【手続補正書】
【提出日】平成20年2月25日(2008.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  糖尿病性腎症の処置のためのＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤の使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】  糖尿病性腎症を処置するためのＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２】  式Ｉ：
【化１】
2003525240.tif 000001
[式中、
Ｒ１は、４−ピラジニル；１−メチル−１Ｈ−ピロリル；アミノ−もしくはアミノ−低級アルキル−置換フェニル {式中、アミノ基はそれぞれ遊離しているか、アルキル化されているか、またはアシル化されている}；５員環の炭素原子で結合している１Ｈ−インドリル、または１Ｈ−イミダゾリル；または、環の炭素原子で結合しており、そして窒素原子が非置換であるかまたは酸素原子によって置換された、非置換ピリジルもしくは低級アルキル−置換ピリジルであり；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、または低級アルキルであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの１個または２個の基は、それぞれニトロ、フッ素置換低級アルコキシ、または式 II：
【化２】
2003525240.tif 000002
{式中、
Ｒ８は、水素、または低級アルキルであり；
Ｘは、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシミノ、または、Ｏ−低級アルキル−ヒドロキシミノであり；
Ｙは、酸素、またはＮＨであり；
ｎは、０または１であり；
そしてＲ１０は、すくなくとも５個の炭素原子を有する脂肪族性の基であるか、または芳香族性、芳香族−脂肪族性、環状脂肪族性、環状脂肪族−脂肪族性、複素環もしくは複素環−脂肪族性の基である}の基であり；
そして、残りのＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ他と独立に、水素、非置換低級アルキル、または遊離しているかもしくはアルキル化されたアミノ、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、またはモルホリニルによって置換された低級アルキル、または低級アルカノイル、トリフルオロメチル、遊離しているか、エーテル化された、もしくはエステル化されたヒドロキシ、遊離しているか、アルキル化されたもしくはアシル化されたアミノ、遊離しているかもしくはエステル化されたカルボキシである]のＮ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、または少なくとも１個の塩を形成する基を有する該化合物の塩である、請求項１に記載のＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項３】  Ｎ−{５−[４−(４−メチル−ピペラジノ−メチル)−ベンゾイルアミド]−２−メチルフェニル}−４−(３−ピリジル)−２−ピリミジン−アミンである、請求項２に記載のＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項４】  モノメシレート塩の形態で用いられる、請求項１から３のいずれかに記載のＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項５】  糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、またはＩｇＡ腎症を処置するための、式Ｉ：
【化３】
2003525240.tif 000003
[式中、
Ｒ１は、炭素原子で結合したピリジルであり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびＲ８は、それぞれ水素であり、
Ｒ４は、低級アルキルであり、
Ｒ７は、式 II：
{式中、Ｒ９は、水素であり、
Ｘは、オキソであり、
ｎは、０であり、
そしてＲ１０は、４−メチル−ピペラジニル−メチルである}の基である]の化合物、またはその薬学的に許容され得る塩である、ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項６】  Ｎ−{５−[４−(４−メチル−ピペラジノ−メチル)−ベンゾイルアミド]−２−メチルフェニル}−４−(３−ピリジル)−２−ピリミジン−アミン、またはその薬学的に許容され得る塩である、請求項５に記載のＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項７】  モノメシレート塩の形態である、請求項５または６に記載のＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、特に式Ｉ[式中、記号および置換基は、本明細書に記載された通りの意義を有する]の、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体の、遊離形または薬学的に許容され得る塩形（化合物は、下記に「本発明の化合物」として集めて記載した）の、糖尿病性腎症の処置のための医薬組成物の製造における新規の使用、および糖尿病性腎症に罹患している恒温動物に、「本発明の化合物」を治療上有効な量投薬する、ヒトを含む恒温動物の処置方法に関する。
