(57)【要約】  ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出用プローブおよびプライマー、並びに抗体の提供を目的とする。本発明によれば、Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられるポリヌクレオチドプローブおよびポリヌクレオチドプライマー、並びにドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられるＮａｔｏ３タンパク質に対する抗体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられるポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる、請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマー。
【請求項３】
Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１で表される塩基配列の１番目〜３６５番目および５３４番目〜６４０番目、配列番号：３で表される塩基配列の１番目〜３７６番目および５４５番目〜６６２番目、配列番号：５で表される塩基配列の１番目〜３０６番目および４７５番目〜５０１番目、配列番号：７で表される塩基配列の１番目〜３７７番目および５４６番目〜８８６番目、配列番号：９で表される塩基配列の１番目〜３１２番目および４８１番目〜５０７番目、配列番号：１１で表される塩基配列の１番目〜３０６番目および４７５番目〜５０１番目、配列番号：１３で表される塩基配列の１番目〜３０６番目および４７５番目〜５０１番目、配列番号：１５で表される塩基配列の１番目〜１７７番目および３４６番目〜３７２番目、配列番号：１７で表される塩基配列の１番目〜３５９番目および５２８番目〜５５７番目、並びに配列番号：１９で表される塩基配列の１番目〜３５７番目および５２３番目〜５５２番目からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列である、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマー。
【請求項４】
少なくとも１５塩基長である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の二種以上のポリヌクレオチドプライマーからなる、ポリヌクレオチドプライマーセット。
【請求項６】
ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられる、Ｎａｔｏ３タンパク質またはそれらの一部に対する抗体。
【請求項７】
Ｎａｔｏ３タンパク質またはそれらの一部が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０４番目および１６１番目〜１６８番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０４番目および１６１番目〜１６８番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列の１番目〜５９番目および１１６番目〜１２３番目、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０１番目および１５８番目〜１６４番目、並びに配列番号：２０で表されるアミノ酸配列の1番目〜１１９番目および１７６番目〜１８３番目からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部を含んでなるタンパク質である、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択する方法。
【請求項９】
Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項８に記載の方法：
（ａ）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドと請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；および 
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程。
【請求項１０】
工程（ａ）において、被験細胞試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ポリヌクレオチドプローブと接触させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項８に記載の方法：
（ｃ）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーまたは請求項５に記載のポリヌクレオチドプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および
（ｄ）形成された増幅産物を検出する工程。
【請求項１２】
工程（ｃ）において、被験細胞試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項８に記載の方法： 
（ｅ）請求項６または７に記載の抗体と被験細胞試料由来のタンパク質とを接触させる工程； および
（ｆ）抗原抗体複合体を検出する工程。
【請求項１４】
被験細胞試料が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞へ分化させる処理が行われたＥＳ細胞である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
分化させる処理が、ＳＤＩＡ法によるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
被験細胞試料が、胎児中脳腹側領域から得られた細胞である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）、工程（ｃ）、または工程（ｅ）において、被験細胞試料として、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞を使用することを特徴とする、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）、工程（ｄ）、または工程（ｆ）の後に、
（ｇ）Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程
を更に含んでなる、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子、Ｍｓｘ２遺伝子、およびＭａｓｈ１遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプローブを少なくとも含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するためのキット。
【請求項２１】
Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでなる請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーまたは請求項５に記載のポリヌクレオチドプライマーセットを少なくとも含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するためのキット。
【請求項２３】
Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでなる請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
請求項６または７に記載の抗体を少なくとも含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するためのキット。
【請求項２５】
Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでなる請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法：
（ｉ）ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞と、被験物質とを接触させる工程；および
（ｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞におけるＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出する工程。
【請求項２７】
（ｉｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞における、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程
を更に含んでなる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子、Ｍｓｘ２遺伝子、およびＭａｓｈ１遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の製造方法であって、
（ｉｖ）ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含み得る細胞を取得する工程；
（ｖ）請求項８〜１９のいずれか一項に記載の方法を用いて、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択する工程；および
（ｖｉ）工程（ｖ）で検出または選択された細胞を培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項３０】
ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択のための、Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの使用。
【請求項３１】
ハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドが、Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１で表される塩基配列の１番目〜３６５番目および５３４番目〜６４０番目、配列番号：３で表される塩基配列の１番目〜３７６番目および５４５番目〜６６２番目、配列番号：５で表される塩基配列の１番目〜３０６番目および４７５番目〜５０１番目、配列番号：７で表される塩基配列の１番目〜３７７番目および５４６番目〜８８６番目、配列番号：９で表される塩基配列の１番目〜３１２番目および４８１番目〜５０７番目、配列番号：１１で表される塩基配列の１番目〜３０６番目および４７５番目〜５０１番目、配列番号：１３で表される塩基配列の１番目〜３０６番目および４７５番目〜５０１番目、配列番号：１５で表される塩基配列の１番目〜１７７番目および３４６番目〜３７２番目、配列番号：１７で表される塩基配列の１番目〜３５９番目および５２８番目〜５５７番目、並びに配列番号：１９で表される塩基配列の１番目〜３５７番目および５２３番目〜５５２番目からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列である、請求項３０または３１に記載の使用。
【請求項３３】
ハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択のための、Ｎａｔｏ３タンパク質またはそれらの一部に対する抗体の使用。
【請求項３５】
Ｎａｔｏ３タンパク質またはそれらの一部が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０４番目および１６１番目〜１６８番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０４番目および１６１番目〜１６８番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列の１番目〜５９番目および１１６番目〜１２３番目、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０１番目および１５８番目〜１６４番目、並びに配列番号：２０で表されるアミノ酸配列の1番目〜１１９番目および１７６番目〜１８３番目からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部を含んでなるタンパク質である、請求項３４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカーであるＮａｔｏ３遺伝子に関し、詳細には、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出手段、並びに該細胞の検出方法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ドーパミン系は、哺乳動物の脳において重要な運動調節、ホルモン分泌調節、情動調節等に関与する非常に重要な系である。従って、ドーパミン作動性神経伝達における異常は、様々な神経系の障害を引き起こす。例えば、パーキンソン病は、中脳黒質のドーパミン産生ニューロンの特異的な脱落が原因で起こる錐体外路系の神経変性疾患である(HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 第２巻 第２３版，Isselbacher et al.編McGraw-HillInc., NY(1994)pp.2275-7)。【０００３】
