(57)【要約】生化学実験・臨床実験・薬剤の開発研究などで好適に使用できる細胞培養容器を提供する。細胞を培養する領域となる凹状区画（ウェル）を複数個備えた細胞培養容器本体１の該ウェルの底面に、親水性感光性組成物を塗布して塗膜３を形成した後、前記塗膜３をパターン露光及び現像して未硬化領域を除去することにより、前記ウェルの底面にパターン状の光硬化物からなる親水性被膜が設けられた細胞培養容器を得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養する領域となる凹状区画（ウェル）を複数個備えた細胞培養容器本体の該ウェルの底面に、親水性感光性組成物を塗布して塗膜を形成した後、前記塗膜をパターン露光及び現像して未硬化領域を除去することにより、前記ウェルの底面にパターン状の光硬化物からなる親水性被膜が設けられた細胞培養容器を得ることを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
【請求項２】
前記親水性感光性組成物が、水溶性高分子の主鎖と光架橋性の感光基とを有する感光性樹脂を含有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器の製造方法。
【請求項３】
前記パターン露光を行う際に、前記ウェル内に挿入される凸部を有すると共に該凸部の前記ウェルの底面に対向する先端部に所望のパターンを有するマスクを使用し、前記先端部を前記ウェルに装着し、前記先端部を前記塗膜に密着又は近接させた状態で露光することを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養容器の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学実験・臨床実験・薬剤の開発研究などで好適に使用できる細胞培養容器の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学実験・臨床実験・薬剤の開発研究の分野において、様々な細胞培養容器が使用されている。例えば、スライドガラスやカバーガラス、プラスチック性の平板上に、細胞接着抑制層を形成あるいは細胞接着抑制層をパターン状に形成する試みが多くなされている。ここで、平板状の基板上に、細胞接着抑制層として水溶性高分子を主体とした光感光性組成物のパターン状の光硬化物を形成した細胞培養容器が提案されている（特許文献１参照）。この技術によると、基板に感光性組成物をスピンコートで塗布するなど、平板基板を使用することで生産性が高く精度の高いパターンを容易に得ることができる。【０００３】
しかしながら、一般に平板上にパターンが構築された基板を生化学実験・臨床実験・薬剤の開発研究の分野等で細胞培養用に使用する場合には、その基板を培養用容器の一種であるディッシュの表面に接着した後ディッシュに細胞含有水溶液を入れる工程、又は、その基板を細胞含有水溶液の入っている培養用ディッシュに沈める工程が必要であり、前者は、接着する作業が煩雑なだけでなく使用した接着剤によってはそこから溶出してくる化合物が細胞に悪影響を与える傾向があるという問題がある。また、後者は、沈めた基板のパターン構築された表面だけでなく、裏面に細胞が回りこむという問題がある。【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２８００７６号公報（請求項９、段落番号［００９３］、［００９４］等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような事情に鑑み、生化学実験・臨床実験・薬剤の開発研究などで好適に使用できる細胞培養容器の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決する本発明の第１の態様は、細胞を培養する領域となる凹状区画（ウェル）を複数個備えた細胞培養容器本体の該ウェルの底面に、親水性感光性組成物を塗布して塗膜を形成した後、前記塗膜をパターン露光及び現像して未硬化領域を除去することにより、前記ウェルの底面にパターン状の光硬化物からなる親水性被膜が設けられた細胞培養容器を得ることを特徴とする細胞培養容器の製造方法にある。【０００７】
本発明の第２の態様は、前記親水性感光性組成物が、水溶性高分子の主鎖と光架橋性の感光基とを有する感光性樹脂を含有することを特徴とする第１の態様に記載の細胞培養容器の製造方法にある。【０００８】
本発明の第３の態様は、前記パターン露光を行う際に、前記ウェル内に挿入される凸部を有すると共に該凸部の前記ウェルの底面に対向する先端部に所望のパターンを有するマスクを使用し、前記先端部を前記ウェルに装着し、前記先端部を前記塗膜に密着又は近接させた状態で露光することを特徴とする第１又は２の態様に記載の細胞培養容器の製造方法にある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養容器の製造方法によれば、細胞を培養する領域となるウェルを複数個備え、このウェルの底面にパターン状の細胞接着抑制層が形成されている細胞培養容器を容易に製造することができ、この細胞培養容器は生化学実験・臨床実験・薬剤の開発研究などで好適に使用できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を示す図である。
【図２】本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を示す図である。
【図３】マスクの具体例を示す図である。
【図４】本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を示す図である。
