(57)【要約】  本発明は、アルコール脱水素酵素CpSADH、アルコール脱水素酵素ReSADH、カルボニル還元酵素ScoPAR、(2S,3S)-ブタンジオール脱水素酵素ZraSBDH、カルボニル還元酵素ScGCY1、トロピノン還元酵素HnTR1、トロピノン還元酵素DsTR1、もしくはアルコール脱水素酵素BstADHTのいずれかの酵素、該酵素を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを製造する方法を提供する。本発明はまた、アルコール脱水素酵素PfODH、該酵素を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールの製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）
【化１】
2007142210.tif 000020
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、式（２）
【化２】
2007142210.tif 000021
で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールの製造方法；
（ａ）配列番号：1〜8のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される (S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：1〜8のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）
【化３】
2007142210.tif 000022
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、式（３）
【化４】
2007142210.tif 000023
で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールの製造方法；
（ａ）配列番号：17に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：17に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質に対応する補酵素、および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を再生する活性を有する脱水素酵素を同時に発現する形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）
【化５】
2007142210.tif 000024
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、
式（２）
【化６】
2007142210.tif 000025
で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールの製造方法；
（ａ）配列番号：1〜8のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される (S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：1〜8のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質に対応する補酵素、および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を再生する活性を有する脱水素酵素を同時に発現する形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）
【化７】
2007142210.tif 000026
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、
式（３）
【化８】
2007142210.tif 000027
で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールの製造方法；
（ａ）配列番号：17に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：17に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を再生する活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵素またはギ酸脱水素酵素である、請求項3又は4に記載の方法。
【請求項６】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を、pH 5.0〜6.4の範囲において、式（１）
【化９】
2007142210.tif 000028
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させ、
式（２）
【化１０】
2007142210.tif 000029
で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを安定して光学純度99.5% e.e.以上で製造する方法；
（ａ）配列番号：1に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：1に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種医薬品、液晶材料などの光学活性原料として有用な光学活性含フッ素化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール、及び
【化１１】
2007142210.tif 000002
下記式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール
【化１２】
2007142210.tif 000003
を製造する方法として、以下<１>〜<４>に記載の方法などが知られている。
<１>
式（１）
【化１３】
2007142210.tif 000004
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンをパン酵母によって不斉還元する方法（非特許文献１）。
<２>
式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを不斉ボラン還元剤であるDIP-Clによって不斉還元する方法（非特許文献２）。
<３>
1,1,1-トリフルオロ-3-ブロモアセトンを不斉ボラン還元剤であるDIP-Clによって不斉還元した後、塩基によって光学活性エポキシドを生成させ、更にヒドリドで開環して光学活性アルコールを得る方法（非特許文献３）。
<４>
式（２）及び式（３）で示されるアルコールのラセミ体混合物のエステルをリパーゼによる加水分解反応で速度論的光学分割を行い、光学活性アルコールを得る方法（非特許文献４）。【０００３】
しかし、<１>、<２>、<４>に記載の方法はいずれも光学純度が低い、<１>に記載の方法は基質濃度が0.3％と非常に低いにもかかわらず、触媒となるパン酵母を、溶媒である水の18％、副原料のグルコースを21％と基質に比べて大量に使用するためきわめて効率が悪い、<２>、<３>に記載の方法は高価な還元剤が必要、<３>に記載の方法は工程が複雑、<４>に記載の方法は理論収率が50%に満たないなど、いずれも工業的製造方法としては問題がある。【０００４】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Synthesis, 897-899 (1983).
【非特許文献２】Tetrahedron, 49 (9), 1725-1738 (1993).
【非特許文献３】J. Org. Chem., 60 (1), 41-46 (1995).
【非特許文献４】Chem. Lett., 855-856 (1996).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、式（２）及び式（３）で表される光学活性アルコールの新たな製造を提供することである。より具体的には、式（２）及び式（３）で表される光学活性アルコールを、収率良く、かつ高純度で製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、理論収率が50％に満たない分割手法ではなく、原料を100％利用可能なケトンを、立体選択性の高い酵素を用いた不斉還元反応により還元し、高い光学純度の光学活性アルコールを製造する方法を検討した。【０００７】
本発明者らは、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトン（以下TFACと略す）を基質として様々なカルボニルを不斉還元する酵素を用い、式（２）又は式（３）に示される光学活性1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール（以下TFIPと略す）の合成方法を検討した。その結果本発明者らは、
キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来のアルコール脱水素酵素CpSADH（配列番号：9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、
ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）由来のアルコール脱水素酵素ReSADH（配列番号：10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、
ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）由来のカルボニル還元酵素ScoPAR（配列番号：11に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、
ズーグレア・ラミゲラ（Zoogloea ramigera）由来の(2S, 3S)-ブタンジオール脱水素酵素ZraSBDH（配列番号：12に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のカルボニル還元酵素ScGCY1（配列番号：13に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、
ヒヨスチアムス・ニガー（Hyoscyamus niger）由来のトロピノン還元酵素HnTR1（配列番号：14に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、
ダツラ・ストラモニウム（Datura stramonium）由来のトロピノン還元酵素DsTR1（配列番号：15に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、
ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来のアルコール脱水素酵素BstADHT（配列番号：16に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、
がいずれも、(S)-TFIPを90%e.e.以上の極めて高い立体選択性で生成することを見出すことに成功した。また本発明者らは、
ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）由来のアルコール脱水素酵素PfODH（配列番号：18に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、
が(R)-TFIPを95%e.e.以上の極めて高い立体選択性で生成することを見出すことに成功した。【０００８】
CpSADH（特許第3574682号）は4-ヒドロキシ-2-ブタノンを不斉還元して(S)-1,3-ブタンジオールを、
ReSADH（Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 380-386 (2003).）、ScoPAR（特開2005-95022）は2-オクタノンを不斉還元して(S)-2-オクタノールを、
ZraSBDH（特開2004-357639）は2,3-ブタンジオンを不斉還元して(2S, 3S)-ブタンジオールを、
ScGCY1（FEBS Lett., 238, 123-128, (1988).）はアセト酢酸エチルを不斉還元して(S)-ヒドロキシブタン酸エチルを、
HnTR1、DsTR1（いずれも特開2003-230398）はトロピノンを不斉還元してトロピンを、
BstADHT（FEBS Lett., 33, 1-3, (1973).）はアセトアルデヒドを還元してエタノールを、
PfODH（WO01-061014）は2-オクタノンを不斉還元して(R)-2-オクタノールを
生成することが知られていた。しかしながら、これらの酵素がTFACに対して活性を有するか否か、活性を有する場合どの程度の立体選択性を持って還元するか、（S）型、(R)型いずれの立体を生成するかは予測不可能であった。そのため、90%e.e.以上の高い選択性で(S)-TFIPまたは(R)-TFIPを生成することを見出したことは驚くべき結果であった。【０００９】
例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来アルコール脱水素酵素ScADH1、ScADH2（Arch. Biochem. Biophys., 126, 933-944 (1968).）やサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来カルボニル還元酵素ScGRE3（J. Org. Chem., 63, 4996-5000, (1998).）は、様々なケトンの酵素を作用させた場合、得られた(S)-TFIPの光学純度はそれぞれ82.3%e.e.、58.0%e.e.、69.6%e.e.であった。【００１０】
