(57)【要約】  ユビキチンと、がん抗原蛋白質または感染症抗原蛋白質と、ヒートショックプロテインＣ末端を含む該融合蛋白質で抗原提示させた抗原提示細胞を用いて、細胞障害性Ｔ細胞を高効率で誘導することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンと、疾病抗原蛋白質と、細胞質内取り込み受容体のリガンドとを含む融合蛋白質。
【請求項２】
ユビキチンのＣ末端側と疾病抗原蛋白質のＮ末端側とが結合し、疾病抗原蛋白質のＣ末端側と細胞質内取り込み受容体のリガンドのＮ末端側とが結合する請求項１項に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
疾病抗原蛋白質ががん抗原蛋白質である請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
疾病抗原蛋白質が感染症抗原蛋白質である請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある請求項１から４のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
リガンドがヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６のＣ末端を含む構造である請求項１から５のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
ヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６のＣ末端を含む構造のアミノ酸配列がＫＤＥＬである請求項６に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを、抗原提示細胞において、主要組織適合抗原クラスＩ経路により抗原提示させるための請求項１から７のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある請求項８に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示させるための請求項８または９に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
抗原提示細胞が樹状細胞である請求項８から１０のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターとともに用いるための請求項１から１１のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
アップレギュレーターがサイトイカンまたは菌製剤である請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
アップレギュレーターがＩＦＮ−γである請求項１２または１３に記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
ユビキチンをコードするＤＮＡ配列と、疾病抗原蛋白質をコードするＤＮＡ配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと、細胞質内取り込み受容体のリガンドをコードするＤＮＡ配列とを含む、融合蛋白質の発現プラスミドを構築するための発現ベクター。
【請求項１６】
リガンドが、ヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６のＣ末端を含む構造である請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
ユビキチンをコードするｃＤＮＡ配列と、疾病抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列と、細胞質内取り込み受容体のリガンドをコードするｃＤＮＡ配列とを含む、融合蛋白質の発現プラスミド。
【請求項１８】
発現プラスミドがユビキチンのＣ末端側と疾病抗原蛋白質のＮ末端側とが結合し、疾病抗原蛋白質のＣ末端側と細胞質内取り込み受容体のリガンドのＮ末端側とが結合する融合蛋白質を発現するよう、ユビキチンをコードするｃＤＮＡ配列と、疾病抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列と、細胞質内取り込み受容体のリガンドをコードするｃＤＮＡ配列が配置されている請求項１７に記載の発現プラスミド。
【請求項１９】
疾病抗原蛋白質ががん抗原蛋白質である請求項１７または１８に記載の発現プラスミド。
【請求項２０】
疾病抗原蛋白質が感染症抗原蛋白質である請求項１７または１８に記載の発現プラスミド。
【請求項２１】
リガンドがヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６のＣ末端を含む構造である請求項１７から２０のいずれか１項に記載の発現プラスミド。
【請求項２２】
リガンドをコードするｃＤＮＡ配列がＫＤＥＬを含むアミノ酸をコードする配列である請求項１７から２１のいずれか１項に記載の発現プラスミド。
【請求項２３】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の融合蛋白質を含む医薬。
【請求項２４】
融合蛋白質が抗原提示細胞と接触して疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させ、疾病抗原蛋白質に対して疾病抗原蛋白質特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療するための請求項２３に記載の医薬。
【請求項２５】
抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療するための請求項２４に記載の医薬。
【請求項２６】
疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある請求項２４または２５に記載の医薬。
【請求項２７】
主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療するための請求項２４から２６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項２８】
抗原提示細胞が樹状細胞である請求項２４から２７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項２９】
がんまたは感染症を予防または治療するための請求項２３から２８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項３０】
融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを含む請求項２３から２９のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項３１】
アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である請求項３０に記載の医薬。
【請求項３２】
アップレギュレーターがＩＦＮ−γである請求項３０または３１に記載の医薬。
【請求項３３】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の融合蛋白質を取り込んだ抗原提示細胞を含有する医薬。
【請求項３４】
抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示している請求項３３に記載の医薬。
【請求項３５】
疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある請求項３４に記載の医薬。
【請求項３６】
主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示している請求項３４または３５に記載の医薬。
【請求項３７】
疾病抗原蛋白質に対して疾病抗原蛋白質特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療するための請求項３４から３６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項３８】
がんまたは感染症を予防または治療するための請求項３３から３７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項３９】
抗原提示細胞が樹状細胞である請求項３４から３８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項４０】
抗原提示細胞とともに疾病抗原の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを含む請求項３３から３８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項４１】
アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である請求項４０に記載の医薬。
【請求項４２】
アップレギュレーターがＩＦＮ−γである請求項４０または４１に記載の医薬。
【請求項４３】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の融合蛋白質と抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、接触させて疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させることを含む抗原提示細胞の加工方法。
【請求項４４】
抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示する請求項４３に記載の抗原提示細胞の加工方法。
【請求項４５】
疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある請求項４４に記載の抗原提示細胞の加工方法。
【請求項４６】
主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示する請求項４４または４５に記載の抗原提示細胞の加工方法。
【請求項４７】
抗原提示細胞が樹状細胞である請求項４３から４６のいずれか１項に記載の抗原提示細胞の加工方法。
【請求項４８】
融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを用いる請求項４３から４７のいずれか１項に記載の抗原提示細胞の加工方法。
【請求項４９】
アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である請求項４８に記載の抗原提示細胞の加工方法。
【請求項５０】
アップレギュレーターがＩＦＮ−γである請求項４８または４９に記載の抗原提示細胞の加工方法。
【請求項５１】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の融合蛋白質をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項５２】
哺乳動物の生体内において、融合蛋白質が抗原提示細胞と接触して疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させ、疾病抗原蛋白質に対して疾病抗原蛋白質特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する請求項５１に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項５３】
抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する請求項５２に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項５４】
疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある請求項５３に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項５５】
主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する請求項５３または５４に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項５６】
抗原提示細胞が樹状細胞である請求項５２から５５のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項５７】
がんまたは感染症を予防または治療するための請求項５１から５６のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項５８】
融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを投与する請求項５１から５７のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項５９】
アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である請求項５８に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６０】
アップレギュレーターがＩＦＮ−γである請求項５８または５９に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６１】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の融合蛋白質を抗原提示細胞に接触させ、次いで、該抗原提示細胞をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６２】
融合蛋白質が抗原提示細胞と接触して疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させ、哺乳動物の生体内において、抗原提示した該抗原提示細胞が疾病抗原蛋白質に対して疾病抗原蛋白質特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する請求項６１に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６３】
抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する請求項６２に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６４】
疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある請求項６３に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６５】
主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する請求項６３または６４に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６６】
抗原提示細胞が樹状細胞である請求項６２から６５のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６７】
がんまたは感染症を予防または治療するための請求項６１から６６のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６８】
融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを抗原提示細胞に接触させるか、あるいは抗原提示細胞とともに該アップレギュレーターを投与する請求項６１から６７のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項６９】
アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である請求項６８に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項７０】
アップレギュレーターがＩＦＮ−γである請求項６８または６９に記載の疾病を予防もしくは治療する方法。
【請求項７１】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の融合蛋白質を取り込んで、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示している抗原提示細胞。
【請求項７２】
抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示している請求項７１に記載の抗原提示細胞。
【請求項７３】
疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある請求項７２記載の抗原提示細胞。
【請求項７４】
主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示している請求項７２または７３に記載の抗原提示細胞。
【請求項７５】
抗原提示細胞が樹状細胞である請求項７１から７４のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
【請求項７６】
融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを用いることにより抗原提示されている請求項７１から７５のいずれか１項に記載の抗原提示細胞。
【請求項７７】
アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である請求項７６に記載の抗原提示細胞。
【請求項７８】
アップレギュレーターがＩＦＮ−γである請求項７６または７７に記載の抗原提示細胞。
【請求項７９】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の融合蛋白質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、抗原提示細胞に取り込ませ、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを主要組織適合抗原クラスＩ経路により抗原提示されることを含む疾病抗原蛋白質のデリバリー方法。
【請求項８０】
疾病抗原の任意のエピトープが、主要組織適合抗原クラスＩＩ経路においても抗原提示される請求項７９に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法。
【請求項８１】
疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある請求項７９または８０に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法。
【請求項８２】
抗原提示細胞が樹状細胞である請求項７９から８１のいずれか１項に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法。
【請求項８３】
融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを抗原提示細胞に取り込ませる請求項７９から８２のいずれか１項に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法。
【請求項８４】
アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である請求項８３に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法。
【請求項８５】
アップレギュレーターがＩＦＮ−γである請求項８３または８４に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法。
【請求項８６】
疾病抗原蛋白質ががん抗原蛋白質または感染症抗原蛋白質である請求項７９から８５いずれか１項に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法。
【請求項８７】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の融合蛋白質を含有し、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを、抗原提示細胞において主要組織適合抗原クラスＩ経路により抗原提示させるための疾病抗原蛋白質のデリバリー剤。
【請求項８８】
疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを、主要組織適合抗原クラスＩＩ経路においても抗原提示させる請求項８７に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー剤。
【請求項８９】
疾病抗原蛋白質ががん抗原蛋白質または感染症抗原蛋白質である請求項８７または８８に記載の疾病抗原のデリバリー剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合蛋白質、該融合蛋白質を発現するための発現プラスミド、該融合蛋白質を用いた医薬、該融合蛋白質を用いた治療法、該融合蛋白質を用いた抗原提示細胞の加工方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんをはじめとする難治性疾患の新たな治療法として、近年免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法とは、患者本人の免疫細胞、特に白血球を取り出して活性化した上で再度患者本人に戻し、人工的に免疫力を強化するという治療方法である。患者本人の細胞を用いるため、従来の抗癌剤治療などと比べて格段に副作用が少ないという利点がある。
現在、免疫細胞療法としては、体外でリンパ球をリンフォカインにより抗原非特異的に活性化し、体内に戻す活性化自己リンパ球療法がすでに普及しつつあるが、さらに強力な細胞障害活性を持ち、病変を特異的に認識・障害する細胞障害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下ＣＴＬと記す）を利用した治療法の普及が望まれている。【０００３】
ここで、現在試みられているＣＴＬを利用した治療法としては、がん抗原ペプチド等を直接患者に投与するという方法がとられているが、この場合、患者の免疫能が低下していることが多いため、そのＣＴＬ誘導能はあまり期待できない。そこで、抗原提示細胞、例えば樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，以下ＤＣとも記す）等と抗原を接触させて、強力に抗原提示を行わせ、そのＤＣにより体内でＣＴＬを誘導する樹状細胞ワクチン療法等がある。
具体的にこの樹状細胞ワクチン療法は、ＤＣが疾病抗原等を取り込んでプロセシングした後、抗原提示を行うことにより、疾病抗原として、例えばがん抗原蛋白質若しくはペプチド、又は感染症抗原蛋白質若しくはペプチドを、直接又は細胞内でプロセシングした後ペプチドの一部を主要組織適合抗原（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ａｎｔｉｇｅｎ：ＭＨＣ抗原、ヒトの場合にはヒト白血球抗原：  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ：  ＨＬＡ）に提示させたＤＣを用いて、ワクチンとして投与し、体内で異常細胞を選択的に攻撃する疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導し、治療を行う療法である（例えば非特許文献１、非特許文献２）。
このように、ＤＣワクチンでは、疾病特異的なＣＴＬを誘導できることから、免疫細胞の中でも特にその治療効果が有望視されている。【０００４】
このＤＣワクチン療法において重要なのは、その抗原等をＤＣに提示させることであるが、その方法としては現在２つが用いられている。蛋白質に由来する抗原ペプチドを該細胞表面のＭＨＣ抗原（ＨＬＡ）（以下、単にＭＨＣとも言う）に直接結合させる方法（例えば非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）、及び貪食作用によって細胞内に取り込ませる方法がある（例えば非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
ここで、ＭＨＣにはクラスＩとクラスＩＩの２種類があり、それぞれ固有の抗原提示ルートを有している。
上記のうち、これまで貪食作用による抗原蛋白質の取り込みとして行われてきたのは、がん細胞の抽出液を単にＤＣの培養液に添加するものである（例えば非特許６、非特許文献７、非特許文献８）。この場合、取り込まれた蛋白質はファゴゾーム内で処理され主としてクラスＩＩ組織適合抗原によって提示されるルートにのり、主としてＣＤ４陽性（ヘルパー）Ｔ細胞を刺激して、その活性化を誘導することとなる。また、細胞外物質を取り込む系として老廃物処理のための受容体に結合した物質を取り込む機構も存在し、例えばマンノース受容体は結合した糖蛋白質等を細胞内に取り込むことが知られているが、これもファゴゾームを介してクラスＩＩによる提示の系に進むことになり、結局ヘルパーＴ細胞活性を誘導する。これに対して、細胞質内の蛋白質はプロテアソームで処理され、主としてクラスＩ組織適合抗原によって提示されるルートにのり、主としてＣＴＬを刺激してその活性化を誘導することとなる。【０００５】
また、がん細胞の抽出液を貪食反応によって取り込ませる方法では、がん細胞の抽出液は、大過剰の正常蛋白質と微量に混在するがん抗原蛋白質からなるため、がん抗原蛋白質そのものは微量にしか利用できない。そのため、がん抗原自体は十分にＤＣに取り込まれることができず、抗原提示が不十分となる問題がある。かつ、この場合には蛋白質の取り込みは貪食作用によるものなので、本質的にはクラスＩＩへの提示経路に進んでしまい、クラスＩからのＣＤ８陽性（キラー）Ｔ細胞、ＣＴＬへの抗原提示が十分にできないという問題がある。【０００６】
さらに別の方法としては抗原蛋白質に由来する抗原ペプチドを、抗原提示細胞のＭＨＣ抗原に直接に結合させる方法が挙げられる（例えば非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。この方法では、標的とする細胞の表面に発現しているＭＨＣ抗原に直接結合することができるエピトープを含むペプチドを用いることで、クラスＩ経路へシグナルが入ってＣＴＬを誘導することはできる。しかしながら、この場合、現在ではこのようなエピトープの配列がわかっている抗原はごくわずかであり、しかも例えばヒトの場合では特定のＨＬＡの、例えばクラスＩのＡ２やＡ２４等に結合する抗原ぺプチドしか同定されていないことから、他のＨＬＡの型には利用することができず、特定のＨＬＡ拘束性となるため、特定の患者にしか用いることができないという問題がある。また、この場合にはクラスＩＩも利用できないため、今度はＣＤ４陽性（ヘルパー）Ｔ細胞機能が利用できないという問題もある。
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０３，３８３−３８９
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．２００１，９８，８８０９−８８１４
【非特許文献３】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７；１８５：４５３−４５９
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３；１７１：４８９３−４８９７
【非特許文献５】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５；１８：８６−９４
【非特許文献６】Ｐｒｏｓｔａｔｅ，１９９５；２７：６３−６９
【非特許文献７】Ｐｒｏｓｔａｔｅ，１９９６；２８：６５−６９
【非特許文献８】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９８；４：３２８−３３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、効率良く抗原提示を行い、ＣＴＬを誘導するための融合蛋白質、これを発現するプラスミド、及び該融合蛋白質の利用を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため、これまで報告されたことがなかった、ユビキチンと細胞質内取り込み受容体リガンド及び疾病抗原蛋白質からなる融合蛋白質を、抗原提示細胞による抗原提示に用いるという発想に至り、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の（１）から（８９）の発明に関するものである。
（１）ユビキチンと、疾病抗原蛋白質と、細胞質内取り込み受容体のリガンドとを含む融合蛋白質；
（２）ユビキチンのＣ末端側と疾病抗原蛋白質のＮ末端側とが結合し、疾病抗原蛋白質のＣ末端側と細胞質内取り込み受容体のリガンドのＮ末端側とが結合する上記（１）に記載の融合蛋白質；
（３）疾病抗原蛋白質ががん抗原蛋白質である上記（１）または（２）に記載の融合蛋白質；
（４）疾病抗原蛋白質が感染症抗原蛋白質である上記（１）または（２）に記載の融合蛋白質；
（５）疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある上記（１）から（４）のいずれか１項に記載の融合蛋白質；
（６）リガンドがヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６のＣ末端を含む構造である上記（１）から（５）のいずれか１項に記載の融合蛋白質；
（７）ヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６のＣ末端を含む構造のアミノ酸配列がＫＤＥＬである上記（６）に記載の融合蛋白質；
（８）疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを、抗原提示細胞において、主要組織適合抗原クラスＩ経路により抗原提示させるための上記（１）から（７）のいずれか１項に記載の融合蛋白質；
（９）疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある上記（８）に記載の融合蛋白質；
（１０）主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示させるための上記（８）または（９）に記載の融合蛋白質；
（１１）抗原提示細胞が樹状細胞である上記（８）から（１０）のいずれか１項に記載の融合蛋白質；
（１２）疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターとともに用いるための上記（１）から（１１）のいずれか１項に記載の融合蛋白質；
（１３）アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である上記（１２）に記載の融合蛋白質；
（１４）アップレギュレーターがＩＦＮ−γである上記（１２）または（１３）に記載の融合蛋白質；【０００９】
（１５）ユビキチンをコードするＤＮＡ配列と、疾病抗原蛋白質をコードするＤＮＡ配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと、細胞質内取り込み受容体のリガンドをコードするＤＮＡ配列とを含む、融合蛋白質の発現プラスミドを構築するための発現ベクター；
（１６）リガンドが、ヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６のＣ末端を含む構造である上記（１５）に記載の発現ベクター；【００１０】
（１７）ユビキチンをコードするｃＤＮＡ配列と、疾病抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列と、細胞質内取り込み受容体のリガンドをコードするｃＤＮＡ配列とを含む、融合蛋白質の発現プラスミド；
（１８）発現プラスミドがユビキチンのＣ末端側と疾病抗原蛋白質のＮ末端側とが結合し、疾病抗原蛋白質のＣ末端側と細胞質内取り込み受容体のリガンドのＮ末端側とが結合する融合蛋白質を発現するよう、ユビキチンをコードするｃＤＮＡ配列と、疾病抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列と、細胞質内取り込み受容体のリガンドをコードするｃＤＮＡ配列が配置されている上記（１７）に記載の発現プラスミド；
（１９）疾病抗原蛋白質ががん抗原である上記（１７）または（１８）に記載の発現プラスミド；
（２０）疾病抗原蛋白質が感染症抗原蛋白質である上記（１７）または（１８）に記載の発現プラスミド；
（２１）リガンドがヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６のＣ末端を含む構造である上記（１７）から（２０）のいずれか１項に記載の発現プラスミド；
（２２）リガンドをコードするｃＤＮＡ配列がＫＤＥＬを含むアミノ酸をコードする配列である上記（１７）から（２１）のいずれか１項に記載の発現プラスミド；【００１１】
（２３）上記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の融合蛋白質を含む医薬；
