【手続補正書】
【提出日】平成20年10月9日(2008.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明はまた、配列番号:2のアミノ酸約50からアミノ酸約149と約90%同一性を有するアミノ酸を含むMDA-7ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、MDA-7ポリペプチドは以下のポリペプチドではない：Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser（配列番号２９）。別の実施態様では、MDA-7ポリペプチドは以下のポリペプチドではない：Met Gln Met Val Val Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val Leu Gln Asn Val Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu（配列番号３０）。
本発明の非限定的な実施態様では、本発明は、以下のMDA-7変種（“MVX”ポリペプチド）を提供する：
MV1（抗増殖活性を有するタンパク質）は、野生型MDA-7のアミノ酸残基48−206に対応する。ある実施態様では、MV1は、長さが約130アミノ酸から約190アミノ酸のアミノ酸配列を有するタンパク質である。別の実施態様では、MV1は、長さが約145アミノ酸から約175アミノ酸のアミノ酸配列を有するタンパク質である。別の実施態様では、MV1は約160アミノ酸を有するタンパク質である。ある実施態様では、MV1タンパク質は、配列番号:2の約48から約206のアミノ酸と少なくとも約80%同一性を有する。別の実施態様では、MV1タンパク質は、配列番号:2の約48から約206のアミノ酸と少なくとも約85%同一性を有する。別の実施態様では、MV1タンパク質は、配列番号:2の約48から約206のアミノ酸と少なくとも約90%同一性を有する。別の実施態様では、MV1タンパク質は、配列番号:2の約48から約206のアミノ酸と少なくとも約95%同一性を有する。別の実施態様では、MV1タンパク質は、配列番号:2の約48から約206のアミノ酸と少なくとも約99%同一性を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
M4及びMDA-7/IL-24タンパク質のC及びFヘリックス内の疎水性残基は生物学的活性に必要である
Vandenbroeckら（2002）の研究によって、全てのIL-10ファミリーメンバー（mda-7/IL-24を含む）の保存されたDnaK/BiP/GRP78結合部位（これら分子の折り畳みを促進するために必要であるかもしれない）が同定された（Vandenbroeck et al. 2002）。前記保存されたDnaK/BiP/GRP78結合部位はヘリックスCに位置し、mda-7/IL-24では8残基配列TLLEFYLK（配列番号３１）から成る。IL-10及びIFN-γの三次元構造では、ヘリックスCのDnaK/BiP/GRP78結合部位は、ヘリックスFに存在する第二の高度に保存されたアミノ酸残基配列（mda-7/IL-24ではKALGEVD（配列番号３２））の隣に配置される。ヘリックスCの保存されたセグメントとは対照的に、ヘリックスFの保存された配列は、DnaK/BiP/GRP78と相互作用することは示されなかった。細胞内で発現されると、MDA-7/IL-24及びM4のどちらもERに局在するので、ヘリックスC及びFに位置するこれら保存された残基セグメントの潜在的役割を、M4及びMDA-7/IL-24による殺作用の媒介において究明した。
MDA-7/IL-24のヘリックスC（TLLEFYLK（配列番号３１））及びF（KALGEVD（配列番号３２））の保存残基の癌細胞特異的死滅活性誘導における役割を解明するために、第二の変異体セット（M4A−M4G）を作成した。MDA-7/IL-24の最後の7残基をM4Aで欠失させ残基104−199を含む変異体を得た。M4B（残基119−206）は、DnaK/BiP/GRP78結合部位を含むヘリックスCの欠失に対応する。M4CはM4（104−206）と同じ長さであるが、ヘリックスC残基TLLEFYLK（配列番号３１）をAGDATAGA（配列番号３３）に変異させた。M4Dでは、完全なFヘリックスが欠失し、構築物はMDA-7/IL-24の残基104から187を保持していた。M4Eでは、ヘリックスFの保存残基（KALGEVD（配列番号３２））をGAHGAVA（配列番号３４）に変異させた。M4F（残基119−187）は二重欠失変異体であり、MDA-7/IL-24のヘリックスC及びFの両方を除去した。最後に、M4GはヘリックスC及びFの両保存残基を、変異体M4C及びM4Eについて先に記載したように変異させた二重変異構築物である（図10A）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
