(57)【要約】本発明は、ビタミンＤ受容体とＣＤＰとの結合を検出する工程を含む、化合物のスクリーニング方法に関する。骨形成作用が強く、副作用が少ない化合物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングできる新規な方法、該スクリーニング方法により選択される骨芽細胞分化に関与する化合物、該化合物を含む、ビタミンＤ受容体とＣＤＰとの複合体によるビタミンＤ受容体を介する転写活性の亢進に関与する疾患の治療薬、および該スクリーニング方法を行うためのキットを提供する。
2008016155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の存在による、ビタミンＤ受容体とＣＤＰとの結合の存否を検出する工程を含む、該結合作用を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
化合物が、ビタミンＤ受容体および／またはＣＤＰに親和性を有する化合物である、請求項１のスクリーニング方法。
【請求項３】
ビタミンＤ受容体とＣＤＰの両方を産生する細胞または該細胞の細胞調製物を用いて行なう請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ビタミンＤ受容体とＣＤＰの両方を産生する細胞が、骨芽細胞様細胞である請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
ビタミンＤ受容体およびＣＤＰの少なくとも１つが精製された形態である、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
試験化合物の存在による、ビタミンＤ受容体とＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を検出する工程を含む、該複合体による転写活性を亢進する化合物のスクリーニング方法。
【請求項７】
化合物が、ビタミンＤ受容体および／またはＣＤＰに親和性を有する化合物である、請求項６のスクリーニング方法。
【請求項８】
ビタミンＤ受容体とＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を検出する工程が、ＣＤＰを過剰発現させることにより、ビタミンＤ受容体を介する転写活性がさらに亢進されることを検出する工程からなる請求項６または７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
ビタミンＤ受容体とＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を検出する工程が、ビタミンＤ受容体を過剰発現させることにより、ＣＤＰを介する転写活性がさらに亢進されることを検出する工程からなる請求項６または７記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ビタミンＤ受容体とＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を、ビタミンＤ受容体およびＣＤＰの両方を発現および／または産生する細胞において検出する請求項６〜９のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ビタミンＤ受容体およびＣＤＰの両方を発現および／または産生する細胞が、骨芽細胞様細胞である請求項１０記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ビタミンＤ受容体およびＣＤＰの両方を発現および／または産生する細胞が、ビタミンＤ受容体遺伝子およびＣＤＰ遺伝子のうち少なくとも１つ導入されたものである請求項１０項記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ビタミンＤ受容体とＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進をレポーター遺伝子アッセイ系で測定する、請求項６〜１２のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ビタミンＤ受容体とＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を、ビタミンＤ受容体標的遺伝子または骨芽細胞の分化マーカー遺伝子の発現を指標として測定する、請求項６〜１２のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
ビタミンＤ受容体標的遺伝子が、ＣＹＰ２４遺伝子であり、骨芽細胞の分化マーカーが、アルカリフォスファターゼ遺伝子、オステオカルシン遺伝子のいずれかから選択される、請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
試験化合物が、ビタミンＤ誘導体である請求項１〜１５のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
試験化合物が、骨芽細胞分化を誘導する化合物である請求項１〜１６のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
化合物が、動物において骨量増加作用を示す化合物である、請求項１〜１７のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
（ａ）ビタミンＤ受容体認識配列およびレポーター遺伝子を含み、ビタミンＤ受容体を介する転写活性亢進を評価するためのベクター；ならびに（ｂ）ＣＤＰ認識配列およびレポーター遺伝子を含み、ＣＤＰを介する転写活性亢進を評価するためのベクターのうち少なくとも１つを含み、さらに
（ｃ）前記レポーター遺伝子の産物を検出するための試薬；を含む請求項６〜１８のいずれか１項記載のスクリーニング方法を行うためのキット。
【請求項２０】
（ａ）ビタミンＤ受容体認識配列、ＣＤＰ認識配列およびレポーター遺伝子を含み、ビタミンＤ受容体とＣＤＰの複合体を介する転写活性亢進を評価するためのベクター；ならびに
（ｂ）前記レポーター遺伝子の産物を検出するための試薬；を含む請求項６〜１８のいずれか１項記載のスクリーニング方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨芽細胞分化に関与する化合物をスクリーニングするための新規な方法に関する。詳細には、本発明は、該化合物をスクリーニングするためのＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）とＣＤＰ（ＣＣＡＡＴ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（以下、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３または１，２５Ｄ３という）または１α−ヒドロキシビタミンＤ３（以下、１α（ＯＨ）Ｄ３）などの活性型ビタミンＤ３誘導体は、既に骨粗鬆症などの代謝性骨疾患の治療薬として広く臨床で使用されている。これらの活性型ビタミンＤ３誘導体はＶＤＲを介して生理作用が発揮されることが知られている。ＶＤＲは、小腸、骨、腎臓、副甲状腺などの組織に存在するのみならず、免役系細胞や悪性腫瘍細胞を含む様々な細胞に存在しているため、活性型ビタミンＤ３誘導体は、（１）カルシウム・骨代謝調節作用；（２）悪性腫瘍細胞、表皮細胞および上皮性細胞の増殖阻害；および（３）免疫系細胞に対する調節作用；などのような様々な生理活性を有することが知られている。
１，２５（ＯＨ）２Ｄ３や１α（ＯＨ）Ｄ３などの活性型ビタミンＤ３誘導体は、動物実験において、実験条件によっては骨量に対して比較的強い骨量増加作用を示す。一方で、臨床では腰椎および大腿骨頚部骨密度の増加効果は弱い。骨密度を指標とした場合、活性型ビタミンＤ３誘導体投与群（臨床投与量）はカルシウム単独投与群の効果を上回るが、ビスホスホネート投与群と比較すると骨量増加作用は弱い。しかし、骨量から予測される以上の骨折抑制効果が示された臨床成績が報告されている。前述のような薬理作用を示すことから骨粗鬆症治療薬として長年用いられていた。しかしながら、活性型ビタミンＤ３誘導体投与による骨量増加作用のメカニズムは未だ明確ではない。
また、活性型ビタミンＤ３誘導体はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、骨形成を担う骨芽細胞の分化促進作用が知られている。しかしながら、この作用の分子生物学的アプローチによる機序は明らかになっていない。
１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、標的組織の１つである骨においては、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎといった骨芽細胞の分化マーカーとして知られる遺伝子発現を誘導することが知られ、また、細胞培養系において骨芽細胞は１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の作用により分化することが知られている（非特許文献１）。さらに、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、他の標的器官として腸管や腎臓が知られるが、これらの臓器では骨芽細胞マーカー遺伝子は発現せず、カルシウムの取り込みに関与するｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）の遺伝子を誘導することが古くから知られており、組織によってその作用は異なっている。そのため、ビタミンＤ３誘導体は血中カルシウム上昇作用があり、臨床使用する場合、高カルシウム血症などの副作用が問題となる場合がある。よって、血中カルシウム上昇作用がないまたは弱い化合物をスクリーニングできれば、副作用の少ない優れた代謝性骨疾患の治療薬の創出が可能となる。
ＶＤＲを介した転写活性化は一般にＶＤＲと基本転写因子に加え、転写コファクター（コアクチベーター・コリプレッサ）が関与して起こることが知られている。ＶＤＲ結合性の転写コファクターは既にいくつか知られているが、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３による骨芽細胞分化メカニズムを説明しうるコファクターは未だに発見されていない。このような組織特異的な遺伝子発現の制御が存在していることから、ＶＤＲに関連するコファクターの発現やリクルートメントが、組織によって異なっている可能性が考えられる。例えば、最近、ケラチノサイトの分化前後でＶＤＲが形成する複合体が異なることが確認された（非特許文献２）。このようなＶＤＲが形成する複合体の違いにより種々の細胞内でのＶＤＲによる遺伝子発現調節機構の組織や細胞特異性が司られていることが示唆されている。しかしながら、骨芽細胞において、ＶＤＲが形成する複合体の分離・同定した結果は報告されていない。
一方、ＣＤＰに関しては、キイロショウジョウバエのＣｕｔホメオドメイン蛋白質の哺乳類におけるホモログが数種の哺乳類から単離されており、ヒト（非特許文献３）、イヌ（非特許文献４）、マウス（非特許文献５）、ラット（非特許文献６）において、それぞれ、ＣＤＰ（ＣＣＡＡＴ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｃｌｏｘ（Ｃｕｔ−ｌｉｋｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、Ｃｕｘ−１（Ｃｕｔ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、ＣＤＰ−２とよばれる。また、ヒトＣＤＰはＣｕｔ−ＬＩＫＥ，１：  ＣＵＴＬ１とも表記されることが知られている。
ＣＤＰは高等な真核生物に存在する転写因子のファミリーに属し、細胞の増殖および分化の制御に関係する（非特許文献７）。キイロショウジョウバエにおいて、ＣＤＰのキイロショウジョウバエホモログであるＣｕｔの組織特異的なエンハンサーと干渉する転移性のインシュレーター配列（絶縁体配列）の挿入に起因する多くの表現型が報告されている（非特許文献８）。それらの表現型は、翼（「ｃｕｔ翼」）、脚、外感覚器、マルピーギ尿細管、気管系、および中枢神経系中のいくつかの構造に現れることが知られている（非特許文献９）。マウスおよびニワトリがＣｕｘ−１およびＣｕｘ−２を有するように、ヒトは、２つのＣＤＰ／Ｃｕｘ遺伝子であるＣＤＰ−１およびＣＤＰ−２を有する（非特許文献１０）。Ｃｕｘ−２は最初に神経組織中で発現されるが、Ｃｕｘ−１は殆どの組織に存在する（非特許文献１０）。Ｃｕｘ−１ノックアウトマウスは、ねじれた頬髯、成長遅延、肺上皮の遅延した分化、改変した毛の濾胞形態形成、オスの生殖不能、並びにＴおよびＢ細胞中の欠損を含む様々な器官における表現型を示す（非特許文献１１）。小型のＣｕｘ−１ノックアウトマウスと比べ、Ｃｕｘ−１を発現する遺伝子組み換えマウスは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下において、多臓器過形成および臓器肥大を示す（非特許文献１２）。このように、ショウジョウバエおよびマウスにおける遺伝子実験は、ＣＤＰ／Ｃｕｘ／Ｃｕｔ遺伝子が様々な組織の発達および恒常性において重要な役割を果たすことを示す。
組織培養系で、ＣＤＰの発現および活性化は細胞の増殖に関係し（非特許文献１３）、その遺伝子発現の抑制は細胞の最終分化期において起こり（非特許文献１４）、更に、マトリックス付着領域の調節に関与していることが知られている（非特許文献１５）。ＣＤＰ／Ｃｕｘ／Ｃｕｔタンパク質は夫々、ＤＮＡ結合性ドメインをもつ。全てのタンパク質は、少なくともＣｕｔホメオドメイン（ＨＤ）および３つのＣｕｔ反復（ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３）を含む。ホメオボックス遺伝子のｃｕｔスーパークラスは、３つのクラスに分割された：ＣＵＸ、ＯＮＥＣＵＴおよびＳＡＴＢ（非特許文献１６）。ショウジョウバエＣｕｔ、ヒトＣＤＰおよびマウスＣｕｘ遺伝子は３つのＣｕｔ反復を含み、各種においてもまた、１つのＣｕｔ反復を含むＯＮＥＣＵＴ遺伝子が存在する（非特許文献１０）。ＳＡＴＢ１は２つのＣｕｔ反復様ドメインおよび多岐にわたるＣｕｔ様ホメオドメインを含む（非特許文献１７）。
