(57)【要約】  経口、経鼻、注射や乳房内注入などの簡便な投与経路により投与して著効を示し、治療担当者の労力・負担や飼い主の経済的負担が少なく、動物にとっても投与負担の少ない哺乳動物の乳房炎治療剤、及び、その治療剤を用いる乳房炎の治療方法を提供することを課題とし、インターフェロンを有効成分として含有する哺乳動物の乳房炎治療剤、及び、この乳房炎治療剤を用いた哺乳動物の乳房炎の治療方法を提供することにより解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてインターフェロンを含んでなる哺乳動物の乳房炎治療剤。
【請求項２】
インターフェロンがヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌの何れかに由来するインターフェロンから選ばれる何れか１種又は２種以上である請求の範囲第１項記載の乳房炎治療剤。
【請求項３】
インターフェロンがヒトインターフェロンαである請求の範囲第１項又は第２項記載の乳房炎治療剤。
【請求項４】
インターフェロンがヒトインターフェロンα及びヒトインターフェロンβである請求の範囲第１項又は第２項記載の乳房炎治療剤。
【請求項５】
ヒトインターフェロンα中にサブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で１：９乃至１０：０の割合で含有している請求の範囲第３項又は第４項記載の乳房炎治療剤。
【請求項６】
インターフェロンが、治療剤１ｇ当たり約０．００５乃至５，０００国際単位含有せしめられている請求の範囲第１項乃至第５項の何れかに記載の乳房炎治療剤。
【請求項７】
投薬形態が経口投与形態、経鼻投与形態または非経口投与形態から選ばれる何れかである請求の範囲第１項乃至第６項の何れかに記載の乳房炎治療剤。
【請求項８】
乳房炎が微生物感染に起因することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第７項の何れかに記載の乳房炎治療剤。
【請求項９】
乳房炎が難治性であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第８項の何れかに記載の乳房炎治療剤。
【請求項１０】
哺乳動物がヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌの何れかであることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第９項の何れかに記載の乳房炎治療剤。
【請求項１１】
インターフェロンを、ヒトを除く哺乳動物の体重１ｋｇ当たり約０．００５乃至５，０００国際単位／回投与することを特徴とする哺乳動物の乳房炎の治療方法。
【請求項１２】
インターフェロンがヒトインターフェロンαである請求の範囲第１１項記載の乳房炎の治療方法。
【請求項１３】
インターフェロンがヒトインターフェロンα及びヒトインターフェロンβである請求の範囲第１１項記載の乳房炎の治療方法。
【請求項１４】
ヒトインターフェロンα中にサブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で、１：９乃至１０：０の割合で含有している請求の範囲第１２項又は第１３項記載の乳房炎の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳房炎の治療剤に関し、とりわけ、インターフェロンを有効成分とする乳房炎の治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
授乳期の哺乳動物は、授乳時の物理的な刺激や乳頭付近の傷の発生、環境の変化や出産などによるストレス、これらに起因する免疫力の低下などの種々の要因により、微生物に感染し、乳房炎を発生する頻度が増加することが知られている。なかでも、この乳房炎は、常に乳を出し続けることを要求される乳牛にあっては、その飼育において最も発生が多く、死廃事故に至る場合も多数あるため、被害が甚大な疾病となっている。【０００３】
乳牛の乳房炎の殆どは微生物の感染に起因するといわれているが、ストレスなどの環境因子も大きく発症に影響する。特に、夏場に多い暑熱ストレスや長距離移送のストレスや、これらのストレスに起因する免疫低下により発症頻度が上昇することが知られている。このように複数の要因が関与するため、乳房炎の発症機序は複雑であり、治療を困難なものとしている。【０００４】
乳房炎では発熱や元気喪失などの全身症状、乳房の異常、乳汁の異常、微生物感染などが観察される臨床型乳房炎と、これら臨床症状は認められないが、乳量の低下を伴う乳汁の異常、特に乳汁中に体細胞が分泌される異常乳と微生物感染が観察される潜在性乳房炎がある。【０００５】
これらの乳房炎の治療は抗生剤やホルモン剤の投与が一般的であり、これ以外にも多数の治療方法が提案されている（例えば特開２００１−２１３７８４号公報及び特開２００３−１７１２９１号公報参照）。しかし、抗生剤やホルモン剤は、感染源によって効果はバラつき、しかも、薬剤耐性菌の出現や免疫能低下を引き起こすため、難治性乳房炎に移行する可能性も高い。また、薬剤耐性菌を増加させることは公衆衛生上からも好ましくなく、潜在性乳房炎も含め、十分な効果を有する治療方法は確立されていないのが実状である。このように乳房炎は乳牛で多発し、乳量が低下するだけでなく、その生産の停止に至る場合もあるので、経済的にも大きなダメージとなる疾病である。また、ヒトを含めて授乳期にある哺乳類は乳房炎にかかり易くなっているため、哺乳動物の乳房炎に対する簡便で有効な予防剤及び／又は治療剤の確立が望まれている。【０００６】
