(57)【要約】  より安全で食経験豊富な食品成分であって、テストステロン量を増加させる物質を提供する。本発明のテストステロン増加剤は、ビタミンKを有効成分として含有する。ビタミンは、メナキノン-4および／またはメナキノン-7であることが好ましい。この増加剤は、テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病を予防、改善および／または治療するための医薬やサプリメント、健康食品または機能性食品として有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンKを有効成分として含有するテストステロン増加剤。
【請求項２】
前記ビタミンKがビタミンK2である、請求項１に記載のテストステロン増加剤。
【請求項３】
前記ビタミンKがメナキノン-4および／またはメナキノン-7である、請求項１に記載のテストステロン増加剤。
【請求項４】
ビタミンKを有効成分として含有するテストステロン増加剤からなる、テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病を予防、改善および／または治療するための医薬。
【請求項５】
ビタミンKを有効成分として含有するテストステロン増加剤を配合したサプリメント、健康食品または機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テストステロン増加剤に関し、より詳細には内因性テストステロンを増量するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
男性ホルモンの一種であるテストステロンは、筋肉を作る働き、認知機能、血管の柔軟性、脂質代謝、性機能などに広く関与している。テストステロン分泌量は、加齢により減少するが、環境ホルモンの存在も影響している。最近では、極端なビタミンK欠乏状態にした無菌ラットのDNAマイクロアレイ解析から、メナキノン-4がテストステロン生合成に関与している可能性が示唆された（非特許文献１、非特許文献２）。【０００３】
テストステロンの分泌量が減少すると、集中力や意欲が低下し、物覚えも悪くなり、また、筋力、排尿機能、男性機能も衰えることが指摘されている。近年は、性腺機能低下症により血中テストステロン量が低下して、上記のような症状が現れる男性更年期障害の患者が増えている。【０００４】
男性更年期障害などの治療の一つとして、テストステロン製剤を注射するホルモン補充療法がある。しかし、注射は、血中のテストステロンレベルを急激に上昇させ、かえって不調をきたすことがある。急激なホルモンレベルの上昇によって、前立腺、血管、肝臓、肺などに有害な副作用をきたすことも懸念される。そのため、ホルモン補充療法を経皮パッチで徐放的に行う場合がある。【０００５】
上記のように外部からテストストロンを補充するのではなく、マカなどに含まれるベンジル類グルコシノレートおよびベンジル類イソチオシアネート（特許文献１）、マカと枝角との混合物（特許文献２）、または置換ピラゾール化合物（特許文献３）を摂取することによって、体内のテストステロン量を強化する方法が提案されている。
【非特許文献１】第8回Vitamin K & Bone研究会  記録集、pp 87-89、2005年12月10日、エーザイ株式会社発行
【非特許文献２】Shirakawa et al, Biochim. Biophys. Acta Vitamin K deficiency reduces testosterone production in the testis through down-regulation of the Cyp11a a cholesterol side chain cleavage enzyme in rats, ARTICLE In Press, Accepted Manuscript, Available online 6 June 2006
【特許文献１】特開2005-306754
【特許文献２】特表2003-523945
【特許文献３】特表2005-504093
【発明の開示】
【０００６】
上記したテストステロン増加作用を有する化合物は、生薬あるいは化学合成した薬物である。食経験豊富で安全な食品成分または栄養素で、血中テストステロン量を増加させるものが好ましいところ、そのような物質は現在知られていない。このような状況で、より安全で食経験豊富な食品成分であって、テストステロン量を増加させる物質を提供することが望まれている。
【０００７】
発明者らは、食品から摂取されたビタミンK1あるいはビタミンK2が体内組織においてメナキノン-4へ変換されることを見出し、特に精巣でメナキノン-4濃度が高くなっていることから、精巣中でのビタミンKの機能解明を試みてきた。これらの研究を経て、本発明者らは、ビタミンKを摂取することで、血中テストステロン量を増加できることを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、ビタミンKを含有するテストステロン増加剤を提供する。
【０００８】
ビタミンKの従来知られている機能は、血液凝固を正常に維持する、骨形成を促進する、骨吸収を抑制する、動脈の石灰化を防止して動脈硬化を予防する、肝疾患を治療することである。ビタミンKにエストロゲン増加作用があることは全く知られていない。非特許文献１や非特許文献２からは、テストステロンの生合成にビタミンKが関与することが示唆されるものの、ビタミンKの投与によってテストステロンが増加することは全く予見されていなかった。
