(57)【要約】  経口、経鼻、注射や子宮内注入などの簡便な投与経路により投与して著効を示し、飼い主の労力や負担が少なく、動物にとっても投与負担の少ない、温血動物の繁殖障害改善剤、及び、その改善剤を用いる繁殖障害の改善方法を提供することを課題とし、インターフェロンを有効成分として含有する温血動物の繁殖障害改善剤、及び、この繁殖障害改善剤を用いた温血動物の繁殖障害の改善方法を提供することにより解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてインターフェロンを含んでなる温血動物の繁殖障害改善剤。
【請求項２】
インターフェロンがヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、ニワトリの何れかに由来するインターフェロンから選ばれる何れか１種又は２種以上である請求の範囲第１項記載の繁殖障害改善剤。
【請求項３】
インターフェロンがヒトインターフェロンαである請求の範囲第１項又は第２項記載の繁殖障害改善剤。
【請求項４】
インターフェロンがヒトインターフェロンα及びヒトインターフェロンβである請求の範囲第１項又は第２項記載の繁殖障害改善剤。
【請求項５】
ヒトインターフェロンα中に、サブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で、１：９乃至１０：０の割合で含有する請求の範囲第３項又は第４項記載の繁殖障害改善剤。
【請求項６】
インターフェロンが、改善剤１ｇ当たり約０．００５乃至５，０００国際単位含有せしめられている請求の範囲第１項乃至第５項の何れかに記載の繁殖障害改善剤。
【請求項７】
投薬形態が経口投与形態、経鼻投与形態または非経口投与形態から選ばれる何れかである請求の範囲第１項乃至第６項の何れかに記載の繁殖障害改善剤。
【請求項８】
温血動物がヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、ニワトリの何れかであることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第７項の何れかに記載の繁殖障害改善剤。
【請求項９】
インターフェロンを、ヒトを除く温血動物の体重１ｋｇ当たり約０．００５乃至５，０００国際単位／回投与することを特徴とする温血動物の繁殖障害の改善方法。
【請求項１０】
インターフェロンがヒトインターフェロンαである請求の範囲第９項記載の繁殖障害の改善方法。
【請求項１１】
インターフェロンがヒトインターフェロンα及びヒトインターフェロンβである請求の範囲第９項記載の繁殖障害の改善方法。
【請求項１２】
ヒトインターフェロンα中に、サブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で、１：９乃至１０：０の割合で含有する請求の範囲第１０項又は第１１項に記載の繁殖障害の改善方法。
【請求項１３】
投薬形態が経口投与形態、経鼻投与形態または非経口投与形態から選ばれる何れかである請求の範囲第９項乃至第１２項の何れかに記載の繁殖障害の改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は繁殖障害改善剤に関し、とりわけ、インターフェロンを有効成分とする温血動物の繁殖障害改善剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、家畜の飼育規模が大規模化し多頭飼育化に伴う畜舎の温度上昇などの環境悪化、過密飼育ストレス、飼育場所の移動ストレス、分娩ストレスなどにより、家畜動物の繁殖成績が悪化する繁殖障害の増加が問題となっている。その原因は、例えば、乳牛では、分娩や移動、さらには、高泌乳化などに伴うストレスにより、ホルモン異常、人工授精の際の受胎率の低下、無発情や微弱発情、発情持続期間の短縮、免疫能の低下などが生じて、乳牛の生産期において空胎日数が増加して分娩間隔が延長してしまうことなどにあると言われている。また、前述のストレスにより、豚でも、受胎率の低下、仔豚の出生効率の低下、離乳期までの子豚の歩留まりの低下、子豚の発育不良、母豚の分娩回転率の低下などが問題となっている。このような繁殖障害の増加は、イヌやネコなどの愛玩動物分野においても、優秀な血統の動物を育成するブリーダーにとって大きな問題である。この動物の繁殖障害の増加により、動物の飼育業者が被る経済的な損失は非常に大きく、繁殖障害を改善し、動物の繁殖成績を上げることは極めて重要な課題となっている。【０００３】
しかしながら、繁殖障害の改善方法は、プロゲステロンなどの高価なホルモン剤や抗生剤を使用する薬物療法、栄養と飼育管理、細かい動物の観察による発情発見率の向上などが一般的で、飼い主に多大な労力と経済的な負担を強いるものが多い。また、これら以外にも多数の改善方法が提案されているものの（例えば特開２００１−２１１７８１号公報及び特表平１１−５０３９０７号公報参照）、依然として、十分な効果を有する改善方法は確立されていないのが実情であり、繁殖障害に対する簡便で有効な改善剤の確立が望まれている。【０００４】
一方、最近、ウシ、ネコ、ブタ、ラット、マウス、ニワトリなどの温血動物の疾患に、比較的小量の同一種或いは異種由来のインターフェロン（以下、「ＩＦＮ」と略記する場合がある。）の経口投与が有効であることが報告されている（例えば、米国特許第５９１０３０４号明細書、特開平６−３４０５４９号公報、『臨床と微生物』、ジョセフ、エム、カミンズ  アンド  ウイリアム、イー、スチュアートＩＩ（Ｊｅｓｅｐｈ  Ｍ．Ｃｕｍｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ＩＩ）、第１８巻、第５号、第６３１−６３５号（１９９１年）参照）。本出願人らも、小量のヒトインターフェロンα（以下、「ＨｕＩＦＮ−α」と略記する場合がある。）を有効成分とする製剤が、ウシの消化器疾患の治療剤として有用であることを提案した（特開２００５−８９３０１号公報参照）。