(57)【要約】本発明は、Ｇ蛋白質共役型受容体Ｒｅｃ１６８を介する新たなメカニズムに基づくアレルギー性疾患又は自己免疫疾患の治療剤の開発のための、脱顆粒調節物質またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質のスクリーニング方法及び肥満細胞における脱顆粒抑制物質またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質の同定方法の提供を目的とする。  本発明は、Ｒｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドの存在下に、被験物質の非共存下及び共存下におけるＲｅｃ１６８に対する該リガンドのシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介するシグナル伝達能抑制物質、肥満細胞における脱顆粒調節物質またはプロスタグランジＤ２２産生抑制物質のスクリーニング方法及び肥満細胞における脱顆粒抑制物質またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質の同定方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドに対するシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
更に、肥満細胞を用いて該被験物質の非共存下及び共存下におけるＲｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を測定し比較することを特徴とする請求の範囲１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドに対するシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質の同定方法。
【請求項４】
更に、肥満細胞を用いて該被験物質の非共存下及び共存下におけるＲｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を測定し比較することを特徴とする請求の範囲３に記載の同定方法。
【請求項５】
請求の範囲３又は請求の範囲４に記載の方法によって同定された脱顆粒抑制物質またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質を有効成分として含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤またはプロスタグランジンＤ２産生抑制剤。
【請求項６】
下記から選ばれる少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する請求の範囲５に記載の脱顆粒抑制剤またはプロスタグランジンＤ２産生抑制剤。
・１−（１０Ｈ−フェナジン−５−イル）−エタノン、
・２−アゼパン−１−イル−７−ベンジル−１、７−ジヒドロ−プリン−６−オン、及び
・３−（ピリジン−２−イルメチル）−２−チオキソ−２、３−ジヒドロ−１Ｈ−キナゾリン−４−オン。
【請求項７】
請求の範囲３又は請求の範囲４に記載の方法によって同定された脱顆粒抑制物質またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質を有効成分として含有してなる肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
【請求項８】
下記から選ばれる少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する請求の範囲７に記載の肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
・１−（１０Ｈ−フェナジン−５−イル）−エタノン、
・２−アゼパン−１−イル−７−ベンジル−１、７−ジヒドロ−プリン−６−オン、及び
・３−（ピリジン−２−イルメチル）−２−チオキソ−２、３−ジヒドロ−１Ｈ−キナゾリン−４−オン。
【請求項９】
Ｒｅｃ１６８アンタゴニスト作用を有する物質を有効成分として含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤またはプロスタグランジンＤ２産生抑制剤。
【請求項１０】
Ｒｅｃ１６８アンタゴニスト作用を有する物質を有効成分として含有してなる肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
【請求項１１】
Ｒｅｃ１６８蛋白質もしくはその部分ペプチド及びそれらの塩、Ｒｅｃ１６８をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｃ１６８に対する抗体又はＲｅｃ１６８リガンドに対する抗体を試薬として含有することを特徴とする肥満細胞が関与する炎症性疾患の診断薬。
【請求項１２】
Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドに対するシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
更に、肥満細胞を用いて該被験物質の非共存下及び共存下におけるＲｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応を測定し比較することを特徴とする請求の範囲１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドに対するシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応を抑制する物質の同定方法。
【請求項１５】
更に、肥満細胞を用いて該被験物質の非共存下及び共存下におけるＲｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応を測定し比較することを特徴とする請求の範囲１４に記載の同定方法。
【請求項１６】
請求の範囲１４又は請求の範囲１５に記載の方法によって同定された脱顆粒抑制物質を有効成分として含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項１７】
下記から選ばれる少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する請求の範囲１６に記載の脱顆粒抑制剤。
・１−（１０Ｈ−フェナジン−５−イル）−エタノン、
・２−アゼパン−１−イル−７−ベンジル−１、７−ジヒドロ−プリン−６−オン、及び
・３−（ピリジン−２−イルメチル）−２−チオキソ−２、３−ジヒドロ−１Ｈ−キナゾリン−４−オン。
【請求項１８】
請求の範囲１４又は請求の範囲１５に記載の方法によって同定された脱顆粒抑制物質を有効成分として含有してなる肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
【請求項１９】
下記から選ばれる少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する請求の範囲１８に記載の肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
・１−（１０Ｈ−フェナジン−５−イル）−エタノン、
・２−アゼパン−１−イル−７−ベンジル−１、７−ジヒドロ−プリン−６−オン、及び
・３−（ピリジン−２−イルメチル）−２−チオキソ−２、３−ジヒドロ−１Ｈ−キナゾリン−４−オン。
【請求項２０】
Ｒｅｃ１６８アンタゴニスト作用を有する物質を有効成分として含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇ蛋白質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下ＧＰＣＲという）Ｒｅｃ１６８蛋白質を介するシグナル伝達能抑制作用を有する物質、より詳しくはＲｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応抑制物質、またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質のスクリーニング方法に関するものである。さらには、Ｒｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応抑制物質、またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質の同定方法、同方法によって同定された物質を含有してなる脱顆粒抑制剤、プロスタグランジンＤ２産生抑制剤又は肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＧＰＣＲは、生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。受容体は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。ＧＰＣＲは、７ヶ所の細胞膜貫通部を有し、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）結合性の制御蛋白質（Ｇ蛋白質）を介して、リガンドの情報をエフェクター系に伝える役割を担っている。Ｇ蛋白質は、α、β及びγの３つのサブユニットからなる３量体で、αサブユニットの種類によってＧｓ、Ｇｉ、Ｇｏ及びＧｑ等に大別され、各々受容体特異性（共役するＧ蛋白質受容体）及びエフェクター系（酵素やイオンチャンネル）の種類が異なっている。
例えば、グルカゴン様ペプチド１受容体やβ２アドレナリン受容体は、Ｇｓと共役してエフェクター系であるアデニル酸シクラーゼ系を促進させ、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を増加させる。また、α２アドレナリン受容体は、Ｇｉと共役してアデニル酸シクラーゼ系を抑制し、ｃＡＭＰを減少させる。Ｈ１ヒスタミン受容体はＧｑと共役してエフェクター系であるホスホリパーゼＣ系を促進し、ジアシルグリセロールとイノシトール３リン酸を増加させ、細胞内Ｃａ２＋を増加させる。エフェクター系の種類は、アデニル酸シクラーゼ系、ホスホリパーゼＣ系、及びｃＧＭＰホスホジエステラーゼ系などが主要なものである。
また、β１アドレナリン受容体は、心臓、脂肪組織、大脳皮質などに局在し、Ｇｓによってアデニル酸シクラーゼ系が促進され、心拍増加、心収縮力増加、脂肪分解といった効果をもたらす。
Ｇ蛋白質は、αサブユニットにＧＤＰ（グアノシン５’−二リン酸）が結合し、βサブユニット及びγサブユニットと会合している。α、β及びγが会合した状態は不活性型で、受容体にリガンドが結合すると、αに結合していたＧＤＰがＧＴＰに置換され、そしてαサブユニットにＧＴＰが結合したα−ＧＴＰと、β−γの結合体とに乖離する。α−ＧＴＰ及びβ−γはエフェクター系に作用してシグナルを伝達する。この間にαサブユニットの持つＧＴＰａｓｅ活性によってＧＴＰが分解されＧＤＰになると、α−ＧＤＰはエフェクター系を離れてβ及びγと会合し、再び不活性型となる。この反応を繰り返すことにより、情報の増幅、伝達が行なわれる。
ＧＰＣＲの生体内分布は特定の器官に局在しているものが多いが、Ｇ蛋白質は生体内に広く分布している。そして、前述したようにＧ蛋白質は、ＧＰＣＲを通じて主に一連の細胞内リン酸化反応の引き金となって、遺伝子レベルでの転写調節から筋収縮まで幅広く細胞及び臓器機能の制御を行なっている。
このように、ＧＰＣＲ／Ｇ蛋白質によって制御される情報伝達系は、生体の生理機能の制御に必須のメカニズムであり、換言すれば、該情報伝達系は種々の疾病の発症に広く関与するものである。従って、ある疾患の発症に関与するＧＰＣＲが同定されれば、該受容体の生理機能を調節する薬剤（アゴニスト、アンタゴニスト、アゴニスト作用阻害物質など）を開発することにより、該薬剤によりその疾患を治療することが可能となる。
ヒトゲノムプロジェクトの完了により、そのデータベースの解析から、多数の新規なＧＰＣＲの存在が示唆され、またそれらのうちすでに単離されているものもある（例えば、特許文献１、２参照）。ヒトゲノム全体でＧＰＣＲは７００から８００近く存在している可能性が示唆されているが、リガンドが既知の受容体が約２５０程度であり、残りはリガンドが未知のオーファン受容体である。したがってＧＰＣＲが関与している生理現象の大部分が未開拓の領域と言える。前述したとおり、ＧＰＣＲは、生体の生理機能の制御及び種々の疾患の発症に深く関与することから、該受容体の生理機能を明らかにすることは、種々の疾患の発症の原因を解明することにおいて極めて重要である。ＧＰＣＲの生理機能を明らかにするために重要なことは、該受容体のリガンドを同定することであり、多くの科学者が精力的に研究を行っている。一方、生理機能が明らかにされたＧＰＣＲのシグナル伝達能を調節する薬剤を創出するための、いわゆるＧＰＣＲ創薬には、米国ベンチャー企業、製薬企業を中心に多くのアプローチが試みられている。その手法は、バイオインフォマティックス、構造生物学などによるいわゆる“ＤＲＹ  ＢＩＯＬＯＧＹからのアプローチ”と従来の分子生物、細胞生物学研究に基づく、蛋白、細胞、個体レベルでのいわゆる“ＷＥＴ  ＢＩＯＬＯＧＹからのアプローチ”に大きく分けられるが、これらの手法は別々のものではなく相互に補完することで創薬ゴールを目指している。いずれにしても重要なことは、リガンド結合部位を同定する等の新規の有用な知見をいち早く獲得することによって、薬剤として有用なアゴニストやアンタゴニストを開発することであり、多くの製薬企業では、受容体の立体構造を予測するアプローチ等も導入して、新薬開発を加速させている。このようにして、ＧＰＣＲを介した薬物治療は、めざましい成功を遂げてきた。現在、使われている薬剤の５０％以上がＧＰＣＲを標的にしたものであり、その薬剤の世界中の売り上げは、上位２５％以上を占めており、売上高は２兆ドルに達しようとしている（例えば非特許文献１参照）。
ＧＰＣＲの重要性は、薬物開発ばかりでなく、遺伝性疾患の多くと関連していることにもある（例えば非特許文献１参照）。現在のところ、視覚において色盲、夜盲症や網膜性色素変性症といった疾患で、ＧＰＣＲの変異が検出されている。また、味覚や臭覚に関連するＧＰＣＲも多く存在すると言われており、味覚や臭覚異常の解明が急速に進展する可能性がある。ＧＰＣＲは細胞外の刺激を受け取る受容体であることから、こうした五感に密接に関連していることも、充分に理解することができる。また、ホルモン分泌におけるＧＰＣＲの変異がかなり報告されており、生理的役割における重要性が示唆されている
しかし、ＧＰＣＲのアゴニストとして複数の物質が明らかになっている場合であっても、人工的なスクリーニング系において該受容体を介してシグナルを入れることができるというだけであって、生体内での機能を反映しているか否か明らかでないものも数多く存在しているのが現状である。
本発明に係るＲｅｃ１６８は、Ｍｒｇファミリーに属するレセプターで、ＭｒｇＸ２と呼ばれているＧＰＣＲのひとつである。Ｒｅｃ１６８の遺伝子配列については、既に知られている（例えば、特許文献３〜５参照）。これらの文献においては、Ｒｅｃ１６８の内因性リガンドについての情報の開示は全くない。また、Ｒｅｃ１６８と同じ蛋白質については、三輪らがすでにｈＴＧＲ−１２として、そのアミノ酸配列、遺伝子配列を開示している（特許文献６参照）。しかしその生理的機能、および生理的リガンドについては具体的な開示はない。その他にも同様の情報が開示されているものの、Ｒｅｃ１６８の生理的機能や、生理的リガンドについて具体的に開示しているものではない。
Ｒｅｃ１６８のリガンド物質に関しては、Ｊａｎｓｓｅｎ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌのＢｕｉｓｔ  Ａｒｊａｎらが、ヒトｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｈＤＲＲｓ）の一つであるＭｒｇＸ２（Ｒｅｃ１６８）はリンパ節で発現しており、ブタ視床下部から精製したＣｈａｐｅｒｏｎｉｎ１０のＮ末端ペプチド断片（４−２１）に対してアゴニスト活性（ＥＤ５０＝３５４ｎＭ）を有することを示した（特許文献７参照）。ＡＣＡＤＩＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌのグループは、ＭｒｇＸ２（Ｒｅｃ１６８）のリガンドはＳＴＩＡであるとしているが、ＳＴＩＡに関しての詳細は不明である。Ｎｉｃｏｌａ  Ｒｏｂａｓらは、睡眠や運動機能を制御するｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎがＭｒｇＸ２（Ｒｅｃ１６８）のリガンドであるとの報告をしている（非特許文献２、特許文献８参照）。ブタ組織から新規に同定されたＭｒｇＸ１を活性化するペプチドのファミリーがＭｒｇＸ２（Ｒｅｃ１６８）にも弱く作用することも報告されている。ＭｒｇＸ１のホモログは、ラットＳＮＳＲ１とマウスＭｒｇＣ１１であるとしている。ＡｓｔｒａｚｅｎｅｃａのＬｅｍｂｏらは、ＳＮＳＲ３＆４（ＭｒｇＸ１）のリガンドはＢＡＭ８−２２であると報告したグループであるが、ラットＳＮＳＲに対する活性において、γ２−ＭＳＨが最も有望なペプチドであり（ＥＣ５０＝３７±１０ｎＭ）、さらに、詳細な構造活性相関解析からγ２−ＭＳＨのＣ末端配列がアゴニストであると報告した（Ｋｄ＝２．７±０．４ｎＭ、Ｂｍａｘ＝３５０±１００ｆｍｏｌ／ｍｇ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ解析から、ＳＮＳＲ（ＭｒｇＸ１）の鎮痛における役割を解析している（非特許文献３参照）。また、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ２−１１、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ＦＦ等がＭｒｇＸ２を活性化するとの報告がなされている（特許文献９参照）。さらに、最近になって、ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓも、ＭｒｇＸ２を活性化するペプチドとして報告されている（非特許文献１４参照）。
なお、ＭｒｇＸ１はＭｒｇＸ２（Ｒｅｃ１６８）とタンパク質レベルで６０−７０％の相同性を持つち、同じファミリーに属するが、ＭｒｇＸ２とは異なるレセプターである。両者の違いは、配列のみならず、リガンドの反応性も異なり、ＭｒｇＸ１はＢＡＭ８−２２に反応するが、ＭｒｇＸ２は反応しない。ＭｒｇＸ１のリガンド特異性は高いが、ＭｒｇＸ２もブロードである。更に、両者の発現組織も異なっている。
以上のようにＲｅｃ１６８のリガンドとして、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ１０のＮ末端ペプチド断片（４−２１）、ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ等が開示されているが、Ｒｅｃ１６８の生理的機能については未だ明らかではなく、示唆される機能として記載されているのは、それらリガンド物質が一般的に有する機能から推定するもののみである。そのためＲｅｃ１６８をターゲットとした医薬品開発は進んでいないのが現状であり、Ｒｅｃ１６８のアゴニスト、アンタゴニストは未だに医薬品として市場に出てはいない。今後Ｒｅｃ１６８をターゲットとした医薬品開発を展開していくためには、Ｒｅｃ１６８の生理的機能および疾患との関わりを明らかにしていくことが必要である。
一方、肥満細胞の脱顆粒は、ＩｇＥが肥満細胞上の高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合して起こる免疫関与のものと、この系を介さない免疫非関与のものに大きく分類され、前者は炎症初期に、後者は慢性炎症像に多いとされている（非特許文献４参照）。免疫関与の脱顆粒については詳細な研究がなされているのに対して、免疫非関与の脱顆粒については、作用メカニズムをはじめほとんど明らかになっていない。
肥満細胞は全身臓器に広く分布し、特に外界と接する皮膚と粘膜内に多く存在している。その細胞の中に多数の顆粒を有しており、細胞表面にはＦｃεＲＩを発現し、ＩｇＥ分子を介して抗原が結合するとＦｃεＲＩが活性化され、種々の細胞内情報伝達機構を介して、顆粒にあるヒスタミンを放出する（脱顆粒）と同時にプロスタグランジンやロイコトリエンという物質も生成する。これらの物質は、化学伝達物質と呼ばれ気管支を収縮し、血管の透過性を亢進させ、痰の分泌を高めて喘息の呼吸困難発作を引き起こす。この反応は短時間に起きるため即時型反応と呼ばれている。さらに最近、ヒスタミンやプロスタグランジンなどのケミカルメディエータの遊離に引き続いて、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＮＦ−α）などのサイトカインが産生放出され、ＦｃεＲＩの会合刺激が核内まで伝わることが知られるようになった。
ヒスタミン等の化学伝達物質や酵素、脂質メディエーターは、平滑筋の収縮、血管の透過性亢進、組織の浮腫などを惹起するが、これに対し数時間の後に放出される各種サイトカインは、皮膚、肺、鼻、目などにおける遅発型アレルギー反応、すなわち蕁麻疹やアトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などの臨床症状発現に関与することが明らかにされつつある。
これまでに、ＩｇＥが関与しない脱顆粒反応が存在し、慢性炎症に関与していることがわかっていた。また、免疫非関与の肥満細胞脱顆粒誘導物質として、ＭＣＤペプチド、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＶＩＰ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、ｃｏｍｏｕｎｄ４８／８０などがＢａｓｉｃ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓとして知られている（例えば非特許文献５〜９参照）。
Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＶＩＰ、ＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎなどＢａｓｉｃ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓは、これまで知られているレセプターよりもはるかに高濃度（２〜３μＭ）で脱顆粒を起こすことが知られていた。そのメカニズムについては、受容体を介さない経路による可能性があるという報告があるが（例えば、非特許文献１０〜１１参照）、詳細は不明である。特異的な受容体に関する報告はない。
肥満細胞のＩｇＥが関与しない脱顆粒反応の疾患へのかかわりについては、炎症に絡んで複数例が報告されている（例えば非特許文献１２〜１３参照）。自己抗体誘発の関節炎モデルにおいて、肥満細胞欠損マウス（Ｗ／Ｗｖ、ｃ−ｋｉｔ  ｍｕｔａｎｔ；Ｓｌ／Ｓｌｄ、ｃ−ｋｉｔ  ｌｉｇａｎｄ  ｍｕｔａｎｔ）では発症しないが、正常肥満細胞を移植することにより発症が確認され、関節炎発症にはＩｇＥ非関与の肥満細胞の作用が優位に働いていることが証明された。肥満細胞の免疫非関与の脱顆粒は関節炎を始めとした、各種慢性炎症などに直接関与すると考えられている。
このような状況の中、肥満細胞の免疫非関与の脱顆粒のメカニズムを解明することができれば、各種慢性炎症の治療に応用していくことができると考えられており、その解明が切望されていた。
【特許文献１】特開平９−２６８号公報
【特許文献２】特開平９−５１７９５号公報
【特許文献３】ＷＯ０１／１９９８３号パンフレット
【特許文献４】ＷＯ０１／４８０１５号パンフレット
【特許文献５】ＷＯ０１／１６１５９号パンフレット
【特許文献６】ＷＯ０２／０４６４１号パンフレット
【特許文献７】ＷＯ０３／００５０３６号パンフレット
【特許文献８】ＷＯ０３／０７３１０７号パンフレット
【特許文献９】ＷＯ０３／１０４８１８号パンフレット
【非特許文献１】Ｆｌｏｗｅｒ、Ｄ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９９）１４２２、２０７−２３４
【非特許文献２】Ｒｏｂａｓ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）２７８、４４４００−４４４０４．
【非特許文献３】Ｔｈｅ  ▲３ｒｄ▼  ｊｏｉｎｔ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｍｍｅｒ  Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（▲１３ｔｈ▼  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ）＆  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｌｕｂ（▲１３ｔｈ▼  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ）、Ｍｏｎｔａｕｋ、ＮＹ、Ｊｕｎｅ  ８−１２、２００３．
【非特許文献４】Ｐｉｌｉｐｏｎｓｋｙ、Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）３８、１３６９−１３７２．
【非特許文献５】Ｂｕｋｕ、Ａ．、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（１９９９）２０、４１５−４２０．
【非特許文献６】Ｅｒｊａｖｅｃ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９８１）３１７、６７−７０．
【非特許文献７】Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ、Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９８１）６９、１２７−１３７．
【非特許文献８】Ｍｏｒｉ、Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ（１９９４）４４、１０４４−６．
【非特許文献９】Ｏｄｕｍ、Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．（１９９８）４７、４８８−４９２．
【非特許文献１０】Ａｒｉｄｏｒ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９０）１１１（３）、９０９−１７．
【非特許文献１１】Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００２）２３（８）、１５０７−１５．
【非特許文献１２】Ｌｅｅ、Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９７、１６８９−９２．
【非特許文献１３】Ｍｅｈｌｈｏｐ、Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９７）９４、１３４４−１３４９．
【非特許文献１４】Ｋａｍｏｈａｒａ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００５）３３０、１１４６−１１５２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、Ｇ蛋白質共役型受容体Ｒｅｃ１６８の生理的機能を解明し、その生理的機能を反映したＲｅｃ１６８およびそのリガンドに関する応用用途を提供することである。より具体的には、本発明の目的は、Ｇ蛋白質共役型受容体Ｒｅｃ１６８蛋白質を介するシグナル伝達能抑制作用を有する物質、より詳しくはＲｅｃ１６８を介する脱顆粒反応抑制物質またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質のスクリーニング方法を提供することである。本発明の別の目的は、Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応抑制物質またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質の同定方法、同方法によって同定された物質を含有してなる脱顆粒抑制剤、プロスタグランジンＤ２産生抑制剤又は肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、本発明の完成に至った。すなわち本発明は、以下に示すとおりである。
１．Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドに対するシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質のスクリーニング方法。
２．更に、肥満細胞を用いて該被験物質の非共存下及び共存下におけるＲｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を測定し比較することを特徴とする上記１に記載のスクリーニング方法。
３．Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドに対するシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質の同定方法。
４．更に、肥満細胞を用いて該被験物質の非共存下及び共存下におけるＲｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を測定し比較することを特徴とする上記３に記載の同定方法。
５．上記３又は４に記載の方法によって同定された脱顆粒抑制物質またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質を有効成分として含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤またはプロスタグランジンＤ２産生抑制剤。
６．下記から選ばれる少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する上記５に記載の脱顆粒抑制剤またはプロスタグランジンＤ２産生抑制剤。
