(57)【要約】本発明は、ウイルス由来プラスミドベクターに改変型Ｌ７プロモーターと治療用遺伝子を機能しうる態様で連結してなるプルキンエ細胞指向性ウイルスベクターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス由来プラスミドベクターに改変型Ｌ７プロモーターと外来遺伝子を機能しうる態様で連結して成る小脳プルキンエ細胞指向性ベクターであって、前記改変型Ｌ７プロモーターが下記ａ）又はｂ）のＤＮＡからなることを特徴とする前記ベクター：
ａ）配列番号３又は４に示される塩基配列を有するＤＮＡ
ｂ）配列番号３又は４に示される塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ａ）のＤＮＡと同等のプルキンエ細胞特異的プロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、及びレンチウイルスから選ばれるものである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記ウイルスがレンチウイルスである、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
前記ベクターによって産生されるウイルスの蛋白質が実質的に分解修飾を受けていない状態にあることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
レンチウイルスプラスミドベクターに外来遺伝子を機能しうる態様で連結して成る小脳プルキンエ細胞指向性ベクターであって、前記ベクターによって産生されるウイルスの蛋白質が実質的に分解修飾を受けていない状態にあることを特徴とするベクター。
【請求項６】
前記外来遺伝子が、ＣＭＶプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、プルキンエ細胞特異的Ｌ７プロモーター、神経細胞特異的ＮＳＥプロモーター、及びβ−ａｃｔｉｎプロモーターから選ばれるいずれかのプロモーターの支配下に連結されている、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記蛋白質が、ウイルスエンベロープ上に存在する糖蛋白質である、請求項４又は６に記載のベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、プロテアーゼ阻害剤を含む培養液中で産生されたものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
前記プロテアーゼ阻害剤がカテプシンＫ阻害活性を有するものである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ベクターが、ｐＨ７．２〜ｐＨ８．０の培養液中で産生されたものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ベクターが、血清を含まない培養液中で産生されたものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２】
前記外来遺伝子がプルキンエ細胞障害性疾患の治療用遺伝子又は当該疾患遺伝子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
前記治療用遺伝子が、ＧＴＰａｓｅ  ＣＲＡＧ、ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆａｃｔｏｒ  Ｅ４Ｂ（ＵＦＤ２ａ）、ＡＴＰａｓｅ  