【図５】本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を示す図である。
【図６】実施例１１で用いたマスクの概略を示す図である。
【図７】試験例の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００１１】
１  細胞培養容器本体
２  ウェル
３  塗膜
４  ホール
５  パターン
１０、２０  マスク
１１  マスク本体
１２  凸部
１３  先端部
１４  パターン
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。【００１３】
本発明の細胞培養容器の製造方法は、細胞を培養する領域となる凹状区画（ウェル）を複数個備えた細胞培養容器本体のウェルの底面に、親水性感光性組成物を塗布して塗膜を形成した後、この塗膜をパターン露光及び現像して未硬化領域を除去することにより、ウェルの底面にパターン状の光硬化物からなる親水性被膜が設けられた細胞培養容器を得るものである。【００１４】
細胞培養容器本体は複数のウェルを有するものであればよく、例えば、従来から広く使用されているウェルの個数が６個、１２個、４８個、９６個又は３８４個などのマルチウェルプレート、具体例としては、市販されているウェル（直径：７ｍｍ、深さ：約１２ｍｍ）９６個を備えたマルチウェルプレート（縦：７５ｍｍ、横：１１５ｍｍ）などを使用することができる。【００１５】
また、細胞培養容器本体の材質は特に限定されないが、培養中の細胞の挙動を観察するためには少なくともウェルの底面が無色透明又は無色透明に近いものであることが好ましい。この観点から、プラスチック、ガラスなどが好ましく、塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、アクリル系などのプラスチックが特に好ましい。なお、ウェルの底面に親水性被膜を形成する際に露光プロセスを使用しているので、ウェル側面からの光の散乱等を抑制する観点からは、ウェルの側面が着色している細胞培養容器本体が好ましい。【００１６】
さらに、本発明で使用する細胞培養容器本体は、表面が修飾されたものであってもよい。表面を修飾する方法は公知の方法でよく、例えば、表面のプラズマ処理による親水化処理ポリスチレンや、ポリ−Ｌ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンなどの生理活性物質コート処理プレートなどが挙げられる。【００１７】
細胞培養容器本体のウェルに塗布する親水性感光性組成物は、親水性感光性樹脂を含有することが好ましい。親水性感光性樹脂は、その光硬化物が細胞の接着を抑制することができる限り特に限定はないが、細胞の接着抑制能の発揮という観点から、主鎖骨格は水溶性高分子でこの水溶性高分子に光架橋性の感光基を側鎖として又は主鎖末端基として導入した感光性樹脂であることが好ましい。なお、低分子量の光架橋剤など、低分子量の感光性化合物を含有した親水性感光性組成物を使用すると、未反応の低分子量の感光性化合物が残存して後の細胞培養時に溶出し、自然な細胞挙動を阻害する要因になる可能性がある。しかしながら、この点を考慮し残存物の影響がない細胞培養系、あるいは残存物の残存をゼロにできる管理が可能であれば、低分子量の感光性化合物を使用することもできる。【００１８】
親水性感光性樹脂の主鎖骨格となる水溶性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールが挙げられる。また、水溶性高分子に導入される光架橋性の感光基は、アジド基を有することが好ましい。アジド基を有する感光基としては、アジド安息香酸などが挙げられ、これらを例えばポリエチレングリコールの両末端に導入したものを、親水性感光性樹脂として使用することができる。また、水溶性高分子に導入される光架橋性の感光基としては、水溶性高分子への導入の容易さなどから、下記式（１）で示される感光基が好ましい。【００１９】
【化１】
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【００２０】
（Ｒ１は下記式（２）から選択される基、Ｒ２は下記式（３）から選択される基であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は少なくとも１個のアジド基を有する。Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アセタール基を有するアルキル基、アリール基、アラルキル基、又は塩基性窒素を含有する置換基であり、好ましくは、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、アセタール基を有するアルキル基、アリール基、アラルキル基、又は塩基性窒素を含有する置換基である。）【００２１】
【化２】
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【００２２】
【化３】
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【００２３】
上記式（１）の具体例としては、下記表１に示す構造（１）−１〜（１）−１５を挙げることができる。これらの構造は、上記式（１）において置換基Ｒ１〜Ｒ３に表１に示される置換基を有する。例えば、構造（１）−１〜（１）−４はＲ２としてアジド基を有し、（１）−５はＲ１及びＲ２共にアジド基を有する。特に、Ｒ１が下記式（４）で、Ｒ２が下記式（５）であることが好ましい。【００２４】
