(57)【要約】  被検者の抵抗感や苦痛を伴うことなく、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出することができる検出技術を提供する。本発明の検出方法は、ヒト生体試料からのＨＰＶの検出方法であって、前記ヒト生体試料としてヒト月経血試料を用い、前記ヒト月経血試料中のＨＰＶ遺伝子を検出することにより、ＨＰＶを検出することを特徴とする。前記ＨＰＶ遺伝子の検出は、ＰＣＲ法により実施することが好ましい。ＨＰＶ５２型遺伝子を検出する場合は、フォワードプライマーとして配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。
2007148762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト生体試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出方法であって、
前記ヒト生体試料としてヒト月経血試料を用い、
前記ヒト月経血試料中のＨＰＶ遺伝子を検出することにより、ＨＰＶを検出する検出方法。
【請求項２】
前記ＨＰＶ遺伝子の検出が、遺伝子増幅法により実施される、請求の範囲１記載の検出方法。
【請求項３】
前記遺伝子増幅法が、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法である、請求の範囲２記載の検出方法。
【請求項４】
検出対象の前記ＨＰＶが、ＨＰＶ５２型である、請求の範囲１記載の検出方法。
【請求項５】
検出対象の前記ＨＰＶが、ＨＰＶ５２型であり、
前記ＨＰＶ遺伝子の検出が、遺伝子増幅法により実施され、
前記遺伝子増幅法に使用されるプライマーセットが、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマーが、下記（Ａ１）または（Ａ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｂ１）または（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１記載の検出方法。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ａ２）配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
検出対象の前記ＨＰＶが、ＨＰＶ１６型である、請求の範囲１記載の検出方法。
【請求項７】
検出対象の前記ＨＰＶが、ＨＰＶ１６型であり、
前記ＨＰＶ遺伝子の検出が、遺伝子増幅法により実施され、
前記遺伝子増幅法に使用されるプライマーセットが、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマーが、下記（Ｃ１）または（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｄ１）または（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１記載の検出方法。
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｄ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｄ２）配列番号４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記遺伝子増幅法が、ＰＣＲ法である、請求の範囲５または７記載の検出方法。
【請求項９】
前記検出方法が、子宮頸癌の診断に使用される方法である、請求の範囲１記載の検出方法。
【請求項１０】
遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）５２型遺伝子の検出に用いるプライマーセットであって、
一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマーが、下記（Ａ１）または（Ａ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｂ１）または（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ａ２）配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記遺伝子増幅法が、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法である、請求の範囲１０記載のプライマーセット。
【請求項１２】
前記プライマーセットが、子宮頸癌の診断に用いるプライマーセットである、請求の範囲１０記載のプライマーセット。
【請求項１３】
遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型遺伝子の検出に用いるプライマーセットであって、
