(57)【要約】本発明は、被検化合物と、スプライシングファクター３ｂ（ＳＦ３ｂ）との結合活性を測定する方法であって、以下の工程：（ａ）標識したプラジエノ化合物および被検化合物を、細胞または細胞画分と接触させ、（ｂ）結合した標識化合物の分布を測定することを含む前記方法を提供する。これにより、プラジエノライド類の標的分子に作用（結合）する新たな活性化合物などをスクリーニングすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化合物と、スプライシングファクター３ｂ（ＳＦ３ｂ）との結合活性を測定する方法であって、以下の工程：
（ａ）標識した下記式（Ｉ）で表される化合物および被検化合物を、細胞または細胞画分と接触させ、
（ｂ）結合した標識化合物の分布を測定すること
を含む前記方法。
2008016187.tif 000069
〔式（Ｉ）中、
Ｒ２、Ｒ１０、Ｒ１２およびＲ１４は、それぞれ独立して、同一または異なって、水素またはメチルを表す；
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって、
（１）水素、
（２）ヒドロキシ、
（３）それぞれ置換基を有していても良い
（ａ）Ｃ１−２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１−２２アルコキシ、
（ｃ）ＡｒＣＨ２Ｏ−（式中、Ａｒはそれぞれ置換基を有していても良いＣ６−１４アリールまたは５員環〜１４員環ヘテロアリールを表す）、
（ｄ）Ｃ２−２２アシロキシ、
（ｅ）Ｃ３−２２不飽和アシロキシ、
（ｆ）−ＯＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏはそれぞれ置換基を有していても良い
（ｉ）Ｃ６−１４アリール、
（ｉｉ）５員環〜１４員環ヘテロアリール、
（ｉｉｉ）Ｃ１−２２アルコキシ、
（ｉｖ）不飽和Ｃ２−２２アルコキシ、
（ｖ）Ｃ６−１４アリールオキシまたは
（ｖｉ）５員環〜１４員環ヘテロアリールオキシを表す）、
（ｇ）Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ、
（ｈ）ベンゼンスルホニルオキシまたは
（ｉ）−ＯＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は、それぞれ独立して、同一または異なってメチル、エチル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチルまたはフェニルを表す）、
（４）ハロゲンまたは
（５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２｛式中、ＲＭは単結合もしくは−Ｏ−ＣＯ−を表す；ＲＮ１およびＲＮ２は、
１）それぞれ独立して、同一または異なって、
（ａ）水素、または
（ｂ）それぞれ置換基を有していても良い
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル、
（ｉｉ）不飽和Ｃ３−２２アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ２−２２アシル、
（ｉｖ）不飽和Ｃ３−２２アシル、
（ｖ）Ｃ６−１４アリール、
（ｖｉ）５員環〜１４員環ヘテロアリール、
（ｖｉｉ）ベンジル
（ｖｉｉｉ）Ｃ１−２２アルキルスルホニルもしくは
（ｉｘ）ベンゼンスルホニルを表すか、あるいは、
２）ＮＲＮ１ＲＮ２が一緒になって置換基を有していても良い３員環〜１４員環の含窒素非芳香族複素環を表しても良い｝を表す；
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは
（１）それぞれ独立して、異なって
１）水素、
２）−ＯＲＨ（式中、ＲＨは水素、メチルまたはアセチルを表す）、
３）−ＯＲＤ｛式中、ＲＤはそれぞれ置換基を有していても良い
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル（ただし、メチルの場合は必ず置換基を有する）、
（ｉｉ）−ＣＨ２Ａｒ、
（ｉｉｉ）Ｃ３−２２アシル、
（ｉｖ）Ｃ３−２２不飽和アシル、
（ｖ）−ＣＯＲｃｏ、
（ｖｉ）Ｃ１−２２アルキルスルホニル、
（ｖｉｉ）ベンゼンスルホニルまたは
（ｖｉｉｉ）−ＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３を表す｝または
４）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２であるか、または
（２）Ｒ７ａとＲ７ｂが一緒になって
１）ケトン構造（＝Ｏ）を表すか、または
２）オキシム構造（＝ＮＯＲｏｘ：式中、Ｒｏｘはそれぞれ置換基を有していても良い
（ａ）Ｃ１−２２アルキル、
（ｂ）不飽和Ｃ３−２２アルキル、
（ｃ）Ｃ６−１４アリール、
（ｄ）５員環〜１４員環ヘテロアリールまたは
（ｅ）ベンジルを表す）を表す；
さらに、Ｒ３ａとＲ３ｂが一緒になってケトン構造（＝Ｏ）もしくはオキシム構造（＝ＮＯＲｏｘ）を表しても良い；
さらに、Ｒ６ａとＲ６ｂが一緒になってスピロオキシラン環またはエキソメチレンを表しても良い；
さらに、Ｒ６ａとＲ６ｂのどちらか一方とＲ７ａとＲ７ｂのどちらか一方が一緒になって１，３−ジオキソラン環を形成しても良い；
Ｇは
［１］
2008016187.tif 000070
｛式中、Ｒ１６ａおよびＲ１６ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって水素、メチルまたはヒドロキシを表す；
Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８ａ、Ｒ１８ｂ、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂ、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって
（１）水素、
（２）置換基を有していても良いメチル、
（３）−ＯＲＨ、
（４）−ＯＲＤ、
（５）ハロゲンまたは
（６）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２を表す；
Ｒ２１ｃは
（１）水素または
2008016187.tif 000071
立して、同一または異なって、
（ａ）水素、
（ｂ）メチル、
（ｃ）ヒドロキシ、
（ｄ）−ＯＲＨ、
（ｅ）−ＯＲＤ、
（ｆ）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２または
（ｇ）ハロゲンを意味する；
さらに、
Ｒ１８ａまたはＲ１８ｂのどちらか一方とＲ１９ａまたはＲ１９ｂのどちらか一方が一緒
2008016187.tif 000072
さらに、
Ｒ１９ａまたはＲ１９ｂのどちらか一方とＲ２０ａまたはＲ２０ｂのどちらか一方が一緒
2008016187.tif 000073
さらに、
Ｒ２１ａとＲ２１ｂが一緒になって
（ａ）ケトン構造（＝Ｏ）を表すかまたは
（ｂ）オキシム構造（＝ＮＯＲｏｘ）を表しても良い；
さらに、
Ｒ２１ａまたはＲ２１ｂのどちらか一方とＲ２２ａまたはＲ２２ｂのどちらか一方が一緒
2008016187.tif 000074
さらに、
Ｒ１９ａまたはＲ１９ｂのどちらか一方とＲ２１ａまたはＲ２１ｂのどちらか一方が一緒
2008016187.tif 000075
［２］
2008016187.tif 000076
｛式中、
Ｒ１６ａ、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８ａおよびＲ１８ｂは式（Ｇ−Ｉ）中の定義と同義である；
Ｒ１８ｃは
（１）水素または
2008016187.tif 000077
は、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、メチル、ヒドロキシ、メトキシまたはアセトキシを表し、Ｒｆ５はメチルまたはエチルを表す）を表す｝で表されるか、または
［３］
2008016187.tif 000078
｛式中、Ｒ１６ａ、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａおよびＲ１７ｂは式（Ｇ−Ｉ）中の定義と同義である；
Ｒ１７ｃは
（１）水素または
2008016187.tif 000079
Ｒｆ４ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、メチル、ヒドロキシ、メトキシまたはアセトキシを表し、Ｒｆ５はメチルまたはエチルを表す）を表す｝で表される。〕
【請求項２】
式（Ｉ）で表される化合物が下記式（ＩＶ）で表される化合物である、請求項１に記載の方法。
2008016187.tif 000080
〔式（ＩＶ）中、
Ｒ１６ｃ、Ｒ１７ｃおよびＲ２１ｃは、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、ヒドロキシまたはメトキシメチルを表す；
Ｒ７ｃは、ヒドロキシ、アセトキシ、Ｏ−ＣＯ−ＮＲＮ１’ＲＮ２’（式中、ＲＮ１’、ＲＮ２’は、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、Ｃ１−６アルキルを表す）
で表される。〕
【請求項３】
式（Ｉ）で表される化合物が下記式（Ｖ）で表される化合物である、請求項１に記載の方法。
2008016187.tif 000081
〔式（Ｖ）中、
Ｒ１６ｄは、水素またはヒドロキシを表す；
Ｒ７ｄは、ヒドロキシ、アセトキシ、Ｏ−ＣＯ−ＮＨＲＮ１’（式中、ＲＮ１’はＣ１−６アルキルを表す）で表される。〕
【請求項４】
被検化合物がＳＦ３ｂ中のＳＡＰ１３０と結合する活性を測定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
標識が放射性同位元素による標識である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
標識が蛍光標識である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
標識がビオチン標識である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
標識が、光照射により蛋白質と結合する化合物による標識である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）において、標識化合物が核に分布する量を測定して、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）において、標識化合物が核スペックルに分布する量を測定して、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）において、標識化合物が核スペックルに分布する形態から、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）において、標識化合物がＳＦ３ｂに結合して分布する量を測定して、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において、標識化合物がＳＡＰ１３０に結合して分布する量を測定して、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によりＳＦ３ｂと結合する活性を有すると判定される、ＳＦ３ｂと結合する抗癌剤。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によりＳＡＰ１３０と結合する活性を有すると判定される、ＳＡＰ１３０と結合する抗癌剤。
【請求項１６】
下記式（ＩＩ）に記載のいずれかの標識化合物。
2008016187.tif 000082
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラジエノライド類およびその誘導体のターゲット分子、本ターゲット分子に結合する化合物及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の抗癌剤研究により、新たなキナーゼ阻害剤が相次いで見出され、このキナーゼ阻害剤は、癌患者の治療やＱＯＬの改善に貢献している。しかしながら、抗癌剤による癌治療成績はいまだ決して十分ではなく、さらに新しい抗癌剤開発が熱望されている。特に新しい創薬ターゲットに基づく新規な抗癌剤の開発は、既存薬では十分な治療効果が得られない癌患者の治療のみならず、既存薬との併用によって新たな治療戦略の構築が可能になると期待されている。
プラジエノライド（Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ）類はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて優れた抗腫瘍活性を発揮することが知られている（ＷＯ  ０２／０６０８９０、ＷＯ０３／０９９８１３、ＷＯ０４／０１１６６１、ＷＯ  ０４／０１１４５９）。そして、プラジエノライド類は既存の抗腫瘍剤とは全く異なる抗癌スペクトラムを示し、新しい作用機序を有することが示唆されている。しかしながら、生体内標的分子をはじめ詳細な作用メカニズムは未解明であった。
【発明の開示】
【０００３】
プラジエノライド類が結合している標的分子を単離・同定することは、新たな創薬ターゲットを見出すことに他ならない。そこで本発明者らは、プラジエノライド類を基に種々のプローブ化合物をデザイン・合成し、その標的的分子の同定を試みた。
本発明は、プラジエノライド類の生理活性を発揮する分子標的を同定するとともに、その同定に用いるプローブ化合物、ならびに新たに同定された分子標的化合物および／またはプローブ関連化合物を用いることにより、プラジエノライド類の標的分子に作用（結合）する新たな活性化合物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の背景からプラジエノライド類が生体内で特異的に結合している標的分子を同定するため鋭意研究を行なった。その結果、本発明者は、プラジエノライド類がＳＡＰ１３０（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ３ｂ３、ＳＦ３ｂ３とも称する）と呼ばれる因子に結合し、ＳＡＰ１３０の機能、更にはＳＡＰ１３０構成要素とする複合体の機能を修飾することにより生理活性を発揮していることを解明した。ここで、ＳＡＰ１３０はＳＦ３ｂ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ３ｂ、Ｗｉｌｌ  Ｃｌ  ｅｔ．ａｌ，ＥＭＢＯ，２００１，２０（１６），４５３６−４６）のコンポーネントであり、ＳＦ３ｂはスプライシングマシナリーであるＵ２  ｓｎＲＮＰの構成因子である。
ＳＦ３ｂの機能に影響を与える化合物は、
（１）スプライシングと転写との密接な関連から（Ｔｏｍ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ＆  Ｒｏｂｉｎ  Ｒｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１６，４９９−５０７、Ｎｉｃｋ  Ｊ．Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｃｅｌｌ，２００２，１０８，５０１−５１２）、転写全般に広く影響を与える可能性があり、
