(57)【要約】  ヘマグルチニンに対するより親和性の高いペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害活性の高いペプチド、並びにこのようなペプチドを用いた医薬組成物を提供するため、ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＰ（ペプチドＡ−１：配列番号１）に対し、変異を導入したペプチドを作製し、ヘマグルチニンに対するより親和性の高いペプチドをスクリーニングすることにより得られた配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８を有するポリペプチドを用いる。また、配列番号３で示されるペプチドに対して、ＡＲＬＰＲ又はＡＲＬＰを残すように配列番号３のＣ末端側を削ることによって、このペプチドのインフルエンザウイルス感染阻害活性を増強することができる。また、これらのインフルエンザウイルス受容体結合性ペプチドを製剤化することにより、インフルエンザウイルス感染阻害剤及びインフルエンザ予防・治療剤を作製することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４
を有する、４残基以上１４残基以下のペプチドであって、
Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、
Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであるペプチド。
【請求項２】
配列番号３の一部において、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４
を含む、４残基以上１４残基以下のペプチドであって、
Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、
Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンである請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記Ｘ４が、プロリンであることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号５２のアミノ酸配列を有する請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号５２において、１から数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有するペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５
を有する、５残基以上１４残基以下のペプチドであって、
Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、
Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、
Ｘ５が、アルギニン又はリジンである請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号３の一部において、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５
を含む、５残基以上１４残基以下のペプチドであって、
Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、
Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、
Ｘ５が、アルギニン又はリジンである請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記Ｘ４が、プロリンであることを特徴とする請求項６又は７に記載のペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＨＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４
の一部において、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５
を含む、５残基以上１４残基以下のペプチドであって、
Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、
Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、
Ｘ５が、アルギニン又はリジンであり、
Ｘ6が、セリン又はスレオニンであり、
Ｘ7が、システイン又はメチオニンであり、
Ｘ８が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ９が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、
Ｘ１０が、アルギニン又はリジンであり、
Ｘ１１が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、
Ｘ１２が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ１３が、グルタミン又はアスバラギンであり、
Ｘ１４が、プロリン、アラニン、又はグリシンである請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記Ｘ４、前記Ｘ９、前記Ｘ１１、及び前記Ｘ１４が、プロリンであることを特徴とする請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号３８、４２〜４４のいずれかのアミノ酸配列を有する請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号３８、４２〜４４において、１から数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有するペプチド。
【請求項１３】
アルキル化されていることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項１５】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方の感染を阻害する請求項１４に記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するインフルエンザ予防・治療剤。
【請求項１７】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方に効果を有することを特徴とする請求項１６に記載のインフルエンザ予防・治療剤。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１８に記載のＤＮＡを有する発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターが導入され、請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドを分泌する細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドを含有するリポソーム。
【請求項２２】
前記ペプチドがアルキル化されていることを特徴とする請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドを含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤であって、
前記ペプチドが両親媒性を有するように修飾されて、ペプチド凝集体を形成していること、
を特徴とするインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項２４】
前記修飾がアルキル化であることを特徴とする請求項２３に記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項２５】
請求項２３に記載のペプチド凝集体。
【請求項２６】
アミノ酸配列
Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１
を有する、４残基以上１４残基以下のペプチドであって、
Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、
Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、
Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、
Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであるペプチド。
【請求項２７】
アミノ酸配列
Ｘ５Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１
を有する、５残基以上１４残基以下のペプチドであって、
Ｘ５が、アルギニン又はリジンである請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
前記Ｘ４が、プロリンであることを特徴とする請求項２６又は２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
配列番号５６又は５７のアミノ酸配列を有する請求項２６に記載のペプチド。
【請求項３０】
配列番号５６又は５７において、１から数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有するペプチド。
【請求項３１】
アルキル化されていることを特徴とする請求項２６〜３０のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３２】
請求項２６〜３１のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項３３】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方の感染を阻害する請求項３２に記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項３４】
請求項２６〜３１のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するインフルエンザ予防・治療剤。
【請求項３５】
ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方に効果を有することを特徴とする請求項３４に記載のインフルエンザ予防・治療剤。
【請求項３６】
請求項２６〜３０のいずれかに記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３７】
