【手続補正書】
【提出日】平成20年6月6日(2008.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】 
【請求項１】  以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
a）選択された遺伝子の2つの対立遺伝子を有する被験者由来のDNA試料を提供する段階；
b）第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率が少なくとも約1.5：1にまで増加するように、DNAの増幅を必要としない方法によって、選択された遺伝子の第一対立遺伝子を濃縮する段階；
c）第一対立遺伝子における2つまたはそれ以上の多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項２】  選択された遺伝子における2つまたはそれ以上の多型部位を同定するために、段階（a）において提供されたDNAの遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】  段階（a）において提供されたDNAの遺伝子型を、段階（c）において決定された第一対立遺伝子における2つまたはそれ以上の多型部位の遺伝子型と比較することにより、遺伝子の第二対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階をさらに含む方法であって、
それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する、請求項1記載の方法。
【請求項４】  以下をさらに含む、請求項1記載の方法：
d）選択された遺伝子の2つの対立遺伝子を有する被験者由来のDNAの第二の試料を提供する段階；
e）第二対立遺伝子の第一対立遺伝子に対する比率が少なくとも約1.5：1にまで増加するように、DNAの増幅を必要としない方法によって、選択された遺伝子の第二対立遺伝子を濃縮する段階；および
f）第二対立遺伝子の2つまたはそれ以上の多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の2つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項５】  DNA試料が、選択された遺伝子の2つまたはそれ以上の多型部位を含むDNA分子の増幅によって得られる、請求項1記載の方法。
【請求項６】  DNA試料がcDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項７】  濃縮段階以前に、試料中のDNAを断片化する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】  DNAの断片化の段階が制限エンドヌクレアーゼ消化を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】  第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】  第二対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項１１】  濃縮段階によって、第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率を少なくとも約2：1にまで増加させる、請求項1記載の方法。
【請求項１２】  濃縮段階によって、第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率を少なくとも約5：1にまで増加させる、請求項1記載の方法。
【請求項１３】  濃縮段階によって、第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率を少なくとも約10：1にまで増加させる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】  以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
a）選択された遺伝子の2つの対立遺伝子を有する被験者由来のDNA試料を提供する段階；
b）2つまたはそれ以上の対立遺伝子のうち、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子には結合するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子には実質的に結合しないDNA結合分子に、DNAを接触させる段階；
c）DNA結合分子と第一対立遺伝子との間に複合体を形成する段階；
d）複合体形成していないDNAから、そのように形成された複合体の少なくとも1つの分画を、少なくとも部分的に精製する段階；
e）第一対立遺伝子の第二多型部位における遺伝子型を解析し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項１５】  遺伝子における2つまたはそれ以上の多型部位を同定するために、段階（a）において提供されたDNA試料を遺伝子型決定する段階、および選択された遺伝子の2つまたはそれ以上の多型部位における遺伝子型を、第一対立遺伝子の2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプと比較する段階をさらに含む方法であって、
それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】  以下をさらに含む、請求項14記載の方法：
f）被験者由来の第二のDNA試料を提供する段階；
