(57)【要約】本発明はアルツハイマー病治療を目的とした新規の治療法および治療薬を提供する。具体的には本発明は、アルツハイマー病の治療あるいは治療薬開発のために用いる、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカイン遺伝子、抗炎症サイトカイン遺伝子を有する(-)鎖RNAウイルスベクターに関する。また本発明は、該サイトカインまたはベクターを含むアルツハイマー病治療または予防用医薬組成物を提供する。また本発明は、抗炎症サイトカイン、または抗炎症サイトカイン遺伝子を有する(-)鎖RNAウイルスベクター等のベクターを投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療方法を提供する。本発明は、アルツハイマー病に対する新規な遺伝子治療を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター、あるいは抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチドを含む、アルツハイマー病治療または予防用医薬組成物。
【請求項２】
抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
(-)鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
(-)鎖RNAウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
抗炎症サイトカインがインターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３およびそれらの部分ペプチドからなる群より選択される、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
経鼻投与用である、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
アルツハイマー病の治療あるいは治療薬開発のために用いる、抗炎症サイトカイン遺伝子またはその部分ペプチドを搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター。
【請求項９】
アルツハイマー病の治療あるいは治療薬開発のために用いる、抗炎症サイトカインタンパク質。
【請求項１０】
(-)鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
(-)鎖RNAウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１２】
抗炎症サイトカインがインターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３およびそれらの部分ペプチドからなる群より選択される、請求項８、１０、または１１に記載のベクター。
【請求項１３】
抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター、あるいは抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチドを投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療または予防方法。
【請求項１４】
投与が経鼻投与である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病治療に関する。具体的には、抗炎症サイトカイン、または抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター等の抗炎症サイトカインを発現するベクターを利用したアルツハイマー病治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
急速な高齢化社会を迎えつつある日本では、65歳以上の老人の約10%が老年性痴呆であると報告されている。アルツハイマー病は、痴呆性疾患の二大原因の一つでその約50%を占め、介護問題も含め社会的に大きな問題となっている。
現在アルツハイマー病に試みられている薬としては、アセチルコリン系賦活薬あるいはアセチルコリンエステラーゼ阻害薬などのアセチルコリンモジュレーター、アミロイドペプチドの生成を阻害するβセクレターゼ（BACE）阻害剤あるいはアミロイドペプチドの凝集阻害剤などのβアミロイドモジュレーター、神経ペプチドおよび神経成長因子などの神経保護と神経栄養治療薬、その他にキレート薬、酸化防止剤そして抗炎症薬などがある。【０００３】
アルツハイマー病の治療薬は治療効果の面で以下の３種類に分類することができる。アルツハイマー病の早期に使用すれば知的機能をある程度改善することはできるが、痴呆の進行そのものを抑制することはほとんどできない第一世代薬、知的機能の改善効果もあり得るが、それよりもアルツハイマー病の進行を抑制する効果の方が期待できる第二世代薬、根本的な予防・治療薬である第三世代薬である。現在評価されている薬剤のほとんどが第一世代薬と考えられている。アルツハイマー病発症および進行のメカニズムとして、アミロイドペプチドの凝集・沈着による老人斑の形成が原因であるとする「アミロイドカスケード仮説」が有力視されており、アミロイドペプチドをターゲットにした薬剤の一部に第二世代薬あるいは第三世代薬に繋がる薬剤があると期待されている。真に有効な第一世代薬はもちろんのこと、アルツハイマー病の根本的な治療薬となる第二・第三世代薬の出現が強く望まれている状況である。【０００４】
一方で、従来から提唱されていたアルツハイマー病発症のメカニズムとして、アルツハイマー病の脳内で炎症性ミクログリアの活性が亢進し、そのために神経細胞死を惹起するという「炎症仮説」がある。実際にアルツハイマー病患者の脳ではミクログリア活性が亢進し、特に老人斑の周囲に集積しており、またアルツハイマー病患者の脳にはこのリンパ球も浸潤していること、さらに炎症時に活性化される物質、例えば補体が脳内に蓄積していることも確認されている。疫学調査の解析結果から、抗炎症剤とくに非ステロイド性抗炎症薬（NonSteroidal Anti-Inflammatory Drugs：NSAIDs）がアルツハイマー病の進行を抑制すると期待され、またインドメサシンがパイロット的臨床試験において有意にアルツハイマー病の進行を抑制した報告もあり（Rogers J et al., Neurology. 1993 Aug;43(8):1609-11.）、消化器障害の少ないCox-2特異的阻害剤を中心として大規模な臨床試験が行われた。しかしながら、軽度から中等度のアルツハイマー病患者を対象にした1年間の試験では、第1世代NSAIDsおよび新世代のNSAIDsを含めてアルツハイマー病進行抑制効果は証明できなかったことが報告されている（Aisen PS et al., JAMA. 2003 Jun 4;289(21):2819-26., Imbimbo BP. Expert Opin Investig Drugs. 2004 Nov;13(11):1469-81., Townsend KP et al., FASEB J. 2005 Oct;19(12):1592-601.）。また、グリア細胞における炎症誘発性のサイトカイン産生の選択的な阻害剤であるMW01-5-188WHと呼ばれる化合物が、マウスへの経口投与で、アミロイドβ1-42によって誘導される海馬におけるインタロイキン１β、腫瘍壊死因子α、S100Bのアップレギュレーションを抑制し、また、海馬のシナプス不全の回復とともに、海馬依存性のY字迷路行動でも改善がみられたことが報告されている（Ralay Ranaivo H et al., J Neurosci. 2006 Jan 11;26(2):662-70.）。
【非特許文献１】Rogers J et al., Neurology. 1993 Aug;43(8):1609-11
【非特許文献２】Aisen PS et al., JAMA. 2003 Jun 4;289(21):2819-26
【非特許文献３】Imbimbo BP. Expert Opin Investig Drugs. 2004 Nov;13(11):1469-81
【非特許文献４】Townsend KP et al., FASEB J. 2005 Oct;19(12):1592-601
【非特許文献５】Ralay Ranaivo H et al., J Neurosci. 2006 Jan 11;26(2):662-70
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、アルツハイマー病治療を目的とした新規の処置法および医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意努力を重ね、アルツハイマー病治療に有効な新たな方法の開発を試みた。抗炎症サイトカイン（anti-inflammatory cytokines）の一つであるインターロイキン−１０（interleukin-10：IL-10）は炎症性サイトカイン（pro-inflammatory cytokines）の活性と競合的に作用することで炎症反応を調節している。アルツハイマー病においては、IL-10のプロモーター領域の遺伝子多型（polymorphism）が存在し、疾患の進行と関連があることが指摘されている（Lio D et al., Genes Immun. 2003 Apr;4(3):234-8.; Scassellati C et al., Neurosci Lett. 2004 Feb 12;356(2):119-22.; Arosio B et al., Neurobiol Aging. 2004 Sep;25(8):1009-15.; Ma SL et al., Neurobiol Aging. 2005 Jul;26(7):1005-10.）。しかしながら、このような抗炎症サイトカインを、アルツハイマー病の治療を目的として評価した例はない。本発明においては、抗炎症サイトカイン、または抗炎症サイトカイン遺伝子を発現する(-)鎖RNAウイルスベクター等のベクターを用いた、アルツハイマー病に対する新たな処置法が提供される。本発明は、アルツハイマー病の治療および予防を目的とした新たな遺伝子治療法等を提供するものである。【０００７】
すなわち本発明は、アルツハイマー病の治療あるいは治療薬開発のために用いる、抗炎症サイトカイン遺伝子を有する(-)鎖RNAウイルスベクター、該(-)鎖RNAウイルスベクターを含むアルツハイマー病医薬組成物、および該(-)鎖RNAウイルスベクターを用いたアルツハイマー病治療および予防方法等に関し、より具体的には、
〔１〕抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチド、あるいは該サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクターを含む、アルツハイマー病治療または予防用医薬組成物、
〔２〕抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクターを含む、〔１〕に記載の組成物、
〔３〕抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチドを含む、〔１〕に記載の組成物、
〔４〕(-)鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔１〕または〔２〕に記載の組成物、
〔５〕(-)鎖RNAウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔１〕または〔２〕に記載の組成物、
〔６〕抗炎症サイトカインがインターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３およびそれらの部分ペプチドからなる群より選択される、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の組成物、
〔７〕経鼻投与用である、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の組成物、
〔８〕アルツハイマー病の治療あるいは治療薬開発のために用いる、抗炎症サイトカイン遺伝子またはその部分ペプチドを搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター、
〔９〕アルツハイマー病の治療あるいは治療薬開発のために用いる、抗炎症サイトカインタンパク質、
〔１０〕(-)鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔８〕に記載のベクター、
〔１１〕(-)鎖RNAウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔８〕に記載のベクター、
〔１２〕抗炎症サイトカインがインターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３およびそれらの部分ペプチドからなる群より選択される、〔８〕、〔１０〕、または１１に記載のベクター、
〔１３〕抗炎症サイトカインまたはその部分ペプチド、あるいは該サイトカインまたはその部分ペプチドをコードする遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクターを投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療または予防方法、
〔１４〕投与が経鼻投与である、〔１３〕に記載の方法、を含み、さらに本発明は、
〔１〕アルツハイマー病の治療あるいは治療薬開発のために用いる、抗炎症サイトカイン遺伝子またはその部分ペプチドを搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター、
〔２〕(-)鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔１〕に記載のベクター、
〔３〕(-)鎖RNAウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔１〕に記載のベクター、
〔４〕抗炎症サイトカインがインターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３およびそれらの部分ペプチドからなる群より選択される、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のベクター、
〔５〕〔１〕から〔４〕のいずれかに記載のベクターを含む、アルツハイマー病治療または予防用医薬組成物、
〔６〕経鼻投与用である、〔５〕に記載の医薬組成物、を含むものである。【０００８】
