【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年4月9日(2008.4.9)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド漏出を低減するために親和クロマトグラフィーマトリックスを少なくとも１つの界面活性剤で処理する方法であって、接触時間が少なくとも４時間であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
以下の工程を含む請求項１記載の親和クロマトグラフィーマトリックスを処理する方法：
ａ）親和クロマトグラフィーマトリックスをカオトロピック物質で処理し、続いて酸性緩衝剤（ｐＨ２．０〜４．０）及び中性緩衝剤（ｐＨ６．５〜８．５）で処理する工程；
ｂ）親和クロマトグラフィーマトリックスを少なくとも４時間２５〜５５℃の処理温度範囲で、又は少なくとも１６時間２５℃未満の処理温度で吸着床の容量の少なくとも５〜１０倍の少なくとも１つの界面活性剤で処理する工程；
ｃ）その後、親和クロマトグラフィーマトリックスをカオトロピック物質で処理し、続いて酸性緩衝剤（ｐＨ２．０〜４．０）及び中性洗浄緩衝剤（ｐＨ６．５〜８．５）で処理する工程。
【請求項３】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤又は両性イオン界面活性剤である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法によって処理された低漏出親和クロマトグラフィーマトリックス。
【請求項５】
マトリックスがタンパク質Ａマトリックスである、請求項４記載の低漏出親和クロマトグラフィーマトリックス。
【請求項６】
以下の工程を含むリガンド漏出の測定方法：
ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の方法によって親和クロマトグラフィーマトリックスを前処理する工程；
ｂ）前処理した親和クロマトグラフィーマトリックスを追加の溶液（プローブ）とともにインキュベートする工程；
ｃ）適した定量的テストを用いて追加の溶液（プローブ）中のリガンドを定量化する工程。
【請求項７】
生物薬剤生成物の精製における請求項１〜３のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項８】
生物薬剤生成物の精製における請求項４又は５記載の低漏出親和クロマトグラフィーマトリックスの使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】親和クロマトグラフィーマトリックスからのリガンド漏出を低減する方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リガンド漏出を低減するのに適した親和クロマトグラフィーマトリックスを処理する方法に関する。本発明は、さらにリガンド漏出を測定するための低漏出親和クロマトグラフィーマトリックス及び方法に関する。
【０００２】
背景
親和クロマトグラフィーマトリックス（以下、親和マトリックスとも呼ぶ。）は種々の物質の工業精製で使用される。固定化リガンドを用いて、使用した特定のリガンドに対してある特定の親和力を有する物質を特異的に濃縮及び精製することができる。抗体の工業精製、特にモノクローナル抗体の精製のために、固定化タンパク質Ａを使用することは初期洗浄工程として十分であることが証明された。移動相の抗体はキャリア（例えば、セファロース）に共有結合的に結合するタンパク質Ａリガンドと特異的に結合する。黄色ブドウ球菌のタンパク質Ａ（野生型タンパク質Ａ）及び遺伝子組換えタンパク質Ａ（組換えタンパク質Ａ）は非共有相互作用によって抗体の定常部（Ｆｃフラグメント）と相互作用する。この特異的な相互作用は、宿主細胞タンパク質及び／又は媒体成分等のプロセス誘導汚染物質を抗体から効果的に分離するために使用できる。ｐＨを変えることによって、抗体とタンパク質Ａリガンドの間の相互作用を故意に停止し、抗体を固定相から解放又は溶出することができる。溶出の際、所望の抗体が放出されるだけでなく、使用されるタンパク質Ａマトリックスの安定性に依存して、ある特定の範囲のタンパク質Ａ、すなわちリガンド自体が放出されることがわかった。カラムマトリックスと共有結合的に結合したタンパク質Ａの放出は、タンパク質Ａ漏出又は一般に「リガンド漏出」（親和クロマトグラフィーマトリックスを使用する場合に一般に観測される効果）と呼ばれる。リガンド漏出の範囲は種々の因子に依存する。一方、リガンド漏出は、リガンドがキャリアと結合する結合効率の影響を受ける。低結合効率は、リガンド漏出を促進することが分かった。一方、リガンド漏出は、またクロマトグラフィーが行われる特別な作業条件の影響を受けるように見える。
使用したリガンドの漏出速度、すなわちマトリックスの単位当たり又は精製されるべき物質の単位当たりカラムの洗い流されるリガンドの量は、使用した親和クロマトグラフィーマトリックスの重要な品質基準である。過度に高いリガンド漏出は、精製される医薬活性物質の品質を損なう重要な汚染物質を一様にもたらす。高価な下流精製工程は、再度リガンドから活性物質を分離するために必要である。リガンド濃度が高すぎるために、不十分に精製された医薬品が患者に望ましくない副作用を誘発する危険もある。
【０００３】
工業プロセスにおけるタンパク質Ａ漏出を低減するために、カラムマトリックスは、タンパク質Ａマトリックスを始めて使用する前、及びある期間使用した後、適した緩衝条件で前処理される（してもよい）。マトリックスは、例えば６Ｍの尿素又は６Ｍのグアニジン塩酸塩（吸着床の容量の等倍）等のカオトロピック物質で前処理されることが推奨される。