（２４）融合蛋白質が抗原提示細胞と接触して疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させ、疾病抗原蛋白質に対して疾病抗原蛋白質特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療するための上記（２３）に記載の医薬；
（２５）抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させて、疾病抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療するための上記（２４）に記載の医薬；
（２６）疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある上記（２４）または（２５）に記載の医薬；
（２７）主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療するための上記（２４）から（２６）のいずれか１項に記載の医薬；
（２８）抗原提示細胞が樹状細胞である上記（２４）から（２７）のいずれか１項に記載の医薬；
（２９）がんまたは感染症を予防または治療するための上記（２３）から（２８）のいずれか１項に記載の医薬；
（３０）融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを含む上記（２３）から（２９）のいずれか１項に記載の医薬；
（３１）アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である上記（３０）に記載の医薬；
（３２）アップレギュレーターがＩＦＮ−γである上記（３０）または（３１）に記載の医薬；【００１２】
（３３）上記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の融合蛋白質を取り込んだ抗原提示細胞を含有する医薬；
（３４）抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示している上記（３３）に記載の医薬；
（３５）疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある上記（３４）に記載の医薬；
（３６）主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示している上記（３４）または（３５）に記載の医薬；
（３７）疾病抗原蛋白質に対して疾病抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療するための上記（３４）から（３６）のいずれか１項に記載の医薬；
（３８）がんまたは感染症を予防または治療するための上記（３３）から（３７）のいずれか１項に記載の医薬；
（３９）抗原提示細胞が樹状細胞である上記（３４）から（３８）のいずれか１項に記載の医薬；
（４０）抗原提示細胞とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを含む上記（３３）から（３８）のいずれか１項に記載の医薬；
（４１）アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である上記（４０）に記載の医薬；
（４２）アップレギュレーターがＩＦＮ−γである上記（４０）または（４１）に記載の医薬；【００１３】
（４３）上記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の融合蛋白質と抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、接触させて疾病抗原の任意のエピトープを抗原提示させることを含む抗原提示細胞の加工方法；
（４４）抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示する上記（４３）に記載の抗原提示細胞の加工方法；
（４５）疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある上記（４４）に記載の抗原提示細胞の加工方法；
（４６）主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示する上記（４４）または（４５）に記載の抗原提示細胞の加工方法；
（４７）抗原提示細胞が樹状細胞である上記（４３）から（４６）のいずれか１項に記載の抗原提示細胞の加工方法；
（４８）融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを用いる上記（４３）から（４７）のいずれか１項に記載の抗原提示細胞の加工方法；
（４９）アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である上記（４８）に記載の抗原提示細胞の加工方法；
（５０）アップレギュレーターがＩＦＮ−γである上記（４８）または（４９）に記載の抗原提示細胞の加工方法；【００１４】
（５１）上記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の融合蛋白質をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む疾病を予防もしくは治療する方法；
（５２）哺乳動物の生体内において、融合蛋白質が抗原提示細胞と接触して疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させ、疾病抗原蛋白質に対して疾病抗原蛋白質特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する上記（５１）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（５３）抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する上記（５２）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（５４）疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある上記（５３）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（５５）主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する上記（５３）または（５４）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（５６）抗原提示細胞が樹状細胞である上記（５２）から（５５）のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（５７）がんまたは感染症を予防または治療するための上記（５１）から（５６）のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（５８）融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを投与する上記（５１）から（５７）のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（５９）アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である上記（５８）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（６０）アップレギュレーターがＩＦＮ−γである上記（５８）または（５９）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；【００１５】
（６１）上記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の融合蛋白質を抗原提示細胞に接触させ、次いで、該抗原提示細胞をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む疾病を予防もしくは治療する方法；
（６２）融合蛋白質が抗原提示細胞と接触して疾病抗蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させ、哺乳動物の生体内において、抗原提示した該抗原提示細胞が疾病抗原蛋白質に対して疾病抗原蛋白質特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する上記（６１）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（６３）抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する上記（６２）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（６４）疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある上記（６３）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（６５）主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示させて、疾病抗原蛋白質特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導して、疾病を予防もしくは治療する上記（６３）または（６４）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（６６）抗原提示細胞が樹状細胞である上記（６２）から（６５）のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（６７）がんまたは感染症を予防または治療するための上記（６１）から（６６）のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（６８）融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを抗原提示細胞に接触させるか、あるいは抗原提示細胞とともに該アップレギュレーターを投与する上記（６１）から（６７）のいずれか１項に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（６９）アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である上記（６８）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；
（７０）アップレギュレーターがＩＦＮ−γである上記（６８）または（６９）に記載の疾病を予防もしくは治療する方法；【００１６】
（７１）上記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の融合蛋白質を取り込んで、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示している抗原提示細胞；
（７２）抗原提示細胞が、主要組織適合抗原クラスＩ経路により、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを抗原提示している上記（７１）に記載の抗原提示細胞；
（７３）疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある上記（７２）記載の抗原提示細胞；
（７４）主要組織適合抗原クラスＩ経路とともに主要組織適合抗原クラスＩＩ経路により抗原提示している上記（７２）または（７３）に記載の抗原提示細胞；
（７５）抗原提示細胞が樹状細胞である上記（７１）から（７４）のいずれか１項に記載の抗原提示細胞；
（７６）融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを用いることにより抗原提示されている上記（７１）から（７５）のいずれか１項に記載の抗原提示細胞；
（７７）アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である上記（７６）に記載の抗原提示細胞；
（７８）アップレギュレーターがＩＦＮ−γである上記（７６）または（７７）に記載の抗原提示細胞；【００１７】
（７９）上記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の融合蛋白質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、抗原提示細胞に取り込ませ、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを主要組織適合抗原クラスＩ経路により抗原提示されることを含む疾病抗原蛋白質のデリバリー方法；
（８０）疾病抗原の任意のエピトープが、主要組織適合抗原クラスＩＩ経路においても抗原提示される上記（７９）に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法；
（８１）疾病抗原蛋白質が全蛋白質の形態にある上記（７９）または（８０）に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法；
（８２）抗原提示細胞が樹状細胞である上記（７９）から（８１）のいずれか１項に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法；
（８３）融合蛋白質とともに疾病抗原蛋白質の抗原性発現機能を促進するアップレギュレーターを抗原提示細胞に取り込ませる上記（７９）から（８２）のいずれか１項に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法；
（８４）アップレギュレーターがサイトカインまたは菌製剤である上記（８３）に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法；
（８５）アップレギュレーターがＩＦＮ−γである上記（８３）または（８４）に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法；
（８６）疾病抗原蛋白質ががん抗原蛋白質または感染症抗原蛋白質である上記（７９）から（８５）いずれか１項に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー方法；【００１８】
（８７）上記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の融合蛋白質を含有し、疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを、抗原提示細胞において主要組織適合抗原クラスＩ経路により抗原提示させるための疾病抗原蛋白質のデリバリー剤；
（８８）疾病抗原蛋白質の任意のエピトープを、主要組織適合抗原クラスＩＩ経路においても抗原提示させる上記（８７）に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー剤；及び
（８９）疾病抗原蛋白質ががん抗原蛋白質または感染症抗原蛋白質である上記（８７）または（８８）に記載の疾病抗原蛋白質のデリバリー剤。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、これまで報告されたことがなかった、ユビキチンと細胞質内取り込み受容体リガンド及び疾病抗原蛋白質からなる融合蛋白質を、抗原提示細胞による抗原提示に用いることにより、抗原提示細胞の抗原提示を効果的に行うことができ、それによって、疾病抗原蛋白質に特異的な細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するができ、がんや感染症などの疾病を有効に予防または治療することを可能にする。
この融合蛋白質を抗原として用いて樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞に抗原提示させることにより、１）全ての主要組織適合抗原（ＭＨＣ抗原（ＨＬＡ））の型に応用できる、２）疾病抗原蛋白質のみを大量に提示させることができる、３）細胞質内取り込み受容体、例えばＫＤＥＬ受容体経由で疾病抗原蛋白質を直接細胞質内に取り込むので、主としてＭＨＣ抗原クラスＩからの提示の経路にのることになり効率よくＣＴＬを活性化することができる、４）ユビキチンの作用で、プロテアソームへ融合蛋白質を導入する効率が高い、５）副反応によって、ＭＨＣ抗原クラスＩＩからも同時に抗原提示がなされる、６）融合蛋白質に用いる疾病抗原蛋白質として全蛋白質を用いることにより、その全蛋白質分子中には既知の種々のエピトープだけでなく、未知のエピトープも含まれているため、それら各種のエピトープによる抗原提示能の向上、等といった多くの利点を有する。