前記種々の構築物を、HeLa及びDU-145癌細胞並びに正常P69細胞におけるコロニー（クローン）形成アッセイを用いて、機能的活性について評価した。これらの実験は、mda-7/IL-24、M4及びM4Aは、コントロールpREP4トランスフェクト細胞と比較して、ヒグロマイシン耐性コロニー形成をHeLa及びDu-145細胞の両細胞で同程度に低下させ、正常なP69細胞ではコロニー形成に有意な変化を与えなかった（図10B、10C及び10D）。C又はFヘリックスの変異若しくは欠失（M4B、M4C、M4D及びM4E）は、mda-7/IL-24、M4又はM4Aによるトランスフェクションと比較して、HeLa及びDU-145細胞におけるコロニー形成を軽度に低下させた。M4F及びM4G変異体（C及びFヘリックスの両方に変異若しくは欠失を含む）は、コロニー阻害活性を欠くか（HeLa）又は極めてわずか（DU-145）の阻害活性を示した（図10B及び10C）。これらの新たに追加した変異体のいずれもP69細胞でのコロニー形成に影響を与えなかった（図10D）。これらのデータは、mda-7/IL-24のM4欠失変異体の癌特異的活性の媒介におけるMDA-7/IL-24タンパク質のC及びFヘリックスの役割を示している。どちらかの部位を変異させるか又は欠失させたとき活性の破壊があり、両部位を欠失又は変異させたとき機能は本質的に消滅した。
MDA-7/IL-24による死滅活性の媒介におけるヘリックスC及びF残基の役割をさらに調べるために、完全長MDA-7/IL-24のヘリックスC及びFの保存領域内に変異を創出した。MDA7(C)では、MDA-7/IL-24のヘリックスCをTLLEFYLK（配列番号３１）からTLAGSRLG（配列番号３５）へ変異させ、MDA7(C/F)では、MDA-7/IL-24のC及びFを変異させた。MDA-7(C/F)では、α-ヘリックスC残基TLLEFYLK（配列番号３１）を残基TLAGSRLG（配列番号３５）へ変異させ、α-ヘリックスF残基KALGEVD（配列番号３２）を残基GAHGAVA（配列番号３４）に変異させた（図10E）。MDA-7(C)に導入した変異は、構築物作成における困難さのためにM4で作成した他のヘリックスC変異とは異なっているが、ヘリックスFの保存領域における変異は、M4構築物で用いたものと同一であった。
コロニー形成アッセイを用いる癌細胞株及び正常細胞株におけるコロニー形成に対するこれらの変異の影響を評価した（図10F及び10G）。ヘリックスCの変異はMDA-7/IL-24の機能的活性を破壊し、CおよびF（C/F）ヘリックスの両方の変異はMDA-7/IL-24の癌特異的阻害活性を抑制し、pREP4ベクターをトランスフェクトした培養で観察されたコロニー数と同様な数のコロニーが生じた（図10F）。しかしながら、これらのコロニーは、ベクターコントロールをトランスフェクトした細胞で形成されたコロニーよりも形態的に小さく、何らかの増殖調節活性の保持が示唆された。これらMDA-7/IL-24変異体のどちらについてもP69細胞では影響は観察されなかった（図10G）。これらの実験により、MDA-7/IL-24タンパク質のC及びFヘリックスの両方が、最適なmda-7/IL-24癌特異的増殖抑制活性の維持に必須であることが確認された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
材料と方法
細胞培養及びトランスフェクションアッセイ
HeLa（ヒト子宮頸癌）、DU-145（ヒト前立腺癌）、T47D（ヒト乳癌）、及びFM516-SV（SV40 T抗原不死化正常ヒトメラニン形成細胞）細胞株は、ダルベッコ改変イーグル培養液（DMEM）（10%ウシ胎児血清補充）で、37℃にて5%CO2インキュベーターで増殖させた。SV40 T抗原不死化正常ヒト前立腺上皮細胞P69は、EGF補充無血清培養液で増殖させた（Bae et al. 1994）。初代ヒト胎児星状細胞は、10%ウシ胎児血清を含むDMEMで増殖させた。リポフェクタミン（Lipofectamine, Invitrogen）2000又はスーパーフェクト（Superfect, Qiagen）を製造業者の指示に従って用いて種々の細胞タイプにトランスフェクトし、24から48時間インキュベートした後、個々の図の説明文に概略したように更なる実験操作を行った。
MDA-7/IL-24変異体の構築
