(57)【要約】本発明は、有効成分としてコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬及び／又は抗血栓症薬を含有し、両薬剤を併用するためのものである、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬等、ならびに、コラーゲン凝集を特異的に抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする血管内皮細胞傷害を伴う疾患の予防・治療剤、およびコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する物質を有効成分として含有する血管内皮細胞傷害又は臓器障害の抑制剤を提供する。これにより、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬の血小板又は血液凝固系と関連する疾患における併用療法、及び併用のための医薬、製剤又は医薬組成物、ならびに、抗ＧＰＶＩ抗体の血管内皮細胞傷害を伴う疾患の予防・治療薬としての新規用途を提供することができる。
2007091719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬及び／又は抗血栓症薬を含有し、両薬剤を併用するためのものである、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬。
【請求項２】
有効成分としてコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬とを併用してなる、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬。
【請求項３】
有効成分としてコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬を含有する、抗血栓症薬と併用するためのものである、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬。
【請求項４】
有効成分として抗血栓症薬を含有する、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と併用するためのものである、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬。
【請求項５】
配合剤であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項６】
コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬とを別々に投与することを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項７】
コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬が抗ＧＰＶＩ抗体である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項８】
コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬が血小板上のＧＰＶＩを消失させる作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬が血小板上のＧＰＶＩをインターナリゼーションにより消失させる作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１０】
前記抗血栓症薬が抗凝固薬である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の医薬
【請求項１１】
前記抗凝固薬がＦＸａ阻害剤である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１２】
前記抗凝固薬がヘパリン又は低分子ヘパリンである、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１３】
前記抗血栓症薬が第二の抗血小板薬である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の医薬
【請求項１４】
前記第二の抗血小板薬がＰ２Ｙ１２拮抗薬である、請求項１３に記載の医薬
【請求項１５】
前記第二の抗血小板薬がクロピドグレルである、請求項１３に記載の医薬
【請求項１６】
コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬を投与し、その後に抗血栓症薬を投与することを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１７】
前記抗血栓症薬を投与し、その後にコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬を投与することを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１８】
コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬とを含有するキットの形態であることを特徴とする、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１９】
ラットＧＰＶＩを特異的に認識する抗体。
【請求項２０】
血小板上のＧＰＶＩを消失させる作用を有する、請求項１９の抗体。
【請求項２１】
血小板上のＧＰＶＩをインターナリゼーションにより消失させる作用を有する、請求項１９又は２０の抗体。
【請求項２２】
ラットＧＰＶＩのループ９を認識する、請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
抗ＧＰＶＩ抗体と血小板を接触させる工程を含むことを特徴とする、抗ＧＰＶＩ抗体と他の薬剤との併用効果を評価するための方法。
【請求項２４】
コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する物質を有効成分として含有する、血管内皮細胞傷害を伴う疾患の予防・治療剤。
【請求項２５】
抗ＧＰＶＩ抗体を有効成分として含有する、請求項２４に記載の予防・治療剤。
【請求項２６】
前記疾患が糖尿病合併症又は移植合併症である、請求項２４又は２５に記載の予防・治療剤。
【請求項２７】
前記疾患が糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症もしくは糖尿病性神経障害、又は静脈閉塞性疾患もしくは血栓性微小血管症である、請求項２４ないし２６のいずれか１項に記載の予防・治療剤。
【請求項２８】
前記抗ＧＰＶＩ抗体がコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する作用を有する、請求項２５ないし２７のいずれか１項に記載の予防・治療剤。
【請求項２９】
前記抗ＧＰＶＩ抗体が血小板表面からＧＰＶＩを消失させる作用を有する、請求項２５ないし２８のいずれか１項に記載の予防・治療剤。
【請求項３０】
前記抗ＧＰＶＩ抗体が血小板表面からＧＰＶＩをインターナリゼーションにより消失させる作用を有する、請求項２５ないし２９のいずれか１項に記載の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬の併用療法及び併用剤に関する。また、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬理試験を実施するための重要な研究ツールである、抗ラット血小板膜糖蛋白質ＶＩ（ＧＰＶＩ）抗体、特に、血小板ＧＰＶＩ消失作用を有する抗体、及び、当該抗体を用いた試験方法に関する。さらに、本発明は、新規な血管内皮細胞傷害を伴う疾患の予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は血栓形成・生体防御において極めて重要な役割を担っており、生理的な役割から種々の病態における関わりが解明されつつある。特に、血小板は止血血栓を形成するという機能において注目されており、例えば、血管内皮細胞が損傷を受けると、血管内皮下の主要なマトリックス蛋白質であるコラーゲンが露出し、ここへ血小板が粘着する。次に、コラーゲンからのシグナルにより血小板が活性化され、最終的にはフィブリノーゲンを介して血小板が凝集する。そして場合によってはこれが血栓塞栓性疾患のような病的状態の原因となることから治療の標的として注目されている。【０００３】
血液凝固因子も血栓形成・生体防御において極めて重要な役割をになっている。すなわち、血液内において組織因子などの凝固促進因子が産生されると、血液凝固カスケードが活性化され、最終的にはトロンビンがフィブリノーゲンをフィブリンに変換することにより、フィブリン塊を形成する。そして、場合によってはこれが血栓塞栓性疾患のような病的状態の原因となることから、治療の標的として注目されている。【０００４】
従来、血小板凝集に基づく血栓症の治療・予防の目的で、アスピリン、チクロピジン、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト等の抗血小板薬が用いられてきたが、有効性および出血等の副作用の面から多くの問題が指摘されている。例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、経皮的インターベンション後の再閉塞予防において高い有効性を示すが、その一方で重篤な出血をきたす場合があり、これらの問題の無い、十分な安全性、および確実かつ適切な作用を有する優れた抗血小板薬の登場が望まれている。【０００５】
ここで、血小板は種々のアゴニストにより凝集することが知られている。たとえば、ＡＤＰは血小板膜上に発現しているＰ２Ｙ１２レセプターに結合することにより、血小板を活性化するし、コラーゲンは血小板膜上の血小板膜糖蛋白質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に結合することにより血小板を活性化する。また、トロンビンは血小板膜上のトロンビンレセプターを活性化することにより血小板を活性化する。そして、最終的には、活性化された血小板がフィブリノーゲンを糊しろとしてＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを介して凝集することにより血小板血栓が形成される。現在、臨床において用いられている抗血小板薬は、これらの反応のいずれか、もしくは複数を抑制することにより抗血小板作用を発揮する。例えば、クロピドグレルはＰ２Ｙ１２レセプターに結合することによりＡＤＰからのシグナルを遮断することにより、アブシキシマブはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとフィブリノーゲンの結合を阻害することにより、ＡＤＰ、コラーゲンおよびトロンビン刺激の血小板凝集の全てを抑制する。しかしながら、現在、臨床の場においてコラーゲン凝集のみを特異的に抑制する薬物はない。【０００６】
血小板膜上に存在するＧＰＶＩは、血小板のコラーゲン受容体であり、コラーゲン刺激による血小板の活性化に中心的役割を担っていることが明らかにされている（非特許文献１：高山博史，日本血栓止血学会誌，２００３年，第１４巻，第２号，ｐ．７５−８１参照）。また、抗マウスＧＰＶＩ抗体は、コラーゲン刺激特異的に血小板凝集を抑制し、出血時間の著明な延長をきたすことなく、抗血栓作用を発揮することが報告されている（非特許文献２：Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１年、第１９４巻、第４号、ｐ．４５９−４６９参照）。さらに、抗ヒトＧＰＶＩ抗体も出血時間の著明な延長をきたすことなく、抗血小板作用を発揮することが報告されている（非特許文献３：Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００５年、第１０６巻、第１１号、ｐ６１２ａ）（特許文献１：ＷＯ２００５／１１１０８３Ａ２）。したがって、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する薬物、例えば抗ＧＰＶＩ抗体は、安全で有効性の高い抗血小板薬となり得ることが期待されている。【０００７】
抗ＧＰＶＩ抗体の医療における有用性を推測するためには、それに先立ち小動物での実験が重要となる。これまでに、マウスＧＰＶＩの遺伝子配列は公開されており、精製されたマウスＧＰＶＩをラットに免疫することにより作成した抗体（ＪＡＱ１）をマウスに投与すると、長期間にわたりコラーゲンに対して不応となることが知られている（非特許文献２：Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１年、第１９４巻、第４号、ｐ．４５９−４６９）。また、ヒトＧＰＶＩをマウスに免疫することにより作成したＯＭ４がラットＧＰＶＩとも反応することが知られている（特許文献１：ＷＯ２００５／１１１０８３Ａ２）。通常、このようなＧＰＶＩ抗体は限定されたエピトープ（ヒトとラットで共通でありマウスと異なる部分）を認識する抗体しか産生されないことが予想される。一般的に、目的とする動物種の蛋白質に対する抗体を作成するためには、当該動物の蛋白質を用いて他動物を免疫することが望ましい。しかしながら、ラットＧＰＶＩ遺伝子およびラットＧＰＶＩを抗原に用いて抗体を作成した事例は報告されていない。【０００８】
ヘパリンは最も一般的に使用されている抗凝固薬の一つであるが、出血の危険性が高いため、その使用においては、抗凝固活性をモニタリングする必要がある。一方、ヘパリンに比べ血液凝固第Ｘ因子（ＦＸａ）阻害活性が強い低分子ヘパリンは、ヘパリンに比べ出血の危険性が少ないことが知られている。また、ＦＸａを特異的に阻害するフォンダパリヌクスは低分子ヘパリンに比べて、さらに出血の危険性が少ない。さらに、ＦＸａを特異的に阻害する低分子ＦＸａ阻害薬、例えばＢＡＹ５９−７９３９も出血の危険性が少ない抗凝固薬となり得る可能性が示唆されている。【０００９】
血栓形成において、血小板活性化と凝固カスケード活性化は密接に関連している。例えば、血管壁が傷害を受けてコラーゲンが露出すると、そこに血小板が粘着し活性化する。そして、活性化した血小板を足場として凝固因子が濃縮され、凝固カスケードが効率的に進行し、大量のトロンビンが産生されてくる。生じたトロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換するのみならず、血小板凝集を惹起する。すなわち、病的血栓形成において、血小板活性化と凝固カスケードの活性化は互いに密接に関連しており、どちらか一方のみが生じることは殆どない。【００１０】
したがって、血栓・塞栓症の予防・治療を目的とした場合、血小板活性化が主に生じている場合には抗血小板薬が用いられ、凝固カスケードの活性化が主に生じている場合には抗凝固薬が用いられているが、場合によっては抗血小板薬と抗凝固薬が併用される場合がある。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｐ２Ｙ１２  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔとＦＸａ阻害剤を併用すると、その抗血栓作用は相乗的に発揮される（非特許文献４：Ａｎｄｒｅ  Ｐ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００３年、１０８巻、ｐ．２６９７−２７０３）。また、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストと低分子ヘパリンの併用は急性心筋梗塞の予防・治療において有用であることが示されている（非特許文献５：Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃａｒｄｉｏｌ．、２００４年、１６巻、３号、ｐ１３６−４４）。しかしながら、これらの抗血小板薬はコラーゲン惹起による血小板凝集を抑制するのみならず、ＡＤＰ惹起の血小板凝集をも抑制するため、コラーゲン惹起による血小板凝集を特異的に阻害する薬物と抗凝固薬の併用効果に関しては明らかでなかった。一方、抗血小板薬同士の併用効果についても研究が進められているが、出血リスクを踏まえてのトータルの有益性について疑問視されている。例えば、クロピドグレルとアスピリンとの併用に関しては、最近集計された大規模臨床試験（ＣＨＡＲＩＳＭＡ試験）では、冠動脈疾患発症の一次予防及び二次予防に対して明らかな有効性は得られず、むしろ両剤の併用は出血リスクを高める可能性が報告され（Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｌｉｅｇｅ．２００６；６１：６５６−６１）、否定的な結果であったとされている（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００７；２０：７１−７）。また、脳梗塞の二次予防に対して、クロピドグレルとアスピリンとの併用は、アスピリン単剤での有効性を上回れなかっただけでなく、出血リスクが高くなったという報告がある（Ｌａｎｃｅｔ  ２００４；３６４：３３１−７）。このように抗血小板薬同士の併用効果を調べた例が知られているが、その有用性については否定的であった。しかしながら、コラーゲン惹起による血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と他の抗血小板薬、特にＰ２Ｙ１２拮抗剤やＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗剤のような抗血小板薬との併用効果については明らかではなかった。【００１１】
さらに、コラーゲン惹起による血小板凝集を特異的に阻害する薬物の臨床応用を考える上で、血管内皮細胞の障害の有無は極めて重要である。すなわち、血管は、すべての臓器に分布しており、生体機能の維持に重要な役割を演じている。その最内層を覆っているのが血管内皮細胞であり、閉じられた内皮細胞管を形成している。したがって、血管内皮細胞は血液と血管壁および組織間質液との境界にあって物理的バリアーとしての機能を果たしている。さらに、血管内皮細胞は、種々の刺激に応答し、多彩な生理機能を果たしており、生体の恒常性の維持に積極的に関与しており、血管内皮細胞の障害は種々の病態形成の原因と考えられている（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｅｄ．ｂｙ  ｂｌｏｏｍ  Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ｐ２１９−２３２）。【００１２】
糖尿病合併症は（１）微小血管症、（２）大血管症、（３）糖尿病皮膚病変、（４）糖尿病足病変、（５）網膜症以外の眼合併症、（６）歯周病、（７）その他に分類されている。そして、微小血管症は網膜症、腎症、神経障害に、大血管症は脳血管障害、虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症に分類される。特に、糖尿病の三大合併症である網膜症、腎症、神経障害では、微小血管の血管内皮細胞障害が生じており、これが合併症の進展に関与していることが指摘されている。さらに、大血管障害である閉塞性動脈硬化症においては、血管内皮細胞障害による凝固活性化が生じており、その結果として、下肢動脈が閉塞する。したがって、糖尿病合併症の予防・治療においては、血管内皮細胞の障害を防止することが重要視されている。【００１３】
糖尿病合併症の最大の危険因子は血糖コントロールの不良であり、糖尿病合併症は血糖コントロール不良者ほど高率、罹病期間が長期になるほど増加する。したがって、糖尿病合併症の予防・治療には、血糖降下薬が処方されている。また、血圧コントロールの重要性も指摘されており、ＡＣＥ阻害薬とβブロッカーにより網膜症の悪化を有意に抑制できたとする報告がある（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ）Ｇｒｏｕｐ、ＢＭＪ、３１７：７０３−７１３、１９９８）。また、糖尿病性神経障害においては、日本においてアルドース還元酵素阻害薬の臨床応用も報告されている（医学のあゆみ、１５２：４０５−４１６、１９９０）。しかしながら、糖尿病合併症の発症率は低下傾向を示すどころか、増加傾向を示している。このことは、現行の予防・治療薬が決して満足できるレベルに達していないことを示している。また、大血管障害である閉塞性動脈硬化症に関しては、薬物治療が必要な場合は、ワルファリンのような抗凝固薬やアスピリンのような抗血小板薬が使用されるが、コラーゲン特異的に血小板凝集を抑制する薬物の効果は未だに明らかでない。【００１４】
骨髄移植は造血器疾患の治療法として開発され、急速に進歩、普及してきた。肝中心静脈閉塞症（ＶＯＤ）は、骨髄移植後早期に発症する症候群であり、その成因は骨髄移植の前処置により、肝臓の小静脈の血管内皮細胞の障害が大きく関与しているとされている（Ｓｃｏｔｔ  ＩＢ、Ｂｌｏｏｄ、８５：３００５−３０２０、１９９５）。そして、ＶＯＤの予後は極めて悪く、移植の成績向上の妨げとなるので、ＶＯＤに対する予防・治療戦略は今後の造血肝細胞移植の展開に重要な意味を持つ。しかしながら、決定的な予防・治療法は確立されていない。【００１５】
骨髄移植後血栓性微小血管症（ＴＭＡ）も同種骨髄移植後の血管内皮細胞障害によって惹起される病態であり、その原因として、移植前処置（超大量化学療法、放射線照射）、シクロスポリンＡやタクロリムスの投与、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）やサイトメガルウイルス（ＣＭＶ）感染症などがあげられる。ＴＭＡの発症は同種骨髄移植の成否を左右する重要な合併症であると認識されているが、未だ確立された予防・治療法はない。特に激症型の重症例はあらゆる治療に対し抵抗性で致死率が高い。【００１６】
