(57)【要約】  示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で１９４〜１９８℃に吸熱ピークを有するとともに、粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．５８、１４．７２、１６．８０、１７．８２、２１．０２及び２２．４６付近に主ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩結晶とすることにより、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、かつ、保存安定性に優れたアズレン系化合物の結晶が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩。
【請求項２】
示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で１９４〜１９８℃に吸熱ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩結晶。
【請求項３】
粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．５８、１４．７２、１６．８０、１７．８２、２１．０２及び２２．４６付近に主ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩結晶。
【請求項４】
示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で１９４〜１９８℃に吸熱ピークを有するとともに、粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．５８、１４．７２、１６．８０、１７．８２、２１．０２及び２２．４６付近に主ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩結晶。
【請求項５】
示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で７８℃付近にブロードな吸熱ピークと、１９５〜１９９℃に吸熱ピークとを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩水和物結晶。
【請求項６】
粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．６６、１７．０８、１７．６６、１９．０２、１９．５８及び２２．１４付近に主ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩水和物結晶。
【請求項７】
示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で７８℃付近にブロードな吸熱ピークと、１９５〜１９９℃に吸熱ピークとを有するとともに、粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．６６、１７．０８、１７．６６、１９．０２、１９．５８及び２２．１４付近に主ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩水和物結晶。
【請求項８】
請求項１に記載のコリン塩、請求項２〜４のいずれかに記載のコリン塩結晶又は、請求項５〜７のいずれかに記載のコリン塩水和物結晶を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項９】
さらに製薬学的に許容される担体を含有する請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
糖尿病治療剤である請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトール（以下、「アズレン系化合物Ａ」又は単に「化合物Ａ」ということがある）のコリン塩、コリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶に関する。さらに詳しくは、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れたアズレン系化合物Ａのコリン塩、コリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶、並びにこれらを有効成分として含有する、特に糖尿病治療剤として有用な医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者等は、下記化学構造式で示される、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトール（アズレン系化合物Ａ）が、医薬、特に、Ｎａ+−グルコース共輸送体阻害剤として、例えば、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）等の糖尿病の他、インスリン抵抗性疾患、及び肥満を含む各種糖尿病関連疾患の治療、並びにこれらの予防に有用な化合物であることを報告している（国際公開第２００４／０１３１１８号パンフレット（以下特許文献１と称する）：実施例７５参照）。【０００３】
【化１】
2007007628.tif 000002
【発明の開示】
【０００４】
上記特許文献１には、アズレン系化合物Ａのフリー体は記載されているものの、化合物Ａの塩については具体的には記載されていないため、まず、特許文献１に記載された化合物Ａのフリー体について鋭意研究した結果、２種類の水和物結晶、及び５種類の無水物結晶の存在が確認された。また、化合物Ａのフリー体の結晶形は多様であるとともに、原薬の製造工程において目的とする単一の結晶を再現性よく得ることは技術的に困難であることがわかった。従って、一定の品質を有する原薬の結晶を安定的に供給することも技術的に困難であり、このものを安定的に供給することは、コスト的に見ても、極めて困難なことであることが判明した。従って、化合物Ａのフリー体を医薬の製造における原薬として用いることは、実際上、不可能であるという問題があった。
【０００５】
次に、医薬や原薬として通常用いられるＮａ塩結晶、Ｋ塩結晶、Ｌｉ塩結晶、Ｃａ塩結晶を鋭意研究した結果、Ｎａ塩結晶、Ｋ塩結晶、Ｌｉ塩結晶はそれぞれ低温から揮発性成分が脱離して変化する形態を有するものであるため、一定の品質を有する原薬を安定的に供給することは極めて困難であることがわかった。また、１／２Ｃａ塩の結晶は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）和物としてのみ得られ、それ故、ＤＭＦに起因する毒性の問題を回避することができないことがわかった。
【０００６】
本発明は、上述の問題を解決するためになされたものであり、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的、かつ、合理的な製造コストでの供給可能性が高い、保存安定性に優れたアズレン系化合物Ａの結晶を提供することを目的とする。
【０００７】