一方、最近、ウシ、ネコ、ブタ、ラット、マウス、ニワトリなどの哺乳動物や鳥類などの温血動物の疾患に、比較的小量の同一種或いは異種由来のインターフェロン（以下、「ＩＦＮ」と略記する場合がある。）の経口投与が有効であることが報告されている（例えば、米国特許第５９１０３０４号明細書、特開平６−３４０５４９号公報、『臨床と微生物』、ジョセフ、エム、カミンズ  アンド  ウイリアム、イー、スチュアートＩＩ（Ｊｅｓｅｐｈ  Ｍ．Ｃｕｍｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ＩＩ）、第１８巻、第５号、第６３１−６３５号（１９９１年）参照）。また、本出願人らも、小量のヒトインターフェロンα（以下、「ＨｕＩＦＮ−α」と略記する場合がある。）を有効成分とする製剤が、ウシの消化器疾患の治療剤として有用であることを提案した（特開２００５−８９３０１号公報参照）。しかしながら、これらの文献には、インターフェロンが乳房炎の予防剤及び／又は治療剤（以下、併せて「乳房炎の治療剤」という場合がある。）として有用である点については、何ら記載も示唆もされていない。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、経口、経鼻、注射や乳房内注入などの簡便な投与経路により投与して著効を示し、治療担当者の労力・負担や飼い主の経済的負担が少なく、動物にとっても投与負担の少ない乳房炎の治療剤を提供することを第一の課題とし、その治療剤を用いる乳房炎の治療方法を提供することを第二の課題とする。
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決する目的で、ＩＦＮによる乳房炎の予防、治療方法について長年に渡り研究を進めてきた。その結果、ヒトを含む哺乳動物の乳房炎の予防、治療に、ＨｕＩＦＮ、とりわけ、ＨｕＩＦＮ−α製剤が有効であり、なかでも、そのサブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α活性中に１０％以上含有する製剤が、著効を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、乳房炎を発症する動物由来のＩＦＮが、当該動物の乳房炎の予防、治療に著効を示すことを見出し、乳房炎の治療剤を確立すると共に、それを用いた乳房炎の治療方法を確立することにより、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ＩＦＮを含んでなる乳房炎の治療剤を提供することにより、上記課題を解決するものである。
【０００９】
本発明によるＩＦＮを有効成分とする動物の乳房炎の治療剤及びその治療剤を用いる乳房炎の治療方法は、乳房炎の各種臨床症状の予防、改善、或いは完治（以下、「予防」、「改善」或いは「完治」を併せて「治療」という場合がある。）に著効を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で使用するＩＦＮ製剤は、哺乳動物の乳房炎に対する治療効果が高く、通常、対象となる動物の体重ｋｇ当たり約０．００５国際単位乃至５，０００国際単位と極めて小用量で事足りる。【００１１】
ＩＦＮは、経口投与しても、非経口投与しても、哺乳動物の乳房炎の治療に著効を発揮する。【００１２】
本発明の治療剤の使用対象となる動物とは、いわゆる哺乳動物（以下、「動物」と略記する場合がある。）であり、具体的には、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌをはじめとする、乳房炎を発症する動物、とりわけ、搾乳により過度の乳分泌を強いられる乳牛を挙げることができる。本発明の治療剤は、これらの動物に対して、乳房炎の治療目的のみでなく、その発症予防の目的で、未発症の動物に使用することもできる。【００１３】
本発明でいう乳房炎とは、哺乳動物の乳房に発生する炎症をいい、ヒトでいう乳腺炎などもこれに含まれる。乳房炎の発症頻度が非常に高い乳牛の場合を例に説明すると、乳房炎は乳牛の体表や飼育環境中に存在する細菌を中心とした微生物の乳房内感染、あるいは、様々な理化学的要因、例えば、搾乳刺激等を直接の原因として発生する。乳牛の乳房炎の殆どは細菌性であり、感染した乳汁、乳頭のキズ、人の手足のキズ等に存在し、牛群に伝播する伝染性細菌（黄色ブドウ球菌、無乳性レンサ球菌）と、体表、敷料や糞便中など飼育環境中に常在する環境性細菌（黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌、環境性レンサ球菌、大腸菌）が原因となる。環境因子も大きく発症に影響する。例えば、乳房が糞便に汚染されやすい牛床の形状、搾乳時の乳房のケア、宿主側の誘因として遺伝、体質、季節・気候変動等の要因があり、ストレス、特に夏場に多い暑熱ストレスや長距離移送のストレスなどに起因する免疫低下などにより発症する。乳房炎は一過性の場合もあるものの、完治が困難な場合が多く、多くの場合慢性乳房炎に移行する。これらの乳房炎の症状としては、発熱や元気喪失などの全身症状（甚急性期、急性期）、乳房の異常（甚急性期乃至慢性期）、乳汁の異常（甚急性期乃至慢性期）、微生物感染などが観察される臨床型乳房炎と、これら臨床症状は認められないが、乳汁の異常、特に乳汁中に体細胞が多数分泌される異常乳や微生物感染が観察される潜在性乳房炎がある。潜在性乳房炎の場合には、乳量の減少や、また異常乳汁の分泌が起こる。本発明の乳房炎治療剤は、上記の原因などにより発症する、上記の諸症状を呈する乳房炎の治療に使用することができる。また、本発明の乳房炎治療剤は、抗生剤やホルモン剤などの治療効果が認められなかったり、十分でない難治性乳房炎に対しても著効を発揮することができる。【００１４】
本発明による動物の乳房炎治療剤に使用するＩＦＮは、対象とする動物の乳房炎に対して治療効果を有するＩＦＮであれば、その由来や製造方法は問わない。通常は、対象とする動物に由来する細胞が産生する天然型のＩＦＮか、該動物由来の細胞から採取したＩＦＮ関連遺伝子を導入した微生物、動物細胞、植物細胞、動物若しくは植物が産生する組み換え型のＩＦＮを、公知の方法で精製し、これを有効成分として使用すればよい。また、組み換え型のＩＦＮとしては、天然型のＩＦＮのアミノ酸配列を有するものはもとより、動物の乳房炎に治療効果を有するものであれば、その一部のアミノ酸が、付加、欠失或いは置換したものであっても、複数のサブタイプの活性部位を組み込んだいわゆるコンセンサス配列を有するＩＦＮも、当然、本発明の乳房炎治療剤の有効成分として使用することができる。さらに、これらのＩＦＮにポリエチレングリコールなどの高分子を結合させた徐放性のＩＦＮなどの、化学的に修飾されたＩＦＮも使用することができる。【００１５】