本発明はこのような事情を鑑みてなされたものであり、以下〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
〔１〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）
【化１４】
2007142210.tif 000005
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、式（２）
【化１５】
2007142210.tif 000006
で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールの製造方法；
（ａ）配列番号：1〜8のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される (S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：1〜8のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
〔２〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）
【化１６】
2007142210.tif 000007
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、式（３）
【化１７】
2007142210.tif 000008
で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールの製造方法；
（ａ）配列番号：17に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：17に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
〔３〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質に対応する補酵素、および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を再生する活性を有する脱水素酵素を同時に発現する形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）
【化１８】
2007142210.tif 000009
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、
式（２）
【化１９】
2007142210.tif 000010
で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールの製造方法；
（ａ）配列番号：1〜8のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される (S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：1〜8のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：9〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
〔４〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質に対応する補酵素、および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を再生する活性を有する脱水素酵素を同時に発現する形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）
【化２０】
2007142210.tif 000011
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、
式（３）
【化２１】
2007142210.tif 000012
で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールの製造方法；
（ａ）配列番号：17に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：17に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：18に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（３）で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
〔５〕還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を再生する活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵素またはギ酸脱水素酵素である、〔３〕又は〔４〕に記載の方法、
〔６〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を、pH 5.0〜6.4の範囲において、式（１）
【化２２】
2007142210.tif 000013
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させ、
式（２）
【化２３】
2007142210.tif 000014
で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを安定して光学純度99.5% e.e.以上で製造する方法；
（ａ）配列番号：1に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：1に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例1で構築したプラスミドpSF-CPA4の制限酵素地図を示す図である。図中、CpSADHはキャンディダ・パラプシロシス由来アルコール脱水素酵素遺伝子を、McFDHはマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素遺伝子を、lac Iqはlacリプレッサーを、P(trc)はtrcプロモーターを、mcはマルチクローニングサイトを、T(rrnB)はrrnBターミネーターを、ampはアンピシリン耐性遺伝を、oriは複製起点を、ropはrop protein遺伝子を意味する。
【図２】実施例4で構築したプラスミドpSE-RED1の制限酵素地図を示す図である。ReSADHはロドコッカス・エリスロポリス由来アルコール脱水素酵素遺伝子を意味する。
【図３】実施例5で構築したプラスミドpSF-RED1の制限酵素地図を示す図である。
【図４】実施例6で構築したプラスミドpSE-SCP7の制限酵素地図を示す図である。ScoPARはストレプトマイセス・セリカラー由来カルボニル還元酵素遺伝子を意味する。
【図５】実施例8で構築したプラスミドpSF-SCP7の制限酵素地図を示す図である。
【図６】実施例11で構築したプラスミドpSE-GCY1の制限酵素地図を示す図である。ScGCYはサッカロマイセス・セレビシエ由来カルボニル還元酵素遺伝子を意味する。
【図７】実施例12で構築したプラスミドpSG-GCY1の制限酵素地図を示す図である。BsGDHはバチルス・サブチリス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を意味する。
【図８】実施例14で構築したプラスミドpSE-BSA1の制限酵素地図を示す図である。BstADHTはジオバチルス・サーモカテニュラス由来アルコール脱水素酵素遺伝子を意味する。
【図９】実施例16で構築したプラスミドpSU-SCA1の制限酵素地図を示す図である。ScADH1はサッカロマイセス・セレビシエ由来アルコール脱水素酵素I遺伝子を意味する。
【図１０】実施例18で構築したプラスミドpSU-SCA2の制限酵素地図を示す図である。ScADH2はサッカロマイセス・セレビシエ由来アルコール脱水素酵素II遺伝子を意味する。
【図１１】実施例20で構築したプラスミドpSE-GRE3の制限酵素地図を示す図である。ScGRE3はサッカロマイセス・セレビシエ由来カルボニル還元酵素遺伝子を意味する。
【００１２】
〔発明の実施の形態〕
本発明は、光学活性な(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを酵素的に製造する方法に関する。本発明は、本発明者らが、本発明の酵素、該酵素を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）
【化２４】
2007142210.tif 000015
で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させることによって、式（２）
【化２５】
2007142210.tif 000016
で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを効率的に製造できることを見出したことに基づく。【００１３】
上記式（１）から式（２）への反応を触媒する酵素としては、
・ アルコール脱水素酵素CpSADH、
・ アルコール脱水素酵素ReSADH、
・ カルボニル還元酵素ScoPAR、
・ (2S, 3S)-ブタンジオール脱水素酵素ZraSBDH、
・ カルボニル還元酵素ScGCY1、
・ トロピノン還元酵素HnTR1、
・ トロピノン還元酵素DsTR1、または
・ アルコール脱水素酵素BstADHT
が含まれる。【００１４】
また本発明は、光学活性な(R)-1,1,1-トリフルオロアセトンを酵素的に製造する方法に関する。本発明は、本発明者らが、本発明の酵素、該酵素を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはそれらの処理物を、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンに作用させることによって、式（３）
【化２６】
2007142210.tif 000017
で示される(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを効率的に製造できることを見出したことに基づく。
ここで、上記式（１）から式（３）への反応を触媒する酵素としては、アルコール脱水素酵素PfODHが挙げられる。なお、本明細書においては、式（１）から式（２）への反応を触媒する酵素、及び、式（１）から式（３）への反応を触媒する酵素を「カルボニル還元酵素活性を有する酵素」と称する。【００１５】
酵素
以下、本発明の酵素（アルコール脱水素酵素CpSADH、アルコール脱水素酵素ReSADH、カルボニル還元酵素ScoPAR、(2S, 3S)-ブタンジオール脱水素酵素ZraSBDH、カルボニル還元酵素ScGCY1、トロピノン還元酵素HnTR1、トロピノン還元酵素DsTR1、アルコール脱水素酵素BstADHT、またはアルコール脱水素酵素PfODH）について説明する。【００１６】
まず、本発明におけるアルコール脱水素酵素CpSADHとしては、配列番号：9に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：1に記載の塩基配列が挙げられる。なお、本発明のアルコール脱水素酵素CpSADHには、
（１）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号：1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列番号：9に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質も含まれる。【００１７】
本発明に利用されるカルボニル還元酵素CpSADHは、特許第3574682号に記載の方法によりキャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）より調製することができる。また、キャンディダ・パラプシロシス由来のCpSADHをコードする配列番号：1に記載のDNAを、キャンディダ・パラプシロシスなどからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてCpSADHを発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。【００１８】
本発明によるCpSADHの酵素活性の測定は、これに限定されるものではないが、例えば次のように行うことができる。すなわち、100 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 9.0）、2.5 mM NAD+、50 mM (S)-1,3-ブタンジオール及び酵素を含む反応液中において、30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定する方法を挙げることが可能である。なお、この場合、1 Uは1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とする。【００１９】
次に、アルコール脱水素酵素ReSADHに関して述べる。本発明におけるアルコール脱水素酵素ReSADHとしては、配列番号：10に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる、また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：2に記載の塩基配列が挙げられる。また、本発明のアルコール脱水素酵素ReSADHには、
