【手続補正書】
【提出日】平成30年12月13日(2018.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞中に導入されると、操作されていないウイルス核酸の宿主細胞への導入によって産生されるウイルス粒子と比較して２つ以上の改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができる、操作されたウイルスゲノムを含み、該２つ以上の改善されたウイルス特性が、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、操作されたｐｈｉＫＭＶ（ΦＫＭＶ）バクテリオファージ。
【請求項２】
前記改善されたウイルス特性のうちの少なくとも１つが宿主域である、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
前記バクテリオファージウイルスゲノムが、以下の１つまたは複数を含む、請求項１に記載のバクテリオファージ：
ｉ）目的の遺伝子を含む発現カセットの挿入；
ｉｉ）ｇｐ１３  Ｃ１７Ｙ、ｇｐ１８  Ｄ３６Ｙ、ｇｐ３８  Ｄ８２ＧおよびＩ８３Ｓ、ならびにｇｐ４０  Ｎ２５３Ｄからなる群より選択され、ＬＵＺ１９と比較して改善された宿主域を示す、１つもしくは複数の変異；
ｉｉｉ）ウイルスＬＫＤ１６由来のｇｐ１８で置換された野生型ＬＵＺ１９  ｇｐ１８；ならびに／または
ｉｖ）ｇｐ３４の位置５５のリジンの欠失（ｇｐ３４Ｌ５５Δ変異）、ここで該ファージは、野生型ファージと比較して増大した溶菌活性を示す。
【請求項４】
前記バクテリオファージウイルスゲノムが、Ｐｐ１５ｇｐ４４（シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ）φ１５に由来する尾部スパイクｇｐ４４）、ＮＴＵｇｐ３４（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ファージＮＴＵＨ−Ｋ２０４４−Ｋ１−１（ＮＴＵ）に由来する尾部スパイクｇｐ３４）、ＬＫＡｌｇｐ４９（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ファージＬＫＡ１に由来する尾部スパイクｇｐ４９）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に由来するフェノール可溶性モルホリン界面活性剤（ＰＳＭα）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来するフェノール可溶性モルホリン界面活性剤（ＰＳＭα３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに由来するフェノール可溶性モルホリン界面活性剤（ＰＳＭβ２）、抗菌性ペプチド、ＤＮａｓｅからなる群より選択される目的の遺伝子を含む発現カセットの挿入を含む、請求項３に記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
前記バクテリオファージウイルスゲノムが、ＤＮａｓｅを発現する目的の遺伝子を含む発現カセットの挿入を含む、請求項４に記載のバクテリオファージ。
【請求項６】
前記バクテリオファージウイルスゲノムが、ＰＳＭαを発現する目的の遺伝子を含む発現カセットの挿入を含む、請求項４〜５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７】
前記バクテリオファージウイルスゲノムが、ＰＳＭβ２を発現する目的の遺伝子を含む発現カセットの挿入を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項８】
前記改変の少なくとも１つが、配列番号３４（野生型ＬＵＺＩ９  Ｇｐ１３タンパク質配列）、配列番号３５（野生型ＬＵＺＩ９  Ｇｐ３８タンパク質配列）、配列番号３６（野生型ＬＵＺＩ９  Ｇｐ４０タンパク質配列）、配列番号２５（野生型ＬＵＺＩ９  ｇｐ４９及びｇｐ４８−ｇｐ４９遺伝子間領域）、配列番号４８（ＬＵＺ１９  Ｇｐ１８タンパク質配列）または配列番号４９（ＬＵＺ１９  Ｇｐ４９タンパク質配列）に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中にある、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項９】
前記操作されたウイルスゲノムが、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも８５％の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項１０】
異種ｇｐ１８遺伝子の全てまたは一部を更に含む、請求項９に記載のバクテリオファージ。
【請求項１１】
前記異種ｇｐ１８遺伝子が、配列番号３８（ＬＫＤ１６  Ｇｐ１８タンパク質配列）に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項１０に記載のバクテリオファージ。
【請求項１２】
操作されたｇｐ３４遺伝子の全てまたは一部を更に含む、請求項９に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３】
前記操作されたｇｐ３４遺伝子が、配列番号５のアミノ酸位置５５に対応する位置に変異を含むアミノ酸をコードする、請求項１２に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４】
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号４８からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸配列中における改変を更に含む、請求項９に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５】
