(57)【要約】  本発明は、炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性の高い患者より採取された血清中の免疫グロブリンＧ糖鎖分画において、式（Ｉ）2007136001.tif 000011で示されるＧ０糖鎖量と、式（ＩＩ）2007136001.tif 000012で示されるＧ２糖鎖量（上記式中、Ｇはガラクトース、Ｍはマンノース、ＧＮはＮ−アセチルグルコサミン、Ｆはフコースを示す）の相対比を測定し、得られた相対比に基づき患者の鑑別判断を行う、炎症性腸疾患の判定方法を提供する。
2007136001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性の高い患者より採取された血清中の免疫グロブリンＧ糖鎖分画において、式（Ｉ）
【化１】
2007136001.tif 000009
で示されるＧ０糖鎖量と、式（ＩＩ）
【化２】
2007136001.tif 000010
で示されるＧ２糖鎖量
（上記式中、Ｇはガラクトース、Ｍはマンノース、ＧＮはＮ−アセチルグルコサミン、Ｆはフコースを示す）
の相対比を測定し、得られた相対比に基づき患者の鑑別判断を行う、炎症性腸疾患の判定方法。
【請求項２】
Ｇ０糖鎖量のＧ２糖鎖量に対する相対比Ｇ０／Ｇ２が予め設定された値より高い場合に、炎症性腸疾患患者がクローン病であると判定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｇ０糖鎖量のＧ２糖鎖量に対する相対比Ｇ０／Ｇ２が予め設定された値より低い場合に、炎症性腸疾患患者が潰瘍性大腸炎であると判定する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｇ０糖鎖量のＧ２糖鎖量に対する相対比Ｇ０／Ｇ２が高いほど該患者の炎症性腸疾患が重症であると判定する、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ｇ０糖鎖量のＧ２糖鎖量に対する相対比Ｇ０／Ｇ２が予め設定された値より低い場合に、該患者の予後が良好であると判定する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
１）血清中の免疫グロブリンＧを単離する工程、
２）免疫グロブリンＧより糖鎖を切り出す工程、
３）該糖鎖におけるＧ２糖鎖量とＧ０糖鎖量の相対比を測定する工程、および
４）得られた相対比によって、炎症性腸疾患を判定する工程
を含む、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項７】
Ｇ０糖鎖量およびＧ２糖鎖量を検出するための試薬を含む、請求項１〜６いずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【請求項８】
以下を含む、請求項７記載のキット：
１）血清中の免疫グロブリンＧを単離するための試薬；および
２）免疫グロブリンＧより糖鎖を切り出すための試薬。
【請求項９】
以下を含む、請求項７記載のキット：
１）抗免疫グロブリンＧ（Ｇ０糖鎖）抗体；
２）抗免疫グロブリンＧ（Ｇ２糖鎖）抗体；
３）免疫グロブリンＧ（Ｇ０糖鎖）および免疫グロブリンＧ（Ｇ２糖鎖）を固定化するための固相支持体；および
４）検出用酵素およびその基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性腸疾患の鑑別判断方法に関する。詳細には、本発明は炎症性腸疾患患者が潰瘍性大腸炎であるかクローン病であるかを鑑別判断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、現在全国で約１２万人の患者が存在する難治性疾患として知られている。現在、ＩＢＤ患者が潰瘍性大腸炎であるかクローン病であるかの鑑別診断は、主に特徴的な注腸造影の所見、内視鏡の所見、類上皮細胞肉芽腫の有無を観察する病理学的所見、血便の有無、肛門病変の合併などを観察する臨床症状の相違に基づき行われている。かかる鑑別診断のためには、内視鏡による検査が必須となり、患者への負担が大きい。非侵襲的で客観的判断の可能な鑑別診断法が求められている。【０００３】
免疫グロブリンＧ（以下「ＩｇＧ」とする）は正常ヒト血清中の生体内に存在する免疫グロブリンの約７５−８５％を占める糖タンパク質である。ＩｇＧは図１に示すように同一の２本のＨ鎖と同一の２本のＬ鎖から構成されている対称形の構造の分子である。【０００４】
ＩｇＧのＦｃ領域には糖鎖が存在しており、ＩｇＧ全体の立体構造を保つ上で重要な働きを有し、またＦｃγレセプターや補体などのエフェクター分子との相互作用に大きな影響を与えることが知られている。このような糖鎖として図２に示す１６種類が存在することが知られている。【０００５】