ＶＣＰ／ｐ９７、ＨＤＪ−２、ＨＳＤＪ及びＢｉＰを含む分子シャペロン、ＹＡＰｄｅｌｔａＣを含む細胞死抑制分子、ＥＲ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＤＥＭ）を含む小胞体蛋白質分解促進分子、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＯＡＳＩＳ、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ及びＡＴＦ６を含むＥＲセンサー分子、スフィンゴミエリナーゼ、ＡＴ−ｍｕｔａｔｅｄ（ａｔｍ）、Ｒｅｅｌｉｎ、Ｂｃｌ−２、ネプリライシン、ＢＤＮＦ、ならびにＮＧＦをコードする遺伝子から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上、あるいはａｔａｘｉｎ−１、ａｔａｘｉｎ−２、ａｔａｘｉｎ−３、α１ａ電位依存型カルシウムチャネル、及びＰＫＣγをコードする遺伝子から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上のｓｉＲＮＡである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
前記疾患遺伝子が、異常伸長したＣＡＧリピートを持つａｔａｘｉｎ−１、ａｔａｘｉｎ−２、ａｔａｘｉｎ−３、ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、及びα１ａ電位依存型カルシウムチャネルコードする遺伝子、ならびに変異を持つＰＫＣγをコードする遺伝子から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上である、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のベクターを含む、小脳プルキンエ細胞障害性疾患の治療用医薬組成物。
【請求項１６】
小脳プルキンエ細胞障害性疾患が、脊髄小脳変性症、及びハンチントン病を含むポリグルタミン病、ニーマンピック病、毛細血管拡張性運動失調症、自閉症、アルツハイマー病、胎児アルコール症候群、アルコール中毒、ならびに加齢性小脳失調から選ばれるいずれかである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のベクターを導入された非ヒト哺乳動物。
【請求項１８】
異常伸長したＣＡＧリピートを持つａｔａｘｉｎ−１、ａｔａｘｉｎ−２、ａｔａｘｉｎ−３、ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、及びα１ａ電位依存型カルシウムチャネルコードする遺伝子、ならびに変異を持つＰＫＣγをコードする遺伝子から選ばれるいずれか１つ又は２つ以上を導入され、小脳プルキンエ細胞障害性疾患のモデル動物である、請求項１７に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１９】
ウイルス由来ベクタープラスミドに配列番号３又は４で示される塩基配列を有する改変型Ｌ７プロモーターを、外来遺伝子に機能しうる態様で連結するか、あるいはレンチウイルスプラスミドベクターに外来遺伝子を機能しうる態様で連結して宿主細胞に導入し、前記細胞をプロテアーゼ阻害剤を含む培養液中で培養して、ウイルスを産生させることを特徴とする、プルキンエ細胞指向性ウイルスベクターの作製方法。
【請求項２０】
前記プロテアーゼ阻害剤がカテプシンＫ阻害活性を有するものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養液がｐＨ７．２〜ｐＨ８．０である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養液が血清を含まないものである、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
カテプシンＫ阻害活性を有する物質を含んで成る、プルキンエ細胞指向性ウイルスベクター作製用培養液。
【請求項２４】
カテプシンＫ阻害活性を有する物質と細胞培養液、またはカテプシンＫ阻害活性を有する物質を含む細胞培養液を構成要素として含む、プルキンエ細胞指向性ウイルスベクター作製用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型Ｌ７プロモーターを利用したプルキンエ細胞指向性ウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