ＴＭＡの治療は、原因薬剤が特定できる場合には、当該薬剤の投与を中止する。その他、血漿交換、アンチトロンビンの投与などが検討されているが、いずれも確定された治療法ではなく、早期に診断し得なかった症例では、治療に困難をきたすことが多い。そして、ＴＭＡは病態が進行してしまえば、治療は困難であり、その予後は極めて不良である。【００１７】
上記の糖尿病合併症、骨髄移植時のＶＯＤおよびＴＭＡの病態形成において、血管内皮細胞障害が重要な役割を果たしている。例えば、血管内皮細胞は種々の接着分子を発現しており、白血球などの血球成分とも相互作用する。白血球と血管内皮細胞の接着は（１）ローリング、（２）接着、（３）離脱と内皮間隙移動のステップに分けられ、さらにこの各ステップが異なる接着分子により制御されている。たとえば、ローリングにおいてはセレクチン類が、接着にはＩｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＩＣＡＭ−１）が重要な役割を果たしている。そして、これらの分子を介した機能を制御することにより、炎症反応の制御が可能であることが示されている。例えば、抗ＩＣＡＭ−１抗体はストレプトゾトシン惹起糖尿病モデル動物において網膜症の発症を抑制する（Ｋｉｙａｍｏｔｏ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１０８３６−１０８４１，１９９９）。また、抗ＩＣＡＭ−１抗体は乾癬や多発性硬化症、炎症性大腸炎といった自己免疫疾患モデル動物においても有効性を示す（Ｄｅｄｒｉｃｋ  Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，８５−９５，２００３）。さらに、抗ＩＣＡＭ−１抗体は移植モデル動物において、移植片の生着を促進し、死亡率を改善することも報告されている（Ｈｅｅｍａｎｎ  Ｕ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，２１９，４−１２，１９９４）。【００１８】
ＩＣＡＭ−１は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖蛋白質であり、血管内皮細胞上に常時発現しているが、その量は少ない。しかしながら、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γのような炎症性サイトカインやＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅのような細菌成分にさらされると、その発現量は著しく高まる。そして、ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎされたＩＣＡＭ−１を介して、白血球が血管内皮細胞に接着することにより、さらに炎症反応は増悪する。従って、ＩＣＡＭ−１は種々の病態形成時において白血球を炎症部位へ集積させ、血管内皮細胞障害を引き起こすと考えられている（Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ  ＣＦ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｇｅｒ  ＤＮ、Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、１４、４４Ｓ−５４Ｓ、２００１）。そして、血管内皮細胞障害が生じた結果として、可溶型ＩＣＡＭ−１が切り出され、血中に遊離してくることになる。それゆえ、可溶型ＩＣＡＭ−１は血管内皮細胞障害のマーカーとして臨床応用されている（Ｗｉｔｋｏｗｓｋａ  ＡＭ  ａｎｄ  Ｂｏｒａｗｓｋａ  ＭＨ、Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｗ、１５、９１−９８、２００４）。【００１９】
可溶型ＩＣＡＭ−１が上昇する疾患、すなわち血管内皮細胞障害が生じている代表的な疾患としては、各種感染症、特発性肺繊維症、気管支喘息、急性呼吸促迫症候群、等の呼吸器疾患、慢性関節リウマチ、多発性筋炎、全身性硬化症、多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血管炎、川崎病、乾癬、ウェゲナー肉芽腫瘍、ベーチェット病、サルコイドーシス、グレーヴス病、等の自己免疫疾患、不安定狭心症、心筋梗塞、リウマチ性心臓病、バイパス手術、僧坊弁置換術、等の心疾患、動脈硬化、高脂血症、糖尿病、高トリグリセリド血症、等の生活習慣病、メラノーマ、胃癌、喉頭癌、等の悪性腫瘍、心臓移植、肝臓移植、腎臓移植、骨髄幹細胞移植、等の臓器移植、その他、播種性血管内凝固症候群や多臓器不全が挙げられる（Ｆａｓｃｈｉｎｇ  Ｐ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８１：４３１３−４３１７，１９９６）。【００２０】
特に、糖尿病合併症の患者では、血管内皮細胞障害が進行しており、これが種々の合併症発症において重要とされている。例えば、網膜症や腎症をもつ糖尿病患者では血液中の可溶型ＩＣＡＭ−１が上昇する（Ｆａｓｃｈｉｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，８１，４３１３−４３１７，１９９６）。さらに、網膜症患者の網膜では白血球の集積が認められ、網膜症形成に、この白血球集積が関与していると考えられており、宮本ら（Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｋ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９６，１０８３６−１０８４１，１９９９）は糖尿病ラットの網膜の研究から、網膜症はＩＣＡＭ−１を介した白血球の集積がその発症に深く関与していることが報告されている。また、骨髄幹細胞移植時の肝中心静脈閉塞症（ＶＯＤ）や血栓性微小血管症（ＴＭＡ）の発症には血管内皮細胞傷害が重要視されており、これらＶＯＤやＴＭＡを合併した患者では可溶型ＩＣＡＭ−１が上昇する（Ｓｕｄｈｏｆｆ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，６０，１０６−１１１，１９９８）（Ｍａｔｓｕｄａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２７，９７７−９８２，２００１）。
【発明の開示】
【００２１】
前述のように抗血小板薬と抗血栓症薬の併用療法において、安全性が高く、有効性が優れ、かつ使いやすい組み合わせが切望されている。
本発明の第１の目的は、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬の血小板又は血液凝固系と関連する疾患、特に血栓形成を伴う疾患における併用療法、及び併用のための医薬、製剤又は医薬組成物を提供するものである。また、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬理試験を実施するための重要な研究ツールである、抗ラットＧＰＶＩ抗体、特に、血小板ＧＰＶＩ消失作用を有する抗体、及び、当該抗体を用いた試験方法を提供する。
また、前述のように、血管内皮傷害を伴う疾患、例えば糖尿病合併症や骨髄移植合併症としてのＶＯＤやＴＭＡの予防・治療において、新たな予防・治療薬、特に血管内皮細胞障害を防止又は軽減し得る薬剤の登場が切望されている。本発明の第２の目的は、コラーゲン凝集を特異的に抑制する物質、例えば抗ＧＰＶＩ抗体の血管内皮細胞傷害を伴う疾患の予防・治療薬としての新規用途を提供するものである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、ＧＰＶＩに対する抗体を産生するマウスハイブリドーマを多数樹立し、それらの産生する抗体と抗血栓症薬、特に、抗凝固薬または抗血小板薬の血栓形成を伴う疾患における併用療法を解析することを着想した。この着想に基づき、鋭意研究を重ねた結果、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬、例えば抗ＧＰＶＩ抗体と抗血栓症薬、特に、抗凝固薬または抗血小板薬、例えばＦＸａを阻害する抗凝固薬または抗Ｐ２Ｙ１２拮抗薬が、相乗的に作用することを明らかにし、また、ラットＧＰＶＩ遺伝子（ｃＤＮＡ）をクローン化し、ラットＧＰＶＩに対するモノクローナル抗体を作製することに成功するとともに、その薬理試験における有用性を見出し、本発明を完成した。加えて、該抗体を用いて、血管内皮細胞傷害が生じる各種モデル動物における抗ＧＰＶＩ抗体の効果を検討することを着想した。この着想に基づき、鋭意研究を重ねた結果、コラーゲン凝集を特異的に抑制する物質、例えば抗ＧＰＶＩ抗体に血管内皮細胞傷害ならびに臓器障害の予防、軽減、改善もしくは抑制作用を見出し、本発明を完成した。
【００２２】
以下に本発明を説明する。本発明の第１の態様は、
（１）有効成分としてコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬及び／又は抗血栓症薬を含有し、両薬剤を併用するためのものである、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬、
（２）有効成分として、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬とを併用してなる、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬、
（３）有効成分としてコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬を含有する、抗血栓症薬と併用するためのものである、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬、
（４）有効成分として抗血栓症薬を含有する、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と併用するためのものである、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬である。
【００２３】
具体的には、
（５）配合剤であることを特徴とする、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の医薬、
（６）コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬とを別々に投与することを特徴とする、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の医薬、
（７）前記コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬が抗ＧＰＶＩ抗体である、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の医薬、
（８）前記コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬が血小板上のＧＰＶＩを消失させる作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体である、上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の医薬、
（９）前記コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬が血小板上のＧＰＶＩをインターナリゼーションにより消失させる作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体である、上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の医薬、
（１０）前記抗血栓症薬が抗凝固薬である、上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の医薬、
（１１）前記抗凝固薬がＦＸａ阻害剤である、上記（１０）の医薬、
（１２）前記抗凝固薬がヘパリン又は低分子ヘパリンである、上記（１０）の医薬、
（１３）前記抗血栓症薬が抗血小板薬（第二の抗血小板薬）である、上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の医薬
（１４）前記第二の抗血小板薬がＰ２Ｙ１２拮抗薬である、上記（１３）の医薬
（１５）前記第二の抗血小板薬がクロピドグレルである、上記（１３）の医薬
（１６）前記コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬を投与し、その後に抗血栓症薬を投与することを特徴とする、上記（１）ないし（１５）のいずれかに記載の医薬、
（１７）前記抗血栓症薬を投与し、その後にコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬を投与することを特徴とする、上記（１）ないし（１５）のいずれかに記載の医薬、
（１８）コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬とを含有するキットの形態であることを特徴とする、上記（１）ないし（１７）のいずれかに記載の医薬である。
【００２４】
本発明の第２の態様は、新規な抗ＧＰＶＩ抗体であり、具体的には、
（１）ラットＧＰＶＩを特異的に認識する抗体（抗ラットＧＰＶＩ抗体）、特に
（２）コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗ＧＰＶＩ抗体、さらには
（３）血小板上のＧＰＶＩを消失させる作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体、また、
（４）血小板上のＧＰＶＩをインターナリゼーションにより消失させる作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体、また、
（５）ＧＰＶＩの特定部位、特に特定のループ領域の少なくとも一部を含有する構造を認識する抗ＧＰＶＩ抗体である。ここで、前記特定のループ領域は、好ましくはループ９（Ｌ９）及び／又はループ１１（Ｌ１１）、より好ましくはＬ９である。
当該抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬理試験を実施するための重要な研究ツールである。例えば、ＧＰＶＩの検出及び測定、各種病態モデルにおける血中ＧＰＶＩレベルの測定、ＧＰＶＩの生理的役割又は各種の病態及び疾患、特に後述する血小板又は血液凝固系と関連する疾患との関連を研究するため、また、各種病態又は疾患モデルにおける抗ＧＰＶＩ抗体の有効性を評価するために有用である。抗ＧＰＶＩ抗体の詳細、及び、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の詳細については後述されている。また、具体的な方法の例は実施例に示されている。
【００２５】
本発明の第３の態様は、抗ＧＰＶＩ抗体を用いることを特徴とする、抗ＧＰＶＩ抗体と他の薬剤との併用効果を評価、同定又は確認するための方法であり、また、抗ＧＰＶＩ抗体と併用効果有する薬剤を同定又はスクリーニングするための方法でもある。具体的には、
（１）抗ＧＰＶＩ抗体と血小板を接触させる工程を含むことを特徴とする、抗ＧＰＶＩ抗体と他の薬剤との併用効果を評価するための方法、
（２）抗ＧＰＶＩ抗体と血小板を接触させることにより、血小板上のＧＰＶＩを消失させる工程を含む、上記（１）の方法、
（３）血小板又はそれを含む生体試料に他の薬剤を作用させる工程を含む、上記（１）又は（２）の方法、
（４）抗ＧＰＶＩ抗体と血小板を接触させた後、前記血小板又はそれを含む生体試料に他の薬剤を作用させる工程を含む、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の方法、
（５）前記血小板又はそれを含む生体試料を用いて、薬効又は副作用の評価パラメータの少なくとも一つを測定することにより併用効果を評価する工程を含む、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法、
（６）抗ＧＰＶＩ抗体が、好ましくはコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗ＧＰＶＩ抗体、より好ましくは血小板上のＧＰＶＩを消失させる作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体である、上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の方法、
（７）血小板又は血液凝固系と関連する疾患に対する併用効果を評価するためのものである、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の方法である。
本発明の第３の態様において、抗ＧＰＶＩ抗体と血小板の接触、又は血小板もしくはそれを含む生体試料と他の薬剤との接触は生体内又は生体外の何れでもよい。対象となる動物種は必ずしも限定されないが、好ましくはラット又はサルである。ラットの場合、用いる抗体は抗ラット抗体であり、好ましくは、本発明の第２の態様の抗体が良い。サルの場合、用いる抗体はサル血小板ＧＰＶＩと結合し得る抗ヒトＧＰＶＩ抗体、好ましく、実施例に記載された抗体、例えば、Ｆ１２３２−３７−２抗体が挙げられる。
【００２６】
上記の血小板を含む生体試料としては、例えば、血液、血漿、多血小板血漿もしくは個体が挙げられる。また、他の薬剤としては、必ずしも限定されないが、例えば、血小板又は血液凝固系と関連する疾患に対する有効性が確認されているもの又は示唆されているものが挙げられる。薬効評価パラメータとしては種々のものが適用可能であり、例えば、生存率等も含まれるが、好ましくは、血小板関連パラメータ及び／又は血液凝固系パラメータが挙げられる。具体的には、血小板関連パラメータとして、血小板数、各種血小板刺激物質、例えば、コラーゲン、ＣＲＰ、コンバルキシン、ＡＤＰもしくはトロンビン等に対する血小板凝集率、血小板粘着率及びＡＴＰ放出量が挙げられる。また、血液凝固系パラメータとしては、凝固時間、トロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間及び出血時間、ならびに各種血液生化学パラメータ（Ｄダイマー、フィブリノーゲン）等が挙げられる。副作用評価パラメータとしては各薬剤特有の副作用が挙げられ、例えば、抗凝固剤の場合、出血時間の延長等が挙げられる。なお、抗ＧＰＶＩ抗体の詳細、及び、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の詳細については後述されており、具体的な方法の例は実施例に示されている。
【００２７】
本発明の第４の態様は、コラーゲン凝集を特異的に抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする血管内皮細胞傷害を伴う疾患の予防・治療剤である。すなわち、
１）コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する物質を有効成分として含有する、血管内皮細胞傷害を伴う疾患の予防・治療剤、
２）抗ＧＰＶＩ抗体を有効成分として含有する、上記１）に記載の予防・治療剤、
３）前記疾患が糖尿病合併症又は移植合併症である、上記１）又は２）に記載の予防・治療剤、
４）前記疾患が糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症もしくは糖尿病性神経障害、又は静脈閉塞性疾患もしくは血栓性微小血管症である、上記１）ないし３）のいずれかに記載の予防・治療剤、
５）前記抗ＧＰＶＩ抗体がコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する作用を有する、上記２）ないし４）のいずれかに記載の予防・治療剤、
６）前記抗ＧＰＶＩ抗体が血小板表面からＧＰＶＩを消失させる作用、特にインターナリゼーションにより消失させる作用を有する、上記２）ないし５）のいずれかに記載の予防・治療剤、である。さらに
７）ＧＰＶＩの特定部位、特に特定のループ領域の少なくとも一部を含有する構造を認識する抗ＧＰＶＩ抗体である。ここで、前記特定のループ領域は、好ましくはループ９（Ｌ９）及び／又はループ１１（Ｌ１１）、より好ましくはＬ９である。
また、本発明の第５の態様は、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する物質を有効成分として含有する、血管内皮細胞傷害又は臓器障害の抑制剤又は予防・治療剤である。
本発明により、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬、特に、抗凝固薬または抗血小板薬の血小板又は血液凝固系と関連する疾患、特に血栓形成を伴う疾患における併用療法、及び併用のための医薬、製剤又は医薬組成物を提供できる。また、本発明により、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬理試験を実施するための重要な研究ツールである、抗ラットＧＰＶＩ抗体、特に、血小板ＧＰＶＩ消失作用を有する抗体、及び、当該抗体を用いた試験方法を提供できる。
