(57)【要約】  本発明は、所定の翻訳系を用いて遺伝子を発現させるとき、高い発現レベルが得ることができる、遺伝子の塩基配列設計方法を提供することを目的としてなされた。本発明にかかる方法によると、その翻訳系が由来する生物種の遺伝子プールを学習データとし、隠れマルコフモデルを用いて、学習データにおけるコドン配列の規則性を計算し、所定の翻訳系を用いて発現させる遺伝子のコドン配列を、その規則性に適合させて決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の翻訳系を用いて発現させる遺伝子の塩基配列設計方法であって、
前記遺伝子のコドン配列を、学習データにおけるコドン配列の規則性に適合させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記学習データが、前記翻訳系が由来する生物種の遺伝子プールであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記学習データが、所定の翻訳系において、すでに発現レベルが所定レベル以上であることが明らかになっている遺伝子プールであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
適合させた前記遺伝子の塩基配列を、適合させる際に用いた学習データに、データとして追加する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
隠れマルコフモデルを用いて、前記遺伝子のコドン配列を、学習データにおける前記コドン配列の規則性に適合させることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
バウム・ウエルチ  アルゴリズムを用いて、前記コドン配列の規則性を計算することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記翻訳系が細胞内にあることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記翻訳系がin vitroタンパク合成系内にあることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
所定の翻訳系を用いて発現させるための遺伝子の塩基配列を設計するためのプログラムであって、
コンピュータに請求項１〜８のいずれかの方法を実行させるプログラム。
【請求項１０】
請求項９に記載のプログラムを記録した、コンピュータで読み取り可能な記録媒体。
【請求項１１】
所定の翻訳系を用いて発現させるための遺伝子の塩基配列設計システムであって、
(i) 塩基配列データを入力するための入力装置、
(ii) 入力されたデータを用いて、請求項９に記載のプログラムを実行するコンピュータ、および
(iii) (ii) により得られた結果を出力するための出力装置
を備えた塩基配列設計システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、翻訳系で発現させるための遺伝子の塩基配列設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、その遺伝子が由来する生物種とは異なる生物種のホスト細胞で発現させる際、翻訳過程が律速段階になり、十分な発現レベルが得られないことがある。【０００３】
そのような場合の解決方法の一つとして、その遺伝子の使用しているコドンを、ホスト細胞の生物種で、高頻度で用いられているコドンに変更するということが行われてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、それでも、十分に発現レベルが高くならない場合があり、発現させる遺伝子の設計に、更なる工夫が期待されている。【０００５】
そこで、本発明は、所定の翻訳系を用いて遺伝子を発現させるとき、高い発現レベルを得ることができる、遺伝子の塩基配列設計方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
翻訳系を用いて遺伝子を発現させる場合、その遺伝子及び翻訳系の由来する生物種に関わらず、その遺伝子をそのまま発現ベクターに組み込んで、翻訳系で発現させることが多い。しかし、生物種によって、codon usageが異なるため、その遺伝子のコドンが、用いている翻訳系ではうまく利用されず、発現レベルが上がらないことがある。本発明者らは、この問題を解決するため鋭意努力した結果、生物種によって、コドン配列の規則性が異なり、このことが、発現レベルが上がらない理由の一つであるという新たな知見を見出し、本発明の完成に至った。【０００７】
