(57)【要約】本発明は、ウイルス本来の良好な増殖能を保持しつつ外来遺伝子を高発現させることができ、しかも、外来遺伝子の長さ及び種類による発現効率への影響が小さく、複数個の外来遺伝子を挿入することができる組換えモノネガウイルスベクターを提供する。本発明の組換えモノネガウイルスベクターは、複数に分節されたゲノムを保持し、少なくとも１つの分節ゲノムが宿主内で発現可能な外来遺伝子を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数に分節されたゲノムを保持し、少なくとも１つの分節ゲノムが宿主内で発現可能な外来遺伝子を含むことを特徴とする、組換えモノネガウイルスベクター。
【請求項２】
外来遺伝子がモノネガウイルスを構成する機能性タンパク質遺伝子より上流側に挿入されたものである、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
少なくとも２つの分節ゲノムが外来遺伝子を含むものである、請求項１記載のベクター。
【請求項４】
外来遺伝子を含む分節ゲノムのうちの少なくとも１つが複数の外来遺伝子を含むものである、請求項１記載のベクター。
【請求項５】
２つに分節されたゲノムを保持し、一方の分節ゲノムがＨ遺伝子及びＬ遺伝子を含み、他方の分節ゲノムがＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子及びＦ遺伝子を含むものである、請求項１記載のベクター。
【請求項６】
３つに分節されたゲノムを保持し、第１の分節ゲノムがＨ遺伝子及びＬ遺伝子を含み、第２の分節ゲノムがＭ遺伝子及びＦ遺伝子を含み、第３の分節ゲノムがＮ遺伝子及びＰ遺伝子を含むものである、請求項１記載のベクター。
【請求項７】
モノネガウイルスが麻疹ウイルス又はセンダイウイルスである、請求項１記載のベクター。
【請求項８】
請求項１記載のベクターに含まれる分節ゲノムＲＮＡ又はそのｃＲＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載のＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを転写し得る鋳型ｃＤＮＡを含むＤＮＡ。
【請求項１０】
プラスミドＤＮＡである、請求項９記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
宿主内に、請求項９記載のＤＮＡと、モノネガウイルスのＮ遺伝子を含むＤＮＡ、Ｐ遺伝子を含むＤＮＡ及びＬ遺伝子を含むＤＮＡと、当該ＤＮＡの転写ユニットとを導入することを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造方法。
【請求項１２】
モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主内に、請求項９記載のＤＮＡと、当該ＤＮＡの転写ユニットとを導入することを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造方法。
【請求項１３】
転写ユニットの導入が、所定のＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを宿主に感染させること、又は、所定のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡを宿主内に導入すること若しくは宿主ゲノムに組込むことである、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
組換えワクシニアウイルスがＬｉｓｔｅｒ株を親株として得られたものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主内に、請求項８記載のＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを導入することを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造方法。
【請求項１７】
宿主がＣＨＯ細胞である、請求項１１、１２又は１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項９記載のＤＮＡ、及び当該ＤＮＡの転写ユニットを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造用キット。
【請求項１９】
モノネガウイルスのＮ遺伝子を含むＤＮＡ、Ｐ遺伝子を含むＤＮＡ及びＬ遺伝子を含むＤＮＡをさらに含む、請求項１８記載のキット
【請求項２０】
転写ユニットが、所定のＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルス、又は、所定のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡである、請求項１８記載のキット
【請求項２１】
ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
組換えワクシニアウイルスがＬｉｓｔｅｒ株を親株として得られたものである、請求項２０記載のキット。
【請求項２３】
請求項８記載のＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造用キット
【請求項２４】
モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主をさらに含む、請求項１８記載のキット。
【請求項２５】
宿主がＣＨＯ細胞である、請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
請求項１記載のベクターを感染させた宿主に外来性タンパク質を発現させ、発現した外来性タンパク質を回収することを含む、外来性タンパク質の製造方法。
【請求項２７】
請求項１記載のベクターを感染させた動物から採取された、組織、細胞又は体液。
【請求項２８】
外来性タンパク質を含む、請求項２７記載の組織、細胞又は体液。
【請求項２９】
請求項１記載のベクターを感染させた動物から回収された、抗血清又は抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えモノネガウイルスベクターに関する。詳しくは、分節ゲノム型の組換えモノネガウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
モノネガウイルス目に分類されるウイルス（モノネガウイルス）は、すべて、非分節型の（−）鎖ＲＮＡのゲノムを有するＲＮＡウイルスである。このウイルスは、遺伝子の並びや機能に共通性があり、類似の遺伝子発現機構を備えている（図１参照）。１９９４年に狂犬病ウイルスを用いて初めて同目のウイルスの遺伝子操作の道が開かれた。以後、同様の方法を用いてモノネガウイルスの代表的なウイルスでは、全てにおいて遺伝子操作システムが開発されている（図２参照）。例えば、麻疹ウイルスに関しては、麻疹ウイルスの受容体ＳＬＡＭ（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞）とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスとを応用した高効率の再構成（リバースジェネティクス）系が構築されている（Ｔａｋｅｄａ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ＳＬＡＭ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２００５  Ｍａｒ；１０８（１−２）：１６１−５）。
モノネガウイルスのポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、ゲノムの３’末端側に存在する単一のプロモーターからのみ転写を開始し、遺伝子間の転写終結配列及び開始配列を認識しながら５’末端側に向かって各遺伝子の転写量を減衰させながら転写を行う。そのため、モノネガウイルスゲノムにおいては、より上流側にある遺伝子ほど発現効率が高いという特性がある。従って、ウイルスベクターとして用いるためウイルスゲノムに外来遺伝子を挿入する場合は、ゲノムの上流側へ挿入するほど発現効率を高くすることができる（図３参照）。しかしながら、外来遺伝子をゲノムの上流側に挿入した場合、ウイルス遺伝子の発現に対する悪影響、すなわち発現効率の低下がより強く現れる傾向にあるため、ウイルスそのものの複製能の低下を招くことが知られている（Ｔｏｋｕｓｕｍｉ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２００２  Ｊｕｎ；８６（１−２）：３３−８．）。
また、ウイルスゲノム中に外来遺伝子を複数個挿入した場合、ウイルス複製能がさらに低下することや（図４参照；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ＭＨ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｕｐ  ｔｏ  ｔｈｒｅｅ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．，２００２  Ｍａｙ  ２５：２９７（１）：１３６−５２．）、挿入する外来遺伝子の長さが長いほどウイルス複製能が低下することも知られている（Ｓａｋａｉ  Ｙ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ：ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９９  Ａｕｇ  ６；４５６（２）：２２１−６．）。
さらに、外来遺伝子の種類によっては、ウイルス複製能が強く抑制される場合があることも分かっている。例えば、図５に示すように、野生型（ｗｔ）ウイルス、ＥＧＦＰ遺伝子を挿入したウイルス、ＤｓＲｅｄ遺伝子を挿入したウイルス、及びＬａｃＺ遺伝子を挿入したウイルスの４種のウイルスの複製能を比較した場合、特に、ＬａｃＺ遺伝子を挿入したウイルスにおいて複製能が顕著に低下することが認められている（図６参照：Ｓａｋａｉ  Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ：ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９９  Ａｕｇ  ６；４５６（２）：２２１−６．；Ｔａｋｅｄａ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ＲＮＡ  ｇｅｎｏｍｅ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００６  Ｍａｙ；８０（９）：４２４２−８．）。
【発明の開示】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、モノネガウイルス本来の良好な増殖能を保持しつつ外来遺伝子を高発現させることができ、しかも、外来遺伝子の長さ及び種類による発現効率への悪影響が小さく、複数個の外来遺伝子を挿入することができる組換えモノネガウイルスベクターを提供することにある。また、このような組換えモノネガウイルスベクターの製造方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ゲノムを複数に分節した状態で有するモノネガウイルスベクターであって、その分節したゲノム中に外来遺伝子を挿入した組換えモノネガウイルスベクターであれば、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）複数に分節されたゲノムを保持し、少なくとも１つの分節ゲノムが宿主内で発現可能な外来遺伝子を含むことを特徴とする、組換えモノネガウイルスベクター。
本発明のベクターは、例えば、外来遺伝子を、モノネガウイルスを構成する機能性タンパク質遺伝子より上流側に挿入することができる。また、本発明のベクターは、例えば、少なくとも２つの分節ゲノムが外来遺伝子を含むことができる。さらに、本発明のベクターは、例えば、外来遺伝子を含む分節ゲノムのうちの少なくとも１つにおいて複数の外来遺伝子を含むことができる。
本発明のベクターとしては、例えば、２つに分節されたゲノムを保持し、一方の分節ゲノムがＨ遺伝子及びＬ遺伝子を含み、他方の分節ゲノムがＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子及びＦ遺伝子を含むもの、並びに、３つに分節されたゲノムを保持し、第１の分節ゲノムがＨ遺伝子及びＬ遺伝子を含み、第２の分節ゲノムがＭ遺伝子及びＦ遺伝子を含み、第３の分節ゲノムがＮ遺伝子及びＰ遺伝子を含むものが挙げられる。
本発明のベクターは、例えば、麻疹ウイルス又はセンダイウイルスの組換えウイルスベクターである。
（２）上記（１）記載のベクターに含まれる分節ゲノムＲＮＡ又はそのｃＲＮＡ。
（３）上記（２）記載のＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを転写し得る鋳型ｃＤＮＡを含むＤＮＡ。
本発明のＤＮＡは、例えば、プラスミドＤＮＡである。
（４）宿主内に、上記（３）記載のＤＮＡと、モノネガウイルスのＮ遺伝子を含むＤＮＡ、Ｐ遺伝子を含むＤＮＡ及びＬ遺伝子を含むＤＮＡと、当該ＤＮＡの転写ユニットとを導入することを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造方法。
（５）モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主内に、上記（３）記載のＤＮＡと、当該ＤＮＡの転写ユニットとを導入することを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造方法。
本発明の方法（上記（４）及び（５）記載の方法）は、転写ユニットの導入として、例えば、所定のＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを宿主に感染させること、又は、所定のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡを宿主内に導入すること若しくは宿主ゲノムに組込むことができる。ここで、ＲＮＡポリメラーゼは、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、また、組換えワクシニアウイルスは、例えばＬｉｓｔｅｒ株を親株として得られたものである。さらに、本発明の方法では、宿主として、例えばＣＨＯ細胞を用いることができる。
（６）モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主内に、上記（２）記載のＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを導入することを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造方法。
本発明の方法では、宿主として、例えばＣＨＯ細胞を用いることができる。
（７）上記（３）記載のＤＮＡ、及び当該ＤＮＡの転写ユニットを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造用キット。
本発明のキットは、例えば、モノネガウイルスのＮ遺伝子を含むＤＮＡ、Ｐ遺伝子を含むＤＮＡ及びＬ遺伝子を含むＤＮＡをさらに含むことができる。また、本発明のキットは、転写ユニットが、例えば、所定のＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルス、又は、所定のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡである。ここで、ＲＮＡポリメラーゼは、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、また、組換えワクシニアウイルスは、例えばＬｉｓｔｅｒ株を親株として得られたものである。
（８）上記（２）記載のＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造用キット
本発明のキットは、例えば、モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主をさらに含むことができる。ここで、宿主は、例えばＣＨＯ細胞である。
（９）上記（１）記載のベクターを感染させた宿主に外来性タンパク質を発現させ、発現した外来性タンパク質を回収することを含む、外来性タンパク質の製造方法。
（１０）上記（１）記載のベクターを感染させた動物から採取された、組織、細胞又は体液。
本発明の組織、細胞又は体液は、例えば外来性タンパク質を含むことができる。
（１１）上記（１）記載のベクターを感染させた動物から回収された、抗血清又は抗体。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、モノネガウイルス粒子及びそのゲノム構造を示す概略図である。
図２は、モノネガウイルス粒子の再構成系の概略を示す図である。
図３は、モノネガウイルスゲノムへの外来遺伝子の挿入位置による発現効率への影響を示す概略図である。
図４は、モノネガウイルスゲノムへの外来遺伝子の挿入個数による発現効率への影響を示す概略図である。
図５は、野生型（ｗｔ）のモノネガウイルス（ＩＣ３２３）、ＥＧＦＰ遺伝子を挿入したモノネガウイルス（ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ遺伝子を挿入したモノネガウイルス（ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄ）、及びＬａｃＺ遺伝子を挿入したモノネガウイルス（ＩＣ３２３−ｌａｃＺ）のゲノム構造を示す概略図である。
図６は、図５に示す４種のモノネガウイルスそれぞれの複製能を示すグラフである。
図７は、分節ゲノム型モノネガウイルスベクターの作製方法を示す概略図である。
図８は、２分節ゲノム型モノネガウイルスベクター（２  ｓｅｇ−ＭｅＶ）のゲノム構造を示す概略図である。
