(57)【要約】  強力な免疫刺激作用を発揮できる安全性の高い免疫アジュバントであって、２種以上の異なる微粒子状免疫刺激物質担体にそれぞれ担持された１種又は２種以上の免疫刺激物質を含み、該微粒子状免疫刺激物質担体として(a)細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウムなどの無機物及び(b)可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物の組み合わせを含む免疫アジュバント。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の異なる微粒子状免疫刺激物質担体にそれぞれ担持された１種又は２種以上の免疫刺激物質を含む免疫アジュバントであって、該微粒子状免疫刺激物質担体として少なくとも(a)無機物及び(b)可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物の組み合わせを含む免疫アジュバント。
【請求項２】
２種類の免疫刺激物質担体の組み合わせが(a)細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウム及び(b)可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物である請求項１に記載の免疫アジュバント。
【請求項３】
上記(a)の微粒子状リン酸カルシウムが最大径1μm以下のリン酸カルシウムである請求項２に記載の免疫アジュバント。
【請求項４】
上記(a)の微粒子状リン酸カルシウムがＣａ／Ｐモル比が１．３以上であって炭酸基ＣＯ32-を３〜６重量％含有し、その結晶性がＣｕＫα線によるＸＲＤスペクトルにおいて２θ値で２６°、３２°、及び３４°に中心がある広いピークが出現し、３３°に３００のミラー指数の肩が出現することで規定される結晶性以上であり、かつ２６°、２８．１°、２９°、３２°、３３°、及び３４°に中心があるピーク又は肩が出現するのに加えて２１１ミラー指数と１１２ミラー指数のピークが分離することで規定される結晶性以下の結晶性である微粒子状リン酸カルシウムである請求項２又は３に記載の免疫アジュバント。
【請求項５】
上記(b)の可溶性蛋白がアルブミンである請求項２ないし４のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項６】
上記(b)のムコ多糖がヘパリンである請求項２ないし５のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項７】
上記(b)の不溶性物質の可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物が蛋白分子間架橋剤により架橋された沈殿物である請求項２ないし６のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項８】
免疫刺激物質がサイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンからなる群から選ばれる１種又は２種以上の誘導剤である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項９】
免疫刺激物質がツベルクリン、精製ツベルクリン、微生物に由来する可溶性成分、トレハロース6,6'-ジミコレート、リポポリサッカライド、リピッドＡ、オリゴヌクレオチド、β-グルカン、キーホールリンペットヘモシアニン、ムラミルジペプチド、ベスタチン、レバミゾール、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項１０】
微生物に由来する可溶性成分が微生物のアルコール抽出物、アセトン抽出物、ピリジン抽出物、及び熱水抽出物からなる群から選ばれる１種又は２種以上の抽出物である請求項９に記載の免疫アジュバント。
【請求項１１】
微生物が細菌である請求項９又は１０に記載の免疫アジュバント。
【請求項１２】
抗原とともにヒトを含む哺乳類動物の体内に投与して該抗原に対する全身性免疫反応を誘導するための請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項１３】
該抗原が、真菌、放線菌、細菌、ウイルス、ファージ、リケッチア、原虫、真菌成分、放線菌成分、細菌成分、ウイルス成分、ファージ成分、リケッチア成分、原虫成分、腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質である請求項１２に記載の免疫アジュバント。
【請求項１４】
ヒトを含む哺乳類動物の腫瘍組織を物理的手段で変性させた後に該腫瘍組織内に投与することにより抗腫瘍免疫反応を誘導するための請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項１５】
物理的手段がマイクロウエーブ照射、ラジオフリークエンシー凝固法、凍結凝固法、電気メス加熱、熱水注入、アルコール注入、塞栓法、放射線照射、レーザー光照射、及び超音波破壊からなる群から選ばれる１種又は２種以上の手段である請求項１４に記載の免疫アジュバント。
【請求項１６】
体外で免疫担当細胞と混合した後にヒトを含む哺乳類動物に投与することにより該動物の生体内において全身性免疫反応を誘導するための請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項１７】
免疫担当細胞が樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及び造血幹細胞からなる群から選ばれる１種又は２種以上の細胞である請求項１６に記載の免疫アジュバント。
【請求項１８】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の免疫アジュバントと抗原とを含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫アジュバントに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、多用されているほとんどの免疫アジュバントは、生体に投与した局所において、(1)抗原が急速に拡散しないように水性又は油性エマルジョンの性状で保持しつつ、抗原を徐々に放出して免疫担当細胞に効率よく供給し、(2)炎症反応を惹起して炎症局所に集合してくる免疫担当細胞を活性化するという２つの役割を果たしている。近年、抗体産生を誘導する液性免疫反応及びキラーＴ細胞を誘導する細胞性免疫反応のいずれにおいても抗原提示細胞が免疫反応の中心的役割を担うこと、及び抗原提示細胞として樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞があることが明らかにされた。これらのなかで樹状細胞が最も強力な抗原提示能を有している（Dendritic Cells, second edition, ed. Lotze, M. T. and Thomson, A. W., Academic Press, San Diego, 2001）。抗原提示細胞を効果的に活性化できる物質を抗原とともに生体に投与すると、この物質は免疫アジュバントとして作用し、液性免疫反応及び細胞性免疫反応のいずれにおいても効率よく抗原に対する免疫反応を誘導・増強できる。【０００３】
従来から多様な免疫アジュバントが知られているが、ヒト腫瘍の治療や、転移及び再発の予防の目的で腫瘍免疫療法に使用可能な安全かつ低価格の免疫アジュバントは少ない。例えば、培養樹状細胞を利用した腫瘍免疫療法では、キーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocianin）が免疫アジュバントとして使用されているが（Geiger, J. D., et al., Cancer Res., 61, pp.8513-8519, 2001）、この物質は高価である。樹状細胞を直接活性化する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor：以下、「GM-CSF」と略す場合がある）等のサイトカイン類を免疫アジュバントとして投与する方法も提案されているが、サイトカイン類はさらに高価である。【０００４】
感染症対策のためのワクチンの製造において、安全かつ低価格の免疫アジュバントとしてアルム（aluminum hydroxide）、フロイントの不完全アジュバント（Freund's imcomplete adjuvant、このアジュバントは油性であるために毒性が懸念されている）、又はモンタナイド(Montanide)等のように、活性が不十分な免疫アジュバントが使用されている。これらは、動物実験で使用されているフロイントの完全アジュバント（Freund's complete adjuvant：以下、「FCA」と略す場合がある）やリビアジュバントシステム（Ribi Adjuvant System) に比べれば、毒性が低いものの免疫アジュバント活性も弱い。【０００５】
結核菌感染歴検出用のツベルクリン、特にツベルクリン中の蛋白成分を硫安沈殿法により精製した精製ツベルクリン（以下、「PPD」と略す場合がある）は、繰り返しヒトに投与しても極めて安全であり、しかも安価であることから全世界に普及している。本発明者らは、PPDが免疫アジュバントとして使用可能であることを見出した（PCT/JP00/00692）。また、本発明者らは、PPDを可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物とし、物理的手段で変性させた腫瘍組織内に投与することにより抗腫瘍免疫反応を誘導するための有効な免疫アジュバントとなることも見出していた（日本国特許第3492671号）。この免疫アジュバントは溶解状態のPPDに比べて高い免疫アジュバント活性を有しており、溶解状態のPPDと同様に極めて高い安全性を有している。もっとも、FCAやエンドトキシンの主成分であるリポポリサッカライド（以下、「LPS」と略す場合がある）と比べると、その免疫アジュバント活性は不十分であった。【０００６】
末梢血中には微粒子状の抗原を貪食できる未成熟な抗原提示細胞が流れている。イン・ビトロ(in vitro)で培養中の未熟な抗原提示細胞にLPSを添加すると、成熟が進み、強力な抗原提示能を示すようになることが知られている。この過程において活性化した抗原提示細胞は、GM-CSF、インターロイキン(以下、「IL」と略す場合がある)-12、インターフェロンγ(以下、「IFNg」と略す場合がある)などの種々のサイトカインを放出する。GM-CSF自体は樹状細胞の生存に必須の細胞成長因子であることから、一旦活性化した樹状細胞はGM-CSFのオートクライン機構によって長期に活性化状態を保ち生存し続けていくことが可能になる。樹状細胞のみならずマクロファージも同じ造血幹細胞から分化する同系統の抗原提示細胞であり、免疫刺激を受けると樹状細胞同様にGM-CSF等のサイトカインを産生する。【０００７】
実際に、固体化し微粒子化した腫瘍組織を抗原としてGM-CSF等のサイトカインとともに体内に投与することにより効率よく腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫反応を誘導できる（PCT/JP00/00692）。この事実はGM-CSF自体が免疫アジュバントとなっていることを示していると同時に、免疫アジュバントの刺激を受けた抗原提示細胞から産生されたGM-CSFの量が元の免疫アジュバントの活性を表す指標となり得ることを示している。すなわち、ヒト由来の抗原提示細胞が産生するGM-CSFを定量することにより、ヒト個体を用いることなくin vitro実験系でヒトにおける免疫アジュバント活性を推定できることになる。【０００８】
本発明者らは、上記の手段を利用して、微生物に由来する可溶性成分[Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin （以下、「BCG菌」と略す場合がある）などの有機溶媒抽出可溶性成分]を免疫刺激物質担体である固体化組織に固定することにより強い免疫アジュバント作用が得られることをヒト末梢血由来の抗原提示細胞を含む末梢血付着性細胞を用いて示した（WO2003/074079）。【０００９】
この免疫アジュバントにおいて免疫刺激物質担体として用いられる固体化組織は抗原提示細胞を含む貪食細胞内において消化され、体内に残存せずに消失する生分解性材料である。もっとも、ヒト個体にこの免疫アジュバントを適用する場合、主要組織適合性抗原が完全に一致する本人又は遺伝子的に一致する一卵性双生児の組織を用いないと、免疫刺激物質担体がそのヒト個体に対して抗原性を持つことになり、免疫刺激物質担体又はその消化タンパク断片に対する抗原抗体反応を惹起することがある。この点は、上記免疫アジュバントを汎用の免疫アジュバントとして用いる場合に（免疫アジュバントに所望の抗原を加え該抗原に対する免疫反応を誘導する場合に）、免疫刺激物質担体自体に対する余分な抗原抗体反応が引き起こされ、該抗原に対する免疫反応が全体の免疫反応のなかに埋没してしまい顕現しにくいという問題を引き起こす。【００１０】
一方、本発明者らは、１又は２以上の被担持分子を担持したリン酸カルシウム微粒子の製造方法を提案している（特開2005-126335号公報）。このリン酸カルシウム微粒子はＣａ／Ｐモル比１．３以上のハイドロキシアパタイトである。また、非晶質リン酸カルシウム微粒子及び低結晶性アパタイトは、親水性のタンパク分子のみならず疎水性の低分子も担持できるため、免疫刺激物質担体となり得ることが示されている（特表2002-524491号公報）。しかしながら、物理化学的性状が全く異なる２種以上の免疫刺激物質担体に１種又は２種以上の免疫刺激物質を担持させ、それらを混合した免疫アジュバントは従来知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、安全性に優れ、かつ強い免疫アジュバント活性を効率的に発揮することができる免疫アジュバントを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ツベルクリンを徐放性製剤とすることにより高い免疫アジュバント活性が得られること、アルブミンとヘパリンとを混合してコアセルベーションによる沈殿を形成する際にツベルクリン蛋白を混合しておくとツベルクリン蛋白がこの沈殿中に巻き込まれて不溶性微粒子が形成され徐放性製剤となること、及びこの不溶性微粒子を可溶性の精製ツベルクリンとともに免疫アジュバントとして腫瘍細胞を抗原として体内に投与すると強力な腫瘍防御効果を示し、熱変性した体内腫瘍組織に投与すると強力な抗腫瘍免疫反応を誘導できることを見出している（日本国特許第3492671号）。【００１３】
一方、リン酸カルシウム微粒子は免疫刺激物質担体となり得ることが示されているが（特表2002-524491号公報）、リン酸カルシウム微粒子の製造方法（特開2005-126335号公報）により生成するリン酸カルシウム微粒子はＣａ／Ｐモル比１．３以上のハイドロキシアパタイトであり、最大径が１μｍに満たないナノメートルサイズの微粒子を大量に含み、極めて生体適合性が高く安全である。このような抗原提示細胞が貪食可能なサイズのリン酸カルシウム微粒子にPPDを担持させることにより、免疫アジュバントを製造することができる。【００１４】
本発明者らは上記の課題を解決すべくさらに研究を続けた結果、ツベルクリンに含まれる可溶性蛋白や微生物に由来する可溶性成分などを免疫刺激物質として用い、該免疫刺激物質を微粒子状の免疫刺激物質担体である(a)無機物、及び(b)可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物にそれぞれ担持させ、それらの担体の混合物を免疫アジュバントとして用いると、一種類の免疫刺激物質担体を単独で用いた場合に比べて相乗的な極めて強い免疫アジュバント作用が得られることを見出した。例えば、アルブミンとヘパリンとを混合してコアセルベーションによる沈殿を形成する際にツベルクリン蛋白を混合して得られる不溶性微粒子と、特開2005-126335号公報に記載の方法により得られるＣａ／Ｐモル比１．３以上のハイドロキシアパタイトであるリン酸カルシウム微粒子にPPDを担持させた微粒子とを含む混合物を免疫アジュバントとして用いると、それぞれの成分を単独で用いた場合に得られる免疫アジュバント活性をはるかに凌駕する相乗的に高い免疫アジュバント作用が得られることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成された。【００１５】
すなわち、本発明により、２種以上の異なる微粒子状免疫刺激物質担体にそれぞれ担持された１種又は２種以上の免疫刺激物質を含む免疫アジュバントであって、該微粒子状免疫刺激物質担体として少なくとも(a)無機物及び(b)可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物の組み合わせを含む免疫アジュバントが提供される。
本発明の好ましい態様によれば、２種類の免疫刺激物質担体の組み合わせが(a)細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウム及び(b)可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物である上記の免疫アジュバントが提供される。【００１６】
