(57)【要約】標識された２種の求核体の存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程とを含む反応性代謝物の検出方法、及び、当該反応工程の後に酢酸アンモニウムを用いて液層分離を行い、有機層を得る分離工程をさらに含む反応性代謝物の検出方法。かかる検出方法により、調製が容易で且つ定量的に反応性代謝物を検出することが可能となり、さらに、偽陽性のシグナル生成を解消させ、又、偽陰性のシグナル生成を低減させることが可能となり、より正確で効率的な被験化合物のスクリーニングを行うことが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応性代謝物の検出方法であって、
標識された２種の求核体の存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、
反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含む反応性代謝物の検出方法。
【請求項２】
反応性代謝物の検出方法であって、
標識された２種の求核体の存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、
高濃度塩溶液を用いて液層分離を行い、有機層を得る分離工程と、
該有機層に含まれる反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含む反応性代謝物の検出方法。
【請求項３】
前記高濃度塩が酢酸アンモニウムである、請求項２に記載の反応性代謝物の検出方法。
【請求項４】
前記分離工程の結果得られた有機層に非標識システインを混合してインキュベートするシステイン混合工程をさらに含む、請求項２又は３に記載の反応性代謝物の検出方法。
【請求項５】
前記２種の求核体がソフト求核体（Ｓｏｆｔ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）及びハード求核体（Ｈａｒｄ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の反応性代謝物の検出方法。
【請求項６】
前記ソフト求核体がシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の反応性代謝物の検出方法。
【請求項７】
前記ハード求核体がシアニド（Ｃｙａｎｉｄｅ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の反応性代謝物の検出方法。
【請求項８】
前記標識が放射性同位体標識である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の反応性代謝物の検出方法。
【請求項９】
反応性代謝物の検出方法であって、
標識されたシステインの存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、
反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含む反応性代謝物の検出方法。
【請求項１０】
反応性代謝物の検出方法であって、
標識されたシステインの存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、
高濃度塩溶液を用いて液層分離を行い、有機層を得る分離工程と、
該有機層に含まれる反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含む反応性代謝物の検出方法。
【請求項１１】
前記高濃度塩が酢酸アンモニウムである、請求項１０に記載の反応性代謝物の検出方法。
【請求項１２】
前記分離工程の結果得られた有機層に非標識システインを混合してインキュベートするシステイン混合工程をさらに含む、請求項１０又は１１に記載の反応性代謝物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の毒性の原因となる反応性代謝物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、コンビナトリアルケミストリーに代表される化合物の合成・スクリーニング技術の急速な発展に伴い、創薬研究の比較的初期の段階で化合物の薬物動態や安全性に関する知見を得ることが重要となっている。
代謝酵素として知られるシトクロムＰ４５０を非可逆的に阻害する反応性中間体の生成や、反応性中間体が代謝酵素のみならず、他のタンパク質へ非可逆的に結合する場合も多くみられる。このような現象は、遅延性毒性や催奇形性を生じる可能性もあることから、より安全な化合物の探索においては、非可逆的結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の測定が行われる場合がある。
これまで、非可逆的結合の測定法として、標識された被験化合物を肝ミクロソームとインキュベーションした後、Ｂｒａｎｄｅｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いた後処理を行なう事で沈殿したタンパク質を分離し、タンパク質と結合した被験化合物を検出し定量する方法が報告されている（非特許文献１）。
