(57)【要約】  受精卵の効率的な培養装置および培養方法を提供すること。本発明は、変形可能な材料で形成される矩形箱状の培養容器を提供する。この培養容器は、上底、下底、および該下底の全周縁から立設する側壁を備え、該上下底と該側壁とから矩形箱状密閉空間が形成され、該上底および該下底が、酸素および二酸化炭素透過性であり、そして、一対の対向する側壁には、該培養容器を一軸水平方向に伸展させる伸展装置に係合させるための係合部がそれぞれ形成されている。この培養容器を用いて、培養液を満たした密閉空間の下底に哺乳動物由来の体細胞と受精卵とを配置し、該培養容器を周期的に一軸水平方向に伸展させながら共培養することにより、非常に効率よく受精卵を培養できる。この培養方法により得られる受精卵は、着床率が非常によい。
2007052653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形可能な材料で形成される矩形箱状の培養容器であって、
上底、下底、および該下底の全周縁から立設する側壁を備え、該上下底と該側壁とから矩形箱状密閉空間が形成され、
該上底および該下底が、酸素および二酸化炭素透過性であり、そして、
一対の対向する側壁には、該培養容器を一軸水平方向に伸展させる伸展装置に係合させるための係合部がそれぞれ形成されている、培養容器。
【請求項２】
前記矩形箱状密閉空間に細胞を導入しかつ培養液を潅流し得るように、該矩形箱状密閉空間と外部とを連通するチューブを備え、そして該連通を遮断するための手段を備える請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
前記矩形箱状密閉空間の高さが２５０μｍ〜１ｃｍである、請求項１または２に記載の培養容器。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかの項に記載の培養容器、および該培養容器の係合部と係合する保持部を備えた伸展装置を備える、培養装置。
【請求項５】
受精卵の培養方法であって、
密閉空間を有し、変形可能な材料で形成きれる培養容器を準備する工程；
該密閉空間に培養液を満たす工程；
該密閉空間の下底に哺乳動物由来の体細胞を播種して該体細胞を培養する工程；および
該培養した体細胞上に受精卵を配置して培養する工程；
を含み、
該体細胞の培養工程および該受精卵の培養工程において、該培養容器が周期的に一軸水平方向に伸展される、培養方法。
【請求項６】
前記培養容器が、前記密閉空間と外部とを連通し得るチューブを備え、そして前記体細胞の培養工程および前記受精卵の培養工程において、該チューブを介して前記培養液を該密閉空間に潅流させる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物の体細胞が子宮内膜細胞である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記培養容器が、請求項１から３のいずれかの項に記載の培養容器であり、そして該培養容器の係合部と係合する保持部を備えた伸展装置に保持されている、請求項５から７のいずれかの項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養容器および該容器を備えた培養装置に関する。さらに詳しくは、生殖医療または再生医療において重要な受精卵の培養に特に適したマイクロデバイス（培養容器）および培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物、特に哺乳動物の精子と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製し、卵割、桑実胚、胞胚、さらには後期胞胚の段階まで培養する技術が開発されている。そして、この卵割から胞胚の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る技術が開発され、家畜における品種改良に用いられ、さらには、ヒトの不妊治療にも応用されている。【０００３】
しかし、生殖医療、とりわけ不妊治療の一手段として行われている体外受精による妊娠成功率は高くない。この成功率は、２７年前の英国における世界初の挙児以来、依然として約２５%程度にとどまっており、その成功率の向上が望まれている。不妊治療には、一般的には、卵子の採取（未成熟の場合は、体外成熟が必要となる）、体外受精、受精卵を子宮内に戻す過程が必要である。そして、最も重要な過程は、受精卵を、移植に適した発育段階（４〜８細胞期、胚盤胞期）まで発生させる過程である。【０００４】
一般に、受精卵は、シャーレなどの培養プレート上での培養、あるいは培養プレートのウェル内に５００μｌ前後の培養液を満たし、そこに受精卵を静置する静置培養、あるいは培養プレート上のウェル内に培養液（微小滴２０μｌ）を入れ、その上部をミネラルオイルで被覆し、その中に受精卵を静置するという静置・閉鎖環境培養により、成熟・発生されている。【０００５】