健常人においてはＩｇＧの１６種類の糖鎖の相対比率はほぼ一定であるが、骨髄腫患者やリューマチ患者の糖鎖は特異的な相対比率を示すことが知られている。例えば慢性関節リウマチ患者においては、ガラクトースを有していないアガラクト糖鎖が多数存在することが報告されている。係る知見に基づき、慢性関節リウマチの診断を行う方法（特許文献１）が提案され、また糖鎖の相対比率を得る手段（非特許文献１）やガラクトース欠損糖鎖を有するアガラクトＩｇＧに対する血中抗体（ＣＡＲＦ）を測定する手段（非特許文献２）等が開発されている。しかし、このＣＡＲＦはリウマチの活動性にはよく相関するものの、必ずしも血中アガラクトＩｇＧの量を反映するものではないことが確認されている。【０００６】
また、ＩｇＧ糖鎖の変化に基いてエイズの病態を診断するエイズ検査試薬（特許文献２）、肝疾患、悪性高血圧疾患、免疫グロブリンＡ腎症、小児疾患等の診断方法（特許文献３）が提案されている。特に炎症性疾患全般において、アガラクトＩｇＧが増えることは古くから報告されている（非特許文献３）。炎症性疾患のなかでも特に自己免疫疾患においてアガラクトＩｇＧ量が上昇することが報告されている。このような疾患でアガラクトＩｇＧが上昇する機序としては、ＴＮＦやＩＬ６など急性期のサイトカインの関与が示唆されているものの、詳細は明らかではない。炎症性腸疾患においても、クローン病や潰瘍性大腸炎でアガラクトＩｇＧが健常人と比べて上昇することが報告されており、しかもその値がＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）や臨床症状と相関すると言われている（非特許文献４および５）。しかしながら、これらの報告は、ＩｇＧ糖鎖の全分画におけるアガラクトＩｇＧの比率を指標として検討されたものであり、特定の糖鎖間の比率に基づいて炎症性腸疾患を鑑別診断する方法について言及した従来技術はない。【０００７】
【特許文献１】特開平８−２３０９１号公報
【特許文献２】特開平７−２０９３０１号公報
【特許文献３】特開平８−８２６２３号公報
【非特許文献１】TAKARA BIO ONLINE CATALOGUE 「PALSTATION(登録商標）を用いたヒトIgGの糖鎖分析」http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0730 (平成１８年３月１５日ダウンロード）
【非特許文献２】血清中抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体測定用医薬品ピコルミ（登録商標）ＣＡ・ＲＦ添付書類
【非特許文献３】Thomas W. Rademacher et al., Springer Semin Immunopathol, Vol. 10, 231-249 (1998)
【非特許文献４】R Dube et al., Gut, Vol. 31, 431-434 (1990)
【非特許文献５】Mae F. Go et al., J. Clin. Gastroenterol. Vol 18, 86-87 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、炎症性腸疾患を鑑別判断するための、客観的かつ非侵襲的方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性の高い患者より採取された血清中の免疫グロブリンＧ糖鎖分画において、式（Ｉ）
【化１】
2007136001.tif 000003
で示されるＧ０糖鎖量と、式（ＩＩ）
【化２】
2007136001.tif 000004
で示されるＧ２糖鎖量
（上記式中、Ｇはガラクトース、Ｍはマンノース、ＧＮはＮ−アセチルグルコサミン、Ｆはフコースを示す）
の相対比を測定し、得られた相対比に基づき患者の鑑別判断を行う、炎症性腸疾患の判定方法を提供する。【００１０】
本発明の方法において、式（Ｉ）で示されるＧ０糖鎖量の式（ＩＩ）で示されるＧ２糖鎖量に対する相対比（Ｇ０／Ｇ２）を測定する。該比が一定の値より高い場合にクローン病であると判定される。一方、該比が一定の値より低い場合には、潰瘍性大腸炎と判定される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、炎症性腸疾患を発症している、あるいはその疑いの高い患者において、潰瘍性大腸炎とクローン病の鑑別診断を行うことができる。本発明の方法は患者より採取された末梢血を用いるものであり内視鏡による診断を必須とする従来の方法と比して患者への負担は格段に低い。