MDA-7/IL-24のN-末端連続欠失変異体（M1からM6）を共通のアンチセンスプライマー及び対応するセンスプライマー（表1；補足データ）を用いPCRによって作成した。M1（アミノ酸48−206）はシグナルペプチドを欠いていた。M2（アミノ酸63−206）では、α-ヘリックスドメインAは中央で破壊されていた。M3（アミノ酸80−206）では、α-ヘリックスドメインBは中央で破壊されていた。M4（アミノ酸104−206）はC、D、E及びFα-ヘリックスドメインを含んでいた。M5（アミノ酸131−206）は、D、E及びFα-ヘリックスドメインのみを含み、一方、M6（アミノ酸159−206）はE及びFα-ヘリックスドメインを含んでいた。より良好な発現のために、開始コドン（GCCACCATG（配列番号３６））を含むKozak配列を変異体の前部に付加した。変異体をベクターpREP4（Invitrogen）のHindIII及びBamHI部位にクローニングした（前記ベクターはヒグロマイシン耐性遺伝子選別マーカーを含んでいる）。同様な欠失変異体を、N-末端に3つのflagタグを含むベクターpCMV3X Flag（Sigma）のHindIII及びBamHI部位でクローニングした。さらに追加の変異を、表1に記載したプライマーを用いPCRによって欠失変異体M4内に作成した（図10A）（M4AからM4G）。これらの変異体は欠失又はスキャンニング変異を有する。M4A（アミノ酸104−199）は、C-末端に制限部位が欠如しているためにコントロールとして維持した。M4B（アミノ酸119-206）ではα-ヘリックスCが欠失し、M4D（アミノ酸104−187）ではα-ヘリックスFが欠失し、M4F（アミノ酸119−187）ではC及びFα-ヘリックスが欠失している。M4C（アミノ酸104−206）では、α-ヘリックスC中のTLLEFYLK（配列番号３１）残基がAGDATAGA（配列番号３３）残基に変異し、一方、M4Eではα-ヘリックスF中のKALGEVD（配列番号３２）残基がGAHGAVA（配列番号３４）残基に変異している。二重変異体M4GはC及びFα-ヘリックスに同じ変異を有している。同様なアプローチを用いて、完全長MDA-7/IL-24のヘリックスC及びFに変異を創出した。変異体MDA7(C)では、α-ヘリックスCのTLLEFYLK（配列番号３１）残基を残基TLAGSRLG（配列番号３５）に変異させた。中央にXbaI制限部位を付加することによって構築物を作成し、PCRによって5'及び3'DNAフラグメントを増幅させ、両フラグメントをpREP4（詳細については表1参照）のHindIII及びBamHI部位に連結した。変異体MDA7(C/F)では、同じ変異をα-ヘリックスCに創出し、さらにα-ヘリックスFのKALGEVD（配列番号３２）残基をGAHGAVA（配列番号３４）残基に変異させた。変異体MDA7(C/F)を作成するために、変異体MDA7(C)を鋳型として用いた。しかしながら、MDA7(C/F)は、その末端に制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しないために、完全長の野生型MDA-7/IL-24の1−199残基を含んでいた。最後の7残基の除去がM4の活性に対して影響をもたなかったので（図10E）、構築物M4AをMDA7(C/F)のためのコントロールとして用いた。全ての変異体をpREP4のHindIII及びBamHI部位でクローニングした。MDA7(C)及びMDA7(C/F)の両変異体もベクターpCMV3Xflagベクターでクローニングし、これらタンパク質のflagタグ付加型をベクターのHindIII及びBamHI部位で作成した。全ての構築物の正しさは配列分析で確認した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
【図１】MDA-7変種M1−M10の模式図を示す。以下の各々は本発明の1つの実施態様である。この例では、M1はアミノ酸48から206、M2はアミノ酸63から206、M3はアミノ酸80から206、M4はアミノ酸104から206、M5はアミノ酸131から206、M6はアミノ酸159から206、M7はアミノ酸48から180、M8はアミノ酸48から158、M9はアミノ酸48から130、M10はアミノ酸48から104である。
【図２Ａ−Ｂ】腫瘍増殖（コロニー形成アッセイによる）及び細胞死滅（HeLa細胞アッセイによる）に対する本発明のポリペプチドの影響を示す棒グラフである。図2Aはコロニー形成アッセイに対する本発明のポリペプチドの効果を示す。図2Bは、ポリペプチド誘導HeLa細胞死滅を示す。
【図３】単層コロニー形成におけるHeLa細胞のコロニー形成に対するMDA-7変種の効果を示す。
【図４】前立腺癌細胞株DU145のコロニー形成に対するMDA-7変種の効果を示す。
【図５】MDA-7のドメインクローンの模式図を示す。ABドメインは野生型MDA-7のアミノ酸63−101を含み、CDドメインはアミノ酸105−154を含み、EFドメインはアミノ酸159−201を含む。
【図６】HeLa細胞の死滅活性に対する種々のドメインの効果を示す。
【図７】DU145細胞に対するMDA-7の死滅作用に対するMDA-7ドメインの効果を示す。
【図８Ａ−Ｅ】MDA-7/IL-24の機能活性領域の同定を示す。図8A：MDA-7/IL-24遺伝子中に作成したN-末端欠失変異の模式図である。フラグメントを発現ベクターpREP4でクローニングした。図8B、8C及び8D：癌及び正常細胞でのコロニー形成に対する種々の欠失変異体の効果を示す。HeLa、DU-145及びP69細胞にMDA-7/IL-24の種々の欠失構築物をトランスフェクトし、次の日に細胞を継代培養し、ヒグロマイシンの存在下でコロニーを形成する能力について2週間選別した。50細胞を超えるコロニーを数え、プロットした。図8E： HeLa細胞へのトランスフェクション後の3X Flag-付加MDA-7/IL-24欠失構築物の発現を示す。