g）2つの対立遺伝子のうち、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第二対立遺伝子には結合するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子には実質的に結合しない第二DNA結合分子とDNAを接触させる段階；
h）第二DNA結合分子と第二対立遺伝子との間に複合体を形成する段階；
i）複合体形成していないDNAから、そのように形成された複合体の少なくとも1つの分画を、少なくとも部分的に精製する段階；
j）第二対立遺伝子の第二多型部位における遺伝子型を解析し、それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項１７】  以下をさらに含む、請求項14記載の方法：
f）被験者由来の第二のDNA試料を提供する段階；
g）2つの対立遺伝子のうち、第二多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第二対立遺伝子には結合するが、第二多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子には実質的に結合しない第二DNA結合分子に、DNAを接触させる段階；
h）第二DNA結合分子と第二対立遺伝子との間に複合体を形成する段階；
i）複合体形成していないDNAから、そのように形成された複合体の少なくとも1つの分画を、少なくとも部分的に精製する段階；
j）第二対立遺伝子の第一多型部位における遺伝子型を解析し、それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項１８】  第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１９】  第二対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項15から17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】  DNA結合分子が二本鎖DNAに結合する、請求項14記載の方法。
【請求項２１】  DNA結合分子が単鎖DNAに結合する、請求項14記載の方法。
【請求項２２】  DNA結合分子がオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸である、請求項14記載の方法。
【請求項２３】  DNA結合分子がタンパク質である、請求項14記載の方法。
【請求項２４】  タンパク質がジンクフィンガーDNA結合タンパク質である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】  DNA結合分子が標識される、請求項14記載の方法。
【請求項２６】  DNA結合分子がビオチン化される、請求項14記載の方法。
【請求項２７】  DNA結合分子が直接的または間接的に固体支持体に結合される、請求項14記載の方法。
【請求項２８】  タンパク質が転写因子である、請求項23記載の方法。
【請求項２９】  タンパク質が、DNA切断活性を実質的に欠く不活性化制限エンドヌクレアーゼ、または二価陽イオンの非存在下において使用される制限エンドヌクレアーゼである、請求項23記載の方法。
【請求項３０】  段階（d）が、DNA結合分子に対する抗体に複合体を接触させる段階を含む、請求項14記載の方法。
【請求項３１】  抗体が固体支持体に結合される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】  選択された遺伝子がApoEである、請求項14記載の方法。
【請求項３３】  接触段階以前に試料中のDNAを断片化する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項３４】  DNAを断片化する段階が制限エンドヌクレアーゼ消化を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】  DNA結合分子が捕捉試薬と相互作用するリガンドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３６】  段階（d）が、捕捉試薬と相互作用するリガンドを複合体に接着する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３７】  リガンドが、ポリヒスチジンタグ、抗体、ニッケル、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、磁気粒子、およびアプタマーからなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３８】  オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、ワトソン-クリック塩基対形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項22記載の方法。
【請求項３９】  オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、Dループ形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項22記載の方法。
【請求項４０】  オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、三本鎖ヘリックス形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項22記載の方法。
