(57)【要約】サトイモ科、パイナップル科、クズウコン科の大量増殖を可能とする新規の方法を提供すること。  サトイモ科、パイナップル科及びクズウコン科から成る群から選択された植物の葉鞘又はその一部を外植片として培養しエンブリオジェニック・カルスを誘導することを含む、エンブリオジェニック・カルスの製造方法、ならびに前記方法で得られたエンブリオジェニック・カルスから不定胚の誘導を経て植物体を再生する増殖方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サトイモ科、パイナップル科及びクズウコン科から成る群から選択された植物の葉鞘又はその一部を外植片として培養し、エンブリオジェニック・カルスを誘導することを含む、エンブリオジェニック・カルスの製造方法。
【請求項２】
外植片が葉鞘基部又は該基部に近い部分である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
サトイモ科、パイナップル科及びクズウコン科の植物の増殖方法であって、該植物の外植片としての葉鞘又はその一部から誘導されたエンブリオジェニック・カルスから不定胚の誘導を経て該植物体を再生することを特徴とする上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物の増殖方法に関し、特にサトイモ科、パイナップル科及びクズウコン科の植物の増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サトイモ科、パイナップル科、クズウコン科には食用及び観賞用の両用途にて重要な植物が多く属している。それら植物の増殖は、挿し木、株分け、塊茎などの種々の方法が用いられているが、特に観賞用植物においては組織培養法による増殖が広く普及、定着している。現在用いられている組織培養法は固体培地（寒天やゲルライト等で固化された培地）上にて多芽体を誘導する方法である。
しかし、従来の組織培養法は増殖率が低く、手工業的手法以外では大量の増殖が困難であるという問題点があった。また、増殖の作業は多芽体に含まれる芽を１つずつ切り分け、更にそれらを１つずつ固体培地に移植する作業となる為、作業効率が低かった。それらの理由によりこれら植物の苗生産は高コストとなっていた。また、増殖率が低い為、新品種を普及させる場面においても長時間を要し、市場ニーズに即した品種の改良と供給の制限要因となっていた。
培養条件下にて増殖率を高める手法の１つとして不定胚による増殖法がある。植物組織からエンブリオジェニック・カルスを誘導し、それらエンブリオジェニック・カルスから不定胚を作成する手法であり、ニンジン（セリ科）を代表的な例として、アルファルファ（マメ科）、セロリ（セリ科）、イネ（イネ科）、アスパラガス（ユリ科）、サツマイモ（ヒルガオ科）、サトウキビ（イネ科）などにおいて多くの研究がなされている。ニンジン、セロリ、イネなどの一部の植物種別では高い効率でのエンブリオジェニック・カルスからの不定胚生産効率の獲得が達成されており、大量増殖の手法としての検討が進んでいる。中には１ｇのエンブリオジェニック・カルスから数万個の不定胚が得られている例もある（例えば非特許文献１参照）。
しかし、従来の不定胚による増殖法は、前述の一部の植物を除く植物の多くの例で、大量増殖に用い得るほどの不定胚誘導効率は得られていないという問題点があった。特にサトイモ科、パイナップル科、クズウコン科の不定胚誘導検討例は極僅かであり、大量増殖につながる技術は確立されていなかった。
例えば、サトイモ科に属する重要な観賞用植物であるスパティフィラムにおいては、花糸からの不定胚誘導が確認されている（例えば非特許文献２参照）が、その試験目的は遺伝子組換えや突然変異への利用にすぎず、その手法においては、エンブリオジェニック・カルスを誘導して増殖するものではなく、花糸から直接不定胚を誘導する方法であり、１つの外植片からの増殖率は極めて限られているという問題点があった。また、液体培地においては不定胚が葯と分離せず誘導され、その後の植物体再生には好ましい条件ではないと指摘されていた。加えて、花糸を外植片として用いる場合には、その部位を採取する時期が開花期に限られ、増殖を目的とした場合には初期の材料の数も限られているという点において適切ではなかった。
またサトイモ科のスパティフィラム以外の植物での不定胚の誘導例としてはアンスリウム（例えば非特許文献３参照）があり、カルス誘導には葉切片が最も適しているとされる。葉切片からのカルスの増殖とそれらカルスからの不定胚の形成が報告されている。さらにサトイモにおいては、塊茎の皮層部からのカルスの誘導と、不定胚経由と思われる再分化が報告されている（例えば非特許文献４参照）。また、イネ科のサトウキビでは、葉鞘を外植片とし、エンブリオジェニック・カルスを誘導した例がある（例えば非特許文献５参照）。
