(57)【要約】  ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたラットの胸管および胸管に付随して並走する下大静脈を用い、内皮細胞およびリンパ管細胞に特異的なマーカーを利用して選別クローニングを行うことで胸管由来または胸管に付随して併走する静脈由来の継代維持可能な細胞株の樹立方法を見出した。さらに、得られたリンパ管内皮細胞および血管内皮細胞をゲル上に播種し管腔形成を観察することで、試験管内での管腔形成能を指標としたリンパ管新生の評価系を構築できた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたトランスジェニック哺乳動物の胸管から採取された胸管リンパ内皮細胞又は胸管に付随して並走する下大静脈から採取された血管内皮細胞に由来する継代可能な細胞株。
【請求項２】
胸管リンパ内皮細胞に由来することを特徴とする請求項１に記載の継代可能な細胞株。
【請求項３】
哺乳動物がラットである請求項１に記載の細胞株。
【請求項４】
内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーの有無によりスクリーニングして得られた請求項１に記載の細胞株。
【請求項５】
内皮細胞に特異的なマーカーが、ＣＤ３１抗原であり、リンパ管に特異的なマーカーがＰｒｏｘ−１及び／又はＬＹＶＥ−１であることを特徴とする請求項４に記載の細胞株。
【請求項６】
前記マーカーの有無を抗体により確認する請求項５に記載の細胞株。
【請求項７】
請求項１に記載のリンパ管細胞及び／又は血管内皮細胞に由来する細胞株を含んでなる、管腔形成を試験管内で観察することによるリンパ管新生の評価キット。
【請求項８】
請求項２に記載のリンパ管細胞に由来する細胞株を含んでなる管腔形成を試験管内で観察することによるリンパ管新生の評価キット。
【請求項９】
ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたトランスジェニック哺乳動物を準備するステップと、
前記哺乳動物の胸管から内皮細胞を含む細胞を得るステップと、
内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーの有無により前記内皮細胞を含む細胞をスクリーニングし、内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーが発現している細胞をリンパ管内皮細胞と同定するステップと
を含む、リンパ管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１０】
哺乳動物がラットである請求項９に記載のリンパ管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１１】
内皮細胞に特異的なマーカーが、ＣＤ３１抗原であり、リンパ管に特異的なマーカーがＰｒｏｘ−１及び／又はＬＹＶＥ−１であることを特徴とする請求項９に記載のリンパ管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１２】
前記マーカーの有無を抗体により確認する請求項９に記載のリンパ管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１３】
請求項９の樹立方法により得られるリンパ管内皮細胞由来の株化細胞。
【請求項１４】
ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたトランスジェニック哺乳動物を準備するステップと、
前記哺乳動物の胸管に付随して並走する下大静脈から内皮細胞を含む細胞を得るステップと、
内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーの有無により前記内皮細胞を含む細胞をスクリーニングし、内皮細胞に特異的なマーカーは発現しているが、リンパ管に特異的なマーカーは発現していない細胞を血管内皮細胞と同定するステップと
を含む、血管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１５】
哺乳動物がラットである請求項１４に記載の血管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１６】
内皮細胞に特異的なマーカーが、ＣＤ３１抗原であり、リンパ管に特異的なマーカーがＰｒｏｘ−１及び／又はＬＹＶＥ−１であることを特徴とする請求項１４に記載の血管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１７】
前記マーカーの有無を抗体により確認する請求項１６に記載の血管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１８】
請求項１４の樹立方法により得られる血管内皮細胞由来の株化細胞。
【請求項１９】