【０００９】
前記ビタミンKは、ビタミンK2であることが好ましい。
【００１０】
より好ましくは、前記ビタミンKは、メナキノン-4および／またはメナキノン-7である。
【００１１】
本発明は、上記テストステロン増加剤からなる、テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病を予防、改善および／または治療するための医薬を提供する。
【００１２】
本発明は、また、上記テストステロン増加剤を添加したサプリメント、健康食品または機能性食品もまた提供する。
【００１３】
本発明によれば、人体にとって安全性の高いビタミンKを摂取することにより、血中テストステロン量を容易に増加させることができる。脂溶性のビタミンKは従来のテストステロン製剤よりも体内に蓄積されやすいため、効果が長続きする。テストステロン量の正常なレベルの回復によって、テストステロンが関与する機能（筋力、性機能など）を維持、改善し、あるいはテストステロンが減少して発症する男性更年期障害などの症状または疾病を改善することができる。本発明のテストステロン増加剤は、機能性食品や健康食品として日常的に摂取することが極めて容易であるので、前記症状や疾病の予防も企図される。
【００１４】
ヒトが一日あたり必要とされるビタミンKの目安量は55〜80μg（日本人の食事摂取基準2005年版）であるのに対し、許容上限摂取量は30mgと極めて高く、ビタミンKは安全性の高い物質である。したがって、本発明のテストステロン増加剤は、従来知られているテストステロン増加剤よりも安全性の点で優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例１に従うMK-4食群、ならびに比較例であるコントロール食群および低K食群を、ラットへ投与したときの、ラット精巣中のビタミンKアナログ濃度を比較した図である。
【図２】図１のラットのP450sccのmRNA発現レベルを比較した図である。
【図３】図１のラットのP450sccのタンパク質量を比較した図である。
【図４】図１のラットの血漿中テストステロン濃度を比較した図である。
【図５】実施例２に従うビタミンK1添加食群およびMK-4添加食群、比較例であるコントロール食群を、ラットへ投与したときの、体重の経日変化を示す図である。
【図６】図５のラットの摂取量の経日変化を示す図である。
【図７】図５のラットの精巣中ビタミンK濃度を比較した図である。
【図８】図５のラットの血中テストステロン値の変化を示す図である。
【図９】図５のラットの精巣中のテストステロン濃度を比較した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明のテストステロン増加剤の一実施形態を詳細に説明する。本発明のテストステロン増加剤に使用可能なビタミンKには、ビタミンK1〜K3がある。ビタミンK1（フィロキノンともいう）は、緑黄色野菜、豆類、植物油、海藻類、魚介類などに多く含まれる。ビタミンK2（メナキノンともいう）は、微生物が産生し、納豆や、チーズなどの乳製品に多く含まれる。ビタミンK2は腸管内の細菌によっても作り出される。ビタミンK2には、ナフトキノン骨格につく側鎖イソプレノイド基の長さに応じてメナキノン-4（MK-4）からメナキノン-15（MK-15）の同族体が存在する。例えばチーズにはMK-6〜MK-9が、納豆にはMK-7が多量に含まれている。ビタミンK3（メナジオンともいう）は合成物である。【００１７】
ビタミンK3は、多量に摂取すると副作用が心配される。よって、これまでの食経験から、野菜から抽出精製されるビタミンK1や納豆菌などを用いた発酵物から抽出されるビタミンK2が、安全性がより高い点で好ましい。さらに好ましくは、安価かつ容易に生産可能なビタミンK2である。食品添加物として認可されているメナキノン-4および／または食品素材として利用されているメナキノン-7が特に好ましい。なお、食品から摂取されたビタミンK1およびK2は、生体内でメナキノン-4に転換されることが知られている。【００１８】
各ビタミンKの製造法は、特に限定されず、市販のものも制限なく使用することができる。具体的には、微生物による発酵法、食品からの抽出・精製、化学合成法を使用することができる。【００１９】
ビタミンK1は、青しそ、エゴマ、モロヘイヤ、パセリ、春菊、小松菜、ほうれん草、三つ葉、アルファルファ、はしばみの葉、栗の葉、大麦の若茎、からす麦の若茎、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、植物油（大豆油、ナタネ油、ゴマ油、落花生油、コーン油、サフラワー油、ひまわり油、米ぬか油、オリーブ油）などから、公知の方法（例えば特開平5-155803）によって抽出および精製される。ビタミンK1は、合成によっても得られる。ビタミンK1は、脂肪に可溶な淡黄色油状であって、熱に対し安定であるが、光に対しては不安定である。ビタミンK1は、酸化物であってもよい。【００２０】
ビタミンK2は、例えば特開平08-073396、特開平11-92414、特開平10-295393、特開2001-136959などに記載の方法に従って、納豆菌などの微生物によって発酵生産される。【００２１】
