(57)【要約】  グルコース量のより正確な測定を可能とする新規な酵素及びその生産菌、並びにその用途を提供する。(1)電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する作用を有し、(2)ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約１００ｋＤａ、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約４００ｋＤａであり、(3)マルトース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-マンノース及びＤ-ガラクトースに対する反応性が低いフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素が提供される。また、当該酵素を生産するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅが提供される。さらに、当該酵素を用いたグルコース測定法、グルコース測定用試薬、及びグルコース測定用キットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性状を備えるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(1)作用：  電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する、
(2)分子量：  ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約１００ｋＤａ、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約４００ｋＤａ、
(3)基質特異性：  マルトース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-マンノース及びＤ-ガラクトースに対する反応性が低い。
【請求項２】
Ｄ-グルコースに対する反応性を１００％としたときのマルトースに対する反応性が５％以下である、請求項１に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
【請求項３】
Ｄ-グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ-ガラクトースに対する反応性が５％以下である、請求項１又は２に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
【請求項４】
Ｄ-グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ-フルクトース及びＤ-マンノースに対する反応性がいずれも５％以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
【請求項５】
以下の性状を更に備える、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(4)至適ｐＨ：  ７付近、
(5)至適温度：  ６０℃付近、
(6)ｐＨ安定性：  ｐＨ３．０〜７．０の範囲で安定、
(7)温度安定性：  ４０℃以下で安定。
【請求項６】
以下の性状を更に備える、請求項１〜５のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(8)Ｋｍ値：  Ｄ-グルコースについてのＫｍ値が約８ｍＭ。
【請求項７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来する酵素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
【請求項８】
配列番号２０で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
【請求項９】
フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−２３６のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６。
【請求項１０】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのＤＮＡからなるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子：
（Ａ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１９で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１９で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の遺伝子が導入されている形質転換体。
【請求項１３】
以下のステップ（１）及び（２）、又はステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含んでなる、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法：
（１）請求項７に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅを培養するステップ；
（２）培養後の培養液及び／又は菌体より、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を回収するステップ；
（ｉ）請求項１２に記載の形質転換体を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（ｉｉ）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
【請求項１６】
請求項１５に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びその用途に関する。詳しくは、本発明はフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素、及び当該酵素の生産菌、当該酵素の製造法、当該酵素を使用したグルコース測定法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極、酵素反応層を形成したものである。ここで用いられる酵素としては、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）などが挙げられる。ＧＯを用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。【０００３】
一方、溶存酸素の影響を受けず且つＮＡＤ（Ｐ）非存在下でグルコースに作用する酵素としてピロロキノリン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）が知られている（例えば特許文献１〜３を参照）。しかしながらＰＱＱ−ＧＤＨには、（１）ＰＱＱが酵素から解離しやすいこと、（２）グルコースに対する選択性が低いこと、及び（３）一般に膜画分に存在していることからその抽出・単離操作に困難を伴うことなどの問題がある。【０００４】
ところで近年、病院で簡易血糖自己測定器を使用した患者において低血糖等を発症した例が報告された。その後の調査・分析の結果、ＰＱＱ−ＧＤＨが輸液成分として含まれるマルトースに反応し、実際の血糖値より高値を示したことが、このような発症例の原因であることが判明した（医薬品・医療用具等安全性情報206号（Pharmaceuticals and Medical Devices Safety Information No.206）、平成16年（2004年）10月、厚生労働省医薬食品局）。このような事情もあって、グルコースに特異的に作用し、特にマルトースへの作用性が低い血糖測定用酵素の開発が切望されている。
尚、ＰＱＱ−ＧＤＨの他、溶存酸素の影響を受けず且つＮＡＤ（Ｐ）非存在下でグルコースに作用する酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素（本明細書において「ＦＡＤ−ＧＤＨ」ともいう）が知られている。これまでに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（非特許文献１〜４）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ（特許文献４）からそれぞれＦＡＤ−ＧＤＨが取得されている。
【特許文献１】特開２０００−３５０５８８号公報
【特許文献２】特開２００１−１９７８８８号公報
【特許文献３】特開２００１−３４６５８７号公報
【特許文献４】国際公開第２００４／０５８９５８号パンフレット
【非特許文献１】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 139, 265-276 (1967).
【非特許文献２】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 139, 277-293 (1967).
【非特許文献３】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. General enzymatic properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967).
【非特許文献４】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 328-335 (1967).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記背景の下で本発明は、グルコース量のより正確な測定を可能とする新規な酵素及びその生産菌、並びにその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上の課題を解決するために本発明者らはまず、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）に注目した。そして、広く微生物を対象としてスクリーニングした結果、ＦＡＤ−ＧＤＨの生産性に優れた菌株を見出した。同定の結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリゼ）と判明した。また、当該菌株が生産するＦＡＤ−ＧＤＨを精製することに成功し、その諸性状を決定することにも成功した。決定された諸性状より、当該ＦＡＤ−ＧＤＨが新規な酵素であることが判明した。また、当該ＦＡＤ−ＧＤＨがグルコースに対する選択性に優れ、しかも反応系に存在する溶存酸素の影響を受けにくく、試料中のグルコース量のより正確な測定を可能にするものであることが示された。一方、当該ＦＡＤ−ＧＤＨと同等の酵素を他の菌株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）が生産することが確認された。
更に検討を進めた結果、上記菌株が保有するＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の配列を決定することに成功した。
本発明は以上の知見ないし成果に基づくものであり、以下に示すフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素などを提供する。
