【手続補正書】
【提出日】令和1年11月6日(2019.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同組換えを介して大きな外因性ゲノムＤＮＡを挿入して、哺乳類の細胞のゲノムにおいて内因性ゲノムＤＮＡを置き換えるｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
哺乳類の動物の細胞に、
（ａ）約１０〜３０ｋｂの近位領域および約１０〜３０ｋｂの遠位領域によって隣接された約１０〜３００ｋｂの大きな外因性ゲノムＤＮＡを含むＢＡＣ、ここで該近位領域および該遠位領域は、前記細胞の該ゲノムにおいて該内因性ゲノムＤＮＡに隣接する近位領域および遠位領域とそれぞれ相同である、
（ｂ）該内因性ゲノムＤＮＡにおける第１のＣａｓ９切断部位を標的とする第１のｇＲＮＡおよび該内因性ゲノムＤＮＡにおける第２のＣａｓ９切断部位を標的とする第２のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの第１の対、ここで該第１および第２のＣａｓ９切断部位は、該細胞の該ゲノムにおいて該内因性ゲノムＤＮＡと結合する近位接合部から１〜２５０ｂｐの遠位の領域内にある、
（ｃ）該内因性ゲノムＤＮＡにおける第３のＣａｓ９切断部位を標的とする第３のｇＲＮＡおよび該内因性ゲノムＤＮＡにおける第４のＣａｓ９切断部位を標的とする第４のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの第２の対、ここで該第３および第４のＣａｓ９切断部位は、該細胞の該ゲノムにおいて該内因性ゲノムＤＮＡと結合する遠位接合部から１〜２５０ｂｐの近位の領域内にある、および
（ｄ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質、または該Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を産生することが可能なＣａｓ９ヌクレアーゼコード配列
を導入するステップを含み、それにより、
（ｉ）ｇＲＮＡの前記第１の対は、該近位接合部で前記内因性ゲノムＤＮＡにおいて前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位を切断するよう前記Ｃａｓ９タンパク質を誘導して、第１および第２の二重鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、
（ｉｉ）ｇＲＮＡの前記第２の対は、該遠位接合部で前記内因性ゲノムＤＮＡにおいて前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位を切断するよう前記Ｃａｓ９タンパク質を誘導して、第３および第４のＤＳＢを生成し、
（ｉｉｉ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡは、相同組換えを介して、近位では前記第１および／または第２のＤＳＢの近くで、ならびに遠位では前記３および／または第４のＤＳＢで、該細胞の該ゲノムに組み込まれて、該近位領域と該遠位領域との間の前記内因性ゲノムＤＮＡを置き換える、前記方法。
【請求項２】
細胞が、相同組換えを介して内因性ゲノムＤＮＡを置き換えた大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有し、かつ生殖系列を介して該大きな外因性ゲノムＤＮＡを伝達することが可能である、非ヒト哺乳類を生成する方法であって、
哺乳類の接合体に、
（ａ）約１０〜３０ｋｂの近位領域および約１０〜３０ｋｂの遠位領域によって隣接された約１０〜３００ｋｂの大きな外因性ゲノムＤＮＡを含むＢＡＣ、ここで該近位領域および該遠位領域は、前記細胞の該ゲノムにおいて該内因性ゲノムＤＮＡに隣接する近位領域および遠位領域とそれぞれ相同である、
（ｂ）該内因性ゲノムＤＮＡにおける第１のＣａｓ９切断部位を標的とする第１のｇＲＮＡおよび該内因性ゲノムＤＮＡにおける第２のＣａｓ９切断部位を標的とする第２のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドの第１の対、ここで該第１および第２のＣａｓ９切断部位は、該細胞の該ゲノムにおいて該内因性ゲノムＤＮＡと結合する近位接合部から１〜２５０ｂｐの遠位の領域内にある、
（ｃ）該内因性ゲノムＤＮＡにおける第３のＣａｓ９切断部位を標的とする第３のｇＲＮＡおよび該内因性ゲノムＤＮＡにおける第４のＣａｓ９切断部位を標的とする第４のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの第２の対、ここで該第３および第４のＣａｓ９切断部位は、該細胞の該ゲノムにおいて該内因性ゲノムＤＮＡと結合する遠位接合部から１〜２５０ｂｐの近位の領域内にある、および
（ｄ）Ｃａｓ９タンパク質、または該Ｃａｓ９タンパク質を産生することが可能なＣａｓ９コード配列
を導入するステップと、
該哺乳類の同じ種の偽妊娠雌を調製するステップと、
前記接合体を、前記偽妊娠雌に移植して、該哺乳類の子孫を生ませるステップ
とを含む、前記方法。
【請求項３】
前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約１５〜２００ｋｂ、約２０〜１００ｋｂ、または約２５ｋｂである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、接合体であり、哺乳類の細胞に導入するステップが、マイクロインジェクションによって実施されてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
哺乳類の接合体に導入するステップが、マイクロインジェクションによって実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
マイクロインジェクションが、約１〜１０ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣ、約２〜８ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣ、または約５ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、胚幹（ＥＳ）細胞であり、哺乳類の細胞に導入するステップが、電気穿孔によって実施されてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＢＡＣが、選択マーカーを保有しない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の同じ種の異なる系統に由来する、または前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の異なる種に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類が、マウスである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、独立して、該近位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、または前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、独立して、該遠位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡが、該内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、または前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡが、該内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、該近位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、または前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、該遠位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、前記第３のｇＲＮＡ、または前記第４のｇＲＮＡを含む複合体中で供給される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類が、該大きな外因性ゲノムＤＮＡに関して半接合体またはホモ接合体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
