(57)【要約】【課題】プロテオーム解析のようなハイスループットな解析において、多数の検体から得られる多数のデータを迅速に解析処理する方法を提供すること。【解決手段】複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析する方法であって、（１）ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から該存在量に対応する測定値を得、（２）該ｎ種類の分析システムで得られたデータの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値をプロットし、（３）ｍ次元の空間内に、夫々、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群を作成し、（４）各クラスター毎に、含まれる測定値を各群間で統計的に処理する、ことから成る、前記方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析する方法であって、
（１）ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から該存在量に対応する測定値を得、
（２）該ｎ種類の分析システムで得られたデータの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値をプロットし、
（３）ｍ次元の空間内に、夫々、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群を作成し、
（４）各クラスター毎に、含まれる測定値を各群間で統計的に処理する、
ことから成る、前記方法。
【請求項２】
更に、少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質をマーカー候補として抽出する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
更に、ｍ次元の空間のプロットが可視化されることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析する方法であって、
（ａ）ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムで得られたデータ、及び、該分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から得られた該存在量に対応する測定値が入力されるステップ、
（ｂ）入力された該データの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値がプロットされるステップ、
（ｃ）ｍ次元の空間内に、夫々、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群が作成されるステップ、及び
（ｄ）作成された各クラスター毎に、含まれる測定値が各群間で統計的に処理されるステップ、から成る前記システム。
【請求項５】
更に、（ｅ）少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質が該マーカー候補として抽出されるステップ、及び／又は、（ｆ）ｍ次元の空間のプロット及び／又はクラスターが可視化されるステップを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
クラスターの作成が、以下のパラメーターの少なくとも２以上を組み合わせた条件下で行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
（１）分析システムで得られたデータの範囲；
（２）各クラスターの大きさ（各データの幅）；
（３）各クラスターの間隔； 
（４）測定値の最低値；
（５）オーバーラップ率；及び
（６）カバー率。
【請求項７】
各試料中の物質のデータが二次元液体クロマトグラフィにおける分画位置と質量分析における（m/z）であり、試料中に含まれる物質の存在量に対応する測定値が質量スペクトルの強度であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
二次元液体クロマトグラフィが、陽イオン交換カラム及び逆相カラムから構成されるものであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を用いるプロテオーム解析システム。
【請求項１０】
複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析するシステムであって、
（ａ）記憶手段に、ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムで得られたデータ、及び、該分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から得られた該存在量に対応する測定値を入力する手段、
（ｂ）処理装置において、記憶手段に記憶された該データ、及び、該測定値を取得する手段、
（ｃ）処理装置において、取得した該データの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値をプロットする手段、
（ｄ）記憶手段に、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群を作成するために予め設定された条件を入力する手段、
（ｅ）処理装置において、記憶手段に記憶された該条件を取得する手段、
（ｆ）処理装置において、取得した条件下で、ｍ次元の空間内にクラスターの群を作成する手段、及び
（ｇ）処理装置において、作成された各クラスター毎に、含まれる測定値を各群間で統計的に処理する手段、から成る前記システム。