また、インターフェロンτ（タウ）（以下、「ＩＦＮ−τ」と略記する。）と呼ばれる特定のアミノ酸配列を有するインターフェロンが、生殖サイクルに関与していることが知られており、受胎能の向上のための使用も提案されている（例えば特表平８−５０５０４７号公報参照）。しかしながら、これらの文献には、ＩＦＮ−τ以外のＩＦＮが、繁殖障害の改善剤として有用である点については、何ら記載も示唆もされていない。また、特表平８−５０５０４７号公報の記載からも明らかなように、ＩＦＮ−τ以外のＩＦＮが生殖サイクルに関与していることは知られていない。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、経口、経鼻、注射や、膣内、子宮内注入などの簡便な投与経路により投与して著効を示し、飼い主の労力や経済的負担が少ない、温血動物の繁殖障害改善剤を提供することを第一の課題とし、その繁殖障害改善剤を用いる繁殖障害の改善方法を提供することを第二の課題とする。
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決する目的で、ＩＦＮによる繁殖障害の改善方法について長年に渡り研究を進めてきた。その結果、温血動物の発情の回帰、受胎率の向上、出産事故の低減、出産後疾病防止、新生仔の疾病防止と歩留まり向上、肥育期の動物の発育不良改善などの繁殖障害の要因の改善に、ＨｕＩＦＮ、とりわけ、ＨｕＩＦＮ−α製剤が有効であり、なかでも、そのサブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α活性中に、１０％以上含有する製剤が、著効を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、繁殖障害を起こす動物由来のＩＦＮが、当該動物の繁殖障害の改善に顕著な効果を示すことを見出し、繁殖障害改善剤を確立すると共に、それを用いた繁殖障害の改善方法を確立することにより、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ＩＦＮ−τを除くＩＦＮを含んでなる繁殖障害改善剤を提供することにより、上記課題を解決するものである。
【０００７】
本発明によるＩＦＮを有効成分とする温血動物の繁殖障害改善剤及びその改善剤を用いる繁殖障害の改善方法は、繁殖障害の各種要因の発生の予防、或いは、改善（以下、「予防」、或いは「改善」を併せて「改善」という場合がある。）に著効を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で使用するＩＦＮ製剤は、温血動物の繁殖障害に対する改善効果が高く、通常、対象となる動物の体重ｋｇ当たり約０．００５国際単位乃至５，０００国際単位と極めて小用量で事足りる。【０００９】
ＩＦＮは、経口投与しても、非経口投与しても、温血動物の繁殖障害の改善に著効を発揮する。【００１０】
本発明の繁殖障害改善剤の使用対象となる動物とは、いわゆる温血動物（以下、「動物」と略記する場合がある。）であり、具体的には、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌをはじめとする哺乳動物やニワトリ、アヒル、ガチョウ、カモをはじめとする鳥類であって繁殖障害が発生する動物、とりわけ、搾乳や肉類の生産のために、過度の繁殖を強いられるウシ、ブタや、過度の産卵を強いられるニワトリなどの家畜や家禽を挙げることができる。また、ヒトを含む動物の不妊症などの治療目的で使用することもできる。【００１１】
本発明でいう繁殖障害とは、繁殖成績を低下させる要因、即ち、母獣の一生のうち、繁殖活動が可能な期間において、出来る限り多くの仔獣をもうけ、さらにその仔獣が生産物を産するまでの成長期間の歩留まりを上げるために障害となるものをいう。具体的には、分娩後における、初回授精日数の延長（出産後の発情回復の遅延）、発情の衰退乃至消失、出産後の排卵日の延長、排卵誘発時の過剰排卵数の減少と授精後の回収胚における正常乃至Ａランク胚の減少、新生仔の出生率の低下、分娩回転率の低下、人工授精率の低下など、分娩によるストレスなどに伴う母獣の生殖機能の低下全般をいう。また、本発明でいう繁殖障害には、分娩ストレスなどに起因する母獣の死亡率の増加、さらには、新生仔の死亡率の増加、新生仔乃至成獣までの発育不良個体や死廃個体の発生率の増加などによる、成長期間中の歩留まりの低下なども含まれる。従って、本発明でいう繁殖障害改善剤とは、具体的には、前記繁殖障害として例示した、何れか１種又は２種以上を改善する目的で使用するものをいう。【００１２】
本発明による動物の繁殖障害改善剤に使用するＩＦＮは、対象とする動物の繁殖障害に対して改善効果を有するＩＦＮ−τ以外のＩＦＮであれば何れであってよく、その由来や製造方法は問わない。通常は、対象とする動物に由来する細胞が産生する天然型のＩＦＮか、該動物由来の細胞から採取したＩＦＮ関連遺伝子を導入した微生物、動物細胞、植物細胞、動物若しくは植物が産生する組み換え型のＩＦＮを、公知の方法で精製し、これを有効成分として使用すればよい。また、組み換え型のＩＦＮとしては、天然型のＩＦＮのアミノ酸配列を有するものはもとより、動物の繁殖障害に改善効果を有するものであれば、その一部のアミノ酸が、付加、欠失或いは置換したものであっても、複数のサブタイプの活性部位を組み込んだいわゆるコンセンサス配列を有するＩＦＮも、当然、本発明の繁殖障害改善剤の有効成分として使用することができる。さらに、これらのＩＦＮにポリエチレングリコールなどの高分子を結合させて徐放性を賦与したＩＦＮなどの、化学的に修飾されたＩＦＮも使用することができる。【００１３】
