(57)【要約】シトクロムＰ４５０の反応系の電子伝達手段としてキノン類縁化合物使用するシトクロムＰ４５０を用いる化合物の無細胞変換反応系が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムＰ４５０の存在下におけるシトクロムＰ４５０の基質となりうる化合物の生物学的変換反応を行うための反応系であって、
（ａ）シトクロムＰ４５０、
（ｂ）初発電子供給手段、及び
（ｃ）キノン類縁化合物、を含んで成る、上記反応系。
【請求項２】
シトクロムＰ４５０が細菌由来である請求項１記載の反応系。
【請求項３】
シトクロムＰ４５０がＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａとアミノ酸配列レベルで４０％以上の相同性をもつ請求項１記載の反応系。
【請求項４】
シトクロムＰ４５０が細菌由来のＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａである請求項１記載の反応系。
【請求項５】
キノン類縁化合物が１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノン、１−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、及びビタミンＫ３からなる群より選ばれる請求項１記載の反応系。
【請求項６】
シトクロムＰ４５０が細菌由来のＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａであり、そしてキノン類縁化合物が１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノン、１−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、及びビタミンＫ３からなる群より選ばれる請求項１記載の反応系。
【請求項７】
初発電子供給手段が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種である請求項１記載の反応系。
【請求項８】
初発電子供給手段が、電子を供給し得る電極である請求項１記載の反応系。
【請求項９】
シトクロムＰ４５０が細菌由来であり、そして初発電子供給手段が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種であるか、または電子を供給し得る電極である請求項１記載の反応系。
【請求項１０】
シトクロムＰ４５０が細菌由来のＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａであり、そして初発電子供給手段が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種であるか、または電子を供給し得る電極である請求項１記載の反応系。
【請求項１１】
シトクロムＰ４５０が細菌由来であり、キノン類縁化合物が１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノン、１−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、及びビタミンＫ３からなる群より選ばれ、そして初発電子供給手段が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種であるかまたは電子を供給し得る電極である請求項１記載の反応系。
【請求項１２】
シトクロムＰ４５０が細菌由来のＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａであり、キノン類縁化合物が１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノン、１−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、及びビタミンＫ３からなる群より選ばれ、そして初発電子供給手段が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種であるかまたは電子を供給し得る電極である請求項１記載の反応系。
【請求項１３】
シトクロムＰ４５０の存在下におけるシトクロムＰ４５０の基質となりうる化合物の生物学的変換反応を行う反応系であって、
（ａ）シトクロムＰ４５０、
（ｂ）初発電子供給手段、及び
（ｃ）キノン類縁化合物、を含んで成る、上記反応系において、シトクロムＰ４５０の基質となりうる化合物の生物学的変換をおこなう工程を含んで成る生物学的変換生成物の製造方法。
【請求項１４】
生物学的変換が酸化型である請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
シトクロムＰ４５０が細菌由来である請求項１３記載の製造方法。
【請求項１６】
シトクロムＰ４５０が細菌由来のＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａとアミノ酸配列レベルで４０％以上の相同性をもつ請求項１３記載の製造方法。
【請求項１７】
キノン類縁化合物が１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノン、１−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、及びビタミンＫ３からなる群より選ばれる請求項１３記載の製造方法。
【請求項１８】
シトクロムＰ４５０が細菌由来であり、そしてキノン類縁化合物が１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノン、１−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、及びビタミンＫ３からなる群より選ばれる請求項１３記載の製造方法。
【請求項１９】
シトクロムＰ４５０が細菌由来のＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａであり、そしてキノン類縁化合物が１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノン、１−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、及びビタミンＫ３からなる群より選ばれる請求項１３記載の製造方法。
【請求項２０】
初発電子供給手段が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種である請求項１３記載の製造方法。
