【手続補正書】
【提出日】平成19年1月10日(2007.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｅｍｒＡＢ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
【請求項２】
ｅｍｒＡＢ遺伝子が以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子である請求項１に記載の微生物、
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質、及び配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
ｅｍｒＡＢ遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子である請求項１に記載の微生物、
（ａ）配列番号１に示す塩基配列及び配列番号３に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
【請求項４】
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｅｍｒＫＹ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
【請求項５】
ｅｍｒＫＹ遺伝子が以下の（Ｃ）又は（Ｄ）の遺伝子である請求項４に記載の微生物、
（Ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｄ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
ｅｍｒＫＹ遺伝子が以下の（ｃ）又は（ｄ）の遺伝子である請求項４に記載の微生物、
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列及び配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
【請求項７】
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｙｏｊＩＨ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
【請求項８】
ｙｏｊＩＨ遺伝子が以下の（Ｅ）又は（Ｆ）の遺伝子である請求項７に記載の微生物、
（Ｅ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｆ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
ｙｏｊＩＨ遺伝子が以下の（ｅ）又は（ｆ）の遺伝子である請求項７に記載の微生物、
（ｅ）配列番号９に示す塩基配列及び配列番号１１に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号１１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
【請求項１０】
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ａｃｒＥＦ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
【請求項１１】
ａｃｒＥＦ遺伝子が以下の（Ｇ）又は（Ｈ）の遺伝子である請求項１０に記載の微生物、（Ｇ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｈ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号１６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
ａｃｒＥＦ遺伝子が以下の（ｇ）又は（ｈ）の遺伝子である請求項１０に記載の微生物、（ｇ）配列番号１３に示す塩基配列及び配列番号１５に示す塩基配列を含む遺伝子、又は（ｈ）配列番号１３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号１５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
【請求項１３】
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｂｃｒ遺伝子の発現が上昇するように改変された微
生物。
【請求項１４】
ｂｃｒ遺伝子が以下の（Ｉ）又は（Ｊ）の遺伝子である請求項１３に記載の微生物、
（Ｉ）配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｊ）配列番号１８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１５】
ｂｃｒ遺伝子が以下の（ｉ）又は（ｊ）の遺伝子である請求項１３に記載の微生物、
（ｉ）配列番号１７に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｊ）配列番号１７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１６】
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｃｕｓＡ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
【請求項１７】
ｃｕｓＡ遺伝子が以下の（Ｋ）又は（Ｌ）の遺伝子である請求項１６に記載の微生物、
（Ｋ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｌ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１８】
ｃｕｓＡ遺伝子が以下の（ｋ）又は（ｌ）の遺伝子である請求項１６に記載の微生物、
（ｋ）配列番号１９に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｌ）配列番号１９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１９】
エシェリヒア属細菌である請求項１〜１８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２０】
エシェリヒア・コリである請求項１９に記載の微生物。
【請求項２１】
さらにセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された請求項１〜２０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養し、Ｌ−システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−システインを採取する、Ｌ−システインの製造法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
また、本発明者らは、Ｌ−システイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼ（serine acetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「SAT」ともいう）を保持するエシェリヒア属細菌を用いたＬ−システインの製造法を開示している（特許文献３又は４参照）。これらの文献では、Ｌ−システイン分解系を抑制する手段としては、細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ活性を低下させることが開示されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
ｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒ、ｃｕｓＡ遺伝子は、過剰発現させた際に宿主微生物に種々の薬剤に対する耐性を付与する遺伝子として知られていた（非特許文献６参照）。しかしながら、これらの遺伝子がシステイン排出能を有するかどうかは不明であった。
【特許文献１】特表２０００−５０４９２６号公報
【特許文献２】特開平１１−５６３８１号公報
【特許文献３】特開平１１−１５５５７１号公報
【特許文献４】特開２００３−１６９６６８号公報
【特許文献５】特許第２９９２０１０号公報
【非特許文献１】FEMS Microbiol. Lett., vol.179 (1999) p453-459
【非特許文献４】J.Bacteriol., 185, (2003) p1161-1166
【非特許文献５】J.Biol.Chem., 277(2002) p49841-49849
【非特許文献６】J.Bacteriol., Vol.183, （2001） p5803-5812
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｅｍｒＡＢ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（２） ｅｍｒＡＢ遺伝子が以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子である（１）の微生物、（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質、及び配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（３） ｅｍｒＡＢ遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子である（１）の微生物、（ａ）配列番号１に示す塩基配列及び配列番号３に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