この前処理に加えて、カラムマトリックスは、各カラムの実施前後に精製される。前記プロセスは、主としてプロセスの衛生（ＣＩＰ）を維持するのに役立つ。タンパク質ＡセファロースのＣＩＰ／ゲル精製について、カラムマトリックスは２カラム体積（ｃｖ）の０．１％非イオン性界面活性剤で、３７℃で濯がれることが推奨される。接触時間は１分間与えられる。起こり得る微生物汚染を低減するために、マトリックスを６時間２％ヒビテン−（２）−グルコナート及び２０％ＥｔＯＨで処理し、次いで結合緩衝剤（ｐＨ７〜８）で注意深く濯ぐことも推奨される。アマシャムファルマシアバイオテック社（ウプサラ、スウェーデン）によって製造される「Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ｒｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ」のＣＩＰについて、タンパク質Ａマトリックスの５％ナトリウム−Ｎ−ラウロイルサルコシナート、２０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１ＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝剤による処理は特異的である（「Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ｒｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ」マニュアル、アマシャムファルマシアバイオテック、コード１８−１１１５−６７）。しかし、我々自身の実験が証明するように（表１、図１）、これらの方法は、タンパク質Ａ漏出を再現よく低いレベルに確実に低減するのに十分に効果的ではない。
生物薬剤の調製について、再現よくタンパク質Ａ漏出を低くする安定なタンパク質Ａマトリックスを使用することは極めて重要である。しかし、現在、確実に漏出を低くするこの種のマトリックスは十分に信頼できる品質で得られていない。このことは、一例としてタンパク質Ａセファロースの異なるバッチについて表１（図１）に示される。
本発明の目的は、親和クロマトグラフィーマトリックスを前処理及び／又は処理する適した方法を開発及び確立することであり、リガンド漏出が再現よく低レベルに低減され、それ故結果として一定の品質の親和マトリックスを保証することができることを保証する。
抗体を精製するために特異的に使用されるタンパク質Ａマトリックスを前処理するための適した方法を提供することは、特に重要である。
【０００４】
発明の詳細な説明
本発明は、親和クロマトグラフィーマトリックスを前処理及び／又は処理する方法に関し、リガンド漏出が、信頼性があり、再現よく低減され、それ故親和クロマトグラフィーマトリックスの活性及び／又はそのクロマトグラフィー特性に負の影響を与えずに、一定の品質の親和クロマトグラフィーマトリックスを保証することができることを保証する。用語「処理」は、以下では、親和クロマトグラフィーマトリックスがクロマトグラフィーの目的で使用される前の親和クロマトグラフィーマトリックスの前処理をも意味する。
驚いたことに、必須工程として親和クロマトグラフィーマトリックスの界面活性剤による処理を含む方法が見出された。本発明の目的の界面活性剤は、非イオン性及び両性イオン界面活性剤を含むイオン性界面活性剤の両方である。本発明の親和クロマトグラフィーマトリックスの前記処理は、以下では、「界面活性剤処理」とも呼ばれる。
【０００５】
本発明の方法の有効性は、処理の長さ（接触時間）、体積、温度及び使用される界面活性剤によって決定される。驚いたことに、処理の長さと処理時間の始めのリガンド漏出の低減との間に線形な相関がないことが分かった。１６未満〜２０時間の接触時間（処理時間）が室温（ＲＴ）でのリガンド漏出の低減に対する影響が小さい又は影響がないということが分かる（図１１及び１４）。室温は１５〜２５℃の温度を意味する。約１６時間の処理時間を経た上でのみリガンド漏出の明らかな低減が見られた。図１１に示されるタンパク質Ａの量は、適した前処理後のタンパク質Ａマトリックスによって示されるリガンド漏出に反比例する。
処理の時間を長くすることによって、リガンド漏出はさらに低減できる。必要な処理の長さは、温度（処理温度）が高くなると短くなる。２５℃よりも高い温度、特に３０〜４０℃、とりわけ３６〜３８℃で、親和クロマトグラフィーマトリックスの活性又はクロマトグラフィー特性に影響を及ぼさないで、再現よく低レベルにリガンド漏出を低減するのに必要な本発明の方法の処理時間は、４〜１６時間である（図１４）。図１２は、例えばさらに５５℃まで高めた温度は、リガンド漏出にさらにプラスの効果を有する（すなわち本発明のリガンド漏出の低減をもたらす）ことを示す。
【０００６】
従って、本発明は、リガンド漏出を低減するための方法に関し、親和クロマトグラフィーマトリックスを少なくとも１つの界面活性剤で、少なくとも１６時間、好ましくは１６〜４８時間１５〜２５℃（ＲＴ）で処理することを含む。前記方法は１５℃未満の温度（ＲＴ）で同じ処理時間（１６〜４８時間）行ってもよいが、ＲＴで処理することが好ましい。２５℃よりも高い温度、特に３０〜４０℃、とりわけ３６〜３８℃で、本発明の処理の長さは少なくとも４時間である。接触時間が４〜１６時間である前記方法は、特に好ましい。４０℃を超える温度に高めることは、接触時間のさらなる短縮をもたらす。最大約５５℃、特に４０〜５５℃、とりわけ５０〜５５℃の温度は、特に好ましい。インキュベーション温度に依存する最適な接触時間は、リガンド漏出を決定するための、本明細書に詳細に説明された方法の１つ（インキュベーションテスト、小スケールプロセス）を用いて、たいした努力もしないで、極めて容易に決定できる。一般に、処理温度が２５〜５５℃であり、接触時間が４〜１６時間である方法が好ましい。室温又はそれ以下の温度で、本発明の方法の接触時間は少なくとも１６時間、好ましくは１６〜４８時間である。
本発明の別の実施態様は、親和クロマトグラフィーマトリックスを少なくとも１６時間ＲＴで吸着床の容量の少なくとも５〜３０倍、好ましくは１０倍以上の少なくとも１つの界面活性剤で処理することを含む。さらに、本発明の１つの方法は、親和クロマトグラフィーマトリックスを少なくとも４時間３６〜４８℃の温度で吸着床の容量の少なくとも５〜１５倍の少なくとも１つの界面活性剤で処理することを含む。この最後の方法において、温度は、また３８℃を超える温度、例えば最大約５５℃の温度に高めてもよい。図１２に示すように、前記温度の上昇はリガンド漏出のさらなる低減をもたらす。
【０００７】