また本発明は、抗炎症サイトカインまたはそれをコードするベクターを投与する工程を含む、アルツハイマー病を治療または予防する方法にも関する。特に本発明は、抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター等の抗炎症サイトカインを発現し得るベクターを投与する工程を含む、アルツハイマー病を治療または予防する方法に関する。該(-)鎖RNAウイルスベクターは好ましくはパラミクソウイルスベクター、より好ましくはセンダイウイルスベクターである。また、抗炎症サイトカインは、好ましくはIL-10である。また、投与は好ましくは経鼻投与である。
また本発明は、アルツハイマー病を治療または予防するための医薬の製造における、抗炎症サイトカインまたはそれをコードするベクターの使用に関する。特に本発明は、アルツハイマー病を治療または予防するための医薬の製造における、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載するベクター、特に抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクターの使用を提供する。該(-)鎖RNAウイルスベクターは好ましくはパラミクソウイルスベクター、より好ましくはセンダイウイルスベクターである。また、抗炎症サイトカインは、好ましくはIL-10である。また、(-)鎖RNAウイルスベクターを含む該医薬は、好ましくは経鼻投与に適した剤形に製剤化される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、抗炎症サイトカインを利用したアルツハイマー病に対する新しい治療薬および治療方法が提供された。特に本発明は、抗炎症サイトカインをコードする(-)鎖RNAウイルスベクターを含むアルツハイマー病治療薬、および該ベクターによるアルツハイマー病の遺伝子治療方法を提供した。本発明の方法は、他のアルツハイマー病治療方法と代替または併用可能な新たな治療手段となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】IL-10発現SeVベクター投与による、血中IL-10量の測定結果を示す図である。対照としてLacZ発現SeVベクターを用いた。血中IL-10は、IL-10発現SeVベクター特異的かつ投与量依存的に検出された。
【図２】大脳新皮質頭頂葉および海馬の老人斑を示す図である（抗Aβ抗体染色）。ベクター投与４週間後（上段）および８週間後（下段）ともに、SeV18+LacZ/TSΔF群の例（左）に比べ、SeV18+mIL10/TSΔF群の例（右）で大脳新皮質の老人斑（赤茶色の斑状物）は明らかに少ない。
【図３】大脳新皮質全領域に占める老人斑面積の割合（％）を示す図である（平均±SE）。投与８週間後の大脳新皮質全領域に占める老人斑の面積率（％）を画像解析ソフトにより求めたところ、SeV18+mIL10/TSΔF群はコントロール群（SeV18+LacZ/TSΔF群）に比べて有意（p<0.01 Student t test）に少なかった。
【図４】嗅球におけるミクログリアの活性化像（Iba-1染色）を示す図である。投与４週間後（上段）および８週間後（下段）ともにSeV18+LacZ/TSΔF群の例（左）に比べ、SeV18+mIL10/TSΔF群の例（右）で嗅球の活性化ミクログリア（赤茶色のアメーバ状細胞）は明らかに増数している。
【図５】Iba-1染色嗅球切片の一区画に占めるミクログリア面積の割合（％）を示す図である（平均±SE）。投与８週間後の嗅球の一区画領域に占めるIba-1陽性ミクログリア面積率（％）を画像解析ソフトにより求めたところ、SeV18+mIL10/TSΔF群はコントロール群（SeV18+LacZ/TSΔF群）に比べて有意（p<0.01 Student t test）に多かった。
【図６】IL-10発現SeVベクター投与による、脳組織中Aβ量の測定結果を示す図である。対照としてLacZ発現SeVベクターを用いた。IL-10発現SeVベクター投与群では、ほとんどの画分でAβの減少が見られ、特に可溶性Aβ40（TBS画分、1% Triton画分）および不溶性Aβ42（ギ酸画分）において顕著な減少が見られた。
【図７】IL-10発現SeVベクター投与による、正常マウスにおける血中IL-10量の測定結果を示す図である。血中IL-10は、ベクターの投与量依存的に検出された。
【図８】IL-10発現SeVベクター投与による血中IL-10量のカイネティクスを示す図である。SeV18+mIL10/TSΔF点鼻1回投与（5x107 CIU/head）で AUC = 176,000 pg・h/ml を得た。
【図９】IL-10発現SeVベクター経鼻投与によるIL-10の脳内移行を示す図である。正常C57BL/6Nマウス（N=5）にSeV18+mIL10/TSΔFまたはSeV18+LacZ/TSΔFを5x108 CIU/head/53μlで経鼻投与した。対照としてDPBS(-)を同量投与した。投与3日目に脳（嗅球、大脳/海馬、小脳/延髄に３分割）、鼻粘膜、気管/肺、血漿を回収し、各組織中のmIL-10をELISAにて定量した。  尚、パネル(A)の嗅球、大脳/海馬、及び小脳/延髄におけるｍIL-10発現量は、縦軸のスケールを拡大してパネル(B)に示した。
【図１０】IL-10発現SeVベクター経鼻投与によるIL-10の脳内移行を示す図である。正常C57BL/6Nマウス（N=5）にSeV18+mIL10/TSΔFまたはSeV18+LacZ/TSΔFを5x108 CIU/head/53μlで経鼻投与した。対照としてDPBS(-)を同量投与した。投与3日目に灌流を行い脳を回収した。脳（嗅球、大脳/海馬、小脳/延髄に３分割）、鼻粘膜、気管/肺、および血漿中のmIL-10をELISAにて定量した。  尚、パネル(A)の嗅球、大脳/海馬、及び小脳/延髄におけるｍIL-10発現量は、縦軸のスケールを拡大してパネル(B)に示した。
【図１１】IL-10発現SeVベクター経鼻投与によるIL-10の脳内移行を示す図である。正常C57BL/6Nマウス（N=5）にSeV18+mIL10/TSΔFまたはSeV18+LacZ/TSΔFを5x108 CIU/head/53μlで経鼻投与した。対照としてDPBS(-)を同量投与した。投与7日目に脳（嗅球、大脳/海馬、小脳/延髄に３分割）、鼻粘膜、気管/肺、血漿を回収し、各組織中のmIL-10をELISAにて定量した。  尚、パネル(A)の嗅球、大脳/海馬、及び小脳/延髄におけるｍIL-10発現量は、縦軸のスケールを拡大してパネル(B)に示した。
【図１２】IL-10発現SeVベクター経鼻投与によるIL-10の脳内移行を示す図である。正常C57BL/6Nマウス（N=5）にSeV18+mIL10/TSΔFまたはSeV18+LacZ/TSΔFを5x108 CIU/head/53μlで経鼻投与した。対照としてDPBS(-)を同量投与した。投与7日目に灌流を行い脳を回収した。脳（嗅球、大脳/海馬、小脳/延髄に３分割）、鼻粘膜、気管/肺、および血漿中のmIL-10をELISAにて定量した。  尚、パネル(A)の嗅球、大脳/海馬、及び小脳/延髄におけるｍIL-10発現量は、縦軸のスケールを拡大してパネル(B)に示した。
【図１３】IL-10発現SeVベクター経鼻投与によるIL-10の脳内移行（CSF内濃度）を示す図である。正常Wistarラット（N=5）にSeV18+mIL10/TSΔF（ラット#1-#5）またはSeV18+LacZ/TSΔF（ラット#6-#10）を1x109 CIU/head/106μlで経鼻投与した。対照としてDPBS(-)を同量投与した（ラット#11-#15）。投与3日目に血漿および脳脊髄液を回収し、mIL-10をELISAにて定量した。
【図１４】正常マウス（C57BL/6N）におけるIL-10蛋白質皮下投与による血中IL-10量のカイネティクスを示す図である。組み換えマウス由来IL-10 (2.0μg/100μl/head) を背部皮下に投与し、血中mIL-10をELISAにて定量した。AUC = 40,800 pg・h/ml を得た。Cmax=約12,000pg/ml；Tmax=約1.5hr；t1/2 =約1hr (初期値）。
【図１５】APPマウスにおけるIL-10蛋白質皮下投与による血中IL-10量を示した図である。
【図１６】APPモデルマウス（Tg2576）におけるIL-10連続皮下投与の効果を示した写真である。抗Aβ抗体（4G8）による大脳新皮質頭頂葉および海馬の切片の免疫染色結果を示している。上段は、IL-10投与群の結果を示しているが、少数の老人斑（茶色の斑点）が大脳新皮質に見られる。下段は、DPBS(-)投与群の結果を示しているが、多数の老人斑が大脳新皮質に見られる。
【図１７】IL-10連続皮下投与したAPPモデルマウス（Tg2576）における老人斑の半定量結果を示した図である。老人斑の大きさ別に、大：９点、中：３点、小：１点のスコアを設定し、脳全体（脳幹・小脳を除く）にみられる老人斑のスコア合計を算出し、群間で統計学的解析を行った（Student's t test、平均±標準誤差）。
【図１８】IL-10連続皮下投与したAPPモデルマウス（Tg2576）について、嗅球、大脳新皮質および海馬においての老人斑の占める面積を定量結果を示した図である（Student t test）。バーの標記について：ＩＬ-10はＩＬ-10投与群、ＤＰＢＳ（-）はＤＰＢＳ（-）投与群の結果を示している。
【００１１】
［発明を実施するための形態]
本発明は、抗炎症サイトカインまたはそれを発現するベクターを含むアルツハイマー病治療薬および予防薬に関する。ベクターとしては、プラスミド、naked DNA、リポソーム組成物、およびウイルスベクター等が挙げられる。特に本発明は、アルツハイマー病の治療あるいは治療薬開発のために用いる、抗炎症サイトカイン遺伝子を有する(-)鎖RNAウイルスベクター、および、該ベクターを含むアルツハイマー病治療または予防用医薬組成物に関する。(-)鎖RNAウイルス（マイナス鎖RNAウイルスとも表記する）とは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をセンスにコードする鎖と相補的なアンチセンス鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスのことである。(-)鎖RNAウイルスはネガティブ鎖RNAウイルスとも呼ばれる。本発明において用いられる(-)鎖RNAウイルスとしては、特に一本鎖(-)鎖RNAウイルス（非分節型 (non-segmented) (-)鎖RNAウイルスとも言う）が好ましい。「一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］RNAをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; genus Paramyxovirus, genus Morbillivirus, genus Rubulavirus, および genus Pneumovirus等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; genus Vesiculovirus, genus Lyssavirus, および genus Ephemerovirus等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）などの科に属するウイルスが含まれる。本発明において用いられる(-)鎖RNAウイルスベクターは、伝播能を有していてもよく、伝播能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。【００１２】
本発明において特に好適に用いられる(-)鎖RNAウイルスを具体的に挙げれば、例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスのセンダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(mumps virus)、麻疹ウイルス(measles virus)、RSウイルス(respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)のインフルエンザウイルス(influenza virus)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(rabies virus)等が例示できる。【００１３】
本発明においては、より好ましくはパラミクソウイルスが用いられる。パラミクソウイルスとは、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）に属するウイルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルス、より好ましくはレスピロウイルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（genus Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス10型（SPIV-10）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。【００１４】
本発明においてベクターとは、核酸を細胞に導入する担体である。センダイウイルスなどの(-)鎖RNAウイルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、ライフサイクルにおいて宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、DNAフェーズを持たないため染色体への組み込み（integration）は起こらない。このため染色体異常による癌化または不死化などの安全面における問題が生じない。(-)鎖RNAウイルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、センダイウイルスを連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Yu, D. et al., Genes Cells 2, 457-466 (1997)）。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（flexibility）など性質上のメリットがある。【００１５】
本発明の(-)鎖RNAウイルスベクターは、例えば(-)鎖RNAウイルスのゲノムRNAとウイルス蛋白質からなる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン（RNP）であってよい。このようなRNPは、具体的には(-)鎖RNAウイルスのゲノムRNA、N蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質を含む複合体である。RNPは細胞内に導入されると、ウイルス蛋白質の働きによりゲノムRNAからウイルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘RNPが形成されるため、持続発現が期待される。細胞へのRNPの導入は、例えば所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて実施することができる。ゲノムRNAの複製は、該RNAのコピー数の増加をRT-PCRまたはノーザンブロットハイブリダイゼーション等により検出することにより確認することができる。【００１６】