【図９Ａ−Ｇ】M4は、完全長のMDA-7/IL-24と類似の生物学的特性及び活性を示す。図9A及び9B：アデノウイルスによるトランスダクションに続くMDA-7/IL-24及びM4の発現を示す。完全長MDA-7/IL-24又はM4構築物を発現するアデノウイルスを、mRNA発現についてはノーザンブロットにより（図9A）、タンパク質発現についてはウェスタンブロット（図9B）によって解析した。Ad.vec（一切の遺伝子挿入物を欠く）、Ad.mda-7（完全長mda-7/IL-24遺伝子を含む）、又はAd.M4（M4欠失構築物を含む）を100pfu/細胞でHeLa細胞に感染させ、mRNA及びタンパク質発現を感染後48時間で決定した。図9C：Ad.M4は癌細胞で選択的に細胞の生存活性を低下させる。表示の細胞タイプを96ウェルプレートに播種し、種々のpfuでAd.vec、Ad.mda-7又はAd.M4を感染させた。5日後に生存率をMTTアッセイで判定し、Ad.vec処置に対する比としてプロットした。図9D：Ad.M4の癌特異的コロニー形成阻害活性を示す。DU145、HeLa、T47D及びP69細胞を種々のpfuのウイルスに感染させ、次の日、細胞を60mm培養皿にてクローニング濃度で継代培養し、2週間コロニーを形成させた。2週間後に、50細胞を超えるコロニーを数え、形成されたコロニー数を最初に播種した細胞数で割ってクローニング効率を算出した。図9E：Ad.M4は種々の癌でアポトーシス細胞死を誘導するが、正常な不死化前立腺細胞では誘導しないことを示す。DU-145、HeLa、T47D及びP69細胞を2ｘ105/ウェルの濃度で6ウェルプレートに播種し、次の日、100pfu/細胞でAd.vec、Ad.mda-7、又はAd.M4を感染させた。20時間後に、前記細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗浄し、アロフィコシアニン（APC）標識アネキシン（BD Biosciences Pharmigen, San Diego, CA）で染色し、フローサイトメトリーで解析した。アポトーシス細胞の量をFlowJo 6.3.1プログラムを用いて定量した。図9F及び9G：完全長MDA-7/IL-24及びM4はERに局在する。DU-145（図9F）及びP69（図9G）細胞を100pfu/細胞のAd.M4又はAd.mda-7で感染させた。感染後24時間で細胞を固定し、MDA-7/IL-24及びM4タンパク質を抗mda-7/IL-24ウサギポリクローナル抗体を用い間接免疫蛍光によって検出した。同時局在は、ERマーカータンパク質、カルレグリンに対する抗体を用いて決定した。MDA-7/IL-24の像及びカルレグリンの像は重なった。
【図１０Ａ−Ｇ】M4及びMDA-7/IL-24のヘリックスC及びヘリックスFの変異解析によって、癌選択的増殖阻害活性の媒介におけるこれら領域の重要性が確認された。図10A：C及びFヘリックスを標的としてM4で発生させた変異の模式図である。領域を欠失させるか又は変異させ、得られた構築物をベクターpREP4にクローニングした。図10B、10C及び10D：最適な癌選択的増殖阻害活性はM4の完全なヘリックスC及びFに依存することを示す。HeLa（図10B）、DU-145（図10C）及びP69（図10D）をM4の種々の欠失構築物でトランスフェクトし、次の日、細胞を継代培養し、ヒグロマイシンの存在下におけるコロニー形成能力について2週間選別した。50細胞を超えるコロニーを数え、プロットした。図10E：完全長MDA-7/IL-24のヘリックスC及びFにおける変異の模式図を示す。図10F及び10G：癌細胞で最大の増殖阻害活性を引き出すためにMDA-7/IL-24のC及びFヘリックスが重要であることを示す。HeLa及びP69細胞をMDA-7/IL-24の変異構築物でトランスフェクトした。次の日、細胞を継代培養し、ヒグロマイシンの存在下におけるコロニー形成能力について2週間選別した。50細胞を超えるコロニーを数え、プロットした。完全長MDA-7/IL-24及びM4をコントロールとして用いた。
