(57)【要約】  持続性に優れ、効果的な害虫防除が可能となることに加え、生態系への影響も少ない、テントウムシを利用した生物農薬を提供する。ベスティジアル遺伝子及び／又はスカロプト遺伝子の発現を抑制することによって、翅形成が不全となったテントウムシを作出する。
2007148567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベスティジアル遺伝子及び／又はスカロプト遺伝子の発現抑制によって翅形成が不全となったテントウムシ科の昆虫を含む生物農薬。
【請求項２】
前記発現抑制が、ベスティジアル遺伝子及び／又はスカロプト遺伝子を標的としたRNAi法による発現抑制である、請求項１に記載の生物農薬。
【請求項３】
前記RNAi法がdsRNAの投与により行われる、請求項２に記載の生物農薬。
【請求項４】
前記発現抑制が前記昆虫の幼虫期に行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の生物農薬。
【請求項５】
前記昆虫が、テントウムシ亜科に属するテントウムシである、請求項１〜４のいずれかに記載の生物農薬。
【請求項６】
前記昆虫がナミテントウである、請求項１〜４のいずれかに記載の生物農薬。
【請求項７】
ベスティジアル遺伝子及び／又はスカロプト遺伝子の発現抑制を行うことを特徴とする、翅形成が不全となったテントウムシ科の昆虫の作出法。
【請求項８】
前記発現抑制が、ベスティジアル遺伝子及び／又はスカロプト遺伝子を標的としたRNAi法による発現抑制である、請求項７に記載の作出法。
【請求項９】
前記RNAi法がdsRNAの投与により行われる、請求項８に記載の作出法。
【請求項１０】
前記発現抑制が前記昆虫の幼虫期に行われる、請求項７〜９のいずれかに記載の作出法。
【請求項１１】
２齢期〜４齢期の幼虫に対して、ベスティジアル遺伝子を標的としたdsRNAを投与して前記発現抑制を行う、請求項７に記載の作出法。
【請求項１２】
１齢期〜２齢期の幼虫に対して、スカロプト遺伝子を標的としたdsRNAを投与して前記発現抑制を行う、請求項７又は１１に記載の作出法。
【請求項１３】
前記昆虫が、テントウムシ亜科に属するテントウムシである、請求項７〜１２のいずれかに記載の作出法。
【請求項１４】
前記昆虫がナミテントウである、請求項７〜１２のいずれかに記載の作出法。
【請求項１５】
請求項７〜１４のいずれかに記載の作出法で作出される、テントウムシ科の昆虫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天敵昆虫を利用した生物農薬に関する。詳しくは、本発明はテントウムシ科の昆虫を含む生物農薬、該生物農薬に利用されるテントウムシ科の昆虫の作出方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物の約３分の１を消失させるといわれる病害虫の防除には化学農薬が主に使用されてきた。しかしながら、環境への負荷が大きいことや耐性の獲得の問題など、化学農薬には様々な弊害や問題がある。これを克服するため、天敵昆虫を利用した生物学的な害虫防除法が試みられている。その一例としてテントウムシを利用した生物農薬が実用化されており、これまでに世界レベルで害虫防除に用いられてきた。しかしながら、テントウムシの成虫のように飛翔して分散する性質の昆虫は持続的な効果が得られ難いという問題があり、周囲の生態系に影響を与える危険性もあった。
尚、テントウムシを利用した生物農薬に関するものではないが、生物農薬に関連する文献を以下に列挙する。
【特許文献１】特開２００３−７９２７１号公報
【特許文献２】特開２００２−４７１１６号公報
【特許文献３】特開２００５−２７２３５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記の通り、テントウムシを利用した生物農薬は効果の持続性の面、及び生態系への影響の面で問題を抱えていた。
そこで本発明は、持続性に優れ、効果的な害虫防除が可能となることに加え、生態系への影響も少ない、テントウムシを利用した生物農薬、及びそれに利用されるテントウムシの作出法を提供することを主たる課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題に鑑み本発明者らは、テントウムシの翅形成に必須の二つの遺伝子、即ち翅形成のマスター遺伝子であるベスティジアル遺伝子及びそのコファクターをコードするスカロプト遺伝子に注目した。そして、標的遺伝子の発現を特異的に阻害するRNA干渉法（RNAi法）を利用し、これらの遺伝子の発現抑制と翅形成との関係を調べた。具体的にはニジュウヤホシテントウを実験モデルとし、ベスティジアル遺伝子及びスカロプト遺伝子の配列に基づき合成した二本鎖RNAを幼虫体に注射し、その効果を検証した。その結果、これらの遺伝子の発現を抑制することによって、翅形成が不全となり飛翔不可能な成虫を効率的に作出することができるとの知見を得た。また、各遺伝子の発現抑制と翅形成との関係、及び遺伝子の発現抑制の時期と翅形成との関係について詳細に検討した結果、有意義かつ興味深い知見を得るに至った。さらに、ベスティジアル遺伝子の発現抑制による翅形成への影響（効果）が、ナミテントウを用いた実験においても確認された。
本発明は主として以上の知見に基づくものであり、本発明の第１の局面は以下の生物農薬を提供する。
［１］ベスティジアル遺伝子及び／又はスカロプト遺伝子の発現抑制によって翅形成が不全となったテントウムシ科の昆虫を含む生物農薬。