さらに好ましい態様によれば、上記(a)の微粒子状リン酸カルシウムが最大径1μm以下のリン酸カルシウムである上記の免疫アジュバント；上記(a)の微粒子状リン酸カルシウムが下記：Ｃａ／Ｐモル比が１．３以上であって炭酸基ＣＯ32-を３〜６重量％含有し、その結晶性がＣｕＫα線によるＸＲＤスペクトルにおいて２θ値で２６°、３２°、及び３４°に中心がある広いピークが出現し、３３°に３００のミラー指数の肩が出現することで規定される結晶性以上であり、かつ２６°、２８．１°、２９°、３２°、３３°、及び３４°に中心があるピーク又は肩が出現するのに加えて２１１ミラー指数と１１２ミラー指数のピークが分離することで規定される結晶性以下の結晶性である微粒子状リン酸カルシウムである上記の免疫アジュバントが提供される。
別のさらに好ましい態様によれば、上記(b)の可溶性蛋白がアルブミンである上記の免疫アジュバント；上記(b)のムコ多糖がヘパリンである上記の免疫アジュバント；上記(b)の不溶性物質の可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物が蛋白分子間架橋剤により架橋された沈殿物である上記の免疫アジュバントが提供される。【００１７】
また、免疫刺激物質がサイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンの誘導剤からなる群から選ばれる１又は２以上の免疫刺激物質である上記の免疫アジュバント；ツベルクリン、精製ツベルクリン(PPD)、微生物に由来する可溶性成分、トレハロース6,6'-ジミコレート、LPS、リピッドＡ、オリゴヌクレオチド、β-グルカン、キーホールリンペットヘモシアニン、ムラミルジペプチド、ベスタチン、レバミゾール、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンからなる群から選ばれる１種又は２種以上の免疫刺激物質である上記の免疫アジュバント；微生物に由来する可溶性成分が微生物のアルコール抽出物、アセトン抽出物、ピリジン抽出物、及び熱水抽出物からなる群から選ばれる１種又は２種以上の抽出物である上記の免疫アジュバントが提供される。【００１８】
別の観点からは、抗原とともにヒトを含む哺乳類動物の体内に投与して該抗原に対する全身性免疫反応を誘導するための上記の免疫アジュバントが提供される。
この発明の好ましい態様によれば、抗原が真菌、放線菌、細菌、ウイルス、ファージ、リケッチア、原虫、これら微生物の成分、腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選ばれる１種又は２種以上の抗原である上記の免疫アジュバントが提供される。【００１９】
また、別の観点からは、ヒトを含む哺乳類動物の腫瘍組織を物理的手段で変性させた後に該腫瘍組織内に投与することにより抗腫瘍免疫反応を誘導するための上記の免疫アジュバントが提供される。
この発明の好ましい態様によれば、物理的手段がマイクロウエーブ照射、ラジオフリークエンシー凝固法、凍結凝固法、電気メス加熱、熱水注入、アルコール注入、塞栓法、放射線照射、レーザー光照射、及び超音波破壊からなる群から選ばれる１又は２以上の手段である上記の免疫アジュバントが提供される。【００２０】
さらに別の観点からは、体外で免疫担当細胞と混合した後にヒトを含む哺乳類動物に投与することにより該動物の生体内において全身性免疫反応を誘導するための上記の免疫アジュバントが提供される。
この発明の好ましい態様によれば、免疫担当細胞が樹状細胞、マクロファージ、Bリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及び造血幹細胞からなる群から選ばれる１又は２以上の細胞である上記の免疫アジュバントが提供される。【００２１】
さらに、上記の免疫アジュバントと抗原とを含むワクチンが提供される。
この発明の好ましい態様によれば、抗原が真菌、放線菌、細菌、ウイルス、ファージ、リケッチア、原虫、又はこれら微生物の成分からなる群から選ばれる１又は２以上の抗原であり、感染症の予防及び／又は治療に用いる上記ワクチン；及び抗原が腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、又は腫瘍抗原ペプチドからなる群から選ばれる１又は２以上の抗原であり、腫瘍の治療及び／又は予防に用いる上記のワクチンが提供される。【００２２】
また、抗原として例えば異種動物タンパクを用いることにより、上記の免疫アジュバントによりヒト以外の哺乳類動物において効率よく該抗原に対する抗体を産生させることができる。従って、本発明により抗体産生動物、及び該抗体産生動物に由来する抗体産生細胞又は抗体遺伝子が提供される。【００２３】
さらに、ヒトを含む哺乳類動物の腫瘍を物理的手段で変性させた後に該腫瘍組織内に投与することにより抗腫瘍免疫反応を誘導するための上記の免疫アジュバントを含む腫瘍ワクチン；体外で免疫担当細胞と混合した後にヒトを含む哺乳類動物に投与することにより該動物の生体内において抗腫瘍免疫反応を誘導するための上記の免疫アジュバントを含む腫瘍ワクチン；体外で免疫担当細胞及び抗原と混合した後にヒトを含む哺乳類動物に投与することにより該動物に生体内において抗腫瘍免疫反応を誘導するための上記免疫アジュバントを含む腫瘍ワクチンが本発明により提供される。【００２４】
さらに別の観点からは、全身性免疫反応の誘導方法であって、ヒトを含む哺乳類動物に上記の免疫アジュバントを投与する工程を含む方法；抗腫瘍免疫反応を誘導する方法であって、ヒトを含む哺乳類動物の腫瘍組織を物理的手段で変性させた後、該腫瘍組織内に上記の免疫アジュバントを投与する工程を含む方法；及び、全身性免疫反応の誘導方法であって、あらかじめ上記の免疫アジュバントと免疫担当細胞とを体外で混合してヒトを含む哺乳類動物の生体内に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】２種類の免疫刺激物質をそれぞれ異なる２種類の免疫刺激物質担体に担持させた本発明の免疫アジュバントの抗原提示細胞刺激効果を示した図である。リン酸カルシウム（以下、「CaP」と略すことがある）を担体としBCG菌抽出物を免疫刺激物質として担持させた。また、コアセルベーション沈殿微粒子を担体としPPDを担持させたTuMPを使用した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本明細書において用いられる用語の意味は以下のとおりである。
「免疫刺激物質」は、ヒトを含む哺乳類動物に投与した場合に体内において何らかの免疫反応を惹起及び／又は増強する物質であり、ヒトを含む哺乳類動物の抗原提示細胞に体外において添加した場合には該細胞の何らかの活性化を惹起及び／又は増強する物質である。従って、抗原自体も何らかの免疫刺激作用がある限り免疫刺激物質に含まれる。
「免疫刺激物質担体」とは、上記の免疫刺激物質を担持するための物質のことである。免疫刺激物質担体それ自体は免疫刺激作用を全く有しないか、又は極めて低い免疫刺激作用を有することが多いが、担体自体が免疫刺激作用を有する場合もある。【００２７】
「２種以上の異なる免疫刺激物質担体」又はその類義語には、異なる化学物質又は異なる組成物からなる２種以上の免疫刺激物質担体のほか、同一の化学物質又は組成物からなり、異なる物理化学的性状を有する免疫刺激物質担体も包含される。例えば、同一成分を含み、かつ該成分の比率が異なる２種類の組成物を２種類の免疫刺激物質担体として用いることができる。あるいは、同一の化学物質又は組成物からなる微粒子であって、粒子表面の物理化学的性状の異なる場合などもこの用語に包含される。本明細書においてこの用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。
「免疫アジュバント」とは、抗原に対する免疫反応を惹起及び／又は増強できる物質又は組成物のことである。免疫刺激作用のほとんどない免疫刺激物質担体のみを免疫アジュバントと呼ぶ場合もあるが、通常は該担体と何らかの免疫刺激物質との組み合わせを意味することが多い。また、免疫刺激物質のみでも免疫アジュバントと呼ばれる場合もある。本発明の免疫アジュバントは、２種類以上の免疫刺激物質担体にそれぞれ担持された１種又は２種以上の免疫刺激物質を意味しており、免疫刺激物質担体と免疫刺激物質との組み合わせを必ず含むものである。【００２８】
本発明の免疫アジュバントは、２種以上の異なる微粒子状の免疫刺激物質担体にそれぞれ担持された１種又は２種以上の免疫刺激物質を含み、該微粒子状免疫刺激物質担体のうち少なくとも１種が無機物、他の１種が可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物であることを特徴としている。本発明の免疫アジュバントは、微粒子状免疫刺激物質担体として(a)無機物及び(b)可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物の組み合わせを含み、上記(a)及び(b)のそれぞれの微粒子状免疫刺激物質担体には同一又は異なる免疫刺激物質が担持される。免疫刺激物質は１種類であってもよいが、２種類以上を用いてもよい。例えば、典型的には、上記(a)及び(b)の微粒子状免疫刺激物質担体のそれぞれに１種類ずつの異なる免疫刺激物質を担持させてもよく、又は上記(a)及び(b)の微粒子状免疫刺激物質担体のそれぞれに同一の免疫刺激物質を担持させてもよい。あるいは、上記(a)及び(b)の微粒子状免疫刺激物質担体のうちの１つに２種類の異なる免疫刺激物質を担持させ、もう１つの免疫刺激物質担体には、それらの免疫刺激物質のうちの１種類又は両方の免疫刺激物質を担持させてもよい。【００２９】
上記(a)及び(b)の微粒子状免疫刺激物質担体は、それぞれ異なる化学物質又は異なる組成物からなる２種以上の微粒子状免疫刺激物質担体を含んでいてもよく、あるいは、それぞれ同一の化学物質又は組成物からなり、異なる物理化学的性状を有する免疫刺激物質担体の混合物であってもよい。例えば、上記(b)の沈殿物である微粒子状免疫刺激物質担体としては、同一成分の組み合わせからなり、かつ該成分の比率が異なる２種類の組成物の混合物を用いてもよい。あるいは、上記(a)の無機物である微粒子状免疫刺激物質担体として、同一の無機物からなる微粒子であって、粒子表面の物理化学的性状の異なる微粒子の混合物を用いてもよい。
本発明の免疫アジュバントは、それぞれ免疫刺激物質が担持された上記(a)及び(b)の微粒子状免疫刺激物質担体の組み合わせを含むが、免疫刺激物質を担持していない免疫刺激物質担体をさらに含むこともできる。このような場合、免疫刺激物質担体として、それ自体が免疫刺激作用を有する免疫刺激物質担体を選択することが望ましい。また、本発明の免疫アジュバントは、免疫刺激物質担体に担持させていない免疫刺激物質をさらに含むこともできる。【００３０】
好ましい態様では、２種類の微粒子状免疫刺激物質担体の組み合わせとして、(a)細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウム、及び(b)可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物を含む。以下、この特定の態様について詳細に説明するが、本発明の免疫アジュバントはこの特定の態様に限定されることはない。上記の(a)細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウムと(b)可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物の組み合わせは特に限定されず、それらの成分の種類、比率、及び調製方法なども含めて任意に選択することができる。また、上記の態様の免疫アジュバントには第３の成分がさらに混合されていてもよい。該第３成分としては、抗原のほか、担持されている免疫刺激物質とは異なる免疫刺激物質などを用いてもよい。抗原は固体の担体に担持されていてもよく、担体としては上記(a)又は(b)の微粒子状免疫刺激物質担体を利用することができる。本発明の免疫アジュバントは、成分(a)又は成分(b)に担持されている免疫刺激物質と同一の免疫刺激物質を担体に担持されていない状態で含んでいてもよい。【００３１】
細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウムは、例えば特開2005-126335号公報に記載されている方法を用いて調製することができる。微粒子状リン酸カルシウムとしては、任意の微粒子状リン酸カルシウムを用いることができる。例えば、当業者に周知の方法によって、市販のリン酸カルシウム粉末を細かく粉砕し、細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウムを選別したものを用いてもよく、リン酸溶液及びカルシウム溶液から製造したものを用いてもよい。【００３２】
また、リン酸カルシウムを微粒子状の基材上に沈殿又は析出させて該基材表面にリン酸カルシウム微粒子の皮膜を形成したものを用いてもよい。このような態様も微粒子状リン酸カルシウムに包含される。基材としては細胞による貪食可能なサイズの微粒子状であれば特に限定されない。例えば、中性領域で不溶性タンパクである繊維状タンパクのコラーゲンや水溶性糖鎖高分子であるコンドロイチン硫酸を水酸化カルシウム懸濁液とリン酸溶液とを混合する過程で低結晶性アパタイトと共沈させ、ナノメートルサイズの微小結晶を含むコラーゲン／コンドロイチン硫酸-アパタイトコンポジットを作製することができ（Rhee, S.H., et al., Biomaterials., 22(21), pp.2843-2847, 2001）、この微粒子を基材として用いることもできる。もっとも、微粒子状リン酸カルシウムを調製するための基材はこれらに限定されるものではない。【００３３】
リン酸カルシウムの種類は特に限定されず、無水物、無水塩、又は含水塩のいずれであってもよく、結晶質又は非晶質のいずれであってもよい。さらに、カルシウムの一部又はリン酸の一部が他の原子や原子団で置換されていてもよい。このようなリン酸カルシウムとしては、具体的には、例えばアパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）、カルシウム欠損アパタイト、金属イオンが一部Caを置換したアパタイト、硫酸イオンがリン酸イオンの一部を置換したアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、金属イオンが一部Caを置換した非晶質リン酸カルシウム、リン酸八カルシウム（Ca8H2(PO4)6・5H2O）、及びリン酸三カルシウム（Ca3(PO4)2）、金属イオンが一部Caを置換したリン酸三カルシウムなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。【００３４】
また、好ましくは炭酸基ＣＯ32-を１重量％〜１５重量％含有する炭酸含有リン酸カルシウムであってもよい。炭酸含有リン酸カルシウムの種類は特に限定されず、無水物、無水塩、又は含水塩のいずれであってもよく、結晶質又は非晶質のいずれであってもよい。炭酸含有リン酸カルシウムの例としては、炭酸含有アパタイトや炭酸含有非晶質リン酸カルシウムなどを挙げることができる。炭酸基の占有する席は特に限定されず、例えば、リン酸サイト、水酸基サイト、そのほかいわゆる非アパタイトサイトや表面吸着サイトであってもよい。特に好ましくは、Ｃａ／Ｐモル比が１．３以上であって炭酸基ＣＯ32-を３〜６重量％含有し、その結晶性がＣｕＫα線によるＸＲＤスペクトルにおいて２θ値で２６°、３２°、及び３４°に中心がある広いピークが出現して３３°に３００のミラー指数の肩が出現することで規定される結晶性以上であり、かつ２６°、２８．１°、２９°、３２°、３３°、及び３４°に中心があるピークや肩が出現するのに加えて２１１ミラー指数と１１２ミラー指数のピークが分離することで規定される結晶性以下の結晶性である微粒子状リン酸カルシウムが挙げられる。【００３５】
細胞による貪食可能な微粒子のサイズは、一般に最大径10μm以下であることが好ましく、最大径1μm以下であることが特に好ましい。ヒトの細胞自体のサイズは一般には球形の場合直径20μm程度であるが、付着した細胞や長期間分裂せずに巨大化した細胞では、長径が100μmを超えることもある。貪食能力の高いマクロファージは直径20μm以上の微粒子を貪食する場合もある。従って、細胞による貪食可能な微粒子のサイズは特に限定されるものではない。【００３６】
細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウムを免疫刺激物質担体として用い、これに免疫刺激物質を担持させる方法としては、例えば特開2005-126335号公報に記載されている方法を用いることができるが、この方法に限定されるものではない。リン酸カルシウムのなかでも、ハイドロキシアパタイト微粉末の比表面積は100m2/gと大きく、吸着能に優れていることから、ハイドロキシアパタイト微粉末は種々の物質の吸着剤として使用されている。ハイドロキシアパタイト微粉末は様々な化合物を用いて吸着型徐放性医薬を調製するための基材となり得るものと考えられており、吸脱着による拡散モデルに従った徐放性を示すとされる（Burgos, A.E., et al., Biomaterials., 23, pp.2519-2526, 2002）。このほか、低結晶性アパタイトや非晶質リン酸カルシウムなどのリン酸カルシウムは本来生体内物質であるがゆえに蛋白などの体内生理活性物質の安全な徐放性医薬の基材となり得ることが知られている。これらのアパタイト類からなる微粒子を免疫刺激物質担体として用いることもできる。【００３７】
