(57)【要約】  本発明の目的は、従来の真核型アマドリアーゼが有する熱安定性に関する欠点を克服し、糖尿病の臨床診断用酵素や酵素センサーの用途に熱安定性の優れた真核型アマドリアーゼを提供すること。本発明は、Coniochaeta属若しくはEupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼをコードするＤＮＡに変異を加え、特定のアミノ酸残基に置換を導入し、熱安定性に関する欠点を克服した真核型アマドリアーゼ、その遺伝子及び組換え体ＤＮＡ、並びに熱安定性に優れた真核型アマドリアーゼの製造法に関する。
2007125779.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の特徴を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）ｐＨ８．０において５０℃、３０分間の熱処理で８３％以上活性が残存する；
（ｂ）配列番号１記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【請求項２】
以下の（ａ）から（ｃ）よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する、請求項１記載の真核型アマドリアーゼ：
（ａ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の１８４位のグリシン；
（ｂ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の２７２位のアスパラギン；
（ｃ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の３８８位のヒスチジン。
【請求項３】
以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）５０℃、３０分間の熱処理で８３％以上活性が残存する；
（ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、及び／又は置換がなされたアミノ酸配列を有する。
【請求項４】
配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、９４位のアルギニン、１８４位のグリシン、２６５位のフェニルアラニン、２７２位のアスパラギン、３０２位のヒスチジン、若しくは３８８位のヒスチジンの位置で１つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する真核型アマドリアーゼ。
【請求項５】
配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、以下の（ａ）から（ｆ）よりなる群から選択される１つ又はそれ以上の改変若しくは変異の組み合わせからなる真核型アマドリアーゼ：
（ａ）９４位のアルギニンがリジンに置換されている；
（ｂ）１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている；
（ｃ）２６５位のフェニルアラニンがロイシンに置換されている；
（ｄ）２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている；
（ｅ）３０２位のヒスチジンがアルギニンに置換されている；
（ｆ）３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている。
【請求項６】
配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、３０２位のヒスチジンがアルギニンに置換され、かつ、３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている真核型アマドリアーゼ。
【請求項７】
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の特徴を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）ｐＨ８．０において５０℃、３０分間の熱処理で５０％以上活性が残存する；
（ｂ）配列表の配列番号２記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【請求項８】
以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）５０℃、３０分間の熱処理で５０％以上活性が残存する；
（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、及び／又は置換がなされたアミノ酸配列を有する。
【請求項９】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、１８４位のグリシン、２７２位のアスパラギン、若しくは３８８位のヒスチジンの位置で１つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する真核型アマドリアーゼ。
【請求項１０】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、以下の（ａ）から（ｃ）よりなる群から選択される１つ又はそれ以上の改変若しくは変異の組み合わせからなる真核型アマドリアーゼ：
（ａ）１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている；
（ｂ）２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている；
（ｃ）３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている。
【請求項１１】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換され、２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、かつ、３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている真核型アマドリアーゼ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項記載のアミノ酸配列をコードする真核型アマドリアーゼ遺伝子。
【請求項１３】
請求項１２記載の真核型アマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
真核型アマドリアーゼを生成する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）請求項１４記載の宿主細胞を培養する段階；
（ｂ）宿主細胞に含まれる真核型アマドリアーゼ遺伝子を発現させる段階；
（ｃ）培養物から真核型アマドリアーゼを単離する段階。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の真核型アマドリアーゼを含む、糖化タンパク質の測定において使用するためのキット。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の真核型アマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定において使用するためのキット。
【請求項１８】
下記の（ａ）から（ｆ）の理化学的性質を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）作用及び基質特異性：酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒する；
（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０；
（ｃ）作用適温の範囲：２０〜４５℃；
（ｄ）熱安定性：ｐＨ８．０において５０℃、３０分間の熱処理で８３％以上の活性が残存；
（ｅ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０；
（ｆ）分子量：約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性に優れた真核型アマドリアーゼ、その遺伝子及び組換え体ＤＮＡ、並びに熱安定性に優れた真核型アマドリアーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、及び過酸化水素を生成する反応を触媒する。【０００３】
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されている（例えば、特許文献１〜４参照）。Aspergillus属、Penicillium属、Fusarium属、Pichia属、Coniochaeta属、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Neocosmospora属、Corynebacterium属、Agrobacterium属からアマドリアーゼが精製され、各アマドリアーゼのアミノ酸配列が決定されている（例えば、非特許文献１〜４、及び特許文献５〜９参照）。【０００４】
これらのアマドリアーゼは、原核型アマドリアーゼと真核型アマドリアーゼの２つのタイプに分類することができる。原核生物由来の原核型アマドリアーゼと真核生物由来の真核型アマドリアーゼとは互いに、それぞれのタイプ内においてのみアミノ酸配列が高い相同性を有する一方で、タイプを異とする真核型と原核型アマドリアーゼのタイプ間においては、アミノ酸配列の相同性は極めて低い。【０００５】
原核型アマドリアーゼは、補酵素との結合が共有結合ではないため、酵素の精製中、若しくは保存中において、一部の補酵素が外れて酵素活性を失ってしまうという問題があった。これに対し、真核型アマドリアーゼは、補酵素との結合が共有結合のため、原核型アマドリアーゼで確認された上記の問題は認められず、従って実用上優れた性質を有している。【０００６】
さて、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼなどで分解し、遊離させた糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを測定する方法が提案されている（例えば、特許文献１０〜１３参照）。【０００７】
