【誤訳訂正書】
【提出日】平成20年8月13日(2008.8.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の未反応の二重結合を含むマクロ孔質ポリマー支持体の後修飾方法であって、当該方法が、
（ａ）ポリマー支持体を、１以上のグラフト化化合物を含む液相と接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物において上記ポリマー支持体の１以上の二重結合とグラフト化化合物の１以上の反応性基との間でフリーラジカル反応を、グラフト化化合物に対して電子受容体として作用するコモノマーの非存在下で、開始する工程、及び
（ｃ）適宜、過剰のグラフト化化合物を除去すべくポリマー支持体を洗浄する工程
を含んでおり、上記グラフト化化合物が、次の一般式（Ｉ）で表されるものである、方法。
【化１】
2005510609.tif 000001
式中、
Ｒは、１以上のヒドロキシル、アミン、カルボニル、エーテル又は酸素で適宜置換されたＣ1〜Ｃ30アルキル鎖であり、
Ｒ’はＨ又はＣＨ3であり、
Ｒ”はＣ0〜Ｃ30脂肪族基又は酸素であり、
ＸはＯnであるが、Ｒ”が酸素のときはｎは０であり、Ｒ”が脂肪族基のときはｎは１であるという条件の下で、ｎは０〜１の整数である。
【請求項２】
前記マクロ孔質ポリマー支持体が、モノマーとしてのメタクリレート及び／又はスチレン誘導体から製造されたクロマトグラフィー支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マクロ孔質ポリマー支持体がジビニルベンゼンを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体が１以上の粒子からなる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、加えたグラフト化化合物をポリマー支持体に重合させるのに十分な量のフリーラジカル開始剤を添加することによって実施される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）において、ＲがＣ1〜Ｃ10アルキル鎖であり、Ｒ’がＨであり、Ｒ”がＯであり、ｎが０である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＲがＣ17アルキル鎖である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＲがＣ1〜Ｃ10アルキル鎖であり、Ｒ’がＨであり、Ｒ”がＣＨ2であり、ｎが１である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記グラフト化化合物が１以上の親水性基を含んでいる請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の方法であって、当該方法がさらに上記親水性基の誘導体化の工程を含んでいる、方法。
【請求項１０】
前記グラフト化化合物が反応性二重結合に加えて１以上の官能基を含み、該官能基が、修飾された支持体の表面上のリガンドとして利用できる、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒが１以上のヒドロキシルで置換されている、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）樹脂の製造に適する、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  多孔質支持体の後修飾
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にクロマトグラフィー用のマクロ孔質ポリマー支持体の分野に関する。具体的には、本発明は、クロマトグラフィーのような分離用途に使用したときに大幅に改善された性質を示す支持体を与える支持体の新規な後修飾法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィー全般に使用できる分離材料を開発するためクロマトグラフィー支持体をグラフトすることは、欧州特許出願公開第０３３７１４４号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｉｔ  ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ  Ｈａｆｔｕｎｇ）から公知である。グラフト化は、通例のレドックス重合の過程で実施される。支持体粒子の細孔表面にラジカル部位を形成するため、セリウム（ＩＶ）イオンが重合触媒として使用される。欧州特許出願公開第０３３７１４４号の一つの目的は、公知の材料に比べて溶解性を向上させることであり、ヒドロキシ基を含有する支持体を共有結合ポリマーでコーティングしたものに基づく親水性分離の使用によって達成される。具体的には、ポリマーは、ヒドロキシ基のα‐Ｃ原子で生じたラジカルを介して支持体に結合し、この種のグラフト化は「からのグラフト化（grafting from）」原理を代表する、例えば、Ｐ．Ｆ．Ｒｅｍｐｐ，  Ｐ．Ｊ．Ｌｕｔｚ：  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．６，ｐｐ．４０３−４２１，  Ｅｄｓ．  Ｇ．Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｏｘｆｏｒｄ  １９８９参照。この技術は支持体表面の限られた数のラジカルによる重合開始に基づいており、例えば酸素による終結に感受性である。好ましいモノマーは生長反応速度の高いモノマーであり、これは典型的にはアクリルアミド、アクリレート又はメタクリレートレトモノマーを意味する。これらのモノマーのポリマーは概して、特にアルカリ性条件下では、加水分解に感受性である。実際的には、これは、欧州特許出願公開第０３３７１４４号のグラフト化生成物が加水分解を受け易いことを意味し、用途によっては短所となりかねない性質である。