請求項７に記載のリンパ管新生評価キットを用いるスクリーニング方法であって、被検物質を前記細胞株と接触させ、管腔形成の程度を測定することを特徴とするリンパ管新生阻害物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項８に記載のリンパ管新生評価キットを用いるスクリーニング方法であって、被検物質を前記細胞株と接触させ、管腔形成の程度を測定することを特徴とするリンパ管新生阻害物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載のリンパ管新生阻害物質又は促進物質のスクリーニング方法により得られるリンパ管新生阻害物質。
【請求項２２】
請求項２０に記載のリンパ管新生阻害物質又は促進物質のスクリーニング方法により得られるリンパ管新生阻害物質。
【請求項２３】
請求項７に記載のリンパ管評価キットを用いて、（ｉ）胸管由来の細胞株に発現する遺伝子または蛋白質と、（ｉｉ）血管内皮細胞由来の細胞株に発現する遺伝子または蛋白質とを比較することを含む、リンパ管関連またはリンパ管新生に関与する遺伝子またはタンパク質を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたラットの胸管リンパ管内皮細胞および該ラット胸管に付随して並走する静脈の内皮細胞由来の株化細胞を利用した、管腔形成を試験管内で観察することを特徴とするリンパ管新生評価系に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内の脈管系は血管内皮細胞から構成される血管系と、リンパ管内皮細胞から構成されるリンパ管系とに大別できる。血管系に関してはこれまでに、各臓器における血管の機能は、臓器特異性を有することが分子および遺伝子のレベルでも明らかとなってきている。また、正常状態では女性の月経時に血管新生が生じ、疾病状態では損傷治癒時、リウマチの悪化時、腫瘍増殖時および転移形成時等に血管新生が生じることが知られている。さらに学際的に多大な努力が費やされ、血管新生が生理的および病理的にも重要な役割を果たしていることが、分子レベル、遺伝子レベルで解明されている。その結果、腫瘍の増殖・転移等を含むこれら病的な新生血管を治療の標的とする戦略が考案されており、既に、数多くの血管新生阻害剤が、リウマチや腫瘍治療に実用化されている。
血管機能や血管新生機序を解明でき、医薬品が開発され、人類の福祉に貢献できたのは、各種臓器より血管内皮細胞が単離され、その培養技術が飛躍的に向上したことにより、細胞・遺伝子レベルでの研究が試行できるようになったことが最大の要因である。例えば、血管内皮細胞はゲル上に播種・培養することで、生体内での血管系機能を維持した管腔を形成するが、これは試験管内血管新生のモデルとして既に汎用されている。試験管内血管新生モデルを使用し、無作為に化学合成された低分子有機化合物について、血管内皮細胞の管腔形成の阻害効果を指標にスクリーニングすることで、血管新生阻害剤が開発され、実用化に至っている。【０００３】
一方、リンパ管系はこれまで、生体内での老廃物等を、ただ、受動的に排出することで生体の恒常性を保持するためだけに存在していると考えられてきた。従って、リンパ管やリンパ管新生が疾病状態において積極的かつ能動的に寄与することは、ほとんど想定されていなかった。学際的にも血管系や血管新生研究と比較すると、その進展はたち遅れている。リンパ管新生が関与している病態は多々あるが、リンパ管機能の異常を基に大別すると、リンパ管新生機能の異常亢進に起因するものと、リンパ管新生機能の傷害に起因するものがある。
（1）リンパ管新生機能の異常亢進に起因する疾病
種々のがん細胞のリンパ節転移が挙げられる。リンパ節転移の機序に関して、最近、腫瘍が産生する脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ）により腫瘍リンパ管新生が惹起され、その結果、リンパ節転移が亢進する事など（非特許文献１）、腫瘍リンパ管新生および腫瘍のリンパ節転移が分子レベルで解明されつつある。しかし、安定したリンパ管新生評価系がなく、腫瘍リンパ管新生の分子・遺伝子レベルでの研究および医薬品開発等への臨床応用研究が発展しない大きな理由となっている。
（2）リンパ管新生機能が傷害される疾病
多くの疾病において、二次的に生じるリンパ浮腫が挙げられる。リンパ浮腫は先天的な遺伝病によるものと後天的なリンパ管損傷によるものがある。代表的な例として、がん手術後の上肢あるいは下肢のリンパ浮腫であり、これは、ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子による遺伝子治療により、リンパ管新生を誘導することで、治療効果を得ている（非特許文献２）。
他方、各臓器におけるリンパ管の機能特異性や腫瘍リンパ管新生を初めとしたリンパ管新生の研究は、電子顕微鏡等を用いた形態学・解剖学的なマクロの視点に立った研究が主に進められているが、リンパ管内皮細胞を用いた研究は、リンパ管内皮細胞の培養・維持・継代は非常に困難であることから、初代培養系で行われているのが現状である。そうした中、ラットのリンパ管内皮細胞を低酸素空気中、内皮成長培地ＥＧＭ−２（ｃｌｏｎｔｅｃｓ  ＵＳＡ）で培養することで、第三から第四継代の細胞株が得られている（特許文献１）。また、微小血管内皮細胞からＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインを認識する特定の抗体を利用してリンパ管内皮細胞を単離する方法が知られている（特許文献２）。【０００４】
