【手続補正書】
【提出日】平成20年4月17日(2008.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】    【請求項１】  糖の1つ以上の部分を鋳型アグリコンに転移させることによってグリコシル化されたハイブリッド産物を産生させるため、 ａ）内因性鋳型アグリコンのプロセッシングに関与する微生物宿主における１又は複数の遺伝子を除去又は不活性化させ、前記微生物宿主による天然のグリコシル化された産物の産生が抑制されるようにし； ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ（GT）をコードする核酸を用いて前記微生物宿主細胞を形質転換し、 ｃ）外因性鋳型アグリコンをGTに供給することによりGTに糖の1つ以上の部分をその外因性鋳型アグリコンに転移させてグリコシル化されたハイブリッド産物を産生させる操作を含む方法において、  上記の糖の1つ以上の部分、外因性鋳型アグリコン、グリコシルトランスフェラーゼ、宿主細胞のいずれかが他の要素と異種である方法。    【請求項２】  外因性鋳型アグリコンと糖の一部が互いに異種である、請求項1に記載の方法。    【請求項３】  外因性鋳型アグリコンおよび／または糖の一部が、宿主細胞とは異種である、請求項1に記載の方法。    【請求項４】  外因性鋳型アグリコンと、糖の一部と、GTが、宿主細胞とは異種である、請求項1に記載の方法。    【請求項５】  宿主細胞を、上記糖の一部を産生する1つまたは複数の遺伝子で形質転換する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。    【請求項６】  グリコシルトランスフェラーゼが、  （a）サッカロポリスポラ・エリトラエアのエリスロマイシン経路からのデソサミニルトランスフェラーゼeryCIIIまたはミカロシルトランスフェラーゼeryBV；  （b）ミクロモノスポラ・メガロミケアのメガロマイシン経路からのデソサミニルトランスフェラーゼmegCIII、ミカロシルトランスフェラーゼmegBVまたはメゴサミニルトランスフェラーゼ；  （c）ストレプトミケス・アンティビオティクスのオレアンドマイシン経路からのオレアンドロシルトランスフェラーゼoleG2（ラムノースとオリボースも転移させる）またはデソサミニルトランスフェラーゼoleG1；  （d）ストレプトミケス・フラディアエのチロシン経路からのミカミノシルトランスフェラーゼtylMII、デオキシアローストランスフェラーゼtylNまたはミカロシルトランスフェラーゼtylCV；  （e）ストレプトミケス・ミカロファキエンスのミデカマイシン経路からのミカミノシルトランスフェラーゼmidI、デオキシアローストランスフェラーゼまたはミカロシルトランスフェラーゼ；  （f）ストレプトミケス・ウェネズエラエのピクロマイシン／ナルボマイシン経路からのデソサミニルトランスフェラーゼdesVII；  （g）サッカロポリスポラ・スピノサのスピノシン経路からのラムノシルトランスフェラーゼまたはフォロサミニルトランスフェラーゼ；  （h）ストレプトミケス・ノドススのアンフォテリシン経路からのミカミノシルトランスフェラーゼamphDI；  （i）ストレプトミケス・アウェルミティリスのアベルメクチン経路からのオレアンドロシルトランスフェラーゼ；  （j）ストレプトミケスのニスタチン経路からのミカミノシルトランスフェラーゼ；  （k）アクチノプラネス・カエルレンスのポリエン67-121C経路からのミコサミニルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ（ミコサミンに転移させる）；  （l）ストレプトミケス・オリワケアオ���スTu2353のエロラマイシン経路からのラムノシルトランスフェラーゼelmGT；  （m）ストレプトミケス・アルギラケウスのミトラマイシン経路からのオリボシルトランスフェラーゼmtmGIV；  （n）ストレプトミケス・ペウケティウスのダウノマイシン経路からのダウノサミニルトランスフェラーゼdnrS；  （o）ストレプトミケス・フラディアエTu2717のウルダマイシン経路からのロジノシルトランスフェラーゼurdGT1c、オリボシルトランスフェラーゼurdGT1b、ロジノシルトランスフェラーゼurdGT1aまたはオリボシルトランスフェラーゼurdGT2である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。    【請求項７】  糖の一部および／または鋳型アグリコンを修飾する酵素を、その糖の一部を鋳型アグリコンに結合させる前または結合させた後に用いる操作をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。    【請求項８】  上記酵素がメチルトランスフェラーゼまたはP450である、請求項7に記載の方法。    