［１］以下の性状を備えるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(1)作用：  電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する、
(2)分子量：  ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約１００ｋＤａ、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約４００ｋＤａ、
(3)基質特異性：  マルトース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-マンノース及びＤ-ガラクトースに対する反応性が低い。
［２］Ｄ-グルコースに対する反応性を１００％としたときのマルトースに対する反応性が５％以下である、［１］に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
［３］Ｄ-グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ-ガラクトースに対する反応性が５％以下である、［１］又は［２］に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
［４］Ｄ-グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ-フルクトース及びＤ-マンノースに対する反応性がいずれも５％以下である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
［５］以下の性状を更に備える、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(4)至適ｐＨ：  ７付近、
(5)至適温度：  ６０℃付近、
(6)ｐＨ安定性：  ｐＨ３．０〜７．０の範囲で安定、
(7)温度安定性：  ４０℃以下で安定。
［６］以下の性状を更に備える、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(8)Ｋｍ値：  Ｄ-グルコースについてのＫｍ値が約８ｍＭ。
［７］Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来する酵素である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
［８］配列番号２０で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有することを特徴とする、［１］〜［７］のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
［９］フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−２３６のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６。
［１０］以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのＤＮＡからなるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子：
（Ａ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１９で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１９で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１１］［１０］に記載の遺伝子を含有するベクター。
［１２］［１０］に記載の遺伝子が導入されている形質転換体。
［１３］以下のステップ（１）及び（２）、又はステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含んでなる、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法：
（１）［７］に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅを培養するステップ；
（２）培養後の培養液及び／又は菌体より、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を回収するステップ；
（ｉ）［１２］に記載の形質転換体を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（ｉｉ）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
［１４］［１］〜［８］のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
［１５］［１］〜［８］のいずれか一項に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
［１６］［１５］に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。両端のレーンは、分子量マーカーで、上から順にホスホリラーゼｂ（９７ｋＤａ）、アルブミン（６６ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、トリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、α−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）。
【図２】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨのＨＰＬＣによる分子量の測定。（Ａ）分子量マーカー。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（２９０ｋＤａ、１１．５０８ｍｉｎ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（１４２ｋＤａ、１３．０１２ｍｉｎ）、エノラーゼ（６７ｋＤａ、１４．６４３ｍｉｎ）、ミオキナーゼ（３２ｋＤａ、１５．３２１ｍｉｎ）、シトクロームＣ（１２．４ｋＤａ、２０．３０３ｍｉｎ）（Ｂ）精製ＦＡＤ−ＧＤＨ。
【図３】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤ−ＧＤＨの分子量の比較。（Ａ）分子量マーカー。溶出が早い順にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ、２９０ｋＤａ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ、１４２ｋＤａ）、ミオキナーゼ（３２ｋＤａ）。（Ｂ），（Ｃ），（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ），（Ｇ），（Ｈ）は、それぞれＡ．ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６、ＩＡＭ２６０３、ＩＡＭ２６２８、ＩＡＭ２６８３、ＩＡＭ２７３６、ＩＡＭ２７０６及びＮＢＲＣ３０１１３由来の培養ろ液を試料とした。
【図４】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの４００−８００ｎｍにおける吸収スペクトル。
【図５】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの至適ｐＨ。
【図６】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの至適温度。
【図７】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨのｐＨ安定性。
【図８】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの温度安定性。
【図９】グリセロール密度勾配等電点電気泳動によるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの等電点の測定。
【図１０】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨのグルコースに対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔ。
【図１１】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの糖含量の測定。
【図１２】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨによるグルコース濃度の測定。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（用語）
本発明において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重も考慮される。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。本発明の酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）に関して使用する場合の「単離された」とは、本発明の酵素が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該酵素以外の成分を実質的に含まない（特に夾雑タンパク質を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。一方、本発明の酵素が遺伝子工学的手法によって調製されたものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素」と記載した場合は「単離された状態のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素」を意味する。フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の代わりに使用される用語「ＦＡＤ−ＧＤＨ」及び「酵素」についても同様である。
ＤＮＡについて使用する場合の「単離された」とは、もともと天然に存在しているＤＮＡの場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「ＤＮＡ」と記載した場合には単離された状態のＤＮＡを意味する。【０００９】
（ＦＡＤ−ＧＤＨ及びその生産菌）
本発明の第１の局面はフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）及びその生産菌を提供する。本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ（以下、「本酵素」ともいう）は以下の性状を備えることを特徴とする。まず、本酵素は次の反応、即ち、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。また、ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動による本酵素の分子量は約１００ｋＤａであり、ゲルろ過による本酵素の分子量は約４００ｋＤａである。尚、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは４量体からなる。