今日、ＩＦＮは、その抗原性や生理活性等の違いに基づき、主としてＩ型（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β（動物種によっては、ＩＦＮ−α／βと称される場合もある））、ＩＩ型（ＩＦＮ−γ）なる三種類、二型に大別されているが、これらは、何れも繁殖障害に対する改善効果において多少の違いはあるものの、本発明で使用することができる（ＩＦＮ−τを除く）。その際、本発明の効果が達せられる範囲内で、ただ一種のＩＦＮを使用してもよいし、同じ型或いは異なる型から選ばれるＩＦＮを組合せて使用してもよいし、異なる動物種由来のＩＦＮの二種以上を適宜組み合わせて使用することも随意である。なかでも、ヒト由来の細胞が産生するヒトＩＦＮか、ヒト由来の細胞から採取したヒトＩＦＮ関連遺伝子を導入した微生物、動物細胞、植物細胞、動物若しくは植物が産生するヒトＩＦＮを有効成分とするものは、ヒトのみでなく、ウシやブタをはじめとする動物全般の繁殖障害に対して優れた改善効果を有することから、汎用性が高く、特に有利に利用することができる。また、ＩＦＮ−αは複数のサブタイプの存在が知られており、これらの１種又は２種以上を組み合わせて使用することも自由である。何れのＩＦＮの場合でも、比活性ができるだけ高いものを使用するのが望ましく、経口投与には、比活性が約１０５国際単位／ｍｇ蛋白質以上の精製品が、また、非経口投与には、約１０７国際単位／ｍｇ蛋白質以上の精製品が望ましく、パイロジェンを除去したものが特に望ましい。【００１４】
本発明者が試験したところ、これらヒトＩＦＮのなかでも、ＨｕＩＦＮ−α、とりわけ、ＢＡＬＬ−１細胞やナマルバ細胞などのヒトリンパ芽球様細胞株が産生する、いわゆる、「天然型ＨｕＩＦＮ−α」は、ヒトのみでなくウシやブタをはじめとする種々の動物の繁殖障害に対する改善効果が高く、副作用も僅少という特徴がある。ことに、効果の点で、ＨｕＩＦＮ−αのサブタイプα８（以下、「サブタイプα８」という）をＨｕＩＦＮ−αの総活性の１０％以上含有する製剤が望ましく、且つ、ＨｕＩＦＮ−α中にサブタイプα８とサブタイプα２（以下、「サブタイプα２」という）とを、活性比で、１：９乃至１０：０の割合で含有する製剤が強い改善効果を示すことからさら望ましく、２：８乃至４：６の割合で含有する製剤が著効を示すことから、特に望ましい。ＢＡＬＬ−１細胞由来のＨｕＩＦＮ−αは、サブタイプα８をＨｕＩＦＮ−αの総活性の約２５％含有し、サブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で、１：３の割合で含有し、そのバランスは極めて良く、この発明に使用して最も優れた効果をもたらした。また、ＨｕＩＦＮ−αとヒトＩＦＮ−βやヒトＩＦＮ−γを組み合わせて使用すると、ＨｕＩＦＮ−αの持つ繁殖障害改善効果が相乗的に増強されることも確認された。【００１５】
本発明による繁殖障害改善剤は、ＩＦＮ単独の形態はもとより、ＩＦＮとそれ以外の生理的及び製剤学的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤、徐放剤、乳化剤さらには、必要に応じて、解熱剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、免疫賦活剤、ホルモン剤、消化剤、栄養剤、餌料などとの組成物としての形態を包含する。さらに、この発明の改善剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明の有効成分たるＩＦＮの、例えば、一日当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離可能な剤型にある薬剤を意味する。また、ＩＦＮの型及び／又はＩＦＮ−αの異なるサブタイプの２種以上を組み合わせて使用する場合には、個々の型のＩＦＮ及び／又はＩＦＮ−αのサブタイプの単剤を組み合わせて使用すること、２種以上の型のＩＦＮを混合して１剤として使用すること、或いは、これらの製剤を組み合わせて使用することも随意である。このような投薬形態の薬剤としては、散剤、ゲル状経口用剤、顆粒剤、液剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、注射剤、フィルム状経口用剤などが挙げられる。また、散剤や顆粒剤などを用時に、その投与経路に応じて、蒸留水、生理食塩水、ミルク、代用ミルクなどに溶解して使用することも随意である。【００１６】
本発明による繁殖障害改善剤の用量、用法について、ＨｕＩＦＮを使用する場合を例に説明すると、本発明の改善剤は、経口的に投与しても非経口的に投与しても、所期の改善効果が得られる。具体的には、動物の種類、繁殖障害の原因やその程度、用量、用法、使用するＩＦＮの型などに依っても変わるけれども、対象とする動物の状態を観察しながら、通常、動物の体重ｋｇ当たり約０．００５乃至５０００国際単位／回、望ましくは、約０．０５乃至５００国際単位／回、より望ましくは、約０．１乃至５０国際単位／回のＩＦＮを１日１乃至３回若しくは１週間に１乃至５回、１日乃至６カ月間投与すればよい。特に動物に対して繁殖障害の誘因となるさまざまなストレス状況が継続していれば、ストレス状態がなくなるまでの期間連続投与すれば、より効果的である。本発明者が試験したところ、用量が上記の範囲を下回ると所期の改善効果が得られ難くなり、逆に、上回ると、抗体産生や副作用が顕著になったり、改善効果に比べて経済的負担が大きくなることがあり、上記範囲を以って最良とした。【００１７】
また、ヒト以外の動物に由来するＩＦＮを使用する場合にも、その用法、用量も、ＨｕＩＦＮを使用した場合に準じればよい。なお、ヒト以外の動物に由来するＩＦＮを使用する場合のＩＦＮの活性は、種が異なると、測定方法により多少の変化はあるものの、ＶＳＶウイルスなどのウイルスによる、マウスＬ９２９細胞、ラットＸＣ細胞、或いは、ウシＭＤＢＫ細胞などの細胞変性を抑制する系を用いて、該当する動物か近縁種の動物の公知のＩＦＮ標準品に基づき換算すればよく、活性の測定に、ヒトと該当する動物のＩＦＮの両方に感受性を示す細胞を使用して、ＨｕＩＦＮの国際標準品に基づき換算してもよい。また、免疫酵素法などを利用して測定したＩＦＮ蛋白の質量をもとに、公知の各種動物のＩＦＮ標準品に基づき換算して、その活性を計算してもよい。【００１８】
