(57)【要約】  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約37,000、約16,000及び／又は約15,400の分子量であり、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１又は２で示される、甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質。  このタンパク質は、安全性、活性、生産性、価格等の面で従来の不凍性タンパク質より優れており、食品をはじめとする広い分野で使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質。
【請求項２】
甲殻類由来のタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約37,000、約16,000及び／又は約15,400の分子量であり、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１又は２で示されるタンパク質である請求項１の不凍活性を有するタンパク質。
【請求項３】
甲殻類が、エビ類、ザリガニ類、カニ類、オキアミ類、シャコ類のいずれかに属するものである請求項１又は２の不凍活性を有するタンパク質。
【請求項４】
甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質を含む不凍活性を有する甲殻類抽出物。
【請求項５】
甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約37,000、約16,000及び／又は約15,400の分子量であり、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１又は２で示されるタンパク質である請求項４の不凍活性を有する甲殻類抽出物。
【請求項６】
甲殻類が、エビ類、ザリガニ類、カニ類、オキアミ類、シャコ類のいずれかに属するものである請求項４又は５の不凍活性を有する甲殻類抽出物。
【請求項７】
甲殻類の殻、肉及び／又は内臓から熱水抽出することを特徴とする不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
【請求項８】
熱水抽出を６０℃以上の熱水を用いて行う請求項７の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
【請求項９】
甲殻類の肉及び／又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び／又は内臓の抽出液を加熱処理及び／又は還元処理することを特徴とする不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
【請求項１０】
甲殻類の肉及び／又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び／又は内臓の抽出液が、抽出液に含まれるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約200,000の分子量であり、還元した場合、約86,000のバンドと約90,000のバンドを示し、Ｎ末端アミノ酸が配列番号３又は４で示されるタンパク質を精製及び／又は濃縮したものである請求項９の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
【請求項１１】
甲殻類の殻、肉及び／又は内臓から界面活性剤を添加した抽出液で抽出することを特徴とする請求項９又は１０の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
【請求項１２】
加熱処理が６０℃以上にすることであり、還元処理が還元剤を添加することである請求項９、１０又は１１の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
【請求項１３】
甲殻類が、エビ類、ザリガニ類、カニ類、オキアミ類、シャコ類のいずれかに属するものである請求項７ないし１２いずれかの不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
【請求項１４】
請求項１ないし３いずれかの不凍活性を有するタンパク質、請求項４ないし６いずれかの不凍活性を有する甲殻類抽出物、又は、請求項７ないし１３いずれかの方法で製造した不凍活性を有する甲殻類抽出物を含む食品の品質改良剤。
【請求項１５】
請求項１４の品質改良剤を添加したことを特徴とする品質改良された食品。
【請求項１６】
食品が冷凍食品である請求項１５の食品。
【請求項１７】
食品が卵、小麦粉、又は、魚肉を材料として使用する食品である請求項１５又は１６の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不凍活性を有するタンパク質およびその製造方法、利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
水は０℃で氷になるといわれているが、厳密には、純水を冷やしても０℃では凍り始めず、凝固点以下の温度でも凍結しない過冷却現象が知られている。水の凍結は、温度が０℃以下になると水の中に存在する何らかの物質が氷の核になり、結晶が成長するという過程で進行する。この凍結現象をコントロールすることができれば、食品の冷凍保存技術、微生物や生物組織の保存技術などをはじめ、人口降雨技術、冷熱輸送技術などあらゆる分野での利用が可能になると考えられている。【０００３】
水の凍結に関係する物質として注目されているのが、氷核タンパク質（Ice Nuclear Protein; INP）と不凍タンパク質 (Anti-Freeze Protein; AFP)である。【０００４】
氷核活性細菌は、−２０℃でも凍結しない純水を−２〜−４℃で凍結させる能力をもつ細菌のことで、水が凍結を開始するときの核として働くことが明らかとなっており、このような細菌は植物に凍霜害を引き起こす原因になることが知られている。この氷核活性細菌としてはシュードモナス（Pseudomonas）属、エルウィニィア（Erwinia）属の細菌が知られている（非特許文献１、２）。氷核タンパク質は、これら氷核活性細菌から得られる氷核活性を有するタンパク質である。氷核タンパク質は、微生物由来のものが大半であり、食品分野での利用も提案されているが、あまり実用化されていないのが現状である。【０００５】
