(57)【要約】  タンパク尿を惹起又は抑制する物質のスクリーニングや薬理効果の評価を迅速且つ安価に行えるin vitroのスクリーニング・評価方法を提供すること。  タンパク尿が惹起又は抑制される際に発現量の変化が認められる遺伝子のプロモーターと、前記プロモーターの下流側に組み込まれる分泌型レポーター遺伝子とを有することを特徴とするプラスミド、及び、これを遺伝子導入した遺伝子導入細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク尿が惹起又は抑制される際に発現量の変化が認められる遺伝子のプロモーターと、前記プロモーターの下流側に組み込まれる分泌型レポーター遺伝子とを有することを特徴とするプラスミド。
【請求項２】
タンパク尿が惹起又は抑制される際に発現量の変化が認められる遺伝子が、ネフリン遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
前記分泌型レポーター遺伝子が、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ遺伝子）であることを特徴とする請求項１又は２に記載のプラスミド。
【請求項４】
タンパク尿が惹起又は抑制される際に発現量の変化が認められる遺伝子を発現する培養細胞に、請求項１に記載のプラスミドを導入したことを特徴とする遺伝子導入細胞。
【請求項５】
ネフリン遺伝子を発現する培養細胞に、請求項２又は３に記載のプラスミドを導入したことを特徴とする遺伝子導入細胞。
【請求項６】
前記培養細胞は、培養糸球体上皮細胞であることを特徴とする請求項４又は５に記載の遺伝子導入細胞。
【請求項７】
請求項４から６のいずれかに記載の遺伝子導入細胞を用いた、タンパク尿を惹起又は抑制する物質の検出に用いることを特徴とするバイオセンサー。
【請求項８】
請求項４から６のいずれかに記載の遺伝子導入細胞を、被験物質の存在下おいて培養し、前記レポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴とするタンパク尿を惹起又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項４から６のいずれかに記載の遺伝子導入細胞を有することを特徴とするタンパク尿を惹起又は抑制する物質のスクリーニング用キット。
【請求項１０】
請求項４から６のいずれかに記載の遺伝子導入細胞を、被験薬物の存在下において培養し、前記レポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴とするタンパク尿に対する薬理効果又は副作用の評価方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の遺伝子導入細胞を、被験物質や因子の存在下において培養し、前記レポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴とする糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関与する物質や因子のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の遺伝子導入細胞を用いることを特徴とするネフリン遺伝子の発現制御，糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関わる糸球体上皮細胞内情報伝達の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク尿を惹起又は抑制する物質のスクリーニングに関する。特に、タンパク尿をきたす腎疾患での発現低下が報告されているネフリンの発現量を簡便に定量することが可能な遺伝子導入細胞を用いたスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓疾患、特に腎糸球体疾患における典型的な臨床所見の一つとしてタンパク尿があげられる。尿中へのタンパクの漏出は、血清中のタンパクレベルの低下による低タンパク血症及び低アルブミン血症を生じさせ、膠質浸透圧の低下により細胞質間や体腔に移動された体液による全身の浮腫や臓器の水腫、胸水・腹水等を招来し、血管内脱水による循環不全をきたす。また、尿腔に漏出したタンパクによる腎臓の尿細管及び間質の傷害、繊維化の進行により、腎臓機能の低下が惹起され、慢性腎不全への移行が促進されることも知られている。このため、腎臓疾患の治療においてタンパク尿の制御は重要な標的となっている。【０００３】
近年の研究により、尿中へのタンパクの漏出の制御は、糸球体基底膜の透過性と糸球体上皮細胞上に存在するスリット膜により行われていることが明らかにされてきている。特に、スリット膜を構成するタンパク質の一つであるネフリンが血中高分子の濾過制御において重要な役割を担うこと（非特許文献１）、また、タンパク尿をきたす腎臓疾患においてネフリン遺伝子の異常やネフリンの発現低下（非特許文献２，３）が認められることが報告されている。また、摂取又は投与によりタンパク尿を惹起又は抑制する薬物（化合物，天然抽出物等）についても多くの報告がなされている。【０００４】
【特許文献１】特表２００２―５０６８８３号公報
【非特許文献１】Tryggvason T., Unraveling the mechanisms of glomerular ultrafiltration: nephrin  a key component of the slit diaphragm, J Am Soc Nephrol 1999; 10: 2440-2445.