しかし、いずれの報告においてもエンブリオジェニック・カルスからの不定胚誘導効率や不定胚からの植物体への再分化効率の記載がなく、また、不定胚の誘導は固体培地のみで行われており、実用的な手法ではないという問題点があった。また、サトウキビの葉鞘の外植片の例では、エンブリオジェニック・カルスは生長点から１ｃｍ以内の葉鞘部では誘導効率が低く、１〜２ｃｍ離れた部位が最適とされていた。
一方、スパティフィラムと同様に重要な観賞植物であるパイナップル科のグズマニア、及びクズウコン科のカラテアにおいては不定胚の誘導の報告例自体がなかった。この様にこれら植物種では、不定胚を大量増殖に用いるのは極めて困難と判断され、検討はほとんど進んでいないのが現状と思われる。
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ３９，Ｐ１３７，１９９４
【非特許文献２】Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ  ５２０，ｐ２６３，２０００
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ４８，ｐ１８９，１９９７
【非特許文献４】九州農業研究  第５４号，ｐ１９６，１９９２
【非特許文献５】Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  １１８，ｐ１６９，１９８３
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、サトイモ科、パイナップル科、クズウコン科の大量増殖を可能とする新規の方法を提供することである。
本発明者らは鋭意検討の結果、サトイモ科、パイナップル科及びクズウコン科の植物の葉鞘を外植片として用いることで、意外にも、カルス誘導率が高く、エンブリオジェニック・カルスが高頻度に存在するカルスを製造できる方法を見出した。
即ち、本発明は、一の態様において、サトイモ科、パイナップル科及びクズウコン科から成る群から選択された植物の葉鞘又はその一部を外植片として培養し、エンブリオジェニック・カルスを誘導することを含む、エンブリオジェニック・カルスの製造方法を提供する。
その実施形態において、外植片が葉鞘そのもの、特にそのうち葉鞘基部又は基部に近い部分である。
その別の実施形態において、外植片が葉鞘基部において茎から剥がれた部分である。ここで葉鞘基部とは、葉鞘長片の下１／４部分を指し、葉鞘基部に近い部分とは当該葉鞘基部を除いた葉鞘長片の下１／２部分を指す。
本発明はまた、別の態様において、サトイモ科、パイナップル科及びクズウコン科の植物の増殖方法であって、植物の外植片としての葉鞘又はその一部から誘導されたエンブリオジェニック・カルスから不定胚の誘導を経て、植物体を再生する増殖方法を提供する。
その実施形態において、本発明の方法は、植物の葉鞘又はその一部を外植片として培養しエンブリオジェニック・カルスを誘導する工程、エンブリオジェニック・カルスから不定胚を誘導する工程及び不定胚を発芽、発根させる工程を含む。
その実施形態において、外植片が葉鞘のうち、葉鞘基部又は基部に近い部分である。
その実施形態において、外植片が葉鞘基部において茎から剥がれた部分である。
その別の実施形態において、不定胚を誘導する工程において、培地がグルタミン酸及び／又はプロリンを含む。
その別の実施形態において、不定胚を誘導する工程において、培地が液体培地である。
その更に別の実施形態において、不定胚を誘導する工程において、培地がフラクトース及び／又は６−ベンジルアデニンを含む。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−３４８１６３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例２の試験区２（グルタミン酸添加区）及び対照区から得られた不定胚の状態を示す。
図２は、実施例２の試験区２（グルタミン酸添加区）及び対照区から得られた不定胚の発芽状態を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
定義
本発明において、エンブリオジェニック・カルスとは、不定胚を経由して植物体までに分化できる能力があり、形態は柔らかく（力を加えることで崩れやすい）、個々の径が１ｍｍ未満の大きさを持ち、クリーム色を呈する粒状の脱分化した細胞又は組織である。
本発明において、不定胚とは培養された植物体細胞（組織）から生ずる胚であって、更に正常な植物体へと発達する胚をいう。
本発明において、葉鞘とは茎を鞘状に包むような形になった葉の基部をいう。
葉鞘外植片からエンブリオジェニック・カルスを誘導する工程
まず、サトイモ科、パイナップル科及びクズウコン科植物の葉鞘から外植片を調製する方法について説明する。
