(57)【要約】【課題】内膜がＰＳ及びＰＥの群から選ばれる１種以上のみからなるマイクロメートルサイズのリポソーム、リポソームの製造方法及び反応制御方法を提供する。【解決手段】内膜リン脂質がホスファチジルセリン及びその誘導体、並びにホスファチジルエタノールアミン及びその誘導体の群から選ばれる１種以上のみから成り、脂質二分子膜から形成される粒径５μｍ以上のリポソームであって、前記内膜リン脂質内に、細胞骨格の重合体を内包する。【選択図】    図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
内膜リン脂質がホスファチジルセリン及びその誘導体、並びにホスファチジルエタノールアミン及びその誘導体の群から選ばれる１種以上のみから成り、脂質二分子膜から形成される粒径５μｍ以上のリポソームであって、
前記内膜リン脂質内に、細胞骨格の重合体を内包するリポソーム。
【請求項２】
前記細胞骨格がアクチンフィラメントである請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
内膜リン脂質がホスファチジルセリン及びその誘導体、並びにホスファチジルエタノールアミン及びその誘導体の群から選ばれる１種以上のみから成り、脂質二分子膜から形成される粒径５μｍ以上のリポソームを製造する方法であって、
油性液体中に、前記内膜リン脂質と、細胞骨格と、水性液体とを混合し、前記内膜リン脂質内に前記細胞骨格が繊維状に結合したＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、
水相に、外膜脂質を溶解した油性液体を加え、油水の分離界面に前記脂質が並んだ分子膜を形成させる工程と、
前記Ｗ／Ｏエマルションを前記分離界面における油相側に加え、遠心分離又は攪拌し、前記Ｗ／Ｏエマルションを前記分離界面における水相側に移行させて、前記Ｗ／Ｏエマルションの外側に前記外膜脂質を付加する工程とを有するリポソームの製造方法。
【請求項４】
前記細胞骨格がアクチンフィラメントである請求項３に記載のリポソームの製造方法。
【請求項５】
前記外膜となる脂質がホスファチジルコリン又はその誘導体を含む請求項３又は４に記載のリポソームの製造方法。
【請求項６】
油性液体中に、１種以上のリン脂質と、反応基質と、水性液体とを混合し、前記反応基質が前記リン脂質内に封入された粒径５μｍ以上のＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、
前記Ｗ／Ｏエマルション内に、前記反応基質と反応する反応剤を導入する工程とを有する微小反応空間内での反応制御方法。
【請求項７】
油性液体中に、１種以上のリン脂質と、反応基質と反応する反応剤と、水性液体とを混合し、前記反応剤が前記リン脂質内に封入された粒径５μｍ以上のＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、
前記Ｗ／Ｏエマルション内に、前記反応基質を導入する工程とを有する微小反応空間内での反応制御方法。
【請求項８】
油性液体中に、１種以上のリン脂質と、反応基質と、水性液体とを混合し、前記反応基質が前記リン脂質内に封入された粒径５μｍ以上の第１のＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、
油性液体中に、１種以上のリン脂質と、前記反応基質と反応する反応剤と、水性液体とを混合し、前記反応剤が前記リン脂質内に封入された粒径５μｍ以上の第２のＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、
前記第１のＷ／Ｏエマルションと前記第２のＷ／Ｏエマルションとを融合させる工程とを有する微小反応空間内での反応制御方法。
【請求項９】
油性液体中に、１種以上のリン脂質と、反応基質と、水性液体とを混合し、前記、反応基質が前記リン脂質内に封入された粒径５μｍ以上のＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、
前記Ｗ／Ｏエマルションに、前記反応基質と反応する波長光又は電磁波を照射する工程とを有する微小反応空間内での反応制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム、リポソームの製造方法及び微小反応空間内での反応制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、リン脂質等の脂質二分子膜によって形成され、その内部に水相を閉じ込めたカプセル構造を有する。リポソームの構造は、生体膜と類似しているため、種々の研究材料や、有効成分を内包した応用（化粧料や薬物輸送システム（ＤＤＳ））が検討されている（例えば、特許文献１、２参照）。