【非特許文献２】Kestila M.  Lenkkeri U.  Mannikko M et al., Positionallly cloned gene for a novel glomerular protein-nephrin-is mutated in congenital nephritic syndrome, Mol Cell 1998; 1: 575-582.
【非特許文献３】Lahdenkari AT.  Kestila AT.  Holmberg C et al., Nephrin gene (NPHS1) in patients with minimal change nephritic syndrome (MCNS), Kidney Int; 65: 1856-1863.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記薬物がどのような分子メカニズムによりタンパク尿を惹起又は抑制するか、また、前記ネフリン遺伝子及びその翻訳物が前記分子メカニズムにどのような関与を有しているかについては未だ十分には明らかにされていない。
そのため、タンパク尿の治療薬として薬理効果を有するか否かの検証・評価は、個々の薬物について動物実験による試行を重ねるしかなく、膨大な時間と費用が必要となっている。また、他の疾患治療薬として用いる薬物が副作用としてタンパク尿を惹起するか否かについても同様に動物実験を行う以外に術がない。【０００６】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、タンパク尿を惹起又は抑制する物質のスクリーニングや薬理効果の評価を迅速且つ安価に行えるin vitroのスクリーニング・評価方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、タンパク尿が惹起又は抑制される際に発現量の変化が認められる遺伝子のプロモーターと、前記プロモーターの下流側に組み込まれる分泌型レポーター遺伝子とを有することを特徴とするプラスミドを提供する。
これによれば、前記タンパク尿の惹起又は抑制の際に発現量が変化する遺伝子のプロモーターの活性化に応じて前記レポーター遺伝子が発現される。
前記タンパク尿が惹起又は抑制される際に発現量の変化が認められる遺伝子は、タンパク尿をきたす腎臓疾患において発現の低下が認められるネフリン遺伝子であるものが好適であり、さらに、前記分泌型レポーター遺伝子は、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ遺伝子）であるものが好適である。【０００８】
本発明は、タンパク尿が惹起又は抑制される際に発現量の変化が認められる遺伝子を発現する培養細胞に、上記プラスミドを導入したことを特徴とする遺伝子導入細胞を提供する。
これによれば、発現されたレポータータンパクは培養細胞の外側に分泌されるから、培養細胞を破砕・抽出することなく前記レポーター遺伝子の発現量を測定できる。
前記培養細胞は、ネフリン遺伝子を発現する培養細胞が好適であり、特に、タンパクの漏出の制御に重要な役割を担う培養糸球体上皮細胞であるものが好適である。【０００９】
本発明は、上記遺伝子導入細胞を有し、レポーター遺伝子の発現量の変化を検出することを特徴とするバイオセンサーを提供する。
これによれば、遺伝子導入細胞に被験物質を添加することにより、タンパク尿を惹起する物質か否か、又は、惹起する物質を含有しているか否かを検出できる。【００１０】
本発明は、上記遺伝子導入細胞を、被験物質の存在下において培養し、前記レポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴とするタンパク尿を惹起又は抑制する物質のスクリーニング方法、これに用いられるスクリーニング用キットを提供する。
これによれば、前記被験物質を遺伝子導入細胞に添加し所定時間培養した後、培養上清中のレポータータンパクの量を測定することにより、前記被験物質がタンパク尿を惹起又は抑制するかどうかをスクリーニングできる。【００１１】
本発明は、上記遺伝子導入細胞を、被験薬物の存在下において培養し、前記レポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴とするタンパク尿に対する薬理効果又は副作用の評価方法を提供する。
これによれば、被験薬物を遺伝子導入細胞に添加し所定時間培養した後、培養上清中のレポータータンパクの量を測定することにより、被験薬物のタンパク尿に対する薬理効果、副作用としてタンパク尿を惹起するかどうかを評価できる。【００１２】
本発明は、ネフリン遺伝子を発現する上記遺伝子導入細胞を、被験物質や因子の存在下において培養し、前記ネフリン遺伝子の発現量を測定することを特徴とする糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関与する物質や因子のスクリーニング方法を提供する。