【請求項１１】
更に、（ｈ）処理装置において、少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質マーカー候補として抽出する手段、及び／又は、（ｉ）出力装置に、ｍ次元の空間のプロット及び／又はクラスターを可視化する手段を含む、請求項１０記載のシステム。
【請求項１２】
クラスターの作成が、以下のパラメーターの少なくとも２以上を組み合わせた条件下で行われることを特徴とする、請求項１０又は１１記載のシステム：
（１）分析システムで得られたデータの範囲；
（２）各クラスターの大きさ（各データの幅）；
（３）各クラスターの間隔； 
（４）測定値の最低値；
（５）オーバーラップ率；及び
（６）カバー率。
【請求項１３】
コンピューターに、複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析するために、
（ａ）ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムで得られたデータ、及び、該分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から得られた該存在量に対応する測定値が入力されるステップ、
（ｂ）入力された該データの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値がプロットされるステップ、
（ｃ）ｍ次元の空間内に、夫々、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群が作成されるステップ、及び
（ｄ）作成された各クラスター毎に、含まれる測定値が各群間で統計的に処理されるステップ、を実行させるためのプログラム。
【請求項１４】
更に、ｅ）少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質がマーカー候補として抽出されるステップ、及び／又は、（ｆ）ｍ次元の空間のプロット及び／又はクラスターが可視化されるステップを実行させるため、請求項１３記載のプログラム。
【請求項１５】
コンピューターを、複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析するために、
（ａ）記憶手段に、ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムで得られたデータ、及び、該分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から得られた該存在量に対応する測定値を入力する手段、
（ｂ）処理装置において、記憶手段に記憶された該データ、及び、該測定値を取得する手段、
（ｃ）処理装置において、取得した該データの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値をプロットする手段、
（ｄ）記憶手段に、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群を作成するために予め設定された条件を入力する手段、
（ｅ）処理装置において、記憶手段に記憶された該条件を取得する手段、
（ｆ）処理装置において、取得した条件下で、ｍ次元の空間内にクラスターの群を作成する手段、及び
（ｇ）処理装置において、作成された各クラスター毎に、含まれる測定値を各群間で統計的に処理する手段、として機能させるためのプログラム。
【請求項１６】
更に、（ｈ）処理装置において、少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質をマーカー候補として抽出する手段、及び／又は、（ｉ）出力装置に、ｍ次元の空間のプロット及び／又はクラスターを可視化する手段として機能させるための、請求項１５記載のプログラム。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体。
【請求項１８】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法で抽出されたマーカー候補物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多数試料中に含まれる物質の存在量を比較解析する方法、同比較解析システム、コンピューターに該方法を実行させるためのプログラム及びコンピューターを該システムとして機能させるためのプログラム、並びに、該プログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム情報は、ＤＮＡからｍＲＮＡ、そしてタンパク質へと変換していく。「ゲノム」に対応して、遺伝子発現産物であるタンパク質を総括したものが「プロテオーム」である。このプロテオーム像をいろいろな視点から解析する研究領域がプロテオミクスと呼ばれる。【０００３】
このプロテオーム解析では、様々な環境下であらゆる生育段階にある器官、組織、又は細胞で発現するすべてのタンパク質が研究対象になる。得られた結果は、遺伝子情報と組み合わせることで遺伝子の同定に用いられるほかに、タンパク質間相互作用の解析、更には、マーカーとなるタンパク質を同定することにより病気等の診断、治療、予防に役立てることが可能である。このためには、プロテオーム解析は、高感度及び高精度が要求されると共に、多数の試料を短時間で比較解析することが出来る「ハイスループット」な分析であることが必要である。【０００４】
質量分析装置においてＭＡＬＤＩ法又はＥＳＩ法などのソフトイオン化法が開発されたことで、現在、このようなハイスループットな分析が要求されるプロテオーム解析において質量分析装置が広く用いられるようになって来た。更に、タンパク質を断片化を経ずにそのまま構造解析する「トップダウン」研究も可能になっている。【０００５】