また、初代細胞にｒａｓやｃ−ｍｙｃなどの発癌遺伝子、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原遺伝子、ヒトパピローマウイルスのＨＰＶ１６遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、しかも継代することによってもその細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞株を樹立する試みがなされている。しかし、この様な不死化細胞株においても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を調製し、これらの癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞株の取得は困難であった。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは極めて困難であった。【０００５】
これに対し、近年確立された動物個体への遺伝子導入技術を用いて、個々の細胞に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入するかわりに、これらの遺伝子を安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出して、個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を細胞の中に保有する動物の臓器から初代細胞を調製して、これを継代することにより不死化細胞株を樹立する方法が報告されている。特に、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットは、その臓器から不死化細胞株を容易に得ることができ、得られた細胞の増殖や分化形質の発現は、温度を変えることによって操作することができるため非常に有効である（非特許文献３）、（非特許文献４）、本ラットから、樹立された細胞株としては、例えば、血液脳関門や血液網膜関門の血管内皮細胞（特許文献３）、網膜神経細胞（特許文献４）、歯根膜細胞（特許文献５）などが知られている。【０００６】
【特許文献１】特開２００４−２４８５７７
【特許文献２】特表２００５−５０００４５
【特許文献３】国際公開ＷＯ００／２０５９９
【特許文献４】特開２００２−１１２７６４
【特許文献５】特開２００２−２６２８６２
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｃｉｎｅ  ７，１８６−１９１（２００１）
【非特許文献２】「血管研究がわかる」１１７頁、洋土社、２００４年
【非特許文献３】Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，２１５−２２５（１９９５）
【非特許文献４】Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ２，２３５−２４４（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リンパ管新生の詳細な細胞・分子・遺伝子レベルでの機序解明の推進および種々の病態に関与するリンパ管新生を抑制する薬剤の開発を行うには、リンパ管新生のメカニズムに合わせたアッセイ系が必要となる。また、アッセイ系の構築にあたっては、リンパ管と血管との差異の詳細も明確とはなっていないことから、常に対照群となる血管内皮細胞を必要とするなど、血管新生の評価系の構築とは違ったアプローチが必要である。
従って、本発明の目的は、リンパ細胞の管腔形成を試験化内でアッセイする評価系の構築、それに使用する細胞株の樹立方法、さらにその評価系の利用によりリンパ管新生の阻害や促進効果を有する化合物、遺伝子、タンパク質等を見出し、癌のリンパ節転移やリンパ浮腫等、リンパ管新生が関与した疾患の新規な治療薬・治療法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、不死化細胞株の樹立に有効なＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を内在性のラージＴ抗原遺伝子プロモーターの支配下で全身性に発現するトランスジェニックラットの胸管およびそれに付随して並走する静脈内にコラゲナーゼ溶液を注入し、剥離してきたリンパ管および血管内皮細胞を採取し、内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーを利用して選別クローニングする方法により不死化細胞株を取得した。得られた不死化リンパ管内皮細胞および血管内皮細胞をゲル上に播種することで、試験管内で管腔形成を観察するリンパ管新生の評価系を構築し、本発明を完成させた。以下、本発明を詳細に説明する。【０００９】
本発明で使用するＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８ラージＴ抗原遺伝子が導入されたラットは、全細胞にｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が発現するトランスジェニックラットであり、その作成法などは特開２０００−２２８９３０に記載されている。また、このラットには、さらに改変型蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子が導入されていてもよい。
