(57)【要約】  ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボン、３−ヒドロキシピリジン、及びバニリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする抗微生物剤及びこれを含有する抗微生物性組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボン、３−ヒドロキシピリジン、及びバニリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする抗微生物剤。
【請求項２】
微生物が、Streptococcus、Enterococcus、Staphylococcus、Escherichia、Salmonella、Yersinia、Vibrio、Pseudomonas、Bacillus、及びCandidaからなる群から選ばれる請求項１記載の抗微生物剤。
【請求項３】
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、及び５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンからなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする抗微生物剤。
【請求項４】
微生物が、Streptococcus、Enterococcus、Staphylococcus、Escherichia、Salmonella、Yersinia、Vibrio、Pseudomonas、Bacillus、及びCandidaからなる群から選ばれる請求項３記載の抗微生物剤。
【請求項５】
３−ヒドロキシピリジンを有効成分として含有し、微生物が、Sterptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Sterptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌), 及びCandida sp. (カンジダ) からなる群から選ばれる請求項１記載の抗微生物剤。
【請求項６】
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドを有効成分として含有し、微生物が、Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Streptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Escherichia coli (大腸菌), Salmonella sp. (サルモネラ菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Vibrio parahaemolyticus (腸炎ビブリオ), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌), Bacillus cereus (セレウス菌), Bacillus subtilis (枯草菌), 及びCandida sp. (カンジダ)からなる群から選ばれる請求項１記載の抗微生物剤。
【請求項７】
バニリンを有効成分として含有し、微生物が、Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Streptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Escherichia coli (大腸菌), Salmonella sp. (サルモネラ菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Vibrio parahaemolyticus  (腸炎ビブリオ), Bacillus cereus (セレウス菌), Bacillus subtilis (枯草菌), 及びCandida sp. (カンジダ) からなる群から選ばれる請求項１記載の抗微生物剤。
【請求項８】
５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンを有効成分として含有し、微生物がSalmonella sp. (サルモネラ菌), 及びPseudomonas aeruginosa (緑膿菌からなる群から選ばれる請求項１記載の抗微生物剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の抗微生物剤を含有する抗微生物性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗微生物剤及び抗微生物性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ササエキスは古くから抗菌性を有することが知られている。例えば、創傷感染症の原因菌となる細菌である黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸菌(Escherichia coli)に対する抗菌効果（特許文献１、特許文献２）や、胃潰瘍の原因菌とされるピロリ菌（Helicobacter pylori）に対する抗菌効果が報告されている。
隈笹は、イネ科ササ属の植物で、一般的に山に生える笹を熊笹というが、冬になると葉緑が白く枯れて隈取られるものを総称していう。熊笹と隈笹とは異なり、隈笹の学名は Sasa albo marginato Makino et Shibata である。現在ではほぼ日本全国に栽培されているが、これは人為的に広められたものである。【０００３】
古来から隈笹は、東洋医学の「漢方薬」として知られているインドのギムマネ・シルベスタ、中国のグァバ、韓国のクコと並び称されるほどその効能は非常に幅広い。日本においても胃病、糖尿病、高血圧などの伝統的な民間薬（非特許文献１−３）として利用されてきた。また、笹団子やチマキなどの食品包装材や保健強壮剤として利用されてきた。
戦後、動物実験によって隈笹にネズミの肝癌に対しの抑制活性があることが発見され、制癌活性の面からいくつかの薬理学的研究（非特許文献４）がなされてきた。また、隈笹の有する優れた防腐効果（非特許文献５）、抗菌効果（非特許文献６）についても研究がなされてきた。しかし、その多くはガスクロマトグラフィーによる有機酸の分析に過ぎず、抗菌効果の本体の単離精製についての報告例は少ない。
クマル酸及びその誘導体が大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌に対する抗菌性を有することも知られている（特許文献３）。
また、クマザサエキスには、クマル酸、フェルラ酸、カフェ酸、バニリン等のフェニルプロパノイド、３−ヒドロキシピリジン等が含まれ、これらの混合物が大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌に対する抗菌性を有することも知られている（特許文献４）。【０００４】
【特許文献１】ＷＯ００／０６７７０７
【特許文献２】特開２００３−２０１２４７
【特許文献３】特開２００４−３５９６２６
【特許文献４】特開２００６−３６７３１
【非特許文献１】柴田丸, 久保恭子, 小野田眞：日本薬学会誌, 98, 1436 (1978).
【非特許文献２】S. Okabe, K. Takeuchi, K. Takagi, M. Shibata, Jpn. J. Pharmacol., 25, 608 (1975).
【非特許文献３】柴田丸, 佐藤冬恵, 竹下一夫, 大谷孝吉:生薬学雑誌,34, 274 (1980)
【非特許文献４】M. Shibata, K. Kubo, M. Onoda, Folia Pharmacol. Jpn, 72, 531-541 (1976)
【非特許文献５】N. V. Chuyen, T. Kurata, H. Kato, J. Antibact. Antifung. Agents, 11, 69-75 (1983)
【非特許文献６】N. V. Chuyen, H. Kato, Agric. Biol. Chem., 46, 2795-2801(1982)3-1128 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗微生物剤を提供することである。
本発明の他の目的は、該抗微生物剤を含有する抗微生物性組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下に示す抗微生物剤及びこれを含有する抗微生物性組成物を提供するものである。
１．ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボン、３−ヒドロキシピリジン、及びバニリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする抗微生物剤。
