(57)【要約】本発明によれば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ及びＲＳＫ阻害剤、すなわちＭＡＰＫ系シグナル伝達活性を指標としてＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤をスクリーニングすることができ、耐性獲得が抑制された抗癌剤、抗癌剤による癌治療効果を高める抗癌剤耐性抑制剤を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤を含有してなるＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤。
【請求項２】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現を阻害する物質またはＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性を阻害する物質である、請求項１に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤。
【請求項３】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、Ｒａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤およびＲＳＫ阻害剤から選択される１種又は２種以上である請求項１または２に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤。
【請求項４】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、
（ａ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質の活性を阻害する低分子化合物、
（ｂ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質の発現を阻害する低分子化合物、
（ｃ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ及び
（ｄ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドから選ばれる少なくとも一種である請求項１〜３のいずれかに記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤。
【請求項５】
Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫまたはＲＳＫ阻害活性を指標として、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤をスクリーニングする方法。
【請求項６】
請求項１に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる耐性獲得が抑制された抗癌剤。
【請求項７】
請求項１に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる抗癌剤耐性抑制剤。
【請求項８】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現を阻害する物質またはＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性を阻害する物質である、請求項７に記載の抗癌剤耐性抑制剤。
【請求項９】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、Ｒａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤およびＲＳＫ阻害剤から選択される１種又は２種以上である請求項７または８に記載の抗癌剤耐性抑制剤。
【請求項１０】
請求項１に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤と抗癌剤とを組み合わせてなる癌治療剤。
【請求項１１】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現を阻害する物質またはＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性を阻害する物質である、請求項１０に記載の癌治療剤。
【請求項１２】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、Ｒａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤およびＲＳＫ阻害剤から選択される１種又は２種以上である請求項１０または１１に記載の癌治療剤。
【請求項１３】
抗癌剤が、塩酸ドキソルビシン、ダウノマイシン、塩酸エピルビシン、アンスラサイクリン類、ビンカアルカロイド類およびタキサン類から選択される請求項１０〜１２のいずれかに記載の癌治療剤。
【請求項１４】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤の有効量を投与することを特徴とする、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を抑制する方法。
【請求項１５】
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、Ｒａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤またはＲＳＫ阻害剤から選択される１種又は２種以上である請求項４に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を抑制する方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる抗癌剤の有効量を投与することによる、癌を治療する方法。
【請求項１７】
抗癌剤耐性獲得を抑制して癌を治療するものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗癌剤の標的癌細胞からの排出を抑制して癌の治療効果を高めるものである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤及びそのスクリーニング方法に関する。また、本発明は、抗癌剤耐性の獲得が抑制された抗癌剤に関する。さらに、本発明は、抗癌剤耐性を獲得した癌に対しても有効な癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン等のアンスラサイクリン類、ビンクリスチン等のビンカアルカロイド類、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン類等の抗癌剤は、抗悪性腫瘍効果が極めて高いことから広く用いられているが、反面、骨髄抑制、下痢などの副作用をおこすことが知られている。また、長期投与により癌が耐性を獲得して抗癌剤の効力が低下すること、患者によっては抗癌剤に対して耐性を示すことから化学療法を施すことができないことが知られている。
癌細胞によるこれらの抗癌剤に対する耐性獲得のメカニズムについては、以前からよく研究されており、多くのＡＢＣトランスポーター（ＡＴＰ結合領域を１分子内に有しＡＴＰによって駆動する膜タンパク質）がこれらの抗癌剤の耐性に関与していることが知られている。
ＡＢＣトランスポーターの一つとしてＰ−糖タンパク質が抗癌剤の耐性に関与していることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３００４−３００８（１９８７））。すなわち、Ｐ−糖タンパク質を発現する癌では、Ｐ−糖タンパク質が抗癌剤を細胞外に排出することにより、抗癌剤の細胞内蓄積を減少させる作用を有することが判明した。このＰ−糖タンパク質をコードする遺伝子がＭＤＲ（Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）１遺伝子である。同様に、ＡＢＣトランスポーターの一つとしてＢＣＲＰ（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）が抗癌剤の耐性に関与していることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（２６），１５６６５−１５６７０（１９９８）。
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、ＡＢＣトランスポーター、特にＰ−糖タンパク質の発現あるいは発現の増大により抗癌剤耐性を獲得するに至った癌細胞系で、Ｐ−糖タンパク質の発現を抑制する低分子化合物はあまり知られていない（特開２００６−６９９１０号公報、特開２００５−２４７７１６号公報）。また、エストロゲン（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ）はヒト培養乳癌細胞株のＰ−糖蛋白発現を低下させることが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：５９６−６０４，２００５、第６４回日本癌学会学術総会・総会記事  ｐ４２５）。また、ＢＣＲＰの発現あるいは発現の増大により抗癌剤耐性を獲得するに至った癌細胞系で、ＢＣＲＰの発現を抑制する低分子化合物はあまり知られていない（特開２００４−１２３５６７号公報、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：５９６−６０４，２００５）。
そこで本発明者は、ＡＢＣトランスポーターであるＰ−糖タンパク質を高発現している癌細胞を用いて、Ｐ−糖タンパク質発現を抑制する化合物を見出す目的で種々の物質についてスクリーニングしたところ、ＭＥＫ阻害剤及びＲａｓ阻害剤がＰ−糖タンパク質発現を顕著に抑制することを見出した。また、ＥＲＫ阻害剤及びＲＳＫ阻害剤もまた、Ｐ−糖タンパク質の発現を抑制することも見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、ＡＢＣトランスポーターであるＢＣＲＰを高発現している癌細胞を用いて、ＭＥＫ阻害剤がＢＣＲＰ発現を顕著に抑制することを見出した。
すなわち本発明は、次に示す、ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤を含有してなるＰ−糖タンパク質発現抑制剤、Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤をスクリーニングする方法、抗癌剤耐性抑制剤、癌治療剤などを提供するものである。
また、本発明は、次に示す、ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤を含有してなるＢＣＲＰ発現抑制剤、ＢＣＲＰ発現抑制剤をスクリーニングする方法、抗癌剤耐性抑制剤、癌治療剤などを提供するものである。
（１）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤を含有してなるＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤。
（２）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現を阻害する物質またはＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性を阻害する物質である、上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤。
（３）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、Ｒａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤およびＲＳＫ阻害剤から選択される１種又は２種以上である上記（１）または（２）に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤。
（４）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、
（ａ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質の活性を阻害する低分子化合物、
（ｂ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質の発現を阻害する低分子化合物、
（ｃ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ及び
（ｄ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドから選ばれる少なくとも一種である上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤。
（５）Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫまたはＲＳＫ阻害活性を指標として、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤をスクリーニングする方法。
（６）上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる耐性獲得が抑制された抗癌剤。
（６ａ）Ｐ−糖タンパク質の発現を抑制する活性と共に、抗癌活性を有するＰ−糖タンパク質発現抑制剤を含有する、上記（６）記載の抗癌剤。
（６ｂ）ＢＣＲＰの発現を抑制する活性と共に、抗癌活性を有するＢＣＲＰ発現抑制剤を含有する、上記（６）記載の抗癌剤。
（６ｃ）Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤がＭＥＫ阻害剤である、上記（６）又は（６ａ）記載の抗癌剤。
（７）上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる抗癌剤耐性抑制剤。
（８）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現を阻害する物質またはＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性を阻害する物質である、上記（７）に記載の抗癌剤耐性抑制剤。
（９）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、Ｒａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤およびＲＳＫ阻害剤から選択される１種又は２種以上である上記（７）または（８）に記載の抗癌剤耐性抑制剤。
（１０）上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤と抗癌剤とを組み合わせてなる癌治療剤。
（１１）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現を阻害する物質またはＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性を阻害する物質である、上記（１０）に記載の癌治療剤。
（１２）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、Ｒａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤およびＲＳＫ阻害剤から選択される１種又は２種以上である上記（１０）または（１１）に記載の癌治療剤。
（１３）抗癌剤が、塩酸ドキソルビシン、ダウノマイシン、塩酸エピルビシン、アンスラサイクリン類、ビンカアルカロイド類およびタキサン類から選択される上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の癌治療剤。
（１４）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤の有効量を投与することを特徴とする、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を抑制する方法。
（１５）ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤が、Ｒａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤またはＲＳＫ阻害剤から選択される１種又は２種以上である上記（４）に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を抑制する方法。
（１６）上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる抗癌剤の有効量を投与することによる、癌を治療する方法。
（１７）抗癌剤耐性獲得を抑制して癌を治療するものである、請求項１６に記載の方法。
（１８）抗癌剤の標的癌細胞からの排出を抑制して癌の治療効果を高めるものである、請求項１６に記載の方法。
なお、本発明は、がん分子標的治療研究会総会（２００６．６．１５−１６、東京）、第６５回  日本癌学会学術総会（２００６．９．２８−３０、横浜）、（Ｔｈｅ  ｊｏｉｎｔ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３ｒｄ  ＩＳＣ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  １１ｔｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２００６．１２．６−８、東京）、日本薬学会第１２７年会（２００７．３．２８−３０、富山）において発表されている。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＭＡＰＫシグナル伝達系、Ａｋｔシグナル伝達系阻害剤による内因性Ｐ−糖タンパク質発現の抑制を示す図である。