【請求項２１】
初発電子供給手段が、電子を供給し得る電極である請求項１３記載の製造方法。
【請求項２２】
シトクロムＰ４５０が細菌由来であり、そして初発電子供給手段が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種であるか、または電子を供給し得る電極である請求項１３記載の製造方法。
【請求項２３】
シトクロムＰ４５０が細菌由来のＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａであり、そして初発電子供給手段が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種であるか、または電子を供給し得る電極である請求項１３記載の製造方法。
【請求項２４】
シトクロムＰ４５０が細菌由来のＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａであり、キノン類縁化合物が１，４−ナフトキノン、１，４−ベンゾキノン、１−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、及びビタミンＫ３からなる群より選ばれ、そして初発電子供給手段が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種であるかまたは電子を供給し得る電極である請求項１３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトクロムＰ４５０の基質となり得る化合物の生物学的変換反応系及びその変換反応系を使用する該化合物の生物学的変換生成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムＰ４５０遺伝子がコードするシトクロムＰ４５０酵素（以下、単にＰ４５０ともいう）は、還元型で一酸化炭素を結合して４５０ｎｍ付近にソーレー吸収帯（Ｓｏｒｅｔ  ｂａｎｄ）を示す一群のプロトヘム含有タンパク質である。Ｐ４５０は動植物を含む高等生物、カビ、酵母、細菌の一部において種を超えて広く分布し、酸化反応などを主とした様々な物質の代謝・分解に関与している。Ｐ４５０については多数の分子種が知られており、系統的研究からスーパーファミリーを形成していることが知られている。
Ｐ４５０はその機能的役割から生体内あるいは生体外物質など多様な物質を基質として、一原子酸素添加反応を介する水酸化反応、エポキシ化反応、脱アルキル化反応、脱窒素反応、あるいは稀にＮＯ還元酵素のようにＮＡＤＨからの電子を用いる還元反応、等の様々な反応を触媒することが知られている。これらの反応は通常、立体特異性（ｓｔｅｒｅｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）や位置特異性（ｒｅｇｉｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）に厳格な反応として行われることが多い。ヒトに対して用いられる薬物の多くは肝臓や腎臓などで発現する特定のＰ４５０のもつ作用、例えば水酸化などにより体内で代謝・不活性化されたり、逆にその薬理効果が向上したり、あるいは副作用が増強されたりするため、Ｐ４５０は、薬物の代謝研究やプロドラッグ開発の観点から医薬産業上極めて高い重要性を有する。
近年、ゲノム情報の蓄積から、動植物や微生物において様々なＰ４５０遺伝子の存在が明らかになり、これらのＰ４５０遺伝子またはＰ４５０の機能を、各種の有用な化合物を取得するための物質もしくは化合物変換に応用すること等について産業上利用し得ることが期待できる。Ｐ４５０遺伝子またはＰ４５０の最も具体的な産業上の利用法としては、所望の変換反応を行うＰ４５０を発現する微生物細胞、または該Ｐ４５０を遺伝子工学的手法により発現させた組換え微生物を用いた物質変換が考えられる。例えば、放線菌シュードノカルディア  オートトロフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）を利用してビタミンＤ３の１α位と２５位を水酸化して活性型ビタミンＤ３を生産する方法が実用化されている。また、哺乳動物Ｐ４５０を機能的に発現させた酵母（非特許文献１参照。なお、本項で引用する具体的文献名は、下記にまとめて記載する。以下、同様。）や大腸菌組換え株（非特許文献２参照）によって、薬物の代謝物を得ることも可能となっている。さらに、種々の細菌由来の様々なＰ４５０をコードする遺伝子を宿主大腸菌で発現させる系に、電子伝達手段として異種のフェレドキシン遺伝子及びフェレドキシン還元酵素遺伝子を組み込むことにより、基質となり得る多様な化合物の効果的な変換系も提案されている（特許文献１参照）。
このようなシトクロムＰ４５０遺伝子またはＰ４５０を用いたある一定の化合物の生物学的もしくは微生物学的変換反応はその酵素を発現している微生物の培養液または菌体を用いて行われてきた。このような変換反応を利用する変換生成物の製造方法は、通常、発酵の形態をとり、製造ロットごとに培養液を仕込み、変換能を有する微生物の培養、基質の変換反応を進行させることが必要である。また、一般に、変換反応終了後においては変換生成物の回収精製に多くのプロセスを要する。
他方、加水分解酵素を用いた物質変換系の多くは、当該酵素または当該酵素活性を有する細胞それ自体もしくは処理物を膜リアクターないし固定化酵素を利用した変換反応系へ改変することによって、上記培養液等を用いる場合の変換方法に比較して、相当コストを抑制することができ、特定物質の産業上極めて有利な変換製造方法として確立している。
かような加水分解酵素と同様な膜リアクターないし固定化酵素による変換反応系がＰ４５０に転用できないことは当該酵素自体のもつ特有の性質に起因する。具体的には、加水分解酵素はコファクター非依存的に反応を行うので、その酵素のみが反応において必要かつ十分であるのに対し、Ｐ４５０は、それが係わる反応において、ＮＡＤＰＨ、フェレドキシン、フェレドキシン還元酵素などの電子伝達機能をもつコファクターを要求するからである。それゆえ、Ｐ４５０を利用した反応の場としては、このようなコファクターが十分機能しかつ再生可能な環境を提供する細胞内が最も望ましい。