不凍タンパク質は、氷晶の成長を阻止する活性を示すタンパク質であり、多くの低温環境下で生息している生物種によって生産されるタンパク質である。それらの生物種とは、南極海や低温環境下に生息している魚、寒冷地で生育している植物、寒冷地で越冬する甲虫の幼虫、低温に適応する微生物などである。これまでに植物由来不凍タンパク質（特許文献１、２）、地衣類由来不凍タンパク質（特許文献２）、魚由来不凍タンパク質（特許文献３、４）、昆虫由来不凍タンパク質（特許文献５）などが報告されている。これだけ広範囲の生物種から不凍タンパク質が得られているにもかかわらず、甲殻類に由来する不凍タンパク質についての報告はされていない。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９８／０４１４８公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ９９／３７６７３公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ９６／１１５８６公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ９７／０２３４３公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ９９／００４９３公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ９０／１３５７１公報
【非特許文献１】Appl. Microbiol. 28, p456, (1974)
【非特許文献２】Proc. 4th Int. Cont. Plant. Path. Bact. P725, (1978)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、安全性、活性、生産性、価格等の面で、食品をはじめとする広い分野で使用できる不凍活性を有する物質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は、多くの種類の生物種から不凍タンパク質が見出されていることから、南極海に生息するオキアミにもそのようなタンパク質が含まれているかもしれないとの考えに基づき、試験を開始したが、公知の文献に記載されているような方法では不凍活性を有する物質を得ることができなかった。抽出方法を工夫することにより、不凍活性を有するタンパク質を見出し、さらに氷核活性を有するタンパク質も見出した。さらにオキアミ以外の甲殻類にも注目した結果、同様の抽出方法を採用することにより類似のタンパク質を得ることに成功した。【０００８】
本発明は、（１）〜（３）の不凍活性を有するタンパク質を提供する。
（１）甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質。
（２）甲殻類由来のタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約37,000、約16,000及び／又は約15,400の分子量であり、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１又は２で示されるタンパク質である（１）の不凍活性を有するタンパク質。
（３）甲殻類が、エビ類、ザリガニ類、カニ類、オキアミ類、シャコ類のいずれかに属するものである（１）又は（２）の不凍活性を有するタンパク質。【０００９】
本発明は、（４）〜（６）の不凍活性を有する甲殻類抽出物を提供する。
（４）甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質を含む不凍活性を有する甲殻類抽出物。
（５）甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約37,000、約16,000及び／又は約15,400の分子量であり、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１又は２で示されるタンパク質である（４）の不凍活性を有する甲殻類抽出物。
（６）甲殻類が、エビ類、ザリガニ類、カニ類、オキアミ類、シャコ類のいずれかに属するものである（４）又は（５）の不凍活性を有する甲殻類抽出物。【００１０】
本発明は、（７）〜（１３）の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法を提供する。
（７）甲殻類の殻、肉及び／又は内臓から熱水抽出することを特徴とする不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
（８）熱水抽出が６０℃以上の熱水である（７）の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
（９）甲殻類の肉及び／又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び／又は内臓の抽出液を加熱処理及び／又は還元処理することを特徴とする不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
（１０）甲殻類の肉及び／又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び／又は内臓の抽出液が、抽出液に含まれるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約200,000の分子量であり、還元した場合、約86,000のバンドと約90,000のバンドを示し、Ｎ末端アミノ酸が配列番号３又は４で示されるタンパク質を精製及び／又は濃縮したものである（９）の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
（１１）甲殻類の殻、肉及び／又は内臓から界面活性剤を添加した抽出液で抽出することを特徴とする（９）又は（１０）の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
（１２）加熱処理が６０℃以上にすることであり、還元処理が還元剤を添加することである（９）、（１０）又は（１１）の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
（１３）甲殻類が、エビ類、ザリガニ類、カニ類、オキアミ類、シャコ類のいずれかに属するものである（７）ないし（１２）いずれかの不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。【００１１】