２．微生物が、Streptococcus、Enterococcus、Staphylococcus、Escherichia、Salmonella、Yersinia、Vibrio、Pseudomonas、Bacillus、及びCandidaからなる群から選ばれる上記１記載の抗微生物剤。
３．ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、及び５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンからなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする抗微生物剤。
４．微生物が、Streptococcus、Enterococcus、Staphylococcus、Escherichia、Salmonella、Yersinia、Vibrio、Pseudomonas、Bacillus、及びCandidaからなる群から選ばれる上記３記載の抗微生物剤。
５．３−ヒドロキシピリジンを有効成分として含有し、微生物が、Sterptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Sterptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌), 及びCandida sp. (カンジダ) からなる群から選ばれる上記１記載の抗微生物剤。
６．ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドを有効成分として含有し、微生物が、Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Streptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Escherichia coli (大腸菌), Salmonella sp. (サルモネラ菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Vibrio parahaemolyticus (腸炎ビブリオ), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌), Bacillus cereus (セレウス菌), Bacillus subtilis (枯草菌), 及びCandida sp. (カンジダ)からなる群から選ばれる上記１記載の抗微生物剤。
７．バニリンを有効成分として含有し、微生物が、Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Streptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Escherichia coli (大腸菌), Salmonella sp. (サルモネラ菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Vibrio parahaemolyticus  (腸炎ビブリオ), Bacillus cereus (セレウス菌), Bacillus subtilis (枯草菌), 及びCandida sp. (カンジダ) からなる群から選ばれる上記１記載の抗微生物剤。
８．５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンを有効成分として含有し、微生物がSalmonella sp. (サルモネラ菌), 及びPseudomonas aeruginosa (緑膿菌からなる群から選ばれる上記１記載の抗微生物剤。
９．上記１〜８のいずれか１項記載の抗微生物剤を含有する抗微生物性組成物。
本発明において「微生物」とは、細菌、放線菌、シアノバクテリア、古細菌、菌類、酵母、藻類、ウイルス等、特にヒトを含む動植物に対して好ましくない影響を及ぼすものを意味するものとする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の抗微生物剤は、各種の微生物、特にStreptococcus、Enterococcus、Staphylococcus、Escherichia、Salmonella、Yersinia、Vibrio、Pseudomonas、Bacillus、Candida等、さらに具体的にはStreptococcus pneumoniae (肺炎球菌)、Streptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌)、Enterococcus faecalis (腸球菌)、Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌)、Escherichia coli (大腸菌)、Salmonella sp. (サルモネラ菌)、Yersinia enterocolitica (エルシニア)、Vibrio parahaemolyticus (腸炎ビブリオ)、Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌)、Bacillus cereus (セレウス菌)、Bacillus subtilis (枯草菌)、Candida sp. (カンジダ)に対して高い抗微生物活性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明者らは、隈笹の抗菌効果の本体を解明し、その抗菌有効成分を特定するため、隈笹の葉の熱水抽出物を各種溶媒にて分画した。次にシリカゲルクロマトグラフィーで分画した後に、TLCによる分取や高速液体クロマトグラフ装置の分取用ODSカラムを用いて単離精製を行い、さらに、各種スペクトルを用いて単離した化合物の構造を決定するとともに13種類の菌に対して抗菌試験を行った。その結果、上記ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボン（以下、「トリシン」ともいう）、及び３−ヒドロキシピリジン、トランス−ｐ−クマル酸（トランス−ｐ−ヒドロキシ桂皮酸）、バニリンが各種の微生物に対して特異的に抗微生物活性を示すことを見出し、本発明を完成した。【０００９】
以下本発明を具体的に説明する。
実験材料は、鳳凰堂株式会社から入手した隈笹の葉の熱水抽出物（Sasa albo-marginato）（商品名TWEBS)を用いた。この熱水抽出物 (以降Saとする) 10 gをエバポレーターで溶媒留去させたところ固形分として6.2 gを得た。このことから原料である隈笹の葉の熱水抽出物は38 %の水分を含有していることを確認した。
この熱水抽出物を用いて各種溶媒にて分画を行った。すなわち、熱水抽出物 (Sa) を酢酸エチルによる抽出操作を行い得られた酢酸エチル層を溶媒留去して酢酸エチル可溶画分 (以降Sa-1とする) とした。水層はさらにn-ブタノールにて抽出操作を行い同様の処理にて、n-ブタノール可溶画分と水層をそれぞれ得た。この処理によって得た酢酸エチル可溶画分 (Sa-1)、n-ブタノール可溶画分、水層および原料である熱水抽出物 (Sa) のStaphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌) に対する抗菌試験を行った。抗菌試験にはcup法という方式を用いた。cup法とは、まず菌培地の中心に直径7.32 mmのカップを置きそのカップに試料溶液を滴下することでカップを中心に試料溶液が同心円状に広がる。抗菌作用がある場合は菌の繁殖を阻止することを示す阻止円が形成される。すなわち、抗菌作用と阻止円の大きさには正の相関があるため、その阻止円の大きさで抗菌効果の強弱を判定するという方法である。各分画成分のStaphylococcus aureusに対する抗菌試験の結果を表１に示す。【００１０】
【表１】
2007105581.tif 000002
判定の表記は、抗菌効果が： ++++ かなり強い、++ ある、+ わずかにある、‐ない
ここで、ブランク7.32 mmはカップの直径である。【００１１】
抗菌試験の結果、酢酸エチル可溶画分が隈笹熱水抽出物の原液とほぼ同様の抗菌活性を示した。一方、n-ブタノール可溶画分、水層画分の抗菌活性はわずかなものであった。
上記抗菌試験の結果より酢酸エチル可溶画分に抗菌活性が局在していることが確認されたので隈笹の葉の熱水抽出物 (Sa) 2.3 kgを酢酸エチルで抽出操作を行った。得られた酢酸エチル層を溶媒留去して酢酸エチル可溶画分 (Sa-1) 78 gを得た。
得られたSa-1のStaphylococcus aureusに対する抗菌活性を確認した結果、活性を示した。【００１２】
Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）に対する抗菌活性
抗菌活性をもつ成分の分画精製
酢酸エチル可溶画分 (Sa-1) の分画