【請求項４１】  オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、フーグステン型塩基対形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項22記載の方法。
【請求項４２】  オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、逆フーグステン型塩基対形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項22記載の方法。
【請求項４３】  DNA結合分子が配列特異的なポリアミドである、請求項14記載の方法。
【請求項４４】  以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
a）選択された遺伝子の2つの対立遺伝子を有する被験者由来のDNA試料を提供する段階；
b）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子に結合し、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子には実質的に結合しない作用物質と、DNAを接触させる段階；
c）第一対立遺伝子に作用物質を架橋結合し、架橋形成した複合体を含む混合物を形成する段階；
d）架橋形成した複合体を含む混合物を、第一対立遺伝子の第一多型部位において、および、第一対立遺伝子の第二多型部位において、架橋形成した複合体を変性できないエキソヌクレアーゼに接触させる段階；および
e）第一対立遺伝子の第二多型部位における遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項４５】  第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】  作用物質がオリゴヌクレオチドである、請求項44記載の方法。
【請求項４７】  オリゴヌクレオチドがホスホロチオアート基を含む、請求項46記載の方法。
【請求項４８】  作用物質を架橋結合する段階が、二核白金（PtII）、トランス白金（II）、またはソラレンからなる群より選択される化合物に作用物質を接触させる段階を含む、請求項44記載の方法。
【請求項４９】  作用物質がペプチド核酸、三本鎖ヘリックス、または配列特異的なポリアミドからなる群より選択される、請求項44記載の方法。
【請求項５０】  エキソヌクレアーゼが、I型ヘビ毒ホスホジエステラーゼまたはT4 DNAポリメラーゼからなる群より選択される、請求項44記載の方法。
【請求項５１】  選択された遺伝子がApoEである、請求項44記載の方法。
【請求項５２】  以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
a）選択された遺伝子の2つの対立遺伝子を有する被験者由来のDNA試料を提供する段階；
b）DNAを断片化し、選択された遺伝子の2つまたはそれ以上の多型部位を含むDNA断片を形成する段階；
c）断片の末端を修飾し、エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性である修飾断片を形成する段階；
d）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子を切断するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない第二対立遺伝子は切断しない制限エンドヌクレアーゼを用いて修飾断片を切断する段階；
e）少なくとも1つの非修飾末端をもつDNAを消化するエキソヌクレアーゼを用いて、段階（d）の切断産物を消化し、第一対立遺伝子を実質的に除去する段階；および
f）第二対立遺伝子に存在する第二多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項５３】  第二対立遺伝子における第三多型部位の遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】  エキソヌクレアーゼが単鎖エキソヌクレアーゼである、請求項52記載の方法。
【請求項５５】  エキソヌクレアーゼが二本鎖エキソヌクレアーゼである、請求項52記載の方法。
【請求項５６】  単鎖エキソヌクレアーゼが、大腸菌エキソヌクレアーゼIII、λファージエキソヌクレアーゼ、T7 エキソヌクレアーゼ、T4ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、および大腸菌ポリメラーゼIのエキソヌクレアーゼ活性からなる群より選択される、請求項54記載の方法。
【請求項５７】  二本鎖エキソヌクレアーゼがBal31である、請求項55記載の方法。
【請求項５８】  単鎖ヌクレアーゼを用いて残余単鎖DNAを除去する段階をさらに含む、請求項54記載の方法。
【請求項５９】  以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
a）選択された遺伝子の2つの対立遺伝子を有する被験者由来のDNA試料を提供する段階
b）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子を切断するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない第二対立遺伝子は切断しない、天然または合成の制限エンドヌクレアーゼを用いてDNAを切断する段階；