質量分析装置にかけるための試料の分離手段としては、従来から二次元電気泳動が使用されているが、最近は、より高速かつ高精度の分離が可能な液体クロマトグラフィを使用する例が見られる（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】Chen X., Cushman SW., Pannell LK., Hess S., J. Proteome Res., 2005;4:570-7
【非特許文献２】Delahunty C., Yates Jr 3rd., Methods, 2005; 35:248-55
【非特許文献３】Xiang R., Shi Y., Dillon DA., Negin B., Horvath C., Wilkins JA., J. Proteome Res., 2004; 3:1278-83
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のプロテオーム解析のようなハイスループットな解析においては、多数の検体から得られるデータを処理する必要がある。例えば、疾患・病態等の診断に使用できるマーカーを同定するような場合には、統計的に有意な結果を得るために、被検群（例えば、患者群）及び対象群（例えば、健常者群）の夫々が、出来るだけ多数の検体から構成されていることが好ましい。従って、このようなハイスループットな解析において得られる多数のデータを迅速に解析処理する方法が必要となる。【０００７】
本発明の目的は、上記課題を解決することであり、発明者は鋭意研究の結果、複数群から得られた多数の検体中に含まれる物質の存在量に対応する測定値を比較解析する方法を検討し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、以下の各態様にかかる。
［１］複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析（Differential 解析）する方法であって、
（１）ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から該存在量に対応する測定値を得、
（２）該ｎ種類の分析システムで得られたデータの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値をプロットし、
（３）ｍ次元の空間内に、夫々、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群を作成し、
（４）各クラスター毎に、含まれる測定値を各群間で統計的に処理する、
ことから成る、前記方法。
［２］更に、少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質をマーカー候補として抽出する、上記１記載の方法。
［３］ 更に、ｍ次元の空間のプロットが可視化されることを特徴とする、上記１又は２記載の方法。
［４］複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析する方法であって、
（ａ）ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムで得られたデータ、及び、該分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から得られた該存在量に対応する測定値が入力されるステップ、
（ｂ）入力された該データの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値がプロットされるステップ、
（ｃ）ｍ次元の空間内に、夫々、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群が作成されるステップ、及び
（ｄ）作成された各クラスター毎に、含まれる測定値が各群間で統計的に処理されるステップ、から成る前記システム。
［５］更に、（ｅ）少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質が該マーカー候補として抽出されるステップ、及び／又は、（ｆ）ｍ次元の空間のプロット及び／又はクラスターが可視化されるステップを含む、上記４記載の方法。
［６］クラスターの作成が、以下のパラメーターの少なくとも２以上を組み合わせた条件下で行われることを特徴とする、上記１〜５のいずれか一項に記載の方法：
（１）分析システムで得られたデータの範囲；
（２）各クラスターの大きさ（各データの幅）；
（３）各クラスターの間隔； 
（４）測定値の最低値；
（５）オーバーラップ率；及び
（６）カバー率。
［７］各試料中の物質のデータが二次元液体クロマトグラフィにおける分画位置と質量分析における（m/z）であり、試料中に含まれる物質の存在量に対応する測定値が質量スペクトルの強度であることを特徴とする、上記１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［８］二次元液体クロマトグラフィが、陽イオン交換カラム及び逆相カラムから構成されるものであることを特徴とする、上記１〜７のいずれか一項に記載の方法。
［９］上記１〜８のいずれか一項に記載の方法を用いるプロテオーム解析システム。
［１０］複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析するシステムであって、
（ａ）記憶手段に、ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムで得られたデータ、及び、該分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から得られた該存在量に対応する測定値を入力する手段、