ここで、リポソームは、通常、リン脂質を水溶液中で懸濁させて多重層リポソーム（いわゆるリポソーム原液）を形成させた後、超音波処理を行って製造するのが通常である。【０００３】
一方、リポソームの内膜をＷ／Ｏエマルションにより作成し、このエマルションの外膜に脂質を付加するリポソームの製造方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。この方法は次のようにして行われる。
まず、油中に少量の水と脂質（リポソームの内膜となるもの）を混合し、Ｗ／Ｏエマルションを作成する。次に、水相に、外膜脂質（リポソームの外膜となるもの）を溶解した油性液体を加え、油水の分離界面に外膜脂質が並んだ分子膜を形成させる。そして、Ｗ／Ｏエマルションを前記分離界面における油相側に加え、遠心分離又は攪拌し、Ｗ／Ｏエマルションを前記分離界面における水相側に移行させて、Ｗ／Ｏエマルションの外側に外膜脂質を付加し、リポソームを製造する。【０００４】
ところで、細胞内での生体物質の機能の研究等を行う際、細胞とほぼ同じ空間スケールや構造を持つマイクロラボ(μｍサイズの反応場)の構築が望まれる。ここで、得られたマイクロラボを各種溶媒等へハンドリングしたり、マイクロラボ中の生体物質を可視光観察するためには、マイクロラボの粒径が小さ過ぎても不都合であり、レーザーピンセットによるハンドリング等を考慮すると、マイクロラボの粒径が約５μｍ以上あることが必要である。
このようなマイクロラボとしては、構造が生体膜と類似するリポソームを用いることができるが、さらに例えば、アクリル樹脂やガラスでマイクロラボを作製したものがある。又、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等の界面活性剤でμｍサイズのＷ／Ｏエマルションを作製し、このエマルション中に反応基質を封入して反応場とする技術がある。【０００５】
一方、リポソーム内にアクチンフィラメント（細胞骨格）を内包させる技術が報告されている（例えば、非特許文献２，３参照）。【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２８２４号公報
【特許文献２】特開２００５−１６２７１２号公報
【非特許文献１】Langmuir 19 (2003) 2870-2879
【非特許文献２】Proc Natl Acad Sci USA, (1992) December 1; 89 (23),11547.1551
【非特許文献３】Eur Phyd J E soft Matter (2003)Apr;10(4). 319-30
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の粒径５μｍ以上のリポソームの製造方法の場合、リポソームの内膜がホスファチジルセリン（以下、「ＰＳ」と表示する）、又はホスファチジルエタノールアミン（以下、「ＰＥ」と表示する）の１種のみからなるリポソームを製造することは困難である。これは、ＰＳやＰＥの負の自発曲率が大きいためと考えられる。そのため、従来は、負の自発曲率が小さい脂質であるホスファチジルコリン（以下、「ＰＣ」と表示する）と、上記ＰＳやＰＥとを混合してリポソームを製造していたが、この場合、内膜がＰＳ又はＰＥの単独層であるリポソームが得られない。【０００８】
一方、上記非特許文献１記載の技術の場合、粒径５μｍ以上のリポソームを製造することが困難である。これは、リポソームが非常に不安定な構造であり、５μm以上に大きくなると、遠心分離等により油水界面でリポソームが壊れてしまうためと考えられる。【０００９】
又、マイクロラボとして、アクリル樹脂やガラスを用いたものは、これらの表面が生体物質を失活させたり変性させたりする問題がある。又、Ｗ／Ｏエマルションをマイクロラボとする場合も、エマルションに用いる界面活性剤が生体物質を失活させたり変性させたりする。
なお、マイクロラボとして細胞膜と同じ脂質二分子膜からなるマイクロメートルサイズのリポソームを用いることができ、リポソームの内部では生体物質が失活せずに反応が進行する。しかしながら、リポソームは不安定な構造なため、浸透圧などの外場の影響で容易に変形、破壊し、反応の制御が困難となる。また、リポソームの内膜として作製できる脂質が限られており、脂質の種類を変えることによってマイクロラボの内部環境を制御することが困難である。【００１０】