アマドリアーゼを糖尿病の臨床診断用酵素としてキット試薬に処方する上では、酵素の性質として熱安定性が要求される。Aspergillus terreus  ＧＰ１株由来の真核型アマドリアーゼは４５℃、１０分間の熱処理で約４０％の残存活性を示している（例えば、非特許文献２参照）。Fusarium oxysporum  Ｓ−１Ｆ４株由来の真核型アマドリアーゼは４５℃、５分間の熱処理で約１０％の残存活性を示している（例えば、非特許文献５参照）。また、Coniochaetidium savoryi  ＡＴＣＣ３６５４７株由来の真核型アマドリアーゼは３７℃以下、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献１４参照）。さらに、Arthrinium sp.  ＴＯ６株、Pyrenochaeta sp.  ＹＨ８０７株、Leptosphaeria nodorum  ＮＢＲＣ７４８０株、Pleospora herbarum  ＮＢＲＣ３２０１２株、Ophiobolus herpotrichus  ＮＢＲＣ６１５８株由来の各真核型アマドリアーゼは４０℃以下、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している。また、Neocosmospora vasinfecta  ＮＢＲＣ７５９０株由来の真核型アマドリアーゼは４５℃以下、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している。Curvularia clavata  ＹＨ９２３株由来の真核型アマドリアーゼは５０℃以下、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献１４参照）。【０００８】
しかし、これらの真核型アマドリアーゼを臨床診断用の酵素として使用する上では、さらなる熱安定性が必要とされる。すなわち、最も熱安定性の高いCurvularia clavata  ＹＨ９２３株由来の酵素で、５０℃以下、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示しているが、糖尿病の臨床診断用酵素としてキット試薬に処方することや、酵素センサーとしての用途を考えると、さらにより高い熱安定性が要求されている。【０００９】
一般的な技術として、酵素の熱安定性を高めるためには、酵素をコードするＤＮＡに変異を加え、酵素のアミノ酸に置換を導入し、熱安定性の優れた酵素を選抜する方法が知られている。また、相同性の高い酵素において、アミノ酸置換によって熱安定性を高めたという例がすでに知られている場合には、その情報をもとに熱安定性の向上を予想することが可能である。
実際、コリネバクテリウム属細菌由来の原核型アマドリアーゼについては、数個のアミノ酸を置換することによって、当該原核型アマドリアーゼの熱安定性が向上することが示されており（例えば、非特許文献５参照）、他の原核型アマドリアーゼへの熱安定性の導入も可能なことであろう。【００１０】
しかし、上記で述べたように、アマドリアーゼのアミノ酸配列は、真核型アマドリアーゼと原核型アマドリアーゼのタイプ間において相同性が極めて低いため、コリネバクテリウム属細菌由来の原核型アマドリアーゼの熱安定性に関与するアミノ酸変異についての情報をもとに、真核型アマドリアーゼの熱安定性の向上を予想することは不可能であった。
また、公知の真核型アマドリアーゼについて、アミノ酸の置換によって熱安定性を向上させたという報告は一例もなく、真核型アマドリアーゼの熱安定性に関する既存の情報を利用することはできない。実際に真核型アマドリアーゼタイプの熱安定性を高めるために配列中のどのアミノ酸を置換すればよいかは、鋭意具体的な研究を要することとなる。【００１１】
【特許文献１】特公平５−３３９９７号公報
【特許文献２】特開２０００−２７０８５５号公報
【特許文献３】特開平７−２８９２５３号公報
【特許文献４】特開平８−３３６３８６号公報
【特許文献５】特開２００３−２３５５８５号公報
【特許文献６】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献７】国際公開第２００４／１０４２０３号パンフレット
【特許文献８】特開平１１−１５５５７９号公報
【特許文献９】特開２００３−７９３８６号公報
【特許文献１０】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献１１】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献１２】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献１３】国際公開第９７／１３８７２号パンフレット
【特許文献１４】特開２００４−２７５０１３号公報
【非特許文献１】Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７８，３４４−５０，２００２
【非特許文献２】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２，４９９−５０５，１９９６
【非特許文献３】Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，６２５−３２，２００４
【非特許文献４】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，  ４８７−９１，１９９５
【非特許文献５】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９，１３９−４５，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、従来の真核型アマドリアーゼが有する熱安定性に関する欠点を克服し、糖尿病の臨床診断用酵素や酵素センサーの用途に熱安定性の優れた真核型アマドリアーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、Coniochaeta属由来の真核型アマドリアーゼ（ＦＰＯＸ−ＣＥ）若しくはEupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼ（ＦＰＯＸ−ＥＥ）における特定のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。【００１４】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の特徴を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）ｐＨ８．０において５０℃、３０分間の熱処理で８３％以上活性が残存する；
（ｂ）配列番号１記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
（２）以下の（ａ）から（ｃ）よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する、上記（１）記載の真核型アマドリアーゼ：
（ａ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の１８４位のグリシン；
（ｂ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の２７２位のアスパラギン；
（ｃ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の３８８位のヒスチジン。
（３）以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）５０℃、３０分間の熱処理で８３％以上活性が残存する；
（ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、及び／又は置換がなされたアミノ酸配列を有する。
（４）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、９４位のアルギニン、１８４位のグリシン、２６５位のフェニルアラニン、２７２位のアスパラギン、３０２位のヒスチジン、若しくは３８８位のヒスチジンの位置で１つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する真核型アマドリアーゼ。
（５）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、以下の（ａ）から（ｆ）よりなる群から選択される１つ又はそれ以上の改変若しくは変異の組み合わせからなる真核型アマドリアーゼ：
（ａ）９４位のアルギニンがリジンに置換されている；
（ｂ）１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている；
（ｃ）２６５位のフェニルアラニンがロイシンに置換されている；
（ｄ）２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている；
（ｅ）３０２位のヒスチジンがアルギニンに置換されている；
（ｆ）３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている。
（６）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において、２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、３０２位のヒスチジンがアルギニンに置換され、かつ、３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている真核型アマドリアーゼ。
（７）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の特徴を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）ｐＨ８．０において５０℃、３０分間の熱処理で５０％以上活性が残存する；
（ｂ）配列表の配列番号２記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
（８）以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）５０℃、３０分間の熱処理で５０％以上活性が残存する；
（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、及び／又は置換がなされたアミノ酸配列を有する。