【請求項９】  宿主細胞を、上記酵素をコードする異種遺伝子で形質転換する、請求項7または8に記載の方法。    【請求項１０】  外因性鋳型アグリコンを、ポリケチド、ポリケチド−ペプチドの混合物、ペプチドからなるグループの中から選択する、請求項1〜９のいずれか1項に記載の方法。    【請求項１１】  ポリケチドを、タイプIのポリケチドとタイプIIのポリケチドからなるグループの中から選択する、請求項10に記載の方法。    【請求項１２】  外因性鋳型アグリコンが、6-デオキシエリスロノリドB、エリスロノリドBまたはチラクトンのいずれかである、あるいはこれらの誘導体である、請求項10に記載の方法。    【請求項１３】  内因性鋳型アグリコンの産生に関与する微生物宿主細胞内の1つ以上の遺伝子を除去または不活性化して、内因性鋳型アグリコンまたは産物の産生を抑制または変更する操作をさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。    【請求項１４】  グリコシル化されたハイブリッド産物であって、  （a）エリスロノリド、エリスロマイシンまたはチラクトンと結合した1つ以上のラムノースまたは置換されたラムノース、ここで当該グリコシル化されたハイブリッド産物はダウミスら（1999年）が開示した化合物M1〜M4とは異なっている；  （b）エリスロマイシンと結合した1つ以上のミカロースまたは置換されたミカロース、  （c）エリスロノリドまたはエリスロマイシンと結合した1つ以上のミカミノースまたは置換されたミカミノース、； （d）チラクトンに結合した1つ以上のグルコースまたは置換されたグルコース；  （e）チラクトンに結合した1つ以上のデソサミノースまたは置換されたデソサミノース；  (f) エリスロノリドまたはエリスロマイシン上に（a）、（b）、（c）の糖置換基を組み合わせたもの；並びに  (g) チラクトン上に（a）、（b）、（c）の糖置換基を組み合わせたもの； からなる群から選ばれる、グリコシル化されたハイブリッド産物。    【請求項１５】  3-O-(2'-O-メチルラムノシル)エリスロノリドB、3-O-(2',3'-ビス-O-メチルラムノシル)エリスロノリドB、3-O-(2',3',4'-トリス-O-メチルラムノシル)エリスロノリドB、8a-ヒドロキシ-3-O-ミカロシル-エリスロノリドB、8,8a-エポキシ-3-O-ミカロシル-エリスロノリドB、8,8a-デヒドロ-6-デオキシエリスロノリドB、8-ヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドB��3-O-(2'-O-メチルラムノシル)エリスロマイシンD、3-O-(2',3'-ビス-O-メチルラムノシル)エリスロマイシンD、3-O-(2',3',4'-トリス-O-メチルラムノシル)エリスロマイシンD、5-O-ミカミノシル-4''-O-ミカロシル-エリスロマイシンA、5-O-グルコシル-チラクトン、23-O-ラムノシル-5-O-ミカミノシル-チラクトン、5-O-(2'-O)-ビス-グルコシル-チラクトン、3-O-ラムノシル-8,8a-デヒドロ-6-デオキシエリスロノリドB、3-O-ラムノシル-8,8a-ジヒドロキシ-エリスロノリドB、3,5  ジ-O-ミカロシルエリスロノリドB、3-O-ラムノシル-8,8a-ジヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドB、8,8a-エポキシ-3-O-ラムノシルエリスロノリドB、8,8a-デヒドロ-6-ミカロシルエリスロノリドB、3-O-(2',3'-ビス-O-メチルラムノシル)-6-デオキシエリスロノリドB、3-O-(2'-メチルラムノシル)-6-デオキシエリスロノリドB、5-O-ミカミノシル-エリスロマイシンA及び23-O-ヒドロキシ-5-O-ミカミノシル-チラクトン、  からなる群から選ばれる、化合物。    【請求項１６】  8,8a-デヒドロ-6-デオキシエリスロノリドB、8-ヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドB、8,8a-エポキシ-6-デオキシエリスロノリドB及び8,8a-ジヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドB、  からなる群から選ばれる、化合物。    【請求項１７】  内因性鋳型アグリコンのプロセッシングに関与する微生物宿主における１又は複数の遺伝子が除去又は不活性化され、前記微生物宿主による天然のグリコシル化された産物の産生が抑制されるようになった、グリコシルトランスフェラーゼ（GT）をコードする核酸を用いて形質転換した宿主細胞であって、GTが宿主細胞とは異種であり、この細胞内で糖の1つ以上の部分を鋳型アグリコンに転移させて、ダウミスら（1999年）が開示した化合物M1〜M4とは異なるグリコシル化されたハイブリッド産物を産生させる、宿主細胞。    