パーキンソン病の治療法としては、産生されるドーパミン量の低下を補うためにＬ−ドーパ（３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン）を経口投与する方法が主に採られているが、効果の持続性が良くないことが知られている。【０００４】
そこで、失われたドーパミン産生ニューロンを補う方法として、最近では、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含む６〜９週齢の中絶胎児の中脳腹側領域を移植する治療法が試みられている（米国特許第５６９０９２７号；Spencer et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1541-8; Freed et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1549-55; Widner et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1556-63; Kordower et al.(1995)N.Engl.J.Med.332:1118-24; Defer et al.(1996)Brain 119:41-50; Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29:977-80)。しかし、現在のところ、この方法では細胞の供給面、倫理面（Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33:106; Turner et al.(1993)Neurosurg.33:1031-7)で問題があるとともに、感染汚染の危険性、免疫学的な移植片拒絶(Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29:977-80; Widner and Brudin(1988)Brain Res.Rev.13:287-324)、胎児組織が糖分解よりも脂質代謝に主に依存しているための生存率の低さ(Rosenstein(1995)Exp.Neurol.33:106)等の様々な面で問題が指摘されている。【０００５】
倫理面や供給不足の問題を解決する方法としては、例えば、ブタ由来の皮質、線条、および中脳細胞を用いる方法等も提案されている（例えば、特表平１０−５０８４８７号公報；特表平１０−５０８４８８号公報；特表平１０−５０９０３４号公報）。しかし、この方法においては、拒絶反応を抑制するため、細胞表面上の抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原）を改変するという煩雑な操作が必要とされる。移植片拒絶を解消する方法としては、例えば、セルトーリ細胞を同時に移植することにより、局在的に免疫抑制する方法も提案されている（特表平11-509170号公報；特表平11-501818号公報；Selawly and Cameron(1993)Cell Transplant 2:123-9)。ＭＨＣがマッチする血縁者、他人の骨髄、骨髄バンク、及び臍帯血バンク等から移植細胞を得ることも可能であるが、患者自身の細胞を用いることができれば、余計な操作や手間なしに拒絶反応の問題も解決することができる。【０００６】
そこで、中絶胎児由来の細胞に代えて、胚性幹細胞(ES)細胞、骨髄間質細胞などの非神経系細胞からのイン・ビトロにおけるドーパミン産生ニューロンの分化系の移植材料としての利用が有望視されている。実際、ラットパーキンソン病モデルの病変線条へのＥＳ細胞移植により機能的なドーパミン産生ニューロンが形成されたとの報告もある(Kimetal.(2002)Nature 418:50-56)。将来的にはＥＳ細胞若しくは患者本人の持つ神経幹細胞からの再生治療の重要性が増してくるものと思われる。【０００７】
一方で、神経組織の損傷の治療においては脳機能の再構築が必要となり、周囲の細胞と適切なリンクを形成する（ネットワーク形成）ために、成熟した細胞ではなくイン・ビボにおいてニューロンへと分化し得る前駆細胞を移植する必要がある。しかし、ニューロン前駆細胞の移植においては、上述した供給面以外に、前駆細胞が不均一な細胞集団へと分化する可能性があるという問題点がある。例えば、パーキンソン病の治療においては、カテコールアミン含有ニューロンの中でもドーパミン産生ニューロンを選択的に移植することが必要であり、これまでに、パーキンソン病の治療に用いる移植細胞として、線条体(Lindvall et al.(1989)Arch.Neurol.46:615-31; Widner et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1556-63)、ヒト胎児神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ＮＴ２Ｚ細胞の有糸分裂後ヒトニューロン（特表平９−５０５０５５４号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）、ドーパミン等のカテコールアミンを産生するように外来遺伝子によりトランスフェクトされた細胞、骨髄ストロマ細胞（特表２００２−５０４５０３号公報；特表２００２−５１３５４５号公報）、遺伝子改変されたＥＳ細胞(Kim et al(2002)Nature 418:50-56)等が提案されている。しかしながらいずれも、ドーパミン産生ニューロンまたはドーパミン産生ニューロンへと分化する細胞のみを含むものではない。【０００８】
未分化な細胞集団からドーパミン産生ニューロンを選択的に濃縮・分離する方法としては、ドーパミン産生ニューロンで発現するチロシンハイドロキシラーゼ（ＴＨ）等の遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光蛋白質を発現するレポーター遺伝子を細胞集団の各細胞に導入し、蛍光を発する細胞を分離することにより、ドーパミン産生ニューロンを生きたまま可視化して濃縮・分離、または同定する方法（特開２００２−５１７７５号公報）が提案されている。しかしこの方法は、外来遺伝子の導入という煩雑な工程を不可欠とするものであり、さらに、遺伝子治療に用いることを日的とする場合、レポーター遺伝子の存在は毒性、免疫原性の面からも問題である。【０００９】
以上のことから、現時点でのパーキンソン病移植治療における大きな問題の一つは、中絶胎児の中脳腹側領域由来あるいは分化誘導されるドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、いずれも多種の細胞の混合物である点である。神経回路形成における安全性を考えると、目的の細胞種のみを分離してから用いるのが望ましい。さらに、細胞の移植先の脳内での生存や、正しくネットワーク形成する能力を考えると、より早期の増殖前駆細胞を分離し、移植することが治療効果の観点から望ましいと言える。【００１０】
これまでに、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現する遺伝子としてＬｒｐ４（ＷＯ２００４／０６５５９９号公報）が報告されている。その他にも、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカーがいくつか報告されており（ＷＯ２００４／０３８０１８号公報、ＷＯ２００５／０５２１９０号公報）、そのうちＬｍｘ１ａについてはヒトおよびマウスのドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞、およびドーパミン産生ニューロンでの発現が確認されている（ＷＯ２００５／０５２１９０号公報）。【００１１】
ところで、Ｎａｔｏ３遺伝子は、塩基性へリックス・ループ・へリックス（basic helix-loop-helix；bHLH）を有する転写因子であり、これまでに、中脳に発現し、発生過程において重要な役割を果たすことが報告されている（Segev, E., N. Halachmi, A. Salzberg, and N. Ben-Arie. 2001. Mech Dev 106:197-202）。また、中脳、特に最腹側（floor  plate）に発現し、神経細胞の分化に関与していることが報告されている（Verzi, M. P., J. P. Anderson, E. Dodou, K. K. Kelly, S. B. Greene, B. J. North, R. M. Cripps, and B. L. Black. 2002. Dev Biol 249:174-90）。【００１２】
しかしながら、Ｎａｔｏ３遺伝子がドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現していることは報告されていない。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、今般、Ｎａｔｏ３遺伝子（本明細書において、単に「Ｎａｔｏ３」と言うことがある）がドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現していることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１４】
本発明は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出手段、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出方法、およびドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出キットを提供することを目的とする。
【００１５】
本発明はまた、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明はさらに、パーキンソン病の治療に用いられるドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明によれば、Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられるポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマー（以下「本発明によるプローブ」または「本発明によるプライマー」ということがある）が提供される。
【００１８】
本発明によれば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられる、Ｎａｔｏ３タンパク質またはそれらの一部に対する抗体（以下「本発明による抗体」ということがある）が提供される。
【００１９】
本発明によればまた、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択方法（以下「本発明による検出方法」ということがある）が提供される。
【００２０】
本発明によれば更に、本発明によるプローブ、本発明によるプライマー、または本発明による抗体を少なくとも含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するためのキットが提供される。
【００２１】
本発明によれば、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される。
【００２２】
本発明によれば、パーキンソン病の治療に用いられるドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の製造方法が提供される。
【００２３】
本発明によれば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択のための、Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００２４】
本発明によれば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択のための、Ｎａｔｏ３タンパク質またはそれらの一部に対する抗体の使用が提供される。
【００２５】
本発明によるプローブ、プライマー、および抗体は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的なマーカーとして利用することができる。したがって、本発明は、移植材料の純度検定やイン・ビトロでのドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞分化誘導法の開発等において極めて有用であり、再生医療の実用化推進に大きく貢献することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ドーパミン産生ニューロン関連マーカー遺伝子の発現時期を示した図である。
【図２】マウス１２．５日胚の中脳を示した図である。中脳を背腹軸に沿って４領域に分けた（Ｖ：最腹側領域、ＶＬ：腹側側方領域、ＤＬ：背側側方領域、Ｄ：最背側領域）。
【図３】中脳の各領域における、Ｎａｔｏ３、ＤＡＴ、Ｌｍｘ１ａおよびＬｒｐ４のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示した図である。
【図４】マウス１１．５日胚の中脳における、Ｎａｔｏ３、Ｎｕｒｒ１およびＴＨのｍＲＮＡ発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した結果を示した図である。点線はドーパミン産生ニューロン発生領域を示し、破線はＶＺ（脳室領域）とＭＬ（外套層）の境界を示す。
【図５】マウス１１．５日胚の中脳における、Ｎａｔｏ３、Ｌｍｘ１ａおよびＮｕｒｒ１のタンパク質発現、並びにこれらの共発現（二重染色）を免疫染色法により解析した結果を示した図である。点線はドーパミン産生ニューロン発生領域を示し、破線はＶＺ（脳室領域）とＭＬ（外套層）の境界を示す。