細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウムに担持させる免疫刺激物質の種類は特に限定されるものではない。上記のように、ハイドロキシアパタイト微粉末は吸着能に優れていることから、担持させる免疫刺激物質として多様な物質を用いることができる。免疫刺激物質としては、例えば、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンの誘導剤からなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質を用いることもできるが、例えば、ツベルクリン、PPD、微生物に由来する可溶性成分、トレハロース6,6'-ジミコレート、LPS、リピッドＡ、オリゴヌクレオチド、β-グルカン、キーホールリンペットヘモシアニン、ムラミルジペプチド、ベスタチン、レバミゾール、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質を用いることが好ましい。微生物に由来する可溶性成分としては、例えば、微生物のアルコール抽出物、アセトン抽出物、ピリジン抽出物、及び熱水抽出物からなる群から選ばれる１種又は２種以上の抽出物を用いることができる。また、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンの誘導剤には、細菌の菌体又は細菌の菌体成分が含まれる。もっとも、リン酸カルシウム微粒子に担持される免疫刺激物質はこれらに限定されるものではない。【００３８】
サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、又はホルモンとしては、抗原提示細胞を刺激してそのサイトカイン産生を誘導できる物質であればいかなるものを用いてもよい。例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン(IL)類（例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-11、IL-12、IL-18、IL-27等）、コロニー刺激因子（CSF）（例えばG-CSF、GM-CSF、M-CSF等）、上皮細胞成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）（例えばFGF-1、FGF-2、FGF-7等）、インスリン、又はヒト成長ホルモンなどが含まれる。【００３９】
微生物に由来する可溶性成分を調製する工程において、有機溶媒及び／又は熱水で可溶性成分を抽出する方法も特に限定されず、当業者に周知の方法を用いればよい。例えば、エタノールを用いて抽出物を調製することが好ましい。微生物に由来する可溶性成分を調製する工程において使用する微生物としては、例えば細菌、真菌、又は放線菌などを例示することができるが、好ましくは細菌を用いることができる。より好ましい細菌の例を以下に示す。これらの細菌群のうち、いずれか1種類、あるいは複数の種類を組み合わせて用いてもよい。【００４０】
コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae); コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis); コリネバクテリウム・ゼロシス(Corynebacterium xerosis); コリネバクテリウム・レナレ(Corynebacterium renale); コリネバクテリウム・クチェリ(Corynebacterium kutscheri); コリネバクテリウム・シュードジフテリチカム(Corynebacterium pseudodiphtheriticum); コリネバクテリウム・エクイ(Corynebacterium equi); コリネバクテリウム・ボビス(Corynebacterium bovis); コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum); コリネバクテリウム・パウロメタボラム(Corynebacterium paurometabolum); コリネバクテリウム・ピオゲネス(Corynebacterium pyogenes); コリネバクテリウム・エンジミカム(Corynebacterium enzymicum); コリネバクテリウム・ホアギイ(Corynebacterium hoagii); コリネバクテリウム・ストリアタム(Corynebacterium striatum); コリネバクテリウム・ムリセプチカム(Corynebacterium murisepticum); コリネバクテリウム・ネフリジイ(Corynebacterium nephridii); コリネバクテリウム・フォケ(Corynebacterium phocae); コリネバクテリウム・バギナリス(Corynebacterium vaginalis);ミクロバクテリウム・フラバム(Microbacterium flavum); コリネバクテリウム・ファシアンス(Corynebacterium fascians); コリネバクテリウム・ラタイ(Corynebacterium rathayi); コリネバクテリウム・アグロピリ(Corynebacterium  agropyri); コリネバクテリウム・トリチシ(Corynebacterium tritici); コリネバクテリウム・イラニカム(Corynebacterium iranicum); コリネバクテリウム・セペドニカム(Corynebacterium sepedonicum); コリネバクテリウム・ベチコーラ(Corynebacterium beticola); コリネバクテリウム・イリシス(Corynebacterium ilicis); コリネバクテリウム・ヒュミフェラム(Corynebacterium humiferum); コリネバクテリウム・ヒュムリ(Corynebacterium humuli); コリネバクテリウム・ヒペルトロフィカンス(Corynebacterium hypertrophicans); コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum); コリネバクテリウム・アセトフィラム(Corynebacterium acetophilum); コリネバクテリウム・オーランチアカム(Corynebacterium aurantiacum); コリネバクテリウム・カルネ(Corynbacterium callunae); コリネバクテリウム・シトレウム-モビリス(Corynebacterium citreum-mobilis); コリネバクテリウム・エタノールアミノフィラム(Corynebacterium ethanolaminophilum); コリネバクテリウム・フラカムファシエンス(Corynebacterium flaccumfaciens); コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum); コリネバクテリウム・ヘルクリス(Corynebacterium herculis); コリネバクテリウム・ヒドロカルボクラスタス(Corynebacterium hydrocarboclastus); コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium); コリネバクテリウム・ルテウム(Corynebacterium luteum); コリネバクテリウム・メディオラナム(Corynebacterium mediolanum); コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola); コリネバクテリウム・ミセトイデス(Corynebacterium mycetoides); コリネバクテリウム・ヌビラム(Corynebacterium nubilum); コリネバクテリウム・ロセウム(Corynebacterium roseum); コリネバクテリウム・サングイニス(Corynebacterium sanguinis);アルスロバクター・ グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis);アルスロバクター・シンプレックス(Arthrobacter simplex);アルスロバクター・ツメセンス(Arthrobacter tumescens);アルスロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus);アルスロバクター・テレゲンス(Arthrobacter terregens);アルスロバクター・フラベセン���(Arthrobacter flavescens);アルスロバクター・デュオデカディス(Arthrobacter duodecadis);アルスロバクター・ルテウス(Arthrobacter luteus);アルスロバクター・マリナス(Arthrobacter marinus);アルスロバクター・バリアビリス(Arthrobacter variabilis);アルスロバクター・ビスコサス(Arthrobacter viscosus);アルスロバクター・ポリクロモゲネス(Arthrobacter polychromogenes);アルスロバクター・コンソシアタス(Arthrobacter consociatus);アルスロバクター・ニコチノボラス(Arthrobacter nicotinovorus);ブレビバクテリウム・リネンス(Brevibacterium linens);ブレビバクテリウム・アセチリカム(Brevibacterium acetylicum);ブレビバクテリウム・エリスロゲネス(Brevibacterium erythrogenes);ブレビバクテリウム・ヘアリイ(Brevibacterium healii);ブレビバクテリウム・リポリチカム(Brevibacterium lipolyticum);ブレビバクテリウム・ブルネウム(Brevibacterium brunneum);ブレビバクテリウム・フルバム(Brevibacterium fulvum);ブレビバクテリウム・フスカム(Brevibacterium fuscum);ブレビバクテリウム・ヘルボラム(Brevibacterium helvolum);ブレビバクテリウム・イモタム(Brevibacterium immotum);ブレビバクテリウム・マリノピスカム(Brevibacterium marinopiscum);ブレビバクテリウム・ソシオビバム(Brevibacterium sociovivum);ブレビバクテリウム・スタチオニス(Brevibacterium stationis);ブレビバクテリウム・マリス(Brevibacterium maris);ブレビバクテリウム・インペリアレ(Brevibacterium imperiale);ブレビバクテリウム・インセルタム(Brevibacterium incertum);ブレビバクテリウム・インセクチフィリウム(Brevibacterium insectiphilium);ブレビバクテリウム・ミヌチフェルラ(Brevibacterium minutiferula);ブレビバクテリウム・クアレ(Brevibacterium quale);ブレビバクテリウム・テグメンチコラ(Brevibacterium tegumenticola);ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes);ブレビバクテリウム・スルフレウム(Brevibacterium sulfureum);ブレビバクテリウム・プロトフォルミエ(Brevibacterium protophormiae);ブレビバクテリウム・サペルデ(Brevibacterium saperdae);ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum);ブレビバクテリウム・インマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum);ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum);ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum);ブレビバクテリウム・サッカロリチカム(Brevibacterium saccharolyticum);ブレビバクテリウム・ジバリカタム(Brevibacterium divaricatum);ブレビバクテリウム・ロイチノファガム(Brevibacterium leucinophagum);ブレビバクテリウム・ィケファシエンス(Brevibacterium liquefaciens);ブレビバクテリウム・ペントソ-アラニカム(Brevibacterium pentoso-alanicum);ブレビバクテリウム・ペントソ-アミノアシジカム(Brevibacterium pentoso-aminoacidicum); ブレビバクテリウム・リチカム(Brevibacterium lyticum);ブレビバクテリウム・アルビダム(Brevibacterium albidum);ブレビバクテリウム・シトレウム(Brevibacterium citreum);ブレビバクテリウム・ルテウム(Brevibacterium luteum);ブレビバクテリウム・テスタセウム(Brevibacterium testaceum);ブレビバクテリウム・プシラム(Brevibacterium pusillum);ブレビバクテリウム・アラニカム(Brevibacterium alanicum);ブレビバクテリウム・アミノゲネス(Brevibacterium aminogenes);ブレビバクテリウム・クロモゲネス(Brevibacterium chromogenes);ブレビバクテリウム・フリゴリトェランス(Brevibacterium frigoritolerans);ブレビバクテリウム・ハロトレランス(Brevibacterium halotolerans);ブレビバクテリウム・フェルメンタンス(Brevibacterium fermentans);ブレビバクテリウム・オキシダンス(Brevibacterium oxydans);ミクロバクテリウム・ラクチカム(Microbacterium lacticum);ミクロバクテリウム・リケファシエンス(Microbacterium liquefaciens);ミクロバクテリウム・フラバム(Microbacterium flavum);ミクロバクテリウム・サーモスファクタム(Microbacterium thermosphactum);セルロモナス・フラビゲナ(Cellulomonas flavigena);セルロモナス・アシズラ(Cellulomonas acidula);セルロモナス・オーロゲナ(Cellulomonas aurogena);セルロモナス・ガルバ(Cellulomonas galba);セルロモナス・プシラ(Cellulomonas pusilla);クルシア・ゾフィイ(Kurthia zopfii),クルシア・バリアビリス(Kurthia variabilis);クルシア・ベソニイ(Kurthia bessonii);プロピオニバクテリウム・フリューデンレイチイ(Propionibacterium freudenreichii);プロピオニバクテリウム・ソエニイ(Propionibacterium thoenii);プロピオニバクテリウム・アシジ-プロピオニシ(Propionibacterium acidi-propionici);プロピオニバクテリウム・ジェンセニイ(Propionibacterium jensenii);プロピオニバクテリウム・アビダム(Propionibacterium avidum);プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes);プロピオニバクテリウム・アクネスタイプII(Propionibacterium acnes Type II);プロピオニバクテリウム・リンフォフィラム(Propionibacterium lymphophilum);プロピオニバクテリウム・グラヌロサム(Propionibacterium granulosum);ユーコバクテリウム・フェガンス(Eucobacterium foedans); 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テリウム・サーモフィルム(Bifidobacterium