今日、ＩＦＮは、その抗原性や生理活性等の違いに基づき、主としてＩ型（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β（動物種によっては、ＩＦＮ−α／βと称される場合もある））、ＩＩ型（ＩＦＮ−γ）なる三種類、二型に大別されているが、これらは、何れも乳房炎に対する治療効果において多少の違いはあるものの、本発明で使用することができる。また、インターフェロンτ（タウ）と呼ばれるＩＦＮも使用することができる。その際、本発明の効果が達せられる範囲内で、ただ一種のＩＦＮを使用してもよいし、同じ型或いは異なる型から選ばれるＩＦＮを組合せて使用してもよいし、異なる動物種由来のＩＦＮの二種以上を適宜組み合わせて使用することも随意である。なかでも、ヒト由来の細胞が産生するヒトＩＦＮか、ヒト由来の細胞から採取したヒトＩＦＮ関連遺伝子を導入した微生物、若しくは、動物や植物、これらの細胞が産生するヒトＩＦＮを有効成分とするものは、ヒトのみでなく、ウシをはじめとする動物全般の乳房炎に対して優れた治療効果を有することから、汎用性が高く、特に有利に利用することができる。また、ＩＦＮ−αは複数のサブタイプの存在が知られており、これらの１種又は２種以上を組み合わせて使用することも自由である。何れのＩＦＮの場合でも、比活性ができるだけ高いものを使用するのが望ましく、経口投与には、比活性が約１０５国際単位／ｍｇ蛋白質以上の精製品が、また、非経口投与には、約１０７国際単位／ｍｇ蛋白質以上の精製品が望ましく、パイロジェンを除去したものが特に望ましい。【００１６】
本発明者が試験したところ、これらＨｕＩＦＮのなかでも、とりわけ、ＢＡＬＬ−１細胞やナマルバ細胞などのヒトリンパ芽球様細胞株が産生する、いわゆる、「天然型ＨｕＩＦＮ−α」は、ヒトのみでなく乳牛をはじめとする種々の動物の乳房炎に対する治療効果が高く、副作用も僅少という特徴がある。ことに、効果の点で、ＨｕＩＦＮ−αのサブタイプα８（以下、「サブタイプα８」という）をＨｕＩＦＮ−αの総活性の１０％以上含有する製剤が望ましく、且つ、ＨｕＩＦＮ−α中にサブタイプα８とサブタイプα２（以下、「サブタイプα２」という）とを、活性比で、１：９乃至１０：０の割合で含有する製剤が強い治療効果を示すことからさら望ましく、２：８乃至４：６の割合で含有する製剤が著効を示すことから、特に望ましい。ＢＡＬＬ−１細胞由来のＨｕＩＦＮ−αは、サブタイプα８をＨｕＩＦＮ−αの総活性の約２５％含有し、サブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で、１：３の割合で含有し、そのバランスは極めて良く、この発明に使用して最も優れた効果をもたらした。また、ＨｕＩＦＮ−αとヒトＩＦＮ−βやヒトＩＦＮ−γを組み合わせて使用すると、ＨｕＩＦＮ−αの持つ治療効果が相乗的に増強されることも確認された。【００１７】
本発明による乳房炎の治療剤は、ＩＦＮ単独の形態はもとより、ＩＦＮとそれ以外の生理的及び製剤学的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤、徐放剤、乳化剤さらには、必要に応じて、解熱剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ホルモン剤、免疫賦活剤、消化剤、栄養剤、餌料などとの組成物としての形態を包含する。さらに、この発明の治療剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明の有効成分たるＩＦＮの、例えば、一日当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離可能な剤型にある薬剤を意味する。また、ＩＦＮの型及び／又はＩＦＮ−αの異なるサブタイプの２種以上を組み合わせて使用する場合には、個々の型のＩＦＮ及び／又はＩＦＮ−αのサブタイプの単剤を組み合わせて使用すること、２種以上の型のＩＦＮを混合して１剤として使用すること、或いは、これらの製剤を組み合わせて使用することも随意である。このような投薬形態の薬剤としては、散剤、ゲル状経口用剤、顆粒剤、液剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、注射剤、フィルム状経口用剤などが挙げられる。また、散剤や顆粒剤などを用時に、その投与経路に応じて、蒸留水、生理食塩水、ミルク、代用ミルクなどに溶解して使用することも随意である。【００１８】
本発明による乳房炎の治療剤の用量、用法について、ＨｕＩＦＮを使用する場合を例に説明すると、本発明の治療剤は、経口的に投与しても非経口的に投与しても、所期の予防及び／又は治療効果が得られる。具体的には、動物の種類、原因微生物の種類、症状、用量、用法、使用するＩＦＮの型などに依っても変わるけれども、対象とする動物の症状や様子を観察しながら、通常、動物の体重ｋｇ当たり約０．００５乃至５０００国際単位／回、望ましくは、約０．０５乃至５００国際単位／回、より望ましくは、約０．１乃至５０国際単位／回のＩＦＮを１日１乃至３回若しくは１週間に１乃至６回、１日乃至６カ月間投与すればよい。本発明者が試験したところ、用量が上記の範囲を下回ると所期の治療効果が得られ難くなり、逆に、上回ると、抗体産生や副作用が顕著になったり、治療効果に比べて経済的負担が大きくなることがあり、上記範囲を以って最良とした。また、ヒト以外の動物に由来するＩＦＮを使用する場合にも、その用法、用量も、ＨｕＩＦＮを使用した場合に準じればよい。なお、ヒト以外の動物に由来するＩＦＮを使用する場合の活性は、種が異なると、測定方法により多少の変化はあるものの、ＶＳＶウイルスなどのウイルスによる、マウスＬ９２９細胞、ラットＸＣ細胞、或いは、ウシＭＤＢＫ細胞などの細胞変性を抑制する系を用いて、該当する動物か近縁種の動物の公知のＩＦＮ標準品に基づき換算すればよく、活性の測定に、ヒトと該当する動物のＩＦＮの両方に感受性を示す細胞を使用して、ＨｕＩＦＮの国際標準品に基づき換算してもよい。また、免疫酵素法などを利用して測定したＩＦＮ蛋白の質量をもとに、公知の各種動物のＩＦＮ標準品に基づき換算して、その活性を計算してもよい。【００１９】
