【手続補正書】
【提出日】平成20年1月25日(2008.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  配列番号113で表される前立腺腫瘍タンパク質の単離された免疫原性部分であって、該免疫原性部分が配列番号710、712、715、717、718または719のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列を含んで成る、上記免疫原性部分。
【請求項２】  請求項１記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】  請求項２記載のポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクター。
【請求項４】  請求項１記載のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質。
【請求項５】  前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされた宿主細胞において、該融合タンパク質の発現を増加させる発現エンハンサーを含んで成る、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】  請求項１記載のポリペプチド内に存在しないTヘルパーエピトープを含んで成る、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項７】  アフィニティータグを含んで成る、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項８】  請求項４記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】  請求項１記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】  免疫刺激剤と請求項１記載の単離されたポリペプチドまたは請求項４記載の融合タンパク質を含む組成物。
【請求項１１】  患者の免疫反応を刺激する方法における、請求項１０記載の組成物の使用。
【請求項１２】  免疫刺激剤と請求項２または８記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１３】  患者の免疫反応を刺激する方法における、請求項１２記載の組成物の使用。
【請求項１４】  患者における癌の有無を決定するための方法であって、
（ａ）該患者由来の生物学的サンプルと、請求項１記載のポリペプチドに結合する結合因子とを接触せしめ；
（ｂ）該結合因子に結合するポリヌクレオチドの量を、該サンプルにおいて検出し；そして
（ｃ）該ポリヌクレオチドの量を、前もって決定されたカットオフ値に比較し、そしてそれから、該患者における癌の有無を決定する段階を含んで成る、上記方法。
【請求項１５】  結合因子が抗体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】  抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】  癌が前立腺癌である、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】  （ａ）請求項１記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体；および、
（ｂ）レポーター基を含む検出試薬、を含んで成る診断用キット。
【請求項１９】  抗体が固体支持体上に固体されている、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】  固体支持体が、ニトロセルロース、ラテックスまたはプラスチック材を含んで成る、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】  検出試薬が抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンを含む、請求項１８記載のキット。
【請求項２２】  レポーター基が、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵素、ビオチンおよび色素粒子から成る群より選択される、請求項１８記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３５】
