【手続補正書】
【提出日】平成20年4月4日(2008.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】    ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスによる感染に対する薬品の生産における、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達連鎖に対して連鎖阻害剤として作用する物質の応用
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本発明において連鎖阻害剤として作用することを特徴とする物質、特にＭＥＫ阻害剤、特にブタジエン派生物、フラビン派生物、またはベンズアミド派生物の化学物質分類に含まれる物質を起源とするもの。
【請求項２】
本発明における連鎖阻害剤の応用、特にブタジエン派生物、またはフラビン派生物、またはベンズアミド派生物の化学物質分類に含まれる物質、特にＭＥＫ阻害剤、特に次のもの、
ａ）  ２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−（１）ベンゾピラン，１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１
ｂ）  ４−ビス[２−アミノフェニルチオ]ブタジエン
ｃ）  ２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピル−メトキシ−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド
ｄ）  ２−（２'−アミノ−３'−メトキシフェニル）−oxanaphthalene−４−on
ｅ）  連鎖阻害剤として、特にＭＥＫ阻害剤として作用する、全ての前段階の物質、塩、プロドラッグ、上記の物質の派生物もしくは混成物、
で、人間または動物においてＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスによる感染の予防と治療のための薬品の製造のために使われるもの。
【請求項３】
請求項２に係る、負鎖ＲＮＡウイルスによる感染に対する治療のための応用。
【請求項４】
請求項２に係る、核内で複製を行う負鎖ウイルスによる感染に対する治療のための応用。
【請求項５】
請求項２に係る、インフルエンザおよびボルナウイルスによる感染に対する治療のための応用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核内で複製する負鎖ウイルス、特にインフルエンザＡウイルスおよびボルナ病ウイルス（ＢＶＤ）の感染がＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ連鎖を引き起こすこと、そして驚くべきことにこの連鎖の阻害、特にＭＥＫ阻害剤による阻害が、毒性の影響を細胞に及ぼさずに、このウイルスグループの複製を著しく阻害することに対する、そもそもの観察を基にしている。
【０００２】
ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルスに対する改良された治療法は、これらウイルスがＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ連鎖作用に依拠し増殖するため、このシグナル伝達経路に対するものが好ましい。このシグナル伝達経路を毒性のない薬理学的な阻害剤の適用によってさえぎることがすでに発明されている。本発明における、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫのシグナル伝達経路に対するこの毒性をもたない薬理学的な阻害剤とは、連鎖を阻害するもの、特にＭＥＫを阻害するものである。
【０００３】
（従来の技術）
ウイルス感染は人間にとっても、動物にとっても健康上の重大なリスクである。特に、インフルエンザＡウイルスによる感染は未だに人間に対する大きな疫病であり、多数の死者のみならず、例えば、病気による欠勤などにより、経済上の大きな損害要因でもある（文献１２）。
【０００４】
同様の経済上の重要性をもつものとしてボルナ病ウイルス（ＢＶＤ）があるが、これは人間からは隔離されており、神経性の病気と関連しているが、特に馬や羊に感染する（文献３  文献１３）。
【０００５】
ＲＮＡウイルス抑制の問題点としてウイルス性ポリメラーゼの高い誤差値により引き起こされるウイルスの適応能力があり、故に適したワクチンと抗ウイルス物の開発が非常に困難である。