（９）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、１８４位のグリシン、２７２位のアスパラギン、若しくは３８８位のヒスチジンの位置で１つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する真核型アマドリアーゼ。
（１０）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、以下の（ａ）から（ｃ）よりなる群から選択される１つ又はそれ以上の改変若しくは変異の組み合わせからなる真核型アマドリアーゼ：
（ａ）１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている；
（ｂ）２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている；
（ｃ）３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている。
（１１）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列において、１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換され、２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、かつ、３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている真核型アマドリアーゼ。
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれか１に記載のアミノ酸配列をコードする真核型アマドリアーゼ遺伝子。
（１３）上記（１２）記載の真核型アマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
（１４）上記（１３）記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
（１５）真核型アマドリアーゼを生成する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）上記（１４）記載の宿主細胞を培養する段階；
（ｂ）宿主細胞に含まれる真核型アマドリアーゼ遺伝子を発現させる段階；
（ｃ）培養物から真核型アマドリアーゼを単離する段階。
（１６）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の真核型アマドリアーゼを含む、糖化タンパク質の測定において使用するためのキット。
（１７）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の真核型アマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定において使用するためのキット。
（１８）下記の（ａ）から（ｆ）の理化学的性質を有する真核型アマドリアーゼ：
（ａ）作用及び基質特異性：酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒する；
（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０；
（ｃ）作用適温の範囲：２０〜４５℃；
（ｄ）熱安定性：ｐＨ８．０において５０℃、３０分間の熱処理で８３％以上の活性が残存；
（ｅ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０；
（ｆ）分子量：約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、熱安定性の優れた真核型アマドリアーゼ及びそれをコードする遺伝子等が提供され、糖尿病の診断用酵素等として、また、糖尿病マーカーの測定用キットに有利に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列（最上段）及び該配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる真核型アマドリアーゼ配列を整列させた図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
アマドリアーゼとは、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。
アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。【００１８】
本発明の真核型アマドリアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するConiochaeta属若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するEupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼ（ＦＰＯＸ−ＣＥ、ＦＰＯＸ−ＥＥ）に基づき作製された、熱安定性の優れた、真核型アマドリアーゼの改変体である。このような変異体の例として、例えば、また、配列番号１若しくは２と高い相同性（例えば、７５％以上、好ましくは、８５％以上、より好ましくは９５％以上）を有するアミノ酸配列を有する真核型アマドリアーゼ、及び、配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列で、１から数個のアミノ酸が改変若しくは変異、又は、欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有する真核型アマドリアーゼを挙げることが出来る。尚、請求の範囲に記載された、熱安定性及び／又はアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Curvlaria属、Neocosmospora属、Penicillium属、Fusarium属、若しくはAspergillus属のような、他の糸状菌若しくは酵母由来の真核型アマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。【００１９】
これらの真核型アマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「真核型アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、真核型アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。【００２０】
ついで、上記真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから真核型アマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、真核型アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的の真核型アマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
このようにして得られた真核型アマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、Coniochaeta属由来の真核型アマドリアーゼ遺伝子（特許文献５）の例などが挙げられる。【００２１】
これらの真核型アマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. ＮＩＳＬ９３３０株由来の真核型アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ（特許文献５）から、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、真核型アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、抽出、精製して得ることができる。【００２２】
なお、本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。【００２３】
真核型アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、真核型アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異を真核型アマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。【００２４】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法  （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。【００２５】
また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の改変真核型アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。【００２６】
上記方法により得られる真核型アマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。【００２７】
上述の如くして得られた真核型アマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換又はそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。【００２８】
次に、本発明の真核型アマドリアーゼの生産株を選抜するためには、例えば、次のような方法を用いることができる。
まず、得られた上記形質転換体がコロニーを形成したＬＢ寒天培地から滅菌したビロード生地等で新しい寒天培地にレプリカを数枚とり、培養する。レプリカをとった寒天培地のコロニーが十分な大きさになったら、リゾチームなどの溶菌剤に浸した膜を培地に重ね、３７℃で、１時間ほど静置し、溶菌させる。このとき溶菌した粗酵素液が膜に吸着する。【００２９】
粗酵素液を吸着させた膜を、５５℃の条件で１時間静置した後、基質であるフルクトシルバリン、パーオキシダーゼ、ＴＯＯＳ、４−アミノアンチピリンを含む０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に浸した膜と重ね合わせ、紫色の発色の度合いを観察する。改変前の真核型アマドリアーゼ生産株についても同様の工程で発色試験を行い、その比較により目的とする形質転換体を選抜する。【００３０】
