(57)【要約】  全ゲノムを対象としたSNPによるゲノムワイド相関研究を行い、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に関連する２種の遺伝子を同定することに成功した。また、該遺伝子上に動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査に利用可能な多型変異を見出すことに成功した。該多型変異の有無を指標とすることにより、被検者について動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査を効率的に実施することができる。また、該遺伝子の発現もしくは機能を指標とすることにより、動脈硬化性疾患の治療薬のスクリーニング方法が可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者におけるＡＧＴＲＬ１遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
【請求項２】
被検者について、ＡＧＴＲＬ１遺伝子におけるＤＮＡ変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
【請求項３】
前記変異が、Ｓｐ１転写因子との結合を変化させる変異である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
被検者におけるＰＲＫＣＨ遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
【請求項５】
被検者について、ＰＲＫＣＨ遺伝子におけるＤＮＡ変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
【請求項６】
変異が多型変異である、請求項１〜５のいずれかに記載の検査方法。
【請求項７】
被検者について、ＡＧＴＲＬ１遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
【請求項８】
多型部位が、ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における（１ａ）１位、（２ａ）１２５４１位、（３ａ）２１５４５位、（４ａ）３３０５１位、（５ａ）３５３６５位、（６ａ）３９２６８位、（７ａ）３９３５３位、（８ａ）３９３７０位、（９ａ）３９４７４位、（１０ａ）３９５５３位、（１１ａ）３９６６５位、（１２ａ）４１７８６位、（１３ａ）４２０１９位、（１４ａ）４２５０９位、（１５ａ）４３０２９位、（１６ａ）４３４０６位、（１７ａ）４３６６３位、（１８ａ）４６７８６位、（１９ａ）４９７６４位、（２０ａ）６４２７６位、（２１ａ）７４４８２位、（２２ａ）７８１６２位、（２３ａ）９３４９２位、または（２４ａ）１０２９３８位の多型部位である、請求項７に記載の検査方法。
【請求項９】
請求項８の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の（１ｂ）〜（２４ｂ）である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される請求項８に記載の検査方法。
（１ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の１位における相補鎖の塩基種がＴ
（２ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の１２５４１位における相補鎖の塩基種がＴ
（３ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の２１５４５位における相補鎖の塩基種がＡ
（４ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３３０５１位における相補鎖の塩基種がＣ
（５ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３５３６５位における相補鎖の塩基種がＴ
（６ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位における相補鎖の塩基種がＡ
（７ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９３５３位における相補鎖の塩基種がＧ
（８ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９３７０位における相補鎖の塩基種がＣ
（９ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９４７４位における相補鎖の塩基種がＴ
（１０ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９５５３位における相補鎖の塩基種がＴ
（１１ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９６６５位が欠失
（１２ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４１７８６位における相補鎖の塩基種がＡ
（１３ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４２０１９位における相補鎖の塩基種がＧ
（１４ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４２５０９位における相補鎖の塩基種がＧ
（１５ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４３０２９位における相補鎖の塩基種がＧ
（１６ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４３４０６位における相補鎖の塩基種がＣ
（１７ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４３６６３位における相補鎖の塩基種がＴ
（１８ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４６７８６位における相補鎖の塩基種がＣ
（１９ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４９７６４位における相補鎖の塩基種がＴ
（２０ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の６４２７６位における相補鎖の塩基種がＴ
（２１ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の７４４８２位における相補鎖の塩基種がＣ
（２２ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の７８１６２位における相補鎖の塩基種がＧ
（２３ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の９３４９２位における相補鎖の塩基種がＧ
（２４ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の１０２９３８位における相補鎖の塩基種がＣ
【請求項１０】
被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックが検出された場合に動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される方法。
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ
【請求項１１】
被検者について動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロック内に存在し互いに連鎖することを特徴とする多型部位の塩基種を決定する工程を含む検査方法。
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ
【請求項１２】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
（ａ）  被検者におけるＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程
（ｂ）（ａ）で決定された塩基種が、以下の（Ａ）に記載のハプロタイプを示すＡＧＴＲＬ１遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する工程
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ
【請求項１３】
前記（ａ）の多型部位が、ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における１位、１２５４１位、２１５４５位、３３０５１位、３５３６５位、３９２６８位、３９３５３位、３９３７０位、３９４７４位、３９５５３位、３９６６５位、４１７８６位、４２０１９位、４２５０９位、４３０２９位、４３４０６位、４３６６３位、４６７８６位、４９７６４位、６４２７６位、７４４８２位、７８１６２位、９３４９２位、または１０２９３８位のいずれかの多型部位である、請求項１２に記載の検査方法。
【請求項１４】
動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるＡＧＴＲＬ１遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法。
【請求項１５】
被検者について、ＰＲＫＣＨ遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
【請求項１６】
多型部位が、ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列における（１ａ）１位、（２ａ）１６２１２位、（３ａ）３０９８１位、（４ａ）３２４０８位、（５ａ）３３４６３位、（６ａ）３４４４６位、（７ａ）３９３２２位、（８ａ）３９４６９位、（９ａ）３９４７１位、（１０ａ）４９２４８位、（１１ａ）４９３６７位、または（１２ａ）５２０３０位の多型部位である、請求項１５に記載の検査方法。
【請求項１７】
請求項１６の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の（１b）〜（１２b）である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される請求項１６に記載の検査方法。
（１b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の１位の塩基種がＡ
（２b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の１６２１２位の塩基種がＧ
（３b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３０９８１位の塩基種がＡ
（４b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３２４０８位の塩基種がＧ
（５b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３３４６３位の塩基種がＧ
（６b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３４４４６位の塩基種がＴ
（７b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３９３２２位の塩基種がＴ
（８b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３９４６９位の塩基種がＡ
（９b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３９４７１位の塩基種がＣ
（１０b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の４９２４８位の塩基種がＣ
（１１b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の４９３６７位の塩基種がＧ
（１２b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の５２０３０位の塩基種がＡ
【請求項１８】
動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるＰＲＫＣＨタンパク質の自己リン酸化活性またはキナーゼ活性が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法。
【請求項１９】
動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者について、ＰＲＫＣＨタンパク質のアミノ酸配列において３７４位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体を有する場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法。
【請求項２０】
被検者由来の生体試料を被検試料として検査に供する、請求項１〜１９のいずれかに記載の検査方法。
【請求項２１】
請求項８の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位、または、請求項１６の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬。
【請求項２２】
請求項８の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位、または、請求項１６の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬。
【請求項２３】
請求項８の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位、または、請求項１６の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬。
【請求項２４】
以下の（ａ）または（ｂ）を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査用試薬。
（ａ）ＡＧＴＲＬ１またはＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１またはＰＲＫＣＨタンパク質を認識する抗体
【請求項２５】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬。
（ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１タンパク質を認識する抗体
（ｃ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における３９３５３位または４２５０９位の部位を含むＤＮＡ領域からなるポリヌクレオチド
【請求項２６】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬。
（ａ）ＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）ＰＲＫＣＨタンパク質を認識する抗体
（ｃ）ＰＲＫＣＨタンパク質のアミノ酸配列において３７４位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するＰＲＫＣＨタンパク質変異体
【請求項２７】
ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
【請求項２８】
ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現抑制物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、請求項２７に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
（ａ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸
【請求項２９】
ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨタンパク質の機能抑制物質が、以下の（ａ）または（ｂ）の化合物である、請求項２７に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
（ａ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨタンパク質に結合する抗体
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨタンパク質に結合する低分子化合物
【請求項３０】
ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における３９３５３位または４２５０９位の部位を含むＤＮＡ領域と、Ｓｐ１転写因子との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
【請求項３１】
ＰＲＫＣＨタンパク質の自己リン酸化活性を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
【請求項３２】
ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
【請求項３３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項３４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項３５】
ＡＧＴＲＬ１遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）の発現が亢進した変異型ＡＧＴＲＬ１遺伝子である、請求項３２〜３４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４２５０９位における相補鎖の塩基種がＧである変異型ＡＧＴＲＬ１遺伝子
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９３５３位における相補鎖の塩基種がＧである変異型ＡＧＴＲＬ１遺伝子
【請求項３６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における３９３５３位または４２５０９位の部位を含むＤＮＡ領域からなるポリヌクレオチド、およびＳｐ１転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリヌクレオチドとＳｐ１転写因子との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項３７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）ＰＲＫＣＨタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）ＰＲＫＣＨタンパク質の自己リン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、自己リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項３８】
前記ＰＲＫＣＨタンパク質が、ＰＲＫＣＨタンパク質のアミノ酸配列において３７４位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体である、請求項３７に記載のスクリーニング方法。
【請求項３９】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）ＰＲＫＣＨタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）ＰＲＫＣＨタンパク質のプロテインキナーゼ活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、プロテインキナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＧＴＲＬ１遺伝子もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現、または多型変異を指標とする動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法、並びに、該遺伝子を利用した動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
1950〜1960年代に、わが国の脳卒中死亡率は世界で最も高かった。その後、1970年代前半からその死亡率は着実に低下して、1990年代に入り欧米諸国と肩を並べるに至っている（非特許文献１）。【０００３】
しかし、現在でも脳卒中は日本人の死因の第三位を占める主な死因の一つであることに変わりはない。またこの間、脳卒中の発生率も低下傾向にあったが、近年その低下傾向が鈍化し横ばい状態になりつつある（非特許文献２）。ひとたび脳卒中が発生すると、多くの場合に罹患者で身体障害や認知機能障害が残ることから、脳卒中は公衆衛生上の深刻な問題である（非特許文献３）。脳卒中発生率は加齢に伴って直線的に増加するが、わが国では高齢人口が急速に増加しつつあることから、脳卒中の一次予防は世界的に重要な社会的課題となっている。【０００４】
脳卒中は、脳梗塞、脳出血およびクモ膜下出血に大きく分けられる（非特許文献４）。このうち脳梗塞の頻度が最も高く、脳卒中全体の約70％を占める（非特許文献５）。脳梗塞はさらに、責任血管の大きさや発生機序により、細い穿通動脈の動脈硬化に起因するラクナ梗塞（LA）、頭蓋外および主要な頭蓋内動脈が冒されるアテローム硬化に起因するアテローム血栓性脳梗塞（AT）、心腔内にできた血栓が脳に飛来して発生する心原性脳塞栓性梗塞（CE）のサブタイプに細分される。LAおよびATは主として、脳を灌流する細い動脈または太い動脈におけるアテローム性動脈硬化が原因となって起こる。（非特許文献４）。【０００５】
脳卒中を初めとする多因子疾患は、環境要因とともに複数の遺伝子が関与する多因子疾患であり患者数も多いことから、その遺伝因子を解明することは、その診断・治療技術の発達や、疾患の予防に大きく貢献するとともに、医療経済に与える影響も大きいと考えられている。これまでの疫学研究で、脳梗塞の危険因子は、高血圧、糖尿病、脂質代謝異常および喫煙などが知られている（非特許文献１、６）。脳卒中の家族歴も危険因子であり、脳卒中のリスクは一卵性双生児の方が二卵性双生児よりも高い（非特許文献７）。これら双生児研究および家族歴研究により、脳梗塞に関する遺伝因子の存在は予想されるものの（非特許文献７）、脳梗塞の遺伝的な決定要因は未だにほとんど解明されていない。【０００６】
遺伝病ではない一般的な疾患（Common disease）の感受性を与える遺伝子を発見することを目的として、いくつかの研究スタイルが提唱されている（非特許文献８）。候補遺伝子アプローチは広く用いられているが、結果に再現性がないことが問題となっている（非特許文献９）。例えばこの手法を用いて脳梗塞の関連遺伝子が検討され、アテローム性動脈硬化に関係するいくつかの既知の候補遺伝子が報告されている。しかし、それらは他の対象集団では必ずしも再現性が得られていない（非特許文献１０）。一方、近年、脳卒中のような複雑な発生機序を有する疾患の関連遺伝子を探索するうえで、信頼性が高い研究手法としてゲノムワイド研究が注目されている（非特許文献１４）。ゲノムワイド相関解析により、わが国では心筋梗塞（非特許文献１１）、関節リウマチ（非特許文献１２）、クローン病（非特許文献１３）の関連遺伝子が同定され、異なる集団においてその再現性が確認されている。また、アイスランド人の集団を対象としたゲノムワイドの連鎖解析および相関解析により、ホスホジエステラーゼ4D（PDE4D）（非特許文献１５）と5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ALOX5AP）（非特許文献１６）が脳卒中の新規関連遺伝子として報告されている。しかし、このうちPDE4Dについては、その研究方法に重大な問題があるとの批判がある（非特許文献１７）。【０００７】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。【０００８】
【特許文献１】WO/2004/022592
【特許文献２】米国特許第6987110号
【特許文献３】米国特許第6492324号
【特許文献４】特願2003-518582号
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【非特許文献２】Kubo, M. et al., Stroke 34, 2349-2354 (2003).
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【非特許文献２０】Hanlon PR. et al., FASEB J. 2005 Aug;19(10):1323-5.
【非特許文献２１】Aronowski J. et al., J Cereb Blood Flow Metab. 2000 Feb;20(2):343-9.
【非特許文献２２】Kleinz MJ, et al., Regul Pept 2005; 126: 233-240.
【非特許文献２３】O’Carroll AM, et al., J Neuroendocrinol 2003; 15: 661-666.
【非特許文献２４】Kagiyama S, et al., Regl Pept 2005; 125: 55-59.
【非特許文献２５】Seyedabadi M, et al., Auton Neurosci. 2002; 101: 32-38.
【非特許文献２６】Katugampola SD, et al., Br J Pharmacol 2001; 132: 1255-1260.
【非特許文献２７】Tatemoto K, et al., Regul Pept 2001; 99: 87-92.
【非特許文献２８】Masri B, et al., FASEB J 2004; 18: 1909-1911.
