(57)【要約】  本発明は、生物化学分野の微分干渉顕微鏡観察に使用されるプレートであって、波長３００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の波長領域における光の透過率が８０％以上であり、かつ、複屈折による波長６３３ｎｍの光の位相差（リタデーション）が３０ｎｍ以下であることを特徴とする生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される樹脂製プレートである。また、前記樹脂製プレートは、面積が１ｍｍ２以下で、かつ、深さが１０μｍ以上の空間構造を表面に複数有することが好適である。  また、上記の樹脂製プレートは、基板上にレジストパターンを形成するステップと、基板上に形成されたレジストパターン、又はその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂製プレートの凹凸パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体の凹凸パターンを転写して樹脂製プレートを形成するステップとを備えた製造方法によって得られる。
2007077899.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長３００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の波長領域における光の透過率が８０％以上であり、かつ、複屈折による波長６３３ｎｍの光の位相差（リタデーション）が３０ｎｍ以下であることを特徴とする生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される樹脂製プレート。
【請求項２】
厚みが、０.０２ｍｍ〜０．３ｍｍの範囲であることを特徴とする生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される請求項１に記載の樹脂製プレート。
【請求項３】
面積が１ｍｍ２以下で、かつ、深さが１０μｍ以上の空間構造を表面に複数有することを特徴とする請求項１または２に記載の樹脂製プレート。
【請求項４】
生物化学分野において微分干渉顕微鏡測定に使用される請求項３に記載の樹脂製プレートを製造する方法であって、
基板上にレジストパターンを形成するステップと、基板上に形成されたレジストパターン、又はその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂製プレートが有する凹凸パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、
前記金属構造体の凹凸パターンを転写して樹脂製プレートを形成するステップとを備えたことを特徴とする生物化学分野において微分干渉顕微鏡測定に使用される樹脂製プレートの製造方法。
【請求項５】
前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、レジストパターンを形成するステップが、レジスト層が所望の高さ、又は深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップを含むことを特徴とする請求項４記載の樹脂製プレートの製造方法。
【請求項６】
前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、露光における各層のパターンの位置が同じ位置になるように、パターンの位置を合わせるマスク位置合わせステップをさらに備えることを特徴とする請求項４または５記載の樹脂製プレートの製造方法。
【請求項７】
前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、異なるパターンのマスクを用いることで、少なくとも２以上の異なる深さの凹部を備えるレジストパターンが形成されることを特徴とする請求項４または５に記載の樹脂製プレートの製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載の樹脂製プレートを底面に備えた細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物化学分野で用いられる微分干渉顕微鏡観察において好適な樹脂製プレートおよびその製造方法に関するものである。また、該樹脂製プレートを備える細胞培養容器。
【背景技術】
【０００２】
生物化学関連用途で使用される生物顕微鏡においては、細胞へのダメージや蛍光褪色を抑えるために、必要最小限の弱い励起光で明るくコントラストの良い蛍光観察ができることが必要となる。微弱な蛍光シグナル（Ｓ）を観察するためには、目的以外の光ノイズ（Ｎ）を少なくすることが重要であり、それらの比Ｓ／Ｎが大きいほどよりコントラストの良い蛍光観察が可能となる（特許文献１参照）。【０００３】
生物化学関連用途の観察対象は、線虫などの厚いものから培養細胞などの薄いものまで厚さはさまざまである。細胞へのダメージや蛍光褪色を抑えるため、厚い標本の細部を見ること、薄い標本をコントラスト良く見ることなど、偏光顕微鏡、微分干渉顕微鏡への要求が拡がっている。【０００４】
光源の前に２枚の偏光板をクロスニコル（透過できる光の振動方向が９０゜違う）の関係で置くと、光源からの光は透過せず黒く見える。ここで前記２枚の偏光板の間に標本を置くと、標本によっては光の振動方向が回転するため、透過光が見えるようになる場合がある。これを顕微鏡に組み込んだものが偏光顕微鏡となる。微分干渉顕微鏡は、無染色の標本を光が通過する際の屈折率の違いや、標本表面の形状による光路差(光の進み方の違い)を、明暗のコントラストに変えて観察することができる。また、特殊なプリズムを使用し、照明光を２つの光線に分け、これらの光の干渉によって生ずる干渉色や明暗のコントラストで、試料を浮き出すような立体感で見ることができる。【０００５】
