【手続補正書】
【提出日】平成20年6月23日(2008.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分解酵素活性の評価方法であって、
ユビキチン、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）および第一ポリペプチドのＣ末端で切断するタンパク質分解酵素によって切断されるアミノ酸配列を有するそれらのＣ末端セグメントからなる群より選択されるポリペプチドを含む第一のポリペプチド、および検出のために必要とされる遊離Ｎ末端アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む第二のポリペプチドを含有する融合ポリペプチドであり、該第一および第二のポリペプチドが第一のポリペプチドのＣ末端と第二のポリペプチドのＮ末端とを介して互いに動作可能に連結されている融合ポリペプチドを供給すること；
該融合ポリペプチドを該タンパク質分解酵素と接触させ、切断された第一のポリペプチドおよび切断された第二のポリペプチドを生産すること；
切断された第二のポリペプチドの量もしくは活性のいずれかと関連するシグナルを検出すること；および
切断された第二のポリペプチドのシグナルとタンパク質分解酵素の活性との相関関係を確立すること
を含む方法。
【請求項２】
０％および１００％切断シグナルを参照することにより各酵素またはサンプルの切断シグナルを正規化すること、および各酵素またはそのサンプルにタンパク質分解酵素活性値を付与することをさらに含み、得られた酵素活性がカットオフ値より下である場合、酵素またはサンプルは不活性であり、カットオフ値より上である場合、それは活性であると判断され得る請求項１記載の方法。
【請求項３】
１００％および０％切断シグナルを得るため、タンパク質分解酵素活性の完全切断および完全阻害に関して、接触、検出および確立工程を繰り返すことによって、０％および１００％切断シグナルが得られる請求項２記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、生理学的流動体、組織サンプル、細胞または細胞分画を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
タンパク質分解酵素活性調節因子を含むことが推測されるサンプルの存在下で、接触、検出および確立工程を繰返すこと；および
サンプルシグナルとサンプルの非存在下で得られる対応の酵素活性シグナルとを参照することによりタンパク質分解酵素活性におけるサンプルの影響に関する値を決定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
接触、検出、確立および決定工程が、タンパク質分解酵素活性調節因子を含むことが推測される複数のサンプルについて別個に行われ、タンパク質分解酵素活性に対するサンプルの影響に関する値を得る請求項５記載の方法。
【請求項７】
各サンプルおよび対照について得られる情報を収集、処理および報告する請求項６記載の方法。
【請求項８】
ユビキチン、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）および第一ポリペプチドのＣ末端で切断するタンパク質分解酵素によって切断されるアミノ酸配列を有するそれらのＣ末端セグメントからなる群より選択されるポリペプチドを含む第一のポリペプチド、および検出のために必要とされる遊離Ｎ末端アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む第二のポリペプチドを含有する融合ポリペプチドであり、該第一および第二のポリペプチドが第一のポリペプチドのＣ末端と第二のポリペプチドのＮ末端とを介して互いに動作可能に連結されている融合ポリペプチドを供給すること；
切断が起こるのに有効な条件下で、融合ポリペプチドを、該タンパク質分解酵素と接触させ、切断された第一のポリペプチドおよび切断された第二のポリペプチドを生産すること；
１００％切断シグナルを得るために、切断された第二のポリペプチドの量に関連するシグナルを検出すること；
０％切断シグナルを得るためにタンパク質分解酵素活性の完全阻害因子の存在下で、接触および検出工程を繰り返すこと；
１組の化合物を提供すること；
切断シグナルを得るために各化合物の存在下で、融合ポリペプチドの接触および検出工程を個別に繰り返すこと；
０％および１００％切断シグナルを参照することにより、各化合物切断シグナルを正規化すること、および各化合物にタンパク質分解酵素活性値を付与すること
を含む、タンパク質分解活性におけるそれらの効果について化合物をスクリーニングする方法。
【請求項９】
０％および１００％切断シグナルの代わりに、１点切断対照シグナルを得るため、既知タンパク質分解酵素活性調節因子を用いて接触および検出工程を行うこと；
