【手続補正書】
【提出日】平成20年9月8日(2008.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、クロストリジウム毒素の存在または活性を判定する方法:
(a)クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に好適な条件下で、以下を含むクロストリジウム毒素基質をサンプルで処理する工程：
(i)フルオロフォア、ここで該フルオロフォアはペプチドまたはペプチド模倣体ではない;
(ii)嵩高い基;および、
(iii)切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列を含むペプチドまたはペプチド模倣体、ここで該切断部位は、 該フルオロフォアと該嵩高い基の間に介在する;そして、
ここで、該クロストリジウム毒素基質の切断の結果、少なくとも 3 ミリ偏光単位(mP)の蛍光偏光の変化が起こる;
(b)該フルオロフォアを平面偏光で励起する工程; および、
(c)該処理された基質の対照基質と比較しての蛍光偏光を測定する工程、
ここで、該対照基質と比較しての該処理された基質からの少なくとも 3 mPの蛍光偏光の変化は、該サンプルにおける該クロストリジウム毒素の存在または活性を示す。
【請求項２】
蛍光偏光の該変化が蛍光偏光の低下である請求項1の方法。
【請求項３】
該フルオロフォアが少なくとも 0.5 ナノ秒の蛍光寿命を有する請求項1の方法。
【請求項４】
該フルオロフォアが少なくとも 5 ナノ秒の蛍光寿命を有する請求項1の方法。
【請求項５】
該フルオロフォアが少なくとも 10ナノ秒の蛍光寿命を有する請求項1の方法。
【請求項６】
該フルオロフォアが、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体、ローダミンまたはローダミン誘導体、およびシアニンまたはシアニン誘導体の群から選択される請求項1の方法。
【請求項７】
該フルオレセインまたは該フルオレセイン誘導体が、ジアミノトリアジニルアミノ-フルオレセイン (DTAF)、カルボキシフルオレセイン (FAM)、二ヒ素に基づくフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体、およびジピロロメテンホウ素ジフルオリドに基づくフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体からなる群から選択される請求項6の方法。
【請求項８】
該ローダミンまたは該ローダミン誘導体が、テトラメチルカルボキシローダミン(TMR)、カルボキシ-x-ローダミン(ROX)、ローダミングリーン、オクタデシルローダミン、二ヒ素に基づくローダミンまたはローダミン誘導体、およびジピロロメテンホウ素ジフルオリドに基づくローダミンまたはローダミン誘導体からなる群から選択される請求項6の方法。
【請求項９】
該シアニンまたは該 シアニン誘導体がインドカルボシアニンである請求項7の方法。
【請求項１０】
該嵩高い基が蛍光タンパク質である請求項1の方法。
【請求項１１】
該嵩高い基が緑色蛍光タンパク質である請求項10の方法。
【請求項１２】
該嵩高い基が 5 kDaよりも大きい請求項1の方法。
【請求項１３】
工程(c)における該処理された基質の該対照基質と比較しての該蛍光偏光変化が少なくとも 5 mPであり、該蛍光偏光変化が該サンプルにおける該クロストリジウム毒素の存在または活性を示す、請求項1の方法。
【請求項１４】
工程(c)における該処理された基質の該対照基質と比較しての該蛍光偏光変化が少なくとも 15 mP であり、該蛍光偏光変化が該サンプルにおける該クロストリジウム毒素の存在または活性を示す、請求項1の方法。
【請求項１５】
該認識配列がBoNT/A 認識配列である請求項1の方法。
【請求項１６】
該 BoNT/A 認識配列がSNAP-25の少なくとも６つの連続残基、またはそのペプチド模倣体を含み、該６つの連続残基がGln Arg、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項15の方法。
【請求項１７】
該 BoNT/A 認識配列が、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号2の残基134〜206、またはそれらのペプチド模倣体のアミノ酸配列を含む、請求項16の方法。
【請求項１８】
該認識配列がBoNT/B 認識配列である請求項1の方法。
【請求項１９】
該 BoNT/B 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がGln-Phe、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項18の方法。
【請求項２０】
該認識配列がBoNT/C1 認識配列である請求項1の方法。
【請求項２１】
該 BoNT/C1 認識配列がシンタキシンの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がLys-Ala、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項20の方法。
【請求項２２】
該 BoNT/C1 認識配列がSNAP-25の少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基が Arg-Ala、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項20の方法。
【請求項２３】
該認識配列が BoNT/D 認識配列である請求項1の方法。
【請求項２４】
該 BoNT/D 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がLys-Leu、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項23の方法。
【請求項２５】
該認識配列がBoNT/E 認識配列である請求項1の方法。
【請求項２６】
該 BoNT/E 認識配列がSNAP-25の少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がArg-Ile、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項25の方法。