【図６】ＥＳ細胞より分化誘導したドーパミン産生ニューロン前駆細胞における、Ｎａｔｏ３およびその他ドーパミン産生ニューロンマーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示した図である。
【図７】セルソーターによるＬｒｐ４陽性細胞と陰性細胞との分離を示した図である。
【図８】マウス１２．５日胚（Ｅ１２．５）の中脳由来細胞およびＳＤＩＡ分化誘導細胞より分離したそれぞれのドーパミン産生ニューロン前駆細胞における、Ｎａｔｏ３およびその他ドーパミン産生ニューロンマーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示した図である。
【発明の具体的な説明】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の記述は、本発明を説明するための例示であり、本発明を記述された実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本明細書中で使用される全ての技術的用語、科学的用語および専門用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有し、単に特定の態様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いることができる。
【００２８】
[ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞]
本発明において検出または選択の対象である「ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞」は、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン前駆細胞を意味する。
【００２９】
ドーパミン産生ニューロンは、神経上皮細胞から、増殖前駆細胞、分裂停止後の前駆細胞の分化段階を経て、成熟ドーパミン産生ニューロンに分化する。ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は、ドーパミン産生ニューロンの最も初期の前駆細胞であるから、移植先の脳内での高い生存率や、高いネットワーク形成能が期待できる。従って、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は、パーキンソン病等、ドーパミン産生ニューロンの変性脱落によるドーパミン減少に起因する疾患の移植治療に有用である。
【００３０】
本発明によるプローブ、プライマー、または抗体を指標として選択された細胞は、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞であることから、従来の雑多な細胞集団または外来遺伝子を導入したドーパミン産生ニューロン前駆細胞と比べて、安全性、生存率、ネットワーク形成能の面でパーキンソン病等の神経変性疾患の移植治療に好ましいものである。該細胞は、分裂停止前、すなわち増殖中のドーパミン産生ニューロン前駆細胞であり、脳内の最適な場所で分化成熟していく可能性があり、また、イン・ビボにおいてさらにドーパミン産生ニューロン前駆細胞が増殖する可能性があることから、より長期的な治療効果も期待できる。従って、本発明は、パーキンソン病等の神経変性疾患の効果的な移植治療の実用化に途を拓くものであるといえる。
【００３１】
［ポリヌクレオチドプローブおよびポリヌクレオチドプライマー］
本発明によるプローブおよびプライマーは、Ｎａｔｏ３遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる。前記のように、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現はドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の指標として有用である。従って、本発明によるプローブおよびプライマーは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞検出用のマーカーとして用いることができる。
【００３２】
本発明によるプローブおよびプライマーは、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖ｃＤＮＡも組織ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖ｃＤＮＡも含まれる。組織中のＲＮＡの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。
【００３３】
本発明によるプローブおよびプライマーは、Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。本発明によるプローブおよびプライマーは、また、Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１０〜５０個または１０〜３０個、１５〜５０個または１５〜３０個、２０〜５０個または２０〜３０個、２５〜５０個または２５〜３０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。
【００３４】
本発明によるプローブおよびプライマーは、少なくとも１０塩基長であることができ、好ましくは、少なくとも１５塩基長、より好ましくは、少なくとも２０塩基長、さらに好ましくは、少なくとも２５塩基長である。本発明によるプローブおよびプライマーは、また、１０〜５０塩基長または１０〜３０塩基長、１５〜５０塩基長または１５〜３０塩基長、２０〜５０塩基長または２０〜３０塩基長、２５〜５０塩基長または２５〜３０塩基長である。
【００３５】
本発明によるプローブおよびプライマーの好ましい態様によれば、Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個（より好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなり、Ｎａｔｏ３遺伝子にハイブリダイズすることができる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられる１５〜３０塩基長のプローブおよびプライマーが提供される。
【００３６】
本発明によるプローブおよびプライマーの好ましい態様によればまた、Ｎａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列のうち、識別性の高い部分にハイブリダイズすることができるプローブおよびプライマーが提供される。このようなプローブおよびプライマーを用いることにより、増殖前駆細胞をより高い精度で検出することが可能となる。このようなプローブおよびプライマーとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列の１番目〜３６５番目および５３４番目〜６４０番目、配列番号：３で表される塩基配列の１番目〜３７６番目および５４５番目〜６６２番目、配列番号：５で表される塩基配列の１番目〜３０６番目および４７５番目〜５０１番目、配列番号：７で表される塩基配列の１番目〜３７７番目および５４６番目〜８８６番目、配列番号：９で表される塩基配列の１番目〜３１２番目および４８１番目〜５０７番目、配列番号：１１で表される塩基配列の１番目〜３０６番目および４７５番目〜５０１番目、配列番号：１３で表される塩基配列の１番目〜３０６番目および４７５番目〜５０１番目、配列番号：１５で表される塩基配列の１番目〜１７７番目および３４６番目〜３７２番目、配列番号：１７で表される塩基配列の１番目〜３５９番目および５２８番目〜５５７番目、並びに配列番号：１９で表される塩基配列の１番目〜３５７番目および５２３番目〜５５２番目からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが挙げられる。
【００３７】
本発明によるプローブは、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプローブとして使用することができる。
【００３８】
本発明によるプローブは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プローブの調製は周知であり、例えば、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997))に従って実施できる。
【００３９】
本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。
【００４０】
本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
【００４１】
本発明によるプライマーセットはＮａｔｏ３遺伝子のヌクレオチド配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマー（プライマーペア）の一方がＮａｔｏ３遺伝子の二本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＬＡＭＰ法（ＷＯ００／２８０８２号公報）においては、標的遺伝子に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３という３つの領域を、それぞれ規定し、この６つの領域を用いて４種類のプライマーを設計することができる。
【００４２】
本発明によるプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997))に従って実施できる。
【００４３】
本発明においてドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の存在の指標となる「Ｎａｔｏ３遺伝子」は、ヒト、マウス、ラット、チンパンジー、イヌ、ウシ、チキン等において公知である。それぞれの配列が開示されているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は下記の通りである。
【００４４】
Ｎａｔｏ３遺伝子
ヒト：ＮＭ＿１５２８９８（配列番号：１（塩基配列）、配列番号：２（アミノ酸配列）、以下同様の順に示す）、ＡＦ５１７１２２（配列番号：３、配列番号：４）、ＢＣ０６９１４７（配列番号：５、配列番号：６）、ＡＦ３６９８９７（ＢＣ０６９１４７と同一）
マウス：ＮＭ＿０３３５２２（配列番号：７、配列番号：８）、ＡＦ５１７１２１（ＮＭ＿０３３５２２と同一）、ＡＦ３６９８９６（配列番号：９、配列番号：１０）  
ラット：  ＸＭ＿３４５６５８（配列番号：１１、配列番号：１２）
チンパンジー：ＸＭ＿５２７６７６（配列番号：１３、配列番号：１４）
イヌ：ＸＭ＿５３９４５７（配列番号：１５、配列番号：１６）
ウシ：ＸＭ＿５８４０９７（配列番号：１７、配列番号：１８）
チキン：ＸＭ＿４２５９８９（配列番号：１９、配列番号：２０）
上記以外の動物（好ましくは、哺乳動物）についても、当業者であれば、公知のＮａｔｏ３遺伝子の全長配列に基づいて、その動物に内在するＮａｔｏ３遺伝子の配列を特定することができる。例えば、ヒトあるいはマウスのＮａｔｏ３遺伝子に基づいて相同性検索を行い、その動物のＮａｔｏ３遺伝子を検索し、特定することができる。相同性検索に当たっては後述するＢＬＡＳＴ等を利用することができる。
【００４５】
Ｎａｔｏ３遺伝子の例としては、
配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるヒトＮａｔｏ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：８および配列番号：１０からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるマウスＮａｔｏ３タンパク質をコードするヌクレオチド；
配列番号：１２のアミノ酸配列からなるラットＮａｔｏ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：１４のアミノ酸配列からなるチンパンジーＮａｔｏ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：１６のアミノ酸配列からなるイヌＮａｔｏ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：１８のアミノ酸配列からなるウシＮａｔｏ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：２０のアミノ酸配列からなるチキンＮａｔｏ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
が挙げられる。
【００４６】
Ｎａｔｏ３遺伝子の例としては、また、
配列番号：１、配列番号：３および配列番号：５からなる群から選択される少なくとも一つに記載のヒトＮａｔｏ３遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：７および配列番号：９からなる群から選択される少なくとも一つに記載のマウスＮａｔｏ３遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：１１のラットＮａｔｏ３遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：１３のチンパンジーＮａｔｏ３遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：１５のイヌＮａｔｏ３遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：１７のウシＮａｔｏ３遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：１９のチキンＮａｔｏ３遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド：