上述の目的を達成するため、本発明者等は、医薬としては通常用いられていないコリン［（ＣＨ3）3Ｎ+ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ］塩について鋭意研究した結果、化合物Ａのコリン塩の場合、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給することが可能で、保存安定性に優れていることを見出すとともに、化合物Ａのコリン塩は、高湿度で処理することで新たに化合物Ａのコリン塩の水和物結晶を生成するが、この水和物結晶も医薬の原薬として有効に用いられることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、上記目的を達成するため、本発明によれば、以下のアズレン系化合物Ａのコリン塩、コリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶、並びにこれらを有効成分として含有する、特に糖尿病治療剤として好適な医薬組成物が提供される。
【０００８】
［１］（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩。
【０００９】
［２］示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で１９４〜１９８℃に吸熱ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩結晶。
【００１０】
［３］粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．５８、１４．７２、１６．８０、１７．８２、２１．０２及び２２．４６付近に主ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩結晶。
【００１１】
［４］示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で１９４〜１９８℃に吸熱ピークを有するとともに、粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．５８、１４．７２、１６．８０、１７．８２、２１．０２及び２２．４６付近に主ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩結晶。
【００１２】
［５］示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で７８℃付近にブロードな吸熱ピークと、１９５〜１９９℃に吸熱ピークとを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩水和物結晶。
【００１３】
［６］粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．６６、１７．０８、１７．６６、１９．０２、１９．５８及び２２．１４付近に主ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩水和物結晶。
【００１４】
［７］示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で７８℃付近にブロードな吸熱ピークと、１９５〜１９９℃に吸熱ピークとを有するとともに、粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．６６、１７．０８、１７．６６、１９．０２、１９．５８及び２２．１４付近に主ピークを有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールのコリン塩水和物結晶。
【００１５】
［８］前記［１］に記載のコリン塩、前記［２］〜［４］のいずれかに記載のコリン塩結晶又は、前記［５］〜［７］のいずれかに記載のコリン塩水和物結晶を有効成分として含有する医薬組成物。
【００１６】
［９］さらに製薬学的に許容される担体を含有する前記［８］に記載の医薬組成物。
【００１７】
［１０］糖尿病治療剤である前記［８］又は［９］に記載の医薬組成物。
【００１８】
本発明によって、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れたアズレン系化合物Ａのコリン塩、コリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶、並びにこれらを有効成分として含有する、特に糖尿病治療剤として好適な医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】［（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのコリン塩）の結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図２】［（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのコリン塩）の結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図３】［（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラートの水和物］（アズレン系化合物Ａのコリン塩水和物）の結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図４】［（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラートの水和物］（アズレン系化合物Ａのコリン塩水和物）の結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図５】［ナトリウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのナトリウム塩）の結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図６】［ナトリウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのナトリウム塩）の結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図７】［カリウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのカリウム塩）の結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図８】［カリウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのカリウム塩）の結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図９】［リチウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのリチウム塩）の結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図１０】［リチウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのリチウム塩）の結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図１１】［ヘミカルシウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａの１／２カルシウム塩）の結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図１２】［ヘミカルシウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａの１／２カルシウム塩）の結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図１３】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−１］（アズレン系化合物Ａの水和物結晶−１）の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図１４】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−１］（アズレン系化合物Ａの水和物結晶−１）の粉末Ｘ線回折図である。