なお、本明細書を通じて、ＨｕＩＦＮの活性は、ＨｕＩＦＮがシンドビスウイルスによるＦＬ細胞の細胞変性を抑制する度合をマイクロタイター法により測定し、その測定値を世界保健機関によるＨｕＩＦＮの国際標準品「Ｇａ２３−９０１−５３２」に基づき決定される「国際単位」に換算して表示する。【００２０】
本発明の治療剤を経口或いは経鼻投与するには、治療剤を、例えば、散剤、トローチ剤、顆粒剤、液剤、錠剤、舌下剤、飼料などの経口或いは経鼻投与可能な形態に調製し、そのままで、或いは、必要に応じて、餌、ミルク、代用ミルクなどに混合・溶解したり、経口投与器、スプレー、胃ゾンデなどの適宜投与補助器具を使いながら、常法にしたがって口腔内、鼻腔内、食道内若しくは胃内に挿入すればよい。また、非経口投与するには、この発明による注射剤を動物の皮内、皮下、筋肉内、血管内（静脈又は動脈をいう）、乳房内（乳頭からの注入を含む）、若しくは腹腔内に注射すればよい。また、本発明の治療剤は、単一の個体に対して、上記の治療剤の形態と投与経路とを適宜組み合わせて使用することも随意である。【００２１】
治療効果と投与のし易さという観点から個々の投与経路を比較すると、経口投与は、ヒトにあってはもちろんのこと、ウシやブタなどの場合にも、一般の飼育場や集積場でも容易に実施できるという利点がある。所定量のＩＦＮを正確に投与する場合には、血管内、皮内、皮下若しくは筋肉内に投与することも随意である。【００２２】
本発明の治療剤は、乳房炎の予防、治療効果に加えて、ウシやブタをはじめとする動物全般のＩＦＮ感受性の各種疾患、輸送時などストレスに伴う感染症や体重の減少などに対する予防剤及び／又は治療剤、各種動物の新生児期、ほ乳期、それ以降の肥育期における肥育促進剤などとしても併せて利用することができる。この場合の用法、用量も、乳房炎の治療の場合に準じればよい。【００２３】
＜実験１：ＨｕＩＦＮ−α標品の調製＞
後述の実施例１に記載の方法に基づき、ＢＡＬＬ−１細胞由来のＨｕＩＦＮ−α（以下、「ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ」と略記する場合がある）の精製品（比活性２×１０８国際単位／ｍｇ蛋白質）を、また、実施例２の方法に基づき、組換え型サブタイプα８（比活性２×１０８国際単位／ｍｇ蛋白質）及び組換え型サブタイプα２（比活性７×１０７国際単位／ｍｇ蛋白質）の精製標品を、それぞれ調製した。また、これらとは別に、常法により、ヒト末梢血から分離した白血球にセンダイウイルスを作用させて誘発させたＨｕＩＦＮ−α（以下、「白血球ＩＦＮ」と略記する場合がある。）をケー・カンテル（Ｋ．Ｃａｎｔｅｌｌ）等、『ザ  ジャーナル  オブ  ジェネラル  バイロロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）』、第３９巻、第５４１〜５４３頁（１９７８年）に記載された方法に準じて精製し、比活性約２×１０６国際単位／ｍｇ蛋白質の部分精製白血球ＩＦＮを得た。次いで、この部分精製ＨｕＩＦＮを、後述の実施例１と同様に、モノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−α抗体を用いる抗体カラムクロマトグラフィーによりさらに精製した後、ヒトアルブミン約０．１ｍｇ／ｍｌを含有する燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたゲル濾過クロマトグラフィーを適用することにより、精製白血球ＩＦＮ（比活性約２×１０８国際単位／ｍｇ蛋白質）溶液を得た。これら２種類のＨｕＩＦＮ−αと、組換え型サブタイプα８及び組換え型サブタイプα２を使用して、以下の実験を行った。【００２４】
＜実験２：ウシの分泌する乳汁中の体細胞数に及ぼすＩＦＮの影響＞
分娩直後のウシは、乳房炎を発症しやすく、それに伴い乳汁中の体細胞数が増加することが知られている。そこで、ウシの分泌する乳汁中の体細胞数に及ぼすＩＦＮの影響を調べる試験を以下のように行った。すなわち、実験１で調製したＢＡＬＬ−１ＩＦＮ標品を、後述の実施例５の方法に準じて、無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）を賦形剤として使用し、４、２００、２０００或いは４００００国際単位／ｇのＢＡＬＬ−１ＩＦＮを含有する４種類の粉末状ＨｕＩＦＮ−α製剤を調製した。３歳乃至５歳で、体重が６００ｋｇ前後のホルスタイン種乳牛５０頭を対象とし、無作為に１群１０頭を選択し、各群に、乾乳日と分娩予定日の７日前に、それぞれ、１回ずつ、前記ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ製剤の何れかを、１頭当たり、約１．５ｇを経口投与し、体重ｋｇ当たりの投与量が、０．０１、０．５、５或いは１００国際単位／ｋｇ体重／回となるように調整した。試験は、主として獣医師が行ない、乾乳日の１日前（以下、「乾乳日前」という。）、分娩６日、９日、１４日目に乳汁中の体細胞数を測定した。対照群として、残りの１０頭に、無水結晶マルトース１．５ｇを経口投与し、ＨｕＩＦＮ−α製剤投与群と同様に、乳汁中の体細胞数を測定した。ＨｕＩＦＮ−α製剤投与群と対照群の各測定日における乳汁中の体細胞数の平均を求め、各群における、分娩６日、９日、１４日目に乳汁中の体細胞数を、各群の乾乳日前の体細胞数で除し、１００倍して、体細胞増減率（％）を求め、その結果を表１に示す。【００２５】
【表１】
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【００２６】