【０００３】
米国特許第５９２９２１４号（Ｐｅｔｅｒｓ他）には、細孔にグラフト化温度応答性ポリマー及びコポリマーが含まれる多孔質合成ポリマーモノリスが開示されている。これらのモノリスは、熱ゲート又は熱バルブとしての用途に特に適する。かかるモノリスの細孔は直径約６００ｎｍ超であり、そのためポリマーは、かかるマクロ細孔を閉塞するのに十分な大きさのものである必要がある。細孔の支持体にグラフトされる熱応答性ポリマーの形成に適当なモノマーは公知であり、窒素原子上の弱い疎水性の基で置換されたアクリルアミド及びメタアクリルアミド、ビニルカプロラクタム、メチルビニルエーテル、３‐ヒドロキシプロピルアクリル酸エステル、酢酸ビニル、２‐（Ｃ2〜Ｃ6）‐アルキル‐１‐ビニルオキサゾリン、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、並びにこれらのモノマーと、得られるポリマーの熱応答性を妨害しない共重合性コモノマーとのコポリマーが包含される。架橋及び制御可能な膨潤性その他の望ましい性質を付与するため、適当なコモノマー（例えばＮ‐アルキルアクリルアミドに対するメチレンビスアクリルアミド）を用いてもよい。米国特許第５９２９２１４号で製造されるポリマーは、それらの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）未満での第一の構造からＬＣＳＴ超での第二の構造への迅速で可逆的な相転移を起こし、そのため「熱収縮」ポリマーと呼ばれる。
【０００４】
Ｄｈａｌ他（Ｄｈａｌ，  Ｐｒａｄｅｅｐ  Ｋ．；  Ｖｉｄｙａｓａｎｋａｒ，  Ｓ．；  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｆｒａｎｃｅｓ  Ｈ．  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｐａｓａｄｅｎａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ．  Ｃｈｅｍ．  Ｍａｔｅｒ．  （１９９５），  ７（１），  １５４−６２）には、官能性ポリマーの表面グラフト化によるマクロ孔質ポリ（トリメチロールプロパントリメタクリル酸エステル）の合成が開示している。官能性モノマーの種類は、元のマトリックスの物理的性質が保持されるように選択される。
【０００５】
さらに、米国特許第５５０３９３３号から、不飽和基を含む疎水性ドメインと親水性ドメインとを含む親水性コーティングで被覆された支持体を形成することが公知である。親水性コーティング剤は、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンのような疎水性ポリマーに、例えば共有結合などで結合させることができる。この米国特許に記載されたコーティングの目的は、疎水性支持体をマスクし、高低の極端なｐＨで化学的に安定なポリマーを提供することである。
【０００６】
多孔質クロマトグラフィー粒子内に存在するミクロ細孔は、立体障害効果を引き起こしかねないので、望ましくないことも知られている。かかる立体効果は、拡散を遅くし、ひいては分離能を低下させてしまう。クロマトグラフィー樹脂内のミクロ細孔の問題は既に議論されており、例えば、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）におけるミクロ細孔の悪影響について記載されたＦ  Ｎｅｖｅｊａｎｓ，  Ｍ  Ｖｅｒｚｅｌｅ：  Ｊ  Ｃｈｒｏｍ  ４０６，  ３２５−３４２  （１９８７）を参照されたい。ミクロ細孔を除去する一つの方法は、ミクロ細孔を塞ぐためのエポキシ樹脂での処理である。しかし、これは複雑な方法であり、この分野では、メソ多孔質及びマクロ孔質クロマトグラフィー樹脂内のミクロ細孔の簡単な除去法が必要とされている。
【０００７】