請求項３６に記載のＤＮＡを有する発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３７に記載の発現ベクターが導入され、請求項２６〜３０のいずれかに記載のペプチドを分泌する細胞。
【請求項３９】
請求項２６〜３０のいずれかに記載のペプチドを含有するリポソーム。
【請求項４０】
前記ペプチドがアルキル化されていることを特徴とする請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４１】
請求項２６〜３０のいずれかに記載のペプチドを含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤であって、
前記ペプチドが両親媒性を有するように修飾されて、ペプチド凝集体を形成していること、
を特徴とするインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項４２】
前記修飾がアルキル化であることを特徴とする請求項４１に記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項４３】
請求項４２に記載のペプチド凝集体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスの感染を阻害するインフルエンザ感染阻害ペプチド、インフルエンザウイルスの感染を阻害するインフルエンザウイルス感染阻害剤、インフルエンザ感染阻害ペプチドを含有するリポソーム、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを含有するインフルエンザの予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルス膜にはヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ、シアリダーゼ）といった２種類のスパイク糖蛋白質が存在し、それぞれウイルスの感染成立及びウイルスの宿主細胞からの出芽に重要な役割を果たしている。前者のヘマグルチニンは、ヒトやその他の動物（ほ乳類、鳥類、は虫類、魚類、両生類等）といった宿主の細胞膜上に普遍的に存在するシアル酸含有糖鎖を受容体として認識してそれに特異的に結合し、インフルエンザウイルスの細胞内へのエンドサイトーシスを導く。一方、後者のノイラミニダーゼは、受容体破壊酵素であり、宿主細胞からウイルス粒子が出芽又は遊離する際に、自らの又は宿主細胞膜上のシアル酸残基を切断する役割を担っている。【０００３】
インフルエンザウイルス感染の第１ステップに関与するヘマグルチニンには、極めて変異しやすい抗原決定領域（Ａ〜Ｅ）のアミノ酸配列の多様性に基づいて、種々の亜型が存在する。ヘマグルチニンの亜型間のアミノ酸配列の相同性は２５〜７５％であるため、抗原性を基にしたインフルエンザワクチンの開発は非常に困難である。一方、宿主細胞の受容体と結合するいわゆる受容体結合ポケット領域は、比較的変異が少なく、その三次元構造はよく保存されている（Y.Suzuki, Prog.Lipid.Res., 33, 429 (1994)）。従って、インフルエンザウイルスの感染を防止するために、感染成立に寄与するヘマグルチニンに特異的に結合することによってその働きを阻害すれば、広くインフルエンザウイルスの感染防止に効果があることが期待され、そのような薬剤の開発が求められている。【０００４】
例えば、ヘマグルチニンが宿主受容体のシアル酸含有糖鎖を認識して結合することに基づいて、ヘマグルチニンのその結合部位に特異的に結合する糖アナログをスクリーニングするという手法により、現在までに種々のヘマグルチニン結合性糖アナログが取得されている（R.Roy, et al., J.Chem.Soc., Chem.Commun., 1869 (1993); M.Mammen, et al., J.Med.Chem., 38,4179 (1995); T.Sato, et al., Chem.Lett., 145 (1999); T.Sato, et al., Chem.Lett., 145 (1999); M.ltzstein, et al., Nature, 363, 418 (1993)）。【０００５】
そのほか、ヘマグルチニンの受容体糖鎖に対するモノクローナル抗体の抗原結合部位のもつ抗原性（イディオタイプ）に対する抗体（抗イディオタイプ抗体）を作成する手法もある。すなわち、これはヘマグルチニンの受容体となるシアル酸及びシアロ糖鎖の三次元構造に代えて、それと立体構造が類似する抗イディオタイプ抗体の超可変部のアミノ酸配列を作成し、宿主細胞のヘマグルチニン受容体に模擬させるというものである（鈴木康夫「ウイルス感染と糖鎖」、別冊日経サイエンス「糖鎖と細胞」,89-101頁, 1994年10月）。【０００６】
しかし、受容体結合ポケット領域は、比較的変異が少なく、その三次元構造はよく保存されているとは言え、これらのいずれもヘマグルチニンの亜型に特異的であり、また結合定数も高くない。従って、ヘマグルチニンの亜型に関わらずインフルエンザウイルス全般に働く薬剤の開発が待たれている。【０００７】
そこで、ファージディスプレイ法を用いて、ヘマグルチニンに結合し、インフルエンザウイルスの感染を防止する１５残基のオリゴペプチドがスクリーニングされ、１１種類（国際公開ＷＯ００／５９９３２）及び３種類（特開２００２−２８４７９８明細書; T. Sato, et al., Peptide Science 2001, 329 (2002)）のオリゴペプチドが同定された（国際公開ＷＯ００／５９９３２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、国際公開ＷＯ００／５９９３２及び特開２００２−２８４７９８明細書においてなされたスクリーニングに用いられたファージライブラリーのタイターは２．５×１０８であり、アミノ酸１５残基の総配列数である２０１５（＝３．３×１０１９）には程遠く、それらのオリゴペプチドより、ヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチドが存在することと考えられた。【０００９】
そこで、本願発明は、より多くのペプチドをスクリーニングすることによって、さらにヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害活性の高いペプチドを提供し、さらに、このようなヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害活性の高いペプチドを用いた医薬組成物を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４
を有する、４残基以上１４残基以下のペプチドであって、Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンである。なお、前記Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００１１】
また、本発明にかかるペプチドは、配列番号３の一部において、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４
を含む、４残基以上１４残基以下のペプチドであって、Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンある。なお、前記Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００１２】
さらに、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５
を有する、５残基以上１４残基以下のペプチドであって、Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ５が、アルギニン又はリジンである。なお、前記Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００１３】
また、本発明にかかるペプチドは、配列番号３の一部において、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５
を含む、５残基以上１４残基以下のペプチドであって、Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ５が、アルギニン又はリジンである。なお、前記Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００１４】
さらに、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＨＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４
の一部において、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５
を含む、５残基以上１４残基以下のペプチドであって、Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ５が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ6が、セリン又はスレオニンであり、Ｘ7が、システイン又はメチオニンであり、Ｘ８が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ９が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ１０が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ１１が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ１２が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ１３が、グルタミン又はアスバラギンであり、Ｘ１４が、プロリン、アラニン、又はグリシンである。なお、前記Ｘ４、前記Ｘ９、前記Ｘ１１、及び前記Ｘ１４は、プロリンであることが好ましい。【００１５】
また、本発明にかかるペプチドは、配列番号３８、４２〜４４、５２のいずれかのアミノ酸配列を有する。【００１６】
さらに、本発明にかかるペプチドは、配列番号３８、４２〜４４、５２において、１から数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有する。【００１７】
なお、前記ペプチドは、アルキル化されていることが好ましい。【００１８】
さらに、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１
を有する、４残基以上１４残基以下のペプチドであって、Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンである。なお、前記Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００１９】