これによれば、被験物質や因子を遺伝子導入細胞に添加し所定時間培養した後、培養上清中のレポータータンパクの量を測定することにより、被験物質や因子が糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関与するかどうかをスクリーニングできる。【００１３】
本発明は、ネフリン遺伝子を発現する上記遺伝子導入細胞を用いることを特徴とするネフリン遺伝子の発現制御，糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関わる糸球体上皮細胞内情報伝達の解析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、遺伝子導入細胞を被験物質・薬物存在下で培養後、培養上清中のレポータータンパクの発現量を測定するin  vitroの簡便な手技により、迅速且つ安価にタンパク尿の惹起又は抑制に関与する物質のスクリーニング、タンパク尿に対する薬物の薬理効果又は副作用の評価をすることができる。【００１５】
本発明は、投薬治療による治癒が困難とされるネフローゼ症候群をはじめとする腎臓疾患に有用な治療薬の探索・開発、タンパク尿が惹起される分子メカニズム等の解析のツールとして優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】(a)本発明の実施の形態にかかる組換えプラスミドp5N-SEAP及びp8N-SEAPの構造を示す説明図である。(b)組換えプラスミドが導入されたＮｅＰｏ５Ｎ５細胞のＳＥＡＰ活性を示すグラフである。(c)ＡＴＲＡ刺激により発現したmRNAを鋳型とするＰＣＲ産物を確認するための電気泳動結果を示す写真である。
【図２】ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞のＳＥＡＰ活性のＡＴＲＡ濃度依存性を示すグラフである。
【図３】ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞のＳＥＡＰ活性のＡＴＲＡ刺激後の培養時間依存性を示すグラフである。
【図４】他のＮｅＰｏ細胞のＳＥＡＰ活性を示すグラフである。
【図５】ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞に種々の被験物質を添加した場合のＳＥＡＰ活性を示すグラフである。
【図６】ＮｅＰｏ細胞のＳＥＡＰ活性のビタミンＤ３濃度依存性を示すグラフである。
【図７】ＮｅＰｏ細胞のＳＥＡＰ活性のデキサメサゾン濃度依存性を示すグラフである。
【符号の説明】
【００１７】
１  組換えプラスミド（p5N-SEAP，p8N-SEAP） 
２  ネフリンプロモーター
３  ＳＥＡＰ遺伝子
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明の実施の形態について添付図面を参照しながら説明する。
本発明の実施の形態においては、タンパク尿が惹起又は抑制される際に発現量の変化が認められる遺伝子として、タンパク尿をきたす腎臓疾患において発現量の低下がみられるネフリン遺伝子に着目し、ネフリン遺伝子の発現を制御するプロモーター遺伝子と、その下流側に接続した分泌型レポーター遺伝子としてのアルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ遺伝子）とからなるレポーター遺伝子を用いている。【００１９】
ここで、前記プロモーターは、前記レポーター遺伝子の発現を誘導可能な配列を有していればよく、プロモーター全配列を含むものだけでなく前記プロモーターの一部の配列を含むものであってもよい。【００２０】
培養細胞への導入に適切な発現ベクターを制限酵素で切断後、前記ネフリンプロモーター，アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ遺伝子）を挿入することにより、ネフリンプロモーターの活性化によりアルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ遺伝子）を発現させる組換えプラスミドを構築することができる。このとき、前記ネフリンプロモーター及びアルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ遺伝子）が接続されたレポーター遺伝子を発現ベクターに組み込んで組換えプラスミドを構築する方法のほか、前記ネフリンプロモーター又はアルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ遺伝子）の一方が組み込まれた組換えプラスミドに、他方の遺伝子を組み込んで構築する方法もある。【００２１】