最後に、米国特許第５８６５９９４号（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）には、陽イオンと複合体を形成し得るクラウンエーテル官能基と、陽イオンと電荷相互作用し得る非クラウンエーテル陽イオン交換官能基とからなる二官能性陽イオン交換組成物が開示されている。好ましい非クラウンエーテル官能性基は、スルホン酸エステル、カルボン酸エステル及びホスホン酸エステル基である。米国特許第５８６５９９４号には、通常の陽イオン交換樹脂の比較例が挙げられており、カルボン酸エステル官能基とリンカーがマクロ孔質ポリマー樹脂にグラフトされている。具体的には、カルボン酸エステル基は無水マレイン酸で与えられ、リンカーはエチルビニルエーテルである。これに関して、ビニルエーテルは一般に単独モノマーとしては極めて重合し難いことが周知である。例えば、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，著者：Ｇｅｏｒｇｅ  Ｏｒｄｉａｎ，出版元：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）２００頁を参照すると、その表３‐１では、ビニルエーテルのファミリーは、ラジカル重合に関して−（マイナス）と評価されている。ただし、上述の米国特許第５８６５９９４号に記載された比較例では、エチルビニルエーテルが電子供与体として作用し、無水マレイン酸が電子受容体として作用するので、重合が可能である。
【発明の開示】
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの目的は、従来用いられてきた方法に比べて、時間的要件及び複雑さが単純化されたマクロ孔質ポリマー支持体の後修飾法を提供することである。これは、請求項１及び従属項に記載された通り、支持体上に存在する未反応二重結合を介して比較的短いポリマー鎖をグラフト化することによって達成される。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、その頑健性が先行技術の方法に比べて向上したマクロ孔質ポリマー支持体の後修飾方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、クロマトグラフィーマトリックスとして有用な、立体障害効果の低減したマクロ孔質ポリマー支持体を提供することである。これは、使用したグラフト化化合物が、拡散移動のため孔径の大きな細孔を開放されたまま残しつつ、ミクロ細孔を本質的に塞ぐのに適した長さの鎖を与える上述のマクロ孔質ポリマー支持体の後修飾によって達成される。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、先行技術の支持体に比べて分解能の向上したクロマトグラフィーマトリックスとして有用なマクロ孔質ポリマー支持体を提供することである。かかる支持体は上述の後修飾法を用いて提供され、当該方法はカラム効率及び選択性の両方を改良することができる。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、支持体で得られる疎水性及び親水性の程度に関して向上した柔軟性を与えることのできるマクロ孔質ポリマー支持体の後修飾法を提供することである。例えば、グラフト化化合物として親水性ビニルエーテルのような親水性モノマーを用いることによって支持体は親水性となる。かかる親水性支持体は、ひいては望ましくない非特異的疎水相互作用が本質的にないイオン交換体、アフィニティークロマトグラフィー樹脂等の製造に使用できる。或いは、例えば疎水性のビニルエーテル又はスチレンもしくはスチレン誘導体をグラフト化化合物として用いると、本質的に疎水性の支持体が得られる。こうして、新規な後修飾法に使用するグラフト化化合物を適当に選択することによって、修飾された支持体の疎水性の程度が容易に制御される。
【００１３】
そこで、本発明のさらに別の目的は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）に使用したときに、向上した効率及び選択性を示すクロマトグラフィー用のマクロ孔質ポリマー支持体を提供することである。これは、請求項１に記載の従来のクロマトグラフィー支持体の後修飾法であって、グラフト化化合物がスチレン、その誘導体もしくはビニルエーテルである後修飾法によって達成される。かかるグラフト化支持体は向上した分解能を与えるので、ＲＰＣでの使用に有利である。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、従来ＲＰＣに用いられてきたアルカリ性条件による分解し易い先行技術のシリカマトリックスよりも加水分解を起こし難いクロマトグラフィー用マクロ孔質ポリマー支持体を提供することである。そこで、本発明は、例えば、水酸化ナトリウムを用いた従来の洗浄法で安定な支持体を提供する。これは、上述の後修飾法によって達成される。
【００１５】
図面の簡単な説明
図１は、未反応ビニル基を有するジビニルベンゼン（ＤＶＢ）樹脂（ＳＯＵＲＣＥ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン））及び実施例１に記載のオクタデシルビニルエーテルによる後修飾後の対応ＤＶＢ樹脂のＩＲスペクトルである。
図２は、上述の未修飾樹脂（下）及び後修飾樹脂（上）を用いたＲＰＣによる４種類のペプチドの分離を示す。
図３は、未反応ビニル基を有するＤＶＢ樹脂（ＳＯＵＲＣＥ（商標））及び実施例２に記載のヒドロキシブチルビニルエーテルによる後修飾後の対応ＤＶＢ樹脂のＩＲスペクトルである。
図４は、未反応ビニル基を有するＤＶＢ樹脂（ＳＯＵＲＣＥ（商標））（下）及び実施例３に記載のスチレンによる後修飾後の対応ＤＶＢ樹脂を用いたＲＰＣによる４種類のペプチドの分離を示すクロマトグラムである。
【００１６】
定義
本明細書では、別途説明しない用語は、本明細書を読む際に当業者が理解する従来の意味で用いられる。