前記操作されたウイルスゲノムが、配列番号３４（Ｐｈｉｋｍｖ様ウイルス属（Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ）ＬＵＺ１９）に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３５（野生型ＬＵＺＩ９  Ｇｐ３８タンパク質配列）に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３６（Ｐｈｉｋｍｖｌｉｋｅｖｉｒｕｓ  ＬＵＺ１９）に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列及び配列番号４８（ＬＵＺ１９  Ｇｐ１８タンパク質配列）に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列のそれぞれをコードする核酸配列中における改変を含む、請求項１４に記載のバクテリオファージ。
【請求項１６】
前記改変が、配列番号３４のアミノ酸位置１７に対応する位置でのＣからＹへの置換、配列番号４８のアミノ酸位置３６に対応する位置でのＤからＹへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８２に対応する位置でのＤからＧへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８３に対応する位置でのＩからＳへの置換及び配列番号３６のアミノ酸位置２５３に対応する位置でのＮからＤへの置換を含む、請求項１５に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７】
配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中における改変を更に含む、請求項９に記載のバクテリオファージ。
【請求項１８】
前記改変が、配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号４９（ＬＵＺ１９  Ｇｐ４９タンパク質配列）に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に含まれる核酸配列の異種核酸分子による置換である、請求項１７に記載のバクテリオファージ。
【請求項１９】
前記異種核酸分子が、配列番号３７（ＰｙｏＳＳタンパク質配列）、配列番号３９（ＬＫＡＩ  Ｇｐ４９タンパク質配列）、配列番号４０（ＮＴＵＨ−Ｋ２０４４−Ｋｌ−ｌ  Ｇｐ３４タンパク質配列）、配列番号４１（Ｐｐ１５  Ｇｐ４４タンパク質配列）、配列番号４３（ＳａＰＳＭａ３タンパク質配列）、配列番号４４（ＳａＰＡＭｂ２タンパク質配列）、配列番号４５（ＳｅＰＳＭａタンパク質配列）、配列番号４６（ＭＳ２  Ｌタンパク質配列）及び配列番号４７（ＰＲＲＩ  Ｌタンパク質配列）からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸配列を含む、請求項１８に記載のバクテリオファージ。
【請求項２０】
前記操作されたウイルス核酸が、配列番号２１（ＬＵＺ１９  ｇｐ３２プロモーター（Ｐ３２））に含まれる核酸配列またはその一部を含むプロモーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項２１】
前記操作されたウイルス核酸が、配列番号２２（ｌＵＺ１９  ｇｐ３２ターミネーター（Ｔ３２））に含まれる核酸配列またはその一部を含むターミネーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項２２】
前記ｐｈｉＫＭＶ（ΦＫＭＶ）バクテリオファージがＬＵＺ１９を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項２３】
（ａ）第１のウイルスゲノムを準備することと、
（ｂ）前記第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子と結合して、前記第１のウイルスゲノムと比較して少なくとも１つの改変を含む第２のウイルスゲノムを作製することによって、操作されたウイルスゲノムを作製することとを含み、
前記第２のウイルスゲノムは、宿主細胞中に導入されると、２つ以上の改善されたウイルス特性を有するウイルス粒子を産生することができる、
所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的のバクテリオファージを作製するための方法。
【請求項２４】
（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を１回以上の反復で繰り返すこと
を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
改善されたウイルス特性のそれぞれが、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｂ）の操作されたウイルスゲノムを作製することが、
（１）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを使用した前記第１のウイルスゲノムの領域のインビトロ消化と、
（２）前記消化された第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子とアセンブルすることと