本発明のテストステロン増加剤に含有されるビタミンKの含有量は、組成物の摂取量によって変わってくるが、通常、0.0001〜100重量％でよく、好ましくは0.001％〜90重量％、より好ましくは0.01〜70重量％、さらに好ましくは１〜50重量％の範囲である。ビタミンKの含有量が0.0001重量％以下であると、テストステロン増加効果を得るのに必要な量を摂取できない場合がある。【００２２】
本発明のテストステロン増加剤には、必須成分のビタミンKに加えて、テストステロンを増加させることが知られている物質、例えばマカなどの植物、シカの角枝などの生薬、これらの抽出物、ベンジル類グルコシノレート、ベンジル類イソチオシアネートおよび置換ピラゾール化合物の一種または二種以上を添加してよい。【００２３】
本発明のテストステロン増加剤には、必須成分のビタミンKや適宜のテストステロン増加作用物質のほかに、薬理学上使用可能な担体、賦形剤、助剤などを、本発明の効果を阻害しない範囲で添加することができる。【００２４】
具体的には、乳糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、ブドウ糖水和物、白糖、精製白糖、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、パラチノース、還元パラチノース、粉末還元麦芽糖、水アメ、カルメロース、デキストリン、トウモロコシデンプン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、バレイショデンプン、コーンスターチ、ヒドロキシプロピルスターチ、アミノ酸、カオリン、無水ケイ酸、ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二水素カルシウム、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、脂肪酸またはその塩、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、アルコール、植物油、オリーブ油、ダイズ油、トウモロコシ油、脂肪油、油脂、粘性パラフィン、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリンなどの担体または賦形剤；結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、デキストリン、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＲＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、マクロゴールなどの結合剤；コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ロウ類、水素添加植物油、ポリエチレングリコール、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、マクロゴール、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、含水二酸化ケイ素、ショ糖脂肪酸エステルなどの滑沢剤；潤滑剤；結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガントなどの崩壊剤；大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールなどの界面活性剤；乳化剤；リン酸ナトリウムなどの溶解補助剤；吸収促進剤；塩酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酒石酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、乳酸などのｐＨ調整剤；天然樹脂などの光沢剤；安定化剤；酸化防止剤；保存剤；湿潤剤；着色剤；芳香剤；無痛化剤などが挙げられる。【００２５】
本発明のテストステロン増加剤は、医薬、サプリメント、機能性食品または健康食品として使用するために、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの形態に加工される。ビタミンKは脂溶性であるため、形態は錠剤またはカプセル剤が好ましい。【００２６】
本発明のテストステロン増加剤は、パン、米飯、スープ、惣菜、菓子、キャンディなどの一般加工食品の製造時に原料に直接添加されてもよい。【００２７】
本発明のテストステロン増加剤を医薬として使用する場合の摂取方法は、特に限定されない。例えば、経口摂取、経皮投与、輸液、注射（筋肉内、腹腔内、皮下または静脈）などである。好ましくは、患者の負担が少ない点で、錠剤またはカプセル剤の経口摂取である。【００２８】
本発明のテストステロン増加剤の医薬としての用量用法は、患者の症状、体重、投与間隔、投与方法、ならびに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮して決定され得る。典型的には、成人男性一日あたりのビタミンK摂取量として、通常、10μg〜100mgでよく、20μg〜100mgが好ましい。治療目的で使用する場合は、6mg〜100mgで使用可能である。【００２９】
本発明のテストステロン増加剤をサプリメント、機能性食品、健康食品または一般の食品に用いる場合には、安全性を考慮して、成人男性一日あたりのビタミンKの摂取量として、10μg〜30mgが好ましく、50μg〜6mgがさらに好ましい。【００３０】