本発明の塩基配列設計方法は、所定の翻訳系を用いて発現させる遺伝子の塩基配列設計方法であって、前記遺伝子のコドン配列を、学習データにおけるコドン配列の規則性に適合させることを特徴とする。前記学習データが、前記翻訳系が由来する生物種の遺伝子プールであってもよく、所定の翻訳系において、すでに発現レベルが所定レベル以上であることが明らかになっている遺伝子プールであってもよい。【０００８】
また、前記塩基配列設計方法が、適合させた前記遺伝子の塩基配列を、適合させる際に用いた学習データに、データとして追加する工程を含んでもよい。【０００９】
さらに、前記塩基配列設計方法が、隠れマルコフモデルを用いて、前記遺伝子のコドン配列を、学習データにおける前記コドン配列の規則性に適合させることを特徴としてもよい。この場合、バウム・ウエルチ  アルゴリズムを用いて、前記コドン配列の規則性を計算してもよい。【００１０】
さらに、前記塩基配列設計方法において、前記翻訳系が細胞内にあってもよく、in vitroタンパク合成系内にあってもよい。【００１１】
本発明のプログラムは所定の翻訳系を用いて発現させるための遺伝子の塩基配列を設計するためのプログラムであって、コンピュータに前記塩基配列設計方法を実行させるプログラムである。本発明の記録媒体は、これらのプログラムの少なくとも一つを記録した、コンピュータで読み取り可能な記録媒体である。【００１２】
本発明の塩基配列設計システムは、所定の翻訳系を用いて発現させるための遺伝子の塩基配列設計システムであって、(i) 塩基配列データを入力するための入力装置、(ii) 入力されたデータを用いて、請求項９に記載のプログラムを実行するコンピュータ、および(iii) (ii)により得られた結果を出力するための出力装置を備える。【００１３】
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
なお、本出願は、２００６年３月９日出願の日本国出願番号特願２００６−６４８１６を基礎とする優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含める。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明にかかる実施の形態における「枝刈り」の例である３つの条件の具体例を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００１６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００１７】
＝＝塩基配列設計方法＝＝
本発明は、所定の翻訳系を用いて発現させる遺伝子の塩基配列設計方法であって、その遺伝子のコドン配列を、学習データにおけるコドン配列の規則性に適合させることを特徴とする。以下、具体的に説明する。なお、本明細書で「コドン配列」とは、「三組みコドンの並び」のことをいうものとする。また、「コドン配列の規則性」とは、「現れることが期待される確率が最も高いコドン配列」を意味するものとする。【００１８】
所定の翻訳系を用いて、目的の遺伝子を発現させる際、翻訳系の由来する生物種や遺伝子の由来する生物種に関わらず、その翻訳系で発現できる発現ベクターに遺伝子をそのまま組み込み、翻訳系に導入することが多い。しかし、本発明に従って、その遺伝子のコドン配列を、学習データにおけるコドン配列の規則性に適合させることによって、その翻訳系における発現に対し、遺伝子の塩基配列を好適化することができ、発現レベルを上げることができる。【００１９】
用いる翻訳系は、ｍＲＮＡを翻訳させられる系であれば限定されず、細胞内にあっても、in vitro翻訳系であってもかまわない。細胞内の翻訳系を用いる場合は、例えば、発現ベクターに、配列を好適化した遺伝子を組み込み、常法をによって細胞に導入すればよい。in vitroの翻訳系を用いる場合は、例えば、in vitroで転写させて合成したｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、あるいは大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系に添加して、翻訳させればよい。【００２０】
発現させる遺伝子は、特に限定されず、アミノ酸配列はどんなものでもよく、天然の遺伝子であっても、人為的に変異を導入された遺伝子でもかまわない。【００２１】
学習データも、特に限定されないが、翻訳系が由来する生物種または近縁種の遺伝子プール、あるいは所定の翻訳系において、すでに発現レベルが所定レベル以上であることが明らかになっている遺伝子プールが好ましく、それらを組み合わせたりしてもよい。また、本発明の塩基配列好適化方法によってコドン配列を適合させた遺伝子データを、適合させる際に用いた学習データに追加し、次に同じ翻訳系を用いる場合、そのデータを追加した学習データを用いてもよい。【００２２】