・１−（１０Ｈ−フェナジン−５−イル）−エタノン、
・２−アゼパン−１−イル−７−ベンジル−１、７−ジヒドロ−プリン−６−オン、及び
・３−（ピリジン−２−イルメチル）−２−チオキソ−２、３−ジヒドロ−１Ｈ−キナゾリン−４−オン。
７．上記３又は上記４に記載の方法によって同定された脱顆粒抑制物質またはプロスタグランジンＤ２産生抑制物質を有効成分として含有してなる肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
８．下記から選ばれる少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する上記７に記載の肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
・１−（１０Ｈ−フェナジン−５−イル）−エタノン、
・２−アゼパン−１−イル−７−ベンジル−１、７−ジヒドロ−プリン−６−オン、及び
・３−（ピリジン−２−イルメチル）−２−チオキソ−２、３−ジヒドロ−１Ｈ−キナゾリン−４−オン。
９．Ｒｅｃ１６８アンタゴニスト作用を有する物質を有効成分として含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤またはプロスタグランジンＤ２産生抑制剤。
１０．Ｒｅｃ１６８アンタゴニスト作用を有する物質を有効成分として含有してなる肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
１１．Ｒｅｃ１６８蛋白質もしくはその部分ペプチド及びそれらの塩、Ｒｅｃ１６８をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｃ１６８に対する抗体又はＲｅｃ１６８リガンドに対する抗体を試薬として含有することを特徴とする肥満細胞が関与する炎症性疾患の診断薬。
１２．Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドに対するシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応を抑制する物質のスクリーニング方法。
１３．更に、肥満細胞を用いて該被験物質の非共存下及び共存下におけるＲｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応を測定し比較することを特徴とする上記１２に記載のスクリーニング方法。
１４．Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドに対するシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応を抑制する物質の同定方法。
１５．更に、肥満細胞を用いて該被験物質の非共存下及び共存下におけるＲｅｃ１６８を介する肥満細胞の脱顆粒反応を測定し比較することを特徴とする上記１４に記載の同定方法。
１６．上記１４又は１５に記載の方法によって同定された脱顆粒抑制物質を有効成分として含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
１７．下記から選ばれる少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する上記１６に記載の脱顆粒抑制剤。
・１−（１０Ｈ−フェナジン−５−イル）−エタノン、
・２−アゼパン−１−イル−７−ベンジル−１、７−ジヒドロ−プリン−６−オン、及び
・３−（ピリジン−２−イルメチル）−２−チオキソ−２、３−ジヒドロ−１Ｈ−キナゾリン−４−オン。
１８．上記１４又は１５に記載の方法によって同定された脱顆粒抑制物質を有効成分として含有してなる肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
１９．下記から選ばれる少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する上記１８に記載の肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤。
・１−（１０Ｈ−フェナジン−５−イル）−エタノン、
・２−アゼパン−１−イル−７−ベンジル−１、７−ジヒドロ−プリン−６−オン、及び
・３−（ピリジン−２−イルメチル）−２−チオキソ−２、３−ジヒドロ−１Ｈ−キナゾリン−４−オン。
２０．Ｒｅｃ１６８アンタゴニスト作用を有する物質を有効成分として含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
上記発明を完成するに至った経緯は次のようなものである。
公開配列データベースＧｅｎＢａｎｋを用いて、ＧＰＣＲに特徴的な配列を有するＲｅｃ１６８を見出した。ヒト精巣ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲにより目的の遺伝子を増幅し、発現ベクターに組み込み、Ｒｅｃ１６８一過性発現細胞及び安定形質発現細胞を作製した。
リガンドが同定されていないＧＰＣＲのリガンド（即ち、該受容体と相互作用する物質であるアゴニストやアンタゴニストなど）を同定するためには、数万種以上の多数の候補物質を試験によりスクリーニングする必要があり、該スクリーニングを迅速に行うことが可能なアッセイ系が必要である。また、該アッセイは、被験物質と該受容体との相互作用の有無を、該受容体が共役するＧ蛋白質を介して誘導される２次メッセンジャーの活性化若しくは抑制の増減を定量的に検出する必要があることから、該メッセージの増減を高感度で検出可能なアッセイ方法が必要である。本発明者らは、このような迅速かつ高感度で検出可能なアッセイ方法について、すでに日本において特許権を取得しており（特許第３６４３２８８号）、本発明においてもそのアッセイ方法を使用した。
作製したＲｅｃ１６８発現細胞を用いて、Ｒｅｃ１６８に対してアゴニスト活性を示す物質のスクリーニングを実施した。その結果、ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ１０のＮ末端２０アミノ酸からなるペプチド、ｐｏｒｃｉｎｅ  ２’、３’−ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３’ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（以後、ｐＣＮＰと略す）のＮ末端１７アミノ酸からなるペプチド、ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎのＮ末端１２アミノ酸からなるペプチド、ＰＡＣＡＰ（６−３６）、ＶＩＰ（３−２７）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、Ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ（以後、ＭＣＤと略す）ペプチドなどを得た。
上述したように、免疫非関与の肥満細胞脱顆粒誘導物質としては、ＭＣＤペプチド、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＶＩＰ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、ｃｏｍｏｕｎｄ４８／８０などがＢａｓｉｃ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓとして知られており、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＶＩＰ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎなどは、これまで知られているレセプターよりもはるかに高濃度（２〜３μＭ）で脱顆粒を起こすことが知られていたが、Ｂａｓｉｃ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓによる免疫非関与の肥満細胞の脱顆粒の機構は未だに不明であった。ところが詳細な解析から、本発明者らが独自のスクリーニングにより取得した、Ｒｅｃ１６８に対してアゴニスト活性を示す物質群の一部と、免疫非関与の肥満細胞の脱顆粒誘導物質として既知であった物質の種類とが一致し、さらに作用濃度もほぼ同じであることが判明した。そこで、免疫非関与の肥満細胞の脱顆粒はＲｅｃ１６８を介するのではないかという、これまでに誰しも予想だにしなかった仮説を立て、さらに研究を進めた。
レポータージーンアッセイによるスクリーニングから得られたＲｅｃ１６８のアゴニスト物質は、細胞内遊離カルシウムアッセイ系で測定してもほぼ同様の反応性を示した。また、アゴニスト活性を示すものから数種類を選択して、ＧＴＰ結合活性を検討した結果、検討したアゴニストはすべてＧＴＰ結合活性を示したことから、Ｒｅｃ１６８に結合することによって、Ｇ蛋白質を介して細胞内シグナル伝達をすることが強く示唆された。
次に、実際に、得られたアゴニスト活性物質群が肥満細胞上のＲｅｃ１６８を介して脱顆粒反応を惹起するか否かを調べた。ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性造血幹細胞を分離し、常法により肥満細胞へと分化させ、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）非存在下で各アゴニスト活性物質を添加したところ、各物質の濃度依存的に脱顆粒反応が惹起された。それに対して、ＦＣＳ存在下では脱顆粒反応は惹起されなかった。ＦＣＳ存在下、非存在下での肥満細胞におけるＲｅｃ１６８の発現について検討したところ、ＦＣＳ非存在下では発現しているものの、ＦＣＳ存在下ではほとんど発現していないことが判明した。以上のことから、Ｒｅｃ１６８アゴニスト活性物質群は、肥満細胞の脱顆粒反応を引き起こし、その反応はＲｅｃ１６８を介して起こっていることが強く示唆された。
さらに同様のアゴニスト活性物質群が肥満細胞上のＲｅｃ１６８を介してプロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）産生を誘導するか否かを調べた。上記と同様に誘導したヒト肥満細胞に対して、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔおよびＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ等のアゴニスト活性物質群は、濃度依存的にＰＧＤ２産生を誘導した。何れの刺激によるＰＧＤ２産生活性もＲｅｃ１６８阻害化合物である、１０μＭのＪＴＰ−３７５８５４あるいは４４５７５５によって阻害されたことから、Ｒｅｃ１６８の活性化はヒト培養肥満細胞の脱顆粒だけではなく、ＰＧＤ２のｄｅ  ｎｏｖｏ合成も誘導することが判明した。ＩｇＥは高親和性ＦｃＲγｅｐｓｉｌｏｎを介してＳｙｋを活性化し、肥満細胞の脱顆粒誘導およびＰＧＤ２のｄｅ  ｎｏｖｏ合成を誘導することが知られているが、Ｒｅｃ１６８はＦｃＲγｅｐｓｉｌｏｎとシグナル伝達経路を一部共有していることが推測された。
ここで、ＥＣＰ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、炎症部位に存在する好酸球の分泌するタンパク質の一つであり、ＭＢＰ（Ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と共に肥満細胞の脱顆粒を誘導する物質として古くから知られている。ＥＣＰは、炎症の引き金ではなく、炎症後期に作用して、炎症を長引かせるものと考えられている。
次にＲｅｃ１６８の発現臓器分布解析を行ったところ、本受容体はＭｒｇＸファミリーに属する他の受容体の発現パターンとは異なり、皮膚および脂肪組織での高発現が特徴であった。肥満細胞は表皮に多く存在していることが確認されている。また、脂肪組織における肥満細胞の存在については明らかではないが、脂肪組織に肥満細胞が混在していることは十分考えられる。
Ｒｅｃ１６８が脱顆粒のシグナルを伝達する受容体であるということは、これまで誰も予想できなかった事であり、またＩｇＥが関与していない免疫非関与の脱顆粒のメカニズムのひとつが、初めて明らかになったという点でも本発明は極めて重要性が高いものである。さらには、脱顆粒のみならず、脱顆粒と同時に起こることが知られているＰＧＤ２産生のシグナルをもＲｅｃ１６８が伝達するということが明らかになった点も注目すべきである。これまで発症のメカニズムが不明であったために、有効な治療薬や治療方法が見つかっていなかった多くの慢性炎症をターゲットとして、今後有効な治療薬の開発を進めていくことが可能となった。
そこで本発明者らはさらに研究を進め、Ｒｅｃ１６８を介した肥満細胞からの脱顆粒反応またはＰＧＤ２産生を抑制することができる薬剤のスクリーニング方法を開発し、実際にスクリーニングを行ったところ、有効な複数の化合物を見出すことにも成功した。
【発明の効果】
【０００５】
本発明者らは、これまで判明していなかったＲｅｃ１６８の生理的機能を見出し、該機能に基づく新たな薬剤のスクリーニング方法及び同定方法を開発し、かかる薬剤となりうる複数の化合物を実際に取得することに成功した。本発明におけるＲｅｃ１６８蛋白質を介するシグナル伝達能抑制作用を有する物質のスクリーニング方法又はＲｅｃ１６８蛋白質を介するシグナル伝達能抑制作用を有する物質の同定方法によると、単にＲｅｃ１６８に結合する物質の結合能を調節するものや、人工的な細胞系においてシグナルを伝達する物質からのシグナル伝達能を調節する物質を得られるのとは異なり、実際にＲｅｃ１６８の生理的機能である脱顆粒反応またはＰＧＤ２産生を抑制する物質を取得することが可能となった。これにより、これまでは不可能であった、肥満細胞の免疫非関与の脱顆粒およびＰＧＤ２産生が関与している炎症性疾患等、特にアレルギー性疾患又は自己免疫疾患等の治療剤の開発も可能となった。
さらに本発明は、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患等の肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤の診断薬をも提供するものである。これは、Ｒｅｃ１６８が肥満細胞の脱顆粒反応またはＰＧＤ２産生を誘導することを見出したことによって初めて可能となったことである。Ｒｅｃ１６８蛋白質の細胞表面発現量や遺伝子発現量の増減、発現しているＲｅｃ１６８蛋白質の構造的な異常、遺伝子の変異が、過剰な脱顆粒反応またはＰＧＤ２産生を介した慢性炎症の原因となる可能性があり、これらを検査することにより、肥満細胞が関与する炎症性疾患、特にアレルギー性疾患又は自己免疫疾患の診断をすることも可能となったものである。
さらには、肥満細胞が関与する炎症性疾患、特にアレルギー性疾患又は自己免疫疾患の原因となるＲｅｃ１６８蛋白やＲｅｃ１６８遺伝子の異常発現を調節することができる物質のスクリーニングも可能となり、この方法により得られる物質は、Ｒｅｃ１６８を介した脱顆粒反応またはＰＧＤ２産生を調節することができるものである。これにより新しいタイプの炎症性疾患の治療剤の開発が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、ＰＣ１２ｈ／ｚｉｆレポーターアッセイ（１）におけるＣｈａｐｅｒｏｎｉｎ１０（１−２０）、２’、３’−ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３’ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（１−１７）、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ（１−１２）の結果を示す図である。図中、黒丸はＣｈａｐｅｒｏｎｉｎ  １０（１−２０）を、黒三角は２’，３’−ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３’ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（１−１７）（ｐＣＮＰ（１−１７））を、黒四角はＴｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ（１−１２）を意味する。ＡはＲｅｃ１６８発現細胞、ＢはＭｏｃｋでの結果を示す。ＡはＲｅｃ１６８発現細胞、ＢはＭｏｃｋでの結果を示す。
図２は、ＰＣ１２ｈ／ｚｉｆレポーターアッセイ（２）におけるＭＣＤ−Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ２８、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐの結果を示す図である。図中、黒丸はＭＣＤ−Ｐｅｐｔｉｄｅ，黒三角はＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ２８、黒四角はＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐを意味する。ＡはＲｅｃ１６８発現細胞、ＢはＭｏｃｋでの結果を示す。
図３は、ＰＣ１２ｈ／ｚｉｆレポーターアッセイ（３）におけるＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０の結果を示す図である。図中、黒丸はＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０を意味する。ＡはＲｅｃ１６８発現細胞、ＢはＭｏｃｋでの結果を示す。
図４は、発現ベクターｐＬＨＣＸＩ４を示す。
図５は、ｐＬＨＣ−Ｒｅｃ１６８−Ｉ４を示す。
図６は、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ濃度依存的な膜画分へのＧＴＰ−Ｅｕ結合（ＧＴＰ結合量の増加）を示す図である。図中、黒丸はＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞から調製した膜画分、白丸は２９３（親株）から調製した膜画分での結果を示す。
図７は、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ１０（１−２０）濃度依存的な膜画分へのＧＴＰ−Ｅｕ結合（ＧＴＰ結合量の増加）を示す図である。図中、黒丸はＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞から調製した膜画分、白丸は２９３（親株）から調製した膜画分での結果を示す。
図８は、ｐＣＮＰ（１−１７）濃度依存的な膜画分へのＧＴＰ−Ｅｕ結合（ＧＴＰ結合量の増加）を示す図である。図中、黒丸はＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞から調製した膜画分、白丸は２９３（親株）から調製した膜画分での結果を示す。
図９は、ＭＣＤ  ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）濃度依存的な膜画分へのＧＴＰ−Ｅｕ結合（ＧＴＰ結合量の増加）を示す図である。図中、黒丸はＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞から調製した膜画分、白丸は２９３（親株）から調製した膜画分での結果を示す。
図１０は、リガンドによるヒト培養肥満細胞の脱顆粒反応（リガンド物質の濃度依存的な脱顆粒反応）を示す図である。陽性対象としてはＡ２３１８７を用いた。脱顆粒を異なる３ｄｏｎｏｒ由来の培養肥満細胞を用いた３回の実験のＭｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍで示した。
図１１は、ヒト培養肥満細胞の脱顆粒反応（ＥＣ２５）とＲｅｃ１６８発現細胞を用いたＣａ  Ａｓｓａｙでの活性（ＥＣ５０）の相関を示す図である。
図１２は、Ｄｏｎｏｒ  ４由来ヒト培養肥満細胞での、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（図１２Ａ）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（図１２Ｂ）及びＡ−２３１８７（図１２Ｃ）刺激による脱顆粒に及ぼす培養時ＦＣＳの影響を示す図である。
図１３は、Ｄｏｎｏｒ  ６由来ヒト培養肥満細胞での、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０刺激による脱顆粒に及ぼす培養時ＦＣＳの影響を示す図である。ＡはＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激、ＢはＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０刺激による脱顆粒に対する培養時添加血清の影響を示す。
図１４は、Ｒｅｃ１６８の組織別ｍＲＮＡ発現量の比較を示す図である。
図１５は、Ｒｅｃ１６８阻害化合物（化合物１（１５−ｂ）、化合物２（１５−ａ）、化合物３（１５−ｃ））の肥満細胞脱顆粒に対する阻害活性に関する図である。図中、白四角はＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１μＭ）、黒四角は［Ｄ−Ｐｒｏ２、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）（１μＭ）、白丸はＰＡＣＡＰ（６−２７）（１μＭ）、黒丸はＡ２３１８７（０．３μＭ）を意味する。
図１６は、ＥＣＰ及びＭＢＰのｆｒａｇｍｅｎｔ  ｍａｐである。ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｍａｐは（Ａ−１）乃至（Ａ−３）の３に分割して示した。ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｍａｐは（Ｂ−１）乃至（Ｂ−３）は３に分割して示した。
図１７は、断片化ＥＣＰのヒト培養肥満細胞に対する脱顆粒誘導活性（Ａ）及びＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞に対するＣａ応答活性（Ｂ）を示す図である。
図１８は、断片化ＭＢＰのヒト培養肥満細胞に対する脱顆粒誘導活性（Ａ）及びＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞に対するＣａ応答活性（Ｂ）を示す図である。
図１９は、ＭＢＰ、ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激によるヒト培養肥満細胞の脱顆粒誘導に対するＲｅｃ１６８阻害化合物（化合物１（Ａ）、化合物２（Ｂ）及び化合物３（Ｃ））の作用を示す図である。
図２０は、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（Ａ）及びＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（Ｂ）刺激によるヒト肥満細胞の脱顆粒誘導に対するＲｅｃ１６８阻害化合物及びＣｒｏｍｏｌｙｎの作用を示す図である。図中、黒丸は化合物１、白丸は化合物３、黒四角はＣｒｏｍｏｌｙｎを示す。
図２１は、ＩｇＥ架橋によるヒト培養肥満細胞の脱顆粒誘導（Ａ）とＲｅｃ１６８阻害化合物及びＣｒｏｍｏｌｙｎの作用（Ｂ）を示す図である。図（Ｂ）中、黒丸は化合物１、白丸は化合物３、黒四角はＣｒｏｍｏｌｙｎを意味する。
図２２は、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（Ａ）、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｂ）及びＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｃ）刺激によるヒト培養肥満細胞のＰＧＤ２産生とＲｅｃ１６８阻害化合物の作用を示す図である。
図２３は、抗Ｒｅｃ１６８抗体（抗ＭｒｇＸ２  ｐｅｐｔｉｄｅ抗体）、抗ヒトＴｒｙｐｔａｓｅ抗体及び抗ヒトＣｈｙｍａｓｅ抗体を用いたヒト培養肥満細胞の免疫染色を示す図である。図中のバーは２０μｍを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明で用いる語句の意味及び本発明の具体的態様を明らかにすることにより本発明をさらに詳細に説明する。
Ｇ蛋白質共役型受容体
本発明における「Ｇ蛋白質共役型受容体」は、細胞膜上に存在する受容体であって、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）結合性の制御蛋白質（Ｇ蛋白質）を介して、該受容体と相互作用するリガンドの情報をエフェクター系に伝える機能を有する蛋白質を意味する。これまでに同定されているほとんどのＧ蛋白質共役型受容体は細胞膜を７回貫通する構造を有している。
Ｒｅｃ１６８を発現している細胞
本発明において「Ｒｅｃ１６８を発現している細胞」とは、細胞表面にＲｅｃ１６８蛋白質を発現している細胞であれば、特に限定されるものではない。
例えば、Ｒｅｃ１６８を発現している細胞としては、既存の細胞株にＲｅｃ１６８遺伝子を導入し、細胞表面に強制発現させた細胞株を用いることもできる。この場合には、比較対象のＲｅｃ１６８を発現していない細胞としては、その親株を用いることができる。ここで用いる既存の細胞株は、特に限定されるものではないが、発現ベクターを含み、発現ベクターの複製又は発現を維持することが可能な細胞であればよい。例えばＥ．ｃｏｌｉのような原核細胞、またはイースト、昆虫、両生類のような真核細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３のような哺乳動物細胞などとすることができる。Ｒｅｃ１６８を効率良く発現させることができる細胞としては、中でも２９３細胞が好ましい。
このとき、Ｒｅｃ１６８強制発現細胞としては、Ｒｅｃ１６８を一過性に発現させたものを用いても、安定的に発現させたものを用いてもよい。尚、Ｒｅｃ１６８強制発現細胞の作成は、当業者に公知の方法で行うことができる。
また、Ｒｅｃ１６８を発現している細胞としては、生体由来であって、ｎａｔｉｖｅにＲｅｃ１６８を発現している細胞を用いることもできる。Ｒｅｃ１６８を発現している細胞であれば特に限定されるものではないが、中でも肥満細胞が好ましい。
ここで本発明における肥満細胞としては、生体から分離した初代培養細胞であっても、肥満細胞としての特徴を保持する既存の細胞株であってもよい。中でも結合組織型肥満細胞が好ましい。例えば、初代培養細胞としては、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞より、常法に従って誘導して得られる肥満細胞を用いることができる。また既存の細胞株としては、特に限定されるものではないが、例えばＰ８１５、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞などが挙げられる。
物質
本発明の方法により同定またはスクリーニングされる「物質」とは、自然界に存在する天然の物質（蛋白質、抗体、ペプチド、天然化合物など）あるいは人工的に調製される任意の物質（化学合成化合物）を意味する。
具体的には、例えば、化学的に合成された任意の「化合物」を挙げることができる。該化合物の種類及び分子量などについては特に限定されないが、分子量について言えば、医薬品として用いられる可能性のある化合物の分子量は、分子量約５０乃至約３０００以下であり、さらに一般的には分子量約１００乃至約２０００であり、さらに一般的には分子量約１００乃至約１０００である。
該物質が、蛋白質、抗体またはペプチドである場合には、生体組織や細胞から単離されるもの、及び遺伝子組換えや化学的合成により調製されるものも包含する。さらにまた、それらの化学修飾体も包含する。
ペプチドとしては、例えば、約３乃至約５００個のアミノ酸、好ましくは約３乃至約３００個のアミノ酸、さらに好ましくは約３乃至約２００個のアミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。
タンパク質、ペプチド、ポリペプチド
本発明で用いられるＲｅｃ１６８は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。Ｒｅｃ１６８は複数の文献（例えばＷＯ０１１６１５９、ＷＯ０１１９９８３、ＷＯ０１７２８３８等）に記載されている公知のタンパク質である。
Ｒｅｃ１６８は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞〔例えば、網膜細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、白血球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞株（ＧＩ−１０１）、結腸癌細胞株（ＣＸ−１、ＧＩ−１１２）、肺癌細胞株（ＬＸ−１、ＧＩ−１１７）、卵巣癌細胞株（ＧＩ−１０２）、前立腺癌細胞株など）など〕、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、ＫＯ−８１２、ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。本明細書におけるＲｅｃ１６８としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性、レセプター結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
Ｒｅｃ１６８としては、（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
本明細書におけるＲｅｃ１６８は、ペプチド表記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。Ｒｅｃ１６８は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
