【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年10月7日(2008.10.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  液体−液体分配を使用する分離方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】  予め決定した化合物の分離方法であって、
ｉ)少なくとも相の１つが熱分離性ポリマー(Ｉ)を５倍より多く含んでおり(相１)、他の相が少く含んでいる(相２)、２相システム(システムＡ)に該化合物を分配し、
ii)当該化合物を含む１つの相(相１または相２)を回収すること
を含み、
ａ)ポリマー(Ｉ)は、その下限臨界溶解温度(ＬＣＳＴ)の濃度で水と混合し、当該温度より低い温度から高い温度に温度を上昇させたときに２相となり、その両方は少なくとも７０％の水濃度を有する、ミセル形成性熱分離性ポリマーであること
を特徴とする、方法。
【請求項２】  熱分離性ポリマー(Ｉ)が、９０℃以下である、下限臨界溶解温度(ＬＣＳＴ)を有することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】  相２が、ポリマー(Ｉ)に不適合な水溶性ポリマー(II)または塩である熱分離性ポリマー(Ｉ)の曇点低下性の少なくとも１つの試薬を含む、請求項１−２の何れかに記載の方法。
【請求項４】  ポリマー(II)が、セルロース、デキストラン、デンプン、末端が誘導化されていないエチレンオキシドとプロピレンオキシドのランダムまたはブロックコポリマー、およびポリエチレングリコールの水溶性型から選択されることを特徴とする、請求項３の方法。
【請求項５】  相１が、ステップ(ii)で回収される相であり、ここで、その相が有意な量の分離すべき化合物を含むならば、相１をさらなる相分離に付して当該化合物を熱分離性ポリマー(Ｉ)の少ない相(相１：２)に向かわせることを特徴とする、請求項１−４の何れかに記載の方法。
【請求項６】  相２が、ステップ(ii)で回収される相であり、ここで、曇点低下剤がポリマー(II)であり、そして該相が有意な量の分離すべき化合物を含むならば、相２をさらなる相分離に付して当該化合物をポリマー(II)の少ない相(相２：２)に向かわせることを特徴とする、請求項１−４の何れかに記載の方法。
【請求項７】  分離すべき化合物が、ａ)ｐＨ依存電荷を示し、ｂ)相１と相２との分配が荷電に依存し、そしてｃ)当該システムのｐＨが、分離すべき化合物をステップ(ii)で回収される相に最大限に分配するように選択されることを特徴とする、請求項１−６の何れかに記載の方法。
【請求項８】  温度が、分離すべき化合物のステップ(ii)で回収される相への最大限の分配を達成するように選択されることを特徴とする、請求項１−６の何れかに記載の方法。
【請求項９】  １つまたはそれ以上の物質がシステムＡ中に存在し、その物質は、分離すべき化合物の、ステップ(ii)中に回収される相への分配を改善する能力を有することを特徴とする、請求項１−８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】  分離すべき化合物が電気的に荷電しており、上記の少なくとも１つまたはそれ以上の物質が該化合物の分配を改善する対イオンを含む塩であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  上記の少なくとも１つの物質が、相１に親和性を有する界面活性剤であることを特徴とする、請求項９−１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】  分離すべき化合物が、オリゴもしくはポリペプチドまたはタンパク質のようなペプチド構造を示すことを特徴とする、請求項１−１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】  ミセル形成性熱分離性ポリマー(I)が、同一または異なり得て、各末端が疎水性基である親水性モノマー単位の中央ポリマー部分を呈示するポリマーから選択されることを特徴とする、請求項１−１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】  各親水性モノマー単位が、少なくとも１／４である酸素原子数対炭素原子数比を示し、疎水性基において多くとも１／５である酸素原子数対炭素原子数比を示すことを特徴とする、請求項１３の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、熱分離性ポリマーを含む少なくとも１つの相を含む水相システムにおける分離に関する。分離すべき化合物は、例えば、脂質、ペプチドおよび／または炭水化物構造を有する生物学的性質(生体分子)のものであり得る。
【０００２】
（背景技術）
典型的な水性の２相システムは、ＰＥＧ／デキストランおよびＰＥＧ／塩システム(ＰＥＧ＝ポリ(エチレングリコール))である。前者のシステムは、ポリマー−ポリマー不適合性に由来するシステムであり、後者は、塩によるポリマーの塩析に由来するシステムである。ＰＥＧ／デキストランシステムは、巨大分子、膜、細胞粒子および細胞の小規模の分離に使用される(Albertsson, Partition of cell particles and macromolecules, 3rd ed., Wiley, New York; and Walter et al. (Ed.), Aqueous two-phase systems, Meth. Enzym. 228 (1994(Academic Press, London))。ＰＥＧ／塩システムは、主に大規模な酵素抽出に使用される(Cordes et al., Meth. Enzymol. 228 (1994) 600-608 (Academnic Press, London)。
【０００３】
より新しい２相システムは、温度が上昇すると水への溶解度が下がるポリマーを利用する(熱分離性ポリマー)。この場合、２つの巨視的相(一方はポリマーに富む下相であり、他方は水に富む上相)を、曇点(cloud point)、すなわち相が分離し始める温度より数度高くポリマーの溶液を加熱することにより得ることができる。あるポリマーの水溶液の曇点は、ポリマー濃度ならびに添加された他の成分(例えば、曇点−低下試薬)の量および型に依存する。最も低い曇点は、下限臨界溶解温度(ＬＣＳＴ)と呼ばれる(Saeki et al., Polymer 17 (1976) 685-688)。この現象はまた、非イオン性界面活性剤、例えばTriton X-114、C12E05の水溶液でも生ずる。生物工学における熱分離性の適用は、概説されている(Galaev et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993) 354-366)。もし特記しなければ、ＬＣＳＴは、純粋なポリマーおよび純水からなるシステムの最も低い曇点をいう。
