【手続補正書】
【提出日】令和1年6月17日(2019.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノム内の突然変異を矯正するための複合体であって、
ａ．突然変異を含む細胞の前記ゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
ｂ．前記ガイドＲＮＡの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、二本鎖切断を作成する、超荷電（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｃ．前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、前記ターゲットＤＮＡ内の突然変異を矯正する、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む、前記複合体。
【請求項２】
前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、請求項１または２のいずれかに記載の複合体。
【請求項４】
前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結している約１０〜約２５アミノ酸長の負荷電ペプチドをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
前記超荷電タンパク質が約＋５〜約＋４０である全体的な正電荷を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記超荷電タンパク質が、超正荷電＋３６ＧＦＰである、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接する前記ゲノム配列にハイブリッド形成する前記ｓｓＯＤＮが、前記ターゲットＤＮＡ内の突然変異の相同配向性修復のための鋳型である、請求項１〜８のいずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
前記ｓｓＯＤＮが、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列にハイブリッド形成する、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１〜１０のいずれかに記載の複合体。
【請求項１２】
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、請求項１〜１１のいずれかに記載の複合体。
【請求項１３】
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：１〜約１．５：１：１：１５である、請求項１〜１２のいずれかに記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の複合体を含む細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、真核細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項１４または１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、造血幹細胞である、請求項１４または１５に記載の細胞。
【請求項１８】
細胞の集団におけるターゲットＤＮＡの部位特異的改変のための組成物であって、請求項１〜１３のいずれかに記載の複合体を含み、前記組成物が、前記細胞へと、相同配向性修復（ＨＤＲ）及び前記ｓｓＯＤＮの前記ターゲットＤＮＡへの組込みを可能にする条件下で導入されることを特徴とする、前記組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、前記細胞へとヌクレオポレーション（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により導入されることを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）の比率が、約１０〜約０．５である、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記突然変異が、前記細胞の少なくとも５％において矯正される、請求項１８〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
矯正された細胞に関する細胞生存率が、少なくとも約５０％である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、請求項１８〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記ターゲットＤＮＡが、ヘモグロビンをコードする、請求項１８〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異に伴う疾患を処置するための組成物であって、請求項９に記載の複合体を含み、前記組成物が相同配向性修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で前記対象から得られた細胞の集団へと導入されて、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列における前記突然変異を矯正することを特徴とし、前記細胞が前記対象へと移植されることを特徴とする、前記組成物。
【請求項２６】
ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列内の突然変異に伴う前記疾患が、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記細胞が、造血幹細胞または誘導多能性幹細胞である、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記移植された細胞の少なくとも５％が、矯正された突然変異を含む、請求項２５〜２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合の比率が、少なくとも約０．５である、請求項２５〜２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、前記細胞へとヌクレオポレーションにより導入されることを特徴とする、請求項２５〜２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
Ｔ細胞障害に関連する突然変異を矯正するための組成物であって、
ａ．前記Ｔ細胞障害に関連する突然変異を含む細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
ｂ．ｇＲＮＡの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を含む前記ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、前記ターゲットＤＮＡ内に二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｃ．前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する第三のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）