したがって、Ｐ４５０等のコファクターを要求する特性を有する酵素を用いて加水分解酵素と同様な膜リアクターないし固定化酵素による目的物質の変換製造方法を実現するには、細胞内の反応系に不可欠なコファクターの機能的役割をいかにして簡易に入手可能な物質または手段により代替するかが当該技術分野における技術的課題であった。この課題を解決する手段の一つとしては、例えば、電子伝達機能をもつ安価な化学メディエーターを用いてＰ４５０を機能させることができる反応系の提供が挙げられる。仮に、このような反応系が提供できれば、Ｐ４５０を用いる生物学的変換反応を無細胞系の反応槽で進行させることが可能になるかも知れない。さらに、膜分離、酵素固定化などの技術の併用により基質となり得る化合物から変換した目的生成物の効率のよい分離が可能となり、産業上有用な連続反応系を構築できる可能性もある。
このような生理的条件下のＰ４５０反応系におけるコファクター機能を代替する物質として従来知られているものとして、酸素と電子を供給可能な、過酸化水素など含む過酸化物が挙げられる。さらに、提案されている別の系では、ある種のコバルト錯体を用いて電極からＰ４５０への電子伝達を可能にし、高級脂肪酸の水酸化を可能にする系が知られている（非特許文献３参照）。さらなる興味ある別の系として、近年、耐熱性Ｐ４５０酵素ＣＹＰ１１９及びＰ４５０ＢＭ３などを適当な媒介物質を間にして電極につなぎ、電極からＰ４５０に電子を伝達することで酵素を活性化させる反応系も提案されている（非特許文献４及び非特許文献５参照）。
引用文献の一覧
【特許文献１】国際公開第０３／０８７３８１号パンフレット
【非特許文献１】Ｈ．Ｍｕｒａｋａｍｉら，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１０８、８５９−８６５、１９９０
【非特許文献２】Ｈ．Ｉｗａｔａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．５５，１３１５−１３２５，１９９８
【非特許文献３】Ａ．Ｋ．Ｕｄｉｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９８，１５４７−１５５０，２００４
【非特許文献４】Ｅ．Ｂｌａｉｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，８６３２−８６３３，２００４
【非特許文献５】Ａ．Ｋ．Ｕｄｉｔら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１０２１８−１０２１９，２００４
【発明の開示】
【０００３】
前述の過酸化物は比較的安価で、酸素と電子を同時に供給可能な系を提供するものの、過酸化物による酵素の失活が大きな問題点となる。コバルト錯体などを化学メディエーターに用いる系では、化学メディエーターの調製にコストがかかることや自然酸化による劣化、反応効率の低さ等の欠点があり、必ずしも効果的な方法とはいえない。
したがって、本発明の目的は、上記の欠点を補うような以下の
（ｉ）煩雑な前処理を必要としない、
（ｉｉ）反応系に補助的に添加するだけでコファクター機能を代替する安価で、入手しやすい、
（ｉｉｉ）比較的自然酸化されにくい、そして
（ｉｖ）酵素機能に障害を及ぼさない
条件を満たす化学メディエーターたり得る物質の入手及びそれらを使用するＰ４５０の関与する反応系を提供することにある。
本発明者等は、新しい化学メディエーターとなり得る物質の探索とそれに適合する応用的価値の高いＰ４５０との組合せを実現するため、鋭意研究を行ってきた。その結果、本発明者らは、これまでシトクロムＰ４５０の化学メディエーターとしては報告されていないキノン類縁化合物がＰ４５０、特に、放線菌由来のＰ４５０を電子伝達タンパク質非依存的に活性化して、基質の変換反応を効果的に進行させることを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。したがって、本発明は、上記の課題を解決すべき手段として、シトクロムＰ４５０の存在下におけるシトクロムＰ４５０の基質となりうる化合物の微生物学的変換反応を行う反応系であって、
（ａ）シトクロムＰ４５０、
（ｂ）初発電子供給手段、及び
（ｃ）キノン類縁化合物、を含んで成る反応系が提供される。
また、上記反応系において、シトクロムＰ４５０の基質となりうる化合物の生物学的変換，特に，酸化型の変換、をおこなう工程を含んで成る生物学的変換生成物の製造方法も提供される。
発明の具体的な態様の記述
本発明にいう，反応系は、変換せしめようとする物質（または基質となりうる化合物）に応じて適切に選択されたシトクロムＰ４５０を用いることにより、所望の生物学的変換生成物を取得するための組成物、装置もしくはバイオリアクター、または特定の基質のアッセイに用いるキット等に適用できる実在物を意味する。ここで使用する生物学的変換の語は、化学的変換に対する概念である。
シトクロムＰ４５０とは、動植物などの高等生物由来の他、カビ、きのこ、酵母、細菌に至るまでの広範囲な生物に分布するもののうち、細胞内で機能する場合には、通常、フェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素もしくはシトクロムＰ４５０還元酵素等の電子伝達機能を有するタンパク質をＰ４５０による変換反応のコファクターとして要求する活性酵素様物質の総称である。このようなシトクロムＰ４５０は、本発明の目的に沿い、前記コファクターをキノン類縁化合物で代替することにより、所定の触媒機能を発現するＰ４５０であれば起源を問うことなく使用できる。しかし、産業利用上、好ましくは、微生物において発現が比較的容易な細菌由来の可溶性Ｐ４５０、例えば、放線菌ノノムラエア  レクチカテナ（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ  旧名Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）ＩＦＯ１４５２５由来のＰ４５０であるＭｏｘＡや放線菌ノカルディア  ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ）ＩＦＭ  １０１５２由来のＰ４５０であるＣＹＰ１５４Ａ等を挙げることができる。その他の微生物由来のＰ４５０の具体的なものには、前記の特許文献１に列挙されたもの、が包含される。