個々のＣｕｔ反復はそれら自身ＤＮＡと結合することできないが、もう一つのＣｕｔ反復またはＣｕｔホメオドメインと協調してＤＮＡと結合することができる（非特許文献１８）。細胞内におけるＣＤＰ／ＣｕｘのＤＮＡ結合活性は２つ報告されている。ＣＤＰ／Ｃｕｘ  ｐ２００は、ＣＲ１ＣＲ２と同様に、一過性にＤＮＡと結合し、ＣＣＡＡＴ  −置換活性をもつ（非特許文献１０）。細胞周期のＧ１／Ｓの移行において、ｐ２００のタンパク質分解性の切断はＣＤＰ／Ｃｕｘ  ｐ１１０を産出し、それは、ＣＲ２ＣＲ３ＨＤを含み、異なるＤＮＡ結合特異性およびキネティクスを示す（非特許文献１９）。特に、ｐ１１０はＤＮＡと安定な相互作用を形成することができる。さらには、ｐ１１０アイソフォームは、子宮平滑筋腫において、高レベルで発現される（非特許文献２０）。
特許文献１には、新規のＣＤＰ／Ｃｕｘアイソフォーム、ｐ７５は、ＣＤＰ／Ｃｕｘ座のイントロン２０中で開始されるｍＲＮＡによりコードされることが発見されたことが記載されている。この新規なアイソフォームは、ｐ２００、ｐ１１０およびｐ１００ＣＤＰ／Ｃｕｘアイソフォームのものとは別々のＤＮＡ結合性を示す。イントロン２０中で開始されるｍＲＮＡの発現は、ある組織または細胞に制限されるが、その発現は、乳房腫瘍細胞株中および初期のヒトの乳房腫瘍中、並びに他の癌組織中で活性化される。このことから癌の検出のための診断および予後方法において有用な、切頭されたＣＣＡＡＴ  −置換タンパク質／Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォーム（ＣＤＰ／Ｃｕｘ）に対する抗体を供する。さらに、癌の検出のために、ｐ７５をコードするＲＮＡ転写物の検出方法を供することが記載されている。また、ＣＤＰ／Ｃｕｘは細胞種特異的、また、細胞分化段階特異的に免疫グロブリン重鎖のイントロンエンハンサー（Ｅμ）のマトリックス結合領域に結合する転写因子と競合的に働き、そのエンハンサー活性を制御することが知られている（非特許文献２１）。
しかし、これらの報告では、骨やビタミンＤ受容体との関わりにおけるＣＤＰの機能に関しては何ら明らかとされていない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０４５３７１号パンフレット
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｖｏｌ．１２，２７−３２，（１９９１）
【非特許文献２】Ｏｄａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｖｏｌ．１７，２３２９−２３３９，（２００３）
【非特許文献３】Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１，５０−５５
【非特許文献４】Ａｎｄｒｅｓ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１６，３２１−３３４
【非特許文献５】Ｖａｌａｒｃｈｅ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１９，８８１−８９６
【非特許文献６】Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１８４５３−１８４６２
【非特許文献７】Ｎｅｐｖｅｕ（２００１）Ｇｅｎｅ  ２７０：１−１５
【非特許文献８】Ｊａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：７３５−７４７
【非特許文献９】Ｊａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｓｕｐｒａ
【非特許文献１０】Ｎｅｕｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ
【非特許文献１１】Ｅｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）ｓｕｐｒａ
【非特許文献１２】Ｌｅｄｆｏｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４５：１５７−１７１
【非特許文献１３】Ｈｏｌｔｈｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４５４−１４５７
【非特許文献１４】Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２０１３−２０２２
【非特許文献１５】Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５２７５−５２８７
【非特許文献１６】Ｂｕｒｇｌｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｓｓａｔａ（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４６：１１５−１２３
【非特許文献１７】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１１４６３−１１４７０
【非特許文献１８】Ｍｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１３２５−３１３３４
【非特許文献１９】Ｍｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：６３３２−６３４５
【非特許文献２０】Ｍｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）ｓｕｐｒａ
【非特許文献２１】Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，．１９：２８４−２９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前述の通り、臨床使用する目的で活性型ビタミンＤ３誘導体を創製する場合、カルシウム血症等の副作用がないまたは弱い誘導体をスクリーニングできる新規方法が望まれている。しかし、副作用が弱く、骨形成作用が強い誘導体かどうかを判断するには、実際に動物に誘導体を投与し、骨形成能と副作用である高カルシウム血症をどの程度引き起こすかを長期的な検討が必要であり、細胞評価系などで簡便に調べることができなかった。よって、骨形成作用が強く、副作用が少ない活性型ビタミンＤ３誘導体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングできる新規な方法の提供が、本発明の目的の１つである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、ＨＯＳ−ＴＥ８５細胞が、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下での培養により分化することを見出し、その一方、このような作用は骨芽細胞以外の子宮癌細胞であるＨｅＬａ細胞や、乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞では認められないことを見出した。そこで、ＨＯＳ−ＴＥ８５細胞内においてＶＤＲが形成する複合体を探索したところ、ＶＤＲとリガンド依存的に直接結合するＣＤＰを同定し、リガンド依存的なＶＤＲとＣＤＰとの結合は、ＣＤＰの存在量の多い骨芽細胞で顕著であることを見出した。また、本発明者らは、ＶＤＲがＣＤＰを過剰発現させることにより１，２５（ＯＨ）２Ｄ３依存的に転写活性が亢進すること、およびＣＤＰが１，２５（ＯＨ）２Ｄ３依存的に転写活性が亢進することを見出した。
本発明におけるスクリーニング方法の一つの形態としては、ＶＤＲとＣＤＰとの結合に対する化合物の作用を指標にすることが挙げられる。
すなわち本発明は、試験化合物の存在による、ＶＤＲとＣＤＰとの結合の存否を検出する工程を含む、該結合作用を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
該化合物としては、ＶＤＲおよび／またはＣＤＰに親和性を有する化合物があげられる。
該スクリーニング方法は、ＶＤＲとＣＤＰの両方を産生する細胞または該細胞の細胞調製物を用いて行なうことができ、また、ＶＤＲおよびＣＤＰの少なくとも一つは精製された形態のものを使用することも可能である。
ＶＤＲとＣＤＰの両方を産生する細胞としては、骨芽細胞様細胞等があげられ、また、ＶＤＲ遺伝子およびＣＤＰ遺伝子のうち少なくとも１つが導入されて発現しているものであってもよい。
また本発明は、試験化合物の存在による、ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を検出する工程を含む、ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性を亢進する化合物のスクリーニング方法に関する。
該化合物としては、ＶＤＲおよび／またはＣＤＰに親和性を有する化合物があげられる。
ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を検出する工程は、ＣＤＰを過剰発現させることにより、ＶＤＲを介する転写活性がさらに亢進されることを検出することにより、またはＶＤＲを過剰発現させることにより、ＣＤＰを介する転写活性がさらに亢進されることを検出することにより行なうことができる。
ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進は、ＶＤＲおよびＣＤＰの両方を発現および／または産生する細胞において検出することができる。
ＶＤＲおよびＣＤＰの両方を発現および／または産生する細胞としては骨芽細胞様細胞等があげられる。
ＶＤＲおよびＣＤＰの両方を発現および／または産生する細胞は、ＶＤＲ遺伝子およびＣＤＰ遺伝子のうち少なくとも１つ導入されたものであってもよい。
前記スクリーニング方法は、ＣＤＰまたはＶＤＲを介する転写活性の亢進をレポーター遺伝子アッセイ系で測定することができる。
ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進は、ＶＤＲ標的遺伝子または骨芽細胞の分化マーカー遺伝子の発現を指標として測定することができる。ここで、ＶＤＲ標的遺伝子の例としてはＣＹＰ２４遺伝子などが、骨芽細胞の分化マーカー遺伝子の例としてはアルカリフォスファターゼ遺伝子、オステオカルシン遺伝子があげられる。
本発明のスクリーニング方法により取得される化合物の候補化合物としては、ビタミンＤ誘導体が例示される。
本発明のスクリーニング方法により取得される化合物は、骨芽細胞分化を誘導する化合物、動物において骨量増加作用を示す化合物として使用できる。
さらに本発明は、前記スクリーニング方法により選択される化合物に関する。
該化合物としては、ビタミンＤ誘導体が例示される。
さらに本発明は、前記化合物を含む、ＶＤＲとＣＤＰとの複合体によるＶＤＲを介する転写活性の亢進作用を有する疾患、骨芽細胞の分化を促進する効果を有する疾患、または骨量増加効果を有する疾患の治療薬にも関する。
疾患としては、たとえば代謝性骨疾患が挙げられる。
また代謝性骨疾患としては、骨粗鬆症があげられる。
さらに本発明は、（ａ）ＶＤＲ認識配列およびレポーター遺伝子を含み、ＶＤＲを介する転写活性亢進を評価するためのベクター；および（ｂ）ＣＤＰ認識配列およびレポーター遺伝子を含み、ＣＤＰを介する転写活性亢進を評価するためのベクターのうち少なくとも１つを含み、さらに
（ｃ）前記レポーター遺伝子の産物を検出するための試薬；を含む前記スクリーニング方法を行うためのキットにも関する。
また本発明は、（ａ）ＶＤＲ認識配列、ＣＤＰ認識配列およびレポーター遺伝子を含み、ＶＤＲとＣＤＰの複合体を介する転写活性亢進を評価するためのベクター；および
（ｂ）前記レポーター遺伝子の産物を検出するための試薬；を含む前記スクリーニング方法を行うためのキットにも関する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、ＧＳＴレジンおよびＧＳＴ−ＶＤＲ（ＤＥＦ）レジンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。
図２は、ＨＯＳ細胞およびＨｅＬａ細胞の核抽出タンパク質を、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３非存在下および存在下においてＧＳＴ−ＶＤＲ（ＤＥＦ）レジンと一晩混合した後の、レジン結合溶出タンパク質の銀染色像を示す。
図３は、ＨＯＳ細胞およびＨｅＬａ細胞の核抽出タンパク質を、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３非存在下および存在下においてＧＳＴ−ＶＤＲ（ＤＥＦ）レジンと一晩混合した後の、レジン溶出溶出タンパク質のウェスタンブロッティング像を示す。上段から抗ＣＤＰ抗体、抗ＴＲＡＰ１００抗体、および抗ＧＳＴ抗体を用いて得られた検出像である。
図４は、３５ＳラベルＣＤＰを、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３非存在下および存在下においてＧＳＴ−ＶＤＲ（ＤＥＦ）レジンと共存させた後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を、３５Ｓで検出した結果を示す。
図５Ａは、ＳａＭ−Ｉ細胞を各種濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下で培養した際の、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法による培養細胞のＣＤＰ遺伝子発現量の変動を示す。図５Ａにおいて◇はビヒクル、●は１０−７Ｍの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、▲は１０−８Ｍの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、■は１０−９Ｍの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下での培養細胞での結果を示す。