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のウイルスゲノムがウイルス粒子から単離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のウイルスゲノムまたは前記少なくとも１つの修復核酸分子が、デノボ合成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記デノボ合成が、化学的に合成された核酸分子、ＰＣＲ増幅された核酸配列、単離された核酸分子の消化断片またはこれらの任意の組み合わせを結合することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のウイルスゲノムまたは前記少なくとも１つの修復核酸分子が、インビトロ消化の前に増幅される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記アセンブリが、
（ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、
（ｂ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または前記ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、
（ｃ）単離されたリガーゼと、
（ｄ）ｄＮＴＰの混合物と
を含む混合物を使用して、
前記操作されたウイルスゲノムを含む組換え核酸を形成するための、前記消化されたウイルス核酸への前記断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素であり、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、（１）キメラｇＲＮＡ、または（２）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記エンドヌクレアーゼが、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記操作されたウイルスゲノムにより宿主細胞を形質転換することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記操作されたウイルスゲノムをウイルス粒子内にパッケージングするためのインビトロパッケージングキットを使用することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法によって作製された、バクテリオファージ。
【請求項３７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のバクテリオファージである、請求項３６に記載のバクテリオファージ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
いくつかの態様において、本開示は、核酸を操作する方法を提供し、当該核酸は、宿主細胞から単離されたプラスミドである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも５ｋｂである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも６ｋｂである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも１０ｋｂである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも１５ｋｂである。いくつかの態様において、プラスミドは、少なくとも２０ｋｂである。
[本発明１００１]
宿主細胞中に導入されると、操作されていないウイルス核酸の宿主細胞への導入によって産生されるウイルス粒子と比較して２つ以上の改善されたウイルス特性を有する非天然ウイルス粒子を産生することができる、操作されたウイルス核酸を含む、操作されたウイルス。
[本発明１００２]
産生された前記ウイルス粒子が、少なくとも３つの改善されたウイルス特性を有する、本発明１００１の操作されたウイルス。
[本発明１００３]
改善されたウイルス特性のそれぞれが、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、本発明１００１の操作されたウイルス。
[本発明１００４]
前記操作されたウイルス核酸が、操作されたウイルスゲノムである、本発明１００１の操作されたウイルス。
[本発明１００５]
前記操作されたウイルスゲノムが、操作されたバクテリオファージゲノムである、本発明１００４の操作されたウイルス。
[本発明１００６]
前記改善されたウイルス特性のうちの少なくとも１つが宿主域である、本発明１００５の操作されたウイルス。
[本発明１００７]
改善されたウイルス特性のそれぞれが、前記操作されたウイルス核酸中における少なくとも１つの改変の結果である、本発明１００１の操作されたウイルス。
[本発明１００８]
少なくとも１つの改善されたウイルス特性が、前記操作されたウイルス核酸中における少なくとも２つの改変の結果である、本発明１００７の操作されたウイルス。
[本発明１００９]
前記操作されたウイルス核酸中における前記少なくとも１つの改変が、１回の工学的ステップの結果である、本発明１００７の操作されたウイルス。
[本発明１０１０]
前記操作されたウイルス核酸中における前記少なくとも１つの改変が、反復的な工学的ステップの結果である、本発明１００７の操作されたウイルス。
[本発明１０１１]
前記改変の少なくとも１つが、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５、配列番号４８または配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中にある、本発明１００７の操作されたウイルス。
[本発明１０１２]
前記操作されたウイルスゲノムが、ＬＵＺ１９ゲノムに対して少なくとも８５％の同一性を有するウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、本発明１００４の操作されたウイルス。
[本発明１０１３]
異種ｇｐ１８遺伝子の全てまたは一部を更に含む、本発明１０１２の操作されたウイルス。
[本発明１０１４]