【０００２】
本発明は、糖尿病性腎症を処置するための医薬の製造における、ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤の使用に関する。
【０００３】
本発明は、糖尿病性腎症を処置するための医薬の製造のための、式Ｉ：
【化４】
2003525240.tif 000004
[式中、
Ｒ１は、４−ピラジニル；１−メチル−１Ｈ−ピロリル；アミノ−もしくはアミノ−低級アルキル−置換フェニル {式中、何れの場合のアミノ基も、遊離しているか、アルキル化され、もしくはアシル化されている}；５員環の炭素原子で結合した、１Ｈ−インドリルまたは１Ｈ−イミダゾリル；または、環の炭素原子で結合しており、そして窒素原子が非置換であるかまたは酸素原子によって置換された、非置換ピリジルもしくは低級アルキル−置換ピリジルであり；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ他方と独立に、水素または低級アルキルであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの１個または２個の基は、それぞれニトロ、フッ素置換低級アルコキシ、または式 II：
【化５】
2003525240.tif 000005
{式中、
Ｒ９は、水素または低級アルキルであり、
Ｘは、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシミノ、またはＯ−低級アルキル−ヒドロキシミノであり、
Ｙは、酸素、またはＮＨ基であり、
ｎは、０または１であり、
そしてＲ１０は、少なくとも５個以上の炭素原子を有する脂肪族性の基であるか、または芳香族性、芳香族−脂肪族性、環状脂肪族性、環状脂肪族−脂肪族性，複素環性、または複素環−脂肪族性の基である}の基であり；
かつ残りのＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ他と独立に、水素、非置換低級アルキル、または遊離しているかもしくはアルキル化されたアミノ、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、またはモルホリニルによって置換された低級アルキル、または低級アルカノイル、トリフルオロメチル、遊離しているか、エーテル化された、もしくはエステル化されたヒドロキシ、遊離しているか、アルキル化されたもしくはアシル化されたアミノ、遊離しているかもしくはエステル化されたカルボキシである]の、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体の、特に新規の使用に関する。
【０００４】
１−メチル−１Ｈ−ピロリルは、１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イル、または１−メチル−１Ｈ−ピロール−３−イルが望ましい。
アミノ−もしくはアミノ−低級アルキル−置換フェニル基である、Ｒ１[式中、それぞれの場合において、アミノ基は、遊離しているか、アルキル化され、またはアシル化されている]は、何れかの望ましい位置（オルト、メタ、またはパラ）で置換されたフェニル [式中、アルキル化されたアミノ基は、モノ−もしくはジ−低級アルキルアミノ基、例えばジメチルアミノが望ましく、かつアミノ−低級アルキルの低級アルキル部分は、特にメチルもしくはエチルのような、直鎖のＣ１−Ｃ３アルキルが望ましい] である。
【０００５】
５員環の炭素原子で結合した１Ｈ−インドリルは、１Ｈ−インドール−２−イル、または１Ｈ−インドール−３−イルである。
環の炭素原子に結合した非置換ピリジル、または低級アルキル−置換ピリジルは、低級アルキル−置換の２−、４−もしくは好ましくは３−ピリジル、または好ましくは非置換の２−、４−もしくは好ましくは３−ピリジルであり、例えば３−ピリジル、２−メチル−３−ピリジル、または４−メチル−３−ピリジルである。窒素原子で酸素によって置換されたピリジルは、ピリジン Ｎ−オキシド、すなわちＮ−オキシド−ピリジルから誘導される基である。
【０００６】
フッ素置換低級アルコキシは、少なくとも１つの、好ましくは幾つかのフッ素置換基を有する低級アルコキシであり、特にトリフルオロメトキシ、または１，１，２，２−テトラフルオロ−エトキシである。
【０００７】
Ｘが、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシミノ、またはＯ−低級アルキル−ヒドロキシミノである場合、Ｃ＝Ｘ基は、上位から、それぞれＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝Ｎ−Ｈ、Ｃ＝Ｎ−低級アルキル、Ｃ＝Ｎ−ＯＨまたはＣ＝Ｎ−Ｏ−低級アルキルである。Ｘは、オキソが望ましい。
ｎは、０、すなわち、Ｙが存在しないことが望ましい。
Ｙは、存在するならば、ＮＨ基が望ましい。
