【手続補正書】
【提出日】平成19年1月31日(2007.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  免疫賦活化組成物
【特許請求の範囲】
【請求項１】 核酸組成物を有効成分として含む免疫賦活作用を有する飲食品。
【請求項２】 核酸組成物が、高分子核酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基からなる群から選ばれる核酸組成物である請求項１に記載の飲食品。
【請求項３】 核酸組成物が、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの混合物である請求項１または２に記載の飲食品。
【請求項４】 ヌクレオチドが、シチジル酸、グアニル酸、アデニル酸、ウリジル酸、およびイノシン酸の少なくとも１つ、または２つ以上を含む請求項３に記載の飲食品。
【請求項５】 ヌクレオシドが、シチジン、グアノシン、アデノシン、ウリジン、およびイノシンの少なくとも１つ、または２つ以上を含む請求項３に記載の飲食品。
【請求項６】 免疫賦活作用が、腸管免疫系における腸管上皮細胞間Ｔリンパ球（ＩＥＬ）のαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのサブセット構成比を、γδ-ＩＥＬを高める方向にシフトする請求項１に記載の飲食品。
【請求項７】 免疫賦活作用が腸管上皮におけるＩＦＮ-γ、ＩＬ-２、ＩＬ-７、およびＴＧＦ-βの産生亢進である請求項１に記載の飲食品。
【請求項８】 免疫賦活作用がマクロファージおよび脾細胞におけるＩＬ-１２の産生亢進である請求項１に記載の飲食品。
【請求項９】 免疫賦活作用が細胞性免疫増強である請求項６〜８のいずれかに記載の飲食品。
【請求項１０】 免疫賦活作用が整腸作用、抗腫瘍作用、抗変異作用、血圧低下作用、抗潰瘍作用、脂質代謝改善作用である請求項１または請求項６〜８のいずれかに記載の飲食品。
【請求項１１】 食品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品、経腸栄養食品、経腸栄養剤、医薬品部外品からなる群から選ばれる請求項１〜１１のいずれかに記載の飲食品。
【請求項１２】 請求項１１に記載の飲食品を製造するための核酸組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、核酸組成物を有効成分として含む免疫賦活作用を有する飲食品および該飲食品の製造のための核酸組成物の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】腸管は、食物を消化吸収し必要な栄養素やエネルギーを得る消化器官であるとともに、有益な食物成分に対する免疫応答を可能な限り抑制する一方で、有害な病原微生物や各種トキシンに対しては免疫防御応答を速やかに惹起する第一級の免疫器官でもある。
【０００３】腸管の免疫器官を総称して腸管関連リンパ組織（gut-associated lymphoid tissue : ＧＡＬＴ）という。ＧＡＬＴは、パイエル板、腸間膜リンパ球、粘膜固有層、および腸管上皮細胞からなり、たがいに協調的に働いている。この中で、抗原の侵入ルートとして特に重要と考えられるのがパイエル板と腸管上皮である。
【０００４】腸管免疫系において、有害な病原微生物や毒素などに対する防御機構として代表的ものがＩｇＡ抗体産生を主体とした局所免疫応答であり、有益な食品を受け入れる機構の代表的なものが経口免疫寛容である。
【０００５】ＩｇＡ抗体は、病原菌の腸管粘膜からの侵入阻止、毒素の中和、アレルゲンの侵入阻止などの働きをしている。これらの抗原はパイエル板から取り込まれ、抗原特異的なＴ細胞の作用により、Ｂ細胞がＩｇＡ抗体産生細胞に分化し、さらにＢ細胞が粘膜固有層に移動してＩｇＡ抗体分泌細胞に分化する。
【０００６】一方、もう一つの抗原侵入ルートとして考えられている腸管上皮は、腸管上皮細胞（intestinal epithelial cells : ＩＥＣ）とその間に埋め込まれた形で存在する巨大なＴ細胞集団である腸管上皮内リンパ球（intraepithelial lymphocytes : ＩＥＬ）からなる。ＩＥＬはそのほとんどがＴ細胞である。Ｔ細胞が抗原を認識する分子すなわちＴＣＲ分子は、α鎖とβ鎖からなるαβＴＣＲとγ鎖とδ鎖からなるγδＴＣＲの２種類がある。ＩＥＬのＴ細胞は、パイエル板や粘膜固有層を構成する細胞とは大きく性質が異なっている。その多くは胸腺には依存せず、腸管独自の選択を受けていると推測され、末梢にはほとんど存在しないγδＴＣＲ（γδ-ＩＥＬ）やＣＤ８ααホモダイマーを発現しているのが多数存在する。現在ＩＥＬが認識している抗原、機能についてはほとんど明らかにされていない。しかしながら、腸管免疫応答において最前線に存在する小腸上皮が、局所的ＩｇＡ抗体産生誘導や経口免疫寛容など特徴的な腸管免疫応答において重要な役割を担っていることは容易に考えられる。そこで、ＧＡＬＴについて、小腸上皮を構成する上皮細胞とＩＥＬとの間のサイトカインとそのレセプターを介した粘膜細胞間の相互作用について活発な研究がなされてきている。
【０００７】例えば、γδ-ＩＥＬはケラチノサイト成長因子（keratinocyte growth factor : ＫＧＦ）を産生し、上皮細胞の成長、増殖をコントロールしている（Boismenu, R. and Havran, W. L.: Sience, 266: 1253, 1994）、ＴＣＲδ-/-マウスでは、上皮細胞の発達が低下している（Komano, H.: et al.: Proc. Natl. Acad.Sci., 92: 6147-6151, 1995）、逆に上皮細胞が分泌するインターロイキン７（ＩＬ-７）が、γδ-ＩＥＬの成長、活性化因子として深く関与している（Fujihashi, K.: et al.: Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3613, 1996）、ＩＬ-７やＩＬ-７レセプター特異的遺伝子が欠落しているマウスでは、これら粘膜系γδ-ＩＥＬの発達の低下や欠損が認められる、マウスの上皮細胞は、幹細胞成長因子（stem cell factor : ＳＣＦ）を産生し、このＳＣＦはγδ-ＩＥＬの増殖と分化に深く関わっている（Puddington, L. et al.: Immunity 1: 733, 1994）、ＩＬ-２とＩＬ-７によりγδ-ＩＥＬが相乗的に増殖する（Fujihashi, K. et al.: Proc. Naqtl. Acad. Sci., 93: 3613, 1996）、上皮細胞の産生するＴＧＦ-βがＩｇＡへのクラススイッチ因子としてＩｇ遺伝子のμ鎖からα鎖への遺伝子変換を促すシグナルを提供する（Sonoda, E. et al.: J. Exp. Med., 170: 1415, 1989）、などの報告がある。
【０００８】したがって、小腸上皮におけるサイトカイン産生亢進をとおして、腸管免疫系の免疫機能を増強することが考えられる。そしてこのようなサイトカイン産生亢進作用を有する経口性組成物は、腸管免疫系の機能低下の予防、改善、あるいは免疫活性の賦活化に有用であると考えられる。これまで、経口経腸的な核酸投与、あるいは経静脈的な核酸成分投与が免疫能に及ぼす効果についての報告（宇佐美 眞・他：化学と生物. 36(10) : 620, 1998）はあるが、核酸成分の経口摂取が腸管上皮におけるサイトカイン産生に及ぼす効果についての報告は見当たらない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、腸管上皮におけるサイトカイン産生を亢進することにより、腸管免疫系の機能低下の改善、予防、あるいは免疫賦活化が期待できる核酸組成物を提供することを課題とする。さらに本発明は該核酸組成物の有効量を含有する経口性組成物を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、核酸組成物の経口摂取により、ＩＥＬにおけるαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのサブセット構成比率において、γδ-ＩＥＬの発現比率が高められる方向にシフトすることを見出した。また、核酸組成物の経口摂取により、小腸上皮において、ＩＦＮ-γ、ＩＬ-２、ＩＬ-７、およびＴＧＦ-βの産生が亢進することを見出した。さらにまた、核酸組成物の経口摂取により、抗原特異的分泌型ＩｇＡ抗体産生が誘導されることを見出した。