一方、本酵素は基質特異性に優れ、Ｄ-グルコースに対して選択的に作用する。詳しくは、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨはマルトースに対する反応性が極めて低く、Ｄ-フルクトースやＤ-マンノース、Ｄ-ガラクトースなどに対する反応性も非常に低い。具体的にはＤ-グルコースに対する反応性を１００％としたときの、これらの基質に対する反応性はいずれも５％以下である。本発明の好ましい態様ではマルトースに対する反応性は１％以下又は実質的に認められない。更に好ましい態様では、Ｄ-フルクトースに対する反応性及びＤ-ガラクトースに対する反応性のいずれについても１％以下又は実質的に認められない。以上のような優れた基質特異性を有する本酵素は、試料中のグルコース量を正確に測定するための酵素として好ましい。即ち、本酵素によれば試料中にマルトースやガラクトースなどの夾雑物が存在していた場合であっても目的のグルコース量をより正確に測定することが可能である。従って本酵素は、試料中にこのような夾雑物の存在が予想又は懸念される用途（典型的には血液中のグルコース量の測定）に適したものであるといえ、しかも当該用途も含め様々な用途に適用可能であること、即ち汎用性が高いともいえる。尚、本酵素の反応性及び基質特異性は、後述の実施例に示す方法（（１−２）の欄、（７−１）の欄、（７−２−２）の欄）で測定・評価することができる。【００１０】
本酵素は好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来するＦＡＤ−ＧＤＨである。ここでの「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来するＦＡＤ−ＧＤＨ」とは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産するＦＡＤ−ＧＤＨ、或いはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（野生株であっても変異株であってもよい）のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたＦＡＤ−ＧＤＨであることを意味する。従って、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅより取得したＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）を導入した宿主微生物によって生産された組み換え体も、「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来するＦＡＤ−ＧＤＨ」に該当する。【００１１】
本酵素がそれに由来することとなるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのことを、説明の便宜上、本酵素の生産菌という。本酵素の生産菌の例として、後述の実施例に示すＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２６０３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２６２８、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２６８３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２７３６、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２７０６、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＢＲＣ３０１１３を挙げることができる。この中でもＢＢ−５６株はＦＡＤ−ＧＤＨの生産性に優れ、特に好ましい生産菌である。ＢＢ−５６株は以下の通り所定の寄託機関に寄託されており、容易に入手可能である。
寄託機関：ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター（〒292-0818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）
寄託日（受領日）：２００６年５月１７日
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−２３６
尚、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２６０３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２６２８、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２６８３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２７３６、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２７０６はＩＡＭカルチャーコレクション（東京大学分子細胞生物学研究所  細胞機能情報研究センター）に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。同様にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＢＲＣ３０１１３はＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門）に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。【００１２】
本発明者らは、後述の実施例に示す通り、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６より、上記性状（作用、分子量、基質特異性）を備えるＦＡＤ−ＧＤＨを調製することに成功した。得られたＦＡＤ−ＧＤＨを詳細に検討した結果、以下の性状を更に備えることが明らかとなった。
(4)至適ｐＨ：  ７付近
(5)至適温度：  ６０℃付近
(6)ｐＨ安定性：  ｐＨ３．０〜７．０の範囲で安定
(7)温度安定性：  ４０℃以下で安定
(8)Ｋｍ値：  Ｄ-グルコースについてのＫｍ値が約８ｍＭ
(9)等電点：  ６．４付近
ここで、至適ｐＨについては後述の実施例に示すように例えばＭｃｌｌｖａｉｎｅバッファー中で測定した値であり、至適温度についても同様に例えばＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）中で測定した値である。また、特定のｐＨ条件の下、３７℃で３０分間処理したときに８０％以上の活性を維持したとき、当該ｐＨ条件において「安定」であるということができる。同様に、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中（例えばＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー、ｐＨ６．５）で２０分間処理した後に活性の実質的な低下が認められない（つまり約１００％の活性を維持する）とき、当該温度条件において「安定」であるということができる。Ｋｍ値及び等電点に関しては、後述の実施例に示す方法（８．の欄、６．の欄）で測定・評価することができる。【００１３】
以上のように、取得に成功した本酵素の性状の詳細が明らかとなった。その結果、本酵素がグルコースに対して選択的且つ高親和性であり、しかも安定性に優れ、グルコースセンサなどへの応用・実用化に適したものであることが判明した。
一方、本酵素の性状の詳細が明らかになった結果、過去に報告された補酵素結合型酵素と全く異なる酵素であることが確認された。
尚、上で例示した他の菌株、即ちＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２６０３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２６２８、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２６８３、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２７３６、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＡＭ２７０６、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＢＲＣ３０１１３についても、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６が生産するＦＡＤ−ＧＤＨと同等の性状を備えたＦＡＤ−ＧＤＨを生産することが確認された。【００１４】
本発明者らの更なる検討の結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６が保有するＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列が決定された。そこで、配列番号２０のアミノ酸配列を有するタンパク質からなるという特徴によって本酵素を更に特徴づけることができる。ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号２０で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有しＦＡＤ−ＧＤＨ活性をもつタンパク質（以下、「相同タンパク質」ともいう）を提供する。ここでの「相同なアミノ酸配列」とは、配列番号２０で示されるアミノ酸配列と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（ここではＦＡＤ−ＧＤＨ活性）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。
「アミノ酸配列の一部の相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違はＦＡＤ−ＧＤＨ活性が保持される限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち相同タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列と例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90％以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有する。【００１５】
好ましくは、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を生じさせることによって相同タンパク質を得る。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。【００１６】
ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。本発明のポリペプチド分子に相同的なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。【００１７】