図９は、３分節ゲノム型モノネガウイルスベクター（３  ｓｅｇ−ＭｅＶ）のゲノム構造を示す概略図である。
図１０は、ＩＣ３２３−ｌａｃＺ、ＩＣ３２３−ＤｓＲｅ、ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶのゲノム構造を示す概略図である。
図１１は、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ感染Ｂ９５ａ細胞における外来遺伝子（ＥＧＦＰ（緑色）；ＤｓＲｅｄ（赤色））の発現を示す写真である。
図１２は、３  ｓｅｇ−ＭｅＶ感染Ｂ９５ａ細胞における外来遺伝子（ＥＧＦＰ（緑色）；ＤｓＲｅｄ（赤色））の発現を示す写真である。
図１３は、３  ｓｅｇ−ＭｅＶ感染Ｂ９５ａ細胞における外来遺伝子（βガラクトシダーゼ遺伝子）の発現を示す写真である。
図１４は、ＩＣ３２３、ＩＣ３２３−ｌａｃＺ、ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄ、ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶそれぞれのウイルス複製能（増殖能）を示すグラフである。
図１５は、ＩＣ３２３、ＩＣ３２３−ｌａｃＺ、ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄ、ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶそれぞれのプラーク形成の有無を示す写真である。
図１６は、ＩＣ３２３、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶそれぞれのプラークにおける、βガラクトシダーゼの発現の有無を示す写真である。
図１７は、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶそれぞれのプラークにおける蛍光、及び、βガラクトシダーゼの発現の有無を示す写真である。
図１８は、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ等が有するゲノム構造の概略図、及び、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ等の感染細胞におけるウイルス粒子の複製の有無と外来遺伝子の発現とを示す模式図である。
図１９は、３  ｓｅｇ−ＭｅＶ等が有するゲノム構造の概略図、及び、３  ｓｅｇ−ＭｅＶ等の感染細胞におけるウイルス粒子の複製の有無と外来遺伝子の発現とを示す模式図である。
図２０は、ＩＣ３２３、ＩＣ３２３−ｌａｃＺ、ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄ、ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶそれぞれの感染細胞における、ウイルスタンパク質及び外来性タンパク質の発現量について、免疫沈降法を用いて解析した結果を示す電気泳動写真である。
図２１は、ＩＣ３２３、ＩＣ３２３−ｌａｃＺ、ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄ、ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶそれぞれの感染細胞における、外来性タンパク質（βガラクトシダーゼ）の発現量について、ルミノメーターを用いて解析した結果を示すグラフである。
図２２は、ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ感染細胞での遺伝子発現量（ｍＲＮＡ量）に対する３  ｓｅｇ−ＭｅＶ感染細胞での遺伝子発現量（ｍＲＮＡ量）の割合について、ＲＴ−定量ＰＣＲ法を用いて解析した結果を示すグラフである。
図２３は、使用したワクシニアウイルス株の違いによるＴ７プロモーターに依存したＧＦＰの有無を示す写真である。
図２４は、使用したワクシニアウイルス株の違いによるミニゲノムウイルス転写・複製実験系におけるルシフェラーゼ発現量（ルシフェリン添加後の蛍光量）の比較を示すグラフ（Ａ）、及び、使用したワクシニアウイルス株の違いによる麻疹ウイルス粒子の合成開始に成功した細胞数の比較を示すグラフ（Ｂ）である。
図２５は、ワクシニアウイルス感染細胞のアポトーシスに対するカスパーゼ阻害剤の添加効果を示す写真（Ａ）、及び、ワクシニアウイルス感染細胞の染色体ＤＮＡの断片化に対するカスパーゼ阻害剤の添加効果を示す電気泳動写真（Ｂ）である。
図２６は、ワクシニアウイルス感染細胞へのカスパーゼ阻害剤の添加の有無によるミニゲノムウイルス転写・複製実験系におけるルシフェラーゼ発現量（ルシフェリン添加後の蛍光量）の比較を示すグラフ（Ａ）、及び、ワクシニアウイルス感染細胞へのカスパーゼ阻害剤の添加量の違いによる麻疹ウイルス粒子の合成開始に成功した細胞数の比較を示すグラフ（Ｂ）である。
図２７は、２分節及び３分節ゲノム型のＦ遺伝子欠損型センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター等のゲノム構造を示す概略図である。
図２８は、ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−ＮＰ−Ｐ−Ｍの構築スキームを表す図である。
図２９は、ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌの構築の構築スキームを表す図である。
図３０は、ｐＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌｕｃｉ−ＮＰ−Ｐの構築スキームを表す図である。
図３１は、ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−Ｍの構築スキームを表す図である。
図３２は、２分節ゲノム型ＳｅＶベクター（ＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−ＬとＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌａｃ  Ｚ−ＮＰ−Ｐ−Ｍ）の再構成と増幅を示すＧＦＰ蛍光写真である。
図３３は、３分節ゲノム型ＳｅＶベクター（ＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌ、ＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌａｃ  Ｚ−ＭとＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌｕｃｉ−ＮＰ−Ｐ）の再構成と増幅を示すＧＦＰ蛍光写真である。
図３４は、２分節ゲノム型ＳｅＶベクター（ＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−ＬとＭｉｎｉｓｅＶ／Ｌａｃ  Ｚ−ＮＰ−Ｐ−Ｍ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現の結果を示す図である（ＬＬＣ−ＭＫ２，Ｄａｙ  ２）。
図３５は、３分節ゲノム型ＳｅＶベクター（ＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌ、ＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌａｃ  Ｚ−ＭとＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌｕｃｉ−ＮＰ−Ｐ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現の結果を示す図である（ＬＬＣ−ＭＫ２、Ｄａｙ  ３）。
図３６は、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＮＰＭＦの構築スキームを表す図である。
図３７は、ｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬの構築スキームを表す図である。
図３８は、ｐ（＋）ＭＶ−ＬａｃＺ−ＮＰの構築スキームを表す図である。
図３９は、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦの構築スキームを表す図である。
図４０は、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦの構築スキームを表す図である。
図４１は、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ−ＳＥＡＰの構築スキームを表す図である。
図４２は、３分節ゲノム型モノネガウイルスベクター（３  ｓｅｇ−ＭｅＶ−ＣＡＴ）の感染Ｖｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞における外来遺伝子（（Ａ）ＥＧＦＰ（緑色）；（Ｂ）ＤｓＲｅｄ（赤色））の発現を示す写真、及び、当該感染細胞のＣＡＴ活性を示す写真（Ｄ）である。
図４３は、３分節ゲノム型モノネガウイルスベクター（３  Ｓｅｇ−ＭｅＶ−ＣＡＴ−ＳＥＡＰ）の感染Ｖｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞のＣＡＴ活性を示す写真（Ａ）及びＳＥＡＰ活性を示すグラフ（Ｂ）である。
【符号の説明】
【０００５】
１：分節ゲノムをコードするプラスミドＤＮＡ
２：Ｎタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ
３：Ｐタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ
４：Ｌタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ
５：分節ゲノム
６：Ｎタンパク質
７：Ｐタンパク質
８：Ｌタンパク質
９：ＲＮＰ複合体
１０：Ｍタンパク質
１１：Ｆタンパク質
１２：Ｈタンパク質
１３：ワクシニアウイルス
１４：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
１５：ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞（麻疹ウイルスの受容体ＳＬＡＭを恒常的に発現するように遺伝子導入されたＣＨＯ細胞）
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国特許仮出願６０／６９９，１０１号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
１．組換えモノネガウイルスベクター
（１）ウイルスベクター
本発明の組換えモノネガウイルスベクターは、複数に分節されたゲノムを保持し、少なくとも１つの分節ゲノムが宿主内で発現可能な外来遺伝子を含むことを特徴とする。
「分節」とは、複数本の塩基鎖からなる一組の塩基鎖群によって一つのウイルスゲノムとして機能するように、複数本の塩基鎖になっていることを意味する。また、「分節ゲノム」とは、通常は、一組の塩基鎖群を構成する個々の塩基鎖を意味するが、一組の塩基鎖群そのものを意味することもある。
モノネガウイルス（（−）鎖ＲＮＡウイルス）のゲノムは、ウイルスの複製に関与するリーダー配列（３’−Ｌｅ）とトレーラー配列（Ｔｒ−５’）とを両端に有し、これらの配列の間に、ウイルスを構成する機能性タンパク質をコードする各種遺伝子を有する。上記機能性タンパク質をコードする遺伝子としては、Ｎタンパク質をコードする遺伝子（以下、「Ｎ遺伝子」という。他の機能性タンパク質をコードする遺伝子もこれに準じて表記する。）、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｈ遺伝子、及びＬ遺伝子が挙げられる。Ｎ遺伝子から発現するＮタンパク質（ヌクレオキャプシド）は、ウイルスＲＮＡに対して５’末端から順に整然と並んで結合し包装する。Ｐ遺伝子からはＰタンパク質、Ｖタンパク質及びＣタンパク質の３種類のタンパク質が発現する。そのうちＰタンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの小サブユニットとして機能し、ウイルスゲノムの転写複製に関与する。Ｌ遺伝子から発現するＬタンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの大サブユニットとして機能し、Ｐタンパク質と共にウイルスゲノムの転写複製に関与する。Ｍ遺伝子から発現するＭタンパク質は、ウイルス粒子構造を内側から支える機能を有する。Ｆ遺伝子から発現するＦタンパク質、及びＨ遺伝子から発現するＨタンパク質は、ともに宿主細胞へのウイルスの侵入に関与する。
本発明のウイルスベクターが保持する分節ゲノムは、モノネガウイルスゲノムと同様に、両端にリーダー配列とトレーラー配列とを有し、これらの配列の間に、前述した機能性タンパク質をコードする遺伝子のいずれかを有する。そして、すべての分節ゲノムを合わせると、ウイルス粒子の複製等に必要なＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｈ遺伝子、及びＬ遺伝子をすべて有する状態となる。なお、これら遺伝子群は、元のモノネガウイルスゲノムにおける配置（並び順）とは無関係に、分節ゲノム中に挿入されていてもよい。また、これら遺伝子群は、モノネガウイルスゲノムに含まれる各遺伝子の塩基配列と完全に同一でなくとも、転写及び複製における活性が天然型の活性と同等かそれ以上であれば、変異が導入されたものであってもよいし、あるいは他のウイルス由来の相当遺伝子で代用されたものであってもよい。本発明においては、ゲノムの分節数は、限定はされないが、最大で６であることが好ましく、特に好ましくは２又は３である。
本発明のウイルスベクターが、２つの分節ゲノムを保持する場合の好ましい形態としては、例えば、第１の分節ゲノムがＨ遺伝子及びＬ遺伝子を含み、第２の分節ゲノムがＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子及びＦ遺伝子を含むものが挙げられる。また、３つの分節ゲノムを保持する場合の好ましい形態としては、例えば、第１の分節ゲノムがＨ遺伝子及びＬ遺伝子を含み、第２の分節ゲノムがＭ遺伝子及びＦ遺伝子を含み、第３の分節ゲノムがＮ遺伝子及びＰ遺伝子を含むものが挙げられる。
本発明のウイルスベクターの分節ゲノムには、宿主内で発現可能な外来遺伝子が含まれる。外来遺伝子としては、限定はされず、本発明のウイルスベクターの用途に応じて適宜選択すればよいが、例えば、ウイルス、細菌及び寄生虫等の病原性を惹起する各種タンパク質をコードする遺伝子や、各種サイトカインをコードする遺伝子、並びに各種ペプチドホルモンをコードする遺伝子等が挙げられる。外来遺伝子が含まれる分節ゲノムは、ウイルスベクターが有する複数の分節ゲノムのうちの１つであってもよいし、２つ以上であってもよく限定はされない。複数個の外来遺伝子をゲノムに挿入する場合は、複数の分節ゲノムのうちの１つの分節ゲノムに、複数個の外来遺伝子をすべて挿入してもよいし、あるいは、２つ以上の分節ゲノムのそれぞれにおいて、１個以上の外来遺伝子を挿入することで、全体として複数個の外来遺伝子を挿入することもできる。１つの分節ゲノム中に複数個の外来遺伝子が挿入される場合、その個数は、ウイルスの構成タンパク質遺伝子の発現効率が著しく低下しない範囲内であれば限定はされない。
分節ゲノムに挿入される外来遺伝子の位置は、限定はされないが、モノネガウイルスを構成する機能性タンパク質遺伝子より上流側であることが好ましい。これにより、宿主内において外来遺伝子をより高発現させることができる。またこの知見を利用して、外来遺伝子の発現量を、遺伝子挿入の位置あるいは遺伝子の前後のＲＮＡ塩基配列により調節することも可能である。
ここで、「上流側」とは、ゲノムの３’末端に存在するリーダー配列（３’−Ｌｅ）側であることを意味する（以下、同様である。）。
本発明のウイルスベクターの分節ゲノムは、通常は、モノネガウイルスが本来有するゲノムと同様に（−）鎖ＲＮＡで構築されたものであればよいが、必要に応じ、（＋）鎖ＲＮＡで構築されたものであってもよい。（＋）鎖ＲＮＡゲノムのウイルスベクターの場合、ウイルス粒子の再構成（リバースジェネティクス）が効率よく行われ、ウイルスの遺伝子操作（すなわちゲノムの分節化や外来遺伝子の挿入）を容易に行うことができる。ここで、「ウイルス粒子の再構成」とは、ウイルスゲノムの核酸を人工的に作製し、試験管内又は細胞内において、もとのウイルス又は組換えウイルスを作製することを意味する。
本発明のウイルスベクターの構築材料となるモノネガウイルスとしては、限定はされないが、例えば、以下のウイルスが挙げられる。
パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｖｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、１型パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  １）、２型パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ２）、３型パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ３）、５型パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５，Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ５）、メタニューモウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、及びジステンパーウイルス（Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）。
ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔａｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、及びウシ流行熱ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  ｅｐｈｅｍｅｒａｌ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）。
フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する、マールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ）、及びエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）。
本発明においては、上記モノネガウイルスのなかでも、麻疹ウイルス、センダイウイルス及びニューカッスル病ウイルスが好ましい。また、合成オリゴヌクレオチドや、ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウイルス等も、必要に応じ、構築材料として使用することができる。さらに、構築材料となるモノネガウイルスとしては、上記列挙したウイルスに由来する組換えモノネガウイルスを用いてもよい。組換えモノネガウイルスとしては、例えば、免疫原性に関与する遺伝子を不活性化したものでもよいし、ＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために一部の遺伝子を改変したものでもよい。
本発明のウイルスベクターは、通常、細胞感染能及び伝播力を有している。「細胞感染能」とは、宿主となる細胞への接着能及び膜融合能等を保持していることにより、細胞内にウイルス内部の核酸等を導入し得る能力を意味する。また、「伝播力」とは、細胞内に導入された核酸を複製し、感染性粒子（又はそれに準ずる複合体）を形成して、当該核酸を別の細胞に伝播し得る能力を意味する。換言すれば、「伝播力」とは、細胞内に導入された核酸情報に基づき、細胞外に放出され自由に運動し得る（他の細胞へ感染し得る）ウイルス粒子を形成することと言うこともできる。
本発明のウイルスベクターは、ベクターとしての安定性に優れるものである。すなわち、本発明のウイルスベクターは、安定的に継代でき、かつ、安定した外来遺伝子の発現能が保持され得るものである。具体的には、ウイルスベクターを適当な培養細胞に低いＭＯＩ（例えば０．０５〜０．０１（ウイルス数／細胞数））で感染させ、その後ウイルス感染による細胞変性効果（ＣＰＥ）が顕著になった段階で培養上清を回収し、再び同様のＭＯＩで別の培養細胞に感染させるという継代操作を８〜１０回繰り返しても外来遺伝子の良好な発現が認められるときは、そのウイルスベクターは安定性に優れるということができる。この場合、継代数は、より好ましくは１０〜２０回であり、さらに好ましくは２０回である。
また本発明は、上述した本発明のウイルスベクターに含まれる分節ゲノムＲＮＡ又はそのｃＲＮＡ（相補ＲＮＡ）を包含するものである。さらに、本発明は、当該ＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを転写し得る鋳型ｃＤＮＡを含むＤＮＡ（好ましくはプラスミドＤＮＡ）も包含するものである。本発明のＲＮＡ又はそのｃＲＮＡは、例えば、先に列挙したモノネガウイルス又はその組換えウイルスのｃＤＮＡを公知の遺伝子組換え技術により改変し（分節化、外来遺伝子の挿入等）、これを鋳型ｃＤＮＡとして試験管内又は細胞内で転写することにより得ることができる。転写において、鋳型ｃＤＮＡは所望のプロモーターの下流に挿入され、その挿入の向きによって本発明のＲＮＡ及びそのｃＲＮＡのいずれか一方、すなわち（−）鎖ＲＮＡ及び（＋）鎖ＲＮＡのいずれか一方が得られる。また、本発明のＲＮＡ又はそのｃＲＮＡは、ウイルスゲノムの両端構造を持つｃＤＮＡ（例えばＤＩ分子など）にウイルスの構成タンパク質遺伝子や外来遺伝子等のｃＤＮＡを人工的に挿入し、挿入後のＤＮＡを試験管内又は細胞内で転写することによって得ることも可能である。なお、公知の遺伝子組換え技術としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の技術を適宜用いることができる（以下、同様）。
（２）ウイルスベクターの製法
分節型のＲＮＡゲノムを有する本発明のウイルスベクターは、各分節ゲノムに対応するｃＤＮＡを用いて、あるいは、各分節ゲノムに相当するＲＮＡを用いて、ウイルス粒子の再構成を行うことにより、作製することができる。いずれの方法においても、通常は、まず所望のモノネガウイルスからゲノムＲＮＡを単離し、逆転写反応等によりこのＲＮＡのｃＤＮＡを作製する。次いで、公知の遺伝子組換え技術及び核酸増幅法等により、当該ｃＤＮＡの分節化、及び外来遺伝子の挿入等の操作を施す。
ここで、ゲノムＲＮＡに基づいて作製された連続した１本のｃＤＮＡを「元のｃＤＮＡ」とすると、「分節化」とは、元のｃＤＮＡを複数のｃＤＮＡに断片化することを意味する。この断片化の方法は、元のｃＤＮＡの塩基配列情報等に基づいて結果的に複数のｃＤＮＡ断片が調製される方法であればよく、限定はされない。元のｃＤＮＡの塩基配列情報に基づく調製方法としては、例えば、元のｃＤＮＡ中の所望の領域を複数設定し、それぞれの領域を鋳型として別々にＰＣＲ法等を行って増幅断片を得る方法が好ましく挙げられる。所望の領域の設定は、再構成において発現させる分節ゲノムの構造を考慮して適宜設定することができ、限定はされない。例えば、ウイルスの機能性タンパク質をコードする各遺伝子断片をそれぞれ個別に増幅できるように設定することが好ましい。このように領域設定した場合は、得られた各遺伝子の増幅断片を、所望の種類、個数、並び順（位置）で結合させることで、複数のｃＤＮＡ断片を調製することができる。
また「外来遺伝子の挿入」は、別途調製した外来遺伝子を含むＤＮＡ断片を、上述の分節化したｃＤＮＡ中に、公知の遺伝子組換え技術を用いて挿入すればよく、限定はされない。
その後、分節化した各ｃＤＮＡを含むＤＮＡ（好ましくはプラスミドＤＮＡ）を構築するか、又は、分節化した各ｃＤＮＡを予めｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡに転写しておき、これらをウイルス粒子の再構成に用いる。
一般に、（−）鎖ＲＮＡウイルスのゲノム又はそのアンチゲノムを裸のＲＮＡのまま宿主細胞内に導入してもＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの鋳型とはならない。鋳型となるには、当該ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成反応の初期段階において、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質が存在し、これらタンパク質とゲノムＲＮＡとの複合体（ＲＮＰ複合体）の形成が必要であることが知られている。そのため、本発明のウイルスベクターを再構成するにあたっては、これらＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を併せて発現させるか、あるいは、発現し得る宿主を用いることが望ましい。
すなわち、本発明のウイルスベクターの製造方法としては、具体的には、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法が挙げられる。
（ｉ）宿主内に、下記（ｂ）〜（ｅ）のＤＮＡと当該ＤＮＡの転写ユニットとを導入することを含む方法。
（ｉｉ）モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主内に、下記（ｂ）のＤＮＡと当該ＤＮＡの転写ユニットとを導入することを含む方法。
（ｉｉｉ）モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主内に、下記（ａ）のＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを導入することを含む方法。
（ａ）前述した本発明のウイルスベクターに含まれる各々の分節ゲノム
ＲＮＡ又はそのｃＲＮＡ
（ｂ）上記（ａ）のＲＮＡ又はｃＲＮＡを転写し得る鋳型ｃＤＮＡを含むＤＮＡ
（ｃ）モノネガウイルスのＮタンパク質遺伝子を含むＤＮＡ
（ｄ）モノネガウイルスのＰタンパク質遺伝子を含むＤＮＡ
（ｅ）モノネガウイルスのＬタンパク質遺伝子を含むＤＮＡ
上記（ｉ）の製法において使用する（ｃ）〜（ｅ）のＤＮＡは、公知の遺伝子組換え技術を用いて所定のタンパク質を発現し得るように構築されたものであればよいが、例えば、プラスミドＤＮＡであることが好ましい。また、（ｃ）〜（ｅ）のＤＮＡに含まれる各タンパク質遺伝子は、モノネガウイルスゲノムに含まれる各タンパク質遺伝子の塩基配列と完全に同一でなくてもよく、例えば、転写及び複製における活性が天然型の各タンパク質と同等又はそれ以上であれば、１若しくは数個（例えば１〜１５個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸からなるタンパク質（変異型タンパク質）をコードする塩基配列であってもよいし、あるいは、他のウイルス由来の相当遺伝子で代用されたものであってもよい。当該変異型のタンパク質と天然型のタンパク質とのアミノ酸配列の相同性は、例えば、９０〜１００％であることが好ましいが、転写及び複製における活性が、保持されていれば、アミノ酸の相同性は、例えば、４０〜９０％であってもよい。なお、変異タンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変位誘発法に従って調製することができる。ＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
上記（ｉ１）及び（ｉｉｉ）の方法におけるモノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質としては、これらの天然型のタンパク質の活性と同等又はそれ以上であれば、完全に同一のものでなくてもよく、例えば、１若しくは数個（例えば１〜１５個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸からなるタンパク質（変異型タンパク質）であってもよいし、あるいは、他のウイルス由来又はアミノ酸配列が大きく異なる全く別のタンパク質であってもよい。当該変異型のタンパク質と天然型のタンパク質とのアミノ酸配列の相同性は、例えば、９０〜１００％であることが好ましいが、転写及び複製における活性が、保持されていれば、アミノ酸の相同性は、例えば、４０〜９０％であってもよい。
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の製法において使用する宿主（形質転換体も含む）は、各種ウイルスＲＮＡが発現し得る細胞であれば、特に限定はされず、例えば、培養された哺乳動物又は鳥類の細胞や鶏卵などが挙げられる。具体的に、培養細胞としては、例えば、ＣＨＯ、２９３細胞、Ｂ９５ａ、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ＬＬＣＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＣＶ−１、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、Ｐ１９、Ｆ９、ＰＣｌＺ、ＢＡＦ３、Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＰＢＭＣＮ、ＭＴ−４、Ｍｏｌｔ−４、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｖｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ、ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ、Ａ５４９／ｈＳＬＡＭ、ＨｅＬａ／ｈＳＬＡＭ、２９３Ｔ、ＢＨＫ及びニワトリ胚繊維芽細胞等を用いることができる。また、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等の昆虫細胞を用いることもできる。
特に、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の製法で使用する宿主は、所定の形質転換体、すなわち、宿主ゲノムにＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子が挿入されたもの、又は、これら遺伝子が宿主ゲノムとは独立したＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ等）として導入されたものである。これら形質転換体は、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、並びに、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等の各種ウイルスを感染させる方法等により得ることができる。また、当該宿主（形質転換体）においては、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子によりコードされる各タンパク質が、宿主自体の転写・翻訳系により発現されることが好ましい。
上記（ｉ）及び（ｉｉ）の製法において、転写ユニットとしては、例えば、所定のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルス、又は、所定のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡなどが好ましい。上記組換えワクシニアウイルスしては、臨床的に既に使用され安全性が認められているＬｉｓｔｅｒ株を親株として得られたものが特に好ましく用いられる。宿主内への転写ユニットの導入は、上記ワクシニアウイルスを用いる場合は当該ウイルスを宿主に感染させればよく、また、上記ＤＮＡを用いる場合は当該ＤＮＡを宿主内に導入するか若しくは宿主ゲノムに組込むようにすればよい。組換えワクシニアウイルスを用いる場合は、ウイルス感染による宿主細胞のアポトーシス誘導を効果的に抑制して作業効率を高めるため、カスパーゼ阻害剤を使用することができる。以上の転写ユニットの導入により、所定のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが宿主内に供給され、（ｂ）〜（ｅ）のＤＮＡが転写され得る。っまり、（ｂ）〜（ｅ）のＤＮＡにおける鋳型ｃＤＮＡや各タンパク質遺伝子は、上記所定のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより特異的に認識されるプロモーターの下流に挿入され、発現制御されていることが好ましい。上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ等が好ましく用いられる。
本発明の製造方法としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法の中でも（ｉ）の方法がより好ましい。特に、麻疹ウイルス又はセンダイウイルスを材料とする組換えウイルスベクターの作製において上記（ｉ）の方法を用いた場合は、再構成の効率を一層高めることができる。
また、本発明の製造方法で得られるウイルスベクターは、他の細胞との共培養等により選択的かつ効率的に増殖させることができる。例えば、麻疹ウイルスを用いたウイルスベクターの場合、本発明の製造方法で得られる培養細胞（再構成したウイルスベクターを含む細胞）を、予め培養しておいたＢ９５ａ細胞上に播き共培養することにより、ウイルスベクターが感染及び増殖したＢ９５ａ細胞の巨細胞を得ることができる、
２．組換えモノネガウイルスベクターの製造用キット
本発明の組換えモノネガウイルスベクターの製造用キットは、前述したウイルスベクターに含まれる分節ゲノムＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを転写し得る鋳型ｃＤＮＡを含むＤＮＡ（好ましくはプラスミドＤＮＡ）、及び、ＤＮＡの転写ユニットを含むものである。当該ＤＮＡ及び転写ユニットの詳細については、前記１．における説明が同様に適用できる。また、以下に記載する他の各構成要素についても同様である。
本発明のキットは、モノネガウイルスのＮタンパク質遺伝子を含むＤＮＡ、Ｐタンパク質遺伝子を含むＤＮＡ及びＬタンパク質遺伝子を含むＤＮＡをさらに含むものであることが好ましい。
本発明のキットは、モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主をさらに含むものであってもよい。この場合、上記のＮタンパク質遺伝子を含むＤＮＡ、Ｐタンパク質遺伝子を含むＤＮＡ及びＬタンパク質遺伝子を含むＤＮＡの使用に代えることができる。
また本発明においては、前述したウイルスベクターに含まれる分節ゲノムＲＮＡ又はそのｃＲＮＡを含む、組換えモノネガウイルスベクターの製造用キットも包含される。当該キットは、モノネガウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を発現する宿主をさらに含むものであってもよい。
３．外来性タンパク質の製造方法等
本発明のウイルスベクターを感染させた宿主に外来性タンパク質を発現させ、発現したタンパク質を回収することにより、外来性タンパク質を製造することができる。「外来性タンパク質」とは、ウイルスゲノム中に導入された遺伝子によりコードされるタンパク質であって発現の目的となるタンパク質を意味する。宿主として培養細胞を用いた場合、常法により、その培養液から外来性タンパク質を回収することができる。また、本発明のウイルスベクターを感染させた動物にタンパク質を発現させ、発現した外来性タンパク質を含む体液を回収することもできる。体液の回収方法としては、感染動物及び体液の種類に応じて、公知の回収方法を用いればよく、限定はされないが、例えば、全血を採取して、遠心により血球成分を取り除く方法などが挙げられる。
さらに、本発明のウイルスベクターを動物に感染させ、この動物から組織、細胞もしくは体液を採取することにより、例えば、抗血清を作製し又は抗体タンパク質を回収して、治療や診断に応用することができる。具体的には、ウイルスや細菌の病原性に関与するタンパク質遺伝子を挿入したウイルスベクターを、宿主となる動物に感染させて、当該遺伝子がコードするタンパク質を発現させ、その後この動物から血清を得ることで、上記タンパク質に対する抗体を含有する抗血清を製造することができる。得られた抗体（抗血清）は、ＥＬＩＳＡや中和試験に使用することができる。