構築されたプラスミドを、ほ乳類などの動物細胞に導入することにより、ネフリンプロモーターの活性化に応じてアルカリホスファターゼを産出し、培養液中に分泌する遺伝子導入細胞（形質転換体）を樹立することができる。遺伝子導入は、リン酸カルシウム法やリポフェクション法などの遺伝子導入に用いられる一般的な方法により行うことができる。前記遺伝子導入細胞においては、ネフリン遺伝子の発現を誘導する物質を、培養液中に分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現として定量的に検出することができる。【００２２】
これによれば、ネフリンプロモーターの下流にレポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどが組み込まれた遺伝子導入細胞の場合とは異なり、ネフリン遺伝子が組み込まれた組換えプラスミドが導入された上記遺伝子導入細胞を用いて、細胞を破壊してタンパクを抽出することなく、前記ネフリン遺伝子の発現誘導に関与する物質のスクリーニングを行うことができる。【００２３】
以下に、プラスミドの構築、遺伝子導入細胞の樹立及びこれを用いたスクリーニング方法などについて実施例を示すが、本発明の実施の形態はこれらに限られるものではない。【００２４】
［実施例１］
プラスミドの構築
図１(a)に、プラスミドp5N-SEAP及びp8N-SEAP (1)の構造図を示している。
レポーター遺伝子として機能する分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ遺伝子）(3)が組み込まれた組換えプラスミドpSEAP-Basic2（BD Biosciences社）を、前記ＳＥＡＰ遺伝子の上流に位置するマルチクローニングサイト（MCS）の制限酵素サイト：Xho1において切断した後、ネフリン遺伝子の上流５.４ kbからなるネフリンプロモーター５Ｎ(2)を挿入して組換えプラスミドp5N-SEAP(1)を構築した。
同様に、前記組換えプラスミドpSEAP-Basic2（BD Biosciences社）にネフリン遺伝子の上流８.３ kbからなるネフリンプロモーター８Ｎ(2)を挿入することで組換えプラスミドp8N-SEAP(1)を構築した。【００２５】
［実施例２］
１．遺伝子導入細胞の樹立
上記組換えプラスミドp5N-SEAP(1)：４μgを、ネオマイシン耐性遺伝子を恒常的に発現させるプラスミドpcDNA3.1（Invitrogen社）：０.４μgと共に、温度感受性SV40 large T 抗原 により不死化した培養マウス糸球体上皮細胞（Dr. Karlhans Endlichより供与）に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen社) ：６μlを用いてリポフェクション法により遺伝子導入した。【００２６】
また、前記組換えプラスミドp8N-SEAP(1)についても、同様にして、前記培養マウス糸球体上皮細胞に遺伝子導入を行った。
遺伝子導入後、ネオマイシン(G418：150μg/ml)を添加した培養条件下において増殖させることにより、安定的な遺伝子導入細胞株：ＮｅＰｏ（nephrin reporting podocyte）を樹立した。【００２７】
２．ＮｅＰｏ細胞の応答性の検証
ネフリンプロモーターは、培養ヒト子宮頸癌由来細胞（HeLa細胞）において、オール・トランス・レチノイン酸（all-trans-retinoic acid：ＡＴＲＡ）により活性化されることが知られている。これを利用して、上記方法により樹立されたＮｅＰｏ細胞の応答性について検証を行った。【００２８】
ＮｅＰｏ細胞を、Ｉ型コラーゲンにてコートした９６穴 培養プレートに播種し（1x104 cells/100μl）、インターフェロンγ（IFNγ）非存在下において４８時間培養した後、１０μMのＡＴＲＡ（１%牛胎児血清存在下）により刺激し、更に、２４時間培養した。ＮｅＰｏ細胞の培養上清を採取し、ＳＥＡＰ活性の測定を行った。
ＳＥＡＰ活性の測定は、Great EscAPe SEAP測定キット（BD Bioscience社）及びルミノメーターを用いて行った。その結果、ＡＴＲＡへの応答性が認められたＮｅＰｏ細胞を選択した。【００２９】
ＡＴＲＡへの応答性が確認されたＮｅＰｏ５Ｎ５細胞（組換えプラスミドp5N-SEAPが導入されたＮｅＰｏ細胞クローンのNo.5）のＳＥＡＰ活性の測定結果を図１(b)に示している。
前記ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞は、ＡＴＲＡによる刺激のない状態（コントロール）においても恒常的なＳＥＡＰ活性（20,000RLU）が認められ、組換えプラスミド導入前の糸球体上皮細胞の形質を保持していることが確認された。また、この細胞を１０μMのＡＴＲＡで刺激することにより、ＳＥＡＰ活性は２.３倍（46,000RLU）に上昇した。【００３０】