Ｒｅｃ１６８がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明でいうＲｅｃ１６８に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、Ｒｅｃ１６８には、上記タンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
Ｒｅｃ１６８の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＲｅｃ１６８などが挙げられる。Ｒｅｃ１６８またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載するＲｅｃ１６８またはＲｅｃ１６８をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
Ｒｅｃ１６８の部分ペプチド（以下、単に「部分ペプチド」と略記する場合がある）としては、上記したＲｅｃ１６８の部分アミノ酸配列を有するペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、Ｒｅｃ１６８の分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、Ｒｅｃ１６８と実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するＲｅｃ１６８の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＲｅｃ１６８の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
また、部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。また部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
さらに、部分ペプチドには、上記したＲｅｃ１６８と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
Ｒｅｃ１６８またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
Ｒｅｃ１６８の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＲｅｃ１６８を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、Ｒｅｃ１６８を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  および  Ｍ．Ａ．  Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド  シンセシス  （Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
ｂ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ  ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）、  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６５年）
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、  丸善（株）  （１９７５年）
ｄ）矢島治明  および榊原俊平、生化学実験講座  １、  タンパク質の化学ＩＶ、  ２０５、（１９７７年）
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発  第１４巻  ペプチド合成  広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ポリヌクレオチド
本発明は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードする核酸、及び配列番号：１で示されるアミノ酸配列のうち１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドも提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明のポリヌクレオチドとしてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有するものも本願発明の範囲に含まれる。なお、下記の実施例１において実際にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列が配列番号：２に示されている。よって、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号：２の塩基配列を有する。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば以下の方法により調製することが可能である。Ｒｅｃ１６８に特徴的な塩基配列をクエリーとして塩基配列の検索を行い、ヒトゲノムよりＲｅｃ１６８を見出す。見出したゲノム配列は又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて、ｃＤＮＡライブラリーなどから本発明ポリヌクレオチド（例えば本発明ＤＮＡ）を調製することができる。
ここで、核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、１３５０−１３５４（１９８５）］、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）［Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４、５６０−５６９（１９８９）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、８９、１１７−１２２（１９９０）；Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、１８９−１９３（１９９１）］、及び転写に基づく増幅［Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、１１７３−１１７７（１９８９）］等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）［Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、３９２−３９６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０、１６９１−１６９６（１９９２）］、自己保持配列複製（３ＳＲ）［Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、１８７４−１８７８（１９９０）］、及びＱβレプリカーゼシステム［リザイルディら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、１１９７−１２０２（１９８８）］等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
実施例１に示すように、配列番号：３及び配列番号：４のプライマーを使用した場合、ＰＣＲ産物として１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して本発明の核酸を得ることができる。
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列に対して少なくとも２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上の同一性を有する。
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２、３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、並びにＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｐｐ．３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７９）に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４、６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；及び（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
本発明は、本発明者らにより同定されたポリヌクレオチド（配列番号：２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖）に相補的な、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。このようなヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜３５ヌクレオチドの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のＤＮＡの少なくとも一部若しくは全部の配列を含む少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。このようなポリヌクレオチドは、好ましくは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするものである。「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、本発明者らにより同定されたポリヌクレオチド（配列番号：２）とハイブリダイズし、他のポリペプチドをコードするＤＮＡとはハイブリダイズしないことを意味する。
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、７．４２−７．４５（２００１）に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
また、このポリヌクレオチドには、Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドが含まれる。このようなポリヌクレオチドには、アンチセンスポリヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ；本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡ、および該ＲＮＡをコードするＤＮＡ）やリボザイム（本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ）が含まれる。
アンチセンスポリヌクレオチドが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座２  核酸ＩＶ  遺伝子の複製と発現」、日本生化学会編、東京化学同人、ｐｐ．３１９−３４７、１９９３）。
本発明で用いられるアンチセンスポリヌクレオチドは、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドも、本発明で利用されるアンチセンスポリヌクレオチドに含まれる。使用されるアンチセンスポリヌクレオチドは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。アンチセンスポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンス効果を引き起こすために、少なくとも１５ヌクレオチド以上、好ましくは１００ヌクレオチド、さらに好ましくは５００ヌクレオチド以上の鎖長を有し、通常、３０００ヌクレオチド以内、好ましくは２０００ヌクレオチド以内の鎖長を有する。
該アンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、Ｒｅｃ１６８をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：２）の配列情報を基にホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ、１９８８  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６、３２０９−２１（１９８８））などにより調製することが可能である。
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするポリヌクレオチドを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子、（１９９０）蛋白質核酸酵素、３５：２１９１）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡまたはＵでも切断されることが示されている（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら、（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２８：２２５）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら、（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：２８５、小泉誠および大塚栄子、（１９９０）蛋白質核酸酵素、３５：２１９１、Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７０５９）。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｊ．Ｍ．Ｂｕｚａｙａｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：３４９、１９８６）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｙ．ＫｉｋｕｃｈｉおよびＮ．Ｓａｓａｋｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６７５１、菊池洋、（１９９２）化学と生物３０：１１２）。
Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドは、遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ法やｉｎ  ｖｉｖｏ法などにより患者へ投与を行うことが考えられる。
抗体
本発明は、Ｒｅｃ１６８に結合する抗体を提供する。ここで「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
Ｒｅｃ１６８またはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細胞は、Ｒｅｃ１６８に結合する抗体を産生するための免疫原としても使用することができる。抗体は、好ましくは、Ｒｅｃ１６８に免疫特異的である。「免疫特異的」とは、その抗体が他のポリペプチドに対するその親和性よりもＲｅｃ１６８に対して実質的に高い親和性を有することを意味する。
本発明における抗体としては、Ｒｅｃ１６８を検出可能であり、かつＲｅｃ１６８の機能に影響を与える活性を有しているものが挙げられる。ここで、Ｒｅｃ１６８の機能とは、リガンド物質の結合機能、リガンド物質が結合することによって細胞の脱顆粒反応を誘導する機能を意味する。従って、本発明における薬剤としての抗体は、Ｒｅｃ１６８とリガンド物質との結合を一部もしくは全部阻害するもの、Ｒｅｃ１６８を介して起こる細胞の脱顆粒反応の一部もしくは全部を抑制するもの、または亢進するものが含まれる。
Ｒｅｃ１６８に対する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。Ｒｅｃ１６８またはその断片あるいはそれらのＧＳＴとの融合タンパク質をウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、Ｒｅｃ１６８をマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、Ｒｅｃ１６８に結合し、かつＲｅｃ１６８の機能に影響を与える抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
本発明における炎症性疾患診断薬、炎症性疾患診断用キットに含まれるＲｅｃ１６８の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はなく、上記と同様、該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。
剤、薬剤
本発明の「剤」または「薬剤」、「医薬組成物」とは、前記で定義される本発明の「化合物」、「ペプチド」、「ポリヌクレオチド」または「抗体」のいずれかと、薬学的に許容され得る担体とからなる医薬組成物である。
これら「剤」または「薬剤」、「医薬組成物」における「化合物」とは、天然又は合成の化合物を意味する。し、同様に「ペプチド」とは、アミノ酸が複数ペプチド結合した化合物を意味し、オリゴ・ペプチドであってもポリペプチドであってもよい。「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドが３０個程度以上重合したポリマーを意味する。「抗体」とは、所謂免疫グロブリン（Ｉｇ）を意味する。
本発明のこれら医薬組成物は、後述する炎症疾患、特に肥満細胞が関与する炎症性疾患の治療剤として有効である。
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分（前記ポリペプチドや抗体など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇ（あるいは１０μｇから５００ｍｇ）の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に０．１μｇ抗体／ｍｌ担体〜１０ｍｇ抗体／ｍｌ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは５０μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。
そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
本発明の「剤」または「薬剤」乃至「医薬組成物」は、肥満細胞の脱顆粒反応が関与している疾患、例えば、炎症性疾患等の治療及び予防に適用が可能である。特にアレルギー性疾患、自己免疫疾患等の慢性炎症に有効である。
なお、アレルギー性疾患について更に詳述すれば以下のとおりである。
アレルギー炎症は、周知のとおり、抗原の生体内への侵入、マクロファージによる貧食と抗原提示、Ｔｈの抗原認識とＩＬ−４産、Ｂ細胞の刺激とＩｇＥ抗体産生、ＦｃεＲＩとの結合と脱顆粒反応への進展の過程を経て発症する。
また、これらアレルギー炎症は病態的には、下記のとおりである。
（１）ＩｇＥ産生を亢進するアトピー性皮膚炎。
（２）ＩｇＥを介さない非特異的な刺激による活性化（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０）。
（３）肥満細胞遊離のケミカルメディエーターによる多彩な炎症像や細胞遊走活性による炎症細胞の集積。
（４）好酸球が遊離物質による組織障害。
（５）局所浸潤のＴ細胞からのサイトカインによる炎症細胞機能修飾（Ｔｈ２細胞からのＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦなどによる好酸球遊走と活性化）。
（６）Ｔ細胞および肥満細胞からのサイトカインによる血管内皮細胞と好酸球などの炎症細胞表面への接着分子誘導。
これら炎症は、生体組織に何らかの有害な起炎物質が作用した時に生体が示す局所反応であり、生体防御の一過程である。血管透過性をあげ、局所に白血球を浸出させ、血漿などの防御因子を局所に漏出させ、血液凝固の促進、血管内閉塞、局所の酸素濃度を低下させることによって病原体の増殖抑制と毒素の拡散を防止する。
そして、これら炎症反応に伴って以下のような現象が監察される。
（１）  組織傷害；
これは、病原生物、物理刺激（火傷）や化学的刺激（酸腐食）、異物、あるいは抗原抗体反応によって起こる。
（２）  微小血管での変化；
微小血管は一時的に収縮した後に拡張し、その結果、細静脈で血管内皮細胞間のｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎの間隙が広がり血漿が浸潤し、その後炎症細胞が血管外へと遊走する。ヒスタミンやプロスタグランディン類が内皮細胞や炎症細胞に作用する。
（３）  修復；
マクロファージが貧食することにより起炎物質を除去し、線維芽細胞の増殖と血管新生により肉芽組織が形成される。傷害された実質細胞が再生することがある。
（４）  慢性化；
修復時に起炎物質が除去されない時は慢性化が起きる。
これら炎症は、起炎物質の作用時に生体が示す反応であり、これには抗原抗体反応を伴う。Ｒｅｃ１６８の反応は免疫非関与であることから、アレルギー炎症の「ＩｇＥを介さない非特異的な刺激による活性化（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０）」の部分と炎症の「火傷による細胞傷害や異物混入（例えば、蜂毒や細菌感染など）」の複合型である。
特に肥満細胞と関わりが強いとされる疾患としては下記のごとき疾患を例示することができる。
（１）胃炎、胃潰瘍：
肥満細胞の優位な増加が認められ、肥満細胞脱顆粒の電顕所見が認められる。
（２）肝硬変：
胆管周囲に存在する肥満細胞集が増加し、肝の線維増生・肝内微小血行調節や血管新生に関与する。
（３）慢性胆道系疾患（肝内結石症、原発性硬化性胆管炎）：
肝内大型胆管や隔壁胆管の胆壁の線維性肥厚や胆管周囲の線維化が認められる。胆管周囲肥満細胞が増加し、この肥満細胞には線維化に関与するｂＦＧＦ、その他ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＴＧＦ−βなどのサイトカインの産生が認められる。
（４）潰瘍性大腸炎：
活動期の潰瘍性大腸炎患者の大腸粘膜では正常の肥満細胞がほとんどなく、脱顆粒後の形態を示す。
（５）慢性炎症性血管病：
肥満細胞の増加と脱顆粒、肥満細胞のキマーゼの過剰発現のために起こるとされるアンジオテンシンＩＩが過剰産生される。
（６）動脈硬化：
ヒト冠状動脈効果病変において肥満細胞を認め、活性化肥満細胞が動脈硬化血管内皮プラークに多く存在する。
（７）心臓アナフィラキシー：
ヒトの心臓、とくに血管周囲や筋鞘の近傍、動脈硬化巣内に肥満細胞が存在する。Ｉ型アレルギーで肥満細胞が活性化する。
（８）肺線維症：
膠原線維の沈着部位に一致して肥満細胞が増加する。ｂＦＧＦ陽性肥満細胞の存在が確認される。
（９）気管支喘息：
肥満細胞が増加し、脱顆粒像の様相を呈する。
（１０）腎炎（尿細管間質腎炎、糸球体腎炎）：
尿細管質、腎間質の血管周囲あるいは糸球体周囲の結合組織内に肥満細胞が増加する。ＩＬ−４陽性肥満細胞の存在が確認される。
（１１）間質性膀胱炎：
肥満細胞が増加する。Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐなどのニューロペプチドの尿中での増加が認められる。
（１２）アトピー性皮膚炎：
肥満細胞の増加、ＴＮＦ−αやＩＬ−４の産生が認められる。Ｃ線維神経終末から分泌されるＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐで新たな肥満細胞の活性化と脱顆粒が惹起される。
（１３）ケロイド：
真皮に於ける膠原線維成分の増加、肥満細胞の増加と脱顆粒像が認められる。膜安定化剤トラニラスト治療と予防への効果あり。
（１４）血管増殖性疾患（カポジ肉腫、悪性血管内皮細胞種）：
肥満細胞の増加とｂＦＧＦ陽性肥満細胞の存在が確認される。
（１５）慢性関節リュウマチ：
滑膜に肥満細胞増加と脱顆粒像が認められる。肥満細胞欠如マウスによる肥満細胞関与が証明された。
（１６）アレルギー性鼻炎：
肥満細胞が増加する。
（１７）アレルギー性結膜炎：
肥満細胞が増生する。
（１８）胃がん：
胃がん周辺に肥満細胞が浸潤、肥満細胞多いと予後悪し。腫瘍血管新生に関与する。
（１９）大腸がん、乳がん、皮膚の基底細胞がん、軟部組織腫瘍、メラノーマなどの悪性腫瘍：
間質に肥満細胞の集積が認められる。
（２０）非小細胞肺がん：
肥満細胞のガン間質への集積、血管新生に関与の可能性、肥満細胞に於けるＶＥＧＦの発現が認められる。
即ち、肥満細胞が関与する疾患としては、上記のとおり、胃炎、胃潰瘍：肝硬変：慢性胆道系疾患（肝内結石症、原発性硬化性胆管炎）：潰瘍性大腸炎：慢性炎症性血管病：動脈硬化：心臓アナフィラキシー：肺線維症：気管支喘息：腎炎（尿細管間質腎炎、糸球体腎炎）：間質性膀胱炎：アトピー性皮膚炎：ケロイド：血管増殖性疾患（カポジ肉腫、悪性血管内皮細胞種）：慢性関節リュウマチ：アレルギー性鼻炎：アレルギー性結膜炎：胃がん：大腸がん、乳がん、皮膚の基底細胞がん、軟部組織腫瘍、メラノーマなどの悪性腫瘍：非小細胞肺がん：その他蕁麻疹、全身性エリトマトーデス、多発性硬化症、膠原病、悪性腫瘍、Ｂリンパ腫、Ｂ細胞白血病、等を挙げることができる。
また、本発明の「剤」または「薬剤」の種々疾患症状の治療効果については、常法に従って、既知の疾患モデル動物に投与することにより試験、検討することができる。
Ｒｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドのシグナル伝達能
本発明において、「Ｒｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンド」とは、Ｒｅｃ１６８を介して細胞内にシグナルを伝達できる物質のことであって、シグナルの種類、物質の種類等は特に限定されるものではない。またここで言う「シグナル伝達能」は、Ｒｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンド物質が、Ｒｅｃ１６８を介して細胞内に伝達することができるシグナルの程度により表されるものであるが、上記と同様にシグナルの種類、リガンド物質の種類等に特に限定はない。
例えば、上記シグナル伝達能を測定する工程としては、以下のようなレポーター遺伝子を用いたアッセイ（レポータージーンアッセイ）（国際特許出願公開ＷＯ９２／０２６３９号、及び特表平６−５０２５２７など）を用いることができる。ここで、レポータージーンアッセイとは、細胞に、被験物質を接触させ、該化合物の作用に依存して発現されるレポーター蛋白質の量を、該蛋白質が発する蛍光の量を測定することにより間接的に測定することにより、該被験物質のＧ蛋白質共役型受容体との相互作用の有無を分析する方法である。また、該レポータージーンアッセイは、マニュアル作業でも可能であるが、機械（ロボット）を用いて自動で行う所謂ハイスループットスクリーニング（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）（組織培養工学、Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．１３、ｐ．５２１−５２４；米国特許第５、６７０、１１３号）を用いることによりより迅速、簡便に行うことができる。
例えば、レポータージーンアッセイを用いて、被験物質のＲｅｃ１６８を介するシグナル伝達能を測定する工程、またはＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドを選定する工程としては、以下のようなものが考えられる。
Ｒｅｃ１６８のリガンドを同定するために物質をスクリーニングする方法における工程であって、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むことを特徴とするもの：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子；及び
（２）Ｒｅｃ１６８を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域に発  現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞の定数からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に異なる物質を接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、いずれの物質にも接触させていない該試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々のシグナルの量を比較する工程。
本工程において、Ｒｅｃ１６８を介した刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域としては、最初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ）のプロモーター領域が挙げられる。本発明で用いられる最初期遺伝子のプロモーターとしては、例えば、ｃ−ｆｏｓプロモーター領域やｚｉｆ２６８プロモーター領域（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、Ｖｏｌ．８６、ｐ．３７７−３８１、１９８９；「ＥＧＲ−１」、「ＮＧＦ１−Ａ」、「Ｋｒｏｘ２４」、「Ｔｉｓ８」または「ｃｅｆ５」とも称される。）が挙げられる。特に好ましい態様としては、ｚｉｆ２６８（ＥＧＲ−１）プロモーター領域が挙げられる。また、本発明で使用されるプロモーターとしては、前記プロモーターの任意の動物種の対応物も包含される。