【０００８】
“低級”という用語は、本明細書の範囲において、７個以下の、好ましくは４個以下の炭素原子を有する基を示す。
低級アルキルＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ９は、メチル、またはエチルが望ましい。
【０００９】
少なくとも５個の炭素原子を有する、脂肪族性の基Ｒ１０は、好ましくは２２個以下の、一般的には１０個以下の炭素原子を有し、そして置換された、または好ましくは非置換のアルキニル、アルケニル、もしくは好ましくはＣ５−Ｃ７アルキル（例えばｎ−ペンチル）のようなアルキル基であるような、置換された、好ましくは非置換の脂肪族性炭化水素基である。芳香族性の基Ｒ１０は、２０個以下の炭素原子を有し、そして非置換であるか、または置換されており、例えば非置換もしくは置換ナフチル、特に２−ナフチルであるか、または好ましくはフェニルである。置換基は、好ましくはシアノ、特にメチルのような非置換低級アルキル、またはヒドロキシ−、アミノ−もしくは４−メチル−ピペラジニル−置換低級アルキル、トリフルオロメチル、遊離しているか、エーテル化された、もしくはエステル化されたヒドロキシ、遊離しているか、アルキル化された、もしくはアシル化されたアミノ、遊離しているかもしくはエステル化されたカルボキシから選ばれる。芳香族−脂肪族性の基Ｒ１０において、芳香族性の部位は上記で定義した通りであり、かつ脂肪族性の部位は、好ましくは低級アルキル、特に置換されたＣ１−Ｃ２アルキル、または好ましくは非置換のＣ１−Ｃ２アルキルであり、例えばベンジルである。環状脂肪族性の基Ｒ１０は、特に３０個以下の、より特別には２０個以下の、そして最も特別には１０個以下の炭素原子を有し、単環式もしくは多環式であり、そして置換されているか、または好ましくは非置換であり、例えばシクロアルキル基、特に５員環もしくは６員環のシクロアルキル基であり、好ましくはシクロヘキシルである。環状脂肪族−脂肪族性基Ｒ１０において、環状脂肪族性の部位は上記で定義した通りであり、脂肪族性の部位は、好ましくは低級アルキルであり、特に置換Ｃ１−Ｃ２アルキルであり、または好ましくは非置換のＣ１−Ｃ２アルキルである。複素環性の基Ｒ１０は、特に２０個以下の炭素原子を含み、そして好ましくは飽和もしくは不飽和であり、５員環もしくは６員環の単環式であって、かつ好ましくは窒素、酸素、硫黄から選ばれる１−３の複素原子を有する基であり、特に、例えばチエニル、または２−、３−もしくは４−ピリジルなどである。または例えば１個もしくは２個のベンゼン環が、上記の単環式の基に連結（縮合）している、二環式もしくは三環式の基である。複素環−脂肪族性の基Ｒ１０において、複素環性の部位は上記で定義した通りであり、そして脂肪族性の部位は、好ましくは低級アルキル、特に置換されたＣ１−Ｃ２アルキル、または好ましくは非置換のＣ１−Ｃ２アルキルである。
【００１０】
エーテル化されたヒドロキシは、低級アルコキシが望ましい。エステル化されたヒドロキシは、低級アルカン酸のような有機カルボン酸によって、またはハロゲン化水素酸のような鉱酸によって、エステル化されたヒドロキシであり、例えば低級アルカノイルオキシ、またはハロゲンによって、特にヨウ素、臭素、または特にフッ素もしくは塩素によって、エステル化されたヒドロキシが望ましい。
【００１１】
アルキル化されたアミノは、例えばメチルアミノのような低級アルキルアミノであるか、またはジメチルアミノのようなジ−低級アルキルアミノである。アシル化されたアミノは、例えば低級アルカノイルアミノ、またはベンゾイルアミノである。
エステル化されたカルボキシは、例えば、メトキシカルボニルのような低級アルコキシカルボニルである。
【００１２】
置換されたフェニル基は、５個以下の、フッ素のような置換基を有し得るが、特にかなり大きな置換基の場合、一般的に１から３個しか置換されない。特に記載がある置換されたフェニル基の例は、４−クロロ−フェニル、ペンタフルオロ−フェニル、２−カルボキシ−フェニル、２−メトキシ−フェニル、４−フルオロ−フェニル、４−シアノ−フェニル、および４−メチル−フェニルである。
【００１３】
式Ｉの化合物における、塩を形成する基は、塩基性または酸性の性質を有する基である。例えば遊離のアミノ基、ピラジニル基、またはピリジル基などの、少なくとも１個の塩基性の基を有する化合物は、例えば塩酸、硫酸もしくはリン酸のような無機酸と、または例えばトリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸またはシュウ酸のような脂肪族性のモノ−もしくはジ−カルボン酸、またはアルギニン酸もしくはリジンのようなアミノ酸、安息香酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、サリチル酸、または４−アミノサリチル酸のような芳香族性のカルボン酸、マンデル酸、桂皮酸のような芳香族−脂肪族性カルボン酸、ニコチン酸もしくはイソニコチン酸のような複素芳香族性カルボン酸、メタン−、エタン−もしくは２−ヒドロキシエタン−スルホン酸のような脂肪族性スルホン酸、または例えばベンゼン−、ｐ−トルエン−、もしくはナフタレン−２−スルホン酸のような芳香族性スルホン酸などの、適切なカルボン酸またはスルホン酸と、酸付加塩を形成し得る。幾つかの塩基性の基がある場合、モノ−もしくはポリ−酸付加塩を形成し得る。