表１から明らかなように、対照群では、分娩後の乳汁中の体細胞数は、乾乳日前に比して経時的に増加し、分娩及びその後の授乳に伴い、乳房炎の発症乃至増悪が認められた。これに対して、ＨｕＩＦＮ−α製剤経口投与群では、０．０１、０．５、５或いは１００国際単位／ｋｇ体重の何れの投与量においても、分娩後の乳汁中の体細胞数が、乾乳前に比して経時的に減少した。この結果は、乾乳期の搾乳牛に、０．０１、０．５、５或いは１００国際単位／ｋｇ体重のＨｕＩＦＮ−α製剤を経口投与することにより、乳房炎の発症予防及び増悪の治療、さらには乳質の改善が図れることを物語っている。【００２７】
＜実験３：ウシの乳房炎に及ぼすＩＦＮの種類の違いによる影響＞
実験２で、ＩＦＮが乳牛の乳房炎の治療及び乳質改善に有効であることが確認されたので、ＩＦＮの種類によりその効果に差があるかどうかを確認する試験を以下のように行った。すなわち、実験１で調製した、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ標品、白血球ＩＦＮ標品、組換え型サブタイプα８標品及び組換え型サブタイプα２標品を、実験２と同様に、無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）を賦形剤として使用し、各々２００国際単位／ｇを含有する粉末状のＨｕＩＦＮ−α製剤を調製した。なお、組換え型サブタイプα８及び組換え型サブタイプα２については、サブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で、１０：０、９：１、８：２、４：６、２：８、１：９、０：１０の割合で含有する７種類の粉末状の製剤を調製した。３歳乃至５歳の乳房炎の症状を呈している乳牛１００頭を対象とし、無作為に選択した１０頭を１群として、各群に、前記ＨｕＩＦＮ−α製剤の何れかを、経口的に、０．５国際単位／ｋｇ体重／回となるように約１．５ｇの用量で、毎日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って投与した。また、対照群として、残ったウシ１０頭に、無水結晶マルトース１．５ｇを１日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って経口投与した。【００２８】
実験は主として獣医師が行ない、投与開始の日から７日目に、表２に示す「無効」、「やや有効」、「有効」、「著効」の４段階の判定基準により、乳房の状態と乳質に対する効果を評価し、乳房の状態についての評価結果を表３に、乳質についての評価結果を表４に示す。また、「著効」と「有効」と判定された場合を、「治療効果有り」と評価して、各ＨｕＩＦＮ−α製剤投与群及び対照群において、著効及び有効と判定されたウシの頭数をその試験群で使用したウシの総頭数（１０頭）で除し、１００倍して、奏功率（％）を求めて、その結果を表３及び表４に併せて示す。【００２９】
【表２】
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【００３０】
【表３】
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【００３１】
【表４】
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【００３２】
表３及び表４から明らかなように、何れのＨｕＩＦＮ−α製剤を投与した場合にも、対照群に比して、顕著な乳房の状態及び乳質の改善が認められ、ＨｕＩＦＮ−αの経口投与により、乳牛の乳房炎が改善されることが確認された。この改善効果は、乳房の状態及び乳質の何れにおいても、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ（サブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α活性中に約２５％含有し、サブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で、１：３の割合で含有）を投与した場合に最も顕著であり、その奏功率は８０％に達した。白血球ＩＦＮ或いは組換え型サブタイプα２のみの投与群では、奏功率が４０％と、低い結果となったのに対して、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ、及び、組換え型サブタイプα８と組換え型サブタイプα２との活性比が１：９乃至１０：０の製剤を投与した群では、何れも、白血球ＩＦＮ或いは組換え型サブタイプα２のみの投与した群よりも高い奏功率が得られた。なかでも、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ、及び、組換え型サブタイプα８と組換え型サブタイプα２との活性比が１：９乃至８：２の製剤を投与した群で、高い奏功率が得られ、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮ、及び、組換え型サブタイプα８と組換え型サブタイプα２との活性比が２：８乃至４：６の製剤を投与した群で、特に高い奏功率が得られた。【００３３】
＜実験４：ウシの乳房炎に及ぼすＩＦＮの投与量の影響＞
上記知見に基づき、最も乳房炎に対する治療効果の高かったＢＡＬＬ−１ＩＦＮを用いて、ウシの乳房炎に及ぼすＩＦＮの投与量の影響を調べる試験を以下のように行った。すなわち、実験１で調製したＢＡＬＬ−１ＩＦＮ標品を、実験２と同様に、無水結晶マルトースを賦形剤として使用し、０．２、２、２０、４０、２００、２００００、２０００００、２００００００、及び、２０００００００国際単位／ｇのＢＡＬＬ−１ＩＦＮを含有する９種類の粉末状ＨｕＩＦＮ−α製剤を調製した。乳房炎と診断された、３歳乃至６歳で、体重が６００ｋｇ前後のホルスタイン種乳牛１００頭を対象とし、無作為に１群１０頭を選択し、各群に前記ＨｕＩＦＮ−α製剤の何れかを、経口的に、表５及び６に示す０．０００５乃至５００００国際単位／ｋｇ体重／回の投与量となるように約１．５ｇの用量で、毎日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って投与した。また、対照群として、残ったウシ１０頭に、無水結晶マルトース１．５ｇを１日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って経口投与した。【００３４】