本発明に使用する葉鞘は必ずしも培養苗から採取する必要はない。温室などの開放条件で維持されている植物から採取してもよい。その場合は常法によって表面殺菌をして外植片とする。培養苗を用いる場合は表面殺菌の必要はない。葉鞘であればどの部位を用いても良いが、好ましくは基部に近い部分が良い。更に好ましくは、その基部、例えば葉鞘を植物苗から採取する際に、メスなどで切断するのではなく、葉鞘を植物苗から剥がす様に採取し、その剥離した部分を含む部位を用いる。葉や根からもカルスが得られる場合があるが、葉鞘に比して頻度は著しく低く、また次工程でのエンブリオジェニック・カルスも誘導されにくいので好ましくない。
次に、調製した葉鞘外植片を培地に置床しエンブリオジェニック・カルスを製造する方法について説明する。
前述のようにして得られた葉鞘外植片をカルス誘導培地に置床することによって先ずカルスを誘導する。その培地はＭＳ培地（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５，ｐ１４３，１９６２）など通常組織培養に用いる培地を基本培地とし、糖源としてショ糖１〜６％（重量／体積％、以下同じ）、望ましくは２〜４％、植物生長調節物質のオーキシン類として望ましくは２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を１〜８ｐｐｍ、望ましくは３〜５ｐｐｍ、その他のオーキシン類としてインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、４−クロロフェノキシ酢酸（ＣＰＡ）、クロロメチルフェノキシ酢酸（ＭＣＰＡ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）、ジクロロメトキシ安息香酸（ＤＩＣＡＭＢＡ）、トリクロロアシノピコリン酸（ＰＩＣＲＯＬＡＭ）を、サイトカイニン類として望ましくは６−ベンジルアデニン（ＢＡ）を０．０５〜２ｐｐｍ、望ましくは０．１〜０．３ｐｐｍ、その他のサイトカイニン類としてゼアチン（ＺＥＡ）、カイネチン（ＫＮ）、６−（ベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロピラニル）−９Ｈ−プリン（ＰＢＡ）、２−イソペンテニルアデニン（２ｉｐ）、チジアズロン（ＴＤＺ）等を用いる。最も良好な結果は２，４−ＤとＢＡを組合せた条件で得られる。２，４−Ｄが１ｐｐｍ未満の場合、カルスと共に植物体が発生しやすく、８ｐｐｍを超えると組織が褐変しやすいことがある。また、カゼイン酸加水分解物を５０〜２００ｐｐｍ、バッファーとしてＭＥＳを０．１〜１０ｍＭを加えても良い。培地のｐＨは５〜７とする。ｐＨ調整後に寒天（０．８〜１．２％）またはゲルライト（０．１〜０．３％）を用いて培地を固形化する。容器は植物組織培養に用いられるものであれば特に限定はない（例えばプラントボックス、旭テクノグラス社製、内容積３００ｍｌ）。光環境は暗所、温度は２０℃〜３０℃、望ましくは２３℃から２７℃とする。培養期間は４〜１２週、望ましくは５〜８週とする。
前述のようにして得られたカルスを同じ培地に継代培養し、生じてくるエンブリオジェニック・カルスを選抜し、同じ培地に移植してエンブリオジェニック・カルスのみの増殖を行う。以後、同様の操作にてエンブリオジェニック・カルスを維持、増殖する。光、温度条件はカルス誘導時と同じとし、培養期間は４〜６週とする。
例えば、本発明の前記方法によって後述の実施例で得られたサトイモ科スパティフィラム属、パイナップル科グズマニア属、クズウコン科カラテア属植物のエンブリオジェニック・カルスの特徴は、形態は柔らかく（力を加えることで崩れやすい）、個々の径が１ｍｍ未満の大きさを持ち、クリーム色を呈するものであった。
前記のようにして得られたエンブリオジェニック・カルスは、同一組成の液体培地にて懸濁培養細胞として維持することも可能である。その場合は、３００〜５００ｍｌ程度の三角フラスコに、培地をフラスコ容積の１５〜３０％程度添加する。
エンブリオジェニック・カルスから不定胚を誘導する工程
前述のように寒天培地上で維持、増殖されたエンブリオジェニック・カルスから不定胚を誘導する方法について説明する。