本発明は、（１４）〜（１７）の不凍活性を有するタンパク質または不凍活性を有する甲殻類抽出物を含む食品の品質改良剤及び当該品質改良剤を添加した食品を提供する。
（１４）（１）ないし（３）いずれかの不凍活性を有するタンパク質、（４）ないし（６）いずれかの不凍活性を有する甲殻類抽出物、又は、（７）ないし（１４）いずれかの方法で製造した不凍活性を有する甲殻類抽出物を含む食品の品質改良剤。
（１５）（１４）の品質改良剤を添加したことを特徴とする品質改良された食品。
（１６）食品が冷凍食品である（１５）の食品。
（１７）食品が卵、小麦粉、又は、魚肉を材料として使用する食品である（１５）又は（１６）の食品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の不凍活性を有するタンパク質は、食品への添加に適した甲殻類由来のタンパク質であるから、各種食品に添加することができる。特に冷凍食品に添加することにより、冷凍食品の冷凍による品質劣化を抑制することができる。また、甲殻類の中でも廃棄される殻にも多く含有されることから、廃棄物の利用にもなり、かつ、安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１のオキアミから抽出したタンパク質のクロマトグラフィーのチャートを示した図である。
【図２】実施例１のSephacryl S-200 HRゲルろ過カラムクロマトグラフィーのチャートを示した図である。
【図３】実施例１のSephacryl S-200 HRゲルろ過カラムクロマトグラフィーのチャートを示した図である。
【図４】本タンパク質試料１の分子量を確認した、SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動の写真である。
【図５】本タンパク質試料２の分子量を確認した、SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動の写真である。
【図６】実施例４の不凍活性の測定結果を示す図である
【図７】実施例４の不凍活性を測定した試験におけるバイピラミダル型の氷結晶の写真である。
【図８】本タンパク質試料２の不凍活性の温度安定性を示す図である。
【図９】本タンパク質試料２の再結晶化阻害活性の測定結果を示す図である。
【図１０】エキス粉末A及びBのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析結果を示す写真である。
【図１１】エキス粉末A及びBの不凍活性の測定結果を示す図である。
【図１２】エキス粉末Aの不凍活性を測定した試験における六角平面状の氷結晶の写真である。
【図１３】エキス粉末Bの不凍活性を測定した試験における六角平面状の氷結晶の写真である。
【図１４】エキス粉末A及びBの氷結晶の再結晶化阻害活性の測定結果を示す図である。
【図１５】実施例８のオキアミ乾燥粉末から抽出したタンパク質のSuperdex G30 ゲルろ過クロマトグラフィーのチャートを示した図である。
【図１６】実施例８の逆相HPLCのチャートを示した図である。
【図１７】実施例８の逆相HPLCのチャートを示した図である。
【図１８】デンプンゲルにおけるオキアミ由来エキス粉末の離水防止効果を示す図である（図中、殻とはオキアミ殻由来のエキス粉末Ｂ、ホールとはオキアミホール由来のエキス粉末Ａを用いたデータである）。
【図１９】エキス粉末無添加のデンプンゲル（7日間冷凍保存）電子顕微鏡で観察した写真である。
【図２０】エキス粉末Aを添加したデンプンゲル（7日間冷凍保存）電子顕微鏡で観察した写真である。
【図２１】エキス粉末Bを添加した落とし身の塩溶解性を示す図である。
【図２２】エキス粉末Ｂを添加した落し身のＤＭＡ生成量を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において甲殻類とは、節足動物大顎亜門甲殻網を指し、さらにカシラエビ亜網（Cepharocarida）、ムカデエビ亜網(Remipedia)、ミジンコ亜網(Branchiopoda)、アゴアシ亜網(Maxillopoda)、エビ亜網(Malacostraca)に分類される動物を指す。特に水産産業上食用として多く利用されているエビ目（十脚目）に含まれるエビ、ザリガニ、カニ、オキアミ目のオキアミ、ナンキョクオキアミ、シャコ目のシャコなどが挙げられる。【００１５】
本発明において不凍活性は、熱ヒステリシスで評価する。熱ヒステリシスとは通常、水の凍結温度と凝固点は同一であるが、不凍タンパク質のような物質が存在すると氷結晶の表面へ結合し、結晶の成長が阻害され、凝固点が降下し、そのとき生じる融解温度と凍結温度の差のことをいう。本明細書の実施例では、不凍活性として、オスモメーター（例：Vogel社製OSMOMETER OM 801）により、溶液の凝固点を求め、熱ヒステリシスを評価した。【００１６】
凍結した水が温度上昇によりわずかに溶けた場合に、溶けた水が再度、残存している氷結晶のまわりに氷結するため、氷結晶の大きさはどんどん成長し大きくなったり、小さい氷結晶同士が結合して大きな結晶を形成したりする現象がある。この現象は氷結晶の再結晶化と呼ばれる。本発明において氷結晶の再結晶化阻害活性とは、この再結晶化を抑制する活性である。すなわち、小さい氷結晶を小さいままで維持する活性である。本発明の不凍タンパク質は、この氷結晶の再結晶化阻害活性を有し、冷凍食品などの凍結の際だけでなく、冷凍保存中の温度変化による食品の品質劣化も抑制することができる。【００１７】
本発明において、氷結晶の再結晶化阻害活性の有無は、氷結晶を顕微鏡で観察し、微小氷結晶数を観察する方法により測定した。すなわち、３０％スクロース溶液に溶解した氷結晶の再結晶化阻害活性を有するタンパク質試料２μlをカバーガラス上に滴下し、さらにその上にカバーガラスを乗せて挟み、温度制御のできる光学顕微鏡（オリンパス社製BH2型顕微鏡、リンカム社製LK600温度制御装置）のステージに乗せ、冷却ステージ内の温度を20℃、−30℃、20℃、−30℃、20℃、−30℃、−10℃の順に0.1℃／秒で冷却、加熱を繰り返した後、−10℃で30分保持し、10.01〜35μm2の面積を有する氷結晶を微小氷結晶として、その個数を数えた。氷結晶の再結晶化阻害活性を有する物質を添加しないと氷結晶は大きく成長し微小氷結晶が少なくなるが、氷結晶の再結晶化阻害活性あると微小氷結晶数が多くなる。【００１８】