また本発明の(-)鎖RNAウイルスベクターは、好ましくは(-)鎖RNAウイルスのウイルス粒子である。ウイルス粒子とは、ウイルス蛋白質の働きにより細胞から放出される、核酸を含む微小粒子を言う。(-)鎖RNAウイルスのウイルス粒子は、ゲノムRNAとウイルス蛋白質を含む上記RNPが細胞膜由来の脂質膜（エンベロープという）に含まれた構造をしている。ウイルス粒子は、感染性を示すものであってよい。感染性とは、(-)鎖RNAウイルスベクターが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベクター内部の核酸を導入することのできる能力を言う。本発明の(-)鎖RNAウイルスベクターは、伝播能を有していてもよく、あるいは伝播能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。【００１７】
(-)鎖RNAウイルスのゲノムRNAは、搭載遺伝子をアンチセンスとしてコードしている。一般に(-)鎖RNAウイルスのゲノムは、3'リーダー領域と5'トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のORFの間には、転写終結配列(E配列) - 介在配列(I配列) - 転写開始配列(S配列) が存在し、これにより各遺伝子のORFをコードするRNAが別々のシストロンとして転写される。本発明のベクターに含まれるゲノムRNAは、該RNAにコードされる遺伝子群の発現およびRNA自身の自律的な複製に必要なウイルス蛋白質である N（ヌクレオキャプシド (またはヌクレオプロテイン (NP) とも言う)）、P（ホスホ）、およびL（ラージ）をアンチセンスにコードしている。また該RNAは、ウイルス粒子の形成に必要なM（マトリックス）蛋白質をコードしていてもよい。さらに該RNAは、ウイルス粒子の感染に必要なエンベロープ蛋白質をコードしていてもよい。(-)鎖RNAウイルスのエンベロープ蛋白質としては、細胞膜融合を起こす蛋白質であるF（フュージョン）蛋白質および細胞への接着に必要なHN（ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ）（またはH (ヘマグルチニン)）蛋白質が挙げられる。但し、ある種の細胞では感染にHN蛋白質は必要なく（Markwell, M.A. et al., Proc. Natil. Acad. Sci. USA 82(4):978-982 (1985)）、F蛋白質のみで感染が成立する。また、F蛋白質および／またはHN蛋白質以外のウイルスエンベロープ蛋白質をコードさせてもよい。【００１８】
例えばパラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、NP遺伝子は"N"とも表記される。また、HNはノイラミニダーゼ活性を有さない場合にはH (ヘマグルチニン) と表記される。
レスピロウイルス属     NP   P/C/V   M   F   HN    -     L
ルブラウイルス属       NP   P/V     M   F   HN   (SH)   L
モービリウイルス属     NP   P/C/V   M   F   H     -     L【００１９】
本発明の(-)鎖RNAウイルスベクターは、野生型(-)鎖RNAウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。ウイルスゲノムRNAは、RNPの再構成に必要なウイルス蛋白質（N、L、およびP）をコードしていれば、エンベロープ構成蛋白質をコードしていなくても細胞内で複製し、搭載する遺伝子を発現することができる。例えば、ウイルスの種類によっても異なるが、F、H、HN、G、M、M1などのエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損するベクターが例示できる（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。例えば、パラミクソウイルスベクターにおいては、M、F、またはHN遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないベクターも、本発明のベクターとして好適に用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはウイルス遺伝子を欠損するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばF遺伝子および／またはHN遺伝子が挙げられる。特に、少なくともF遺伝子を欠損するベクターは、本発明において好ましい。例えば、F遺伝子が欠損した組み換え(-)鎖RNAウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、F蛋白質の発現ベクターならびにN、P、およびL蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（国際公開番号 WO00/70055 および WO00/70070; Li, HO. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。また、例えば、F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウイルスを製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。【００２０】
また、RNPの再構成に必要なウイルス蛋白質（N、L、およびP）をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠失または欠損させれば、細胞に導入された後でゲノムRNAが増幅するのを防ぐことができる。このようなベクターは、ウイルス産生細胞において、N、P、およびL蛋白質を発現させて製造することができる。【００２１】
また、本発明のウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的として感染するベクターを作り出すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供給されてもよい。【００２２】
また本発明のベクターは、例えばウイルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはRNAの転写効率または複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウイルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えば(-)鎖RNAウイルスベクターにおいては、複製因子であるN、P、およびL遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の１つであるHN蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（hemagglutinin）活性とノイラミニダーゼ（neuraminidase）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、F蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるF蛋白質またはHN蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウイルスベクターを作製することもできる。さらに、二次放出粒子（またはVLP:virus like particle）放出抑制を目的として、ウイルス遺伝子に温度感受性変異を導入することができる（WO2003/025570）。例えば、M遺伝子については、G69E，T116A，A183Sを、HN遺伝子については、A262T，G264，K461Gを、P遺伝子については、L511Fを、L遺伝子については、N1197S，K1795Eの変異導入を行うことができるが、導入可能な温度感受性変異はこれらに限定されない。WO2003/025570を参照のこと。【００２３】
本発明のベクターは、上記の(-)鎖RNAウイルスベクターのゲノムRNA中に、外来遺伝子として抗炎症サイトカインをコードする。本発明において抗炎症サイトカイン（抗炎症性サイトカインとも言う）とは、炎症を抑制する方向に作用するポリペプチドを総称し、炎症を抑制するシグナル伝達を促進するシグナル伝達分子および/または炎症を促進するシグナル伝達を阻害するシグナル伝達分子（例えば炎症性サイトカインインヒビター）が含まれる。本発明において抗炎症サイトカインには、具体的には、interleukin (IL)-4、IL-10、IL-11、IL-13、TGF-β、soluble TNF-α receptor，IL-1 receptor antagonist (IL-1ra)、およびその他のTh2サイトカインが含まれる。Th2サイトカインとは、1型のヘルパーT細胞（Th1 cells）よりも2型のヘルパーT細胞（Th2 cells）において優位に産生されるサイトカインを言い、具体的にはIL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、およびIL-13 が含まれる。ベクターにコードされる抗炎症サイトカインは、天然のポリペプチドの全長でもよく、活性が維持される限りその部分ペプチド（活性断片など）でもよい。例えば、N末端および/またはC末端のアミノ酸残基の欠失（例えば1〜30アミノ酸、より特定すれば、1、2、3、4、5、10、15、20、または25アミノ酸）はサイトカインの活性に影響を与えない可能性が高い。また、炎症性サイトカイン受容体の可溶型断片（リガンド結合ドメインを含む）や、炎症性サイトカイン受容体のリガンド結合ドメインに結合する抗体または抗体断片などであって、炎症性サイトカインのシグナル伝達を阻害するポリペプチドでもよい。炎症性サイトカインとしては、シグナル配列が除去された成熟ポリペプチドを含む所望の断片を利用することができ、細胞外に分泌させるためのN末端のシグナル配列は、適宜所望の蛋白質のシグナル配列を利用することができる。分泌シグナル配列としては、例えば interleukin (IL)-2やtissue plasminogen activator (tPA) などの所望の分泌蛋白質のシグナル配列を用いることができるが、これらに限定されない。また、他のペプチドとの融合蛋白質として発現させてもよい。【００２４】
本発明において抗炎症サイトカインは、より好ましくはIL-4、IL-10、IL-13、およびTGF-beta からなる群より選択されるサイトカインであり、最も好ましくはIL-10である。各サイトカイン遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は知られている（IL-4：NM_000589, NP_000580, AAH66277, AAH67515, NP_758858, NP_067258, NP_958427； IL-10：NM_000572, NP_000563, CAG46825, NP_034678, NP_036986；IL-13：NM_002188, NP_002179, AAB01681, NP_032381, NP_446280；TGF-beta（transforming growth factor-beta）：M_60316）。【００２５】
抗炎症サイトカインをコードする遺伝子は、上記に例示した抗炎症サイトカイン遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーション等により取得することができる。ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を挙げれば、例えば、25％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中で、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度の洗浄液および温度条件で実施することができる。また、天然のサイトカイン遺伝子は、各タンパク質の機能を損なわないような軽微な変異を、公知方法によって導入することができる。例えば、PCR法やカセット変異法等により部位特異的に変異を導入したり、化学試薬やランダムヌクレオチド等によりランダム変異を導入することが可能である。これらにより取得される抗炎症サイトカインのアミノ酸配列は、通常、上記に例示した抗炎症サイトカインのアミノ酸配列と高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも60％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98から99％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて開発されたBLASTX(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)によってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(NCBIのウェブページを参照)。【００２６】
各抗炎症サイトカインの活性は、公知の方法により検出することができる。例えば、マウスmast cell MC/9（ATCC CRL-8306）、ヒト赤白血病（erythroleukemia）細胞株 TF-1 (ATCC CRL-2003) などを用いた増殖アッセイにより活性を検出する方法が知られている（Thompson-Snipes, L. et al., 1991, J. Exp. Med. 173:507-510；Kruse N et al., EMBO J. 1993;12:5121-5129; Oshima Y et al., J Biol Chem 2001;276:15185-91; Oshima, Y., et al., J. Biol. Chem. 275, 14375-14380, 2000; Leland, P. et al.,Oncol. Res. 7, 227-235, 1995）。例えば、遺伝子組み換え技術を用いて作製した各種抗炎症サイトカインの欠失変異体をこの方法によりアッセイして、活性断片を同定することができる。50% effective dose (ED50) を算出し、野生型と比べ50％以上、好ましくは60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または95％以上の活性を持つ部分ペプチド等を用いるとよい。【００２７】
