(57)【要約】本発明は、微生物にグリセリン資化能を付与する手段を提供することを目的とする。本発明は、細菌にグリセリン取り込みタンパク質遺伝子を導入することにより、該細菌にグリセリン資化能を付与する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌にグリセリン取り込みタンパク質遺伝子を導入することにより、該細菌にグリセリン資化能を付与する方法。
【請求項２】
細菌がコリネ型細菌である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
細菌がラルストニア属細菌である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
ラルストニア属細菌がラルストニア・ユートロファである、請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
細菌がアルカリゲネス属細菌である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項７】
アルカリゲネス属細菌がアルカリゲネス・ファエカリスである、請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】
グリセリン取り込みタンパク質遺伝子が大腸菌由来ｇｌｐＦ遺伝子である、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
グリセリン取り込みタンパク質遺伝子がコリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＦ遺伝子である、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
細菌にグリセロールキナーゼ遺伝子をさらに導入する、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
グリセリン取り込みタンパク質をコードする遺伝子が導入された、グリセリン資化能を有する組換え細菌。
【請求項１２】
コリネ型細菌である、請求の範囲第１１項記載の組換え細菌。
【請求項１３】
コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求の範囲第１２項記載の組換え細菌。
【請求項１４】
ラルストニア属細菌である、請求の範囲第１１項記載の組換え細菌。
【請求項１５】
ラルストニア・ユートロファである、請求の範囲第１４項記載の組換え細菌。
【請求項１６】
アルカリゲネス属細菌である、請求の範囲第１１項記載の組換え細菌。
【請求項１７】
アルカリゲネス・ファエカリスである、請求の範囲第１６項記載の組換え細菌。
【請求項１８】
グリセリン取り込みタンパク質遺伝子が大腸菌由来ｇｌｐＦ遺伝子である、請求の範囲第１１項〜第１７項のいずれか１項記載の組換え細菌。
【請求項１９】
グリセリン取り込みタンパク質遺伝子がコリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＦ遺伝子である、請求の範囲第１１項〜第１７項のいずれか１項記載の組換え細菌。
【請求項２０】
グリセロールキナーゼ遺伝子がさらに導入された、請求の範囲第１１項〜第１９項のいずれか１項記載の組換え細菌。
【請求項２１】
請求の範囲第１１項〜第２０項のいずれか１項記載の組換え細菌を、グリセリンを含有する培地で培養し、培養物から発酵生成物または反応生成物を取得することを含む、発酵生成物または反応生成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌にグリセリン資化能を付与する方法、グリセリン資化能を有する組換え細菌、および該組換え細菌を用いてを発酵生成物または反応生成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
界面活性剤産業やバイオディーゼル燃料産業においては、グリセリンが副産物として大量に排出される。通常グリセリンは、ニトログリセリンの製造、そのほか医薬および化粧品などに用いられるが、上記の副産物として排出されるグリセリンは不純物を含んだ水溶液の状態であるため、そのまま上記用途に用いることはできず廃棄されているのが現状である。このように廃棄物となるグリセリンを有効利用することができれば、地球環境問題など資源の有効活用の面からも非常に好ましいと考えられる。
一方、現在まで、微生物による有用生産物の製造において、その発酵原料として利用されるのは、農産物に由来する糖質がほとんどである。アミノ酸、有機酸などの有用物質を発酵生産するために広く使用されているコリネ型細菌もまた、グルコースを炭素源としている。しかしながら、今後農産物に由来する糖価格は上昇の傾向にあるため、その代替発酵原料が求められている。糖以外の炭素源を資化する能力を微生物に付与する方法としては、コリネ型細菌にメタノール脱水素酵素遺伝子を導入し、さらにヘキシュロースフォスフェートシンターゼ遺伝子およびホスホヘキシュロイソメラーゼ遺伝子を導入することにより、同細菌にメタノール資化能を付与する方法が報告されている（特開２００４−２６１１５０号公報）。しかし、微生物にグリセリン資化能を付与することについては知られていない。
上記の界面活性剤産業やバイオディーゼル燃料産業において副産物として排出される不純物を含んだグリセリン水溶液は、発酵原料として用いる場合には問題がないことから、微生物にグリセリン資化能を付与してグリセリンを原料に有用物質を製造することは、糖以外の発酵原料の開発という観点だけでなく、廃棄物の有効利用という観点からも望まれている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、微生物にグリセリン資化能を付与する手段を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、細菌にグリセリン取り込みタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、細菌がグリセリン資化能を獲得することを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）細菌にグリセリン取り込みタンパク質遺伝子を導入することにより、該細菌にグリセリン資化能を付与する方法。
（２）細菌がコリネ型細菌である、（１）記載の方法。
（３）コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、（２）記載の方法。
（４）細菌がラルストニア属細菌である、（１）記載の方法。
（５）ラルストニア属細菌がラルストニア・ユートロファである、（４）記載の方法。
（６）細菌がアルカリゲネス属細菌である、（１）記載の方法。
（７）アルカリゲネス属細菌がアルカリゲネス・ファエカリスである、（６）記載の方法。
（８）グリセリン取り込みタンパク質遺伝子が大腸菌由来ｇｌｐＦ遺伝子である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）グリセリン取り込みタンパク質遺伝子がコリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＦ遺伝子である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（１０）細菌にグリセロールキナーゼ遺伝子をさらに導入する、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）グリセリン取り込みタンパク質をコードする遺伝子が導入された、グリセリン資化能を有する組換え細菌。
（１２）コリネ型細菌である、（１１）記載の組換え細菌。
（１３）コリネバクテリウム・グルタミカムである、（１２）記載の組換え細菌。
（１４）ラルストニア属細菌である、（１１）記載の組換え細菌。
（１５）ラルストニア・ユートロファである、（１４）記載の組換え細菌。
（１６）アルカリゲネス属細菌である、（１１）記載の組換え細菌。
（１７）アルカリゲネス・ファエカリスである、（１６）記載の組換え細菌。
（１８）グリセリン取り込みタンパク質遺伝子が大腸菌由来ｇｌｐＦ遺伝子である、（１１）〜（１７）のいずれかに記載の組換え細菌。
（１９）グリセリン取り込みタンパク質遺伝子がコリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＦ遺伝子である、（１１）〜（１７）のいずれかに記載の組換え細菌。
（２０）グリセロールキナーゼ遺伝子がさらに導入された、（１１）〜（１９）のいずれかに記載の組換え細菌。
（２１）（１１）〜（２０）のいずれかに記載の組換え細菌を、グリセリンを含有する培地で培養し、培養物から発酵生成物または反応生成物を取得することを含む、発酵生成物または反応生成物の製造方法。
本発明は、本願の優先権の基礎である特願２００５−２２１２８２号の特許請求の範囲、明細書および図面に記載された内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例１において大腸菌形質転換体からプラスミドを抽出しインサートの確認を行った結果を示す。
図２は、実施例２においてコリネバクテリウム・グルタミカムへのハイブリッドプラスミド導入を確認した結果を示す。
図３は、実施例３におけるＫＯＤ−遺伝子ポリメラーゼを用いたｇｌｐＦＫ遺伝子のＰＣＲ増幅の結果を示す。
図４は、ＰＣＲ増幅により得られたｇｌｐＦＫ遺伝子のバンドを切り出して回収し、ｐＣＲ４ＴＯＰＯに固定した結果を示す。
図５は、実施例３においてｇｌｐＦＫ−ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８プラスミドのインサートを確認した結果を示す。
図６は、ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８シャトルベクターに大腸菌のｇｌｐＦＫ遺伝子を導入したプラスミドｇｌｐＦＫ−ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８を、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株にエレクトロポレーションで導入した結果を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法において、グリセリン取り込みタンパク質遺伝子を導入する細菌としては、通常、グリセリン資化能を有しない細菌を用いる。また、好ましくはグリセロールキナーゼ遺伝子を有する細菌を用いる。好ましくはコリネ型細菌、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌またはアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌を用いる。