【００１１】すなわち、本発明は、（１） 核酸組成物を有効成分として含む免疫賦活作用を有する飲食品、（２） 核酸組成物が、高分子核酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基からなる群から選ばれる核酸組成物である（１）の飲食品、（３） 核酸組成物が、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの混合物である（１）または（２）の飲食品、（４） ヌクレオチドが、シチジル酸、グアニル酸、アデニル酸、ウリジル酸、およびイノシン酸の少なくとも１つ、または２つ以上を含む（３）の飲食品、（５） ヌクレオシドが、シチジン、グアノシン、アデノシン、ウリジン、およびイノシンの少なくとも１つ、または２つ以上を含む（３）の飲食品、（６） 免疫賦活作用が、腸管免疫系における腸管上皮細胞間Ｔリンパ球（ＩＥＬ）のαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのサブセット構成比を、γδ-ＩＥＬを高める方向にシフトする（１）の飲食品、（７） 免疫賦活作用が腸管上皮におけるＩＦＮ-γ、ＩＬ-２、ＩＬ-７、およびＴＧＦ-βの産生亢進である（１）の飲食品、（８） 免疫賦活作用がマクロファージおよび脾細胞におけるＩＬ-１２の産生亢進である（１）の飲食品、（９） 免疫賦活作用が細胞性免疫増強で（６）〜（８）のいずれかの飲食品、（１０） 免疫賦活作用が整腸作用、抗腫瘍作用、抗変異作用、血圧低下作用、抗潰瘍作用、脂質代謝改善作用である（１）または（６）〜（８）のいずれかの飲食品、（１１） 食品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品、経腸栄養食品、経腸栄養剤、医薬品部外品からなる群から選ばれる（１）〜（１１）のいずれかの飲食品、（１２） （１１）の飲食品を製造するための核酸組成物の使用、に関する。以下本発明を詳細に説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】Ｔ細胞はサイトカインの分泌により機能を発揮する。タンパク質抗原を経口投与し、Ｔ細胞応答を誘導し、産生されるサイトカインや抗体産生ヘルパー機能などを解析する場合、免疫能増強のためアジュバントを共に投与するのが通常である。この場合、アジュバントの影響を否定できない。タンパク質抗原の経口投与に対するＴ細胞応答は、アジュバントなしで投与した場合に相当する。最近、アジュバントを用いずにタンパク質抗原を経口投与した場合の弱いＴ細胞応答を、ＴＣＲ遺伝子を導入したＴＣＲ-トランスジェニック（ＴＣＲ-Ｔｇ）マウスを用いることにより解析することが可能となった。通常のマウスでは、抗原特異的Ｔ細胞の頻度が極めて低く、解析が困難であるのに対し、ＴＣＲ-Ｔｇマウスでは、単一の抗原を認識するＴ細胞の頻度が極めて高い。そこで本発明者らは、通常のマウスの他に、卵白アルブミン（ＯＶＡ）を認識するＴＣＲを発現するＴＣＲ-Ｔｇマウス（ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウス）を用い、核酸の経口摂取が腸管免疫系におけるＴ細胞応答に及ぼす影響を調べた。
【００１３】以下本発明を試験例に基づき説明するが、本発明は、これらの試験例に限定されるものではなく、当業者であるならば、本試験例に基づいて導き出される本発明のさらなる技術の広がりをも当然含まれる。
【００１４】１） 核酸の経口摂取がＩＥＬにおけるＴ細胞サブセット構成に及ぼす影響マウスの腸管に存在するＩＥＬの８０〜９０％はＣＤ３+Ｔ細胞であり（これは、他の生体部位に分布するＴ細胞の半数以上がＣＤ４+Ｔ細胞であることを考えると際だった特徴である）、γδ-ＩＥＬが末梢血リンパ球と比較して非常に多く、約半数を占める。抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体を用いてＣＤ３+Ｔ細胞を染色すると、１）ＣＤ４-ＣＤ８+群（ＣＤ８+）、２）ＣＤ４+ＣＤ８+群、３）ＣＤ４-ＣＤ８-群、および４）ＣＤ４+ＣＤ８-群（ＣＤ４+）の４つのサブセットに分類できる。また、この４つのサブセット群においてαβ-ＩＥＬはＣＤ４+群、ＣＤ８+群、ＣＤ４+ＣＤ８+群に存在し、γδ-ＩＥＬはＣＤ４-ＣＤ８+群、ＣＤ４-ＣＤ８-群のみに認められる。マウスＩＥＬにおけるＴ細胞サブセットの全体像を把握しやすいように表１に示した。
【００１５】
【表１】
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【００１６】核酸を添加した食餌を、通常のマウスに２週間自由に経口摂取させた後、ＩＥＬにおけるＴＣＲサブセット構成を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で解析した。
【００１７】核酸摂取群におけるαβ-ＩＥＬの発現率（％）は、核酸非摂取群（対照群）のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に低くなり、逆にγδ-ＩＥＬの発現率は、対照群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に高くなった（図１）。これを、核酸摂取群におけるαβ-ＩＥＬ/γδ-ＩＥＬの発現比、対照群におけるαβ-ＩＥＬ/γδ-ＩＥＬの発現比で比較すると、核酸摂取群の方が対照群よりも有意（ｐ＜０．０５）に低下した（図２）。これらの結果は、核酸を添加した食餌を経口摂取すると、ＩＥＬにおけるαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの構成比が、γδ-ＩＥＬが高められる方法にシフトすることを示している。
【００１８】さらに、αβ-ＩＥＬおよびγδ-ＩＥＬのそれぞれにおけるＣＤ４とＣＤ８の発現比率をＦＡＣＳで個体別に解析した。
【００１９】αβ-ＩＥＬにおける核酸摂取群のＣＤ８αα+の発現率（％）が、対照群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に低くなったのに対し、γδ-ＩＥＬにおける核酸摂取群のＣＤ８αα+の発現比率（％）は、対照群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に高くなった（図３）。
【００２０】データは示さないが、核酸摂取群と対照群との間で、αβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αβ+の発現比率には差は認められなかったこと、ＣＤ４+、ＣＤ４+ＣＤ８+、の発現比率は、核酸摂取群と対照群で変わらなかったこと、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ４-ＣＤ８-は、核酸摂取群で僅かに増加したが、対照群と有意差はなかったことから、核酸摂取群において、αβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα+の構成比率が低くなり、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα+の構成比率が高くなることと、αβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの構成比率が、γδ-ＩＥＬの発現比率が高められる方向にシフトすることとは相関していることを示していると考えられる。したがって、核酸の経口摂取は、胸腺外でのγδ-ＩＥＬ発達・分化を促進すると考えられる。
【００２１】さらに、タンパク質抗原の経口摂取が、ＩＥＬにおけるＴＣＲサブセットの発現、およびＣＤ４とＣＤ８発現に及ぼす影響を、主要な食物アレルゲンである卵白アルブミン（ＯＶＡ）に特異的なＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）をもつトランスジェニックマウス（ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇ）で調べた。
【００２２】核酸を含む食餌とともにＯＶＡを含む水を自由に摂取したＯＶＡ-ＴＣＲ ＴｇマウスからＩＥＬを調製し、ＴＣＲサブセット構成、およびαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬにおけるそれぞれのＣＤ４とＣＤ８サブセット発現を、ＦＡＣＳで個体別に解析した。
【００２３】経口抗原存在下でも、αβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの構成比は、核酸の経口摂取により、γδ-ＩＥＬが高められる方向に有意（ｐ＜０.０５）にシフトした（図４）。ＣＤ８αα+の発現率（％）についても、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα+の発現率は、対照群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に高くなった（図５）。しかしながら、核酸摂取群、対照群ともにαβ-ＩＥＬの発現比率が、通常マウスの場合に比較して著明に増加した（図１と４参照）。