一方、低分子のトラップ剤を用いて反応性中間体を捕捉する方法も利用されている。これは、代謝酵素で代謝された被験化合物由来の反応性中間体を標識された低分子のトラップ剤で捕捉し、このトラップ剤の標識を検出することにより定性的な分析を行うことができる。例えば、非特許文献２及び特許文献１には、標識されたグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）をトレーサーとして用いて肝ミクロソームによって代謝された反応性中間体とグルタチオンの結合体を検出する方法が開示されている。また、非特許文献３には、標識されたシアニドをトレーサーとして用いて肝ミクロソームによって代謝された反応性中間体とシアニドの結合体を検出する方法が開示されている。
また、非特許文献４には、標識されていないグルタチオンとシアニドの存在下で肝ミクロソームとアセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ）をインキュベートし、グルタチオンをトレーサーとして代謝産物の検出を行った試験が開示されている。
【特許文献１】特開２００２−２３８５９７号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ、第１７巻、３頁、２００４年
【非特許文献２】Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、第９７巻、３７頁、１９９５年
【非特許文献３】Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、第１０巻、６９０頁、１９８２年
【非特許文献４】Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４８巻、２４２３頁、１９９１年
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、被験化合物を標識する方法では、放射標識された被験化合物の合成が必要であるため、人的にも時間的にも非常に労力がかかるという問題点があった。また、低分子のトラップ剤をトレーサーとして用いて反応性中間体を検出する方法では、定性的な試験として使用することはできるが、定量的な結果の解釈は十分に実証されていなかった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、調製が容易で且つ定量性・定性性に優れた反応性代謝物の検出方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、２種類の標識された低分子のトラップ剤の存在下で被験化合物の代謝反応を進行させ、トラップ剤と結合した反応性代謝物を検出することにより、定量的に反応性代謝物を検出することができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の反応性代謝物の検出方法は、標識された２種の求核体の存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。かかる方法により、被験化合物を個別に標識することなく簡便に反応性代謝物の検出を行うことが可能となる。
また、本発明の反応性代謝物の検出方法は、標識された２種の求核体の存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、高濃度塩溶液を用いて液層分離を行い、有機層を得る分離工程と、当該有機層に含まれる反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。かかる方法により、被験化合物を個別に標識することなく簡便に反応性代謝物の検出を行うことが可能となるとともに、偽陽性（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ：非可逆的結合が生じていないにもかかわらず、標識が検出される）又は偽陰性（ｆａｌｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ：非可逆的結合が生じているにもかかわらず、標識が検出されない）のシグナルの生成を解消させることが可能となる。
ここで、本発明の反応性代謝物の検出方法においては、前記高濃度塩が酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム又はギ酸アンモニウムであることが好ましい。かかる塩を使用することにより、偽陽性又は偽陰性のシグナルの生成を解消させることが可能となる。
また、前述の反応性代謝物の検出方法において、前記分離工程の結果得られた有機層に非標識システインを混合してインキュベートするシステイン混合工程をさらに含んでいてもよい。かかる工程を経ることにより、偽陽性又は偽陰性のシグナルの生成をさらに解消させることが可能となる。