ウイルスの活動に対して抗ウイルス物質をただちに投じるというやり方は、変異後の耐性変種による淘汰へとすぐさま帰着する。これに関する例として、膜貫通型の蛋白質に対する抗インフルエンザ因子であるアマンタジンとその派生物が挙げられるが、これらは時を経ずして新しい型の耐性変種を生み出した。インフルエンザ・ウイルスの表面であるノイラミニダーゼ蛋白質を阻害する新しい抗インフルエンザ治療因子は、ドイツのグラクソ・ヴェルカム社のレランザという商標で売られているが、すでに患者の体内には変種が発生している（文献１０）。故に、この治療因子に対する期待は、実現されているとは言えない。
【０００６】
多くの場合小さいゲノムしか有さず、故に複製のための必要な機能に対して不十分なコード容量しかもたないため、全てのウイルスは、大体の場合において宿主細胞の機能に依拠しなければならない。ウイルスの複製のために必要な細胞の機能に対して影響を与えることにより、感染された細胞においてウイルスの複製に都合のよい影響を与えることができる。ウイルスは適応化によって細胞の失われた機能を補うことはできない。この場合においては、変異によって淘汰圧から逃れる術はない。このことは、例えば、細胞のキナーゼとメチルトランスフェラーゼに対して比較的特定されにくい阻害物質を持つインフルエンザＡウイルスの例においてすでに見て取ることができる（文献１８）。
【０００７】
これらの阻害物質に関する欠点は、これらが比較的特定されにくく幅広い効力をもち、細胞において阻害がおきる箇所は曖昧にしか規定できないということにある。これらは故に治療因子として適当でない。問題は次の通りである。今日まで、細胞内の酵素における阻害物質は、細胞に対して毒性にはならずに特定の効果を持つことも、ウイルスの複製、特にボルナウイルスまたはインフルエンザＡウイルスといったＲＮＡウイルスの複製を阻害することもできなかった。
【０００８】
ウイルス感染の後、細胞におきる過程に関連して、多数のＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが、感染している細胞の中で、特定の一つの形質導入経路を活性化させることが発見されたが、これがいわゆるＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼ連鎖である（文献２  文献４  文献１４  文献１７）。
このキナーゼ連鎖は細胞内の最も重要なシグナル伝達経路に属し、増殖および分化過程の根幹的な役割を果たす。
【０００９】
成長要因によって引き起こされるシグナル伝達は連続しておきるリン酸化によってセリン／テオリンキナーゼＲａｆから２つの特定されたキナーゼＭＥＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ／ＥＲＫキナーゼ）へ、そしてキナーゼＥＲＫ（細胞外において、シグナルによって制御されているキナーゼ）へと移行する。Ｒａｆのキナーゼ基質として、ＭＥＫしか知られておらず、またＭＥＫの基質としてしか、ＥＲＫのイソ型が認識されていないが、ＥＲＫは多くの基質をリン酸化する。例えば、細胞の遺伝子発現の直接的な変化へと帰着する転写調整因子のリン酸化もこのようなケースの一つである（文献５  文献１５  文献２０）。
【００１０】
細胞の決定過程におけるこのシグナル伝達経路に関する調査は、幾つかの薬理学的な阻害剤の識別へと帰着したが、これらの阻害剤は、色々な段階のなかで、いわゆる隘路であるＭＥＫの段階でシグナル伝達経路を阻害する。
【００１１】
ＭＥＫ阻害剤  ＰＤ９８０５９  ２−（２’−アミノ−３'−メトキシフェニル）−oxanaphthalene−４−on（文献７）はＭＥＫの活性化をキナーゼＲａｆで阻害する。
ＭＥＫ阻害剤  Ｕ０１２６  （１、４−ジアミノ−２、３−ジシアノ−１、４−ビス[２−アミノフェニルチオ]ブタジエン）はＡＰ−１に依拠する遺伝子発現の活性化（文献９）及びＴ細胞の増殖を部分的に阻害する物質として説明されている（文献６）。
ＰＤ９８０５９と比較して、Ｕ０１２６はＭＥＫの活性化のみならず、キナーゼの活動そのものも阻害する。
【００１２】
最後に、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ１８４３５２は、（２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピル−メトキシ−３、４−ジフルオロ−ベンズアミド）（文献１９）と描写されているが、実験対象のネズミに経口投与したところ、体重（Ｋｇ）×６ｇ／Ｋｇまでは特にこれといった毒性の反応を示さず、大腸癌の成長を阻害した。
【００１３】
（発明の目的）
本発明は、核内で複製を行う負鎖ウイルスに対する予防もしくは治療への応用のための物質を提供することにあり、そのような物質はただちにウイルスの作用に対して適用されるのではなく、細胞内の酵素を選択的に阻害し、このような選択された効力を介することによってウイルスのウイルス性複製を阻害する。
驚くべきことに、この目的は、本発明による連鎖阻害剤、または特に請求項１にあるようにＭＥＫ阻害剤を含む薬品によって達成できる。
【００１４】
