【手続補正書】
【提出日】平成20年6月12日(2008.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  Skp2プロモーター配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】  プロモーター配列が少なくとも15、所望により少なくとも25、所望により少なくとも50、所望により少なくとも100、もしくは所望により少なくとも500、またはストリンジェント条件下でそれとハイブリダイズし得る配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】  配列が10kb未満、所望により5kb未満、所望により1kb未満からなる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】  配列番号1もしくは配列番号2で示される配列、またはその断片、またはストリンジェント条件下でそれとハイブリダイズし得る配列を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】  配列番号1または配列番号2の全体または一部と少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、いっそう好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも99%の相同性を有する、請求項４に記載のポリヌクレオチドまたは断片。
【請求項６】  プロモーター配列に作動可能なように連結された転写配列をさらに含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】  転写配列の発現産物が細胞死を引き起こすか、または細胞の分裂もしくは生存能を阻害し、好ましくは転写配列がプロアポトーシス遺伝子である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】  転写配列の発現産物が毒素である、請求項６または７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】  転写配列の発現産物が抗腫瘍薬または抗腫瘍療法、例えば放射線療法または化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を高める、請求項４から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】  細胞を死滅させる、またはそれらの分裂もしくは生存能を阻害するという点で発現産物と抗腫瘍薬または抗腫瘍療法の間に相乗効果がある、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】  レポータータンパク質またはペプチドをコードする転写配列を含む、請求項６から１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】  レポーターが酵素、リガンド結合タンパク質、蛍光タンパク質またはリン光性タンパク質の１以上から選択される、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】  レポータータンパク質がホタル・ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質またはヒト分泌型アルカリホスファターゼから選択される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】  転写配列がアンチセンス配列である、請求項６または７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】  請求項１から１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチド。
【請求項１６】  請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝構築物。
【請求項１７】  請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
【請求項１８】  請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１９】  ウイルス、好ましくはアデノウイルスである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】  請求項１から１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２１】  請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターを細胞へ導入することを含む、腫瘍細胞死滅法。
【請求項２２】  ポリヌクレオチドまたはベクターがin vitroで細胞へ導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】  請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターの有効量を個体に投与することを含む、癌の治療法。
【請求項２４】  請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターを細胞へ導入することを含む、細胞においてSkp2の発現を阻害する方法。
【請求項２５】  請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項２６】  １以上の医薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】  請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターの医薬としての使用。