また、本発明の反応性代謝物の検出方法において、前記２種の求核体がソフト求核体（Ｓｏｆｔ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）及びハード求核体（Ｈａｒｄ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）であることが好ましい。かかる組合せの求核体を使用することにより、偽陽性又は偽陰性のシグナルの生成をさらに解消させることが可能となる。ここで、前記ソフト求核体の一例としてシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を挙げることができる。また、前記ハード求核体の一例として、シアニド（Ｃｙａｎｉｄｅ）を挙げることができる。
また、上述の本発明の反応性代謝物の検出方法においては、前記標識が放射性同位体標識であることが好ましい。
さらに、本発明の反応性代謝物の検出方法は、標識されたシステインの存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。かかる方法により、被験化合物を個別に標識することなく簡便に反応性代謝物の検出を行うことが可能となる。
また、本発明の反応性代謝物の検出方法は、標識されたシステインの存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、高濃度塩溶液を用いて液層分離を行い、有機層を得る分離工程と、当該有機層に含まれる反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。かかる方法により、被験化合物を個別に標識することなく簡便に反応性代謝物の検出を行うことが可能となるとともに、偽陽性又は偽陰性のシグナルの生成を解消させることが可能となる。
ここで、当該本発明の反応性代謝物の検出方法においては、前記高濃度塩が酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム又はギ酸アンモニウムであることが好ましい。かかる塩を使用することにより、偽陽性又は偽陰性のシグナルの生成を解消させることが可能となる。
さらに、当該反応性代謝物の検出方法において、前記分離工程の結果得られた有機層に非標識システインを混合してインキュベートするシステイン混合工程をさらに含んでいてもよい。かかる工程を経ることにより、偽陽性又は偽陰性のシグナルの生成をさらに解消させることが可能となる。
本発明の反応性代謝物の検出方法によれば、簡便に反応系を準備することができ、且つ、定量的且つ定性的に反応性代謝物を検出することが可能となる。また、偽陽性のシグナル生成を解消させ、又、偽陰性のシグナル生成を低減させることが可能となり、より正確で効率的な被験化合物のスクリーニングを行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、トラップ剤として［３５Ｓ］システインを単独で用いて非可逆的結合を検出した場合のＲＩエリアとＢｒａｎｄｅｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて評価した非可逆的結合との関係を示す図である。
図２は、トラップ剤として［１４Ｃ］シアン化ナトリウムを単独で用いて非可逆的結合を検出した場合のＲＩエリアとＢｒａｎｄｅｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて評価した非可逆的結合との関係を示す図である。
図３は、トラップ剤として［３５Ｓ］システイン及び［１４Ｃ］シアン化ナトリウムを用いて非可逆的結合を検出した場合のＲＩエリアとＢｒａｎｄｅｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて評価した非可逆的結合との関係を示す図である。
図４は、トラップ剤として［３５Ｓ］システイン及び［１４Ｃ］シアン化ナトリウムを用い、酢酸アンモニウム緩衝液を用いて抽出を行い、非可逆的結合を検出した場合のＲＩエリアとＢｒａｎｄｅｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて評価した非可逆的結合との関係を示す図である。
図５は、代謝を受けた化合物のＲＩ−ＨＰＬＣ（Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ−Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）測定の結果を示す図である。
図６は、代謝生成物のＭＳ／ＭＳ測定の結果を示す図である。
図７は、代謝生成物のＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先ず、本発明に係る用語について説明する。
本発明に係る「反応性代謝物」とは、投与された有機化合物（主に医薬、又は医薬候補化合物）が体内で代謝された結果生じた、化学反応性を有する代謝物（反応性中間体）をいう。