（１）配列番号：10に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号：2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列番号：10に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質も含まれる。【００２０】
本発明に利用されるアルコール脱水素酵素ReSADHは、Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 380-386 (2003) に記載の方法によりロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）より調製することができる。また、ロドコッカス・エリスロポリス由来のReSADHをコードする配列番号：2に記載のDNAを、ロドコッカス・エリスロポリスなどからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてReSADHを発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。【００２１】
本発明によるReSADHの酵素活性の測定は、これに限定されるものではないが、例えば次のように確認することができる。すなわち、100 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 9.0）、2.5 mM NAD+、5 mM (S)-2-オクタノール及び酵素を含む反応液中において、30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定する。なおこの場合、1 Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とする。【００２２】
次に、カルボニル還元酵素ScoPARに関して述べる。本発明においてカルボニル還元酵素ScoPARとしては、配列番号：11に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：3に記載の塩基配列が挙げられる。また、本発明のカルボニル還元酵素ScoPARには、
（１）配列番号：11に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号：3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列番号：11に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質も含まれる。【００２３】
本発明に利用されるカルボニル還元酵素ScoPAR は、特開2005-95022に記載の方法によりストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）より調製することができる。また、ストレプトマイセス・セリカラー由来のScoPARをコードする配列番号：3に記載のDNAを、ストレプトマイセス・セリカラーなどからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてScoPARを発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。【００２４】
本発明によるScoPARの酵素活性の測定は、これに限定されるものではないが、例えば次のように確認することができる。すなわち、100 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 9.0）、2.5 mM NAD+、5 mM (S)-2-オクタノール及び酵素を含む反応液中において30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定する。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とする。【００２５】
次に、(2S, 3S)-ブタンジオール脱水素酵素ZraSBDHに関して述べる。本発明において(2S, 3S)-ブタンジオール脱水素酵素ZraSBDHとしては、配列番号：12に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる、また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：4に記載の塩基配列が挙げられる。また、本発明の(2S, 3S)-ブタンジオール脱水素酵素ZraSBDHには、下記（１）〜（３）
（１）配列番号：12に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号：4に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列番号：12に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質も含まれる。【００２６】
本発明に利用される(2S, 3S)-ブタンジオール脱水素酵素ZraSBDHは、特開2004-357639に記載の方法によりズーグレア・ラミゲラ（Zoogloea ramigera）より調製することができる。また、ズーグレア・ラミゲラ由来のZraSBDHをコードする配列番号：4に記載のDNAを、ズーグレア・ラミゲラなどからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてZraSBDHを発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。【００２７】
本発明によるZraSBDHの酵素活性の測定はこれに限定されるものではないが、例えば次のように確認することができる。すなわち、100 mM リン酸緩衝液（pH 8.0）、2.5 mM NAD+、50 mM (2S, 3S)-ブタンジオール及び酵素を含む反応液中において30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定する。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とする。【００２８】
次に、カルボニル還元酵素ScGCY1に関して述べる。本発明におけるカルボニル還元酵素ScGCY1としては、配列番号：13に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：5に記載の塩基配列が挙げられる。また、本発明のカルボニル還元酵素ScGCY1には、
（１）配列番号：13に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号：5に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列番号：13に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質も含まれる。【００２９】
本発明に利用されるカルボニル還元酵素ScGCY1は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のScGCY1をコードする配列番号：5に記載のDNAを、サッカロマイセス・セレビシエなどからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてScGCY1を発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。【００３０】
本発明によるScGCY1の酵素活性の測定は、これに限定されるものではないが、例えば次のように確認することができる。すなわち、100 mM リン酸緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM NADPH、20 mM アセト酢酸エチル及び酵素を含む反応液中において30℃で反応させ、NADPHの減少に由来する340 nmの吸光度の減少を測定する。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とする。【００３１】
次に、トロピノン還元酵素HnTR1に関して述べる。本発明におけるトロピノン還元酵素HnTR1としては、配列番号：14に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：6に記載の塩基配列が挙げられる。また、本発明のトロピノン還元酵素HnTR1には、
（１）配列番号：14に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号：6に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列番号：14に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質も含まれる。【００３２】
本発明に利用されるトロピノン還元酵素HnTR1は、特開2003-230398に記載の方法によりヒヨスチアムス・ニガー（Hyoscyamus niger）より調製することができる。また、ヒヨスチアムス・ニガー由来のHnTR1をコードする配列番号：6に記載のDNAを、ヒヨスチアムス・ニガーなどからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてHnTR1を発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。【００３３】
本発明によるHnTR1の酵素活性の測定は、これに限定されるものではないが、例えば次のように確認することができる。すなわち、100 mM リン酸緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM NADPH、4 mM トロピノン及び酵素を含む反応液中において30℃で反応させ、NADPHの減少に由来する340 nmの吸光度の減少を測定する。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とする。【００３４】
次に、トロピノン還元酵素DsTR1に関して述べる。本発明におけるトロピノン還元酵素DsTR1としては、配列番号：15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる、また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：7に記載の塩基配列が挙げられる。また、本発明のトロピノン還元酵素DsTR1には、
（１）配列番号：15に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号：7に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列番号：15に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質も含まれる。【００３５】
本発明に利用されるトロピノン還元酵素DsTR1は、特開2003-230398に記載の方法によりダツラ・ストラモニウム（Datua stramonium）より調製することができる。また、ダツラ・ストラモニウム由来のDsTR1をコードする配列番号：7に記載のDNAを、ダツラ・ストラモニウムなどからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてDsTR1を発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。【００３６】
本発明によるDsTR1の酵素活性の測定は、これに限定されるものではないが、例えば次のように確認することができる。すなわち、100 mM リン酸緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM NADPH、4 mM トロピノン及び酵素を含む反応液中において30℃で反応させ、NADPHの減少に由来する340 nmの吸光度の減少を測定する。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とする。【００３７】
次に、アルコール脱水素酵素BstADHTに関して述べる。本発明におけるアルコール脱水素酵素BstADHTとしては、配列番号：16に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：8に記載の塩基配列が挙げられる。また、本発明のアルコール脱水素酵素BstADHTには、
（１）配列番号：16に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号：8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列番号：16に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質も含まれる。【００３８】
本発明に利用されるアルコール脱水素酵素BstADHTは、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来のBstADHTをコードする配列番号：8に記載のDNAを、ジオバチルス・ステアロサーモフィラスなどからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてBstADHTを発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。【００３９】