該調節因子の非存在下で得られる対応する酵素活性値を参照することにより、タンパク質分解酵素活性値を決定すること；および
対照切断シグナルを参照することにより、各化合物の切断シグナルを正規化し、各化合物にタンパク質分解酵素活性値を付与すること
を含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
カットオフ値が、５０％タンパク質分解酵素活性であり、化合物の存在下での酵素活性が少なくとも５０％まで減少する場合、前記化合物は阻害因子であり、そして酵素活性が少なくとも５０％まで増強される場合、前記化合物はエンハンサーであると判断されうる請求項８記載の方法。
【請求項１１】
酵素活性を５０％まで阻害する化合物濃度（ＩＣ50）および／または増強する化合物濃度（ＥＣ50）を決定すること；および
該化合物のＩＣ50および／またはＥＣ50を比較して、阻害因子および／またはエンハンサーとしてのその酵素活性強度を評価することをさらに含む請求項８記載の方法。
【請求項１２】
調節因子が、タンパク質分解酵素活性アクチベーターを含む請求項８記載の方法。
【請求項１３】
調節因子が、タンパク質分解酵素活性阻害因子を含む請求項８記載の方法。
【請求項１４】
正規化工程が、酵素活性切断値の曲線を参照することにより各酵素またはサンプル切断シグナルを正規化し、各その酵素またはサンプルにタンパク質分解酵素活性を付与することによって行われ、得られた酵素活性がカットオフ値より下である場合、酵素またはサンプルは不活性であり、カットオフ値より上である場合、それは活性であると判断され得る請求項２または８記載の方法。
【請求項１５】
第一のポリペプチドが、ユビキチン、ＳＵＭＯ、Ｎｅｄｄ８、ＩＳＧ１５、Ａｐｇ８、Ａｐｇ１２、ＦＡＴ１０、Ｕｒｍ１、Ｈｕｂ、ＵＢｉ、Ｒｕｂ１、ＩＳＧ１５、またはＣ末端にαへリックス１およびβストランド３を連結する第一のポリペプチドのループ内のアミノ酸を含み、タンパク質分解酵素によって切断されるアミノ酸配列を有するそれらのＣ末端セグメントを含む請求項１または８記載の方法。
【請求項１６】
第二のポリペプチドが、レポータータンパク質、抗原、転写因子またはそれらの機能性フラグメントを含み；および／または
第一のポリペプチドが、ユビキチン、ＵＢＬ、またはＣ末端にαへリックス１およびβストランド３を連結するループ内のアミノ酸を含み、タンパク質分解酵素によって切断されるアミノ酸配列を有するそれらのＣ末端セグメントを含む
請求項１または８記載の方法。
【請求項１７】
第一のポリペプチドのＣ末端にαへリックス１およびβストランド３を連結するループ内のアミノ酸を含む第一のポリペプチドのＮ末端セグメント、または該第一のポリペプチドのＣ末端セグメントと完全な第一のポリペプチドを形成する残りのアミノ酸セグメントであって、第一結合パートナーおよび第二結合パートナーの一方に動作可能に連結される第一のＮ末端セグメントを取得すること；および
第二結合パートナーを取得すること、
を含み、融合ポリペプチドが、第一および第二結合パートナーの結合によって切断される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
結合パートナーが、受容体および受容体結合剤を含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
受容体結合剤が、薬剤、ホルモン、抗原、リガンドまたは受容体結合活性を有するそのフラグメントを含み、受容体が、薬剤受容体、ホルモン受容体、抗体、リガンド結合受容体または結合剤結合活性を有するそれらのフラグメントを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
第一のポリペプチドのＮ−およびＣ−末端の結合が、第一のポリペプチドの立体構造の認識、およびタンパク質分解酵素によるＣ末端でのポリペプチド切断を可能にする請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
第二のポリペプチドが、タンパク質分解酵素切断により検出可能となる請求項１または８記載の方法。
【請求項２２】
第二のポリペプチドが、それが伝達するシグナルの活性化により、および／または検出可能なシグナルに結合するかまたはそれを発生することにより検出可能になる請求項１または８記載の方法。
【請求項２３】
検出可能なシグナルが、放射活性、蛍光、リン光、色素原、超音波、化学発光シグナルを含む請求項１または８記載の方法。
【請求項２４】
第一および第二のポリペプチドが、互いに共有結合で連結されている請求項１または８記載の方法。
【請求項２５】
第一および第二のポリペプチドが、リンカーを介して動作可能に連結されている請求項１または８記載の方法。
【請求項２６】
リンカーが、少なくとも１つのアミノ酸を含む請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
