【手続補正書】
【提出日】平成19年12月4日(2007.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  少なくとも２つの選択マーカーおよび１つの組換えプラスミドを有する、酵母細胞の安定な一倍体集団であって、ここで：
（ａ）該第１の選択マーカーは、優性選択マーカーであり、該マーカーは、必須の酵母遺伝子内に組換え挿入されて、該必須の遺伝子を不活化し；
（ｂ）該第２の選択マーカーは、規定された一倍体選択劣性マーカーであり；そして
（ｃ）該組換えプラスミドは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから得られた機能的遺伝子を含み、該遺伝子は、非Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ異種遺伝子であり、該遺伝子は、該優性選択マーカーによって不活化された該必須の遺伝子を相補する、
一倍体集団。
【請求項２】  前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１に記載の一倍体集団。
【請求項３】  前記優性選択マーカーが、ＫＡＮ、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＡＤＥ２からなる群より選択される、請求項１に記載の一倍体集団。
【請求項４】  前記規定された一倍体選択劣性マーカーが、親二倍体酵母における対応する優性対選択（感受性）対立遺伝子を有する選択マーカーである、請求項１に記載の一倍体集団。
【請求項５】  前記一倍体劣性選択マーカーが、劣性選択表現型を生じる挿入または欠失によって生成された、請求項１に記載の一倍体集団。
【請求項６】  前記優性対選択（感受性）対立遺伝子が、ＣＡＮ１、ＣＹＨ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５およびＵＲＡ３からなる群より選択される、野生型対立遺伝子である、請求項４に記載の一倍体集団。
【請求項７】  前記規定された一倍体選択劣性マーカーが、ｃａｎ１、ｃｙｈ２−１、ｌｙｓ２、ｍｅｔ１５およびｕｒａ３からなる群由来の選択マーカーである、請求項１に記載の一倍体集団。
【請求項８】  二倍体集団が、１，０００，０００個中に１個未満である、請求項１に記載の一倍体集団。
【請求項９】  前記一倍体集団が、１より多い遺伝子に挿入された複数の異なる優性選択マーカーを有する、請求項１に記載の一倍体集団。
【請求項１０】  前記酵母が、親二倍体酵母中の対応する優性対選択（感受性）対立遺伝子を有する第２の異なる規定された一倍体選択劣性マーカーをさらに含む、請求項４に記載の一倍体集団。
【請求項１１】  個々のメンバーのアレイであって、該メンバーは、少なくとも２つの選択マーカーおよび１つの組換えプラスミドを有する、酵母細胞の安定な一倍体集団であって、ここで：
（ａ）該第１の選択マーカーは、優性選択マーカーであり、該マーカーは、必須の酵母遺伝子内に組換え挿入されて、該必須の遺伝子を不活化し；
（ｂ）該第２の選択マーカーは、規定された一倍体選択劣性マーカーであり；そして
（ｃ）該組換えプラスミドは、該優性選択マーカーによって不活化された該必須の遺伝子を相補する、機能的遺伝子を含み；
ここで、該アレイの少なくとも２つのメンバーは、異なる必須の酵母遺伝子に挿入されそして該異なる必須の酵母遺伝子を不活化する該優性選択マーカーを有し、そして該組換えプラスミドの該機能的遺伝子が異なる、
アレイ。
【請求項１２】  前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１３】  前記優性選択マーカーが、ＫＡＮ、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＡＤＥ２からなる群より選択される、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１４】  前記規定された一倍体選択劣性マーカーが、親二倍体酵母における対応する優性対選択（感受性）対立遺伝子を有する選択マーカーである、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１５】  前記優性対選択（感受性）対立遺伝子が、ＣＡＮ１、ＣＹＨ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５およびＵＲＡ３からなる群より選択される、野生型対立遺伝子である、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１６】  前記一倍体選択マーカーが、劣性選択表現型を生じる挿入、欠失または点変異によって生成された、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１７】  前記規定された一倍体選択劣性マーカーが、ｃａｎ１、ｃｙｈ２−１、ｌｙｓ２、ｍｅｔ１５およびｕｒａ３からなる群より選択される選択マーカーである、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１８】  