（２）また、ＳＦ３ｂが、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅとの結合を介してｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅと関連することが示唆されることから（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ａｕｇ；１８（８）：４５２６−３６）、ＳＦ３ｂはｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅにも影響を及ぼすと考えられる。
これらのことから、ＳＦ３ｂは、新規な抗癌剤のターゲットとして非常に有望であると考えられる。
さらに、新たにデザイン・合成したプローブ化合物を利用することによりＳＡＰ１３０、ＳＦ３ｂ、およびＵ２ｓｎＲＮＰに結合する新たな生理活性物質を探索することが可能であることが示され、これらの分子と結合する抗腫瘍剤をスクリーニングし得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである。
（１）被検化合物と、スプライシングファクター３ｂ（ＳＦ３ｂ）との結合活性を測定する方法であって、以下の工程：
（ａ）標識した下記式（１）で表される化合物および被検化合物を、細胞または細胞画分と接触させ、
（ｂ）結合した標識化合物の分布を測定すること
を含む前記方法。
2008016187.tif 000002
〔式（Ｉ）中、
Ｒ２、Ｒ１０、Ｒ１２およびＲ１４は、それぞれ独立して、同一または異なって、水素またはメチルを表す；
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって、
（１）水素、
（２）ヒドロキシ、
（３）それぞれ置換基を有していても良い
（ａ）Ｃ１−２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１−２２アルコキシ、
（ｃ）ＡｒＣＨ２Ｏ−（式中、Ａｒはそれぞれ置換基を有していても良いＣ６−１４アリールまたは５員環〜１４員環ヘテロアリールを表す）、
（ｄ）Ｃ２−２２アシロキシ、
（ｅ）Ｃ３−２２不飽和アシロキシ、
（ｆ）−ＯＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏはそれぞれ置換基を有していても良い
（ｉ）Ｃ６−１４アリール、
（ｉｉ）５員環〜１４員環ヘテロアリール、
（ｉｉｉ）Ｃ１−２２アルコキシ、
（ｉｖ）不飽和Ｃ２−２２アルコキシ、
（ｖ）Ｃ６−１４アリールオキシまたは
（ｖｉ）５員環〜１４員環ヘテロアリールオキシを表す）、
（ｇ）Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ、
（ｈ）ベンゼンスルホニルオキシまたは
（ｉ）−ＯＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は、それぞれ独立して、同一または異なってメチル、エチル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチルまたはフェニルを表す）、
（４）ハロゲンまたは
（５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２｛式中、ＲＭは単結合もしくは−Ｏ−ＣＯ−を表す；ＲＮ１およびＲＮ２は、
１）それぞれ独立して、同一または異なって、
（ａ）水素、または
（ｂ）それぞれ置換基を有していても良い
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル、
（ｉｉ）不飽和Ｃ３−２２アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ２−２２アシル、
（ｉｖ）不飽和Ｃ３−２２アシル、
（ｖ）Ｃ６−１４アリール、
（ｖｉ）５員環〜１４員環ヘテロアリール、
（ｖｉｉ）ベンジル
（ｖｉｉｉ）Ｃ１−２２アルキルスルホニルもしくは
（ｉｘ）ベンゼンスルホニルを表すか、あるいは、
２）ＮＲＮ１ＲＮ２が一緒になって置換基を有していても良い３員環〜１４員環の含窒素非芳香族複素環を表しても良い｝を表す；
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは
（１）それぞれ独立して、異なって
１）水素、
２）−ＯＲＨ（式中、ＲＨは水素、メチルまたはアセチルを表す）、
３）−ＯＲＤ｛式中、ＲＤはそれぞれ置換基を有していても良い
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル（ただし、メチルの場合は必ず置換基を有する）、
（ｉｉ）−ＣＨ２Ａｒ、
（ｉｉｉ）Ｃ３−２２アシル、
（ｉｖ）Ｃ３−２２不飽和アシル、
（ｖ）−ＣＯＲｃｏ、
（ｖｉ）Ｃ１−２２アルキルスルホニル、
（ｖｉｉ）ベンゼンスルホニルまたは
（ｖｉｉｉ）−ＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３を表す｝または
４）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２であるか、または
（２）Ｒ７ａとＲ７ｂが一緒になって
１）ケトン構造（＝Ｏ）を表すか、または
２）オキシム構造（＝ＮＯＲｏｘ：式中、Ｒｏｘはそれぞれ置換基を有していても良い
（ａ）Ｃ１−２２アルキル、
（ｂ）不飽和Ｃ３−２２アルキル、
（ｃ）Ｃ６−１４アリール、
（ｄ）５員環〜１４員環ヘテロアリールまたは
（ｅ）ベンジルを表す）を表す；
さらに、Ｒ３ａとＲ３ｂが一緒になってケトン構造（＝Ｏ）もしくはオキシム構造（＝ＮＯＲｏｘ）を表しても良い；
さらに、Ｒ６ａとＲ６ｂが一緒になってスピロオキシラン環またはエキソメチレンを表しても良い；
さらに、Ｒ６ａとＲ６ｂのどちらか一方とＲ７ａとＲ７ｂのどちらか一方が一緒になって１，３−ジオキソラン環を形成しても良い；
Ｇは
［１］
2008016187.tif 000003
｛式中、Ｒ１６ａおよびＲ１６ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって水素、メチルまたはヒドロキシを表す；
Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８ａ、Ｒ１８ｂ、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂ、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって
（１）水素、
（２）置換基を有していても良いメチル、
（３）−ＯＲＨ、
（４）−ＯＲＤ、
（５）ハロゲンまたは
（６）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２を表す；
Ｒ２１ｃは
（１）水素または
2008016187.tif 000004
して、同一または異なって、
（ａ）水素、
（ｂ）メチル、
（ｃ）ヒドロキシ、
（ｄ）−ＯＲＨ、
（ｅ）−ＯＲＤ、
（ｆ）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２または
（９）ハロゲンを意味する；
さらに、
Ｒ１８ａまたはＲ１８ｂのどちらか一方とＲ１９ａまたはＲ１９ｂのどちらか一方が一緒
2008016187.tif 000005
さらに、
Ｒ１９ａまたはＲ１９ｂのどちらか一方とＲ２０ａまたはＲ２０ｂのどちらか一方が一緒
2008016187.tif 000006
さらに、
Ｒ２１ａとＲ２１ｂが一緒になって（ａ）ケトン構造（＝Ｏ）を表すかまたは（ｂ）オキシム構造（＝ＮＯＲｏｘ）を表しても良い；
さらに、
Ｒ２１ａまたはＲ２１ｂのどちらか一方とＲ２２ａまたはＲ２２ｂのどちらか一方が一緒
2008016187.tif 000007
さらに、
Ｒ１９ａまたはＲ１９ｂのどちらか一方とＲ２１ａまたはＲ２１ｂのどちらか一方が一緒
2008016187.tif 000008
［２］
2008016187.tif 000009
｛式中、
Ｒ１６ａ、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８ａおよびＲ１８ｂは式（Ｇ−Ｉ）中の定義と同義である；
Ｒ１８ｃは
（１）水素または
2008016187.tif 000010
は、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、メチル、ヒドロキシ、メトキシまたはアセトキシを表し、Ｒｆ５はメチルまたはエチルを表す）を表す｝で表されるか、または
［３］
2008016187.tif 000011
｛式中、Ｒ１６ａ、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａおよびＲ１７ｂは式（Ｇ−Ｉ）中の定義と同義である；
Ｒ１７ｃは
（１）水素または
2008016187.tif 000012
びＲｆ４ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、メチル、ヒドロキシ、メトキシまたはアセトキシを表し、Ｒｆ５はメチルまたはエチルを表す）を表す｝で表される。〕
（２）式（Ｉ）で表される化合物が下記式（ＩＶ）で表される化合物である、（１）に記載の方法。
2008016187.tif 000013
〔式（ＩＶ）中、
Ｒ１６ｃ、Ｒ１７ｃおよびＲ２１ｃは、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、ヒドロキシまたはメトキシメチルを表す；
Ｒ７ｃは、ヒドロキシ、アセトキシ、Ｏ−ＣＯ−ＮＲＮ１’ＲＮ２’（式中、ＲＮ１’、ＲＮ２’は、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、Ｃ１−６アルキルを表す）で表される。〕
（３）式（Ｉ）で表される化合物が下記式（Ｖ）で表される化合物である、（１）に記載の方法。
2008016187.tif 000014
〔式（Ｖ）中、
Ｒ１６ｄは、水素またはヒドロキシを表す；
Ｒ７ｄは、ヒドロキシ、アセトキシ、Ｏ−ＣＯ−ＮＨＲＮ１’（式中、ＲＮ１’はＣ１−６アルキルを表す）で表される。〕
（４）被検化合物がＳＦ３ｂ中のＳＡＰ１３０と結合する活性を測定する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）標識が放射性同位元素による標識である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）標識が蛍光標識である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（７）標識がビオチン標識である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（８）標識が、光照射により蛋白質と結合する化合物による標識である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（９）工程（ｂ）において、標識化合物が核に分布する量を測定して、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）工程（ｂ）において、標識化合物が核スペックルに分布する量を測定して、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）工程（ｂ）において、標識化合物が核スペックルに分布する形態から、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）工程（ｂ））において、標識化合物がＳＦ３ｂに結合して分布する量を測定して、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）工程（ｂ）において、標識化合物がＳＡＰ１３０に結合して分布する量を測定して、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）前記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法によりＳＦ３ｂと結合する活性を有すると判定される、ＳＦ３ｂと結合する抗癌剤。
（１５）前記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法によりＳＡＰ１３０と結合する活性を有すると判定される、ＳＡＰ１３０と結合する抗癌剤。
（１６）下記式（ＩＩ）に記載のいずれかの標識化合物
2008016187.tif 000015
本発明により、プラジエノライド類の標的分子に作用（結合）する新たな活性化合物などをスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１ａは、１Ｈ−ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍの図である。
図１ｂは、ＥＳＩ−ＭＳの図である。
図１ｃは、トリチウムプローブ化合物の細胞内分布を示す図である。グラフの縦軸はサンプル中の放射活性値をプローブの比活性値からモル数に換算した値で示した。
図１ｄは、トリチウムプローブ化合物の細胞内分布（活性炭アッセイ）を示す図である。
図２は、プラジエノ類縁体および誘導体によるトリチウムプローブとの競合実験結果（競合化合物の生物活性値と競合率の相関）を示す図である。
図３ａは、蛍光プローブの細胞内局在の観察結果を示す図である。
図３ｂは、蛍光プローブの細胞内局在の観察結果（プラジエノライド化合物競合実験結果）を示す図である。
図４は、トリチウムプローブ処理細胞から調整した核フラクションの免疫沈降実験結果を示す図である。
図５ａは、光アフィニティー・ビオチンプローブ処理による結合蛋白質の検出結果を示す図である。
図５ｂは、光アフィニティー・ビオチンプローブ処理による結合蛋白質の検出結果（ＳＡＰ１５５，ＳＡＰ１４５，ＳＡＰ１３０のバンド位置の比較結果）を示す図である。
図６ａは、ＧＦＰ融合ＳＡＰ１４５を用いたバンドシフトの検出実験結果を示す図である。
図６ｂは、ＧＦＰ融合ＳＡＰ１３０を用いたバンドシフトの検出実験結果を示す図である。
図７は、プラジエノ化合物による光アフィティー・ビオチンプローブとの競合実験結果を示す図である。
図８ａは、画像解析に用いた蛍光プローブの画像の代表例を示す図である。
図８ｂは、画像解析結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる、米国仮出願６０／８２１，１９９の開示内容を包含する。
本発明において、上記式（Ｉ）で表される化合物は、ＷＯ  ０２／０６０８９０、ＷＯ０３／０９９８１３、ＷＯ  ０４／０１１６６１、ＷＯ  ０４／０１１４５９に記載され、抗腫瘍活性が認められている化合物群であり、本発明中における標識される化合物として使用することができる。本明細書中では「プラジエノライド類」と称し、場合によっては「プラジエノライド類縁体または誘導体」とも称する。その好適な例は下記式（ＩＶ）または（Ｖ）に示す化合物である。
2008016187.tif 000016
〔式（ＩＶ）中、
Ｒ１６ｃ、Ｒ１７ｃおよびＲ２１ｃは、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、ヒドロキシまたはメトキシメチルを表す；
Ｒ７ｃは、ヒドロキシ、アセトキシ、Ｏ−ＣＯ−ＮＲＮ１’ＲＮ２’（式中、ＲＮ１’、ＲＮ２’は、それぞれ独立して、同一または異なって、水素、Ｃ１−６アルキルを表す）で表される。〕
2008016187.tif 000017
〔式（Ｖ）中、
Ｒ１６ｄは、水素またはヒドロキシ、好ましくは水素を表す；
Ｒ７ｄは、ヒドロキシ、アセトキシ、Ｏ−ＣＯ−ＮＨＲＮ１’（式中、ＲＮ１’はＣ１−６アルキルを表す）で表される。〕
