【手続補正書】
【提出日】平成20年9月26日(2008.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、ポリペプチドであって、該アミノ酸配列はフィターゼ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
単離および／または精製されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託されたＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９株由来であるという点で特徴付けられる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも１００Ｕ／ｍｇ、より好ましくは少なくとも２００Ｕ／ｍｇ、最も好ましくは少なくとも３００Ｕ／ｍｇという比活性を有するという点で特徴付けられ、該比活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５に含有される、２ｍＭのフィターゼ、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で３７℃の温度で該ポリペプチドをインキュベートすることによって決定される、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、約ｐＨ３〜６、好ましくは約ｐＨ４〜５、最も好ましくは約ｐＨ４．５において最大活性を有するという点で特徴付けられ、該活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に含有される、２ｍＭのフィターゼ、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で該ポリペプチドを３７℃の温度でインキュベートすることによって決定される、ポリペプチド。
【請求項６】
５９位、７０位、１２２位、１２５位、１６７位、１９３位、１９７位、２０４位、２０９位、２１１位、２２１位、２２３位、２２５位、２４０位、２４２位、２４４位、２６８位、２８１位、２８９位、２９４位、３０３位、３３６位または３５１位（配列番号３におけるナンバリングに従って番号付けしている）のうちの少なくとも１つにおいて変異を含む、請求項１〜５のうちのいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
【化１−１】
2008516597.tif 000001
【化１−２】
2008516597.tif 000002
という変異のうちの１つ以上を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｋ５９Ｅ；Ｔ１６７Ｖ；Ｋ２４０Ｔ；Ｔ１６７Ｉ；Ｋ２４０Ｅ；Ｄ２４４Ｃ；Ｑ２８９Ｙ；Ｔ２０９ＫまたはＦ１９７Ｓからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項６または請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
【化２】
2008516597.tif 000003
からなる群より選択される変異の組み合わせを含む、請求項６〜８のうちのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記単離されたポリペプチドが、フィターゼ酵素改変体であり、該フィターゼ酵素改変体は、該フィターゼ酵素が由来する親フィターゼ酵素と比較して、より高い熱安定性および／またはより高い比活性および／またはより高いタンパク質分解安定性を有する、請求項６〜９のうちのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
単離された核酸分子であって、
ｉ）請求項１〜１０のうちのいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子、
ｉｉ）配列番号３のポリペプチドをコードする核酸に対して、５０℃かつ０．２×ＳＳＣでのストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸、
ｉｉｉ）配列番号２に示される配列を含む単離された核酸分子、
ｉｖ）配列番号２に対して、５０℃かつ０．２×ＳＳＣでのストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸、
から選択される、単離された核酸分子。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の単離された核酸分子であって、
配列番号２と同じヌクレオチド配列、
配列番号２と相補的なヌクレオチド配列、または
配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列、
を含む、単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項６〜１０のポリペプチドをコードする、請求項１１〜１３のうちのいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のうちのいずれか１項に記載のヌクレオチドを含む、プラスミドまたはベクター系。
【請求項１６】
請求項１〜１０に記載の酵素のうちのいずれかを発現するための発現ベクターであり、かつ／または、
微生物中において、請求項１１〜１４のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、
請求項１５に記載のプラスミドまたはベクター系。
【請求項１７】
請求項１５または１６のうちのいずれかに記載のプラスミドまたはベクター系を用いて形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１０のうちのいずれかに記載のポリペプチドを含む、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、微生物に由来し、該微生物は、
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌と、
Ｈ．ｐｏｌｙｍｐｒｐｈａ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母、ならびにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．およびＡ．ｏｒｙｚａｅなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．を包含する糸状菌を包含する真菌と
を包含する、宿主細胞。
【請求項２０】
原核生物細菌細胞であり、好ましくはＥ．ｃｏｌｉである、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託された、細菌細胞Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９株。
【請求項２２】
ポリペプチドを産生する方法であって、
宿主細胞中において、請求項１〜１０のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を発現させ、かつ／または請求項１１〜１４のうちのいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現させる工程と、
該宿主細胞培養培地から該フィターゼを分離する工程と
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項１〜１０のうちのいずれかに記載されるポリペプチドを、食物または動物飼料に対して液体形態で噴霧する工程
を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
【請求項２４】
請求項１〜１０のうちのいずれかに記載のポリペプチドを乾燥生成物として、食物または動物飼料と混合する工程
を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
【請求項２５】
食物または動物飼料における請求項１〜１０のうちのいずれかに記載のフィターゼの使用。
【請求項２６】
ｉ）請求項１〜１０のうちのいずれかに記載のフィターゼ、および／または
ｉｉ）請求項２３もしくは２４に記載の方法によって生成された動物飼料、
のいずれかを含む、食物または動物飼料組成物。
【請求項２７】
フィターゼ酵素改変体を調製するための方法であって、該方法は、以下の連続的工程：
ａ）少なくとも１つの親フィターゼ酵素を選択する工程であって、該少なくとも１つの親フィターゼ酵素は、請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載のポリペプチドから選択される、工程、
ｂ）該親フィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換またはそれらの組み合わせである該親フィターゼ酵素の少なくとも１つの変更を導入することによって、少なくとも１つのフィターゼ改変体を作製して、少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体を得る工程、
ｃ）該少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体をスクリーニングして、該親フィターゼ酵素と比較して、
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．より高い比活性および／または
ｉｉｉ．より高いタンパク質分解安定性
から選択される改良された特性（単数または複数）を有する改良されたフィターゼ酵素改変体を同定する工程、および
ｄ）該改良されたフィターゼ酵素改変体を調製して、好ましくは、単離されかつ／または精製されたフィターゼ酵素改変体を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
工程ｂ）の間にフィターゼ酵素改変体の集団が生成され、かつ工程ｃ）において、該フィターゼ酵素改変体の集団の少なくとも一部がスクリーニングされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程ａ）が、親フィターゼ酵素をコードする請求項１１〜１４のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列を変異誘発に供する工程を包含し、かつ
工程ｂ）が、工程（ａ）で得られた変異されたヌクレオチド配列を宿主細胞において発現させる工程を包含し、かつ
工程ｃ）が、宿主細胞またはその抽出物を、前記改良された特性（単数または複数）を有する改良されたフィターゼ酵素改変体についてスクリーニングする工程を包含する、
請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｃ）および必要に応じてｄ）の後に、反復工程ａ）〜ｃ）および必要に応じてｄ）の少なくとも１回の引き続くラウンドをさらに含み、好ましくは該引き続くラウンド（単数または複数）において、工程ａ）の少なくとも１つの親フィターゼ酵素が、請求項２７〜２９のうちのいずれかに記載の方法に従って調製された、前記少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体および／または改良されたフィターゼ改変体から選択される、請求項２７〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程ｃ）が、ｉ）前記親フィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのいずれかと比較して、少なくとも２．５という熱安定性の差を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する、請求項２７〜３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程ｃ）が、ｉ）前記親フィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのいずれかと比較して、少なくとも３０というペプシン安定性を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する、請求項２７〜３１に記載の方法。
【請求項３３】
工程ｃ）が、ｉ）前記親フィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのいずれかと比較して、配列番号３によってコードされるフィターゼと比較した場合に少なくとも１１０という比活性比を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する、請求項２７〜３２に記載の方法。