thermophilum);ビフィドバクテリウム・スイス(Bifidobacterium suis);ビフィドバクテリウム・アステロイデス(Bifidobacterium asteroids);ビフィドバクテリウム・インジカム(Bifidobacterium indicum);ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ(Bifidobacterium coryneforme);バクテリオネマ・マトルチョチイ(Bacterionema matruchotii);ロシア・デントカリオサ(Rothia dentocariosa);マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis);マイコバクテリウム・ミクロチ(Mycobacterium microti);マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis);マイコバクテリウム・ボビス・BCG  (Mycobacterium bovis BCG);マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum);マイコバクテリウム・カンサシイ(Mycobacterium kansasii);マイコバクテリウム・マリナム(Mycobacterium marinum);マイコバクテリウム・シミエ(Mycobacterium simiae);マイコバクテリウム・ガストリ(Mycobacterium gastri);マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム(Mycobacterium nonchromogenicum);マイコバクテリウム・テレ(Mycobacterium terrae);マイコバクテリウム・トリビアレ(Mycobacterium triviale);マイコバクテリウム・ゴルドネ(Mycobacterium gordonae);マイコバクテリウム・スクロフェラセウム(Mycobacterium scrofulaceum);マイコバクテリウム・パラフィニカム(Mycobacterium paraffinicum);マイコバクテリウム・イントラセルラエ(Mycobacterium intracellulare);マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium);マイコバクテリウム・ゼノピ(Mycobacterium xenopi);マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans);マイコバクテリウム・フレイ(Mycobacterium phlei);マイコバクテリウム・バケ(Mycobacterium vaccae);マイコバクテリウム・ジエルンホフェリ(Mycobacterium diernhoferi);マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis);マイコバクテリウム・サムノフェオス(Mycobacterium thamnopheos);マイコバクテリウム・フラベセンス(Mycobacterium flavescens);マイコバクテリウム・フォルツイタム(Mycobacterium fortuitum);マイコバクテリウム・ペレグリナム(Mycobacterium peregrinum);マイコバクテリウム・ケロネイ(Mycobacterium chelonei);マイコバクテリウム・パラツベルクロシス(Mycobacterium paratuberculosis);マイコバクテリウム・レプレ(Mycobacterium leprae);マイコバクテリウム・レプレムリウム(Mycobacterium lepraemurium);フランキア・アルニ(Frankia alni); 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treptomyces phaeopurpureus);ストレプトマイセス・プルペオファスカス(Streptomyces purpeofuscus);ストレプトマイセス・ショウドエンシス(Streptomyces showdoensis);ストレプトマイセス・タナシエンシス(Streptomyces tanashiensis);ストレプトマイセス・ビオラセオレクタス(Streptomyces violaceorectus);ストレプトマイセス・ザオミセチカス(Streptomyces zaomyceticus);ストレプトマイセス・アブラビエンシス(Streptomyces aburaviensis);ストレプトマイセス・ケルレウス(Streptomyces caeruleus);ストレプトマイセス・カテヌレ(Streptomyces catenulae);ストレプトマイセス・クリソマラス亜種フミガタス(Streptomyces chrysomallus subsp. fumigatus);ストレプトマイセス・ザンソシジカス(Streptomyces xanthocidicus);ストレプトマイセス・アクロモゲネス亜種ルブラジリス(Streptomyces achromogenes subsp. rubradiris);ストレプトマイセス・アナンジイ(Streptomyces anandii);ストレプトマイセス・オーランチオグリセウス(Streptomyces aurantiogriseus);ストレプトマイセス・ボビリ亜種スポリフィカンス(Streptomyces bobili subsp. sporificans);ストレプトマイセス・シネロクロモゲネス(Streptomyces cinerochromogenes);ストレプトマイセス・シラツス(Streptomyces cirratus);ストレプトマイセス・コリナス(Streptomyces collinus);ストレプトマイセス・ユーリセルマス(Streptomyces eurythermus);ストレプトマイセス・ガルバス(Streptomyces galbus);ストレプトマイセス・ガリレウス(Streptomyces galilaeus);ストレプトマイセス・グリセオルバー(Streptomyces griseoruber);ストレプトマイセス・グリセオスポレウス(Streptomyces griseosporeus);ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス亜種オサマイセチカス(Streptomyces hygroscopicus subsp. ossamyceticus);ストレプトマイセス・クルサノビイ(Streptomyces kurssanovii);ストレプトマイセス・ルテオグリセウス(Streptomyces luteogriseus);ストレプトマイセス・マサスポレウス(Streptomyces massasporeus);ストレプトマイセス・ミラビリス(Streptomyces mirabilis);ストレプトマイセス・マルチスピラリス(Streptomyces multispiralis);ストレプトマイセス・ナガニシイ(Streptomyces naganishii);ストレプトマイセス・ネヤガワエンシス(Streptomyces neyagawaensis);ストレプトマイセス・ノジリエンシス(Streptomyces nojiriensis);ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス(Streptomyces olivochromogenes);ストレプトマイセス・フェオファシエンス(Streptomyces phaeofaciens);ストレプトマイセス・プルベラセウス(Streptomyces pulveraceus);ストレプトマイセス・ラメウス(Streptomyces rameus);ストレプトマイセス・レジストマイシフィカス(Streptomyces resistomycificus);ストレプトマイセス・リシリエンシス(Streptomyces rishiriensis);ストレプトマイセス・サーモビオラセウス(Streptomyces thermoviolaceus);ストレプトマイセス・ビオラセオクロモゲネス(Streptomyces violaceochromogenes);ストレプトマイセス・アフガニエンシス(Streptomyces afghaniensis);ストレプトマイセス・アレネ(Streptomyces arenae);ストレプトマイセス・アトロシアネウス(Streptomyces attrocyaneus);ストレプトマイセス・クロモフスカス(Streptomyces chromofuscus);ストレプトマイセス・ダルハネンシス(Streptomyces durhamensis);ストレプトマイセス・エキナタス(Streptomyces echinatus);ストレプトマイセス・フィリピネンシス(Streptomyces filipinensis);ストレプトマイセス・フィンブリアタス(Streptomyces fimbriatus);ストレプトマイセス・グリセオクロモゲネス(Streptomyces griseochromogenes);ストレプトマイセス・イアキラス(Streptomyces iakyrus);ストレプトマイセス・ルセンシ���(Streptomyces lucensis);ストレプトマイセス・マラキトフスカス(Streptomyces malachitofuscus);ストレプトマイセス・マラキトレクタス(Streptomyces malachitorectus);ストレプトマイセス・ピロサス(Streptomyces pilosus);ストレプトマイセス・アルビドファスカス(Streptomyces albidofuscus);ストレプトマイセス・アルボグリセオラス(Streptomyces albogriseolus);ストレプトマイセス・アンボファシエンス(Streptomyces ambofaciens);ストレプトマイセス・アンソシアニカス(Streptomyces anthocyanicus);ストレプトマイセス・アンチマイコチカス(Streptomyces antimycoticus);ストレプトマイセス・アルゲンテオラス(Streptomyces argenteolus);ストレプトマイセス・アトラタス(Streptomyces atratus);ストレプトマイセス・オーレオファシエンス(Streptomyces aureofaciens);ストレプトマイセス・アベラネウス(Streptomyces avellaneus);ストレプトマイセス・ケシウス(Streptomyces caesius);ストレプトマイセス・カルノサス(Streptomyces carnosus);ストレプトマイセス・チベンシス(Streptomyces chibaensis);ストレプトマイセス・ケレセンス(Streptomyces coelescens);ストレプトマイセス・ケリカラー亜種アクロウス(Streptomyces coelicolor subsp. achrous);ストレプトマイセス・ケリカラー亜種ケリコファース(Streptomyces coelicolor subsp. coelicofers);ストレプトマイセス・ケリカラー亜種ケリコラタス(Streptomyces coelicolor subsp. coelicolatus);ストレプトマイセス・ケリカラー亜種ケリコバリアンス(Streptomyces coelicolor subsp. coelicovarians);ストレプトマイセス・コルコルシイ(Streptomyces corchorusii);ストレプトマイセス・シアノゲナス(Streptomyces cyanogenus);ストレプトマイセス・ジアスタチカス亜種アルデシアカス(Streptomyces diastaticus subsp. ardesiacus);ストレプトマイセス・ジアスタトクロモゲネス亜種ブラカス(Streptomyces diastatochromogenes subsp. bracus);ストレプトマイセス・エンダス(Streptomyces endus); ストレプトマイセス・エルンペンス(Streptomyces erumpens); ストレプトマイセス・グリセオオーランチアカス(Streptomyces griseoaurantiacus);ストレプトマイセス・グリセオフスカス(Streptomyces griseofuscus);ストレプトマイセス・グリセオサフスカス(Streptomyces griseolosuffuscus);ストレプトマイセス・グリセオルテウス(Streptomyces griseoluteus);ストレプトマイセス・グリセウス亜種ジフィシリス(Streptomyces griseus subsp. difficilis);ストレプトマイセス・ヒュミダス(Streptomyces humidus);ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus);ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス亜種アンガストマイセチカス(Streptomyces hygroscopicus subsp. angustmyceticus); ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス亜種デコイカス(Streptomyces hygroscopicus subsp. decoyicus);ストレプトマイセス・ヒグロスコピウス亜種グレボサス(Streptomyces hygroscopius subsp. glebosus);ストレプトマイセス・リバニ(Streptomyces libani);ストレプトマイセス・リバニ亜種ルファス(Streptomyces libani subsp. rufus);ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans); ストレプトマイセス・ルシタナス(Streptomyces lusitanus);ストレプトマイセス・リジカス(Streptomyces lydicus);ストレプトマイセス・メラノスポロファシエンス(Streptomyces melanosporofaciens);ストレプトマイセス・ミシオネンシス(Streptomyces misionensis);ストレプトマイセス・ムリナス(Streptomyces murinus); ストレプトマイセス・ムタビリス(Streptomyces mutabilis);ストレプトマイセス・ニグレセンス(Streptomyces nigrescens);ストレプトマイセス・ノドサス(Streptomyces nodosus);ストレ��トマイセス・ノガラテル(Streptomyces nogalater);ストレプトマイセス・オリバセイスクレロチカス(Streptomyces olivaceiscleroticus);ストレプトマイセス・オリバセオビリジス(Streptomyces olivaceoviridis);ストレプトマイセス・オリバセウス(Streptomyces olivaceus); ストレプトマイセス・パルバラス(Streptomyces parvullus);ストレプトマイセス・プラテンシス(Streptomyces platensis);ストレプトマイセス・プリカタス(Streptomyces plicatus);ストレプトマイセス・ポオネンシス(Streptomyces poonensis);ストレプトマイセス・サモチカス(Streptomyces psammoticus);ストレプトマイセス・プルプロゲネイスクレロチカス(Streptomyces purpurogeneiscleroticus);ストレプトマイセス・レシフェニス(Streptomyces recifenis); ストレプトマイセス・ロケイ(Streptomyces rochei);ストレプトマイセス・ロクゲンシス(Streptomyces rokugoensis);ストレプトマイセス・ロゼオジアスタチカス(Streptomyces roseodiastaticus);ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス亜種カステラレンセ(Streptomyces rutgersensis subsp. castelarense);ストレプトマイセス・サヤメンシス(Streptomyces sayamaensis);ストレプトマイセス・センダイエンシス(Streptomyces sendaiensis);ストレプトマイセス・シオヤエンシス(Streptomyces sioyaensis);ストレプトマイセス・テンデ(Streptomyces tendae);ストレプトマイセス・サーモブルガリス(Streptomyces thermovulgaris);ストレプトマイセス・トリカラー(Streptomyces tricolor);ストレプトマイセス・ツベルシジカス(Streptomyces