本発明によるBstADHTの酵素活性の測定は、これに限定されるものではないが、例えば次のように確認することができる。すなわち、100 mM リン酸緩衝液（pH 8.0）、2.5 mM NAD+、100 mM エタノール及び酵素を含む反応液中において30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定する。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とする。【００４０】
最後に、アルコール脱水素酵素PfODHに関して述べる。本発明におけるアルコール脱水素酵素PfODHとしては、配列番号：18に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、該アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：17に記載の塩基配列が挙げられる。また、本発明のアルコール脱水素酵素PfODHには、
（１）配列番号：18に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号：17に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列番号：18に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式（１）で示される1,1,1-トリフルオロアセトンを還元し、式（２）で示される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
によりコードされるタンパク質も含まれる。【００４１】
本発明に利用されるアルコール脱水素酵素PfODHは、WO01/061014に記載の方法によりピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）より調製することができる。また、ピキア・フィンランディカ由来のPfODHをコードする配列番号：17に記載のDNAを、ピキア・フィンランディカなどからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてPfODHを発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。【００４２】
本発明によるPfODHの酵素活性の測定は、これに限定されるものではないが、例えば次のように確認することができる。すなわち、100 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 9.0）、2.5 mM NAD+、5 mM (R)-2-オクタノール及び酵素を含む反応液中において30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定する。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。【００４３】
上記本発明の酵素（配列番号：9-16、及び18のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）において、1もしくは複数（例えば、2〜100個、好ましくは2〜50個、さらに好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列は、配列番号：9-16、及び18のいずれかに記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982); Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991).）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより得ることが可能である。【００４４】
本発明における配列番号：1-8、及び17のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：1-8、及び17のいずれかに記載のポリヌクレオチドの任意の少なくとも20個、好ましくは少なくとも30個、例えば40、60または100個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、wash：42 ℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的な「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、42 ℃、2×SSC、0.1％ SDSの条件であり、好ましくは50 ℃、2×SSC 、0.1％ SDSの条件であり、さらに好ましくは、65 ℃、0.1×SSCおよび0.1％ SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。【００４５】
本発明におけるポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：9-16、18のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも85より好ましくは90%、91％、92％、93％、94％、更に好ましくは95%以上（例えば、96％、97％、98％、99％）のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質のホモロジー検索は、例えばSWISS-PROT, PIR, DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST, FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
なお、上記本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドは、本発明の酵素をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNAなども含まれる。【００４６】
酵素を機能的に発現する微生物もしくは形質転換体とそれらの処理物
本発明の製造方法においては、上記酵素に代えて、上記酵素を機能的に発現する微生物またはその処理物を用いることも出来る。本発明の微生物としては、上記酵素のうちの少なくとも１つを発現する、分離された微生物が挙げられる。このような微生物としては、これらに限定されるものではないが、例えば、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ズーグレア・ラミゲラ（Zoogloea ramigera）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ヒヨスチアムス・ニガー（Hyoscyamus niger）、ダツラ・ストラモニウム（Datura stramonium）、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）などの微生物を挙げることが出来る。
また本発明の微生物には、上記酵素のうちの少なくとも１つをコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された微生物も含まれる。このような微生物は下記に記載の形質転換体と同様の方法によって作成することが出来る。
また「機能的に発現する」とは、酵素がその機能を保持した状態で発現することを意味する。本発明においては、酵素がその機能を保持している限り、酵素を発現させる方法は制限されない。また本発明においては、微生物の上記酵素の発現量も制限されない。従って、わずかでも上記酵素を発現していれば本発明の微生物に含まれる。【００４７】
本発明の製造方法においては、上記酵素に代えて、上記酵素をコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体、もしくはその処理物を用いてもよい。
上記酵素に代えて、上記酵素をコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体を用いる場合の適当なベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ等の種々のベクターを挙げることができる（Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press(1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons(1987)参照）。本発明で用いる好ましいベクターとしては、これに限定されるわけではないが、例えば、大腸菌における発現ベクターpSE420Dに上記本発明の酵素をコードする遺伝子を発現可能に挿入したpK4EC等が挙げられる。【００４８】
前記ベクターは、好ましくは、挿入されたＤＮＡの発現に必要とされる制御配列の全ての構成成分を含むものである。さらに該ベクターは、ベクターが導入された宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができる。【００４９】
本発明では、ＤＮＡに、シグナルペプチドをコードする配列を付加することもできる。シグナルペプチドの付加によって、宿主細胞内で発現されたタンパク質を小胞体内腔に移行させることができる。あるいは、グラム陰性菌を宿主とする場合には、シグナルペプチドによって、宿主細胞内で発現されたタンパク質を、ペリプラズム内、または細胞外へと移行させることができる。利用する宿主細胞において機能することができる任意のシグナルペプチドを利用することができる。したがって、宿主にとって異種由来のシグナルペプチドを利用することもできる。さらに必要に応じ、ＤＮＡのベクターへの導入に当たって、リンカー、開始コドン(ATG)、終止コドン(TAA、TAGまたはTGA)等を付加することもできる。【００５０】
本発明において各酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、それぞれの酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、それぞれの酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
・エシェリヒア(Escherichia)属
・バチルス(Bacillus)属
・シュードモナス(Pseudomonas)属
・セラチア(Serratia)属
・ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
・コリネバクテリウム(Corynebacterium)属
・ストレプトコッカス(Streptococcus)属
・ラクトバチルス(Lactobacillus)属
など宿主ベクター系の開発されている細菌
・ロドコッカス(Rhodococcus)属
・ストレプトマイセス(Streptomyces)属
など宿主ベクター系の開発されている放線菌
・サッカロマイセス(Saccharomyces)属
・クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
・シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
・チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
・ヤロウイア(Yarrowia)属
・トリコスポロン(Trichosporon)属
・ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
・ピキア(Pichia)属
・キャンディダ(Candida)属
などの宿主ベクター系の開発されている酵母
・ノイロスポラ(Neurospora)属
・アスペルギルス(Aspergillus)属
・セファロスポリウム(Cephalosporium)属
・トリコデルマ(Trichoderma)属
などの宿主ベクター系の開発されているカビ【００５１】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明のNADPHを電子供与体とするカルボニル還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座8 遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng., 43, 75-102 (1990)、Yeast, 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。【００５２】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature, 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。【００５３】
ベクターへのＤＮＡの導入は、制限酵素サイトを利用したリガーゼ反応により行うことができる（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons(1987) Section 11.4-11.11; Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press(1989) Section 5.61-5.63）。また、使用する宿主のコドン使用頻度を考慮し、必要に応じポリヌクレオチド配列の改変を行い、発現効率の高いベクターを設計するようにしてもよい（Grantham et al., Nucleic Acids Res (1981) 9:r43-74）。【００５４】