また、本発明に係る「求核体」とは、置換反応、付加反応等において、基質の攻撃にあずかる電子対をもった反応試剤をいう。求核体は、電子が不足した反応中心に対して高い親和性を持つ試剤であり、一般に非共有電子対を持つことが多い。さらに、本発明に係る「ソフト求核体」及び「ハード求核体」における「ソフト」及び「ハード」とは、ＨＳＡＢ（Ｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｏｆｔ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｂａｓｅｓ）の原理における「ソフト」及び「ハード」を指し、ルイス酸及びルイス塩基について、ハードな酸はハードな塩基と相性がよく、ソフトな酸はソフトな塩基と相性がよいことを示す原理に基づく用語である。ここで、「ソフト求核体」としては、具体的には、例えば、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、又はシステインを挙げることができ、「ソフト求電子体」としては、エポキシド（Ｅｐｏｘｉｄｅ）、キノン（Ｑｕｉｎｏｎｅ）、α、β−不飽和カルボニル（α，β−ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｎｙｌ）を挙げることができる。また、「ハード求核体」としては、具体的には、例えば、シアニド（例えばシアン化ナトリウム、シアン化カリウム）が挙げられ、「ハードな求電子体」としては、イミニウムイオンが挙げられる。
本発明における求核体は、検出可能な状態で標識されている必要がある。標識の種類としては特に制限はないが、具体的には、例えば、放射性同位体標識、蛍光標識が挙げられる。求核体を標識する方法についても特に制限はなく、当業者に周知の方法で行うことができる。
また、本発明にかかる「被験化合物」としては、その種類は特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。
次に、本発明の反応性代謝物の検出方法の第１の態様について説明する。
本発明の反応性代謝物の検出方法の第１の態様は、反応性代謝物の検出方法であって、標識された２種の求核体の存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。
先ず、本発明に係る反応工程において、標識された２種の求核体の存在下で被験化合物の代謝反応を行う。
ここで、かかる代謝反応において１種の求核体を用いて反応性代謝物の検出を行うことも可能であるが、この場合には、当該求核体の物理化学的性質に起因して特定の反応性代謝物由来のシグナルが検出されない場合がある（偽陰性）。本発明者らは、異種の２種の求核体を用いることによって互いの性質によって生じる相補的なシグナルを検出することにより、より正確なアッセイを行うことを可能にしている。なお、１種の求核体を用いる場合には、システインを用いることが好ましい。
当該反応の条件は、被験化合物の代謝反応が生じる条件であれば特に制限はないが、生体内の条件を反映していることが好ましい。かかる条件としては、具体的には、例えば、ｐＨ６．０〜８．０、温度３５〜４０℃の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等）を挙げることができ、このような溶液を反応液として用いることができる。代謝反応は、前記の溶液に被験化合物、代謝酵素を添加して行うが、その他、好適な反応条件になるよう、適宜試薬（塩化マグネシウム等）を添加してもよい。また、ここで使用される代謝酵素は、試験の目的に応じて精製又は粗精製された特定の薬物代謝酵素（例えば、シトクロムＰ４５０）を使用してもよく、代謝酵素を含む生体抽出物（例えば、肝ミクロソーム）を使用してもよい。
また、被験化合物、代謝酵素等の添加は、反応液調製と同時に添加してもよく、反応液を調製してプレインキュベーション（例えば、５〜３０分）をした後、添加してもよい。代謝反応の時間は特に制限はなく、試験の目的に応じて適宜決定すればよい。
所望の反応時間が経過した後、反応を停止させるが、反応を停止させる方法としても特に制限はなく、具体的には、例えば、アセトニトリルの添加、反応温度の変更（例えば、氷上へ静置）を挙げることができる。
また、前述のように反応停止後は、次の検出工程に供するために、必要に応じて求核体が結合した反応性代謝物を抽出する工程を経てもよい。抽出は、当業者に公知の方法によって行うことができるが、具体的には、例えば、アセトニトリルの添加と遠心分離又はこれを繰り返すことによるアセトニトリル層の分離と、かかる分離に続く濃縮乾固による抽出法が挙げられる。
こうして反応工程を経た後、反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程へと進む。求核体の標識の検出は、標識の種類に応じて適宜好適な方法により実施すればよく、具体的には、例えば、放射性同位体であればＲＩ−ＨＰＬＣによる検出法を挙げることができる。
こうして検出された求核体には、反応性代謝物が結合している。すなわち、かかる検出により反応性代謝物の定性及び定量が可能となる。
次に、本発明の反応性代謝物の検出方法の第２の態様について説明する。
本発明の反応性代謝物の検出方法の第２の態様は、反応性代謝物の検出方法であって、標識された２種の求核体の存在下で被験化合物の代謝反応を行う反応工程と、酢酸アンモニウムを用いて液層分離を行い、有機層を得る分離工程と、当該有機層に含まれる反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。
先ず、本発明に係る反応工程において、標識された２種の求核体の存在下で被験化合物の代謝反応を行う。