また、標識は抗腫瘍活性が消失しない限りいかなる位置に導入してもよいが、好ましくは７位のアセチル基を修飾（標識）することが好ましい。標識方法としては、放射性同位元素による標識、蛍光色素（蛍光発色団）による標識等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、標識する分子にビオチンを結合させて、特異的に結合するアビジンを用いて検出する方法も採用することができる。但し、特異的結合は、ビオチンとアビジンとのペアによる検出に限定されるものではない。
標識する分子に、光照射により活性化して周囲の官能基と共有結合を形成する構造（光アフィニティーモイエティー）を導入し、光を当てて共有結合させた後は、ＳＤＳ等の蛋白質変性剤で処理しても標識分子が解離しないような工夫を施すことも可能である。
標識化合物の合成方法は、具体的には、実施例Ａ１〜Ａ５に記載されている。本明細書中では、「標識化合物」は、式（Ｉ）で表される化合物を標識した化合物であり、その好適な例は、式（ＩＩ）に記載されているいずれかの化合物である。
被検化合物が、Ｕ２  ｓｎＲＮＰと、好ましくはＳＦ３ｂと、更に好ましくはＳＡＰ１３０と作用する（結合する）ことを検定するためのスクリーニング方法としては、（ａ）標識した下記式（Ｉ）で表される化合物および被検化合物を、細胞または細胞画分と接触させ、（ｂ）結合した標識化合物の分布を測定することを含む方法が挙げられ、より具体的には、以下の方法が挙げられる。尚、「接触」とは、標識した式（Ｉ）で表される化合物および被検化合物と細胞または細胞画分とを同一の反応系又は培養系に存在させることを意味し、例えば、標識した式（Ｉ）で表される化合物および被検化合物を細胞の培養容器に添加すること、標識した式（Ｉ）で表される化合物および被検化合物の存在下で細胞を培養すること、ならびに標識した式（Ｉ）で表される化合物および被検化合物と細胞画分溶液とを混合することなどが含まれる。
１．被検化合物が、核への標識プラジエノライド類の分布を抑制する活性を利用して検定する方法
（１）細胞を被検化合物及び標識プラジエノライド類の存在下で培養した後、細胞を核画分とそれ以外の画分に分画する。被検化合物が存在する場合において、標識プラジエノライド類の核画分中の量が被件化合物の存在しない場合と比べて少なくなったとき、例えば、５０％以下、好ましくは７０％以下、更に好ましくは９０％以下のときは、被検化合物は、Ｕ２  ｓｎＲＮＰと、好ましくはＳＦ３ｂと、更に好ましくはＳＡＰ１３０と作用する（結合する）活性を有すると判断する。
本発明においては、細胞を核画分とそれ以外の画分に分画した後に、被検化合物及び標識プラジエノライド類をそれぞれの画分に加えて適当な時間インキュベーションし、その後、核画分中の標識プラジエノライド類の量を測定することも可能である。また、被検化合物と標識プラジエノライド類は、各画分に同時に加えてもよく、被検化合物および標識プラジエノライド類のいずれか一方を先に加えてもよい。好ましくは、被検化合物を先に加える方が良い。
実施例Ｂ２に記載されている通り、被検化合物の抗腫瘍活性と、標識プラジエノライド類の核画分への分布の抑制活性の間には強い相関関係が認められる。したがって、本発明の方法により、Ｕ２  ｓｎＲＮＰと、好ましくはＳＦ３ｂと、更に好ましくはＳＡＰ１３０と作用（結合）して抗腫瘍活性を示す化合物をスクリーニングすることが可能である。
（２）核への標識プラジエノライド類の分布は、細胞を光学的に解析（例えば顕微鏡を用いて核への分布を画像から定量）することにより調べることができる。そして、光学的に解析した結果を指標として、核への標識プラジエノライド類の分布を抑制する化合物を検定することができる。画像解析により核への標識プラジエノライド類の分布を調べる方法の例を実施例Ｂ９に記載した。
２．被検化合物が、核スペックルへの標識プラジエノライド類の分布を抑制する活性を利用して検定する方法
細胞を被検化合物及び標識プラジエノライド類の存在下で培養した後、核スペックルへの標識プラジエノライド類の分布を、細胞を光学的に解析（例えば顕微鏡を用いて核スペックルへの分布を画像から定量）することにより調べることができる。そして、光学的に解析した結果を指標として、核スペックルへの標識プラジエノライド類の分布を抑制する化合物を検定することができる。
核スペックルは、核スペックルに存在する蛋白質に対する抗体、例えば抗ＳＣ−３５抗体により染色することができ、染色した核スペックルと同様に分布する標識プラジエノライド類を定量することにより、標識プラジエノライド類の核スペックルへの分布を測定することが可能である。
被検化合物が存在する場合において、標識プラジエノライド類の核スペックル中の量が被件化合物の存在しない場合と比べて少なくなったとき、例えば、５０％以下、好ましくは７０％以下、更に好ましくは９０％以下のときは、被検化合物は、Ｕ２  ｓｎＲＮＰと、好ましくはＳＦ３ｂと、更に好ましくはＳＡＰ１３０と作用する（結合する）活性を有すると判断する。
また細胞を光学的に観察あるいは画像解析して、標識化合物が核スペックルに分布する形態から、被検化合物がＳＦ３ｂと結合する活性を測定することもできる。例えば、核スペックルが凝集して大きな核スペックルとして観察される場合に、被検化合物が、Ｕ２  ｓｎＲＮＰと、好ましくはＳＦ３ｂと、更に好ましくはＳＡＰ１３０と作用する（結合する）活性を有すると判断することができる。
実施例Ｂ３に記載されている通り、被検化合物の抗腫瘍活性と、標識プラジエノライド類の核スペックルへの分布の抑制活性との間に相関が認められることから、本発明の方法により、Ｕ２  ｓｎＲＮＰと、好ましくはＳＦ３ｂと、更に好ましくはＳＡＰ１３０と作用（結合）して抗腫瘍活性を示す化合物をスクリーニングすることが可能である。
３．被検化合物が、Ｕ２ｓｎＲＮＰ、ＳＦ３ｂまたはＳＡＰ１３０への標識プラジエノライド類の結合を抑制する活性を利用して検定する方法
細胞を被検化合物、及び標識プラジエノライド類、好ましくは光アフィニティー標識プラジエノライド類の存在下で培養する。標識プラジエノライド類として光アフィニティー標識プラジエノライド類を使用するときは、培養物に光を照射する。そして、光を照射した後に細胞を可溶化し、可溶化成分中に含まれる蛋白質を分画、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画して、ＳＡＰ１３０が含まれる画分の標識プラジエノライド類を定量する。
好ましくは、被検化合物、および光アフィニティー標識プラジエノライド類存在下で培養した細胞を可溶化して得られた可溶化成分に対して、抗ＳＡＰ１５５抗体、抗ＳＡＰ１４５抗体、抗ＳＡＰ１２０抗体あるいは抗Ｕ２Ｂ”抗体等、好ましくは抗ＳＡＰ１５５抗体を処理して得た免疫沈降サンプルに対して、光照射を行うこともできる。また、可溶化成分に抗ＳＡＰ１５５抗体、抗ＳＡＰ１４５抗体、抗ＳＡＰ１２０抗体あるいは抗Ｕ２Ｂ”抗体等、好ましくは抗ＳＡＰ１５５抗体を処理して得た免疫沈降サンプルに対して、被検化合物、および光アフィニティー標識プラジエノライド類を処理した後、光照射を行うことも出来る。
光照射の際の波長は特に限定されるものではないが、使用する光アフィニティープローブを活性化する波長が好ましい。
被検化合物が存在する場合において、標識プラジエノライド類のＵ２ｓｎＲＮＰ、ＳＦ３ｂまたはＳＡＰ１３０画分中の量が被検化合物の存在しない場合と比べて少なくなったとき、例えば５０％以下、好ましくは７０％以下、更に好ましくは９０％以下のときは、被検化合物は、Ｕ２  ｓｎＲＮＰと、好ましくはＳＦ３ｂと、更に好ましくはＳＡＰ１３０と作用する（結合する）活性を有すると判断する。
本発明においては、被検化合物及び標識プラジエノライド類を、細胞を可溶化した後にその可溶化成分中に加えて適当な時間インキュベーションし、その後ＳＡＰ１３０画分中の標識プラジエノライド類の量を測定することも可能である。また、被検化合物と標識プラジエノライド類は、可溶化成分中に同時に加えてもよく、被検化合物および標識プラジエノライド類のいずれか一方を先に加えてもよい。好ましくは被検化合物を先に加える方が良い。
ＳＡＰ１３０を、例えばＧＦＰの様なタグとなる蛋白質との融合蛋白として発現させた細胞を用いると、ＳＡＰ１３０の分画が容易となり好適である。また、ＳＡＰ１４５を例えばＧＦＰの様なタグとなる蛋白質との融合蛋白質として発現させた細胞に対して、抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫沈降実験を行うことでＳＦ３ｂの分画することも出来る。
実施例Ｂ７に記載されている通り、被検化合物の抗腫瘍活性と、標識プラジエノライド類のＳＡＰ１３０画分への分布の抑制活性の間に相関が認められることから、この方法によりＳＡＰ１３０に作用（結合）して抗腫瘍活性を示す化合物をスクリーニングすることが可能である。
本スクリーニング系により見出される化合物は、ＲＮＡのスプライシングに影響を与え、抗癌剤として有用である。更にスプライシングの異常により起こると考えられる他の疾患、例えば神経変性疾患（例えば家族性アルツハイマー病）、痴呆（例えば前頭側頭型痴呆症（Ｈｕｔｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９３：７０２−７０５，１９９８））、精神疾患（例えば家族性自律神経失調症（Ｈｉｍｓ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００７，８５（２）：１４９−６１．Ｅｐｕｂ２００７）、筋萎縮性および緊張性の変性疾患（例えば脊髄性筋萎縮症、筋強直性ジストロフィー）、早老症、脳腫瘍、家族性高コレステロール血症、家族性成長ホルモン単独欠乏症タイプＩＩ（Ｆａｕｓｔｉｎｏ，Ｎ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１７：４１９−４３７，２００６）、及び自己免疫疾患の治療剤としても有用であると考えられる。また、増殖の過程でスプライシングを利用しているウイルス、例えばレトロウイルス（特にＨＩＶ）感染症の治療剤としても有用であると考えられる。
ここで、式（Ｉ）の化合物について説明する。
式（Ｉ）において、Ｒ２、Ｒ１０、Ｒ１２およびＲ１４は、それぞれ独立して、同一または異なって、水素またはメチルを表す。
式（Ｉ）において、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって、次の（１）〜（５）のいずれかを表す。
（１）水素、
（２）ヒドロキシ、
（３）それぞれ置換基を有していても良い、
（ａ）Ｃ１−２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１−２２アルコキシ、
（ｃ）ＡｒＣＨ２Ｏ−（式中、Ａｒはそれぞれ置換基を有していても良いＣ６−１４アリールまたは５員環〜１４員環ヘテロアリールを表す）、
（ｄ）Ｃ２−２２アシロキシ、
（ｅ）Ｃ３−２２不飽和アシロキシ、
（ｆ）−ＯＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏはそれぞれ置換基を有していても良い
（ｉ）Ｃ６−１４アリール、
（ｉｉ）５員環〜１４員環ヘテロアリール、
（ｉｉｉ）Ｃ１−２２アルコキシ、
（ｉｖ）不飽和Ｃ２−２２アルコキシ、
（ｖ）Ｃ６−１４アリールオキシまたは
（ｖｉ）５員環〜１４員環ヘテロアリールオキシを表す）、
（ｇ）Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ、
（ｈ）ベンゼンスルホニルオキシまたは
（ｉ）−ＯＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は、それぞれ独立して、同一または異なってメチル、エチル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチルまたはフェニルを表す）、
（４）ハロゲンまたは
（５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２｛式中、ＲＭは単結合もしくは−Ｏ−ＣＯ−。
この場合、ＲＮ１およびＲＮ２は、次の１）又は２）を表す。
１）それぞれ独立して、同一または異なって、
（ａ）水素、または
（ｂ）それぞれ置換基を有していても良い
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル、
（ｉｉ）不飽和Ｃ３−２２アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ２−２２アシル、
（ｉｖ）不飽和Ｃ３−２２アシル、
（ｖ）Ｃ６−１４アリール、
（ｖｉ）５員環〜１４員環ヘテロアリール、
（ｖｉｉ）ベンジル
（ｖｉｉｉ）Ｃ１−２２アルキルスルホニルもしくは
（ｉｘ）ベンゼンスルホニルを表すか、あるいは、
２）ＮＲＮ１ＲＮ２が一緒になって置換基を有していても良い３員環〜１４員環の含窒素非芳香族複素環を表しても良い。
式（Ｉ）において、Ｒ７ａおよびＲ７ｂは次の（１）又は（２）を表す。
（１）それぞれ独立して、異なって
１）水素、
２）−ＯＲＨ（式中、ＲＨは水素、メチルまたはアセチルを表す）、
３）−ＯＲＤ｛式中、ＲＤはそれぞれ置換基を有していても良い
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル（ただし、メチルの場合は必ず置換基を有する）、
（ｉｉ）−ＣＨ２Ａｒ、
（ｉｉｉ）Ｃ３−２２アシル、
（ｉｖ）Ｃ３−２２不飽和アシル、
（ｖ）−ＣＯＲｃｏ、
（ｖｉ）Ｃ１−２２アルキルスルホニル、
（ｖｉｉ）ベンゼンスルホニルまたは
（ｖｉｉｉ）−ＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３を表す｝または
４）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２であるか、または
（２）Ｒ７ａとＲ７ｂが一緒になって
１）ケトン構造（＝Ｏ）を表すか、または
２）オキシム構造（＝ＮＯＲｏｘ：式中、Ｒｏｘはそれぞれ置換基を有していても良い
（ａ）Ｃ１−２２アルキル、
（ｂ）不飽和Ｃ３−２２アルキル、
（ｃ）Ｃ６−１４アリール、
（ｄ）５員環〜１４員環ヘテロアリールまたは
（ｅ）ベンジル。
式（Ｉ）において、Ｒ３ａとＲ３ｂが一緒になってケトン構造（＝Ｏ）もしくはオキシム構造（＝ＮＯＲｏｘ）を表しても良い。また、Ｒ６ａとＲ６ｂが一緒になってスピロオキシラン環またはエキソメチレンを表しても良い。さらに、Ｒ６ａとＲ６ｂのどちらか一方とＲ７ａとＲ７ｂのどちらか一方が一緒になって１，３−ジオキソラン環を形成しても良い。
式（Ｉ）において、Ｇは、次の［１］〜［３］のいずれかを表す。
［１］
2008016187.tif 000018
式（Ｇ−Ｉ）中、Ｒ１６ａおよびＲ１６ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって水素、メチルまたはヒドロキシを表す。
式（Ｇ−Ｉ）中、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８ａ、Ｒ１８ｂ、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂ、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは、それぞれ独立して、同一または異なって次の（１）〜（６）のいずれかを表す。
（１）水素、
（２）置換基を有していても良いメチル、
（３）−ＯＲＨ、
（４）−ＯＲＤ、
（５）ハロゲンまたは
（６）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２。
式（Ｇ−Ｉ）中、Ｒ２１ｃは次の（１）または（２）を表す。
（１）水素または