図５Ｂは、ＳａＭ−Ｉ細胞を各種濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下で培養した際の、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法による培養細胞のオステオカルシン遺伝子発現量の変動を示す。図５Ｂにおいて◇はビヒクル、●は１０−７Ｍの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、▲は１０−８Ｍの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、■は１０−９Ｍの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下での培養細胞での結果を示す。
図６Ａは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下もしくは非存在下またはＣＤＰ存在下もしくは非存在下におけるプラスミドｐＭ−ＶＤＲ（ＤＥＦ）によるＶＤＲ（ＤＥＦ）を介する転写活性化能の評価結果を示す。
図６Ｂは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下もしくは非存在下またはＣＤＰ存在下もしくは非存在下におけるプラスミドｐＭ−ＶＰ１６によるＶＰ１６を介する転写活性化能の評価結果を示す。
図７Ａは、ｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰを導入されたＨＯＳ細胞を各種濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下で培養した際の、培養細胞のＣＹＰ２４遺伝子の発現量を示す。図７Ａにおいて、ｍｏｃｋとは、ｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰが導入されていないＨＯＳ細胞を、ＣＤＰとはｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰが導入されたＨＯＳ細胞を示す。
図７Ｂは、ｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰを導入されたＨＯＳ細胞を各種濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下で培養した際の、培養細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）遺伝子の発現量を示す。図７Ａにおいて、ｍｏｃｋとは、ｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰが導入されていないＨＯＳ細胞を、ＣＤＰとはｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰが導入されたＨＯＳ細胞を示す。
図７Ｃは、ｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰを導入されたＨＯＳ細胞を各種濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下で培養した際の、培養細胞のオステオカルシン遺伝子の発現量を示す。図７Ａにおいて、ｍｏｃｋとは、ｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰが導入されていないＨＯＳ細胞を、ＣＤＰとはｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰが導入されたＨＯＳ細胞を示す。
図８Ａは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下もしくは非存在下またはＣＤＰ存在下もしくは非存在下におけるＣＹＰ２４遺伝子プロモーター転写活性化の評価結果を示す。
図８Ｂは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下もしくは非存在下またはＣＤＰ存在下もしくは非存在下におけるオステオカルシン遺伝子プロモーター転写活性化の評価結果を示す。
図９は、ＣＤＰ、ＦＬＡＧ−ＶＤＲの両方またはＣＤＰのみを導入されたＨＯＳ細胞を、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下および非存在下で培養した際のＣＤＰとＦＬＡＧ−ＶＤＲの結合の存否を表すウェスタンブロッティング像を示す。上段から抗ＣＤＰ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体を用いて得られた検出像を示す。
図１０は、ＣＤＰ、ＦＬＡＧ−ＶＤＲの両方またはＣＤＰのみを導入されたＨＯＳ細胞を、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下および非存在下で培養した際のＣＤＰとＦＬＡＧ−ＶＤＲの結合の存否を表すウェスタンブロッティング像を示す。上段から抗ＣＤＰ抗体および抗ＴＲＡＰ１００抗体を用いて得られた検出像を示す。
図１１は、ＧＳＴ−ＶＤＲと１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下で結合するタンパク質およびタンパク質複合体の分画を示す。上段から抗ＣＤＰ抗体、抗ＴＲＡＰ１００抗体、および抗ＶＤＲ抗体を用いて得られた検出像を示す。
図１２は、ＧＳＴ−ＶＤＲと１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下で結合するタンパク質を抗ＣＤＰ抗体で免疫沈降を行いＣＤＰとＶＤＲとの複合体をＤＲＩＰ複合体と別個に分取したことを示す。上段から抗ＣＤＰ抗体、抗ＴＲＡＰ１００抗体、および抗ＶＤＲ抗体を用いて得られた検出像を示す。
図１３は、各種濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３で刺激された骨芽細胞様細胞（ＳａＭ−１）のアルカリフォスファターゼ染色による検出像を示す。上段はＣＤＰを過剰発現させた群（Ａｄ−ＣＤＰ）、下段はＣＤＰを過剰発現させていない、空のアデノウイルスを感染させた群（Ａｄ−ｍｏｃｋ）の検出像を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、試験化合物の存在による、ＶＤＲとＣＤＰとの結合を検出する工程を含む、当該結合作用を有する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明は、ＶＤＲとＣＤＰがＶＤＲリガンド依存的に結合するという発見に基づく。
かかるＶＤＲリガンドの存在により、ＶＤＲとＣＤＰは結合するため、本発明のスクリーニング系によって選択される化合物の一つの形態は、ＶＤＲリガンドが挙げられる。なお、本発明のスクリーニング方法の目的は、ＶＤＲとＣＤＰとの結合を量的または速度論的に亢進する化合物の取得であるため、本発明のスクリーニング方法においてスクリーニングされる化合物としては、ＶＤＲおよび／またはＣＤＰに親和性を有する化合物があげられる。また、本件明細書において、ＶＤＲおよび／またはＣＤＰに親和性を有する化合物は、ＶＤＲリガンド、ＣＤＰリガンド、ＶＤＲとＣＤＰとの結合を亢進する化合物、またはＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性を亢進する化合物とも言う。かかる化合物の候補化合物としては、例えば、ビタミンＤ誘導体があげられる。ビタミンＤ誘導体とは、エルゴカルシフェロールまたはコレカルシフェロールの生物学的作用を示すステロイドをいう。なお、本発明のスクリーニング方法は、ＶＤＲとＣＤＰとの結合を量的または速度論的に亢進する化合物、またはＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性を亢進する化合物を単離することを目的とするため、かかる化合物であればビタミンＤ誘導体に特に限定されるものではない。
本発明において、ＶＤＲとは哺乳類動物に由来する核内タンパク質で、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３への結合活性を有するものをいう。そのようなＶＤＲとしては、好ましくはヒト、マウス、ラットのＶＤＲがあげられ、より好ましくはヒトのＶＤＲがあげられる。これらのＶＤＲのアミノ酸配列は、例えばヒトであればＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ１１４７３、マウスであればＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ４８２８１、ラットであればＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ１３０５３に開示されている情報を参照することができる。また本発明においては少なくともＶＤＲアミノ酸配列のビタミンＤ結合領域を含む配列を有し、ＤＮＡ結合領域などを欠損したＶＤＲも含まれる。このようなＶＤＲの例としては、上述のＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ１１４７３に開示されているヒトＶＤＲのアミノ酸配列のうち、少なくともＮ末端から２３２番目のアミノ酸から３９４番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む配列よりなり、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３への結合を有するものが挙げられる。さらに、本発明におけるＶＤＲには上述のＶＤＲと他の機能を有するタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質も含まれる。そのようなものの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインタンパク質、ＶＰ１６転写活性化ドメインタンパク質や蛍光タンパク質等とＶＤＲの融合タンパク質があげられる。
一方、ＣＤＰ（ＣＣＡＡＴ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、骨芽細胞においてに、ＶＤＲとリガンド依存的に直接結合することが本発明において初めて見出されたタンパク質である。このような作用は、骨芽細胞以外の子宮癌細胞であるＨｅＬａ細胞や、乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞では認められなかった。また、ＣＤＰが骨芽細胞において存在量が多いことも、本発明において見出された。本発明におけるＣＤＰとはキイロショウジョウバエのＣｕｔ遺伝子に類似する哺乳類の核内タンパク質であり、ＣＵＴＬ１、ＣＵＸ、ＣＡＳＰ、ＣＯＹｌ、Ｃｌｏｘとも呼ばれる。本発明におけるＣＤＰは好ましくはヒト、マウス、ラットのＣＤＰがあげられ、より好ましくはヒトのＣＤＰがあげられる。これらのＣＤＰのアミノ酸配列は、例えばヒトであればＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ３９８８０、マウスであればＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｐ５３５６４、ラットであればＮＣＢＩ＿ＲＥＦＳＥＱ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＰ＿００１０７０４８２に開示されている情報を参照することができる。またＣＤＰの既知のアイソフォームやＣＤＰの配列の一部においてアミノ酸の置換・欠損・挿入を行ったタンパク質も、それらがＶＤＲリガンド存在下でＶＤＲへの結合やＶＤＲと複合体を形成して転写活性の亢進する機能を持つものは、本発明のＣＤＰに含まれる。さらに、本発明におけるＣＤＰには上述のＣＤＰと他の機能を有するタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質も含まれる。そのようなものの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインタンパク質、ＶＰ１６転写活性化ドメインタンパク質や蛍光タンパク質等とＶＤＲの融合タンパク質があげられる。
本発明のスクリーニング方法において用いられるＶＤＲとＣＤＰの組み合わせは、それぞれの配列が由来する種が異なってもかまわないが、好ましくは同じ種に由来する配列を含むＶＤＲとＣＤＰの組み合わせが用いられ、さらに好ましくはヒトのＶＤＲとＣＤＰの配列に由来するものの組み合わせが用いられる。
ＶＤＲとＣＤＰを結合させるＶＤＲリガンドは、骨芽細胞分化マーカーであるオステオカルシン遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現をも亢進させることから、本発明のスクリーニング方法により、骨芽細胞分化に関与するＶＤＲリガンドその他の化合物を取得することができる。さらには、該化合物は、骨芽細胞において存在量が多いＣＤＰとＶＤＲとの結合に関与するものであるため、本発明のスクリーニング方法により、高カルシウム血症等の副作用の少ない骨芽細胞選択的な化合物を取得することができる。
本発明のスクリーニング方法は、ＶＤＲとＣＤＰの両方を産生する細胞または該細胞の細胞調製物を用いて行なうことができる。すなわち、該細胞を試験化合物存在下で培養したり、該細胞の培地中に試験化合物を混合させたりすることにより、試験化合物を細胞に直接接触させてもよいし、該細胞を調製し、ライセート等の細胞調製物に試験化合物を混合させてもよい。このように、本発明のスクリーニング方法は、細胞を用いる細胞評価系、および細胞調製物等を用いる無細胞評価系など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行なうことができる。
細胞の細胞調製物は、当業者であれば適宜調製することができる。本発明のスクリーニング方法で使用できる細胞調製物としては、例えば、核抽出タンパク質、細胞溶解液などがあげられる。細胞質タンパク質はリガンド存在下でのＶＤＲ結合タンパク質を精製する場合に狹雑タンパク質となるため、本発明のスクリーニング方法に用いる細胞調製物としては、特に、核抽出タンパク質が、スクリーニングの過程でノイズとなる細胞質中のタンパク質を減少させることができる点で好ましい。