また、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ５Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１
を有する、５残基以上１４残基以下のペプチドであって、Ｘ５が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ４が、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ３が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２が、アルギニン又はリジンであり、Ｘ１が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンである。なお、前記Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００２０】
また、本発明にかかるペプチドは、配列番号５６、５７のいずれかのアミノ酸配列を有する。【００２１】
さらに、本発明にかかるペプチドは、配列番号５６、５７において、１から数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有する。【００２２】
なお、前記ペプチドは、アルキル化されていることが好ましい。【００２３】
本発明にかかるインフルエンザウイルス感染阻害剤は、前記いずれかのペプチドを有効成分として含有する。なお、前記インフルエンザウイルス感染阻害剤は、ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方の感染を阻害する。【００２４】
また、本発明にかかるインフルエンザ予防・治療剤は、前記いずれかのペプチドを有効成分として含有する。なお、前記インフルエンザ予防・治療剤は、ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルス及びヘマグルチニンＨ３を有するインフルエンザウイルスの両方に効果を有する。【００２５】
本発明にかかるＤＮＡは、前記いずれかのペプチドをコードする。【００２６】
また、本発明にかかる発現ベクターは、前記ＤＮＡを有する。【００２７】
さらに、本発明にかかる細胞は、前記発現ベクターが導入され、前記いずれかのペプチドを分泌する。【００２８】
また、本発明のリポソームは、前記いずれかのペプチドを含有する。なお、前記リポソームにおいて、前記ペプチドがアルキル化されていることが好ましい。【００２９】
本発明にかかるインフルエンザウイルス感染阻害剤は、前記いずれかのペプチドを含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤であって、前記ペプチドが両親媒性を有するように修飾されて、ペプチド凝集体を形成していることを特徴とする。なお、前記インフルエンザウイルス感染阻害剤において、前記修飾は、アルキル化であることが好ましい。【００３０】
また、本発明にかかるペプチド凝集体は、前記ペプチド凝集体をいう。【００３１】
本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４９：ｓ２（２−８）（ｇｅｎｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａ））を有し、Ｘ２がアルギニン又はリジンであり、Ｘ３がアラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４がプロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ５がアルギニン又はリジンであり、Ｘ６がセリン又はスレオニンであり、Ｘ７がメチオニン又はシステインであり、Ｘ８がアラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンである。なお、前記Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００３２】
また、本発明にかかるペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４９）において、１から数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有する。なお、前記Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００３３】
なお、前記ペプチドは、アルキル化されていることが好ましい。【００３４】
本発明にかかるインフルエンザウイルス感染阻害剤は、前記いずれかのペプチドを有効成分として含有する。なお、前記インフルエンザウイルス感染阻害剤は、ヘマグルチニンＨ１を有するインフルエンザウイルスの感染を阻害する。【００３５】
＜関連文献とのクロスリファレンス＞
なお、本願は、2006年3月13日付けで出願した日本国特願2006-68020号に基づく優先権を主張する。この文献を参照することにより、本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施例において、ＥＬＩＳＡを用いて、Ａ−１とＨ３Ｇ−１とのヘマグルチニンに対する結合活性を比較したグラフである。
【図２】本発明の実施例において、ＥＬＩＳＡを用いて、配列番号２〜１８のアミノ酸配列を有するペプチドのヘマグルチニンに対する結合活性を、Ａ−１（配列番号１）の結合活性と比較したグラフである。
【図３】（Ａ）は、本発明の実施例において、ｓ−２ペプチドに関し、各濃度における時間（ｘ軸）とレゾナンス（ｙ軸）との関係を示した図であり、（Ｂ）は、本発明の実施例において、各ヘマグルチニン結合性ペプチドに関し、所定の時間における濃度（ｘ軸）に対するレゾナンス（ｙ軸）の変化を示した図である。
【図４】（Ａ）は、本発明の実施例において、各ヘマグルチニン結合性ペプチドのペプチド濃度１００μＭにおける、レゾナンス（ｙ軸）の時間（ｘ軸）経過に対する変化を示した図であり、（Ｂ）は、本発明の実施例において、各ヘマグルチニン結合性ペプチドのペプチド濃度２００μＭにおける、Ａ−１ペプチドの結合量を １ としたときのヘマグルチニン結合性ペプチドのレゾナンスの相対値を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００３８】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００３９】
＝＝ヘマグルチニン結合性ペプチド＝＝
本明細書で用いられるヘマグルチニン結合性ペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。
【表１】
2007105565.tif 000002
【００４０】
この中で、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドＡ−１は、これまで同定されたヘマグルチニン結合性ペプチドのうち最も高い結合活性を有するが（国際公開ＷＯ００／５９９３２、特開２００２−２８４７９８明細書及び実施例参照）、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、実施例に示すように、Ａ−１より、さらにヘマグルチニンに対する結合活性が高い。また、実施例に示すように、これら配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に結合する。【００４１】
また、本発明にかかるヘマグルチニン結合性ペプチドは、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８において、１〜数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、Ａ−１より、ヘマグルチニンに対し高い結合活性を有するペプチドであってもよい。【００４２】
ここで、ヘマグルチニンに対するヘマグルチニン結合性ペプチドの結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定することができるが、これに限らず、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ウエスタン・ブロッティング、など、タンパク質間の相互作用を定量的に測定できる手法であればどんなものを用いて測定してもよい。【００４３】
＝＝インフルエンザウイルス感染阻害ペプチド＝＝
また、本明細書で用いられるインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのアミノ酸配列を表２に示す。
【表２】
2007105565.tif 000003
【００４４】
以下の実施例に記載する通り、配列番号３８、４２〜４４、５２、５６、及び５７のアミノ酸配列を有するインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染を強く阻害することができる。【００４５】
また、本発明にかかるインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、配列番号３８、４２〜４４、５２、５６、及び５７において、１から数アミノ酸残基の置換・欠失・付加を有するアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルス感染阻害活性を有するペプチドペプチドであってもよい。【００４６】
ここで、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドによるインフルエンザウイルスの宿主細胞への感染阻害は、例えば、プラークアッセイ法によって測定することができる。【００４７】
一般に、当業者において、同じ性質を有する側鎖（例えば、脂肪族の側鎖等）を有するアミノ酸は、ペプチド内で置換してもペプチドの機能は変わらないことが知られている。【００４８】
従って、ＡＲＬＰ（配列番号５２）配列を有するペプチドにおいて、例えば、Ａを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｖ、Ｌ又はＩ）へ、Ｒを塩基性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｋ）へ、Ｌを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｖ、Ａ又はＩ）へ置換しても、置換後のペプチドは、ＡＲＬＰ（配列番号５２）配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考えられる。また、一般的な点変異の実験ではプロリンをアラニンやグリシンに変えても同程度の活性を有することも知られている（松原輝彦,学位論文,東京工業大学（2000年））。従って、ＰをＡやＧへ置換しても、置換後のペプチドは、ＡＲＬＰ（配列番号５２）配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考えられる。すなわち、このような配列は、一般式として、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（配列番号５８：ｓ２（１−４）（ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａ））