抗菌活性を示した酢酸エチル可溶画分 (Sa-1) 52 gを中性シリカゲルクロマトグラフィーを用いて分画した。カラムの溶出溶媒は、段階的に溶媒の混合比を変えていくstep wise方式を採用した。n-ヘキサン/酢酸エチル＝5:5を2.5 L、4:6, 3:7, 2:8で各1 Lづつ、メタノールのみで2.5 Lを使用した。溶出成分の分別はTLCの結果に基づき、それらのスポットの検出はUV 254 nmを用いた。その結果、酢酸エチル可溶画分を7フラクションに分画した。7フラクションはそれぞれSa-1-A (90 mg), Sa-1-B (250 mg), Sa-1-C (3.36 g), Sa-1-D (3.00 g), Sa-1-E (110 mg), Sa-1-F (1.56 g), Sa-1-G (30.0 g) とした。【００１３】
まず、Sa-1-C (3.36 g) をクロロホルム5 mLに溶解させ、クロロホルムと同量のn-ヘキサンを加え一晩静置した。すると二層に分離したため、上層 (以降Sa-1-C(1)とする) と下層 (以降Sa-1-C(2)とする) に分けた。このSa-1-C(1) を溶媒留去すると2.22 g、Sa-1-C(2) は1.14 gであった。
Sa-1-C(1) の分析
Sa-1-C(1) 2.22 g にシリカゲル3.50 gを加え吸着させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画した。カラムの溶出溶媒にはstep wise方式を採用し、その組成はクロロホルム/アセトン＝20:1を2 L、7:3, 6:4で各100 mLづつ、アセトンのみで500 mLを使用した。その回収には、110 個の50 mLバイアルを用いた。110 個の50 mLバイアルからTLCに基づき、同じ位置にスポットがあったNo. 21, 22 のバイアルを混合して濃縮することで濃縮物 (以降Sa-1-C(1)-aとする) を得た。この濃縮物をメタノール (0.5 mL) に溶かし、高速液体クロマトグラフ装置 (HPLC) の分取用ODSカラムを用いて分画を試みた。【００１４】
No. 21, 22のバイアル濃縮物 (Sa-1-C(1)-a) のHPLC分取
溶出条件：カラム：Wakosil-II 5C18HG prep,φ20.0 mm×250 mm、移動層：20 % アセトニトリル水溶液、流速：5 mL / min、カラム温度：30 ℃、検出：UV 260 nm
34.5 分の主要なピークを分取し、白色固体 (以降Sa-1-C(1)-aaとする) 60 mgを得た。この白色固体 (Sa-1-C(1)-aa) を重メタノールで1H, 13C NMRスペクトルを測定した。
白色固体 (Sa-1-C(1)-aa) の1H, 13C NMRスペクトル
1H NMR (500 MHz, CD3OD) : δ 3.91 (s, 3H), 6.94 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 9.74 (s, 1H)
13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ56.3, 111.2, 116.3, 127.9, 130.6, 149.6, 154.6, 192.8
IR (KBr) : 3179, 1668 cm-1
mp : 114-115℃【００１５】
1H NMRスペクトルにおいてδ9.74に水素1個のシグナルと13C NMRスペクトルにおいてδ192.8のシグナルを観測したことからアルデヒド基が存在することが示唆された。1H NMRスペクトルにおいてδ3.91のシグナルと13C NMRスペクトルにおいてδ56.3のシグナルからメトキシ基が存在することが示唆された。また、1H NMRスペクトルにおいてδ6.94 (d, J = 8.6 Hz, 1H)とδ7.42 (d, J = 8.6 Hz, 1H), δ7.43 (s, 1H) に水素3個分および13C NMRスペクトルにおいてδ111.2-154.6に芳香族環に由来する6本のシグナルが観測された。さらにIRスペクトルにおいて3179 cm-1に水酸基の特徴的な吸収を確認した。以上の結果から白色固体 (Sa-1-C(1)-aa) の構造は、３−ヒドロキシ−４−メトキシベンズアルデヒド (バニリン) であると推定した。バニリンは、既知化合物であるため文献値（The Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra EDITION 1 Volume 2, Aldrich Chemical Company, Inc.）との比較を行い、さらに異性体であるイソバニリンの可能性もあるためこの白色固体 (Sa-1-C(1)-aa) と試薬として購入したバニリン、イソバニリンを用いて高速液体クロマトグラフ装置 (HPLC) の分析用ODSカラムで確認し、この白色固体 (Sa-1-C(1)-aa) がバニリンであると決定した。【００１６】
次に110 個の50 mLバイアルからTLCに基づき、同じ位置にスポットがあったNo. 48- 55のバイアルを混合して濃縮することで濃縮物 (以降Sa-1-C(1)-bとする) 152 mgを得た。これを再びシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画を行った。カラムの溶出溶媒にはstep wise方式を採用し、クロロホルムのみ200 mLから始め、クロロホルム/アセトン＝9.5:0.5を200 mL 、9:1, 8:2, 7:3, アセトンのみで各100 mLづつ、最後にメタノールのみで200 mLを使用した。その回収には42 個の50 mLバイアルを用いた。
42 個の50 mLバイアルからTLCに基づき、同じ位置にスポットがあったNo. 23- 33 のバイアルを混合して濃縮することで濃縮物 (以降Sa-1-C(1)-baとする) 102 mgを得た。この濃縮物を分取用TLCを用いて精製した。展開溶媒には、クロロホルム/アセトン＝7/3を使用した。検出には、UV 254 nmを用い、掻き取ったシリカゲルをアセトンで溶出し吸引濾過後、溶媒留去して薄黄色固体 (以降Sa-1-C(1)-baaとする) 86 mgを得た。この薄黄色固体 (Sa-1-C(1)-baa) を重メタノールで1H, 13C NMRスペクトルを測定した。【００１７】
薄黄色固体 (Sa-1-C(1)-baa) の1H, 13C NMRスペクトル
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δ6.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 9.76 (s, 1H)
13C NMR (125 MHz, CD3OD): δ116.8, 130.2, 133.4, 165.1, 192.8
IR (KBr) : 3168, 1670 cm-1
mp : 118-119℃【００１８】
1H NMRスペクトルにおいてδ9.76に水素1個のシグナルと13C NMRスペクトルにおいてδ192.8のシグナルを観測したことからアルデヒド基が存在することが示唆された。また、1H NMRスペクトルにおいてδ6.92, 7.77に水素2個分で8.6 Hzのダブレットのシグナルが認められ、13C NMRスペクトルではδ116.8-165.1に4本の芳香族由来のシグナルが観測されたことよりパラ位に置換された芳香族環で存在することがわかる。さらにIRスペクトルにおいて3168 cm-1に水酸基の特徴的な吸収を確認した。以上の結果からこの薄黄色固体 (Sa-1-C(1)-baa) は、アルデヒド基と水酸基がパラ位に置換したｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドであると考えた。そこで、文献値（The Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra EDITION 1 Volume 2, Aldrich Chemical Company, Inc.）との比較を行い、この薄黄色固体 (Sa-1-C(1)-baa) は、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドであると決定した。【００１９】
Sa-1-C(2) の分析
Sa-1-C(2) 1.14 gを2度の再結晶 (アセトン/ヘキサン) によって薄い黄緑色固体 (以降Sa-1-C(2)-aとする) 478 mgを得た。この薄い黄緑色固体 (Sa-1-C(2)-a) を重メタノールで1H, 13C NMRスペクトルを測定した。
薄い黄緑色固体 (Sa-1-C(2)-a) の1H, 13C NMRスペクトル
1H NMR (500 MHz, CD3OD) : δ6.28 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 16.0 Hz, 1H)
13C NMR (125 MHz, CD3OD) : δ115.6, 116.8, 127.2, 131.1, 146.7, 161.1, 171.0
IR (KBr) : 3168, 2830, 975 cm-1
mp : 213-214℃【００２０】