コリネ型細菌は、Ｂａｒｇｅｙｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、８、５９９（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌を意味し、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ならびに従来ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９８１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含み、具体的には以下のものが例示される：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｉｕｍ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｌｖｏｌｕｍ。本発明の方法において遺伝子を導入する細菌としては、好ましくはコリネバクテリウム属細菌を用い、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いる。
遺伝子を導入する細菌としてラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌を用いることもできる。ラルストニア属細菌としては、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｏｘａｌａｔｉｃａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｉｎｓｉｄｉｏｓａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｍａｎｎｉｔｏｌｉｌｙｔｉｃａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ等が挙げられる。本発明の方法において遺伝子を導入する細菌としては、好ましくはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）を用いる。
また、遺伝子を導入する細菌としてアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌を用いることもできる。アルカリゲネス属細菌としては、例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ａｅｓｔｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｃｕｐｉｄｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｐａｃｉｆｉｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｒｕｈｌａｎｄｉｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｖｅｎｕｓｔｕｓ等が挙げられる。本発明の方法において遺伝子を導入する細菌としては、好ましくはアルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）を用いる。
グリセリンを原料とした物質生産の宿主細菌としての性質を調べる中で、本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム、ラルストニア・ユートロファおよびアルカリゲネス・ファエカリスが、グリセリンを炭素源とした培地で明確な生育を示さないことを見いだした。コリネバクテリウム・グルタミカム、ラルストニア・ユートロファおよびアルカリゲネス・ファエカリスは、グリセリンをリン酸化して代謝の中枢に導くグリセロールキナーゼ遺伝子が有しているにも関わらず、グリセリン資化能を有しないことは驚くべきことであった。一実施形態において本発明は、上記知見に基づくものである。
グリセリン取り込みタンパク質は、疎水性タンパク質であり、細胞膜に挿入された状態をとることにより、細胞外と内部をつなぐチャンネルを形成し、グリセリンの細胞内への取り込みを促進する働きをすると考えられている。本発明において、細菌に導入するグリセリン取り込みタンパク質遺伝子としては、グリセリンの細胞内への取り込みを促進する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されないが、グリセリン資化能を有する微生物に由来するもの、好ましくはｇｌｐＦ遺伝子を有するもの、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属、Ｘｙｌｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌に由来するもの、具体的には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ  ｘｙｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）に由来するものなどが挙げられ、大腸菌由来のものが好ましい。また、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）に由来するものも好ましく用いられる。なお、本発明において、遺伝子には、核酸、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。
大腸菌やコリネバクテリウム・ジフテリアなどのグリセリン資化能を有する微生物には、グリセリンの取り込みに関与すると考えられているｇｌｐＦＫ遺伝子が存在しており、ｇｌｐＦはグリセリン取り込みタンパク質（ファシリテーターとも称される）、ｇｌｐＫはグリセロールキナーゼをコードしている。本発明において細菌に導入するグリセリン取り込みタンパク質遺伝子としては、ｇｌｐＦ遺伝子、特に大腸菌由来ｇｌｐＦ遺伝子およびコリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＦ遺伝子が好ましい。
グリセリン取り込みタンパク質遺伝子の具体例としては、配列番号１または７で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。本発明のグリセリン取り込みタンパク質遺伝子には、配列番号１または７の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子が包含される。ここで「機能的に同等」とは、対象となる遺伝子によってコードされるタンパク質が、配列番号１または７の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。
あるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子を調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９））を利用する方法が挙げられる。
配列番号１または７の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、配列番号１または７の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。当該遺伝子によってコードされるタンパク質は、グリセリン取り込みタンパク質の活性、すなわちグリセリンの細胞内への取り込みを促進する活性を有する。
ストリンジェントな条件とは、ＤＩＧ遺伝子Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製、カタログ番号１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製カタログ番号１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）を意味する。
すなわち、配列番号１または７に記載の塩基配列全長において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断による核酸断片の変異、欠失、連結等により、部分的にその配列が変化したものであっても、これらの変異型遺伝子が配列番号１または７の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記グリセリンの細胞内への取り込みを促進する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、配列番号１または７に示した塩基配列との相違に関わらず、グリセリン取り込みタンパク質遺伝子に含まれる。
また本発明においてグリセリン取り込みタンパク質遺伝子には、配列番号１または７の塩基配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子も包含される。
グリセリン取り込みタンパク質遺伝子には、配列番号２または８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。該遺伝子には、配列番号２または８のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子が包含される。「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、配列番号２または８のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。
配列番号２または８のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質としては、配列番号２または８のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。当該タンパク質は、上記のグリセリン取り込みタンパク質の活性、すなわちグリセリンの細胞内への取り込みを促進する活性を有する。
配列番号２または８のアミノ酸配列における、１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換は、常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０  ６４７８−６５００，１９８２）により、実施することができる。
ここで、タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、異なるアミノ酸残基間の保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）またはアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が知られている。
従って、配列番号２または８のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換が生じた結果得られたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質であっても、その変異が配列番号２または８に記載のアミノ酸配列の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異型タンパク質が上記グリセリン取り込みタンパク質の活性を有しているのであれば、これらの変異型タンパク質をコードする遺伝子もまたグリセリン取り込みタンパク質遺伝子に包含される。ここで、数個とは、通常２〜５個、好ましくは２〜３個である。
また本発明においてグリセリン取り込みタンパク質遺伝子には、配列番号２または８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含される。
