【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年8月6日(2008.8.6)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の詳細な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
（１）明細書第１６頁１７−１８行、２１−２２行、第３７頁２２行に「少数変異標的から（の）圧倒的なシグナルを回避し」とあるを、「少数変異標的からのシグナルが圧倒されることを回避し（to avoid overwhelming signal from minority mutant target）」と訂正する。
（２）明細書第３８頁４−５行に「少数変異標的からの圧倒的なシグナルが回避され」とあるを、「少数変異標的からのシグナルが圧倒されることを回避し」と訂正する。
（３）明細書第３８頁１５行に「シグナルが圧倒的になるのを防止する」とあるを、「シグナルが圧倒されるのを防止する」と訂正する。
（４）明細書第３８頁２１−２２行に「少数変異標的からの圧倒的なシグナルが回避され」とあるを、「少数変異標的からのシグナルが圧倒されることを回避し」と訂正する。
（５）明細書第１００頁、表５に「Ｎ鎖型の２５０ｆｍｏｌ中の１０ｍｏｌ鋳型」とあるを、「Ｎ鎖型の２５０ｆｍｏｌ中の２．５ｆｍｏｌ Ｃ鋳型」と訂正する。
（６）明細書第１４頁９、１０、２０、２１（２箇所）、２６−２７行、明細書第１５頁４、５、６、７、９−１０、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２５−２６、２８−２９行、明細書第１６頁１、３行、明細書第３６頁下から２、下から１行、明細書第３７頁１０、１１（２箇所）、１６−１７、２７行、明細書第３８頁１２、１４、１５行、明細書第３９頁、１５、２４、明細書第４２頁下から４（２箇所）、下から３、下から１（２箇所）行に「連絡反応」とあるを、「連結」と、明細書第３９頁２５行に「連絡」とあるを、「連結」と訂正する。
（７）明細書第１７頁下から９行に「図１２Ａ−Ｂは、図１１の変異リガーゼをつくるためのプライマーを表わす。」とあるを、「図１２Ａ−Ｂは、図１１の変異リガーゼをつくるためのプライマーを表わす。
これらのプライマーは以下の配列番号を有する：プライマーaは、配列番号：1(JL501)、および配列番号：78 (JL505)として特定される;プライマーbは、配列番号：2 (JL503R)、配列番号：79 (JL507R)、配列番号：80 (JL537R)、配列番号：81 (JL535R)、配列番号：82 (JL525R)、配列番号：83 (JL527R)、配列番号：84 (JL529R)、配列番号：85 (JL531R)、および配列番号：86 (JL533R) として特定される;プライマーcは、配列番号：3 (JL502)、配列番号：87 (JL509)、配列番号：88 (JL506)、配列番号：89 (JL536)、配列番号：90 (JL534)、配列番号：91 (JL524)、配列番号：92 (JL526)、配列番号：93 (JL528)、配列番号：94 (JL530)、および配列番号：95 (JL532)として特定される;プライマーdは、配列番号：4 (JL504R)、配列番号：96 (JL508R)、および配列番号：97 (JL518R)として特定される;プライマーb1は、配列番号：5として特定される;プライマーc1は、配列番号：6として特定される;プライマーb2は、配列番号：8として特定される;およびプライマーc2は、配列番号：7として特定される。」と訂正する。
（８）明細書第１７頁下から８行−第１８頁１３行に「図１３Ａ−Ｃは、・・・によって識別することができる。」とあるを、「図１３Ａ−Ｃは、連結反応アッセイのために用いられたオリゴヌクレオチドの模式的表示である。プローブ配列は、ヒト真核蛋白質合成開始因子eIF-4E(Rychlik, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:945-49(1987)、出典明示により本明細書の一部とする）から誘導された。このランダム真核ＤＮＡ配列は、部分的に精製された変異ＴthＤＮＡリガーゼ製造における細菌性ＤＮＡ汚染からの偽のシグナルを回避するために、選別された。プローブの融点は、最も近似の熱力学的方法（Breslauer, K. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3746-3750(1986)、出典明示により本明細書の一部とする（ＯＬＩＧＯ4.0 program, National Biosciences Inc., Plymouth, ＭＮ)を用いて、推測した。図１３Ａおよび図１３Ｂは、例として鋳型鎖の一つＡＬｇを用いてのニックＤＮＡ二重らせんの形成を表わす。図１３Ａに示すように、４つの異なるニックＤＮＡ基質が、共通の蛍光標識オリゴヌクレオチド、ｃｏｍ５Ｆ（配列番号：9）および識別 oligo（ＲＰ５’Ａ（配列番号：10）、ＲＰ５’Ｃ（配列番号：11）、ＲＰ５’Ｇ（配列番号：12）、ＲＰ５’Ｔ（配列番号：13））の一つを鋳型鎖、ＡＬｇ（配列番号：14）にアニールすることによって形成される。図１３Ｂでは４つの異なるニックＤＮＡ基質が、共通の蛍光標識オリゴヌクレオチド、ｃｏｍ３Ｆ（配列番号：15）および識別 olego（ＬＰ３’Ａ（配列番号：16）、ＬＰ３’Ｃ（配列番号：17）、ＬＰ３’Ｇ（配列番号：18）、ＬＰ３’Ｔ（配列番号：19））の一つを鋳型鎖、ＡＬｇ（配列番号：14）にアニールすることによって形成される。マッチおよびミスマッチ塩基対の全１６組合せの完全セットが、鋳型鎖としてＡＬｇ（配列番号：14）、ＧＬｇ（配列番号20：）、ＴＬｇ（配列番号：21）およびＣＬｇ（配列番号：22）（図１３Ｃに示す）を用いて、形成される。これは下線を引いた塩基で相異している。共通蛍光標識プローブへの連結反応で形成された産物は、異なる長さの”Ａ”テイルの取りこみよって変性ポリアクリルアミドゲル上のサイズによって識別することができる。」と訂正する。
（９）明細書第２０頁６行−２２行に「図１８は、・・・割合と定義する。」とあるを、「図１８は、Thermus thermophilusリガーゼの忠実性（適合性）の改善に関する表である。プローブＬＰ３’Ｃ、ＬＰ３’ＴおよびＣｏｍ３Ｆの配列は図１４に示されている。他の識別プローブの配列は下記の通り。
SLP3'C:  5' TACGTCTGCGGTGTTGCGTC 3' (配列番号：23).  
SLP3'T:  5' CGTCTGCGGTGTTGCGTT  3' (配列番号：24).  
SLP3'ATC:  5' ATGCGTCTGCGGTGTTGCATC 3' (配列番号：25).  