本発明によれば連鎖阻害剤、特にＭＥＫ阻害剤は「Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤のための連鎖測定法」においてＩｎ  Ｖｉｔｒｏ状態でシグナル伝達連鎖を阻害し、「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ測定法」においてＩｎ  Ｖｉｖｏでシグナル伝達連鎖を阻害することに特徴づけられる物質である。
【００１５】
（Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤のための連鎖測定法）
この連鎖測定法では、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫにおける阻害剤の効力は、ミエリン基蛋白質（ＭＢＰ）内の放射性物質３２Ｐのキナーゼを介した統合によって、ＥＲＫ（ｈｉｓ−ＥＲＫ）の６Xヒスチジン融合蛋白質とＭＥＫ（ＧＳＴ−ＭＥＫ）のグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼがある中で測定される。
【００１６】
反応混合溶液は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣ１２、１ｍＭのＥＧＴＡそして５０ｍＭ  ３２Ｐ−ｇａｍｍａ−ＡＴＰからなる緩衝溶液の中の組み替え蛋白質を含み、合計１００μｌの容積をもつ。反応は摂氏３０度で１５分間を要し、２０μｌのラエムリ緩衝溶液で止められる。放射性物質の影響を受けた蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分けられ、ホスフォイメージャーによって見ることができる。この試薬内での連鎖阻害剤の阻害能力は５−２０μＭの中で測定される。
【００１７】
この試薬内において、構成物をＭＥＫ阻害剤か、ＥＲＫ阻害剤かに分別するためには、物質はＧＳＴ−ＭＥＫがない上記の反応状況で、ＭＢＰとｈｉｓ−ＥＲＫを利用した第二実験方法で測定される。構成物が第一方法で効果を示し、第二方法で効果を示さなかった場合、これはＭＥＫ阻害剤である。構成物が第二方法で効果を示し、第一方法で効果を示さなかった場合、これはＥＲＫ阻害剤である。両方の方法で効果を示さなかったが、次に挙げるＩｎ  Ｖｉｖｏ  ＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ測定法で効果を示す場合、これはＲａｆ阻害剤である。ここで説明された阻害剤は、本発明によれば、全て連鎖阻害剤である。
【００１８】
（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ測定法）
細胞が１０ｃｍの細胞培養皿に植え付けられ、１０％の牛の胎児の血清とともに、皿の８０％にまで培養される。血清は８時間から１２時間の間、細胞から取り除かれる。そして、１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＡまたは１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦといったマイトジェンによる刺激を加える３０分前に、連鎖阻害剤、特にＭＥＫ阻害剤を加える。
マイトジェンによる刺激を与えた状態での１０分間の培養した後、細胞をＰＢＳで洗い、三重陽子溶解緩衝溶液に溶解する。（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４、５０  ｍＭ  Ｎａ−β−グリセロールリン酸塩、２０ｍＭ  Ｎａ  ピロリン酸塩、１３７  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン、１％（ｖ／ｖ）  三重陽子Ｘ１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１ｍＭ  Ｎａ−バナジウム塩酸、５ｍＭ  ベンズアミジン、５μｇ／ｍｌ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、５μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）。
【００１９】
これらの細胞溶解物から、内因性ＭＥＫがＭＥＫ特定抗血清が免疫沈降によって得られ、１０ｍＭ  ＭＧＣｌ２、２５  ｍＭ  β−グリセロールリン酸塩、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．５、５ｍＭ  ベンズアミジン、０．５ｍｌ  ＤＴＴそして１ｍＭ  Ｎａ  バナジウム塩酸の中で基質蛋白質として３２Ｐ−ガンマ−ＡＴＰ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、及びキナーゼ不活性ｈｉｓ−ＥＲＫ  Ｋ＞Ｍの組み替え体がある中で、摂氏３０度のなかで１５分間、免疫複合キナーゼ試薬の中で培養する。