本発明のテストステロン増加剤は、ヒト以外にも、雄の家畜動物、愛玩動物などの動物へ摂取する医薬や機能性食品として用いてもよい。投与方法は、注射などの非経口摂取、機能性食品や配合飼料の形態の経口摂取がある。【００３１】
本発明のテストステロン増加剤、該増加剤からなる医薬および該増加剤を添加した食品を、ヒトを含む雄の哺乳動物が摂取した場合に、ビタミンKによってテストステロン量が増加する。よって、本発明のテストステロン増加剤は、原発性または続発性精巣機能低下症や、加齢または環境因子によるテストステロン欠乏症の治療薬または予防薬としての効果が期待できる。本発明のテストステロン増加剤は、テストステロンの低下に起因する各種疾病を予防、改善および／または治療することができ、特に、筋肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代謝、性機能、男性機能、排尿機能などの低下の予防、改善および／または治療を期待できる。【００３２】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本発明のテストステロン増加剤による血中テストステロン量の増強効果を、通常のラットを用いて調べた。通常のラットとは、腸内細菌の作るビタミンKを吸収しているため餌にビタミンKが含まれていなくても極端なビタミンK欠乏は起こらないラットで、通常の生活しているヒトに外挿できるモデルである。【００３３】
（材料および方法）
Ｉ  モデル動物の作製
（実験動物の飼育）
実験動物および飼育環境は、以下のとおりである。
実験動物：通常ラット（Wistar/Std、8週齢の雄）
飼育環境：温度23℃、湿度50±5％、午前8時点灯、午後8時消灯の12時間の明暗サイクルに設定された飼育室で飼育した。【００３４】
実験食群として、以下の3群を設けた。
(1)低K食群（ビタミンK無添加食）
(2)コントロール食群（ビタミンK1  0.75mg/kg添加食）
(3)MK-4添加食群（メナキノン-4  75mg/kg添加食）
ここで、コントロール食中のビタミンK1量は、AIN93Gの標準精製飼料で使用されているビタミンK1濃度であって、よってコントロール食群は、ラットの通常の飼料から摂取されるビタミンK量を配合した標準食を意味する。MK-4添加食群に添加したメナキノン-4には、製品名:メナテトレノン（日清ファルマ社製）を使用した。【００３５】
各実験食は、表１の組成割合となるように、ビタミンK1またはメナキノン-4(以下、MK-4ともいう)を添加して、均一に混ぜ合わせた。用いた実験食の組成を表１に示す。【００３６】
【表１】
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※Vitamin  Kは、低K食群には無添加、コントロール食群にはK1を7.5mg、そしてMK-4添加食群にはMK-4を750mg添加し、さらに全量をスクロースで100gに調整してビタミン混合とした。【００３７】
飼育方法は、市販の固型飼料（製品名：MRラボストック、日本農産工業株式会社製）を用いて、3〜5日間自由摂食、自由摂水で予備飼育を行った。各実験食群に供するラットは、それぞれ4匹ずつ金網ケージ内にて集団飼育を行った。予備飼育後、実験食を給餌し、自由摂食と自由摂水で35日間飼育を行った。採血及び精巣の摘出を行った。【００３８】
II  ビタミンK含量の測定
（HPLC測定用サンプルの調製）
共栓付き褐色遠沈管に、組織1gを正確に量り取り、66％ IPA溶液を2ml加え、氷冷下においてバイオトロン（ポリトロン型ホモジナイザー）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズ時に、シャフトについたホモジネートを66％ IPA 3mlで洗い落とし、サンプルに加えた。これに、ヘキサン5mlを内部標準としてMK-3を9.96ng/mlあるいは996ng/ml含むヘキサン溶液を1ml加え、５分間振とう抽出を行った。【００３９】
その後、遠心分離（3000rpm、4℃、5分）を行い、上層のヘキサン層5mlを褐色試験管に分取した。これを遠心型濃縮機で減圧留去し、乾固させたものを再びヘキサン2mlに溶解した。このサンプルを、あらかじめヘキサン・エーテル（96：4、v/v）溶液10mlとヘキサン10mlで洗浄しておいたSep-Pakシリカカートリッジ（Waters社）にアプライした。【００４０】
ヘキサン10mlでカートリッジを洗浄した後に、ヘキサン・エーテル（96：4、v/v）溶液5mlを用いてK類を溶出させた。再び、遠心型濃縮機で乾固させた後、残留物にエタノール200μl（MK-3、996ng/mlの内部標準を用いた場合は2ml）を加えて溶解し、0.5μmのフィルター（DISMIC03JP050AN、ADVANTEC）で微粒子を除去し、これをHPLC測定用サンプルとした。【００４１】
（HPLCの測定条件）
作製したHPLC測定用サンプル中でのビタミンK類は、非蛍光性の酸化型である。そこで、サンプルをHPLCによって分離し、白金触媒カラムを用いることによって蛍光性の還元型として、その蛍光強度を測定するHPLC-還元蛍光法によって、ビタミンK類の定量を行った。ビタミンK類は、内部標準であるMK-3との相対値として求めた。【００４２】
（HPLCによるビタミンKの測定系）
HPLCによるビタミンKの測定系は、以下のとおりである。
・HPLC用機器：Waters 600E system（Waters社）
・カラム：Puresil C18、5 μm、120A、4.6nm×50mm（Waters社）