このようなＰ４５０については、特許文献１にも一部詳細に記載されているが、今日、様々な公開情報を利用して入手が可能である。近年、ＧｅｎＢａｎｋやＥＭＢＬなどの遺伝子データベースに加えて、インターネット上でＰ４５０遺伝子情報やゲノム情報を公開しているサイトから極めて多数のＰ４５０遺伝子配列やその起源生物の情報を容易に入手することができる。このような情報源の中には、Ｄ．ＮｅｌｓｏｎによるＰ４５０遺伝子データベースｈｔｔｐ：／／ｄｒｎｅｌｓｏｎ．ｕｔｍｅｍ．ｅｄｕ／ｂａｃｔｅｒｉａ．ｈｔｍｌや細菌の中でも比較的多種のＰ４５０遺伝子を有する放線菌ゲノムの公開データベース、例えば、Ｐ４５０遺伝子に２６種を含むノカルディア  ファルシニカ  ＩＦＭ  １０１５２（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２）のゲノムデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｎｏｃａｒｄｉａ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／（このデータベースは石川らによる論文、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００４、１０１（４１）：１４９２５−３０の記載内容により補足される）や、Ｐ４５０遺伝子３３種を含むストレプトミセス  エバーミチリス  ＭＡ−４６８０（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０）のゲノムデータベース、ｈｔｔｐ：／／ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ．ｌｓ．ｋｉｔａｓａｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／（このデータベースはＬａｍｂらによる論文、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、３０７（３）：６１０−９の記載内容により補足される）などが含まれている。当業者であれば、これらの遺伝子情報を利用して由来生物あるいはその近縁種から目的のＰ４５０遺伝子あるいはその相同遺伝子をクローニングし、適当な宿主にてそれらの遺伝子を発現させて、Ｐ４５０を取得できる。したがって、こうして取得できるＰ４５０も本発明で使用できる。
その具体的な取得方法のうち、最も容易なものは、入手できる遺伝子配列情報に基づき、特定の遺伝子配列のＰ４５０コード領域のＮ−末端配列およびＣ−末端配列部分に対応するＤＮＡ配列からプライマーを作製し、ＰＣＲでＰ４５０遺伝子コード領域を増幅する。次にこの増幅断片を発現ベクターに挿入し、その発現系が機能する宿主に形質転換することである。
例えば、ＭｏｘＡをコードする遺伝子（ｍｏｘＡ）の取得方法については当該技術分野で周知の方法で実施することができる。これらの操作全体についての詳細は、本出願人による前記特許文献１に記載されている（記載内容は引用することにより本明細書に組み入れられる。）。こうして取得されたＰ４５０遺伝子の周辺領域を含むヌクレオチド配列（コード配列におけるアミノ酸配列）を配列表の配列番号１に示す。この配列の塩基３１３〜塩基１５３３までの連続するヌクレオチド配列がＰ４５０遺伝子（ｍｏｘＡ）に相当する。また、アミノ酸配列レベルでＭｏｘＡと４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、特に、好ましくは９０％以上の相同性をもつＰ４５０であって、その機能的性状もＭｏｘＡと類似しているもの、具体的にはＮｅｖｅｒｔらの分類定義（Ｄ．Ｒ．Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６，１−４２，１９９６）に基づいてＣＹＰ１０５ファミリーに帰属される多くのＰ４５０群も本発明の反応系に用いることができる。なお、本明細書にいう、上記のような相同性は、配列の相同性を評価することのできる、市販のソフトウエア、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０（株式会社ゼネティックス（英文表記：ＧＥＮＥＴＹＸ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）東京都渋谷区）のアミノ酸配列ホモロジー検索機能を用いて評価できる。ＣＹＰ１５４Ａ遺伝子は前述のノカルディア  ファルシニカ  ＩＦＭ  １０１５２のゲノムデータベースにおいて遺伝子コードｎｆａ２２９３０で特定されるＰ４５０遺伝子である。この遺伝子の塩基配列およびコード配列を配列番号２に示す。ＭｏｘＡと同じ分類定義に基づき、ＣＹＰ１５４ファミリーに帰属される多くのＰ４５０群も本発明の反応系に用いることができる。その「Ｐ４５０群」とは、ＣＹＰ１５４Ａとアミノ酸配列レベルで４０％以上の相同性を有する類似した構造および機能をもつＰ４５０をいう。
クローニングしたＰ４５０遺伝子を適当な宿主にて発現する場合は様々な発現系を使うことができるが、Ｐ４５０による変換を産業上利用するのに都合のよい微生物宿主を用いるのが望ましい。例えば、大腸菌を宿主として利用できるが、この場合、Ｐ４５０遺伝子の発現にはｐＵＣ１８、ｐＴｒｃＨｉｓ及びｐＥＴ１１ａ等の様々なベクターが利用可能である。放線菌を宿主とする場合には、ｐＩＪ７０２及びｐＩＪ９４３等のベクターが利用可能である。酵母を宿主とする場合には、ｐＰＩＣＺ，ｐＰＩＣ９Ｋ，ｐＭＥＴ，及びｐＴＥＦ１／Ｂｓｄ等のベクターが利用可能である。
またＰ４５０を発現させた細胞から、すでに一般的に知られている生化学的方法に従ってＰ４５０タンパク質を精製することができる。特に、大腸菌組換え体で発現させる場合には、目的のＰ４５０のＣ−末端にヒスチジン−タグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ）を接続して発現させ、ニッケル−ＮＴＡ  アガロースカラムなどを用いて容易に精製する手法が確立されている。
このような精製方法に基づき、酵素源として調製されたＰ４５０は、本発明の反応系の触媒として使用することができる。Ｐ４５０の酵素源になり得るものとしては、所望の反応を触媒するＰ４５０を発現する細胞それ自体もしくはそのＰ４５０遺伝子の組換え体それ自体であってもよい。
さらにＰ４５０の酵素源はそれらの細胞から抽出精製したＰ４５０タンパク質のみならず、精製コスト低減のため、Ｐ４５０タンパク質を含む細胞自体あるいはその加工物、すなわち無細胞抽出液またはそれに部分精製等の処理を施したものなども使用することができる。ここで、Ｐ４５０の酵素源に精製タンパク質を使用する場合を除いて、厳密にいえば夾雑タンパク質として電子伝達機能をもつタンパク質が混入する可能性が想定されるが、本発明の反応系はこのような夾雑電子伝達タンパク質の有無に関わらず、実質的に添加したキノン類縁化合物が電子伝達タンパク質の役割を代替する現象を利用するものであるから、当該夾雑電子伝達タンパク質を積極的に共存させてもよい。