融合ポリペプチドが、融合タンパク質を含む請求項１または８記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質分解酵素が、イソペプチダーゼまたはイソペプチダーゼ活性を有するその機能性フラグメントを含む請求項１または８記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質分解酵素が、ユビキチンＣ末端加水分解酵素、ユビキチン特異的プロテアーゼまたは加水分解酵素もしくはユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有するその機能性フラグメントを含む請求項１または８記載の方法。
【請求項３０】
タンパク質分解酵素が、ＵＬＰ１、ＵＬＰ２、ＳＥＮＰ１、ＳＥＮＰ２、酵母ＹＵＨ１、哺乳類ＵＣＨＬ１、ＵＣＨ−Ｌ３、ＵＣＨ３７、Ｂａｐ１、ＵＳＰ−Ｍ、ＵＳＰ７、ＵＮＰ、ＣＹＬＤ、ＣＹＬＤ１、ＫＩＡＡ０８４９、ＵＳＰ９Ｘ、ＤＦＦＲＸ、ＵＳＰ９、ＦＡＦＸ、ＵＳＰ９Ｙ、ＤＦＦＲＹ、ＵＳＰ１０、ＦＡＦＹ、ＯＴＵＢ１、ＯＴＢ１、ＯＴＵ１、ＨＳＰＣ２６３、ＯＴＵＢ２、Ｃ１４ｏｒｆ１３７、ＯＴＢ２、ＯＴＵ２、ＫＩＡＡ０１９０、ＵＳＰ１１、ＵＨＸ１、ＵＳＰ１２、ＵＢＨ１ｍ、ＵＳＰ１２Ｌ１、ＵＳＰ１３、ＩＳＯＴ３、ＵＳＰ１４、ＴＧＴ、ＵＳＰ１５、ＫＩＡＡ０５２９、ＵＳＰ１６、ＵＢＰＭ、ＵＳＰ１８、ＵＢＰ４３、ＵＳＰ１９、ＫＩＡＡ０８９１、ＺＭＹＮＤ９、ＵＳＰ２０、ＫＩＡＡ１００３、ＬＳＦＲ３Ａ、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２３、ＮＥＤＤ８特異的プロテアーゼ、ＵＳＰ２２、ＫＩＡＡ１０６３、ＵＳＰ２４、ＫＩＡＡ１０５７、ＵＳＰ２５、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ２９、ＵＳＰ３０、ＵＳＰ３２、ＵＳＰ３３、ＫＩＡＡ１０９７、ＶＤＵ１、ＵＳＰ３５、ＫＩＡＡ１３７２、ＵＳＰ３４、ＵＳＰ３６、ＫＩＡＡ１４５３、ＵＳＰ３７、ＫＩＡＡ１５９４、ＵＳＰ３８、ＫＩＡＡ１８９１、ＵＳＰ４０、ＵＳＰ４２、ＵＳＰ４４、ＵＳＰ４６、ＵＳＰ４９、ＵＳＰ５１、ＵＢＰ１、ＵＳＰ１、ＵＢＰ２、ＵＳＰ２、ＵＢＰ４１、ＵＢＰ３、ＵＳＰ３、ＵＢＰ４、ＵＳＰ４、ＵＮＰＨ、ＵＢＰ５、ＵＳＰ５、ＩＳＯＴ、ＵＢＰ６、ＵＳＰ６、ＴＲＥ２、ＵＢＰ７、ＵＳＰ７、ＨＡＵＳＰ、ＵＢＰ８、ＵＳＰ８、ＫＩＡＡ００５５、ＵＢＰＹ、ＶＣＩＰ、ＶＣＩＰ１３５、ＫＩＡＡ１８５０、セザンヌ１、セザンヌ２、Ａ２０、ＵＣＨ−Ｌ１、パーク５、ＵＣＨ−Ｌ５、ＵＣＨ−３７、ＡＴＸＮ３、ＡＴＸ３、ＭＪＤ、ＭＪＤ１、ＳＣＡ３、ＰＯＨ１、ＰＳＭＤ１４、ＣＳＮ５、ＣＯＰＳ５、ＪＡＢ１、ＳＥＮＰ３、ＳＳＰ３、ＳＵＳＰ３、ＳＥＮＰ５、ＦＫＳＧ４５、ＳＥＮＰ６、ＦＫＳＧ６、ＫＩＡＡ０７９７、ＳＳＰ１、ＳＵＳＰ１、ＳＥＮＰ７、ＫＩＡＡ１７０７、ＳＳＰ２、ＳＵＳＰ２、ＳＥＮＰ８、ＦＫＳＧ８、ＰＲＳＣ２、ＤＵＢ１、ＤＵＢ２、ＤＵＢ３、ＤＵＢ４、および全長タンパク質の活性を有するそれらの機能性フラグメントからなる群より選択されるタンパク質を含む請求項１または８記載の方法。
【請求項３１】
第二のポリペプチドが、セリンプロテアーゼ、プロホルモン前駆体、サブチリシン／ケクシン様プロホルモン変換酵素、カルボキシペプチダーゼ、トロンボスポンジンＩ型モチーフを有するジスインテグリン様およびメタロプロテアーゼドメイン（レプロリシン型）（ＡＤＡＭＴＳ）、ジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン（ＡＤＡＭ）、システインアスパラターゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ末端求核原子（Ｎｔｎ）加水分解酵素、４−オキサロクロトン酸互変異性化酵素、コリスミン酸シンターゼ、β−ラクタムアシラーゼ、逆転写酵素、ホスホリパーゼ、転写因子、ならびに全長タンパク質の活性を有するそれらの機能性フラグメントからなる群より選択されるタンパク質を含む請求項１または８記載の方法。
【請求項３２】