一実施形態においては、上記細菌に、さらにグリセロールキナーゼ遺伝子を導入する。グリセロールキナーゼは、グリセリンをリン酸化する活性を有するタンパク質であり、グリセリンの代謝において、以下の反応を触媒する活性を有する。
グリセロール＋ＡＴＰ→Ｌ−グリセロール−３−リン酸＋ＡＤＰ
グリセロールキナーゼ遺伝子としては、グリセリンをリン酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されないが、グリセリン資化能を有する微生物に由来するもの、好ましくはｇｌｐＫ遺伝子を有するもの、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属、Ｘｙｌｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ属、Ａｑｕｉｆｅｘ属、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属の細菌に由来のものが挙げられる。具体的には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅ���ｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ  ｘｙｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２（特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓに由来するものなどが挙げられ、本発明においては、大腸菌由来のものが好ましい。また、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）に由来するものも好ましく用いられる。
本発明において細菌に導入するグリセロールキナーゼ遺伝子としては、上記ｇｌｐＦＫ遺伝子におけるｇｌｐＫ遺伝子、特に大腸菌由来ｇｌｐＫ遺伝子およびコリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＫ遺伝子が好ましい。グリセロールキナーゼ遺伝子は、導入するグリセリン取り込みタンパク質遺伝子と同じ細菌に由来するものが好ましい。グリセリン取り込みタンパク質遺伝子として大腸菌由来ｇｌｐＦ遺伝子を導入する場合は、大腸菌において同一のオペロンに存在する大腸菌由来ｇｌｐＫ遺伝子を導入することにより、グリセリン資化能に優れた組換え細菌を得ることができる。また、グリセリン取り込みタンパク質遺伝子としてコリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＦ遺伝子を導入する場合は、コリネバクテリウム・ジフテリアにおいて同一のオペロンに存在するコリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＫ遺伝子を導入することにより、グリセリン資化能に優れた組換え細菌を得ることができる。また、ｇｌｐＦ遺伝子とｇｌｐＫ遺伝子は、大腸菌またはコリネバクテリウム・ジフテリア等においてｇｌｐ（グリセロールホスフェートオペロン）に含まれるｇｌｐＦＫ遺伝子として導入することがさらに好ましい。
グリセロールキナーゼ遺伝子の具体例としては、配列番号３または９で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。グリセロールキナーゼ遺伝子には、配列番号３または９の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子も包含される。ここで「機能的に同等」とは、上記と同様である。
配列番号３または９の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、配列番号３または９の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。当該遺伝子によってコードされるタンパク質は、グリセリンリン酸化活性を有する。ストリンジェントな条件については、上記のとおりである。
すなわち、配列番号３または９に記載の塩基配列全長において、種々の人為的処理により、部分的にその配列が変化したものであっても、これらの変異型遺伝子が配列番号３または９の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、グリセリンリン酸化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、配列番号３または９に示した塩基配列との相違に関わらず、グリセロールキナーゼ遺伝子に含まれる。
また本発明においてグリセロールキナーゼ遺伝子には、配列番号３または９の塩基配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子も包含される。
グリセロールキナーゼ遺伝子には、配列番号４または１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。該遺伝子には、配列番号４または１０のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子が包含される。
配列番号４または１０のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質としては、配列番号４または１０のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。当該タンパク質は、上記のグリセロールキナーゼの活性、すなわちグリセリンリン酸化活性を有する。
配列番号４または１０のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換が生じた結果得られたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質であっても、その変異が配列番号４または１０に記載のアミノ酸配列の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異型タンパク質が上記グリセロールキナーゼの活性を有しているのであれば、これらの変異型タンパク質をコードする遺伝子もまたグリセロールキナーゼ遺伝子に包含される。ここで、数個とは、通常２〜５個、好ましくは２〜３個である。
また本発明においてグリセロールキナーゼ遺伝子には、配列番号４または１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含される。
グリセリン資化能を付与しようとする対象の細菌がグリセリンキナーゼ遺伝子を有しない場合は、グリセロールキナーゼ遺伝子を導入する必要がある。しかし、対象の細菌がグリセロールキナーゼ遺伝子を有する場合は、グリセロールキナーゼ遺伝子は必ずしも導入しなくてもよい。
一実施形態においては、上記細菌に、さらにグリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する。グリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ（グリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼとも称する）は、グリセロール三リン酸（グリセリン三リン酸とも称する）を脱水する活性を有するタンパク質である。
グリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、グリセロール三リン酸を脱水する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されないが、グリセリン資化能を有する微生物に由来するもの、好ましくはｇｌｐＡ遺伝子を有するもの、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ａｑｕｉｆｅｘ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属の細菌に由来のものが挙げられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ  ＣＴ１８、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＯ９２、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２４５７Ｔ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｄ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３９１３、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＫＡＣＣ１０３３１、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ  ＣＭＣＰ６、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ  ＤＣ３０００、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｐｆ−５、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ���ａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ  Ｋ９６２４３、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ２６６９５、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｔｉｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８（ＵＷａｓｈ／Ｄｕｐｏｎｔ）、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＣＧＡ００９、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ  １４５８０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｎ３１５、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ−ｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＳＦ３７０（ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｍ１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＴＩＧＲ４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ２６０３（ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｖ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＮＲＺ１０６６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｕｌｍｏｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍ���ｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓに由来するものなどが挙げられ、本発明においては、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）由来のものが好ましい。
