【手続補正書】
【提出日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】エピカテキンとカフェインを配合して得る抗ストレス効果を高めた組成物。
【請求項２】エピカテキンとカフェインの配合比率が１０：１０から１０：５の重量比率であることを特徴とする請求項１に記載の抗ストレス効果を高めた組成物。
【請求項３】エピカテキンとカフェインを含有する抗ストレス効果を高めたキャンディー。
【請求項４】エピカテキンとカフェインの配合比率が１０：１０から１０：５の重量比率であることを特徴とする請求項３に記載の抗ストレス効果を高めたキャンディー。
【請求項５】エピカテキンとカフェインを含有する抗ストレス効果を高めたチョコレート。
【請求項６】エピカテキンとカフェインの配合比率が１０：１０から１０：５の重量比率であることを特徴とする請求項５に記載の抗ストレス効果を高めたチョコレート。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
【従来の技術】
高度な情報社会である現代社会においてストレスに悩む人の数は非常に増加している。更に近年の不況やリストラなどの影響もあり、平成10年の自殺者の死因別死亡順位は第6位と高いレベルに順位付けされ、前年に比較して35％も増加した。特に中高年の自殺が増えている一方で若年層の自殺も増加しており、社会問題化している。また心身症や神経症などで神経科にかかる患者も増加傾向にある。この様な自殺やうつ病あるいは心身症の発症には心理的ストレスにより惹起される不安、恐れ、悲しみ、緊張などの情動変化が関わっていることは周知のことである。このような心理的ストレスや身体的ストレスに対して、予防および適応形成を促進する効果ある物質としてカカオに含まれるカカオポリフェノール類が有効であることが特開平9-206026に開示されている。しかしながら、特開平9 -206026はポリフェノール類とカフェインとの併用投与による抗ストレス効果については何ら言及していない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
【課題を解決するための手段】前記課題を解決する手段として鋭意研究の結果、エピカテキンとカフェインを併用することにより、恐怖条件付けストレス試験法により評価される抗ストレス効果を発揮する物質と抗ストレス効果を賦与した組成物を発明するに至った。本発明は以下に示すものである。
（１）  エピカテキンとカフェインを配合して得る抗ストレス効果を高めた組成物。
（２）  エピカテキンとカフェインの配合比率が１０：１０から１０：５の重量比率であ
ることを特徴とする（１）に記載の抗ストレス効果を高めた組成物。
（３）  エピカテキンとカフェインを含有する抗ストレス効果を高めたキャンディー。
（４）  エピカテキンとカフェインの配合比率が１０：１０から１０：５の重量比率であ
ることを特徴とする（３）に記載の抗ストレス効果を高めたキャンディー。
（５）  エピカテキンとカフェインを含有する抗ストレス効果を高めたチョコレート。
（６）  エピカテキンとカフェインの配合比率が１０：１０から１０：５の重量比率であ
ることを特徴とする（５）に記載の抗ストレス効果を高めたチョコレート。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の内容について以下説明する。恐怖条件付けストレス試験法としては日本薬理学会誌１１３巻、p.１１３（１９９９）（亀井浩行、野田幸裕、鍋島俊隆）に開示の方法を用いて実施した。即ち、電気ショックを動物に与え、再び該電気ショックを受けた場所に置かれると、再び電気ショックを受けなくてもその場にじっとすくんでしまう。この動物のすくみ行動は、動物が過去に電気ショックを受けた環境がストレス要因となる。このストレス試験法は条件情動反応の一つで恐怖条件付けストレス反応といわれる。そして、該反応を用いたストレス試験法が恐怖条件付けストレス試験である。