前記異種ｇｐ１８遺伝子が、配列番号３８に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明１０１３の操作されたウイルス。
[本発明１０１５]
操作されたｇｐ３４遺伝子の全てまたは一部を更に含む、本発明１０１２の操作されたウイルス。
[本発明１０１６]
前記操作されたｇｐ３４遺伝子が、配列番号５のアミノ酸位置５５に対応する位置に変異を含むアミノ酸をコードする、本発明１０１５の操作されたウイルス。
[本発明１０１７]
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号４８からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸配列中における改変を更に含む、本発明１０１２の操作されたウイルス。
[本発明１０１８]
前記操作されたウイルスゲノムが、配列番号３４に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３５に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３６に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列及び配列番号４８に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列のそれぞれをコードする核酸配列中における改変を含む、本発明１０１７の操作されたウイルス。
[本発明１０１９]
前記改変が、配列番号３４のアミノ酸位置１７に対応する位置でのＣからＹへの置換、配列番号４８のアミノ酸位置３６に対応する位置でのＤからＹへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８２に対応する位置でのＤからＧへの置換、配列番号３５のアミノ酸位置８３に対応する位置でのＩからＳへの置換及び配列番号３６のアミノ酸位置２５３に対応する位置でのＮからＤへの置換を含む、本発明１０１８の操作されたウイルス。
[本発明１０２０]
配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中における改変を更に含む、本発明１０１２の操作されたウイルス。
[本発明１０２１]
前記改変が、配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列への異種核酸分子の挿入、または配列番号４９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に含まれる核酸配列の異種核酸分子による置換である、本発明１０２０の操作されたウイルス。
[本発明１０２２]
前記異種核酸分子が、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸配列を含む、本発明１０２１の操作されたウイルス。
[本発明１０２３]
前記操作されたウイルス核酸が、配列番号２１に含まれる核酸配列またはその一部を含むプロモーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む、本発明１００１の操作されたウイルス。
[本発明１０２４]
前記操作されたウイルス核酸が、配列番号２２に含まれる核酸配列またはその一部を含むターミネーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含む、本発明１００１の操作されたウイルス。
[本発明１０２５]
（ａ）第１のウイルスゲノムを準備することと、
（ｂ）前記第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子と結合して、前記第１のウイルスゲノムと比較して少なくとも１つの改変を含む第２のウイルスゲノムを作製することによって、操作されたウイルスゲノムを作製することとを含み、
前記第２のウイルスゲノムは、宿主細胞中に導入されると、２つ以上の改善されたウイルス特性を有するウイルス粒子を産生することができる、
所望のウイルス特性を２つ以上有する、目的の操作されたウイルスを作製するための方法。
[本発明１０２６]
（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を１回以上の反復で繰り返すこと
を更に含む、本発明１０２５の方法。
[本発明１０２７]
改善されたウイルス特性のそれぞれが、宿主域、ウイルス溶菌サイクル、吸着、付着、注入、複製及びアセンブリ、溶菌、放出数、免疫回避、免疫刺激、免疫不活性化、バイオフィルムの分散、細菌のファージ耐性、細菌の抗生物質感受性化、ビルレンス因子の調節、ならびに標的化された宿主ゲノム消化または編集からなる群から選択される、本発明１０２５の方法。
[本発明１０２８]
ステップ（ｂ）の操作されたウイルスゲノムを作製することが、
（１）エンドヌクレアーゼを使用した前記第１のウイルスゲノムの領域のインビトロ消化と、
（２）前記消化された第１のウイルスゲノムの少なくとも１つの断片を少なくとも１つの修復核酸分子とアセンブルすることと
を含む、本発明１０２５の方法。
[本発明１０２９]
前記第１のウイルスゲノムがウイルス粒子から単離される、本発明１０２８の方法。
[本発明１０３０]
前記第１のウイルスゲノムまたは前記少なくとも１つの修復核酸分子が、デノボ合成される、本発明１０２８の方法。
[本発明１０３１]
前記デノボ合成が、化学的に合成された核酸分子、ＰＣＲ増幅された核酸配列、単離された核酸分子の消化断片またはこれらの任意の組み合わせを結合することを含む、本発明１０３０の方法。
[本発明１０３２]
前記第１のウイルスゲノムまたは前記少なくとも１つの修復核酸分子が、インビトロ消化の前に増幅される、本発明１０３０の方法。
[本発明１０３３]