【請求項１８】  1つ以上の補助遺伝子を用いて宿主細胞をさらに形質転換する、請求項17に記載の宿主細胞。    【請求項１９】  補助遺伝子が、糖の一部の生合成に関与するタンパク質をコードする糖経路遺伝子であり、そのことによって、発現カセットを用いて宿主細胞を形質転換してこの宿主細胞に糖の一部を産生させ、それを外因性鋳型アグリコンに転移させることが可能となる、請求項18に記載の宿主細胞。    【請求項２０】  補助遺伝子が、その糖の一部を外因性鋳型アグリコンに結合させる前または結合させた後に糖の一部および／または外因性鋳型アグリコンを修飾する酵素を含む、請求項17又は18に記載の宿主細胞。    【請求項２１】  上記酵素がメチルトランスフェラーゼまたはP450である、請求項20に記載の宿主細胞。    【請求項２２】  宿主細胞が放線菌株である、請求項17〜21のいずれか1項に記載の宿主細胞。    【請求項２３】  放線菌株を、サッカロポリスポラ・エリトラエア、ストレプトミケス・コエリコロル、ストレプトミケス・アウェルミティリス、ストレプトミケス・グリセオフスクス、ストレプトミケス・キンナモネンシス、ストレプトミケス・フラディアエ、ストレプトミケス・ロンギスポロフラウス、ストレプトミケス・ヒュグロスコピクス、ミクロモノスポラ・グリセオルビダ、ストレプトミケス・ラサリエンシス、ストレプトミケス・ウェネズエラエ、ストレプトミケス・アンティビオティクス、ストレプトミケス・リウィダンス、ストレプトミケス・���モスス、ストレプトミケス・アルブス、アミコラトプシス・メディテッラネイおよびストレプトミケス・ツクバエンシスからなるグループの中から選択する、請求項22に記載の宿主細胞。    【請求項２４】  グリコシル化されたハイブリッド産物を産生させる方法であって、請求項17〜23のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養し、その結果として産生された産物を単離する操作を含む方法。    【請求項２５】  グリコシル化された複数のハイブリッド産物を含んで成るライブラリーを生成するため、ａ）内因性鋳型アグリコンのプロセッシングに関与する微生物宿主における１又は複数の遺伝子を除去又は不活性化させ、前記微生物宿主による天然のグリコシル化された産物の産生が抑制されるようにし；ｂ）1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ（GT）をコードする核酸を用いて前記微生物宿主細胞を形質転換し、ｃ）1つ以上の外因性鋳型アグリコンをGTに供給することによりGTに糖の1つ以上の部分を外因性鋳型アグリコンに転移させてグリコシル化された上記複数のハイブリッド産物を産生させる操作を含む方法において、  上記の糖の1つ以上の部分、外因性鋳型アグリコン、グリコシルトランスフェラーゼ、宿主細胞のいずれかが他の要素と異種である方法。    【請求項２６】  1つ以上の補助遺伝子を用いて宿主細胞をさらに形質転換する、請求項25に記載の方法。    【請求項２７】  補助遺伝子が、糖の一部の生合成に関与するタンパク質をコードする糖経路遺伝子であり、そのことによって、発現カセットを用いて宿主細胞を形質転換してこの宿主細胞に糖の一部を産生させ、それを外因性鋳型アグリコンに転移させることが可能となる、請求項26に記載の方法。    【請求項２８】  補助遺伝子が、その糖の一部を外因性鋳型アグリコンに結合させる前または結合させた後に糖の一部および／または外因性鋳型アグリコンを修飾する酵素を含む、請求項26又は27に記載の方法。    【請求項２９】  上記酵素がメチルトランスフェラーゼまたはP450である、請求項28に記載の方法。    【請求項３０】  グリコシル化されたハイブリッド産物のライブラリーをスクリーニングして望む特性を有するものを見つける操作をさらに含む、請求項25〜29のいずれか1項に記載の方法。    【請求項３１】  ライブラリーが、異なる少なくとも2つのグリコシル化されたハイブリッド産物を含む、請求項25〜30のいずれか1項に記載の方法。    【請求項３２】  ライブラリーが、異なる少なくとも10種類のグリコシル化されたハイブリッド産物を含む、請求項25〜30のいずれか1項に記載の方法。    【請求項３３】  ライブラリーが、異なる少なくとも100種類のグリコシル化されたハイブリッド産物を含む、請求項25〜30のいずれか1項に記載の方法。    【請求項３４】  望むグリコシル化されたハイブリッド産物を産生する宿主細胞を単離する操作をさらに含む、請求項25〜30のいずれか1項に記載の方法。    【請求項３５】  宿主細胞を培養し、その結果として産生された産物を単離する操作をさらに含む、請求項34に記載の方法。    