【図１５】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−２］（アズレン系化合物Ａの水和物結晶−２）の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図１６】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−２］（アズレン系化合物Ａの水和物結晶−２）の粉末Ｘ線回折図である。
【図１７】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−１］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−１）の粉末Ｘ線回折（昇温粉末Ｘ線）図である。
【図１８】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−２］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−２）の粉末Ｘ線回折（昇温粉末Ｘ線）図である。
【図１９】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−３］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−３）の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図２０】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−３］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−３）の粉末Ｘ線回折図である。
【図２１】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−４］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−４）の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図２２】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−４］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−４）の粉末Ｘ線回折図である。
【図２３】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−５］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−５）の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。
【図２４】［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−５］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−５）の粉末Ｘ線回折図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための最良の形態を具体的に説明する。
本発明のアズレン系化合物Ａ（（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトール）のコリン塩、コリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶（以下、「本発明結晶」ということがある）は、下記に示す化学構造式を有している。また、本発明結晶は、上述のように、アズレン系化合物Ａのフリー体の２種類の水和物結晶、及び５種類の無水物結晶、Ｎａ塩結晶、Ｋ塩結晶、Ｌｉ塩結晶、Ｃａ塩結晶とは異なり、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れたものである。これらの結晶形の相違は、特に、示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）及び粉末Ｘ線回折によって区別される。なお、「本発明結晶」とは、上述のコリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶に加えて、コリン塩結晶とコリン塩水和物結晶との混合物、及びコリン塩結晶とコリン塩水和物結晶との混晶をも含む概念を意味する。【００２１】
【化２】
2007007628.tif 000003
【００２２】
【化３】
2007007628.tif 000004
【００２３】
すなわち、本発明結晶のうち、コリン塩結晶は、示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で１９４〜１９８℃に吸熱ピークを有し、及び／又は粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．５８、１４．７２、１６．８０、１７．８２、２１．０２及び２２．４６付近に主ピークを有するものであり、コリン塩水和物結晶は、示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で７８℃付近にブロードな吸熱ピークと、１９５〜１９９℃に吸熱ピークとを有し、及び／又は、粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．６６、１７．０８、１７．６６、１９．０２、１９．５８及び２２．１４付近に主ピークを有するものである。【００２４】
本発明結晶のうち、コリン塩結晶は表１に、また、コリン塩水和物結晶は表２にそれぞれ示される、粉末Ｘ線回折スペクトルにおける回折角（２θ（°））及び相対強度によって特徴付けられる。なお、粉末Ｘ線回折はデータの性質上、結晶の同一性認定においては結晶格子間隔や全体的なパターンが重要であり、相対強度は結晶成長の方向、粒子の大きさ、測定条件によって多少は変わり得るものであるから、厳密に解されるべきではない。【００２５】
【表１】
2007007628.tif 000005
【００２６】
【表２】
2007007628.tif 000006
【００２７】
「粉末Ｘ線回折」及び「示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）」はそれぞれ以下の条件で測定した。
（粉末Ｘ線回折）
「ＭＡＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＭＸＰ１８ＴＡＨＦ２２」を用い、管球：Ｃｕ、管電流：４０ｍＡ、管電圧：４０又は２００ｋＶ、サンプリング幅：０．０２０°、走査速度：３°／ｍｉｎ、波長：１．５４０５６Å、測定回折角範囲（２θ）：３又は５〜４０°の条件で測定した。
（示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析））
「ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＴＡ  ５０００」を用い、室温〜３００℃（１０℃／ｍｉｎ）、Ｎ2（５０ｍｌ／ｍｉｎ）、アルミニウム製サンプルパンの条件で測定した。【００２８】
（製造法）
本発明結晶は、特許文献１の実施例７５に記載されたアズレン系化合物Ａのフリー体から通常の造塩反応によって製造することができる。【００２９】
本発明の医薬組成物は、上述の本発明結晶を有効成分として含有するものであり、さらに製薬学的に許容される担体を含有するものであり、特に、糖尿病治療剤として有用なものである。【００３０】
本発明結晶の１種又は２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、通常用いられている製剤用の担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、注射剤、坐剤、軟膏、貼付剤等に調製され、経口的又は非経口的に投与される。【００３１】
本発明結晶のヒトに対する臨床投与量は適用される患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定されるが、通常成人１日当たり経口で０．１〜５００ｍｇ、非経口で０．０１〜１００ｍｇであり、これを１回或いは数回に分けて投与する。投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。【００３２】
本発明結晶の経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤や繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、ラクトースのような安定化剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような可溶化剤又は溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。【００３３】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エチルアルコールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、溶解補助剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。【００３４】
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射剤用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油；エチルアルコールのようなアルコール類；ポリソルベート８０（商品名）等がある。【００３５】
このような組成物は、更に等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ラクトース）、可溶化剤又は溶解補助剤のような添加剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
【実施例】
【００３６】
以下本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。【００３７】
（実施例１）
［（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのコリン塩）の結晶
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトール（１．０ｇ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液にアルゴン雰囲気下、コリンヒドロキシド（５０％水溶液）（０．６ｍＬ）を加え、室温にて攪拌した。減圧下溶媒を留去し、さらにトルエンを加えて共沸した後、減圧乾燥した。残渣にエタノール（２０ｍＬ）を加え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、エタノールで洗浄後、減圧下５０℃で乾燥した。得られた個体（１．１５ｇ）にエタノール（４６ｍＬ）を加え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、エタノールで洗浄後、減圧下５０℃で乾燥し、（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート（１．０２ｇ）を得た。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図１に、粉末Ｘ線回折図を図２に示す。【００３８】
（実施例２）
［（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラートの水和物］（アズレン系化合物Ａのコリン塩水和物）の結晶
（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート（コリン塩）（１．００ｇ）を、温度２５℃で、硝酸カリウムを用いて調湿した相対湿度９３％のデシケーターに１週間保存することにより、（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラートの水和物結晶（コリン塩水和物）（１．０４ｇ）を得た。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図３に、粉末Ｘ線回折図を図４に示す。【００３９】
（比較例１）
［ナトリウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのナトリウム塩）の結晶
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトール（９９１ｍｇ）にエタノール（１０ｍＬ）とメタノール（１０ｍＬ）を加えた。１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２．５ｍＬ）を加え、室温にて攪拌した。減圧下溶媒を留去し、さらにトルエンを加えて共沸した。得られた個体を減圧下５５℃で乾燥した。この固体（３６０ｍｇ）に、２−プロパノール：水＝５：１（７．２ｍＬ）を加え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、２−プロパノール：水＝５：１で洗浄後、減圧下４５℃で乾燥してナトリウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート（１９３ｍｇ）を得た。得られた結晶は、低温から揮発性成分が脱離して変化する形態であるため、一定の品質を有する製品を安定的に供給することは極めて困難なものであった。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図５に、粉末Ｘ線回折図を図６に示す。【００４０】
（比較例２）
［カリウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのカリウム塩）の結晶
比較例１と同様の方法により、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の代わりに１Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてカリウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラートを得た。得られた結晶は、低温から揮発性成分が脱離して変化する形態であるため、一定の品質を有する製品を安定的に供給することは極めて困難なものであった。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図７に、粉末Ｘ線回折図を図８に示す。【００４１】
（比較例３）
［リチウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａのリチウム塩）の結晶
比較例１と同様の方法により、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の代わりに１Ｍ水酸化リチウム水溶液を用いてリチウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラートを得た。得られた結晶は、低温から揮発性成分が脱離して変化する形態であるため、一定の品質を有する製品を安定的に供給することは極めて困難なものであった。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図９に、粉末Ｘ線回折図を図１０に示す。【００４２】
（比較例４）
［ヘミカルシウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート］（アズレン系化合物Ａの１／２カルシウム塩）の結晶
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトール（８５０ｍｇ）にメタノール（３．５ｍＬ）、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２．１５ｍＬ）を加え、室温にて攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣を水（１５ｍＬ）に溶解した。塩化カルシウム（４７７ｍｇ）を水（２．５ｍＬ）に溶解したものを加え、室温にて攪拌した。析出した固体をろ過し、水、２−プロパノールで洗浄した。得られた個体を減圧下加熱乾燥した。この固体にテトラヒドロフランを加え、不溶物をろ過し、ろ液を濃縮して得られた個体を減圧下加熱乾燥した。この固体（２００ｍｇ）にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１．０ｍＬ）、水（２．０ｍＬ）を加え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し水で洗浄後、減圧下６０℃で乾燥してヘミカルシウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート（６５ｍｇ）を得た。結晶はＤＭＦ和物としてのみ得られ、ＤＭＦに起因する毒性の問題を回避することができないものであった。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図１１に、粉末Ｘ線回折図を図１２に示す。【００４３】
（比較例５）
［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−１］（アズレン系化合物Ａの水和物結晶−１）
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトール（３００ｍｇ）に２−プロパノール：水＝１：２（７．５ｍＬ）を加え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、２−プロパノール：水＝１：２で洗浄後、減圧下４５℃で乾燥して（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−１（２２２ｍｇ）を得た。得られた結晶は、加熱又は減圧乾燥により脱水し、アズレン系化合物Ａの無水物結晶−３に転移する性質を示すが、その間、経由するアズレン系化合物Ａの無水物結晶−１、アズレン系化合物Ａの無水物結晶−２への転移の様式はロット間で異なり、再結晶での再現性が得られなかった。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図１３に、粉末Ｘ線回折図を図１４に示す。【００４４】
（比較例６）
［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−２］（アズレン系化合物Ａの水和物結晶−２）
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトール（５００ｍｇ）にエタノール（２．０ｍＬ）を加え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、エタノールで洗浄後、減圧下４５℃で乾燥して（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−２（１２２ｍｇ）を得た。この結晶は、再結晶において１ロットのみで得られただけであり、再現されなかった。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図１５に、粉末Ｘ線回折図を図１６に示す。【００４５】
（比較例７）
［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−１］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−１）
比較例５で得た（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−１を、示差走査熱量計分析装置（ＤＳＣ分析装置）において、専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、窒素雰囲気下、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で加熱した際に、約１００℃において、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−１の生成を確認した。また、比較例５で得た（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−１を、昇温粉末Ｘ線回折装置において、専用の銅製試料板に充填し、窒素雰囲気下、１００℃における粉末Ｘ線回折測定において、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−１の生成を確認した。この結晶は、アズレン系化合物Ａの水和物結晶−１の加熱処理において生成するが、高温でのみ安定に存在する結晶形であり、室温では単離されなかった。この結晶の粉末Ｘ線回折（昇温粉末Ｘ線）図を図１７に示す。【００４６】
（比較例８）
［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−２］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−２）