【請求項２７】
該認識配列がBoNT/F 認識配列である請求項1の方法。
【請求項２８】
該 BoNT/F 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がGln-Lys、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項27の方法。
【請求項２９】
該認識配列がBoNT/G 認識配列である請求項1の方法。
【請求項３０】
該 BoNT/G 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がAla-Ala、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項29の方法。
【請求項３１】
該認識配列がTeNT 認識配列である請求項1の方法。
【請求項３２】
該 TeNT 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がGln-Phe、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項31の方法。
【請求項３３】
該クロストリジウム毒素基質が少なくとも 100 残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項1の方法。
【請求項３４】
該クロストリジウム毒素基質が多くとも20 残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項1の方法。
【請求項３５】
該サンプルが、粗細胞可溶化液、単離クロストリジウム毒素、単離クロストリジウム毒素軽鎖、または製剤されたクロストリジウム毒素産物である請求項1の方法。
【請求項３６】
該製剤されたクロストリジウム毒素産物が、製剤された BoNT/A産物、製剤された BoNT/B産物、製剤された BoNT/C1産物、製剤された BoNT/D産物、製剤された BoNT/E産物、製剤された BoNT/F産物、製剤された BoNT/G産物または製剤された TeNT産物である、請求項35の方法。
【請求項３７】
該製剤された産物が製剤された BoNT/A 毒素産物である請求項36 の方法。
【請求項３８】
工程(c)における該処理された基質の該蛍光偏光変化測定が、経時的に該処理された基質の蛍光偏光の変化を測定することを含み、該経時的蛍光偏光変化が該サンプルにおける該クロストリジウム毒素の存在または活性を示す、請求項1の方法。
【請求項３９】
以下の工程を含む、クロストリジウム毒素の存在または活性を判定する方法：
(a)クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に好適な条件下で、以下を含むクロストリジウム毒素基質をサンプルで処理する工程、
(i)ドナーフルオロフォア;
(ii)該ドナーフルオロフォアの発光スペクトルとオーバーラップする吸光度スペクトルを有するアクセプター;および、
(iii)切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列を含むペプチドまたはペプチド模倣体、ここで該切断部位は、該ドナーフルオロフォアと該アクセプターとの間に介在し、そして、適当な条件下で、該ドナーフルオロフォアと該アクセプターとの間で共鳴エネルギー移動が示される;
ここで、該クロストリジウム毒素基質の切断の結果、少なくとも 3 ミリ偏光単位(mP)の蛍光偏光の変化が起こる;
(b)該ドナーフルオロフォアを平面偏光で励起する工程;および、
(c)該処理された基質の対照基質と比較しての蛍光偏光を測定する工程、
ここで、該対照基質と比較しての該処理された基質からの少なくとも 3 mP の蛍光偏光の変化は、該サンプルにおける該クロストリジウム毒素の存在または活性を示す。
【請求項４０】
蛍光偏光における該変化が蛍光偏光の上昇である請求項39の方法。
【請求項４１】
該ドナーフルオロフォアが少なくとも 0.5 ナノ秒の蛍光寿命を有する請求項39の方法。
【請求項４２】
該ドナーフルオロフォアが少なくとも 5 ナノ秒の蛍光寿命を有する請求項39の方法。
【請求項４３】
該ドナーフルオロフォアが、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体、ローダミンまたはローダミン誘導体、およびシアニンまたはシアニン誘導体の群から選択される請求項39の方法。
【請求項４４】
該ドナーフルオロフォアが、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質の群から選択される請求項43の方法。
【請求項４５】
該ドナーフルオロフォアが緑色蛍光タンパク質である請求項44の方法。
【請求項４６】
該アクセプターが、テトラメチルカルボキシローダミン(TMR)、カルボキシ-x-ローダミン(ROX)、ローダミングリーン、オクタデシルローダミン、二ヒ素に基づくローダミンまたはローダミン誘導体、およびジピロロメテンホウ素ジフルオリドに基づくローダミンまたはローダミン誘導体からなる群から選択されるローダミンまたはローダミン誘導体である、請求項39または請求項45の方法。
【請求項４７】
該アクセプターが、ジアミノトリアジニルアミノ-フルオレセイン (DTAF)、カルボキシフルオレセイン (FAM)、二ヒ素に基づくフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体、およびジピロロメテンホウ素ジフルオリドに基づくフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体からなる群から選択されるフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である請求項39の方法。
【請求項４８】
該認識配列が BoNT/A 認識配列である請求項39の方法。
【請求項４９】
該 BoNT/A 認識配列がSNAP-25の少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がGln-Arg、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項48の方法。
【請求項５０】