しかし、このような静置・閉鎖環境培養方法の問題点は、受精卵の培養条件が体内（子宮、卵管内）の状況とかなり異なっていることである。すなむち、子宮の組織には、極性があり、内膜細胞、間質細胞などからなる層状の構造であること、子宮および卵管の内腔に内液の流れがあることなどが知られている。そのため、プレート上のウェル内と比べて、その物理化学的および生物学的な環境には、かなりの隔たりがある。このような体内の環境とはかけ離れた条件下で、受精後２日〜５日にわたって受精卵の培養を行った後に、移植に適した発育段階の、品質のよい（断片化の少ない）受精卵を高い頻度で得ることは容易でない。すなわち、受精卵は、シャーレなどの生体内環境とかけ離れた条件下で単に培養するだけでは、生体内で発現していた特異的な機能を失ってしまう。【０００６】
そのため、培養担体として三次元構造を有するマトリックスを用いる方法が提案されている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。特許文献１では、従来用いられている培養担体が生体組織における細胞の周囲環境を反映しておらず、生体内に酷似した細胞外環境を実現できていないという欠点を解消することを目的としており、そのために生物の組織を薄切りにした切片を使用することが提案されている。しかし、組織の薄切りした切片を種々の形態の培養容器に貼り付けることは、手間がかかる上、容易ではない。特許文献２は、受精卵の三次元的発育を誘導することを目的として、受精卵と共培養する担体を開示している。この担体は、動物の細胞、コラーゲンゲル、マトリゲルなどのマトリックス構成成分、および三次元培養のための空間を形成できる程度の開口部を有する繊維状のメッシュ体を共培養して得られ、細胞組込型三次元組織再構築体と呼ばれている。この担体（細胞組込型三次元組織再構築体）の空間部に受精卵を配置し、共培養することにより、受精卵を培養したことが記載きれている。【０００７】
しかし、この方法は、担体の作成方法が複雑であり、時間がかかる上、受精卵を受け入れる空間を確実に提供できるとはいえず、成熟した受精卵の取り出しにも大きな問題がある。
【特許文献１】特開２００１―３４００７６号公報
【特許文献２】特開２００２―１４３７５３号公報
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細胞、特に受精卵を、生殖器官である卵管・子宮内部に近い環境条件において培養し、成熟させ得る簡単な方法および装置を提供することを目的とする。【０００９】
本発明は、変形可能な材料で形成される矩形箱状の培養容器を提供し、該培養容器は、上底、下底、および該下底の全周縁から立設する側壁を備え、該上下底と該側壁とから矩形箱状密閉空間が形成され、
該上底および該下底が、酸素および二酸化炭素透過性であり、そして、
一対の対向する側壁には、該培養容器を一軸水平方向に伸展させる伸展装置に係合させるための係合部がそれぞれ形成されている。【００１０】
１つの実施態様では、上記培養容器は、上記矩形箱状密閉空間に細胞を導入しかつ培養液を潅流し得るように、該矩形箱状密閉空間と外部とを連通するチューブを備え、そして該連通を遮断するための手段を備える。【００１１】
さらなる実施態様では、上記培養容器の上記矩形箱状密閉空間の高さは２５０μｍ〜１ｃｍである。【００１２】
本発明はさらに、上記のいずれかの培養容器、および該培養容器の係合部と係合する保持部を備えた伸展装置を備える、培養装置を提供する。【００１３】
本発明はまた、受精卵の培養方法を提供し、該方法は、
密閉空間を有し、変形可能な材料で形成される培養容器を準備する工程；
該密閉空間に培養液を満たす工程；
該密閉空間の下底に哺乳動物由来の体細胞を播種して該体細胞を培養する工程；および
該培養した体細胞上に受精卵を配置して培養する工程；
を含み、
該体細胞の培養工程および該受精卵の培養工程において、該培養容器が周期的に一軸水平方向に伸展される。【００１４】
１つの実施態様では、上記方法においては、上記培養容器は、上記密閉空間と外部とを連通し得るチューブを備え、そして上記体細胞の培養工程および上記受精卵の培養工程において、該チューブを介して上記培養液を該密閉空間に潅流させる。
また、上記培養容器は、上底、下底、および該下底の全周縁から立設する側壁を備え、該上下底と該側壁とから矩形箱状密閉空間が形成され、該上底および該下底が、酸素および二酸化炭素透過性であり、そして、一対の対向する側壁には、該培養容器を一軸水平方向に伸展させる伸展装置に係合させるための係合部がそれぞれ形成されているものとすることが好ましい。【００１５】
さらなる実施態様では、上記哺乳動物の体細胞は子宮内膜細胞である。【００１６】
別の実施態様では、上記方法においては、上記のいずれかの培養容器を用い、そして該培養容器は、該培養容器の係合部と係合する保持部を備えた伸展装置に保持されている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、細胞、特に受精卵を培養するのに適した生体内環境に近い環境を提供できる簡単な構造の培養容器および培養装置が提供される。本発明の受精卵の培養装置および培養方法は、受精卵を培養するための複雑な三次元構造体を用いる必要がない。この装置を用いれば、受精卵を、潅流条件下、水平方向に応力をかけながら培養するという簡単な方法で、受精卵を生殖器官である卵管・子宮内部に近い環境条件において培養・成熟することが可能である。したがって、不妊治療の成功率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の培養容器の一実施態様の断面模式図である。
