【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年5月12日(2008.5.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚幹細胞のヒトトロホブラスト細胞への分化の誘発方法であって、
該ヒト胚幹細胞を、骨形成たんぱく質4 (BMP4)、骨形成たんぱく質2 (BMP2)、骨形成たんぱく質7 (BMP7)、並びに増殖および分化因子5 (GDF5)であるたんぱく質トロホブラスト誘発性因子を含む培養培地において培養して、該ヒト胚幹細胞のヒトトロホブラスト細胞への分化を起こす工程を含む、方法。
【請求項２】
前記たんぱく質トロホブラスト誘発性因子の濃度が培養培地１ミリリットル当り1〜100ナノグラムである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
霊長類胚幹細胞の霊長類トロホブラスト細胞への分化の誘発方法であって、
該霊長類胚幹細胞を、骨形成たんぱく質4 (BMP4)、骨形成たんぱく質2 (BMP2)、骨形成たんぱく質7 (BMP7)、並びに増殖および分化因子5 (GDF5)であるたんぱく質トロホブラスト誘発性因子を含む培養培地において培養する工程を含む、方法。
【請求項４】
前記たんぱく質トロホブラスト誘発性因子の濃度が培養培地１ミリリットル当り1〜100ナノグラムである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
霊長類トロホブラスト細胞系統の細胞に対する作用因子の作用について試験する方法であって、
（ａ）未分化霊長類胚幹細胞を、骨形成たんぱく質4 (BMP4)、骨形成たんぱく質2 (BMP2)、骨形成たんぱく質7 (BMP7)、並びに増殖および分化因子5 (GDF5)であるたんぱく質トロホブラスト誘発性因子を含む培養培地において培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞を作用因子に暴露する工程、及び
（ｃ）該作用因子のトロホブラスト細胞に対する作用を観察する工程
を含む方法。
【請求項６】
前記トロホブラスト誘発性因子を培養培地１ミリリットル当り1〜100ナノグラムの濃度で前記未分化霊長類胚幹細胞に適用する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記未分化霊長類胚幹細胞がヒト胚幹細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記作用因子が避妊薬又は受胎調節剤である、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記作用因子が胎盤関連の出生異常を防止する治療薬である、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
トロホブラスト誘発性因子に暴露された未分化霊長類胚幹細胞に由来する霊長類トロホブラスト細胞の補充可能な集団を含む生体外培養物であって、
該トロホブラスト誘発性因子が骨形成たんぱく質4 (BMP4)、骨形成たんぱく質2 (BMP2)、骨形成たんぱく質7 (BMP7)、並びに増殖および分化因子5 (GDF5)であり、
該未分化霊長類胚幹細胞由来の霊長類トロホブラスト細胞は、絨毛性ゴナダトロフィンを発現し、かつ、胚様体段階を経ることなく未分化細胞に直接に由来している、培養物。
【請求項１１】
前記霊長類トロホブラスト細胞がヒト細胞である、請求項１０記載の培養物。
【請求項１２】
前記霊長類トロホブラスト細胞がヒト以外の霊長類細胞である、請求項１０記載の培養物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
背景技術
現代の細胞生物学においては、生きた生物体の各種細胞を生体外で操作する種々の方法がある。とりわけ興味あるのは、幹細胞として知られる細胞カテゴリーである。幹細胞は、多くの前駆体および成熟細胞系統およびタイプに分化する能力を有する未分化またはほんの部分的に分化した細胞である。用語“幹細胞”は、造血幹細胞のような大きめの生物体中の分化細胞系統の前駆体である細胞タイプを称するのに使用し得、あるいは生体組織のいずれかに分化する能力を少なくとも理論的に有する完全に未分化の幹細胞を称し得る。幹細胞は少なくとも多能性であり、幹細胞が多くの異なる細胞タイプに分化する潜在力を有し且つ全能性であり得ることを意味し、種の成熟器官のどの細胞タイプへも分化する潜在力を有すること意味している。幹細胞培養物は、種々の組織タイプおよび多くの異なる動物から開発されている。
