【手続補正書】
【提出日】令和1年5月17日(2019.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
ある特定の実施態様の例が本明細書で提供されるが、当業者には、様々な変更及び改変を加えることができることが明らかであろう。また、そのような改変は、本件開示の範囲内にあるものとする。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することであって；該非改変T細胞及び該改変T細胞が、それぞれ放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触しており；該改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記測定することを含み、ここで該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、該活性が増加している場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法。
（構成２）
前記対象が、1 Gy〜20 Gyの線量で、腫瘍を標的とした放射線を受けている、構成1記載の方法。
（構成３）
前記活性が、増殖、細胞周期の活性化、細胞死の阻害、サイトカイン産生、及び細胞傷害性活性からなる群から選択される、構成1又は2記載の方法。
（構成４）
それぞれ放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触した、前記非改変T細胞の活性及び前記改変T細胞の活性を測定することをさらに含み；ここで該非改変T細胞及び該改変T細胞における活性が実質的に同じである、構成1〜3のいずれか1項記載の方法。
（構成５）
癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、
(i) 非改変T細胞及び改変T細胞を放射線照射を受けた腫瘍を有する試験対象に注射することであって；該改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること、並びに
(ii) 該試験対象における該非改変T細胞の活性及び該改変T細胞の活性を測定することであって、該活性が、増殖活性又は抗腫瘍活性である、前記測定すること、を含み、
ここで、該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、該活性が増加している場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法。
（構成６）
前記改変T細胞が参照T細胞である、構成5記載の方法。
（構成７）
前記対象が、1 Gy〜20 Gyの線量で、腫瘍を標的とした放射線を受けている、構成5記載の方法。
（構成８）
前記非改変T細胞及び前記改変T細胞を、放射線照射を受けていない試験対象に注射することをさらに含み、ここで該放射線照射を受けていない試験対象において該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、前記活性が実質的に同じである、構成5記載の方法。
（構成９）
前記活性が、注射されたT細胞の蓄積により測定される増殖活性である、構成5〜8のいずれか1項記載の方法。
（構成１０）
前記活性が、腫瘍細胞の死又は腫瘍サイズの低下により測定される抗腫瘍活性である、構成5〜8のいずれか１項記載の方法。
（構成１１）
前記活性が、試験対象の生存の増加により測定される抗腫瘍活性である、構成5〜8のいずれか1項記載の方法。
（構成１２）
前記試験対象がマウスである、構成5〜11のいずれか1項記載の方法。
（構成１３）
前記マウスが二腫瘍マウスであり、一方の腫瘍のみが標的化された放射線を受けている、構成12記載の方法。
（構成１４）
前記活性が、放射線照射を受けていない腫瘍のサイズの低下により測定される抗腫瘍活性である、構成13記載の方法。
（構成１５）
前記T細胞がナイーブT細胞である、構成1〜14のいずれか1項記載の方法。
（構成１６）
前記T細胞がCD8+ T細胞である、構成1〜14のいずれか1項記載の方法。
（構成１７）
前記T細胞がマウスから単離されたものである、構成1〜14のいずれか1項記載の方法。
（構成１８）
前記マウスが野生型である、構成17記載の方法。
（構成１９）
前記マウスが、マウスにおいて天然には存在しない抗原に対して特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されている、構成17記載の方法。
（構成２０）
前記抗原がオボアルブミンである、構成19記載の方法。
（構成２１）
前記T細胞が標識されている、構成1〜20のいずれか1項記載の方法。
（構成２２）
前記標識がカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）である、構成21記載の方法。
（構成２３）
前記候補遺伝子が、shRNAによってノックダウン又はノックアウトされている、構成1〜22のいずれか1項記載の方法。
（構成２４）
ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、構成23記載の方法。
（構成２５）
前記候補遺伝子が、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることにより、前記改変T細胞においてノックダウン又はノックアウトされている、構成1〜22のいずれか1項記載の方法。
（構成２６）
前記候補遺伝子が、CAS9（CRISPR）を用いることにより、前記改変T細胞においてノックダウン又はノックアウトされている、構成1〜22のいずれか1項記載の方法。
（構成２７）
癌治療の標的遺伝子を同定するプールスクリーニング方法であって、
(i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び
(ii) 該T細胞の初期集団をある期間にわたり放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触させて、T細胞の選択された集団を産生すること、を含み、
ここで、該T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている該候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する、前記プールスクリーニング方法。
（構成２８）
癌治療の標的遺伝子を同定するインビボプールスクリーニング方法であって、