一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマーが、下記（Ｃ１）または（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｄ１）または（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｄ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｄ２）配列番号４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記遺伝子増幅法が、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法である、請求の範囲１３記載のプライマーセット。
【請求項１５】
前記プライマーセットが、子宮頸癌の診断に用いるプライマーセットである、請求の範囲１３記載のプライマーセット。
【請求項１６】
遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）５２型遺伝子の検出に用いる検出キットであって、請求の範囲１０記載のプライマーセットを含む検出キット。
【請求項１７】
前記遺伝子増幅法が、ＰＣＲ法である、請求の範囲１６記載の検出キット。
【請求項１８】
前記検出キットが、子宮頸癌の診断に用いるキットである、請求の範囲１６記載の検出キット。
【請求項１９】
遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型遺伝子の検出に用いる検出キットであって、請求の範囲１３記載のプライマーセットを含む検出キット。
【請求項２０】
前記遺伝子増幅法が、ＰＣＲ法である、請求の範囲１９記載の検出キット。
【請求項２１】
前記検出キットが、子宮頸癌の診断に用いるキットである、請求の範囲１９記載の検出キット。
【請求項２２】
ヒト生体試料を用いた子宮頸癌の診断方法であって、
ヒト生体試料が、ヒト月経血試料であり、
請求の範囲１記載のＨＰＶの検出方法によって、ヒト月経血試料中のＨＰＶを検出することにより、子宮頸癌を診断する診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出方法、ＨＰＶ５２型の検出のためのプライマーセットおよび検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、我が国で最も多い婦人科悪性腫瘍である。子宮頸癌の検診は、まず、内診し、子宮の形状や大小を調べ、それから、綿棒、ブラシ、小さな木のスティック等の器具を使って、子宮頚部等から細胞ないし組織を採取し、細胞診テストを行うという流れである。前記細胞診テストでは、Ｐａｐ染色法により実施されるのが一般的である。前記Ｐａｐ染色法は、子宮頚部等から採取した細胞をスライドグラスに塗布し、ヘマトキシンやエオジン等の染色液を用いて前記細胞を染色し、顕微鏡により、細胞の形態や核の形態を観察して、異常を判定する方法である。子宮頸部細胞の異常は、異形成と癌とに大別される。前記異形成は、軽度異形成、中等度異形成および高度異形成に分類され、癌は、その進行度に応じ、０期、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期およびＩＶ期の５つのステージに分類される。【０００３】
一方、子宮頸癌の発癌過程に、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ）が関与することが、これまでの研究で明らかになっている（非特許文献１）。ＨＰＶは、２本鎖ＤＮＡを有する腫瘍ウイルスであり、ヒトの皮膚や粘膜等の上皮に感染する。ＨＰＶのＤＮＡは、環状で、７．９ｂｐである。ＨＰＶのＤＮＡにおける遺伝子構成は、遺伝子発現調整領域であるＵＲＲ（ｕｐ−ｓｔｒｅａｍ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ）、ウイルスの複製に関与するｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎと呼ばれるＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７の６個の遺伝子、ウイルスキャプシドをコードするｌａｔｅ  ｒｅｇｉｏｎと呼ばれるＬ１、Ｌ２に分類される。これらの遺伝子の中で、Ｅ６およびＥ７の両遺伝子が、発癌に関与する主要な遺伝子であることが分かっている。ＨＰＶのサブタイプ（型）は、１００を超え、発見された順番に番号が付されて分類されている。ＨＰＶのサブタイプにおいて、癌との関連性が高いのは、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型であるといわれている。これらのサブタイプの中でも、５２型は、日本、韓国および中国等の東アジア地域のＨＰＶの主流のサブタイプであるため、その検出が重要であるといわれている。また、ＨＰＶ１６型は、１８型と共に、子宮頚癌の全症例の原因の約７０％を占めることが報告されている。【０００４】
ＨＰＶは、子宮頚部の扁平上皮に感染し、ＨＰＶ感染の約９０％は自然消失するが、残りの約１０％が持続感染となる。日本人は、平均して約７５％が持続感染になるといわれている。持続感染の場合、子宮頚部細胞が異形成をおこす可能性がある。異形成が起こってもウイルスが排除されれば、細胞は正常に戻るが、ウイルスが排除されずに、感染が継続すると、細胞の異形成の程度が進行することがある。軽度異形成の場合は、自然治癒することが多いが、中等度異形成ないし高度異形成に進むと、自然治癒が困難になる。そして、高度異形成を治療せずに長期間放置すると、病変が進行し、子宮頸癌になる可能性がある。したがって、子宮頸癌の検診において、ＨＰＶの検出は重要であり、特に、日本人では、ＨＰＶ５２型の検出が重要である。また、高い発症原因であることから、ＨＰＶ１６型の検出も重要である。【０００５】