小脳は複数の筋肉が関与する歩行などの協調運動に重要な役割を果たしている。小脳に損傷があると、協調運動の調節がうまく行かず、なめらかな動きができなくなる。大脳皮質からの運動の指令は脳幹を通って、脊髄、筋肉に伝達されるが、同時に脳幹（橋）から苔状線維を介して小脳皮質にも伝達される。苔状線維を介して伝達された信号は、小脳皮質の神経細胞である顆粒細胞に入力される。そして、顆粒細胞はその軸索である平行線維を介してプルキンエ細胞に信号を伝える。
一つのプルキンエ細胞は平行線維との間に１０万個以上のシナプスを形成し、そこからの入力情報を統合し、小脳の深部にある小脳核へ情報を出力する。プルキンエ細胞は小脳皮質からの唯一の出力神経細胞であり、小脳において非常に重要な役割を果たしているが、脆弱であり、小脳出血、外傷、小脳腫瘍や遺伝性神経変性疾患により障害を受けやすい。
近年のゲノム科学の発展によりヒトやマウスの全ゲノム配列が決定され、生命科学研究は同定された遺伝子の役割解明へと向かっている。神経細胞に野生型や変異遺伝子を導入し、その影響を調べる手法は、神経科学分野の研究面において非常に効果的であるが、遺伝子治療としての臨床応用面からも、神経細胞への遺伝子導入は注目を集めている。
しかしながら、神経細胞は非分裂細胞であり遺伝子導入が難しい。なかでも、プルキンエ細胞への遺伝子導入は極めて困難であり、２０００年以前まで効率的な遺伝子導入の成功例も報告されていなかった。最近ウイルスベクターの開発が進み、プルキンエ細胞への効率的な遺伝子導入が可能になってきたが、それでもわずか４編の論文が報告されているにすぎない（非特許文献１〜４）。
プルキンエ細胞に効率的に遺伝子導入するには、レンチウイルスやアデノ随伴ウイルスなどの神経に対して高親和性を持つウイルスベクターを使う必要がある。ちなみに、これまでの報告では、プルキンエ細胞への遺伝子導入には、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス由来レンチウイルスが用いられている。
ところで、野生型のレンチウイルスはＣＤ４受容体を持つリンパ球にしか感染しない。そのため、現在使われているレンチウイルスベクターは神経細胞にも感染するように、そのエンベロープがＶｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＶＳＶ−Ｇ）に置換されている。このＶＳＶ−Ｇは細胞膜の構成成分であるリン脂質（フォスファチジルセリン）に結合能を持つため、神経以外のグリア細胞、血管内皮細胞などにも非特異的に感染する。また小脳においては、レンチウイルスはプルキンエ細胞以外にも、星状細胞（Ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ）、籠細胞（Ｂａｓｋｅｔ  ｃｅｌｌ）、ゴルジ細胞（Ｇｏｌｇｉ  ｃｅｌｌ）、バーグマングリア（Ｂｅｒｇｍａｎｎ  ｇｌｉａ）にも感染する。
上述のとおり、アデノ随伴ウイルスベクターやレンチウイルスベクターは神経細胞に外来遺伝子を導入し発現させる能力を持つが、パッケージング能力の問題から発現可能な遺伝子サイズに制限がある。発現可能遺伝子サイズはアデノ随伴ウイルスベクターとレンチウイルスベクターにおいて、プロモーター領域と合わせてそれぞれ４ｋｂと８ｋｂといわれている。しかしこれは理論的な値であり、レンチウイルスベクタープラスミドでは安全性を増すためさまざまな改良がなされていることから、使用するベクタープラスミドによって異なるが、発現は５ｋｂ前後が限界であることが多い。
一方、Ｌ７プロモーターはプルキンエ細胞特異的に活性を持ち、プルキンエ細胞だけに外来遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの作出に利用されている。しかしながら、Ｌ７プロモーターは全長約３ｋｂと大きく、アデノ随伴ウイルスベクターやレンチウイルスベクターに組み込んで用いる場合、発現可能な外来遺伝子のサイズは大きな制限を受ける。また、そのプロモーター活性はＣＭＶやＭＳＣＶプロモーター等の非特異的プロモーターに比べて著しく低い。
小脳プルキンエ細胞への効率的かつ特異的な遺伝子導入は、トランスジェニックマウスを作出するしか方法がなかった。しかしウイルスベクターを用いて、プルキンエ細胞に特異的に高効率で遺伝子導入することができれば、これまでできなかったさまざまな研究が可能となり、小脳を対象とする研究の進展に大きく寄与すると考えられる。また、プルキンエ細胞が障害される脊髄小脳変性症などの遺伝子治療への応用も期待される。