SLP3'ATT:  5' GCGTCTGCGGTGTTGCATT 3' (配列番号：26).  
SLP3'QTC:  5' AAATGCGTCTGCGGTGTTGCQTC 3' (配列番号：27)
SLP3'QTT:  5' ATGCGTCTGCGGTGTTGCQTT  3' (配列番号：28)
識別オリゴヌクレオチドにおける塩基“Ｎ”はＣまたはＴのいずれかである。“Ｑ”はＱ塩基類似体を示す。Ｑ塩基類似体を含有する鋳型鎖を除き、試験した全基質についての鋳型鎖はＧＬｇであり、その配列を図１４に示す。Ｑ塩基類似体を含有する基質における鋳型鎖はＧＬｇ.ｍ３Ａであり、太字体で示された単一部位でＧＬｇと相違する。連結反応の初速度（fmol/min）は、分での時間を表わすＸ軸とfmolでの産物量を表わすＹ軸との直線グラフの勾配として計算した。ＴthＤＮＡリガーゼの連結反応忠実性は、完全マッチ連結反応の初速度のミスマッチ連結反応の初速度に対する割合と定義する。
図１７は、また、プライマーＳＬＰ３’ＴＴＣ (配列番号：29)、ＳＬＰ３’ＴＴＴ (配列番号：30)、Com 610-3’F (配列番号：31)、GLg．m3A (配列番号：32)、GLg．m3A．Rev (配列番号：33)、ALg．m3A (配列番号：34)、ALg．m3A.Rev (配列番号：35)、GLg． (配列番号：36)、GLg．Rev (配列番号：37)、SLP3’GTC (配列番号：38)、SLP3’GTT (配列番号：39)、GLg．m3T (配列番号：40)、およびGLg．m3T．Rev (配列番号：41)のための配列を示す。」と訂正する。
（１０）明細書第２１頁１４行−２３行に「図２０Ａ−Ｂは、・・・を用いる。」とあるを、「図２０Ａ−Ｂは、野性型または変異Ｋ２９４Ｒ ＴthのＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰におけるＴ：ＧミスマッチについてのＬＤＲオリゴヌクレオチドプレーブ（図２０Ａ）および鋳型配列（図２０Ｂ）を示す。ＧＬｇ.ｍ３ＡおよびＧＬｇｍ３Ａ.ｒｅｖはミスマッチ鋳型（正常鋳型）を表わし、ＡＡＬｇ.ｍ３ＡおよびＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖは完全なマッチ鋳型（癌鋳型）を表わす。プライマーＳＬＰ３’ＴＴＴは、完全マッチ（癌）鋳型についての正常プライマーを表わし、ＳＬＰ３’ＴＴＣはミスマッチ（正常）鋳型についての正常プライマーを表わす。同様に、Ｔ：ＧミスマッチについてのＱ類似体での実験では、マッチ（癌）鋳型についての正常プライマーとしてＳＬＰ３’Ｑ２ＴＴ(配列番号：42)およびＳＬＰ３’Ｑ１８ＴＴ(配列番号：43)を用いる。図２０についての残りの配列は、図１７について示された配列番号を有する。」と訂正する。
（１１）明細書第２４頁下から１０行−下から９行に「図２５Ａ−Ｄは、・・・を示す。」とあるを、「図２５Ａ−Ｄは、本発明のＰＤＲ／ＬＤＲプロセスのＬＤＲ相のためのヌクレオチド類似体を有するオリゴヌクレオチドプローブの種々の形を示す。図２５Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ中でヌクレオチドアナログＱを有するプローブは、それぞれ、指定された配列番号：44、45、46、および47である。これらの図のそれぞれにおいて、標的ＤＮＡ配列は同じであり、指定された配列番号：48である。」と訂正する。
（１２）明細書第２８頁５行−８行に「図３１Ａ−Ｂは、・・・を示している。」とあるを、「図３１Ａ−Ｂは、野性型または変異Ｋ２９４ ＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰下の典型的ＬＤＲ反応におけるコドン１２、１３および６１での種々の変異を検出するために使用したＫ−ｒａｓＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブの名前および配列を示している。図３１Ａ−Ｂは、以下のプライマーのための配列を示す：Fam-K-ras c12.2D (配列番号：49)、Tet-K-ras c12.2A (配列番号：50)、Fam-K-ras c12.2V (配列番号：51)、K-ras c12 Com-2 (配列番号：52)、Tet-K-ras c12.1S (配列番号：53)、Fam-K-ras c12.1R (配列番号：54)、Tet-K-ras c12.1C (配列番号：55)、K-ras c12 Com-1 (配列番号：56)、Fam-K-ras c13.4D (配列番号：57)、Tet-K-ras c13.4A (配列番号：58)、Fam-K-ras c13.4V (配列番号：59)、K-ras c13 Com-4 (配列番号：60)、Tet-K-ras c13.3S (配列番号：61)、Fam-K-ras c13.3R (配列番号：62)、Tet-K-ras c13.3C (配列番号：63)、K-ras c13 Com-3 (配列番号：64)、Tet-K-ras c61.7HT (配列番号：65)、Fam-K-ras c61.7HC (配列番号：66)、K-ras Com-7 (配列番号：67)、Tet-K-ras c61.6R (配列番号：68)、Fam-K-ras c61.6P (配列番号：69)、Tet-K-ras c61.6P (配列番号：70)、K-ras Com-6 (配列番号：71)、Fam-K-ras c61.5K (配列番号：72)、Tet-K-ras c61.5E (配列番号：73)、およびK-ras Com-5 (配列番号：74)。」と訂正する。
（１３）明細書第６５頁下から９行−第６６頁９行に「実施例２−・・・に貯蔵した。」とあるを、「実施例２−Ｔth ＤＮＡリガーゼ変異Ｋ２９４ＲおよびＫ２９４Ｐの構築
図１１の変異リガーゼは、下記のように図１２Ａ−Ｂのオリゴヌクレオチドを用いて調製した。Ｋ２９４部位で複数の部位特異的変異を作るためにＰＣＲ反応用の４つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。それらの配列は次のとおりである：プライマーa (JL505) (配列番号：78): 5'CAG AAC CTC CTC ACC ATC 3'; プライマーb (JL507R) (配列番号：79): 5'CTC GTC CAG (G,C) (T, G, C, A) G CAC CAC CAC CCC GTC 3';プライマーc (JL506) (配列番号：88): 5' TGG TGG TGC (A, C, G, T) (C, G) C TGG ACG AGC TTG CCC T 3';およびプライマーd (JL508R) (配列番号：96): 5' CTC TAT GTA GCT CTC GTT GTG 3'。プライマーｂとｃは、変異部位で縮重コドンを含有する重複プライマーである。これらのプライマーは、各種試薬とPerkin-Elmer Corporation, Foster City, CAのApplied Biosystems Divisionからの３９４自動ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成後、プライマーを３０％水酸化アンモニウム中、５５℃で１２時間脱保護し、高速真空乾燥し、ddＨ２Ｏ(即ち、二重蒸留水)１００μlに再懸濁し、エタノール沈殿により精製した。ペレットをddＨ２Ｏ２００μlに再懸濁し、その濃度を分光測光法によりＯＤ２６０で測定した。次いで、プライマーを等分し、使用まで−２０℃で冷凍庫に貯蔵した。」と訂正する。
