【手続補正書】
【提出日】平成20年8月5日(2008.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１７に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）配列番号１７によって表されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、
（ｃ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項３】
適切な調節配列に作動可能に結合する請求項１に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子コンストラクト。
【請求項４】
請求項３に記載のキメラ遺伝子コンストラクトを含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項５】
（ａ）配列番号１６で表される配列の一部に相当する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在するインサートを増幅すること
を含んでなり、
増幅されたインサートがカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする、カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子の取得方法。
【請求項６】
（ａ）少なくとも１つのβ−イオノンタイプ環を有する環状カロテノイドを生成する宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を
（ｉ）請求項１に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子で形質転換し、そして、
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を適切な条件下で生育させ、それによってヒドロキシル化カロテノイドを生成せしめること
を含んでなるヒドロキシル化カロテノイド化合物の製造方法。
【請求項７】
（ａ）カロテノイド生合成経路を含んでなり、少なくとも１つのβ−イオノンタイプ環を有する環状カロテノイドを生成する宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を
（ｉ）請求項１に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子で形質転換し、そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を条件下で生育させ、それによってヒドロキシル化カロテノイド生合成を制御すること
を含んでなる生物体中での環状ヒドロキシル化カロテノイド生合成の制御方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６０】
ｐＤＣＱ３４４を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０Ｇまたはメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ＭＷＭ１２００からの抽出物のＨＰＬＣ分析を図４に示す。アスタキサンチンは、ｐＤＣＱ３４４を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）中で生成された総カロテノイドのおよそ８０％を含んでなった。５．２〜５．３分で溶出したアスタキサンチンピークは４８０ｎｍの最大吸収、および５９７の分子量ｍ／ｚを有し、それはアスタキサンチンの合成標準物質のそれらと同一であった。５．８〜５．９分溶出したマイナーピークは、４６４ｎｍの吸収最大および５８３の分子量ｍ／ｚを有し、それはアドニキサンチンの合成標準物質のそれらと同一であった。合成アスタキサンチンおよびアドニキサンチン標準物質は、スイス国ルプシンゲンのカロテナチュア（ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ（Ｌｕｐｓｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））から購入した。ｐＤＣＱ３６６を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂまたはメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ＭＷＭ１２００からの抽出物のＨＰＬＣ分析を図５に示す。アスタキサンチンは、この試行で４．４〜４．６分に溶出する主カロテノイドとして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）の双方から生成した。いくつかのマイナーピークに加えて、１１．２分に溶出するピークは、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）中の総カロテノイドの１０％を含んでなった。このピークは４４８ｎｍ、４７４ｎｍ、５０４ｎｍの最大吸収、および５３６の分子量ｍ／ｚを有し、これはアスタキサンチン生合成中間体のリコペンのそれらと一致する。
なお、本発明の主たる特徴及び態様を要約すれば、以下のとおりである。
１．  （ａ）配列番号１７に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）配列番号１７によって表されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、
（ｃ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
２．  配列番号１６によって表される上記１に記載の単離された核酸分子。
３．  上記１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
４．  適切な調節配列に作動可能に結合する上記１または２に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子コンストラクト。
５．上記４に記載のキメラ遺伝子コンストラクトを含んでなる形質転換宿主細胞。
６．  宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される上記５に記載の形質転換宿主細胞。
７．  宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される上記６に記載の形質転換宿主細胞。
８．  宿主細胞がダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐｓ）、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、広葉樹、針葉樹、および牧草よりなる群から選択される上記６に記載の形質転換宿主細胞。
９．  （ａ）配列番号１６で表される配列の一部に相当する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在するインサートを増幅すること
を含んでなり、
増幅されたインサートがカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする、カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子の取得方法。
１０．  （ａ）少なくとも１つのβ−イオノンタイプ環を有する環状カロテノイドを生成する宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を
（ｉ）上記１または２に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子で形質転換し、そして、
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を適切な条件下で生育させ、それによってヒドロキシル化カロテノイドを生成せしめること
を含んでなるヒドロキシル化カロテノイド化合物の製造方法。
１１．  ヒドロキシル化カロテノイドがアスタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３'−ヒドロキシエキネノン、アドニルビン、アドニキサンチン、テトラヒドロキシ−β，β'−カロテン−４，４'−ジオン、テトラヒドロキシ−β，β'−カロテン−４−オン、カロキサンチン、エリスロキサンチン、ノストキサンチン、フレキシキサンチン、３−ヒドロキシ−γ−カロテン、３−ヒドロキシ−４−ケト−γ−カロテン、バクテリオルビキサンチン、バクテリオルビキサンチナール、およびルテインよりなる群から選択される上記１０に記載の方法。
１２．  環状カロテノイドがβ−カロテン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３'−ヒドロキシエキネノン、エキネノン、アドニルビン、γ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、デオキシ−フレキシキサンチン、およびα−カロテンよりなる群から選択される上記１０に記載の方法。
１３．  形質転換された宿主が細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される上記１０に記載の方法。
１４．  形質転換宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される上記１３に記載の方法。
１５．  形質転換宿主細胞がダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、広葉樹、針葉樹、および牧草よりなる群から選択される上記１３に記載の方法。
１６．  形質転換宿主細胞がメチロトローフである上記１３に記載の方法。
１７．  メチロトローフがメタノトローフである上記１６に記載の方法。
１８．  メタノトローフがメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）である上記１７に記載の方法。
１９．  （ａ）カロテノイド生合成経路を含んでなり、少なくとも１つのβ−イオノンタイプ環を有する環状カロテノイドを生成する宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を
（ｉ）上記１または２に記載の核酸分子、および
（ｉｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子で形質転換し、そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を条件下で生育させ、それによってヒドロキシル化カロテノイド生合成を制御すること
を含んでなる生物体中での環状ヒドロキシル化カロテノイド生合成の制御方法。
２０．  カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子が上方制御される上記１９に記載の方法。
２１．  カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子がマルチコピープラスミド上で過剰発現する上記２０に記載の方法。
２２．  カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子が、誘導可能プロモーターまたは制御プロモーターに作動可能に結合する上記２１に記載の方法。
２３．  カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子が下方制御される上記１９に記載の方法。
２４．  カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子がアンチセンス方向で発現される上記１９に記載の方法。
２５．  カロテノイドヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸分子がコード領域への外来性ＤＮＡの挿入によって中断される上記１９に記載の方法。