また、最近、ウイルスベクターを遺伝子治療としてヒトに用いる場合、牛海綿状脳症をはじめとする感染が近年、大きな問題となっている。これは、現在のプロトコールではウイルス産生時の培地にウシの血清を加えることが必要であるためである。このようなことから、特に血清を用いることなく、プルキンエ細胞に高効率で遺伝子導入できるウイルスベクターを産生できれば、その臨床応用はより広がることが期待される。
【非特許文献１】Ａｇｕｄｏ  Ｍ．，Ｔｒｅｊｏ  Ｊ．Ｌ．，  Ｌｉｍ  Ｆ．，Ａｖｉｌａ  Ｊ．，Ｔｏｒｒｅｓ−Ａｌｅｍａｎ  Ｉ．，Ｄｉａｚ−Ｎｉｄｏ  Ｊ．＆  Ｗａｎｄｏｓｅｌｌ  Ｆ．（２００２）Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  Ｉ  ａｍｐｌｉｃｏｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１３，６６５−６７４．
【非特許文献２】Ａｌｉｓｋｙ  Ｊ．Ｍ．，Ｈｕｇｈｅｓ  Ｓ．Ｍ．，Ｓａｕｔｅｒ  Ｓ．Ｌ．，Ｊｏｌｌｙ  Ｄ．，Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  Ｔ．Ｗ．Ｊｒ．，Ｓｔａｂｅｒ  Ｐ．Ｄ．，Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  Ｊ．Ａ．＆  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｂ．Ｌ．（２０００）Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＦＩＶ  ａｎｄ  ＡＡＶ５  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１１，２６６９−２６７３．
【非特許文献３】Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ  Ｗ．Ｆ．，Ｒｅｄｄｙ  Ｒ．Ｇ．，Ｗａｒｌｉｃｋ  Ｃ．Ａ．，Ｈａｒｔｕｎｇ  Ｓ．Ｄ．，ＭｃＩｖｏｒ  Ｒ．Ｓ．＆  Ｌｏｗ  Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，４４６−４５７．
【非特許文献４】Ｘｉａ  Ｈ．，Ｍａｏ  Ｑ．，Ｅｌｉａｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．，Ｈａｒｐｅｒ  Ｓ．Ｑ．，Ｍａｒｔｉｎｓ  Ｉ．Ｈ．，Ｏｒｒ  Ｈ．Ｔ．，Ｐａｕｌｓｏｎ  Ｈ．Ｌ．，Ｙａｎｇ  Ｌ．，Ｋｏｔｉｎ  Ｒ．Ｍ．＆  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｂ．Ｌ．（２００４）ＲＮＡｉ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１０，８１６−８２０．
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、小脳プルキンエ細胞に高い親和性を持ち、プルキンエ細胞選択的に感染して遺伝子発現するウイルスベクターを提供することにある。
発明者らは、これまで小脳への遺伝子導入について報告がなかったヒト免疫不全ウイルス由来レンチウイルスベクターを用いて小脳への遺伝子導入実験を行い、ウイルスのプルキンエ細胞選択性は、ウイルス産生時の培養液ｐＨがわずかに酸性側にシフトするだけで急激に低下すること、培養液に添加する血清のＬｏｔによりウイルスのプルキンエ細胞への選択性が異なり、それゆえ血清中の何らかの成分がプルキンエ細胞選択性維持に関与していることを発見した。
さらに、上記の知見に基づき、発明者らは以下のような仮説を立て、その実証を試みた。
（１）培養液のｐＨに依存して変化することから、ｐＨ感受性酵素、おそらく宿主細胞から放出されたプロテアーゼがウイルスの蛋白質（特に、ウイルスエンベロープ上に存在する糖蛋白質）を分解することで、ウイルスのプルキンエ細胞への選択性が低下する。