第二のポリペプチドが、ウイルス性逆転写酵素、シグマ転写因子、グルタミンホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）アミドトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴａｓｅ）、凝固因子Ｘａ、３ＤｐｏｌＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、グルタミン５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、逆転写酵素、コリスミン酸シンターゼ、トリプターゼ、キマーゼ、エンテロキナーゼ、転写因子σK、トロンビン、ジペプチジルペプチダーゼ、ＨｔｒＡ２、ニューロフィシン、バソプレシン、フリン、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ、ｖＷＦ−切断プロテアーゼ／ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭ１、ＡＤＡＭ２、カスパーゼ、ペプシン、レニン、カテプシンＤ、マソン−ファイザー・サルウイルスプロテイナーゼ、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２６、グリコシルアスパラギナーゼ、２０Ｓプロテアソームβサブユニット、グルタミンＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ、ＹｄｃＥ、ＹｗｈＢ、セファロスポリンアシラーゼ、ＣａＭＶ逆転写酵素、ホスホリパーゼＡ2、および全長タンパク質の活性を有するそれらの機能性フラグメントからなる群より選択されるタンパク質を含む請求項１または８記載の方法。
【請求項３３】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現に有効な条件下で、該ポリヌクレオチドを発現することをさらに含む請求項１または８記載の方法。
【請求項３４】
ポリヌクレオチドが、真核生物の細胞、またはその分画あるいは抽出物に発現される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
融合タンパク質を単離し、任意には、該融合タンパク質を精製することをさらに含む請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上の工程が、インビトロ、インビボ、エキソビボ、細胞もしくは組織培養物内、または細胞もしくは組織抽出物上で行われる請求項１または８記載の方法。
【請求項３７】
検出工程が、細胞増殖の、または色素原、放射性、蛍光、リン光もしくは化学発光シグナルの検出を含む請求項１または８記載の方法。
【請求項３８】
自動化されている請求項６または８記載の方法。
【請求項３９】
各サンプルおよび対照について得られる情報を収集、処理および報告する請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
ユビキチン、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）および第一ポリペプチドのＣ末端で切断するタンパク質分解酵素によって切断されるアミノ酸配列を有するそれらのＣ末端セグメントからなる群より選択されるポリペプチドを含む第一のポリペプチド、および検出のために必要とされる遊離Ｎアミノ酸末端を有するアミノ酸配列を含む第二のポリペプチドを含み、第一および第二のポリペプチドが、第一のポリペプチドのＣ末端および第二のポリペプチドのＮ末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリペプチド；および
タンパク質分解酵素アッセイを行い、切断された第二のポリペプチドの量または活性に関連したシグナルを検出し、そして切断された第二のポリペプチドの検出されるシグナルとタンパク質分解酵素活性との相関関係を確立するための取扱説明書；および
任意には、ＵＢＬのＣ末端で切断された第一のポリペプチドおよび切断された第二のポリペプチドを生産するタンパク質分解酵素源
を含むタンパク質分解酵素活性を評価するためのキット。
【請求項４１】
ユビキチン、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）および第一ポリペプチドのＣ末端で切断するタンパク質分解酵素によって切断されるアミノ酸配列を有するそれらのＣ末端セグメントからなる群より選択されるポリペプチドを含む第一のポリペプチド、および検出のために必要とされる遊離Ｎアミノ酸末端を有するアミノ酸配列を含む第二のポリペプチドを含み、第一および第二のポリペプチドは、第一のポリペプチドのＣ末端および第二のポリペプチドのＮ末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリペプチド；および
タンパク質分解酵素アッセイを行い、切断された第二のポリペプチドの量または活性に関連したシグナルを検出し、そして切断された第二のポリペプチドの検出されるシグナルと、複数の調節因子および対照に対するタンパク質分解酵素活性との相関関係を確立するための取扱説明書；および
任意には、ユビキチンまたはＵＢＬのＣ末端で切断された第一のポリペプチドおよび切断された第二のポリペプチドを生産するタンパク質分解酵素源
を含むタンパク質分解酵素活性調節因子スクリーニングキット。
【請求項４２】