c）増幅産物が第二対立遺伝子のみから生じる、エンドヌクレアーゼ制限試料に対して増幅法を実施する段階；
d）第二対立遺伝子における第二多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項６０】  第二対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項59記載の方法。  
【請求項６１】  サイズ選択法によって増幅産物を単離する段階をさらに含む、請求項59記載の方法。
【請求項６２】  遺伝子がApoEである、請求項59記載の方法。
【請求項６３】  制限エンドヌクレアーゼがNotIである、請求項59記載の方法。
【請求項６４】  以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
a）選択された遺伝子の2つの対立遺伝子を有する被験者由来のDNA試料を提供する段階；
b）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子を切断するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない第二対立遺伝子は切断しない、天然または合成の制限エンドヌクレアーゼを用いてDNAを切断する段階；
c）サイズ選択法によって、第一対立遺伝子を第二対立遺伝子から少なくとも部分的に分離する段階；
d）第一対立遺伝子における第二多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項６５】  第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項64記載の方法。
【請求項６６】  以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、2つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
a）平らな表面上に、選択された遺伝子の2つまたはそれ以上の多型部位を含むDNA断片を固定化する段階；
b）作用物質の選択的な結合をさせるような条件下にて、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ対立遺伝子に選択的に結合する作用物質と固定化DNA断片を接触させる段階；
c）第二作用物質の選択的な結合をさせるような条件下にて、第二多型部位において、選択された遺伝子型を有する対立遺伝子に選択的に結合する第二作用物質と、固定化DNA断片とを接触させる段階；および
d）少なくとも1つのDNA断片上の第一作用物質および第二作用物質の位置を光学マッピングする段階。
【請求項６７】  第一作用物質および第二作用物質のいずれかまたは両方が、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６８】  第一作用物質の選択的な結合がDループの形成をもたらし、第二作用物質の選択的な結合がDループの形成をもたらす、請求項66記載の方法。
【請求項６９】  RecAタンパク質に固定化DNA断片を接触させる段階をさらに含む、請求項66記載の方法。
【請求項７０】  第一作用物質および第二作用物質がタンパク質である、請求項66記載の方法。
【請求項７１】  タンパク質が、転写因子、DNA切断活性を実質的に欠く不活性化制限エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーDNA結合タンパク質、および二価陽イオンの非存在下にて使用される制限エンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項66記載の方法。
【請求項７２】  標的核酸配列における多型部位の遺伝子型を決定するための方法であり、以下の段階を含む方法：
a）標的核酸配列を含むDNA試料を提供する段階；
b）標的核酸配列を増幅させ、増幅産物を生み出す段階であり、増幅により、多型部位に近接した切断部位をもつ第一制限酵素および第二制限酵素によって増幅産物が切断されるような配列の、増幅産物への挿入がもたらされる段階。
c）増幅産物を切断する段階；および
d）多型部位の遺伝子型を決定する段階。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
様々な態様において、本方法は、第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む；作用物質はオリゴヌクレオチドである；オリゴヌクレオチドはホスホロチオアート基を含む；作用物質は、以下からなる群より選択される化合物に作用物質を接触させる段階を含む：二核白金（PtII）、トランス白金（II）、またはソラレン；作用物質は、以下からなる群より選択される：ペプチド核酸、三本鎖ヘリックス、または配列特異的ポリアミド；エキソヌクレアーゼはI型ヘビ毒ホスホジエステラーゼまたはT4 DNA ポリメラーゼからなる群より選択される；および選択された遺伝子はApoEである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  特定の制限酵素FokIおよびFspIの制限酵素認識部位を組み入れるように設計されたプライマーの描写。プライマー（プライマーR配列）は標的DNAの所望の増幅領域由来の変更された塩基を有する。多型ヌクレオチドは標的DNA領域に含まれ、下線で示されている。PCR増幅後、組み入れられたプライマーの変更塩基対はそれによりアンプリコン中にFokIおよびFspI制限酵素部位を組み入れる。アンプリコンは、引き続いて、両酵素による消化の最適条件下でFokIおよびFspI制限酵素存在下で消化されうる。酵素消化後の結果としての断片は、8 merおよび12 merであり、描写されている通りである。この図において、多型（A、下線部）は12 mer断片内に含まれている。