しかし、本発明は、また接触時間が２５℃よりも高い温度で４時間未満であり、最大２５℃の温度で１６時間未満である方法に関し、全体として前記方法の範囲で、親和クロマトグラフィーマトリックスの活性又はクロマトグラフィー特性に影響を及ぼさないで、再現よく低レベルにリガンド漏出を低減することができる。リガンド漏出の低減に対する反応温度の上昇のプラスの影響は、例えば図１２から明らかである。
本発明の目的で再現よく低レベルとは、例えば以下に記載されるリガンド漏出を測定する方法（インキュベーションテスト、小スケールプロセス）の１つによって測定される親和クロマトグラフィーマトリックスのリガンド漏出が親和マトリックス１ｍｇ当たり８０ｎｇ未満のリガンドの値を有することを意味する。本発明の好ましい実施態様において、これらの方法の１つを用いて測定されるリガンド漏出は親和マトリックス１ｍｇ当たり４０ｎｇ未満のリガンドの値を有し、特に好ましい実施態様において、親和マトリックス１ｍｇ当たり２０ｎｇ未満のリガンドであり、本発明の別の特に好ましい実施態様において、親和マトリックス１ｍｇ当たり１０ｎｇ未満のリガンドである。
【０００８】
本明細書に記載される本発明の方法は、タンパク質Ａマトリックスからのリガンド漏出を低減するのに特に適している。従って、本明細書に記載される方法は、タンパク質Ａマトリックスを処理するために使用される場合、本発明の方法であるとみなされる。本発明の目的でタンパク質Ａマトリックスは、リガンドとして固定化タンパク質Ａを含む親和クロマトグラフィーマトリックスである。このようなものとしては、例えばリガンドとして黄色ブドウ球菌由来の野生型タンパク質Ａを含む親和マトリックスが挙げられる。タンパク質Ａは、特にLofdahl, S.ら, 1983及びLindmarkら, 1983に記載される。さらに、本発明は、リガンドとして組換えによって生成されたタンパク質Ａを有するマトリックスに関する。組換えタンパク質Ａは、例えばDuggleby C.J.及びJones, S.A., 1983又はLi, R.ら, 1998に記載され、当業者に知られている。
タンパク質Ａは、例えばアガロース、多糖類、デキストラン、シリカゲル及びガラスビーズ等の種々のキャリア材料と結合していてもよい。決して完全ではない適したキャリア材料の一覧はHarlow, E.及びLane, D. 1999に示される。１つの使用頻度の高いキャリア材料は、アマシャムファルマシアバイオテック、ウプサラ、スウェーデンによって製造される「セファロース」等のアガロースベース材料から形成され、当業者に知られている。
タンパク質Ａセファロースの特定の例は、２００１年から始まる「親和クロマトグラフィー」の主題の前記企業によって作成されたマニュアルに見つけることができる。さらに、当業者は、例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムファルマシアバイオテック社、ウプサラ、スウェーデン）、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（アマシャムファルマシアバイオテック社、ウプサラ、スウェーデン）及びＰｏｒｏｓ  Ａ（ミリポア、ダラム、イングランド）等の他のタンパク質Ａクロマトグラフィーマトリックスをよく知っている。本発明の方法は、前記マトリックスの処理を含むが、マトリックスの一覧は一例として与えられ、完全であることを意味しない。
【０００９】
リガンドの結合は、遊離アミノ、カルボキシル又は硫黄基を介して、キャリアマトリックスと結合する臭化シアン、活性剤、ＮＨＳ活性剤又はチオールによって一般に達成される。例えば、マニュアル「親和クロマトグラフィー」、アマシャムファルマシアバイオテック、ウプサラ、スウェーデン、２００１を参照のこと。
親和マトリックス１ｍｇ当たり１ｎｇのリガンドでリガンド漏出を与えることに加えて、抗体の濃度に対してリガンド（プロセス汚染物質）の濃度を特定するため、特にタンパク質Ａセファロースのリガンド漏出について、抗体１ｍｇ当たり１ｎｇのタンパク質Ａ（＝ｐｐｍ）のデータを有するのに有用である。再現よく低レベルのリガンド漏出で、親和マトリックス１ｍｇ当たり１ｎｇのリガンドの上述の数値は概ね互いに一致する。
従って、再現性のよい低レベルのタンパク質Ａ漏出は、例えば８０ｐｐｍ未満のタンパク質Ａの値の、以下に記載されるリガンド漏出を測定する方法の１つ（インキュベーションテスト、小スケールプロセス）によって測定される漏出と一致する。本発明の好ましい実施態様において、これらの方法の１つによって測定されるタンパク質Ａ漏出は、４０ｐｐｍ未満のタンパク質Ａの値を有し、特に好ましい実施態様において、２０ｐｐｍ未満のタンパク質Ａの値を有し、本発明の別の特に好ましい実施態様において、１０ｐｐｍ未満のタンパク質Ａの値を有する。
【００１０】
リガンド漏出、特にタンパク質Ａ漏出が低減される本発明の方法の有効性は、マトリックスを追加の処理工程に供することによって高めることができる。効果を与える１つの方法は、（少なくとも１つの界面活性剤による）界面活性剤処理に加えて、カオトロピック物質で親和マトリックスの前処理及び／又は後処理することを含む。
本発明の好ましい実施態様において、カオトロピック物質による処理工程は、親和マトリックスに適した（stringent）溶離緩衝剤を伴う。用語「親和マトリックスに適した（stringent）溶離緩衝剤」とは、本発明の目的で、そのリガンドから精製されるべきである物質の特異的な溶離を与える溶離緩衝剤を意味する。例えば、精製されるべき物質が抗体であり、リガンドがタンパク質Ａである場合、酸性溶離緩衝剤（ｐＨ２．０〜４．０）は本発明の目的で適した溶離緩衝剤の要求を満足する（親和クロマトグラフィー−原理及び方法、第６３頁、アマシャムファルマシアバイオテック、ウプサラ、スウェーデン）。
特に好ましい実施態様において、親和マトリックスに適した緩衝剤による洗浄工程は、中性緩衝剤による別の洗浄工程を伴い、中性緩衝剤のｐＨは、例えば６．５〜８．５である。
従って、本発明は、上述の「界面活性剤処理」に加えて、以下の工程の１つを含む方法に関し：
（Ａ）マトリックスをカオトロピック物質で処理する工程、又は