（２）血清にはプロテアーゼの活性を阻害する物質が含まれており、そのためにウイルスエンベロープの糖蛋白質の分解が抑えられ、プルキンエ細胞への選択性が保たれる。
実際、センダイウイルスやインフルエンザウイルスではプロテアーゼによりエンベロープの糖蛋白質が分解され、細胞への感染性が変化することが知られている。そして、発明者らの実験結果は上記の仮説を支持するものであった。ウイルス産生時の培養液にプロテアーゼ阻害剤を加えることで、プルキンエ細胞に親和性の高いベクターを得ることができた。しかしながら、プルキンエ細胞以外の細胞にも全体の１〜２割程度は感染し、遺伝子発現を誘導する。そこで、完全にプルキンエ細胞だけで遺伝子発現が誘導されるように、ウイルスベクターに組み込まれているプロモーターを非選択的なＣＭＶあるいはＭＳＣＶプロモーターからＬ７プロモーターへの変更を検討した。その際、従来のＬ７プロモーターは３ｋｂの長さがあるため、これより短い種々の長さのものを調整し、ウイルスプラスミドに組み込んだ。これらのウイルスプラスミドを用いて、ウイルスベクターを得、生体マウス小脳に接種して検討した。その結果、配列番号３又は４で示される塩基配列を有する改変型Ｌ７プロモーターを組み込んだウイルスベクターでは、プルキンエ細胞だけに遺伝子発現が見られ、かつその発現程度も従来のＬ７プロモーターよりはるかに高いことがわかった。
すなわち、本発明は、ウイルス由来ベクタープラスミドに配列番号３又は４で示される塩基配列を有する改変型Ｌ７プロモーターを、外来遺伝子に機能しうる態様で連結して成る小脳プルキンエ細胞指向性ベクターに関する。
用いられるウイルス由来ベクタープラスミドとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、及びレンチウイルス由来のベクタープラスミドが挙げられ、プロテアーゼ阻害剤の効果に関してはエンベローブの糖蛋白質がＶＳＶ−Ｇであることが望ましい。
前記ベクターによって産生されるウイルスの蛋白質、特にウイルスエンベロープ上に存在する糖蛋白質は、実質的に分解修飾を受けていない状態にあることが望ましい。
前記ウイルスエンベロープ上に存在する糖蛋白質が実質的に分解修飾を受けていない状態にあるベクターは、プロテアーゼ阻害剤を含む培養液中で宿主細胞にウイルスを産生させることにより得ることができる。前記プロテアーゼ阻害剤としては、カテプシンＫ阻害活性を有するもの（カテプシンＫ阻害剤やカテプシン阻害剤）が好ましい。
ウイルス産生時の培養液のｐＨは、７．２〜８．０に維持されることが望ましい。
また、感染防止等の安全性の点から、前記培養液は血清を含まないことが望ましい。
本発明はまた、レンチウイルスベクタープラスミドに外来遺伝子を機能しうる態様で連結して成る小脳プルキンエ細胞指向性ベクターであって、前記ベクターによって産生されるウイルスの蛋白質、特にウイルスエンベロープ上に存在する糖蛋白質が、実質的に分解修飾を受けていない状態にあることを特徴とするベクターも提供する。ウイルスエンベロープ上に存在する糖蛋白質が実質的に分解修飾を受けていない状態にあるベクターは、上記した方法によって得ることができる。
ウイルスベクターに導入される外来遺伝子としては、プルキンエ細胞障害性疾患の治療用遺伝子や当該疾患遺伝子が挙げられる。このような遺伝子を導入することで、本発明のベクターはプルキンエ細胞障害性疾患の遺伝子治療やモデル動物の作製に用いることができる。
前記治療用遺伝子の具体例としては、たとえば、ＧＴＰａｓｅ  ＣＲＡＧ、ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆａｃｔｏｒ  Ｅ４Ｂ（ＵＦＤ２ａ）、ＡＴＰａｓｅ  ＶＣＰ／ｐ９７、ＨＤＪ−２、ＨＳＤＪ及びＢｉＰを含む分子シャペロン、ＹＡＰｄｅｌｔａＣを含む細胞死抑制分子、ＥＲ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＤＥＭ）を含む小胞体蛋白質分解促進分子、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＯＡＳＩＳ、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ及びＡＴＦ６を含むＥＲセンサー分子（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）、スフィンゴミエリナーゼ、ＡＴ−ｍｕｔａｔｅｄ（ａｔｍ）、Ｒｅｅｌｉｎ、Ｂｃｌ−２、ネプリライシン、ＢＤＮＦ、ならびにＮＧＦをコードする遺伝子、あるいはａｔａｘｉｎ−１、ａｔａｘｉｎ−２、ａｔａｘｉｎ−３、α１ａ電位依存型カルシウムチャネル、ＰＫＣγをコードする遺伝子のｓｉＲＮＡを挙げることができる。