【図２】  この図は、ある鎖上において認識部位の3'に9塩基の距離で、認識配列の外側で、そして別の鎖上の認識部位から13塩基離れてDNAを切断し、4塩基突出（突出している5'末端）を残す、タイプIIS制限酵素であるFokIの有用性を描写している。この図に示されているように、FokI認識部位がプライマーの3'端から12塩基またはそれ未満に位置するようにプライマーを設計することにより、FokI切断がプライマー配列の外側で切断することを確実にすることが可能である。消化後に平滑末端を残す制限酵素であるFspIの有用性がさらに示されている。消化後、FspI認識部位、TGCGCA、は、示されているような断片を生じる。
【図３】  この図においては、本発明に関するFokI/FspIの酵素対の有用性が示される。FspI認識部位はFokI認識部位と重複し、2つの部位が部分的に組み合わせられることを可能にする。したがって、プライマー中に組み合わせFspI/FokI配列を含むことは、修飾プライマー中に導入される塩基数を減少させ、プライマー設計をより単純にし、そして引き続く増幅反応において機能する可能性をより高くする。
【図４】  この図においては、本発明におけるプライマー設計の別の方法が、内部ループを有するプライマーを使用することを含む。プライマー（プライマーR1）は天然型配列に相当する塩基の1つが除去され、そしてループで置換されるように設計される。この事例においては、標的配列の下に矢印で示されているG/Cは、FokIおよびFspIに関する認識部位で置換される。DNA鋳型にハイブリダイゼーションされた時に、プライマーはループ構造を形成する。このループは増幅過程においてアンプリコンに組み入れられ、それによりFokIおよびFspI制限酵素部位（囲みで示されている）が導入される。結果生じるアンプリコンは最適消化条件下でFokIおよびFspIを用いてインキュベーションされ、8 merおよび12 mer断片を生産する。図1にあるように、12 merは多型塩基（A、下線部）を含み、そして多型部位の塩基を同定するために質量分析により解析することが可能である。
【図５】  標的DNAの増幅された領域に別の制限酵素認識部位を組み入れることが示されている。FspI/FokI酵素対に関して図1〜4に描写されているように、この図において、PvuII/FokI制限酵素部位が図1〜4に関して以前に記載されたのと同じ方法で組み入れられることが可能である。標的DNA配列にプライマーがハイブリダイズする時に、BsgI/PvuII部位がヘアピンループ構造を形成するようにプライマーが設計される。PCRによる増幅の後、結果生じるアンプリコンは、結果生じるアンプリコン中に組み入れられたPvuII/FokI部位を有する（囲み配列により示されているように）。PvuIIおよびBsgIに関して最適消化条件下で消化した後、14 merおよび16 merの結果として生じた断片は、質量分析解析に十分であり、そして多型部位は16 mer中に含まれる（A、下線部）。
【図６】  質量分析解析用の多型部位を断片を調整するための別の制限酵素対がこの図に示されている。PvuII/FokI制限酵素認識部位は、標的DNA配列にハイブリダイズされた時に、ヘアピンループを形成する。PCRによる増幅の後、結果生じるアンプリコンは、結果生じるアンプリコン中に組み入れられたPvuII/FokI部位を有する（囲み配列により示されているように）。PvuIIおよびFokI制限に関して最適消化条件下で消化した後、16 merおよび20 merの結果として生じた断片は、質量分析解析に十分であり、そして多型部位は20 mer中に含まれる（A、下線部）。
【図７】  この図においては、図4に描写されている方法の修飾が示される。図4に示されているように、多型を含むDNAセグメントが2個のプライマーを用いて増幅される。1個のプライマーは、鋳型DNAにハイブリダイズされた時にヘアピンループを形成する、鋳型DNAに相補的ではない、挿入されたDNAセグメントを用いて設計される。非相補的DNAセグメントの挿入は、PCR増幅後に、重複しているFokIおよびFspI制限酵素部位（囲みで示されている）を組み入れる結果となる。PCR増幅反応に続いて、反応物は、未取りこみプライマー、ヌクレオチドおよび緩衝液構成成分を除去するために浄化処理に供される。PCR産物はその後、FokI制限酵素を用いて消化され、プライマーの3'末端から多型ヌクレオチドを超えて伸長する5'突出を生じる。3'陥没末端はその後、多型部位における可能性のあるヌクレオチド塩基の1つに相当する標準ヌクレオチドが質量修飾ヌクレオチド（Tmod）である、外来的に添加されたヌクレオチドを用いて埋めることが可能である。これらの断片は修飾多型ヌクレオチドの質量分析解析に十分である。
【図８】  引き続く消化および調整された断片の質量分析解析のために、アンプリコン中に単一の制限酵素認識部位を組み入れることがこの図には示されている。その認識部位の5'側に1つおよび3'側に1つの、2つの二本鎖切断を作製する能力がある制限酵素であるBcgIを組み入れることがこの図に示されている。BcgIの認識部位は12/10（N)CGA(N)6TGC(N）12/10であり、消化後、断片を用いた質量分析解析および多型塩基同定に十分である、断片を結果生じる。
【図９】  制限酵素が二本鎖切断を生じる代わりにDNAアンプリコン中にニックを生成する制限酵素認識部位を含む、本発明の有用性の例がこの図に示されている。この図に示されているように、プライマーRはFokI制限酵素部位に加えてN.BstNBI認識部位