更に具体的に述べれば、本発明は、炎症性腸疾患患者から採取した末梢血を用いて、該腸疾患が潰瘍性大腸炎に由来するものか或いはクローン病に由来するものかを鑑別判断し得る方法に関するものである。本発明の方法により、従来は特徴的な注腸造影の所見、内視鏡の所見、類上皮細胞肉芽腫の有無を観察する病理学的所見、血便の有無、肛門病変の合併などを観察して総合的に判断する必要のあったこれらの鑑別を、例えば血便の有無、肛門病変の合併等の非侵襲的所見から炎症性腸疾患と判断される患者の末梢血を用いて、当該炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎に由来するものかあるいはクローン病に由来するものかを鑑別判定し得るので、患者の肉体的、精神的負担を大いに軽減できるという効果を奏する。また、本発明の方法に用いられるＧ０／Ｇ２比は炎症性腸疾患の予後予測マーカーとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＩｇＧ抗体の模式図を示す。
【図２】ＩｇＧ抗体の糖鎖全１６種類を示す。
【図３】ＨＰＬＣの各ピークと図２に示す各糖鎖構造との対応関係を示す。
【図４】ＨＰＬＣパターンとＧ０／Ｇ２測定方法を示す
【図５】健常人由来のＩｇＧの糖鎖のＨＰＬＣパターンの一例を示す。
【図６】クローン病患者由来のＩｇＧの糖鎖のＨＰＬＣパターンの一例を示す。
【図７】潰瘍性大腸炎患者由来のＩｇＧの糖鎖のＨＰＬＣパターンの一例を示す。
【図８】クローン病患者（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）および健常人（ＨＣ）のＧ０／Ｇ２比の分布を示す。
【図９】クローン病患者（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）および健常人（ＨＣ）のＧ０／Ｇ２比の分布を示す。
【図１０】クローン病患者（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）の疾患活動性および罹病範囲とＧ０／Ｇ２比の関係を示す。
【図１１Ａ】クローン病患者（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）および健常人（ＨＣ）のガラクトース欠損（ａＧＡＬ）陽性／陰性率を示す。
【図１１Ｂ】クローン病患者と健常人の鑑別判断のためのＧ０／Ｇ２比およびＡＳＣＡレベルについてのＲＯＣ曲線を示す。
【図１１Ｃ】クローン病患者と潰瘍性大腸炎患者の鑑別判断のためのＧ０／Ｇ２比およびＡＳＣＡレベルについてのＲＯＣ曲線を示す。
【図１１Ｄ】クローン病患者（ＣＤ）におけるＧ０／Ｇ２比とＡＳＣＡレベルの関係を示す。
【図１１Ｅ】潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）におけるＧ０／Ｇ２比とＡＳＣＡレベルの関係を示す。
【図１２】慢性関節リウマチと潰瘍性大腸炎を併発している患者の糖鎖のＨＰＬＣパターンを示す。
【図１３Ａ】クローン病患者（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）および健常人（ＨＣ）の形質細胞におけるβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β４ＧａｌＴ）１の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。
【図１３Ｂ】クローン病患者（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）および健常人（ＨＣ）のＢ細胞におけるβ４ＧａｌＴ１の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。
【図１３Ｃ】クローン病患者（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）および健常人（ＨＣ）の形質細胞におけるβ４ＧａｌＴの酵素活性を示す。
【図１４】クローン病患者（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）の血清中の抗アガラクトＩｇＧ抗体量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法は、患者より採取された末梢血より得られた血清を用いる。本明細書および請求の範囲において「炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性の高い患者」は、従来から知られた炎症性腸疾患と関連づけられる臨床所見により炎症性腸疾患の罹患が確認された患者、および臨床所見より炎症性腸疾患に罹患している疑いが高いと考えられる患者である。【００１４】
本発明の方法においては、患者の末梢血より得られた血清中のＩｇＧの糖鎖構造を調べる。患者の末梢血より血清を得る方法は、現在臨床検査で採用されているいずれの方法を用いても良い。【００１５】
得られた血清よりＩｇＧを得、その糖鎖パターンを解析する。前述の非特許文献１、非特許文献３等に記載されているように、血清中のＩｇＧ糖鎖パターンを調べる方法はいくつか報告されている。本発明においては、血清中のＩｇＧの糖鎖中の式（Ｉ）で示されるＧ０糖鎖と式（ＩＩ）で示されるＧ２糖鎖の相対比を調べることができる方法であれば、いずれの方法を採用してもよい。例えば糖鎖を単離し、蛍光標識し、これをＨＰＬＣで展開してＧ０糖鎖とＧ２糖鎖の相対比を調べる方法が例示される。【００１６】