2008016187.tif 000019
同一または異なって、
（ａ）水素、
（ｂ）メチル、
（ｃ）ヒドロキシ、
（ｄ）−ＯＲＨ、
（ｅ）−ＯＲＤ、
（ｆ）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２または
（ｇ）ハロゲンを意味する）。
式（Ｇ−Ｉ）において、さらに、Ｒ１８ａまたはＲ１８ｂのどちらか一方とＲ１９ａまたはＲ１９ｂのどちらか一方が一緒になって単結合を形成し、部分構造
2008016187.tif 000020
式（Ｇ−Ｉ）において、さらに、Ｒ１９ａまたはＲ１９ｂのどちらか一方とＲ２０ａまたはＲ
2008016187.tif 000021
しても良い。
式（Ｇ−Ｉ）において、さらに、Ｒ２１ａとＲ２１ｂが一緒になって（ａ）ケトン構造（＝Ｏ）を表すかまたは（ｂ）オキシム構造（＝ＮＯＲｏｘ）を表しても良い。
式（Ｇ−Ｉ）において、さらに、Ｒ２１ａまたはＲ２１ｂのどちらか一方とＲ２２ａまたはＲ
2008016187.tif 000022
しても良い。
式（Ｇ−Ｉ）において、さらに、Ｒ１９ａまたはＲ１９ｂのどちらか一方とＲ２１ａまたはＲ
2008016187.tif 000023
も良い。
［２］
2008016187.tif 000024
式（Ｇ−ＩＩ）において、Ｒ１６ａ、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８ａおよびＲ１８ｂは式（Ｇ−Ｉ）中の定義と同義である。
式（Ｇ−ＩＩ）において、Ｒ１８ｃは次の（１）または（２）を表す。
（１）水素または
2008016187.tif 000025
ぞれ独立して、同一または異なって、水素、メチル、ヒドロキシ、メトキシまたはアセトキシを表し、Ｒｆ５はメチルまたはエチルを表す）。
［３］
2008016187.tif 000026
式（Ｇ−ＩＩＩ）において、Ｒ１６ａ、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａおよびＲ１７ｂは式（Ｇ−Ｉ）中の定義と同義である。
式（Ｇ−ＩＩＩ）において、Ｒ１７ｃは次の（１）または（２）を表す。
（１）水素または
2008016187.tif 000027
それぞれ独立して、同一または異なって、水素、メチル、ヒドロキシ、メトキシまたはアセトキシを表し、Ｒｆ５はメチルまたはエチルを表す）。
ここで、本明細書において用いる「Ｃ１−２２アルキル」とは、炭素数が１〜２２個の直鎖もしくは分枝状アルキル基またはシクロアルキル基を示し、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１−プロピルプロピル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等があげられ、好ましくは炭素数が１〜６個の直鎖もしくは分枝状アルキル基またはシクロアルキル基を示し、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基等が挙げられ、中でも例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が好ましい。
本明細書において用いる「不飽和Ｃ３−２２アルキル」とは、炭素数３〜２２個の直鎖または分枝状アルケニル基、あるいは炭素数が３〜２２個の直鎖または分枝状アルキニル基を示し、例えばアリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１−ペンテニル基、１−ヘキセニル基、１，３−ヘキサンジエニル基、１，５−ヘキサンジエニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１−エチニル−２−プロピニル基、２−メチル−３−ブチピニル基、１−ペンチニル基、１−ヘキシニル基、１，３−ヘキサンジインイル基、１，５−ヘキサンジインイル基等が挙げられ、好ましくは炭素数３〜１０個の直鎖または分枝状アルケニル基あるいは炭素数が３〜１０個の直鎖または分枝状アルキニル基を示し、例えばアリル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、イソプロペニル基、３−メチル−２−ブテニル基、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、３−メチル−１−プロピニル基等である。
本明細書において用いる「Ｃ１−２２アルコキシ」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、好適な基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉｓｏ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉｓｏ−ペンチルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキソキシ基、ｉｓｏ−ヘキソキシ基、１，１−ジメチルプロピルオキシ基、１，２−ジメチルプロポキシ基、２，２−ジメチルプロピルオキシ基、１−メチル−２−エチルプロポキシ基、１−エチル−２−メチルプロポキシ基、１，１，２−トリメチルプロポキシ基、１，２，２−トリメチルプロポキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブチルオキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２−エチルブトキシ基、２−メチルペントキシ基、３−メチルペントキシ基、ヘキシルオキシ基等があげられ、好ましくは例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉｓｏ−プロポキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、２，２−ジメチルプロピルオキシ基等である。
本明細書において用いる「不飽和Ｃ２−２２アルコキシ」とは、前記定義の「不飽和Ｃ３−２２アルキル」、ビニルおよびエチルにおいて、その末端に酸素原子が結合した基を意味する。好適な基としては、例えばビニロキシ基、アリロキシ基、１−プロペニルオキシ基、２−プロペニルオキシ基、イソプロペニルオキシ基、２−メチル−１−プロペニルオキシ基、２−メチル−２−プロペニルオキシ基、１−ブテニルオキシ基、２−ブテニルオキシ基、３−ブテニルオキシ基、１−ペンテニルオキシ基、１−ヘキセニルオキシ基、１，３−ヘキサンジエニルオキシ基、１，５−ヘキサンジエニルオキシ基、プロパルギルオキシ基、２−ブチニルオキシ基等が挙げられ、好ましくは例えばアリロキシ基、プロパルギルオキシ基、２−ブチニルオキシ基等である。
本明細書において用いる「Ｃ６−１４アリール」とは、６〜１４個の炭素原子で構成された芳香族炭化水素環式基を意味し、単環式基、二環式基、三環式基等の縮合環も含まれる。例えばフェニル基、インデニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アズレニル基、ヘプタレニル基、インダセニル基、アセナフチル基、フルオレニル基、フェナレニル基、フェナントレニル基、アントラセニル基等があげられ、好ましくは例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等である。
本明細書における「５員環〜１４員環ヘテロアリール」とは、窒素原子、硫黄原子および酸素原子からなる群より選ばれる複素原子を１個以上含んでなる単環式、二環式または三環式の５〜１４員芳香族複素環式基をいう。好適な例をあげると、含窒素芳香族複素環式基としては、例えばピロリル基、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ベンゾトリアゾリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、ベンツイミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、インドリジニル基、プリニル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キノリジル基、フタラジル基、ナフチリジニル基、キノキサリル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、プテリジニル基、イミダゾトリアジニル基、ピラジノピリダジニル基、アクリジニル基、フェナントリジニル基、カルバゾリル基、カルバゾリニル基、ペリミジニル基、フェナントロリニル基、フェナシニル基、イミダゾピリジニル基、イミダゾピリミジニル基、ピラゾロピリジニル基、ピラゾロピリジニル基等；含硫黄芳香族複素環式基としては、例えばチエニル基、ベンゾチエニル基等；含酸素芳香族複素環式基としては、例えばフリル基、ピラニル基、シクロペンタピラニル基、ベンゾフリル基、イソベンゾフリル基等；２個以上の異種複素原子を含んでなる芳香族複素環式基としては、例えばチアゾリル基、イソチアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズチアジアゾリル基、フェノチアジニル基、イソキサゾリル基、フラザニル基、フェノキサジニル基、オキサゾリル基、イソキサゾイル基、ベンゾオキサゾリル基、オキサジアゾリル基、ピラゾロオキサゾリル基、イミダゾチアゾリル基、チエノフラニル基、フロピロリル基、ピリドオキサジニル基等があげられ、好ましくは、例えばチエニル基、フリル基、ピリジル基、ピリダジル基、ピリミジル基、ピラジル基等である。
本明細書において用いる「Ｃ６−１４アリールオキシ」とは、前記定義の「Ｃ６−１４アリール」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、具体的には、例えばフェニルオキシ基、インデニルオキシ基、１−ナフチルオキシ基、２−ナフチルオキシ基、アズレニルオキシ基、ヘプタレニルオキシ基、インダセニルオキシ基、アセナフチルオキシ基、フルオレニルオキシ基、フェナレニルオキシ基、フェナントレニルオキシ基、アントラセニルオキシ基等が挙げられ、好ましくは例えばフェニルオキシ基、１−ナフチルオキシ基、２−ナフチルオキシ基等である。
本明細書において用いる「５員環〜１４員環ヘテロアリールオキシ」とは、前記定義の「５員環〜１４員環ヘテロアリール」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、具体的には、例えばピロリルオキシ基、ピリジルオキシ基、ピリダジニルオキシ基、ピリミジニルオキシ基、ピラジニルオキシ基、トリアゾリルオキシ基、テトラゾリルオキシ基、ベンゾトリアゾリルオキシ基、ピラゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、ベンツイミダゾリルオキシ基、インドリルオキシ基、イソインドリルオキシ基、インドリジニルオキシ基、プリニルオキシ基、インダゾリルオキシ基、キノリルオキシ基、イソキノリルオキシ基、キノリジルオキシ基、フタラジルオキシ基、ナフチリジニルオキシ基、キノキサリルオキシ基、キナゾリニルオキシ基、シンノリニルオキシ基、プテリジニルオキシ基、イミダゾトリアジニルオキシ基、ピラジノピリダジニルオキシ基、アクリジニルオキシ基、フェナントリジニルオキシ基、カルバゾリルオキシ基、カルバゾリニルオキシ基、ペリミジニルオキシ基、フェナントロリニルオキシ基、フェナシニルオキシ基、イミダゾピリジニルオキシ基、イミダゾピリミジニルオキシ基、ピラゾロピリジニルオキシ基、ピラゾロピリジニルオキシ基、チエニルオキシ基、ベンゾチエニルオキシ基、フリルオキシ基、ピラニルオキシ基、シクロペンタピラニルオキシ基、ベンゾフリルオキシ基、イソベンゾフリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、イソチアゾリルオキシ基、ベンゾチアゾリルオキシ基、ベンズチアジアゾリルオキシ基、フェノチアジニルオキシ基、イソキサゾリルオキシ基、フラザニルオキシ基、フェノキサジニルオキシ基、オキサゾリルオキシ基、イソキサゾイルオキシ基、ベンゾオキサゾリルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、ピラゾロオキサゾリルオキシ基、イミダゾチアゾリルオキシ基、チエノフラニルオキシ基、フロピロリルオキシ基、ピリドオキサジニルオキシ基等があげられ、好ましくは、例えばチエニルオキシ基、ピリジルオキシ基、ピリミジルオキシ基、ピラジルオキシ基等である。
本明細書において用いる「Ｃ２−２２アシル」とは、炭素数が２〜２２個からなるアシル基を示し、好適な基としてはアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基、バレリル基、ｉｓｏ−バレリル基、ピバリル基、カプロイル基、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、アラキドイル基、等の直鎖または分枝状アシル基があげられる。
また本明細書において用いる「Ｃ２−２２アシロキシ」は「Ｃ２−２２アシル」に対応する部分構造を有する基である。
本明細書において用いる「不飽和Ｃ３−２２アシル」とは、炭素数が３〜２２個からなり二重結合または三重結合を有するアシル基を示し、好適な基としてはアクリル基、プロピオル基、クロトニル基、ｉｓｏ−クロトニル基、オレイノル基、リノレノイル基、等の直鎖または分枝状アシル基があげられる。
また本明細書において用いる「Ｃ３−２２不飽和アシロキシ」は「Ｃ３−２２不飽和アシル」に対応する部分構造を有する基である。
本明細書において用いる「Ｃ１−２２アルキルスルホニル」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル」が結合したスルホニルを意味し、具体的には、例えばメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、ｎ−プロピルスルホニル基、ｉｓｏ−プロピルスルホニル基等が挙げられ、好ましくは例えばメチルスルホニル基等である。
本明細書において用いる「Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキルスルホニル」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、例えばメチルスルホニルオキシ基、エチルスルホニルオキシ基、ｎ−プロピルスルホニルオキシ基、ｉｓｏ−プロピルスルホニルオキシ基等が挙げられ、好ましくは例えばメチルスルホニルオキシ基等である。
本明細書において用いる「３員環〜１４員環の含窒素非芳香族複素」とは、窒素原子１つの他に、窒素原子、硫黄原子および酸素原子からなる群から選ばれる複素原子をさらに１個以上含んでいても良い単環式、二環式または三環式の３乃至１４員非芳香族複素環式基をいう。好適な例をあげると、アジリジニル基、アセチジル基、ピロリジニル基、ピロリル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリジル基、イミダゾリジル基、モルホリル基、チオモルホリル基、イミダゾリニル基、オキサゾリニル基、等があげられる。また、当該非芳香族複素環式基には、ピリドン環から誘導される基や、非芳香族性の縮合環（例えばフタルイミド環、スクシンイミド環、等から誘導される基）も含まれる。
