(57)【要約】光学異性体分離にあたり光学異性体分離用カラムを使用した分離成否の迅速、簡便な確認方法及びイソクラティク溶出条件での溶離液組成条件の簡便な設定方法を提供する。  光学異性体分離にあたり、光学異性体分離用カラムを使用したＨＰＬＣグラジエント溶出分析方法を適用することによって簡便、迅速な分離成否の確認を行うことができる。さらに分離成功時にはグラジエント溶出分析の溶出時間から、イソクラティック溶出条件の溶離液組成が推算可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学異性体の混合物を、多糖類誘導体を不斉識別剤とした耐溶剤型ＨＰＬＣ用光学異性体分離用カラムを用い２成分以上の溶剤を用いるグラジエント溶出法により光学異性体を分離することを特徴とする光学異性体の分析方法又は分離方法。
【請求項２】
グラジエント溶出法に用いられる溶剤が、低極性溶剤と高極性溶剤との組み合わせからなる２成分以上の溶剤組成もしくは低極性溶剤と中極性溶剤との組み合わせからなる２成分以上の溶剤組成、もしくは中極性溶剤と高極性溶剤との組み合わせからなる２成分以上の溶剤組成、あるいは低極性溶剤と中極性溶剤と高極性溶剤との組み合わせからなる３成分以上の溶剤組成であることを特徴とする請求項１記載の光学異性体の分析方法又は分離方法。
【請求項３】
グラジエント溶出法に用いられる溶剤に、アミン化合物若しくは酸化合物の片方もしくは両方を０．０１〜５．０％まで含有させることを特徴とする請求項２記載の光学異性体の分析方法又は分離方法。
【請求項４】
請求項１のグラジエント分析法で得られた第１ピークの溶出時間（ｔ１）に基づき、グラジエント勾配から算出されるｔ１時の溶剤組成比率にファクター（ｆ１）を掛けて得られる組成比率で、イソクラティック条件下、光学異性体分離を行うことを特徴とする光学異性体の分析方法又は分離方法。
【請求項５】
上記ファクター（ｆ１）が０．８〜０．１の範囲であることを特徴とする請求項４記載の光学異性体の分析方法又は分離方法。
【請求項６】
上記ファクターが（ｆ１）０．５〜０．１の範囲であることを特徴とする請求項５記載の光学異性体の分析方法または分離方法。
【請求項７】
請求項４においてグラジエント終了後に化合物が溶出される場合、先ずはグラジエント終了時の溶剤比率に０．２を掛けてイソクラティックでの比率を算定し、この比率に、第１ピークの溶出時間とグラジエントに要した時間との差にファクター（ｆ２）を掛けて得られる組成比率で、イソクラティック条件下、光学異性体分離を行うこと特徴とする光学異性体の分析方法又は分離方法。
【請求項８】
上記のファクター（ｆ２）が４〜３０の範囲であることを特徴とする請求項４記載の光学異性体の分析方法又は分離方法。
【請求項９】
上記のファクター（ｆ２）が５〜２０の範囲であることを特徴とする請求項４記載の光学異性体の分析方法又は分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学異性体の分析方法又は分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析では一定組成の溶剤で溶離するイソクラティック分析法と、時間とともに移動相組成を変化させて溶離するグラジエント分析法が用いられている。イソクラティック分析法では安定したクロマトグラムが得られるが、固定相に対する保持力が異なる成分の分離の際に長時間要したり、ピークが拡がったりすることがある。一方、グラジエント分析法では、移動相の組成比を変化させ、溶離力を上げていくことにより、分析時間を短縮し、ピークの拡がりを抑制することができる。【０００３】
光学異性体分離用の固定相として、種々の分離剤およびカラムが市販されている。このような光学異性体用分離剤としては、広範囲の化合物の分離において優れた分離性能を示す多糖類誘導体がよく用いられる。又、近年、極性溶媒の移動相条件でも使用可能な、担体に多糖誘導体が固定化された耐溶剤型の光学異性体用分離剤も開発されている（特許文献１、２）。この多糖類型耐溶剤型分離剤を充填した光学異性体分離用カラムは、多糖類誘導体の高い分離性能を維持しながら、種々の溶剤が移動相として利用可能となったことで注目されているが、短時間での分析（望ましくは３０分以内）でシャープな分離を得るには試行錯誤が必要である。