【００２４】一方、八村らは、ＯＶＡを経口摂取したＯＶＡＴＣＲ-Ｔｇマウスでは、ＯＶＡ特異的ＣＤ４+-ＩＥＬが増殖し、ＩＥＬ全体に占める割合が増加することを明らかにしている（八村敏志・他：日本農芸化学会誌, 73(5): 523-527, 1999）。
【００２５】２） 核酸の経口摂取が腸管上皮におけるサイトカイン産生に及ぼす影響核酸を添加した食餌とともにＯＶＡを含む水を自由に摂取したＯＶＡ-ＴＣＲＴｇマウスから調製したＩＥＬと、未感作のＢＡＬＢ/ｃマウスから調製しマイトマイシンＣ処理した脾細胞（抗原提示細胞）とを、ＯＶＡの存在下、あるいは非存在下で共培養すると、核酸摂取群において、ＯＶＡ特異的ＩＦＮ-γおよびＩＬ-２の産生増強が観察された（図６および７）。
【００２６】これは、核酸の経口摂取は、ＩＥＬ中の抗原特異的なＴｈ１タイプの細胞の増殖応答を誘導することを示していると考えられる。
【００２７】核酸の経口摂取はマウスの小腸上皮細胞のＩＬ-７産生を有意（ｐ＜０．０１）に増強する（図８）。
【００２８】また、核酸を添加した食餌とともにＯＶＡを含む水を自由に摂取したＯＶＡ-Ｔｇマウスの小腸上皮細胞のＩＬ-７産生およびＴＧＦ-β産生は、核酸摂取により有意（ｐ＜０．０１）に増強した（図９および１０）。
【００２９】３） 核酸の経口摂取が抗原特異的ＩｇＡ抗体産生に及ぼす影響【００３０】核酸の経口摂取は、腸管における抗原特異的ＩｇＡ抗体の産生を対照群に比較して有意（ｐ＜０．０５）に増強した（図１１）。
【００３１】ヌクレオチドをマウスに経口摂取させ、脾臓細胞や腹腔マクロファージのp70型のＩＬ-１２に与える影響を、生物学的測定法（Bioassay法）で検討した。また、in vitroでヌクレオチドとともにマクロファージを培養し、その上清中のＩＬ-１２活性をBioassay法で測定した。腹腔マクロファージのＩＬ-１２活性は、ＬＰＳ刺激下でヌクレオチド投与群の方がヌクレオチド非投与群に比べて有意に高くなった（図１２）。また、in vitroでヌクレオチドとともに腹腔マクロファージを培養した場合のＩＬ-１２活性は、ヌクレオチドを添加していない場合に比べて、有意差は見られないものの高くなる傾向が見られた（図１３）。
【００３２】脾臓リンパ細胞のＩＬ-１２活性は、ヌクレオチド投与群の方がヌクレオチド非投与群に比べて有意に高くなった（図１４）。
【００３３】以上のことから、核酸組成物の経口摂取は、マクロファージなどによるＩＬ-１２産生を促進し、ＩＬ-１２はナイーブＴ細胞からＴｈ１細胞への分化の促進、抹消血からＩＦＮ-γ産生を誘導することから、生体内でのＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１優位にシフトすることが期待される。その結果、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが波綻し、Ｔｈ２優位に変異することに起因する疾患、例えば、アレルギー疾患や自己免疫疾患に対して、核酸組成物を含む飲食品を日常の食生活のなかで摂取することにより、その予防、改善あるいは治療が期待できる。
【００３４】また、ＩＬ-１２は、静止期のＴ細胞およびＮＫ細胞からのＩＦＮ-γの産生誘導、ＮＫ細胞活性の亢進、ＬＡＫ細胞活性の誘導、静止期Ｔ細胞のレクチン刺激による細胞増殖亢進などが知られており、核酸組成物を含む飲食品を日常の食生活のなかで摂取することにより、生体内での微生物および腫瘍細胞に対する排除能を高め、ＩＦＮ-γの産生増強をとおしてウイルスや腫瘍細胞に対する防御能を高めることが期待される。
【００３５】これらの結果から、核酸の経口摂取は、１）ＩＥＬにおけるＴ細胞のαβ-ＩＥＬサブセットとγδ-ＩＥＬサブセットの構成比がγδ-ＩＥＬ優位に高められ、それは、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα+の比率の増加と、αβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα+の比率の減少と相関しており、２）ＩＥＬにおいて、抗原特異的ＩＬ-２およびＩＦＮ-γの産生を促進し、３）腸管上皮細胞におけるＩＬ-７およびＴＧＦ-βの産生を促進し、４）抗原特異的ＩｇＡ抗体産生を誘導する、５）ＩＬ-１２産生を増強することが示された。
【００３６】一方、本発明者らは、ヌクレオチドを含む食餌を経口摂取したマウスは、１）パイエル板Ｔリンパ球のマイトジェン刺激に対する増殖応答能およびＩｇＡ産生能が、ストレス下（絶食）で促進されること、２）血清中のＩｇＥ産生が抑制されること、３）ＩｇＧ１／ＩｇＧ２aが低下すること、４）脾細胞のＩＦＮ-γの産生が促進され、ＩＬ-４産生が抑制されること、を示した（特開平9-323979）。さらにその後、本発明者らは、ヌクレオチドを含む食餌を経口摂取したマウスの血清中では、１）カゼイン特異的ＩｇＧ１は変化なかったが、ＩｇＧ２aは高まったこと、２）卵白アルブミン（ＯＶＡ）特異的ＩｇＧ１は変化なかったが、ＩｇＧ２aは高くなり、またＯＶＡ特異的ＩｇＥは低下したこと、３）血清中の全ＩｇＥが低くなったこと、を示した（特開平11-35468）。
【００３７】一方、γδ-ＩＥＬはＫＧＦを産生し小腸上皮細胞の成長、増殖を制御している（Boismenu, R. & Havran, W.L.: Science, 266: 1253, 1994; Komano, H. etal.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: 6147, 1995）、分泌型ＩｇＡ産生を促進する（Fujihashi, K. et al.: J. Exp. Med., 183: 1929, 1996）、経口免疫寛容の誘導に必要である（Ke, Y. et al.: J. Immunol., 158: 3610-3618, 1997）、などから、ＩＥＬにおけるγδ-ＩＥＬの発現が高まる方向へのシフトは、腸管免疫系の賦活化に重要であると考えられる。
【００３８】また、Ｔｈ１細胞の産生するＩＦＮ-γは、上皮細胞の基底膜側に発現している分泌成分（serectory component: ＳＣ）産生に深く関与している（Taguchi,T. et al.: J. Immunol., 3736, 1991）。このＳＣとＩｇＡ形質細胞が産生する２量体のＩｇＡは結合して分泌型ＩｇＡを形成する。
【００３９】また、上皮細胞のＩＬ-７は、γδ-ＩＥＬのＩＬ-７レセプター（ＩＬ-７Ｒ）を介してγδ-ＩＥＬの分化・増殖に重要な役割を果たす（Fujihashi, K. et al.: Eur. J. Immunol., 27: 2133, 1997）。さらに、ＩＬ-２とＩＬ-７は胸腺由来のγδ-ＩＥＬやαβ-ＩＥＬに対して活性化因子として働いている（Okazaki,et al.: J. Immunol., 143: 2917, 1989）。
【００４０】また、ＴＧＦ-βは、免疫抑制性のサイトカインとして知られており、これを分泌するＴ細胞は経口免疫寛容における調節性Ｔ細胞として、免疫応答を抑制していることが示唆されている（八村敏志・他：日本農芸化学会誌, 73(5): 523-527, 1999）。また、ＴＧＦ-βは、ＩｇＡへのクラススイッチを行うことが知られており（Sonoda, E. et al.: J. Exp. Med., 170: 1415, 1989）、腸管におけるＩｇＡへの関与も示唆されている。
【００４１】ところで、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、産生するサイトカインプロフィルとそれに基づくエフェクター機能によって、ＩＬ-２やＩＦＮ-γを産生するＴｈ１細胞と、ＩＬ-４やＩＬ-５、ＩＬ-１０を産生するＴｈ２細胞に分類される。このＴｈ１とＴｈ２のバランスの破綻は、がん、感染症、アレルギー、自己免疫疾患、動脈硬化など、さまざまな免疫病の発症に関与しているほか、ストレスと免疫、移植免疫、妊娠免疫にも重要な因子であることが知られている。核酸の経口摂取は、このＴｈ１とＴｈ２のバランスにおけるＴｈ２優位へのバランス破綻を、Ｔｈ１の発現を高めることにより、該バランスを改善することが期待される。
【００４２】結論として、有効量の核酸の経口摂取により、腸管免疫系に抗原特異的な分泌型ＩｇＡ抗体産生を促進して、有害な病原体などに対する防御能を高め、一方、抗原特異的な経口免疫寛容を効果的に誘導し、さらに、Ｔｈ１/Ｔｈ２細胞のバランスの破綻を改善し、結果、腸管免疫系、あるいは全身免疫系を賦活化することが期待される。
【００４３】本明細書における“核酸の有効量”は、例えば、ＩＥＬにおけるγδ-ＩＥＬの発現比率が高められること、腸管上皮におけるＩＦＮ-γ、ＩＬ-２、ＩＬ-７、およびＴＧＦ-βの産生が促進されること、抗原特異的ＩｇＡ抗体の産生が促進されること、血清中の抗原特異的ＩｇＥ抗体産生やｔｏｔａｌＩｇＥ抗体産生が抑制されること、脾細胞におけるＩＬ-４産生が抑制されること、ＩｇＧ１/ＩｇＧ２ａの比が低下すること、等を指標にして、公知のアッセイによりその有効量を決定し、さらに臨床症状等を勘案して、有効摂取量を決定することができる。
