【手続補正書】
【提出日】平成20年5月16日(2008.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有糸分裂の能力があり、そしてＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及び任意の胚性期特異的な抗原を発現する、単離された細胞。
【請求項２】
単離された細胞が、さらに胚性期特異的な抗原を発現するものである請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項３】
細胞が、宿主への移植後、少なくとも１週、１〜約２週、約２〜約３週、約３〜約４週又は約５週以上経過した後に、卵母細胞を産生することが可能である、請求項１又は２に記載の単離された細胞。
【請求項４】
細胞が、宿主へに移植された後、１週未満で卵母細胞を産生することが可能である、請求項１〜３のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項５】
細胞が、宿主に移植された後、約２４〜約４８時間未満で、卵母細胞を産生することが可能である、請求項１〜４のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項６】
細胞が、胚性期特異的な抗原を発現する細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項７】
細胞が、雌性の生殖細胞系列幹細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項８】
細胞が、雌性の生殖細胞系列幹細胞の前駆細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項９】
細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項１０】
細胞がヒトの細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項１１】
胚性期特異的な抗原が、胚性期特異的な抗原−１型である、請求項１〜１０のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項１２】
ａ）請求項１〜１１のいずれかに記載の単離された細胞を、細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤の存在下で培養することにより、卵母細胞を産生させる、及び、
ｂ）インビトロで前記卵母細胞を受精させて接合体を形成させる
工程からなる、インビトロで受精させる方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかに記載の単離された細胞を、細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤の存在下で培養し、それにより卵母細胞を産生することを包含する、生体外で卵母細胞を産生する方法。
【請求項１４】
細胞を卵母細胞へ分化させる薬剤が、形質転換増殖因子、骨形成タンパク質、Ｗｎｔファミリータンパク質、ｋｉｔ−リガンド、白血病抑制因子、減数分裂活性化ステロール、Ｉｄタンパク質機能の調節因子及びＳｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ転写因子機能の調節因子からなる群より選択される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに記載の単離された細胞又はそれを含む細胞集団、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
細胞がヒトの細胞である、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
単離された細胞又はそれを含む細胞集団が、前記組成物中に、約５０〜約５５％、約５５〜約６０％、約６５〜約７０％、約７０〜約７５％、約７５〜約８０％、約８０〜約８５％、約８５〜約９０％、約９０〜約９５％又は約９５〜約１００％の細胞で存在する、請求項１５〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
医薬組成物の細胞が、組織へ生着して卵母細胞へと分化し、それにより卵母細胞を産生させるための医薬組成物である請求項１５〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２０】
医薬組成物の細胞が、組織へ生着して卵胞内で卵母細胞へと分化し、それにより卵胞形成を誘導させるための医薬組成物である請求項１５〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記組織が卵巣組織である、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
医薬組成物の細胞が、卵巣に生着して卵母細胞へ分化し、それにより不妊を治療するための医薬組成物である請求項１５〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
医薬組成物の細胞が、組織へ生着し卵母細胞へと分化し、それにより傷害を受けた卵巣組織を修復するための医薬組成物である請求項１５〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記傷害が、化学療法剤又は放射線照射に曝露された結果である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記化学療法剤が、ブスルファン、シクロホスファミド、５−ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、シスプラチン、メトトレキセート及びドキソルビシンからなる群より選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記傷害が、癌、多嚢胞性卵巣疾患、遺伝性疾患、免疫不全又は代謝性疾患の結果である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