【非特許文献２９】Hashimoto Y, et al., Int J Mol Med 2005; 16: 787-792.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
過去に脳梗塞の関連遺伝子として報告されているものは、CADASILにおけるNOTCH3遺伝子の異常およびMELASにおけるミトコンドリアDNAの遺伝子異常があるが、これらは明らかな遺伝性脳梗塞の原因遺伝子であり、一般に認められる脳梗塞の関連遺伝子ではない。一般的な脳梗塞の関連遺伝子としては、これまで主に脳梗塞の発症機序から推測される遺伝子（例えば凝固系遺伝子、ACE遺伝子、MTHFR遺伝子など）の多型を用いた候補遺伝子研究が行われているが一定の見解は得られていない。従って、新たな脳梗塞の関連遺伝子を同定するにはヒトの全ゲノムを対象としたゲノムワイド相関研究が必要である。これまでに脳卒中を対象としたゲノムワイド相関研究の報告としては、アイスランドのdeCODEグループからPDE4D遺伝子およびALOX5AP遺伝子が報告されているのみである。PDE4D遺伝子はアテローム血栓性脳梗塞と心原性塞栓症を併せた解析のみで有意な関連が見られたことから、その結果を疑問視する声があり、他集団での再現性の報告もない。ALOX5AP遺伝子は複数の集団で脳梗塞との関連が確認されているが、その関連はアイスランド以外の集団では極めて弱い。【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に関連する遺伝子、および該遺伝子の特徴を利用する用途の提供を課題とする。より具体的には本発明は、動脈硬化性疾患に関連する遺伝子、および該遺伝子上の多型を利用した動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法、並びに、動脈硬化性疾患の治療のための薬剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った。本発明者らは、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に対する遺伝的寄与に関して調べるために、遺伝子をベースとする大規模tag-SNPマーカーを用いてケースコントロール研究を行った。【００１２】
本発明者らは、プロテインキナーゼC（PKC）ファミリー遺伝子であるPRKCHが、ラクナ梗塞およびアテローム血栓性の梗塞と高度の関連性（p＝4.7×10-6）があることを見出した。14年間の前向き追跡研究において、PRKCH中のSNP（1425G＞A）はPKC活性に影響を及ぼし、脳梗塞発生のリスクを増大させた（p＝0.043、相対リスク2.58）。本発明者らはまた、PKCηがヒトのアテローム硬化病変の血管内皮細胞および泡沫マクロファージで発現され、重症度と相関することも見出した。上記の結果は、PRKCH中のSNPが、そのキナーゼ活性を変化させることにより、脳梗塞に関する新規な遺伝的危険因子となることを示している。【００１３】
今回、本発明者らは、脳梗塞症例1,112例と年齢・性を対応させた同数の対照例を用いた遺伝子ベースの大規模なケースコントロール研究を行い、PRKCHが脳梗塞に関連する遺伝子であることを新たに見出した。PRKCHのエクソン9中のSNP（1425G＞A）は、ラクナ梗塞群およびラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを併せた群と高い関連性があった。PKCηはアテローム硬化病変で発現されており、その発現レベルはアテローム硬化の重症度に伴って上昇した。機能解析により、このアミノ酸置換（V374I）はPKC活性を1.6倍の高さに誘導することが判明した。さらに、前向き追跡研究において、AA遺伝子型を有する対象者では、GA遺伝子型またはGG遺伝子型を有する対象者と比べて、脳梗塞の発生率が2.58倍高かった。これらの結果から、PRKCHは脳梗塞に関与する遺伝子であり、特にPRKCH中の多型変異(SNP)（1425G＞A）がその責任部位であることが示された。【００１４】
さらに発明者らは、AGTRL1遺伝子中のSNPが脳梗塞と関連することを新たに見出した。AGTRL1遺伝子によってコードされるAPJ受容体（アンジオテンシン1型受容体と相同性のある受容体タンパク質）は、心血管系（非特許文献２２）および中枢神経系（非特許文献２３）で発現され、これは血圧の調節（非特許文献２４〜２７）ならびに内皮細胞の移動（非特許文献２８）および増殖（非特許文献２９）に働くことが示されている。インビトロ機能解析により、本発明者らは、Sp1転写因子がAGTRL1のプロモーターおよびイントロン中のSNPと結合し、mRNAの発現レベルに影響を及ぼすことを見出した。これらの結果は、AGTRL1のハプロタイプが、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に対する感受性にかかわる新規の遺伝的決定要因であること、およびアテローム性動脈硬化の発症機序に関与していることを示している。【００１５】
今回見出された2遺伝子のうちAGTRL1遺伝子は7回膜貫通型G蛋白共役受容体であるAGTRL1をコードする遺伝子であり、高血圧や動脈硬化と深い関連を持つAngiotensin II receptor type 1と30%のホモロジーを有することが知られている。AGTRL1のリガンドとしてApelinが報告されており、これまでにラットの実験でApelinが血圧調節に関与することが報告されている。ヒトにおいては心不全患者でApelinやAGTRL1の発現が上昇していることやApelinの投与により静脈が収縮することが報告されている。従って、これまでの報告からAGTRL1は血圧調節に関与することが推測されるが、ヒトにおいてこれまで脳梗塞との関連を報告したものはない。一方、PRKCH遺伝子はPKCファミリーに属するPKC-etaをコードする遺伝子であり、これまでの報告ではマウスの皮膚に発現が高く癌における細胞増殖やアポトーシスとの関連が示唆されているが、ヒトにおける機能は全く不明でありPKC-etaの基質やシグナル伝達経路もほとんど解明されていない。従って、PKC-etaと脳梗塞との関連はこれまでの知見からでは全く示唆されない。【００１６】
上述の如く本発明者らは、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に関連する2遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成させた。【００１７】
本発明は、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に関連する遺伝子、および該遺伝子上の多型を利用した動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法、並びに、動脈硬化性疾患の治療のための薬剤のスクリーニング方法に関し、より具体的には、
〔１〕  被検者におけるＡＧＴＲＬ１遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔２〕  被検者について、ＡＧＴＲＬ１遺伝子におけるＤＮＡ変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔３〕  前記変異が、Ｓｐ１転写因子との結合を変化させる変異である、〔２〕に記載の検査方法、
〔４〕  被検者におけるＰＲＫＣＨ遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔５〕  被検者について、ＰＲＫＣＨ遺伝子におけるＤＮＡ変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔６〕  変異が多型変異である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検査方法、
〔７〕  被検者について、ＡＧＴＲＬ１遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔８〕  多型部位が、ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における（１ａ）１位、（２ａ）１２５４１位、（３ａ）２１５４５位、（４ａ）３３０５１位、（５ａ）３５３６５位、（６ａ）３９２６８位、（７ａ）３９３５３位、（８ａ）３９３７０位、（９ａ）３９４７４位、（１０ａ）３９５５３位、（１１ａ）３９６６５位、（１２ａ）４１７８６位、（１３ａ）４２０１９位、（１４ａ）４２５０９位、（１５ａ）４３０２９位、（１６ａ）４３４０６位、（１７ａ）４３６６３位、（１８ａ）４６７８６位、（１９ａ）４９７６４位、（２０ａ）６４２７６位、（２１ａ）７４４８２位、（２２ａ）７８１６２位、（２３ａ）９３４９２位、または（２４ａ）１０２９３８位の多型部位である、〔７〕に記載の検査方法、
〔９〕  〔８〕の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の（１ｂ）〜（２４ｂ）である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される〔８〕に記載の検査方法、
（１ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の１位における相補鎖の塩基種がＴ
（２ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の１２５４１位における相補鎖の塩基種がＴ
（３ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の２１５４５位における相補鎖の塩基種がＡ
（４ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３３０５１位における相補鎖の塩基種がＣ
（５ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３５３６５位における相補鎖の塩基種がＴ
（６ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位における相補鎖の塩基種がＡ
（７ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９３５３位における相補鎖の塩基種がＧ
（８ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９３７０位における相補鎖の塩基種がＣ
（９ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９４７４位における相補鎖の塩基種がＴ
（１０ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９５５３位における相補鎖の塩基種がＴ
（１１ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９６６５位が欠失
（１２ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４１７８６位における相補鎖の塩基種がＡ
（１３ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４２０１９位における相補鎖の塩基種がＧ
（１４ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４２５０９位における相補鎖の塩基種がＧ
（１５ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４３０２９位における相補鎖の塩基種がＧ
（１６ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４３４０６位における相補鎖の塩基種がＣ
（１７ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４３６６３位における相補鎖の塩基種がＴ
（１８ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４６７８６位における相補鎖の塩基種がＣ
（１９ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４９７６４位における相補鎖の塩基種がＴ
（２０ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の６４２７６位における相補鎖の塩基種がＴ
（２１ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の７４４８２位における相補鎖の塩基種がＣ
（２２ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の７８１６２位における相補鎖の塩基種がＧ
（２３ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の９３４９２位における相補鎖の塩基種がＧ
（２４ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の１０２９３８位における相補鎖の塩基種がＣ
〔１０〕  被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックが検出された場合に動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される方法、
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ
〔１１〕  被検者について動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロック内に存在し互いに連鎖することを特徴とする多型部位の塩基種を決定する工程を含む検査方法、
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ
〔１２〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
（ａ）  被検者におけるＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程
（ｂ）（ａ）で決定された塩基種が、以下の（Ａ）に記載のハプロタイプを示すＡＧＴＲＬ１遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する工程
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ
〔１３〕  前記（ａ）の多型部位が、ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における１位、１２５４１位、２１５４５位、３３０５１位、３５３６５位、３９２６８位、３９３５３位、３９３７０位、３９４７４位、３９５５３位、３９６６５位、４１７８６位、４２０１９位、４２５０９位、４３０２９位、４３４０６位、４３６６３位、４６７８６位、４９７６４位、６４２７６位、７４４８２位、７８１６２位、９３４９２位、または１０２９３８位のいずれかの多型部位である、〔１２〕に記載の検査方法、
〔１４〕  動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるＡＧＴＲＬ１遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法、
〔１５〕  被検者について、ＰＲＫＣＨ遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔１６〕  多型部位が、ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列における（１ａ）１位、（２ａ）１６２１２位、（３ａ）３０９８１位、（４ａ）３２４０８位、（５ａ）３３４６３位、（６ａ）３４４４６位、（７ａ）３９３２２位、（８ａ）３９４６９位、（９ａ）３９４７１位、（１０ａ）４９２４８位、（１１ａ）４９３６７位、または（１２ａ）５２０３０位の多型部位である、〔１５〕に記載の検査方法、
〔１７〕  〔１６〕の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の（１b）〜（１２b）である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される〔１６〕に記載の検査方法、
（１b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の１位の塩基種がＡ
（２b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の１６２１２位の塩基種がＧ
（３b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３０９８１位の塩基種がＡ
（４b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３２４０８位の塩基種がＧ
（５b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３３４６３位の塩基種がＧ
（６b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３４４４６位の塩基種がＴ
（７b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３９３２２位の塩基種がＴ
（８b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３９４６９位の塩基種がＡ
（９b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３９４７１位の塩基種がＣ
（１０b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の４９２４８位の塩基種がＣ
（１１b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の４９３６７位の塩基種がＧ
（１２b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の５２０３０位の塩基種がＡ
〔１８〕  動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるＰＲＫＣＨタンパク質の自己リン酸化活性またはキナーゼ活性が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法、
〔１９〕  動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者について、ＰＲＫＣＨタンパク質のアミノ酸配列において３７４位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体を有する場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法、
〔２０〕  被検者由来の生体試料を被検試料として検査に供する、〔１〕〜〔１９〕のいずれかに記載の検査方法、
〔２１〕  〔８〕の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位、または、〔１６〕の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔２２〕  〔８〕の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位、または、〔１６〕の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔２３〕  〔８〕の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位、または、〔１６〕の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔２４〕  以下の（ａ）または（ｂ）を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査用試薬、
（ａ）ＡＧＴＲＬ１またはＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１またはＰＲＫＣＨタンパク質を認識する抗体
〔２５〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬、
（ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１タンパク質を認識する抗体
（ｃ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における３９３５３位または４２５０９位の部位を含むＤＮＡ領域からなるポリヌクレオチド
〔２６〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬、
（ａ）ＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）ＰＲＫＣＨタンパク質を認識する抗体
（ｃ）ＰＲＫＣＨタンパク質のアミノ酸配列において３７４位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するＰＲＫＣＨタンパク質変異体
〔２７〕  ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
〔２８〕  ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現抑制物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、〔２７〕に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
（ａ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸
〔２９〕  ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨタンパク質の機能抑制物質が、以下の（ａ）または（ｂ）の化合物である、〔２７〕に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
（ａ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨタンパク質に結合する抗体
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨタンパク質に結合する低分子化合物
〔３０〕  ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における３９３５３位または４２５０９位の部位を含むＤＮＡ領域と、Ｓｐ１転写因子との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
〔３１〕  ＰＲＫＣＨタンパク質の自己リン酸化活性を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
〔３２〕  ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
〔３３〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔３４〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔３５〕  ＡＧＴＲＬ１遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）の発現が亢進した変異型ＡＧＴＲＬ１遺伝子である、〔３２〕〜〔３４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４２５０９位における相補鎖の塩基種がＧである変異型ＡＧＴＲＬ１遺伝子
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９３５３位における相補鎖の塩基種がＧである変異型ＡＧＴＲＬ１遺伝子
〔３６〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における３９３５３位または４２５０９位の部位を含むＤＮＡ領域からなるポリヌクレオチド、およびＳｐ１転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリヌクレオチドとＳｐ１転写因子との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
〔３７〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）ＰＲＫＣＨタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）ＰＲＫＣＨタンパク質の自己リン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、自己リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程
〔３８〕  前記ＰＲＫＣＨタンパク質が、ＰＲＫＣＨタンパク質のアミノ酸配列において３７４位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体である、〔３７〕に記載のスクリーニング方法、
〔３９〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）ＰＲＫＣＨタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）ＰＲＫＣＨタンパク質のプロテインキナーゼ活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、プロテインキナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程
を、提供するものである。【００１８】
さらに本発明は、以下を提供する。
〔４０〕  下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の物質の、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬の製造における使用。
（ａ）  〔８〕の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位、または、〔１６〕の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド
（ｂ）  〔８〕の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位、または、〔１６〕の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相
（ｃ）  〔８〕の（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位、または、〔１６〕の（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチド
（ｄ）  ＡＧＴＲＬ１またはＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｅ）  ＡＧＴＲＬ１またはＰＲＫＣＨタンパク質を認識する抗体
〔４１〕  下記（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の物質の、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬の製造における使用。
（ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）ＡＧＴＲＬ１タンパク質を認識する抗体
（ｃ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における３９３５３位または４２５０９位の部位を含むＤＮＡ領域からなるポリヌクレオチド
（ｄ）ＰＲＫＣＨ遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｅ）ＰＲＫＣＨタンパク質を認識する抗体
（ｆ）ＰＲＫＣＨタンパク質のアミノ酸配列において３７４位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するＰＲＫＣＨタンパク質変異体
〔４２〕  ＡＧＴＲＬ１もしくはＰＲＫＣＨ遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質の、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤の製造における使用。
〔４３〕  以下の（ａ）または（ｂ）に記載の物質の、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤の製造における使用。
（ａ）  ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における３９３５３位または４２５０９位の部位を含むＤＮＡ領域と、Ｓｐ１転写因子との結合を阻害する物質
（ｂ）  ＰＲＫＣＨタンパク質の自己リン酸化活性を阻害する物質
〔４４〕被検者（ヒト、またはその他哺乳動物等、好ましくは、動脈硬化性疾患の患者等）へ本発明の薬剤を投与する工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】PRKCHにおける遺伝子構造、症例-対照関連および連鎖不平衡を示す図である。a. PRKCH周辺のゲノム構造。b. PRKCHのエクソン-イントロン構造．ジェノタイピングがなされたPRKCH中のSNPは遺伝子の下に示されている（縦の線）。c. ラクナ性およびアテローム血栓性梗塞のケースコントロール相関解析。アレル頻度に関する-対数変換されたp値がy軸に対してプロットされている。d. D'（左下）およびΔ（右上）により計測したSNP間のペアワイズ連鎖不平衡。