本発明において細菌に導入するグリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、コリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＡ遺伝子が好ましい。グリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、導入するグリセリン取り込みタンパク質遺伝子と同じ属に属する細菌に由来するものが好ましい。
グリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する場合、コリネバクテリウム・ジフテリア等において同一のオペロン（ｇｌｐ）に含まれるｇｌｐＡＦＫ遺伝子として導入することにより、グリセリン資化能に優れた組換え細菌を得ることができる。
グリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の具体例としては、配列番号１１で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。グリセロールキナーゼ遺伝子には、配列番１１の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子も包含される。ここで「機能的に同等」とは、上記と同様である。
配列番号１１の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、配列番号１１の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。当該遺伝子によってコードされるタンパク質は、グリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。ストリンジェントな条件については、上記のとおりである。
すなわち、配列番号１１に記載の塩基配列全長において、種々の人為的処理により、部分的にその配列が変化したものであっても、これらの変異型遺伝子が配列番号１１の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、グリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、配列番号１１に示した塩基配列との相違に関わらず、グリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に含まれる。
また本発明においてグリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子には、配列番号１１の塩基配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子も包含される。
グリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子には、配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。該遺伝子には、配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子が包含される。
配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質としては、配列番号１２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。当該タンパク質は、グリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。
配列番号１２のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換が生じた結果得られたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質であっても、その変異が配列番号１２に記載のアミノ酸配列の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異型タンパク質が上記グリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼの活性を有しているのであれば、これらの変異型タンパク質をコードする遺伝子もまたグリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に包含される。ここで、数個とは、通常２〜５個、好ましくは２〜３個である。
また本発明においてグリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子には、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含される。
グリセリン資化能を付与しようとする対象の細菌がグリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有しない場合は、グリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する必要がある。しかし、対象の細菌がグリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する場合は、グリセリン三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は必ずしも導入しなくてもよい。
また、上記の遺伝子としては、好ましくはすべて、導入対象である細菌と同じ属に属する細菌に由来するものを導入する。例えば、コリネバクテリウム属細菌に遺伝子を導入する場合は、コリネバクテリウム属細菌、好ましくはコリネバクテリウム・ジフテリアに由来する遺伝子を導入することが好ましい。好ましくはコリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＦ遺伝子、特にコリネバクテリウム・ジフテリア由来グリセロールホスフェートオペロンに含まれるｇｌｐＡＦＫ遺伝子として導入する。コリネバクテリウム・ジフテリアはグリセリン資化能を有するが、病原体であるため利用が困難であった。しかし、コリネバクテリウム・ジフテリア由来のグリセリン取り込みタンパク質遺伝子を他のコリネバクテリウム属細菌に導入することにより、グリセリン資化能に優れ、かつ病原性のない細菌を得ることができる。
細菌への遺伝子の導入は、上記遺伝子またはその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより、または相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子またはその一部を挿入することにより実施できる。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる各遺伝子の一部分を指す。
細菌ゲノムから所望の遺伝子をクローニングにより取得する方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換に適した量のＤＮＡを得ることができる。グリセリン取り込みタンパク質遺伝子またはグリセロールキナーゼ遺伝子は、既知のグリセリン取り込みタンパク質遺伝子またはグリセロールキナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて適当に設計された合成ＤＮＡプライマーを鋳型として用いてハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法などにより取得することもできる。
遺伝子のクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１．２１（１９８９）に記載されている。
遺伝子を連結するベクターとしては、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、ファージおよびコスミド等が挙げられる。好ましくは、導入する遺伝子が由来する細菌と遺伝子を導入する細菌との間で移動可能なシャトルベクターを用いる。大腸菌由来のグリセリン取り込みタンパク質遺伝子をコリネ型細菌に導入する場合は、大腸菌とコリネ型細菌との間で移動可能なシャトルベクターが好ましい。大腸菌由来のグリセリン取り込みタンパク質遺伝子をラルストニア属細菌に導入する場合は、大腸菌とラルストニア属細菌との間で移動可能なシャトルベクターが好ましい。大腸菌由来のグリセリン取り込みタンパク質遺伝子をアルカリゲネス属細菌に導入する場合は、大腸菌とアルカリゲネス属細菌との間で移動可能なシャトルベクターが好ましい。
具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ２２５６由来のｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．４８，２９０１−２９０３（１９８４）およびＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐＳｅｒ．ｖｏｌ．１６，２６５−２６７（１９８５））、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０５８株由来のｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．４８，２９０１−２９０３（１９８４））、ｐＣＲＹ３０（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．５７，７５９−７６４（１９９１））、ｐＣＧ１００（Ｔｒａｕｔｗｅｔｔｅｒ  ＆  Ｂｌａｎｃｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３７，２０９３−２１０１（１９９１））コリネバクテリウム・グルタミカムＴ２５０由来のｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｖｏｌ．１５９，３０６−３１１（１９８４））、ｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡＧ１４、ｐＡＧ５０（特開昭６２−１６６８９０）、ｐＥＫ０、ｐＥＣ５、ｐＥＫＥｘ１（Ｇｅｎｅｖｏｌ．１０２，９３−９８（１９９１））等、またはそれらから誘導されるハイブリッドプラスミド等が使用可能である（Ｔｒａｕｔｗｅｔｔｅｒ  ＆  Ｂｌａｎｃｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３７，２０９３−２１０１（１９９１））。