一般に、APCsに本発明のポリヌクレオチド（またはその部分または変異体）をトランスフェクトさせることにより、コード化ポリペプチド、またはその免疫原性部分を細胞表面に発現させることができる。このようなトランスフェクション処理を生体外で行い、このトランスフェクトされた細胞を含有する薬剤を、本願明細書中に述べるよう治療目的に使用することができる。あるいは、樹状またはその他の抗原提示細胞をターゲットとする遺伝子運搬手段を患者に投与することによって、トランスフェクションが生体内で起こるようにすることもできる。例えば樹状細胞の生体内および生体外トランスフェクション処理は、WO97/24447に記載されているような公知の方法で、またはMahvi et alがImmunology and cell Biology75：456-460（1997）に記述している遺伝子銃アプローチを利用して行うことができる。樹状細胞の抗原ローディングは樹状細胞または前駆細胞を腫瘍ポリペプチド、DNA（そのまま、またはプラスミドベクターに挿入して）またはRNAと一緒に；または抗原発現組換え細菌またはウィルス（例えばワクシニア、鶏痘ウィルス、アデノウィルスまたはレンチウィルスベクター）と一緒にインキュベートすることによって達成される。ローディングに先立ち、ポリペプチドを、（例えばキャリヤ分子のような）T細胞ヘルプを提供する免疫パートナーと共有結合させる。あるいは、ポリペプチドとは別に、またはポリペプチドの存在において、樹状細胞を非共有結合免疫パートナーでパルス処理してもよい。
本発明の薬剤には、当業者に公知の適当なキャリヤを使用できるが、キャリヤのタイプは投与態様に応じて異なるのが普通である。本発明の薬剤は局所、経口、経鼻腔、経粘膜、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、筋肉内など、該当の投与態様に合わせて調合すればよい。
このような薬剤中に使用されるキャリヤは生体適合性であり、生物分解性であってもよい。或る実施例では、活性成分の放出レベルが比較的一定となるように調合することが好ましい。しかし、他の実施例では、投与と同時に比較的迅速に放出することが好ましい。このような薬剤の調合は公知技術を使用する当業者のレベルで充分可能である。この点で有用なキャリヤとしては、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、でんぷん、セルロース、デクストランなどの微粒子が挙げられる。抑制放出キャリヤとしては、非流動性親水コア（例えば架橋多糖類またはオリゴ糖）および必要に応じてリン脂質のような両親媒性化合物からなる外層を含む超分子バイオベクターが挙げられる（米国特許第5,151,254号およびPCT出願WO94・20078号、WO94/23701号およびWO96/06638号を参照）。抑制放出調合物に含まれる活性化合物の量は、着床部位、放出速度および放出時間および治療または予防すべき状態の性質に応じて異なる。
他の実施例では、本発明の薬剤のキャリヤとして、生物分解性ミクロスフェア（例えば、ポリアクテート  ポリグリコレート）を使用する。適当な生物分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号；5,075,109号；5,928,647号；5,811,128号；5,820,883号；5,853,763号；5,814,344号；5,407,609号および5,942,252号に開示されている。WO99/40934号に開示され、本願明細書にも参考として引用している変性B型肝炎コアタンパク質キャリヤ系も種々の用途に好適である。他のキャリヤ／デリバリ系は米国特許第5,928,647号に開示されているような顆粒タンパク質複合体を使用し、この複合体は宿主におけるクラスI-被制限細胞毒Tリンパ球応答を誘発することがある。
本発明の薬剤は多くの場合、1種または2種以上の緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水または燐酸塩緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデクストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン、酸化防止剤、静菌剤、EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤、助剤（例えば、水酸化アンモニウム）、患者の血液で調剤を等張、高張、または劣張化する溶質、懸濁化剤、濃縮剤および／または保存剤をも含む。本発明の薬剤は凍結乾燥物として調合することもできる。
本発明の薬剤は密閉アンプルまたは密閉水薬びんのような1回服用分または複数回服用分の容器で提供される。このような容器は使用まで無菌性と安定性を維持するように密閉される。一般に、調剤は油性または水性ビークル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態で保存される。凍結乾燥状態で保存され、使用の直前に無菌液を添加するだけでよい形態も可能である。
特定の薬剤を使用するため、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、筋肉内投与に適した調合を行うことは既に種々開発されており、その幾つかを以下に説明する。
用途によっては、本発明の薬剤を経口方式で動物に投与することができる。その場合、これらの薬剤を不活性希釈剤または同化可能な食用キャリヤで調剤するか、または硬質または軟質ゼラチンカプセルに封入するか、または圧縮して錠剤にするか、または食品と直接組合わせることができる。