また、前記疾患遺伝子の具体例としては、たとえば、異常伸長したＣＡＧリピートを持つａｔａｘｉｎ−１、ａｔａｘｉｎ−２、ａｔａｘｉｎ−３、ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、もしくはα１ａ電位依存型カルシウムチャネルをコードする遺伝子、又は変異を持つＰＫＣγをコードする遺伝子を挙げることができる。
本発明は、上記した小脳プルキンエ細胞指向性ベクターを含む、小脳プルキンエ細胞障害性疾患の治療用医薬組成物も提供する。
前記小脳プルキンエ細胞障害性疾患としては、たとえば、脊髄小脳変性症やハンチントン病を含むポリグルタミン病、ニーマンピック病、毛細血管拡張性運動失調症、自閉症、アルツハイマー病、胎児アルコール症候群（ＦＡＳ）、アルコール中毒、加齢性小脳失調を挙げることができる。
本発明はまた、本発明のベクターを導入された非ヒト哺乳動物を提供する。特に、プルキンエ細胞を障害する遺伝子（異常伸長したＣＡＧリピートを持つａｔａｘｉｎ−１、ａｔａｘｉｎ−２、ａｔａｘｉｎ−３、ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、もしくはα１ａ電位依存型カルシウムチャネルをコードする遺伝子、又は変異を持つＰＫＣγをコードする遺伝子を導入され、当該遺伝子をプルキンエ細胞特異的に発現する非ヒト哺乳動物は、前記した小脳プルキンエ細胞障害性疾患のモデル動物として用いることができる。
本発明はまた、レンチウイルスプラスミドベクターに外来遺伝子を機能しうる態様で連結して宿主細胞に導入し、前記細胞をプロテアーゼ阻害剤を含む培養液中で培養してウイルスを産生させることを特徴とする、プルキンエ細胞指向性ウイルスベクターの作製方法を提供する。あるいは、ウイルス由来ベクタープラスミドに配列番号３又は４で示される塩基配列を有する改変型Ｌ７プロモーターを、外来遺伝子に機能しうる態様で連結し、前記細胞をプロテアーゼ阻害剤を含む培養液中で培養してウイルスを産生させることを特徴とする、プルキンエ細胞指向性ウイルスベクターの作製方法を提供する。
さらに本発明は、カテプシンＫ阻害活性を有する物質を含んで成る、プルキンエ細胞指向性ウイルスベクター作製用培養液や、そのような培養液（カテプシンＫ阻害活性を有する物質と細胞培養液、またはカテプシンＫ阻害活性を有する物質を含む細胞培養液）を構成要素として含む、プルキンエ細胞指向性ウイルスベクター作製用キットも提供する。
本発明で用いられる改変型Ｌ７プロモーターは、従来のＬ７プロモーターのおよそ３分の１のサイズであるため、ベクターに組込みうる外来遺伝子のサイズは大幅に拡大する。しかも、同じコピー数が染色体に組み込まれた場合、従来のＬ７プロモーターよりもはるかに高いプロモーター活性を持ち、強力に下流に配置された外来遺伝子の発現を誘導する。
よって、本発明によれば、小脳で最も重要なプルキンエ細胞に選択的に、かつ高効率で遺伝子発現が可能となる。これにより、基礎研究においては、小脳が司る運動学習、協調運動のメカニズムを分子レベルで解明するための研究が大きく進展することが期待される。また、遺伝子治療をはじめとする臨床応用においては、プルキンエ細胞選択的な遺伝子導入が可能となり、他の神経細胞やグリア細胞への遺伝子導入および発現に伴う副作用の軽減が期待される。さらに、本発明では、ウシ血清を使用することなくベクターを調製しうるため、牛海綿状脳症などの感染の問題もなく、血清のＬｏｔに依存することなく、安定してプルキンエ細胞指向性ベクターを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ｐＣＬ２０ｃ  ＭＳＣＶ−ＧＦＰの構造を示す。