微分干渉顕微鏡において顕微鏡光源からの光は、偏光子で光の振動方向が揃えられ、微分干渉素子を通る際、振動方向が直行する２つの成分に分けられる。２つに分けられた光は、標本の異なる場所を通過する。その際、２つの光束の間に位相のずれが生じる。位相がずれた２つの光を干渉させることで観察像にコントラストを生じさせ、標本の微細構造観察することが可能となる。すなわち、生きた微生物や透明な試料でも染色しないで観察できるので、医学や生物学など生物化学関連の分野で多く使用されている。【０００６】
微分干渉顕微鏡は、偏光を利用した光学系である。このため、標本の支持板として光学的歪が大きい通常のプラスチック材料を使用した場合、標本によるものとは異なる原因により観察光の偏光状態が影響を受けるため、微分干渉のコントラストが著しく低下する。したがって、従来プラスチック材料は標本の支持板としては使用できないという問題を有していた。【０００７】
このため、微分干渉観察を行う場合は、ガラスシャーレまたは底部にカバーガラスを貼り付けた市販のガラスボトムシャーレが使用されている。ガラスシャーレは、高額であることに加え、その底面の板厚が、例えば０．５ｍｍ〜１ｍｍと厚いため、高倍率観察を行う際にシャーレ底面に対物レンズが接触する問題を有していた。市販のガラスボトムシャーレは、プラスチック製シャーレの底面に、例えば０．１ｍｍ〜０．５ｍｍのカバーガラスを貼り付けたものである。【０００８】
薄い板厚のカバーガラスを使用することで高倍率観察が可能になる反面、プラスチックにカバーガラスを張り合わせるには、その融点が異なるため、高度な融着技術が必要となり、その価格は高額となり実用化には適さない問題を有していた。一方、接着剤を使用すると、プラスチックとカバーガラスの接着は容易となるが、接着剤に含まれる溶剤が培養液に溶出し、細胞への毒性を示す場合があるため使用には適さない。【０００９】
【特許文献１】特開２００３−１２１４４２公報、段落００７３〜００８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記したように、スライドガラスを樹脂製プレートに置き換えようとすると、測定波長の光が樹脂製プレートを透過しない、偏光が乱れるなどのために、生物化学分野における微分干渉顕微鏡観察に使用できないという課題がある。【００１１】
また、微細凹凸パターンを有するガラス製プレートを、樹脂製プレートに変更しようとすると、測定波長の光が樹脂製プレートを透過しない、偏光が乱れるなどのために、生物化学分野における微分干渉顕微鏡観察に使用できないという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで、本発明者らは、上記の問題を解決するために鋭意検討した結果、光、特に紫外線の透過率および複屈折による波長６３３ｎｍの光の位相差（以下、これを単にリタデーションと称する。）を一定範囲内とすることで、微分干渉顕微鏡観察を目的とした生物化学分野に使用される樹脂製プレートとして好適なものが得られることを見出して本発明を完成した。【００１３】
すなわち本発明は、波長３００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の波長領域における光の透過率が８０％以上であり、かつ、複屈折による波長６３３ｎｍの光の位相差（リタデーション）が３０ｎｍ以下であることを特徴とする生物化学関連用途において微分干渉顕微鏡観察に使用される樹脂製プレートである。また、底面の厚みが、０.０２ｍｍ〜０．３ｍｍの範囲であってもよく、面積が１ｍｍ２以下で、かつ、深さが１０μｍ以上の空間構造を表面に複数有してもよい。【００１４】
また本発明は、生物化学分野において微分干渉顕微鏡測定に使用される上記の樹脂性プレートを製造する方法であって、基板上にレジストパターンを形成するステップと、基板上に形成されたレジストパターン、又はその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂製プレートが有する凹凸パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体の凹凸パターンを転写して樹脂製プレートを形成するステップとを備えたことを特徴とする生物化学分野において蛍光分析に使用される樹脂製プレートの製造方法である。そして、前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、レジストパターンを形成するステップが、レジスト層が所望の高さ、又は深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップを含んでいても良い。【００１５】
さらに本発明は、前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、露光における各層のパターンの位置が同じ位置になるように、パターンの位置を合わせるマスク位置合わせステップをさらに備えていてもよいし、前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、異なるパターンのマスクを用いることで、少なくとも２以上の異なる深さの空間構造を備えるレジストパターンを形成してもよい。【００１６】
さらに本発明は、前記の樹脂製プレートを底面に備えた細胞培養容器である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、生物化学分野において微分干渉顕微鏡による生体高分子の微細構造を観察する場合において好適な樹脂製プレートを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１において、微分干渉顕微鏡観察によるによるバックグラウンド測定結果を示す図である。