【化４】
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【００２５】
【表１】
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【００２６】
このような親水性感光性樹脂を製造する方法は特に限定されず公知の方法で製造すればよい。例えば、上記式（１）で表される感光基を水溶性高分子に導入した親水性感光性樹脂を製造する方法としては、アミノ基を側鎖、あるいは末端に有する水溶性高分子と、このアミノ基と結合して当該アミノ基と共に上記式（１）の構造を形成する化合物とを反応させればよい。あるいはアセタール基とアミノ基とを共に有する化合物のアミノ基と結合して当該アミノ基と共に上記式（１）の構造を形成する化合物を反応させた後、残るアセタール基とヒドロキシ基を有する高分子を反応させてもよい。【００２７】
アミノ基を有する水溶性高分子あるいはアセタール化合物と結合してそのアミノ基と共に上記式（１）の構造を形成する化合物としては、例えば、４−（（４−アジドフェニル）メチレン）−２−フェニル−１，３−オキザゾリン−５−オン（光官能性化合物１）、４−（（４−アジドフェニル）メチレン−２−（３−ピリジル）−１，３−オキザゾリン−５−オン）（光官能性化合物２）、２−（４−アジドフェニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキザゾリン−５−オン（光官能性化合物３）、２−（２−（４−アジドフェニル）ビニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキサゾリン−５−オン（光官能性化合物４）、４−（４−アジド−β−メチル−シンナミリデン）−２−フェニル−２−オキザゾリン−５−オン（光官能性化合物５）、４−（４−アジド−β−メチル−シンナミリデン）−２−（３−ピリジル）−２−オキザゾリン−５−オン（光官能性化合物６）など、公知文献（特開２００３−２９２４７７号）に記載される感光基ユニットが挙げられる。なお、この光官能性化合物は、前記公知文献に記載される方法で製造することができる。【００２８】
親水性感光性組成物は、通常、上記親水性感光性樹脂を溶媒に溶解させた溶液である。溶媒は、親水性感光性樹脂を溶解でき、細胞培養容器本体に障害を与えない限り特に限定されないが、水、水と相溶性のある有機溶媒、又はそれらの混合物が好ましい。水と相溶性のある有機溶媒としては、例えば、エタノールなどのアルコール類、ジメチルスルフォキシドなどが挙げられる。これらの中で水が特に好ましい。有機溶媒を使用した場合には、細胞培養容器本体に悪影響を及ぼしたり、光硬化後の残存溶媒が細胞に悪影響を及ぼす場合があるためである。【００２９】
親水性感光性組成物は、光硬化物を形成することを阻害しない範囲で添加物を含有していてもよい。添加物としては、例えば感光性組成物のｐＨを調整するための酸として、鉱酸、有機酸などを、塩基として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水溶液などを挙げることができる。また、塩強度を調整するための塩化ナトリウムなどの塩や、ｐＨを安定化させるためのリン酸緩衝液などの緩衝液、消泡剤なども添加することができる。【００３０】
この親水性感光性組成物を露光すると、光架橋反応が起こり親水性の光硬化物となる。本発明においては、ウェルの底面に親水性感光性組成物を塗布して塗膜を形成した後、この塗膜をパターン露光及び現像することにより、未硬化領域である未露光領域を除去する。これにより、ウェルの底面にパターン状の光硬化物からなる親水性被膜が設けられた細胞培養容器を得ることができる。【００３１】
細胞培養容器本体のウェルの底面に親水性感光性組成物を塗布する方法は、ウェルの底面に実質的に均一に塗布することができる方法である限り特に限定されない。例えば、所定量ピペット操作による分注により、あるいは定容量ディスペンサーを使用して行うことが好ましい。また、感光性組成物を塗布する量はウェルの容量により適宜決めればよいが、細胞培養容器本体として例えば直径が７ｍｍ、深さが１２ｍｍ程度のウェルを９６個備えた市販の９６穴マルチウェルプレートに塗布する場合、塗布量は５〜２００μＬが好ましく、５〜５０μＬが特に好ましい。親水性感光性組成物の塗膜の厚さは均一であることが好ましく、塗膜の厚さは、５ｎｍ〜１０μｍ程度が好ましい。膜厚が５ｎｍ未満では、均一に膜形成されているかを確認することが容易ではなく、また、膜厚が１０μｍを超えるものを作成する場合は、感光性組成物の溶液の粘度を高くすることが必要となり、塗布工程上の問題が発生しやすくなるためである。【００３２】
なお、感光性組成物を塗布して塗膜を形成した後、露光を行う前に、必要に応じて加熱処理を行ってもよい。加熱処理条件は、細胞培養容器や親水性感光性組成物に悪影響を及ぼさない条件である限り特に限定されないが、通常は４〜７０℃で１分〜２４時間程度、好ましくは２０〜４０℃で５分〜１時間程度である。【００３３】
この親水性感光性組成物の塗膜のパターン露光は、従来公知のパターン露光手段で行えばよく、通常は、所望のパターンを有するマスクを使用する。所望のパターン状の光硬化物を構築させるためのマスクとして、所望の光硬化物のパターンに対応する領域が露光する光を透過し、その領域以外の領域が露光する光を透過しないマスクを使用することが好ましい。例えば、露光する光を透過する材質、例えば、ガラス、石英、ポリメチルメタクリレートなどからなるマスク本体に、エマルジョンマスクやクロムをパターン形状に蒸着させたクロムマスクを使用することができる。【００３４】