該哺乳類の子孫の約５０％または１００％が、該大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
必要に応じて、該大きな外因性ゲノムＤＮＡに関して半接合体またはホモ接合体である該哺乳類の子孫を生成するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳類が、ＥＳ細胞技術が欠如している種である、請求項２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
【表５−３】
2018532415.tif 000001
発明の態様
［態様１］相同組換えを介して大きな外因性ゲノムＤＮＡを挿入して、哺乳類の細胞のゲノムにおいて内因性ゲノムＤＮＡを置き換える方法であって、
（ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）を供給するステップと、
（ｂ）約１０〜３００ｋｂの大きな外因性ゲノムＤＮＡを供給するステップと、
（ｃ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを、前記ＢＡＣに挿入するステップであって、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡは、約１０〜３０ｋｂの近位領域および約１０〜３０ｋｂの遠位領域によって隣接され、前記近位領域および前記遠位領域は、前記細胞の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡに隣接する、ステップと、
（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第１の対を調製するステップであって、前記第１の対は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡは、前記近位領域が該細胞の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する近位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第１のＣａｓ９切断部位および第２のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
（ｅ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第２の対を調製するステップであって、前記第２の対は、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡを含み、前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡは、前記遠位領域が該細胞の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する該遠位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第３のＣａｓ９切断部位および第４のＣａｓ９切断部位を標的とする、調製するステップと、
（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質、または該Ｃａｓ９タンパク質を産生することが可能なＣａｓ９コード配列を供給するステップと、
（ｇ）前記哺乳類の前記細胞に、
（ｉ）ステップ（ｃ）における前記ＢＡＣ、
（ｉｉ）ステップ（ｄ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第１の対、
（ｉｉｉ）ステップ（ｅ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第２の対、および
（ｉｖ）ステップ（ｆ）における前記Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９コード配列
を導入するステップと
を含み、それにより、
（ｉ）ｇＲＮＡの前記第１の対は、該近位接合部で前記内因性ゲノムＤＮＡにおいて前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位を切断するよう前記Ｃａｓ９タンパク質を誘導して、第１の二重鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、
（ｉｉ）ｇＲＮＡの前記第２の対は、該遠位接合部で前記内因性ゲノムＤＮＡにおいて前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位を切断するよう前記Ｃａｓ９タンパク質を誘導して、第２のＤＳＢを生成し、
（ｉｉｉ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡは、相同組換えを介して前記第１のＤＳＢおよび前記第２のＤＳＢで該細胞の該ゲノムに組み込まれて、該近位領域と該遠位領域との間の前記内因性ゲノムＤＮＡを置き換える、前記方法。
［態様２］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約１５〜２００ｋｂである、態様１に記載の方法。
［態様３］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約２０〜１００ｋｂである、態様１に記載の方法。
［態様４］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約２５ｋｂである、態様１に記載の方法。
［態様５］前記細胞が、接合体である、態様１に記載の方法。
［態様６］ステップ（ｇ）が、マイクロインジェクションによって実施される、態様５に記載の方法。
［態様７］マイクロインジェクションが、約１〜１０ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、態様６に記載の方法。
［態様８］マイクロインジェクションが、約２〜８ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、態様６に記載の方法。
［態様９］マイクロインジェクションが、約５ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、態様６に記載の方法。
［態様１０］前記細胞が、胚幹（ＥＳ）細胞である、態様１に記載の方法。
［態様１１］ステップ（ｇ）が、電気穿孔によって実施される、態様１０に記載の方法。
［態様１２］前記ＢＡＣが、選択マーカーを保有しない、態様１に記載の方法。
［態様１３］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の同じ種の異なる系統に由来する、態様１に記載の方法。
［態様１４］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の異なる種に由来する、態様１に記載の方法。
［態様１５］前記哺乳類が、マウスである、態様１に記載の方法。
［態様１６］前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、独立して、前記近位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、態様１に記載の方法。
［態様１７］前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、独立して、前記遠位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、態様１に記載の方法。
［態様１８］前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡが、前記内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、態様１に記載の方法。