【図２】比較例１において、微分干渉顕微鏡観察によるバックグラウンド測定結果を示す図である。
【図３】この発明の実施例において、樹脂製プレート表面の空間構造をなす凹凸パターンを示す図である。
【図４】この発明の実施例において、樹脂製プレートを形成する工程を示す模式図である。
【図５】比較例３の樹脂製プレートの微分干渉顕微鏡観察によるバックグラウンドを示す図である。
【符号の説明】
【００１９】
１  基板
２  第１レジスト層
３  マスクＡ
４  第２レジスト層
５  マスクＢ
６  レジストパターン
７  導電性膜
８  金属構造体
９  樹脂製プレート
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される樹脂性プレートは、
（ａ）光線透過率
（ｂ）リタデーション
が一定範囲内であることを特徴とする。【００２１】
（ａ）光線透過率
微分干渉顕微鏡観察に限らず、生物化学標本等の光学顕微鏡観察において光線透過率の高いことが重要であるのは自明であるが、生物化学分野においては特に、蛍光マーカーによる生体反応の観察が多用されるため、紫外線領域の光線の透過率が特に重要である。蛍光過程によって分析する蛍光顕微鏡、マイクロアレイスキャナー等は、蛍光色素を光らせるための光（励起光）を照射する光学系と、それにより発生した蛍光（蛍光放射光）を観察、又は蛍光強度測定することで解析を行う。光（励起光）の波長は蛍光色素の感度に応じて多様であり、励起光は、観察側の反対側から樹脂製プレートを通して照射されることが多いため、樹脂製プレートの光透過率の高いことが蛍光（蛍光放射光）を観察、又は蛍光強度測定するうえで必要となる。また、樹脂プレートの観察側から励起光を照射する場合にも、樹脂プレートの光透過率が低いと、光を吸収して温度が上がるなどの問題が生じやすいため、樹脂製プレートの紫外線領域を含む光透過率が高いことは重要である。【００２２】
ガラス製プレートと同等の光透過率とするには、紫外線領域を含んだ波長３００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の波長領域において光透過率が８０％以上であることが必要である。上記の条件を満たすため、樹脂製プレートには紫外線吸収剤が含まれていないことが必要である。上記の条件を満たすためには、ＰＣ（ポリカーボネート）、ポリスチレン等、その化学構造にベンゼン環を有している材料は、使用しないことが必要である。さらに上記の条件を満たすため、他の成分としては、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物のなかで、紫外線吸収剤が含まれていないことが必要である。【００２３】
また、蛍光マーカーを用いた観察においては培養プレートの自家蛍光が少ないことも重要であるので、これついて説明する。
自家蛍光とは、ポリマー分子が紫外・可視の光を吸収した後、光を放出して自ら蛍光を発するという現象のことをいう。ガラス製プレートは自家蛍光を発しないのに対し、樹脂製プレートの多くは自家蛍光を発するため、サンプルから発生した蛍光（蛍光放射光）を識別することができなくなり、これまで蛍光分析の特徴である微量分析が不可能であった。【００２４】
ガラス製プレートと同様に、自家蛍光の影響を受けないためには、波長２３０ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の波長領域の光を照射によっては自家蛍光を発しないことが重要である。上記の条件を満たすために、材料としては、ＰＣ（ポリカーボネート）、ポリスチレン等、その化学構造にベンゼン環を有するものを含まないことが必要である。上記の条件を満たすため、他の成分としては、紫外線吸収剤、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物のなかで、紫外線吸収剤が含まれていないことに加え、自家蛍光の可能性を極力排除するため、可能な限り少量、もしくは添加しないことが好ましい。【００２５】
（ｂ）リタデーション
微分干渉のコントラストを低下させることなく、微分干渉顕微鏡観察行うためには、材料に対する光学的歪を小さくし複屈折を小さくすることが重要である。すなわち、リタデーションを小さくすることが前提であり、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳｔ）等、その化学構造にベンゼン環を有しない樹脂材料を選択することが必要である。【００２６】
培養プレートのリタデーションについて説明する。複屈折とは、光の振動方向によって屈折率が異なる物質を透過したときに、その物質の屈折率の異方性によって、２つの光線(通常光線と異常光線)に分けられることをいう。
微分干渉顕微鏡は、光の振動方向の異なる２つの光、すなわち偏光を使用しそれらの干渉により標本の微細構造を観察する方法である。ここで、光路中に光学的に異方性の材料が存在する場合には、偏光によって２つに分けた参照光相互に位相差が生じるため、原理的に測定が困難となる。したがって、微分干渉顕微鏡観察に用いる樹脂プレートとしては、その材料が異方性を持たないことが重要であり、その化学構造にベンゼン環を有しないこと、かつ、プレートの厚みを一定範囲内とすることで、リタデーションを小さい一定範囲内とすることで、その適用性を高めることが可能となる。リタデーションは、本明細書においては、６３３ｎｍの光を垂直入射したシングルパスの値で示される。【００２７】
