(57)【要約】  血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することで、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測を可能とする。  血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測のためのキット、肝癌幹細胞の検出方法、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞を見分ける方法、肝癌幹細胞及びその調製方法も提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。
【請求項２】
特定の遺伝子が、表Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのいずれかに列挙されている遺伝子の少なくとも１つである請求項１記載の方法。
【請求項３】
表Ａ及び／又はＣに列挙されている遺伝子の少なくとも１つの発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する請求項２記載の方法。
【請求項４】
表Ｂ及び／又はＤに列挙されている遺伝子の少なくとも１つの発現が低下している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する請求項２記載の方法。
【請求項５】
特定の遺伝子が、CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR及びPF6からなる群並びにPCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1及びSESN3からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である請求項１記載の方法。
【請求項６】
CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR及びPF6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する請求項５記載の方法。
【請求項７】
PCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1及びSESN3からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する請求項５記載の方法。
【請求項８】
特定の遺伝子が、XRCC5である請求項１記載の方法。
【請求項９】
XRCC5の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
特定の遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
特定の遺伝子の発現をRNAレベルで測定する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子の発現を測定することができる試薬を含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測のためのキット。
【請求項１３】
血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌幹細胞の検出方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。
【請求項１４】
血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞とを見分ける方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。
【請求項１５】
二次移植をした場合に、腫瘍形成能を保持している肝癌細胞。
【請求項１６】
side population細胞分離法により、蛍光シグナルの弱い細胞集団を分離することを含む、請求項１５記載の肝癌細胞の調製方法。
【請求項１７】
請求項１５記載の肝癌細胞を用いて、抗癌剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、癌細胞は種種の癌において機能的不均一性を示す(非特許文献1)が、癌はその起源においては単細胞であると考えられてきた（非特許文献2,3）。軟寒天培地におけるコロニー形成アッセイ及び脾臓コロニーアッセイにより、コロニー形成能を有する細胞は小集団であり、大部分の癌細胞はコロニー形成能を有さないことが示された(非特許文献4, 5)。In vivo移植アッセイにおいて、小サブセットの癌細胞を注射しても癌が発生した(非特許文献6, 7)。これらの結果は、少数集団の細胞だけが腫瘍を惹起する能力を有し、大多数の細胞は腫瘍を惹起する活性を欠いていることを示している。これらの実験を観察することにより、２つの一般論が導かれた(非特許文献8, 9)。確率モデルは、確率的な事象を経験することにより、癌が比較的同種の細胞集団と、極度に増殖するポテンシャルを獲得して新たな腫瘍を形成するわずかの細胞とから構成されることを示している。もう一つの仮説（すなわち、階層モデル）は、癌幹細胞のサブ集団が、多様な分化した子孫細胞を含む階層構造を形成し、極度に増殖することにより高頻度で新しい腫瘍を惹起すると仮定する。【０００３】
フローサイトメトリーを用いる細胞分離、細胞培養、及び免疫不全マウスへの移植といった幹細胞生物学の技術的進歩により、腫瘍における幹細胞の同定が容易になった。非肥満糖尿病/重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウスにヒト急性骨髄性白血病を惹起する能力を有する小サブセットの細胞が白血病患者から同定された(非特許文献10)。これらの細胞は、CD34+CD38-細胞として分離され、連続的な移植においても白血病を惹起することができた。さらに、造血性幹細胞と白血病幹細胞の両方の自己複製を調節する共通の機構が存在することが報告されている(非特許文献11)。白血病幹細胞の分野を越えて、フローサイトメトリーを用いて、固形腫瘍における腫瘍形成性のサブ集団を検出する試みもなされている。最近、CD44+CD24-/low ESA（上皮特異的抗原）+乳癌細胞、及び髄芽腫又は神経膠芽腫のCD133+細胞は「癌幹細胞」と予想されるものとして同定された(非特許文献12, 13)。これらの研究において、癌幹細胞として精製された小サブセットの細胞は腫瘍形成ポテンシャルを示したが、腫瘍細胞の大多数はin vivo移植アッセイにおいてそのようなポテンシャルを示さなかった。白血病における癌幹細胞の表現型及び固形腫瘍は、それらの起源幹細胞の大部分を再利用するので、おそらく癌幹細胞は自己複製と分化とのバランスを調節し、正常幹細胞が発生と再生において組織を形成するのと同じようなやり方で腫瘍を再構成しているのだろう。培養及びin vivo移植アッセイから得られるこれらの観察からは、階層モデルが提唱されるかもしれない(非特許文献14)。【０００４】
肝癌細胞(HCC)は世界中で共通の悪性腫瘍であり、いまだに死亡率が高い(非特許文献15)。遺伝的及び後成的な変化の蓄積が多段階の肝臓癌形成に貢献すると推定されている(非特許文献16-18)。しかしながら、肝臓癌形成の根底にある全体的な機構は明らかに実証されていない。さらに、HCCの細胞起源は解明されずにいる。癌幹細胞と予想されるものを同定し、HCC細胞における階層性を解明することは、肝臓癌形成を理解し、新規治療法を探索することに役立つかもしれない。【０００５】
Side population(SP)細胞ソーティングは、最初に造血性幹細胞の同定に適用され、多種多様な組織と器官における幹細胞の区画の濃縮に利用されている(非特許文献19-21)。SP細胞は、ATP結合カセット(ABC)膜トランスポーターを通してHoechst 33342色素を流出する能力によって検出される。最近、SP細胞は癌細胞の幹細胞様画分を分離する試みにも用いられた(非特許文献22)。この方法は合理的で価値のあるものと思われる。なぜならば、HCCを含む種種の癌はABCトランスポーターを高度に発現し、多剤耐性に密接に貢献することが示されているからである(非特許文献23)。【０００６】