上記ベクターにおいては、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続する。使用する発現プロモーターは、グリセリンにより抑制されないものであれば特に制限されず、宿主に応じて当業者が適宜選択すればよい。例えば宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λ−ＰＬプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が使用できる。大腸菌由来ｇｌｐＦ遺伝子を導入する場合は、グリセリン取り込みタンパク質の効率的な発現の観点から、大腸菌のｇｌｐ（グリセロールホスフェートオペロン）に含まれるプロモーター（ＰｇｌｐＦＫ）を用いるのが好ましい。コリネバクテリウム・ジフテリア由来ｇｌｐＦ遺伝子を導入する場合は、グリセリン取り込みタンパク質の効率的な発現の観点から、コリネバクテリウム・ジフテリアのｇｌｐ（グリセロールホスフェートオペロン）に含まれるプロモーター（ＰｇｌｐＦＫ）を用いるのが好ましい。また、グリセリンによって誘導を受けるプロモーターも好ましい。
上記ベクターの宿主への導入方法としては、特に制限されないが、例えば、電気パルス法（Ｙ．Ｋｕｒｕｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：４４３−４４７（１９９０））、カルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８））等を挙げることができる。
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、このＤＮＡ断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と薬剤耐性遺伝子を連結したＤＮＡ断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えを利用して導入することもできる。
目的とする遺伝子が導入された組換え細菌を選択する方法は、特に制限されないが、目的とする遺伝子が導入された組換え細菌のみを、容易に選択できる手法によるものが好ましい。また組換え細菌の培養条件は、宿主として用いる細菌の種類に応じて当技術分野で通常行われている条件に基づいて設定できるが、その際、組換え細菌を培養する培地はグリセリンを唯一の炭素源として含有することが望ましい。
組換え細菌のグリセリン資化能試験は、グリセリンを含有する培地で、これらの組換え細菌を培養し、グリセリンの取り込み速度および細菌細胞量の変化を追跡することにより実施できる。組換え細菌によるグリセリンの取り込み速度の測定は、培地中に残存するグリセリンの濃度をＨＰＬＣ分析法等を用いて測定することにより実施できる。また細菌細胞量の変化の測定は、分光光度計による６６０ｎｍでの光学密度の変化の測定により実施できる。
上記のようにして取得される本発明の組換え細菌を培地に培養し、培地または細菌細胞内に発酵生成物または反応生成物を生成、蓄積させ、培地または細菌細胞から該生成物を採取することによって、グリセリンを用いて発酵生成物または反応生成物を製造することができる。
本発明の方法を適用することができる発酵生成物または反応生成物としては、例えば、グリセリンの代謝によって生成する物質、および、グリセリンの代謝によって生成するエネルギーを利用して産生される物質が挙げられる。具体的には、例えば、アミノ酸、例えばグルタミン酸、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン等；有機酸、例えば、ピルビン酸、乳酸、酢酸などの解糖系周辺の有機酸、クエン酸、フマル酸、Ｌ−リンゴ酸、コハク酸、イタコン酸などのＴＣＡサイクル周辺の有機酸、グリセリン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸などのグリセリン周辺の有機酸；アルコール、例えば、エタノール、プロパノール、１．３−プロパンジオール；ビタミン類、例えば、ビタミンＣ；更には高分子物質、例えば、各種の酵素等が挙げられる。細菌を用いたアミノ酸の製造は、炭素源としてグリセリンを含む培地を用いることを除き、当技術分野で公知の方法によって実施できる（例えば、アミノ酸発酵、相田浩  他編、学会出版センター）。
培養に用いる培地および培養条件は、使用する細菌の種類に応じて適宜設定することができるが、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。
炭素源としては、グリセリンを用いる。グリセリンとともに、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、ソルビトールなどのアルコール類、またはフマル酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を、併用してもよい。
ここで炭素源としてのグリセリンは、界面活性剤産業やバイオディーゼル燃料産業において、副産物として大量に排出される、不純物を含んだ水溶液の状態のものでも使用できる。従って、本発明は、これまで廃棄されていた副産物を有効活用できるという観点からも有利である。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が添加される。有機微量栄養素としては、Ｌ−ホモセリン、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は、用いる細菌の生育に好適な条件で行われる。コリネ型細菌の場合、通常、好気的条件下で１６〜９６時間実施するのがよく、培養温度は２０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８．５に制御する。ｐＨ調整には無機または有機の酸性またはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。また、宿主として好熱性細菌を用いる場合には、培養温度は４２℃〜６０℃で培養することができる。培養は菌体増殖を好気的に行い、その後嫌気的条件にする方法も採用できる。特に乳酸、コハク酸などの有機酸を生産する場合にはこの方法が有効である。またコハク酸を製造する場合には炭酸ガス、炭酸イオンを培地に含有させると収率が高くなるので好ましい。
培養終了後の培地液からの発酵生成物または反応生成物の採取は、本発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。尚、炭素源として、農産物に由来する糖質を用いる場合に比べて、グリセリンを使用した場合は、目的物質の精製や、廃液処理プロセスを簡略化できる場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
（実施例１）ハイブリッドプラスミドの構築
ハイブリッドプラスミドの作成には、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０５８株由来プラスミドｐＣＧ１００（３ｋｂｐ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来プラスミドｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ社）を用いた。
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０５８株由来のｐＣＧ１００プラスミドを取得し、ｐＨＳＧ３９８とライゲーションしてハイブリットプラスミドを作成した。
１−１．ｐＣＧ１００プラスミドの取得
菌体前培養：
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０５８株を、ＪＣＭ２６培地（５ｍｌ）中、３０℃で一晩振とう培養した。培養したコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０５８株をＪＣＭ２６プレートに播種し、３０℃で一晩、振盪培養した。ＪＣＭ２６プレートからループで１かき分接種し、ＪＣＭ２６培地（５ｍｌ）中、３０℃で、６時間振とう培養した。
菌体本培養：
前培養液１ｍｌをＪＣＭ２６培地（イソニコチン酸ヒドラジド２００ｍｇ／５０ｍｌ）５０ｍｌに接種し、３０℃で、一晩振とう培養した。培養終了後、氷上で冷却した。培養液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心にかけ、菌体を回収した。
プラスミド抽出：
回収した菌体ペレットから、ＭＩＤＩ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドを抽出した。回収の際、リゾチーム６０ｍｇを含むＰ１バッファー６ｍｌで菌体ペレットを懸濁し、３７℃のウォーターバスで１時間振とう処理した。
１−２．制限酵素処理およびライゲーション
ｐＨＳＧ３９８（ＢａｍＨＩで切断）とのライゲーションを行うため、１−１で取得したｐＣＧ１００を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断処理し、ｐＨＳＧ３９８は脱リン酸化処理してセルフライゲーションが起こらないようにした。
ｐＣＧ１００（ＢｇｌＩＩで切断）とｐＨＳＧ３９８（ＢａｍＨＩで切断）をライゲーションし、大腸菌に導入した。
１−３．形質転換
ＴＯＰ１０  エレクトロコンピテントセルに２．５ｋｖ／２００Ω／２５μＦを印加することにより、形質転換を行った。得られた大腸菌形質転換体をＳＯＣ培地０．５ｍｌに接種し、１５ｍｌ遠沈管に入れた。３７℃で１時間振とう培養した。３７℃でＬＢＣｍ培地に１００μｌ広げ、３０℃で、静置培養した。
１−４．インサートの確認
大腸菌形質転換体からプラスミドを抽出し、インサートの確認を行った（図１）。制限酵素ＰｖｕＩで切断した場合、ハイブリッドプラスミドが構築されていれば３本のバンド（３９４４ｂｐ、７７７ｂｐ、５６０ｂｐの３本バンド）が検出されるはずである。５番のサンプルでは、予想された３本のバンドが計算どおりのサイズで検出され、目的のハイブリッドプラスミドの構築が確認された。
【実施例２】
【０００７】
（実施例２）ハイブリッドプラスミドのコリネバクテリウム・グルタミカムへの導入と複製の確認
実施例１で得られたハイブリッドプラスミドを含む大腸菌を再度培養してプラスミドを大量に調製し、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株に導入した。
２−１．コリネバクテリウム・グルタミカムコンピテントセルの作成
前培養：
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株のコロニーをループ１かき分接種した。５０％グルコース０．２ｍｌを含むＬＢ培地５ｍｌ中、３００ｒｐｍ、３０℃で、１６時間培養した。培養終了時にＯＤ６６０を測定した。
本培養：
前培養液を、Ｅｐｏ培地５０ｍｌを含む坂口フラスコに、ＯＤ６６０が０．３になるように接種した。１２０ｒｐｍ、１８℃で、２８時間培養した。
菌体回収：
ＯＤ６６０を測定し、培養液を氷上で充分に冷却した。培養液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心にかけ、菌体を回収した。
洗浄：