【図１１Ａ−Ｅ】完全長MDA-7/IL-24及びM4はBiP/GRP78と結合する。図11A：内在性BiP/GRP78によるMDA-7/IL-24及びM4の同時免疫沈降を示す。HeLa細胞に100pfu/細胞のAd.mda-7、Ad.M4又はAd.vecを感染させ、48時間後にBiP/GRP78抗体を用いて免疫沈降解析を実施した。図11B：Flag-付加MDA-7/IL-24又はM4のBiP/GRP78による同時免疫沈降を示す。Flag-付加MDA-7/IL-24又はM4及びMyc-付加BiP/GRP78をHela細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、BiP/GRP78をBiP/GRP78ポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させた。サンプルを穏やかに洗浄し、12%SDS-PAGEで分離し、Flag-M2抗体で検査した。図11Bによって、BiP/GRP78によるMDA-7/IL-24及びM4の同時免疫沈降が確認され、myc抗体を用いたMyc-付加BiP/GRP78の発現及び免疫沈降プロフィルが示される。図11C：MDA-7/IL-24欠失変異体M1、M2及びM3はBiP/GRP78と結合する。図11Bに示したように、BiP/GRP78ポリクローナル抗体を用いてサンプルの免疫沈降を実施し、さらにFlag-M2モノクローナル抗体を用いて同時免疫沈降を実施した。図11D：MDA-7/IL-24及びM4のFlag付加CプラスFヘリックス変異体の発現の確認である。ヘリックスC及びFに変異を有する表示のMDA-7/IL-24及びM4のFlag付加変異体、完全長MDA-7/IL-24並びにM4の発現をFlag-M2モノクローナル抗体により確認した。図11E：ヘリックスC及びFに変異を有するMDA-7/IL-24及びM4変異体はBiP/GRP78と結合しない。同時免疫沈降実験を図11Dに記載した変異体を用いて実施し、Flag-M2モノクローナル抗体で検査した。
【図１２Ａ−Ｄ】完全長MDA-7/IL-24タンパク質並びに変異体M1、M2、M3及びM4によってコードされるタンパク質はER中でBiP/GRP78と共局在化する。図12A：HeLa細胞を一過性にFlag付加完全長MDA-7/IL-24又は表示のMDA-7/IL-24欠失変異体でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を固定し、FlagM2抗体を用い間接免疫蛍光によってMDA-7/IL-24タンパク質を検出した。同時局在化は、BiP/GRP78に対する抗体を用いることによって決定した。Bip/GRP78の画像及びMDA-7/IL-24の画像は重なった。図12B：MDA-7/IL-24、M1及びM4はP38 MAPKのリン酸化を誘導し、一方、不活性な変異体M2及びM3はその活性を欠いている。完全長MDA-7/IL-24、MDA-7/IL-24の特定の欠失変異体、M4又はMDA-7/IL-24若しくはM4の特定の配列変異を発現する構築物をHeLa細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を溶解し、P38のリン酸化状態をホスホ-p38抗体を用いて確認した。全p38タンパク質もまた測定した。図12C：完全長MDA-7/IL-24、M1及びM4によるGadd34及びGadd153の活性化を示す。HeLa細胞を表示の構築物でトランスフェクトし、24時間後に細胞を溶解し、RNAを単離し、Gadd34及びGadd153に特異的なプローブを用いてノーザンブロット検査を実施した。完全長のmda-7/IL-24及び活性な変異体M1及びM4は、ノーザンブロット検査で確認されたとおりGadd34及びGadd153遺伝子発現を誘導し、一方、不活性な変異体はGadd153発現と同様にGadd34発現の低下を誘導した。サンプルの等量ローディングはハウスキーピング遺伝子gapdhを用いて確認した。図12D：mda-7/IL-24誘導アポトーシスの分子メカニズムの提唱モデルである。Ad.mda-7によってデリバーされるMDA-7/IL-24タンパク質（灰色のひし形）は小胞体（ER）に局在し、MDA-7/IL-24タンパク質はBIP/GRP78と相互作用し、このことは、未だ同定されていない分子（X）の活性化及び“ER”のストレスを生じ、アポトーシスをもたらすp38 MAPKの活性化及びGADDファミリー遺伝子の活性化を伴うかもしれない。分泌されたMAD-7/IL-24は同族レセプターと細胞表面で相互作用し、アポトーシスをもたらすシグナル伝達カスケードを活性化する。しかしながら、このシグナル伝達カスケードもまた“ERストレス”を必要とするか否かは未だ決定されてはいない。
【図１３Ａ−Ｂ】Ad.M4は、ヌードマウスへのヒト乳房腫瘍の実験的異種移植において強力な抗腫瘍活性をin vivoで示す。T47Dヒト乳癌細胞を、オスの無胸腺ヌードマウスの左右のわき腹の皮下に注射した。腫瘍が形成された後、左側の腫瘍のみに1ｘ108pfuの投与量で種々のAdを腫瘍内に注射した。注射は、最初の週に1週につき3回、続いて、次の2週には2回注射した。実験の終了時に動物を犠牲にし、腫瘍を取り出して重さを測定した。図13Aは左側の腫瘍体積を示し、図13Bは右側の腫瘍体積を示す。
【図１４】HeLa細胞、DU-145細胞及びA549細胞で測定した、mda-7/IL-24及びM4の等価のバイスタンダー活性である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  Fisher, Paul B.