ＨＰＶは、子宮頚部から採取した細胞の細胞診でも、その感染を確認することができる。また、採取した細胞から遺伝子を抽出し、ＰＣＲ法により遺伝子を選択的に増幅して、ＨＰＶを検出する方法も開発されている（特許文献１）。しかし、細胞診は、被検者にとって心理的に抵抗のある処置を必要とし、また、細胞採取の際に、軽度とはいえ生体組織を損傷する可能性もある。このため、子宮頸癌検診は、公費負担（自己負担無し）で受診できるにも関わらず、内診に対する抵抗感等から、利用率が最も低い検診である。
【特許文献１】特開２００４−１２１２４０号公報
【非特許文献２】「ウイルス」、第５２巻  第２号、ｐｐ．２８７−２９３，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、被検者が抵抗感や苦痛を伴うことなく、ＨＰＶを検出できる検出技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、前記目的を達成するために、一連の研究を重ねた。その過程で、ＨＰＶウイルスの所在を中心に検討したところ、子宮体部にＨＰＶが存在することを突き止めた。そして、さらに研究を続けたところ、子宮内膜から剥離した月経血中にＨＰＶが存在することを見出した。この知見は、前述の従来の常識を覆すものである。すなわち、前述のように、ＨＰＶは、子宮頚部の扁平上皮に感染することが常識であり、子宮体部にＨＰＶが存在すること、および、子宮内膜から剥離した月経血中にＨＰＶが存在することは、常識に反することであった（非特許文献１参照）。本発明者等による発見は、子宮頸癌等の子宮関連疾患において、学術的かつ臨床的に重大な発見である。そして、この知見に基づき、さらに研究を進めたところ、下記の特定のフォワードプライマーとリバースプライマーを用いれば、遺伝子増幅法により月経血中からＨＰＶ５２型遺伝子またはＨＰＶ１６型遺伝子を特異的に検出できることを見出し、本発明に到達した。【０００８】
すなわち、本発明の検出方法は、ヒト生体試料からのＨＰＶの検出方法であって、前記ヒト生体試料としてヒト月経血試料を用い、前記ヒト月経血試料中のＨＰＶ遺伝子を検出することにより、ＨＰＶを検出する方法である。【０００９】
本発明の第１のプライマーセットは、遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのＨＰＶ５２型遺伝子の検出に用いるプライマーセットであって、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが、下記（Ａ１）または（Ａ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｂ１）または（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドである。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ａ２）配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失または付加された塩基配列からなり、かつヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失または付加された塩基配列からなり、かつヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。【００１０】
本発明の第２のプライマーセットは、遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのＨＰＶ１６型遺伝子の検出に用いるプライマーセットであって、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが、下記（Ｃ１）または（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｄ１）または（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドである。
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｄ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｄ２）配列番号４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。【００１１】
本発明の第１の検出キットは、遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのＨＰＶ５２型遺伝子の検出に用いる検出キットであって、前記本発明の第１のプライマーセットを含む。また、本発明の第２の検出キットは、遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのＨＰＶ１６型遺伝子の検出に用いる検出キットであって、前記本発明の第２のプライマーセットを含む。【００１２】