一の態様において本発明は、１）炎症性腸疾患患者の血清中の免疫グロブリンＧを単離する工程、
２）免疫グロブリンＧより糖鎖を切り出す工程、
３）Ｇ２糖鎖量とＧ０糖鎖量の相対比を測定する工程、および
４）得られた相対比によって、炎症性腸疾患を鑑別する工程
を含む。【００１７】
各工程は、いずれも公知の方法を採用して行えばよく、特に限定されるものではない。例えば血清からプロテインＡを用いてＩｇＧを単離し、次いでＮ−グリカナーゼにて糖鎖を遊離させ、遊離された糖鎖を蛍光標識したものをＨＰＬＣで展開することによって、患者のＩｇＧ糖鎖のパターンを測定することができる（例えば非特許文献１等）。【００１８】
具体的に説明する。プロテインＡはＩｇＧと特異的に結合する。このプロテインＡを担体に結合させたカラムが市販されている。かかるカラムに血清を作用させることにより、ＩｇＧを単離することができる。【００１９】
得られたＩｇＧより糖鎖を切り出す。糖鎖の切り出しは、ヒドラジン分解、Ｎアセチル化処理等を用いる化学的方法、Ｎ−グリカナーゼ等の酵素を作用させる方法が知られており、いずれを用いてもよい。ＩｇＧより切り出された糖鎖を、ピリジルアミノ（ＰＡ）化する。得られたＰＡ化糖鎖を次いで、市販の糖鎖分析用カラムを用いて、カラム記載のプロトコルに従いＨＰＬＣ分析する。【００２０】
図３に、糖鎖分析ＨＰＬＣパターンを示す。図２に示す各ＩｇＧ糖鎖に対応するピークを各アルファベットで示した。図４にＧ０／Ｇ２測定の概念図を示す。本態様においてはＧ０糖鎖量とＧ２糖鎖量の相対比として、Ｇ０糖鎖のピークおよびＧ２糖鎖のピークの高さの比を用いる。【００２１】
本発明の判定方法においては、抗ＩｇＧ（Ｇ０糖鎖）抗体および抗ＩｇＧ（Ｇ２糖鎖）抗体をそれぞれ作成し、これらを用いてＥＬＩＳＡ法等の常套の方法にて患者の血清中のＩｇＧ糖鎖パターンを調べてもよい。抗体は、ＩｇＧ（Ｇ０糖鎖）とＩｇＧ（Ｇ２糖鎖）を特異的に区別し、その相対的な量比を測定することが可能なものであれば、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。抗体の調製、ＥＬＩＳＡ法を利用した定量法はよく知られており、公知のいずれの方法によって行ってもよい。【００２２】
本発明においては、上記のようにして得られる血清中のＩｇＧ糖鎖におけるＧ２糖鎖とＧ０糖鎖の相対比に基づき、炎症性腸疾患の患者の鑑別判定を行う。Ｇ２糖鎖に対するＧ０糖鎖の相対比（Ｇ０／Ｇ２）が予め設定された値より高い場合に、炎症性腸疾患はクローン病である、あるいはクローン病である可能性が高いと判定される。炎症性腸疾患患者において該相対比が予め設定された値より低い場合には、潰瘍性大腸炎である、あるいは潰瘍性大腸炎である可能性が高いと判定される。【００２３】
さらに、患者の炎症性腸疾患は、Ｇ０／Ｇ２比がより高いほど重症であると判定、あるいは将来重症になると予測される。【００２４】
ここで「予め設定された値」は、ＩｇＧ糖鎖パターンの測定プロトコルを決定した後、該プロトコルにて、従来からの判定基準によりクローン病であるか、潰瘍性大腸炎であるかの診断がされている患者の血清、および健常人の血清についてのデータを元に設定される値である。【００２５】
例えば、本願明細書に記載の実施例において用いた方法である、Ｇ２糖鎖とＧ０糖鎖の量の相対比として、ＩｇＧから糖鎖を単離し、Ｇ０糖鎖とＧ２糖鎖の量の相対比（Ｇ０／Ｇ２）を、それぞれの糖鎖のＨＰＬＣピークの高さの比として求めた場合、Ｇ０／Ｇ２が１．５以上、好ましくは２．０以上、より好ましくは２．１以上である場合に患者はクローン病である、あるいはクローン病である可能性が高いと判定される。一方、炎症性腸疾患患者においてＧ０／Ｇ２が２．１未満である場合、好ましくは２．０未満である場合、さらに好ましくは１．５未満である場合に患者は潰瘍性大腸炎である、あるいは潰瘍性大腸炎である可能性が高いと判定される。なお、この値は限定的ではなく、当業者は当該プロトコルにて症例数を増やして検討し、さらに信頼性の高い値を得ることができる。【００２６】
なお、慢性関節リウマチ患者においてアガラクトＩｇＧ含量が高いことが知られており、その他の炎症性疾患においてもＩｇＧの糖鎖パターンに変化が見られることが知られている。本発明による炎症性腸疾患の判定に際しては患者が併発する疾患について考慮する必要がある。【００２７】
本発明の別の態様において、前記Ｇ０／Ｇ２が予め設定された値より低い場合に該患者の予後が良好であると判定される。本態様における「予め設定された値」は健常人のＧ０／Ｇ２比に基づき設定され、例えば健常人のＧ０／Ｇ２比の平均＋２ＳＤであり、その値として１．４が例示される。この値が限定的でないことは前記と同様である。【００２８】