微分干渉顕微鏡観察を良好に行うためには、リタデーションは３０ｎｍ以下であることが必要であり、２０ｎｍ以下であることが好ましい。リタデーションの値を小さくするには、異方性の少ない材料を用いるのに加え、成形法を最適化することが効果的である。例えば、溶融押し出し法といった成形を行うと、押出し及びその後の延伸によってポリマー分子が配向する。分子が配向した状態では、配向方向に複屈折が生じることがよく知られている。ポリマー分子の配向の影響を小さくするには、厚さを薄くして、透過距離自体を小さくすることが効果的である。また、成形時の分子配向が極力小さくなるキャスト成形法などで製造することがあげられる。また、押し出し成形時の分子配向を緩和する方法として、再加熱による緩和減少を利用することも可能であり、工業技術の再現性、コストの面から適宜選択することが望ましい。【００２８】
リタデーションを小さくするには、上記したとおり、厚みを一定範囲内とすることが必要となる。リタデーションを小さくし、かつ、工業的に薄肉化が可能な範囲としては、０.０２ｍｍ〜０.３ｍｍの範囲が好ましく、０.０５ｍｍ〜０．２ｍｍの範囲から選択することがより好ましい。【００２９】
上記の生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される樹脂製プレートは、面積が１ｍｍ２以下で、かつ、深さが１０μｍ以上の空間構造を表面に複数有することが好ましい。より好ましい空間構造の面積は０．５ｍｍ２以下であり、より好ましい空間構造の深さは、５０μｍ以上である。空間構造の数は、細胞培養や測定などの目的に応じて適宜選択可能であるが、装置上および製造上の制約条件が許すかぎり多いことが求められ、例えば２４個以上、望ましくは１００個以上であるのが好ましい。表面に空間構造を有することにより、ハイスループットスクリーニング等の用途に好適に用いられると同時に、培養された細胞の形態、性状もより生体内におけるものに近いものとなることが期待される。【００３０】
上記の表面に複数の空間構造を有する生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される樹脂製プレートを得るための方法、即ち、基板上に凹凸パターンを形成するステップと、基板上に形成された凹凸パターン、又はその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂製プレートの構造パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して樹脂製プレートを形成するステップとを備えた樹脂製プレートの製造方法について説明する。【００３１】
本発明により得られる樹脂製プレートは、従来のパターン付きガラス製プレートと対比しても充分に高い精度を発揮することができる。また、当該樹脂製プレートは精密であると同時に安価に形成することができるため、製造コストを極力抑えられる利点を発揮できるような産業上大量に使用される用途に適用した場合に、特に効果的である。【００３２】
前記金属構造体を形成するステップにおいて、基板上に形成されたパターンの転写パターンを複数作製し、それに金属を付着させ金属構造体を作製することで、金属構造体を作製するコストを更に低減することが可能である。基板上に形成されたパターンの転写パターンを作製する方法としては、例えば、金属を付着させる方法、樹脂を流し込み、熱、光等で硬化させる方法があげられる。【００３３】
基板上にレジストパターンを形成する方法において、レジスト層が所望の高さ、又は深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返ことも有用である。特に粘度の低いレジストを使用した場合、１回のレジストコートで所望の高さ、又は深さを得ようとすると、レジストの平面性が損なわれることが懸念される。例えば、スピンコート法でレジストを塗布する場合、複数回のレジスト塗布を行うことで、高い平面精度を保持したうえで、所望の高さ、又は深さを有する構造体を得ることが可能となる。また、レジスト層の形成、露光を複数回繰り返し、所望の高さ、又は深さを得ることも可能である。特に、使用するレジストの感度に起因し、１回の露光で所望の高さ、又は深さを得られない場合は、レジスト層の形成、露光を複数回繰り返すことで可能となる。【００３４】
露光における各層のパターンとマスクとの位置合わせには、基板とマスクの同位置に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置を合わせる方法、基板とマスクの同位置に位置マークを作製し、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板に位置マークを作製し、マスクにはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、５μｍ以内の精度が簡単に得られる点で有効である。【００３５】
樹脂製プレートは、各種の表面処理が可能になる点においても好適である。サンプルの付着／離脱を促すため、親水／疎水化処理等の表面処理が適用できる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射などを用いる方法、細胞の付着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法が挙げられる。また、一部分を被覆しておき、任意の部分を改質することも可能である。【００３６】
基板上にパターンを形成するステップと、前記基板上に形成された前記パターンにしたがって金属を付着し、金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体を使用して、樹脂成形品を形成するステップによる樹脂製プレートの製造方法について、更に詳細に説明する。【００３７】
図４に示すように本形態の樹脂製プレートは、
（ｉ）基板上への第１レジスト層の形成（図４工程ａ）
（ii）基板とマスクＡとの位置合わせ
（iii）マスクＡを用いた第１レジスト層の露光