［２］前記発現抑制が、ベスティジアル遺伝子及び／又はスカロプト遺伝子を標的としたRNAi法による発現抑制である、［１］に記載の生物農薬。
［３］前記RNAi法がdsRNAの投与により行われる、［２］に記載の生物農薬。
［４］前記発現抑制が前記昆虫の幼虫期に行われる、［１］〜［３］のいずれかに記載の生物農薬。
［５］前記昆虫が、テントウムシ亜科に属するテントウムシである、［１］〜［４］のいずれかに記載の生物農薬。
［６］前記昆虫がナミテントウである、［１］〜［４］のいずれかに記載の生物農薬。【０００５】
一方、本発明の第２の局面は、生物農薬として有用なテントウムシの作出法及びそれによって得られるテントウムシを提供する。
［７］ベスティジアル遺伝子及び／又はスカロプト遺伝子の発現抑制を行うことを特徴とする、翅形成が不全となったテントウムシ科の昆虫の作出法。
［８］前記発現抑制が、ベスティジアル遺伝子及び／又はスカロプト遺伝子を標的としたRNAi法による発現抑制である、［７］に記載の作出法。
［９］前記RNAi法がdsRNAの投与により行われる、［８］に記載の作出法。
［１０］前記発現抑制が前記昆虫の幼虫期に行われる、［７］〜［９］のいずれかに記載の作出法。
［１１］２齢期〜４齢期の幼虫に対して、ベスティジアル遺伝子を標的としたdsRNAを投与して前記発現抑制を行う、［７］に記載の作出法。
［１２］１齢期〜２齢期の幼虫に対して、スカロプト遺伝子を標的としたdsRNAを投与して前記発現抑制を行う、［７］又は［１１］に記載の作出法。
［１３］前記昆虫が、テントウムシ亜科に属するテントウムシである、［７］〜［１２］のいずれかに記載の作出法。
［１４］前記昆虫がナミテントウである、［７］〜［１２］のいずれかに記載の作出法。
［１５］［７］〜［１４］のいずれかに記載の作出法で作出される、テントウムシ科の昆虫。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ナミテントウの幼虫の形態を成長段階毎に模式的に示す図。
【図２】ニジュウヤホシテントウのベスティジアル遺伝子（vg）の全長cDNA配列及びそれがコードする推定アミノ酸配列を示す図。
【図３】ニジュウヤホシテントウのスカロプト遺伝子（sd）のcDNA部分配列及びそれがコードする推定アミノ酸配列を示す図。
【図４】ニジュウヤホシテントウの幼虫に対するRNAi（larval  RNAi法）実験の結果。Ev-vg(a-d)：vgの二本鎖RNAを各幼虫期に注射して得られた表現型、Ev-sd(e-h)：sdの二本鎖RNAを各幼虫期に注射して得られた表現型、Ev-vg+Ev-sd(i-l)：vgの二本鎖RNA及びsdの二本鎖RNAを各幼虫期に注射して得られた表現型、gfp(m-p)：gfpの二本鎖RNAを各幼虫期に注射して得られた表現型（対照）。
【図５】ナミテントウの幼虫に対するRNAi（larval  RNAi法）実験の結果。Ha-vg：vgの二本鎖RNAを幼虫期に注射して得られた表現型。gfp：gfpの二本鎖RNAを幼虫期に注射して得られた表現型（対照）。
【図６】ナミテントウの幼虫に対するRNAi（larval  RNAi法）実験の結果。sdの二本鎖RNAを幼虫期に注射して得られた表現型。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の生物農薬は、特定の遺伝子の発現抑制によって翅形成が不全となったテントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｉｄａｅ）の昆虫を含む。
本発明において用語「発現抑制」は、「発現阻害」や「機能阻害」と置換可能な用語として用いる。また、本明細書では説明の便宜上、テントウムシ科の昆虫を総称する用語として「テントウムシ」を用い、本発明の生物農薬を構成することになるテントウムシを「本発明のテントウムシ」と呼ぶ。【０００８】
「生物農薬」とは一般に、生物を用いた農薬をいい、化学農薬と峻別される。生物農薬の中でも天敵生物を用いたものは「天敵農薬」と呼ばれる。本発明の生物農薬はこの天敵農薬に該当する。生物農薬はその本質的な特徴によって一般に化学農薬に比較して有効期間が短い。特に昆虫を用いた生物農薬の場合はこの傾向が顕著であるといわれる。本発明の生物農薬では天然のテントウムシを利用した場合に比較して大幅な有効期間の延長が図られるとともに、その使用に伴う生態系への影響を効果的に抑えることができる。つまり、持続的な効果を発揮できる点及び安全性が高い点に本発明の最大の特徴がある。【０００９】
テントウムシ科の昆虫として、テントウムシ亜科に分類されるナミテントウ、カメノコテントウ、ヒメカメノコテントウ、ナナホシテントウ、ダンダラテントウ、シロホシテントウ及びキイロテントウ、ヒメテントウムシ亜科に分類されるアミダテントウ、クチビルテントウムシ亜科に分類されるヨツボシテントウ、アカホシテントウ及びヒメアカホシテントウ、マダラテントウ亜科に分類されるニジュウヤホシテントウ、オオニジュウヤホシテントウ及びトホシテントウ等を例示することができる。本発明の生物農薬における昆虫は、好ましくは、一般に益虫とされるテントウムシ亜科に属するテントウムシである。具体的には、ナミテントウ、カメノコテントウ、ヒメカメノコテントウ、ナナホシテントウ、ダンダラテントウ、シロホシテントウ及びキイロテントウ等が好ましい。ナミテントウ、カメノコテントウ、ヒメカメノコテントウ、ナナホシテントウ及びダンダラテントウは肉食性であり、アブラムシやカイガラムシ等を捕食する。また、シロホシテントウ及びキイロテントウは菌食性であり、うどんこ病菌などを捕食する。特に好ましくは、本発明の生物農薬における昆虫はナミテントウである。【００１０】