このラットから、リンパ管内皮細胞および血管内皮細胞を得るには、ラットの胸管およびそれに付随して並走する下大静脈などの静脈内を結紮し、トリプシン、コラゲナーゼなどの酵素溶液を注入後、酵素溶液内に剥離したリンパ管および血管内細胞をシャーレ上に回収し、さらに、回収したリンパ管内皮細胞および血管内皮細胞を２回継代培養の後、コロニー形成を行い、増殖速度の比較的速いコロニーを、ペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離する。この操作を３回繰り返して行い細胞株を単離すればよい。また、培養に使用する培地は、公知のものあるいは市販のものを適宜使用すればよい。【００１０】
培養された細胞は特異的なマーカーによりリンパ管内皮細胞あるいは血管内皮細胞として同定することができる。例えば、内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１抗原をＦＡＣＳ法(fluorescence-activated cell sorter)で検定することにより、細胞株が内皮細胞であることを同定できる。また、リンパ管内皮細胞のマーカーであるＰｒｏｘ−１、ＬＹＶＥ−１をウエスタンブロティング法およびＲＴ−ＰＣＲで検定することにより、胸管より得られた細胞株がリンパ管内皮細胞であることを同定できる。【００１１】
得られた細胞をゲル上で管腔形成能を指標に評価することにより、リンパ管および血管内皮細胞本来の機能を保持することを確認することができる。
また、３３℃におけるラージＴ抗原の発現と、３７℃での消失をウエスタンブロティング法で検出することにより、両細胞株が温度感受性を有することを確認することができる。【００１２】
試験管内リンパ管および対照群となる血管新生のアッセイ系は、例えば、得られたリンパ管内皮細胞あるいは血管内皮細胞を培地に懸濁し、ゲルをコートしたプレートに播種し、ゲル上での管腔形成能を倒立顕微鏡などで観察すればよい。管腔形成能は、例えば、倒立顕微鏡にカメラを装着し、撮影した写真からランダムに数視野を選び、リンパ管内皮細胞および血管内皮細胞が形成した管腔の長さを画像解析により計測し、リンパ管内皮細胞群の血管内皮細胞群に対する割合を算出し指標とすればよい。【００１３】
本発明のリンパ管新生系において、リンパ管の新生を阻害する物質をスクリーニングする場合、予め、線維芽細胞増殖因子２（FGF2）等で、増殖能を高めた本発明のリンパ管内皮細胞を用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】リンパ管内皮細胞およびそれに付随・並走する静脈からのリンパ管および血管内皮細胞の樹立方法（写真１）
【図２】樹立した細胞株におけるラージＴ抗原タンパク質の確認（写真２）
【図３】樹立した細胞株におけるＣＤ３１およびＰｒｏｘ−１の発現の確認（写真３）
【図４】樹立した細胞株を用いた試験管内リンパ管および対照となる血管新生モデルの構築（写真４）
【図５】本発明のモデルを用いて探索されたリンパ管新生特異的発現遺伝子（写真５）
【図６】FGF誘導性の樹立した細胞株の細胞管腔形成能に及ぼすJNK、MEK、PI3KおよびFGFR-TK阻害剤の効果
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の胸管リンパ内皮細胞に由来する継代可能な細胞株は、ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたトランスジェニック哺乳動物から胸管内皮細胞を採取して得られる。また、本発明の血管内皮細胞に由来する継代可能な細胞株は、ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたトランスジェニック哺乳動物から胸管に付随して並走する静脈を採取して得られる。これらの内皮細胞は、コラゲナーゼ／ＥＤＴＡ溶液で処理して内皮細胞を分離することにより得られる。
胸管又は静脈細胞を培養後、マーカー蛋白質の発現の有無を確認することにより、得られた細胞について、リンパ管内皮細胞又は血管内皮細胞であると同定することができる。具体的には、リンパ管内皮細胞の同定には、内皮細胞マーカーを発現し、かつ、リンパ管内皮細胞特異マーカーを発現することを確認する。血管内皮細胞の同定には、内皮細胞マーカーを発現するが、リンパ管内皮細胞特異マーカーを発現することを確認する。内皮細胞マーカーとしては、ＣＤ３１抗原、Ｔｉｅ−２、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、ＣＤ３４、Ｎｏｔｃｈ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲからなる群から選択される１以上を用いることができ、リンパ管特異的マーカーとしては、Ｐｒｏｘ−１、ＬＹＶＥ−１、VEGFR-3、Ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ、ＳＬＣからなる群から選択される１以上を用いることができる。【００１６】