ここで「プロモーター領域」とは、プロモーター活性を発現するために必須な最小の塩基配列を含む任意の領域を意味しする。例えば、該遺伝子の転写部位に対して上流約５００ｂｐ乃至約２ｋｂｐの領域の一部または全部を用いることが可能である。さらに本発明における標記プロモーター領域としては、ミニマルプロモーターの上流に転写因子結合配列であるＳＲＥ（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）及び／またはＣＲＥ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を有するプロモーター領域が挙げられる。
本工程における「レポーター遺伝子」は、検出可能な蛍光を発するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を意味する。具体的には、例えば、蛍若しくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、またはクラゲ由来のＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などを挙げることができる。さらには、例えば、βガラクトシダーゼをコードする遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びβラクタマーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。
本工程における「ＰＣ１２由来細胞」とは、ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、Ｖｏｌ．７３、ｐ．２４２４−２４２６、１９７６；Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２２９、ｐ．３９３−３９５、１９８５；ＥＭＢＯ  Ｊ．、Ｖｏｌ．２、ｐ．６４３−６４８、１９８３）または該ＰＣ１２細胞株からからサブクローニングされた任意の細胞株を意味する。好ましくは、該サブクローニングされた細胞であって、且つ下記の性質を有するものである。
即ち、該細胞に、（１）Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子、並びに（２）「Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子」を外来的に導入して得た組換え細胞に、Ｒｅｃ１６８のリガンドを接触させた場合に、発現が誘導される該レポーター遺伝子産物の量が、宿主細胞として該ＰＣ１２細胞株を用いて検出されるレポーターの量よりも高い値が得られる細胞である。
該サブクローニングされた細胞としては、例えば、ＰＣ１２ｈ細胞株（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２２２、ｐ．２２５−２３３、１９８１）並びに該ＰＣ１２ｈ細胞株からサブクローニングされた種々細胞を好ましい態様として例示することができる。
さらに、上記シグナル伝達能を測定する工程としては、細胞内遊離カルシウム量を測定する方法が用いられることもある。細胞表面に発現したＲｅｃ１６８と、これに結合する化合物を含むと予想される被験物質とを接触せしめ、常法に従って細胞内遊離カルシウムを測定し、Ｒｅｃ１６８を介して細胞内にシグナルを伝達する活性を有する化合物を選択することができる。
この工程においては、Ｒｅｃ１６８発現細胞及びＲｅｃ１６８非発現細胞のそれぞれに対して被験物質を添加し、細胞内遊離カルシウム濃度の変化を測定する。両者の結果を比較し、Ｒｅｃ１６８を強制発現させた細胞株のみで細胞内遊離カルシウム濃度の変化が大きい物質をＲｅｃ１６８を介するシグナル伝達能の高い物質とし、Ｒｅｃ１６８のリガンドの候補として選定することができる。
細胞内遊離カルシウム濃度の測定は当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、９６穴や３８４穴などのマルチウエルプレートに細胞を播種し、細胞内カルシウムの蛍光検出試薬（Ｆｕｒａ−２など）をロードし、リガンド候補物質で刺激を行い、細胞内カルシウム測定用蛍光分光器で測定することができる。
さらに、上記シグナル伝達能を測定する工程としては、例えばＧＴＰ結合試験を用いることもできる。この試験においては、フィルタープレートに添加したＲｅｃ１６８発現細胞及び非発現細胞の細胞膜画分に被験物質を反応させ、膜画分に結合したＧＴＰ量を測定し比較することにより、被験物質がＧ蛋白質共役型受容体であるＲｅｃ１６８を介して特異的なシグナルを伝達するか否かを解析することができる。ＧＴＰ結合活性の測定は当業者に公知の方法で行うことができ、特に限定されないが、例えば、パーキンエルマー社のＤＥＬＦＩＡ  ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｔ  ＡＤ０１６７等のキットを用いると簡便に測定することができる。
本発明における、「Ｒｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンド」の好ましい例としては、例えば、ＭＣＤ−Ｐ、［Ｄ−Ｐｒｏ２、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、［Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ２８、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ１０（１−２０）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ−４、ｐＣＮＰ（１−１７）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ、Ａｎｇｉｏｐｅｐｔｉｎ、ＰＡＣＡＰ（６−２７）、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、Ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ  １４、ＭＢＰ、ＭＢＰ（９９−１１０）、ＥＣＰ、ＥＣＰ（２９−４５）等を挙げることができる。
Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質
本発明は、Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドのシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。また、本発明は、Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドのシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程を含むことを特徴とする、Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質の同定方法をも提供する。
Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質の同定方法とは、披験物質がＲｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質であるか否かを同定することを意味する。したがって、かかる「Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質の同定方法」は、概念上、「Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質のスクリーニング方法」を包含する。
本発明者らは、Ｒｅｃ１６８が肥満細胞の脱顆粒及びプロスタグランジンＤ２産生を誘導する蛋白質であることを見出した。すなわち、Ｒｅｃ１６８アゴニスト活性を有するリガンド物質がＲｅｃ１６８に結合することにより、細胞内シグナル伝達過程を経て、脱顆粒反応及びプロスタグランジンＤ２産生が誘導される。
本発明において「Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質」とは、Ｒｅｃ１６８アゴニスト活性を有するリガンド物質がＲｅｃ１６８に結合することにより引き起こされる細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制することができる物質のことであり、このような作用を有する物質であれば、特に限定されるものではない。このような作用を有する物質は、言い換えれば、「Ｒｅｃ１６８アンタゴニスト作用を有する物質」である。
Ｒｅｃ１６８が肥満細胞の脱顆粒またはプロスタグランジンＤ２産生を誘導する蛋白質であるため、Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドのシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程により選択された同シグナル伝達能を抑制する物質であれば、Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質であると考えられる。従って、本発明においてＲｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質のスクリーニング方法または同定方法としては、Ｒｅｃ１６８を発現している細胞を用いて、被験物質の共存下及び非共存下においてＲｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンドのシグナル伝達能を測定する工程、並びに両測定値を比較する工程のみが含まれているものであってもよい。
さらには、上記工程に以下の工程を組み合わせた方法も好ましい。また、Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質のスクリーニング方法または同定方法としては、以下に示す工程のみでもよい。
例えば、Ｒｅｃ１６８と、Ｒｅｃ１６８アゴニスト活性を有するリガンド物質との結合を抑制する物質は、Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質であると考えられる。このような物質のスクリーニング方法または同定方法としては、被験物質存在下、非存在下での、リガンド物質のＲｅｃ１６８への結合性を比較する方法が可能である。尚、リガンド物質の結合性の検出、比較は、次のように行うことができる。
ここで、本発明におけるスクリーニングまたは同定に用いられるＲｅｃ１６８は組換えポリペプチドであっても、天然由来のポリペプチドであってもよい。また部分ペプチドであってもよい。また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。被験物質としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製ポリペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被験物質を接触させる本発明のポリペプチドは、例えば、精製したポリペプチドとして、可溶型ポリペプチドとして、担体に結合させた形態として、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被験物質に接触させることができる。
被験物質存在下、非存在下での、リガンド物質のＲｅｃ１６８への結合性を検出、比較する方法としては、リガンド物質がポリペプチドである場合には、以下のように当業者に公知の多くの方法により行うことができる。
例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ｐ．８３−１４１（１９８２））、ＥＦ−１  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ  ９１、ｐ．２１７−２２３（１９９０））、ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １０８、ｐ．１９３−２００（１９９１））、ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２、ｐ．６８４−７０４（１９８７）、ＳＲ  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、ｐ．４６６（１９８８））、ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４、ｐ．３３６５−３３６９（１９８７））、ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１、ｐ．３８５−３９４（１９８２））、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９、ｐ．９４６（１９８９））、ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５、１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ、Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７、２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ、Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２、５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ、Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ、Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ、Ｂ．Ｃｅｌｌ  ７、１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ、Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５、２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ、Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９、２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＲｅｃ１６８のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてＲｅｃ１６８を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３、８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。
融合ポリペプチドにすることによりＲｅｃ１６８の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ウイルス糖蛋白質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０蛋白質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、Ｒｅｃ１６８に結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学  １３、８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、被験物質の存在下及び非存在下において、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＲｅｃ１６８、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。被験物質が、Ｒｅｃ１６８とリガンド物質との結合を抑制する活性を有するものである場合には、これら免疫複合体中のリガンド物質の量がコントロールと比較して減少することとなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のポリペプチドに対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のポリペプチドに対する抗体は、例えば、Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＲｅｃ１６８の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、Ｒｅｃ１６８を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、Ｒｅｃ１６８の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｐｐ．５１１−５５２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
また、Ｒｅｃ１６８に結合するリガンド物質であるポリペプチドの量を測定する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ、Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ（１９９１）６５、８３−９０）が考えられる。すなわち、Ｒｅｃ１６８と結合するリガンドポリペプチドを発現している細胞、組織、臓器（例えば、精巣）よりファージベクター（λｇｔ１１、ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、被験物質の存在下、及び非存在下において、精製して標識した本発明のポリペプチドと上記フィルターとを反応させ、Ｒｅｃ１６８と結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。被験物質がＲｅｃ１６８とリガンド物質との結合を阻害する活性を有するものである場合には、カウントが低く検出されることとなる。Ｒｅｃ１６８を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、Ｒｅｃ１６８又はＲｅｃ１６８に融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
被験物質存在下、非存在下での、リガンド物質のＲｅｃ１６８への結合性を検出、比較する方法としては、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行う方法も考えられる。例えば、Ｒｅｃ１６８をアフィニティーカラムの担体に固定し、被験物質存在下、非存在下でＲｅｃ１６８アゴニスト活性を有するリガンド物質を結合させた後、カラムを洗浄し、Ｒｅｃ１６８に結合したリガンド物質量を比較することができる。
被験物質存在下、非存在下での、リガンド物質のＲｅｃ１６８への結合性を検出、比較する方法としては、ペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、Ｒｅｃ１６８に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．、Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６、２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．、Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６、３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６、３８４  ｐ１７−９）が当業者に公知である。
本発明において、結合した物質を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、Ｒｅｃ１６８と被験物質との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のポリペプチドと被験物質との結合を評価することが可能である。
また、Ｒｅｃ１６８を介する脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質のスクリーニング方法または同定方法としては、直接的に、細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を測定し、比較する方法も可能である。
尚、Ｒｅｃ１６８発現細胞に被験物質を接触せしめ、Ｒｅｃ１６８を介した細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を誘導することができる物質は「Ｒｅｃ１６８アゴニスト作用を有するリガンド」のひとつであると言える。
例えば、Ｒｅｃ１６８を発現した肥満細胞と発現していない肥満細胞に対して被験物質を添加することによって、Ｒｅｃ１６８を発現した肥満細胞においては脱顆粒またはプロスタグランジンＤ２産生を誘導するが、発現していない細胞においては誘導しないような物質を選定する方法が考えられる。肥満細胞は、造血幹細胞より常法に従って分化誘導させることができ、培養条件によってＲｅｃ１６８発現細胞、非発現細胞を誘導することが可能である。
ここで、肥満細胞としては、血液、組織から直接分離したものを用いることもできる。Ｒｅｃ１６８発現細胞、非発現細胞は、Ｒｅｃ１６８に対する抗体を用いたソーティングにより分離することも可能である。また、肥満細胞としては、培養細胞株を用いることもできる。
Ｒｅｃ１６８を介する細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生を抑制する物質のスクリーニング方法としては、被験物質存在下、非存在下での、Ｒｅｃ１６８を介したリガンド物質による細胞の脱顆粒反応またはプロスタグランジンＤ２産生の程度を比較する工程が含まれていれば特に限定されるものではない。
Ｒｅｃ１６８の発現を制御する物質のスクリーニング方法
さらに、本発明は、細胞におけるＲｅｃ１６８蛋白質、又はＲｅｃ１６８をコードするポリヌクレオチドの発現を制御する物質のスクリーニング方法をも提供することができる。
本発明のひとつの態様としては、細胞に対して披検物質を作用させる前後における細胞表面上のＲｅｃ１６８蛋白質発現、又はＲｅｃ１６８遺伝子発現の程度を比較することにより行うことができる。
細胞におけるＲｅｃ１６８の発現の変化を検出する方法としては、当業者に公知の方法で行うことができる。このような方法としては、例えば、ノーザンブロッティング法やＲＴ−ＰＣＲ法などを例示することができるがこれらに制限されない。ノーザンブロッティング法においては、検査対象となる細胞のＲＮＡを精製し、アガロースゲル中にて電気泳動し、メンブレンにブロットしたものに、本発明の遺伝子を放射能などで標識したプローブをハイブリダイズさせ、特異的に出現するバンドの有無、濃淡で本発明のポリヌクレオチドの発現を測定する。また、ＲＴ−ＰＣＲ法では、検査対象となる細胞のＲＮＡを精製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡとし、これを鋳型として、Ｒｅｃ１６８に特徴的な配列をプライマーとして、本発明の遺伝子の転写産物由来のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する。これにより増幅されたｃＤＮＡの量は鋳型となったｃＤＮＡの量、ひいてはＲｅｃ１６８の転写産物の量に比例すると考えられるので、このＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の量を電気泳動法などを用いて測定することで、Ｒｅｃ１６８の発現量を測定できる。
また他の方法としては、例えば、本発明の抗体を用い、抗原抗体反応を行わせることにより、Ｒｅｃ１６８または該ポリペプチドを含む細胞を免疫学的に検出することができる。該検出方法は、Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子（ゲノムＤＮＡ等）の変異または発現異常が原因となり得る疾患の診断にも利用することができる。また、Ｒｅｃ１６８の定量方法としては、免疫学的に検出する方法として、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等があげられる。また、液相中でＲｅｃ１６８と反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、放射性ヨード等の放射性同位体で標識した本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドを認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等があげられる。
また他の方法として、Ｒｅｃ１６８の転写を制御する領域の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験物質とを接触させ、Ｒｅｃ１６８の発現を制御する化合物を選択することにより行うこともできる。レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、Ｒｅｃ１６８をコードするＤＮＡもまた含まれる。
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
また、Ｒｅｃ１６８をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
また、該遺伝子からコードされるＲｅｃ１６８を含む画分を定法に従って回収し、該ポリヌクレオチドの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、Ｒｅｃ１６８に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ポリペプチドの発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
本発明のスクリーニング方法または同定方法により得られる物質は、Ｒｅｃ１６８蛋白質若しくはＲｅｃ１６８をコードするポリヌクレオチドの発現を制御するための、又はＲｅｃ１６８蛋白質の活性（例えば、Ｒｅｃ１６８蛋白質を介するシグナル伝達能）を調節（例えば、抑制）するための薬剤の候補となり、Ｒｅｃ１６８の発現異常や機能異常などに起因する疾患やＲｅｃ１６８の活性を制御することにより治療可能な疾患の治療への応用が考えられる。治療や予防の対象となる疾患としては、例えば、炎症性疾患、特にアレルギー性疾患、自己免疫疾患等の慢性炎症が考えられる。本発明のスクリーニング方法または同定方法により得られる物質の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される物質も、本発明の範囲に含まれる。
炎症性疾患
炎症性疾患とは、特に肥満細胞が関与する炎症性疾患とは、特に肥満細胞が関与するアレルギー性疾患、自己免疫疾患等の慢性炎症を意味し、それらアレルギー性疾患又は自己免疫疾患の具体的な例としては、前記の通り、胃炎、胃潰瘍：肝硬変：慢性胆道系疾患（肝内結石症、原発性硬化性胆管炎）：潰瘍性大腸炎：慢性炎症性血管病：動脈硬化：心臓アナフィラキシー：肺線維症：気管支喘息：腎炎（尿細管間質腎炎、糸球体腎炎）：間質性膀胱炎：アトピー性皮膚炎：ケロイド：血管増殖性疾患（カポジ肉腫、悪性血管内皮細胞種）：慢性関節リュウマチ：アレルギー性鼻炎：アレルギー性結膜炎：胃がん：大腸がん、乳がん、皮膚の基底細胞がん、軟部組織腫瘍、メラノーマなどの悪性腫瘍：非小細胞肺がん：その他蕁麻疹、全身性エリトマトーデス、多発性硬化症、膠原病、悪性腫瘍、Ｂリンパ腫、Ｂ細胞白血病、等を挙げることができる。
診断薬
本発明は、Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子の発現の異常またはＲｅｃ１６８の活性の異常に関連した疾患の診断薬を提供する。Ｒｅｃ１６８は肥満細胞の脱顆粒を誘導する機能を有するため、その発現や機能の異常は、慢性炎症等種々の疾患の原因となり得る。従って、Ｒｅｃ１６８の不適当な活性または発現、リガンド分子の体内発現量を指標とすることにより、このような疾患の診断を行うことも可能である。
本発明において「診断薬」とは、疾患の症状を呈している被験者の治療戦略を立てるための診断薬のみならず、被験者が疾患にかかりやすいか否かを判断するために使用する予防のための診断薬も含まれる。
本発明の診断薬の一つの態様は、被験者におけるＲｅｃ１６８のリガンド物質の体内発現量を測定するために用いるＲｅｃ１６８蛋白質またはその部分ペプチドを含有する診断薬である。Ｒｅｃ１６８蛋白質またはその部分ペプチドをあらかじめコーティングしたプレートに被験者から調製した血液試料を添加し、標識したリガンド物質に対する抗体を用いて、血液試料中のリガンド物質の量を定量することができる。
本発明の診断薬の一つの態様は、被験者におけるＲｅｃ１６８をコードする遺伝子またはその発現制御領域における変異を検出できるものである。
一つとしては、被験者におけるＲｅｃ１６８をコードする遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を直接決定することによって検査を行うための診断薬であり、例えばＲｅｃ１６８をコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプローブ又はプライマーを含むものである。被験者におけるＲｅｃ１６８をコードする遺伝子またはその発現制御領域における変異を検出することができれば、その使用方法は特に限定されない。例えば、まず、被験者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液等から抽出した染色体ＤＮＡあるいはＲＮＡを基に調製することができる。染色体ＤＮＡから本方法のＤＮＡ試料を調製するには、例えば染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ベクターにクローニングして、ゲノムライブラリーを作製すればよい。ＲＮＡからＤＮＡ試料を調製するには、例えば、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製すればよい。次いで、Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプローブを用いて、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングをすることにより行うことができる。また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲによって単離することもできる。次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。選択したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。「対照」とは、正常な（野生型の）Ｒｅｃ１６８をコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡの塩基配列を言う。このような比較の結果、被験者のＤＮＡの塩基配列が対照と異なっていた場合には、被験者は、疾患に罹患しているまたは発症の危険があると判定される。