本発明のスクリーニング方法に使用できるＶＤＲとＣＤＰの両方を産生する細胞としては、骨芽細胞様細胞等があげられる。また、ここでいう骨芽細胞様細胞とは、骨芽細胞の他、一般的な骨芽細胞マーカーを一つあるいは一つ以上発現する細胞をさし、骨芽細胞マーカーとしては、アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、骨シアロタンパク質などが含まれる。また、活性型ビタミンＤ３、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、アスコルビン酸、アスコルビン酸とベータグリセロリン酸による共刺激、及びＢｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）などの骨芽細胞への分化を誘導するとされる処理に応じて上記骨芽細胞マーカーを発現する細胞が含まれる。このような細胞としては、例えば、初代のヒト骨芽細胞、骨芽細胞、骨膜由来の骨芽細胞様細胞、骨肉腫細胞、ヒト幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞などが挙げられ、入手可能な細胞株としては、例えば、ＨＯＳ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．Ｌ‐１５４３）、ＳａＭ−１細胞、ＳａｏＳ−２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ‐８５）、Ｕ−２  ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ‐９６）、ＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１４２７）、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ‐２５９３）、Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ‐２２６）、ＵＭＲ−１０６細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６６１）ＳＴ２細胞（独立行政法人  理化学研究所  筑波研究所  バイオリソースセンター細胞番号ＲＣＢ０２２４）、ＲＯＳ１７／２．８（独立行政法人  理化学研究所  筑波研究所  バイオリソースセンター  細胞番号  ＲＣＢ４６２）等があげられるが、これらに限定されない。なお、本発明のスクリーニングに使用される細胞は、ＶＤＲとＣＤＰの両方を産生する細胞であれば良いため、例えば、ＶＤＲ遺伝子およびＣＤＰ遺伝子を導入された細胞も使用することができる。
ＶＤＲ遺伝子等の導入は、当業者であれば適宜選択し実施することができる。遺伝子導入方法としては、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法などがあげられる。遺伝子導入される宿主細胞も、当業者であれば適宜選択し実施することができる。かかる宿主細胞としては、例えば、ＨＯＳ細胞、ＳａＭ−１細胞、ジャーカット細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＨｅｐＧ２、ＣａＣＯ−２、ＳａＯＳ、Ｋ５６２、ＣＶ−１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｆ９、ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１、ＰＣ−１２、ＲＯＳ１７／２．８、ＣＨＯ−Ｋ１、ＢＨＫ−２１などがあげられる。また上述の哺乳類に由来する細胞以外にも、出芽酵母細胞や分裂酵母細胞、大腸菌等の微生物など当業者で有れば適宜選択し、目的に応じた方法で遺伝子を導入して使用することができる。
本発明のスクリーニング方法において、ＶＤＲとＣＤＰとの結合は、試験化合物がＶＤＲとＣＤＰの結合を量的または速度論的に亢進する作用により検出することができる。
ＶＤＲとＣＤＰの結合を量的に解析する系としては、例えば、プルダウンアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｏｃｔ．２００４，ｐ．８８４７−８８６１）や免疫沈降法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＶＯＬ．２７６，ＩＳＳＵＥ  ３１，２８８３５−２８８４１，Ａｕｇｕｓｔ  ３，２００１）などの方法を用いることができる。例えばプルダウンアッセイにおいては実施例２で作製したＧＳＴ−ＶＤＲと、ビタミンＤ誘導体やその他の化合物の存在下または非存在下で、精製されたまたはＣＤＰを含有する細胞核抽出物などを反応させ、グルタチオン結合レジンを用いてＧＳＴ−ＶＤＲを沈降させ、結合したＣＤＰを実施例３に記載のウエスタンブロティングなどの方法で検出することによって、ＶＤＲと結合したＣＤＰの量を検出することが可能である。
ＶＤＲとＣＤＰの結合を速度論的に解析する系としては、例えば表面プラズモン共鳴法などを使う方法も挙げられる（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２７８，Ｉｓｓｕｅ  １５，１３２７１−１３２７７，Ａｐｒｉｌ  １１，２００３）。この方法では例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）タンパク質相互作用解析システムにおいてＶＤＲをセンサーチップ上に固定化し、ビタミンＤ誘導体またはその他の被検化合物を反応後または共存させた状態で、精製されたＣＤＰまたはＣＤＰを含む細胞核抽出物を反応させたときに得られるシグナルから、ＶＤＲとＣＤＰの間の結合速度・解離速度やＶＤＲに対するＣＤＰの結合量などで測定することが可能である。速度論的な解析においては結合速度がより高いおよび／または解離速度が遅い作用を示す化合物は、ＶＤＲとＣＤＰの結合をより促進する化合物として評価される。
その他のＶＤＲとＣＤＰの結合を検出するスクリーニング系の例としては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法が挙げられる（ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＶＯＬ．２７５，ＩＳＳＵＥ  ５２，４１１１４―４１１２３，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２９，２０００）。例えば、ＶＤＲとＣＤＰをそれぞれｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）およびｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＦＰ）との融合タンパク質として発現させ、それらの融合タンパク質が存在する状態で、被検化合物を反応させた時のＶＤＲとＣＤＰの結合を検出できる。この場合、ＶＤＲとＣＤＰ間の結合が亢進した状態は融合タンパク質として発現しているＢＦＰの励起波長（３７０―３９０ｎｍ付近）の励起光を当てたときのＢＦＰの蛍光波長（４３５―４８５ｎＭ付近）の光強度の減少および／またはＧＦＰの蛍光波長（５１５−５５５ｎＭ付近）の光高度の上昇を計測することによって測定することができる。また、ＶＤＲ融合タンパク質とＣＤＰ融合タンパク質が存在している状態で、被検化合物を反応させてからの時間経過でのＢＦＰの蛍光波長における光強度の減少および／またはＧＦＰの蛍光波長での光強度の上昇を測定することによって、ＶＤＲとＣＤＰの結合の速度を測定することも可能である。さらに、細胞内でＶＤＲ蛍光タンパク質およびＣＤＰ融合タンパク質を発現させ、被検化合物を反応させたときに、蛍光顕微鏡を用いて観察することによって、細胞内の局所、例えば核内においてのＶＤＲとＣＤＰとの結合を観察することも可能であり、イメージアナライザーなどとの組み合わせによって、その蛍光強度の増減を測定することも可能である。
ＶＤＲとＣＤＰの結合を量的に解析する系においては、ＶＤＲとＣＤＰの両方を産生する細胞または該細胞の細胞調製物を用いて行なうことが可能であるが、ＶＤＲおよびＣＤＰの少なくともいずれかが精製されたものを用いることも可能である。精製されたＶＤＲまたはＣＤＰを調製するための製造方法としては、ＶＤＲまたはＣＤＰのタンパク質をコードする遺伝子を適宜発現用ベクター内にそれらのタンパク質が発現するのに適した形状で組み込んだベクターを作製し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、大腸菌等の微生物などのいずれかに導入した形質転換体を作成して、その形質転換体を培養することによって製造することが例示できる。また、製造方法としては、インビトロ翻訳反応系に代表される無細胞系タンパク質合成による方法が挙げられ、例えばＶＤＲまたはＣＤＰタンパク質をコードする遺伝子の５’上流に転写調節を制御する配列、好ましくはＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター等を付加し、その遺伝子を細胞内もしくはインビトロにおいて転写することでＶＤＲまたはＣＤＰタンパク質をコードするＲＮＡ分子を作成し、小麦胚芽、大腸菌、網状赤血球などから調製されたインビトロ転写反応用の細胞抽出物を用いることで行うことができる（澤崎等  蛋白質・核酸・酵素  ２００３年  ４８巻  ｐ５４９−５５４）。このような形質転換体または無細胞系タンパク合成により生産されたＶＤＲまたはＣＤＰは、所望によりその物理学的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作［日本生化学会編  「生化学データブックＩＩ」第１版第１刷、株式会社東京化学同人  １９８０年６月２３日発行  ｐ１１７５〜１２５９；Ａｒａｋａｗａ等  バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（ＵＳＡ）１９８６年１２月１６日発行２５巻２５号ｐ８２７４〜８２７７（１９８６）；ラングレイ（Ｌａｎｇｌｅｙ）等  ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｇｅｒｍａｎｙ）１９８７年３月２日発行  １６３巻２号  ｐ３１３〜３２１等参照］により分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、タンパク質沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外ろ過、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合わせ等を例示できる。前記ポリペプチドとのアフィニティーを利用する精製には、たとえば、前述の前記ポリペプチドと結合する抗体を用いることができ、該ポリペプチドと該抗体との脱着により行うことができる。
またその他の精製されたＶＤＲまたはＣＤＰを調製する方法の例としては、ＶＤＲまたはＣＤＰがアフィニティータグを融合した形になるように形質転換体または無細胞系タンパク合成で産生させ、該ＶＤＲまたはＣＤＰを分離、精製することによっても行なうことができる。このようなアフィニティータグが融合して形でＶＤＲまたはＣＤＰを発現させれば、このタグを利用するアフィニティー精製を実施することが可能である。該アフィニティータグとしては、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ、シスク（Ｓｉｓｋ）等  ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）（ＵＳＡ）１９９４年２月発行  ６８巻２号  ｐ７６６〜７７５）およびＦＬＡＧタグ（ホップ（Ｈｏｐｐ）等バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１９８８年発行  ６巻  ｐ１２０４〜１２１０）があげられる。この方法において、ＧＳＴを融合したＧＳＴ融合タンパク質の場合は、グルタチオン固定化担体を用いることによって、ＧＳＴと該グルタチオン結合担体との吸着・脱着反応を用いて精製でき、Ｈｉｓタグ融合タンパク質の場合には、金属イオンキレート担体を用いることによってＨｉｓタグと該金属イオンキレート担体との吸着・脱着反応を用いて精製でき、ＦＬＡＧタグ融合タンパク質の場合には、抗ＦＬＡＧタグ抗体の結合した担体を用いることによって、ＦＬＡＧタグと該抗体の結合した担体との吸着・脱着反応を用いて精製することができる。
上記のスクリーニング系においては、被検化合物によるＶＤＲとＣＤＰの結合の程度を量的または速度論的な数値として比較することに加えて、被検化合物が存在しない場合または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３などを標準化合物として用いた場合での数値との相対値として比較することも可能である。
また、上記のスクリーニング系によって選別された候補化合物は、骨芽細胞の分化や正常非ヒト動物や病態動物モデルでの骨形成能を指標にして、該化合物の骨形成への作用を検証することができる。例えば、実施例７に示したようにＨＯＳ細胞などの骨芽細胞系の細胞に、候補化合物を反応させたときに、その骨芽細胞分化マーカー（アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン等）の遺伝子またはタンパク質の発現を指標にして、その候補化合物の骨量増加作用を検証できる。また動物での候補化合物の効果の検証については、正常非ヒト動物や卵巣摘出動物などの病態モデル動物に投与して、その動物における骨密度（ＢＭＤ）やＭｉｃｒｏＣＴ・組織標本での骨組織の解析などを行うことで、候補化合物の骨量増加など活性を検証することが可能である（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ＶＯＬ．８９，ｐ．２５５−２６６  ２００２）。
また本発明は、試験化合物の存在による、ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を検出する工程を含む、ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性を亢進する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明は、ＶＤＲを介する転写活性およびＣＤＰを介する転写活性が、ＶＤＲリガンド依存的に亢進するという発見に基づく。かかるＶＤＲリガンドの存在により、ＶＤＲを介する転写活性またはＣＤＰを介する転写活性が亢進されるため、本発明のスクリーニング系によって選択される化合物の一つの形態としては、ＶＤＲリガンドを挙げることができる。なお、本発明のスクリーニング方法の目的は、ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性を亢進する化合物の取得であるため、本発明のスクリーニング方法においてスクリーニングされる化合物としては、ＶＤＲリガンドのほか、ＣＤＰに親和性を有する化合物も含まれる。
