(57)【要約】  作物を栽培することを計画された土壌やその水源について、その土壌や水源が作物の生育に悪影響を与える汚染源によって汚染されているかを簡便に判定する方法を提供する。  土壌汚染及び／または水質汚染の判定方法であって、１）検定植物を判定しようとする土壌に植えて／又は検定植物に判定しようとする水を与えて１〜１４日間栽培すること、２）栽培した検定植物の組織から核酸を回収すること、３）回収した核酸において、土壌及び／または水に含まれる汚染源と検定植物との接触によって発現が変動する検定植物由来の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法。  本発明の方法は、微生物等の汚染源を検体から単離する必要がない、単離した微生物等の感染性を別の方法で検証する必要がない、短時間に多数の検体について判定を行うことができる、一度の操作で感染性ないし有害性まで判定することができる、などの利点を有する方法である。  また判定は特異的な遺伝子の発明の有無によって行われるので、顕微鏡観察等の特別な熟練操作は特に必要とせず、また判定の信頼性が高い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌汚染及び／又は水質汚染の判定方法であって、１）検定植物を判定しようとする土壌に植えて／又は検定植物に判定しようとする水を与えて１〜１４日間栽培すること、２）栽培した検定植物の組織から核酸を回収すること、３）回収した核酸において、土壌及び／または水に含まれる汚染源と検定植物との接触によって発現が変動する検定植物由来の１以上の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法。
【請求項２】
検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ウリ科植物、マメ科植物、バラ科及びユリ科よりなる群から選ばれる一種以上である、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の判定方法。
【請求項４】
汚染源が植物病原性線虫、植物病原性微生物、植物病原性昆虫、植物病原性ウイルス、重金属、及び有機汚染源より選ばれる一種以上である、請求項１に記載の判別方法。
【請求項５】
遺伝子の発現の確認を、ＤＮＡアレイを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡアレイがナイロンメンブレンを用いたＤＮＡマクロアレイである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
検定植物から抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
土壌及び／又は水に含まれる植物栄養源の過不足の判定方法であって、１）検定植物を判定しようとする土壌に植えて／又は検定植物に判定しようとする水を与えて１〜１４日間栽培すること、２）栽培した検定植物の組織から核酸を回収すること、３）回収した核酸において、土壌及び／または水に含まれる植物栄養源の過不足によって発現が変動する検定植物由来の１以上の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法。
【請求項９】
検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ウリ科植物、マメ科植物、バラ科及びユリ科よりなる群から選ばれる一種以上である、請求項８に記載の判定方法。
【請求項１０】
核酸がＲＮＡである、請求項８に記載の判定方法。
【請求項１１】
植物栄養源は窒素、リン又はカリウムである、請求項８に記載の判別方法。
【請求項１２】
遺伝子の発現の確認を、ＤＮＡアレイを用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡアレイがナイロンメンブレンを用いたＤＮＡマクロアレイである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
検定植物から抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、作物を栽培することを計画された土壌やその水源について、その土壌や水源が作物の生育に悪影響を与える汚染源によって汚染されているかを簡便に判定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ある土壌または水源が作物の栽培に適しているか、あるいは作物を土壌に植えて、あるいは水源の水を利用して栽培を行うことが可能かどうかを調べるために、その土壌や水源が作物の生育に悪影響を与える微生物、ウイルス、線虫、重金属や有機物質などに汚染されているか否か、又はその土壌や水源が植物の生長にとって望ましい量の植物栄養源を含んでいるか否か、を確認することは、極めて重要な作業である。【０００３】
これまでは、作物の生育に悪影響を与える微生物、ウイルス、線虫、重金属や有機物質などの汚染源を直接検出する方法が主に使用されてきた。例えば、土壌に生育する線虫を直接的に顕微鏡等で観察したり（非特許文献１）、土壌や水源から微生物を単離し、適当な培地上で増殖させてその存在を確認したり（非特許文献２）、あるいは特定の生物が有するＤＮＡをＰＣＲ法などによって増幅させて確認したりして（非特許文献３）、汚染源の有無を判定する方法が知られている。また、土壌や水源中の重金属や有機物質などについては、ガス又は液体クロマトグラフ、マススペクトルなどの分析化学的手法を用いて検出することが行われている（非特許文献４）。【０００４】
しかしながら、線虫等の直接観察は卓越した技術者による経験的な判断を必要とし、多数の検体を迅速に検査するためには適さない方法である。また微生物の単離等は、検体から菌体を分離・培養して、さらに検定植物に感染させて病原性を確認するまでに例えば２ヶ月程度の長時間を要するなどの問題を抱えている。ＰＣＲを利用した方法は、時間的な問題を解消するけれども、非特異的産物（ノイズ）を提示することがしばしば認められている。また、ＰＣＲ法は単に汚染源の存在のみを結果として与えるだけで、その汚染源の現実的な毒性、感染性ないし有害性については全く情報を与えない方法である。そのため、ＰＣＲ法は、感染性の有無の決定に別の検定植物を用いた判定方法を必要とする。【０００５】
また、分析化学的手法は、重金属や有機汚染物質などの非生物的汚染源を種類ごとに正確に定量することを可能とするが、通常、測定対象に応じて適正な検体の前処理を行う必要がある。またこの方法は、測定設備を有する施設を要求するので、調べようとする土壌や水源をその場で検査することは極めて難しい方法である。さらにこの方法は、汚染源の存在を確認するのみであり、汚染源の毒性、感染性ないし有害性を提示する方法ではない。そのため、有害性等の判定のために、測定結果を既知の有害物質データベースと照らし合わせたり、検定植物などを用いて確認試験をしたりなどが必要となる。【０００６】
近年、汚染源によって発現が制御される特定のプロモーターにレポーター遺伝子を連結した遺伝子を有する形質転換植物を用意し、その種子を土壌に播いて形質転換植物を生育させた後に、レポーター遺伝子の発現の有無を確認して、土壌汚染源の検出を行う方法が報告されている（特許文献１）。【０００７】
しかしこの方法は、特定の形質転換植物を用意しなければならないこと、その様な形質転換体の種子を土壌環境に播く必要があること、感染した植物個体を種子から栽培して回収するのに長期間を要することなどから、土壌汚染の判別方法としては非実用的である。【０００８】
【非特許文献１】線虫学実験法  2004年、日本線虫学会
【非特許文献２】原秀紀、小野邦明  タバコ立ち枯れ病の発生生態に関する研究.  第一報病原細菌の検出・定量用培地.  岡山タバコ試報第42巻、第127−138頁
【非特許文献３】Clapp, JPら、MOLECULAR ECOLOGY、2000年、第9巻、第9号、第1223-1232頁
【非特許文献４】テクノ東京２１、2003年、9月号、第126巻、第2‐3頁、東京都産学労働局
【特許文献１】特表２００５−５３４２９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、土壌や水源の現場でも行うことができ、汚染源の存在の有無だけではなく、その汚染源の有害性ないし感染性も的確に判定することのできる、新たな汚染土壌や汚染水の判定方法を提供する。また、本発明は、土壌や水源に含まれる植物栄養源の状態を簡便に判定できる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、植物が汚染源と接触したときに汚染源毎に異なって定まる特定の遺伝子群の発現が植物組織において変動することに着目し、検定植物を汚染源に直接接触させることでこの遺伝子群発現の変動を生じさせ、これを確認することで、汚染源の有無を判定することができることを見出し、以下の各発明を完成した。【００１１】
（１）土壌汚染及び／または水質汚染の判定方法であって、１）検定植物を判定しようとする土壌に植えて／又は検定植物に判定しようとする水を与えて１〜１４日間栽培すること、２）栽培した検定植物の組織から核酸を回収すること、３）回収した核酸において、土壌及び／または水に含まれる汚染源と検定植物との接触によって発現が変動する検定植物由来の１以上の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法。【００１２】