なお、本明細書を通じて、ＨｕＩＦＮの活性は、ＨｕＩＦＮがシンドビスウイルスによるＦＬ細胞の細胞変性を抑制する度合をマイクロタイター法により測定し、その測定値を世界保健機関によるＨｕＩＦＮの国際標準品「Ｇａ２３−９０１−５３２」に基づき「国際単位」に換算して表示する。【００１９】
本発明の改善剤を経口或いは経鼻投与するには、改善剤を、例えば、散剤、トローチ剤、顆粒剤、液剤、錠剤、舌下剤、飼料などの経口或いは経鼻投与可能な形態に調製し、そのままで、或いは、必要に応じて、餌、ミルク、代用ミルクなどに混合・溶解したり、経口投与器、スプレー、ゾンデなどの適宜投与補助器具を使いながら、常法にしたがって口腔内、鼻腔内、食道内若しくは胃内に挿入すればよく、これらの改善剤を、膣内や子宮内に投与することもできる。非経口投与するには、この発明による注射剤を動物の皮内、皮下、筋肉内、血管内（静脈又は動脈をいう）若しくは腹腔内に投与すればよい。また、本発明の改善剤は、単一の個体に対して、上記の改善剤の形態と投与経路とを適宜組み合わせて使用することも随意である。当該改善剤或いはこれを配合した組成物は、医薬品としてだけでなく、医薬部外品、配合剤、飼料、飼料添加物、健康食品などとして利用することもできる。【００２０】
改善効果と投与のし易さという観点から個々の投与経路を比較すると、経口投与は、ヒトにあってはもちろんのこと、ウシやブタなどの場合にも、一般の飼育場や集積場でも容易に実施できるという利点がある。所定量のＩＦＮを正確に投与する場合には、血管内、皮内、皮下若しくは筋肉内に投与することも随意である。【００２１】
また、本発明の繁殖障害改善剤は、種々の作用効果を有するので、ウシやブタなど温血動物に対して、暑熱ストレス、分娩舎などへの移動ストレス、分娩ストレスなどに伴って発生する疾患や消耗の発生の予防剤や軽減剤、分娩後の初回授精までの日数の延長抑制剤、受胎率の低下防止剤、妊娠牛の受胎までの日数の延長抑制剤、分娩後の発情までの日数の短縮剤、発情持続期間の延長剤、妊娠確定率の向上剤、排卵誘発時の過剰排卵数の増加剤、正常胚乃至Ａランク胚の獲得数の向上剤、新生仔或いは肥育期の動物の発育促進剤などとして使用することもできる。また、その際の用法、用量は、繁殖障害の改善の場合に準じればよい。【００２２】
＜実験１：ＨｕＩＦＮ−α標品の調製＞
後述の実施例１に記載の方法に基づき、ＢＡＬＬ−１細胞由来のＨｕＩＦＮ−α（以下、「ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ」と略記する場合がある）の精製品（比活性２×１０８国際単位／ｍｇ蛋白質）を、また、実施例２の方法に基づき、組換え型サブタイプα８（比活性２×１０８国際単位／ｍｇ蛋白質）及び組換え型サブタイプα２（比活性７×１０７国際単位／ｍｇ蛋白質）の精製標品を、それぞれ調製した。また、これらとは別に、常法により、ヒト末梢血から分離した白血球にセンダイウイルスを作用させて誘発させたＨｕＩＦＮ−α（以下、「白血球ＩＦＮ」と略記する場合がある。）をケー・カンテル（Ｋ．Ｃａｎｔｅｌｌ）等、『ザ  ジャーナル  オブ  ジェネラル  バイロロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）』、第３９巻、第５４１〜５４３頁（１９７８年）に記載された方法に準じて精製し、比活性約２×１０６国際単位／ｍｇ蛋白質の部分精製白血球ＩＦＮを得た。次いで、この部分精製ＨｕＩＦＮを、後述の実施例１と同様に、モノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−α抗体を用いる抗体カラムクロマトグラフィーによりさらに精製した後、ヒトアルブミン約０．１ｍｇ／ｍｌを含有する燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたゲル濾過クロマトグラフィーを適用することにより、精製白血球ＩＦＮ（比活性約２×１０８国際単位／ｍｇ蛋白質）溶液を得た。これら２種類のＨｕＩＦＮと、組換え型サブタイプα８及び組換え型サブタイプα２を使用して、以下の実験を行った。【００２３】
＜実験２：暑熱期の分娩牛の繁殖障害に及ぼすＩＦＮの影響＞
ウシは、暑熱ストレスや分娩ストレスにより、食欲の減退や健康状態の低下を伴う繁殖障害を起こし易いと言われている。そこで、暑熱期の分娩牛の繁殖障害に及ぼすＩＦＮの影響を調べる試験を以下のように行った。すなわち、実験１で調製したＢＡＬＬ−１ＩＦＮ標品を、後述の実施例５の方法に準じて、無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）を賦形剤として使用し、２００国際単位／ｇのＢＡＬＬ−１ＩＦＮを含有する試験製剤を調製した。３歳乃至７歳で、８月乃至９月に分娩予定の、体重６００ｋｇ前後のホルスタイン種乳牛２９頭を、無作為に、試験製剤１回投与群（８頭）、３回投与群（９頭）、無投与群（１２頭、対照）の３群に分けた。１回投与群には、分娩予定日の７日前に、試験製剤１ｇを、１頭あたり１回投与した。また、３回投与群には、分娩予定日の７日前から３日連続で、試験製剤１ｇを毎日１回、経口投与した。分娩前後のウシの健康状態を観察して、その結果を表１に示す。また、分娩後の繁殖状況について、分娩後の人工授精までの日数、分娩後６ヶ月間における受胎数、受胎までの日数を測定して、各指標について、各群での平均日数或いは平均受胎数を求めて、その結果を表２に示す。また、各群のウシの受胎数を、その群の全頭数で徐し、１００倍して受胎率（％）を求め、併せて、表２に示す。なお、分娩後の授精は、獣医師による発情確認後、試験に使用した乳牛のうち、対照群９頭、１回投与群５頭、３回投与群８頭に対して実施した。【００２４】
【表１】
2007037098.tif 000002
【００２５】
【表２】
2007037098.tif 000003
【００２６】