上述のように、様々な細胞が宿主細胞株として確立されている。そして、各細胞株に適した発現ベクターの導入法も公知であり、当業者であれば、各選択した宿主細胞に好適な導入法を選択することができる。例えば、原核細胞については、カルシウム処理、エレクトポレーションによる形質転換等が知られている。また、植物細胞については、アグロバクテリウムを用いた方法が公知であり、哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム沈降法を例示することができる。本発明は特にこれらの方法に限定されるわけではなく、選択した宿主に応じ、その他公知の核マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、DEAE-デキストラン法、細胞融合、電気パルス穿孔法、リポフェクタミン法(GIBCO BRL)、FuGENE6試薬(Boehringer-Mannheim)を用いた方法をはじめとする種々の公知の方法により発現ベクターの導入を行うことができる。【００５５】
以上のようにしてＤＮＡを含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養することにより、1,1,1-トリフルオロアセトンを還元して光学活性1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを生成する活性を有するタンパク質を製造することができる。【００５６】
形質転換体の培養方法は特に限定されず、選択した各宿主細胞の生育に適し、かつ、本発明の酵素の生産に最も適した培地、温度、時間等の条件を選択することが望ましい。形質転換体からの酵素の精製は、当業者に公知の方法により行なうことができる。例えば、形質転換体は、宿主の生育に適した培地で培養し、十分に増殖させた後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェニルメタンスルホニルフルオリド等の還元剤やプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより酵素を精製することができる。【００５７】
本発明に記載の式（２）及び式（３）に表される光学活性アルコール製造の好ましい態様においては、酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する（発現する）微生物もしくは形質転換体またはそれらの処理物を反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることによって、光学活性アルコールの製造を行うことができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。【００５８】
本発明で用いる処理物は、生物細胞に対して、物理処理、生化学的処理、あるいは化学的処理等を行った産物を指す。生物細胞は、上記酵素を含む植物細胞に加え、当該酵素の遺伝子を発現可能に保持する形質転換体も含まれる。また処理物を得るための物理処理には、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、あるいは磨砕処理等が含まれる。また生化学的処理とは、具体的にはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理を示すことができる。更に、化学的処理としては、界面活性剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶媒との接触処理などが挙げられる。このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。【００５９】
また、本発明で用いる生物細胞あるいは処理物は、例えばポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（κ-カラギーナンゲル法など）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法、イオン交換樹脂法などの公知方法により固定化して使用することもできる。【００６０】
補酵素
本発明の好ましい態様においては、CpSADH、ReSADH、ScoPAR、ZraSBDH、ScGCY1、HnTR1、DsTR1、またはBstADHTから選択される、カルボニル還元酵素活性を有するタンパク質、該酵素またはタンパク質を産生する（発現する）微生物もしくは形質転換体、またはそれらの処理物を1,1,1-トリフルオロアセトン（以下TFACと略す）に作用させ、(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール(以下(S)-TFIPと略す)を製造する方法を提供する。また本発明は、カルボニル還元酵素活性を有するタンパク質（PfODH）、該酵素またはタンパク質を産生する（発現する）微生物もしくは形質転換体、またはそれらの処理物をTFACに作用させ、(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール(以下(R)-TFIPと略す)を製造する方法を提供する。
本発明の製造方法においては、カルボニル還元酵素活性を有するタンパク質（酵素）に加え、該酵素に対応する補酵素、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を再生する活性を有する脱水素酵素を同時に使用することも可能である。【００６１】
上記還元反応に付随してNAD(P)Hから生成するNAD(P)+の、NAD(P)Hへの再生は、微生物の持つNAD(P)+還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらNAD(P)+還元能は、反応系にグルコースやエタノールなどを添加することにより増強することが可能である。また、NAD(P)＋からNAD(P)Hを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）、亜リン酸脱水素酵素、ヒドロゲナーゼなどを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてNAD(P)Hの再生を行うことができる。これらのNAD(P)H再生に必要な反応を構成する成分は、本発明による光学活性アルコールの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはNAD(P)Hの交換が可能な膜を介して接触させることができる。【００６２】
ここで、本発明において用いられる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を再生する活性を有する脱水素酵素及び、カルボニル還元酵素活性を有する酵素の組み合わせは、何ら制限されるものではないが、好ましい組み合わせとしては、下記（１）に記載の脱水素酵素から選択される脱水素酵素と、下記（２）に記載のカルボニル還元酵素活性を有する酵素から選択されるカルボニル還元酵素活性を有する酵素の組み合わせを挙げることができる。より具体的には、例えばカルボニル還元酵素活性を有する酵素としてCpSADHを選択した場合、これと組み合わせて用いられる脱水素酵素としては、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）、亜リン酸脱水素酵素、又はヒドロゲナーゼの任意の脱水素酵素から選択される脱水素酵素を用いることが可能である。これは、カルボニル還元酵素活性を有する酵素としてCpSADH以外の酵素を選択した場合も同様である。このように、本発明の光学活性アルコールの製造方法においては、カルボニル還元酵素活性を有する酵素と脱水素酵素の組み合わせは実施例に記載のそれに限定されるものではない。
（１）脱水素酵素
グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）、亜リン酸脱水素酵素、ヒドロゲナーゼ
（２）カルボニル還元酵素活性を有する酵素
アルコール脱水素酵素CpSADH、アルコール脱水素酵素ReSADH、カルボニル還元酵素ScoPAR、(2S, 3S)-ブタンジオール脱水素酵素ZraSBDH、カルボニル還元酵素ScGCY1、トロピノン還元酵素HnTR1、トロピノン還元酵素DsTR1、アルコール脱水素酵素BstADHT、アルコール脱水素酵素PfODH【００６３】
また本発明の方法においては、本発明に利用可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含むことも可能である。本発明の方法において、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を利用する場合には、NAD(P)H再生のための付加的な反応系を不要とすることが可能な場合がある。すなわち、NAD(P)H再生活性の高い微生物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、NAD(P)H再生用の酵素を添加することなく効率的な反応を行うことが可能である。さらに、NAD(P)H再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）、亜リン酸脱水素酵素、ヒドロゲナーゼなどの遺伝子を、本発明のNAD(P)H依存性酵素をコードするDNAと同時に宿主に導入することによって、より効率的なNAD(P)H依存性カルボニル還元酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。これらの2つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。【００６４】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。【００６５】
例えば、NADPH再生用酵素として、バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）やサーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）に由来するグルコース脱水素酵素が利用可能である。また、NADH再生用酵素として、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）に由来するギ酸脱水素酵素が利用可能である。【００６６】
具体的には、光学活性TFIP合成には、CpSADH、ReSADH、ScoPAR、ZraSBDH、PfODHのいずれかのカルボニル還元能を有する酵素の遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素遺伝子を共に導入した共発現プラスミド（それぞれ、pSF-CPA4（本発明実施例に記載）、pSF-RED1（本発明実施例に記載）、pSF-SCP7（本発明実施例に記載）、pSF-ZRD1（特開2004-357639）、pSF-PFO2（WO01-061014））が挙げられる。また、ScGCY1、HnTR1、DsTR1のいずれかのカルボニル還元能を有する酵素の遺伝子とバチルス・サブチリス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を共に導入した共発現プラスミド（それぞれ、pSG-GCY1（本発明実施例に記載）、pSG-HNR1（特開2003-230398）、pSG-DSR1（特開2003-230398））が挙げられる。【００６７】
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエステルなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系、もしくは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。【００６８】
また、本反応の原料である式（１）に表されるTFACの濃度は制限されない。通常、基質濃度0.01−50%、好ましくは0.1−20%、さらに好ましくは1−10%で行うことができる。基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは間欠的に添加してもよい。基質は式（１）に表されるTFACの状態で反応系に投入してもよいが、式（４）で示される水和物、あるいは式（１）または式（４）で表される化合物の水溶液あるいはその他溶媒の溶液状態で添加してもよい。
【化２７】
2007142210.tif 000018
なお、本発明における濃度%は、いずれも「原料または生成物の重量／反応液の重量（w/w）%」を意味するものとし、変換率とは、「生成物濃度／（[残存原料濃度]＋[生成物濃度]）%」を意味するものとする。また、%e.e.は(S)-TFIPの場合、「（[(S)-TFIP濃度]−[(R)-TFIP濃度]）／（[(S)-TFIP濃度]＋[(R)-TFIP濃度]）×100」を意味するものとする。同様に、(R)-TFIPの場合、%e.e.は、「（[(R)-TFIP濃度]−[(S)-TFIP濃度]）／（[(R)-TFIP濃度]＋[(S)-TFIP濃度]）×100」を意味するものとする。【００６９】
本発明の反応は、酵素がその触媒作用を示すことのできる温度を選択することができる。具体的には、反応温度4−50 ℃、好ましくは10−40 ℃、より好ましくは10−30℃で実施することができる。本発明の反応の基質である式（１）に表されるTFAC、生成物である式（２）及び式（３）に示される光学活性TFIPは共に沸点が低いため、反応は低い温度で実施することが望ましい。反応のpHは、酵素がその触媒作用を示すことのできる範囲を選択することができる。具体的には、pH 3-9、pH 4-8、より好ましくはpH 5-7で行うことができる。また、反応系には必要に応じて補酵素NAD+、NADH、NADP＋もしくはNADPHが0.001−100 mM、好ましくは、0.01−10 mMの濃度で添加できる。【００７０】