で表わすことができる。ここで、Ｘ１は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２は、アルギニン又はリジンであり、Ｘ３は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４は、プロリン、アラニン、又はグリシンである。なお、Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００４９】
本発明のペプチドは、このアミノ酸配列（配列番号５８）を有する４残基以上１４残基以下のペプチドである。【００５０】
同様に、ＡＲＬＰＲ（配列番号４４）配列を有するペプチドにおいて、例えば、Ａを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｖ、Ｌ又はＩ）へ、Ｒを塩基性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｋ）へ、Ｌを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｖ、Ａ又はＩ）へ置換しても、置換後のペプチドは、ＡＲＬＰＲ（配列番号４４）配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考えられる。また、ＰをＡやＧへ置換しても、置換後のペプチドは、ＡＲＬＰＲ（配列番号４４）配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考えられる。すなわち、このような配列は、一般式として、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号４８：ｓ２（１−５）（ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａ））
で表わすことができる。ここで、Ｘ１は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２は、アルギニン又はリジンであり、Ｘ３は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４は、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ５は、アルギニン又はリジンである。なお、Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００５１】
本発明のペプチドは、このアミノ酸配列（配列番号４８）を有する５残基以上１４残基以下のペプチドである。【００５２】
一方、配列番号３のアミノ酸配列は、一般式として、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＨＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号５０：ｓ２（ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａ））
で表わすことができる。ここで、Ｘ１は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２は、アルギニン又はリジンであり、Ｘ３は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４は、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ５は、アルギニン又はリジンであり、Ｘ６は、セリン又はスレオニンであり、Ｘ７は、システイン又はメチオニンであり、Ｘ８は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ９は、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ１０は、アルギニン又はリジンであり、Ｘ１１は、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ１２は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ１３は、グルタミン又はアスバラギンであり、Ｘ１４は、プロリン、アラニン、又はグリシンである。なお、Ｘ４、Ｘ９、Ｘ１１、及びＸ１４は、プロリンであることが好ましい。【００５３】
従って、本発明のペプチドは、上記アミノ酸配列（配列番号５０）の一部において、アミノ酸配列（配列番号５８）を含む、４残基以上１４残基以下のペプチドであってもよく、特に、配列番号３の一部において、このアミノ酸配列（配列番号５８）を含む、４残基以上１４残基以下のペプチドであることが好ましい。また、本発明のペプチドは、アミノ酸配列（配列番号４８）を含む、５残基以上１４残基以下のペプチドであってもよく、特に、このアミノ酸配列（配列番号４８）を含む、５残基以上１４残基以下のペプチドであることが好ましい。【００５４】
さらに、本発明のペプチドは、ＡＲＬＰＲ（配列番号４４）配列又はＡＲＬＰ（配列番号５２）配列を反転させた配列を有するペプチドであってもよい。このようにＡＲＬＰＲ（配列番号４４）配列を反転させた配列ＲＰＬＲＡ（配列番号５６）配列又はＡＲＬＰ（配列番号５２）配列を反転させた配列ＰＬＲＡ（配列番号５７）配列を有するペプチドにおいて、例えば、Ａを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｖ、Ｌ又はＩ）へ、Ｒを塩基性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｋ）へ、Ｌを脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｖ、Ａ又はＩ）へ置換しても、置換後のペプチドは、ＲＰＬＲＡ（配列番号５６）配列又はＰＬＲＡ（配列番号５７）配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考えられる。また、ＰをＡやＧへ置換しても、置換後のペプチドは、ＲＰＬＲＡ（配列番号５６）配列又はＰＬＲＡ（配列番号５７）配列を有するペプチドと同様の活性を有すると考えられる。すなわち、このような配列は、一般式として、
Ｘ５Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１（配列番号５９：ｓ２（ｒ１−５）（ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａ））又はＸ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１（配列番号６０：ｓ２（ｒ１−４）（ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａ））で表わすことができる。ここで、Ｘ１は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ２は、アルギニン又はリジンであり、Ｘ３は、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであり、Ｘ４は、プロリン、アラニン、又はグリシンであり、Ｘ５は、アルギニン又はリジンである。なお、Ｘ４は、プロリンであることが好ましい。【００５５】
＝＝ヘマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを含有する医薬組成物＝＝
インフルエンザウイルスが細胞に感染する際、インフルエンザウイルスの有するヘマグルチニンが、宿主細胞の受容体に特異的に結合し、その受容体を足場として、ウイルスが細胞に感染する。本発明のヘマグルチニン結合性ペプチドは、そのヘマグルチニンに特異的に結合する。この結合により、ヘマグルチニンが宿主細胞受容体に結合することを妨げることができ、従って、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害することができる。【００５６】
このように、本発明のヘマグルチニン結合性ペプチドは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害することができる。また、以下の実施例に示す通り、本発明のインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、インフルエンザウイルスが宿主に感染するのを阻害することができた。従って、本発明のヘマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、インフルエンザに罹患したヒト又はヒト以外の脊椎動物に投与することにより、体内でのインフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。また、インフルエンザ罹患前のヒト又はヒト以外の脊椎動物に予め投与しておくことにより、インフルエンザウイルスが体内に侵入しても感染を防止することができる。【００５７】
こうした医療用以外にも、本発明のヘマグルチニン結合性ペプチドは、ヘマグルチニンを介して生じるインフルエンザウイルスの感染、及びそれに伴う種々の細胞機能や生命現象を解明するためのツールとして用いることもできる。【００５８】
なお、本発明が対象とするインフルエンザウイルスは、ヘマグルチニンＨ１又はヘマグルチニンＨ３の少なくとも一方を有していれば、その型や由来を特に制限するものではなく、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型、又はヒト分離型、ブタやウマ等の他の哺乳動物分離型もしくは鳥類分類型等のいずれであってもよい。【００５９】
以上のように、本発明のヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物として、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害するためのインフルエンザウイルス感染阻害剤、インフルエンザに罹患した患者を治療するためのインフルエンザ治療剤、インフルエンザに罹患する前に予防的に投与するためのインフルエンザ予防剤等が考えられる。これらの医薬組成物は、有効成分としてヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドと、必要に応じて薬学的に許容される担体とを含有する製剤として、インフルエンザウイルスに感染したヒト又はヒト以外の脊椎動物に投与したり、感染前のヒト又はヒト以外の脊椎動物に予防的に投与したりすることができる。【００６０】
ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬組成物の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。例えば、医薬組成物が溶液形態として調製される場合、担体として、精製水（滅菌水）又は生理学的緩衝液、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。また、この医薬組成物には、慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含むことができる。【００６１】
これらの医薬組成物の投与方法には特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定すればよいが、製剤形態としては、特に注射剤、点滴剤、噴霧剤（エアゾール）、点鼻剤、吸入剤などが好ましい。【００６２】
投与経路としては、経口投与又は非経口投与があり、具体的には、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、気管内投与、吸入投与、舌下投与等が挙げられるが、これらに限定されない。【００６３】
例えば、ヒトインフルエンザウイルスは、口腔や鼻腔から侵入し、主に上気道の粘膜上皮細胞で増殖することが知られているので、本剤は、医薬組成物として、ヒトインフルエンザウイルスが感染するヒト又はヒト以外の脊椎動物に対し、経口、気管内、鼻、口腔咽頭、吸入等の投与経路で使用されることが好ましい。具体的には、本剤をスプレー、（噴霧式）エアゾール又は吸入剤として製剤化すれば、本剤を経口、気管内、鼻、口腔咽頭、吸入等の投与経路を通じて投与することができ、インフルエンザウイルスの気道上皮細胞への感染を直接阻害することができる。【００６４】
また、これらの医薬組成物の１日当たりの投与量は、投与する者の症状、年齢、体重、性別、治療期間、治療効果、投与方法などにより適宜変更しうるが、インフルエンザ感染を阻害でき、かつ、生じる副作用が許容し得る範囲内であれば特に限定されない。当該製剤は１日１回投与に限らず、数回に分けて投与してもよい。【００６５】
これらの医薬組成物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗ウイルス剤、抗炎症剤や、症状を緩和する薬剤など）と組み合わせて使用してもよい。【００６６】
また、本剤は、インフルエンザワクチンが使用できない場合、例えば、インフルエンザワクチンの効果が現れるまでに罹患の可能性があるハイリスク患者や、免疫不全者等ワクチンの効果が十分に現れない患者や、ワクチン接種が禁忌である患者に対しても使用可能である。【００６７】
なお、ヒト以外の脊椎動物に経口投与する場合、水や飼料に本剤を混合して摂取させてもよい。【００６８】
＝＝ヘマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの製造方法＝＝
本発明のヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、常法に従って、化学合成することにより製造できる。例えば、通常の液相法及び固相法によってペプチド合成することができる。より具体的には、上記アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法などを利用できる。【００６９】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種のペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。【００７０】
なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って行うことができる。【００７１】
このように作製されたペプチドは、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等、ペプチド化学の分野で汎用されている常法に従って、適宜その精製を行うことができる。【００７２】
別法として、上記ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドをコードするＤＮＡを作製して発現ベクターに組み込み、培養細胞などの真核細胞又は大腸菌などの原核細胞に導入し、そこで発現させたペプチドを精製してもよい。発現ベクターは、導入する宿主細胞に従って、適宜選択する。ペプチドをコードするＤＮＡの組み込みなどを含むベクターの構築、宿主細胞への導入、宿主細胞での発現、宿主細胞の抽出物の調製は、分子生物学的手法を用いて、常法に従って行うことができる。目的のペプチドは、その抽出物から、上記したペプチド化学の分野で汎用されている常法によって、精製することができる。【００７３】
また、上記ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドにタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＧＳＴタグなど）を付加したペプチドをコードするＤＮＡを作製し、上記と同様に宿主細胞で発現させ、このタグを利用して、アフィニティカラム等で精製することもでき、その後タグのみを切断しペプチド部分のみを精製できるように発現ベクターを設計することもできる。さらに、最終的に、上記したペプチド化学の分野で汎用されている常法によって、ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを精製してもよい。【００７４】
＝＝ヘマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの化学修飾＝＝
上記本発明のヘマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、適宜に化学修飾することができる。例えば、アルキル化や脂質化（リン脂質化）等による化学修飾によって、ヘマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの細胞親和性や組織親和性を増大させたり、血中半減期を延長させ薬理効果を増強をさせたりすることができる。【００７５】
ヘマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのアルキル化は、常法に従って行うことができる。例えば、上記ペプチド合成と同様に、脂肪酸とヘマグルチニン結合性ペプチドのＮ末端アミノ基とのアミド結合形成反応により容易に行うことができる。脂肪酸としては、直鎖脂肪酸でも分枝鎖脂肪酸でもよく、また飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよく、どんな脂肪酸でも広く使用できるが、特に、生体内に存在する脂肪酸を用いるのが好ましく、具体的にはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸等の飽和脂肪酸；オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の不飽和脂肪酸など、炭素数が１２〜２０程度の脂肪酸が挙げられる。【００７６】
またアルキル化は、前記ペプチド合成と同様にして、アルキルアミンとヘマグルチニン結合性ペプチドのＣ末端カルボキシル基とのアミド結合形成反応によっても行うことができる。アルキルアミンとしては、上記脂肪酸と同様に各種のアルキルアミンを用いることができるが、特に生体内に存在する脂肪鎖（炭素数が１２〜２０程度）を用いるのが好ましい。【００７７】
ヘマグルチニン結合性ペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの脂質化も常法に従って実施できる（例えば、New Current, 11(3), 15-20 (2000); Biochemica et Biophysica Acta., 1128, 44-49 (1992); FEBSLetters, 413, 177-180 (1997); J.Biol.Chem., 257, 286-288 (1982)等を参照）。例えば、各種リン脂質の２位水酸基或いは３位のリン酸基に対し、任意のスペーサーを介して、縮合法によってヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドに結合させることができる。必要によっては、ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのＮ端或いはＣ端に任意の長さ（通常数個）のシステインを含むアミノ酸配列を付加して、縮合に利用される反応性ＳＨ基をあらかじめ導入することもできる。ここで用いられるリン脂質には、特に制限はなく、例えば、上記脂肪酸からなる、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール等が使用できる。【００７８】
なお、これらのアルキル化や脂質化された本発明のヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチド（リポペプチド）は、リポソーム調製の際の脂質成分として利用することができる。その際、ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドがリポソーム上に提示されることにより、ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは後述するリポソーム製剤として有効に利用できる。【００７９】
＝＝ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを含有するリポソーム＝＝
本発明のヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドはリポソーム製剤として調製することができる。このリポソーム製剤においては、酸性リン脂質を膜構成成分とするか或いは中性リン脂質と酸性リン脂質とを膜構成成分とするリポソームに、本発明のヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドが保持されている。【００８０】
膜構成成分としての酸性リン脂質としては、例えば、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、卵黄ホスファチジルグリセロール（卵黄ＰＧ）、水添卵黄ホスファチジルグリセロール等の天然又は合成ホスファチジルグリセロール類（ＰＧ）及びジラウロイルホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）；ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）、大豆ホスファチジルイノシトール（大豆ＰＩ）、水添大豆ホスファチジルイノシトール等の天然又は合成ホスファチジルイノシトール類（ＰＩ）などを用いることができる。これらの酸性リン脂質は一種単独で又は二種以上混合して使用することができる。【００８１】