試験は、主として獣医師が行ない、投与開始の日から７日目に、表２に示す「無効」、「やや有効」、「有効」、「著効」の４段階の判定基準により、乳房の状態と乳質に対する効果を評価し、乳房の状態についての結果を表５に、乳質についての結果を表６に示す。また、「著効」と「有効」と判定された場合を、「治療効果有り」と評価して、各ＨｕＩＦＮ−α製剤投与群において、著効及び有効と判定されたウシの頭数をその試験群で使用したウシの総頭数（１０頭）で除し、１００倍して、奏功率（％）を求めて、その結果を表５及び表６に併せて示す。【００３５】
【表５】
2007037099.tif 000006
【００３６】
【表６】
2007037099.tif 000007
【００３７】
表５及び表６から明らかなように、ＨｕＩＦＮ−α製剤を０．０００５国際単位／ｋｇ体重／回投与した場合には、対照群と同様に、乳房の状態及び乳質の改善は認めらなかった。これに対して、ＨｕＩＦＮ−α製剤を０．００５乃至５０００国際単位／ｋｇ体重／回投与した場合には、顕著な乳房の状態及び乳質の改善が認められた。この効果は、乳房の状態及び乳質の何れにおいても、０．０５国際単位ｋｇ体重／回以上の投与で「著効」が得られ、０．１国際単位ｋｇ体重／回以上の投与でさらに顕著となる。しかしながら、５００００国際単位／ｋｇ体重／回の投与では、やや有効例や無効例で副作用の可能性も考えられる、発熱、活動性や乳量の低下が認められた。この結果は、ＨｕＩＦＮ−α製剤を０．００５乃至５０００国際単位／ｋｇ体重／回のＨｕＩＦＮ−α製剤を投与することにより、乳房炎が治療可能であり、その治療効果の点では、０．０５乃至５０００国際単位／ｋｇ体重／回が望ましく、０．０５乃至５００国際単位／ｋｇ体重／回がさらに望ましく、０．１乃至５０国際単位／ｋｇ体重／回が特に望ましいことを物語っている。【００３８】
本試験の期間中、５００００国際単位／ｋｇ体重／回の投与量以外では、ＨｕＩＦＮ−α製剤の投与に起因すると考えられる、特段の副作用は全く認められず、この発明による治療剤がウシの乳房炎の治療に極めて効果的、且つ、安全であることを裏付けていた。さらに、これらのウシの一部について、５回目の投与後から３０日目と６０日目に、血液検査を実施したところ、ＨｕＩＦＮ−αに起因すると思われる抗体産生は全く検出されなかった。このことは、この発明による治療剤が、ウシの乳房炎を治療する目的で、同一のウシに反復投与しても安全なことを示唆している。【００３９】
＜実験５：難治性乳房炎に及ぼすＩＦＮの影響＞
従来乳房炎の治療には、ホルモン剤や抗生剤が使用されてきたものの、十分な治療効果を得られない場合が多く、難治性乳房炎を発症している乳牛が多い。そこで、これらの難治性乳房炎に及ぼすＩＦＮの影響を調べる試験を以下のように行った。すなわち、実験１で調製したＢＡＬＬ−１ＩＦＮを、実験２と同様に、無水結晶マルトースを賦形剤として使用し、ＢＡＬＬ−１ＩＦＮを２００国際単位／ｇ含有する粉末状のＨｕＩＦＮ−α製剤を調製した。難治性乳房炎と診断された、３歳乃至６歳で、体重が６００ｋｇ前後のホルスタイン種乳牛２０頭を対象とし、無作為に１０頭づつ２群に分け、一方の群に前記ＨｕＩＦＮ−α製剤を、経口的に、０．５国際単位／ｋｇ体重／回となるように約１．５ｇの用量で、毎日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って投与した。また、対照として、残ったウシ１０頭に、無水結晶マルトース１．５ｇを１日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って経口投与した。【００４０】
実験は、主として獣医師が行ない、投与開始の日から７日間、毎日、表２に示す「無効」、「やや有効」、「有効」、「著効」の４段階の効果の判定基準により、乳房の状態と乳質を評価し、その結果を表７に示す。また、「著効」と「有効」と判定された場合を、「治療効果有り」と評価して、ＨｕＩＦＮ−α製剤投与群及び対照群において、著効及び有効と判定されたウシの頭数をその試験群で使用したウシの総頭数（１０）で除し、１００倍して、奏功率（％）を求め、併せて、表７に示す。【００４１】
【表７】
2007037099.tif 000008
【００４２】
表７から明らかなように、試験期間をつうじて、対照の乳牛の乳房の状態と乳質に、著効や有効を示す、改善例は認められなかった。これに対して、ＨｕＩＦＮ−α製剤を経口投与した乳牛では、投与２日目から有効例が認められ、３日目からは著効例が認められた。また、投与開始６日目には、乳房の状態及び乳質の何れにおいても、奏功率が８０％となった。【００４３】
これらの試験結果は、ＨｕＩＦＮ−α製剤が、一般の難治性乳房炎を含む乳房炎の治療剤として有用であることを物語っている。【００４４】
以下、実施例に基づき、本発明を具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
特公昭５６−５４１５８号公報に記載された方法に準じ、ハムスター体内で増殖させたＢＡＬＬ−１細胞に培養培地中でセンダイウイルスを作用させてＨｕＩＦＮ−αを誘発させた。この培養培地を遠心分離して得られた上清を濃縮し、濃縮物にフェニルセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーを適用することにより、比活性約１０６国際単位／ｍｇ蛋白質の部分精製ＨｕＩＦＮ−αを得た。次に、この部分精製ＨｕＩＦＮ−αを、常法により、モノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−α抗体を水不溶性担体に結合させた抗体カラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した後、ゼラチン約０．１ｍｇ／ｍｌを含有する燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたゲル濾過クロマトグラフィーを適用することにより、比活性約２×１０８国際単位／ｍｇの精製ＨｕＩＦＮ−αを含有するＢＡＬＬ−１ＩＦＮ溶液を得た。本品を、高速液体クロマトグラフィーで分析し、その活性を比較したところ、ＨｕＩＦＮ−αの総活性対して、サブタイプα８を約２５％とサブタイプα２を約７５％含有していた。【００４６】