本発明において「翅形成が不全となった」とは、正常な翅形成が行われず、飛翔能力に障害を来した状態をいう。ここでの「障害」の程度は、天然の（野生型）対応するテントウムシとの間で飛翔能力に優劣の差が認められる限り特に限定されない。好ましくは、本発明に係るテントウムシは実質的な飛翔能力を有しない。【００１１】
テントウムシの飛翔能力の有無又は程度は例えば、所定期間放置したときの飛翔回数や移動距離を計測することによって評価できる。この評価系を用いて試験対象のテントウムシと、対応する野生型のテントウムシとの間で飛翔能力を比較すれば、試験対象のテントウムシの飛翔能力がどの程度の障害を受けているかを判定することができる。具体的には、試験対象のテントウムシと、対応する野生型のテントウムシとをそれぞれ同条件下で落下させ、飛翔の有無及び／又は飛翔距離の観点から両者を比較することによって、試験対象のテントウムシの飛翔能力を評価することができる。尚、「対応するテントウムシ」とは、同種のテントウムシのことである。例えば、本発明に係るテントウムシがナミテントウテントウの場合、野生型のナミテントウが「対応するテントウムシ」となる。
以上のような試験系によってテントウムシの飛翔能力を確実に評価・判定することができる。一方、翅の形態観察によってテントウムシの飛翔能力を推定することもできる。例えば、形態観察の結果、翅が認められない場合や、翅が認められるもののその大きさが極度に小さく、実質的に翅として機能しないと判断される場合などであれば、当該テントウムシは飛翔能力を実質的に有しないと評価・判定することができる。【００１２】
本発明において発現抑制の対象となる遺伝子はベスティジアル遺伝子（vestigial、本明細書では必要に応じて略称「vg」を使用する）及びスカロプト遺伝子（scalloped、本明細書では必要に応じて略称「sd」を使用する）である。即ち、これらの遺伝子のいずれか又は両方の発現抑制によって、翅形成が不全となったテントウムシを作出し、得られたテントウムシを本発明の生物農薬として用いる。
ベスティジアル遺伝子は、ショウジョウバエにおいて翅形成のマスター遺伝子としてクローニングされた遺伝子である。ベスティジアル遺伝子は有翅昆虫に必須の遺伝子と考えられるが、保存性の低さから他の生物種でそのクローニングに成功したとの報告はほとんどない。本発明者らのグループではショウジョウバエや蚊のベスティジアル遺伝子の配列情報を基にニジュウヤホシテントウのベスティジアル遺伝子のクローニングに成功したことを報告している（修士論文「昆虫翅形成遺伝子の単離と機能解析」、名古屋大学大学院生命農学研究科、生物機構・機能科学専攻、三輪雅代、2002年3月）。ニジュウヤホシテントウのベスティジアル遺伝子（cDNA）及びそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。本発明者らは同様の手段でナミテントウのベスティジアル遺伝子の部分配列のクローニングにも成功した。ナミテントウのベスティジアル遺伝子（cDNA部分配列）及びそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５及び配列番号６に示す。
特定のテントウムシのベスティジアル遺伝子のクローニングは先の報告（修士論文「昆虫翅形成遺伝子の単離と機能解析」、名古屋大学大学院生命農学研究科、生物機構・機能科学専攻、三輪雅代、2002年3月）又は後述の実施例を参考にして行うことができる。簡単に説明すれば、幼虫期の翅原基からの全RNAの抽出、一本鎖cDNAの合成、特異的プライマーを用いたRT-PCR、を経て目的のベスティジアル遺伝子を得ることができる。【００１３】
一方のスカロプト遺伝子はベスティジアル遺伝子と同様に翅形成に必須の遺伝子としてクローニングされた遺伝子であり、ショウジョウバエ等においてその存在が確認されている。スカロプト遺伝子はベスティジアル遺伝子と協同して翅形成に関与すると考えられている。本発明者らのグループではニジュウヤホシテントウのスカロプト遺伝子（部分配列）のクローニングに成功したことを報告している（修士論文「昆虫翅形成遺伝子の単離と機能解析」、名古屋大学大学院生命農学研究科、生物機構・機能科学専攻、三輪雅代、2002年3月）。ニジュウヤホシテントウのスカロプト遺伝子（cDNA部分配列）及びそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。本発明者らは同様の手段でナミテントウのスカロプト遺伝子の部分配列のクローニングにも成功した。ナミテントウのスカロプト遺伝子（cDNA部分配列）及びそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６に示す。
ベスティジアル遺伝子と同様、特定のテントウムシのスカロプト遺伝子のクローニングも先の報告（修士論文「昆虫翅形成遺伝子の単離と機能解析」、名古屋大学大学院生命農学研究科、生物機構・機能科学専攻、三輪雅代、2002年3月）又は後述の実施例を参考にして行うことができる。簡単に説明すれば、幼虫期の翅原基からの全RNAの抽出、一本鎖cDNAの合成、特異的プライマーを用いたRT-PCR、を経て目的のスカロプト遺伝子を得ることができる。【００１４】