NADH、NADPHの再生のために、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、アルコール脱水素酵素を利用する場合にはエタノールもしくはイソプロパノールが、ギ酸脱水素酵素を利用する場合にはギ酸が、アミノ酸脱水素酵素を利用する場合にはアミノ酸が、リンゴ酸脱水素酵素を利用する場合にはリンゴ酸が、グリセロール脱水素酵素を利用する場合にはグリセロールが、亜リン酸脱水素酵素を利用する場合には亜リン酸が、ヒドロゲナーゼを利用する場合の水素などが、反応系に添加される。これらの化合物は、基質ケトンに対してモル比で0.1−20、好ましくは1−5倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、亜リン酸脱水素酵素、ヒドロゲナーゼなどの、NAD(P)H再生用の酵素は、本発明のNAD(P)H依存性酵素に比較して酵素活性で0.01−100倍、好ましくは0.1−20倍程度添加することができる。【００７１】
また本発明の製造方法においては、さらに(S)-TFIP又は(R)-TFIPを回収する工程を含んでもよい。(S)-TFIP又は(R)-TFIPの回収は、例えば実施例に記載の方法によって行うことが出来るが、これに限定されるものではない。
本発明のTFACの還元により生成する光学活性TFIPの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、蒸留、乾燥剤による乾燥、カラムクロマトグラフィーなどを適当に組み合わせることにより行うことができる。【００７２】
例えば、光学活性TFIP合成では微生物菌体を含む反応液を蒸留し、光学活性TFIPとして採取することができる。好ましくは、蒸留操作の前には菌体を除去する操作、例えば遠心分離、膜処理などを実施することができる。更に反応生成物の純度を上げ、特に水分含量を低減させるには、各種乾燥剤により乾燥を行い、必要に応じて再蒸留を行うことにより、更に高度に精製することができる。乾燥剤は一般的に乾燥用途に用いられるものが使用可能である。【００７３】
なお、光学活性TFIPとは、一方の対掌体の濃度が他方の対掌体の濃度よりも高い状態にあるTFIPを意味するが、工業的に実用にたる高い光学純度としては90% e.e.以上、好ましくは93% e.e.以上が挙げられる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない
なお、本発明においてLB培地とは、1% バクトトリプトン、0.5% バクト酵母エキス、1% 塩化ナトリウム、pH 7.2の構成の培地を指し、アンピシリンを含むLB培地とは、上記構成のLB培地にアンピシリンを50 mg/mL濃度で添加した培地を指す。【００７５】
酵素活性の測定
大腸菌HB101株またはJM109株を、以下に示す本実施例で調製したプラスミド及び文献記載のプラスミドで形質転換した。得られた形質転換株を、アンピシリンを含むLB培地中で終夜培養した。0.1 mMイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（以下IPTGと略す）を添加して遺伝子の発現を誘導し、更に4時間培養を行った。得られた菌体を、集菌後、0.02% メルカプトエタノールを含むトリス−塩酸緩衝液またはリン酸緩衝液に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕した。これを遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を用いて、それぞれ下記の方法で酵素活性を測定した。【００７６】
（CpSADH、ReSADH,、ScoPAR、及びPfODH活性の測定）
無細胞抽出液、100 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 9.0）、基質、2.5 mM NAD+を含む反応液を30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定した。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。基質としては、CpSADH活性の測定には50 mM (S)-1,3-ブタンジオール、ReSADH活性とScoPAR活性の測定には5 mM (S)-2-オクタノール、PfODH活性の測定には5 mM (R)-2-オクタノールを用いた。【００７７】
（ZraSBDH、BstADHT、ScADH1、及びScADH2活性の測定）
無細胞抽出液、100 mM リン酸緩衝液（pH 8.0）、基質、2.5 mM NAD+を含む反応液を30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定した。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。基質としては、ZraSBDH活性の測定には50 mM (2S, 3S)-ブタンジオール、BstADHT, ScADH1, ScADH2活性の測定には100 mM エタノールを用いた。【００７８】
（ScGCY1、HnTR1、DsTR1、及びScGRE3活性の測定）
無細胞抽出液、100 mM リン酸緩衝液（pH 6.5）、基質、0.2 mM NADPHを含む反応液を30℃で反応させ、NADPHの減少に由来する340 nmの吸光度の減少を測定した。1 Uは、1分間に1μmolのNADPHの減少を触媒する酵素量とした。基質として、ScGCY1活性の測定には20 mM アセト酢酸エチル、HnTR1活性とDsTR1活性の測定には4 mM トロピノン、ScGRE3活性の測定には100 mM キシロースを用いた。【００７９】
（ギ酸脱水素酵素活性の測定）
無細胞抽出液、100 mM リン酸緩衝液（pH 7.0）、100 mM ギ酸ナトリウム、2.5 mM NAD+を含む反応液を30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定した。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。【００８０】
（グルコース脱水素酵素活性の測定）
無細胞抽出液、100 mM リン酸緩衝液（pH 7.0）、100 mM D-グルコース、2.5 mM NAD+を含む反応液を30℃で反応させ、NADHの生成に由来する340 nmの吸光度の増加を測定した。1 Uは、1分間に1μmolのNADPHの生成を触媒する酵素量とした。【００８１】
分析条件
（分析条件1）TFAC及びTFIPの定量分析
反応液を等容のジクロロメタンで抽出した有機層、またはTFIP 10 mgをアセトニトリル1 mLに溶解したサンプルを以下の条件で分析した。
カラム：スペルコワックス10（スペルコ製）（30 m × 0.25 mm × 0.25μm）
カラム温度：60 ℃ 〜 120 ℃（4 ℃/分）
注入部及び検出部温度：250 ℃
検出方法：水素炎イオン化検出法
キャリアガス：ヘリウム（100 kPa）
以上の条件で分析をおこなったところ、TFACは保持時間2.2分に、TFIPは5.6分に検出された。【００８２】
（分析条件2）TFIPの光学純度分析
反応液を等容のジクロロメタンで抽出した有機層、またはTFIP 5 mgをジクロロメタン1 mLに溶解したサンプルを以下の条件で分析した。
カラム：BGB-174（BGBアナリティク製）（30 m × 0.25 mm × 0.25μm）
カラム温度：60 ℃ 〜 85 ℃（1 ℃/分）〜 110 ℃（5 ℃/分）
注入部温度：180 ℃
検出部温度：200 ℃
検出方法：水素炎イオン化検出法
キャリアガス：ヘリウム（100 kPa）
以上の条件で分析をおこなったところ、(R)-TFACは保持時間21.8分に、(S)-TFIPは23.5分に検出された。【００８３】
［実施例１］キャンディダ・パラプシロシス由来アルコール脱水素酵素CpSADH遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素McFDH遺伝子を共発現するプラスミドpSF-CPA4の構築
特許公報（特許第3574682号）に記載の塩基配列（Accession No. E09871）を元に、クローニング用のセンスプライマーCPA-ATG5（配列番号：19）、アンチセンスプライマーCPA-TAA5(配列番号：20)を合成した。
配列番号：19  GTGGAATTCTATAATGTCAATTCCATCAAGCCAG
配列番号：20  CTGAAGCTTATTATGGATTAAAAACAACACGACCTTCATAAGC
プライマーCPA-ATG5、CPA-TAA5を各10 pmol、dNTP 10 pmol、Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 481-483 (2002) に記載のプラスミドpSE-CPA1 10 pmol、Pfu Turbo DNA polymerase 1.25 U（STRATAGENE製）を含む50μLを用い、変性（95 ℃、30秒）、アニール（50 ℃、1分）、伸長（72 ℃、2分30秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400を用いてPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。
増幅産物を制限酵素NcoI、XbaIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、目的とするバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit（ファルマシア製）で精製した。
得られた制限酵素消化済みPCR増幅DNA断片を、制限酵素NcoI、XbaIで二重消化したベクターpSE-MF26（特開2003-199595）とTAKARA Ligation Kitによりライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析し、得られた塩基配列を配列番号：1に、そのアミノ酸配列を配列番号：9に示した。また、得られたプラスミドをpSF-CPA4（図1）とした。【００８４】
［実施例２］キャンディダ・パラプシロシス由来アルコール脱水素酵素CpSADHとマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素McFDH共発現プラスミドによる形質転換体の酵素活性
実施例1で得られたpSF-CPA4で形質転換した大腸菌HB101株より上記方法により無細胞抽出液を調製した。上記方法に従い、その酵素活性を測定したところ、CpSADHの比活性は5.96 U/mg-タンパク質、McFDHの比活性は0.474 U/mg-タンパク質であった。【００８５】
［実施例３］ロドコッカス・エリスロポリスからの染色体DNAの調製
ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）DSM 743株をブイヨン培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの調製は、Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980)に記載の方法により行った。【００８６】
［実施例4］ロドコッカス・エリスロポリス由来アルコール脱水素酵素ReSADHのクローニング
Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 380-386 (2003) に記載の塩基配列（Accession No. AY161280）を元に、クローニング用のセンスプライマーRE-ATG1（配列番号：21）、アンチセンスプライマーRE-TAA1（配列番号：22）を合成した。
配列番号：21  CACGAATTCTATCATGAAAGCAATCCAGTACACG
配列番号：22  TCGAAGCTTCTAGATTAAAGACCAGGGACCACAAC
プライマーRE-ATG1、RE-TAA1を各10 pmol、dNTP 10 nmol、実施例3で調製したロドコッカス・エリスロポリス由来染色体50 ng、Pfu Turbo DNA polymerase 1.25 U（STRATAGENE製）を含む50μLを用い、変性（95 ℃、30秒）、アニール（50 ℃、1分）、伸長（72 ℃、2分30秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400を用いてPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。
増幅産物を制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、目的とするバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit（ファルマシア製）で精製した。
得られた制限酵素消化済みPCR増幅DNA断片を、制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化したベクターpSE420D（特開2000-189170）とTAKARA Ligation Kitによりライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析した結果、プライマー部分を除き、文献に記載されている塩基配列と比較して4塩基の置換と1アミノ酸の置換が認められた。得られた塩基配列を配列番号：2に、そのアミノ酸配列を配列番号：10に示した。また、得られたプラスミドをpSE-RED1（図2）とした。【００８７】