【０００４】
多くの熱分離性ポリマーは、エチレンオキシド基を含む。ＰＥＧ自体が一例であるが、その曇点は、生体物質の分離用の熱分離工程での使用には温度が高過ぎる(１００℃以上)。エチレンオキシド(ＥＯ)−プロピレンオキシド(ＰＯ)ランダムコポリマーは、より低い曇点を有する。Ucon 50 HB-5100およびBreox 50A 1000は、５０％ＥＯ基および５０％ＰＯ基から成るランダムコポリマーである(ＥＯＰＯ−ポリマー)。両方のコポリマーは、５０℃のＬＣＳＴを有する。
【０００５】
種々のＥＯ／ＰＯ比を有するポリマーの相システムが、タンパク質の分離において研究されてきた(Harris et al., Biosep. 2 (1991) 237-246; Alred et al., J. Chromatogr. 659 (1994) 289-298; Persson et al., J. Chromatogr. 711 (1998) 97-109; Berggren et al., J. Chromatogr. A 718 (1995) 67-79; Johanssson et al., Biochim. Biophys. Acta 1290 (1996) 289-298)。ＥＯおよびＰＯ単位のブロックからなる熱分離性ポリマー(Pluronics)および酵素の分離におけるその使用が述べられている(Tani et al., Analytical Science 13 (1997) 925-929および14 (1998) 875-888)。Taniらにより使用されたポリマーは、中央に親水性ＥＯブロックおよび末端部分に親水性が低いＰＯブロックを有する、またはその逆を有する(ＥＯＰＯブロックコポリマー)。
【０００６】
本発明者のうち二人(Folke TjerneldおよびJosefine Persson)はまた、ＷＯ９８１１１２７およびＷＯ９８１１４０の発明者であり、その何れもが、熱分離性ポリマーを含む水性２相システムにおけるアポリポタンパク質の精製について述べている。
【０００７】
種々の疎水性および正味の荷電(net charge)を有するアミノ酸およびオリゴペプチドの分配は、水／Uconシステムで研究されている(Johansson et al., Biosep. 5 (1995) 269-279; Johansson et al., Biochim. Biphys Acta 1335 (1996) 315-325)。
【０００８】
これまでに使用されている熱分離性ポリマーの不利な点および本発明の目的
熱分離性ポリマーを含む相システムにおいて、現在まで、ポリマー相は比較的高濃度のポリマー(４０％を超える)を含み、それと同時にほとんどのタンパク質が水相に排他的に分配されていた。ａ)ポリマー相に存在するポリマーが少ないシステムを得ること、ｂ)分離すべき化合物を相間で往復させ得ること、そしてｃ)熱分離性ポリマーの再利用を促進する分離工程を得ることが利点となり得る。
【０００９】
定義
ポリマー：ポリマーなる語句を本発明で使用する場合、他に強調しなければ、水溶性／水混和性ポリマーをいう。さらにポリマーなる語句は、異なるかまたは同等であり得る２０以上のモノマー単位を含むことを意味する。
【００１０】
熱分離性ポリマーは、温度が上昇すると水への溶解度が下がるポリマーである。
【００１１】
曇点−低下試薬(cloud point-decreasing agents)は、ポリマー−水溶液に加えたとき、当該溶液の曇点を下げる化合物である。
【００１２】
曇点−上昇試薬(cloud point-increasing agents)は、水中の熱分離性ポリマーの溶液に加えたとき、当該溶液の曇点を上げる化合物である。
【００１３】
不適合なポリマー。本明細書の文脈において、２つのポリマーを水と混合したとき、２つの水相が形成され得るならば、一方のポリマーは他方のポリマーと不適合である。当該定義はまた、第１のポリマーが一方の相に優勢に存在し、第２のポリマーが他方の相に優勢に存在することを含む。
【００１４】
ミセル形成および非ミセル形成ポリマー
熱分離性ポリマーのミセル形成特性は、ポリマー濃度が純水およびポリマーからなる溶液中で変化するとき、曇点変化に反映される。図１参照：実験部分で使用したBreox PAG 50A 1000(International Speciality Chemicals Lt, Southampton, U.K.)の僅かに凹状の湾曲および疎水性に修飾したエチレンオキシドプロピレンオキシドランダムコポリマー(ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー)の強い凹状の湾曲が、Breoxが非ミセル形成性であり、そしてＨＭ−ＥＯＰＯポリマーがミセル形成性であることを反映している。単純にするため、および本発明の好ましい様式の文脈において、ミセル形成性熱分離性ポリマーは、そのＬＣＳＴの濃度で水と混合し、この温度より低い温度から高い温度まで温度を上げるとき、２つの相(その両方は、少なくとも７０％、例えば８０％の水濃度を有する)を与えることができるポリマーである。これらポリマーの多くは、顕著に低下したＬＣＳＴを示す。図１のＨＭ−ＥＯＰＯポリマー(ミセル形成性)のカーブをBreox(非ミセル形成性)と比較のこと。非ミセル形成性ポリマーは、ミセル形成性ポリマーの定義とは一致しない水溶性／水混和性ポリマーである。上記および下記のパーセンテージの値は、特記しなければ、ｗ／ｗに基く。
【００１５】
非ミセル形成性ポリマーは、通常、ミセル形成性ポリマーと不適合であり、このため非ミセル形成性ポリマーはしばしば水とミセル形成性ポリマーの混合物に対して曇点低下試薬として作用し、そして逆に、水と非ミセル形成性ポリマーの混合物にミセル形成性ポリマーを導入しても同様に作用する。
【００１６】
本発明
本発明により、上記定義のようにミセル形成性である熱分離性ポリマーを選択した場合に上記考察した目的に合うことが判明した。したがって、本発明は、予め決定した化合物の分離方法であって、
ｉ)少なくとも相の１つが熱分離性ポリマー(Ｉ)を多く含んでおり(相１)、他の相が少し含んでいる(相２)、２相システム(システムＡ)に該化合物を分配し、
ii)当該化合物を含む１つの相(相１または相２)を回収し、
iii)必要ならば、ステップiiで回収した相から当該化合物を後処理(work up)すること、
を含む方法に関する。
【００１７】