1H NMRスペクトルにおいてδ6.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H) および7.45 (d, J = 8.6 Hz, 2H) に水素4個分の2個のダブレットシグナルが13C NMRスペクトルにおいてδ115.6および131.1に炭素2個分の大きなシグナルが2本観測されたことからこの化合物は、パラ位に置換した芳香族環を有すると判断された。また、1H NMRスペクトルにおいてδ6.28 (d, J = 16.0 Hz, 1H)および7.61 (d, J = 16.0 Hz, 1H)に16.0 Hzのカップリング定数がある水素がそれぞれ2個観測されたところからトランス位に置換したアルケンが1組存在することがわかった。さらに、13C NMRスペクトルにおいてδ171.0にカルボニル基の存在が確認された。さらにIRスペクトルにおいて3168 cm-1に水酸基の特徴的な吸収を確認した。以上のことからこの薄い黄緑色固体 (Sa-1-C(2)-a) の構造は、トランス−ｐ−クマル酸であると判断した。そこで文献値（The Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra EDITION 1 Volume2, Aldrich Chemical Company, Inc.）との比較を行い、この薄い黄緑色固体 (Sa-1-C(2)-a)は、トランス−ｐ−クマル酸であると決定した。【００２１】
Sa-1-Fの分析
酢酸エチル可溶画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画したフラクションのうちSa-1-F (1.56 g) にクロロホルムを加えよく攪拌し、溶けた液層を取り除いた。その後、クロロホルムに溶けなかったものに対してアセトンを加え、アセトン可溶の液層(以降Sa-1-F(1)とする) とアセトン不溶の固層(以降Sa-1-F(2)とする) に分けた。Sa-1-F(1) は溶媒留去して162 mg、Sa-1-F(2) は1.40 gであった。【００２２】
Sa-1-F(1) の分析
Sa-1-F(1) 162 mg に再びアセトンを加え溶かし、静置した。その後、液層の濁っていない上層部のみを回収した。アセトン溶媒を留去し黄色固体 (以降Sa-1-F(1)-aとする) 10 mgを得た。高速液体クロマトグラフ装置 (HPLC) の分析用ODSカラムを用いてこの化合物の純度を確認したところ、純度は非常に高いことがわかった。また、UV 260 nmにおいて強い吸収を持つことがわかった。
この黄色固体 (Sa-1-F(1)-a) を重アセトンで1H, 13C NMRスペクトルを測定した。【００２３】
黄色固体 (Sa-1-F(1)-a) の1H, 13C NMRスペクトル
1H NMR (500 MHz, (CD3)2CO) : δ3.97 (s, 6H), 6.26 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 7.39 (s, 2H)
13C NMR (125 MHz, (CD3)2CO) : δ56.9, 94.9, 99.7, 104.7, 105.2, 105.4, 122.4, 140.9, 149.1, 158.8, 163.4, 164.9, 165.1, 183.1
IR (KBr) : 3357, 1615 cm-1
mp : 276-277℃
MS (FAB) : m/z = 331 [M++1]【００２４】
13C NMR スペクトルより炭素が17個存在し、DEPTより1級炭素が2個、3級炭素が5個、4級炭素が10個存在することを確認した。1H NMRスペクトルにおいてδ3.97 (s, 6H) に水素6個分のシングレットシグナルが13C NMR スペクトルにおいてδ56.9にシグナルが観測されたことから2個の等価なメトキシ基が存在することがわかる。さらにIRスペクトルにおいて3357 cm-1に水酸基の存在、1615 cm-1に水素結合の可能性のあるカルボニル基の吸収を確認した。また、質量分析の結果、分子量は330であり、C17H14O7の可能性が考えられた。この黄色固体 (Sa-1-F(1)-a) が下記の式で５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンであると考えた。そこで文献値（C. Kong, X. Xu, B. Zhou, F. Hu, C. Zhang, M. Zhang, Phytochemistry, 65, 1123-1128 (2004)）との比較を行い、文献値と近いことからこの黄色固体 (Sa-1-F(1)-a) が５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンであると決定した。【００２５】
Sa-1-F(2) の分析
Sa-1-F(2) 1.40 g にシリカゲル3.00 g を加え吸着させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画した。カラムの溶出溶媒にはstep wise方式を採用し、クロロホルム/アセトン＝10:1, 8:2を200 mL、5:5, 3:7, アセトンのみで各300 mLづつ、メタノールのみで200 mLを使用した。その回収には、53 個の50 mLバイアルを用いた。
53個の50 mL バイアルからTLCの結果に基づき、同じ位置にスポットがあったNo. 42-48のバイアルを混合して濃縮することで薄黄色個体 (以降Sa-1-F(2)-aとする) 46 mgを得た。この薄黄色固体 (Sa-1-F(2)-a) を重メタノールで1H, 13C NMRスペクトルを測定した。【００２６】
薄黄色固体 (Sa-1-F(2)-a) の1H, 13C NMRスペクトル
1H NMR (500 MHz, CD3OD) : δ 7.21-7.28 (m, 2H), 7.99 (dd, J = 4.1.0.7 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 2.3 Hz, 1H)
13C NMR (125 MHz, CD3OD) : δ 124.4, 125.9, 138.3, 140.8, 155.9
IR (KBr) : 3449 cm-1
mp : 127-128℃【００２７】
1H NMRスペクトルにおいてδ7.21-7.28 (m, 2H)とδ7.99 (dd, J = 4.1.0.7 Hz, 1H), δ8.09 (d, J = 2.3 Hz, 1H)に水素4個分および13C NMRスペクトルにおいてδ124.4-155.9に芳香族環に由来する5本のシグナルが観測された。さらにIRスペクトルにおいて3168 cm-1に水酸基の特徴的な吸収を確認した。以上のことから薄黄色固体 (Sa-1-F(2)-a) が３−ヒドロキシピリジンであると考えた。そこで文献値（The Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra EDITION 1 Volume2, Aldrich Chemical Company, Inc.）との比較を行い、文献値と近いこと、および融点 (文献値 126-129℃) からこの薄黄色固体 (Sa-1-F(2)-a) が３−ヒドロキシピリジンであると決定した。【００２８】
抗菌試験
寒天希釈法（Agar dilution法）
トランス−ｐ−クマル酸, ３−ヒドロキシピリジン, ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド, バニリンに対しては、寒天希釈法という抗菌試験法を用いた。
寒天希釈法とは、はじめに溶かした試料溶液を数段階に希釈し、寒天培地と混ぜ、試料濃度の異なる平板培地を作成する。この平板培地に菌を植え付け、試料に抗菌活性がある場合は菌の発育を阻止することができ、菌の発育を阻止できた最も低い濃度を最小発育阻止濃度 (MIC : Minimum Inhibitory Concentration) として試料の抗菌効果の強弱を判定するという方法である。
まず、試料400 mgをDMSO 1 mLに溶かし、400 mg/mLの試料溶液を調製した。この400 mg/mLの試料溶液0.5 mLを2倍希釈し、200 mg/mLの試料溶液を調製し、同様にして100 mg/mL, 50.0 mg/mL, 25.0 mg/mLの試料溶液を調製した。また、300 mg/mL試料溶液も用意した。これらの試料溶液0.2 mLをBHI (Brain Heart Infusion Agar, Becton Dickinson, MD) 培地19.8 mLと混ぜ、シャーレに試料濃度4.0 mg/mL, 3.0 mg/mL, 2.0 mg/mL, 1.0 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mLの平板培地を作成した。試料の抗菌効果の比較対照としてカテキンの同濃度平板培地も作成した。カテキンはDMSOに難溶なため、滅菌水を用いた。【００２９】