上記アミノ酸配列を有する本酵素は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本酵素をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞（例えば大腸菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。【００１８】
（ＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡ）
本発明の第２の局面は本酵素をコードする遺伝子、即ち新規なＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を提供する。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる。当該態様の具体例は、配列番号１９で示される塩基配列からなるＤＮＡである。
ところで、一般に、あるタンパク質をコードするＤＮＡの一部に改変を施した場合において、改変後のＤＮＡがコードするタンパク質が、改変前のＤＮＡがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちＤＮＡ配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号１９で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「相同ＤＮＡ」ともいう）を提供する。ここでの「相同な塩基配列」とは、配列番号１９で示される核酸と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードするタンパク質の機能（ここではＦＡＤ−ＧＤＨ活性）が実質的な影響を受けていない塩基配列のことをいう。【００１９】
相同ＤＮＡの具体例は、配列番号１９で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。【００２０】
相同ＤＮＡの他の具体例として、配列番号１９で示される塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該ＤＮＡがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような相同ＤＮＡは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及び／又は逆位を含むように配列番号１９で示される塩基配列を有するＤＮＡを改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同ＤＮＡを得ることができる。
相同ＤＮＡの更に他の例として、ＳＮＰ（一塩基多型）に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるＤＮＡを挙げることができる。【００２１】
本発明の遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって単離された状態に調製することができる。具体的には、適当な糸状菌類、酵母菌類のゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリー、或は糸状菌類、酵母菌類の菌体内抽出液から、本発明の遺伝子に対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ・プライマーを適宜利用して調製することができる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーは、市販の自動化ＤＮＡ合成装置などを用いて容易に合成することができる。尚、本発明の遺伝子を調製するために用いるライブラリーの作製方法については、例えばMolecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる。
例えば、配列番号１９で示される塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばPCR）を利用して増幅及び単離することができる。【００２２】
（ベクター）
本発明のさらなる局面は本発明の遺伝子を含有するベクターに関する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるものではない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）の形態をとり得る。
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例を挙げれば、大腸菌を宿主とするベクター（M13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）など）、酵母を宿主とするベクター（pYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクター（pAc、pVLなど）、哺乳類細胞を宿主とするベクター（pCDM8、pMT2PCなど)等である。【００２３】
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。【００２４】
（形質転換体）
本発明は更に、本発明の遺伝子が導入された形質転換体に関する。本発明の形質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann, M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))、Hanahanの方法(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983))、酢酸リチウム法(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989))、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984))等によって実施することができる。
宿主細胞としては大腸菌などの細菌細胞、酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris）、糸状菌細胞（例えば、Aspergillus oryzae, Aspergillus niger）等を例示することができる。【００２５】
（ＦＡＤ−ＧＤＨの製造法）
本発明の更なる局面はＦＡＤ−ＧＤＨの製造法を提供する。本発明の製造法の一態様では、本酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）の生産能を有する微生物を培養するステップ（ステップ（１））及び培養後の培養液及び／又は菌体より、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を回収するステップ（ステップ（２））が行われる。
ステップ（１）に使用される微生物として例えば上記のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６等を使用することができる。培養法及び培養条件は、目的の酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、本酵素が生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。以下、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。【００２６】
培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のｐＨは例えば約３〜８、好ましくは約５〜７程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは３〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。【００２７】
以上の条件で培養した後、培養液又は菌体よりＦＡＤ−ＧＤＨを回収する（ステップ（２））。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。
他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
尚、各精製工程では原則としてＦＡＤ−ＧＤＨ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を既に設定可能な場合にはこの限りでない。【００２８】
本発明の他の態様では、上記の形質転換体を用いてＦＡＤ−ＧＤＨを製造する。この態様の製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する（ステップ（ｉ））。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質（即ち、ＦＡＤ−ＧＤＨ）を回収する（ステップ（ｉｉ））。回収及びその後の精製については、上記態様の場合と同様に行えばよい。【００２９】
本酵素の精製度は特に限定されないが、例えば比活性が５０〜１６０（Ｕ／ｍｇ）、好ましくは比活性が１００〜１６０（Ｕ／ｍｇ）の状態に精製することができる。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。【００３０】
（ＦＡＤ−ＧＤＨの用途）
本発明の更なる局面は本酵素の用途に関する。この局面ではまず、本酵素を用いたグルコース測定法が提供される。本発明のグルコース測定法では本酵素による酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。本発明は例えば血糖値の測定、食品（調味料や飲料など）中のグルコース濃度の測定などに利用される。また、発酵食品（例えば食酢）又は発酵飲料（例えばビールや酒）の製造工程において発酵度を調べるために本発明を利用してもよい。本酵素では補酵素であるＦＡＤが常にＧＤＨに結合していることから測定に際して補酵素の添加が不要であり、簡便な測定系を構築できる。
本発明はまた、本酵素を含むグルコース測定用試薬を提供する。当該試薬は上記の本発明のグルコース測定法に使用される。【００３１】
本発明は更に、本発明のグルコース測定法を実施するためのキット（グルコース測定用キット）を提供する。本発明のキットは、本酵素を含むグルコース測定用試薬の他、反応用試薬、緩衝液、グルコース標準液などを任意の要素として含む。また、本発明のグルコース測定キットには通常、使用説明書が添付される。
【実施例】
【００３２】
１．ＦＡＤ−ＧＤＨ生産菌のスクリーニング
（１−１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅの培養
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅの７菌株（ＢＢ−５６、ＩＡＭ２６０３、ＩＡＭ２６２８、ＩＡＭ２６８３、ＩＡＭ２７３６、ＩＡＭ２７０６、ＮＢＲＣ３０１１３）を以下の方法によって培養した。【００３３】
（１−１−１）前培養
酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）０．２％（ｗ/ｖ）、大豆ペプトン（ＤＭＶ社）１．０％（ｗ/ｖ）、グルコース（和光純薬工業株式会社）２．０％（ｗ/ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬工業株式会社）０．１％（ｗ/ｖ）、及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社）０．０５％（ｗ/ｖ）（ｐＨ５．７）の組成からなる培地５０ｍＬを３００ｍＬ容の三角フラスコに分注し、１２１℃、０．１２ＭＰａで２０分間殺菌した。冷却後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅの各種菌株をスラント５×５ｍｍ角で接種し、３０℃、２００ｒｐｍで３日間前培養を行った。【００３４】