（ｂ）処理装置において、記憶手段に記憶された該データ、及び、該測定値を取得する手段、
（ｃ）処理装置において、取得した該データの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値をプロットする手段、
（ｄ）記憶手段に、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群を作成するために予め設定された条件を入力する手段、
（ｅ）処理装置において、記憶手段に記憶された該条件を取得する手段、
（ｆ）処理装置において、取得した条件下で、ｍ次元の空間内にクラスターの群を作成する手段、及び
（ｇ）処理装置において、作成された各クラスター毎に、含まれる測定値を各群間で統計的に処理する手段、から成る前記システム。
［１１］更に、（ｈ）処理装置において、少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質マーカー候補として抽出する手段、及び／又は、（ｉ）出力装置に、ｍ次元の空間のプロット及び／又はクラスターを可視化する手段を含む、上記１０記載のシステム。
［１２］クラスターの作成が、以下のパラメーターの少なくとも２以上を組み合わせた条件下で行われることを特徴とする、上記１０又は１１記載のシステム：
（１）分析システムで得られたデータの範囲；
（２）各クラスターの大きさ（各データの幅）；
（３）各クラスターの間隔； 
（４）測定値の最低値；
（５）オーバーラップ率；及び
（６）カバー率。
［１３］コンピューターに、複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析するために、
（ａ）ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムで得られたデータ、及び、該分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から得られた該存在量に対応する測定値が入力されるステップ、
（ｂ）入力された該データの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値がプロットされるステップ、
（ｃ）ｍ次元の空間内に、夫々、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群が作成されるステップ、及び
（ｄ）作成された各クラスター毎に、含まれる測定値が各群間で統計的に処理されるステップ、を実行させるためのプログラム。
［１４］更に、ｅ）少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質がマーカー候補として抽出されるステップ、及び／又は、（ｆ）ｍ次元の空間のプロット及び／又はクラスターが可視化されるステップを実行させるため、上記１３記載のプログラム。
［１５］コンピューターを、複数群から得られた検体中に含まれる物質の存在量を比較解析するために、
（ａ）記憶手段に、ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムで得られたデータ、及び、該分析システムにおいて、各検体から派生する複数の試料から得られた該存在量に対応する測定値を入力する手段、
（ｂ）処理装置において、記憶手段に記憶された該データ、及び、該測定値を取得する手段、
（ｃ）処理装置において、取得した該データの少なくとも一部で規定されるｍ次元の空間に各測定値をプロットする手段、
（ｄ）記憶手段に、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群を作成するために予め設定された条件を入力する手段、
（ｅ）処理装置において、記憶手段に記憶された該条件を取得する手段、
（ｆ）処理装置において、取得した条件下で、ｍ次元の空間内にクラスターの群を作成する手段、及び
（ｇ）処理装置において、作成された各クラスター毎に、含まれる測定値を各群間で統計的に処理する手段、として機能させるためのプログラム。
［１６］更に、（ｈ）処理装置において、少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質をマーカー候補として抽出する手段、及び／又は、（ｉ）出力装置に、ｍ次元の空間のプロット及び／又はクラスターを可視化する手段として機能させるための、上記１５記載のプログラム。
［１７］上記１３〜１６のいずれか一項に記載のプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体。
［１８］上記５〜８のいずれか一項に記載の方法で抽出されたマーカー候補物質。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、各分析装置における実験誤差を考慮して同一物質（例えば、タンパク質）に由来するものと判断される測定値（例えば、質量スペクトルの強度）をクラスター化して、各クラスター内でその測定値をハイスループットに統計処理することができる。こうすることによって、夫々、1,000検体以上にも及ぶ多数の検体から成る100群を超える群間の比較解析も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】液体クロマトグラフィからの分画番号をＹ軸、及び、質量分析装置で得られる「ｍ／ｚ」をＸ軸とする２次元の空間に、質量（マス）スペクトルにおける強度（ピーク）をプロットした様子を示す。
【図２】各試料中の同一物質に由来する測定値（ピーク）から構成されるクラスターの群を作成した様子を示す。