【図２】本発明の培養容器の一実施態様の斜視図である。
【図３】本発明の培養容器の他の実施態様の断面模式図である。
【図４】本発明の培養装置の一実施態様の斜視図である。
【図５】種々の培養容器を用いて共培養した場合のマウス２細胞期卵子から胚盤抱への発生率の経時変化を示すグラフである。
【図６】種々の培養容器を用いて共培養した場合の、二重蛍光染色法により計測したマウス胚盤胞を構成する総細胞数および内部細胞塊（ＩＣＭ）数を示すグラフである。
【図７】種々の培養容器を用いて共培養で得られた胚盤胞を受胚雌子宮内に移植した際の妊娠率ならびに産仔生産率を示すグラフである。
【図８】種々の培養容器を用いて培養した場合の、マウス２細胞期卵子から胚盤胞への発生率の経時変化を示すグラフである。
【図９】種々の培養容器を用いて培養した場合の、二重蛍光染色法により計測したマウス胚盤胞を構成する総細胞数および内部細胞塊（ＩＣＭ）数を示すグラフである。
【図１０】種々の培養容器を用いて培養で得られた胚盤胞を受胚雌子宮内に移植した際の妊娠率ならぴに産仔生産率を示すグラフである。
【符号の説明】
【００１９】
１００、１００’    培養容器
１００    上底
１２０    下底
１３０（１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄ）    側壁
１４０    矩形箱状密閉空間
１５０（１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ、１５０ｄ）    係合部
１６０    チューブ
１７０    キャップ
２００    伸展装置
２１０    固定プレート
２２０    可動プレート
２３０    ステップモーター
２４０    制御装置
２５０    連結器
２６０（２６０ａ、２６０ｂ）    係合ピン
２７０（２７０ａ、２７０ｂ）    係合ピン
３００    培養装置
４００    受精卵
５００    体細胞
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
Ａ．培養容器
本発明の培養容器の一つの実施態様である培養容器を、図1に示す断面模式図に基づいて説明する。培養容器１００は、変形可能な材料で形成される矩形箱状である。培養容器１００は、上底１１０、下底１２０、および下底１２０の全周縁から立設する側壁１３０を備え、上底１１０、下底１２０および側壁１３０から矩形箱状密閉空間１４０が形成されている。そして、一対の対向する側壁１３０（１３０ａおよび１３０ｂ）には、培養容器１００を水平方向に伸展させる後述の伸展装置２００に係合させるための係合部１５０がそれぞれ形成されている。【００２１】
さらに、培養容器１００の矩形箱状密閉空間１４０にセンサーを取り付け、培養液の状態を示す種々の指標（温度、浸透圧、ｐＨ、有用物質、有害物質など）を測定し、リアルタイムでモニタリング（表示記録）するように構成することができる。【００２２】
図２は、図１に示す培養容器１００の斜視図である。一対の側壁１３０ａおよび１３０bは他方の側壁１３０ｃおよび１３０ｄよりも厚く構成されている。側壁１３０ａおよび１３０ｂには、係合部１５０ａ、１５０ｂおよび１５０ｃ、１５０ｄが形成されている。この係合部１５０は、後述の伸展装置２００に連結される。したがって、係合部１５０を伸展装置２００に係合して伸展するために、側壁１３０ａ、１３０ｂの厚みは、側壁１０３ｃおよび１３０ｄよりも厚いことが必要である。側壁１３０ｃおよび１３０ｄの厚みは０．１〜３０mmであることが好ましく、１〜２ｍｍであることがより好ましい。【００２３】
上記培養容器１００は、変形可能な材料からなるマイクロ流体デバイスであり得る。ここで、変形可能とは、少なくとも水平方向の引っ張りあるいは押圧に対して、箱状空間の形状を破壊することなく伸縮し得ることを意味する。変形可能な材料としては、代表的には、シリコーンエラストマーが用いられる。シリコーンエラストマーとしては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ジメチルシロキサンなどのエラストマーが挙げられる。他の材料としては、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ（Ｎ一ビニルピロサドン）、ポリジメチルアクリルアミド、ポリグリセロールメタクリレート、ポリブチルアクリレ一トなどが挙げられる。上底１１０、下底１２０および側壁１３０は、同一材料で形成されていてもよい。あるいは、これらの材料の組み合わせ（例えば、二層構造）であってもよい。このような容器の製造方法は、特に限定されない。例えば、上底１１０および約半分の高さの側壁１３０を備える凹型部材と、下底１２０および約半分の高さの側壁１３０を備える凹型部材とを、内部に密閉空間を形成するように上下で貼り合わせることによって製造され得る。貼り合わせる際には、容器を繰り返して伸展させる場合においても剥がれないシリコーン系接着剤と用いてもよい。あるいは、適切な有機溶剤を接着面に塗布することにより上記の材料表面を溶解させて、互いに接着させてもよい。【００２４】