ベスティジアル遺伝子及びスカロプト遺伝子の発現抑制の手段は特に限定されない。例えば、RNAi法、アンチセンス法、又はリボザイムの使用による方法を採用することができる。これらの方法による場合、ゲノム中の遺伝子に影響を与えることなく目的の遺伝子の発現を抑制することができる。これによって、次世代への遺伝による生態系への影響を実質的に伴うことのない生物農薬となる。このような特徴は、野外への放虫を伴う生物農薬として好ましい。【００１５】
（RNAi法による発現抑制）
発現抑制手段としてRNAi法を採用することが特に好ましい。RNAi法によれば特異的且つ効果的な発現抑制を達成することができる。「RNAi」とは、標的遺伝子に相同な（特に標的遺伝子に対応するmRNAに相同な）配列のRNAを標的細胞に導入することにより、標的遺伝子の発現が抑えられる現象をいう。
昆虫を対象としたRNAi法による発現抑制では通常、標的遺伝子（本発明の場合ベスティジアル遺伝子又はスカロプト遺伝子）の一部に相当する配列のdsRNA（二本鎖RNA）が用いられる。一つの標的遺伝子に対して二種類以上のdsRNAを使用することにしてもよい。【００１６】
哺乳動物細胞を標的としたRNAi法の場合は、２１〜２３ヌクレオチド程度の短いdsRNA（siRNA）が用いられるが、昆虫細胞ではむしろ数百ヌクレオチド以上という長いdsRNAがより有効なものとして用いられる。RNAi法に使用するdsRNAの長さは例えば３０ヌクレオチド以上、好ましくは２００ヌクレオチド以上である。効果的な発現抑制を引き起こすためにはdsRNAが好ましいが、一本鎖RNAの使用を妨げるものではない。
使用するdsRNAは必ずしもセンス鎖とアンチセンス鎖の２分子に分かれている必要はなく、例えばdsRNAを構成するセンス鎖とアンチセンス鎖がヘアピンループで連結された構造のdsRNAであってもよい。【００１７】
dsRNAは、好ましくはdsRNA溶液の注入により標的生物（卵、幼虫、又は成虫）内に導入される。但し、後述のように摂食を介した導入を行うことも可能である（Timmons  L,  Fire  A:  Specific  Interference  by  ingested  dsRNA.  Nature  395:  854,  1988を参照）。さらには、dsRNA溶液に幼虫を浸漬する方法（Tabara  H,  Grishok  A,  Mello  CC:  RNAi  in  C.  elegans:  soaking  in  the  genome  sequence.  Science  282:  430-431,  1998を参照）や、dsRNA溶液に卵を浸漬する方法を採用してもよい。尚、テントウムシを対象としたRNAiのプロトコルについては本発明者らの論文（新美輝幸ら、ナミテントウのRNAiプロトコル、細胞工学、Vol.22  No.1  pp80-85.  2003）が参考になる。【００１８】
dsRNAを直接（そのままの状態で）標的生物内に導入するのではなく、又はこの方法に加えて、目的のdsRNAをコードするDNA配列を挿入した発現ベクターを導入することにしてもよい。このように発現ベクターを利用したRNAiによれば例えばRNAi効果の持続時間をコントロールすることが可能である。【００１９】
RNAi法に使用するdsRNAは化学合成によって、又は適当な発現ベクターを用いてin  vitro又はin  vivoで調製することができる。発現ベクターによる方法は、比較的長いdsRNAの調製を行うことに特に有効である。dsRNAの設計には通常、標的核酸に固有の配列（連続配列）が利用される。尚、適当な標的配列を選択するためのプログラム及びアルゴリズムが開発されている。
dsRNAの調製法の具体例は後述の実施例の欄に示される。【００２０】
（アンチセンス法による発現抑制）
アンチセンス法による発現抑制を行う場合には通常、それが転写された際、標的遺伝子に対応するmRNAの固有の部分に相補的なRNAを生成するアンチセンス・コンストラクトが使用される。このようなアンチセンス・コンストラクト（アンチセンス核酸ともいう）は例えば、発現プラスミドの形態で標的細胞に導入される。アンチセンス・コンストラクトとして、標的細胞内に導入されたときに、標的遺伝子のDNA配列又はそれに対応するmRNA配列（以上をまとめて「標的核酸」ともいう）とハイブリダイズしてその発現を阻害するオリゴヌクレオチド・プローブを採用することもできる。このようなオリゴヌクレオチド・プローブとしては、好ましくは、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼなどの内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であるものが用いられる。
アンチセンス核酸としてDNA分子を使用する場合、標的遺伝子に対応するmRNAの翻訳開始部位（例えば-10〜+10の領域）を含む領域に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。【００２１】
アンチセンス核酸と標的核酸との間の相補性は厳密であることが好ましいが、多少のミスマッチが存在していてもよい。標的核酸に対するアンチセンス核酸のハイブリダイズ能は一般に、両核酸の相補性の程度及び長さの両方に依存する。通常、使用するアンチセンス核酸が長いほど、ミスマッチの数が多くても、標的核酸との間に安定な二重鎖（又は三重鎖）を形成することができる。当業者であれば、標準的な手法を用いて、許容可能なミスマッチの程度を確認することができる。【００２２】