表１から明らかなように、対照群では、分娩後の健康状態が不良の個体が１２頭中、５頭（約４２％）に認められた。これに対して、試験製剤１回投与群では健康状態が不良の個体が８頭中３頭（約３８％）認められ、その発生率は、対照群と差はなかったものの、３回投与群では、健康状態が不良の個体は、９頭中１頭（約１０％）のみであった。また、表２から明らかなように、分娩後の初回人工授精までの日数は、試験製剤の投与回数に比例して短くなった。分娩後６ヶ月間における受胎率（妊娠確定率）は、試験製剤の投与回数に比例して増加した。妊娠牛の受胎までの平均日数についても、試験製剤投与群の方が、対照群に比して短縮された。【００２７】
この結果は、ＨｕＩＦＮ製剤の投与により、暑熱ストレスや分娩ストレス下にある乳牛の分娩後の健康状態を良好に維持することができ、これらのストレスにより発生する、分娩後の初回授精までの日数の延長、受胎率の低下、妊娠牛の受胎までの日数の延長などの妊娠障害を改善できることを物語っている。さらに、ＨｕＩＦＮ製剤の投与により、分娩後の授精までの日数が短縮することは、ＨｕＩＦＮ製剤が、分娩後の発情までの日数の短縮や発情持続期間を延長することができることを物語っており、妊娠確定率が向上することは、授精後の授精卵の発達が良好で正常胚乃至Ａランク胚を増加させることができることを物語っている。なお、対照群と試験製剤１回投与群では、各２頭の死廃牛が発生したものの、３回投与群では発生は認められなかった。また、対照群では、分娩後４頭に、乳房炎、蹄疾患、乳熱、第四胃変異が発生したものの、試験製剤投与群では何れも１頭に、蹄疾患及び第四胃変異の発生が認められたのみで、ＨｕＩＦＮ製剤による繁殖障害の改善には、当該製剤の持つ、暑熱ストレスや分娩ストレス下にある乳牛の各種疾患の発生の抑制作用も寄与していることを物語っている。【００２８】
＜実験３：分娩ブタの繁殖障害に及ぼすＩＦＮの影響＞
ブタは、暑熱ストレス、移動ストレスや分娩ストレスにより、食欲の減退、消耗や健康状態の低下を伴う繁殖障害を起こし易いと言われている。そこで、暑熱期の分娩ブタの繁殖障害に及ぼすＩＦＮの影響を調べる試験を、実験２で使用したものと同じ、２００国際単位／ｇのＢＡＬＬ−１ＩＦＮを含有する試験製剤を使用して、以下のように行った。すなわち、暑熱ストレスの発生しやすい初秋に出産予定の、体重約１３０ｋｇのブタ２４頭を、無作為に、試験製剤１ｇ／回投与群（１２頭）と無投与群（１２頭、対照群）との２群に分けた。試験製剤の投与は、それぞれのブタを、分娩予定日の７日前に、分娩舎に移動させ、移動日（移動の前）とその翌日に、２日連続で、試験製剤を１日１回、経口投与した。分娩前後のブタの健康状態の観察結果と、分娩後の交配の状況を表３に示す。また、出産後の子豚の生時体重、離乳率、離乳日齢、離乳日までの一日当たりの体重増加量の平均を表４に示す。子豚の下痢の発生状況をスコア化して、併せて、表４に示す。なお、離乳率（％）は、同腹子（１腹当たり６乃至１５頭）において、離乳できるまでに生育した子豚の頭数を、当該同腹子の出産時の子豚の頭数で除し、１００倍し、その平均を計算して求めた。また、下痢の発生状況のスコアは、同腹子（１腹当たり６乃至１５頭）において下痢の疾病の発生について、発生が、ない場合を０、１乃至２頭の場合を１、２乃至３頭の場合を２、３乃至４頭の場合を３、４乃至５頭の場合を４、及び、６頭以上の場合を５とし、それぞれのスコアに該当する下痢が発現した日数を乗じて計算し、その平均を求めた。いずれかのスコアの下痢が発生した日数の合計を総発現日数とし、併せて、表４に示す。【００２９】
【表３】
2007037098.tif 000004
【００３０】
【表４】
2007037098.tif 000005
【００３１】
表３から明らかなように、対照群では、分娩後健康不良乃至消耗の認められたブタが３頭発生し、離乳後に３頭のブタが淘汰されて、繁殖に供することができなかったのに対して、試験製剤投与群では、健康不良乃至消耗の認められたブタの発生や淘汰はなく、全頭が繁殖に使用された。繁殖に使用したブタは、対照群及び試験製剤投与群の何れのブタも、交配後すぐに妊娠した。また、表４から明らかなように、試験製剤投与群では、対照群に比して、出産後の子豚の生時体重、離乳率、離乳日までの一日当たりの体重増加量の何れの平均も高い数値を示した。離乳日齢の平均は、対照群に比して試験製剤投与群の方が、１日以上短縮した。さらに、試験製剤投与群では、対照群に比して、下痢の発生スコアが低く、その総発現日数も短かった。【００３２】
この結果は、ＨｕＩＦＮ製剤の投与により、暑熱ストレス、分娩舎への移動ストレス、分娩ストレスなどのストレス下にあるブタの分娩後の健康状態を良好に維持することができ、これらのストレスにより発生する、分娩ブタの消耗、死亡や淘汰による繁殖障害を改善できることを物語っている。また、この製剤の投与により、生まれた子豚の健康状態を向上してその発育障害を改善すると共に、子豚の離乳までの期間を短縮して、分娩回転率を改善することにより、ブタの繁殖障害が改善できることを物語っている。【００３３】
＜実験４：ウシの繁殖障害に及ぼすＩＦＮの種類の違いによる影響＞
実験２で、ＩＦＮが乳牛の繁殖障害の改善に有効であることが確認されたので、ＩＦＮの種類によりその効果に差があるかどうかを確認する試験を以下のように行った。すなわち、実験１で調製した、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ標品、白血球ＩＦＮ標品、組換え型サブタイプα８標品及び組換え型サブタイプα２標品を、実験２と同様に、無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）を賦形剤として使用し、各々２００国際単位／ｇを含有する粉末状のＨｕＩＦＮ−α製剤を調製した。なお、組換え型サブタイプα８及び組換え型サブタイプα２に付いては、サブタイプα８とサブタイプα２を活性比で、１０：０、９：１、８：２、４：６、２：８、１：９、０：１０含有する７種類の粉末状の製剤を調製した。３歳乃至７歳で、暑熱ストレスの発生しやすい夏乃至初秋に出産予定の、体重６００ｋｇ前後のホルスタイン種乳牛１２０頭を対象とし、無作為に選択した１２頭を１群として、各群に、前記ＨｕＩＦＮ−α製剤の何れかを、分娩予定日の７日前から、経口的に、０．５国際単位／ｋｇ体重／回となるように約１．５ｇの用量で、毎日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って投与した。また、対照群として、残ったウシ１２頭に、無水結晶マルトース１．５ｇを１日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って経口投与した。【００３４】