［態様１９］前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡが、前記内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、態様１に記載の方法。
［態様２０］前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、前記近位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、態様１に記載の方法。
［態様２１］前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、前記遠位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、態様１に記載の方法。
［態様２２］ステップ（ｆ）において、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、前記第３のｇＲＮＡ、または前記第４のｇＲＮＡを含む複合体中で供給される、態様１に記載の方法。
［態様２３］細胞が、相同組換えを介して内因性ゲノムＤＮＡを置き換えた大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有し、かつ生殖系列を介して該大きな外因性ゲノムＤＮＡを伝達することが可能である、非ヒト哺乳類を生成する方法であって、
（ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）を供給するステップと、
（ｂ）約１０〜３００ｋｂの大きな外因性ゲノムＤＮＡを供給するステップと、
（ｃ）前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを、前記ＢＡＣに挿入するステップであって、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡは、約１０〜３０ｋｂの近位領域および約１０〜３０ｋｂの遠位領域によって隣接され、前記近位領域および前記遠位領域は、前記哺乳類の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡに隣接する、ステップと、
（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第１の対を調製するステップであって、前記第１の対は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡは、前記近位領域が該哺乳類の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する近位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第１のＣａｓ９切断部位および第２のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
（ｅ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の第２の対を調製するステップであって、前記第２の対は、第３のｇＲＮＡおよび第４のｇＲＮＡを含み、前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡは、前記遠位領域が該哺乳類の該ゲノムにおいて前記内因性ゲノムＤＮＡと結合する遠位接合部から約２５０ｂｐ以内にある、該内因性ゲノムＤＮＡにおける、それぞれ第３のＣａｓ９切断部位および第４のＣａｓ９切断部位を標的とする、ステップと、
（ｆ）Ｃａｓ９タンパク質、または該Ｃａｓ９タンパク質を産生することが可能なＣａｓ９コード配列を供給するステップと、
（ｇ）前記哺乳類の接合体に、
（ｉ）ステップ（ｃ）における前記ＢＡＣ、
（ｉｉ）ステップ（ｄ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第１の対、
（ｉｉｉ）ステップ（ｅ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの前記第２の対、および
（ｉｖ）ステップ（ｆ）における前記Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９コード配列
を導入するステップと、
（ｈ）前記哺乳類の同じ種の偽妊娠雌を調製するステップと、
（ｊ）前記接合体を、前記偽妊娠雌に移植して、該哺乳類の子孫を生ませるステップ
とを含む、前記方法。
［態様２４］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約１５〜２００ｋｂである、態様２３に記載の方法。
［態様２５］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約２０〜１００ｋｂである、態様２３に記載の方法。
［態様２６］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、約２５ｋｂである、態様２３に記載の方法。
［態様２７］ステップ（ｇ）が、マイクロインジェクションによって実施される、態様２３に記載の方法。
［態様２８］前記哺乳類が、該大きな外因性ゲノムＤＮＡに関して半接合体またはホモ接合体である、態様２３に記載の方法。
［態様２９］該哺乳類の子孫の約５０％または１００％が、該大きな外因性ゲノムＤＮＡを保有する、態様２３に記載の方法。
［態様３０］必要に応じて、該大きな外因性ゲノムＤＮＡに関して半接合体またはホモ接合体である該哺乳類の子孫を生成するステップをさらに含む、態様２３に記載の方法。
［態様３１］前記ＢＡＣが、選択マーカーを保有しない、態様２３に記載の方法。
［態様３２］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の同じ種の異なる系統に由来する、態様２３に記載の方法。
［態様３３］前記大きな外因性ゲノムＤＮＡが、前記哺乳類の異なる種に由来する、態様２３に記載の方法。
［態様３４］前記哺乳類が、マウスである、態様２３に記載の方法。
［態様３５］前記哺乳類が、ＥＳ細胞技術が欠如している種である、態様２３に記載の方法。
［態様３６］マイクロインジェクションが、約１〜１０ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、態様２７に記載の方法。
［態様３７］マイクロインジェクションが、約２〜８ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、態様２７に記載の方法。
［態様３８］マイクロインジェクションが、約５ｎｇ／μＬの、前記大きな外因性ゲノムＤＮＡを含有する前記ＢＡＣを使用して実施される、態様２７に記載の方法。
［態様３９］前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、独立して、前記近位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、態様２３に記載の方法。
［態様４０］前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、独立して、前記遠位接合部から約１００ｂｐ、５０ｂｐまたは１０ｂｐ以内にある、態様２３に記載の方法。
［態様４１］前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡが、該内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、態様２３に記載の方法。
［態様４２］前記第３のｇＲＮＡおよび前記第４のｇＲＮＡが、該内因性ゲノムＤＮＡの異なる鎖に結合する、態様２３に記載の方法。
［態様４３］前記第１および前記第２のＣａｓ９切断部位が、該近位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、態様２３に記載の方法。
［態様４４］前記第３および前記第４のＣａｓ９切断部位が、該遠位接合部に最も近い２つの潜在的なＣａｓ９切断部位である、態様２３に記載の方法。
［態様４５］ステップ（ｆ）において、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、前記第３のｇＲＮＡ、または前記第４のｇＲＮＡを含む複合体中で供給される、態様２３に記載の方法。