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、肝癌細胞から精製したSP細胞が癌幹細胞様の性質を有するか否かを明らかにした上で、SP細胞とNon-SP細胞との遺伝子発現プロファイルの相違を調べ、その情報を利用して、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測を可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
最近の幹細胞生物学の進歩により、正常固形組織における推定上の幹細胞同様、固形腫瘍における癌幹細胞を同定できるようになった。本発明者らは、癌幹細胞として機能するサブ集団を検出し、それらの腫瘍形成における役割を解明するために、side population(SP)細胞分析とソーティングを行い、肝細胞癌(HCC)の細胞株を確立した。Huh7及びPLC/PRF/5細胞におけるSPサブ集団がそれぞれ全細胞数中0.25%及び0.80%の割合で検出された。SP細胞は、Non-SP細胞と比較して、高い増殖能と抗アポトーシス性を示した。免疫細胞化学検査により、SP画分は肝細胞と胆管細胞の両方の系譜の特徴を提示する多数の細胞を含んでいることが明らかになった。非肥満糖尿病/重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウスへの異種移植実験により、腫瘍形成には、わずか1x103 個のSP細胞で十分であったのに対して、1x10６ 個のNon-SP細胞を注射しても腫瘍は惹起されないことが明らかになった。SP細胞が誘導した腫瘍を再分析したところ、SP細胞はSP細胞とNon-SP細胞の両方を生成し、腫瘍を惹起するポテンシャルは連続的な移植においてSP細胞のみに維持されていた。マイクロアレイ分析によりSP細胞とNon-SP細胞との遺伝子発現プロファイルの相違が明らかになり、いくつかのいわゆる「幹細胞性遺伝子(stemness genes)」がHCC細胞中のSP細胞においてアップレギュレートしていた。結論として、本発明者らは、HCC細胞中のSP細胞として検出された少数のものが、非常に高い腫瘍形成ポテンシャルを有し、明らかな階層構造によって特徴付けされる癌幹細胞システムにおける不均一性を構成していることを提唱する。【０００９】
SP細胞とNon-SP細胞との間で遺伝子発現プロファイルを比較したときに、SP細胞でアップレギュレートした遺伝子及びダウンレギュレートした遺伝子は、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測のマーカーとして利用可能である。【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。
（２）  特定の遺伝子が、表Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのいずれかに列挙されている遺伝子の少なくとも１つである（１）記載の方法。
（３）  表Ａ及び／又はＣに列挙されている遺伝子の少なくとも１つの発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する（２）記載の方法。【００１１】
（４）  表Ｂ及び／又はＤに列挙されている遺伝子の少なくとも１つの発現が低下している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する（２）記載の方法。
（５）  特定の遺伝子が、CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR及びPF6からなる群並びにPCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1及びSESN3からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である（１）記載の方法。【００１２】
（６）  CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR及びPF6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する（５）記載の方法。
（７）  PCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1及びSESN3からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する（５）記載の方法。【００１３】
（８）  特定の遺伝子が、XRCC5である（１）記載の方法。
（９）  XRCC5の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する（８）記載の方法。
（１０）  特定の遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定する（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  特定の遺伝子の発現をRNAレベルで測定する（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１２）  肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子の発現を測定することができる試薬を含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測のためのキット。【００１４】
（１３）  血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌幹細胞の検出方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。
（１４）  血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞とを見分ける方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。
（１５）  二次移植をした場合に、腫瘍形成能を保持している肝癌細胞。
（１６）  side population細胞分離法により、蛍光シグナルの弱い細胞集団を分離することを含む、（１５）記載の肝癌細胞の調製方法。
（１７）  （１５）記載の肝癌細胞を用いて、抗癌剤をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測の診断マーカーが提供された。
本発明により、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法及びキットも提供された。
また、本発明により、肝癌幹細胞の検出方法、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞とを見分ける方法、肝癌幹細胞及びその調製方法が提供された。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2006‐138072号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】SP細胞分析。HepG2及びHuh6細胞はSP画分を含まないが、Huh7及びPLC/PRF/5細胞においては、それぞれ、0.25%及び0.80%のSPサブ集団が検出された。SP細胞はHoechst及びベラパミル処理により消失した。
【図２】Huh7及びPLC/PRF/5細胞における分離後、24、48及び72時間目の細胞生存率(A, B)及びアポトーシス感受性(C, D)。Huh7及びPLC/PRF/5細胞から精製されたSP細胞は、対応するNon-SP細胞より高い生存率を示した。SP細胞におけるTUNEL陽性細胞の数は一貫して両細胞中のNon-SP細胞におけるTUNEL陽性細胞の数より多かった。*は統計的有意差あり。