さらに、当該融合蛋白質と、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）等のアップレギュレーターとを併用することにより、抗原提示能を向上させるとともに、ＭＨＣ抗原クラスＩ経路による抗原提示により活性化されるＣＤ８陽性細胞の数も従来以上に効率よく増やすことが可能となる。
以上、本発明によれば、ＤＣなどの抗原提示細胞の持つ潜在能力のごく一部しか利用できていなかった疾病抗原蛋白質の取り込み及び疾病抗原特異的ＣＴＬへの抗原提示の効率を向上させることが可能となり、従来よりも確実にＣＴＬへの抗原提示を行うことが可能となる。それにより、ＣＴＬの誘導効率を向上させることが可能となり、効果の高い医薬、治療方法等を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について説明する。
融合蛋白質
本発明の融合蛋白質は、ユビキチン、疾病抗原蛋白質、細胞質内取り込み受容体のリガンドからなる。
通常ＤＣなどの抗原提示細胞が抗原提示を行うためには、抗原提示細胞内に抗原が取り込まれる必要があるが、例えば受容体介在反応によって直接細胞質内に取り込まれた抗原の場合には、細胞質内に取り込まれたあと、細胞内でプロテアソームでプロセシングを受けた上で小胞体に取り込まれ、小胞体内で合成されたＭＨＣクラスＩ抗原に結合し、その複合体が細胞表面に移動することにより抗原提示細胞表面に抗原提示がなされる。
ここで、疾病抗原蛋白質とは、疾病を引き起こす原因となる抗原の蛋白質や疾病に特異的に発生する抗原マーカーの蛋白質などを指す。疾病抗原蛋白質は、全蛋白質、あるいはその配列の一部置換、欠損、転座などがあるものや、エピトープを有し、抗原性を保持していれば、該蛋白質の部分蛋白質であってもかまわない。本発明では、特に、全蛋白質が適している。本発明において、全蛋白質を用いた場合には、全蛋白質は既知及び未知の様々なエピトープを有しているため、ＭＨＣ抗原クラスＩの経路により、更には、ＭＨＣ抗原クラスＩの経路に加えて、ＭＨＣ抗原クラスＩＩの経路により、広範囲の様々な抗原提示が可能となる、という利点を有する。【００２１】
ここで、細胞質内取り込み受容体のリガンドとは、「細胞外物質の細胞質内への受容体介在反応による取り込みに関与する受容体のリガンド」を意味する。このリガンドの例としては、例えばヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０００；１９１：１９６５−１９７４）やトランスフェリン受容体リガンド（Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，１９８２；９１：４９５−５２１）などがあげられる。特にＨＳＰｇｐ９６のＣ末端を含む構造では、アミノ酸配列ＫＤＥＬを含むことが好ましい。
ユビキチンは、真核細胞に普遍的に見出される分子量７５００の蛋白質であり、細胞内でプロテアソームに取り込まれて分解される性質を有するものである（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９３；３２４：３４５−３４８）。本発明では、細胞内でプロテアソームに取り込まれて分解される性質を有するものであれば、いずれの真核細胞由来のユビキチンであってもよく、また、その蛋白質のアミノ酸配列の一部置換、欠損、転座などがあるものや、該蛋白質の部分蛋白質であってもかまわない。【００２２】
このような構成により、本発明の融合蛋白質は、例えばこのＫＤＥＬ部分がＤＣ表面の受容体との接着部位となって直接に細胞質内に取り込まれ、ＭＨＣ抗原クラスＩ経路による抗原提示の経路にのり、ユビキチンがプロテアソームへの輸送を促進するため、従来の蛋白質の取り込みよりも効率良く抗原提示でき、それにより、ＣＴＬの誘導効率を向上させることが可能となる。【００２３】
ここで、疾病抗原蛋白質としては、いずれのものであっても用いることが可能であり、そのため、特定の疾病に限らず、様々な疾病に適用できるという汎用性があるが、中でもがん抗原や感染症抗原の蛋白質が好適に用いられる。
疾病抗原ががん抗原である場合、そのがん抗原のがんの種類は問わず、どのような抗原も用いることができる。例えば、前立腺がん、肝がん、すい臓がん等のどのようながん抗原であっても利用できる。がん抗原としては、例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＲＡＧＥ等のＭＡＧＥ遺伝子ファミリーにコードされるものが挙げられる。他のがん抗原としては、例えば、ｐ５３、Ｋ−ｒａｓ、ＣＤＫ４及びｂｃｌ−ｃ−ａｂｌ遺伝子産物等の変異により生じるがん抗原、ｃ−ｅｒｂ２（ｎｅｕ）蛋白等のがん細胞で過剰発現されるがん抗原、および、ＨＰＶ−１６のＥ７蛋白等の発がんウイルス抗原等が挙げられる。さらに、ＴＲＰ−２等のメラノーマ抗原、がん胎児抗原（ＣＥＡ）やα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍胎児抗原、ならびに、ＰＡＰ等の前立腺特異的抗原や、白血病およびリンパ腫のＢ細胞で発現するＣＤ−１０（ＣＡＬＬＡ抗原）等の分化抗原も使用することができる。
また、感染症抗原の感染症の種類も、特に制限されず、例えば、エイズやＢ型・Ｃ型肝炎、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染症、ＨＰＶ感染症等のウイルス性感染症の中でも難治性疾患も挙げられる。また、マラリア原虫のスポロゾイド周囲蛋白のような寄生虫の抗原も用いることができる。
また、本発明の融合蛋白質は特定のＭＨＣ（ＭＨＣ抗原（ＨＬＡ））に拘束されることがないので、どのような患者であっても適用することができる。【００２４】
上述の通り疾病抗原蛋白質としてはどのようなものでも使用可能ではあるが、具体的には、ＡＡＲＳ（胎盤）、ＡＢＬ１（繊維芽細胞腫）、ＡＣＡＤＶＬ（胎盤腫）、ＡＣＬＴ７Ｂ（脳腫瘍）、ＡＣＰ２（リンパ腫）、ＡＣＶＲ２Ｂ（脳腫瘍）、ＡＤＰＲＴ（繊維芽細胞腫）、ＡＤＳＬ（脳腫瘍）、ＡＦ６（骨髄腫）、ＡＦＰ（）、ＡＧＰＡＴ２（腎がん）、ＡＩＢＰ（腎がん）、ＡＩＭ１（肝がん）、ＡＫＡＰ９（脳腫瘍）、ＡＬＤＡ（繊維芽細胞腫）、ＡＬＤＯＡ（繊維芽細胞腫）、ＡＬＯＸ１２Ｂ（脳腫瘍他）、ＡＬＰＨＡ  ＮＡＣ（脳腫瘍）、ＡＭＨＲ２（こうがん）、ＡＮＴ３（脳腫瘍、肺がん他）、ＡＮＸＡ１１（テラトカルシノーマ）、ＡＮＸＡ２（各種がん）、ＡＰ１Ｇ２（肝がん）、ＡＰ１Ｍ１（肝がん）、ＡＰ２Ｍ１（骨髄腫）、ＡＰ３Ｄ１（肉腫他）、ＡＰＣ（大腸がん他）、ＡＰＥＸＬ２（肺がん他）、ＡＲＬ１（膀胱がん）、ＡＲＬ６ＩＰ（骨髄腫）、ＡＲＮＴＬ１（脳腫瘍）、ＡＳＮＡ１（子宮がん）、ＡＴＦ３（肉腫）、ＡＴＩＣ（肝がん）、ＡＴＰ５Ｂ（胎盤）、ＡＴＲＸ（各種がん）、ＢＡＧ５（脳腫瘍）、ＢＡＧＥ（メラノーマ、各種癌）、ＢＡＳＰ１（脳腫瘍）、ＢＡＺ１Ａ（子宮頸がん）、ＢＡＺ２Ａ（こうがん）、ｂｃｒ−ａｂｌ（慢性骨髄性白血病）、ＢＩＲＣ２（肝がん）、ＢＩＲＣ３（肝がん）、ＢＭＡＬ２（脳腫瘍）、ＢＭＳ１Ｌ（骨髄腫）、ＢＭＸ（前立腺がん他）、ＢＲＤ２（Ｔリンパ腫）、ＢＴＧ３（子宮がん）、Ｃ２１ＯＲＦ２（肺がん他）、ＣＡＬＵ（ケラチノサイトーマ）、ＣＡＲＨＳＰ１（胎盤腫）、ＣＡＳＰ−８（扁平上皮癌）、ＣＣＮ１（脳腫瘍）、ＣＣＴ８（骨髄腫）、ＣＤ４３（腎がん）、ＣＤＣ２７（メラノーマ）、ＣＤＣ２Ｌ５（グリオブラストーマ）、ＣＤＩＰＴ（こうがん）、ＣＤＫ４（メラノーマ）、ＣＥＡ（大腸がん他）、ＣＥＮＦ（乳がん）、ＣＥＮＰＢ（子宮がん）、ＣＨＤ３（胸腺腫）、ＣＫＡＰ１（骨髄腫）、ＣＬＩＣ６（消化器がん）、ＣＬＫ３（子宮頸がん）、ＣＬＮ６（肺がん）、ＣＮＴＦ（肺がん他）、ＣＯＧ８（子宮がん）、ＣＯＰＢ２（肺がん）、ＣＯＲＯ１Ａ（脳腫瘍他）、ＣＯＲＯ１Ａ（脳腫瘍）、ＣＯＴＬ１（胎盤他）、ＣＳＤＡ（胎盤）、ＣＴＡＧ１（メラノーマ）、ＣＴＡＧ２（メラノーマ）、ＣＴＡＧＥ−１（こうがん）、ＣＴＮＮＡ１（大腸がん他）、ＣＵＬ５（こうがん）、ＤＡＤ１（脳腫瘍）、ＤＣＴＮ１（脳腫瘍）、ＤＤＸ５（肉腫）、ＤＫＦＺＰ４３４Ｎ０７３５（脳腫瘍）、ＤＫＦＺＰ４３４Ｐ１１２（こうがん）、ＤＫＦＺＰ５６４Ｃ２３６（脳腫瘍）、ＤＬＧ５（脳腫瘍）、ＤＮＡＪＡ１（胎盤）、ＤＮＡＪＡ２（皮膚がん）、ＤＮＡＪＢ１（胎盤腫）、ＤＳＰ（皮膚がん）、ＤＵＳＰ１２（胎盤腫）、ＤＹＨ１Ｂ（肝がん）、ＥＢＰ（肝がん）、ＥＢＶ−ＢＭＬＦ１（Ｂリンパ腫他）、ＥＢＶ−ＥＢＮＡ−２，３，４，６（Ｂリンパ腫他）、ＥＤＦ−１（膵がん）、ＥＥＦ１Ｇ（肝がん他）、ＥＥＦ２（卵巣がん）、ＥＦ１Ｄ（皮膚がん他）、ＥＧＬＮ１（扁桃がん）、ＥＩＦ３Ｓ６ＩＰ（脳腫瘍、子宮頸がん他）、ＥＩＦ４ＥＢＰ３（リンパ腫）、ＥＩＦ４Ｇ２（胎盤腫他）、ｅｌａ２（急性リンパ球性白血病）、ＥＭＳ１（乳がん）、ＥＰＨＢ２（胃がん他）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１���急性単球性白血病）、ＦＢＬＮ１（脳腫瘍）、ＦＢＸＯ７（膵がん）、ＦＤＦＴ１（肝がん）、ＦＨ（脳腫瘍）、ＦＫＳＧ１１（乳がん）、ＦＮＢＰ３（皮膚がん）、ＦＸＹＤ５（骨髄腫）、ＧＡＧＥ３，４，５，６，７Ｂ（メラノーマ、各種癌）、ＧＣＣ２（リンパ腫）、ＧＤＦ１１（脳腫瘍）、ＧＬＩＰＲ１（グリオーマ）、ＧＮＢ３（脳腫瘍）、ＧＮＧ４（脳腫瘍）、ＧＯＡ４（胃がん）、ＧＯＬＧＡ１（子宮頸がん、こうがん）、ＧＯＴ１（肝がん）、ｇｐ１００（メラノーマ）、ＧＲＢ７（肺がん他）、ＧＴＦ２Ｈ２（皮膚がん他）、ＧＴＦ２Ｉ（子宮頸がん）、ＧＵＣＹ２Ｄ（網膜腫）、Ｈ２ＡＦＹ（肺がん他）、ＨＣ５８（肝がん）、ＨＤＡＣ５（大腸、直腸がん他）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（乳がん、卵巣がん、胃がん）、ＨＫＦ１（脳腫瘍）、ＨＭＧＡ２（肝がん）、ＨＭＧＮ１（骨髄腫）、ＨＭＭＲ（乳がん）、ＨＮＲＰＡＢ（胎盤腫他）、ＨＰＶ１６−Ｅ６（子宮頸がん他）、ＨＰＶ１６−Ｅ７（子宮頸がん他）、ＨＰＶ１８−Ｅ６（子宮頸がん他）、ＨＰＶ１８−Ｅ７（子宮頸がん他）、ＨＲＡＳＬＳ３（肝がん他）、ＨＳＰ６０（肝がん、子宮がん）、ＨＳＰ９０Ａ（各種）、ＨＳＰＡ４（リンパ腫）、ＨＳＰＣＡ（胎盤腫）、ＨＳＰＥ１（子宮がん）、ＨＳＰＨ１（骨髄性白血病）、ＨＴＬＶ−１  ｔａｘ（成人Ｔ細胞白血病）、ＩＤ４（子宮がん）、ＩＤＨ２（心臓、大腸がん）、ＩＦＩ１６（Ｔ細胞性白血病）、ＩＧＢＰ１（Ｂリンパ腫他）、ＩＫＢＫＡＰ（子宮頸がん）、ＩＬＦ３（Ｔリンパ細胞腫、子宮頸がん）、ＩＮＰＰ１（大腸がん）、ＪＰＨＬ１（骨髄腫）、ＪＵＮ（各種がん）、ＫＣＮＡＢ３（脳腫瘍）、ＫＩＡＡ０１１７（骨髄腫、肺がん）、ＫＩＡＡ０１７５（骨髄性白血病）、ＫＩＡＡ０２９１（脳腫瘍他）、ＫＩＡＡ０５７０（脳腫瘍）、ＫＩＡＡ０６１９（脳腫瘍）、ＫＩＡＡ０８０１（脳腫瘍）、ＫＩＡＡ０９０９（脳腫瘍）、ＫＩＡＡ０９７５（脳腫瘍）、ＫＩＡＡ０９７５（脳腫瘍）、ＫＩＡＡ０９８９（脳腫瘍）、ＫＩＦ２２（リンパ芽腫）、ＫＩＦ９（こうがん他）、ＫＬＨＬ２（脳腫瘍）、ＫＮＳ２（脳腫瘍他）、ＫＲＴ１３（膵がん）、ＫＲＴ１４（膵がん）、ＫＲＴ１８（子宮頸がん）、ＫＲＴ７（胎盤腫）、ＫＲＴ８（大腸がん他）、ＫＴＮ１（リンパ腫）、ＬＡＧＥ（各種がん）、ＬＢ１（Ｂリンパ腫他）、ＬＤＨＡ（肉腫）、ＬＤＨＢ（膀胱がん他）、ＬＤＨＢ（肉腫）、ＬＧＡＬＳ１（肺がん）、ＬＧＡＬＳ４（胃がん）、ＬＩＭＳ１（骨髄腫）、ＬＭＮＡ（肺がん、腎がん）、ＬＲＰ１３０（肝がん）、ＬＹＳＴ（肺がん他）、ＭＡＧＥ−１（メラノーマ、各種癌）、ＭＡＧＥ−２（メラノーマ、各種癌）、ＭＡＧＥ−３（メラノーマ、各種癌）、ＭＡＧＥ−４（メラノーマ、各種癌）、ＭＡＧＥ−６（メラノーマ、各種癌）、ＭＡＧＥＤ２（乳がん、各種癌）、ＭＡＮ２Ｃ１（こうがん他）、ＭＡＰ１Ｂ（脳腫瘍）、ＭＡＰＫ１（肺がん他）、ＭＡＲＫ４（脳腫瘍）、ＭＡＲＴ−１（メラノーマ）、ＭＡＺ（膵がん他）、ＭＡＺ（膵がん）、ＭＢＤ２（リンパ腫）、ＭＣＭ３（子宮頸がん、膵がん）、ＭＥＤ６（肺がん他）、ＭＥＳＤＣ２（骨髄腫）、ＭＩＦ（脳腫瘍他）、ＭＪＤ１（脳腫瘍）、ＭＫ１６７（各種がん）、ＭＬＦ１（膀胱がん他��、ＭＬＨ１（膵がん、膀胱がん）、ＭＲＰＳ２６（皮膚がん）、ＭＳＬＮ（子宮がん）、ＭＵＣ−１ムチン（乳がん、卵巣がん、膵がん他）、ＭＵＭ−１（メラノーマ）、ＭＶＰ（網膜腫）、ＭＹＨ１０（肉腫）、ＭＹＨ９（骨髄腫）、ＭＹＯ９Ｂ（肝がん）、ＮＡＦ１（リンパ腫）、ＮＡＰ（こうがん）、ＮＡＰ１Ｌ１（メラノーマ）、ＮＡＳＰ（こうがん）、ＮＢＣ４（こうがん）、ＮＣＯＲ２（脳腫瘍）、ＮＤＵＦＶ３（脳腫瘍）、ＮＥＤＤ９（リンパ腫）、ＮＦＥ２Ｌ２（メラノーマ）、ＮＭＥ１（肺がん他）、ＮＭＥ２（網膜腫）、ＮＯＴＣＨ２（乳がん他）、ＮＲＩＰ１（乳がん）、ＮＵＤＴ４（胎盤腫）、ＮＵＰＬ１（脳腫瘍、胎盤腫）、ＮＹ−ＣＯ−１０（大腸、直腸がん）、ＮＹ−ＣＯ−３３（大腸がん）、ＮＹ−ＣＯ−７（大腸、直腸がん）、ＮＹ−ＣＯ−８（大腸、直腸がん）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（こうがん）、ＯＣＬＮ（大腸がん）、ＯＧＦＲ（皮膚がん他）、ｐ５３（扁平上皮がん他）、ＰＡＤ３（腎がん）、ＰＡＦ１（肝がん）、ＰＡＰ（前立腺がん）、ＰＤＡＰ１（各種がん）、ＰＤＩ（大腸がん、肺がん他）、ＰＤＸＫ（卵巣がん）、ＰＥＣＩ（肝がん）、ＰＦＡＳ（脳腫瘍）、ＰＦＫＦＢ３（脳腫瘍他）、ＰＦＮ１（大腸、肺、膵がん）、ＰＦＮ２（脳腫瘍）、ＰＨＦ１１（赤芽細胞腫）、ＰＨＦ３（グリオーマ他）、ＰＨＫＧ２（肝がん他）、ＰＩ３（皮膚がん）、ＰＩＡＳ１（Ｂ細胞性白血病）、ＰＩＣＡＬＭ（骨髄腫）、ＰＫＣＢ１（Ｔ細胞腫）、ＰＫＤ１（腎がん）、ＰＭＳＣＬ１（リンパ芽腫）、ＰＯＬＲ２Ｅ（肺がん）、ＰＰＭ１Ｂ（肝がん）、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ（骨髄腫他）、ＰＰＰ４Ｃ（胎盤腫）、ＰＰＰ４Ｃ（骨髄腫）、ＰＲＣ１（腎がん）、ＰＲＤＭ５（各種がん）、ＰＲＤＸ１（膀胱がん）、ＰＲＫＷＮＫ２（大腸がん）、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ３（急性骨髄性白血病）、ＰＳＡ（前立腺がん）、ＰＳＭＡ（前立腺がん）、ＰＳＭＤ４（脳腫瘍）、ＰＳＭＤ９（肉腫）、ＰＳＭＥ３（肺がん他）、ＰＴＭＳ（腎がん）、ＰＴＴＧ（脳腫瘍）、ＱＰＲＴ（脳腫瘍他）、ＱＰＲＴ（脳、腎、肉腫）、ＲＡＢ５Ｃ（肺がん他）、ＲＡＧＥ（腎がん）、ＲＡＮ（脳腫瘍）、ｒａｓ（膵がん、大腸がん、肝がん他）、ＲＡＳＳＦ１（膵がん）、ＲＢＭ１０（肺がん）、ＲＢＭ１０（骨髄腫）、ＲＢＭ６（肺がん）、ＲＧＳ１９ＩＰ１（肺がん他）、ＲＮＦ１２（腎がん）、ＲＮＦ４３（結腸、直腸がん）、ＲＮＰＣ２（肝がん）、ＲＰＡ２（腎がん他）、ＲＰＬ１０（乳がん）、ＲＰＬ１０Ａ（皮膚がん）、ＲＰＬ２１（大腸がん）、ＲＰＬ２７Ａ（大腸がん）、ＲＰＬ３（大腸がん）、ＲＰＬ３０（乳がん）、ＲＰＬ３２（腎がん）、ＲＰＬ３４（子宮がん）、ＲＰＬ３７Ａ（脳腫瘍）、ＲＰＳ１５Ａ（大腸がん）、ＲＰＳ１８（胎盤腫）、ＲＳＮ（単球性白血病）、ＲＳＮ（単球性白血病）、ＲＵＶＢＬ１（大腸、直腸がん）、ＳＡＲＴ−１（各種がん）、ＳＡＴＢ１（肺がん）、ＳＢＤＳ（子宮がん）、ＳＣＮＮ１Ａ（腎がん他）、ＳＣＰ１（こうがん）、ＳＣＰ１（こうがん）、ＳＣＰ２（肝がん）、ＳＣＲ３（肺がん）、ＳＤＢＣＡＧ８４（乳がん）、ＳＥＣ１４Ｌ１（肺がん他）、ＳＥＰＴ１（乳がん）、ＳＦＲＳ５（大腸がん）、ＳＧＰＬ１（脳腫瘍）、ＳＩＮ３Ａ（��腫瘍）、ＳＫ−Ｂｒ−３（乳がん）、ＳＬＣ２２Ａ１７（脳腫瘍）、ＳＬＣ２５Ａ１１（脳腫瘍）、ＳＬＣ２５Ａ２（こうがん）、ＳＬＣ２５Ａ２７（脳腫瘍）、ＳＬＸ１３（脳腫瘍）、ＳＭＴＮ（大腸がん）、ＳＮＮ（脳腫瘍）、ＳＮＴ−１（子宮がん）、ＳＮＸ６（各種がん）、ＳＯＸ１（脳腫瘍）、ＳＯＸ２（脳腫瘍）、ＳＰＮ（腎がん他）、ＳＲ＋８９（肺がん）、ＳＲＰ１９（肝がん他）、ＳＳＡ１（胸腺腫他）、ＳＳＡ２（皮膚がん）、ＳＳＮＡ１（こうがん）、ＳＳＰ１（肝がん他）、ＳＳＳＣＡ１（子宮がん）、ＳＳＸ１（繊維芽細胞腫）、ＳＳＸ４（膀胱がん他）、ＳＴ１３（大腸がん）、ＳＴＡＲＤ１０（大腸がん）、ＳＴＡＲＤ７（子宮がん他）、ＳＴＩＰ１（肺がん）、ＳＴＫ１１（肝がん他）、ＳＴＭ（脳腫瘍）、ＳＴＸ４Ａ（各種がん）、ＳＵＣＬＡ２（肝がん他）、ＳＵＬＴ１Ａ３（脳腫瘍他）、ＳＵＲＦ５（肺がん他）、ＳＵＲＦ５（皮膚がん）、ＳＹＣＰ１（こうがん）、ＴＡＤＡ３Ｌ（各種がん）、ＴＡＦ１０（肝がん他）、ＴＡＦ７（皮膚がん）、ＴＢＣ１Ｄ１（脳腫瘍他）、ＴＢＣ１Ｄ４（脳腫瘍）、ＴＢＣ１Ｄ５（骨髄腫）、ＴＣＥ１（腎がん）、ＴＣＥＢ３（肺がん）、ＴＣＦ４（胸腺腫）、ＴＤＲＤ３（胎盤腫）、ＴＥＬ−ＡＭＬ１（急性単球性白血病）、ＴＧＦＢＩ（腎がん）、ＴＩＡＦ１（乳がん）、ＴＩＭＰ３（腎がん）、ＴＫＴ（肝がん）、ＴＭＦ１（子宮頸がん、膵がん）、ＴＮＫＳ２（乳がん）、ＴＮＮＴ１（肉腫）、ＴＯＰ２Ｂ（各種がん）、ＴＰ５３ＢＰ２（各種がん）、ＴＰＤ５２（乳がん）、ＴＰＩ１（肝がん）、ＴＰＭ１（肝がん）、ＴＲＡＰＰＣ１（子宮がん）、ＴＲＰ−１（メラノーマ）、ＴＲＰ−２（メラノーマ）、ＴＳＴＡ３（肺がん）、ＴＴＣ１２（リンパ腫）、ＴＸＮＲＤ１（膵がん他）、ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ（メラノーマ）、Ｕ２ＡＦ１Ｌ１（脳腫瘍）、Ｕ２ＡＦ１Ｌ２（脳腫瘍）、ＵＢＥ１（胎盤）、ＵＢＥ２Ｄ２（こうがん）、ＵＢＱＬＮ２（肺がん）、ＵＥ３Ａ（ケラチノサイトーマ）、ＵＮ１（乳がん、肺がん、胃がん他）、ＵＳＨ１Ｃ（大腸がん）、ＵＳＰ１（こうがん）、ＵＳＰ１０（骨髄腫）、ＵＳＰ１６（こうがん）、ＵＳＰ１９（脳腫瘍）、ＵＳＰ３２（脳腫瘍）、ＵＳＰ４（脳腫瘍）、ＶＣＬ（子宮がん）、ＶＥＧＦＢ（繊維芽細胞腫）、ＶＥＳＰＲ（皮膚がん）、ＶＰＳ４５Ａ（脳腫瘍）、ＷＴ１（各種白血病、各種がん）、ＸＡＧＥ（各種がん）、ＹＡＲＳ