比較例５で得た（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−１を、ＤＳＣ装置において、専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、窒素雰囲気下、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で加熱した際に、約１４０℃において、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−２の生成を確認した。また、比較例５で得た（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−１を、昇温粉末Ｘ線回折装置において、専用の銅製試料板に充填し、窒素雰囲気下、１４０℃における粉末Ｘ線回折測定において、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−２の生成を確認した。この結晶は、アズレン系化合物Ａの水和物結晶−１の加熱処理において生成するが、高温でのみ安定に存在する結晶形であり、室温では単離されなかった。この結晶の粉末Ｘ線回折（昇温粉末Ｘ線）図を図１８に示す。【００４７】
（比較例９）
［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−３］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−３）
比較例５で得た（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−１を、示差走査熱量計分析装置（ＤＳＣ分析装置）において、専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、窒素雰囲気下、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で１５０℃まで加熱して（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−３を得た。この結晶は、アズレン系化合物Ａの水和物結晶−１の加熱処理においてのみ生成し、再結晶からは得られなかった。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図１９に、粉末Ｘ線回折図を図２０に示す。【００４８】
（比較例１０）
［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−４］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−４）
比較例６で得た（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの水和物結晶−２を、示差走査熱量計分析装置（ＤＳＣ分析装置）において、専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、窒素雰囲気下、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で１８５℃まで加熱して（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−４を得た。この結晶は、アズレン系化合物Ａの水和物結晶−２の加熱処理においてのみ生成し、再結晶からは得られなかった。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図２１に、粉末Ｘ線回折図を図２２に示す。【００４９】
（比較例１１）
［（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−５］（アズレン系化合物Ａの無水物結晶−５）
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトール（３００ｍｇ）にアセトニトリル（３．０ｍＬ）を加え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、アセトニトリルで洗浄後、減圧下４５℃で乾燥して（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（アズレン−２−イルメチル）−２−ヒドロキシフェニル］−Ｄ−グルシトールの無水物結晶−５（１０１ｍｇ）を得た。この結晶は、再結晶において１ロットのみで得られ、再現されなかった。なお、示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で２本の吸熱ピークが確認されたことから、単一結晶として得られない可能性がある。この結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図２３に、粉末Ｘ線回折図を図２４に示す。【００５０】
（保存安定性試験）
（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート（４６ｇ）をポリエチレン袋に入れてビーズバンドで封鎖し、さらにシリカゲル（１２ｇ）を入れたポリエチレン袋に入れてビーズバンドで封鎖したものを、金属缶に入れて密栓し、暗所、温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で６箇月間保存した。別に、（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラート（１０ｇ）を開放した褐色容器に入れて、暗所、温度４０℃、相対湿度７５％の条件下で６箇月間保存した。その結果を表３に示す。【００５１】
【表３】
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【００５２】
表３から、いずれの保存条件でも、類縁物質の量及び定量値に変化はないため、（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム  ４−（アズレン−２−イルメチル）−２−β−Ｄ−グルコピラノシルフェノラートの無水物及び水和物は、どちらも安定な化合物であることが明らかとなった。【００５３】
以上の実施例、比較例の結果から、先ず、アズレン系化合物Ａと、医薬品として通常用いられるナトリウム、カリウム、リチウム、又はカルシウムとのアルカリ類との塩は、低温においてすら揮発性成分が脱離して変化する形態であり、１／２Ｃａ塩結晶の場合にはＤＭＦ和物でしか存在し得ないために、ＤＭＦに起因する毒性の問題を回避できないという欠点を有し、これらの結晶を使用して医薬品としての製品化できないことが明らかとなった。【００５４】
また、アズレン系化合物Ａのフリー体には、水和物結晶−１、水和物結晶−２、無水物結晶−１、無水物結晶−２、無水物結晶−３、無水物結晶−４、及び無水物結晶−５からなる、合計７種類もの結晶形が存在している。そして、それぞれの結晶は、他の結晶に転移する性質を有していたり、再結晶操作において、再現が困難だったり、高温でのみで安定に存在し室温では単離できなかったり、加熱処理においてのみ生成するものであった。そして、それらの結晶は、所定の条件、例えば、特定の条件下であっても、結晶が取得できたり、できなかったりするという欠点を有し、結晶多形の生成を制御して、単一の結晶を取得することはできなかった。従って、アズレン系化合物Ａのフリー体の結晶では、医薬品としては製品化できないことが明らかとなった。