分娩後に死亡した個体以外について、分娩後の繁殖状況を確認するために、その分娩後の人工授精までの日数、分娩後６ヶ月間における受胎数、受胎までの日数を測定して、各群の平均を求めて表５に示す。また、各群のウシの受胎数を、その群の全頭数で除し、１００倍して受胎率（％）を求め、併せて、表５に示す。【００３５】
【表５】
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【００３６】
表５から明らかなように、何れのＨｕＩＦＮ−α製剤を投与した場合にも、対照群に比して、分娩後の人工授精までの日数短縮、分娩後６ヶ月間における受胎数の増加、受胎までの日数の短縮が認められ、ＨｕＩＦＮ−αの経口投与により、乳牛の繁殖障害が改善されることが確認された。この改善効果は、その何れの指標においても、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ（サブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α活性中に約２５％含有し、サブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で、１：３含有）を投与した場合に最も顕著であった。白血球ＩＦＮ或いは組換え型サブタイプα２のみの投与群では、改善効果は低い結果となったのに対して、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ、及び、組換え型サブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α活性中の１０％或いはそれ以上含有し、サブタイプα８：サブタイプα２との活性比が１：９乃至１０：０の製剤を投与した群では、何れも、白血球ＩＦＮ或いは組換え型サブタイプα２のみの投与した群よりも高い改善効果が認められた。なかでも、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ、及び、組換え型サブタイプα８とサブタイプα２との活性比が１：９乃至８：２の製剤を投与した群で、高い改善効果が認められ、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ、及び、サブタイプα８：サブタイプα２の活性比が、２：８乃至４：６の製剤を投与した群で、特に高い改善効果が認められた。【００３７】
＜実験５：ウシの繁殖障害に及ぼすＩＦＮの投与量の影響＞
上記知見に基づき、最も繁殖障害に対する改善効果の高かったＢＡＬＬ−１ＩＦＮを用いて、ウシの繁殖障害に及ぼすＩＦＮの投与量の影響を調べる試験を以下のように行った。すなわち、実験１で調製したＢＡＬＬ−１ＩＦＮ標品を、実験２と同様に、無水結晶マルトースを賦形剤として使用し、０．２、２、２０、４０、２００、２００００、２０００００、２００００００、及び、２０００００００国際単位／ｇのＢＡＬＬ−１ＩＦＮを含有する９種類の粉末状ＨｕＩＦＮ−α製剤を調製した。３歳乃至７歳で、暑熱ストレスの発生しやすい７月乃至９月に、出産予定の、体重が６００ｋｇ前後のホルスタイン種乳牛１１０頭を対象とし、無作為に１群１１頭を選択した。各群に前記ＨｕＩＦＮ−α製剤の何れかを、経口的に、表６に示す０．０００５乃至５００００国際単位／ｋｇ体重／回の投与量となるように約１．５ｇの用量で、出産予定日の７日前から、毎日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って投与した。また、対照群として、残ったウシ１１頭に、無水結晶マルトース１．５ｇを１日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って経口投与した。【００３８】
分娩後に死亡した以外の乳牛について、分娩後の繁殖状況を確認するために、分娩後６ヶ月間における受胎数を確認した。また、各群のウシの受胎数を確認し、その群の全頭数で除し、１００倍して受胎率（％）を求め、その結果を表６に示す。【００３９】
【表６】
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【００４０】
表６から明らかなように、ＨｕＩＦＮ−α製剤を０．０００５国際単位／ｋｇ体重／回投与した場合には、対照群と同じ受胎率となった。これに対して、ＨｕＩＦＮ−α製剤を０．００５乃至５０００国際単位／ｋｇ体重／回投与した場合には、対照群或いは０．０００５国際単位／ｋｇ体重／回投与群に比して、受胎率の上昇が認められた。この効果は、０．０５国際単位ｋｇ体重／回以上の投与でさらに顕著となった。しかしながら、５００００国際単位／ｋｇ体重／回の投与では、受胎の認められなかった個体で、副作用の可能性も考えられる、発熱、活動性や出産後の乳量の低下が認められた。この結果は、ＨｕＩＦＮ−α製剤を０．００５乃至５０００国際単位／ｋｇ体重／回のＨｕＩＦＮ−α製剤を投与することにより、受胎率の改善が可能であり、その改善効果の点では、０．０５乃至５０００国際単位／ｋｇ体重／回が望ましく、０．０５乃至５００国際単位／ｋｇ体重／回がさらに望ましく、０．１乃至５０国際単位／ｋｇ体重／回が特に望ましいことを物語っている。【００４１】
本試験の期間中、５００００国際単位／ｋｇ体重／回の投与量以外では、ＨｕＩＦＮ−α製剤の投与に起因すると考えられる特段の副作用は全く認められず、この発明による改善剤がウシの繁殖障害の改善に極めて効果的、且つ、安全であることを裏付けていた。さらに、これらのウシの一部について、５回目の投与後から３０日目と６０日目に、血液検査を実施したところ、ＨｕＩＦＮ−αに起因すると思われる抗体産生は全く検出されなかった。このことは、この発明による改善剤が、ウシの繁殖障害を改善する目的で、同一のウシに反復投与しても安全なことを示唆している。【００４２】
