【手続補正書】
【提出日】令和1年10月30日(2019.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅中の生体サンプル中の標的ＲＮＡを増幅する方法であって、
前記生体サンプル、逆転写酵素、熱安定性ポリメラーゼ、および前記生体サンプル中の前記標的ＲＮＡを増幅するように構成されたプライマーを含む反応混合物を提供するステップと、ここで、前記逆転写酵素が低減された濃度で提供され、前記ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、かつ、プライマーがそれぞれ少なくとも２μＭの濃度で提供され、
５分以下の逆転写時間にわたりインキュベートすることによって前記ＲＮＡをＤＮＡに逆転写するステップと、
エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、前記ＤＮＡを増幅するステップと、ここで、各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する、
を含む方法。
【請求項２】
前記逆転写時間が、１分以下、好ましくは１６秒以下、さらに好ましくは８秒以下、さらに好ましくは４秒以下、さらに好ましくは２秒以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーがそれぞれ、少なくとも４μＭの濃度で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅するステップが、前記逆転写するステップと同じ反応混合物中で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記反応混合物が、１０ｍＭ以下のＫＣｌ濃度を有し、好ましくは、前記反応混合物が、カリウムを実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記反応混合物が、還元剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記逆転写酵素の低減された濃度が、製造元によるＲＴ反応における逆転写酵素の推奨濃度より低い、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記逆転写酵素が、４．０ユニット／μＬ以下の濃度で提供されるＭＭＬＶである、または０．８ユニット／μＬ以下の濃度で提供されるＡＭＶである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅するステップが、前記サイクル時間に前記サイクルの回数をかけた値に等しい増幅時間を有し、
前記方法が、前記逆転写時間と前記増幅時間との合計に等しい全体時間を有し、
前記逆転写時間が、前記全体時間の５０％以下、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応混合物の第１の部分が凍結された状態で提供され、前記反応混合物の第２の部分が冷却された状態で提供され、前記逆転写するステップの前に前記第１の部分および前記第２の部分を混合するステップをさらに含み、好ましくは前記第２の部分中に、ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ２が提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応混合物の第１の部分が、第１のプライマーと共に提供され、前記反応混合物の第２の部分が、第２のプライマーと共に提供され、前記逆転写するステップの前に前記第１の部分および前記第２の部分を混合するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合するステップが完了して１秒以内に、前記逆転写するステップが始まる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の部分および前記第２の部分の一方が、前記逆転写酵素を含み、前記第１の部分および前記第２の部分の他方が、前記熱安定性ポリメラーゼを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応混合物が、アプタマーをさらに含み、好ましくは、前記アプタマーが少なくとも１μＭの濃度で提供され、さらに好ましくは、前記アプタマーが３’−ブロッカーで修飾されている請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行うためのキットであって、
ｄＮＴＰと、
低減された濃度で提供された逆転写酵素と、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
所定の実施形態を参照しながら本発明を詳細に説明したが、以下の特許請求の範囲で記載および定義された本発明の範囲および趣旨内にある変更形態および改変形態が存在する。
出願時の特許請求の範囲は以下の通りである。
［請求項１］
増幅中の生体サンプル中の標的ＲＮＡを増幅する方法であって、
前記生体サンプル、逆転写酵素、熱安定性ポリメラーゼ、および前記生体サンプル中の前記標的ＲＮＡを増幅するように構成されたプライマーを含む反応混合物を提供するステップと、ここで、前記ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、かつ、プライマーがそれぞれ少なくとも２μＭの濃度で提供され、
５分以下の逆転写時間にわたりインキュベートすることによって前記ＲＮＡをＤＮＡに逆転写するステップと、
エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、前記ＤＮＡを増幅するステップと、ここで、各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する、
を含む方法。
［請求項２］
前記逆転写時間が、１分以下である、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
前記逆転写時間が、１６秒以下である、請求項２に記載の方法。
［請求項４］
前記逆転写時間が、８秒以下である、請求項２に記載の方法。
［請求項５］
前記逆転写時間が、４秒以下である、請求項２に記載の方法。
［請求項６］
前記逆転写時間が、２秒以下である、請求項２に記載の方法。
［請求項７］