tubercidicus);ストレプトマイセス・ツメマセランス(Streptomyces tumemacerans);ストレプトマイセス・バスタス(Streptomyces vastus);ストレプトマイセス・ビオラセオラタス(Streptomyces violaceolatus);ストレプトマイセス・ビオラセウス-ニゲル(Streptomyces violaceus-niger);ストレプトマイセス・ビオラセウス-ルバー(Streptomyces violaceus-ruber);ストレプトマイセス・ビリジファシエンス(Streptomyces viridifaciens);ストレプトマイセス・アトロオリバセウス(Streptomyces atroolivaceus);ストレプトマイセス・シアノカラー(Streptomyces cyanocolor); 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apingens);ストレプトマイセス・ビリドニゲル(Streptomyces viridoniger);ストレプトマイセス・ウェラエンシス(Streptomyces werraensis);ストレプトマイセス・アルボフラバス(Streptomyces alboflavus);ストレプトマイセス・バシラリス(Streptomyces bacillaris);ストレプトマイセス・カボレンシス(Streptomyces cavourensis);ストレプトマイセス・シアネオファスカタス(Streptomyces cyaneofuscatus);ストレプトマイセス・ファルビシマス(Streptomyces fulvissimus);ストレプトマイセス・グリセオブルネウス(Streptomyces griseobrunneus);ストレプト��イセス・ミシガネンシス(Streptomyces michiganensis);ストレプトマイセス・ツシマエンシス(Streptomyces tsusimaensis);ストレプトマイセス・ザンソクロモゲナス(Streptomyces xanthochromogenus);ストレプトマイセス・アルビドフラバス(Streptomyces albidoflavus);ストレプトマイセス・アルボビリジス(Streptomyces alboviridis);ストレプトマイセス・アヌラタス(Streptomyces anulatus);ストレプトマイセス・バジアス(Streptomyces badius);ストレプトマイセス・カリフォルニカス(Streptomyces californicus);ストレプトマイセス・カネセンス(Streptomyces canescens);ストレプトマイセス・セルロフラバス(Streptomyces celluloflavus);ストレプトマイセス・セルローサ(Streptomyces cellulosae);ストレプトマイセス・チャンパバチイ(Streptomyces champavatii);ストレプトマイセス・クリソマラス(Streptomyces chrysomallus);ストレプトマイセス・シトレオフルオレセンス(Streptomyces citreofluorescens);ストレプトマイセス・ケリカラー(Streptomyces coelicolor);ストレプトマイセス・フェレウス(Streptomyces felleus);ストレプトマイセス・フィミカリウス(Streptomyces fimicarius);ストレプトマイセス・フロリデ(Streptomyces floridae);ストレプトマイセス・フルオレセンス(Streptomyces fluorescens);ストレプトマイセス・グロビスポラス(Streptomyces globisporus);ストレプトマイセス・グロビスポラス亜種コーカシカス(Streptomyces globisporus subsp. caucasicus);ストレプトマイセス・グロビスポラス亜種フラボファスカス(Streptomyces globisporus subsp. flavofuscus);ストレプトマイセス・グロビスポラス亜種ブルガリス(Streptomyces globisporus subsp. vulgaris);ストレプトマイセス・グーゲロチイ(Streptomyces gougerotii);ストレプトマイセス・グリセイナス(Streptomyces griseinus);ストレプトマイセス・グリセオロアルバス(Streptomyces griseoloalbus);ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus);ストレプトマイセス・グリセウス亜種アルファ(Streptomyces griseus subsp. alpha);ストレプトマイセス・グリセウス亜種クレトサス(Streptomyces griseus subsp. cretosus);ストレプトマイセス・グリセウス亜種ソルビファシエンス(Streptomyces griseus subsp. solvifaciens);ストレプトマイセス・インテルメジウス(Streptomyces intermedius);ストレプトマイセス・カナマイセチカス(Streptomyces kanamyceticus);ストレプトマイセス・レボリス(Streptomyces levoris);ストレプトマイセス・リモサス(Streptomyces limosus);ストレプトマイセス・リプマニイ(Streptomyces lipmanii);ストレプトマイセス・ミクロフラバス(Streptomyces microflavus);ストレプトマイセス・オドリファー(Streptomyces odorifer);ストレプトマイセス・パルバス(Streptomyces parvus);ストレプトマイセス・プルリカラレセンス(Streptomyces pluricolorescens);ストレプトマイセス・ニューモニカス(Streptomyces pneumonicus);ストレプトマイセス・プレコックス(Streptomyces praecox);ストレプトマイセス・プニセウス(Streptomyces puniceus);ストレプトマイセス・ラフィノサス(Streptomyces raffinosus);ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス(Streptomyces rutgersensis);ストレプトマイセス・サンプソニイ(Streptomyces sampsonii);ストレプトマイセス・セトニイ(Streptomyces setonii);ストレプトマイセス・シンデネンシス(Streptomyces sindenensis);ストレプトマイセス・サルファレウス(Streptomyces sulphureus);ストレプトマイセス・ウィルモレイ(Streptomyces willmorei);ストレプトマイセス・ハワイエンシス(Streptomyces hawaiiensis);ストレプトマイセス・アルボヘルバタス(Streptomyces albohelvatus);ストレプトマイセ���・オーリギネウス(Streptomyces aurigineus);ストレプトマイセス・カナリウス(Streptomyces canarius);ストレプトマイセス・クリセウス(Streptomyces chryseus);ストレプトマイセス・フラビドビレンス(Streptomyces flavidovirens);ストレプトマイセス・ヘルバチカス(Streptomyces helvaticus);ストレプトマイセス・ロンギスポロフラバス(Streptomyces longisporoflavus);ストレプトマイセス・ニベウス(Streptomyces niveus);ストレプトマイセス・ポーシジアスタチカス(Streptomyces paucidiastaticus);ストレプトマイセス・スフェロイデス(Streptomyces spheroides);ストレプトマイセス・ピンプリナ(Streptomyces pimprina);ストレプトマイセス・カポアマス(Streptomyces capoamus);ストレプトマイセス・シンナバリナス(Streptomyces cinnabarinus);ストレプトマイセス・クリスタリナス(Streptomyces crystallinus);ストレプトマイセス・フラボトリシニ(Streptomyces flavotricini);ストレプトマイセス・ゴビトリシニ(Streptomyces gobitricini);ストレプトマイセス・リンコルネンシス(Streptomyces lincolnensis);ストレプトマイセス・メラノゲネス(Streptomyces melanogenes);ストレプトマイセス・フェオクロモゲネス(Streptomyces phaeochromogenes);ストレプトマイセス・フェオクロモゲネス亜種クロロマイセチカス(Streptomyces phaeochromogenes subsp. chloromyceticus);ストレプトマイセス・シュードベネズエラ(Streptomyces pseudovenezuelae);ストレプトマイセス・ロゼオビリジス(Streptomyces roseoviridis);ストレプトマイセス・スペクタビリス(Streptomyces spectabillis);ストレプトマイセス・サブラチラス(Streptomyces subrutilus);ストレプトマイセス・アンブリナス(Streptomyces umbrinus);ストレプトマイセス・ベネズエラ(Streptomyces venezuelae);ストレプトマイセス・ザンソフェウス(Streptomyces xanthophaeus);ストレプトマイセス・オーレオモノポジアレス(Streptomyces aureomonopodiales);ストレプトマイセス・エクスフォリアタス(Streptomyces exfoliatus);ストレプトマイセス・フィラメントサス(Streptomyces filamentosus);ストレプトマイセス・プラニカラー(Streptomyces prunicolor);ストレプトマイセス・ロゼオファルバス(Streptomyces roseofulvus);ストレプトマイセス・ロゼオラス(Streptomyces roseolus);ストレプトマイセス・ロゼオポラス(Streptomyces roseoporus);ストレプトマイセス・ルビギノソヘルボラス(Streptomyces rubiginosohelvolus);ストレプトマイセス・テルミタス(Streptomyces termitum);ストレプトマイセス・シンナモネンシス(Streptomyces cinnamonensis);ストレプトマイセス・コロンビエンシス(Streptomyces colombiensis);ストレプトマイセス・ゴシキエンシス(Streptomyces goshikiensis);ストレプトマイセス・カトレ(Streptomyces katrae);ストレプトマイセス・ラベンドフォリエ(Streptomyces lavendofoliae);ストレプトマイセス・ラベンズレ(Streptomyces lavendulae);ストレプトマイセス・ラベンズレ亜種アビレウス(Streptomyces lavendulae subsp. avireus);ストレプトマイセス・ラベンズレ亜種ブラシリカス(Streptomyces lavendulae subsp. brasilicus);ストレプトマイセス・ラベンズレ亜種グラセリウス(Streptomyces lavendulae subsp. grasserius);ストレプトマイセス・ラベンズルカラー(Streptomyces lavendulcolor);ストレプトマイセス・ルリダス(Streptomyces luridus);ストレプトマイセス・オーキダセウス(Streptomyces orchidaceus);ストレプトマイセス・ラセモクロモゲネス(Streptomyces racemochromogenes);ストレプトマイセス・シリンゲ(Streptomyces syringae);ストレプトマイセス・トキシトリシニ(Streptomyces toxytricini);ストレプトマイセス・チュイラス(Streptomyces tuirus);ストレプトマイセス・ビナセウス(Streptomyces vinaceus);ストレプトマイセス・ビルギニエ(Streptomyces virginiae);ストレプトマイセス・ラテリタス(Streptomyces lateritus);ストレプトマイセス・フラボバリアビリス(Streptomyces flavovariabilis);ストレプトマイセス・ジャンシナス(Streptomyces janthinus);ストレプトマイセス・プルプラセンス(Streptomyces purpurascens);ストレプトマイセス・ロゼオスピナス(Streptomyces roseospinus);ストレプトマイセス・ロゼオヴィオラセウス(Streptomyces roseoviolaceus);ストレプトマイセス・ビオラセウス(Streptomyces violaceus);ストレプトマイセス・ビオラセウス亜種コンフィナス(Streptomyces vio
laceus subsp. confinus);ストレプトマイセス・ビオラセウス亜種ビシナス(Streptomyces violaceus subsp. vicinus);ストレプトマイセス・ビオララス(Streptomyces violarus);ストレプトマイセス・ビオラタス(Streptomyces violatus);ストレプトマイセス・ヨコスカネンシス(Streptomyces yokosukanensis);ストレプトマイセス・アルボスポレウス(Streptomyces albosporeus);ストレプトマイセス・オーランチアカス(Streptomyces aurantiacus);ストレプトマイセス・オーレオバーチシラタス(Streptomyces aureoverticillatus);ストレプトマイセス・オーリニ(Streptomyces aurini);ストレプトマイセス・クレメウス(Streptomyces cremeus);ストレプトマイセス・ダヘスタニカス(Streptomyces daghestanicus);ストレプトマイセス・フラジエ(Streptomyces fradiae);ストレプトマイセス・フラジリス(Streptomyces fragilis);ストレプトマイセス・フマナス(Streptomyces fumanus);ストレプトマイセス・グロメロオーランチアカス(Streptomyces glomeroaurantiacus);ストレプトマイセス・グリセオビリジス(Streptomyces griseoviridis);ストレプトマイセス・ニベオルバー(Streptomyces niveoruber);ストレプトマイセス・ピューセチアス(Streptomyces peucetius);ストレプトマイセス・フェオビリジス(Streptomyces phaeoviridis);ストレプトマイセス・ロゼイスクレロチカス(Streptomyces roseiscleroticus);ストレプトマイセス・ロゼオフラバス(Streptomyces roseoflavus);ストレプトマイセス・ロゼオリラシナス(Streptomyces roseolilacinus);ストレプトマイセス・ルボ-シアネウス(Streptomyces rubo-cyaneus);ストレプトマイセス・タウリカス(Streptomyces tauricus);ストレプトマイセス・ビナセウス-ドラパス(Streptomyces vinaceus-drappus);ストレプトマイセス・ビロシダス(Streptomyces virocidus);ストレプトマイセス・エリスレウス(Streptomyces erythraeus);ストレプトマイセス・ルテオフルオレセンス(Streptomyces luteofluorescens);ストレプトマイセス・エリスログリセウス(Streptomyces erythrogriseus);ストレプトマイセス・ガリファラス(Streptomyces garyphalus);ストレプトマイセス・ラベンズラレクタス(Streptomyces lavendularectus);ストレプトマイセス・ナガサキエンシス(Streptomyces nagasakiensis);ストレプトマイセス・ルブロラベンズレ(Streptomyces rubrolavendulae);ストレプトマイセス・シンナモネンシス(Streptomyces cinnamonensis);ストレプトマイセス・アシュカバシカス(Streptomyces ashchabadicus);ストレプトマイセス・ポリクロモゲネス(Streptomyces polychromogenes);ストレプトマイセス・アマクサエンシス(Streptomyces amakusaensis);ストレプトマイセス・ケレスチス(Streptomyces