【図３】Huh7及びPLC/PRF/5 SP細胞における免疫組織化学分析。(A-D)AFP及びCK19発現をHuh7 SP細胞(A)、Huh7 Non-SP細胞(B)、PLC/PRF/5 SP細胞(C)及びPLC/PRF/5 Non-SP細胞(D)において調べた。(E, F) AFP又はCK19のいずれかに陽性の細胞はNon-SP細胞に優先的に見いだされたが、AFP及びCK19の両方に対して陽性である多数の細胞がHuh7 SP細胞(E)及びPLC/PRF/5 SP細胞(F)において観察された。スケールバー=(a, b)20μm; (c,d)=50μm
【図４】SP細胞における腫瘍形成性。(a)1x103個のHuh7 SP細胞の注射による代表的な皮下腫瘍（矢印）。Huh7 SP細胞(b)及びPLC/PRF/5 SP細胞(c)に由来する腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色。Non-SP細胞の移植は16週間で腫瘍を惹起することはできなかった。スケールバー=50μm
【図５】SPに由来する腫瘍の再分析。Huh7及びPLC/PRF/5 SPに由来する腫瘍細胞におけるSPサブ集団をそれぞれ0.34%及び0.90%で検出した。SP分析パターンは以前に分離したHuh7及びPLC/PRF/5細胞のそれと似ていた。
【図６】マイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイル。(A) Huh7及びPLC/PRF/5 SP細胞においてアップレギュレートした（比＞2.0）遺伝子中、440及び789個の遺伝子がそれぞれ特徴付けされた。それらの遺伝子は11群にカテゴリー化された。(B)HCC SP細胞における遺伝子発現プロファイル中の幹細胞性の遺伝子と、Ramalho-SantosらとIvanovaらにより報告された幹細胞濃縮遺伝子との重複。(C)リアルタイムRT-PCRにより算出されたSP/Non-SPのfold changeはマイクロアレイデータのそれと比較的一致している。ESCは胚性幹細胞、NSCは神経幹細胞、HSCは造血幹細胞。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法を提供する。特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである。「発現が相違する」態様としては、遺伝子の発現の有無が異なること、発現量が異なることが挙げられる。特定の遺伝子は、表Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのいずれかに列挙されている遺伝子の少なくとも１つであることが好ましく、１種でも複数種であってもよい。例えば、CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR、PF6、PCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1、SESN3、XRCC5などを例示することができる。【００１８】
表Ａには、Huh7 SP細胞でアップレギュレートした遺伝子（後述の実施例で確認）をまとめた。表Ｂには、Huh7 SP細胞でダウンレギュレートした遺伝子（後述の実施例で確認）をまとめた。表Ｃには、Alexander細胞（PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株）でアップレギュレートした遺伝子（後述の実施例で確認）をまとめた。表Ｄには、Alexander細胞（PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株）でダウンレギュレートした遺伝子（後述の実施例で確認）をまとめた。表中、１列目には発現量、２列目には遺伝子名（略号：NCBIシンボルネーム）、３列目にはGeneBankの登録番号、４〜７列目には遺伝子名、８列目にはクローニング方法、９列目にはUnigene（ユニジーン）登録番号を記載した。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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PCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1及びSESN3は、Huh7 SP細胞及びAlexander細胞（PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株）の両方でダウンレギュレートした遺伝子（後述の実施例で確認）である。【００１９】
CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR及びPF6は、Huh7 SP細胞及びAlexander細胞（PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株）の両方でアップレギュレートした遺伝子（後述の実施例で確認）である。
XRCC5は、Huh7 SP細胞及びAlexander細胞（PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株）の両方でアップレギュレーションを示す幹細胞性遺伝子（後述の実施例で確認）である。
例えば、以下のように、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測をすることができる。【００２０】
１．表Ａ及び／又はＣに列挙されている遺伝子の少なくとも１つの発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する。
２．表Ｂ及び／又はＤに列挙されている遺伝子の少なくとも１つの発現が低下している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する。
３．CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR及びPF6からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する。【００２１】
４．PCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1及びSESN3からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する。
５．XRCC5の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する。【００２２】
本発明の鑑別、判定又は予測方法において、特定の遺伝子の発現が上昇又は低下していると判断する際には、正常肝細胞又は肝組織をコントロールとして比較するとよい。あるいは、予後不良肝癌（再発・浸潤・転移あり）と予後良好肝癌（再発・浸潤・転移無し）との間で特定の遺伝子の発現を比較してもよい。その場合、コントロールは予後良好肝癌となる。
本発明の方法において、血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現は、タンパク質レベルで測定してもよいし、RNAレベルで測定してもよい。例えば、ノーザンブロット法、PCR法、ウェスタンブロット法、免疫組織化学分析法などで測定することができる。あるいはまた、cDNAマイクロアレイ、ELISA法などを利用して測定してもよい。【００２３】
特定の遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定するためには、測定の対象となるタンパク質を特異的に認識する抗体を用いるとよい。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの抗体は公知の方法で製造することができるし、また、市販されているものもある。ウェスタンブロット法で測定する場合には、抗体は、125I標識プロテインＡ、ペルオキシダーゼ結合IgGなどを用いて二次的に検出される。免疫組織化学分析法で測定する場合には、抗体は、蛍光色素、フェリチン、酵素などで標識するとよい。【００２４】