活性化合物を賦形剤と組合せ、錠剤、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハーなどの形態で使用できる（例えば、Mathiwits et al., Nature 1997 Mar 27；386（6623)：410-4；Hwang et al., Crit Rev Ther drug Carrier Syst 1998：15（3)-243-84；米国特許第5,641,515号；米国特許第5,580,579号および米国特許第5,792,451号を参照）。錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは種々の助剤、例えば、トラガカント、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンのようなバインダー；燐酸ジカルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などのような分散剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑剤；およびスクロース、ラクトース、サッカリンのような甘味料、またはペパーミント、ウィンターグリーン・オイル、チェリー・フレーバリングのような香料をも含むことができる。服用形態がカプセルである場合、上記材料の他に、液状キャリヤをも含むことができる。コーティングのため、または服用形態を物理的に変えるため、他に種々の材料を含むことがある。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルはセラック、糖またはこれら両者でコーティングすることがある。当然のことながら、服用形態に関係なく、使用される材料は薬学的に純粋であり、使用量が実質的に無害でなければならない。
多くの場合、これらの調剤は少なくとも約0.1％またはそれ以上の活性化合物を含有するが、活性成分の％は一様ではなく、調剤全体の重量または容積の約1または2％から約60％または70％またはそれ以上である。それぞれの治療目的に有用な薬剤中の活性化合物量は、所与の化合物の1回服用分で必要な摂取量が確保されるように調合される。可溶性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、貯蔵期間、およびその他の薬学的留意点は製薬分野の当業者が熟知であり、多様な投与および治療方法が望ましい。
経口投与の場合、本発明の薬剤は1種または2種以上の賦形剤と組合わせて、うがい薬、歯磨き剤、口腔剤、吸入剤、舌下錠などの形態に調剤させることができる。活性成分を、例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、炭酸水素カリウムを含む口腔剤に組込んだり、歯磨き剤に組込んだり、水、バインダー、研磨剤、香料、発泡剤、湿潤剤を含む組成物に治療に有効な量を添加することもできる。舌下に挟むなど、口腔内で溶かす錠剤または溶液の形態に調剤することもできる。
場合によっては、本発明の薬剤を非経口、静脈内、筋肉内または腹腔内投与することが望ましい。このようなアプローチは公知であり、そのいくつかは米国特許第5,543,158号、l5,641,515号および5,399,363号に開示されている。或る実施例では、遊離塩基または薬学的に許容できる塩の形態を取る活性化合物を、ヒドロキシプロピルセルロースのような計面活性剤と混合した水溶液として調合する。グリセロール、液状ポリエチレン・グリコール、およびこれらの混合物及びオイル中に分散させる調合も可能である。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調合物は微生物の生長を防止する保存剤を含むのが普通である。
注射用の形態としては、無菌の水溶液または水性分散液またはその場でこのような無菌の注射用水溶液または水性分散液を調製できる無菌粉末（例えば、米国特許第5,466,468号参照）がある。いずれの場合でも、無菌でなければならず、容易に注射できるだけの流動性が必要である。製造および貯蔵の段階において、安定であり、細菌や黴のような微生物の汚染作用から保護されねばならない。キャリヤは水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレン・グリコールなど）これらの適当な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であればよい。レシチンのようなコーティングを利用するか、分散液の場合なら必要な粒度を維持するか、および／または界面活性剤を使用することによって適正な流動性を維持することができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベンス、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって容易に防止できる。多くの場合、糖または塩化ナトリウムのような等張剤を含むことが好ましい。注射薬を長く吸収させるためには、吸収を遅らせる、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンのような吸収遅延剤を含有させればよい。