不定胚誘導の報告例の多くは固体培地若しくは三角フラスコ等の小容器を用いた液体培地での例であり、培養槽（液体培地）での大量増殖の例は少ない。固体培地から得られた不定胚に比して培養槽から得られる不定胚はその後の生育が劣るとの報告例（Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｐ３５，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）や、液体培地での不定胚誘導のスケールアップに大型の三角フラスコを用いる例もある（Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｐ７５，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。本発明での不定胚誘導は寒天培地などの固体培地でも良いが、大量増殖の目的では液体培地、更には培養槽などの大型且つ大量培養に適した容器が良い。培養槽を用いた不定胚の大量誘導としてはニンジンの例があり（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ３９，ｐ１３７，１９９４）、本発明において参照可能である。本発明には市販されている多くの植物組織培養用の培養槽（例えば柴田科学社製）を用いることができる。エアーリフト型の培養槽でも良いが、望ましくは内部に攪拌翼を持つタイプの培養槽を用いることができる。本発明では、エンブリオジェニック・カルスを懸濁培養細胞増殖を経ることなく直接培養槽での不定胚誘導の置床材料とすることにより、工程の単純化を図ることができ、かつ極少量のエンブリオジェニック・カルスから大量に不定胚を誘導することができる。
不定胚誘導培地はＭＳ培地などを基本培地とし、グルタミン酸及び／またはプロリンを夫々１〜１０ｍＭ、望ましくは２〜５ｍＭ添加する。これらのアミノ酸を添加することにより、不定胚誘導培地中での発芽を抑え不定胚の質や誘導効率を高めることができる。基本培地には、糖源としてショ糖を０．５〜４％、望ましくは１〜２％添加する。培養する植物品種によってはフラクトースを０．５〜４％、望ましくは０．５〜２％を添加する。フラクトースを添加することにより、通常条件では不定胚誘導の困難な品種（例えば実施例５で使用したスパティフィラム・ダブルテイク）においても高い効率での不定胚誘導が可能になる。また、その他の糖類としてソルビトール又はマンニトールを１〜６％、望ましくは２〜４％を添加しても良い。植物生長調節物質のオーキシン類として望ましくは２，４−ジコロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を０〜２ｐｐｍ、望ましくは０．０１〜０．０５ｐｐｍ、その他のオーキシン類としてインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、４−クロロフェノキシ酢酸（ＣＰＡ）、クロロメチルフェノキシ酢酸（ＭＣＰＡ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）、ジクロロメトキシ安息香酸（ＤＩＣＡＭＢＡ）、トリクロロアジノピコリン酸（ＰＩＣＲＯＬＡＭ）を、サイトカイニン類として望ましくは６−ベンジルアデニン（ＢＡ）を０〜０．５ｐｐｍ、望ましくは０．０５〜０．２ｐｐｍを加えることができる。ＢＡを添加することにより、さらに不定胚誘導効率における品種間差の改善を図ることができる。その他のサイトカイニン類としてゼアチン（ＺＥＡ）、カイネチン（ＫＮ）、６−（ベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロピラニル）−９Ｈ−ブリン（ＰＢＡ）、２−イソペンテニルアデニン（２ｉｐ）、チジアズロン（ＴＤＺ）等を用いる。また、バッファーとしてＭＥＳを０．１〜１０ｍＭを加えても良い。培地のｐＨは５〜７とする。
光環境は明条件（１２〜１６時間日長、光合成光量子束密度５．７〜３４．２μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）が望ましいが、暗条件でも良い。温度は２０℃〜３０℃、望ましくは２３℃〜２７℃とする。培養期間は４〜１２週、望ましくは５〜１０週とする。
培養槽への置床材料は、固体培地上で維持、増殖されたエンブリオジェニック・カルスまたは液体培地での懸濁培養細胞のどちらを用いても良いが、本発明における固体培地上で維持されたエンブリオジェニック・カルスからの液体培地での不定胚誘導効率は極めて高いことから、それらエンブリオジェニック・カルスを置床材料とすることが望ましい。懸濁培養細胞を用いる場合は、フラスコ振とう機などの機器類及び懸濁培養細胞の回収に必要な種々の器具類が必要となり、大量培養には最適ではない。本発明で誘導されるエンブリオジェニック・カルスは、前述の通り液体培地での不定胚誘導効率が極めて高い為、単位培地あたりの置床量は少量で良い。０．０５〜５ｇ／ｌ程度、望ましくは０．１〜２ｇ／ｌとする。
不定胚の脱水工程