培養容器１００の矩形箱状密閉空間１４０を形成する上底１１０および下底１２０は、酸素および二酸化炭素の透過性の観点から、薄膜状であることが好ましい。より好ましくは５０〜５００μｍ、さらに好ましくは１００〜２００μｍの厚さである。さらに、上底１１０および下底１２０は、受精卵の培養過程の観察（光学顕微鏡に観察など）の点から、透明であることが好ましい。このような材料としては、酸素および二酸化炭素透過性のシリコーンエラストマ一などが挙げられる。具体的には、シリコーンエラストマーとしては、ポリジメテルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマ一などが挙げられる。【００２５】
受精卵を培養するためには、矩形箱状密閉空間１４０は１００μｍ以上の高さ（図１において「ｈ」で示す）、好ましくは１００〜２００μｍ程度の高さを有することが必要である。この高さは受精卵の大きさを考慮して決定すればよい。【００２６】
下底１２０の矩形箱状密閉空間１４０側の表面は、培養した細胞が剥がれにくいようにコーティングされていることが好ましい。コーティングには、細胞外基質が好ましく用いられる。細胞外基質としては、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニンなどが挙げられる。【００２７】
培養容器１００には、矩形箱状密閉空間１４０と外部とを連通するチューブ１６０が備えられていてもよい。図３は、矩形箱状密閉空間１４０と外部とを連通するチューブ１６０を備える培養容器１００’の断面模式図である。このチューブ１６０を介して培養液が潅流し得るように構成されている。潅流は、例えば、ペリスタルティックポンプなどを用い、パーソナルコンピューター（ＰＣ）で、流量を調整するように構成してもよい。また、センサーを取り付け、培養液の状態を示すさまざまな指標（温度、浸透圧、ｐＨ，有用物質量、有害物質量など）を測定し、リアルタイムでモニタリング（表示記録）することができる。【００２８】
また、このチューブ１６０を介して、培養すべき細胞を矩形箱状密閉空間１４０に導入することもできる。そのため、チュ一ブ１６０の内径は、少なくとも導入される細胞の直径よりも大きいことが好ましい。好ましくは１３０〜１５０μｍφである。チューブの材料は、特に限定されないが、例えば、ポリカーボネートなどが挙げられる。好ましくは、チューブの内径表面が、テフロン（登録商標）コーティングされているものが好ましい。【００２９】
このチューブ１６０の外側には、培養容器１００’内の密閉を維持することが可能なように、該連通を遮断するための手段が備えられ得る。このような手段として、図３に示すようなキャップ１７０、チューブ１６０を挟むクリップなどが挙げられる。【００３０】
Ｂ．培養装置
本発明の培養装置は、上記培養容器１００を伸展装置２００に係合することにより、構成される。図４に本発明の培養装置３００を示す。【００３１】
伸展装置２００は、水平方向に応力をかけ得るものであれば、その構造に特に制限はない。図４において、伸展装置２００は、固定プレート２１０、可動プレート２２０、ステップモーター２３０、制御装置２４０、ステップモーター２３０と可動プレート２２０とを連結する連結器２５０を備えている。そして、固定プレート２１０には、係合ピン２６０ａおよび２６０ｂが立設されている。可動プレート２２０上には、係合ピン２７０ａおよび２７０ｂが立設されている。そして、培養容器１００の係合部１１０ａ〜１１０ｄを貫通孔として、あるいは所定の高さまで設けた穴として、固定プレート２１０および可動プレート２２０にそれぞれ設けられた係合ピン２６０および２７０をこの貫通孔あるいは穴に挿入することにより、培養容器１００が固定プレート２１０と可動プレート２２０との間に懸架され、伸展装置２００に固定される。【００３２】
伸展装置２００のステップモーター２３０を駆動（例えば、回転）させることにより、可動プレート２２０と固定プレート２１０との間隔が変化する。これによって、変形可能な材料からなる培養容器１００は一軸水平方向に伸展し、矩形箱状密閉空間１４０の下底１２０の表面上に配置された細胞（体細胞５００および受精卵４００）に応力がかけられる。伸展の周期は、制御装置２４０で制御されている。周期は、培養される細胞によって異なる。好ましくは、当該培養細胞が由来する動物の心拍数と同じになるように制御され得る。また、伸展の強さは、培養中の細胞の大きさが非伸展時の約１．２倍になるように制御されることが好ましい。【００３３】
なお、培養容器１００と伸展装置２００とを懸架するための手段は、上記ピン構造などに限定されない。【００３４】
本発明の培養装置３００は、ＣＯ2インキュベータ内に設置きれ、温度、湿度などを制御するように構成されていることが、培養の管理の点で好ましい。以下、このようなＣＯ２インキュベータ内に設置された培養装置３００を、本明細書では培養ユニットという。培養ユニットのパネルには、矩形箱状密閉空間１４０内に設置したセンサーからの、培養液の状態を示すさまざまな指標（例えば、温度、溶存酸素、有用物質の量、アンモニア濃度など）が計測・表示され、これをもとに、培養容器１００内に潅流する培養液の量をコンピュータで制御するように構成されている。【００３５】