当該方法の特徴は、
ａ)ポリマー(Ｉ)がミセル形成性熱分離性ポリマーであること、そして
ｂ)相２が、熱分離性ポリマー(Ｉ)の曇点低下性の試薬、例えばポリマー(Ｉ)に不適合なポリマー(II)または塩を含み得ること、
である。
【００１８】
ポリマー(II)は、通常の場合、相２に優勢に存在する。
【００１９】
２相システムは、１つまたはそれ以上の更なる水溶性ポリマーを含む更なる水性液体相を含む多相システムの一部となり得る。
【００２０】
一方の相がポリマーを多く含み、他方の相がポリマーを少し含んでいるという表現は、一方の相が他方よりもポリマーを多く含む(５倍よりも多い)ということのみをいう。
【００２１】
２相は、分離すべき化合物を含むサンプルを含む必要な成分をシステムの曇点よりも低い温度で予め混合し、次いで、システムの曇点を超えるまで温度を上げることにより得ることができる。別法として、最終システムの曇点を超える温度で所定の２相システムの成分を混合する。
【００２２】
ポリマーの再利用
相のポリマーは、当該方法の第２回目のステップ(ｉ)において、それぞれ、ポリマー(Ｉ)およびポリマー(II)として再利用され、使用され得る。これは、相当量の分離すべき化合物および／または他の望ましくない成分を含まない場合に、直接相の再利用により、行われ得る。そうでなければ、以下の更なる分離ステップを実施することが好ましい。
例えば、
・ポリマー(Ｉ)：相１を、例えば、水および／または１つもしくはそれ以上の曇点低下剤を添加することにより、および／または形成され、そして相１を基礎とする相システムの曇点よりも高い温度に上げることにより、第２の相分離ステップに付される。この相分離ステップは、相１：１(ポリマー(Ｉ)を多く含む)および相１：２(ポリマー(Ｉ)を少し含んでいる)を生じる。必要ならば、緩衝性物質、ならびにステップ(ｉ)で分離すべき成分を分配に向かわせることができる、および／または望ましくない成分を相１：２に向かわせることができる物質を加える。次いで、望むならば、相１：１を、恐らくポリマー(Ｉ)に関して更なる富化の後、再利用できる。
・ポリマー(II)：ポリマーIIが熱分離性ポリマーである場合、相１と同じ原理を相２の再利用に適用し得る。例えば、水および／または曇点低下試薬を加え、恐らく続いて、相２を一方がポリマー(II)を多く含む相および他方がそれを僅かに含む相に分離するために(それぞれ、相２：１および相２：２)、温度を上げ得る。望むならば、相２：１を、当該方法の第２回目のステップ(ｉ)において、ポリマー(II)として再利用し、使用できる。ポリマー(Ｉ)および／またはポリマー(II)が再利用される場合、第２回目のステップ(ｉ)においてシステムＡに更なる量の各ポリマーを供する必要があるかもしれない。
【００２３】
熱分離性ポリマー(Ｉ)(ミセル形成性ポリマー)
システムＡのポリマー(Ｉ)の総量は、通常、最大でも５０％である。本発明の最も重要な利点の１つは、ポリマー(Ｉ)の我々の選択が２０％未満、さらに１０％未満(ｗ／ｗ)の濃度とし得ることである。
【００２４】
有用なミセル形成性熱分離性ポリマーは、９０℃以下、好ましくは５０℃以下、例えば４０℃以下または２０℃以下であるＬＣＳＴを典型的に有する。タンパク質およびオリゴまたはポリペプチド構造を有する他の化合物は、しばしば、熱感受性であり、そのため、４０℃以下または２０℃以下のＬＣＳＴを有するポリマーが必要となる。他方では、脂質または炭水化物構造を有する化合物は、しばしば、より熱に安定であり、９０℃までまたはそれよりも高いＬＣＳＴを有するミセル形成熱分離性ポリマーの使用が可能である。より低いＬＣＳＴを有するポリマーは、実際的な理由(加熱の必要が少ない)のためにより高いＬＣＳＴを有するポリマーよりも好ましい。
【００２５】
適当なポリマーの選択は、試験することにより、例えば、上記のような曇点を有する熱分離性ポリマーを純水と混合し、種々のポリマー濃度での曇点を決定し、図１に示し、そして相当する実験部分で述べられるような相図を構築することにより、行うことができる。
【００２６】
試験すべきポリマーの初期選択は、既知熱分離性ポリマー、例えば、Galaevら(Enzyme Microbiol. Technol. 15 (1993) 354-366)により示されるものの中に存在する多くの構造を含む水溶性の熱分離性ポリマー群からであり得る。
【００２７】
本発明に適当なミセル形成ポリマーの鍵となる特徴は、同一または異なる親水性モノマー単位からなる中央ポリマー部分と、それぞれ疎水性基からなる末端基であると考えられている。親水性モノマー単位(炭素、水素および酸素原子のみを含む)は、酸素原子数対炭素原子数が、少なくとも１／４、好ましくは少なくとも１／３となる比率を示す。疎水性末端基(酸素、炭素および水素原子を含む)は、酸素原子数と炭素原子数が、多くとも１／５の比率を示す。相当する法則が他の型の親水性および疎水性基の親水性および疎水性、それぞれに適用される。
【００２８】
ポリマーの中央部分は、直線状であるかまたは分枝状の鎖であり得る。中央部分は、多くの異なるまたは同一のサブユニットからなり、それぞれは、上記のような親水性モノマー単位の直鎖からなり、各サブユニットは他のサブユニットと２価架橋(divalent bridge)(サブユニットの一部ではなく全体でポリマーに水不溶性を付与するわけではない)で結合している。当該架橋は、直線状、分枝状または環状の２価Ｃ２−６−炭化水素基、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＲ１−、−ＣＯＯ−、−ＮＲ２Ｒ３−、−ＳＯ２ＮＲ１−、−ＯＣＯ−、−ＮＲ１ＣＯＮＲ２−、−ＮＲ２ＣＯＯ−[式中、Ｒ１−３は、水素、ならびに１−１２炭素原子を含む低級炭化水素、例えばＣ１−１２−アルキル、−アリールアルキルおよび−アルキルアリールから選択される]から選択される１つまたはそれ以上の構造エレメントを含み得る。
【００２９】
好ましい変法では、モノマー単位は、例えば、ランダムまたはブロックコポリマーのような、またはホモ重合体のようなエチレンオキシドおよび直線状または分枝状プロピレンオキシドから、ポリマー(Ｉ)の中央部分かサブユニットの何れかとして選択される(それぞれ、ランダムまたはブロックＥＯＰＯポリマー)。
【００３０】
疎水性基は、同一であっても異なっていてもよい。それらは、例えば、１−４の炭素原子が、上記で架橋連結サブユニットとして与えられた任意の構造性エレメントで一緒に置換された、１０−３０ｓｐ３−混成炭素原子を含む炭化水素基群から選択され得る。
【００３１】
ＥＰ２６０４３０は、適当なポリマーを含む構造の定義に該当するポリマーについて記載している。
【００３２】
ポリマーの水溶液用の曇点低下試薬