さらに、本発明により、有効成分としてコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する物質を含有し、血管内皮傷害を伴う疾患の予防又は治療のための医薬等を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図１は、ラットＧＰＶＩ遺伝子配列およびその遺伝子にコードされるアミノ酸配列を示す図である。
図２は、ヒト可溶型ＧＰＶＩおよびラット可溶型ＧＰＶＩのアミノ酸列のアライメントである。矢印は、ＧＰＶＩの各ドメイン領域を、また四角はモデリングによって予測されたループ領域の位置（Ｌ１−Ｌ１４）を示す。
図３は、ヒト可溶型ＧＰＶＩおよびマウス可溶型ＧＰＶＩのアミノ酸列のアライメントである。矢印は、ＧＰＶＩの各ドメイン領域を、また四角はモデリングによって予測されたループ領域の位置（Ｌ１−Ｌ１４）を示す。
図４は、実施例３で得られたラットＧＰＶＩ−Ｆｃ融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２はラットＧＰＶＩ−ヒトＦｃ融合蛋白質、レーン３はラットＧＰＶＩ−マウスＦｃ融合蛋白質を示す。
図５は、実施例５で得られた抗体（Ｆ１２３９−６−１抗体）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は精製抗体を示す。
図６は、ＧＰＶＩループ置換体に対する結合能を調べた結果を示す。
図７は、抗ラットＧＰＶＩ抗体のラット血小板に対する結合能を調べた結果を示す。
図８は、抗ラットＧＰＶＩ抗体投与ラット血小板の凝集能を調べた結果を示す。
図９は、ラット血小板ＧＰＶＩの消失を確認した結果を示す。
図１０は、抗ＧＰＶＩ抗体と低分子ヘパリンの併用効果を調べた結果を表す。
図１１は、抗ＧＰＶＩ抗体とＢＡＹ５９−７９３９の併用効果を調べた結果を表す。
図１２は、Ｆ１２３２−３７−２抗体のカニクイザルｅｘ  ｖｉｖｏ試験（血小板ＧＰＶＩの消失およびコラーゲン惹起血小板凝集能）の結果を示す。
図１３は、モノクロタリン惹起ラットＶＯＤモデルにおける試験結果を示す。（Ａ）可溶型ＩＣＡＭ−１、（Ｂ）ビリルビンおよび（Ｃ）ＧＯＴの値を示す。
図１４は、エンドトキシン惹起ラットＴＭＡモデルにおける試験結果を示す。（Ａ）ＢＵＮ及び（Ｂ）ＧＰＴの値を示す。
図１５は、ストレプトゾトシン惹起ラット糖尿病モデルにおける試験結果（可溶型ＩＣＡＭ−１の値）を示す。
図１６は、抗ＧＰＶＩ抗体と抗凝固薬（低分子ヘパリン）のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるクロット形成時間に対する併用効果を示す。
図１７は、抗ＧＰＶＩ抗体と抗凝固薬（低分子ヘパリン）併用時のラットの出血時間を示す。
図１８は、抗ＧＰＶＩ抗体と抗凝固薬（グロピドグレル）のｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板凝集に対する併用効果を示す。
図１９は、抗ＧＰＶＩ抗体と抗凝固薬（グロピドグレル）併用時のラットの出血時間を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の医薬は、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬、特に、抗凝固薬または抗血小板薬とを併用するためのものである。本明細書においては、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬を単に「抗血小板薬」と、それぞれを「各薬剤」のように記載することがある。また、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と併用する薬剤が抗血小板薬である場合、「第二の抗血小板薬」のように記載することがある。【００３０】
本発明において「予防・治療剤」は予防剤及び／又は治療剤である。また、「コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する物質」または「コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬」とは、コラーゲンと血小板、具体的には血小板上のコラーゲン受容体、特にＧＰＶＩ、との相互作用の結果として起こる血小板の活性化を、及び／又は、その結果として起こる血小板凝集を特異的に抑制する物質または薬剤である。例えば、ＡＤＰ凝集を抑制することなくコラーゲン凝集を抑制する低分子化合物も含んでいる。その作用機序は必ずしも限定されず、例えば、コラーゲンに結合することで、又は、ＧＰＶＩに結合することによって前記相互作用を阻害する薬剤、前記相互作用の結果生じるシグナルを抑制する薬剤、血小板コラーゲン受容体、特にＧＰＶＩの発現を抑制する物質、例えば、ＧＰＶＩ遺伝子もしくはｍＲＮＡに対するアンチセンス化合物又はｓｉＲＮＡ等が挙げられる。
コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する物質またはコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬としては、種々のものが適用可能である。例えば、コラーゲンに対する抗体、コラーゲンペプチド、その断片及び誘導体（例えば、ＷＯ９９／５０２８１等参照）、ＧＰＶＩ−Ｆｃ（例えば、ＷＯ０１／８１０及びＷＯ０３／１０４２８２等参照）、コラーゲンに結合する血小板膜蛋白質に対する抗体などが挙げられる。好ましくは、ＧＰＶＩ特異的結合物質、特に抗ＧＰＶＩ抗体もしくはその活性断片又はそれらの誘導体である。以下、代表例として抗体を記載するが、本発明においては、適用可能な範囲で、抗体以外のＧＰＶＩ特異的結合物質、例えば、抗体の断片又はその誘導体についても抗体の記載に準ずることができる。【００３１】
抗ＧＰＶＩ抗体は、特異的にＧＰＶＩを認識又は結合する抗体であれば、必ずしも限定されない。ＧＰＶＩとの結合親和性（Ｋｄ）が、１０−７Ｍ以下、好ましくは３Ｘ１０−８Ｍ以下、より好ましくは１Ｘ１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは３Ｘ１０−９Ｍ以下、特に好ましくは１Ｘ１０−９Ｍ以下である。抗体の由来動物種は必ずしも限定されず、例えば、哺乳類、特にマウス、ラット、ハムスターもしくはウサギ等が挙げられ、また、遺伝子組換え技術により作製される抗体であってもよい。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも適用可能であるが、特異性等の性状及び物質的な均一性の点ではモノクローナル抗体は好ましい。
本発明において用いられる抗ＧＰＶＩ抗体は、血小板ＧＰＶＩ、特に、ヒト血小板ＧＰＶＩを特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。具体的には、コラーゲンとＧＰＶＩとの相互作用の結果として起こる血小板の活性化を、及び／又は、その結果として起こる血小板凝集を抑制するものであれば、必ずしも限定はなく、種々のものが適用可能である。公知の抗ＧＰＶＩ抗体の内、例えば、マウス抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体９０１２、ＯＭ１、ＯＭ２及びＯＭ４（ＷＯ０１／８１０、ＷＯ０２／８０９６８、ＷＯ２００５／１１１０８３等参照）、ラット抗マウスＧＰＶＩモノクローナル抗体ＪＡＱ１（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、ラット抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体ｈＧＰ５Ｃ４（ＷＯ２００５／５４２９４等参照）が挙げられる。これらをヒトに適用する場合には、公知の方法に従い、ヒトキメラ抗体又はヒト化抗体を作製し、それを用いることが望ましい。また、ヒトに適用する場合の好適な例として、ヒト一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（ＷＯ０１／８１０、ＷＯ０３／５４０２０等参照）及びヒト抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体（ＷＯ０５／７８００）が挙げられる。【００３２】
本発明において、抗ＧＰＶＩ抗体は、好ましくは、血小板上のＧＰＶＩを消失させる作用、特にインターナリゼーションにより消失させる作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体である。そのような抗体の例としては、実施例に示された抗体及びＷＯ２００６／１１８３５０（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０９４３１）の実施例に記載された抗体が挙げられる。血小板と接触させることにより、特に、生体内において接触させることにより、血小板膜上のＧＰＶＩを少なくとも部分的に消失させる作用を有するものである。その作用は、本発明の抗体と血小板とを一定時間接触させた後、血小板を分離し、その表面上のＧＰＶＩ発現量を測定することにより確認しうる。ＧＰＶＩ発現量はウェスタンブロッティング又はＦＡＣＳ等を用いた常法により測定でき、具体的な方法は実施例に示されている。本発明の抗体は、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．３ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇの投与量で、投与前値または対照群の値と比較して、好ましくは４０％以上、より好ましくは８０％以上、血小板上のＧＰＶＩを消失させる作用を有する。【００３３】
ここで、前記抗体は、好ましくは血小板の活性化作用が弱い、より好ましくは血小板の活性化作用が実質的にない抗体である。血小板の活性化は、種々の方法で測定しうる。例えば、公知の方法で測定しうるが、血小板表面抗原、好ましくはＣＤ６２Ｐの発現量、血小板粘着能もしくは血小板凝集率を指標とすることができる。例えば、本発明の抗体を投与した生体から一定時間経過後に血小板を分離し、そのＣＤ６２Ｐの発現量を常法により測定する方法、及び、生体から分離した血小板と本発明の抗体を接触させ、一定時間経過後にそのＣＤ６２Ｐの発現量を常法により測定する方法等が挙げられる。
また、本発明において、抗ＧＰＶＩ抗体は、好ましくは、ＧＰＶＩの特定部位、特に特定のループ領域の少なくとも一部を含有する構造を認識する抗ＧＰＶＩ抗体である。ここで、前記特定のループ領域は、例えば、ループ２（Ｌ２）、好ましくはループ９（Ｌ９）及び／又はループ１１（Ｌ１１）、より好ましくはＬ９である。そのような抗体の例としては、実施例に示された抗体及びＷＯ２００６／１１８３５０（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０９４３１）の実施例に記載された抗体が挙げられる。そのような抗体の製造方法及び同定方法は種々の方法が適用でき、公知の方法を応用することもできるが、好ましくは、ＧＰＶＩの特定部位、特に特定のループ領域、好ましくはＬ９及び／又はＬ１１、より好ましくはＬ９のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列、具体的には、他の動物種のＧＰＶＩの対応するアミノ酸配列で置換した変異体を免疫用抗原又は抗体の同定用抗原として用いる方法が挙げられ、具体的には実施例に記載された方法を適用することができる。また、それらの抗体の認識領域等は、当該置換変異体と抗体との結合性及びＧＰＶＩと抗体との結合性を公知の方法に準じて測定することにより推定しうる。具体的な方法は実施例に示されている。そのような抗体は、ＧＰＶＩ消失作用を有し、及び／又は、血小板の活性化作用、血小板凝集惹起作用、血小板減少誘導作用もしくは出血時間の延長作用が弱く好ましくはほとんど認められず、本発明において特に有用である。これらの作用は公知の方法で測定しうる。
さらに、本発明において、抗ＧＰＶＩ抗体は、ＧＰＶＩ消失作用の有無に関らず、例えば、ＧＰＶＩとコラーゲンの結合を直接阻害することにより、コラーゲン惹起血小板凝集を抑制する抗体であっても良い。
本発明において抗体の形態は、必ずしも限定されず、種々のものが適用可能である。例えば、本発明の抗体としては、その活性、例えば、ＧＰＶＩとの結合能を有する限りにおいて、抗体の断片または一部でもよい。例えば、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２（例えば、Ｏｒｉｔａ  Ｔ，Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：５６２−５６６参照）、ｎａｎｏｂｏｄｙ（例えば、Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  Ｖ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４，２８５３−２８５７，２００４参照）及びＣＤＲを含有するペプチド等が挙げられる。これらは公知の方法で作製しうる。【００３４】
本発明において「抗血栓症薬」としては、必ずしも限定されないが、例えば血栓溶解剤（例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）及びそれらの誘導体（改変体あるいはいわゆる第二世代といわれるものも含む）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ）、あるいは抗血小板薬（例えばアスピリン、Ｐ２Ｙ１２拮抗薬、例えば、チクロピジン、クロピドグレル、トロンボキサンアンタゴニスト、トロンボキサン合成阻害剤、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト）、抗凝固薬（例えばワーファリン、ヘパリン、低分子ヘパリン、ペンタサッカライド、トロンビン阻害剤、ＦＸａ阻害剤、ＦＶＩＩａ阻害剤）などが挙げられる。これらの内で、抗凝固薬または抗血小板薬（第二の抗血小板薬）が好ましく、特に、抗凝固薬が好ましい。「抗凝固薬」とは、血液凝固を抑制する薬剤である。その作用機序は必ずしも限定されず、例えば、血液凝固因子（例えば、トロンビン、Ｘａ因子（ＦＸａ）、ＩＸａ因子、ＶＩＩａ因子／組織因子）の阻害剤、血液凝固因子の産生抑制剤、血液凝固系の補助因子の機能を阻害する薬剤又はプロテインＣ抗凝固経路の亢進薬などが挙げられ、具体的には、トロンビン阻害剤（例えば、アルガトロバン）、ＦＸａ阻害剤、ヘパリン、低分子ヘパリン、抗凝固作用を有するオリゴ糖（例えば、ｄａｎａｐａｒｏｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ、ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ  ｓｏｄｉｕｍ、Ｉｄｒａｐａｒｉｎｕｘ  ｓｏｄｉｕｍ）、ワーファリン、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンボモジュリン、プロテインＣおよび活性化プロテインＣなどである。好ましくは、ヘパリン、低分子ヘパリン又はＦＸａ阻害剤、より好ましくは、低分子ヘパリン又は低分子ＦＸａ阻害剤である。抗血小板薬（第二の抗血小板薬）としては、Ｐ２Ｙ１２拮抗薬が好ましく、クロピドグレルが特に好ましい。【００３５】
本発明において低分子ヘパリンとしては種々のものが適用可能であり、例えば、ｐａｒｎａｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ、ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ、ｔｉｎｚａｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ、ａｒｄｅｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ、ｂｅｍｉｐａｒｉｎ等の他、市販品としては一般名ｄａｌｔｅｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ（商品名：フラグミン）及びレビパリンＮａ（商品名：ローモリン、クリバリン）等が挙げられる。【００３６】
本発明において低分子ＦＸａ阻害剤として種々のものが適用可能であり、例えば、以下に示す化合物を適用することができる。
（１）特表２００４−５３４０８３号（国際公開２００３／０００２５６号）パンフレット（この公報を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されている置換オキサゾリジノン誘導体であって、下記式（Ｉ）
2007091719.tif 000003
（式中、Ｒ１は、塩素、臭素、メチルまたはトリフルオロメチルの群からの基によって５位で置換されている２−チオフェンであり、Ｒ２は、Ｄ−Ａ−であり：そこでは：
「Ａ」基はフェニレンであり；「Ｄ」基は、窒素原子を通して「Ａ」に連結し、連結する窒素原子に直近のカルボニル基を有し、そして、その中の環炭素員がＳ  ＮおよびＯからのヘテロ原子によって置換されてもよい、飽和した５−または６員のヘテロ環であり；そこでは：
上記の「Ａ」基は、任意に、フッ素、塩素、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル、メチルまたはシアノの群からの基によって、オキサゾリジノンへの結合に対してメタ位において１度または２度置換されてもよく、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は水素である。）の少なくとも１つの化合物（特表２００４−５３４０８３号の式（Ｉ）で表された化合物）、その医薬的に許容し得る塩、水和物、プロドラッグまたはそれらの混合物。
より具体的には、特表２００４−５３４０８３号の実施例（特表２００４−５３４０８３号の２８頁−９４頁）に記載された化合物等、特には、５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソ−４−モルホリニル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）−２−チオフェンカルボキサミド（ＢＡＹ−５９−７９３９）が好ましい。
（２）特表２００３−５０２３１４号（国際公開２０００／０７６９７１号）パンフレット（この公報を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されているベンズアミド誘導体であって、下記式（ＩＩ）
2007091719.tif 000004
［式中、Ｒ２は５または６員の芳香族炭素環であって、該環は場合により、窒素、酸素または硫黄の環内原子によって中断されている。該環は場合により、３および／または４位でハロ、ニトロ、チオール、ハロアルキル、ヒドラジノ、アルキルヒドラジド、アミノ、シアノ、ハロアルキル、アルキルチオ、アルケニル、アルキニル、アシルアミノ、トリもしくはジフルオロアルキル、カルボキシ、アシルオキシ、ＭｅＳＯ２−またはＲ１によって置換されているか、あるいは３および４位の置換基が一緒になって、５または６員の炭素環またはヘテロ環である縮合環（これらの環は場合により、ハロ、ハロアルコキシ、ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アミノ、ヒドラジド、アルキルチオ、アルケニル、アルキニル、またはＲ１ｊによって置換されている）を形成する。該環は場合により、Ｘ−Ｘ基のα位（すなわち、例えば６員芳香環の６位）でアミノ、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、シアノ、アミド、アミノアルキル、アルコキシまたはアルキルチオによって置換されている。但し、Ｒ２はアミノイソキノリルではあり得ない。Ｘは各々独立して、Ｃ、Ｎ、ＯもしくはＳ原子、またはＣＯ、ＣＲ１ａ、Ｃ（Ｒ１ａ）２もしくはＮＲ１ａ基であって、少なくとも１つのＸはＣ、ＣＯ、ＣＲ１ａまたはＣ（Ｒ１ａ）２である。Ｒ１ａは各々独立して水素であるか、またはヒドロキシル、アルコキシ、アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシメトキシカルボニルまたはアルキルアミノ（これらは場合により、ヒドロキシ、アルキルアミノ、アルコキシ、オキソ、アリールまたはシクロアルキルによって置換され得る）である。Ｒ１はＲ１ａで定義する通りであるが、但しＲ１は無置換のアミノアルキルでない。Ｌは、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選ばれる骨格原子を１〜５個含有する有機結合基、または分枝アルキル基もしくは環状基である。Ｙは、窒素原子またはＣＲ１ｂ基である。Ｃｙは、飽和もしくは不飽和で単環もしくは多環のホモもしくはヘテロ環（これらは場合により、Ｒ３ａによって置換されている）またはフェニル（これは場合により、Ｒ３ａによって置換されている）である。Ｒ３ａは各々独立して、Ｒ１ｃ、アミノ、ハロ、シアノ、ニトロ、チオール、アルキルチオ、アルキルスルホニル、アルキルスルフェニル、トリアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ヒドラジド、アルキルイミダゾリル、チアゾリル、アルキルチアゾリル、アルキルオキサゾリル、オキサゾリル、アルキルスルホンアミド、アルキルアミノスルホニル、アミノスルホニル、ハロアルコキシおよびハロアルキルである。Ｌｐは、親油性の有機基である。Ｄは、水素結合供与基である。ｎは０、１または２である。そして、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃおよびＲ１ｊはＲ１ａで定義する通りである］で表される化合物（特表２００３−５０２３１４号の式（Ｉ）で表された化合物）またはその生理学的に許容し得る塩。