前記生体サンプルに糖もさらに添加される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項８］
前記糖が、少なくとも０．２Ｍのトレハロースである、請求項７に記載の方法。
［請求項９］
前記逆転写するステップが、５４℃から６２℃の間の温度で起こる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］
前記逆転写するステップが、５６℃の温度で起こる、請求項９に記載の方法。
［請求項１１］
前記プライマーがそれぞれ、少なくとも４μＭの濃度で提供される、請求項１に記載の方法。
［請求項１２］
前記プライマーがそれぞれ、少なくとも６μＭの濃度で提供される、請求項１に記載の方法。
［請求項１３］
前記増幅するステップが、前記逆転写するステップと同じ反応混合物中で起こる、請求項１に記載の方法。
［請求項１４］
前記反応混合物が、１０ｍＭ以下のＫＣｌ濃度を有する、請求項１に記載の方法。
［請求項１５］
前記反応混合物が、カリウムを実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
［請求項１６］
前記反応混合物が、還元剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
［請求項１７］
前記逆転写酵素が、約１．０から約５０Ｕ／μｌで提供されるＭＭＬＶである、請求項１に記載の方法。
［請求項１８］
前記転写酵素が、４．０ユニット／μＬ以下の濃度で提供されるＭＭＬＶである、請求項１に記載の方法。
［請求項１９］
前記逆転写酵素が、約０．１から約１０Ｕ／μｌで提供されるＡＭＶである、請求項１に記載の方法。
［請求項２０］
前記逆転写酵素が、０．８ユニット／μＬ以下の濃度で提供されるＡＭＶである、請求項１に記載の方法。
［請求項２１］
前記増幅するステップが、前記サイクル時間に前記サイクルの回数をかけた値に等しい増幅時間を有し、
前記方法が、前記逆転写時間と前記増幅時間との合計に等しい全体時間を有し、
前記逆転写時間が、前記全体時間の５０％以下である、請求項１に記載の方法。
［請求項２２］
前記逆転写時間が、前記全体時間の２０％以下である、請求項２１に記載の方法。
［請求項２３］
前記逆転写時間が、前記全体時間の１０％以下である、請求項２１に記載の方法。
［請求項２４］
前記反応混合物が、６〜１２ｍＭの間のＭｇＣｌ２を含む、請求項１に記載の方法。
［請求項２５］
前記反応混合物の第１の部分が凍結された状態で提供され、前記反応混合物の第２の部分が冷却された状態で提供され、前記逆転写するステップの前に前記第１の部分および前記第２の部分を混合するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
［請求項２６］
前記第２の部分中に、ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ２が提供される、請求項２５に記載の方法。
［請求項２７］
前記反応混合物の第１の部分が、第１のプライマーと共に提供され、前記反応混合物の第２の部分が、第２のプライマーと共に提供され、前記逆転写するステップの前に前記第１の部分および前記第２の部分を混合するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
［請求項２８］
前記第１の部分または前記第２の部分の少なくとも一方が、混合前に遠心分離される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２９］
前記混合するステップが完了して１秒以内に、前記逆転写するステップが始まる、請求項２８に記載の方法。
［請求項３０］
前記第１の部分および前記第２の部分の一方が、前記逆転写酵素を含み、前記第１の部分および前記第２の部分の他方が、前記熱安定性ポリメラーゼを含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３１］
前記反応混合物が、アプタマーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
［請求項３２］
前記アプタマーが、少なくとも１μＭの濃度で提供される、請求項３１に記載の方法。
［請求項３３］
前記アプタマーが、ＲＮＡアプタマーである、請求項３１に記載の方法。
［請求項３４］
前記アプタマーが、ＲＮＡアプタマーおよびＤＮＡアプタマーの混合物である、請求項３１に記載の方法。
［請求項３５］
前記アプタマーが、３’−ブロッカーで修飾されている、請求項３１に記載の方法。
［請求項３６］
前記３’−ブロッカーが、Ｃ６−アミノ末端修飾剤である、請求項３５に記載の方法。
［請求項３７］
前記３’−ブロッカーが、正電荷を有する、請求項３５に記載の方法。
［請求項３８］
前記アプタマーが、安定化されたヘアピンループを有する、請求項３１に記載の方法。
［請求項３９］
ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行うためのキットであって、
ｄＮＴＰと、
逆転写酵素と、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含むキット。
［請求項４０］
糖をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
［請求項４１］
前記糖が、トレハロースおよびスクロースからなる群から選択される、請求項４０に記載のキット。
［請求項４２］
前記糖が、０．６Ｍで提供される、請求項４０に記載のキット。
［請求項４３］
前記糖が、０．２Ｍで提供される、請求項４０に記載のキット。
［請求項４４］
還元剤をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
［請求項４５］
前記ｄＮＴＰ、前記逆転写酵素、前記ポリメラーゼ、および前記一対のプライマーが、カリウムを実質的に含まない混合物中に提供される、請求項３９に記載のキット。
［請求項４６］
ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行うための反応混合物であって、
ｄＮＴＰと、
逆転写酵素と、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含む反応混合物。
［請求項４７］
１０ｍＭ以下のＫＣｌ濃度を有する、請求項４６に記載の反応混合物。
［請求項４８］
カリウムを実質的に含まない、請求項４７に記載の反応混合物。