これらの試験結果は、ＨｕＩＦＮ−αを有効成分とする製剤が、ウシやブタなどの温血動物の暑熱ストレス、分娩舎などへの移動ストレス、分娩ストレスなどに伴って発生する疾患や消耗の発生の予防や軽減、分娩後の初回授精までの日数の延長の抑制、受胎率の低下の抑制、妊娠牛の受胎までの日数の延長の抑制、分娩後の発情までの日数の短縮や発情持続期間の延長などによる妊娠確定率の向上、正常胚乃至Ａランク胚の増加、新生児或いはその後の子獣の発育促進などの効果を有する繁殖障害改善剤として利用できることを物語っている。【００４３】
以下、実施例に基づき、本発明を具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
特公昭５６−５４１５８号公報に記載された方法に準じ、ハムスター体内で増殖させたＢＡＬＬ−１細胞に培養培地中でセンダイウイルスを作用させてＨｕＩＦＮ−αを誘発させた。この培養培地を遠心分離して得られた上清を濃縮し、濃縮物にフェニルセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーを適用することにより、比活性約１０６国際単位／ｍｇ蛋白質の部分精製ＨｕＩＦＮ−αを得た。次に、この部分精製ＨｕＩＦＮ−αを、常法により、モノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−α抗体を水不溶性担体に結合させた抗体カラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した後、ゼラチン約０．１ｍｇ／ｍｌを含有する燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたゲル濾過クロマトグラフィーを適用することにより、比活性約２×１０８国際単位／ｍｇの精製ＨｕＩＦＮ−αを含有するＢＡＬＬ−１ＩＦＮ溶液を得た。本品を、高速液体クロマトグラフィーで分析し、その活性を比較したところ、ＨｕＩＦＮ−αの総活性に対して、サブタイプα８を約２５％とサブタイプα２を約７５％含有していた。【００４５】
このようにして調製したＢＡＬＬ−１由来の精製ＨｕＩＦＮ−αを約５ｍｇ蛋白質／ｍｌにまで膜濃縮し、１％（ｗ／ｖ）局方精製ゼラチンと０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する生理食塩水にＨｕＩＦＮ−α濃度が５００国際単位／ｍｌになるよう希釈し、膜濾過して滅菌した後、バイアルに１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥した。【００４６】
本品は、有効成分としてＢＡＬＬ−１細胞由来の精製ＨｕＩＦＮ−αを含有し、賦形剤たるゼラチンは抗原性がなく、動物の繁殖障害改善剤用注射剤として有用である。
【実施例２】
【００４７】
＜組換え型サブタイプα２及びサブタイプα８＞
特開２００２−２０１１４１号公報の実験１−１（ａ）及び実験１−１（ｂ）の方法に準じて、組換え型サブタイプα８（比活性、約３×１０８国際単位／ｍｇ蛋白質）及び組換え型サブタイプα２（比活性、約８×１０７国際単位／ｍｇ蛋白質）の精製標品を調製した。【００４８】
このようにして調製したサブタイプα８標品とサブタイプα２標品を各々約２ｍｇ蛋白質／ｍｌにまで膜濃縮後、サブタイプα８とサブタイプα２を活性比で、１：３となるように混合し、１％（ｗ／ｖ）局方精製ゼラチンと０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する生理食塩水にＨｕＩＦＮ−α濃度が１０００国際単位／ｍｌになるよう希釈し、膜濾過して滅菌した後、バイアルに１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥した。【００４９】
有効成分として組換え型の精製サブタイプα８とサブタイプα２を含有せしめた本品は、改善効果及び副作用において実施例１の注射剤よりやや劣るものの、動物の繁殖障害改善用注射剤として有用である。
【実施例３】
【００５０】
実施例１と同様にしてＢＡＬＬ−１細胞にセンダイウイルスを作用させて調製した精製ＢＡＬＬ−１ＩＦＮを、３％（ｗ／ｖ）局方精製ゼラチンと０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する生理食塩水にＨｕＩＦＮ−α濃度が４００国際単位／ｍｌとなるように希釈し、膜濾過して滅菌した後、バイアルに１ｍｌずつ充填し、凍結乾燥した。【００５１】
本品は、実施例１の注射剤と同様、有効成分としてＢＡＬＬ−１細胞由来の精製ＨｕＩＦＮ−αを含有し、賦形剤たるゼラチンは抗原性がなく、対象動物の繁殖障害改善用注射剤として有用である。
【実施例４】
【００５２】
蒸留水に白糖を２％（ｗ／ｖ）溶解し、溶液に実施例１の方法で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の部分精製ＨｕＩＦＮ−αを含有する溶液を加え、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−αを１５０国際単位含有するＨｕＩＦＮ−α溶液を得た。この溶液３２質量部に０．５質量部の「ツイーン８０」を１５質量部のエタノールに溶解して混合し、さらに、その混合物に０．５質量部のトリエタノールアミンを１５質量部のグリセリンに溶解して混合した後、小量のトリエタノールアミンを加えて、ｍｌ当たりＨｕＩＦＮ−αを約５０国際単位含む、ほぼ中性のゲル状製剤を得た。【００５３】
有効成分としてＢＡＬＬ−１細胞由来のＨｕＩＦＮ−αを含有する本品は、適度の口腔内滞留時間を有し、対象動物に飲ませ易い繁殖障害改善用ゲル状経口用剤である。また、本品は、鼻腔内、膣内或いは子宮内へ投与することもできる。
【実施例５】
【００５４】