この様にして、優れた熱安定性を有する本発明の真核型アマドリアーゼの生産能を有する形質転換体を得ることができる。【００３１】
さらに必要により、熱安定性の真核型アマドリアーゼの生産能を有する形質転換体を用い、改変された該真核型アマドリアーゼ遺伝子に対して、上記に示した改変方法により、さらに変異導入を繰り返し行うことにより、さらに熱安定性の優れた改変された真核型アマドリアーゼ及びその生産能を有する形質転換体を得ることもできる。【００３２】
例えば、このようにして得られた熱安定性の優れた真核型アマドリアーゼを生産する形質転換体の一例として、ｐＨ８．０において５０℃、３０分間の熱処理による残存活性率が８３％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上になった真核型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株を挙げることができる。一例として示した本発明の真核型アマドリアーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００６年３月３１日付けで寄託され、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５９３が付与されている。【００３３】
なお、アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。【００３４】
また、「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各真核型アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となる真核型アマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。【００３５】
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１８４位のグリシンに対応する位置」とは、確定した真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１の真核型アマドリアーゼの１８４位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。
すなわち、Eupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは１８４位のグリシン、Pyrenochaeta属由来の真核型アマドリアーゼでは１８４位のグリシン、Arthrinium属由来の真核型アマドリアーゼでは１８４位のグリシン、Neocosmospora属由来の真核型アマドリアーゼでは１８４位のグリシン、Penicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは１８４位のセリン、Aspergillus属由来の真核型アマドリアーゼでは１８３位のグリシンである。【００３６】
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２７２位のアスパラギンに対応する位置」とは、確定した真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の２７２位のアスパラギンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは２７２位のアスパラギン、Pyrenochaeta属由来の真核型アマドリアーゼでは２７０位のアスパラギン、Arthrinium属由来の真核型アマドリアーゼでは２７２位のアスパラギン、Neocosmospora属由来の真核型アマドリアーゼでは２７２位のアスパラギン、Penicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは２７２位のアスパラギン、Aspergillus属由来の真核型アマドリアーゼでは２７２位のアスパラギンである。【００３７】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３８８位のヒスチジンに対応する位置」とは、確定した真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１の真核型アマドリアーゼの３８８位のヒスチジンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは３８８位のヒスチジン、Pyrenochaeta属由来の真核型アマドリアーゼでは３８６位のヒスチジン、Arthrinium属由来の真核型アマドリアーゼでは３８９位のヒスチジン、Neocosmospora属由来の真核型アマドリアーゼでは３８８位のヒスチジン、Penicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは３８８位のヒスチジン、Aspergillus属由来の真核型アマドリアーゼでは３８８位のヒスチジンである。【００３８】
上記のようにして得られた熱安定性の優れた真核型アマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該真核型アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。【００３９】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。
また、培養は、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは３７℃前後の培養温度で４〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。【００４０】
培養終了後、該培養物より真核型アマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、又はリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、真核型アマドリアーゼの粗酵素を得る。【００４１】
上記真核型アマドリアーゼの粗酵素よりさらに真核型アマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された真核型アマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望の熱安定性の優れた真核型アマドリアーゼを得ることができる。【００４２】
また、本発明の「熱安定性の優れた」とは、以下に述べる活性測定方法及び熱安定性測定方法に記載した反応条件下で、配列番号１の真核型アマドリアーゼについては、ｐＨ８．０において５０℃、３０分間熱処理した後の残存活性比が熱処理前の活性に対して８３％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上残存していること、配列番号２の真核型アマドリアーゼについては、ｐＨ８．０において５０℃、３０分間熱処理した後の残存活性が熱処理前の活性に対して５０％以上、好ましくは７０％以上残存していることをいう。熱安定性の優れた真核型アマドリアーゼは、該酵素含有製品等における保存性が著しく向上するため、産業上非常に有利である。
なお、熱安定性の優れた真核型アマドリアーゼは、タンパク質の構造自体が高度に安定化しており、したがって、例えば、タンパク質のプロテアーゼに対する耐性能も向上している。
アマドリアーゼによるＨｂＡ１ｃ測定の際、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼで分解させた後、アマドリアーゼを作用させるわけだが、その際、プロテアーゼ耐性能が高いアマドリアーゼを用いることは、非常に有用である。なぜなら本測定系においてプロテアーゼは、ＨｂＡ１ｃだけではなくアマドリアーゼに対しても作用してしまい、ＨｂＡ１ｃの測定値に悪影響を及ぼしてしまうからである。プロテアーゼ耐性能を有するアマドリアーゼを用いることで、プロテアーゼによるアマドリアーゼの分解が防がれ、分離操作が不要かつ、より正確な測定が可能になる。また、これまで不可能だった高濃度でのプロテアーゼ処理も可能となり、測定値の精度が向上させることが可能になる。また、プロテアーゼ反応の短時間化を図ることができ、ＨｂＡ１ｃの迅速測定にもつなげることができる。
また、本発明の「プロテアーゼ耐性能を有する」とは、真核型アマドリアーゼについて、ｐＨ８．０において３７℃、３０分間、５０ｍＵのプロテアーゼ処理した後の残存活性比がプロテアーゼ処理前の活性に対して４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上残存していることをいう。例えば、プロテアーゼ耐性能測定方法は、アマドリアーゼ活性が約０．０５Ｕ／ｍｌとなるように、０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）でアマドリアーゼ酵素液若しくは粗酵素液を希釈し、各サンプルに５０ｍＵの中性プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）を加えた後、３７℃で３０分間加温し、中性プロテアーゼ処理前と処理後のサンプル中に含まれる酵素活性を測定し、残存活性比を求めることでプロテアーゼ耐性能を評価できる。【００４３】
真核型アマドリアーゼの活性の測定方法、基質親和性測定方法及び熱安定性測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いる真核型アマドリアーゼ活性の測定方法及び熱安定性測定方法について説明する。【００４４】
（真核型アマドリアーゼ活性の測定方法）
本発明における真核型アマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。【００４５】
以下、本発明における真核型アマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、フルクトシルバリンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
フルクトシルバリン等の糖化アミノ酸、及びフルクトシルバリルヒスチジン等の糖化ペプチドは、阪上らの方法に基づき合成、精製した（特開２００１−９５５９８号公報参照）。【００４６】
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ−４−ＡＡ溶液