（肺がん他）、ＹＷＨＡＥ（肝がん他）、ＺＦＰ３６Ｌ２（Ｔ細胞性白血病）、ＺＩＣ２（脳腫瘍）、ＺＮＦ２０２（こうがん）、ＺＮＦ２３２（赤芽球）、ＺＮＦ２８２（Ｔリンパ球性白血病）、ＺＮＦ２９２（胎盤腫）、β−カテニン（メラノーマ）、抗体イディオタイプ（Ｂリンパ腫）、等が挙げられる。
また、感染症抗原としては、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ等が挙げられる。【００２５】
これら上記蛋白質にかかる疾病は、従来の治療法では汎用的に用いることができる技術がなかったが、本発明を用いることにより、様々な患者・疾病に対して、従来より効果の高い治療方法を提供することが可能となる。
また、本発明に用いる疾病抗原蛋白質の形態としては、所望の疾病抗原蛋白質を単独で用いてもよいし、同じ疾病抗原蛋白質を複数個あるいは異なる種類の蛋白質を複数個結合させて用いてもよい。
このような形態で用いることにより、より抗原提示能を高めたり、一つの融合蛋白質で複数の疾患に対応することが可能となる。【００２６】
また、ユビキチン、疾病抗原蛋白質、リガンドの構成としては、どのような結合形態を用いることも可能だが、好ましくはユビキチンのＣ末端側と疾病抗原蛋白質のＮ末端側が結合し、疾病抗原のＣ末端側とリガンドのＮ末端側とが結合する形態が良い。ここで、「結合」とは、ユビキチン、疾病抗原蛋白質及びリガンドのそれぞれの結合部においてそれぞれが直接結合していてもよいし、１個〜複数個アミノ酸が挿入されていてもよく、適当なリンカーを介して結合されていてもよいことを意味する。このような結合形態により、細胞内への取り込みや、取り込まれた後の小胞体でのプロセシングが、一層効率良く行うことが可能となる。【００２７】
融合蛋白質を作製するための発現ベクター
次に本発明の融合蛋白質を作製するための発現ベクターについて説明する。
本発明の発現ベクターは、ユビキチンのｃＤＮＡと、疾病抗原蛋白質のｃＤＮＡを組み込むマルチクローニングサイトと、細胞質内取り込み受容体リガンドのｃＤＮＡを含む。図１に本発明の発現ベクターの構成図を示す。ここではリガンドの具体例としてヒートショックプロテインＨＳＰｇｐ９６Ｃ末端のアミノ酸配列ＫＤＥＬのｃＤＮＡを含む構成となっている。このベクターとしては、通常入手することができる発現ベクターあるいはウイルスベクターを適宜用いることができる。例としてはｐＱＥ３０，３１，３２、ｐＣｏｌｄＩ  ＤＮＡ、ｐＥＴ３（以上大腸菌系）、ｐＲＣ／ＣＭＶ（哺乳類）、ｐＡＸｃｗ（哺乳類、アデノウイルスベクター）等をあげることができる。
また、本発明のプ発現ベクターのマルチクローニングサイトには、ＳｗａＩとＦｓｅＩの認識部位が含まれているのが好ましい。これらは８塩基を認識する制限酵素であり、通常の遺伝子には非常にまれにしか現れないので、発現させたい抗原遺伝子に含まれる可能性も低く、それにより、これら制限酵素で発現させたい遺伝子が切断される可能性も非常に低くなり、簡便かつ効率よく所望の遺伝子を挿入することが可能となる。
これらの構成から、本発明の発現ベクターを用いることにより、様々な疾病抗原蛋白質を含有するユビキチン−疾病抗原蛋白質−ＨＳＰｇｐ９６Ｃ末端の融合蛋白質を効率よく作製することが可能となる。【００２８】
本発明の発現ベクターは、通常の組換えプラスミドの作製方法を用いて作製することができる。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）等を参照して作製することが可能である。例えば、後述する本発明の実施例中にある発現ベクターの構造によれば、疾病抗原蛋白質ｃＤＮＡを組み込むマルチクローニングサイトを含む必要要素（プロモータ領域、Ｈｉｓタグ領域なども含む）が全て含まれているため、このような発現ベクターを用いて、その時々の必要とする疾病抗原蛋白質をコードするＤＮＡの配列を組み込むだけで、所望の融合蛋白質を発現する発現プラスミドをより簡便かつ確実に得ることが可能となる。もちろん、上記構成以外にも、例えばＨｉｓタグの代わりに、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）タグ、ｍｙｃタグ、Ｓタグ、もしくはＴ７タグ等を用いることも可能である。【００２９】
融合蛋白質を用いた医薬、抗原提示細胞を用いた医薬、抗原提示細胞の加工方法
次に本発明の融合蛋白質の利用について説明する。
上述した通り、本発明の融合蛋白質は、上記発現プラスミドを用いて得ることができ、抗原提示細胞、特にＤＣにおける抗原の取り込み、プロセシング及び抗原提示を従来と比較して高率で行わしめるという利点がある。よって、融合蛋白質を直接投与する形態の医薬、又はこの融合蛋白質をＤＣなどの抗原提示細胞と同時に投与もしくはＤＣなどの抗原提示細胞に取り込ませた後にそのＤＣなどの抗原提示細胞を投与するという形態のＤＣなどの抗原提示細胞ワクチン作製用の医薬を提供できる。
本発明の融合蛋白質を医薬として用いる場合、感染症やがんの予防薬としても用いることが可能である。ここでいう予防とは、初期感染・発症だけでなく、例えばがんでは手術などを行った後の再発予防なども含まれる。
本発明の融合蛋白質は従来の抗原蛋白質自体、あるいは抗原ペプチドよりも、ＤＣなどの抗原提示細胞を介したＣＴＬ誘導能が高いため、直接投与して体内のＤＣなどの抗原提示細胞に取り込ませる場合でも、あるいは体外でＤＣなどの抗原提示細胞に取り込ませたものをＤＣなどの抗原提示細胞ワクチンとして用いる場合でも、ＣＴＬの誘導能が従来よりも高いという利点がある。それにより、治療効果の高い医薬として用いることが可能となる。あるいは、このワクチンを用いてインビトロでＣＴＬを誘導してそれを患者に投与するという形態も可能である。【００３０】
融合蛋白質そのものを投与する場合には、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であるが、通常投与量として、１用量として０．０１μｇ〜１０ｍｇの範囲で投与することが好ましい。投与回数は、用いる疾病抗原蛋白質の性質、疾病の種類、状態及び患者の状態に応じて適宜選択することができる。例えば抗原性の弱い蛋白質を用いる場合は、例えば週一回投与を連続して１〜数ヶ月行うことができる。患者の機能が活性化してきたらしばらくの間（数週間〜数ヶ月）間隔をおき、その後必要に応じて再度投与を開始しても良い。また、抗原性の強い蛋白質を用いる場合は、一回の投与のみとすることも可能であるし、例えば週一回投与を複数回行っても良い。あるいは、一回投与した後、数週間〜数ヶ月の間隔をおいて再度投与することも可能である。投与する方法としては静脈、皮下、皮内等への注射により注入することも、所属リンパ節へ直接注入することも、直接病変部に注入することも、もしくは点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。これらの投与の際の投与用製剤は、周知の剤型を任意に採用することがでる。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水性担体、あるいはその水性担体に、例えばスクワラン、スクワレンあるいはα−トコフェロール等非毒性油等を加えた水中油滴型エマルジョンとしたものを用いた製剤が挙げられる。
また、本発明の融合蛋白質をＤＣなどの抗原提示細胞に取り込ませた後に、それらのＤＣなどの抗原提示細胞を投与するには、投与する細胞数としては、ヒトの場合、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であるが、通常、一回の投与で１０６〜１０８個／人であることが好ましく、より好ましくは１０７個／人以上である。投与回数は患者の状態により異なるが、通常、４〜６回を１クールとして投与する。投与間隔は投与する樹状細胞数に依存し、１週間から１ヶ月に一度であることが好ましく、さらには投与する樹状細胞数が５×１０６個である場合には２週間に１度、２×１０７以上であるならば１ヶ月に一度投与することが好ましい。投与する方法としては静脈、皮下、皮内等への注射により注入することも、所属リンパ節へ直接注入することも、直接病変部に注入することも、もしくは点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。これらの抗原提示細胞を投与の際の投与用製剤は、周知の剤型を任意に採用することができる。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水性担体、あるいはその水性担体に、例えばスクワラン、スクワレンあるいはα−トコフェロール等非毒性油等を加えた水中油滴型エマルジョンとしてたものを用いた製剤などが挙げられる。【００３１】
融合蛋白質とアップレギュレーターとからなる医薬
次に、本発明の融合蛋白質とアップレギュレーターとを併用した医薬について説明する。
当該医薬は、本発明の融合蛋白質と、アップレギュレーターとを併用したものである。ここで、「アップレギュレーター」とは、それを用いることによりＤＣなどの抗原提示細胞の抗原提示量を増加させる、発現誘導機能を有するものを指す。具体的には、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）やＴＮＦ−α等のサイトカイン、ＯＫＴ４３２、ＢＣＧ等の菌製剤等が挙げられる。
例えば、体内においてがん細胞が存在する場合、通常はその細胞表面にＭＨＣ抗原クラスＩ分子が発現しているが、個体差、あるいはそのがん組織の大きさ、がん種などにより、その発現量は一定していない。発現量が少ない場合は、それだけ抗原提示機能も低くなるため、発現量は多いほうが好ましい。
本発明の医薬においては、これらアップレギュレーターと当該融合蛋白質を組み合わせて投与することにより、体内のがん細胞においてＭＨＣ抗原クラスＩ分子を多く発現させることが可能となるため抗原提示機能も向上し、効率よくがん細胞をＣＴＬの標的にできる。
例えばＤＣとＩＦＮ−γを接触させた場合には、ＤＣの抗原提示がより効率よくなされ、ＣＤ８陽性細胞（ＣＴＬ）を産生することが可能となる。従来であればＭＨＣ抗原クラスＩ分子の発現量が少なくてＣＴＬの標的にならなかったがん細胞でも、ＩＦＮ−γと組み合わせることで、抗原提示機能が回復し、効率よく免疫細胞療法を行うことが可能となる。【００３２】
具体的な方法としては、融合蛋白質を投与し、同時に、もしくは数時間〜数日の期間をおいてＩＦＮ−γなどのアップレギュレーターを投与する。ＩＦＮ−γなどのアップレギュレーターは投与した後、１〜５日目にＭＨＣ抗原クラスＩ発現量を最大限に増加させ、またＤＣなどの抗原提示細胞を成熟させるため、体内で融合蛋白質が例えばＤＣなどの抗原提示細胞に取り込まれる時に抗原提示細胞が効率よく抗原提示できる状態となり、かつ、標的となる細胞におけるＭＨＣ抗原クラスＩ分子の産生量も増加しているため、効率よく治療を行うことが可能となる。投与量として、融合蛋白質は、１用量として０．０１μｇ〜１０ｍｇ、ＩＦＮ−γなどのアップレギュレーターは、国際単位として２００万単位〜３００万単位、ＤＣなどの抗原提示細胞を含む場合、全体の投与量として２０万単位〜３００万単位の範囲で投与することが好ましい。しかしながら最適な投与範囲は、それぞれの治療対象となる患者の諸条件により異なるのは言うまでもない。【００３３】
また、当該融合蛋白質とＩＦＮ−γなどのアップレギュレーターとの組み合わせを体外でＤＣなどの抗原提示細胞に接触させた後、該ＤＣなどの抗原提示細胞を投与してもよい。この場合は、融合蛋白質、ＩＦＮ−γなどのアップレギュレーターをそれぞれ０．０１μｇ〜１０ｍｇ、１千単位２０万単位（国際単位として）の量に対して、ＤＣなどの抗原提示細胞を１ｘ１０５〜１ｘ１０７個（細胞数）用いて接触させれば効果的に樹状細胞の抗原提示能を発揮させることができる。
これら融合蛋白質とアップレギュレーター、もしくは融合蛋白質とアップレギュレーター及びＤＣなどの抗原提示細胞とを組み合わせた本発明の医薬は、これらに他に、通常投与する際に採用される剤型に応じて、通常使用されるに任意の担体を用いてもよい。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水性担体、あるいはその水性担体に、例えばスクワラン、スクワレンあるいはα−トコフェロール等非毒性油等を加えた水中油滴型エマルジョンとして用いてもよい。【００３４】
融合蛋白質を用いた抗原デリバリー方法、抗原デリバリー剤
本発明の抗原デリバリー方法、抗原デリバリー剤は、本発明の融合蛋白質が抗原提示細胞の細胞内に取り込まれることにより、ＭＨＣ抗原クラスＩ及びクラスＩＩ両方の経路により抗原提示がなされるものである。特に、本発明の抗原デリバリー方法、抗原デリバリー剤は、全蛋白質の形態にある疾病抗原蛋白質を、抗原提示細胞において、ＭＨＣ抗原クラスＩの経路により、抗原提示させるのに適している。
従来の抗原提示方法では、ＣＴＬを誘導するためにＭＨＣ抗原クラスＩ経路の抗原提示をしようと思っても、抗原提示できるほどに十分な抗原取り込みが行われなかったり、ＭＨＣ抗原クラスＩＩの経路に乗ってしまい、効率よく抗原提示を行うことができなかった。しかしながら本発明のデリバリー剤、デリバリー方法では、貪食によって本発明の融合蛋白質が細胞内に取り込まれたとしても、ユビキチンとＨＳＰｇｐ９６Ｃ末端（ＫＤＥＬ）により、疾病抗原蛋白質は細胞内の小胞体に取り込まれ、疾病抗原蛋白質が、適切に分解されて抗原ペプチドが細胞表面に提示されることになる（ＭＨＣ抗原クラスＩ経路）。
さらに、それだけではなく、従来どおり貪食によってＭＨＣ抗原クラスＩＩへの経路にも乗るため、ＭＨＣ抗原クラスＩ及びクラスＩＩ経路両方から、ＣＴＬ（ＣＤ８陽性細胞）及びヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性細胞）を誘導し、従来以上の免疫機能活性化を可能にする。これにより、従来以上に治療効率を向上させることが可能となる。【００３５】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものでないことは言うまでもない。
実施例１
発現ベクターの作製
まず、疾病抗原蛋白質を組み込む前の、マルチクローニングサイトを有する発現ベクターとして、ユビキチン（以下Ｕｂｉともいう）をコードする塩基配列、マルチクローニングサイトおよびＨＳＰｇｐ９６Ｃ末端（Ｃｔ）をコードする塩基配列を含む発現ベクターを作製した。【００３６】
１．ＨＳＰｇｐ９６Ｃ末端ＤＮＡの合成
合成にあたっては、以下の合成ＤＮＡオリゴマーを用いた。
配列番号１：５’−ＧＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＧ−３’（ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ：Ｆ）
配列番号２：３’−ＣＣＣＡＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＣＴＡＧ−５’（ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ：Ｒ）
上記配列をアニーリング（９５℃、５ｍｉｎ→３０℃、１０分→４℃）した後、その配列を、ｐＩＶＥＸ２．４ａ（ロシュ社製）を制限酵素ＳｍａＩ及びＢａｍＨＩで処理したベクターにライゲーションにより挿入した。その後、配列を挿入したプラスミドでＥ．Ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）をトランスフォームし、ついで培養、コロニーセレクションをおこなった。
その後、シーケンサーで配列を確認し、該プラスミドにＨＳＰｇｐ９６Ｃ末端ＤＮＡ、すなわち、ＫＤＥＬをコードするＤＮＡ配列が挿入されたことが確認された。かくして、プラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔを得た。【００３７】
２．ユビキチン挿入用ＤＮＡの作製
