【手続補正書】
【提出日】令和1年11月8日(2019.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療する必要がある対象における、角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療するための医薬組成物であって、角膜ジストロフィー標的核酸中の核酸突然変異が操作されて修正された幹細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記幹細胞が、１以上の単離された幹細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記幹細胞が、複数の培養された幹細胞である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記幹細胞が、操作後に培養されたものである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記幹細胞が、安定した細胞株である、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記幹細胞が自己由来であるか、又は相同性ドナー由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記幹細胞が、対象から得られたものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＴＧＦβＩ標的核酸である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記核酸突然変異が、ＴＧＦβＩポリペプチド中のアルギニン１２４、アルギニン５５５、又はヒスチジン６２６のアミノ酸置換をコードする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記核酸突然変異が、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ及びＨ６２６Ｐから選択されるアミノ酸置換をコードする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１−２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１、又はＰＬＰ１の標的核酸である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記核酸突然変異が、ＣＯＬ４Ａ１の中のＱ１３３４Ｈ、ＣＯＬ４Ａ２中のＧ６８３Ａ、ＣＯＬ４Ａ２中のＰ７１８Ｓ、ＣＯＬ４Ａ２中のＲ５１７Ｋ、ＣＯＬ４Ａ３中のＤ３２６Ｙ、ＣＯＬ４Ａ３中のＨ４５１Ｒ、ＣＯＬ４Ａ４中のＶ１３２７Ｍ、ＬＯＸ中のＲ１５８Ｑ、ＡＫＡＰ１３中のＡ１０４６Ｔ、ＡＫＡＰ１３中のＧ６２４Ｖ、ＺＮＦ４６９中のＧ２３５８Ｒ、ＳＬＣ２９Ａ３中のＳ１５８Ｆ、ＭＵＣ５ＡＣ中のＰ４４９３Ｓ、ＣＲＯＣＣ中のＰ３７０Ｓ、又はそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸置換をコードする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記核酸突然変異が、ｒｓ３７４２２０７、ｒｓ３８０３２３０、ｒｓ９５８３５００、ｒｓ７９９０３８３、ｒｓ５５７０３７６７、ｒｓ１１６７７８７７、ｒｓ２２２９８１３、ｒｓ１８００４４９、ｒｓ１０５３４１１、ｒｓ２１１６７８０、ｒｓ３７４９３５０、ｒｓ２２８６１９４、ｒｓ１２５３６６５７、ｒｓ２６１４６６８、ｒｓ７４５１９１、ｒｓ１２５９８４７４、ｒｓ１０９３２９７６、ｒｓ５９０８６７８、ｒｓ３５８０３４３８、ｒｓ１３２７２８、ｒｓ１３２７２９、ｒｓ１３２７３０、ｒｓ８５９０６３、ｒｓ２８９３２７６、ｒｓ６６８７７４９、ｒｓ１３１８９８５５、ｒｓ６８７６５１４、ｒｓ６８７６５１５、ｒｓ１３３６１７０１、ｒｓ８８３７６４、ｒｓ７８０６６７、ｒｓ７８０６６８、ｒｓ１３１６６１４８、ｒｓ１０９４１２８７、ｒｓ７９０７２７０、ｒｓ２００９２２７８４、ｒｓ９４３５７９３、ｒｓ１１６３００９７４、又はｒｓ２２３３６９６に相当する、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＴＧＦβＩ、ＫＲＴ３、ＫＲＴ１２、ＧＳＮ又はＵＢＩＡＤ１の標的核酸である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記核酸突然変異が、
（ｉ）ＴＧＦβＩ標的核酸中のＬｅｕ５０９Ａｒｇ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎ、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓ、Ｖａｌ５０５Ａｓｐ、Ｉｌｅ５２２Ａｓｎ、Ｌｅｕ５６９Ａｒｇ、Ｈｉｓ５７２Ａｒｇ、Ａｒｇ４９６Ｔｒｐ、Ｐｒｏ５０１Ｔｈｒ、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５１５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５１８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇ、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇ、Ｔｈｒ５３８Ｐｒｏ、Ｔｈｒ５３８Ａｒｇ、Ｖａｌ５３９Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４０ｄｅｌ、Ｐｈｅ５４０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５４４Ｓｅｒ、Ａｌａ５４６Ｔｈｒ、Ａｌａ５４６Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ５５１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ５５８Ｐｒｏ、Ｈｉｓ５７２ｄｅｌ、Ｇｌｙ５９４Ｖａｌ、Ｖａｌ６１３ｄｅｌ、Ｖａｌ６１３Ｇｌｙ、Ｍｅｔ６１９Ｌｙｓ、Ａｌａ６２０Ａｓｐ、Ａｓｎ６２２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ６２３Ａｒｇ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ｖａｌ６２４＿Ｖａｌ６２５ｄｅｌ、Ｖａｌ６２４Ｍｅｔ、Ｖａｌ６２５Ａｓｐ、Ｈｉｓ６２６Ａｒｇ、Ｈｉｓ６２６Ｐｒｏ、Ｖａｌ６２７ＳｅｒｆｓＸ４４、Ｔｈｒ６２９＿Ａｓｎ６３０ｉｎｓＡｓｎＶａｌＰｒｏ、Ｖａｌ６３１Ａｓｐ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐ、Ａｒｇ１２４Ｓｅｒ、Ａｓｐ１２３ｄｅｌｉｎｓ、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５０９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０３＿Ｓｅｒ１０４ｄｅｌ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ａｓｐ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、及び／又はＴｈｒ１２５＿Ｇｌｕ１２６ｄｅｌ、