（Ｂ）親和マトリックスに適した（stringent）溶離緩衝剤による洗浄する工程を伴う、マトリックスをカオトロピック物質で処理する工程、又は
（Ｃ）親和マトリックスに適した（stringent）溶離緩衝剤及び中性洗浄緩衝剤（好ましくは、ｐＨ６．５〜８．５）による洗浄する工程を伴う、マトリックスをカオトロピック物質で処理する工程、
特にこれらの工程の１つを先に行い、及び／又は続いて界面活性剤処理を行う。特に好ましい方法において、カオトロピック物質は尿素又はグアニジン塩酸塩であり、好ましくは４〜６Ｍの濃度である。
前記方法は、特にタンパク質Ａマトリックスからのリガンド漏出を低減するのに適し、それ故本発明は、特に酸性溶離緩衝剤を、好ましくは２．０〜４．０のｐＨを有するものを用いる方法に関する。
【００１１】
本発明の別の好ましい実施態様は、以下の工程を含む、又は以下の工程からなる方法に関する：
（Ａ）酸性緩衝剤（好ましくは、ｐＨ２．０〜４．０）及び中性緩衝剤（好ましくは、ｐＨ６．５〜８．５）で処理する工程を伴う、親和クロマトグラフィーマトリックスをカオトロピック物質で前処理する工程、；
（Ｂ）親和クロマトグラフィーマトリックスをリガンド漏出を低減するのに適した上述の方法の１つに従う少なくとも１つの界面活性剤で処理する工程；
（Ｃ）その後、酸性緩衝剤（ｐＨ２．０〜４．０）及び中性洗浄緩衝剤（ｐＨ６．５〜８．５）で処理する工程を伴う、親和クロマトグラフィーマトリックスをカオトロピック物質で処理する工程。
本発明の別の実施態様において、酸性溶離緩衝剤は、親和マトリックスに適した任意の望ましい溶離緩衝剤によって置き代えてもよい。好ましくは、上述の本発明の方法は、タンパク質Ａマトリックスからのリガンド漏出を低減するために使用してもよい。
【００１２】
本発明の目的で界面活性剤は、非イオン性及びイオン性界面活性剤、特に両性イオン界面活性剤である。非イオン性界面活性剤は、好ましくはＰＥＧ−アルキルエーテル、ＰＥＧ−ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルフェニル−ＰＥＧ−エーテル又はＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーの中から選択される。本発明の特に好ましい実施態様において、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエテル（Ｂｒｉｊ３５、Ｃ12Ｈ25（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ、ｎ〜２３、ＣＡＳ：９００２−９２−０）及びポリオキシル−２０−セトステアリルエテール等のＰＥＧ−アルキルエーテル、又はポリオキシエチレン（２０）ソルビタン−モノラウラート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０、ＣＡＳ：９００５−６４−５）又はポリオキシエチレン（２０）ソルビタン−モノオレアート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０、ＣＡＳ：９００５−６５−６）等のＰＥＧ−ソルビタン脂肪酸エステル（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ誘導体）、又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、ＣＡＳ：９００２−９３−１）等のアルキルフェニル−ＰＥＧ−エーテル（オクトキシノール誘導体）、又はポリグリコールエーテル（非イオン性界面活性剤）タイプＮＰ−４０（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ４０、ＣＡＳ：１２７０８７−８７−０）又は分枝ポリオキシエチレン−ノニルシクロヘキシルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、Ｃ9Ｈ19Ｃ6Ｈ10（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ、ＣＡＳ：１２３３５９−４１−１）等のノニルフェノール−ポリオキシエチレンエーテル、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ６８、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８、ＣＡＳ：９００３−１１−６又はＰｏｌｏｘａｍｅｒ  ４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ１２７、ＣＡＳ：９００３−１１−６）等のＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ誘導体）が使用される。また、親和マトリックスを処理するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用することは適しており、従って、また本発明はその使用に関する。
【００１３】
ポリグリコールエーテル（非イオン性界面活性剤）タイプＮＰ−４０（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ４０、ＣＡＳ：１２７０８７−８７−０）は、以下の構造式を有する化合物を意味する：
2005509169.tif 000001
【００１４】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ６８、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８、ＣＡＳ：９００３−１１−６）は、以下の構造式をゆする化合物を意味する：
2005509169.tif 000002
【００１５】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ１２７、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ４０７、ＣＡＳ：９００３−１１−６）は、以下の構造式を有する化合物を意味する：
2005509169.tif 000003