【特許文献１】特許２７５１００３号公報
【特許文献２】特許２７５１００４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、多糖類誘導体を不斉識別剤とした耐溶剤型ＨＰＬＣ用光学異性体分離用カラムを用いた簡単な分析法又は分離方法を提供する。
課題の解決手段【０００５】
本発明者らは、鋭意検討の結果、グラジエント分析法により良好な分離を達成する分析条件が簡便に得られること、又、グラジエント分析結果からイソクラティック分析の条件を簡単に設定できることを見いだし、本発明を完成した。【０００６】
すなわち、本発明は、光学異性体の混合物を、多糖類誘導体を不斉識別剤とした耐溶剤型ＨＰＬＣ用光学異性体分離用カラムを用い２成分以上の溶剤を用いるグラジエント溶出法により光学異性体を分離することを特徴とする光学異性体の分析方法を提供する。【０００７】
また、本発明は、グラジエント分析法で得られた第１ピークの溶出時間（ｔ１）に基づき、グラジエント勾配から算出されるｔ１時の溶剤組成比率にファクター（ｆ１）を掛けて得られる組成比率で、イソクラティック条件下、光学異性体分離を行うこと特徴とする光学異性体の分析方法又は分離方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、グラジエント分析により、多糖類誘導体を不斉識別剤とした耐溶剤型ＨＰＬＣ用光学異性体分離用カラムによる不斉識別の可能性が迅速かつ簡便に確認でき、また精密な分析又は分取のためのイソクラティックな分析又は分離の条件を簡単に設定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１で得られたクロマトグラムである
【図２】実施例２で得られたクロマトグラムである
【図３】比較例１で得られたクロマトグラムである
【図４】実施例３で得られたクロマトグラムである
【図５】実施例５で得られたクロマトグラムである
【図６】比較例２で得られたクロマトグラムである
【図７】実施例５で得られたクロマトグラムである
【図８】実施例６で得られたクロマトグラムである
【図９】実施例７で得られたクロマトグラムである
【図１０】実施例８で得られたクロマトグラムである
【図１１】実施例９で得られたクロマトグラムである
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ＨＰＬＣ装置は、市販のものを用いることができる。【００１１】
本発明に用いられる不斉識別剤としては多糖類誘導体が用いられる。多糖類としては、例えばセルロース、アミロースなどである。【００１２】
本発明において、多糖類誘導体とは、多糖類の水酸基が修飾されているものを意味し、好ましい多糖類誘導体は芳香族置換基を有するカルバメート誘導体又はエステル誘導体である。さらに好ましくは、アルキル置換芳香族基を有するカルバメート誘導体又はエステル誘導体である。特に好ましい多糖類誘導体は、アミロース  トリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）及びセルロース  トリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメートである。
本発明における多糖類の誘導体化は公知の方法で行われる。例えば、国際公開９５／２３１２５号パンフレット等に記載されているように、多糖が有する水酸基と反応可能な化合物であって、前記官能基を含むかまたは前記水酸基との反応によって前記官能基となる化合物と、多糖類とを脱水反応等によって反応させることにより作成することができる。【００１３】