Gupta, Pankaj
<120>  MDA-7 PROTEIN VARIANTS HAVING ANTIPROLIFERATIVE ACTIVITY
<130> X1O1388
<150>  US 60/632,423
<151>  2004-12-02
<160>  36    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  1700
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  1
cttgcctgca aacctttact tctgaaatga cttccacggc tgggacggga accttccacc     60
cacagctatg cctctgattg gtgaatggtg aaggtgcctg tctaactttt ctgtaaaaag    120
aaccagctgc ctccaggcag ccagccctca agcatcactt acaggaccag agggacaaga    180
catgactgtg atgaggagct gctttcgcca atttaacacc aagaagaatt gaggctgctt    240
gggaggaagg ccaggaggaa cacgagactg agagatgaat tttcaacaga ggctgcaaag    300
cctgtggact ttagccagac ccttctgccc tcctttgctg gcgacagcct ctcaaatgca    360
gatggttgtg ctcccttgcc tgggttttac cctgcttctc tggagccagg tatcaggggc    420
ccagggccaa gaattccact ttgggccctg ccaagtgaag ggggttgttc cccagaaact    480
gtgggaagcc ttctgggctg tgaaagacac tatgcaagct caggataaca tcacgagtgc    540
ccggctgctg cagcaggagg ttctgcagaa cgtctcggat gctgagagct gttaccttgt    600
ccacaccctg ctggagttct acttgaaaac tgttttcaaa aactaccaca atagaacagt    660
tgaagtcagg actctgaagt cattctctac tctggccaac aactttgttc tcatcgtgtc    720
acaactgcaa cccagtcaag aaaatgagat gttttccatc agagacagtg cacacaggcg    780
gtttctgcta ttccggagag cattcaaaca gttggacgta gaagcagctc tgaccaaagc    840
ccttggggaa gtggacattc ttctgacctg gatgcagaaa ttctacaagc tctgaatgtc    900
tagaccagga cctccctccc cctggcactg gtttgttccc tgtgtcattt caaacagtct    960
cccttcctat gctgttcact ggacacttca cgcccttggc catgggtccc attcttggcc   1020
caggattatt gtcaaagaag tcattcttta agcagcgcca gtgacagtca gggaaggtgc   1080
ctctggatgc tgtgaagagt ctacagagaa gattcttgta tttattacaa ctctatttaa   1140
ttaatgtcag tatttcaact gaagttctat ttatttgtga gactgtaagt tacatgaagg   1200
cagcagaata ttgtgcccca tgcttcttta cccctcacaa tccttgccac agtgtggggc   1260
agtggatggg tgcttagtaa gtacttaata aactgtggtg ctttttttgg cctgtctttg   1320
gattgttaaa aaacagagag ggatgcttgg atgtaaaact gaacttcaga gcatgaaaat   1380
cacactgtct gctgatatct gcagggacag agcattgggg tgggggtaag gtgcatctgt   1440
ttgaaaagta aacgataaaa tgtggattaa agtgcccagc acaaagcaga tcctcaataa   1500
acatttcatt tcccacccac actcgccagc tcaccccatc atccctttcc cttggtgccc   1560
tccttttttt tttatcctag tcattcttcc ctaatcttcc acttgagtgt caagctgacc   1620
ttgctgatgg tgacattgca cctggatgta ctatccaatc tgtgatgaca ttccctgcta   1680
ataaaagaca acataactca                                               1700
<210>  2
<211>  206
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Asn Phe Gln Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Thr Leu Ala Arg Pro 
1               5                   10                  15      
Phe Cys Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met Val Val 
20                  25                  30          
Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser Gly 
35                  40                  45              
Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val 
50                  55                  60                  
Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met 
65                  70                  75                  80  
Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val 
85                  90                  95      
Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu 
100                 105                 110         
Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr 
115                 120                 125             
Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe 
130                 135                 140                 
Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe 
145                 150                 155                 160 
Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala 
165                 170                 175     
Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu 
180                 185                 190         
Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 
195                 200                 205     
<210>  3
<211>  159
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly 
1               5                   10                  15      
Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr 
20                  25                  30          
Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu 
35                  40                  45              
Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr 
50                  55                  60                  
Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg 
65                  70                  75                  80  
Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn 
85                  90                  95      
Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met 
100                 105                 110         
Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg 
115                 120                 125             
Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly 
130                 135                 140                 
Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 
145                 150                 155                 
<210>  4
<211>  144
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Gly Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp 
1               5                   10                  15      
Thr Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln 
20                  25                  30          
Glu Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His 
35                  40                  45              
Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn 
50                  55                  60                  
Arg Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn 
65                  70                  75                  80  
Asn Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu 
85                  90                  95      
Met Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg 
100                 105                 110         
Arg Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu 
115                 120                 125             
Gly Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 
130                 135                 140                 
<210>  5
<211>  126
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val 
1               5                   10                  15      
Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu 
20                  25                  30          
Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr 
35                  40                  45              
Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe 
50                  55                  60                  
Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe 
65                  70                  75                  80  
Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala 
85                  90                  95      
Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu 
100                 105                 110         
Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 
115                 120                 125     
<210>  6
<211>  103
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr 
1               5                   10                  15      
Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys 
20                  25                  30          
Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu 
35                  40                  45              
Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His 
50                  55                  60                  
Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu 
65                  70                  75                  80  
Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp 
85                  90                  95      
Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 
100             
<210>  7
<211>  75
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile 
1               5                   10                  15      
Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Ile Arg 
20                  25                  30          
Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala Phe Lys Gln 
35                  40                  45              
Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu Val Asp Ile 
50                  55                  60                  
Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 
65                  70                  75  
<210>  8
<211>  48
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  8
Met Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg 
1               5                   10                  15      
Arg Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu 
20                  25                  30          
Gly Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 
35                  40                  45              
<210>  9
<211>  133
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly 
1               5                   10                  15      
Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr 
20                  25                  30          
Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu 
35                  40                  45              
Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr 
50                  55                  60                  
Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg 
65                  70                  75                  80  
Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn 
85                  90                  95      
Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met 
100                 105                 110         
Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg 
115                 120                 125             
Ala Phe Lys Gln Leu 
130             
<210>  10
<211>  111
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly 
1               5                   10                  15      
Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr 
20                  25                  30          
Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu 
35                  40                  45              
Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr 
50                  55                  60                  
Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg 
65                  70                  75                  80  
Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn 
85                  90                  95      
Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu 
100                 105                 110     
<210>  11
<211>  83
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  11
Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly 
1               5                   10                  15      
Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr 
20                  25                  30          
Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu 
35                  40                  45              
Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr 
50                  55                  60                  
Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg 
65                  70                  75                  80  
Thr Val Glu 
<210>  12
<211>  57
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly 
1               5                   10                  15      
Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr 
20                  25                  30          
Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu 
35                  40                  45              
Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu 
50                  55          
<210>  13
<211>  39
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Gly Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp 
1               5                   10                  15      
Thr Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln 
20                  25                  30          
Glu Val Leu Gln Asn Val Ser 
35                  
<210>  14
<211>  50
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val 
1               5                   10                  15      
Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser 
20                  25                  30          
Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln 
35                  40                  45              
Pro Ser 
50  
<210>  15
<211>  43
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Met Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg 
1               5                   10                  15      
Arg Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu 
20                  25                  30          
Gly Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln 
35                  40              
<210>  16
<211>  477
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  16
ggggcccagg gccaagaatt ccactttggg ccctgccaag tgaagggggt tgttccccag     60
aaactgtggg aagccttctg ggctgtgaaa gacactatgc aagctcagga taacatcacg    120
agtgcccggc tgctgcagca ggaggttctg cagaacgtct cggatgctga gagctgttac    180
cttgtccaca ccctgctgga gttctacttg aaaactgttt tcaaaaacta ccacaataga    240
acagttgaag tcaggactct gaagtcattc tctactctgg ccaacaactt tgttctcatc    300
gtgtcacaac tgcaacccag tcaagaaaat gagatgtttt ccatcagaga cagtgcacac    360
aggcggtttc tgctattccg gagagcattc aaacagttgg acgtagaagc agctctgacc    420
aaagcccttg gggaagtgga cattcttctg acctggatgc agaaattcta caagctc       477
<210>  17
<211>  432
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  17
ggggttgttc cccagaaact gtgggaagcc ttctgggctg tgaaagacac tatgcaagct     60
caggataaca tcacgagtgc ccggctgctg cagcaggagg ttctgcagaa cgtctcggat    120
gctgagagct gttaccttgt ccacaccctg ctggagttct acttgaaaac tgttttcaaa    180
aactaccaca atagaacagt tgaagtcagg actctgaagt cattctctac tctggccaac    240
aactttgttc tcatcgtgtc acaactgcaa cccagtcaag aaaatgagat gttttccatc    300