図２は、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６による内因性又は外因性Ｐ−糖タンパク質発現の経時的な発現抑制を示す図である。
図３は、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０９８０５９による内因性又は外因性Ｐ−糖タンパク質発現の経時的な発現抑制を示す図である。
図４は、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＲＳＫ遺伝子のノックダウンによる内因性又は外因性Ｐ−糖タンパク質発現の経時的な発現抑制を示す図である。
図５は、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６による内因性ＢＣＲＰ発現の経時的な発現抑制を示す図である。
図６は、ＭＥＫ阻害剤による、がん細胞におけるパクリタキセルに対する感受性の増大を示す図である。
図７は、ＭＥＫ阻害剤による、がん細胞におけるＰ−糖タンパク質の蛍光基質Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３の取り込み量の増加を示す図である。
まず、本発明は、ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤を含有してなるＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰ発現抑制剤を提供する。ここで、「ＭＡＰＫ系シグナル伝達」は、外界からのシグナルを細胞内に伝達する細胞内シグナル伝達経路の一つであり、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質結合受容体）、細胞増殖因子、細胞分化因子、ストレス刺激等のシグナルによって活性化されることが知られている。ＭＡＰＫ系シグナル伝達経路（ＭＡＰキナーゼカスケード）は、ＭＡＰＫＫＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ）、ＭＡＰＫＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）、ＭＡＰキナーゼの３段階のキナーゼによるカスケードを含んでいる。ＭＡＰＫ系シグナル伝達経路は、例えば、ＭＡＰＫとして、ＥＲＫ、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ＥＲＫ５／ＢＭＫなどが、ＭＡＰＫＫとして、ＭＥＫ、ＭＫＫなどが、ＭＡＰＫＫとして、Ｒａｆ、Ｍｏｓ、Ｔｐｌ２、ＭＬＫ、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ＭＥＫＫ、ＡＳＫなどが知られている。本発明において、ＭＡＰＫ系シグナル伝達経路のうち特に対象とする経路は、（１）Ｒａｆ又はＭｏｓ（ＭＡＰＫＫＫ）、（２）ＭＥＫ（ＭＡＰＫＫ）、（３）ＥＲＫ（ＭＡＰＫ）の順にシグナルが伝達される経路である。
「Ｐ−糖タンパク質」は、ＭＤＲ１（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  １）ともよばれる抗癌剤耐性に関するＡＢＣトランスポーターとして最初に同定されたタンパク質であり、ＭＤＲ１遺伝子にコードされている。Ｐ−糖タンパク質の遺伝子であるＭＤＲ１遺伝子のヒト全長ｃＤＮＡの配列は公知である。ＭＤＲ１遺伝子はＧｅｎ  Ｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ１４７５８として登録されており、Ｃｅｌｌ  ４７：３８１−３８９（１９８６）などで報告されている。本明細書中、ヒト野生型ＭＤＲ１  ｃＤＮＡと称する遺伝子は、ヒトの副腎のｃＤＮＡライブラリーより単離されたものである（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １６２：２２４−２３１（１９８９））。
「ＢＣＲＰ（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、正常組織では心臓組織での発現が確認され、癌組織では特に乳ガン組織で高発現することが明らかとなった抗癌剤耐性に関するＡＢＣトランスポーターとして同定されたタンパク質である。ＢＣＲＰ遺伝子にコードされている。ＢＣＲＰの遺伝子であるＢＣＲＰ遺伝子のヒト全長ｃＤＮＡの配列は公知である。ＢＣＲＰ遺伝子はＧｅｎ  Ｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０５６８６７として登録されており、Ｄｏｙｌｅ，Ｌ．Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．，Ａｂｒｕｚｚｏ，Ｌ．Ｖ．，Ｋｒｏｇｍａｎｎ，Ｔ．，Ｇａｏ，Ｙ．，Ｒｉｓｈｉ，Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｒｏｓｓ，Ｄ．Ｄ．Ａｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＭＣＦ−７  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５（２６），１５６６５−１５６７０（１９９８）などで報告されている。
「抗癌剤耐性」は、抗癌剤の反復的な投与の結果または先天的にＰ−糖タンパク質やＢＣＲＰの発現が亢進等している結果、癌の治療または予防の処置において薬理効果の減少または消失がおこることをいう。
「抗癌剤耐性の獲得」は、抗癌剤の反復的な投与の結果としてその抗癌剤又はその類縁抗癌剤への感受性が減弱すること、または、先天的あるいは後天的に何らかの理由によりＰ−糖タンパク質やＢＣＲＰの発現が亢進した状態となった結果としてその抗癌剤又はその類縁抗癌剤への感受性が減弱していることをいう。
本発明者らは、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現をＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤（特に、Ｒａｆ、Ｍｏｓ、ＭＥＫ及びＥＲＫが関与するカスケードのシグナル伝達を阻害する阻害剤）によって抑制できることを見出したものである。
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤とは、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に携わるＲａｓ、ＭＯＳ、ＴｐＩ２、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＲＳＫ、ＭＫＫ、ｐ３８  ＭＡＲＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＭＬＫ、ＭＥＫＫ、ＭＬＫ、ＡＳＫ等の生体内分子の発現阻害、活性化阻害、不安定化等を介してシグナル伝達を阻害する薬物をいう。シグナルの阻害には、完全に遮断することも、シグナルが減弱されることも含まれる。かかる薬物としては、低分子若しくは高分子化合物のほか、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、抗体、アンチセンス、ペプチド、タンパク質、酵素などを用いることができる。
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤としては、例えば、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現を阻害する物質、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質（ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与する遺伝子の翻訳産物を含む）の活性を阻害する物質など、を用いることができる。ここで、「タンパク質の発現を阻害する」とは、当該タンパク質の遺伝子の発現阻害を含む、当該タンパク質をコードする遺伝子からタンパク質生成までの一連の事象（例えば、転写（ｍＲＮＡの生成）、翻訳（タンパク質の生成）を含む）のうちのいずれかの事象を阻害することによって、当該タンパク質の生成を阻害することを意味する。「タンパク質の活性を阻害する」とは、当該タンパク質が有する生理的作用（例えば、ＭＡＰＫシグナル伝達経路における次段階のタンパク質のリン酸化）を阻害することをいい、当該タンパク質を活性型に変換する事象（例えば、リン酸化）を阻害すること、不安定化（または安定化阻害）などによって当該タンパク質の生理的作用を抑制することも含む。
ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質（例えば、Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質、ＲＳＫタンパク質など）を本発明で用いられるタンパク質と称することがある。ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与する遺伝子（ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む）を本発明で用いられる遺伝子と称することがある。
本発明で用いられるＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤としては、例えば、（ａ）本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する低分子化合物、（ｂ）本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する低分子化合物、（ｃ）本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、（ｄ）本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、（ｅ）本発明で用いられるタンパク質に対する抗体、（ｆ）本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、（ｇ）本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用する本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド、（ｈ）本発明で用いられるタンパク質に対するアプタマーなどが挙げられる。
本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する物質としては、本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害するものであれば特に制限はないが、例えば、（ｉ）本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）から本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡへの転写を阻害する物質、（ｉｉ）本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を阻害する物質などが挙げられる。（ｉ）本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）から本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡへの転写を阻害する物質としては、本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）から本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡへの転写を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡへの転写に関与する因子に結合し、本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡへの転写を阻害する物質などが挙げられる。（ｉｉ）本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を阻害する物質としては、本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡから本発明で用いられるタンパク質への翻訳に関与する因子に結合し、本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を阻害する物質などが挙げられる。このような本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する物質としては、具体的には、例えば、（ｂ）本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する低分子化合物、（ｃ）本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、（ｄ）本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、（ｆ）本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、などが挙げられる。
本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質としては、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害するものであれば特に制限はないが、例えば、（ｉ）ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性化を阻害する物質、（ｉｉ）ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質が、その下流の因子（例えば、タンパク質）を活性化することを阻害する物質などが挙げられる。ここで、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性化を阻害するとは、例えば、ＭＡＰ系シグナル伝達に関与するタンパク質を活性型に変換する事象（例えば、リン酸化）を直接的に阻害することを含むが、これに限定されない。例えば、ＭＡＰＫ系シグナル伝達系の上流の因子（例えば、タンパク質）の発現阻害、活性化阻害、不安定化（または安定化阻害）などによってＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性化を阻害することも、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性化を阻害することに含まれる。
ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤としては、より具体的には、例えば、Ｒａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤などを用いることができる。これらの阻害剤は、単独で、必要に応じてそれらの２種以上を組み合わせて用いることができる。
Ｒａｓ阻害剤としては、実施例記載の薬物（ＦＴＩ−２７７）の他、Ｒ１１５７７７（Ｚａｒｎｅｓｔａ）、ＢＭＳ−２１４６６２、ＳＣＨ６６３３６、Ｌ−７７８，１２３などが挙げられる。なお、Ｒ１１５７７７、ＢＭＳ−２１４６６２、ＳＣＨ６６３３６はファルネシル転移酵素阻害剤で、Ｌ−７７８，１２３はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤である。これらの阻害剤は、ｒａｓスーパーファミリーの低分子量Ｇタンパク質が、細胞の膜構造に結合して機能を発揮するために必要な修飾（ファルネシル化とゲラニルゲラニル化）を阻害するため、Ｒａｓの活性化を阻害する。なお、ＦＴＩ−２７７はファルネシル転移酵素阻害剤（一般名：Ｎ−［４−［２−（Ｒ）−ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ］ａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｂｅｎｚｏｙｌ］ｍｅｈｉｏｎｉｎｅ）であり、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手可能である（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：４９１９−４９２６（１９９９））。
Ｒａｆ阻害剤としては、例えば、Ｂａｙ４３−９００６（Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆの選択的阻害剤。ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）とも呼ばれる。）などが挙げられる。Ｒａｆ阻害剤としては、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ阻害剤が好ましく、なかでも特に好ましくはＢ−Ｒａｆ阻害剤である。