が挙げられる。
【００４７】
本発明によるＮａｔｏ３遺伝子には、Ｎａｔｏ３タンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで「機能的に同等」であるかどうかは、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現と関連する生体現象あるいは機能を評価することにより、例えば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞において選択的に発現しているか否かを評価することにより決定することができる。
【００４８】
また、Ｎａｔｏ３タンパク質と機能的に同等のものとしては、アミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）をコードする遺伝子が多型である場合、当該多型も含まれる。
【００４９】
Ｎａｔｏ３タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子としては下記が挙げられる。
・ Ｎａｔｏ３タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列）において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）をコードする遺伝子；
・ Ｎａｔｏ３タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列）をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子；および
・ Ｎａｔｏ３タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列）と少なくとも７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【００５０】
本願明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされた」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。
【００５１】
Ｎａｔｏ３タンパク質の改変アミノ酸配列は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、Ｎａｔｏ３タンパク質のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００５２】
ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００５３】
本願明細書において「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを意味する。具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、標的ヌクレオチド配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０℃〜７０℃、好ましくは６０℃〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。さらに、ハイブリダイズしたものを洗浄するときの条件は、０．２または２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、温度２０−６８℃で行うことができる。ストリンジェント（high stringency）な条件にするかマイルド（low stringency）な条件にするかは、洗浄時の塩濃度又は温度で差を設けることができる。塩濃度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ストリンジェント洗浄バッファー（high stringency wash buffer）として０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、マイルド洗浄バッファー（low stringency wash buffer）として２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行うことができる。また、温度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ストリンジェントの場合は６８℃、中等度（moderate stringency）の場合は４２℃、マイルドの場合は室温（２０−２５℃）でいずれの場合も０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行えばよい。
【００５４】
通常、プレハイブリダイズを実施する場合にはハイブリダイズと同じ条件で実施するが、ハイブリダイズとプレ（予備）洗浄は同じ条件で行うとは限らない。
【００５５】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００５６】
本願明細書において、アミノ酸配列について「同一性」（相同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983)）。相同性の計算には、市販のソフトであるＢＬＡＳＴ（Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、ＦＡＳＴＡ(Peasron: Methods in Enzymology 183:63-69 (1990))等を用いることができる。
【００５７】
Ｎａｔｏ３タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
【００５８】
「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
【００５９】
［抗体］
本発明による抗体は、Ｎａｔｏ３タンパク質を特異的に認識することができる。前記のように、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現はドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の指標として有用である。従って、本発明による抗体は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞検出用のマーカーとして用いることができる。
【００６０】
本発明による抗体を得るためのＮａｔｏ３タンパク質は、Ｎａｔｏ３の抗原性を有していればよく、Ｎａｔｏ３タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が包含される。このようなタンパク質が元のタンパク質と同じ生物学的活性が維持されることは公知である(Mark et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5662-6;Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res. 10:6487-500;Wang et al.(1984)Science 224:1431-3;Dalbadie-McFarland et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6409-13)。あるタンパク質において、元のタンパク質の抗原性を維持した状態で、１若しくは複数個のアミノ酸を欠失、挿入、置換または付加させる方法は公知である。例えば、部位特異的変異誘発法により変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドを調製し、適宜発現させて得ることができる(Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,(1987-1997),Section8.1-8.5;Hashimoto-Goto et a1.(1995)Gene 152:271-5;Kinkel(1985)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 82:488-92;Kramer and Fritz(1987)Method.Enzymol 154:350-67;Kunke1(1988)Method.Enzymo1.85:2763-6)。
【００６１】
本発明による抗体には、Ｎａｔｏ３タンパク質の一部に対して特異的な抗体も含まれる。即ち、本発明の抗体を得るためのＮａｔｏ３タンパク質には、Ｎａｔｏ３タンパク質の全長アミノ酸配列を有するポリペプチドに加えて、Ｎａｔｏ３タンパク質の少なくとも６アミノ酸残基以上（例えば、６、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）と同一の配列を有するポリペプチド断片である。本明細書におけるＮａｔｏ３タンパク質のポリペプチド断片は、Ｎａｔｏ３タンパク質の抗原性さえ有すればどのような断片であってもよい。
【００６２】
好ましい断片としては、Ｎａｔｏ３タンパク質のアミノ末端、カルボキシル末端等のポリペプチド断片を挙げることができる。ポリペプチドの抗原決定部位は、タンパク質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性を解析する方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Biol. 157:105-22)、二次構造を解析する方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem. 47:251-76)により推定し、さらにコンピュータープログラム(Anal.Biochem. 151:540-6(1985))または短いペプチドを合成しその抗原性を確認するＰＥＰＳＣＡＮ法（特表昭６０−５００６８４号公報）等の手法により確認することができる。
【００６３】
Ｎａｔｏ３タンパク質に対する抗体の例としては、
配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：８および配列番号：１０からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：１２のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：１４のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：１６のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：１８のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：２０のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体：
が挙げられる。
【００６４】
本発明による抗体の好ましい態様によれば、Ｎａｔｏ３タンパク質において識別性の高いポリペプチド部分を認識する抗体が提供される。このような抗体を用いることにより、増殖前駆細胞をより高い精度で検出することが可能となる。このような抗体としては、Ｎａｔｏ３タンパク質において識別性の高いポリペプチド部分に対する抗体が挙げられ、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０４番目および１６１番目〜１６８番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０４番目および１６１番目〜１６８番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０２番目および１５９番目〜１６６番目、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列の１番目〜５９番目および１１６番目〜１２３番目、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１０１番目および１５８番目〜１６４番目、並びに配列番号：２０で表されるアミノ酸配列の1番目〜１１９番目および１７６番目〜１８３番目からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部を含んでなるタンパク質に対する抗体が挙げられる。
【００６５】
本発明による抗体は、当業者に周知方法を用いて得ることができる（例えば、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))、Antibodies:A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。
【００６６】
本発明による抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、多特異性抗体、並びに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ等の抗体断片が含まれる。
【００６７】
ポリクローナル抗体であれば、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離し、ポリクローナル抗体を含む血清とすることができる。
【００６８】