又、アクチンをリポソームに内包させる非特許文献２，３記載の技術は、予めリポソーム内にアクチンのモノマーを内包しておき、これを温度上昇（非特許文献２）や重合剤（非特許文献３）によって重合させてアクチンフィラメントを形成させている。これは、リポソームに巨大分子であるアクチンフィラメントを内包させるのが困難なためであるが、上記と同様にリポソームとして用いる脂質が限られ、ＰＳやＰＥを用いることができない。通常の細胞膜内膜の主成分はＰＳやＰＥであり、細胞骨格（ここではアクチン）が細胞内膜に囲まれた環境で機能している。従って、マイクロラボ内に細胞骨格を内包させる場合、脂質としてはＰＳやＰＥを用いたほうが細胞骨格との適合性が良いことが期待される。
さらに、非特許文献２，３記載の技術の場合、アクチンフィラメントの重合や緩衝液に用いる塩の濃度が自由に選択できないという問題がある。例えば、非特許文献２、３には、アクチンの緩衝液として、G-buffe(アクチンの緩衝液としてよく用いられている：2 mM Tris HCl, pH8.2, 0.5 mM CaCl2, 0.2 mM ATP, 0.2 mM NaN3, 0.5 mM dithiothreitol)を使用することが記載されているが、緩衝液の濃度がこの範囲を外れた場合にリポソームが形成されるかどうかは不明である。通常、リポソームは塩濃度が高くなると作製が困難になる傾向があり、そのため使用可能な塩濃度が限定されるからである。
将来的にリポソームをDDSに利用する場合、リポソーム内に薬を高濃度で内封させることになるため、リポソームの作製条件として溶質濃度に制限が無い方が有利である。【００１１】
従って、本発明の目的は、内膜がＰＳ及びＰＥの群（これらの誘導体を含む）から選ばれる１種以上のみからなるマイクロメートルサイズのリポソーム、及びその製造方法を提供することにある。又、本発明の目的は、マイクロメートルサイズの微小反応空間内での反応制御方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち本発明のリポソームは、内膜リン脂質がホスファチジルセリン及びその誘導体、並びにホスファチジルエタノールアミン及びその誘導体の群から選ばれる１種以上のみから成り、脂質二分子膜から形成される粒径５μｍ以上のリポソームであって、前記内膜リン脂質内に、細胞骨格の重合体を内包するリポソームである。【００１３】
前記細胞骨格がアクチンフィラメントであることが好ましい。【００１４】
本発明のリポソームの製造方法は、内膜リン脂質がホスファチジルセリン及びその誘導体、並びにホスファチジルエタノールアミン及びその誘導体の群から選ばれる１種以上のみから成り、脂質二分子膜から形成される粒径５μｍ以上のリポソームを製造する方法であって、油性液体中に、前記内膜リン脂質と、細胞骨格と、水性液体とを混合し、前記内膜リン脂質内に前記細胞骨格が繊維状に結合したＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、水相に、外膜脂質を溶解した油性液体を加え、油水の分離界面に前記脂質が並んだ分子膜を形成させる工程と、前記Ｗ／Ｏエマルションを前記分離界面における油相側に加え、遠心分離又は攪拌し、前記Ｗ／Ｏエマルションを前記分離界面における水相側に移行させて、前記Ｗ／Ｏエマルションの外側に前記外膜脂質を付加する工程とを有する。【００１５】
前記細胞骨格がアクチンフィラメントであることが好ましく、前記外膜となる脂質がホスファチジルコリン又はその誘導体を含むことが好ましい。【００１６】
本発明の微小反応空間内での反応制御方法は、油性液体中に、１種以上のリン脂質と、反応基質と、水性液体とを混合し、前記、反応基質が前記リン脂質内に封入された粒径５μｍ以上のＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、前記Ｗ／Ｏエマルション内に、前記反応基質と反応する反応剤を導入する工程とを有する。【００１７】
又、本発明の微小反応空間内での反応制御方法は、油性液体中に、１種以上のリン脂質と、反応基質と、水性液体とを混合し、前記反応基質が前記リン脂質内に封入された粒径５μｍ以上の第１のＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、油性液体中に、１種以上のリン脂質と、前記反応基質と反応する反応剤と、水性液体とを混合し、前記反応剤が前記リン脂質内に封入された粒径５μｍ以上の第２のＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、前記第１のＷ／Ｏエマルションと前記第２のＷ／Ｏエマルションとを融合させる工程とを有する。【００１８】