本発明のキットは、本発明の判定方法を実施するため、Ｇ０糖鎖量およびＧ２糖鎖量を検出するための試薬を含む。前述のように患者の血清中のＧ０糖鎖量およびＧ２糖鎖量は、ＨＰＬＣによって、あるいは抗ＩｇＧ（Ｇ０糖鎖）抗体および抗ＩｇＧ（Ｇ２糖鎖）抗体を用いるＥＬＩＳＡ法等によっても調べることができる。よって、Ｇ０糖鎖量およびＧ２糖鎖量を検出するための試薬には、これら方法に使用されるあらゆる試薬が包含される。【００２９】
キットの一例は、（１）血清中のＩｇＧを単離するための試薬、；および（２）ＩｇＧより糖鎖を切り出すための試薬、を含むキットである。「血清中のＩｇＧを単離するための試薬」には、当該目的に使用可能なあらゆる手段が包含され、例えばプロテインＡまたはＧを有するカラムが挙げられる。本キットはさらに、切り出した糖鎖を修飾するための試薬、例えば２−アミノピリジン、および／または糖鎖分析用ＨＰＬＣカラムを含んでもよい。【００３０】
キットの別の例は、例えばＥＬＩＳＡ法に有用なキットであり、（１）抗ＩｇＧ（Ｇ０糖鎖）抗体；（２）抗ＩｇＧ（Ｇ２糖鎖）抗体；（３）ＩｇＧ（Ｇ０糖鎖）およびＩｇＧ（Ｇ２糖鎖）を固定化するための固相支持体、例えばマイクロプレート、プラスチックチューブまたはビーズ；および（４）検出用酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、およびその基質、を含む。本キットはさらに適当な希釈液、洗浄液、標準物質を含んでもよい。【００３１】
この度、潰瘍性大腸炎患者においてクローン病患者および健常人と比較して糖転移酵素であるβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β４ＧａｌＴ）１のｍＲＮＡの発現が上昇しており、より高いβ４ＧａｌＴ活性が観察されることが明らかとなった（実施例６）。よって本願は、炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性の高い患者においてβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を測定すること、およびその測定結果に基づき患者の鑑別判断を行うことを含む、炎症性腸疾患の判定方法を包含する。
【実施例】
【００３２】
実施例１
表１に記載のクローン病患者（ＣＤ）２７例、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）２７例および健常人（ＨＣ）１０例の末梢血より常法により血清を得た。なお、患者には関節炎リウマチに罹患している者はいなかった。【００３３】
【表１】
2007136001.tif 000005
【００３４】
血清からのＩｇＧの精製はタカラバイオ（株）のImmunoPure IgG Purification Kitを用い、キットに添付されたプロトコルに従ってＩｇＧを含む画分を集めた。
得られたＩｇＧ画分の約２ｎｍｏｌ相当をマイクロ遠心チューブに投入して凍結乾燥し、１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．６）４０μｌと水２０μｌを加えて溶解した。ここへグリコペプチダーゼＦ（タカラバイオ（株））を２０μｌ（１０ｍＵ）加え、３７℃で一晩インキュベーションした。反応後、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌを添加し、３７℃にて１時間インキュベーションし、グリコシルアミンからアンモニアを遊離させて、糖鎖を単離した。【００３５】
得られた液をＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮ（登録商標）（タカラバイオ（株））により、添付のプロトコルに従いピリジルアミノ化（ＰＡ化）した。【００３６】
ＰＡ化糖鎖の約１／１０量（約２００ｐｍｏｌ相当）を溶離液Ｂ２０％、溶離液Ａ８０％を含む液で平衡化した糖鎖分析用ＯＤＳ  シリカカラムＰＡＬＰＡＫ  Ｔｙｐｅ  Ｒ（登録商標  タカラバイオ株式会社）へ注入し、溶離液Ｂの割合を６０分かけて５０％まで直線的に上昇させて、糖鎖を溶出した。糖鎖の検出は、蛍光検出器（Ｅｘ３２０ｎｍ  Ｅｍ４００ｎｍ）により行った。【００３７】
カラム： PALPAK Type R（4.6 mmΦ×250 mm） タカラバイオ（株）
溶離液Ａ： 10 mM 酢酸−トリメチルアミン（pH3.8） 
溶離液Ｂ：0.5% 1-ブタノール含有溶離液Ａ 
流速： 1.0 ml/min 
カラム温度： 40℃ 
蛍光検出：Ｅｘ３２０ｎｍ  Ｅｍ４００ｎｍ【００３８】
図５〜７に健常人、クローン病患者、潰瘍性大腸炎患者の代表的なＨＰＬＣパターンを示す。Ｇ０／Ｇ２は、上記式（Ｉ）（図２のＥ）で示される糖鎖（Ｇ０糖鎖）およびで式（ＩＩ）（図２のＨ）で示される糖鎖（Ｇ２糖鎖）のピーク高さの比である。患者の背景は下記のとおりである。【００３９】
図５：
健常人  ５８歳男性  Ｇ０／Ｇ２＝０．５７
図６：