本発明の不凍活性を有するタンパク質を製造するには、まず、甲殻類からタンパク質を抽出する。タンパク質を抽出し、分離、濃縮するための一般的な方法を用いることができる。すなわち、甲殻類に存在するすべての組織を破砕し、得られた懸濁液を遠心分離し、不溶性物質を取り除く。この際に界面活性剤（陰イオン系、非イオン系、両性イオン系、陽イオン系、高分子界面活性剤など）を使用することにより可溶化が促進され、抽出性が増す。特に、非イオン系の界面活性剤が適している。得られた上澄みは次に示す一般的な方法でタンパク質を分離・濃縮することができる。塩析による方法として硫安分画による分離・濃縮方法。有機溶媒による分離・濃縮方法としてアセトン、エタノール、プロパノール、メタノールを用いた方法。塩酸、硫酸、三塩化酢酸を用いた酸沈殿法。水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール、デキストランを用いた分離・濃縮方法。限外ろ過（膜濃縮）による分離・濃縮方法。イオン交換クロマトグラフィー担体、疎水クロマトグラフィー担体、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー担体、逆相クロマトグラフィー担体、及びゲルろ過クロマトグラフィー担体でそれぞれ吸着・分離することができる。さらには上澄みを加熱処理して他のタンパク質を熱変性させ沈殿させることもできる。また得られた分離物は凍結乾燥やスプレードライなどで粉末化することもできる。さらに不凍活性を有するタンパク質が氷結晶の表面に吸着する性質を利用してタンパク質が含まれている水溶液から氷結晶を介して分離することも可能である。【００１９】
上記方法で得られたタンパク質を、加熱処理、還元処理、または、加熱還元処理を施すことにより不凍活性を示すタンパク質を生成する。２-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、アスコルビン酸などの還元剤を添加し、さらに加熱することで不凍活性を示す。不凍活性を有するタンパク質を得るためには抽出処理や分離・濃縮処理時に適時、還元剤を加えて加熱処理などを行うことが好ましいが、添加しなくても加熱処理を施すだけでも得ることが出来る。【００２０】
具体的な製造例としては、甲殻類の肉、内臓、及び／又は殻の冷凍品、生のまま、あるいは乾燥品を破砕して懸濁液を製造する。これを熱水抽出すれば、本発明の不凍タンパク質が直接得られる。また、低温で抽出したタンパク質を加熱処理、または還元処理して分解させることによっても本発明の不凍タンパク質が得られる。このとき、熱水抽出は６０℃以上が好ましく、特に好ましくは８０℃以上である。また、０〜６０℃の低温で抽出した場合は、抽出液を加熱処理（６０℃以上にする）あるいは、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、アスコルビン酸などの還元剤による処理をすることにより、抽出されたタンパク質が分解されて不凍タンパク質が得られる。【００２１】
本発明の不凍活性を有するタンパク質には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約37,000、約16,000及び／又は約15,400の分子量であり、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１又は２で示されるタンパク質が含まれる。上記の抽出液はそのままで不凍活性を有するが、さらに精製、濃縮する場合は、これらのタンパク質の特徴を指標に精製、濃縮することができる。【００２２】
本発明のタンパク質は不凍活性、氷結晶の再結晶化阻害活性を有するので、食品に添加することにより、凍結による食品の劣化を抑制することができる。食品への添加量は、食品の種類、使用目的によるが、食品の総重量に対して、実施例１の本発明タンパク質試料２や実施例８の各エキス粉末のような純度の抽出物の場合、0.00001％〜10％、好ましくは0.0001%〜0.1％程度添加するのが好ましい。【００２３】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
＜南極オキアミ（ホール）からの不凍活性を有するタンパク質の抽出・精製＞
冷凍南極オキアミ８０ｇに対して５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．９）、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出液420ｍｌを用いてホモジナイザーで懸濁した。この懸濁液にTriton-X１００（シグマ社製）を0.1％になるように加えて、氷冷下で1時間攪拌した。その後、この懸濁液を10,000×ｇで３０分間遠心分離を行い、得られた上清に対して硫安分画を行った。すなわち３５〜６５％飽和の硫安を加えて得られる沈殿を10,000×ｇで３０分間遠心分離を行い回収した。この沈殿に対して１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．９）（Ａ液）を含む溶液を加えて懸濁した。この懸濁液を10,000×ｇ  ２０分間遠心して得られた上清を上記Ａ液の緩衝液で平衡化してある2.6cm×20cm（106ml）の疎水カラムクロマトグラフィー（TOYOPEARL Phenyl  650M  東ソー社製）に供与し、50ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．９）（Ｂ溶液）を用いて直線濃度勾配でタンパク質を溶出した。この結果、図１に示すクロマトグラフィーのＡピークの画分を得た。【００２５】
さらにこの画分を透析膜に入れ、その周囲にポリエチレングリコール６０００（和光純薬工業株式会社製）をまぶし、４℃下で約３時間静置し約１０倍に濃縮した。これを次に１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（pH7.9）溶液に４℃で一晩透析した。透析後、同溶液で予め平衡化しておいた1.6cm×60cmのSephacryl S-200 HRゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供与した。図２に示すクロマトグラフィーの矢印で示すピークの画分が得られた。この画分を透析膜に入れ、蒸留水にて透析した後、それを凍結乾燥した。この精製方法により８０ｇの冷凍南極オキアミから８０ｍｇのタンパク質（本タンパク質試料１）を得た。【００２６】