本発明の診断方法は、ヒト生体試料を用いた子宮頸癌の診断方法であって、ヒト生体試料が、ヒト月経血試料であり、本発明のＨＰＶの検出方法によって、ヒト月経血試料中のＨＰＶを検出することにより、子宮頸癌を診断する方法である。
【発明の効果】
【００１３】
このように、本発明の検出方法によれば、月経血試料を用いて、ＨＰＶ遺伝子を検出できるため、従来の細胞診のように器具を用いて組織を採取する必要がなく、被検者に抵抗感や苦痛がほとんどない。また、前記本発明の第１のプライマーセットは、ＨＰＶ５２型遺伝子に対する特異性、前記本発明の第２のプライマーセットは、ＨＰＶ１６型遺伝子に対する特異性が、それぞれ高いため、これらを用いることによって、ＨＰＶ５２型遺伝子およびＨＰＶ１６型遺伝子をそれぞれ確実に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の一実施例における、月経血試料を用いたＰＣＲ反応により得られた増幅産物の電気泳動写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、「ＨＰＶ遺伝子の検出」とは、例えば、ＨＰＶ遺伝子の有無の検出、ＨＰＶ遺伝子の発現の有無の検出、ＨＰＶ遺伝子の発現量の検出等を含み、いずれの検出であってもよい。【００１６】
本発明の検出方法において、前記ＨＰＶ遺伝子の検出は、特に制限されないが、遺伝子増幅法により実施されることが好ましい。前記遺伝子増幅法は、特に制限されず、ポリメラーゼチェーンリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、中でもＰＣＲ法が好ましい。【００１７】
本発明の検出方法において、検出対象のＨＰＶの型（サブタイプ）は、特に制限されず、あらゆる型（サブタイプ）に適用可能である。本発明の検出方法において、検出対象となる好ましいＨＰＶの型（サブタイプ）は、例えば、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型または６８型である。【００１８】
前記本発明の第１のプライマーセットを使用する場合、ＨＰＶ５２型を高い特異性で検出できる。したがって、検出対象がＨＰＶ５２型の場合、本発明の検出方法において、前記ＨＰＶ遺伝子の検出は、遺伝子増幅法により実施され、前記遺伝子増幅法に使用されるプライマーセットが、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが、前記（Ａ１）または（Ａ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、前記（Ｂ１）または（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記遺伝子増幅法は、制限されないが、ＰＣＲ法が好ましい。【００１９】
前記本発明の第２のプライマーセットを使用する場合、ＨＰＶ１６型を高い特異性で検出できる。したがって、検出対象がＨＰＶ１６型の場合、本発明の検出方法において、前記ＨＰＶ遺伝子の検出は、遺伝子増幅法により実施され、前記遺伝子増幅法に使用されるプライマーセットが、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが、前記（Ｃ１）または（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、前記（Ｄ１）または（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記遺伝子増幅法は、制限されないが、ＰＣＲ法が好ましい。【００２０】
本発明の検出キットは、前述のように本発明のプライマーセットを含んでいればよく、その他の構成等は何ら制限されない。【００２１】
本発明の第１のプライマーセットおよび第１の検出キットによれば、前述の本発明の検出方法において、ＨＰＶ５２型の検出を、効率良く行うことができる。また、本発明の第２のプライマーセットおよび第２の検出キットによれば、前述の本発明の検出方法において、ＨＰＶ１６型の検出を、効率良く行うことができる。【００２２】
本発明のプライマーセットおよび検出キットにおいて、前記遺伝子増幅法は、ＰＣＲ法であることが好ましい。【００２３】
本発明の検出方法、プライマーセットおよび検出キットは、子宮頸癌の診断に用いることが好ましい。【００２４】
つぎに、本発明について、詳しく説明する。【００２５】
前述のように、本発明の検出方法は、全てのＨＰＶを対象とすることができる。このため、遺伝子増幅法によりＨＰＶ遺伝子の検出を行う場合は、ＨＰＶの型（サブタイプ）に応じたプライマーセットを選択すればよい。【００２６】
前述のように、検出対象がＨＰＶ５２型の場合、前記プライマーセットとしては、前記本発明の第１のプライマーセットを使用することが好ましい。本発明の第１のプライマーセットは、前述のように、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが、下記（Ａ１）または（Ａ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｂ１）または（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
ｇｔｇｔａｇｃｔａａｃｇｃａｃｇｇｃｃａ（配列番号１）
（Ａ２）配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を検出可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