より具体的には、特表２００３−５０２３１４号の実施例（特表２００３−５０２３１４号の９７頁−２８２頁）に記載された化合物等、特には、Ｎ−［２−［４−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−２−オキソ−１（Ｒ）−フェニルエチル］−１Ｈ−インドール−６−カルボキサミド（ＬＹ−５１７７１７）が好ましい。
（３）特表２０００−５０２７１０（国際公開９７／２４１１８号）パンフレット（この公報を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されている置換Ｎ−［（アミノイミノメチル又はアミノメチル）フェニル］プロピオアミド誘導体であって、下記式（ＩＩＩ）
2007091719.tif 000005
（式中、Ｒ１及びＲ２は水素又は一緒になって＝ＮＲ９を表し、Ｒ３は−ＣＯ２Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯＮＲ６Ｒ６、−ＣＨ２ＯＲ７又は−ＣＨ２ＳＲ７を表し、Ｒ４は式：
2007091719.tif 000006
で示される基であるか又は水素、アルキル、シクロアルキル若しくはシクロアルキルアルキルを表し、
Ｒ５はアルキル、アルケニル、適宜置換されたアリール又は適宜置換されたヘテロアリールを表し、
Ｒ６は水素又は低級アルキルを表し、
Ｒ７は水素、低級アルキル、低級アシル、アロイル又はヘテロアリールを表し、
Ｒ８は水素又は低級アルキルを表し、
Ｒ９はＲ１０Ｏ２Ｃ−、Ｒ１０Ｏ−、ＨＯ−、シアノ、Ｒ１０ＣＯ−、ＨＣＯ−、低級アルキル、ニトロ又はＹ１Ｙ２Ｎ−（式中、Ｒ１０は適宜置換されたアルキル、適宜置換されたアラルキル又は適宜置換されたヘテロアラルキルを表し、Ｙ１及びＹ２は独立して水素又はアルキルを表す）を表し、
Ａ及びＢは水素又は一緒になって結合を表し、
Ａｒは適宜置換されたアリール又は適宜置換されたヘテロアリールを表し、
ｎは０、１又は２を表す。）で表される化合物（特表２０００−５０２７１０号の式Ｉで表される化合物）、その製薬学的に許容しうる塩、その窒素酸化物、その水和物又はその溶媒和物。
より具体的には、特表２０００−５０２７１０号の２３頁１４行−３３頁に記載されている化合物等を挙げることができ、特には、２（Ｒ）−（３−アミジノベンジル）−３（Ｒ）−［４−（１−オキシドピリジン−４−イル）ベンズアミド］ブチリック酸メチルエステル（Ｏｔａｍｉｘａｂａｎ）が好ましい。
（４）特表２００１−５０９１４５号（国際公開９８／２８２６９号）パンフレット（この公報を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されている１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド誘導体であって、下記式（ＩＶ）
2007091719.tif 000007
（上式で、環Ｍが、Ｊに加えて、０〜３個のＮ原子を含み、ただし、Ｍが２個のＮ原子を含む場合はＲ１ｂは不存在であり、Ｍが３個のＮ原子を含む場合はＲ１ａおよびＲ１ｂは不存在であり、
Ｊが、ＮまたはＮＨであり、
Ｄが、ＣＮ、Ｃ（＝ＮＲ８）ＮＲ７Ｒ９、ＮＨＣ（＝ＮＲ８）ＮＲ７Ｒ９、ＮＲ８ＣＨ（＝ＮＲ７）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８、および（ＣＲ８Ｒ９）ｔＮＲ７Ｒ８から選択され、ただし、Ｄは、Ｅ上でＧに対して、メタ位またはパラ位で置換され、
Ｅが、１個のＲで置換された、フェニル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、およびピペリジニルから選択され、
あるいは、Ｄ−Ｅ−Ｇが共に、１個のＲで置換されたピリジルを表し、
Ｒが、Ｈ、ハロゲン、（ＣＨ２）ｔＯＲ３、Ｃ１〜４アルキル、ＯＣＦ３、およびＣＦ３から選択され、
Ｇが、不存在であるか、またはＮＨＣＨ２、ＯＣＨ２、およびＳＣＨ２から選択され、ただし、ｓが０のときは、Ｇは環Ｍの炭素に結合し、
Ｚが、Ｃ１〜４のアルキレン、（ＣＨ２）ｒＯ（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＮＲ３（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲ３（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＮＲ３Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＯＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＯＣ（Ｏ）ＮＲ３（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＳ（Ｏ）ｐ（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２）ｒＳＯ２ＮＲ３（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２），ＮＲ３ＳＯ２（ＣＨ２）ｒおよび（ＣＨ２）ｒＮＲ３ＳＯ２ＮＲ３（ＣＨ２）ｒから選択され、ただし、Ｚは、環Ｍまたは基ＡとＮ−Ｎ、Ｎ−Ｏ、Ｎ−Ｓ、ＮＣＨ２Ｎ、ＮＣＨ２ＯまたはＮＣＨ２Ｓの結合を形成せず、
Ｒ１ａおよびＲ１ｂが独立して、不存在であるか、または、−（ＣＨ２）ｒ−Ｒ１’、ＮＣＨ２Ｒ１”、ＯＣＨ２Ｒ１”、ＳＣＨ２Ｒ１”、Ｎ（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ｔＲ１’、Ｏ（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ｔＲ１’およびＳ（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ｔＲ１’から選択されるか、または結合して、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される０〜２個のヘテロ原子を含む、０〜２個のＲ４で置換された、５〜８員の飽和、部分飽和、または不飽和の環を形成し、
Ｒ１’が、Ｈ、Ｃ１〜３のアルキル、ハロ、（ＣＦ２）ｒＣＦ３、ＯＲ２、ＮＲ２Ｒ２ａ、Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｃ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２、（ＣＦ２）ｒＣＯ２Ｒ２Ｃ、Ｓ（Ｏ）ｐＲ２ｂ、ＮＲ２（ＣＨ２）ｒＯＲ２，ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ２ｂ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）２Ｒ２ａ、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２Ｒ２ｂ、０〜２個のＲ４で置換されたＣ３〜６の炭素環式残基、および０〜２個のＲ４で置換された、Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜１０員の複素環式系から選択され、
Ｒ１”が、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、Ｓ（Ｏ）Ｒ２ｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒ２ｂおよびＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａから選択され、
Ｒ２が、それぞれの場合に、Ｈ、ＣＦ３、Ｃ１〜６のアルキル、ベンジル、０〜２個のＲ４ｂで置換されたＣ３〜６の炭素環式残基、および０〜２個のＲ４ｂで置換された、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜６員複素環式系から選択され、
Ｒ２ａが、それぞれの場合に、Ｈ、ＣＦ３、Ｃ１〜６のアルキル、ベンジル、０〜２個のＲ４ｂで置換されたＣ３〜６の炭素環式残基、および０〜２個のＲ４ｂで置換された、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜６員複素環式系から選択され、
Ｒ２ｂが、それぞれの場合に、ＣＦ３、Ｃ１〜４のアルコキシ、Ｃ１〜６のアルキル、ベンジル、０〜２個のＲ４ｂで置換されたＣ３〜６の炭素環式残基、および０〜２個のＲ４ｂで置換された、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜６員の複素環式系から選択され、
Ｒ２ｃが、それぞれの場合に、ＣＦ３、ＯＨ、Ｃ１〜４のアルコキシ、Ｃ１〜６のアルキル、ベンジル、０〜２個のＲ４ｂで置換されたＣ３〜６の炭素環式残基、および０〜２個のＲ４ｂで置換された、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜６員の複素環式系から選択され、
あるいは、Ｒ２およびＲ２ａが結合して、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される０〜ｋ１個の別のヘテロ原子を含む、０〜２個のＲ４ｂで置換された、５または６員の飽和、部分飽和、または不飽和の環を形成し、
Ｒ３が、それぞれの場合に、Ｈ、Ｃ１〜４のアルキル、およびフェニルから選択され、
Ｒ３ａが、それぞれの場合に、Ｈ、Ｃ１〜４のアルキル、およびフェニルから選択され、
Ａが、０〜２個のＲ４で置換されたＣ３〜１０の炭素環式残基、および０〜２個のＲ４で置換された、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜１０員の複素環系から選択され、
Ｂが、Ｘ−Ｙ、ＮＲ２Ｒ２ａ、Ｃ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２Ｃ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、０〜２個のＲ４ａで置換されたＣ３〜１０の炭素環式残基、および０〜２個のＲ４ａで置換された、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜１０員の複素環系から選択され、
Ｘが、Ｃ１〜４のアルキレン、−ＣＲ２（ＣＲ２Ｒ２ｂ）（ＣＨ２）ｔ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲ）−、−ＣＲ２（ＮＲ１”Ｒ２）−、−ＣＲ２（ＯＲ２）−、−ＣＲ２（ＳＲ２）−、−Ｃ（Ｏ）ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＣ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）ｐ−、−Ｓ（Ｏ）ｐＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＳ（Ｏ）ｐ−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ２Ｓ（Ｏ）２ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＣＲ２Ｒ２ａＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２−、−ＮＲ２ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＮＲ２−、Ｏ、−ＣＲ２Ｒ２ａＯ−、および−ＯＣＲ２Ｒ２ａ−から選択され、Ｙが、（ＣＨ２）ｒＮＲ２Ｒ２ａ（Ｘ−ＹがＮ−Ｎ、Ｏ−Ｎ、またはＳ−Ｎの結合を形成しないことを条件として）、０〜２個のＲ４ａで置換されたＣ３〜１０の炭素環式残基、および０〜２個のＲ４ａで置換されたＮとＯとＳとからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜１０員の複素環系から選択され、
Ｒ４が、それぞれの場合に、＝Ｏ、（ＣＨ２）ｒＯＲ２、ハロ、Ｃ１〜４のアルキル、−ＣＮ、ＮＯ２、（ＣＨ２）ｒＮＲ２Ｒ２ａ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＣＨ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＨＣ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２−Ｃ１〜４アルキル、ＮＲ２ＳＯ２Ｒ５、Ｓ（Ｏ）ｐＲ５、（ＣＦ２）ｒＣＦ３、ＮＣＨ２Ｒ１”、ＯＣＨ２Ｒ１”、ＳＣＨ２Ｒ１”、Ｎ（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ｔＲ１’、Ｏ（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ｔＲ１’、およびＳ（ＣＨ２）２（ＣＨ２）ｔＲ１’から選択され、
あるいは、１つのＲ４が、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜６員の芳香族複素環であり、
Ｒ４ａが、それぞれの場合に、＝Ｏ、（ＣＨ２）ｒＯＲ２、ハロ、Ｃ１〜４のアルキル、−ＣＮ、ＮＯ２、（ＣＨ２）ｒＮＲ２Ｒ２ａ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＣＨ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＨＣ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２−Ｃ１〜４アルキル、ＮＲ２ＳＯ２Ｒ５、Ｓ（Ｏ）ｐＲ５、および（ＣＦ２）ｒＣＦ３から選択され、あるいは、１つのＲ４ａが、０〜１個のＲ５で置換された、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜６員の芳香族複素環であり、
Ｒ４ｂが、それぞれの場合に、＝Ｏ、（ＣＨ２）ｒＯＲ３、ハロ、Ｃ１〜４のアルキル、−ＣＮ、ＮＯ２、（ＣＨ２）ｒＮＲ３Ｒ３ａ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｒ３、ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ３ａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ３ａ、ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ３ａ、ＣＨ（＝ＮＲ３）ＮＲ３Ｒ３ａ、ＮＨ３Ｃ（＝ＮＲ３）ＮＲ３Ｒ３ａ、ＳＯ２ＮＲ３Ｒ３ａ、ＮＲ３ＳＯ２ＮＲ３Ｒ３ａ、ＮＲ３ＳＯ２−Ｃ１〜４アルキル、ＮＲ３ＳＯ２ＣＦ３、ＮＲ３ＳＯ２−フェニル、Ｓ（Ｏ）ｐＣＦ３、Ｓ（Ｏ）ｐ−Ｃ１〜４アルキル、Ｓ（Ｏ）ｐ−フェニル、および（ＣＦ２）ｒＣＦ３から選択され、
Ｒ５が、それぞれの場合に、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、０〜２個のＲ６で置換されたフェニル、および０〜２個のＲ６で置換されたベンジルから選択され、
Ｒ６が、それぞれの場合に、Ｈ、ＯＨ、（ＣＨ２）ｒＯＲ２、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、（ＣＨ２）ｒＮＲ２Ｒ２ａ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、およびＮＲ２ＳＯ２Ｃ１〜４アルキルから選択され、
Ｒ７が、それぞれの場合に、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルカルボニル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜４アルコキシカルボニル、（ＣＨ２）ｎ−フェニル、Ｃ６〜１０アリールオキシ、Ｃ６〜１０アリールオキシカルボニル、Ｃ６〜１０アリールメチルカルボニル、Ｃ１〜４アルキルカルボニルオキシＣ１〜４アルコキシカルボニル、Ｃ６〜１０アリールカルボニルオキシＣ１〜４アルコキシカルボニル、Ｃ１〜６アルキルアミノカルボニル、フェニルアミノカルボニル、およびフェニルＣ１〜４アルコキシカルボニルから選択され、
Ｒ８が、それぞれの場合に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、および（ＣＨ２）ｎ−フェニルから選択され、
あるいは、Ｒ７およびＲ８が、結合して、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される０〜１個の別のヘテロ原子を含む５または６員の飽和環を形成し、
Ｒ９が、それぞれの場合に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、および（ＣＨ２）ｎ−フェニルから選択され、
ｎが、それぞれの場合に、０、１、２、および３から選択され、
ｍが、それぞれの場合に、０、１、および２から選択され、
ｐが、それぞれの場合に、０、１、および２から選択され、
ｒが、それぞれの場合に、０、１、２、および３から選択され、
ｓが、それぞれの場合に、０、１、および２から選択され、
ｔが、それぞれの場合に、Ｏおよび１から選択され、
ただし、Ｄ−Ｅ−Ｇ−（ＣＨ２）ｓ−および−Ｚ−Ａ−Ｂが、ともにベンズアミジンではない）で表される化合物（特表２００１−５０９１４５号の式Ｉで表された化合物）、その立体異性体、またはその薬剤学的に許容される塩。
より具体的には、特表２００１−５０９１４５号の６６頁２４行−８９頁２７行に記載されている化合物等を挙げることができ、特に、１−［３−（アミノメチル）フェニル］−Ｎ−［３−フルオロ−２’−（メチルスルホニル）ビフェニル−４−イル］−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド（ＤＰＣ−４２３）が好ましい。
（５）国際公開２００１／５７００３号パンフレット（この公報を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されている３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン誘導体であって、下記式（Ｖ）
2007091719.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｊ、Ｙ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑは、国際公開２００１／５７００３号パンフレットの７頁１５行−１１頁１０行に記載されているものである）で表される化合物（国際公開２００１／５７００３号パンフレットの式（Ｉ）で表された化合物）、異性体、製薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、またはプロドラッグ誘導体。
より具体的には、国際公開２００１／５７００３号パンフレット２１頁１行−３２頁２３行に記載されている化合物等を挙げることができ、特に、７−［７−［１−（エタンイミドイル）ピペリジン−４−イルオキシ］−３−オキソ−３，４−ジヒドロ２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−４−イルメチル］ナフタレン−２−カルボキサミドが好ましい。
（６）特表２００５−５０７８８９号（国際公開２００３／０２６６５２号）パンフレット及び特表２００５−５１１７１２号（国際公開２００３／０４９６８１号）パンフレット（この公報を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されている４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン誘導体であって、下記式（ＶＩ）
2007091719.tif 000009
（式中、Ｄ環は４−クロロフェニル、４−メトキシフェニル、２−シアノフェニル、２−（アミノメチル）フェニル、２−（ＰｇＮＨＣＨ２）フェニル、３−シアノフェニル、３−（アミノメチル）フェニル、３−（ＰｇＮＨＣＨ２）フェニル、３−シアノ−４−フルオロフェニル、（３−アミノ）ベンズ［ｄ］イソキサゾール−６−イルおよび３−（ＰｇＮＨ）ベンズ［ｄ］イソキサゾール−６−イルから選択され；
Ｐｇはアミン保護基を示し、
Ｒ１およびＲ２はＣ１−６アルキル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニルおよびベンジルから選択され、
あるいは、ＮＲ１Ｒ２は炭素、Ｎおよび０−１個のＯよりなる３−８員環を構成し；
Ｒ１ａはＲ１ａがＮ−ハロ、Ｎ−Ｎ、Ｎ−Ｓ、Ｎ−Ｏ又はＮ−ＣＮ以外の結合を形成するとして、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＮ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＯＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２ＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＳＣＨ３、Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、ＣＨ２Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、Ｓ（Ｏ）２ＣＨ３、ＣＨ２Ｓ（Ｏ）２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＯ２ＮＨ２、ピリジン−２−イル、ピリジン−３−イル、ピリジン−４−イル、ピリジン−２−イル−Ｎ−オキシド、ピリジン−３−イル−Ｎ−オキシド、ピリジン−４−イル−Ｎ−オキシド、イミダゾール−１−イル、ＣＨ２イミダゾール−１−イル、１，２，３，４−テトラゾール−１−イル、１，２，３，４−テトラゾール−５−イル、ＣＨ２−１，２，３，４−テトラゾール−１−イルおよびＣＨ２−１，２，３，４−テトラゾール−５−イルから選択され；