アンチセンス核酸はDNA、RNA、若しくはこれらのキメラ混合物、又はこれらの誘導体や改変型であってもよい。また、一本鎖でも二本鎖でもよい。塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格部分を修飾することで、アンチセンス核酸の安定性、ハイブリダイゼーション能等を向上させることなどができる。
アンチセンス核酸は例えば市販の自動DNA合成装置（例えばアプライド・バイオシステムズ社等）を使用するなど、常法で合成することができる。核酸修飾体や誘導体の作製には例えば、Stein  et  al.(1988),  Nucl.  Acids  Res.  16:3209やSarin  et  al.,  (1988),  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  85:7448-7451等を参照することができる。【００２３】
標的細胞内におけるアンチセンス核酸の作用を高めるために、昆虫細胞内で強力に作用するプロモーター（例えばアクチンプロモーターやｉｅ１プロモーター）を利用することができる。即ち、このようなプロモーターの制御下に配置されたアンチセンス核酸を含むコンストラクトを標的細胞に導入すれば、当該プロモーターの作用によって十分な量のアンチセンス核酸の転写を確保できる。【００２４】
（リボザイムによる発現抑制）
本発明の他の一態様ではリボザイムによる発現抑制を行う。部位特異的認識配列でmRNAを開裂させるリボザイムを用いて、標的遺伝子に対応するmRNAを破壊することもできるが、好ましくはハンマーヘッド・リボザイムを使用する。ハンマーヘッド・リボザイムの構築方法については例えばHaseloff  and  Gerlach,  1988,  Nature,  334:585-591を参考にすることができる。
アンチセンス法の場合と同様に、例えば安定性やターゲット能を向上させることを目的として、修飾されたオリゴヌクレオチドを用いてリボザイムを構築してもよい。効果的な量のリボザイムを標的細胞内で生成させるために、昆虫細胞で強力に作用するプロモーター（例えばアクチンプロモーターやｉｅ１プロモーター）の制御下に、当該リボザイムをコードするDNAを配置した核酸コンストラクトを使用することが好ましい。【００２５】
ところで、後述の実施例に示すように、本発明者等の検討によって、各遺伝子の発現抑制と翅形成との関係、及び遺伝子の発現抑制の時期と翅形成との関係が明らかとなった。当該知見に基づき本発明の一態様では２齢期〜４齢期、好ましくは３齢期〜４齢、更に好ましくは３齢初期〜４齢初期、最も好ましくは３齢後期の幼虫に対してベスティジアル遺伝子の発現抑制を行い（RNAi法による発現抑制を採用するのであれば例えば、ベスティジアル遺伝子を標的としたdsRNAを投与する）、翅形成が不全となったテントウムシを得る。本発明の他の一態様では１齢期〜２齢期、好ましくは１齢期の幼虫に対してスカロプト遺伝子を標的とした同様の発現抑制を行う。また、ベスティジアル遺伝子とスカロプト遺伝子の発現抑制を行う場合には１齢期〜２齢期、好ましくは１齢期の幼虫に対して同様の操作を行う。
尚、本明細書において「発現抑制の時期」とは、「発現抑制の操作を行う時期」のことをいう。従って、注射によるRNAi法の場合、注射の時期が即ち「発現抑制の時期」であり、実際に生物内で発現抑制効果が生じる時期はそれよりも後になる。【００２６】
テントウムシの幼虫期は１齢期、２齢期、３齢期、及び４齢期に分かれる。以下、図１に示すナミテントウの幼虫を例にとり、各齢期を説明する。１齢期は孵卵直後の期間であり、典型的には約２日〜４日程度の長さをもつ。１齢期の幼虫は体長が短く、全身が黒色である。２齢期は１齢期に続く期間であり、体節に模様が現れる時期である。典型的には約２日〜４日程度の長さである。体節A1に橙色の斑点があることによって２齢期の幼虫であることを見分けることができる。２齢期を経た幼虫は３齢期にはいり、体節A1〜A5にかけて周縁部に斑点を現す。３齢期は通常、約２日〜４日程度継続する。４齢期は幼虫期の最後の期間であり、幼虫が蛹になる準備期間として位置付けることができる。４齢期の幼虫は体長が大きく、体節A1〜A5にかけて周縁部に斑点が認められるとともに、体節A1、A4、A5では中央付近にも斑点が現れるという特徴的な形態を示す。
尚、本明細書では各期間の最初の１日〜２日を当該期間の初期と呼び、同様に最後の１日〜２日を当該期間の後期と呼ぶ。【００２７】
以上のように幼虫への注射により発現抑制を行うことによって、形質転換体による遺伝子改変操作とは異なり、基本的には次世代に遺伝的な影響を及ぼさない。従って本発明の生物農薬は生態系への影響が極めて少ないと言える。【００２８】
幼虫に対して、RNAi法による発現抑制を行う場合、典型的には、dsRNAを含む溶液を幼虫に注入する。注入部位は特に限定されず、例えば胸部の体節間膜にガラス針などを利用して注入すればよい。注入量（液量）は幼虫の生存に影響のない範囲で設定され、例えば０．２μｌ〜０．５μｌとする。導入するdsRNA量は、期待される発現効果が得られるのに必要な量で且つ幼虫の生存に影響を与えない量とし、塩基長によって変動するが概ね０．４μｇ〜１μｇとすればよい。尚、ベスティジアル遺伝子とスカロプト遺伝子の両者を発現抑制する場合は少なくとも二種類のdsRNAが使用されることになるが、その量については合計のRNA量が上記の範囲内となるようにする。