本発明における多糖類誘導体を不斉識別剤とした耐溶剤型ＨＰＬＣ用光学異性体分離用カラムとは、多糖類誘導体からなる耐溶剤型光学異性体分離用充填剤が充填されたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）用カラムを意味する。
ここで、多糖類誘導体からなる耐溶剤型光学異性体分離用充填剤は、前述の多糖類誘導体を担体上で固定化したものである。かかる固定化は、特許文献１や２、その他特開２００２−１４８２４７号公報、特開２００４−１６７３４３号公報、または国際公開２００４／０９５０１８号パンフレット等に記載されている方法で行うことができる。
このようにして得られる耐溶剤型光学異性体分離用充填剤が充填されたＨＰＬＣ用カラムは、例えばダイセル化学工業株式会社からキラルパックＩＡ、ＩＢ等として市販されている。【００１４】
グラジエント分析法では、移動相の溶剤混合比、移動相の溶剤組成比、イオン強度、ｐＨなどを時間とともに凸型、直線型、凹型に変化させる。好ましくは、移動相の溶剤組成比を直線型に変化させる。グラジエント溶出法に用いられる溶剤組成は、ヘキサンなどの低極性溶剤とＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、アセトンなどの高極性溶剤（メタノール、エタノール、２−プロパノールなどのアルコールは除く）との組み合わせからなる２成分以上の溶剤組成、もしくはヘキサンなどの低極性溶剤とクロロホルムなどの中極性溶剤との組み合わせからなる２成分以上の溶剤組成、もしくは中極性溶剤と高極性溶剤との組み合わせからなる２成分以上の溶剤組成、あるいは低極性溶剤と中極性溶剤と高極性溶剤との組み合わせからなる３成分以上の溶剤組成である。グラジエント溶出法に用いられる溶剤に、ジエチルアミンなどのアミン化合物若しくはトリフルオロ酢酸、酢酸などの酸化合物の片方もしくは両方を０．０１〜５．０％まで添加してもよい。【００１５】
次にグラジエント分析データからイソクラティック条件を設定する方法について説明する。先ず、グラジエント分析中に化合物が溶出される場合には、グラジエント分析法で得られた第１ピークの溶出時間（ｔ１）に基づき、設定したグラジエント勾配（Ｖ）から算出される第１ピークの溶出時（ｔ１）の溶剤組成比率を算定する。得られた溶剤組成比率のうち、初期条件で比率の小さかった溶剤（より極性の高い溶剤）の比率にファクター（ｆ１）を掛けて得られる組成比率（Ｃ）で、イソクラティック条件を設定する（１式）。
このファクターは、第１ピークの溶出時間、分離係数および設定グラジエントカーブと実際のグラジエントカーブの差を考慮して、０．８〜０．１の範囲で適宜設定する。短時間で良好な分離を得るためには、好ましくは０．５〜０．１の範囲である。【００１６】
Ｃ＝（Ａ＋Ｖ×ｔ１）×ｆ１        （１式）
Ａ：グラジエントさせる溶剤（初期条件において比率の小さな溶剤）の初期組成比率（％）
Ｖ：溶剤のグラジエント勾配（％／ｍｉｎ）
Ｃ：イソクラティック条件におけるグラジエントさせた溶剤（初期条件において比率の小さな溶剤）の組成比率（％）
一方、グラジエント終了後に化合物が溶出される場合には、先ずグラジエント終了時の溶剤比率のうち、初期条件において比率の小さかった溶剤の比率に０．２を掛けてイソクラティックでの比率（Ｂ）を算定する（３式）。この比率に、第１ピークの溶出時間（ｔ１）とグラジエントに要した時間（Ｇｔ）の差にファクター（ｆ２）を掛けて得られる組成比率（Ｄ）で、イソクラティック条件を設定する（２式）。ファクター（ｆ２）は４〜３０の範囲で、好ましくは５〜２０の範囲である。【００１７】
Ｄ＝Ｂ＋（ｔ１−Ｇｔ）×ｆ２        （２式）
Ｂ＝（Ａ＋Ｖ×Ｇｔ）×０．２        （３式）
Ａ：グラジエントさせる溶剤（初期条件において比率の小さな溶剤）の初期組成比率（％）
Ｂ：グラジエント終了時の溶剤組成比率をイソクラティック条件へ読み替えた比率
Ｖ：溶剤のグラジエント勾配（％／ｍｉｎ）
Ｇｔ：グラジエントさせた時間（ｍｉｎ）
Ｄ：イソクラティック条件におけるグラジエントさせた溶剤（初期条件において比率の小さな溶剤）の組成比率（％）
【実施例】