特定の遺伝子の発現をRNAレベルで測定するためには、測定の対象となる遺伝子のmRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを用いるとよい（ノーザンブロット法で測定する場合）。あるいはまた、測定の対象となる遺伝子のmRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマー及び前記mRNAを鋳型として合成されるcDNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマーからなる１対の核酸プライマーを用いてもよい（PCR法で測定する場合）。核酸プローブ及び核酸プライマーは、測定の対象となる遺伝子の配列情報に基づいて設計することができる。核酸プローブは、通常、約１５〜１５００塩基のものが適当である。核酸プローブは、放射性元素、蛍光色素、酵素などで標識するとよい。核酸プライマーは、通常、約１５〜３０塩基のものが適当である。【００２５】
本発明において、血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子発現の有無を検出してもよいし、発現量を測定してもよい。遺伝子発現の有無は、所定の位置におけるスポットやバンドの出現の有無により確認できる。遺伝子の発現量はスポットやバンドの染色強度により測定できる。あるいはまた、遺伝子発現産物であるタンパク質及び／又は遺伝子転写産物であるmRNAを公知の方法で定量してもよい。複数の遺伝子発現や複数のタンパク発現を同時に検出するためには、ＤＮＡアレイ（プローブを基板に固定）（NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, DECEMBER 2002, 951-960）、プロテインチップ（抗体を基板に固定）（NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, SEPTEMBER 2002, 683-695）、ルミネックス（NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, JUNE 2002, 447-456）等の検出法を用いることが好ましい。【００２６】
血液、肝癌細胞又は肝癌組織は判定の対象となる被験体に由来するものであるとよく、被験体の生物種としては、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物を挙げることができる。
本発明の方法により、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測をするためには、肝癌生検試料、あるいはそこから得られる培養肝癌細胞、培養肝癌組織、血液などを用いることができる。肝癌生検試料としては、外科手術により摘出した腫瘍組織を挙げることができる。
本発明は、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測のためのキットも提供する。本発明のキットは、肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子の発現を測定することができる試薬を含む。【００２７】
一つの例として、本発明のキットは、肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子の発現産物であるタンパク質を特異的に認識できる抗体を試薬として含む。肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子は、表Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのいずれかに列挙されている遺伝子の少なくとも１つであることが好ましく、１種でも複数種であってもよい。例えば、CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR、PF6、PCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1、SESN3、XRCC5などを例示することができる。キットには、さらに、血液、肝癌細胞又は組織を採取するための器具、肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子の発現産物であるタンパク質を免疫化学的に検出するための試薬一式、取扱説明書などが含まれてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測基準なども記載しておくとよい。【００２８】
別の一例として、本発明のキットは、肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子の転写産物であるmRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを試薬として含む。肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子は、表Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのいずれかに列挙されている遺伝子の少なくとも１つであることが好ましく、１種でも複数種であってもよい。例えば、CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR、PF6、PCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1、SESN3、XRCC5などを例示することができる。キットには、さらに、血液、肝癌細胞又は組織を採取するための器具、採取した血液、肝癌細胞又は組織からRNAを抽出するための試薬類、RNAをノーザンブロット法で分析するための試薬類、取扱説明書などが含まれてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測基準なども記載しておくとよい。【００２９】
さらに別の一例として、本発明のキットは、肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子の転写産物であるmRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマー及び前記mRNAを鋳型として合成されるcDNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマーからなる１対の核酸プライマーを試薬として含む。肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子は、表Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのいずれかに列挙されている遺伝子の少なくとも１つであることが好ましく、１種でも複数種であってもよい。例えば、CHM、MSH6、NCOA7、CYP2E1、TM4SF1、F2RL1、TRPM3、AKR1C1、FOXH1、RAB40C、MGC27085、PPP1R3E、UST、CANP、PRSS3、UACA、FOSL2、PSPC1、EXOSC6、LOC388558、RTTN、FAM20A、FGF18、HOXA13、FOLR1、TMF1、PCGF5、GSTA1、XRCC5、MAP3K7IP2、RTN4、BCDO2、CDH22、MYCNOS、FMNL2、PHEX、WDR56、HERC6、SBNO1、FDFT1、ZFR、PF6、PCOTH、ZCCHC6、HRMT1L1、INHBC、ATP8B3、TAL1、FGF1、ADCY9、CAPS2、ANXA2、FLJ34077、AD7C-NTP、GLRB、MGAT2、SASH1、HIF1A、LMTK3、EYA3、IPP、CAPN2、GAFA1、HELLS、NF1、NUSAP1、SESN3、XRCC5などを例示することができる。キットには、さらに、血液、肝癌細胞又は組織を採取するための器具、採取した血液、肝癌細胞又は組織からRNAを抽出するための試薬類、RNAをRT-PCR法で分析するための試薬類、取扱説明書などが含まれるとよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測基準なども記載しておくとよい。【００３０】