ＭＥＫ阻害剤としては、実施例記載の薬物（Ｕ０１２６、ＰＤ０９８０５９）の他、ＰＤ１８４１６１（ＭＥＫ１及びＭＥＫ２選択的阻害剤）などが挙げられる。Ｕ０１２６はＭＥＫ１／２の選択的阻害剤（一般名：１，４−ｄｉａｍｉｎｏ−２，３−ｄｉｃｙａｎｏ−１，４−ｂｉｓ［２−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ−ｔｈｉｏ］ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）である。Ｕ０１２６は、化学合成された有機化合物（１．４−ｄｉａｍｉｎｏ−２，３−ｄｉｃｙａｎｏ−１，４−ｂｉｓ［２−ａｍｉｎｏ−ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ］ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）で、ＭＡＰＫＫ（ＭＥＫ）活性を阻害し、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２の活性化を抑制する。Ｕ０１２６は、ＰＤ０９８０５９に比べるとＲａｆによるＭＥＫ１／２のリン酸化とＭＥＫ１／２によるＥＲＫ１／２のリン酸化の両方を阻害するため、より効率よく阻害することができる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１８６２３−１８６３２（１９９８））。Ｕ０１２６はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手可能である。ＰＤ０９８０５９はＭＥＫ１の選択的阻害剤（一般名：２’−Ａｍｉｎｏ−３’−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）で、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能である。ＰＤ０９８０５９は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼＩ（ＭＡＰキナーゼ・キナーゼＩまたはＭＥＫ１）に対する強力で、細胞透過性を有する選択的な阻害剤であり、ＭＥＫ１の活性化をブロックするため次段階のＭＡＰキナーゼのリン酸化／活性化を阻害する（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５３，２５５−２７０（１９９９））。
また、ＭＥＫ阻害剤としては、国際公開第９８３７８８１号パンフレット、国際公開第９９９０１４２６号パンフレット、特開２００１−５５３７６号公報、国際公開第２０００４１５０５号パンフレット、国際公開第２０００４１９９４号パンフレット、国際公開第２０００４２００２号パンフレット、国際公開第２０００４２００３号パンフレット、国際公開第２０００４２０２２号パンフレット、国際公開第２０００４２０２９号パンフレット、国際公開第２０００５６７０６号パンフレット、国際公開第２０００６８１９９号パンフレット、国際公開第２０００６８２００号パンフレット、国際公開第２０００６８２０１号パンフレット、国際公開第２００１６８６１９号パンフレット、国際公開第２００２３６５７０号パンフレット等に記載の薬物等が挙げられる。なかでも、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２阻害剤が好ましい。
ＥＲＫ阻害剤としては、例えば、特開２００５−３３０２６５号公報に記載の阻害剤、ＥＲＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｍｅｒｃｋ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、５−Ｉｏｄｏｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ（Ｍｅｒｃｋ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）等が挙げられる。ＥＲＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｍｅｒｃｋ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）はＥＲＫ２特異的阻害剤（ＫＤ＝〜５ｍＭ）（一般名：３−（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−５−（（４−ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−２，４−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）である。５−Ｉｏｄｏｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ（Ｍｅｒｃｋ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）はＥＲＫ２競合的阻害剤（Ｋｉ＝５３０ｎＭ）（一般名：４−Ａｍｉｎｏ−５−ｉｏｄｏ−７−（β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３−ｄ］−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）であり、ａｄｅｎｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅも阻害することが知られている（Ｋｉ＝３０ｎＭ）。なかでも、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２阻害剤が好ましい。
ＲＳＫ阻害剤としては、例えば、Ｋａｅｍｐｈｅｒｏｌ−３−Ｏ−（４’−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−ａ−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）等が挙げられる。ＲＳＫ阻害剤としては、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２及びＲＳＫ３阻害剤が好ましい。
本発明において好ましく用いられるＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤は、例えば、（ａ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質の活性を阻害する低分子化合物、（ｂ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質の発現を阻害する低分子化合物、（ｃ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、（ｄ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、（ｅ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質に対する抗体、（ｆ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質に対するリボザイムなどが挙げられる。これらの物質は、単独で、必要に応じてそれらの２種以上を組み合わせて用いることができる。
なお、「低分子化合物」とは、分子量１０，０００以下（好ましくは、分子量５，０００以下、より好ましくは分子量２，０００以下、特に好ましくは分子量７００以下）の有機および無機物質を意味する。
Ｒａｓタンパク質は、ＧＴＰ結合蛋白質であり、ＭＡＰＫ系シグナル伝達経路においてＭＡＰＫＫＫであるＲａｆタンパク質にシグナルを伝達する機能を有するＧＴＰ結合蛋白質で、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓなどが知られている。例えば、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７：１２６３−１２９３（２００３）に記載されている。Ｒａｓタンパク質の活性の測定は、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：７８６５−７８７４（２００２）に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
Ｒａｆタンパク質は、ＭＡＰＫＫＫであり、ＭＡＰＫ系シグナル伝達経路においてＭＡＰＫＫであるＭＥＫタンパク質にシグナルを伝達する機能を有するキナーゼで、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆなどがある。例えば、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７：１２６３−１２９３（２００３）に記載されている。Ｒａｆタンパク質の活性の測定は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５５：２７９−２９０（１９９５）に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
ＭＥＫタンパク質は、ＭＡＰＫＫであり、ＭＡＰＫ系シグナル伝達経路においてＭＡＰＫであるＥＲＫタンパク質にシグナルを伝達する機能を有するキナーゼでＭＥＫ１、ＭＥＫ２などがある。例えば、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７：１２６３−１２９３（２００３）に記載されている。ＭＥＫタンパク質の活性の測定は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：４７８−４８０（１９９２）に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
ＥＲＫタンパク質は、ＭＡＰキナーゼであり、種々の転写因子のセリン・スレオニン残基をリン酸化して遺伝子発現を促進する機能を有し、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２などがある。例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００６  Ａｐｒ  ２１；１２（１５）：２４４５−２４４９．Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｌｉｎｋｓなどに記載されている。ＥＲＫタンパク質の活性の測定は、例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００６  Ａｐｒ  ２１；１２（１５）：２４４５−２４４９．Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｌｉｎｋｓなどに記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
ＲＳＫタンパク質は、ＭＡＰキナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫＡＰキナーゼ）で、例えば、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７：１２６３−１２９３（２００３）に記載されている。ＲＳＫタンパク質の活性の測定は、例えば、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６７４−６８４（１９９５）に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
本明細書中、本発明で用いられるタンパク質の活性を、ＭＡＰＫ系シグナル伝達経路において次段階のタンパク質にシグナルを伝達する活性（例えば、リン酸化活性；以下、「ＭＡＰＫ系シグナル伝達経路シグナル伝達活性」ともいう）と称することもある。
なお、本明細書では、Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質という用語は、それらと実質的に同一の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。上記タンパク質の変異体としては、例えば、上記文献に記載のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
実質的に同質の活性としては、例えばＭＡＰＫ系シグナル伝達活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、脂肪酸合成酵素活性などが同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
Ｐ−糖タンパク質発現抑制活性は、後述の実施例にて記載したＰ−糖タンパク質発現量をウエスタンブロット法で測定することができる。また、ＢＣＲＰ発現抑制活性は、後述の実施例にて記載したＢＣＲＰ発現量をウエスタンブロット法で測定することができる。
その他にもＦＡＣＳによって測定することもできる。ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）での測定は、標識抗体を用いて細胞表面に発現しているであろうＰ−糖タンパク質を染色し、染色処理後の細胞を液流にのせ、標識量（Ｐ−糖タンパク質量）を測定することによって行うことができる。具体的には、例えば、ビオチン化Ｐ−糖タンパク質抗体（ＭＲＫ１６）を細胞表面に発現しているＰ−糖タンパク質と反応させた後、ＰＥ標識ストレプトアビジンと反応た後、ＦＡＣＳではＰＥの輝度を測定することにより、細胞表面上に発現しているＰ−糖タンパク質量を測定できる。
また、ＢＣＲＰ発現量のＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）での測定は、標識抗体を用いて細胞表面に発現しているであろうＢＣＲＰを染色し、染色処理後の細胞を液流にのせ、標識量（ＢＣＲＰ量）を測定することによって行うことができる。具体的には、例えば、ビオチン化ＢＣＲＰ抗体を細胞表面に発現しているＢＣＲＰと反応させた後、ＰＥ標識ストレプトアビジンと反応た後、ＦＡＣＳではＰＥの輝度を測定することにより、細胞表面上に発現しているＢＣＲＰ量を測定できる、
（ａ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質の活性を阻害する低分子化合物
本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害することができるので、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質として好適に使用することができる。本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩としては、本発明で用いられるタンパク質の有する活性（例、ＭＡＰＫ系シグナル伝達活性）を阻害しうる化合物またはその塩であればよく特に制限はないが、例えば、本発明で用いられるタンパク質に結合し、その活性を阻害する化合物またはその塩などが挙げられる。このような化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であってもよい。該化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。該化合物の塩としては、例えば、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、生理学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩，カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩，マグネシウム塩，バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
このような化合物としては、前述のＲａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤などが挙げられる。また、このような化合物は、後述するスクリーニング方法によって得ることができる。
（ｂ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質の発現を阻害する低分子化合物
本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩は、本発明で用いられるタンパク質の発現を抑制することができるので、本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する物質として好適に使用することができる。本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩としては、本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害しうるものであればよく特に制限はないが、例えば、（ｉ）本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）から本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡへの転写を阻害する化合物、（ｉｉ）本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。（ｉ）本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）から本発明で用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡへの転写を阻害する化合物としては、本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡへの転写を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡへの転写に関与する因子に結合し、転写を阻害する化合物などが挙げられる。（ｉｉ）本発明で用いられるタンパク質ＡをコードするｍＲＮＡから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を阻害する化合物としては、本発明で用いられるタンパク質ＡをコードするｍＲＮＡから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、本発明で用いられるタンパク質ＡをコードするｍＲＮＡから本発明で用いられるタンパク質への翻訳に関与する因子に結合し、翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。