（iv）第１レジスト層の熱処理（省略可能）（ここまで図４工程ｂ）
（v）第１レジスト層上への第２レジスト層の形成（図４工程ｃ）
（vi）基板とマスクＢとの位置合わせ
（vii）マスクＢを用いた第２レジスト層の露光
（viii）第２レジスト層の熱処理（省略可能）（ここまで図４工程ｄ）
（ix）レジスト層の現像（図４工程ｅ）
を行い、所望のレジストパターンを形成する。【００３８】
さらに、
（x）形成されたレジストパターンを導電化処理した後、形成されたレジストパターンにしたがって、基板上に金属構造体をメッキにより堆積させる。（図４工程ｆ，ｇ）
（xi）この金属構造体を型として、樹脂成形品を形成する（図４工程ｈ）
ことによって、樹脂製プレートが製造される。
（v）〜（viii）の工程は任意であり、設ける凹部の深さが一種類のみの場合は省略が可能である一方、３種類以上の深さが必要なときには（v）〜（viii）の工程を複数回繰り返すこともできる。
（vi）および（viii）の工程は、レジストとして後述する化学増幅系ネガレジストを用いない場合には省略してもよい。【００３９】
レジストパターン形成処理について更に詳細に説明する。
基板上に、例えば、深さ３０μｍと深さ１００μｍの構造体を得ようとした場合、第１レジスト層（厚さ７０μｍ）、第２レジスト層（厚さ３０μｍ）順に形成し、各層に露光、または露光、熱処理を行う。現像工程では、最初に第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンが得られ、次に第１レジスト層と第２レジスト層を合わせた深さ１００μｍのパターンが得られる。深さ１００μｍのパターンが得られた時点で、第２レジスト層である深さ３０μｍのパターンを現像液に溶解、または変形させないためには、各層の現像液への溶解性を制御させることが要求される。【００４０】
スピンコート方式によりレジスト層を形成する場合、第２レジスト層のベーク（溶剤の乾燥）時間を調整することによって、耐アルカリ性を発現させることが可能である。【００４１】
光分解型のポジ型レジストを用いて、耐アルカリ性を発現させる方法の一つとして、ベーク時間（溶剤の乾燥時間）を長くし、レジストを硬化させることがあげられる。通常、レジストは膜厚、シンナー等の溶剤濃度、および感度に応じてベーク時間を設定している。この時間を長くすることによって耐アルカリ性を持たせることが可能となる。また、第１レジスト層のベークが進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像において光が照射された部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。ベークに用いる装置は、溶剤を乾燥できれば特に限定されるものではなく、オーブン、ホットプレート、熱風乾燥機等があげられる。光架橋型のネガ型レジストと比較して、耐アルカリ性の発現幅は制限されるため、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜２００μｍの範囲内が好ましく、１０〜１００μｍの範囲内であることがより好ましい。【００４２】
光架橋型のネガ型レジストを用いて耐アルカリ性を発現させる方法として、ベーク時間の最適化の他に、架橋密度の最適化があげられる。通常、ネガ型レジストの架橋密度は、露光量によって設定することが可能である。化学増幅系ネガ型レジストの場合、露光量および熱処理時間によって架橋密度を設定することが可能である。この露光量、または熱処理時間を長くすることによって、耐アルカリ性を発現させることが可能となる。光架橋型のネガ型レジストの場合、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて５〜５００μｍの範囲内が好ましく、１０〜３００μｍの範囲内であることがより好ましい。【００４３】
（i）基板上への第１レジスト層の形成について説明する。
成形品形成ステップで得られる樹脂製プレートの平面度は、基板１上へ第１レジスト層２を形成する工程にて決定づけられる。すなわち、基板１上に第１レジスト層２を形成した時点の平面度が金属構造体、ひいては樹脂製プレートの平面度に反映される。【００４４】
基板１上に第１レジスト層２を形成する方法は何ら限定されないが、一般的にスピンコート方式、ディッピング方式、ロール方式、ドライフィルムレジストの貼り合わせ等を挙げることができる。なかでも、スピンコート方式は、回転しているガラス基板上にレジストを塗布する方法で、直径３００ｍｍを超えるガラス基板にレジストを高い平面度で塗布する利点がある。従って、高い平面度を実現できる観点から、スピンコート方式が好ましく用いられる。【００４５】
用いられるレジストはポジ型レジスト、ネガ型レジストのいずれもが使用可能である。いずれも、レジストの感度、露光条件により、レジストの焦点深度が変わるため、例えばＵＶ露光装置を使用した場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジスト厚さ、感度に応じて種類を選択するのが望ましい。【００４６】
用いるレジストがウェットレジストの場合、例えばスピンコート方式で所定のレジスト厚さを得るには、スピンコート回転数の変更による方法と、粘度調整による方法とがある。スピンコート回転数の変更による方法は、スピンコーターの回転数を適宜設定することによって所望のレジスト厚さを得る方法である。粘度調整による方法は、レジスト厚さが厚い場合、又は塗布面積が大きくなる場合には、平面度が低下することが懸念されるため、実際使用上で要求される平面度に応じて粘度を調整する方法である。【００４７】
例えばスピンコート方式の場合、１回で塗布するレジスト層の厚さは、高い平面度を保持することを考慮し、好ましくは１０〜５０μｍ、さらに好ましくは、２０〜５０μｍの範囲内であることが望ましい。高い平面度を保持したうえで、所望のレジスト層の厚さを得るためには、レジスト層を複数回に分けて形成することができる。【００４８】