パターンを有するマスクの大きさは、ウェルの底面の面積より小さくてもよく、この場合、塗膜上に各々独立に配置することになる。また、ウェルの底面の面積より大きく、ウェル内に挿入される凸部を有すると共にこの凸部のウェルの底面に対向する先端部に所望のパターンを有するマスクを使用してもよく、この場合、マスクの先端部を各ウェルに装着し、この先端部を塗膜に密着又は近接するように配置する。ウェル底面の面積より大きいマスクを使用する方が、生産性がよいため好ましい。【００３５】
このようなマスクを使用して塗膜をパターン露光する際には、マスクを塗膜に密着させて配置する、マスクを塗膜の上に塗膜に対し不活性な液体層を介して近接配置する、又は、マスクを塗膜の上に気体層を介して近接配置することが好ましい。マスクを塗膜に密着又は近接させると、露光する光の干渉が抑制されるため、パターン露光を所望の特定領域に限定して行うことができ、現像後に特に優れたパターン状の親水性硬化被膜を形成することができるためである。このようにマスクを配置した場合、マスクの塗膜とは反対側から露光を行う。また、塗膜が形成された細胞培養容器本体が透明の場合には、細胞培養容器本体の塗膜の設けられている側とは反対側の面に、パターンを有するマスクを密着又は近接させて配置し、そのマスク側から露光を行うようにしてもよい。なお、マスクを塗膜に密着又は近接させる際のマスクの配置方法は、マスクや塗膜を傷つけない限り特に限定されない。【００３６】
塗膜をパターン露光する際の光源は、親水性感光性組成物を感光させることが可能な光源であれば特に限定されない。例えば、光源としてＸ線、電子線、エキシマレーザー（Ｆ２、ＡｒＦ、ＫｒＦレーザーなど）及び固体紫外線レーザーをそれぞれ発生させる光源、メタルハライドランプ、キセノンランプ、又は高圧水銀灯を使用することができる。露光エネルギーは感光性の官能基の構造、使用する光源のエネルギーに応じて適宜設定すればよく、通常０．１ｍＪ／ｃｍ２〜５０００ｍＪ／ｃｍ２であり、特に１ｍＪ／ｃｍ２〜１０００ｍＪ／ｃｍ２程度が好ましい。【００３７】
なお、必要に応じて露光後加熱処理を行ってもよい。この加熱処理の条件は、感光性組成物を塗布した後露光する前に適宜行う加熱処理の条件と同様でよい。【００３８】
現像液を使用し現像により未硬化領域を除去してパターン状の光硬化物を形成する方法は、未硬化領域の塗膜を溶解することができる方法であれば特に限定されない。好適な方法としては、露光後の細胞培養容器本体ごとを現像液に浸漬する方法、細胞培養容器本体に現像液を塗付もしくはスプレーする方法などを挙げることができる。例えば露光後の細胞培養容器を現像液に浸漬する方法では、現像液槽に１分間浸漬することで良好なパターン状の光硬化物を得ることができる。現像によりパターン状の光硬化物を形成した後に、必要に応じてリンスを行ってもよい。【００３９】
現像する際の現像液については、未硬化領域と硬化領域との溶解度差を十分に有しており、細胞培養容器に変性などの悪影響を与えない限り特に限定されない。感光性組成物塗膜の未硬化領域を溶解できる溶媒としては、水や、水と相溶性のある有機溶媒、あるいはその混合溶液等を使用することができる。水と相溶性のある有機溶媒の非限定的な例として、エタノールなどのアルコール類、ジメチルスルフォキシド等などが挙げられる。これらの中で水が特に好ましい。親水性感光性組成物の溶媒と同様に、有機溶媒の残存による細胞への影響が無いからである。これらの溶媒を使用すると、現像残りの無いパターンを作製することができる。また、現像液は上述したように混合溶液としてもよく、その濃度は未硬化領域を溶解することができる限り特に限定的ではないが、例えば、現像液が水とエタノールとの混合溶液であれば、エタノールの含有割合が０重量％より大きく１００重量％未満の任意の値をとることができる。【００４０】
現像後乾燥する工程は、現像液を除去することができる限り特に限定されないが、恒温乾燥機、ホットプレート、エアドライヤーなどを使用することができる。恒温乾燥機を使用して一定温度で乾燥することが好ましい。乾燥の条件は、通常は３０〜７０℃で１分〜２４時間程度、好ましくは３０〜４０℃で３分〜１時間程度である。【００４１】
このように簡単な方法で、ウェルの底面にパターン状の光硬化物からなる親水性被膜が設けられた細胞培養容器を製造することができる。なお、本発明の製造方法で製造される細胞培養容器はそのまま生化学実験・臨床実験・薬剤の開発研究の細胞培養容器として使用することができ、一般に平板上にパターンが構築された基板を細胞培養用に使用する場合に必要な、基板を培養用容器の一種であるディッシュの表面に接着した後ディッシュに細胞含有水溶液を入れる工程や基板を細胞含有水溶液の入っている培養用ディッシュに沈める工程が不要である。従って、接着剤から溶出してくる化合物が細胞に悪影響を与えるという問題や、沈めた基板のパターン構築された面の裏面に細胞が回りこむという問題も生じない。【００４２】