この本タンパク質試料１に終濃度で１ｍMになるように2-メルカプトエタノールを加えて８５℃  ５分間の加熱を行い、再度Sephacryl S-200HRゲルろ過クロマトグラフィーに供した。その結果、図３に示すように低分子側にピークＢが現れた。このピークＢ画分を集め、凍結乾燥により濃縮した。この方法により１０２ｍｇの本タンパク質試料１から７０ｍｇのタンパク質を得た（本タンパク質試料２）
【実施例２】
【００２７】
＜タンパク質の分子量の確認＞
本タンパク質試料１の分子量をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した。１０％アクリルアミドゲルを用いて、０．１％SDS、２５ｍMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１９２ｍMグリシン（ｐＨ８．６）を含む緩衝液を用いて、12ｍAで約２時間泳動を行った後、CBB  R-250でタンパク質を染色した。その結果このタンパク質は約８６ｋＤａ又は９０ｋＤａの単量体によって構成される約２００ｋＤａのサブユニット構造を有することが示された（図４；最左列は分子量マーカー、左から２列目は２００ｋＤａのサブユニットを、３列目は８６ｋＤａ又は９０ｋＤａの単量体を示す）。糖鎖の確認はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルを約１時間室温で７．５％の酢酸溶液に浸した。次いで0.2％過ヨウ素酸に移し、４℃で４５分間インキュベートした。さらにシッフ試薬（和光純薬工業（株））に移し、４５分間冷凍した。その後、シッフ試薬を除き、１０％酢酸で洗浄した。その結果、８６ｋＤａ、９０ｋＤａ、２００ｋＤａのバンドが発色し、これらのタンパク質には糖が付いていることが示された（図４；右から２列目）。脂質の確認はNile  Blue  Aにより検出した。Nile  blue  A溶液は 0.25gを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、その後濃硫酸を１ｍｌ加え、その後、２時間ボイルし、フィルターでろ過して作成した。この溶液中に電気泳動後のゲルを移し５０℃で３０分間インキュベーションした。その後、５％酢酸溶液に移し、５０℃で２日間インキュベートし、さらにその後０．５％塩酸溶液に５分間インキュベートし、蒸留水で洗浄した。その結果、８６ｋＤａ、９０ｋＤａ、２００ｋＤａのバンドが発色し、これらのタンパク質に脂肪酸が結合していることが示された（図４；最右列）。【００２８】
本タンパク質試料２については、１５−２５％アクリルアミドゲルで電気泳動により、３７ｋＤａ、１６ｋＤａ及び１５．４ｋＤａにバンドが確認された（図５）。
【実施例３】
【００２９】
本タンパク質試料１のN末端アミノ酸配列を分析した。すなわち、実施例２と同様にSDS-ポリアクリルアミド電気泳動を行った後、セミドライ式転写装置を用いてポリフッ化ビニリデン膜に転写した。そして本タンパク質試料１のバンドを切出し、そのN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（ABI社製  473A型プロテインシーケンサー）で分析した。その結果、本タンパク質試料のN末端のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３及び４に示したとおりであることが明らかとなった。またこのことから、本タンパク質試料１中には、類似のアミノ酸配列を持つアイソフォームが存在することが示された。【００３０】
同様に本タンパク質試料２の３７ＫＤａのタンパク質についてN末端アミノ酸配列を分析した。その結果、本タンパク質試料２のN末端のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１及び２に示したとおりであることが明らかとなった。またこのことから、本タンパク質試料２中にも、類似のアミノ酸配列を持つアイソフォームが存在することが示された。
【実施例４】
【００３１】
＜不凍活性の測定＞
上記本タンパク質試料１及び本タンパク質試料２について不凍活性として熱ヒステリシスを測定した。Vogel社製OSMOMETER OM 801により溶液の凝固点を求め、熱ヒステリシスを求めた。その結果、本タンパク質試料２では、タンパク質濃度が0〜10mg/mlで濃度依存的に熱ヒステレシスが上昇して、１０mg/mlの濃度では０．４２℃の熱ヒステレシスが示された（図６）。一方、本タンパク質試料１では熱ヒステレシスの上昇は認められなかった。この結果より還元下で生成した低分子量のタンパク質が不凍活性を有していること示された。【００３２】
また、氷結晶を直接顕微鏡で観察し、その形態にバイピラミダルや六角形などの特徴的な変化があるかどうかで不凍活性の有無を調べた。精製されたタンパク質溶液1μlをカバーガラス上に滴下し、さらにその上にカバーガラスを乗せて挟んでOlympus社製BH２型顕微鏡のステージに乗せ、リンカム社製LK600温度制御装置により冷却ステージ内の温度を毎秒0.1℃で冷却して行き、氷結晶を観察した。その結果、本タンパク質試料２を添加した場合には、図７に示したようなバイピラミダル型の氷結晶が観察された。
＜温度安定性＞
本タンパク質試料２の温度安定性について試験した。各試料を５０ｍM  炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐH７．９）に溶解し（タンパク質濃度7.5mg/ml）、０〜９０℃にそれぞれ1時間保持し、その後、不凍活性を測定した。その結果、０℃で保持した試料の活性に対して不凍活性は１００〜１１０％を保持しており熱に安定であることが示された（図８）。
【実施例５】
【００３３】
＜再結晶化阻害活性の測定＞
本タンパク質試料２の氷結晶の再結晶化阻害活性として、氷結晶を顕微鏡で観察し、微小氷結晶数を観察した。すなわち、３０％スクロース溶液に溶解した本タンパク質試料２μlをカバーガラス上に滴下し、さらにその上にカバーガラスを乗せて挟み、光学顕微鏡（オリンパス社製 ＢＨ２型）のステージに乗せ温度制御装置（リンカム社製ＬＫ６００）により冷却ステージ内の温度を２０℃、−３０℃、２０℃、−３０℃、２０℃、−３０℃、−１０℃の順に０．１℃／秒で冷却、加熱を繰り返した後、−１０℃で３０分保持し、１０．０１〜３５μm2の面積を有する氷結晶を微小氷結晶として数えた。その結果、図９に示したように濃度１．０×１０-2ｍｇ／ｍｌにピークを示し、氷結晶の再結晶化阻害活性を有することが確認された。
【実施例６】
【００３４】
＜南極オキアミの各部位からの本タンパク質試料１の精製＞