非経口投与水溶液の形態を取る実施例では、必要に応じて溶液を適当に緩衝し、希釈液を先ず充分な量の食塩水またはグルコースで等張化する。このような水溶液は静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。これに使用できる無菌水性媒は本発明の開示内容に照らして当業者が容易に理解するところである。例えば、1回分を1mlの等張NaCl溶液中に溶解させ、1000mlの皮下注入液に添加するか、または所定の注入部位に注入する（例えば、“REMINGTON's Pharmaceutical Sciences"15th Edition, pp1035-1038および1570-1580）。患者の状態に応じて、投与量をある程度変化させる必要がある。また、ヒトに投与する場合、当然のことながら、食品医薬品局の生物製剤基準部が定める無菌性、発熱性、その他一般的な安全性と純粋性の基準を満たさねばならない。
本発明の他の実施例では、薬剤を中性または塩形態に調合する。医薬として許容可能な塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）酸添加塩があり、この塩は塩化水素酸または燐酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸酒石酸、マンデル酸のような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、および有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導できる。調合を終えたら溶液は投与形態に適合した態様で、且つ治療目的に適った量が投与される。
キャリヤは溶媒、分散媒、ビークル、コーティング、希釈剤、抗菌および抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤、緩衝液、キャリヤ溶液、懸濁液、コロイドなどをも含む。薬剤として活性の物質にこれらの媒質や作用剤を使用することは公知である。公知の媒質または作用剤が活性成分と不適合でない限り、治療剤剤中に使用することができる。構成要素に補足的な活性成分を組込むことも可能である。尚、“薬剤として許容可能な”とは、ヒトに投与した場合、アレルギーなどのような有害な反応を発生させない分子および組成物を意味する。
或る実施例では、薬剤を鼻腔内スプレー、吸入および／またはその他のエアロゾル投与ビークルによって投与することができる。遺伝子、核酸およびペプチドを鼻腔エアロゾルスプレーを介して直接肺へ投与する方法は、例えば、米国特許第5,756,353号および5,804,212号に開示されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂を利用して薬剤を投与する方式（Takenaga et al.,J Controlled Release 1998 Mar 2；52（1-2)：81-7）およびリソホスファチジル-グリセロール化合物（米国特許第5,725,871号）も公知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態で粘膜を介して薬剤を投与する方式も米国特許第5,780,045号に開示されている。
或る実施例では、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子,気胞などを利用して、本発明の薬剤を適当な宿主細胞／器官に導入する。特に、本発明の薬剤は脂質粒子、リポソーム、気胞、ナノスフェア、ナノ粒子などに封入して投与するように調合することができる。あるいは、共有または非共有の形でキャリヤ・ビークルの表面に結合させることもできる。
有望なキャリヤとしてのリポソームおよびリポソーム状剤の形成および利用は当業者に公知である（例えば、Lasic,Trends Biotechol 1998 Jul；16（7)：307-21；Takakura,Nippon Rinsho 1998 Mar；56（3)：691-5；Chandran et al.,Indian J Exp Biol.1997 Aug；35（8)：801-9；Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995；12（2-3)：233-61；参考のため本願明細書中に引用した米国特許第5,567,434号；米国特許第5,795,587号）。
リポソームを他の方法ではトランスフェクションが困難な多くの種類の細胞、例えば、T細胞懸濁液、1次肝細胞菌株、PC12細胞と併用して成功を収めている（Renneisen et al.,J Biol Chem.1990 Sep 25；265（27)：16337-42；Muller et al.,DNA Cell Biol. 1990 Apr；9（3)：221-9）。さらにまた、リポソームはウィルス-ベース投与系に典型のDNA長さの制約がない。遺伝子、種々の薬剤、放射線治療剤、酵素、ウィルス、転写調節因子、アロステリック・エフェクタなどを種々の培養細胞系および動物に導入するために利用され、成功を収めている。また、リポソームの使用が自己免疫反応や由々しき中毒事故の要因となるとは考えられない。