これにより、樹立されたＮｅＰｏ５Ｎ５細胞において、ネフリンプロモーターの活性化によりＳＥＡＰ遺伝子の発現が誘導されることが検証された。【００３１】
３．ＳＥＡＰ活性とネフリン遺伝子発現との相関関係の検証
次に、前記ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞のＡＴＲＡ刺激によるＳＥＡＰ活性とネフリン遺伝子の発現との相関関係を検証するために、ＲＴ−ＰＣＲ法によりネフリンmRNAの発現を確認した。
前記ＮｅＰｏＮ５Ｎ細胞を、６穴培養プレートに播種し（1x105cells/100μl）、ＡＴＲＡにより２４時間刺激した後、Trisol（Invitrogen社）を用いてtotal RNAを抽出し、これを鋳型としてOmniscript RT kit（Qiagen社）を用いて逆転写反応を行った。【００３２】
逆転写用プライマーとして、ネフリンプライマーＦ：5’-CCCCAACATCGACTTCACTT-3'及びネフリンプライマーＲ: 5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'（Operon社）を用いて、PCRを行った結果、ＰＣＲ産物として全長343bpのＤＮＡ断片が得られた。
また、コントロールとして、glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase：ＧＡＰＤＨプライマーＦ: 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'及びＧＡＰＤＨプライマーＲ：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'を用いてPCRを行った結果、ＰＣＲ産物として全長452 bpのＤＮＡ断片が得られた。上記PCR反応は、いずれも、94℃・30秒→57℃・30 秒→72℃・30秒を１サイクルとし、計２５サイクル行った。【００３３】
図１(c)は、PCR法により得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示している。
ＡＴＲＡ(+)(-)レーンを比較すると、ＡＴＲＡにより刺激された(+)レーンにおいてネフリンmRNAの発現が増強していることが確認できる。また、ＳＥＡＰ活性の測定結果と同様に、ＡＴＲＡによる刺激のない状態（コントロール）においても恒常的なネフリン遺伝子の発現が認められた。
これにより、ＮｅＰｏＮ５Ｎ細胞において、ＳＥＡＰ活性とネフリン遺伝子の発現増加とが相関関係を有することが確認された。【００３４】
４．ＮｅＰｏ細胞のＳＥＡＰ活性のＡＴＲＡ濃度・培養時間依存性
図２は、ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞におけるＡＴＲＡ濃度依存的なＳＥＡＰ活性の変化を示している。
刺激するＡＴＲＡの濃度上昇に伴い、ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞のＳＥＡＰ活性が増加していることが確認できる。これにより、ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞において、ＡＴＲＡの濃度に依存してネフリン遺伝子の発現が増強されていることがわかる。【００３５】
図３は、ＡＴＲＡにより刺激した後のＮｅＰｏ５Ｎ５細胞の培養時間とＳＥＡＰ活性の変化を示している。
ＡＴＲＡ刺激によるＮｅＰｏ５Ｎ５細胞のＳＥＡＰ活性の増加は、ＡＴＲＡ刺激後、４時間培養した時点において明らかな有意差が生じていること、また、ＡＴＲＡ刺激後、ＳＥＡＰ活性の増加が少なくとも４８時間は持続することが確認できる。これにより、ＮｅＰｏ細胞に導入されたネフリンプロモーターはＡＴＲＡ刺激により短時間で活性化されると共に、活性化が長時間にわたって持続されることが確認された。【００３６】
図４は、上記ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞と共に樹立されたＮｅＰｏ５Ｎ１７細胞（組換えプラスミドp5N-SEAPが導入されたＮｅＰｏ細胞クローンのNo.17）及びＮｅＰｏ８Ｎ２細胞（組換えプラスミドp8N-SEAPが導入されたＮｅＰｏ細胞クローンのNo.2）における、ＡＴＲＡ刺激によるＳＥＡＰ活性の変化を示している。
前述のＮｅＰｏ５Ｎ５細胞の場合と同じ手法で培養し、ＡＴＲＡによる刺激後、ＳＥＡＰ活性の測定を行った結果、前記ＮｅＰｏ５Ｎ１７細胞及びＮｅＰｏ８Ｎ２細胞についても、前述のＮｅＰｏＮ５Ｎ細胞と同様のＡＴＲＡへの応答性を有することが確認された。【００３７】