【図２】374Vおよび374IのPKC活性の比較を示す図および写真である。a. rs2230500（1425G＞A）およびrs17098388（1427A＞C）のシークエンシングの結果を示す図である。b. PRKCHのドメイン構造．矢印はrs2230500の位置を示している。c. クーマシーブリリアントブルー染色によるモック、PRKCH-374VおよびPRKCH-374Iの免疫沈降物を示す写真である。d.等量のモック、PRKCH-374VおよびPRKCH-374Iの免疫沈降物を用いてウェスタンブロット法を行った結果を示す写真である。e. PS 10nMおよびPDBu 100μMによる刺激後のモック、PRKCH-374VおよびPRKCH-374Iの自己リン酸化アッセイを示す写真である。f. PS 10nMおよびPDBu 100μMによる3分間の刺激後のPRKCH-374VおよびPRKCH-374IのPKC活性を示す図である。
【図３】PRKCHのアミノ酸置換の位置を示す図である。PRKCHのアミノ酸置換（V374I）は、PKCファミリーの保存されたATP結合部位の内部に位置する。星印は保存されたATP結合部位を示し、#はV374Iのアミノ酸置換を示している。
【図４】種々のヒト組織におけるPRKCH mRNAの相対的発現を示す図である。相対的mRNA発現は、リアルタイムPCRによって定量し、ACTB発現により標準化した。
【図５−１】アテローム硬化性動脈におけるPKCηの発現を示す写真である。a. 冠動脈アテローム硬化（AHAタイプIV病変）を有する症例の低倍率像（マッソントリクローム染色）。b. PKCη発現に関する低倍率像。c. c-1およびc-2は、パネルb中に枠で囲んで示した領域からの、連続切片の対応病変である。各連続パネルはCD31（c-1）およびPKCη（c-2）に対する免疫反応性を示している。CD31陽性内皮細胞はPKCηに対しても陽性であった。d. d-1およびd-2は、パネルb中に枠で囲んで示した領域からの、連続切片の対応病変である。各連続パネルはCD68（d-1）およびPKCη（d-2）に対する免疫反応性を示している。CD68陽性マクロファージの多くはPKCηに対しても陽性であった。e. e-1およびe-2は、パネルb中に枠で囲まれた領域からの、連続切片の対応病変である。各連続パネルはα-SMA（e-1）およびPKCη（e-2）に対する免疫反応性を示している。α-SMA陽性平滑筋細胞の一部はPKCηに対しても陽性であった。パネルbからeまでは、ヘマトキシリンにより対比染色されている。スケールバー：aおよびb＝500μm、cからeまで＝50μm。
【図５−２】AHA分類により定義されるアテローム硬化のグレードとアテローム硬化性内膜のPKCη発現との関係を示した棒グラフを示す図である。各バーは各群で検討した全切片における陽性面積の平均値±s.e.m.を表している。PKCη発現は冠動脈アテローム硬化の重症度に伴って直線的に増加した。
【図６】久山町研究における14年間の追跡による、PKCη遺伝子型別にみた、年齢および性別を調整した脳梗塞の発生率（1425G＞Aはアミノ酸置換V374Iに対応）を示す図である。
【図７】久山町研究における14年間の追跡による、PKCη遺伝子型別にみた、年齢および性別を調整した冠動脈疾患の発生率（1425G＞Aはアミノ酸置換V374Iに対応）を示す図である。
【図８】AGTRL1遺伝子の周辺の相関解析を示す図である。a. 症例群においてD'（左下の三角印）およびΔ2（右上の三角印）により評価した、AGTRL1遺伝子の周辺のSNP間のペアワイズ連鎖非平衡（LD）地図。SNP6（矢印）は2回目のスクリーニングで検出されたマーカーSNPである。b. AGTRL1遺伝子の周辺での症例-対照プロット［-log10（P値）］。LAおよびATを有する被験症例860例と対照被験者860例とを比較した。SNP6（矢印）は2回目のスクリーニングで検出されたマーカーSNPである。c. AGTRL1遺伝子における遺伝子構造および多型。SNPの正確な位置は表１−１〜表１−６に示されている。ATG：開始コドン、TAG：終止コドン、I／D：挿入／欠失多型。
【図９】AGTRL1多型におけるEMSAの結果を示す写真および図である。a. 9種類の多型の各アレルの周辺に25bpプローブを用いたEMSA。SBC-3細胞からの核抽出物を用いた。b. EMSAに用いたプローブの配列。大文字は多型を示す。1：リスクアレル、2：非リスクアレル。c. MATCHプログラムによって推測したSNP4およびSNP9の各アレルの周辺のDNA配列とSp1との結合親和性。配列中の大文字は多型を示す。d. Sp1抗体によるSNP4領域およびSNP9領域のスーパーシフトアッセイ。SBC-3の核抽出物を用いた。矢印はプローブ-Sp1複合体のバンドおよびスーパーシフトしたバンドを示している。1：リスクアレル、2：非リスクアレル、C：Sp1コンセンサスオリゴヌクレオチド（Sp1と結合した陽性対照）。
【図１０】Sp1過剰発現細胞におけるAGTRL1 mRNAのRT-PCRの結果を示す写真および図である。293T細胞に対して、モックpCAGGSベクターまたはpCAGGS-Sp1ベクターをトランスフェクトした。AGTRL1 mRNAはSp1過剰発現により時間依存的に増加した。B2Mを内部対照用に用いた。a. 半定量的RT-PCR。b. 定量的リアルタイムRT-PCR。
【図１１】SNPによる影響を受ける転写調節活性の結果を示す図である。a. 5'隣接領域におけるSNP4（-279G／A）の各アレルの周辺の44 bp断片がpGL3-basicベクターに挿入されている。-279Gおよび-279Aはそれぞれ、SNP4のリスクアレルおよび非リスクアレルを示している。b. SNP4周辺の44bp断片およびSNP9（+1355G／A）周辺の53bp断片がpGL3-basicに挿入されている。ルシフェラーゼアッセイを、モックpCAGGSおよびpCAGGS-Sp1との同時トランスフェクション条件下でSBC-3細胞を用いて行った。Hap1、Hap2およびHap3はそれぞれ、リスク型ハプロタイプ（-279Gおよび+1355G）、非リスク型ハプロタイプ（-279Gおよび+1355A）および中間型ハプロタイプ（-279Gおよび+1355G）を示している。示されているデータは平均±s.d.である（n＝3、* P＜0.05、** P＜0.01）。各サンプルの試験は3回ずつ行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明者らは、脳梗塞等の動脈硬化性疾患と関連する遺伝子として、AGTRL1遺伝子およびPRKCH遺伝子を同定し、さらに、該遺伝子の発現もしくは機能に関与する多型変異(SNP)を同定した。また、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能の亢進は動脈硬化性疾患の発症と深く関連していることが見出された。被検者について、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現が亢進していれば、動脈硬化性疾患のリスク素因を有する（動脈硬化性疾患に罹患しやすい体質である）ものと判定することが可能である。【００２１】
本発明において「動脈硬化性疾患」とは、通常、動脈硬化を起因とする疾患を指す。具体的には、脳梗塞（例えば、ラクナ梗塞、アテローム性血栓性梗塞を含む）、心筋梗塞、動脈硬化症（例えば、アテローム性動脈硬化症を含む）、閉塞性動脈硬化症、大動脈瘤、腎動脈狭窄等を例示することができる。また、上記のラクナ梗塞は細動脈硬化を起因とする疾患であり、例えば、脳血管性痴呆（特にビンスワンガー病）、無症候性脳梗塞、微小心筋梗塞等も、本発明の動脈硬化性疾患に含まれる。【００２２】
AGTRL1遺伝子またはPRKCH遺伝子上の多型変異または発現等を指標とすることにより、動脈硬化症のリスク素因の有無の検査が可能であることが、本発明者らによって初めて見出された。【００２３】
本発明は、まず、被検者（被検者由来の生体試料）におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法を提供する。【００２４】
従って、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性（機能）を指標とすることにより、被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査することができる。【００２５】
本発明におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の塩基配列、およびそれら遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する情報は、上記のGenBankのアクセッション番号から、容易に取得することが可能である。また当業者においては、遺伝子表記（遺伝子名）を基に、公共の遺伝子データベースあるいは文献データベース等から遺伝子の塩基配列、および該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する情報を容易に入手することが可能である。【００２６】
AGTRL1遺伝子およびPRKCH遺伝子の、それぞれの塩基配列およびアミノ酸配列に関するGenBank等の公共のデータベースのアクセッション番号および配列表における配列番号を以下に示す。
AGTRL1mRNA:NM_005161(RefSeq)（配列番号：３）、アミノ酸：NP_005152（配列番号：４）
PRKCH mRNA:NM_006255(RefSeq)（配列番号：５）、アミノ酸：NP_006246（配列番号：６）【００２７】
なお、AGTRL1遺伝子を含むゲノムDNA領域の塩基配列を、配列番号：１に示す。また、PRKCH遺伝子を含むゲノムDNA領域の塩基配列を、配列番号：２に示す。なおAGTRL1遺伝子およびPRKCH遺伝子ともに、配列表はプラス鎖を掲載している。【００２８】
本発明において「被検者」とは、通常ヒトであるが、本発明の検査方法は必ずしもヒトのみを被検対象とする方法に限定されない。ヒト以外の生物（好ましくは、脊椎動物であり、より好ましくはマウス、ラット、サル、イヌ、ネコ等の哺乳動物）を検査対象とする場合は、被検対象とする生物が有する内在性のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子に相当する遺伝子について、その発現量を指標として検査を行う。従って本発明における「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子」には、例えば、配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性のDNA（AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子ホモログ等）が含まれる。【００２９】
また、配列番号：１もしくは２に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、配列番号：１もしくは２に記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、配列番号：１もしくは２に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の生物におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。【００３０】
また本発明は、被検者におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される、動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法を提供する。【００３１】
上記方法においては、通常、被検者由来の生体試料を被検試料とする。該被検試料におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量の測定は、当業者においては公知の技術を用いて適宜実施することが可能である。【００３２】
なお、上記遺伝子の「発現」には、該遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」が含まれる。【００３３】
遺伝子の発現量を、該遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の生成量を指標として測定する場合、例えば、被検試料からタンパク質試料を調製し、該タンパク質試料に含まれるAGTRL1もしくはPRKCHの量を測定する。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法(ELISA)、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.5（2002）、蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.8（2002））、2次元電気泳動法、SDSポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられるが、これらに限定されない。【００３４】
遺伝子の発現量を、該遺伝子の転写産物（mRNA）の生成量を指標として測定する場合、例えば、被検試料からRNA試料を調製し、該RNA試料に含まれるAGTRL1もしくはPRKCHをコードするRNAの量を測定する。また、被検試料からcDNA試料を調製し、該cDNA試料に含まれるAGTRL1もしくはPRKCHをコードするcDNAの量を測定することによって、発現量を評価することも可能である。被検試料からのRNA試料やcDNA試料は、被検者由来の生体試料から、当業者に周知の方法で調製することができる。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を挙げることができる。【００３５】
なお、上記「対照」とは、通常、健常者由来の生体試料におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量を指す。なお、本発明におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現とは、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子から転写されるmRNAの発現、またはAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の両方を意味するものである。【００３６】
また本発明は、被検者について、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子における変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法を提供する。【００３７】
本発明において「動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査」には、被検者について動脈硬化性疾患の非リスク素因を有するか否かの検査、または、被検者について動脈硬化性疾患に罹患する可能性が高いか低いかを判定するための検査が含まれる。本発明の方法においては、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子において変異が検出された場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有する、または、動脈硬化性疾患の非リスク素因を有さない、あるいは動脈硬化性疾患に罹患しやすい体質を有すると判定される。【００３８】
一方、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子において変異が検出されない場合に、被検者は動脈硬化性疾患の非リスク素因を有する、または動脈硬化性疾患のリスク素因を有さない等と判定される。【００３９】
また本発明の方法により、動脈硬化性疾患を罹患していない被検者であっても、動脈硬化性疾患を罹患する可能性が高いか低いかを判定することができる。【００４０】
なお、本明細書で用いられる「治療」とは、通常、薬理学的なおよび／または生理学的な効果を得ることを意味する。効果とは、疾患や症状を完全にあるいは部分的に妨げる点で予防的であってもよく、疾患の症状を完全にあるいは部分的に治療する点で治療的であっても良い。本明細書における「治療」とは、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療すべてを含んでいる。そしてさらに、疾患のリスク素因があるが未だ発病していると診断されていない被検者の発病の予防、疾患の進行を抑制すること、または疾患を軽減させること、発症を遅らせることなどもこの「治療」に含まれる。【００４１】
本発明の検査方法により、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを判定し、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定された患者は、発症する前に適切な治療を選択し、動脈硬化性疾患の発症を事前に予防することができると考えられる。【００４２】
本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のDNA配列としては、具体的には、それぞれ配列番号：１または２に記載の配列が挙げられる。【００４３】
上記本発明の検査方法における「変異」の位置は、通常、上記AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のORF中、あるいは上記遺伝子の発現を制御する領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン等）中などに存在するが、これらに限定されるものではない。また、この「変異」とは、通常、上記遺伝子の発現量を亢進させる、mRNAの安定性を向上させる、あるいは上記遺伝子によってコードされるタンパク質の有する活性を上昇させるような変異であることが好ましい。本発明の変異の種類としては、例えば、塩基の付加、欠失、置換、挿入変異等を挙げることができる。【００４４】
AGTRL1遺伝子においては、Sp1転写因子の結合活性が変化するような「変異」であることが好ましい。該変異の好ましい例としては、後述の実施例において示すSNP4多型変異（配列番号：１に記載の塩基配列上において42509位の多型部位の塩基種がＣ（その相補鎖における塩基種がＧ）またはSNP9多型変異（配列番号：１に記載の塩基配列上において39353位の多型部位の塩基種がＣ（その相補鎖における塩基種がＧ）を挙げることができる。
また、PRKCH遺伝子の場合には、好ましい態様として、該遺伝子によってコードされるPRKCHタンパク質のアミノ酸配列において、３７４位のバリンがイソロイシンへ変化させるようなDNA変異を例示することができる。【００４５】
本発明者らは、被検者におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子において、動脈硬化性疾患に対して有意に関連する多型変異を見出すことに成功した。従って、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子上の多型部位について変異の有無を指標とする（塩基種を決定する）ことにより、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査を行なうことが可能である。【００４６】
本発明の好ましい態様においては、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子における多型変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査する方法である。【００４７】
多型とは、遺伝学的には、人口中1%以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義されるが、本発明における「多型」は、この定義に制限されない。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が欠失あるいは挿入している多型等が挙げられる。さらに、多型部位の数も、1個に限定されず、複数個の多型であってもよい。【００４８】
また本発明は、被検者について、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査する方法を提供する。【００４９】
本発明の動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査する方法における「多型部位」は、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子上、もしくはその周辺領域に存在する多型であれば、特に制限されない。AGTRL1上に見出される多型部位に関する情報を表１−１〜表１−６、PRKCH遺伝子上に見出される多型部位に関する情報を表２−１〜表２−６にそれぞれ示す。表中、「ストランド」の列における「＋」はプラス鎖を、「−」はマイナス鎖を表す。また、「多型の種類」の列における「snp」は一塩基多型変異を、「in-del」は挿入・欠失変異を表す。【００５０】
【表１−１】
2007123233.tif 000002
【００５１】
表１−２は表１−１の続きの表である。
【表１−２】
2007123233.tif 000003
【００５２】
表１−３は表１−２の続きの表である。
【表１−３】
2007123233.tif 000004
【００５３】
表１−４は表１−３の続きの表である。
【表１−４】
2007123233.tif 000005
【００５４】
表１−５は表１−４の続きの表である。
【表１−５】
2007123233.tif 000006
【００５５】
表１−６は表１−５の続きの表である。
【表１−６】
2007123233.tif 000007
【００５６】
下記表２−１〜表２−６において、網掛け領域がLDブロックを表す。
【表２−１】
2007123233.tif 000008
【００５７】
表２−２は表２−１の続きの表である。
【表２−２】
2007123233.tif 000009
【００５８】
表２−３は表２−２の続きの表である。
【表２−３】
2007123233.tif 000010
【００５９】
表２−４は表２−３の続きの表である。
【表２−４】
2007123233.tif 000011
【００６０】
表２−５は表２−４の続きの表である。
【表２−５】
2007123233.tif 000012
【００６１】
表２−６は表２−５の続きの表である。
【表２−６】
2007123233.tif 000013
【００６２】
即ち、本発明の好ましい態様においては、上記の表に記載された多型部位について塩基種を決定することを特徴とする方法である。
本発明の動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法に利用可能な多型部位としては、上記の多型部位の中でも、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子もしくは該遺伝子の周辺領域上の部位であることが好ましい。例えば、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における1位、296位、824位、932位、1042位、1072位、1666位、1840位、3096位、3181位、3225位、3381位、3416位、3778位、3911位、4243位、4257位、4665位、5057位、5179位、5417位、5448位、5530位、6002位、6401位、6563位、6878位、6897位、6961位、7496位、8690位、9040位、9159位、9440位、10350位、10499位、10535位、11235位、11290位、12541位、13104位、13735位、13793位、13855位、14025位、14955位、15071位、16909位、18281位、19106位、19474位、19654位、21090位、21545位、21776位、21890位、22337位、22374位、22992位、23248位、23297位、23643位、23694位、23845位、23926位、24060位、25119位、25448位、25463位、25738位、25794位、25893位、25959位、26569位、26826位、27070位、27131位、27892位、28039位、28121位、28634位、29116位、29129位、29190位、29305位、29389位、29727位、29854位、30221位、30289位、30290位、31284位、31581位、32022位、32477位、32611位、32707位、32776位、33051位、33395位、33521位、33656位、33781位、34650位、34876位、35091位、35274位、35365位、36267位、36325位、36596位、36619位、36681位、36682位、36689位、37100位、37110位、37112位、37119位、37123位、38159位、38577位、39052位、39268位、39353位、39370位、39474位、39553位、39593位、39689位、39947位、41023位、41786位、42019位、42291位、42509位、43029位、43050位、43406位、43663位、43988位、44040位、44043位、44158位、44355位、44368位、45099位、45245位、45624位、45978位、46786位、47018位、47040位、47086位、47533位、47544位、47856位、48601位、49486位、49612位、49717位、49764位、49955位、50184位、50690位、51270位、51277位、51345位、51927位、52104位、52105位、52111位、52199位、52565位、52805位、53178位、53204位、53294位、53344位、53374位、53803位、53950位、53951位、54173位、54176位、54503位、54675位、54759位、54878位、54999位、55126位、55741位、55844位、56311位、56685位、57034位、57481位、57532位、57958位、58146位、58306位、58349位、58819位、58857位、58897位、58905位、58922位、59043位、59241位、59591位、59839位、59902位、59985位、60094位、60414位、60607位、60787位、61115位、62272位、63956位、64000位、64276位、64346位、64347位、64822位、65200位、65728位、66097位、67396位、67439位、67621位、67686位、67735位、68077位、68365位、68404位、68569位、68708位、69107位、69600位、70230位、70323位、70848位、71415位、71661位、71905位、72191位、72470位、73045位、73202位、73320位、73587位、73796位、73828位、73880位、73896位、74007位、74013位、74072位、74117位、74146位、74176位、74203位、74482位、74690位、74836位、74894位、75641位、75692位、75814位、75855位、76163位、76390位、76580位、76805位、77111位、77112位、77277位、77312位、77831位、78162位、78588位、78820位、79154位、79207位、79365位、79434位、80159位、80450位、80452位、80885位、80988位、83257位、83725位、83991位、84278位、84739位、84837位、85040位、85626位、86221位、86546位、86668位、86693位、86853位、87029位、87233位、87347位、87395位、88324位、89226位、89277位、89449位、89939位、91547位、92560位、93492位、93934位、94294位、94335位、94472位、95090位、95492位、95874位、95941位、95991位、96195位、97257位、97738位、97753位、97792位、97812位、98004位、98851位、98887位、99073位、99807位、99951位、100013位、100179位、101328位、101571位、102318位、102423位、102662位、または102938位の多型部位が好ましい。【００６３】