ベクターにコードされる抗炎症サイトカインの由来に特に制限はなく、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、イヌ、チンパンジー、サル、ヒト等の哺乳類のいずれをも用いることができるが、投与対象と同種由来のものを用いるのが適当である。これらのサイトカインをコードする核酸の塩基配列は、上記のようにデータベースから入手可能であるが、さらに例を挙げれば、マウスIL-10であれば、Genbank Accession No. AY410237、NM_010548、ヒトIL-10であれば、Genbank Accession No.AY029171、NM_000572 が挙げられる。外来遺伝子の挿入位置は、例えばウイルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えばゲノムRNAの3'リーダー領域と3'端に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間、各ウイルス蛋白質ORFの間、および/または5'端に最も近いウイルス蛋白質ORFと5'トレイラー領域の間に挿入することができる。また、M、FまたはHN遺伝子などのエンベロープ構成蛋白質遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域に挿入してもよい。パラミクソウイルス科ウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が6の倍数となるように挿入することが望ましい（Kolakofski, D. et al., J. Virol. 1998: 72; 891-899; Calain, P. and Roux, L. J. Virol. 1993: 67; 4822-4830）。挿入した外来遺伝子とウイルスORFとの間には、E-I-S配列が構成されるようにする。E-I-S配列を介して2またはそれ以上の外来遺伝子をタンデムに並べて挿入することもできる。【００２８】
なお、本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。核酸にはRNAおよびDNAが含まれる。本発明においてポリペプチドをコードする核酸は、該ポリペプチドの遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質をコードしていないものも含まれ、例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスRNAなどの機能的RNAをコードするものでもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするORFをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。また本発明において外来遺伝子とは、ベクターが由来する野生型ウイルスが搭載してない遺伝子を言う。【００２９】
ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（マイナス鎖の3'側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（WO01/18223）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、マイナス鎖の3'の近くに挿入するほど発現レベルが高く、5'の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。一般に、抗炎症サイトカインの高い発現が得られることが有利と考えられるため、抗炎症サイトカインをコードする外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、マイナス鎖ゲノムの3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、3'リーダー領域と3'に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間に挿入される。あるいは、3'に一番近いウイルス蛋白質遺伝子と2番目のウイルス蛋白質遺伝子のORFの間、または3'から２番目と３番目のウイルス蛋白質遺伝子の間に挿入してもよい。野生型パラミクソウイルスにおいては、ゲノムの3'に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はN遺伝子であり、2番目の遺伝子はP遺伝子、3番目の遺伝子はM遺伝子である。逆に、抗原ポリペプチドの高発現が望ましくない場合は、例えば外来遺伝子の挿入位置をマイナス鎖ゲノムのなるべく5'側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウイルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。【００３０】
外来遺伝子をコードする核酸をゲノムに挿入するときに付加するS配列としては、例えば(-)鎖RNAウイルスの所望のS配列を用いることができるが、センダイウイルスであれば、3'-UCCCWVUUWC-5'（W= AまたはC; V= A, C, またはG）（配列番号：１）のコンセンサス配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5'（配列番号：２）、3'-UCCCACUUAC-5'（配列番号：３）、および 3'-UCCCACUUUC-5'（配列番号：４）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするDNA配列で表すとそれぞれ 5'-AGGGTCAAAG-3'（配列番号：５）、5'-AGGGTGAATG-3'（配列番号：６）、および 5'-AGGGTGAAAG-3'（配列番号：７）である。センダイウイルスベクターのE配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5'（配列番号：８）（プラス鎖をコードするDNAでは 5'-TAAGAAAAA-3' (配列番号：９)）が好ましい。I配列は、例えば任意の3塩基であってよく、具体的には 3'-GAA-5'（プラス鎖DNAでは 5'-CTT-3'）を用いればよい。【００３１】
本発明のベクターは、このように抗炎症サイトカインをコードする遺伝子を挿入した以外の位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。このような外来遺伝子としては制限はない。例えばベクターの感染をモニターするためのマーカー遺伝子であってもよく、あるいは免疫系を調節するサイトカイン、ホルモン、受容体、抗体、それらの断片、またはその他の遺伝子であってもよい。本発明のベクターは、生体への直接（in vivo）投与、および患者由来細胞またはそれ以外の細胞に本発明のベクターを導入し、その細胞を投与する間接（ex vivo）投与により抗炎症サイトカインを発現させることができる。【００３２】
なお、本発明の(-)鎖RNAウイルスベクターは、Aβ抗原をコードしない。すなわち本発明の(-)鎖RNAウイルスベクターは、Aβ抗原をコードする核酸を含まない。本発明のベクターは、Aβ抗原をコードすることなく、アルツハイマー病に対する治療効果を発揮することができる。Aβ抗原とは、Aβまたはその抗原性部分ペプチドを言い、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-44、およびこれらの抗原性を有する部分断片を含むポリペプチドが含まれる。本発明の(-)鎖RNAウイルスベクターは、例えばAβ1-43（DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT／配列番号：10）の連続する10アミノ酸以上（好ましくは9、8、7、6、または5アミノ酸以上）を含むポリペプチドをコードしない。【００３３】
組み換え(-)鎖RNAウイルスベクターの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的には、（ａ）哺乳動物細胞または鳥類細胞において、(-)鎖RNAウイルスのゲノムRNAを含むRNPを構成するウイルス蛋白質の存在下、抗炎症サイトカインをコードする(-)鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖（アンチゲノムRNA。プラス鎖）をコードするDNAを転写させる工程、（ｂ）生成した(-)鎖RNAウイルスまたは該ゲノムRNAを含むRNPを回収する工程、により製造することができる。上記のRNPを構成するウイルス蛋白質とは、ウイルスゲノムRNAと共にRNPを形成し、ヌクレオカプシドを構成する蛋白質を言う。これらはゲノムの複製および遺伝子発現に必要な蛋白質群であり、典型的には、N（ヌクレオキャプシド (またはヌクレオプロテイン (NP) とも言う)）、P（ホスホ）、およびL（ラージ）蛋白質である。ウイルス種によっては、表記は異なることもあるが、対応する蛋白質群は当業者には知られている (Anjeanette Robert et al., Virology 247:1-6 (1998))。例えば、NはNPと表記されることもある。【００３４】
ウイルス再構成に際しては、上記にように、(-)鎖RNAゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させても、プラス鎖RNA（アンチゲノム。ゲノムRNAの相補鎖）を生成させてもよいが、ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはプラス鎖を生成させる。ウイルスゲノムRNAとしては、RNPの再構成に必要なウイルス蛋白質をコードしていれば、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子は欠失していてもよい。具体的には、例えば、N、P、およびL蛋白質をコードしていれば、F、HN、Mなどのウイルス蛋白質はコードしていなくてもよい。このような欠損型ウイルスは、細胞内でゲノムRNAを増幅できるが、感染性ウイルス粒子を放出しないため、安全性の高い遺伝子導入ベクターとして有用である（WO00/70055、WO00/70070、および WO03/025570; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ウイルスベクターを製造する場合は、これらのエンベロープ構成蛋白質を、ウイルス産生細胞内で別途発現させ、粒子形成を相補する。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、適当なプロモーターの下流に該蛋白質またはゲノムをコードするDNAが連結されたベクターを、宿主細胞に導入する。プロモーターとしては、例えばCMVプロモーター（Foecking, M.K, and Hofstetter H. Gene 1986; 45: 101-105）、レトロウイルスLTR（Shinnik, T. M., Lerner, R. A. & Sutcliffe (1981) Nature, 293, 543-548)、EF1プロモーター、CAGプロモーター (Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199、特開平3-168087) などが用いられる。【００３５】
ゲノムRNAの末端は、天然のウイルスゲノムと同様に3'リーダー配列と5'トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。このためには、例えば転写産物の5'端に自己切断型のリボザイムを付加しておき、リボザイムにより(-)鎖RNAウイルスゲノムの末端を正確に切り出させる（Inoue, K. et al. J. Virol. Methods 107, 2003, 229-236）。あるいは、転写産物の5'端を正確に制御するために、転写開始部位にバクテリオファージのRNAポリメラーゼ認識配列を利用し、該RNAポリメラーゼを細胞内で発現させて転写を誘導する。バクテリオファージのRNAポリメラーゼとしては、例えば大腸菌T3ファージおよびT7ファージ、およびサルモネラSP6ファージ等が用いられる (Krieg, P.A. and Melton, D.A. 1987, Methods Enzymol. 155: 397-15; Milligan, J.F. et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 8783-798; Pokrovskaya, I.D. and Gurevich, V.V., 1994, Anal. Biochem. 220: 420-23)。バクテリオファージのRNAポリメラーゼは、例えばこれを発現するワクシニアウイルス (Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) を用いて供給することができるし、あるいはプラスミドなどの発現ベクターから供給することもできる。転写産物の3'端を制御するには、例えば転写産物の3'端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に3'端が切り出されるようにする（Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 1997: 78; 2813-2820、Kato, A. et al., EMBO J. 1997,: 16; 578-587 及び Yu, D. et al., Genes Cells. 1997: 2; 457-466）。リボザイムとしては、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand）由来の自己開裂リボザイムが使用できる。【００３６】
エンベロープ構成蛋白質の遺伝子を欠失させたウイルスの再構成においては、欠失させたエンベロープ構成蛋白質および/または別のエンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させ、産生されるウイルスの感染性を相補することができる。例えば、ウイルスベクターのゲノムとは由来が異なる(-)鎖RNAウイルスのエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化することもできる。このようなエンベロープ蛋白質としては、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）（J. Virology 39: 519-528 (1981)）を用いることができる（Hirata, T. et al., 2002, J. Virol. Methods, 104:125-133; Inoue, M. et al., 2003, J. Virol. 77:6419-6429; Inoue M. et al., J Gene Med. 2004;6:1069-1081）。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばF、HN、H、Gなどのスパイク蛋白質遺伝子、Mなどのエンベロープ裏打ち蛋白質遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。スパイク蛋白質遺伝子の欠失は、(-)鎖RNAウイルスベクターを非伝播性にするために有効であり、また、M蛋白質などのエンベロープの裏打ち蛋白質遺伝子の欠失は、感染細胞からの粒子形成を不能にするために有効である。例えば、F遺伝子欠失型(-)鎖RNAウイルスベクター（Li, H.-O. et al., J.Virol. 74, 6564-6569 (2000)）、M遺伝子欠失型(-)鎖RNAウイルスベクター（Inoue, M. et al., J.Virol. 77, 6419-6429 (2003)）などは好適に用いられる。また、F、HN (またはH)、およびMの少なくとも２つの遺伝子の任意の組み合わせを欠損するベクターは、より安全性が保障される。例えば、MおよびF遺伝子両欠失型ベクターは、高レベルの感染性および遺伝子発現能を保ったまま、非伝播性でかつ粒子形成を欠くベクターとなる。【００３７】