［実施例５］ロドコッカス・エリスロポリス由来アルコール脱水素酵素ReSADH遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素McFDH遺伝子を共発現するプラスミドpSF-RED1の構築
実施例4で得られたpSE-RED1を制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化し、DNA断片を精製した。更に、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドpSE-MF26（特開2003-199595）を制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化し、pSL-RED1から切り出したDNA断片とTAKARA Ligation Kitを用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製し、ReSADHとギ酸脱水素酵素McFDHを同時に発現可能なプラスミドであるpSF-RED1（図3）を得た。【００８８】
［実施例６］ロドコッカス・エリスロポリス由来アルコール脱水素酵素ReSADHとマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素McFDH共発現プラスミドによる形質転換体の酵素活性
実施例5で得られたpSF-RED1で形質転換した大腸菌HB101株より上記方法により無細胞抽出液を調製した。上記方法に従い、その酵素活性を測定したところ、ReSADHの比活性は8.49 U/mg-タンパク質、McFDHの比活性は1.52 U/mg-タンパク質であった。【００８９】
［実施例7］ストレプトマイセス・セリカラー由来カルボニル還元酵素ScoPARのクローニング
配列番号：11に記載のアミノ酸配列に基づき、DNAを合成した。合成したDNAの配列を配列番号：3に示した。得られた配列を制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化し、精製した。
得られた制限酵素消化済み合成DNA断片を、制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化したベクターpSE420D（特開2000-189170）とTAKARA Ligation Kitによりライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析した結果、配列番号：11に記載の塩基配列と一致した。得られたプラスミドをpSE-SCP7（図4）とした。【００９０】
［実施例8］ストレプトマイセス・セリカラー由来カルボニル還元酵素ScoPARとマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素McFDH遺伝子を共発現するプラスミドpSF-SCP7の構築
実施例7で得られたpSE-SCP7を制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化し、DNA断片を精製した。更に、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素McFDH遺伝子を含むプラスミドpSU-MF26（特願2005-169919）を制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化し、pSL-SCP7から切り出したDNA断片とライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製し、ScoPARとMcFDHを同時に発現可能なプラスミドであるpSF-SCP7（図5）を得た。【００９１】
［実施例9］ストレプトマイセス・セリカラー由来カルボニル還元酵素ScoPARとマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素McFDH共発現プラスミドによる形質転換体の酵素活性
実施例8で得られたpSF-SCP7で形質転換した大腸菌HB101株より上記方法により無細胞抽出液を調製した。上記方法に従い、その酵素活性を測定したところ、ScoPARの比活性は0.67 mU/mg-タンパク質、McFDHの比活性は0.25 U/mg-タンパク質であった。【００９２】
［実施例10］サッカロマイセス・セレビシエからの染色体DNAの調製
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）をYEPD培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの調製は、Meth. Cell Biol., 29, 39 (1975)に記載の方法により行った。【００９３】
［実施例11］サッカロマイセス・セレビシエ由来カルボニル還元酵素ScGCY1のクローニング
FEBS Lett., 238, 123-128 (1988) に記載のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のカルボニル還元酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. X13228）を元にクローニング用のセンスプライマーGCY1-ATG1（配列番号：23）、アンチセンスプライマーGCY1-TAA1（配列番号：24）を合成した。
配列番号：23  GAGCCATGGCACCTGCTACTTTACATGATTCTACGAA
配列番号：24  GAGCTTAAGTCTAGATTATTTGAATACTTCGAAAGGAGACCA
実施例10で得られたサッカロマイセス・セレビシエから精製した染色体DNAを鋳型とし、プライマーGCY1-ATG1とGCY1-TAA1を用いて実施例4と同様の方法でPCRを行った。
増幅産物を制限酵素NcoI、XbaIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、目的とするバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit（ファルマシア製）で精製した。
得られた制限酵素消化済みPCR増幅DNA断片を、制限酵素NcoI、XbaIで二重消化したベクターpSE420D（特開2000-189170）とライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析した結果、プライマー部分を除き、文献に記載されている塩基配列と一致することを確認した。得られた塩基配列を配列番号：5に、そのアミノ酸配列を配列番号：13に示した。また、得られたプラスミドをpSE-GCY1（図6）とした。【００９４】
［実施例12］サッカロマイセス・セレビシエ由来カルボニル還元酵素ScGCY1とバチルス・サブチリス由来グルコース脱水素酵素BsGDH遺伝子を共発現するプラスミドpSG-GCY1の構築
実施例11で得られたpSE-GCY1を制限酵素NcoI、XbaIで二重消化し、DNA断片を精製した。更に、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来のグルコース脱水素BsGDH酵素遺伝子を含むプラスミドpSE-BSG1（特開2000-189170）を制限酵素NcoI、XbaIで二重消化し、pSL-GCY1から切り出したDNA断片とライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製し、ScGCY1とBsGDHを同時に発現可能なプラスミドであるpSG-GCY1（図7）を得た。【００９５】
［実施例13］サッカロマイセス・セレビシエ由来カルボニル還元酵素ScGCY1とバチルス・サブチリス由来グルコース脱水素酵素BsGDH共発現プラスミドによる形質転換体の酵素活性
実施例12で得られたpSF-GCY1で形質転換した大腸菌HB101株より上記方法により無細胞抽出液を調製した。上記方法に従い、その酵素活性を測定したところ、ScGCY1の比活性は0.27 U/mg-タンパク質、BsGDHの比活性は3.72 U/mg-タンパク質であった。【００９６】
［実施例14］ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来アルコール脱水素酵素BstADHTのクローニング
J. Bacteriol., 174, 1397-1402 (1992) に記載のジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来のアルコール脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. D90421）を元にクローニング用のセンスプライマーBSAT-AT1（配列番号：25）、アンチセンスプライマーBSAT-TA1（配列番号：26）を合成した。
配列番号：25  GAGGAATTCAATCATGAAAGCTGCAGTTGTG
配列番号：26  GTCAAGCTTCTAGATTAATCTACTTTTAACACGACGC
プラスミドpTBAD40を鋳型とし、プライマーBSAT-AT1とBSAT-TA1を用いて実施例4と同様の方法でPCRを行った。
増幅産物を制限酵素BspHI、XbaIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、目的とするバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit（ファルマシア製）で精製した。
得られた制限酵素消化済みPCR増幅DNA断片を、制限酵素NcoI、XbaIで二重消化したベクターpSE420D（特開2000-189170）とライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析した結果、プライマー部分を除き、文献に記載されている塩基配列と一致することを確認した。得られた塩基配列を配列番号： 8に、そのアミノ酸配列を配列番号： 16に示した。また、得られたプラスミドをpSE-BSA1（図8）とした。【００９７】
［実施例15］ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来アルコール脱水素酵素BstADHT発現プラスミドによる形質転換体の酵素活性
実施例14で得られたpSE-BSA1で形質転換した大腸菌HB101株より上記方法により無細胞抽出液を調製した。上記方法に従い、その酵素活性を測定したところ、BstADHTの比活性は1.08 U/mg-タンパク質であった。【００９８】
［参考例1］サッカロマイセス・セレビシエ由来アルコール脱水素酵素−I, ScADH1のクローニング
Basic Life Sci., 19, 335-361 (1982) に記載のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のアルコール脱水素酵素−I遺伝子の塩基配列（Accession No. M38456）を元にクローニング用のセンスプライマーScADH1-A1（配列番号：27）、アンチセンスプライマーScADH1-T1（配列番号：28）を合成した。
配列番号：27  GTCGAATTCATACATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGG
配列番号：28  CTGCTTAAGTCTAGATTATTTAGAAGTGTCAACAACGTAACGACCAA
実施例10で得られたサッカロマイセス・セレビシエから精製した染色体DNAを鋳型とし、プライマーScADH1-A1とScADH1-T1を用いて実施例4と同様の方法でPCRを行った。
増幅産物を制限酵素EcoRI、AflIIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、目的とするバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit（ファルマシア製）で精製した。
得られた制限酵素消化済みPCR増幅DNA断片を、制限酵素EcoRI、AflIIで二重消化したベクターpSE420U（特願2005-169919）とライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析した結果、プライマー部分を除き、文献に記載されている塩基配列と比較して10塩基の置換、1アミノ酸の置換が確認された。得られた塩基配列を配列番号：29に、そのアミノ酸配列を配列番号：30に示した。また、得られたプラスミドをpSU-SCA1（図9）とした。【００９９】
［参考例２］サッカロマイセス・セレビシエ由来アルコール脱水素酵素−I, ScADH1発現プラスミドによる形質転換体の酵素活性
参考例1で得られたpSU-SCA1で形質転換した大腸菌JM109株より上記方法により無細胞抽出液を調製した。上記方法に従い、その酵素活性を測定したところ、ScADH1の比活性は4.92 U/mg-タンパク質であった。【０１００】
［参考例3］サッカロマイセス・セレビシエ由来アルコール脱水素酵素−II, ScADH2のクローニング
J. Biol. Chem., 258, 2674-2682 (1983) に記載のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のアルコール脱水素酵素−II遺伝子の塩基配列（Accession No. J01314, M13475）を元にクローニング用のセンスプライマーScADH2-A1（配列番号：31）、アンチセンスプライマーScADH2-T1（配列番号：32）を合成した。
配列番号：31  GTCGAATTCATACATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAGC
配列番号：32  GCACTTAAGTCTAGATTATTTAGAAGTGTCAACAACGTAACGACCAG