このような化合物としては、前述のＲａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤などが挙げられる。また、このような化合物は、後述するスクリーニング方法によって得ることができる。
（ｃ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉ作用を有する二重鎖ＲＮＡ（例、本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）は、低毒性であり、本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子の翻訳を抑制することができ、本発明で用いられるタンパク質の発現を抑制することができるので、本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する物質として好適に使用することができる。このような、本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉ作用を有する二重鎖ＲＮＡとしては、本発明で用いられるタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ（例、本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）など）などが挙げられる。
このような二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年；特表２００２−５１６０６２号公報；米国特許出願公開第２００２／０８６３５６号明細書；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４巻，１８０−１８３頁，２０００年；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６巻，２４０−２４４頁，２０００年；Ｎａｔｕｒｅ，４０７巻，３１９−３２０頁，２００２年；Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１６巻，９４８−９５８頁，２００２年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９巻，５５１５−５５２０頁，２００２年；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６巻，５５０−５５３頁，２００２年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９巻，６０４７−６０５２頁，２００２年；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０巻，４９７−５００頁，２００２年；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０巻，５００−５０５頁，２００２年；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０巻，ｅ４６，２００２年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
本発明で用いられるＲＮＡｉ作用を有する二重鎖ＲＮＡの長さは、通常、１７〜３０塩基、好ましくは１９〜２７塩基、より好ましくは２０〜２２塩基である。
（ｄ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明で用いられるＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明で用いられるＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明で用いられるＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明で用いられるＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明で用いられるＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明で用いられるＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（ｉ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明で用いられるタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ｉｉ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明で用いられるＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、または本発明で用いられるタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
（ｅ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質（以下、「本発明で用いられるタンパク質」ともいう）に対する抗体
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明で用いられるタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ｉ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明で用いられるタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明で用いられるタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
（ｆ）Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対してリボザイム活性を有するポリヌクレオチドは、本発明で用いられるタンパク質の発現を抑制することができるので、本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する物質として好適に使用することができる。このようなリボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２２８巻，２２８頁，１９８８年；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２３９巻，２８５頁，１９８８年；Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７巻，７０５９頁，１９８９年；Ｎａｔｕｒｅ，３２３巻，３４９頁，１９８６年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９巻，６７５１頁，１９９１年；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．３巻，７３３頁，１９９０年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９巻，３８７５頁，１９９１年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９巻，５１２５頁，１９９１年；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８６巻，１２７１頁，１９９２年など参照）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明で用いられるタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明で用いられるタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。上記リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１  ＲＮＡなどのラージリボザイム、ハンマーヘッド型やヘアピン型などのスモールリボザイムなどが含まれる（タンパク質核酸酵素，３５巻，２１９１頁，１９９０年）。ハンマーヘッド型リボザイムについては、例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２２８巻，２２８頁，１９８８年；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２３９巻，２８５頁，１９８８年；タンパク質核酸酵素，３５巻，２１９１頁，１９９０年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７巻，７０５９頁，１９８９年などを参照することができる。また、ヘアピン型リボザイムについては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２３巻，３４９頁，１９８６年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９巻，６７５１頁，１９９１年；化学と生物，３０巻，１１２頁，１９９２年などを参照することができる。
（ｇ）本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用する本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド
本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用する本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドは、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害することができるので、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質として好適に使用することができる。本明細書において、「本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用するタンパク質の変異体」とは、それが発現することによって、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害（消失もしくは低下）させる作用を有するタンパク質を意味する（多比良和誠編，遺伝子の機能阻害実験法，羊土社，２６−３２頁，２００１年など参照）。
（ｈ）本発明で用いられるタンパク質に対するアプタマー
本発明で用いられるタンパク質に対するアプタマーは、本発明で用いられるタンパク質の活性や機能を阻害することができるので、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質として好適に使用することができる。アプタマーは、公知の方法、例えばＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５６巻，５５５−５８３頁，２００５年）を用いて取得する。アプタマーの構造は、公知の方法を用いて決定することができ、その構造を基に公知の方法に従いアプタマーを製造する。
（Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤及び抗癌剤耐性抑制剤）
（ＢＣＲＰ発現抑制剤及び抗癌剤耐性抑制剤）
本発明においては、上記（ａ）本発明で用いられるタンパク質に対する抗体、（ｂ）本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、（ｃ）本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、（ｄ）本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、（ｅ）本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する低分子化合物、（ｆ）本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する低分子化合物などの活性成分を常套手段に従って、製剤化し、Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤として投与することができる。Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤は、Ｐ−糖タンパク質の発現を抑制することによって、抗癌剤の細胞外への排出を抑制することができる。よって、Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤は、抗癌剤耐性抑制剤として用いることができる。ＢＣＲＰ発現抑制剤は、ＢＣＲＰの発現を抑制することによって、抗癌剤の細胞外への排出を抑制することができる。よって、ＢＣＲＰ発現抑制剤は、抗癌剤耐性抑制剤として用いることができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
なお前記した各組成物は、上記活性成分との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
該活性成分の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、抗癌剤に対して耐性を獲得した肺癌の抗癌剤耐性抑制の目的で本発明の活性成分を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該活性成分を、約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該活性成分の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、抗癌剤に対して耐性を獲得した肺癌の抗癌剤耐性抑制の目的で本発明の活性成分を注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該活性成分を、約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
より具体的には、（ａ）上記本発明のタンパク質の活性を阻害する低分子化合物またはその塩、（ｂ）上記本発明のタンパク質の発現を阻害する低分子化合物またはその塩などは、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例えば、経口投与のための製剤（医薬組成物）としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられる。注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記アンチセンスポリヌクレオチドは、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下、関節腔内、癌病変部等に投与してもよい。上記二重鎖ＲＮＡ、リボザイム、上記本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用する本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドなどは、上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
上記抗体、アプタマーなどは、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、静脈注射）に適する剤形として提供される。好ましくは吸入剤として提供される。
また、本発明のＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤の対象となる癌は、前記の抗癌剤の適用対象となる癌であれば特に制限されない。
（Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫまたはＲＳＫ阻害活性を指標として、Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤をスクリーニングする方法）
（Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫまたはＲＳＫ阻害活性を指標として、ＢＣＲＰ発現抑制剤をスクリーニングする方法）
次に、本発明は、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫまたはＲＳＫ阻害活性などのＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害活性を指標として、Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、試験化合物のＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害活性を評価し、ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害活性を有する化合物を選択することを含む方法である。ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害活性とは、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現阻害、活性化阻害、不安定化などによりＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質を介したシグナル伝達を阻害しうる活性を意味する。したがって、ＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害活性は、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に対する阻害活性によって評価しうる他、Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質、ＲＳＫタンパク質などのＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現阻害活性、活性化阻害活性、不安定化活性などにより評価することもできる。このようにして選択された化合物は、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を抑制する化合物であり、抗癌剤耐性抑制剤のための候補化合物となる。
ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現阻害活性、活性化阻害活性、不安定化活性などは公知の方法に従って測定することができる。具体的には、例えば、Ｒａｓ阻害活性、Ｒａｆ阻害活性、ＭＥＫ阻害活性、ＥＲＫ阻害活性、ＲＳＫ阻害活性などによりＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害活性を評価することが可能である。ここで、Ｒａｓ阻害活性、Ｒａｆ阻害活性、ＭＥＫ阻害活性、ＥＲＫ阻害活性またはＲＳＫ阻害活性とは、Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質の発現阻害、活性化阻害、不活性化などによりＲａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質またはＲＳＫタンパク質を介したシグナル伝達を阻害しうる活性を意味する。
Ｒａｓ阻害活性は、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６８０２−２６８０６（１９９５）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１７２７−１７３０（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４９１９−４９２６（１９９９）に記載の方法により測定することができる。Ｒａｆ阻害活性、例えば、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６８（１９９９）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．４０：５６７−５６８（２００２）に記載の方法により測定することができる。ＭＥＫ阻害活性は、例えば、ＷＯ９９／０１４２６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，４１７５（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１８６２３（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，６１６８（１９９９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，６７４７（１９９９）；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８，２８３９（１９９８）．等に記載の方法により測定することができる。ＥＲＫ阻害活性は、例えば、特開２００５−３３０２６５号公報に記載の方法により測定することができる。ＲＳＫ阻害活性は、例えば、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．７：１０９７−１０９９（２００５）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１４：３９７４−３９７７（２００６）に記載の方法により測定することができる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
より具体的には、例えば、（１）（ｉ）試験化合物を細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）試験化合物を細胞に接触させない場合との、該細胞のＲａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫまたはＲＳＫを介したシグナル伝達などのＭＡＰＫ系シグナル伝達活性の比較を行うことを特徴とするＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
本方法においては、まず、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質を発現する細胞に、試験化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、トリなど、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質を発現する細胞」としては、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質を発現している細胞、または外因性のＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外因性のＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子が発現した細胞は、通常、それぞれＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
次に、ＭＡＰＫ系シグナル伝達活性（例えば、リン酸化活性）を測定する。具体的には、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、そのＭＡＰＫ系シグナル伝達活性を測定する。ＭＡＰＫ系シグナル伝達活性は、公知の方法、例えば、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＲＳＫのリン酸化をそれらのタンパク質に対して特異的に反応するリン酸化抗体を用いたウエスタンブロッティング法あるいはＥＬＩＳＡ法により、あるいはその下流に存在する転写因子（ＣＲＥＢ、ｃ−Ｆｏｓなど）のリン酸化をそれらのタンパク質に対して特異的に反応するリン酸化抗体を用いたウエスタンブロッティング法あるいはＥＬＩＳＡ法などにより測定することができる。また、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の下流に存在する転写因子の転写活性化能の測定、例えば、その転写因子の標的遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝子）をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることにより、ＭＡＰＫ系シグナル伝達活性を測定することもできる。試験化合物としては、前記と同様のものが用いられる。
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、ＭＡＰＫ系シグナル伝達を抑制（低下）させる化合物を選択する。例えば、上記（ｉ）の場合におけるＭＡＰＫ系シグナル伝達活性を、上記（ｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上抑制する試験化合物を、ＭＡＰＫ系シグナル伝達を抑制（低下）させる化合物として選択することができる。このようにして選択された化合物は、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を抑制する化合物またはその塩であり、抗癌剤耐性抑制剤のための候補化合物となる。
また、例えば（２）（ｉ）試験化合物を細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）試験化合物を細胞に接触させない場合との、該細胞のＲａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質、ＲＳＫタンパク質などのＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルの比較を行うことを特徴とするＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
本方法においては、まず、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞に、前記と同様にして試験化合物を接触させる。該細胞としては、Ｒａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質、ＲＳＫタンパク質などのＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞、例えば、ヒト外陰部がん細胞Ａ４３１、ヒト大腸がん細胞ＨＣＴ−１５、ＳＷ６２０、ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト非小細胞肺がん細胞Ａ５４９、ヒト卵巣がん細胞ＯＶＣＡＲ−５などが好ましく用いられる。
次に、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を測定する。具体的には、例えば、上記（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、それらのＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する。遺伝子の発現レベルの測定は、転写レベルまたは翻訳レベルの測定など、公知の方法によって行うことができる。例えば、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを常法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルを測定することができる。あるいは、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色などを指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない）をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、それぞれＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、該遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質に対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体のいずれも利用することができる。試験化合物としては、前記と同様のものが用いられる。
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを抑制（低下）させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を抑制する化合物またはその塩であり、抗癌剤耐性抑制剤のための候補化合物となる。
さらに、例えば、（３）（ｉ）試験化合物の存在下および（ｉｉ）試験化合物の非存在下におけるＲａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質、ＲＳＫタンパク質などのＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性の比較を行うことを特徴とするＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤のスクリーニング方法も提供する。具体的には、例えば、上記（ｉ）と（ｉｉ）の場合においてＲａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質、ＲＳＫタンパク質などのＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性を測定する。次いで、試験化合物の非存在下の場合（コントロール）と比較して、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性を抑制（低下）させる化合物を選択する。ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性は、公知の方法、例えば、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＲＳＫのリン酸化をそれらのタンパク質に対して特異的に反応するリン酸化抗体を用いたウエスタンブロッティング法あるいはＥＬＩＳＡ法により、あるいはその下流に存在する転写因子（ＣＲＥＢ、ｃ−Ｆｏｓなど）のリン酸化をそれらのタンパク質に対して特異的に反応するリン酸化抗体を用いたウエスタンブロッティング法あるいはＥＬＩＳＡ法などにより測定することができる。また、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の下流に存在する転写因子の転写活性化能の測定、例えば、その転写因子の標的遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝子）をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることにより、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性を測定することもできる。このようにして選択された化合物は、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を抑制する化合物またはその塩であり、抗癌剤耐性抑制剤のための候補化合物となる。
また、例えば、（４）（ｉ）試験化合物の存在下および（ｉｉ）試験化合物の非存在下におけるＲａｓタンパク質、Ｒａｆタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質、ＲＳＫタンパク質などのＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の安定性の比較を行うことを特徴とするＰ−糖タンパク質発現抑制剤のスクリーニング方法なども提供する。具体的には、例えば、上記（ｉ）と（ｉｉ）の場合においてＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の安定性を測定する。ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の安定性は、公知の方法、例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：５９６−６０４（２００５）に記載の方法（３５Ｓ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｕｌｓｅ  ｃｈａｓｅ法）などにより測定することができる。次いで、試験化合物の非存在下の場合（コントロール）と比較して、ＭＡＰＫ系シグナル伝達に関与するタンパク質の安定性を抑制（低下）させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、Ｐ−糖タンパク質の発現を抑制する化合物またはその塩であり、抗癌剤耐性抑制剤のための候補化合物となる。
上記方法によって選択された化合物は、さらにＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を指標としてスクリーニングするのが好ましい。例えば、（１）（ｉ）試験化合物を細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）試験化合物を細胞に接触させない場合との、該細胞のＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現レベルの比較を行うことによってＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤をスクリーニングするのが好ましい。
具体的には、例えば、上記（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、それらのＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰをコードする遺伝子の発現レベルを測定する。遺伝子の発現レベルの測定は、転写レベルまたは翻訳レベルの測定など、公知の方法によって行うことができる。例えば、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰをコードする遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを常法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルを測定することができる。あるいは、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰをコードする遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色などを指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない）をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰをコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、それぞれＰ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、該遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰに対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体のいずれも利用することができる。試験化合物としては、上記方法によって選択された化合物が用いられる。