例えばF遺伝子欠失型の組み換えウイルスの製造を具体的に例示すれば、F遺伝子が欠損した(-)鎖RNAウイルスゲノムまたはその相補鎖を発現するプラスミドを、F蛋白質を発現する発現ベクター、ならびにN、P、およびL蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションする。または、F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いれば、より効率的にウイルスを製造することができる（WO00/70070）。この場合は、F遺伝子を誘導発現できるように、Cre/loxPやFLP/FRTなどの配列特異的組み換え酵素とその標的配列を用いて、発現を誘導できるようにしておくことが好ましい（WO00/70055 および WO00/70070；Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820参照）。具体的には、例えばCre/loxP誘導型発現プラスミドpCALNdlw（Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, p1115-1121）等の組み換え酵素標的配列を持つベクターにエンベロープ蛋白質遺伝子を組み込む。発現の誘導は、例えばアデノウイルスAxCANCreをmoi=3〜5 で感染させて行う（Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al., J. Virol 72,1115-1121 (1998)）。【００３８】
本発明において用いる(-)鎖RNAウイルスは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばセンダイウイルス（SeV）のアクセサリー遺伝子の１つであるV遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するSeVの病原性が顕著に減弱する（Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71:7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179）。【００３９】
また(-)鎖RNAウイルスは、感染の持続性を高めるために、P遺伝子またはL遺伝子に変異を有するものを使用してもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換、または他の(-)鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および/または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、または他の(-)鎖RNAウイルスL蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。【００４０】
より具体的な組み換えウイルスの再構成は、例えば以下の文献を参照することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含む(-)鎖RNAウイルスを、DNAから再構成させることができる。【００４１】
本発明は、(a) 抗炎症サイトカインをコードする(-)鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖（アンチゲノムRNA）をコードするDNAを、(-)鎖RNAウイルスのゲノムRNAを含むRNPを構成するウイルス蛋白質の存在下、哺乳動物細胞において転写させる工程、および (b) 生成した(-)鎖RNAウイルスまたは該ゲノムRNAを含むRNPを回収する工程、を含む、アルツハイマー病治療薬および/または予防薬（アルツハイマー病治療および/または予防用医薬組成物）の製造方法を提供する。また本発明は、アルツハイマー病治療薬および/または予防薬（アルツハイマー病治療および/または予防用医薬組成物）の製造における、抗炎症サイトカインをコードする(-)鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖（アンチゲノムRNA）をコードするDNAの使用にも関する。さらに本発明は、抗炎症サイトカインをコードする(-)鎖RNAウイルスを有効成分とする、アルツハイマー病治療薬および/または予防薬（アルツハイマー病治療および/または予防用医薬組成物）にも関する。また本発明は、アルツハイマー病治療薬および/または予防薬（アルツハイマー病治療および/または予防用医薬組成物）の製造における、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカインを産生する細胞、抗炎症サイトカインをコードする核酸、または抗炎症サイトカインをコードする核酸が外来的に導入された細胞の使用にも関する。さらに本発明は、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカインを産生する細胞、抗炎症サイトカインをコードする核酸、または抗炎症サイトカインをコードする核酸が外来的に導入された細胞を有効成分とする、アルツハイマー病治療薬および/または予防薬（アルツハイマー病治療および/または予防用医薬組成物）にも関する。【００４２】
ウイルス産生には所望の哺乳動物細胞などを用いることができるが、具体的には、例えば、サル腎由来のLLC-MK2細胞（ATCC CCL-7）およびCV-1細胞 (例えばATCC CCL-70)、ハムスター腎由来のBHK細胞 (例えばATCC CCL-10) などの培養細胞、ヒト由来細胞等が挙げられる。また、大量にウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編,(1993),「神経科学研究の先端技術プロトコールIII, 分子神経細胞生理学」, 厚生社, 大阪, pp.153-172）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間 37〜38℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウイルス実験プロトコール」, 永井、石浜監修, メジカルビュー社, pp.68-73,(1995)）。【００４３】
回収されたウイルスの力価は、例えばCIU（Cell-Infected Unit）測定または赤血球凝集活性(HA)の測定することにより決定することができる（WO00/70070; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999）。また、GFP（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばGFP-CIUとして）。このようにして測定した力価は、CIUと同等に扱うことができる（WO00/70070）。【００４４】
ウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターを含む溶液中で該ウイルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウイルスベクター組成物は、溶液中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクターの成分として含まれる蛋白質の割合が10% (重量/重量) 以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占めることにより確認することができる。ウイルスベクターの具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公報、および特公昭62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法（WO97/32010）等を例示することができるが、これらに制限されない。【００４５】
また本発明は、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカインを産生する細胞、抗炎症サイトカインをコードする核酸、または抗炎症サイトカインをコードする核酸が外来的に導入された細胞を含む、アルツハイマー病の治療、予防、およびアルツハイマー病の治療薬および予防薬開発のための組成物に関する。特に本発明は、抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを産生する細胞、または該ベクターが導入された細胞を含む、アルツハイマー病の治療、予防、およびアルツハイマー病の治療薬および予防薬開発のための組成物に関する。ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターまたは細胞を懸濁できる所望の溶液が挙げられ、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、5%デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。なお本発明の組成物は、Aβ抗原またはAβ抗原をコードする核酸は含まない。本発明のベクターおよびそれを含む組成物は、アルツハイマー病の治療、予防、およびアルツハイマー病の治療薬および予防薬開発のために有用である。本発明は、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカインを産生する細胞、抗炎症サイトカインをコードする核酸、または抗炎症サイトカインをコードする核酸が外来的に導入された細胞と、薬学的に許容される担体または媒体とを含む組成物を製造する工程を含む、アルツハイマー病の治療薬および予防薬の製造方法に関する。また本発明は、アルツハイマー病の治療薬および予防薬の製造における、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカインを産生する細胞、抗炎症サイトカインをコードする核酸、または抗炎症サイトカインをコードする核酸が外来的に導入された細胞の使用にも関する。また本発明は、抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを産生する細胞、または該ベクターが導入された細胞と、薬学的に許容される担体または媒体とを含む組成物を製造する工程を含む、アルツハイマー病の治療薬および予防薬の製造方法に関する。また本発明は、アルツハイマー病の治療薬および予防薬の製造における、抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを産生する細胞、または該ベクターが導入された細胞の使用にも関する。本発明のベクターを用いれば、血中の抗炎症サイトカインレベルを極めて効率的に上昇させ、高いAUC (area under the pharmacokinetic curve) を実現できる。これにより、Aβの蓄積および老人斑の生成を効果的に抑制することができる。【００４６】
本発明のベクターを含む組成物は、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などを担体として組み合わせることもできる。【００４７】
また、本発明の組成物、例えば抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクターを含む組成物は、抗炎症サイトカインまたは抗炎症サイトカインをコードする核酸をさらに含んでもよい。抗炎症サイトカインとしては、本明細書に記載したもの、およびそれらの組み合わせを用いることができる。好ましくは、抗炎症サイトカインは、IL-4、IL-10、およびIL-13 からなる群から選択される。【００４８】
また、本発明の組成物はアジュバントを含むことができる。例えば、Th2アジュバントを含む組成物を用いることにより、Th1/Th2バランスのTh2へのシフトをより促進することができる。Th2アジュバントとは、1型のヘルパーT細胞（Th1 cells）よりも2型のヘルパーT細胞（Th2 cells）を優位に活性化するアジュバントを言い、具体的には、aluminum hydroxide (alum)、cholera toxin (B subunit)、Schistosoma mansoni egg抽出蛋白質（例えば Lacto-N-fucopentaose III）などを用いることができる (Grun, J. L. and P. H. Maurer, 1989, Cellular Immunology 121: 134-145; Holmgren J et al., 1993, Vaccine 11:1179-1184; Wilson AD et al., 1993, Vaccine 11:113-118; Lindsay DS et al, 1994, Int Arch Allergy Immunol 105:281-288; Xu-Amano J et al., 1993, J Exp Med 178:1309-1320; Okano M et al., 2001, J Immunol. 167(1):442-50)。【００４９】
抗炎症サイトカインをコードする(-)鎖RNAウイルスまたはそれを含む組成物などの本発明の組成物は、アルツハイマー病の治療または予防、あるいは治療薬または予防薬開発のために用いられる。本発明において、「アルツハイマー病の治療または予防、あるいは治療薬または予防薬開発のために用いる」とは、それぞれ、もっぱらアルツハイマー病の治療または予防、あるいは治療薬または予防薬開発の用途のみに用いることを言う。治療薬または予防薬の開発とは、それぞれ治療薬または予防薬としての効果を評価するために、(-)鎖RNAウイルスまたはそれを含む組成物のアルツハイマー病に対する少なくとも１つの治療効果または予防効果を検出することを言う。またアルツハイマー病の治療とは、アルツハイマー病の少なくとも１つの症状を改善することであり、例えば、脳組織または血中等におけるAβの蓄積、あるいは老人斑またはその面積などを減少させることが挙げられる。本発明の組成物は、Aβの蓄積抑制剤、特に脳組織または血中等におけるAβの蓄積を、本発明の組成物を投与しない場合に比べ抑制する薬剤として有用である。また本発明の組成物は老人斑抑制剤、特に老人斑の数および/または面積の合計を、本発明の組成物を投与しない場合に比べ減少させるための薬剤として有用である。なお本発明におけるアルツハイマー病の治療または予防、あるいは治療薬または予防薬開発は、Aβ抗原またはAβ抗原をコードする核酸を個体に投与する工程は含まない。本発明は、アルツハイマー病の治療または予防、あるいは治療薬または予防薬開発に用いるための、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカインを産生する細胞、抗炎症サイトカインをコードする核酸、または抗炎症サイトカインをコードする核酸が外来的に導入された細胞、特に抗炎症サイトカイン遺伝子を有する(-)鎖RNAウイルスベクターの使用に関する。また本発明は、アルツハイマー病治療または予防用医薬組成物の製造における、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカインを産生する細胞、抗炎症サイトカインをコードする核酸、または抗炎症サイトカインをコードする核酸が外来的に導入された細胞、特に抗炎症サイトカイン遺伝子を有する(-)鎖RNAウイルスベクターの使用に関する。【００５０】