第１レジスト層２にポジ型レジストを使用した場合、ベーク時間（溶剤の乾燥）が過度に進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像においてパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。【００４９】
（ii）基板とマスクＡとの位置合わせについて説明する。
第１レジスト層２のパターンと、第２レジスト層４のパターンにおける位置関係を所望の設計通りにするためには、マスクＡ３を用いた露光時に、正確な位置合わせを行うことが必要となる。位置合わせには、基板とマスクＡの同位置に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置だしする方法、基板とマスクＡの同位置に位置マークを作製、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板に位置マークを作製し、マスクＡにはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、５μｍ以内の精度が簡単に得られる点で有効である。【００５０】
（iii）マスクＡ３を用いた第１レジスト層２の露光について説明する。
図４（ｂ）に示される工程で使用するマスクＡ３は何ら限定されないが、エマルジョンマスク、クロムマスク等を挙げることが出来る。レジストパターン形成ステップでは、使用するマスクＡ３によって寸法、および精度が左右される。そして、その寸法、および精度は、樹脂製プレートにも反映される。したがって、樹脂製プレートの各寸法、および精度を所定のものとするためには、マスクＡの寸法、および精度を規定する必要がある。マスクＡの精度を高める方法は何ら限定しないが、例えば、マスクＡのパターン形成に使用するレーザー光源をより波長の短いものに変えることを挙げることができるが、設備費用が高額であり、マスクＡ製作費が高額となるため、樹脂製プレートが実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが望ましい。【００５１】
マスクＡの材質は温度膨張係数、ＵＶ透過吸収性能の面から石英ガラスが好ましいが比較的高価であるため、樹脂成形品が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが望ましい。設計通りの所望の深さ、または高さが異なる構造体、または第１レジストパターンと第２レジストパターンが異なる構造体を得るには、第１レジスト層、および第２レジスト層の露光に用いるマスクのパターン設計（透過／遮光部）が確実であることが必要であり、ＣＡＥ解析ソフトを使用したシミュレーションもその解決策の一つである。【００５２】
露光に用いられる光線は設備費用が安価である紫外線またはレーザー光であることが好ましい。シンクロトロン放射光は、設備費用が高額であり、実質的に樹脂製プレートの価格が高額となるものの、露光深度が深いものを得たい場合などに用いることができる。【００５３】
露光時間や露光強度等の露光条件はレジスト層２の材質、厚み等により変化するため、得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。特に凹凸パターンの寸法、および精度に影響を与えるため、露光条件の調節は重要である。また、レジストの種類により焦点深度が変わるため、例えばＵＶ露光装置を使用した場合、露光時間、ＵＶ出力値をレジストの厚さ、感度に応じて選択するのが望ましい。【００５４】
（iv）第１レジスト層２の熱処理について説明する。露光後の熱処理は、レジストパターンの形状を補正するためにアニールといわれる熱処理が知られている。ここでは、化学架橋を目的とし、化学増幅系ネガレジストを使用した場合のみに行う。化学増幅系ネガレジストとは、主に、２成分系、または３成分系からなり、露光時の光によって、例えば、化学構造の末端のエポキシ基が開環し、熱処理によって架橋反応させるものである。熱処理時間は、例えば膜厚１００μｍの場合、設定温度１００℃の条件下においては数分で架橋反応は進行する。第１レジスト層の熱処理が進行しすぎると、後の現像において未架橋部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが１００μｍ以上でない場合、熱処理時間を短くする、または後の第２レジスト層の熱処理のみとする等、適宜選択することが好ましい。【００５５】
（v）第１レジスト層２上への第２レジスト層４の形成について説明する。
（i）について説明したことに加え、以下の点を記す。
スピンコート方式にて、ポジ型レジストを使用してレジスト層を形成する場合、ベーク時間を通常の１．５〜２．０倍程度とすることで、耐アルカリ性を発現させることができる。これにより、第１レジスト層２と第２レジスト層４の現像終了時、第２レジスト層４のレジストパターンの溶解、または変形を防止することができる。【００５６】
（vi）基板１とマスクＢ５との位置合わせについて説明する。（ii）について説明したことと同様の要領にて、位置合わせを実施する。【００５７】
（vii）マスクＢ５を用いた第２レジスト層４の露光について説明する。（iii）について説明したことと同様の要領にて、露光を実施する。【００５８】
（viii）第２レジスト層４の熱処理について説明する。（iv）について説明したことに加え、以下の点を記す。
第２レジスト層４の熱処理は、後の現像において第１レジスト層２のパターンが得られた時点で、第２レジスト層４のパターンが溶解、または変形させないために行う。熱処理によって化学架橋が進行し、架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。耐アルカリ性を発現させるための熱処理時間は、通常の１．１〜２．０倍の範囲からレジストの厚さに応じて適宜選択することが好ましい。【００５９】