caelestis);ストレプトマイセス・アズレウス(Streptomyces azureus);ストレプトマイセス・ベラス(Streptomyces bellus);ストレプトマイセス・チャルトレウシス(Streptomyces chartreusis);ストレプトマイセス・ケリアタス(Streptomyces coeliatus);ストレプトマイセス・ケルラタス(Streptomyces coerulatus);ストレプトマイセス・ケルラタス亜種アミロリチカス(Streptomyces coerulatus subsp. amylolyticus);ストレプトマイセス・ケルレオファスカス(Streptomyces coeruleofuscus);ストレプトマイセス・ケルレオルビダス(Streptomyces coeruleorubidus);ストレプトマイセス・ケルレセンス(Streptomyces coerulescens);ストレプトマイセス・クラコイ(Streptomyces curacoi);ストレプトマイセス・シアネウス(Streptomyces cyaneus);ストレプトマイセス・シアノグロメラス(Streptomyces cyanoglomerus);ストレプトマイセス・インジゴカラー(Streptomyces indigocolor);ストレプトマイセス・ラナタス(Streptomyces lanatus);ストレプトマイセス・ラズレウス(Streptomyces lazureus);ストレプトマイセス・バリナス(Streptomyces valynus);ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes);ストレプトマイセス・グローセセンス(Streptomyces glaucescens);ストレプトマイセス・ブレンシス(Streptomyces blensis);ストレプトマイセス・ケルラタス亜種アナセウリ(Streptomyces coerulatus subsp. anaseuli);ストレプトマイセス・ケルレオロセウス(Streptomyces coeruleoroseus);ストレプトマイセス・イポメエ(Streptomyces ipomoeae);ストレプトマイセス・スピノサス(Streptomyces spinosus);ストレプトマイセス・グリセオマイシニ(Streptomyces griseomycini);ストレプトマイセス・グリセオストラミネウス(Streptomyces griseostramineus);ストレプトマイセス・プラシノスポラス(Streptomyces prasinosporus);ストレプトマイセス・ガネンシス(Streptomyces ghanaensis);ストレプトマイセス・ヒルスタス(Streptomyces hirsutus);ストレプトマイセス・プラシナス(Streptomyces prasinus);ストレプトマイセス・ビリドスポラス(Streptomyces viridosporus);ストレプトマイセス・アクリマイシニ(Streptomyces acrimycini);ストレプトマイセス・バンベルギエンシス(Streptomyces bambergiensis);ストレプトマイセス・プラシノピロサス(Streptomyces prasinopilosus);ストレプトマイセス・ホートン(Streptomyces horton);ストレプトマイセス・レクチビオラセウス(Streptomyces rectiviolaceus);ストレプトマイセス・リラシノフルバス(Streptomyces lilacinofulvus);ストレプトマイセス・モーベカラー(Streptomyces mauvecolor);ストレプトマイセス・ビオランス(Streptomyces violans);ストレプトマイセス・ビオラセンス(Streptomyces violascens);ストレプトバーチシリウム・バルダシイ(Streptoverticillium baldaccii); ストレプトバーチシリウム・フェルベンス(Streptoverticillium fervens);ストレプトバーチシリウム・ルブロクロリナム(Streptoverticillium rubrochlorinum);ストレプトバーチシリウム・ビベルチシラタム(Streptoverticillium biverticillatum);ストレプトバーチシリウム・オーレオバーサレス(Streptoverticillium aureoversales);ストレプトバーチシリウム・ペンタチカム(Streptoverticillium pentaticum);ストレプトバーチシリウム・ロゼオバーチシラタム(Streptoverticillium roseoverticillatum);ストレプトバーチシリウム・ルブロバーチシラタム(Streptoverticillium rubroverticillatum);ストレプトバーチシリウム・ヒロシメンス(Streptoverticillium hiroshimense);ストレプトバーチシリウム・サルモニス(Streptoverticillium salmonis);ストレプトバーチシリウム・ルテオバーチシラタム(Streptoverticillium luteoverticillatum);ストレプトバーチシリウム・オリボレチキュリ(Streptoverticillium olivoreticuli);ストレプトバーチシリウム・ワクスマニイ(Streptoverticillium waksmanii);ストレプトバーチシリウム・グリセオカルネウム(Streptoverticillium griseocarneum);ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム(Streptoverticillium cinnamoneum);ストレプトバーチシリウム・ハチジョエンス(Streptoverticillium hachijoense);ストレプトバーチシリウム・アルダム(Streptoverticillium ardum);ストレプトバーチシリウム・アビコエンセ(Streptoverticillium abikoense);ストレプトバーチシリウム・アルビレチキュリ(Streptoverticillium albireticuli);ストレプトバーチシリウム・ユーロシジカム(Streptoverticillium eurocidicum);ストレプトバーチシリウム・キシワデンセ(Streptoverticillium kishiwadense);ストレプトバーチシリウム・マシュエンセ(Streptoverticillium mashuense);ストレプトバーチシリウム・オリボバーチシラタム(Streptoverticillium olivoverticillatum);ストレプトバーチシリウム・オリノシ(Streptoverticillium orinoci);ストレプトバーチシリウム・パルビスポロゲネス(Streptoverticillium parvisporogenes);ストレプトバーチシリウム・ケンタケンセ(Streptoverticillium kentuckense); ストレプトバーチシリウム・アルバム(Streptoverticillium album); ストレプトバーチシリウム・ジスタリカム(Streptoverticillium distallicum);ストレプトバーチシリウム・エヒメンセ(Streptoverticillium ehimense);ストレプトバーチシリウム・フラボペルシカム(Streptoverticillium flavopersicum);ストレプトバーチシリウム・グリセオバーチシラタム(Streptoverticillium griseoverticillatum);ストレプトバーチシリウム・ネトロプシス(Streptoverticillium netropsis);ストレプトバーチシリウム・レクチバーチシラタム(Streptoverticillium rectiverticillatum);ストレプトバーチシリウム・セプタタム(Streptoverticillium septatum);ストレプトバーチシリウム・モバレンセ(Streptoverticillium mobaraense);ストレプトバーチシリウム・ブラストマイセチカム(Streptoverticillium blastmyceticum);ストレプトバーチシリウム・ラベンズリグリセウム(Streptoverticillium lavenduligriseum);ストレプトバーチシリウム・リラシナム(Streptoverticillium lilacinum);ストレプトバーチシリウム・カシュミレンセ(Streptoverticillium kashmirense);ストレプトバーチシリウム・シオルテウム(Streptoverticillium thioluteum);スポリチシア・ポリモルファ(Sporichthya polymorpha); ミクロエロボスポリア・シネレア(Microellobosporia cinerea);ミクロエロボスポリア・ビオラセア(Microellobosporia violacea);ミクロエロボスポリア・フラベア(Microellobosporia flavea);ミクロエロボスポリア・グリセア(Microellobosporia grisea);ミクロモノスポラ・カルセア(Micromonospora chalcea); ミクロモノスポラ・ハロフィチカ(Micromonospora halophytica);ミクロモノスポラ・カルボナセア(Micromonospora carbonacea);ミクロモノスポラ・ナラシノエンシス(Micromonospora narashinoensis);ミクロモノスポラ・メラノスポレア(Micromonospora melanosporea);ミクロモノスポラ・エキノスポラ(Micromonospora echinospora);ミクロモノスポラ・プルプレア(Micromonospora purpurea);ミクロモノスポラ・プルプレオクロモゲネス(Micromonospora purpureochromogenes);ミクロモノスポラ・ビカラー(Micromonospora bicolor);ミクロモノスポラ・ケルレア(Micromonospora coerulea);ミクロモノスポラ・グロボサ(Micromonospora globosa);ミクロモノスポラ・エロンガタ(Micromonospora elongata);ミクロモノスポラ・パルバ(Micromonosora parva);ミクロモノスポラ・ガリカ(Micromonospora gallica);ミクロモノスポラ・アセトフォルミシ(Micromonospora acetoformici);ミクロモノスポラ・プロピオニシ(Micromonospora propionici);サーモアクチノマイセス・ブルガリス(Thermoactinomyces vulgaris); サーモアクチノマイセス・サッカリ(Thermoactinomyces sacchari);アクチノビフィダ・ジコトミカ(Actinobifida dichotomica); アクチノビフィダ・アルバ(Actinobifida alba);アクチノビフィダ・クロモゲナ(Actinobifida chromogena);サーモモンスポラ・カーバタ(Thermomonspora curvata); サーモモンスポラ・ビリジス(Thermomonospora viridis);ミクロビスポラ・ロゼア(Microbispora rosea); ミクロビスポラ・エラタ(Microbispora aerata);ミクロビスポラ・アメシストゲネス(Microbispora amethystogenes);ミクロビスポラ・ビスポラ(Microbispora bispora);ミクロビスポラ・クロモゲネス(Microbispora chromogenes);ミクロビスポラ・ジアスタチカ(Microbispora diastatica);ミクロビスポラ・パルバ(Microbispora parva);ミクロビスポラ・サーモジアスタチカ(Microbispora thermodiastatica);ミクロビスポラ・サーモロセア(Microbispora thermorosea);ミクロポリスポラ・ブレビカテナ(Micropolyspora brevicatena);ミクロポリスポラ・アンギオスポラ(Micropolyspora angiospora);ミクロポリスポラ・ケシア(Micropolyspora caesia);ミクロポリスポラ・フェニ(Micropolyspora faeni);ミクロポリスポラ・レクチビルグラ(Micropolyspora rectivirgula);ミクロポリスポラ・ルブロブルネア(Micropolyspora rubrobrunea);ミクロポリスポラ・サーモビリダ(Micropolyspora thermovirida);及びミクロポリスポラ・ビリジニグラ(Micropolyspora viridinigra)。【００４１】
また、細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウムには免疫刺激物質とともに、あるいはそれとは別に、抗原を担持させてもよい。このような目的で用いられる抗原は微粒子状リン酸カルシウムに担持可能なものであれば種類は特に限定されない。例えば、水溶性で溶解度が極めて高いウシ血清アルブミンを抗原として担持させることができる（特開2005-126335号公報）。また、上記の微生物に由来する可溶性成分と同様にして、疎水性の物質を抗原として担持させることもできる。抗原は、真菌、放線菌、細菌、ウイルス、ファージ、リケッチア、原虫、これら微生物の成分、原虫成分、腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。【００４２】
可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる微粒子状の沈殿物の調製方法は、例えば米国特許第5,759,582号明細書に詳細に記載されており、当業者は容易に上記沈殿物を調製することが可能である。例えば(i)可溶性蛋白としてアルブミン、(ii)ムコ多糖としてヘパリン、及び(iii)免疫刺激物質としてPPDを用いる方法については、日本国特許第3492671号明細書に詳細に述べられており、この方法を用いることが最も好ましいが、これに限定されるものではない。また、可溶性蛋白及びムコ多糖の組み合わせは上記の組み合わせに限定されることはない。免疫刺激物質として、例えばツベルクリンに含有される可溶性蛋白を用いることもでき、あるいは当業者に周知の方法でツベルクリンから調製した可溶性蛋白の全部又はその一部を用いることもできる。上記の(i)、(ii)、及び(iii)の３成分を攪拌することにより成分（i）及び成分（ii）のコアセルベーションによる沈殿が生成し、その際に成分(iii)が該沈殿に取り込まれて共沈殿して沈殿物を与える。可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物は、投与の簡便さから注射針を通過できる大きさの微粒子状に調製されることが好ましい。該微粒子の粒径は、通常1μm以下が好ましい。沈殿物を微粒子状に調製する方法は当業者に周知の方法を用いればよく、特定の方法に限定されるものではない。【００４３】
免疫刺激物質に含有される可溶性蛋白と(i)の可溶性蛋白との比率は特に限定されず、(i)の可溶性蛋白及び(ii)のムコ多糖がコアセルベーションを起こす範囲内であればいかなる比率であってもよい。一例を挙げれば、pH 2.5の2.5％ヒト血清アルブミン溶液を可溶性蛋白として用いる場合、ムコ多糖として約5 mg/mlの市販ヘパリン溶液を用い、600μlのムコ多糖に対してPPDを2.5 μg溶解した後、この混合物を撹拌しつつ上記ヒト血清アルブミン溶液を滴下し、コアセルベーションによる微粒子を形成する。この懸濁液を遠心し、その上清のタンパク質含量を定量し、混合したタンパク質のほとんどが微粒子に取り込まれる容量比を選ぶのが好ましい。もっとも、成分(i)ないし(iii)の比率やコアセルベーションの条件などは当業者が適宜選択できることは言うまでもない。得られる沈殿に含まれる微粒子の粒径は通常1μm程度であるが、特定のサイズに限定されるものではない。【００４４】
得られた微粒子状沈殿は免疫刺激物質を担持した担体としてそのまま本発明のアジュバントの１成分として用いることができるが、必要に応じて沈殿を蒸留水で洗浄してもよい。また、沈殿を安定化するため、蛋白分子間架橋剤を作用させることにより架橋を形成して不溶性の微粒子を形成してもよい。蛋白分子間架橋剤の種類は特に限定されず、当業者に周知の架橋剤を周知の方法で用いることができる。例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを20 mg/mlの水溶液とし、終濃度 0.8〜1.5 mg/ml になるようにボルテックスミキサーで混ぜながら加え、その後、室温で15分間静置すれば、沈殿中の蛋白分子間に十分安定な架橋が形成される。もっとも、架橋形成は上記の特定の条件又は特定の蛋白分子間架橋剤に限定されるものではない。上記のようにして得られる微粒子状沈殿、好ましくは架橋処理された微粒子状沈殿は、水で洗浄しても溶解することはなく、本発明のアジュバントの成分として好適に用いることができる。【００４５】