テンプレートは、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２，００６;  ８４:  １−１０に記載の、配列番号２３に示すユビキチンをコードするＤＮＡ配列を含むｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０ｍＵｂを用いてＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２，００６;  ８４:  １−１０に記載の通り作製した。プライマーとして、以下の配列を有する合成ＤＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲにより配列を増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃、３分→（９４℃、３０秒；６０℃、３０秒；７２℃、３０秒）×３０サイクル→７２℃、７分→４℃とした。
2007058235.tif 000003
配列番号３中、実線下線はＳａｌＩ領域、点線下線はＵｂｉ配列を示す。また、配列番号４中、下線はＳｐＨＩ領域を示す。
ＰＣＲにより、Ｕｂｉ配列下流にｐＴｒａｃｅｒ由来のマルチクローニングサイトを含むＤＮＡ配列が合成された。
この配列から、ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＶ断片を取り出し、上記１．で作製したｐＩＶＥＸ２．４ａ−ＨＳＰｇｐ９６ＣｔをＳａｌＩ及びＳｍａＩで処理し、ライゲーションして挿入した。このプラスミドで大腸菌をトランスフォームし、上記１．と同様にコロニーセレクションを行い、シーケンサーで塩基配列を確認したところ、プラスミドにユビキチン配列及びマルチクローニングサイトも挿入されたことが確認された。かくしてプラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ−Ｕｂｉ−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔを構築した。【００３８】
３．ＦａｃｔｏｒＸａサイトとユビキチン配列間の短縮
上記２．で作製されたプラスミドは、ユビキチン、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、ＨＳＰｇｐ９６Ｃ末端配列のほか、Ｔ７プロモーター領域、ＨｉｓＴａｇ領域、及びＦａｃｔｏｒＸａサイトを有している。構成としてはＴ７−ＨｉｓＴａｇ−ＦａｃｔｏｒＸａ−Ｕｂｉ−ＭＣＳ−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔとなっているが、ここで、ＦａｃｔｏｒＸａサイト下流の制限酵素ＳａｃＩＩ領域からＵｂｉ配列上流のＳａｌＩ領域を削除してＸａサイトとユビキチン配列間を短縮した。
まず、ＳａｌＩで切断し、ＳａｌＩ−ＳｍａＩアダプター配列を挿入した。その後ＳｍａＩで切断し、セルフライゲーションにより再び環状に戻した。その後、大腸菌（ＤＨ５α）をトランスフォームし、コロニーセレクションにより選別を行った。
次いでＳｍａＩ及びＳａｃＩＩにより切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより末端部分を平滑化した。その後再びセルフライゲーションさせ、大腸菌をトランスフォーム、コロニーセレクションを行った。
選別されたプラスミドの配列をシーケンサーで確認したところ、ＦａｃｔｏｒＸａサイトのＳａｃＩＩ領域が削除されていることが確認された。かくしてプラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ（△ＳａｃＩＩ）−Ｕｂｉ−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔを構築した。【００３９】
４．マルチクローニングサイトの入れ替え
次に、抗原遺伝子の挿入効率を上げるため、８塩基を認識するＳｗａＩ及びＦｓｅＩ認識配列を含むマルチクローニングサイトにするため、マルチクローニングサイトの入れ替えを行った。
上記３．で作製したｐＩＶＥＸ２．４ａ（△ＳａｃＩＩ）−Ｕｂｉ−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔのマルチクローニングサイトを新たなサイトに替えるため、下記合成ＤＮＡオリゴマーを用いた。
配列番号５：５’−ＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＣＡ−３’（ＳｗａＩ：Ｆ）
配列番号６：３’−ＣＡＴＧＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧ−５’（ＦｓｅＩ：Ｒ）
上記配列をアニーリング（９５℃、５分→３０℃、１０分→４℃）し、ｐＩＶＥＸ２．４ａ（ΔＳａｃＩＩ）−Ｕｂｉ−ＨＳＰｇｐ９６ＣｔをＫｐｎＩとＰｓｔＩで切断した後にライゲーションを行い、大腸菌をトランスフォームした。その後、コロニーセレクションを行い、シーケンサーで配列を確認すると、確かに新たなマルチクローニングサイトが挿入されていることが確認された。
かくして、マルチクローニングサイトを有する発現ベクターとして、ｐＩＶＥＸ２．４ａ−（・ＳａｃＩＩ）−Ｕｂｉ−ＭＣＳ−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔを構築した。【００４０】
実施例２
がん抗原蛋白質をコードする塩基配列を含む融合蛋白質の発現プラスミドの作製
本発明の発現プラスミドの一例として、図１に示す構造を有し、疾病抗原蛋白質としてメラノーマ抗原であるＴＲＰ−２を含む融合蛋白質を発現するプラスミドを作製した。【００４１】
１．ユビキチン−ｍＴＲＰ−２−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ融合蛋白質を発現する発現プラスミドの作製
マウスチロシナーゼ関連蛋白質（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ２：ｍＴＲＰ−２）ｃＤＮＡの全長鎖は以下のように単離した。マウス黒色腫細胞Ｂ１６より全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型に、下記配列の合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、９４℃、３０秒、（９４℃、３０秒；６０℃、３０秒；７２℃、９０秒）×３０サイクル、７２℃、７分とした。
配列番号７：５’−ＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＧＡＴＧＧＧＧ−３’（ＴＲＰ−２：Ｆ）
配列番号８：５’−ＡＡＡＡＣＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＧＴＧＴＡＴＣＴＣＴＴ−３’（ＴＲＰ−２：Ｒ）
上記のＰＣＲにより得た１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＳｍａＩサイトに挿入し、クローニングした。塩基配列を確認し、ｍＴＲＰ−２ｃＤＮＡの全長鎖が挿入されたものをｐＵＣ１９／ｍＴＲＰ−２とした。【００４２】
ｐＵＣ１９／ｍＴＲＰ−２をＦｓｅＩで消化し、ｍＴＲＰ−２全長鎖ｃＤＮＡ断片を得た。これをライゲーション反応によりｐＩＶＥＸ２．４ａ（δＳａｃＩＩ）−Ｕｂｉ−ＭＣＳ−ＨＳＰｇｐ９６ＣｔのＦｓｅＩサイトに挿入した。
次にこの反応液を用いて大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換し、クローニングを行った。得られたクローンの塩基配列を確認し、挿入されたＤＮＡがｐＵＣ１９／ｍＴＲＰ−２と同一の配列をもつものをｐＩＶＥＸ２．４ａ／Ｕｂｉ−ＴＲＰ−２−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔとした。【００４３】
ｐＩＶＥＸ２．４ａ／Ｕｂｉ−ＴＲＰ−２−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔを鋳型とし、プライマーに下記配列の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｍＴＲＰ−２ｃＤＮＡの５’端の一部と３’端の一部側を欠損させたＤＮＡ断片を作製した。
配列番号９：５’−ＡＴＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＧＣＡＧＴＧ−３’（ｍＴＲＰ−２−２：Ｆ）
配列番号１０：５’−ＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣ−３’（ｍＴＲＰ−２−２：Ｒ）
次にこの断片をＦｓｅＩとＳｗａＩで消化後、ライゲーション反応によりｐＩＶＥＸ２．４ａ（ΔＳａｃＩＩ）−Ｕｂｉ−ＭＣＳ−ＨＳＰｇｐ９６ＣｔのＦｓｅＩ／ＳｗａＩサイトに挿入した。この反応液を用いて大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換し、クローニングを行った。塩基配列を確認し、図１に示す構造を有する、デザイン通りの配列をもつ発現プラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ／ＵΔＴＣを構築した。この発現プラスミドは、ユビキチン−ｍＴＲＰ−２−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔの本発明の融合蛋白質（以下、ＵＴＣという）を発現する。【００４４】
２．比較例用の融合蛋白質もしくは蛋白質を発現する発現プラスミドの作製
１）．ｍＴＲＰ−２−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ融合蛋白質を発現する発現プラスミ
ドの作製
ｐＩＶＥＸ２．４ａ／ＵΔＴＣをＳａｌＩとＦｓｅＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ処理し、セルフライゲーションを行った。この反応液で大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換し、クローニングを行った。塩基配列を確認し、ユビキチンを含まない、ｍＴＲＰ−２−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔの融合蛋白質（以下、ＴＣという）を発現する発現プラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ／ΔＴＣを構築した。【００４５】
２）．ユビキチン−ｍＴＲＰ−２融合蛋白質を発現する発現プラスミドの作製
上記実施例２の１．と同様に、ｐＩＶＥＸ２．４ａ／ＴＲＰ−２を鋳型、プライマーに下記配列の合成ＤＮＡと配列番号１０の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｍＴＲＰ−２ｃＤＮＡの５’端の一部と３’端の一部を欠損させたＤＮＡ断片を作製した。
配列番号１１：５’−ＡＴＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＧＣＡＧＴＧ−３’（ｍＴＲＰ−２−３：Ｆ）
この断片をＦｓｅＩとＳｗａＩで消化後、ライゲーション反応によりｐＩＶＥＸ２．４ａ（ΔＳａｃＩＩ）−Ｕｂｉ−ＭＣＳ−ＨＳＰｇｐ９６ＣｔのＦｓｅＩ／ＳｗａＩサイトに挿入した。さらにＳｗａＩとＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行った。この反応液を電気泳動し、直鎖状にしたプラスミドＤＮＡを回収した。【００４６】
その後、終止コドンを挿入するための下記配列の合成ＤＮＡをアニーリングし、末端にリン酸基を導入したＤＮＡと、先に直鎖状にしたプラスミドＤＮＡをライゲーション反応により結合させた。
配列番号１２：５’−ＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＡ−３’（Ｔｅｒｍ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）
この反応液で大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換し、クローニングを行った。塩基配列を確認し、ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ末端配列（ＫＤＥＬ）を含まない、ユビキチン−ｍＴＲＰ−２の融合蛋白質（以下、ＵＴという）を発現する発現プラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ／ＵΔＴを構築した。【００４７】
３）．ｍＴＲＰ−２蛋白質を発現する発現プラスミドの作製
ｐＩＶＥＸ２．４ａ／ＵΔＴをＳａｌＩとＦｓｅＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ処理し、セルフライゲーションを行った。この反応液で大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換し、クローニングを行った。塩基配列を確認し、ユビキチン及びＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ末端配列（ＫＤＥＬ）を含まない、ｍＴＲＰ−２蛋白質（以下、Ｔという）を発現する発現プラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ／ΔＴを構築した。【００４８】
実施例３
各種融合蛋白質または蛋白質の作製
インビトロトランスレーション用のキットＲＴＳ  Ｐｒｏｔｅｏｍａｓｔｅ  Ｅ．ｃｏｌｉＨＹ（ロシュ社製）を利用し、マニュアルに従い実施例２で作製した各々の発現プラスミドを含む反応液を調製した。ＲＴＳ  ＰｒｏｔｅｏＭａｓｔｅｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）で３０℃、２４時間反応を行った。
各々の反応液を回収し、ニッケルを固層化したアフィニティーカラムを用い、常法にてＨｉｓ−ｔａｇがついた各融合蛋白質及び蛋白質を精製した。各精製標品についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製度を確認したところ、いずれもほぼ単一バンドであった。
また、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、ＯＢ０５）、及び抗マウスＴＲＰ−２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、ｓｃ−２５５４４）を用いて常法にてウェスタンブロッティングを行い、精製した各融合蛋白質に反応することを確認した。図２に抗マウスＴＲＰ−２抗体を用いたウェスタンブロッティングの画像を示す。【００４９】
実施例４
融合蛋白質の樹状細胞へ及ぼす抗原提示効果の評価
実施例３で作製した各種融合蛋白質または蛋白質の樹状細胞へ及ぼす抗原提示効果を、感作リンパ球の数の測定、細胞障害性試験及びサイトカイン産生能測定により評価した。【００５０】
１．樹状細胞の誘導
実施例３で得られた融合蛋白質を用いて樹状細胞（ＤＣ）による抗原提示能を評価するため、ＤＣの調製を行った。
Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６マウス（Ｈ−２ｂ、８週齢、雄）から骨髄細胞を採取し、カナマイシンとストレプトマイシンを夫々５０μｇ／ｍｌ含んだＡＩＭ−Ｖ培地（ＧＩＢＣＯ社製、０８７−０１１２ＤＫ）に懸濁させた。この懸濁液をセルストレイナー（４０μｍ、Ｆａｌｃｏｎ社製、ＲＥＦ３５２３４０）でろ過した後、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞の沈殿を回収した。この沈殿を０．８４％ＮＨ４Ｃｌ溶液で懸濁させ、室温で５分間静置して赤血球を溶解させた。ここに培地を加え、遠心し、沈殿を回収し、洗浄した。さらに２回洗浄し、回収された細胞を培地に懸濁させた。【００５１】
細胞数を数え、２．５×１０７細胞／１５ｍｌ／フラスコで７５ｃｍ２のフラスコに移し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２時間静置した。その後フラスコを静かに振とうし、非付着細胞を除き、付着細胞上に新たに２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製、３１５−０３）と１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−４（ＩＬ−４，Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製、２１４−１４）を含んだ培地を１５ｍｌ加えた。その後５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養を続け、培養開始後７日目まで一日おきに培地を交換し、新鮮なＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を含んだ培地で培養した。７日目に細胞を回収し、その一部をフローサイトメーターで解析した。