「マクロ孔質（macroporous）」という用語は、所定の孔径の材料をいう。ＩＵＰＡＣ定義によれば、ミクロ細孔は直径＜２ｎｍを有し、メソ細孔は２〜５０ｎｍの範囲内の直径を有し、マクロ細孔は、＞５０ｎｍの直径を有する。ミクロ細孔は、支持体の外表面にも存在し得るが、上記で定義したようなメソ細孔又はマクロ細孔内にも存在し得る。そこで、材料はその最大細孔に応じて分類されることが理解されるであろう。その結果、本明細書で用いる「マクロ孔質」という用語とは、メソ細孔及び／又はミクロ細孔も含んでいてもよい材料をいう。
【００１７】
「グラフト化」という用語は、本明細書では、最初の重合後に未反応のまま残った二重結合のような基を反応させる２回目の重合について用いられる。（グラフト化の様々な原理の総説としては、例えばＰ．Ｆ．Ｒｅｍｐｐ，  Ｐ．Ｊ．Ｌｕｔｚ：  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．６，ｐｐ．４０３−４２１，  Ｅｄｓ．  Ｇ．Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｏｘｆｏｒｄ  １９８９参照。）
【００１８】
【発明を実施するための最良の形態】
具体的には、本発明は、１以上の未反応の二重結合を含むマクロ孔質ポリマー支持体の後修飾方法であって、当該方法が、
（ａ）ポリマー支持体を、１以上のグラフト化化合物を含む液相と接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物において上記ポリマー支持体の１以上の二重結合とグラフト化化合物の１以上の反応性基との間で、フリーラジカル反応を開始する工程、及び
（ｃ）ポリマー支持体を洗浄して、過剰のグラフト化化合物も除去する工程
を含んでおり、上記グラフト化化合物が、反応性基としての二重結合が線状又は環状炭素鎖に結合してなり、適宜１以上のヘテロ原子を含んでいてもよいものである、方法に関する。未反応の二重結合は、支持体の製造から残存したものでも及び／又は意図的に導入されたものでもよい。未反応の二重結合は、本明細書中で記載した通り、反応に利用できると理解される。
【００１９】
上述のように、後修飾法は、将来的にイオン交換法に用いるための１以上の官能基を導入できる可能性の向上した柔軟な方法である。本発明のグラフト化法は、マクロ細孔内及び支持体の外表面で有益な重合を生じ、クロマトグラフィーでの結果はおそらくは物質移動の向上に起因して改善される。
【００２０】
本後修飾法の予想外の効果は、マクロ孔質ポリマー支持体内に存在する多数のミクロ細孔が除去又は少なくとも本質的に減少することである。上述のように、ミクロ細孔は、場合によってはクロマトグラフィー支持体には望ましくないことがあり、かかるミクロ細孔を除去するための従来の試みは複雑で時間のかかる方法であった。本発明の後修飾法は、クロマトグラフィーに用いたときの立体的相互作用の数の低減したグラフト化ポリマー支持体を生じる。そこで、本発明の後修飾支持体を、例えばイオン交換又は逆相クロマトグラフィーによる分離に使用すると、従来の支持体を用いた場合に比べて、分解能の向上のような改善された結果を与えることができる。
【００２１】
本発明の後修飾は、ポリマー支持体に存在する未反応二重結合（不飽和基）への適当な化合物のグラフト化である。かかる二重結合を用いる代わりに、上述の欧州特許出願公開第０３３７１４４号（Ｍｅｒｃｋ）では、支持体上に存在するヒドロキシル基のα‐Ｃ原子を介してグラフトすることを提案している。したがって、本発明と欧州特許出願公開第０３３７１４４号との一つの相違点は、本発明で提供する後修飾では、出発物質の適切な選択によって本質的に加水分解に安定な支持体が得られるのに対して、欧州特許出願公開第０３３７１４４号に記載の方法でグラフトされる支持体は、アルカリなどによる加水分解を起こし易いことである。その結果、先行技術と比較した本発明の利点は、本発明の方法で後修飾した支持体は、アルカリを用いる従来の洗浄法に耐性であり、ＲＰＣマトリックスの分解を全く起こさないことである。
【００２２】
上述の米国特許第５９２９２１４号によって解決される問題は、熱ゲートとして機能し得るモノリスを提供することである。これは、特定の条件下でマクロ細孔を閉塞するのに十分な重合によって達成される。かかる閉塞を可能にするため、米国特許第５９２９２１４号に記載された重合は、比較的長いポリマー鎖を与える程度まで実施する必要がある。実際、米国特許第５９２９２１４号には、分子量を増大させて、細孔のかかる閉塞を容易にするため、特定の量の架橋モノマーを含むことさえ教示されている。ビニルエーテルのラジカル重合については、おそらくはかかる重合では所要のポリマー鎖長を得ることができないので、米国特許第５９２９２１４号では具体的には示唆されていない。米国特許第５９２９２１４号に記載された方法でグラフトしたポリマーは、実際には対流及び拡散流動の双方が減少又は停止するのに十分なほど大きく、そのためこれらの材料はクロマトグラフィーでの使用には不適当なものとなる。対照的に、本発明の新規な後修飾はフリーラジカル重合で得られ、マクロ細孔がその後のクロマトグラフィー法に依然として利用できるマクロ孔質ポリマー支持体を与える。
【００２３】