（２）検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ウリ科植物、マメ科植物、バラ科、及びユリ科よりなる群から選ばれる一種以上である、（１）に記載の判定方法。【００１３】
（３）核酸がＲＮＡである、（１）に記載の判定方法。【００１４】
（４）汚染源が植物病原性線虫、植物病原性微生物、植物病原性昆虫、植物病原性ウイルス、重金属、及び有機汚染源より選ばれる一種以上である、（１）に記載の判別方法。【００１５】
（５）遺伝子の発現の確認を、ＤＮＡアレイを用いて行う、（１）に記載の方法。【００１６】
（６）ＤＮＡアレイがナイロンメンブレンを用いたマクロアレイである、（５）に記載の方法。【００１７】
（７）検定植物から抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用する、請求項１に記載の方法。【００１８】
（８）土壌及び／又は水に含まれる植物栄養源の過不足の判定方法であって、１）検定植物を判定しようとする土壌に植えて／又は検定植物に判定しようとする水を与えて１〜１４日間栽培すること、２）栽培した検定植物の組織から核酸を回収すること、３）回収した核酸において、土壌及び／または水に含まれる植物栄養源の過不足によって発現が変動する検定植物由来の１以上の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法。【００１９】
（９）検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ウリ科植物、マメ科植物、バラ科及びユリ科よりなる群から選ばれる一種以上である、（８）に記載の判定方法。【００２０】
（１０）核酸がＲＮＡである、（８）に記載の判定方法。【００２１】
（１１）植物栄養源は窒素、リン又はカリウムである、（８）に記載の判別方法。【００２２】
（１２）遺伝子の発現の確認を、ＤＮＡアレイを用いて行う、（８）に記載の方法。【００２３】
（１３）ＤＮＡアレイがナイロンメンブレンを用いたＤＮＡマクロアレイである、（１２）に記載の方法。【００２４】
（１４）検定植物から抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用する、（８）に記載の方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の方法は、微生物等の汚染源を検体から単離する必要がない、単離した微生物等の感染性を別の方法で検証する必要がない、短時間に多数の検体について判定を行うことができる、一度の操作で感染性ないし有害性まで判定することができる、などの利点を有する方法である。
また、判定は特異的な遺伝子の発現の有無によって行われるので、顕微鏡観察等の特別な熟練操作は特に必要とせず、判定の信頼性は高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１で使用したＤＮＡマクロアレイの模式図である。図中の１〜１６は１：SubC29 P-rich protein、２：hypothetical protein Zinnia elegans TED4、３：Wound-induced protein Sn-1、４： PR protein STH-2、５：homeotic protein VAHOX、６：gibberellin-regulated protein RSI-1、７：protease inhibitor multicystatin、８：putative receptor like kinase、９：Protease Inhibitor type II (Short)、１０：Protease Inhibitor type II (long)、１１：dof zinc finger、１２：BURP-domain containing protein、１３：pectinesterase にそれぞれ対応するプローブＤＮＡのスポットであり、１４〜１６はそれぞれ１４：elongation factor-1 α、１５：β-tubulin、１６：actinである。
【図２−ａ】健全トマト（左端）と感染トマト（中：３日目、右：７日目）から回収したＲＮＡについてＤＮＡマクロアレイで発現を解析したときのハイブリダイズしたスポットを示す写真である。
【図２−ｂ】感染トマトと健全トマトについて、ＤＮＡマクロアレイ上のスポットの強度を表したグラフである。
【図３−ａ】実施例１のトマトの根についてＤＮＡマクロアレイで解析したときのスポット（左：感染トマト、右：健全トマト）を示す写真である。
【図３−ｂ】実施例１のトマトの葉についてＤＮＡマクロアレイで解析したときのスポット（左：感染トマト、右：健全トマト）を示す写真である。
【図３−ｃ】図３−ａ、ｂの各マクロアレイ上のスポットの強度を表した図である。
【図４】実施例１のトマトの葉についてＢＴ/ＢＣＩＰ基質を用いた化学発色によるＤＮＡマクロアレイで解析したときのスポットを表す図である。
【図５】CDP-Star基質による化学発光とNBT-BCIP基質による化学発色で得られたシグナルの相関を示すグラフである。
【図６】フザリウムに感染したトマト（左端）、健全トマト（中）及び線虫感染トマト（右）から回収したＲＮＡについてＤＮＡマクロアレイで発現を解析したときのハイブリダイズしたスポットを示す写真である。□で囲ったスポットはWater Channel遺伝子のスポットである。
【図７】リン含有水耕培養液（＋Ｐ）、リン非含有水耕培養液（−Ｐ）で栽培したイネの根と地上部（葉）から回収したＲＮＡについてＤＮＡマクロアレイで発現を解析したときのハイブリダイズしたスポットを示す写真である。□で囲ったスポットは、上がOsIPS1の、下がOsPI1の各スポットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明で判定する汚染は、主に農業用作物の生育に支障を来すおそれのある汚染を対象とするが、農業用作物の生育に支障を来すものでない汚染であっても、検定植物において一定の遺伝子の発現を誘導するような汚染であれば、本発明における判定対象とすることができる。【００２８】
例えば、本発明の方法は、ダイズシストセンチュウ、ジャガイモシストセンチュウ、ジャガイモネコブセンチュウ等の植物病原性線虫、Fusarium，Rhizoctonia，Pythium，Pseudomonas，Xanthomonas等の植物病原微生物、テンサイそう根病、ムギ縞萎縮病等の土壌伝搬性ウイルス、ネキリムシ等の土壌性昆虫、カドミウム、ヒ素、鉛、水銀等の重金属、ダイオキシン、PCB、化学肥料、殺虫剤、殺菌剤、除草剤などの有機汚染源による土壌汚染及び／又は水質汚染を判定することができる。また本発明の方法は、植物の生育にとって重要な栄養源、特に窒素、リン、カリウムの含有量が、その植物を植えようとする土壌や水耕栽培用の水において欠乏しているのかあるいは過剰なのかを判定することができる。【００２９】
本発明の方法は、検定植物を判定しようとする土壌に植えて／又は検定植物に判定しようとする水を与えて１〜１４日間栽培することを、工程の一つとする。【００３０】
検定植物としては、トマト、ジャガイモなどのナス科植物、シロイヌナズナなどのアブラナ科植物、ムギ、イネなどのイネ科植物、メロンなどのウリ科植物、ダイズなどのマメ科植物、イチゴなどのバラ科、又はユリなどのユリ科などを利用することができる。好ましくは、汚染源のない環境下で根、茎ならびに葉を有する植物個体にまで生育させたこれらの植物を利用する。【００３１】
土壌汚染又は土壌中の植物栄養源の状態を判定する場合には、判定しようとする土壌に検定植物を直接植えてもよく、また適当なポットに判定しようとする土壌を回収し、これに検定植物を植えてもよい。ポットで検定植物を培養する際には、適当なプラスチック製の、例えばポリエチレン製のあるいはポリプロピレン製のバッグに入れた土壌をポッドに置き、このバッグに入れた土壌に検定植物を植えることが好ましい。ポッドに直接置いた土壌で植物を栽培すると、ポッドから植物を回収する際に根切れを起こすことがしばしばあり、植物に不要なストレスと当該ストレスに反応する遺伝子発現の変動を与えるおそれがあるが、バッグに入れた土壌で植物を栽培することによって、植物を回収する際の根切れによる遺伝子発現の変動を防止することができる。【００３２】
水質汚染を判定する場合には、汚染源のない土壌に検定植物を植え、ここに判定しようとする水を加えて栽培すればよい。また判定しようとする水を用いた水耕栽培を行ってもよい。水に含まれる植物栄養源の状態を判定する場合は、その水を用いた水耕栽培を行うことが好ましい。なお、判定しようとする土壌や水源の汚染源に影響を与えない範囲であれば、検定植物の栽培に好適な肥料や添加物を適宜判定しようとする土壌や水に加えてもよい。【００３３】
検定植物の栽培は、１〜１４日間、好ましくは3〜１４日間継続して行う。栽培条件は、検定しようとする土壌や水源、それらの周囲環境、気候、検定植物等に応じて適宜定めればよく、その様な条件設定は当業者の通常の能力によって行うことができる。【００３４】