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に実施例１の方法で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の精製ＨｕＩＦＮ−α（約１０８国際単位／ｍｌ）３質量部を均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の「ファイントース」を均一に混合し、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−αを約１００国際単位含む散剤を得た。【００５５】
本品は適度の口腔内滞留時間と優れた保存安定性を有し、動物の繁殖障害改善剤として有用である。本品は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、対象動物に飲ませ易い散剤である。また、本品は、鼻腔内、膣内或いは子宮内へ投与することもできる。
【実施例６】
【００５６】
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に実施例１の方法で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の部分精製ＨｕＩＦＮを含有する水溶液（約４０００国際単位／ｍｌ）１５質量部を均一に混ぜた後、打錠機にかけて顆粒剤を得た。【００５７】
本品は、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−αを約１５００国際単位含み、優れた保存安定性を有し、動物の繁殖障害改善用散剤として有用である。また、本品は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、対象動物に飲ませ易い顆粒剤である。また、本品は、鼻腔内、膣内或いは子宮内へ投与することもできる。
【実施例７】
【００５８】
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に市販のＨｕＩＦＮ−β製剤（持田製薬株式会社販売、商品名「ＩＦＮβ注射用６００万Ｉ．Ｕ．」）を蒸留水１ｍｌに溶解したもの４質量部を均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の「ファイントース」を均一に混合し、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−βを約４５０国際単位含む散剤を得た。【００５９】
本品は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、対象動物に飲ませ易い散剤である。また、本品は、鼻腔内、膣内或いは子宮内へ投与することもできる。
【実施例８】
【００６０】
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に、市販されている注射用の組み換え型ネコＩＦＮの凍結乾燥性剤（株式会社東レ製造、商品名「インターキャット」）に、１ｍｌの生理食塩水を加えて溶解（約１０７単位／ｍｌ）したもの２質量部を均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の「ファイントース」を均一に混合し、１ｇ当たりネコＩＦＮを約１００単位含む散剤を得た。なお、本品のＩＦＮ活性は、商品の添付資料に記載された活性をもとに算出した。【００６１】
本品は適度の口腔内滞留時間と優れた保存安定性を有し、ネコの繁殖障害改善剤として有用である。本品は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、動物に飲ませ易い散剤である。また、本品は、鼻腔内、膣内或いは子宮内へ投与することもできる。
【実施例９】
【００６２】
実験１でヒト白血球ＩＦＮを製造した方法に準じて、ウシの末梢血から分離した白血球に、センダイウイルスを作用させてウシＩＦＮ−αを誘発し、精製して、比活性１×１０７国際単位／ｍｇの標品を得た。この標品生理食塩水溶液２質量部（約１０８国際単位／ｍｌ）を無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に、均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の「ファイントース」を均一に混合し、１ｇ当たりウシＩＦＮ−αを約１００単位含む散剤を得た。なお、本品のウシＩＦＮ−αの活性は、シンドビスウイルスによるＭＤＢＫ細胞（ウシ腎由来）の細胞変性を抑制する度合いを、ＭＴＴにより測定し、ＨｕＩＦＮ−αの国際標準品を標準として決定される「国際単位」に換算して表示した。【００６３】
本品は適度の口腔内滞留時間と優れた保存安定性を有し、ウシをはじめとする動物の繁殖障害改善剤として有用である。本品は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、動物に飲ませ易い散剤である。また、本品は、鼻腔内、膣内或いは子宮内へ投与することもできる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の改善剤が有効成分として含有するＩＦＮは、動物の繁殖障害の改善に小用量でも著効を発揮するので、小用量投与の場合は、飼主の経済的負担を大幅に低減する。同じ理由により、本発明の改善剤によるときには、ＩＦＮを必ずしも動物の血管内に投与する必要が無くなり、経口投与や、皮内、皮下、筋肉内などの血管以外の経路より非経口的に投与することによっても、所期の効果が得られる。これにより、神経質で警戒心が強い動物にも所定量のＨｕＩＦＮを確実、且つ、容易に投与できることとなり、飼い主の労力の負担も大幅に低減する。このような優れた効果を有する本発明は、医学や畜産分野に貢献することとなり、その産業的意義は極めて大きい。
【国際調査報告】
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