架橋ポリマーのマクロ孔質ビーズポリマーは、例えば、従来の懸濁重合法（例えば、Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｗｏｏ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉ．，  １９８４，  ２２，  ３８６参照）で製造し得る。最初に、モノマー材料、架橋剤及びポロジェンとしての希釈剤を、乳化剤によって水中油型エマルジョン中の液滴として懸濁する。開始剤の添加とともに、重合は液滴中で進行し、ポリマーマトリックス内に閉じ込められたポロジェンとしての希釈溶媒を含有するゲルビーズを形成する。閉じ込められたポロジェンは、エタノール、アセトン、トルエン等の第二の溶媒による抽出で除去されて、揮発性の高い第二の溶媒の蒸発後に、ポリマーマトリックス中に無溶媒マクロ細孔を残す。一方、架橋ポリマー相は、マトリックス中にミクロ細孔を形成する。望ましい官能基は、その誘導体化によってポリマーの表面上に提供される。マクロ多孔質ビーズは、例えばＤｙｎａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ａ／Ｓ（ノルウェー）から市販されている。
【００２４】
本方法の一実施態様では、工程（ｂ）は、加えたグラフト化化合物をポリマー支持体に重合させるのに十分な量のフリーラジカル開始剤を添加することによって実施される。フリーラジカルは、例えば、過酸化ジアセチル、過酸化ジベンゾイル、過酸化ジラウロイル、ペルオキシピバル酸ｔ‐ブチル、過オクタン酸ｔ‐ブチル、ペルオキシピバル酸ｔ‐アミル、ペルオキシ‐２‐エチルへキサン酸ｔ‐ブチル、ジ‐（４‐ｔ‐ブチルシクロヘキシル）ペルオキシジカーボネート、２，２’‐アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’‐アゾ‐ビス（２，４‐ジメチルバレロニトリル）、もしくは１，１’‐アゾ‐ビス（シアノシクロヘキサン）及びそれらの混合物に基づく任意の適当な市販の開始剤でよい。具体例は、製品Ｖ６５（＝２，２’‐アゾ‐ビス（２，４‐ジメチルバレロニトリル、和光純薬工業）又はＡＩＢＮ（＝２，２’‐アゾ‐ビス（イソブチロニトリル）、同じく和光純薬工業製）である。フリーラジカル開始剤の選択は、使用するグラフト化化合物を考慮して、当業者が容易になし得るが、これについては以下でさらに詳細に説明する。その量は決定的な重要性はなく、例えば、１〜１０モル％（モノマー当たり）の範囲内で、当業者が容易に選択できる。フリーラジカル開始剤の適量を決める際に考慮すべき基本的な事項は、単に、実質的に過剰であると重合に悪影響を与えかねないが、一方、過少量では望ましい結果には不十分となりかねないということである。
【００２５】
グラフト化化合物上の反応性基と、支持体上に存在する二重結合と、上述のフリーラジカル開始剤との間のラジカル反応は、加熱、ＵＶ光照射、化学物質の添加等の従来の方法で開始できる。或いは、重合はガンマ線又は電子線照射によって開始でき、その場合には開始剤の存在は必要ない。加熱を用いる場合、加熱浴、オーブン等を使用し得る。正確な温度は、例えばグラフト化化合物及びフリーラジカル開始剤の性状に依存するであろうが、例えば約７０℃のように約５０℃以上とすることができ、２〜２０時間のような適当な時間継続すればよい。
【００２６】
上述のように、本発明の利点の一つは、方法が簡単であることである。上述の重合反応は従来の化学に基づいており、工程にはいかなる特殊な装置も必要とせず、当業者によって容易に適合化される。当然、任意の従来のフリーラジカル重合法に対するものと同じ考慮事項が、本発明の方法にも適用され、そこでは、例えば、酸素等と接触することなく作業することの利点が利用できる。ただし、これらの詳細は当業者には周知であり、請求項に規定した本発明の概念を変えるものではない。
【００２７】
本発明のその他の利点は、純粋な形態の共重合を与えることである。したがって、２種以上のモノマーを用いて二官能性ポリマーを製造する米国特許第５９６８３６３号と比較すると、本発明の後修飾法は、ポリマー鎖長の一段と均一な分布をもたらすが、このことが、その後のクロマトグラフィーにマクロ細孔を依然として利用できる一方で、上述のようにミクロ細孔が閉塞されることの理由として考えられる。ラジカル重合においては、ビニルエーテルはゆっくりと単独重合して短鎖を与える。しかし、無水マレイン酸のような強力な電子吸引性モノマーと共重合する場合には、交互コポリマー鎖構造をもつ格段に長い鎖を形成するであろう。こうした長い鎖は、不都合なことにマクロ細孔も容易に閉塞しかねない。また、鎖中に無水カルボン酸基が存在するが、これらは容易に加水分解してカルボン酸基を形成するので、ＲＰＣ、ＨＩＣ及び陰イオン交換の用途には望ましくない。
【００２８】
多くの場合、本発明の後修飾は、工程（ｃ）として記載した、グラフト化ゲルポリマー支持体の洗浄工程を含む。かかる洗浄は、使用したグラフト化化合物及びポリマー支持体に応じて、例えば水、メタノール、エタノール、アセトンその他の適当な緩衝液又は溶液を用いて実施できる。このような、ゲルに共有結合していない過剰のモノマー、オリゴマー及びポリマーの除去は、当分野における慣用手段であり、その条件は当業者は容易に決定し得る。
【００２９】
本発明の後修飾の後にどの程度の二重結合がポリマー支持体に残存しているかを求めるための最も便利な方法は、単に重量法を用いることである。言い換えると、後修飾の前後に支持体を秤量し、重量増加がグラフト化化合物を表わす。具体的には、グラフト化ポリマーの量は、残存する二重結合の数に逆比例する。或いは、この分野で慣用されるＩＲを用いて結果を評価することもできる。このように、当業者は、本発明の後修飾の定量的又は定性的な結果を求めるための対照実験を容易に実施し得る。