ここで、かかる代謝反応において１種の求核体を用いて反応性代謝物の検出を行うことも可能であるが、この場合には、当該求核体の物理化学的性質に起因して特定の反応性代謝物由来のシグナルが検出されない場合がある（偽陰性）。本発明者らは、異種の２種の求核体を用いることによって互いの性質によって生じる相補的なシグナルを検出することにより、より正確なアッセイを行うことを可能にしている。なお、１種の求核体を用いる場合には、システインを用いることが好ましい。
当該反応の条件は、被験化合物の代謝反応が生じる条件であれば特に制限はないが、生体内の条件を反映していることが好ましい。かかる条件としては、具体的には、例えば、ｐＨ６．０〜８．０、温度３５〜４０℃の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等）を挙げることができ、このような溶液を反応液として用いることができる。代謝反応は、前記の溶液に被験化合物、代謝酵素を添加して行うが、その他、好適な反応条件になるよう、適宜試薬（塩化マグネシウム等）を添加してもよい。また、ここで使用される代謝酵素は、試験の目的に応じて精製又は粗精製された特定の薬物代謝酵素（例えば、シトクロムＰ４５０）を使用してもよく、代謝酵素を含む生体抽出物（例えば、肝ミクロソーム）を使用してもよい。
また、被験化合物、代謝酵素等の添加は、反応液調製と同時に添加してもよく、反応液を調製してプレインキュベーション（例えば、５〜３０分）をした後、添加してもよい。代謝反応の時間は特に制限はなく、試験の目的に応じて適宜決定すればよい。
所望の反応時間が経過した後、反応を停止させるが、反応を停止させる方法としても特に制限はなく、具体的には、例えば、アセトニトリルの添加、反応温度の変更（例えば、氷上へ静置）を挙げることができる。
また、反応工程を経た後は、必要に応じて求核体が結合した反応性代謝物を抽出する工程を経てもよい。抽出は、当業者に公知の方法によって行うことができるが、具体的には、例えば、アセトニトリルの添加と遠心分離又はこれを繰り返すことによるアセトニトリル層の分離と、かかる分離に続く濃縮乾固による抽出法が挙げられる。
次に、反応を停止させた溶液について高濃度塩溶液を用いて液層分離を行い、有機層を得る。ここで、高濃度塩としては、具体的には、例えば、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム又はギ酸アンモニウムを挙げることができる。また、高濃度塩溶液の濃度は、具体的には、酢酸ナトリウム又はギ酸アンモニウムの場合では、０．０５〜５．０Ｍであることが好ましく、０．１〜２Ｍであることがより好ましく、０．５〜１．５Ｍであることがさらに好ましく、０．７〜１．３Ｍであることが特に好ましい。また、酢酸アンモニウムの場合には、具体的には、０．１〜２Ｍであることが好ましく、０．５〜１．５Ｍであることがより好ましく、０．７〜１．３Ｍであることがさらに好ましい。また、添加量は反応系の総量に応じて適宜決定すればよいが、具体的には、例えば、反応系と同量を添加する方法を挙げることができる。高濃度塩を添加することにより偽陽性の原因となる構造を分解することができ、その結果と、偽陽性の生成を低減させることが可能となる。例えば、分子内にチアゾリジン構造を有する被験化合物の場合、酢酸アンモニウム添加によりチアゾリジン構造が分解され、偽陽性が低減することを、本発明者らは見出している。
続いて当該有機層に標識されていない非標識（ｃｏｌｄ）システインを添加してインキュベーションすることで、偽陽性を解消又は著しく低減させることが可能となる。システインの濃度に特に制限はないが、例えば１０〜６０ｍＭであることが好ましい。また、標識システインと置換し得るものであれば前記非標識システインに代えて使用することが可能であり、係る物質の例としては、例えば、グルタチオンを挙げることができる。
被験化合物が偽陽性なシグナルを生成した場合、非可逆的結合が生じていない、すなわち反応性がなくこの点については生体に対する毒性が無いと考えられる物について、逆の判断をしてしまうことから、医薬として良好な物性を有する化合物を排除してしまう原因となる。分離工程において酢酸アンモニウム溶液や標識されていないのシステインを用いることにより係る不都合が解消され、より効率のよい医薬の創製が可能となる。
こうして分離工程を経た後、反応性代謝物に結合した求核体の標識を検出する検出工程へと進む。求核体の標識の検出は、標識の種類に応じて適宜好適な方法により実施すればよく、具体的には、例えば、放射性同位体であればＲＩ−ＨＰＬＣによる検出法を挙げることができる。また、定性的な分析を行うには、ＭＳ（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：質量分析）を併用してもよい。ＲＩ−ＨＰＬＣ及びＭＳによる測定は、当業者に公知の方法により行えばよく、用いる装置の取扱説明書に従って行うことができる。
こうして検出された求核体には、反応性代謝物が結合している。すなわち、かかる検出により反応性代謝物の定性及び定量が可能となる。