人の不安や、恐怖、などの情動の変化は条件付けや学習性のものが多いことから、該恐怖条件付けストレス反応は人の精神的なストレス状態を反映した動物モデル試験法と記載している。更に恐怖条件付けストレス試験は単にヒトの心理的ストレスモデルとなるばかりではなく、既存の抗不安薬や抗うつ薬に抵抗性を示すストレス関連精神疾患の発症機序の解明やそれらの治療薬の開発において有用なモデルの一つであると開示している。本発明者等はポリフェノール類の一種であるエピカテキンとカフェインの併用投与による抗ストレス効果を前記恐怖条件付けストレス試験法により評価した。
具体的には行動量および無動時間を測定する計測室の床にステンレス棒を格子状に配置し、該ステンレス棒に電気刺激発信部を接続して電気刺激装置とし、これを用いて行動量および無動時間の測定に供した。この計測室内にマウスを一匹入れ、四肢に電気刺激を所定時間与え、しかる後、該マウスを通常の飼育ケージにもどし、24時間後に再度、先に使用した行動量および無動時間を測定する為の計測室に戻し、電気刺激を与えることなく、マウスの行動量および無動時間を測定した。
本発明の抗ストレス組成物の抗ストレス効果を確認するために下記の実験方法により抗ストレス効果試験を実施した。
１.試験方法
本試験の電気刺激装置はダイアメディカルシステム社製電気刺激装置（DPS-165B）に電気刺激発生器を接続して用いた。試験には7週齢のＩＣＲ系雄性マウスを試験区一群毎8匹のマウスを用いて試験を行った。試験測定は1匹ずつ実施した。マウスを該電気刺激装置に静かに入れ、床面に格子状に配列したステンレス棒に電気刺激発生器を接続し、電気ショックを与えた。該電気刺激装置には行動量および無動時間の計測室が設置されており、該計測室は床に直径３ｍｍのステンレス棒が１.２ｃｍ間隔で格子状に配置され、内側は黒色の円筒（直径２０ｃｍ、高さ４０ｃｍ）型から成っている。該計測室の中央にマウスを静かに入れ、四肢に1秒間、直流電流1mAを１０秒間隔で通電する条件で6分間与えた。該電気刺激を負荷したマウス（ストレス試験区群）は直ちに飼育ケージに戻した。またこれとは別に電気刺激を与えないマウス（非ストレス試験区群）による試験区を設けた。すなわち、非ストレス試験区群はストレス試験区群と同様にマウスを電気刺激装置に6分間入れるが、電気刺激は与えず、直ちに飼育ケージに戻した。どちらの試験区群も24時間後にマウスを電気刺激装置に再び戻し、電気刺激を与えることなく行動量と無動時間を6分間測定した。マウスの行動量および無動時間はニューロサイエンス社製ビデオイメージモーションアナライザーを用いて測定した。無動時間とは６分間当たりのマウスの停止時間と動作速度が４ｃｍ／秒以下の行動時間と動作が１秒未満の行動時間の総和を言い、行動量とは６分間当たりのマウスの体位の移動距離の総和を言う。試験投与するエピカテキン及び／又はカフェインより成る試料量はその増強効果を確認するため、それぞれマウス体重1ｋｇあたりの上記試料量の投与量を変化させ、行動量と無動時間の測定を実施した。投与する試料は上記投与量に応じたエピカテキンとカフェインを1重量％のカルボキシルメチルセルロースを含む水溶液に分散、懸濁し、試験３０分前にゾンデにより胃内直接投与した。３０分及び上記６分という時間は予備実験により行動の差が現われる経過時間であることを確認し、設定した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
２．試験結果
上記試験結果を表１に示した。
対照群として１重量％のカルボキシメチルセルロースのみを含む水溶液を経口投与したマウスの場合には、前日に電気刺激を受けたマウスは受けなかったマウスに比べて顕著な行動量の低下および無動時間の増加を示した。