本件明細書において、「ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性」とは、ＶＤＲとＣＤＰとが結合して複合体が形成されることにより特異的に生じる転写活性をいい、具体的には骨芽細胞において見られる転写活性をいう。ＶＤＲとＣＤＰとの複合体形成は、骨芽細胞以外の子宮癌細胞であるＨｅＬａ細胞や、乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞では認められず、骨芽細胞において見出された事象であるため、かかる複合体による転写活性は、骨芽細胞分化を促す一方、血中カルシウム上昇作用は弱いことが期待される。
また、ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を検出する工程は、ＣＤＰを過剰発現させることにより、ＶＤＲを介する転写活性がさらに亢進されることを検出することにより、またはＶＤＲを過剰発現させることにより、ＣＤＰを介する転写活性がさらに亢進されることを検出することにより行なうことができる。
本件明細書において、「ＶＤＲを介する転写活性」とは、ＶＤＲが活性化することにより生じるＶＤＲ認識配列の転写等が挙げられるが、ＶＤＲとＣＤＰとが結合して複合体が形成されることにより特異的に生じる転写活性である限り、特に限定されない。かかるＶＤＲ認識配列を含むＤＮＡ領域の転写を評価することにより、ＶＤＲを介する転写活性が亢進されたかどうか評価することができる。また、ＶＤＲを介する転写活性は、人為的に、ＶＤＲのうちＤＮＡ結合活性以外の受容体機能に必要なＶＤＲ（ＤＥＦ領域）（以下、ＶＤＲ（ＤＥＦ）と略称する場合もある。）を残し、それ以外のＶＤＲのＤＮＡ結合領域等を、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン等の実験室的に用いられる転写調節遺伝子に置換することにより、後述するレポーター遺伝子アッセイ系で測定することもできる。かかるレポーター遺伝子アッセイ系によると、ＶＤＲ、ＣＤＰまたは試験化合物それぞれにより生じ得るノイズとなる反応を減少し得る点で好ましい。またその他の方法として、哺乳類細胞でのＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ法（ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬ．２７４，ＩＳＳＵＥ  ４５，３２３７６−３２３８１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ５，１９９９）や酵母細胞でのＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＶＯＬ．１１，Ｎｏ．３，ｐ３６６−３７８，１９９７）などの方法から、当業者であれば適宜選択して転写活性を指標としたスクリーニング系を構築することが可能である。
本件明細書において、「ＣＤＰを介する転写活性」とは、ＣＤＰが活性化することにより生じるＣＤＰ認識配列の転写等が挙げられるが、ＶＤＲとＣＤＰとが結合して複合体が形成されることにより特異的に生じる転写活性である限り、特に限定されない。かかるＣＤＰ認識配列を含むＤＮＡ領域の転写を評価することにより、ＣＤＰを介する転写活性が亢進されたかどうか評価することができる。ＣＤＰを介する転写活性は、前述のＶＤＲを介する転写活性と同様、レポーター遺伝子アッセイ系等により測定することができる。
ＣＤＰを過剰発現させることによりＶＤＲを介する転写活性を亢進させるＶＤＲリガンドは、骨芽細胞分化マーカーであるオステオカルシン遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現をも亢進させることから、本発明のスクリーニング方法により、骨芽細胞分化に関与するＶＤＲリガンドを取得することができる。さらには、該ＶＤＲリガンドは、骨芽細胞において存在量が多いＣＤＰとＶＤＲとの結合に関与するものであるため、本発明のスクリーニング方法により、骨形成作用が強く、高カルシウム血症等の副作用の少ない骨芽細胞選択的なＶＤＲリガンドを取得することができる。
本発明のスクリーニング方法は、ＶＤＲおよびＣＤＰの両方を発現および／または産生する細胞を使用して行なうことができる。かかるＶＤＲおよびＣＤＰの両方を発現および／または産生する細胞としては、前述の骨芽細胞様細胞等があげられる。なお、本発明のスクリーニングに使用される細胞は、ＶＤＲおよびＣＤＰの両方を発現および／または産生する細胞であれば良いため、例えば、ＶＤＲ遺伝子およびＣＤＰ遺伝子のうち少なくとも１つ導入された細胞も使用することができる。
さらに、本発明のスクリーニング方法は、前述の通り、ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進を、レポーター遺伝子アッセイ系で測定することができる。レポーター遺伝子とは、プロモーターやエンハンサーの転写活性などを調べるためにＤＮＡへ組み込まれる目印用の遺伝子であり、その発現量を測定できる遺伝子であれば特に限定されず、一般的には検出が簡単で定量化可能なものが好ましい。かかるレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子、ｈＧＨ（分泌型ヒト成長ホルモン）遺伝子、ＳＥＡＰ（ヒト分泌型アルカリフォスファターゼ）遺伝子、ＧＦＰ（グリーンフルオレッセントタンパク質）遺伝子およびＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子などがあげられる。
レポーター遺伝子を使用するアッセイは、当業者であれば適宜実施することができる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用するアッセイは、細胞抽出液に基質と酸素を与えて発光反応を起こさせ、発光の度合いを測定してルシフェラーゼの発現量を評価することにより、ＣＤＰを介する転写活性またはＶＤＲを介する転写活性の亢進を評価することができる。
ＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性の亢進は、ＶＤＲ標的遺伝子または骨芽細胞の分化マーカー遺伝子の発現を指標として測定することができる。ＶＤＲ標的遺伝子としてはＣＹＰ２４遺伝子などがあげられる。ＶＤＲ標的遺伝子の発現の亢進が検出された場合には、ＶＤＲが活性化されＶＤＲを介する転写活性が亢進されたと判断できる。骨芽細胞の分化マーカー遺伝子としては、アルカリフォスファターゼ遺伝子、オステオカルシン遺伝子などがあげられる。骨芽細胞の分化マーカー遺伝子の発現の亢進が検出された場合には、ＶＤＲが活性化されＶＤＲを介する転写活性が亢進された結果、またはＣＤＰが活性化されＣＤＰを介する転写活性が亢進された結果、もしくはＶＤＲとＣＤＰとの複合体によりＶＤＲもしくはＣＤＰを介する転写活性が亢進された結果、骨芽細胞分化が誘導されたと判断できる。
また、上記のスクリーニング系によって選別された候補化合物は、骨芽細胞の分化や正常非ヒト動物や病態動物モデルでの骨形成能を指標にして、該化合物の骨形成への作用を検証することができる。例えば、実施例７に示したようにＨＯＳ細胞などの骨芽細胞系の細胞に、候補化合物を反応させたときに、その骨芽細胞分化マーカー（アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン等）の遺伝子またはタンパク質の発現を指標にして、その候補化合物の骨量増加作用を検証できる。また動物での候補化合物の効果の検証については、正常非ヒト動物や卵巣摘出動物などの病態モデル動物に投与して、その動物における骨密度（ＢＭＤ）やＭｉｃｒｏＣＴ・組織標本での骨組織の解析などを行うことで、候補化合物の骨量増加など活性を検証することが可能である（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ＶＯＬ．８９，ｐ．２５５−２６６  ２００２）。
前記スクリーニング方法によれば、前述の通り、骨芽細胞分化に関与する化合物および／または高カルシウム血症等の副作用の少ない骨芽細胞選択的な化合物の取得が期待できる。また、当該化合物が、動物において骨量増加作用を示すものであればより好ましい。
さらに本発明は、前記スクリーニング方法により選択される化合物、例えば、ＶＤＲおよび／もしくはＣＤＰに親和性を有する化合物、ＶＤＲとＣＤＰとの結合を量的または速度論的に亢進する化合物、またはＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性を亢進する化合物に関する。かかる化合物としては、例えば、ＶＤＲリガンド、ＶＤＲに親和性を有する化合物、ＣＤＰリガンド、またはＣＤＰに親和性を有する化合物などがあげられる。具体的には、かかる化合物としては、例えばビタミンＤ誘導体があげられるが、ＶＤＲとＣＤＰとの結合を量的または速度論的に亢進する化合物、またはＶＤＲとＣＤＰとの複合体による転写活性を亢進する化合物であればこれに限定されるものではない。
さらに本発明は、前記化合物を含む、ＶＤＲとＣＤＰとの複合体によるＶＤＲを介する転写活性の亢進に関与する疾患の治療薬にも関する。該ＣＤＰの結合によるＶＤＲを介する転写活性の亢進に関与する疾患としては、たとえば代謝性骨疾患、異常な細胞分化および／または細胞増殖によって特徴付けられる疾患、座瘡、脱毛症、アルツハイマー病、自己免疫性糖尿病、骨折治癒、乳癌、前立腺癌、大腸癌、脳膠細胞腫、骨肉腫、黒色腫、骨髄線維症、原発性副甲状腺機能亢進症、Ｉ型糖尿病、宿主対移植片反応、移植片対宿主反応、移植組織拒絶、ステロイド誘発性皮膚萎縮、体液性高カルシウム血症、誘導性糖尿病、白血病、狼瘡、多発性硬化症、皮脂分泌不足、骨軟化症、骨粗鬆症、皮膚の弾力（ｆｉｒｍｎｅｓｓ）不足、皮膚の保湿（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）不足、乾癬性（ｐｈｏｒｉａｔｉｃ）関節炎、乾癬、腎不全、腎性骨ジストロフィー、強皮症、自己免疫型慢性皮膚疾患、円板状および全身性エリテマトーデス、関節リウマチ等があげられる。また、前記スクリーニング方法により、骨芽細胞分化に関与する化合物および／または高カルシウム血症等の副作用の少ない骨芽細胞選択的な化合物の取得が期待できため、中でも、骨芽細胞の分化を促進する効果を有する疾患、または骨量増加効果を有する疾患の治療薬として有用である。かかる対象疾患としては、代謝性骨疾患があげられる。代謝性骨疾患としては、骨粗鬆症、骨パジェット病、骨軟化症、腫瘍性骨軟化症、大理石病、腎性骨異栄養症等があげられる。本発明のスクリーニング方法により取得される化合物は、骨芽細胞分化に関与する化合物および／または高カルシウム血症等の副作用の少ない骨芽細胞選択的な化合物であることが期待できるため、特に、骨粗鬆症の治療薬として有用である。
さらに本発明は、（ａ）ＶＤＲ認識配列およびレポーター遺伝子を含み、ＶＤＲを介する転写活性亢進を評価するためのベクター；ならびに
（ｂ）ＣＤＰ認識配列およびレポーター遺伝子を含み、ＣＤＰを介する転写活性亢進を評価するためのベクターのうち少なくとも１つを含み、さらに
（ｃ）前記レポーター遺伝子の産物を検出するための試薬；を含む前記スクリーニング方法を行うためのキットにも関する。該キットにより、簡便に前記スクリーニングを行なうことができる。また、該キットには、ＶＤＲおよびＣＤＰの両方を転写する細胞を含ませてもよい。
また別の形態のキットとしては、（ａ）ＶＤＲ認識配列、ＣＤＰ認識配列およびレポーター遺伝子を含み、ＶＤＲとＣＤＰの複合体を介する転写活性亢進を評価するためのベクター；ならびに
（ｂ）前記レポーター遺伝子の産物を検出するための試薬；を含む前記スクリーニング方法を行うためのキットに関する。高等生物におけるゲノム上での遺伝子転写調節領域においては、複数の転写制御因子の認識部位を含んでおり、それらの組み合わせによって遺伝子転写の制御がなされている。そのため、ＶＤＲ認識部位を持つＶＤＲ認識配列とＣＤＰ認識配列の両者を含有する調節領域にレポーター遺伝子を結合させたベクターも、ＶＤＲとＣＤＰの複合体による転写活性の測定にもちいることができる。
前記ＶＤＲ認識配列とは、ＶＤＲリガンドの作用特異的にＶＤＲが結合するＤＮＡ配列を言い、より好ましくはＶＤＲとＣＤＰの複合体においてＶＤＲが結合する配列をさす。このようなＶＤＲ認識部位の配列としては、ヒトＣＹＰ２４のプロモーター／エンハンサー領域に存在する２つのＶＤＲ認識配列：ＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＧＡＧＧＧＣＧおよびＧＧＡＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＴＧＴＧ（Ｃｈｅｎ  ＫＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２６３：１−９（１９９５））や、ヒトオステオカルシンプロモーターにおけるＶＤＲ認識配列：ＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＣＡ（Ｏｚｏｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：２１８８１−２１８８８）／ＴＴＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＣＧＧＧＴＧＡ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＮＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２６５：２１８８１−２１８８８）／ＴＴＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＣＡ（Ｓｃｈｒａｄｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５５０１−５５０４）などの塩基配列を含むものが例示される（配列中下線部分はＶＤＲが結合するのに重要とされる部分）。但し、ＶＤＲ認識配列とは、ＶＤＲリガンドの作用特異的にＶＤＲが結合するＤＮＡ配列を言い、より好ましくはＶＤＲとＣＤＰの複合体が結合する配列であれば上記に例示に限定されるものではなく、当業者であれば適宜それらの部分配列の組み合わせや一部の変異塩基の導入、また他の配列などを選択することも可能である（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｐｉｋｅ，Ｇｌｏｒｉｅｕｘ（ｅｄｓ．），ｐ３１３−３２５）。