さらに、本発明は、血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌幹細胞の検出方法を提供する。特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである。肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものは前述の通りである。
さらにまた、本発明は、血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞とを見分ける方法を提供する。特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである。肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものは前述の通りである。【００３１】
本発明は、二次移植をした場合に、腫瘍形成能を保持している肝癌細胞を提供する。この細胞は肝癌幹細胞と考えられる。この細胞は、side population細胞分離法により、蛍光シグナルの弱い細胞集団を分離することにより、調製することができる。具体的には、後述の実施例に記載のようにして、肝癌幹細胞を調製することができる。簡単に説明すると、肝臓癌由来の細胞をHoechst 33342とともにインキュベートした後、濾過などの手法で単一の懸濁細胞を得る。細胞内に残存するHoechst 33342をUVレーザーで350 nmにて励起し、蛍光の発光を405/BP30(Hoechst blue)及び570/BP20(Hoechst red)光フィルターで測定する。Hoechst 33342は、膜透過性の高いDNA結合色素で、UV励起により短波長の青色と長波長の赤色の蛍光を発する。かくして、肝癌幹細胞は、蛍光シグナルの弱い細胞の亜集団として検出される。この亜集団は、フローサイトメーターを用いたソーティングにより分取することができる。この亜集団の細胞を免疫不全動物に移植し、形成された腫瘍を採取して、刻んだ後に、コラゲナーゼで消化してバラバラになった細胞を培養する。培養細胞を採取し、再度、side population細胞分離法により、蛍光シグナルの弱い細胞集団を分離して、免疫不全動物に移植すると、腫瘍が形成されうる。このような細胞を標的とする薬剤を開発することができれば、新規な抗癌剤として有効に利用できる。【００３２】
本発明は、二次移植をした場合に、腫瘍形成能を保持している肝癌細胞を用いて、抗癌剤をスクリーニングする方法も提供する。
例えば、被験物質の存在下又は非存在下で、本発明の肝癌幹細胞を培養し、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質の非存在下で培養した細胞の増殖率又は生存率を比較するとよい。被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、被験物質の存在下で培養した細胞の増殖率又は生存率が低下した場合には、その物質は抗癌剤として有効であると考えられる。肝癌幹細胞の培養は、スクリーニングに適したいかなる条件下で行ってもよい。細胞の生存率及び増殖率は、例えば、MTT法(Carmichael et al., Cancer Res. 47:936-942, 1987)などの手法で生細胞数を測定することにより、調べることができる。【００３３】
あるいはまた、本発明の肝癌幹細胞を移植することにより腫瘍を形成した免疫不全動物を用いて、被験物質の抗癌活性を調べてもよい。抗癌活性は、例えば、被験物質を投与した動物とコントロール（被験物質を投与しない動物）との間で、腫瘍重量、動物の生存率、生存日数などを比較することにより、評価することができる。コントロールと比較して、被験物質を投与した動物で、腫瘍重量の減少、動物の生存率の上昇、生存日数の長期化が観察されれば、その物質は抗癌剤として有効であると考えられる。
被験物質は、天然物又は合成品のいずれであってもよく、具体的には、植物および微生物由来の抽出物およびその精製品、低分子合成化合物、抗体、ペプチド、アプタマー、siRNA、遺伝子治療に用いられる核酸、その修飾体や誘導体などを挙げることができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
材料及び方法【００３５】
細胞培養  ヒト肝臓癌細胞株HepG2、Huh6、Huh7及びPLC/PRF/5をヒューマンサイエンス研究資源バンク(HSRRB, Osaka, Japan)から得た。これらの細胞を10% FCS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)含有ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)で培養し、37℃で5% CO2を含む培養器中でインキュベートした。【００３６】
フローサイトメトリーを用いたSide population分析  トリプシン-EDTA(Invitrogen)を用いて皿から細胞を剥がし、3% FCSと10 mM Hepesを補充したハンクス平衡塩類溶液中に1x106 cells/mlで懸濁させた。その後、これらの細胞を37℃で90分間単独又は50μMのベラパミル(Sigma)の存在下で20μg/mlのHoechst 33342 (Sigma Chemical, St Louis, MO)とともにインキュベートした。インキュベーション後、1μg/mlのヨウ化プロピジウム(BD Pharmingen, San Diego, CA)を添加し、その後、40μmのcell strainer (BD Falcon)で濾過して、単一の懸濁細胞を得た。三重レーザーを保持するMoFlo(DakoCytomation, Fort Collins, CO)を用いて、細胞分析及び精製を行った。Hoechst 33342をUVレーザーで350 nmにて励起し、蛍光の発光を405/BP30(Hoechst blue)及び570/BP20(Hoechst red)光フィルターで測定した。死細胞を判別するためにヨウ化プロピジウム標識を630/BP30フィルターを通して測定した。【００３７】
増殖アッセイ及びアポトーシス検出  ウェル毎にSP細胞とNon-SP細胞(5ｘ103)を96ウェルマイクロプレートに分離し、3(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウムinner salt (MTS)アッセイを行い、既報のように(24)各々三検体のサンプルで細胞生存率を調べた。製造者の説明書(Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)に従い、TUNELアッセイによりおのおの三検体でアポトーシス細胞の定量を行った。ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼを用い、フルオレッセインイソチオシアネート(FITC)で細胞を標識し、DNAフリーの末端を抗FITC西洋わさびペルオキシダーゼ及びジアミノベンジジンで染色した。1 x 103 個の細胞をランダムに計測することにより、TUNEL陽性細胞の比率を算出した。細胞ソーティング後24、48及び72時間目にMTS及びTUNELアッセイを行った。【００３８】
免疫細胞化学アッセイ  ソーティングしたSP細胞及びNon-SP細胞を12時間培養し、PBS中で洗浄した。細胞をメタノールで-20℃にて20分間固定し、0.1% Tween 20 (Wako)を含有するPBSで洗浄した。10%ヤギ正常血清で１時間ブロッキングした後、一次抗体であるウサギ抗α-1-フェトプロテイン(AFP)(DakoCytomation)及びマウス抗サイトケラチン19(CK19)(WakoCytomation)とともに湿室内で4℃にて一晩、固定細胞をインキュベートした。0.1% Tween 20を含有するPBS中でこれらの細胞を洗浄し、再度、30分間ブロッキングを行い、Alexa 555結合ヤギ抗ウサギIgG(Molecular Probes, Eugene, OR)及びAlexa 488結合ヤギ抗マウスIgG(Molecular Probes)で室温にて１時間処理した。PBS中で洗浄した後、DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を含有するmounting mediumを細胞に乗せてカバーグラスをかけ、Olympus IX70顕微鏡下で観察した。【００３９】