得られた菌体を５ｍｌの１０％グリセリンに懸濁し、氷上で冷却した。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心にかけ、上澄みを捨てた。１ｍｌの１０％グリセリンでピペッティングし、１．５ｍｌ滅菌済みエッペンに移した。１５０００ｒｐｍで１分間遠心にかけ、上澄みを捨てた。１ｍｌの１０％グリセリンで再度ピペッティングした。１５０００ｒｐｍで１分間遠心にかけ、上澄みを捨てた（４回）。
保存：
０．５ｍｌの１０％グリセリンでピペッティングし、０．５ｍｌ滅菌済みエッペンに１００μｌずつ分注した。液体窒素で急冷却し、−８０℃で保存した。
２−２．形質転換
２−１で得られたコンピテントセルに、２．５ｋｖ／６００Ω／２５μＦで電圧を印加した。ＢＨＩＳ培地１ｍｌに移し、１５ｍｌ遠沈管に入れた。４６℃のウォーターバスに６分間静置し、３分間氷冷してから３０℃で１時間振とう培養することにより、復元培養した。ＬＢＨＩＳ培地Ｃｍ３０および６０に、各５枚２セット計２０枚にプレーティングし、３０℃で静置培養した。
ＪＣＭ２６培地、Ｅｐｏ培地、ＢＨＩＳ培地およびＬＢＨＩＳプレートは以下のとおり調製した。
ＪＣＭ２６培地組成：
2007013695.tif 000002
Ｅｐｏ培地：
使用直前に以下のＢを調製し、Ａと混合して１Ｌとした。
Ａ（Ｂａｃｔｏトリプトン  １０ｇ、Ｂａｃｔｏ酵母抽出物  ５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、蒸留水  ８００ｍｌ（オートクレーブ滅菌））
Ｂ（イソニコチノヒドラジド  ４ｇ、グリシン  ２５ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  １ｍｌ、蒸留水  ２００ｍｌ（濾過滅菌））
ＢＨＩＳ培地：
使用直前に以下のＡとＢを混合した。
Ａ（日水製薬  ブレインハートインフュージョン粉末  １８．５ｇ、蒸留水  ８００ｍｌ（オートクレーブ滅菌））
Ｂ（ソルビトール  ９１ｇ、蒸留水  ２００ｍｌ（オートクレーブ滅菌））
ＬＢＨＩＳ培地：
以下のＡとＢを混合してプレートに広げた。
Ａ（Ｂａｃｔｏトリプトン  ５ｇ、Ｂａｃｔｏ酵母抽出物  ２．５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、寒天  １８．５ｇ、蒸留水  ８００ｍｌ（オートクレーブ滅菌））
Ｂ（ソルビトール  ９１ｇ、蒸留水  ２００ｍｌ（オートクレーブ滅菌））
２−３．コリネバクテリウム・グルタミカムへのハイブリッドプラスミド導入の確認
プレートに生育したコロニーをＪＣＭ２６Ｃｍ６０培地３ｍｌに接種し、３０℃で７２時間培養した。この菌体を遠心分離で回収し、プラスミドを抽出した。抽出したプラスミドがｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８ハイブリッドプラスミド（５２８０ｂｐ）であるか確認するため、制限酵素ＫｐｎＩで切断した。
電気泳動で確認したところ、５０００ｂｐアップの位置にｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８（５２８０ｂｐ）のバンドが確認できた（図２）。
構築したハイブリッドプラスミドｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８は、シャトルベクターとして、大腸菌とコリネバクテリウム・グルタミカムの両方で安定に保持されることが確認できた。
【実施例３】
【０００８】
（実施例３）大腸菌のｇｌｐＦＫ遺伝子のクローニング
大腸菌は、グリセリン資化系遺伝子として（ａ）グリセロール取り込みタンパク質（グリセロールファシリテーター）および（ｂ）グリセロールキナーゼをオペロン（ｇｌｐＦＫオペロン）として持っており、プロモーター、ファシリテーター、キナーゼの順に配置されている。
プロモーター＋（ａ）＋（ｂ）の断片を下記のプライマーを用いてＰＣＲで作成し、ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８シャトルベクターに挿入してコリネバクテリウム・グルタミカムに導入した。
ｇｌｐ−ＦＫ−Ｆ：
５’−ｃｃｃｃｃｔｇｃａｇｇｃａａｃａｇａｇｔｇａｔｇｇｔａｔｃａａｔｃ−３’（ＰｓｔＩ）（配列番号５）
ｇｌｐ−ＦＫ−Ｒ２：
５’−ｃｃｃｃｃｃｃｔｃｔａｇａａａｇｃａｇｃｃｔｔｔａｔｃｇｃｃｔａｃｔｇ−３’（ＸｂａＩ）（配列番号６）
ＫＯＤ−遺伝子ポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅で３３５０ｂｐ付近にバンドの増幅が得られ（図３）、ｇｌｐＦＫのサイズと一致していたことから、このバンドを切り出して回収し、ｐＣＲ４ＴＯＰＯに固定した（図４）。
１、２、５、６、７、９、１０番のプラスミドをＰｓｔＩ−ＸｂａＩで切断後、電気泳動でターゲットサイズのインサートが確認されたので、１番のサンプルの下側のバンドを切り出し回収した。同様にＰｓｔＩ−ＸｂａＩで切断したｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８／ＢＡＰと先に切り出した断片をライゲーションし、大腸菌に導入してｇｌｐＦＫ−ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８プラスミドを得た。
ｇｌｐＦＫ−ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８プラスミドのインサートを確認をしたところ１、６、８、９、１０の５つが目的のサイズの断片を保有していることがわかった（図５）。１０番のプラスミドを大量調製し、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株に導入した。
【実施例４】
【０００９】
（実施例４）コリネバクテリウム・グルタミカムへのｇｌｐＦＫ遺伝子の導入
ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８シャトルベクターに大腸菌のｇｌｐＦＫ遺伝子を導入したプラスミドｇｌｐＦＫ−ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８を、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株にエレクトロポレーションで導入した。ＬＢＣｍ６０ｐｐｍプレートでコロニー生育が確認できたので、生育したクローンを培養し、プラスミド抽出後、インサートを確認した。その結果、５株とも全てｇｌｐＦＫ−ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８と思われるバンドが確認された（図６）。
得られた５株のコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換体をグリセリンを炭素源とする培地に接種して３０℃で一夜培養したところ、５株とも良好な生育を示した。この結果から、大腸菌由来のｇｌｐＦＫ遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム細胞内で機能し、コリネバクテリウム・グルタミカムにグリセリン資化能を付与できることが明らかとなった。
【実施例５】
【００１０】
（実施例５）グリセリン資化能の確認
生育試験培地の組成は以下のとおりとした。
尿素                            ４ｇ
硫酸アンモニウム                １４ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                    ０．５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                    ０．５ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ            ０．５ｇ
ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ            ２０ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ            ２０ｍｇ
ビオチン                        ２００μｇ
チアミン塩酸塩                  １００μｇ
酵母エキス                      １ｇ
カザミノ酸                      １ｇ
ｐＨ７．８（ＫＯＨ）
蒸留水                          １Ｌ
上記の培地をオートクレーブ滅菌したのち、炭素源を添加するものは、濾過滅菌した５０％グルコースまたは５０％グリセリンをそれぞれ４０ｍｌ添加した。
５−１．生育試験
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２野生株またはｇｌｐＦＫ遺伝子導入株をプレートから生育試験培地に接種し、３０℃で２４時間培養したときの生育を、ＯＤ６６０の濁度で測定した。結果を以下の表に示す。
炭素源                      グルコース      グリセリン      なし      
野生株                          １５．３      ０．８５      ０．８７
ｇｌｐＦＫ導入株                １４．８      １３．９      ０．６９
プラスミドのみの導入株          １５．８      ０．７４      ０．８０
上記の結果から、コリネバクテリウム・グルタミカム野生株がグリセリン資化能を有しないのに対し、本発明の組換え細菌がグリセリン資化能を有することが示された。また、本発明の組換え細菌はグルコース資化能と同等のグリセリン資化能を有することがわかる。
５−２．コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される細菌の生育試験
コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される以下の野生株について、上記と同様にグルコースもしくはグリセリンを炭素源としたとき、または炭素源無しのときの生育を３０℃で２４時間培養し、ＯＤ６６０の濁度を測定することにより試験した。
（１）コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２（ＮＢＲＣ１２１６８）
（２）コリネバクテリウム・エフィシェンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）ＪＣＭ１１１８９
（３）コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３８６９
（４）ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＮＢＲＣ１２０７２
（５）ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ＮＢＲＣ１２６１２
結果を以下の表に示す。
2007013695.tif 000003
上記のとおりいずれの野生株もグルコースを炭素源としたときには旺盛な生育が見られたが、グリセリンを炭素源とした場合には炭素源無しの条件との間で差がみられなかった。従って、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される野生株が、グリセリン資化能を有しないことが確認された。