医薬組成物の細胞が、卵巣に生着して卵母細胞へと分化し、それにより卵巣機能を回復させるための医薬組成物である請求項１５〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２８】
卵巣機能の回復が、閉経前又は閉経後のいずれかの段階である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を卵母細胞に分化させる薬剤を含む、卵母細胞を産生させるための医薬組成物。
【請求項３０】
分化させる薬剤が、形質転換増殖因子、骨形成タンパク質、Ｗｎｔファミリータンパク質、ｋｉｔ−リガンド、白血病抑制因子、減数分裂活性化ステロール、Ｉｄタンパク質機能の調節因子及びＳｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ転写因子機能の調節因子からなる群より選択される、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤と接触させ、それにより当該の雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を増大（expand）させることを含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞をエクスビボ又はインビトロで増大（expand）させる方法。
【請求項３２】
雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤が、細胞の増殖又は生存を促進する薬剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
薬剤が、インスリン様成長因子、形質転換増殖因子、骨形成タンパク質、Ｗｎｔタンパク質、線維芽細胞成長因子、スフィンゴシン−１−リン酸、レチノイン酸、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３の阻害剤、Ｂａｘ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、一酸化窒素産生の阻害剤及びヒストン脱アセチル化酵素活性の阻害剤からなる群より選択される、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞の量を増加させる薬剤を含む、雌性の生殖細胞系列幹細胞又はそれらの前駆細胞を増大（expand）させるための医薬組成物。
【請求項３５】
薬剤が、インスリン様成長因子、形質転換増殖因子、骨形成タンパク質、Ｗｎｔタンパク質、線維芽細胞成長因子、スフィンゴシン−１−リン酸、レチノイン酸、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３の阻害剤、Ｂａｘ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、一酸化窒素産生の阻害剤及びヒストン脱アセチル化酵素活性の阻害剤からなる群より選択される、請求項３４に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
哺乳動物の雌性の生殖細胞系列幹細胞の存在は、制御された様式で休止（原始）卵母細胞を含む卵胞の産生又は再産生、その結果として新しい備蓄をする卵巣の生来の能力を意味する。この問題を直接解明するために、成熟の雌性マウスは、卵母細胞死を同調するドキソルビシンを注入され（Perez, G. I. et al, (1997) Nature Med. 3, 1228-32）、そして生殖細胞動態を評価するために、薬物曝露後に複数の間隔で卵巣を回収した。予想したように、原始及び早期に成育している卵胞（卵母細胞）の急激で大規模な喪失が、ドキソルビシン処置後の最初の２４時間以内に起きた。しかしながら、原始及び全未成熟卵胞プールの両方の自発的な再生産は、処置後２４〜３６時間に観察され、卵母細胞を含む未成熟卵胞の数は、その後安定していた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
成熟哺乳動物の卵巣が新規の卵母細胞を十分に産生できることを更に示すために、ヒストン脱アセチル化阻害が造血幹細胞を急激に増大させることを示す最近の報告（Milhem, M. et al. (2004) Blood 103, 4102-4110）をベースとして用い、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）活性のインビボでの強烈な抑制が、同様に生殖細胞系列幹細胞機能を促進するかどうかをテストした。思春期前の雌性マウスは、広い範囲のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ；１０ｍｇ／ｋｇ・体重、ＤＭＳＯ中に再懸濁）又は対照媒体（ＤＭＳＯ）を、単回腹腔内投与された。動物は投与後２４時間で犠牲にされ、卵巣の組織学的調製が準備され、標準的な研究室の手順により卵母細胞を含む卵胞が数えられた（実施例１参照）。ＴＳＡ処置では、対照媒体処置された対照マウスの卵巣と比較して、卵巣当たり全健常の未成熟卵母細胞を含む卵胞の数を５３％増大させた。休止（原始）卵胞プールを４２％増加させただけでなく、早期に成育している（一次の）卵胞の数も増大させた（図７）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
ＴＳＡが２４０日齢の雌性マウスにおける原始卵胞数を２４時間以内に８９％まで増加させるという、かなり注目に値する結果が、成熟体で得られた。観察された増加は、発達の一次段階に対する原始卵胞の増殖活性化の比率が減少する（図７）、又は閉鎖発生率が減少する、の何れの原因にもならないことから、これらのデータは、卵母細胞産生及び卵胞形成が哺乳動物の雌性個体の成熟期の間持続するという、追加の証拠を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
