【手続補正書】
【提出日】平成20年3月17日(2008.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
例えばアトピー性疾患に関するアレルギー性応答は、ヒトのＩｇＥと高い親和性を有する受容体ＦｃεＲＩとの相互作用を伴う。ＦｃεＲＩは、例えば肥満細胞や好塩基球の表面に発現する。ＦｃεＲＩは、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの１つであり、ヒトのＩｇＥに高い親和性を持って結合する（ＫＤ＝１０−１０Ｍ）。ＦｃεＲＩは、例えば肥満細胞および好塩基球中の四量体のマルチ−サブユニット複合体（αβγ２）、または単球、好酸球、ランゲルハンス細胞、および樹状細胞上の三量体の複合体（αγ２）の何れかとして発現し得る。ＦＣεＲＩα−サブユニットは、高い親和性を有するＩｇＥ結合部位を完全に含む２つのＩｇ様ドメイン、すなわちα１遠位膜、およびα２隣接膜を含む、細胞外領域ｅｃＦｃεＲＩαを有する複合膜たんぱく質である。ＦｃεＲＩ結合ＩｇＥのアレルゲン交差結合は、受容体凝集を起こし、次に細胞の活性化は、例えばヒスタミンなどの前もって形成された、またはロイコトリエンなどのように、新規に作られた血管作用性でかつ気管支収縮性メディエーターの放出を引き起こす。これらの物質は、細胞の活性化、例えばタイプＩ即時過敏性の臨床的な症候を引き起こす。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明によると、ペプチドのアミノ酸配列ＰＲＥＫＹは、例えばスクリーニングアッセイにおいて標的分子として、ＦｃεＲＩαを介して誘発された細胞の活性化を妨げるリガンドの同定方法に用いられ得る。アミノ酸配列ＰＲＥＫＹに結合する化合物（リガンド）は、ｍＡｂ ５Ｈ５Ｆ８と相同性があり、ＩｇＥ過敏性のヒトの末梢血白血球から、アレルゲン誘発性スルフィドロイコトリエンが放出されるのを阻害し得る。結果として、同定された化合物は、ＦｃεＲＩαが結合したヒトのＩｇＥの交差結合後の、細胞活性化の原因である、シグナル伝達カスケードを妨げ得る。例えば、薬学的に許容され得る賦形剤、担体、または希釈剤を組み合わせた、該リガンドの有効量を含む医薬組成物の形態などでの、該スクリーニングアッセイによって同定された化合物は、従って、例えばアトピー性疾患に関するアレルギー性応答に伴う、肥満細胞／好塩基球の活性化を阻害するのに有用で有り得る。従って、本発明によって同定されたリガンドは、アレルギー性喘息（ＡＡ）、アレルギー性鼻炎（ＡＲ）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、および慢性蕁麻疹（ＣＵ）のような、ＩｇＥまたはＦｃεＲＩに向けられた自己抗体が介在するアトピー性疾患の処置において有用であり得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
上記の方法またはスクリーニングアッセイによって同定したリガンドは、
−ＩｇＥ過敏性のヒトの末梢血白血球からの、アレルゲン誘発性のスルフィドロイコトリエンの放出を阻害する；
−ヒトのＩｇＥに結合したＦｃεＲＩαの交差結合後の、細胞の活性化の原因である、シグナル伝達カスケードを妨げる；
−肥満細胞／好塩基球の活性化を阻害する；
−アレルギー性喘息（ＡＡ）、アレルギー性鼻炎（ＡＲ）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、慢性蕁麻疹（ＣＵ）のような、ＩｇＥまたはＦｃεＲＩαに向けられた自己抗体が介在する、アトピー性疾患の処置；
に有用であり得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
下記の実施例は、本発明を例示するものである。全ての温度は摂氏である。
実施例１