ウェルの底面に形成されたこの親水性被膜は乾燥状態、溶液中の何れの環境下でも、安定にその構造を維持できる。乾燥状態、加湿状態においても十分にその構造を維持することが可能であるのみならず、３７℃程度の水中又は水系溶媒中下においても、長期間、例えば１日以上、さらに１０日以上安定にその構造を維持する。溶液下、特に水又は水と相溶性のある有機溶媒中下で安定に存在できることは重要であり、特に細胞培養容器の各ウェルの底面は乾燥状態や水溶液、さらには有機溶媒溶液にさらされることがあり、そのどれにも耐性を有していることが求められるからである。ここで水系溶媒とは、水を含有している溶液であれば特に限定されない。水系溶媒としては、例えば、エタノールなどのアルコール類、ジメチルスルフォキシドなど水と相溶する有機溶媒と水との混合物、リン酸ニ水素カリウム・リン酸水素ニナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム・炭酸ナトリウム水溶液などの緩衝液、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウムなどの無機・有機塩水溶液、グルコース、ガラクトース、ブドウ糖、澱粉、ヘパリン、ヘパラン硫酸などの、単糖、多糖を含む糖類水溶液、タンパク質水溶液、ＤＮＡ、ＲＮＡ水溶液、液体培地、さらにはそれらの混合物を挙げることができる。また水中又は水系溶媒中に溶解せず分散するものを含んでいてもよく、例えば、クレイなどの鉱物類、金ナノ粒子などの金属微粒子、ポリスチレンビーズ、ラテックス粒子などの高分子微粒子、動物細胞、植物細胞、微生物、ウイルスなどや、これらの混合物を挙げることができる。また、本発明で製造される細胞培養容器を使用することができる温度は、細胞培養容器が変質・変形等悪影響を受けない限り特に限定されないが、通常は、−８０℃〜７０℃が好ましく、特に好ましくは２０〜４０℃である。７０℃を超えると感光性樹脂の感光基などが分解され光硬化物が安定に存在し得なくなる可能性があるからである。【００４３】
本発明の製造方法で得られる細胞培養容器は、ウェルの底面に、親水性被膜が設けられた領域、すなわち細胞非接着性の領域と、細胞培養容器のウェルの底面が露出している領域、すなわち細胞接着性の領域とが設けられているため、細胞をパターン状に培養する用途など新しい培養系に使用するのに好適である。具体的には、細胞を懸濁させた液体培地を本発明で得られる細胞培養容器のウェルに入れると、ウェルの底面におけるパターン状の親水性被膜以外の領域に細胞を付着させることができる。そのため、ウェルの底面にてパターン状に細胞を培養することができる。なお、親水性被膜のパターンの形状は、マスクの設計により、容易にホール、ドットあるいはストライプなど所望の形状とすることができる。また、本発明の細胞培養容器はウェルを複数備えているので、必要に応じて、ウェル間で互いに異なっている細胞を培養することが可能であり、細胞培養に関係した各種の評価・研究開発を行う上で、好都合である。さらには、細胞培養に日常的に多く使用されているマルチウェルプレートの上にパターンを形成できることから、従来から多く導入されているマルチウェルプレート用の機器、例えばイムノリーダーなどの蛍光測定機や多量のマルチウェルプレートを一度に処理できる自動培地交換機などが、そのまま使用できるという効果を奏する。【００４４】
以下、本発明にかかる細胞培養容器の製造方法の具体例を、図１〜５を使用して説明する。図１（ａ）は細胞培養容器本体の上面図、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ´矢視断面図、図２（ａ）はウェルの底面に親水性感光性組成物の塗膜を形成した細胞培養容器本体の上面図、図２（ｂ）は図２（ａ）のＡ−Ａ´矢視断面図、図３はマスクの断面図、図４はマスクを親水性感光性組成物の塗膜を形成した細胞培養容器本体に配置した状態を示す断面図、図５（ａ）は製造された細胞培養容器の上面図、図５（ｂ）は図５（ａ）のＡ−Ａ´矢視断面図である。【００４５】
図１に示すように、細胞培養容器本体１はウェル２を６個有する。この細胞培養容器本体１の各ウェル２の底面に、図２に示すように、水溶性感光性組成物を塗布して塗膜３を形成する。次に、図３に示すマスク１０を用いて塗膜３をパターン露光する。マスク本体１１は透明な材料で作成されており、図３に示すように、ウェル２内に挿入される円柱状の凸部１２を有すると共に、円柱状の凸部１２のウェル２の底面に対向する先端部１３、すなわち塗膜３が形成された面に対向する先端部１３に、クロム蒸着により形成され光を透過しないドットが１６個形成されたパターン１４を有する。図４に示すように、このマスク１０の先端部１３をウェル２に装着し、先端部１３を塗膜３に密着又は近接させた状態で、マスク１０の上部から露光することにより、塗膜３をパターン露光する。露光された領域は架橋して硬化するので、未露光領域を現像して除去することにより、図５に示すように、ウェル２の底面に親水性感光性組成物の光硬化体からなる被膜にドット状のホール４を有するパターン５（請求項の「パターン状の光硬化物」に相当する）が形成される。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明について実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（合成例１）感光性樹脂Ａの合成
ポリエチレングリコールジアミン（日本油脂（株）製、数平均分子量１０００）７．９ｇ、光官能性化合物４（２−（２−（４−アジドフェニル）ビニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキサゾリン−５−オン）を１０．０ｇ（ポリエチレングリコールジアミンのアミノ基に対して２．０倍モル当量）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）７０ｇを混合して、２５℃で１８時間反応させた。反応終了後、ＴＨＦをエバポレートして除去し、その後水５０ｇ、酢酸エチル５０ｇを添加して分液抽出操作を行った。有機層を捨て、新たに酢酸エチルを５０ｇ添加して再度分液抽出操作を行い、静置後三相に分かれた一番下相のオイル相を得た。このオイル相を凍結乾燥することにより、下記式（ａ）で表されｎ＝２３の感光性樹脂Ａ７．２ｇを得た。得られた感光性樹脂Ａを１Ｈ−ＮＭＲ測定したところ、３．５ｐｐｍに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、６．８ｐｐｍから８．７ｐｐｍに見られる光官能性化合物４に由来する芳香環のプロトンピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能性化合物４の導入率は９５％であった。【００４７】