【００３０】
マクロ孔質ポリマー支持体は、有利には、ポリビニルベンゼン及びポリスチレン（適宜それらのコポリマーとして）などの疎水性ベースマトリックスから製造された粒子（ビーズ）の形態又は連続的な形態（モノリス）のマトリックス支持体のような、クロマトグラフィー支持体である。マトリックスは、分離すべき液体試料と接触する支持体上（つまり外表面及び細孔表面の両方）に疎水性基を露出したポリマーネットワークから構築される。有利な実施態様では、本支持体は、１以上の粒子の形態にある。
【００３１】
そこで、一実施態様では、マクロ孔質ポリマー支持体は、モノマーとしてのメタクリレート及び／又はスチレン誘導体から製造されたクロマトグラフィー支持体である。
【００３２】
本方法の特定の実施態様では、マクロ孔質ポリマー支持体は、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）を含んでいて、例えば懸濁重合又は活性化膨潤法で製造された任意の市販マクロ孔質ビーズでもよい。
【００３３】
そこで、一実施態様では、後修飾すべきマクロ孔質ポリマー支持体は、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）、Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ（商標）等のビーズ上に存在し得る。本発明で特に有利に用いられる材料は、不飽和基の支持体密度が比較的高いものである。その理由は、かかる材料は、その後のクロマトグラフィーに有用な誘導体化に利用できる多数の部位を提供するからである。
【００３４】
有利な実施態様において、グラフト化化合物は、ヒドロキシル基のように容易に誘導体化される官能基を含む。ヒドロキシル基は、例えばグリシドールで誘導体化できる。三フッ化ホウ素エーテル錯体の添加によってヒドロキシにグリシドールの複数の分子を重合で結合して、複数のヒドロキシルを含むポリマー鎖を含む共有結合コーティングを生成させることができる。或いは、ヒドロキシルを酸化して、複数のカルボン酸基を生成することもできる。別の実施態様では、ヒドロキシルを、エピハロヒドリンのような化合物（例えばエピブロモヒドリン）と反応させると、共有結合コーティングの末端ハロゲン化物を生成させることができ、これをアミンと反応させれば第四級アミンを生成させることができる。
【００３５】
通常、グラフト化化合物はモノマー化合物をいうので、以下ではモノマーについて説明する。グラフト化反応の際に、添加したモノマーは、支持体上に存在する未反応二重結合と直接反応する。しかし、最初に幾つかのモノマー同士が反応して、短いポリマー鎖を形成し、それが未反応の二重結合を介して支持体にグラフトされることも起こり得る。
【００３６】
本方法の一つの態様は、グラフト化合物が次の一般式（Ｉ）で表される、マクロ孔質ポリマー支持体の後修飾法である。
【化１】
2005510609.tif 000002
式中、
ＲはＣ1〜Ｃ30アルキル鎖であるが、１以上のヒドロキシル、アミン、カルボニル、エーテル、酸素又は最終支持体の性質に全く又は最小限の悪影響しか与えない他の適当な基で適宜置換されていてもよく、
Ｒ’はＨ又はＣＨ3であり、
Ｒ”はＣ0〜Ｃ30脂肪族もしくは芳香族基又は酸素であり、
ＸはＯnであるが、Ｒ”が酸素又は芳香族基のときはｎは０であり、Ｒ”がアルキル鎖のときはｎは１であるという条件の下で、ｎは０〜１の整数である。
【００３７】
一実施態様では、ＲはＣ1〜Ｃ30アルキル鎖であり、Ｒ”はＣ0〜Ｃ30脂肪族基又は酸素である。
【００３８】
かくして、グラフト化化合物は、有利には、１つの二重結合と１つのエーテル官能基とを含み、これらが適宜１以上の炭素原子で互いに離隔したものであることが判明した。好ましくは、グラフト化化合物は、炭素鎖が２以上の炭素からなるビニルエーテル、即ちエチルビニルエーテルである。
【００３９】
具体的には、一実施態様では、グラフト化化合物は、式（Ｉ）で表されるもので、ＲがＣ1−Ｃ10アルキル鎖であり、Ｒ’がＨであり、Ｒ”がＯであり、ｎが整数０であるものである。別の特定の実施態様では、ＲはＣ17アルキル鎖であり、Ｒ’はＨであり、Ｒ”はＯであり、ｎは整数０である。この実施態様では、グラフト化化合物はビニルエーテルである。現在、約１５０種の異なるビニルエーテルが市販されている。特定の実施態様では、グラフト化化合物は、１種類のビニルエーテルのホモポリマーであるか、或いは２種類以上の異なるビニルエーテルの混合物のいずれかである。ビニルエーテルは、陽イオン条件下で容易に重合することが知られているが、本発明は、ポリマー支持体のグラフト化という目的に対して満足できるビニルエーテルのフリーラジカル重合について初めて開示したものである。一般に、取扱いが容易であるため、約１００℃以上の沸点を有する液体の形態のビニルエーテルが好ましい。そこで、エチルビニルエーテル、ｎ‐ブチルビニルエーテル、イソ‐ブチルビニルエーテル、ｔｅｒｔ‐ブチルビニルエーテル、シクロヘキシルビニルエーテル、オクタデシルビニルエーテル、ヒドロキシブチルビニルエーテル、エチレングリコールモノビニルエーテル、シクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテル、等のビニルエーテルが簡便に用いられる。ビニルエーテルをグラフト化化合物として用いたときに特に観察される技術的効果は、それらが、その後でのマクロ細孔内及びビーズ支持体上での誘導体化に利用できる多数の部位を与えるのに十分に効果的である重合をもたらす一方で、同時に、得られた重合がマクロ細孔を閉塞するには十分に効率的ではないことである。この結果は予期し得ないものであり、本発明で得られる利点に寄与する。