を含む複合体を含み、前記組成物が、前記細胞へと、相同配向性修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で導入されて、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を矯正することを特徴とする、前記組成物。
【請求項３２】
前記ターゲットＤＮＡが、Ｔリンパ球発達に関連するタンパク質をコードする、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記細胞が、造血幹細胞または多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項３１または３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、請求項３１〜３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
前記Ｔ細胞障害を有する対象から得た細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合の比率が、少なくとも約０．５である、請求項３１〜３５のいずれかに記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物が、前記細胞へとヌクレオポレーションにより導入されることを特徴とする、請求項３１〜３６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
前記Ｔ細胞障害を有する対象から得た細胞の前記集団の少なくとも５％が、ＨＤＲを受けて、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異が矯正される、請求項３１〜３７のいずれかに記載の組成物。
【請求項３９】
ＨＤＲで矯正された前記細胞を単離されることを特徴とする、請求項３１〜３８のいずれかに記載の組成物。
【請求項４０】
ＨＤＲで矯正された前記細胞が単離されることを特徴とする、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記細胞が、増殖のための条件下で培養されることを特徴とする、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記細胞が、前記細胞のＴ細胞への分化を促進する条件下で培養されることを特徴とする、請求項４０または４１に記載の組成物。
【請求項４３】
対象において遺伝的突然変異に伴うＴ細胞障害を処置するための請求項３１〜４２のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物が、前記対象に移植されることを特徴とする、前記組成物。
【請求項４４】
細胞のゲノムにおけるＴ細胞障害に関連する突然変異を矯正するための複合体であって、
ａ．前記Ｔ細胞障害に関連する突然変異を含む細胞の前記ゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
ｂ．前記ｇＲＮＡの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を含む前記ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、前記ターゲットＤＮＡ内に二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｃ．前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットＤＮＡに組み込んで、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する第三のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む、前記複合体。
【請求項４５】
前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項４４に記載の複合体。
【請求項４６】
超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結したトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、請求項４４または４５に記載の複合体。
【請求項４７】
前記超荷電タンパク質が約＋５〜約＋４０である全体的な正電荷を有する、請求項４４〜４６のいずれかに記載の複合体。
【請求項４８】
前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項４４〜４７のいずれかに記載の複合体。
【請求項４９】
前記超荷電タンパク質が、超正荷電＋３６ＧＦＰである、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５０】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項４４〜４９のいずれかに記載の複合体。
【請求項５１】
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、請求項４４〜５０のいずれかに記載の複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異に伴う疾患を処置する方法をさらに提供する。該方法は、対象から得られた細胞の集団へと、ヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異を矯正するための複合体を、相同配向性修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で導入して、ヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異を矯正すること、及びその矯正された細胞を対象へと移植することを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
細胞のゲノム内の突然変異を矯正するための複合体であって、
ａ．突然変異を含む細胞の前記ゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
ｂ．前記ガイドＲＮＡの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、二本鎖切断を作成する、超荷電（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｃ．前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、前記ターゲットＤＮＡ内の突然変異を矯正する、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む、前記複合体。
(項目２)
前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、項目１に記載の複合体。
(項目３)
前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、項目１または２のいずれかに記載の複合体。
(項目４)
前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、項目１〜３のいずれかに記載の複合体。