【００１６】
両性イオン界面活性剤の３−（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ、ＣＡＳ：７５６２１−０３−３）又は３−（３−コールアミドプロピル）−ジメチル−アンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ、ＣＡＳ：８２４７３−２４−３）は、本発明のマトリックスの処理に特に適している。
非イオン性界面活性剤は、好ましくは０．００１〜５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用される。０．００５％（ｖ／ｖ）よりも高い濃度でＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ（２０及び８０）を、０．００１％（ｖ／ｖ）よりも高い濃度でＰｌｕｒｏｎｉｃ（Ｆ６８）を、０．００１％（ｖ／ｖ）よりも高い濃度でＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を使用することは、特に好ましい。本発明の別の実施態様において、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ、好ましくはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０は、０．００５〜０．５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用され、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、好ましくはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００は、０．００１〜０．１％（ｖ／ｖ）の濃度で使用される。ポリエチレングリコールは、また０．０１（ｖ／ｖ）よりも高い濃度で適しており、好ましくは０．０１〜１％の濃度で使用される。
両性イオン界面活性剤は、好ましくは０．０１〜１％（ｖ／ｖ）の濃度で使用され、界面活性剤ＣＨＡＰＳ及び／又はＣＨＡＰＳＯは、最も好ましくは０．０１％（ｖ／ｖ）よりも高い濃度で使用される。別の実施態様において、ＣＨＡＰＳ及び／又はＣＨＡＰＳＯの濃度は０．０１〜１％（ｖ／ｖ）である。
本発明は、また親和クロマトグラフィーマトリックスの処理、好ましくはタンパク質Ａマトリックスの前記界面活性剤の組み合わせによる処理に関する。
【００１７】
リガンド漏出を低減する方法に加えて、本発明は、また上述の本発明のリガンド漏出を低減する方法の１つによって処理された「低漏出」親和クロマトグラフィーマトリックスに関する。好ましい実施態様において、本発明は、タンパク質Ａ漏出を低減する前記方法によって処理される範囲で、低漏出タンパク質Ａマトリックスに関する。低漏出タンパク質Ａマトリックスは、例えば黄色ブドウ球菌由来のタンパク質Ａ等の野生型タンパク質Ａを含むマトリックス、及び組換えタンパク質Ａを含むものの両方を意味する。例としては、タンパク質Ａセファロース及びタンパク質Ａセファロースビーズ（例えば、アマシャムファルマシアバイオテック社、ウプサラ、スウェーデンのＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ）が挙げられるが、これらは単なる一例であり、網羅的であることを意図しない。
【００１８】
親和マトリックスからのリガンド漏出を低減する上記方法及びそれによって処理された低漏出親和クロマトグラフィーマトリックスに加えて、本発明はリガンド漏出を測定する方法を含む。１つの前記方法は、以下インキュベーションテスト、あるいは小スケールプロセスと呼ぶ。
本発明のインキュベーションテストは以下に記載される工程（Ａ）〜（Ｃ）を含み、特に好ましい実施態様において、インキュベーションテストはこれらの工程からなる：
（Ａ）本発明の上述の方法の１つによって親和クロマトグラフィーマトリックスを前処理する工程（前記方法はリガンド漏出を低減するのに適している）、
（Ｂ）前処理した親和クロマトグラフィーマトリックスを追加の溶液とともにインキュベートする工程（追加の溶液はプローブとも呼ばれる）、及び
（Ｃ）適した定量的テストを用いて追加の溶液（プローブ）中のリガンドを定量化する工程（定量的テストは、例えばリガンド特異的ＥＬＩＳＡであってもよい）。
【００１９】
リガンド漏出を測定するために本明細書に示される本発明の方法の特別の実施態様において、親和クロマトグラフィーマトリックスは、以下のように工程Ａで前処理される：
第１工程（工程（Ａ１））において、親和マトリックスはカオトロピック物質、好ましくは尿素又はグアニジン塩酸塩で、最も好ましくは４〜６Ｍの濃度で処理され、続いて親和マトリックスに適した溶離緩衝剤で洗浄され、続いて中性緩衝剤、好ましくは６．５〜８．５のｐＨで洗浄される。
工程（Ａ２）において、親和マトリックスは吸着床の容量の数倍、好ましくは５〜３０倍の少なくとも１つの界面活性剤で処理され、接触時間は少なくとも４時間であり、インキュベーション温度は２５〜３７℃である。しかし、また前記温度は３７℃を超えるまで、例えば最大約５５℃のレベルに高めてもよい。
工程（Ａ３）において、親和クロマトグラフィーマトリックスはカオトロピック物質、好ましくは尿素又はグアニジン塩酸塩で、最も好ましくは４〜６Ｍの濃度で再度処理され、続いて親和マトリックスに適した溶離緩衝剤で洗浄され、続いて中性緩衝剤、好ましくは６．５〜８．５のｐＨで洗浄される。
【００２０】
工程（Ｂ）に記載される追加の溶液は、好ましくは生産条件下で、親和クロマトグラフィー用出発材料として使用される中間生成物に相当するプローブである。例えば、親和クロマトグラフィーが初期精製工程である場合、例えば発酵工程由来の採収プローブであってもよい。しかし、また細胞培養液又は任意の所望の緩衝剤を使用することは、本発明で考えられる。本発明の別の好ましい実施態様において、追加のプローブはプロセス条件下で得られる溶離液である。特別の実施態様において、プローブの処理（工程Ｂ）の接触時間は８時間以上であり、インキュベーション温度は１８℃以上、好ましくは約３７℃である。