Ａは、０−１個のＲ４が置換したフェニル、０−１個のＲ４が置換したピリジルおよび０−１個のＲ４が置換したピリミジルから選択され；
Ｂは、Ｂ１、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｓ、ＯＴｓ、ＯＳＯ２Ｐｈ、ＣＨ２Ｂｒ、ＣＨ２ＯＨおよびＣＨＯから選択され；
あるいはＡ−Ｂは水素であり；
Ｂ１はＹ又はＸ−Ｙであって；
Ｘは、Ｃ１−４アルキレン、−ＣＲ２（ＣＨＲ２Ｒ２ｂ）（ＣＨ２）ｔ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＲ２（ＯＲ２）−、−ＣＲ２（ＳＲ２）−、−Ｃ（Ｏ）ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＣ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）ｐ−、−Ｓ（Ｏ）ｐＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＳ（Ｏ）ｐ−、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ２Ｓ（Ｏ）２ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＣＲ２Ｒ２ａＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２−、−ＮＲ２ＣＲ２Ｒ２ａ−、−ＣＲ２Ｒ２ａＮＲ２−、Ｏ、−ＣＲ２Ｒ２ａＯ−および−ＯＣＲ２Ｒ２ａ−から選択され；
Ｙは、０−２個のＲ４ａで置換されたＣ３−１０の炭素環と、（Ｎ、ＯおよびＳ）よりなる群から選択される１−４個のヘテロ原子を含み、０−２個のＲ４ａで置換されたヘテロ５−１０員環より選択され；
Ｒ４は、それぞれ、Ｈ、（ＣＨ２）ｒＯＲ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＮ、ＮＯ２、（ＣＨ２）ｒＮＲ２Ｒ２ａ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、Ｃ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、Ｃ（＝ＮＳ（Ｏ）２Ｒ５）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＨＣ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２−Ｃ１−４アルキル、ＮＲ２ＳＯ２Ｒ５、Ｓ（Ｏ）ｐＲ５および（ＣＦ２）ｒＣＦ３から選択され；
Ｒ４ａは、それぞれ、Ｈ、＝Ｏ、ＣＨＯ、（ＣＨ２）ｒＯＲ２、（ＣＨ２）ｒ−Ｆ、（ＣＨ２）ｒ−Ｂｒ、（ＣＨ２）ｒ−Ｃｌ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＮ、ＮＯ２、（ＣＨ２）ｒＮＲ２Ｒ２ａ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、（ＣＨ２）ｒＮ＝ＣＨＯＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、Ｃ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＨＣ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ２ａ、ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２−Ｃ１−４アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨＳＯ２−Ｃ１−４アルキル、ＮＲ２ＳＯ２Ｒ５、Ｓ（Ｏ）ｐＲ５、（ＣＦ２）ｒＣＦ３から選択され；
Ｒ２は、それぞれ、Ｈ、ＣＦ３、Ｃ１−６アルキル、ベンジル、０−２個のＲ４ｂで置換されたＣ３−６炭素環、０−２個のＲ４ｂで置換されたＣ３−６炭素環−ＣＨ２、（Ｎ、ＯおよびＳ）よりなる群から選択される１−４個のヘテロ原子を含み、０−２個のＲ４ｂで置換されたヘテロ５−６員環から選択され；
あるいはＲ２はアミノ窒素原子と結合した場合、Ｒ２はアミノ保護基を示し；
Ｒ２ａは、それぞれ、Ｈ、ＣＦ３、Ｃ１−６アルキル、ベンジル、０−２個のＲ４ｂで置換されたＣ３−６炭素環、０−２個のＲ４ｂで置換されたＣ３−６炭素環−ＣＨ２、（Ｎ、ＯおよびＳ）よりなる群から選択される１−４個のヘテロ原子を含み、０−２個のＲ４ｂで置換されたヘテロ５−６員環から選択され；
Ｒ２ｂは、それぞれ、ＣＦ３、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−６アルキル、ベンジル、０−２個のＲ４ｂで置換されたＣ３−６炭素環、（Ｎ、ＯおよびＳ）よりなる群から選択される１−４個のヘテロ原子を含み、０−２個のＲ４ｂで置換されたヘテロ５−６員環から選択され；
Ｒ２ｃは、それぞれ、ＣＦ３、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−６アルキル、ベンジル、０−２個のＲ４ｂで置換されたＣ３−６炭素環、（Ｎ、ＯおよびＳ）よりなる群から選択される１−４個のヘテロ原子を含み、０−２個のＲ４ｂで置換されたヘテロ５−６員環から選択され；
あるいはＲ２とＲ２ａは、それらが置換した原子と一緒になり、Ｎ、ＯおよびＳよりなる群から選択される０−１個のヘテロ原子を追加的に含み、０−２個のＲ４ｂで置換された、飽和、一部飽和若しくは不飽和の５−６員環を形成してもよく；
Ｒ３は、それぞれ、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）３およびフェニルから選択され；
Ｒ３ａは、それぞれ、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）３およびフェニルから選択され；
Ｒ３ｂは、それぞれ、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）３およびフェニルから選択され；
Ｒ３ｃは、それぞれ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）３およびフェニルから選択され；
Ｒ４ｂは、それぞれ、Ｈ、＝Ｏ、（ＣＨ２）ｒＯＲ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＮ、ＮＯ２、（ＣＨ２）ｒＮＲ３Ｒ３ａ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｒ３、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＯＲ３ｃ、ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ３ａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ３ａ、ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ３ａ、Ｃ（＝ＮＲ３）ＮＲ３Ｒ３ａ、ＮＨＣ（＝ＮＲ３）ＮＲ３Ｒ３ａ、ＳＯ２ＮＲ３Ｒ３ａ、ＮＲ３ＳＯ２ＮＲ３Ｒ３ａ、ＮＲ３ＳＯ２−Ｃ１−４アルキル、ＮＲ３ＳＯ２ＣＦ３、ＮＲ３ＳＯ２−フェニル、Ｓ（Ｏ）ｐＣＦ３、Ｓ（Ｏ）ｐ−Ｃ１−４アルキル、Ｓ（Ｏ）ｐ−フェニルおよび（ＣＦ２）ｒＣＦ３から選択され；
Ｒ５は、それぞれ、ＣＦ３、Ｃ１−６アルキル、０−２個のＲ６で置換されたフェニルおよび０−２個のＲ６で置換されたベンジルより選択され；
Ｒ６は、それぞれ、Ｈ、ＯＨ、（ＣＨ２）ｒＯＲ２、ハロ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＮ、ＮＯ２、（ＣＨ２）ｒＮＲ２Ｒ２ａ、（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ２ａ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、ＮＲ２ＳＯ２ＮＲ２Ｒ２ａ、およびＮＲ２ＳＯ２−Ｃ１−４アルキルから選択され；
ｐは、それぞれ、０、１および２より選択され；
ｒは、それぞれ、０、１、２および３より選択され；
ｔは、それぞれ、０、１、２および３より選択される。）
で表される化合物（特表２００５−５１１７１２号の式ＩＶで表された化合物）、またはその製薬学的に許容される塩。
より具体的には、特表２００５−５１１７１２号の実施例（特表２００５−５１１７１２号の４６頁−７９頁）に記載された化合物等を挙げることができ、特に、１−（４−メトキシフェニル）−７−オキソ−６−［４−（２−オキソピペリジン−１−イル）フェニル］−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−ピイラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボキサミド（ａｐｉｘａｂａｎ）が好ましい。
（７）国際公開２００１／０７４７７４号パンフレット（この公報を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されているエチレンジアミン誘導体であって、下記式（ＶＩＩ）
Ｑ１−Ｑ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−Ｑ３−Ｎ（Ｒ２）−Ｔ１−Ｑ４（ＶＩＩ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｔ１は、国際公開２００１／０７４７７４号パンフレットの３頁１３行−６頁２２行に記載されているものである）で表される化合物（国際公開２００１／０７４７７４号パンフレットの式（１）で表された化合物）、その塩、それらの溶媒和物またはそれらのＮ−オキシド。
より具体的には、国際公開２００１／０７４７７４号パンフレットの実施例（国際公開２００１／０７４７７４号パンフレットの６８頁−４５４頁）に記載された化合物等が好ましい。
（８）国際公開２００３／０００６８０号パンフレット（この公報を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されているジアミン誘導体であって、下記式（ＶＩＩＩ）
Ｑ１−Ｑ２−Ｔ０−Ｎ（Ｒ１）−Ｑ３−Ｎ（Ｒ２）−Ｔ１−Ｑ４（ＶＩＩＩ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｑ１、Ｑ２−、Ｑ３、Ｑ４、Ｔ０、Ｔ１は、国際公開２００３／０００６８０号パンフレットの３頁１２行−７頁４行に記載されているものである）で表される化合物（国際公開２００３／０００６８０号パンフレットの式（１）で表された化合物）、その塩、それらの溶媒和物またはそれらのＮ−オキシド。
より具体的には、国際公開２００３／０００６８０号パンフレットの８７頁２５行−１００頁２０行に記載されている化合物等を挙げることができる。
（９）国際公開２００１／０２３９７号パンフレット（この公報を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されているスピロ結合を有する三環系化合物であって、下記式（ＩＸ）
2007091719.tif 000010
［式中、Ａは、水素原子であるか、または
（１）飽和もしくは不飽和の５〜６員の環状炭化水素基、または飽和もしくは不飽和の５〜６員の複素環基、（２）アミノ基、（３）イミドイル基（ここで（１）〜（３）の基は置換基を有していてもよい）から選ばれる基であり、
Ｂは、単結合、カルボニル基、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、もしくは置換されていてもよいＣ１−２アルキレン基であり、
Ｄは、水素原子、−ＣＯ−Ｒ５（Ｒ５は水素原子もしくは置換基）、もしくは置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、
Ｘは、窒素原子、またはＡ’−Ｂ’−基で置換されていてもよいメチン基（Ａ’はＡの定義から、Ｂ’はＢの定義から選択される基を表す）であり、
Ｙは、酸素原子、−Ｓ（Ｏ）ｙ−、または置換されていてもよいイミノ基（−ＮＨ−）であり、
Ｚは、メチレン基、カルボニル基、またはチオカルボニル基であり、
Ｔは、−Ｓ（Ｏ）ｚ−、カルボニル基、または置換されていてもよいＣ１−２のアルキレン基であり、
Ｑは、炭化水素基もしくは複素環基であり、これらの基は置換基を有していてもよく、
ｌ、ｍ、ｎ、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ独立に０、１、２から選択される整数であり、但しｌ、ｍは同時に０ではなく、ｒは０もしくは１の整数であり、
Ｘを含む環、Ｙを含む環、Ｚを含む環の３つの環はそれぞれ置換されていても良く、Ｚを含む環中、点線と実線とで表される結合は、単結合、もしくはｒが０のときは二重結合を表わす。］で表される化合物（国際公開２００１／０２３９７号パンフレットの式（Ｉ）で表される化合物）またはその製薬学的に許容される塩。
より具体的には、国際公開２００１／０２３９７号パンフレットの４２頁１２行−４７頁１８行に記載された化合物が好ましい。
（１０）特願２００５−１０５４４４の明細書（この明細書を引用し、これをもって本明細書の一部とする）に記載されているアミド型置換基を有する三環系スピロ誘導体であって、下記式（Ｘ）
2007091719.tif 000011
［式中、Ｔは、置換されていてもよい脂肪族炭化水素基、置換されていてもよい３〜４員の脂環式炭化水素基、置換されていてもよいＣ２〜６アルカノイル基またはトリフルオロメチル基であり、Ｄは、水素原子、−ＣＯ−Ｒ５（Ｒ５は水素原子もしくは置換基）、または置換されていてもよいＣ１〜６アルキル基であり、Ｙは、酸素原子、−Ｓ（Ｏ）ｙ−、または置換されていてもよいイミノ基（−ＮＨ−）であり、Ｑは、炭化水素基もしくは複素環基であり、これらの基は置換基を有していてもよく、ｌ、ｍ、ｎ、ｙは、それぞれ独立に０、１、２から選択される整数であり、但しｌ、ｍは同時に０ではなく、ｒは０もしくは１の整数であり、Ｔ−ＣＯ−が結合しているＮを含む環、Ｙを含む環、−ＳＯ２−Ｑが結合しているＮを含む環の３つの環はそれぞれ置換されていてもよい。］で表される化合物またはその製薬学的に許容される塩。
より具体的には、
（−）−１’−アセチル−７−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）スルホニル］テトラヒドロ−８ａ−（メトキシメチル）−１−メチル−スピロ［イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−５（１Ｈ）−オン；
（−）−７−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）スルホニル］テトラヒドロ−８ａ−（メトキシメチル）−１−メチル−１’−プロパノイル−スピロ［イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−５（１Ｈ）−オン；
（−）−７−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）スルホニル］−１’−シクロブタンカルボニル−テトラヒドロ−８ａ−（メトキシメチル）−１−メチル−スピロ［イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−５（１Ｈ）−オン；
（−）−７−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）スルホニル］テトラヒドロ−８ａ−（メトキシメチル）−１−メチル−１’−プロピノイル−スピロ［イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−５（１Ｈ）−オン；
（−）−７−［（６−クロロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）スルホニル］テトラヒドロ−８ａ−（メトキシメチル）−１−メチル−１’−プロピノイル−スピロ［イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−５（１Ｈ）−オン；
光学活性１’−アセチル−８ａ−（アセチルアミノメチル）−７−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）スルホニル］テトラヒドロ−１−メチル−スピロ［イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−５（１Ｈ）−オン；
（−）−７−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）スルホニル］テトラヒドロ−８ａ−（メトキシメチル）−１’−プロパノイル−スピロ［イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−５（１Ｈ）−オン；
（−）−１’−アセチル−７−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）スルホニル］テトラヒドロ−８ａ−（メトキシメチル）−スピロ［５Ｈ−オキサゾロ［３，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−５−オン；
光学活性−１’−アセチル−７−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）スルホニル］テトラヒドロ−８ａ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル）−スピロ［５Ｈ−オキサゾロ［３，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−５−オン；
光学活性−Ｎ−［［７−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）スルホニル］テトラヒドロ−５−オキソ−１’−プロパノイル−スピロ［５Ｈ−オキサゾロ［３，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ），４’−ピペリジン］−８ａ−イル］メチル］−Ｎ−メチルグリシンが好ましい。
或いは、これらの（＋）もしくは（−）光学異性体、およびそれらの製薬学的に許容される塩（例えばメタンスルホン酸塩（モノ塩もしくはジ塩））を挙げることもできる。
また、臨床開発が手がけられたことのあるＦＸａ阻害剤としてさらに、ＫＦＡ−１９８２或いはその活性本体ＫＦＡ−１８２９、８１３８９３、ＴＣ−１０、ＳＲ−１２３７８１、ＹＭ−１５０、ＤＵ−１７６ｂ、ＡＶＥ−５０２６（ｏｃｔａｐａｒｉｎｅ）、フォンダパリヌクス（ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ  ｓｏｄｉｕｍ）等が挙げられる。経口投与可能なものは服用の利便性の面で好ましい。【００３７】
本発明において、血小板又は血液凝固系と関連する疾患は、血小板の活性化もしくは凝集、特にコラーゲンによる血小板の活性化もしくは凝集、または血管内皮障害もしくは動脈硬化性の反応に起因するもしくはそれらを伴う疾病、又は血液凝固系の異常、例えば、血液凝固系の亢進に起因するもしくはそれを伴う疾患を含む。特に、血栓もしくは塞栓に起因するもしくはそれらを伴う疾患、例えば、血栓症及び塞栓症等の予防及び／または治療に利用することができる。これらの疾患には、動脈性血栓症のみならず、静脈性血栓症も含まれ、また、心房細動に起因する脳梗塞も含まれる。
具体的には、狭心症、心筋梗塞、血栓溶解療法時、経皮的冠動脈内腔拡張術施行時、ステント施行時、バイパス手術施行時もしくは人工血管施行時の、またはこれらの後の血管内皮肥厚、血管再狭窄、狭心症もしくは心筋梗塞、等が挙げられる。さらに、心房細動もしくは心房粗動及びこれらに起因する血栓症、塞栓症、特に脳梗塞、等が挙げられる。その他、閉塞性血栓性血管炎、急性動脈閉塞症、閉塞性動脈硬化症または深部静脈血栓症等があり、脳梗塞（アテローム性血栓性梗塞、ラクナ梗塞、心原性梗塞）、一過性脳虚血発作、くも膜下出血後の脳血管攣縮、肺血栓、肺塞栓症、血管性紫斑病、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固症候群、血液体外循環時（血液透析）の血液凝固防止、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、紫斑病性腎炎、糖尿病に伴う内皮細胞傷害、糖尿病性腎炎、糖尿病性網膜症、腎塞栓、移植治療に伴う合併症（肝静脈閉塞症、血栓性微小血管症、移植片対宿主病）等が挙げられる。【００３８】
本発明において「併用」とは、組み合わせて用いることであり、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬をともに含む配合剤として投与すること、及び、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬とがそれぞれ別個の製剤として同時期にもしくは時間差をおいて別々に投与することを含み、それは必ずしも患者の体内、例えば血中において同時に存在する場合に限られない。
