【手続補正書】
【提出日】令和1年6月17日(2019.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む融合タンパク質であって、
（ａ）前記ＤＮＡ局在化成分が少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記エフェクター分子が、不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはその不活化ヌクレアーゼドメインを含み、前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１を含むか；または
（ｂ）前記ＤＮＡ局在化成分が転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のＤＮＡ結合性ドメインを含み、前記ＴＡＬＥＮが、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するものであり、前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＤＮＡ局在化成分が、２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、第１のｇＲＮＡが、二本鎖ＤＮＡ標的配列の第１の鎖に特異的に結合し、第２のｇＲＮＡが、前記二本鎖ＤＮＡ標的配列の第２の鎖に特異的に結合する、請求項１（ａ）に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ｄＣａｓ９が、不活化小型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）である、請求項１（ａ）に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１（ａ）、２または３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸であって、必要に応じて、前記核酸は、Ｔ２Ａペプチドをコードする配列をさらに含む、核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
（ａ）請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、または
（ｂ）請求項４に記載の核酸、または
（ｃ）請求項５に記載のベクター
を含む細胞。
【請求項７】
（ａ）請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、または
（ｂ）請求項４に記載の核酸、または
（ｃ）請求項５に記載のベクター、または
（ｄ）請求項６に記載の細胞
を含み、必要に応じて、薬学的に許容される担体をさらに含む組成物。
【請求項８】
（ａ）請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、または
（ｂ）請求項４に記載の核酸、または
（ｃ）請求項５に記載のベクター、または
（ｄ）請求項６に記載の細胞、または
（ｅ）請求項７に記載の組成物
を含む多細胞生物。
【請求項９】
（ａ）前記多細胞生物が植物であるか、または
（ｂ）前記多細胞生物が動物であり、必要に応じて、前記動物が、ヒトまたはヒト胚ではない、請求項８に記載の多細胞生物。
【請求項１０】
タンパク質を生物のゲノム内の特定の遺伝子座に導くためのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、ゲノムＤＮＡ配列に、請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４に記載の核酸、請求項５に記載のベクター、請求項６に記載の細胞または請求項７に記載の組成物をもたらすステップを含み、必要に応じて、前記ゲノムＤＮＡ配列が、ヒトゲノムＤＮＡ配列ではない、方法。
【請求項１１】
生物のゲノムを改変するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、ゲノムＤＮＡ配列または塩基対に、請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４に記載の核酸、請求項５に記載のベクター、請求項６に記載の細胞または請求項７に記載の組成物をもたらすステップを含む方法。
【請求項１２】
前記もたらすステップが、ゲノム配列または塩基対に、前記融合タンパク質、前記核酸、前記ベクター、前記細胞または前記組成物の少なくとも１つを接触させることを含み、必要に応じて、前記接触を、流体伝達によって実現することができる、請求項１１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの方法。
【請求項１３】
（ａ）前記ゲノム配列または塩基対がエンドヌクレアーゼの活性によって分離される、ならびに／あるいは
（ｂ）前記ゲノム配列または塩基対が欠失する、挿入される、置換される、反転する、および／または再配置する、ならびに／あるいは
（ｃ）ＤＮＡ修復機構により、欠失、挿入、置換、反転、および／または再配置が誘導される、ならびに／あるいは
（ｄ）ＤＮＡ修復機構により、欠失、挿入、置換、反転、および／または再配置が誘導され、必要に応じて、前記挿入を含むゲノム配列が、天然に存在しないものである、
請求項１２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの方法。
【請求項１４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４に記載の核酸、請求項５に記載のベクターまたは請求項６に記載の細胞を含む組成物、あるいは請求項７に記載の組成物であって、生物のゲノムを改変するための、ゲノムＤＮＡ配列または塩基対に前記融合タンパク質、前記核酸、前記ベクター、前記細胞または前記組成物をもたらすステップを含む方法において使用するための、組成物。
【請求項１５】
（ａ）前記融合タンパク質、前記核酸、前記ベクター、前記細胞または前記組成物が、ｉｎ  ｖｉｖｏで前記ゲノムＤＮＡ配列または塩基対に接触し、必要に応じて、前記ゲノムＤＮＡ配列がヒトゲノムＤＮＡ配列でない、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
（ａ）前記ゲノム配列または塩基対がエンドヌクレアーゼの活性によって分離される、ならびに／あるいは
（ｂ）前記ゲノム配列または塩基対が欠失する、挿入される、置換される、反転する、および／または再配置する、ならびに／あるいは
（ｃ）ＤＮＡ修復機構により、欠失、挿入、置換、反転、および／または再配置が誘導される、ならびに／あるいは
（ｄ）前記挿入が、外因性配列、人工配列、および／または異種配列を含み、必要に応じて、前記挿入が天然に存在しないものである
ことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１０から１３までのいずれか一項に記載の方法に従って改変されたゲノム配列を含む細胞であって、ヒト細胞またはヒト胚細胞ではない、細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
本開示は、本開示の方法により生じた改変を含む細胞を提供する。細胞またはそのゲノム配列の改変は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実施することができる。例えば、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて改変し、対象に投与することができる。ある特定の実施形態では、本開示の改変された細胞または改変されたゲノム配列は、ヒト細胞でもヒトゲノム配列でもない。ある特定の実施形態では、本開示の改変された細胞または改変されたゲノム配列は、ヒト胚細胞でもヒト胚ゲノム配列でもない。
本開示の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む融合タンパク質。
（項目２）
前記ＤＮＡ局在化成分が、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
前記ＤＮＡ局在化成分が、２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、第１のｇＲＮＡが、二本鎖ＤＮＡ標的配列の第１の鎖に特異的に結合し、第２のｇＲＮＡが、前記二本鎖ＤＮＡ標的配列の第２の鎖に特異的に結合する、項目２に記載の融合タンパク質。