【図１−１】図１−１は、出生後の卵巣生殖細胞の動態を表すグラフを示す。パネル（a）は、非閉鎖の卵胞の数、一方（b）は出生後の発達中のマウス卵巣における閉鎖、休止（原始）及び全未成熟（原始、一次、小さな前卵胞）卵胞の数を示す。
【図１−２】図１−２は、出生後の卵巣生殖細胞の動態を表すグラフを示す。パネル（c）は、分娩後２５日目に９，１０−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）に曝された卵巣における原始及び一次卵胞閉鎖の発生を表す。パネル（d）は、Ｃ５７Ｂｌ／６、ＣＤ１及びＡＫＲ／Ｊ系統のマウスにおける非閉鎖及び閉鎖の未成熟卵胞数の比較を示す。
【図２】図２は、赤毛猿に残存する非閉鎖の卵母細胞の数を示す。
【図３】図３は、出生後のマウス卵巣における減数分裂期の遺伝子発現の免疫組織化学的及びＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。パネル（a）から（d）は、単一細胞のＳＰＣ３免疫染色を表す。パネル（e）から（g）は、若年の成熟マウスから回収された、卵巣対精巣又は様々な組織におけるＳｃｐ３、Ｓｐｏ１１及びＤｍｃ１発現を示す。
【図４】図４は、幹細胞関連遺伝子の出生後の卵巣内発現を示す。左のパネルは、示された日齢又は分娩後８ヶ月（８ｍ）に回収されたマウス卵巣におけるｍｉｌｉ、ｐｕｍｉｌｉｏ−１（ｐｕｍ１）、ｐｕｍｉｌｉｏ−２（ｐｕｍ２）及びヌクレオステミン（nucleostemin）発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を表す。右のパネルは、分娩後４０〜４２日齢の雌性マウスの卵巣、脳、心臓、腎臓、肺及び脾臓から調製されたＲＮＡ試料における遺伝子の組織分布の分析を示す。
【図５】図５は、成熟の雌性マウスにおける原始卵胞貯蔵のブスルファン仲介の除去を表す。（a）のグラフは、対照媒体又はブスルファン処置マウスの卵巣に存在する非閉鎖及び閉鎖原始卵胞の数を示す。差し込み図は、原始卵胞閉鎖の結果を示す。パネル（b）から（e）は、対照媒体処置又はブスルファン処置マウスの卵巣の組織学的外見を表す。
【図６】図６は、マウスの卵巣機能に及ぼす抗がん処置（ブスルファン）の長期の評価結果における一次卵胞に対する原始卵胞の比率を示しているグラフである。この比率の計算は、増殖活性化を介して原始卵胞の喪失速度の評価を可能にする。
【図７】図７は、１３日目における雌性マウスの卵巣当たりの非閉鎖の未成熟卵胞の数に及ぼす広い範囲のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の効果を表すグラフを示す。右のパネルは休止（原始）及び早期成育（一次及び前卵胞）卵胞の数を定量しているのに対し、左のパネルは、対照媒体又はＴＳＡに応答する非閉鎖の未成熟卵胞の数を示す。
【図８】図８は、野生型卵巣組織が緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子導入の宿主の卵巣組織に結合し血管新生化されていることを示す。（a、b）外科手術後３〜４週間での嚢腔からの除去前（a）、及び除去後（b）における代表的な卵巣移植片の全体の形態。パネル（c）から（f）は、外科手術後３〜４週での顕微鏡下で光学（c、e）及び蛍光（ＧＦＰ；d、ｆ）で見られる代表的な卵巣移植片の全体の組織学的外見（白い点線）を示す。
【図９】図９は、ＧＦＰ遺伝子導入の生殖細胞が野生型卵巣における卵胞内の卵母細胞を形成することを示している顕微鏡写真である。パネル（a）及び（b）は、ヨウ化プロピジウムで対比染色された宿主（ＧＦＰ遺伝子導入の）及び移植された（野生型）卵巣組織の切片におけるＧＦＰ発現を示す。（a）ＧＦＰ陰性の顆粒膜細胞内に囲まれたＧＦＰ陽性の卵母細胞を含む移植された卵巣組織における卵胞。（b）。ＧＦＰ陰性の顆粒膜細胞内に囲まれたＧＦＰ陽性の卵母細胞を含む移植された卵巣組織における一次卵胞（白い点線）。
【図１０】図１０は、移植された卵巣組織における卵胞産生の追加例である。ＧＦＰ遺伝子導入のレシピエントの雌性個体の卵巣嚢腔に移植後４週目での野生型（ｗｔ）卵巣組織内に存在するＧＦＰ遺伝子導入の卵母細胞及び野生型顆粒膜細胞を含むふたつの隣り合う未成熟卵胞（ＰＩ、ヨウ化プロピジウム対比染色）。
【図１１】図１１は、出生後の初期（分娩後４日）と初期の生殖成熟体（分娩後４２日）の間のＢａｘ欠損の雌性マウス（遺伝子ノックアウト、ＫＯ）における卵母細胞の動態を表すグラフを示す。
【図１２】図１２は、出生後初期（分娩後４日）及び初期繁殖成熟体（分娩後４２日）の間のカスパーゼ-６欠損雌性マウス（遺伝子ノックアウト、ＫＯ）における卵母細胞の動態を表すグラフを示す。
【図１３】図１３は、分娩後４日の野生型（Ａ、Ｃに拡大図）及びＡｔｍ（毛細血管拡張性運動失調症遺伝子変異）の欠損（Ｂ、Ｄ）の卵巣の代表的組織を表す。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、野生型及びＡｔｍ欠損卵巣両方に生殖細胞系列マーカーの存在を示す（Ｅ）。
【図１４】図１４は、成熟マウス卵巣（Ｂ、Ａに示されるＳＳＥＡ１陽性細胞のより大きな拡大図；Ａ及びＣ、異なるマウス由来の卵巣；Ｄ、抗原の細胞表面発現を示している成熟卵巣における単一のＳＳＥＡ１陽性細胞）におけるＳＳＥＡ１発現（赤、ヨウ化プロピジウムにより青く強調された核と共に）の免疫組織化学的解析を表す。
【図１５】図１５は、雌性の生殖細胞系列幹細胞及び／又はその前駆体の単離のための１つの方法を図式的に示す。
【図１６】図１６は、ＳＳＥＡ−１単離（免疫精製）画分が、多分化能を意味する遺伝子（ＳＳＥＡ−１、Ｏｃｔ−４）、及びその系列細胞を生殖細胞系列に配置する遺伝子（Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｍｖｈ／Ｖａｓａ）を発現する細胞集団であるが、減数分裂進行中の生殖細胞（ＳＣＰ３）又は卵母細胞（ＧＤＦ９、ＺＰ３、ＨＤＡＣ６）で発現する遺伝子を欠如している細胞集団であることを表している。残存する卵巣組織は、成育卵母細胞及び休止原始卵母細胞を含み、このように全てのマーカー遺伝子はこの画分で発現している。