このようにして調製したＢＡＬＬ−１由来の精製ＨｕＩＦＮ−αを約５ｍｇ蛋白質／ｍｌにまで膜濃縮し、１％（ｗ／ｖ）ゼラチンと０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する生理食塩水にＨｕＩＦＮ−α濃度が３００国際単位／ｍｌになるよう希釈し、膜濾過して滅菌した後、バイアルに１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥した。【００４７】
本品は、有効成分としてＢＡＬＬ−１細胞由来の精製ＨｕＩＦＮ−αを含有し、ウシをはじめとする動物の乳房炎治療用注射剤として有用である。
【実施例２】
【００４８】
＜組換え型サブタイプα２及びサブタイプα８＞
開２００２−２０１１４１号公報の実験１−１（ａ）及び実験１−１（ｂ）の方法に準じて、組換え型サブタイプα８（比活性、約３×１０８国際単位／ｍｇ蛋白質）及び組換え型サブタイプα２（比活性、約８×１０７国際単位／ｍｇ蛋白質）の精製標品を調製した。【００４９】
このようにして調製したサブタイプα８標品とサブタイプα２標品を各々約２ｍｇ蛋白質／ｍｌにまで膜濃縮後、サブタイプα８とサブタイプα２とを、活性比で１：３となるように混合し、１％（ｗ／ｖ）局方精製ゼラチンと０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する生理食塩水にＨｕＩＦＮ−α濃度が１００国際単位／ｍｌになるよう希釈し、膜濾過して滅菌した後、バイアルに１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥した。【００５０】
有効成分として組換え型の精製サブタイプα８とサブタイプα２とを含有せしめた本品は、治療効果及び副作用において実施例１の注射剤よりやや劣るものの、ウシをはじめとする動物の乳房炎治療用注射剤として有用である。
【実施例３】
【００５１】
実施例１と同様にしてＢＡＬＬ−１細胞にセンダイウイルスを作用させて調製した精製ＢＡＬＬ−１ＩＦＮを、３％（ｗ／ｖ）ゼラチンと０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する生理食塩水にＨｕＩＦＮ−α濃度が１，０００国際単位／ｍｌとなるように希釈し、膜濾過して滅菌した後、バイアルに１ｍｌずつ充填し、凍結乾燥した。【００５２】
本品は、実施例１の注射剤と同様、有効成分としてＢＡＬＬ−１細胞由来の精製ＨｕＩＦＮ−αを含有し、対象動物の乳房炎治療用注射剤として有用である。
【実施例４】
【００５３】
蒸留水にマンニトールを２％（ｗ／ｖ）溶解し、溶液に実施例１の方法で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の部分精製ＨｕＩＦＮ−αを含有する溶液を加え、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−αを７５国際単位含有するＨｕＩＦＮ−α溶液を得た。この溶液３２質量部に０．５質量部の「ツイーン８０」を１５質量部のエタノールに溶解して混合し、さらに、その混合物に０．５質量部のトリエタノールアミンを１５質量部のグリセリンに溶解して混合した後、小量のトリエタノールアミンを加えて、ｍｌ当たりＨｕＩＦＮ−αを約２５国際単位含む、ほぼ中性のゲル状製剤を得た。【００５４】
有効成分としてＢＡＬＬ−１細胞由来のＨｕＩＦＮ−αを含有する本品は、適度の口腔内滞留時間を有し、患畜に飲ませ易い乳房炎治療用ゲル状経口用剤である。
【実施例５】
【００５５】
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に実施例１の方法で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の精製ＨｕＩＦＮ−α（約１０８国際単位／ｍｌ）３質量部を均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の「ファイントース」を均一に混合し、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−αを約３００国際単位含む散剤を得た。【００５６】
本品は適度の口腔内滞留時間と優れた保存安定性を有し、動物の乳房炎治療剤として有用である。本品は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、対象動物に飲ませ易い散剤である。
【実施例６】
【００５７】
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に実施例１の方法で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の部分精製ＨｕＩＦＮを含有する水溶液（約２，０００国際単位／ｍｌ）１５質量部を均一に混ぜた後、打錠機にかけて顆粒剤を得た。【００５８】
本品は、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−αを約２５０国際単位含み、優れた保存安定性を有し、動物の乳房炎治療用散剤として有用である。また、本品は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、対象動物に飲ませ易い顆粒剤である。【００５９】