ａｔａｃｃｔｃｔｃｔｔｃｇｔｔｇｔａｇｃ（配列番号２）
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失または付加された塩基配列からなり、かつヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を検出可能なオリゴヌクレオチド。【００２７】
前記（Ａ２）および（Ｂ２）において、置換、欠失または付加される塩基の数は、例えば、１〜５個の範囲であり、好ましくは１〜３個の範囲であり、より好ましくは１もしくは２個であり、特に好ましくは１個である。【００２８】
前述のように、検出対象がＨＰＶ１６型の場合、前記プライマーセットとしては、前記本発明の第２のプライマーセットを使用することが好ましい。本発明の第２のプライマーセットは、前述のように、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが、下記（Ｃ１）または（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｄ１）または（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
ａｃｃｇｔｔｇｔｇｔｇａｔｔｔｇｔｔａａｔｔａｇｇｔ（配列番号３）
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を検出可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｄ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
ｇｃｔｔｔｔｔｇｔｃｃａｇａｔｇｔｃｔｔｔｇｃ（配列番号４）
（Ｄ２）配列番号４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失または付加された塩基配列からなり、かつヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を検出可能なオリゴヌクレオチド。【００２９】
前記（Ｃ２）および（Ｄ２）において、置換、欠失または付加される塩基の数は、例えば、１〜５個の範囲であり、好ましくは１〜３個の範囲であり、より好ましくは１もしくは２個であり、特に好ましくは１個である。【００３０】
本発明において、プライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば、汎用のＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、商品名：Ｍｏｄｅｌ  ３９４）を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、本発明の技術分野において、よく知られる他の方法のいずれかを用いて合成してもよい。【００３１】
本発明の検出方法について、一例として、ＰＣＲによりヒト月経血試料中のＨＰＶ遺伝子を検出する方法を説明する。なお、本発明は、これには限定されない。【００３２】
まず、月経血試料を準備する。月経血試料は、例えば、採取直後のものを使用してもよいし、冷蔵保存や冷凍保存により保存したものを用いてもよい。また、各薬剤処理を施した月経血試料を用いてもよい。【００３３】
つぎに、前記月経血試料からＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出方法は、何ら制限されず、例えば、フェノール・クロロホルムによる抽出法等、従来公知の方法が採用できる。また、市販のＤＮＡ抽出試薬等を用いて実施してもよい。【００３４】
そして、抽出したＤＮＡを鋳型として、検出対象のＨＰＶ遺伝子を増幅するためのプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い、前記ＨＰＶ遺伝子を増幅させる。【００３５】
前記プライマーセットは、例えば、ＨＰＶ遺伝子のコーディング領域中の配列が増幅されるよう選択することが好ましい。このようなプライマーセットは、本発明において、月経血試料におけるＨＰＶ遺伝子の発現を検出するために用いることができる。具体的には、例えば、検出対象のＨＰＶ遺伝子の型（サブタイプ）に応じて、前記型に特有のコーディング領域中の配列が増幅されるように、プライマーセットを選択することが好ましい。なお、本発明の第１のプライマーセットは、ＨＰＶ５２型遺伝子のコーディング領域中の配列が増幅可能なように設計されており、本発明の第２のプライマーセットは、ＨＰＶ１６型遺伝子のコーディング領域中の配列が増幅可能なように設計されている。【００３６】
ＰＣＲに使用するポリメラーゼは、特に制限されず、従来公知のポリメラーゼが使用でき、例えば、例えば、Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ社製）等があげられる。ＰＣＲの反応条件は、特に制限されず、当業者であれば、例えば、プライマーのＴｍ等に基づいて適宜設定できる。具体例としては、例えば、９４℃で５分間、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間を１サイクルとして合計２５サイクル、次に７２℃で５分間の処理を行う。【００３７】