本発明にいう、シトクロムＰ４５０の基質となりうる化合物には、上記に挙げたいずれかのＰ４５０もしくはそれらの機能上等価の活性酵素様物質の基質もしくは基質様物質となり得る化合物を意味する。基質となり得る化合物には、上記の各種情報源から確認できる基質のみならず、当該基質を参照して、それらと構造上類似しもしくは類似しないが、現に、基質としていずれかのシトクロムＰ４５０の反応に関与できるものとして選択される化合物が包含される。
キノンは、芳香族化合物のＣＨ原子団二つをＣＯ原子団に変え、さらに二重結合をキノイド構造にするのに必要なだけ動かしてできる化合物の総称である。本発明の反応系に用いられるキノン類縁化合物は、本発明の目的に沿い、生理的条件下でのＰ４５０反応系におけるコファクター機能を代替することのできる上記キノンの定義に該当する化合物の全てを包含する。限定されるものでないが、キノン類縁化合物としては、ベンゾキノン、ナフトキノンのように芳香族キノンのほか、それらの化合物をアミノ基、カルボキシル基、メチル基で修飾した種種の誘導体、さらにナフトエ酸のように還元されたキノン化合物を挙げることができる。具体的な化合物の例としては、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（以下、ＡＣＮＱとも言う）、１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ビタミンＫ３、１，４−ベンゾキノンなどが挙げられる。以下にＡＣＮＱ、１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ビタミンＫ３、１，４−ベンゾキノンの構造式を示す。
ＡＣＮＱは次式
2007032540.tif 000002
で表される。１，４−ナフトキノンは次式
2007032540.tif 000003
で表される。１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は次式
2007032540.tif 000004
で表される。ビタミンＫ３は次式
2007032540.tif 000005
で表される。１，４−ベンゾキノンは次式
2007032540.tif 000006
で表される。
このようなキノン類縁化合物を含んで成る本発明に従うシトクロムＰ４５０の反応系は、従来反応に不可欠とされ、制限要因とされてきた電子伝達コファクターを排除することができ、安価で有用な物質変換に利用することができる。
本発明で使用する、初発電子供給手段とは、Ｐ４５０とキノン類縁化合物と，場合により、Ｐ４５０の基質となり得る化合物の存在する系において、電子を供給することのできる物質もしくは構造物を意味する。かような物質の代表的なものとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）などを挙げることができる。また、例えば，非特許文献５に記載されるように、例えば、グラファイト電極に一定の固定媒体またはリガンドを介して、必要により改変したＰ４５０またはその活性ドメインを固定すると、電極からＰ４５０に電子を伝達でき、例えば、一方では、共存する二原子酸素（ｄｉｏｘｙｇｅｎ）を水までに変換できることが知られている。限定されるものでないが、このような電子を伝達できる電極であって、本発明の目的に沿うものであれば、本発明にいう初発電子供給手段に包含される。
以上の本発明の反応系は、例えば、通常の酵素変換を想定して組まれた反応形態のように、ＮＡＰＤＨまたはＮＡＤＨ、キノン類縁体、Ｐ４５０を含む適当な緩衝液を入れた反応槽に基質を添加する方法で、バッチまたは連続的な反応を行うことで実用に適する。
一方、初発電子供給手段に電極を選択する場合は電極を設置した反応槽内にキノン類縁体、およびＰ４５０を含む適当な緩衝液を入れ、さらに基質を添加しながら通電してバッチまたは連続的な反応を行う。この場合は電極からキノンへの電子伝達を円滑に行うためにフェリシアニド（ｆｅｒｒｉｃｉａｎｉｄｅ，化学式  Ｆｅ（ＣＮ）６３−）等の添加物を加えることもできる。このように反応系を構築することで、所望の基質をその酸化型化合物へ変換できるバイオリアクターを構築することもできる。
本発明の反応系では、初発電子供給手段、Ｐ４５０、キノン類縁化合物、存在させる場合の基質となり得る化合物は、バッチ式に、または連続様式でＰ４５０以外の要素を供給でき、それらの使用割合は、通常、
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ        ０．１〜１ｍＭ
Ｐ４５０                        ０．１〜１０μＭ
キノン類縁化合物                ０．０１〜１μＭ
基質有機化合物                  １ｍＭ〜１０００ｍＭ
とすることができる。
こうして、基質となり得る化合物からそれらの酸化型化合物に変換する工程を含んで成る該酸化型化合物の製造方法もさらなる別の態様の本発明として提供できる。反応系を稼動する温度は、使用するＰ４５０の温度感受性に応じて決定することができる。例えば、上述した耐熱性のＰ４５０酵素ＣＹＰ１１９の場合には、３０〜８０℃で本発明の系を使用できる。かような反応系は通常、その系で働くＰ４５０酵素の至適ｐＨにて十分な緩衝効果をもつような緩衝剤を使用して、至適ｐＨに調整した緩衝液、例えばｐＨ７．３付近が至適ｐＨであれば１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）などを使用することができる。また、この緩衝液には必要に応じてＰ４５０酵素を安定化するのに寄与する物質、例えばグリセロールやジチオスレイトールなどを補助的に添加してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＡＣＮＱなどの添加とＭｏｘＡによるジクロフェナクの４’位水酸化変換量の関係を表すグラフである。図中、ａはＭｏｘＡおよびジクロフェナクを添加するが、ＡＣＮＱ、ＮＡＤＨ＋ＮＡＤＰＨおよびグルコースデヒドロゲナーゼ＋グルコースは無添加の系、ｂはＭｏｘＡ、ジクロフェナクおよびＡＣＮＱを添加するが、ＮＡＤＨ＋ＮＡＤＰＨおよびグルコースデヒドロゲナーゼ＋グルコースは無添加の系、ｃはＭｏｘＡ、ジクロフェナク、ＡＣＮＱおよびＮＡＤＨ＋ＮＡＤＰＨを添加するが、グルコースデヒドロゲナーゼ＋グルコースは無添加の系、そしてｄはＭｏｘＡ、ジクロフェナク、ＡＣＮＱ、ＮＡＤＨ＋ＮＡＤＰＨおよびグルコースデヒドロゲナーゼ＋グルコースを添加した系を表す。