塩基配列を好適化するのは、発現させる遺伝子のコドン配列を、学習データにおけるコドン配列の規則性に適合させることにより行う。【００２３】
例えば、今、２つのコドン配列の規則性によって、発現させる遺伝子のコドン配列を決める場合を考える。例として、発現させる遺伝子中の２つのアミノ酸の並びをＡ−Ｂとする。Ａには、３種類のコドンａ１、ａ２、ａ３が存在し、Ｂには、ｂ１、ｂ２の２種類のコドンが存在するとすると、コドンの選び方には６通り存在する。学習データにおいては、その中で、ａ１−ｂ２の頻度が最も高いとすると、発現させる遺伝子の塩基配列として、ａ１−ｂ２を選択する。このように、学習データにおいて、出現すると期待される確率が最も高いコドン配列を選択し、発現させる遺伝子のコドン配列とする。【００２４】
この例では、規則性を考えるコドン配列におけるコドン数を２つとしたが、３つ以上でも良く、学習データと発現させる遺伝子のコドン配列の適合性を考えると、コドン数は多い方が良いと考えられる。隠れマルコフモデルを利用する場合には、理論的には任意の長さのコドン配列の適合性を計算できるが，隠れ状態の数によって規則性を考えるコドン配列におけるコドン数が決まる。その数は、コドン数が多くなると、それに伴い、コドン配列の頻度の計算量が増え、コストも増加するので、１０個〜５０個にするのが好ましい。【００２５】
学習データにおけるコドン配列の規則性を規定するための方法は、特に限定されないが、隠れマルコフモデルを利用するのが好ましい。隠れマルコフモデルにおいては、大量の学習データ {g1, ..., g, ..., gT} を収集し、これらすべての遺伝子におけるコドンciに対して，
2007102578.tif 000002
を最大化するようなパラメータの組 {πa, sab, da(ci)} を求める。（ここで、πaはスタートコドン(Met)出力前における状態aの初期確率、sabは状態 a から状態 bへの状態遷移確率、da(ci)は状態 a で コドンci が観測される出力確率である。）【００２６】
ここで、各パラメータはバウム・ウエルチ（Baum Welch）アルゴリズムを用いて決定されるのが好ましい。即ち、
1. 初期値π１, sab, da(ci)を設定する。  
2. 学習データ上の遺伝子gにおいてi番目のコドンで状態aから状態bへの遷移確率γi(a,b,g)を、i,a,b全ての組み合わせに関して学習データから演算する。  
具体的には、以下の式を計算する（ここで、Ｌは遺伝子gの全コドン数、ciLはｉ番目からL番目(つまり最後まで)のコドンを意味する文字列、Ｓは状態 a から状態 bへの状態遷移に対応したsabに関して全ての状態遷移に対応したsab、Ｄはコドンciに対応したda(ci)に関して全てのコドンに対応したda(ci)である。）
2007102578.tif 000003
3. γi(a,b,g)からπ１, sab, da(ci)を計算して再定義する。  
具体的には、以下の式を計算する。  
2007102578.tif 000004
4.各パラメータが安定しなければ2へ戻る。【００２７】
このアルゴリズムを、各パラメータが完全に安定するまで行ってもよいが、それには事実上膨大な時間がかかるので、このサイクルを所定の回数行ってアルゴリズムを終了してもよい。この場合の回数は１００回〜１０００回程度行えばよい。なお、１において、初期値の設定方法は特に限定されないが、実施例のように擬似乱数に確率的な制約を加えて設定してもよい。【００２８】
Baum Welchアルゴリズムで得られた各パラメータを用い、すべてのコドンの組み合わせにおける出力確率を演算して、最大のものを求めれば、目的のコドン配列が得られる。即ち、Baum Welchアルゴリズムによって決定されたモデルＭにおける文字列の出力確率は状態遷移σ1,a,σ2,a2,・・・σL,aLの組み合わせ全てを足したもの
2007102578.tif 000005
となる。【００２９】
しかしながら、この計算には膨大な時間がかかるため、近似値が得られる手法を用いてもよく、その手法は限定されないが、例えば、以下のような３つの条件を有する「枝刈り」を利用してもよい。（なお、図１に、この３つの条件の具体例を挙げた。）
2007102578.tif 000006
まず、(i)に関しては明らかであって、ここでの目的が、発現させる遺伝子のコドン配列を決めることであるため、目的とすべきアミノ酸配列はあらかじめ決まっており、i番目に、アミノ酸aiに対応しないコドンciを使用している塩基配列を選択できない(ii)に関しても明らかといえるが、以下、帰納法にて厳密に証明する。  
2007102578.tif 000007