（１−１−２）本培養
グルコース１５．０％（ｗ/ｖ）、Ｍｅａｓｔ  Ｐ１Ｇ（アサヒフードアンドヘルスケア株式会社）３．０％（ｗ/ｖ）、大豆ペプトン６．０％（ｗ/ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４０．３％（ｗ/ｖ）、Ｋ２ＨＰＯ４（和光純薬工業株式会社）０．２％（ｗ/ｖ）、及び４ｍＭ  Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ（和光純薬工業株式会社）（ｐＨ６．０）の組成からなる培地５０ｍＬを３００ｍＬ容の三角フラスコに分注し、１２１℃、０．１２ＭＰａで２０分間殺菌した。冷却後、上記前培養の培養液１ｍＬを接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４日間本培養を行った。培養終了後、培養液をＮｏ．２のろ紙（アドバンテック株式会社）でろ過し、各菌株の培養ろ液のＦＡＤ−ＧＤＨ活性の有無を確認した。【００３５】
（１−２）ＦＡＤ−ＧＤＨ活性の検出
ＦＡＤ−ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。ＦＡＤ−ＧＤＨ活性の検出は、下記の反応系で行った。
【数１】
2007139013.tif 000002
【００３６】
尚、式中のＰＭＳはＰｈｅｎａｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅを表し、ＮＴＢはＮｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ  ｂｌｕｅを表す。
反応（１）において、グルコースの酸化に伴って還元型ＰＭＳが生成し、更に反応（２）において還元型ＰＭＳによるＮＴＢの還元により生成したＤｉｆｏｒｍａｚａｎを５７０ｎｍの波長で測定する。
酵素活性（ユニット）は以下の計算式によって算出される。
【数２】
2007139013.tif 000003
尚、式中のＶｔは総液量を、Ｖｓはサンプル量を、２０．１はｄｉｆｏｒｍａｚａｎの０．５μｍｏｌｅあたりの吸光係数（ｃｍ２/０．５μｍｏｌｅ）を、１．０は光路長（ｃｍ）を、ｄｆは希釈倍数をそれぞれ表す。【００３７】
０．２２％（ｗ/ｖ）トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６．５  ２．５５ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液０．０９ｍＬ、３ｍＭ  ＰＭＳ溶液０．２ｍＬ、及び６．６ｍＭ  ＮＴＢ溶液０．１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、上記培養ろ液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行と共に５７０ｎｍに吸収を持つＤｉｆｏｒｍａｚａｎが生成される。１分間あたりの５７０ｎｍにおける吸光度の増加を測定することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定した。
その結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６、ＩＡＭ２６０３、ＩＡＭ２６２８、ＩＡＭ２６８３、ＩＡＭ２７３６、ＩＡＭ２７０６、ＮＢＲＣ３０１１３由来の培養ろ液中にＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出された（表1）。特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６及びＮＢＲＣ３０１１３の生産性が優れていた。
【表１】
2007139013.tif 000004
【００３８】
２．ＦＡＤ−ＧＤＨの生産、及び酵素の精製
（２−１）菌株の培養
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６を培養してＦＡＤ−ＧＤＨを生産させた。酵母エキス０．２％（ｗ/ｖ）、大豆ペプトン０．５％（ｗ/ｖ）、グルコース２．０％（ｗ/ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％（ｗ/ｖ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％（ｗ/ｖ）（ｐＨ５．７）の組成からなる前培養の培地を調製した。この液体培地５０ｍＬを３００ｍＬ三角フラスコに分注し、１２１℃、０．１２ＭＰａで２０分間殺菌後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで３日間培養した。
ＦＡＤ−ＧＤＨの生産は、以下の組成からなる本培養の培地で行った。グルコース１０．０％（ｗ/ｖ）、Ｍｅａｓｔ  Ｐ１Ｇ  ２．０％（ｗ/ｖ）、大豆ペプトン４．０％（ｗ/ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３％（ｗ/ｖ）、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．２％（ｗ/ｖ）、及び４ｍＭ  Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ（ｐＨ６．０）。この本培養の培地２０Ｌを３０Ｌジャー・ファーメンター中で１２１℃、０．１２ＭＰａ、２００ｒｐｍで２０分間殺菌後、３０℃に冷却した。上記前培養の培養液２００ｍＬを本培養の培地に接種し、３０℃、３５０ｒｐｍ、０．０５ＭＰａ、通気量０．７５ｖｖｍで４日間培養することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの生産を行った。【００３９】
（２−２）ＦＡＤ−ＧＤＨの精製
上記のようにして得られた３０Ｌジャー・ファーメンターの培養液１５．０Ｌをシリカ＃６００Ｓ（中央シリカ株式会社）を用いた珪藻土ろ過により培養液中の菌体及びその他の固形成分を除去した。該操作によって得られた清澄液１６．４Ｌを限外ろ過膜（ＡＣＰ−３０１３、１３，０００カット、旭化成株式会社、以下同様）で３．０Ｌに脱塩・濃縮した。該濃縮液を９０％飽和硫安で塩析処理し、遠心上清を限外ろ過膜により脱塩（１０mmol/L  ＭｃｌｌｖａｉｎｅバッファーｐＨ５．５）・濃縮を行い、ｐＨ５．５、電導度１．１０ｍＳ/ｃｍに調整した。該脱塩・濃縮液を１０mmol/L  ＭｃｌｌｖａｉｎｅバッファーｐＨ５．５で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（カラム容積１，０００ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライし、ＦＡＤ−ＧＤＨをカラムに吸着させた。１０mmol/L  ＭｃｌｌｖａｉｎｅバッファーｐＨ５．５でカラムを洗浄後、０．１mol/L  ＮａＣｌを含む１０mmol/L  ＭｃｌｌｖａｉｎｅバッファーｐＨ５．５でＦＡＤ−ＧＤＨを溶出させ、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性画分を回収した。回収した活性画分を限外ろ過膜で濃縮し、該濃縮液を２．５mol/L硫酸アンモニウムを含む１０mmol/L  Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５で平衡化したＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（カラム容積２００ｍＬ）にアプライし、ＦＡＤ−ＧＤＨをカラムに吸着させた。２．５mol/L硫酸アンモニウムを含む１０mmol/L  Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５でカラムを洗浄後、同バッファー中の硫酸アンモニウムの濃度を段階的に２．０、１．５、１．０、０．５mol/Lに変更することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨを溶出させた。ＦＡＤ−ＧＤＨの活性画分を回収し、限外ろ過膜で脱塩（２０mmol/L  Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５）・濃縮した。該脱塩・濃縮液を２０mmol/L  ＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ  ｐＨ６．５バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（カラム容積５０ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライし、２０mmol/L  ＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ  ｐＨ６．５バッファーによりＦＡＤ−ＧＤＨを溶出させた。この画分を限外ろ過膜により脱塩（１０mmol/L  ＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ  ｐＨ６．５）・濃縮することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの精製酵素標品を得た。表２に示すように、精製酵素の収率は、珪藻土ろ液に対して１４％の収率であり、比活性は約４１，０００倍に上昇した。
【表２】
2007139013.tif 000005
【００４０】
３．分子量の測定
（３−１）ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるＦＡＤ−ＧＤＨの分子量の測定
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。ゲルはＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ１２．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、分子量マーカーはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ  １４．４−９７ｋＤａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により行った。ＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｂｌｕｅ  Ｒ（クマシーＲ３５０染色）でゲル上の蛋白質のバンドを染色し、蛋白質を検出した。その結果、分子量１００ｋＤａの付近に単一バンドとして検出された（図１）。【００４１】
（３−２）ゲルろ過クロマトグラフィーによるＦＡＤ−ＧＤＨの分子量の測定