図２は、各種キノン化合物のジクロフェナクの４’位水酸化変換に対する効果を表すグラフである。図中、■印はＡＣＮＱの添加系、▲印は１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の添加系、□印はビタミンＫ３の添加系、＊印は１，４−ベンゾキノンの添加系、および●印は１，４−ナフトキノンの添加系を表し、そして◆印はキノン無添加系を表す。
図３は、１，４−ナフトキノンの添加の有無とＣＹＰ１５４Ａにより生成する７−ヒドロキシクマリン量の関係を表すグラフである。図中、ａは精製ＣＹＰ１５４Ａ溶液を添加しないが、１，４−ナフトキノン、ＮＡＤＰＨおよび７−エトキシクマリンを添加した系、ｂは１，４−ナフトキノンを添加しないが、精製ＣＹＰ１５４Ａ溶液、ＮＡＤＰＨおよび７−エトキシクマリンを添加した系、ｃは精製ＣＹＰ１５４Ａ溶液、１，４−ナフトキノン、ＮＡＤＰＨおよび７−エトキシクマリンを添加した系を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、ノノムラエア  レクチカテナＩＦＯ  １４５２５由来のＰ４５０であるＭｏｘＡ、およびノカルディア  ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２）由来のＰ４５０であるＣＹＰ１５４Ａを用いた、反応例を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
プラスミドの構築
（１）  ｐＭｏｘＡｈｉｓの構築
プライマーＭｏｘＡ−１Ｆ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＡＡＣＴＧ−３’）（配列番号３参照）およびＭｏｘＡ−Ｒｈｉｓ（５’−ＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＡＣ−３’）（配列番号４参照）を用いて、Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ  ＩＦＯ  １４５２５の全ＤＮＡを鋳型にして以下の反応条件にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ｍｏｘＡ遺伝子を増幅した。
（反応液組成）
滅菌精製水                                                ３０μｌ
２倍濃縮ＧＣ緩衝液Ｉ（宝酒造社製）                        ５０μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、
ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）                              １６μｌ
ＭｏｘＡ−１Ｆプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）            １μｌ
ＭｏｘＡ−Ｒｈｉｓプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）        １μｌ
Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ
ＩＦＯ  １４５２５全ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）        １μｌ
ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ、
宝酒造社製）                                          １μｌ
５０μｌずつ２本のマイクロチューブに分注する。
（温度条件）
９４℃  ３分，（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）２５サイクル，７２℃  ５分
この反応により増幅されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。このＤＮＡ溶液を反応容量５０μｌ中で制限酵素Ｎｄｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで処理した後、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出した１．２ｋｂ  ｍｏｘＡ遺伝子断片を含むゲル切片から同断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収し、精製した。この断片を大腸菌プラスミドベクターｐＥＴ２９ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅ  Ｉ部位およびＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結して、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、プラスミドｐＭｏｘＡｈｉｓを構築した。
（２）  ｐＮｆａ２２９３Ｈｉｓの構築  プライマーＮｆａ２２９３−１Ｆ（５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＣＡＡＣＣＣＡＧＡＴＧＣＣＧ−３’）（配列番号５参照）およびＮｆａ２２９３−３Ｒ（５‘−ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＣＧＣＣＧＴＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣＧＧ−３’）（配列番号６参照）を用いて、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２の全ＤＮＡを鋳型にして以下の反応条件にてＰＣＲを行い、ＣＹＰ１５４Ａ遺伝子を増幅した。
（反応液組成）
滅菌精製水                                                  ７１μｌ
１０倍濃縮ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液（東洋紡社製）            １０μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                                          ４μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、
ｄＣＴＰ各２ｍＭ）                                    １０μｌ