本発明のウイルスベクターを感染させる動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、イヌ、フェレット、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ及びウマ等のヒトを除く哺乳類動物が好ましく挙げられ、中でも、マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類（ネズミ目）動物がより好ましく、特に好ましくはマウスである。採取する組織又は細胞としては脾臓又はリンパ節など、採取する体液としては血液、リンパ液及び髄液等が挙げられる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
ウイルスベクターの作製
１．分節ゲノム型組換え麻疹ウイルスベクターの作製
１．１  作製方法の概要（図７参照）
まず、分節ゲノムの各々をコードするプラスミドＤＮＡ１、並びに麻疹ウイルスウイルスのＮタンパク質６（ヌクレオキャプシド）を発現し得るプラスミドＤＮＡ２、Ｐタンパク質７（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの小サブユニット）を発現し得るプラスミドＤＮＡ３、及びＬタンパク質８（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの大サブユニット）を発現し得るプラスミドＤＮＡ４をそれぞれ構築し、これらをＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞１５へ導入した（ＤＮＡの発現は、Ｔ７プロモーターで制御されている）。併せて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）１４を発現するワクシニアウイルス１３（ｖＴＦ７−３株）を感染させ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１４をＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞内に供給した。これにより、分節ゲノム５にヌクレオキャプシド（Ｎ）及びポリメーラーゼ（Ｐ，Ｌ）が結合して、ＲＮＰ複合体９が形成された。その後、ＲＮＰ複合体９に含まれる分節ゲノム中のＭ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨ遺伝子からＭタンパク質１０、Ｆタンパク質１１及びＨタンパク質１２が発現され、Ｍタンパク質１０は、ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞膜の一部を利用してウイルス粒子の膜構造を形成し、Ｆタンパク質１１及びＨタンパク質１２は、ウイルス粒子の膜構造の外側表面に提示された。これとともに、ＲＮＰ複合体９が上記膜構造に内包されてウイルス粒子となり細胞外へ放出された。
なお、ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞のワクシニアウイルスによる細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を阻止してウイルスベクターの作製効率を向上させるため、カスパーゼ阻害剤を添加した。ワクシニアウイルスは、ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞内でａｂｏｒｔｉｖｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎを起こし増殖できないため、容易にウイルスベクターだけを得ることができた。
１．２  麻疹ウイルスゲノム由来ｃＤＮＡの作製
ベクターの分節化を麻疹ウイルスの系で実施するにあたって、すでに構築が完了した公知のプラスミドｐ（＋）ＭＶ３２３（Ｔａｋｅｄａ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００  Ｊｕｌ；７４（１４）：６６４３−７．）を基礎に用いた。ｐ（＋）ＭＶ３２３は、麻疹ウイルスの野生型株（ＩＣ−Ｂ株）のゲノム（（−）鎖ＲＮＡ）の完全な長さ（１５，８９４塩基）のｃＤＮＡをコードしているプラスミドであり、その麻疹ウイルスゲノムｃＤＮＡ（１５，８９４塩基）の上流末端には、Ｔ７プロモーター配列が、下流末端にはリボザイム配列を配置してある。そのため、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７プロモーターに結合して、ＲＮＡ合成を開始し、麻疹ウイルスのｃＤＮＡ領域（１５，８９４塩基）から完全長の麻疹ウイルスＲＮＡゲノム（１５，８９４塩基）を合成することができる。下流末端に配置されたリボザイム配列によって、合成された麻疹ウイルスＲＮＡゲノムの下流末端が、正確に１５，８９４塩基で切断される。ｐ（＋）ＭＶ３２３の構造や、この合成されたＲＮＡゲノムから、感染性を持った麻疹ウイルス粒子が合成できることは、既に知られている（Ｔａｋｅｄａ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００  Ｊｕｌ，７４（１４）：６６４３−７．）。麻疹ウイルス（ＩＣ−Ｂ株）のゲノム塩基配列情報（配列番号１）は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に「アクセッション番号：ＮＣ＿００１４９８」として公表されている。
１．３  ２分節ゲノム型麻疹ウイルスベクターの再構成
２分節ゲノム型ベクターとして、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びマーカー遺伝子としてのＤｓＲｅｄ遺伝子を搭載したＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＮＰＭＦ、並びにＨ遺伝子、Ｌ遺伝子及びマーカー遺伝子としてのＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬの２分節化を試みた（図８）。２分節ゲノム型ベクターの再構成用のｃＤＮＡをそれぞれｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＮＰＭＦ及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬと呼び、使用する。
１．３．１  ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＮＰＭＦの構築
構築スキームを（図３６）に示す。対照ウイルスベクター用完全長ゲノムプラスミドｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤｓＲｅｄ（下記１．５を参照）を基礎に用いて構築した。
ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤｓＲｅｄを制限酵素ＰａｃＩとＣｌａＩで切断して、Ｈタンパク質のコード領域のすべて、及びＬタンパク質のコード領域の大半を切り出した。
一方、下記の２本の合成一本鎖ＤＮＡ：
５’−ｔａａａａｃｔｔａｇｇｇｔｇｃａａｇａｔｃａｔｃｃａｃａａｔｇｔｇａｔａａｔ−３’（配列番号２）
５’−ｃｇａｔｔａｔｃａｃａｔｔｇｔｇｇａｔｇａｔｃｔｔｇｃａｃｃｃｔａａｇｔｔｔｔａａｔ−３’（配列番号３）
をそれぞれ０．３μｇずつ、ｄＨ２Ｏ内で混合し、９５℃で１０分加熱後、５０℃で１０分間アニール反応を行うことによってＰａｃＩとＣｌａＩに対応する突出末端を持つ二重鎖ＤＮＡを合成し、それを上記の切り出し部に、公知の遺伝子組換え技術で組み込むことによって構築した。短い合成二重鎖ＤＮＡが挿入された部位は、新たな遺伝子挿入部位として機能するように合成二重鎖の配列を調整してある（図１０のＥｍｐ−１に相当する）。
１．３．２  ｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬの構築
構築スキームを（図３７）に示す。対照ウイルスベクター用完全長ゲノムプラスミドｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰ（下記１．５を参照）を基礎に用いて構築した。ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰを制限酵素ＢｓｔＢＩとＰａｃＩで切断して、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質及びＦタンパク質のコード領域のすべてを切り出した。
一方、下記の２本の合成一本鎖ＤＮＡ：
５’−ｃｇａａｃｇａｇａｔｇｇｃｃａａｃｇａｔａｔｃｇｇｔａｇｔｔａａｔ−３’（配列番号４）
５’−ｔａａｃｔａｃｃｇａｔａｔｃｇｔｔｇｇｃｃａｔｃｔｃｇｔｔ−３’（配列番号５）
をそれぞれ０．３μｇずつ、ｄＨ２Ｏ内で混合し、９５℃で１０分加熱後、５０℃で１０分間アニール反応を行うことによってＢｓｔＢＩとＰａｃＩに対応する突出末端を持った二重鎖ＤＮＡを合成し、それを上記の切り出し部に、公知の遺伝子組換え技術で組み込むことによって構築した。短い合成二重鎖ＤＮＡが挿入された部位は、新たな遺伝子挿入部位として機能するように合成二重鎖の配列を調整してある（図１０のＥｍｐ−２に相当する）。
１．３．３  ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−Ｎ、ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−ＰΔＣ及びｐＧＥＭＣＲ−９３０１Ｂ−Ｌの構築
上記プラスミドから感染性をもつウイルス（ウイルスベクター）を再構成するためには、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質をそれぞれ発現する３種のプラスミドが必要である。これらのプラスミドは、公知のｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−Ｎ、ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−ＰΔＣ及びｐＧＥＭＣＲ−９３０１Ｂ−Ｌを利用した（Ｔａｋｅｄａ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ＳＬＡＭ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２００５  Ｍａｒ；１０８（１−２）：１６１−５．）。
ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−Ｎ及びｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−ＰΔＣは、その骨格にｐＣＡＧＧＳプラスミド（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，１９９１，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ．，Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−１９９．）を持ち、公知の遺伝子組換え技術で、Ｔ７プロモーター配列とその下流に、ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−ＮではＮタンパク質のコード塩基配列が挿入され、ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−ＰΔＣではＰタンパク質のコード塩基配列が挿入されている。
ｐＧＥＭＣＲ−９３０１Ｂ−Ｌは、ｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ社）プラスミドを骨格に持ち、ｐＧＥＭ−３Ｚ内部のＴ７プロモーターの下流に、Ｌタンパク質のコード塩基配列が挿入されている。
１．３．４  ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３株
上記１．３．１〜１．３．３に記載の５種のプラスミドから、麻疹ウイルスベクターの２つの分節ゲノム（ＲＮＡゲノム）、並びにＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質をコードするｍＲＮＡを合成するために、組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３株を用いた。ｖＴＦ７−３株は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する公知の組換えワクシニアウイルスであり（Ｆｕｅｒｓｔ  ＴＲ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈａｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９８６  Ｎｏｖ；８３（２１）：８１２２−６．）、様々な研究用途に応用されているものである。
１．３．５  宿主細胞の準備
（１）常法により、直径１０ｃｍ培養皿に適度に密に生育させたＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞を用意した。
（２）上記生育後のＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞を、複数枚の６穴培養プレートに播種した。培養液としては、７．５％の胎児牛血清入ＲＰＭＩ培養液を用いた。
（３）３７℃で６時間、ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の培養を行った。
１．３．６  ワクシニアウイルスの感染
（１）２．５×１０６ＰＦＵ／ｍｌに感染価を調整したｖＴＦ７−３株のウイルス液を用意した。
（２）６穴培養プレートのＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の培養液を取り除き、ウイルス液を２４０μｌ／ｗｅｌｌずつ加えた。
（３）３７℃で１時間培養し、感染させた。
１．３．７  プラスミドＤＮＡの導入
（１）ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＮＰＭＦ（２．５μｇ）及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬ（２．５μｇ）、並びにｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−Ｎ（１μｇ）、ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−ＰΔＣ（１．５μｇ）及びｐＧＥＭＣＲ−９３０１Ｂ−Ｌの各プラスミドをポリスチレンチューブに入れ混和して用いた。
（２）上記チューブに、２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液（インビトロジェン社）を加えて混和した。
（３）別のポリスチレンチューブに、７μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（インビトロジェン社）及び２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液を入れて混和した。
（４）上記（２）により得た混和液と上記（３）により得た混和液とを混和し、室温で２０分放置した。
（５）６穴培養プレートのウイルス液をＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞から取り除いた（前記１．３．６（３）の培養終了後）。
（６）次いで、カスパーゼ阻害剤（ｚ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＤＣＢ、ペプチド研究所）を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液２ｍｌを、６穴培養プレートのＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の各穴に添加した。
（７）６穴培養プレートのＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の各穴に、上記（４）により得た混和液を滴下した。
（８）３７℃で１８時間培養し、宿主への各プラスミドの導入、及び麻疹ウイルス粒子（麻疹ウイルスベクター）の再構成を行った。
１．３．８  Ｂ９５ａ細胞との共培養
（１）直径１０ｃｍの培養皿に約６０％程度の密度に均一に培養されたＢ９５ａ細胞を用意した。
（２）前記１．３．７（８）の培養後のＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞をトリプシン液で剥がして上記（１）のＢ９５ａ細胞上に播種し、３７℃で共培養を行った。
（３）共培養後、約３０時間以内に、再構成及び増殖された麻疹ウイルスが感染した巨細胞が多数観察された。
通常、ｖＴＦ７−３株の排除は、再構成されたウイルス粒子（ウイルスベクター）をＢ９５ａ細胞で増殖させた後に、プラークアイソレーションすることや、ウイルス液の限界希釈によって容易に行うことができるが、ワクシニアウイルスの中和抗体を用いることで、さらに容易に行うことができる。
１．３．９  再構成したウイルスベクター
再構成した２分節ゲノム型麻疹ウイルスベクターの各分節ゲノムの構造模式図を図８及び図１０に示す。１分節目（図８（Ａ））には、ウイルス遺伝子のＨ遺伝子及びＬ遺伝子に加え、外来遺伝子のＥＧＦＰ遺伝子が挿入されている。２分節目（図８（Ｂ））には、ウイルス遺伝子のＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子及びＦ遺伝子に加え、外来遺伝子のＤｓＲｅｄ遺伝子が挿入されている。外来遺伝子を高発現させるために、挿入部位は各々の分節ゲノムの最上流に設置した。また、空の遺伝子ユニットが、各々の分節ゲノムにもう１箇所ずつ用意されており（矢印部分参照）、この遺伝子ユニットに、さらに外来遺伝子を挿入することが可能である。すなわち、合計４つの外来遺伝子の挿入が可能である２分節ゲノム型麻疹ウイルスベクターを作製することができた。