【請求項２８】  癌治療薬の製造に用いる、請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクター。
【請求項２９】  癌が乳癌、頭頚部癌から選択されるものである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】  Skp2プロモーター活性を調節する化合物を同定する方法であって、請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと化合物を接触させ、ポリヌクレオチドを発現系下に置き、転写配列の発現量を測定することを含む方法。
【請求項３１】  発現系が無細胞系である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】  Skp2プロモーター活性を調節する化合物を同定する方法であって、転写配列を発現する請求項２０の細胞を化合物と接触させ、転写配列の発現量を測定することを含む方法。
【請求項３３】  発現量が転写配列の発現産物の活性量を測定することにより求められる、請求項３０から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】  請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを細胞へ導入することを含む、細胞においてSkp2プロモーターを阻害する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は腫瘍および癌治療の分野、より詳しくは、周囲の非腫瘍または非癌細胞に対して腫瘍または癌細胞を選択的に死滅させる、あるいは増殖、分裂または生存能(viability)を低下させることを意図した療法に関する。本発明の関連分野の１つの態様は、腫瘍または癌細胞における遺伝子の選択的発現であり、それにより腫瘍または癌細胞は死滅するか、それらの活性(activities)が阻害されるか、あるいは既存の治療因子、例えば電離放射線に対する感受性が高くなるというものである。本発明はまた、周囲の非腫瘍または非癌細胞に対して腫瘍細胞または癌細胞で特異的に発現する、または過剰発現する遺伝子のプロモーター配列を含む核酸、核酸構築物(nucleic acid construct)、ベクターおよび組換えウイルスに関する。また、癌治療の方法および癌治療の医薬製剤も本発明の関連分野である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
過去数十年間で、癌の分子的基礎の理解は指数関数的に高まって来ており、数系統の証拠によりヒトにおける腫瘍発達が多段階のプロセスであることが示されている。これらのステップは正常なヒト細胞の、高い細胞増殖、低い細胞死、遺伝的不安定性および脈管形成の持続を特徴とする悪性性の高い派生物への進行的悪性転換を誘導する遺伝変異を反映している(Hanahan D. & Weinberg R.A. (2000) Cell 100: 57-70)。これらの洞察はまた、腫瘍細胞において変化している分子の相互作用および生化学経路を特異的にターゲッティングする新たな治療アプローチを示唆するものであった。この試みはますます増える癌の分子的基礎の理解を癌治療における改良へと翻訳するということである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
腫瘍細胞は細胞周期の正常な制御を失っているので、正常細胞と比較して制御を外れて分裂する。細胞周期を制御する細胞下機構(sub-cellular machinery)は、細胞の内容物の複製と分裂の必須プロセスを誘導および統制する１組の相互作用タンパク質からなる複合型生化学装置である。正常な細胞周期では、この制御系は周期内の特定のポイントで停止できるように調節される。この停止点は複製または分裂のプロセスからのフィードバック制御系を考慮したものである。それらはまた環境シグナルによる調節に関するポイントも備えている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
Chao Y et al (1998) Cancer Research 58: 985-990は、患者のサイクリンAの過剰発現と正常なサイクリンAレベルを発現する患者と比較した腫瘍細胞の増殖活性との間の関係を報告している。サイクリンAを過剰発現する患者は過剰発現しない人より短い中度の無病生存時間を有した。Chao et al (1998)はまた、サイクリンA相互作用タンパク質(Skp2)が過剰発現した場合にはサイクリンAと同様の腫瘍細胞活性との関連を示さなかったことを報告している。Chao et al (1998) はSkp2の発現がどのように細胞周期の進行の制御に関与していると考えられるかについて述べているが、Skp2の実際の生化学的機能はまだ分かっていないとも注記している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
CDKの活性は細胞内で調節を受け、CDK阻害剤タンパク質(p27)が同定されている。正常細胞では、p27はDNA複製に必要なCDKの作用を調節することが示されている。p27のレベルは休止細胞で高く、分裂刺激細胞では低いことが分かっている。p27は、それ自体細胞分裂を駆動する活性型のCDKを阻害することで細胞分裂のブレーキとして働くと考えられる。p27レベルの低下は活性化CDKを阻害から解放し、細胞分裂を駆動する。このp27の活性は、その不安定化が一般に癌患者の腫瘍の攻撃性および予後の悪さと関連する経過と一致する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