また、本発明の検出方法について、一例として、ＰＣＲによりヒト月経血試料中のＨＰＶ遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡの発現）を検出する方法を説明する。なお、本発明は、これには限定されない。【００３８】
まず、前述と同様にして準備した月経血試料からＲＮＡを抽出する。ＲＮＡの抽出方法は、何ら制限されず、例えば、グアニジンイソチオシアネートおよびフェノール・クロロホルム抽出等、従来公知の方法が採用できる。また、市販のＲＮＡ抽出試薬を用いてもよい。【００３９】
つぎに、抽出したＲＮＡを鋳型として、後述するＰＣＲ反応の鋳型となるｃＤＮＡを調製する。ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する方法は、特に制限されず、逆転写ＰＣＲ法等の従来公知の方法を適用できる。例えば、プライマーとして市販のランダムプライマーを用い、ｄＮＴＰｓの存在下、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成することができる。逆転写酵素としては、例えば、商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が使用できる。【００４０】
そして、得られたｃＤＮＡを鋳型として、検出対象のＨＰＶ遺伝子を増幅するためのプライマーセットを用いて、前述と同様にＰＣＲ反応を行う。これによって、ヒト月経血中で発現されているＨＰＶ遺伝子を増幅させる。【００４１】
以上のような方法において、ＨＰＶ遺伝子の増幅が確認された場合は、被検者がＨＰＶの感染者であることを意味する。また、前記プライマーとて、ＨＰＶの各型（サブタイプ)の遺伝子を特異的に増幅するプライマーを使用した場合、ＨＰＶの型（サブタイプ）を判別することも可能である。前記遺伝子の増幅の有無の検出は、特に制限されず、例えば、増幅産物を電気泳動で確認してもよいし、増幅産物を検出し得る試薬により確認してもよい。【００４２】
また、本発明のＨＰＶの検出方法により、ＨＰＶ感染であると判断された場合、例えば、ＨＰＶ感染の被検者は、ＨＰＶ未感染の被検者と比較して、子宮頸癌を発症する危険性が高いと判断することができる。このため、本発明のＨＰＶ検出方法によれば、例えば、子宮頸癌をはじめとする子宮関連疾患の診断、予防、治療等において、非常に有用な判断指標を得ることができる。
【実施例１】
【００４３】
ＨＰＶ５２型遺伝子の検出
複数人の被検者から月経血試料を採取し、これらの各月経血試料から、酸フェノール法により全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（１μｇ）から、ランダムプライマー（商品名ランダムプライマー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型として、前記フォワードプライマー（配列番号１）および前記リバースプライマー（配列番号２）を用い、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間を１サイクルとして合計２５サイクルの処理を行い、続いて、７２℃で５分間の処理を行った。ＰＣＲ反応液の組成を以下に示す。各月経血試料由来のＰＣＲ反応物を電気泳動に供し、目的の大きさ（約１５０ｂｐ）の増幅産物の有無を確認した。その結果、１０人の被検者の各月経血試料から、目的の増幅産物を得ることができた。ＨＰＶ５２型の核酸配列(ゲノムＤＮＡ)は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．Ｘ７４４８１．１に登録されている。前記プライマーセットによって増幅されるのは、登録された核酸配列において、８１番目−２２８番目の領域である。【００４４】
2007148762.tif 000003
【００４５】
電気泳動の結果の一部を図１に示す。同図は、採取した複数の月経血試料のうち無作為に選択した９つの試料由来のＰＣＲ反応物の電気泳動写真である。同図において、Ｌａｎｅ６は、マーカーφＸ１７４／ＨａｅIIIである。Ｌａｎｅ１〜３、Ｌａｎｅ５およびＬａｎｅ７〜１１は、それぞれ、各月経血試料由来のＰＣＲ反応物（計９サンプル）である。Ｌａｎｅ４は、ＨＰＶ５２型の遺伝子をサブクローニングした組換えプラスミドをサンプルとして、ＰＣＲ反応を行ったポジティブコントロールである。このプラスミドは、プラスミドベクターｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、以下同様）のＡ末端ＰＣＲ反応物挿入部位に、１４８塩基対（８１番目−２２８番目）のＨＰＶ５２型遺伝子の部分配列が挿入されている。同図に示すように、Ｌａｎｅ１、３、７は、ポジティブコントロールであるＬａｎｅ４と同じ位置（約１５０ｂｐ）にバンドが確認された。この結果から、前述のプライマーセットにより、特異的にＨＰＶ５２型遺伝子の部分配列が増幅されていることが示された。なお、Ｌａｎｅ２、５、８〜１１およびＬａｎｅ３の下のバンドは、プライマーダイマーである。【００４６】