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰをコードする遺伝子の発現レベルを抑制（低下）させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰの発現を抑制する化合物またはその塩であり、抗癌剤耐性抑制剤のための候補化合物となる。
（Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤を含有してなる耐性獲得が抑制された癌治療剤）
（ＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる耐性獲得が抑制された癌治療剤）
さらに、本発明は、Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤を含有してなる耐性獲得が抑制された抗癌剤（以下、「耐性獲得抑制抗癌剤」という）を提供する。本発明の耐性獲得抑制抗癌剤は、Ｐ−糖タンパク質の発現を抑制する活性と共に抗癌活性を有するＰ−糖タンパク質発現抑制剤を含有する。したがって、本発明の耐性獲得抑制抗癌剤は、癌細胞を選択的に死滅させ、癌細胞の増殖を抑制し、および／または癌細胞のアポトーシスを誘導することができると共に、Ｐ−糖タンパク質の発現を抑制することによって癌細胞の薬剤耐性獲得を抑制することができるので、耐性獲得が抑制された抗癌剤として有用である。本発明の耐性獲得抑制抗癌剤は、Ｐ−糖タンパク質の発現を抑制する活性と共に抗癌活性を有するＰ−糖タンパク質発現抑制剤を単独で含有することができるし、さらに、これ以外の抗癌剤を配合することもできる。
さらに、本発明はＢＣＲＰ発現抑制剤含有してなる耐性獲得が抑制された抗癌剤（以下、「耐性獲得抑制抗癌剤」という）を提供する。本発明の耐性獲得抑制抗癌剤は、ＢＣＲＰの発現を抑制する活性と共に抗癌活性を有するＢＣＲＰ発現抑制剤を含有する。したがって、本発明の耐性獲得抑制抗癌剤は、癌細胞を選択的に死滅させ、癌細胞の増殖を抑制し、および／または癌細胞のアポトーシスを誘導することができると共に、ＢＣＲＰの発現を抑制することによって癌細胞の薬剤耐性獲得を抑制することができるので、耐性獲得が抑制された抗癌剤として有用である。本発明の耐性獲得抑制抗癌剤は、ＢＣＲＰの発現を抑制する活性と共に抗癌活性を有するＢＣＲＰ発現抑制剤を単独で含有することができるし、さらに、これ以外の抗癌剤を配合することもできる。
本発明の耐性獲得が抑制された抗癌剤に用いられるＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤としては、上記したＭＡＰＫ系シグナル伝達阻害剤を好ましく用いることができるが、なかでもＲａｓ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤およびＲＳＫ阻害剤が好ましい。
本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤を上述の剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
上記Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、肺癌の治療の目的で本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該剤を、それぞれ約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該剤の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、肺癌の治療の目的で本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤を注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該剤を、それぞれ約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、本発明のＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤は、ホルモン療法剤、抗癌剤（例、化学療法剤、免疫療法剤、チロシンキナーゼシグナル経路阻害剤（細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤）など（以下、併用薬物と略記する）と併用して使用することができる。
本発明の化合物は単剤として使用しても優れた抗癌作用を示すが、さらに前記併用薬物の一つまたは幾つかと併用（多剤併用）することによって、その効果をより増強させることができる。
また、本発明のＰ−糖タンパク質発現抑制剤は、抗癌剤耐性抑制剤として用いることができるので、Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤（例、ホルモン療法剤、化学療法剤、免疫療法剤、または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤）とを組み合わせると、耐性を獲得した癌に対して癌治療剤として極めて有効である。
より具体的には、本発明の（Ａ）Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤と（Ｂ）前記の癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、耐性を獲得した癌に対する治療効果が回復するので、これら成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物又は併用剤は新たな癌治療剤として有用である。
また、本発明の（Ａ）Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤と（Ｂ）前記の癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、癌に対する耐性を獲得するのを抑制して癌治療を行うことができるので、これら成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物又は併用剤は新たな癌治療剤として有用である。
また、本発明のＢＣＲＰ発現抑制剤は、抗癌剤耐性抑制剤として用いることができるので、ＢＣＲＰ発現抑制剤と抗癌剤（例、ホルモン療法剤、化学療法剤、免疫療法剤、または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤）とを組み合わせると、耐性を獲得した癌に対して癌治療剤として極めて有効である。
より具体的には、本発明の（Ａ）ＢＣＲＰ発現抑制剤と（Ｂ）前記の癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、耐性を獲得した癌に対する治療効果が回復するので、これら成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物又は併用剤は新たな癌治療剤として有用である。
また、本発明の（Ａ）ＢＣＲＰと（Ｂ）前記の癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、癌に対する耐性を獲得するのを抑制して癌治療を行うことができるので、これら成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物又は併用剤は新たな癌治療剤として有用である。
かかる癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤としては、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰにより耐性を生じる抗癌剤であれば制限されないが、例えば、塩酸ドキソルビシン、ダウノマイシン、塩酸エピルビシン、アドリアマイシン等のアンスラサイクリン類；ビンクリスチン等のビンカアルカロイド類；パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン類の他にも、ホルモン療法剤、化学療法剤、免疫療法剤、または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤などが挙げられる。
「ホルモン療法剤」としては、例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、ジエノゲスト、アソプリスニル、アリルエストレノール、ゲストリノン、ノメゲストロール、タデナン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキシフェン、レボルメロキシフェン、抗エストロゲン（例、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン等）、ＥＲダウンレギュレーター（例、フルベストラント等）、ヒト閉経ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等）、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害薬（例、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタン等）、抗アンドロゲン（例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド等）、５α−レダクターゼ阻害薬（例、フィナステリド、デュタステリド、エプリステリド等）、副腎皮質ホルモン系薬剤（例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン等）、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロン等）、レチノイドおよびレチノイドの代謝を遅らせる薬剤（例、リアロゾール等）などが挙げられる。ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等）が好ましい。
「化学療法剤」としては、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来抗癌剤などが挙げられる。
「アルキル化剤」としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシンなどが挙げられる。
「代謝拮抗剤」としては、例えば、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、５−ＦＵ系薬剤（例、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフール等）、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチンなどが挙げられる。
「抗癌性抗生物質」としては、例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシンなどが挙げられる。
「植物由来抗癌剤」としては、例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビンなどが挙げられる。
「免疫療法剤（ＢＲＭ）」としては、例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、ＢＣＧワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドＫ、プロコダゾールなどが挙げられる。
「細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤」における「細胞増殖因子」としては、細胞の増殖を促進する物質であればどのようなものでもよく、通常、分子量が２０，０００以下のペプチドで、受容体との結合により低濃度で作用が発揮される因子が用いられ、具体的には、（１）ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）またはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、ＥＧＦ、ハレグリン（ＨＥＲ２リガンド）等〕、（２）インシュリンまたはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、インシュリン、ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−１、ＩＧＦ−２等〕、（３）ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）またはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＫＧＦ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ−１０等〕、（４）その他の細胞増殖因子〔例、ＣＳＦ（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＩＬ−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）等〕などが挙げられる。
「細胞増殖因子の受容体」としては、前記の細胞増殖因子と結合能を有する受容体であればいかなるものであってもよく、具体的には、ＥＧＦ受容体、ハレグリン受容体（ＨＥＲ２）、インシュリン受容体、ＩＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体−１またはＦＧＦ受容体−２などが挙げられる。
「細胞増殖因子の作用を阻害する薬剤」としては、トラスツズマブ（ハーセプチン（商標）；ＨＥＲ２抗体）、メシル酸イマチニブ、ＺＤ１８３９またはセツキシマブ、ＶＥＧＦに対する抗体（例、ベバシツマブ）、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体、ゲフィチニブ、エルロチニブなどが挙げられる。
前記の薬剤の他に、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトン、塩酸プロカルバジン、プロトポルフィリン・コバルト錯塩、水銀ヘマトポルフィリン・ナトリウム、トポイソメラーゼＩ阻害薬（例、イリノテカン、トポテカン等）、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬（例えば、ソブゾキサン等）、分化誘導剤（例、レチノイド、ビタミンＤ類等）、血管新生阻害薬（例、サリドマイド、ＳＵ１１２４８等）、α−ブロッカー（例、塩酸タムスロシン、ナフトピジル、ウラピジル、アルフゾシン、テラゾシン、プラゾシン、シロドシン等）セリン・スレオニンキナーゼ阻害薬、エンドセリン受容体拮抗薬（例、アトラセンタン等）、プロテアゾーム阻害薬（例、ボルテゾミブ等）、Ｈｓｐ９０阻害薬（例、１７−ＡＡＧ、ＤＭＡＧ（１７−ｄｅｓｍｅｔｈｏｘｙ−１７−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）等）、スピロノラクトン、ミノキシジル、１１α−ヒドロキシプロゲステロン、骨吸収阻害・転移抑制薬（例、ゾレドロン酸、アレンドロン酸、パミドロン酸、エチドロン酸、イバンドロン酸、クロドロン酸）なども用いることができる。
本発明の新たな抗癌剤、抗癌剤耐性抑制剤、癌治療剤は、これらの成分が従来用いられている製剤をそのまま併用することにより投与してもよいが、これらの成分を含む新たな製剤としてもよい。これらの製剤の形態としては、経口剤、注射剤（筋肉、皮下、静脈を含む）、坐剤、外用剤（パッチ剤、塗布剤）等が挙げられる。
上記本発明の癌治療剤などの医薬は、本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤と、本発明で用いられる抗癌剤とが同時に作用を示すことができる形態であればよい。例えば、本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤と、本発明で用いられる抗癌剤とを、一つの医薬組成物（例、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、坐剤など）中に製剤化した配合剤としてもよい。また、本発明の癌治療剤などの医薬は、本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤と、本発明で用いられる抗癌剤とからなるキットであってもよい。この場合、本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤と、本発明で用いられる抗癌剤とは、本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤とが同時に作用することができるかぎり時間差を置いて投与してもよいが、同時に投与するのが好ましい。
本発明の癌治療剤などの医薬におけるＰ−糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤との投与量の比率（または配合比）は、投与（または配合）される本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤および抗癌剤の種類および／または組み合わせ、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、重量比で、約１：５００〜５００：１、好ましくは約１：１００〜１００：１、より好ましくは１：１０〜１０：１、特に好ましくは１：５〜５：１である。また、本発明の癌治療剤などの医薬におけるＢＣＲＰ発現抑制剤と抗癌剤との投与量の比率（または配合比）は、投与（または配合）される本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤および抗癌剤の種類および／または組み合わせ、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、重量比で、約１：５００〜５００：１、好ましくは約１：１００〜１００：１、より好ましくは１：１０〜１０：１、特に好ましくは１：５〜５：１である。