・カラムヒーター：Column heater（Bio-Rad社）
・カラムヒーター温度：50℃
・還元装置：白金還元カラム  IRICA-RC-10-1（IRICA社）
・蛍光検出器：F-1000（日立社、検出波長Ex 240nm、Em 430nm）
・記録計：D-2000（日立社）
・分析条件：移動層MeOH-EtOH（8：2）、流速1.0ml/min【００４３】
この方法では、サンプル中に存在する非蛍光性の酸化型のビタミンK類を、白金触媒カラムを用いることにより蛍光性の還元型として、その蛍光強度を測定するHPLC-還元蛍光法を用いている。そのため、移動相中に酸素が溶存している状態では、還元化に悪影響を及ぼす。そこで、移動層は、予め減圧下で超音波をかけることによって溶存酸素を除去し、測定２時間前から終了時まで窒素ガス（200ml/min 以上）をバブリングした。【００４４】
III  RNAの測定
（Total RNAの調製）
各個体の精巣を専用のチューブに約0.1gとり、RNA抽出試薬であるISOGEN（NIPPONGENE社）を1ml加え、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジネートをエッペンドルフチューブに移し、室温で5分間置いた。その後、クロロホルム200μlを加え、ボルテックスを用いて15秒間激しく攪拌した。2〜3分間静置後、遠心分離（13000rpm、4℃、15分）し、3層に分離したものの上層のみを分取した。これにIPAを500μl加え、軽く上下に振った後、10分間放置した。【００４５】
再び、遠心分離（13000rpm、4℃、15分）を行い、得られた沈殿を75％エタノールで1000μl、500μlと2回エタノールリンスした。沈殿を300μlのDEPC-dH2Oで溶解させ、その一部を吸光度測定（260nm、280nm）およびアガロースゲル電気泳動（0.7％TAE アガロースゲル、150V、35分）に供し、RNAの濃度および純度の検定を行った。【００４６】
（逆転写反応によるcDNAの調製）
各個体から得られたRNAを、1μg/μlとなるようにDEPC-dH2Oに溶解し、このRNA溶液をPCRチューブに4μlずつ2本に分注した。1本は、逆転写酵素加えないRT（-）用、ゲノムDNA混入の有無の確認用に作製した。【００４７】
DEPC-dH2O 10μlに、Oligo(dT)20(50μM)を1μl、10mM dNTPmix（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）を1μl加えたものを、それぞれのチューブに分注した。チューブをPCR Thermal cycler（TaKaRa社製）にセットし、65℃、5分間加温した。【００４８】
加温後、氷上に１分間以上置いた後、スピンダウンを行い、これに、5×First-Strand Bufferを4μl、0.1M DTTを1μl、RNase OUTを0.5μl、Super Script III（RT（-）ではdH2Oを用いた）を0.5μlずつ混和したものを加えた。再び、Thermal cyclerにセットし、50℃、60分 → 70℃、15分間で逆転写反応を行い、cDNAサンプルを得た。【００４９】
（定量RT-PCR）
逆転写反応により調製したcDNA溶液を100倍希釈したものを、サンプルとして用いた。反応試薬は、SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）（TaKaRa）を用いた。サンプルまたはスタンダード用cDNA 4μlに、SYBR Premix Ex Taq 25μl、Rox Reference Dye 1μl、フォワードおよびリバースプライマー溶液を各1.5μl、dH2O 17μlを加えた。MicroAmp Optical 96-well Reaction Plateに、上記反応溶液を24μlずつ2wellに分注し、ABI PRISM 7000 Sequence Detection Systemにセットした。【００５０】
PCR反応サイクルは、（60℃、2分間）×1 → （95℃、10分間）×1 → （95℃、15秒 → 60℃、1分間）×50サイクルで行った。表２に、定量RT-PCRで使用したプライマーの塩基配列（フォワード：配列番号１、リバース：配列番号２）を示す。
【表２】
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【００５１】
本方法では、遺伝子発現量の内部標準遺伝子としてGAPDHおよび真核細胞伸長因子1α1（EF-1）を用い、各遺伝子の発現量は、対象遺伝子発現量/内部標準遺伝子発現量で算出し、コントロール食群の値を1として相対値で示した。【００５２】
IV  ウエスタンブロット法によるP450sccタンパク質量の測定
（生体組織試料および抗体）
解剖後、-80℃で保存しておいた上記各群の精巣を用いた。抗P450scc抗体は、Chemicon社から購入した。【００５３】
（組織ホモジネートの調製）
精巣0.2gを、1mlの1×Phosphate buffered saline（PBS、10μlの100mM phenyl methane sulfonyl fluoride（PMSF）を含む）中で氷冷しながら、バイオトロン（ポリトロン型ホモジナイザー）でホモジナイズした。これを3000rpm、5分間、4℃の遠心分離により未破砕細胞を取り除いた上清を回収し、組織ホモジネートとした。この一部をタンパク質定量に用いた。【００５４】