【００４４】経口的に摂取された核酸は、膵液中のリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼによって加水分解を受け、ヌクレオチドになり、ホスファーターゼによってリン酸がはずれてヌクレオシドになり、さらにヌクレオシダーゼによって分解されて核酸塩基と五炭糖になる。胃腸からの吸収は、ヌクレオチド、ヌクレオシドとして行われる。
【００４５】ここでいう塩基は、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、シトシン、ウラシル、チミンのことである。ここでいうヌクレオシドは、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、リポチミジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、チミジン、イノシン、キサントシンのことである。
【００４６】ここでいうヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分にリン酸がエステル結合で結合している化合物のことで、結合するリン酸の位置はどこでもよく、結合するリン酸の数もいくつでもよい。また、例えば、１つのリン酸が 5'、3' 位の両方に結合する化合物もヌクレオチドに含める。この場合も結合するリン酸の数や位置はどこでもよい。
【００４７】ここでいう核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドや上記したヌクレオチドが結合したポリヌクレオチドのことである。本発明の核酸は、アデノシン-n'-一リン酸、シチジン-n'-一リン酸、グアノシン-n'-一リン酸、ウリジン-n'-一リン酸、チミジン-n'-一リン酸、およびイノシン-n'-一リン酸の１種または２種以上を含む核酸組成物を意味する。ここでn'は２'、３'、または５'を示す。
【００４８】本発明の核酸組成物は、特定の組み合わせの核酸を有効成分として含有するものであり、組み合わせを遊離形で示すと、次のとおりである。なお、核酸成分は、ＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ規定、あるいは当該分野における慣用記号にしたがう。
【００４９】すなわち、アデノシンーリン酸（ＡＭＰ）／シチジンーリン酸（ＣＭＰ）／グアノシンーリン酸（ＧＭＰ）／ウリジンーリン酸（ＵＭＰ）／イノシン-n'-一リン酸（ＩＭＰ）の各組み合わせである。これらの組み合わせにおける各成分としては、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド類、またはこれらの無毒性塩が含まれる。
【００５０】また、核酸成分の配合割合を、例えば核酸のモル比で表せば、モル比は、上記のアッセイ系で、核酸成分の種類、配合量等を決定し、さらに患者の病態等を勘案して決定することができる。これらの好ましい組み合わせの１例としては、モル比として、ＩＭＰ：ＡＭＰ：ＧＭＰ：ＣＭＰ：ＵＭＰ：ＡＭＰ＝１〜４：１〜４：１〜４：１〜４である。さらに好ましい一つの例として、ＧＭＰ：ＣＭＰ：ＵＭＰ：ＩＭＰ＝１：３〜４：１〜２：１〜３である。
【００５１】これらの核酸塩基のうちでの最適な核酸塩基の選択、あるいは組み合わせは、当業者であれば、上記アッセイ系で適切に決定することが可能である。したがって、そのようにして得られた核酸組成物も本発明に包含される。
【００５２】核酸はその由来に制限はなく、例えば、酵母、細菌、乳、魚介類、動物、植物由来が挙げられる。飲食品タイプの核酸組成物として使用する場合には、有効量の核酸成分（その処理物）をそのまま、使用したり、他の食品ないし食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。有効量の核酸成分を用いる本発明に係る組成物は、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよいが、甘味料、酸味料、ビタミン剤その他ドリンク剤製造に常用される各種成分を用いて、健康ドリンクに製剤化すると好適である。
【００５３】腸管免疫系の賦活化（抗原特異的ＩｇＡ抗体産生や免疫寛容）を目的として、核酸の有効量を、食品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品、経腸栄養食品、あるいは経腸栄養剤等の医薬品製剤や医薬部外品製造のために配合することができる。それは周知・慣用技術である。
【００５４】プリン・ピリミジンの成人１日の必要量は、450〜700mgとされ、また、尿酸に蓄積を生じない最大安全量は、４g/日とされている（Rudolph, F.B. et al.: Nutrition, 6 : 45, 1990）。
【００５５】［試験例］ 以下、核酸の経口摂取が免疫系に及ぼす影響についての試験例を示すが、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
【００５６】統計処理データの統計的有意差は、Student's testによつて決定した。p＜０.０５における値を有意とみなした。
【００５７】フローサイトメトリー一次抗体は、ビオチン化抗マウスＴＣＲβ(Ｈ５７-５９７)（PharMingen, SanDiego, CA, U.S.A）、ビオチン化抗マウスＣＤ４(Ｈ１２９.１９)（PharMingen）、およびビオチン化抗マウスＩＬ-２Ｒ抗体(ＣＤ２５)(７Ｄ４)(PharMingen)、を用いた。インキュベーションは全て遮光下に行った。細胞は、一次抗体、あるいはアイソタイプコントロール抗体とともに、氷上で３０分間インキュベートした。Ｈａｎｋ's平衡塩類溶液で細胞を洗浄後、Fluorescein isothiocyanate（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＴＣＲδ抗体(ＧＬ３)(Cedar Lane Lab.)、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４(Ｈ１２９.１９)（PharMingen）、phycoerythrin（ＰＥ）標識抗マウスＣＤ８α(５３-６.７)（GIBCO,Grand Island, NY, U.S.A）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８β(Ｙ８.７７)（Seikagaku Co., Tokyo, Japan)、ＰＥ標識抗マウスＴＣＲβ、(Ｈ８７-５９７)(PharMingen)、およびstreptavidin-Red 670(GIBCO)、とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞は、遠心して洗浄した。染色細胞は、３カラーによるフローサイトメトリー（Becton Dickinson FACSort）でＩＥＬsサブセットを解析した。解析には、Lysis IIソフトウエアを用いた。
【００５８】サイトカインアッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイバッファーとして３％ポリエチレングリコール６０００（Nacalai Tesque Inc., Japan）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）を用いた（アッセイバッファー）。洗浄バッファーには、０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）（ＰＢＳ-０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を用いた。ＩＦＮ-γ、およびＩＬ-２は、ＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbentassay）で測定した。ラット抗マウスＩＦＮ-γ抗体（６Ａ２）(PharMingen)、ラット抗マウスＩＬ-２抗体（ＪＥＳ６-１Ａ１２）(PharMingen)と、ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ-γ抗体（ＸＭＧ１.２）(PharMingen)、ビオチン化ラット抗マウスＩＬ-２抗体（ＪＥＳ６-５Ｈ４)（PharMingen）を用いた。０.０５Ｍ-Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８.９）で希釈したラット抗マウスＩＦＮ-γ抗体（１μg/ｍｌ）、あるいは０.１Ｍ-NaHCO3で希釈したラット抗マウスＩＬ-２抗体（１μg/ｍｌ）を、マイクロタイタープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）の各ウエルに分注した。