本発明の診断薬の一つの態様は、被験者におけるＲｅｃ１６８蛋白の発現量または活性を測定するために用いるＲｅｃ１６８あるいはその部分ペプチドに対する抗体、又はＲｅｃ１６８のリガンド物質を含有する診断薬である。被験者から調製した血液試料中から肥満細胞を分離し、Ｒｅｃ１６８あるいはその部分ペプチドに対する抗体、又はリガンド物質を反応させ、肥満細胞上のＲｅｃ１６８分子の発現量、リガンド結合能をフローサイトメーターにて測定することができる。発現量やリガンド結合能が増大している場合には、発症の危険があると判定される。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【０００８】
Ｒｅｃ１６８（ＭＲＧＸ２）のクローニング
ヒト精巣ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。反応にはＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）に添付される試薬を使用した。反応系は、ヒト精巣ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（１μｇ／μＬ）０．０１μＬ、２×Ｂｃａ  １ｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ  ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）０．８μＬ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ）０．２μＬ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．１μＬ、Ｂｃａ  ＰＬＵＳ  ＲＴａｓｅ（４２Ｕ／μＬ）０．２μＬ、Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒ（５０μＭ）０．２μＬを滅菌水でメスアップし４μＬとした。これを６５℃１分、３０℃１分、３０−６５℃１５分、６５℃３０分、９８℃５分、５℃５分反応させた。
１次ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）に添付される試薬を使用した。上記で合成したｃＤＮＡを含む逆転写反応液４μＬに、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）０．４μＬ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．１μＬに、それぞれ配列番号：３及び４に示した配列を有するプライマー１６８＿ＰＣＲ＿Ｆ１（５μＭ）４μＬ及び１６８＿ＰＣＲ＿Ｒ１（５μＭ）４μＬを添加し、滅菌水でメスアップし２０μＬとした。これを、９４℃３０秒、（９４℃３０秒、７２−５６℃（１サイクルごとに１℃下げる）３０秒、７２℃２分）×１７サイクル、（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分）×１３サイクル、７２℃３分反応させた。
２次ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）に添付される試薬を使用した。１次ＰＣＲ反応液の１００倍希釈液１μＬに、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）０．８μＬ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ  １μＬ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．０５μＬに、それぞれ配列番号：５及び６に示した配列を有するプライマー１６８＿ＰＣＲ＿Ｆ２（５μＭ）２μＬと１６８＿ＰＣＲ＿Ｒ２（５μＬ）２μＬを添加し、滅菌水でメスアップし１０μＬとした。これを、９４℃３０秒、（９４℃３０秒、７２−５６℃（１サイクルごとに１℃下げる）３０秒、７２℃２分）×１７サイクル、（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分）×１３サイクル、７２℃３分反応させた。
２次ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルを用いて電気泳動法にて分離し、アガロースゲルの破片からＤＮＡを抽出した。Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を使用して、末端のリン酸化を行い、これをＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ）を使用して、マルチクローニングサイトを制限酵素ＨｐａＩで消化し、脱リン酸化処理したベクターｐＥＮＴＲＩＡ（インビトロジェン株式会社）と反応させた。この反応液を大腸菌ＤＨ５α株へ導入・形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選択した。得られた大腸菌コロニーから、遺伝子が挿入されたクローンを選別し、プラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡを鋳型とし、Ｒｅｃ１６８（ＭＲＧＸ２）のプライマー６種類を用いて塩基配列解析を行なった。プライマーは、１６８＿ＰＣＲ＿Ｆ２（配列番号：５）、１６８＿ＰＣＲ＿Ｒ２（配列番号：６）、１６８＿ＳＥＱ＿Ｆ１（配列番号：７）、１６８＿ＳＥＱ＿Ｆ２（配列番号：８）、１６８＿ＳＥＱ＿Ｒ１（配列番号：９）、１６８＿ＳＥＱ＿Ｒ２（配列番号：１０）を使用した。ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アマシャム  バイオサイエンス株式会社）を用いたダイターミネーター法で反応させ、シークエンサーＭｅｇａＢａｃｅ１０００（アマシャム  バイオサイエンス株式会社）を使用して解析した。目的の配列が挿入されたプラスミドＤＮＡを「ｐＥＮＴＲ−Ｒｅｃ１６８」と名付けた。
【実施例２】
【０００９】
発現ベクターの構築
ｐＥＮＴＲ１Ａ（エントリーベクター）にクローニングされたｐＥＮＴＲ−Ｒｅｃ１６８をＧａｔｅｗａｙ  Ｓｙｓｔｅｍテクノロジー（インビトロジェン株式会社）によって、目的の発現ベクター（デスティネーションベクター）へ挿入配列部分を相同組換え技術によって入れ換えた。
ａｔｔＬ×ａｔｔＲ組換え反応を仲介する酵素Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（インビトロジェン株式会社１１７９１−０１９）を使用した。試薬は酵素に添付されている。今回は発現ベクターには、ｐＭＥ１８Ｓをデスティネーション化したｐＭＥ１８Ｓ．ｒｆＡを使用した。エントリーベクター１００ｎｇとデスティネーションベクター１００ｎｇをＴＥ  ｂｕｆｆｅｒで６μＬにメスアップし、５×ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬと混合した。ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μＬを添加し、室温（２５℃）で１時間インキュベーションした。反応停止するためにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２μｇ／μＬ）１μＬ添加し３７℃で１０分間インキュベーションした。反応終了後、氷上にて冷した。この反応液２．５μＬで氷上解凍したコンピテントセルＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢ）をｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎし、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選択した。得られた大腸菌コロニーから、遺伝子が挿入されたクローンを選別し、プラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡを鋳型とし、遺伝子特異的なプライマーを用いて塩基配列解析を行った。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用いたダイターミネーター法で反応させ、シークエンサーＡＢＩ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用して解析した。目的の配列が挿入されたプラスミドＤＮＡを「ｐＭＥ−Ｒｅｃ１６８」と名付けた。
【実施例３】
【００１０】
Ｒｅｃ１６８一過性発現ＰＣ１２ｈ細胞におけるレポーター活性の変化９６ウェル法
１０％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２６０５０−０８８）と５％ウシ胎児血清（ＪＲＨ１２１０３−７８Ｐ）および０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ０９０６）含有Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）（日研生物  ＣＭ４４０２）培地にてコラーゲンｔｙｐｅ  Ｉコートフラスコ（イワキ硝子  ４１４３−０１０）で培養したラット腎臓由来ＰＣ１２ｈ細胞を、２２５ｃｍ２フラスコ（１×１０７個細胞）からＰＢＳ（−）（日研生物  ＣＭ６２０１）でリンスした後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ５３００−０５４）を用いて剥がした後、０．５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２６０５０−０８８）と０．２５％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  １２１０３−７８Ｐ）および０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ０９０６）含有Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）フェノールレッドフリー（日研生物  ＣＭ４４１０）培地にて１．５×１０５個細胞／ｍＬに調製した。この細胞懸濁液１ｍＬあたり、ホタルルシフェラーゼ−ｚｉｆレポータープラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ２−ｚｉｆ）を１００ｎｇ、Ｇａ１６−ｐｒｏｔｅｉｎプラスミドＤＮＡ（ｐＭＥ−ｎｅｏ−Ｇ１６）を５０ｎｇ、レセプタープラスミドＤＮＡ（ｐＭＥ−ＭＲＧＸ２）１μｇを、Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）フェノールレッドフリー（日研生物  ＣＭ４４１０）培地６０μＬに溶解し、トランスフェクション試薬ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ３０１３０７）を２μＬと混合した。これと上記細胞懸濁液を混合したものを、コラーゲンｔｙｐｅ  Ｉコート９６ウェルプレート（イワキ硝子  ４８６０−０１０）に１００μＬずつ分注し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて４８時間培養した。
培養上清５０μＬを除去したのち、終濃度の２倍濃溶液にＤ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）フェノールレッドフリー（日研生物  ＣＭ４４１０）培地を用いて調製した被験物質を５０μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて６時間培養した。培養上清をすべて除去し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１５３１）を２５μＬ／ウェル添加し、細胞を溶解した。
細胞溶解液１０μＬを９６ウェル白プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３９１２）分注し、ルミノメーターＬＢ９６Ｖ（ベルトールド）にてルシフェラーゼ基質フラッシュタイプ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ４５５０）を５０μＬ添加し、ルシフェラーゼ活性（単位；ＲＬＵ）を測定した。ルシフェラーゼ活性値をＹ軸に、被験物質の濃度をＸ軸にプロットした濃度依存曲線を作成し、ＥＣ５０値を導き出した。
３８４ウェル法
９６ウェル法と同様にトランスフェクションした細胞懸濁液を、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）コーティングした３８４ウェル白プレート（Ｆａｌｃｏｎ３９８８）に４０μＬずつ分注し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて４８時間培養した。ＰＥＩコーティングは、ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３１４３）を滅菌水で１０００倍希釈し、これを２５μＬ／ウェル添加し１時間以上放置後、７０μＬ滅菌水で２回洗浄した。
培養上清５０μＬを除去したのち、終濃度の５倍濃溶液にＤ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）（日研生物  ＣＭ４４０２）培地を用いて調製した被験物質を１０μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて６時間培養した。反応終了後、Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２５５０）を２５μＬ／ウェル添加し、１４５０  ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ（Ｗａｌｌａｃ）にてルシフェラーゼ活性（単位；ＣＣＰＳ）を測定した。ルシフェラーゼ活性値をＹ軸に、被験物質の濃度をＸ軸にプロットした濃度依存曲線を作成し、ＥＣ５０値を導き出した。
被検物質としては、Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＣＤ−Ｐ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ４１−９−３０）、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ２８（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ６８−１−５０）、Ａｔｒｉａｌ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（１−２８）、ｒａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １４−５−４１）、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １８−１−１０）、Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ６０−１−１２）、Ｍａｇａｉｎｉｎ  ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ７２−２−２６）、Ｇｒａｎｕｌｉｂｅｒｉｎ  Ｒ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ８７−０−７２）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（ペプチド研究所  ４０１４−ｖ）、Ｈｉｓｔａｔｉｎ５（ペプチド研究所  ４２７０−ｓ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ−４（ペプチド研究所  ４３０５−ｖ）、α−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ−１（ＨＮＰ−１）（ペプチド研究所  ４２７１−ｓ）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（Ｓｉｇｍａ  Ｃ２３１３）、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ９４０４）、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ  ＧｒｏＥＳ（宝酒造  ７３３１）、ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ  １０（１−２０）（合成品）、２’、３’−ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３’  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（１−１７）（ｐＣＮＰ（１−１７））（合成品）、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（合成品）、ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（合成品）、ｈｕｍａｎ  ＨＲＰ−１（合成品）、ｈｕｍａｎ  ＨＲＰ−２（合成品）、［ｄ−Ｐｒｏ４、ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（４−１１）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｈ４６９５）、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ（合成品）、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ（合成品）、ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ  ＳＳ−Ｎ（合成品）、［ｄ−Ｐｒｏ２］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（合成品）、［ｄ−Ｐｒｏ４］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（合成品）、ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ（ＬＬ−３７）（合成品）、ｃａｔｅｓｔａｔｉｎ（合成品）、Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ７２−２−２８）、Ａｎｇｉｏｐｅｐｓｉｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ６８−１−４５、ＰＡＣＡＰ（６−２７）（合成品）、ＶＩＰ（１−２８）（合成品）、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ６８−１−１０）、ＢＡＭ（８−２２）（合成品）、ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ１４（ペプチド研究所  ４３２９−ｖ）、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ（１−１２）（合成品）を用いた。陽性コントロールとして、１０μＭ  Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＲＢＩ  Ｆ１０５）および１００ｎＭ  Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）（和光純薬  ５４５−００２１６）を使用した。
使用した被検物質のペプチド配列は下記表１のとおりである。
【表１】
2007058336.tif 000002
Ｒｅｃ１６８を一過性発現させたＰＣ１２ｈ−１７細胞に対し、様々な被検物質で刺激した。その結果、ＭＣＤ−Ｐ、ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ１４、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０、ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ２８、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ４、［Ｄ−Ｐｒｏ２］ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、［Ｄ−Ｐｒｏ４］Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ｐＣＮＰ（１−１７）、Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ、Ａｎｇｉｏｐｅｐｓｉｎ、ＰＡＣＡＰ（６−２７）ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ｈｕｍａｎ  ＨＲＰ−１では、Ｒｅｃ１６８を導入したＰＣ１２ｈ細胞でルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。今回試した被検物質で全く応答しなかったものは、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（４−１１）、Ｇｒａｎｕｌｉｂｅｒｉｎ  Ｒ、Ｈｉｓｔａｔｉｎ５、α−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ−１、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ  ＧｒｏＥＳであった。
結果を図１〜３及び表２に示した。
図１に示すとおり、全てにおいてＲｅｃ１６８を導入したＰＣ１２ｈ細胞でルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。なお、ここでＡはＲｅｃ１６８発現細胞、ＢはＭｏｃｋでの結果を示す。
図２に示すとおり、全てにおいてＲｅｃ１６８を導入したＰＣ１２ｈ細胞でルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。なお、ここでＡはＲｅｃ１６８発現細胞、ＢはＭｏｃｋでの結果を示す。
図３に示すとおり、Ｒｅｃ１６８を導入したＰＣ１２ｈ細胞でルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。なお、ここでＡはＲｅｃ１６８発現細胞、ＢはＭｏｃｋでの結果を示す。
【表２】
2007058336.tif 000003
【実施例４】
【００１１】
安定形質発現細胞の作製
発現ベクター構築
Ｒｅｃ１６８  ｃＤＮＡを、発現ベクターｐＬＨＣＸＩ４（図４参照）にサブクローニングし、ｐＬＨＣ−Ｒｅｃ１６８−Ｉ４（図５参照）を構築した。このｐＬＨＣ−Ｒｅｃ１６８−Ｉ４で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを培養後、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてｐＬＨＣ−Ｒｅｃ１６８−Ｉ４のＤＮＡを調製した。
２９３細胞のｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）を１０％牛胎仔血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地（日研生物医学研究所  ＣＭ４４０２）でファルコン６ウェルプレートに７．５×１０５個播種し、５％  ＣＯ２インキュベーターで３７℃一晩培養した。上記発現プラスミドｐＬＨＣ−Ｒｅｃ１６８−Ｉ４  ＤＮＡ  ２．５μｇを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）８μＬで添付取扱説明書の記述に従いトランスフェクションし、６時間後に培地を交換した。さらに、２日間培養した後、選択培地［２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１０６８７−０１０）と１０％牛胎仔血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地（日研生物医学研究所  ＣＭ４４０２）］に交換した。３〜４日ごとに選択培地を交換しながら４週間培養を行い、ハイグロマイシン耐性細胞を得た。
ＭＡＣＳによるＣＤ４陽性細胞の選択
上記で得たハイグロマイシン耐性細胞から、ＣＤ４陽性細胞をＭＡＣＳｅｌｅｃｔ  ４  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）で回収した。上記で得たハイグロマイシン耐性細胞を選択培地［２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０６８７−０１０）と１０％牛胎仔血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地（日研生物医学研究所  ＣＭ４４０２）］で７５ｃｍ２フラスコに播種し、１×１０７個になるまで培養した。培地を廃棄し、Ｄ−ＰＢＳ（日研生物医学研究所  ＣＭ６２０１）を１０ｍＬで細胞を洗浄した。５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したＤ−ＰＢＳを５ｍＬ加え、室温で１０分置いて細胞を剥離させた。
２１０×ｇで３分間遠心して細胞を回収し、７２０μＬのＰＢＥ（Ｄ−ＰＢＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．５％  ＢＳＡ）に懸濁した。８０μＬのＭＡＣＳｅｌｅｃｔ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を添加し、４℃で１５分間結合させた後、ＰＢＥを１．２ｍＬ加えて希釈した。添付取扱説明書の記述に従いＰＢＥ３ｍＬで洗浄したＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）にＭＡＣＳｅｌｅｃｔ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを結合させた細胞懸濁液を添加して結合させた。カラムを３ｍＬのＰＢＥで４回洗浄後、ＭＡＣＳｓｅｐａｒａｔｏｒ磁石からはずし、５ｍＬのＰＢＥでＣＤ４陽性細胞を回収した。回収したＣＤ４陽性細胞を２１０×ｇで３分間遠心した後、選択培地で７５ｃｍ２フラスコに播種した。３−４日ごとに選択培地を交換しながら１０日間培養を行い、ＣＤ４陽性ハイグロマイシン耐性細胞を得た。得られたＣＤ４陽性ハイグロマイシン耐性細胞をＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞とした。
【実施例５】
【００１２】
細胞内遊離カルシウム測定
Ｒｅｃ１６８安定発現２９３細胞における細胞内遊離Ｃａ２＋濃度の変化
１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  １２１０３−７８Ｐ）および０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ０９０６）含有Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）（日研生物  ＣＭ４４０２）培地にて培養したＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞、および２９３細胞（親株）を、ＰＢＳ（−）（日研生物  ＣＭ６２０１）でリンスした後、フラスコを叩いて細胞を剥がした。Ｃａ２＋アッセイバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ナカライ１７５１４−１５）；（ｐＨ７．４；１Ｍ  ＫＯＨ（ナカライ  ２８６−１６）で調製）、１１５ｍＭＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ５１５０）、５．４ｍＭ  ＫＣｌ（ナカライ  ２８５−１４）、０．８ｍ  ＭｇＣｌ２（ナカライ  ２０９−０９）、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２（ナカライ  ０６７−２９）、１３．８ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（ナカライ  １６８−０６）、０．２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ８８０６）、２．５ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８７６１）で１回洗浄した後、Ｆｕｒａ２ローディングバッファー（２μＭ  Ｆｕｒａ２−ＡＭ（同仁化学  ３４３−０５４０１）、０．０２％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｐ６８６６）を含む上記Ｃａ２＋アッセイバッファー）１０ｍＬに懸濁し、室温で１時間インキュベーションした。Ｃａ２＋アッセイバッファーで２回洗浄し、１×１０６個細胞／ｍＬに調製した。３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ．１４２７６１）に４０μＬずつ播き、４００００個細胞／ウェルとした。