回収した不定胚は固体培地上でそのままでも発芽能力を有するが、発芽率は低く、再分化個体はビトリフィケーションの状態となりやすい。不定胚を脱水することで再分化効率が向上し苗も正常となる。脱水を行う容器は特に限定されないが、少量を処理する場合はシャーレ（直径９ｃｍ、高さ１．５ｃｍ、など）、多量の場合は透明なプラスティック製の箱型容器（例えば２２ｃｍｘ１７ｃｍｘ７ｃｍ程度のサイズ）を用いる。何れの場合も底部にペーパータオルを敷いて不定胚を適量入れる（９ｃｍシャーレの場合は１〜２０ｇ程度、上記箱型容器の場合は３０〜１００ｇ程度）。光環境は１２〜１６時間日長、光合成光量子束密度１．１〜３４．２μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ、望ましくは３．４〜２２．８μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃの明条件が望ましいが、暗条件でも良い。温度は２０℃〜３０℃、望ましくは２３℃〜２７℃とする。期間は３日〜２１日、望ましくは５日〜１４日とし、不定胚の生重量が脱水開始前の４０〜８０％、望ましくは５０〜７０％となる様に脱水する。脱水を終えた不定胚は、ペーパータオルを敷いた９ｃｍシャーレに１０〜２０ｇ入れた状態にて、常温で３〜１２ヶ月間保存が可能である。望ましい保存環境は上記脱水環境と同一であるが限定されるものではない。低温、暗所での保存も可能である。
不定胚を発芽させる工程
脱水不定胚は固体培地上でも液体培地中でも高効率で発芽するが、大量増殖の目的では液体培地を用いることが望ましい。発芽に用いる培地はＭＳ培地などを基本培地とし、糖源としてショ糖を１〜６％、望ましくは２〜４％添加する。発根などが激しい場合は、その他の糖類としてソルビトール又はマンニトールを１〜６％、望ましくは２〜４％を添加しても良い。植物生長調節物質は特に添加する必要はないが、オーキシン類やサイトカイニン類を添加して発芽を促進させても良い。培地のｐＨは５〜７とする。光環境は明条件、１２〜１６時間日長、光合成光量子束密度１．１〜３４．２μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ、望ましくは２．３〜２２．８μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃとする。温度は２０℃〜３０℃、望ましくは２３℃〜２７℃とする。固体培地の場合は寒天（０．８〜１．２％）またはゲルライト（０．１〜０．３％）を用いて培地を固形化する。容器は植物組織培養に用いられるものであれば特に限定されるものではないが、固体培地の場合は前述のプラントボックス、液体培地の場合は前述の攪拌式もしくはエアーリフトタイプの培養槽を用いる。脱水不定胚の置床量は、固体培地の場合は、上記プラントボックスに培地を５０ｍｌ添加し、不定胚を０．０５〜１ｇ、望ましくは０．１〜０．５ｇ置床する。液体培地の場合は、０．１〜２ｇ／ｌ、望ましくは０．３〜１ｇ／ｌにて置床する。培養期間は、固体培地の場合は４〜１２週間、液体培地の場合は３〜６週間とする。その期間中に、脱水不定胚は発根し数枚の葉を展開するサイズの植物体となる。液体培地中では、植物体は攪拌の影響により葉の展開は固体培地に比して抑制される。それら液体培地で誘導された植物体は温室などに直接馴化が可能であるが、固体培地に移植して更に生長させても良い。その場合の固体培養の条件は、上述の脱水不定胚の発芽条件と同一である。またその工程は、液体培地を用い静置培養にて行っても良い。その場合は、上記固体培養の条件から固化剤（寒天またはゲルライト）を除く以外は固体培地での不定胚発芽条件と同一でよい。培養槽を用いることにより、不定胚からの発芽及び植物体の再生を効率的に行うことができる。なお、従来の不定胚による増殖法では、不定胚からの発芽及び植物体の再生を培養槽にて効率的に行った例はなかった。
温室への移植
不定胚から再分化した植物体は、温室にて正常に生育する。移植に用いる土は特に限定されるものではなく、育苗用に市販されている培養土で良い。植物体を移植した後、１〜３週間程度、適度の加湿と遮光を行うことが望ましい。
適用可能な植物
上述した本発明の手法により増殖が可能な植物は、サトイモ科、パイナップル科、クズウコン科に属する各種植物である。具体的には、サトイモ科に属する植物としては、サトイモ、タロイモ、コンニャク、スパティフィラム、アンスリウム、カラジウム、アグラオネマ、アローカシア、ディエフェンバキア、モンステラ、フィロデンドロン、ポトス、シンゴニューム、カラー、ミズバショウ、ザゼンソウ、ショウブ、カラスビシャク等が、パイナップル科に属する植物としては、ネオレゲリア、エクメア、フリーセア、チランジア、クリプタンサス、アナナス（パイナップル）、グズマニア等が、クズウコン科に属する植物としては、マランタ、クテナンテ、ストロマンテ、カラテア等が、それぞれ挙げられる。
【実施例１】
【０００６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではない。