非肥満糖尿病/重症複合免疫不全異種移植  NOD/SCIDマウスをSankyo Laboratory Co. Ltd. (Tsukuba, Japan)から購入した。100-1x106個の種種の数のSP及びNon-SP細胞を200μlのDMEMとマトリゲル(BD)(1:1)中に懸濁し、ケタミンとキシラジンのカクテルを用いた麻酔下で雄NOD/SCIDマウス（6-10週令）に移植した。SP細胞とNon-SP細胞をぞれぞれ右と左の背中の皮下空間に注射した。腫瘍形成を毎週観察と触診により16週間モニターした。皮下腫瘍をホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。切片を組織学的な分析のためにヘマトキシリン-エオシン染色した。次に、SP由来の腫瘍を除去し、氷上の無菌のPBS中で刻んだ。得られた腫瘍の小切片を5 mg/mlのII型コラゲナーゼ(Sigma)含有DMEM中に置き、37℃で3時間消化した。洗浄と濾過をした後、造血細胞や線維芽細胞のような非上皮細胞を除くために細胞を7日間培養した。採取した細胞をフローサイトメトリーで分析し、上述のように再度NOD/SCIDマウスに注射した。これらの実験は実験室動物の使用に関する施設ガイドラインに従って行われた。【００４０】
RNA抽出及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析  Isogen reagent(Nippon Gene,Toyama, Japan)を用い、製造者の説明書に従って、全RNAをSP細胞とNon-SP細胞から別々に抽出した。RNAの品質と濃度はNanoDrop(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)及びAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)により測定した。マイクロアレイ分析は標準プロトコル(Affymetrix GeneChip Manual)に従って行った。簡単に説明すると、oligo(dT)24-T7プライマーとSuperScript kit(Invitrogen)を用いて1μgの全RNAから第一及び第二のcDNAを生成した。その後、Bioarray, High Yield RNA Transcript Labeling Kit(Enzo Diagonostics, Farmingdale, NY)を用いて、ビオチン標識したcRNAを合成した。精製と断片化を行った後、15μgのcRNAをHuman Genome U133A Plus 2.0 Arrays(Affymetrix, Santa Clara, CA)にハイブリダイズさせた。このアレイは、38,500個の特徴付けされた遺伝子を含む、47,000個以上の遺伝子転写物を提示する。増幅を行い、ストレプトアビジン結合フィコエリトリン蛍光を通してハイブリダイズシグナルを検出した後、GeneChip Scanner 3000(Affymetrix)を用いて、アレイ画像をスキャンした。得られたデータをGeneChip Operating Softwareで分析した。完全マッチ及びミスマッチプローブ対を用いて、検出P値を算出し、各プローブをabsent(A)、marginal(M)又はpresent(P) callとして割り当てた。SP細胞及び対応するNon-SP細胞の両方においてA callとスコア付けされたプローブを以下の分析から排除した。実験の標準化後、GeneSpring system(Agilent Technologies)を用いて、fold change測定とカテゴリー化を含むデータマイニングを行った。【００４１】
定量的リアルタイム逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応  増幅グレードのDNase I(Invitrogen)で前処理を行った後、first-strand superscript(Invitrogen)を用いて逆転写(RT)を行った。ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)を用い、TaqMan技術でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行った。ITGB1, FMN2, ABCF2, USP9X, ZFX, TXNL, WTAP, ELAVL4, AF5Q31, ADARB1, FZD7, ABCB1, STATIP1, GCLM, XRCC5及びβ-actin (assay IDは、それぞれ、Hs00236976_m1, Hs00298949_m1, Hs00255026_m1, Hs00245009_m1, Hs00268739_m1, Hs00169455_m1, Hs00191727_m1, Hs00222634_m1, Hs00232683_m1, Hs00210562_m1, Hs00275833_s1, Hs00184500_m1, Hs00217448_m1, Hs00157694_m1, Hs00221707_m1 及びHs99999903_m1; Applied Biosystems)用の遺伝子発現アッセイプライマー及びプローブ混合物を用いた。95℃で15分間、60℃で1分間の45サイクルを用い、おのおの三検体を用いて、thermal cyclingを行った。β-actinを標準化のために用いた。製造者が記述しているようなcomparative cycle threshold (CT)を用いて、相対的な定量を行った。【００４２】
統計分析  データは平均値±SEMで表す。Mann-Whitney U検定を用いて、２群間の統計差を分析した。P値が0.05より小さければ、有意差があると見なした。【００４３】
結果
肝癌細胞におけるSide populationの検出  Hoechst 33342染色によるフローサイトメトリー分析により、Huh7及びPLC/PRF/5細胞が、それぞれ、0.25%及び0.80%のSPサブ集団を含むことが示された。これらのSP細胞はHoechst 33342とカルシウムチャンネルブロッカーであるベラパミルの存在下で実際に減少した。一方、Huh6及びHepG2細胞ではSP細胞が検出されなかった。Huh7及びPLC/PRF/5細胞中のSP細胞及びNon-SP細胞を別々にソーティングし、さらなる実験に用いた(図1)。形態学的にはSP細胞とNon-SP細胞に顕著な差はなかった。【００４４】
増殖活性及びアポトーシス耐性  SP細胞及びNon-SP細胞のin vitro増殖活性の差を調べるために、MTSアッセイを用いて生細胞数を測定した。Huh細胞(図2A)及びPLC/PRF/5細胞(図2B)においては、SP細胞の細胞可変性は一貫してNon-SP細胞より高かった。PLC/PRF/5細胞の72時間培養物中のSP細胞はNon-SP細胞より有意に(p＜0.05)高い細胞生存率を示した。SP細胞及びNon-SP細胞のアポトーシス感受性の差をTUNELアッセイで調べた。Huh7及びPLC/PRF/5細胞において、SP細胞におけるTUNEL陽性細胞の百分率はNon-SP細胞より低かった(Huh7細胞(図2C)、PLC/PRF/5細胞(図2D))。24時間及び72時間培養物中のHuh 7 SP細胞におけるTUNEL陽性と、72時間培養物中のPLC/PRF/5 SP細胞におけるTUNEL陽性とは、Non-SP細胞のそれと比較して統計的有意差(p＜0.05)を示した。【００４５】
系譜マーカー発現の分析  デュアル免疫細胞化学分析を行い、SP細胞とNon-SP細胞の分化ポテンシャルを比較した(図3A-D)。Huh7及びPLC/PRF/5細胞は、肝細胞特異的マーカーであるαフェトプロテイン(AFP)と胆管細胞特異的マーカーであるサイトケラチン19(CK19)の両方でマーキングされた多数の細胞を含んでいた。Huh7及びPLC/PRF/5細胞において、AFP及びCK19の両方に対して陽性の細胞の百分率は、それぞれ、68.2%及び55.0%であった。一方で、大多数のNon-SP Huh7及びPLC/PRF/5細胞はAFP又はCK19のいずれかで標識された。Huh7及びPLC/PRF/5 Non-SP細胞において、ただ一つのマーカーのみを発現した細胞の百分率は、それぞれ、74.4%及び79.6%であった。これらの細胞株において、AFPでもCK19でもマーキングされなかった少数の細胞がこれらの細胞株のSP細胞にもNon-SP細胞にも同様に存在した。【００４６】