この試薬は、一方または両方の相(水溶性)に溶解できる塩、または非ミセル形成性でありおよび／またはポリマー(Ｉ)に不適合であり、それ故に相２中に主に存在する第２ポリマー(II)であり得る。また、低分子量水溶性非イオン性化合物は、曇点低下剤として作用し得る。
【００３３】
適当な塩は、塩化物、臭化物、酢酸、リン酸(ＰＯ４３−；ＨＰＯ４２−；Ｈ２ＰＯ４−)、硫酸(ＳＯ４２−)などの水溶性のナトリウム、カリウムおよびアンモニウム(Ｒ４Ｒ５Ｒ６Ｒ７Ｎ＋、この場合、Ｒ４−７は、水素、ならびにＣ１−３０アルキル、アリール、アラルキルおよびアルキルアリール(alkaryl))塩から選択され得る。
【００３４】
ポリマー(II)は、例えば、低いミセル形成傾向を有することにより、ポリマー(Ｉ)に不適合であるポリマーから選択され得る。例は、セルロース、デキストラン、デンプンなどのようなポリサッカライド（それは、必要ならば、適当に誘導および／または断片化し得る）、末端を誘導体化していないエチレンオキシドとプロピレンオキシドのランダムまたはブロックコポリマー、ポリエチレングリコールである。ポリマー(II)は、例えば、Galaevら(Enzyme Microb. Technol. 15 (1993) 354-66)により示されるもののから選択される、ポリマー(Ｉ)に不適合である熱分離性ポリマーであり得る。登録商標Breox、UconおよびPluronicsで販売されているポリマーについての上記考察もまた参照。
【００３５】
ポリマー(II)の熱分離性形の水溶液のための曇点低下試薬は、異なるポリマーがポリマー(II)に不適合性であるべきであることを除き、ポリマー(Ｉ)に習って選択され得る。
【００３６】
曇点上昇試薬
例は、脂肪族アルコール、荷電界面活性剤などである。この型の試薬は、通常、システムの曇点を上げるためだけに加えるのではなく、それらが有する幾つか他の性質を利用するために加えられる。例えば、荷電界面活性剤が、分離されるべき化合物の特定相への好都合な分配に使用され得る。
【００３７】
分離すべき化合物を他の層に向かわせる方法
化合物の分配は、化合物の電気的荷電に依存し得る。荷電がｐＨ依存の場合、相システムのｐＨは、本発明の方法のステップ(ii)で回収される相への化合物の最大限の分配を達成するように調節され得る。ｐＨ依存荷電を有し得る化合物の例は、オリゴまたはポリペプチド構造を示す化合物である。
【００３８】
分配係数は、温度に依存する。そのため、温度は、当該方法のステップ(ii)で回収される相への化合物の最大限の分配が達成されるように変え得る。
【００３９】
ステップ(ii)で回収される相への最大分配を達成するための第３の方法は、化合物と結合する能力を有し、それゆえ、ステップiiで回収される相中へ分離すべき化合物を安定化する物質を相システム中に組み込むことである(改善された分配)。例は、界面活性剤および塩である。
【００４０】
最大限の分配には、ｐＨ、温度および／または分離すべき化合物と結合する物質を、最適または最大量の化合物が望ましい相に分配されるように適用させることが含まれる。結合する物質の場合、これには、型および量が含まれる。
【００４１】
分離すべき化合物が、電気的に荷電している場合、その分配は、存在する対イオンの型に依存する。可溶性塩の添加は、しばしば、システムの対イオンプロファイルを変化させ、そのため、また分離すべき化合物の分配を変化させ得る。
【００４２】
分離すべき化合物が陽性に荷電している場合、比較的大きい(低濃度の荷電)陰イオンを含む塩は、より疎水性の相、この場合相１(ポリマー(Ｉ)を多く含む)への分配を改善し得る。典型例は、ハライドイオン(Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−など)、ＳＣＮ−、ＣｌＯ４−を含む塩および例えばカルボン酸陰イオン基、スルホン酸陰イオン基(例えばドデシルスルホン酸)、硫酸陰イオン基、ホスホン酸陰イオン基、リン酸陰イオン基を含む陰イオン性界面活性剤である。
【００４３】
分離すべき化合物が陰性に荷電している場合、比較的大きい(低濃度の荷電)陽イオンを含む塩は、より疎水性の相への分配を改善し得る。典型例は、一般式Ｒ４Ｒ５Ｒ６Ｒ７Ｎ＋[式中、Ｒ４−７は、例えば、水素ならびにＣ１−３０アルキル、アリール、アラルキルおよびアルキルアリールから選択され得る]の陽イオンを含むアルキルアンモニウム塩である。アンモニウム成分は、第一級、第二級、第三級または第四級アンモニウムイオン、例えばセチルトリエチルアンモニウム、ドデシルトリエチルアンモニウム、トリエチルアンモニウムおよび他の陽イオン界面活性剤であり得る。
【００４４】
最も低濃度の熱分離性ポリマー(Ｉ)を有する相(＝相２)への荷電化合物の分配を改善したい場合、分離すべき化合物に対する潜在的対イオンが少量であり、高濃度の荷電を有する水溶性塩を選択すべきである。この場合、陽性荷電化合物の分離に使用する典型的な塩は、ＰＯ４３−、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、ＳＯ４２−、ＡｃＯ−のような陰イオンおよび陰性荷電親水性ポリマー、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、ホスホン酸基、リン酸基のような陰イオン含有基を含むデキストラン、デンプンである。この場合、陰性荷電化合物の分離に使用される典型的な塩は、陽イオンが第一級、第二級、第三級および／または第四級アンモニウム基(−＋ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４[式中、Ｒ１−４は、ＨおよびＣ１−１２アルキル基、好ましくはＨまたはあるＣ１−１２アルキル基から選択される])を示す親水性ポリマーである塩である。
【００４５】
また他の型の化合物が、望ましい相への分配を改善するために添加され得る。典型例は、分離すべき化合物に対する親和性対応物であり、その対応物は、例えば、ポリマー、または界面活性剤のような該相に優先性を有する任意の他の成分への共有結合により、望ましい相への改善された分配を有するように誘導体化されている。
【００４６】
ステップ(ii)で回収される相および更なる後処理
この相は、添加成分がどのように選択されるか、および分離すべき化合物の分配に対してこれらが有する結果に依存して相１または相２の何れかである。特定の環境下では、例えば、粗開始サンプルが異なる相に優先性を有する２つの望ましい化合物を含むとき、相１および相２の両方が回収され、更に処理される。
【００４７】