本発明の方法は、判定しようとする土壌及び／又は検定しようとする水を用いて栽培した検定植物の組織から核酸を回収することを、工程の一つとする。【００３５】
回収される組織は、検定植物のいずれの組織でもよいが、好ましくは根、葉、又は茎である。本発明の方法において、判定しようとする土壌ないし水と直接接触する組織は主に根であるので、汚染源の影響を受けて遺伝子発現の変動が観察される組織も根であると想定されたが、意外にも、僅か３〜７日の栽培であっても、その様な遺伝子発現の変動は葉や茎でも観察されることが確認された。したがって、本発明の方法は、栽培後の検定植物の葉を摘み取って回収するだけで土壌汚染の判定を行うことができるという、優れた作業性を有する発明であるということができる。  回収する核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、遺伝子発現の変動を観察するという目的からすれば、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡを含む全ＲＮＡを回収することが好ましい。ＤＮＡあるいはＲＮＡの植物組織からの回収は、当業者に公知の種々の方法（例えばMolecular cloning - A Laboratory Manual, 3rd ed., chapter7, protocols 1-2に記載の方法）を利用して行うことができる。【００３６】
本発明の方法は、土壌及び／または水に含まれる汚染源と検定植物との接触によって発現変動が生じる検定植物由来の遺伝子を検出することを、工程の一つとする。【００３７】
本発明者らは、ジャガイモシストセンチュウ（Potato Cyst Nematode）に感染したトマトにおいて特異的に発現変動が生じる遺伝子を網羅的に解析し、その結果、表１に示す特定の遺伝子の発現変動が生じることを確認した。【００３８】
【表１】
2007139100.tif 000002
【００３９】
従って、トマトを土壌等に植えて栽培した後に、トマトにおいて上記の遺伝子群の発現を検出することにより、トマトがジャガイモシストセンチュウに感染したことを確認することができ、その結果、土壌は感染性のジャガイモシストセンチュウによって汚染されていたと判定することができる。この様に、本発明の方法の好適な一態様は、土壌等に検定植物であるトマトを植えて栽培した後、検定植物において上記の遺伝子の発現変動が生じているかどうかを確認することで、土壌等がジャガイモシストセンチュウに汚染されているかどうかの判定を行う方法である。【００４０】
上記の例はトマトとジャガイモシストセンチュウとの例であるが、その他にも、線虫、重金属、病原菌などの、ある特定の汚染源とこれに接触ないし感染した植物において特異的に発現変動が生じる遺伝子については、既に多数の例が報告されている。以下はその非限定的な例示である。【００４１】
（１）線虫について
・Jammes, F., Lecomte, P., De Almedia Engler, J., Bitton, F., Martin-Magnitte, M-L., Renou, J.P., Abad, P. and Favery, B.,  Genome-wide expression profiling of the host response to root-knot nematode infection in Arabidopsis.,  Plant J. 44, 447-458, 2005.
・Khan, R., Alkharouf, N., Beard, H., MacDonald, M., Chouikha, I., Meyer, S., Greffenstette, J., Knap, H. and, Matthews, B.,  Microarray analysis of gene expression in soybean roots susceptible to the soybean cyst nematode two days post invasion., J. Nematol., 36, 241-248, 2004.
・Puthoff, D., Nettleton, D., Rodermel, S.R. and Baum, T.J.,  Arabidopsis gene expression changes during cyst nematode parasitism revealed by statistical analyses of microarray expression profiles.,  Plant J., 33, 911-921, 2003.
・Klink, V.P., Alkharouf, N., MacDonald, M. and Mattews, B.,  Laser capture microdissection (LCM) and expression analyses of Glycine max (soybean) syncytium cinining root regions formed by the plant pathgen Heterodera glycines (soybean cyst nematode)., Plant Mol. Biol.,  59, 965-979, 2005.【００４２】
（２）重金属について
・Krizek, B.A., Prost, V., Joshi, R.M., Stoming, T. and Glenn, T.C.,  Developing transgenic arabidopsis plants to be metal-specific bioindicators. Environmental Toxicology and Chemistry, 22, 175-181, 2003. 
・Weber, M., Harada, E., Vess, C., Roepenack-Lahaye, E. v. and Clemens, S., Comparative microarray analysis of Arabidopsis thaliana and Arabidopsis halleri roots identifies nicotianamine synthase, a ZIP transporter and other genes as potential metal hyperaccumulation factors., The Plant Journal, 37, 269-281, 2004【００４３】
（３）病原性微生物について
・Rep, M., Dekker, H.L., Vossen, J.H., de Boer, A.D., Houterman, P.M., Speijer, D., Back, J.W., de Koster, C.G., Cornelissen, B.J.C.,  Mass spectrometric identification of isoforms of PR proteins in xylem sap of fungus-infected tomato. Plant Physiology, 130, 904-917, 2002
・Iqbal, M.J., Yaegashi, S., Ahsan, R., Shopinski, K.L. and Lightfoot, D.A., Root response to Fusarium solani f. sp. glycines: temporal accumulation of transcripts in partially resistant and susceptible soybean., Theor. Appl. Genet., 110, 1429-1438, 2005【００４４】
本発明においては、上記に例示した汚染源とそれにより発現変動が生じる１以上の遺伝子との組み合わせのいずれも利用することができる。また上記の例示に制限されず、その他の汚染源とそれにより発現変動が生じる遺伝子の公知の組み合わせも利用可能である。【００４５】
また、後述する実施例においても実証されているように、調べようとする汚染源を用いて適当な検定植物を人為的に感染させ、その結果発現変動が生じる遺伝子をマイクロアレイやディファレンシャルディスプレイ法などの公知の手法を用いて予め特定することによって、植物において発現変動が生じる遺伝子が未知である汚染源についても、本発明を適用することができる。【００４６】
また、土壌及び／又は水に含まれる植物栄養源の過不足を判定する方法は、土壌及び／または水に含まれる植物栄養源の過不足によって発現が変動する検定植物由来の１以上の遺伝子の発現を確認することを含む。例えば、リン欠乏状態に置かれたイネ（Oryza sativa）では、遺伝子OsPI1 の発現が亢進することが知られている（Wasaki ら、New Phytologist、2003年、第158巻、第239-248頁）。本発明者らはさらに、リン欠乏状態に置かれたイネ（Oryza sativa）において、下記に示される遺伝子の発現の亢進をマイクロアレイを用いて確認した。【００４７】
【表２】
2007139100.tif 000003
【００４８】
上記の遺伝子のうち、OsIPS1遺伝子、OsSAP1遺伝子及び／又はOsGMR1遺伝子は、リンの欠乏状態の判定に利用可能である。【００４９】