（ix）レジスト層２，４の現像について説明する。
上記までで露光されたレジスト層を、所定の現像液を用いて現像することで所望のパターンを有するレジストパターン６が得られる。現像液としては、ここまでの工程で用いたレジストに対応するものから適宜選択すればよい。現像時間、現像温度、現像液濃度等の現像条件はレジスト厚みやパターン形状に応じて適宜調節することが好ましい。例えば、必要な深さを得るために現像時間を長くしすぎると、所定の寸法よりも大きくなってしまうため、適宜条件を設定することが好ましい。【００６０】
レジスト層全体の厚みが増してくると、現像工程において、パターン底部の幅（または直径）よりも表面の幅（または直径）が広くなることが懸念される。レジストを複数層形成する場合、各レジスト層の形成において、感度の異なるレジストを段階に分けて形成することが好ましい場合がある。この場合には、例えば、表面に近い層のレジストの感度を底部に近い層よりも高くすることなどが挙げられる。さらに具体的には、感度の高いレジストとして東京応化工業株式会社製のＢＭＲ  Ｃ−１０００ＰＭを、そして感度の低いレジストとして東京応化工業株式会社製のＰＭＥＲ−Ｎ−ＣＡ３０００ＰＭを用いることができる。その他、レジストの乾燥時間を変えることにより感度を調整するようにしてもよい。例えば、東京応化工業株式会社製のＢＭＲ  Ｃ−１０００ＰＭを使用した場合、スピンコート後のレジスト乾燥時、１層目の乾燥時間を１１０℃で４０分、２層目の乾燥時間を１１０℃で２０分とすることで、１層目の感度を高めることができる。【００６１】
樹脂製プレートの上面、または微細パターン底部の平面精度を高める方法としては、例えば、レジスト塗布で使用するレジスト種類（ネガ型、ポジ型）を変更する方法、金属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。【００６２】
尚、所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、それら複数のレジスト層を同時に露光・現像処理する、あるいは、一つのレジスト層を形成及び露光処理した後、さらにレジスト層の形成及び露光処理を行い、２つのレジスト層を同時に現像処理することが可能である。【００６３】
（x）金属構造体形成ステップについてさらに詳細に説明する。
金属構造体形成ステップとはレジストパターン形成ステップで得られたレジストパターン６に沿って金属を堆積させ、レジストパターン６から凹凸面を写し取ることにより、金属構造体８を得る工程である。【００６４】
図４に示されるように、この工程では予めレジストパターンに沿って導電性膜７を形成する。該導電性膜７の形成方法は特に限定されないが、好ましくは蒸着、スパッタリング等を用いることができる。導電性膜７に用いられる導電性材料としては金、銀、白金、銅、アルミニウムなどを挙げることができる。【００６５】
図４に示されるように、導電性膜７を形成した後、パターンに沿って金属をメッキにより堆積して金属構造体８を形成する。金属を堆積させるメッキ方法は特に限定されないが、例えば電解メッキ、無電解メッキ等を挙げることができる。用いられる金属は特に限定されないが、ニッケル、ニッケル−コバルト合金、銅、金を挙げることができ、経済性・耐久性の観点からニッケルが好ましく用いられる。【００６６】
金属構造体８はその表面状態に応じて研磨しても構わない。ただし、汚れが造形物に付着することが懸念されるため、研磨後、超音波洗浄を実施することが好ましい。また、金属構造体８はその表面状態を改善するために、離型剤等で表面処理しても構わない。なお、金属構造体８に写し取られたパターンの深さ方向の傾斜角度は、樹脂成形品の形状から５０°〜９０°であることが望ましく、より望ましくは６０°〜８７°である。
メッキにより堆積した金属構造体８はレジストパターン６から分離される。【００６７】
金属構造体８は、レジストパターン６からパターンを直接写し取るだけでなく、レジストパターン６の転写パターンおよびさらにその転写パターン等に対してさらにメッキ等を行うことでも製造することができる。ここで、レジストパターン６の転写パターンは、メッキ、熱硬化性樹脂、紫外線硬化性樹脂等を用いて得ることができる。この転写パターンの作製は元のレジストパターン６の形状を保持できる限り何回行っても良いが、得られる金属構造体８のパターンは、常に樹脂製プレート９の構造パターンの反対形状を有している。レジストパターン６の転写パターンのいずれかが充分な強度を有していれば、一つのレジストパターン６から複数の金属構造体８を得ることができる。【００６８】
（xi）成形品形成ステップについて更に詳細に説明する。
成形品形成ステップは、図４に示されるように、前記金属構造体８を型として、樹脂製プレート９を形成する工程である。樹脂成形品の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体を型として射出成形で樹脂製プレート９を形成する場合、金属構造体８の形状を高い転写率で樹脂製プレートに再現することが可能である。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）等を使用して行うことができる。【００６９】
金属構造体８を型として、例えば射出成形で樹脂製プレート９を形成する場合、１枚の金属構造体で１万枚〜５万枚、場合によっては２０万枚もの樹脂製プレートを得ることができ、金属構造体の製作にかかる費用負担を大幅に解消することが可能である。前述したように一つのレジストパターン６から複数の金属構造体８を作製する場合には、さらに費用負担を軽減できる。また、射出成形１サイクルに必要な時間は５秒〜３０秒と短く、生産性の面で極めて効率的である。射出成形１サイクルで同時に複数個の樹脂製プレートを形成可能な成形金型を使用すれば、更に生産性を向上することが可能となる。上記成形方法では金属構造体を金属型として用いても、金属構造体を予め用意した金属型内部にセットして用いても構わない。【００７０】