また本発明は、抗炎症サイトカイン、抗炎症サイトカインを産生する細胞、抗炎症サイトカインをコードする核酸、または抗炎症サイトカインをコードする核酸が外来的に導入された細胞を含む容器を含む、アルツハイマー病の予防および/または治療用パッケージおよびキットに関する。特に本発明は、抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクターを含む容器を含む、アルツハイマー病の予防および/または治療用パッケージおよびキットに関する。ベクターとしては、本明細書に記載したものを用いることができる。容器は、好ましくは抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクター等の有効成分を滅菌状態で保存するのに適した形態を持つ。具体的には、ガラス製または樹脂性のアンプル、バイアル、チューブ、ボトル、シリンジ等であってよい。該パッケージおよびキットは、抗炎症サイトカインまたは抗炎症サイトカインをコードする別のベクターをさらに含んでもよい。抗炎症サイトカインとしては、本明細書に記載したもの、およびそれらの組み合わせを用いることができる。好ましくは、抗炎症サイトカインは、IL-4、IL-10、およびIL-13 からなる群から選択される。なお該パッケージおよびキットは、Aβ抗原またはAβ抗原をコードする核酸を含まない。(-)鎖RNAウイルスベクターは、例えば経鼻投与に適した組成物とすることができる。また該容器、パッケージ、および/またはキットは、抗炎症サイトカインまたはその遺伝子等の有効成分がアルツハイマー病の予防および/または治療に用いられることの記載または教示を含んでよい。例えば抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクターを含むキットにおいては、該ベクターが、アルツハイマー病の予防および/または治療に用いられることの記載または教示を含んでよい。また、Aβ抗原またはAβ抗原をコードする核酸と併用しないことの記載または教示を含んでよい。本発明のキットは、例えばAβの蓄積抑制、特に脳組織または血中等におけるAβの蓄積を、キットの使用しない場合に比べて抑制するために有用である。また本発明のキットは、老人斑抑制、特に老人斑の数および/または面積の合計を、キットの使用しない場合に比べて減少させるために有用である。【００５１】
抗炎症サイトカインまたは抗炎症サイトカインを発現する核酸を直接または間接に個体に投与することにより、アルツハイマー病の治療および予防を実施することができる。特に、抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスまたはそれを含む組成物を個体に投与することにより、アルツハイマー病の効果的な治療および予防を実施することができる。本発明は、抗炎症サイトカインまたは抗炎症サイトカインを発現する核酸を直接または間接に投与する工程を含む、アルツハイマー病を治療および/または予防する方法を提供する。特に本発明は、抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載する(-)鎖RNAウイルスベクターを投与する工程を含む、アルツハイマー病を治療および/または予防する方法を提供する。なお本発明の方法は、Aβ抗原または該抗原をコードする核酸を投与する工程を含まない。本発明の方法は、外来的なAβ抗原を投与することなくアルツハイマー病に対する処置を可能にする。抗炎症サイトカインまたは抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載するベクターの投与は、in vivo投与でも、細胞を介したex vivo投与でもよい。また、(-)鎖RNAウイルスベクターを投与する場合は、投与するベクターは感染性ウイルス粒子であっても、非感染性ウイルス粒子やウイルスのコア（ゲノムおよびゲノム結合ウイルス蛋白質を含むRNP複合体）などであってもよい。本発明において(-)鎖RNAウイルスベクターとは、(-)鎖RNAウイルス由来のゲノムRNAおよび該RNAの複製および搭載遺伝子の発現に必要なウイルス蛋白質を有するリボヌクレオプロテイン（RNP）複合体を含み、感染した細胞において該ゲノムRNAを複製し、搭載遺伝子を発現する複合体である。該RNPは、例えば(-)鎖RNAウイルスのゲノムRNAおよびN、L、P蛋白質を含む複合体である。すなわち、本発明において(-)鎖RNAウイルスベクターには、ウイルスの感染粒子、非感染性粒子（ウイルス様粒子；VLPとも言う）、および(-)鎖RNAウイルスのヌクレオカプシドなどの、ゲノムRNAおよびゲノムRNAに結合するウイルス蛋白質を含むRNPなどが含まれる。ウイルス粒子からエンベロープを除去したRNP（ウイルスコア）であっても、細胞に導入されれば、細胞内においてウイルスゲノムRNAを複製することができる（WO97/16538; WO00/70055）。RNPまたはVLPは、例えばトランスフェクション試薬などと共に投与するとよい（WO00/70055; WO00/70070）。【００５２】
細胞を介して(-)鎖RNAウイルスベクターを投与する場合は、適当な培養細胞または接種対象動物から採取した細胞などに(-)鎖RNAウイルスベクターを導入する。(-)鎖RNAウイルスを体外（例えば試験管またはシャーレ内）で細胞に感染させる場合は、例えば培養液または生理食塩水など所望の生理的水溶液中でin vitro（またはex vivo）で行う。この時、MOI（多重感染度; 細胞1つあたりの感染ウイルス数）は1〜1000の間にすることが好ましく、より好ましくは2〜500、さらに好ましくは3〜300、さらに好ましくは5〜100である。(-)鎖RNAウイルスと細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば1分以上、好ましくは3分以上、5分以上、10分以上、または20分以上接触させればよく、例えば1〜60分程度、より特定すれば5分〜30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。【００５３】
ウイルスゲノムRNAを含むRNPや非感染性ウイルス粒子（ウイルス様粒子 (VLP)）、あるいはnaked DNAやプラスミド等をトランスフェクションにより細胞に導入する方法を具体的に挙げれば、リン酸カルシウム (Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6:632-638; Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)、DEAE-デキストラン (Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152:704-709)、種々のリポソームベースのトランスフェクション試薬 (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))、エレクトロポレーション (Ausubel, F. et al. (1994) In Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY), Vol. 1, Ch. 5 および 9) など、当業者に知られる様々な方法が例示できる。エンドソームでの分解を抑制するため、トランスフェクションにおいてクロロキンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。トランスフェクション試薬を幾つか例示すれば、DOTMA（Roche）、Superfect Transfection Ragent（QIAGEN, Cat No. 301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）、TransIT-LT1 (Mirus, Product No. MIR 2300)、CalPhosTM Mammalian Transfection Kit (Clontech #K2051-1)、CLONfectinTM (Clontech #8020-1) などが挙げられる。エンベロープウイルスはウイルス粒子形成の際に宿主細胞由来の蛋白質を取り込むことが知られており、このような蛋白質は、細胞に導入した際に抗原性や細胞傷害性の原因となることが考えられる（J. Biol. Chem. (1997) 272, 16578-16584）。従って、エンベロープが除去されたRNPを用いることには利点がある（WO00/70055）。【００５４】
また、ウイルスゲノムRNAを発現する発現ベクター、および該ゲノムRNAの複製に必要なウイルス蛋白質（N、PおよびL蛋白質）をコードする発現ベクターを細胞に導入して、細胞内でウイルスRNPを直接形成させることもできる。ウイルスベクターが導入された細胞をこのようにして作製してもよい。【００５５】
(-)鎖RNAウイルスベクターが導入された細胞を調製したら、これを12時間〜5日間（好ましくは1〜3日間）程度培養し、ベクターから抗炎症サイトカインを発現させるとよい。ベクターから発現させる抗炎症サイトカインは、シグナルペプチドを付加しておき、該サイトカインを細胞外に分泌させることができる。得られた細胞は、そのまま、あるいはウイルスベクターを含む細胞破砕物（ライセート）として動物に投与してよい。また細胞は、放射線照射、紫外線照射または薬剤処理等により増殖能をなくしてもよい。ベクター導入細胞のライセートを得る場合は、界面活性剤で細胞膜を溶解する方法、凍結・融解をくり返す方法などで作製することができる。界面活性剤としては非イオン性のTriton X-100、Nonidet P-40などが用いられる。ライセートを投与する場合は、トランスフェクション試薬と共に投与してもよい。【００５６】
本発明の組成物の投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。特に筋注（例えば腓腹筋）、皮下投与、鼻腔内投与（点鼻）、手掌または足蹠皮内投与、脾臓直接投与、腹腔内投与などが好適であり、もっとも好適な投与方法は鼻腔内投与、皮下投与、あるいは筋肉内投与である。抗炎症サイトカインを投与する場合は、例えば皮下投与が好ましく、(-)鎖RNAウイルスベクターを投与する場合は、経鼻投与（点鼻、スプレー、カテーテルによる投与等を含む）が好ましい。接種部位は、一箇所または複数箇所（例えば2〜15箇所）であってよく、また、接種量は、接種対象動物、接種部位、接種回数などに応じて適宜調整してよい。サイトカイン蛋白質の投与量は、体重1ｋｇあたり約8000 μｇ（8000 μｇ/ｋｇ）以下の投与量が考えられるが（Regul Toxicol Pharmacol. 2002 Feb;35(1):56-71）、好ましくは25 μｇ/kg〜100 μｇ/ｋｇ（Pharmacol Rev. 2003 Jun;55(2):241-69）の投与量が考えられる。(-)鎖RNAウイルスベクターにおいては、投与されるベクターは好ましくは約105 CIU/mlから約1011 CIU/ml、より好ましくは約107 CIU/mlから約109 CIU/ml、最も好ましくは約1×108 CIU/mlから約5×108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は、ウイルス力価に換算して、1×104 CIU〜 5×1011 CIU (cell infectious unit)、好ましくは 2×105 CIU〜 2×1010 CIUで、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。単回投与だけでも有意な効果を発揮できるが、２回以上の投与を行えば、効果をより上昇させることができる。また、抗炎症サイトカイン自体をさらに投与してもよい。【００５７】
細胞を介して接種（ex vivo投与）する場合は、例えばヒト細胞、好ましくは自己の細胞に(-)鎖RNAウイルスベクターを感染させ、104〜109細胞、好ましくは105〜108細胞、またはそのライセートを投与することができる。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明のベクターを含む組成物の投与対象は、好ましくは哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む）である。具体的には、ヒト、サル等の非ヒト霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌなどその他の全ての哺乳動物が含まれる。投与対象となる動物は、アルツハイマー病の少なくとも１つの因子を有するか、またはアルツハイマー病の少なくとも１つの症状を呈する動物・患者が挙げられ、例えばアルツハイマー病に罹患した個体、Aβ量またはAβ沈着が亢進している個体、アルツハイマー型変異遺伝子を持つ個体、アルツハイマー病モデル動物などである。【００５８】
本発明の方法により、アルツハイマー病の少なくとも１つの症状が改善する。アルツハイマー病の症状としては、例えばミクログリア活性の亢進、脳、特に老人斑へのミクログリアの浸潤および/または集積、炎症時に活性化される物質、例えば補体の脳内の蓄積、脳組織内のAβ蓄積および/または沈着、学習および/または記憶力の低下などが挙げられる。【００５９】