その結果、ＤＣのフェノタイプであるＣＤ１１ｃ陽性細胞が７６．２％であった。７日目に培地を交換した細胞（未成熟ＤＣ）を２．４×１０６細胞／３ｍｌ／ウェルで６穴プレートに蒔き、そこへ、実施例３で作製したＵＴＣ、ＵＴ、ＴＣ、Ｔの各融合蛋白質または蛋白質とＨ−２Ｋｂ拘束性ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ：マウスＴＲＰ−２ペプチド）を各々２２５ｐｍｏｌｅ加え、さらに、抗原提示を促進するアップレギュレーターとして、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製、３１５−０５）を２０ｎｇ／ｍｌとなるように加えた。その後更に２日間培養を続け、成熟ＤＣとした。【００５２】
２．樹状細胞の抗原提示能の評価
Ａ）感作リンパ球の調製１
上記１．で調製した、各成熟ＤＣをＣ５７Ｂｌａｃｋ／６マウス（１０週齢、雄：上記１．で骨髄細胞を採取するために用いたＣ５７Ｂｌａｃｋ／６マウスと同一の遺伝子を持つ）の腹腔に１．５×１０５細胞／マウスで投与した。投与後１０日目に各マウスから脾細胞を回収し、カナマイシンとストレプトマイシンを夫々５０μｇ／ｍｌ含んだＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製、１１８７５−０９３）に懸濁させた。
次にこの懸濁液をセルストレイナー（４０μｍ、Ｆａｌｃｏｎ社製、ＲＥＦ３５２３４０）でろ過し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞の沈殿を回収した。回収した細胞からＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を利用し、ＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製、１３０−０４９−４０１）により、各マウスの脾細胞から各ＣＤ８陽性画分と各ＣＤ８枯渇画分を回収した。これらのＣＤ８陽性画分は、ＭＨＣ抗原クラスＩ経路で抗原提示した成熟ＤＣにより活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞を含み、ＣＤ８枯渇画分は、ＭＨＣ抗原クラスＩＩ経路で抗原提示した成熟ＤＣにより活性化したＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む。
各ＣＤ８陽性画分は細胞数を数えた。各画分の細胞数のグラフを図３に示す。
回収細胞数はＵＴＣとＵＴを添加した場合が、ＴＣ、ＴおよびマウスＴＲＰ−２ペプチドを添加した場合よりも多い傾向が認められた。なお、図３では、ＣＤ８陽性細胞数は、ＵＴＣの場合よりもＵＴの場合の方が多いが、これは見掛けの細胞数を示すものであり、実際の抗原提示能の効果は、細胞障害性Ｔ細胞の活性化を示す、後述する図４のデータと共に見て評価すべきものである。
また、各ＣＤ８枯渇画分は１０％ＦＢＳを含むｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＰＭＩ培地で各２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した後、２４ウェルプレートに蒔いた。その全ウェルにＴ蛋白質を２００ｎｇ加えることでＴＲＰ−２特異的な刺激を加え、１日目、３日目に夫々の培養上清を回収した。【００５３】
Ｂ）感作リンパ球の調製２
上記Ａ）と同様に、各成熟ＤＣをＣ５７Ｂｌａｃｋ／６マウスの腹腔に１．５×１０５細胞／マウスで各３匹に投与し、一週間後に同じ条件で再度各成熟ＤＣを投与した。投与後１０日目に各マウスから脾細胞を回収し、カナマイシンとストレプトマイシンを夫々５０μｇ／ｍｌ含んだＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製、１１８７５−０９３）に懸濁させた。その後、上記Ａ）と同様に各マウスの脾細胞から各ＣＤ８陽性画分を回収した。この各ＣＤ８陽性画分は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）とインターロイキン２（ＩＬ−２）（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ，ＣＨＩＲＯＮ社製）を５Ｕ／ｍｌを含むｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ１６４０に２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、２０μＭ  Ｌ−グルタミン、１０μＭ  ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１００ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有させた）培地で２日間培養を行った。【００５４】
Ｃ）．細胞障害性試験（ＭＨＣ抗原クラスＩ経路による抗原提示効果）
上記Ｂ）．で培養して得られた各ＣＤ８陽性画分に含まれるＣＤ８陽性Ｔ細胞による、がん細胞に対する細胞障害性、すなわち殺傷効果を調べた。
ＴＲＰ−２を産生することが判っているＢ１６メラノーマ（Ｈ−２Ｋｂ）を１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ社製、１１９６５−０９２）で培養し、継代後１日目に、アップレギュレーターとしてＩＦＮ−γを２０ｎｇ／ｍｌで加えて培養した。また、ＴＲＰ−２を産生しないＭ５０７６肉腫（Ｈ−２Ｋｂ）を、１０％ＦＢＳを含むｃｏｍｐｌｅｔｅＲＰＭＩ培地で継代培養しておいた。
これらの各細胞を継代後３日目に回収し、１０％ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製、１１８３５−０３０）に懸濁し、カルセインＡＭ（ＤＯＴＩＴＥ社製、３４９−０７２０１）を１／１０００容量加え、３７℃で２０分間静置した。カルセインＡＭを取り込んだ各細胞懸濁液中の余分なカルセインＡＭを除くため各細胞を１０％ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、細胞数を数えた後、２×１０４細胞／１００μｌ／ウェルで９６穴プレートに蒔き、細胞障害性試験のターゲット細胞とした。【００５５】
上記Ｂ）．で培養して調製した各ＣＤ８陽性画分から各ＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター細胞）を回収し、細胞数を数え、４×１０４、１×１０５、及び２×１０５細胞／１００μｌ／ウェルでターゲット細胞に添加し（エフェクター細胞数／ターゲット細胞数の割合：Ｅ／Ｔ比＝２、５、及び１０）、５％ＣＯ２存在下３７℃で３時間反応させた。
反応後、軽くプレートを振とうし１５００ｒｐｍで遠心した。速やかに各ウェルの上清を回収し、別の９６穴プレートに夫々移した後、λｅ×＝４９０、λｅｍ＝５１５で各ウェルの蛍光強度を測定し、この蛍光強度から細胞障害活性を計算した。その結果を図４のグラフに示す。図４のグラフに示すとおり、特に、本発明の融合蛋白質であるＵＴＣ処理したＤＣの細胞障害活性については、ＴＲＰ−２を産生しないＭ５０７６肉腫に対する細胞障害活性に比べ、Ｂ１６メラノーマ（Ｂ１６）に対する障害性が高く、特異的な細胞障害性であることが理解される。また、この特異的な細胞障害活性は、本発明の融合蛋白質であるＵＴＣ処理したＤＣの場合に最も高いことも理解される。【００５６】
以上より、ＤＣのＭＨＣ抗原クラスＩに抗原を提示させる方法として、ユビキチン−抗原蛋白質−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔの形態の融合蛋白質を添加するのが最も効率が高く、実際に抗原特異的細胞障害活性（ＣＴＬ）の誘導の効率も最も高いことが明らかになった。【００５７】
Ｄ）．サイトカイン産生能（ＭＨＣ抗原クラスＩＩへの抗原提示効果）
上記Ａ）．でＴ蛋白質を添加して培養し、回収したＣＤ８枯渇画分の培養上清中のＩＦＮ−γ及び、ＩＬ−４の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製、３５−３９１２）に精製抗マウスＩＦＮ−γ（ｃａｐｔｕｒｅ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、５５１２１６）及び精製抗マウスＩＬ−４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、５５４３８７）を夫々５μｇ／ｍｌで１００μｌ入れ、３７℃で２時間静置した。
その後各プレートを２００μｌ／ウェルの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で５回各ウェルを洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒＩｎ  ＴＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製、３７５３５）を２００μｌ／ｗｅｌｌで入れた。３７℃で２時間静置した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで５回各ウェルを洗浄した。これらのプレートに１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌに調製したＩＦＮ−γ（スタンダード）またはＩＬ−４（スタンダード）を１００μｌ／ウェルで入れると同時に、各培養上清を１００μｌ／ウェルで入れた。３７℃で２時間静置した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで５回各ウェルを洗浄した。【００５８】
洗浄後、５μｇ／ｍｌに調製したビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、５５４４１０）またはビオチン化ラット抗マウスＩＬ−４モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、５５４３９０）を１００μｌ／ウェルで入れた。３７℃で２時間静置した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで５回各ウェルを洗浄した。ＨＯＲＳＥＲＡＤＩＳＨ  ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ  ＡＶＩＤＩＮ  Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、Ａ−２００４）を５μｇ／ｍｌに調製し、１００μｌ／ウェルで各ウェルに入れ３７℃で２時間静置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで７回各ウェルを洗浄した後、速やかにＴＭＢパーオキシダーゼ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、１７２−１０６８）を１００μｌ／ウェルで加え６５０ｎｍの吸光度を測定した。ＩＦＮ−γとＩＬ−４の各スタンダードの吸光度から検量線を作成し、各培養上清中のＩＦＮ−γとＩＬ−４の濃度をもとめた。その結果を図５及び６に示す。【００５９】
これらの結果から、ＩＦＮ−γの産生でも、ＩＬ−４の産生でも、本発明の融合蛋白質であるＵＴＣを添加した場合が最も産生量が多かった。
以上から、ユビキチン−抗原蛋白質−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔの形態の本発明の融合蛋白質で樹状細胞を抗原提示することにより、ＭＨＣ抗原クラスＩだけでなく、ＭＨＣ抗原クラスＩＩへの提示も同時に効率高く行われることが明らかになった。【００６０】
実施例５
融合蛋白質によるワクチン効果の評価
ＴＲＰ−２を疾病抗原蛋白質として用いた生体における、本発明の融合蛋白質の効果を確認する試験を行った。
１．融合蛋白質で抗原提示させたＤＣによるワクチン効果の検討（ｉｎ  ｖｉｖｏでのワクチン効果）
実施例４の１．と同様にＤＣを誘導し、ＵＴＣ及びＴＲＰ−２ペプチドを各々加え、同時に２０ｎｇ／ｍｌのアップレギュレーターとしてのＩＦＮ−γも加え一晩培養を行った。この操作で抗原提示させたＤＣを回収し、３０ｐｍｏｌ抗原／２×１０５細胞／マウスで皮下投与を行った（ＵＴＣ添加ＤＣ：ＤＣ−ＵＴＣ、ＴＲＰ−２ペプチド添加ＤＣ：ＤＣ−ペプチドまたは生理食塩水群は各１０匹を用いた）。一週間後、同様に追加の免疫を行い、その１０日後、２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γで処理したＢ−１６メラノーマを１×１０５細胞／マウスで腹部皮下に投与した。その後のＢ−１６メラノーマ腫瘍の生着率の観察と腫瘍体積の観察を行った。【００６１】
生着率の結果を図７に示す。縦軸は非生着率を横軸はＢ−１６移植後の日数を表している。図７から明らかなようにＵＴＣで抗原提示させたＤＣで免疫した群は生理食塩水群と比較して生着までの時間が有意に（ｐ＜０．０５）遅くなっていた。またＴＲＰ−２ペプチド群は生理食塩水群とほぼ変わらない結果であった。
腫瘍体積の結果を図８に示す。縦軸は平均腫瘍体積（短径２×長径／２＝ｍｍ３）で表してある。生食群は最も腫瘍の増殖が速く、１４日目に一匹、１７日目に３匹が死亡した。ＴＲＰ−２ペプチド群は生食群と比較して有意差がなかった。一方、ＵＴＣ群はＴＲＰ−２ペプチド群と比較しても、有意な（ｐ＜０．０１）増殖抑制が観察された。
以上から、融合蛋白質で抗原提示させたＤＣはペプチドパルスＤＣよりも強い抗腫瘍免疫を誘導できることが示された。【００６２】
２．直接融合蛋白質を体内へ投与した場合のワクチン効果の検討
上記１．の抗原提示させたＤＣの場合と同様の投与スケジュールで１５０ｐｍｏｌｅのＵＴＣ単独（ｎ＝１０）、ＴＲＰ−２ペプチド単独（ｎ＝１０）または生理食塩水（ｎ＝８）を二回後足蹠（ｆｏｏｔ  ｐａｄ）に投与した。その１０日後に２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γで処理したＢ−１６メラノーマを１×１０５細胞／マウスで腹部皮下に投与した。
Ｂ−１６メラノーマを投与した後、腫瘍体積を観察した。結果を図９に示す。図９から明らかなようにＵＴＣ群とＴＲＰ−２ペプチド群は生食群と比較して有意な（ｐ＜０．０５）腫瘍増殖抑制効果を示した。
このことから、本発明の融合蛋白質は直接体内に投与する場合でも、少なくともＴＲＰ−２ペプチドと同等のワクチン効果が示され、本発明の融合蛋白質ではペプチドと異なりＨＬＡタイプに拘束されることなしに任意の固体に対してワクチン効果が期待出来る。【００６３】
実施例６
ウイルス抗原蛋白質を含む融合蛋白質の発現プラスミドの作製
実施例１で作製された発現ベクターにヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ）抗原蛋白質である、ＨＰＶ１６型Ｅ７抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）をコードするｃＤＮＡを挿入して発現プラスミドを作製した。【００６４】
１．ユビキチン−ＨＰＶ１６Ｅ７−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔの融合蛋白質を発現する発現プラスミドの作製
ヒトパピローマウイルス１６型Ｅ７抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）ｃＤＮＡの全長鎖は以下のように単離した。
Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｈａｇｅｍｉｄをＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、これを鋳型に用いて、下記配列の合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、３００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、９４℃、６０、（９４℃、３０秒；６３℃、３０秒；７２℃、６０秒）×３０サイクル、７２℃、７分とした。
配列番号１７：５’−ＴＴＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３’（ＨＰＶ１６−Ｅ７−１：Ｆ）
配列番号１８：５’−ＣＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧ−３’（ＨＰＶ１６−Ｅ７−２：Ｒ）
【００６５】