リガンドの定量的測定は、リガンドの定量化に適した当業界で知られた任意の望ましい測定方法を用いて行ってもよい。例えば、タンパク質含有リガンドの場合、タンパク質はビウレット又はローリーの方法（Harris及びAngal, 1995）によって測定してもよい。タンパク質又はペプチドリガンドを定量化する別の方法は、抗体−抗原相互作用を利用することである。リガンドがこのリガンドに対して作られる特異的な抗体によって測定される前記テストシステムの使用は、例えば「イムノアッセイ」、Diamandis, P.及びChristopoulos T.K. (1996)に記載され、いかなる発明的な努力もなく、当業者によって実施される。本明細書に記載される方法は、単なる例であり、網羅的であると理解されるべきではない。
【００２１】
本発明は、特にタンパク質Ａマトリックスからのリガンド漏出を測定する方法の上述の実施態様に関する。１つの前記方法において、酸性緩衝剤、最も好ましくは２．０〜４．０のｐＨを有する緩衝剤が溶離緩衝剤として使用される。タンパク質Ａ漏出を測定する方法の別の実施態様は、実施例に記載される（下記参照）。本発明は、さらに図２に示されるタンパク質Ａ漏出を測定する方法に関する。
タンパク質Ａを検出する１つの好ましい方法は、例えば少量（ｐｐｍ）のタンパク質Ａを検出できるいわゆる「サンドウィッチタンパク質Ａ  ＥＬＩＳＡ」の使用である。前記テストの原理は、例えば「ＥＬＩＳＡ」、Kemeny, D.M. (1994)に記載され、当業者は容易に使用できる。タンパク質Ａ  ＥＬＩＳＡのために、高親和性抗タンパク質Ａ抗体は、反応容器、主に９６ウエルマイクロタイタープレートに固定される。分析されるサンプル中のタンパク質Ａの検出は、酵素、例えばペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼによりさらに標識された第２の等しく高い親和性抗タンパク質Ａ抗体を用いて、固定した抗タンパク質Ａ抗体によりサンプルをインキュベートした後行われる。前記非標識抗タンパク質Ａ抗体及び／又は酵素で標識されたものは当業界で知られており、例えばアメリカンリサーチプロダクツ社（ベルモント、ＵＳＡ）、バイオジェネイシス社（プール、イングランド）又はＯ．Ｅ．Ｍ．コンセプツ社（ニュージャージー、ＵＳＡ）から得ることができる。前記インキュベーションテストは、また再現よく低レベルのリガンド漏出、特に容認できるタンパク質Ａ漏出のために、本発明に従って閾値を決定する参照方法として役立つ。
【００２２】
本発明は、また同じ原理に基づき、緩衝剤組成物及び／又はインキュベーション条件の変化によってのみ異なるインキュベーションテストに関する。リガンド漏出の測定として、同じ原理に基づく別のテストは、親和マトリックスが異なる溶液によってインキュベートされ、少なくとも１つの溶液中のリガンドの量を測定する方法である。
本発明は、さらにリガンド漏出を測定する別の方法に関する。これは、プロセス条件下でリガンド漏出を測定するために使用することができる方法であり、以下では小スケールプロセスとも呼ばれる。本発明の方法は、以下に記載される工程を含み、又は以下に記載される工程からなる：
（Ａ）リガンド漏出を低減することができる上述の本発明の方法の１つによって親和クロマトグラフィーマトリックスを前処理する工程、
（Ｂ）親和クロマトグラフィーマトリックスに精製されるべき物質を加える工程、
（Ｃ）親和クロマトグラフィーマトリックスを特異的な洗浄緩衝剤で洗浄する工程、
（Ｄ）親和クロマトグラフィーマトリックスを適した溶離緩衝剤とともにインキュベートする工程、
（Ｅ）適した定量的テスト（例えば、リガンド特異的ＥＬＩＳＡであってもよい）を用いて溶離緩衝剤中のリガンドを定量化する工程。
本発明に従って、前記方法はバッチ方法及びカラムクロマトグラフィー方法の両方を使用してもよい。前記方法の好ましい実施態様は、タンパク質Ａマトリックスからのリガンド漏出を測定するために使用される。本発明の前記方法は実施例に記載される。１つの特別な実施態様は、図３に示される方法に実質的に相当するタンパク質Ａ漏出を測定する方法である。
【００２３】
さらに、本発明は、親和クロマトグラフィーマトリックスからのリガンド漏出を低減するための本発明の方法の１つが生物薬剤生成物の精製で使用される方法に関する。従って、また本発明は、低漏出親和クロマトグラフィーマトリックスが生物薬剤生成物を精製するために使用される方法に関する。本発明の目的で低漏出親和マトリックスは、本明細書に記載される本発明の方法の１つによって処理又は前処理された前記マトリックスである。
本発明の目的で生物薬剤生成物は、タンパク質、ペプチド、核酸及びその誘導体である。
従って、また本発明は、生物薬剤生成物の精製における親和クロマトグラフィーマトリックスからのリガンド漏出を低減する方法の使用及び低漏出親和クロマトグラフィーマトリックスの使用に関する。
１つの特別な実施態様は、タンパク質Ａ漏出を低減する本明細書に記載される方法の１つがそのフラグメント又は誘導体を含む抗体又はキメラ抗体分子の精製で使用される方法、従ってその使用である。従って、本発明は、また低漏出タンパク質Ａマトリックスがそのフラグメント又は誘導体を含む前記抗体、キメラ抗体分子の精製で使用される方法、すなわち本明細書に記載されるタンパク質Ａ漏出を低減する本発明の方法の１つによって処理又は前処理されたタンパク質Ａマトリックスに関する。また、本発明は、そのフラグメント又は誘導体を含む前記抗体、キメラ抗体分子を精製するための低漏出タンパク質Ａマトリックスの使用に関する。
【００２４】
実施態様の例
テストの説明：タンパク質Ａマトリックスについて一例としてリガンド漏出をインキュベーションテスト又は小スケールプロセスで分析した。これを行うために、クロマトグラフィーマトリックス（この場合、タンパク質Ａセファロース）をテストの記載／添付図面（図２及び３）に示されるテスト構造に示されるように処理し、次いでインキュベートし、又は所望の溶液（プローブ）を加えた。使用したプローブは、例えば細胞培養液又は発酵プロセスからの収集プローブであった：