以上述べたように、本発明の反応性代謝物の検出方法によれば、被験化合物の標識をする必要がないことから簡便に反応系を準備することができ、且つ、定性のみならず定量的に反応性代謝物を検出することが可能となる。また、偽陽性又は偽陰性のシグナル生成を解消させることが可能となり、より正確で効率的な被験化合物のスクリーニングを行うことが可能となる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（インキュベーション）
肝ミクロソーム（１ｍｇ／ｍＬ）、３ｍＭ塩化マグネシウム、５０μＭの被験化合物Ａ、１ｍＭ［３５Ｓ］システイン又は１００μＭ［１４Ｃ］シアン化ナトリウムを終濃度で加えたリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）を５分間、３７℃でプレインキュベーションし、ＮＡＤＰＨ水溶液を終濃度で１ｍＭとなるように加えて反応を開始した（インキュベーション容量１５０μＬ）。インキュベーション開始１時間後、反応液の３倍量（４５０μＬ）のアセトニトリルを加えて反応を停止させた。次に、５０ｍＭの非放射標識のシステインを含む１５０μＬの１Ｍリン酸緩衝液を加えて室温でよく混合し、遠心分離機で１００００ｇ、室温で５分間遠心分離しアセトニトリル層を得た。再び４５０μＬのアセトニトリルを加えて前記の方法と同様に液−液抽出を行い、アセトニトリル層を得た。得られたアセトニトリル溶液を窒素気流下で濃縮乾固し、４０μＬの４０％メタノール水溶液で再懸濁後ＲＩ−ＨＰＬＣ分析に供した。
（ＨＰＬＣによる分析）
前述のインキュベーションにより得られたサンプルをＲＩ−ＨＰＬＣに３０μＬインジェクションした。夾雑物によるＲＩ検出器のセルの汚染を防ぐために、インジェクション後５分間はｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｖａｌｖｅを用いてＲＩ検出器の前で排除した。ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
機種：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００  ｓｅｒｉｅｓ
カラム温度：４０℃
移動相：
Ｂｉｎａｒｙ  ｐｕｍｐ  Ａ：ＣＨ３ＣＮ／１００ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４／Ｈ２Ｏ＝５／１０／８５（Ｖ／Ｖ／Ｖ）
Ｂｉｎａｒｙ  ｐｕｍｐ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／１００ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４＝９０／１０（Ｖ／Ｖ）
７５分間のグラジエント分析を行った。
［３５Ｓ］システインを単独で用いた試験の結果から、Ｂｒａｎｄｅｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ法により得られた非可逆的結合値を横軸に、当該アッセイで得られたＲＩエリアを縦軸に対数表示でプロットした結果を図１に示す。図１に示すとおり、非可逆的結合値とＲＩエリア値との間にはある程度の相関が観測された。しかし、非可逆的結合が観測されないのにＲＩエリアが観測される“偽陽性”化合物が認められ、またその逆である“偽陰性”化合物も認められた。一方、図２に示すとおり、［１４Ｃ］シアン化ナトリウムを単独で用いた試験の結果から、ハード求電子体であるイミニウムを生成しうる構造を有する化合物群では非可逆的結合との間に、ある程度の相関関係が得られたが、イミニウムを生成し得ない構造を有する化合物についてはＲＩエリアを得ることができず、多くの偽陰性を与える結果となった。これらの試験の結果を詳細に解析すると、放射標識システインの系でＲＩピークを作らなかった化合物が、放射標識シアノの系でＲＩピークを生成したという結果が得られた。
［実施例２］
次に、放射標識されたシステインとシアノを混合してインキュベーションを行うことで２つの相異なった代謝的活性化機構を経て生成した反応性代謝物を同時にトラップすることにより、２種のトラップ剤相互の結果を相補できるのではないかと考え、２種のトラップ剤を混合して“ｍｉｘｅｄ  ｔｒａｐｐｉｎｇ”を行った。
先ず、被験化合物Ａと肝ミクロソームとのインキュベーションは実施例１と同様に行った。インキュベーション開始１時間後、反応液の３倍量（４５０μＬ）のアセトニトリルを加えて反応を停止させた。次に、１５０μＬの１Ｍリン酸緩衝液を加えて室温でよく混合し、遠心分離機で１００００ｇ、室温で５分間遠心分離しアセトニトリル層を得た。再び４５０μＬのアセトニトリルを加え、前記の方法と同様に液層分離を行ってアセトニトリル層を得た。得られたアセトニトリル溶液を窒素気流下で濃縮乾固し、４０μＬの４０％メタノール水溶液で再懸濁後ＲＩ−ＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣは実施例１と同様の条件で実施した。
Ｍｉｘｅｄ  ｔｒａｐｐｉｎｇの結果、図３に示すとおり、トラップ剤としてシステイン又はシアン化ナトリウム単独で用いた場合よりも、ＲＩエリアと非可逆的結合との相関関係、特に偽陰性の認められる頻度に関して、改善がみとめられた。しかし、依然として特定の化合物において偽陽性が検出された。