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を組み入れるように設計される。以前の図にあるように、プライマーは標的DNA領域にハイブリダイズされた時にヘアピンループ構造を形成する、しかしながらPCRアンプリコンは組み入れられた制限酵素部位配列を有している。FokIおよびN.BstNBIを用いた消化は多型塩基（T、下線部）を含む10 mer断片を結果として生じる。そのような断片は質量分析を用いた解析に十分である。
【図１０】  上記図9のニック酵素計画と類似した戦略がこの図に示されている。この方法においては、1個の制限酵素および、デオキシリボヌクレオチドの1つに対してリボヌクレオチドへの置換を含むプライマー。示されているように、プライマーは標的DNA配列にハイブリダイズされた時にヘアピンループを形成するFokI認識部位を含むように設計される。プライマーはまた付加的にアンプリコンの中に組み入れられるリボヌクレオシド（rG）置換を有する。リボヌクレオシド置換は塩基性に不安定であり、そして塩基性条件下ではその部位においてDNA骨格に切断を生じる。この計画に示されているように、アンプリコンは制限酵素（FokI）とインキュベーションされ、二本鎖切断を生じる。アンプリコンはその後、リボヌクレオチドGおよび3'のデオキシリボヌクレオチドTの間で切断を生じる塩基存在下でインキュベーションされ、質量分析により容易に解析することが可能である7塩基の断片を放出する。
【図１１】  説明図は、対立遺伝子濃縮法の対立遺伝子捕捉群内のハプロタイプ決定の主要な方法を説明する。示されているように、方法はおおまかには（i）一本鎖DNAを指向するもの、および（ii）二本鎖DNAを指向するものに分類することが可能である。単一塩基差異を識別するタンパク質または核酸への親和性により対立遺伝子特異的様式でDNA断片を捕捉することが可能である。異なる型のタンパク質および核酸親和性薬剤が囲み内に示されている。1つの対立遺伝子に付着するタンパク質または核酸が、引き続いて核酸混合物から、ストレプトアビジンまたは抗体被膜ビーズ等の当技術分野において既知である方法により選択されうる。第三の非親和性を基本とする対立遺伝子分離法は多型部位における制限エンドヌクレアーゼ切断（2つの対立遺伝子から有意に異なるサイズの断片が生産されるように）および電気泳動または遠心分離を用いて、切断された産物を引き続いてサイズ分画することを含む。2つの対立遺伝子の各々に相当する単離された断片の遺伝子型決定がハプロタイプを提供すると考えられる。
【図１２】  この説明図は、対立遺伝子特異的増幅に基づくハプロタイプ決定の様々な方法を描写する。1つの対立遺伝子を切断した後、他の対立遺伝子は選択的に増幅されてもよく、またはサイズ選択処理により分離されてもよく、または切断された対立遺伝子が対立遺伝子選択的破壊処理により除去されてもよい。
【図１３】  この説明図は、対立遺伝子特異的制限に基づくハプロタイプ決定戦略の様々な方法の分類を描写する。これらの方法においては、多型部位における配列差異を利用するプライマーまたは複数のプライマーを設計することにより、2つの対立遺伝子の混合物から1つの対立遺伝子が優先的に増幅される。
【図１４】  ヘアピンループプライマー。この図においては、PCR増幅に使用されるプライマーが示されている。対立遺伝子1において、多型部位はT（下線部）であり、そして、プライマーのATCTGGA 5'部分の組み入れが、少なくとも1ラウンドの増幅後に生じる。対立遺伝子2において、多型部位はまたT（下線部）であり、そして、プライマーのATCTGGA 5'部分の組み入れが、少なくとも1ラウンドの増幅後に生じる。
【図１５】  ヘアピンループプライマー。この図においては、PCR増幅に使用されるプライマーが示されている。対立遺伝子1において、多型部位はC（下線部）であり、そして、プライマーのATCCGGA 5'部分の組み入れが、少なくとも1ラウンドの増幅後に生じる。対立遺伝子2において、多型部位はまたC（下線部）であり、そして、プライマーのATCCGGA 5'部分の組み入れが、少なくとも1ラウンドの増幅後に生じる。
【図１６】  ヘアピンループプライマー。この図においては、図14に示されているPCR増幅段階により生成された対立遺伝子1のマイナス鎖が、Tプライマーを用いることにより、5'プライマーがハイブリダイズすることおよび効果的に対立遺伝子1の増幅を防止することができないことを描写している。または対立遺伝子2のマイナス鎖はミスマッチのためヘアピンループを形成できない。したがってヘアピンループ形成およびPCR増幅の防止はもたらされず、この対立遺伝子2鎖の増幅がTプライマーを用いてもたらされる。
【図１７】  ヘアピンループプライマー。この図においては、図19に示されているPCR増幅段階により生成された対立遺伝子2のマイナス鎖が、Cプライマーを用いることにより、5'プライマーがハイブリダイズすることおよび効果的に対立遺伝子2の増幅を防止することができないことを描写している。または対立遺伝子1のマイナス鎖はミスマッチのためヘアピンループを形成できない。したがってヘアピンループ形成およびPCR増幅の防止は生じず、そしてこの対立遺伝子1鎖の増幅がCプライマーを用いて生じる。
【図１８】  ハプロタイプ決定のためのエクソヌクレアーゼに基づく方法。ハプロタイプ決定されるDNAセグメントにおいて、1つの同定された多型部位がRFLPである、その結果、1つの対立遺伝子に関しては制限酵素（この例ではBamHI）は対立遺伝子を消化すること、および異なる長さのセグメントを生じることが可能である。