（サンプルのSDS化）
組織ホモジネート200μlに3×SDS buffer（a）100μlを加え、沸騰湯浴中で5分間放置し、SDS化を行った。【００５５】
（SDS-PAGE）
SDS化したサンプルをタンパク質濃度が1μg/μlとなるように、1×SDS bufferで希釈した後、その15μlをポリアクリルアミドゲル（b）に供し、電気泳動（c）（100V、90分）を行った。【００５６】
（トランスファー）
泳動終了後、ブロット用パット上に陽極側からtransfer buffer（d）に浸した3MM（Whatman社）3枚、ゲル、ImmobilonTM （PVDF transfer membrane（MILLIPORE社）、予めメタノール、transfer bufferで平衡化した）、3MM 3枚をのせた。これらをパットで挟み、transfer bufferが入ったブロッティング槽（Bio-Rad社）に入れ、トランスファーを行った（250mA、180分間）。【００５７】
（ブロッキング）
トランスファー終了後のmembraneをTBS-T（e）で洗い、5％スキムミルクを含むTBS-T（スキムミルク溶液）で1時間ブロッキングを行った。【００５８】
（抗体反応）
一次抗体反応は、抗P450scc抗体（1/5000）を含むスキムミルク溶液中で1時間行った。二次抗体反応は、抗Rabbit IgG-HRP抗体（1/5000）を含むスキムミルク溶液中で1時間行った。コントロールとして抗β-actin抗体を用いた。【００５９】
（検出・解析）
ECLTM Western blotting検出試薬（Amersham社製） 1mlを、membraneに全体に行き渡るようにかけ、遮光下で、5分間反応させた。発光シグナルをLas-1000 imaging system（FUJIFILM社製）で画像化し、ImageGauge（商標）画像処理ソフトで定量を行った。【００６０】
(a)SDS buffer
70mM Tris-HCl (pH 6.8)、33mM NaCl、1mM Na2EDTA、2％ SDS (w/v)、
40mM DTT、0.01％ bromophenol blue (w/v)、10％ glycerol
(b)ポリアクリルアミドゲル
分離ゲル：12.5％アクリルアミド、375mM Tris-HCl (pH 8.8)、0.1％ SDS、
0.05％ TEMED、0.075％ APS (w/v)
濃縮ゲル：3.8％アクリルアミド、125mM Tris-HCl(pH 6.8)、0.1％ SDS
0.05％ TEMED、0.075％ APS (w/v)
(c)泳動buffer
25mM Tris、0.19M glycine、0.1％ SDS (w/v)
(d)Transfer buffer
48mM Tris、39mM glycine、20％ methanol
(e)TBS-T buffer
0.1M Tris-HCl (pH 7.5)、0.37M NaCl、0.5％ Tween 20【００６１】
（組織ホモジネート中のタンパク質の定量分析）
組織ホモジネート中のタンパク質濃度を、Bradford法により測定した。適宜希釈したサンプル溶液20μlをエッペンドルフチューブにとり、そこへ5倍希釈したBio-Rad protein assayを1ml加え、ボルテックスにより混和した。室温で5分間放置後、595nmの吸光度を測定した。標準曲線は、ウシ血清アルブミン（BSA）を用いた。【００６２】
V  テストステロンの測定
本測定では、以下のキットを用いた。
Testosterone EIA kit （Cayman chemical社製）【００６３】
（サンプルの調製）
血漿中および精巣ホモジネート中に、アッセイを阻害する物質が含まれている可能性があるため、予め、エーテルによるステロイドホルモンの抽出を行った。【００６４】
（血漿からの抽出）
血漿0.5mlを試験管に取り、ジエチルエーテル2.5mlを加え、ボルテックスで約1分間混和し、遠心分離を行った（3000rpm、4℃、5分間）。得られたエーテル層（上層）を回収後、再び、血漿サンプルにジエチルエーテルを2.5ml加え、同様の操作を行った。【００６５】
回収したエーテル層は、遠心型減圧濃縮機（TAITEC社製）で減圧乾固した。得られた濃縮物を、kitに付属のEIA buffer 0.5mlに溶解し、これを血漿サンプルとした。【００６６】
（精巣からの抽出）
精巣組織100mgを、phosphate buffered saline 5ml中で氷冷しながらバイオトロンを用いてホモジナイズした。このホモジネート1mlを試験管に取り、ジエチルエーテル5mlを加え、ボルテックスで約1分間混和し、遠心分離を行った（3000rpm、4℃、5分間）。【００６７】
得られたエーテル層（上層）を回収後、再び、精巣ホモジネートにジエチルエーテルを5ml加え同様の操作を行った。回収したエーテル層を、遠心型減圧濃縮機（TAITEC社）で減圧乾固した。得られた濃縮物を、kitに付属のEIA buffer 1mlに溶解し、これを精巣サンプルとした。【００６８】
VＩ  統計解析
データは、一元配置分散分析による群間差を確認後、Scheffeの多重比較検定により行った。【００６９】