４℃で一晩インキュベートし、抗体をウエルに吸着させた。ウエルを洗浄後、５％ＦＣＳを含むアッセイバッファーを加え、室温１時間ブロックした。ウエルを洗浄後、アッセイバッファーで希釈した培養上清を各ウエルに加え、２時間インキュベートした。ウエルを洗浄後、アッセイバッファーで希釈したビオチン化抗マウスＩＦＮ-γ抗体、またはビオチン化抗マウスＩＬ-２抗体を各ウエルに加え、２時間インキュベートした。洗浄後、アッセイバッファーで希釈したアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（Zymed Lab., South San Francisco, CA, U. S.A）を各ウエルに加え反応させた。ウエルを洗浄後、基質溶液［０.１Ｍジエタノールアミン緩衝液(ｐＨ９.８)に溶解した0.１％４ニトロフェニルホスフェイト（Tokyo Kasei Co.）］を各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートした。５Ｎ-NaOHを加えて反応を停止し、４０５ｎｍにおける吸光値を測定した。ＩＬ-７およびＴＧＦ-βは、ＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００５９】0.１Ｍ-NaHCO3で希釈した抗マウスＩＬ-７抗体溶液（２μg/ｍｌ）(Genzyme)をマイクロタイタープレート（Nunc）の各ウエルに分注し、４℃一晩インキュベートし、抗体をウエルに吸着させた。ウエルを洗浄後、１０％ＯＶＡを含むアッセイバッファーをウエルに加え、室温１時間ブロックした。ウエルを洗浄後、0.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むアッセイバッファーで希釈した培養上清をウエルに加え、２時間インキュベートした。ウエルを洗浄後、0.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むアッセイバッファーで希釈してヒツジ抗マウスＩＬ-７抗体(１μg/ｍｌ）（R and D, Minneapolis, MN, USA）を各ウエルに加え２時間インキュベートした。ウエルを洗浄後、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むアッセイバッファーで希釈したビオチン化抗ヒツジＩｇＧ抗体を各ウエルに加え、１５分間反応させた。ウエルを洗浄後、アッセイバッファーで希釈したアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを各ウエルに加えた。ウエルを洗浄後、ＩＦＮ-γおよびＩＬ-２と同様に、基質溶液を各ウエルに加え、４０５ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００６０】［試験例１］ＩＥＬのＴＣＲサブセット発現に及ぼす影響３週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウス［ＳＬＣ,Hamamatsu, Japan］は、ヌクレオチド非添加食餌［ＮＴ(−)］群（ｎ＝４）、およびヌクレオチド添加食餌［ＮＴ(＋)］群（ｎ＝４）、の２群にランダムに分けた。ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、それぞれ２週間自由摂取させた。ヌクレオチド［Yamasa Co.（Chosi, Japan）］組成を表２に示す。
【００６１】
【表２】
2001314172.tif 000002
【００６２】また該ヌクレオチドを含みホエータンパク質（ＷＰＩ）［Davisco, International Inc.（Le Sueur, MN, U.S.A）］を基本とした食餌組成を表３に示す。
【００６３】
【表３】
2001314172.tif 000003
【００６４】食餌の摂取後、小腸を摘出し、ＩＥＬを、Nannoらの方法（Nanno, M. et al.:J. Immunol., 153: 2014-2020, 1994）にしたがって調製した。マウスから小腸を摘出した。腸管腔内容物を洗い流した後、ポリエチレンチューブを貫通させ、一端を固定し、内腔が外側になるように反転した。反転した腸管を４等分し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＨＢＳＳ４５ｍｌを入れた５０ｍｌコニカルチューブに移し、３７℃で４５分間、水平方向に１３５ｒｐｍ振とうした。振とう後、ガラスウールカラムで濾過して異物を取り除き、細胞を回収した。細胞は、３０％パーコール（Pharmacia, Uppsala, Sweden）に浮遊させ、１８００ｒｐｍで２５分間遠心した。パーコールを用いた密度勾配遠心（１８００ｒｐｍで２５分間遠心）により、４４％と７０％パーコールの境界に集積したＩＥＬを採取した。ＩＥＬの生存ＣＤ３+Ｔ細胞は、＞９０％であった。得られたＩＥＬのＴＣＲサブセット構成を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で個体別に解析した。αβ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群における発現率、およびγδ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群における発現率を図１に示す。また、ＮＴ(−)群におけるαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの発現比、およびＮＴ(＋)群におけるαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの発現比を図２に示す。αβ-ＩＥＬの発現率（％）は、ＮＴ(＋)群がＮＴ(−)群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に低くなり、γδ-ＩＥＬの発現率は、ＮＴ(＋)群がＮＴ(−)群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に高くなった（図１）。ＮＴ(＋)群のαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの発現比は、ＮＴ(−)群のαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの発現比よりも有意（ｐ＜０．０５）に低下した（図２）。以上の結果、核酸の経口摂取は、αβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのバランスを、γδ-ＩＥＬ優位に誘導することが明らかとなった。
【００６５】［試験例２］ＩＥＬのＣＤ４、ＣＤ８サブセット発現に及ぼす影響αβ-ＩＥＬは、ＣＤ８αα+、ＣＤ８αβ+、ＣＤ４+、およびＣＤ４+ＣＤ８αα+の４つのサブセットに分類されるのに対し、γδ-ＩＥＬは、ほとんどがＣＤ８αα+で残りがＣＤ４-ＣＤ８-ある（表１参照）。試験例１の、αβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのＣＤ４とＣＤ８の発現率を、ＦＡＣＳで個体別に解析した（図３）。結果、αβ-ＩＥＬにおいては、ＮＴ(＋)群のＣＤ８αα+の発現比率がＮＴ(−)群のそれよりも有意に低下し、逆にγδ-ＩＥＬにおいては、ＮＴ(＋)群のＣＤ８αα+の発現比率がＮＴ(−)群のそれよりも有意に高くなった。一方、αβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αβ+の発現比率とγδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αβ+の発現比率には差は認められなかった（データは示さない）。また、ＣＤ４+、ＣＤ４+ＣＤ８+、およびＣＤ４-ＣＤ８-の発現比率は、ＮＴ(＋)群とＮＴ(−)群で変わらなかった。γδ-ＩＥＬＣＤ４-ＣＤ８-は、ＮＴ(＋)群で僅かに増加したが有意差はなかった（データは示さない）。
【００６６】これらの結果は、核酸の経口摂取による、γδ-ＩＥＬサブセットの優位な誘導が、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα+の有意(ｐ＜０.０５)な上昇およびαβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα+の有意（ｐ＜０.０５）な低下、と相関していることを示している。
【００６７】［試験例３］ＩＥＬのＴＣＲサブセット発現に及ぼす影響卵白アルブミン（ＯＶＡ）特異的ＴＣＲを発現するＴＣＲトランスジェニックマウス（ＯＶＡＴＣＲ-Ｔｇマウス）（ＯＶＡ２３-３；Sato, T. et al.: Eur.J. Immun., 24: 1512-1516, 1994）を用いた。