Side Population 移植により引き起こされた腫瘍惹起  腫瘍形成活性がSP細胞とNon-SP細胞とで異なるか否かという問題を検証するために、Huh7及びPLC/PRF/5細胞における種種の数のSP細胞及びNon-SP細胞をNOD/SCIDマウスに注射した(図4a)。皮下腫瘍形成には、少なくとも1x106個のソーティングされていないHuh7及びPLC/PRF/5細胞の注射が必要であった。Huh7及びPLC/PRF/5 SP細胞では、それぞれ、1x103個程度の少量の細胞注射で、それぞれ、9匹中8匹、8匹中8匹のマウスに腫瘍を惹起した（表1）。しかしながら、Huh7及びPLC/PRF/5細胞における1x106個のNon-SP細胞を注射しても、一貫してすべてのマウスに腫瘍が形成されなかった。これらのSPサブ集団は腫瘍形成細胞に対して少なくとも1,000倍濃縮されている。Huh7及びPLC/PRF/5 SP細胞起源の腫瘍を組織学的に分析したところ、ソーティングされていない細胞の注射により形成された腫瘍と同様の特徴を示した（図4b, 4c）。
【表３３】
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【００４７】
Side Population由来の腫瘍の再分析及び連続的な移植  SP細胞が自己複製し、in vivoで非対称的な細胞分裂により非腫瘍形成性のNon-SP細胞を生成するか否かを解明するために、SP由来の皮下腫瘍のフローサイトメトリー分析を行った。SP分析により、Huh7及びPLC/PRF/5細胞は、それぞれ、0.34%及び0.90%のSPサブ集団を含むことが示された（図5）。これらの分析パターンは、以前に分離したHCC細胞のそれに似ていた。Huh7及びPLC/PRF/5細胞は、4週間の培養後にSP細胞とNon-SP細胞の両方を生成した（データは示さず）。続いて、NOD/SCIDマウスへのSP細胞とNon-SP細胞の二次移植を行った（表2）。Non-SP細胞を注射しても新しい腫瘍は形成されなかったが、両細胞株中の1x103個程度の少数のSP細胞が5匹のNOD/SCIDマウス中4匹に腫瘍を形成した。
【表３４】
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【００４８】
マイクロアレイ分析に基づく遺伝子発現プロファイル  SP細胞とNon-SP細胞との遺伝子発現プロファイルの違いを明らかにするために、マイクロアレイ分析を行った。全部で、Huh7細胞中の26,764個のプローブ及びPLC/PRF/5細胞中の25,755個のプローブを上述のcallアルゴリズムに従って分析した。対応するNon-SP細胞と比較して、Huh7及びPLC/PRF/5 SP細胞中でアップレギュレートされた（比＞2.0）遺伝子の数は、それぞれ、1,015個及び1,542個であった。利用可能のウェブサイトを用いて、これらの遺伝子を以下のように機能的にカテゴリー化した。Gene Ontology (http://www.geneontology.org) 及び GeneCards (http://thr.cit.nih.gov/cards/index.shtml)。Huh7及びPLC/PRF/5 SP細胞においてアップレギュレーションを示した遺伝子（特徴付けされている）の百分率は、それぞれ、43.3%(440/1,015)及び51.2%(789/1,542)であった。これらの遺伝子はその機能に従って以下の11群にカテゴリー化された。転写調節(Transcriptional regulation)、核酸結合(Nucleic acid binding)、シグナル伝達(Signaling)、輸送(Transport)、代謝(Metabolism)、タンパク質合成(Protein synthesis)、ユビキチン化/タンパク質分解(Ubiquitination/Proteolysis)、受容体活性(Receptor activity)、アポトーシス/細胞周期(Apoptosis/Cell cycle)、細胞骨格/膜(Cytoskeleton/Membrane)、及びその他(Others)である（図6A）。これらの遺伝子の約1/3が「転写調節」及び「核酸結合」群にカテゴリー化された。62個のアップレギュレートされた遺伝子が両方の細胞株に共通に見出された（表3）。一方、940個及び941個の遺伝子が、それぞれ、Huh7及びPLC/PRF/5 SP細胞においてダウンレギュレギュ−ションを示し（比＜0.5）、51個の遺伝子が両細胞株で重複した。【００４９】
次に、SP細胞においてアップレギュレートした遺伝子のプロファイリングをいわゆる「幹細胞性遺伝子」の以前のマイクロアレイに基づくプロファイリングと比較した。「幹細胞性遺伝子」は幹細胞（胚性幹細胞(ESC)、神経幹細胞(NSC)及び造血性幹細胞(HSC)）に共通に発現している(25, 26)。利用可能なウェブサイトを用いてこれらのプロファイリングデータをヒト相同体に変換し、本発明者らの現在のデータと比較した（図6B、表4）。その結果、Huh7 SP細胞におけるITGB1, USP9X及びZFX、PLC/PRF/5 SP細胞におけるTXNL, WTAP, ABCB1, STATIP1及びGCLMを含む5個の遺伝子が、Ramalho-Santosらが報告した(25)幹細胞性の遺伝子の発現プロファイリングと一致した。さらに、Huh7 SP細胞とPLC/PRF/5 SP細胞の両方でXRCC5がアップレギュレートしていることが示された。Huh7 SP細胞におけるFMN2及びABCF2、PLC/PRF/5 SP細胞におけるAF5Q31, ADARB1, ELAVL4及びFZD7を含む４個の遺伝子が、Ivanovaらにより示された幹細胞性遺伝子プロファイリング(26)に含まれていた。【００５０】
【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【００５１】
定量的リアルタイム逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応を用いたマイクロアレイデータの確認  Huh7 SP細胞及びNon-SP細胞におけるITGB1, FMN2, ABCF2, XRCC5, USP9X及びZFXを含む6個の遺伝子のmRNAの発現を定量的リアルタイムRT-PCRにより分析した。PLC/PRF/5 SP細胞及びNon-SP細胞における、 10個の遺伝子、すなわち、TXNL, WTAP, ELAVL4, XRCC5, AF5Q31, ADARB1, FZD7, ABCB1, STATIP1及びGCLMも調べた。リアルタイムRT-PCRにより、これら16個の遺伝子は、Non-SP細胞よりSP細胞でmRNAの発現レベルが高いことが示され、このことはマイクロアレイデータと非常によく一致した（図6C）。【００５２】
考察
広範に増殖し、自己複製し、分化する能力は、幹細胞に最も特徴的な性質である。本研究では、HCC細胞から精製したSPサブ集団が培養物中及び異種移植片アッセイ中で幹細胞様の性質を有するか否かを評価した。全細胞の1%以下の割合を占めるSPサブ集団がHuh7及びPLC/PRF/5細胞において検出できた。しかしながら、HepG2及びHuh6細胞にはこのようなサブ集団は見られなかった。HepG2及びHuh6細胞は、Hoechst色素の用量を増やして染色したときもフローサイトメトリー分析パターンの変化をほとんど示さなかった。高い排出能力に基づいて幹細胞様サブ集団を検出することは必ずしも有効ではないのかもしれない。なぜならば、このようなサブ集団は検討した癌細胞株の30%以下でしか検出されなかったことが実証されているからである(27)。【００５３】