（項目４）
前記ＤＮＡ局在化成分が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のＤＮＡ結合性ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目５）
前記エフェクター分子が、ホモ二量体を含む、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目６）
前記エフェクター分子が、ヘテロ二量体を含む、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目７）
前記エフェクター分子が、ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを含む、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目８）
前記エフェクター分子が、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、項目７に記載の融合タンパク質。
（項目９）
前記エフェクター分子が、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１を含む、項目７または８に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
前記エフェクター分子が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む、項目１、２、３、５、６、７または８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
前記Ｃａｓ９が、不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）または不活化ヌクレアーゼドメインである、項目１０に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
前記ｄＣａｓ９が、不活化小型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）である、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩを含む、項目１０、１１または１２に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１を含む、項目１０、１１または１２に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩを含む、項目１または４から９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１を含む、項目１または４から９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
前記ＴＡＬＥＮが、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するものである、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目１８）
前記ＴＡＬＥＮが、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓに由来するものである、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目１９）
項目１から１８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（項目２０）
項目１９に記載の核酸を含むベクター。
（項目２１）
項目１から１８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む細胞。
（項目２２）
項目１９に記載の核酸を含む細胞。
（項目２３）
項目２０に記載のベクターを含む細胞。
（項目２４）
項目１から１８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む組成物。
（項目２５）
項目１９に記載の核酸を含む組成物。
（項目２６）
項目２０に記載のベクターを含む組成物。
（項目２７）
項目２１から２３までのいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
（項目２８）
薬学的に許容される担体をさらに含む、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
項目１から１８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む多細胞生物。
（項目３０）
項目１９に記載の核酸を含む多細胞生物。
（項目３１）
項目２０に記載のベクターを含む多細胞生物。
（項目３２）
項目２１から２３までのいずれか一項に記載の細胞を含む多細胞生物。
（項目３３）
項目２４から２８までのいずれか一項に記載の組成物を含む多細胞生物。
（項目３４）
植物である、項目２９から３３までのいずれか一項に記載の多細胞生物。
（項目３５）
動物である、項目２９から３３までのいずれか一項に記載の多細胞生物。
（項目３６）
前記動物が、ヒトまたはヒト胚ではない、項目２９から３３までのいずれか一項に記載の多細胞生物。
（項目３７）
タンパク質を生物のゲノム内の特定の遺伝子座に導くための方法であって、ゲノムＤＮＡ配列に、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物をもたらすステップを含む方法。
（項目３８）
前記融合タンパク質、前記核酸、前記ベクター、前記細胞または前記組成物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて前記ゲノムＤＮＡ配列に接触する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ゲノムＤＮＡ配列が、ヒトゲノムＤＮＡ配列ではない、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
生物のゲノムを改変するための方法であって、ゲノムＤＮＡ配列または塩基対に、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物をもたらすステップを含む方法。
（項目４１）
前記もたらすステップが、ゲノム配列または塩基対に、前記融合タンパク質、前記核酸、前記ベクター、前記細胞または前記組成物の少なくとも１つを接触させることを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
接触を、流体伝達によって実現することができる、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ゲノム配列または塩基対がエンドヌクレアーゼの活性によって分離される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記ゲノム配列または塩基対が欠失する、挿入される、置換される、反転する、および／または再配置する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ＤＮＡ修復機構により、欠失、挿入、置換、反転、および／または再配置が誘導される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記挿入が、外因性配列、人工配列、および／または異種配列を含む、項目４４または４５に記載の方法。
（項目４７）
前記挿入を含むゲノム配列が、天然に存在しないものである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
項目４０から４７までのいずれか一項に記載の方法に従って改変されたゲノム配列。
（項目４９）
項目４８に記載のゲノム配列を含む細胞。
（項目５０）
前記改変が、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて起こる、項目４９に記載の細胞。
（項目５１）
ヒト細胞またはヒト胚細胞ではない、項目４９または５０に記載の細胞。