好ましい態様によれば、抗原性のある可溶性蛋白と免疫アジュバント活性のあるツベルクリン可溶性蛋白とを混合しておき、上記(iii)に替えてこの混合物を用いて上記と同様にして沈殿物を得ることができる。この沈殿物は免疫刺激物質と抗原を担持した担体であり、本発明のアジュバントの１成分として用いることもできる。【００４６】
可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物には、免疫刺激物質とともに、あるいはそれとは別に、抗原を担持させてもよい。抗原としては、例えば、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、又はホルモンの誘導剤を用いることもできる。また、抗原としてツベルクリン、PPD、微生物に由来する可溶性成分、トレハロース6,6'-ジミコレート、LPS、リピッドＡ、オリゴヌクレオチド、β-グルカン、キーホールリンペットヘモシアニン、ムラミルジペプチド、ベスタチン、レバミゾール、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、又はホルモンからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質を用いることもできる。また、抗原として微生物のアルコール抽出物、アセトン抽出物、ピリジン抽出物、及び熱水抽出物からなる群から選ばれる１種又は２種以上の抽出物を用いることもできる。微生物としては細菌が好ましく、該抽出物が可溶性蛋白に結合されていることがさらに好ましい。微生物としては上記に例示したものが好ましく用いられる。もっとも、可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物に担持される抗原は上記の特定の例に限定されるものではない。【００４７】
可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物と他の不溶性蛋白分子や抗原とを蛋白分子間架橋剤により架橋し、免疫刺激物質を担持した担体を不溶性の微粒子形態で調製することもできる。蛋白分子間架橋剤の種類は特に限定されず、当業者に周知の架橋剤を周知の方法で用いることができる。例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなどを用いることができる。【００４８】
本発明の免疫アジュバントの免疫アジュバント活性は、本発明の明細書に具体的に説明した方法及び以下に説明する方法により当業者が容易に測定可能である。THP-1細胞株は、ヒト由来のマクロファージ系統の樹立細胞株であり、培養中にPhorbol 12-Myristate 13-Acetate（以下、「PMA」と略す場合がある）を作用させて分化誘導すると貪食能を示し（Kurosaka, K., et al., J. Immunol., 161, pp.6245-6249, 1998）、抗原提示細胞となることが知られている（Hu, P. Q., et al., J. Immunol., 172, pp.1595-1601, 2004）。また、この細胞をIFNgで前処理するとＴ細胞への抗原提示能が増強される（Brett, S. J., et al., J. Immunol. 150, pp.2869-84, 1993）。従って、THP-1細胞株を分化させ、産生するGM-CSFを定量することによって、ヒト抗原提示細胞を含む末梢血由来付着性細胞を使用せずにヒト抗原提示細胞の活性化程度を測定することが可能になる。THP-1細胞は樹立細胞株であることから、ヒト個体差とは無関係に質的に安定した試験材料を確保することができる。【００４９】
本発明の免疫アジュバントは、抗原と混合した後、ヒトを含む哺乳類動物の体内に投与することにより該抗原に対する全身性免疫反応を誘導することができ、通常用いられる一般的な免疫アジュバントと同様に使用することができる。抗原としては、被投与個体内に本来的に存在しない生物又は物質を用いることができ、より具体的には、例えば、真菌、放線菌、細菌、ウイルス、ファージ、リケッチア、原虫、これら微生物の成分、腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質を抗原として用いることができるが、これらに限定されるものではなく、抗原として作用可能な物質であればいかなる物質を用いてもよい。また、抗原を独立の製剤としてヒトを含む哺乳類動物の体内に投与し、本発明の免疫アジュバントを別個に該動物の体内に投与し、該抗原に対する全身性免疫反応を誘導することもできる。あるいは、先に説明したように本発明の免疫アジュバントの成分である２種以上の免疫刺激物質担体のいずれか又は２種以上に抗原を担持させておいてもよく、さらにその場合においても抗原を別途に投与することも可能である。【００５０】
抗原が、真菌、放線菌、細菌、ウイルス、ファージ、リケッチア、原虫、及び／又はこれら微生物の成分である場合は、本発明の免疫アジュバントと抗原とを投与することにより、感染症の予防及び／又は治療のためのワクチン療法を行うことができる。また、抗原が腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、及び／又は腫瘍抗原ペプチドである場合は、本発明の免疫アジュバントを上記抗原とともに投与することにより腫瘍の予防及び／又は治療のためのワクチン療法を行うことができる。例えば、患者から分離して不活性化した腫瘍細胞と本発明の免疫アジュバントとを混合して患者に投与することにより、患者の生体内において当該腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫反応を誘導できる。もっとも、本発明の混合免疫アジュバント製剤の使用方法は上記の態様に限定されることはなく、免疫アジュバントを用いる通常の形態のいずれの方法を用いてもよい。本発明の免疫アジュバントの投与量及び投与方法は特に限定されないが、一般的には、通常は注射（皮下注射など）の非経口投与により免疫反応が十分に惹起されるように投与することができる。【００５１】
さらに、患者の体内にある腫瘍組織を物理的手段によって変性させた後、その組織内に本発明の免疫アジュバントを投与することにより、患者の体内に生残している腫瘍細胞に対して抗腫瘍免疫反応を誘導することができる。腫瘍組織の物理的変性の手段は特に限定されないが、例えば、マイクロウエーブ照射、ラジオフリークエンシー凝固法、凍結凝固法、電気メス加熱、熱水注入、アルコール注入、塞栓法、放射線照射、レーザー光照射、超音波破壊等の手段を採用することができる。もっとも、物理的変性手段はこれらに限定されるものではなく、腫瘍組織内にある腫瘍細胞の細胞死を誘導することができる手段であればいかなるものを用いてもよい。２以上の物理的手段を適宜組み合わせてもよい。【００５２】
例えば、腫瘍組織をマイクロウエーブ照射により加熱凝固し、その凝固組織内に本発明の免疫アジュバントを投与すると、当該腫瘍組織内部やその周辺に生残している腫瘍細胞に対して抗腫瘍免疫反応を誘導できる。本発明の免疫アジュバントを投与するに際して、ツベルクリン溶液を同時に投与することも好ましい。もっとも、本発明の免疫アジュバントの投与方法は上記の態様に限定されるものではなく、当該変性腫瘍組織に集まってくる抗原提示細胞に本発明の免疫アジュバントが変性腫瘍組織に含まれる腫瘍抗原とともに取り込まれるか、又は本発明の免疫アジュバントが抗原提示細胞を直接刺激できる環境を与えるものであれば、いかなる方法を採用してもよい。【００５３】
また、あらかじめ本発明の免疫アジュバントと免疫担当細胞とを体外で混合してから患者の体内に投与し、体内における免疫反応を刺激することもできる。その免疫担当細胞としては、樹状細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、及び／又は造血幹細胞などを好ましく用いることができるが、これらに限定されるものではない。【００５４】
別の観点からは、本発明の免疫アジュバント及び抗原を有効成分として含むワクチンが本発明により提供される。このワクチンを投与するに際しては、当業者に周知の方法を用いればよく、免疫担当細胞を同時に混合してもよい。抗原として、例えばウイルスやウイルス成分等の感染症を引き起こした感染源由来の物質を使用することにより、未感染患者に対する感染予防のみならず、該感染症に罹患した患者の治療を行うこともできる。また、患者から分離した腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選ばれる１種又は２種以上の生体試料及び上記免疫アジュバントを含むワクチンを該腫瘍が由来する患者に投与することにより腫瘍を治療することもできる。【００５５】
さらに、抗原が例えば異種動物タンパクの場合、上記の免疫アジュバントとともにヒト以外の動物に投与することによって該抗原に対する抗体を宿主動物に効率よく産生させることができる。この方法により抗体産生動物を容易に作出することができ、該抗体産生動物に由来する抗体産生細胞や抗体遺伝子を容易に入手することもできる。抗原は宿主に対して抗原性を持つものであればいかなる物質であってもよく、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。【００５７】
例１：１種類の免疫刺激物質を２種類の免疫刺激物質担体に担持させた免疫アジュバントの抗原提示細胞刺激効果
THP-1細胞株をPMAで分化させ抗原提示細胞とし、PPDを２種類の免疫刺激物質担体に担持させ、培養条件下で抗原提示細胞に添加したときのGM-CSFの産生量を測定した。
Ａ．材料及び方法
１．リン酸カルシウム（以下、CaPと略す）微粒子核液の調製
炭酸カルシウムCaCO3（カルシード株式会社製、純度99.99％）を2 mol相当量を計り取り高純度アルミナこう鉢に入れ、箱形炉で1000℃、３時間焼成し、脱炭酸を行い高純度の酸化カルシウムCaOを得、これをビーカーに入れた。空気中の水分とCaOが反応して二酸化炭素とさらに反応することを極力抑えるためにビーカー上部をラップでふさぎ、反応槽である内容量10Lのポリエチレン容器中に置いた。容器中に窒素ガスを充満させ、その後ビーカーのラップを取り去り、ビーカー中に超純水を滴下した。この際に発熱から保護するためポリエチレン容器にも超純水を満たした。反応熱が収まったところでビーカー中の反応物をすべて超純水で洗い流しポリエチレン容器中に移した。ここで用いた超純水の総量はCaO量から計算される濃度が0.5 mol/Lとなるように合わせた。この段階で水酸化カルシウムCa(OH)2懸濁液を得た。この懸濁液を攪拌機（EYELA社製、MAZELA Z-1000）で約500 rpmで撹拌しながら、その中に0.6 mol/Lに調製したオルトリン酸H2PO4（国産化学株式会社製、濃度85％）２Ｌを、25 mL/minを越えない速度で滴下した。滴下終了後24時間そのまま撹拌し、CaP核液とした。【００５８】
２．CaP微粒子液、CaP-PPD微粒子液の調製
2.1リン酸カルシウム過飽和溶液とCaP微粒子液の調製
リンゲル液（扶桑薬品工業株式会社製）を8.28 mL、クリニザルツＢ液（小林製薬工業株式会社製）を1.24 mL、バイフィル専用炭酸水素ナトリウム補充液（清水製薬製）を0.48 mLの割合で混合し、10 mLにした。このリン酸カルシウム過飽和溶液9mLにエタノールを1 mL 添加し、混合液 10 mL当たり、CaP微粒子核液を一滴加え、一夜放置した。懸濁液を遠心し、沈殿を得、それを注射用生理食塩水で十分洗浄し、1mLの注射用生理食塩水に懸濁した。これをCaP微粒子液とした。【００５９】
2.2  CaP-PPD微粒子液の調製
リンゲル液を8.28 mL、クリニザルツＢ液を1.24 mL、バイフィル専用炭酸水素ナトリウム補充液を0.48 mLの割合で混合し、10 mLにした。このリン酸カルシウム過飽和溶液9 mLにツベルクリン標準品(日本BCG製造株式会社、一般診断用精製ツベルクリン（PPD）)を0.5μgないし10μgを溶解した。この溶液9mLにエタノールを1 mL添加し、混合液 10 mL当たり、CaP微粒子核液を一滴加え、一夜放置した。懸濁液を遠心し、沈殿を得、それを注射用生理食塩水で十分洗浄し、1mLの注射用生理食塩水に懸濁した。ここで得られたCaP-PPD微粒子懸濁液は、調製に用いたPPD量に応じてCaP-PPD(0.5 μg/mL)ないしCaP-PPD(10 μg/mL)のように表記した。また、これらを培養液（10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地）に添加したとき最終濃度がこの1/5であるときは、CaP-PPD(0.1 μg/mL)ないしCaP-PPD(2.0 μg/mL)のように表記した。【００６０】
2.3  PPD液の調製
ツベルクリン標準品(日本ビーシージー製造株式会社製、一般診断用精製ツベルクリン（PPD）) 0.25μgを0.5 mLの培養液に溶解し、PPD液とした。
2.4   PPD担持コアセルベーション沈殿微粒子（以下、TuMPと略す）液の調製
１）25％ ヒト血清アルブミン溶液（HSA, Baxter Albumac、Baxter社製）を滅菌水で2.5％になるように希釈し、4N HCl でpH 2.5 に合わせた。
２）予めこの2.5％ ヒト血清アルブミン溶液とヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注1000、1000 単位/mL、約7.69mg/mL以下、アベンティスファーマ株式会社）を様々な割合で混合し、ヘパリン溶液の至適混合比を決定した。至適混合比は、当初適当な混合比でマイクロパーティクルを作成し、2,500 rpm (1300 g) にて15分遠心し、その上清のタンパク質含量をプロテインアッセイキット１（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ、東京）にて定量し、混合したタンパク質の99.9％以上がマイクロパーティクルに取り込まれる条件とした。
３）PPDを注射用ヘパリン溶液に懸濁し、ボルテックスミキサーで混ぜながら、あらかじめ決めておいた割合で2.5％ヒト血清アルブミン溶液を滴下した。
４）4,300 rpm (1300 g)で 15分遠心し、蒸留水で２回洗い、蒸留水に再懸濁した。
５）1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド溶液 （EDC、SIGMA社製、水に溶解し20 mg/mLとしたもの）を終濃度 0.8〜1.5 mg/mL になるようにボルテックスミキサーで混ぜながら加え、その後、室温で15分間静置した。
６）0.1M Glycine水溶液を等量添加し、室温で15分間静置した。
７）4,300 rpm (1300 g)で15分遠心し、蒸留水で３回洗い、PPD量で0.5μg/mLの濃度となるように生理食塩水に再懸濁した。
これをTuMP液とした。【００６１】
2.5  LPS液の調製
リポポリサッカライド（以下、LPSという）（シグマアルドリッチジャパン株式会社、東京）をカルシウム・マグネシウム不含ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（以下、PBS(-)という）（SIGMA社製）にて溶解し、1 mg/mLとした。
2.6  THP-1細胞株の分化誘導培養とGM-CSF産生試験
ヒトマクロファージ様細胞株THP-1を遠心回収し、PBS(-)で２回洗い、培養液（10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地）にて細胞数を400万個/mLに調整し、これにPMA溶液 (SIGMA社製PMAをDMSOに1.62 mMとなるように溶解したもの)を終濃度1.6 μMになるように添加し、24穴プレートに1穴あたり0.5 mL播種して４日間培養した。培養後、PBSで２回洗い、新しい培養液に交換し、さらに一夜培養した。その後、各種刺激用培養液0.5 mLに交換した。この0.5 mLの調製のとき、CaP微粒子液、CaP-PPD微粒子液は1/5容量を添加した。また、PPDは培養液に溶解して0.5μg/mLとしたものの1/5容量を添加した。TuMP 液(2.5 μg/mLのもの) は1/25容量を添加した。LPS液は終濃度が表１記載の濃度となるように培養液で希釈し添加した。それぞれの終濃度は表１に記載した。
2.6  GM-CSFの測定試料
各種刺激用培養液0.5 mLに交換後、24時間培養し、その培養上清を回収し、GM-CSFの測定用サンプルとした。【００６２】
３．GM-CSFの定量
ヒトGM-CSF定量用キット（Human GM-CSF ELISA System Biotrak、AmershamLIFE SCIENCE社製）を使用し、キットの指示書に従って使用した。GM-CSFの定量はduplicateで行った。マイクロプレートリーダー（BiotrakII、Amersham Biosciences社製）にて30分以内の450 nmの吸光度を測定、検量線よりGM-CSFの値を算出した。【００６３】