また、中性リン脂質としては、例えば、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、水添大豆ホスファチジルコリン、水添卵黄ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、パルミトイルステアリイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等の天然又は合成ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、大豆ホスファチジルエタノールアミン、卵黄ホスファチジルエタノールアミン、水添大豆ホスファチジルエタノールアミン、水添卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＰＥ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等の天然又は合成ホスファチジルエタノールアミン類（ＰＥ）等を用いることができる。これらの中性リン脂質は、一種単独で又は二種以上混合して使用することができる。【００８２】
上記リポソーム膜は、上記酸性リン脂質を単独で構成成分として用いるか又は上記中性リン脂質と酸性リン脂質とを併用して、常法に従い形成される。ここで酸性リン脂質の併用割合は、リポソーム膜構成成分中に約０．１〜１００モル％程度、好ましくは約１〜９０モル％、より好ましくは約１０〜５０モル％程度とするのがよい。【００８３】
リポソームの調製に当たっては、さらに、例えばコレステロールなどを添加することができる。このコレステロールの添加によってリン脂質の流動性を調整し、リポソームの調製をより簡便にすることができる。このコレステロールは、通常リン脂質に対して等量まで添加できるが、特に０．５〜１倍量で添加されるのが好ましい。【００８４】
リポソームを調製する際、脂質化ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドと酸性リン脂質との分子数の割合は、ペプチド１に対して酸性リン脂質が０．５〜１００程度、好ましくは１〜６０程度、より好ましくは１．５〜２０程度とするのがよい。【００８５】
このような脂質を用いて、例えば多重層リポソーム（ＭＬＶ）を次のようにして調製する。まず、脂質を有機溶媒（クロロホルム、エーテル等）に溶解した後、丸底フラスコに入れ、窒素気流下又は減圧下で有機溶媒を除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜をつくる。この場合、さらに減圧下でデシケーター中に放置することによって有機溶媒を完全に除去することもできる。次いで、脂質化ヘマグルチニン結合性ペプチドの水溶液を脂質薄膜上に加えて脂質を水和させることによって乳濁色のリポソーム懸濁液が得られる。【００８６】
また、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）は、ホスファチジルセリンの小さな一枚膜リポソームにＣａ２＋を添加し、融合させてシリンダー状のシートとした後、キレート剤であるＥＤＴＡを添加しＣａ２＋を除去する方法（Biochim. Biophys. Acta394, 483-491, 1975）やエーテルに溶解した脂質を約６０℃の水溶液中に注入し、エーテルを蒸発させる方法（Biochim. Biophys. Acta 443, 629-634, 1976）により作ることができる。【００８７】
また、作製されたリポソーム懸濁液にペプチドの水溶液を加えることでペプチド組み込みリポソームを作製できる。【００８８】
これらの調製法のほかに、フレンチプレス法により粒子径の小さなリポソームを調製することもできる（FEBS lett. 99, 210-214, 1979）。また大沢らによって報告されているリポソームへの保持効率の高い凍結乾燥法（Chem. Pharm. Bull. 32, 2442-2445, 1984）と凍結融解法（Chem. Pharm. Bull. 33, 2916-2923,1985）を利用することもできる。【００８９】
このように調製されたリポソームに含まれる脂質化ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの割合は、全脂質中、数モル％から数十モル％程度であればよく、５〜２０モル％程度であるのが好ましいが、通常は５モル％程度であってもよい。【００９０】
さらに、こうして調製されたリポソームは、透析法（J. Pharm. Sci. 71, 806-812,1982）やポリカーボネート膜を用いたろ過法（Biochim. Biophys. Acta 557, 9-23, 1979；Biochim. Biophys. Acta 601, 559-571, 1980）により、粒子径を一定にすることができる。また調製されたリポソーム溶液から、リポソーム内に保持されなかった脂質化ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを除くためには、透析法、ゲルろ過法、遠心分離法を利用することができる（リポソーム．"脂質の化学"[日本生化学会編、生化学実験講座３]、東京化学同人、1974）。更にまた透析膜を用いてリポソームを濃縮することも可能である。【００９１】
このようにして調製されるリポソーム分散液には、製剤設計上必要な添加剤として、防腐剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、吸収促進剤等の各種の公知物質を適宜配合することができ、また必要に応じてこれらの添加物を含む液又は水で希釈することもできる。上記添加剤の具体例としては、防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、パラベン類（メチルパラベン、エチルパラベン等）、チメロサール等の真菌及び細菌に有効な防腐剤を、等張化剤としてはＤ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−キシリトール、グリセリン、ブドウ糖、マルトース、庶糖、プロピレングリコール等の多価アルコール類や塩化ナトリウム等の電解質類を、また安定化剤としてはトコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、システイン等をそれぞれ用いることができる。【００９２】
また、本発明のヘマグルチニン結合性ペプチドからなる上記リポソームの内部には、例えば抗ウイルス剤等の他の薬剤を更に封入させて、リポソーム製剤とすることも可能である。【００９３】
リポソーム製剤の製造は、具体的には例えばウッドレら（Long Circulating Liposomes: old drugs, New therapeutics., M.C. Woodle, G.Storm,Eds: Springer-Verlag Berlin (1998)）又はナンバら（Liposomal applications to cancer therapy, Y.Namba, N.Oku, J.Bioact.Compat.Polymers, 8, 158-177 (1993)）の文献に記載される方法に従って調製することができる。【００９４】
上記リポソーム製剤中のヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの量としては、特に限定されず、広範囲に適宜選択されるが、通常組成物中０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％）程度、好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％）程度とするのがよい。【００９５】
＝＝ペプチド凝集体＝＝
ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、インフルエンザウイルス感染阻害剤としてそのまま用いてもよいが、ペプチド凝集体を形成させることによって、さらに効率よくインフルエンザウイルスの宿主細胞への感染を阻害することができる。ここで、本明細書におけるペプチド凝集体は、ミセル（疎水基を内側に向け、親水基を外側に並べて球の形状を示すもの）と自己ペプチド集合体（溶液中にて自然に凝集する直径数百ｎｍ〜数μｍのペプチド凝集体）をいう。【００９６】
この際、ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを修飾し、親水性と疎水性の性質を兼ね備える両親媒性の化合物を作製することにより、ペプチド凝集体を形成しやすくすることができる。例えば、ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドをアルキル化することにより、両親媒性の化合物を作製することができる。アルキル化は、前述の通りに行われることができる。【００９７】
ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチド、もしくは両親媒性に修飾されたヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、液体中において臨界濃度に達すると凝集して、ペプチド凝集体を形成する。すなわち、所定の濃度以上のヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを溶液中で懸濁させることにより、ペプチド凝集体を形成させることができる。このようなヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのペプチド凝集体の形成は、ヘマグルチニンと宿主細胞に存在するインフルエンザウイルス受容体との結合を立体的に障害するためにも効果的であると考えられる。なお、ペプチド凝集体の直径は、例えば、光強度分布（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ＰＳＤ）を用いて測定することができる。【００９８】
＝＝他の形態を有する医薬組成物＝＝
前述のヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを投与する代わりに、これらのペプチドを細胞で発現できる発現ベクターを投与してもよい。ベクターは、プラスミドでもウイルスベクターでもよいが、用いた細胞で挿入遺伝子を発現できるプロモーターを有する必要がある。投与形態としては、ＤＮＡをそのまま投与しても、このＤＮＡを含むウイルスを感染させても、このＤＮＡを含む細胞を移植してもよい。ウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルスなど、特に限定されないが、体内で細胞に感染し、ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを発現し、分泌できるようにするのが好ましい。また、細胞を移植する場合も、ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを発現し、分泌できるようにベクターが構築されているのが好ましい。発現したペプチドを分泌させるためには、例えば、ヘマグルチニン結合性ペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのＮ端側にシグナルペプチドが融合した融合ペプチドを発現させるようにベクターを構築すればよいが、分泌させるための方法は必ずしもこれに限定されない。