本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤とを上述の剤として使用する場合、例えば上述した方法など、常套手段に従って製剤化することができる。また、本発明で用いられるＢＣＲＰ発現抑制剤と抗癌剤とを上述の剤として使用する場合、例えば上述した方法など、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記剤を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤とが、それぞれ含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
上記剤の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、肺癌の治療の目的で本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤とを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該剤を、それぞれ約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該剤の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、肺癌の治療の目的で本発明で用いられるＰ−糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤とを注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該剤を、それぞれ約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本明細書および配列表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【実施例】
【０００５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
調製例１（Ｐ−糖タンパク質高発現株の調製）
（１）ＭＤＲ１遺伝子
本発明でヒト野生型ＭＤＲ１  ｃＤＮＡと呼ぶ遺伝子としては、ヒトの副腎のｃＤＮＡライブラリーより単離されたヒト野生型ＭＤＲＩ  ｃＤＮＡを用いた（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １６２：２２４−２３１（１９８９）参照）。
（２）ＭＤＲ１発現プラスミド
野性型ＭＤＲ１発現レトロウイルスベクタープラスミドｐＨａＭＤＲは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：６９４−６９８（１９９４）に記載されたものを用いた。
（３）ＭＤＲ１レトロウイルスの作成
本発明に用いた野性型ＭＤＲ１発現レトロウイルスＨａＭＤＲのレトロウイルス液は、ｐＨａＭＤＲプラスミドをマウスのａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅであるＰＡ３１７細胞にリン酸カルシウム法を用いて導入したのちに３５ｎｇ／ｍｌのビンクリスチンで選択し、さらに得られたビンクリスチン耐性細胞を限界希釈法でクローニングすることによって得られたレトロウイルス産生細胞３Ｐ２６の培養上清を用いた。３Ｐ２６細胞については、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３：９４７−９５４（１９９７）に記載されている。
３Ｐ２６細胞の培養上清を集めて、これを０．４５マイクロメーターのフィルターでろ過してレトロウイルス液とした。
（４）ＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ細胞の調製
ＨａＭＤＲレトロウイルス液をヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７の培養に加えることにより遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を６ｎｇ／ｍｌのビンクリスチンで選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をＭＣＦ−７／ＭＤＲと名付けた。また、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ細胞をＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞と同様の方法で調製した。
（５）ＳＷ６２０−１４細胞の調製
大腸がん細胞株ＳＷ６２０細胞を限界希釈法で作製した。具体的には、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ社製）に１個／ｗｅｌｌになるように大腸がん細胞株ＳＷ６２０細胞をまき、細胞が増えてきたｗｅｌｌの細胞のみ、２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ社製）に移して培養した。細胞が増えた後、さらに１００ｍｍ−ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ社製）に移して培養した。このようにして得た各クローンについて、Ｐ−糖タンパク質を高発現しているクローンをＦＡＣＳで確認し、Ｐ−糖タンパク質を高発現するクローン１４を得た。この細胞をＳＷ６２０−１４細胞と名付けた。なお、ＦＡＣＳの実施方法は、前述１５ページ８行目から記載されている方法に準じて行った。
実施例１（内因性Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤のスクリーニング）
Ｐ−糖タンパク質を高発現している大腸癌由来のＨＣＴ−１５細胞（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡより入手）、大腸癌由来のＳＷ６２０細胞（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡより入手）において、Ｐ−糖タンパク質発現量を減少する薬剤のスクリーニングをウエスタンブロット法で行った。７％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地にＲａｓ阻害剤（ファルネシル転移酵素阻害剤）ＦＴＩ−２７７（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＭＥＫ阻害剤  Ｕ０１２６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ｈｓｐ９０阻害剤１７−ＡＡＧ（１７−（ａｌｌｙｌａｍｉｎｏ）−１７−ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ；Ａｌｍｏｎｅ  ｌａｂｓより購入）ＰＩ３Ｋ阻害剤  ＬＹ２９４００２（２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）−８−ｐｈｅｎｙｌ−１（４Ｈ）−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ；Ｍｅｒｃｋ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）又はｍＴＯＲ阻害剤ｒａｐａｍｙｃｉｎ（２３，２７−ｅｐｏｘｙ−３Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［２，１−ｃ］［１，４］ｏｘａａｚａｃｙｃｌｏｈｅｎ−ｔｒｉａｃｏｎｔｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ社製）を添加して、ＨＣＴ−１５細胞又はＳＷ６２０細胞を１２時間培養した。細胞の培養は、初期細胞数を、それぞれＨＣＴ−１５：３０万個／６ｃｍシャーレ、ＳＷ６２０：５０万個／６ｃｍシャーレとし、炭酸ガス濃度：５％、温度：３７℃で培養した。１２時間培養した後に、各薬剤を添加して培養した後のＰ−糖タンパク質発現量を抗Ｐ−糖タンパク質抗体（Ｚｙｍｅｄ社製、商品名：Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  １＋３（ＭＤＲ，ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｈｏｓｔ：Ｍｏｕｓｅ，Ｃｌｏｎｅ：Ｃ２１９））を用いたウエスタンブロット法で調べた。薬剤を添加せず培養したものをコントロールとした（薬物未添加７％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）。各レーンには各々１０μｇのタンパク質を電気泳動した。結果は図１に示す。なお、タンパク質の定量は、ブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ染色液）で行った。より具体的には、培養後の細胞をスクレーパーを用いて回収し、遠心（５，０００ｒｐｍ  ｘ  ３分）によりペレットダウンした。細胞ペレットに０．２％ＮＰ−４０を含むｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加え、５分おきにボルテックスをしながら、合計３０分間氷上にて細胞膜および細胞質画分を可溶化した。そして遠心（１５，０００ｒｐｍ  ｘ  １５分）した上清をサンプルとし、蛋白の定量を行った。
Ｒａｓ阻害剤（ファルネシル転移酵素阻害剤）ＦＴＩ−２７７又はＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の存在下で、ＨＣＴ−１５細胞及びＳＷ６２０細胞においてＰ−糖タンパク質発現量がコントロールの２０％以下に減少したが、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２やｍＴＯＲ阻害剤ｒａｐａｍｙｃｉｎの存在下では、ＨＣＴ−１５細胞及びＳＷ６２０細胞ともにＰ−糖タンパク質発現は抑制されていなかった（図１）。
Ｒａｓ阻害剤又はＭＥＫ阻害剤の添加によって、内因性に発現しているＰ−糖タンパク質の発現量が顕著に減少した。Ｒａｓ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤には、Ｐ−糖タンパク質発現抑制効果があることがわかった。
実施例２（ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６による経時的なＰ−糖タンパク質の発現抑制）
調整例１に記載の方法と同じ調整により得られた内因性Ｐ−糖タンパク質を発現しているＨＣＴ−１５細胞、ＳＷ６２０細胞、及び外因性Ｐ−糖タンパク質を発現しているＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ細胞のＰ−糖タンパク質発現量に及ぼすＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の抑制効果を、実施例１と同様の方法で、経時的に試験した。
具体的には、７％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に、最終濃度が１０μＭとなるようにＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６を添加して、０〜１６時間培養した後、Ｐ−糖タンパク質発現量をウエスタンブロット法で確認した。結果は図２に示す。
ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６存在下で、ＨＣＴ−１５細胞及びＳＷ６２０細胞におけるＰ−糖タンパク質発現量は４〜８時間後にコントロールの１０〜２０％に減少した。また、同様にＵ０１２６存在下でＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ細胞におけるＰ−糖タンパク質発現量は８〜１２時間でコントロールの１０％以下に減少した。なお、ＭＤＲ１  ｍＲＮＡの発現量に変化は認められなかった。
ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６を、内因性Ｐ−糖タンパク質を発現しているＨＣＴ−１５細胞及びＳＷ６２０細胞に添加した結果、経時的にＰ−糖タンパク質の発現量が減少した。４〜８時間という短時間で、顕著にＰ−糖タンパク質の発現量が減少することが判明した。また、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６を、Ｐ−糖タンパク質遺伝子であるＭＤＲ１遺伝子を導入し外因性のＰ−糖タンパク質を発現するＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ細胞に添加した場合にも、８〜１２時間後には、Ｐ−糖タンパク質の発現量が顕著に減少した。
ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６は、これまでに知られているＰ−糖タンパク質発現抑制剤と比較して、最も短時間にＰ−糖タンパク質抑制効果を示した。
実施例３（ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０９８０５９による経時的なＰ−糖タンパク質の発現抑制）
Ｕ０１２６とは作用機作の異なるＭＥＫ阻害剤ＰＤ０９８０５９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入；Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５３，２５５参照）を用いて、内因性Ｐ−糖タンパク質を発現しているＨＣＴ−１５細胞、ＳＷ６２０細胞、及び外因性Ｐ−糖タンパク質を発現しているＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ細胞のＰ−糖タンパク質発現量に及ぼすＭＥＫ阻害剤ＰＤ０９８０５９の抑制効果を、実施例１と同様の方法で、経時的に試験した。
具体的には、７％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に、最終濃度が５０μＭとなるようにＭＥＫ阻害剤ＰＤ０９８０５９を添加して、８時間又は１２時間培養した後、Ｐ−糖タンパク質発現量をウエスタンブロット法で確認した。結果は図３に示す。
いずれの細胞においても、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０９８０５９存在下で培養すると、８又は１２時間後のＰ−糖タンパク質発現量はコントロールの１０〜２０％に減少した。
ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６とは作用機作の異なるＭＥＫ阻害剤ＰＤ０９８０５９によっても、同程度の時間でＰ−糖タンパク質の発現量が減少することが判明した。従って、これらの薬物は、強力なＰ−糖タンパク質発現抑制剤として有用である。これらのＭＡＰＫシグナル系阻害剤は非常に短時間でＰ−糖タンパク質の発現を低下させ、Ｐ−糖タンパク質による抗癌剤耐性を克服することが可能である。
実施例４（ＭＡＰＫシグナル伝達系遺伝子ｓｉＲＮＡによるＰ−糖タンパク質発現抑制）
ＭＡＰＫシグナル伝達系遺伝子であるＭＥＫ１及び２、ＥＲＫ１及び２、ＲＳＫ１及び２及び３のｓｉＲＮＡを用いて、ＭＡＰＫシグナル伝達系遺伝子がノックダウンすることによるＰ−糖タンパク質発現抑制効果をウエスタンブロット法で試験した。細胞には、内因性Ｐ−糖タンパク質を発現しているＨＣＴ−１５細胞、ＳＷ６２０細胞、及び外因性Ｐ−糖タンパク質を発現しているＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ細胞を用いた。これらの細胞は、実施例１または実施例２と同様にして入手した。