Ｂ．結果
表１に結果を示す。表中の略号は、CaP、リン酸カルシウム微粒子；PPD、精製ツベルクリン（終濃度はかっこ内に記載）；TuMP、PPD担持コアセルベーション沈殿微粒子（担持されたPPDの終濃度はかっこ内に記載）；CaP-PPD、PPD担持リン酸カルシウム微粒子（担持されたPPDの終濃度はかっこ内に記載）；LPS、リポポリサッカライド（終濃度はかっこ内に記載）である。本試験系で産生されたGM-CSFの量は、添加したLPS濃度に対して定量的な用量反応性を示した。従って、本試験系の定量性は優れたものである。分化し抗原提示細胞となったTHP-1細胞は、PPD、TuMP、及び両者で刺激した場合でも、わずかしかGM-CSFを産生しなかった。これに対して、CaP-PPDは0.1μg/mLの濃度では未刺激の場合の3倍、2.0μg/mLの濃度では未刺激の場合の13倍のGM-CSFを産生させた。さらにCaP-PPDにPPD、TuMPを追加すると、CaP-PPD、PPD、TuMPをそれぞれ単独に添加した場合の産生GM-CSF濃度を単純に加算した場合よりも多くのGM-CSFを産生させた。このような相加的効果を越える効果はCaP-PPDの濃度が0.1、0.4、2.0μg/mLのいずれの場合にも認められ、CaP-PPD濃度が高い程大きく発現し、相乗的効果となっていることが確認された。【００６４】
【表１】
2007077629.tif 000002
【００６５】
例２：２種類の免疫刺激物質をそれぞれ別の免疫刺激物質担体に担持させた免疫アジュバントの抗原提示細胞刺激効果
Ａ．材料及び方法
試薬の調製、THP-1細胞株の分化誘導培養とGM-CSF産生試験、GM-CSFの測定試料、及びGM-CSFの定量は例１に従った。その他の試薬調製は以下のとおりである。
１．BCG菌抽出物担持リン酸カルシウム微粒子（以下、CaP-Bxと略す）液の調製
１）乾燥BCGワクチンアンプル1本（日本ビーシージー製造株式会社、12 mg入り）を110℃で5分間、オートクレーブにかけ、エタノール1 mlを加え、６時間以上攪拌した後、その懸濁液を採取して別の乾燥BCG製剤1本に加え、再び十分に攪拌し、その後、エッペンドルフ型微量高速遠心器にて12,000 rpmで5分間遠心し、この上清を回収し、BCG菌体由来エタノール可溶性成分溶液（以下BCG抽出液という）とした。
２）リンゲル液を8.28 mL、クリニザルツＢ液を1.24 mL、バイフィル専用炭酸水素ナトリウム補充液を0.48 mLの割合で混合し、10 mLにした。このリン酸カルシウム過飽和溶液9mLにBCG抽出液を1 mL 添加し、混合液 10 mL当たり、CaP微粒子核液を一滴加え、一夜放置した。懸濁液を遠心し、沈殿を得、それを注射用生理食塩水で十分洗浄し、1mLの注射用生理食塩水に懸濁した。これをCaP-Bx液とした。GM-CSF産生試験においては、1/5容量を刺激用培養液に添加した。【００６６】
Ｂ．結果
図１に結果を示す。No. 10、11、及び12の棒グラフ上の縦線は標準偏差を示す。図中の略号は、CaP、リン酸カルシウム微粒子；PPD、精製ツベルクリン（終濃度は0.1 μg/mL）；TuMP、PPD担持コアセルベーション沈殿微粒子（担持されたPPDの終濃度は0.1 μg/mL）；CaP-Bx、BCG菌抽出物担持リン酸カルシウム微粒子（BCG菌抽出物の作製法及び終濃度は上記Ａ１.１）を参照のこと）；LPS、リポポリサッカライド（終濃度はかっこ内に記載）である。図中の試料中の免疫刺激物質を以下の表２に示した。【００６７】
【表２】
2007077629.tif 000003
【００６８】
担持担体であるCaP微粒子には抗原提示細胞の刺激作用は認められなかった。TuMP、PPDは、例１の場合と同様に、極めて弱い刺激作用しかなく、CaP、TuMP、PPDを混合した場合でもその刺激作用は弱く、最大でも産生GM-CSF量は12.4 ng/mL（No.5）であった。CaP-Bxでは128.7 ng/mL（No.9）となり、これにPPDを追加してもほとんど変化はないが、TuMPを追加した場合、明瞭な相乗的効果が観察された（No.10及びNo.12）。【００６９】
例３：２種類の免疫刺激物質を１種類の免疫刺激物質担体に担持させ、別の免疫刺激物質担体に１種類の免疫刺激物質を担持させた免疫アジュバントの抗原提示細胞刺激効果
Ａ．材料及び方法
試薬の調製、THP-1細胞株の分化誘導培養とGM-CSF産生試験、GM-CSFの測定試料、及びGM-CSFの定量は例１に従った。その他の試薬調製は以下のとおりである。
１．PPD-BCG菌抽出物担持リン酸カルシウム微粒子（以下、「CaP-PPD-Bx」と略す）液の調製
１）リンゲル液を8.28 mL、クリニザルツＢ液を1.24 mL、バイフィル専用炭酸水素ナトリウム補充液を0.48 mLの割合で混合し、10 mLにした。このリン酸カルシウム過飽和溶液9mlに5μgのPPDを溶解した。この溶液9 mLに、BCG抽出液を1 mL 添加し、混合液 10 mL当たり、CaP微粒子核液を一滴加え、一夜放置した。懸濁液を遠心し、沈殿を得、それを注射用生理食塩水で十分洗浄し、1mLの注射用生理食塩水に懸濁した。これをCaP-PPD-Bx液とした。GM-CSF産生試験においては、1/5容量を刺激用培養液に添加した。【００７０】
Ｂ．結果
表３に結果を示す。表中の略号は、CaP、リン酸カルシウム微粒子；PPD、精製ツベルクリン（終濃度は0.1 μg/mL）；TuMP、PPD担持コアセルベーション沈殿微粒子（担持されたPPDの終濃度は0.1 μg/mL）；CaP-PPD、PPD担持リン酸カルシウム微粒子（担持されたPPDの終濃度は1.0 μg/mL）；CaP-PPD-Bx、PPDとBCG菌抽出物を同時に担持したリン酸カルシウム微粒子（作製法及び終濃度は上記Ａ１．１）を参照のこと。担持されたPPDの終濃度は1.0 μg/mL）；LPS、リポポリサッカライド（終濃度はかっこ内に記載）である。表３のうち、No.8は、例１の結果の再現性を確認したものであり、CaP-PPDにPPD、TuMPを追加すると、CaP-PPD、PPD、TuMPをそれぞれ単独に添加した場合の産生GM-CSF濃度を単純に加算した場合よりも多くのGM-CSFを産生していたことから、再現性は良好であると判断された。この試料からPPD液を除いたNo.7でも同様に相乗的効果が認められた。しかも、CaP-PPD-BxにTuMPを添加した場合も同様に、極めて強い相乗的効果が認められた。【００７１】
【表３】
2007077629.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の免疫アジュバントを用いると、強力な免疫刺激作用があることが知られているLPSを用いて抗原提示細胞を刺激した場合と同程度又はそれを越える大量のGM-CSFを抗原提示細胞から放出させることができる。従って、GM-CSFがオートクライン細胞成長因子として作用している抗原提示細胞の強力な活性化とその状態の維持が可能である。従って、本発明の免疫アジュバントを抗原とともにヒトを含む哺乳類動物の生体内に投与することにより、活性化抗原提示細胞に依存した該抗原に対する液性免疫反応及び／又は細胞性免疫反応を誘導することができ、感染症や腫瘍に対して極めて有効なワクチン療法を行うことが可能になる。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月3日(2007.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の異なる微粒子状免疫刺激物質担体にそれぞれ担持された１種又は２種以上の免疫刺激物質を含む免疫アジュバントであって、該微粒子状免疫刺激物質担体として少なくとも（ａ）細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウム及び（ｂ）可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物の組み合わせを含み、上記（ａ）の微粒子状リン酸カルシウムがＣａ／Ｐモル比が１．３以上であって炭酸基ＣＯ３２−を１〜１５重量％含有し、その結晶性がＣｕＫα線によるＸＲＤスペクトルにおいて２θ値で２６°、３２°、及び３４°に中心がある広いピークが出現し、３３°に３００のミラー指数の肩が出現することで規定される結晶性以上であり、かつ２６°、２８．１°、２９°、３２°、３３°、及び３４°に中心があるピーク又は肩が出現するのに加えて２１１ミラー指数と１１２ミラー指数のピークが分離することで規定される結晶性以下の結晶性である微粒子状リン酸カルシウムである免疫アジュバント。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
上記（ａ）の微粒子状リン酸カルシウムが最大径１μｍ以下のリン酸カルシウムである請求項１に記載の免疫アジュバント。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
上記（ｂ）の可溶性蛋白がアルブミンである請求項１又は３に記載の免疫アジュバント。
【請求項６】
上記（ｂ）のムコ多糖がヘパリンである請求項１、３、又は５のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項７】
上記（ｂ）の不溶性物質の可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物が蛋白分子間架橋剤により架橋された沈殿物である請求項１、３、５、又は６のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項８】
免疫刺激物質がサイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンからなる群から選ばれる１種又は２種以上の誘導剤である請求項１、３、又は５ないし７のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項９】
免疫刺激物質がツベルクリン、精製ツベルクリン、微生物に由来する可溶性成分、トレハロース６，６’−ジミコレート、リポポリサッカライド、リピッドＡ、オリゴヌクレオチド、β−グルカン、キーホールリンペットヘモシアニン、ムラミルジペプチド、ベスタチン、レバミゾール、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質である請求項１、３、又は５ないし８のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項１０】
微生物に由来する可溶性成分が微生物のアルコール抽出物、アセトン抽出物、ピリジン抽出物、及び熱水抽出物からなる群から選ばれる１種又は２種以上の抽出物である請求項９に記載の免疫アジュバント。
【請求項１１】
微生物が細菌である請求項９又は１０に記載の免疫アジュバント。
【請求項１２】
抗原とともにヒトを含む哺乳類動物の体内に投与して該抗原に対する全身性免疫反応を誘導するための請求項１、３、又は５ないし１１のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項１３】
該抗原が、真菌、放線菌、細菌、ウイルス、ファージ、リケッチア、原虫、真菌成分、放線菌成分、細菌成分、ウイルス成分、ファージ成分、リケッチア成分、原虫成分、腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質である請求項１２に記載の免疫アジュバント。
【請求項１４】
ヒトを含む哺乳類動物の腫瘍組織を物理的手段で変性させた後に該腫瘍組織内に投与することにより抗腫瘍免疫反応を誘導するための請求項１、３、又は５ないし１１のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項１５】
物理的手段がマイクロウエーブ照射、ラジオフリークエンシー凝固法、凍結凝固法、電気メス加熱、熱水注入、アルコール注入、塞栓法、放射線照射、レーザー光照射、及び超音波破壊からなる群から選ばれる１種又は２種以上の手段である請求項１４に記載の免疫アジュバント。
【請求項１６】
体外で免疫担当細胞と混合した後にヒトを含む哺乳類動物に投与することにより該動物の生体内において全身性免疫反応を誘導するための請求項１、３、又は５ないし１１のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項１７】
免疫担当細胞が樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及び造血幹細胞からなる群から選ばれる１種又は２種以上の細胞である請求項１６に記載の免疫アジュバント。
【請求項１８】
請求項１、３、又は５ないし１１のいずれか１項に記載の免疫アジュバントと抗原とを含むワクチン。
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月14日(2008.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の異なる微粒子状免疫刺激物質担体にそれぞれ担持された１種又は２種以上の免疫刺激物質を含む免疫アジュバントであって、免疫刺激物質がツベルクリン、精製ツベルクリン、微生物に由来する可溶性成分、トレハロース6,6'-ジミコレート、リポポリサッカライド、リピッドＡ、オリゴヌクレオチド、β-グルカン、キーホールリンペットヘモシアニン、ムラミルジペプチド、ベスタチン、レバミゾール、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子、及びホルモンからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質であり、該微粒子状免疫刺激物質担体として少なくとも(a)細胞による貪食可能なサイズの微粒子状リン酸カルシウム及び(b)アルブミンとヘパリンとのコアセルベーションによる沈殿物の組み合わせを含み、上記(a)の微粒子状リン酸カルシウムがＣａ／Ｐモル比が１．３以上であって炭酸基ＣＯ32-を１〜１５重量％含有し、その結晶性がＣｕＫα線によるＸＲＤスペクトルにおいて２θ値で２６°、３２°、及び３４°に中心がある広いピークが出現し、３３°に３００のミラー指数の肩が出現することで規定される結晶性以上であり、かつ２６°、２８．１°、２９°、３２°、３３°、及び３４°に中心があるピーク又は肩が出現するのに加えて２１１ミラー指数と１１２ミラー指数のピークが分離することで規定される結晶性以下の結晶性である微粒子状リン酸カルシウムである免疫アジュバント。
【請求項２】
上記(a)の微粒子状リン酸カルシウムが最大径1μm以下のリン酸カルシウムである請求項１に記載の免疫アジュバント。
【請求項３】
上記(b)の不溶性物質の可溶性蛋白とムコ多糖とのコアセルベーションによる沈殿物が蛋白分子間架橋剤により架橋された沈殿物である請求項１又は２のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項４】
微生物に由来する可溶性成分が微生物のアルコール抽出物、アセトン抽出物、ピリジン抽出物、及び熱水抽出物からなる群から選ばれる１種又は２種以上の抽出物である請求項３に記載の免疫アジュバント。
【請求項５】
微生物が細菌である請求項３又は４に記載の免疫アジュバント。
【請求項６】
抗原とともにヒトを含む哺乳類動物の体内に投与して該抗原に対する全身性免疫反応を誘導するための請求項１ないし４のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項７】
該抗原が、真菌、放線菌、細菌、ウイルス、ファージ、リケッチア、原虫、真菌成分、放線菌成分、細菌成分、ウイルス成分、ファージ成分、リケッチア成分、原虫成分、腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質である請求項６に記載の免疫アジュバント。
【請求項８】
ヒトを含む哺乳類動物の腫瘍組織を物理的手段で変性させた後に該腫瘍組織内に投与することにより抗腫瘍免疫反応を誘導するための請求項１ないし７のいずれか１項に記載の免疫アジュバントであって、物理的手段がマイクロウエーブ照射、ラジオフリークエンシー凝固法、凍結凝固法、電気メス加熱、熱水注入、アルコール注入、塞栓法、放射線照射、レーザー光照射、及び超音波破壊からなる群から選ばれる１種又は２種以上の手段である免疫アジュバント。
【請求項９】
体外で免疫担当細胞と混合した後にヒトを含む哺乳類動物に投与することにより該動物の生体内において全身性免疫反応を誘導するための請求項１ないし５のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
【請求項１０】
免疫担当細胞が樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及び造血幹細胞からなる群から選ばれる１種又は２種以上の細胞である請求項９に記載の免疫アジュバント。
【請求項１１】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の免疫アジュバントと抗原とを含むワクチン。
【国際調査報告】
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