agagacagtg cacacaggcg gtttctgcta ttccggagag cattcaaaca gttggacgta    360
gaagcagctc tgaccaaagc ccttggggaa gtggacattc ttctgacctg gatgcagaaa    420
ttctacaagc tc                                                        432
<210>  18
<211>  381
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  18
atgcaagctc aggataacat cacgagtgcc cggctgctgc agcaggaggt tctgcagaac     60
gtctcggatg ctgagagctg ttaccttgtc cacaccctgc tggagttcta cttgaaaact    120
gttttcaaaa actaccacaa tagaacagtt gaagtcagga ctctgaagtc attctctact    180
ctggccaaca actttgttct catcgtgtca caactgcaac ccagtcaaga aaatgagatg    240
ttttccatca gagacagtgc acacaggcgg tttctgctat tccggagagc attcaaacag    300
ttggacgtag aagcagctct gaccaaagcc cttggggaag tggacattct tctgacctgg    360
atgcagaaat tctacaagct c                                              381
<210>  19
<211>  309
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  19
gagagctgtt accttgtcca caccctgctg gagttctact tgaaaactgt tttcaaaaac     60
taccacaata gaacagttga agtcaggact ctgaagtcat tctctactct ggccaacaac    120
tttgttctca tcgtgtcaca actgcaaccc agtcaagaaa atgagatgtt ttccatcaga    180
gacagtgcac acaggcggtt tctgctattc cggagagcat tcaaacagtt ggacgtagaa    240
gcagctctga ccaaagccct tggggaagtg gacattcttc tgacctggat gcagaaattc    300
tacaagctc                                                            309
<210>  20
<211>  228
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  20
gtcaggactc tgaagtcatt ctctactctg gccaacaact ttgttctcat cgtgtcacaa     60
ctgcaaccca gtcaagaaaa tgagatgttt tccatcagag acagtgcaca caggcggttt    120
ctgctattcc ggagagcatt caaacagttg gacgtagaag cagctctgac caaagccctt    180
ggggaagtgg acattcttct gacctggatg cagaaattct acaagctc                 228
<210>  21
<211>  144
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  21
atgttttcca tcagagacag tgcacacagg cggtttctgc tattccggag agcattcaaa     60
cagttggacg tagaagcagc tctgaccaaa gcccttgggg aagtggacat tcttctgacc    120
tggatgcaga aattctacaa gctc                                           144
<210>  22
<211>  399
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  22
ggggcccagg gccaagaatt ccactttggg ccctgccaag tgaagggggt tgttccccag     60
aaactgtggg aagccttctg ggctgtgaaa gacactatgc aagctcagga taacatcacg    120
agtgcccggc tgctgcagca ggaggttctg cagaacgtct cggatgctga gagctgttac    180
cttgtccaca ccctgctgga gttctacttg aaaactgttt tcaaaaacta ccacaataga    240
acagttgaag tcaggactct gaagtcattc tctactctgg ccaacaactt tgttctcatc    300
gtgtcacaac tgcaacccag tcaagaaaat gagatgtttt ccatcagaga cagtgcacac    360
aggcggtttc tgctattccg gagagcattc aaacagttg                           399
<210>  23
<211>  333
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  23
ggggcccagg gccaagaatt ccactttggg ccctgccaag tgaagggggt tgttccccag     60
aaactgtggg aagccttctg ggctgtgaaa gacactatgc aagctcagga taacatcacg    120
agtgcccggc tgctgcagca ggaggttctg cagaacgtct cggatgctga gagctgttac    180
cttgtccaca ccctgctgga gttctacttg aaaactgttt tcaaaaacta ccacaataga    240
acagttgaag tcaggactct gaagtcattc tctactctgg ccaacaactt tgttctcatc    300
gtgtcacaac tgcaacccag tcaagaaaat gag                                 333
<210>  24
<211>  249
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  24
ggggcccagg gccaagaatt ccactttggg ccctgccaag tgaagggggt tgttccccag     60
aaactgtggg aagccttctg ggctgtgaaa gacactatgc aagctcagga taacatcacg    120
agtgcccggc tgctgcagca ggaggttctg cagaacgtct cggatgctga gagctgttac    180
cttgtccaca ccctgctgga gttctacttg aaaactgttt tcaaaaacta ccacaataga    240
acagttgaa                                                            249
<210>  25
<211>  171
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  25
ggggcccagg gccaagaatt ccactttggg ccctgccaag tgaagggggt tgttccccag     60
aaactgtggg aagccttctg ggctgtgaaa gacactatgc aagctcagga taacatcacg    120
agtgcccggc tgctgcagca ggaggttctg cagaacgtct cggatgctga g             171
<210>  26
<211>  117
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  26
ggggttgttc cccagaaact gtgggaagcc ttctgggctg tgaaagacac tatgcaagct     60
caggataaca tcacgagtgc ccggctgctg cagcaggagg ttctgcagaa cgtctcg       117
<210>  27
<211>  150
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  27
agctgttacc ttgtccacac cctgctggag ttctacttga aaactgtttt caaaaactac     60
cacaatagaa cagttgaagt caggactctg aagtcattct ctactctggc caacaacttt    120
gttctcatcg tgtcacaact gcaacccagt                                     150
<210>  28
<211>  129
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  28
atgttttcca tcagagacag tgcacacagg cggtttctgc tattccggag agcattcaaa     60
cagttggacg tagaagcagc tctgaccaaa gcccttgggg aagtggacat tcttctgacc    120
tggatgcag                                                            129
<210>  29
<211>  53
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  29
Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu 
1               5                   10                  15      
Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr Val Glu Val Arg Thr 
20                  25                  30          
Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile Val Ser 
35                  40                  45              
Gln Leu Gln Pro Ser 
50              
<210>  30
<211>  126
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  30
Met Gln Met Val Val Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp 
1               5                   10                  15      
Ser Gln Val Ser Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys 
20                  25                  30          
Gln Val Lys Gly Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala 
35                  40                  45              
Val Lys Asp Thr Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu 
50                  55                  60                  
Leu Gln Gln Glu Val Leu Gln Asn Val Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe 
65                  70                  75                  80  
Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala 
85                  90                  95      
Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu 
100                 105                 110         
Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 
115                 120                 125     
<210>  31
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  31
Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys 
1               5               
<210>  32
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  32
Lys Ala Leu Gly Glu Val Asp 
1               5           
<210>  33
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  33
Ala Gly Asp Ala Thr Ala Gly Ala 
1               5               
<210>  34
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  34
Gly Ala His Gly Ala Val Ala 
1               5           
<210>  35
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  35
Thr Leu Ala Gly Ser Arg Leu Gly 
1               5               
<210>  36
<211>  9
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  36
gccaccatg                                                              9