【化５】
2007125894.tif 000008
【００４８】
（合成例２）感光性樹脂Ｂの合成
ポリエチレングリコールジアミン（日本油脂（株）製、数平均分子量２０００）７．９ｇ、光官能性化合物４（２−（２−（４−アジドフェニル）ビニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキサゾリン−５−オン）を６．０ｇ（ポリエチレングリコールジアミンのアミノ基に対して２．４倍モル当量）とした他は、合成例１と同様の操作を行い、分液抽出操作で水相を有機相で２回洗浄した後、水相を凍結乾燥することにより、上記式（ａ）で表されｎ＝４５の感光性樹脂Ｂを７．０ｇ得た。得られた感光性樹脂Ｂを１Ｈ−ＮＭＲ測定したところ、３．５ｐｐｍに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、６．８ｐｐｍから８．７ｐｐｍに見られる光官能性化合物４に由来する芳香環のプロトンピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能性化合物４の導入率は９６％であった。【００４９】
（合成例３）感光性樹脂Ｃの合成
ポリエチレングリコールジプロピルアミン（和光純薬工業（株）製、数平均分子量９，０００〜１０，０００）２３．７ｇ、光官能性化合物４（２−（２−（４−アジドフェニル）ビニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキサゾリン−５−オン）を４．０ｇ（ポリエチレングリコールジプロピルアミンのアミノ基に対して２．４倍モル当量）、テトラヒドロフラン６５ｇ、アセトニトリル６５ｇを混合した他は、合成例１と同様の操作を行い、下記式（ｂ）で表されｎ＝２１６の感光性樹脂Ｃを２３．２ｇ得た。得られた感光性樹脂Ｃを１Ｈ−ＮＭＲ測定したところ、３．５ｐｐｍに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、６．８ｐｐｍから８．７ｐｐｍに見られる光官能性化合物４に由来する芳香環のプロトンピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能性化合物４の導入率は９０％であった。【００５０】
【化６】
2007125894.tif 000009
【００５１】
（合成例４）感光性樹脂Ｄの合成
ポリエチレングリコールジアミン（日本油脂（株）製、数平均分子量２０００）１７．２ｇ、光官能性化合物３（２−（４−アジドフェニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキザゾリン−５−オン）を６．０ｇ（ポリエチレングリコールジアミンのアミノ基に対して１．２倍モル当量）とした他は、合成例１と同様の操作を行い、下記式（ｃ）で表されｎ＝４５の感光性樹脂Ｄを１９．７ｇ得た。得られた感光性樹脂Ｄを１Ｈ−ＮＭＲ測定したところ、３．５ｐｐｍに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、６．８ｐｐｍから８．７ｐｐｍに見られる光官能性化合物３に由来する芳香環のプロトンピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能性化合物３の導入率は７０％であった。【００５２】
【化７】
2007125894.tif 000010
【００５３】
（合成例５）感光性樹脂Ｅの合成
ポリエチレングリコールジアミン（日本油脂（株）製、分子量２０００）１５．１ｇ、光官能性化合物６（４−（４−アジド−β−メチル−シンナミリデン）−２−（３−ピリジル）−２−オキザゾリン−５−オン）を６．０ｇ（ポリエチレングリコールジアミンのアミノ基に対して１．２倍モル当量）とした他は、合成例１と同様の操作を行い、下記式（ｄ）で表されｎ＝４５の感光性樹脂Ｅを１８．４ｇ得た。得られた感光性樹脂Ｅを１Ｈ−ＮＭＲ測定したところ、３．５ｐｐｍに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、６．８ｐｐｍから８．７ｐｐｍに見られる光官能性化合物６に由来する芳香環のプロトンピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比より光官能性化合物６の導入率は７１％であった。【００５４】
【化８】
2007125894.tif 000011
【００５５】
（合成例６）感光性樹脂Ｆの合成
ポリビニルアルコール（ＥＧ−３０、日本合成化学工業（株）製）５０ｇを水４５０ｇに溶解し、これに、特開２００３−２９２４７７号公報の合成例５に従い合成した光官能性化合物（２−（３−（４−アジドフェニル）プロプ−２−エノイルアミノ）−Ｎ−（４，４’−ジメトキシブチル）−３−（３−ピリジル）プロプ−２−エンアミド）を３．５ｇ、燐酸１．５ｇを加え、６０℃で２４時間反応した。アセタール化は９７％であった。燐酸をイオン交換処理により除去し、感光基がＰＶＡのヒドロキシ基に対し０．８ｍｏｌ％導入された感光性樹脂Ｆを調製した。【００５６】
（合成例７）感光性樹脂Ｇの合成