(項目５)
前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結している約１０〜約２５アミノ酸長の負荷電ペプチドをさらに含む、項目１〜４のいずれかに記載の複合体。
(項目６)
前記負荷電ペプチドが、配列番号５０を含むＩＮＦ７ペプチドである、項目５に記載の複合体。
(項目７)
前記超荷電タンパク質が、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する、項目１〜６のいずれかに記載の複合体。
(項目８)
前記全体的な正電荷が、約＋５〜約＋４０である、項目７に記載の複合体。
(項目９)
前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、項目８に記載の複合体。
(項目１０)
前記超荷電タンパク質が、超正荷電＋３６ＧＦＰである、項目９に記載の複合体。
(項目１１)
前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接する前記ゲノム配列にハイブリッド形成する前記ｓｓＯＤＮが、前記ターゲットＤＮＡ内の突然変異の相同配向性修復のための鋳型である、項目１〜１０のいずれかに記載の複合体。
(項目１２)
前記ｓｓＯＤＮが、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列にハイブリッド形成する、項目１１に記載の複合体。
(項目１３)
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目１〜１２のいずれかに記載の複合体。
(項目１４)
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、項目１〜１３のいずれかに記載の複合体。
(項目１５)
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：１〜約１．５：１：１：１５である、項目１〜１４のいずれかに記載の複合体。
(項目１６)
項目１〜１５のいずれかに記載の複合体を含む細胞。
(項目１７)
前記細胞が、真核細胞である、項目１６に記載の細胞。
(項目１８)
前記真核細胞が、ヒト細胞である、項目１７に記載の細胞。
(項目１９)
前記細胞が、生殖系列細胞、幹細胞、または前駆細胞である、項目１６〜１８のいずれかに記載の細胞。
(項目２０)
前記幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、項目１９に記載の細胞。
(項目２１)
前記前駆細胞が、造血幹細胞である、項目１９に記載の細胞。
(項目２２)
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにある、項目１６〜２１のいずれかに記載の細胞。
(項目２３)
細胞の集団におけるターゲットＤＮＡの部位特異的改変の方法であって、項目１〜１５のいずれかに記載の複合体を前記細胞に導入することを含み、前記複合体が、前記細胞へと、相同配向性修復（ＨＤＲ）及び前記ｓｓＯＤＮの前記ターゲットＤＮＡへの組込みを可能にする条件下で導入される、前記方法。
(項目２４)
前記複合体が、前記細胞へとヌクレオポレーション（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により導入される、項目２３に記載の方法。
(項目２５)
前記ターゲットＤＮＡへと組み込まれた前記ｓｓＯＤＮが、前記ターゲットＤＮＡ内の突然変異を矯正する、項目２３または２４に記載の方法。
(項目２６)
細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）の比率が、約１０〜約０．５である、項目２３〜２５のいずれかに記載の方法。
(項目２７)
前記突然変異が、前記細胞の少なくとも５％において矯正される、項目２３〜２６のいずれかに記載の方法。
(項目２８)
矯正された細胞に関する細胞生存率が、少なくとも約５０％である、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、項目２３〜２８のいずれかに記載の方法。
(項目３０)
前記ターゲットＤＮＡが、ヘモグロビンをコードする、項目２３〜２９のいずれかに記載の方法。
(項目３１)
前記部位特異的改変が、鎌状赤血球貧血症に関連するヘモグロビン突然変異を矯正する、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
前記部位特異的改変が、β−サラセミアに関連する突然変異を矯正する、項目３０に記載の方法。
(項目３３)
対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異に伴う疾患を処置する方法であって、
ａ．前記対象から得られた細胞の集団へと、項目１１に記載の複合体を、相同配向性修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で導入して、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列における前記突然変異を矯正すること、及び
ｂ．ステップ（ａ）の前記細胞を前記対象へと移植することを含む、前記方法。
(項目３４)
ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列内の突然変異に伴う前記疾患が、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアである、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
前記細胞が、造血幹細胞または誘導多能性幹細胞である、項目３３または３４に記載の方法。
(項目３６)
前記移植された細胞の少なくとも５％が、矯正された突然変異を含む、項目３３〜３５のいずれかに記載の方法。
(項目３７)
細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合の比率が、少なくとも約０．５である、項目３３〜３６のいずれかに記載の方法。
(項目３８)
前記複合体が、前記細胞へとヌクレオポレーションにより導入される、項目３３〜３６のいずれかに記載の方法。
(項目３９)
Ｔ細胞障害に関連する突然変異を矯正する方法であって、前記Ｔ細胞障害を有する対象から得た細胞の集団へと：
ａ．前記Ｔ細胞障害に関連する突然変異を含む細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
ｂ．ｇＲＮＡの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を含む前記ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、前記ターゲットＤＮＡ内に二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｃ．前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する第三のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む複合体を導入することを含み、前記複合体が、前記細胞へと、相同配向性修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で導入されて、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する、前記方法。