又、本発明の微小反応空間内での反応制御方法は、油性液体中に、１種以上のリン脂質と、反応基質と、水性液体とを混合し、前記、反応基質が前記リン脂質内に封入された粒径５μｍ以上のＷ／Ｏエマルションを形成する工程と、前記Ｗ／Ｏエマルションに、前記反応基質と反応する波長光又は電磁波を照射する工程とを有する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、内膜がＰＳ及びＰＥの群（これらの誘導体を含む）から選ばれる１種以上からなるマイクロメートルサイズのリポソームを製造することができる。又、本発明によれば、リン脂質からなるマイクロメートルサイズの微小反応空間内で反応を制御することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について説明する。【００２１】
１．本発明のリポソーム
本発明のリポソームは、内膜リン脂質がホスファチジルセリン及びその誘導体、並びにホスファチジルエタノールアミン及びその誘導体の群から選ばれる１種以上のみから成り、脂質二分子膜から形成される粒径５μｍ以上のリポソームであって、前記内膜リン脂質内に、細胞骨格の重合体を内包するリポソームである。
このようにすると、リポソームの内膜がＰＳ及び／又はＰＥであるため、内包される細胞骨格との適合性が向上することが期待できる。【００２２】
２．本発明に係るリポソームの製造方法
<混合工程（Ｗ／Ｏエマルションの作製）>
本発明のリポソームの製造方法においては、まず、油性液体中に、内膜リン脂質と、細胞骨格と、水性液体とを混合し、内膜リン脂質内に細胞骨格が繊維状に結合したＷ／Ｏエマルション（内膜リン脂質の単分子膜粒子）を形成する。
内膜リン脂質としては、ＰＳ又はその誘導体、及びＰＥ又はその誘導体の群から選ばれる１種以上から成るものを用いる。ここで、ＰＳの誘導体としては、ジオレイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）等が挙げられる。従って、本発明において、内膜リン脂質は、例えばＰＳ単独でもよく、ＰＳとＰＥから成っていてもよい。【００２３】
細胞骨格は細胞の形態を維持し、細胞内外の運動を生じさせるための細胞内の線維状構造である。細胞骨格は、電子顕微鏡で観察することができ、その太さによって３種に分類される。１）マイクロフィラメント（アクチンフィラメント）：繊維外径が５ｎｍ程度のものであり、通常、アクチンを構成単位とする。２）中間フィラメント：多種の線維が含まれ、繊維外径が１０ｎｍ程度のものである。３）微小管：繊維外径が２５ｎｍ程度のものであり、通常、チューブリンを構成単位とする。
本発明においては、Ｗ／Ｏエマルションを作成する際に、内膜リン脂質の内部の水相に細胞骨格を閉じ込め、細胞骨格を繊維状に結合させることによって、Ｗ／Ｏエマルションを強化する。【００２４】
なお、Ｗ／Ｏエマルション内部で細胞骨格を重合させて繊維状に結合させるため、細胞骨格の重合剤を添加することが好ましい。重合剤は、Ｗ／Ｏエマルションを作成する際に混合すればよい。例えば、細胞骨格としてアクチンフィラメントを用いる場合、重合剤として２ｍｍｏｌ／Ｌ程度のMg2+を添加すればよい。この場合、長さ１０μｍ程度のアクチンフィラメントが得られ、これらの単位長さを持つアクチンフィラメントが相互に絡み合い、内膜リン脂質と結合してＷ／Ｏエマルションを強化する。【００２５】
ここで、リポソームをDDSに利用する場合、リポソーム内に薬を高濃度で内封させることになるため、リポソームの作製条件として溶質濃度に制限が無い方が有利である。
そして、本発明の製造方法においては、まず、１分子膜小胞を作製し、それをアクチンフィラメントで強度を増した後、２分子膜小胞を作製するという新規の過程を経るため、塩濃度を自由に選択できる（濃度の下限は０、つまり純水でも作製することができ、従来より高濃度とすることもできる）。
この理由は、最初の１分子膜小胞の形成段階では、表面張力の影響が支配的であり、塩濃度を特に限定しなくともよいためと考えられる。一方、従来のように、２分子膜小胞を一度に形成する場合、その形成過程において塩濃度の影響が大きくなり、濃度条件が限定されると考えられる。