一方、上記各種塩の結晶およびフリー体の各種結晶とは異なり、本発明結晶は、一定の品質を有する単一の結晶が再現性良く得られ、医薬の原薬の結晶として安定的に供給されることができ、保存安定性にも優れたものであって、これにより医薬品としての製品化が初めて可能となった。【００５５】
（薬理試験）
［ヒトＮａ+−グルコース共輸送体（ヒトＳＧＬＴ２）活性阻害作用確認試験］
１）ヒトＳＧＬＴ２発現ベクターの作製
まず、Superscript II（Gibco社製）とランダムヘキサマーを用いて、ヒト腎臓由来の全ＲＮＡ（Clontech社製）から１本鎖ｃＤＮＡを逆転写した。次に、これを鋳型とし、Pyrobest  ＤＮＡポリメラーゼ（Takara社製）を用いたＰＣＲ反応により、ヒトＳＧＬＴ２（Wells R.G. et al., Am. J. Physiol., 1992, 263(3)F459）をコードするＤＮＡ断片を増幅した（このＤＮＡ断片の５’側にHind IIIサイトが、３’側にEcoRIサイトが導入されるようなプライマーを用いた）。
増幅された断片をTopo TA Cloningキット（Invitrogen社製）を用いてpCR2.1-Topoベクターにクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルに導入して、アンピシリン耐性を示すクローンをアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地中で増殖した。増殖した大腸菌からHanahanの方法（Maniatisら、Molecular Cloningを参照）によりプラスミドを精製し、このプラスミドをHindIII、EcoRI消化して得られるヒトＳＧＬＴ２をコードするＤＮＡ断片を、発現ベクターpcDNA3.1（Invitrogen社製）の同サイトにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Roche Diagnostics社製）を用いてライゲーションし、クローニングした。ライゲーションしたクローンを、上記と同様に大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖させ、Hanahanの方法によりヒトＳＧＬＴ２発現ベクターを取得した。【００５６】
２）ヒトＳＧＬＴ２安定発現細胞の作製
ヒトＳＧＬＴ２発現ベクターをLipofectamine2000（Gibco社製）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。遺伝子導入後、細胞をペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ。大日本製薬社製）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ。大日本製薬社製）、Geneticin（４０μｇ／ｍＬ。Gibco社製）と１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（日水製薬社製）中で、３７℃、５％ＣＯ2存在下で２週間ほど培養し、Geneticin耐性のクローンを得た。これらのクローンの中からヒトＳＧＬＴ２を安定発現する細胞を、定常レベルに対するナトリウム存在下の糖取り込みの比活性を指標に選択し、取得した（糖取り込みの測定方法の詳細については、次段落参照）。【００５７】
３）メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み阻害活性の測定
ヒトＳＧＬＴ２安定発現ＣＨＯ細胞の培地を除去し、１ウェルあたり前処置用緩衝液（塩化コリン１４０ｍＭ、塩化カリウム２ｍＭ、塩化カルシウム１ｍＭ、塩化マグネシウム１ｍＭ、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸１０ｍＭ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５ｍＭを含む緩衝液ｐＨ７．４）を１００μＬ加え、３７℃で２０分間静置した。
試験結晶を含む取り込み用緩衝液（塩化ナトリウム１４０ｍＭ、塩化カリウム２ｍＭ、塩化カルシウム１ｍＭ、塩化マグネシウム１ｍＭ、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド５０μＭ、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸１０ｍＭ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５ｍＭを含む緩衝液ｐＨ７．４）１０００μＬに１１μＬのメチル−α−Ｄ−（Ｕ−１４Ｃ）グルコピラノシド（Amersham Pharmacia Biotech社製）を加え混合し、取り込み用緩衝液とした。対照群に試験結晶を含まない取り込み用緩衝液を調製した。また、試験結晶及びナトリウム非存在下の基礎取り込み測定用に塩化ナトリウムに替えて１４０ｍＭの塩化コリンを含む基礎取り込み用緩衝液を同様に調製した。【００５８】
前処置用緩衝液を除去し、取り込み用緩衝液を１ウェルあたり２５μＬずつ加え３７℃で２時間静置した。取り込み用緩衝液を除去し、洗浄用緩衝液（塩化コリン１４０ｍＭ、塩化カリウム２ｍＭ、塩化カルシウム１ｍＭ、塩化マグネシウム１ｍＭ、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド１０ｍＭ、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸１０ｍＭ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５ｍＭを含む緩衝液ｐＨ７．４）を１ウェルあたり２００μＬずつ加え、すぐに除去した。この洗浄操作を更に１回行い、０．５％ラウリル硫酸ナトリウムを１ウェルあたり２５μＬずつ加え、細胞を可溶化した。ここに７５μＬのマイクロシンチ４０（Packard社製）を加えマイクロシンチレーションカウンタートップカウント（Packard社製）にて放射活性を計測した。対照群の取り込み量から基礎取り込み量を差し引いた値を１００％とし、取り込み量の５０％阻害する濃度（ＩＣ50値）を濃度−阻害曲線から最小二乗法により算出した。その結果、実施例１で示したアズレン系化合物Ａのコリン塩及び実施例２で示したアズレン系化合物Ａのコリン塩水和物は、特許文献１の表２４における実施例７５で示した値（８．９ｎＭ）と同等の値を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明結晶は、保存安定性に優れるとともに、Ｎａ+−グルコース共輸送体阻害作用及び血糖降下作用を有するため、医薬、特に、糖尿病治療剤として、例えば、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）、インスリン抵抗性疾患及び肥満の治療、並びにこれらの予防に有効である。【００６０】
本発明結晶の、優れた保存安定性及び顕著なＮａ+−グルコース共輸送体阻害作用及び血糖降下作用は、上記に示す保存安定性試験、並びに薬理試験により確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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