上記本タンパク質試料１がオキアミのどの部位に多く含まれるかを確認するために眼球、身肉、肝膵臓、殻に分けて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認したところいずれの部位にも存在することが確認された。特に殻に多く含まれることが確認されたので南極オキアミの殻からも実施例１と同じ方法で精製したところ、１０ｇの殻から２０ｍｇのタンパク質が得られた。
【実施例７】
【００３５】
＜甲殻類由来タンパク質の不凍活性の測定＞
オキアミ以外の甲殻類由来タンパク質の不凍活性の観察を行った。実施例１と同様の方法により、タラバガニ、ズワイガニ、アメリカザリガニの殻から加熱生成物を精製し、観察を行った結果、不凍活性を有することが確認された（表１）。【００３６】
【表１】
2007105734.tif 000002
【実施例８】
【００３７】
＜南極オキアミからの不凍タンパク質の抽出方法の検討＞
１．オキアミホールからの抽出
冷凍オキアミ2kgをフードプロセッサーで粉砕後、水道水2Lを加えた懸濁液を作製した。次に作製した懸濁液を80℃で30分間加熱した上で5000G30分間、遠心分離し上清2.6Lを回収した。この上清を45℃で減圧濃縮し、濃縮液0.52Lを得た。この濃縮液をスプレードライヤーで乾燥し粉末(エキス粉末A)を得た。得られた粉末の重量は121ｇであり、その粉末に含まれるタンパク質の割合は24.2%であった。
２．オキアミ殻乾燥物からの抽出
オキアミから殻を分離し乾燥した上で粉砕し、オキアミ殻乾燥物を得た。得られたオキアミ殻乾燥物1kgに対して水道水7Lを加え懸濁液を作製した。次に作製した懸濁液を80℃で30分間加熱した上で5000G、30分間、遠心分離し上清4.7Lを回収した。この上清を45℃で減圧濃縮し、濃縮液0.86Lを得た。この濃縮液をスプレードライヤーで乾燥し粉末（エキス粉末B）を得た。得られた粉末の重量は124ｇであり、その粉末に含まれるタンパク質の割合は10.6%であった。【００３８】
前記エキス粉末AおよびBのSDS-ポリアクリルアミド電気泳動分析を行った。エキス粉末Aには分子量37kDaのタンパク質が、エキス粉末Ｂには16kDa及び15.4kDaのタンパク質が含まれていることが確認された。（図１０）
＜エキス粉末Ａ及びＢの不凍活性の測定１＞
エキス粉末AおよびBの不凍活性の観察を行った。エキス粉末を蒸留水に懸濁後、エタノール沈澱処理により脱塩を行った上で熱ヒステレシスをオスモメーターにより測定した。両エキス粉末共にタンパク質濃度依存的に熱ヒステレシスが上昇していることが確認された（図１１）。以上の結果から、上記の抽出方法で製造したオキアミ由来エキス粉末には不凍活性を有するタンパク質が含まれていることが示された。また、表２に示したように1mg/ml当たりの熱ヒステレシスを比較するとオキアミ殻乾燥物から抽出したエキス粉末Ｂの不凍活性がエキス粉末Ａと比較して３倍程度不凍活性が強いことが観察された。【００３９】
【表２】
2007105734.tif 000003
＜エキス粉末Ａ及びＢの不凍活性の測定２＞
オキアミ由来エキス粉末による氷結晶の成長抑制効果を顕微鏡により観察した。顕微鏡に設置した冷却ステージ内にエキス粉末を蒸留水に懸濁した上で2枚のカバーガラスで挟みこむようにアプライした。冷却ステージ内の温度を−30℃まで下降させ一旦懸濁液を凍結させた上で0℃付近まで昇温させて氷結晶のつぶを作製した。次に1℃/minの速度で冷却ステージ内の温度を低下させて、温度低下に伴い成長する氷結晶の様子を観察した。オキアミホール由来エキス粉末A、オキアミ殻由来エキス粉末Bの懸濁液を使用した場合、共に図12、13に示したように氷結晶の成長が抑制されて六角平面状の氷結晶が観察された。よってこれら両エキス粉末が氷結晶成長抑制効果を有していることが示された。
＜エキス粉末Ａ及びＢの氷結晶の再結晶化阻害活性の測定＞
オキアミ由来エキス粉末による氷結晶の再結晶化制御効果を観察した。すなわち、３０％スクロース溶液に溶解した本タンパク質試料２μlをカバーガラス上に滴下し、さらにその上にカバーガラスを乗せて挟み、光学顕微鏡（オリンパス社製 ＢＨ２型）のステージに乗せ温度制御装置（リンカム社製ＬＫ６００）により冷却ステージ内の温度を２０℃、−３０℃、２０℃、−３０℃、２０℃、−３０℃、−１０℃の順に０．１℃／秒で冷却、加熱を繰り返した後、−１０℃で３０分保持し、１０．０１〜３５μm2の面積を有する氷結晶を微小氷結晶として数えた。図１４に示したようにオキアミホール由来エキス粉末Aでは濃度0.001％をピークに、オキアミ殻由来エキス粉末Bでは濃度依存的に再結晶化阻害活性を有することが確認された。
＜南極オキアミ乾燥粉末からの不凍活性を有するタンパク質の抽出・精製＞
南極オキアミ乾燥粉末5ｇに対して20mM Tris-HCl（pH 7.5）pPMSF 1mM を含む抽出液50mlを加え、懸濁後、90℃で30分抽出した。その後、この懸濁液を10,000×gで３０分間遠心分離を行い、上清を得た。これを20mM Tris-HCl（pH 7.5）で平衡化したSuperdex G30（GE Healthcare）に供し、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。このとき図１５に示すクロマトグラムの溶出量8〜10ml（図１５ A）及び18〜20ml（図１５ B）の画分に不凍活性を有するタンパク質が存在することを温度制御装置と顕微鏡を用いた、氷結晶の形状変化で確認した。次にこれらの画分を逆相HPLCに供した。すなわち、それぞれの画分20μlを終濃度0.1%トリフルオロ酢酸に調整し、0.1%トリフルオロ酢酸で平衡化したODSカラム（Mightysil RP-18 GP、150-4.6mm）を装着した高速液体クロマトグラフィー（JASCO PU-1580、UV-1570、DG-1580-53、HG-1580-32、CO-1565）に供し、0〜40％アセトニトリルの直線濃度勾配により、タンパク質を分離・溶出した。この結果を図１６（溶出量8〜10ml画分）、図１７（18〜20ml画分）に示す。図示したように、本タンパク質は2.41、2.78、4.11、6.36、8.89、10.00、17.73、19.92、23.70、26.84、31.48、41.65と2.28、2.93、10.44、28.58、33.1の保持時間で溶出されるピークを有していた。
上記逆相HPLCの測定条件は以下のとおりである。
カラム: Mightysil RP-18 GP、150-4.6mm
溶離液: 
0-10min：0.1% トリフルオロ酢酸水溶液
10-60min：0.08％ トリフルオロ酢酸、80% アセトニトリル
流速: 0.8 ml/min.