また、PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列における1位、670位、1055位、1087位、1494位、1569位、1636位、1673位、1967位、1976位、2000位、2135位、2432位、2531位、2707位、4528位、5037位、5356位、5691位、6055位、6420位、7157位、7421位、7671位、7997位、8045位、8197位、8421位、9171位、9174位、9193位、9561位、9990位、10026位、10028位、10046位、10048位、10056位、10064位、10081位、10091位、10275位、10498位、11304位、11566位、11727位、12205位、12208位、12565位、12756位、12848位、12939位、13045位、13186位、13810位、14069位、14712位、15222位、15681位、16212位、16283位、16556位、17323位、17660位、17662位、17680位、18386位、18453位、18769位、19092位、19612位、20731位、21172位、21232位、21524位、21869位、22215位、22308位、22447位、22637位、23306位、23341位、23523位、23562位、24341位、24407位、24573位、24901位、25146位、25484位、26387位、26538位、26577位、27368位、27379位、28687位、30299位、30379位、30635位、30981位、31231位、31400位、31814位、31848位、31849位、31850位、31866位、31878位、32151位、32408位、33352位、33463位、34226位、34373位、34446位、34826位、34932位、35303位、35431位、35443位、35552位、35706位、35940位、36119位、36475位、36491位、36572位、36631位、36635位、36771位、37157位、37691位、37707位、38017位、38079位、38109位、39236位、39322位、39370位、39445位、39469位、39471位、39851位、39965位、40516位、41394位、41744位、41765位、42501位、42815位、42948位、43148位、43179位、43210位、43536位、44467位、44584位、44761位、45165位、45767位、45908位、45959位、46156位、46169位、46382位、46433位、47238位、48148位、48524位、48529位、48707位、48766位、48821位、49248位、49367位、49430位、49721位、50038位、50612位、50627位、51150位、51226位、51404位、51462位、51545位、51547位、51773位、51850位、51989位、または52030位の多型部位が好ましい。（なお、本明細書においては、該多型部位を単に『本発明の多型部位』と記載する場合がある）。【００６４】
なお、当業者においては掲載されたdbSNPデータベースのrs番号をもとに、当該部位についての塩基種の情報を適宜取得することができる。また、SNP IDの記載内容は、先頭にrsが付くものはdbSNPデータベースの登録IDのうちNCBIにより一配列に一意に定まるIDを付与されたものである。また、dbSNPデータベースはウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html）に公開されており、SNP IDに記載された登録ID番号を用いてウェブサイト上で検索することにより、塩基配列におけるSNPsの詳細な情報（例えば、染色体上の位置、多型部位の塩基の種類、前後の配列等）が入手できる。これらの情報を用いた場合、当業者においては、本発明に記載する検査を容易に行うことができる。【００６５】
当業者においては、通常、本明細書において開示された多型に付与された登録ID番号、例えばdbSNPデータベースにおけるrs番号によって、本発明の多型部位の実際のゲノム上の位置および前後の配列等を容易に知ることができる。これによって、知ることができない場合であっても、当業者においては、配列番号：１で示される塩基配列および多型部位等に関する情報から、適宜、該多型部位に相当する実際のゲノム上の位置を知ることは容易である。例えば、公開されているゲノムデータベース等と照会することにより、本発明の多型部位のゲノム上の位置を知ることができる。即ち、配列表に記載の塩基配列とゲノム上の実際の塩基配列との間に若干の塩基配列の相違がみられた場合であっても、配列表に記載の塩基配列を基にゲノム配列と相同性検索等を行うことにより、本発明の多型部位について、実際のゲノム上の位置を正確に知ることが可能である。また、ゲノム上の位置が特定できない場合でも、本明細書に記載の配列表および多型部位の情報から本発明に記載する検査を行うことは容易である。【００６６】
また、ゲノムDNAは、通常、互いに相補的な二本鎖DNA構造を有している。従って、本明細書においては、便宜的に一方の鎖におけるDNA配列を示した場合であっても、当然の如く、当該配列（塩基）に相補的な配列も開示したものと解釈される。当業者にとって、一方のDNA配列（塩基）が判れば、該配列（塩基）に相補的な配列（塩基）は自明である。なお、現在ヒトゲノム配列については、ほぼ最終版といわれているヒトゲノム国際プロジェクトbuild35が発表されており、本明細書に記した配列等はヒトゲノム国際プロジェクトbuild35の結果に基づいている。【００６７】
本発明の動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法においては、以下に記載の多型部位について検査を行なうことが好ましい。【００６８】
また本発明のさらに好ましい態様においては、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法においては、以下の（１ａ）の多型部位と（２４ａ）の多型部位との間の領域に含まれる多型部位、好ましくは、ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における（１ａ）１位、（２ａ）１２５４１位、（３ａ）２１５４５位、（４ａ）３３０５１位、（５ａ）３５３６５位、（６ａ）３９２６８位、（７ａ）３９３５３位、（８ａ）３９３７０位、（９ａ）３９４７４位、（１０ａ）３９５５３位、（１１ａ）３９６６５位、（１２ａ）４１７８６位、（１３ａ）４２０１９位、（１４ａ）４２５０９位、（１５ａ）４３０２９位、（１６ａ）４３４０６位、（１７ａ）４３６６３位、（１８ａ）４６７８６位、（１９ａ）４９７６４位、（２０ａ）６４２７６位、（２１ａ）７４４８２位、（２２ａ）７８１６２位、（２３ａ）９３４９２位、または（２４ａ）１０２９３８位の多型部位について検査を行う。【００６９】
本発明の好ましい態様においては、上記（１ａ）〜（２４ａ）に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の（１b）〜（２４b）である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される。被検者の動脈硬化性疾患の罹患の有無に関係無く、動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の判定を行うことができる。
（１ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の１位における相補鎖の塩基種がＴ
（２ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の１２５４１位における相補鎖の塩基種がＴ
（３ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の２１５４５位における相補鎖の塩基種がＡ
（４ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３３０５１位における相補鎖の塩基種がＣ
（５ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３５３６５位における相補鎖の塩基種がＴ
（６ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位における相補鎖の塩基種がＡ
（７ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９３５３位における相補鎖の塩基種がＧ
（８ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９３７０位における相補鎖の塩基種がＣ
（９ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９４７４位における相補鎖の塩基種がＴ
（１０ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９５５３位における相補鎖の塩基種がＴ
（１１ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９６６５位が欠失
（１２ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４１７８６位における相補鎖の塩基種がＡ
（１３ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４２０１９位における相補鎖の塩基種がＧ
（１４ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４２５０９位における相補鎖の塩基種がＧ
（１５ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４３０２９位における相補鎖の塩基種がＧ
（１６ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４３４０６位における相補鎖の塩基種がＣ
（１７ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４３６６３位における相補鎖の塩基種がＴ
（１８ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４６７８６位における相補鎖の塩基種がＣ
（１９ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の４９７６４位における相補鎖の塩基種がＴ
（２０ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の６４２７６位における相補鎖の塩基種がＴ
（２１ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の７４４８２位における相補鎖の塩基種がＣ
（２２ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の７８１６２位における相補鎖の塩基種がＧ
（２３ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の９３４９２位における相補鎖の塩基種がＧ
（２４ｂ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の１０２９３８位における相補鎖の塩基種がＣ【００７０】
なお、上記の塩基種は、本発明の遺伝子の塩基配列の＋鎖もしくは−鎖のいずれかの鎖における塩基種を表す。当業者であれば、本明細書に開示された情報を基に、当該多型部位において検出すべき塩基の種類を適宜判断することができる。【００７１】
また別の態様においては、また本発明のさらに好ましい態様においては、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法においては、以下の（１ａ）の多型部位と（１２ａ）の多型部位との間の領域に含まれる多型部位、好ましくはＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列における（１ａ）１位、（２ａ）１６２１２位、（３ａ）３０９８１位、（４ａ）３２４０８位、（５ａ）３３４６３位、（６ａ）３４４４６位、（７ａ）３９３２２位、（８ａ）３９４６９位、（９ａ）３９４７１位、（１０ａ）４９２４８位、（１１ａ）４９３６７位、または（１２ａ）５２０３０位の多型部位について検査を行う。【００７２】
本発明の好ましい態様においては、上記（１ａ）〜（１２ａ）に記載の多型部位における塩基種が、以下の（１b）〜（１２b）である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される。被検者の動脈硬化性疾患の罹患の有無に関係無く、動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の判定を行うことができる。
（１b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の１位の塩基種がＡ
（２b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の１６２１２位の塩基種がＧ
（３b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３０９８１位の塩基種がＡ
（４b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３２４０８位の塩基種がＧ
（５b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３３４６３位の塩基種がＧ
（６b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３４４４６位の塩基種がＴ
（７b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３９３２２位の塩基種がＴ
（８b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３９４６９位の塩基種がＡ
（９b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の３９４７１位の塩基種がＣ
（１０b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の４９２４８位の塩基種がＣ
（１１b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の４９３６７位の塩基種がＧ
（１２b）ＰＲＫＣＨ遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列の５２０３０位の塩基種がＡ【００７３】
本発明の方法において、上述の多型変異は一方のゲノムについて（ヘテロで）検出されればよいが、特に制限されないが、双方のゲノムにおいて（ホモで）検出されることが好ましい。【００７４】
例えば、PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号：２に記載の塩基配列における３９４６９位の遺伝子型がＡＡ（ホモ）である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと好適に判定される。【００７５】
本発明においては、上記多型部位以外であっても、該多型部位とその周辺のDNA領域は強く連鎖しているものと考えられることから、この強く連鎖しているDNAブロック上に存在する多型変異を検出することにより、本発明の検査方法を実施することも可能である。【００７６】
例えば、AGTRL1遺伝子については、多型部位の塩基種が上記（１b）〜（２４b）の塩基種であるような、動脈硬化性疾患の患者を含むヒトの小集団について、この「近傍の多型部位」（例えば、上記表１−１〜表１−６に記載の多型部位）における塩基種を予め決定する。【００７７】
次いで、この「近傍の多型部位」について被検者における塩基種を決定し、予め決定された前記塩基種と比較することにより、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査を行うことができる。予め決定された塩基種と同一の塩基種である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される。本発明の検査方法により、被検者の動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを判定することができ、治療方針の決定や薬剤投与量の決定等に利用することができる。【００７８】
例えば、AGTRL1遺伝子上の配列番号：１に記載の塩基配列における３９２６８位の多型部位の塩基種がＡである動脈硬化性疾患を罹患している人を含むヒトの小集団について、近傍の多型部位、例えば２９６位の多型部位の塩基種を決定する。この部位の塩基種が上記の動脈硬化性疾患を罹患している人においてＴである頻度が、上記動脈硬化性疾患を発症していない人に比べ高かった場合、被検者について１位の多型部位の塩基種を調べ、この部位の塩基種が同様にＴであった場合には、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される。【００７９】
以上のように、本発明により、動脈硬化性疾患に関連する遺伝子上の領域が明らかになったことにより、当業者に過度の負担を強いることなく、上記動脈硬化性疾患のリスク素因の有無について検査を行うことができる。【００８０】
また、ヒトゲノムの解析が進み全塩基配列やSNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLPsなどの多型情報も充実してきた。ゲノムの塩基配列について詳細が明らかになりつつある現在、最大の関心事は遺伝子あるいは特定の配列と機能（疾患・疾患の進行性などの表現型）との関連を解析することである。これを解決するための有力な手法の一つがハプロタイプを用いた遺伝統計学的解析である。【００８１】
ヒトの染色体は２本１組で存在し、それぞれ父親と母親から由来している。ハプロタイプとは、その一方に関する個体の遺伝子型の組み合わせをいい、それぞれ父母由来の１本の染色体上に遺伝子座がどのように並んでいるかを示すものである。染色体を父母から１本ずつ受け継ぐので、配偶子形成の際に組み換えが起きないとすれば１本の染色体上にのっている遺伝子は必ず一緒に子に伝えられる、すなわち連鎖する事になる。しかし、実際は減数分裂の際に組み換えが起きるため、１本の染色体上にのっている遺伝子であっても必ずしも連鎖しているわけではない。しかし逆に、遺伝的組み換えが起きた場合であっても同一染色体上の距離が近い遺伝子座は強く連鎖する。【００８２】
このような現象を集団において観察し、アリルの非独立が認められる事を連鎖不平衡という。例えば、３つの遺伝子座を観察した場合、これらの間に連鎖不平衡がないとすると、存在するハプロタイプは２3通りと予測され、それぞれの頻度は各遺伝子座の頻度から予測される値となるが、連鎖不平衡がある場合には２3通りより少ないハプロタイプしか存在せず、その頻度も予測と異なる値を示す結果となる。【００８３】
近年、ハプロタイプが連鎖不平衡解析に有用である事が示されており（Genetic Epidemiology 23:221-233）研究が行われているが、ゲノム上には組換えが起きやすい部位と起きにくい部位があり、１つの領域として先祖から子孫へと伝えられる部分（ハプロタイプによって特定される領域）は人種を越えて共通性がある事が明らかになっている（Science 226, 5576:2225-2229）。即ち、強く連鎖するDNA領域が存在し、この領域は一般的にDNAブロックと呼ばれる。本発明においては、本発明の多型部位を含むDNAブロックの存在の有無を検出することによっても、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査を行うことができる。【００８４】
即ち本発明の好ましい態様においては、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックの存在が検出された場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定されることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査する方法を提供する。
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ【００８５】
本発明において、DNAブロックとは、各遺伝子座間で強い連鎖不平衡を示す部位（領域）を指す。動脈硬化性疾患と関連するDNAブロックが見出されれば、該DNAブロックを検出することにより、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査が可能となる。【００８６】
動脈硬化性疾患と関連するハプロタイプ（を示すDNAブロック）が見出されれば、該ハプロタイプを検出することにより、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査が可能となる。本発明者らは、鋭意研究により、動脈硬化性疾患に対する感受性と関連するハプロタイプを見出すことに成功した。【００８７】
従って、本発明はAGTRL1遺伝子上に存在する、動脈硬化性疾患と関連するハプロタイプ（を示すDNAブロック）を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法を提供する。【００８８】
本方法においては、被検者について「動脈硬化性疾患と関連するハプロタイプ」を検出することで、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを判定することができる。これらの判定は例えば治療方針の決定等に利用することができる。【００８９】
上記「動脈硬化性疾患と関連するハプロタイプ（を示すDNAブロック）」とは、具体的には以下のようなハプロタイプ（を示すDNAブロック）を挙げることができる。
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ【００９０】
本発明の上記方法の好ましい態様においては、被検者について動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロック内に存在し互いに連鎖することを特徴とする多型部位の塩基種を決定する工程を含む検査方法である。
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ【００９１】
即ち、本明細書において具体的に記載された部位以外の多型部位であっても、上記DNAブロック上に含まれる多型であって、本発明の多型部位と互いに連鎖している多型部位であれば、本発明の検査方法に利用することが可能である。【００９２】
上記方法の好ましい態様においては、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者が動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法である。
（ａ）  被検者におけるAGTRL1遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程、
（ｂ）（ａ）で決定された塩基種が、以下の（Ａ）に記載のハプロタイプを示すAGTRL1遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する工程
（Ａ）ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の３９２６８位、３９３５３位、４１７８６位、４２０１９位、および４３４０６位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれＡ、Ｇ、Ａ、ＧおよびＣであるハプロタイプ【００９３】
なお、上記工程（ａ）における多型部位としては、例えば、上記表１−１〜１−６に記載の各多型部位を挙げることができるが、好ましくは、ＡＧＴＲＬ１遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における１位、１２５４１位、２１５４５位、３３０５１位、３５３６５位、３９２６８位、３９３５３位、３９３７０位、３９４７４位、３９５５３位、３９６６５位、４１７８６位、４２０１９位、４２５０９位、４３０２９位、４３４０６位、４３６６３位、４６７８６位、４９７６４位、６４２７６位、７４４８２位、７８１６２位、９３４９２位、または１０２９３８位のいずれかの多型部位を示すことができる。【００９４】
本発明の多型部位における塩基種の決定は、当業者においては種々の方法によって行うことができる。一例を示せば、本発明の多型部位を含むDNAの塩基配列を直接決定することによって行うことができる。【００９５】
本発明の検査方法に供する被検試料は、通常、予め被検者から取得された生体試料であることが好ましい。生体試料としては、例えばDNA試料を挙げることができる。本発明においてDNA試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、手術により採取あるいは切除した組織または細胞、検査等の目的で採取された体液等から抽出した染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。【００９６】
即ち本発明は、通常、被検者由来の生体試料（予め被検者から取得された生体試料）を被検試料として検査に供する方法である。【００９７】
当業者においては、公知の技術を用いて、適宜、生体試料の調製を行うことができる。例えば、DNA試料は、本発明の多型部位を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって調製することができる。【００９８】
本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者においては、DNAシークエンサー等を用いて容易に実施することができる。【００９９】
本発明の多型部位は、通常、その部位の塩基種のバリエーションが既に明らかになっている。本発明における「塩基種の決定」とは、必ずしもその多型部位についてＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃのいずれかの塩基種であるかを判別することを意味するものではない。例えば、ある多型部位について塩基種のバリエーションがＡまたはＧであることが判明している場合には、その部位の塩基種が「Ａでない」もしくは「Ｇでない」ことが判明すれば充分である。【０１００】
予め塩基のバリエーションが明らかにされている多型部位について、その塩基種を決定するための様々な方法が公知である。本発明の塩基種の決定のための方法は、特に限定されない。例えば、PCR法を応用した解析方法として、TaqMan PCR法、AcycloPrime法、およびMALDI-TOF/MS法等が実用化されている。またPCRに依存しない塩基種の決定法としてInvader法やRCA法が知られている。更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明における多型部位の塩基種の決定に応用できる。【０１０１】
［TaqMan PCR法］
TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。TaqMan PCR法は、アリルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、TaqManプローブを利用した解析方法である。TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアリルを含む領域にハイブリダイズするように設計される。【０１０２】
TaqManプローブのTmに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、１塩基の相違によってTaqManプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。TaqManプローブの存在下でPCR法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたTaqManプローブに到達する。このときDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって、TaqManプローブはその5'末端から分解される。TaqManプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、TaqManプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、TaqManプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。１塩基の相違のためにTaqManプローブのハイブリダイズが低下すればTaqManプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。【０１０３】
多型に対応するTaqManプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時に塩基種の判定を行うこともできる。例えば、レポーター色素として、あるアリルのアリルＡのTaqManプローブに6-carboxy-fluorescein(FAM)を、アリルＢのプローブにVICを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアリルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、FAMまたはVICのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アリルＡまたはアリルＢのホモであることが判明する。他方、アリルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。TaqMan PCR法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてPCRと塩基種の決定を同時に行うことができる。そのため、TaqMan PCR法は、多くの被検者についての塩基種を決定できる方法として有用である。【０１０４】
［AcycloPrime法］
PCR法を利用した塩基種を決定する方法として、AcycloPrime法も実用化されている。AcycloPrime法では、ゲノム増幅用のプライマー１組と、多型検出用の１つのプライマーを用いる。まず、ゲノムの多型部位を含む領域をPCRで増幅する。この工程は、通常のゲノムPCRと同じである。次に、得られたPCR産物に対して、SNPs検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。SNPs検出用のプライマーは、検出対象となっている多型部位に隣接する領域にアニールするようにデザインされている。【０１０５】
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ3'-OHをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネータ）を用いる。その結果、多型部位に相当する位置の塩基に相補的な塩基が１塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光(Fluorescence polarization;FP)の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる２種類のラベルを用いれば、特定のSNPsが２種類の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、１度の解析でアリルがホモかヘテロかを判定することもできる。【０１０６】