クローン病患者  １７歳男性  大腸型：Ｇ０／Ｇ２＝７．９３
図７：
潰瘍性大腸炎患者  １７歳男性  全大腸炎型：Ｇ０／Ｇ２＝１．２１【００４０】
また、全症例のＧ０／Ｇ２の値の分布を図８に示した。ＨＰＬＣのパターンは、クローン病群と、潰瘍性大腸炎および健常人群に分類された。クローン病患者全症例において、Ｇ０糖鎖はＧ２糖鎖より高いピークを呈した。Ｇ０／Ｇ２の比が２．１以上を陽性とすると、健常人は全例陰性であったが、クローン病患者の８１％、潰瘍性大腸炎患者では１１％が陽性であった。一方、１．５以上を陽性とすると、クローン病で全例が陽性であり、潰瘍性大腸炎の３７％、健常人の２０％が陽性であった。カットオフ値を１．５、２．０、２．１とした場合の、各群に含まれる人数を表２に示す。【００４１】
【表２】
2007136001.tif 000006
【００４２】
実施例２
クローン病患者（ＣＤ）４５例、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）４２例、および健常人（ＨＣ）２５例の血清を用いて、実施例１と同様の実験を行った。詳細な患者特性は表３に示す。
【表３】
2007136001.tif 000007
【００４３】
血清ＩｇＧはプロテインＧカラム (Amersham Biotech. Bucks, UK)を用いて精製した。詳細には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で半分に希釈した血清をプロテインＧカラムにロードした。次いでカラムを最低１０カラム量のＰＢＳで洗浄し、その後同量の１０ｍＭ重炭酸アンモニウムで洗浄した。カラムに結合したＩｇＧを０．１Ｍトリフルオロ酢酸（ｐＨ２．２）で溶出した。ＩｇＧの濃度は、Nanodrop ND-1000 spectroscopy (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE)により２８０ｎｍにて測定した。【００４４】
精製したＩｇＧ（１０−２０ｎｍｏｌ）のサンプルをＳｐｅｅｄＶａｃシステム(Labconco Corp., Kansas City, MO) により乾燥した後、２０μｌの１００ｍＭ重炭酸アンモニウムに溶解した。０．５ｍＵグリコペプチダーゼＦ (タカラバイオ（株）) と一晩３７℃でインキュベーションし、ＩｇＧからＮ結合糖鎖を遊離させた。この糖鎖をさらに５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０）と３０分間インキュベーションし、凍結乾燥した。【００４５】
GlycoTag （タカラバイオ（株））を製造元のプロトコルにしたがい使用し、遊離させた糖鎖を２−アミノピリジンで標識した。過剰な２−アミノピリジンをCellulose Cartridge Glycan preparation kit （タカラバイオ（株））により除去し、次いでその糖鎖を２Ｍ酢酸と８０℃で２時間インキュベーションしてシアル酸を除去した。【００４６】
ＰＡ化糖鎖を逆相ＨＰＬＣシステム (Waters Corp., Milford, MA) により分析した。
カラム：PALPAK Type R-MB（2 mmΦ×150 mm、タカラバイオ（株））
溶離液Ａ：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）
溶離液Ｂ：０．５％  １−ブタノール含有リン酸ナトリウム緩衝液
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
溶離液Ｂ（０−５０％勾配）３０分および溶離液Ｂ（５０％）１０分にて糖鎖を溶出した。糖鎖の検出は、蛍光検出器 (Waters 2475) （Ｅｘ３２０ｎｍ、Ｅｍ４００ｎｍ）にて行った。【００４７】
クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者のＧ０／Ｇ２比は健常人のＧ０／Ｇ２比よりも有意に高かった（クローン病患者（平均±ＳＤ＝２．３３±１．５８）；潰瘍性大腸炎患者（１．２４±０．７８）；健常人（０．６９±０．３４）、クローン病患者ｖｓ．健常人、潰瘍性大腸炎患者ｖｓ．健常人のいずれもＰ＜０．０１、図９）。さらに、クローン病患者のＧ０／Ｇ２比は潰瘍性大腸炎患者のＧ０／Ｇ２比よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１、図９）。【００４８】
実施例３