（１４）明細書第７０頁５行−下から４行に「実施例８−・・・定量した。」とあるを、「実施例８−ニック−閉鎖(closure)活性についてのアッセイ
２つの短いオリゴヌクレオチドプローブ(ＪＬ５３８およびＪＬ５１４)をより長い相補性オリゴヌクレオチド標的(ＪＬ５３９)にアニーリングすることによりニック形成ＤＮＡ二本鎖基質を形成させた。これらのヌクレオチド配列は：JL538 (配列番号：75): 5' AAC CAC AGG CTG CTG CGG ATG CCG GTC GGA G 3'; JL514 (配列番号：76): 5' AGA GCC GCC ACC CTC AGA ACC GCC ACC CTC 3'; JL539配列番号：77): 5' GAG GGT GGC GGT TCT- GAG GGT GGC GGC TCT CTC CGA CCG GCA TCC GCA GCA GCC TGT GGT T 3'である。
反応は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＮＡＤ＋とニック形成ＤＮＡ二本鎖基質６０fmolを含有する緩衝液４０μl中で実施した。ＤＮＡプローブと標的は、反応混合物を９４℃で２分間インキュベーションして変性させ、６５℃で２分間再度アニーリングした。連結反応は、Ｔth ＤＮＡリガーゼの添加により開始し、６５℃で３０分間実施した。停止溶液(８３％ホルムアミド、８.３ｍＭＥＤＴＡおよび０.１７％ブルーデキストラン)４０μlを添加して反応を止めた。サンプルを９３℃で２分間変性させ、迅速に氷で冷却し、その後、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲル上に２０μlを充填した。電気泳動後、ゲルをホスホリメジャースクリーン(phosphorimager screen)に２０分間さらした。放射性標識連結反応産物をMolecular Dynamics Phosphorimager (Sunnyvale, CA)にて分析し、Image-Quant ソフトトウェアを用いて定量した。」と訂正する。
（１５）明細書第１５頁６行−１３行に「このリガーゼは、・・・特徴とする。」とあるを、「このリガーゼは、連結部で標的ヌクレオチド配列と３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブとの間の連結部においてミスマッチを有する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結するための一定の初速度対する、連結部で標的ヌクレオチド配列と３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブとの間で連結部において完全マッチを有する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結するための一定の初速度として定義される忠実性比率（適合性比率）によって特徴付けられる。熱安定性変異リガーゼの忠実性比率（適合性比率）は、野生型リガーゼの忠実性比率（適合性比率）より高い。」と訂正する。
（１６）明細書第１８頁１７行、第１９頁１５行、第２０頁６行、第２３頁下から４行に「適合性」とあるを、「忠実性（適合性）」と訂正する。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図４】
2000514659.tif 000001
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図５】
2000514659.tif 000002
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図６】
2000514659.tif 000003
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図７】
2000514659.tif 000004
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図８】
2000514659.tif 000005
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９】
2000514659.tif 000006
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により１以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している１以上の少数標的ヌクレオチド配列を、サンプル中で、検出する方法であって、
前記サンプルは、前記１以上の少数標的ヌクレオチド配列および前記１以上の多数標的ヌクレオチド配列を、前記１以上の少数標的ヌクレオチド配列が前記１以上の多数標的ヌクレオチドに対して１：１０より小さく、且つ１：１０００より大きい割合で含み、
該方法が、
１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは、(a)標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b)標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的少数ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結部で連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有するものであり；