【実施例】
【００９９】
［実施例１］
まず、西、佐谷らの報告（Nishi T., Saya H., et al., FEBS Lett, 399, 237-240 (1996)）で使用されたファージディスプレイシステムを用い、配列番号１〜１８の各アミノ酸配列を有するペプチドを外殻表面に提示する繊維状ファージｆｄを作製した。即ち、これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（上述の表１参照）を外殻タンパク質ｐＩＩＩ遺伝子のＮ末端部分に相当する領域に遺伝子組み換えの手法を用いて挿入すると、この挿入ＤＮＡにコードされた１５残基のアミノ酸配列からなるペプチドをファージ外殻表面に発現するように、ファージＤＮＡを構築することができる。Ｋ９１Ｋａｎの宿主菌を用い、常法により、これらの各ファージを増幅し、ファージ溶液を作製した。【０１００】
次に、配列番号２〜１８の各アミノ酸配列を表面に提示するこれらのファージのヘマグルチニン（ＨＡ）に対する結合性をＥＬＩＳＡで調べた。なお、プレートに固定するヘマグルチニンとして、Ａ型のＨ１亜型であるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のエーテル抽出物、及びＡ型のＨ３亜型であるＡ／武漢／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２）のエーテル抽出物を用いた。以下、具体的な手順を述べる。【０１０１】
まず、９６穴カルボプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）に結合したカルボキシル基を活性化させるため、プレートの各ウェルに、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）及びＮ−ヒドロキシスクシイミドの等量混合液６０μｌを添加して、１０分放置した。【０１０２】
次に、活性化プレートにヘマグルチニンを固定するため、各ウェルを５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．６）で６回洗浄し、Ｈ１Ｎ１溶液（７０μｌ／ｍｌ）又はＨ３Ｎ２溶液（７０μｌ／ｍｌ）を１００μｌ添加した。２時間放置した後、５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．６）で６回洗浄し、１ｍＭエタノールアミン水溶液を１００μｌ添加した。１０分放置した後、再度５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．６）で６回洗浄した。【０１０３】
ヘマグルチニンを固定したプレートに各ファージクローン溶液を５０μｌ（１ｘ１０１０ｐｆｕ含有）添加し、室温で２時間放置した。各ウェルをＴＢＳＴ（ＴＢＳ／５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで希釈した抗ｆｄファージ抗体（シグマ社；１０００倍希釈で使用）を１００μｌ添加し、室温で１時間放置した。各ウェルをＴＢＳＴ（ＴＢＳ／５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで希釈したＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（シグマ社；１０００倍希釈）を１００μｌ添加し、室温で１時間放置した。各ウェルをＴＢＳＴ（ＴＢＳ／５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄後、基質としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液を１００μｌ添加し、１０〜１５分放置した。３ＮＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸収を測定し、結合活性とした。【０１０４】
なお、コントロールとして、上記記載の１次ファージディスプレイ・ライブラリー及び２次ファージディスプレイ・ライブラリー、及びＡ−１（配列番号１）の結合活性と比較した。Ａ−１は、これまで同定されたヘマグルチニン結合性ペプチド（国際公開ＷＯ００／５９９３２及び特開２００２−２８４７９８明細書参照）に比べ、同等の結合活性を有する。（一例として、図１に、同様にして測定したＨ３Ｇ−１の結合活性との比較を示す。）そこで、配列番号２〜１８のアミノ酸配列を有するペプチドの結合活性を、ここでは、Ａ−１のＨ１Ｎ１とＨ３Ｎ２各々に対する結合活性を１として全データを標準化し、グラフにした（図２）。この図２のグラフから、ｅ−４とｅ−７以外のペプチドは、両者のヘマグルチニンに対し、Ａ−１より強い結合活性を示すことがわかった。特にｓ−２はＡ−１に比べ約３倍もの強い結合活性を示した。なお、上記各ライブラリーは、Ａ−１の数分の一の活性しか示さなかった。【０１０５】
以上より、配列番号２〜７，９〜１０，１２〜１８を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合性ペプチドより、ヘマグルチニンに対し高い結合活性を有するペプチドであって、本発明の一つの目的である医薬組成物として有用であると考えられる。【０１０６】
なお、これらの配列は、共通配列（コンセンサス配列）として
ｘＲＬ（Ｓ／Ｐ）ｘｘＭＶ（Ｈ／Ｒ）ｘｘｘｘＱｘ
（配列番号３７）を有するので、この共通配列をもつペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘマグルチニン結合性ペプチドより、ヘマグルチニンに対し高い結合活性を有すると考えられる。【０１０７】
［実施例２］
実施例１で行ったＥＬＩＳＡにおいて、特にヘマグルチニン（ＨＡ）に対する結合性の高かったｓ−２（配列番号３）及びｅ−１（配列番号５）の配列を持つペプチドを化学合成し（東レ株式会社に依頼）、ペプチドだけの状態でヘマグルチニンに対する結合性を評価した。【０１０８】
本実施例で用いたペプチド及びそのアミノ酸配列を表３に示す。
【表３】
2007105565.tif 000004
【０１０９】
これらのヘマグルチニン結合性ペプチドを用いて、以下のように、ヘマグルチニン固定化膜に対する結合性を評価した。実施例１のプレートと同様にＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ，  ＢＲ−１０００−１４）にＨ３Ｎ２を固定化し、これに対するペプチドの結合性をＢｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ社）によって評価を行った。具体的には、各ペプチドに対し、時間を追ってレゾナンスがどのように変化するかを、複数のペプチド濃度で測定した。【０１１０】
まず、ｓ−２ペプチドに関し、各濃度における時間（ｘ軸）とレゾナンス（ｙ軸）との関係を図３Ａに示す。そして、同様の実験を各ヘマグルチニン結合性ペプチドで行い、所定の時間における濃度（ｘ軸）に対するレゾナンス（ｙ軸）の変化を図３Ｂに示す。このように、いずれのヘマグルチニン結合性ペプチドも、その濃度に依存してヘマグルチニンへの結合量が増えていくことがわかった。【０１１１】
次に、上記の結果から、所定のペプチド濃度における各ヘマグルチニン結合性ペプチドの結合性を比較した。図４Ａに、各ヘマグルチニン結合性ペプチドのペプチド濃度１００μＭにおける、レゾナンス（ｙ軸）の時間（ｘ軸）経過に対する変化を示す。また、図４Ｂに、ペプチド濃度２００μＭにおいて、Ａ−１ペプチドの結合量を  １  としたときのヘマグルチニン結合性ペプチドのレゾナンスの相対値を示す。このように、各ペプチドはｓ−２＞ｅ−１＞Ａ−１＞ｐＶＩＩＩ（配列番号５１）の強さの順で、ヘマグルチニンに結合することがわかった。この結合の強さの順序は、各ヘマグルチニン結合性ペプチドを発現するファージで測定した結合性の順序とも対応している。【０１１２】
以上の結果より、ｅ−１、ｓ−２はＡ−１よりそれぞれ１．２倍、２．１倍強くヘマグルチニンに結合することが分かり、アミノ酸が置換されたことによって、ペプチドの機能が向上したことが示唆された。ヘマグルチニンに対する結合量が少ないために、解離定数  Ｋｄ  を求めることはできないが、本実験で固体化したリガンド量から理論的最大結合量を求めると２２８ＲＵであるため、例えばｓ−２の２００μＭのときの結合量がこれのちょうど半分程度であることから、これらのペプチドの解離定数は１０−３〜１０−４Ｍ程度だと考えられる。【０１１３】
ＧＭ３キャスト膜を用いてＧＭ３−ヘマグルチニン（ＨＡ）間相互作用の阻害評価をＥＬＩＳＡを用いて評価したところ（永田和宏・半田宏、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法‐ＢＩＡＣＯＲＥを中心に」シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、１９９８年）、ペプチドＡ−１は、ｍＭオーダーでＧＭ３に対するヘマグルチニンの結合を阻害した（Ｈ３に対するＡ−１のＩＣ５０＝１．９ｍＭ）。また、ヘマグルチニンと遊離のシアリルラクトースとの結合定数はｍＭオーダーであることがＮＭＲによる評価から報告されている（α（２，３）−ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ  Ｋ０＝３．２ｍＭ）。従って、本実施例の結果は、Ｉｎｏｕｅによって報告されたペプチドの阻害定数とほぼ一致し、また、本実施例の結果は、Ａ−１の阻害定数あるいはシアリルラクトースで得られている結合定数と同じオーダーもしくは一桁小さいことから、これらのヘマグルチニン結合性ペプチドは、ヘマグルチニンのリガンドである糖鎖の優れたアナログとなり得ることが示唆された。【０１１４】
［実施例３］
実施例１により、配列番号２〜７、９〜１０、１２〜１８を有するポリペプチドは、ヘマグルチニンに対して高い結合活性を有することが明らかになったが、インフルエンザウイルスの感染を防止できる、より少ない残基のペプチドを同定すべく、以下の実験を行った。【０１１５】
（１）アルキル化ペプチドの作製
ペプチド凝集体を形成させるため、アルキル化させたペプチドを本実験に用いた。【０１１６】
まず、以下の表４に示す各々のペプチド（配列番号１、３、３８〜４７、５２〜５５）を、Ｆｍｏｃ法を用いて、自動ペプチドシンセサイザーＰＳＳＭ−８（島津製作所）で合成した。ここで、固相樹脂としてＦｍｏｃ−ＳＡＬ−Ｒｅｓｉｎ（ｃｏｄｅ  Ａ００１０２，渡辺化学）を用いてペプチドの合成反応を行った。次に、ジクロロメタンに溶解させたＣ１８−ＣＯＯＨ（ステアリン酸、シグマ）を上記ペプチド合成後の固相樹脂と反応させ、これらのペプチドのＮ末端側をアルキル化させた。その後、Ｃ１８ペプチドを固相合成樹脂から切り出して、Ｃ１８ペプチドアミド（Ｃ末端が−ＣＯＮＨ２）を得た。【０１１７】