上記の約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化し、ｐＲＣ／ＣＭＶのＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに挿入し、クローニングした。塩基配列を確認し、ＨＰＶ１６−Ｅ７ｃＤＮＡの全長鎖が挿入されたものをｐＲＣ−ＣＭＶ／ＨＰＶ１６−Ｅ７とした。さらにｐＲＣ−ＣＭＶ／ＨＰＶ１６−Ｅ７を鋳型に、下記配列の合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＫｐｎＩとＰｓｔＩで消化し、ｐＩＶＥＸ２．４ａ（ΔＳａｃＩＩ）−Ｕｂｉ−ＭＣＳ−ＨＳＰｇｐ９６ＣｔのＫｐｎＩ／ＰｓｔＩサイトにライゲーション反応により挿入した。ＰＣＲ条件は、９４℃、６０、（９４℃、３０秒；６３℃、３０秒；７２℃、６０秒）×３０サイクル、７２℃、７分とした。
配列番号１９：５’−ＴＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧ−３’（ＨＰＶ１６−Ｅ７−Ｆ：Ｆ）
配列番号２０：５’−ＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧ−３’（ＨＰＶ１６−Ｅ７−Ｒ２：Ｆ）
次にこの反応液を用いて大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換し、クローニングを行った。得られたクローンの塩基配列を確認し、挿入したｐＲＣ−ＣＭＶ／ＨＰＶ１６Ｅ７と同一の配列をもつプラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ／Ｕｂｉ−ＨＰＶ１６Ｅ７−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔを構築した。この発現プラスミドは、Ｕｂｉ−ＨＰＶ１６Ｅ７−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔの融合蛋白質（以下、ＵＥＣという）を発現する。【００６６】
２．比較例用の融合蛋白質または蛋白質を発現する発現プラスミドの作製
１）．ＨＰＶ１６Ｅ７−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔの融合蛋白質を発現する発現プラスミドの作製
ｐＩＶＥＸ２．４ａ／Ｕｂｉ−ＨＰＶ１６Ｅ７−ＨＳＰｇｐ９６ＣｔをＳａｌＩで消化し、ユビキチンをコードしている領域を欠失させ、セルフライゲーションを行った。得られたクローンの塩基配列を確認し、ユビキチンを含まない、ＨＰＶ１６Ｅ７−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔの融合蛋白質（以下、ＥＣという）を発現する発現プラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ／ＨＰＶ１６Ｅ７−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔを構築した。【００６７】
２）．ユビキチン−ＨＰＶ１６Ｅ７の融合蛋白質を発現する発現プラスミドの作製
上記１）．と同様に、ｐＲＣ−ＣＭＶ／ＨＰＶ１６−Ｅ７を鋳型、プライマーにＨＰＶ１６−Ｅ７−Ｆ（配列番号１９）と下記配列の合成ＤＮＡ（配列番号２１）１６−Ｅ７−Ｒを用いてＰＣＲを行い、約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。
配列番号２１：５’−ＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧ−３’（１６−Ｅ７−Ｒ：Ｒ）
上記の約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＫｐｎＩとＰｓｔＩで消化し、ｐＩＶＥＸ２．４ａ（ΔＳａｃＩＩ）−Ｕｂｉ−ＭＣＳ−ＨＳＰｇｐ９６ＣｔのＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ  サイトにライゲーション反応により挿入した。さらにＢａｍＨＩで消化し、セルフライゲーションすることで、ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔをコードする領域を欠失させた。得られたクローンの塩基配列を確認し、ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ末端配列を含まない、Ｕｂｉ−ＨＰＶ１６Ｅ７の融合蛋白質（以下、ＵＥという）を発現する発現プラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ／Ｕｂｉ−ＨＰＶ１６Ｅ７を構築した。【００６８】
３）．ＨＰＶ１６Ｅ７の蛋白質を発現する発現プラスミドの作製
ｐＩＶＥＸ２．４ａ／Ｕｂｉ−ＨＰＶ１６Ｅ７をＢａｍＨＩで消化した後、セルフライゲーションを行った。この反応液で大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換し、クローニングを行った。得られたクローンの塩基配列を確認し、ユビキチン及びＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ末端配列を含まない、ｍＨＰＶ１６Ｅ７蛋白質（以下、Ｅという）を発現する発現プラスミドｐＩＶＥＸ２．４ａ／ＨＰＶ１６Ｅ７を構築した。【００６９】
実施例７
各種融合蛋白質及び蛋白質の作製
インビトロトランスレーション用のキットＲＴＳ  ＰｒｏｔｅｏｍａｓｔｅｒＥ．ｃｏｌｉＨＹ（ロシュ社製）を利用し、マニュアルに従い、実施例６で作製した各々の発現プラスミドを含む反応液を調製した。ＲＴＳ  ＰｒｏｔｅｏＭａｓｔｅｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）で３０℃、２４時間反応を行った。反応後目的の蛋白質が発現されているか抗ＨＰＶ１７Ｅ７抗体（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ＭＡＢ８６８０）を用いて常法にてウェスタンブロッティングを行い、すべての蛋白質が発現していることを確認した。図１０に抗ＨＰＶ１６Ｅ７抗体を用いたウェスタンブロッティングの画像を示す。【００７０】
各々の反応液を回収し、ニッケルを固層化したアフィニティーカラムを用い、常法にてＨｉｓ−ｔａｇがついた各融合蛋白質を回収し、さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００でゲルろ過を行って精製した。各精製標品についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＣＢＢ染色を行い、精製度を確認した。精製後の画像を図１１に示す。図１１に示すとおり、いずれも単一バンドであり、抗ＨＰＶ１７Ｅ７抗体（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ＭＡＢ８６８０）を用いて常法にてウェスタンブロッティングを行い、精製した各融合蛋白質に反応することを確認した。また、ヒトの樹状細胞を用いた評価に使用するＵＥＣ融合蛋白質のエンドトキシンの含量を測定したところ、１５ｎｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、エンドトキシンによる影響は無視できる量であった。【００７１】
実施例８
融合蛋白質により抗原提示した樹状細胞のワクチン効果の評価
ヒト細胞を用いて、ＨＰＶ１６型Ｅ７抗原蛋白質（ＨＰＶ１６−Ｅ７）を含む、本発明の融合蛋白質（ＵＥＣ）を抗原提示させた樹状細胞のワクチン効果を検証し、ＨＰＶ１６−Ｅ７のエピトープペプチドでパルスした樹状細胞のワクチン効果と比較した。
１．ヒト樹状細胞の誘導
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の健常人ボランティアから末梢血を採取し、比重遠心法にて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。このＰＢＭＣから、ＭＡＣＳ及びＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製，１３０−０５０−２０）を利用して、ＣＤ１４陽性画分とＣＤ１４陰性画分を分離した。
ＣＤ１４陽性細胞をＧＭ−ＣＳＦ（５００  ＩＵ／ｍｌ，ＢＥＲＬＥＸ社製，８７−８９５）とＩＬ−４（５００  ＩＵ／ｍｌ，Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）を含むＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社製，２００１）で５日間培養して、樹状細胞（ＤＣ）に分化させた。一部の細胞は凍結保存し、凍結保存しない細胞は培養上清をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ，ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社製，１００６）及びプロスタグランジンＥ２（１μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ社製，Ｐ６５３２）を含むＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ  Ｍｅｄｉｕｍへ交換し、培養を継続した。培養６日目に、ＤＣに、ＵＥＣ及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性エピトープペプチド（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ：ＨＰＶ１６−Ｅ７のエピトープペプチド）を添加し、終濃度７５ｐｍｏｌｅ／ｍｌとなるようにした。さらに一日培養を継続した。【００７２】
２．抗原提示ＤＣによるリンパ球の感作
凍結保存しておいた上記１．で調製したＣＤ１４陰性細胞集団（１×１０６個）と、上記１．で調製した各ＤＣ（２×１０５個）を、１０％ヒトＡＢ型血清とヒトＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ，Ｃｈｉｒｏｎ社製，８７−８９０）を含むＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、２４ウェルプレートに播種した。その３日後に培養上清を新鮮なものに交換し、７日後に２次刺激を行った。２次刺激は１×１０４個／ウェルのＣＤ１４陰性細胞集団に対して、上記１．と同様に調製した各ＤＣを１×１０３個／ウェル添加し、３時間行った。この細胞懸濁液を用いて、ヒトＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔ（ＭＡＢｔｅｃｈ社製，３４２０−２Ａ）を行った。【００７３】
３．ヒトＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ヒトＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を図１２に示した。ＵＥＣで抗原提示させたＤＣでリンパ球を感作した条件は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性エピトープペプチドをパルスしたＤＣでリンパ球を感作した条件よりもＩＦＮ−γ産生細胞数が多いことが確認された。この結果より、ＵＥＣを使用することで従来のエピトープペプチドパルス法よりも強い細胞性免疫が誘導されることが示され、ＤＣによるＣＴＬの誘導効率が向上すると予想された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上、詳細に説明したように、本発明の融合蛋白質により、抗原提示細胞における抗原提示能を向上させることが可能である。これにより、該融合蛋白質の発現プラスミド、融合蛋白質の製造、該融合蛋白質を用いた抗原提示細胞の加工方法、治療技術といったものまで含めて、優れた抗原提示システムを提供できる。
また、用いる疾病抗原蛋白質により様々な疾病、様々なＭＨＣ抗原（ＨＬＡ）タイプの患者への治療に応用でき、質の高い治療を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の発現ベクターを説明する構造図である。
【図２】インビトロトランスレーション後のウェスタンブロッティングの結果を示す画像である。
【図３】ＵＴＣ，ＵＴ，ＴＣ，Ｔ及びペプチドを用いた各成熟樹状細胞投与後回収されたＣＤ８陽性細胞数を示すグラフである。
【図４】ＵＴＣ，ＵＴ，ＴＣ，Ｔ及びペプチドを用いた各樹状細胞で誘導されたＣＤ８陽性細胞の障害活性を示す表である。
【図５】ＵＴＣ，ＵＴ，ＵＣ，Ｔ及びペプチドそれぞれのＩＦＮ−γ産生能力を比較した試験の結果を示すグラフである。
【図６】ＵＴＣ，ＵＴ，ＴＣ，Ｔ及びペプチドそれぞれのＩＬ−４産生能力を比較した試験の結果を示すグラフである。
【図７】ＵＴＣ及びペプチドをＤＣワクチンに用いた場合の腫瘍生着率の結果を示す図である。
【図８】ＵＴＣ及びペプチドをＤＣワクチンに用いた場合の腫瘍体積の差異を示す図である。
【図９】ＵＴＣ及びペプチドを直接投与した場合の腫瘍体積の差異を示す図である。
【図１０】抗ＨＰＶ１６Ｅ７抗体を用いた各種融合蛋白質（ＵＥＣ，ＵＥ，ＥＣ，Ｅ）のウェスタンブロッティングの画像である。
【図１１】ＵＥＣ，ＵＥ，ＥＣ，ＥそれぞれのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像である。
【図１２】ＵＥＣ及びペプチドをＤＣワクチンに用いた場合のリンパ球集団中のＩＦＮ−γ産生細胞数を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号１：合成ＤＮＡ：ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ：Ｆ
配列番号２：合成ＤＮＡ：ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ：Ｒ
配列番号３：プライマー：Ｕｂｉ−ＳａｌＩ：Ｆ
配列番号４：プライマー：ＳｐＨＩ：Ｒ
配列番号５：合成ＤＮＡ：ＳｗａＩ：Ｆ
配列番号６：合成ＤＮＡ：ＦｓｅＩ：Ｒ
配列番号７：プライマー：ｍＴＲＰ−２：Ｆ
配列番号８：プライマー：ｍＴＲＰ−２：Ｒ
配列番号９：プライマー：ｍＴＲＰ−２−２：Ｆ
配列番号１０：プライマー：ｍＴＲＰ−２−２：Ｒ
配列番号１１：プライマー：ｍＴＲＰ−２−３：Ｆ
配列番号１２：合成ＤＮＡ：Ｔｅｒｍ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ
配列番号１３：Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ：ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ
配列番号１４：ＤＮＡ：Ｕｂｉ−ＭＣＳ−ＨＳＰｇｐ９６Ｃｔ
配列番号１５：ＤＮＡ：ｍＴＲＰ−２
配列番号１６：Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ：ｍＴＲＰ−２
配列番号１７：合成ＤＮＡ：ＨＰＶ１６−Ｅ７−１：Ｆ
配列番号１８：合成ＤＮＡ：ＨＰＶ１６−Ｅ７−２：Ｒ
配列番号１９：合成ＤＮＡ：ＨＰＶ１６−Ｅ７−Ｆ：Ｆ
配列番号２０：合成ＤＮＡ：ＨＰＶ１６−Ｅ７−Ｒ２：Ｒ
配列番号２１：合成ＤＮＡ：ＨＰＶ１６−Ｅ７−Ｒ：Ｒ
配列番号２２：ＤＮＡ：Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ１６  Ｅ７
配列番号２３：合成ＤＮＡ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ
【図１】
2007058235.tif 000004
【図２】
2007058235.tif 000005
【図３】
2007058235.tif 000006
【図４】
2007058235.tif 000007
【図５】
2007058235.tif 000008
【図６】
2007058235.tif 000009
【図７】
2007058235.tif 000010
【図８】
2007058235.tif 000011
【図９】
2007058235.tif 000012
【図１０】
2007058235.tif 000013
【図１１】
2007058235.tif 000014
【図１２】
2007058235.tif 000015
【配列表】
2007058235000001.app
【国際調査報告】
2007058235.tif 000016
2007058235.tif 000017
2007058235.tif 000018
2007058235.tif 000019
2007058235.tif 000020
2007058235.tif 000021
2007058235.tif 000022