内皮細胞マーカー又はリンパ管内皮細胞特異的マーカーの発現の有無を確認する前に、ラージＴ抗原蛋白質の発現が温度感受性であることを確認することが望ましい。すなわち、ラージＴ抗原蛋白質が３３℃の培養条件では発現するが、３７℃の培養条件では発現しないことを確認することが望ましい。このようなＳＶ４０温度感受性突然変異細胞株は、温度条件によりその増殖を制御しうる、すなわち３３〜３７℃において永久的増殖能を保持し、３９℃においては増殖を停止するため、細胞固有の分化形質の発現を制御することができることから好ましい。
このようにして得られた細胞はリンパ管又は血管細胞が有する管腔形成能力を有する。管腔形成能力は、顕微鏡による観察などにより確認することができる。【００１７】
得られたリンパ管内皮細胞株及び血管内皮細胞株は、管腔形成阻害剤又は促進剤のスクリーニングに用いることができる。例えば、管腔形成阻害剤のスクリーニングには、ＦＧＦなどの細胞増殖因子を含有する培地中に被検物質を添加し、本発明のリンパ管内皮細胞株又は血管内皮細胞株の管腔形成の程度を測定することにより行うことができる。被検物質の添加により管腔形成がコントロールよりも低下した場合には、被検物質を管腔形成阻害剤の候補とすることができる。また、管腔形成促進剤のスクリーニングには、培地中に被検物質を添加し、本発明のリンパ管内皮細胞株又は血管内皮細胞株の管腔形成の程度を測定することにより行うことができる。被検物質の添加により管腔形成がコントロールよりも向上した場合には、被検物質を管腔形成促進剤の候補とすることができる。
また、本発明のリンパ管内皮細胞株及び血管内皮細胞株を用いて、リンパ管内皮細胞と血管内皮細胞とで発現する遺伝子又は蛋白質を比較し、リンパ管内皮細胞では発現されるが血管内皮細胞で発現されない遺伝子若しくは蛋白質を同定することにより、リンパ管関連遺伝子若しくは蛋白質又はリンパ管新生に関与する遺伝子若しくは蛋白質を同定することができる。      【００１８】
以下は、本発明の実施態様例である。
（１）ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたラットの胸管から採取した細胞を、内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーを利用して選別クローニングして得られる胸管リンパ内皮細胞由来の継代維持可能な細胞株を用い、該細胞株の管腔形成を試験管内で観察することを特徴とするリンパ管新生評価系。
（２）ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたラットの胸管および胸管に付随して並走する下大静脈から採取した細胞を、内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーを利用して選別クローニングして得られる胸管および胸管に付随して並走する静脈内皮細胞由来の継代維持可能な細胞株を用い、該細胞株の管腔形成を試験管内で観察し比較することを特徴とするリンパ管新生評価系。
（３）内皮細胞のマーカーとしてＣＤ３１抗原、リンパ管のマーカーとしてＰｒｏｘ−１および／またはＬＹＶＥ−１を使用し、それらに対する抗体を用いて細胞を選別することを特徴とする上記（１）及び（２）に記載のリンパ管新生評価系。
（４）ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたラットの胸管および胸管に付随して並走する下大静脈を用い、内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーを利用して選別クローニングを行うことを特徴とする胸管由来または胸管に付随して並走する静脈由来の継代維持可能な細胞株の樹立方法。
（５）マーカーとして、ＣＤ３１抗原並びにＰｒｏｘ−１および／またはＬＹＶＥ−１を使用し、それらに対する抗体を用いて細胞を選別し、株化リンパ管内皮細胞または胸管に付随して並走する静脈内皮細胞を得ることを特徴とする上記（４）記載の方法。
（６）上記（４）または（５）記載の細胞株の樹立方法により得られるリンパ管内皮細胞由来の株化細胞または胸管に付随して並走する静脈内皮細胞由来の株化細胞。
（７）上記（１）〜（３）のいずれかリンパ管評価系を用い、ラット胸管由来の細胞株の遺伝子と（ｉｉ）ラット胸管に付随して並走する静脈皮内皮細胞の遺伝子またはタンパク質を比較することを特徴とするラットのリンパ管関連またはリンパ管新生の遺伝子またはタンパク質の同定もしくはその機能解析する方法。
【実施例】
【００１９】
以下の実施例によって本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示したのみであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
下記の例で使用する主な略号：
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩
ＥＧＦＰ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ【００２０】
実施例１
トランスジェニックラットの胸管からのリンパ管内皮細胞およびそれに付随して並走する静脈からの血管内皮細胞の分離