細胞内タンパク質のユビキチン系のブレークダウンは通常の生物機能のメディエーターであり、腫瘍発達を伴うある種の異常である(Koepp D.M. et al., (1999) Cell 97: 431-434; and Krek W. (1998) Curr. Opin. Genet. Dev. 8: 36-42)。リン酸化p27のユビキチン化に必要な酵素はまだ分かっていないが、酵母などの系におけるユビキチン化の知見からはp27に特異的なヒトユビキチンタンパク質リガーゼ(E3)である可能性があると予測される。Fボックス／ロイシンリッチリピートを含む癌タンパク質Skp2は腫瘍のシグナル伝達に役割を持つようである。Skp2はユビキチン化機構の基質特異的レセプターとして機能すると考えられる(ユビキチン化および分解に関するタンパク質をターゲッティングするSCFユビキチンタンパク質リガーゼ(Lisztwan J. et al., (1998) EMBO J. 17: 368-383)。Skp2は細胞周期導入動態の調節に重要な役割を果たし、哺乳類細胞に存在し、ユビキチン化および分解に関してサイクリン依存性キナーゼ阻害剤であり多組織型腫瘍サプレッサーであるp27Kip1をターゲッティングすることが示されている。そうすることで、Skp2は拘束を受けない細胞周期進行を促進する(Sutterluety H. et al., (1999) Nature Cell Biology 1(4): 207-214)。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
pRBはE2F細胞周期型調節転写因子ファミリーのメンバーと結合し、そうすることでそれらを転写アクチベーターから転写レプレッサーへと変換する(Sherr C.J. (1996) Science 274: 1672-1677)。従って機能的pRBを欠いた細胞はpRB-E2F転写レプレッサー複合体の欠損および転写を活性化し得る過剰量の遊離型E2Fを特徴とする。E2Fレベルの上昇は細胞で細胞増殖を誘導することができるが、数系統の証拠が、遊離型E2Fの増加は、癌細胞の、p53依存的およびp53非依存的経路によるアポトーシスによる細胞死の受けやすさと相関があることを示唆している(Phillips A.C. et al., Genes Dev. 11: 1853-1863; Qin X.-Q. et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10918-10922; Wu X. & Levine A.J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3602-3606)。E2Fの後者の特性は、多くの腫瘍がp53機能を欠損していることから癌治療で注目されている(Levine, A. (1997) Cell 88: 323-331)。このように、正常細胞と癌細胞の間には特定の違いが存在し得る。これらの違いの同定および利用は、それらの正常な相対物は無傷のまま癌細胞を選択的にターゲッティングできる新しい機会を提供し得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドはプロモーター配列に作動可能なように連結された転写配列を含んでもよい、あるいはさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、転写配列の発現産物は細胞死または生存能の低下を引き起こすか、あるいは細胞分裂を阻害する。転写配列は直接または間接的にその作用を発揮し得る。従って転写配列はアポトーシスと関連があるものであり得る。転写配列は潜伏していて何らかの方法で活性化され得る産物をコードするか、あるいは基質、例えば活性な医薬へ変換されるプロドラッグに作用する産物をコードする。別の例では、転写配列はチミジンキナーゼ(TK)をコードしてもよく、ガンシクロビルを投与した際にTK発現細胞は選択的に破壊される。好ましい実施形態では、転写配列はプロアポトーシス遺伝子であり得る。他の好ましい実施形態では、細胞の照射と発現配列の発現産物、特に適宜形質転換された細胞におけるプロアポトーシス遺伝子の産物との間の相乗作用的関係に利点がある。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
その他の有用な実施形態は、レポータータンパク質またはペプチドをコードする転写配列を有し得る。レポーターは例えば酵素、リガンド結合タンパク質、蛍光タンパク質またはリン光タンパク質の１以上から選択できる。このレポータータンパク質はホタル・ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質もしくは他の蛍光タンパク質、またはヒト分泌型アルカリホスファターゼから選択できる。腫瘍細胞における可視マーカーの存在が、例えばレーザーによる腫瘍細胞の除去によるなど、患者から細胞を切除しようとする外科医の指標となり得るのが有利である。マーカータンパク質は腫瘍細胞が鮮明になり、容易に識別できるようにレーザー光線の周波数を調節するように(またはその逆)選択することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
もう１つの態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドを提供する。プラスミドは本発明のポリヌクレオチドをクローニングする好適な手段を提供することができるか、細胞内で、または無細胞系での発現を達成するのに便宜なビヒクルを提供し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、SV40、パピローマウイルス、HBPエプスタインバーウイルス、ワクシニアおよびセムリキ森林ウイルス(SFV)を基にしたものが挙げられる。アデノウイルスが好ましい。これらのベクターはしばしば、改変されたウイルスゲノムとそれを封入する外被の２成分からなっている。ウイルスベクターはまた、外被を欠いているという意味において裸のものであってもよい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