(i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び
(ii) 該T細胞の初期集団を放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に注射することであって、該T細胞の初期集団が該対象においてT細胞の選択された集団を産生する、前記注射すること、を含み、
ここで、該T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている該候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する、前記プールスクリーニング方法。
（構成２９）
T細胞の初期集団を調製することが、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることを含む、構成27又は28記載のプールスクリーニング方法。
（構成３０）
T細胞の初期集団を調製することが、CAS9（CRISPR）を用いることを含む、構成27又は28記載のプールスクリーニング方法。
（構成３１）
T細胞の初期集団を調製することが、shRNAライブラリにT細胞を感染させることを含む、構成27又は28記載のプールスクリーニング方法。
（構成３２）
前記shRNAライブラリがレンチウイルスベクターライブラリである、構成31記載のプールスクリーニング方法。
（構成３３）
前記初期集団のT細胞がナイーブT細胞である、構成27〜32のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成３４）
前記初期集団のT細胞がCD8+ T細胞である、構成27〜33のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成３５）
前記初期集団のT細胞がマウスから単離されたものである、構成27〜34のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成３６）
前記マウスが野生型である、構成35記載のプールスクリーニング方法。
（構成３７）
前記マウスが、マウスにおいて天然には存在しない抗原に対して特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されている、構成35記載のプールスクリーニング方法。
（構成３８）
前記抗原がオボアルブミンである、構成37記載のプールスクリーニング方法。
（構成３９）
前記T細胞の初期集団が標識されている、構成27〜38のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成４０）
前記標識がカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）である、構成39記載のプールスクリーニング方法。
（構成４１）
前記T細胞の選択された集団を前記試験対象の試料から単離することを含む、構成27〜40のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成４２）
前記試料が腫瘍試料である、構成41記載のプールスクリーニング方法。
（構成４３）
前記腫瘍試料が標的化された放射線を受けたものである、構成42記載のプールスクリーニング方法。
（構成４４）
前記試験対象が二腫瘍モデルであり、かつ前記腫瘍試料が標的化された放射線を受けたものでない、構成42記載のプールスクリーニング方法。
（構成４５）
前記試料が非腫瘍試料である、構成41記載のプールスクリーニング方法。
（構成４６）
前記非腫瘍組織試料が脾臓試料又はリンパ節試料である、構成45記載のプールスクリーニング方法。
（構成４７）
前記T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている候補遺伝子を、該T細胞の選択された集団から単離されたゲノムDNAのNGSにより同定する、構成27〜46のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成４８）
前記初期集団のそれぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子に対するshRNAを有し、かつ前記T細胞の初期集団と比較して、前記T細胞の選択された集団において該候補遺伝子に対する該shRNAが富化されている場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であると同定する、構成31〜46のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成４９）
非腫瘍組織試料と比較して、腫瘍試料から取得した前記T細胞の選択された集団において、候補遺伝子に対する前記shRNAが富化されている場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であると同定する、構成48記載のプールスクリーニング方法。
（構成５０）
前記非腫瘍組織試料と比較して、前記腫瘍試料において候補遺伝子に対する前記shRNAが2倍超富化されている場合に、該候補遺伝子を標的遺伝子として同定する、構成48記載のプールスクリーニング方法。
（構成５１）
前記非腫瘍組織試料と比較して、前記腫瘍試料において候補遺伝子に対する前記shRNAが3倍超、4倍超、5倍超、10倍超、15倍超、又は20倍超富化されている場合に、該候補遺伝子を標的遺伝子として同定する、構成48記載のプールスクリーニング方法。
（構成５２）
前記T細胞の選択された集団におけるshRNAをNGSにより定量化することを含む、構成48〜51のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成５３）
T細胞の、構成1〜52のいずれか1項において同定された前記標的遺伝子を阻害することにより、該T細胞を活性化させる方法。
（構成５４）
前記T細胞が腫瘍を有する対象において存在する、構成53記載の方法。
（構成５５）
前記腫瘍を有する対象が放射線照射を受けている、構成54記載の方法。
（構成５６）
それを必要とする対象において癌を治療するための方法であって、構成1〜52のいずれか1項において同定された前記標的遺伝子を阻害することを含む、前記方法。
（構成５７）
それを必要とする対象において癌を治療するための方法であって、構成1〜52のいずれか1項において同定された前記標的遺伝子が、ノックダウン又はノックアウトされているT細胞を用いて、前記対象にT細胞療法を施すことを含む、前記方法。
（構成５８）
前記対象に、腫瘍を標的とした放射線を施すことをさらに含む、構成56又は57記載の方法。