【手続補正書】
【提出日】平成31年4月11日(2019.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
順方向及び逆方向プライマーと標的核酸を含むサンプルとを接触させる接触工程と、
増幅反応を実行する実行工程と、を有し、
前記標的核酸の増幅されたセグメントは、前記標的核酸がテンプレートとして役割を果たしつつ、前記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成され、
前記プライマーは、4つの標準ヌクレオチドタイプのうちの1又は複数が非主流のものであり、
前記非主流ヌクレオチドタイプは、前記プライマーにおいて同じであり、
増幅された前記セグメントは、前記順方向及び/又は逆方向プライマーの伸長によって形成された主要な増幅産物である、
標的核酸のセグメントを増幅する方法。
【請求項２】
前記標的核酸は、逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイトの相補体を含むストランドを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
増幅した前記セグメントは、前記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成された全ての増幅産物の少なくとも99%を構成する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記順方向及び逆方向プライマーは、前記順方向及び逆方向プライマー結合サイトに対してより大きな相補性を、前記サンプルにおける増幅を支持するプライマー結合サイトの任意の他の対よりも有する、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記順方向及び逆方向プライマーは、4つの標準ヌクレオチドタイプのうちの1つだけが非主流である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記順方向プライマー結合サイト及び前記逆方向プライマー結合サイトは、前記順方向及び逆方向プライマーにおける前記非主流ヌクレオチドタイプの相補体において非主流である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記順方向及び逆方向プライマーは、非主流ヌクレオチドタイプのユニットを1つだけ有し、
前記順方向プライマー結合サイト及び前記逆方向プライマー結合サイトは、前記非主流ヌクレオチドタイプの相補体のユニットを2つ以下有する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記順方向及び逆方向プライマーの前記非主流ヌクレオチドタイプは、前記順方向及び逆方向プライマーの3'位置を占有しない、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記順方向及び逆方向プライマーは、前記非主流ヌクレオチドタイプ以外の3つのヌクレオチドからなり、
前記順方向プライマー結合サイト及び前記逆方向プライマー結合サイトは、前記順方向及び逆方向プライマーにおける前記非主流ヌクレオチドの相補体以外の3つのヌクレオチドからなる、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記順方向及び逆方向プライマーは、5'末端で非主流ヌクレオチドのユニットを1つ有する、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記逆方向プライマー結合サイトと前記順方向プライマー結合サイトの相補体は、隣接している、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記逆方向プライマー結合サイト及び前記順方向プライマー結合サイトの前記相補体は、前記順方向及び逆方向プライマー並びにその相補体における非主流ヌクレオチドタイプを排除している領域によって分離される、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記逆方向プライマー結合サイト及び前記順方向プライマー結合サイトの相補体は、前記順方向及び逆方向プライマー又はその相補体又はその両方における非主流ヌクレオチドを含む領域によって分離される、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーの3'ヌクレオチドは、前記順方向及び逆方向プライマーにおける非主流ヌクレオチドの相補体である、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーの3'ヌクレオチドは、C又はGである、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、イノシン、isoC、isoG、7-デアザ-2'-デオキシグアノシン、又は、7-デアザ-2'-デオキシアデノシンである非天然ヌクレオチドを含む、請求項1から15のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、前記順方向及び/又は逆方向プライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する人工オリゴヌクレオチドにその5'末端で連結される、請求項1から16のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅は、前記順方向及び逆方向プライマーの非主流ヌクレオチドタイプに相補的なヌクレオチド三リン酸モノマーを除くヌクレオチド三リン酸モノマーを用いて実行される、
又は、
前記順方向及び逆方向プライマーにおいて非主流である前記ヌクレオチドタイプの相補的なヌクレオチド三リン酸モノマーは、他の標準ヌクレオチド三リン酸モノマーに対して低濃度で存在する、
請求項1から13、15及び16のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記逆方向プライマー結合サイト及び前記順方向プライマー結合サイトの相補体に関する前記標的核酸のストランドの配列をサーチするサーチ工程を更に有する、請求項1から18のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記順方向プライマー結合サイト及び/又は前記逆方向プライマー結合サイトは、前記順方向及び逆方向プライマーの前記非主流ヌクレオチドタイプの相補的なヌクレオチドタイプのユニットを少なくとも1つ含み、