また本発明は、本発明の組成物、例えば本発明のベクターまたは該ベクターを含む組成物を、アルツハイマー病に罹患した個体に投与する工程、および該個体におけるアルツハイマー病の少なくとも1つの症状を検出する工程を含む、アルツハイマー病に対する治療効果を測定する方法に関する。比較対象として、本発明の組成物、例えば該ベクターを投与しない場合におけるアルツハイマー病の症状と比較してもよい。アルツハイマー病の症状としては、上記のように、ミクログリア活性の亢進、脳、特に老人斑へのミクログリアの浸潤および/または集積、炎症時に活性化される物質、例えば補体の脳内の蓄積、脳組織内のAβ蓄積および/または沈着、学習および/または記憶力等を測定することができる。また本発明は、本発明の組成物、例えば本発明のベクターまたは該ベクターを含む組成物を個体に投与する工程、および該個体におけるアルツハイマー病の症状を検出する工程を含む、アルツハイマー病に対する治療効果を測定する方法に関する。投与個体は、アルツハイマー病の少なくとも１つの因子を有するか、またはアルツハイマー病の少なくとも１つの症状を呈する個体が挙げられ、例えばアルツハイマー病に罹患した個体、Aβ量またはAβ沈着が亢進している個体、アルツハイマー型変異遺伝子を持つ個体、アルツハイマー病モデル動物などである。アルツハイマー病発症前の個体に投与した場合は、投与しない対照個体がアルツハイマー病の少なくとも１つの症状を呈するまで待ち、投与の有無による効果を比較する。これらの方法により、アルツハイマー病の治療および予防効果のモニタリングが可能である。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。【００６１】
〔実施例１〕IL-10遺伝子を搭載したF遺伝子欠失型SeVゲノムcDNAの構築
（１−１）各遺伝子のNotIフラグメントの構築（センダイウイルスの転写シグナル付加）
マウスIL-10（mIL-10）遺伝子cDNA（Accession number NM_010548；配列番号：11；アミノ酸は配列番号：12）をtemplateにして、pmIL10-N（配列番号：13）およびpmIL10-C（配列番号：14）の２種のプライマーを用いてPCRを行い、NotIで消化後pBluescriptTM II KS（Stratagene）にサブクローニングし、センダイウイルスの転写シグナルを付加したmIL-10遺伝子NotIフラグメント（配列番号：15）を構築した。
配列番号 11
ATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTACTGACTGGCATGAGGATCAGCAGGGGCCAGTACAGCCGGGAAGACAATAACTGCACCCACTTCCCAGTCGGCCAGAGCCACATGCTCCTAGAGCTGCGGACTGCCTTCAGCCAGGTGAAGACTTTCTTTCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTTGCCAAGCCTTATCGGAAATGATCCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCAGAGAAGCATGGCCCAGAAATCAAGGAGCATTTGAATTCCCTGGGTGAGAAGCTGAAGACCCTCAGGATGCGGCTGAGGCGCTGTCATCGATTTCTCCCCTGTGAAAATAAGAGCAAGGCAGTGGAGCAGGTGAAGAGTGATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGTGTCTACAAGGCCATGAATGAATTTGACATCTTCATCAACTGCATAGAAGCATACATGATGATCAAAATGAAAAGCTAA
配列番号 13：ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTG
配列番号 14：ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAGCTTTTCATTTTGATCATCATGTATGCTTC
配列番号 15：
gcggccgccaaagttcaATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTACTGACTGGCATGAGGATCAGCAGGGGCCAGTACAGCCGGGAAGACAATAACTGCACCCACTTCCCAGTCGGCCAGAGCCACATGCTCCTAGAGCTGCGGACTGCCTTCAGCCAGGTGAAGACTTTCTTTCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTTGCCAAGCCTTATCGGAAATGATCCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCAGAGAAGCATGGCCCAGAAATCAAGGAGCATTTGAATTCCCTGGGTGAGAAGCTGAAGACCCTCAGGATGCGGCTGAGGCGCTGTCATCGATTTCTCCCCTGTGAAAATAAGAGCAAGGCAGTGGAGCAGGTGAAGAGTGATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGTGTCTACAAGGCCATGAATGAATTTGACATCTTCATCAACTGCATAGAAGCATACATGATGATCAAAATGAAAAGCTAAccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc【００６２】
（１−２）mIL-10遺伝子搭載F遺伝子欠失型SeV cDNAの構築
F遺伝子欠失型SeVベクター（WO00/70070）のcDNA（pSeV18+NotI/ΔF）をNotIで消化し、そのNotI部位にmIL-10遺伝子NotIフラグメントを挿入し、IL-10遺伝子搭載F遺伝子欠失型SeV cDNA（pSeV18+mIL10/ΔF）を構築した。【００６３】
〔実施例２〕センダイウイルスベクターの再構成と増幅
ウイルスの再構成および増幅はLiらの報告（Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WO00/70070）およびその改良法（WO2005/071092）に従って行った。ベクターの製造には、Cre/loxP発現誘導システムを利用してF蛋白質を発現誘導できるF蛋白質のヘルパー細胞を使用した。当該システムはCre DNA リコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドpCALNdLw（Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121 (1988)）を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにCre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウイルス（AxCANCre）をSaitoらの方法（Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821 (1995), Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115-1121 (1998)）で感染させて挿入遺伝子を発現させた。
これらの方法によって、マウス由来IL-10遺伝子（以下mIL-10と標記する）を搭載したF遺伝子欠失型SeVベクター（SeV18+mIL10/ΔFと表記する）を調製した。SeV18+mIL10/ΔFのゲノムRNA（マイナス鎖）を配列番号：16に、アンチゲノムRNA（プラス鎖）を配列番号：17に示す。また、M蛋白質にG69E，T116A，およびA183Sの温度感受性変異を、HN蛋白質にA262T，G264，およびK461Gの温度感受性変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197SおよびK1795E変異を持つ、F遺伝子を欠失したIL-10発現センダイウイルスベクター（以下SeV18+mIL10/TSΔFと表記する）のゲノムRNA（マイナス鎖）の配列を配列番号：18に、アンチゲノムRNA（プラス鎖）の配列を配列番号：19に示した。コントロールとして、大腸菌LacZ遺伝子を搭載するF遺伝子欠失型SeVベクター（SeV18+lacZ/ΔFと表記する）および温度感受性変異型のF遺伝子欠失SeVベクター（以下SeV18+LacZ/TSΔFと表記する）を同様の方法により製造した。【００６４】
〔実施例３〕アルツハイマー病モデル動物におけるSeV-mIL10/ΔF点鼻（経鼻）投与による治療効果
（３−１）動物および投与方法
APPトランスジェニックマウス（Tg2576；Hsiao K et al., Science, 1996, 274: 99-102）等のアルツハイマー病モデルマウス（以下APPマウスと標記する）を用い、本発明のSeV18+mIL10/ΔFによるアルツハイマー病に対する治療および予防効果を検討することができる。マウスを4匹ずつ2群にわけ、一方を治療群とし、もう一方をコントロール群とする。尚、今回検討で用いたＡＰＰトランスジェニックマウスの体重は、約20ｇであった。治療群には、1匹あたり5x106 CIU のSeV18+mIL10/ΔFを、コントロール群には、1匹あたり5x106 CIUのSeV18+lacZ/ΔFを点鼻（経鼻）投与する。例えば、SeV18+mIL10/TSΔF及びSeV18+LacZ/TSΔFを用いた実験例を示せば、16ヶ月齢のAPPマウス (Tg2576) (雌) を10匹ずつ3群に分け、それぞれ1匹あたり5x106, 5x107 CIU /20μl /headのSeV18+mIL10/TSΔF, または 5x107 CIU /20μl /headのSeV18+LacZ/TSΔFを点鼻投与した。投与前および投与3日後、マウスから血液を採取、血漿を調製し、血漿中のIL-10量を測定した。測定には、mouse IL10 ELISA Kit Quantikine (R&D Systems) を使用し、添付のプロトコールに従った。マウス血漿は、Kit付属のdilution buffer を用いて、1/50倍に希釈した。投与前血漿中のIL-10量は検出限界 (4 pg/mL) 以下または同程度であった。投与3日後の血漿中IL-10量を図１に示す。個体間に差はあるが、血漿中のIL-10は投与量依存的に検出された。【００６５】
（１）老人斑消失効果
センダイウイルスベクターを点鼻（経鼻）投与したマウスから、投与後8週間の時点を解剖し、例えば前頭葉皮質・頭頂葉・海馬の領域において、それぞれ脳組織切片を作製し、その凍結切片を用いて以下の実験を行うことができる。組織中のAβ蛋白や老人斑を検出するために、70％ギ酸で処理し、5％ H2O2で内因性のペルオキシダーゼ活性を失活させる。ラビット抗pan-Aβ抗体(1000倍希釈)と反応させた後、ペルオキシダーゼ標識2次抗体を加え、DAB染色を行う。各領域におけるAβ蓄積部分の面積を測定し、各測定部位に占めるAβ蓄積部分の面積率を計算する。【００６６】
具体的には、12ヶ月齢のAPPトランスジェニック雌マウス（Tg2576）（Hsiao K et al., Science, 1996, 274: 99-102）を用い、SeV18+mIL10/TSΔFによる効果を検討した。マウスを15匹ずつ２群に分け、一方を治療群とし、もう一方を対照群とした。治療群には、一匹あたり5×106 CIU のSeV18+mIL10/TSΔFを、対照群には一匹あたり5×105 CIU のSeV18+LacZ/TSΔFをセボフルレン軽麻酔下、点鼻（経鼻）投与した。処置４週間後の時点でSeV18+mIL10/TSΔF群５匹、SeV18+LacZ/TSΔF群４匹、および８週間後の時点でSeV18+mIL10/TSΔF群１０匹、SeV18+LacZ/TSΔF群９匹を採血後に解剖した。嗅球を含む脳を左右に縦分割し、一方を生化学的測定用に急速凍結保存、一方を病理組織学的検査用に４％パラフォルムアルデヒド液にて浸漬固定した。パラフィン包埋病理組織切片は中央線から1 mmの部分の嗅球を含む縦断面とし、一般的病理組織学的検査用にヘマトキシリン・エオジン染色を施し鏡検した。組織中のAβ蛋白や老人斑を検出するために抗Aβ抗体（4G8）で免疫染色を、また、ミクログリアおよびマクロファージの染色にはIba-1免疫染色を実施した。
抗Aβ抗体染色標本は、嗅球、大脳新皮質、海馬、および脳幹・小脳の４区画に分け、それぞれの領域に存在する老人斑および抗Aβ抗体染色陽性血管の多寡を光学顕微鏡で観察した。大脳新皮質に関しては同一倍率で取り込んだ画像を用いて、画像解析ソフト（NIH Image 日本語版）により老人斑の占める面積を定量した。
切片の染色結果の一例を図２（大脳新皮質頭頂葉および海馬）に示す。また、Aβ沈着面積率を図３に示す。海馬においては両群とも老人斑の発生が少なかったために明らかな差は認められなかったが、８週間後の大脳新皮質においてはSeV18+mIL10/TSΔF群で明らかに老人斑面積の減少が認められ、統計学的に有意（p<0.01）な差であった。
一方、Iba-1免疫染色標本では、大脳新皮質、海馬、脳幹・小脳などでは明らかな差異は観察されなかったが、嗅球において活性化ミクログリアの数に明らかな差異が観察された。図４に示すように、SeV18+mIL10/TSΔF群で４週間後および８週間後に活性化ミクログリア数が増加しており、同一倍率で取り込んだ画像を解析した結果、図５に示すようにIba-1陽性細胞の占める面積率は８週間後のSeV18+mIL10/TSΔF群で統計学的に有意（p<0.01 Student t test）に増加していた。このことは、SeV18+mIL10/TSΔF群では嗅球における異物（主にSeV感染嗅細胞の死骸）処理が活性化したミクログリアあるいはマクロファージにより盛んに行われていることを示唆している。また、鼻粘膜細胞で発現したmIL-10蛋白質が嗅細胞軸策を逆方向に嗅球まで輸送され、嗅球においてミクログリアの活性化が促進されていることを示唆している。また、各群の画像解析例数が少なく、また、解析例数が異なっていたため統計解析は実施しなかったが、投与４週間後でもSeV18+mIL10/TSΔF群はコントロール群（SeV18+LacZ/TSΔF群）に比べて明らかにミクログリア数は多かった。【００６７】
（２）脳組織におけるAβの測定
マウス大脳・小脳を正中裂で切断し、半球を-80℃に急速冷凍保存する。脳半球を1mlのTBS溶液中でホモジェナイズし、卓上超遠心機で100,000 g, １時間遠心する。可溶画分(TBS分画)を保存し、不溶画分を2%SDSに溶解しホモジェナイズ後、さらに100,000 g, １時間遠心する。可溶画分(2%SDS分画)を保存し、不溶画分を70%ギ酸に溶解しホモジェナイズ後、再び100,000 g, １時間遠心し可溶画分（ギ酸分画）を保存する。脳組織中のAβ40,42の測定には、Biosource社のELISA kitを使用する。TBS分画は、4倍希釈、2%SDS分画は、400-2000倍希釈、ギ酸分画は1M Tris溶液で1000倍希釈後にさらにELISA用希釈液を用いて希釈し（2〜10倍）測定する。【００６８】