カラム温度: 25℃
【実施例９】
【００４０】
＜オキアミ由来エキス粉末の添加によるデンプンゲル離水防止効果＞
オキアミ由来エキス粉末の添加によるデンプンゲル離水防止効果を観察した。馬鈴薯デンプンを原料としてRVA（ラピッドビスコアナライザー）を用いてデンプンゲルを作製した。−20℃で凍結した上で、−10℃で保存し、融解後の離水の様子を観察した結果、オキアミ由来エキス粉末を添加することで離水量上昇が抑制されることが確認された（図１８）。また、7日間冷凍保存後のデンプンゲルをフリーズドライしたうえで構造を電子顕微鏡で観察した結果、エキス粉末を添加したデンプンゲルの方が無添加のゲルと比較してきめ細かい構造をとっていることが確認された。（図１９、２０）これはオキアミ由来エキス粉末がデンプンゲルの冷凍保存中の氷結晶の成長を抑制し、デンプンゲルの冷凍保存中の劣化を抑制しているためであると考えられる。
【実施例１０】
【００４１】
＜水産物への応用―スケソウタラ落とし身への添加―＞
三陸沖で漁獲された鮮魚であるスケソウタラから肉を採取し、３ｍｍメッシュのミンサーで挽肉状にした。それを５００ｇ取り、水５０ｇ、砂糖５０ｇを加え、さらにエキス粉末Bをそれぞれ０〜０．１％になるように加え、卓上ミキサーで２５秒間攪拌した。これを落とし身サンプルとして使用した。次にそれぞれを−２５℃で一晩凍結し、その後−１０℃で2週間保存したものを保存性評価の指標となる塩溶解性、ＴＭＡＯ分解度の測定用に用いた。
塩溶解性の測定
落とし身３ｇに0.1M KCl 20mM Tris-HCl(pH7.5)溶液を27ml加え、ホモジナイズした（10,000rpm×30秒  3回）、その後、5,000rpm×１０分間の遠心分離を行い、沈殿物を得て、さらにその沈殿物に0.5M KCl 20mM Tris-HCl(pH7.5)を27ml加えて攪拌する。再び5,000rpm×１０分間の遠心分離を行い、得られた沈殿物に0.5M KCl 20mM Tris-HCl(pH7.5)溶液を27ml加えて攪拌し、１M  ATP30μl加えて一晩氷蔵下で保存する。その後攪拌し、ビウレット法にてその懸濁溶液の蛋白質濃度と容量を測定しておく。さらに懸濁溶液は7,000rpm×１５分間遠心分離を行い、得られた上澄みの蛋白質濃度をビウレット法で測定し、併せて容量も測定した。以上の測定より、先の上澄み中の蛋白質量と懸濁液中の蛋白質量の比から塩溶解性を算出した。その結果、図２１に示すように塩溶解性についてはエキス粉末Bの添加量とともに増加しており、エキス粉末Bの添加により冷凍保存時のスケソウタラ落とし身の品質劣化が抑制される傾向が示された。
TMAOの分解反応の測定
落とし身サンプル１０ｇに対して蒸留水１０ml、１０％トリクロロ酢酸（TCA）10mlを加えてホモジナイズする（12,000rpm×2分間）。その後遠心分離（7,500×20分）して上澄みを得る。沈殿物には5％TCA溶液を5ml加えよく攪拌し、遠心分離を行い上澄みを得る。この操作を2回行い、ここまで得られた上澄みを50mlメスフラスコに加え、さらに5％TCA溶液でメスアップし、これをTCA抽出液とする。
TCA抽出液1mlと蒸留水3mlを混合し、銅−アンモニア試薬0.4ml、5％二硫化炭素−ベンゼン溶液を添加し、４０℃  5分間インキュベートした。その後、振とうを繰り返し、遠心分離（3,500×5分）を行い、得られた上澄みに対して無水硫酸ナトリウム約0.2ｇ入りの試験管に移し、その溶液を440nmで吸光値を測定する。生成するDMA量は次の式で表される。
DMA量(mM)=（440nm測定値）÷1.3×２×50÷1000÷（サンプル重量）×1000
TMAOの分解によるDMAの生成量は図２２に示すようにエキス粉末Bの添加量とともに低下していくことが示された。エキス粉末Bの添加によりＴＭＡＯが分解されＤＭＡと同等量のホルムアルデヒドが生じる。ＤＭＡの生成量が抑制されたことは、ホルムアルデヒドの生成が抑制されたことを意味し、ホルムアルデヒドによる冷凍保存時のスケソウタラ落とし身の冷凍変性が抑制されることを示す。
【実施例１１】
【００４２】
＜食品への応用＞
１．うどん
うどんを表３に示す配合（この配合により、添加品はうどん中に本タンパク質試料２を0.00036％含有する）で混合、混捏し圧延後、ビニールで麺帯を包み、室温下で1時間熟成した。その後、さらに圧延し、切り出しを行い、沸騰水中で１０分間茹でた。その後流水中で5分間冷却し、ざるに移し、５分間水切り後、−２０℃で1晩凍結した。その後、−１０℃へ移し２週間凍結保存した。室温下で約２時間自然解凍を行い、その食感について評価した。またコントロールとして本発明のタンパク質を含まないうどんを作成して比較を行った。その結果、表３のように本タンパク質試料２を含むうどんはコントロールと比較して、麺の表面が滑らかであり、かつモチモチした食感で弾力があった。【００４３】
【表３】
2007105734.tif 000004
２．炊飯米
表４に示す配合（この配合により、添加品は炊飯米中に本タンパク質試料２を0.00036％含有する）で炊飯米を作成し評価を行った。精白米（きらら３９７  Ｈ１７年産米）に対して１．３５倍量の水を加えて家庭用の炊飯器を用いて炊いた。炊飯後、３０分間蒸らした後、２０ｇ×１０個の寿司の押し型で成型した。その後、−２０℃で３日間凍結後、−１０℃へ移し５日間凍結保存した。評価は室温下で約２時間自然解凍を行い、食感を評価した。その結果、表４に示すようにコントロールに比べて、添加品は粘りがあり、食味が良好であった。【００４４】