前記第１のウイルスゲノムが、少なくとも３ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも２５ｋｂまたは少なくとも３０ｋｂである、本発明１０２６の方法。
[本発明１０３４]
前記アセンブリがインビトロまたはインビボで実施される、本発明１０２８の方法。
[本発明１０３５]
前記アセンブリが、
（ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、
（ｂ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または前記ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、
（ｃ）単離されたリガーゼと、
（ｄ）ｄＮＴＰの混合物と
を含む混合物を使用して、
前記操作されたウイルスゲノムを含む組換え核酸を形成するための、前記消化されたウイルス核酸への前記断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される、本発明１０３４の方法。
[本発明１０３６]
前記エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、本発明１０２８の方法。
[本発明１０３７]
少なくとも１つのガイドＲＮＡを更に含む、本発明１０３６の方法。
[本発明１０３８]
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素であり、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、（１）キメラｇＲＮＡ、または（２）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、本発明１０３７の方法。
[本発明１０３９]
前記エンドヌクレアーゼが、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される、本発明１０２８の方法。
[本発明１０４０]
前記インビトロ消化がスペルミジンを更に含む、本発明１０２８の方法。
[本発明１０４１]
前記操作されたウイルスゲノムにより宿主細胞を形質転換することを更に含む、本発明１０２８の方法。
[本発明１０４２]
前記操作されたウイルスゲノムをウイルス粒子内にパッケージングするためのインビトロパッケージングキットを使用することを更に含む、本発明１０２８の方法。
[本発明１０４３]
本発明１０２６〜１０４６のいずれかの方法によって作製された、操作されたウイルス。
[本発明１０４４]
本発明１００１〜１０２５のいずれかの操作されたウイルスである、本発明１０４７の操作されたウイルス。
[本発明１０４５]
（ａ）精製された組換えＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、
（ｃ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または前記ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、
（ｄ）単離されたリガーゼと
を含む、ウイルス核酸分子を操作するためのキット。
[本発明１０４６]
（１）クラウディング剤、
（２）ｄＮＴＰの混合物、及び
（３）好適な緩衝液
のうちの１つ以上を更に含む、本発明１０４５のキット。
[本発明１０４７]
個別化されたガイドＲＮＡを更に含む、本発明１０４５のキット。
[本発明１０４８]
アセンブリ反応において挿入されるＤＮＡ断片として機能するための、個別化された合成核酸分子を更に含む、本発明１０４５のキット。
[本発明１０４９]
形質転換のためのコンピテント宿主細胞を更に含む、本発明１０４５のキット。
[本発明１０５０]
単離されたウイルスゲノム核酸を更に含む、本発明１０４５のキット。
[本発明１０５１]
（ａ）核酸を準備することと、
（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用した前記核酸の領域のインビトロ消化と、
（ｃ）前記消化された核酸へのＤＮＡ断片の挿入による組換え核酸のアセンブリと
を含み、前記アセンブリは、
（ｉ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された５’→３’エキソヌクレアーゼと、
（ｉｉ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、または前記ＤＮＡポリメラーゼ及び３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼの混合物と、
（ｉｉｉ）単離されたリガーゼと、
（ｉｖ）ｄＮＴＰの混合物と
を含む成分の混合物を含む単一容器中で、組換え核酸を形成するための、前記消化された核酸への前記断片の挿入に効果的である条件下で、インビトロで実施される、核酸配列を操作する方法。
[本発明１０５２]
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９由来酵素である、本発明１０５１の方法。
[本発明１０５３]
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、アセンブリの前に、熱不活性化されるか、または除去される、本発明１０５１の方法。
[本発明１０５４]
（ｄ）前記組換え核酸による宿主細胞の形質転換を更に含む、本発明１０５１の方法。
[本発明１０５５]
前記核酸が、宿主細胞から単離されたプラスミドである、本発明１０５１の方法。
[本発明１０５６]
前記プラスミドが少なくとも６ｋｂである、本発明１０５５の方法。
[本発明１０５７]
前記プラスミドが少なくとも１０ｋｂである、本発明１０５５の方法。
[本発明１０５８]
前記プラスミドが少なくとも１５ｋｂである、本発明１０５５の方法。
[本発明１０５９]
前記プラスミドが少なくとも２０ｋｂである、本発明１０５５の方法。