また前記のＣＤＰ認識配列とは、ＣＤＰが特異的に結合するＤＮＡ配列であり、好ましくはＶＤＲとＣＤＰの複合体においてＣＤＰが結合する領域をいう。このような配列としては、ＣＣＡＡＴまたはＣＣＧＡＴとＣＡＡＴまたはＣＧＡＴとの組み合わせからなるいわゆるＣＣＡＡＴボックスや、ＡＴＣＧＡＴなどの塩基配列を含むものが例示されるが、これに限定されるものではなく、当業者であれば適宜それらの部分配列の組み合わせや一部の変異塩基の導入、また他の配列などを選択することも可能である（Ａｌａｉｎ  Ｎｅｐｖｅｕ．  Ｇｅｎｅ  ＶＯＬ．２７０，２００１，ｐ１−１５）。かかるＣＤＰ認識配列を含むＤＮＡ領域の転写を評価することにより、ＣＤＰを介する転写活性が亢進されたかどうか評価することができる。
「前記レポーター遺伝子の産物を検出するための試薬」としては、レポーター産物を検出するための基質、細胞固定液、細胞溶解液、試料を希釈するための緩衝液などのうちから必要なものが選択される。レポーター遺伝子として、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子、ＳＥＡＰ（ヒト分泌型アルカリフォスファターゼ）遺伝子、およびＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子を用いた場合には、レポーター産物を検出するための基質とはそれぞれの酵素と反応する基質をさし、それぞれの酵素についての基質は試薬メーカーから提供されているものを用いることができる。この場合、レポーター遺伝子の発現誘導の程度は基質の反応によって計測されるが、それは基質の種類に応じて放射能、発色、蛍光、発光などのパラメーターで測定することが可能である。またレポーター遺伝子の発現による産物がタンパク質の場合には、ＥＩＡ法やＥＬＩＳＡ法などの免疫学的測定によっても計測が可能であり、そのための試薬については当業者であれば適宜選択して含めることが可能である。さらにレポーター遺伝子の発現を転写産物であるｍＲＮＡで測定することも可能であり、そのためのプライマー・プローブ・競合プローブなどの試薬については当業者であれば適宜選択して含めることが可能である。
そのほか、本発明のキットには、付加的な要素として陽性対照、陰性対照、反応容器、光学的解析のためのフィルター、アッセイプロトコルを記載した指示書などを適宜含めることができる。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
なお、当該スクリーニングを行うキットとしては、哺乳類細胞でのＯｎｅ−ｈｙｂｒｉｄシステム、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムや酵母のＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムなどの方法も考えられ、当業者であればそれらの選択されたスクリーニング方法に適した形のキットを構築することができる。
【実施例】
【０００７】
次に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［実施例１］  グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ＶＤＲによるタンパク質複合体精製
まず、ベイトタンパク質であるＧＳＴ−ＶＤＲを大腸菌内に発現させた。Ｋｉｔａｇａｗａら，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１１３，９０５−９１７，２００３の報告に用いられたラットＶＤＲ配列のうちリガンド結合領域が組み込まれたｐＧＥＸ４Ｔ−１（アマシャムバイオサイエンス社製）もしくは、ヒトＶＤＲのリガンド結合領域（ＤＥＦ領域）（ＶＤＲのドメイン構造についてはＪ．Ｗｅｓｌｅｙ  Ｐｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．（２００５）Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｐｉｋｅ，Ｇｌｏｒｉｅｕｘ（ｅｄｓ．），１６７−１９１に解説されている。）をコードするＤＮＡ配列が組み込まれたｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターのうどちらか一方をトランスフォームされた大腸菌（ＤＨ５ａｌｐｈａ株）を３７℃、２ＬのＬＢ培地により振盪機にて１２０回転で培養し、６００ｎｍでの吸光度が０．４−０．５になった時点で０．１ｍＭ  ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加し、２７℃にて３時間１２０回転で振盪機にて培養することでＧＳＴ−ＶＤＲタンパク質発現を誘導した。その後、遠心分離などの方法で菌体を集菌し、１００ｍＬのＰＢＳ（−）を加えよく細胞を懸濁し、ソニケーションを行い、２０％  トライトンＸ−１００／ＰＢＳ（−）を溶液量の２０分の１量加え、４℃で穏やかに３０分間転倒混和することにより細胞を破砕し、４℃、１０００ｘｇ程度で、５分間の遠心分離の後、上清の可溶性画分にＧＳＴ−ＶＤＲを得ることができる。この溶液をＰＢＳ（−）で少なくとも３回洗浄したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ファルマシアバイオサイエンス）とともに４℃で一晩転倒混和した後、ＰＢＳ（−）約５ｍＬで５回洗浄することでＧＳＴ−ＶＤＲタンパクがＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに結合したレジン以下、「ＧＳＴ−ＶＤＲレジン」を作成した。比較としてＶＤＲが融合していないＧＳＴのみ発現をするベクターをもちいて同様の操作をすることによりＧＳＴレジンも作成した。これらレジンに５マイクロリットルに対して水で２倍希釈した、ＳＤＳサンプルバッファ（ＴｒｉｓＳＤＳ  β−ＭＥ  サンプルバッファ、第一化学薬品製、品番３０１７８０）を５マイクロリットル加え、９８℃の水浴にて２分間過熱し、結合しているタンパク質を還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル泳動）を行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を施してタンパク質を可視化した像を図１に示した。レーン２に約２６ｋＤａのＧＳＴタンパク質、レーン３に約６０ｋＤａのＧＳＴ−ＶＤＲタンパク質を検出し、ＧＳＴ−ＶＤＲレジンが作製できた。レーン１には分子量マーカーを泳動している。
［実施例２］  ＧＳＴ−ＶＤＲ（ＤＥＦ）への結合タンパク質の精製と同定
Ｄｉｇｎａｍ  ＪＤ．らＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８３，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．５  １４７５−１４８９に記載されている方法に従って、ヒト骨芽細胞株であるＨＯＳ細胞（ＡＴＣＣより購入した。品番ＣＲＬ−１５４３）から、核抽出タンパク質を調製した。得られた核抽出タンパク質はバッファＤ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０％グリセロール、０．１５Ｍ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．０１％  ２−メルカプトエタノール（ｐＨ＝７．９））に溶解している。この核抽出タンパク質を、ＶＤＲのリガンドである１，２５（ＯＨ）２Ｄ３非存在下および存在下においてＧＳＴ−ＶＤＲレジンと１時間ないし一晩混合した後、ＧＳＴ−ＶＤＲレジンを洗浄し、特異的な結合タンパク質のみがＧＳＴ−ＶＤＲレジンに結合している状態とした。このＧＳＴ−ＶＤＲレジンに１５ｍＭ濃度の還元型グルタチオン溶液（ｐＨ＝８．０）によりレジンに結合しているタンパク質を溶出した。実施例１と同様に溶出されたタンパク質を還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後、ゲルを銀染色（ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔＴＭ  Ｓｉｌｖｅｒ  ＳｔａｉｎｉｎｇＫｉｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社を用いた）を施した結果を図２に示す。レーン３のリガンド存在下でのみ検出される、または、レーン２よりも強く検出されるタンパク質バンドがリガンド存在下に特異的にＶＤＲに結合するタンパク質であり、これらのバンドを切り出し、ＤＴＴによる還元、ヨードアセタミドによるアルキル化を行い、ゲル内でトリプシン消化した後、ペプチドをゲル内から溶出し、ペプチド溶液をａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄと混合してｕｌｔｒａｆｌｅｘＴＭ（ブルカー・ダルトニクス社）付属のターゲットにスポットし、業者指定の方法により質量分析し、ペプチドマスフィンガープリント法により解析することによりＣＣＡＡＴ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＤＰ）を同定した。ＶＤＲにＣＤＰが結合することはこれまでに知られていない。
［実施例３］  ウェスタンブロッティングによるＣＤＰの検出
実施例２の溶出液の一部を還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社、品番ＩＰＶＨ３０４Ｆ０）にブロットし、常法に従って検出した。一次抗体はａｎｔｉ−ＣＤＰ（Ｍ−２２２）ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、品番ｓｃ−１３０２４）、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）を用い、２次抗体はＨＲＰ標識したａｎｔｉ‐ｒａｂｂｉｔＩｇＧ（アマシャムバイオサイエンス社、品番ＮＡ９３４Ｖ）をもちいた。検出にはＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、品番ＲＰＮ２１３２）を用いた。結果を図３に示した。ＣＤＰのバンドはリガンド非存在下であるレーン３には殆ど検出されないが、リガンドが存在するレーン４ではＣＤＰのバンドは強く検出されている。また、比較対照として骨芽細胞ではない子宮癌由来細胞であるＨｅＬａ細胞の核抽出タンパク質を同様に得てリガンド存在下にＧＳＴ−ＶＤＲと混合し、還元型グルタチオンで結合タンパク質を溶出したものをレーン５で泳動している。レーン５ではＣＤＰのバンドが見られないことから、ＣＤＰのリガンド存在下のＧＳＴ−ＶＤＲへの結合は骨芽細胞特異的であることが示された。一方でＧＳＴ−ＶＤＲと直接結合しないが、既にリガンド存在下にＧＳＴ−ＶＤＲに複合体（ＤＲＩＰ複合体）を形成して結合する因子の一つとしてＴＲＡＰ１００が知られている（Ｒａｃｈｅｚら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９８，１２，１７８７−１８００）。そこでＴＲＡＰ１００を同様に１次抗体としてａｎｔｉ−ＴＲＡＰ１００  ｇｏａｔ  ＩｇＧ（Ｃ−１６）（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、品番ｓｃ−５３３８）を用いて、２次抗体としてａｎｔｉ−ｇｏａｔＩｇＧ  ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社、品番Ｐ０４４９）を用いウェスタンブロッティングにより検出したところ、レーン４、５において、ＨＯＳ細胞（レーン４）においてもＨｅＬａ細胞から調製した核抽出タンパク質を用いた場合（レーン５）においてもリガンドが存在している条件であればＴＲＡＰ１００を確認できた。これらことから、ＴＲＡＰ１００のようなタンパク質は細胞によらずにＧＳＴ−ＶＤＲにリガンド依存的に複合体を形成して結合することが示された。レーン１とレーン７にＨＯＳ細胞とＨｅＬａ細胞の核抽出タンパク質を泳動している。この比較より、ＣＤＰタンパク質の核抽出タンパク質中の存在量自体がＨＯＳ細胞の方が、ＨｅＬａ細胞よりも多いことが示された。
［実施例４］  ＧＳＴ−ｐｕｌｌｄｏｗｎアッセイによるＣＤＰとＶＤＲの直接の結合性
ＴｎＴ  ＳＰ６  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、品番Ｌ４６００）を用いて１．５ｍＬチューブ内で３５Ｓ標識されたＣＤＰタンパク質を合成した。テンプレートＤＮＡはｐＳＰＯＲＴ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＳＰ６プロモーター下流のマルチクローニングサイト内にＣＤＰをコードする配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．ＢＣ０６６５９２）が挿入されているものをＯｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から購入（品番ＥＨＳ１００１−７５１６５９７）して用いた（ｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰ）。ＧＳＴまたは、ＧＳＴ−ＶＤＲ結合したグルタチオンセファロース４Ｂレジン２５ｕＬと、３５Ｓ標識されたＣＤＰタンパク質とをＮＥＴ−Ｎ＋バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ４０）中に１，２５（ＯＨ）２Ｄ３  １０−６Ｍ存在、非存在下、４℃条件下１時間混和した。レジンを遠心分離し、上清を除去し、ＮＥＴ−Ｎ＋バッファーにてレジンを３回洗浄した。得られたレジンにＳＤＳサンプルバッファーを加え、還元条件下での１０％変性アクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを乾燥し、バイオイメージングアナライザー（富士フィルム社、品名ＢＡＳ１５００）により３５Ｓ標識ＣＤＰを検出した。その結果を図４に示す。ＧＳＴタンパク質のみが結合したレジン（レーン２）、及びリガンドが存在していない条件でのＧＳＴ−ＶＤＲ（ＤＥＦ）レジンには３５Ｓ標識ＣＤＰは結合がみられず（レーン３）、リガンドが存在している条件下にのみ３５Ｓ標識ＣＤＰを検出した（レーン４）。このことから、ＣＤＰはリガンド依存的にＶＤＲに結合することが示された。