ここで、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが完全マッチを有する少数標的ヌクレオチド配列に、少数標的ヌクレオチド配列と連結反応部で３’末端を有する第１オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でハイブリダイズし、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブがミスマッチを有する多数標的ヌクレオチド配列に、多数標的ヌクレオチド配列と連結反応部で３’末端を有する第１オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でハイブリダイズし、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットは標的核酸配列の相補物とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブセットを含まず；
配列番号：９７のアミノ酸配列を有する野性型熱安定性ＤＮＡリガーゼの変異体である、熱安定性変異リガーゼを準備し、ここで、該変異熱安定性ＤＮＡリガーゼは、配列番号：９７のアミノ酸配列において、アミノ酸残基２９４をリジンから他のアミノ酸残基に代える変異、アミノ酸残基４１５をシステインから他のアミノ酸残基に代える変異、Ｒ３３７Ｋ、Ｃ４１２Ａ、Ｃ４２８Ａ、Ｄ１２０ＥおよびＤ１２０Ｎからなる群から選択される変異を有し、熱安定性変異リガーゼが、少数および多数両方の標的ヌクレオチド配列から産生した連結反応産物配列の量の、多数標的ヌクレオチド配列単独の同じ量から産生した連結反応産物配列の量に対するシグナル対ノイズ比率を有し、この比率は野生型リガーゼについてのシグナル対ノイズ比率より大きく；
サンプル、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ反応検出反応混合物を形成し；
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、この変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、このハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、その夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して線形的な増幅を達成し、各セットがリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別し得るために、連結反応産物配列と一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結反応産物配列を形成し、その中で、オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるが、１以上のミスマッチの存在によって一緒に連結せず、そして変性処理の際に個々に分離しているものであり；
連結反応産物配列の存在を検出する；
ことを含む方法。
【請求項２】
標的ヌクレオチド配列と連結反応部に３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部で完全マッチを有する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブを連結するための一定の初速度の、標的ヌクレオチド配列と連結反応部に３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でミスマッチを有する標的にハイブリダイズした第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブを連結するための一定の初速度に対する、適合性比率をリガーゼが有し、その比率が野生型リガーゼについての適合性比率よりも大きいものである、請求項１の方法。
【請求項３】
特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別され得るようにユニーク長を有し、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
該検出後に、サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む請求項１の方法。
【請求項４】
各セットの第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し、該検出は、アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を示し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
サンプル中に存在する多数標的ヌクレオチドの結果として産生した多数連結反応産物配列を検出し；
検出した多数連結反応産物配列を定量し；
検出した少数連結反応産物配列を定量する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブを含む１以上の配列特異的プローブセットを準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し；
多数および少数の連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた多数および少数の連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
各セットの第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し；
アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた捕捉連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた捕捉連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が１以上の単一ヌクレオチド位置における標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項６の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる長さを有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項６の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能レポーター標識を有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項６の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるアドレス可能アレイ特異的部分を有する、請求項７の方法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、アドレス可能なアレイ特異的部分を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能なレポーター標識を有する、請求項７の方法。