【図３】肝がん患者及び健常人の２つ群の間で統計的有意差がある物質をマーカー候補として抽出し、それを表として出力した結果を示す。尚、強度（Intensity）は内部標準で清純化（normalize）した。
【図４】統計的有意差がある物質をマーカー候補として抽出し表に出力した様子を示す。Score（SensitivityとSpecificityの平均）の値が９０％以上のものが３０クラスター、８０％以上のものが１２９クラスター見つかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明においては、ｎ種類（ｎは２以上）の分析システムにより、各検体から派生する複数の試料から、検体中に含まれる物質の存在量に対応する測定値を得るものである。本発明は、プロテオーム解析のようなハイスループットな解析に有用なものである。【００１２】
従って、本発明方法には、分析システム（装置）による具体的な測定値及びデータを得る「ウェット」な要素と、こうして得られた各種の情報をコンピューターにより処理する「ドライ」な要素から成る方法が含まれる。【００１３】
各群は、例えば、健常人、或るいは病態又は特定の疾患患者のように、特定の生理的条件に関して共通の状態を有するか、又は共通の環境下にある検体提供者から構成される。各群は通常、複数ないし多数の検体提供者を有する。本発明の特徴の一つは、このような多数の検体提供者から構成される複数ないし多数の群に由来する多数の検体から得られた測定値を統計処理することにより、ハイスループットに群間の比較解析を可能とすることである。【００１４】
本発明で使用する「検体」は、最初の分析システムにおいて処理対象となるものである。検体の種類は特に限定されない。例えば、生体の任意の部位から採取し得る試料、例えば全血、血清、血しょう、尿、唾液等の体液が挙げられる。これらの検体は、プロテアーゼインヒビター等の添加等の適当な前処理を施されたものでも良い。【００１５】
本発明で、「試料」とは、分析システムにおける分離操作等によって各検体から派生するもので、ｎ種類の分析システムにおける最後の分析装置における一回分の分析（処理）操作の対象となるものである。【００１６】
かかる分析システムは当業者に公知の任意の装置から構成される。測定対象となる物質の種類に応じて、適宜選択して組み合わせることが可能である。例えば、タンパク質等の存在量を測定する場合には、二次元液体クロマトグラフィ（１段階目）と質量分析装置（２段階目）の２種類のシステムから構成することが出来る。【００１７】
従って、分析システムがこのように二次元液体クロマトグラフィと質量分析装置から構成される場合に、二次元液体クロマトグラフィにおける一次元目のカラム処理対象となるのが「検体」であり、二次元液体クロマトグラフィで分離され、次の質量分析装置において、夫々、分析対象となる各分画が「試料」となる。【００１８】
質量分析装置は、通常、試料導入部、イオン化室、分析部、検出部、記録部等を含むものである。イオン化法としては電子衝撃イオン化（EI）法、化学イオン化（CI）法、フィールドデソープション（FD）法、二次イオン化（SIMS）法、高速原子衝突（FAB）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（matrix-assisted laser desorption ionization:MALDI）、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法等を用いればよい。また、分析部は、二重収束質量分析計、四重極型質量分析計、飛行時間型質量分析計（TOF）、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計等が用いられる。MALDI法及びESI法によるイオン化を用いると、分子量１〜１０万程度のタンパク質を測定することも可能である。又、MALDI-TOF-MSなどを用いた質量分析の感度は通常attoモルからzeptoモルレベルであり、ELISA、RIA、CLIAなどよりも優れている。【００１９】
このような質量分析装置と組み合わせる二次元液体クロマトグラフィは、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、サイズエクスクルージョンカラム、及び逆相カラム等の当業者に公知の任意のカラムを適当に組み合わせて構成することが出来る。但し、質量分析装置におけるイオン化を阻害する緩衝液及び塩類を質量分析装置にかける試料中から排除するために、二次元目のカラムとしては、有機溶媒を使用する逆相カラムが好ましい。【００２０】
本発明において測定対象となる物質に特に制限はなく、比較解析の目的等に応じて、適宜選択することが出来る。例えば、タンパク質、核酸、糖類、脂質、それらの誘導体乃至複合体、又はこれらの複合体等を挙げることが出来る。これらの中で、例えば、或る病態又は疾患の検出に使用できるマーカー（バイオマーカー）の候補となる物質（マーカー候補）を抽出（同定）する目的で比較解析する場合には、検体中のタンパク質を測定対象とすることができる。【００２１】
尚、本明細書中で、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド又はオリゴペプチドのような複数のアミノ酸残基のペプチド結合により構成される物質も包括的に意味し、更に、生体中に存在するインタクトな状態の「タンパク質」に加えて、それらが何らかの原因で分解されて生じる部分ペプチド又はペプチド断片も含むものである。【００２２】