本明細書において用いる「置換基を有していても良い」の置換基とは、Ｃ１−８アルキル基、Ｃ２−８アルケニル基（例えばビニル基）、Ｃ２−８アルキニル基（例えばエチニル基）、Ｃ６−１４アリール基（例えば、フェニル基、等）、５乃至１４員ヘテロアリール基（例えば、チエニル基、フリル基、ピリジル基、ピリダジル基、ピリミジル基、ピラジル基、等）、水酸基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ１−８アシル基、Ｃ２−８アシロキシ基、Ｃ２−８アルケニルオキシカルボニル基、Ｃ２−８アルキニルオキシカルボニル基、Ｃ１−８アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシカルボニル基、チオール基、Ｃ１−８アルキルチオ基、Ｃ１−８アルキルスルホキサイド基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニルオキシ基、ヒドロキシスルホニル基、ニトリル基、ニトロ基、ニトロソ基、アミノ基、、Ｎ−Ｃ１−８アルキルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジＣ１−８アルキルアミノ基、Ｎ−Ｃ２−８アルケニルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジＣ２−８アルケニルアミノ基、Ｎ−Ｃ２−８アルキニルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジＣ２−８アルキニルアミノ基、Ｎ−アリールアミノ基（例えば、フェニルアミノ基）、Ｎ−ヘテロアリールアミノ基（例えば２−ピリジルアミノ基、３−ピリジルアミノ基、１−ピロイルアミノ基、等）、Ｎ−Ｃ１−８アルキル−Ｎ−アリールアミノ基、Ｎ−Ｃ１−８アルキル−Ｎ−ヘテロアリールアミノ基、アラルキルオキシ基、ヘテロアリールオキシ基、Ｃ１−８アルキルスルホニルアミノ基、Ｃ２−８アルケニルスルホニルアミノ基、Ｃ２−８アルキニルスルホニルアミノ基、Ｎ−Ｃ１−８アルキルカルバモイル基、Ｎ−Ｃ１−８アルキルカルバモイル基、Ｎ−Ｃ２−８アルケニルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジＣ２−８アルキニルカルバモイル基、Ｃ２−８アシルアミノ基、等から選ばれる１個以上の基があげられる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
尚、以下の実施例において、プラジエノライドＡ、Ｂ、ＤおよびＥ７１０７は次の化合物である。
プラジエノライドＡ
2008016187.tif 000028
プラジエノライドＢ
2008016187.tif 000029
プラジエノライドＤ
2008016187.tif 000030
Ｅ７１０７
2008016187.tif 000031
本発明の標識化合物は、以下に記載の方法により合成した。
【実施例】
【０００６】
実施例Ａ１
（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（Ｎ−［Ｇ−３Ｈ］エチルカルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
2008016187.tif 000032
（１）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（Ｎ−［Ｇ−３Ｈ］エチルカルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリ（１−エトキシエトキシ）−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
特許文献（ＷＯ  ０２／０６０８９０）の実施例Ｂ４４に記載された（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，２１−トリ（１−エトキシエトキシ）−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（４−ニトロフェノキシ）カルボキシ−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（１５ｍｇ）を無水ＴＨＦ（１．５ｍＬ）に溶解した。反応溶液に［Ｇ−３Ｈ］エチルアミン（８．７Ｃｉ）を蒸留し、滴下した。反応溶液を室温にて２４時間攪拌した後、溶媒を減圧留去し、残渣を少量の酢酸エチルに溶解した（収量  ６８０ｍＣｉ）。シリカゲルＨＰＬＣ（溶出溶媒  ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：４−１：１）により精製し、表記化合物を得た（収量１１３ｍＣｉ）。
（２）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（Ｎ−［Ｇ−３Ｈ］エチルカルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（Ｎ−［Ｇ−３Ｈ］エチルカルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリ（１−エトキシエトキシ）−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（１１３ｍＣｉ）およびピリジニウム  ｐ−トルエンスルホン酸（０．７５ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、反応液を室温にて４．５時間攪拌した。反応溶液を窒素気流下にて溶媒を蒸発させた後、得られた残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液をシリカゲルショートカラムに通し、粗精製物を得た（１０５ｍＣｉ）。
得られた粗精製物をシリカゲルＨＰＬＣ（溶出溶媒  ｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝６：４）により精製した。目的物フラクションをあわせ溶媒を留去、乾固したのち、エタノールに溶解した（１０５ｍＣｉ）。１ｍＣｉ／ｍｌエタノール溶液とし、保管した。
ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ５９０，５９２（ｍａｉｎ  ｐｅａｋ），５９４（Ｍ＋Ｎａ）＋
Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｕｒｉｔｙ：９７．０％（ｂｙ  ＨＰＬＣ）、９７％（ｂｙ  ＴＬＣ）
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：５６Ｃｉ／ｍｍｏｌ（ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）
実施例Ａ２
７−（Ｎ−（２−（２−（２−（Ｎ−（５−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−４−イウム−５−ウイド−３−イル）ペンタノイル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
2008016187.tif 000033
（１）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリス（１−エトキシエトキシ）−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（１２７ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、ここに、特許文献（ＷＯ  ０２／０６０８９０）の実施例Ｂ４４に記載された（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，２１−トリ（１−エトキシエトキシ）−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（４−ニトロフェノキシ）カルボキシ−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（１５０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）溶解した溶液を滴下した。反応溶液を室温にて３時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｆｕｊｉ  Ｓｉｌｙｓｉａ，ＮＨ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ，ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）にて精製し、表記化合物（０．１０ｇ、６６％）を淡黄色油状物として得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ８８５（Ｍ＋Ｈ）＋．
（２）７−（Ｎ−（２−（２−（２−（Ｎ−（５−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−４−イウム−５−ウイド−３−イル）ペンタノイル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリ（１−エトキシエトキシ）−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリス（１−エトキシエトキシ）−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（１０．６ｍｇ，１２μｍｏｌ）および４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタン酸  コハク酸イミドエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：５ｍｇ，１２μｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、反応液を室温にて１２時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｋａｎｔｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ，ｓｐｈｅｒｉｃａｌ，ｎｅｕｒｔａｌ，ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）にて精製し、表記化合物（１３．１ｍｇ，９２％）をオレンジ色油状物として得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １２１０（Ｍ＋Ｎａ）＋．
（３）７−（Ｎ−（２−（２−（２−（Ｎ−（５−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−４−イウム−５−ウイド−３−イル）ペンタノイル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
７−（Ｎ−（２−（２−（２−（Ｎ−（５−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−４−イウム−５−ウイド−３−イル）ペンタノイル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイルオキシ）−３，６，２１−トリ（１−エトキシエトキシ）−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（１３ｍｇ，１１μｍｏｌ）メタノール（４ｍＬ）およびピリジニウム  ｐ−トルエンスルホン酸（２ｍｇ，８μｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）に溶解し、反応液を室温にて２４時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣を酢酸エチルに溶解し、蒸留水、炭酸水素ナトリウム水溶液および食塩水にて順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去し、得られた残渣をプレパラティブＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｒｔ１０５６２８，ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）にて精製し，表記化合物（９．３ｍｇ，８７％）をオレンジ色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．１８−１．２０（４Ｈ，ｍ），１．３０−１．７０（８Ｈ，ｍ），１．７２−１．８４（７Ｈ，ｍ），２．２８−２．３４（５Ｈ，ｍ），２．４６−２．６４（７Ｈ，ｍ），２．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．１Ｈｚ），２．７６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊｄ＝２．４Ｈｚ，Ｊｔ＝６．０Ｈｚ），２．８２（２Ｈ，ｂｒ），２．９８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．３２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），３．３８−３．４２（２Ｈ，ｍ），３．５２−３．６０（５Ｈ，ｍ），３．６２（４Ｈ，ｓ），３．７８−３．８４（１Ｈ，ｍ），４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），５．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０，１５．２Ｈｚ），５．６９（１Ｈ，ｄｄ，８．４，１５．１Ｈｚ），５．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０，１５．１Ｈｚ），６．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），６．２３（１Ｈ，ｓ），６．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，１５．２Ｈｚ），６．４０（１Ｈ，ｄ，４．１Ｈｚ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．４５（１Ｈ，ｓ）；ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ９９３（Ｍ＋Ｎａ）＋．
実施例Ａ３
（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（Ｎ−（２−（２−（２−（Ｎ−（５−（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイルオキシ）−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
2008016187.tif 000034