ポリビニルアルコール（ＥＧ−３０、日本合成化学工業（株）製）１００ｇを水７００ｇ、メタノール２００ｇに溶解し、これに、特開２００３−２９２４７７号公報の合成例１に従い合成した光官能性化合物（３−（４―アジドフェニル）―Ｎ−（４，４’−ジメトキシブチル）―２−フェニルカルボニルアミノプロパ−２−エンアミド）を１０ｇ、燐酸３ｇを加え、６０℃で２４時間反応した。アセタール化は９７％であった。燐酸をイオン交換処理により除去し、感光基がＰＶＡのヒドロキシ基に対し０．８ｍｏｌ％導入された感光性樹脂Ｇを調製した。【００５７】
（合成例８）感光性樹脂Ｈの合成
ポリビニルアルコール（ＥＧ−３０、日本合成化学工業（株）製）１００ｇを水９００ｇに溶解し、これに、特開２００３−２９２４７７号公報の合成例３に従い合成した光官能性化合物（３−（４−アジドフェニル）−Ｎ−（４，４’−ジメトキシブチル）−２−[（３−ピリジル）カルボニルアミノ]−プロパ−２−エンアミド）を１０ｇ、燐酸３ｇを加え、６０℃で２４時間反応した。アセタール化は９７％であった。燐酸をイオン交換処理により除去し、感光基がＰＶＡのヒドロキシ基に対し０．８ｍｏｌ％導入された感光性樹脂Ｈを調製した。【００５８】
（合成例９）感光性樹脂Ｉの合成  
下記式（ｅ）の各繰り返し単位を有し、主鎖の両末端がヒドロキシル基であるアミノ基導入ポリエチレングリコール（日本油脂（株）製、分子量３２００、平均の繰り返し単位数ｘ＝３．１、ｙ＝６０．０）０．５ｇ、前述の光官能性化合物４（２−（２−（４−アジドフェニル）ビニル）−４−（３−ピリジルメチレン）−１，３−オキサゾリン−５−オン）を０．２ｇ（ポリエチレングリコール誘導体のアミノ基に対して１．５倍モル当量）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）７ｇを混合して、２５℃で１９時間反応させた。反応終了後、ＴＨＦを減圧下で除去し、その後水７ｇ、酢酸エチル７ｇを添加して分液抽出操作を行った。有機層を捨て、新たに酢酸エチルを７ｇ添加して再度分液抽出操作を行い、静置後水相を分離した。この水相を凍結乾燥することにより、下記式（ｆ）の各繰り返し単位を有し、主鎖の両末端がヒドロキシル基で、それぞれ平均の繰返し単位数はｍ＝３．０、ｎ＝６０．０、ｐ＝０．１の感光性樹脂Ｉを０．６ｇ得た。得られた感光性樹脂Ｉを1Ｈ−ＮＭＲ測定したところ、３．５ｐｐｍに見られるポリエチレンオキサイドのメチレン鎖のプロトンピークと、６．８ｐｐｍから８．７ｐｐｍに見られる光官能性化合物４に由来する芳香環のプロトンピークにより目的の化合物と確認した。またこれらのピークの積分比よりｍ／（ｍ＋ｎ）は０．０４８であった。【００５９】
【化９】
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【００６０】
【化１０】
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【００６１】
（感光性組成物Ｉの調製）
合成例１で得られた感光性樹脂Ａを、塩酸でｐＨ３に調製した水に対して固形分総重量が表２になるように混合した。得られた水溶液を０．４５μｍセルロースアセテートメンブレンフィルター（以下「フィルター」という）でろ過することにより、感光性組成物Ｉ−１を得た。【００６２】
（感光性組成物II(II−１〜II−４)〜IXの調製）
使用した感光性樹脂及び固形分総重量を表２又は表３に従い、ｐＨ３に調整した水の代わりに純水を用いた以外は感光性組成物Ｉの調製と同様にして、感光性組成物II〜IXを得た。【００６３】
（実施例１）
汎用マルチウェルプレートの基材として、ポリスチレン製９６穴マルチウェルプレート平底タイプ（住友ベークライト（株）社製：商標「スミロンマルチプレート９６Ｆ」、０．３２ｃｍ２／ウェル以下「ノンコート樹脂プレート」という。）を使用した。調製した感光性組成物Ｉ−１を、塗布量がそれぞれ１０μＬとなるように各ウェル内にピペットで分注して、ウェル内に存在させた。その後、６０℃に設定した恒温乾燥機内に静置して、３０分間放置し、各ウェル内に感光性組成物Ｉ−１の塗膜を得た。【００６４】
得られた各ウェル内の塗膜上に、４ｍｍ□（縦４ｍｍ×横４ｍｍ）内に１５０μｍφドットパターン（ドット数は１６９。各ドットはクロム蒸着により形成されたもの。）が施されたマスク（材質：石英）を、吸着ピンセットを使用することにより設置し、高圧水銀灯によってマスクを介して露光（１０００ｍＪ／ｃｍ２）を行った。その露光処理により、塗膜のうち露光された部分だけが光硬化した。その後水浴中にマルチウェルプレートを浸漬し、２５℃、１分間現像を行った後、６０℃で１０分間乾燥を行い、９６穴マルチウェルプレートの各ウェルの底面上に、前記ドットパターンに対応したドット状ホールの群を有する感光性組成物Ｉ-１の光硬化物が設けられた細胞培養容器を得た。なお、感光性組成物の塗布量を５０μＬ及び１００μＬにしたものについても同様の操作を行い、それぞれ細胞培養容器を得た。【００６５】
（実施例２〜９）
使用した感光性樹脂、ウェル内に存在させる各塗布量及び露光量を表２又は表３に従った以外は、実施例１と同様の操作を行い、９６穴マルチウェルプレートの各ウェルの底面上に、前記ドットパターンに対応したドット状ホールの群を有する感光性組成物の光硬化物が設けられた細胞培養容器を得た。なお、感光性組成物II−１〜II−４及びVI−１〜VI−４については、乾燥条件を、６０℃１時間、６０℃１５時間、３７℃３０分及び３７℃１時間としたものについても行った。また、感光性組成物II−１〜II−４及びVI−１〜VI−４については、汎用ウェルプレートの基材として、コラーゲンＩ型がコーティングされているポリスチレン製コラーゲンＩ型コーティング９６ウェルプレート平底タイプ（住友ベークライト（株）社製：商標「スミロンセルタイト  Ｃ−１プレート９６Ｆ」０．３２ｃｍ２／ウェル。以下「コラーゲンコートプレート」という。）、ガラス製９６ウェルプレート平底タイプ（日本板硝子（株）製。以下「ノンコートガラスプレート」という。）、及び、表面にアミノ基を有するアミノシランコート付ポリスチレン製９６ウェルプレート平底タイプ（住友ベークライト（株）製：商標「スミロンセルタイトＰＬプレート９６Ｆ」０．３２ｃｍ２／ウェル。以下「ＡＰＳコート樹脂プレート」という。）を使用してそれぞれ上記乾燥条件及び表３の条件下でも行った。【００６６】