胸管からのリンパ管内皮細胞および胸管に付随して並走する静脈からの血管内皮細胞の分離は  以下のように行なった。ＥＧＦＰ−ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットを麻酔化で開胸し、下大静脈とそれに付随するリンパ管を結合組織より剥離し、リンパ管と静脈を実体顕微鏡化でピンセットを用いて乖離した。次に、胸管および静脈のそれぞれの上端を縫合糸で結紮し、下端より、ツベルクリン用注射針でコラゲナーゼ／ＥＤＴＡ溶液を注入した。コラゲナーゼ／ＥＤＴＡ溶液が胸管及び静脈内に含まれている状態のまま、注射針の進入部より上端を縫合糸で結紮し、コラゲナーゼ／ＥＤＴＡ溶液が内包されている胸管および静脈を摘出した。摘出した胸管および静脈をシャーレ内に静置し、37℃の炭酸ガス培養器内で放置することにより、内包されたコラゲナーゼ／ＥＤＴＡ溶液により胸管および静脈からリンパ管および血管内皮細胞を剥離させた。その後、剥離したリンパ管および血管内皮細胞が浮遊している内包されたコラゲナーゼ／ＥＤＴＡ溶液を7mLの培養液（Ｈｕ−Ｍｅｄｉａ  ＥＧ２、クラボウ社製）に分散して１枚のI型コラーゲンをコートした100mmφ培養シャーレ（ベクトン・ディッキンソン社製）に種播した。37℃の炭酸ガス培養器（5％二酸化炭素−95％空気、飽和湿度）内で培養（初代培養）してコロニーを形成させた。培地を一週間に2回交換し、7〜10日後にコロニーを形成した増殖速度の比較的速いコロニーを、ペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離した。得られた細胞を再び100mmφ培養シャーレに播種して33℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロニー形成を行った。さらにペニシリンカップを用いて増殖速度の比較的速いコロニーを周囲の細胞から単離して胸管由来リンパ管細胞株（Ｂ２ＴＤ）および静脈由来の血管内皮細胞株（Ｐ４ＩＶＣ）を得た。（図１／写真１）【００２１】
実施例２
ラージＴ抗原タンパク質の確認
実施例１で得られた胸管由来リンパ管細胞株（Ｂ２ＴＤ）および静脈由来の血管内皮細胞株（Ｐ４ＩＶＣ）におけるラージＴ抗原蛋白質の発現をウエスタンブロット法（実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ「分子生物学的アプローチによる癌研究プロトコール」、108〜115頁、羊土社、1995年発行）により検討した。両細胞株（継代数：20）を60mmφ培養シャーレで飽和まで培養した。回収した細胞を3％ＳＤＳ−ＰＢＳ（ｐH7.4）で可溶化した後、遠心（10000rpm、10分間）して不溶画分を除去した後、フラッドフォード法（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製プロテインアッセイキットを使用）で総蛋白質量を定量した。それぞれ20μgの蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロース膜に転写した。3％スキムミルク溶液でさらにブロッキングした後に、ニトロセルロース膜に一次抗体として抗ＳＶ４０ラージＴ抗原抗体（ＤＰ０２−Ｃ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を、ニ次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させ、ラージＴ抗原蛋白質特異的な反応を、アマシャム社製ＥＣＬウエスタンブロティング検出システム（ＲＰＮ２１０６Ｍ１）を用いて検出した。両細胞株においてラージＴ抗原蛋白質が３３℃では発現するが、３７℃以上ではその発現が消失することが確認され、ラージＴ抗原蛋白質の発現は温度感受性であることが確認された。（図２／写真２）【００２２】
実施例３
胸管由来細胞株におけるリンパ管内皮細胞の同定
得られた胸管由来細胞株Ｂ２ＴＤがリンパ管内皮細胞であることを、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１抗原の発現をＦＡＣＳ法にて、リンパ管内皮細胞特異マーカーのＰｒｏｘ−１をウエスタンブロティング法で検定することにより同定した。
先ず、ＣＤ３１抗原の発現をＦＡＣＳ法で検定した。胸管由来リンパ管細胞株（Ｂ２ＴＤ）を60mmφ培養シャーレで80％飽和まで培養した。回収した細胞1×106個を1mLのＰＢＳ（−）で懸濁し、遠心後、ペレットを0.1ｍLのＰＢＳ（−）で再懸濁し、一次抗体として抗ラットＣＤ３１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を反応させ、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を反応させ、ＣＤ３１抗原特異的な発現を、ベクトン社製ＦＡＣＳを用いて検出した。
さらに、リンパ管内皮細胞特異マーカーのＰｒｏｘ−１をウエスタンブロティング法で検定を行った。実施例２と同じ方法で作製したニトロセルロース膜を用いて、一次抗体として抗ラットＰＲＯＸ−１抗体（ＡｎｇｉｏＢＩｏ社製）を、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を反応させた。Ｐｒｏｘ−１蛋白質特異的な反応を、アマシャム社製ＥＣＬウエスタンブロティング検出システム（ＲＰＮ２１０６Ｍ１）を用いて検出した。ＣＤ３１抗原陽性かつＰｒｏｘ−１陽性であることから、得られた胸管由来細胞株の細胞株Ｂ２ＴＤがリンパ管内皮細胞であることが同定された。（図３／写真３）【００２３】