１．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度  ５ｍＭ）
フルクトシルバリン４１７ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。【００４７】
Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１，１００μｌの試薬２、及び１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−２０００Ａ、日立社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。これをあらかじめ作製しておいた過酸化水素の標準溶液を試薬３の代わりに、また酵素液の代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３７℃、１分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を計算し、この数値を酵素液中の活性単位とした。【００４８】
（熱安定性測定方法）
真核型アマドリアーゼ粗酵素液、または真核型アマドリアーゼ精製標品を約０．１Ｕ／ｍｌとなるように、１０％  キシリトールを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、５０℃にて３０分間加温した。加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、残存（酵素）活性（％）を求めることで安定性を評価した。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ  ＤＮＡの調製
Coniochaeta属由来真核型アマドリアーゼ（配列番号１）遺伝子の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）株（特許文献５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３２：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年８月１日付けで寄託）を、ＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ）  バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］１００ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰを抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ  ＤＮＡを１００μｇ得た。
【実施例２】
【００５０】
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ  ＤＮＡの改変操作
上記組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ  ＤＮＡ１００μｇのうち、２０μｇを用いて、ＸＬ１−ＲＥＤ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）（増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすい）をＤ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６〜３３１，１９７９）に従って形質転換し、約５，０００株の形質転換株を得た。
全コロニーからプラスミドＤＮＡを回収するためにＱＩＡＧＥＮ  ｓｏｌ  Ｉ（キアゲン社製）を寒天培地上に加え、スプレッダーでＱＩＡＧＥＮ  ｓｏｌ  Ｉとともにコロニーを掻き集め、ピペットマンで溶液を回収し、以降は通常のプラスミド回収の方法で、改変操作を加えた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ  ＤＮＡを１００μｇ得た。前記の被改変組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ  ＤＮＡ２０μｇを用いてＤ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６〜３３１，１９７９）に従って大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、約１，０００株の改変を受けたプラスミドを保有する形質転換株を得た。
【実施例３】
【００５１】
（３）熱安定性に優れた真核型アマドリアーゼの探索
まず、得られた上記形質転換体の全てを、ビロード生地を用いて新しいＬＢ−ａｍｐ寒天培地にレプリカした。レプリカプレート上のコロニーをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、１０ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ社製）液に浸した。このＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を４８℃で１時間処理した後、２ｍＭ  フルクトシルバリン、１ｍｇ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１ｍｇ／ｍｌ  ４−アミノアンチピリン（東京化成社製）、１０ｍｇ／ｍｌ  ＴＯＯＳ（同仁化学社製）を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に浸したところ、少数の強い発色を示す株が認められた。
この強い発色に相当するコロニーをマスタープレート上より選択し、２ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地で液体培養することにより、プラスミドにコードされる改変真核型アマドリアーゼを生産させた。
培養後、得られた各菌体を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。超音波破砕し、１２，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離の後、上清を回収した。この粗酵素液を用いて、上記の（熱安定性測定方法）に従い、残存活性（％）（処理後の活性／未処理の活性）を算出した。【００５２】
同様にして培養、抽出、熱処理をし、活性測定をした改変前の真核型アマドリアーゼと活性残存率の比較を行うことで、活性残存率が向上した改変された２つの真核型アマドリアーゼとその生産大腸菌を得ることができた。
得られた２株をＬＢ−ａｍｐ培地２ｍｌ中、３７℃で１８時間振盪培養し、この培養液からＧＦＸ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてプラスミドを単離した。該プラスミドをそれぞれｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２と命名し、各プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。
その結果、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１中には、配列番号１記載のアミノ酸配列の３０２番目のヒスチジンがアルギニンに、もうひとつのｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２には、配列番号１記載のアミノ酸配列の３８８番目のヒスチジンがチロシンに置換する変異が導入されていることが明らかとなった。
【実施例４】
【００５３】
（４）二重変異株ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３の作製
組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１及びｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２を、制限酵素ＡａｔＩＩ及びＳａｃＩで２重消化した。上記ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１ＤＮＡから約１ｋｂＤＮＡ断片を、上記ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２ＤＮＡから約５ｋｂＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分取し、常法により精製した。さらに、両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３を得た。【００５４】
こうして得られた各組換え体プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３）株を、ＬＢ−ａｍｐ培地で３７℃、２０時間培養した。その後、各菌体をｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
このようにして調製した酵素液について上記の（熱安定性測定方法）の方法により、アマドリアーゼの残存する酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
表１において、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰは、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）株由来の野性型真核型アマドリアーゼを示し、他の３種類の酵素は本発明の真核型アマドリアーゼを示す。この表１から明らかなように、本発明で得られた真核型アマドリアーゼは、優れた熱安定性を有することが判る。【００５５】
【表１】
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【実施例５】
【００５６】
（５）改変の蓄積
上記（４）で取得した改変された真核型アマドリアーゼ生産株である大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３）株から上記（１）に記載の方法によりプラスミドＤＮＡを調製した。さらに、上記（２）の方法より変異を導入し、続いて上記（３）の方法を用い、本実施例５では、先に得た改変された真核型アマドリアーゼを比較対照として選択を行った。ｐＨ８．０における５０℃、３０分の熱処理による残存活性率が高く、さらに改変された真核型アマドリアーゼを生産する大腸菌を４株取得した。このようにして得られた大腸菌４株を用いて、ＬＢ−ａｍｐ培地２ｍｌ中で、３７℃、１８時間の振盪培養を行った。