［実施例３］
実施例２において、偽陽性を示した化合物について、そのほとんどが放射標識システインに由来したピークを示すことと、ＬＣ−ＭＳにおけるＭＳ／ＭＳフラグメントパターンの解析から、化合物とシステインの結合様式が類似している可能性が示唆されていた。この事から、偽陽性を示した代表的な化合物について、システイン共存下で肝ミクロソームのインキュベーションを行い、得られたシステイン付加体に関してＮＭＲを用いて構造解析を行った。その結果、システイン付加体はシステインが分子内で環状化し、安定なチアゾリジン構造をとっていることが明らかとなった。また、チアゾリジン構造の生成メカニズムから、代謝的に生成するアルデヒドとシステインのアミノ基が反応し、結果として生成したイミンにシステインのスルフィドリル基が反応し、チアゾリジン構造を生成したと考えられた。この付加−環化反応は、ｔｒａｐｐｉｎｇ試薬としてシステインを用いる限り不可避であり、偽陽性を示す可能性が高いと考えられた。ここで、代謝的なアルデヒドの生成を止めることはできないので、生成したチアゾリジンを分解するか、非放射標識のシステインと置き換えてＲＩピークを減少させるという観点から、インキュベーション後のサンプル処理について検討した。
先ず、被験化合物Ａと肝ミクロソームとのインキュベーションは実施例１と同様に行った。インキュベーション開始１時間後、反応液の３倍量（４５０μＬ）のアセトニトリルを加えて反応を停止させた。次に、１５０μＬの１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を加えて室温でよく混合し、遠心分離機で１００００ｇ、室温で５分間遠心分離しアセトニトリル層を得た。再び４５０μＬのアセトニトリルを加え、前記の方法と同様に液−液抽出を行ってアセトニトリル層を得た。得られたアセトニトリル溶液に５０ｍＭの非放射標識のシステイン水溶液を１５０μＬ加え、よく混合した後３７℃で５時間インキュベーションした。インキュベーション後、窒素気流下で濃縮乾固し、４０μＬの４０％メタノール水溶液で再懸濁後ＲＩ−ＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣは実施例１と同様の条件で実施した。
図４に示すとおり、非可逆的結合とＲＩエリアとの間の相関関係は改善され、また、偽陽性を示す付加体の生成を抑えることができた。この結果から、本発明の反応性代謝物の検出方法は、非可逆的結合のアッセイとして非常に有用であることを確認することができた。
［実施例４］
ヒト肝ミクロソームに代えてラットの肝ミクロソームを用いた以外は実施例３と同様に試験を行った結果、実施例３と同様に、非可逆的結合とアッセイ結果との間に比較的良い相関関係がみられ、また、偽陽性を示す付加体の生成を抑えられたことから、非可逆的結合のアッセイとして非常に有用であることを確認することができた。
［実施例５］
ＲＩ−ＨＰＬＣ測定による定量的な活性代謝物生成の評価に加え、ＲＩ−ＨＰＬＣ−ＭＳ測定を行なうことにより活性代謝物の定性的評価を同時に実施することを目的として、下記の試験を行った。
（インキュベーション）
肝ミクロソーム（１ｍｇ／ｍＬ）、３ｍＭ塩化マグネシウム、５０μＭの被験化合物（トログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）：ＳＩＧＭＡ社）、１ｍＭ［３５Ｓ］システイン又は１００μＭ［１４Ｃ］ｓｏｄｉｕｍ  ｃｙａｎｉｄｅを加えたリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）を５分間、３７℃でプレインキュベーションし、ＮＡＤＰＨ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを加え反応を開始した（濃度は終濃度、インキュベーション容量１５０μＬ）。トログリタゾンの構造式は下記のとおりである。
【化１】
2007032544.tif 000002
１時間後、反応液の３倍量（４５０μＬ）のアセトニトリルを加えて反応を停止させた後、１５０μＬの１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を加えて室温でよく混合し、遠心分離機で１３０００ｇ、室温で５分間遠心分離しアセトニトリル層を得た。再び４５０μＬのアセトニトリルを加え、同上の抽出操作を行いアセトニトリル層を得た。得られたアセトニトリル溶液に５０ｍＭの非放射標識のシステイン水溶液を１５０μＬ加え、よく混合した後３７℃で５時間インキュベーションした。インキュベーション後、窒素気流下で濃縮乾固し、４０μＬの４０％メタノール水溶液で再懸濁後ＲＩ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析に供した。
（分析方法）
得られたサンプルをＲＩ−ＨＰＬＣ−ＭＳにて測定した。サンプル注入量は３０μＬとした。夾雑物によるＲＩ検出セルの汚染防止のため、サンプル注入後６．５分間はＨＰＬＣカラムからの溶出液は検出器へ導入しなかった（その間、ＲＩ検出器へは０．１％ギ酸含有アセトニトリルを導入した）。サンプル注入後６．５分以降の溶出液はＲＩ検出器に導入し、オンラインでの放射活性測定を行なった。またサンプル注入後７分以降の溶出液は質量分析装置にも導入し、ＲＩ検出器による放射活性の測定と同時にＭＳ／ＭＳ（／ＭＳ）分析を行なった。質量分析装置及びＲＩ検出器への溶出液の流入比は、質量分析装置：ＲＩ検出器＝１：４（体積比）とした。