スパティフィラム（品種Ｐｅｔｉｔｅ）の培養苗の各種組織から、カルス誘導及びそれらカルスからのエンブリオジェニック・カルスの誘導を行った。同培養苗は、ＭＳ培地にショ糖３％、寒天（和光純薬社、東京、日本国）０．８％を添加しｐＨを５．８に調整した固体培地上にて、明所（光合成光量子束密度５．７μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ、１６時間日長）、２５℃の条件下にて継代維持されているものである。培養容器には旭テクノグラス社製のプラントボックスを用いた（内容積３００ｍｌ）。培養４週目の培養苗から、葉鞘を株から剥がす様に採取し、剥離部分を含む約２ｃｍの切片（葉鞘基部）を外植片とした。その外植片を、ショ糖３％、２，４−Ｄ  ４ｐｐｍ、ＢＡ  ０．２ｐｐｍ、カゼイン酸加水分解物１００ｐｐｍ、ＭＥＳ  ５ｍＭを添加し０．８％寒天にて固化したＭＳ培地（ｐＨ５．８、以下「カルス誘導・増殖培地」）に６切片／容器ずつ置床した（容器はプラントボックス、培地量は５０ｍｌ）。全部で４個の容器を使用した。２５℃、暗所条件にて８週間培養しカルスの誘導状況を調査した。その結果、置床切片の９２％（カルス誘導切片数／置床切片数＝２２／２４）においてその剥離部分にカルスが誘導された。それらカルスを０．２ｇ／容器ずつ同一培地に継代し１ヶ月培養することによって、エンブリオジェニック・カルスが選抜された。このようなエンブリオジェニック・カルスは、５０％の率（エンブリオジェニック・カルス誘導容器数／処理容器＝４／８）にて誘導された。
このエンブリオジェニック・カルスを、ショ糖１％、ソルビトール  ３％、ＭＥＳ  ５ｍＭを含むＭＳ液体培地（ｐＨ５．８）を１６０ｍｌ添加した５００ｍｌの三角フラスコに各０．０５ｇずつ置床し、２５℃、明所（１６時間日長、光合成光量子束密度２２．８μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）にて６週間浸とう培養を行った（８０ｒｐｍ）ところ、不定胚が形成された。それら不定胚を、ショ糖３％を含み寒天０．８％にて固化したＭＳ培地（ｐＨ５．８、以下「発芽培地」）５０ｍｌを添加したプラントボックスに０．２ｇずつ置床し、２５℃、明所（１６時間日長、光合成光量子束密度５．７μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）にて８週間培養を行ったところ、不定胚は発芽し完全な植物が得られた。エンブリオジェニック・カルスは、４週間毎に「カルス誘導・増殖培地」へ継代することにより、不定胚誘導能を保持したまま２年間の維持が可能であった。
［比較例１］
スパティフィラム（品種Ｐｅｔｉｔｅ）の培養苗の葉鞘の代わりに比較的一般的に用いられる根及び葉をカルス誘導の外植片として用いた。根は生長点部を除き約１ｃｍ程度の切片、葉は約５ｍｍ角程度の切片とし実施例１と同じ条件で置床し、８週間後にカルス誘導状況を調査した。葉では殆どカルスは形成されず、また、根においては一部カルスは形成されたが、不定根の発生によってカルスとしての維持が困難であった。従っていずれの外植片においても最終的に不定胚を得ることは出来なかった。
【実施例２】
【０００７】
実施例１と同じ条件で誘導した品種Ｐｅｔｉｔｅのエンブリオジェニック・カルスを用い、プロリン及びグルタミン酸が不定胚誘導に及ぼす影響について検討した。基本培地をショ糖１％、ソルビトール３％、ＭＥＳ  ５ｍＭを含むＭＳ液体培地（ｐＨ５．８）とし、以下の濃度のプロリン、グルタミン酸を添加した。それら培地４０ｍｌを含む３００ｍｌ三角フラスコ各５本ずつにエンブリオジェニック・カルス０．０５ｇずつを置床し、２５℃、明所（１６時間日長、光合成光量子束密度２２．８μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）にて６週間浸とう培養を行い（７０ｒｐｍ）、誘導された不定胚の生重量を計測した（表１）。
【表１】
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回収重量は、プロリン及び／又はグルタミン酸を添加した全区にて対照区を大きく上回った。また、それらの区では回収重量の増加と共に液体培地中での不定胚の発芽が抑えられ、組織の褐変部分がなくなり均一な不定胚が得られた（図１）。更に、回収された不定胚の発芽状態は対照区に比して旺盛であり且つ葉緑体の発達が勝っていた（図２）。これらの結果により、プロリン及び／又はグルタミン酸の不定胚誘導培地への添加効果は明らかであった。
【実施例３】
【０００８】