【００６８】３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスは、ＮＴ(−)群(ｎ=１０)、およびＮＴ(＋)群(ｎ=７)の２群に分けた。ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を４週間自由摂取させた。この期間中、２％ＯＶＡを含む水を自由摂取させた。その後、ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスは殺し、腸を摘出し、試験例１と同様にＩＥＬを調製した。
【００６９】ＩＥＬのＴＣＲサブセットの発現比率（％）、およびαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのＣＤ４とＣＤ８サブセットの発現比率を、ＦＡＣＳで個体別に解析した。αβ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群における発現率、およびγδ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群における発現率を図４に示す。また、αβ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群におけるＣＤ８αα+サブセット発現比率、およびγδ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群におけるＣＤ８αα+サブセット発現比率、を図５に示す。
【００７０】図５にＮＴ(−)群のαβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα+サブセット発現比率、γδ-ＩＥＬにおけるそれらの発現比率をそれぞれ示す。抗原を摂取したＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスの場合、ＩＥＬにおけるαβ-ＩＥＬサブセットの発現比率が、通常のＢＡＬＢ／ｃマウスに比較して、図１と図４に示すように、ＮＴ(−)群においては約４８％から約８３％、ＮＴ(＋)群においては約４０％から約７７％と顕著に増加した。しかし、ＮＴ(＋)群におけるγδ-ＩＥＬの発現比率はＮＴ(−)群におけるそれに比較して有意に高く（図４）、これは、ＮＴ(＋)群のγδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα+の発現比率が、ＮＴ(−)群におけるそれに比較して有意に高い（図５）ことと相関している。
【００７１】［試験例４］ＩＥＬにおける抗原特異的サイトカイン産生に及ぼす影響試験例３におけるＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスから得たＩＥＬは、１０％非働化ＦＣＳ、ペニシリン１００Ｕ/ｍｌ、ストレプトマイシン１００μg/ｍｌ、メルカプトエタノール５×１０-5Ｍ、および２ｍＭ Ｌ-グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Nissui, Pharmaceutical Co., Tokyo）に、５.０×１０5細胞/１.０ｍｌ浮遊させ、９６ウエルプレートに、それぞれ、０.２ｍｌ/ウエルまいた（duplicate）。
【００７２】一方、抗原提示細胞として用いる脾細胞は、以下のように調製した。未感作のＢＡＬＢ/ｃマウスから脾臓を無菌的に摘出し、細かくきざんだ。細胞（１×１０8細胞）は、５０μg/ｍｌのマイトマイシンＣ（SIGMA, St. Louis, MO, U.S.A）を含む１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地培養液中で、３７℃、４５分間インキュベートした。細胞は、0.８３％ＮＨ4Ｃｌ溶液に浮遊させ、赤血球を溶解除去した。つぎに、細胞浮遊液は、ステンレススチールのメッシュに通し、均一の細胞浮遊液を得た。細胞は、ＲＰＭＩ-１６４０培地で２回洗浄した。マイトマイシンＣ処理した脾細胞（５×１０5細胞）とＴ細胞とを、５０μＭ濃度のＯＶＡ（Seikagaku Co.）の存在下、あるいは非存在下、５％ＣＯ2/９５％ａｉｒの湿潤条件下で、３７℃２日間培養した。培養後、培養上清は、遠心して集め、−２５℃で貯蔵した。上清中のＩＦＮ-γ、およびＩＬ-２レベルをＥＬＩＳＡ法で測定した。ＩＦＮ-γについて図６に、ＩＬ-２について図７に示す。ＯＶＡ特異的ＩＦＮ-γの産生増強が、ＮＴ(−)群と比較して、有意な差はないがＮＴ(＋)群で観察された。ＮＴ(＋)群におけるＯＶＡ特異的ＩＬ-２産生は、ＮＴ(−)群よりも有意（ｐ＜０.０５）に高かった。
【００７３】［試験例５］腸管上皮細胞のＩＬ-７産生に及ぼす影響３週齢のＢＡＬＢ/ｃマウスにＮＴ(−)(ｎ＝８)とＮＴ(＋)(ｎ＝９)をそれぞれ２週間自由摂取させた。その後、小腸を摘出し小腸上皮細胞を調製した。小腸上皮細胞の培養は、Perreaultらの方法（Perreaul, N. and Beaulieu, J. F. :Exp. Cell. Res., 245: 34-42, 1998）にしたがった。小腸を縦に開き、ＰＢＳで洗浄し、４つのセグメントにカットした。これらのセグメントは、１０ｍｌのice-cold MatriSperse(Collaborative BiomedicalProducts, Becton Dickinson Lab.)を含む１５-ｍｌチューブに移した。小腸は、４℃で８〜１０時間攪拌なしでインキュベートした。つぎに、各チューブは、穏やかに振って上皮細胞を分離した。浮遊液は、ＰＢＳで２回洗浄（４℃、１２００ｒｐｍ、８分間）した。１０％ＦＣＳ、ペニシリン１００Ｕ/ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ/ｍｌ、メルカプトエタノール５×１０-5Ｍおよび２ｍｌ-グルタミンを添加した９６ウエルプレート中のＲＰＭＩ １６４０培地に浮遊させた。これらの上皮細胞は、５％ＣＯ2インキュベーターに入れ、３７℃で１６時間培養した。培養上清のＩＬ-７レベルは、Sharmaらの方法（Sharma, S. et al.: Gene Therapy., 4: 1361-1370, 1997）にしたがい、ＥＬＩＳＡ法で測定した（図８）。ＮＴ(＋)群において、小腸上皮細胞のＩＬ-７産生が、ＮＴ(−)群のそれに比較して有意（ｐ＜０.０１）に増強していることが認められる。すなわち、核酸の経口摂取は小腸上皮細胞のＩＬ-７産生を増強することが明らかとなった。
【００７４】［試験例６］核酸の経口摂取が腸管上皮細胞のＩＬ-７およびＴＧＦ-β産生に及ぼす影響３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ ＴｇマウスにＮＴ(−)とＮＴ(＋)をそれぞれ４週間自由摂取させた。実験期間中、２％ＯＶＡを添加した水を自由に摂取させた。その後、小腸を摘出し、４℃で８時間マトリスパーゼ中に静置した。静置後、軽く振とうし、腸管を除き、マトリスパーゼ中の小腸上皮細胞を２回洗浄した。洗浄後、小腸上皮細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ-1640培地またはＦＣＳを含まないＲＰＭＩ-1640培地で１６時間培養した。培養後、上清中のＩＬ-７およびＴＧＦ-βをＥＬＩＳＡで測定した。その結果、小腸上皮細胞のＩＬ-７産生は、ＮＴ(+)食群の方がＮＴ(-)食群に比べて有意（ｐ＜０.０１）に高くなった（図９）。また、小腸上皮細胞のＴＧＦ-β産生も、ＮＴ(+)食群の方がＮＴ(-)食群に比べて有意（ｐ＜０.０５）有意に高くなった（図１０）。
【００７５】［試験例７］抗原特異的ＩｇＡ抗体産生に及ぼす影響３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウス にＮＴ(−)（ｎ＝１８）とＮＴ(＋)（ｎ＝１６）を自由摂取させた。実験期間中、２％ＯＶＡを添加した水を自由に摂取させた。６、７、８週齢で糞便を採取し、ＯＶＡ特異的ＩｇＡ抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を図１１に示す。ＯＶＡ特異的ＩｇＡ抗体は、８週齢でＮＴ(＋)食群の方が有意に高くなった。したがって、核酸の経口摂取は、腸管免疫系の抗原特異的ＩｇＡの産生を増強することが明らかとなった。