Ｎｆａ２２９３−１Ｆプライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）          １μｌ
Ｎｆａ２２９３−３Ｒプライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）          １μｌ
Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２
全ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）                            １μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（１ｕｎｉｔ／μｌ、東洋紡社製）                        ２μｌ
５０μｌずつ２本のマイクロチューブに分注する。
（温度条件）
９４℃  ３分，（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８度  ２分）２５サイクル，７２℃  ５分
この反応により増幅されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。このＤＮＡ溶液を反応容量５０μｌ中で制限酵素Ｎｄｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで処理したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出した１．２ｋｂ  ＣＹＰ１５４Ａ遺伝子断片を含むゲル切片から同断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収し、精製した。この断片を大腸菌プラスミドベクターｐＥＴ２９（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅ  Ｉ部位およびＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結して、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、プラスミドｐＮｆａ２２９３Ｈｉｓを構築した。
【実施例２】
【０００７】
Ｐ４５０酵素の調製法
プラスミドｐＭｏｘＡｈｉｓ  ＤＮＡまたはｐＮｆａ２２９３Ｈｉｓを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。得られた株の２０％グリセロール保存カルチャーを調製し、その１０μｌを、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加したＬＢ培地２ｍｌに加え、３０℃、１６時間、２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液５００μｌを、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加したＭ９ｍｉｘ培地（Ｍ９塩、０．４％グルコース、０．５％カザミノ酸、２０μｌ／ｍｌチミン、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＦｅＳＯ４）５０ｍｌに加え、３７℃で２．５時間振とう培養後、１００ｍＭ  ＩＰＴＧを５０μｌ、８０ｍｇ／ｍｌ５−アミノレブリン酸を５０μｌ順次添加し、２２℃、１２０ｒｐｍで１６時間振とう培養した。遠心分離により、この培養液から回収した菌体をトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％グリセロール）１０ｍｌで１回洗浄し、次に菌体を１０ｍｌの同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液９ｍｌにＢｕｇＢａｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を９００μｌ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ社製、２５ｕｎｉｔｓ／μｌ）を３μｌ、リゾチーム溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）を９００μｌ順次添加し、３０℃で２０分インキュベートした。この溶菌液を遠心分離（３０００ｘｇ、４℃、１０分）した後に得られた上清を、予めイオン交換水で洗浄した後トリス緩衝液で平衡化させた、ＰｒｏＢｏｎｄカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に通過させた。その後カラムをトリス緩衝液１０ｍｌで洗浄した。次に５０ｍＭ  イミダゾールを含むトリス緩衝液５ｍｌでカラムを洗浄した後、２００ｍＭ  イミダゾールを含むトリス緩衝液５ｍｌでＭｏｘＡまたはＣＹＰ１５４Ａを溶出させた。この溶出液をＣＶ−１緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０％グリセロール、２ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  グルコース）中で透析した結果得られた溶液を精製Ｐ４５０溶液とした。この溶液はＳＤＳ−ＰＡＧＥでＰ４５０タンパク質の推定分子量と一致する約４５ｋＤに、ほぼ単一のバンドを示した。また、大村および佐藤らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６４２３９：２３７０−に３７８）に従って、還元条件下で一酸化炭素結合前後の差スペクトルを測定することで溶液中に含まれるＰ４５０濃度を測定した結果、ＭｏｘＡ溶液で６．１μＭ、ＣＹＰ１５４Ａ溶液で１１．２μＭのＰ４５０が含まれていた。これらの精製Ｐ４５０溶液を以下の実施例にて記述する反応に使用した。
【実施例３】
【０００８】
ＡＣＮＱを用いたジクロフェナクの水酸化
以下に示す条件にてジクロフェナクの水酸化反応試験を実施した。
（反応液組成）
６．１μＭ  精製ＭｏｘＡ溶液                        ２３４μｌ
１０ｍＭ  ＡＣＮＱ（ＤＭＳＱ溶液）                      ５μｌ
５０ｍＭ  ＮＡＤＨ                                    ２５μｌ
５０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ                                  ２５μｌ