さらに、後述するように、マグネシウムイオン濃度によってアクチンフィラメントの構造が多様に変化することが判明している。従って、塩濃度を自由に選択できるということは、アクチンフィラメントの構造によってリポソームの強度を制御できる可能性があるということを意味する。【００２６】
粒径５μｍ以上のＷ／Ｏエマルションを形成させるため、内膜リン脂質と、油性液体と、水性液体とを、通常、以下の混合比率で混合することが好ましい。
１）内膜リン脂質の油性液体中の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであるように配合する。ここで、内膜リン脂質として２種以上を用いる場合は、それらの合計濃度を上記範囲とする。
２）水性液体と油性液体の配合割合を、体積比で（水性液体／油性液体）＝１／１０００〜１／１０となるようにする。【００２７】
ここで、内膜リン脂質の油性液体中の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、得られた単分子膜粒子の粒径が小さくなりすぎるか、単分子膜粒子が形成されない場合がある。一方、濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると単分子膜粒子の粒径が５μｍ以下となるか、又は粒子状とならずにラメラ状等になる場合がある。なお、通常、Ｗ／Ｏエマルションの粒径は４０μｍ以下とすることが好ましい。
又、（水性液体／油性液体）で表される比が１／１０００未満であると、油性液体の割合が多くなり過ぎ、良好なＷ／Ｏエマルション（内膜リン脂質の単分子膜粒子）を形成し難い場合がある。一方、上記比が１／１０を超えると水性液体の割合が多くなり過ぎ、やはり良好なＷ／Ｏエマルションを形成し難い場合がある。【００２８】
油性液体は、内膜リン脂質を安定に分散させるものであれば特に制限されないが、例えば、鉱物油（ミネラルオイル）を用いることができる。水性液体は特に制限されず、又、最終的に得られるリポソームに内包する有効成分等を水性液体に含有させてもよいが、単分子膜粒子（リポソーム）の粒径を制御し易いことから、水(純水)が好ましい。【００２９】
<リポソームの作製（外膜脂質の付加）>
次に、上記単分子膜粒子の表面に、外膜となる脂質を付加し、内膜と外膜の脂質二分子膜から形成される粒径５μｍ以上のリポソームを作製する。
ここで、最終的に得られるリポソームの粒径が５μｍ未満であると、リポソームをレーザーピンセットで捕捉、ハンドリングするや、リポソームを可視光観察することが困難となる。
なお、最終的に得られるリポソームの粒径を５μｍ以上とするため、正確には上記単分子膜粒子の粒径は、外膜脂質の長さだけリポソームの粒径より小さいが、上記説明では、便宜上、リポソームの粒径と同様とみなす。【００３０】
リポソームの粒径は、例えば光学顕微鏡により測定することができる。【００３１】
外膜となる脂質を付加する方法としては、例えば文献（Langmuir, 19(2003)p.2870-2879、及びProc. Natl. Acad. Sci., 101. (2004) p.17669 - 17674）に記載された方法を用いることができる。
具体的には、１）水相に、外膜脂質を溶解した油性液体を加え、油水の分離界面に前記脂質が並んだ分子膜を形成させる。通常、油相が水相より上側になる。
２）次に上記Ｗ／Ｏエマルションを、上記１）の分離界面における油相側に注ぐ。これを遠心分離又は攪拌すると、Ｗ／Ｏエマルションが分離界面を通過して水相側に移行する。この通過の際にＷ／Ｏエマルションの外側に、分子膜として並んだ外膜脂質が付加される。【００３２】
外膜となる脂質としては、例えば、ＰＣ又はその誘導体を用いることができる。上記リポソームを安定させるため、膜安定化剤、電荷付与物質、各種助剤を添加してもよい。【００３３】
３．本発明に係る微小反応空間内での反応制御方法
３−１．Ｗ／Ｏエマルションに反応剤を導入する実施態様
この実施態様は、以下の工程を含む。
<Ｗ／Ｏエマルションの作製>
本発明の反応制御方法においては、まずＷ／Ｏエマルションを形成する。Ｗ／Ｏエマルションの形成方法は、上記リポソームの製造方法の場合と同様であり、油性液体中に、１種以上のリン脂質と、反応基質と、水性液体とを混合し、反応基質がリン脂質内に封入された粒径５μｍ以上のＷ／Ｏエマルションを形成する。リン脂質としては特に制限はないが、例えば、ＰＳ及びその誘導体、ＰＥ及びその誘導体、PC（ホスファチジルコリン）及びその誘導体、SM（スフィンゴミエリンなど）及びその誘導体が挙げられる。