尚、幼虫に対して注入操作でRNAiを引き起こす方法のことを本明細書では「larval  RNAi法」とも呼ぶ。テントウムシを対象としたlarval  RNA法については、T.  Niimi,  H.  Kuwayama  and  T.  Yaginuma:  Larval  RNAi  Applied  to  the  Analysis  of  Postembryonic  Development  in  the  Ladybird  beetle,  Harmonia  axyridis.  Journal  of  Insect  Biotechnology  and  Sericology  74,  95-102(2005)、及び新美輝幸・柳沼利信(2006)ナミテントウのlarval  RNAi法、日本比較内分泌学会ニュース、121,32-37が参考になる。【００２９】
本発明の一態様では、雌成虫から産生される次世代において翅形成が不全となるように雌成虫に対して標的遺伝子の発現抑制を行う。RNAi法を例にとれば、雌成虫に対して所定のdsRNAを注入する。注入部位は好ましくは生殖器官の存在する腹部とし、生殖細胞系列へdsRNAが効率的に導入されるようにする。尚、このように成虫を対象としたRNAi法のことを本明細書では「Parental  RNAi法」とも呼ぶ。larval  RNAi法では幼虫１個体ずつへの注入操作が必要であるが、Parental  RNAi法によれば雌成虫１個体への注入操作によって、翅形成が不全のテントウムシを大量に得ることが可能となる。【００３０】
本発明の他の一態様では、摂食を介した発現抑制を行う。具体的には例えば、標的遺伝子に対するsiRNAを人工飼料に混合し、幼虫に与える。このような摂食を介した発現制御によれば簡易に目的のテントウムシ、即ち翅形成が不全のテントウムシを得ることができる。
【実施例】
【００３１】
＜翅形成が不全となったニジュウヤホシテントウの作出＞
１．ベスティジアル遺伝子（vestigial：vg）、及びスカロプト遺伝子（scalloped：sd）のクローニング
先の報告（修士論文「昆虫翅形成遺伝子の単離と機能解析」、名古屋大学大学院生命農学研究科、生物機構・機能科学専攻、三輪雅代、2002年3月）に従い、以下の方法でベスティジアル遺伝子（vg）のcDNA（部分配列）及びスカロプト遺伝子（sd）のcDNA（部分配列）をクローニングした。尚、当該報告には、ニジュウヤホシテントウを含め数種の昆虫よりvgホモログ及びsdホモログのcDNA（部分配列）のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定したことが記載されている。
（１）供試昆虫
ニジュウヤホシテントウ（Henosepilachna  vigintioctopunctata。従来の学名はEpilachna  vigintioctopunctata）（名古屋大学大学院生命農学研究科圃場のジャガイモ葉上より採集）を用いた。
（２）cDNAの調製
ニジュウヤホシテントウ（Ev）の前蛹期の幼虫の翅原基より全RNAをTRIZOL（Invitrogen）を用いた塩酸グアニジン法により抽出した。このRNAを鋳型として、SMARTTM  RACE  cDNA  Amplification  Kit（CLONTECH）に基づき、Superscript  II  reverse  transcriptase  （Invitrogen)を用いて1本鎖cDNAを合成した。
（３）RT-PCR
上記の通り調製した1本鎖cDNAを鋳型として、Polymerase  chain  reaction（PCR）を行った。PCRのTaq  DNAポリメラーゼにはAmpli  Taq  Gold  （Applied  Biosystems)を用いた。PCRに用いたプライマーを以下に示す。尚、配列中のWはA+T、SはC+G、YはC+T、RはA+G、Iはイノシンをそれぞれ表す。
vgセンスプライマー；
vg-01:  5′-GTIWSITGYCCIGARGTIATGTA-3′(23mer、配列番号７)【００３２】
vgアンチセンスプライマー；
vg-04:  5′-RTAYTGIGCCATRTTRTGRTGRTA-3′(24mer、配列番号８)【００３３】
sdセンスプライマー；
sd-01:  5′-GAYGCIGARGGIGTITGG-3′(18mer、配列番号９)【００３４】
sdアンチセンスプライマー；
sd-04:  5′-TTYTCIARIACISWRTTCATCATRTA-3′(26mer、配列番号１０)【００３５】
PCRの条件は以下の通りとした。
（ａ）vg  cDNA
酵素の活性化反応：95℃、9分
サイクル：50
変性反応：94℃、1分
アニール反応：49℃、30秒
伸長反応：72℃、3分
（ｂ）sd  cDNA
酵素の活性化反応：95℃、9分
サイクル：50
変性反応：94℃、1分
アニール反応：41℃、30秒
伸長反応：72℃、2分【００３６】
（４）PCR産物のpBluescriptへのサブクローニング