１ｕｎｉｔ／μｌ  グルコースデヒドロゲナーゼ
（東洋紡社製）                                  １０μｌ
２Ｍ  グルコース                                      １０μｌ
１００ｍＭ  ジクロフェナクナトリウム（ＤＭＳＯ溶液）    ５μｌ
ＣＶ−１緩衝液で最終容量が５００μｌになるように調整
この他、上記反応液組成に倣って、（１）ＡＣＮＱ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースを添加しないもの、（２）ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースを添加しないもの、（３）グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースを添加しないものも比較するため反応液を調製し、３０℃で２００ｒｐｍのしんとう条件下、２０時間反応を行った。
反応後、５００μｌのメタノールを加え、ボルテックスした後、遠心して得られた上清を下記の条件によりＨＰＬＣで分析した。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０（７５×４．６ｍｍ  ｉ．Ｄ．ワイエムシー社製）
移動相：０．８５％リン酸水溶液−メタノール（４０：６０）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出波長：２６７ｎｍ
保持時間：ジクロフェナク：１１．５ｍｉｎ、４’−水酸化ジクロフェナク：４．０ｍｉｎ
その結果、図１に示すように、反応系にＡＣＮＱを添加した時にのみジクロフェナクの水酸化が認められた。この時、ＡＣＮＱ単独よりＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨを加えた系にて水酸化物変換量が７倍以上増加し、これにＮＡＤＨの再生のためにグルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコースを添加すると、変換量はさらに約２倍増加した。
【実施例４】
【０００９】
各種キノンのジクロフェナクの水酸化に対する効果
以下に示す条件にて、
（反応液組成）
６．１μＭ  精製ＭｏｘＡ溶液                  ４０μｌ
５０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ                          １０μｌ
１０ｍＭ  各種キノン−ＤＭＳＯ溶液＊            １μｌ
１００ｍＭ  ジクロフェナクナトリウム            １μｌ
ＣＶ−１緩衝液                                ４８μｌ
＊  上記反応液組成における各種キノンについては、ＡＣＮＱ、１，４−ナフトキノン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ビタミンＫ３、１，４−ベンゾキノンを試験した。対照（キノン無添加）にＤＭＳＯのみを用いた。
反応後、５μｌの１Ｎ塩酸を加えて、１００μｌの酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル抽出液５０μｌをサンプルチューブに移して、エバポレーターで減圧乾固した。これをメタノール２００μｌに溶解し、試料溶液として実施例３に記載した条件と同様にしてＨＰＬＣで分析した。
この試験の結果、図２に示すように５種のキノン類のうち、いずれを添加した反応系においても、ジクロフェナクの水酸化活性が認められた。水酸化体の変換量から、この反応に比較的適したキノンはＡＣＮＱと１，４−ナフトキノンであった。各種キノン類縁化合物存在下で得られた４’−水酸化ジクロフェナクの変換量は、本反応条件において、１，４−ナフトキノンを添加した場合の１８時間後に得られた４’−水酸化ジクロフェナクの量を１００とした相対値で表した。
【実施例５】
【００１０】
１，４−ナフトキノンを用いた７−エトキシクマリンの脱エチル化
以下に示す条件にて７−エトキシクマリンの脱エチル化試験を実施した。
（反応液組成）
１１．２μＭ  精製ＣＹＰ１５４Ａ溶液                ８０μｌ
１０ｍＭ  １，４−ナフトキノン（ＤＭＳＯ溶液）        ４μｌ
１００ｍＭ  ＮＡＤＰＨ                              １０μｌ
１００ｍＭ  ７−エトキシクマリン（ＤＭＳＯ溶液）  ０．８μｌ
ＣＶ−１  緩衝液で最終容量が４００μｌになるように調整
この他、上記反応液組成に倣って、
（１）精製ＣＹＰ１５４Ａ溶液を添加しないもの、
（２）１，４−ナフトキノンを添加しないものも比較するため反応液を調製し、３０℃で１２５ｒｐｍのしんとう条件下、４時間反応を行った。
反応後、４００μｌの酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル抽出液２００ｕｌを試験管に移して、エバポレーターで減圧乾固した。乾固物を２５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）４ｍｌに溶解し、試料溶液とした。７−エトキシクマリンの脱エチル化の結果生成する７−ヒドロキシクマリンを検出するため、蛍光検出器により励起波長３８０ｎｍにおける４５０ｎｍの蛍光を測定した。
その結果、図３に示すように、１，４−ナフトキノンの存在下でＣＹＰ１５４Ａによる７−エトキシクマリンの脱エチル化が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明によれば、無細胞系である一定の有機化合物を効果的に変換できる酸化的反応系が提供できるので、本発明は、例えば、生物活性を改変した医薬の製造業、薬物代謝の研究ツール等を提供する産業、等で利用可能である。
［配列表］
2007032540.tif 000007
2007032540.tif 000008
2007032540.tif 000009
2007032540.tif 000010
2007032540.tif 000011
2007032540.tif 000012
【図１】
2007032540.tif 000013
【図２】
2007032540.tif 000014
【図３】
2007032540.tif 000015
【国際調査報告】
2007032540.tif 000016
2007032540.tif 000017
2007032540.tif 000018
2007032540.tif 000019