本発明の培養装置を備えた培養ユニットを用いれば、温度、湿度、培養液の流量を制御しつつ、酸素および二酸化炭素の透過性を有する薄膜で構成された培養容器を、応力をかけながら培養することができる。それにより、より体内に近い環境条件で培養を行うことができる。例えば、受精卵の培養においては、子宮および卵管内部の流れが模擬され、体内に近い環境条件で成熟・発生操作を行うことができる。【００３６】
なお、上記の本発明の培養容器および培養装置は、種々の細胞の培養に用いることができる。このような細胞としては、初代培養細胞、株化細胞などであってもよい。具体的には、血管内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、子宮内膜細胞、卵管上皮細胞、繊維芽細胞、卵細胞（受精卵を含む）などが挙げられる。特に、以下に詳述する本発明の受精卵の培養方法に好適に用いられる。また、これらの細胞が由来する動物種も、特に限定されないが、哺乳動物に由来する細胞が好適である。【００３７】
C．受精卵の培養方法
本発明の受精卵の培養方法は、変形可能な材料で形成される密閉空間を有する培養容器を用いて、培養容器を周期的に一軸水平方向に伸展させつつ、受精卵を体細胞と共培養することにより行われる。必要に応じて、密閉空間内の培養液が潅流可能な培養容器を用いてもよい。ここで用いられる培養容器としては、上記の条件を満たすものであれば、特に限定されないが、上記の本発明の培養容器が好適に用いられる。【００３８】
ここで、「共培養」とは、同種あるいは異種の細胞を同時に培養することをいう。特に、本発明の受精卵の培養方法においては、哺乳動物の体細胞と哺乳動物の卵子を同時に培養することを意味する。【００３９】
本発明の方法に用いられる哺乳動物由来の体細胞には、特に制限はなく、生殖器官由来細胞、繊維芽細胞などが用いられる。好ましくは生殖器官由来の体細胞、例えば、子宮内膜細胞が用いられる。体細胞は、必ずしも受精卵と同種の動物由来の細胞である必要はないが、同種の動物、好ましくは受精卵を採取した同一動物に由来することが好ましい。同一動物から得られる生殖器官由来体細胞（特に子宮内膜細胞）と受精卵との共培養が最も好ましい。【００４０】
本発明には、好ましくは、哺乳動物由来の受精卵が用いられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒヒ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどが挙げられる。【００４１】
また、培養に用いる受精卵は、接合子、卵割、桑実胚、胞胚のいずれの段階のものでもよいが、受精卵以外のライフサイクルにある卵子（例えば、卵胞内卵子、排卵卵子など）を培養容器内で培養し、受精させて用いてもよい。さらに、凍結・融解後の受精卵を用いてもよい。【００４２】
培養液は、所望の細胞、好ましくは上記の哺乳動物由来の細胞、より好ましくは受精卵および子宮内膜細胞が培養できるものであれば、特に制限はない。例えぼ、ＧＩＢＣＯ社のα―ＭＥＭ、メディカルト社のＩＶＣ、アーバイン社のＨＴＦなどの培地が用いられる。【００４３】
培養液中には、さらに培養のための有用物質を含んでいてもよい。例えば、気相中の酸素による過酸化による発生阻害を防止するためのβメルカプトエタノールが挙げられる。逆に、培養中に発生し得る有害物質は、以下に記載のようにモニターされ得る。このような有害物質としては、アンモニアなどが挙げられる。【００４４】
培養条件は、受精卵の培養に当業者が通常用いる条件が採用される。例えば、温度は、約３７〜３８℃、浸透圧は、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇである。培養液の流量は、種々の条件を考慮して、適宜設定され得る。【００４５】
本発明の受精卵の培養方法を、図１に基づいて説明する。まず、培養容器１００の密閉空間１４０に、例えば、注射針などを用いて培養液を充填し、密閉空間１４０を培養液で満たす。密閉空間１４０内には、気体が残らないようにすることが好ましい。次いで、培養容器１００の密閉空間１４０の下底１２０に哺乳動物由来の体細胞５００を、例えば、注射針などを用いて導入して播種し、体細胞５００を培養（増殖）する。この培養時から、伸展装置２００を駆動させて、培養容器１００を周期的に一軸水平方向に伸展させる。次いで、培養した体細胞５００上に、例えば、注射針などを用いて受精卵４００を配置し、受精卵４００を培養する。この受精卵培養時にも伸展装置２００を駆動させ、培養容器１００を周期的に一軸水平方向に伸展させる。伸展の周期は、上述のように、培養細胞が由来する動物の心拍数と同じになるように制御され得、伸展の強さは、培養中の細胞（体細胞５００および受精卵４００）の大きさが非伸展時の約１．２倍になるように制御されることが好ましい。また、培養中のガス置換は、上底１１０および下底１２０を通して行われ得る。このように培養して、胚盤胞期まで成熟させた受精卵４００は、上底１１０を破断することによって取り出し、その後子宮内に移植し得る。このように、体細胞上に受情卵を配置し、受精卵の培養液を潅流しつつ、培養容器を伸展することにより、受精卵の生育・成熟環境に類似した環境を提供できる。【００４６】