前記プライマーと前記プライマー結合サイトのハイブリダイゼーションは、少なくとも1つのミスマッチになる、請求項1から19のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅は、ミスマッチ安定化剤の存在下で実行される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、4つ全ての標準ヌクレオチドタイプを含む前記標的核酸に相補的である5'セグメントにその5'末端で連結される、前記順方向又は逆方向プライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する人工配列のリンカーセグメントにその5'末端で連結する、請求項1から21のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、前記プライマーセグメントと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する人工セグメントにその5'末端で連結されるプライマーセグメントであり、
前記増幅は、標的結合サイト及び前記人工セグメントの相補体を含むジャンクションプライマーを用いて実行され、
前記ジャンクションプライマーの標的結合サイトは、4つ全ての標準ヌクレオチドを含む、請求項1から21のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する二本鎖オリゴヌクレオチドのストランドの1つにその5'末端で連結し、
前記人工二本鎖オリゴヌクレオチドは、前記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成される主要な増幅産物とは融解温度が異なり、
前記主要な増幅産物の形成は、融解曲線分析によって検出され、
前記主要な融解温度は、人工二本鎖のオリゴヌクレオチドのものから前記主要な増幅産物のものへと遷移する、請求項1から23のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
種々の融解温度を有する種々の人工セグメントに連結する種々のプライマーを有する複数の順方向及び/又は逆方向プライマーを用いて、マルチプレックスを実行する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する人工オリゴヌクレオチド配列にその5'末端で連結し、
増幅した前記セグメントは、増幅反応の間に形成された5'末端人工オリゴヌクレオチドの相補的なストランドにハイブリダイズすることによって、蛍光体と消光物質が分離し、増幅した前記セグメントの存在を示す蛍光シグナルを発生させる、5'末端人工オリゴヌクレオチドと同じ配列を有する前記蛍光体及び消光物質ラベル化オリゴヌクレオチドによって検出される、請求項1から23のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する一本鎖人工オリゴヌクレオチドにその5'末端で連結し、
前記人工オリゴヌクレオチドは、蛍光体及び消光物質でラベル化されており、それによって、前記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成された増幅された前記セグメントは、前記蛍光体及び消光物質を分離し、増幅された前記セグメントの存在を示す蛍光シグナルを発生させる、請求項1から23のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する蛍光ラベル化尾部にその5'末端で連結する、請求項1から27のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、消光物質でラベル化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする尾部によって供給され、
前記オリゴヌクレオチドは、増幅の間に前記プライマーから解離して、前記蛍光ラベル化オリゴヌクレオチドから前記消光物質を分離し、蛍光シグナルを発生させる、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
共通5'人工セグメントに連結した種々の標的結合領域を有する前記順方向及び/又は逆方向プライマーの複数対を用いてマルチプレックスを実行し、
前記増幅は、前記共通5'人工セグメントの相補体に相補的な3'セグメントを有する検出プローブを用いて実行される、請求項1から29のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結する前記プライマーと同じ非主流ヌクレオチドを有する人工尾部にその5'末端で連結し、
前記プライマーは、蛍光体及び消光物質を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように供給され、前記消光物質又は蛍光体は、増幅の際にオリゴヌクレオチドから分かれて、蛍光シグナルを発生させる、請求項1から29のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結する前記プライマーと同じヌクレオチドタイプにおいて非主流である尾部にその5'末端で連結し、
前記5'尾部の相補体にハイブリダイズするループを有するヘアピン並びにその末端に蛍光体及び消光物質を含む分子ビーコンオリゴヌクレオチドが提供され、
前記分子ビーコンオリゴヌクレオチドは、増幅された前記標的配列にハイブリダイズして、前記蛍光体及び消光物質が分離し、蛍光シグナルを発生させる、請求項1から29のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、3'単一ストランド粘着末端及びその5'末端セグメントのヘアピンループ構造を有し、
前記ヘアピンループ構造における5'末端の最後ヌクレオチドは、前記非主流ヌクレオチドの相補体である、請求項1から32のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルは、互いに異なる濃度で前記順方向及び逆方向プライマーと接触する、請求項1から33のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅は、温度サイクルで実行される、請求項1から34のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記増幅は、等温で実行される、請求項1から34のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
増幅された前記セグメントは、融解曲線分析、キャピラリー電気泳動、質量分析、リアルタイム蛍光検出、配列決定又はマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションによって検出される、請求項1から36のいずれかに記載の方法。