各RT-PCR産物をインサートとしてpBluescriptTMKS(+)（pBS）のEco  RV認識部位に挿入した。ライゲーション反応は、DNA  Ligation  Kit  Ver.  2（TaKaRa）を用いて行った。このライゲーション反応液を、大腸菌（XL1-Blue）への形質転換に用いた。この形質転換した大腸菌培養液をLBプレートに引き、37℃で一晩培養した。ホワイトコロニーを選出し、PCR法を用いて目的のPCR断片が挿入されたクローンを選択した。このときのPCRのTaq  DNAポリメラーゼにはSIGMA  Taq（SIGMA）を用い、プライマーはSKプライマーおよびKSプライマーを用いた。PCRは25サイクルを変性、95℃/30秒間；アニーリング、55℃/30秒間；伸長、72℃/30秒間の条件で行った。選択したクローンをLB中で37℃で一晩振とう培養し、FlexiPrep  Kit（Amersham  Biosciences）によりキットのプロトコルに従ってプラスミドDNAを調製した。
以上のようにして、vg-01とvg-04で増幅されたRT-PCR産物（vg  cDNA部分配列）がEcoRVサイトにサブクローニングされたpBluescript  KS+と、sd-01とsd-04で増幅されたRT-PCR産物（sd  cDNA部分配列）がEcoRVサイトにサブクローニングされたpBluescript  KS+を得た。尚、vgの全長cDNAの塩基配列（配列番号１）及び推定アミノ酸配列（配列番号２）を図２に示す。図２において塩基番号445-1141の配列が、サブクローニングされたvg  cDNA部分配列に相当する。一方、sdのcDNA部分配列（配列番号３）及びそれに対応する推定アミノ酸配列（配列番号４）を図３に示す。図３において塩基番号1-864の配列が、サブクローニングされたsd  cDNA部分配列に相当する。【００３７】
２．Larval  RNAi法によるvg及び／又はsdの発現抑制効果
（１）RNA合成用の鋳型の増幅
二本鎖RNAを合成するための鋳型には、クローニングした遺伝子（vg  cDNA部分配列、sd  cDNA部分配列）の両末端にT7  RNAポリメラーゼのプロモーター配列を付加したPCR産物を用いた。このPCRを行う際には、上記のベクターにクローニングしたどの遺伝子にも共通して使用可能となるように、ベクター配列にT7  RNAポリメラーゼのプロモーター配列を付加した下記のPCRプライマーを使用した。【００３８】
T7-KSプライマー：
5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACTCGAGGTCGACGGTATC-3'（配列番号１１）
T7-SKプライマー：
5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCGCTCTAGAACTAGTGGATC-3'（配列番号１２）
PCRは下記の条件で行い、十分なPCR産物量を得るため、下記の反応チューブを4〜8本準備した。【００３９】
（ａ）反応溶液
テンプレートDNA（20〜50  ng）+  H2O：  37.75μl
10×  Buffer：  5μl
2  mM  dNTP：  5μl
10  pmol/ml  T7-KSプライマー：  1μl
10  pmol/ml  T7-SKプライマー：  1μl
AmpliTaq  Gold  (Applied  Biosystems)：  0.25μl
合計：  50μl【００４０】
（ｂ）反応条件
1stステージは95℃で9分、2ndステージは94℃で60秒、55℃で30秒、そして72℃で60秒を1サイクルとし、それを40サイクル、3rdステージは72℃で7分、4thステージは4℃で∞の条件でPCRを行った。【００４１】
上記の反応で得られたPCR産物をエタノール沈殿により濃縮した後、アガロース電気泳動に供し、続いてMag  Extractor（Toyobo）を用いてゲルから鋳型DNAを精製した。得られる鋳型DNAの量は、通常下記の二本鎖RNAの合成反応の数回分に相当する。【００４２】
（２）二本鎖RNAの合成
上記鋳型DNAを1μg用い、MEGAscrtipt  T7  Kit（Ambion）に従ってRNAを合成し、適量のヌクレアーゼ・フリーの超純水に溶解した。
二本鎖RNAのアニーリングを行うため、得られたRNA溶液を、ヒートブロックを用いて65℃、30分間インキュベートした後、1〜2時間かけて室温に戻した。この二本鎖RNAを少量用い、濃度測定およびアガロース電気泳動による確認を行った。合成が確認された二本鎖RNAは、インジェクション一回分ずつに小分けして-80℃で保存した。【００４３】
（３）幼虫体への注射
FemtoJet（Eppendorf）を用いたインジェクション装置を利用して、二酸化炭素で麻酔した幼虫（１齢幼虫、３齢初期幼虫、３齢後期幼虫、４齢初期幼虫）に二本鎖RNAを適量注射した。注射には、外径1mmの芯入ガラス管（GDC-1,  Narishige）を用いた。一個体当たり約1μg/μlの濃度の二本鎖RNAを0.5μl程度（約0.5μg）注射した。vgの二本鎖RNAとsdの二本鎖RNAを同時に注射する場合は、注射量がそれぞれ約0.25μgとなるように調整した混合液を使用した。
注射操作後の幼虫を通常の条件下で飼育し、成虫になった段階で形態観察に供した。形態観察の結果を図４に示す。ａ〜ｄはvgの二本鎖RNAを各幼虫期に注射して得られた表現型（成虫）である（注射時期は順に１齢期、３齢初期、３齢後期、４齢初期）。ａでは翅の多少の変形が認められる。ｂ〜ｄでは翅の大幅な変形及び萎縮を認め、飛翔能力が重大な損傷を受けていることが窺える。
一方、ｅは、sdの二本鎖RNAを１齢幼虫に注射して得られた表現型（成虫）であり、痕跡的な翅しか認められず、飛翔能力が完全に欠落している。vgの二本鎖RNA及びsdの二本鎖RNAを注射した場合（ｉ）も同様に飛翔能力が欠落している。