実施例４
静脈由来細胞株における血管内皮細胞の同定
得られた血管由来細胞株Ｐ４ＩＶＣが血管内皮細胞であることを、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１抗原の発現をＦＡＣＳ法にて、リンパ管内皮細胞特異マーカーのＰｒｏｘ−１をウエスタンブロティング法で検定することにより同定した。
先ず、ＣＤ３１抗原の発現をＦＡＣＳ法で検定した。血管由来リンパ管細胞株（Ｐ４１ＶＣ）を60mmφ培養シャーレで80％飽和まで培養した。回収した細胞1×106個を1mLのＰＢＳ（−）で懸濁し、遠心後、ペレットを0.1mLのＰＢＳ（−）で再懸濁し、一次抗体として抗ラットＣＤ３１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を反応させ、二次次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を反応させ、ＣＤ３１蛋白質特異的な発現をベクトン社製ＦＡＣＳで検出した。
さらに、リンパ管内皮細胞特異マーカーのＰｒｏｘ−１をウエスタンブロティング法で検定を行った。実施例２と同じ方法で作製したニトロセルロース膜を用いて、一次抗体として抗ラットＰｒｏｘ−１抗体（ＡｎｇｉｏＢＩｏ社製）を、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を反応させた。Ｐｒｏｘ−１蛋白質特異的な反応を、アマシャム社製ＥＣＬウエスタンブロティング検出システム（ＲＰＮ２１０６Ｍ１）を用いて検出した。ＣＤ３１抗原陽性かつＰｒｏｘ−１陰性であることから、得られた静脈由来細胞株の細胞株Ｐ４ＩＶＣが血管内皮細胞であることが同定された。（図３／写真３）【００２４】
実施例５
リンパ管新生評価系の構築
得られた両細胞株がリンパ管および血管機能を保有しているかどうかを、ゲル上での管腔形成能力を指標に検定した。すなわち、両細胞株を0.2％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に懸濁し（6×104／mL）、ゲル（1mg／ウェル）をコートした48穴プレート（No.3548、Ｃｏｓｔａｒ社製）に播種した。1時間毎に、ゲル上でのリンパ管内皮細胞および血管内皮細胞の管腔形成能を倒立顕微鏡にて観察し写真撮影を行った（図４／写真４）。その結果、両細胞とも良好な管腔を形成していた。管腔形成能力は、細胞播種後経時的に撮影像よりランダムな５視野を選び、リンパ管内皮細胞および対照群のとなる血管内皮細胞が形成した管腔の長さを画像解析により計測し、対照群に対する割合を算出することにより評価した。【００２５】
実施例６
リンパ管管腔形成阻害物質のスクリーニング
血清飢餓状態のＢ２ＴＤ細胞(1×104)をＦＧＦ２含有ＤＭＥＭ培地に懸濁し、ＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤）、Ｕ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）、ＬＹ２９４００２（ＰＩＫ阻害剤）又はＳＵ４９８４（ＦＧＦＲ−ＴＫ阻害剤）により、それぞれ20 mMで5分間前処理した後、マトリゲルをコートした96穴プレートに播種した。37℃で3時間培養した後に、 形成した管腔の長さを、マップメーターを用いて測定した。データは平均（4穴）±標準偏差で示した。*p < 0.05はＦＧＦ２処理群と比較したｐ値を示す。（図６）
したがって、実施例１で得られた胸管由来リンパ管細胞株は既存の阻害物質により管腔形成の阻害を受けることが示され、胸管由来リンパ管細胞株は、リンパ管管腔形成阻害物質のスクリーニングに有効であることがわかった。【００２６】
リンパ管新生特異的発現遺伝子の探索
実施例５で構築した試験管内リンパ管新生評価系を使用して、リンパ管新生特異的発現遺伝子の探索を行った。両細胞株をゲル上に播種した直後および管腔形成時に、両細胞株を回収しｃＤＮＡマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用し、網羅的な発現解析を行った。その結果、約400個のリンパ管およびリンパ管新生特異的な遺伝子が同定された。（図５／写真５）
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明の方法で得られた管腔形成能力を有するリンパ管内皮細胞および静脈血管内皮細胞の不死化細胞株により、それらを用いた管腔形成を試験管内で観察することを特徴とするリンパ管新生評価系が提供される。
本発明により提供されるリンパ管新生評価系は、リンパ管での薬物透過研究、リンパ管に対する各種因子の供給や代謝物質の研究、リンパ管内皮細胞膜に存在する選択的物質透過の輸送機構研究、リンパ管内皮細胞に対する薬物の毒性研究に活用することできる。さらに該評価系は、医薬品の安全性や有効性に関するスクリーニング、生体内恒常性維持、リンパ組織の機能障害に関連する疾患の診断およびその治療方法の開発等を細胞レベルで研究する評価系として利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月25日(2007.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたトランスジェニック哺乳動物の胸管から採取された胸管リンパ内皮細胞又は胸管に付随して並走する下大静脈から採取された血管内皮細胞に由来する継代可能な細胞株。