【００３０】
このように、(i)と(ii)に関しては好適解を求めるにあたって間違いを起こさないが、(iii)に関しては好適解を求めるに当たって間違いを起こしうる。nを十分に大きくすることで(iii)の条件が厳しくなり、誤った枝刈りを起こす可能性は減るため、nを十分大きくすることが好ましい。ただし、ｎを大きくするほど，(ii)のチェックを行うのに必要な計算量が増加する。【００３１】
＝＝塩基配列設計システム＝＝
上記塩基配列設計方法を自動化するために、コンピュータに実行させることができるようにプログラム化する。こうして作成されたプログラムも、本発明の権利範囲内である。【００３２】
さらに、このプログラムを実行するためのコンピュータとともに、塩基配列データを入力するための入力装置、及びプログラムの実行により得られた結果を出力するための出力装置を備えた塩基配列設計システムとすることもできる。【００３３】
＜実施例＞
（１）S.cerevisiaeのadh1遺伝子及びadh2遺伝子の塩基配列の設計
本実施例では、翻訳系として大腸菌JM109を用いた。この細胞株は、大腸菌K12株に由来する菌株であるため、学習データとして、ゲノムデータベースDDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)のE.coli K12 MG1655の塩基配列データを利用した。この翻訳系で発現させる遺伝子として、Saccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子adh1（adh1w、配列番号１）及びadh2（adh2w、配列番号２）を用いた。【００３４】
まず、規則性を考えるコドン配列におけるコドン数を８個とし、コドンを決定するアミノ酸の８個前までのコドン配列についての規則性を検討した。学習データにおけるコドン配列の規則性を規定するためには、隠れマルコフモデルを利用した。バウム・ウエルチ（Baum Welch）アルゴリズムにおいては、初期値として、時刻を入力して発生させた疑似乱数に対し、状態遷移確率や出力確率のすべての確率値の合計が１になるように設定した乱数を用いた。また、３５０回のアルゴリズムを行って学習データを学習させた。【００３５】
このようにして得られたモデルを用い、Adh1及びAdh2に対するコドン配列を好適化した。その際、上記３つの条件を有する「枝刈り」を用いた。本実施例では、ｎを５０として、演算を行ったところ、S.cerevisiae由来のAdh1及びAdh2の両者で(iii)の枝刈りは起こらなかったため、誤りを含み得る枝刈りを行わなくても済み、厳密な最適解を得ることができた。【００３６】
（２）好適化したadh1遺伝子及びadh2遺伝子の合成
好適化したadh1遺伝子（adh1c、配列番号３）及びadh2遺伝子（adh2c、配列番号４）を以下のように合成した。【００３７】
adh1cに関しては40bpのプライマー群をつなげ合わせる方法(Assembly PCR法）で合成を行った。まず、adh1cの塩基配列に対応するforwardプライマーとreverseのプライマーを、40bpの長さずつに切り分ける形で用意した。adh1の塩基配列の長さは1047bpであるために、forwardプライマー26本（配列番号５〜３０）、reverseプライマー26本（配列番号３１〜５６）となった。このようにして用意した26×2本のプライマーを以下の条件でAssembly PCR法を行った。【００３８】
まず、全プライマーを等濃度混合したprimer mix(250μM)を作製し、以下の反応液（50μl）で、９４℃３０秒−５２℃３０秒−７２℃３０秒を５５サイクル行った。  
反応液：  0.2 mM dNTP                 5μl
primer mix                  0.5μl
Pfu Ultra (Stratagene)      0.25μl
Pfu Ultra用10×buffer       5μl
滅菌水                      39.25μl【００３９】
反応終了後、反応液をテンプレートにして、再び以下の反応液でPCRを行った。条件は、９４℃２分の変性反応後、９４℃３０秒−５３℃３０秒−７２℃６０秒を３０サイクル行い、７２℃１０分の伸長反応を行った。このとき、プライマーとして、後の段階でベクターとのライゲーションができるように、先頭のforwardプライマー（配列番号５）の最初にEcoRIサイトをつけて長さを調節したプライマー（配列番号５７）と最初のreverseプライマー（配列番号３１； EcoRIサイト付加済み）を用いた。  
反応液：  テンプレート                              1μl