また、種々の植物栄養素の欠乏培地あるいは植物栄養源を過剰に含む培地で検定植物を栽培して、その結果発現変動が生じる遺伝子をマイクロアレイやディファレンシャルディスプレイ法などの公知の手法を用いて予め特定することによって、検出すべき遺伝子を特定しておくことが好ましい。【００５０】
上記のように特定された遺伝子の検出は、ノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲなどの、遺伝子発現を検出することのできる公知の方法を利用して行うことが可能である。特に本発明では、特定された遺伝子の全部あるいは一部の塩基配列からなるプロープを担持させたＤＮＡアレイの利用が好ましい。【００５１】
ＤＮＡアレイは、自体公知の検出手段であり、数千〜数万種類のＤＮＡを担持したチップないし平板の形態で利用され、また商業的に生産されている（例えばGenomics, gene expression and DNA arrays，Nature, ２０００年、第４０５巻、第８２７−８３６頁参照）。  本発明では、かかるＤＮＡアレイを利用することができる。特に、本発明では検出すべきＤＮＡの種類と数が予め特定されていることから、その様な遺伝子のみを特別に担持させたＤＮＡアレイを適時使用することにより、簡便かつ正確な判定を行うことができる。【００５２】
本発明で使用するＤＮＡアレイは、前項で述べた特定の遺伝子の塩基配列の全部又は一部の塩基配列からなるプローブＤＮＡをＰＣＲ法あるいはＤＮＡシンセサイザー等を用いて合成し、これをスライドガラスやメンブレン等に担持させることで、簡便に調製することができる。あるいは、Affymetrix社のGeneChipの様な平板上で上記のプローブＤＮＡを合成することで得られるＤＮＡアレイも、本発明で利用することができる。    また、プローブＤＮＡの合成の際に、色素、蛍光物質、放射性同位体元素その他の適当な標識化合物を利用して、プローブＤＮＡをラベル化することができる。プローブＤＮＡのラベル化に代えてあるいはプローブＤＮＡのラベル化と同時に、サンプル中の核酸をラベル化してＤＮＡアレイ上のプローブＤＮＡとハイブリダイズさせて検出を行ってもよい。ＤＮＡアレイ上でハイブリダイスした核酸の検出は、用いた標識の種類に応じて公知の方法を採用して行い、さらに必要に応じて定量化すればよい。【００５３】
ＤＮＡの合成法、標識化合物の種類、該標識化合物を用いたＤＮＡの標識化の手法、さらにはスライドガラスやメンブレン上にＤＮＡを担持させる方法などは、いずれも当業者に公知の方法を利用して行うことができる。【００５４】
本発明で好適に利用されるＤＮＡアレイとしては、株式会社ラボ（http://www.labo.co.jp/）が製造するメンブレンを用いたマクロアレイを挙げることができる。このマクロアレイは、ナイロン製メンブレン上に、複数種類（１０〜２００種類程度）のｃＤＮＡのＰＣＲ産物を等間隔で担持させたＤＮＡアレイである。スポッターを用いた作製法（特許第３３０５２９５号）によりプローブＤＮＡ溶液が定量的にスポットされており、アレイ間の高い均一性が特長である。このＤＮＡアレイは、検体中のＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を、発色反応によって検出するので、パーソナルコンピュータなどに接続して使用するスキャナーを用いて、ＤＮＡアレイ上のハイブリダイゼーションの有無を確認することができる。通常のＤＮＡマイクロアレイでは、複雑な機構を有する検出機器の使用が必要となるが、上記のナイロンメンブレンを用いたマクロアレイはその様な複雑な検出機器を必要とせず、極めて簡便かつ安価に分析を行うことができる点で有利である。また、複雑な検出機器を必要としないことから、土壌や水源現場で分析を行うことも可能である。【００５５】
また、多数の汚染源について、それらの汚染源に応じて発現が変動する遺伝子群について詳細な発現解析を行い、さらに汚染の種類間でクロスして変動する遺伝子などについても把握した上で、かかる汚染源とそれに応じて発現が変動する遺伝子群に関するデータベースを構築することもできる。遺伝子群の発現パターンの変化は、上記に説明したマクロアレイによれば着色によって検出できるため、肉眼での簡易判定も可能であるが、適当なスキャナーを用いてこの着色で表されるパターンを読み取り、これを適当な解析プログラムによって前記データベースと照合した上で、土壌汚染の有無ならびに汚染源の特定を含めた総合判定を行うシステムを構築することもできる。このシステムは、判定の精度ならびに信憑性を著しく高め、誤診を最小限にする。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５６】
＜予備試験＞
汚染源としてジャガイモシストセンチュウ（Globodera rostchiensis、Potato Cyst Nematode、ＰＣＮ）を、検定植物としてトマト（強力米寿）をそれぞれ選択し、人工的に孵化させたＰＣＮに感染させたトマトをポジティブコントロール（感染トマト）として、ＰＣＮへの感染によって発現変動が生じる遺伝子を特定する予備実験を行った。【００５７】
ａ）感染トマトの作製
ＰＣＮを温室で栽培したジャガイモで増殖させ、シストから卵を分離した後、トマト根浸出液中でふ化させ、２期幼虫を獲得した。トマト（強力米寿）を２２℃、１６時間照明にてポットで栽培し、播種後３０日で上記のＰＣＮの２期幼虫をトマトの根元に１万頭程度接種して、感染トマトを作製した。また、水を接種したトマトをネガティブコントロールトマト（健全トマト）として準備した。
ＰＣＮないし水を接種後、３日目、７日目、１４日目に感染トマトと健全トマトのそれぞれの根を回収し、発現解析に用いた。【００５８】
ｂ）全ＲＮＡの回収
回収した根２ｇを乳鉢に入れ、液体窒素を加えて凍結させ乳棒で破砕した後、TRIZOL Reagent（Invitrogen）を用いて、そのプロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。【００５９】
ｃ）遺伝子解析
土壌診断の指標となり得る遺伝子を同定するために、トマトｃＤＮＡマイクロアレイＴＯＭ１（ＣＧＥＰ）とＳＡＧＥ（Serial Analysis of Gene Expression）による網羅的な遺伝子発現解析を行った。前者はボイストンプソン研究所から提供された、ＴＯＭ１マイクロアレイのホームページ記載の方法（http://ted.bti.cornell.edu/array/interface/protocol/protocol.html）、後者はインビトロジェン社から提供されたプロトコルに従って実行した。【００６０】
ｃＤＮＡマイクロアレイ解析は、ｂ）の全ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成後、各々ｃｙ３とｃｙ５で蛍光標識した。マイクロアレイ解析は、ＮＣトマトからのサンプルのｃｙ３標識ｃＤＮＡとＰＣトマトからの各サンプルのｃｙ５標識ｃＤＮＡの混合液を調製し、それを１枚のマイクロアレイ上でハイブリダイズする、いわゆる２色法で行われた。得られた数値の標準化は、global normalizationにより行い、さらにＤｙｅバイアスを補正するためにLowess法を適用した。蛍光色素のシグナル強度と発現比を参考にして、線虫感染によって有意な発現変化を示す遺伝子を選定した。【００６１】
ＳＡＧＥにより、感染トマトの１４日目のサンプルと健全トマトの１４日目のサンプルの遺伝子発現が比較された。ＳＡＧＥライブラリーは、I-SAGE long Kit（Invitrogen）を用いて、そのプロトコルに従って構築された。シークエンシング反応はBigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kitを用いて行い、その反応液はＤＮＡシークエンサーABI PRISM 3100(Applied Biosystems)により解析された。シークエンスデータの解析は、ＳＡＧＥ解析ソフトSAGE2000 ver.4.5（Invitrogen）を用いて行われた。そのソフトで抽出されたタグ配列のアノテーションのために、Sol Genomics Network（SGN）のcDNA and EST databaseでその配列をＢＬＡＳＴ検索した。１７ｂｐのタグ配列と完全に一致する配列を含む遺伝子が同定された後、その遺伝子配列中でタグ配列が正しい方向に向いているかどうか、及び制限酵素NlaIIIの切断部位の下流に位置しているかが確認された。同定された遺伝子の健全トマトサンプルと感染トマトサンプルのタグの数が比較された。【００６２】
上記の網羅的発現解析の結果を基に、線虫感染により発現が変化する遺伝子12種類を選抜した。以下に遺伝子名とSGNのUnigene IDを示す。【００６３】
Protease Inhibitor type II (SGN-U212876)
Wound-induced protein Sn-1 (SGN-U216965)
hypothetical protein Zinnia elegans TED4 (SGN-U214087)
SubC29 P-rich protein (SGN-U213037)
PR protein STH-2 (SGN-U214460)