【００４０】
本発明の一実施態様では、グラフト化化合物は、反応性二重結合に加えて１以上の官能基を含んでおり、該官能基は、修飾支持体の表面のリガンドとして利用できる。したがって、二官能性又は多官能性ポリマー支持体を本方法で製造することができる。
【００４１】
マクロ孔質ポリマー支持体の後修飾法のもう一つの態様では、グラフト化化合物は次の一般式（ＩＩ）で表される。
【化２】
2005510609.tif 000003
式中、環は、最終生成物の望ましい性質に全く又は最小限の悪影響しか与えない任意の適当な置換基を有し得る。したがって、この実施態様はまた、式（ＩＩ）の誘導体、即ちスチレン誘導体を包含する。適当なスチレン誘導体は、ルーチン試験後に当業者が容易に選択できる。
【００４２】
有利な実施態様では、本方法は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）樹脂の製造に適する。
特定の実施態様では本方法は、上記の通り製造した後修飾クロマトグラフィー支持体を、クロマトグラフィー、好ましくは逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）に使用する追加の工程（ｄ）を含む。
【００４３】
ＲＰＣは、例えばペプチド及び小さなタンパク質の分離及び精製に多用される方法である。本発明者は驚くべきことに、本発明の方法で後修飾したポリマー支持体をＲＰＣに用いると、効率及び選択性に関して大幅に改良された結果を与えるという知見を得た。インスリンの場合のように、幾つかの場合には、シリカマトリックスを用いる従来のＲＰＣで、ジビニル系マトリックスよりも優れた結果が得られることが判明している。しかし、このような事例でのシリカの使用には、そのアルカリに対する感受性に起因する短所がある。シリカ系材料は、現場洗浄（ＣＩＰ）が実施される方法での使用に関しては、かかる洗浄には通常水酸化ナトリウムが用いられるので、不適当である。したがって、シリカ系マトリックスの寿命は余り短かすぎて経済的ではない。これに対して、ジビニル系マトリックスの後修飾は、以下の実施例で示すように、例えば分解能に関して優れた結果を与える材料を与えることが本発明者らによって実証された。したがって、特に有利な実施態様では、上述のように本方法を用いて後修飾したマトリックスを用いるＲＰＣによって、インスリンを精製する。本発明のかかる精製は、例えば、インスリンが組換え法で生産される方法での最終工程であってもよく、最初に粗捕捉工程を例えばイオン交換クロマトグラフィーで実施し、次いで上述のようなＲＰＣで実施する。或いは、本支持体は、インスリンの精製における捕捉工程で用いられる。当然、本発明は、その他及び類似のタンパク質についても、例えば、ＲＰＣを用いた最終高純度精製にも有利である。特に、薬学的用途を有するタンパク質は、医薬産業で要求される高レベルの純度を達成できるので、この方法で特に有利に精製される。本発明にしたがって後修飾したマクロ孔質ポリマー支持体を用いるＲＰＣを利用できる別の有利な例は、分析用途、即ち上述の分取クロマトグラフィーよりも小規模での用途である。
【００４４】
本発明には、上述の方法を用いて後修飾したポリマー支持体も包含する。かかる支持体は、例えば、粒子、モノリス又は膜であってもよく、クロマトグラフィー又はバッチ式分離に有用である。かくして、本発明には、上記で定義した後修飾マクロ孔質ポリマー支持体のクロマトグラフィーにおける使用も包含する。
【００４５】
本発明の最後の態様は、上記で定義した後修飾マクロ孔質ポリマー支持体を含むクロマトグラフィーカラムである。かかるカラムは、例えば充填カラムであってもよく、例えば、ＲＰＣのようなクロマトグラフィー用のキットの一部又は工業規模での精製用の大スケールカラムであってもよい。
【００４６】
図の詳細な説明
図１は、未反応ビニル基を有するジビニルベンゼン（ＤＶＢ）樹脂（ＳＯＵＲＣＥ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，  スウェーデン）及び実施例１に記載のオクタデシルビニルエーテルによる後修飾後の対応ＤＶＢ樹脂を示すＩＲスペクトルである。図から明らかに通り、残存ビニル基のほとんどすべてが消費されており（９８５ｃｍ-1）、かなりの量のオクタデシルビニルエーテルが樹脂に組み込まれている（１０９６ｃｍ-1）。
図２は、未修飾樹脂（下）及び実施例１に記載の後修飾樹脂（上）を用いたＲＰＣによる４種類のペプチドの分離を示す。
【００４７】
図３は、未反応ビニル基を有するＤＶＢ樹脂（ＳＯＵＲＣＥ（商標）及び実施例２に記載のヒドロキシブチルビニルエーテルによる後修飾後の対応ＤＶＢ樹脂を示すＩＲスペクトルである。図から明らかに通り、残存ビニル基のほとんどすべてが消費されており（９８５ｃｍ-1）、かなりの量のヒドロキシブチルビニルエーテルが樹脂に組み込まれている（１０９６ｃｍ-1及び３４００ｃｍ-1）。