最初に、本発明者らは、培養系でHuh7及びPLC/PRF/5細胞におけるSP細胞が対応するNon-SP細胞より高い増殖能力を有することを示した。この能力はアポトーシスに対する耐性を伴っていた。種種の組織起源の正常な幹/先駆細胞はBcl-2のような抗アポトーシス性タンパク質を高レベルで発現することが報告されている(28, 29)。まとめると、抗アポトーシス作用は、本質的に、消耗の心配から正常及び癌幹細胞の両方において用意された機構である。【００５４】
次に、本発明者らは、NOD/SCIDマウス異種移植アッセイにおけるSP細胞の腫瘍形成ポテンシャル及び自己複製能を検討した。Huh7及びPLC/PRF/5細胞から精製した1x103個のSP細胞を注射すると、腫瘍を発生させることができた。しかしながら、癌細胞の大多数を構成するNon-SP細胞は、注射する細胞の数を増加させたにもかかわらず、腫瘍を形成することができなかった。SP表現型のさらなるマーカーは、乳癌におけるCD44+CD24-/low ESA+細胞(12)のような癌幹細胞の濃縮を促進するのかもしれない。これらの結果は、SPサブ集団だけが腫瘍惹起能力を有し、機能的及び表現型の不均一性(heterogeneity)がHCC細胞株に存在することを示している。4週間の培養物中のSP細胞のこれらの分析により、SP細胞とNon-SP細胞の両方の存在が示された。さらに、SP由来の腫瘍もSP細胞とNon-SP細胞を生成し、このことはSP細胞の自己複製と分化の両方の能力を示している。SP由来の腫瘍におけるSP細胞とNon-SP細胞の割合は、Huh7及びPLC/PRF/5細胞の両方における以前に分離された細胞のそれに類似していた。SP細胞とNon-SP細胞の割合は、in vitro及びin vivoで密接に調節され、維持されていると思われる。さらに、SP細胞を二次移植しても腫瘍が形成され、腫瘍形成能力は連続的な移植においてよく保持されているようである。【００５５】
Huh7及びPLC/PRF/5細胞はどちらもAFPを産生し、CK19陽性の細胞株であることがよく知られている(30, 31)。形質転換した細胞は通常その起源から分化ポテンシャルを引き継ぐと考えられている。例えば、コンデショナルなトランスジェニックモデルにおけるMYC不活性化は、幹細胞の性質を有するいくつかの肝腫瘍細胞を導き、正常な肝細胞及び胆管細胞系譜に分化する(32)。外科的検体の分析により、胆汁マーカー陽性のHCCが示され、このことは、少なくともHCCのあるものは二分化性の幹/前駆的性質を有するサブ集団から生じている可能性を示している(33)。免疫細胞化学的分析から、SP細胞とNon-SP細胞との間にマーカー発現の不均衡があることが明白になった。AFPとCK19の両方を発現する細胞がこれらのSP細胞において高度に濃縮された一方で、大半のNon-SP細胞がAFP又はCK19のいずれかに対して陽性であった。仮想の肝幹/前駆体と考えられている卵細胞又は肝芽腫(34)の二分化能を考慮すると、SPサブ集団はHCC細胞の上流の階層内に存在し、適当な培養条件下で肝細胞及び胆管細胞に分化する潜在能力を保持している。【００５６】
オリゴヌクレオチドアレイを用いた網羅的ゲノムスクリーニングにより、Huh7及びPLC/PRF/5細胞におけるSP細胞とNon-SP細胞との間で遺伝子発現プロファイリングが異なっていることが明らかになった。これらのSP細胞中の千個の遺伝子の２つ組が遺伝子発現の変動を示したが、このことは、遺伝子的観点からはHCC細胞が明らかに不均一であることを示している。Huh7及びPLC/PRF/5 SP細胞の両方において、アップレギュレートした62個の遺伝子のうち、HOXA13及びCYP2E1遺伝子だけがHCCに含まれることが以前に実証されている(35, 36)。SP細胞は、大部分のHCC細胞株(30, 36)及び外科的試料(37, 38)と比較して、全く異なるmRNA発現パターンを示すことを強調すべきである。【００５７】
次に、本発明者らは、SP細胞においてアップレギュレートしている遺伝子のサブセットを示すデータをいわゆる「幹細胞性遺伝子」のプロファイリング(25, 26)と比較した。これらの遺伝子は、幹細胞における機能的及び表現型の性質を維持するのに非常に重要であると考えられる。この分析において、Huh7 SP細胞においてアップレギュレートした6個の遺伝子及びPLC/PRF/5 SP細胞においてアップレギュレートした10個の遺伝子は、以前のマイクロアレイ研究で実証された「幹細胞性遺伝子」と重複していた。Huh7 SP細胞においてアップレギュレートしたITGB1(CD29)は肝臓における幹細胞マーカーの一つであると認められる。ITGB1に対するモノクローナル抗体はしばしばフローサイトメトリーを用いる肝幹細胞の分離に利用される(39)。PLC/PRF/5 SP細胞においてアップレギュレートしたFZD7は、Wntシグナル伝達経路の受容体の一つであり、これは幹細胞の自己複製の調節と密接に関連がある。さらに、WNT5A, WNT6, CTNNB1及びJUNはWnt経路の重要な構成要素であるが、これもPLC/PRF/5 SP細胞においてアップレギュレートしている。調節不全になったWnt経路は時折腫瘍細胞の広範な増殖を許し(40)、FZD7の癌化の役割はすでにHCCにおいて報告されている(41)。まとめると、これらの結果は、これらの遺伝子が、肝臓の正常幹細胞及び癌幹細胞の両方の維持に深く関与していることを示しているのかもしれない。今後、これらの遺伝子発現が、SP細胞における腫瘍形成を含む癌幹細胞様の性質の決定に重篤に関与するか否かを調べた方がよいであろう。【００５８】
SP細胞の著しい減少がABCG2/BCRP1ヌルマウスの骨髄で観察されたので、SP表現型はABCG2/BCRP1により決定されると報告されている(42, 43)。しかしながら、ABCB1(MDR1)のような他のABCトランスポーターが同様に表現型に関係しているか否かは議論の余地がある(44)。本発明者らのマイクロアレイ分析によると、Huh7 SP細胞におけるABCG1及びABCF2、PLC/PRF/5 SP細胞におけるABCB2、ABCC7、ABCA5及びABCB1はアップレギュレートしているが、どちらのSP細胞においてもABCG2/BCRP1はアップレギュレートしていないことが示された。また、ABCA3は、神経芽細胞腫SP細胞においてNon-SP細胞より高度に発現していることが実証された(45)。まとめると、正常細胞と形質転換細胞との間では、Hoechst色素を排出する別の機構が作動しているのかもしれない。【００５９】
結論として、本発明者らは、Huh7及びPLC/PRF/5細胞におけるSP細胞ソーティングを用いて腫瘍形成性のサブ集団を定義することができた。これらのデータは、HCC細胞株の癌幹細胞を起点とする明確な階層性により特徴付けられる不均一性を示す。最近の癌研究及び治療様式の大半は、比較的同種の細胞からなる塊として癌を考えているように思われるが、腫瘍の不均一性を認識し、癌幹細胞を標的とする治療方法を探索する必要がある。SPサブ集団が培養物中で抗癌剤に対して低い感受性を示したことが実証されている(45, 46)。原発のHCC試料において、幹細胞様の性質を持つ細胞を同定し、特徴付けするためのさらなる研究は、新規な治療戦略の確立に貢献するであろう。【００６０】
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本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違する遺伝子を見出した。これらの遺伝子をマーカーとして利用することにより、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測をすることができる。
また、本発明により得られた肝癌幹細胞は、この細胞を標的とする抗癌剤の開発に利用することができる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図１】
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【図５】
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【国際調査報告】
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