［MALDI-TOF/MS法］
PCR産物をMALDI-TOF/MSで解析することによって塩基種の決定を行うこともできる。MALDI-TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、タンパク質のアミノ酸配列や、DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。MALDI-TOF/MSによる塩基種の決定のためには、まず解析対象であるアリルを含む領域をPCRで増幅する。次いで増幅産物を単離してMALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アリルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。【０１０７】
MALDI-TOF/MSを利用した塩基種の決定には、PCR産物の分離工程などが必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確な塩基種の決定が期待できる。また複数の場所の多型の同時検出にも応用することができる。【０１０８】
［IIs型制限酵素を利用したSNPs特異的な標識方法］
PCR法を利用した更に高速な塩基種の決定が可能な方法も報告されている。例えば、IIs型制限酵素を利用して多型部位の塩基種の決定が行われている。この方法においては、PCRにあたり、IIs型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素（II型）は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してIIs型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。従って、この塩基数の分だけ離れた位置にIIs型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、IIs型制限酵素によってちょうど多型部位で増幅産物を切断することができる。【０１０９】
IIs型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、SNPsの塩基を含む付着末端(cohesive end)が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、多型変異に対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物は多型部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。【０１１０】
前記IIs型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー(capture primer)を組み合せてPCR法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。例えばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、塩基種を決定することができる。【０１１１】
［磁気蛍光ビーズを使った多型部位における塩基種の決定］
複数のアリルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。複数のアリルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成分が必要である。しかし実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができる。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気によって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、多重化多型タイピングが考え出された(バイオサイエンスとバイオインダストリー, Vol.60 No.12, 821-824)。【０１１２】
磁気蛍光ビーズを利用した多重化多型タイピングにおいては、各アリルの多型部位に相補的な塩基を末端に有するプローブが磁気蛍光ビーズに固定化される。各アリルにそれぞれ固有の蛍光シグナルを有する磁気蛍光ビーズが対応するように、両者は組み合せられる。一方、磁気蛍光ビーズに固定されたプローブが相補配列にハイブリダイズしたときに、当該アリル上で隣接する領域に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴDNAを調製する。【０１１３】
アリルを含む領域を非対称PCRによって増幅し、上記の磁気蛍光ビーズ固定化プローブと蛍光標識オリゴDNAをハイブリダイズさせ、更に両者をライゲーションする。磁気蛍光ビーズ固定化プローブの末端が、多型部位の塩基に相補的な塩基配列であった場合には効率的にライゲーションされる。逆にもしも多型のために末端の塩基が異なれば、両者のライゲーション効率は低下する。その結果、各磁気蛍光ビーズには、試料が当該磁気蛍光ビーズに相補的な塩基種であった場合に限り、蛍光標識オリゴDNAが結合する。【０１１４】
磁気によって磁気蛍光ビーズを回収し、更に各磁気蛍光ビーズ上の蛍光標識オリゴDNAの存在を検出することにより、塩基種が決定される。磁気蛍光ビーズは、フローサイトメーターでビーズ毎に蛍光シグナルを解析できるので、多種類の磁気蛍光ビーズが混合されていてもシグナルの分離は容易である。つまり、多種類の多型部位について、単一の反応容器で並行して解析する「多重化」が達成される。【０１１５】
［Invader法］
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。例えば、Invader法では、アリルプローブ、インベーダープローブ、およびFRETプローブの３種類のオリゴヌクレオチドと、cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、塩基種の決定を実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはFRETプローブのみである。【０１１６】
アリルプローブは、検出すべきアリルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アリルプローブの5'側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アリルプローブは多型部位の3'側にハイブリダイズし、多型部位の上でフラップに連結する構造を有する。【０１１７】
一方インベーダープローブは、多型部位の5'側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって3'末端が多型部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける多型部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、多型部位を挟んでインベーダープローブとアリルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。【０１１８】
多型部位がアリルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアリルプローブの両者がアリルにハイブリダイズすると、アリルプローブの多型部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入(invasion)した構造が形成される。cleavaseは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアリルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも多型部位の塩基がアリルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、多型部位におけるインベーダープローブとアリルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってcleavaseによるフラップの切断が起こらない。【０１１９】
FRETプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。FRETプローブは5'末端側に自己相補配列を有し、3'末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。FRETプローブの3'末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがFRETプローブにハイブリダイズすると、FRETプローブの自己相補配列の5'末端部分にフラップの3'末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。cleavaseは侵入構造を認識して切断する。FRETプローブのcleavaseによって切断される部分を挟んで、TaqMan PCRと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、FRETプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。【０１２０】
なお、理論的には、フラップは切断されない状態でもFRETプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアリルプローブの状態で存在しているフラップとでは、FRETに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、FRETプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。【０１２１】
Invader法に基づいて塩基種を決定するためには、アリルＡとアリルＢのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、２種類のアリルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのFRETプローブも２種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、TacMan PCR法と同様の考え方によって、塩基種を決定することができる。【０１２２】
Invader法の利点は、標識の必要なオリゴヌクレオチドがFRETプローブのみであることである。FRETプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。従って、大量生産が可能である。一方アリルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、結局、ジェノタイピングのための試薬を安価に製造することができる。【０１２３】
［RCA法］
PCR法に依存しない塩基種の決定方法として、RCA法を挙げることができる。鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが、環状の１本鎖DNAを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくDNAの増幅方法が、Rolling Circle Amplification(RCA)法である(Lizardri PM et al.,Nature Genetics 19, 225, 1998)。RCA法においては、環状DNAにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第２のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。【０１２４】
RCA法には、鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって２本鎖となった部分は、より5'側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。例えば、環状DNAを鋳型とする相補鎖合成反応は、１周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い１本鎖DNAが生成される。一方、環状DNAを鋳型として生成した長い１本鎖DNAには、第２のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。RCA法において生成される１本鎖DNAは、環状のDNAを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。従って、長い１本鎖の連続的な生成は、第２のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる１本鎖部分が連続的に生成される。こうして、DNAの増幅が達成される。【０１２５】
RCA法に必要な環状１本鎖DNAが多型部位の塩基種に応じて生成されれば、RCA法を利用して塩基種の決定をすることができる。そのために、直鎖状で１本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、5'末端と3'末端に検出すべき多型部位の両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。多型部位がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アリルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をDNAリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、RCA法の反応がトリガーされる。DNAリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。従って、ライゲーションの有無をRCA法で確認することによって、多型部位の塩基種の決定が可能である。【０１２６】
RCA法は、DNAを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アリル毎に反応を行わなければ、通常、塩基種を決定することができない。これらの点を塩基種の決定のために改良した方法が公知である。例えば、モレキュラービーコンを利用して、RCA法に基づいて１チューブで塩基種の決定を行うことができる。モレキュラービーコンは、TaqMan法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの5'末端と3'末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、RCA法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはRCA法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。【０１２７】
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アリル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる２種類のモレキュラービーコンを組み合わせれば、１チューブで塩基種の決定が可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。【０１２８】
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。MALDI-TOF/MSを除けば、通常、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らない塩基種決定法も古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。【０１２９】
RFLPは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、RFLPの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。【０１３０】
標識プローブを必要としない方法として、DNAの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。PCR-SSCPでは、１本鎖DNAの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)。PCR-SSCP法は、PCR産物を１本鎖DNAに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、１本鎖DNAの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。【０１３１】
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。【０１３２】
具体的には、まずPCR法等によって多型部位を含む領域を増幅する。増幅産物に、塩基配列がわかっているプローブDNAをハイブリダイズさせて２本鎖とする。これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。プローブDNAとのハイブリダイズによってミスマッチを生じたDNA断片では、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなる。こうして生じた移動度の差を検出することによりミスマッチの有無を検出することができる。【０１３３】
更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる（細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」,秀潤社,2000.4/20発行,pp97-103「オリゴDNAチップによるSNPの解析」,梶江慎一）。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA（あるいはRNA）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、例えば、多数の多型部位について同時に解析するには、DNAアレイは有用である。【０１３４】
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。【０１３５】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インビトロ(in vitro)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。【０１３６】
オリゴヌクレオチドは、検出すべきSNPsを含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。更に、一般にDNAアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション（非特異的ハイブリダイゼーション）による誤差を避けるために、ミスマッチ(MM)プローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチ（PM)プローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。【０１３７】
DNAアレイ法によるジェノタイピングのための試料は、被検者から採取された生物学的試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生物学的試料は特に限定されない。例えば被検者の血液、末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出した染色体DNAから、DNA試料を調製することができる。判定すべき多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、染色体DNAの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスPCR法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスPCR法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるPCR法である。複数の多型部位を解析するときには、マルチプレックスPCR法が有用である。【０１３８】
一般にDNAアレイ法においては、PCR法によってDNA試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。例えば、まず多型部位を含む領域に特異的なプライマーセットによるPCR法でゲノムDNAを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングPCR法によって、ビオチンラベルされたDNAを合成する。こうして合成されたビオチンラベルDNAを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたDNAを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。【０１３９】
上記方法をより具体的に示せば、被検者から調製した本発明の多型部位を含むDNA、およびヌクレオチドプローブが固定された固相、を取得した後、次いで、該DNAと該固相を接触させる。さらに、固相に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、本発明の多型部位の塩基種を決定する。【０１４０】
本発明において「固相」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な材料を意味する。本発明の固相は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、具体的には、マイクロプレートウェル、プラスチックビーズ、磁性粒子、基板などを含む固相等を例示することができる。本発明の「固相」としては、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。また、本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。【０１４１】
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アリル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アリル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべき多型部位が存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によって多型部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。【０１４２】
本発明の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬（検査薬）として利用できる。これは遺伝子発現を指標とする検査、または遺伝子多型を指標とする検査に使用される。【０１４３】
該オリゴヌクレオチドは、本発明の多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出する遺伝子もしくは該遺伝子の近傍DNA領域における本発明の多型部位を含む塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。【０１４４】
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」及び「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。【０１４５】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明の多型部位を含むDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。【０１４６】
本発明は、本発明の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー、および多型部位を含むDNA領域にハイブリダイズするプローブを提供する。【０１４７】
本発明において、多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーには、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるプライマーも含まれる。該プライマーは、多型部位を含むDNAにおける、多型部位の3'側に複製開始点を与えるためのプライマーと表現することもできる。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。たとえば、DNAチップによる解析のためのプライマーであれば、多型部位を含む領域として、２０〜５００、通常５０〜２００塩基の長さの増幅産物が得られるようにプライマーをデザインすることができる。当業者においては、多型部位を含む周辺DNA領域についての塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプライマーをデザインすることができる。本発明のプライマーを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。【０１４８】
本発明のプライマーには、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。例えば、IIs型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、IIs型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。このような、塩基配列を修飾したプライマーは、本発明のプライマーに含まれる。更に、本発明のプライマーは、修飾することができる。例えば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーが各種のジェノタイピング方法において利用される。これらの修飾を有するプライマーも本発明に含まれる。【０１４９】
一方本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブとは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを言う。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。従って、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。【０１５０】
言いかえれば、ゲノムDNA上の本発明の多型部位、または多型部位に隣接する部位にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のプローブとして好ましい。本発明のプローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。例えば、Invader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおける本発明の多型部位の周辺DNA領域の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。【０１５１】
本発明のプライマーまたはプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。本発明のプライマーまたはプローブの、ゲノムDNAに相補的な塩基配列の長さは、通常１５〜１００、一般に１５〜５０、通常１５〜３０である。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。【０１５２】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合には、適宜、放射性同位体または非放射性化合物などで標識して用いられる。また、プライマーとして使用する場合には、例えば、オリゴヌクレオチドの3'末端側の領域を標的とする配列に対して相補的にし、5'末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。このような少なくとも連続した15塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドは、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のmRNAに対してハイブリダイズすることができる。【０１５３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然以外の塩基、例えば、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、2’-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、β-D-ガラクトシルキュェオシン、2’-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β-D-マンノシルキュェオシン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-D-リボフラノシル-2-メチルリオプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチルカルバモイル)トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、2’-O-メチル-5-メチルウリジン、2’-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン等を必要に応じて含んでいてもよい。【０１５４】