実施例Ａ２と同様の方法にて、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタンに代えて、Ｎ−（＋）−ビオチニル−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（Ｐｉｅｒｃｅ：Ｂｉｏｔｉｎ  ＰＥＯ−Ａｍｉｎｅ）を用いることにより、表記化合物（８ｍｇ）を無色油状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．０９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．１６−１．２６（４Ｈ，ｍ），１．２７−１．８０（１７Ｈ，ｍ），２．２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．４２−２．６４（４Ｈ，ｍ），２．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．１Ｈｚ）２．６８−２．７６（２Ｈ，ｍ），２．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１２．９Ｈｚ），２．９８−３．２５（１Ｈ，ｍ），３．２８−３．３４（２Ｈ，ｍ，ｃｏｖｅｒｄ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３ＯＤ），３．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．４９−３．５８（５Ｈ，ｍ），３．６２（４Ｈ，ｓ），３．７５−３．８２（１Ｈ，ｍ），４．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，７．８Ｈｚ），４．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．９，７．８Ｈｚ），４．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），５．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５，１５．４Ｈｚ），５．６３−５．７８（２Ｈ，ｍ），６．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），６．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，９，１５．１Ｈｚ）；ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ９１７（Ｍ＋Ｎａ）＋，９２９（Ｍ＋Ｃｌ）−
実施例Ａ４
Ｎ−（（１Ｓ）−５−アミノ−１−（メチル（２−（メチル（５−（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）アミノ）エチル）カルバモイル）ペンチル）−４−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル）ベンズアミド
2008016187.tif 000035
（１）ベンジル＝（（１Ｓ）−５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−１−（メチル（２−（メチルアミノ）エチル）カルバモイル）ペンチル）カルバマート
１，４−ジメチルエチレンジアミン（０．８８ｇ，１０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、室温攪拌しつつ市販のＺ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＮＰ（１ｇ，２ｍｍｏｌ）を数回に分けて加えたのち、反応溶液を室温にて１２時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルにて油水分配した。有機層をさらに蒸留水および食塩水で順次洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｆｕｊｉ  Ｓｉｌｙｓｉａ，ＮＨ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ，ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ＝１０：１）にて精製し、表記化合物（９００ｍｇ，ｑｕａｎｔ．）を無色油状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＣＤ３Ｃｌ３，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：１．３０−１．７８（１５Ｈ，ｍ），２．３８−２．４８（３Ｈ，ｍ），２．６８−２．８８（２Ｈ，ｍ），２．９６（１Ｈ，ｓ），３．００−３．１６（４Ｈ，ｂｒ−ｍ），３．３２−３．６０（２Ｈ，ｍ），４．５８−４．７６（２Ｈ，ｍ），５．０９（３Ｈ，ｓ），５．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２８−７．４０（５Ｈ，ｍ）；ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７３（Ｍ＋Ｎａ）＋．
（２）ベンジル＝（（１Ｓ）−５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−１−（メチル（２−（メチル（５−（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）アミノ）エチル）カルバモイル）ペンチル）カルバマート
上記（１）の生成物（０．９ｇ，２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ−ＤＭＦ（２０ｍＬ−１０ｍＬ）に溶解し、室温攪拌下にビオチン  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７ｇ，２ｍｍｏｌ）を数回に分けて加えた。反応溶液を室温で１２時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルにて油水分配した。有機層をさらに蒸留水および食塩水で順次洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ，Ａｒｔ．１．０９３８５，ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）にて精製し、表記化合物（１．２ｇ，８９％）を無色アモルファスとして得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：１．１０−１．６５（２１Ｈ，ｍ），２．０５−３．６５（１７Ｈ，ｍ），４．０４−４．１５（１Ｈ，ｍ），４．２２−４．４０（２Ｈ，ｍ），４．９２−５．０６（２Ｈ，ｍ），６．３０−６．４８（２Ｈ，ｍ），６．７０−６．８０（１Ｈ，ｍ），７．２２−７．４４（６Ｈ，ｍ）；ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ６９９（Ｍ＋Ｎａ）＋．
（３）ｔｅｒｔ−ブチル＝（（５Ｓ）−５−アミノ−６−（メチル（２−（メチル（５−（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル９アミノ）エチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）カルバマート
上記（２）の生成物（１．２ｇ，１．８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２０ｍＬ−１０ｍＬ）に溶解した反応溶液に、７Ｍアンモニアメタノール溶液（２０ｍＬ）を加えた。この反応溶液に１０％パラジウム炭素（０．８３ｇ）を懸濁し、水素添加装置にて接触還元反応を行った。反応の収量をＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｒｔ．１．０５７１９，ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）にて確認した後、触媒を濾去し、濾液を減圧留去した。得られた残渣をデシケーターで減圧乾固し、表記化合物（０．９５ｇ，９８％）を淡黄色アモルファスとして得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：１．０５−１．７０（２１Ｈ，ｍ），２．１０−２．４０（２Ｈ，ｍ），２．５０−２．６５（１Ｈ，ｍ），２．７４−３．６６（１５Ｈ，ｍ），４．０６−４．２０（１Ｈ，ｍ），４．２６−４．３６（１Ｈ，ｍ），６．３３６（１Ｈ，ｂｒ−ｓ），６．４３（１Ｈ，ｂｒ−ｓ），６．７０−６．８４（１Ｈ，ｍ）；ＮＨ２は明確なピークとして検出されなかった；ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６５（Ｍ＋Ｎａ）＋．
（４）ｔｅｒｔ−ブチル＝（（５Ｓ）−６−（メチル（２−（メチル（５−（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）アミノ）エチル）アミノ）−６−オキソ−５−（（４−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル）ベンゾイル）アミノ）ヘキシル）カルバマート
上記（３）の生成物（０．９５ｇ，１．７５ｍｍｏｌ）および文献報告（Ｎａｓｓａｌ  Ｍ．Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１９８３，１５１０−１５２３）にしたがって合成した４−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル）安息香酸（０．４４ｇ，１．９３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ−ＤＭＦ（２０ｍＬ−２０ｍＬ）に溶解し、この反応溶液に縮合剤：４−（４，６−ジメトキシ［１．３．５］トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム  クロライド水和物（Ｗａｋｏ，１．０５ｇ，３．４５ｍｍｏｌ）を数回に分けて加えたのち、この反応溶液を室温にて２４時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルにて油水分配した。有機層をさらに蒸留水および食塩水で順次洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ，Ａｒｔ．１．０９３８５，ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝２０：１−８：１）にて精製し表記化合物（１．１８，８９％）を無色アモルファスとして得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：１．０５−１．７０（２１Ｈ，ｍ），２．１０−２．３８（２Ｈ，ｍ），２．４４−２．６２（１Ｈ，ｍ），２．７０−３．８０（１４Ｈ，ｍ），４．０４−４．２０（１Ｈ，ｍ），４．２４−４．３６（１Ｈ，ｍ），４．７０−４．９０（１Ｈ，ｍ），６．３０−６．５８（２Ｈ，ｍ），６．７０−６．８４（１Ｈ，ｍ），７．３７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９４−８．０６（２Ｈ，ｍ），８．６４−８．９６（１Ｈ，ｍ）；ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ７７７（Ｍ＋Ｎａ）＋．
（５）Ｎ−（（１Ｓ）−５−アミノ−１−（メチル（２−（メチル（５−（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）アミノ）エチル）カルバモイル）ペンチル）−４−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル）ベンズアミド
上記（４）の生成物（０．２９ｇ，０．３８ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解し氷冷下攪拌し、ここに、４Ｍ塩化水素−酢酸エチル溶液（５ｍＬ）を加え、この反応溶液を室温にて１２時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を塩化メチレンとアンモニア水にて油水分配し、水層をさらに塩化メチレンで再抽出した。得られた有機層を合わせて、食塩水で洗浄したのち、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去し表記化合物（０．２１，８４％）を無色のアモルファスとして得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ６５５（Ｍ＋Ｈ）＋，６８９（Ｍ＋Ｃｌ）−
実施例Ａ５
（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（Ｎ−（（５Ｓ）−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（５−（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）アミノ）エチル）アミノ）−６−オキソ−５−（Ｎ−（４−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル）ベンゾイル）アミノ）ヘキシル）カルバモイルオキシ）−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
2008016187.tif 000036
実施例Ａ４で合成したアミン化合物を用いて、実施例Ａ２と同様の方法により表記化合物（４０ｍｇ，２５％）を無色油状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：図１ａ、（ＣＤ３ＯＤ，７００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：０．８３（３Ｈ，ｍ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．１７（３Ｈ，ｓ），１．１９（１Ｈ，ｍ），１．２３−１．９０（２０Ｈ，ｍ），１．７１（３Ｈ，ｓ），２．１３−２．５７（６Ｈ，ｍ），２．６２−２．７４（３Ｈ，ｍ），２．８４−３．３５（１０Ｈ，ｍ），３．４０−４．１０（６Ｈ，ｍ），４．２２−４．５２（２Ｈ，ｍ），４．８０−５．１０（３Ｈ，ｍ），５．５２（１Ｈ，ｍ），５．６２−５．７２（２Ｈ，ｍ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ），６．３０（１Ｈ，ｍ），７．３０−７．３７（２Ｈ，ｍ），７．９０−８．００（２Ｈ，ｍ）
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １１９７（Ｍ＋Ｎａ）＋：図１ｂ
合成した標識プラジエノライド類を用いて、プラジエノライド類の標的蛋白質を以下の実施例Ｂ１〜Ｂ７に記載の通りに特定した。また標識プラジエノライド類を用いて被検化合物が、Ｕ２  ｓｎＲＮＰと、好ましくはＳＦ３ｂと、更に好ましくはＳＡＰ１３０と作用する（結合する）ことを検定することが可能であることを、実施例Ｂ２、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９に示した。
実施例Ｂ１
トリチウムプローブ化合物の細胞内分布
１５ｃｍ  ｄｉｓｈに培養（＞８０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）したヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣＨＴＢ−１３２）に、実施例Ａ１にて製造したトリチウムプローブ化合物を３〜３０ｎＭとなるよう添加し、３７℃インキュベーターにて１時間培養した。培地を除去したのち、Ｈａｎｋｓ’  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０ｍＬ  ｘ２）にて洗浄し、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ（１０％  ｇｌｙｒｅｃｏｌ，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．８，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）３ｍＬを添加した。しばらく静置した後、セルスクレイパーにて細胞を回収し、ダウンスホモジナイザーにてｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調整した。