必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。
【００６９】
モノクローナル抗体であれば、上記抗原を感作した哺乳動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を取り出し、骨髄腫細胞などと細胞融合させ、得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
【００７０】
免疫抗原としては、Ｎａｔｏ３タンパク質のフラグメントを用いることができる。あるいは、上記アミノ酸配列に基づき合成したものを用いることができる。抗原はキャリア蛋白質との複合体として用いてもよい。抗原とキャリアタンパク質の複合体の調製には種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
【００７１】
免疫される動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなどが挙げられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内の投与が挙げられる。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。
【００７２】
免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。
【００７３】
細胞融合の操作は既知の方法、例えば、Nature, 256,495, 1975に従って実施できる。
【００７４】
融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられ、通常には、２０〜５０％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用いて２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度下、抗体 産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０：１程度、約１〜１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
【００７５】
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。例えば、Ｎａｔｏ３タンパク質をコートしたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いるＥＩＡ法、Ｎａｔｏ３タンパク質を含むサンプルを電気泳動後、ニトロセルロース転写膜を用いるイムノブロット法などが挙げられる。
【００７６】
このようなウェルから更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行い、クローンを得ることができる。ハイブリドーマの選別、育種は、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタンを投与したＳＣＩＤマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。
【００７７】
モノクローナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらにＮａｔｏ３タンパク質を用いるアフィニティクロマトグラフィーなどの手段により容易に達成することができる。
【００７８】
血清からのポリクローナル抗体の精製も同様に行うことができる。
【００７９】
［検出方法］
Ｎａｔｏ３遺伝子の発現は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の存在の指標となる。従って、本発明によれば、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。
【００８０】
ここで、「Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出する」方法としては、被験細胞試料におけるＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
【００８１】
ここで、「被験細胞試料」とは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる細胞試料であればよく、中脳腹側領域の細胞を用いることができる。中脳腹側領域の細胞は、公知の方法により取得することができる（Studer, L., et al. Nature Neurosci (1998) 1:290-295）。好ましくは、胎児（好ましくは、ヒト中絶胎児）または患者自身の中脳腹側領域の細胞を被験細胞試料として用いることができる。また、イン・ビトロで分化誘導されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含む培養細胞を被験細胞試料として用いることができる。イン・ビトロにおけるドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導は、公知のＥＳ細胞（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(1):31-40, Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579）、骨髄間質細胞、神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）等の細胞を出発材料として、公知の方法、例えば、ＳＤＩＡ法（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(1):31-40）、５−ｓｔａｇｅ法(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)等による分化させる処理を行うことにより実施することができる。好ましくは、ＳＤＩＡ法による分化させる処理が行われたＥＳ細胞を被験細胞試料として用いることができる。
【００８２】
ここで「ＳＤＩＡ法」は、無血清培地中で、ＥＳ細胞をストローマ細胞株ＰＡ６と共培養することにより行うことができる（Kawasaki et. al. Neuron. 2000 28(1):31-40）。また、「５−ｓｔａｇｅ法」は、ＥＳ細胞を血清存在下で非付着性培養皿上で培養することによりｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ（ＥＢ）を形成させ、続いてＥＢを付着性培養皿上に付着させることで、神経前駆細胞を選択する。最後に、Ｓｈｈ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８等の成長因子を添加し、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を誘導することにより行うことができる(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。
【００８３】
本発明による検出法の第一の態様によれば、本発明によるプローブを核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を検出することにより細胞試料におけるＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出することができる。
【００８４】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989)、特にSection 9.47-9.58)、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997)、特にSection 6.3-6.4)、『DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University(1995)、条件については特にSection 2.10)を参照することができる。
【００８５】
ハイブリダイゼーション法を利用したＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ａ）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および 
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程。
【００８６】
工程（ａ）において、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。
【００８７】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、および３５Ｓ）、蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。
【００８８】
ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。
【００８９】
ハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞は、Ｎａｔｏ３遺伝子を発現している細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
【００９０】
本発明による検出法の第二の態様によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、細胞試料におけるＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出することができる。
【００９１】
核酸増幅法を利用したＮａｔｏ３遺伝子の発現の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ｃ）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および
（ｄ）形成された増幅産物を検出する工程。
【００９２】
工程（ｃ）において、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いることができる。
【００９３】
増幅産物の検出は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を用いて実施できる。
【００９４】
増幅産物が検出される細胞は、Ｎａｔｏ３遺伝子を発現している細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
【００９５】
本発明による検出法の第三の態様によれば、本発明による抗体と細胞試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより細胞試料におけるＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出することができる。
【００９６】
抗原抗体反応を利用したＮａｔｏ３遺伝子の発現の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ｅ）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程； および
（ｆ）抗原抗体複合体を測定する工程。
【００９７】
抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料中のＮａｔｏ３タンパク質を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては螢光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。
【００９８】
抗原抗体複合体が検出される細胞は、Ｎａｔｏ３遺伝子を発現している細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
【００９９】
パーキンソン病の治療に用いるためには、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は純度が高いことが望ましい。
【０１００】
前記の各検出工程は１回のみならず、同工程を繰り返し行うことにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。
【０１０１】
従って、本発明による検出方法によれば、前記の工程を２回以上行うことにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞をより高精度に検出または選択することができる。
【０１０２】
また、他のマーカー遺伝子、好ましくはＮａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子、を併用することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。
【０１０３】
従って、本発明による検出方法によればまた、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子や分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子等を併用し、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現のみならず、前記した他のマーカー遺伝子の発現をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞をより高精度に検出または選択することができる。
【０１０４】