Ｇ０／Ｇ２比が臨床パラメーターと相関するかついて検討した。疾患活動性は、クローン病患者についてはクローン病活動指数（ＣＤＡＩ）、潰瘍性大腸炎患者については潰瘍性大腸炎活動指数（ＣＡＩ）により決定した。疾患活動期のクローン病患者（ＣＤＡＩ＞＝１５０）のＧ０／Ｇ２比は、緩解期の患者（ＣＤＡＩ＜１５０）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５、図１０Ａ）。また、炎症が回腸に限定されない罹病範囲の広いクローン病患者（ウィーン分類のカテゴリーＬ２およびＬ３）のＧ０／Ｇ２比は、回腸末端のみに炎症が見られる患者（カテゴリーＬ１）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０１、図１０Ｂ）。同様に、疾患活動期の潰瘍性大腸炎患者（ＣＡＩ＞＝６）のＧ０／Ｇ２比は、緩解期の患者（ＣＡＩ＜６）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０１、図１０Ｃ）。さらに、罹病範囲の広い（大腸全体）潰瘍性大腸炎患者のＧ０／Ｇ２比は、左側の結腸のみが罹患している患者よりも有意に高かった（図１０Ｄ）。なお、Ｇ０／Ｇ２比とＣＲＰ値、発症年齢または罹病期間との間に相関は見られなかった（データ非提示）。【００４９】
実施例４
炎症性腸疾患の血清マーカーとしてのガラクトース欠損ＩｇＧの有効性について検討した。Ｇ０／Ｇ２比のカットオフ値を１．４（健常人のＧ０／Ｇ２比の平均＋２ＳＤ）として、ＩｇＧのガラクトース欠損の陽性／陰性（ａＧＡＬ（＋）／（−））を判断した。その結果、クローン病患者の７３％、潰瘍性大腸炎患者の３３％、および健常人の０％が陽性であった。各群間の差は有意であった（ｐ＜０．０１、図１１Ａ）。【００５０】
最も一般的なクローン病患者のマーカーである抗サッカロマイセス・セレヴィシエ抗体（ＡＳＣＡ）のレベルを測定し、Ｇ０／Ｇ２比と比較した。血清中のＡＳＣＡの濃度は、ASCA IgG ELISA kit (Genesis Diagnostics, Cambridge shire, UK) により製造元の説明にしたがい測定し、１０Ｕ／ｍｌ以上を陽性とした。ＲＯＣ（Receiver operated characteristic）曲線およびＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）により、Ｇ０／Ｇ２比の感度および特異性は、クローン病患者と健常人との相違に関してＡＳＣＡよりも高いことがわかった（Ｇ０／Ｇ２比のＡＵＣｖｓ．ＡＳＣＡのＡＵＣ＝０．９２６（９５％ＣＩ、０．８７２−０．９８０）ｖｓ．０．８１５（９５％ＣＩ、０．７３２−０．８９７）；図１１Ｂ）。さらに、クローン病患者と潰瘍性大腸炎患者との相違に関しても、Ｇ０／Ｇ２比の感度および特異性はＡＳＣＡよりも高いことがわかった（Ｇ０／Ｇ２比のＡＵＣｖｓ．ＡＳＣＡのＡＵＣ＝０．８４９（９５％ＣＩ、０．７８０−０．９１８）ｖｓ．０．７９２（９５％ＣＩ、０．７１４−０．８６９）；図１１Ｃ）。なお、クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者のＧ０／Ｇ２比およびＡＳＣＡレベルの分布図において、Ｇ０／Ｇ２比とＡＳＣＡレベルの間に相関は見られなかった（図１１Ｄ、Ｅ）。【００５１】
実施例５
ガラクトース欠損ＩｇＧ（Ｇ０／Ｇ２比に基づく）と炎症性腸疾患の予後との関係について調べた。患者がサラゾスルファピリジン（ＳＡＳＰ）または５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）のいずれかの投与（コルチコステロイド、抗ＴＮＦα抗体、および免疫調節薬なし）により１年以上緩解状態を維持している場合を「臨床的無再発」と定義した。ガラクトース欠損の陽性／陰性（ａＧＡＬ（＋）／（−））は、実施例４と同様に判断した。ガラクトース欠損陽性の潰瘍性大腸炎患者の臨床的無再発率（１１％）は、陰性患者（７７％）よりも有意に低かった（ｐ＜０．００１；表４）。また、ガラクトース欠損陽性のクローン病患者の臨床的無再発率は陰性患者と比較して低かった（表４）。さらに、ＣＲＰ値が陰性（＜０．３ｍｇ／ｄｌ）の場合も、ガラクトース欠損陽性の潰瘍性大腸炎患者の臨床的無再発率（０％（０／５））は陰性患者（９０％（１９／２１））より有意に低かった（ｐ＜０．００１）。これらの結果は、Ｇ０／Ｇ２比が炎症性腸疾患の予後予測マーカーとなることを示唆する。
【表４】
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【００５２】
参考例１
潰瘍性大腸炎とリウマチを合併した患者から採取された血清中の、ＩｇＧ糖鎖パターンを実施例１と同様の方法にて調べた。
潰瘍性大腸炎患者  ６９歳女性、ＣＲＰ５．４３、左側大腸炎型、リウマチを合併。
ＨＰＬＣパターンを図１２に示す。クローン病患者と同様の糖鎖パターンを示し、Ｇ０／Ｇ２＝２．７０であった。【００５３】
実施例６
炎症性腸疾患患者の血清中のβ−ガラクトシダーゼ（糖鎖末端のガラクトースを遊離させる酵素）の活性を調べた。クローン病患者および健常人の血清を、外腕ガラクトースを有するＰＡ化二分岐糖鎖 (PA-Sugar chain 001、タカラバイオ（株）) と３日間３７℃でインキュベートし、この糖鎖をＨＰＬＣにより分析した。その結果、クローン病患者および健常人のいずれの血清によっても末端ガラクトースの欠失が観察された（データ非提示）。これは、クローン病患者と健常人の間でβ−ガラクトシダーゼ活性には差がないことを示唆する。【００５４】