油性液体、リン脂質、及び水性液体として用いることのできる種類や、これらの配合割合は、上記リポソームの製造方法の場合と同様である。
反応基質としては、生体物質である各種タンパク質やＤＮＡ等を合成するための生体物質を好適に用いることができる。生体物質は周囲の環境に非常に左右されやすく、従来のマイクロメートルサイズの微小空間では、生体物質の反応を制御することは困難である。本発明によれば、細胞膜の主成分と同様なリン脂質で生体物質を囲むことができ、内部が細胞内環境に類似した微小反応空間を作製して、生体物質が失活せずに反応を制御することができる。【００３４】
次に、このＷ／Ｏエマルション内に、反応基質と反応する反応剤を導入する。
反応剤としては、反応基質と反応するものであればよい。例えば反応基質がタンパク質の場合、それと特異的に反応する酵素が反応剤となる。
Ｗ／Ｏエマルション内に反応剤を導入する方法としては、マイクロマニピュレータによってＷ／Ｏエマルション内にマイクロピペットを挿入し、ピペット内の反応剤を注入する方法が挙げられる。
なお、この実施態様において、反応剤をＷ／Ｏエマルション内に封入し、このＷ／Ｏエマルションに外部から反応基質を導入してもよい。【００３５】
３−２．複数のＷ／Ｏエマルションを融合する実施態様
この実施態様は、以下の工程を含む。
<第１のＷ／Ｏエマルションの作製>
油性液体中に、反応基質が封入された粒径５μｍ以上の第１のＷ／Ｏエマルションを形成する。Ｗ／Ｏエマルションを形成するための油性液体、リン脂質、及び水性液体として用いることのできる種類や、これらの配合割合は、上記リポソームの製造方法の場合と同様である。
反応基質としては、上記２−１の実施態様で説明したものを好適に用いることができる。
<第２のＷ／Ｏエマルションの作製>
油性液体中に、反応剤が封入された粒径５μｍ以上の第１のＷ／Ｏエマルションを形成する。Ｗ／Ｏエマルションを形成するための油性液体、リン脂質（ＰＳ、ＰＥ及びそれらの誘導体）、並びに水性液体として用いることのできる種類や、これらの配合割合は、上記リポソームの製造方法の場合と同様である。
反応剤としては、上記２−１の実施態様で説明したものを好適に用いることができる。【００３６】
この実施態様は、反応基質が封入されたＷ／Ｏエマルションに反応剤を導入する代わりに、反応基質が封入された第１のＷ／Ｏエマルションと、反応剤が封入された第２のＷ／Ｏエマルションとを融合させ、反応を進行させる点に特徴がある。両者を融合させる方法としては、予め、両者を離間して油中に配置し、レーザーピンセットにより両者を把持して融合させる方法が挙げられる。この場合、例えば、ガラスプレートを底面とし、底面からプラスチックの側壁を立上げた油溜めに上記鉱物油を加え、この油中に上記Ｗ／Ｏエマルションを投入することができる。上記鉱物油にはエマルション作製に用いた脂質を0.01~1mM溶かしておくとよい。【００３７】
３−３．Ｗ／Ｏエマルションに波長光又は電磁波を照射する実施態様
この実施態様は、反応基質が封入されたＷ／Ｏエマルションに、反応基質と反応する波長光又は電磁波を照射すること以外は、上記２−１の実施態様と同様であるので説明を省略する。【００３８】
<実施例>
以下に、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
<リポソームの製造方法についての実施例>
【実施例１】
【００３９】
内膜リン脂質としてＤＯＰＳ１ｍｍｏｌ／Ｌを鉱物油（ナカライ社製、製品番号SP 23306-84）に溶かし、鉱物油に対して体積比で１／１００の量の蒸留水を加えるとともに、さらに鉱物油1００μlに対し1μlのアクチン溶液（１mg/mlアクチン、及び２mＭのマグネシウムイオン）を加えて攪拌し（ピペットで数回、混合液の出し入れを繰り返す）Ｗ／Ｏエマルションを作製した。混合及び攪拌は常温で行った。２時間放置することで、繊維状に結合したアクチンフィラメントがＤＯＰＳに内包されたＷ／Ｏエマルションが得られた。Ｗ／Ｏエマルションの粒径が５〜４０μｍであることが光学顕微鏡で確認された。
次に、外膜脂質（ＰＣ）１ｍｍｏｌ／Ｌを溶かした鉱物油2mLを、水３mLの上から加え、約９０分放置した。油水が二相分離し、油水分離界面に外膜脂質が１分子膜として並んだ。なお、分離界面の上側が油相で下側が水相であった。
上記Ｗ／Ｏエマルション1mLをこの油水分離界面における油相に注ぎ、液全体を遠心分離した（120gの液を５〜10分）。エマルションが油水界面を通過する時に外膜脂質が付加され、リポソームが得られた。