本発明の医薬における併用の形態は、特に限定されず、各薬剤が組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）両薬剤を同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）両薬剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同−投与経路での同時投与、（３）両薬剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）両薬剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）両薬剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、抗血小板薬−抗血栓症薬の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）などが挙げられる。同時期に投与する場合、投与経路が同一であれば、直前に両薬剤を混合して用いてもよく、別々に投与しても良い。また、種々の目的で計画的に投与時期をずらして用いることができる。例えば、両薬剤の併用効果を高めるため、一方の薬剤の効果を増強するため、副作用を軽減するため、治療効果の持続させるため、又は両薬剤の直接的もしくは間接的な相互作用を軽減するため等の目的である。【００３９】
具体的な例としては、一方の薬剤を投与し、その効果が発現し始める時期もしくは充分に発現している間に、他方の薬剤を投与して作用させる方法である。このような方法は一方の薬剤の効果発現に時間を要する場合、又は、一方の薬剤の効果が長期間維持される場合で両薬剤の相互作用を避けたい場合等に有用である。
本発明の好ましい態様においては、抗血小板薬として抗ＧＰＶＩ抗体、特にＧＰＶＩ消失作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体が用いられる。用いる抗体がコラーゲン惹起血小板凝集を直接抑制しない場合、即時効果は期待できないかもしれないが、そのＧＰＶＩ消失作用によりコラーゲン惹起血小板凝集抑制効果が長期間維持されるため、当該抗体は上記のような併用方法が適用される好適な例である。
また例えば、一方の薬剤の休薬期間に他方の薬剤を投与する方法が挙げられる。当該方法においては、治療効果の持続性向上、薬剤に対する認容性の向上又は副作用の軽減等の効果を期待しうるとともに、治療期間を長く設定することが可能となる。【００４０】
本発明の医薬は、コラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬と抗血栓症薬、特に、抗凝固薬または抗血小板薬とを併用することにより、血小板又は血液凝固系と関連する疾患、特に血栓形成を伴う疾患の予防又は治療における相乗効果、各薬剤の用量の低減、一方の薬剤による他方の薬剤の作用の増強、治療効果の持続性向上及び副作用の軽減等の効用が期待される。例えば、本発明の好適な例として、抗ＧＰＶＩ抗体、好ましくは、ＧＰＶＩ消失作用を有する抗ＧＰＶＩ抗体を先に投与し、その効果が発現している間に、抗血栓症薬、特に、抗凝固薬または抗血小板薬、好ましくは低分子ヘパリンもしくは低分子ＦＸａ阻害剤、特に、上述の式Ｉないし式ＶＩＩＩで表される化合物、または、好ましくはＰ２Ｙ１２拮抗薬、より好ましくはクロピドグレルを投与する併用方法が挙げられるが、本方法においては、抗ＧＰＶＩ抗体と抗血栓症薬、特に、抗凝固剤または抗血小板薬の相乗効果ないしは抗ＧＰＶＩ抗体による抗凝固剤または抗血小板薬の作用増強効果が認められることから、抗血栓症薬、特に、抗凝固剤または抗血小板薬の用量を低減でき、それにより副作用、例えば、出血時間の延長等を低減しうる。【００４１】
本発明において、「血管内皮細胞傷害を伴う疾患」には、血管内皮細胞傷害に起因する疾患もしくは病態、及び、疾患等に伴って血管内皮細胞傷害が生じるような疾患及び病態、ならびに、これらの疾患の合併症及びこれらの疾患を原疾患もしくは基礎疾患とする二次的疾患及び病態が含まれる。また、種々の疾患、好ましくは血管内皮細胞障害マーカー、例えば、可溶型トロンボモジュリンや可溶型Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ等が上昇する疾患が含まれるが、特に、可溶型ＩＣＡＭ−１が上昇する疾患が含まれる。これらの疾患等に対する本発明の予防・治療剤の効果は、公知の方法で確認することができ、例えば、実施例に記載の方法で確認しうる。【００４２】
本発明の第４の態様の予防・治療剤は、公知の実験系、例えば、実施例に示すようなストレプトゾトシン惹起糖尿病モデルラットにおいて、血中可溶型ＩＣＡＭ−１上昇抑制作用、すなわち、血管内皮細胞傷害抑制作用を示す。また、同モデルにおいて、臨床においても合併症の指標として用いられている凝固活性化の分子マーカーであるトロンビン／アンチトロンビン複合体（以下、ＴＡＴと略す）の上昇を改善することができる。従って、本発明の予防・治療剤は、糖尿病に伴う血管内皮細胞傷害及び臓器障害の予防又は治療に有用であり、糖尿病合併症、特に、糖尿病三大合併症である、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害および糖尿病性腎症に用いることができる。【００４３】
本発明の第４の態様の予防・治療剤は、公知の実験系、例えば、実施例に示すようなモノクロタリン惹起ＶＯＤモデルラットにおいて、血中可溶型ＩＣＡＭ−１上昇抑制作用、すなわち、血管内皮細胞傷害抑制作用を示す。また、同モデルにおいて、臨床においても骨髄移植合併症であるＶＯＤの指標として用いられている肝障害マーカーであるビリルビン値及びＧＯＴ値の上昇抑制作用を示す。従って、本発明の予防・治療剤は、種々の原因、例えば、各種の移植、特に骨髄移植に伴う、もしくは、移植前処置（超大量化学療法、放射線照射）、薬剤、例えば、シクロスポリンＡやタクロリムスの投与、急性ＧＶＨＤやＣＭＶ感染症などに起因する血管内皮細胞傷害又は臓器障害、例えば、肝障害、特に急性肝障害の予防又は治療に有用であり、移植、特に骨髄移植合併症、好ましくはＶＯＤに用いることができる。【００４４】
本発明の第４の態様の予防・治療剤は、公知の実験系、例えば、実施例に示すようなエンドトキシン惹起ＴＭＡモデルラットにおいて、血中可溶型ＩＣＡＭ−１上昇抑制作用、すなわち、血管内皮細胞傷害抑制作用を示す。また、同モデルにおいて、腎障害の指標として用いられている血中尿素窒素（ＢＵＮ）値及び肝障害マーカーであるＧＰＴ値の上昇抑制作用を示す。従って、本発明の予防・治療剤は、種々の原因、例えば、各種の移植、特に骨髄移植に伴う、もしくは、移植前処置（超大量化学療法、放射線照射）、例えば、シクロスポリンＡやタクロリムスの投与、感染症などに起因する血管内皮細胞傷害もしくは臓器障害、例えば、腎障害もしくは肝障害、特に急性腎障害もしくは急性肝障害の予防又は治療に有用であり、移植、特に骨髄移植合併症、好ましくはＴＭＡに用いることができる。また、各種の感染症、菌血症、エンドトキシン血症もしくは敗血症、これらの合併症、特に、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）や多臓器不全（ＭＯＦ）又は、これらに起因する血管内皮細胞傷害もしくは臓器障害、例えば、腎障害もしくは肝障害、特に急性腎障害もしくは急性肝障害の予防又は治療に用いることができる。【００４５】
本発明の第４の態様の予防・治療剤は、血管内皮細胞傷害の予防・治療作用ならびに血管内皮細胞傷害抑制作用を有する。従って、種々の血管内皮細胞傷害を伴う疾患の予防又は治療に有用である。対象となる疾患としては、例えば、特発性肺繊維症、気管支喘息、急性呼吸促迫症候群、等の呼吸器疾患、慢性関節リウマチ、多発性筋炎、全身性硬化症、多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血管炎、川崎病、乾癬、ウェゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、サルコイドーシス、グレーヴス病、等の自己免疫疾患、不安定狭心症、心筋梗塞、リウマチ性心臓病、バイパス手術、僧坊弁置換術、等の心疾患、動脈硬化、高脂血症、糖尿病、高トリグリセリド血症、等の生活習慣病、メラノーマ、胃癌、喉頭癌、等の悪性腫瘍、心臓移植、肝臓移植、腎臓移植、骨髄幹細胞移植、等の臓器移植、その他、各種感染症、敗血症、ＤＩＣやＭＯＦが挙げられる。より好ましくは、糖尿病合併症および臓器移植、特に骨髄幹細胞移植時の合併症、特に好ましくは、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症及び糖尿病性神経障害ならびにＶＯＤ及びＴＭＡが挙げられる。その他に、高安動脈炎、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎）、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、過敏性血管炎等の血管炎症候群が対象疾患として挙げられる。【００４６】
本発明の第４の態様の予防・治療剤は、その作用が各種血管内皮細胞傷害を伴う疾患のモデル動物で確認されているので、抗ＧＰＶＩ抗体が血管内皮細胞障害を伴う疾患の予防・治療剤としてｉｎ  ｖｉｖｏで有効であることがわかる。また、抗ＧＰＶＩ抗体はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストに付随するような出血傾向などの副作用も少なく、医薬品として安全性が高いことが期待されている（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９３，４５９−４６９，２００１）。さらに抗ＧＰＶＩ抗体のような抗体医薬品は生体内半減期が長く、医薬品として好ましい体内動態を示すことも確認されている。従って、本発明の予防・治療剤は、上述の疾患等の患者又はその疑いのある対象者等に、予防的に又は治療的に投与することができ、それによって、上述の疾患もしくは病態を予防もしくは治療でき、又はそれらの症状を緩和もしくは改善しうる。【００４７】
本発明の第４の態様の予防・治療剤は有効成分としてコラーゲン凝集を特異的に抑制する物質を含有していればよく、特に抗ＧＰＶＩ抗体を含有していればよく、公知の製剤製造法により製造することができる。当該、抗ＧＰＶＩ抗体は、薬剤として一般的に用いられる適当な担体または、媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油、鉱油、高級アルコール、高級脂肪酸、無害性有機溶媒など、さらには必要に応じて賦形剤、着色剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、溶解補助剤、吸着防止剤、安定化剤、保存剤、保湿剤、酸化防止剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤などと適宜組合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経鼻吸収剤、経口剤などの医薬用製剤、好ましくは注射剤に調製することができ、これらの具体例のいくつかについては公知である。注射剤の製剤としては、例えば凍結乾燥品や、注射用水剤、あるいは浸透圧ポンプに封入した形などで提供できる。【００４８】
本発明の医薬及び予防・治療剤ならびに有効成分としての各薬剤は、通常各薬剤について用いられる剤型、例えば錠剤、注射剤、散剤、坐剤等に調製され、人間その他の動物に対して投与される。それらは、自体公知の方法に従って、必要に応じて薬理学的に許容される担体と混合して種々の剤型の製剤、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等として、経口的又は非経口的（例、局所、直腸、皮下、静脈投与等）に安全に投与することができる。注射剤は、静脈内、筋肉内、皮下または臓器内投与あるいは直接病巣に投与することができる。本発明の併用剤の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
非経口投与のための組成物は、通常、必要に応じて、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された有効成分、例えば免疫グロブリンの溶液又はそれの混液を含む。種々の水性担体、例えば、水、緩衝水、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒトアルブミン溶液等が用いられ得る。これらの溶液は、無菌であり、そして一般的には微粒子物質が存在しない。これらの組成物は、慣用の、良く知られた滅菌方法により滅菌されうる。組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、薬学的に許容できる補助物質、例えばｐＨ調節及び緩衝化剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムを含みうる。これらの製剤中の有効成分、例えば抗体の濃度は、広範囲に、即ち、約０．００５重量％未満（通常は、少なくとも約１重量％）から１５又は２０重量％と大きい量まで変化することができ、主として、選択された投与の特定の様式に従って、液容量、粘性等に基づいて選択される。非経口投与組成物を調製するための現実の方法は、本技術分野の熟練者にとって公知又は明白であり、例えば、レミントンズ  ファーマシューティカル  サイエンス（第１５版、マック  パブリッシング  カンパニー、イーストン、ペンシルバニア、１９８０）（本引例をもって本明細書の一部と成す）に更に詳細に記載されている。
いくつかの薬学的組成物は、本発明の医薬の有効成分及びその疾患に於いて常用される他の治療剤を含みうる。また、予防的または治療的に投与することができる。【００４９】
本発明の医薬及び予防・治療剤ならびに有効成分としての各薬剤の投与量は、対象患者の年齢、体重、性別、感受性差、症状、症状の程度、薬剤の種類、剤形、投与方法、投与の時期、間隔、投与期間などにより異なるが、例えば、患者（成人、体重約６０ｋｇ）一人あたり、通常、本発明の医薬及び有効成分としての各薬剤として、それぞれ１日約０．０１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、とりわけ約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇを、なかでも約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇを１日１回から数回に分けて静脈投与される。もちろん、前記したように投与量は種々の条件で変動するので、前記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また範囲を超えて投与する必要のある場合もある。
本発明の医薬及び予防・治療剤ならびに有効成分としての各薬剤の剤型及び投与経路ならびに投与量、投与回数及び投与期間は、対象疾患、病態および患者の状態等によって、各薬剤について通常用いられる剤型及び投与経路から適宜選択され、また、通常用いられる投与量、投与回数及び投与期間の範囲の中から適宜設定される。本発明の医薬の好ましい態様においては、各薬剤の投与量、投与回数及び投与期間を単独で用いる場合に比べて低減でき、例えば、１／１．５、好ましくは１／２、より好ましくは１／３、さらに好ましくは１／１０に低減し得る。【００５０】
本発明の医薬または予防・治療剤において、抗血小板薬が抗ＧＰＶＩ抗体である場合、ヒトに適用する場合、その投与経路は、通常非経口投与であり、静脈内投与（ボーラス投与、連続点滴、間欠的点滴）、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、経皮投与、経鼻投与等があるが、好ましくは、皮下投与または静脈内投与である。ある局面においては、皮下投与は効果の持続性という点で好ましい。本発明の医薬または予防・治療剤、特に有効成分が抗ＧＰＶＩ抗体である場合のヒトに対する臨床投与量は適用される患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定されるが、通常成人一日あたり、静脈内投与で１〜１００００ｍｇ、好ましくは５〜１０００ｍｇであり、これを１回あるいは数回にわけて投与する。投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
本発明の医薬において抗凝固薬が低分子ヘパリンである場合、通常、投与経路は皮下投与であり、投与量は成人一日あたり、１〜１０００単位／ｋｇ、好ましくは５〜２００単位／ｋｇであるが、これに限定されない。また、本発明の医薬において抗凝固薬が低分子ＦＸａ阻害剤である場合、剤型及び投与方法等は必ずしも限定されないが、好ましくは経口剤及び経口投与である。
本発明第１の態様の医薬において各薬剤の用量比は必ずしも限定はなく、対象疾患、病態および患者の状態ならびに併用する薬剤等によって適宜決定されうる。例えば、１回、１日、１治療単位もしくは１クール当たりの投与量の比率が、０．００１〜１０００、好ましくは０．０１〜１００であるが、これに限定されるものではない。【００５１】
本発明の第４の態様の予防・治療剤において有効成分が抗ＧＰＶＩ抗体である場合、ヒトに適用する場合、その投与経路は、通常非経口投与であり、静脈内投与（ボーラス投与、連続点滴、間欠的点滴）、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、経皮投与、経鼻投与等があるが、好ましくは、皮下投与または静脈内投与である。ある局面においては、皮下投与は効果の持続性という点で好ましい。本発明の予防・治療剤の、特に有効成分が抗ＧＰＶＩ抗体である場合の、ヒトに対する臨床投与量は適用される患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定されるが、通常成人１日あたり、静脈内投与で１〜１００００ｍｇ、好ましくは５〜１０００ｍｇであり、これを１回あるいは数回にわけて投与する。投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。【００５２】
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
【実施例１】
【００５３】
ラットＧＰＶＩ遺伝子のクローニング
ラットＧＰＶＩ遺伝子は、先ず、公知であるマウスＧＰＶＩ遺伝子の情報を基に、全エクソンをそれぞれ増幅可能なプライマー（６対）を設計した（表１参照）。すなわち、第１エクソン用として、ｒａｔ  ＧＰＶＩ−ａとｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｃ（配列番号１，２）、第２，３エクソン用として、ｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｆとｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｇ（配列番号３，４）、第４エクソン用として、ｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｊとｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｌ（配列番号５，６）、第５エクソン用として、ｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｍとｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｏ（配列番号７，８）、第６エクソン用として、ｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｒとｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｓ（配列番号９，１０）、第７エクソン用として、ｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｖとｒａｔ  ＧＰＶＩ−ｗ（配列番号１１，１２）、の６対である。これらを用いて、ラットゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、特異的に増幅された遺伝子断片をシークエンスし、つなぎあわせることで、ラットＧＰＶＩ遺伝子配列を推定した。次に、この配列情報に基づいてラットＧＰＶＩ用プライマー（ｒａｔＧＰＶＩ−＃ａ，ｍＧＰＶＩ−ｍ）を再設計し（表１、配列番号１３，１４）、ラット骨髄由来ｃＤＮＡ（ラット骨髄由来ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写して合成）を鋳型としたＰＣＲで、全長遺伝子を増幅した。増幅産物をゲルから抽出し、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ（Ｔ）ベクター（タカラバイオ）にＴＡクローニングした後、塩基配列を決定した。また、この配列を有するプラスミドをｐＴＫ−２４７８とした。図１にラットＧＰＶＩ遺伝子の塩基配列を示す。【００５４】
【表１】
2007091719.tif 000012
【実施例２】
【００５５】
ラットＧＰＶＩ（Ｄ１Ｄ２）マウスＧＰＶＩ（Ｄ３）‐マウスＦｃ融合蛋白質（ｒＧＰＶＩ−ｍＦｃ）の作製ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白発現プラスミドの構築