BURP-domain containing protein (SGN-U217045)
protease inhibitor multicystatin (SGN-U220775)
putative receptor like kinase (SGN-U224043)
pectinesterase (SGN-U213347)
homeotic protein VAHOX (SGN-U213417)
dof zinc finger (SGN-U224743)
gibberellin-regulated protein RSI-1 (SGN-U213623)【００６４】
上記の遺伝子の一部について、回収した核酸に対して半定量ＰＣＲやノーザンブロッティングによる発現解析を行い、網羅的な発現解析の結果と同じく、ＰＣＮ感染による発現変化が生じていることを確認した。【００６５】
ｄ）診断用遺伝子のクローニング
土壌診断の指標として、マクロアレイにスポットされるプローブＤＮＡのクローニングを行うために、ｃ）で特定した１２種の遺伝子の各塩基配列に特異的なＰＣＲ用プライマーセットを設計した。Takara RNA PCR Kit (AMV) ver.1.1を用いて、上記プライマーセットを用いて全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりプローブＤＮＡを増幅後、ｐGEM T Easy vector（Promega）にＴＡクローニングした。このプライマーセットによって増幅されるプローブＤＮＡの塩基配列は次の通りである。【００６６】
Protease Inhibitor type II long（配列番号１）
GCCTTGTACTATGGAATGTGGTCATCTTGGGTTTGGGATATGCCCACGTTCACAAGGAAGTCCGCAGAATCCCATATGCACCAATTGTTGTTCAGGTTTTAAAGGTTGCAATTATTATAGTGTTAATGGGACTTTTATTTGTGAAGGACAATCTGACCCAAGAAAACCAAAACCTTGCCCCTTAAATTGTGATCCACATATTGCCTATTCAAAGTGTCCCCGTTCAGGAGGAAAGACGTTTATTTATCCCACTGGATGTACCACGTGTTGCACGGGATACAAAGGCTGCTACTATTTCGGTAAAGATGGCAAGTTTGTTTGTGAAGGAGAGAGTGATGAACCCAAGGTATGTACCATGGAATGTGACCCTAGAGTTGCATACATGATTTGTCCATCTTCTGGATTGGCCAAACTTAGCCAAGTTTGTGTTAATTGTTGCACTGCAGGGGACGGTTGCAAACTCTATGGATATGATGGATCTTTAATTTGTACTGGGGAGCCTCAGAGCTACATATCT【００６７】
Protease Inhibitor type II Short（配列番号２）
GCCTTGTACTATGGAATGTGGTCATCTTGGGTTTGGGATATGCCCACGTTCACAAGGAAGTCCGCAGAATCCCATATGCACCAATTGTTGTTCAGGTTTTAAAGGTTGCAATTATTATAGTGTTAATGGGACTTTTATTTGTGAAGGACAATCTGACCCAAGAAAACCAAAACCTTGCCCCTTAAATTGTGATCCACATATTGCCTATTCAAAGTGTCCCCGTTCAGGAGGAAAGACGTTTATTTATCCCACTGGATGTACCACGTGTTGCACGGGATACAAAGGTTGCTACTATTTCGGTAAAAATGGCAAGTTTGTTTGTGAAGGAGAGAGTGATGAACCCAAGGAGAGGGTTGCAAACTCTATGGATATGATGGATCTTTAATTTGTACTGGGGAGCCTCAGAGCTACATATCT【００６８】
Wound-induced protein Sn-1 （配列番号３）
AGGCAAGTTGATCGCTTCAGTAGAAGTAAAGTGTGGAGGACACTTGGTTCACGATATATTTCATACCAAGACTCATCATATATCCAATATATGCCCTAGCAAAATCCAAAATTTCGAGATTCATGAAGGTGATTCCGTAAAAGTTGGTTCAGTCGTTAGCTGGAAATATAACGATGATGGAAAGGATAAGATTTCAAAGCAAATGATTGAAGCCATCGATCATGAAACCAAAACAATCACTTGGAAATTGATTGGTGGAGATCTGTTAGAGTTGTACAATTCCTTCACTATTATCACATCATGTGACCACGAATGGACTACATGGACATTTCTGTATGAGAAGAAAACTGAAGACATACCAGAGCCTCTCGTTCTCTTGGGTTTTGTCCTTCACGTTACAAAAGATATCGAAGGTCACCTTCTCAAGTAATAAAACATCAATGCTACTCAATGGCTCATAGCCCTATTTATACATATGCAATATATATATATATATATATATTGTACACACAAATATGTATGTGTGTGTGTGTGATATTGACTAGCTAGTTCTGTCTAGCTAGCTAGTGTGT【００６９】
hypothetical protein Zinnia elegans TED4 （配列番号４）
AGTGAATTGCTTGTCACGGAGGCCGTGACATGCAGTGTTACAGAGCTAGTTCCATGTGCCGCGGCGATCCTGTCATCACAACCACCCTCTAAGGAATGTTGCAATAAGTTGAAAGAGCAAAAGCCTTGTCTTTGTGGATATCTTAAGAATCCAAGCCTTAAGCAATATGTCAACTCTCCTAATGCCAAAAAAGTTGCTAAAACTTGTGGAGTATCCACTCCAAGTTGTTAGGATTCTAACAAATAAAAATTCACAAATGATGATCATTCATGGATGACCAGAAAACGCCTTTCGTTTTCCACACTTCCTCAAAGTGTCTA【００７０】
SubC29 P-rich protein（配列番号５）
GTGAGTGCATGTGGCACTTGTCCAGGTCCTAAACCAAAGCCGAAGCCAAAGCCAAAGCCAAAGCCAACCCCGAGCCCTAGCTCAAAAGGCAAATGCCCTATTGATACACTAAAATTAGGTGTTTGTGCTAATGTTCTTGGAAATTTGCTTGGAGTAGTACTTGGAAATCCACCAAAGAAACCTTGTTGCTCTCTAATTGAAGGACTTGTTGATCTAGAGGCTGCTCTTTGTCTTTGCACTGCCATTAAAGCAAATATTCTTGGGATTAACCTAAATGTCCCTCTTTCTCTAAGCCTTCTTCTTAATGTTTGTGGCAAAAAAGCTCCATCTGGCTTTCAATGCCCTAAGTGAACAAACAAACAATAGCTACTACGTCTCAGTCCCAAATAAGTTGGGGTCAGCTATATGAATGTTCATTCTATCACTACTATATAGTTTGATTTGAGTTTTTTGGATTTTTAATTTTGTTTTGCTTATGAGCAATGTTCAAGTG      【００７１】
PR protein STH-2（配列番号６）
GAAACCACAACACCAGTTGCCCCTACTAGGTTGTTCAAAGCTTTGGTTGTTGATTCTGATAATCTTATTCCTAAGTTGATGCCACAAGTTAAAAATATTGAGGCTGAGGGAGATGGAAGTATCAAAAAGATGAACTTTGTTGAAGGTTCACCAATCAAGTACTTGAAGCACAAGATTCATGTTGTTGATGACAAGAATTTGGTGACCAAATATTCAATGATTGAAGGAGATGTTCTTGGAGACAAACTTGAGTCAATTTCCTATGACCTAAAATTTGAAGCTCATGGAAATGGAGGATGTGTTTGCAAGTCTATAACTGAGTATCACACAAAAGGTGATTATGTGTTGAAGGATGAAGAACATAATGAAGGCAAAAAACAAGCCATGGAACTTTTCAAGATTGTTGAAGCATACCTCCTCGAGAATCCTTCTGTCTACGCTTAAGTGATGAAATAAGAATCAGGTCCACACGTGTT【００７２】
BURP-domain containing protein （配列番号７）
CTCTACAAGAAGTGAGCGACAAACAAGAAGAAAACAAGCATCAACAAGTAAAAACAGCAAAGGCACATATCCATTCATCATCCCATATGGATCATATTGATCCTTCTTTAAGAGTTTTCTTCCTAATAAATGATCTAAAGATAGGGAAAACAATAACTGTCTCCTTCCCAAGAAGAGATCTTTCTTCTTCTCCGAGTTTCTTGCCAAAAGAAGAAGCTGATTCCATTCCATTTTCACAAAAGGAACTCCCAAACCTCCTTCAACGTTTCTCATTCTCTCGAAACTCTCCACAGGGGAAAGCCATGGAAGACACACTGAGAGAATGTGAGGCTCCACATATTAAGGGAGAGACAAAGTACTGTGCCACATCCGCGGAGGCAATGCTTGATTTTGTTCAAGGAATCATGGGAGAGAAAACTCAATTCAAAGCTCTGTCCACAACTCATTTCTCAAACTCAACTCCCCCACTTCAAGAGTATACTATTTTGGATGCTCCTCAAGAAGTAGAAACTCCCAAGATGGTGGCATGTCATACCA             【００７３】