このｌｙｓａｔｅをｘ２０００ｇ，４℃，１０ｍｉｎ．の遠心分離を行い、上清（２０００ｇ−ｓｕｐ．）と沈殿（２０００ｇ−ｐｅｌｌｅｔ）を得た。２０００ｇ−ｓｕｐ．は、更にｘ１０００００ｇ，４℃，６０ｍｉｎ．の遠心分離を行い、細胞質画分（ｃｙｔｏｓｏｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を上清として、また膜画分（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を沈殿として得た。２０００ｇ−ｐｅｌｌｅｔは０．５Ｍ  ＮａＣｌに懸濁し、氷冷下３０分静置し核内蛋白を溶出した後、ｘ３０００ｇ，４℃，１０ｍｉｎ．の遠心分離を行い、核画分（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を上清として、また核ペレット（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｅｌｌｅｔ）を沈殿として得た。
各画分中に存在するトリチウムプローブの放射活性を次の方法にて測定した。すなわち、細胞質画分および核画分についてはハイオニックフロー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と均一に混合し、また膜画分および核ペレットはＳｏｌｕｅｎｅ−３５０（Ｐａｃｋａｒｄ）（１ｍＬ）に溶解した後、ハイオニックフローと混合し、それぞれ液体シンチレーションカウンターにより放射活性を測定した。
同時に、放射性同位元素非標識体プラジエノライドを用いてコールド阻害実験を行った。すなわち、トリチウムプローブ処理濃度の５０倍濃度（０．１５〜１．５μＭ）のプラジエノライド処理し、３７℃インキュベーターにて１時間培養した後、トリチウムプローブを処理し、各画分を調整し、放射活性を測定した。
結果を図１ｃに示した。
トリチウムプローブの放射活性は、３−３０ｎＭいずれの処理濃度においても核画分中に最も高く検出された。次いで核ペレット中の放射活性が高かった。また、これらの放射活性はプラジエノライドＢ前処理によりほぼ完全に消失した。
さらに、ここで調整した細胞質画分および核画分について活性炭アッセイ（ｃｈａｒｃｏａｌ  ａｓｓａｙ）を行い、被検体中のラベルカウントが蛋白等への結合した結合型プローブに由来するものなのか、あるいは非結合のフリー体に由来するものなのかを検証した。
すなわち、細胞質画分おより核画分に１／１０量（体積比）の１０％活性炭懸濁液を添加し、数秒間ボルテックス処理したのち、１５０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．（ＴＯＭＹ  ｍｉｎｉ  ＭＸ−１５）遠心分離し、上清中の放射活性を上記と同様の方法で測定した。
得られた結果を図１ｄに示した。
核画分中の放射活性は活性炭処理によっても消失しなかった。一方、細胞質画分の放射活性はほぼ消失した。
以上の結果から、プラジエノライドが結合する標的分子は核内に存在することが示唆された。
実施例Ｂ２
プラジエノライド類縁体および誘導体によるトリチウムプローブとの競合実験
１５ｃｍ  ｄｉｓｈに培養（＞８０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）したヒト大腸癌ＷｉＤｒ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１８）に、抗腫瘍活性を有する種々のプラジエノライド類縁体または誘導体をそれぞれ５００ｎＭとなるよう添加し、３７℃インキュベーターにて１時間培養した。次いで、トリチウムプローブ化合物を１０ｎＭとなるよう培地に添加し、３７℃インキュベーターにてさらに１時間培養した。実施例Ｂ１と同様の方法にて各サンプルについて核画分を調整し、放射活性を測定した。
種々のプラジエノライド類縁体または誘導体の存在下で結合したトリチウムプローブ化合物のコントロール（競合なし）に対する割合（結合％）を縦軸に、各化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制活性のＩＣ５０（ｎＭ）を横軸に、各化合物をプロットしたグラフを図２に示した。
各サンプル中の放射活性は、競合させたプラジエノライド類およびその誘導体のＷｉＤｒに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制活性のＩＣ５０に比例した。即ち、強い細胞増殖抑制活性を示す化合物でより強い競合阻害がみられた。
この結果から、トリチウムプローブを用いて追跡することにより核内に存在することが示された標的分子は、プラジエノライドの細胞増殖抑制活性に関与している分子であることが示された。
尚、本実施例で用いたプラジエノライド類縁体または誘導体は次のものである。
（１）．本願実施例Ａ３の化合物、
（２）．ＷＯ０２／０６０８９０実施例Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ａ−７、Ａ−８、Ｂ−６８、Ｂ−４４、Ｂ−５０、Ｂ３６−１およびＢ３６−２の化合物
（３）．ＷＯ０３／０９９８１３実施例１２および４５の化合物
実施例Ｂ３
蛍光プローブの細胞内局在観察
ＨｅＬａ細胞に実施例Ａ２にて製造した蛍光プローブ１μＭを添加し、１時間３７℃インキュベーターにて培養した。その後培地を除去し、プローブ非添加の新たな培地中にて、さらに１時間培養し、非特異的に吸着した化合物を洗浄した。再び培地を除去し、ＰＢＳにて洗浄したのち、３．７％ホルムアルデヒドｉｎ  ＰＢＳ中で細胞を固定した。
固定した細胞はＰＢＳ洗浄にてよく洗浄し、０．５又は１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｉｎ  ＰＢＳにより可溶化したのち、ＦＢＳまたはブロッキング溶液によりブロッキングを行い、一次抗体（抗ＳＣ−３５モノクローナル抗体、シグマ；Ｓ４０４５）を添加し反応させた。ＰＢＳにて洗浄したのち、再びＦＢＳまたはブロッキング溶液によりブロッキングを行い、蛍光標識二次抗体（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識，Ｊａｃｋｓｏｎ）を添加し反応させた。標識したサンプルは蒸留水ですばやくリンスしたのち、Ｐｒｏｌｎｇ  ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に封入し、蛍光顕微鏡（Ｄｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）または共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）にて蛍光プローブおよび抗ＳＣ−３５抗体の局在を観察した。
結果を図３ａに示した。
蛍光プローブは主に核内の顆粒状構造体に局在することが確認された（図３ａ上）。この構造体は抗ＳＣ−３５抗体の局在と一致した。ＳＣ−３５はスプライシング因子の代表的な分子であり、核スペックルのマーカーであることから、プラジエノライド類の標的分子は核スペックルに存在することが示唆された。さらに、蛍光プローブの蛍光を過度の光照射により褪色させた後に上記と同様の条件で撮影を行うと、蛍光プローブのチャンネルにはシグナルが検出されなくなったので抗ＳＣ−３５抗体染色のシグナルの漏出がないことが確かめられ、蛍光プローブ特異的なシグナルが検出されていることが確認された（図３ａ下）。
また、上記実験操作においてプラジエノライド類またはその誘導体を用いて競合実験を行った。即ち、蛍光プローブ添加に先立ってプラジエノライド類またはその誘導体１μＭを添加した条件で１時間培養したのち、上記と同様の操作により固定・染色し、顕微鏡観察を行い蛍光プローブの局在を確認した。
結果を図３ｂに示した。
各サンプル中の蛍光プローブ由来の蛍光強度は、競合させたプラジエノライド類およびその誘導体の細胞増殖抑制活性のＩＣ５０に比例した（プラジエノライドＡ＞非標識トリチウムプローブ化合物＞プラジエノライドＢ、Ｄ）。即ち、強い細胞増殖抑制活性を示す化合物でより強く競合阻害がみられ、プローブ由来の蛍光はほぼ消失していた（図３ｂ左段）。また、抗ＳＣ−３５抗体により染色される核スペックルは、数が少なく大きくなっていることが観察された（図３ｂ右段）。
この結果から、蛍光プローブを用いた実験から核スペックル中に存在することが示された標的分子は、プラジエノライドの細胞増殖抑制活性に関与している分子であることが示された。また、トリチウムプローブと同一の構造を有する非標識トリチウムプローブ化合物は、その細胞増殖抑制活性に比例した強度で蛍光プローブと競合したことから、これら二つのプローブの標的分子（結合蛋白）が同一であることが示された。
実施例Ｂ４
トリチウムプローブ処理細胞から調整した核フラクションの免疫沈降実験
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をトリチウムプローブ３０ｎＭ存在下で１時間培養したのち、実施例Ｂ１記載の方法と同様の方法にて核フラクションを調整した。ここに希釈バッファーを添加して最終濃度０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％  ＣＡ−６３０，４０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．５とし、免疫沈降溶液を調製した。
この溶液にスプライシング因子、転写因子またはそれらに関与する分子に対する抗体を１μｇ／ｍＬとなるよう添加し、４℃低温室にてサンプルローテーターを用いて約１２時間ゆっくりと攪拌した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ−アガロースコンジュゲート５０％懸濁液を２０μＬ添加し、さらに低温室にて２時間攪拌した。
アガロース樹脂を回収し、洗浄液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％  ＣＡ−６３０，２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．５）にて洗浄した。これにＳＤＳサンプルバッファーを添加し、ボルテックスにて攪拌したのち、９９℃にて１０分間ボイルし、免疫沈降されてきた蛋白質を溶出した。この溶出液をハイオニックフローと均一に混合し、液体シンチレーションカウンターにて溶出液中に存在するトリチウムプローブの放射活性を測定した。
結果を図４に示した。
約４０種の抗体を用いて実験を行った結果、ＴＭＧ抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ＮＡ０２）、Ｕ１Ａ／Ｕ２Ｂ”抗体（Ｐｒｏｇｅｎｅ  ５７０３５）、Ｕ２Ｂ”抗体（Ｐｒｏｇｅｎ  ５７０３６）、ＳＭＢＢ’＆Ｄ１抗体（Ｐｒｏｇｅｎ  ５７０３２）、ＳＡＰ１５５抗体（ＭＢＬ  Ｄ２２１−３）、ＳＡＰ１４５抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｉｚ  ｓｃ−１４２７９）、ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ抗体（Ｚｙｍｅｄ  ３２−１５００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｉｚ  ｓｃ−２４８，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｉｚ  ｓｃ−４８１）において特異的に放射活性が観察された。これらの抗体は、全てＵ２  ｓｎＲＮＰの構成蛋白質、またはＵ２  ｓｎＲＮＰと複合体を形成することが報告されている蛋白質（ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ）に対する抗体であった。
以上の結果から、プラジエノライドの標的分子はＵ２  ｓｎＲＮＰ複合体中に存在する蛋白質であることが示された。
実施例Ｂ５
光アフィニティー・ビオチンプローブ処理による結合蛋白質の検出
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞から、実施例Ｂ１に記載の方法に従って２０００ｇ−ｐｅｌｌｅｔを調製した。これをＣＳＫバッファー（３００ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ，ｐＨ＝７．０，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）に懸濁し、実施例Ａ３にて合成した光アフィニティー・ビオチンプローブ１．５μＭで処理した。この懸濁液を４℃にて１時間静置した後、ｘ２０００ｇ，４℃，１０分遠心分離した。上清を除き、得られた沈殿物から実施例Ｂ１と同様の方法にて核フラクションを調整したのち、実施例Ｂ４と同様の方法にて免疫沈降溶液を調整し、標的分子が免疫沈降されてくることが示されている抗体を用いて免疫沈降実験を行った。
得られた免疫沈降物（アガロース樹脂）に対してＵＶ照射（３６５ｎｍおよび３０２ｎｍ）を行い、架橋反応を行った。これにＳＤＳサンプルバッファーを添加し、ボルテックスにて攪拌したのち、９９℃にて１０分間ボイルし、免疫沈降されてきた蛋白質を溶出した。常法に従って、この溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦ膜へのブロッテイングを行った後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを処理することで、プローブが結合した蛋白質の検出を試みた。
結果を図５ａに示した。
いずれの抗体においても１３０−１４０ｋＤａに一本のバンドが検出された。
次いで、同一のサンプル（ブロッティング膜）について、ＳＡＰ１５５抗体、ＳＡＰ１４５抗体、ＳＡＰ１３０抗体を用いてウエスタンブロットを行い、それらの蛋白のバンド位置と光アフィニティープローブが結合している標的分子のバンド位置を比較した。
結果を図５ｂに示した。
標的分子とＳＡＰ１５５の位置は明らかに異なった。一方、標的分子とＳＡＰ１４５およびＳＡＰ１３０はほぼ同一位置に観察された。
以上の結果から、標的分子はＳＡＰ１４５またはＳＡＰ１３０であることが示唆された。
実施例Ｂ６
ＧＦＰ−１４５株、ＧＦＰ−１３０株の獲得
（１）プラスミドの構築
ＧＦＰ融合型ＳＡＰ１３０蛋白質の安定発現株を獲得するために、ｐＥＧＦＰ−ＳＡＰ１３０プラスミドを作製した。ｐＥＧＦＰ−ＳＡＰ１３０は、ＥＧＦＰ蛋白質コーディング配列（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２由来：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、ヒトＳＡＰ１３０（ＳＦ３Ｂ３）蛋白質コーディング配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：ＮＭ＿０１２４２６）、およびそれらを繋ぐリンカー配列から構成される配列番号１（ＧＦＰ−ＳＡＰ１３０のＮｈｅ  Ｉ−Ｐｍｅ  Ｉフラグメント、４４３２ｂｐ）に記載の約４．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＮｈｅ  Ｉ−Ｐｍｅ  Ｉサイトに挿入することによって作製した。同プラスミドを導入した細胞では、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＧＦＰ−ＳＡＰ１３０蛋白質が発現することが予想された。