［実施例５］  ＣＤＰの骨芽細胞分化過程での遺伝子発現
ヒト骨膜由来細胞であるＳａＭ−Ｉ細胞（Ｋｏｓｈｉｈａｒａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １４５：６５１−７，Ｋｏｓｈｉｈａｒａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５：３７−４３，Ｔｏｇａｒｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２３３：１２５−８）を２８日間、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、品番１２５７１−０７１）、１０％牛胎仔血清、カナマイシン０．１ｍｇ／ｍＬ、２ｍＭ  α−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（東京化成工業、品番Ｇ００９６）、各種濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下及び非存在下にて、２〜３日に一度培地を交換しながら培養した。２８日目の最終分化（石灰化）するまでの間、培養４日目、７日目、１４日目、２８日目に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、品番７４１０４）により総ＲＮＡを抽出し、ＯｍｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、品番２０５１１０）によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、品番４３６７６５９）と各種遺伝子の増幅に適したプライマーオリゴを混合し骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ、オステオカルシンとＣＤＰ、及び普遍的に発現しているハウスキーピング遺伝子として知られるベーターアクチンの遺伝子発現の変動をＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）または、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより検討した。各種遺伝子に相補的なオリゴは一般的な方法により設計し、シグマジェノシス社により合成した。結果をベータアクチンの発現量に対する相対値で示した。オステオカルシン、ＣＤＰのＣＴ値（検出の増幅閾値に達した時のサイクル番号）はΔΔＣＴ法により、ヒトのベータアクチン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）発現量に対して標準化した。相対的発現量の値は、式：２−（対象とする遺伝子のΔΔＣＴ−ベータアクチンΔΔＣＴ）により計算した。
図５に示すように骨芽細胞分化マーカーであるオステオカルシン遺伝子発現（図５Ｂ）と同様にＣＤＰの遺伝子発現が亢進していることを示している（図５Ａ）。この事からＣＤＰは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３刺激による骨芽細胞分化に関与をしていることが示唆された。
［実施例６］  ＣＤＰによるＶＤＲを介した骨芽細胞選択的な転写活性化への影響
ＣＤＰの発現がＶＤＲリガンド依存的転写活性化を増加させるかどうかを測定するため、一過性トランスフェクションによるデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。デュアルルシフェラーゼアッセイに用いたレポーターベクターはルシフェラーゼ遺伝子の上流に１７ｍｅｒのＵＡＳ配列を５回繰り返した配列を組み込んだｐＧＬ３ベクターを構築した。ｐＧＬ３ベクターはｐｒｏｍｅｇａ社から購入した。更に、ヒトＶＤＲリガンド結合領域（ＤＥＦ領域）をコードするＤＮＡ配列または、ヘルペスウイルス転写活性化因子であるＶＰ−１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列をＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＤＢＤ）を有するｐＭベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）に挿入し、プラスミドｐＭ−ＶＤＲ（ＤＥＦ）、及び、ｐＭ−ＶＰ１６を構築した。ＣＤＰタンパク質を細胞内で発現させるための発現ベクターは実施例４で使用したｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰを用いた。アッセイに用いるＨＯＳ細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、品番１１８５−０９２）で培養し、２日あるいは３日ごとに継代した。培養の条件は３７℃、５％ＣＯ２とした。アッセイ時のＨＯＳ細胞の培養には、１０％ＤＣＣ−ＦＢＳ（チャコール処理したＦＢＳ）を含むフェノールレッド不含のＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、品番  １１０５４−０２０）を使用した。ＨＯＳ細胞を４８穴プレートに８×１０４ｃｅｌｌｓ／０．２５ｍＬ／ウエルの密度となる計算で細胞懸濁液を調製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、品番１１６６８−０１９）試薬を用いてレポーターベクター、各種ｐＭベクター、発現ベクター等をトランスフェクションするための混合液を調製し、それを細胞懸濁液に混合し、細胞を１ウェルあたり０．２５ｍＬづつ撒きこみ、２時間後にＶｅｈｉｃｌｅ（エタノール）もしくは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−８Ｍ）を含む１０％ＤＣＣ−ＦＢＳ（チャコール処理したＦＢＳ）を含むフェノールレッド不含のＤＭＥＭ培地と交換した。２４時間後に培地を取り除き、ＰＢＳ（−）で一度洗浄した後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、品番Ｅ１９８０）に従って、ルミノメータ（ベルトールドジャパン社製、品名  ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ  ９６Ｖ）によりルシフェラーゼ活性を測定した。結果はホタルルシフェラーゼ活性／レニラルシフェラーゼ活性の値をＦｏｌｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎとしてあらわした。図６ＡではｐＭ−ＶＤＲによる転写活性化は１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−８Ｍ）存在下に亢進しており、その活性をＣＤＰが発現されると更に亢進することを示している。それに対して、図６ＢではｐＭ−ＶＰ１６による転写活性化は１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−８Ｍ）の存在に関係なく、また、ＣＤＰの発現によっても影響を受けていない。この結果より、ＣＤＰの転写活性化はＶＤＲに対して選択性があることを示している。
［実施例７］  ＣＤＰによるＨＯＳ細胞の骨芽細胞分化への影響
ＣＤＰをＨＯＳ細胞に発現させると１，２５（ＯＨ）２Ｄ３による骨芽細胞分化を誘導することを検討するため、ＨＯＳ細胞にｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて遺伝子導入し、細胞がコンフルエントになり、２４時間経過した後、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ、１０％牛胎仔血清、５０ｕｇ／ｍＬアスコルビン酸、各種濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３または、Ｖｅｈｉｃｌｅ（エタノール）存在下培養した。３日後に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、品番７４１０４）にて総ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１８０８０−０４４）によりｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒを用いて逆転写反応を行い、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＧｅｎｅＡｍｐ  ７０００）にて各種遺伝子発現量を測定した。各遺伝子発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨにて補正し、ＧＡＰＤＨと、夫々の遺伝子発現量の相対値を示した。計算式は実施例５と同様にして行った。  ＣＤＰを導入した群については１，２５（ＯＨ）２Ｄ３刺激によるＣＹＰ２４（図７Ａ）の他、骨芽細胞分化マーカーとして知られるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）（図７Ｂ）、オステオカルシン（図７Ｃ）の遺伝子発現が亢進した。このことから、ＣＤＰは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３刺激による骨芽細胞分化を亢進する事が示唆された。
［実施例８］  ＣＤＰによるＶＤＲを介したＶＤＲ標的遺伝子発現への影響
ＣＤＰの発現がＶＤＲリガンド依存的転写活性化を増加させるかどうかを測定するため、一過性トランスフェクションによるデュアルルシフェラーゼアッセイを実施例６と同様にして行った。デュアルルシフェラーゼアッセイに用いたレポーターベクターはルシフェラーゼ遺伝子の上流にヒトＣＹＰ２４遺伝子プロモーター部分の配列または、ヒトオステオカルシン遺伝子プロモーター部分の配列を組み込んだｐＧＬ４ベクターを構築した。ｐＧＬ４ベクターはｐｒｏｍｅｇａ社から購入した。更に、ヒトＶＤＲの４〜４２７アミノ酸残基の領域をコードするＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列をｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入しヒトＶＤＲ発現プラスミドを構築した。ＣＤＰタンパク質を細胞内で発現させるための発現ベクターは実施例４で使用したｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰを用いた。アッセイに用いるＨＯＳ細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養し、２日あるいは３日ごとに継代した。培養の条件は３７℃、５％ＣＯ２とした。アッセイ時のＨＯＳ細胞の培養には、１０％ＤＣＣ−ＦＢＳ（チャコール処理したＦＢＳ）を含むフェノールレッド不含のＤＭＥＭ培地を使用した。ＨＯＳ細胞を４８穴プレートに８×１０４ｃｅｌｌｓ／０．２５ｍＬ／ウエルの密度となる計算で細胞懸濁液を調製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）試薬を用いてレポーターベクター、各種発現ベクター等をトランスフェクションするための混合液を調製し、それを細胞懸濁液に混合し、細胞を１ウェルあたり０．２５ｍＬづつ撒きこみ、２時間後にＶｅｈｉｃｌｅ（エタノール）もしくは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−８Ｍ）を含む１０％ＤＣＣ−ＦＢＳ（チャコール処理したＦＢＳ）を含むフェノールレッド不含のＤＭＥＭ培地と交換した。２４時間後に培地を取り除き、ＰＢＳ（−）で一度洗浄した後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に従って、ルミノメータ（ベルトールド社）によりルシフェラーゼ活性を測定した。結果はホタルルシフェラーゼ活性／レニラルシフェラーゼ活性の値を「転写活性化」として表した。図８ＡではヒトＣＹＰ２４プロモーターのＶＤＲを介した転写活性化は１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−８Ｍ）存在下に亢進しており、その活性をＣＤＰが発現されると更に亢進することを示している。同様に、図８Ｂではヒトオステオカルシンプロモーターの転写活性化は１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−８Ｍ）存在下に亢進しており、その活性をＣＤＰが発現されると更に亢進することを示している。この結果より、天然のＶＤＲ標的遺伝子であるＣＹＰ２４やオステオカルシンのプロモーターにおいてもＶＤＲを介した転写活性化を亢進することを示している。ただし、図８ＢではＶＤＲ発現ベクターを遺伝子導入せずにＨＯＳ細胞内に存在するＶＤＲを用いてアッセイしている。
［実施例９］  ＨＯＳ細胞内でのＶＤＲとＣＤＰのリガンド依存的な結合