ヒトの末梢血白血球（ｈＰＢＬ）の単離と、スルフィドロイコトリエン（ｓＬＴ）の定量は、ＣＡＳＴ−ＥＬＩＳＡ（Buehlmann Laboratories AG, Allschwil, Switzerland）を用いて、プロトコルで示された濃度の、ｍＡｂ ６Ｆ９Ｇ９と、ｍＡｂ ５Ｈ５Ｆ８と、ポリクローナル（ｐｃ.）血清ｐｃ.ａ−ｈｕＩｇＥと、ｐｃ．ａ−ＦｃεＲＩαで、製造者のプロトコルに従って行う。ＪＷ８を示して、かつマウスのＶＨ鎖とヒトのＣε鎖とハプテンに特異的な４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチルを含む、ヒトのキメラのＩｇＥ（形質転換 ＪＷ８／５／１３；ECACC, Porton Down, UK, ref. No. 87080706）を、過敏化するために用いる。ＪＷ８のＩｇＥ過敏性ｈＰＢＬからのｓＬＴの放出は、牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）が結合したＮＩＰ（ＮＩＰ−ＢＳＡで示される）で誘発させた後、細胞の上清で測定される。ＰＢＬは、デキストラン溶液（７５０μｌ）を加え、２５℃で９０分間インキュベートした後、全血液（３ｍｌ）から単離する。上相の１４００μｌを沈殿させ、細胞のペレットを８５０μｌの刺激緩衝液中で再度懸濁する。得られた２００μｌの細胞懸濁液を、それぞれ１．２５μｇのＪＷ８ ＩｇＥ、または１．２５μｇのｍＡｂ ６Ｆ９Ｇ９、または１．２５μｇのｍＡｂ ５Ｈ５Ｆ８の何れか（各々は、刺激緩衝液（CAST-ELISA kit component）を含むインターロイキン−３を含む）を含むチューブに加える。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
感作は、２５分間穏やかに攪拌した後、３７℃で５０分間行う。ＪＷ８の感作細胞は、１００ｎｇ／ｍｌのＮＩＰ−ＢＳＡで、４０分間３７℃で誘発される。放出されたｓＬＴは、一定量のｓＬＴでラベルしたアルカリ性ホスファターゼ（ｓＬＴ−ＡＰ）を用いて、競合ＥＬＩＳＡによって定量した。最後のインキュベーションの後、試料を簡単に遠心分離し（１０００ｇ）、等分した上清２０
０μｌを、ｓＬＴ−ＡＰ溶液とＥＬＩＳＡ緩衝液の１：１の混合液２００μｌと混合する。抗−マウスＩｇＧで前もってコートしたミクロタイタープレートを、５０μｌのマウスの抗−ｓＬＴ ｍＡｂ（キットの構成要素）と共に、２５℃で２時間インキュベートする。ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ Ｋ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．５）で２回洗浄し、試料を含む１９５μｌのｓＬＴを二列(duplicate)に加え、２５℃で９０分間インキュベートする。ウェルを３００μｌのＰＢＳで二回洗浄し、ｐ−ジニトロフェニルリン酸塩基質で、２５℃で４０分間発色する。４０５ｎｍでＯＤを測定し、ＣＡＳＴ−ＥＬＩＳＡ評価プロトコルに従って、分泌されたｓＬＴの量を測定する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
結果は、図４に示す。図４において、ＮＩＴＶＩを用いて得られた値は、記号−●−によって示し、ＥＳＥＰＬＮＩＴＶＩＫＡＰＲＥを用いて得られた値は、記号−〇−によって示し、ＥＳＥＰＬＮＩＴＶＩＫＡＰＲＥＫＹＷＬを用いて得られた値は、記号−Ｘ−によって示し、ＮＩＴＶＩＫＡＰＲＥＫＹを用いて得られた値は、記号−■−によって示し、ＫＡＰＲＥＫＹＷＬを用いて得られた値は、記号−□−によって示し、ＰＲＥＫＹを用いて得られた値は、記号−▲−によって示す。図４において示されたＯ．Ｄは、ペプチドがないウェルに結合したバックグラウンドを引くことによって補正しており、かつ２個の平均値で表している。図４から、５Ｈ５Ｆ８は、ＰＲＥＫＹおよびＰＲＥＫＹを含むペプチド（またはたんぱく質）に結合する（そして、ＰＲＥＫＹを含まないペプチドの場合は結合しない）ことが明らかである。