或る実施例では、リン脂質を水性媒中に分散させ、自然発生的に多層同心二重気胞（多層気胞（MLVs）とも呼称される）を発生させることによってリポソームを形成する。
他の実施例では、本発明の薬剤の、薬剤として許容可能なナノカプセル調剤を可能にする。一般に、ナノカプセルは薬剤を安定且つ再生可能に封入することができる（例えば、Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pham. 1998 Dec；24（12)：1113-28参照）。細胞内重合過負荷に起因する副作用を回避するため、ポリマーを利用してこの超微粒子（約0.1μm）を生体内で分解できるようにする。この粒子の製法は、例えば、Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988；5（1)：1-20；Muhlen et al., Eur J Pharm Biopham. 1998 Mar；45（2)：149-55；Zambaux et al.,J Controlled Release 1998 Jan 2；50（1-3)：31-40；oyobi米国特許第5,145,684号に開示されている。
癌の治療方法
本発明の別の観点として、上記薬剤を癌、特に前立腺癌の免疫治療に利用することができる。この治療方法では、上記薬剤を、典型的には温血動物、好ましくはヒトに投与する。患者は癌に罹っていてもいなくてもよい。即ち、上記薬剤を使用することによって、癌の発生を防止するか、または癌患者を治療することができる。原発腫瘍の外科的切除および／または放射線治療または従来の化学的治療剤投与の前後に薬剤およびワクチンを投与する。上述したように、薬剤の投与は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所、経口など、適宜の方法で投与すればよい。
或る実施例では、免疫療法は内因性宿主免疫システムをの生体内刺激に依存する積極的な免疫療法であり、免疫反応変性剤（例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与で腫瘍を抑制するというものである。
他の実施例では、免疫療法は、直接または間接的に抗腫瘍作用を仲介し、必ずしも無傷の宿主免疫システムに依存しない、定評のある腫瘍免疫反応性を有する薬剤（エフェクタ細胞または抗体）を投与する消極的な免疫療法である。エフェクタ細胞の例としては、上記T細胞、Tリンパ球（CD8+細胞毒Tリンパ球およびCD4+T-ヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キラー細胞（Natural Killer細胞およびリンパ球活性化キラー細胞）、B細胞およびポリペプチドを発現する抗原提示細胞（樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。養子免疫療法のためには、ポリペプチドに特異なT細胞レセプタおよび抗体レセプタをクローニングし、発現させて、他のベクターまたはエフェクタ細胞に移行させればよい。消極的免疫療法では、抗体または抗イディオタイプの抗体を発生させるためにもポリペプチドを利用することができる（米国特許第4,918,164号参照）。
エフェクタ細胞は、試験管内培養によって養子免疫療法に充分な量を得ることができる。単一の抗原特異性エフェクタ細胞を数十億個にまで増殖させて、生体内での抗原認識を可能にする培養条件は公知である。このような試験管内培養条件としては、多くの場合、シトカイン（例えば、IL-2）および非分割支持細胞の存在において、間歇的な抗原による刺激が利用される。上述したように、免疫反応性のポリペプチドを利用することによって抗原特異性T細胞菌株を急速に増殖させ、免疫療法に必要な細胞数を発生させることができる。具体的には、公知の技術で、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞および／またはB細胞のような抗原提示細胞を免疫反応性ポリペプチドでパルス処理するか、または1種または2種以上のポリヌクレオチドをトランスフェクトすればよい。例えば、抗原提示細胞に、組換えウィルスまたは他の発現システムでの発現を促進するのに好適なプロモータを有するポリヌクレオチドをトランスフェクトすることができる。療法に使用するため培養されるエフェクタ細胞は成長して広く分布し、長期にわたって生体内に生存できなければならない。研究結果によれば、培養されたエフェクタ細胞を生体内で成長させ、IL-2で補足される抗原による刺激を繰返すことで、長期に亙って多数のエフクタ細胞を生存させることができる（例えば、Cheever et al.,Immunological Reviews 157：177,1997）