【請求項１３】
単一標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違、または多重標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違を、重複し得る部分を有するオリゴヌクレオチドプローブセットで識別する、請求項１の方法。
【請求項１４】
サンプルにおいて、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、該検出において、連結反応産物配列の標識が検出され、それによって１以上の標的ヌクレオチド配列中の１以上のヌクレオチド位置における1以上の低存在量の対立遺伝子のサンプル中の存在が示される、請求項１の方法。
【請求項１５】
サンプル中に未知量で存在する、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を定量し、該方法がさらに、
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
１以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを準備し；
各セットは、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、該複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよび該複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、マーカーヌクレオチド配列を含み、単一ヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し得、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブとを分かち持ち、リガーゼ検出反応混合物を形成するための該混合が、マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出反応混合物に混合することを含み；
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知のサンプルから生じた連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列のレベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む請求項１の方法。
【請求項１６】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが変異対立遺伝子特異的プローブよりも低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１７】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、および／または１以上の内部ミスマッチまたは修飾を含有し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１８】
正常対立遺伝子特異的プローブが正常塩基を３’末端に含有する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
正常対立遺伝子特異的プローブが１以上の内部ミスマッチまたは修飾を３’末端から４塩基以内に含有する、請求項１８の方法。
【請求項２０】
修飾が１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、４−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−２−カルボキサミド、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、２−デオキシイノシン、６−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド〔４，５−Ｃ〕〔１，２〕オキサジン−７−オン、２−アミノ−７−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メトキシアミノプリン、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、３−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−チオピリミジン、５−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニルピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−３−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾン−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロイミダゾールおよび１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項１７の方法。
【請求項２１】
修飾オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、２'−メトキシまたは３'−アミノ−２'，３'−ジデオキシ修飾をその糖ホスフェート・バックボーンに、連結反応部から４塩基の１つまたは組合せの位置に含有する、請求項１７の方法。
【請求項２２】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２３】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：２０００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２４】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のすべてのミスマッチについて相対比率１：１００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２５】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇ以外のミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２６】
リガーゼ検出混合物が、ミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
