【手続補正書】
【提出日】平成19年7月2日(2007.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  核酸塩基配列を決定する方法であって、
（１）塩基配列の解析を所望する核酸（ＤＮＡ）の、該塩基配列の解析を所望とする部位より３'側の塩基配列の一部、または、全部に相補的な核酸（ＤＮＡ）を、前記塩基配列の解析を所望する核酸を鋳型として核酸伸長反応する際に用いるプライマーとして、光によって切断される部分構造を該プライマー中の前記相補的な塩基配列よりも５'側に含む構造で基板上に固定する工程；
（２）前記塩基配列の解析を所望する核酸を、前記相補的な塩基配列部分で、該基板上に固定されたプライマーとアニールして、ハイブリッドを形成する工程；
（３）前記核酸伸長反応に必要な４種の２'−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ＮはＡ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン）と、核酸伸長反応のターミネーターとして、４種の２'，３'−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）との共存下で、前記ハイブリッドを形成した基板上で、該塩基配列を所望する核酸を鋳型として酵素を用いて伸長反応を行う工程；
（４）前記核酸伸長反応が行われた基板から、鋳型核酸を除去する工程；
（５）光によって切断される部分構造を含む構造で基板に固定されているプライマー部分を含む、鎖長の異なる複数の伸長反応産物に対して、該切断される部分構造が切断される光を照射し、
該光照射によって切断された前記伸長反応産物の質量分析を行い、
前記伸長反応産物における、プライマーの分子量からの分子量増加量に基づき、前記伸長反応産物の伸長部分の塩基配列を明らかにする工程；
（６）前記伸長部分の塩基配列に基づいて、前記塩基配列の解析を所望とする核酸の解析を所望する塩基配列の一部、または、全部を解析する工程；
少なくとも、上記（１）〜（６）の各工程を有する
ことを特徴とする核酸塩基配列の決定方法。
【請求項２】  前記質量分析を行う手段が、マトリクス援助レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳと略す）法である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記工程（５）において、照射される光が、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光である
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】  前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法の分析時に使用されるレーザー光は、
波長３３７ｎｍの窒素レーザー光である
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】  前記工程（５）において、光照射によって切断される部分構造として、
ニトロベンゼンを含む構造を選択する
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】  前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Iを用いて構築されている
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【化１】
2004033043.tif 000001
化合物Ｉ
【請求項７】  前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式IIで示される化合物を用いて構築されている
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【化２】
2004033043.tif 000002
一般式II
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ3Ｎａである）
【請求項８】  前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５'末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式IIで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われている
ことを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】  前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われている
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】  前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５'末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式IIで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われている
ことを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】  前記ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われている
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】  前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式IIIで示される化合物を用いて構築されている
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【化３】
2004033043.tif 000003
化合物III
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【請求項１３】  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法により質量分析するにあたり、基板上に固定されている、前記プライマーを含む伸長反応産物の脱離、及び、イオン化を支援する物質（マトリクス物質）を、少なくとも、前記基板上の質量分析を行う領域にコーティングする
ことを特徴とする請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】  核酸伸長反応に用いられる酵素が耐熱性である
ことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】  複数の核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（１）塩基配列の解析を所望する複数の核酸（ＤＮＡ）の、それぞれの塩基配列の解析を所望とする部位より３’側の塩基配列の一部、または、全部に相補的な複数の核酸（ＤＮＡ）を、前記それぞれの塩基配列の解析を所望する複数の核酸を鋳型として核酸伸長反応するに必要なプライマーとして、光によって切断される部分構造を該プライマーの上記相補的な塩基配列より５’側に含む構造で基板上にマトリクス状に固定する工程；
（２）前記塩基配列の解析を所望する複数の核酸を、前記相補的な塩基配列部分で、該基板上に固定されたそれぞれのプライマーとアニールしてハイブリッドを形成する工程；
（３）核酸伸長反応に必要な４種の２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ＮはＡ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン）と、伸長反応のターミネーターとての４種の２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）との共存下で、前記ハイブリッドを形成した基板上で、該塩基配列を所望する核酸を鋳型として酵素を用いて核酸伸長反応を行う工程；
（４）前記核酸伸長反応が行われた基板から、鋳型核酸を除去する工程；
（５）光によって切断される部分構造を含む構造で基板に固定されているプライマー部分を含む、鎖長の異なる複数の伸長反応産物に、該切断される部分構造が切断される光を照射し、該光照射によって切断された各々の伸長反応産物の質量分析を行い、プライマーの分子量からの分子量増加量に基づき、前記複数の伸長反応産物の伸長部分の塩基配列を明らかにする工程；
（６）前記伸長部分の塩基配列に基づいて、前記塩基配列の解析を所望とする複数の核酸の解析を所望するそれぞれの塩基配列の一部、または、全部を解析する工程；
少なくとも、上記（１）〜（６）の各工程を有する
ことを特徴とする核酸塩基配列の決定方法。
【請求項１６】  塩基配列の解析を所望する複数の核酸（ＤＮＡ）の、それぞれの塩基配列の解析を所望とする部位より３'側の塩基配列の一部、または、全部に相補的な複数の核酸（ＤＮＡ）が、前記塩基配列の解析を所望する複数の核酸を鋳型として核酸伸長反応するに必要なプライマーとして、光によって切断される部分構造を該プライマーの上記相補的な塩基配列より５'側に含む構造で基板上にマトリクス状に固定された核酸プライマーチップ。
【請求項１７】  前記光によって切断される部分構造がニトロベンゼンを含む構造である請求項１６に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項１８】  前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の化合物Iを用いて構築されている
ことを特徴とする請求項１７に記載の核酸プライマーチップ。
【化７】
2004033043.tif 000004
化合物Ｉ
【請求項１９】  前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式IIで示される化合物を用いて構築されている
ことを特徴とする請求項１７に記載の核酸プライマーチップ。
【化８】
2004033043.tif 000005
一般式II
（式中、ｎ＝３、または、４、Ｘ＝Ｈ、または、ＳＯ3Ｎａである）
【請求項２０】  前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５'末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式IIで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われている
ことを特徴とする請求項１８または１９に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項２１】  前記ガラス基板への１級アミノ基の形成が、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行われている
ことを特徴とする請求項２０に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項２２】  前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５'末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式IIで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われている
ことを特徴とする請求項１８または１９に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項２３】  前記ガラス基板へのスルファニル基の形成が、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行われている
ことを特徴とする請求項２２に記載の核酸プライマーチップ。
【請求項２４】  前記ニトロベンゼンを含む構造は、下記の一般式IIIで示される化合物を用いて構築されている
ことを特徴とする請求項１７に記載の核酸プライマーチップ。
【化９】
2004033043.tif 000006
化合物III
（式中、ＤＭＴｒＯは、ジメトキシトリチルオキシ基、ＣＮＥｔは、２−シアノエチル基を表す。）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
その際、前記基板は、表面に１級アミノ基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にスルファニル（ＳＨ）基が結合されており、
該アミノ基と、該スルファニル基との結合が、前記化合物Ｉ、あるいは、一般式IIで示される化合物を介して、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応、及び、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応によって行われていることが望ましい。例えば、前記ガラス基板への１級アミノ基の形成は、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて行うことができる。あるいは、前記基板は、表面にスルファニル基が形成されたガラス基板であり、
前記プライマーの５’末端にアミノ基が結合されており、
該スルファニル基と、該アミノ基の結合が、化合物Ｉ、あるいは、一般式IIで示される化合物を介して、スルファニル基とこれら化合物のブロムベンジル部位との反応、及び、アミノ基とこれら化合物のスクシイミドエステル部位との反応によって行われている形態とすることも可能である。この時、例えば、前記ガラス基板へのスルファニル基の形成は、スルファニル基を有するシランカップリング剤を用いて行うことができる。