【図１９】  ハプロタイプ決定のためのエクソヌクレアーゼに基づく方法。図18において示されている、および記載されているセグメントを用いて、DNA断片の末端がエクソヌクレアーゼ消化より保護される。保護された断片はその後、示されているようにNheI部位の、RFLPの突出のために、認識部位が1つの断片には存在するがもう1つには存在しない、第二の制限酵素を用いて消化される。NheIを用いて断片を制限消化することは効果的にBamHI断片を短縮するが、しかし付加的にエクソヌクレアーゼ消化からの保護を取り除く。
【図２０】  ハプロタイプ決定のためのエクソヌクレアーゼに基づく方法。図19において示されているように生成された断片を用いて、これらの断片はその後エクソヌクレアーゼ存在下でインキュベーションされる。示されているように、エクソヌクレアーゼは断片の1つを消化するが、しかし保護された断片は未消化で残る。
【図２１】  対立遺伝子特異的PCR増幅のプライマー媒介性阻害。上記の特性を有するプライマーがジヒドロピリミジン脱水素酵素（DPD）遺伝子のハプロタイプ決定のために設計された。DPD遺伝子は塩基186（T：C）および597（A：G）においてコード領域内に2つの多様性部位を有し、図21の囲み内に示されているように、各々Cys：ArgおよびMet：Valのアミノ酸変化を生じる。塩基597における2番目の部位は制限断片長多型（RFLP）であり、A対立遺伝子が存在するならば酵素BsrDIを用いて切断される。予測断片は図に示されているとおりである。
【図２２】  DPD遺伝子の対立遺伝子特異的プライマー。Aにおいては、少なくとも2つの異なる領域を含む3個のプライマーが設計された。プライマーの3'部分は増幅される鋳型DNAに相当する。DPDASCFおよびDPDASTFプライマーに関しては、付加的なヌクレオチドが、ヌクレオチド多様性を含む配列内の領域に相補的なプライマーの5'末端に付加された。DPDNSFプライマーはDPD相補的配列のみしか含まず、そして対立遺伝子特異的増幅にはつながらない。Bにおいては、多型部位を含むDPD遺伝子配列が示されている。
【図２３】  DPDNSFプライマーを用いたDPD遺伝子のPCR増幅。TまたはC対立遺伝子を含む鋳型へのDPDNSFプライマーのハイブリダイゼーションが示されている。以下は、示されているようにTまたはC対立遺伝子に関して、DPDNSFプライマーを用いたDPD遺伝子領域の予測産物。
【図２４】  DPDASTFプライマーを用いたDPD遺伝子のPCR増幅。TまたはC対立遺伝子を含む鋳型へのDPDASTFプライマーのハイブリダイゼーションが示されている。以下は、示されているようにTまたはC対立遺伝子に関して、DPDASTFプライマーを用いたDPD遺伝子領域の予測産物。
【図２５】  DPDASCFプライマーを用いたDPD遺伝子のPCR増幅。TまたはC対立遺伝子を含む鋳型へのDPDASCFプライマーのハイブリダイゼーションが示されている。以下は、示されているようにTまたはC対立遺伝子に関して、DPDASCFプライマーを用いたDPD遺伝子領域の予測産物。
【図２６】  コンピュータープログラムオリゴ4を用いて、DPDNSFプライマーを用いて作製されたPCR産物の逆鎖とともに形成される安定ヘアピンループ構造。これは、DPDNSFプライマーが引き続く増幅ラウンドでハイブリダイゼーションする鎖であるため、逆鎖のみが示されている。
【図２７】  コンピュータープログラムオリゴ4を用いてDPDASCFプライマーを用いて作製されたPCR産物の逆鎖とともに形成される安定ヘアピンループ構造。図26にあるように、逆鎖のみが示されている。
【図２８】  コンピュータープログラムオリゴ4を用いてDPDASTFプライマーを用いて作製されたPCR産物の逆鎖とともに形成される安定ヘアピンループ構造。図26にあるように、逆鎖のみが示されている。
【図２９】  生成されたPCR断片に関してDPDNSFプライマーを用いてさらなる増幅が試行された時の、プライマーハイブリダイゼーションおよび増幅事象。プライマーはDPD遺伝子のTおよびC対立遺伝子の両者と形成されるヘアピン構造を効果的に競合することが可能であり、そして両方の対立遺伝子の増幅が効率的に進む。
【図３０】  生成されたPCR断片に関してDPDASCFプライマーを用いてさらなる増幅が試行された時の、プライマーハイブリダイゼーションおよび増幅事象。DPDASCFプライマーは、その融点がヘアピンループのそれより高いので（42℃と比較して60℃）、C対立遺伝子と形成されるヘアピンループとのハイブリダイゼーションを競合することが可能である。しかしながら、T対立遺伝子に関して形成されたヘアピンループはプライマーよりも高い融点を有する、そしてしたがって効果的にプライマーとハイブリダイゼーションを競合する。ヘアピンループはT対立遺伝子のPCR増幅を阻害し、結果C対立遺伝子の対立遺伝子特異的増幅につながる。
【図３１】  生成されたPCR断片に関してDPDASTFプライマーを用いてさらなる増幅が試行された時の、プライマーハイブリダイゼーションおよび増幅事象。ヘアピンループ構造は、C対立遺伝子に関してプライマーよりも高い融点を有し、そしてT対立遺伝子に関してプライマーよりも低い融点を有する。これはC対立遺伝子上でのプライマーハイブリダイゼーションおよび伸長の阻害を引き起こし、そしてT対立遺伝子の対立遺伝子特異的増幅につながる。