［実施例３］
タンパク尿を惹起又は抑制する物質のスクリーニング
上記手順により樹立された遺伝子導入細胞：ＮｅＰｏ細胞をバイオセンサーとして用いて、タンパク尿を惹起又は抑制する物質をスクリーニングする方法について説明する。
従来の研究からタンパク尿の抑制又は惹起に関与する可能性があると考えられる下記の被験物質（薬剤及び生理活性物質など）についてスクリーニングを行った。【００３８】
ＮｅＰｏ５Ｎ５細胞をＩ型コラーゲンにてコートした９６穴 培養プレートに播種し（1x104 cells/100μl）、インターフェロンγ（IFNγ）非存在下において４８時間培養した後、被験物質（１％牛胎児血清存在下）を添加した。更に、２４時間培養した後、培養上清を採取し、ＳＥＡＰ活性を測定した。
コントロールとして一切の刺激を与えないＮｅＰｏ５Ｎ５細胞を用いると共に、ポジティブコントロールとして添加によりＳＥＡＰ活性が増加することが確認されているＡＴＲＡを用いた。【００３９】
上記被験物質としては、（1) ＡＴＲＡ：１μＭ，(2)ＡＴＲＡ：１０μＭ，(3)デキサメサゾン：０.１μＭ，(4) デキサメサゾン：１μＭ，(5)活性型ビタミンＤ３：１０-８Ｍ，(6) 活性型ビタミンＤ３：１０-７Ｍ，(7)ヘパリン：１０Ｕ/ｍｌ，(8)インドメタシン：５０μＭ，(9) インドメタシン：１００μＭ，(10)リスベラトロール：２５μＭ，(11)リスベラトロール：５０μＭ，(12)ホルボールエステル：１０ｎＭ，(13)ホルボールエステル：５０ｎＭ，(14)インターロイキン-１β（IL-1β）：１０ｎｇ/ｍｌ，(15)インターロイキン-１β（IL-1β）：２０ｎｇ/ｍｌ，(16) 腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor-α；TNFα）：２５０Ｕ/ｍｌ，(17)フォルスコリン：１０μＭ，(18) 血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor；VEGF）;１/５００，(19) 肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor;HGF）:５０ｎｇ/ｍｌ，(20) 肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor;HGF）: １００ｎｇ/ｍｌ，(21)マニトール：１９.５ｍＭ，(22)高糖（high glucose concentration；HG）：４５０ｍｇ/ｄｌ，(23) 牛胎児血清（fetal bovine serum；FBS）：１０％を添加した。【００４０】
図５は、上記被験物質を添加した場合のＳＥＡＰ活性の変化を示している。
デキサメサゾン，活性型ビタミンＤ３を添加したＮｅＰｏ５Ｎ５細胞において、ポジティブコントロールであるＡＲＴＡと同様に、有意なＳＥＡＰ活性の増加が認められた。一方、インターロイキン-１β（IL-1β），腫瘍壊死因子（TNFα）等の炎症刺激や肝細胞増殖因子（HGF）等の増殖刺激を与える物質を添加したＮｅＰｏ５Ｎ５細胞において、ＳＥＡＰ活性の有意な低下が認められた。【００４１】
これにより、デキサメサゾン，活性型ビタミンＤ３等はネフリン遺伝子の発現増加を介してタンパク尿を抑制する効果を有する可能性が示唆されると共に、インターロイキン-１β（IL-1β），腫瘍壊死因子（TNFα），肝細胞増殖因子（HGF）等の炎症関連の刺激がネフリン遺伝子の発現を低下させ、結果としてタンパク尿を惹起・誘導する可能性が示唆される。
実際に、炎症性サイトカインが関与する糸球体腎炎においてタンパク尿が惹起されること、また、ある種の糸球体疾患において、ステロイド剤がタンパク尿を抑制する効果を有することは広く知られており、本発明に係るスクリーニング方法による結果と合致している。【００４２】
図６及び図７は、活性型ビタミンＤ３及びデキサメサゾンの濃度によるＮｅＰｏ細胞のＳＥＡＰ活性の変化を示している。
前述のＡＴＲＡ刺激の場合と同様に、活性型ビタミンＤ３及びデキサメサゾンの濃度の上昇に比例して、ＮｅＰｏＮ５Ｎ細胞のＳＥＡＰ活性が増加することが確認できる。ここでは図示しないが、ＲＴ―ＰＣＲ法により前記ＳＥＡＰ活性とネフリン遺伝子の発現とが相関関係を有していることも確認されている。【００４３】
本実施例のスクリーニングにおいては、被験物質による刺激後、２４時間培養した後に活性測定を行っているが、図３に示されるように、培養４時間後にコントロールに対して約２倍の有意差が生じていることから、短時間で結果を得ることも可能である。また、活性測定のために細胞を破砕する必要がなく、経時的に培養上清を採取して活性の測定ができることから、被験物質によるＳＥＡＰ活性の経時変化について信頼できるデータを取得することができる。【００４４】