１．４  ３分節ゲノム型麻疹ウイルスベクターの再構成
３分節ゲノム型ベクターとして、Ｎ遺伝子及びＰ遺伝子とマーカー遺伝子としてのＬａｃＺ遺伝子とを搭載したＭＶ−ＬａｃＺ−ＮＰ、Ｍ遺伝子及びＦ遺伝子とマーカー遺伝子としてのＤｓＲｅｄ遺伝子とを搭載したＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦ、並びにＨ遺伝子及びＬ遺伝子とマーカー遺伝子としてのＥＧＦＰ遺伝子とを搭載したＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬの３分節化を試みた（図９）。３分節ゲノム型ベクターの再構成用のｃＤＮＡをそれぞれｐ（＋）ＭＶ−ＬａｃＺ−ＮＰ、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦ及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬと呼び、使用した。そのうちｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬは、２分節ゲノム型及び３分節ゲノム型ベクターの両者の再構成に共通に使用する。
１．４．１  ｐ（＋）ＭＶ−ＬａｃＺ−ＮＰの構築
構築スキームを（図３８）に示す。対照ウイルスベクター用完全長ゲノムプラスミドｐ（＋）ＭＶ３２３−ｌａｃＺ（下記１．５を参照）を基礎に用いて構築した。ｐ（＋）ＭＶ３２３−ｌａｃＺを制限酵素ＳａｌＩとＰｍｌＩで切断して、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質及びＨタンパク質のコード領域のすべて、及びＬタンパク質のコード領域の大半を切り出した。
一方、下記の２本の合成一本鎖ＤＮＡ：
５’−ｔｃｇａｃｃｔａａｔｔａｇｔｇｇｃｃｃｇａａｇｔｃａｃ−３’（配列番号６）
５’−ｇｔｇａｃｔｔｃｇｇｇｃｃａｃｔａａｔｔａｇｇ−３’（配列番号７）
をそれぞれ０．３μｇずつ、ｄＨ２Ｏ内で混合し、９５℃で１０分加熱後、５０℃で１０分間アニール反応を行うことによってＳａｌＩとＰｍｌＩに対応する突出末端を持った二重鎖ＤＮＡを合成し、それを上記の切り出し部に、公知の遺伝子組換え技術で組み込むことによって構築した。
１．４．２  ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦの構築
構築スキームを（図３９）に示す。上記の分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター用ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＮＰＭＦＨ（上記１．３を参照）を基礎に用いて構築した。ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＮＰＭＦＨを制限酵素ＢｌｐＩで切断して、Ｎタンパク質及びＰタンパク質のコード領域のほとんどすべてを切り出した。
一方、下記の２本の合成一本鎖ＤＮＡ：
５’−ｔｔａｇｃａｔａｇｔｔｃｔａａｔｇａａａｃａａｇｃ−３’（配列番号８）
５’−ｔｇａｇｃｔｔｇｔｔｔｃａｔｔａｇａａｃｔａｔｇｃ−３’（配列番号９）
をそれぞれ０．３μｇずつ、ｄＨ２Ｏ内で混合し、９５℃で１０分加熱後、５０℃で１０分間アニール反応を行うことによってＢｌｐＩに相当する突出末端を持った二重鎖ＤＮＡを合成し、それを上記の切り出し部に、公知の遺伝子組換え技術で組み込むことによって構築した。短い合成二重鎖ＤＮＡが挿入された部位は、新たな遺伝子挿入部位として機能するように合成二重鎖の配列を調整してある（図１０のＥｍｐ−３に相当する）。
１．４．３  再構成方法
３分節ゲノム型ウイルスベクターの再構成方法は、前述した２分節ゲノム型ウイルスベクターの再構成方法において、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＮＰＭＦ及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬの代わりにｐ（＋）ＭＶ−ｌａｃＺ−ＮＰ、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦ及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬを使用したこと以外は、同様に行った。なお、ｐ（＋）ＭＶ−ｌａｃＺ−ＮＰ、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦ及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬの使用量は、それぞれ２μｇとした。
１．４．４  再構成したウイルスベクター
再構成した３分節ゲノム型麻疹ウイルスベクターの各分節ゲノムの構造模式図を図９及び図１０に示す。１分節目（図９（Ａ））には、ウイルス遺伝子のＨ遺伝子とＬ遺伝子に加え、外来遺伝子のＥＧＦＰ遺伝子が挿入されている。２分節目（図９（Ｂ））には、ウイルス遺伝子のＭ遺伝子とＦ遺伝子に加え、外来遺伝子のＤｓＲｅｄ遺伝子が挿入されている。３分節目（図９（Ｃ））には、ウイルス遺伝子のＮとＰに加えて外来遺伝子のＬａｃＺ遺伝子が挿入されている。外来遺伝子を高発現させるために、挿入部位は各々の分節ゲノムの最上流に設置した。また、空の遺伝子ユニットが、１分節目には１箇所、２分節目に２箇所用意されており（矢印部分参照）、さらに外来遺伝子の挿入が可能である。すなわち、３分節ゲノム型麻疹ウイルスベクターには、合計６つの外来遺伝子の挿入が可能である。
１．５  対照ウイルスベクターの再構成
比較対照として、外来遺伝子を挿入した３種の非分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター（ＩＣ３２３−ｌａｃＺ、ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄ、ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ）を作製した（図５，図１０参照）。具体的には、野生型の麻疹ウイルス（ＩＣ３２３株）のゲノムにＬａｃＺ遺伝子、ＤｓＲｅｄ遺伝子、又はＥＧＦＰ遺伝子が挿入された組換えゲノムを有するウイルスベクターである。外来遺伝子を高発現させるため、挿入部位はいずれもゲノムの最上流に設置した。
１．５．１  ＩＣ３２３−ＥＧＦＰを再構成するためのプラスミドＤＮＡ
ＩＣ３２３−ＥＧＦＰを再構成するためのプラスミドＤＮＡとして、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰを利用した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｋ，ｅｔ．ａｌ．，ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００２  Ｊｕｌ；７６（１３）：６７４３−９．）。ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰは、ｐ（＋）ＭＶ３２３の麻疹ウイルスのゲノムｃＤＮＡ領域内のＴ７プロモーター側の最上流側に麻疹ウイルスの遺伝子の転写開始配列と転写終結配列、そしてＡｓｃＩ及びＡａｔＩＩの２つの制限酵素認識配列を公知の遺伝子組換え技術にて挿入し、さらにその制限酵素認識配列を利用して、その間に、ＥＧＦＰタンパク質のコード配列を挿入したプラスミドである（図１０を参照）。このｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰから得られる麻疹ウイルスをＩＣ３２３−ＥＧＦＰとよび、そのウイルスは、ＩＣ−Ｂ株と同じ遺伝子構造をもつｐ（＋）ＭＶ３２３から得られるＩＣ３２３と、ＥＧＦＰを発現すること以外は、同じ表現型を有している（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｋ，ｅｔ．ａｌ．，ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００２  Ｊｕｌ；７６（１３）：６７４３−９．）。
１．５．２  ＩＣ３２３−ｌａｃＺを再構成するためのプラスミドＤＮＡ
ＩＣ３２３−ｌａｃＺを再構成するためのプラスミドＤＮＡとして、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＬａｃＺを利用した（Ｔａｋｅｄａ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ＳＬＡＭ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２００５  Ｍａｒ；１０８（１−２）：１６１−５．）。ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＬａｃＺは、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰのＥＧＦＰ遺伝子のコード領域（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ［ＯＲＦ］）の開始コドン、終止コドンの内部配列のみをＥＧＦＰ翻訳配列からＬａｃＺ（βガラクトシダーゼ）翻訳配列に公知
の遺伝子組換え技術で置換えたプラスミドである。このｐ（＋）ＭＶ３２３−ＬａｃＺから得られる麻疹ウイルスをＩＣ３２３−ＬａｃＺとよび、そのウイルスは、ＩＣ−Ｂ株と同じ遺伝子構造をもつｐ（＋）ＭＶ３２３から得られるＩＣ３２３と、βガラクトシダーゼを発現すること、増殖能力が低下していること以外は、同じ表現型を有している。
１．５．３  ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄを再構成するためのプラスミドＤＮＡ
ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄを再構成するためのプラスミドＤＮＡとして、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤｓＲｅｄを用いた。ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤｓＲｅｄは、上記ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＬａｃＺと同様の方法で構築することができ、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰのＥＧＦＰ遺伝子のコード領域（ＯＲＦ）の開始コドン、終止コドンの内部配列のみをＥＧＦＰ翻訳配列からＤｓＲｅｄ翻訳配列に公知の遺伝子組換え技術で置換えたプラスミドである。このｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤｓＲｅｄから得られる麻疹ウイルスをＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄとよび、そのウイルスは、ＩＣ−Ｂ株と同じ遺伝子構造をもつｐ（＋）ＭＶ３２３から得られるＩＣ３２３と、ＤｓＲｅｄを発現すること、増殖能力が低下していること以外は、同じ表現型を有している。
ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰ、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤｓＲｅｄ、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ｌａｃＺからのＩＣ３２３−ＥＧＦＰ、ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄ、ＩＣ３２３−ｌａｃＺの再構成方法は、前述した２分節ゲノム型ウイルスベクターの再構成方法において、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＮＰＭＦ及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬの代わりにｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰ、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤｓＲｅｄ及びｐ（＋）ＭＶ３２３−ｌａｃＺを使用したこと以外は、同様に行った。なお、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰ、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＤｓＲｅｄ及びｐ（＋）ＭＶ３２３−ｌａｃＺの使用量は、それぞれ５μｇとした。
１．６  外来性遺伝子の追加挿入
３分節ゲノム型ウイルスベクターの分節、ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦへの外来性遺伝子の追加挿入を行った。
１．６．１  ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ  ＭＦの構築：Ｅｍｐ−３へのＣｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）遺伝子の挿入
下記の合成一本鎖ＤＮＡ：
５’−ａｇｔｔｃｇａａｇｃｔａａａａｔｇｇａｇａａａａａａａｔｃ−３’（配列番号１０）
５’−ｃｇｇｃｔｇａｇｃｔｔａｃｇｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｃｃａｃｔ−３’（配列番号１１）
をプライマーとして使用し、ｐ１０７ＭＶ（−）：ＣＡＴプラスミド（Ｓｉｄｈｕ  ＭＳ，ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｍｉｎｉｒｅｐｌｉｃｏｎｓ：ｍｅａｓｌｅｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｅｒｍｉｎｉｄｉｒｅｃｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５  Ａｐｒ  ２０；２０８（２）：８００−７．）を鋳型にして公知の核酸増幅技術（ＰＣＲ）に従って、ＣＡＴ遺伝子のコード配列とその両末端にＢｓｔＢＩとＢｌｐＩ制限酵素認識配列をもつＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を公知の遺伝子組換え技術によってｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦプラスミドのＥｍｐ−３内部のＢｓｔＢＩとＢｌｐＩ制限酵素認識配列部へ挿入することにより、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦプラスミドを得た（図４０）。
上記ＰＣＲの反応液組成及び反応条件は、次の通りである。
＜反応液組成＞
鋳型ＤＮＡ（１．０μｇ／μＬ）：          １μＬ
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：  １ｕｎｉｔ
Ｆプライマー（１００μＭ）：              ０．５μＬ
Ｒプライマー（１００μＭ）：              ０．５μＬ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）：        １０μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ：                      １０μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                      ４μＬ
滅菌水：                                  ７３μＬ    
合計：                                    １００μＬ
＜反応条件＞
「９４℃で１５秒間の熱変性・解離→５５℃で３０秒間のアニーリング→６８℃で２分間の合成・伸長」を１サイクルとするサイクル条件で、計２０サイクル。
１．６．２  ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ−ＳＥＡＰの構築：Ｅｍｐ−１へのＳｅｃｒｅｔｅｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＥＡＰ）遺伝子の挿入
下記の合成一本鎖ＤＮＡ：
５’−ｇａｔｔａａｔｔａａａａｃｔｔａｇｇｇｔｇｃａａｇａｔｃａｃｇｃｇａａｔｔｃｇｃｃｃａｃｃａｔｇｃ−３’（配列番号１２）
５’−ａｔａｇｃｇｃｔｔｃａｔｇｔｃｔｇｃｔｃｇａａｇｃｇｇｃ−３’（配列番号１３）
をプライマーとして使用し、ｐＳＥＡＰ−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミド（クローンテック社）を鋳型にして公知の核酸増幅技術（ＰＣＲ）に従って、ＳＥＡＰ遺伝子のコード配列とその両末端にＰａｃＩとＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素認識配列をもつＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を公知の遺伝子組換え技術によってｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦプラスミドのＥｍｐ−１内部のＰａｃＩとＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素認識配列部へ挿入することにより、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ−ＳＥＡＰプラスミドを得た（図４１）。