実施例10で得られたサッカロマイセス・セレビシエから精製した染色体DNAを鋳型とし、プライマーScADH2-A1とScADH2-T1を用いて実施例4と同様の方法でPCRを行った。
増幅産物を制限酵素EcoRI、AflIIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、目的とするバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit（ファルマシア製）で精製した。
得られた制限酵素消化済みPCR増幅DNA断片を、制限酵素EcoRI、AflIIで二重消化したベクターpSE420U（特願2005-169919）とライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析した結果、プライマー部分を除き、文献に記載されている塩基配列と比較して1塩基の置換が確認された。得られた塩基配列を配列番号：33に、そのアミノ酸配列を配列番号：34に示した。また、得られたプラスミドをpSU-SCA2（図10）とした。【０１０１】
［参考例4］サッカロマイセス・セレビシエ由来アルコール脱水素酵素−II, ScADH2発現プラスミドによる形質転換体の酵素活性
参考例3で得られたpSU-SCA2で形質転換した大腸菌JM109株より上記方法により無細胞抽出液を調製した。上記方法に従い、その酵素活性を測定したところ、ScADH2の比活性は32.3 mU/mg-タンパク質であった。【０１０２】
［参考例5］サッカロマイセス・セレビシエ由来カルボニル還元酵素ScGRE3のクローニング
Appl. Environ. Microbiol., 61, 1580-1585 (1995) に記載のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のカルボニル還元酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. U00059）を元にクローニング用のセンスプライマーGRE3-ATG1（配列番号：35）、アンチセンスプライマーGRE3-TAA1（配列番号：36）を合成した。
配列番号：35  GAGTCATGAGTTCACTGGTTACTCTTAATAACGGTC
配列番号：36  GACGAATTCCTCTAGATTATGCAAAAGTGGGGAATTTACCATC
実施例10で得られたサッカロマイセス・セレビシエから精製した染色体DNAを鋳型とし、プライマーGRE3-ATG1とGRE3-TAA1を用いて実施例4と同様の方法でPCRを行った。
増幅産物を制限酵素BspHI、EcoRIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、目的とするバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit（ファルマシア製）で精製した。
得られた制限酵素消化済みPCR増幅DNA断片を、制限酵素NcoI、EcoRIで二重消化したベクターpSE420D（特開2000-189170）とライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrep Kit（ファルマシア製）により精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析した結果、プライマー部分を除き、文献に記載されている塩基配列と一致することを確認した。得られた塩基配列を配列番号：37に、そのアミノ酸配列を配列番号：38に示した。また、得られたプラスミドをpSE-GRE3（図11）とした。【０１０３】
［参考例6］サッカロマイセス・セレビシエ由来カルボニル還元酵素, ScGRE3発現プラスミドによる形質転換体の酵素活性
実施例20で得られたpSE-GRE3で形質転換した大腸菌JM109株より上記方法により無細胞抽出液を調製した。上記方法に従い、その酵素活性を測定したところ、ScGRE3の比活性は206 mU/mg-タンパク質であった。【０１０４】
［実施例16］TFAC水和物の調製
100 mL メスフラスコに100 mM リン酸緩衝液（pH 7.4）40mLを入れ、氷浴上で冷却した。そこに1,1,1-トリフルオロアセトン（TFAC）を少しずつ加えて溶解させて100 mLとし、TFAC濃度944 g/LのTFAC水和物を得た。【０１０５】
［実施例17］TFACを基質とした光学活性TFIPの製造
プラスミドpSF-CPA4（本明細書実施例1に記載）、pSF-RED1（本明細書実施例5に記載）、pSF-SCP7（本明細書実施例8に記載）、pSF-ZRD1（特開2004-357639）、pSF-PFO2（WO01-061014）でそれぞれ大腸菌HB101株を形質転換し、得られた形質転換体を2×YT培地（2% バクトトリプトン、1% バクト酵母エキス、1% 塩化ナトリウム、pH 7.2）を用いて33 ℃で終夜培養した。培地に0.1 mM IPTGを添加して各酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、各酵素遺伝子を発現する大腸菌を得た。
反応容器に基質であるTFACの終濃度が2% (178 mM) となるように実施例16で得たTFAC水和物、100 mM リン酸緩衝液（pH 6.5）、TFACに対して2当量のギ酸ナトリウム、培養液10 g分から得た集菌菌体を加えて総重量10 gの反応液を調製し、20 ℃で終夜回転振盪した。反応液から0.8 mLずつをサンプリングし、ジクロロメタン0.8 mLで抽出し、有機層を後述する分析条件1、2により分析し、TFIPの定量と光学純度分析をそれぞれ行った。その結果を表1に示す。
【表１】
2007142210.tif 000019
【０１０６】
［実施例18］TFACを基質とした光学活性TFIPの製造
プラスミドpSG-GCY1（本明細書実施例12に記載）、pSG-HNR1（特開2003-230398）、pSG-DSR1（特開2003-230398）でそれぞれ大腸菌HB101株を形質転換し、得られた形質転換体を2×YT培地（2% バクトトリプトン、1% バクト酵母エキス、1% 塩化ナトリウム、pH 7.2）を用いて33 ℃で終夜培養した。培地に0.1 mM IPTGを添加して各酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、各酵素遺伝子を発現する大腸菌を得た。
反応容器に基質であるTFACの終濃度がそれぞれ2% (178 mM) となるように実施例16で得たTFAC水和物、100 mM リン酸緩衝液（pH 6.5）、TFACに対して2当量のD-グルコース、培養液10 g分から得た集菌菌体を加えて総重量10 gの反応液を調製し、20 ℃で終夜回転振盪した。反応液から0.8 mLずつをサンプリングし、ジクロロメタン0.8 mLで抽出し、有機層を後述する分析条件1、2により分析し、TFIPの定量と光学純度分析をそれぞれ行った。その結果を表1に示す。【０１０７】
［実施例19］TFACを基質とした光学活性TFIPの製造
プラスミドpSE-BSA1（本明細書実施例14に記載）で大腸菌HB101株を形質転換し、得られた形質転換体を2×YT培地（2% バクトトリプトン、1% バクト酵母エキス、1% 塩化ナトリウム、pH 7.2）を用いて33 ℃で終夜培養した。培地に0.1 mM IPTGを添加して各酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、各酵素遺伝子を発現する大腸菌を得た。
反応容器に基質であるTFACの終濃度が2% (178 mM) となるように実施例16で得たTFAC水和物、100 mM リン酸緩衝液（pH 6.5）、TFACに対して2当量のD-グルコース、培養液10 g分から得た集菌菌体、5 U グルコース脱水素酵素（Amano-2、天野エンザイム製）を加えて総重量10 gの反応液を調製し、20 ℃で終夜回転振盪した。反応液から0.8 mLずつをサンプリングし、ジクロロメタン0.8 mLで抽出し、有機層を後述する分析条件1、2により分析し、TFIPの定量と光学純度分析をそれぞれ行った。その結果を表1に示す。【０１０８】
［実施例20］TFACを基質とした(S)-TFIPの製造
プラスミドpSF-CPA4（本明細書実施例1に記載）で大腸菌HB101株を形質転換し、得られた形質転換体を2×YT培地（2% バクトトリプトン、1% バクト酵母エキス、1% 塩化ナトリウム、pH 7.2）を用いて33 ℃で終夜培養した。培地に0.1 mM IPTGを添加して各酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、CpSADHとMcFDHを共発現する大腸菌を得た。
反応容器に基質であるTFACの終濃度が6%（535 mM）となるように実施例20で得たTFAC水和物、100 mM リン酸緩衝液（pH 6.0）、803 mM ギ酸ナトリウム、培養液267 g分から得た集菌菌体を加えて総重量400 gの反応液を調製し、40％ 硫酸でpH 6.0にコントロールしながら20 ℃で撹拌することで反応させた。26時間後、反応液から0.8 mLずつをサンプリングし、ジクロロメタン0.8 mLで抽出し、有機層を後述する分析条件1、2により分析し、TFIPの定量と光学純度分析をそれぞれ行った結果、変換率は99%、光学純度は99.8% e.e. (S)であった。【０１０９】
［実施例21］(S)-TFIPの精製
さらに、実施例20で得た反応液1230 gを遠心分離することによって除菌した。得られた上清を蒸留し、蒸気温度77-79 ℃の部分を主留として60.17 g得た。得られた主留の59.02 gに対して飽和塩化カルシウム水溶液を11.8 mL加えて1時間室温で撹拌した後、静置して有機層を分離した。この有機層を再び蒸留し、蒸気温度72-74 ℃の部分を主留として48.63 g得た。また、主留部分を分析条件1、2により分析したところ、TFIP純度は97.3%、光学純度は99.7% e.e. (S) であった。【０１１０】
［比較例1］TFACを基質とした(S)-TFIPの製造
プラスミドpSU-SCA1（本明細書参考例1に記載）、pSU-SCA2（本明細書参考例3に記載）、pSE-GRE3（本明細書参考例5に記載）で大腸菌HB101株を形質転換し、得られた形質転換体を2×YT培地（2% バクトトリプトン、1% バクト酵母エキス、1% 塩化ナトリウム、pH 7.2）を用いて33 ℃で終夜培養した。培地に0.1 mM IPTGを添加して各酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、各酵素遺伝子を発現する大腸菌を得た。
反応容器に基質であるTFACの終濃度が2% (178 mM)となるように実施例20で得たTFAC水和物、100 mM リン酸緩衝液（pH 6.5）、TFACに対して2当量のD-グルコース、培養液10 g分から得た集菌菌体、5 U グルコース脱水素酵素（Amano-2、天野エンザイム製）を加えて総重量10 gの反応液を調製し、20 ℃で終夜回転振盪した。反応液から0.8 mLずつをサンプリングし、ジクロロメタン0.8 mLで抽出し、有機層を後述する分析条件1、2により分析し、TFIPの定量と光学純度分析をそれぞれ行った。その結果を表1に示す。【０１１１】
［比較例2］反応pHの光学純度への影響
反応液に添加する基質の終濃度を5%（446 mM）とし、リン酸緩衝液のpHをそれぞれpH 6.5とし、反応中のpHコントロールをそれぞれpH 6.5とした以外は実施例20と同様にして反応を行った。その結果、光学純度は99.1-99.2% e.e. (S)であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明により、光学活性な(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール及び(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを酵素的に製造する方法が提供された。本発明の方法によって製造される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール及び(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールは共に、高い光学純度を与える。すなわち、光学分割剤を利用する従来の方法に対して、高度な光学純度を安価に、かつ容易に達成することができる。
また本発明によれば、多量の原料を用いて、目的とする化合物を効率的に得ることができる。より具体的には、本発明に基づいて、例えば（S）-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール及び(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールを、簡便、かつ経済的に、工業的に製造することが可能となった。すなわち、本発明における酵素活性物質は、多量の基質、並びに基質から生成する反応生成物による阻害作用を受けにくい。そのため、より多くの原料を用いて、目的とする化合物を効率的に得ることが可能となった。
本発明の方法によって製造される(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール及び(R)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノールは、各種医薬品、液晶材料などの光学活性原料として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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