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの分子量をＨＰＬＣ（ＬＣ−１０  ＡＤ  ＶＰ、株式会社島津製作所）によるゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。０．３Ｍ  ＮａＣｌを含んだ５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．９で平衡化したＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ、東ソー株式会社）に精製ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液２５μＬをアプライし、カラム温度２５℃、流速０．７ｍＬ/ｍｉｎで同バッファーにより溶出させ、２８０ｎｍの吸光度を測定した。分子量マーカー（ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、オリエンタル酵母工業株式会社）により検量線を作成した結果、精製ＦＡＤ−ＧＤＨは分子量が約４００，０００の蛋白であることが示された（図２）。【００４２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６、ＩＡＭ２６０３、ＩＡＭ２６２８、ＩＡＭ２６８３，ＩＡＭ２７３６、ＩＡＭ２７０６、ＮＢＲＣ３０１１３の各菌株が生産するＦＡＤ−ＧＤＨの分子量を比較した。０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００（直径２．２ｃｍ  ×  高さ１０５ｃｍ、カラム容積３６０ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６、ＩＡＭ２６０３、ＩＡＭ２６２８、ＩＡＭ２６８３、ＩＡＭ２７３６、ＩＡＭ２７０６、ＮＢＲＣ３０１１３の培養ろ液３ｍＬをアプライし、ＦＡＤ−ＧＤＨをカラムにチャージさせた。チャージしたＦＡＤ−ＧＤＨを上記バッファーで溶出し、溶出画分を回収し、各画分のＦＡＤ−ＧＤＨ活性を上記１．の方法で測定した。分子量マーカーにより検量線を作成した結果、何れの培養ろ液も分子量約４００，０００の位置でＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出された（図３）。このことから、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６、ＩＡＭ２６０３、ＩＡＭ２６２８、ＩＡＭ２６８３、ＩＡＭ２７３６、ＩＡＭ２７０６、ＮＢＲＣ３０１１３由来のＦＡＤ−ＧＤＨは、共通して分子量４００，０００の蛋白質であることが示された。【００４３】
４．吸収スペクトル
Ａ．ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨを１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．５で希釈し、４００−８００ｎｍにおける吸収スペクトルを吸光度計（株式会社島津製作所）によりスキャンした。その結果、フラビン酵素に特有の４６０ｎｍ付近に極大吸収があることが示されたことから、この酵素は、フラビン結合蛋白質であることが確認された（図４）。【００４４】
５．ＦＡＤ−ＧＤＨの至適ｐＨ・温度、及びｐＨ・温度安定性
（５−１）至適ｐＨの検討
０．２２％（ｗ/ｖ）トリトンＸ−１００を含む１００mＭ Ｍｃｌｌｖａｉｎｅバッファー（ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、又はｐＨ８．０に調整）２．５５ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液０．１ｍＬ、３mＭ  ＰＭＳ溶液０．２ｍＬ、及び６．６mＭ  ＮＴＢ溶液０．１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応によって生成するＤｉｆｏｒｍａｚａｎを５７０ｎｍの吸光度で測定し、１分間当たりのＤｉｆｏｒｍａｚａｎの生成量を測定することにより酵素活性を測定した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの至適ｐＨは、７．０であった（図５）。【００４５】
（５−２）至適温度の検討
０．２２％（ｗ/ｖ）トリトンＸ−１００を含む５０mＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５  ２．５５ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液０．１ｍＬ、３mＭ  ＰＭＳ溶液０．２ｍＬ、及び６．６mＭ  ＮＴＢ溶液０．１ｍＬを混合し、３０、３７、４５、５５、６０又は６５℃で５分間保温後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、３０、３７、４５、５０、５５、６０又は６５℃で反応を開始した。酵素反応によって生成するＤｉｆｏｒｍａｚａｎを５７０ｎｍの吸光度で測定し、１分間当たりのＤｉｆｏｒｍａｚａｎの生成量を測定することにより酵素活性を測定した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨの至適温度は約６０℃であった（図６）。【００４６】
（５−３）ｐＨ安定性の検討
精製ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液を０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ３、ｐＨ４）、０．１Ｍ  Ｍｃｌｌｖａｉｎｅバッファー（ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０）、又は０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ９．５）で希釈し（５０Ｕ/ｍＬ）、各ｐＨにおいて３７℃で３０分間処理した。各処理液を０．２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５で適宜希釈し、上記１．の方法でＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定した。コントロールとして０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５で希釈した氷冷保存した精製ＦＡＤ−ＧＤＨの活性も測定した。その結果、ＦＡＤ−ＧＤＨは、少なくともｐＨ３．０−７．０の範囲で８０％以上の活性を維持しており、ｐＨ３．０〜７．０の範囲で安定であることが示された（図７）。【００４７】
（５−４）温度安定性の検討
精製ＦＡＤ−ＧＤＨを１ｍＭ塩化カルシウム、０．１％（ｗ/ｖ）トリトンＸ−１００、及び０．１％（ｗ/ｖ）ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５で１Ｕ／ｍＬに希釈し、各指定温度（５、３０、４０、５０、又は６０℃）で２０分間処理した。氷中で冷却後、各処理液を１ｍＭ塩化カルシウム、０．１％（ｗ/ｖ）トリトンＸ−１００、０．１％（ｗ/ｖ）ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５で希釈し、上記１．に記載の方法でＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定した。コントロールとして、熱処理していない酵素のＦＡＤ−ＧＤＨも測定した。その結果、ＦＡＤ−ＧＤＨは４０℃以下でほぼ１００％の活性を維持していたことから、４０℃以下で安定であることが示された（図８）。【００４８】
６．等電点の測定
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液３ｍＬをダイアライシスメンブレン３６（和光純薬工業株式会社）に入れ、精製水に浸漬し、４℃で一晩、透析を行った。この透析サンプルをグリセロール密度勾配電気泳動に供した。カラム容量１１０ｍＬ、両性担体（ＰｈａｒｍａｌｙｔｅＴＭ３−１０  ｆｏｒ ＩＥＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）、平均終濃度１％）、を使用し、５℃で４００Ｖの定電圧で４８時間、通電を行った。通電後、約２ｍＬ/ｍｉｎの流速でサンプルの回収を行った（１フラクションを１．５ｍＬとした）。各フラクションのｐＨ及びＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定した結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来のＦＡＤ−ＧＤＨのｐＩは、６．４であった（図９）。【００４９】
７．基質特異性
（７−１）基質特異性の検討１（精製ＦＡＤ−ＧＤＨの基質特異性）
０．２２％（ｗ/ｖ）トリトンＸ−１００を含む５０mＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５  ２．５５ｍＬ、１Ｍ  基質（Ｄ−グルコース、マルトース、ガラクトース、キシロース、マルトトリオース、マルトヘキサオース、又はマルトペンタオース）溶液０．０９ｍＬ、３mＭ  ＰＭＳ溶液０．２ｍＬ、及び６．６mＭ  ＮＴＢ溶液０．１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、精製ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応によって生成するＤｉｆｏｒｍａｚａｎを５７０ｎｍの吸光度で測定し、１分間当たりのＤｉｆｏｒｍａｚａｎの生成量を測定することにより酵素活性を測定した。Ｄ−グルコースに対する反応速度を１００％とした各基質に対する相対活性を算出した（表３）。
【表３】
2007139013.tif 000006
【００５０】
（７−２）基質特異性の検討２（各菌株が生産するＦＡＤ−ＧＤＨの基質特異性の比較）
（７−２−１）酵素サンプルの調製
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６、ＩＡＭ２６０３、ＩＡＭ２６２８、ＩＡＭ２６８３、ＩＡＭ２７３６、ＩＡＭ２７０６、又はＮＢＲＣ３０１１３由来の各培養ろ液１０ｍＬをダイアライシスメンブレン３６に入れ、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ中、４℃で一晩、透析を行った。【００５１】
（７−２−２）相対活性の測定
２ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファーｐＨ７．０  ２．５ｍＬ、０．４Ｍ基質溶液（Ｄ−グルコース、２−デオキシグルコース、キシロース、フルクトース、マンノース、又はマルトース）０．３ｍＬを混合し、２５℃で５分間保温後、２０ｍＭ  ＰＭＳ溶液０．０５ｍＬ、４ｍＭ  ＤＣＩＰ（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ）溶液０．０５ｍＬ、各透析サンプル０．１ｍＬを添加して酵素反応を開始した。本還元反応によるＤＣＩＰ減少を６００ｎｍの吸光度で測定することによって、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定した。Ｄ−グルコースを基質としたときの活性を１００％とし、各基質に対する相対活性を算出した（表４）。この結果より、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６、ＩＡＭ２６０３、ＩＡＭ２６２８、ＩＡＭ２６８３、ＩＡＭ２７３６、ＩＡＭ２７０６、又はＮＢＲＣ３０１１３由来のＦＡＤ−ＧＤＨの基質特異性は同じであることが示された。
【表４】
2007139013.tif 000007
【００５２】
８．ミカエリス-メンテン(Michaelis-Menten、Ｋｍ)定数の測定