0.2 mM dNTP                               5μl
プライマー（配列番号５７）(250μM)        0.5μl
プライマー（配列番号３１）(250μM)        0.5μl
Pfu Ultra (Stratagene)                    1μl
Pfu Ultra 用10×buffer                    5μl
滅菌水                                    36μl
PCR産物をアガロースゲルで精製し、EcoRIで切断後、pUC19のEcoRI部位に挿入した。塩基配列を決定することにより、正しい配列を有していることを確認した。また、adh2cに関しては、adh1cと同様に設計したプラスミドの合成をoperon社に合成委託したが、基本的には、adh1cと同様に合成することができる。【００４０】
（３）adh1遺伝子及びadh2遺伝子の合成
一方、adh1w及びadh2wは、S.cerevisiae YPH 499から抽出したゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行い、各クローンを得た。なお、PCRは、それぞれの遺伝子に対するプライマーペア（adh1wに対しては、配列番号５８と５９のプライマーペア、adh2wに対しては配列番号６０と６１のプライマーペア）を用い、９４℃２分の変性反応後、９４℃３０秒−５３℃３０秒−７２℃６０秒を３０サイクル行い、７２℃１０分の伸長反応を行った。  
プライマー(大文字はクローニングのために付加した制限酵素サイトを示す)：
adh1w増幅用forwardプライマー（配列番号５８）：
GGAATTCatgtctatcccagaaactcaaaaaggtgtt
adh1w増幅用reverseプライマー（配列番号５９）：
GGAATTCttatttagaagtgtcaacaacgtatctacc
adh2w増幅用forwardプライマー（配列番号６０）：
GGAATTCatgtctattccagaaactcaaaaagccatt
adh2w増幅用reverseプライマー（配列番号６１）：
GGAATTCttatttagaagtgtcaacaacgtatctacc
反応液：  テンプレート                              1μl
0.2 mM dNTP                               5μl
フォワードプライマー(250μM)              0.5μl
リバースプライマー(250μM)                0.5μl
Pfu Ultra  (Stratagene)                   1μl
Pfu Ultra 用10×buffer                    5μl
滅菌水                                    36μl
PCR産物をアガロースゲルで精製し、EcoRIで切断後、pUC19のEcoRI部位に挿入した。塩基配列を決定することにより、正しい配列を有していることを確認した。【００４１】
（４）adh1w、adh2w、adh1c、adh2cの各遺伝子の発現ベクターの構築
このようにして得られたadh1c、adh2c、adh1w及びadh2wがEcoRI部位に挿入されたプラスミドを鋳型とし、PCRを行った。なお、PCRは（３）と同様の条件で行なったが、プライマーは各遺伝子を特異的に増幅するプライマーペア（adh1cに対しては、配列番号６２と６３のプライマーペア、adh2cに対しては配列番号６４と６５のプライマーペア、adh1wに対しては、配列番号６６と６７のプライマーペア、adh2wに対しては配列番号６８と６９のプライマーペア）を用いた。  
プライマー(大文字はクローニングのために付加した制限酵素サイトを示す)：
pCold用adh1c増幅用forwaordプライマー（配列番号６２）
CCGGAATTCatgagcattccggaaacgcaaaaaggtgtg
pCold用adh1c増幅用reverseプライマー（配列番号６３）
AACTGCAGttatttgctggtatccaccacatagcggcc
pCold用adh2c増幅用forwaordプライマー（配列番号６４）
CCGGAATTCatgagcattccggaaacccagaaagcgattatt
pCold用adh2c増幅用reverseプライマー（配列番号６５）
AACTGCAGttatttgctggtatccaccacatagcggcc
pCold用adh1w増幅用forwaordプライマー（配列番号６６）
CCGGAATTCatgtctatcccagaaactcaaaaaggtgttatc
pCold用adh1w増幅用reverseプライマー（配列番号６７）