複数の試料から得られる測定値をプロットするｍ次元の空間はｎ種類の分析システムで得られたデータの少なくとも一部を使用して規定される。ここで、分析システムで得られたデータとは、その試料を特定するパラメーターであり、具体的には、例えば、二次元液体クロマトグラフィにおける二次元目のカラムからの分画番号（分画位置）、及び、質量分析装置で得られる「ｍ／ｚ」（分子量／電荷）である。従って、これらのデータを用いた場合には、２次元の空間を構成することができる。尚、ここで、「ｎ」と「ｍ」は別の数字又は別の数字であっても良い。即ち、例えば、３種類の分析システムから得られる２種類のデータで２次元の空間を構成しても良いし、或いは、２種類の分析システムから得られる３種類のデータで３次元の空間を構成することも可能である。【００２３】
こうして規定されたｍ次元の空間内に、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターを作成する。即ち、本来、同一物質であるならば、いずれの検体由来のものであっても、ｎ種類の分析システムにおいて、同一のデータが得られ、上記ｍ次元の空間内で同一座標上にプロットされることが期待される。しかしながら、分析システムにおける微妙な条件の設定の相違又は操作中の条件の変動等の不可避的な原因により、各試料間で同一物質に由来する測定値に誤差（バラつき）が生じることがある。従って、上記クラスターは、このような誤差を考慮して、ｍ次元の空間において別の位置にプロットされた測定値であっても、本来、同一物質に由来するものであると考えられるようなものを一つの集合として把握することにより、多数試料から得た測定値に基づき、各群間で統計的に処理することを可能とするものである。【００２４】
このようなクラスターを作成するための条件は、当業者が、検体及び測定対象物質の種類、及び使用する分析システムの構成等に応じて、適宜、設定することができる。例えば、非限定的な例ではあるが、以下のパラメーターの少なくとも２以上を組み合わせた条件下でクラスターを作成することができる。
（１）分析システムで得られたデータの範囲；
（２）各クラスターの大きさ（各データの幅）；
（３）各クラスターの間隔； 
（４）測定値の最低値；
（５）オーバーラップ率；及び
（６）カバー率。
ここで、「オーバーラップ率」とは、ｍ次元空間上におけるクラスターの重なり率を意味する。例えば、２次元空間上にクラスターを形成する場合には、例えば、クラスターの大きさをdx=10, dy=20 としたときに、（10,5）−（20,25）のクラスターと（15,0）−（25,20）のクラスターの重なり合っている部分は（15,5）−（20,20）の範囲となり、この場合に、オーバーラップ率は、（（20-15）x（20-5））／（10 x 20）=３７．５％となる。
又、「カバー率」とは、クラスター中に含まれる試料の全試料における割合を意味する。例えば、Ａ群及びＢ群に属する、夫々、２０個の試料の比較解析を行うときに、あるクラスターに含まれるＡ群ぼ試料数が１３個、及びＢ群の試料が４個だとすると、Ａ群のカバー率は６５％、Ｂ群のカバー率は２０％と計算される。このような場合には、クラスターとして成立させるには、カバー率が大きい方（Ａ群のカバー率）が指定したカバー率よりも大きいことを条件とする。【００２５】
より具体的には、例えば、二次元液体クロマトグラフィにおける二次元目のカラムからの分画番号（分画位置）、及び、質量分析装置で得られる「ｍ／ｚ」をデータとして用いて２次元の空間を規定した場合には、上記パラメーターは以下の通りである。
（１）対象とするm/zの範囲；
（２）クラスターの大きさ（クロマトグラフィー分画位置（数）とm/zの幅で指定する）；
（３）m/z 間隔及びFraction 間隔；
（４）質量分析における強度（インテンシティ）の最低値；
（５）カバー率の最小値。即ち、予め指定されたカバー率以上であるかを確認する。いずれかの群の指定されたカバー率未満のときはそのクラスター候補を除外する。；
（６）オーバーラップ率の最大値。即ち、クラスター候補が他のクラスター候補とのオーバーラップ率が指定されたオーバーラップ率未満であるかを確認する。予め指定されたオーバーラップ率を超える場合には、オーバーラップしている２つのクラスター候補のうち、統計的に処理した後の評価の高いクラスター候補を残し、評価の低いクラスター候補を除外する。【００２６】
各クラスター毎に、含まれる測定値を各群間で統計的に処理する。この統計的な処理は当業者に公知の適当な手段を用いて行うことができる。例えば、アルゴリズム（Support Vector Machine:SVMによるCross Validation、Welchのt-検定など）を用いて行うことができる。【００２７】
その結果、少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質をマーカー候補として抽出することが出来る。統計的有意差があるか否かの選択（評価）は、予め定められた一定の基準に従い行うことが出来る。例えば、Sensitivity「感度」（診断用マーカーとして使用した場合に、罹患者を陽性と検出する割合。例えば、罹患者２０名に対して、陽性者が１４名だったときには、Sensitivityは14/20=70% となる。）とSpecificity「特異度」（診断用マーカーとして使用した場合に、非罹患者を陰性と検出する割合。例えば、非罹患者２０名に対して、陰性者が１２名だったときには、Specificityは12/20=60% となる。）との算術平均であるScoreかの値が高い、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上の物質を統計的有意差がある物質として選択することが出来る。また、このようなマーカー候補として抽出された物質属するクラスターＩＤ、Sensitivity、Specificity、及びScore等の具体的な数値等を表として出力することも可能である。【００２８】