本発明はまた、動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法に使用するための試薬（検査薬）を提供する。本発明の試薬は、前記本発明のプライマーおよび／またはプローブを含む。動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査においては、本発明の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーおよび／またはプローブを用いる。【０１５５】
本発明の試薬には、塩基種の決定方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを組み合せることができる。酵素としては、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、あるいはIIs制限酵素などの、上記の塩基種決定方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、例えば、相補鎖合成用の基質等が用いられる。【０１５６】
更に本発明の試薬には、多型部位における塩基が明らかな対照を添付することができる。対照は、予め多型部位の塩基種が明らかなゲノム、あるいはゲノムの断片を用いることができる。ゲノムは、細胞から抽出されたものでもよいし、細胞あるいは細胞の分画を用いることもできる。細胞を対照として用いれば、対照の結果によってゲノムDNAの抽出操作が正しく行われたことを証明することができる。あるいは、多型部位を含む塩基配列からなるDNAを対照として用いることもできる。具体的には、本発明の多型部位における塩基種が明らかにされたゲノム由来のDNAを含むYACベクターやBACベクターは、対照として有用である。あるいは多型部位に相当する数百ベースのみを切り出して挿入したベクターを対照として用いることもできる。【０１５７】
さらに、本発明における試薬の別の態様は、本発明の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬である。【０１５８】
これらは本発明の多型部位を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、上述の通りである。【０１５９】
また、本発明の好ましい態様においては、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法に関する。【０１６０】
従って、該検査方法においてAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物の検出の際にプローブとして利用可能な、例えば、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、本発明の検査用試薬の一例である。【０１６１】
また、該検査方法においてAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の翻訳産物の検出の際に利用可能な、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質を認識する抗体（抗AGTRL1タンパク質抗体、もしくは抗PRKCHタンパク質抗体）もまた、本発明の検査用試薬の好ましい具体例である。【０１６２】
本発明者らによって、AGTRL1遺伝子の発現亢進が、動脈硬化性疾患と関連することが明らかとなった。またPRKCHタンパク質の自己リン酸化が脳梗塞等の動脈硬化性疾患と関連することが示された。従って、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能（活性）を抑制する物質は、動脈硬化性疾患の治療薬もしくは予防薬となるものと考えられる。【０１６３】
本発明は、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の発現、または、該遺伝子によってコードされるタンパク質（AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質）の機能（活性）を抑制する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患治療薬を提供する。【０１６４】
本発明の好ましい態様においては、まず、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現の発現抑制物質を有効成分として含む、動脈硬化性疾患治療薬（動脈硬化性疾患治療もしくは予防のための薬剤・医薬組成物）を提供する。【０１６５】
本発明においてAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現抑制物質には、例えば、AGTRL1もしくはPRKCHの転写もしくは該転写産物からの翻訳を抑制する物質が含まれる。本発明の上記発現抑制物質の好ましい態様として、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現をRNAi効果により抑制する作用を有する核酸【０１６６】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また、所謂PNA (peptide nucleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。【０１６７】
特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。【０１６８】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子(AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子)の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は、必ずしもこの長さに限定されない。【０１６９】
本発明のアンチセンスは、特に制限されないが、例えば、配列番号：１または２に記載の塩基配列を基に作成することができる。【０１７０】
また、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現の抑制は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。【０１７１】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。【０１７２】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. ＆ Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて本発明におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。【０１７３】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interferance；RNAi）によっても行うことができる。本発明のRNAi効果による抑制作用を有する核酸は、一般的にsiRNAとも言われる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる二本鎖RNAを細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組み換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目を集めている。RNAiに用いるRNAは、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。【０１７４】
本発明の上記（ｃ）の核酸の好ましい態様として、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子に対してRNAi（RNA interference；RNA干渉）効果を有する二本鎖RNA（siRNA）を挙げることができる。より具体的には、配列番号：１に記載の塩基配列の部分配列に対するセンスRNAおよびアンチセンスRNAからなる二本鎖RNA(siRNA)を挙げることができる。【０１７５】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。【０１７６】
例えば、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を動脈硬化性疾患治療薬として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。【０１７７】
なお、上記RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る一本鎖RNA分子もまた本発明に含まれる。【０１７８】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：１もしくは２に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：１もしくは２に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖（例えば、配列番号：１もしくは２に記載の塩基配列）が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。【０１７９】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。【０１８０】
また、本発明の発現抑制物質には、例えば、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現調節領域（例えば、プロモーター領域）と結合することにより、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を抑制する化合物が含まれる。該化合物は、例えば、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を抑制するか否かの判定を、公知の方法、例えば、レポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。【０１８１】
また、本発明者らは、AGTRL1遺伝子上に存在する多型変異「SNP4」、「SNP9」によって該AGTRL1遺伝子の発現が亢進することを示した。【０１８２】
これら多型変異は転写調節因子であるSp1と結合するDNA領域中に存在する。これらの多型変異によって、該DNA領域に対するSp1転写因子の結合活性が変化し、AGTRL1遺伝子の発現が亢進する。【０１８３】
従って、上記多型を含むAGTRL1遺伝子のDNA領域と、Sp1転写因子との結合活性を低下させる化合物は、AGTRL1遺伝子の転写を抑制するものと考えられ、本発明の上記発現抑制物質の好ましい態様の一つと言える。上記DNA領域としては、例えば、多型部位「SNP4」または「SNP9」を含むDNA領域を挙げることができる。【０１８４】
また、本発明の多型変異を有するDNA配列であって、Sp1転写因子との結合活性が変化したDNA配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、後述の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法に、好適に用いることが可能であり有用である。例えば、以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドは、動脈硬化性疾患の治療薬のスクリーニングのための用途に利用できる。
（ａ）配列番号：１に記載のDNA配列の部分断片ポリヌクレオチドであって、４２５０９位、または３９３５３位の多型部位を含むポリヌクレオチド
（ｂ）上記（ｂ）のポリヌクレオチド配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、Sp1転写因子との結合能が上昇していることを特徴とするポリヌクレオチド【０１８５】
さらに、本発明の多型変異を有するDNAによってコードされるタンパク質であって、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性が亢進したタンパク質を含むポリペプチドは、例えば、後述の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法に好適に利用することができる。例えば、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドは、動脈硬化性疾患の治療薬のスクリーニングのための用途に利用可能である。
（ａ）PRKCHタンパク質の全長もしくは断片ポリペプチドであって、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において３７４位のバリンがイソロイシンへ置換されたポリペプチド
（ｂ）上記（ｂ）のポリペプチド配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリペプチドであって、自己リン酸化活性が上昇していることを特徴とするポリペプチド【０１８６】
また本発明は、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能抑制物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患治療薬を提供する。【０１８７】
本発明におけるAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能抑制物質としては、例えば、以下の（ａ）または（ｂ）の化合物を挙げることができる。
（ａ）AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体
（ｂ）AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子化合物【０１８８】
本発明者らによって、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性の亢進と動脈硬化性疾患との関連性が見出された。従って、本発明における上記機能抑制物質としては、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性の亢進を阻害する抗体もしくは低分子化合物を好適に例示することができる。【０１８９】
AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体（抗AGTRL1タンパク質抗体、もしくは抗PRKCHタンパク質抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【０１９０】
本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。【０１９１】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質は、その由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて、適宜、取得することができる。【０１９２】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片あるいは中央部のキナーゼ活性部位等が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。【０１９３】
本発明における抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体(scFv)(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, Vol. 113, Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag (1994) pp. 269-315)、ヒト化抗体、多特異性抗体(LeDoussal et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt. 78: 118-32; Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 537-9; Zimmermann (1986) Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; VanDijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9)、並びに、Fab、Fab’、F(ab')2、Fc、Fv等の抗体断片が含まれる。このような抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。また、β‐ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、GST、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質として製造して、二次抗体を用いずに検出できるようにすることも可能である。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の検出、回収を行い得るように改変することもできる。【０１９４】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。【０１９５】
本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に対する抗体は、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質と結合することにより、該タンパク質の機能を抑制し、例えば、脳梗塞等の動脈硬化性疾患の治療や改善効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。【０１９６】
さらに本発明は、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能を抑制し得る物質として、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。【０１９７】
上記（ｂ）のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子化合物には、例えば、AGTRL1もしくはPRKCHに対して親和性が高い化合物が含まれる。【０１９８】
さらに、本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能を抑制し得る物質として、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質変異体を挙げることができる。「AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有する該タンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。【０１９９】
また、既にAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能を阻害することが知られている物質（化合物）は、本発明の上記「AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能を抑制し得る物質」の具体例として、好適に示すことができる。【０２００】
また、本発明の機能抑制物質は、本発明のAGTRL1もしくはPRKCHの有する活性を指標とするスクリーニング方法により、適宜、取得することができる。【０２０１】
また、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性またはプロテインキナーゼ活性を阻害（抑制）する物質もまた、本発明の動脈硬化性疾患治療薬として有用である。従って本発明は、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性またはプロテインキナーゼ活性を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患治療薬を提供する。【０２０２】
また本発明は、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤（候補化合物）のスクリーニング方法を提供する。【０２０３】
本発明のスクリーニング方法の一態様は、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを指標とする方法である。AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを低下させる化合物は、動脈硬化性疾患治療もしくは予防のための薬剤となることが期待される。【０２０４】
本発明の上記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程【０２０５】
本方法においては、まずAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現している細胞、または外来性のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子が発現した細胞は、通常、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。【０２０６】
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。【０２０７】
AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。【０２０８】
本方法においては、次いで、該AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。【０２０９】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤となる。【０２１０】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として同定する方法である。【０２１１】
本発明の上記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程【０２１２】
本方法においては、まず、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。【０２１３】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクトアミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。【０２１４】
「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。【０２１５】
本方法における「接触」は、「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。【０２１６】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。【０２１７】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤となる。【０２１８】
また、本発明の上記スクリーニング方法におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子は、通常、野生型の遺伝子を用いることができるが、本発明者らによって見出された発現亢進に関与する多型変異（「SNP4」、「SNP9」）を含むAGTRL1遺伝子（変異型AGTRL1遺伝子）を好適に使用することも可能である。【０２１９】
この変異型AGTRL1遺伝子は、もともと遺伝子の発現が亢進していることから、該遺伝子の発現を抑制する（低下させる）物質のスクリーニングに好適である。また、実際の脳梗塞患者において見出された変異型AGTRL1遺伝子について、その亢進された遺伝子発現を抑制する（低下させる）物質は、格好の脳梗塞等の動脈硬化性疾患の予防もしくは治療薬となることが期待される。【０２２０】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、AGTRL1遺伝子上のSp1転写因子との結合DNA領域と、Sp1転写因子との相互作用活性（結合活性）を指標とする方法である。【０２２１】
本発明の上記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における42509位または39353位の部位を含むＤＮＡ領域からなるポリヌクレオチド、およびSp1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリヌクレオチドとSp1転写因子との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程【０２２２】
本方法においては、まず、AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における42509位または39353位の部位を含むＤＮＡ領域からなるポリヌクレオチド、およびSp1転写因子と、被検化合物を接触させる。【０２２３】
次いで該ポリヌクレオチドとSp1転写因子の相互作用活性（結合活性）を測定する。この相互作用活性は、当業者においては公知の種々の方法を利用して、評価することが可能である。【０２２４】
一例を示せば、シフトアッセイにより相互作用活性を評価することができる。具体的には、後述の実施例９に記載の方法によって適宜実施することができる。【０２２５】
さらに、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、相互作用活性を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は動脈硬化性疾患治療のための薬剤となる。【０２２６】
本発明のスクリーニング方法のさらに他の態様は、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性もしくはプロテインキナーゼ活性を指標とする方法である。該活性を低下させる化合物は、動脈硬化性疾患に対する治療効果が期待される。【０２２７】
本発明の上記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）PRKCHタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性もしくはプロテインキナーゼ活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程【０２２８】
本方法においては、まず、PRKCHタンパク質と、被検化合物を接触させる。この「接触」は、例えば、PRKCHタンパク質を発現させた細胞と被検化合物を接触させることにより実施することも可能である。【０２２９】
次いでPRKCHタンパク質の自己リン酸化活性もしくはプロテインキナーゼ活性を測定する。上記方法において使用するPRKCHタンパク質は、好ましくは、自己リン酸化活性が亢進した変異タンパク質であることが好ましい。該変異タンパク質としては、例えば、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体を好適に示すことができる。また、変異を含まない野生型タンパク質を利用することも可能である。さらに、PRKCHタンパク質においてリン酸化を受ける部位を含む部分ポリペプチド、もしくは該部位を含む変異ポリペプチドであってもよい。【０２３０】
なおPRKCHタンパク質における自己リン酸化されるアミノ酸部位としては、例えば、T510（510番目のスレオニン）、T650（650番目のスレオニン）、S672（672番目のセリン）を挙げることができる。このうち１箇所（T510位）がPKD1でリン酸化され、残りの２箇所（T650位、S672位）が自己リン酸化されることが知られている（B.D.Gomperts et al.,  上代淑人監訳、「シグナル伝達」、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、p206）。本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、上記のアミノ酸部位の自己リン酸化状態を指標とする方法である。【０２３１】
リン酸化活性の測定は当業者に公知の手法によって行うことができるが、例えば、リン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロット法等により測定することができる。より具体的には、リン酸化活性の測定は、後述の実施例に記載の方法によって適宜実施することができる。【０２３２】
上記方法においてはさらに、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記リン酸化活性を低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性もしくはプロテインキナーゼ活性を抑制する結果、動脈硬化性疾患に対する治療もしくは予防効果を発揮するものと期待される。【０２３３】
また、上記の各種スクリーニング方法において使用される化合物もまた、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬として有用である。【０２３４】
本発明の上記試薬の具体例としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬を挙げることができる。
（ａ）AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質を認識する抗体