樹脂製プレートの平面度の最小値は、工業的に再現し易い観点から１μｍ以上であることが好ましい。樹脂製プレートの平面度の最大値は、例えば、該成形品にソリ等が発生して光学系ユニットと接触しない等、支障とならない観点から２００μｍ以下であることが好ましい。樹脂成形品の造形部に対する寸法精度は、工業的に再現し易い観点から±０．５〜１０％の範囲内であることが好ましい。【００７１】
樹脂製プレートの厚さに対する寸法精度は、工業的な再現のし易さの観点から±０．５〜１０％の範囲内であることが好ましい。樹脂製プレートの厚さは特に規定されないが、射出成形における取り出し時の破損、取り扱い時の破損、変形、歪みなどを考慮し、０．２〜１０ｍｍの範囲内であることが好ましい。樹脂製プレートの寸法は特に限定されないが、リソグラフィー法でレジストパターンを形成する際、例えば、レジスト層の形成をスピンコート法にて行う場合、直径４００ｍｍの範囲の中から採取できるよう用途に応じて適宜選択することが好ましい。【００７２】
本発明は、上記の生物化学分野の微分干渉顕微鏡観察に用いられる樹脂製プレートを低部に備えた細胞培養容器であってもよい。例えば、上記の樹脂製プレートの周囲にリブを設けてもよいし、底部に穴のあいたシャーレにおいて、該穴を上記の樹脂製プレートで塞いだ構成のシャーレであってもよい。また、上記の樹脂製プレートを底部に一体に成形した樹脂製のシャーレであっても良い。
【実施例】
【００７３】
本発明にしたがって、樹脂製プレートを形成する方法について、図を参照しながら以下により具体的に説明する。実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００７４】
まず、本発明の生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される樹脂製プレートについて、以下に具体的に説明する。【００７５】
表１に示されるプレートを用いて微分干渉顕微鏡（カールツァイス株式会社製タイプ：ルーチン倒立顕微鏡  型式：Axiovert  40）にてバックグラウンドの観察を行い、Ｓ／Ｎを目視にて評価した。【００７６】
【表１】
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【００７７】
各プレートは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）またはポリスチレン（ＰＳｔ）を材料とし、平板のものは押出しシートを用い、空間構造が形成されたものは、押出しシートを次の方法で作製したＮｉ構造体を用いてプレス法により得られたものを用いた。空間構造のパターンは、図３に示すものとした。【００７８】
空間構造を形成する凹凸パターンを表面に有する樹脂製プレートを形成する方法について、図４を参照しながら以下により具体的に説明する。
図４（ａ）を参照して、まず基板上に、有機材料（東京応化工業製「ＰＭＥＲ  Ｎ-ＣＡ３０００ＰＭ」をベースとする１回目のレジスト塗布を行った。
そして、図４（ｂ）を参照して第１レジスト層を形成した後、基板と所望のマスクパターンに加工したマスクＡとの位置合わせを行った。【００７９】
次にＵＶ露光装置（キャノン製「ＰＬＡ−５０１Ｆ」波長３６５ｎｍ、露光量３００ｍＪ／ｃｍ２）により、第１レジスト層をＵＶ光により露光を行った後、ホットプレート（１００℃×４分）を用いて第１レジスト層の熱処理を行った。【００８０】
図４（ｃ）を参照して、まず基板上に、有機材料（東京応化工業製「ＰＭＥＲ  Ｎ-ＣＡ３０００ＰＭ」をベースとする２回目のレジスト塗布を行った。
そして、図４（ｄ）を参照して第２レジスト層を形成した後、基板と所望のマスクパターンに加工したマスクＢとの位置合わせを行った。【００８１】
次にＵＶ露光装置（キャノン製「ＰＬＡ−５０１Ｆ」波長３６５ｎｍ、露光量１００ｍＪ／ｃｍ２）により、第２レジスト層をＵＶ光により露光を行った後、ホットプレート（１００℃×８分）を用いて第２レジスト層の熱処理を行った。【００８２】
図４（ｅ）に示すように、前記レジスト層を有する基板を現像し、基板上にレジストパターンを形成した（現像液：東京応化工業製「ＰＭＥＲ現像液Ｐ-７Ｇ」）。【００８３】
そして、図４（ｆ）に示すように前記レジストパターンを有する基板表面に蒸着、またはスパッタリングを行い、レジストパターンの表面に銀からなる導電性膜を堆積させた。
この工程において、他に白金、金、銅などを堆積させることができる。【００８４】
次に、図４（ｇ）に示すように前記レジストパターンを有する基板をメッキ液に浸け、電気メッキを行い、レジストパターンの谷間に金属構造体（以下、Ｎｉ構造体）を得た。この工程において、他に銅、金などを堆積させることができる。
図４（ｈ）に示すように、得られたＮｉ構造体を金型として、プレス成形で厚さ０．３ｍｍのＰＭＭＡシートまたはＰＳｔシートにＮｉ構造体のパターンを転写し、樹脂製プレートを得た。【００８５】
リタデーションの測定は、エリプソメトリー測定装置（株式会社溝尻光学工業所製ＥＬＰ−１５０ＡＲＴ型）を用いて、垂直入射による透過のワンパスで行った。【００８６】
表より、リタデーションが３０ｎｍ以下の実施例においては、微分干渉顕微鏡のバックグラウンドのＳ／Ｎが良好であることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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