細胞内遊離Ｃａ２＋濃度の測定はＦＤＳＳ３０００（浜松ホトニクス）を用いて経時的に測定した。具体的には、細胞を撒いた３８４ウェルプレートの蛍光強度を１．５秒毎に３．５分間測定した。終濃度の５倍濃溶液にＣａ２＋アッセイバッファーを用いて調製したリガンドは、測定開始３０秒後に１０μＬ添加し、２０秒間攪拌させた。
測定値は、２種類の励起波長３４０ｎｍ（Ｃａ２＋結合型）、３８０ｎｍ（Ｃａ２＋非結合型）に対して得られる蛍光波長５００ｎｍの蛍光強度のＲａｔｉｏ値［３４０ｎｍ励起（Ｃａ２＋結合）÷３８０ｎｍ励起（Ｃａ２＋非結合型）］で表される。このＲａｔｉｏ値をＹ軸に、時間をＸ軸にしてプロットし、各種リガンドに対する細胞内遊離Ｃａ２＋濃度の変化を測定した。また、各種被験物質のさまざまな濃度刺激におけるＲａｔｉｏ値の最大値をＹ軸に、被験物質の濃度をＸ軸にプロットした濃度依存曲線を作成し、ＥＣ５０値を導き出した。アッセイを４回実施し、それぞれのＥＣ５０値をカリキュレーションソフト「ＸＬｆｉｔ」を使用して算出し、それの平均値を求めた。
被験物質として、Ａｎｇｉｏｐｅｐｔｉｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ６８−１−４５）、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １８−１−１０）、Ｇｒａｎｕｌｉｂｅｒｉｎ  Ｒ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ８７−０−７２）、Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ７２−２−２８）、Ｍａｇａｉｎｉｎ  ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ７２−２−２６）、ＰＡＣＡＰ（６−２７）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ３４−０−４５）、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ２８（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ６８−１−５０）、ＶＩＰ（１−２８）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ４８−１−１０）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（Ｓｉｇｍａ  Ｃ２３１３）、Ａｔｒｉａｌ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（１−２８）、ｈｕｍａｎ（ペプチド研４１３５−ｖ）、ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ  １４（ペプチド研  ４３２９−ｖ）、Ｈｉｓｔａｔｉｎ  ５（ペプチド研  ４２７０−ｓ）、ＭＣＤ−Ｐ（ペプチド研  ４２５８−ｖ）、Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ（ペプチド研  ４０２９−ｖ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ−４（ペプチド研  ４３０５−ｖ）、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ（ペプチド研  ４０２３−ｖ）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（ペプチド研  ４０１４−ｖ）、及び下記合成方法（Ａ）によって得られた［Ｄ−Ｐｒｏ２、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、ＢＡＭ（８−２２）、Ｃａｔｅｓｔａｔｉｎ、ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ（ＬＬ−３７）、ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ  １０（１−２０）、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ｈｕｍａｎ  ＨＲＰ−１、ｈｕｍａｎ  ＨＲＰ−２、ＰＡＣＡＰ（６−３８）、ｐＣＮＰ（１−１７）、［Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ（１−１２）、の３１種類を使用した。陽性コントロールとして、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（ＢＩＯＭＯＬ  ＣＡ２０１）を使用した。
合成方法（Ａ）
上記ペプチドは、自動ペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａ、アプライド  バイオシステム社製）を用いて合成した。ペプチドの合成及び保護は、メーカーのマニュアルに従って行なった。得られたペプチド製剤に含まれる不純物は、高速液体クロマトグラフ（ウォーターズ社製）を用いて、逆相Ｃ１８カラム（５μｍ、２ｘ２５０ｍｍ、ＹＭＣ−Ｐａｃ  ＯＤＳ−Ａ、ＹＭＣ）に吸着させ、０．１％トリフルオロ酢酸（溶液Ａ）及びアセトニトリル（溶液Ｂ）のグラディエントにて分離した。得られた合成ペプチド製剤の構造及び純度は、レーザーイオン化質量分析計（ＫＯＭＰＡＣＴＭＡＬＤＩ  ＩＩＩ、島津製作所製）による分子量測定によって確認した。
結果
Ｒｅｃ１６８安定発現２９３細胞に対し、３１種類のリガンドを刺激した。その結果、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ（１−１２）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ−４、Ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ  １４、Ａｎｇｉｏｐｅｐｔｉｎ、ＨＲＰ−２、Ｍａｇａｉｎｉｎ  ２、ＭＣＤ−Ｐ、ＰＡＣＡＰ（６−２７）、ＶＩＰ（１−２８）、Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ２８、ＰＡＣＡＰ（６−３８）、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、［Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）［Ｄ−Ｐｒｏ２、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ｐＣＮＰ（１−１７）、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｈｉｓｔａｔｉｎ  ５、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０、ＢＡＭ（８−２２）、ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ  １０（１−２０）、ｃａｔｅｓｔａｔｉｎ、ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ｈｕｍａｎ  ＨＲＰ−１、Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎで細胞内遊離Ｃａ濃度の上昇が認めらた。結果を表３に示した。単位はμＭである。ただしＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０はμｇ／ｍＬで表示した。
【表３】
2007058336.tif 000004
【実施例６】
【００１３】
ＧＴＰ結合試験
Ｒｅｃ１６８安定発現２９３細胞の膜画分調製
Ｒｅｃ１６８安定発現２９３細胞は、細胞培養用フラスコ（培養面積１７５ｃｍ２）中に５０ｍＬの培地（１０％ウシ胎仔血清、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、０．０５ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ；ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）（日研生物医学研究所製）中、３７℃５％  ＣＯ２で培養した。継代後２日以上経過し約８０％コンフルエントになった細胞を、冷却したＤ−ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４；Ｃａ２＋不含、Ｍｇ２＋不含）（日研生物医学研究所製）で洗浄した。回収した細胞は冷却した溶解緩衝液（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ｐＨ７．４〜７．５）に懸濁し、ガラスホモジナイザーで破砕した。この細胞破砕液を遠心分離（５０、０００×ｇ、３０分、４℃）し、得られた沈殿物に溶解緩衝液を添加した。更にこれを遠心分離（５０、０００×ｇ、３０分、４℃）し、得られた沈殿を保存液（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、ｐＨ７．５）に懸濁して、Ｒｅｃ１６８安定発現２９３細胞の膜画分を得た。
Ｒｅｃ１６８安定発現２９３細胞とＧＴＰとの結合試験
ＧＴＰ結合実験はＤＥＬＦＩＡ  ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｔ  ＡＤ０１６７（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて実施した。９６穴フィルタープレート（ＡｃｒｏＷｅｌｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ）に１穴あたり反応緩衝液（０．０３μＭ  ＧＤＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３００μｇ／ｍＬ  Ｓａｐｏｎｉｎ、終濃度で表記）を添加した。これに５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒで適当な濃度に希釈した被験物質を１穴あたり２０μＬ加えた。更に上記で調製した膜画分を１穴あたり３．８５８μｇとなるように５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒで２０μＬに調製して加えた。これを室温で３０分間プレートシェーカーを用い静かにインキュベーションした後、ユーロピウム標識したＧＴＰ（ＧＴＰ−Ｅｕ、１００ｎＭ）を１穴あたり１０μＬ添加し、反応を開始した。室温で４５分間プレートシェーカーを用い静かにインキュベーションした後、フィルタープレートを濾過する（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製）事で反応を停止した。濾過後更に冷却した洗浄液３００μＬで２回洗浄した後、フィルター上の膜画分に結合したＧＴＰ−Ｅｕ量を時間分解能蛍光測定装置で測定した。
ＧＤＰとＧＴＰの交換反応はＧ蛋白質共役型受容体の非存在下でも起こるので、検体添加時の結合活性は、測定値（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ）と、検体の非存在時の測定値（基底シグナル（Ｂａｓａｌ  ｓｉｇｎａｌ））を比較し、百分率で算出［％  ｏｖｅｒ  ｂａｓａｌ＝  （Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ／Ｂａｓａｌ  ｓｉｇｎａｌ×１００）−１００］した。
また、非特異的結合量は１穴あたり５μＭ（終濃度）のＧＴＰ−γ−Ｓ存在下で測定した。対照として、Ｒｅｃ１６８を導入していない２９３細胞（親株）から上記と同様に調製した膜画分を用い、同一条件下でＧＴＰ結合活性を観察した。被験物質としては、ＭＣＤ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ペプチド研究所製）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（アメリカン・ペプチド社製）、ヒトＡｒｉａｌ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（１−２８）（ペプチド研究所製）、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ１０（１−２０）、ｐＣＮＰ（１−１７）、Ｂｏｖｉｎｅ  Ａｄｒｅｎａｌ  Ｍｅｄｕｌｌａ（８−２２）の６種類を使用した。
結果
その結果を図６〜９に示した。
図６から明らかなとおり、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐの濃度依存的にＧＴＰ結合量の増加が見られた。
図７から明らかなとおり、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ１０（１−２０）の濃度依存的にＧＴＰ結合量の増加が見られた。
図８から明らかなとおり、ｐＣＮＰ（１−１７）の濃度依存的にＧＴＰ結合量の増加が見られた。
図９から明らかなとおり、ＭＣＤ  ｐｅｐｔｉｄｅの濃度依存的にＧＴＰ結合量の増加が見られた。
この結果よりＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞膜画分を用いた場合に、Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ１０（１−２０）、ｐＣＮＰ（１−１７）を添加することによって濃度依存的にＧＴＰ−Ｅｕの結合量が増加した。これらの中でＭＣＤ  ｐｅｐｔｉｄｅが最も低濃度（３０ｎＭ以上）でＧＴＰ結合が認められ、次いでＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ｐＣＮＰ（１−１７）は３００ｎＭ以上でＧＴＰ結合を確認した。Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ  １０（１−２０）は１μＭ以上でＧＴＰ結合活性を確認した。一方、２９３細胞（親株）から調製した膜画分では、被験物質依存的なＧＴＰ結合が認められなかった。
【実施例７】
【００１４】
ヒト培養肥満細胞脱顆粒試験
臍帯血の入手
京都専売病院よりインフォームドコンセントによる同意を得て、ヘパリン採血した臍帯血を６例入手した。６例の入手日は、２００４年２月２３日、２月２６日、３月２日、４月１２日、４月２１日および５月１７日であり、それぞれＤｏｎｏｒ  １、２、３、４、５および６とした。
造血幹細胞の分離
ヘパリン採血した臍帯血１０−６０ｍＬを等量のＢｕｆｆｅｒ（０．５％  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  （ＢＳＡ）、  ２ｍＭ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ／Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（−））にて希釈後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に重層（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ：Ｂｌｏｏｄ（１：２））し、４００×ｇ（１３５０ｒｐｍ）、４℃にて３０分間遠心分離をすることで単核球画分を取得した。Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄（１５００ｒｐｍ、４℃、５分）後、細胞数を計数し、１×１０８ｃｅｌｌｓに対して０．１ｍＬのＲｅａｇｅｎｔ  Ａ１（Ｆｃ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ、ＣＤ３４  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、４６７−０１）を加えた。撹拌後、０．１ｍＬのＲｅａｇｅｎｔ  Ａ２（ＣＤ３４  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｈａｐｔｅｎ）を加え（ｆｉｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ０．５ｍＬ／１×１０８ｃｅｌｌ）、さらに撹拌後９℃にて１５分間インキュベーションした。Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄（１５００ｒｐｍ、４℃、５分）後、Ｂｕｆｆｅｒ（０．４ｍＬ）に再懸濁し、０．１ｍＬのＲｅａｇｅｎｔ  Ｂ（ａｎｔｉ  ｈａｐｔｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）を加えて撹拌（ｆｉｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ０．５ｍＬ／１×１０８ｃｅｌｌ）後、９℃にて１５分間インキュベーションした。再びＢｕｆｆｅｒにて２回洗浄（１５００ｒｐｍ、４℃、５分）した後、Ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍＬ）に再懸濁し、ＭＡＣＳ（ＭＡｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、第一化学薬品）にセットしたＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を通し、３０ｍＬのＢｕｆｆｅｒで洗浄してＣＤ３４−ｃｅｌｌを除去した。カラムをＭＡＣＳからはずして３０ｍＬのＢｕｆｆｅｒにて結合したＣＤ３４＋ｃｅｌｌを溶出し、それらを造血幹細胞集団とした。
造血幹細胞長期培養によるヒト肥満細胞への分化
分離したＣＤ３４＋ｃｅｌｌをｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ（ｒｈ）ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ、１μｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｒｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−６（０．５μｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｒｈＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（１％、Ｇｉｂｃｏ）、２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ、５×１０−５Ｍ、Ｇｉｂｃｏ）、ＢＳＡ（０．１％、Ｓｉｇｍａ）を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ、Ｇｉｂｃｏ）培地に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で再懸濁し、０．１ｍＬ／ｗｅｌｌにて２４ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに播種した。そこへ０．９％ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ入りＩＭＤＭ（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ、ＳＦＢＩＴ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を０．９ｍＬ添加し培養を開始した。１週間後、０．９％ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅを除く上記培地を１００μＬ／ｗｅｌｌにて添加し、その後１週間に１回の間隔で、さらにＩＬ−３を除いた培地を１００μＬ／ｗｅｌｌにて添加した。増殖の程度を見ながら細胞を希釈し、およそ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｗｅｌｌレベルを維持しながら、約８週間以上培養することでヒト培養肥満細胞へと分化させた。
培養途中におけるｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）の影響の検討
Ｄｏｎｏｒ  ４およびＤｏｎｏｒ  ６由来の細胞を用いた。それぞれ培養開始から５７および２７日目の細胞を１０％ＦＣＳの存在下、非存在下に分けてそれ以降、９２および５７日目まで培養した。
脱顆粒試験
以下の脱顆粒試験は全て１％Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５×１０−５Ｍ２−ＭＥ、０．１％ＢＳＡ含有ＩＭＤＭ培地を用いて行った。得られたヒト培養肥満細胞を培地にて洗浄後、６×１０３ｃｅｌｌｓ／１８０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  Ｕ  ｂｏｔｔｏｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに播種した。Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０および各種ペプチドを０．１−１０μＭとなるように２０μＬ加え、３７℃で３０分間刺激した。対照としてＤＭＳＯに溶解したＡ−２３１８７（Ｓｉｇｍａ）を、０．１−１０μＭ（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）となるように２０μＬ添加し、３７℃で３０分間刺激した。刺激後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、５分）を行い、上清を５０μＬ／ｗｅｌｌ回収し、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの活性を測定した。培養上清５０μＬに対してβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの基質であるｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ、β、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ（１ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有）を等量加え、３７℃で２時間反応させた後、Ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ、ｐＨ１０）を１００μＬ加えて反応を停止した。吸光度は波長４０５ｎｍにてＰｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。各サンプルにおける脱顆粒率は、無処置の細胞を水で破砕させたときの値（細胞内顆粒最大遊離量；ｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ）を１００％として算出した。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０および１５種のペプチドによるヒト培養肥満細胞（Ｄｏｎｏｒ  ３、４、５）の脱顆粒反応を、Ａ−２３１８７による反応と比較検討した。レポーターアッセイ、ＣａアッセイでＲｅｃ１６８に反応した、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０およびＣｈａｐｅｒｏｎｉｎ  １０（１−２０）、ｐＣＮＰ（１−１７）、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ（１−１２）、Ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ  １４、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、Ａｎｇｉｏｐｅｐｔｉｎ、Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ、［Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）（６−２７）、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）の１２種のペプチドは、いずれも０．１−１０μＭで濃度依存的な脱顆粒反応を惹起し、また、それらの１０μでの最大反応は細胞内顆粒最大遊離量の３３−４４％であり、Ａ−２３１８７の１０μＭでの２９−３０％に匹敵するものであった（図１０参照）。これらが細胞内顆粒最大遊離量の２５％を誘発する濃度（ＥＣ２５）は０．２−３．７μＭであった（表４参照）。Ｒｅｃ１６８発現細胞でのｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙおよびＣａ２＋  ｉｎｆｌｕｘ  ａｓｓａｙにおけるＥＣ５０値と、培養ヒト肥満細胞での脱顆粒反応におけるＥＣ２５値の相関図を図１１に示す。
【表４】
2007058336.tif 000005
肥満細胞の培養時にＦＣＳの共存下では性質が変わり、脱顆粒を誘発するペプチドに反応しなくなるという報告（Ｍｏｏｎ  ＴＣ、Ｌｅｅ  Ｅ、Ｂａｅｋ  ＳＨ、Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｍ、Ｋｕｄｏ  Ｉ、Ｋｉｍ  ＮＳ、Ｌｅｅ  ＪＭ、Ｍｉｎ  ＨＫ、Ｋａｍｂｅ  Ｎ、Ｃｈａｎｇ  ＨＷ．Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ．１６：１５４−１６０（２００３）．）に基づき、今回得られたヒト臍帯血由来肥満細胞をＦＣＳ存在下あるいは非存在下に培養し、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０およびＡ−２３１８７による脱顆粒反応を比較した。その結果、臍帯血採取の５７日目から９２日目までＦＣＳ存在下に培養したＤｏｎｏｒ  ４の肥満細胞では、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ＰおよびＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０による脱顆粒反応は１０μＭまで全く認められなかった。ＦＣＳ非存在下での細胞は、１０μＭで約２０−２５％の脱顆粒反応を示した（図１２参照）。一方、Ａ−２３１８７はＦＣＳの存在、非存在に関わらず１０μＭで約４５−５５％の脱顆粒反応を示した。さらに、Ｄｏｎｏｒ  ６で同様の検討を行った結果、Ａ−２３１８７を用いた検討は行っていないが、Ｄｏｎｏｒ  ４と同様にＳｕｂｓｔａｎｃｅ  ＰおよびＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０による脱顆粒反応はＦＣＳ存在下で培養した細胞では認められなかった（図１３参照）。
【実施例８】
【００１５】
Ｒｅｃ１６８のｍＲＮＡ発現解析
Ｒｅｃ１６８の発現組織分布の解析は、リアルタイムモニタリングによる定量的ＰＣＲ法（ＴａｑＭａｎ法）によって行った。ＴａｑＭａｎ法はＰＣＲ増幅された特異的ＰＣＲ鎖をＴａｑＭａｎプローブと呼ばれる蛍光プローブの蛍光強度によってリアルタイムに７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって検出、定量する原理に基付いている。Ｒｅｃ１６８を特異的に認識するＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーは、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｓｓａｙ  ＩＤ：Ｈｓ００３６５０１９  ｓ１）を用いた。
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応における鋳型は、ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ由来ｔｏｔａｌＲＮＡと４１種類のヒト組織由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）より合成したｃＤＮＡを鋳型として使用した。ｃＤＮＡの合成は、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ６．５μｇまたはｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  １μｇから、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ、プライマーとしてランダムヘキサマーを用い、添付の使用説明書に従い、４２℃で行った。反応液組成は、鋳型ｃＤＮＡとしてはｔｏｔａｌ  ＲＮＡから合成したｃＤＮＡはＲＮＡ量換算で３０ｎｇ、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから合成したｃＤＮＡはＲＮＡ量換算で４ｎｇを使用し、２×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ０．５μＬ、ＴａｑＭａｎ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）０．５μＬを加え、総液量を１０μＬとした。Ｒｅｃ１６８発現量と同時にＧＡＰＤＨ発現量を測定してｎｏｒｍａｌｉｚｅすることにより、Ｒｅｃ１６８組織分布を比較した。スタンダードＤＮＡとして、ｐＭＥ−Ｒｅｃ１６８を２．３ｘ１０１−２．４×１０８コピー／４μＬに調製して使用した。ＰＣＲ反応は９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回行い、反応終了と同時にＰＣＲの定量的自動解析を行った。結果を図１４に示した。