今回被験菌としてStreptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Streptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Enterococcus faecalis (腸球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Escherichia coli (大腸菌), Salmonella sp. (サルモネラ菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Vibrio parahaemolyticus  (腸炎ビブリオ), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌), Bacillus cereus (セレウス菌), Bacillus subtilis (枯草菌) MB-32, Bacillus subtilis (枯草菌) ATCC6633, Candida sp. (カンジダ) の13株を用いた。
これらの菌を滅菌したMHBR 液体培地 (Mueller Hinton BrothR, Becton Dickinson, MD) 2 mLに混ぜ、濁度1 (菌濃度108/mL) の菌液を調製した。あらかじめ目皿のそれぞれのセルに小試験管を入れ滅菌した。目皿のそれぞれの小試験管の中に13株の菌液1 mLを注入した。ミクロプランター (SAKUMA, 型式MIT-P) で目皿の各試験管から10 μLを摂取し別の試験管に移し、菌液を100倍 (菌濃度106/mL) に希釈した。
ミクロプランターを用いてこの菌液10μL (菌数14.0) を各濃度の試料溶液を混入しておいた平板培地に植え付け、37℃の恒温器中で18時間培養し、化合物の抗菌力の評価を行った。結果を表２〜６に示す。【００３０】
【表２】
2007105581.tif 000003
【００３１】
【表３】
2007105581.tif 000004
【００３２】
【表４】
2007105581.tif 000005
【００３３】
【表５】
2007105581.tif 000006
【００３４】
【表６】
2007105581.tif 000007
【００３５】
以上の結果からトランス−ｐ−クマル酸は、Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Streptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Vibrio parahaemolyticus  (腸炎ビブリオ), Bacillus cereus (セレウス菌), Bacillus subtilis (枯草菌) ATCC6633, Candida sp. (カンジダ) に対して活性を示した。最小発育阻止濃度 (MIC) は、肺炎球菌に対しては2.0 mg/mL、化膿性連鎖球菌, 腸炎ビブリオ, セレウス菌, 枯草菌ATCC6633, カンジダに対しては3.0 mg/mL、黄色ブドウ球菌, エルシニアに対しては4.0 mg/mLであった。
３−ヒドロキシピリジンは、Sterptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Sterptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌), Candida sp. (カンジダ) に対して活性を示した。MICは、肺炎球菌, 化膿性連鎖球菌, 黄色ブドウ球菌, エルシニア, 緑膿菌, カンジダに対して4.0 mg/mLであった。【００３６】
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドは、Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Streptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Escherichia coli (大腸菌), Salmonella sp. (サルモネラ菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Vibrio parahaemolyticus (腸炎ビブリオ), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌), Bacillus cereus (セレウス菌), Bacillus subtilis (枯草菌) MB-32, Bacillus subtilis (枯草菌) ATCC6633, Candida sp. (カンジダ) と多くの菌に対して活性を示した。特にエルシニアに対して強い活性を示し、MICは0.5 mg/mLであった。
バニリンは、Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Streptococcus pyogenes (化膿性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Escherichia coli (大腸菌), Salmonella sp. (サルモネラ菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Vibrio parahaemolyticus  (腸炎ビブリオ), Bacillus cereus (セレウス菌), Bacillus subtilis (枯草菌) MB-32, Bacillus subtilis (枯草菌) ATCC6633, Candida sp. (カンジダ) に対し活性を有することを確認した。バニリンも同様に多くの菌に対する活性を有し、そのなかでも特にエルシニアに対して強い活性を示し、MICは0.5 mg/mLであった。【００３７】
Paper Disk法
５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンの抗菌試験として、溶媒の影響が出ても抗菌活性の有無の判定が可能なPaper Disk法を用いた。
Paper Disk法とは、はじめに濃度の異なる試料溶液を調製し、この試料溶液を専用のペーパーディスクに吸収させて乾燥させる。調製した菌液と寒天培地と混ぜて作成した平板の上に試料溶液を吸収させたペーパーディスクを並べる。試料に抗菌活性がある場合はペーパーディスクを中心に菌の繁殖を阻止することを示す阻止円が形成される。その阻止円の大きさで抗菌効果の強弱を判定するという方法である。
まず、試料である５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボン 4 mgを200 μLに溶かし20 mg/mLの試料溶液を調製した。この20 mg/mLの試料溶液100 μLに滅菌水100 μLを加え、10 mg/mLの試料溶液200 μLを調製した。そこにDMSO 60 μLと滅菌水140 μLを加え、5.0 mg/mLの試料溶液400 μLを調製した。DMSO 30 %では試料が析出してしまうため、DMSO 40 %に設定した。5.0 mg/mLの試料溶液350 μLにDMSO 140 μLと滅菌水210 μLを加え、2.5 mg/mLの試料溶液700 μLを調製した。同様にして1.25 mg/mL, 0.625 mg/mLの試料溶液を調製した。コントロールとしてDMSO 40 %, 滅菌水60 %溶液も用意した。比較対照として同濃度のカテキン水溶液も用意した。これらの溶液70 μLをペーパーディスク (直径8.12 mm) に吸収させ、1日乾燥させた。
被験菌としてStaphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Salmonella sp. (サルモネラ菌), Yersinia enterocolitica (エルシニア), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌), Candida sp. (カンジダ) を用いた。これらの菌を滅菌水 2 mLに混ぜ、濁度1 (108/mL) の菌液を調製した。この菌液0.2 mLとBHI培地19.8 mLを混ぜ、平板培地を作成した。この平板培地の上に乾燥させたペーパーディスクを置き、37℃の恒温器中で培養し、評価を行った。結果を表７に示す。表中（−）は抗菌活性を示さないことを表す。【００３８】
【表７】
2007105581.tif 000008
【００３９】
以上の結果より、５，７，４’−トリヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシフラボンは、サルモネラ菌, 緑膿菌に対して抗菌活性を有することがわかった。また、カテキンと比較してもその抗菌活性はとても強いことがわかった。【００４０】
