣＶの０.３Ｍ  ＮａＣｌでの洗浄により除去する。全ての段階を２０ｍｌ／分の流速で行なう。満たしたＭＣ／Ｍカラムを、５ＣＶの緩衝液Ｂ(２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ  ７.９、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ  Ｅ−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１００ｍＭ  イミダゾール)で平衡化し、部位を飽和させ、続いて１０ＣＶの緩衝液Ａ(０.５ｍＭ  イミダゾール以外、緩衝液Ｂと同じ)で満たす。ラン当たり９０〜９５ｍｌの粗溶解物を、２０ｍｌ／分の流速で、カラムに充填する。続く段階を、３０ｍｌ／分の流速で行なう。任意の非結合物質を１２ＣＶの緩衝液Ａでの洗浄により除去し、ＥＸ２０は０〜５０％緩衝液Ｂの１０ＣＶにわたる勾配で溶出する。フラクション(８ｍｌ)を勾配にわたり回収する。ＥＸ２０含有フラクションを合わせ、プロテアーゼ阻害剤を、上記溶解緩衝液に関して記載の最終濃度まで添加する。ＤＴＴも最終濃度１ｍＭまで添加する。合わせたフラクションを、一晩、４リットルの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ  ７.９、１ｍＭ  ＤＴＴ、０.２ｍＭ  ＰＭＳＦに対して４℃で透析する。タンパク質濃度を測定し、必要な場合には、サンプルをMillipore Ultrafree-15遠心デバイス(ＭＷカットオフ５０ｋＤａ)で４℃にて濃縮する。デバイスを、使用前に水で濯ぐ。−８０℃での長期貯蔵に使用する緩衝液は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ  ７.９、１ｍＭ  ＤＴＴ、約１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロールである。グリセロールは、４℃での貯蔵では、サンプルから除くことができる。