図１に、低K食群（ビタミンK無添加）、コントロール食群（K1  0.75mg/kg添加食）、MK-4添加食群（MK-4  75mg/kg添加食）をラットに35日間投与し、精巣中のビタミンK1（Right）とMK-4（Left）の濃度を分析した結果を示す。全例において、精巣中のビタミンKは、投与形態にかかわらずMK-4に変化していることが確認された。低K食群とコントロール食群とは有意差がなかったが、MK-4添加食群ではMK-4濃度が顕著に増加していた。【００７０】
図２に、ステロイドホルモン合成経路遺伝子であるP450sccのmRNA発現レベルを示す。低K食群が、コントロール食群およびMK-4添加食群と比べて若干低下していた。【００７１】
図３に、P450sccのタンパク質量を示す。コントロール食群と低K食群では変化はみられなかったが、MK-4添加食群で顕著に増加していた。【００７２】
図４に、血漿テストステロン濃度を示す。MK-4添加食群は、コントロール食群と比較して血漿テストステロン濃度が有意に増加した。【００７３】
以上のことから、ビタミンKを投与することによって、血中テストステロン量が増加することがわかった。コントロール食のビタミンK濃度は、ビタミンK必要量を配合しており、これは日常の食事で摂取できる量であり、ビタミンKが不足することによって血中テストステロンが減少することはまれにしか起こらないと考えられる。一方、本発明に従いビタミンKを積極的に摂取することによって、血中テストステロンが増加したことから、何らかの原因により血中テストステロンが減少している場合は、ビタミンKの摂取により血中テストステロンを増加させることができる。【００７４】
〔実施例２〕
（材料および方法）
実験動物および飼育環境は、実施例１と同様に、通常ラット（Wistar/Std、8週齢の雄）を温度23℃、湿度50±5％、午前8時点灯、午後8時消灯の12時間の明暗サイクルに設定された飼育室で飼育した。【００７５】
実験食群として、以下の3群を設けた。
(1)コントロール食群（ビタミンK1  0.75mg/kg添加食）
(２)ビタミンK1添加食群（ビタミンK1  75mg/kg添加食）
(３)MK-4添加食群（メナキノン-4  75mg/kg添加食）
ビタミンK1は、和光純薬（株）から購入した。メナキノン-4は、日清ファルマ社製を使用した。各実験食は、実施例１の表１の組成割合となるように、ビタミンK1またはMK-4を添加して、均一に混ぜ合わせた。【００７６】
飼育期間は３５日であり、毎週18時に尾静脈採血を行なった。測定項目は、体重、摂餌量、精巣中ビタミンK含量、精巣中テストステロン濃度、血漿中テストステロン濃である。分析法は、実施例１と同様である。【００７７】
（統計解析）
精巣中のビタミンK濃度およびテストステロン濃度のデータについては、Tukey法により解析した。血中テストステロン濃度の経時変化の解析は、二元配置分散分析（繰り返しあり）法で行った。いずれも、P<0.05を有意差とした。【００７８】
（結果）
コントロール食群（K1  0.75mg/kg添加食）、ビタミンK1添加食群、MK-4添加食群間で、体重および摂食量は差が認められなかった（図５、６）。【００７９】
図７に、精巣中のビタミンK濃度（Right:ビタミンK1、Left:MK-4）の結果を示す。ビタミンK1添加食群、MK-4添加食群ともに、精巣中のMK-4濃度が顕著に増加した。ビタミンK１が体内でMK-4に転換したものと考えられる。【００８０】
図８に、血中テストステロン値の変化を示す。ビタミンK1添加群の血中テストステロン値は、４週目、５週目でコントロール群と差が認められなかった。２週目および３週目では、コントロール食群よりも高かった。全体を通して二元配置分散分析解析を行なったところ、P<0.01で有意差が認められた。MK-4添加群では、投与後２週間目〜５週間目で、血中テストステロン濃度が高く、二元配置分散分析の結果P<0.01で有意差が認められた。【００８１】
図９に、精巣中のテストステロン濃度の結果を示す。ビタミンK1添加食群ならびにMK-4添加食群のいずれも、テストステロン値が高くなった。【００８２】
以上のことから、ビタミンK１ならびにビタミンK2（メナキノン-4）のいずれも、血中および精巣中のテストステロン量が増加することがわかった。好ましくは、ビタミンK2の投与である。体重変化および食事摂取量の変化も認められないことから、ビタミンKによるテストステロン増加は、安全性の高い方法であると言える。【００８３】
以上、本発明をその好ましい実施態様について詳細に説明してきた。しかし、当業者は本願の開示を考慮することによって、本発明の範囲および精神の範囲内で変形および改良を行い得ることが理解される。本発明の実施態様には、以下が挙げられる。
１．ビタミンKを有効成分として含有するテストステロン増加剤。
２．ビタミンKの含有量が0.0001〜100重量％である、上記１項に記載のテストステロン増加剤。
３．前記ビタミンKがビタミンK2である、上記１項に記載のテストステロン増加剤。
４．前記ビタミンKがメナキノン-4および／またはメナキノン-7である、上記１項に記載のテストステロン増加剤。
５．ビタミンKを有効成分として含有するテストステロン増加剤からなる、テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病を予防、改善および／または治療するための医薬。
６．前記症状および疾病が、筋肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代謝、性機能、男性機能または排尿機能の低下である、上記５項の医薬。
７．ビタミンKを有効成分として含有するテストステロン増加剤を配合したサプリメント、健康食品または機能性食品。