工程１において、タンパク質Ａセファロースを、吸着床の容量の１倍（ＢＶ）の尿素緩衝剤（６Ｍ）、４ＢＶの酸性溶離緩衝剤（０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．０）及び６ＢＶの生理学的平衡緩衝剤（３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７〜８）で連続的に前処理する。
工程２において、タンパク質Ａマトリックスを４〜４８時間界面活性剤（主に０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ又は０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０）により２５〜３７℃でインキュベートし／濯ぐ。これはおよそ５〜３０ＢＶの緩衝剤（工程２）に相当する。
次いで工程３で、マトリックスを吸着床の容量の１倍（ＢＶ）の尿素緩衝剤（６Ｍ）、４ＢＶの酸性溶離緩衝剤（０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．０）及び６ＢＶの中性緩衝剤（３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７〜８）で濯ぐ。
インキュベーションテストにおいてタンパク質Ａ漏出を測定するために、タンパク質Ａセファロースのサンプルを適した前処理したマトリックスから得、ある長さの時間にわたって特異的なプローブの容量でインキュベートする。たいていの場合、プローブとして細胞培養液を使用した。しかし、酸性溶離緩衝剤又は任意の所望の緩衝剤を使用することも可能である。タンパク質Ａマトリックスを、次いで遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ、Ｅｘｐｅｎｄｅｒ  Ｒｏｔｏｒ  Ｆ４５−２４−１１）により分離した。タンパク質Ａ漏出を、次いでサンプル中のタンパク質Ａの量から測定した（下記参照）。
【００２５】
あるいは、タンパク質Ａ漏出を、使用した工業精製プロセスに直接基づく小スケールプロセスにより測定した。このため、処理工程１〜３（上記参照）に従うマトリックスに精製されるべき選択物質を含むチャージング緩衝剤を加えた。次いで、親和マトリックスをプロセス条件下で洗浄緩衝剤（３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７〜８）で洗浄した。この後、酸性溶離緩衝剤（０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．０）による溶離工程を行った。溶離液を集め、タンパク質Ａの量をタンパク質Ａ漏出の指標として測定した。
いずれの場合も、タンパク質Ａはサンドウィッチタンパク質Ａ  ＥＬＩＳＡ（極めて少量（ｐｐｍ）のタンパク質Ａでさえ検出できる）によって測定した。これを行うために、高親和性抗タンパク質Ａ抗体を、反応容器、主として９６ウエルマイクロタイタープレートに固定した。固定した抗タンパク質Ａ抗体とともにサンプルをインキュベーションした後、さらに酵素、例えばペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼによって標識された同じように高親和性の第２抗タンパク質Ａ抗体によって、タンパク質Ａを測定した。前記非標識及び酵素標識抗タンパク質Ａ抗体は当業者に知られ、例えばアメリカンリサーチプロダクツ社（ベルモント、ＵＳＡ）、バイオジェネイシス社（プール、イングランド）又はＯ．Ｅ．Ｍ．コンセプツ社（ニュージャージー、ＵＳＡ）から得ることができる。あるいは、タンパク質Ａを測定する市販のテストキット（ＥＬＩＳＡ）は、例えばReliGen社（ニーダム、ＵＳＡ）から得ることができる。テストは製造業社の取扱説明書に従って行われる。
【００２６】
結果：タンパク質Ａ漏出を低減するためのタンパク質Ａセファロースの前処理
高タンパク質Ａ漏出を示すタンパク質Ａマトリックスのタンパク質Ａ漏出特性は、尿素緩衝剤、溶離緩衝剤、平衡緩衝剤及び非イオン性界面活性剤による親和マトリックスの組み合わせた前処理によって明らかに低減することができる（図４）。使用した界面活性剤濃度は０．２％であった。処理前にすでに低漏出であるタンパク質Ａセファロースのタンパク質Ａ漏出特性は、安定した状態を保ち、前処理によって影響を受けない（図４）。記載されたタンパク質Ａマトリックスの前処理は、親和マトリックスの活性又はそのクロマトグラフィー特性（性能）に負の影響を与えない。処理されたタンパク質Ａセファロースは、多くの添加及び溶離サイクルに対して安定なリガンド漏出を示し（図５）、安定した状態を保ち、その容量及び溶離特性において影響を受けない。
【００２７】
界面活性剤濃度の関数としてのタンパク質Ａ漏出の誘発
タンパク質Ａ漏出の誘発は使用した界面活性剤の濃度に依存する。使用した界面活性剤の最適濃度範囲は０．００１〜１．０％であり、物質に依存する（図６〜１０参照）。最適界面活性剤濃度はインキュベーションテスト又は小スケールプロセス又は親和マトリックスの各適用に見合う方法に基づくテストによって決定される。
【００２８】
タンパク質Ａ漏出反応の時間依存性
タンパク質Ａセファロースの反応／前処理の時間依存性をインキュベーション実験で示した。タンパク質Ａセファロースが界面活性剤含有緩衝剤中（例えば、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）でインキュベーションされる場合、タンパク質Ａセファロースの漏出は時間に依存する（図１１）。驚いたことに、タンパク質Ａ漏出における明らかな低減が少なくとも１６〜２４時間の処理時間（接触時間）後にのみ達成されることが分かった。
また、図１４は、２５℃の接触時間は１６〜４８時間が理想的であることを示す。温度が約２５℃、例えば３７℃まで上昇する場合、必要な処理時間は少なくとも４時間、理想的には４〜１６時間に短縮される。同様に、タンパク質Ａマトリックスの界面活性剤による前処理の直接容積依存性も存在する。
【００２９】
タンパク質Ａ漏出反応の温度依存性