ベクターはエンハンサー配列、ならびにエピソームの維持、染色体組込みまたは高レベル転写に必要なその他のいずれかの調節エレメントをさらに含んでもよい。選択マーカーおよびその他の識別配列もベクターの有用な成分となり得る。細胞の内外でベクターに安定性を与える、またはそのベクターを所定の細胞種のトランスフェクションに向ける、または細胞への侵入を媒介する助けとするため、なおさらなる配列を含んでもよい。ウイルスベクターの一部として特に有用なのは腫瘍細胞表面特異的マーカーに結合するリガンドである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ウイルスまたはアデノウイルスを含む医薬組成物を提供する。好ましい医薬組成物は１以上の医薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、水またはデキストロースをさらに含む。非経口または経口などのあらゆる投与形が本発明の範囲内にあり、これらの製剤は同時投与用であれ、個別投与用であれ、逐次投与用であれ、その他の活性剤、例えばタキソールなどの化学療法薬を含んでもよい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
Skp2プロモーター調節化合物を同定する上記の方法において、発現量を測定するのに用いる発現系はin vivoでもin vitroでもよく、すなわち、後者の場合の系は無細胞系であり得る。発現量は転写配列の発現産物の量を測定することで求めればよく、例えば蛍光、酵素活性またはリガンド結合アッセイなど、産物に組み込まれた標識の検出、あるいは産物の天然(または誘導型)の特性の検出がある。測定したプロモーター活性における低下は、その試験化合物がSKP2プロモーター活性の阻害剤であることを示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
実施例
細胞培養。以下の実施例で用いる細胞は、ラット胚繊維芽細胞REF52、継代回数の少ないマウス胚繊維芽細胞HEK293(ATCC CRL-1573)、形質転換ヒト胚腎細胞Cre8；ACHN腎腺癌(ATCC CRL 1611)、ヒト胚肺繊維芽細胞MRC5(AG05965B)、MRC5-SV40(AG10076)、IMR90(IMR90)、IMR90-SV40(AG03204A)(全てthe NIA Aging Cell Culture Repository (Camden, NJ)から)、およびヒト乳房上皮細胞HMEC(Clonetics BioWhittaker Europeから)であった。HMECは供給者から購入した添加剤(ウシ下垂体抽出物、ヒト組換えEGF、インスリン、ヒドロコルチゾンおよびゲンタマイシン)を添加した乳房上皮細胞基本培地で培養した。その他の乳房細胞としては、SKBR-3(乳腺癌ATCC HTB 30由来の悪性胸膜滲出液)、MDA-MB231(乳腺癌ATCC HTB 26由来の胸膜滲出液)、BT474(乳腺管癌細胞ATCC HTB 20)であった。RP-TEC はClonetics BioWhittaker Europeから購入し、供給者が奨励する培地で培養した。HMECおよびRPTEC以外の全ての細胞は10%FCS(Gibco)を添加したDMEMで維持した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
実施例1  マウスSkp2プロモーターのクローニング
GI-H3(5'-TAGGAAGCACCTTCAGGAGATTCC-3'; 配列番号3)およびGI-H4(5'-ACCTGGAAAGTTCTCCCGACTAAG-3'; 配列番号4)オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRによりBAC(細菌人工染色体)マウスゲノムDNAライブラリーをスクリーニングした(図3)。このゲノムライブラリーは胚幹細胞DNAから作製したものである(Shizuya et al, (1992) PNAS 89: 8794-8797)。かかるDNAライブラリーは市販されている。H3およびH4プライマーを用いたマウスゲノムDNAのPCR増幅の産物はマウスSkp2遺伝子のエクソン2に相当する277bpの断片である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
転写開始部位の同定にはRACE(cDNA末端の迅速増幅)解析を用いた。要するに、マウス精巣から単離した全RNAを、エクソン2(5’CTCCCGACTAAGCTTCGGCCGA3’; 配列番号14)においてハイブリダイズするSkp2特異的プライマーを用いたAMV-RTで逆転写した。製造業者が奨励する手順を用い、cDNAを精製し(High Pure PCR purification columns, Roche)、OligodTアンカー(Roche)で末端処理した。１回目のPCRはOligodTアンカーとネスティッドSkp2特異的プライマー(5’GAGCAGTCCATGTGGGATGTTCTCA3’; 配列番号15)を用いて行った。２回目のPCRはOligodTアンカーと別のネスティッドSkp2特異的プライマー(5’CATCCCCACGTGAAGCTGGTGGT3’; 配列番号16)を用いて行った。PCR産物をゲル精製し、SalIで消化し、pBluescript(Stratagene)へサブクローニングした。RACE解析によれば、約250bpのPCR断片が優勢であり、それにより主要転写開始部位が確認された。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