ｐＴＫ−２４７８を鋳型とし、プライマー対（ｒａｔ  ＧＰＶＩ−＃ａおよびｒａｔ  ＧＰＶＩ−＃ｔ）（表１、配列番号１３、表２、配列番号１７）でＰＣＲを行うことで、ラットＧＰＶＩのＤ１およびＤ２（ＧＰＶＩの細胞外領域のドメイン１およびドメイン２）をコードする遺伝子断片Ａを増幅した。同様に、ｐＴＫ−２４４０（ＭＤ０７５４ＪＰ  Ｐ０５−０２６８  特願２００５−３４８５３４に記載）を鋳型とし、プライマー対（ｒａｔ  ＧＰＶＩ−＃ｓおよびＩｇＧ１−ｉ）（表２、配列番号１６，１５）でＰＣＲを行うことで、マウスＧＰＶＩのＤ３（ＧＰＶＩの細胞外ドメインで、Ｄ１およびＤ２以外の領域）をコードする遺伝子断片Ｂを増幅した。次にＡおよびＢを混合して鋳型とし、プライマー対（ｒａｔ  ＧＰＶＩ−＃ａおよびＩｇＧ１−ｉ）で再度ＰＣＲを行うことで、ラットＧＰＶＩ（Ｄ１およびＤ２）とマウスＧＰＶＩ（Ｄ３）が連結された遺伝子断片Ｃを得た。この断片Ｃの５’側をＥｃｏ  ＲＩ、３’側をＢａｍ  ＨＩで切断後、マウスＦｃ領域（ｍＦｃ）をＥＦプロモーターの下流に有するプラスミド（ｐＴＫ−２２９９：ＭＤ０７５４ＪＰ  Ｐ０５−０２６８  特願２００５−３４８５３４に記載）のＥｃｏ  ＲＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位に挿入することで、ｒＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白を発現可能なｐＴＫ−２４８３を構築した。【００５６】
【表２】
2007091719.tif 000013
【００５７】
なお、ｍＦｃをｈＦｃに置き換えたラットＧＰＶＩ−ヒトＦｃ（ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ）、マウスＧＰＶＩ−ヒトＦｃ（ｍＧＰＶＩ−ｈＦｃ）、ヒトＧＰＶＩ−ヒトＦｃ（ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ）、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ２，５−ｈＦｃ（ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃのループ２、５をｈＧＰＶＩの対応する配列で置換したＧＰＶＩ変異体蛋白質）、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ９，１１−ｈＦｃ（ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃのループ９、１１をｈＧＰＶＩの対応する配列で置換したＧＰＶＩ変異体蛋白質）及びｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃ（ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃのループ９をマウスＧＰＶＩの対応する配列に置換したＧＰＶＩ変異体蛋白質）の各発現プラスミドを、公知のヒトＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの配列、図１のラットＧＰＶＩの配列ならびにヒト及びラットＧＰＶＩのアミノ酸配列のアラインメント（図２）又はヒト及びマウスＧＰＶＩのアミノ酸配列のアラインメント（図３）に示された各ループのアミノ酸配列に基づいて、公知の方法（ＷＯ０１／８１０、ＷＯ０３／５４０２０、ＷＯ２００５／７８００等参照）を参考に、実施例２と同様の手法で作製した。
【実施例３】
【００５８】
ｒＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白質の発現および精製
ＣＯＳ−１細胞は１０％牛胎児血清入りのダルベッコＭＥＭ培地で継代した。無血清のダルベッコＭＥＭ培地にトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６、ロシュダイアグノスティックス）を混和後、ｐＴＫ−２４８３を適量混和し、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に培地交換したＣＯＳ−１細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で、３日間培養後上清を回収し、新たな培地でさらに３日間培養し、それらの上清をプロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−ｖＡ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にて精製したものを抗ラットＧＰＶＩ抗体作製用の抗原とした。得られたｒＧＰＶＩ−ｍＦｃを定法にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。すなわち、５−２０％のグラジエントゲルにサンプルと分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）をアプライし、電気泳動した後、銀染色した（図４）。図４中、レーン１は分子量マーカー、レーン３はｒＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白質を示す。尚、レーン２はｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合蛋白質である。
なお、ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ、ｍＧＰＶＩ−ｈＦｃ、ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ２，５−ｈＦｃ、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ９，１１−ｈＦｃ及びｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃも同様に発現及び精製した。
【実施例４】
【００５９】
抗ラットＧＰＶＩモノクローナル抗体の作製
Ａｌｕｍ（ＰＩＥＲＣＥ）１２．５μＬとＣｐＧアジュバント１ｍｇと精製ラットＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合タンパク２０μｇを混合し１００μＬとした投与抗原をｄｄＹマウス（メス、８週令、ＳＬＣ）の両足のフットパッド内にマイクロシリンジによりそれぞれ５０μＬ投与した。１１日後、投与抗原２０μｇを５０μＬの生理食塩水で希釈したものをフットパッド内に各２５μＬずつ投与した。３日後、腸骨リンパ節よりリンパ球を分離し、得られたリンパ球をＰ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ１（ＡＴＴＣ）と混合した後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。すなわち、０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと記載）で精製ラットＧＰＶＩ−ｈＦｃタンパクを３μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウエル添加した。４℃でＯｖｅｒ  Ｎｉｇｈｔ反応後、イオン交換水で３回洗浄し、２％Ｓｔａｂｉｌｇｕｒｄを含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。次に培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、精製ラットＧＰＶＩ−ｈＦｃタンパクと反応した細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１１日後、同様にスクリーニングを行い、精製ラットＧＰＶＩ−ｈＦｃタンパクと反応する抗体を産生するクローン１７クローンを得た（表３）。【００６０】
【表３】
2007091719.tif 000014
【実施例５】
【００６１】
ハイブリドーマが産生する抗体の調製
以後の操作は特に記載が無い限り４℃にて実施した。調製されたマウスハイブリドーマ培養液を、プレフィルターとして１μｍの孔径を有するカプセルカートリッジフィルター（東洋濾紙株式会社）、本フィルターとして０．２２μｍの孔径を有するフルオロダインフィルター（ＰＡＬＬ）およびミリパック２００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）をそれぞれ用い、室温にて清澄化し培養上清を得た。この培養上清を予めＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ）にて平衡化したプロテインＡ（ｒｍｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅバイオサイエンス）に吸着させ、非吸着蛋白質をＰＢＳ−にて洗浄後、非特異的に吸着している蛋白質を１０×ＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ）にて溶出した。その後、プロテインＡに結合している抗体を、１００  ｍＭグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ  ３．０）にて溶出した。溶出液はその容量を測定し、直ぐに１／１０容量の２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）を添加し、ｐＨを中性に戻し精製抗体溶液とした。この精製抗体溶液を、攪拌式セルを用いて、分子量カット３０，０００のバイオマックスＰＢ限外濾過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）により濃縮したのち、生理食塩液（大塚生食注、大塚製薬工場）に対して透析し、最終的な精製抗体溶液とした。得られた抗体を定法にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。すなわち、５−２０％のグラジエントゲルにサンプルと分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）をアプライし、電気泳動した後、銀染色した（図５）。図５中、レーン１は分子量マーカー、レーン２は精製抗体を示す。
【実施例６】
【００６２】
抗ラットＧＰＶＩ抗体における認識領域の解析
実施例４で得られた抗ラットＧＰＶＩモノクローナル抗体の認識ドメインの解析を行った。すなわちＰＢＳで精製ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃタンパクを２μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウエル添加した。３７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、２％Ｓｔａｂｉｌｇｕｒｄを含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。次に実施例５で精製したモノクローナル抗体を各種濃度に調製しポリプロピレンプレート（ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウエルで添加し、またそこにｒＧＰＶＩ−ｈＦｃ、ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ２，５−ｈＦｃ（ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃのループ２、５をｈＧＰＶＩの配列に置換したタンパク）、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ９，１１−ｈＦｃ（ｒＧＰＶＩ−ｈＦｃのループ９、１１をｈＧＰＶＩの配列に置換したタンパク）をそれぞれ５０μＬ／ウエルで添加し混合した。本混合サンプルをｒＧＰＶＩ−ｈＦｃを固相した上記のイムノプレートに５０μＬ／ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスカッパ鎖抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ｒＧＰＶＩ−ｈＬ２，５−ｈＦｃを添加した時に吸光度が低下しない抗体、つまりはループ２及び／又はループ５を認識している抗体が１種類（Ｆ１２３９−１１−１）、またｒＧＰＶＩ−ｈＬ９，１１−ｈＦｃを添加した時に吸光度が低下しない抗体、つまりはループ９及び／又はループ１１を認識している抗体が３種類（Ｆ１２３９−４−２、Ｆ１２３９−６−１、Ｆ１２３９−２２−２）存在する事が示された（図６）。
なお、上記の３種類の抗体（Ｆ１２３９−４−２、Ｆ１２３９−６−１、Ｆ１２３９−２２−２）は同様の方法においてマウスＧＰＶＩ−Ｆｃとは結合しなかった。ラットＧＰＶＩとマウスＧＰＶＩのループ１１のアミノ酸配列は同一であることを併せて考察すると、ループ１１が重要な認識領域とは考えにくく、上記の抗体は少なくともラットＧＰＶＩのループ９の一部を含有する構造を認識しているものと推定された。
【実施例７】
【００６３】
低分子ＦＸａ阻害薬：５‐クロロ−Ｎ−（［（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソ−４−モルホリニル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル］メチル）−２−チオフェンカルボキサミド（ＢＡＹ５９−７９３９）の合成
特表２００３−５１９１４１号公報の実施例４４に記載の方法で標記化合物を得た。機器分析データ（１Ｈ−ＮＭＲ）は同号公報記載の値と一致した。
【実施例８】
【００６４】
抗ラットＧＰＶＩ抗体のラット血小板に対する結合能
ラットの腹部大動脈から採血したクエン酸加血を１１０×ｇ、２５℃、１０分間遠心分離することにより多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を得た。次に得られたＰＲＰを０．５％非働化ＦＢＳと２．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳバッファー）で希釈し、実施例４にて作製した抗ラットＧＰＶＩモノクローナル抗体（Ｆ１２３９−６−１）を添加後、２５℃で３０分間静置した。３０分後、ＦＡＣＳバッファーで血小板を洗浄した後、抗マウスイムノグロブリンズ抗体−ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ）を添加して、２５℃、遮光下で３０分間静置した。３０分後、ＦＡＣＳバッファーで血小板を洗浄した後、フローサイトメーターＣＹＴＯＭＩＣＳ  ＦＣ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）で血小板の蛍光強度を測定することにより抗ラットＧＰＶＩモノクローナル抗体の結合について解析した。その結果、Ｆ１２３９−６−１はラット血小板に結合することが示された（図７）。
【実施例９】
【００６５】
抗ラットＧＰＶＩ抗体の血小板凝集抑制作用
実施例４および５にて作製した抗ラットＧＰＶＩモノクローナル抗体あるいは生理食塩水を、雄性ＳＤラットに３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。投与６日後に血液を採取し、７３０ｒｐｍで遠心することにより血小板多血漿（ＰＲＰ）を調製した。血小板凝集能（コラーゲンおよびＡＤＰに対する反応性）は血小板凝集測定装置（ＭＣＭ  ＨＥＭＡＴＲＡＣＥＲ  ３１３Ｍ、エム・シー・メディカル）を用いて測定した。すなわち、ＰＲＰの血小板数が３．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｕＬとなるように同一ラットより取得した血漿を用いて希釈した後、終濃度１ｍＭのＣａＣｌ２溶液を添加し、３７℃で３分間インキュベートした。さらに終濃度１０μｇ／ｍｌのコラーゲン溶液あるいは終濃度で２０μＭのＡＤＰ溶液を添加し、３７℃で１２分間インキュベートした。血小板凝集率は光の透過率を測定することにより求めた。その結果、Ｆ１２３９−６−１を投与したラットから採血、調製したＰＲＰにおいてコラーゲン惹起血小板凝集能は著明に低下したが、ＡＤＰ惹起血小板凝集は影響を受けなかった（図８）。
【実施例１０】
【００６６】
抗ラットＧＰＶＩ抗体のラット血小板ＧＰＶＩの消失作用
実施例９と同様の方法でＰＲＰを調製して、ラット血小板上におけるＧＰＶＩ蛋白質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより解析した。すなわち、ラット抗ＧＰＶＩ抗体を皮下投与したラットよりＰＲＰを調製し、これを２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳにより２回洗浄した。血小板数が０．５×１０６血小板／μＬになるようにＰｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒおよびＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加したトリスＳＤＳ  β−ＭＥサンプル処理液（第一化学薬品）で調製し、９９℃で５分間熱処理を行った。このサンプルを５−２０％の濃度勾配ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ）を使用し、１レーンあたり２．５×１０６血小板になるようにサンプルをチャージし、ゲル一枚につき３０ｍＡで泳動を行った。ブロッティングは常法に従い、セミドライ法により低蛍光のメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬＰＶＤＦ，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写した。ブロッティング後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で軽くすすぎ、ＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬株式会社）により４℃で一晩ブロッキングを行った。ブロッキング反応後、１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅ／ＴＰＢＳで希釈した一次抗体を添加、室温で一時間、回転混合しながら反応させた。一次抗体は抗ＧＰＶＩ抗体（ヒトＧＰＶＩ合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体）を使用した。一次抗体反応後、ＴＰＢＳによりよくすすいだ後に、ＴＰＢＳで洗浄した。洗浄後、１０％ＢｌｏｃｋＡｃｅ／ＴＰＢＳにより希釈した二次抗体を添加し室温で３０分間回転混合しながら反応させた。二次抗体はＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇｓ  ＨＲＰを使用した。
二次抗体反応後、ＴＰＢＳによりよく洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出を行なった。反応後、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により発光検出を行った。検出条件はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅモードを使用し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ発光中間体を検出した。検出されたバンドを解析ソフトＩｍａｇｅＱｕａｎｔ５．２を使用し、発現蛋白質の定量を行った。その結果、抗ラットＧＰＶＩモノクローナル抗体投与６日後に顕著なＧＰＶＩ蛋白質の発現量減少が認められ、当該抗体の血小板上からＧＰＶＩを消失させる作用が確認された（図９）。
【実施例１１】
【００６７】
低分子ヘパリンとの併用効果
低分子ヘパリンの血液凝固抑制作用は全自動血液凝固測定装置（ＡＭＡＸ  ＣＳ１９０、ＡＭＥＬＵＮＧ）を用いて測定した。すなわち、実施例９と同様の方法で調製したＰＲＰにコラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）および低分子ヘパリン（製品名：フラグミン静注、一般名：ダルテパリンナトリウム、キッセイ薬品工業）（終濃度：０．５Ｕ／ｍＬ）を添加し、３７℃にて３分間、インキュベートした後、ＣａＣｌ２（終濃度：１０ｍＭ）を加え凝固時間を測定した。その結果、無処置ラットから調製したＰＲＰにおいて低分子ヘパリンは凝固時間を２倍に延長したにすぎなかったが、Ｆ１２３９−６−１を投与したラットから調製したＰＲＰにおいて低分子ヘパリンは凝固時間を４．７倍に延長した。なお、Ｆ１２３９−６−１を投与したラットから調製したＰＲＰの凝固時間は無処置ラットから調製したＰＲＰの凝固時間の１．１倍にすぎなかった（図１０）。
【実施例１２】
【００６８】
ＢＡＹ５９−７９３９との併用効果
ＢＡＹ５９−７９３９の血液凝固抑制作用は全自動血液凝固測定装置（ＡＭＡＸ  ＣＳ１９０、ＡＭＥＬＵＮＧ）を用いて測定した。すなわち、実施例９と同様の方法で調製したＰＲＰにコラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）およびＢＡＹ５９−７９３９（終週濃度：２μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃にて３分間、インキュベートした後、ＣａＣｌ２（終濃度：１０ｍＭ）を加え凝固時間を測定した。その結果、無処置ラットから調製したＰＲＰにおいてＢＡＹ５９−７９３９は凝固時間を２．９倍に延長したにすぎなかったが、Ｆ１２３９−６−１を投与したラットから調製したＰＲＰにおいてＢＡＹ５９−７９３９は凝固時間を４．７倍に延長した。なお、Ｆ１２３９−６−１を投与したラットから調製したＰＲＰの凝固時間は無処置ラットから調製したＰＲＰの凝固時間の１．７倍にすぎなかった（図１１）。