矩形箱状密閉空間１４０と外部とを連通するチューブ１６０を備える培養容器１００’を用いる場合は、このチューブ１６０を介して培養時に培養液を潅流させることが好ましい。この場合は、各種の測定をするためのセンサーを取り付け、測定した温度、浸透圧、ｐＨ、有害物質などの量を考慮して、潅流量を決定することにより、より生体内環境に近づけることができる。これらの制御は、コンピュータを介して行われ得る。そのため、従来法に比べて、極めて簡便に、かつ効率よく、受精卵の三次元的な成熟が可能となる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施側に制限されないことはいうまでもない。【００４８】
（実施例1）
図１に示す培養容器１００を用いて、マウス生殖器官由来細胞であるマウス子宮内膜細胞（ＭＥＣ）およびマウス２細胞期卵子（受精卵）を共培養した。この培養容器は、ＰＤＭＳエラストマ一で形成されている。【００４９】
まず、３７℃のインキュベータ内に、図２に示す培養装置３００を設置し、注射針を培養容器１００に穿刺して密閉空間１４０を気相が残らないように培養液で満たした。培養液としては、ＧＩＢＣＯ社のα―ＭＥＭを用いた。なお、予め、気相中の酸素による過酸化による発生阻害を防止するために、５０μＭのβメルカプトエタノールを培養液に添加しておいた。【００５０】
マウス子宮内膜細胞を、日本クレア社より購入した６週齢ＩＣＲ系雌マウスより、当業者が通常用いる方法に従って採取し、試験に用いた。注射針を用いて培養容器１００に穿刺して、下底１２０上に１００〜１０００個を播種した。伸展装置２００を駆動させて、一軸周期的伸展（２０％、１Ｈｚ）を与えながら９６時間培養した。次いで、マウス２細胞期卵子は、日本クレア社より購入した６週齢ＩＣＲ系メスマウスに当業者が通常用いる方法でホルモンを投与して過剰排卵を促し、同じく日本クレア社の６週齢のＣ５７ＢＬ系雄と交配させて、２細胞胚採取したものを試験に用いた。培養したＭＥＣ上に注射針を用いて配置した。次いで、伸展装置２００を駆動させて、一軸周期的伸展（２０％、１Ｈｚ）を与えながら９６時間培養した。【００５１】
２４時間毎に９６時間までの卵子の胚盤胞への発生を倒立顕微鏡で観察・記録した。胚盤胞への発生率の経時変化を図５に示す。また、二重蛍光染色法（Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ  ＡＨおよびＨｕｎｔｅｒ  Ｓ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｚｏｏｌ．，  １９８４、  Ｓｅｐ；２３１（３）：４２９−３４）によりマウス胚盤胞を構成する総細胞数および内部細胞塊（ＩＣＭ）数を計測した。この結果を図６に示す。【００５２】
さらに、９６時間の培養後の胚盤胞を、受胚雌マウス子宮内に移植して妊娠させ、約１５日間飼育し、出産させた。妊娠率および産仔生産率(移植した卵子数に占める誕生した産件数)を図７に示す。【００５３】
（比較例１）
カルチャーディッシュ（コ一ニング社製）上に上記実施例１と同じ培養液２ｍｌを入れ、共培養用のＭＥＣを播種し、次いでマウス２細胞期卵子（受精卵）を配置し、静置状態で９６時間共培養した。培養後、胚盤胞を、受胚雌マウス子宮内に移植した。胚盤胞への発生率、総細胞数およびＩＣＭ数、ならびに妊娠率および産仔生産率を、それぞれ図５〜７に示す。【００５４】
（比較例２）
躯体の底部に膜構造を有するセルカルチャーインサート（ＣＣＩ）（コ一ニング社製）を用い、このＣＣＩ底部の膜上に上記実施例１と同じ培養液２ｍｌを入れ、共培養用のＭＥＣを播種し、次いでマウス２細胞期卵子（受精卵）を配置し、静置状態で９６時間共培養した。培養後、胚盤胞を、受胚雌マウス子宮内に移植した。胚盤胞への発生率、総細胞数およびＩＣＭ数、ならびに妊娠率および産仔生産率を、それぞれ図５〜７に示す。【００５５】
図５は、上記実施例１ならびに比較例１および２におけるマウス２細胞期卵子から胚盤胞への発生率の経時変化を示すグラフである。図５によると、本発明の装置を用いて培養した（実施例１）場合の方が、従来の静置共培養（比較例１）および膜上静置共培養（比較例２）の場合に比べて、胚盤胞期到達時間が有意に早いことが明らかとなった。【００５６】
図６に、二重蛍光染色法により計測したマウス胚盤胞を構成する総細胞数および内部細胞塊（ＩＣＭ）数を示す。この結果から、総細胞数およびＩＣＭ数ともに、本発明の培養装置を用いた実施例１の場合の方が、比較例１および２の場合よりも、有意に多いことが明らかとなった。【００５７】
図７に、得られた胚盤胞の移植試験の結果、すなわち、受胚雌子宮内に移植した際の妊娠率ならびに産仔生産率を示す。図７によれば、妊娠率および産仔生産率ともに、実施例１の方法で共培養した場合の方が、比較例１および２の場合よりも、有意に高いことが明らかとなった。【００５８】
これらの結果から、半透膜上で培養した体細胞（子宮内膜細胞）上で受精卵を培養するに際し、体細胞を体細胞培養液で、そして受精卵を受精卵培養液で、それぞれ潅流すること、および培養容器を周期的に伸展させることにより、マウス卵子の発生率が上昇することが確認された。この結果は、本発明の培養装置および培養方法が、哺乳動物の卵子の受精卵の発生能を著しく高めることを示している。【００５９】