７％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に、ＨＣＴ−１５細胞及びＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞は２０万個／６ｃｍディッシュ（未コーティングの培養用ディッシュ、旭テクノグラス社製）、ＳＷ６２０細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ細胞は３０万個／６ｃｍディッシュとなるようにまいて、一晩培養後（約１６時間）、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ；商品名：Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）ｓｉＲＮＡ、型番：１０２２０７６）あるいはＭＥＫＩ  ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ；商品名：Ｈｓ＿ＭＡＰ２Ｋ１＿６＿ＨＰ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ、型番：Ｓ１００３００６９９）、ＭＥＫ２  ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ；商品名：Ｈｓ＿ＭＡＰ２Ｋ２＿５＿ＨＰ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ、型番：Ｓ１０２２２５０９０）、ＥＲＫ１  ｓｉＲＮＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；商品名：ＳｉｇｎａｌＳｉｌｅｎｃｅ  ｐ４４  ＭＡＰＫ  ｓｉＲＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、型番：６４３６）、ＥＲＫ２  ｓｉＲＮＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；商品名：ＳｉｇｎａｌＳｉｌｅｎｃｅ  Ｐｏｏｌ  ｐ４２  ＭＡＰＫ  ｓｉＲＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、型番：６３９１）、ＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ；商品名：Ｈｓ＿ＲＰＳ６ＫＡ１＿１０＿ＨＰ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ、型番：Ｓ１０２２２３０６７）、ＲＳＫ２  ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ；商品名：Ｈｓ＿ＲＰＳ６ＫＡ２＿９＿ＨＰ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ、型番：Ｓ１０２２２４９９９）、ＲＳＫ３  ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ；商品名：Ｈｓ＿ＲＰＳ６ＫＡ３＿６＿ＨＰ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ、型番：Ｓ１００２８８１９７）を、最終濃度が各々２５ｎＭあるいは５０ｎＭとなるように調製し、遺伝子導入用カチオン性脂質（商品名「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を製品添付書に記載の方法に従って混合し各細胞に添加した。添加後、さらに５％炭酸ガス培養器で３７℃、４８時間培養し、Ｐ−糖タンパク質発現量をウエスタンブロットで調べた。結果は図４に示す。図４の各レーンに対応する細胞に対するｓｉＲＮＡ添加量は、それぞれ次の通りである。すなわち、左から１レーン目（Ｃｏｎｔ．）は最終濃度５０ｎＭのＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡを添加、２レーン目（ＭＥＫ左）は最終濃度１２．５ｎＭのＭＥＫ１  ｓｉＲＮＡおよび最終濃度１２．５ｎＭのＭＥＫ２  ｓｉＲＮＡを混合して（ｓｉＲＮＡの最終濃度としては２５ｎＭ）添加、３レーン目（ＭＥＫ右）は最終濃度２５ｎＭのＭＥＫ１  ｓｉＲＮＡおよび最終濃度２５ｎＭのＭＥＫ２  ｓｉＲＮＡを混合して（ｓｉＲＮＡの最終濃度としては５０ｎＭ）添加、４レーン目（ＥＲＫ左）は最終濃度１２．５ｎＭのＥＲＫ１  ｓｉＲＮＡおよび最終濃度１２．５ｎＭのＥＲＫ２  ｓｉＲＮＡを混合して（ｓｉＲＮＡの最終濃度としては２５ｎＭ）添加、５レーン目（ＥＲＫ右）は最終濃度２５ｎＭのＥＲＫ１  ｓｉＲＮＡおよび最終濃度２５ｎＭのＥＲＫ２  ｓｉＲＮＡを混合して（ｓｉＲＮＡの最終濃度としては５０ｎＭ）添加、６レーン目（ＲＳＫ左）は最終濃度８．３ｎＭの���ＳＫ１  ｓｉＲＮＡ、最終濃度８．３ｎＭのＲＳＫ２  ｓｉＲＮＡおよび最終濃度８．３ｎＭのＲＳＫ３  ｓｉＲＮＡを混合して（ｓｉＲＮＡの最終濃度としては２５ｎＭ）添加、７レーン目（ＲＳＫ右）は最終濃度１６．７ｎＭのＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡ、最終濃度１６．７ｎＭのＲＳＫ２  ｓｉＲＮＡおよび最終濃度１６．７ｎＭのＲＳＫ３  ｓｉＲＮＡを混合して（ｓｉＲＮＡの最終濃度としては２５ｎＭ）添加した。
ＭＥＫ１／２  ｓｉＲＮＡを導入した細胞ではコントロールと比べていずれもＰ−糖タンパク質発現量はほとんど差がなかったが、ＥＲＫ１／２  ｓｉＲＮＡを導入した細胞ではコントロールと比べてＰ−糖タンパク質発現量は用量依存的に約５０％前後に減少した。また、ＲＳＫ１／２／３  ｓｉＲＮＡを導入した細胞ではコントロールと比べてＰ−糖タンパク質発現量が用量依存的に１０〜２０％に減少した。ＭＡＰＫシグナル伝達系のｓｉＲＮＡ、とくにＲＳＫ１  ｓｉＲＮＡは、非常に効率よくＰ−糖タンパク質の発現を低下させることが示された。
内因性ＢＣＲＰを発現しているヒト大腸癌ＨＴ−２９細胞及びＫＭ１２細胞、ヒト非小細胞肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０細胞及びＡ５４９細胞、ヒト卵巣癌ＯＶＡＣＡＲ−５細胞のＢＣＲＰ発現量に及ぼすＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の抑制効果を、経時的に試験した。
ＢＣＲＰを高発現しているヒト大腸癌由来のＨＴ−２９細胞及びＫＭ１２細胞、（各々Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡより入手）、ヒト非小細胞肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０細胞及びＡ５４９細胞（各々Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡより入手）、ヒト卵巣癌ＯＶＡＣＡＲ−５細胞（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡより入手）のＢＣＲＰ発現量に及ぼすＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の抑制効果を、経時的に試験した。
具体的には、７％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加して、各細胞を８時間又は１２時間培養した。細胞の培養は、初期細胞数を、それぞれＨＴ−２９：２０万個／６ｃｍシャーレ、ＫＭ１２：２０万個／６ｃｍシャーレ、ＮＣＩ−Ｈ４６０：２０万個／６ｃｍシャーレ、Ａ５４９：２０万個／６ｃｍシャーレとし、ＯＶＡＣＡＲ−５：２０万個／６ｃｍシャーレ炭酸ガス濃度：５％、温度：３７℃で培養した。８時間又は１２時間培養した後に、各薬剤を添加して培養した後のＢＣＲＰ発現量を抗ＢＣＲＰ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、商品名：ＢＸＰ−２１）を用いたウエスタンブロット法で調べた。各レーンには各々１０μｇのタンパク質を電気泳動した。結果は図５に示す。
なお、タンパク質の定量は、ブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  プロテインアッセイ染色液）で行った。より具体的には、培養後の細胞をスクレーパーを用いて回収し、遠心（５，０００ｒｐｍ  ｘ  ３分）によりペレットダウンしました。細胞ペレットに０．２％  ＮＰ−４０を含むｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加え、５分おきにボルテックスをしながら、合計３０分間氷上にて細胞膜および細胞質画分を可溶化した。そして遠心（１５，０００ｒｐｍ  ｘ  １５分）した上清をサンプルとし、蛋白の定量を行った。
また、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の効果を、ｐ４４／ｐ４２ＥＲＫのリン酸化状態を指標として判定した。結果は図５に示す。なお、図５では、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｓｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量をも示した。
ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６存在下、ヒト大腸癌細胞、ヒト非小細胞肺がん細胞及びヒト卵巣癌細胞において、１２時間後にＢＣＲＰ発現量が減少した。
ＭＥＫ阻害剤を用いてＭＡＰＫシグナル伝達系を阻害することによって、ＢＣＲＰが発現抑制されることが示された。
実施例５（パクリタキセルに対する感受性の増大）
内因性Ｐ−糖タンパク質を発現している大腸がん細胞ＨＣＴ−１５（１×１０５個／６０ｍｍ−ｄｉｓｈ）、調整例１で得たＳＷ６２０−１４（２×１０５個／６０ｍｍ−ｄｉｓｈ）、外因性Ｐ−糖タンパク質を発現させた乳がん細胞ＭＣＦ−７／ＭＤＲ（１×１０５個／６０ｍｍ−ｄｉｓｈ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ（２×１０５個／６０ｍｍ−ｄｉｓｈ）を１６時間培養後、１０μｍｏｌ／Ｌ  Ｕ０１２６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。２４時間毎にＵ０１２６含有培地を交換しながら、合計７２時間培養した。これらの細胞のうち、特に記載のないものについては、実施例１または実施例２と同様にして入手した。
各細胞において予めもとめたパクリタキセルに対するＩＣ５０濃度（５０％増殖阻害濃度）、すなわち、ＨＣＴ−１５細胞には１００ｎＭ、ＳＷ６２０−１４細胞には５ｎＭ、ＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞には４ｎＭ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ細胞には８００ｎＭの濃度の０倍、１倍、３倍濃度のパクリタキセルを、１０μｍｏｌ／Ｌ  Ｕ０１２６と共に添加し、さらに２４時間培養した。コントロール群は、Ｕ０１２６不含培地で同様に７２時間培養後、パクリタキセルのみを２４時間処理した。パクリタキセルに対するＩＣ５０濃度（５０％増殖阻害濃度）は、具体的には、細胞増殖阻害試験にて調べた。それぞれの細胞を１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ社製）に５０００個／ｍｌ／ウェルでまき、続いてメディウムで各濃度に希釈した薬剤をｗｅｌｌあたり１ｍｌ加えた。このプレートを５％炭酸ガス培養器で３７℃、５日間で培養した。５日後、リン酸緩衝バッファーで細胞を洗浄後、０．５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡで細胞をはがしメディウム１ｍｌで懸濁し、９ｍｌのセルパック希釈液（東亞医用電子）をいれたビーカーに各ウェルの細胞液をそれぞれ加え、Ｓｙｓｍｅｘ  ＣＤＡ−５００自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。その結果として、細胞数を５０％に減少させるパクリタキセル濃度（ＩＣ５０）を求めた。
細胞回収後、細胞膜および細胞質画分を可溶化し、ウエスタンブロット法によりＰ−糖タンパク質、ＰＡＲＰ（ポリ  ＡＤＰ  リボースポリメラーゼ）の切断断片、ＧＡＰＤＨの発現変化を確認した。ウエスタンブロット法において、それぞれのタンパク質を検出するために使用した抗体は、Ｐ−糖タンパク質について抗Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  １＋３モノクローナル抗体（Ｃ２１９）（Ｚｙｍｅｄ社製）、ＰＡＲＰについて抗ＰＡＲＰ  ｐ８５  ｆｒａｇｍｅｎｔポリクローナル抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＧＡＰＤＨについて抗Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  モノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を使用した。
ＰＡＲＰは、アポトーシスの実行本体であるＣａｓｐａｓｅ−３の基質である。抗がん剤などによりアポトーシスシグナルが活性化すると、Ｃａｓｐａｓｅ−３が活性化し、ＰＡＲＰを切断する。本実験では、アポトーシスシグナル伝達の指標として、ＰＡＲＰの切断断片の発現を確認した。結果を図６に示す。
図６に示されるように、ＭＥＫ阻害剤により、がん細胞におけるパクリタキセルに対する感受性が増大することが確認された。
実施例６（Ｐ−糖タンパク質の蛍光基質Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３の取り込み量の増加）
ＨＣＴ−１５（１×１０５／６０ｍｍ−ｄｉｓｈ）、ＳＷ６２０−１４（２×１０５／６０ｍｍ−ｄｉｓｈ）、ＭＣＦ−７／ＭＤＲ（１×１０５／６０ｍｍ−ｄｉｓｈ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＭＤＲ（２×１０５／６０ｍｍ−ｄｉｓｈ）細胞（これらの細胞は、実施例５と同様にして入手した。を、実施例５と同様に１０μｍｏｌ／Ｌ  Ｕ０１２６含有培地で７２時間培養した。コントロール群は、Ｕ０１２６不含培地で同様に７２時間培養した。細胞回収後、細胞数を測定し、１×１０５個／ｍＬになるように細胞懸濁液を培地で調製した。細胞懸濁液に、最終濃度が３００ｎｍｏｌ／ＬになるようにＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（Ｓｉｇｍａ社）を加えた。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３を取り込ませないコントロールは、培地のみとした。それらを３７℃で２０分間培養してＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３を細胞内に取り込ませた後、遠心して細胞を回収し、氷冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄した。アイソフローで細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳで測定した。ＦＡＣＳではＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３の輝度を測定することにより、細胞内に取り込まれたＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３を測定できる。結果を図７に示す。
図７に示されるように、ＭＥＫ阻害剤により、がん細胞におけるＰ−糖タンパク質の蛍光基質Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３の取り込み量が増加することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明によれば、Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤を提供できる。また、本発明によれば、ＢＣＲＰ発現抑制剤を提供できる。
上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる耐性獲得が抑制された抗癌剤は、抗癌剤に対して耐性を獲得した癌に対しても、抗癌剤の薬効回復が期待でき有効な癌化学療法が可能となる。また、耐性を抑制できるため、抗癌剤の投薬量を減することができ副作用をも抑制した癌化学療法が可能となる。さらに、先天的あるいは後天的に、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰを過剰に発現していることにより抗癌剤による癌治療が有効でない患者に対しても、癌化学療法が可能となる。
また、上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤の有効量と抗癌剤の有効量とを投与することを特徴とする、抗癌剤に対する耐性を抑制し癌治療効果を高める方法を提供する。
上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる抗癌剤耐性抑制剤は、抗癌剤に対して耐性を獲得した又は獲得しうる癌に対して投与することにより、抗癌剤の薬効回復し有効な癌化学療法が可能となる。
上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる抗癌剤耐性抑制剤と抗癌剤を組み合わせてなる癌治療剤は、抗癌剤に対して耐性を獲得した癌に対して投与することにより、抗癌剤の薬効回復に有効な癌化学療法が可能となる。また、耐性を抑制できるため、抗癌剤の投薬量を減することができ副作用をも抑制した癌化学療法が可能となる。さらに、先天的あるいは後天的に、Ｐ−糖タンパク質またはＢＣＲＰを過剰に発現していることにより抗癌剤による癌治療が有効でない患者に対しても、癌化学療法が可能となる。
さらに、本発明によれば、上記（１）に記載のＰ−糖タンパク質発現抑制剤またはＢＣＲＰ発現抑制剤を含有してなる抗癌剤の有効量を投与することによる、抗癌剤耐性獲得を抑制し癌を治療する方法を提供できる。
本発明によれば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫまたはＲＳＫ阻害活性を指標として、Ｐ−糖タンパク質発現抑制剤を得ることが可能となる。また、本発明によれば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫまたはＲＳＫ阻害活性を指標として、ＢＣＲＰ発現抑制剤を得ることが可能となる。
【図１】
2007132867.tif 000002
【図２】
2007132867.tif 000003
【図３】
2007132867.tif 000004
【図４】
2007132867.tif 000005
【図５】
2007132867.tif 000006
【図６】
2007132867.tif 000007
【図７】
2007132867.tif 000008
【国際調査報告】
2007132867.tif 000009
2007132867.tif 000010
2007132867.tif 000011
2007132867.tif 000012
2007132867.tif 000013
2007132867.tif 000014
2007132867.tif 000015