粗精製の後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。また、ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）で精製後のペプチドの分子量を測定した。なお、ＭＳ測定は、ａｕｔｏｆｌｅｘＴＭ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用い、マトリックスにはα−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｓ（α−ＣＨＣＡ）を用いた。【０１１８】
（２）プラークアッセイを用いたインフルエンザウイルス感染阻害活性の評価
上記（１）の方法によって作製した各種ペプチドが、インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染をどの程度阻害するかを調べるために、以下の実験を行った。【０１１９】
まず、６ウェルマイクロプレートに１０％ウシ胎児血清、０．１％ＮａＨＣＯ３、１０μｇ／ｍｌグルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリンＧ及び１００ユニット／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｅａｇｌｅ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い、ＭＤＣＫ（Ｍａｒｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターでコンフルエントになるまで単層培養した。なお、ＭＤＣＫ細胞及び以下の実験で使用するインフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４ウイルス株（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ／愛知／２／６８ウイルス株（Ｈ３Ｎ２）は、Ｋ．Ｎａｇａｔａ（筑波大学（日本））から入手した。ＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型全てに対して高い感受性を示し、さらに、細胞増殖時に、ヘマグルチニンの変異株が出現しないことから、インフルエンザウイルスの感染実験において広く用いられている。【０１２０】
次に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス溶液（Ａ型インフルエンザウイルス／ＰＲ／８／３４を１００個前後のプラークを形成する濃度に希釈した溶液）及びＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス溶液（Ａ型インフルエンザウイルス／Ａｉｃｈｉ／２／６８を１００個前後のプラークを形成する濃度に希釈した溶液）と、各種ペプチド溶液（ペプチド濃度０．２〜２００μＭ）をそれぞれ１００μＬずつ混合し、合計２００μＬの検体を作製した。【０１２１】
次に、６ウェルマイクロプレート中の培地を除去し、ＰＢＳ（−）を１〜２ｍＬ／ウェル入れて細胞表面を洗浄した。ＰＢＳ（−）を除去後、上記の方法によって作製した検体を、２００μＬ／ウェルずつ入れ、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターで３０分間インキュベートした。【０１２２】
３０分後、検体溶液を除去し、ＰＢＳ（−）を１〜２ｍＬ／ウェル入れて細胞を洗浄した。次に、予め５０℃に加温しておいた２％の寒天０．６２５ｍｌ／ウェル（Ｏｘｏｉｄ，  ＬＴＤ．，製品番号：Ｌ２８）と１．４７５ｍｌ／ウェルの重層培地（６ウェル分では、２×ＭＥＭ＋ＢＡを６．２５ｍｌ、精製水を２．２５ｍｌ、１％ＤＥＡＥデキストランを０．１２５ｍｌ、７．５％  ＮａＨＣＯ３を０．１６７ｍｌ、アセチルトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ（ＰＢＳ））を０．１２５ｍｌ）（２×ＭＥＭ＋ＢＡは、９．４ｇ  ＭＥＭを４７４ｍＬ  ＭｉｌｉＱ水に加え、高圧滅菌し、濾過滅菌した１０ｍＬのＬ−グルタミン溶液（×１００、３０ｍｇ／ｍＬ）及び１０ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（２．４ｇ／１０ｍＬ）、６ｍＬ  ３５％  ｂｏｖｉｎｅ  ａｌｂｕｍｉｎ  （Ａ−７４０９，Ｓｉｇｍａ）を加えて作製した。）を混合し、これを２ｍＬ／ウェルずつ分注入した。室温で３０分間静置し、寒天が固まったら反転して、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターで２日間インキュベートした。【０１２３】
インフルエンザウイルスを感染させてから２日後、重層培地をはずし、プレートを乾燥させた。次に、クリスタルバイオレット染色液（５０ｍｇ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ／５０ｍＬ  ２０％エタノール）を５００μＬ／ウェル入れて、５分程度染色を行った後、５回精製水で洗い、風乾させた。最後に、プラークの数をカウントし、コントロール（インフルエンザウイルスのみをインキュベートしたもの）と比較し、各ペプチドに対するインフルエンザウイルス感染阻害率を計算した。【０１２４】
各種ペプチドを用いたＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス又はＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス感染率を示した結果を表４に示す。なお、Ｃ１８−ｓ２（ｒ１−８）をネガティブコントロールとした。ここで、Ｃ１８−ｓ２（ｒ１−８）（配列番号４１）とは、ｓ２（１−８）（配列番号３８）と同じアミノ酸構成だが、配列番号３８とは異なる配列を有するペプチドをいう。また、ＩＣ５０とは、ペプチドを入れない場合の感染率を１００％とし、その感染を５０％まで阻害するのに必要なペプチド濃度をいう。
【表４】
2007105565.tif 000005
【０１２５】
その結果、Ｃ１８−Ｓ２ペプチド（配列番号３）と比べ、配列番号３のＣ末端を削ったＡＲＬＰＲ配列を有するペプチド（Ｃ１８−ｓ２（１−８）ペプチド（配列番号３８）、Ｃ１８−ｓ２（１−７）ペプチド（配列番号４２）、Ｃ１８−ｓ２（１−６）ペプチド（配列番号４３）、Ｃ１８−ｓ２（１−５）ペプチド（配列番号４４））、Ｃ１８−ｓ２（１−４）ペプチド（配列番号５２）は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する感染をより強く阻害できること、また、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスに対する感染を、同等か、それ以上により強く阻害できることが示された。【０１２６】
また、Ｃ１８−Ｓ２（２−８）ペプチドは、Ｃ１８−Ｓ２ペプチド（配列番号３）と比べ、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する感染を、同等以上に阻害できることが示された。【０１２７】
一方、Ｃ１８−ｓ２（１−３）ペプチド（配列番号５４）とＣ１８−ｓ２（１−２）ペプチド（配列番号５５）は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス及びＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスに対する感染を阻害できないことが示された。【０１２８】
以上の結果から、配列番号３のＣ末端を削ったＡＲＬＰＲ配列を有するペプチドは、インフルエンザウイルスのＭＤＣＫ細胞への感染を強く阻害することが明らかになった。また、さらにＮ末端を１残基削ったＲＬＰＲ配列を有するペプチドは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのＭＤＣＫ細胞への感染を、強く阻害することが明らかになった。さらに、配列番号３のＣ末端を削ったＡＲＬＰ配列を有するペプチドも、インフルエンザウイルスのＭＤＣＫ細胞への感染を強く阻害することが明らかになった。【０１２９】
さらに、上記と同様の方法を用いて、配列番号３のＣ末端を削ったＡＲＬＰＲ配列（Ｃ１８−ｓ２（１−５）ペプチド：配列番号４４）を反転させた配列を有するペプチド（Ｃ１８−ｓ２（ｒ１−５）ペプチド：配列番号５６）と配列番号３のＣ末端を削ったＡＲＬＰ配列（Ｃ１８−ｓ２（１−４）ペプチド：配列番号５２）を反転させた配列を有するペプチド（Ｃ１８−ｓ２（ｒ１−４）ペプチド：配列番号５７）を作製し、上記の方法を用いて、これらのペプチドを用いたＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス又はＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス感染率を示した結果を表５に示す。
【表５】
2007105565.tif 000006
【０１３０】
その結果、Ｃ１８−ｓ２（ｒ１−８）（配列番号４１）と比べ、Ｃ１８−ｓ２（ｒ１−５）ペプチド（配列番号５６）とＣ１８−ｓ２（ｒ１−４）ペプチド（配列番号５７）は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス及びＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＭＤＣＫ細胞への感染を、より強く阻害できることが示された。【０１３１】
本発明によって、インフルエンザウイルスの宿主への感染を阻害できる、４〜８残基のペプチドを提供することが可能になった。このようにして得られた４〜８残基のペプチドは、１５残基のペプチドより安価に合成できる。
【産業上の利用の可能性】
【０１３２】
本発明によると、ヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチド及びインフルエンザウイルス感染阻害活性の高いペプチドを提供し、さらに、このようなヘマグルチニンに対する親和性の高いペプチド又はインフルエンザウイルス感染阻害活性の高いペプチドを用いた医薬組成物を提供することができるようになる。
【図１】
2007105565.tif 000007
【図２】
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【図３】
2007105565.tif 000009
【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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