【実施例２】
【００４０】
内膜リン脂質としてＤＯＰＳの代わりに、ＤＯＰＥ１０ｍｍｏｌ／Ｌを用いたこと以外は、実施例１とまったく同様にして、粒径が５〜４０μｍのリポソームを得た。【００４１】
<比較例１>
アクチン溶液を加えなかったこと以外は、実施例１とまったく同様にしてＷ／Ｏエマルションを作製し、これに外膜脂質（ＰＣ）を付加した。上記油水分離界面における油相にＷ／Ｏエマルションを注ぎ、液を遠心分離したところ、エマルションが破壊され、粒径５μｍ以上のリポソームが得られなかった。【００４２】
以上から明らかなように、各実施例の場合、内膜リン脂質がＤＯＰＳ又はＤＯＰＥのみから成り、外膜がＰＣである粒径５〜４０μｍのリポソームが得られた。
図１は、実施例１の懸濁液を示す。内膜リン脂質が粒径約１０μｍの単分子膜粒子２として分散したエマルションが形成されたことがわかる。【００４３】
一方、アクチン溶液を加えなかった比較例１の場合、粒径５μｍ以上のリポソームが得られなかった。これは、Ｗ／Ｏエマルションの内部（水相）に細胞骨格が繊維状に結合せず、エマルションの強度が向上しなかったために遠心分離でエマルションが破壊されたと考えられる。
【実施例３】
【００４４】
<ＤＯＰＳのＷ／Ｏエマルション内での高分子の構造変化>
上記したＤＯＰＳ単分子膜粒子の内部がマイクロメートルサイズの反応場として利用できることを示すため、実施例１と同様な方法でアクチンフィラメントを内包するＷ／Ｏエマルション（ＤＯＰＳを使用）を作製し、アクチンの構造変化を観察した。アクチンフィラメントは、マグネシウムイオン等の多価カチオンの存在下で凝集構造をとることが知られている。
なお、蛍光物質を用いてアクチンフィラメントを赤く蛍光させ、共焦点顕微鏡を用いてアクチンフィラメントの構造を観察した。【００４５】
図２は、単分子膜粒子内のアクチンフィラメントの構造を示す。図２において、Ｍｇ2+を濃度は４ｍｍｏｌ／Ｌ（カチオン換算）であり、アクチンフィラメント８は単分子膜粒子４内に一様に分布した。アクチンフィラメントは負に帯電した高分子であり、ＤＯＰＳ膜も負電荷を帯びているため、静電反発により、両者が凝集しないと考えられる。
図３は、Ｍｇ2+を濃度１２ｍｍｏｌ／Ｌ（カチオン換算）とした場合を示す。アクチンフィラメント８が膜へ凝集転移していることがわかる。
図４は、Ｍｇ2+を濃度４０ｍｍｏｌ／Ｌ（カチオン換算）とした場合を示す。アクチンフィラメント８がBundle転移を起こし、膜への付着が少なくなっていることがわかる。Bundle転移すると、曲率を持つＤＯＰＳ膜にアクチンフィラメントの太く硬いbundleが付着することはエネルギー損失を伴うため、膜への付着が減少したと考えられる。
なお、単分子膜粒子としてＤＯＰＳの代わりにＤＯＰＥを用いた場合も、同様にアクチンフィラメントの構造変化を観察することができた。
<微小反応空間内での反応制御方法についての実施例>
【実施例４】
【００４６】
反応基質としてカルセインAM（ビス［N,N-ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フルオレセン）を用いた。又、反応剤として、カルセインAMを加水分解して蛍光を発するカルセインを生成させるエステラーゼ酵素を用いた。
鉱物油に対しアクチン溶液を加える代わりに、カルセインAMを加えたこと以外は、実施例１と全く同様にしてＷ／Ｏエマルションを作製した。なお、Ｗ／Ｏエマルション中のカルセインAMが５０μｍｏｌ／Ｌとなるように、カルセインAMの添加量を調整した。
ガラスプレートを底面とし、底面からプラスチックの側壁を立上げた油溜めに上記鉱物油を加え、この油中に上記Ｗ／Ｏエマルションを投入した。次に、マイクロマニピュレータ（Narishige社製のマイクロインジェクタIM-300）を用い、上記Ｗ／Ｏエマルション内にマイクロピペット（先端直径１〜２μｍ）を挿入し、ピペット内のエステラーゼ酵素（２．５mg/ml）を注入した。
図５は、Ｗ／Ｏエマルション１０にピペット１２を注入する態様を示す。この図において、ピペット１２内の酵素がＷ／Ｏエマルション内のカルセインAM１０ａと反応する。【００４７】
又、エステラーゼ酵素を注入した後のＷ／Ｏエマルションの状態を図６に示す。この図において、図６（ａ）は注入直後の状態を示し、図６（ｂ）は注入してから２４分後の状態を示す。図６（ｂ）のエマルション１０は光っており、これより、蛍光を発するカルセインへの化学反応が進行していることを蛍光顕微鏡で確認することができた。以上のように、本発明で初めて、マイクロメートルサイズの反応場においてタンパク質を変性させずに反応を制御することができた。
