【手続補正書】
【提出日】平成31年2月26日(2019.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ
を含む核酸構築物であって、
式中
Ａは、第１のシグナルペプチドを含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列であり；Ｂは、第２のシグナルペプチドを含む第２のポリペプチドをコードする核酸配列であり、Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、
前記第１のシグナルペプチドまたは前記第２のシグナルペプチドは、より少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異（複数可）を含む、
核酸構築物。
【請求項２】
前記第１のシグナルペプチドおよび前記第２のシグナルペプチドが同じ配列に由来するが、一方のシグナルペプチドが他方のシグナルペプチドと比較して１つまたは複数の疎水性アミノ酸を除去／置き換えるように１つまたは複数のアミノ酸欠失／置換を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記疎水性アミノ酸（複数可）が、群：アラニン（Ａ）；バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐ）；チロシン（Ｙ）；トリプトファン（Ｗ）から選択される、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記疎水性アミノ酸（複数可）が、群：バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；およびトリプトファン（Ｗ）から選択される、請求項３に記載の核酸構築物。
【請求項５】
一方のシグナルペプチドが、他方のシグナルペプチドよりも最大で５つ多い疎水性アミノ酸を含む、請求項１から４のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、両方とも膜貫通タンパク質である、請求項１から５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記第１の膜貫通タンパク質および前記第２の膜貫通タンパク質が、両方ともキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記第１のシグナルペプチドと前記第２のシグナルペプチドとの間の差異が、前記核酸構築物が細胞中で発現される場合に細胞表面での前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの相対発現に差異が生じるような差異である、請求項６または７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
Ｘが、自己切断ペプチド、フューリン切断部位またはタバコエッチウイルス切断部位をコードする核酸配列である、請求項１から８のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１０】
Ｘが、アフトもしくはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドをコードする、請求項９に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸構築物または請求項１１または１２に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１４】
異なる数の疎水性アミノ酸を有する異なるシグナルペプチドを有する２つのキメラ抗原受容体を含む細胞であって、より多い数の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体が、より少ない数の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体よりも細胞表面で高度に発現される、細胞。
【請求項１５】
異なるシグナルペプチドを有する２つのキメラ抗原受容体を含む細胞であって、一方のキメラ抗原の前記シグナルペプチドが、より少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異を含む、細胞。
【請求項１６】
変異されたシグナルペプチドを有する前記キメラ抗原受容体が、変異されていないシグナルペプチドを有する前記キメラ抗原受容体よりも細胞表面で低いレベルで発現される、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１３から１６のいずれかに記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれかに記載の核酸構築物または請求項１１もしくは１２に記載のベクターを単離された細胞に導入するステップを含む、請求項１３から１７のいずれかに記載の細胞を作製するための方法。
【請求項１９】
一方のタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列を、他方のタンパク質のシグナルペプチドと比較して１つまたは複数の疎水性アミノ酸を除去または置き換えるために変異させるステップを含む、第２のタンパク質を伴って単一の核酸構築物から発現される第１のタンパク質の相対的な細胞表面発現を調節するための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本発明は、連結されたポリペプチドとして発現され、切断部位によって分離される３つまたはそれを超えるタンパク質の相対発現およびさまざまな活性のシグナルシグナルによって決定される相対表面発現を調節するために拡張されてよい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ
を含む核酸構築物であって、
式中
Ａは、第１のシグナルペプチドを含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列であり；Ｂは、第２のシグナルペプチドを含む第２のポリペプチドをコードする核酸配列であり、Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、
前記第１のシグナルペプチドまたは前記第２のシグナルペプチドは、より少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異（複数可）を含む、
核酸構築物。
（項目２）
前記第１のシグナルペプチドおよび前記第２のシグナルペプチドが同じ配列に由来するが、一方のシグナルペプチドが他方のシグナルペプチドと比較して１つまたは複数の疎水性アミノ酸を除去／置き換えるように１つまたは複数のアミノ酸欠失／置換を含む、項目１に記載の核酸構築物。
（項目３）
前記疎水性アミノ酸（複数可）が、群：アラニン（Ａ）；バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐ）；チロシン（Ｙ）；トリプトファン（Ｗ）から選択される、項目２に記載の核酸構築物。
（項目４）
前記疎水性アミノ酸（複数可）が、群：バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；およびトリプトファン（Ｗ）から選択される、項目３に記載の核酸構築物。
（項目５）
一方のシグナルペプチドが、他方のシグナルペプチドよりも最大で５つ多い疎水性アミノ酸を含む、前記項目のいずれかに記載の核酸構築物。
（項目６）
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、両方とも膜貫通タンパク質である、前記項目のいずれかに記載の核酸構築物。
（項目７）
前記第１の膜貫通タンパク質および前記第２の膜貫通タンパク質が、両方ともキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目６に記載の核酸構築物。
（項目８）
前記第１のシグナルペプチドと前記第２のシグナルペプチドとの間の差異が、前記核酸構築物が細胞中で発現される場合に細胞表面での前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの相対発現に差異が生じるような差異である、項目６または７に記載の核酸構築物。
（項目９）
Ｘが、自己切断ペプチド、フューリン切断部位またはタバコエッチウイルス切断部位をコードする核酸配列である、前記項目のいずれかに記載の核酸構築物。
（項目１０）
Ｘが、アフトもしくはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドをコードする、項目９に記載の核酸構築物。
（項目１１）
前記項目のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
（項目１２）
項目１１に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
（項目１３）
項目１から１０のいずれか一項に記載の核酸構築物または項目１１または１２に記載のベクターを含む細胞。
（項目１４）
異なる数の疎水性アミノ酸を有する異なるシグナルペプチドを有する２つのキメラ抗原受容体を含む細胞であって、より多い数の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体が、より少ない数の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体よりも細胞表面で高度に発現される、細胞。
（項目１５）
異なるシグナルペプチドを有する２つのキメラ抗原受容体を含む細胞であって、一方のキメラ抗原の前記シグナルペプチドが、より少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異を含む、細胞。
（項目１６）
変異されたシグナルペプチドを有する前記キメラ抗原受容体が、変異されていないシグナルペプチドを有する前記キメラ抗原受容体よりも細胞表面で低いレベルで発現される、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、項目１３から１６のいずれかに記載の細胞。
（項目１８）
項目１から１０のいずれかに記載の核酸構築物または項目１１もしくは１２に記載のベクターを細胞に導入するステップを含む、項目１３から１７のいずれかに記載の細胞を作製するための方法。
（項目１９）
一方のタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列を、他方のタンパク質のシグナルペプチドと比較して１つまたは複数の疎水性アミノ酸を除去または置き換えるために変異させるステップを含む、第２のタンパク質を伴って単一の核酸構築物から発現される第１のタンパク質の相対的な細胞表面発現を調節するための方法。