【請求項２】
胸管リンパ内皮細胞に由来することを特徴とする請求項１に記載の継代可能な細胞株。
【請求項３】
哺乳動物がラットである請求項１に記載の細胞株。
【請求項４】
内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーの有無によりスクリーニングして得られた請求項１に記載の細胞株。
【請求項５】
内皮細胞に特異的なマーカーが、ＣＤ３１抗原であり、リンパ管に特異的なマーカーがＰｒｏｘ−１及び／又はＬＹＶＥ−１であることを特徴とする請求項４に記載の細胞株。
【請求項６】
前記マーカーの有無を抗体により確認する請求項５に記載の細胞株。
【請求項７】
請求項１に記載のリンパ管細胞及び／又は血管内皮細胞に由来する細胞株を含んでなる、管腔形成を試験管内で観察することによるリンパ管新生の評価キット。
【請求項８】
請求項２に記載のリンパ管細胞に由来する細胞株を含んでなる管腔形成を試験管内で観察することによるリンパ管新生の評価キット。
【請求項９】
ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたトランスジェニック哺乳動物を準備するステップと、
前記哺乳動物の胸管から内皮細胞を含む細胞を得るステップと、
内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーの有無により前記内皮細胞を含む細胞をスクリーニングし、内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーが発現している細胞をリンパ管内皮細胞と同定するステップと
を含む、リンパ管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１０】
哺乳動物がラットである請求項９に記載のリンパ管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１１】
内皮細胞に特異的なマーカーが、ＣＤ３１抗原であり、リンパ管に特異的なマーカーがＰｒｏｘ−１及び／又はＬＹＶＥ−１であることを特徴とする請求項９に記載のリンパ管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１２】
前記マーカーの有無を抗体により確認する請求項９に記載のリンパ管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１３】
請求項９の樹立方法により得られるリンパ管内皮細胞由来の株化細胞。
【請求項１４】
ＳＶ４０温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が導入されたトランスジェニック哺乳動物を準備するステップと、
前記哺乳動物の胸管に付随して並走する下大静脈から内皮細胞を含む細胞を得るステップと、
内皮細胞およびリンパ管に特異的なマーカーの有無により前記内皮細胞を含む細胞をスクリーニングし、内皮細胞に特異的なマーカーは発現しているが、リンパ管に特異的なマーカーは発現していない細胞を血管内皮細胞と同定するステップと
を含む、血管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１５】
哺乳動物がラットである請求項１４に記載の血管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１６】
内皮細胞に特異的なマーカーが、ＣＤ３１抗原であり、リンパ管に特異的なマーカーがＰｒｏｘ−１及び／又はＬＹＶＥ−１であることを特徴とする請求項１４に記載の血管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１７】
前記マーカーの有無を抗体により確認する請求項１６に記載の血管内皮細胞株の樹立方法。
【請求項１８】
請求項１４の樹立方法により得られる血管内皮細胞由来の株化細胞。
【請求項１９】
請求項７に記載のリンパ管新生評価キットを用いるスクリーニング方法であって、被検物質を前記細胞株と接触させ、管腔形成の程度を測定することを特徴とするリンパ管新生阻害物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項８に記載のリンパ管新生評価キットを用いるスクリーニング方法であって、被検物質を前記細胞株と接触させ、管腔形成の程度を測定することを特徴とするリンパ管新生阻害物質又は促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
（削除）
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
請求項７に記載のリンパ管評価キットを用いて、（ｉ）胸管由来の細胞株に発現する遺伝子または蛋白質と、（ｉｉ）血管内皮細胞由来の細胞株に発現する遺伝子または蛋白質とを比較することを含む、リンパ管関連またはリンパ管新生に関与する遺伝子またはタンパク質を同定する方法。
【国際調査報告】
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