図１４から明らかなとおり、皮膚及び脂肪組織においてＲｅｃ１６８の高い発現が見られた。
【実施例９】
【００１６】
臍帯血由来ヒト培養肥満細胞における発現解析
Ｒｅｃ１６８および関連受容体の臍帯血由来ヒト培養肥満細胞における発現解析は、リアルタイムモニタリングによる定量的ＰＣＲ法（ＴａｑＭａｎ法）によって行った。Ｒｅｃ１６８および関連受容体を特異的に認識するＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーは、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（表５参照）を用いた。
【表５】
2007058336.tif 000006
2007058336.tif 000007
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応における反応組成は、臍帯血由来ヒト培養肥満細胞由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（Ｄｏｎｏｒ  ４、Ｄｏｎｏｒ  ５）および血清添加または血清非添加培養にて分化誘導を行った臍帯血由来ヒト培養肥満細胞由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ＦＣＳ＋、ＦＣＳ−）より逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ、プライマーとしてランダムヘキサマーを用い、添付の使用説明書に従って４２℃で合成したｃＤＮＡをｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算で５ｎｇ鋳型として使用し、２×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ０．５μＬ、ＴａｑＭａｎ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）０．５μＬを加え、総液量１０μＬとした。Ｒｅｃ１６８発現量または関連受容体発現量と同時にＧＡＰＤＨ発現量を測定してｎｏｒｍａｌｉｚｅすることにより、Ｒｅｃ１６８および関連受容体の臍帯血由来ヒト培養肥満細胞における発現を比較した。スタンダードＤＮＡとして、各遺伝子ｃＤＮＡ断片を保持するベクターを２．３×１０１−８．９×１０６コピー／４μＬに調製して使用した。ＰＣＲ反応は９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回行い、反応終了と同時にＰＣＲの定量的自動解析を行った。結果（コピー数／５ｎｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を表６に示した。
【表６】
2007058336.tif 000008
2007058336.tif 000009
【実施例１０】
【００１７】
Ｒｅｃ１６８阻害剤のスクリーニング
Ｒｅｃ１６８安定発現２９３細胞におけるＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐによる細胞内遊離Ｃａ濃度上昇の抑制を指標として、Ｒｅｃ１６８阻害剤のスクリーニングを行った。２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０６８７−０１０）と１０％牛胎児血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地（日研生物医学研究所  ＣＭ４４０２）で培養したＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞を、２μＭ  Ｆｕｒａ−２／ＡＭ（同仁化学研究所）を含むＣａ２＋アッセイバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ナカライ  １７５１４−１５）、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ５１５０）、５．４ｍＭ  ＫＣｌ（ナカライ  ２８５−１４）、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ナカライ  ２０９−０９）、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２（ナカライ  ０６７−２９）、１３．８ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（ナカライ  １６８−０６）、０．２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ８８０６）、２．５ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８７６１）、ＫＯＨでｐＨ７．４に調整）に懸濁して３７℃１時間インキュベーションした。Ｃａ２＋アッセイバッファーで２回洗浄後、Ｃａ２＋アッセイバッファーに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。細胞懸濁液を３８４ウェル黒色プレートに２０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、Ｃａ２＋アッセイバッファーで１００μＭに希釈した被験物質を４μＬ添加した。５分経過後、ＦＤＳＳ３０００（浜松ホトニクス株式会社）で２５μＭ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（株式会社  ペプチド研究所）を１６μＬ添加し、励起光波長３４０ｎｍと３８０ｎｍでの蛍光強度変化を測定した。測定した蛍光強度から、蛍光強度比（励起光波長３４０ｎｍの蛍光強度／励起光波長３８０ｎｍの蛍光強度；Ｒａｔｉｏ値）を算出し、さらにＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ添加後のＲａｔｉｏ値の最大値からＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ添加前のＲａｔｉｏ値を差し引いたＲａｔｉｏ値の変化量（ΔＲａｔｉｏ値）を計算した。被験物質による細胞内Ｃａ２＋遊離の抑制率は、以下の数式で求めた。
数式中Ａ、Ｂはそれぞれ以下の意味を表す。
Ａ：被験物質およびＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ添加時のΔＲａｔｉｏ値
Ｂ：被験物質およびＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐの両方が非添加時のΔＲａｔｉｏ値
Ｃ：Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐのみ添加時のΔＲａｔｉｏ値
阻害率［％］＝［１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）ｘ１００
Ｒｅｃ１６８阻害活性化合物として以下の３化合物を得た。
2007058336.tif 000010
2007058336.tif 000011
【実施例１１】
【００１８】
Ｒｅｃ１６８阻害化合物によるＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞における細胞内遊離Ｃａ２＋濃度上昇の抑制
２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０６８７−０１０）と１０％牛胎児血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地（日研生物医学研究所  ＣＭ４４０２）で培養したＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞を、２μＭ  Ｆｕｒａ−２／ＡＭ（同仁化学研究所）を含むＣａ２＋アッセイバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ナカライ  １７５１４−１５）、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ５１５０）、５．４ｍＭ  ＫＣｌ（ナカライ  ２８５−１４）、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ナカライ  ２０９−０９）、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２（ナカライ  ０６７−２９）、１３．８ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（ナカライ  １６８−０６）、０．２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ８８０６）、２．５ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８７６１）、ＫＯＨでｐＨ７．４に調整）に懸濁して３７℃１時間インキュベーションした。Ｃａ２＋アッセイバッファーで２回洗浄後、Ｃａ２＋アッセイバッファーに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。細胞懸濁液を３８４ウェル黒色プレートに２０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、Ｃａ２＋アッセイバッファーで３０μＭ〜１００μＭに希釈した被験物質を４μＬ添加した。５分経過後、ＦＤＳＳ３０００（浜松ホトニクス株式会社）で刺激剤として２５μＭ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（株式会社  ペプチド研究所）、２．５μＭ  ＰＡＣＡＰ（６−２７）（合成品）、７．５μＭ［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）（合成品）、及び７．５μＭ  Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（ＢＩＯＭＯＬ  ＣＡ−２０１）を１６μＬ添加し、励起光波長３４０ｎｍと３８０ｎｍでの蛍光強度変化を測定した。測定した蛍光強度から、蛍光強度比（励起光波長３４０ｎｍの蛍光強度／励起光波長３８０ｎｍの蛍光強度；Ｒａｔｉｏ値）を算出し、さらに刺激剤添加後のＲａｔｉｏ値の最大値から刺激剤添加前のＲａｔｉｏ値を差し引いたＲａｔｉｏ値の変化量（ΔＲａｔｉｏ値）を計算した。
Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）及びＰＡＣＡＰ（６−２７）刺激によるＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞における細胞内遊離Ｃａ２＋濃度上昇を化合物１、化合物２及び化合物３は何れも濃度依存的に阻害した。Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激に対する化合物１、化合物２及び化合物３の阻害率（ＩＣ５０値）はそれぞれ４．５、４．０及び５．６μＭ、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）刺激に対するＩＣ５０値はそれぞれ３．２、３．８及び５．９μＭ、ＰＡＣＡＰ（６−２７）刺激に対するＩＣ５０値はそれぞれ３．７、４．２及び５．８μＭであった。一方、何れの化合物もＩｏｎｏｍｙｃｉｎ刺激に対するＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞における細胞内遊離Ｃａ２＋濃度上昇を阻害しなかった（図１５参照）。
【実施例１２】
【００１９】
Ｒｅｃ１６８阻害化合物の肥満細胞脱顆粒に対する阻害活性の検討
材料は以下のものを使用した。リコンビナントヒトＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ｃａｔ．３００−０７）、リコンビナントヒトＩＬ−６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、２００−０６）、リコンビナントヒトＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、２００−０３）、５５ｍＭ  ２−ＭＥ（ＧＩＢＣＯ社、２１９８５−０２３）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ、ＧＩＢＣＯ社、１２４４０−０５３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＧＩＢＣＯ社、４１４００−０４５）、３５％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社、Ａ−７４０９）、ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＳＦＢＩＴ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、０４２３６）、ＰＢＳ（−）（日科研社、ＣＭ６２０１）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（ペプチド研社、４０１３−ｖ）、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）（合成品）、ＰＡＣＡＰ（６−２７）（合成品）、Ａ２３１８７（ＳＩＧＭＡ社、Ｃ−７５２２）、ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ｐＮ−ＧｌｃＮＡｃ、ＳＩＧＭＡ社、Ｎ９３７６）、ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社、Ｄ−２６６０）
１μｇ／ｍＬリコンビナントヒトＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬリコンビナントヒトＩＬ−３及び５００ｎｇ／ｍＬリコンビナントヒトＩＬ−６、０．１％ＢＳＡ、１％Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ＩＭＤＭ培地１ｍＬに臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ）を懸濁し、ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＳＦＢＩＴを１０倍量添加し、ＣＯ２インキュベーターにて培養を開始した。１週間に１回の間隔で１００ｎｇ／ｍＬリコンビナントヒトＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬリコンビナントヒトＩＬ−６、１ｎｇ／ｍＬリコンビナントヒトＩＬ−３入りの基本培地を用いて１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度になるように細胞を希釈し、細胞の増殖が観察されなくなった場合は同培地にて半量交換を行った。８週間以上培養を維持することによりヒト培養肥満細胞を得た。
得られたヒト培養肥満細胞を回収し、０．１％ＢＳＡ、１％Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ＩＭＤＭ培地にて２回浄後、約２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６穴Ｕ字底の培養プレートに１６０μＬずつ播種した。３、１０、３０及び１００μＭの化合物１、化合物２及び化合物３（１％ＤＭＳＯ、０．１％ＢＳＡ、１％Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ＩＭＤＭ培地溶液）を２０μＬずつ細胞に添加し、１０μＭ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、１０μＭ［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、１０μＭ  ＰＡＣＡＰ（６−２７）及び３μＭ  Ａ２３１８７を２０μＬずつ添加して混和後、ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃にて３０分間インキュベートした。遠心後（４℃、３，０００ｒｐｍ、５分間）、上清を５０μＬずつ回収した。脱顆粒量の測定は培養上清中に遊離した顆粒中に含まれるβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｄａｓｅ活性を指標にして行った。培養上清５０μＬに等量の４ｍＭ  ｐＮ−ＧｌｃＮＡｃ（０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ４．５）を添加し、３７℃にて２時間インキュベートした。０．１Ｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０）を等量添加して反応を停止し、波長４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダーにて測定した。各刺激による脱顆粒率は細胞を水にて破砕したβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｄａｓｅ活性を１００％として算出した。また、化合物による脱顆粒阻害活性は０．１％ＤＭＳＯ存在下におけるＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）、ＰＡＣＡＰ（６−２７）及びＡ２３１８７刺激後の脱顆粒率を１００％として算出した。
Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）及びＰＡＣＡＰ（６−２７）刺激によるヒト培養肥満細胞の脱顆粒誘導化合物１、化合物２及び化合物３は何れも濃度依存的に阻害した（表７参照）。Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激に対する化合物１、化合物２及び化合物３の阻害率（ＩＣ５０値）はそれぞれ１．５、０．６及び１．０μＭ、［Ｄ−Ｐｒｏ４、Ｄ−Ｔｒｐ７、９、１０］−Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（１−１１）刺激に対するＩＣ５０値はそれぞれ３．０、１．４及び４．４μＭ、ＰＡＣＡＰ（６−２７）刺激に対するＩＣ５０値はそれぞれ１．２、０．４及び１．０μＭであった。一方、何れの化合物もＡ２３１８７刺激に対する肥満細胞の脱顆粒誘導を阻害しなかった。
【表７】
2007058336.tif 000012
【実施例１３】
【００２０】
ＥＣＰおよびＭＢＰ断片のヒト培養肥満細胞に対する脱顆粒作用
材料は以下のものを使用した。
Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋（ＣＡＭＢＲＥＸ、２Ｃ−１０１Ａ）、Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＭＮＣ（ＳＴＥＭＣＹＴＥ、ＣＡＩ  ００１）、Ｒｅｃ１６８発現ＨＥＫ２９３細胞。  ｒｈＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、３００−０７）、ｒｈＩＬ−６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００−０６）、ｒｈＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００−０３）、５５ｍＭ  ２−ＭＥ（ＧＩＢＣＯ、２１９８５−０２３）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ、ＧＩＢＣＯ、１２４４０−０５３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＧＩＢＣＯ、４１４００−０４５）、３５％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ、Ａ−７４０９）、ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＳＦＢＩＴ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、０４２３６）、酢酸（ＪＵＮＳＥＩ、３１０１０−０３３０）、ＰＢＳ−（日科研、ＣＭ６２０１）、Ａ２３１８７（ＳＩＧＭＡ、Ｃ−７５２２）、ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｂ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ｐＮ−ＧｌｃＮＡｃ、ＳＩＧＭＡ、Ｎ９３７６）、ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ−２６６０）、化合物１、化合物２、化合物３（Ｒｅｃ１６８分子阻害剤）、α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、４１０６１−０２９）、ＦＢＳ（ＪＲＨ、１２１０３−７８Ｐ）、Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０４６−７０２）、Ｆｕｒａ−２ＡＭ（ＤｏＪＩＮＤＯ、３４３−０５４０１）、１０％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｐ−６８６６）、Ｃａ  ａｓｓａｙ用ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５．３ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１３．８ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．２％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（ペプチド研、４０１３−ｖ）および下記合成法によって得られた
ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ
（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＯＨ）、
ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ
（Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ）
上記ペプチドは、自動ペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａ、アプライドバイオシステム社製）を用いて合成した。ペプチドの合成及び保護は、メーカーのマニュアルに従って行なった。得られたペプチド製剤に含まれる不純物は、高速液体クロマトグラフ（ウォーターズ社製）を用いて、逆相Ｃ１８カラム（５μｍ、２ｘ２５０ｍｍ、ＹＭＣ−Ｐａｃ  ＯＤＳ−Ａ、ＹＭＣ）に吸着させ、０．１％トリフルオロ酢酸（溶液Ａ）及びアセトニトリル（溶液Ｂ）のグラディエントにて分離した。得られた合成ペプチド製剤の構造及び純度は、レーザーイオン化質量分析計（ＫＯＭＰＡＣＴ  ＭＡＬＤＩ  ＩＩＩ、島津製作所製）による分子量測定によって確認した。
培地の調製及びヒト肥満細胞の培養は以下のとおり行った。
ＩＭＤＭ  １００ｍＬに３５％  ＢＳＡ  ２８６μＬおよびＩｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  １ｍＬを添加し、２−ＭＥを１００μＬ添加し、ヒト培養用の基本培地とした。ｒｈＳＣＦ１０μｇに１０ｍＭ酢酸水溶液２０μＬ添加して溶解し、軽く遠心後、１ｍＬの基本培地を添加した（１０μｇ／ｍＬ  ｒｈＳＣＦ）。ｒｈＩＬ−６  ２０μｇに１０ｍＭ酢酸水溶液４０μＬ添加して溶解し、軽く遠心後、１ｍＬの基本培地を添加した（２０μｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−６）。ｒｈＩＬ−３  １０μｇに蒸留水４０μＬ添加して溶解し、軽く遠心後、１ｍＬの基本培地を添加した（１０μｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−３）。
Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋細胞（１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ）に１μｇ／ｍＬ  ｒｈＳＣＦ、０．５μｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−６、０．０１μｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−３入りの基本培地を５００μＬ添加して２４穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、３０４７）に１００μＬずつ播種した。ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＳＦＢＩＴを０．９ｍＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーターにて培養を開始した。１週間に１回の間隔で１００ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−６、１ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−３入りの基本培地を用いて１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度になるように細胞を希釈し、細胞の増殖が観察されなくなった場合は同培地にて半量交換を行った。８週間以上培養を維持することによりヒト培養肥満細胞を得た。
Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＭＮＣよりＣＤ３４陽性細胞の調製は以下のように行った。ＰＢＳ−１００ｍＬに５００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ４００μＬ、３５％  ＢＳＡ  １４２８μＬを添加し（Ｃｅｌｌ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）、凍結保存してあるＣｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＭＮＣ（１．６１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を解凍し、Ｃｅｌｌ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後、Ｃｅｌｌ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．３ｍＬにて再懸濁した。１００μＬのＦｃＲ  Ｂｌｏｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを添加し、１００μＬ  ＣＤ３４ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを添加し、９℃にて３０分間インキュベートした。Ｃｅｌｌ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄し、３０μｍ  Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒを通過した細胞をＭｉｎｉＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔにアプライし、ＣＤ３４陽性細胞を回収した。
脱顆粒の測定法は以下のとおりである。
得られたヒト培養肥満細胞を回収し、基本培地にて洗浄後、約１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６穴Ｕ字底の培養プレートに播種し、各濃度のＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔまたはＡ２３１８７を１／１０量添加し、ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃にて３０分間インキュベートした（ｆｉｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ２００μＬ／ｗｅｌｌ）。遠心後（４℃、３、０００ｒｐｍ、５分間）、上清を５０μＬずつ回収した。脱顆粒量の測定は培養上清中に遊離した顆粒中に含まれる・−Ｈｅｘｏｓａｍｉｄａｓｅ活性を指標にして行った。培養上清５０μＬに等量の４ｍＭ  ｐＮ−ＧｌｃＮＡｃ（０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ４．５）を添加し、３７℃にて２時間インキュベートした。０．１Ｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０）を等量添加して反応を停止し、波長４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダーにて測定した。各刺激による脱顆粒率は細胞を水にて破砕したβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｄａｓｅ活性を１００％として算出した。化合物１、２及び３はＲｅｃ１６８リガンド添加１０分前に１／１０量添加して評価した。
また、Ｃａ  ａｓｓａｙは以下のとおり行った。