（４） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｅｍｒＫＹ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（５） ｅｍｒＫＹ遺伝子が以下の（Ｃ）又は（Ｄ）の遺伝子である（４）の微生物、（Ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｄ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び
配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（６） ｅｍｒＫＹ遺伝子が以下の（ｃ）又は（ｄ）の遺伝子である（４）の微生物、（ｃ）配列番号５に示す塩基配列及び配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
（７） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｙｏｊＩＨ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（８） ｙｏｊＩＨ遺伝子が以下の（Ｅ）又は（Ｆ）の遺伝子である（７）に記載の微
生物、
（Ｅ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｆ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（９） ｙｏｊＩＨ遺伝子が以下の（ｅ）又は（ｆ）の遺伝子である（７）の微生物、（ｅ）配列番号９に示す塩基配列及び配列番号１１に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号１１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
（１０） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ａｃｒＥＦ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（１１） ａｃｒＥＦ遺伝子が以下の（Ｇ）又は（Ｈ）の遺伝子である（１０）の微生物、
（Ｇ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｈ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号１６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１２） ａｃｒＥＦ遺伝子が以下の（ｇ）又は（ｈ）の遺伝子である（１０）の微生物、
（ｇ）配列番号１３に示す塩基配列及び配列番号１５に示す塩基配列を含む遺伝子、又は（ｈ）配列番号１３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号１５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
（１３） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｂｃｒ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（１４） ｂｃｒ遺伝子が以下の（Ｉ）又は（Ｊ）の遺伝子である（１３）の微生物、（
Ｉ）配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｊ）配列番号１８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１５） ｂｃｒ遺伝子が以下の（ｉ）又は（ｊ）の遺伝子である（１３）の微生物、（ｉ）配列番号１７に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｊ）配列番号１７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１６） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｃｕｓＡ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（１７） ｃｕｓＡ遺伝子が以下の（Ｋ）又は（Ｌ）の遺伝子である（１６）の微生物、
（Ｋ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｌ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１８） ｃｕｓＡ遺伝子が以下の（ｋ）又は（ｌ）の遺伝子である（１６）の微生物、
（ｋ）配列番号１９に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｌ）配列番号１９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１９） エシェリヒア属細菌である（１）〜（１８）のいずれかの微生物。
（２０） エシェリヒア・コリである（１９）の微生物。
（２１） さらにセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された（１）〜（２０）のいずれかの微生物。
（２２） （１）〜（２１）のいずれかの微生物を培地で培養し、Ｌ−システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−システインを採取する、Ｌ−システインの製造法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明において、ｅｍｒＡＢ遺伝子としてはｅｍｒＡ遺伝子及びｅｍｒＢ遺伝子を含む遺伝子をいう。これらの遺伝子は同時に発現を強化してもよいし、別々に発現強化してもよい。ｅｍｒＡ遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。また、ｅｍｒＢ遺伝子としては、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子は、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、上記数個とは、２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個が特に好ましい。Ｌ−システイン排出能は、例えば、上記遺伝子を導入した微生物を培養したときに培地中に排出されるＬ−システインの量が野生株に比べて増加するか否かを調べることによって測定することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
（１）システイン排出遺伝子及びシステイン生合成系を増強した菌株の構築
親株としてはJM39株（F+ cysE51 tfr-8）（Denk,D. and Bock,A., J. Gen. Microbiol., 133, 515-525 (1987)）を用いた。JM39株を、pUC118に各種システイン排出遺伝子を組み込んだプラスミド（pUCemrAB、pUCemrKY、pUCyojIH、pUCacrEF、pUCbcr、pUCcusA）で各々形質転換した。各プラスミドの構築は、J.Bacteriol., Vol.183, 2001, 5803-5812のMaterials and Methods及びTable 1に記載の方法で行った。なお、pUCemrABはエシェリヒア・コリのemrR , emrA , 及びemrB遺伝子を含む3.9-kbのSalI-BamHI fragmentを含むプラスミドである。pUCemrKYはエシェリヒア・コリのevgS/A, emrK 及びemrY遺伝子を含む7.5-kbのSphI-BamHI fragmentである。pUCyojIHはエシェリヒア・コリのyojI 及びyojH遺伝子を含む4.0-kbのSalI-SphI fragmentである。pUCacrEFはエシェリヒア・コリのenvR, acrE 及びacrF遺伝子を含む5.9-kbのSalI-SphI fragmentである。pUCbcrはエシェリヒア・コリのyeiD 及びbcr遺伝子を含む2.3-kbのAccI-KpnI fragmentである。pUCcusAはエシェリヒア・コリのcusS, cusR/C/F/B 及びcusA遺伝子を含む9.0-kbのSphI-EcoRI fragmentである。形質転換株は、アンピシリン耐性を指標として選択した。得られた形質転換体について、256番目のMetがIleに置換された変異型SAT遺伝子を含有するプラスミド（pACYC256I）にて形質転換した。形質転換株は、アンピシリン耐性＋クロラムフェニコール耐性を指標として選択した。なお、pACYC256IはpCEM256I（特開平１１−１５５５７１）に基き、以下のようにして構築した。すなわち、pCEM256I をBamHIとSalIで切断し、得られたMet256Ile変異型SATの遺伝子（プロモーター領域含む）を同制限酵素で切断したpACYC184（NIPPON GENE社）のラージフラグメントに連結してpACYC256Iを作製した。