【００１４】
酸性の基、例えばＲ１０に遊離のカルボン酸を有する式Ｉの化合物は、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩のような金属塩、またはアンモニア、もしくは例えばトリ−(２−ヒドロキシエチル)−アミンなどの第３級モノアミンのような適切な有機アミンのアンモニウム塩、または例えばＮ−エチル−ピペリジンもしくはＮ,Ｎ'−ジメチルピペラジンなどの複素環塩基性塩を形成し得る。
酸性の基と塩基性の基の両方を有する 式Ｉの化合物は、分子内塩を形成し得る。
【００１５】
中間体としてさらに用いられる化合物の場合と同様に、単離または精製の目的のために、薬学的に許容されない塩を用い得る。しかし、治療の目的のためには、薬学的に許容され得て、毒性のない塩のみが使われ、従ってこれらの塩が望ましい。
【００１６】
さらに適切なＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤は、WO 98/35958（特に実施例６２）と US 5,093,330 において開示されている。それぞれの特許において、特に化合物の請求項と実施例の最終生成物とに記載されており、該明細書に言及したことによって本明細書に組み込まれたものとする。
【００１７】
糖尿病性腎症は、持続性アルブミン尿症（＞３００mg／２４時間、または２００μｇ／分）によって特徴付けられ、下記の付加的な標準を満たすかどうかで臨床的に判断し得る：糖尿病性網膜症が存在する；糖尿病性糸球体硬化症以外の腎臓または泌尿器管の疾患の、臨床的証拠または検査上の証拠がない。糖尿病性腎症は、西洋では、腎臓疾患の最終段階の最も一般的な原因である。
【００１８】
確立された試験モデル、特に本明細書中に記載の試験モデルによって、特に「本発明の化合物」またはそれぞれの場合においてその薬学的に許容され得る塩は、特に糖尿病性腎症の、さらに糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、またはＩｇＡ腎症の、より効果的な予防または望ましい処置をもたらすことを示し得る。関連する業界の技術者は、上記のおよび下記に示した治療の適応症と有益な効果を証明するために、関連した試験モデルを十分に選び得る。薬理学的な活性は、例えば臨床研究において、または下記に本質的に記載した通りの試験手順において、証明し得る。
【００１９】
試験実施例１：腎亜全摘（５／６）ラットにおける抗蛋白尿作用 [巣状糸球体硬化症モデル；T. W. Meyer と H. G. Renake, Am. J. Physio. 254, F856 (1988)]．
５週目のオスのラットを、ペントバルビタール ナトリウムの腹腔内注射によって麻酔をかけ、右の腎臓を２／３除去した。１週間後、同様の麻酔下で左の腎臓全部を除去した。２週間飼育した後、２４時間尿を集め、尿中の全蛋白量とアルブミン量をＡ／Ｇ−Ｂテスト（和光純薬）を用いて測定した。尿蛋白と血圧を基に、ラットを２つのグループ（賦形剤処置するラットと、「本発明の化合物」を経口で１mg／kg／日で処置するラット）に分ける。左の腎臓のみを腎摘出したラットを、シャム施術ラットとして用いた。「本発明の化合物」は、アラビアゴム中に懸濁し、懸濁液を経口で１日に１回、８週間投薬する。尿中の全蛋白量と尿中のアルブミンの量を測定するために、処置してから２週間目、４週間目、６週間目、８週間目に、２４時間尿を集める。
【００２０】
試験実施例２：インスリン非依存性（ＮＩＤＤ）糖尿病のラット（Ｗｉｓｔａｒ肥満ラット）における抗蛋白尿作用[H. Ikeda ら、Diabetes 30,1045 (1981)]
血中のグルコースのレベルと尿中の蛋白量を基に、１１週のＷｉｓｔａｒ肥満ラットを２つのグループ（賦形剤処置するラットと、「本発明の化合物」を経口で１mg／kg／日で処置するラット）に分ける。非糖尿病性コントロールラット（やせたラット）もまた用いる。「本発明の化合物」は、アラビアゴムに懸濁し、懸濁液を経口で１日に１回１０日間投薬する。処置してから２週間目、４週間目、６週間目、８週間目に、２４時間尿を集める。尿は、３，０００rpm で遠心分離し、上清の一部をカラム (Pharmacia PD10) で脱塩する。尿中の全蛋白量とアルブミンの量は、それぞれ LowryおよびELISA 法を用いて測定する。
細胞の増殖と細胞外マトリックス蓄積は、ヒトの進行性糸球体疾患の特徴的な観点であり、かつ最終段階の腎機能障害の主要な原因である。
【００２１】
試験実施例３：in vitro におけるメサンギウム細胞増殖の阻害