（ｉｉ）ＫＲＴ３標的核酸中のＧｌｕ４９８Ｖａｌ、Ａｒｇ５０３Ｐｒｏ、及び／又はＧｌｕ５０９Ｌｙｓ、
（ｉｉｉ）ＫＲＴ１２標的核酸中のＭｅｔ１２９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１２９Ｖａｌ、Ｇｌｎ１３０Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｖａ、Ｌｅｕ１３２Ｈｉｓ、Ａｓｎ１３３Ｌｙｓ、Ａｒｇ１３５Ｇｌｙ、Ａｒｇ１３５Ｉｌｅ、Ａｒｇ１３５Ｔｈｒ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｌａ１３７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１４０Ａｒｇ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｌｌｅ３９１＿Ｌｅｕ３９９ｄｕｐ、Ｉｌｅ４２６Ｖａｌ、Ｉｌｅ４２６Ｓｅｒ、Ｔｙｒ４２９Ａｓｐ、Ｔｙｒ４２９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４３０Ｐｒｏ、及び／又はＬｅｕ４３３Ａｒｇ、
（ｉｖ）ＧＳＮ標的核酸中のＡｓｐ２１４Ｔｙｒ、並びに
（ｖ）ＵＢＩＡＤ１標的核酸中のＡｌａ９７Ｔｈｒ、Ｇｌｙ９８Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０２Ｓｅｒ、Ａｓｐ１１２Ａｓｎ、Ａｓｐ１１２Ｇｌｙ、Ａｓｐ１１８Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１２１Ｖａｌ、Ｌｅｕ１２１Ｐｈｅ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｕ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１７１Ｐｒｏ、Ｔｙｒ１７４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１７５Ｉｌｅ、Ｇｌｙ１７７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１８１Ａｒｇ、Ｇｌｙ１８６Ａｒｇ、Ｌｅｕ１８８Ｈｉｓ、Ａｓｎ２３２Ｓｅｒ、Ａｓｎ２３３Ｈｉｓ、Ａｓｐ２３６Ｇｌｕ、及び／又はＡｓｐ２４０Ａｓｎ、
からなる群から選択されるアミノ酸置換をコードする、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記複数の幹細胞が、角膜縁上皮幹細胞、口腔粘膜上皮幹細胞、歯の幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯ライニング幹細胞、又は胚性幹細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記複数の幹細胞が、角膜縁上皮幹細胞である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記角膜ジストロフィーが眼レーザー手術後に生じる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記核酸突然変異が、単離された複数の幹細胞に１組の核酸操作試薬を導入することにより操作され、それによって前記核酸操作試薬が１以上の複数の幹細胞における核酸突然変異を修正する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記核酸操作試薬を、電気穿孔、トランスフェクション、又はウイルス送達を使用して、前記複数の幹細胞へ導入する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記１組の核酸操作試薬が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、再設計ホーミングヌクレアーゼ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）試薬、又はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ヌクレアーゼシステムの試薬を含む、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記核酸操作試薬が、複数の幹細胞内で角膜ジストロフィー標的核酸とハイブリダイズするガイドＲＮＡ核酸と、ヌクレアーゼをコードするヌクレアーゼ核酸とを含む、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ヌクレアーゼシステムの試薬であり、それにより、前記ガイドＲＮＡが前記標的核酸を標的とし、前記ヌクレアーゼが前記標的核酸を切断する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記ガイドＲＮＡが、検出可能な標識を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ガイドＲＮＡの検出可能な標識が核酸バーコード又は蛍光バーコード標識である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記核酸操作試薬が、野生型の角膜ジストロフィー標的核酸又はそのフラグメントを含む修復核酸を更に含み、それによって前記ガイドＲＮＡが前記標的核酸を標的とし、前記ヌクレアーゼが前記標的核酸を切断して、前記標的核酸切断部位を生成し、それによって前記標的核酸切断部位の生成後、前記修復核酸が前記角膜ジストロフィー標的核酸と相同組み換えすることができる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記修復核酸が、検出可能な標識を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記修復核酸の検出可能な標識が、核酸バーコード又は蛍光バーコード標識である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼシステムの試薬は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路に関与する遺伝子を抑制することにより複数の幹細胞において相同組み換えの頻度を増加させる、１以上の薬剤を更に含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