０．２２％（ｗ/ｖ）トリトンＸ−１００を含む５０mＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５  ２．５５ｍＬ、（６．１−６１０ｍＭ  Ｄ−グルコース溶液０．１ｍＬ、３mＭ  ＰＭＳ溶液０．２ｍＬ、及び６．６mＭ  ＮＴＢ溶液０．１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、精製ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応によって生成するＤｉｆｏｒｍａｚａｎを５７０ｎｍの吸光度で測定し、１分間当たりのＤｉｆｏｒｍａｚａｎの生成量を測定することにより酵素反応速度を測定した。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔによりＫｍ値を算出（図１０）した結果、精製ＦＡＤ−ＧＤＨのＤ−グルコースに対するＫｍ値は８．２ｍＭであった。【００５３】
９．糖含量
フェノール硫酸法で酵素蛋白あたりの糖含量を測定した。精製ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液１．０ｍＬ、５％（ｗ/ｖ）フェノール溶液１．０ｍＬ、９８％硫酸５．０ｍＬを混合し、室温で２０分間放置した。流水で冷却後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。０−０．０３ｍｇ/ｍＬのＤ−グルコース標準液で検量線を作成（図１１）し、酵素１ｍｇあたりの糖含量を算出した。その結果、ＦＡＤ−ＧＤＨの糖含量は、酵素１ｍｇ当たり０．４３ｍｇ（４３％）であった。【００５４】
１０．グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）との比較
（１０−１）ＦＡＤ−ＧＤＨ活性の測定
０．２２％（ｗ/ｖ）トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５  ２．５５ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液０．１ｍＬ、３mＭ  ＰＭＳ溶液０．２ｍＬ、及び６．６mＭ  ＮＴＢ溶液０．１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、適宜希釈した酵素溶液（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨ、又はＧＯ（天野エンザイム株式会社））０．１ｍＬを添加し、３７℃で反応を開始した。酵素反応によって生成するＤｉｆｏｒｍａｚａｎを５７０ｎｍの吸光度で測定し、１分間当たりのＤｉｆｏｒｍａｚａｎの生成量を測定することによって酵素活性を測定した。【００５５】
（１０−２）ＧＯ活性の測定
グルコースオキシダーゼ活性は、以下の反応原理で測定される。
【数３】
2007139013.tif 000008
反応１においてＧＯによって生成したＨ２Ｏ２は、反応２においてペルオキシダーゼによるキノンイミン染料の生成反応に使用される。キノンイミン染料を５００ｎｍの吸光度で測定することにより、ＧＯ活性を測定した。ＧＯ活性１ユニットは、３７℃におけるこの反応条件下において、１分間に１μｍｏｌｅのＤ−グルコースを酸化する酵素量と定義する。以下に実際の測定方法を示す。
フェノール溶液（０．１５２％のフェノールと０．１５２％のトリトンＸ−１００を含む０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ７．０）２．０ｍＬ、０．５５５ｍｏｌ/Ｌ  Ｄ−グルコース溶液０．５ｍＬ、２５Ｕ/ｍＬペルオキシダーゼ（天野エンザイム株式会社）溶液０．５ｍＬ、及び４ｍｇ/ｍＬ  ４−アミノアンチピリン溶液０．１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、適宜希釈した酵素溶液（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨ、又はＧＯ）０．１ｍＬを添加し、３７℃で反応を開始した。反応開始２分後及び５分後の５００ｎｍにおける吸光度を測定した。また、酵素ブランクとして、酵素溶液の代わりに０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ７．０を添加し、同様に吸光度を測定した。以下の計算式でＧＯ活性を算出した。
【数４】
2007139013.tif 000009
上記式中の「３」は反応時間を、「１２．８８」はキノンイミン染料の分子吸光定数（ｍＭ）を、「１/２」は２ｍｏｌｅのＨ２Ｏ２から１ｍｏｌｅのキノンイミン染料が生成することに基づく係数を、「３．２」は反応液の最終液量を、「０．１」はサンプル量（ｍＬ）を、「Ｄｍ」は希釈倍数をそれぞれ表す。【００５６】
この結果から、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来の精製ＦＡＤ−ＧＤＨは、専らＧＤＨ活性を有し、ＧＯ活性を実質的に有さないことが示された。一方、ＧＯは主としてＧＯ活性を有するが、ＧＤＨ活性も併せ持つことが判明した（表５）。即ち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来のＦＡＤ−ＧＤＨは、電子伝達系の物質を用いてＤ−グルコースを測定する際、ＧＯと比べて反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示された。
【表５】
2007139013.tif 000010
【００５７】
１１．グルコース濃度の測定
本願発明に係るＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤ−ＧＤＨの利用例を以下に示す。０．２２％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファーｐＨ６．５  ２．５５ｍＬ、Ｄ−グルコース溶液（０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００ｍｇ/ｄＬ）０．１０ｍＬ、３ｍＭ  ＰＭＳ溶液０．２０ｍＬ、及び６．６ｍＭ  ＮＴＢ溶液０．１０ｍＬを混合し、３７℃で５分間放置後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来のＦＡＤ−ＧＤＨ酵素液（０．３Ｕ／ｍＬ）０．１０ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応によって生成するＤｉｆｏｒｍａｚａｎを５７０ｎｍの吸光度で測定し、３分間当たりの５７０ｎｍにおける吸光度の増加とグルコース濃度の関係を図１２に示した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤ−ＧＤＨは、８００ｍｇ/ｄＬ以下のグルコース濃度であれば、試料検体中のグルコース濃度を精度よく測定できることが示された。【００５８】
１２．阻害試験
以下の方法で対照群及び試験群（１，１０−フェナントロリン添加群）の酵素活性を測定して両者を比較することにより、精製ＦＡＤ−ＧＤＨに対する１，１０−フェナントロリンの阻害効果を調べた。
（対照群の酵素活性の測定（表６を参照））
【表６】
2007139013.tif 000011
*1)希釈バッファー：0.1M  KH2PO4-NaOH  pH7.0【００５９】
まず、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍＬ、１ＭのＤ−グルコース溶液１．０ｍＬ、３ｍＭのＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）０．１ｍＬ、３ｍＭの１−メトキシＰＭＳ（５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト）溶液０．２ｍＬ、精製水０．６５ｍＬを石英セルに入れ、３７℃で５分間保温した。続いて、酵素溶液０．０５ｍＬを添加し、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化（ΔＡＢＳ／ｍｉｎ）を測定し、次式によって酵素活性を算出した。
【数５】
2007139013.tif 000012
【００６０】
（試験群の酵素活性の測定（表７を参照））
【表７】
2007139013.tif 000013
上記の測定法において、それぞれ終濃度が１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、及び５０ｍＭとなるように１，１０−フェナントロリンを加えた場合の酵素活性を求めた。【００６１】
（試験結果）
表８に示すように、精製ＦＡＤ−ＧＤＨに対する１，１０−フェナントロリンの阻害効果は低く、１ｍＭの１，１０−フェナントロリンでは２％程度の阻害効果が認められるに過ぎなかった。
【表８】
2007139013.tif 000014
【００６２】
１３．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６株の同定
（１）方法
（１−１）菌株
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６
（１−２）培地組成
Klich, M. A. (2002). Identification of Common Aspergillus species. Utrecht : Centraalbureau voor Schimmelcultures, 116 pp.の報告を参考にし、以下の培地を調製した。
CYA培地：K2HPO4 1g，Czapek Concentrate 10mL，Yeast extract (Difco) 5g，Sucrose 30g，寒天（和光）15g，精製水 1000mL
CZ培地：K2HPO4 1g，Czapek Concentrate 10mL，Sucrose 30g，寒天（和光） 17.5g，精製水 1000mL
CY20S培地：K2HPO4 1g，Czapek Concentrate 10mL，Yeast extract. (Difco) 5g，Sucrose 200g，寒天（和光）15g，精製水 1000mL
MEA培地：Malt extract (Difco) 20g，Glucose 20g，Bacto-peptone (Difco) 1g，Agar（和光）15g，精製水 1000mL 
PDA培地：Potato dextrose agar（栄研）を用いた。
Czapek Concentrate：NaNO3 30g，KCl 5g，MgSO4・7H2O 5g，FeSO4・7H2O 0.1g，ZnSO4・7H2O 0.1g，CuSO4・5H2O 0.05g，精製水100mL
（１−３）表現形質
生育度は、25℃若しくは37℃で7日間培養し、コロニーの直径を測定した。
生育状態は、CYA培地、CZ培地、CY20S培地、MEA培地で観察した（25℃、7日間）。
形態観察は、CYA培地、25℃培養で行った（6〜21日間培養）。
走査型電顕による分生子表面の観察は、CYA培地で25℃、15日培養し、オスミウム酸蒸気固定による処理を行い、観察した。
コロニーの色調は、日本園芸植物標準色票（財団法人 日本色彩研究所発行）に従った。【００６３】
（２）結果
（２−１）生育度（コロニーの直径）
各種培地における生育度（7日培養）を以下の表に示す。
【表９】
2007139013.tif 000015
【００６４】
（２−２）生育状態