更に、ｍ次元の空間のプロット及び／又はクラスターは、ディスプレイ等の適当な出力装置を用いて可視化することが出来る。この際に、各群に属する検体に由来する測定値は、夫々、同一の色でスポットし、他の群に属する検体に由来する測定値と、視覚的に容易に識別できるようにすることが好ましい。更に、測定値の大小（強弱）に応じて、出力装置上のスポットの輝度等を変化させることも可能である。【００２９】
本発明は、上記のようにして同定されたマーカー（バイオマーカー）候補にも係るものである。このようなマーカー候補のあるものは、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、質量分析法、二次元電気泳動、表面プラズモン共鳴等の当業者に公知の任意のアッセイ系でマーカーとして使用され、各種病態又は疾患等の検出・診断方法等に有用である。【００３０】
本発明のシステムに使用する記憶手段、処理装置、及び出力装置は、適当なメモリー装置、ＣＰＵ及びディスプレイ装置等の当業者に公知の任意の装置である。【００３１】
又、本発明のプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体は、ＦＤ、ＭＤ、ＣＤ、テープ、ハードディスク等の当業者に公知の任意の形態をとることが出来る。【００３２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は当業者に公知の標準的な方法で行われ、又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【実施例１】
【００３３】
肝がん患者（２０検体）及び健常人（２０検体）から血液を採取し、血清を得、それぞれの血清中のペプチドを、２次元ミクロ高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にて分画した。一次元目の液体クロマトグラフィーは陽イオン交換モードとし、カラムはPolySulfoethyl A 50 x 1 mm, 5μm, 200 Å (Poly LC社)を用いた。また、２次元目は、逆相モードとし、カラムはBetaBasic C-18  0.3 mm x 100 mm, 5μm, 150 Å (Keystone 社)を用いた。血清20μl を１次元目の陽イオン交換カラムにアプライし、カラムに吸着したペプチドを６分画に溶出した。溶出液は、10 mM ギ酸アンモニウムバッファー pH3.8に、0%、10%、20%、30%、50%、100%の100 mM 硫酸アンモニウムを添加したものとした。こうして得られた６分画のそれぞれを更に２次元目の逆相クロマトグラフィーにて190分画に採取した。吸着したペプチドは、水/アセトニトリル/ギ酸＝95/5/0.1 (v/v)溶液に水/アセトニトリル/ギ酸＝20/80/0.1 (v/v) を0%から80%までリニアーモードで添加していくことにより溶出した。こうして、各サンプル血清中のペプチドは、1,140 (6 x 190) に分画されたことになる。この1,140分画の溶出液（本発明における「試料」に相当する）のそれぞれをサンプルプレートにスポッティングし、マトリックス溶液(DHB)を添加して各分画中のペプチドと共結晶させた。この状態で質量分析計（MALDI-TOF型：島津製作所 AXIMA CFR plus）に装着して自動分析を行ない、質量（マス）スペクトルを得た。なお、各ピークの取得に際して、キャリブレーションは常法に従い、内部標準（Bradykinin）を用いて行った。【００３４】
上記二次元液体クロマトグラフィにおける二次元目のカラムからの分画番号をＹ軸、及び、質量分析装置で得られる「ｍ／ｚ」をＸ軸とする２次元の空間を構成し、これに、質量（マス）スペクトルにおける強度（ピーク）を物質の存在量に対する測定値としてプロットした（図１）。次に、以下の条件下で、各試料中の同一物質に由来する測定値から構成されるクラスターの群を作成した（図２）。
（１）分析システムで得られたデータの範囲：５００ｍ／ｚ〜５０００ｍ／ｚ、
（２）各クラスターの大きさ（各データの幅）：２４分画（Ｙ軸：クロマトグラフィ）及び０．３ｍ／ｚ（Ｘ軸：質量分析）、
（３）各クラスターの間隔：２分画（Ｙ軸：クロマトグラフィ）及び０．０２ｍ／ｚ（Ｘ軸：質量分析）、
（４）測定値の最低値：内部標準（Bradykinin）の強度（Intensity） を50,000としたときに1,000
（５）オーバーラップ率：２０％、及び
（６）カバー率：５０％。
更に、各クラスター毎に、含まれる測定値を、SVMによる２群識別（Cross Validation）及びt-検定により各群間で統計的に処理した（図３)。その結果、少なくとも２つの群の間で統計的有意差がある物質がマーカー候補として抽出され、その上位の一部を表（クラスターリスト）として出力された(図４)。尚、出力装置に、図１〜図３に示されたｍ次元の空間のプロット及びクラスターは、適当なディスプレイ装置に可視化されたものである。尚、上記条件下で、Pentium（登録商標）4 3.2 GHz, Windows （登録商標）XP のシステムを使用して解析に要した時間は、約８時間であった。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、基礎科学に関する研究にのみでなく、医療への応用など、社会的な貢献度も高い。例えば本発明方法を用いることによって、多群から成る患者と健常人から由来した血液や組織に含まれるタンパク質、核酸、糖質、脂質、代謝産物個々の物質の発現量を比較解析することにより、疾患に伴って発現量が変化する物質（疾患バイオマーカー）を発見し診断に役立てることも可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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