【００２０】
同時に、同じ溶解物から特定ＥＲＫの抗血清を伴った免疫沈降された内因性のＥＲＫが得られ、ＭＥＫと同じ状況下で純化されたＭＢＰと共に培養される。蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離され、ホスフォイメージャーによって見ることができる。連鎖阻害剤、特にＭＥＫ阻害剤が、この試薬の中においては、ｈｉｓ−ＥＲＫ  Ｋ＞Ｍのリン酸化を測ることによりＭＥＫ活性化に対しても、また、ＭＢＰのリン酸化を測ることによりＥＲＫ活性化に対しても、阻害的な活動を行うことが分かる。
【００２１】
連鎖阻害剤、特にＭＥＫ阻害剤の本発明による応用、特に次の物質に関連する、
Ａ）  ２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−（１）ベンゾピラン（ＷＯ９８／３７８８１にも説明されている。）
Ｂ）  １，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス[２−アミノフェニルチオ]ブタジエン  （省略名称：Ｕ０１２６）
Ｃ）  ２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピル−メトキシ−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド）（省略した形の名称：ＰＤ１８４５３）
Ｄ）  ２−（２'−アミノ−３'−メトキシフェニル）−oxanaphthalene−４−on（省略した形の名称：PD９８０５９）
Ｅ）  本発明における連鎖阻害剤として作用することを特徴とし、特にブタジエン派生物、またはフラビン派生物、またはベンズアミド派生物の化学物質分類に含まれる物質、
Ｆ）  連鎖阻害剤、特にＭＥＫ連鎖阻害剤として作用する、上記に挙げた物質の派生物、
Ｇ）  さらに、連鎖阻害剤として作用し、特にＭＥＫ阻害剤（前段階の物質、もしくは塩、もしくは文献１１および文献１６における意味での「プロドラッグ」に属する上記された構成物またはその派生物で、それらの効果がＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の阻害剤の連鎖測定法もしくは「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ測定法」で証明されたもの。）
【００２２】
本発明は、ＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルス、特に例えばインフルエンザＡウイルス、ボルナ病ウイルスといった核内で複製する負鎖ＲＮＡウイルスに感染している患者に対する薬品としてのこれらの物質の応用に関連する。
【００２３】
本発明のもう一つの応用では、ＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスによる感染、特に例えばインフルエンザＡウイルス、ボルナ病ウイルスといった核内で複製する負鎖ＲＮＡウイルスを予防する薬品を構成するのにこれらの物質が使われることが推奨される。
【００２４】
「患者」という言葉は、人間と動物の両方に係る。故に、これらの薬品は人間と動物に対して適用されうる。本発明が示す治療に効果的な物質は、患者に投与されるが、それは薬学上許容される構成が、経口投与、直腸注入、静脈注射、筋内もしくは皮下投与、くも膜下槽投与、膣投与、腹膜投与、血管内投与、局所における利用（粉末状、軟膏状、もしくは液状）もしくは霧状で利用される。
【００２５】
薬学上許容される構成は、塩、エステル、アミド、そして「プロドラッグ」を含み、信頼性のある医学上の評価の結果、過剰の毒性や患者に炎症やアレルギー反応が生じない範囲のものである。
「プロドラッグ」という言葉は、より良い受容性のために、例えば血液内における加水分解といった変更を加えられた構成に関連する。詳しい議論は文献１１および文献１６に記載されている。
【００２６】
本発明の構成物の局部に対する投与方法は、軟膏、粉末、霧、もしくは吸入の各方法を含む。活性化した成分は安定した状況で、肉体にとって許容される担体、必要に応じて保存剤、緩衝剤、または使用促進物と混ぜられる。
【００２７】
（使用例）
例１のＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６においては、細胞の培養基において阻害剤Ｕ０１２６の濃度を上げていった場合、新しく出来上がった感染性のインフルエンザＡウイルス粒子が著しく減少した。
【００２８】
インフルエンザＡウイルスの増殖において許容性の真核細胞培養基（マディーン−ダービー  イヌ肝臓（ＭＤＣＫ）細胞）は、同じ細胞数をもつ生理的食塩水を伴う並列方法で洗われ、同量の感染性インフルエンザＡウイルスの株ＷＳＮ−ＨＫ（インフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３の７遺伝子分とインフルエンザウイルス株Ａ／ＨＫ／８／６８のＮＡ遺伝子をもつ再集合子）により、１細胞において０．００２５感染ウイルスという比率で、常温で感染させた。