実施例１と同じ条件で誘導した品種Ｐｅｔｉｔｅのエンブリオジェニック・カルスを用い、培養槽での不定胚誘導を行った。不定胚誘導培地には、ショ糖１％、ソルビトール３％、２，４−Ｄ  ０．０２ｐｐｍ、プロリン３ｍＭ、グルタミン酸３ｍＭ、ＭＥＳ  ５ｍＭを添加したＭＳ培地（ｐＨ５．８、以下「不定胚誘導培地」）を、培養槽には、幅１５ｃｍの攪拌翼（柴田科学社製）を有した底面積３１４ｃｍ２、高さ２４ｃｍの円筒型の培養槽（内容積８ｌ、以下「不定胚誘導培養槽」）を用いた。不定胚誘導培地５ｌを入れた培養槽９個に、エンブリオジェニック・カルスを２ｇずつ置床し、攪拌翼を毎分５０ｒｐｍの速度で回転させ、底部から０．０６ｖｖｍの通気を行いながら不定胚の誘導を行った。培養条件は、２５℃、明所（１６時間日長、光合成光量子束密度２２．８μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）条件とした。５週間の培養の後、不定胚をステンレスの笊を用いて回収した。回収した不定胚は２〜３ｍｍサイズ且つ芽及び根の伸長が抑えられた均一な形態であった。それら不定胚の余分な水分をペーパータオルで吸収し、透明なプラスティック製の箱型容器（サイズは２２ｃｍｘ１７ｃｍｘ７ｃｍ、底部にペーパータオルを敷く）に６０ｇずつ置床した。回収された不定胚の生重量は、培養槽あたり平均３５２ｇであった。１週間の脱水工程の後の生重量は平均２３７ｇであり、脱水前生重の６７％であった。脱水した不定胚０．５ｇを、発芽培地５０ｍｌを分注したプラントボックスに置床し、１０週間、明所条件（１６時間日長、光合成光量子束密度５．７μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）で培養したところ、容器あたり平均約５０個の完全な再分化植物体が得られた。これは、脱水不定胚１ｇあたり１００苗、不定胚誘導培養槽あたり２．４万苗、エンブリオジェニック・カルス１ｇあたり１．２万苗、の高い増殖効率である。
［比較例２］
不定胚誘導培養槽に用いる培地に実施例２の対照区の培地を用いたところ、回収された不定胚の生重量は培養槽あたり平均１７６ｇ（培養槽数＝１０）、脱水後の重量は平均１０４ｇであり、実施例３の結果の夫々５０％、４４％であった。
【実施例４】
【０００９】
実施例３から得られた脱水不定胚のうち３．８ｇを、ＭＳ培地にショ糖３％を添加した５ｌの液体培地（ｐＨ５．８）を含む円筒型の培養容器（底面積約１９０ｃｍ２、高さ約４５ｃｍ、内容積約６ｌ、以下「植物体誘導培養槽」）に植え付け、０．０６ｖｖｍの通気を底面部から行いながら、２５℃、明所（１６時間日長、光合成光量子束密度２２．８μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）にて６週間培養した。不定胚は葉や根を発生させながらも、攪拌されていることによって過度な生育はせず、径１〜２ｃｍ程度のコンパクト且つ均一な多芽体となり、容器あたり１２５ｇが得られた。それら多芽体を回収後、１芽ずつに分割してから「発芽培地」に置床し、明所（１６時間日長、光合成光量子束密度５．７μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）にて４週間培養したところ、葉及び根が展開、伸長した完全な植物体が得られた。苗数量は、脱水不定胚１ｇあたり２５０苗、植物体誘導培養槽あたり９５０苗、不定胚誘導培養槽あたり５．９万苗となり、この液体発芽工程を経ることにより、不定胚からの苗生産効率が更に高まることが確認された。供試した脱水不定胚と同一ロットの脱水不定胚は、６ヶ月間常温で保存後でも保存前と同様の効率にて発芽、生育が可能であった。
【実施例５】
【００１０】
スパティフィラムの品種Ｄｏｕｂｌｅ  Ｔａｋｅから、実施例１と同じ手法にてエンブリオジェニック・カルスを誘導した。そのエンブリオジェニック・カルスを実施例３の「不定胚誘導培地」を用いて不定胚誘導を試みたところ、品種Ｐｅｔｉｔｅに比して不定胚回収重量が低くまた得られた不定胚も褐変枯死しやすいことが判明した。そこで、「不定胚誘導培地」の糖組成の変更及びＢＡの添加の効果を検討した。第２表の組成培地（記載条件以外の組成は「不定胚誘導培地」と同じ）を作製し、実施例２と同じ条件に培養を行い不定胚回収重量を計測した（表２）。
【表２】
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対照区に比して、フラクトース及びＢＡの添加区では不定胚誘導率が大幅に増加した。また、得られた不定胚からの植物体再生効率について固体培地を用いて比較を行った。回収した不定胚を９ｃｍｘ１．５ｃｍのシャーレに入れ、実施例３の条件にて脱水し、それら脱水不定胚０．２ｇを、「発芽培地」５０ｍｌを分注したプラントボックスに置床した。培養条件は２５℃、明所（１６時間日長、光合成光量子束密度５．７μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）条件とし、６週間培養した。その結果、対照区では不定胚１ｇあたり得られた植物体数は４７本であったのに対し、試験区２では８８本であった。これにより、フラクトースを加えた条件区では、不定胚誘導効率に関する品種間差の改善及び、不定胚からの植物体再生効率の向上に有効であることが確認できた。