図４は、未反応ビニル基を有するＤＶＢ樹脂（ＳＯＵＲＣＥ（商標）（下）及び実施例３に記載のスチレンによる後修飾後の対応ＤＶＢ樹脂を用いたＲＰＣによる４種類のペプチドの分離を示すクロマトグラムである。
【００４８】
【実施例】
本実施例は、単に例示のために本明細書中に記載したものであり、請求項で定義される本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下及び本明細書中の他の所において含まれる全ての参考文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００４９】
実施例１：オクタデシルビニルエーテルで後修飾したＲＰＣ用支持体
２，２’‐アゾ‐ビス（２，４‐ジメチルバレロニトリル（Ｖ‐６５）１．０ｇをトルエン２．０ｍＬ中に溶解し、次いでオクタデシルビニルエーテル４０．０ｍＬに３０℃で加えた。ラジカル重合に利用できる残存ビニル基を有するマクロ孔質ＤＶＢ樹脂４．００ｇを、モノマー／開始剤溶液に浸漬した。反応混合物を７０℃で１５時間、機械的撹拌器で穏やかに撹拌した。反応完了後、樹脂に共有結合しなかった過剰のモノマー、オリゴマー及びポリマーを、溶媒としてヘキサンを用いる洗浄法で除去した。オクタデシルビニルエーテルで修飾された樹脂４．７５ｇが得られ、１９％の質量増加を生じた。ＩＲスペクトル（図１）に示す通り、残存ビニル基のほとんどすべてが消費され（９８５ｃｍ-1）、かなりの量のオクタデシルビニルエーテルがマクロ孔質ＤＶＢ樹脂に組み込まれていた（１０９６ｃｍ-1）。さらに、マクロ孔質ＤＶＢ樹脂にオクタデシルビニルエーテルをグラフトしたことの有益な効果を、当業者に周知の標準的手順で調製し、実施したＲＰＣによる４種類のペプチド（Ｉｌｅ7‐アンジオテンシン‐ＩＩＩ、Ｖａｌ4‐アンジオテンシン‐ＩＩＩ、アンジオテンシン‐Ｉ、アンジオテンシン‐ＩＩＩ；図２を参照）の分離について示す。
【００５０】
実施例２：ヒドロキシブチルビニルエーテルで後修飾した支持体からイオン交換体の製造
２，２’‐アゾ‐ビス（２，４‐ジメチルバレロニトリル（Ｖ‐６５）１．０ｇをヒドロキシブチルビニルエーテル４０．０ｍＬ中に溶解した。ラジカル重合に利用できる残存ビニル基を有するマクロ孔質ＤＶＢ樹脂４．００ｇを、モノマー／開始剤溶液に浸漬した。反応混合物を７０℃で１５時間、機械的撹拌器で穏やかに撹拌した。反応完了後、樹脂に共有結合しなかった過剰のモノマー、オリゴマー及びポリマーを、溶媒としてメタノールを用いる洗浄手順で除去した。ヒドロキシブチルビニルエーテルで修飾された樹脂４．９４ｇが得られ、２４％の質量増加を生じた。ＩＲスペクトル（図３）に示す通り、残存ビニル基のほとんどすべてが消費され（９８５ｃｍ-1）、かなりの量のヒドロキシブチルビニルエーテルがマクロ孔質ＤＶＢ樹脂に組み込まれていた（１０９６及び３４００ｃｍ-1）。５Ｍ  ＮａＯＨ１０ｍＬを、ヒドロキシブブチルビニルエーテルでグラフト化した樹脂２．０ｇと３０分間反応させた。過剰の塩基を、ろ過ケークに「最初の亀裂」が認められるまでろ過により除去した。次いで、樹脂を塩化グリシジルトリ‐メチルアンモニウム水溶液１０ｍＬに加えて、室温で２０時間機械的撹拌器を用いて反応させた。反応完了後、過剰の塩化グリシジルトリ‐メチルアンモニウムを、溶媒として水を用いる洗浄工程で除去した。製造した陰イオン交換樹脂の滴定は、５４μｍｏｌＣｌ−／ｍＬの容量を示した。
【００５１】
実施例３：ＲＰＣ用にスチレンで後修飾した支持体
２，２’‐アゾ‐ビス（２，４‐ジメチルバレロニトリル（Ｖ‐６５）１．０ｇを、スチレン２４．０ｍＬ及びトルエン１６ｍＬの溶液中に溶解した。ラジカル重合に利用できる残存ビニル基を有するマクロ孔質ＤＶＢ樹脂４．００ｇを、モノマー／開始剤溶液に浸漬した。反応混合物を７０℃で１５時間、機械的撹拌器で穏やかに撹拌した。反応完了後、樹脂に共有結合しなかった過剰のモノマー、オリゴマー及びポリマーを、溶媒としてジクロロメタンを用いる洗浄法で除去した。スチレンで修飾された樹脂４．９０ｇが得られ、２３％の質量増加を生じた。図４に、マクロ孔質ＤＶＢ樹脂にスチレンをグラフトすることの効果を、実施例１に記載のＲＰＣによる４種類のペプチドの分離について示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、未反応ビニル基を有するジビニルベンゼン（ＤＶＢ）樹脂（ＳＯＵＲＣＥ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン））及び実施例１に記載のオクタデシルビニルエーテルによる後修飾後の対応ＤＶＢ樹脂のＩＲスペクトルである。
【図２】図２は、上述の未修飾樹脂（下）及び後修飾樹脂（上）を用いたＲＰＣによる４種類のペプチドの分離を示す。
【図３】図３は、未反応ビニル基を有するＤＶＢ樹脂（ＳＯＵＲＣＥ（商標））及び実施例２に記載のヒドロキシブチルビニルエーテルによる後修飾後の対応ＤＶＢ樹脂のＩＲスペクトルである。
【図４】図４は、未反応ビニル基を有するＤＶＢ樹脂（ＳＯＵＲＣＥ（商標））（下）及び実施例３に記載のスチレンによる後修飾後の対応ＤＶＢ樹脂を用いたＲＰＣによる４種類のペプチドの分離を示すクロマトグラムである。