protease inhibitor multicystatin （配列番号８）
TGGGTGAAGGAATGGGAGGACTTCAAAAAAGTTGTAGAATTCAAGCTTGTTGGTGATGATAGTCCAAATCCTGGGGGCATTACCAATGTTCCATTCCCAAACCTCCCCCAGTTCAAAGATCTTGCTCGTTTTGCTGTTCAAGATTATAATAAGAAAGAGAATGCTCATTTGGAGTTTGTAGAAAATTTGAATGTGAAGGAACAAGTTGTTGCTGGAATAATATACTATATAACGCTTGTGGCAACTGATGCTGGAAAGAAGAAAATATATGAGACCAAGATTTTGGTGAAGGGATGGGAGAATTTCAAGGAAGTTCAAGAATTCAAGCTTGTTGGTGATGCCACTAAGTGAAATGA【００７４】
putative receptor like kinase（配列番号９）
GGGAATACTAGTAGATGGACAGGAAATCGCTGTGAAGAGGCTTTCCAAGAGTTCTGGACAAGGATTGAATGAATTCAAAAAATGAAGTGAAGCTGATAGCAAAACTTCAGCATCGAAATCTCGTAAAGCTCGTTGGAAGTTGTATTGATGATGAAGAGAAGATGTTGATCTACGAATACATGGCTAATAGGAGCTTGGATTCTTTTGTTTTTGGTTTGTATCTTTAGAGAAGAGTTCCTATAGCTATCCTGTTAGCCCTGAATGAAAGTTTTAGTTAGAGAACTGGACTAACTTAACTCTAAACTGCTAGAGCGAACAAGGCGTAAACAATTGGGCTGGTCAAAGTTCTTCCAGATCATCGATGGAATTGCACGTGGGCGTCTCTACCTTCATCAGGATTCGAGATTGCGAATTATGCACATAG【００７５】
pectinesterase （配列番号１０）
CCTCACAACCCATCAGTGTAAGCGACACCAGTAGATTTTAACCATGCTGCTCCTTGAATCAGCTGACCCACAGTGAACTTTGTGGCCTCGGATGTTGTTAAAGCTTTATGATAACCAGGCCAGTTAACTCTCTTACTAATGCCAGCACCAGCTCCTTTGTTCATGTACTCACCATAATACAGTGTTTTCAATGCAAAATCACCGTCCCATTCTGACCAACCTGCTGGATCAATATGGTCTCCAATGTTGGACTGCATGTACACTGTCCTCGAATACGCTTTCCATGGTCTGC【００７６】
homeotic protein VAHOX （配列番号１１）
GTAGAATTCGAAGCTATGATGGCTCCAGGGATTCTCTATGGTGGTTCTTCTAATTTCGATGGCGTTTTTACTCAAAAACAGAGAGACGTGTTTTCTTCATCTACTGCACCGAAAGGGCATCTTGGTTCCCTTTTTGCCCCTGCCTCTTCTTCTTCTAATTTCTTGGGATCCAGTTCCATGGTGAGTTTTCGCGGTGTTAATGGAGGGAAGAGATCATTCTTTGATTCGTTCGATCAGGATGACAATGAAGCTGATGAATTGGGGGAATATCTTCATCAAGCGGAGAAGAAGAGGCGACTTACTGACAACCAAGTTCAGTTTCTTGAGAAGAGTTTTGGGGAAGAGAACAAACTTGAACCAGAAAGGAAAGTTCAGCTTGCTAAAGAACTTGGTCTGCAGCC【００７７】
dof zinc finger （配列番号１２）
ATGCTAGCACAGAAACCCTAGAAGCTTACTTTAATCAAGCTAGCTTCCCTAATCTCAAAATAATCCTAGTACAAATTAACAACAATATAACCAGATCAACTATATCTTCTACCATATATGTTAGTACGTACTTAGTTCTAATTAAACATGAACAAACAAATTATTAGTAACCTAAGCACGTATAACAACAACATACTCAACCCAGTGTAATCCCACGCCTGGAGTCTGGATTAACGTGAAAAAGAAAAAAGAGATTTGTGTGCACATTGTTCATGTTTCTTTAATTTACCAAGATCCTCCAGTACCACTTATCATCCCACTCCAATATAAACCAGCAGTTGAATTATTATTCTCCTGTCCCTTAGTCAGGTGATCAACTTGATTTGTACTTGAAAGTTGCTTTAATCCTCCTAGAGGGAACATTATTCTTGCACCTGATCCA        【００７８】
gibberellin-regulated protein RSI-1 （配列番号１３）
GGCAAAGAGTGGTTACAATGCTAGCTTCTTGTTACTTATCTCAATGTTCTTGATTTTGCTCACTTTCTCTAACGTGGTCGAGGGTTACAACAAGCTCCGCCCAACAGATTGCAAGCCAAGATGTACTTATAGATGCTCAGCAACATCACACAAGAAGCCATGTATGTTCTTTTGTCAAAAATGTTGTGCAACATGTTTATGTGTTCCTAAAGGAGTTTATGGCAACAAACAATCATGCCCTTGTTACAACAATTGGAAGACTCAAGAAGGAAAACCTAAATGCCCTTAATTAATTAAAATATTAATAATTAGGGAAATTAATCTTTTTTTCCCAATAATTAATGGAAAAGATTAAGAGTACTATAGCTATATGGTCATATTGTGTCTTGTATTGCATTAAATTGATTTGGAGTAATTTTGATGTAATGTTTTAAGCATTTTGTATTTCTCTACTTGTGTTATCATGTTGTCTGAGCTGAGTTGTAGTACTGGAGC【００７９】
４）ＤＮＡマクロアレイの作製 (図１)
ＤＮＡアレイに担持させるプローブＤＮＡは、上記の各遺伝子のプラスミドクローンをテンプレートとしてＰＣＲにより増幅後、各々０．５μg/μlの濃度に調整された。調製されたプローブＤＮＡは、HYDRA-HTS（Robbins）により、ナイロンメンブレンbiodine plus nylon membrane(Pall）に０．２μlずつ、各クローンにつき２スポットずつ分注された。プローブＤＮＡをメンブレンに固定するため、スポット後のメンブレンをろ紙に挟んだ状態でオーブンで１２０℃３０分処理した後、メンブレンに対してUV cross-linker（ＵＶＰ）にて１２０mJ/cm2のＵＶ照射を行った。【００８０】
５）ｍＲＮＡの精製
ｂ）で抽出された全ＲＮＡ５０μgから、MagExtractor-mRNA-（TOYOBO）を用い、そのプロトコルに従ってｍＲＮＡを精製した。【００８１】
６）ビオチン標識されたｃＤＮＡの増幅と精製
上記で精製したｍＲＮＡから、Gene Navigator cDNA amplification system ver.2（TOYOBO）を用い、そのキットのプロトコルに従い、アンカー配列付加オリゴｄＴプライマーから逆転写酵素ReverTra Aceを用いてｃＤＮＡを合成したＰＣＲ反応により、ビオチン標識ｃＤＮＡを増幅した。増幅ｃＤＮＡをエタノール沈殿により精製した後、ｄＡＴＰを加え、Terminal  deoxynucleotidyl Transferase（TdT）によって、1st strand ｃＤＮＡの３’末端にdA tailを付加した。そのdA tailを付加されたｃＤＮＡをテンプレートとして、アンカー配列付加oligo（dT）プライマーとアンカー配列プライマーを加えて、ＤＮＡポリメラーゼKOD dashを用いたＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応液にbiotin-16-dUTPを添加しておくことで、ビオチン標識されたｃＤＮＡを増幅した。ビオチン標識ｃＤＮＡは、エタノール沈殿により精製後、再蒸留水１００μlで溶解した。【００８２】
７）ハイブリダイゼーション