【図３２】  DPD遺伝子のハプロタイプ決定のためのヘアピンループ形成を使用する能力が説明されている。ハプロタイプが、対立遺伝子1-T186：A597、対立遺伝子2-C186：G597であることが知られているcDNA試料を用いて。DPDNSF、DPDASTFおよびDPDASCFプライマーを用いての増幅により生成された597bpからBsrDIにより生成される断片のサイズは、597位の塩基がAまたはGであるかに依存する。BsrDIによる制限消化はA塩基が597位にあることを示している。もし断片が597にA塩基を有するならば、138、164および267bpの長さの3個の断片が生成される。もしG塩基が597位に存在するならば、164および405bpの長さの2個の断片のみが生成される。試料が597位においてAおよびGのヘテロ接合であるならば、138、164（2x）、267および405bpの全部で4個のバンドの生成が生じる。各プライマーに関してBsrDI制限により生成される予測断片は囲みの中に示されている。
【図３３】  186および597位の両方においてヘテロ接合であるcDNA試料中のDPD遺伝子に関する各プライマーによる増幅および引き続くBsrDI制限により生成される断片のアガロースゲル電気泳動。DPDNSFレーンは、DPDNSFプライマーを用いて選択されたcDNAに関する制限断片パターンを示し、この試料が実際に597位においてヘテロ接合であることを示している。しかしながら、同じcDNA試料およびプライマーDPDASTFを用いると（DPDASTFレーン）、制限パターンは597位においてAのホモ接合である試料を代表するパターンと関連する。DPDASTFプライマーはT対立遺伝子の増幅のみを可能にするので、試料中のそれに関するハプロタイプはT186：A597である。プライマーDPDASCFを用いた制限消化パターン（DPDASCFレーン）は597位にGが存在する予測パターンと関連する。プライマーDPDASCFを用いたcDNA試料の増幅は、試料中のC対立遺伝子のみ増幅する結果となる。したがってこの対立遺伝子に対するハプロタイプはC186：G597でなければならない。
【図３４】  ApoE遺伝子のゲノム21250位における多様性の遺伝子型決定。このゲノム部位において、DNAのT：C多様性は、ApoEタンパク質のアミノ酸176位におけるシステインからアルギニンへのアミノ酸変化を結果生じる。ApoE遺伝子標的領域を増幅する、および2つの制限酵素部位（FokI、FspI）を多様性部位に近接してアンプリコン内に導入する、両者のために2個のプライマーが設計された。この図はプライマーおよび標的DNAの配列を描写する。Apo21250-LFRプライマーは制限酵素認識部位を含むループプライマーであり、そしてApo21250-LRプライマーはPCR増幅過程において使用されるリバースプライマーである。多型ヌクレオチドは斜字体で示されている。
【図３５】  増幅後の、ApoE遺伝子のT対立遺伝子およびC対立遺伝子の両方のアンプリコンの配列が示されている。多型部位は下線部のTまたはCで示されている。
【図３６】  ApoE遺伝子のNcoI制限エンドヌクレアーゼ消化部位が示されている。実施例4に示されているように、2つの外側部位および多型16747位を含む1つの部位の、3つのNcoI部位が存在する。加えて、2組のプライマーが示されている、第1の組（10）は最も外側のNcoI部位内に位置し、そして16747位を通じてDNA配列を増幅することが可能である。第2の組（20）プライマー組は、それらが16747位および17030位の周りの短い配列を増幅するために使用されているので、示されている。
【図３７】  質量対絶対強度のスペクトルが、16747多型部位を含む断片の、酵素なし（図37A）またはNcoI消化（図37B）のアンプリコン試料に関して示されている。
【図３８】  質量対絶対強度のスペクトルが、17030多型部位を含む断片の、酵素なし（図38A）またはNcoI消化（図38B）のアンプリコン試料に関して示されている。
【図３９】  提案されている二核白金（II）複合体が示されている。描写されているように、介在性炭素が4、5または6個のメチル基であることが可能である。オリゴヌクレオチドをDNA分子へクロスリンクさせるためのこれらの提案されている分子の使用は詳細な説明に記載されている通りである。
【図４０】  既知の多型（対立遺伝子1）を含む標的DNAの領域に相補的であるチオ含有オリゴヌクレオチドが設計される。二核白金（II）（PtII）は、Gruffらにより記載された処理、または類似の方法を用いてチオ基を通じてこのオリゴヌクレオチドに連結される。チオ基を有さない第二のオリゴヌクレオチドもまた設計される。このオリゴヌクレオチドは、他の対立遺伝子（対立遺伝子2）に相当する塩基を有する多様性部位を除いて、チオオリゴヌクレオチドと同一の配列を有する。これら2つのオリゴヌクレオチドは、多様性の標的部位においてヘテロ接合である試料と混合され、そしてハイブリダイズされうる。PtII結合オリゴヌクレオチドは、それが完全にマッチする対立遺伝子（対立遺伝子1）にハイブリダイズし、そして他のオリゴヌクレオチドは、それが完全にマッチする他の対立遺伝子（対立遺伝子2）にハイブリダイズする。PtII結合オリゴヌクレオチドはその後、標的DNAに化学的にクロスリンクされる。このクロスリンクは標的DNAのこの対立遺伝子を、エクソヌクレアーゼ破壊から保護すると考えられる。
【図４１】  特定の末端から一および二本鎖DNAを破壊することが知られている、およびPtII付加体により阻止されることが知られている、エクソヌクレアーゼからのクロスリンクされたDNAの保護が、クロスリンクされた（対立遺伝子1）または二本鎖のDNA試料（対立遺伝子2）に関して描写されている。DNA試料をエクソヌクレアーゼとインキュベーションすることは、PtII付加体を有さない全てまたはほとんどのDNA（対立遺伝子2）を除去することが示されている、一方エクソヌクレアーゼと共に、クロスリンクされた複合体をインキュベーションすることはDNA（対立遺伝子1）の部分消化を結果として生じる。