【００１８】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。ＨＰＬＣ分析は、クロマトデータ処理システム：Ｊｕｓｔｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｏｆｔａｒｅ社製  Ｃｈｒｏｍ  Ｐｅｒｆｅｃｔ、クロマト制御システム：日本分光社製ＢＯＷＩＮ、液体クロマトグラフ用ポンプ：日本分光社製ＰＵ−１５８０、液体クロマトグラフ用ＵＶ検出器：日本分社製ＰＵ−１５７５、液体クロマトグラフ用オートサンプラー：日本分社製ＰＵ−１５５５、液体クロマトグラフ用ミキシングマシーン：日本分社製ＨＧ１５８０−３２、液体クロマトグラフ用デガッサー：日本分社製ＤＧ１５８０−５３、を用いて測定した。【００１９】
（実施例１）
光学異性体分離カラムとしてダイセル化学工業株式会社製カラム（登録商標キラルパックＩＡ（０．４６ｃｍΦ×２５ｃｍＬ））を、移動相としてヘキサン／ＴＨＦ混合溶剤を用いて、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、温度２５℃でｔ−スチルベンオキシドの分割を行った。その際、移動相中のＴＨＦ比率（ｖ／ｖ）を５％から９５％へ１８分（ｍｉｎ）掛けて上げながら、分析した。第一ピークは６．３０分、第二ピークは１１．２０分で溶出され、分離係数（α）は２．４８であった。第一ピーク溶出時の移動相中のＴＨＦ量は５％＋５％×６．３０＝３６．５％で約３７％である。本比率にファクター（ｆ１）として、０．２を掛けてイソクラティック移動相中のＴＨＦ比率を設定（ヘキサン／ＴＨＦ＝９３／７）することにより、短時間でベースライン分離を得ることができた。結果を表１及び図１に示した。【００２０】
（実施例２）
実施例２のファクター（ｆ１）として、０．３３を掛けてイソクラティック移動相中のＴＨＦ比率を設定（ヘキサン／ＴＨＦ＝８８／１２）することにより、短時間でベースライン分離を得ることができた。結果を表１及び図２に示した。【００２１】
（比較例１）
実施例１におけるファクター（ｆ１）として、１を掛けてＴＨＦ比率を設定（ヘキサン／ＴＨＦ＝６３／３７）し分離を行ったが、かろうじて完全分離であった。結果を表１及び図３に示した。【００２２】
【表１】
2007148834.tif 000002
【００２３】
（実施例３）
光学異性体分離カラムとしてダイセル化学工業株式会社製カラム（登録商標キラルパックＩＡ（０．４６ｃｍΦ×２５ｃｍＬ））を、移動相にヘキサン／ＴＨＦを用いて、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、温度２５℃でアミノグルテチミドの分割を行った。その際、移動相中のＴＨＦ比率（ｖ／ｖ）を５％から９５％へ１８分掛けて変化させた。グラジエント終了時の組成比率を維持しながら通液を継続した。アミノグルテチミドの第一ピークは注入後２０．０分、第二ピークは２１．７８分で溶出され、分離係数（α）は１．４２であった。本グラジエント分析の結果をもとに、第一ピーク溶出時のＴＨＦ比率をイソクラティックへ読み変えた比率（Ｂ）は９５×０．２＝１９である。この比率に、第１ピークの溶出時間（ｔ１）とグラジエントに要した時間（Ｇｔ）の差にファクター（ｆ２）６．５を掛けて得られる値を加算して得られる組成比率（Ｄ）で、イソクラティック条件を設定（ヘキサン／ＴＨＦ＝６８／３２）することにより良好な分離を得た。結果を表２及び図４に示した。【００２４】
（実施例４）
実施例３において、第１ピークの溶出時間（ｔ１）とグラジエントに要した時間（Ｇｔ）の差にファクター（ｆ２）８．５を掛けて得られる値を加算して得られる組成比率（Ｄ）で、イソクラティック条件を設定（ヘキサン／ＴＨＦ＝６４／３６）することにより良好な分離を得た。結果を表２及び図５に示した。【００２５】
（比較例２）