【実施例６】
【００１１】
（実施例６）アミノ酸の産生
下記の培地を２Ｌジャーファーメンターに入れてオートクレーブ滅菌し、同組成の培地５０ｍｌで培養した大腸菌ｇｌｐＦＫ遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を接種し、０．５ｖｖｍで通気しながら、２５％アンモニア水でｐＨを７．２に調節しながら３０℃で４８時間培養を行った。
培地組成：
グリセリン                  １００ｇ
硫酸アンモニウム            １０ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                ２ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        １ｇ
ＦｅＳＯ４                  １０ｍｇ
ＭｎＳＯ４                  １０ｍｇ
チアミン塩酸塩              ０．５ｍｇ
ビオチン                    ５μｇ
味液                        １０ｍｌ
培養後、遠心分離によって菌体を除き、上清を得た。培養液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、１Ｌ中に６ｇのグルタミン酸が含まれていた。
一方、大腸菌のｇｌｐＦＫ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を用いて同様の培養を行った場合は、菌体増殖が殆ど起こらなかった。
【実施例７】
【００１２】
（実施例７）有機酸の産生
培養用培地１００ｍｌを５００ｍｌフラスコで滅菌し、滅菌５０％グリセリン溶液４ｍｌを加えて、大腸菌ｇｌｐＦＫ遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を接種し、３０℃で２４時間振盪培養した（坂口１本）。培養終了後、菌体を遠心分離した。１００ｍｌの培養液から得た湿菌体は３．７３ｇであった。これを反応に使用した。
１００ｍｌ培地ビンに反応用培地１００ｍｌを入れ、菌体と５０％グリセリン溶液１２ｍｌを加えて（グローブボックス内で作業）密閉した状態で、３０℃にて２４時間スターラーで攪拌しながら反応させた。反応後、培養液を遠心分離し、分析を行った。
分析は、ＨＰＬＣ  イオン交換カラムＫＣ−８１１  ＯＤＳを使用して行った。その結果、２４時間反応後のｐＨは５．７であった。また、培養液中には、リンゴ酸  ０．４％、コハク酸  １．４％、酢酸  ０．２％、乳酸  １．９％が含まれていた。
一方、大腸菌のｇｌｐＦＫ遺伝子を導入していないコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を用いて同様に培養を行った場合は、菌体が増殖しなかった。
実施例６および７の結果から、グリセリン取り込みタンパク質をコードする遺伝子が導入された組換え細菌を、グリセリンを含有する培地で培養することにより、アミノ酸や有機酸を製造できることが示された。
【実施例８】
【００１３】
（実施例８）ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９７株へのグリセリン資化能の付与
ラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７株はグリセリンを炭素源とした生育をすることができない。このラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７株に大腸菌由来のグリセリン利用遺伝子ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫを導入することによってグリセリン資化能を付与した。
８−１．ｇｌｐＦＫ遺伝子断片の調製
コリネバクテリウム・グルタミカムに導入したｇｌｐＦＫ／ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８プラスミドを鋳型として下記のプライマーセットを用いてＰＣＲによりｇｌｐＦＫ遺伝子断片を増幅した。
ｇｌｐＦＫ−Ｆ：５’−ｃｃｃｃｃｃｃｃａｔｇｇｃａａｃａｇａｔｇａｔｇｇｔａｔｃａａｔｃ−３’（配列番号１３）
ＮｃｏＩサイト
ｇｌｐＦＫ−Ｒ２：５’−ｃｃｃｃｃｃｃｃａｔｇｇａａｇｃａｇｃｃｔｔｔａｔｃｇｃｃｔａｃｔｇ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲにより３．３ｋｂｐのｇｌｐＦＫ遺伝子断片が増幅されたのでこの断片をｐＣＲ４ＴＯＰＯクローニングベクターに固定し、ｇｌｐＦＫ−ＮｃｏＩ／ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミドを得た。このプラスミドをＰＣＲプライマー領域に設定した制限酵素サイトＮｃｏＩで切断し、電気泳動によって分離、染色した後、３．３ｋｂｐのサイズの断片を切り出して回収した。
８−２．ベクターの調製とライゲーション
広域宿主ベクタ−ｐＢＢＲ１２２プラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）にはクロラムフェニコールとカナマイシンの２つの抗生物質に対する耐性遺伝子が含まれる。ｇｌｐＦＫ遺伝子断片を、このクロラムフェニコール耐性遺伝子上に存在する制限酵素ＮｃｏＩサイトに導入するため、制限酵素ＮｃｏＩで切断したのちアルカリホスファターゼで処理して脱リン酸化した。このベクターＤＮＡ断片を電気泳動で分離し、切り出して回収した。この断片と先のｇｌｐＦＫ遺伝子断片をライゲーションし、大腸菌に導入してｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２プラスミドを得た。
ｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２プラスミドのインサートを確認したところ、３．３ｋｂｐのサイズのインサートと５．３ｋｂｐのサイズのベクターを確認することができた。このプラスミドを大量調製し、ラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７株に導入した。
８−３．ラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７株コンピテントセルの作成
ラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７株のコロニーをＬＢ培地５ｍｌにループ１かき分接種し、３００ｒｐｍ、３０℃で一夜培養した。ＬＢ培地５０ｍｌに培養液０．５ｍｌを植え継ぎ、３０℃、１２０ｒｐｍで３時間培養し、培養液を氷上で十分に冷却した。培養液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心にかけ、菌体を回収した。得られた菌体を５ｍｌの滅菌処理した１０％グリセリンに懸濁し、氷上で冷却した。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心にかけ、上澄みを捨てた。１ｍｌの１０％グリセリンでピペッティングし、１．５ｍｌ滅菌済エッペンに移した。１５０００ｒｐｍで１分間遠心にかけ、上澄みを捨てた。１ｍｌの１０％グリセリンで再度ピペッティングし、１５０００ｒｐｍで１分間遠心にかけ、上澄みを捨てた。この操作を４回繰り返した。得られた菌体を０．５ｍｌの１０％グリセリンで懸濁し、コンピテントセルとした。
８−４．ラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７株へのｇｌｐＦＫ遺伝子の導入
ｐＢＢＲ１２２プラスミドに大腸菌のｇｌｐＦＫ遺伝子を導入したプラスミドｇｌｐＦＫ−ｐＢＢＲ１２２プラスミドをラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７株にエレクトロポレーションで導入した。先に作成したコンピテントセル５０μｌに大量調製したｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２プラスミド溶液（１．５μｇ／μｌ）２μｌを加え、２．５ＫＶ、２５０Ω、２５μＦで電圧を印加した。
ｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２プラスミド溶液のかわりにインサートのないｐＢＢＲ１２２プラスミド溶液を２μｌ加えたものにも同様に電圧を印加した。電圧印加後ＳＯＣ培地１ｍｌで懸濁し、３０℃で１時間振盪培養した。１時間後、ＮＢ培地にカナマイシン５０ｐｐｍを添加した培地５０ｍｌに全量接種し、３０℃で一夜培養した。一夜後、培養液を１０３〜１０６に希釈し、ＮＢ培地にカナマイシン３００ｐｐｍを加えた培地に広げて３０℃で静置培養し、コロニーを形成させた。
生育したコロニーを、ＮＢ培地にカナマイシン５０ｐｐｍを加えた培地に接種し、３０℃で１０時間培養した。培養液１．５ｍｌから菌体を遠心分離で回収し、プラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを確認するため制限酵素ＮｃｏＩで切断した。電気泳動で確認したところ、ｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２プラスミドを導入した形質転換体では５３００ｂｐと３３００ｂｐの位置にｇｌｐＦＫ由来、ｐＢＢＲ１２２プラスミド由来と思われるバンドが確認でき、インサートのないｐＢＢＲ１２２プラスミドを導入した形質転換体では５３００ｂｐの位置にｐＢＢＲ１２２プラスミド由来と思われるサイズのバンドのみが確認できた。
ラルストニア・ユートロファ形質転換体を、それぞれラルストニア・ユートロファ／ｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２とラルストニア・ユートロファ／ｐＢＢＲ１２２命名した。
８−５．ラルストニア・ユートロファ形質転換体の生育試験
ラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７野生株と、先のラルストニア・ユートロファ／ｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２と、ラルストニア・ユートロファ／ｐＢＢＲ１２２の３株を用いて、ラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７株が生育可能なＬ−リンゴ酸を単一の炭素源とした最少培地とグリセリンを単一の炭素源とした最少培地で、生育の確認を行った。
ラルストニア・ユートロファ  ＡＴＣＣ１７６９７野生株はＮＢ培地５ｍｌに、ラルストニア・ユートロファ／ｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２株及びラルストニア・ユートロファ／ｐＢＢＲ１２２株は、ＮＢ培地にカナマイシン３００ｐｐｍを添加した培地５ｍｌに接種し、３０℃で一夜培養した。
下記の最少培地に炭素源としてＬ−リンゴ酸、グリセリンを添加した培地５０ｍｌに一夜培養した培養液を５０μｌ接種し、３０℃で２４時間培養した。