目的が、精製された形のステップ(ｉ)で分離される化合物である場合、ポリマー(ポリマー(Ｉ)またはポリマー(II)のいずれか)が少ない相、すなわち水相中に化合物が存在するように相システムの成分を選択することが、しばしば有利となる。これは、当該化合物を相２へ、または、ポリマー(II)を多く含む場合、相２：２または相１：２へ向かわせるべきであることを意味する。これを達成するため、上記と同じ原理が、ポリマー(Ｉ)および／またはポリマー(II)の再利用を伴うかまたは伴わずに適用され得る。
【００４８】
ステップ(ｉ)で回収される相へ分離される化合物は、さらに、例えば、更なる２相分離(例えば上記概要のように)により、電気泳動、液体クロマトグラフィー(イオン交換、生体親和性などのクロマトグラフィー)、沈殿、密度勾配遠心分離、抽出などにより後処理され得る。
【００４９】
本発明は、ここでは、優先日に意図された最善の様式を提供する実験部分により解説される。
【００５０】
実験部分
材料および方法
材料：使用するＨＭ−ＥＯＰＯポリマーは、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド鎖のランダムコポリマーであり、それは各鎖の一端基とジイソシアン酸イソホロンの各イソシアネート基との反応から誘導された中央基に隣接する。残りの端の両方には、Ｃ１４Ｈ２９アルキル基が存在する。合成については、ＥＰ２６０４３０を参照のこと。使用するポリマーの分子質量は、約７５００−８０００Ｄａであった。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーは、Akzo Nobel, Stenungsund, Swedenから得た。無脂肪酸ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)は、Boehringer Mannheim, Mannheim, Germanyから得、鶏卵リゾチームは、Sigma Chemicals Co, St Louis, MO, U.S.A.から得た。精製されたアポリポタンパク質Ａ−１は、Pharmacia & Upjohn, Stockholm, Swedenから頂き、それは、組換え体変異体、Milanoであり、通常のモノマー型とは対照的な二量体である(Persson et al., J. Chromatog. 711 (1998) 97-109)。すべての塩は、分析用の品質であった。Millipore水をすべての溶液に使用した。リン酸トリエチルアンモニウムのストック溶液を、リン酸をトリエチルアンモニウムに滴下することにより調製した。トリエチルアンモニウムリン酸塩溶液塩は、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートと略する。ヒトの血漿およびE.coli抽出物はPharmacia & Upjohn, Stockholm, Swedenから頂いた。ヒトの血漿は、通常のモノマー型のアポリポタンパク質Ａ−１を含んでいた。
【００５１】
相図
温度対ポリマー濃度の相図を、異なる温度でシステムを分離し、相の上部および下部、それぞれのポリマーの濃度を測定することにより作成した。ポリマー濃度は、屈折率の測定により決定した。屈折率測定器は、Carl Zeiss, Oberkochen/Wuertt., Germanyであった。屈折率測定は、４℃で行った。
【００５２】
当該システムの曇点は、水浴中でマグネットスターラーで攪拌しながら一相システムを加熱することにより決定した。曇点は、溶液が濁り出す温度とした。加熱速度は、１℃／分未満であった。
【００５３】
塩分配の研究
塩の分配は、無タンパク質システムにおける伝導率測定で測定した。ポリマー濃度は４％(ｗ／ｗ)であり、システム中の塩濃度は５０ｍＭであった。Ｎａ−ホスフェートを含む当該相システムは、２２℃で分離し、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートおよびＮａＣｌＯ４を有するシステムは、２７℃で分離した。ｐＨ７のＮａ−ホスフェートおよびＥｔ３ＮＨ−ホスフェートは陰イオンＨ２ＰＯ４−およびＨＰＯ４２−を含む。当該サンプルを、水浴中で一晩静置し、分離した。使用する伝導率測定器はMetrohm 644 (Herisan, Switzerland)であった。すべてのシステムについて２つ調製し、平均値をとった。
【００５４】
タンパク質分配試験
純粋ＢＳＡ、リゾチームおよびアポリポタンパク質Ａ−１の分配の全ての実験において、塩濃度は５０ｍＭであり、緩衝液濃度は１０ｍＭであった(リン酸ナトリウムｐＨ７.０)。リン酸ナトリウムを本システム中で塩として使用したとき、総ホスフェート濃度は６０ｍＭであった(即ち５０ｍＭ塩＋１０ｍＭ緩衝液)。ポリマー濃度は４％(ｗ／ｗ)であり、タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。８ｇシステムを調製し、０−４℃で注意深く混合した。これらの温度で全てのシステムは１相であった。冷システムの各々から７ｇを回収し、目盛り付ピペットに入れ、それの上下をパラフィルムで密封した。システムが入ったピペットを必要な溶液温度の水浴に浸した。最初にシステムを試験温度で平衡化し、再混合し、分離した。システムを２−３時間放置した。上部および底部相の容量を読んだ。相を注意深く分離し、分析した。全てのシステムのデュプリケートを調製した。
【００５５】
ヒト血漿からのアポリポタンパク質の精製
熱分離性ポリマーを血漿に純粋成分として添加した。システムの総質量は６.０ｇであり、４％(ｗ／ｗ)ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーおよび３ｇヒト血漿を含んだ。あるシステムには１００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４を添加した。システム中の総タンパク質濃度は１５ｍｇ／ｍｌであった。システムのｐＨは、２２℃で混合システムで測定して７.８であった。システムを２６℃で８０分、水浴中で分離した。
【００５６】
E. coli抽出物からのアポリポタンパク質の精製