実施例３において、第１ピークの溶出時間（ｔ１）とグラジエントに要した時間（Ｇｔ）の差にファクター（ｆ２）４．５を掛けて得られる値を加算して得られる組成比率（Ｄ）で、イソクラティック条件を設定（ヘキサン／ＴＨＦ＝７２／２８）することにより完全分割は得られたが、第１ピークの溶出時間は２５分と長かった。結果を表２及び図６に示した。【００２６】
【表２】
2007148834.tif 000003
【００２７】
（実施例５）
化合物としてトレガ−塩基を用いて、実施例１と同様にイソクラティックの条件を決めた。結果を表３及びクロマトグラムを図７に示した。【００２８】
（実施例６）
化合物として１，１’−２−ビナフトールを用いて、実施例１と同様にイソクィラテックの条件を決めた。結果を表３及びクロマトグラムを図８に示した。【００２９】
（実施例７）
化合物としてコバルトアセチルアセトネートを用いて、実施例１と同様にイソクラティックの条件を決めた。結果を表３及びクロマトグラムを図９に示した。【００３０】
【表３】
2007148834.tif 000004
【００３１】
（実施例８）
実施例１において、移動相としてヘキサン／酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）／ジエチルアミン（ＤＥＡ）の混合溶剤を用いて、化合物ラウダノシンの分割を行った。その際、ＤＥＡの比率を０．１％で固定し、ＡｃＯＥｔの比率（ｖ／ｖ）を５％から９５％へ１８分掛けて上げながら分析した。その結果、殆ど分離されずにピークは１５．２７分に溶出されてきた。ピーク溶出時の移動相中のＡｃＯＥｔは５％＋５％×１５．２７＝８１．３５％である。本比率にファクター（ｆ１）として、０．２を掛けてイソクラティック移動相中のＴＨＦ比率を設定（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ／ＤＥＡ＝８４／１６／０．１）することにより、部分分離を得ることができた。結果を表４及び図１０に示した。【００３２】
【表４】
2007148834.tif 000005
2007148834.tif 000006
【００３３】
（実施例９）
実施例３の移動相をヘキサン／クロロホルム（ＣＨＣｌ３）／ジエチルアミン（ＤＥＡ）混合溶媒に変えて分割を行った。その際、移動相中のＣＨＣｌ３比率（ｖ／ｖ）を５％から９５％へ１８分掛けて変化させた。グラジエント終了時の組成比率を維持しながら通液を継続した。アミノグルテチミドの第一ピークは注入後２６．６８分、第二ピークは３２．９６分で溶出され、分離係数（α）は１．２７であった。本グラジエント分析の結果をもとに、第一ピーク溶出時のＣＨＣｌ３比率をイソクラティックへ読み変えた比率（Ｂ）は９５×０．２＝１９である。この比率に、第１ピークの溶出時間（ｔ１）とグラジエントに要した時間（Ｇｔ）の差にファクター（ｆ２）６．５を掛けた値を加算して得られる組成比率（Ｄ）で、イソクラティック条件を設定（ヘキサン／ＣＨＣｌ３／ＤＥＡ＝２５／７５／０．１）することにより良好な分離を得た。結果を表５及び図１１に示した。【００３４】
【表５】
2007148834.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明によれば、光学異性体分離にあたり、光学異性体分離用カラムを使用したＨＰＬＣグラジエント溶出分析方法を適用することによって簡便、迅速な分離成否の確認を行うことができる。さらに分離成功時にはグラジエント溶出分析の溶出時間から、イソクラティック溶出条件の溶離液組成が容易に推算可能である。
【図１】
2007148834.tif 000008
【図２】
2007148834.tif 000009
【図３】
2007148834.tif 000010
【図４】
2007148834.tif 000011
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
2007148834.tif 000019
2007148834.tif 000020
2007148834.tif 000021
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