【表４】
2007105734.tif 000005
３．茶碗蒸し
茶碗蒸しを表５に示した配合（この配合により、添加品は茶碗蒸し中に本タンパク質試料２を0.00033％含有する）で作成し評価を行った。材料を混合した後、耐熱容器に６０ｇずつ加え、蒸し器に入れ、蒸した。室温下で粗熱を取った後、−２０℃で3日間凍結し、−１０℃で5日間凍結保管した。評価は蒸し器で１０分間蒸して食感を評価した。
その結果、コントロールに比べて添加品は“す”が入らず、食感も滑らかなものであり、またドリップもなく良好な食味であった。【００４５】
【表５】
2007105734.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のタンパク質は、ミール、キチン、キトサン原料に利用される以外はその大半が廃棄される甲殻類の殻に多く含まれるために、大量調製が可能で、かつ安価に生産することが出来る。また、食品由来のタンパク質であるから食品への添加に応用しやすい。本発明のタンパク質は、不凍活性、氷結晶の再結晶化阻害活性を有するので、冷凍食品等の品質保持などの目的に広く利用が可能である。
［配列表フリーテキスト］
配列番号：１
N末端アミノ酸配列
配列番号：２
N末端アミノ酸配列
配列番号：３
N末端アミノ酸配列
配列番号：４
N末端アミノ酸配列
［配列表］
<110>  Nippon Suisan Kaisha Ltd.
<120>  不凍活性を有する甲殻類由来タンパク質
<130>  YCT-1258
<141>  2007-03-13
<150>  JP 2006-67758
<151>  2006-03-13
<160>  4
<210>  1
<211>  20
<212>  PRT
<213>  南極オキアミ(Euphausiacea sp.)
<400>  KYGGEFPARPDNIXFENVDG  （一文字記号）
Lys Tyr Gly Gly Glu Phe Pro Ala Arg Pro Asp Asn Ile Xaa Phe Glu
Asn Val Asp Gly  （三文字記号）
<210>  2
<211>  19
<212>  PRT
<213>  南極オキアミ(Euphausiacea sp.)
<400>  TTYKYGGEFPARPDNXXFE  （一文字記号）
Thr Thr Tyr Lys Tyr Gly Gly Glu Phe Pro Ala Arg Pro Asp Asn Xaa
Xaa Phe Glu  （三文字記号）
<210>  3
<211>  20
<212>  PRT
<213>  南極オキアミ(Euphausiacea sp.)
<400>  DYDVAHEQQDVNAFLTKITG  （一文字記号）
Asp Tyr Asp Val Ala His Glu Gln Gln Asp Val Asn Ala Phe Leu Thr
Lys Ile Thr Gly  （三文字記号）
20
<210>  4
<211>  18
<212>  PRT
<213>  南極オキアミ(Euphausiacea sp.)
<400>  SDPKFQQDINTRLXNVYE  （一文字記号）
Ser Asp Pro Lys Phe Gln Gln Asp Ile Asn Thr Arg Leu Xaa Asn Val
Tyr Glu  （三文字記号）
【図１】
2007105734.tif 000007
【図２】
2007105734.tif 000008
【図３】
2007105734.tif 000009
【図４】
2007105734.tif 000010
【図５】
2007105734.tif 000011
【図６】
2007105734.tif 000012
【図７】
2007105734.tif 000013
【図８】
2007105734.tif 000014
【図９】
2007105734.tif 000015
【図１０】
2007105734.tif 000016
【図１１】
2007105734.tif 000017
【図１２】
2007105734.tif 000018
【図１３】
2007105734.tif 000019
【図１４】
2007105734.tif 000020
【図１５】
2007105734.tif 000021
【図１６】
2007105734.tif 000022
【図１７】
2007105734.tif 000023
【図１８】
2007105734.tif 000024
【図１９】
2007105734.tif 000025
【図２０】
2007105734.tif 000026
【図２１】
2007105734.tif 000027
【図２２】
2007105734.tif 000028
【国際調査報告】
2007105734.tif 000029
2007105734.tif 000030
2007105734.tif 000031
2007105734.tif 000032