【実施例５】
【００４８】
反応基質及び反応剤として、実施例４と全く同様のものを用いた。
まず、実施例４と全く同様にして、カルセインAMが封入された第１のＷ／Ｏエマルションを作製した。又、カルセインAMの代わりにエステラーゼ酵素を添加したこと以外は実施例４と全く同様にして、エステラーゼ酵素が封入された第２のＷ／Ｏエマルションを作製した。【００４９】
上記第１及び第２のＷ／Ｏエマルションを、それぞれ上記鉱物油からなる油溜めに離間して載置した。次に、レーザーピンセット（Nd:YAGレーザー、SpectronのSL902T、波長は1064nm）を用い、第１及び第２のＷ／Ｏエマルションをそれぞれ把持し、両者を融合した。
図７は、第１のＷ／Ｏエマルション２０、第２のＷ／Ｏエマルション３０を油溜め４０上に離間して載置した状態を示す。【００５０】
第１及び第２のＷ／Ｏエマルションが融合した状態を図８に示す。この図において、図８（ａ）は融合前の第１のＷ／Ｏエマルション２０、第２のＷ／Ｏエマルション３０、及びレーザ−ピンセット(レーザースポット)５０を示す。図８（ｂ）は融合中の状態を示し、図８（ｃ）は融合後の状態を示す。この実施例においても、蛍光を発するカルセインへの化学反応が進行していることを蛍光顕微鏡による確認することができた。従って、本発明で初めて、マイクロメートルサイズの反応場においてタンパク質を変性させずに反応を制御することができた。
【実施例６】
【００５１】
反応基質として、タンパク質（GFP）を合成するための生体物質を用いた。この生体物質は、内容物は全２０種アミノ酸・リボソームなど遺伝子発現に必要な多数の生体物質からなる。実験では、Promega社製の「E.coli S30 Extract System for circular DNA 」のキットを用いた。
反応剤として、タンパク質（GFP）を合成する遺伝子（PromegaのE.coli S30 Extract System for circular DNA）を用いた。
鉱物油に対しアクチン溶液を加える代わりに、上記遺伝子及びアミノ酸を加えたこと以外は、実施例１と全く同様にしてＷ／Ｏエマルションを作製した。次に、Ｗ／Ｏエマルション内で遺伝子を発現させ、タンパク質（GFP）を合成させた。蛍光を発するタンパク質（GFP）が合成されたことを蛍光顕微鏡により確かめた。Ｗ／Ｏエマルション１０内でタンパク質（GFP）が蛍光を発する状態を図９に示す。図９は、エマルションを３７度で1時間放置後の蛍光顕微鏡像である。【００５２】
以上のように、実施例４〜６で用いたマイクロメートルサイズの反応場（Ｗ／Ｏエマルション）は細胞内環境に類似しているため、タンパク質を代表とする生体物質を変性させず、また反応を制御できる点でも優れている。さらに、この反応場の容量は、通常の試験管の約１兆分の１であることから、多数の実験の組み合わせによって試行錯誤を強いられる生化学実験や、各種の血液検査、製薬の製造又は効用の試験などにおいて、必要とする試薬や血液等の量が少なくて済み、低コストや患者に負担をかけない検査などに非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実施例１の懸濁液の顕微鏡写真を示す図である。
【図２】単分子膜粒子内のアクチンフィラメントの構造の顕微鏡写真を示す図である。
【図３】単分子膜粒子内のアクチンフィラメントの構造の顕微鏡写真を示す別の図である。
【図４】単分子膜粒子内のアクチンフィラメントの構造の顕微鏡写真を示すさらに別の図である。
【図５】Ｗ／Ｏエマルションにピペットを注入する態様を示す図である。
【図６】エステラーゼ酵素を注入した後のＷ／Ｏエマルションの状態を示す図である。
【図７】第１のＷ／Ｏエマルション、第２のＷ／Ｏエマルション３０をガラスプレート上に離間して載置した状態を示す図である。
【図８】第１及び第２のＷ／Ｏエマルションが融合した状態を示す図である。
【図９】Ｗ／Ｏエマルション内でタンパク質（GFP）が蛍光を発する状態を示す図である。
【符号の説明】
【００５４】
２、４、１０、２０、３０      Ｗ／Ｏエマルション（単分子膜粒子）
８                            アクチンフィラメント
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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