より詳しくは、pGL3#2としてサブクローニングされたプロモーター断片の活性を、MEF(マウス胚繊維芽細胞)、E1A+ras形質転換MEF、ヒト肺繊維芽細胞MRC5(またはIMR90)およびSV40形質転換MRC5(またはIMR90)などの細胞株を1μgのpGL3#21でトランスフェクトすることで評価した。非形質転換細胞のトランスフェクション効率を至適化するため、市販のFUGENE試薬(Roche)を製造業者の説明書に従って用いた。典型的には、細胞を24ウェルディッシュで80%密集まで増殖させた。FuGENE(商標)6:DNA比3:1(μl:μg)を用いて、トランスフェクション複合体を形成した。細胞株間でのトランスフェクション効率は、β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミド(0.1μg)を同時にトランスフェクトすることでノーマライズした。このように、ウェル当たりに試験プラスミド(ルシフェラーゼを発現)とノーマライズプラスミド(laczを発現)を49:1の比率で含む全DNA500μgを加えた。トランスフェクションは典型的には３回とした。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
実施例4  Skpプロモーター-ルシフェラーゼプラスミドおよびE2F-1をコードするエフェクタープラスミドでの細胞の同時トランスフェクション
293細胞、マウス胚繊維芽細胞およびヒト肺繊維芽細胞をSkp2プロモーター-ルシフェラーゼプラスミドpGL3#21(1μg)およびE2F-1またはその変異体をコードするエフェクタープラスミド(0.2μg)で同時トランスフェクトした(Krek et al, (1995) Cell, 83: 1149-1158、およびKrek et al, (1993) Science, 262: 1557-1560参照)。CMVプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドを同時トランスフェクション実験の対照として用いた。E2F-1はSkp2プロモーターの優れたアクチベーターであると考えられた。DNA結合または転写の活性化のいずれかに欠陥があるE2F-1変異体はSkp2プロモーター-ルシフェラーゼレポーターを活性化することができなかったことから、この活性化は特異的なものであった。Skp2プロモーターは、pRB経路が破壊されている場合に過剰に活性化する調節エレメントである。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
血清刺激後、様々な時点(6〜10時間間隔で0〜40時間)でルシフェラーゼ活性を評価した。ここでもまた、細胞周期を通してルシフェラーゼ活性に変動は見られなかった。これに対し、同じ実験で、サイクリンAプロモーターは予測されたように細胞周期で周期性に発現した。Skp2プロモーター活性は、他の公知のE2Fにより調節されるいずれのプロモーターとも全く対照的に、細胞周期中に調節されず、むしろSkp2プロモーター活性は細胞の状態、すなわち、形質転換されているかされていないかによって異なる。従ってSkp2プロモーターは腫瘍細胞選択的な導入遺伝子の発現に十分適している。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
ウイルスE1領域を以下の特徴を持つトランスジェニック領域で置換した：
(i)  マウスSkp2プロモーター配列(すなわち、断片図2および図4に示されている366bpのSma I断片)、または対照としての市販のベクターpRc/CMV(Invitrogen)から入手したCMVプロモーター；
(ii)  対象cDNA(例えば、EGFP, pEGFP-N1ベクター由来, Clontech;ルシフェラーゼ, pGL3基本ベクター由来, Promega;またはヒトE2F-1, De Gregori et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7245-7250); および
(iii)  SV40由来のポリアデニル化シグナル(サルウイルス40ゲノムのヌクレオチド2752番から2534番)。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
実施例9  アポトーシス誘導遺伝子の発現を駆動するためにSkp2プロモーターを用いるアデノウイルスベクターの構築
Skp2プロモーターに基づくウイルスベクターの特殊な特性は、アポトーシス遺伝子、特にE2F-1の発現のために理想的なものとなる。Skp2プロモーターの下流にE2F-1 cDNAを含むアデノウイルスベクターを構築する。このベクターはAdSkp2E2F-1と呼ばれる。調節を受けないE2F-1発現はp53依存性の、およびp53非依存性のアポトーシスの双方を誘導することが分かっていることからE2F-1を用いる。一時トランスフェクション実験では、E2F-1はSkp2プロモーターの有効なアクチベーターとして働く(図8参照)。この組換えアデノウイルスベクターの作用を組織培養細胞、次いでマウスで増殖させた腫瘍について評価する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ】  Skp2プロモーターを含む直鎖DNA断片の3720bpの配列を示す(配列番号1)。
【図２】  図１Ｃの2653〜3024bpのDNA配列を示し、Skp2プロモーターの特定の領域を同定する(配列番号2)。
【図３】  マウスSkp2の5’非翻訳領域(UTR)のマップを示す。
【図４】  Skp2プロモーターの領域を含むpGL3プラスミドのマップを示す。