リガーゼ検出混合物が、多数標的ヌクレオチド配列に対するミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを、少数標的ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの量より少量で、且つサンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効である量で、含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
リガーゼ検出混合物が、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効な形態で、多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号：９７のアミノ酸配列を有する野生型熱安定性ＤＮＡリガーゼの変異体である、熱安定性ＤＮＡリガーゼであって、前記変異体熱安定性ＤＮＡリガーゼが、アミノ酸残基２９４をリジンから他のアミノ酸へ、アミノ酸残基４１５をシステインから他のアミノ酸へ代える変異、Ｒ３３７Ｋ、Ｃ４１２Ａ、Ｃ４２８Ａ、Ｄ１２０ＥおよびＤ１２０Ｎからなる群から選択される、配列番号：９７のアミノ酸配列における変異を有する、熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３０】
配列番号：９７のアミノ酸配列を有する野生型熱安定性ＤＮＡリガーゼの変異体である、熱安定性ＤＮＡリガーゼであって、前記変異体の熱安定性ＤＮＡリガーゼが、アミノ酸残基２９４をリジンから他のアミノ酸残基へ、アミノ酸残基４１５をシステインから他のアミノ酸残基へ代える変異、Ｒ３３７Ｋ、Ｃ４１２Ａ、Ｃ４２８Ａ、Ｄ１２０ＥおよびＤ１２０Ｎからなる群から選択される、配列番号：９７のアミノ酸配列における変異を有する、熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３１】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、アミノ酸残基２９４をリジンから他のアミノ酸残基へ代える変異である、請求項３０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３２】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｋ２９４Ｒ、Ｋ２９４Ｑ、Ｋ２９４ＬおよびＫ２９４Ｐからなる群から選択される、請求項３１に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３３】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｋ２９４Ｒである、請求項３２に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３４】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｋ２９４Ｑである、請求項３２に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３５】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｋ２９４Ｌである、請求項３２に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３６】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｋ２９４Ｐである、請求項３２に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３７】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｒ３３７Ｋである、請求項３０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３８】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｃ４１２Ａである、請求項３０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項３９】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、アミノ酸残基４１５をシステインから他のアミノ酸残基に代える変異である、請求項３０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４０】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｃ４１５Ａ、Ｃ４１５Ｖ、Ｃ４１５ＴおよびＣ４１５Ｍからなる群から選択される、請求項３９に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４１】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｃ４１５Ａである、請求項４０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４２】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｃ４１５Ｖである、請求項４０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４３】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｃ４１５Ｔである、請求項４０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４４】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｃ４１５Ｍである、請求項４０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４５】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｃ４２８Ａである、請求項３０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４６】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｄ１２０Ｅである、請求項３０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４７】
配列番号９７のアミノ酸配列における変異が、Ｄ１２０Ｎである、請求項３０に記載の熱安定性ＤＮＡリガーゼ。