次に、糖転移酵素であるβ−ガラクトシルトランスフェラーゼの酵素活性を炎症性腸疾患患者において調べた。ＩｇＧはＢ細胞および形質細胞により産生されることから、これら細胞におけるβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β４ＧａｌＴ）１のｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲにより調べた。また、形質細胞におけるβ４ＧａｌＴの酵素活性を調べた。【００５５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を炎症性腸疾患患者および健常人の静脈血からFicoll-Hypaque密度勾配遠心により単離した。このＰＢＭＣから、B cell isolation kit IIおよびPlasma cell isolation kit (Miltenyi Biotec., Bergisch Gladbach, Germany) により添付の説明書にしたがいＢ細胞および形質細胞を単離した。【００５６】
全ＲＮＡをIsogen-LS (Wako Chemicals, Osaka, Japan) により単離し、Superscript III first strand system (Invitrogen, Carlsbad, CA)を添付の説明書にしたがい使用して相補的ＤＮＡを合成した。ヒトβ４ＧａｌＴ１(Assay ID: Hs00155245_m1)および内部標準βアクチン用の設計および標識済みのTaqMan PCR プライマーとプローブのセット (TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems, Foster City, CA) およびABI PRISM 7900HT Sequence Detection System の装置およびソフトウェア (Applied Biosystems)を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。【００５７】
また、単離した形質細胞を１００μｌのＴＮＥバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、超音波分解し、１２，０００ｇで１０分間４℃で遠心し、上清を回収した。７．５μｌの細胞サンプルを、６．２５μｌの８０ｍＭ  ＵＤＰ−ガラクトース（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、５μｌの０．７７  ｍＭ  ピリジルアミノ化アガラクトＮ結合オリゴ糖（アクセプター分子として使用）とインキュベートし、ＨＥＰＥＳバッファーで２５μｌに調節した（反応混合物中のアクセプター分子の最終濃度は７７μＭである）。この混合物を３７℃で２４時間インキュベートし、反応を１分間の煮沸により終了させた。次いでサンプルを１２，０００ｇで１０分間遠心し、２５μｌの上清のうち５μｌを前述のようにＨＰＬＣで分析した。β４ＧａｌＴ活性は、反応中に上昇したガラクトシル化グリカンのピークの曲線下面積を測定し、その濃度を標準的ガラクトシル化二分岐ＰＡ糖を用いて決定することで計算した。β４ＧａｌＴ活性は、ガラクトシル化グリカンの濃度をインキュベーション時間で割り、ｎｍｏｌ／時間で示した。【００５８】
形質細胞における潰瘍性大腸炎患者のβ４ＧａｌＴ１のｍＲＮＡの発現は、クローン病患者（Ｐ＜０．０５）および健常人（Ｐ＜０．０１）よりも有意に高かった（図１３Ａ）。また、潰瘍性大腸炎患者のＢ細胞では、クローン病患者または健常人と比較してβ４ＧａｌＴ１のｍＲＮＡの発現が有意に増加していた（図１３Ｂ）。さらに、潰瘍性大腸炎患者の形質細胞では、クローン病患者または健常人と比較してβ４ＧａｌＴの活性が大幅に上昇していた（図１３Ｃ）。【００５９】
参考例２
リウマチの診断マーカーである抗アガラクトＩｇＧ抗体のレベルをクローン病患者および潰瘍性大腸炎患者において調べた。抗アガラクトＩｇＧ抗体が陽性であったのは、４１例のクローン病患者のうち１例（２％）および３８例の潰瘍性大腸炎患者のうち２例（５％）のみであった（図１４）。これら３例の抗アガラクトＩｇＧ抗体陽性のクローン病患者および潰瘍性大腸炎患者では、陰性患者と比較して疾患特性や腸管外合併症の相違は観察されなかった。
以上の結果から、抗アガラクトＩｇＧの抗体レベルでは炎症性腸疾患の鑑別診断、より具体的にはクローン病と潰瘍性大腸炎の鑑別判断は難しいことが判る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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