更に、上記の培地組成変更の効果について、「不定胚誘導培養槽」を用いて検討した。培地として対照区と試験区３を用い、それ以外の条件は実施例３と同じ条件を用い不定胚の誘導を行った。その結果、得られた不定胚重量（脱水後）は、対照培地区が７２ｇであるのに対し試験区３培地が１６０ｇとなり、改良培地が培養槽を用いた不定胚大量誘導時にも有効であることが確認された。更に、試験区３培地から回収された不定胚を、実施例４の方法にて液体培地での発芽体の誘導を行ったところ（培養期間のみ８週間に変更）、最終的に苗数量は、脱水不定胚あたり２１２苗、植物体誘導培養槽あたり７９５苗、不定胚誘導培養槽あたり３．４万苗となり、高い植物体増殖効果が得られた。
【実施例６】
【００１１】
実施例１のエンブリオジェニック・カルス誘導の手法をグズマニア（品種Ａｎｔｏｎ）に適用したところ、９１％の率にて葉鞘基部からカルスが誘導され（カルス誘導切片数／置床切片数＝４９／５４）、それらのカルスは、スパティフィラムと同様の特徴を有したエンブリオジェニック・カルスであった。それらのエンブリオジェニック・カルスに実施例３の培養槽での不定胚誘導条件を適用したところ、置床した２ｇのエンブリオジェニック・カルスから５０ｇの脱水不定胚が得られた。得られた不定胚を実施例３の「発芽培地」に置床し同条件にて培養したところ均一且つ旺盛に増殖する多芽体が得られた。それら多芽体を１芽ずつに分割し「発芽培地」でさらに生育させたところ完全な植物体となった。最終的に、不定胚誘導培養槽あたり８０万本に相当する苗が得られ、本発明の手法がグズマニアにても有効であることが確認された。
【実施例７】
【００１２】
実施例１のエンブリオジェニック・カルス誘導の手法をカラテア（品種Ｐｉｃｔａ  Ｒｏｙａｌｅ）に適用したところ、２１％の率にて葉鞘基部からカルスが誘導され（カルス誘導切片数／置床切片数＝３／１４）、それらのカルスは、スパティフィラムやグズマニアと同様の特徴を有したエンブリオジェニック・カルスであった。それらのエンブリオジェニック・カルス０．０５ｇを、実施例３の不定胚誘導培地の２，４−Ｄ濃度を０．２ｐｐｍに変更した液体培地（培地１６０ｍｌ／５００ｍｌ三角フラスコ）に置床し、２５℃、明所（１６時間日長、光合成光量子束密度２２．８μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）にて１０週間浸透培養を行った（７０ｒｐｍ）ところ、フラスコあたり平均９．１ｇの不定胚が得られた。それら不定胚を実施例５の条件にて脱水したのち、それら不定胚（脱水不定胚）を、「発芽培地」を５０ｍｌ入れたプラントボックスに０．１ｇずつ置床した。培養条件は２５℃、明所（１６時間日長、光合成光量子束密度５．７μｍｏｌｅ／ｍ２／ｓｅｃ）条件とし、１２週間培養した。その結果、プラントボックスあたり平均１０本の植物体の再生（すなわち１ｇのエンブリオジェニック・カルスあたり１．８万本の植物体数）が認められ、本発明の手法がカラテアにても有効であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００１３】
本発明のエンブリオジェニック・カルスの製造方法によれば、葉鞘又はその一部を外植片として培養することにより、不定胚誘導効率のきわめて高いカルスを製造できる。
本発明の植物増殖方法によれば、不定胚による大量増殖法を改善することによって、増殖率及び作業効率を高め、従来法に比してより効率的且つ低コストで植物苗を生産できる。より詳しく言えば、サトイモ科、パイナップル科、クズウコン科等の不定胚での増殖例が殆ど無い植物において、葉鞘、葉鞘基部又は基部に近い部分から不定胚効率の極めて高いカルス（エンブリオジェニック・カルス）を誘導し、それらを大量培養に適した、例えば液体培地を添加した培養槽にて大量に不定胚を誘導し、さらに固体培地上又は液体培地中で植物体へと再生させることによって、短期間に低コストにて植物を急速増殖できる。
また、エンブリオジェニック・カルスを懸濁培養細胞増殖を経ることなく直接培養槽での不定胚誘導の置床材料とすることによる工程の単純化、不定胚誘導培地の改善による品種間差の低減、更には、誘導された不定胚の常温での数ヶ月の貯蔵など、不定胚法の実生産への適用場面にて問題となる課題についても解決策を含んでおり、本発明の方法によれば、組織培養法や株分け法等の従来技術に依存していた各種植物、特にサトイモ科、パイナップル科、クズウコン科植物の低コスト且つ短期間の大量増殖が可能となる。
本発明は、サトイモ科、パイナップル科、クズウコン科の植物の大量増殖に利用可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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