本試験ではｉｏｎ  ｔｒａｐ型の質量分析装置を用いた（ＬＣＱ  ｄｅｃａ  ＸＰ  ｐｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎｅ社）。ＭＳ／ＭＳ分析は、評価対象化合物に１分子のシステインが付加した場合を意味する［被験化合物分子イオン＋１１９］Ｄａ並びに評価対象化合物に１酸化及び１分子のシステインが付加した場合を意味する［被験化合物分子イオン＋１６＋１１９］Ｄａに対して行った。また、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析は、ＭＳ／ＭＳ分析にて得られたＭＳ／ＭＳフラグメントの中で最も強度が強いイオンを自動的にＭＳ／ＭＳ／ＭＳスキャンする方法（ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｓｓ  ｓｃａｎ、ＬＣＱの付属機能）により行った。それぞれの化合物のＭＳ（／ＭＳ）測定に対するｔｕｎｉｎｇ  ｆｉｌｅは測定前に作成し、実測時にそれぞれを使用した。
移動相はＡ液としてＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ／１００ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４／ＣＨ３ＣＮ＝０．５／８００／１００／１００、Ｂ液としてＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ／１００ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４／ＣＨ３ＣＮ＝０．５／１００／９００を用い、７０分間のグラジエント分析を行った。ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
機種：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００  ｓｅｒｉｅｓ
カラム温度：４０℃
移動相：
Ｂｉｎａｒｙ  ｐｕｍｐ  Ａ：ＣＨ３ＣＮ／１００ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４／Ｈ２Ｏ／ＨＣＯＯＨ＝１００／１００／８００／０．５（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）
Ｂｉｎａｒｙ  ｐｕｍｐ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／１００ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４／ＨＣＯＯＨ＝９００／１００／０．５（Ｖ／Ｖ／Ｖ）
Ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ  ｐｕｍｐ：ＣＨ３ＣＮ／ＨＣＯＯＨ＝１００／０．１（Ｖ／Ｖ）
図５〜７に示すとおり、ＭＳ／ＭＳ測定において、インキュベーションにより生成した［３５Ｓ］システイン付加体（図５）のＭＳ／ＭＳスペクトル（図６）、及びＭＳ／ＭＳ／ＭＳスペクトル（図７）を一度の測定で得ることができ、効率的に付加体の構造解析を行うことができた。構造解析から推定される代謝反応後の構造式を化２に示す。
【化２】
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化合物の定性的な解析が可能となることにより、化合物合成の際の構造変換の指標となるばかりか、反応性代謝物が化合物のどの部分に生成するかを推測することが可能となる。
すなわち、本発明の方法により、反応性代謝物の生成を定量的に評価できると同時に、代謝的活性化部位を絞り込めると考えられ、創薬段階の化合物の最適化に有効であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の反応性代謝物の検出方法によれば、簡便に反応系を準備することができ、且つ、定量的に反応性代謝物を検出することが可能となる。また、ＭＳを組み合わせることにより定性的な検出も可能となる。さらに、偽陽性（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のシグナル生成を解消させ、又、偽陰性（ｆａｌｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）のシグナル生成を低減させることが可能となり、より正確で効率的な被験化合物の薬物動態試験やスクリーニングを行うことが可能となる。従って、ヒトのみならず動物の医薬に至るまで、医薬の開発段階において非常に便利な手法として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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