【手続補正書】
【提出日】平成31年4月10日(2019.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の遺伝子または核酸における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は：
（ｉ）遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムであって、
ａ）標的ＤＮＡと反対側のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡであって、該標的ＤＮＡは、深部イントロン突然変異と、該深部イントロン突然変異の両端に位置する配列とを含み、第１のガイドおよび第２のガイドは、該両端配列と反対側の部位にハイブリダイズする、前記第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡ、および
ｂ）Ｃａｓタンパク質
を含む、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム；
（ｉｉ）遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムをコードする核酸であって、
ａ）標的ＤＮＡと反対側のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡであって、該標的ＤＮＡは、深部イントロン突然変異と、該深部イントロン突然変異の両端に位置する配列とを含み、第１のガイドおよび第２のガイドは、該両端配列と反対側の部位にハイブリダイズする、前記第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡ、および
ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む、前記核酸；
または
（ｉｉｉ）ウイルスベクターを含むウイルス粒子であって、該ウイルスベクターは、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムをコードする核酸を
コードし、
ａ）標的ＤＮＡと反対側のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡであって、該標的ＤＮＡは、深部イントロン突然変異と、該深部イントロン突然変異の両端に位置する配列とを含み、第１のガイドおよび第２のガイドは、該両端配列と反対側の部位にハイブリダイズする、前記第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡ、および
ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む、前記ウイルス粒子；
を含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出す、
前記組成物。
【請求項２】
個体の核酸における突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムをコードする核酸；ならびに、
ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡとハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位
を含むＣａｓ発現カセット；
を含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットから発現され；
該Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し；および
該Ｃａｓタンパク質は、該第１のガイドＲＮＡ標的部位で該Ｃａｓ発現カセットを切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、
前記組成物。
【請求項３】
細胞において標的核酸を切断するための組成物であって、該組成物は、
ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムをコードする核酸；ならびに
ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡとハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位
を含むＣａｓ発現カセット；
を含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットから発現され；
該Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し；および
該Ｃａｓタンパク質は、該第１のガイドＲＮＡ標的部位で該Ｃａｓ発現カセットを切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較し
て、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、
前記組成物。
【請求項４】
Ｃａｓ発現カセットは、
ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡとハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位
をさらに含み；
Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減し；および
該第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、
該第２のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、または
該第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし、該第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、
請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
Ｃａｓ発現カセットは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリアデニル化（ポリＡ）配列をさらに含み、そして、該Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列間の作動可能な連結を妨げる、請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、眼の障害、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖網膜色素変性症、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症、または、Ｘ連鎖低リン酸血症である、請求項１、２、４または５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
深部イントロン突然変異は、
（ｉ）表１または表２に示される深部イントロン突然変異である；
（ｉｉ）中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）の深部イントロン突然変異であり、場合によりヒトＣＥＰ２９０、および／または配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む；
（ｉｉｉ）ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である；
（ｉｖ）核酸の５'スプライス供与部位の約１〜１０，０００ヌクレオチド、約１〜１０００ヌクレオチドまたは約１００〜１０００ヌクレオチド下流に位置する；
（ｖ）核酸の３'スプライス受容部位の約１〜１０，０００ヌクレオチド、約１〜１０００ヌクレオチドまたは約１００〜１０００ヌクレオチド上流に位置する；または
（ｖｉ）核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する；
請求項１、２または４〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
（ｉ）第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡガイド配列は、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズし、場合によりヒトＣＥＰ２９０、および／または配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む；
（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡは、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号１９、配列番号５０、配列番号５１または配列番号５２の配列を含むＤＮＡによってコードされる；
（ｉｉｉ）第２のガイドＲＮＡは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号５３または配列番号５４の配列を含むＤＮＡによってコードされる；
（ｉｖ）第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列と融合されており、場合により該ｔｒａｃｒ配列は、配列番号２５によってコードされるヌクレオチド配列を含む；
（ｖ）第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、真核細胞において発現される；
（ｖｉ）第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている；
（ｖｉｉ）第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、場合によりＵ６、７ＳＫまたはＨ１プロモーター、と作動可能に連結されている；および／または
（ｖｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、場合により、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）由来の最小プロモーター断片、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）プロモーター、と作動可能に連結されている；