各種培地における生育状態（25℃、7日培養）を以下の表に示す。尚、色は、日本園芸植物標準色票（財団法人  日本色彩研究所発行）に従った（括弧内の数字は色票番号）。
【表１０】
2007139013.tif 000016
【００６５】
（２−３）形態
Raper, K. B. & Fennell, D. I. (1965). The genus Aspergillus. Williams & Wilkins Co., Baltimore, 686 pp.、Kozakiewicz, Z. (1989). Aspergillus species on stored products. Mycological Papers. No.161: 1-188.、Klich, M. A. (2002). Identification of Common Aspergillus species. Utrecht : Centraalbureau voor Schimmelcultures, 116 pp.、Samson, R. A. Hoekstra, E. S. Frisvad, J. C. & Filtenborg, O. (2002). Introduction to food- and airborne fungi, 6th edn, pp.64-97. Utrecht : Centraalbureau voor Schimmelcultures, 389 pp.を参考にすると、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６は、コロニーの色が濃緑黄色または暗緑黄色であること（表７）、生育度がCYA培地（25℃、7日培養）で59〜62mm、MEA培地（25℃、7日培養）で52〜64mmであること（表６）、分生子頭が放射状とゆるいカラム状であること、分生子柄が頂のうの下でくびれないこと、単列と2列のアスペルジラが混在すること、頂のうが亜球形ないしフラスコ形でその直径が10〜42μmであること、分生子が亜球形ないし球形でその大きさが5.6〜8.8×5.2〜8.8μm、表面が滑面ないしわずかに粗面であること（表８）からＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅであることが確認された。
【表１１】
2007139013.tif 000017
【００６６】
１４．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＢ−５６由来ＦＡＤ−ＧＤＨの同定
（１）アミノ酸配列の解析
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＢＢ−５６を培養し、得られた精製酵素を６．に示した方法で等電点分画した。得られた精製酵素をゲルPAG Mini DAIICHI 7.5（第一化学薬品株式会社）を用いたSDS-PAGEに供した。転写緩衝液1（0.3M Tris (pH10.4)、20% methanol）、転写緩衝液2（30mM Tris (pH10.4)、20% methanol）、転写緩衝液3（40mM 6-aminohexanoic acid(pH7.6)、20% methanol）を転写緩衝液として用い、泳動後のゲルをPVDF膜に転写した。転写操作は転写緩衝液１を陽極側、転写緩衝液２をメンブレンを含む中央部、転写緩衝液３を陰極側で用い、セミドライ転写装置を用いて定電流0.8mA／PVDF膜cm2、90minの条件下で行った。転写後にCBB（Coomassie Brilliant Blue R-250）染色を行い当該酵素にあたるバンドを切り出しN末端アミノ酸配列解析用サンプルとした。同様に泳動後のゲルをCBB染色し当該酵素にあたるバンドを切り出し、そのまま内部アミノ酸配列解析用サンプルとした。解析の結果、N末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列が明らかとなった。【００６７】
（２）Ｎ末端アミノ酸配列による相同性検索
特開２００５−１７６６０２により公開されたアスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０の遺伝子情報のうち全ＣＤＳ配列を特開２００５−１７６６０２の出願人より入手し、明らかになったN末端アミノ酸配列による相同性検索をデータベースソフトウェアKiroku  Ver.3（株式会社ワールドフュージョン）を用いて実施した。その結果、Glucose  Oxidase  Precursorとホモロジーのあるアミノ酸配列（特開２００５−１７６６０２の配列表における配列番号２０４９４）との間に高い相同性が認められた。同配列には内部アミノ酸配列解析により明らかになったアミノ酸配列と一致する領域も存在していた。これらの事実より、同配列（配列番号１）が当該酵素のアミノ酸配列に対応することが明らかになった。【００６８】
（３）アスペルギルス・オリゼ  ＢＢ−５６からのゲノム抽出
アスペルギルス・オリゼ  ＢＢ−５６をYPD培地（Yeast Extract 1%、Peptone 2%、Glucose 2%）100mlを入れた坂口フラスコを用いて30℃一晩培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。-80℃で凍結後、凍結乾燥して得られた重量約0.3gの菌体を薬匙1杯の海砂とともに乳鉢、乳棒を用いて破砕し、Extraction buffer（1% hexadecyltrimethylammonium bromide、0.7M NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、1% メルカプトエタノール）12mlに懸濁した。室温で30分回転撹拌を続けた後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）溶液を加えて攪拌、遠心分離（1,500g、5分、室温）して上清を得た。得られた上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（1,500g、5分、室温）を行った。その結果得られた上清に等量のイソプロパノールを穏やかに加えた。この処理によって析出した染色体DNAを遠心分離（20,000g、10分、4℃）して得られた沈殿を70%エタノールで洗浄し、真空乾燥した。このようにして得られた染色体DNAを再びTE 4mlに溶解し、10mg/ml RNase A （シグマアルドリッチジャパン株式会社）200μlを加えた後、37℃、30分間インキュベートした。次いで、20mg/ml Proteinase K,recombinant,PCR Grade（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）溶液40μlを加えて37℃、30分間インキュベートした後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）溶液を加えた。攪拌後、遠心分離（1,500g、5分、室温）し、上清を得た。この洗浄操作を２回繰り返した後、得られた上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（1,500g、5分、室温）を行った。その結果得られた上清に対して、その1/10容量の3M NaOAc(pH4.8)と2倍容量のエタノールを加えて-80℃で冷却することにより染色体DNAを析出させた。析出した染色体DNAを遠心処理（20,000g、20分、4℃）により回収した。回収された染色体DNAを70%エタノールで洗浄した後、真空乾燥させ、最後に400μlのTE溶液に溶解して濃度約1mg/mlの染色体DNA溶液を得た。【００６９】
（４）合成プライマーの設計
配列番号１のアミノ酸配列（特開２００５−１７６６０２の配列表において配列番号２０４９４で示される配列）をコードする全鎖長3226bpのRIB40株由来遺伝子配列（配列番号２）の5’、3’両末端の配列に相当する合成プライマーFG-F、FG-R（配列番号３、４）を合成した。【００７０】
（５）PCR法によるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の増幅
（３）で調製した染色体DNAを鋳型としたPCR反応を実施した。反応はTAKARA LA-TaqTM（タカラバイオ社）を用い、反応液組成は添付の定法に従った。プライマー（FG-F、FG-R）をそれぞれ0.4μM、鋳型ゲノムを10ng/μlの濃度になるように加えPCR反応を実施した。反応サイクルは次の通りとした。即ち、94℃2分の反応後、94℃30秒の反応、60℃30秒の反応、72℃10分の反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に72℃10分の反応を行った。反応終了後、サンプルを4℃で保存した。【００７１】
（６）ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
PCR反応液をアガロース電気泳動に供して増幅断片とプライマーを分離し、GENECLEANTM IIIを（BIO 101社）用いてアガロースゲルから抽出した。抽出した増幅断片はベクターpUC19（タカラバイオ社）SmaIサイトにサブクローンした。その後サブクローンしたプラスミドpFG2の当該酵素遺伝子に相当する領域の塩基配列解析を実施した。シークエンス反応はBigDyeTM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用い、製品の使用説明書に従ってシークエンス反応を行った。解析にはABI PRISM 310シークエンサー（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用した。当該酵素遺伝子の塩基配列解析を実施するために合成プライマーFG-1（配列番号５）、FG-2（配列番号６）、FG-3（配列番号７）、FG-4（配列番号８）、FG-5（配列番号９）、FG-6（配列番号１０）、FG-7（配列番号１１）、FG-8（配列番号１２）、FG-9（配列番号１３）、FG-10（配列番号１４）、FG-11（配列番号１５）、FG-12（配列番号１６）、M13-M5（配列番号１７）、M13-RV2（配列番号１８）を合成した。塩基配列解析の結果、配列番号１９に示す全鎖長3241bpのアスペルギルス・オリゼ  ＢＢ−５６由来当該酵素遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列より予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号２０に示した。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは基質特異性に優れ、グルコース量をより正確に測定することを可能にする。従って本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは血糖値の測定や食品（調味料や飲料など）中のグルコース濃度の測定などに好適といえる。【００７３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2007139013.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007139013.tif 000026
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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