隈笹の葉の熱水抽出液 (Sa, 2.3 kg) を酢酸エチルによって抽出し、酢酸エチル可溶画分 (Sa-1, 78 g) を得た。Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）に対する抗菌試験の結果、酢酸エチル可溶画分 (Sa-1) に抗菌活性が局在した。酢酸エチル可溶画分 (Sa-1) を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて7フラクションに分画した。7フラクションはそれぞれSa-1-A (90 mg), Sa-1-B (250 mg), Sa-1-C (3.36 g), Sa-1-D (3.00 g), Sa-1-E (110 mg), Sa-1-F (1.56 g), Sa-1-G (30.0 g) とした。Sa-1-C (3.36 g) にクロロホルムとn-ヘキサンを加えることで2層に分離し、Sa-1-C(1) (2.22 g), Sa-1-C(2) (1.14 g) を得た。Sa-1-C(1) (2.22 g) を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画し、Sa-1-C(1)-a, Sa-1-C(1)-bを得た。Sa-1-C(1)-aを高速液体クロマトグラフ装置 (HPLC) の分取用ODSカラムを用いて分画した結果、白色固体 (Sa-1-C(1)-aa) 60 mgを得た。スペクトルデータおよびHPLCによる分析の結果、白色固体 (Sa-1-C(1)-aa) は、バニリンであると決定した。また、Sa-1-C(1)-bを再度中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画したSa-1-C(1)-baを分取用TLCによって薄黄色固体 (Sa-1-C(1)-baa) 86 mgを得た。スペクトルデータから薄黄色固体 (Sa-1-C(1)-baa) は、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドであると決定した。さらにSa-1-C(2) (1.14 g) を2度の再結晶によって薄い黄緑色固体 (Sa-1-C(2)-a) 478 mgを得た。スペクトルデータから薄い黄緑色固体 (Sa-1-C(2)-a) は、トランス−ｐ−クマル酸であると決定した。次にSa-1-F (1.56 g) をアセトン可溶のSa-1-F(1) (162 mg) とアセトン不溶のSa-1-F(2) (1.40 g) に分離した。Sa-1-F(1) (162 mg) に再度アセトンを加え、液層を分離し、黄色固体 (Sa-1-F(1)-a) 10 mgを得た。スペクトルデータから黄色固体 (Sa-1-F(1)-a) は、５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンであると決定した。さらにSa-1-F(2) (1.40 g) を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて薄黄色個体 (Sa-1-F(2)-a) 46 mgを得た。スペクトルのデータから薄黄色固体 (Sa-1-F(2)-a) が３−ヒドロキシピリジンであると決定した。【００４１】
2007105581.tif 000009
【００４２】
バニリン, ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド, トランス−ｐ−クマル酸, ３−ヒドロキシピリジンの抗菌活性は寒天希釈法を用いて調べた。その結果、バニリン, ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド, トランス−ｐ−クマル酸, ３−ヒドロキシピリジンが抗菌活性を有することを確認した。その中でも特にバニリン, ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドは食中毒菌であるYersinia enterocolitica (エルシニア) に対して強い抗菌活性を示した。５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンの抗菌試験には、Paper Disk法を用いた。その結果、５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボンはSalmonella sp. (サルモネラ菌), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌) に対して抗菌活性を示した。この活性は、カテキンと比較してもとても強いものであった。【００４３】
本発明者は隈笹以外の植物についても上述の有効成分の抽出を試みた。その結果、イネ科に属する多くの植物、例えば、イネ（米）、コムギ(小麦)、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、タケ、ススキ、パンパスグラス、アシ（葦、ヨシともいう）等にも５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボン（トリシン）が多量に含まれることを見出した。具体的な植物名は以下のとおりである。
イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ、タケ、マコモ、サトウキビ、ハトムギ、ヨシ、ススキ、ササ、ダンチク、シロガネヨシ、シバ。【００４４】
イネ科  Gramineae
タケ亜科  Bambusioideae（タケ科  Bambusaceae）
ホウライチク属  Bambusa：ホウライチク、ホウオウチク（以上バンブー類） 
オカメザサ属  Shibataea：オカメザサ 
マダケ属  Phyllostachys：モウソウチク、マダケ、ハチク 
ナリヒラダケ属  Semiarundinaria：ナリヒラダケ、ヤシャダケ（以上タケ類） 
メダケ属  Pleioblastus：ネザサ、アズマネザサ、メダケ、リュウキュウチク 
ヤダケ属  Pseudosasa：ヤダケ、ヤクシマダケ 
スズダケ属  Sasamorpha：スズタケ 
アズマザサ属  Arundrinaria：アズマザサ、スエコザサ 
ササ属  Sasa：ミヤコザサ、チマキザサ、クマザサ、チシマザサ（以上ササ類）【００４５】
イチゴツナギ亜科  Poelideae
カモジグサ属  Agropyron：シバムギ、カモジグサ、アオカモジグサ 
スズメノテッポウ属  Alopecurus：スズメノテッポウ、セトガヤ 
ダンチク属  Arundo：ダンチク 
コバンソウ属  Briza：コバンソウ、ヒメコバンソウ 
スズメノチャヒキ属  Bromus：スズメノチャヒキ、イヌムギ 
カモガヤ属  Dactylis：カモガヤ 
スズメガヤ属  Eragrostis：カゼクサ、スズメガヤ、シナダレスズメガヤ、ニワホコリ 
オオムギ属  Horudeum：オオムギ、ムギクサ 
コムギ属  Triticum：コムギ 
ドクムギ属  Lolium：ホソムギ、ネズミムギ、ドクムギ 
イチゴツナギ属  Poa：スズメノカタビラ、イチゴツナギ 
ウシノケグサ属  Festuca：ナギナタガヤ、ウシノケグサ、トボシガラ 
ドジョウツナギ属  Glyceria：ムツオレグサ、ドジョウツナギ 
コメガヤ属  Melica：ミチシバ、コメガヤ 
ササクサ属  Lophatherum：ササクサ 
アゼガヤ属  Leptochloa：アゼガヤ 
カズノコグサ属  Beckmannia：カズノコグサ 
ネズミノオ属  Sporobolus：ネズミノオ、ヒゲシバ 
オヒシバ属  Eleusine：オヒシバ、シコクビエ 
ギョウギシバ属  Cynodon：ギョウギシバ 
ヨシ属  Phragmites：ウラハグサ、ヨシ、ツルヨシ 
タキキビ属  Phaenosperma 
サヤヌカグサ属  Leersia 
イネ属  Oryza：イネ 
マコモ属  Zizania：マコモ 
カラスムギ属  Avena：カラスムギ、エンバク 
コメススキ属  Deshampsia：コメススキ、ヒロハノコメススキ 
カニツリグサ属  Trisetum：カニツリグサ、リシリカニツリ 
ミノボロ属  Koeleria：ミノボロ 
コウボウ属  Hierochloe：コウボウ、ミヤマコウボウ 
クサヨシ属  Phalaris：クサヨシ、カナリークサヨシ 
コヌカグサ属  Agrostis：コヌカグサ、ヌカボ 
ヒエガエリ属  Polypogon 
アワガエリ属  Phleum：アワガエリ、オオアワガエリ 
ノガリヤス属  Calamagrostis：ノガリヤス、ホッスガヤ、ヤマアワ 
シバ属  Zoysia：シバ、コウライシバ、オニシバ、ナガミオニシバ【００４６】
キビ亜科  Panicoideae
トダシバ属  Arundinella 
ウンヌケ属  Eulalia：ウンヌケ、ウンヌケモドキ 
チゴザサ属  Isachne：チゴザサ、ハイチゴザサ 
キビ属  Panicum：キビ、ハイキビ、ヌカキビ 
ヒエ属  Echinochloa：ヒエ、イヌビエ 
チヂミザサ属  Oplismenus：チヂミザサ 
エノコログサ属  Setaria：ササキビ、エノコログサ、アワ、キンエノコロ 
スズメノヒエ属  Paspalum：スズメノヒエ、キシュウスズメノヒエ、シマスズメノヒエ 
メヒシバ属  Digitaria、メヒシバ、アキメヒシバ 
チカラシバ属  Pennisetum：チカラシバ、ナピアグラス 