（ｃ）AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における３９３５３位または４２５０９位の部位を含むＤＮＡ領域からなるポリヌクレオチド
（ｄ）PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において３７４位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するPRKCHタンパク質変異体【０２３５】
さらに本発明は、本発明の検査方法またはスクリーニング方法を実施するために用いられる各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。【０２３６】
本発明のキットは、例えば、本発明の上述の各種試薬の中から、実施する検査方法あるいはスクリーニング方法に合わせて適宜選択することができる。例えば、本発明のキットは、本発明の遺伝子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体等を構成要素とすることができる。より具体的には、（１）本発明のプライマーオリゴヌクレオチド、およびPCR用反応試薬（Taq ポリメラーゼ、緩衝液等）、または（２）本発明のプローブオリゴヌクレオチド、およびハイブリダイゼーション用緩衝液、（３）本発明の抗AGTRL1タンパク質抗体もしくは抗PRKCHタンパク質抗体、およびELISA用試薬、等を例示することができる。
さらに、本発明のキットには、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。【０２３７】
また本発明は、本発明の薬剤を被検者へ投与する工程を含む、動脈硬化性疾患を治療もしくは予防する方法に関する。本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
【実施例】
【０２３８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【０２３９】
＜PRKCH遺伝子に関する各種実験の材料および手法等＞
被験集団
ゲノムワイド・ケースコントール研究に関しては、九州大学の7つの関連病院からの脳梗塞の症例を登録した。症例はすべて、脳卒中に熟練した内科医により、臨床情報および脳画像検査を用いて診断・分類された。脳梗塞のサブタイプは、米国国立神経疾患・脳卒中研究所によって提唱された脳血管疾患分類III（Whisnant JP, et al., Stroke; 21: 637-676 (1990).）、ならびに急性脳卒中治療におけるOrg 10172の治験（TOAST）試験（Adams, HP Jr.et al., Stroke 24, 35-41 (1993).）および脳塞栓症タスクフォース（No authors listed Arch.Neurol. 43, 71-84 (1986).）の診断基準に基づいて判定した。【０２４０】
対照被験者は久山町研究の参加者から組み入れた。久山町研究は、1961年に設定された地域集団を用いた心血管疾患に関する進行中の前向き疫学研究である。この研究の詳細は以前に記載されている（Kubo, M. et al., Stroke 34, 2349-2354 (2003).、Kiyohara, Stroke. 34, 2343-2348 (2003).）。2002年から2003年までの間に、本研究のためのスクリーニング調査を行った。手短に述べると、40歳以上の参加者計3,328例（参加率78％）が健康状態の検査に参加することに同意し、包括的評価を受けた。脳卒中または冠動脈疾患の既往のある被験者を除外した後に、本発明者らは年齢（5歳以内）および性別を一致させた対照被験者を、乱数を用いて1：1に対応するように選択した。【０２４１】
脳梗塞の発生に関するrs2230500のリスクを検討するために、本発明者らは、1988年に設定された久山町研究のコホート集団を用いた（Kubo, M. et al., Stroke 34, 2349-2354 (2003).）。手短に述べると、1988年に40歳以上の久山町住民2,742人が健康状態の検査に参加した（参加率80.0％）。脳卒中または冠動脈疾患の既往のある被験者を除外した後に、2,637人の参加者を心血管疾患または死亡の発生に関して連続的に追跡した。このコホート対象のうち、2002年には1,683人の対象が検査に参加した。【０２４２】
本発明者らは、すべての試験対象から、九州大学大学院医学研究院、東京大学医科学研究所および各参加病院の倫理審査委員会によって承認された通りに署名によるインフォームド・コンセントを得た。【０２４３】
SNPジェノタイピング
ゲノムDNAは末梢血白血球から標準的なプロトコールによって抽出した。SNPのジェノタイピングは、PCRを用いる複合的インベーダーアッセイ（Third Wave Technologies, Madison, Wis.）をOhnishiらの記載の通り（Ohnishi Y, et al., J. Hum. Genet. 46,471-477 (2001).）に用いるか、またはABI3700キャピラリー式シークエンサー（Applied Biosystems）を標準的なプロトコールに従って用いるPCR産物の直接シークエンシングによって行った。【０２４４】
細胞培養、トランスフェクションおよび免疫沈降
293T細胞は、10％ウシ胎仔血清および1 ％抗生物質を加えたDMEM中において37℃、5％CO2下で維持した。完全長PKCη-374Vを発現するプラスミドは、ヒト胸腺cDNAをp3xFLAG-CMV-14発現ベクター（Sigma）中にクローニングすることによって構築した。完全長PKCη-374Iを発現するプラスミドは、p3xFLAG-CMV-14-PKCη-374Vベクターから、QuikChange XL Site-Directed Mutagenesisキット（Stratagene）を製造元の指示に従って用いて構築した。一過性トランスフェクションのためには、293T細胞を15 cm培養皿にプレーティングしてほぼ集密化させた上で、FuGENE6（Roche）を製造元の指示に従って用いてp3xFLAG-CMV-14-PKCη-374Vおよびp3xFLAG-CMV-14-PKCη-374Iをトランスフェクトした。48時間後に細胞を収集し、1％ Nonidet P-40、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、1 mMジチオトレイトール、0.1％プロテアーゼ阻害薬混合物セットIII（Calbiochem）を含むライシスバッファー中にて4℃で溶解させた。氷上で30分間インキュベートした後に、溶解液を15,000 rpm、4℃で15分間遠心した。上清を、rec-タンパク質G-Sepharose 4B結合物（Zymed）およびマウス正常IgGによる30分間の前処理後に、抗Flag M2アフィニティーゲル（Sigma）とともに4℃で3〜4時間インキュベートした。インキュベーション後に、ゲルをライシスバッファーで2回、1×TBSバッファーで1回洗浄し、3×Flagペプチド（Sigma）15μgを添加することによってFlag標識タンパク質を溶出させた。免疫沈降物の純度および量はクーマシーブリリアントブルー染色によって評価した。タンパク質濃度はBradford法によって測定した。【０２４５】
PKC活性および自己リン酸化アッセイ
PKC自己リン酸化活性およびキナーゼ活性は、Ikutaらが記載した方法に従って測定した（Ikuta, T. et al., Cell Growth Diff. 5, 943-947 (1994).）。PKC自己リン酸化アッセイに関しては、モック、PKCη-374VおよびPKCη-374Iの免疫沈降物を、20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM MgSO4、1 mM EGTAおよび5μCiの[γ-32P]ATPを10μMホスファチジルセリン（PS、Sigma）および100 nMホルボール-12,13-ジブチレート（PDBu、Sigma）とともに含む合計容積50μlの反応混合物中において指定の期間にわたり30℃でインキュベートした上で、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーに供した。プロテインキナーゼ活性は、[γ-32P]ATPからのミエリン塩基性タンパク質（MBP）ペプチド（Sigma）への32P取り込みによって測定した。インキュベーション混合物には、合計容積50μl中に、20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM MgSO4、1 mM EGTA、100μM ATP、1μCiの[γ-32P]ATP、10μg MBPペプチドおよびPKCη免疫沈降物を、10μM PSおよび100 nM PDBuとともに含めた。30℃での3分間のインキュベーションを行った後に、P81 phosphocellulose square（Upstate）に直接適用することによって反応を停止させ、その後に75 mMリン酸で洗浄した上で放射能をカウントした。活性1単位は、ATPからMBPへの放射性リン酸1 nmol／分の取り込みと定義した。【０２４６】
リアルタイムPCRを用いたPRKCH発現の定量
本発明者らは、ABI 7700（Applied Biosystems）をSYBR Premix ExTag（TaKaRa）とともに製造元の指示に従って用いて、リアルタイム定量的PCRを行った。種々の組織由来のヒト全RNA（Clonetech）を購入し、オリゴd（T）12-18プライマーおよびSuperscript III逆転写酵素（Invitrogen）を用いて1μgの全RNAにより単鎖cDNAを合成した。PRKCH mRNAの相対的発現は、製造元により記載されている標準曲線法を用いることにより、同じcDNA中のベータアクチンの量に対して標準化した。【０２４７】
冠動脈の免疫組織化学検査および形態計測解析
久山町の住民であった年齢68〜91（81.1±6.2）歳の日本人患者16例から、死亡16時間以内に九州大学での剖検時に心臓を入手した（男性8例および女性8例）。冠動脈にカニューレを挿入し、0.1 mol/L リン酸緩衝食塩水、pH 7.4で洗浄した上で、4％（wt/vol）パラホルムアルデヒド（0.1 mol/L リン酸ナトリウム、pH 7.4中）1 Lを100 mmHgで灌流した。続いて、心臓を4％パラホルムアルデヒド中に4℃で少なくとも24時間浸漬した。右冠動脈および左前下行枝冠動脈を心臓の表面から切除し、長軸に対して直交方向に3 mm間隔で切断した上でパラフィン中に包埋した。60個のブロックを入手し、3μm厚連続切片を直ちに作成した。各ブロックからの切片に対して、ヘマトキシリン・エオジン染色、エラスチカ・ワンギーソン染色およびマッソントリクローム染色、ならびに免疫組織化学検査を連続的に行った。AHAのCommittee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosisによって提唱された定義（Stary, HC. et al., Circulation. 92, 1355-74 (1995).）に従い、各切片のアテローム硬化病変のタイプを慎重に分類した。【０２４８】
免疫組織化学検査はNakanoらが記載した通りに行った（Nakano, T. et al., Hum Pathol. 36, 330-40 (2005).）。手短に述べると、脱パラフィン処理した切片を3％脱脂乳とともにインキュベートした上で、ヒトPKCη（Santa Cruz）、内皮細胞（抗ヒトCD31、Dako）、単球／マクロファージ（抗ヒトCD68、Dako）および平滑筋細胞（抗ヒトα-SMA、Sigma）に対する一次抗体に続いて、ペルオキシダーゼ標識した二次抗体（Dako）とインキュベートした。このスライドを3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸（DAB）とともにインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。各アイソタイプの非免疫ウサギIgGまたは非免疫マウスIgGも、それぞれの一次抗体の代わりに各陰性対照として用いた。ヒト乳腺から採取した組織ブロックをPKC-ηに関する陽性対照として用いた（Masso-Welch, PA. et al., Breast Can. Res. Treat. 68, 211-223 (2001)）。PKCη陽性病変の定量はアテローム硬化病変のタイプを知らされていない単一の観察者が行い、アテローム硬化内膜における陽性領域を判定することによって分析した。すべての画像の取り込みおよび解析は米国国立衛生研究所（National Institute of Health）の画像ソフトウエアによって行った。【０２４９】
統計分析
別記する場合を除き、データは平均±sdとして提示した。関連性およびHardy-Weinberg平衡に関する評価は、カイ二乗検定およびFisherの直接法によって行った。連鎖不平衡指数、Δ指数の算出および図１ｄの描写はTokuhiroらが記載した通りに行った（Tokuhiro, S. et al., Nat. Genet. 35, 341-348 (2003).）。多重検定の調整のために、本発明者らはSAS9.12ソフトウエア中のMULTTEST法を用いて、ランダム並べ替え検定を10,000回繰り返し行った。rs2230500遺伝子型による脳梗塞の14年間の発生率の差に関しては、年齢および性別に関する調整後にCox比例ハザードモデルを用いて評価した。臨床的危険因子の調整のためには、SASソフトウエアにより、ケースコントロール研究に関してはロジスティック回帰モデルを用い、前向きコホート研究に関してはCox比例ハザード回帰モデルを用いた。動脈アテローム硬化のグレード間でのPKCη陽性面積の比較に関しては、Bonferroni補正を伴うSpearmanの順位相関法によって解析した。【０２５０】
〔実施例１〕  遺伝子ベースのSNPマーカーを用いた大規模ケースコントロール研究
脳梗塞に対する感受性と関連性のある遺伝子を同定するために、本発明者らは、脳梗塞患者1,112例、ならびに年齢および性別が一致する対照被験者1,112例を用いて、大規模なゲノムワイドケースコントロール研究を実施した。本ケースコントロール研究の被験集団の臨床的特徴を表３に示す。【０２５１】
【表３】
2007123233.tif 000014
【０２５２】
本発明者らはまず、JSNPデータベース（Tsunoda, T. et al., Hum. Mol. Genet. 13, 1623-1632 (2004).）から選択した遺伝子ベースの52,608箇所のtag-SNPを用いて、脳梗塞を有する日本人症例188例、ならびに年齢および性別が一致する対照例188例のジェノタイピングを行った。これらのうち、ジェノタイピングに成功した48,083箇所のSNP（全体的な成功率は91.4％）のアレル頻度を比較し、症例と対照との間でp＜0.01であった1,098箇所のSNPを同定した。【０２５３】
本発明者らは次に、2回目のスクリーニングで、これらのSNPに関して残りの症例および対照のジェノタイピングを行った。被験者を脳梗塞サブタイプ毎に層別化したところ、ラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群と高度の相関性があるSNPがいくつか同定された。これらのうち、染色体14q22-23上にあるPRKCHのイントロン6中のSNP_15（IMS-JST140193、rs3783799）は、ラクナ梗塞（アレル頻度に関してp＝4.73×10-6）およびラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群（優性モデルにおいてp＝7.91×10-6、表５）と高度の相関性があった。2回目のスクリーニングでジェノタイピングを行ったすべてのSNPを用いた並べ替え検定の後にも、SNP_15は依然としてラクナ梗塞（p＝0.0036）およびラクナ・アテローム血栓複合型梗塞（p＝0.0063）と関連性があった。このことから、本発明者らは、ラクナ梗塞およびアテローム血栓性梗塞に対する感受性座位がSNP_15周辺に存在する可能性があると考えた。【０２５４】
以下の表４は、ジェノタイピングを行ったPRKCH遺伝子中のSNPの位置（NCBIビルド35）を示す。【０２５５】
【表４】
2007123233.tif 000015
【０２５６】
以下の表５は、脳梗塞のサブタイプ別にみた、PRKCH_SNP_15のケースコントロール相関解析の概要を示す。
【表５】
2007123233.tif 000016
【０２５７】
上記表５中、アレル1はリスクアレルとしている。P値は、スクリーニングで検討したすべてのSNPに関して、104回の並べ替え検定により調整した。c.i.は信頼区間を指す。【０２５８】
次に本発明者らは、45箇所のSNPを用いてPRKCHの高精度マッピングを行い、SNP_15のLDの範囲を、ラクナ梗塞およびアテローム血栓性梗塞の症例、ならびに年齢および性別が一致する対照を用いて評価した。これらのSNPのジェノタイピングを行い、マイナーアレル頻度が0.2を上回る27種のSNPに関してD'およびΔ指数を算出した（図１ｄ）。PRKCH中に2つのLDブロックが同定され、SNP_15はブロック1内部に位置づけられた（図１ｄ）。本発明者らはまた、症例と対照との間のアレル頻度も比較し、その関連性がPRKCHのブロック1で最大であり、5'領域および3'領域では徐々に低下することを見いだした。これらの結果から、本発明者らは、PRKCHがラクナ性およびアテローム血栓性の脳梗塞に対する感受性遺伝子であると結論づけた。【０２５９】
続いて本発明者らは、症例48例および対照48例から、5'および3'非翻訳領域を含む、PRKCH中の全エクソンのシークエンシングを行った結果、4つのSNPが同定された：rs3742633（695A＞G、エクソン2中）、rs2230500（1425G＞A、エクソン9中）、rs17098388（1427A＞C、エクソン9中）、rs1088680（1979C＞T、エクソン12中）。これらのうち、rs3742633およびrs1088680はブロック1の外側に位置し、関連性を示さなかった。rs2230500およびrs17098388は互いに1塩基の隔たりがあり、ブロック1に位置していた。さらに、rs2230500はバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸置換を引き起こしたが（V374I、図２ａ）、一方、rs17098388は同義SNPであった。シークエンシングの結果、これらの2つのSNPは完全に連鎖していた。【０２６０】
続いて本発明者らは、ラクナ性およびアテローム血栓性梗塞の全症例、ならびに年齢および性別が一致する対照において、直接シークエンシングにより、rs2230500のジェノタイピングを行った。Ileへのアミノ酸変化を引き起こすrs2230500のAアレルは症例において高頻度に観察され、これはラクナ梗塞（p＝9.84×10-6、オッズ比（OR）1.66、95 ％信頼区間（c.i.）1.33〜2.09、アレル頻度モデルの場合、表７）およびラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群（p＝4.92×10-5、OR 1.42、95 ％c.i. 1.20〜1.68）のいずれとも高度の関連性があった。PRKCHにおけるジェノタイピングを行った45箇所のSNP間での並べ替え検定を適用したところ、ラクナ梗塞に関してはp＝0.0004、ラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群に関してはp＝0.0014が得られた。これらの結果はいずれも統計学的に有意であった。【０２６１】
症例と対照との間の差の交絡的影響を明らかにするために、本発明者らはロジスティック回帰モデルを用いて臨床的危険因子を調整した。脳梗塞に対する遺伝子型リスクは、年齢、性別、高血圧、高脂血症および糖尿病に関する調整後も実質的に変化しなかった（表８）。このため、本発明者らは、PRKCHにおけるV374Iというアミノ酸置換がPKCηのシグナル伝達に影響を及ぼして脳梗塞の発生をもたらす可能性があるという仮説を立てた。【０２６２】
以下の表６は、ラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群のサブグループに関する、PRKCH遺伝子中の45種のSNPのケースコントロール相関解析の結果を示す。【０２６３】
【表６】
2007123233.tif 000017
【０２６４】
上記表６において、P値は、PRKCH遺伝子検討したすべてのSNPに関して、104回の並べ替え検定により調整した。MAFはマイナーアレル頻度を示す。【０２６５】
さらに以下の表７は、rs2230500（1425G＞A、V374I）のケースコントロール研究の結果を示す。【０２６６】
【表７】
2007123233.tif 000018
【０２６７】
上記表７において、P値は、PRKCH遺伝子中の検討したすべてのSNPに関して、104回の並べ替え検定により調整した。c.i.は信頼区間を指す。【０２６８】
以下の表８は、ラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群のサブグループにおけるrs2230500（1425G＞A、V374I）の多変量ロジスティック解析の結果を示す。【０２６９】
【表８】
2007123233.tif 000019
【０２７０】
上記表８において、多変量解析は年齢、性別、高血圧（あり／なし）、高脂血症（あり／なし）および糖尿病（あり／なし）に関して調整した。【０２７１】
本発明者らは、STRUCTUREおよびgenomic controlを用いて、症例と対照との間の集団階層化に関して調べたが、いずれの解析からも本発明者らの被験者における有意な集団階層化は示されなかった。【０２７２】
〔実施例２〕  PKCη活性に対するV374Iの影響
PKCηにおけるV374Iというアミノ酸置換は、PKCファミリーにおいて保存されているATP結合部位の内部に存在する（図２ｂ、図３）（Osada, S. et al., Cell Growth Diff. 4, 167-175 (1993).）。そこで本発明者らは、PKCηキナーゼ活性に対するV374Iの影響について調べた。本発明者らはFlag-PKCη-374VおよびFlag-PKCη-374Iの発現ベクターを構築し、それらを293T細胞に対してトランスフェクトした。一過性トランスフェクション後に、両方のタンパク質を免疫沈降させ、抗Flag M2アガロースゲルを用いることによって精製した。免疫沈降物の質および濃度はクーマシーブリリアントブルー染色およびウェスタンブロット法によって評価した（図２ｃ、ｄ）。PKCηは自己リン酸化により活性化されることが報告されているため（Nishizuka, Y. Science. 258, 607-614 (1992).）、本発明者らは各タンパク質のキナーゼ活性を自己リン酸化アッセイによって調べた。10 nMホスファチジルセリン（PS）および100 nMホルボール12,13-ジブチレート（PDBu）による刺激後に、PKCηの自己リン酸化が少なくとも1分間にわたって観察され、自己リン酸化の程度はPKCη-374Iの方がPKCη-374Vよりも高かった（図２ｄ）。これらの結果を確かめるために、ミエリン塩基性タンパク質を基質として用いることによってPKC活性を検討したところ、PKCη-374Iにおける活性は、PKCη-374Vの1.6倍であった（p＝0.009、図２ｅ）。これらの結果は、PKCηにおける374Vから374Iへのアミノ酸変化が、刺激後のより高度の自己リン酸化およびキナーゼ活性を誘導し、下流シグナル伝達経路の活性化をもたらす可能性を示唆する。【０２７３】
〔実施例３〕  アテローム硬化におけるPKCηの発現
PKCηはマウスでは、皮膚、消化管および気道を含む上皮組織で主に発現する（Osada, S. et al., J Biol. Chem. 265, 22434-22440 (1990).）。ヒトにおけるPKCηの発現パターンは未確定であり、マウスにおけるこの分布パターンからはPKCηと脳梗塞との間の関係を説明することができない。【０２７４】
ヒト組織におけるPKCηの発現パターンを検討するために、本発明者らは種々の組織においてヒトcDNAを用いる定量的リアルタイムPCRを行った。PKCηは種々のヒト組織で普遍的に発現しており、胸腺および脾臓における発現が幾分高度であった（図４）。この結果および脳梗塞との関連性から、本発明者らはアテローム硬化病変におけるPKCηの発現を調べた。剖検時に入手した冠動脈標本の免疫組織染色により、PKCηは動脈内膜内の内皮細胞および一部の泡沫マクロファージ、ならびに動脈内膜および中膜内の紡錘状平滑筋細胞において発現していることが示された（図５−１のｂ−ｅ）。外膜では、PKCηは一部の血管内皮細胞によって定常的に発現していた（非提示データ）。この発現は、免疫原性ペプチドまたは正常ウサギIgGを用いて前吸収を行った標本ではみられなかった。【０２７５】
PKCηとアテローム硬化との関係についてさらに検討するために、剖検時に入手した60件の冠動脈標本を、アテローム硬化病変のタイプ（AHA分類（Stary, HC. et al., Circulation. 92, 1355-74 (1995).））別に慎重に分類した。PKCη陽性細胞をNIH像によって定量したところ、PKCηの発現は冠動脈アテローム硬化の重症度と合致しており、進行した病変でより高頻度に観察された（p＜0.0001、図５−２のf）。これらの結果は、PKCηが、ヒトにおけるアテローム硬化の発生および進行に密接に関係していることを示唆する。【０２７６】
〔実施例４〕  集団ベースの前向きコホートを用いたV374Iのバリデーション試験
ケースコントロール研究には、被験者、特に対照例の選択バイアスが原因となって偽陽性の結果が誘発される恐れがある。このため、1件の相関解析で同定された候補SNPを異なる集団でも検証すべきである。しかし、本発明者らの相関解析におけるマーカーSNPとしたSNP_15（IMS-JST140193）のマイナーアレル頻度は、日本人群では0.239、中国人群では0.229、アフリカ人群では0.022、欧州人群では0.00であった。これらのデータは、PRKCH中の候補SNPはアジア系集団に特異的であり、白人では再現性を得ることが難しいことを示唆する。【０２７７】
この問題を克服するために、本発明者らは、1988年に構築した集団ベースの前向きコホートにおいてrs2230500の関連性を検証した。14年間の追跡調査の間に、ベースライン検査時には脳卒中の病歴がなかった被験者1642例のうち67例の被験者に初めて脳梗塞が生じた。脳梗塞の発生率をrs2230500遺伝子型別に比較した結果、本発明者らは、GGからGA、AA遺伝子型の順（これはアミノ酸置換VV、VIからIIに対応する）に発生率が直線的に増加することを見いだした（図６）。年齢および性別で調整した脳梗塞の発生率に関する相対リスクは、GG遺伝子型と比較して、GA遺伝子型の場合は1.31（95 ％c.i.、0.78〜2.19）であり、AA遺伝子型の場合は2.83（95 ％c.i.、1.11〜7.22）であった（表９）。AA遺伝子型の被験者における脳梗塞の発生に対するリスクは、GA遺伝子型またはGG遺伝子型の被験者におけるものよりも有意に高かった（p＝0.043、相対リスク2.58、95 ％c.i.、1.03〜6.44）。この関係は、年齢、性別、高血圧、糖尿病、血清コレステロール、喫煙および飲酒の習慣を含む、ベースラインの臨床的危険因子の調整後も実質的に変化しなかった。同じコホート内の被験者1661例を用いた冠動脈疾患の発生に対するrs2230500のリスクも同様の結果を示した（図７）。これらの結果は、PRKCH中のrs2230500が脳梗塞および心筋梗塞の発生にかかわる遺伝的危険因子であることを示している。この所見は他の前向き研究でも再現される必要があるが、本発明者らは将来、rs2230500によって脳梗塞のリスクが予測される可能性があると考えている。【０２７８】
以下の表９は、14年間追跡した日本人一般集団1,638人における、rs2230500遺伝子型別にみた、脳梗塞の発生に関する、年齢および性別を調整し、多変量解析に関して調整した相対リスクを示す。【０２７９】
【表９】
2007123233.tif 000020
【０２８０】
上記表９中、HRはハザード比、ciは信頼区間を指す。多変量解析に関する調整は年齢、性別、高血圧、糖尿病、コレステロール、喫煙および飲酒に関して行った。【０２８１】
＜AGTRL1遺伝子に関する各種実験の材料および手法等＞
被験集団
1961年以来、本発明者らは、福岡市（日本）に隣接した近郊地域である久山町の住民における心血管疾患に関して、地域集団を用いたコホート研究を行っている（Hata J, et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 2005; 76: 368-372.、Tanizaki Y, et al., Stroke 2000; 31: 2616-2622.）。2002〜2003年の間に、本発明者らは久山町の住民におけるスクリーニング研究を実施し、年齢40歳以上の3,328人（この年齢群の全人口の78 ％）がこの研究に参加した。彼らのうち3,196人（96 ％）が、自らの臨床情報およびDNAサンプルを本研究に用いることに同意した。【０２８２】
本発明者らは、九州大学病院および福岡都市部の6つの協同施設病院（独立行政法人国立病院機構九州医療センター、独立行政法人国立病院機構福岡東医療センター、福岡赤十字病院、白十字病院、今津赤十字病院、誠愛リハビリテーション病院）からの脳梗塞患者を登録した。被験症例は全例、神経内科医により、コンピュータ断層撮影法（CT）および／または磁気共鳴画像法（MRI）を含む臨床情報および脳画像検査を用いて脳卒中と診断され、LA、AT、CEおよび他のサブタイプに細分された。被験者はすべて日本人であり、研究への参加に関して文書によるインフォームド・コンセントを得た。【０２８３】
本研究は、九州大学大学院医学研究院、東京大学医科学研究所および各参加病院の倫理委員会による承認を得ている。【０２８４】
相関解析