インターロイキン−１０は、in vitro および in vivo の両方で、メサンギウム細胞の増殖を刺激することが示される（S. J. Chadban ら、Lab. Invest 76 (5,1997,619-627）。１０９７ラットのメサンギウム細胞株の増殖（Y. Kakizaki ら、Clin. Exp. Immunol. 85 (1), 1991,157-63）は、３Ｈ−チミジンの取り込みで評価される。細胞は、３０−４０回目の継代の間の細胞を用いる。細胞は、ＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco, USA）中で、熱で不活性化した牛胎児血清（ＦＣＳ）と、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液と、１００単位／ml のペニシリンと、１００μｇ／ml のストレプトマイシンと共に、加湿した５％ ＣＯ２雰囲気下で、３７℃で培養する。メサンギウム細胞は、低密度で９６−ウェル平底マイクロタイタープレート中のＲＰＭＩ／１０％ ＦＣＳ中に移し、一晩固着させる。次いで、サブコンフルエントの細胞を、ＲＰＭＩ／０．５％ ＦＣＳ中で、３日間飢餓状態に置く。次いで、２μmol／ml の「本発明の化合物」を含む溶液、好ましくは「本発明の化合物」をＤＭＳＯに溶解し、この保存液を標準生理食塩水で１：１０に希釈して新しく調整した溶液によって、またはサイトカイン類（R&D systems）を添加しもしくは添加しないコントロールによって、培地を置き換える。さらに４８時間細胞を培養し、３Ｈ−チミジンで６時間パルスした後、採取する。ＩＬ−１０（２０−１００ｎｇ／ml）を選択したウェルに加える。全試験において、６ウェルの２倍を用い、試験は３−５回繰り返す。ＩＬ−１０は、コントロールと比べて、常に１０９７増殖を促進する。（２５−７５％の増大、コントロールに対してＰ＜０．０１−０．００１）。Ｎ−{５−[４−(４−メチル−ピペラジノ−メチル)−ベンゾイルアミド]−２−メチルフェニル}−４−(３−ピリジル)−２−ピリミジン−アミン（ＣＧＰ５７１４８Ｂ）を、「本発明の化合物」として用いれば、メサンギウム細胞増殖の増大は、「本発明の化合物」の添加によって、完全に阻害される。
【００２２】
試験実施例４：オスのＷｉｓｔａｒラットにおける、モノクローナルＯＸ−７ 抗ラットＴｈｙ−１.１抗体で誘発される、メサンギウム細胞増殖性糸球体腎炎
モノクローナルＯＸ−７ 抗ラットＴｈｙ−１.１抗体は、メサンギウム細胞増殖性糸球体腎炎の誘発に用いられ（D. W. Mason と A. F. Williams, Biochem. J. 187 (1), 1980,1−20）、マクロファージは、ＥＤ１ 抗ラットＣＤ６８（C. D. Dijkstra ら、Immunology 54 (3), 1985,589-99）を用いて検出し、筋繊維芽細胞は、１Ａ４、抗ヒトａ−平滑筋アクチンでラベルすることによって同定し（Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO）、そしてＭ７４４、抗−ＢｒｄＵ（Dako, Glostrup, Denmark）は、増殖している細胞を同定するために用いる。ヤギのポリクローナル 抗牛／抗ヒト タイプIVコラーゲン抗体（Southern Biotechnology, Birmingham, AL）は、細胞外マトリックスの試験に用いる。
【００２３】
抗−Ｔｈｙ−１腎炎は、２グループの８匹のオスのＷｉｓｔａｒラット（１５０−１７０ｇ）に、５mg／kg のＯＸ−７ ＩｇＧ（D. J. Nikolic-Paterson ら、J. Am. Soc. Nephrol. 7 (7), 1996, 1006-14）の静脈注射によって、誘発される。ＯＸ−７ ＩｇＧを投薬して１日後から６日目の殺す前まで、動物に、毎日ＣＧＰ ５７１４８Ｂ（５０mg／kg）または賦形剤のコントロール（生理食塩水中、１０％のＤＭＳＯ）の何れかを腹腔内注射する。殺す３時間前に、細胞のサイクルのＤＮＡ合成の（Ｓ）相の細胞をラベルするために、全てのラットに、５０mg／kg のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の腹腔内注射を接種する。８匹の標準のラットの１グループはまた、殺す３時間前にＢｒｄＵを注射する。
【００２４】
２４時間集めた尿と血液の試料は、試験の−３日目（試験前）と６日目に採取する。尿蛋白濃度は、塩化ベンゾチオニウム法によって測定する（Iwata, J.ら、Clin. Chem. 25 (7), 1979,1317-9）。血清と尿のクレアチンレベルは、Ｊａｆｆｅ速度反応法を用いて測定する（Larsen, K., Clin. Chim. Acta 41,1972,209-17）。
【００２５】
組織は、４％の中性緩衝−ホルマリン液中で固定し、そしてパラフィンで包埋する。腎臓切片（４μｍ）は、過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色する。核の定量は、動物当たり５０個（hilar）の糸球体を試験することによって行う。
【００２６】
免疫染色は、Rumble ら、J. Clin. Invest. 99,1997, 1016-1027 に記載の通りに行った。二重免疫組織化学的染色は、抗体の交差反応を避けるために、マイクロ波技術を用いて、ホルマリンで固定した組織切片中で行う。（G. H. Tesch ら、Am. J. Pathol. 151 (1), 1997,141-50）
【００２７】
ＢｒｄＵまたはＥＤ１抗体の何れかで染色された切片は、ＥＤ１＋またはＢｒｄＵ＋として採点される。