(項目４０)
前記ターゲットＤＮＡが、Ｔリンパ球発達に関連するタンパク質をコードする、項目３９に記載の方法。
(項目４１)
前記細胞が、造血幹細胞または多能性幹細胞からなる群より選択される、項目３９または４０に記載の方法。
(項目４２)
前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、項目４１に記載の方法。
(項目４３)
前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、項目３９〜４２のいずれかに記載の方法。
(項目４４)
超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結したトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、項目３９〜４３のいずれかに記載の方法。
(項目４５)
前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、項目３９〜４４のいずれかに記載の方法。
(項目４６)
前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結している約１０〜約２５アミノ酸長の負荷電ペプチドをさらに含む、項目３９〜４５のいずれかに記載の方法。
(項目４７)
前記負荷電ペプチドが、配列番号５０を含むＩＮＦ７ペプチドである、項目４６に記載の方法。
(項目４８)
前記超荷電タンパク質が、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する、項目３９〜４７のいずれかに記載の方法。
(項目４９)
前記全体的な正電荷が、約＋５〜約約＋４０である、項目４８に記載の方法。
(項目５０)
前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、項目３９〜４９のいずれかに記載の方法。
(項目５１)
前記超荷電タンパク質が、超正荷電＋３６ＧＦＰである、項目５０に記載の方法。
(項目５２)
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目３９〜５１のいずれかに記載の方法。
(項目５３)
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、項目３９〜５２のいずれかに記載の方法。
(項目５４)
前記Ｔ細胞障害を有する対象から得た細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合の比率が、少なくとも約０．５である、項目３９〜５３のいずれかに記載の方法。
(項目５５)
前記複合体が、前記細胞へとヌクレオポレーションにより導入される、項目３９〜５４のいずれかに記載の方法。
(項目５６)
前記Ｔ細胞障害を有する対象から得た細胞の前記集団の少なくとも５％が、ＨＤＲを受けて、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異が矯正される、項目３９〜５５のいずれかに記載の方法。
(項目５７)
ＨＤＲで矯正された前記細胞を単離することをさらに含む、項目３９〜５６のいずれかに記載の方法。
(項目５８)
ＨＤＲで矯正された前記細胞を培養することをさらに含む、項目５７に記載の方法。
(項目５９)
前記細胞が、増殖のための条件下で培養される、項目５８に記載の方法。
(項目６０)
前記細胞が、前記細胞のＴ細胞への分化を促進する条件下で培養される、項目５８または５９に記載の方法。
(項目６１)
対象において遺伝的突然変異に伴うＴ細胞障害を処置する方法であって、前記対象に、項目３９〜６０のいずれか一項に記載の方法により得られた細胞を移植することを含む、前記方法。
(項目６２)
前記移植が、自家性である、項目６１に記載の方法。
(項目６３)
前記Ｔ細胞障害が、重症複合免疫不全症である、項目３９〜６２のいずれかに記載の方法。
(項目６４)
細胞のゲノムにおけるＴ細胞障害に関連する突然変異を矯正するための複合体であって、
ａ．前記Ｔ細胞障害に関連する突然変異を含む細胞の前記ゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
ｂ．前記ｇＲＮＡの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を含む前記ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、前記ターゲットＤＮＡ内に二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｃ．前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットＤＮＡに組み込んで、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する第三のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む、前記複合体。
(項目６５)
前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、項目６４に記載の複合体。
(項目６６)
超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結したトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、項目６４または６５に記載の複合体。
(項目６７)
前記超荷電タンパク質が、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する、項目６４〜６６のいずれかに記載の複合体。
(項目６８)
前記全体的な正電荷が、約＋５〜約＋４０である、項目６７に記載の複合体。
(項目６９)
前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、項目６４〜６８のいずれかに記載の複合体。
(項目７０)
前記超荷電タンパク質が、超正荷電＋３６ＧＦＰである、項目６９に記載の複合体。
(項目７１)
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目６４〜７０のいずれかに記載の複合体。
(項目７２)
ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、項目６４〜７１のいずれかに記載の複合体。
(項目７３)
超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、超正荷電＋３６ＧＦＰに作動可能に連結した組換えＣａｓ９である、項目１〜１５のいずれかに記載の複合体。
(項目７４)
超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、超正荷電＋３６ＧＦＰに作動可能に連結した組換えＣａｓ９である、項目１〜１５のいずれかに記載の複合体
(項目７５)
超正荷電＋３６ＧＦＰが、Ｃａｓ９のカルボキシ末端に作動可能に連結している、項目７４に記載の複合体。
(項目７６)
前記ｓｓＯＤＮが、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列にハイブリッド形成し、配列番号５２を含む、項目７４または７５に記載の複合体。