ＣＤＰが実際の細胞内で１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下にＶＤＲと結合しているかどうかを検討するため、まず、ヒトＶＤＲをコードするＤＮＡ配列のＮ末にＦＬＡＧタグ配列をコードするＤＮＡ配列をつなぎ合せたＤＮＡ配列をｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入しＦＬＡＧ−ヒトＶＤＲ（ＦＬＡＧ−ｈＶＤＲ）発現プラスミドを構築した。ＨＯＳ細胞にｐＳＰＯＲＴ６−ＣＤＰ、ＦＬＡＧ−ｈＶＤＲを両方もしくは片方のみのプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて遺伝子導入し（各発現プラスミドを遺伝子導入したサンプルには図９中に「＋」、遺伝子導入していないサンプルには「−」で示している。）、２４時間経過した後、各種濃度の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３または、Ｖｅｈｉｃｌｅ（エタノール）を含み、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ存在下２４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、スクレーパーでかきとり、遠心機にて細胞を集めた。更に、細胞をＴＮＥバッファ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）にて溶解し、４℃条件下、１５０００ｘｇで３０分間遠心分離し上清を細胞溶解液とした。この細胞溶解液に抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２レジン（ＳＩＧＭＡ社製、品番Ａ２２２０）を添加し、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下および非存在下に３時間、４℃条件下に混合した。その後、レジンをＴＮＥバッファで３回洗浄し、レジンにＳＤＳサンプルバッファを添加しＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング方法は実施例３と同様に行った。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ウェスタンブロッティングにてＣＤＰ及びＦＬＡＧ−ＶＤＲを検出した。なお、ＦＬＡＧペプチドに対する一次抗体はＳＩＧＭＡ社製、抗ＦＬＡＧウサギＩｇＧ（品番Ｆ７４２５）を用いた。ＣＤＰタンパク質の検出には抗ＣＤＰヤギＩｇＧ（Ｃ−２０）（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製、品番  ｓｃ−６３２７）を用いた。結果を図９に示した。レーン１〜３の「Ｉｎｐｕｔ」は抗ＦＬＡＧ抗体レジンと混合する前の細胞溶解液をそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したものであり、レーン４〜６の「ＩＰ：ＦＬＡＧ」は抗ＦＬＡＧ抗体レジンと混合することで、ＦＬＡＧ−ＶＤＲをＦＬＡＧ−ＶＤＲに結合しているタンパク質とともに免疫沈降することで得られたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングに供した結果を表している。レーン６ではＣＤＰタンパク質のバンドを検出したが、レーン５では殆ど検出できない。一方、ＦＬＡＧ−ＶＤＲはレーン５，６とも同様に検出している。すなわち１，２５（ＯＨ）２Ｄ３が存在しているレーン６ではＦＬＡＧ−ＶＤＲとＣＤＰが結合し、複合体として免疫沈降されているが、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３が存在しないレーン５ではＦＬＡＧ−ＶＤＲとＣＤＰの複合体が形成せずにＦＡＬＧ−ＶＤＲが免疫沈降されたことを示す。
［実施例１０］  ＣＤＰのＨＯＳ細胞特異的なＶＤＲとの結合
実施例２、３と同様にして、Ｃａｃｏ−２細胞から核抽出タンパク質を得て、ＣＤＰとＶＤＲがリガンド依存的に結合するかどうかを検討した結果を図１０に示す。比較としてＨＯＳ細胞由来の核抽出タンパク質を用いて検討した。「Ｉｎｐｕｔ」はＧＳＴ−ＶＤＲレジンと混合する前の核抽出タンパク質をそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したレーンを示す。Ｃａｃｏ−２由来核抽出タンパク質は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−６Ｍ）非存在下及び存在下にＧＳＴ−ＶＤＲと一晩４℃条件下で混合したのちレジンをバッファーＤで洗浄し、還元型グルタチオンで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ウェスタンブロッティングにてＣＤＰおよびＴＲＡＰ１００を検出した。ただし、ＨＯＳ細胞由来核抽出タンパク質は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−６Ｍ）存在下にＧＳＴ−ＶＤＲと一晩４℃条件下で混合した。ウェスタンブロッティングの結果を図１０に示す。レーン１よりＣａｃｏ−２細胞においてもＣＤＰは発現していることがわかる。また、レーン２、３から１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下にＶＤＲへ複合体を形成して結合する既知因子ＴＲＡＰ１００はＧＳＴ−ＶＤＲへ結合しているにもかかわらず、ＣＤＰは結合していないことを示している。一方でＨＯＳ細胞由来核抽出タンパク質を用いたレーン４では、リガンド存在下にＣＤＰがＧＳＴ−ＶＤＲへ結合している。このことは、ＣＤＰは骨芽細胞特異的にＶＤＲと１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下に結合することを示している。
［実施例１１］  ＣＤＰ−ＶＤＲ複合体のＤＲＩＰ複合体との分離
ＨＯＳ核抽出タンパク質溶液を用いて、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下に形成されたＧＳＴ−ＶＤＲとＣＤＰの複合体と、既によく知られるＶＤＲタンパク質複合体であるＤＲＩＰ複合体の各々の分子量を検討するために、ＧＳＴ−ＶＤＲと複合体を形成したサンプルをグリセロール密度勾配遠心法を用いてサイズ分画した。まず、実施例２，３と同様に１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−６Ｍ）存在下に形成された複合体を還元型グルタチオンで溶出し、バッファーＤの組成の中のグリセロール濃度が２０〜５０％の濃度勾配を持つバッファ１０ｍＬが入った遠心管（日立工機製、品名  １３ＰＡチューブ）の最上部に重層し、１６時間、４℃、３８，０００回転、ＲＰＳ−４０Ｔ４８０ローター（日立工機製）を用いて遠心した（日立工機社製ＣＰ７０Ｇまたは、ＣＰ１００ＭＸ）。遠心分離後、上層から３００マイクロリッターずつ回収し、分画した。夫々の溶液を等量の２０％トリクロロ酢酸／アセトンを加え、１０分間氷浴に静置し、４℃、１５０００ｘｇ程度にて３０分間遠心することによりタンパク質を沈殿させ上清を除き、氷冷したエタノールにて沈殿を洗浄した後、乾燥させ、ＳＤＳサンプルバッファに溶解した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、上記と同様にしてウェスタンブロッティングによりＣＤＰ、ＴＲＡＰ１００、及びＶＤＲタンパク質を検出した。ＶＤＲの検出には一次抗体として、抗ＶＤＲ（Ｃ−２０）ウサギＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、品番ｓｃ−１００８）を用い、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ（アマシャムバイオサイエンス社、品番  ＮＡ９３４Ａ）を用いた。検出はＥＣＬ  ｐｌｕｓ試薬（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、品番ＲＰＮ２１３２）を用いた。結果を図１１に示す。「Ｉｎｐｕｔ」は分画する前のＧＳＴ−ＶＤＲの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下に結合するタンパク質の還元型グルタチオン溶出液を示す。画分の番号は小さいものからグリセロール密度の低い部分の分画であり、画分の番号が大きい画分（下層）よりも小さい分子量のタンパク質複合体が分画される。ここで用いた２０〜５０％グリセロール密度勾配遠心法では予備検討の結果より第５画分付近に１５０ｋＤａ、第８画分付近に７６０ｋＤａのタンパク質が分画されることがわかっている。結果を図１１に示した。既知のリガンド依存的なＶＤＲ複合体であるＤＲＩＰ複合体のコンポーネントであるＴＲＡＰ１００は第１０画分から第２２画分まで検出されており少なくとも１ＭＤａ程度の複合体を形成していることが示唆される。実際ＤＲＩＰ複合体は１ＭＤａ程度の大きさの複合体を形成することが知られている。一方でＣＤＰは第４画分から第８画分まで検出されている。約１５０〜２００ｋＤａの分子量のタンパク質が分画されると予想できる第４、５画分に出現したＣＤＰは何も複合体を取っていないものと考えられるが、第６〜８画分に分画されるＣＤＰは約３００から７６０ｋＤａの複合体を形成していることを示唆している。また、ＶＤＲはいずれの画分にも検出できるためＣＤＰおよびＤＲＩＰ複合体に含まれていることがわかる。これらのことは、ＣＤＰとＶＤＲが形成する複合体は、ＤＲＩＰ複合体とは別個の新規なタンパク質複合体である���とを示している。
また、上記グリセロール密度勾配遠心法に供する前の、ＧＳＴ−ＶＤＲレジンに結合したリガンド存在下でＶＤＲに結合しているタンパク質複合体の還元型グルタチオン溶出液４００マイクロリットルに、抗ＣＤＰヤギＩｇＧ（Ｃ−２０）（ＳａｎｔａｃｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製、品番  ｓｃ−６３２７）を加えて２時間、４℃条件下に混合し、ＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ（以下ＰｒｏｔｅｉｎＧレジン）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、品番１７−０６１８−０１）を添加し、さらに２時間、４℃条件下に混和した。その後、ＰｒｏｔｅｉｎＧレジンを遠心により集め、フロースルーを回収した。ＰｒｏｔｅｉｎＧレジンは４回バッファーＤで洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファを加えてＰｒｏｔｅｉｎＧレジンに結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングに供した。ＣＤＰに結合していないタンパク質であるフロースルーにもＳＤＳサンプルバッファを加えてウェスタンブロッティングに供した。結果を図１２に示した。図中レーン１の「Ｉｎｐｕｔ」は、抗ＣＤＰ抗体を加える前の、ＧＳＴ−ＶＤＲと１，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下に結合するタンパク質の還元型グルタチオン溶出液サンプルを示す。レーン２では抗ＣＤＰ抗体により免疫沈降したタンパク質が泳動されており、ＣＤＰが検出されているが、ＴＲＡＰ１００は検出されない。一方でレーン３のフロースルー（ＦＴ）にはＣＤＰは検出されないが、ＴＲＡＰ１００は検出される。また、レーン１〜３を通してＶＤＲは検出される。これらのことから、ＣＤＰ−ＶＤＲ複合体は、ＴＲＡＰ１００が含まれる既知のＤＲＩＰ複合体とは別個の複合体であることが示された。
［実施例１２］ヒト骨膜由来細胞の骨芽細胞分化系におけるＣＤＰの作用
ＣＤＰを哺乳動物において過剰発現させるためのアデノウイルスをＡｄｅｎｏ−Ｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）］に従って作製した。あわせて、比較としてＣＤＰを発現しないアデノウイルスも作製した（Ａｄ−ｍｏｃｋ）。
ＳａＭ−１細胞はＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、品番１２５７１−０７１）、１０％牛胎仔血清、カナマイシン０．１ｍｇ／ｍＬ含有培地（増殖用培地）にて培養した。この細胞を２４ウェルのマルチウェルプレートに播種し培養した。細胞が８０％程度コンフルエントになった時点でウイルスを含む増殖用培地に交換し一晩培養して細胞をウイルスに感染させた後、ウイルスを含まない増殖用培地に交換した。ＣＤＰを過剰発現させるウイルスを感染させた場合を（Ａｄ−ＣＤＰ）、ＣＤＰを過剰発現させないウイルスを感染させた場合を、Ａｄ−ｍｏｃｋとして示した（図１３）。更に一晩培養した後、Ｖｅｈｉｃｌｅもしくは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−８〜−７Ｍ）を含む分化用の培地（増殖用培地に２ｍＭ  α‐Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（東京化成工業、品番Ｇ００９６）を含有する培地）に培地を交換し、２日おきに培地を交換しながら７日間培養した。７日目培養後にアルカリフォスファターゼ染色を行った。Ａｄ−ＣＤＰ群およびＡｄ−ｍｏｃｋ群はともに、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３刺激により青色に染色されたアルカリフォスファターゼ陽性細胞数が増加した。また、Ａｄ−ＣＤＰ群における、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３刺激によるアルカリフォスファターゼ陽性細胞数の増加は、より顕著であった。このことは、ＣＤＰの過剰発現により、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３刺激の作用が骨芽細胞分化過程においても亢進することを示唆している。
なお、ＳａＭ−１細胞に限らず、その他の骨芽細胞様細胞においても同様に本実施例を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明によって、骨芽細胞分化に関与するＶＤＲリガンドをスクリーニングするための新規な方法が提供される。例えば、これを用いて骨芽細胞選択的な活性の強い試験化合物を選択し、副作用である血中カルシウム上昇作用を軽減あるいは消失させ骨芽細胞選択的にＶＤＲリガンド作用を示す治療薬を早期に創製することを可能とする。
本発明によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、骨芽細胞分化に関与するＶＤＲリガンドをスクリーニングするための新規な方法が提供される。さらに、本発明のスクリーニング方法で得られる化合物は骨芽細胞での作用が顕著であることから、骨形成作用が強く、高カルシウム血症等の副作用が少ない化合物をスクリーニングするための新規な方法が提供される。
［配列表］
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【図５Ａ】
2008016155.tif 000004
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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2008016155.tif 000023
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