各分化段階において選択的に発現するドーパミン産生ニューロン関連マーカー遺伝子を図１に示す。
【０１０５】
Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においては、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を併用し、Ｎａｔｏ３遺伝子のみならず、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
【０１０６】
具体的には、工程（ａ）、工程（ｃ）、または工程（ｅ）において、被験細胞試料として、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞、工程（ｄ）において増幅産物が検出された細胞、または工程（ｆ）において抗原抗体複合体が検出された細胞は、いずれもＮａｔｏ３遺伝子を発現し、かつ、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現している細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
【０１０７】
また、工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞、工程（ｄ）において増幅産物が検出された細胞、または工程（ｆ）において抗原抗体複合体が検出された細胞について、それぞれ、（ｇ−１）Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程を更に実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｇ−１）において、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞は、Ｎａｔｏ３遺伝子を発現し、かつ、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現している細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
【０１０８】
Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子を併用し、Ｎａｔｏ３遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出されないことを確認することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
【０１０９】
具体的には、工程（ａ）、工程（ｃ）、または工程（ｅ）において、被験細胞試料として、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出されなかった細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞、工程（ｄ）において増幅産物が検出された細胞、または工程（ｆ）において抗原抗体複合体が検出された細胞は、いずれもＮａｔｏ３遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
【０１１０】
また、工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞、工程（ｄ）において増幅産物が検出された細胞、または工程（ｆ）において抗原抗体複合体が検出された細胞について、それぞれ、（ｇ−２）分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程を更に実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｇ−２）において、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出されない細胞は、Ｎａｔｏ３遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
【０１１１】
「Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」としては、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現しているＮａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子、Ｍｓｘ２遺伝子、Ｍａｓｈ１遺伝子が挙げられる。
【０１１２】
Ｌｒｐ４遺伝子については、ＷＯ２００４／０６５５９９号公報に記載されている。Ｍａｓｈ１遺伝子については、Kele J, Simplicio N, Ferri AL, Mira H, Guillemot F, Arenas E, Ang SL.Neurogenin 2 is required for the development of ventral midbrain dopaminergic neurons. Development. 2006 Feb;133(3):495-505に記載されている。Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子については、本発明者らによってドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現されることが確認されている（データ省略）。
【０１１３】
Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
【０１１４】
「分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子」としては、中脳最腹側外套層（ＭＬ領域）に発現している遺伝子が挙げられ、例えば、Ｎｕｒｒ１遺伝子、Ｅｎ１遺伝子、Ｅｎ２遺伝子、Ｐｔｘ３遺伝子、ＴＨ遺伝子が挙げられる。また、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現している遺伝子が挙げられ、例えば、６５Ｂ１３遺伝子が挙げられる。
【０１１５】
Ｎｕｒｒ１遺伝子については、Science. 1997 11;276(5310):248-50に記載されている。Ｅｎ１遺伝子については、J. Neurosci.2001 21(9): 3126-34に記載されている。Ｅｎ２遺伝子については、J. Neurosci.2001 21(9): 3126-34に記載されている。Ｐｔｘ３遺伝子については、Proc.Natl.Acad.Sci.1997 94: 13305-10に記載されている。ＴＨ遺伝子については、Science. 1997 11;276(5310):248-50に記載されている。６５Ｂ１３遺伝子については、ＷＯ２００４／０３８０１８号公報に記載されている。
【０１１６】
分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
【０１１７】
［検出キット］
本発明によれば、本発明による検出方法を実施するための検出キットが提供される。
【０１１８】
本発明による検出キットの第一の態様としては、本発明による第一の態様の検出法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法によりＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出する。
【０１１９】
従って第一の態様の検出方法は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１２０】
本発明による第一の態様の検出キットは、精度の高い検出を行うために、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を更に検出する。
【０１２１】
本発明による検出用キットの第二の態様としては、本発明による第二の態様の検出法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法によりＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出する。
【０１２２】
従って第二の態様の検出方法は、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、ＰＣＲが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１２３】
本発明による第二の態様の検出キットは、精度の高い検出を行うために、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を更に検出する。
【０１２４】
本発明による検出キットの第三の態様としては、本発明による第三の態様の検出法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、Ｎａｔｏ３タンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することによりＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出する。
【０１２５】
従って第三の態様の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１２６】
本発明による第三の態様の検出キットは、精度の高い検出を行うために、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を更に検出する。
【０１２７】
［スクリーニング方法］
本発明による検出方法は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニングに適用することができる。すなわち、被験物質の添加により、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化誘導されたか否かを、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を指標として判定することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞分化誘導に有効な物質をスクリーニングすることができる。
【０１２８】
従って、本発明によれば、下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
（ｉ）ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞と、被験物質とを接触させる工程；および
（ｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞におけるＮａｔｏ３遺伝子の発現を検出する工程。
【０１２９】
工程（ｉ）において、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞は、好ましくは、胎児中脳腹側領域、またはＥＳ細胞より分化誘導した神経前駆細胞を含む培養細胞から採取することができる。
【０１３０】
工程（ｉ）において、「被験物質を接触させる」とは、例えば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞を含む培養細胞に被験物質を添加することにより行うことができる。
【０１３１】
「被験物質」としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、核酸（アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ等）等が挙げられ、好ましくは、合成低分子化合物であるが、これらに限定されるものではない。「被験物質」は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
【０１３２】
工程（ｉｉ）においては、本発明による検出法に従って、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出することができる。
【０１３３】
具体的には、ハイブリダイゼーション法を利用した検出については工程（ａ）および（ｂ）を、核酸増幅法を利用した検出については工程（ｃ）および（ｄ）を、抗原抗体反応を利用した検出については工程（ｅ）および（ｆ）を、それぞれ実施することにより、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を検出することができる。
【０１３４】
工程（ｉｉ）において、被験物質を接触させて、細胞試料においてＮａｔｏ３遺伝子の発現が検出された場合に、該物質をドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質であると判定することができる。
【０１３５】
本発明によるスクリーニング法により特定された物質は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質として用いることができる。
【０１３６】
本発明によれば、更に下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
（ｉｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞における、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程。
【０１３７】
工程（ｉｉ）において、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現が検出され、かつ、工程（ｉｉｉ）において、Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された場合に、該物質をドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質であると高精度に判定することができる。