最近、ヒトおよびアカゲザルの胚幹細胞を含む霊長類胚幹細胞の培養物を産生させ、培養し、維持することが可能になってきている。例えば、Thomsonに付与された米国特許第5,843,780号および第6,200,806号を参照されたい。霊長類胚幹細胞は、培養物内で無期限に生存し且つ霊長類生体の主要組織タイプに分化する能力を示す胚から産生させた幹培養物である。霊長類胚幹細胞は、培養物内で未分化状態で無期限に維持し得、あるいは各種の細胞が１つまたは複数の発生系統に関与するようになる分化過程を開始させ得る。典型的には、幹細胞の異なる組織タイプへの分化は、胚様体(embryoid body)の発生によって開始し、胚様体によって胚体（embryonic body）内の幹細胞の種々の細胞タイプへの分化は開始される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、観察を前提としている。本発明者等は、ある種のたんぱく質因子が霊長類の胚幹細胞をトロホブラスト細胞に直接分化させることを見出した。このトロホブラスト細胞は、安定であり、胎盤前駆体細胞の細胞特性の全てを示す。霊長類およびヒトの胚幹細胞の産生および培養は標準化され容易に再現可能になってきているので、この観察は、ヒトまたは他の霊長類の幹細胞源からの直接の主要群の単一細胞タイプ(トロホブラスト細胞)の産生を、胚様体の産生に介入することなく初めて可能にしている。ここで、霊長類胚幹細胞のトロホブラスト細胞への直接分化を生ずる上記たんぱく質因子としては、骨形成たんぱく質4 (BMP4)およびBMP2、BMP7のような関連たんぱく質因子、並びに増殖および分化因子5 (GDF5)があることを見出した。そのような因子は、本明細書においては、トロホブラスト誘発因子と称する。
再現可能な量でヒトおよび他の霊長類のトロホブラスト細胞を入手し得ることは、胎盤細胞の挙動についての多くの調査研究を可能にする。今や、胎盤前駆体細胞の再現性のある無限の供給を得ることが可能である。とりわけ、上記トロホブラスト細胞培養物は、胎盤細胞に対する一般毒性および特異的作用の双方についての薬物試験において使用する胎盤細胞の挙動をモデルする化学反応研究において使用し得ることが考えられる。例えば、子宮内での受胎胚着床を抑制するであろう作用因子、即ち、受胎調節剤は、上記トロホブラスト細胞培養物に対する推定作用因子の作用を観察することによって研究することができる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
本発明の開示は、ヒトおよび他の霊長類の幹細胞を単一たんぱく質因子によってトロホブラスト細胞に直接形質転換させ得ることを実証するデータを含む。本明細書において使用するとき、霊長類幹細胞とは、少なくとも多能性であるヒトまたは他の霊長類の未分化細胞を称する。以下の各実施例において使用する幹細胞は、ヒトおよびアカゲザルの胚由来であり、従って、霊長類胚幹細胞としては既知である。胚幹細胞は、発生のある段階におけるヒト由来の幹細胞である。しかしながら、本明細書において説明する方法は、成熟霊長類生体から分離した胚生殖系細胞および幹細胞のような他の起源に由来するヒト幹細胞にも等しく応用し得る。ヒト幹細胞をトロホブラスト細胞に分化させるという事実はマウス幹細胞における試験に基づいては予想外であることに留意されたい。外部培養環境の操作によって栄養外胚葉組織をマウス幹細胞から誘導するという努力は今のところ成功しておらず、無欠着床前胚によってキメラ中に形成させた場合、マウス幹細胞はトロホブラストに殆ど寄与していない。マウス胚幹細胞がトロホブラスト細胞を形成し得なかったということは、マウス胚幹細胞が、原始外胚葉の内部細胞集団からの離脱後に形成し且つトロホブラスト系統にはもはや寄与しない原始外胚葉に発生的に類似しているという理論に一致している。ヒト胚幹細胞がトロホブラスト細胞を形成する能力は、マウスとヒトの胚幹細胞発生力間の基本的な差異を示唆している。
本発明方法は、幹細胞の分化に通常関連する介入方法に何らよることなく、培養物中の幹細胞に上記トロホブラスト誘発性因子を直接適用させることを含むことに留意されたい。特に、胚様体への転移期は本発明方法には関与しないことに留意されたい。他の方法によって培養した幹細胞における分化過程は、多くの異なる細胞系または細胞タイプが通常生ずるという点で、一般に均一ではない。対照的に、本発明方法は、幹細胞の共通分化細胞タイプ、即ち、トロホブラストへの集団分化をもたらす。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
実施例
ヒト胚幹細胞系、H1を、マウス胚線維芽細胞(MEF)に対して状態調節し4mg/mlで塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を補充した培地中のMatrigelTMコーティーングプラスチックプレート上で培養した。ヒト骨形成たんぱく質4 (BMP4) (ミネソタ州ミネアポリスのR & D Systems社。本明細書に挙げた他の組換えたんぱく質の源でもある)を上記幹細胞に培養培地の1、10および100ng/mlの濃度で適用した。幹細胞は、胚様体内で単層として存在し、凝集してなかった。その後、上記H1細胞は、投与量および時間依存性形態変化を受け、拡散し、平坦で薄くなり、拡大または伸張し、細胞核は小さくなった。これらの変化は、トロホブラスト細胞の形態と一致していた。形態変化は、各コロニーの端部の細胞で始まり、そこから内部に拡大した。変化形態は、100ng/mlのBMP4で処理した培養物においては2日目で、10ng/mlで処理した培養物においては3日目または4日目で、1ng/mlのBMP4で処理した培養物においては4〜5日目で明白になった。
同様な試験をBMP4たんぱく質シグナル群の他のメンバーによっても実施した。同様な作用を活性化させ、幹細胞をトロホブラスト細胞に変化させるのを実証したたんぱく質は、BMP2、BMP7、および増殖および分化因子5 (GDF5)を含んでいる。TGFベータ1およびアクチビンのようなTGF上科のメンバーを含む他のたんぱく質は、幹細胞内でこの同じ形態変化を活性化しないことが判明した。同様な形態変化は、BMP4、BMP2、BMP7およびGDF5で処理したアカゲザル胚幹細胞系においても観察された。