計数は、糸球体房領域を測定し、そして糸球体房に限定するために、計数線を用いて行い、それにより細管の内腔の細胞を除く。５０個の糸球体を、各々の動物で計数し、ラベルされた細胞を１ｍｍ２当たり平均値±ＳＤとして表す。さらに、二重にラベルされた切片の細胞の数はまた、ＥＤ１＋ＢｒｄＵ＋、ＥＤ１＋ＢｒｄＵ−、およびＥＤ１−ＢｒｄＵ＋として計数する。この疾患のモデルにおいて、有足細胞が増殖せず、かつ糸球体の内皮が増殖している細胞の＜３％を占めるので、増殖している細胞は、ＥＤ１＋ＢｒｄＵ＋としたマクロファージ、またはＥＤ１−ＢｒｄＵ＋とした増殖したメサンギウム細胞の何れかとして同定される。
【００２８】
タイプIVコラーゲンのための免疫染色の大きさは、以前に記載された通りのコンピューター補助イメージ分析（H. A. Lehr et al., J. Histochem. Cytochem. 45 (11), 1997,1559-65）を用いて定量される。
【００２９】
蛋白尿は、ＯＸ−７ ＩｇＧを摂取した動物で、コントロールラットと比べて穏やかに増大し、ＣＧＰ ５７１４８Ｂ４の処置によって影響を受けない（標準コントロール：２.１±０.２mg／２４時間；賦形剤処置したＴｈｙ−１腎炎：１３.４±７.２mg／２４時間、ＣＧＰ ５７１４８Ｂ−処置したＴｈｙ−１腎炎：１６.４±７.０mg／２４時間）。処置していないラットの糸球体において、ＰＡＳ−染色切片のメサンギウム 細胞過多と、増大したメサンギウム細胞マトリックスが示される。これらの病理学的変化は、ＣＧＰ ５７１４８Ｂを摂取したラットにおいては、観測されない。
【００３０】
図の記載：抗Ｔｈｙ−１腎炎の動物は、核の数を数えることによって評価した場合に、コントロール動物と比較して、適度な糸球体細胞過多を表し、そしてＣＧＰ ５７１４８Ｂで処置したラットにおいて、有意に減少する（図１）。メサンギウム細胞（ＢｒｄＵ＋ＥＤ１−）増殖は、コントロールラットと比べて５倍に増大し、そしてＣＧＰ ５７１４８Ｂで処置によって、有意に減少する（図２）。同様に、活性化されたメサンギウム細胞の数（ａ−平滑筋アクチンはポジティブである）はまた、抗Ｔｈｙ−１腎炎で処置していないラットにおいて増大し、ＣＧＰ ５７１４８Ｂの投薬によって、有意に減少する（図３）。著しい免疫染色性タイプIVコラーゲンの糸球体マトリックス蓄積は、抗Ｔｈｙ−１腎炎で処置していないラットに存在し、ＣＧＰ ５７１４８Ｂの投薬によって有意に減少する。（図４）
【００３１】
試験実施例５：２００から２５０ｇの体重のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、実験的糖尿病性腎症への、「本発明の化合物」の効果
糖尿病は、上記のラットにおいて、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ，５５mg／kg）を注射することによって誘発される。
７日以内で糖尿病を発症した全動物（ランダム・グルコース＞１５mmol／l）を、下記の試験に用いる。全ての糖尿病のラットに、体重を維持させ、そして正常血糖値を伴わないケトン尿を避けるために２単位／日のインシュリン（ヒトのウルトラレンテ）を摂取し、グルコースのレベルを２０−２５ｍＭにする。コントロールラットは、緩衝液のみを偽注射する。「本発明の化合物」、例えばＣＧＰ ５７１４８Ｂは、２０mg／kg／日の用量で、胃管栄養法によって投薬する。ＳＴＺ−糖尿病ラットは、「本発明の化合物」または賦形剤の摂取のために無作為化する。各々１６匹のラットで構成される試験群は、それぞれ下記：
（Ｉ）コントロ−ルラット、薬剤非投与；
（II）コントロールラット、「本発明の化合物」投与；
（III）ＳＴＺ−糖尿病性ラット、薬剤非投与；
（IV）ＳＴＺ−糖尿病性ラット、「本発明の化合物」投与；
の通りである。０週目、１週目、４週目、８週目、１２週目、２４週目および３２週目において、体重、血圧、グルコース、ＨｂＡ１Ｃ、水摂取量、食物摂取量を測定する。糸球体と管間質の組織学的分析は、試験の最後に行う。
糸球体の構造は、定量的組織形態学電子顕微鏡によって評価する。
ラットの除去した腎臓は、ＧＢＭの厚さと断片メサンギウム細胞の体積について分析する。
【００３２】
得られた結果によって、例えばメサンギウム細胞増殖性糸球体腎炎の、病理学的所見の改善、特にメサンギウム細胞過多とマトリックス蓄積の改善などによって、「本発明の化合物」が、特に糖尿病性腎症、また糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、またはＩｇＡ腎症の、予防または好ましくは処置のために、使われ得ることを示している。
【００３３】
式Ｉの「本発明の化合物」は、
[式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち、１個もしくは２個の基は、それぞれニトロ、または式 II：
{式中、Ｒ９は、水素または低級アルキルであり、
Ｘは、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシミノ、またはＯ−低級アルキル−ヒドロキシミノであり、
Ｙは、酸素またはＮＨであり、
ｎは、０または１であり、
そしてＲ１０は、少なくとも５個の炭素原子を有する脂肪族性の基であるか、または芳香族性、芳香族−脂肪族性、環状脂肪族性、環状脂肪族−脂肪族性、複素環性、または複素環−脂肪族性の基である}の基であり；