組換えアポリポタンパク質Ａ−１、変異型MilanoをE. coli発酵で発現させた。アポリポタンパク質Ａ−１は細胞膜周辺腔に運搬され、それはその後発酵ブロス中に得られた。細胞を凝集および続く遠心により除去した。アポリポタンパク質Ａ−１を含む上清を、１００００Ｍｒカットオフの膜を使用した限外濾過で８倍に濃縮した(Persson et al., J. Chromatog. 711 (1998) 97-109)。限外濾過後のアポリポタンパク質の濃度は２.５ｍｇ／ｍｌ（ELISAアッセイで測定)であり、総タンパク質濃度は２７ｍｇ／ｍｌであった(Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254)にしたがって決定)。このE. coli抽出物中の緩衝液は２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ８.０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.１％  Tween 80であった。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー水システムにおける精製を、７.０ｇシステムで行った。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー濃度は４％(ｗ／ｗ)であり、E. coli抽出物１.０ｇを３.７ｇの上記緩衝液に加えて添加した。システム中の総タンパク質濃度は４ｍｇ／ｍｌであり、アポリポタンパク質Ａ−１濃度は０.４ｍｇ／ｍｌであった。システムのｐＨは混合システムで測定して７.５であった。
【００５７】
タンパク質および酵素測定
相システムにおける純粋タンパク質の測定を、１ｇサンプルと、サンプルにおける熱分離を予防する１ｍｌ  ５０％(ｖ／ｖ)メタノールの混合により行った。この混合物のタンパク質濃度は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度で測定した。リゾチームをShugar(Shugar, Biochim. Biophys Acta 8 (1952) 302-)にしたがった活性測定により測定した。使用したスペクトロフォトメーターはUV-2101 PC(島津株式会社、京都、日本)であった。分配係数はＫ＝Ｃｔ／Ｃｂ(式中、ＣｔおよびＣｂは各々上部および底部相のタンパク質濃度である)である。システムのｐＨは分離後除去した上部相で測定した。
【００５８】
ヒト血漿からアポリポタンパク質Ａ−１を精製したとき、タンパク質の分配はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での上部および底部相の分析により定量的に測定した。Phast System(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を使用し、ゲルは均質２０％ＳＤＳゲルであった。ゲルをCoomassie R350で染色し、濃度計での走査により分析した(Personal Densitometer SI, Molecular Dynamics, Sunnyvale, Ca, U.S.A.)。
【００５９】
E. coli抽出物を分配したときのアポリポタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡで測定した(Persson et al., J. Chromatog. 711 (1998) 97-109)。ビオチン抗体接合体を使用し、更に、アルカリフォスファターゼ結合したアビジンに結合させた。アルカリフォスファターゼをマーカーとして使用し、吸収を４０５ｎｍで測定した。
【００６０】
収率を：
収率＝(ＣｔApo×Ｖｔ)／(ＣApo×Ｖ)
(式中、ＣｔApoは上部相中のアポリポタンパク質Ａ−１の濃度およびＶｔは上部相の容量、ＣApoは出発物質中のアポリポタンパク質Ａ−１の濃度およびＶはシステムに添加した物質の容量である)
として計算した。システムにおけるアポリポタンパク質の精製係数は：
精製係数＝(ＣｔApo／Ｃｔ)／(ＣApo／Ｃ)
(式中、Ｃｔは上部相中のタンパク質濃度およびＣは出発物質中のタンパク質の濃度である)
として計算した。
【００６１】
結果
水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステム
水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー(■)および水／Breox PAG 50A 1000システム(●)に関する温度対ポリマー濃度相ダイアグラムを図１に示す。相分離は温度の上昇により誘導する。共存曲線の上で溶液相は二つの肉眼で見える相に分離する。形成された層は両方とも水性であり、一つはポリマーに富み、他方はポリマーが少ない(図１)。共存曲線の最小である低臨界点は３％ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーおよび１４℃である。数個の試験された熱分離性水／ポリマーシステムとは異なり(Saeki et al., Polymer 17 (1976) 685-; Karlstroem, J. Phys. Chem. 89 (1985) 4962-; Johansson et al., Macromolecules 26 (1993) 4478-; およびNystroem et al., Langmuir 11 (1995) 1994-2002)、水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステムは相分離のポリマー濃度への強い依存性を示し、即ち、共存曲線が明白な凹状の上向き形を有する。ポリマー富化相はＥＯおよびＰＯの他の熱分離性ランダムコポリマーと比較して、高濃度の水を含む(Johansson et al., Macromolecules 26 (1993) 4478-; およびJohansson et al., Biochim. Biophys Acta 1290 (1996))。１７から３０℃の間で、ポリマー富化相中のポリマー濃度は５−９％であり、水相中でポリマー濃度は１％以下である。水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステムは先に試験された熱分離性水／Ｕｃｏｎシステムよりも、より高い粘性を示す。ポリマーの相対的に高い粘性は、注意深い混合および長い平衡時間を必要とする。試験した全てのシステムにおいて、ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相は下部相であり、水相は上部相であった(図２および図３)。
【００６２】
塩分配
全ての試験した例において、塩は水相に強く分配し、Ｋは１以上であった。塩の分配係数はＮａ−ホスフェート(Ｋ＝１.３８)からＥｔ３ＮＨ−ホスフェート(Ｋ＝１.２７)およびＮａＣｌＯ４(Ｋ＝１.１８)で減少した。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相はより疎水性の相であり、塩の相対的疎水性は低い分配係数で増加する。これは、試験した塩でＮａＣｌＯ４が最も疎水性であり、Ｎａ−ホスフェートが最も親水性であることを示す。
【００６３】
タンパク質の分配における異なる塩の効果