ポリペプチドを発現するベクターを患者から採取された抗原提示細胞に導入し、生体外でのクローニング処理で増殖させ、これを再び同じ患者に移植することができる。公知の手段で、好ましくは無菌の状態で、静脈内、腔内、腹腔内または腫瘍内投与で患者に再導入することができる。
治療薬の投与経路、頻度および用量は個々の患者に応じて異なり、標準的な技術によって容易に決定することができる。一般に、薬剤やワクチンは注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内投与（例えば、吸入）または経口で投与される。好ましくは、1ヶ月間隔で6回投与し、その後、ブースタワクチン投与を行う。個々の患者にはそれぞれ異なるプロトコルが適切な場合がある。投与した時に、抗腫瘍免疫反応を促進することができ、少なくとも（治療前に比較して）10−50％レベルアップすれば、それが適量である。免疫反応は患者の抗腫瘍抗体を測定するか、または試験管内で患者の腫瘍細胞を殺すことができる細胞溶解性エフェクタ細胞の、ワクチンによる発生によってモニターすることができる。このようなワクチンは免疫反応を起こさせ、ワクチンを投与されない患者よりも臨床転帰を改善させることが可能でなければならない。（例えば、回復が早く、完全に、または部分的に、または長期に亙って生存）。一般に、1種または2種以上のポリペプチドを含む薬剤およびワクチンでは、1回の投与量中に存在する各ポリペプチドの量は宿主体重1kg当り約25μg〜5mgである。適量は患者のサイズに応じて異なるが、約0.1mL〜約5mLが普通である。
一般に、投与量と治療方法が妥当であるためには、治療および／または予防効果を発揮するに充分な量の活性化合物が投与されねばならない。このような効果はワクチンを投与されない患者よりも臨床転帰が改善されている（例えば、回復が早く、完全に、または部分的に、または長期に亙って生存）ことでモニターすることができる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫反応は改善された臨床転帰と相関する。このような免疫反応は治療の前後に患者から得られたサンプルを使用して行われる標準的な増殖、細胞毒性またはサイトカイン分析によって評価することができる。
癌検出・診断のための薬剤、方法及びキット
一般に、患者から得られる生体サンプル（例えば、血液、血清、痰および／または腫瘍組織）中の、1つまたは2つ以上の前立腺腫瘍タンパク質および／またはこのようなタンパク質を符号化するポリヌクレオチドの存在に基づいて、患者の癌を検出することができる。換言すれば、このようなタンパク質をマーカーとして利用することによって前立腺癌のような癌の有無を検出できる。このようなタンパク質はその他の癌の検出にも役立つ。一般に、本発明の結合剤は、生体サンプル中の結合剤に結合する抗原のレベル検出を可能にする。ポリヌクレオチド・プライマーおよびプローブを利用することによって、腫瘍タンパク質を符号化するmRNAレベルを検出することができ、癌の有無をも示唆する。一般に、前立腺腫瘍配列は正常組織よりも3倍以上のレベルで存在する。
サンプル中のポリペプチド・マーカーを検出するのに結合剤を使用する種々の分析方法は当業者に公知である。例えば、Harlow and Lane,Antibodies：A laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory,1988を参照されたい。一般に、患者における癌の有無は(a)患者から得られた生体サンプルを結合と接触させ；(b)サンプル中の、結合剤と結合するポリペプチドのレベルを測定し；(c)ポリペプチドのレベルを所定の合格値と比較することによって判定できる。
好ましい実施例では、この分析において、固形支持材に固定した結合剤を使用し、これにポリペプチドを結合させ、サンプルの残余の部分から取り除く。結合しているポリペプチドを検出するため、リポーター・グループを含有し、結合剤／ポリペプチドと特異的に結合する検出試薬を使用する。検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体と特異的に結合する結合剤またはこの結合剤と特異的に結合する抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンなどである。或いは、ポリペプチドをリポーター・グループで標識し、結合剤をサンプルと共にインキュベートした後、固定結合剤に結合させる、競合アッセイを利用することもできる。この分析に使用できるポリペプチドとしては、完全長前立腺腫瘍タンパク質および、上記のように結合剤が結合するポリペプチド部分が挙げられる。