【請求項３６】  細胞内に天然に存在している1つ以上のPKS遺伝子の突然変異、または欠失、または不活性化によって細胞内でのポリケチドの生合成を抑制する、請求項25〜35のいずれか1項に記載の方法。    【請求項３７��  1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子と、プロモータの制御下で作用可能式に連結した1つ以上の補助遺伝子とを含む発現カセット。    【請求項３８】  補助遺伝子が、糖の一部の生合成に関与するタンパク質をコードする糖経路遺伝子であり、そのことによって、発現カセットを用いて宿主細胞を形質転換してこの宿主細胞に糖の一部を産生させ、それを鋳型アグリコンに転移させることが可能となる、請求項37に記載の発現カセット。    【請求項３９】  補助遺伝子が、糖の一部または鋳型アグリコンのプロセシングを、グリコシルトランスフェラーゼがこの糖の一部をアグリコンに転移させる前または転移させた後に行なうことに関与する酵素をコードする、請求項37又は38に記載の発現カセット。    【請求項４０】  上記酵素が、メチルトランスフェラーゼまたはP450である、請求項39に記載の発現カセット。    【請求項４１】  上記遺伝子が連結されて先頭から末尾まで連続した集合体となっている、請求項37〜40のいずれか1項に記載の発現カセット。    【請求項４２】  上記遺伝子を発現カセットに導入するにあたって、  その遺伝子を含むPCR断片の3'末端または5'末端にXbaI制限部位を導入し、  XbaIに隣接した断片をクローニングして活性なDamメチラーゼとともに宿主菌株に導入する、請求項37〜41のいずれか1項に記載の発現カセット。    【請求項４３】  上記遺伝子を単一のプロモータの制御下に置く、請求項37〜42のいずれか1項に記載の発現カセット。    【請求項４４】  上記プロモータが強力なプロモータである、請求項43に記載の発現カセット。    【請求項４５】  上記遺伝子をactIプロモータの制御下に置く、請求項44に記載の発現カセット。    【請求項４６】  上記遺伝子をactII-Orf4調節遺伝子の制御下に置く、請求項44又は45に記載の発現カセット。    【請求項４７】  発現カセット内の末尾に位置する遺伝子に隣接したヒスチジン・タグをコードする核酸配列を含む、請求項37〜46のいずれか1項に記載の発現カセット。    【請求項４８】  糖の1つ以上の部分を鋳型アグリコンに転移させることによってグリコシル化されたハイブリッド産物を産生することのできる宿細胞を産生するため、請求項37〜47のいずれか1項に記載の発現カセットで宿主細胞を形質転換してその発現カセットに含まれる遺伝子を発現させ、GTと、補助遺伝子によってコードされているタンパク質とを産生させる操作をさらに含む、方法。    【請求項４９】  請求項48に記載の方法によって作製される宿主細胞。【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】    【表２９】2003530857.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】    【図１Ａ】  eryB中に1247塩基対の欠失があるサッカロポリスポラ・エリトラエアΔorf14を単離した図である。tsrは、チオストレプトン耐性を意味する。    【図１Ｂ】  eryBV中の欠失とeryCIII中の1191塩基対の欠失の両方を含むサッカロポリスポラ・エリトラエア菌株DMを単離した図である。tsrは、チオストレプトン耐性を意味する。    【図２】  発現プラスミドpSG142の構造図である。EryRHSは、エリスロマイシン生合成遺伝子クラスターのermE遠位フランクからのDNA断片を意味する。    【図３】  クローニングしたグリコシルトランスフェラーゼ（glctr）がインビボでアグリコンをグリコシル化する能力を有するかどうかをスクリーニングする方法の概略図である。    【図４】  3-O-ラムノシル-エリスロノリドBと3-O-ラムノシル-6-デオキシエリスロノリドBの構造図である。    【図５Ａ】  5-O-デソサミニルチラクトンの構造図である。    【図５Ｂ】  5-O-グルコシルチラクトンの構造図である。    【図６】  プラスミドpSGSpnI、pSGSpnK、pSGSpnHの概略図である。    【図６Ｂ】  spnI/SpnIと公開された配列登録番号AY007564のDNA配列を比較した図（上）とアミノ酸配列を比較した図（下）である。訂正したヌクレオチド配列とアミノ酸配列に含まれる変化を下線で示してある。    【図７】  SGT2pSGSpnIの染色体DNAを鋳型として用いて行なったspnIの分析結果である。    【図８】  SGT2pSGSpnKの染色体DNAを鋳型として用いて行なったspnKの分析結果である。    【図９】  SGT2pSGSpnHの染色体DNAを鋳型として用いて行なったspnHの分析結果である。    