２４時間培養後の生育を培養液のＯＤ６６０の濁度で示した。
炭素源                        Ｌ−リンゴ酸      グリセリン      無し      
野生株                              ８．８        ０．０７      ０．０６
ｇｌｐＦＫ導入株                    ８．５        ５．４        ０．０５
プラスミドのみの導入株              ９．２        ０．０５      ０．０７
上記の結果から、ラルストニア・ユートロファの野生株がグリセリン資化能を有しないのに対し、本発明の組換え細菌がグリセリン資化能を有することが示された。また、本発明の組換え細菌は、野生株におけるＬ−リンゴ酸資化能と同等のグリセリン資化能を有することがわかる。
本実施例で用いた培地の組成は以下のとおりである。
生育試験用最少培地：
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ０．９ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                ０．１５ｇ
ＮＨ４Ｃｌ                  ０．０５ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．２ｇ
微量金属溶液                １ｍｌ
蒸留水                      １Ｌ
ｐＨ７．０
微量金属溶液：
ＦｅＣｌ３                  ９．７ｇ
ＣａＣｌ２                  ７．８ｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ        ０．２１８ｇ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ        ０．１５６ｇ
ＮｉＣｌ３・６Ｈ２Ｏ        ０．１１８ｇ
蒸留水                      １Ｌ
ＬＢ培地組成：
Ｂａｃｔｏトリプトン        １０ｇ
Ｂａｃｔｏ酵母エキス        ５ｇ
食塩                        １０ｇ
蒸留水                      １Ｌ
寒天培地には寒天１８ｇを添加
ＳＯＣ培地組成：
Ｂａｃｔｏトリプトン        ２０ｇ
Ｂａｃｔｏ酵母エキス        ５ｇ
食塩                        ０．５ｇ
蒸留水                      １Ｌ
オートクレーブ滅菌後、上記に濾過滅菌した１Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液１０ｍｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４溶液１０ｍｌ、１Ｍグルコース溶液２０ｍｌを加えた。
ＮＢ培地組成：
Ｂａｃｔｏ肉エキス          ３ｇ
Ｂａｃｔｏペプトン          ５ｇ
蒸留水                      １Ｌ
寒天培地には寒天１８ｇを添加
【実施例９】
【００１４】
実施例９  アルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ１８７５０株へのグリセリン資化能の付与
アルカリゲネス・ファエカリス  ＡＴＣＣ１８７５０株はグリセリンを炭素源として生育をすることができない。このアルカリゲネス・ファエカリス  ＡＴＣＣ１８７５０株に大腸菌由来のグリセリン利用遺伝子ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫを導入することによってグリセリン資化能を付与した。
実施例８で用いたｇｌｐＦＫ−ｐＢＢＲ１２２プラスミドを用いて同様にプラスミドの導入と生育試験を行った。形質転換体として、アルカリゲネス・ファエカリス／ｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２及びアルカリゲネス・ファエカリス／ｐＢＢＲ１２２を得た。
アルカリゲネス・ファエカリス  ＡＴＣＣ１８７５０野生株と、アルカリゲネス・ファエカリス／ｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２と、アルカリゲネス・ファエカリス／ｐＢＢＲ１２２の３株を用いてアルカリゲネス・ファエカリス  ＡＴＣＣ１８７５０株が生育可能なＬ−リンゴ酸を単一の炭素源とした最少培地とグリセリンを単一の炭素源とした最少培地での生育の確認を行った。
アルカリゲネス・ファエカリス  ＡＴＣＣ１８７５０野生株はＮＢ培地５ｍｌに、アルカリゲネス・ファエカリス／ｇｌｐＦＫ／ｐＢＢＲ１２２株及びアルカリゲネス・ファエカリス／ｐＢＢＲ１２２株はＮＢ培地にカナマイシン３００ｐｐｍを添加した培地５ｍｌにそれぞれ接種し、３０℃で一夜培養した。
下記の最少培地に炭素源としてＬ−リンゴ酸又はグリセリンを添加した培地５０ｍｌに一夜培養した培養液を５０μｌ接種し、３０℃で２４時間培養した。
２４時間培養後の生育を培養液のＯＤ６６０の濁度で示した。
炭素源                        Ｌ−リンゴ酸      グリセリン      無し 
野生株                          １２．３          ０．０６      ０．０４
ｇｌｐＦＫ導入株                １３．４          １０．５      ０．０５
プラスミドのみの導入株          １３．７          ０．０７      ０．０６
上記の結果から、アルカリゲネス・ファエカリスの野生株がグリセリン資化能を有しないのに対し、本発明の組換え細菌がグリセリン資化能を有することが示された。また、本発明の組換え細菌は、野生株におけるＬ−リンゴ酸資化能と同等のグリセリン資化能を有することがわかる。生育試験に用いた最少培地の組成は以下のとおりである。
生育試験用最少培地：
ＫＨ２ＰＯ４                １ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                ３ｇ
（ＮＨ）２ＳＯ４            １ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．２ｇ
酵母エキス                  ０．１ｇ
蒸留水                      １Ｌ
ｐＨ６．８
オートクレーブ滅菌後、濾過滅菌した５０％炭素源溶液を２０ｍｌ加えて使用した。
【実施例１０】
【００１５】
実施例１０  コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）のｇｌｐＡＦＫ遺伝子のコリネバクテリウム・グルタミカムへの導入
１０−１．ｇｌｐＡＦＫ遺伝子断片の調製
コリネバクテリウム・ジフテリア  ＡＴＣＣ７００９７１Ｄ株のゲノムＤＮＡを鋳型にしてｇｌｐＡＦＫ遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。
Ｃｄ−ｇｌｐ−Ｆ：５’−ｃｃｃｃｃｃｔｃｔａｇａｔｃｔｃｇｇｃａｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇ−３’（配列番号１５）
Ｃｄ−ｇｌｐ−Ｒ：５’−ｃｃｃｃｃｃｃｔｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｇａａｔａｃｃｔｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｃ−３’（配列番号１６）
形質転換して得られた株からプラスミドを抽出し、ＰｓｔＩ−ＸｂａＩで切断後、電気泳動で４６００ｂｐのターゲットサイズのインサートが確認されたので、このバンドを切り出し回収した。シャトルベクターｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８をＸｂａＩ−ＰｓｔＩでダブルカットし、電気泳動した後、ゲルからシャトルベクターのバンドを切り出し回収した。このベクターにｐＣＲ４ＯＰＯから切り出したｇｌｐＡＦＫ遺伝子断片をライゲーションし、大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、制限酵素ＸｂａＩとＰｓｔＩで切断してインサートの確認を行ったところ、導入したｇｌｐＡＦＫ遺伝子と同じサイズの４６００ｂｐのバンドが確認された。このプラスミドをＣｄ−ｇｌｐＡＦＫ−ｐＣＧ１００−ｐＨＳＧ３９８と命名した。
コリネバクテリウム・グルタミカムのコンピテントセルを調製してこのプラスミドをエレクトロポレーション法で導入した。
１０−２．形質転換体の生育試験
上記で得られた形質転換体と野生株について、実施例５と同様に生育試験を実施した。２４時間培養後の生育を培養液のＯＤ６６０の濁度で示した。
炭素源                        グルコース      グリセリン      なし      
野生株                          １５．３        ０．８５      ０．８７
ｇｌｐＡＦＫ導入株              １５．８        １５．１      ０．８２
プラスミドのみの導入株          １５．８        ０．７４      ０．８０
上記の結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムの野生株がグリセリン資化能を有しないのに対し、本発明の組換え細菌がグリセリン資化能を有することが示された。また、本発明の組換え細菌は、野生株におけるグルコース資化能と同等のグリセリン資化能を有することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明により、細菌にグリセリン資化能を付与することができる。本発明により、グリセリンを有効活用する手段が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
［配列表］
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2007013695.tif 000005
2007013695.tif 000006
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2007013695.tif 000025
2007013695.tif 000026
2007013695.tif 000027
【図１】
2007013695.tif 000028
【図２】
2007013695.tif 000029
【図３】
2007013695.tif 000030
【図４】
2007013695.tif 000031
【図５】
2007013695.tif 000032
【図６】
2007013695.tif 000033
【国際調査報告】
2007013695.tif 000034
2007013695.tif 000035
2007013695.tif 000036
2007013695.tif 000037