健康なウシ５頭に、本品０．８ｇを、各々分娩予定日の７日前に１回投与した。また、健康なウシ８頭に、本品０．８ｇ（投与１回当たり）を、各々、分娩の予定日の７日前から、１日１回連日３日間投与した。分娩１ヶ月後及び２ヶ月後の乳汁中の体細胞数を計測して、その平均値を計算したところ、本品１回投与群の、分娩１ヶ月後及び２ヶ月後の乳汁中の体細胞数は、各々、１１．７万個／ｍｌと７．４万個／ｍｌとなり、３回投与群では、各々１１．７万個／ｍｌと６．１万個／ｍｌとなった。何も投与しなかった健康なウシ６頭の、分娩１ヶ月後及び２ヶ月後の乳汁中の体細胞数の平均は、各々６．６万個／ｍｌと１３．３万個／ｍｌであった。本品を投与した場合には、１回投与及び３回投与の何れの場合においても、分娩１ヶ月後よりも２ヶ月後の体細胞数が減少していたのに対して、何も投与しなかったウシでは、分娩１ヶ月後よりも２ヶ月後の体細胞数が増加したことから、本品には、乳房炎の抑制効果があることが確認された。
【実施例７】
【００６０】
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に市販のＨｕＩＦＮ−β製剤（持田製薬株式会社販売、商品名「ＩＦＮβ注射用６００万Ｉ．Ｕ．」）を蒸留水１ｍｌに溶解したもの４質量部を均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の「ファイントース」を均一に混合し、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−βを約１００国際単位含む散剤を得た。【００６１】
このＨｕＩＦＮ−β製剤を使用して、実験３の方法に準じて乳房炎の症状を呈する３乃至４歳と推定されるブタ３０頭を使用して、１０国際（Ｉ．Ｕ．）単位／ｋｇ体重を７日間、経口投与したところ、奏功率は約４７％となり、本品は、無投与群（２０頭、奏功率５％）に比して、有意に高い奏功率を示したことから、乳房炎に対する治療効果があると判断された。【００６２】
また、実験３の方法に準じて、乳房炎の症状を呈する３乃至４歳と推定されるブタ２０頭を使用して、前記ＨｕＩＦＮ−β製剤を５国際（Ｉ．Ｕ．）単位／ｋｇ体重と実験４で調製した２００国際単位／ｇの組み換え型サブタイプα８の製剤１０国際単位／ｋｇ体重とを、７日間、経口投与したところ、奏功率は５０％となり、本品及び組み換え型サブタイプα８製剤の併用は、２０頭のブタにサブタイプα８の製剤を１５国際単位／ｋｇ体重投与した群（奏功率４０％）、及び、無投与群（１０頭、奏功率１０％）に比して、有意に高い奏功率を示したことから、ブタの乳房炎に対する優れた治療効果があると判断された。【００６３】
前記ＨｕＩＦＮ−β製剤は適度の口腔内滞留時間と優れた保存安定性を有している。しかも、上記の試験結果は、ＨｕＩＦＮ−β製剤が、ブタの乳房炎治療剤として有用であること、及び、ＨｕＩＦＮ−β製剤は、ＨｕＩＦＮ−α製剤と併用すると、ＨｕＩＦＮ−α製剤の治療効果を増強させることができることが判明した。また、このＨｕＩＦＮ−β製剤は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、対象動物に飲ませ易い散剤である。
【実施例８】
【００６４】
無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に、市販されている注射用の組み換え型ネコＩＦＮの凍結乾燥性剤（株式会社東レ製造、商品名「インターキャット」）に、１ｍｌの生理食塩水を加えて溶解（約１０７単位／ｍｌ）したもの２質量部を均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の「ファイントース」を均一に混合し、１ｇ当たりネコＩＦＮを約２０単位含む散剤を得た。なお、本品のＩＦＮ活性は、商品の添付資料に記載された活性をもとに算出した。【００６５】
本品は適度の口腔内滞留時間と優れた保存安定性を有し、ネコの乳房炎治療剤として有用である。本品は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、動物に飲ませ易い散剤である。
【実施例９】
【００６６】
実験１でヒト白血球ＩＦＮを製造した方法に準じて、ウシの末梢血から分離した白血球に、センダイウイルスを作用させてウシＩＦＮ−αを誘発し、精製して、比活性１×１０７国際単位／ｍｇの標品を得た。この標品生理食塩水溶液２質量部（約１０８国際単位／ｍｌ）を無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名「ファイントース」）１００質量部に、均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の「ファイントース」を均一に混合し、１ｇ当たりウシＩＦＮ−αを約２００単位含む散剤を得た。なお、本品のウシＩＦＮ−αの活性は、シンドビスウイルスによるＭＤＢＫ細胞（ウシ腎由来）の細胞変性を抑制する度合いを、ＭＴＴにより測定し、ＨｕＩＦＮ−αの国際標準品を標準として決定される「国際単位」に換算して表示した。【００６７】
本品は適度の口腔内滞留時間と優れた保存安定性を有し、ウシをはじめとする動物の乳房炎治療剤として有用である。本品は適度の甘味を有し、動物の口腔内に投与しても刺激が少なく、動物に飲ませ易い散剤である。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の治療剤が有効成分として含有するＩＦＮは、動物の乳房炎に小用量でも著効を発揮するので、小用量投与の場合は、飼主の経済的負担を大幅に低減する。同じ理由により、本発明の治療剤によるときには、ＩＦＮを必ずしも動物の血管内に投与する必要が無くなり、経口投与や、皮内、皮下、筋肉内などの血管以外の経路より非経口的に投与することによっても、所期の効果が得られる。これにより、神経質で警戒心が強い動物にも所定量のＨｕＩＦＮを確実、且つ、容易に投与できることとなり、医者や獣医師等の治療担当者の労力・負担も大幅に低減する。また、本発明の治療剤は乳牛の難治性を含む乳房炎に対しても顕著な治療効果を発揮することから、乳牛の乳房炎による経済的損失を大きく軽減することができる。このような優れた効果を有する本発明は、医学や畜産分野に貢献することとなり、その産業的意義は極めて大きい。
【国際調査報告】
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