該 BoNT/A 認識配列が、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号2の残基 134 〜 206、およびそれらのペプチド模倣体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項49の方法。
【請求項５１】
該認識配列が BoNT/B 認識配列である請求項39の方法。
【請求項５２】
該 BoNT/B 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がGln-Phe、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項51の方法。
【請求項５３】
該認識配列がBoNT/C1 認識配列である請求項39の方法。
【請求項５４】
該 BoNT/C1 認識配列がシンタキシンの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がLys-Ala、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項53の方法。
【請求項５５】
該 BoNT/C1 認識配列がSNAP-25の少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がArg-Ala、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項53の方法。
【請求項５６】
該認識配列がBoNT/D 認識配列である請求項39の方法。
【請求項５７】
該 BoNT/D 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がLys-Leu、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項56の方法。
【請求項５８】
該認識配列がBoNT/E 認識配列である請求項39の方法。
【請求項５９】
該 BoNT/E 認識配列がSNAP-25の少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がArg-Ile、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項58の方法。
【請求項６０】
該認識配列がBoNT/F 認識配列である請求項39の方法。
【請求項６１】
該 BoNT/F 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がGln-Lys、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項60 の方法。
【請求項６２】
該認識配列が BoNT/G 認識配列である請求項39の方法。
【請求項６３】
該 BoNT/G 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がAla-Ala、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項62の方法。
【請求項６４】
該認識配列がTeNT 認識配列である請求項39の方法。
【請求項６５】
該 TeNT 認識配列がVAMPの少なくとも６つの連続残基を含み、該６つの連続残基がGln-Phe、またはそのペプチド模倣体を含む、請求項64 の方法。
【請求項６６】
該クロストリジウム毒素基質が少なくとも 100 残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項39の方法。
【請求項６７】
該クロストリジウム毒素基質が多くとも 20 残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項39の方法。
【請求項６８】
該サンプルが、粗細胞可溶化液、単離クロストリジウム毒素、単離クロストリジウム毒素軽鎖、または製剤されたクロストリジウム毒素産物である、請求項39の方法。
【請求項６９】
該製剤されたクロストリジウム毒素産物が、製剤された BoNT/A産物、製剤された BoNT/B産物、製剤された BoNT/C1産物、製剤された BoNT/D産物、製剤された BoNT/E産物、製剤された BoNT/F産物、製剤された BoNT/G産物または製剤された TeNT産物である、請求項68の方法。
【請求項７０】
該製剤された産物が製剤された BoNT/A 毒素産物である請求項69の方法。
【請求項７１】
工程(c)における該対照基質と比較しての該処理された基質の該蛍光偏光変化が少なくとも 5 mPであり、該蛍光偏光変化が該サンプルにおける該クロストリジウム毒素の存在または活性を示す、請求項39の方法。
【請求項７２】
工程(c)における該対照基質と比較しての該処理された基質の該蛍光偏光変化が少なくとも 15 mPであり、該蛍光偏光変化が該サンプルにおける該クロストリジウム毒素の存在または活性を示す、請求項39の方法。
【請求項７３】
工程(c)における該処理された基質の該蛍光偏光変化測定が、該処理された基質の蛍光偏光変化を経時的に測定することを含み、該経時的蛍光偏光変化が該サンプルにおける該クロストリジウム毒素の存在または活性を示す、請求項39の方法。
【請求項７４】
該クロストリジウム毒素基質が少なくとも 300 残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項1の方法。
【請求項７５】
該クロストリジウム毒素基質が少なくとも 500残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項1の方法。
【請求項７６】
該クロストリジウム毒素基質が多くとも 50 残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項1の方法。
【請求項７７】
該クロストリジウム毒素基質が少なくとも 300 残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項39の方法。
【請求項７８】
該クロストリジウム毒素基質が少なくとも 500残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項39の方法。
【請求項７９】
該クロストリジウム毒素基質が多くとも 50 残基を有するペプチドまたはペプチド模倣体を含む請求項39の方法。