この培養液からＧＦＸ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてプラスミドを単離した。該プラスミドをそれぞれｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ４、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ５、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ６、及びｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７と命名し、各プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。【００５７】
その結果、３０２番目のヒスチジンがアルギニンに、３８８番目のヒスチジンがチロシンに置換する変異に加え、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ４中には、９４番目のアルギニンがリジンに、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ５には１８４番目のグリシンがアスパラギン酸に、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ６中には、２６５番目のフェニルアラニンがロイシンに、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７には２７２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換された変異が導入されていることが明らかとなった。【００５８】
こうして得られた組換え体プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ４）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ５）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ６）、及び大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）を、ＬＢ−ａｍｐ培地で３７℃、２０時間培養し、各菌体を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、超音波破砕して１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
このようにして調製した酵素液について上記（熱安定性測定方法）の方法により、残存する酵素活性を測定した。結果を表２に示す。【００５９】
表２において、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰは、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）由来の改変前の真核型アマドリアーゼを示し、他の５種類の酵素は本発明の真核型アマドリアーゼを示す。この表２から明らかなように、本発明で得られた真核型アマドリアーゼは、ｐＨ８．０における５０℃、３０分間の熱処理によってもほとんど活性が失われず、優れた熱安定性を有することが判る。【００６０】
【表２】
2007125779.tif 000004
【実施例６】
【００６１】
（６）本発明真核型アマドリアーゼの生産及び精製
上記のようにして得られた本発明の真核型アマドリアーゼを生産する形質転換体、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）をＬＢ−ａｍｐ培地１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度６００ｒｐｍの条件で、３０℃の培養温度で２４時間攪拌培養した。
得られた培養液１０Ｌを７，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して集菌し、バッファーＡ（１０ｍＭ  リン酸バッファー、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  グリセロール、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ８）５００ｍｌに懸濁後、フレンチプレスにより破砕した。
破砕液は９，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清に硫酸アンモニウムを４０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。４℃で一晩放置後、遠心（９，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、上清を回収した。【００６２】
さらにこの上清に硫酸アンモニウムを６０％飽和となるよう徐々に添加し、目的の蛋白質を沈殿させた。４℃で一晩放置後、遠心（９，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、沈殿物を回収した。この沈殿物に１０ｍｌのバッファーＢ（１０ｍＭ  リン酸バッファー、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  グリセロール、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）を加え、溶解し、ＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）によりバッファー置換した後、あらかじめバッファーＢで平衡化しておいたＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ３４（ＩＢＦバイオテクニクス社製）カラム（２．８ｃｍ×８５ｃｍ）にアプライした。この後、１ＬのバッファーＢで溶出させ、活性画分を回収した。【００６３】
得られた活性画分をセントリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮後、バッファーＡでバッファー置換し、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）カラム（１．０ｃｍ×８ｃｍ）にアプライした。溶出はバッファーＣ（１０ｍＭ  リン酸バッファー、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  グリセロール、ｐＨ８）〜バッファーＤ（１０ｍＭ  リン酸バッファー、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  グリセロール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）のリニアグラジエントで行った。得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、単一なバンドが確認できた（分子量約５２，０００）。【００６４】
このようにして得られた酵素について、至適ｐＨ、基質特異性などの性質を調べたところ、改変前の酵素の性質と同様であった。すなわち、本発明真核型アマドリアーゼは、熱安定性以外の性質に関しては改変前の酵素の性質と同様であることがわかった。
【実施例７】
【００６５】
（７）真核型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの作製
Eupenicillium属由来真核型アマドリアーゼ（配列番号２）遺伝子の組換え体プラスミド（ｐｕｃ−ＥＦＰ）（特許文献５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３１）のＤＮＡを鋳型として、リン酸化した配列番号３、４のプライマー、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。【００６６】
すなわち、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液（タカラバイオ社製）を１０μｌ、ｄＮＴＰがそれぞれ２．５ｍＭになるように調整されたｄＮＴＰ混合溶液を８μｌ、鋳型となるｐｕｃ−ＥＦＰプラスミドのＤＮＡを３５０ｎｇ、上記プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加えて、全量を１００μｌとした。サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、＜９４℃、２０秒−６０℃、６０秒−７２℃、１２０秒＞のサイクルを３０回繰り返した。
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約１，３００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。
ＰＣＲで増幅したEupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼ遺伝子を、制限酵素ＨｐａＩで切断したｐＵＴＥ１００Ｋ’ベクター（特開平６−２９２５８４号公報）と連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰを得た。【００６７】
この組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰを保持する大腸菌ＪＭ１０９株（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ）株を、ＬＢ−ａｍｐ培地において、３７℃の培養温度で、２０時間振とう培養し、培養物を得た。得られた培養菌体を洗浄した後、超音波破砕したところ、Eupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼ活性の発現が確認された。
そこで、大腸菌ＪＭ１０９株（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ）株を、ＬＢ−ａｍｐ培地１００ｍｌに接種して、３７℃の培養温度で、２０時間振とう培養し、培養物を得た。この培養物を７，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。