このように、本発明のスクリーニング方法によれば、遺伝子導入細胞であるＮｅＰｏ細胞を被験物質存在下で所定時間培養させた後、培養上清を採取し、ＳＥＡＰ活性を測定するin vitroの簡便な手技により、一度に大量の被験物質について、迅速且つ安価に、タンパク尿の惹起又は抑制に関与するか否かのスクリーニングを行うことができる。そのため、ネフローゼ症候群をはじめとするタンパク尿をきたす糸球体疾患の治療薬の開発に有用である。【００４５】
［実施例４］
タンパク尿の治療に対する薬理効果・副作用の評価
タンパク尿をきたす腎臓疾患に対する治療薬の開発において、個体に投与した際の薬理効果・副作用についての予見を得ることは、治験を行う上で極めて有用且つ重要である。【００４６】
本発明のＮｅＰｏ細胞を用いることにより、治験開始前に、治療薬をＮｅＰｏ細胞に添加後、培養し、ＳＥＡＰ活性を測定することにより、in vitroにおいてタンパク尿に対する薬理効果・副作用の有無についての評価を得ることができる。また、同様にして、他の疾患の治療薬として投与される薬物が副作用としてタンパク尿を惹起するか否かについても評価することができる。
これにより、in vivoにおいてタンパク尿を惹起する可能性があるかどうかをin vitroにおける評価に基づいて予見することができるから、より的確な治験を行うことができる。【００４７】
［実施例５］
糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関与する物質や因子のスクリーニング
ネフリンは、糸球体足突起間に形成されるスリット膜の主要構成要素であると共に、糸球体上皮細胞の分化マーカーとして知られている。
従って、実施例３において前述した方法と同様に、ＮｅＰｏ細胞に糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関与する可能性がある物質や因子などを添加、培養し、ＳＥＡＰ活性を測定することにより、糸球体上皮細胞の分化を誘導する物質、あるいは、脱分化を惹起する物質を同定することが可能である。【００４８】
例えば、図５に示されたスクリーニング結果から、レチノイン酸，ステロイドホルモン，ビタミンＤなどの生体の恒常性維持に必要とされる物質が、糸球体上皮細胞の内因性分化因子としての役割を担っていることが示唆され、また、炎症時にのみ局所的に産生されるインターロイキン−１β（IL-１β）、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor-α；TNFα）などの炎症性サイトカインが糸球体上皮細胞の脱分化因子として作用することが示唆される。【００４９】
本発明のＮｅＰｏ細胞を種々の物質に曝露させ、培養上清中のＳＥＡＰ活性を測定することにより、ネフリン遺伝子の発現の惹起又は抑制に関与する物質や因子を簡便にスクリーニングすることができる。【００５０】
［実施例６］
ネフリン遺伝子の発現制御，糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関与する糸球体上皮細胞内情報伝達の解析
様々な細胞機能や細胞動態を制御する細胞内のシグナル経路の代表として、プロテインキナーゼＡ，プロテインキナーゼＣを介した情報伝達経路が挙げられる。【００５１】
図５に示されたスクリーニングの結果において、前記プロテインキナーゼＡを活性化するフォルスコリン，プロテインキナーゼＣを活性化するホルボールエステルは、いずれもネフリンプロモーターの活性を抑制している。これより、ネフリン遺伝子の発現及び糸球体上皮細胞の分化が、前記プロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣを介した情報伝達経路により負の制御を受けていることが示唆される。【００５２】
このように、各種細胞内情報伝達系を特異的に刺激又は阻害する物質や因子をＮｅＰｏ細胞に添加し、培養上清中のＳＥＡＰ活性を測定することにより、ネフリン遺伝子の発現や、糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関与する細胞内分子，細胞内情報伝達経路を容易に解明することが可能である。【００５３】
以上のことから、本発明のＮｅＰｏ細胞は、ネフリン遺伝子の発現制御や糸球体上皮細胞の分化又は脱分化に関わる細胞内メカニズム、また、糸球体上皮細胞の生物学的な特性等の解析を行う上においても、有用な解析ツールとして利用することができる。【００５４】
本明細書は、２００５年７月１４日出願の特願２００５−２０６０１８に基づく。この内容はすべてここに含めておく。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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