【０１３８】
工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉ）の後に行われればよく、工程（ｉｉ）の前でも後でもよい。
【０１３９】
「Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」としては、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現しているＮａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｍｓｘ１遺伝子、Ｍｓｘ２遺伝子、Ｍａｓｈ１遺伝子が挙げられる。
【０１４０】
Ｎａｔｏ３遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
【０１４１】
［製造方法］
本発明による検出方法は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞はパーキンソン病の治療に用いることができる。従って、Ｎａｔｏ３遺伝子の発現を指標として、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞から、パーキンソン病の治療に用いられるドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を製造することができる。
【０１４２】
本発明によれば、下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の製造方法が提供される：
（ｉｖ）ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含み得る細胞を取得する工程；
（ｖ）本発明による検出方法を用いて、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択する工程；および
（ｖｉ）（ｖ）の工程で検出または選択された細胞を培養する工程。
【０１４３】
本発明によれば、本発明による検出方法により検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞、または本発明による製造方法により製造されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を、ヒトを含む哺乳動物に移植する工程を含んでなる、パーキンソン病の治療方法が提供される。
【０１４４】
本発明の治療方法によれば、移植されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞がドーパミンを産生することによって、パーキンソン病を予防および／または治療することができる。
【０１４５】
本発明による治療方法の実施に当たっては、ヒトを含む哺乳動物、好ましくは移植を受ける個体自身または中絶胎児、からドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含み得る細胞を取得することができる。
【０１４６】
ここで、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は脳、好ましくは中脳、に移植することができる。
【０１４７】
なお、本願明細書において「検出」には、「識別」も含まれる。
【実施例】
【０１４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明の範囲を限定するものではない。【０１４９】
［実施例１］Ｎａｔｏ３遺伝子の発現解析
（１）ＲＴ−ＰＣＲ法による解析
Ｎａｔｏ３遺伝子がドーパミン産生ニューロン系列の細胞に発現することを確認するため、以下のプロトコールによるＲＴ−ＰＣＲ法により、マウス胎児中脳各領域におけるＮａｔｏ３、ＤＡＴ、Ｌｍｘ１ａ、Ｌｒｐ４のｍＲＮＡの発現を調べた。ここで、ＤＡＴは、ドーパミン産生ニューロンのマーカー遺伝子であり（Development. 2004;131(5):1145-55.）、Ｌｍｘ１ａは、ドーパミン産生ニューロンおよびドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカー遺伝子であり（ＷＯ２００５／０５２１９０）、Ｌｒｐ４は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞のマーカー遺伝子である（ＷＯ２００４／０６５５９９）。【０１５０】
マウス（SLCより入手）１２．５日胚より図２に示した中脳の４領域（Ｖ領域：最腹側領域、ＶＬ領域：腹側側方領域、ＤＬ領域：背側側方領域、Ｄ領域：最背側領域）を切り出し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ (TAKARA)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩ（TAKARA）で消化したのち、ａｄ２を付加し、ａｄ２Ｓをプライマーとして、１５サイクルのＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを増幅して、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型に用いた。増幅条件は、７２℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で２分の反応を１５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
ａｄ２Ｓ： cagctccacaacctacatcattccgt（配列番号:２１）
ａｄ２Ａ： acggaatgatgt（配列番号: ２２）【０１５１】
次に、増幅したｃＤＮＡ  ４ｎｇ、０．４ｎｇ、０．０４ｎｇ相当分のｃＤＮＡを鋳型に用いて以下の反応系でＰＣＲを行った。
１０×ＥｘＴａｑ                            １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                    ０．８μｌ
ＥｘＴａｑ                            ０．０５μｌ
１００μＭ  プライマー                各０．１μｌ
ｃＤＮＡ                                    １μｌ
蒸留水                                ６．９５μｌ
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で２分の増幅反応を行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。ＰＣＲの増幅は、Ｌｒｐ４、ＤＡＴ、Ｌｍｘ１ａは２６サイクル、Ｎａｔｏ３は２５サイクルで行った。【０１５２】
下記プライマーをＰＣＲに使用した。
Ｌｒｐ４   ：tagtctaccactgctcgactgtaacg（配列番号:２３） 
cagagtgaacccagtggacatatctg（配列番号:２４）
ＤＡＴ     ：cagaatcctgtgctcacggtagttgc（配列番号:２５）
actaaagtggctgcaagctgaccagg（配列番号:２６）
Ｌｍｘ１ａ ：tggttcaggtgtggttccagaaccag（配列番号:２７）
tctgaggttgccaggaagcagtctcc（配列番号:２８）
Ｎａｔｏ３ ：cctgggaagactgtcgcagtttgatg（配列番号:２９）
gaaggcctcgtttaggttgaacatcc（配列番号:３０）【０１５３】
その結果、Ｎａｔｏ３のｍＲＮＡは、ドーパミン産生ニューロンおよびドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカー遺伝子と同様に中脳のＶ領域に選択的に発現することが明らかになった（図３）。【０１５４】
（２）ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションによる解析  
さらに詳細に発現パターンを調べるために以下のプロトコールによるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、Ｎａｔｏ３、Ｎｕｒｒ１およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のｍＲＮＡの発現解析を行った。Ｎｕｒｒ１およびＴＨは、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞において、分裂停止後に初めて発現が誘導されることが知られているマーカー遺伝子である（Science. 1997 11;276(5310):248-50.）。【０１５５】
まず、以下の方法でＤＩＧ化プローブを作製した。
マウス（SLCより入手）１２．５日胚より中脳後脳領域を切り出し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ (TAKARA)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡを鋳型に用いて以下の反応系でＮａｔｏ３、Ｎｕｒｒ１、ＴＨのｃＤＮＡを増幅した。
１０×ＥｘＴａｑ                            ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                        ４μｌ
ＥｘＴａｑ                            ０．２５μｌ
１００μＭ  プライマー                各０．５μｌ
ｃＤＮＡ                                    １μｌ
蒸留水                               ３８.７５μｌ
増幅条件は、９４℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で２分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。【０１５６】
下記プライマーをＰＣＲに使用した。
Ｎａｔｏ３  ：atcggcagctatgccattcctgcaag（配列番号３１）
tgctccaagcaagaagctctaactcc（配列番号３２）
ＴＨ        ：gctgtcacgtccccaaggttcattgg（配列番号３３）
ggagcgcatgcagtagtaagatgtgg（配列番号３４）
Ｎｕｒｒ１  ：catatgatcgagcagaggaagacacc（配列番号３５）
agtgcgaacaccgtagtgctgacagg（配列番号３６）【０１５７】
増幅したｃＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ(Invitrogen)にクローニングし、これを鋳型に用いてＤＩＧ化プローブを以下の反応系で合成した（試薬は全てRocheより購入）。
ＲＮＡ  ポリメラーゼ  バッファー            ２μｌ
ＮＴＰ  ラベリング  ミックス                ２μｌ
ＲＮａｓｅ  インヒビター                    １μｌ
ＲＮＡ  ポリメラーゼ（Ｔ７またはＳＰ６）    ２μｌ
鋳型ＤＮＡ                                  １μｇ
蒸留水                                総量２０μｌ
３７℃２時間の後、ＤＮａｓｅＩ（Roche）処理を３７℃で１５分行い、ＤＩＧ化ＲＮＡプローブをエタノール沈殿により回収した。【０１５８】
次に、マウス１１．５日胚を摘出し４％ＰＦＡ（WAKO）／ＰＢＳ（−）を用いて４℃で２時間固定した後、２０％ショ糖（WAKO）／ＰＢＳ（−）を用いて４℃で一晩置換し、ＯＣＴ（サクラセイキ）で包埋した。厚さ１２μｍの切片を作製し、スライドガラス上で乾燥させた後に４％ＰＦＡを用いて室温で３０分間再固定した。ＰＢＳで洗浄した後、ハイブリダイゼーション（１μｇ／ｍｌ  ＤＩＧ化ＲＮＡプローブ、５０％ホルムアミド（ナカライテクス）、５ｘＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌ  酵母ＲＮＡ（Sigma）、５０μｇ／ｍｌ  ヘパリン）を６８℃で４０時間行った。その後、洗浄（５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ）を６８℃で行い、さらに洗浄（５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ）を６８℃で行った。１ｘＴＢＳＴで室温で洗浄ののち、ブロッキング（ブロッキング剤：Roche）を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（DAKO）を４℃で一晩反応させ、洗浄（１ｘＴＢＳＴ、２ｍＭ  レバミソール）の後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ (DAKO)を基質として発色させた。【０１５９】