ツキイゲ属  Spinifex：ツキイゲ 
サトウキビ属  Saccharum：サトウキビ、ワセオバナ 
チガヤ属  Imperata：チガヤ 
アブラススキ属  Eccoilopus：アブラススキ 
ススキ属  Miscanthus：ススキ、オギ、トキワススキ、カリヤス 
アシボソ属  Microstegium：ササガヤ、アシボソ 
イタチガヤ属  Pogonatherum：イタチガヤ 
カリマタガヤ属  Dimeria：カリマタガヤ 
ウシノシッペイ属  Hemarthria：ウシノシッペイ、コバノウシノシッペイ 
アイアシ属  Phacelurus：アイアシ 
カモノハシ属 Ischaemum：カモノハシ、ケカモノハシ 
コブナグサ属  Arthraxon：コブナグサ 
オガルカヤ属  Cymbopogon：オガルカヤ 
ヒメアブラススキ属  Bothriochloa：ヒメアブラススキ 
ウシクサ属  Schizoachyrium：ウシクサ 
メリケンカルカヤ属  Andropogon：メリケンカルカヤ 
メガルカヤ属  Themeda：メガルカヤ 
モロコシ属  Sorgham：モロコシ、サトウモロコシ、セイバンモロコシ、スーダングラス 
ジュズダマ属  Coix：ジュズダマ、ハトムギ 
トウモロコシ属  Zea：トウモロコシ 【００４７】
上記植物の葉、茎等を適切な溶媒を使用して抽出し、ＨＰＬＣ等の分離精製手段を用いてトリシンを分離精製できる。例えば、水抽出物を濃縮し、固形物をアルコール、含水アルコール（例えば、メタノール、エタノール、含水メタノール、含水エタノール）抽出し、固形分を水に溶解し、酢酸エチルとの分配等により精製できる。
隈笹の乾燥葉５ｇを各種有機溶媒５０ｍｌに浸漬静置し、抽出液を濃縮し、固形分を得た。隈笹の葉の質量を１００としたときの各種抽出液の固形分の割合とこの固形分中に含まれるトリシンの割合を以下の表に示す。
2007105581.tif 000010
【００４８】
次に隈笹の葉５０ｇ、溶媒１Lを用いて抽出し、抽出液の溶媒を留去した際の固形分に含まれるトリシンの量（ｍｇ）を求めた。結果を以下の表に示す。
2007105581.tif 000011
【００４９】
隈笹の葉５０ｇをメタノール５００ｍｌに浸漬し、静置した。その後、濾過し、溶媒留去してメタノール抽出物５．０５ｇを得た。次にヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル、ｎ−ブタノールの順で分配作業を行い、固形分の量及びその中のトリシンの量を求めた。結果を以下の表に示す。
2007105581.tif 000012
【００５０】
次に隈笹の葉５０ｇを用いてメタノール５００ｍｌで、抽出を行い、溶媒留去後、これを水に溶解し、各種溶媒を用いて分配作業した際の各固形分に含まれるトリシンの量を求めた。結果を以下の表に示す。
2007105581.tif 000013
【００５１】
隈笹の葉の各種含水エチルアルコール抽出液を濃縮乾燥して固形分（Ｂ）を得た。これを水に溶解後、酢酸エチルとの分配作業を行い、溶媒を留去し、固形分（Ｃ）を得た。固形分（Ｂ）を１００としたときの酢酸エチル抽出固形分（Ｃ）の割合を以下の表に示す。また固形分（Ｂ）及び固形分（Ｃ）中のトリシンの分析結果（質量％）も合わせて示す。
2007105581.tif 000014
＊：予備濃縮済【００５２】
葦（アシ、ヨシ）の葉、茎、及び及び竹の葉の各種含水エチルアルコール抽出液（Ｄ）の溶媒を留去して固形分（Ｅ）を得た。これを水に溶解し、酢酸エチルにより分配作業を行い、酢酸エチル可溶部の固形分（Ｆ）を得た。固形分（Ｅ）１００ｇ用いた場合の固形分（Ｅ）及び固形分（Ｆ）中のトリシンの量を分析した。結果を以下の表に示す。
2007105581.tif 000015
【００５３】
本発明の抗微生物性組成物
上記化合物（バニリン, ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド, トランス−ｐ−クマル酸, ３−ヒドロキシピリジン、５，７，４’−トリヒドロキシ−3’，５’−ジメトキシフラボン）（この明細書において「本発明の化合物」ともいう）の少なくとも１種を有効成分とする本発明の抗微生物剤は、種々の形態で使用できる。例えば、粘膜保護組成物、細菌感染予防及び／又は治療用組成物、防腐剤、濾過装置等の抗微生物剤として好適である。
本発明の抗微生物剤の剤型は、液体状、固体状、気体状いずれでも良い。本発明の抗微生物剤は、経口、非経口投与いずれの投与形態で投与してもよい。経口投与形態としては錠剤、丸剤、粉剤、液剤、チューインガム、飴、チョコレート、パン、クッキー、そば、うどん、各種ドリンク剤等の食品形態が、非経口投与形態としては、注射剤、局所投与剤（クリーム、軟膏等）、座薬等が挙げられる。局所投与剤の剤型の例としては、本発明の抗微生物剤を、天然繊維又は合成繊維製のガーゼ等の担体に含浸させたもの、口紅等の化粧品に含有させたもの等が挙げられる。
本発明の抗微生物剤は、ヒトはもとより、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類等用の抗微生物剤としても有効である。従って本発明の抗微生物剤は、これらの動物の用の抗微生物剤（例えば、ペット用医薬、ペットフード等）として使用することができる。さらに本発明の抗微生物剤は、動物以外に、各種植物に対する抗微生物剤としても有用であり、また、防腐剤としても有用である。【００５４】
本発明の種々の剤型の抗微生物剤の製造には、所定量の上記化合物のほか、通常の医薬組成物、化粧品、皮膚用組成物等に使用される油性成分等の基材成分、保湿剤、防腐剤等を使用することができる。
抗微生物剤に使用する水は、水道水、天然水、精製水等、特に限定されないが、一般にイオン交換水等の高純度の水が好ましい。
油性成分としては、スクワラン、牛脂、豚脂、馬油、ラノリン、蜜蝋等の動物性油、オリーブ油、グレープシード油、パーム油、ホホバ油、胚芽油（例えば、米胚芽油）等の植物性油、流動パラフィン、高級脂肪酸エステル（例えば、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル）、シリコーン油等の合成油、半合成油が挙げられる。
油性成分は、皮膚の保護、エモリエント性付与効果（皮膚表面を薄膜で覆い、乾燥を防ぐと共に、柔軟性、弾力性を与える効果）、さっぱり感等の要求性能に合わせて適宜組み合わせて用いられる。スクワラン、オリーブ油及びミリスチン酸オクチルドデシルの組合せは好ましい例の一つである。
抗微生物剤の硬さ、流動性を調節するために、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ベヘニン酸、セタノール、ワセリン等の固体油が用いられ、好ましくはステアリン酸とセタノールが組み合わせて用いられる。【００５５】
本発明の抗微生物剤をクリーム組成物として製造するためには、本発明の化合物、水、油性成分をクリーム状にするためのクリーム化剤が用いられる。クリーム化剤は、特に限定されないが、モノステアリン酸グリセリンと自己乳化型モノステアリン酸グリセリン（モノステアリン酸グリセリンに乳化剤を添加したもの）とを組み合わせて使用するのが一般的である。
本発明の抗微生物剤には、さらに必要に応じて安定化剤、保湿剤、創傷治癒剤、防腐剤、界面活性剤等を含有させることができる。
安定化剤としては、カルボキシビニルポリマーと水酸化カリウムの組合せ、ジステアリン酸ポリエチレングリコール等が挙げられる。特に、セスキステアリン酸ポリエチレングリコール（ジステアリン酸ポリエチレングリコールとモノステアリン酸ポリエチレングリコールの１：１混合物）（ポリエチレングリコールの分子量は１０００〜２万）は、安定性が高く、水と油に分離することがなく、また、クリーム組成物として皮膚に塗布する際の硬さを効果的に調節することができるので好ましい。
保湿剤としては、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、アロエエキス（特に、木立アロエ由来のアロエエキス（２）が好ましい）、尿素、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、トレハロース、ソルビトール、アミノ酸、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等が挙げられる。
創傷治癒剤としては、アラントイン、グリチルリチン酸ジカリウム、カンゾウエキス、ヨモギエキス等が挙げられる。【００５６】
防腐剤は、本発明の化合物自体に抗菌作用があるため補助的に用いられるものである。例えば、安息香酸ナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル（例えば、メチル、エチル、プロピル又はブチルエステル等のパラベンと称されるもの）、プロピオン酸ナトリウム、混合脂肪酸エステル（カプリン酸グリセリル、ラウリン酸ポリグリセリル−２、ラウリン酸ポリグリセリル−１０の混合物）、フェノキシエタノール、感光素２０１号（黄色色素）、１，２−ペンタンジオール等が挙げられるが、パラベン、混合脂肪酸エステル、１，２−ペンタンジオールが好ましい。