上記の方法において記載した組成のシステムに関して、ＮａＣｌＯ４含有システムの曇点は１４℃、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェート含有システムは１３℃およびリン酸ナトリウム含有システムは９℃であった。ＮａＣｌＯ３およびＥｔ３ＮＨ−ホスフェート含有システムを２６℃で分離した。リン酸ナトリウム含有システムを２２℃で分離した。各システムを曇点の約１３℃上で分離した。これを行うことにより、システムは臨界点から同じ距離になり、相の容量比は非常に類似となった。したがって、相は比較可能になった。このセクションにおいて、全ての分配試験はｐＨ７.０で行った。
【００６４】
ａ)陰性に荷電したアポリポタンパク質Ａ−１、ｐＩ５.６−５.７(Brouillette et al., Biochom. Biophys. Acta 1256 (1995) 103-109)は、Ｋ値０.０２以下でポリマー富化相に強く分配した。最強の分配がシステムにおけるＥｔ３ＮＨ−ホスフェートで得られた(Ｋ＝０.００５)。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相への最も弱い分配は、システムにおけるＮａＣｌＯ４で得られた。
【００６５】
ｂ)陰性に荷電したＢＳＡ、ｐＩ５.０(Righetti et al., J. Chromat. 220 (1981) 115-194)は、アポリポタンパク質Ａ−１と比較してより水相に分配した。ＮａＣｌＯ４含有システムが、水相への最も強い分配を提供した。Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートとリン酸ナトリウム含有システムの間の分配係数は僅かな差しかなかった。
【００６６】
ｃ)リゾチーム、ｐＩ１１.０(Righetti et al., J. Chromat. 220 (1981) 115-194)は、ＮａＣｌＯ４が存在するとき、ポリマー富化相に最も強く分配した(Ｋ＝０.６)。ポリマー富化相が優先することは、しかし、この場合、アポリポタンパク質Ａ−１よりもはるかに弱かった。ＢＳＡの場合と同様、塩Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートとリン酸ナトリウムは同様の分配係数を提供し、リゾチームは水に分配された。酵素活性の有意な損失はこれらのシステムで見られなかった。上部および底部相で一緒に回収されたリゾチーム活性は、ＮａＣｌＯ４、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートおよびＮａ−ホスフェートシステムで１０２、１０３および１０３％であった。
【００６７】
分配における異なる層分離温度の効果
温度は相中のポリマー濃度に強く影響する(図１参照)。結果は、アポリポタンパク質Ａ−１の分配係数が、温度によりどのように変化するかを示した。システム組成は４％(ｗ／ｗ)ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー、６０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.０、およびアポリポタンパク質Ａ−１の濃度は１.０ｍｇ／ｍｌであった。アポリポタンパク質Ａ−１は試験した全ての温度でポリマー富化相が優先した。ポリマー富化相への最も強い分配がＫ値０.０２で２２から３２℃の間で得られた。４０℃を越えてもタンパク質はまたポリマー富化相に分配したが、はるかに強度は低かった(５０および６０℃でＫ＝０.５−０.６)。
【００６８】
ＢＳＡの分配におけるｐＨの効果
これらの実験におけるシステムの組成は４％(ｗ／ｗ)ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー、１００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ緩衝液および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡであった。使用した緩衝液はクエン酸ナトリウム(ｐＨ３.０)、酒石酸ナトリウム(ｐＨ５.０)およびリン酸ナトリウム(ｐＨ６.０および７.０)であった。分離後に上部相で測定したｐＨ値は各々３.３、４.３、５.０、６.０および７.０であった。非荷電(ｐＨ５.０)および陰性荷電(５.０を越えるｐＨ)ＢＳＡは、水相により分配した。ＢＳＡの等電点以下の分配係数の劇的な減少があった、ｐＨ＝５.０でＫ＝１.９、ｐＨ４.３でＫ＝０.０３およびｐＨ３.３でＫ＝０.０１。異なる塩の低いｐＨでの効果を比較するために、唯一の塩としてＮａ−ホスフェート(１００ｍＭ)を有する水／BermodolシステムにおけるＢＳＡの分配を行った。ｐＨは４.３であり、このシステムのＫ値は１.２±０.１であった。したがって、ホスフェートからＣｌＯ４−へのアニオンの変化は、ポリマー富化相への非常な分配をもたらした。
【００６９】
逆抽出
ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相から水相への逆抽出の技術を純粋アポリポタンパク質Ａ−１で試験した(図２の原理参照)。このタンパク質を４％ＨＭ−ＥＯＰＯ−水システムに分配し、２７℃で分離した。システム中の塩および緩衝液は２０ｍｍ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７.４、１５０ｍｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.１％  Tween 80であった。アポリポタンパク質Ａ−１は、２７℃でＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配した(Ｋ＝０.０１５±０.００５)。９６±のアポリポタンパク質Ａ−１がこの相で検出された。上部水相を回収し、等量の１０ｍＭ  Tris−Ｈｃｌ緩衝液ｐＨ８.５および１００ｍＭのＮａＣｌＯ４と交換した。システムを混合し、再び５０℃で２０分分離させた。この処理の後、先にＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に分配していたタンパク質の９４±１％が、新規水相に分配係数Ｋ＝４.０±１.０で逆抽出された。したがって、タンパク質の総回収は９０±１％であった。
【００７０】
ヒト血漿からのアポリポタンパク質の精製