なお、上記ＰＣＲの反応液組成及び反応条件は、１．６．１と同様にして行った。
１．６．３  再構成方法
これらｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ又はｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ−ＳＥＡＰ）を用いての３分節ゲノム型ウイルスベクターの再構成方法は、前述した３分節ゲノム型ウイルスベクターの再構成方法において、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦの代わりにｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＰ又はｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ−ＳＥＡＰを使用したこと以外は、同様に行った。なお、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ及びｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ−ＳＥＡＰの使用量は、いずれも２μｇとした。
２．外来遺伝子の発現
２．１  ２分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター（図１１参照）
再構成された２分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター（以下、「２  ｓｅｇ−ＭｅＶ」という）は、宿主ＣＨＯ細胞において、ＥＧＦＰ（緑色、図１１Ａのパネル）及びＤｓＲｅｄ（赤色、図１１Ｂのパネル）の蛍光を発する巨細胞を形成しながら増殖していることが、蛍光顕微鏡下で認められた。なお、図１１Ｃのパネルは、図１１Ａのパネルと図１１Ｂのパネルを重ね合わせて表示したものであり、図１１Ｄのパネルはウイルス細胞そのもの（励起光未照射）の写真である。
２．２  ３分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター（図１２、１３参照）
２．２．１  ｐ（＋）ＭＶ−ＬａｃＺ−ＮＰ、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＭＦ及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬで再構成された３分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター
当該ウイルスベクター（以下、「３  ｓｅｇ−ＭｅＶ」という）は、宿主Ｂ９５ａ細胞において、ＥＧＦＰ（緑色、図１２Ａのパネル）及びＤｓＲｅｄ（赤色、図１２Ｂのパネル）の蛍光を発する巨細胞を形成しながら増殖していることが、蛍光顕微鏡下で認められた。なお、図１２Ｃのパネルは、図１２Ａのパネルと図１２Ｂのパネルを重ね合わせて表示したものであり、図１２Ｄのパネルはウイルス細胞そのもの（励起光未照射）の写真である。また、上記蛍光に加えて、ｌａｃＺ遺伝子にコードされているβガラクトシダーゼが発現していることも認められた（図１３Ｂのパネル、図１３Ａのパネル（拡大））。
２．２．２  ｐ（＋）ＭＶ−ＬａｃＺ−ＮＰ、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬで再構成された３分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター
当該ウイルスベクター（以下、「３  ｓｅｇ−ＭｅＶ−ＣＡＴ」という）は、宿主Ｖｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞において、ＥＧＦＰ（緑色、図４２Ａのパネル）及びＤｓＲｅｄ（赤色、図４２Ｂのパネル）の蛍光を発する巨細胞を形成しながら増殖していることが、蛍光顕微鏡下で認められた。なお、図４２Ｃのパネルは、図４２Ａのパネルと図４２Ｂのパネルを重ね合わせて表示したものであり、ウイルス細胞そのもの（励起光未照射）の写真である。また、上記蛍光に加えて、ｌａｃＺ遺伝子にコードされているβガラクトシダーゼが発現していることも認められた。それらに加えて、３  ｓｅｇ−ＭｅＶ−ＣＡＴを感染させた宿主Ｖｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞を経時的に採取してＣＡＴ活性を解析したところ、ＣＡＴ活性の経時的な増加が確認できた（図４２Ｃ）。
２．２．３  ｐ（＋）ＭＶ−ＬａｃＺ−ＮＰ、ｐ（＋）ＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＣＡＴ−ＭＦ−ＳＥＡＰ及びｐ（＋）ＭＶ−ＥＧＦＰ−ＨＬで再構成された３分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター
当該ウイルスベクター（以下、「３  ｓｅｇ−ＭｅＶ−ＣＡＴ−ＳＥＡＰ）」という）は、宿主Ｖｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞において、ＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの蛍光を発する巨細胞を形成しながら増殖していることが、蛍光顕微鏡下で認められた。また、上記蛍光に加えて、ｌａｃＺ遺伝子にコードされているβガラクトシダーゼが発現していることも認められた。それらに加えて、３  ｓｅｇ−ＭｅＶ−ＣＡＴ−ＳＥＡＰを感染させた宿主Ｖｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞を経時的に採取してＣＡＴ活性及びＳＥＡＰ活性を解析したところ、ＣＡＴ活性（図４３Ａ）及びＳＥＡＰ活性（図４３Ｂ）の経時的な増加が確認できた。
３．ウイルス複製能
２  ｓｅｇ−ＭｅＶが、野生型麻疹ウイルス（ＩＣ３２３株）と同程度の増殖能を維持していることが認められた（図１４参照）。
３  ｓｅｇ−ＭｅＶは、感染後２４時間までは、野生型麻疹ウイルス（ＩＣ３２３株）と同程度に増殖することが認められた。また、ＬａｃＺ遺伝子を有する非分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター（ＩＣ３２３−ｌａｃＺ）と比較すると、感染後２４時間の時点で約５０倍量のウイルスを生産していることが認められた（図１４参照）。
これらの結果から、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶは高い増殖性を維持した麻疹ウイルスベクターであることが確認された。
４．プラーク形成能
４．１  プラーク形成能（図１５参照）
２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶは、いずれも、野生型麻疹ウイルス（ＩＣ３２３株）と同様にプラーク形成能を保持していることが認められた。なお、各プラークが１つの粒子に由来するであろうことは、希釈系列とプラークの数とのｌｉｎｅａｌｉｔｙにより確認されている。
４．２  プラークにおけるβガラクトシダーゼの発現（図１６参照）
３  ｓｅｇ−ＭｅＶのプラークが、βガラクトシダーゼを高発現していることが認められた。
野生型麻疹ウイルス（ＩＣ３２３株）及び２  ｓｅｇ−ＭｅＶのプラークでは、βガラクトシダーゼの発現は認められなかった。
４．３  プラークにおける蛍光の発現（図１７参照）
２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶは、いずれも、２色（赤色、緑色）の蛍光を発するプラークを形成していることが認められた（図１７Ａ〜Ｄ）。さらに、３  ｓｅｇ−ＭｅＶは、βガラクトシダーゼを発現していることが認められた（図１７Ｇ）。
また、３  ｓｅｇ−ＭｅＶのプラークの周辺には、緑色の蛍光とβガラクトシダーゼの発現は認められるが、赤色の蛍光発現は認められない細胞が観察された。これについて後述する（詳しくは、４．３．２を参照）。
４．３．１  ２  ｓｅｇ−ＭｅＶについて（図１８参照）
通常、ウイルスゲノムの転写、すなわち遺伝子発現に必須のウイルスタンパク質は、ヌクレオキャプシド（Ｎ）とポリメラーゼ（Ｐ，Ｌ）である。２  ｓｅｇ−ＭｅＶでは、遺伝子発現に両分節が必ず必要なため（図１８（Ｃ）のパネル）、全ての巨細胞（ＨとＦによる）が、２色の蛍光を発する。
４．３．２  ３  ｓｅｇ−ＭｅＶについて（図１９参照）
一方、３  ｓｅｇ−ＭｅＶでは、前述したように、ｌａｃＺとＥＧＦＰをもつ２分節のみでも遺伝子発現が可能であることを示唆する結果が得られた。これは、３分節のゲノムを全て有していなくても、図１９（Ｂ）のパネルに示すように２分節のゲノムを有していれば、少なくともヌクレオキャプシド（Ｎ）とポリメラーゼ（Ｐ，Ｌ）については発現することができるためである。このような、３分節ゲノム型のウイルスベクターの複製時に生じ得る非増殖型のウイルス粒子、すなわちＭ遺伝子やＦ遺伝子を持たないことにより伝播性や感染性を有しないウイルス粒子は、安全性の高いウイルスベクターの開発や、タンパク質持続発現型ベクターの開発に応用が可能である。
５．外来性タンパク質の発現解析
５．１  免疫沈降法を用いた解析（図２０参照）
２  ｓｅｇ−ＭｅＶを感染させたＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶを感染させたＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞における、ウイルスタンパク質及び外来性タンパク質の発現を、免疫沈降法を用いて解析した。
２  ｓｅｇ−ＭｅＶ感染細胞では、ＥＧＦＰとＤｓＤｅｄを発現していることがことが認められ（図２０左から５レーン目「２  ｓｅｇ−ＭｅＶ」）、３  ｓｅｇ−ＭｅＶ感染細胞では、ＥＧＦＰ、ＤｓＤｅｄに加えてβガラクトシダーゼも発現していることが認められた（図２０左から６レーン目「３  ｓｅｇ−ＭｅＶ」）。しかも、これら分節ゲノム型ウイルス感染細胞におけるタンパク質（外来性タンパク質及びウイルスタンパク質）発現効率は、非分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター（ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ，ＩＣ３２３−ＤｓＲｅｄ，ＩＣ３２３−ｌａｃＺ）の感染細胞よりも優れていることが確認された（図２０右から１レーン目「３  ｓｅｇ−ＭｅＶ」、２レーン目「２  ｓｅｇ−ＭｅＶ」）。
５．２  ルミノメーターを用いた解析（図２１参照）
３  ｓｅｇ−ＭｅＶ等を感染させたＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞におけるβガラクトシダーゼの発現量を、ルミノメーターを用いて定量した。非分節ゲノム型麻疹ウイルスベクターＩＣ３２３−ｌａｃＺよりも、３  ｓｅｇ−ＭｅＶの方が、６倍以上発現効率が高いことが確認された。
６．遺伝子発現量（ｍＲＮＡ量）の解析（図２２参照）
３  ｓｅｇ−ＭｅＶを感染させたＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞における各遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）を、ＲＴ−定量ＰＣＲ法により定量し、非分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター（ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ）の感染細胞におけるｍＲＮＡ量と比較した。
その結果、３  ｓｅｇ−ＭｅＶ感染細胞でのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量は、ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ感染細胞でのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量に対して約５０％程度であった。しかしながら、３  ｓｅｇ−ＭｅＶ感染細胞でのウイルスタンパク質のｍＲＮＡ量は、３種の外来遺伝子の挿入にも関わらず、いずれも、ＩＣ３２３−ＥＧＦＰ感染細胞でのウイルスタンパク質のｍＲＮＡ量に対して１００％以上であることが確認された。
以上の結果、及び前記２，４，５での結果から、２  ｓｅｇ−ＭｅＶ及び３  ｓｅｇ−ＭｅＶにより２種及び３種の外来性タンパクを高発現させ得ることが確認できた。
また、３  ｓｅｇ−ＭｅＶの分節ゲノムには、さらに３つの外来遺伝子の追加挿入にも対応し得る空の遺伝子ユニット（遺伝子挿入部位）が残されており、３  ｓｅｇ−ＭｅＶは、合計６つもの外来遺伝子を挿入できる極めて有用なウイルスベクターである。このうちの２つの挿入部位には、それぞれＣＡＴとＳＥＡＰ遺伝子を挿入し、発現されることを、前記１．６の外来性遺伝子の追加挿入の項目で示した。
【実施例２】
【０００８】
分節ゲノム型組換え麻疹ウイルスベクターの安定性
本実施例では、分節ゲノム型組換え麻疹ウイルスベクターが、外来遺伝子の発現を維持しつつ、安定的に継代できるものであるかどうかを確認した。
実施例１において作製した３分節ゲノム型麻疹ウイルスベクター（３  ｓｅｇ−ＭｅＶ）を、約０．０１程度の低いＭＯＩで、Ｖｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞へ感染させた。
その後、感染後の細胞変性効果（ＣＰＥ）を、位相差顕微鏡又は蛍光顕微鏡で毎日観察し、ＣＰＥが顕著になった段階（すなわちすでに十分量、ウイルスが生産され、ウイルス合成量がピークに達し、以後、宿主細胞の死滅のためにウイルス合成が減衰すると予想される段階）で、細胞培養上清（ウイルス液）を回収し、再び低いＭＯＩで、別のＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞へ感染させた。
このような継代操作を２０回繰り返したときの細胞培養上清を新たなＶｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ細胞に感染させて、外来遺伝子（レポーター遺伝子）の発現を観察した。すなわち、感染細胞におけるＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの蛍光を蛍光顕微鏡で観察し、併せて、Ｘ−ｇａｌ染色法により感染細胞を染色してβ−ガラクトシダーゼの発現を観察した。
観察の結果、ウイルス感染により形成された多核巨細胞の全細胞数の９０％以上において、ＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの両蛍光が検出され、かつβ−ガラクトシダーゼを発現していることが確認された。
以上の結果から、３  ｓｅｇ−ＭｅＶが、外来遺伝子の発現を維持しつつ、安定的に継代できるものであることが示された。
【実施例３】
【０００９】
ワクシニアウイルスＬＯ−Ｔ７−１株を利用した麻疹ウイルスの再構成
１．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現ワクシニアウイルスＬＯ−Ｔ７−１株の利用
Ｌｉｓｔｅｒ株を親株とする、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスＬＯ−Ｔ７−１株は、公知のものを使用した（Ｙａｓｕｉ  Ｋ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｈｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８  Ｊｕｌ；７２（７）：６０４８−５５．；Ｋａｓｈｉｗａｋｕｍａ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｙ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＦＥＩＡ）．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９６  Ｍａｒ  ２８；１９０（１）：７９−８９．）。
２．麻疹ウイルスゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡｐ（＋）ＭＶ３２３の構築
野生型麻疹ウイルス（ＩＣ−Ｂ株）から、常法により、ゲノムＲＮＡを抽出し、下記に示す条件で逆転写反応を行い、全長ゲノムのｃＤＮＡを持つプラスミドｐ（＋）ＭＶ３２３を作製した。
逆転写反応の反応液組成及び反応条件は、次の通りである。
＜反応液組成＞
鋳型ＲＮＡ（１．０μｇ／μＬ）：              ５μＬ
逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ：        １ｕｎｉｔ
プライマー（１０μＭ）：                      ０．５μＬ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）：            ４μＬ
ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：              １ｕｎｉｔ
５Ｘ  Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ：４μＬ
０．１Ｍ  ＤＴＴ                              ２μＬ
滅菌水：                                      適量（約２．５μＬ）
合計：                                        ２０μＬ
＜反応条件＞
「４２℃で６０分間（ｃＤＮＡ合成）→６５℃で１５分間（酵素失活）
→４℃で保存（冷却）」