そして残りのＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ他と独立に、水素、非置換低級アルキル、または、遊離しているかもしくはアルキル化されたアミノ、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、もしくはモルホリニルによって置換された低級アルキル、または低級アルカノイル、トリフルオロメチル、遊離しているか、エーテル化された、もしくはエステル化されたヒドロキシ、遊離しているか、アルキル化されたもしくはアシル化されたアミノ、または遊離しているかもしくはエステル化されたカルボキシであり、
そして残りの置換基は上記で定義した通りである] の化合物が望ましい。
【００３４】
式Ｉの「本発明の化合物」は、
[式中、Ｒ１は、ピリジルまたはＮ−オキシド−ピリジル（それぞれ炭素原子で結合している）であり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ水素であり；
Ｒ４は、水素、または低級アルキルであり；
Ｒ５は、水素、低級アルキル、またはトリフルオロメチルであり；
Ｒ６は、水素であり；
Ｒ７は、ニトロ、フルオロ−置換低級アルコキシ、または式 II：
{式中、Ｒ９は、水素であり、
Ｘは、オキソであり、
ｎは０であり、
そしてＲ１０は、炭素原子で結合したピリジル、非置換フェニル、またはハロゲン、シアノ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルキル、もしくは４−メチル−ピペラジニル−メチルによって置換されたフェニル、またはＣ５−Ｃ７アルキル、チエニル、２−ナフチル、またはシクロヘキシルである}の基であり；
そしてＲ８は、水素である] の化合物が望ましい。
【００３５】
式Ｉの「本発明の化合物」は、
[式中、少なくとも１つのＲ４およびＲ８は、低級アルキルであり、かつ残りの置換基が上記で定義した通りである] が特に好ましい。
【００３６】
上記の全ての、式Ｉの「本発明の化合物」は、
[式中、Ｒ１は、炭素原子で結合したピリジルであり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびＲ８は、それぞれ水素であり、
Ｒ４は、低級アルキルであり、
Ｒ７は、式 II：
{式中、Ｒ９は水素であり、
Ｘはオキソであり、
ｎは０であり、
そしてＲ１０は４−メチル−ピペラジニル−メチルである}の基である]の化合物が望ましい。
【００３７】
上記の全てで特別な式Ｉの「本発明の化合物」、ＣＧＰ ５７１４８Ｂ：{Ｎ−{５−[４−（４−メチル−ピペラジノ−メチル）−ベンゾイルアミド]−２−メチルフェニル}−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジン−アミン}であることが望ましい。
非常に好ましい本発明の化合物は、モノメシレート塩の形態で用いられる。
【００３８】
式Ｉの「本発明の化合物」は、一般的にそして特定的に、特許出願 EP 0 564 409 A1 および WO 99/03854 中で、特に請求項の化合物と実施例の最終生成物において開示され、最終生成物の対象、医薬製剤、および請求項は、引用により本明細書に包含する。また、対応する立体異性体と、対応する多形態、例えば、該明細書で開示されている結晶の変化を含む。
【００３９】
EP 0 564 409 A1 において、式Ｉの「本発明の化合物」は、癌、血栓症、繊維症、皮膚硬化症、およびアテローム性動脈硬化症の治療に有効であると記載されている。本発明に従って、「本発明の化合物」は、驚くべきことに、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、およびＩｇＡ腎症に対して、有利な効果を有することが見出された。
【００４０】
本発明の望ましい具体的態様において、「本発明の化合物」は、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、またはＩｇＡ腎症の処置のための、医薬の製造のために用いられる。該使用は、当業者に既知の糖尿病性腎症、糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、またはＩｇＡ腎症を処置するための他の医薬と比較して、副作用の減少を伴う。
【００４１】
好ましくは、「本発明の化合物」は、糖尿病性腎症の処置のための、医薬の製造に用いられる。
【００４２】
本発明の特定の発見に従って、本発明はまた、「本発明の化合物」の治療上効果的な量を、糸球体腎障害、慢性腎盂腎炎、ＩｇＡ腎症、または好ましくは糖尿病性腎症に罹患した恒温動物に投薬することを含む、ヒトを含む恒温動物の処置方法を提供する。
【００４３】
本発明の好ましい具体的態様において、「本発明の化合物」を含む医薬の投薬は、本明細書で記載の試験系の１つ、または好ましくは進行性糸球体疾患に罹患したヒトにおいて、恒温動物の糸球体細胞過多、メサンギウム細胞増殖、活性化したメサンギウム細胞の量と比べて、糸球体細胞過多、メサンギウム細胞増殖、活性化したメサンギウム細胞の数の減少をもたらす。
【００４４】
本発明の別の具体的態様において、「本発明の化合物」を含む医薬の投薬は、本明細書で記載の試験形の１つ、例えば抗Ｔｈｙ−１腎炎のラットにおいて、または好ましくは進行性糸球体疾患に罹患したヒトにおいて、免疫染色可能なタイプIVコラーゲンの糸球体マトリックス蓄積が増大した恒温動物における糸球体マトリックス蓄積の量と比べて、免疫染色可能なタイプIVコラーゲンの糸球体マトリックス蓄積の減少をもたらす。