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり、場合により、
（ｉ）化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９タンパク質である；
（ｉｉ）真核細胞、場合により哺乳動物のまたはヒトの細胞、における発現のために最適化されたコドンである；
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、１つまたはそれ以上の核局在性シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み、場合により、
（ｉ）Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳを含む；
（ｉｉ）該ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中のＣ末端配列である；
（ｉｉｉ）該ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号２７）を含む；
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置し、場合により該ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、または、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり、そして第１のガイドＲＮＡ、第２のガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸は、１つ、２つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がその両端に位置する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲであり、そしてＡＡＶ粒子は、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含むＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含み；場合によりベクターは、自己相補的ベクターである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための医薬を製造する方法における、請求項１、２、または４〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、眼の障害、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖網膜色素変性症、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ｉａ型、先天性グリコシル化異常症ＩＩ型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病Ａ、遺伝性巨赤芽球性貧血１、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症ＩＩ型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、眼白子症Ｉ型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマト
ーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖高免疫グロブリンＭ血症、または、Ｘ連鎖低リン酸血症である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
深部イントロン突然変異は、
（ｉ）表１または表２に示される深部イントロン突然変異である；
（ｉｉ）中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）の深部イントロン突然変異であり、場合によりヒトＣＥＰ２９０、および／または配列番号２３に示される配列の深部イントロン突然変異を含む；
（ｉｉｉ）ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異である；
請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
組成物は、個体の眼に投与され、場合により該投与は、網膜下または硝子体内である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
【請求項１９】
ウイルスベクターを含むウイルス粒子であって、該ウイルスベクターは、
ａ）標的ＤＮＡと反対側のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡであって、該標的ＤＮＡは、深部イントロン突然変異と、該深部イントロン突然変異の両端に位置する配列とを含み、第１のガイドおよび第２のガイドは、該両端配列と反対側の部位にハイブリダイズする、前記第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡ、および
ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムをコードする核酸を含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し；および、該ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、または、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、
前記ウイルス粒子。
【請求項２０】
核酸における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを作製するための方法であって、
ａ）真核細胞に、
ｉ）核酸中のイントロンの標的ＤＮＡ配列への単一ガイドＲＮＡ、
ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）所望のイントロン突然変異およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の両端に位置する相同性アームを含む相同性組換え修復（ＨＤＲ）鋳型を含む一本鎖オリゴヌクレオチド
を含む、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードする核酸を導入すること；および
ｂ）核酸中に組み込まれた突然変異を含む細胞を単離することと
を含む前記方法。
【請求項２１】
深部イントロン突然変異は、核酸の５'スプライス供与部位の約１〜１０，０００ヌクレオチド、約１〜１０００ヌクレオチドまたは約１００〜１０００ヌクレオチド下流に位
置する、および／または、核酸の３'スプライス受容部位の約１〜１０，０００ヌクレオチド、約１〜１０００ヌクレオチドまたは約１００〜１０００ヌクレオチド上流に位置し、場合いより、深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＡＭは、細胞において発現されたＣａｓタンパク質による一本鎖オリゴヌクレオチドの切断を避けるために突然変異を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞において標的核酸を切断するためのインビトロ方法であって、該方法は、
細胞に、
ａ）突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖とハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムをコードする核酸；ならびに、
ｂ）ｉ）Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡとハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ標的部位
を含むＣａｓ発現カセット；
を含む組成物の有効量を送達することを含み、
該Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットから発現され；
該Ｃａｓタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的ＤＮＡ配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的ＤＮＡの部分を切り出し；および
該Ｃａｓタンパク質は、該第１のガイドＲＮＡ標的部位で該Ｃａｓ発現カセットを切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減する、
前記インビトロ方法。
【請求項２４】
Ｃａｓ発現カセットは、
ｉｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡがハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ標的部位
をさらに含み；
Ｃａｓタンパク質は、該Ｃａｓ発現カセットを、第１および第２のガイドＲＮＡ標的部位で切断し、それによって、該Ｃａｓ発現カセットの切断前の該Ｃａｓタンパク質の発現と比較して、該Ｃａｓタンパク質の発現を低減し；および
ａ）該第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、
ｂ）該第２のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位および第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、または
ｃ）該第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズし、該第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ標的部位とハイブリダイズする、
請求項２３に記載のインビトロ方法。
【請求項２５】
Ｃａｓ発現カセットは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリアデニル化（ポリＡ）配列をさらに含み、そして、該Ｃａｓタンパク質による第１または第２のガイドＲＮＡ標的部位の切断は、該Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリＡ配列間の作動可能な連結を妨げる、請求項２３に記載のインビトロ方法。