ｐ（＋）ＭＶ３２３から再構成されたウイルス（１３個の同義置換「アミノ酸置換を伴わない塩基置換」を除き親株のＩＣ−Ｂ株と同じゲノム構造と有している）をＩＣ３２３と呼ぶ。ｐ（＋）ＭＶ３２３の構築は、すでに完了している（Ｔａｋｅｄａ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００  Ｊｕｌ；７４（１４）：６６４３−７．）。ｐ（＋）ＭＶ３２３は、麻疹ウイルスの野生型株（ＩＣ−Ｂ株）のゲノム（（−）鎖ＲＮＡ）の完全な長さ（１５，８９４塩基）のｃＤＮＡをコードしているプラスミドであり、その麻疹ウイルスゲノムｃＤＮＡ（１５，８９４塩基）の上流末端には、Ｔ７プロモーター配列が、下流末端にはリボザイム配列が配置されている。そのため、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７プロモーターに結合して、ＲＮＡ合成を開始し、麻疹ウイルスのｃＤＮＡ領域（１５，８９４塩基）から完全長の麻疹ウイルスＲＮＡゲノム（１５，８９４塩基）を合成することができる。下流末端に配置されたリボザイム配列によって、合成された麻疹ウイルスＲＮＡゲノムの下流末端が、正確に１５，８９４塩基で切断される。ｐ（＋）ＭＶ３２３の構造や、この合成されたＲＮＡゲノムから、感染性を持った麻疹ウイルス粒子が合成できることは公知である（Ｔａｋｅｄａ  Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００  Ｊｕｌ；７４（１４）：６６４３−７．）。麻疹ウイルス（ＩＣ−Ｂ株）のゲノム塩基配列情報（配列番号１）は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に「アクセッション番号：ＮＣ＿００１４９８」として公表されている。
３．麻疹ウイルスの再構成
３．１  宿主細胞の準備
（１）常法により、直径１０ｃｍ培養皿に適度に密に生育させたＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞を用意した。
（２）上記生育後のＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞を、６穴培養プレート一枚に播種した。培養液としては、７．５％の胎児牛血清入ＲＰＭＩ培養液を用いた。
（３）３７℃で６時間、ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の培養を行った。
３．２  ワクシニアウイルスの感染
（１）２．５×１０６ＰＦＵ／ｍｌに感染価を調整したＬＯ−Ｔ７−１株ウイルス液を用意した。
（２）６穴培養プレートのＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の培養液を取り除き、各穴に上記ウイルス液を２４０μｌ加えた。
（３）３７℃で１時間培養し、ＬＯ−Ｔ７−１株を感染させた。
３．３  各種プラスミドＤＮＡの導入、及びウイルス粒子の再構成
（１）ｐ（＋）ＭＶ３２３（５μｇ）、並びに実施例１で構築したｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−Ｎ（１μｇ）、ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−ＰΔＣ（１．５μｇ）及びｐＧＥＭＣＲ−９３０１Ｂ−Ｌ（１μｇ）の各プラスミド溶液を、それぞれ所定のＤＮＡ量となるようにポリスチレンチューブに入れて混和した。
（２）上記チューブに、２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液（インビトロジェン社）を加えて混和した。
（３）別のポリスチレンチューブに、７μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（インビトロジェン社）及び２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液を入れて混和した。
（４）上記（２）により得た混和液と上記（３）により得た混和液とを混和し、室温で２０分放置した。
（５）６穴培養プレートのＬＯ−Ｔ７−１ウイルス液をＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞から取り除いた（前記３．２（３）の培養終了後）。
（６）次いで、カスパーゼ阻害剤（ｚ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＤＣＢ、ペプチド研究所、５０μｌ／ｍｌ）を添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液２ｍｌを、６穴培養プレートのＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の各穴に添加した。
（７）６穴培養プレートのＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の各穴に、上記（４）により得た混和液を滴下した。
（８）３７℃で１８時間培養し、宿主への各プラスミドの導入、及び麻疹ウイルス粒子の再構成を行った。
３．４  Ｂ９５ａ細胞との共培養
（１）直径１０ｃｍの培養皿に約４０％程度の密度に均一に培養されたＢ９５ａ細胞を用意した。
（２）前記３．３（８）の培養後のＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞をトリプシン液で剥がして上記（１）のＢ９５ａ細胞上に播種し、３７℃で共培養を行った。
（３）共培養後、約３０時間以内に、再構成及び増殖された麻疹ウイルスが感染した巨細胞が多数観察された。
【実施例４】
【００１０】
ＬＯ−Ｔ７−１株を用いた外来遺伝子の転写・発現効果
１．ＧＦＰを指標にしたＴ７プロモーターの駆動性（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現性）の検証実験
１．１  宿主細胞の準備
（１）常法により、直径６穴培養プレートに適度に密に生育させたＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞を用意した。
（２）培養液としては、７．５％の胎児牛血清入ＲＰＭＩ培養液を用いた。
１．２  ワクシニアウイルスの感染
（１）２．５×１０６ＰＦＵ／ｍｌに感染価を調整したｖＴＦ７−３株（実施例１参照）、ＬＯ−Ｔ７−１株（実施例３参照）及びＭＶＡ−Ｔ７株（Ｗｙａｔｔ  ＬＳ，ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５  Ｊｕｎ  ２０；２１０（１）：２０２−５．）のウイルス液をそれぞれ用意した。
（２）６穴培養プレートのＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の培養液を取り除き、プレートごとに異なるウイルス液を感染価がＭＯＩ＝５になるように加えた。
（３）３７℃で１時間培養し、各ウイルス株を感染させた。
１．３  プラスミドＤＮＡの導入、及び外来遺伝子の転写・発現
（１）ｐＢＳ−ＧＦＰ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ストラタジーン社）にＧＦＰ遺伝子を組み込んだもの）のプラスミド溶液を、１．０μｇのＤＮＡ量となるようにポリスチレンチューブに入れた。
（２）上記チューブに、２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液（インビトロジェン社）を加えて混和した。
（３）別のポリスチレンチューブに、７μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（インビトロジェン社）及び２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液を入れて混和した。
（４）上記（２）により得た混和液と上記（３）により得た混和液とを混和し、室温で２０分放置した。
（５）６穴培養プレートのウイルス液をＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞から取り除いた（前記１．２（３）の培養終了後）。
（６）次いで、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培養液２ｍｌを、６穴培養プレートのＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の各穴に添加した。
（７）６穴培養プレートのＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞の各穴に、上記（４）により得た混和液を滴下した。
（８）３７℃で２４時間培養し、宿主への各プラスミドの導入、及び外来遺伝子の転写・発現を行った。
（９）上記（１）〜（８）の操作を各プレートについて行った。
１．４  外来遺伝子の発現確認
各ＣＨＯ細胞についてＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡による蛍光の検出により確認した。その結果、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３株及びＬＯ−Ｔ７−１株を感染させた細胞において、ＥＧＦＰの蛍光が確認された（図２３参照）。
２．ルシフェラーゼの発現を指標にしたミニゲノムウイルス転写・複製実験系によるＲＮＰ複合体形成誘導能の検証実験
上記、実施例３（麻疹ウイルスの再構成）において、ｐ（＋）ＭＶ３２３の代わりにｐ１８ＭＧＦＬｕｃ０１（Ｋｏｍａｓｅ  Ｋ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｍｅａｓｌｅｓ  ＡＩＫ−Ｃ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．，２００６  Ｆｅｂ  ６；２４（６）：８２６−３４．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ａｕｇ  １５．）を用いたこと以外は同様にして、ルシフェラーゼの発現（すなわちルシフェリン添加後の蛍光量）を確認した。
その結果、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３株及びＬＯ−Ｔ７−１株を感染させた細胞において蛍光が確認された。なお、ＬＯ−Ｔ７−１株を感染させた細胞の方が若干蛍光量は少なかった（図２４（Ａ）参照）。
３．麻疹ウイルス（ＥＧＦＰを発現するもの：１．５対照ウイルスベクターの再構成を参照）粒子の再構成
上記１．のＧＦＰの発現において、ｐＢＳ−ＧＦＰ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ストラタジーン社）にＧＦＰ遺伝子を組み込んだもの）の代わりに、ｐ（＋）ＭＶ３２３−ＥＧＦＰ（５μｇ）（１．５対照ウイルスベクターの再構成を参照）、並びにｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−Ｎ（１μｇ）、ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−ＰΔＣ（１．５μｇ）及びｐＧＥＭＣＲ−９３０１Ｂ−Ｌ（１μｇ）（実施例１参照）の各プラスミドを混和して用い、また、ワクシニアウイルスＭＶＡ−Ｔ７株を使用しなかったこと以外は上記１と同様にして、麻疹ウイルス粒子の合成開始に成功した細胞数を測定した。
その結果、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３株及びＬＯ−Ｔ７−１株を感染させた細胞において、いずれも麻疹ウイルス粒子の複製が確認された。なお、ＬＯ−Ｔ７−１株を感染させた方では、ｖＴＦ７−３株を感染させた方に比べ、約５５〜６０％程度の細胞数であった（図２４（Ｂ）参照）。
【実施例５】
【００１１】
ＬＯ−Ｔ７−１株感染細胞におけるカスパーゼ阻害剤の効果
１．ワクシニアウイルスの感染によるアポトーシス抑制効果
実施例４中の１．の１．１及び１．２と同様にして、ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞を用意した。２．５×１０６ＰＦＵ／ｍｌに感染価を調整したＬＯ−Ｔ７−１株（実施例３参照）のウイルス液を用意し、ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞に添加して（２４０μｌ／ｗｅｌｌ）、３７℃で１時間培養し、ＬＯ−Ｔ７−１株を感染させた。
培養後、ウイルス液をＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ細胞から取り除いた。その後、一部のウェルにはカスパーゼ阻害剤（ｚ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＤＣＢ、ペプチド研究所、５０μｌ／ｍｌ）を添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液２ｍｌを添加した。その後、３７℃で１８時間培養した。
その結果、カスパーゼ阻害剤を添加しなかったウェルにおいてはアポトーシスによる細胞死が多く確認されたが、カスパーゼ阻害剤を添加したウェルにおいてはアポトーシスによる細胞死がほとんど確認されなかった（図２５（ａ））。
また、カスパーゼ阻害剤を添加しなかったウェルの細胞では染色体ＤＮＡの断片化が生じたが、カスパーゼ阻害剤を添加したウェルの細胞では染色体ＤＮＡの断片化はほとんど生じなかった（図２５（ｂ））。
２．ルシフェラーゼの発現を指標にしたミニゲノムウイルス転写・複製実験系によるＲＮＰ複合体形成誘導能の亢進
実施例４中の２．と同様にして、ワクシニアウイルスＬＯ−Ｔ７−１株を感染させた細胞におけるルシフェラーゼの発現（すなわちルシフェリン添加後の蛍光量）を確認した。一方、対照として、カスパーゼ阻害剤を使用せずに同様の操作を行った。
その結果、カスパーゼ阻害剤を添加しなかった場合は、添加した場合に比べ、蛍光量が約１／１０程度に低下した（図２６（ａ））。カスパーゼ阻害剤を添加することによる（ルシフェラーゼの発現を指標にした）ミニゲノムウイルス転写・複製実験系によるＲＮＰ複合体形成誘導能の亢進が認められた。
３．ウイルス粒子合成開始に成功した細胞数の増加
実施例４中の３．と同様にして、ワクシニアウイルスＬＯ−Ｔ７−１株を感染させた細胞における麻疹ウイルス粒子の合成開始に成功した細胞数えを測定した。対照として、カスパーゼ阻害剤の濃度を２５μｌ／ｍｌとした場合、及び、カスパーゼ阻害剤を使用しなかった場合（０μｌ／ｍｌ）についても同様の操作を行った。
その結果、カスパーゼ阻害剤の濃度依存的に麻疹ウイルス粒子の合成開始に成功した細胞数の増加が確認された（図２６（ｂ））。
【実施例６】
【００１２】
ＳｅＶベクターによる分節ゲノム型ベクターｃＤＮＡの構築
ベクターの分節化をセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター系で実施するにあたって、遺伝子治療及び遺伝子ワクチンへの臨床応用可能なベクター化に成功している「非伝播性Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター」（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４；６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）をベースにした分節化を検討した。
２分節ゲノム型ベクターとして、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＭ遺伝子とマーカー遺伝子としてのＬａｃＺ遺伝子とを搭載したＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−ＮＰ−Ｐ−Ｍ、並びにＨＮ遺伝子及びＬ遺伝子とマーカー遺伝子としてのＧＦＰ遺伝子とを搭載したＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌの２分節化を試み、３分節ゲノム型ベクターとして、ＮＰ遺伝子及びＰ遺伝子とマーカー遺伝子としてのｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子とを搭載したＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌｕｃｉ−ＮＰ−Ｐ、Ｍ遺伝子とマーカー遺伝子としてのＬａｃＺ遺伝子とを搭載したＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−Ｍ、並びにＨＮ遺伝子及びＬ遺伝子とマーカー遺伝子としてのＧＦＰ遺伝子とを搭載したＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌの３分節化を試みた（図２７）。２分節ゲノム型ベクターの再構成用のｃＤＮＡをそれぞれｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−ＮＰ−Ｐ−Ｍ及びｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌと呼び、３分節ゲノム型ベクターの再構成用のｃＤＮＡをそれぞれｐＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌｕｃｉ−ＮＰ−Ｐ、ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−Ｍ及びｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌと呼び、使用した。そのうちｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌは、２分節ゲノム型及び３分節ゲノム型ベクターの両者の再構成に共通に使用する。
（１）ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−ＮＰ−Ｐ−Ｍの構築