本発明者らは、ゲノムワイド相関解析を、1回目および2回目のスクリーニングからなる段階的な様式で行った。1回目のスクリーニングでは、脳梗塞に罹患した被験症例188例を無作為に選択した。各症例に対して、脳卒中および冠動脈疾患に罹患したことがない久山町住民から、年齢および性別が一致する対照被験者1例を無作為に選択した。【０２８５】
2回目のスクリーニングでは、LAおよびATを有する被験症例860例を対象として組み入れた。CEおよび脳梗塞の他のサブタイプは、LAおよびATとは異なる機序を有するという理由から、2回目のスクリーニングには含めなかった。各被験症例に対して、年齢および性別が一致する対照被験者1例を久山町住民から無作為に選択した。両群とも平均年齢±s.d.は70±10歳であり、被験者の60.7 ％が男性であった。【０２８６】
SNPジェノタイピング
ゲノムDNA試料は全血から標準的な方法によって抽出した。各ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて多数のゲノム断片を増幅し、インベーダーアッセイによってSNPのジェノタイピングを行った（Ohnishi Y, et al., J Hum Genet 2001; 46: 471-477.、Lyamichev V, et al., Nat Biotech 1999; 17: 292-296.）。【０２８７】
細胞培養
ヒト胃腺癌SBC-3細胞は、10％ウシ胎仔血清（FBS）および1％抗生物質・抗真菌薬溶液（SIGMA）を含むRPMI 1640培地中で増殖させた。ヒト胚性腎線維芽細胞293T細胞は、10 ％FBSおよび1 ％抗生物質・抗真菌薬溶液（SIGMA）を含むダルベッコ変法イーグル培地中で増殖させた。いずれの細胞も、5 ％CO2を含む37℃の加湿空気中でインキュベートした。【０２８８】
電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）
EMSAに用いるプローブは、図９ａに示されているように、各多型の周辺の25 bp二本鎖オリゴヌクレオチドとして構築した。Sp1-コンセンサスオリゴヌクレオチド（SantaCruz, sc-2502）を、Sp1の結合に関する陽性対照として用いた。各プローブを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（TOYOBO）を用いて[γ-32P]-ATP（Amersham）で標識した。SBC-3核抽出物10μgを、15 mM Tris-HCl（pH 7.5）、6.5％グリセロール、50 mM KCl、0.7 mM EDTA（pH 8.0）、0.2 mMジチオトレイトール、1 mg/mlウシ血清アルブミン、ポリ（dI-dC）1μgおよびサケ精子DNA 0.1μgを含む反応混合物中において、プローブ（＞500000 cpm）とともに室温で30分間インキュベートした。Sp1スーパーシフトアッセイに関しては、抗ヒトSp1ヤギポリクローナル抗体（SantaCruz, sc-59X）2μgを添加し、室温でさらに30分間インキュベートした。この混合物を、0.5×Tris-ホウ酸-EDTA緩衝液を含む4％ポリアクリルアミドゲル上での120 V、3時間の電気泳動にかけた。ゲルを乾燥させた後にX線フィルムに対して露光させた。【０２８９】
Sp1の過剰発現および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
完全長ヒトSp1cDNAをpCAGGS発現ベクター中にサブクローニングした（pCAGGS-Sp1）。6ウェル培養プレート内でほぼ集密化するまで増殖させた293T細胞に対して、1ウェル当たり3μlのFuGENE6（Roche）を用いて、1μgのpCAGGS-Sp1またはモックpCAGGSをトランスフェクトした。トランスフェクションの前または後の種々の時点で全RNAを収集し、RNeasy Mini KitおよびRNase-free DNase Set（QIAGEN）を用いて精製した。cDNAはSuperscript II逆転写酵素（Invitrogen）により合成した。ヒトAGTRL1およびハウスキーピング遺伝子B2Mの発現レベルは半定量的RT-PCRを用いて決定し、リアルタイムRT-PCRによって定量的に確かめた。【０２９０】
半定量的RT-PCRに関しては、ExTaq DNAポリメラーゼ（TaKaRa）および以下のプライマー対のそれぞれを用いてcDNAを増幅した；AGTRL1（5'-CTGTGGGCTACCTACACGTAC-3'／配列番号：７および5'-TAGGGGATGGATTTCTCGTG-3'／配列番号：８）ならびにB2M（5'-CACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'／配列番号：９および5'-TACCTGTGGAGCAACCTGC-3'／配列番号：１０）。【０２９１】
リアルタイムPCRに関しては、SYBR Premix ExTaq（TaKaRa）を用いてcDNAを増幅し、ABI PRISM 7700（Applied Biosystems）および以下のプライマー対のそれぞれによって分析した：AGTRL1（5'-TGCCATCTACATGTTGGTCTTC-3'／配列番号：１１および5'-GTCACCACGAAGGTCAGGTC-3'／配列番号：１２）ならびにB2M（5'-TCTCTCTTTCTGGCCTGGAG-3'／配列番号：１３および5'-AATGTCGGATGGATGAAACC-3'／配列番号：１４）。mRNAの定量は、得られたPCR閾値サイクルをcDNA標準曲線に対して関連づけることによって行った。標準化されたAGTRL1発現量は、AGTRL1値をB2M値によって除算することによって得た。【０２９２】
ルシフェラーゼアッセイ
SNP4（rs9943582）のいずれかのアレルを含むAGTRL1の5'隣接領域のnt-291から-248までに、および／または、SNP9（rs2282624）のいずれかのアレルを含むイントロンのnt+1329から+1381までに対応するDNA断片を合成し、pGL3-basicレポータープラスミド（Promega）のマルチクローニングサイトにクローニングした。24ウェル培養プレート内でほぼ集密化するまで増殖させたSBC-3細胞に対して、1ウェル当たり0.6μlのFuGENE6（Roche）を用いて、各レポーター構築物90 ng、トランスフェクション効率に関する内部対照としたpRL-CMVベクター10 ng、およびpCAGGS-Sp1またはモックpCAGGSベクターのいずれか100 ngをそれぞれトランスフェクトした。48時間後に細胞を収集し、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。【０２９３】
統計分析
相関解析およびHardy-Weinberg平衡に関する統計分析は、Yamadaらが記載した通りに行った（Yamada R, et al., Am J Hum Genet 2001; 68: 674-685.）。多重検定の調整のために、本発明者らはSASソフトウエア（SAS Institute）のMULTITEST法を用いて10,000回の並べ替え検定を行った。ハプロタイプ頻度および連鎖非平衡係数（D'およびΔ2）を、期待値最大化アルゴリズムを用いて評価した。相対的ルシフェラーゼ活性はStudentのt検定によって比較した。【０２９４】
URL
JSNPデータベースは、http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index.htmlにある。国際HapMapプロジェクトのデータベースは、http://www.hapmap.orgにある。米国の国立バイオテクノロジー研究センター（National Center of Biotechnology Information）によって提供されているdbSNPデータベースは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.htmlにある。GENSCANプログラムは、http://genes.mit.edu/GENSCAN.htmlにある。MATCHプログラムは、http://www.gene-regulation.com/にある。【０２９５】
〔実施例５〕  ゲノムワイド相関解析
本発明者らはゲノムワイド相関解析を段階的な様式で行った。1回目のスクリーニングに関しては、脳梗塞の日本人患者188例ならびに年齢および性別が一致する対照被験者188例を用いて、ハイスループットの複合的PCR-インベーダーアッセイ法（Ohnishi Y, et al., J Hum Genet 2001; 46: 471-477.）により、遺伝子をベースとする52,608箇所のSNPをJSNPデータベース（Haga H, et al., J Hum Genet 2002; 47: 605-610.）から選択した。症例と対照との間で遺伝子型およびアレル頻度を比較し、p値が0.01未満であることが示された1098種のSNPを同定した。【０２９６】
本発明者らは続いて、2回目のスクリーニングを目的として、LAまたはATを有する患者860例ならびに年齢および性別が一致する対照被験者860例を用いて、これらの1098種のSNPのジェノタイピングを行った。本発明者らは、これらのうち、AGTRL1遺伝子中のSNP（SNP6、rs948847）が、アレル頻度モデル（p＝0.000028）および劣性モデル（p＝0.000057）において低いp値を示すことを見いだした。多重検定に関する並べ替え検定を行った後の、劣性モデルにおける調整p値は0.0498であった。本発明者らは、SNP6が脳梗塞と関連性のあるマーカーSNPの候補であると考えた。【０２９７】
〔実施例６〕  マーカーSNP6周辺の高精度マッピング
SNP6が位置する染色体11q12領域を検討するために、本発明者らは全被験者を用いて、AGTRL1周辺の240 kb領域内部の48種のSNPのジェノタイピングを行った。この領域はPRG2、PRG3、P2RX3、SSRP1、TNKS1BP1、AGTRL1およびLRRC55という7つの遺伝子をカバーしていた。これらのうち、10種のSNPがAGTRL1中にあり、マイナーアレル頻度が20 ％を上回る他の38種のSNPが、国際HapMapプロジェクト（The International HapMap Consortium. Nature 2005; 437: 1299-1320.）のデータベースおよびJSNPデータベース（Haga H, et al., J Hum Genet 2002; 47: 605-610.）から選択された。【０２９８】
本発明者らは、この領域における連鎖不平衡（LD）地図を構築した（図８ａ）。これらのD'値により、マーカーSNP6が、5つの遺伝子（P2RX3、SSRP1、TNKS1BP1、AGTRL1およびLRRC55）によってカバーされる領域と関連づけられることが示された。その結果、脳梗塞に関する単一の候補遺伝子をLDマッピングのみによって決定することは困難であった。【０２９９】
引き続いて、本発明者らは、この領域内での相関解析におけるP値を評価した（図８ｂ）。最も有意な関連性がみられたSNPはTNKS1BP1遺伝子とAGTRL1遺伝子との間に位置していたが、この領域には遺伝子も発現配列タグも報告されておらず、GENSCANプログラムによってオープンリーディングフレームも推定されなかった。P2RX3、SSRP1、TNKSBP1およびLRRC55中のSNPは、AGTRL1遺伝子中のマーカーSNP6よりも関連性の有意さの程度が低かった。さらに、AGTRL1の産物であるAPJ受容体は、心血管系（Kleinz MJ, et al., Regul Pept 2005; 126: 233-240.）および中枢神経系（O’Carroll AM, et al., J Neuroendocrinol 2003; 15: 661-666.）で発現されること、ならびに心血管系（Kagiyama S, et al., Regl Pept 2005; 125: 55-59.、Seyedabadi M, et al., Auton Neurosci. 2002; 101: 32-38.、Katugampola SD, et al., Br J Pharmacol 2001; 132: 1255-1260.、Tatemoto K, et al., Regul Pept 2001; 99: 87-92.、Masri B, et al., FASEB J 2004; 18: 1909-1911.、Hashimoto Y, et al., Int J Mol Med 2005; 16: 787-792.）に関係する機能を有することが報告されていることから、本発明者らはAGTRL1を脳梗塞に関する候補遺伝子として選択した。【０３００】
〔実施例７〕  AGTRL1遺伝子におけるSNP解析
AGTRL1遺伝子は、2つのエクソンおよび1つのイントロンからなる（図８ｃ）。タンパク質コード領域はエクソン1のみに存在する。以前の報告（Saito S, et al., J Hum Genet 2003; 48: 461-468.）における直接シークエンシングにより、AGTRL1遺伝子における遺伝的変異は転写開始部位の2 kb上流から最終エクソンまでの範囲にわたる領域がスクリーニングされている。その報告では、9つのSNP、2つの単一反復多型および1つの挿入／欠失（I／D）多型が発見されている。本発明者らは、以前の報告では発見されていないが、dbSNPデータベース中にrs11544374としてすでに登録されていたさらに1つのSNP（SNP5）を、エクソン1の5'非翻訳領域（UTR）で見いだした。本発明者らは、LAおよびATを有する被験症例860例ならびに対照被験者860例を用いて、これらの10種のSNPのジェノタイピングを行った。イントロン中のI／D多型についても直接シークエンシングによってジェノタイピングを行ったところ、これはSNP7およびSNP10と絶対的連鎖があることが判明した。【０３０１】
このケースコントロール研究において脳梗塞と有意な関連性のある多型は9つ（SNP2、3、4、5、6、7、9、10およびI／D）であった（表１０）。【０３０２】
以下の表１０は、AGTRL1遺伝子のケースコントロール相関解析結果を示す。【０３０３】
【表１０】
2007123233.tif 000021
【０３０４】
上記表１０中、1はリスクアレル、2は非リスクアレル、ORはオッズ比、CIは 信頼区間を指す。【０３０５】
さらに脳梗塞全体における相関解析の結果を以下の表１１−１および１１−２に示す。またラクナ群およびアテローム群における相関解析の結果を以下の表１２−１および１２−２に示す。【０３０６】
【表１１−１】
2007123233.tif 000022
【０３０７】
表１１−２は表１１−１の続きの表である。
【表１１−２】
2007123233.tif 000023
【０３０８】
【表１２−１】
2007123233.tif 000024
【０３０９】
表１２−２は表１２−１の続きの表である。
【表１２−２】
2007123233.tif 000025
【０３１０】
アミノ酸の置換を引き起こすSNPはなかった。このことから、本発明者らは、これらの多型のいくつかはAGTRL1遺伝子のプロモーター活性またはエンハンサー活性を変化させる可能性があると考えた。【０３１１】
〔実施例８〕  AGTRL1遺伝子におけるハプロタイプ解析
本発明者らは、AGTRL1におけるハプロタイプのセットを構築した。脳梗塞と有意に関連づけられた9種のSNPのうち、SNP2、3および4は完全連鎖している。同様に、I／D、SNP7および10も完全連鎖していた。これらのSNPを検討した上で、本発明者らは5種類のタグSNP（SNP2、SNP5、SNP6、SNP9およびSNP10）をハプロタイプの推定のために用い、両群の被験者の90 ％超をカバーする高頻度のハプロタイプ3種を見いだした（表１３）。【０３１２】
以下の表１３は、AGTRL1遺伝子のハプロタイプ解析の結果を示す。【０３１３】
【表１３】
2007123233.tif 000026
【０３１４】
上記表１３において、5つのSNPs (SNP2, 5, 6, 9, 10) がハプロタイプの推定に利用された。ORはオッズ比、CIは信頼区間を指す。【０３１５】
Hap1におけるSNPはすべてリスクアレルであった。Hap1における脳梗塞のリスクは他のハプロタイプよりも有意に高かった（オッズ比（OR）＝1.60,（95 ％信頼区間（CI）、1.22〜2.09）；p＝0.00058、劣性モデルにおける）。これに対して、Hap3におけるSNPはすべて非リスクアレルであり、Hap3における脳梗塞のリスクは他のものよりも有意に低かった（OR＝0.76（95％CI、0.65〜0.88；p＝0.00032、アレル頻度モデルにおける）。その結果、Hap1、Hap2およびHap3はそれぞれリスク型、中間型および非リスク型のハプロタイプであると判断された。【０３１６】
〔実施例９〕  Sp1転写因子はAGTRL1遺伝子のSNP4およびSNP9のリスクアレルと結合する
AGTRL1 mRNAを高発現する細胞系を選択するために、本発明者らは89種の細胞系からのcDNAを用いてRT-PCRを行った。その結果、SBC-3細胞がAGTRL1 mRNAを最も高度に発現した（非提示データ）。【０３１７】
SNP周辺のDNA配列と転写因子との間の結合を評価するためにEMSAを行った。9つの多型候補の各アレルに対して、32P標識した二本鎖DNAプローブを構築し、SBC-3細胞からの核抽出物とインキュベートした上で電気泳動を行った（図９ａ）。本発明者らは、DNA-タンパク質結合が、SNP4のリスクアレルSNP4（-279G）では検出されるが、同じ結合が非リスクアレル（-279A）では検出されないことを見いだした。本発明者らはまた、DNA-タンパク質結合がSNP9のリスクアレル（+1355G）では検出されるが、非リスクアレル（+1355A）では検出されないことも見いだした。293T細胞からの核抽出物を用いることによっても同様の結果が得られた（非提示データ）。このアッセイに用いたプローブの配列は図９ｂに示されている。これらの結果は、何らかの転写因子がアレル特異的な様式で結合してAGTRL1の発現をトランス活性化する可能性を示唆している。【０３１８】
TRANSFACデータベースを利用したMATCHプログラムでは、転写因子Sp1はSNP4およびSNP9のリスクアレル周辺のDNA配列と結合することが推測された（図９ｃ）。これらのSNPとSp1との結合をインビトロで確かめるために、本発明者らは特異抗体を用いるSp1スーパーシフトアッセイを行った（図９ｄ）。SNP4のリスクアレルにおけるDNA-タンパク質複合体のバンドは、抗Sp1抗体の存在下では上方にスーパーシフトした。SNP9のリスクアレルでも同様のスーパーシフトが検出された。【０３１９】
以上より、本発明者らは、Sp1転写因子が SNP4およびSNP9のリスクアレル周辺のDNA配列と結合すると結論づけた。本発明者らは、Sp1とこれらのSNPとの間の相互作用がAGTRL1遺伝子のプロモーター活性またはエンハンサー活性に影響を与える可能性があるとの仮説を立てた。【０３２０】
〔実施例１０〕  Sp1はAGTRL1 mRNAの転写を誘導する
Sp1がAGTRL1遺伝子の転写に影響を及ぼすという仮説を確かめるために、本発明者らは293T細胞に対して、pCAGGSモックベクターまたはSp1-発現ベクター（pCAGGS-Sp1）のいずれかをトランスフェクトし、種々の時点で半定量的RT-PCRによりAGTRL1 mRNAレベルを比較した（図１０ａ）。本発明者らは、内因性293T細胞ではAGTRL1 mRNAは検出されないが、Sp1の過剰発現がAGTRL1 mRNAの転写を顕著に誘導することを見いだした。リアルタイムRT-PCRによっても同じ結果が定量的に確かめられた（図１０ｂ）。【０３２１】
〔実施例１１〕  Sp1はSNP4のリスクアレルにおけるプロモーター機能を活性化する
SNP4におけるプロモーター活性を評価するために、本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターベクター（pGL3-basic）に、リスクアレルおよび非リスクアレルに相当するSNP4周囲の44 bp断片を含めたもの（それぞれ-279G-Lucおよび-279A-Luc）を構築した上で、それらをモックpCAGGSベクターまたはpCAGGS-Sp1ベクターのいずれかと同時トランスフェクトしたSBC-3細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行った（図１１ａ）。モックpCAGGSをトランスフェクトした細胞では、ルシフェラーゼ活性がSNP4断片によって上昇することはなかった。Sp1を過剰発現させた細胞では、ルシフェラーゼ活性はリスクアレルの方が対照（pGL3-basic）よりも2.3倍の高さであった。非リスクアレルでは、活性は対照の1.7倍の高さに過ぎなかった。すなわち、SNP4周辺のプロモーター機能はSp1転写因子の存在下では活性化され、リスクアレルは非リスクアレルよりも有意に強い活性を示した（p＝0.003）。【０３２２】
〔実施例１２〕  SNP4およびSNP9の組み合わせはAGTRL1の転写に影響を及ぼす
本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターベクター（pGL3-basic）に、表１３で明らかにした3つのハプロタイプ別にSNP4周囲の44 bp断片およびSNP9周囲の53 bp断片を含めたものを構築した上で、それらをモックpCAGGSベクターまたはpCAGGS-Sp1ベクターと同時トランスフェクトしたSBC-3細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行った（図１１ｂ）。モックpCAGGSをトランスフェクトした細胞では、ルシフェラーゼ活性ではHap1構築物（リスクハプロタイプ）で最も高く、Hap3構築物（非リスクハプロタイプ）で最も低かった。Hap2構築物（中間型ハプロタイプ）は中間の活性を示した。その結果、AGTRL1遺伝子のプロモーター活性を増強させるイントロン性エンハンサーはSNP9のリスクアレル（+1355G）周辺に存在した。これらのデータは、ハプロタイプ解析におけるオッズ比の結果と整合する（表１１）。Sp1を過剰発現させた細胞では、活性はさらに増強された。
【産業上の利用可能性】
【０３２３】
本発明者らは、全ゲノムを対象としたSNPによるゲノムワイド相関研究を行い、脳梗塞の関連遺伝子の同定を行った。患者群は九州大学大学院病態機能内科学および関連施設に通院中の脳梗塞患者1,112例であり、対照群は2002年から2003年に施行した久山町住民健診受診者の中から患者群1例に対し性別および年齢を対応させた対照者を無作為に選出した。文部科学省・厚生労働省・経済産業省共同の「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」に基づき、説明者による説明後、書面によるインフォームドコンセントを取得し、血液サンプルおよび臨床情報を得た。この患者群1,112例および対照群1,112例の中から無作為に188例ずつを選び、全ゲノムに分布する52,608ヶ所のSNPを測定し、1次スクリーニングを行った。1次スクリーニングにおいて患者群と対照群の間に関連が認められた1098ヶ所のSNPについて全対象者を用いた2次スクリーニングを行い、脳梗塞に関連する遺伝子の同定を行った。全ゲノムにおけるSNPの測定には、東京大学医科学研究所のインベーダー法を利用した大量高速SNPタイピングシステムを用いた。【０３２４】
その結果、AGTRL1（Angiotensin II receptor-like 1）遺伝子とPRKCH（Protein kinase C eta）遺伝子を脳梗塞の関連遺伝子として同定した。AGTRL1遺伝子においては、5’側、遺伝子内および3’側に存在するSNPのほとんどが患者群と対照群の間にp＜1x10-4の有意差を認めた。この関連は対象者を動脈硬化と関連する脳梗塞（ラクナ梗塞およびアテローム血栓性梗塞）患者に限った場合にも認められた。また、ルシフェラーゼアッセイおよびゲルシフトアッセイによりAGTRL1遺伝子のSNP間で転写因子の結合に差が見られ、5’側または3’側のSNPを含む領域への転写因子の結合の差がAGTRL1遺伝子のmRNA発現量を変化させることが明らかとなった。従って、AGTRL1遺伝子においては5’または3’側のSNPを含む領域への転写因子の結合の差によりAGTRL1の発現量が変化し脳梗塞等の動脈硬化性疾患の発症に関与すると考えられた。【０３２５】
一方、PRKCH遺伝子においては遺伝子内の中央部分（イントロン5-イントロン10）の領域のみで動脈硬化と関連する脳梗塞患者群（ラクナ梗塞群およびアテローム血栓性梗塞群）の間にp＜1x10-4の有意差を認めた。この領域のダイレクトシークエンスによりアレルがGからAに変わることにより374番目のアミノ酸がバリン（Val）からイソロイシン（Ile）に置換されるSNP（rs2230500）を認め、Ile（Aアレル）をもつ人は脳梗塞患者群に有意に多かった。In vitro autophosphorylation assayを用いてこのアミノ酸置換がPRKCHの遺伝子産物であるプロテインキナーゼη(Protein kinase C eta; PKC-eta)の活性に与える影響を検討したところ、ValからIleへのアミノ酸置換はPKC-etaの自己リン酸化反応を亢進させる事が明らかとなった。すなわち、PKC-etaの374番目のアミノ酸をValからIleに置換するSNP（rs2230500）はPKC-etaの活性に影響しており、この活性の差が脳梗塞と関連していると考えられた。また、PKC-etaの市販抗体（ラビットポリクローナル抗体、Santa Cruz）を用いてヒトの剖検例の冠状動脈の免疫組織染色を行った所、PKC-etaはヒト冠状動脈の内皮細胞および動脈硬化巣に発現しており、その程度は動脈硬化の程度と強く相関していた。すなわちPKC-etaはヒトの動脈硬化の発症・進展に深く関与していることが明らかとなった。さらに、PKC-etaのアミノ酸置換を伴うSNP（rs2230500）がヒトの動脈硬化性疾患の発症に関与するかどうかを検討するために、1988年に久山町一般住民健診を受けて長期観察中の久山町研究の第3集団のうち2002年から2003年にゲノムDNAを収集した1,683例を用いて、脳梗塞および心筋梗塞発症との関連を検討した。14年間の追跡期間中67例の脳梗塞発症および37例の心筋梗塞発症を認め、rs2230500のアレルがGGである人と比べ、AAの人の脳梗塞のリスクは2.83倍と有意に高かった。同様に心筋梗塞のリスクもGGの人に比べAAの人は2.89倍上昇していた。以上の結果より、PRKCH遺伝子のエクソン９に存在する374番目のアミノ酸をValからIleへ置換するSNP（rs2230500）は、アミノ酸置換によりPKC-etaの活性が上昇し、種々のシグナル伝達を介してヒトにおける動脈硬化を進行させ、最終的に一般住民における脳梗塞や心筋梗塞のリスクを上昇させていると考えられる。【０３２６】
従来の高血圧、心筋梗塞、脳卒中、糖尿病、慢性関節リウマチなどの一般的な疾患（common disease）におけるゲノムワイド相関研究を用いた候補遺伝子の探索においては、疾患群と対照群におけるSNPの頻度の差を比較し候補領域の絞込みを行うケース・コントロール研究が用いられている。しかし、脳梗塞などの疾患は加齢とともに発症率が上昇し、またその発症率に男女差があることもよく知られている。従って、患者群と対照群のSNPの差を比べる際には、両群間の年齢、男女比を考慮する必要がある。しかしながら、これまでの報告においては疾患群と対照群とを完全に一致させたものは見当たらない。その理由のひとつとして、患者群は病院に通院している患者であるため比較的容易にサンプルの収集が可能であるが、対照群は病気を持たない一般住民であるためサンプルの収集が困難であり、また性別や年齢を一致させるためには患者群より数倍多いサンプルの収集が必要となることがある。久山町の疫学集団は一般住民の健診受診者からなる集団であるため、これまでの研究では収集が困難である病気をもたない人を多数含んでおり、患者群の1例ごとに性別・年齢を一致させた対照群を設定することが可能であった。また、ケース・コントロール研究では対照群の設定に偏りがあると疾患群・対照群の差が本来とは異なる結果を生じることが知られている（selection bias）。久山町の住民は、これまでの疫学調査の結果より、性、年齢構成等が日本人の標準的構成であることから、日本人全体のサンプル集団であると証明されており、その集団の中から無作為に設定された対照群には偏りがないと考えられる。従って、今回の脳梗塞の関連遺伝子を探索する際に久山町集団を対照群に設定したことにより従来の報告と比べ、より正確に高い精度で疾患と関連する遺伝子を同定できていると考えられる。【０３２７】
久山町住民を用いることによる最大の利点は、この集団が一般住民を対象とした長期前向き追跡研究のための集団である点にある。ゲノムワイド相関研究で見つけ出される疾患関連遺伝子やその遺伝子多型が真に疾患と関係しているかどうかを検証するために、現時点では疾患関連遺伝子を選び出した集団とはまったく別の集団を用いてケース・コントロール研究を行い再現性が得られるかどうかを検討している。しかしながら、ケース・コントロール研究は対象集団の選択による偏りの可能性が否定できないため別の集団を用いて再現性が得られても疑陽性の可能性が否定できない。一般的に疾患と危険因子の関連を検討する場合、疾患を発症していない集団を長期に追跡し、危険因子が疾患の発症に及ぼす影響を検討する前向き追跡研究（コホート研究）の研究手法がもっとも精度の高い方法と考えられているが、対象者の収集及び追跡調査に莫大な時間・労力・費用がかかるためこれまでにこの方法を用いて疾患と遺伝子多型の関連を検討した報告はない。久山コホートはこの目的のために設定された集団であり、しかも以前の集団も追跡調査が継続されているため今回のPRKCH遺伝子のように遺伝子多型と脳梗塞との関連を14年間にわたる長期前向き追跡調査のデータを元に検証することが可能となった。今回の結果は一般住民レベルで遺伝子多型が疾患の発症と関連していることを証明した世界で始めてのケースである。また、久山コホートは、性、年齢構成等が日本人の標準的構成であることから、日本人全体のサンプル集団であるということができ、今回の結果は久山町住民だけでなく日本人全体に当てはまると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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