各細胞をＰＢＳ−にて洗浄後、Ｃａ  ａｓｓａｙ用ｂｕｆｆｅｒに溶解した２μＭＦｕｒａ−２ＡＭ溶液に置換し、室温にて１時間インキュベートした。Ｃａ  ａｓｓａｙ用ｂｕｆｆｅｒにて２回洗浄後、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＣａ  ａｓｓａｙ用ｂｕｆｆｅｒにて再懸濁し、３８４穴黒プレート（ＮＵＮＣ、２４２７６４）に４０μＬずつ添加した。最終濃度の１０倍濃い各刺激リガンドを各細胞に１０μＬずつ添加した。測定はＦＤＳＳ（浜松ホトニクス）を用いて測定し、Ｃａ応答の評価は３４０ｎｍ／３８０ｎｍ比を用い、リガンド刺激後の最高３４０ｎｍ／３８０ｎｍ比からリガンド刺激前の３４０ｎｍ／３８０ｎｍ比の差をリガンド活性値とした。
上記実験から以下のことが明らかになった。
Ｒｅｃ１６８とＭＢＰが肥満細胞の同一部位を認識しているとの報告とＲｅｃ１６８リガンド類が８〜３０のアミノ酸残残基ペプチドであることより、ＥＣＰ及びＭＢＰのＴｒｙｐｔａｓｅ切断部位を推定して（図１６）、８−２５アミノ酸残基に断片化したＥＣＰ及びＭＢＰを合成した。ＥＣＰ及びＭＢＰの各ｆｒａｇｍｅｎｔ（１０μＭ）をヒト培養肥満細胞の脱顆粒誘導活性を指標にして探索したところ、ＥＣＰの２９番目から４５番目の領域、またＭＢＰの９９番目から１１０番目の領域を含むペプチドｆｒａｇｍｅｎｔが活性を有することが判明した（図１７、１８）。さらに、脱顆粒誘導活性を示したＥＣＰ及びＭＢＰのｆｒａｇｍｅｎｔ（３０μＭ）はＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞に対するＣａ応答活性を示し、ヒト培養肥満細胞の脱顆粒誘導活性とＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞に対するＣａ応答活性は相関していた（図１７、１８）。また、ＭＢＰの９〜２５番目アミノ酸残基ペプチド（Ｆｒ．Ｎｏ．２３）はヒト培養肥満細胞に対する脱顆粒誘導活性を示したが、同領域が重複するＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｆｒ．Ｎｏ．２２、２４）には活性が認められなかったため、アゴニスト作用はＭＢＰの９〜２５番目領域にはないと判断した。そこで、ＥＣＰ及びＭＢＰ断片の内、最も活性の強かった各ｆｒａｇｅｍｅｎｔを以後の実験に用いた。
ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐによるヒト培養肥満細胞の脱顆粒誘導に対してＲｅｃ１６８阻害化合物は濃度依存的に抑制し（図１９）、化合物１のＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激に対するＩＣ５０値はそれぞれ１．０２μＭ、０．３３μＭ及び１．７２μＭ、化合物２のＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激に対するＩＣ５０値はそれぞれ２．１９μＭ、０．５２μＭ及び１．８６μＭ、化合物３のＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激に対するＩＣ５０値はそれぞれ２．５４μＭ、０．４２μＭ及び２．２５μＭであった（表８）。
【表８】
2007058336.tif 000013
Ｒｅｃ１６８のアゴニストの一つであるＳｕｂｓｔａｎｃｅ  ＰとＭＢＰが肥満細胞の同一分子により認識されて肥満細胞が活性化するとの報告から、Ｒｅｃ１６８がＭＢＰをアゴニストとする可能性が考えられた。また、疾患部位にはＭＢＰやＥＣＰと同様にＴｒｙｐｔａｓｅの存在が確認されていることから、ＥＣＰ及びＭＢＰのＴｒｙｐｔａｓｅ切断部位を推定して、８−２５アミノ酸残基に断片化したＥＣＰ及びＭＢＰを合成した。ＥＣＰの２９番目から４５番目の領域、またＭＢＰの９９番目から１１０番目の領域を含むペプチドｆｒａｇｍｅｎｔがヒト培養肥満細胞の脱顆粒誘導活性を有することが判明した。さらに、同ｆｒａｇｍｅｎｔ（３０μＭ）は、ヒト培養肥満細胞活性化のみならずＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞に対するＣａ応答活性も示した（図１６、１７）。また、これらのｆｒａｇｍｅｎｔが誘導する肥満細胞の活性化はＲｅｃ１６８阻害化合物によって抑制されることから、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ刺激がＲｅｃ１６８受容体を介していることが判明した。
Ｒｅｃ１６８を活性化するＭＢＰ及びＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いてヒト培養肥満細胞の脱顆粒誘導を検討したところ、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔとＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔは何れもヒト培養肥満細胞に対して濃度依存的に、また、Ｇｉ  ｐｒｏｔｅｉｎ依存的に脱顆粒を誘導した。これらのｆｒａｇｍｅｎｔが、全長タンパク質と同様の活性を有するかどうかについては、ｆｒａｇｍｅｎｔ活性がＰａｔｅｌｌａの報告した活性と同程度であることや、また、Ｐｉｌｉｐｏｎｓｋｙらの報告したように、Ｒｅｃ１６８介在のヒト肥満細胞脱顆粒誘導がＧｉ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅであることから、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔでも各全長タンパク質と同様の肥満細胞脱顆粒誘導活性を有するものと考えられた。さらに、Ｒｅｃ１６８阻害化合物によってＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ刺激の肥満細胞脱顆粒誘導が抑制されたことにより、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ刺激がＲｅｃ１６８受容体を介していることが判明した。
今回の検討により、神経因性の肥満細胞の活性化とＥｏｓｉｎｏｐｈｉｌによる肥満細胞活性化にＲｅｃ１６８が関与する可能性が強く示唆された。アトピー性皮膚炎のモデルマウス（ＮＣ／Ｎａマウス）にストレス付加すると、アトピー性皮膚炎様の症状を示す。さらに、ストレスによりアトピー性皮膚炎様症状を示したＮＣ／Ｎａマウスの血中Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ量は上昇し、肥満細胞及びＥｏｓｉｎｏｐｈｉｌの増加、掻痒行為を引き起こすと報告されている。そこで、慢性炎症時におけるＲｅｃ１６８の役割については、ストレス等により惹起される神経過敏状態によって神経ペプチドが分泌され、それによりＲｅｃ１６８を介して肥満細胞を活性化したサイトカイン類やエイコサノイドがＥｏｓｉｎｏｐｈｉｌを増殖・活性化し、増殖・活性化されたＥｏｓｉｎｏｐｈｉｌより分泌されるＥＣＰなどにより再びＲｅｃ１６８を介して肥満細胞を活性化する重要な役割であろうと推測した。このように、Ｒｅｃ１６８は慢性炎症時における悪循環の中心的な役割を果たしている可能性が高く、Ｒｅｃ１６８阻害剤は慢性炎症時の有効な治療薬となる可能性があると考えられた。
【実施例１４】
【００２１】
Ｒｅｃ１６８阻害化合物およびＣｒｏｍｏｌｙｎのヒト培養肥満細胞脱顆粒に対する作用
使用した試薬及び材料は以下のとおりである
Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋（ＣＡＭＢＲＥＸ、２Ｃ−１０１Ａ）、Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＭＮＣ（ＳＴＥＭＣＹＴＥ、ＣＡＩ  ００１）。ｒｈＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、３００−０７）、ｒｈＩＬ−６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００−０６）、ｒｈＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００−０３）、５５ｍＭ  ２−ＭＥ（ＧＩＢＣＯ、２１９８５−０２３）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ、ＧＩＢＣＯ、１２４４０−０５３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＧＩＢＣＯ、４１４００−０４５）、３５％  ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ、Ａ−７４０９）、ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＳＦＢＩＴ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、０４２３６）、酢酸（ＪＵＮＳＥＩ、３１０１０−０３３０）、ＰＢＳ−（日科研、ＣＭ６２０１）、ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｂ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ｐＮ−ＧｌｃＮＡｃ、ＳＩＧＭＡ、Ｎ９３７６）、ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ−２６６０）、化合物１、化合物３（Ｒｅｃ１６８分子阻害剤）、α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、４１０６１−０２９）、ＦＢＳ（ＪＲＨ、１２１０３−７８Ｐ）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（ペプチド研、４０１３−ｖ）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（Ｓｉｇｍａ  Ｃ２３１３）。
培地の調製、ヒト肥満細胞の培養は上記実施例１３と同様にして行った。また、脱顆粒の測定は、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔまたはＡ２３１８７に代えてＳｕｂｓｔａｎｃｅ  ＰまたはＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０を使用した点以外は実施例１３の「ＥＣＰおよびＭＢＰ断片のヒト培養肥満細胞に対する脱顆粒作用」の測定法と同様の方法によって行なった。
上記実験から以下のことが明らかになった。
肥満細胞脱顆粒抑制化合物であるＣｒｏｍｏｌｙｎとＲｅｃ１６８阻害化合物のヒト培養肥満細胞の脱顆粒に対する阻害作用を比較検討した。化合物１および３のＲｅｃ１６８阻害化合物もＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激によるヒト培養肥満細胞の脱顆粒誘導に対して濃度依存的に阻害したが、Ｃｒｏｍｏｌｙｎは殆ど阻害しなかった（図２０（Ａ）参照）。しかし、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０刺激による脱顆粒誘導に対して、Ｃｒｏｍｏｌｙｎは濃度依存的に阻害し、１０ｍＭで完全に阻害した（図２０（Ｂ）参照）。また、Ｒｅｃ１６８阻害化合物はＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０刺激の脱顆粒誘導に対して濃度依存的に阻害するが、何れの化合物も１０μＭでは５０％程度の阻害率であった（図２０（Ｂ）参照）。さらに、ＩｇＥ架橋によるヒト肥満細胞の脱顆粒誘導に対してはＲｅｃ１６８阻害化合物及びｒｏｍｏｌｙｎの何れも阻害作用を示さなかった（図２１（Ｂ）参照）。
神経性のペプチドであるＳｕｐｓｔａｎｃｅ  Ｐや炎症に関わるＭＢＰやＥＣＰ由来の塩基性ペプチドがＲｅｃ１６８アゴニスト活性を示すため、炎症の複雑なネットワークにおける肥満細胞の活性化にＲｅｃ１６８が寄与する可能性がある。そこで、広域なアレルギー治療薬として知られている肥満細胞安定化薬Ｃｒｏｍｏｌｙｎとヒト培養肥満細胞について活性化抑制効果を比較したところ、Ｒｅｃ１６８阻害化合物はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激による肥満細胞の脱顆粒反応を抑制したが、Ｃｒｏｍｏｌｙｎは抑制しなかった（図２０）。また、Ｒｅｃ１６８阻害化合物はＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０刺激による脱顆粒反応を１０μＭで５０％程度阻害したが、Ｃｒｏｍｏｌｙｎは１０ｍＭの高濃度で完全に抑制した（図２０（Ｂ））。ＣｒｏｍｏｌｙｎはＲｅｃ１６８安定発現２９３細胞のＣａ応答を抑制しないことより、Ｒｅｃ１６８を介したＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０刺激のヒト培養肥満細胞の脱顆粒反応抑制ではなく、Ｒｅｃ１６８以外のＣｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０作用点を介した脱顆粒反応の抑制であると考えられた。従って、Ｒｅｃ１６８阻害化合物は生体内アゴニストに対してＣｒｏｍｏｌｙｎより高い阻害効果を示すこと、また、分子ターゲットとしてレセプターを特定できる観点からもＲｅｃ１６８阻害化合物の方がＣｒｏｍｏｌｙｎよりも有用であると考えられた。
【実施例１５】
【００２２】
ヒト肥満細胞におけるＰＧＤ２産生の検討
試薬及び材料は以下のものを使用した。
Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋（ＣＡＭＢＲＥＸ、２Ｃ−１０１Ａ）、Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＭＮＣ（ＳＴＥＭＣＹＴＥ、ＣＡＩ  ００１）。ｒｈＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、３００−０７）、ｒｈＩＬ−６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００−０６）、ｒｈＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００−０３）、５５ｍＭ  ２−ＭＥ（ＧＩＢＣＯ、２１９８５−０２３）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ、ＧＩＢＣＯ、１２４４０−０５３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＧＩＢＣＯ、４１４００−０４５）、３５％  ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ、Ａ−７４０９）、ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＳＦＢＩＴ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、０４２３６）、酢酸（ＪＵＮＳＥＩ、３１０１０−０３３０）、ＰＢＳ−（日科研、ＣＭ６２０１）、ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ−２６６０）、化合物１、化合物３（Ｒｅｃ１６８分子阻害剤）、α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、４１０６１−０２９）、ＦＢＳ（ＪＲＨ、１２１０３−７８Ｐ）、Ｃａｒｎｏｙ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６０％エタノール、３０％クロロホルム、１０％氷酢酸）Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０４６−７０２）、Ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ  Ｄ２−ＭＯＸ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ、５１２０１１）。
培地の調製及びヒト肥満細胞の培養は、実施例１３と同様にして行った。
ＰＧＤ２産生及び測定は以下のとおり行った。
ヒト培養肥満細胞を回収し、基本培地にて洗浄後、約１．０ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６穴Ｕ字底の培養プレートに播種し、各濃度のＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔを１／１０量添加し、ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃にて３０分間インキュベートした（ｆｉｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ２００μＬ／ｗｅｌｌ）。遠心後（４℃、３、０００ｒｐｍ、５分間）、上清を５０μＬずつ回収した。回収した培養上清に含まれるＰＧＤ２量をＰｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ  Ｄ２−ＭＯＸ  ＥＩＡ  ｋｉｔにて測定した。測定法はＫｉｔの操作手順書に従った。阻害化合物はＲｅｃ１６８リガンド添加１０分前に１／１０量添加して評価した。
これら実験の結果、以下のことが明らかになった。
肥満細胞が活性化されると炎症性Ｍｅｄｉａｔｏｒであるエイコサノイドが合成（ｄｅ  ｎｏｖｏ合成）・分泌されることが知られている。また、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＭＢＰ及びＥＣＰによってエイコサノイドであるＰｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ  Ｄ２（ＰＧＤ２）が産生されることが報告されている。そこで、Ｒｅｃ１６８の活性化によるヒト培養肥満細胞のＰＧＤ２産生への関与を検討した。Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ（０．３μＭ、１μＭ）及びＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（３μＭ、１０μＭ）はヒト培養肥満細胞に対して添加濃度に応じてＰＧＤ２産生を誘導した（図２２）。Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激によるＰＧＤ２産生誘導活性が最も強かった。何れの刺激によるＰＧＤ２産生活性もＲｅｃ１６８阻害化合物である、１０μＭの化合物１あるいは化合物３によって阻害された（図２２）。
Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ＭＢＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔおよびＥＣＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔはヒト培養肥満細胞において濃度依存的にＰＧＤ２産生を誘導した。何れの刺激によるＰＧＤ２産生活性もＲｅｃ１６８阻害化合物である、１０μＭの化合物１あるいは化合物３によって阻害された（図２２）ことから、Ｒｅｃ１６８の活性化はヒト培養肥満細胞の脱顆粒だけではなく、ＰＧＤ２のｄｅ  ｎｏｖｏ合成も誘導することが判明した。ＩｇＥは高親和性ＦｃＲγ  ｅｐｓｉｌｏｎを介してＳｙｋを活性化し、肥満細胞の脱顆粒誘導およびＰＧＤ２のｄｅ  ｎｏｖｏ合成を誘導することが知られているが、Ｒｅｃ１６８はＦｃＲγ  ｅｐｓｉｌｏｎとシグナル伝達経路を一部共有していることが推測された。
【実施例１６】
【００２３】
ヒト肥満細胞の抗Ｒｅｃ１６８ｐｅｐｔｉｄｅ抗体、抗Ｔｒｙｐｔａｓｅ抗体及び抗Ｃｈｙｍａｓｅ抗体による染色
試薬及び材料は以下のものを使用した。
Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋（ＣＡＭＢＲＥＸ、２Ｃ−１０１Ａ）、Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＭＮＣ（ＳＴＥＭＣＹＴＥ、ＣＡＩ  ００１）。ｒｈＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、３００−０７）、ｒｈＩＬ−６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００−０６）、ｒｈＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００−０３）、５５ｍＭ２−ＭＥ（ＧＩＢＣＯ、２１９８５−０２３）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ、ＧＩＢＣＯ、１２４４０−０５３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＧＩＢＣＯ、４１４００−０４５）、３５％  ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ、Ａ−７４０９）、酢酸（ＪＵＮＳＥＩ、３１０１０−０３３０）、ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＳＦＢＩＴ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、０４２３６）、ＰＢＳ−（日科研、ＣＭ６２０１）、α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、４１０６１−０２９）、ＦＢＳ（ＪＲＨ、１２１０３−７８Ｐ）、Ｃａｒｎｏｙ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６０％エタノール、３０％クロロホルム、１０％氷酢酸）、ウサギ抗Ｒｅｃ１６８  ｐｅｐｔｉｄｅ抗体（ａｂｃａｍ社）、抗ヒトＴｒｙｐｔａｓｅ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ、ＭＡＢ１２２２）、抗ヒトＣｈｙｍａｓｅ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ、ＭＡＢ１２５４）、Ｎ−ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｏｕｓｅ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｎ１６９８）、ＬＳＡＢ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＡＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｋ０６７８）、Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｓ１９６４）、Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０４６−７０２）。
培地の調製及びヒト肥満細胞の培養は実施例１３と同様にして行った。
免疫染色は下記のとおり行った。
各細胞が１．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製し、サイトスピン２を用いて細胞懸濁液（１００〜１５０μＬ）をスライドグラスに塗沫した。塗沫標本を十分に乾燥後、Ｃａｒｎｏｙ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに１分間固定し、蒸留水にて洗浄した。抗Ｔｒｙｐｔａｓｅ抗体及び抗Ｃｈｙｍａｓｅ抗体を０．１％  ＢＳＡ、ＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒにて１μｇ／ｍＬに調製。塗沫標本を１μｇ／ｍＬのウサギ抗Ｒｅｃ１６８  ｐｅｐｔｉｄｅ抗体、マウスＴｒｙｐｔａｓｅ抗体、抗Ｃｈｙｍａｓｅ抗体及びコントロール抗体（に浸し、室温にて１時間静置した。ＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後（１０分間間隔にてＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを交換）、ＬＳＡＢ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＡＰ  ｋｉｔのＢｉｏｔｉｎ化抗マウスＩｇ抗体に浸し、室温にて３０分間静置した。再びＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後（１０分間間隔にてＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを交換）、ＬＳＡＢ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＡＰ  ｋｉｔのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰに浸し、室温にて１５分間静置した。塗沫標本をＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後（１０分間間隔にてＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを交換）、ＬＳＡＢ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＡＰ  ｋｉｔのＦｕｃｈｓｉｎ＋  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ基質に浸し、室温にて１０分間静置した。蒸留水にて洗浄後（１０分間間隔にて蒸留水を交換）、余分な水分を切り、Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍの１、２滴を滴下し、スライドグラスを水平な台にて静置し、風乾した。
上記実験から下記のことが明らかになった。
ヒト培養肥満細胞のｃｅｌｌ  ｔｙｐｅを検討するため、抗ＭｒｇＸ２−ｐｅｐｔｉｄｅ抗体、抗ヒトＴｒｙｐｔａｓｅ抗体及び抗ヒトＣｈｙｍａｓｅ抗体による免疫染色を行った。コントロール抗体と比較して、何れの抗体によってもヒト培養肥満細胞は強く染色された（図２３）。本条件で培養したヒト培養肥満細胞はＲｅｃ１６８陽性細胞であり、また、Ｔｒｙｐｔａｓｅ及びＣｈｙｍａｓｅ陽性細胞であった。
ヒト肥満細胞は大別して２つのｃｅｌｌ  ｔｙｐｅに分類することができる。すなわち、Ｔｒｙｐｔａｓｅ陽性細胞であるＭＣＴ細胞とＴｒｙｐｔａｓｅ及びＣｈｙｍａｓｅ陽性細胞であるＭＣＴＣ細胞である。ＭＣＴ細胞は粘膜型肥満細胞と呼ばれ、主に消化管粘膜に多く、一方、ＭＣＴＣ細胞は結合組織型と呼ばれ、皮下組織に多い。ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰやｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０に反応する肥満細胞は後者のタイプである。今回、Ｒｅｃ１６８陽性の肥満細胞はＴｒｙｐｔａｓｅ及びＣｈｙｍａｓｅ陽性細胞であったであったことから、結合組織型肥満細胞であることが判明した。長期罹患関節リウマチ患者の滑膜にはＭＣＴＣ細胞が優位に存在すること、間質性膀胱炎患者の疾患部位ではＭＣＴＣ細胞および好酸球の増加が認められること、ＭＣＴＣ細胞の産生するＴＮＦが細菌感染時にＴ細胞をリンパ節に誘導し腫張させるなどの報告があり、結合組織型肥満細胞の炎症と免疫応答との関わりから、ストレスによるアトピー性皮膚炎に留まらず、これら疾患とＲｅｃ１６８のつながりについても検討を加える必要がある。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
以上のように、本発明のＧ蛋白質共役型受容体Ｒｅｃ１６８を介する新たなメカニズムに基づく、脱顆粒調節物質のスクリーニング方法及び肥満細胞における脱顆粒抑制物質の同定方法は、新たなアレルギー性疾患又は自己免疫疾患の治療剤の開発方法として有用であり、特に肥満細胞が関与するアレルギー性疾患又は自己免疫疾患の治療剤の開発方法として適している。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６（Ａ−１）】
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【図１６（Ａ−２）】
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【図１６（Ａ−３）】
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【図１６（Ｂ−１）】
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【図１６（Ｂ−２）】
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【図１６（Ｂ−３）】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９（Ａ）】
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【図１９（Ｂ）】
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【図１９（Ｃ）】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２（Ａ）】
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【図２２（Ｂ）】
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【図２２（Ｃ）】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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