【表２】
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【００６７】
【表３】
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【００６８】
（実施例１０）
汎用マルチウェルプレートの基材として、ポリスチレン製１２穴マルチウェルプレート平底タイプ（住友ベークライト（株）社製：商標「スミロンマルチプレート１２Ｆ」、３．６ｃｍ２／ウェル）を使用した。実施例２で調製した、感光性組成物II−１を各ウェル内に分注して、１００μＬ塗布量を各ウェル内に存在させた。その後、６０℃に設定した恒温乾燥機内に静置して、３０分間放置し、各ウェル内に感光性組成物II−１の塗膜を得た。【００６９】
得られた各ウェル内の塗膜上に、１０ｍｍ□（縦１０ｍｍ×横１０ｍｍ）内に１５０μｍφドットパターン（ドット数９００。各ドットはクロム蒸着により形成されたもの。）が施されたマスク（材質：石英）を、吸着ピンセットを使用することにより設置し、高圧水銀灯によってマスクを介して露光（１０００ｍＪ／ｃｍ２）を行った。その露光処理により、塗膜のうち露光された部分だけが光硬化した。その後水浴中にマルチウェルプレートを浸漬し、２５℃、１分間現像を行った後、６０℃で１０分間乾燥を行い、９６穴マルチウェルプレートの各ウェルの底面上に、前記ドットパターンに対応したドット状ホールの群を有する感光性組成物II-１の光硬化物が設けられた細胞培養容器を得た。【００７０】
（実施例１１）
４ｍｍ□内に１５０μｍφドットパターンが施されたマスクを用いる代わりに、図６に示すマスクを使用し、感光性組成物II-１〜II-４を使用した以外は、実施例１と同様の操作を行い、９６穴マルチウェルプレートの各ウェルの底面上に、ドットパターンに対応したドット状ホールの群を有する感光性組成物II-１〜II-４の光硬化物が設けられた細胞培養容器を得た。なお、図６（ａ）は、実施例１１で用いたマスクの上面図であり、図６（ｂ）は図６（ａ）の凸部の先端部の一部を拡大した図、図６（ｃ）は図６（ａ）のＡ−Ａ´矢視断面図である。図６に示すように、マスク２０は、１１５ｍｍ×７５ｍｍの平板基板（材質：石英）２１上に６ｍｍφで１１．６ｍｍの高さを有する円柱（材質：石英）２２が９６本マルチウェルプレートの各ウェルの配置に対応して構築されており、その円柱２２の先端部（頂部）２３に１００μｍφドット２４の群からなるパターン（ドット２４の数は１３５で、各ドット２４はクロム蒸着により形成されたもの。）が施されている。【００７１】
（実施例１２）
前記４ｍｍ□内に１５０μｍφドットパターンが施されたマスクを使用する代わりに、１１５ｍｍ×７５ｍｍの平板基板（材質：石英）上に１００μｍφドットパターン（ドット数１６９。各ドットはクロム蒸着により形成されたもの。）が施されたマスク（材質：石英）を使用し、９６穴マルチウェルプレート裏面に密着させ裏面から露光した以外は、実施例１と同様の操作を行い、９６穴マルチウェルプレートの各ウェルの底面上に、ドットパターンに対応したドット状ホールの群を有する感光性組成物II-１〜II-４の光硬化物が設けられた細胞培養容器を得た。【００７２】
（試験例）溶媒暴露試験
実施例１〜１２で得られた各細胞培養容器について、各ウェルに２５℃又は３７℃の水系溶媒を注入し、その後３日経過した時点及び２１日経過した時点において、各ウェルの底面上の親水性被膜を観察して、親水性被膜の形状、ウェル底面からの剥離の有無を調査した。なお、使用した水系溶媒は、純水又はリン酸ニ水素カリウム・リン酸水素ニナトリウム水溶液（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）である。例示として、リン酸緩衝液に２１日間浸漬した後の状態を図７（ａ）〜（ｄ）に示す。図７（ａ）はコラーゲンコートプレートに感光性組成物II−１を５μＬ塗布し乾燥条件を６０℃３０分としたもの、図７（ｂ）はコラーゲンコートプレートに感光性組成物II−１を５μＬ塗布し乾燥条件を３７℃３０分としたもの、図７（ｃ）はコラーゲンコートプレートに感光性組成物VI−１を１０μＬ塗布量し乾燥条件を６０℃３０分としたもの、図７（ｄ）はコラーゲンコートプレートに感光性組成物VI−１を１０μＬ塗布量し乾燥条件を６０℃１５時間としたものを、リン酸緩衝液に２１日間浸漬した後の状態である。【００７３】
各ウェルの底面上の親水性被膜は、浸漬前後で表面形状は変化が無く、また、膨潤による被膜の剥離、または崩壊が起こっておらず、形状・構造が安定な状態であった。このことから、本発明に係る製造方法により得られた細胞培養容器における各ウェルの底面上に設けられている親水性被膜は、短期から長期までの培養操作において、耐性がありその機能を維持できることを確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2007125894.tif 000024
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