【実施例１３】
【００６９】
抗ＧＰＶＩ抗体と抗凝固薬のｉｎ  ｖｉｖｏにおける併用効果
抗ＧＰＶＩ抗体と抗凝固薬のｉｎ  ｖｉｖｏにおける併用効果は、ラットＤＩＣモデルやラットＡＶ−ｓｈｕｎｔモデル動物を用いて検討することができる。当該モデルにおいて、抗ＧＰＶＩ抗体と抗凝固薬は相乗的に作用し、抗血栓作用を発揮する。
【実施例１４】
【００７０】
抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体の作製
精製ｈＧＰＶＩ−ｍＦｃ２０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）又はＡｌｕｍ（ＰＩＥＲＣＥ）及びオリゴＣｐＧと混合し、投与抗原とした。ｄｄＹマウス（メス、８週令、ＳＬＣ）に２回投与し、３日後、リンパ節又は脾臓よりリンパ球を分離した。
得られたリンパ球をＰ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ１（ＡＴＣＣ）と混合した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｓｉｇｍａ）を用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社、ｐ８３）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマをｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ及びｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃに対する結合活性を指標としてスクリーニングした。すなわち、精製ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃまたはｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃをＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウエル添加し、実施例６の記載の方法と同様にして固相化した。次に培養上清を各ウエルに添加し室温で１時間反応させた後、実施例６に記載の方法と同様にしてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ、Ｐ２６０）を用いて反応を行い、吸光度を測定した。その結果、精製ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃと結合し（吸光度１以上）、ｈＧＰＶＩ−ｍＬ９−ｈＦｃとは結合しない（吸光度０．５以下）抗体を産生している細胞を選択し、常法に従いクローニングした。８〜１０日後、同様にスクリーニングを行い、Ｌ９特異的マウス抗ヒトＧＰＶＩ抗体を産生するハイブリドーマを得た。実施例４と同様に、得られたハイブリドーマを培養し、モノクローナル抗体を精製した。各抗体のＧＰＶＩ結合活性を、上記ＥＬＩＳＡ法における吸光度が０．５以下を−、０．５〜１．０までを＋、１．０〜２．０を＋＋、２．０以上を＋＋＋として、表示した（表４）。
同様の手法を用いて、Ｌ２特異的マウス抗ヒトＧＰＶＩ抗体を産生するハイブリドーマ（Ｆ１２３２−１０−１）を得た。【００７１】
【表４】
2007091719.tif 000015
【実施例１５】
【００７２】
抗ＧＰＶＩ抗体による血小板ＧＰＶＩ消失作用の確認
実施例１０で調製したＦ１２３２−３７−２を１ｍｇ／ｋｇの投与量でカニクイザルに皮下投与し、投与前および投与後継時的な採血により得られた血液を試料として、血小板ＧＰＶＩの発現および血小板凝集能（コラーゲンおよびＡＤＰに対する反応性）を実施例９及び１０と同様に測定した。図１２に示すように、血小板数自体には影響を及ぼすことなく、投与１２時間後には血小板のコラーゲンに対する応答性の低下がみられ、投与翌日には血小板上のＧＰＶＩ量の低下が認められた。一方、同時に測定した血小板ＧＰＩＩＩａ量及びＧＰＩＸ量、ならびに血小板のＡＤＰに対する応答性は影響を受けなかった。
【実施例１６】
【００７３】
抗ＧＰＶＩ抗体の可変領域アミノ酸配列の決定
常法に従い、ハイブリドーマＦ１２３２−３７−２及びＦ１２３２−１０−１より一本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としたＭｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）によるＰＣＲで抗ＧＰＶＩ抗体の可変領域をコードするＤＮＡを増幅し、その塩基配列を決定した。各ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体Ｆ１２３２−３７−２及びＦ１２３２−１０−１の重鎖及び軽鎖可変領域の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列表に示した（配列番号１８−２５）。
【実施例１７】
【００７４】
モノクロタリン惹起ラットＶＯＤモデル
Ｄｅｌｅｖｅら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２９，１７７９−１７９１，１９９９）の方法に準じてモノクロタリン惹起ラットＶＯＤモデル動物を作成し、抗ラットＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）の効果を検討した。すなわち、雄性Ｗｉｓｔａｒラットに抗ラットＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）を１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体投与から７日後にモノクロタリンを１４０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。モノクロタリン投与より６日後にペントバルビタールにて麻酔し、腹部大動脈よりクエン酸加採血し、血漿を取得した。得られた血漿を用い、血管内皮細胞障害のマーカーとして可溶型ＩＣＡＭ−１をＥＬＩＳＡ法（Ｒａｔ  ｓＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｒ＆Ｄ社）にて測定した。また、肝障害のパラメータとしてビリルビンおよびＧＯＴをＤＲＩ−ＣＨＥＭ５０００（富士写真フィルム）を用いて測定した。結果を図１３に示す。モノクロタリンを経口投与することにより、可溶型ＩＣＡＭ−１の上昇が認められた。また、ビリルビンおよびＧＯＴの上昇が認められた。一方、抗ＧＰＶＩ抗体を投与しておいたラットでは、可溶型ＩＣＡＭ−１、ビリルビンおよびＧＰＴの上昇が抑制された。以上の実験結果から、本発明の予防・治療剤のＶＯＤにおける血管内皮細胞障害及び臓器障害、すなわち肝障害の抑制作用が確認され、ＶＯＤに対する予防及び／又は治療効果が示された。さらに、本実験結果から、種々の薬剤、特に移植時に用いられる薬剤による臓器障害、特に肝障害に対する予防及び／又は治療効果も期待される。
【実施例１８】
【００７５】
エンドトキシン惹起ラットＴＭＡモデル
Ｚｈｏｕら（Ｚｈｏｕ  ＸＪ，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，８０，１０７９−１０８７，２０００）の方法に準じてエンドトキシン惹起ラットＴＭＡモデル動物を作成し、抗ラットＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）の効果を検討した。すなわち、雌性Ｗｉｓｔａｒラットに抗ラットＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）を１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体投与から６日後に、ペントバルビタールにて麻酔し、エンドトキシンを４０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。エンドトキシン投与開始前および投与開始より４時間後に頚静脈からクエン酸加採血し、血漿を得た。得られた血漿を用い、肝障害マーカーとしてＧＰＴを、腎障害マーカーとしてＢＵＮを測定した。結果を図１４に示す。エンドトキシンを静脈内投与することによりＧＰＴおよびＢＵＮは上昇するが、抗ＧＰＶＩ抗体はこれらのパラメータの上昇を抑制した。以上の実験結果から、本発明の予防・治療剤のＴＭＡにおける血管内皮細胞障害及び臓器障害、すなわち、腎障害及び肝障害の抑制作用が確認され、ＴＭＡに対する予防及び／又は治療効果が示された。さらに、本実験結果から、エンドトキシンに起因する疾患、例えば、敗血症、ＤＩＣもしくはＭＯＦに対する予防及び／又は治療効果も期待される。
【実施例１９】
【００７６】
ストレプトゾトシン惹起ラット糖尿病モデル
Ｐｆｌｕｅｇｅｒら（Ｐｆｌｕｅｇｅｒ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７７（５Ｐｔ２），Ｒ１４１０−Ｒ１４１７）の方法に準じてストレプトゾトシン惹起ラット糖尿病モデル動物を作成し、抗ラットＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）の効果を検討した。すなわち、雄性Ｗｉｓｔａｒラットに抗ラットＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）を１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体投与から７日後にストレプトゾトシンを５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。ストレプトゾトシン投与より２週間後にペントバルビタールにて麻酔し、腹部大静脈よりクエン酸加採血し、血漿を得た。得られた血漿を用い、血管内皮細胞障害のマーカーとして可溶性ＩＣＡＭ−１をＥＬＩＳＡ法（Ｒａｔ  ｓＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｒ＆Ｄ社）にて測定した。結果を図１５に示す。ストレプトゾトシンを腹腔内投与することにより、可溶型ＩＣＡＭ−１の上昇が認められた。一方、抗ＧＰＶＩ抗体を投与しておいたラットでは、可溶型ＩＣＡＭ−１の上昇が抑制された。以上の実験結果から、本発明の予防・治療剤の糖尿病における血管内皮細胞障害の抑制作用が確認され、糖尿病合併症に対する予防及び／又は治療効果が期待される。
【実施例２０】
【００７７】
抗ＧＰＶＩ抗体と抗凝固薬のｉｎ  ｖｉｖｏにおける併用効果
雄性ＳＤラットに抗ＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）を１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体投与から６日後にペントバルビタールにて麻酔し、低分子ヘパリン（製品名：フラグミン静注、一般名：ダルテパリンナトリウム、キッセイ薬品工業）を静脈内投与した。低分子ヘパリン投与５分後に腹部大動脈よりクエン酸加採血し、Ｓｙｓｍｅｘ  Ｆ−８２０に供し、血小板数等を求めた後、１１０×ｇ、２５℃、１０分間遠心分離することにより多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を、引き続き、１８００ｇ、２５℃、１０分間遠心分離することにより乏血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｐｏｏｒ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＰＰ）を得た。ＰＲＰを用いてクロット形成時間の測定を以下のように行った。先ず、血小板の濃度が１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＲＰをＰＰＰで希釈した後、終濃度１０ｍＭのＣａＣｌ２溶液と終濃度５０μｇ／ｍＬのコラーゲンを添加し、濁度の変化をＴＨＥＲＭＯｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で６００ｎｍの吸光度を測定した。６００ｎｍの吸光度の最低値を最小値、６００ｎｍの吸光度がプラトーに達したところを最大値としたときの最小値と最大値の５０％点を算出しクロット形成時間とした。結果を図１６に示す。抗ＧＰＶＩ抗体と低分子ヘパリンを併用することによりクロット形成時間は６０分を超過した（図１６（Ａ））。なお、低分子ヘパリン単剤では３００Ｕ／ｋｇを用いても３６分程度までしか延長しなかった（図１６（Ｂ））。
【実施例２１】
【００７８】
抗ＧＰＶＩ抗体と抗凝固薬との併用のラット出血時間に及ぼす影響
雄性ＳＤラットに抗ＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）を１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体投与から６日後にペントバルビタールにて麻酔し、低分子ヘパリン（製品名：フラグミン静注、一般名：ダルテパリンナトリウム、キッセイ薬品工業）を静脈内投与した。低分子ヘパリン投与５分後に尾の先端から５−６ｃｍの背側に動脈および静脈を避け、剃刀を用いて切創を作製した。尾の先端１２ｃｍを垂直にたらし、作製した切創に３０秒間隔で濾紙をあて、血液が付着しなくなるまでの時間を測定し出血時間とした。結果を図１７に示す。抗ＧＰＶＩ抗体１ｍｇ／ｋｇ単剤、低分子ヘパリン１００Ｕ／ｋｇ単剤および併用時のいずれにおいて出血時間はほとんど延長しなかった（図１７（Ａ））。一方、低分子ヘパリン３００Ｕ／ｋｇ単剤においては２０分を超える出血時間の延長がみられた（図１７（Ｂ））。
【実施例２２】
【００７９】
抗ＧＰＶＩ抗体と抗血小板薬のｉｎ  ｖｉｖｏにおける併用効果
雄性ＳＤラットに抗ＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）を０．１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体投与から６日後にクロピドグレル（製品名：プラピックス錠、一般名：硫酸クロピドグレル、サノフィ・アベンティス）を経口投与した。ペントバルビタールにて麻酔し、クロピドグレル投与４時間後に腹部大動脈よりクエン酸加採血し、Ｓｙｓｍｅｘ  Ｆ−８２０に供し、血小板数等を求めた後、１１０×ｇ、２５℃、１０分間遠心分離することにより多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を、引き続き、１８００ｇ、２５℃、１０分間遠心分離することにより乏血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｐｏｏｒ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＰＰ）を得た。ＰＲＰを用いてコラーゲンおよびＡＤＰに対する反応性を以下のように行った。先ず、血小板の濃度が３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＲＰをＰＰＰで希釈した後、終濃度１ｍＭのＣａＣｌ２溶液を添加し、３７℃で３分間インキュベートした。さらに終濃度１０μｇ／ｍｌのコラーゲン溶液あるいは終濃度で２０μＭのＡＤＰ溶液を添加し、３７℃で１２分間インキュベートしながらＰＲＰの光の透過率をＭＣＭヘマトレーサー３１３Ｍ（エム・シー・メディカル）で測定することによりコラーゲンあるいはＡＤＰ応答性の血小板凝集を求めた。結果を図１８に示す。クロピドグレル３ｍｇ／ｋｇ単剤はコラーゲン惹起血小板凝集抑制作用が認められなかったが、抗ＧＰＶＩ抗体を併用することにより血小板凝集抑制作用の増強が認められた（図１８）。一方、クロピドグレル１０ｍｇ／ｋｇ単剤では約５０％の阻害が認められたが、その作用は抗ＧＰＶＩ抗体０．１ｍｇ／ｋｇとクロピドグレル３ｍｇ／ｋｇの併用より弱かった。
【実施例２３】
【００８０】
抗ＧＰＶＩ抗体と抗血小板薬併用時のラット出血時間に及ぼす影響
雄性ＳＤラットに抗ＧＰＶＩ抗体（Ｆ１２３９−６−１）を０．１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。抗体投与から６日後にクロピドグレル（製品名：プラピックス錠、一般名：硫酸クロピドグレル、サノフィ・アベンティス）を経口投与した。ペントバルビタールにて麻酔し、クロピドグレル投与４時間後に尾の先端から５−６ｃｍの背側に動脈および静脈を避け、剃刀を用いて切創を作製した。尾の先端１２ｃｍを垂直にたらし、作製した切創に３０秒間隔で濾紙をあて、血液が付着しなくなるまでの時間を測定し出血時間とした。切創作製後２０分後までに止血しない個体については出血時間を２０分として集計した。結果を図１９に示す。抗ＧＰＶＩ抗体単剤、クロピドグレル３ｍｇ／ｋｇ単剤および併用時のいずれにおいて出血時間はほとんど延長しなかった（図１９）。一方、クロピドグレル１０ｍｇ／ｋｇ単剤では、２０分を超えて出血する個体が認められた。
【実施例２４】
【００８１】
抗ＧＰＶＩ抗体のラットＰＡＤモデルに対する作用
体重が均一になるように群分けをした非絶食ＳＤラット（雄、Ｃｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳ，８ｗ）に３ｍｇ／ｋｇのＦ１２３９−６−１もしくは生理食塩水を１ｍＬ／ｋｇの用量で皮下投与する。投与６日後にペントバルビタールの腹腔内投与（５０ｍｇ／ｋｇ，１ｍＬ／ｋｇ）により麻酔し、大体動脈にカニューレを設置する。このカニューレより２．５ｍｇ／ｋｇのラウリン酸を０．３３ｍＬ／ｋｇの用量で投与してモデル動物を作成する。７日後に次の方法により病変をスコアリングして薬効を評価する。０：正常、１：病変部が爪の部分に限局される、２：病変部が指の部分に限局される、３：指の部分が脱落しはじめるか、病変部が足全体に及ぶ、４：足の部分が脱落しはじめるか、病変部が脚部に及ぶ。
抗体投与動物については生理食塩水投与群と比べて評価スコアが有意に低下する。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明により、有効成分としてコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する抗血小板薬及び／又は抗血栓症薬を含有し、両薬剤を併用するためのものである、血小板又は血液凝固系と関連する疾患の予防又は治療のための医薬等を提供できる。また、本発明により、有効成分としてコラーゲン惹起血小板凝集を特異的に抑制する物質を含有し、血管内皮障害を伴う疾患の予防又は治療のための医薬等を提供できる。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号１は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号２は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号３は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号４は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号５は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号６は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号７は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号８は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号９は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１０は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１１は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１２は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１３は実施例１、２のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１４は実施例１のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１５は実施例２のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１６は実施例２のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号１７は実施例２のＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列である。
［配列表］
2007091719.tif 000016
2007091719.tif 000017
2007091719.tif 000018
2007091719.tif 000019
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2007091719.tif 000024
2007091719.tif 000025
2007091719.tif 000026
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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