【００７６】［試験例８］マクロファージの機能に及ぼす影響Whey Protein Isolate（ＷＰＩ）をタンパク源としたヌクレオチド無添加の食餌 (ＮＴ(-)食) および以下の割合で配合したヌクレオチドを０.４％添加した食餌 (ＮＴ(+)食) をそれぞれ１群６匹でＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに３週齢から自由摂取させた。なお、このとき２％ＯＶＡ水溶液を自由摂取させた。チオグリコレートを腹腔投与し、投与後４日後（７週齢）に腹腔マクロファージを採取した。このマクロファージをＬＰＳ（0.1μg/mlおよび1μg/ml）刺激下で２日間培養し、その上清のＩＬ-１２活性をBioassay法で測定した。マウスＩＬ-１２のbioassayは、Skeenら (Skeen, M.J.ら, J Immunol 156:1196 - 1206, 1996) の方法で行った。すなわち、９６ウェルプレートに10μg/mlの抗ＩＬ-１２p40抗体をコーティングした。ウェルを洗浄し、様々な濃度のリコンビナントＩＬ-１２ (rＩＬ-１２) 、脾臓またはマクロファージの培養上清をウェルに加え、プレートを一晩インキュベートした。正常マウスの脾臓細胞を、CO2インキュベーター中で37℃２日間の培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ-γ濃度をELISAで測定した。既知のrＩＬ-１２濃度とＩＦＮ-γ濃度との検量線から上清中のＩＬ-１２濃度を外挿した。コーティングした抗体に、ＩＬ-１２p40とp70が結合するが、ＩＬ-１２p70だけがＩＦＮ-γ産生を誘導できる。その結果、ＬＰＳ濃度が0.1μg/mlでも1μg/mlいずれでも、ＩＬ-１２活性については、ＮＴ(+)食群の方が、ＮＴ(-)食群より有意に高くなった (図１２)。
【００７７】［試験例９］マクロファージの機能に及ぼす影響８週齢の雌性ＢＡＬＢ/cマウスにチオグリコレートを腹腔投与し、４日後（７週齢）、腹腔マクロファージを採取した。この腹腔マクロファージをヌクレオチド（０〜１０μg/ml）とともに１日間培養し、その上清中のＩＬ-１２活性をBioassay法で測定した。その結果、0.３２〜１０μg/mlのヌクレオチドを添加したときのＩＬ-１２活性は、ヌクレオチドを添加していない場合に比べて、有意差は見られないものの高くなる傾向が見られた(図１３)。
【００７８】［試験例１０］脾細胞におけるサイトカイン産生に及ぼす影響Whey Protein Isolateをタンパク源としたヌクレオチド無添加の食餌 (ＮＴ(-)食) および上記の割合で配合したヌクレオチドを０.４％添加した食餌 (ＮＴ(+)食) をそれぞれ3週齢のＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウス（１群６匹）に、２％ＯＶＡ水溶液とともに自由摂取させ、７週齢で脾臓細胞を採取した。この脾臓細胞をＯＶＡ（100μg/ml）刺激下で2日間培養し、その上清のＩＬ-１２活性をBioassay法で測定した。その結果、脾臓細胞のＩＬ-１２活性については、ＮＴ(+)食群の方が、NT(-)食群より有意に高くなった (図１４)。
【００７９】
【実施例】 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００８０】［実施例１］核酸関連物質として、下記の配合割合の核酸混合物を0.０１％の割合で市販の育児用調製粉乳（明治乳業 (株) 製）に配合した。
シチジン5' - 一リン酸 1.62g/kgグアノシン5' - 一リン酸 0.57g/kgイノシン5' - 一リン酸 1.10g/kgウリジン5'-一リン酸 0.71g/kg粉乳１gあたり、0.1mg、好ましくは0.01〜4mgを使用すればよい。また、一般に核酸関連物質の構成成分である塩基は、魚介類や肉などの食品に含まれているので安全である。したがって、上記範囲を越えて使用しても何ら差し支えはないし、予防ないし保健を目的とする場合は、上記範囲よりも少量使用してもよい。また、育児用粉乳以外の飲食品を調製する場合も、上記範囲を参考にしてヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 または塩基の使用量を定めればよい。
【００８１】［実施例２］アレルゲンとなるタンパク質を酵素分解した育児用調製粉乳（明治乳業 (株) 製; 調製粉乳A、調製粉乳B）に、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸(RNA、DNA) またはその構成成分である塩基の混合物0.01%を配合した。この場合、調製粉乳Aは乳清タンパク質を酵素分解し、調製粉乳Bはカゼインを酵素分解したものである。しかし、酵素分解するタンパク質に制限はないし、分解に用いる酵素にも制限はない。製品の配合組成は下記表1の通りである。なお、ヌクレオチドの配合割合は実施例1の通りである。なお、本発明による育児用粉乳を製造するにあたり、核酸関連物質の構成成分である塩基は、上記の使用量を１例として使用することができるが、本発明においては、粉乳1gあたり、0.1mg、好ましくは0.01〜4mgを使用すればよい。また、上記範囲を越えて使用しても何ら差し支えはないし、予防ないし保健を目的とする場合は、上記範囲よりも少量使用してもよい。
【００８２】［実施例３］ビタミンC40gまたはビタミンCとクエン酸の等量混合物40g、グラニュー糖100g、コーンスターチと乳糖の等量混合物60gに、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基を40g加えて十分に混合した。混合物を袋に詰め、1袋1.5gのスティック状栄養健康食品を100袋製造した。
【００８３】［実施例４］次の配合によりTCRγδ陽性Ｔ細胞とTCRαβ陽性Ｔ細胞の比率を高める製剤を製造した。(1)ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基50g、(2)ラクトース90g、(3)コーンスターチ29g、(4)ステアリン酸マグネシウム1g。先ず、(1)、(2)、(3) (但し17g) を混合し、(3) (但し7g) から調製したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒に (3) (但し5g) と (4) を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、1錠あたりヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基を10mg含有する錠剤100個を製造した。投与量は、患者の症状、年齢によっても異なるが、0.1〜1500mg/kg/dayで1日1〜4回投与する。本発明において用いるヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)、塩基は、本来食品由来のものであり、既述のように安全性にはほとんど問題はなく、したがって、上記容量を越えて、投与しても差し支えはない。また、健康の維持増進、保健栄養剤等としてこれを利用する場合は、上記容量より少ない量を長期間にわたって服用すればよい。また、既述のように本発明による錠剤は、経口投与以外の方法でも投与することができるが、静脈投与および筋肉投与の場合は0.01〜1200mg/kg/dayである。
【００８４】［実施例５］次の配合を用意した。(1)ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基 1g、(2)塩化ナトリウム 8g、(3)クロロブタノール 4g、(4)炭酸水素ナトリウム 1g。全成分を蒸留水1000mlに溶解し、これを500mlの点滴ビン2本に分注し、TCRγδ陽性Ｔ細胞とTCRαβ陽性Ｔ細胞の比率を高め、IgA抗体の産生を促進する製剤を製造した。
【００８５】［実施例６］次の配合を用意した。(1)ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基 0.5g、(2)殺菌乳 1l 。(1)を(2)に無菌的に混合し、ビン詰めした。本発明においては、殺菌乳 1l あたり、(1)を 0.01〜10gを混合すればよい。
【００８６】［実施例７］実施例1の配合割合のヌクレオチドを有効成分として用い、下記に示す組成にて皮膚外用剤を調製した。処方例の配合中、「適量」とは、全体で100％重量になる量を意味する。
【００８７】
処方例１ クリーム（１）
Ａ （重量％） モノステアリン酸 ポリエチレングリコール（40.E.O) ２.０ 自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５.０ ステアリン酸 ５.０ ベヘニルアルコール １.０ 流動パラフィン １０.０ トリオクタン酸グリセリル 1 ０.０ ビタミンE ０.１ ヌクレオチド １.０Ｂ グリセリン ５.０ エチルパラベン ０.１ 精製水 適量Ａに属する成分を加熱溶解する。別に、Ｂに属する成分を加熱溶解する。ＡにＢを添加して撹拌、乳化後、冷却してクリームを製造した。
【００８８】
処方例２ クリーム（２）
Ａ （重量％）