８．筋肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代謝、性機能、男性機能または排尿機能の低下の予防、改善および／または治療に用いる上記７項のプリメント、健康食品または機能性食品。
９．ビタミンKを有効成分として含有するテストステロン増加剤の有効量を患者へ投与することからなる、テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病を、予防、改善および／または治療する方法。
１０．ビタミンKの含有量が0.0001〜100重量％である、上記９項に記載の方法。
１１．前記ビタミンKがビタミンK2である、上記９項に記載の方法。
１２．前記ビタミンKがメナキノン-4および／またはメナキノン-7である、上記９項に記載の方法。
１３．前記症状および疾病が、筋肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代謝、性機能、男性機能または排尿機能の低下である、上記９項の方法。
１４．テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病を予防、改善および／または治療するテストステロン増加剤を製造するためのビタミンKの使用。
１５．ビタミンKの含有量が0.0001〜100重量％である、上記１４項に記載の使用。
１６．前記ビタミンKがビタミンK2である、上記１４項に記載の使用。
１７．前記ビタミンKがメナキノン-4および／またはメナキノン-7である、上記１４項に記載の使用。
１．前記症状および疾病が、筋肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代謝、性機能、男性機能または排尿機能の低下である、上記１４項に記載の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月12日(2007.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＫを有効成分として含有するテストステロン増加剤。
【請求項２】
前記ビタミンＫがビタミンＫ２である、請求項１に記載のテストステロン増加剤。
【請求項３】
前記ビタミンＫがメナキノン−４および／またはメナキノン−７である、請求項１に記載のテストステロン増加剤。
【請求項４】
ビタミンＫを有効成分として含有するテストステロン増加剤からなる、テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病（認知機能の低下を除く）を予防、改善および／または治療するための医薬。
【請求項５】
ビタミンＫを有効成分として含有するサプリメント、健康食品または機能性食品を、テストステロンを増加させるために使用する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
好ましい。
［００２６］
本発明のテストステロン増加剤は、パン、米飯、スープ、惣菜、菓子、キャンディなどの一般加工食品の製造時に原料に直接添加されてもよい。
［００２７］
本発明のテストステロン増加剤を医薬として使用する場合の摂取方法は、特に限定されない。例えば、経口摂取、経皮投与、輸液、注射（筋肉内、腹腔内、皮下または静脈）などである。好ましくは、患者の負担が少ない点で、錠剤またはカプセル剤の経口摂取である。
［００２８］
本発明のテストステロン増加剤の医薬としての用量用法は、患者の症状、体重、投与間隔、投与方法、ならびに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮して決定され得る。典型的には、成人男性一日あたりのビタミンＫ摂取量として、通常、１０μｇ〜１００ｍｇでよく、２０μｇ〜１００ｍｇが好ましい。治療目的で使用する場合は、６ｍｇ〜１００ｍｇで使用可能である。
［００２９］
本発明のテストステロン増加剤をサプリメント、機能性食品、健康食品または一般の食品に用いる場合には、安全性を考慮して、成人男性一日あたりのビタミンＫの摂取量として、１０μｇ〜３０ｍｇが好ましく、５０μｇ〜６ｍｇがさらに好ましい。
［００３０］
本発明のテストステロン増加剤は、ヒト以外にも、雄の家畜動物、愛玩動物などの動物へ摂取する医薬や機能性食品として用いてもよい。投与方法は、注射などの非経口摂取、機能性食品や配合飼料の形態の経口摂取がある。
［００３１］
本発明のテストステロン増加剤、該増加剤からなる医薬および該増加剤を添加した食品を、ヒトを含む雄の哺乳動物が摂取した場合に、ビタミンＫによってテストステロン量が増加する。よって、本発明のテストステロン増加剤は、原発性または続発性精巣機能低下症や、加齢または環境因子によるテストステロン欠乏症の治療薬または予防薬としての効果が期待できる。本発明のテストステロン増加剤は、テストステロンの低下に起因する各種疾病を予防、改善および／または治療することができ、特に、筋肉、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代謝、性機能、男性機能、排尿機能などの低下の予防、改善および／または治療を期待できる。
［００３２］
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【国際調査報告】
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