AACTGCAGttatttagaagtgtcaacaacgtatctacc
pCold用adh2w増幅用forwaordプライマー（配列番号６８）
CCGGAATTCatgtctattccagaaactcaaaaagccattatc
pCold用adh2w増幅用reverseプライマー（配列番号６９）
AACTGCAGttatttagaagtgtcaacaacgtatctacc
PCR産物をアガロースゲルで精製し、EcoRI及びPstIで切断後、低温発現誘導型のベクターであるpColdIII及びpColdIV（タカラバイオ社）のEcoRI-PstI部位に挿入した。このようにして作製したプラスミド（表１）をJM109に形質転換した。
【表１】
2007102578.tif 000008
【００４２】
（５）好適化したadh1遺伝子及びadh2遺伝子の発現誘導
まず、各プラスミドを有するE.coli JM109株及びインサートを有さないpUC19を有するJM109株を3 ml LB液体培地にて、37 ℃ 12 時間程度、撹拌しながら前培養した。その後の本培養は、以下のようにベクターによって操作が異なる。【００４３】
pUC19をベクターとするプラスミドは、前培養の後に、坂口フラスコに入った100 ml LB液体培地(+アンピシリン 50 μg/ml)に3 mlの培養液全てを加え、37 ℃で1.5 時間振盪培養(120 rpm)したのちに、終濃度100 μMになるようにIPTGを加え、その後に再び37 ℃で24 時間振盪培養(120 rpm)した。【００４４】
pColdをベクターとするプラスミドは、前培養の後に、坂口フラスコに入った 100 ml LB液体培地(+アンピシリン50 μg/ml)に3 mlの培養液全てを加え、37 ℃で1.75 時間振盪培養(120 rpm)した後に、15 ℃で30 min静置した。その後、終濃度100 μMになるようにIPTGを加えて、さらに15 ℃で24 時間振盪培養(120 rpm)した。【００４５】
このようにして得られた培養液を10,000 rpm 10 minにて遠心分離を行い、上清を捨てた後に残った菌体を100 mM トリスバッファー(pH8)に懸濁した。その懸濁液を再び7,200 rpmにて10 min遠心分離を行い、上清を捨てた後に残った菌体を100 mMトリスバッファー(pH8)に懸濁した。このようにして得られた懸濁液を4℃で10 min超音波破砕をした後に、再び10,000 rpmにて10 min遠心分離を行い、上清を無細胞抽出物とした。【００４６】
この無細胞抽出物中のADH活性を以下のように測定した。すなわち、無細胞抽出物を1倍、10倍、100倍、1000倍に希釈し、各100μlを下記の基質溶液900μlと混合し、10 sec間隔で50secまで波長340 nmでの吸光度を測定した。  
基質溶液：    ピロリン酸ナトリウム      85mM
セミカルバジド塩酸塩      6.5mM
グリシン                  18mM
エタノール                550mM
NAD+                      1.75mM【００４７】
また、各無細胞抽出物について、BSAをスタンダードとしてブラッドフォード法(CBB法)を用いて総タンパク質量の測定を行った。得られた吸光度から、下記式を用いて、ADH活性を算出した。表２にその結果を示す。なお、ネガティブコントロール（プラスミドを何も組み込まないE.coli JM109株及びインサートを持たないpUC19を有するE.coli JM109株）の比活性は0であった。  
2007102578.tif 000009
【表２】
2007102578.tif 000010
【００４８】
このように、塩基配列を好適化することにより、1つの組み合わせ(adh2とpColdIV)を除いて、タンパク質の発現量が2.5倍から10倍増強された。以上より、所定の翻訳系を用いて遺伝子を発現させる際、本発明の塩基配列設計方法によって、発現レベルを少なくとも2.5倍から10倍増強させ得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明によって、所定の翻訳系を用いて遺伝子を発現させるとき、高い発現レベルを得ることができる、遺伝子の塩基配列設計方法を提供できる。
【図１】
2007102578.tif 000011
【配列表】
2007102578000001.app
【国際調査報告】
2007102578.tif 000012
2007102578.tif 000013
2007102578.tif 000014
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