【００２９】
感染の３０分前にはＭＤＣＫ細胞は、異なった濃度のＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６に反応しつつ、適当な細胞培養基からなる媒体において、摂氏３７度と５％の二酸化炭素の中で培養させられる（ＤＳＭＯの中に溶解された０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ）。基準溶媒として、ＭＤＣＫ細胞は対応する様々な量のＤＭＳＯが加えられた細胞培養基からなる媒体において培養する。感染させている間に、溶媒としてのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６またはＤＭＳＯが、対応する濃度の溶液なかの接種材料に加えられる。
【００３０】
そして、接種材料が取り除かれ、感染された細胞は、適当な細胞培養基からなる媒体において、異なった濃度のＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６に反応しつつ、４８時間の間、摂氏３７度と５％の二酸化炭素の中で培養された（ＤＳＭＯの中に溶解された０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ）。基準溶媒として、ＭＤＣＫ細胞は対応する様々な量のＤＭＳＯが加えられた細胞培養基からなる媒体において培養する。
【００３１】
感染から２４時間後、媒体である上澄みが２００μｌ取り除かれ、同量の阻害剤またはＤＭＳＯを含んだ細胞培養基からなる媒体がもう一度、媒体である上澄みに加えられる。４８時間後、もう一度、サンプルが取られる。２４時間後と４８時間後に取られたサンプルである細胞培養基の上澄みが、従来のウイルス学方法で、ウイルス粒子の総生産量を表す赤血球凝縮価（ＨＡ  Ｔｉｔｅｒ）の量および新しく作り出されたウイルス粒子の量が測定される（ＭＤＣＫ細胞に対するプラーク測定法）。
【００３２】
その結果、この実験方法から、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６濃度の増加を伴う実験例では、細胞培養基からなる媒体において、新しく作り出された感染性のウイルス粒子が、ＭＥＫ阻害剤を伴わない基準例もしくは様々な基準溶媒と比較して著しく減ったこと（おおよそ５０μＭのＵ０１２６に対して８０％）が確認された。肉眼検査およびプロピジウムアイオダイドによる染色を利用した細胞毒性検査では、対応した濃度のＤＭＳＯまたはＤＭＳＯに溶解されたＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６を与えられたＭＤＣＫ細胞に関して、溶媒も阻害剤も細胞に対して重大な毒性の影響を与えていないことが示された。
【００３３】
例２では、細胞培養基からなる媒体において、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６はＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の濃度を上げると、新しく作り出された感染性のボルナ病ウイルス粒子が著しく減少することが示されている。
【００３４】
前もって阻害剤を与えられた細胞にＢＤＶを感染させ、感染の拡がりをウイルス性の核蛋白質に対比させた間接的な免疫蛍光剤で観察する。２５μＭのＭＥＫ阻害剤（Ｕ０１２６）を一度のみ与えると、７日間の培養期間後、ウイルスの病巣はなく、個々の感染されている細胞しか発見されない。１２．５μＭのキナーゼ阻害剤（Ｕ０１２６）を一度与えると、効果は明らかではなくなる。６μＭのキナーゼ阻害剤（Ｕ０１２６）を一度与えると、治療を施していない基準細胞と比べ、ウイルスの病巣に関する相違はなくなる。故に阻害剤は、ウイルスの複製の段階に対して、投与量に依存する形で作用する。
【００３５】
上記の応用に示されたＭＥＫ阻害剤（Ｕ０１２６）の阻害効果においては、連鎖阻害剤、特にＭＥＫ阻害剤は、抗ウイルス因子として、特にインフルエンザウイルスとボルナウイルスに対して使うことができるが、ウイルスの増殖がＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ連鎖へ依存するＲＮＡウイルスやＤＮＡウイルスに対しても使うことができる。シグナル伝達経路こそが、本発明によれば、抗ウイルス治療の目標であるし、毒性のない薬理学的な連鎖阻害剤、特にＭＥＫ阻害剤の応用対象として望ましい。
【００３６】
（文献）  
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