具体的には、10ヶ月齢のAPPマウス (Tg2576) を10匹ずつ2群に分け、それぞれSeV18+mIL10/TSΔFとSeV18+LacZ/TSΔFを1匹あたり5x106 CIU /20μl /headで点鼻（経鼻）投与した。投与8週間後に脳を摘出、右半脳を用いた。protease inhibitor cocktail (CALBIOCHEM) を含有するTBS (50mM Tris-HCl, pH7.6, 150mM NaCl) をマウス脳の5倍量加え、テフロン（登録商標）ホモジナイザーでホモジナイズした。このホモジネートを100,000g, 4℃, 1 hr遠心し、上清を回収、-80℃に保存した（TBS画分）。沈殿物にマウス脳の3倍量の1% Triton X-100/TBS (protease inhibitors含有) を加え、ハンドホモジナイザーでホモジナイズした。このホモジネートを37℃, 15分インキュベートの後、100,000g, 4℃, 1 hr遠心し、上清を回収、-80℃に保存した（1% Triton画分）。さらに沈殿物にマウス脳の3倍量の2% SDS /TBS (protease inhibitors含有) を加え、ハンドホモジナイザーでホモジナイズした。このホモジネートを37℃, 15分インキュベートの後、100,000g, 25℃, 1 hr遠心し、上清を回収、-80℃に保存した（2% SDS画分）。最後に、沈殿物にマウス脳と等量の70%ギ酸を加え、ハンドホモジナイザーでホモジナイズした。このホモジネートを100,000g, 4℃, 1 hr遠心し、その上清を回収した。その上清に10倍量の1M Tris を加えてpH を調整した後、-80℃に保存した（FA画分）。
脳組織中Aβ量の測定には Human/Rat β Amyloid ELISA Kit WAKO (和光純薬) を使用した。測定結果を図６に示す。SeV18+LacZ/TSΔF投与群に比べ、SeV18+mIL10/TSΔF投与群でSoluble Aβ40 (TBS画分, 1%Triton画分) および insoluble Aβ42 (FA画分) が減少していた。【００６９】
〔実施例４〕SeV18+mIL10/TSΔF投与 (点鼻（経鼻）投与) におけるIL-10蛋白量測定
SeV18+mIL10/TSΔFの経鼻投与後の正常マウスにおける血中IL-10量の測定を、以下のように行った。8週齢のC57BL/6Nマウスを6匹ずつ2群に分け、それぞれ1匹あたり5x107, 5x108 CIU /20μl /headのSeV18+mIL10/TSΔFを点鼻（経鼻）投与した。投与前および投与3日後、マウスから血液を採取、血漿を調製し、血漿中のIL-10量を測定した。測定には、mouse IL10 ELISA Kit Quantikine (R&D Systems) を使用し、添付のプロトコールに従った。マウス血漿は、Kit付属のdilution buffer を用いて、1/50倍に希釈した。
投与前血漿中のIL-10量は検出限界 (4 pg/mL) 以下または同程度であった。投与3日後の血漿中IL-10量は、投与量依存的に増加した (図７)。【００７０】
〔実施例５〕SeV18+mIL10/TSΔF 投与（点鼻（経鼻）投与）によるIL-10蛋白分布
（１）血中IL-10量測定 Kinetics
5x107 CIU/20μl および5x106 CIU/20μlになるようにDPBS(-)に懸濁したSeV18+mIL10/TSΔF ベクター20μlを正常マウス（C57BL/6N, メス）各群６頭に経鼻投与した後、24時間おきに７日目までヘパリン入りヘマトクリット採血管を用いて眼窩採血した。採血後ヘマトクリット遠心機により血漿を分離し、-80℃にて保存した。対照として６頭にSeV18+LacZ/TSΔF を5x107 CIU/20μl を20μlを経鼻投与した。血漿中のマウスIL-10はELISA (R&D Systems 社  カタログ番号 M1000) を用いて操作書の指示に従って測定した。
その結果、SeV18+mIL10/TSΔF点鼻1回投与（5x107 CIU/head）のAUC (area under the pharmacokinetic curve) は 176,000 pg・h/ml であった（図８）。【００７１】
（２）脳内移行（脳組織中濃度）
5x108 CIU/53μlになるようにDPBS(-) に懸濁したSeV18+mIL10/TSΔF および対照として同濃度のSeV18+LacZ/TSΔFベクター 53μlを正常マウス（C57BL/6N, メス）各群10頭に経鼻投与した。非投与対照として10頭にDPBS(-)53μlを経鼻投与した。上記ベクターを投与後、３日目および７日目に、マウスをサクリファイスした。尚、以下、３日目にサクリファイスしたマウスの組織中についてのサンプルの標記は「3日目サンプル」と、7日目にサクリファイスしたマウスの組織中についてのサンプルの標記は「7日目サンプル」と標記する。各群5頭はエーテル麻酔下に開胸し、右心耳を切断した後左心房に24G針を装着した注射器を用いて30mlの生理食塩水を約８分かけて注入して灌流を行なった。灌流後第一環椎を切断した後開頭し、脳を回収した。脳は半球に分割後さらに嗅球、大脳部、小脳・延髄部に３分割し、液体窒素で急速凍結した後-80℃にて保存した。灌流しない5頭は、セボフレン麻酔下に開腹、後大静脈、腹大動脈を切断放血後開頭し、上記同様に脳を回収、保存した。灌流しない場合は、投与部位である鼻腔粘膜を含む鼻中隔、篩骨、鼻甲介を同様に回収保存した。各サンプルは抽出バッファー（1% Triton X-100, 50mM Tris-HCl, pH7.5, Complete Protease Inhibitor cocktail (Roche Diagnostics)）中でガラス-テフロン（登録商標）ホモジェナイザー（750rpm, 10 strokes）さらにDremel ホモジェナイザー（30,000rpm, 30sec）でホモジェナイズした後100,000g, 1時間超遠心して遠心上清を回収し、抽出液とした。抽出液は-80℃にて保存した。抽出液中のマウスIL-10はELISA (R&D Systems 社  カタログ番号 M1000) を用いて操作書の指示に従って測定した。
上記ベクターを投与後、3日目サンプルの灌流しない群において、各組織でｍIL-10が確認され、血漿及び鼻腔粘膜で発現した0.1％程度のｍIL-10量が、投与マウスの脳抽出液中で検出された（図９（Ｂ））。また灌流により血液除去した群においても、脳を含む各組織でIL-10が確認された（図１０（Ｂ））。７日目サンプルの灌流により血液を除去した群においても（図12（Ｂ））、嗅球では、７日目サンプル灌流しない群（図11（Ｂ））と同レベルmIL-10量が検出された。
また、上記ベクターを投与後、7日目サンプルの灌流しない群において、嗅球においては、3日目サンプルの灌流しない群（図9（Ｂ））と同レベルのｍIL-10量が検出された（図１１（Ｂ））。更に、７日目サンプルの灌流により血液を除去した群において、嗅球では、3日目サンプルの灌流により血液を除去した群（図10（Ｂ））と同レベルのｍIL-10量が検出された（図１２（Ｂ））。
このように、経鼻投与されたSeVベクターから発現したmIL-10は、中枢神経系組織に移行することが示された（図10（Ｂ）及び図12（Ｂ））。
特に嗅球においては、発現が確認できたmIL-10量は、灌流の有無によっても変化しないことから（図１０（Ｂ）及び図12（Ｂ））、点鼻投与されたSeVベクターから発現したmIL-10が、mIL-10が確実に嗅球に移行することが示唆された。【００７２】
（３）脳内移行（CSF内濃度）
1x109 CIU/106μlになるようにDPBS(-)に懸濁したSeV18+mIL10/TSΔF および対照として同濃度のSeV18+LacZ/TSΔFベクター106μlを正常ラット（Wistar メス）各群5頭に経鼻投与した。非投与対照として5頭にDPBS(-)106μlを経鼻投与した。投与後３日目にラットをサクリファイスした。麻酔下に後頚部の皮膚と筋肉を除去し硬膜を露出し、200μlピペットチップを大漕（magna sterna）内に挿入して脳脊髄液（CSF）を採取し、液体窒素で急速凍結し-80℃にて保存した。CSF中のマウスIL-10はELISA (R&D Systems 社  カタログ番号 M1000) を用いて操作書の指示に従って測定した。
その結果、血漿中濃度の約1/10程度のmIL-10が投与ラットのCSF中に検出された（図13）。血漿中mIL-10濃度とラットのCSF中mIL-10濃度には正の相関があった。経鼻投与されたSeVベクターから発現したmIL-10が、中枢に移行することが示された。【００７３】
〔実施例６〕IL-10 蛋白（皮下投与）による有効性評価
（１）血中IL-10量測定Kinetics
2.0μg/100μlになるようにDPBS(-)に懸濁した組み換えマウスIL-10（和光純薬  カタログ番号 M1000091-04691）100μlあるいは対照としてDPBS(-)100μlを正常マウス（C57BL/6N）各群3頭に背部皮下投与した後、1, 2, 3, 6, 9, 12, 24時間後にヘパリン入りヘマトクリット採血管を用いて眼窩採血した。採血後ヘマトクリット遠心機により血漿を分離し、-80℃にて保存した。血漿中のマウスIL-10はELISA (R&D Systems 社  カタログ番号 M1000) を用いて操作書の指示に従って測定した（図14）。Cmax=約12,000pg/ml；Tmax=約1.5hr；t1/2 =約1hr (初期値）。AUC は 40,800 pg h/ml であった。SeV18+mIL10/TSΔF投与（図８）とのAUC比は176,000/40,800 = 4.3 であり、約４回のくり返し投与により、SeV18+mIL10/TSΔF経鼻投与時のAUCを確保できることが示唆される。【００７４】
（２）APPマウスにおける血中IL-10量測定
組み換えマウス由来IL-10（和光純薬コードNo. 091-04691, http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/bai/article/cytokine.htm）を2.0μg/100μlになるようにDPBS(-)に懸濁し、その懸濁液100μl（以下ＩＬ-10懸濁液と標記する）あるいは対照としてDPBS(-)100μlを、APPマウス（Tg2576、メス  13月齢）各群８頭に、７日間にわたり12時間おきに計14回背部皮下投与した。尚、今回測定で用いたAPPトランスジェニックマウスの体重は、約20〜30ｇであった。１回目（Day 0）、７回目（Day 3）、13回目（Day 6）の投与1時間後にヘパリン入りヘマトクリット採血管を用いて眼窩採血した。採血後ヘマトクリット遠心機により血漿を分離し、-80℃にて保存した。血漿中のマウスIL-10はELISA (R&D Systems 社  カタログ番号 M1000) を用いて操作書の指示に従って測定した。
組み換えマウスIL-10の背中皮下注射により、投与１時間後のIL-10の血漿中濃度5000 pg/ml 〜 8,000 pg/ml を達成した（図15）。【００７５】
（３）IL-10タンパク質を投与したAPPマウスにおける老人斑消失効果
IL-10タンパク質を１日２回連続７日間皮下投与したマウスを、投与後４および8週間の時点で解剖し、例えば前頭葉皮質・頭頂葉・海馬の領域において、それぞれ脳組織切片を作製し、その凍結切片を用いて以下の実験を行うことができる。組織中のAβ蛋白や老人斑を検出するために、70％ギ酸で処理し、5％ H2O2で内因性のペルオキシダーゼ活性を失活させる。ラビット抗pan-Aβ抗体(1000倍希釈)と反応させた後、ペルオキシダーゼ標識2次抗体を加え、DAB染色を行う。各領域における老人斑（Aβ蓄積部分）の程度を調べるため、光学顕微鏡下で半定量あるいは組織切片の画像を用いて老人斑面積を測定し、各測定部位に占める老人斑の面積率を計算する。【００７６】
具体的には、13ヶ月齢のAPPトランスジェニック雌マウス（Tg2576）を用い、IL-10懸濁液による効果を検討した。尚、今回検討で用いたAPPトランスジェニックマウスの体重は、約20〜30ｇであった。マウスを15匹ずつ２群に分け、一方を治療群とし、もう一方を対照群とした。治療群には、一匹あたり2μg/100μl のマウスIL-10懸濁液を、対照群には一匹あたり100μlのDPBS(-)を１日２回１２時間間隔で皮下投与した。処置終了４週間後の時点でIL-10懸濁液投与群8匹、DPBS(-)投与群7匹を採血後に解剖した。嗅球を含む脳を左右に縦分割し、一方を生化学的測定用に急速凍結保存、一方を病理組織学的検査用にOTCコンパウンドに包埋しドライアイスにて凍結した。病理組織標本は中央線から1mmの部分の嗅球を含む縦断面とし、凍結切片を作製、短時間ホルマリン固定後、一般的病理組織学的検査用にヘマトキシリン・エオジン染色を施し鏡検した。組織中のAβ蛋白や老人斑を検出するために抗Aβ抗体（4G8）で免疫染色を、また、ミクログリアおよびマクロファージの染色にはIba-1免疫染色を実施した。
抗Aβ抗体染色標本は、嗅球、大脳新皮質、海馬、および脳幹・小脳の４区画に分け、それぞれの領域に存在する老人斑および抗Aβ抗体染色陽性血管の多寡を光学顕微鏡で観察した。一般に脳幹・小脳部分には老人斑沈着はみられないので、嗅球、大脳新皮質および海馬に関して、光学顕微鏡下で認められる老人斑を大きさにより３種類（大・中・小）に区分し、それぞれにスコアを設定（大：９点、中：３点、小：１点）し、そのスコア合計により老人斑の程度を半定量的に評価した。また、各個体のスコア合計点を用いてIL-10の効果について統計解析した。嗅球、大脳新皮質および海馬に関しては、同一倍率で取り込んだ画像を用いて、画像解析ソフト（NIH Image 日本語版）により老人斑の占める面積を定量した。
切片の染色結果の一例を図16（大脳新皮質頭頂葉および海馬）に示す。また、老人斑の半定量成績を図17、老人斑面積定量成績を図18に示す。嗅球、大脳新皮質および海馬においては両群とも老人斑の発生が明らかに認められた。４週間後の嗅球・大脳新皮質・海馬においてはDPBS(-)投与対照群に比べてIL-10懸濁液投与群で明らかに老人斑の減少（約５０％）が認められ（図16）、半定量の結果、統計学的に有意（p<0.05）な差であった（図17）。また、老人斑面積定量の結果では、PBS対照群に比べmIL-10投与群では、老人斑の程度は減少傾向（約５０％）を示した（p=0.06）（図18）。このことから、IL-10懸濁液投与群では脳における老人斑ないしAβ沈着物の処理が、活性化したミクログリアあるいはマクロファージにより亢進したことを示唆している。【００７７】
尚、上記実施例ではSeV18+mIL10/TSΔF及びSeV18+LacZ/TSΔFを用いたが、本発明のベクターは上記形態に限定されるものではない。例えば、F遺伝子を欠失していないSeVベクター、F遺伝子欠失型だが温度感受性ではないSeVベクター等にIL-10などの抗炎症サイトカイン遺伝子を搭載したベクターを用いても、本実施例に示した同様の効果が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により、抗炎症サイトカイン、または抗炎症サイトカインをコードする(-)鎖RNAウイルスベクターなどの抗炎症サイトカインを発現するベクターを含むアルツハイマー病治療薬、および該サイトカインまたはベクターによるアルツハイマー病の遺伝子治療方法が提供された。本発明の方法は、他のアルツハイマー病治療方法と代替または併用可能な新たな治療手段となり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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