界面活性剤としては、例えば、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等が挙げられる。
さらに必要により、香り成分、例えば、オレンジオイル、レモンオイル、トウヒ油、香料等を含有させてもよい。【００５７】
本発明の抗微生物剤を含有する粘膜保護組成物、細菌感染予防及び／又は治療用組成物は、目、鼻、喉、耳、肛門、陰部等の粘膜や、創傷部位及び皮膚からの感染性細菌の体内への侵入を効果的に抑制し、院内感染を含む細菌感染を効果的に予防し、及び／又は治療するものである。粘膜保護組成物、細菌感染の予防及び／又は治療用組成物のさらに具体的な形態としては、粘膜保護布や口腔組成物が挙げられる。【００５８】
粘膜保護布は、通気性を有する担体、例えば、シルク、綿、麻等の天然繊維、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、アクリル等の合成繊維、半合成繊維、あるいはこれらの２種以上の混合物の繊維自体又は糸、又はその織布、編布、不織布、紙等に本発明の抗微生物剤を含浸、噴霧等の方法により含有させたものである。この明細書中「保護布」には、便宜上、布の他、繊維自体、糸、紙等も含むものとする。
具体的な形態としては、ガーゼ、マスク、眼帯、生理帯、生理用ナプキン、包帯、トイレットペーパー、痔疾処置用ガーゼ、耳栓、水絆創膏等の衛生用品に分類される粘膜や皮膚に直接接触する保護布の他、白衣等の衣類、手袋、帽子、靴下、足袋等の衣料品小物、シーツ、布団カバー、枕カバー、ベッド用品等の寝具類、カーテン、壁紙、カーペット等の室内装飾品及び内装材料、手術用縫合糸等の医療材料等、皮膚に直接又は間接に接触する物品も挙げられる。【００５９】
本発明の抗微生物剤を含有する口腔組成物としては、例えば、グミ、ゼリー、トローチ、キャンディー、チューインガム、錠剤、丸剤、洗口剤、嗽剤、歯磨き、粘膜貼付フイルム、咽頭部炎症治療用噴霧剤、等が挙げられる。【００６０】
先の実験例から明らかなように、本発明の化合物はクマザサエキス中その固形分に対しておよそ１０００分の１〜１０万分の１の濃度で含まれている。従って、本発明の化合物を抗微生物剤として使用する場合は、クマザサエキス固形分の使用量のおよそ１０００分の１〜１０万分の１の濃度で良い。その濃度は使用目的に合わせて適宜決定される。
例えば、本発明の化合物を粘膜保護布に含有させるには、例えば、保護布を本発明の化合物の２〜２０×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％溶液（水、アルコール、ＤＭＳＯ等の有機溶媒又はこれらの混合溶媒）に含浸し、あるいは、保護布に本発明の化合物の２〜２０×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％溶液を噴霧し、乾燥すればよい。この際、本発明の化合物の含浸量又は噴霧量は、本発明の化合物の固形分で好ましくは２〜２０×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％、さらに好ましくは６〜１５×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％、最も好ましくは８〜１２×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％程度とするのが適当である。【００６１】
本発明の化合物を、例えば、グミ、ゼリー、トローチ、キャンディー、チューインガム、錠剤、丸剤（例えば、笹丹）、洗口剤、嗽剤、歯磨き、粘膜貼付フイルム、等の口腔組成物に含有させるには、口腔組成物製造のいずれかの段階で、口腔組成物原料に対して、本発明の化合物の固形分で好ましくは２〜２０×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％、さらに好ましくは６〜１５×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％、最も好ましくは８〜１２×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％程度添加するのが適当である。【００６２】
本発明の口腔組成物には、剤型により適宜適切な慣用の成分を配合することができる。
例えば、ぶどう糖、乳糖、蔗糖、水あめ、デキストリン、シクロデキストリン等の賦形剤、アラビアガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、ガムベース等の結合剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、蔗糖脂肪酸エステル等の滑沢剤、香料、クロロフィル、ハッカ、ｌ−メントール等の清涼化剤等が挙げられる。【００６３】
本発明の粘膜保護組成物を保護布の形態で使用する場合、粘膜や創傷部位に接触する部位の保護布（ガーゼ等）に本発明の化合物を含有させておき、これを１日１〜３回程度交換すればよい。手術用縫合糸の形態で使用した場合、縫合患部からの細菌の侵入を効果的に抑制し、患部の炎症を抑制し、手術部位の回復を促進する。
病院等における院内感染防止のために本発明の粘膜保護組成物を保護布の形態で使用する場合、本発明の粘膜保護組成物の感染防止効果は長期間にわたり存続する。洗濯によりその効果が低減した場合には、適宜交換するか、本発明の化合物を再度含有させるための処理を行えば良い。【００６４】
本発明の粘膜保護組成物を口腔組成物の形態で使用する場合、その摂取量は特に限定されないが、本発明の化合物の固形分として、２〜１５×（１０００分の１〜１０万分の１）ｍｇ程度を、例えば、１日１〜５回、通常は１〜３回程度摂取すればよい。摂取量、摂取回数は目的に合わせて適宜増減すればよい。【００６５】
本発明の粘膜保護組成物は、本発明の化合物を固形分で２〜２０×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％含有しており、従来、抗生物質が効かない耐性菌に対しても顕著な殺菌効果を示す。
また、本発明の粘膜保護組成物を口腔組成物として使用する場合、適宜、必要な際に、口に含んでおくことにより、極めて簡便に感染性細菌の感染を予防し、またその増殖を抑制することができる。また、チューインガム、キャンディー等の徐放性形態の組成物はその効果を長時間にわたって発揮することができ有利である。
本発明の粘膜保護組成物は、ローションやオイルの形態で使用することもできる。本発明の化合物を固形分で２〜２０×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％含有するローションやオイルを、皮膚等に塗布しておくことにより、極めて簡便に感染性細菌の感染を予防し、またその増殖を抑制することができる。【００６６】
防腐剤
本発明はまた、本発明の化合物を有効成分として含有する防腐剤を提供するものである。防腐剤として使用する際の形態は特に限定されない。防腐対象となる組成物としては、例えば、食品、飲料水、調味料、化粧品（ローションやオイルを含む）、創傷部位治療用噴霧剤、咽頭部炎症治療用噴霧剤等が挙げられる。これらの対象物に本発明の化合物を固形分で好ましくは２〜２０×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％、さらに好ましくは６〜１５×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％、最も好ましくは８〜１２×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％程度含有させるのが適当である。【００６７】
濾過装置
本発明はまた、本発明の化合物を有効成分として含有する空気の濾過装置を提供するものである。具体的な形態としては、換気扇、エアコン、カーエアコン、空気吸入口、空気排出口、網戸、空気清浄機等の空気が通過する部位に使用されるフィルターが挙げられる。フィルターの素材は特に限定されないが、シルク、綿、羊毛、麻等の天然繊維、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、アクリル等の合成繊維、半合成繊維、あるいはこれらの２種以上の混合物の織布、編布、不織布、紙等が挙げられる。これらのフィルターに本発明の化合物の水希釈液を、含浸、噴霧等の方法により含有させ、乾燥すればよい。フィルター中の本発明の化合物の含有量は、固形分で好ましくは２〜２０×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％、さらに好ましくは６〜１５×（１０００分の１〜１０万分の１）質量％、最も好ましくは８〜１２質量％程度とするのが適当である。
【国際調査報告】
2007105581.tif 000016
2007105581.tif 000017
2007105581.tif 000018
2007105581.tif 000019
2007105581.tif 000020
2007105581.tif 000021