ＤＮＡマクロアレイをハイブリダイゼーションボトル（Thermo Hybaid）にセットし、再蒸留水５ｍｌを加え、ハイブリダイゼーションオーブン（Iwaki）で６８℃１０分間洗い、ハイブリダイゼーションバッファーPerfectHyb（TOYOBO）５ｍｌで６８℃１時間プレハイブリダイゼーションを行った。前述のビオチン標識ｃＤＮＡ溶液５０μlを１００℃５分で変性後、PerfectHyb  ５ｍｌに添加して、６８℃１４時間ハイブリダイゼーションを行った。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ洗浄液で６８℃１０分間の洗浄を３回洗浄行い、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ洗浄液で６８℃５分間の洗浄を３回行った後、Phototope-Star detection kit(New England Biolabs)を用いて化学発光により検出した。その化学発光シグナルはFluor-S MultiImager(BioRad)により画像化した。【００８３】
８）数値化・診断
ＴＩＦＦフォーマットで得られたマクロアレイ画像データのスポットをＤＮＡチップ発現解析用ソフトウェアImaGene(biodiscovery社)により数値化した。内部標準遺伝子としてactin（SGN-U213638）、β-tubulin(SGN-U212618)、elongation factor-1 α（SGN-U212845）を同じアレイ上にスポットした。これらの遺伝子は、そのシグナル強度の値で各スポットのシグナル強度値を割って標準化するのに利用した。【００８４】
９）感染トマトの遺伝子発現パターンの解析
人工的にＰＣＮに感染させて、各々３日目と７日目のトマトと健全なトマトを含んだ３種類の検体について、上記６）〜８）で説明したＤＮＡマクロアレイを用いた発現解析を行った（図２−ａ）。【００８５】
その結果、健全トマトは２つのＰＣＮ感染トマトの発現パターンと比較して、ＤＮＡマクロアレイ上の各遺伝子の発現量が最も少なかった。線虫感染後３日目の感染トマトの発現パターンは、健全トマトに比べてprotease inhibitor typeIIの発現が顕著な増加を示した。線虫感染後７日目トマトでは、protease inihibitor typeIIの他にも、さらにSubC29 P-rich protein、STH-2の発現量の増加が見られた（図２−ｂ）。これらの結果の再現性は非常に高いものであった。【００８６】
＜実施例１＞
北海道倶知安町の圃場から採取された土壌200ｇに、汚染されていない土壌で栽培して調製したトマト（強力米寿、根、葉、茎を有する植物個体）を植え、22℃、16時間照明で、ポットにて１４日間栽培した。【００８７】
栽培後のトマトの根から、上記予備試験における操作に準じてＲＮＡを回収し、ＤＮＡマクロアレイを用いて解析した（図３−ａ）。その結果得られた圃場土サンプルの根の発現は、予備試験における感染トマトの７日目サンプルと同様の発現パターンを示した（図３−ａ、図３−ｃ）。また栽培後のトマトの葉から回収したＲＮＡについても発現解析を行い、根における発現パターンと同様の発現パターンが確認された（図３−ｂ、図３−ｃ)。この結果、北海道倶知安町の圃場から採取された土壌がＰＣＮにより汚染されていることを確認した。【００８８】
＜実施例２＞
実施例１で回収した葉について、Phototope  Star detection Kit (New England Biolabs)による化学発光検出に使用されたマクロアレイフィルター（図３−ｂ）を、Wash溶液１（０．５％ＳＤＳ、１２．５ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭ sodium phosphate）で１０分間２回洗浄を行い、さらにWash溶液２（１０ｍＭ Tris-HCl、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５）で５分間３回洗浄を行った。洗浄したフィルターについてＮＢＴ/ＢＣＩＰ基質(Roche)を用いた化学発色による検出を行い、その化学発光シグナルはFluor-S MultiImager(BioRad)により画像化された（図４）。ＴＩＦＦフォーマットで得られたマクロアレイ画像データのスポットをＤＮＡチップ発現解析用ソフトウェアImaGene(biodiscovery社)により数値化した。化学発光と化学発色の数値化データは、高い相関（相関係数０．９９）を示した（図５）。【００８９】
＜実施例３＞
トマト（強力米寿）をポットに播種して22℃、16時間照明14日間栽培後、トマト萎凋病菌であるフザリウム菌（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, race2）をトマト苗の根元に接種した。接種後、前記の条件でさらに７日間栽培した後にトマトの根を回収し、TRIzol(invitrogen)を用いて、そのプロトコルに従って全RNAを抽出し、RNeasy plant mini kitのRNeasyスピンカラムを用いて精製した。非変性アガロースゲル電気泳動、Agilent 2100バイオアナライザ及び分光光度計等により、精製全RNAの収量（濃度）の測定及び純度を確認した。【００９０】
純度確認後の全RNAをサンプルとして、ＤＮＡマイクロアレイ（Filgen Array tomato13K）を用いた網羅的な発現解析を行った。RNAの増幅と標識の工程及び、ハイブリダイゼーションから得られたシグナル強度の標準化は、前記予備試験に記載した線虫感染サンプルのマイクロアレイ解析と同様の方法で行った。このマイクロアレイによる網羅的な発現解析の結果、フザリウム感染により発現が変化する遺伝子として、PR-1a（Unigene ID：Les.54）、PR-5（Unigene ID：Les.3683）、chitinase(Unigene ID：Les.122)、XTH3(Unigene ID：Les.4353)、water channel(Unigene ID：les.12273)の５種類を選抜した。【００９１】
選抜した５種類の遺伝子由来のＲＮＡの増幅及び標識を、illumina total prep RNA amplification kit（Ambion）を用いて、そのプロトコルに従って行い、そのＰＣＲ増幅断片をナイロンメンブレンにスポット、固定化して、ｃＤＮＡマクロアレイを作製した。このｃＤＮＡマクロアレイには、上記５種類の遺伝子由来のＤＮＡと、コントロールＤＮＡとしてtubulin及びactinのｃＤＮＡを、それぞれダブルでスポットした。【００９２】
このcDNAマクロアレイを用いて、フザリウム菌接種後7日目のトマトと陰性コントールとして健全トマトの根について発現解析を行った。その結果を図６に示す。図６の各スポットのシグナル強度は、その遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す。ｃＤＮＡマクロアレイのハイブリダイゼーションからシグナルの数値化・標準化の工程は、前記＜予備試験＞に記載した線虫診断用ｃＤＮＡマクロアレイの解析時と同様の方法で行った。【００９３】
図６に示される様に、Water Channel遺伝子（図中□で囲んだスポット）のシグナルは、健全トマト（コントロール）及び比較対象として用意した線虫感染トマトと比較して、フザリウム菌感染トマトにおいて明らかに強く、その発現量の差は明瞭であった。また、PR-1a遺伝子とPR-5遺伝子の発現も、健全トマト（コントロール）及び線虫感染トマトと比較して、フザリウム菌感染トマトにおいて亢進していることが確認された。この様に、本発明の方法は、Water Channel遺伝子、PR-1a遺伝子及び／又はPR-5遺伝子の検定植物における発現量を調べることで、フザリウム感染を線虫感染と区別して検出することが出来、フザリウム菌の感染をもたらす土壌汚染を明らかにすることができることが示された。【００９４】
＜実施例４＞
イネ（Oryza sativa L.品種：キタアケ）の種子を1 mM CaCl2溶液中で暗所にて48時間エアレーションを行い、発芽処理を行った。1 mM CaCl2溶液を満たしたバットの上に網を浮かべ、その上に発芽したイネ種子を載せて前培養を行った。草丈が10〜15 cm程度になったところで、下記の組成からなるリン含有水耕培養液とリン非含有水耕培養液に前培養後のイネ種子を移植し、各培養液を毎日交換しながら、10日間栽培した。【００９５】
【表３】
2007139100.tif 000004
【００９６】
全ての栽培は人工気象器（28℃、相対湿度60％、24時間明期）で実施した。栽培終了後、根部と地上部に分けて採取し、液体窒素につけて凍結後-80℃で保存した。【００９７】
凍結した試料約0.5 gをそのままマルチビーズショッカー（安井器械）を用いて粉砕し、Plant RNA Isolation Mini Kit (Agilent Technologies社) を用いて抽出した全RNAをサンプルとして、イネオリゴマイクロアレイ(Agilent Technologies社）を用いた網羅的な発現解析を行った。Low RNA Input Linear Amplification & Labeling Kit (Agilent Technologies)を用いて、全RNAからCy3およびCy5標識されたcRNAを合成し、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて精製した後に、プロトコルに従って標識cRNAを用いて60℃で16時間ハイブリダイゼーションを行い、6 x SSC, 0.005% TritonX-102と0.1 x SSC, 0.005% Triton X-102を用いて洗浄後、マイクロアレイスキャナ (Agilent Technologies)を使用して搭載された各遺伝子の発現量を定量した。RNAの増幅と標識の工程及び、ハイブリダイゼーションから得られたシグナル強度の標準化は、前記予備試験に記載した線虫感染サンプルのマイクロアレイ解析と同様の方法で行った。【００９８】