その結果、ドーパミン産生ニューロンの発生する時期であるマウス１１．５日胚において、Ｎａｔｏ３のｍＲＮＡは、ＴＨ及びＮｕｒｒ１と同様にＶ領域に強く発現することが明らかになった（図４）。また、ＴＨおよびＮｕｒｒ１のｍＲＮＡが分裂停止後のニューロンの存在する外套層（mantle layer；ＭＬ）領域のみに発現するのに対して、Ｎａｔｏ３のｍＲＮＡは、ＭＬ領域には発現せず、増殖前駆細胞の存在する脳室領域（ventricular zone；ＶＺ）にのみに発現することも明らかになった（図４）。以上の結果から、Ｎａｔｏ３のｍＲＮＡは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に強く発現することが明らかになった。【０１６０】
[実施例２]Ｎａｔｏ３タンパク質の発現解析
次に、抗Ｎａｔｏ３抗体を用いてＮａｔｏ３タンパク質の発現を検討した。また、抗Ｌｍｘ１ａ抗体および抗Ｎｕｒｒ１抗体を用いた二重染色も行った。【０１６１】
まず、Ｎａｔｏ３タンパク質のうち、１−９２アミノ酸にあたる領域をＧＳＴタンパク質との融合タンパク質として大腸菌ＪＭ１０９株（TAKARA）で発現させて回収した。回収した融合タンパク質をラットに免疫したのち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と細胞融合させ、抗Ｎａｔｏ３抗体産生ハイブリドーマを得た（ハイブリドーマ作製はコージンバイオに外注）。同様に、Ｌｍｘ１ａタンパク質のうち、２７１−３０７アミノ酸にあたる領域をＧＳＴタンパク質との融合タンパク質として発現させて回収した。回収した融合タンパク質をハムスター（SLCより入手）に免疫したのち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞（ATCC）と細胞融合させ抗Ｌｍｘ１ａ抗体産生ハイブリドーマを得た。【０１６２】
マウス１１．５日胚を摘出し、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）を用いて４℃で２時間固定した後、２０％ショ糖／ＰＢＳ（−）を用いて４℃で一晩置換し、ＯＣＴで包埋した。厚さ１２μｍの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で３０分乾燥させ、ＰＢＳ（−）で再び湿潤させた。その後、ブロッキング（ブロックエース（大日本製薬））を室温で３０分間行い、一次抗体（抗Ｎａｔｏ３および抗Ｌｍｘ１ａ抗体は上記ハイブリドーマ培養上清、抗Ｎｕｒｒ１抗体はサンタクルーズより入手）を室温で１時間反応させた後、さらに４℃で一晩反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（−）を用いて室温で１５分間の洗浄を３回行った。次に、蛍光標識した２次抗体（Jackson）を室温で１時間反応させ、同様に洗浄を行った後、ＰＢＳ（−）によって室温で１０分間洗浄し、封入した。【０１６３】
その結果、Ｎａｔｏ３は、マウス１１．５日胚の中脳においてｍＲＮＡだけでなくタンパク質としても発現していることが明らかになった（図５）。また、抗Ｌｍｘ１ａ抗体および抗Ｎｕｒｒ１抗体との二重染色の結果より、Ｎａｔｏ３タンパク質は、Ｌｍｘ１ａタンパク質と共発現することから、ドーパミン産生ニューロン系列の細胞に選択的に発現することが明らかになった（図５）。更に、Ｎａｔｏ３タンパク質は、Ｎｕｒｒ１タンパク質が発現しないＶＺ領域に選択的に発現することから、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現することも明らかになった（図５）。【０１６４】
［実施例３］ＥＳ細胞より分化誘導したドーパミン産生ニューロンにおけるＮａｔｏ３の発現
ＥＳ細胞をイン・ビトロでドーパミン産生ニューロンに分化誘導させた場合に、Ｎａｔｏ３遺伝子が発現するか否かを検討した。【０１６５】
まず、ＳＤＩＡ法（Kawasaki et. al. Neuron. 2000 Oct;28(1):31-40.）に従い、ＥＳ細胞（理研CDB西川氏から提供されたマウス由来ＣＣＥ株、Kawasaki et. al. Neuron. 2000 28(1):31-40.）よりドーパミン産生ニューロンへの分化誘導を行った。誘導後４、６、８、１０、１２日後に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、１μｇの全ＲＮＡに対して、ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ(TAKARA)を用いてｃＤＮＡ合成を行った。このうち１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ相当分のｃＤＮＡを鋳型に用いて以下の反応系でＰＣＲを行った。
１０×ＥｘＴａｑ                            ２μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                    １．６μｌ
ＥｘＴａｑ                              ０．１μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ              各０．２μｌ  
ｃＤＮＡ                                    １μｌ
蒸留水                                １４．９μｌ
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で２分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。【０１６６】
下記のプライマーをＰＣＲに使用した。
ＴＨ      ：gttcccaaggaaagtgtcagagttgg（配列番号:３７） 
gaagctggaaagcctccaggtgttcc（配列番号:３８） 
ＤＡＴ    ：ctccgagcagacaccatgaccttagc（配列番号:３９） 
aggagtagggcttgtctcccaacctg（配列番号:４０）
Ｎｕｒｒ１：cactcctgtgtctagctgccagatgc（配列番号:４１） 
agtgcgaacaccgtagtgctgacagg（配列番号:４２）
Ｐｔｘ３  ：tgagccgcaggtctgtggatccatcc（配列番号:４３） 
tccctgttcctggccttagtcctagg（配列番号:４４）
Ｅｎ１    ：atcctccgagtggacattcacatagg（配列番号:４５） 
atgtccagcaaatagagatcgctacac（配列番号:４６）
なお、Ｎａｔｏ３、Ｌｍｘ１ａは実施例１のプライマーを使用した。また、Ｐｔｘ３およびＥｎ１は、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカーとして知られている。【０１６７】
その結果、Ｎａｔｏ３のｍＲＮＡは、ＥＳ細胞（ＣＣＥ）およびストローマ細胞（ＰＡ６）においては発現が認められなかったが、分化誘導の結果、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞のマーカー遺伝子であるＬｍｘ１ａと同様に４日目から発現が誘導されることが明らかになった（図６）。【０１６８】
［実施例４］Ｌｒｐ４によりソーティングしたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞におけるＮａｔｏ３の発現
次に、Ｎａｔｏ３遺伝子がドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に発現することを確認するために、マウス１２．５日胚の中脳由来細胞およびＳＤＩＡ分化誘導細胞より、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現するＬｒｐ４遺伝子をマーカーとして、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞をそれぞれ分離し、これらの細胞におけるＮａｔｏ３のｍＲＮＡの発現を調べた。【０１６９】
まず、Ｌｒｐ４遺伝子のうち、細胞外領域（１６１−５０２アミノ酸）をコードする遺伝子配列を２９３Ｅ細胞（ATCC）に遺伝子導入して、Ｌｒｐ４タンパク質の細胞外領域を発現させて回収した。回収したタンパク質をハムスター（SLCより入手）に免疫したのち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞（ATCC）と細胞融合させ、抗Ｌｒｐ４抗体産生ハイブリドーマを得た。【０１７０】
マウス１２．５日胚中脳由来あるいはＳＤＩＡ法によりイン・ビトロにおいてＥＳ細胞より分化誘導させたドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含む細胞群をそれぞれ、細胞分散バッファー（Invitrogen）を用いて分散させた後、固定・透過処理せずに、抗Ｌｒｐ４モノクローナル抗体（培養上清  １／２希釈、１％ウシ胎児血清（JRH）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(1):31-40））を用いて４℃で２０分間染色した。その後、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地を用いて４℃で３分間の洗浄を３回行い、ビオチン標識抗ハムスターＩｇＧ抗体（Jackson、１０μｇ／ｍｌ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地）を用いて４℃で２０分間染色し、同様に洗浄した。そして、ＰＥ標識ストレプトアビジン（Pharmingen、２０μｇ／ｍｌ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地）を用いて４℃で２０分間染色し、同様に洗浄した。染色後、セルソーター（ＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ、Becton Dickinson）によりＬｒｐ４陽性細胞および陰性細胞を分離した（図７）。分離直後の細胞からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ (TAKARA)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。制限酵素ＲｓａＩで消化したのち、ａｄ２を付加し、ａｄ２Ｓをプライマーとして、１５サイクルのＰＣＲでｃＤＮＡを増幅して、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型に用いた。増幅条件は、７２℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で２分の反応を１５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。【０１７１】
次に、増幅したｃＤＮＡ  ４ｎｇ、０．４ｎｇ、０．０４ｎｇ相当分のｃＤＮＡを鋳型に用いて以下の反応系でＰＣＲを行った。
１０×ＥｘＴａｑ                            １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                    ０．８μｌ
ＥｘＴａｑ                            ０．０５μｌ
１００μＭ  プライマー                各０．１μｌ
ｃＤＮＡ                                    １μｌ
蒸留水                                ６．９５μｌ
プライマーは上記配列を使用した。【０１７２】
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で２分の増幅反応を行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。ＰＣＲの増幅は、Ｌｍｘ１ａ、Ｎｕｒｒ１は、２４サイクル、それ以外は２６サイクルで行った。【０１７３】
その結果、マウス１２．５日胚の中脳由来細胞において、Ｎａｔｏ３のｍＲＮＡは、Ｌｒｐ４陽性細胞集団（すなわち、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）に強く発現していることが明らかになった（図８）。また、ＳＤＩＡ分化誘導細胞においても、Ｎａｔｏ３のｍＲＮＡは、Ｌｒｐ４陽性細胞集団に強く発現していた（図８）。よって、マウス胎児中脳由来の細胞ばかりでなく、ＳＤＩＡ分化誘導細胞においても、Ｎａｔｏ３のｍＲＮＡは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に発現していることが明らかになった。【０１７４】
したがって、Ｎａｔｏ３遺伝子は、胎児中脳由来のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞だけでなく、イン・ビトロでＥＳ細胞より分化誘導したドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を識別するのにも有用なマーカーであることが明らかになった。
【図１】
2007021003.tif 000002
【図２】
2007021003.tif 000003
【図３】
2007021003.tif 000004
【図４】
2007021003.tif 000005
【図５】
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【図６】
2007021003.tif 000007
【図７】
2007021003.tif 000008
【図８】
2007021003.tif 000009
【配列表】
2007021003000001.app
【国際調査報告】
2007021003.tif 000010
2007021003.tif 000011