ヒト血漿を、水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステム中での分配によるアポリポタンパク質Ａ−１の単離のためのタンパク質溶液として使用した。１００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４の添加をしたシステム、および余分の塩を添加しなかった他のシステムを試験した。アルブミン、ｐＩ４.８(１８)はヒト血漿で優位なタンパク質であり、ヒトアルブミンはＢＳＡと非常に類似した分配行動を有すると予期された。したがって、ＮａＣｌＯ４をアルブミンを水相に向かわせるために添加した。相分離を２６℃で８０分行った。
【００７１】
ゲル電気泳動からの結果は、アポリポタンパク質Ａ−１が殆ど排他的にポリマー富化相に分配され、アルブミンは水相に優勢に分配されたことを示す。ＮａＣｌＯ４の添加ありまたはなしのシステムで比較したとき、総タンパク質の分配に殆ど変化はなかった、各々Ｋ＝５.６±０.５およびＫ＝４.７±０.５。アポリポタンパク質Ａ−１に関して、対応する分配係数は各々０.０９±０.０１およびＫ＝０.０８±０.０１であった。約７の精製係数が、アポリポタンパク質Ａ−１の、水／ＨＭ−ＥＯＰＯシステムにおけるＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相への抽出により達成された。
【００７２】
E. coli抽出物からのアポリポタンパク質の逆抽出による精製
E. coliの無細胞発酵溶液からの組換えアポリポタンパク質の精製を試験した。E. coli抽出物を４％水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステムに分配した。システムにおいて、２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７.４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.１％  Tween 80を含む緩衝液を使用した。システムを６０分、３０℃で水浴中で２相に分離させた。表４において、第１の抽出システムにおけるアポリポタンパク質の分配係数を示し、Ｋ＝０.０４±０.０１である。アポリポタンパク質はＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配し、より親水性の汚染タンパク質は、水相に分配された。アポリポタンパク質Ａ−１は、ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相への分配により約７倍(７±２)精製され、この相からのタンパク質の回収は９５％以上であった。
【００７３】
純粋アポリポタンパク質Ａ−１のために開発された逆抽出の技術を、E. coli抽出物からのアポリポタンパク質Ａ−１の精製に使用した。アポリポタンパク質Ａ−１をＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に抽出し、汚染タンパク質を水相と共に除去した。Tris−ＨＣｌ  ｐＨ８.５および１００ｍｍ  ＮａＣｌＯ４を含む新しい水相を添加した(図２参照)。５０℃での熱分離の後、アポリポタンパク質Ａ−１は、水相にＫ＝６.０±１で抽出された。逆抽出は９５％以上の収率で、７±２の精製係数で行うことができた。アポリポタンパク質Ａ−１の総回収は９０％以上であった。
【００７４】
２ポリマー２層システム
分離実験において、水、ＨＭ−ＥＯＰＯおよびBreox PAG 50A(International Speciality Chemicals Ltd, Southhamptoin, U.K.)から形成される２層システムを試験した。Breox PAG 50A 1000は等量のエチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイドのランダムコポリマーであり、相対的に高い曇点(１０％濃度でＬＣＳＴ５０℃)を有する。温度をコポリマー曇点以上に上げることにより、両方のコポリマーを相分離することが可能である。図３参照。ＰＥＧ／デキストランシステムと比較して、相対的に低い濃度のコポリマーが２層の形成に必要である(各コポリマー２％(ｗ／ｗ))。Breox／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーから成る水性２相システムは、タンパク質の分離に使用できる。ＢＳＡとリゾチームの分離は、ＰＥＧ／デキストランシステムと類似の方法における塩添加により指示できる。両親媒性アポリポタンパク質Ａ−１はＨＭ−ＥＯＰＯポリマーにより形成されたミセルと相互作用し、ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配する。上部Breox相および底部ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相の熱分離後、水溶液中のタンパク質の回収およびコポリマーの回収と再利用が可能である。熱分離後、９７.５％のＨＭ−ＥＯＰＯポリマーおよび７３％のBreoxコポリマーが回収できた。アポリポタンパク質Ａ−１は、無細胞E. coli発酵溶液からＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に抽出できた。再利用コポリマーのシステムは、３つのポリマー再利用の間、類似の精製係数および収率を示した。
製品名：Breox、Ucon、Triton、Tween、Metrohm、Phast SystemおよびCoomassieは商標登録されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  水／ＨＭ−ＥＯＰＯシステム(●)および水／Breox PAG 50A 100(■)に関する実験的に測定した相ダイアグラム。
【図２】  水／ポリマー水性２相システムにおけるタンパク質精製。標的タンパク質(白色点)をポリマー相(ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー)にポリマーの曇点(ＣＰＴ、１４℃)を越える温度で分配する。汚染タンパク質(黒色点)は主に水相に分配する。相を分離し、逆抽出のために新規水相をポリマー相に添加する。ｐＨ(および／または塩)を変え、熱分離を第１抽出よりも高い温度で行う。標的タンパク質は水相に逆抽出し、ポリマーは再利用される。
【図３】  熱分離性ポリマーを有する水性２相システムにおけるタンパク質分離およびポリマーの再利用。最初に、ポリマーBreox PAG 50A 100およびＨＭ−ＥＯＰＯポリマーから成る水性２相システムを混合する。相分離後、上部Breoxおよび底部ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相を単離し、ポリマーの曇点を越える温度の水浴に移す。これは水相およびポリマー富化相の形成を導く。水相の回収後、ポリマーを回収し、新規水性２層システムに再使用できる。