この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰを抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰのＤＮＡを１００μｇ得た。
【実施例８】
【００６８】
（８）部位特異的改変操作
配列番号２記載のアミノ酸配列の１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている変異、２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている変異、３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている変異を導入することにした。
まず、配列番号２記載のアミノ酸配列の１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている変異を導入するため、配列番号５、６のＤＮＡ配列よりなるプライマーを、常法により合成した。次に、上記（７）で得た組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰのＤＮＡを鋳型として、配列番号５、６のプライマー、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、上記（７）と同様の条件でＰＣＲ反応を行った。【００６９】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで分析することにより、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが確認された。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ処理で残存している鋳型を切断した後、制限酵素ＫｐｎＩで処理した。このＤｐｎＩ及びＫｐｎＩで処理したＤＮＡを、１．０％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルから常法によりＤＮＡを抽出して、ＤＮＡ断片を回収した。
こうして得られた上記ＤＮＡ断片をリガーゼで連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ１を得た。【００７０】
続いて、配列番号２記載のアミノ酸配列（ＦＰＯＸ−ＥＥ）の２７２位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている変異を導入するため、プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ  ＤＮＡを鋳型、配列番号７、８のプライマー、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、上記（７）と同様の条件でＰＣＲ反応を行った。約６，０００ｂｐの増幅ＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩとＮｓｐＶで処理し、常法により精製した後、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ２を得た。【００７１】
また、配列番号２記載のアミノ酸配列（ＦＰＯＸ−ＥＥ）の３８８位のヒスチジンがチロシンに置換されている変異を導入するため、プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ  ＤＮＡを鋳型、配列番号９、１０のプライマー、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、上記（７）と同様の条件でＰＣＲ反応を行った。約６，０００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を、制限酵素ＤｐｎＩ及びＳｎａＢＩで処理し、常法によりＤＮＡ断片を精製した後、リガーゼで連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ３を得た。【００７２】
さらに、プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ２のＤＮＡを鋳型として、上記配列番号２記載のアミノ酸配列の３８８位のヒスチジンがチロシンに置換される変異導入を行うことで、プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ４を、続いてプラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ４を鋳型として、配列番号２記載のアミノ酸配列の１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている変異の導入を行うことで、プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５を得た。【００７３】
配列番号５    5’ GCTGGTACCTTTCAGCAACCTCTGTTCG   3’  （順方向プライマー）
配列番号６    5’ AAAGGTACCAGCATCTCCAAAGCCAAACTTG   3’  （逆方向プライマー）
（Ｇ１８４Ｄの導入用。下線部は、制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を示す）
配列番号７    5’ TCTTTTTCGAACCCGACGAGTATGGGGTG   3’  （順方向プライマー）
配列番号８    5’ TCGGGTTCGAAAAAGAACCCATATTCACC   3’  （逆方向プライマー）
（Ｎ２７２Ｄの導入用。下線部は、制限酵素ＮｓｐＶの認識配列を示す）
配列番号９    5’ ACATCGGGAAATACGTAGTTGAGCTTTTAG   3’  （順方向プライマー）
配列番号１０  5’ CTAAAAGCTCAACTACGTATTTCCCGATGT   3’  （逆方向プライマー）
（Ｈ３８８Ｙの導入用。下線部は、制限酵素ＳｎａＢＩの認識配列を示す）【００７４】
各プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。【００７５】
その結果、プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ１中には、配列番号２記載のアミノ酸配列の１８４番目のグリシンがアスパラギン酸に、プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ２中には配列番号２記載のアミノ酸配列の２７２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に、プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ３中には配列番号２記載のアミノ酸配列の３８８番目のヒスチジンがチロシンに、プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ４中には配列番号２記載のアミノ酸配列の２７２番目のアスパラギンがアスパラギン酸、及び３８８番目のヒスチジンがチロシンに置換する変異が、並びにプラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５中には配列番号２記載のアミノ酸配列の１８４番目のグリシンがアスパラギン酸に、２７２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に、及び３８８番目のヒスチジンがチロシンに置換する変異が、導入されていることが確認された。【００７６】
こうして得られた上記組換え体プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ１）株、ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ２）株、ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ３）株、ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ４）株、及びＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５）株を、ＬＢ−ａｍｐ培地において、３７℃の培養温度で２０時間培養した。得られた各培養菌体を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、超音波破砕処理を行い、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
このようにして調製した酵素液について上記（熱安定性測定方法）に示した方法により、残存するアマドリアーゼの酵素活性を測定した。結果を表３に示す。【００７７】
表３に示すように、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ）株によって生産される改変前の真核型アマドリアーゼの、ｐＨ８．０における５０℃、３０分間の熱処理における残存酵素活性は、熱処理前の活性の２．８％であった。
これに対して、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ１）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ２）株によって生産される改変後の真核型アマドリアーゼでは、改変前の真核型アマドリアーゼよりも、ｐＨ８．０、５０℃、３０分間の熱処理における残存酵素活性がそれぞれ７．４％、１１．９％に向上していた。また、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ３）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ４）株、及び大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５）株によって生産される改変後の真核型アマドリアーゼでは、改変前の真核型アマドリアーゼよりも、ｐＨ８．０、５０℃、３０分間の熱処理における残存酵素活性がそれぞれ４９．７％、５４．８％、７８．９％とさらに顕著に向上していた。
本発明で得られた真核型アマドリアーゼは、優れた熱安定性を有することが判った。【００７８】