モノステアリン酸 ポリエチレングリコール（40.E.O） ２.０ 自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５.０ ステアリン酸 ５.０ ベヘニルアルコール １.０ 流動パラフィン １０.０ トリオクタン酸グリセリル １０.０ ビタミンE ０.２ ヌクレオチド ０.５Ｂ グリセリン ５.０ エチルパラベン ０.１ 精製水 適量Ａに属する成分を加熱溶解する。別に、Ｂに属する成分を加熱溶解する。ＡにＢを添加して撹拌、乳化後、冷却してクリームを製造した。
【００８９】
処方例３ 乳液Ａ （重量％）
モノステアリン酸 ポリオキシエチレンソルビタン（20.E.O） １.０ モノステアリン酸 ポリオキシエチレンソルビタン（60.E.O） ０.５ 親油型モノステアリン酸グリセリン １.０ ステアリン酸 ０.５ ベヘニルアルコール ０.５ アボガド油 ４.０ トリオクタン酸グリセリル ４.０ ヌクレオチド ５.０Ｂ １, ３ - ブチレングリコール ５.０ エチルパラベン ０.１ 精製水 適量Ａに属する成分を加熱溶解する。別に、Ｂに属する成分を加熱溶解する。ＡにＢを添加して撹拌、乳化後、冷却して乳液を製造した。
【００９０】
処方例４ 化粧水Ａ （重量％）
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60.E.O） ８.０ エタノール １５.０ ヌクレオチド ０.１ エチルパラベン ０.１ クエン酸 ０.１ クエン酸ナトリウム ０.３ １, ３ - ブチレングリコール ４.０ エデト酸二ナトリウム ０.０１ 精製水 適量上記の各成分を混合、均一に撹拌、溶解し、化粧水を製造した。
【００９１】
処方例５ 親水性軟膏Ａ （重量％）
ポリオキシエチレンセチルエーテル ２.０ グリセリンモノステアレート １０.０ 流動パラフィン １０.０ ワセリン ４.０ セタノール ５.０ ヌクレオチド ３.０Ｂ プロピレングリコール １０.０ メチルパラベン ０.１ 精製水 適量Ａに属する成分を加熱溶解する。別に、Ｂに属する成分を加熱溶解する。ＡにＢを添加して撹拌、乳化後、冷却して親水性軟膏を製造した。本発明においては、実施例1の配合割合のヌクレオチドだけでなく、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基いずれを用いてもよい。また、上記範囲を越えて使用しても何ら差し支えはないし、上記範囲よりも少量使用してもよい。好ましくは、皮膚外用剤1gあたり、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基を0.1〜100mg使用すればよい。
【００９２】
【発明の効果】核酸組成物の経口摂取により、ＩＥＬにおけるαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのサブセット構成比がγδ-ＩＥＬが高められる方向にシフトすることが明らかにされた。さらに、核酸組成物の経口摂取により、腸管上皮におけるサイトカイン（ＩＬ-２、ＩＬ-７、ＩＦＮ-γ、ＴＧＦ-βなど）の産生が亢進することが明らかにされた。さらに、腸管における抗原特異的分泌型ＩｇＡ抗体の産生が亢進することが明らかにされた。これらの結果、有効量の核酸の経口摂取により、腸管免疫系に抗原特異的な分泌型ＩｇＡ抗体産生を促進して、有害な病原体などに対する防御能を高め、一方、抗原特異的な経口免疫寛容を効果的に誘導し、さらに、Ｔｈ１/Ｔｈ２細胞のバランスの破綻を改善し、結果、腸管免疫系、あるいは全身免疫系を賦活化することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ３週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスに、ヌクレオチド非添加食餌［ＮＴ(−)］、あるいはヌクレオチド添加食餌［ＮＴ(＋)］を、２週間自由摂取させた後の、ＮＴ(−)群におけるＴＣＲαβ+ＩＥＬとＴＣＲγδ+Ｔ細胞との構成比率（％）、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲγδ+Ｔ細胞とＴＣＲγδ+Ｔ細胞との構成比率（％）、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;ｐ＜０.０５）。
【図２】 同上の、ＮＴ(−)群におけるＩＥＬのＴＣＲαβ+Ｔ細胞とＴＣＲγδ+ＩＥＬとの比、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲαβ+Ｔ細胞とＴＣＲγδ+Ｔ細胞との比、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;*ｐ＜０.０５）。
【図３】 同上のＩＥＬのＣＤ４分子およびＣＤ８分子の発現パターンのうち、ＮＴ(−)群におけるＴＣＲαβ+ＣＤ８αα+Ｔ細胞とＴＣＲγδ+ＣＤ８αα+ＩＥＬの構成比率（％）、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲαβ+ＣＤ８αα+Ｔ細胞とＴＣＲγδ+ＣＤ８αα+Ｔ細胞との構成比率（％）、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;*ｐ＜０.０５）
【図４】 ３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡ添加した水とともに、４週間自由摂取させた後のＮＴ(−)群におけるＴＣＲαβ+Ｔ細胞とＴＣＲγδ+Ｔ細胞との構成比率（％）、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲαβ+Ｔ細胞とＴＣＲγδ+Ｔ細胞との構成比率（％）、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;ｐ＜０.０５）。
【図５】 同上のＩＥＬのＣＤ４分子、およびＣＤ８分子の発現パターンのうち、ＮＴ(−)群におけるＴＣＲαβ+ＣＤ８αα+Ｔ細胞とＴＣＲγδ+ＣＤ８αα+Ｔ細胞の構成比率（％）、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲαβ+ＣＤ８αα+Ｔ細胞とＴＣＲγδ+ＣＤ８αα+Ｔ細胞の構成比率（％）、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;*ｐ＜０.０５）
【図６】 ３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡを添加した水とともに、４週間自由摂取させた後のＮＴ(−)群におけるＩＥＬのインターフェロン-γ（ＩＦＮ-γ）産生、あるいはＮＴ(＋)群におけるＩＦＮ-γ産生をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ）。
【図７】 同上のＮＴ(−)群におけるＩＥＬのインターロイキン２（ＩＬ-２）産生、あるいはＮＴ(＋)群におけるＩＬ-２産生をそれぞれ示す。（平均値±ＳＥ;ｐ＜０.０５）。
【図８】 ３週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を２週間自由摂取させた後のＮＴ(−)群における小腸上皮細胞のインターロイキン７（ＩＬ-７）産生、あるいはＮＴ(＋)群における小腸上皮細胞のインターロイキン７（ＩＬ-７）産生をそれぞれ示す。（平均値±ＳＥ;ｐ＜０.０１）。
【図９】 経口摂取されたヌクレオチドが、OVA-TCR Tgマウス (n=10) の小腸上皮細胞のＩＬ-７産生に与える影響（**; p <０.０１）を示す。(平均値±ＳＤ)
【図１０】 経口摂取されたヌクレオチドがＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウス(n=4) のＩＥＬのＴＧＦ-β産生に与える影響（*; p <０.０５）を示す。(平均値±ＳＤ)
【図１１】 ３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡ添加した水とともに、自由摂取させ、６、７、および８週齢で、糞中のＯＶＡ特異的なＩｇＡ抗体量を測定した結果を示す（平均値±ＳＥ;p＜０.０５）
【図１２】 ３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡ添加した水とともに４週間自由摂取させ後（７週齢）の腹腔マクロファージのＩＬ-１２産生を示す（平均値±ＳＥ;p＜０.０５）。
【図１３】 ヌクレオチド存在下で培養した８週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスの腹腔マクロファージのＩＬ-１２産生を示す（平均値±ＳＥ）。
【図１４】３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡ添加した水とともに４週間自由摂取させ後（７週齢）の脾細胞のＩＬ-１２産生を示す（平均値±ＳＥ;p＜０.０５）。