前記プラスミドの前記機能的遺伝子が、非Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ生物由来の異種遺伝子である、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１９】  前記メンバーが、１より多い遺伝子に挿入されそして該遺伝子を不活化する複数の異なる優性選択マーカーを有する、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項２０】  前記メンバーが、前記第１のマーカーとは異なる第２の優性選択マーカーを保持し、該第２の優性選択マーカーが、一倍体特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項２１】  少なくとも２つの組換え挿入物を有しそして少なくとも１つの組換えプラスミドによって形質転換された、二倍体酵母細胞の集団であって、ここで：
（ａ）該第１の挿入物は、優性選択マーカーであり、該マーカーは、必須の酵母遺伝子内に組換え挿入されて、該必須の遺伝子を不活化し；そして
（ｂ）該第２の組換え挿入物は、１コピーの優性対選択（感受性）マーカーであり、かつ親二倍体酵母における対応する一倍体選択劣性マーカーに対する対立遺伝子である、
二倍体酵母細胞の集団。
【請求項２２】  前記細胞が、２つの一倍体選択劣性マーカーを有する、請求項２１に記載の酵母細胞。
【請求項２３】  前記優性対選択マーカーが、ＣＡＮ１、ＣＹＨ２、ＵＲＡ３、ＬＹＳ２およびＭＥＴ１５からなる群より選択され、そして前記対応する一倍体選択劣性対立遺伝子が、ｃａｎ１、ｃｙｈ２−１、ｕｒａ３、ｌｙｓ２およびｍｅｔ１５からなる前記対応する対立遺伝子から選択される、請求項２１に記載の酵母細胞。
【請求項２４】  前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２１に記載の酵母細胞。
【請求項２５】  前記優性選択マーカーが、ＫＡＮ、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＡＤＥ２からなる群より選択される、請求項２１に記載の酵母細胞。
【請求項２６】  前記一倍体選択劣性マーカーが、挿入または欠失によって生成された、請求項２１に記載の酵母細胞。
【請求項２７】  二倍体酵母細胞であって、以下の組換え挿入物：
（ａ）必須の酵母遺伝子内に組換え挿入されて該必須の遺伝子を不活化にする優性選択マーカーである、第１の挿入物；
（ｂ）セントロメアから約５センチモルガン以内に配置された、第２の組換え挿入物であって、該挿入物は、１コピーの第１の優性対選択マーカーであり、該第１の優性対選択マーカーは、対応する劣性選択マーカーに対する対立遺伝子である、第２の組換え挿入物；および
（ｃ）第３の組換え変異であって、該変異は、該第１の優性対選択マーカーに対応する遺伝子のネイティブコピーに導入されそして該遺伝子座を劣性選択マーカーにする、第３の組換え変異、
を有する、二倍体酵母細胞。
【請求項２８】  前記第３の組換え変異が、前記第１の優性対選択マーカーに対応する前記遺伝子の２つのネイティブコピーに導入されている、請求項２７の酵母細胞。
【請求項２９】  請求項２７に記載の酵母細胞であって、第４の組換え挿入物および第５の組換え変異を有し、該第４の組換え挿入物は、前記第２の組換え挿入の染色体とは異なる染色体のセントロメアから約５センチモルガン以内にあり、かつ１コピーの第２の異なる優性対選択マーカーであり、該第５の組換え変異は、該第２の優性対選択マーカーに対応する遺伝子のネイティブコピーに導入され、そして該遺伝子座を劣性選択マーカーにする、酵母細胞。
【請求項３０】  前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２７に記載の酵母細胞。
【請求項３１】  生物学的に活性な化合物の標的をコードする遺伝子を決定するための方法であって、以下の工程：
（Ａ）少なくとも２つの選択マーカーと１つの組換えプラスミドとを有する酵母細胞の安定な一倍体集団のアレイを作製する工程であって、ここで：
（ａ）該第１の選択マーカーは、優性選択マーカーであり、該マーカーは、必須の酵母遺伝子内に組換え挿入されて、該必須の遺伝子を不活化し、ここで、該アレイの該メンバーは、異なる必須の遺伝子が不活化されており；
（ｂ）該第２の選択マーカーは、規定された一倍体選択劣性マーカーであり；そして
（ｃ）該組換えプラスミドは、該優性選択マーカーによって不活化された該必須の遺伝子を相補する機能的な異種遺伝子を含み；
（ｄ）該一倍体集団は、少なくとも２つの組換え挿入物を有しかつ少なくとも１つの組換えプラスミドで形質転換された、二倍体酵母細胞の集団に由来し、
（ｉ）該第１の挿入物は、優性選択マーカーであり、該マーカーは、必須の酵母遺伝子内に組換え挿入されて、該必須の遺伝子を不活化し；そして