【００４５】
本明細書で用いる“処置方法”という用語はまた、特に本明細書で記載した疾患の予防方法、すなわち、本明細書に記載の疾患、特に糖尿病性腎症の発生を予防するために、健康な患者に、「本発明の化合物」を含む医薬組成物を、予防的に投薬することに関する。
【００４６】
本発明はまた、糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、ＩｇＡ腎症、または好ましくは糖尿病性腎症の処置のための、医薬組成物に関する。
【００４７】
糖尿病性腎症、糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、またはＩｇＡ腎症を処置するための医薬組成物は、局所の、例えば経口もしくは直腸などの経腸の、または非経腸の投薬に適し、かつ無機化学的または有機化学的な固体もしくは液体であり得る、薬学的に許容され得る担体と、効果的な量の本発明の化合物を含む。経口の投薬において、「本発明の化合物」と、例えばラクトース、ブドウ糖、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースなどの希釈剤、および／またはグリセロール、および／または例えばケイ酸、タルク、ステアリン酸、またはステアリン酸マグネシウムやステアリン酸カルシウムのような塩などの潤滑剤、および／またはポリエチレングリコールを含む、特に錠剤またはゼラチンカプセルを用いる。錠剤はまた、例えばケイ酸アルミニウムマグネシウム、とうもろこし澱粉、小麦澱粉、米澱粉のような澱粉、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどの結合剤、および／またはポリビニルピロリドン、所望により、例えば澱粉、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのような塩などの崩壊剤、および／または発泡性の混合物、または吸収剤、染料、風味剤および甘味料を含んでもよい。「本発明の化合物」はまた、非経腸の投薬をし得る組成物の形態で、または点滴液の形態で用い得る。該溶液は、好ましくは、例えば少なくとも１つの「本発明の化合物」のみ、もしくは例えばマンニトールなどの担体を共に含む親液性の組成物の場合では、使用する前に製造し得る、等浸透圧性の水溶液または懸濁液である。本医薬組成物は、所望により滅菌処理してもよく、かつ／または保存料、安定剤、加湿剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調整するための塩、および／または緩衝液などの賦形剤を含んでもよい。本医薬組成物は、所望により、抗生物質や抗糖尿病に活性な化合物のような薬理学的に活性な物質を、さらに含んでもよい。該医薬組成物は、それ自体既知の方法で、例えば慣用の混合、造粒、糖衣、不溶化または親液化の工程の方法によって製造し、そして約１％から１００％、特に約１％から約２０％の活性成分を含む。
【００４８】
「本発明の化合物」は、例えば、WO 99/03854 の実施例４および６に記載した通りに製剤化され得る。
「本発明の化合物」の使用される用量の範囲は、恒温動物の種類、体重、年齢、投薬方法、使用される特定の物質および処置される疾患を含む、当業者に既知の因子に依存する。本明細書で別記しない限り、「本発明の化合物」は、好ましくは１日当たり１から４回投薬される。さらに、「本発明の化合物」、特にＮ−{５−[４−(４−メチル−ピペラジノ−メチル)−ベンゾイルアミド]−２−メチルフェニル}−４−(３−ピリジル)−２−ピリミジン−アミン（ＣＧＰ ５７１４８Ｂ）は、好ましくは約１から１０００mg／１日の範囲の用量で、さらに好ましくは２５から２５０mg／１日の範囲で、最も好ましくは２５から２５０mg／１日の範囲（特に恒温動物が体重約７０kg のヒトである場合）で、恒温動物に投薬される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  動物当たり５０個の糸球体における、糸球体断面（ｇｃｓ）当たりの核の数（平均値±ＳＤ）によって評価した、糸球体細胞質。糸球体細胞過多は、ＣＧＰ ５７１４８Ｂによって有意に減衰した。＊ｐ＜０．０５。
【図２】  動物当たり５０個の糸球体核における、糸球体断面（ｇｃｓ）当たりのＢｒｄＵ＋／ＥＤ１−細胞の数（平均値±ＳＥＭ）によって評価した、メサンギウム細胞増殖。メサンギウム細胞増殖は、ＣＧＰ ５７１４８Ｂによって有意に減衰した。＊ｐ＜０．００１。
【図３】  非処置ラット、およびＣＧＰ ５７１４８Ｂで処置したラット由来の、動物当たり５０個の糸球体における、糸球体断面（ｇｃｓ）当たりのａ−平滑筋アクチン免疫染色細胞の数（平均値±ＳＤ）によって評価した、活性化したメサンギウム細胞。＊ｐ＜０．０５。
【図４】  免疫染色した糸球体の断片領域（平均値±ＳＤ）によって評価した、タイプIVコラーゲンの定量。非処置ラットに対して＊ｐ＜０．０５。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2003525240.tif 000006