（参考例１）
上記実施例１で用いたものと同じ培養装置を用いて、体細胞と共培養することなく、マウス２細胞期卵子（受精卵）のみを培養した。すなわち、３７℃のインキュベータ内に、図２に示す培養装置３００を設置し、注射針を培養容器１００に穿刺して密閉空間１４０を気相が残らないように培養液で満たした。培養液は、実施例１と同じものを使用した。上記実施例１で用いたものと同じ受精卵１０〜１５個を、注射針を用いて下底１２０上に配置した。次いで、伸展装置２００を駆動させて、一軸周期的伸展（２０％、１Ｈｚ）を与えながら９６時間培養した。２４時間毎に９６時間までの卵子の発生を観察・記録した。胚盤胞への発生率の経時変化を図８に示す。また、二重蛍光染色法によりマウス胚盤胞を構成する総細胞数およびＩＣＭ数を計測した。この結果を図９に示す。【００６０】
さらに、９６時間の培養後の胚盤胞を、受胚雌マクス子宮内に移植して妊娠させ、約１５日間飼育し、出産させた。妊娠率および産仔生産率を図１０に示す。【００６１】
（参考比較例１）
力ルチャ一ディッシュ（ＮＵＮＣ社製）上に上記実施例１と同じ培養液２ｍｌを入れ、マウス２細胞期卵子（受精卵）を配置し、静直状態で９６時間培養した。培養後、胚盤胞を、受胚雌マウス子宮内に移植した。胚盤胞への発生率、総細胞数および内部細胞塊（ＩＣＭ）数、ならびに妊娠率および産仔生産率を、それぞれ図８〜１０に示す。【００６２】
（参考比較例２）
躯体の底部に膜構造を有するセルカルチャーインサート（ＣＣＩ）（コ一ニング社製）を用い、このＣＣＩ底部の膜上に上記実施例１と同じ培養液２ｍｌを入れ、このＣＣＩ底部の膜上にマウス２細胞期卵子（受精卵）を静置し、静置状態で９６時間培養した。培養後、胚盤胞を、受胚雌マウス子宮内に移植した。胚盤胞への発生率、総細胞数およびＩＣＭ数、ならびに妊娠率およぴ産仔生産率を、それぞれ図８〜１０に示す。【００６３】
図８は、上記参考例１ならびに参考比較例１および２におけるマウス２細胞期卵子から胚盤胞への発生率の経時変化を示すグラフである。図８によると、本発明の装置を用いて培養した（参考例１）場合の方が、従来の静置培養（参考比較例１）および膜上静置培養（参考比較例２）の場合に比べて、胚盤胞期到達時間が有意に早いことが明らかとなった。【００６４】
図９に、マウス胚盤胞を構成する総細胞数およびＩＣＭ数を示す。この結果から、総細胞数およびＩＣＭ数ともに、本発明の培養装置を用いた参考例１の場合の方が、参考比較例１および２の場合よりも、有意に多いことが明らかとなった。【００６５】
図１０に、受胚雌子宮内に移植した際の妊娠率ならびに産仔生産率を示す。図１０によれば、妊娠率および産仔生産率ともに、参考例１、参考比較例１および参考比較例２のそれぞれにおいて、胚盤胞に達した胚を受胚マウス子宮へ移植した結果、妊娠率および産仔生産率ともに、参考例１の方法で培養した場合の方が、参考比較例１および２の場合よりも、有意に高いことが明らかとなった。【００６６】
妊娠率および産仔生産率についての上記実施例１の結果（図７）と参考例１の結果（図１０）とを比較すると、体細胞との共培養系である実施例１の方が、妊娠率および産仔生産率ともに良好であった。したがって、受精卵は、体細胞と共培養することにより、体内に移植したときの着床率および出産率が従来よりもさらに上昇し得ると考えられる。また、参考例１の結果は、上記実施例１の共培養の系に比べて、効果は劣るものの、マウス卵子の発生率の上昇が確認された。この結果は、共培養なしの系でも、本発明の潅流と培養容器の周期的な伸展とを組み合わせることにより、卵子の発生能が高められ得ることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、受精卵の培養に適する培養容器、培養装置、および培養方法が提供される。本発明の培養容器、培養装置および培養方法は、受精卵の培養だけでなく、凍結・融解後の回復培養や胚性幹細胞樹立、着床後の哺乳動物の発生機構の解析（人工子宮の開発も含む）などのための新しい手法としても利用され得る。特に、不妊治療を含む生殖医療、再生医療などの分野において、極めて有用である。また、培養容器および培養装置のサイズ／スケールを変化させることにより、これらの新規用途に利用され得る。
【図１】
2007052653.tif 000003
【図２】
2007052653.tif 000004
【図３】
2007052653.tif 000005
【図４】
2007052653.tif 000006
【図５】
2007052653.tif 000007
【図６】
2007052653.tif 000008
【図７】
2007052653.tif 000009
【図８】
2007052653.tif 000010
【図９】
2007052653.tif 000011
【図１０】
2007052653.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月13日(2007.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形可能な材料で形成される矩形箱状の培養容器（１００）であって、