（ｉｉ）該第２の組換え挿入物は、１コピーの優性対選択（感受性）マーカーであり、かつ親二倍体酵母における対応する一倍体選択劣性マーカーに対する対立遺伝子であり、
（ｅ）該アレイ中の集団は、生存について異なる異種遺伝子に依存する、
工程；
（Ｂ）該アレイに、該アレイの全ての集団ではなく１つの集団と化合物特異的反応を生じる量で、生物学的に活性な化合物を接触させる工程；および
（Ｃ）該化合物と反応性である該アレイ内の酵母集団を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３２】  前記二倍体酵母細胞が、前記第１の挿入物の前記マーカーとは異なる第２の優性選択マーカーを保持し、該第２の優性選択マーカーは、一倍体特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】  前記優性選択マーカーが、異なる必須の酵母遺伝子内に組換え挿入される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】  前記優性選択マーカーが、ＫＡＮ、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＡＤＥ２からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】  前記優性対選択（感受性）対立遺伝子が、ＣＡＮ１、ＣＹＨ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５およびＵＲＡ３からなる群より選択される野生型対立遺伝子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】  前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】  個々のメンバーのアレイであって、該メンバーは、少なくとも２つの選択マーカーと１つの組換えプラスミドとを有する酵母細胞の安定な一倍体集団であって、ここで：
（ａ）該第１の選択マーカーは、優性選択マーカーであり、該マーカーは、必須の酵母遺伝子内に組換え挿入されて、該必須の遺伝子を不活化し；
（ｂ）該第２の選択マーカーは、規定された一倍体選択劣性マーカーであり；そして
（ｃ）該組換えプラスミドは、該優性選択マーカーによって不活化された該必須の遺伝子を相補する機能的遺伝子を含み、該アレイの少なくとも２つのメンバーは、異なる必須の酵母遺伝子に挿入されそして該異なる必須の酵母遺伝子を不活化する該優性選択マーカーを有するか、または該アレイの少なくとも２つのメンバーは、同じ必須の遺伝子において該優性選択マーカーを有しそして該組換えプラスミドの該機能的遺伝子が異なる、
アレイ。
【請求項３８】  前記組換えプラスミド上にある機能的な異種遺伝子が、天然に存在する遺伝子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】  前記組換えプラスミド上にある機能的な異種遺伝子が、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから得られる、請求項３１に記載の一倍体集団。
【請求項４０】  必須の遺伝子を相補する機能的な異種遺伝子の特異的タンパク質産物に対する活性を有するが他のタンパク質産物に対しては活性を有さない化合物を同定するための方法であって、該方法は、
（ｉ）少なくとも２つの選択マーカーと１つの組換えプラスミドとを有する酵母細胞の安定な一倍体集団のアレイを作製する工程であって、
（ａ）該第１の選択マーカーは、優性選択マーカーであり、該マーカーは、必須の酵母遺伝子内に組換え挿入されて、該必須の遺伝子を不活化し、ここで、該アレイの該メンバーは、異なる必須の遺伝子が不活化されており；
（ｂ）該第２の選択マーカーは、規定された一倍体選択劣性マーカーであり；そして
（ｃ）該組換えプラスミドは、該優性選択マーカーによって不活化された該必須の遺伝子を相補する機能的な異種遺伝子を含み；該アレイ中の集団は、生存について異なる異種遺伝子に依存し、該集団の各々は、該アレイの別々のメンバーを規定する、
工程；
（ｉｉ）該アレイに、該アレイの全ての集団ではなく１つの集団と化合物特異的反応を生じ得る量で、生物学的に活性な化合物を接触させる工程；および
（ｉｉｉ）該アレイの１つのメンバーと特異的に反応するが該アレイの他のメンバーとは反応しない化合物を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項４１】  請求項４０に記載の方法であって、前記一倍体集団は、少なくとも２つの組換え挿入物を有しかつ少なくとも１つの組換えプラスミドで形質転換された二倍体酵母細胞の集団に由来し、
（ａ）該第１の選択マーカーは、優性選択マーカーであり、該マーカーは、必須の酵母遺伝子内に組換え挿入されて、該必須の遺伝子を不活化し、
（ｂ）該第２の組換え挿入物は、１コピーの優性対選択（感受性）マーカーであり、かつ親二倍体酵母における対応する一倍体選択劣性マーカーに対する対立遺伝子である、
方法。