【表３】
2007125779.tif 000005
【実施例９】
【００７９】
（９）改変の蓄積（４重変異体の作製）
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７は、配列番号１記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列の２７２番目のアスパラギンをアスパラギン酸に、３０２番目のヒスチジンをアルギニンに、３８８番目のヒスチジンをチロシンに置換する変異を含んでいる。これに、さらに９４番目のアルギニンをリジンに、１８４番目のグリシンをアスパラギン酸に、２６５番目のフェニルアラニンをロイシンに置換するような変異を加えていくことによって、最終的に６重変異体を作製することにした。
まず、Ｆ２６５Ｌの変異を導入するため、配列番号１１、１２のＤＮＡ配列よりなるプライマーを常法により合成した。次に、上記（５）で得た組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を鋳型、配列番号１１、１２のプライマー、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、上記（７）と同様の条件でＰＣＲ反応を行った。【００８０】
配列番号１１    5’ TTCTTCGAACCTGATGAGTTTGGTGTAATAAAG   3’  （順方向プライマー）
配列番号１２    5’ AGGTTCGAAGAAGAAGCCAAGTTCGCC   3’  （逆方向プライマー）
（Ｆ２６５Ｌの導入用。下線部は、ＮｓｐＶの認識配列を示す）【００８１】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで分析することにより、約６kｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることが確認された。こうして得られたＤＮＡをＤｐｎＩ処理で残存している鋳型を切断した後、ＮｓｐＶで処理した。このＤｐｎＩ、ＮｓｐＶ処理済みＤＮＡを１．０％アガロースで電気泳動し、ゲルから常法により抽出してＤＮＡを回収した。こうして得られたＤＮＡをライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ８を得た。なお、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ８プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した結果、Ｆ２６５Ｌ、Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３０２Ｒ、Ｈ３８８Ｙの各置換に相当する変異が導入されていることが明らかとなった。【００８２】
改変の蓄積（５重変異体の作製）
組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ８及びｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ５を制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｎａＢＩで２重消化し、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ８ＤＮＡから約５００ｂｐＤＮＡ断片を、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ５ＤＮＡから約５．５ｋｂＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分取し、常法により精製したのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９を得た。
なお、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した結果、Ｇ１８４Ｄ、Ｆ２６５Ｌ、Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３０２Ｒ、Ｈ３８８Ｙの各置換に相当する変異が導入されていることが明らかとなった。【００８３】
改変の蓄積（６重変異体の作製）
組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９及びｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ４を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９ＤＮＡから約９００ｂｐＤＮＡ断片を、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ４ＤＮＡから約５．０ｋｂＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分取し、常法により精製したのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１０を得た。なお、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ10プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した結果、Ｒ９４Ｋ、Ｇ１８４Ｄ、Ｆ２６５Ｌ、Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３０２Ｒ、Ｈ３８８Ｙの各置換に相当する変異が導入されていることが明らかとなった。
こうして作製されたプラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１０は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００７年３月１６日付けで受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８００として寄託されている。【００８４】
こうして得られた組換え体プラスミドを保持する大腸菌、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ８）、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９）、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１０）を、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）とともに、ＬＢ−ａｍｐ培地で３７℃，２０時間培養し、各菌体を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、超音波破砕して１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。【００８５】
このようにして調製した酵素液について上記（熱安定性測定方法）の方法により、残存する酵素活性を測定した。結果を表４に示す。表４において、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）は改変前の真核型アマドリアーゼを示し、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ８）、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９）、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１０）の酵素は本発明の真核型アマドリアーゼを示す。この表４から明らかなように、本発明で得られた真核型アマドリアーゼは、ｐＨ８．０において、５０℃、３０分間のみならず、６０分間の熱処理によっても活性をほとんど失わず、優れた熱安定性を有していることが判る。【００８６】
【表４】
2007125779.tif 000006
【実施例１０】
【００８７】
（１０）プロテアーゼ耐性能の確認
実施例９までに取得した組換え体プラスミドを保持する大腸菌、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１０）を、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）とともに、ＬＢ−ａｍｐ培地で３７℃，２０時間培養し、各菌体を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、超音波破砕して１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
アマドリアーゼ活性が約０．０５Ｕ／ｍｌとなるように、０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で粗酵素液を希釈し、各サンプルに５０ｍＵの中性プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）を加えた後、３７℃で３０分間加温した。各サンプルについて、プロテアーゼ処理前と処理後のサンプル中に含まれる酵素活性を測定し、残存活性比を求めることでプロテアーゼ耐性能を評価した。結果を表５に示す。表５において、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）は改変前の真核型アマドリアーゼを示し、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−ＣＦＰ−Ｔ７）、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１０）の酵素は本発明の真核型アマドリアーゼを示す。この表５から明らかなように、本発明で得られた真核型アマドリアーゼは、プロテアーゼに対する耐性能も著しく向上しており、優れた安定性を有していることが判る。【００８８】
【表５】
2007125779.tif 000007
【図１】
2007125779.tif 000008
【配列表】
2007125779000001.app
【国際調査報告】
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2007125779.tif 000010
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