マウスに電気刺激を与えた後に飼育ケージに戻し、24時間経過後に再度同じ電気刺激を与えた装置に入れるが、今度は電撃を与えない恐怖条件付けストレス試験区に於いて1重量％のカルボキシルメチルセルロースを含む水溶液のみを投与した群をストレス試験区対照群とした。非ストレス試験区群、ストレス試験区対照群、ストレス試験区群の各試験区に於ける行動量と無動時間の計測値の平均値をストレス試験区対照群の計測値の平均値で除し、該値を１００倍した数値を行動量指数、無動時間指数として表示した。それ故、ストレス試験区対照群の上記二つの指数は１００となり、これを基準値とした。この結果、一回も電気刺激を与えなかった非ストレス試験区の行動量指数は１７７となり、無動時間指数は１３となった。この試験結果から、本試験装置が正常に恐怖条件付けストレスを与えることを確認し、各種試験区について試験を実施した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
製造例１
エピカテキン素材を得るためにエピカテキン０．１０９重量％，カフェイン０．０４２重量％を含有するカカオマス（ＬＮビターチョコレート（明治製菓（株）製））１７０重量部を通常の脱脂プレス装置を使用して、カカオ脂含量１２重量％の脱脂カカオマス１００重量部を得た。該脱脂カカオマスを通常ココア製造に使用する破砕機にて粉砕し、脱脂カカオマス粉末を得た。該脱脂カカオマス粉末１００重量部と５０重量％エタノール水溶液５００重量部を抽出器（サニタリータンク；（株）精研舎製）に投入し、攪拌し、混合、分散、溶解し、50℃で1時間抽出した。かくして得たカカオエキス抽出液をその後、遠心分離機（スクリュウデカンタ；国産精工（株）製）を用いて３,０００Ｇで分離して得た分離抽出液を精密濾過器（ウルトラフィルター；ミウラ化学装置（株）製）で２０℃で濾過し、カカオエキス濾過抽出液を得た。かくして得た、カカオエキス濾過抽出液を真空凍結乾燥機（大川原製作所製-SF-05型）で２０Pa，−５０℃で真空凍結乾燥し、粉砕し、カカオポリフェノールエキス粉末１２重量部を得た。該カカオポリフェノールエキス粉末のエピカテキン含有量は１．５４重量％であり、カフェイン含有量は０．５９重量％であった。該カカオポリフェノールエキス粉末をエピカテキン素材粉末とした。一方、薬局方天然カフェイン０．４３重量部を澱粉分解物（マックス２０００；松谷化学（株）製）９９．７２重量部と混合して均一に分散し、カフェイン素材粉末とした。かくして得た、エピカテキン素材粉末とカフェイン素材粉末を等量づつ配合、混合し、本発明のエピカテキン０．７７重量％、カフェイン０．５１重量％の抗ストレス可食性組成物を得た。
実施例２
砂糖５３重量部、麦芽水飴（水分２５重量％）４８重量部、水１８重量部を攪拌機・ジャケット付きケットルに投入し、ジャケットにゲージ圧0.6ＭＰａの蒸気を通して加熱し、溶解し、１４５℃に煮詰め、キャンディー生地を得た。該キャンディー生地９１．３重量部に前記の抗ストレス可食性組成物８．７重量部をニーダーにて混練して、均一に混合、分散し、９０℃に冷却し、スタンピング成型機にて、一粒４．５ｇの抗ストレス可食性組成物入りキャンディーを得た。該抗ストレス可食性組成物入りキャンディー５粒を喫食することにより、エピカテキン15ｍｇ、カフェイン10mgが摂取される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
実施例３
下記、配合量により、配合したチョコレート原料をミキサーにて混合、均質化し、しかる後、チョコレート製造工程で使用するレファイナーにより、チョコレート原料を微粒化し、得たフレーク状チョコレート生地をコンチェに投入し、４０時間コンチング処理し、チョコレート生地を得た。該チョコレート生地をデポジッターにて型に一定量を注入し、冷却、固化して板チョコレートを製造した。なお以下の実施例中の数値の単位は全て重量部である。かくして、１００ｇ当たり、エピカテキン２１．８ｍｇ、カフェイン１４．５ｍｇを含有するチョコレートが得られた。
砂糖                      41.5539
ＬＮビターチョコレート    20.0000 (エピカテキン109mg，カフェイン42mg含有）
全脂粉乳                  16.5000
カカオバター              21.5000
レシチン                   0.4000
薬局方天然カフェイン       0.0061
クローブバニラ             0.0400
（全量）                 100.0000