さらに、目的のバンドが検出されたＰＣＲ反応物について、実際に、目的断片（ＨＰＶ５２型遺伝子の部分配列）のみが増幅されているか否かを確認した。この確認は、ＰＣＲ増幅産物をＴＡクローニングによりｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターに入れ、ベクター内の配列をプライマーとした塩基配列解析により行った。この結果、目的のバンドが確認されたＰＣＲ反応物には、目的断片のみが含まれていることが確認できた。つまり、前述のプライマーセットにより、他の配列は増幅されておらず、ＨＰＶ５２型遺伝子の目的配列のみが増幅されていることが証明できた。【００４７】
続いて、同じ複数の被検者について、従来法によりＨＰＶ５２型の感染の有無を調べ、月経血試料を用いた本発明の実施例による結果の信頼性を確認した。すなわち、前述の複数人の被検者について、子宮頚部から扁平上皮細胞を擦り取って、これらを試料とした。これらの細胞試料について、液相（核酸）ハイブリダイゼーションにより、ＨＰＶの検査をおこなった（ＳＲＬ社）。その結果、月経血試料を用いたＰＣＲによってＨＰＶ５２型が陽性と判断された被検者は、同様に陽性を示した。一方、月経血試料を用いたＰＣＲによってＨＰＶ５２型が陰性と判断された被検者は、従来方法により同様に陰性を示した。これらの結果から、本発明の月経血試料を用いた方法によれば、扁平上皮細胞の採取を行うことなく、且つ、扁平上皮細胞を用いた従来法と同様の信頼性で、ＨＰＶ遺伝子の検出ならびにＨＰＶ感染の有無が判別可能であるといえる。
【実施例２】
【００４８】
ＨＰＶ１６型遺伝子の検出
前記実施例１で調製したｃＤＮＡを鋳型として、前記フォワードプライマー（配列番号３）および前記リバースプライマー（配列番号４）を用い、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲの条件は、前述と同様である。各月経血試料由来のＰＣＲ反応物を電気泳動に供し、目的の大きさ（約８６ｂｐ）の増幅産物の有無を確認した。その結果、数人の被検者の各月経血試料から、目的増幅産物を得ることができた。ＨＰＶ１６型の核酸配列(ゲノムＤＮＡ)は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＦ５３４０６１．１に登録されている。前記プライマーセットによって増幅されるのは、登録された核酸配列において、３８５番目−４７０番目の領域である。【００４９】
続いて、同じ複数の被検者について、従来法によりＨＰＶ１６型の感染の有無を調べ、月経血試料を用いた本発明の実施例による結果の信頼性を確認した。すなわち、前述の複数人の被検者について、子宮頚部から扁平上皮細胞を擦り取って、これらを試料とした。これらの細胞試料を用いて、前述と同様にして、全ＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製、ならびに、ＰＣＲによるＨＰＶの検査を行った。その結果、月経血試料を用いたＰＣＲによってＨＰＶ１６型が陽性と判断された被検者は、同様に陽性を示した。一方、月経血試料を用いたＰＣＲによってＨＰＶ１６型が陰性と判断された被検者は、従来法により同様に陰性を示した。これらの結果から、本発明の月経血試料を用いた方法によれば、扁平上皮細胞の採取を行うことなく、且つ、扁平上皮細胞を用いた従来法と同様の信頼性で、ＨＰＶ遺伝子の検出ならびにＨＰＶ感染の有無が判別可能であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上のように、本発明の検出方法では、ヒト月経血試料を用いるため、被検者の抵抗感および苦痛がほとんど無く、ＨＰＶ感染の有無が判別できる。したがって、本発明は、例えば、子宮頸癌等の子宮関連疾患の診断、治療、予防や学術研究等に広く適用できる。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月22日(2008.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト生体試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出方法であって、
前記ヒト生体試料としてヒト月経血試料を用い、
前記ヒト月経血試料中のＨＰＶ遺伝子を検出することにより、ＨＰＶを検出する検出方法。
【請求項２】
前記ＨＰＶ遺伝子の検出が、遺伝子増幅法により実施される、請求の範囲１記載の検出方法。
【請求項３】
前記遺伝子増幅法が、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法である、請求の範囲２記載の検出方法。
【請求項４】
検出対象の前記ＨＰＶが、ＨＰＶ５２型である、請求の範囲１記載の検出方法。
【請求項５】
検出対象の前記ＨＰＶが、ＨＰＶ５２型であり、
前記ＨＰＶ遺伝子の検出が、遺伝子増幅法により実施され、
前記遺伝子増幅法に使用されるプライマーセットが、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマーが、下記（Ａ１）または（Ａ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｂ１）または（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１記載の検出方法。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ａ２）配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