ｆ〜ｈ（sdの二本鎖RNAを３齢初期、３齢後期、４齢初期に注射した場合）及びｊ〜ｌ（vgの二本鎖RNA及びsdの二本鎖RNAを３齢初期、３齢後期、４齢初期に注射した場合）は蛹化直前に致死となり成虫にまで成長しなかった。
以上の結果より、次の事項が導き出される。
（ａ）vgを標的としたRNAi及びsdを標的としたRNAiはいずれも、翅形成に実質的な影響を与えることができる。換言すれば、これらの手段によれば飛翔能力が損傷ないし欠落した成虫を得ることができる。
（ｂ）二本鎖RNAiの注射時期によって、翅形成への影響（RNAiの効果）は大きく異なる。即ち、vgを標的とした場合、若齢幼虫への注射は効果が低い。特に、１齢幼虫への注射では高い効果を期待できず、２齢期以降に注射することが好ましいと考えられる。特に３齢期〜４齢期に注射した場合に高い効果を期待でき、中でも３齢後期が最も効果的な時期といえる。
（ｃ）sdを標的とした場合は若齢期に注射することが好ましい。具体的には３齢期前の幼虫に注射することが好ましい。特に１齢期が好ましいと考えられる。１齢期に注射することによって完全に飛翔能力が欠落した成虫を得ることができる。一方、注射の時期が遅いと致死的な影響を与える。
（ｄ）vg及びsdの両者を標的とした場合は、sdを標的とした場合と同様であり、若齢期（特に１齢期が好ましい）での注射によって完全に飛翔能力が欠落した成虫を得ることができる。
以上のように、翅形成が不全の（飛翔能力に障害のある）テントウムシ成虫の作出法として、vg及び／又はsdを標的としたlarval  RNAi法が有効であることが示された。また、注射時期（RNAiの操作時期）が重要であることが判明するとともに、効果的に翅形成を阻害することができる時期が明らかとなった。【００４４】
＜翅形成が不全となったナミテントウの作出＞
上記のニジュウヤホシテントウの場合と同様の手順（１．（１）〜（４））で、ナミテントウ（Harmonia  axyridis、野外採集したものを継代して使用）のベスティジアル遺伝子（vestigial：vg）をクローニングした。但し、cDNAを調製する際のサンプルに蛹化後一日の蛹の前翅原基を用いたこと、及びRT-PCRに用いたプライマーセットが以下のvg5-vg7であることが異なる。尚、配列中のWはA+T、SはC+G、YはC+T、RはA+G、Iはイノシンをそれぞれ表す。
vgセンスプライマー；
vg-05:  5′-ATGTAYSRIGCITAYTAYCCITAYYTITA-3′(29mer、配列番号１３)
vgアンチセンスプライマー；
vg-07:  5′-SWRTTCCARAAISWIGGIGGRAARTT-3′(26mer、配列番号１４)【００４５】
クローニングに成功した、ナミテントウのvgのcDNA部分配列及びそれに対応する推定アミノ酸配列をそれぞれ、配列表の配列番号５及び配列番号６に示す。このようにして調製したcDNA配列を利用してvgの二本鎖RNAを合成し、Larval  RNAi法によるvgの発現抑制効果を調べた。尚、Larval  RNAi法もニジュウヤホシテントウの場合と同様に行った。【００４６】
形態観察の結果を図５に示す。図の左及び中央は、vgの二本鎖RNAを３齢中期幼虫に注射して得られた表現型（成虫）である。翅の大幅な変形及び萎縮を認め、飛翔能力が重大な損傷を受けていることが窺える。この結果から、vgを標的としたRNAiは翅形成に実質的な影響を与えることができるといえる。【００４７】
ナミテントウのスカロプト遺伝子についても、ニジュウヤホシテントウの場合と同様の手順（１．（１）〜（４））でクローニングした。但し、サンプルに蛹化後一日の蛹の前翅原基を用いた。RT-PCRに用いたプライマーセットは以下の通りである。尚、Larval  RNAi法もニジュウヤホシテントウと同様の方法で行った。
sdセンスプライマー；
sd-01:  5′-GAYGCIGARGGIGTITGG-3′(18mer、配列番号９)
sdアンチセンスプライマー；
sd-04:  5′-TTYTCIARIACISWRTTCATCATRTA-3′(26mer、配列番号１０)【００４８】
クローニングに成功した、ナミテントウのsdのcDNA部分配列及びそれに対応する推定アミノ酸配列をそれぞれ、配列表の配列番号１５及び配列番号１６に示す。このようにして調製したcDNA配列を利用してsdの二本鎖RNAを合成し、Larval  RNAi法によるsdの発現抑制効果を調べた。尚、Larval  RNAi法はニジュウヤホシテントウの場合と同様に行った。【００４９】
形態観察の結果を図６に示す。翅の大幅な変形及び萎縮が認められる。このように、sdを標的としたRNAiは翅形成に実質的な影響を与えた。【００５０】
以上のように、ナミテントウについても、翅形成が不全の（飛翔能力に障害のある）テントウムシ成虫の作出法としてvg又はsdを標的としたlarval  RNAi法が有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、テントウムシを天敵とする害虫の防除に利用される。本発明の生物農薬を構成するテントウムシは飛翔能力に障害を有する。従って本発明の生物農薬によれば、飛翔による成虫の分散が効果的に抑制され、効率的且つ持続的な害虫防除効果が得られる。【００５２】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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