固形支持材は、腫瘍タンパク質を付着させることができるなら、公知のいかなる材料であってもよい。例えば、マイクロタイタープレートのテスト・ウェル、ニトロセルロースなどのような膜を利用できる。ガラス、ファイバーグラス、ラテックス、またはポリスチレン、ポリ塩化ビニルのようなプラスチック材からなるビーズやディスクでもよい。さらには、米国特許第5,359,681号に開示されているような磁気粒子はファイバーオプチック・センサーでもよい。結合剤を固形支持材に固定するには、特許文献などに数多く記載されている種々の公知技術を利用すればよい。本発明において、“固定"とは吸着のような非共有結合と（結合剤と支持材の官能基との間の直接的なリンケージまたは架橋剤を介してのリンケージである）共有結合との双方を含む。マイクロタイタープレートのウェルまたは膜への吸着による固定が好ましい。この場合、適当な緩衝液中で結合剤を、適当な時間に亙って固形支持材と接触させることで吸着が得られる。接触時間は温度にも左右されるが、典型的には約1時間〜約1日である。一般に、（ポリスチレンやポリ塩化ビニルのような）プラスチック製マイクロタイターのウェルを、約10ng〜約10μg、好ましくは約100ng〜約1μgの結合剤と接触させれば、充分な量の結合剤を固定することができる。
結合剤を固形支持材に共有結合させるには、支持材とも結合剤のヒドロキシルまたはアミノ基とも反応する二元機能試薬と支持材とを反応させることによって達成される。例えば、ベンゾキノンを使用するか、または支持材のアルデヒド基を結合パートナーの活性水素と縮合することによって、結合剤を、適当なポリマー・コーティングを有する支持材と共有結合させることができる（Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12-A13）。
或る実施例では、2抗体サンドイッチ方式分析を採用する。この分析法では、マイクロタイター・プレートのような固形支持材に固定された抗体を、サンプルと接触させることによって、サンプル中のポリペプチドを固定抗体と結合させる。結合しなかったサンプルを、固定されたポリペプチド-抗体複合体から除去し、リポーター・グループを含む検出試薬（好ましくはポリペプチドの異なる部位に結合できる第2抗体）を添加する。固形支持材と結合したままの検出試薬量を、特定リポーター・グループに適した方法を利用して測定する。
具体的には、上記のように抗体を支持材に固定したら、支持材上の残余のタンパク質結合部位をブロックする。ブロック剤は公知のものでよく、例えば、ウシ血清アルブミンまたはTween20（商標）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）などがある。次いで、固定された抗体をサンプルと一緒にインキュベートし、ポリペプチドを抗体と結合させる。インキュベーションに先立って、サンプルを燐酸塩緩衝食塩水（PBS）のような適当な希釈剤で希釈する。一般に、好適な接触時間（即ち、インキュベーション時間）は前立腺癌のある個人から得られたサンプル中のポリペプチドの存在を検出するのに充分な時間である。接触時間は結合および非結合ポリペプチド間の平衡が少なくとも約95％となる結合レベルを達成するのに充分な時間であることが好ましい。当業者には明らかなように、平衡を達成するのに必要な時間は、一定時間に亙って起こる結合レベルを評価することによって容易に測定できる。
次いで、例えば、0.1％Tween20（商標）を含有するPBSのような適当な緩衝液で固形支持材を洗浄することによって非結合サンプルを除去する。リポーター・グループを含有する第2抗体を固形支持材に加える。好ましリポーター・グループは上述したようなものである。
次に、結合ポリペプチドを検出するのに充分な時間に亙って、検出試薬を、固定された抗体-ポリペプチド複合体と一緒にインキュベートする。検出に適当な時間は、一定時間に亙って起こる結合のレベルを評価することによって決定することができる。次いで、結合しなかった検出試薬を除去し、結合した検出試薬を、リポーター・グループを利用して検出する。
一般に、APCsに本発明のポリヌクレオチド（またはその部分または変異体）をトランスフェクトさせることにより、コード化ポリペプチド、またはその免疫原性部分を細胞表面に発現させることができる。このようなトランスフェクション処理を生体外で行い、このトランスフェクトされた細胞を含有する薬剤を、本願明細書中に述べるよう治療目的に使用することができる。あるいは、樹状またはその他の抗原提示細胞をターゲットとする遺伝子運搬手段を患者に投与することによって、トランスフェクションが生体内で起こるようにすることもできる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７５】
好ましい実施例では、この分析において、固形支持材に固定した結合剤を使用し、これにポリペプチドを結合させ、サンプルの残余の部分から取り除く。結合しているポリペプチドを検出するため、リポーター・グループを含有し、結合剤／ポリペプチドと特異的に結合する検出試薬を使用する。検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体と特異的に結合する結合剤またはこの結合剤と特異的に結合する抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンなどである。或いは、ポリペプチドをリポーター・グループで標識し、結合剤をサンプルと共にインキュベートした後、固定結合剤に結合させる、競合アッセイを利用することもできる。この分析に使用できるポリペプチドとしては、完全長前立腺腫瘍タンパク質および、上記のように結合剤が結合するポリペプチド部分が挙げられる。