検出対象の前記ＨＰＶが、ＨＰＶ１６型である、請求の範囲１記載の検出方法。
【請求項７】
検出対象の前記ＨＰＶが、ＨＰＶ１６型であり、
前記ＨＰＶ遺伝子の検出が、遺伝子増幅法により実施され、
前記遺伝子増幅法に使用されるプライマーセットが、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマーが、下記（Ｃ１）または（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｄ１）または（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１記載の検出方法。
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｄ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｄ２）配列番号４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記遺伝子増幅法が、ＰＣＲ法である、請求の範囲５または７記載の検出方法。
【請求項９】
前記検出方法が、子宮頸癌の診断に使用される方法である、請求の範囲１記載の検出方法。
【請求項１０】
請求の範囲２記載の遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）５２型遺伝子の検出方法に用いるプライマーセットであって、
一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマーが、下記（Ａ１）または（Ａ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｂ１）または（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ａ２）配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ５２型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記遺伝子増幅法が、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法である、請求の範囲１０記載のプライマーセット。
【請求項１２】
前記プライマーセットが、子宮頸癌の診断に用いるプライマーセットである、請求の範囲１０記載のプライマーセット。
【請求項１３】
請求の範囲２記載の遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型遺伝子の検出方法に用いるプライマーセットであって、
一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記フォワードプライマーが、下記（Ｃ１）または（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、下記（Ｄ１）または（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
（Ｄ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（Ｄ２）配列番号４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト月経血試料からＨＰＶ１６型遺伝子を増幅可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記遺伝子増幅法が、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法である、請求の範囲１３記載のプライマーセット。
【請求項１５】
前記プライマーセットが、子宮頸癌の診断に用いるプライマーセットである、請求の範囲１３記載のプライマーセット。
【請求項１６】
請求の範囲２記載の遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）５２型遺伝子の検出方法に用いる検出キットであって、請求の範囲１０記載のプライマーセットを含む検出キット。
【請求項１７】
前記遺伝子増幅法が、ＰＣＲ法である、請求の範囲１６記載の検出キット。
【請求項１８】
前記検出キットが、子宮頸癌の診断に用いるキットである、請求の範囲１６記載の検出キット。
【請求項１９】
請求の範囲２記載の遺伝子増幅法によるヒト月経血試料からのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型遺伝子の検出方法に用いる検出キットであって、請求の範囲１３記載のプライマーセットを含む検出キット。
【請求項２０】
前記遺伝子増幅法が、ＰＣＲ法である、請求の範囲１９記載の検出キット。
【請求項２１】
前記検出キットが、子宮頸癌の診断に用いるキットである、請求の範囲１９記載の検出キット。
【請求項２２】
ヒト生体試料を用いた子宮頸癌の診断方法であって、
ヒト生体試料が、ヒト月経血試料であり、
請求の範囲１記載のＨＰＶの検出方法によって、ヒト月経血試料中のＨＰＶを検出することにより、子宮頸癌を診断する診断方法。
【国際調査報告】
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