操作されたクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システムが前記幹細胞に導入されており、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド分子を含む少なくとも１つのベクターを含み、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び前記ｓｇＲＮＡが共に天然起源ではない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記ｓｇＲＮＡが、（ｉ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を標的とするＣＲＩＳＰＲと、（ｉｉ）トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列とを含み、前記ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列が共に天然起源ではない、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号２又は配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、又はそれらの変異体に由来する、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、配列番号４又は配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド分子が、配列番号３又は配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼが同じベクター上に含まれる、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
角膜ジストロフィーの治療を必要とする対象における角膜ジストロフィーの治療のためのキットであって、
角膜ジストロフィー標的核酸とハイブリダイズするガイドＲＮＡ核酸と、
ヌクレアーゼをコードするヌクレアーゼ核酸とを備える、キット。
【請求項３８】
野生型の角膜ジストロフィー標的核酸又はそのフラグメントを含む修復核酸を更に備える、請求項３７に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
幾つかの場合、１以上の細胞取り込み試薬はトランスフェクション試薬である。トランスフェクション試薬として、例えば、ポリマー系（例えばＤＥＡＥデキストラン）トランスフェクション試薬、及びカチオンリポソーム媒介トランスフェクション試薬が挙げられる。また、電気穿孔方法を使用して、核酸操作試薬の取り込みを促進してもよい。外部電場を印加することによって、細胞において膜電位差の変更が誘導され、正味の膜電位差の値（印加の合計、及び静止電位差）が閾値より大きい場合、一時的な浸透構造がメンブレンに生成され、電気穿孔が達成される。例えば、Ｇｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１７７：４３７−４４７（２００３）を参照されたい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、当該技術分野で知られ、本明細書に記載される任意の好適な方法を使用して、細胞に導入することができる。或る実施の形態では、導入は、培養中の幹細胞又は宿主生物に幹細胞に操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することを含んでもよい。上で考察されるように、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを導入する例示的な方法として、限定されないが、トランスフェクション、電気穿孔、及びウイルスに基づく方法が挙げられる。幾つかの場合では、１以上の細胞取り込み試薬は、トランスフェクション試薬である。トランスフェクション試薬として、例えば、ポリマー系（例えばＤＥＡＥデキストラン）トランスフェクション試薬、及びカチオンリポソーム媒介トランスフェクション試薬が挙げられる。また、電気穿孔法を使用して、核酸操作試薬の取り込みを促進してもよい。外部電場を印加することによって、細胞において膜電位差の変更が誘導され、正味の膜電位差の値が（印加の合計、及び静止電位差）閾値より大きい場合、一時的な浸透構造がメンブレンに生成され、電気穿孔が達成される。例えば、Ｇｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１７７：４３７−４４７（２００３）を参照されたい。また、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ウイルス形質導入により細胞に送達されてもよい。好適なウイルス送達システムとして、限定されないが、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、及びレンチウイルスの送達システムが挙げられる。かかるウイルス送達システムは、細胞がトランスフェクションに抵抗性である場合に有用である。ウイルス媒介送達システムを使用する方法は、核酸操作試薬をコードするウイルスベクターを作製する工程、及びウイルス粒子中に該ベクターをパッケージングする工程を更に含んでもよい。核酸試薬送達の他の方法として、限定されないが、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、又は脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により増強された取り込みが挙げられる。また、全ての目的、特に、試薬送達システムに関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｎｅｉｗｏｅｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２：１３４１−１３５３（２０１４）、並びに米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号、及び米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい。或る実施の形態では、導入は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及びリポソーム等の送達ビヒクルと複合体化した核酸を含む非ウイルスベクター送達システムによって行われる。送達は、細胞（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの投与）に対してでもよく、又は標的組織（例えばｉｎ  ｖｉｖｏでの投与）に対してもよい。