ＧＦＰ融合型ＳＡＰ１４５蛋白質の安定発現株を獲得するために、ｐＥＦ１−ＧＦＰ−ＳＡＰ１４５プラスミドを作製した。ｐＥＦ１−ＧＦＰ−ＳＡＰ１４５は、ＥＧＦＰ蛋白質コーディング配列（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２由来：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、ヒトＳＡＰ１４５（ＳＦ３Ｂ２）蛋白質コーディング配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：ＮＭ＿００６８４２）、およびそれらを繋ぐリンカー配列から構成される配列番号３（ＧＦＰ−ＳＡＰ１４５のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｐｍｅ  Ｉフラグメント、３４５４−ｂｐ）に記載の約３．５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを、ｐＥＦ１−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ  Ａベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｐｍｅ  Ｉサイトに挿入することによって作製した。同プラスミドを導入した細胞では、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＧＦＰ−ＳＡＰ１４５蛋白質が発現することが予想された。
（２）安定発現株の取得
ｐＥＦ１−ＧＦＰ−ＳＡＰ１４５およびｐＥＧＦＰ−ＳＡＰ１３０を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＨｅＬａ細胞に導入した。遺伝子導入４０時間後に、最終濃度５００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）添加によって遺伝子導入細胞の選択を開始した。そして、遺伝子導入１４日後に、蛍光顕微鏡観察によってＧＦＰ蛍光を発するクローンをマークしてピックアップした後、さらに希釈継代してシングルコロニーを単離した。ｐＥＦ１−ＧＦＰ−ＳＡＰ１４５から得られたＣｌｏｎｅ＃２（ＧＦＰ−１４５株）および、ｐＥＧＦＰ−ＳＡＰ１３０由来のＣｌｏｎｅ＃３（ＧＦＰ−１３０株）を、以降の実験に供した。
実施例Ｂ７
ＧＦＰ融合ＳＡＰ１４５またはＧＦＰ融合ＳＡＰ１３０蛋白を用いたバンドシフトの検出実験
標的分子と考えられるＳＡＰ１４５およびＳＡＰ１３０がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ同一の位置に検出されるため、それぞれＧＦＰ融合蛋白の安定発現株を調製し、光アフィニティー・ビオチンプローブを用いた実験を行った。
ＧＦＰ−ＳＡＰ１４５安定発現ＨｅＬａ細胞に、光アフィニティー・ビオチンプローブ１．５μＭを添加し１時間培養した。ＰＢＳにて細胞を洗浄したのち、Ｍ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ）を添加し、４℃にて１時間振とうした。ここに１／１０量の１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液を添加したのち、ボルテックス処理した（１０秒ｘ３）後、１５０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ．遠心分離を行った（ＴＯＭＹ  ＭＸ−１５）。ここで得られた上清を０．４５μｍメンブレンを用いてろ過し、ろ液を免疫沈降実験に用いた。
免疫沈降溶液にＧＦＰ抗体（Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ  ＡＦＰ５００２）、またはＳＡＰ１５５抗体（ＭＢＬ  Ｄ２２１−３）を添加し（１０μｇ／ｍＬ）、３０分間４℃にてゆっくりとｒｏｔａｔｏｒにて攪拌した。次いで、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ−アガロース（５０％懸濁液）を免疫沈降溶液の１／１０量加え、４℃にてさらに１時間、上記と同様に攪拌した。アガロース樹脂をｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒにて３回洗浄したのち、樹脂に実施例Ｂ５と同様の方法にてＵＶ照射を行った後、樹脂に結合した蛋白を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびブロッティング後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを処理してプローブが結合した蛋白質の検出を行った。
また、同一サンプルを用いてＳＡＰ１４５抗体およびＳＡＰ１３０抗体によりそれぞれＳＡＰ１４５、ＳＡＰ１３０の検出を行った。
結果を図６ａ（ｐｒｏｂｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）に示した。
ＧＦＰ抗体、およびＳＡＰ１５５抗体で免疫沈降を行ったサンプルの両方で１３０〜１４５ｋＤａの位置にプローブが結合した蛋白のバンドが検出された。これらのバンドはプローブ非処理サンプルでは検出されていないことから、標的分子に結合したプローブに由来するシグナルであると判断される。
同一のサンプルをＳＡＰ１４５抗体、およびＳＡＰ１３０抗体でｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。ＧＦＰ抗体で免疫沈降を行ったサンプル中には１３０〜１４５ｋＤａの位置にｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＳＡＰ１４５は全く検出されず、ＳＡＰ１４５−ＧＦＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎのみが約１７０ｋＤａのシフトした位置に存在していることが示された。一方、ＳＡＰ１３０抗体を用いた実験結果からは、プローブが検出された位置にＳＡＰ１３０が存在することが示された。
以上の結果、標的分子のバンド位置にはＳＡＰ１４５が存在せず、ＳＡＰ１３０のみが存在することが示されたことから、標的分子がＳＡＰ１３０であることが強く示唆された。
また、上記実験操作においてプローブ未処理の細胞から調製したアガロース樹脂にプローブを処理したのち、同様の操作にてＵＶ照射、蛋白溶出操作を行い、得られたサンプルにおいて同様のバンドが検出されるか否かを検証した。
結果を図６ａ（ｐｒｏｂｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ＩＰ  ｂｅａｄｓ）に示した。
予め免疫沈降を行ったサンプルにプローブを処理した場合も、ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌに処理した場合と同様の結果が得られた。したがって、免疫沈降されてきた標的分子を含む複合体に対しても、プラジエノライドが親和性を有することが示された。
次に、ＧＦＰ−ＳＡＰ１３０安定発現ＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
結果を図６ｂに示した。
ＳＡＰ１５５抗体で免疫沈降したサンプルにおいては、約１７０ｋＤａの位置にシフトしたバンドと従来の１３０〜１４５ｋＤａの二つの位置にバンドが検出された。一方、ＧＦＰ抗体で免疫沈降したサンプルでは１７０ｋＤａにシフトしたバンドのみが検出された。これらのバンドはプローブ非処理サンプルでは検出されていないことから、標的分子に結合したプローブに由来するシグナルであると判断された。
同一のサンプルをＳＡＰ１３０抗体でｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。ＳＡＰ１５５抗体で免疫沈降を行ったサンプル中にはバンドシフトが観察された位置と、従来のＳＡＰ１３０位置にシグナルが検出された。一方、ＧＦＰ抗体のサンプルでは、バンドシフトが観察された位置にのみＳＡＰ１３０シグナルが観察された。
以上の結果から、光アフィニティー・ビオチンプローブが結合している蛋白はＳＡＰ１４５ではなく、ＳＡＰ１３０であると判断された。
実施例Ｂ８
プラジエノ類縁体および誘導体による光アフィティー・ビオチンプローブとの競合実験
実施例Ｂ７と同様の方法で、プローブ未処理のＧＦＰ−ＳＡＰ１４５安定発現ＨｅＬａ細胞からＧＦＰ抗体、およびＳＡＰ１５５抗体を用いて免疫沈降実験を行い、免疫沈降サンプル（アガローズ樹脂）を調製した。この樹脂をｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、プラジエノライド類、およびその誘導体（Ｅ７１０７）を７５μＭにて前処理し、４℃にて３０分ｒｏｔａｔｏｒにて攪拌した。ついで、光アフィニティー・ビオチンプローブを１．５μＭで処理し、同様にさらに３０分攪拌した。樹脂をｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄したのち、実施例Ｂ７と同様の方法でＵＶ照射、蛋白溶出を行った。得られたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ブロッティングを行い、光アフィニティー・ビオチンプローブと前処理したプラジエノライド化合物が競合することにより、プローブ由来のバンドが消失するか否かを検証した。
結果を図７に示した。
ＧＦＰ抗体サンプル、およびＳＡＰ１５５抗体サンプルの両方において、プラジエノライド化合物（プラジエノライドＢ、ＤおよびＥ７１０７）を競合させることにより、プローブ由来のバンドが消失した。したがって、光アフィニティー・ビオチンプローブの結合蛋白質は、プラジエノライド類の結合蛋白質と同一であると結論された。
以上のように、複数のプローブ化合物を用いてプラジエノライドの標的分子を追跡した。その結果、プラジエノライドの標的分子はＳＦ３ｂの構成蛋白質の一つであるＳＡＰ１３０であると結論付けられた。
実施例Ｂ９
ＳＦ３ｂに結合する化合物を多くの評価検体より効率的、定量的に探索可能とする目的で、Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅと蛍光プローブを用いた簡便な評価法を確立した。
９０μｌ（１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）のＨｅＬａ細胞を蛍光測定用の９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまき、一晩３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養したＨｅＬａ細胞に、実施例Ｂ８の結果からＳＦ３ｂに結合することが判明しているＥ７１０７の希釈系列を作り、終濃度（０，０．１５，０．４６，１．４，４．１，１２，３７，１１１，３３３，１０００ｎＭ）になるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３０分培養した。次に、３μＭに調整した蛍光プローブを５０μｌ添加（終濃度１μＭ）し２時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで反応させた。培地を除去後、２％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで５分間処理後、ＰＢＳで洗浄し、１μｇ／ｍｌのＨ３３３４２（ＳＩＧＭＡ社）で核染色後、ＩＮＣｅｌｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｈｃａｒｅ社）で核染色と蛍光プローブの画像を取得した。得られた画像を画像解析ソフトであるＤｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、核内の蛍光プローブの蛍光強度を解析し、ＳＦ３ｂに結合するＥ７１０７によって核内への蛍光プローブ集積が阻害されるか否かを検証した。
画像解析に用いた蛍光プローブの画像（縦６枚は同一濃度）の代表例（各ウェル３視野を撮影した）を図８ａに、画像解析のまとめを図８ｂに示した。Ｅ７１０７は濃度依存的に核内への蛍光プローブの集積を阻害しており、この方法により、
ＳＦ３ｂに結合する化合物を簡便に定量的に測定できるようになった。
［配列表］
2008016187.tif 000037
2008016187.tif 000038
2008016187.tif 000039
2008016187.tif 000040
2008016187.tif 000041
2008016187.tif 000042
2008016187.tif 000043
2008016187.tif 000044
2008016187.tif 000045
2008016187.tif 000046
2008016187.tif 000047
2008016187.tif 000048
2008016187.tif 000049
2008016187.tif 000050
2008016187.tif 000051
2008016187.tif 000052
2008016187.tif 000053
2008016187.tif 000054
2008016187.tif 000055
2008016187.tif 000056
2008016187.tif 000057
2008016187.tif 000058
2008016187.tif 000059
2008016187.tif 000060
2008016187.tif 000061
2008016187.tif 000062
2008016187.tif 000063
2008016187.tif 000064
2008016187.tif 000065
2008016187.tif 000066
2008016187.tif 000067
2008016187.tif 000068
【図１ａ】
2008016187.tif 000083
【図１ｂ】
2008016187.tif 000084
【図８ｂ】
2008016187.tif 000085
【図１ｃ】
2008016187.tif 000086
【図１ｄ】
2008016187.tif 000087
【図２】
2008016187.tif 000088
【図３ａ】
2008016187.tif 000089
【図３ｂ】
2008016187.tif 000090
【図４】
2008016187.tif 000091
【図５ａ】
2008016187.tif 000092
【図５ｂ】
2008016187.tif 000093
【図６ａ】
2008016187.tif 000094
【図６ｂ】
2008016187.tif 000095
【図７】
2008016187.tif 000096
【図８ａ】
2008016187.tif 000097
【国際調査報告】
2008016187.tif 000098
2008016187.tif 000099
2008016187.tif 000100
2008016187.tif 000101
2008016187.tif 000102
2008016187.tif 000103
2008016187.tif 000104