第一および第二の結合パートナーであり、第一のパートナーが、ＵＢＬのＮ末端セグメントに動作可能に連結され得、および第一および第二の結合パートナーが互いに結合し、ＵＢＬのＣ末端セグメントが、ＵＢＬの立体構造を可能にするＵＢＬのＮ末端セグメントに結合するとき、タンパク質分解酵素が融合ポリペプチドを切断する、結合パートナー；
酵素切断工程を行うための試薬；
検出工程を行うための手段；および
検出可能なシグナルを、タンパク質分解酵素活性またはその変化と相互に関連させるための手段
の１つ以上をさらに含む請求項４０または４１記載のキット。
【請求項４３】
融合ポリペプチドが融合タンパク質を含み；
キットがさらに、
該融合ポリペプチドに代わる該融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチド；および
任意には、１つ以上の
ポリヌクレオチドを発現するための試薬；および／または
融合タンパク質の代わりに使用される場合、ポリヌクレオチドを発現するための細胞またはその細胞分画もしくは抽出物
を含む請求項４０または４１記載のキット。
【請求項４４】
複数のサンプルを別個に含有するための手段；および
アッセイを自動的に行うための取扱説明書
をさらに含む請求項４０または４１記載のキット。
【請求項４５】
各サンプルについてのデータを自動的に処理するための手段；および
その使用に関する取扱説明書
をさらに含む請求項４０または４１記載のキット。
【請求項４６】
任意には、細胞、植物または動物の染色体に統合されるユビキチン−またはＵＢＬ−レポーター融合ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞、植物または動物であって、レポーターが、特定の疾患または症状もしくはそれらのファミリーと関連しているトランスジェニック細胞、植物または動物。
【請求項４７】
ユビキチンまたはＵＢＬ−レポーター融合タンパク質を発現することができる請求項４６記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
【請求項４８】
融合ポリヌクレオチドをベクターにクローニングすることによりハイブリッドベクターを形成し、細胞、植物または動物をハイブリッドベクターでトランスフェクトすることによって得られる請求項４７記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
【請求項４９】
ベクターがプラスミドを含み、細胞が真核生物の細胞を含む請求項４８記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
【請求項５０】
疾患または症状のための細胞、植物または動物モデルとしての役割を果たすようにさらに修飾されている請求項４０記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
【請求項５１】
イソペプチダーゼが、自己免疫、新生物、遺伝子突然変異、代謝、心臓血管または神経変性疾患または症状に関連している請求項５０記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
【請求項５２】
疾患または症状が、癌、狼瘡、糖尿病、ＩＢＤ、心臓血管疾患、神経変性、または炎症性疾患を含む請求項５１記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
【請求項５３】
細胞、植物または動物を取得すること；
ユビキチン−、ＵＢＬ−またはそれらのＣ末端結合機能性フラグメント−レポーター融合ポリヌクレオチドを取得すること；
ベクターに動作可能に連結したハイブリットポリヌクレオチドを担持するハイブリットベクターを取得すること；および
該ハイブリットベクターを、細胞、植物または動物に安定にトランスフェクトすること
を含む請求項４６記載のトランスジェニック細胞、植物または動物の製造方法。
【請求項５４】
融合ポリヌクレオチドが、細胞、植物または動物の染色体に統合されるようになる請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
融合ポリヌクレオチドが、融合デオキシリボヌクレオチドを含む請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
疾患または症状の診断方法であって、
レポーターが疾患または症状に関連しているものである請求項４６記載の細胞、植物もしくは動物、またはそれらの分画もしくは組織を取得すること；
該疾患および症状に罹っていることが推測される対象から得られたサンプルを、該細胞、植物または動物と接触させるか、または投与すること；
該サンプルの存在下でレポーターにより発生される任意のシグナルを検出すること；および
０％と１００％シグナルの対照と前記シグナルを比較すること
を含む方法。