構築スキームを（図２８）に示す。ＳｅＶベクターゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋１８）：Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８：２８１３−２８２０）をｔｅｍｐｌａｔｅとして、次の２種のプライマー、ＮｏｔＩ−ＮＰ−Ｆ及びＳａｃ  ＩＩ−Ｍ−Ｒを用いてＰＣＲを行い、両端にそれぞれＮｏｔＩ認識配列及びＳａｃＩＩ認識配列を有するＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＭ遺伝子を含むｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｏｔ  Ｉ−ＮＰ／Ｐ／Ｍ−Ｓａｃ  ＩＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：配列番号１６）を得た。
Ｎｏｔ  Ｉ−ＮＰ−Ｆ：
５’−ｔｔｃａｃｇｃｇｇｃｃｇｃａｇａｔｃｔｔｃａｃｇ−３’（２４ｍｅｒ，配列番号１４）
Ｓａｃ  ＩＩ−Ｍ−Ｒ：
５’−ｔｃｃａｔｃｃｇｃｇｇａｇｃｔｔａｔｔｔａａｇａｃａａｇｇａｇｔｇａｃ−３’（３５ｍｅｒ，配列番号１５）
このｆｒａｇｍｅｎｔをＮｏｔＩ及びＳａｃＩＩで消化し精製後、ｐＳｅＶ（＋１８）を同様にＮｏｔＩ  とＳａｃ  ＩＩで消化し、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子及びＬ遺伝子の全遺伝子配列断片を取り除いたｃＤＮＡに挿入し、ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＮＰ−Ｐ−Ｍを得た。ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＮＰ−Ｐ−Ｍを再度ＮｏｔＩ消化し、ＥＩＳ配列を含むＬａｃＺ遺伝子のＮｏｔＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（配列番号１７）をｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＮＰ−Ｐ−Ｍに挿入したｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−ＮＰ−Ｐ−Ｍを構築した。
（２）ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌの構築
構築スキームを図２９に示す。ＳｅＶベクターゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋１８））をｔｅｍｐｌａｔｅとして、下記の２種のプライマー、Ｎｏｔ  Ｉ−ＨＮ−Ｆ及びＳａｃ  ＩＩ−Ｒを用いてＰＣＲを行い、両端にそれぞれＮｏｔＩ認識配列及びＳａｃＩＩ認識配列を有するＨＮ遺伝子及びＬ遺伝子を含むｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｏｔ  Ｉ−ＨＮ／Ｌ−Ｓａｃ  ＩＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：配列番号２０）を得た。
Ｎｏｔ  Ｉ−ＨＮ−Ｆ：
５’−ａａｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｃａｇａｔｃａｔｇｇａｔｇｇｔｇａｔａｇ−３’（３５ｍｅｒ，配列番号１８）
Ｓａｃ  ＩＩ−Ｒ：
５’−ｔｔｃｃａｇｇｔａｃｃｇｃｇｇａｇｃｔｔｃｇａｔｃ−３’（２５ｍｅｒ，配列番号１９）
このｆｒａｇｍｅｎｔをＮｏｔＩ及びＳａｃＩＩで消化し精製後、ｐＳｅＶ（＋１８）を同様にＮｏｔ  ＩとＳａｃ  ＩＩで消化し、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子及びＬ遺伝子の全遺伝子配列断片を取り除いたｃＤＮＡに挿入し、
ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＨＮ−Ｌを得た。ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＨＮ−Ｌを再度ＮｏｔＩ消化し、ＥＩＳ配列を含むＧＦＰ遺伝子のＮｏｔＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔを（配列番号２１）をｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＨＮ−Ｌに挿入したｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌを構築した。
（３）ｐＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌｕｃｉ−ＮＰ−Ｐの構築
構築スキームを図３０に示す。ＳｅＶベクターゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋１８））をｔｅｍｐｌａｔｅとして、下記の２種のプライマーを用いてＰＣＲを行い、両端にそれぞれＮｏｔＩ認識配列及びＳａｃＩＩ認識配列を有するＮＰ遺伝子及びＰ遺伝子を含むｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｏｔ  Ｉ−ＮＰ／Ｐ−Ｓａｃ  ＩＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：配列番号２３）を得た。
Ｎｏｔ  Ｉ−ＮＰ−Ｆ：
５’−ｔｔｃａｃｇｃｇｇｃｃｇｃａｇａｔｃｔｔｃａｃｇ−３’（２４ｍｅｒ，配列番号１４）
Ｓａｃ  ＩＩ−Ｐ−Ｒ：
５’−ｔｃｃａｔｃｃｇｃｇｇａｇｃｔａｇｔｔｇｇｔｃａｇｔｇａｃｔｃｔａｔｇ−３’（３５ｍｅｒ，配列番号２２）
このｆｒａｇｍｅｎｔをＮｏｔＩ及びＳａｃＩＩで消化し精製後、ｐＳｅＶ（＋１８）を同様にＮｏｔ  ＩとＳａｃ  ＩＩで消化し、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子及びＬ遺伝子の全遺伝子配列断片を取り除いたｃＤＮＡに挿入し、
ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＮＰ−Ｐを得た。ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＮＰ−Ｐを再度ＮｏｔＩ消化し、ＥＩＳ配列を含むｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子のＮｏｔＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔを（配列番号２４）をｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＮＰ−Ｐに挿入したｐＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌｕｃｉ−ＮＰ−Ｐを構築した。
（４）ｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−Ｍの構築
構築スキームを図３１に示す。ＳｅＶベクターゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋１８））をｔｅｍｐｌａｔｅとして、下記の２種のプライマー、並びにＮｏｔ  Ｉ−Ｍ−Ｆ及びＳａｃ  ＩＩ−Ｍ−Ｒを用いてＰＣＲを行い、両端にそれぞれＮｏｔＩ認識配列及びＳａｃＩＩ認識配列を有するＭ遺伝子を含むｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｏｔ  Ｉ−Ｍ−Ｓａｃ  ＩＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：配列番号２６）を得た。
Ｎｏｔ  Ｉ−Ｍ−Ｆ
５’−ａａｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃａｃｇｇｃｇｃａａｔｇｇｃａｇａｔａｔｃ−３’（３３ｍｅｒ，配列番号２５）
Ｓａｃ  ＩＩ−Ｍ−Ｒ：
５’−ｔｃｃａｔｃｃｇｃｇｇａｇｃｔｔａｔｔｔａａｇａｃａａｇｇａｇｔｇａｃ−３’（３５ｍｅｒ，配列番号１５）
このｆｒａｇｍｅｎｔをＮｏｔＩ及びＳａｃＩＩで消化し精製後、ｐＳｅＶ（＋１８）を同様にＮｏｔ  ＩとＳａｃ  ＩＩで消化し、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子及びＬ遺伝子の全遺伝子配列断片を取り除いたｃＤＮＡに挿入し、ｐＭｉｎｉＳｅＶ／Ｍを得た。ｐＭｉｎｉＳｅＶ／Ｍを再度ＮｏｔＩ消化し、ＥＩＳ配列を含むＬａｃＺ遺伝子のＮｏｔＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（配列番号１７）をｐＭｉｎｉＳｅＶ／Ｍに挿入したｐＭｉｎｉＳｅＶ／ＬａｃＺ−Ｍを構築した。
【実施例７】
【００１３】
分節ゲノム型ＳｅＶベクターの再構成と増幅
分節ゲノム型ＳｅＶベクターの再構成は、非分節Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶの再構成法であるＬｉらの方法（Ｌｉ，Ｈ，−Ｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４：６５６４−６５６９（２０００）；ＷＯ００／７００７０）及びその改良法（ＷＯ  ２００５／０７１０９２）に従って行った。また、本分節型ベクターはＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクターをベースにした分節型であるので、その増幅のためにはＦタンパク質を高発現するパッケージング細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ：Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４：６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）を利用した。２分節ゲノム型ベクターの増幅の過程におけるＧＦＰ蛍光写真を図３２に示すが、パッケージング細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）を用いた培養を行うことで、２分節ゲノム型ベクターの増幅が可能であった。また、３分節ゲノム型ベクターについてもパッケージング細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）を用いることで、ベクターを増幅することが可能であった（図３３）。
【実施例８】
【００１４】
分節ゲノム型ＳｅＶベクター由来搭載遺伝子発現確認
１．  ２分節ゲノム型ＳｅＶベクターによる発現確認
コンフルエントになったＬＬＣ−ＭＫ２（１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）細胞へ、ＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−ＬとＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌａｃ  Ｚ−ＮＰ−Ｐ−Ｍの２分節ＳｅＶベクター溶液（増幅後培養上清）或は１０倍希釈液を１ｍｌ／ｗｅｌｌで添加し、遺伝子導入した。２日後にＧＦＰ蛍光観察を行い、写真を撮影した（ＧＦＰ発現の確認）。また、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのβ−Ｇａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ１４６５−０１）を用いて染色し、明視野写真を撮影した（Ｌａｃ  Ｚ発現の確認）。図３４に示したように、ＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−ＬとＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌａｃ  Ｚ−ＮＰ−Ｐ−Ｍの２分節ＳｅＶベクターによって感染した細胞ではＧＦＰとＬａｃ  Ｚの両者の発現が確認された。
２．  ３分節ゲノム型ＳｅＶベクターによる発現確認
コンフルエントになったＬＬＣ−ＭＫ２（１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）細胞（２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）へ、ＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌ、ＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌａｃ  Ｚ−ＭとＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌｕｃｉ−ＮＰ−Ｐの３分節ＳｅＶベクター溶液（増幅後培養上清）を０．５ｍｌ／ｗｅｌｌで感染した。３日後ＧＦＰ蛍光観察を行い、写真を撮影した（ＧＦＰ発現の確認、図３５Ａ）。また、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のβ−Ｇａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ１４６５−０１）を用いて染色し、明視野写真を撮影した（Ｌａｃ  Ｚ発現の確認、図３５Ｂ）。また、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ抗体を一次抗体とし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ抗体を二次抗体として蛍光免疫染色を行い、染色した細胞の蛍光写真を撮影した（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現の確認、図３５Ｃ）。さらに、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２６１０）を用いて感染細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した（図３５Ｄ）。図３５に示したように、ＭｉｎｉＳｅＶ／ＧＦＰ−ＨＮ−Ｌ、ＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌａｃ  Ｚ−ＭとＭｉｎｉＳｅＶ／Ｌｕｃｉ−ＮＰ−Ｐの３分節ＳｅＶベクターによって感染した細胞ではＧＦＰ、Ｌａｃ  Ｚ及びＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの３種の発現が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明によれば、ウイルス本来の良好な増殖能を保持しつつ外来遺伝子を高発現させることができ、しかも、外来遺伝子の長さ及び種類による発現効率への影響が小さく、複数個の外来遺伝子を挿入することができる組換えモノネガウイルスベクター、その製造方法、及びその製造用キットを提供することができる。本発明のベクターの開発により、モノネガウイルスがゲノムの分節化という大胆な改変が可能なウイルスであることが証明されるとともに、モノネガウイルスのゲノム操作が大きく簡便化された。さらに、当該ウイルスベクターを用いた外来性タンパク質の製造方法、並びに、当該ウイルスベクターを用いて得られる動物組織、細胞又は体液、及び抗血清又は抗体を提供することができる。
本発明のウイルスベクターは、安定性に優れ、複数の外来遺伝子をそれぞれ高発現させることができる実用性の高いベクターとして、極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００１６】
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２６：合成ＤＮＡ
［配列表］
2007007921.tif 000002
2007007921.tif 000003
2007007921.tif 000004
2007007921.tif 000005
2007007921.tif 000006
2007007921.tif 000007
2007007921.tif 000008
2007007921.tif 000009
2007007921.tif 000010
2007007921.tif 000011
2007007921.tif 000012
2007007921.tif 000013
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【図１】
2007007921.tif 000040
【図２】
2007007921.tif 000041
【図３】
2007007921.tif 000042
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2007007921.tif 000049
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2007007921.tif 000052
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2007007921.tif 000057
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2007007921.tif 000061
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
2007007921.tif 000073
【図３５】
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【図３６】
2007007921.tif 000075
【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
2007007921.tif 000078
【図４０】
2007007921.tif 000079
【図４１】
2007007921.tif 000080
【図４２】
2007007921.tif 000081
【図４３】
2007007921.tif 000082
【国際調査報告】
2007007921.tif 000083
2007007921.tif 000084
2007007921.tif 000085
2007007921.tif 000086