【図１０】  ラムノシル-エリスロノリドBを供給した後にSGT2とSGT2pSGSpnIの培養物の上清を分析した結果である。    【図１１】  3-O-(2'-O-メチルラムノシル)エリスロノリドBの構造図である。    【図１２】  3-O-(2'-O-メチルラムノシル)エリスロノリドBを供給した後にSGT2とSGT2pSGSpnKの培養物の上清を分析した結果である。    【図１３】  プラスミドpSGSpnHKとpSGSpnHKIの概略図である。    【図１４】  3-O-(2',3'-ビス-O-メチルラムノシル)エリスロノリドBの構造図である。    【図１５】  3-O-(2',3',4'-トリス-O-メチルラムノシル)エリスロノリドBの構造図である。    【図１６】  3-O-ラムノシル-エリスロマイシンD（A）；3-O-(2'-O-メチルラムノシル)エリスロマイシンD（B）；3-O-(2',3'-ビス-O-メチルラムノシル)エリスロマイシンD（C）の構造図である。    【図１７】  3-O-(2'-O-メチルラムノシル)エリスロマイシンDとエリスロマイシンAに対するバイオアッセイの結果である。    【図１８】  oleG2、spnI、spnH、spnK、eryCIIIからなる遺伝子カセットを単離する方法を示す。    【図１９】  SGT3pSGcasoleG2spnIspnKの培養物の上清を分析した結果である。    【図２０】  SGT3pSGcasoleG2spnIspnKeryCIIIの培養物の上清を分析した結果である。    【図２１】  8a-ヒドロキシ-3-O-ミカロシル-エリスロノリドBと8,8a-エポキシ-3-O-ミカロシル-エリスロノリドBの構造図である。    【図２２】  8,8a-デヒドロ-6-デオキシエリスロノリドBと8-ヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドBの構造図である。    【図２３】  遺伝子カセットを構成して組み込むことによりサッカロポリスポラ・エリトラエアを形質転換する方法である。    【図２４】  3-O-ラムノシル-8,8a-デヒドロ-6-デオキシエリスロノリドBと3-O-ラムノシル-8,8a-ジヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドBの構造図である。    【図２５】  oleG1開始領域のDNA配列である（登録番号AJ002638）。    【図２６】  サッカロポリスポラ・エリトラエアのSGT2とSGT2pSGOleG1におけるeryCIIIの突然変異が相補性を持つかどうかを示す結果である。3-O-ミカロシル-エリスロノリドBを以前報告されている（Gaisser他、2000年）ようにして培養物に供給した。3-O-ミカロシル-エリスロノリドBが存在していることは、保持時間が20分の位置にピークがあることに現われている。保持時間が15.7分の位置のピークとm/z=734は、エリスロマイシンAが存在していることを示す。    【図２７】  6-デオキシエリスロノリドBを、SGQ1、SGQ1pSGOleG1、SGQ1pSGOleG2、SGQ1pSGOlePに供給した結果である。主な化合物の構造を示してある。    【図２８】  3-O-ラムノシル-6-デオキシエリスロノリドBを、SGQ1、SGQ1pSGOleG1、SGQ1pSGOleG2、SGQ1pSGOlePに供給した結果である。主な化合物の構造を示してある。    【図２９】  23-O-ラムノシル-5-O-ミカミノシル-チラクトンの構造図である。    【図３０】  23-O-ラムノシル-5-O-デソサミニル-チラクトンの構造図である。    【図３１】  5-O-(2'O-)-ビス-グルコシル-チラクトンの構造図である。    【図３２】 5-O-ミカミノシル-エリスロマイシンAと5-O-ミカミノシル-(4"-O-ミカロシル-)エリスロマイシンAの構造図である。    【図３３】  遺伝子tylMI、tylM3、tylBの配列であり、公開された配列と比べるとtylBにおいて8個の領域でアミノ酸が変化していることがわかる。    【図３４】  pUC18tylMIII-tylB構造体とpUC18tylMIII-tylB-tylMI構造体を作るために用いるpUC18の中の遺伝子カセット集合体である。    【図３５】  pSGCIII、pSGTYLM2、pSGDESVII、pSGTYLCVの制限地図である。    【図３６】  プラスミドpGG1の制限地図である。    【図３７】 5-O-ミカミノシル-エリスロマイシンAと3,5-ジ-O-ミカロシル-エリスロノリドBの質量スペクトルである。【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３２】2003530857.tif 000002