このマイクロアレイによる網羅的な発現解析の結果、リン欠乏状態に置かれることで発現が変化する遺伝子として、下記の遺伝子を選抜した。【００９９】
【表４】
2007139100.tif 000005
【０１００】
また、既知のリン欠乏誘導性遺伝子としてOsPI1 を、コントロールとしてイネのactin遺伝子をそれぞれ選択して、上記の８種類の選抜遺伝子に追加した。【０１０１】
選抜した８種類の遺伝子由来のＲＮＡ、OsPI1遺伝子由来のRNA、コントロールとしてactin遺伝子由来のRNAの増幅及び標識を、illumina total prep RNA amplification kit（Ambion）を用いて、そのプロトコルに従って行い、そのＰＣＲ増幅断片をナイロンメンブレンにスポット、固定化して、ｃＤＮＡマクロアレイを作製した。このｃＤＮＡマクロアレイには、上記８種類の選抜遺伝子のｃＤＮＡ、OsPI1遺伝子由来のｃＤＮＡ、コントロールのactinのｃＤＮＡを、それぞれダブルでスポットした。上記のRNA試料の増幅及び標識は、illumina totalprep RNA amplification kitを用いて、そのプロトコルに従って行った。また、ｃＤＮＡマクロアレイのハイブリダイゼーションからシグナルの数値化・標準化の工程は、線虫診断用ｃＤＮＡマクロアレイの解析時と同様の方法で行った。【０１０２】
このマクロアレイを用いて、リン含有水耕培養液で１０日間培養したイネ及びリン非含有水耕培養液で栽培したイネそれぞれの根と地上部から抽出した全ＲＮＡを解析した（図７）ところ、リン非含有水耕培養液で培養したイネの根において、OsIPS1（図中上の□）とOsPI1（図中下の□）の強い発現の亢進が観察され、またOsSAP1とOsHADPでも発現の亢進が観察された。OsIPS1とOsPI1は、地上部でもリンの欠乏による発現の亢進が確認された。また、地上部特異的にOsPMの発現の抑制が確認された。【０１０３】
この様に、本発明の方法は、OsIPS1遺伝子、OsPI1遺伝子、OsSAP1遺伝子、OsHADP遺伝子及び／又はOsPM遺伝子の検定植物における発現量を調べることで、栽培培地におけるリン不足を明らかにすることができることが示された。また、検定植物の組織として、根のみでなく、地上部の組織も利用可能であることが示された。地上部組織での診断は、根に比べて組織の採取やRNA抽出が容易なため、根組織での診断より有利である。
【図１】
2007139100.tif 000006
【図２−ｂ】
2007139100.tif 000007
【図３−ｃ】
2007139100.tif 000008
【図５】
2007139100.tif 000009
【図２−ａ】
2007139100.tif 000010
【図３−ａ】
2007139100.tif 000011
【図３−ｂ】
2007139100.tif 000012
【図４】
2007139100.tif 000013
【図６】
2007139100.tif 000014
【図７】
2007139100.tif 000015
【配列表】
2007139100000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月27日(2008.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌汚染及び／又は水質汚染の判定方法であって、１）非組み換え検定植物を判定しようとする土壌に植えて／又は非組み換え検定植物に判定しようとする水を与えて１〜１４日間栽培すること、２）栽培した非組み換え検定植物の組織から核酸を回収すること、３）回収した核酸において、土壌及び／または水に含まれる汚染源と非組み換え検定植物との接触によって発現が変動する非組み換え検定植物由来の２以上の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法。
【請求項２】
非組み換え検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ウリ科植物、マメ科植物、バラ科及びユリ科よりなる群から選ばれる一種以上である、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の判定方法。
【請求項４】
汚染源が植物病原性線虫、植物病原性微生物、植物病原性昆虫、植物病原性ウイルス、重金属、及び有機汚染源より選ばれる一種以上である、請求項１に記載の判別方法。
【請求項５】
遺伝子の発現の確認を、ＤＮＡアレイを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡアレイがナイロンメンブレンを用いたＤＮＡマクロアレイである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
非組み換え検定植物から抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
土壌及び／又は水に含まれる植物栄養源の過不足の判定方法であって、１）非組み換え検定植物を判定しようとする土壌に植えて／又は非組み換え検定植物に判定しようとする水を与えて１〜１４日間栽培すること、２）栽培した非組み換え検定植物の組織から核酸を回収すること、３）回収した核酸において、土壌及び／または水に含まれる植物栄養源の過不足によって発現が変動する非組み換え検定植物由来の２以上の遺伝子の発現を確認することを含む、前記判定方法。
【請求項９】
非組み換え検定植物がナス科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、ウリ科植物、マメ科植物、バラ科及びユリ科よりなる群から選ばれる一種以上である、請求項８に記載の判定方法。
【請求項１０】
核酸がＲＮＡである、請求項８に記載の判定方法。
【請求項１１】
植物栄養源は窒素、リン又はカリウムである、請求項８に記載の判別方法。
【請求項１２】
遺伝子の発現の確認を、ＤＮＡアレイを用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡアレイがナイロンメンブレンを用いたＤＮＡマクロアレイである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非組み換え検定植物から抽出した核酸に放射性標識もしくは非放射性標識を付して使用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
非組み換え検定植物がトマトであり、汚染が線虫であり、遺伝子がＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅＩＩ（ＳＧＮ−Ｕ２１２８７６）、Ｗｏｕｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｎ−１（ＳＧＮ−Ｕ２１６９６５）、ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｚｉｎｎｉａ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＴＥＤ４（ＳＧＮ−Ｕ２１４０８７）、ＳｕｂＣ２９  Ｐ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＧＮ−Ｕ２１３０３７）、ＰＲ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳＴＨ−２（ＳＧＮ−Ｕ２１４４６０）、ＢＵＲＰ−ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＧＮ−Ｕ２１７０４５）、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｃｙｓｔａｔｉｎ（ＳＧＮ−Ｕ２２０７７５）、ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＳＧＮ−Ｕ２２４０４３）、ｐｅｃｔｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ（ＳＧＮ−Ｕ２１３３４７）、ｈｏｍｅｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＡＨＯＸ（ＳＧＮ−Ｕ２１３４１７）、ｄｏｆ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ（ＳＧＮ−Ｕ２２４７４３）及びｇｉｂｂｒｅｌｌｉｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＲＳＩ−１（ＳＧＮ−Ｕ２１３６２３）よりなる群から選ばれる２種以上である、請求項１に記載の判定方法。
【請求項１６】
非組み換え検定植物の組織が葉組織及び／又は地上部である、前記何れかの請求の範囲に記載の判定方法。
【国際調査報告】
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