タンパク質Ａ漏出の溶離／誘導は、インキュベーション温度に依存する。２〜８℃、２５℃（ＲＴ）及び３７℃又は２〜８℃、３７℃、４５℃、５０℃及び５５℃の２つの独立のテストシリーズにおけるタンパク質Ａセファロースのリガンド漏出の比較は、リガンド漏出が温度に直接依存することを示す：インキュベーション温度が高いほど、不安定な又は非共有結合的に結合したタンパク質Ａはより効果的に親和マトリックスから溶解することができる（図１２）。工業用途に理想的なインキュベーション温度は２０〜２５℃（ＲＴ）である。必要に応じて、温度は、また３７℃以上、例えば約５０℃又は約５５℃に高めてもよく、その結果として、必要な処理の長さ及び濯ぎ量は、同じ効果を達成するために少なくすることができる（図１４参照）。
【００３０】
種々のタンパク質Ａマトリックスの前処理
タンパク質Ａ漏出の誘導は、マトリックスが本発明に従って界面活性剤により処理された後、種々のタンパク質マトリックス（例えば、野生型／組換えタンパク質Ａセファロース、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ等）について得られる（図１３）。
【００３１】
文献
Diamandis, E.P.及びChristopoulos, T.K. (1996). Immunoassay, Academic Press.
Duggleby, C.J.及びJones, S.A. (1983), Cloning and expression of Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichia coli. Nucl.Acid.Res. 1983 May 25; 11(10):3065-76.
Harris及びAngel (1989): protein Purification Methods  A practical approach, IRL Press, Oxford University Press Inc., New York, 1995.
Kemeny, D.M. (1994). ELISA  Anwendung des Enzyme Linked Immunosorbent Assay im biologisch/medizinischen Labor. Gustav Fischer Verlag.
Li, R. Dowd, V., Stewart, D.J., Burton, S.J. Lowe, C.R. (1998), Design, synthesis and application of a protein A mimetic. Nat.Biotechnol. 1998 Feb; 16(2):190-5.Lindmark, R., Thoren-Tolling, K., Sjoquist J (1983); Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera: J Immunol Methods 1983 Aug 12;62(1):1-13.
Lofdahl, S., Guss, B., Uhlen, M., Philipson, L., Lindberg, M. (1983), Gene for staphylococcal protein A. PNAS, U S A, Feb; 80(3):697-701
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の方法の１つによって前処理されていないタンパク質Ａセファロースからの異なるリガンド漏出を示す。
【図２】タンパク質Ａマトリックスからのタンパク質Ａ漏出を測定するための本発明のインキュベーションテストを示す。
【図３】タンパク質Ａマトリックスからのタンパク質Ａ漏出を測定するための本発明の小スケールプロセスを示す。
【図４】タンパク質Ａ漏出の低減に対する、高及び低タンパク質Ａ漏出によるタンパク質Ａマトリックスの前処理の影響を示す。
【図５】マトリックスが小スケールプロセスにおいて生物学的プローブで繰り返し処理される場合の、タンパク質Ａ漏出の低減に対する本発明の方法によるタンパク質Ａマトリックスの処理の影響を示す。
【図６】タンパク質Ａ漏出の低減に対するＴｗｅｅｎ  ２０の濃度の影響を示す。
【図７】タンパク質Ａ漏出の低減に対するＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８の濃度の影響を示す。
【図８】タンパク質Ａ漏出の低減に対するＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００の濃度の影響を示す。
【図９】タンパク質Ａ漏出の低減に対するＣＨＡＰＳの濃度の影響を示す。
【図１０】タンパク質Ａ漏出の低減に対するポリエチレングリコールの濃度の影響を示す。
【図１１】タンパク質Ａ漏出の低減に対する処理時間の影響を示す。
【図１２】タンパク質Ａ漏出の低減に対する処理温度の影響を示す。（Ａ、Ｂ）及び（Ｃ、Ｄ）は独立に行われた２つのテストを示す。
【図１３】種々のタンパク質Ａマトリックスについてタンパク質Ａ漏出の界面活性剤依存性誘導／低減を示す。
【図１４】時間、温度及び濯ぎに用いた容量の関数としてタンパク質Ａ漏出の低減を示す。濯ぎに用いた容量は処理の長さに直接依存する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図６】
2005509169.tif 000004
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図７】
2005509169.tif 000005
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図８】
2005509169.tif 000006
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９】
2005509169.tif 000007
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１０】
2005509169.tif 000008
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１１】
2005509169.tif 000009