上底（１１０）、下底（１２０）、および該下底の全周縁から立設する側壁（１３０）を備え、該上下底（１１０，１２０）と該側壁（１３０）とから矩形箱状密閉空間（１４０）が形成され、
該上底（１１０）および該下底（１２０）が、酸素および二酸化炭素透過性であり、そして、
一対の対向する側壁（１３０ａ，１３０ｂ）には、該培養容器（１００）を一軸水平方向に伸展させる伸展装置に係合させるための係合部（１５０）がそれぞれ形成され、前記一対の側壁（１３０ａ，１３０ｂ）のそれぞれには、前記矩形箱状密閉空間（１４０）に細胞を導入しかつ培養液を潅流し得るように、該矩形箱状密閉空間（１４０）と外部とを連通するチューブ（１６０，１６０）が備えられ、そして該連通を遮断するための手段（１７０，１７０）を備え、
前記一対の対向する側壁（１３０ａ，１３０ｂ）は、前記矩形箱状密閉空間を形成する他の一対の側壁（１３０ｃ，１３０ｄ）より厚く形成されている、培養容器。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記矩形箱状密閉空間の高さが２５０μｍ〜１ｃｍである、請求項１に記載の培養容器。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかの項に記載の培養容器、および該培養容器の係合部と係合する保持部を備えた伸展装置を備える、培養装置。
【請求項５】
請求項４に記載の培養装置を用いて行なう受精卵の培養方法であって、
密閉空間を有し、変形可能な材料で形成きれる培養容器を準備する工程；
該密閉空間に培養液を満たす工程；
該密閉空間の下底に哺乳動物由来の体細胞を播種して該体細胞を培養する工程；および
該培養した体細胞上に受精卵を配置して培養する工程；
を含み、
該体細胞の培養工程および該受精卵の培養工程において、該培養容器が周期的に一軸水平方向に伸展される、培養方法。
【請求項６】
前記体細胞の培養工程および前記受精卵の培養工程において、前記チューブを介して前記培養液を該密閉空間に潅流させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物の体細胞が子宮内膜細胞である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記培養容器が、請求項１から３のいずれかの項に記載の培養容器であり、そして該培養容器の係合部と係合する保持部を備えた伸展装置に保持されている、請求項５から７のいずれかの項に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月21日(2008.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形可能な材料で形成される矩形箱状の培養容器(100)であって、
上底(110)、下底(120)、および該下底の全周縁から立設する側壁(130)を備え、該上下底(110,120)と該側壁(130)とから矩形箱状密閉空間(140)が形成され、
該上底(110)および該下底(120)が、酸素および二酸化炭素透過性であり、そして、
一対の対向する側壁(130a, 130b)には、該培養容器(100)を一軸水平方向に伸展させる伸展装置に係合させるための係合部(150)がそれぞれ形成され、前記一対の側壁(130a,130b)のそれぞれには、前記矩形箱状密閉空間(140)に細胞を導入しかつ培養液を潅流し得るように、該矩形箱状密閉空間(140)と外部とを連通するチューブ(160,160)が備えられ、そして該連通を遮断するための手段(170,170)を備え、
前記一対の対向する側壁(130a, 130b)は、前記矩形箱状密閉空間を形成する他の一対の側壁(130c, 130d)より厚く形成されている、培養容器。
【請求項２】
前記矩形箱状密閉空間の高さが２５０μｍ〜１ｃｍである、請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかの項に記載の培養容器、および該培養容器の係合部と係合する保持部を備えた伸展装置を備える、培養装置。
【請求項４】
請求項３に記載の培養装置を用いて行なう受精卵の培養方法であって、
密閉空間を有し、変形可能な材料で形成きれる培養容器を準備する工程；
該密閉空間に培養液を満たす工程；
該密閉空間の下底に哺乳動物由来の体細胞を播種して該体細胞を培養する工程；および
該培養した体細胞上に受精卵を配置して培養する工程；
を含み、
該体細胞の培養工程および該受精卵の培養工程において、該培養容器が周期的に一軸水平方向に伸展される、培養方法。
【請求項５】
前記体細胞の培養工程および前記受精卵の培養工程において、前記チューブを介して前記培養液を該密閉空間に潅流させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物の体細胞が子宮内膜細胞である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記培養容器が、請求項１または２のいずれかの項に記載の培養容器であり、そして該培養容器の係合部と係合する保持部を備えた伸展装置に保持されている、請求項４から６のいずれかの項に記載の方法。
【国際調査報告】
2007052653.tif 000013
2007052653.tif 000014