図２は、（Ａ）実施例１の実験手順、（Ｂ）トランスフェクション後４０時間でウイルスを回収する直前のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＧＦＰの発現、及び（Ｃ）トランスフェクション後６４時間でウイルスを回収する直前のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＧＦＰの発現を示す蛍光顕微鏡画像である。
図３は、（左）トランスフェクション後４０時間で回収したウイルス、（中）トランスフェクション後６４時間で回収したウイルス、（右）トランスフェクション後４０時間のウイルスを含む培養液に希塩酸を加えてｐＨを７．０に調節した後に回収したウイルス、を接種して１週間後の小脳皮質の全ＧＦＰ発現細胞における各細胞の割合（％）を示したグラフである。図中、（Ａ）プルキンエ細胞（Ｐｕｒｋｉｎｅｊｅ  ｃｅｌｌｓ）、（Ｂ）バーグマングリア（Ｂｅｒｇｍａｎ  ｇｌｉａｓ）、（Ｃ）星状細胞／籠細胞（Ｓｔｅｌｌａｔｅ  ＆  Ｂａｓｋｅｔ  ｃｅｌｌｓ）、（Ｄ）判別不能（Ｕｎｋｎｏｗｎ  ｃｅｌｌｓ）を示す。
図４は、トランスフェクション後４０時間のウイルスを含む培養液に希塩酸を加え、ｐＨを７．０に調節した後に回収したウイルスを接種後一週間の、小脳皮質分子層におけるＧＦＰの発現を示す共焦点レーザー顕微鏡画像である。図中（Ａ）バーグマングリア（矢印）に選択的なＧＦＰの発現を認める。プルキンエ細胞はＧＦＰの発現がなく、黒く抜けて見える（矢頭）。（Ｂ）（Ａ）の拡大像。（Ｃ）グリア細胞マーカーであるＧＦＡＰに対する抗体を用いた２重染色像。ＧＦＰの発現はＧＦＡＰの分布（赤）と重なる。（Ａ）のスケールバー１００μｍ、（Ｂ）のスケールバー５０μｍ
図５は、Ｌｏｔの異なる８種のウシ血清を用いて産生、回収したウイルスを小脳に接種し、一週間後の脳の蛍光実体顕微鏡写真、及びその矢状断におけるＧＦＰの発現の様子を示す共焦点レーザー顕微鏡画像である。
図６は、２０倍の対物レンズを用いた観察視野における、ＧＦＰを発現している全細胞中のプルキンエ細胞の割合（％）を示すグラフである。
図７は、２０倍の対物レンズを用いた観察視野における、全プルキンエ細胞中のＧＦＰ発現プルキンエ細胞の割合（％）を示すグラフである。
図８は、ＧＦＰと融合した脊髄小脳変性症３型遺伝子ａｔａｘｉｎ−３［Ｑ６９］を発現するウイルスのプロウイルス部分の構造を示した模式図（Ａ）、このウイルスを小脳に接種後、２ヶ月して施行したロータロッドテストの結果（Ｂ）、このマウスのプルキンエ細胞内のＧＦＰ融合ａｔａｘｉｎ−３［Ｑ６９］凝集塊（Ｃ）、を示す。
図９は、プルキンエ細胞特異的Ｌ７プロモーター制御下で、脊髄小脳変性症３型遺伝子ａｔａｘｉｎ−３［Ｑ６９］を発現するマウス作出に用いたコンストラクトの模式図（Ａ）、作出した３ライン（ａ，ｂ，ｃ  ｌｉｎｅ）の脊髄小脳変性症３型モデルマウスにおける、生後３週から１４週にかけてのロータロッドテストの成績（Ｂ）、生後８０日の野生型マウスの脳矢状断（Ｃ）、同週齢の脊髄小脳変性症３型モデルマウスｂ  ｌｉｎｅの脳矢状断（Ｄ）、を示す。
図１０は、Ｆｌａｇタグを付加したＣＲＡＧ、あるいはＶＣＰ（Ｃ５２２Ｔ）（ＶＣＰ／ｐ９７の５２２番目のシステインをスレオニンに置換したもの）を発現するウイルスベクターのプロウイルス部分の構造を示した模式図（Ａ）、このウイルスベクターの脊髄小脳変性症３型モデルマウスの小脳への接種を示す模式図（Ｂ）、ｃ  ｌｉｎｅのモデルマウスの小脳にＣＲＡＧ発現ウイルスを接種した後８週間までのロータロッドの成績（Ｃ）、ｂ  ｌｉｎｅのモデルマウスの小脳にＧＦＰ、ＣＲＡＧ、あるいはＶＣＰ（Ｃ５２２Ｔ）発現ウイルスを接種後４週間と８週間で行ったロータロッドの成績（Ｄ）（Ｃ，Ｄともロッドは止まった状態からスタートし、１８０秒後に４０回転／分の速度となる）、ｂ  ｌｉｎｅのモデルマウスの小脳にＧＦＰ、ＣＲＡＧ、あるいはＶＣＰ（Ｃ５２２Ｔ）発現ウイルスを接種後８週間で行った定速（５回転／分）ロータロッドの成績（Ｅ）、を示す。
図１１は、何も接種していない（Ａ，Ｂ）、ＣＲＡＧ（Ｃ，Ｄ）、あるいはＶＣＰ（Ｃ５２２Ｔ）（Ｅ，Ｆ）発現ウイルスを接種後、８週間で灌流固定して作製した小脳切片を、抗ＨＡタグ抗体を用いて免疫組織染色したもの（Ａ，Ｃ，Ｅ）、それらを抗カルビンディン抗体による二重免疫組織染色の像と重ね合わせたもの（Ｂ，Ｄ，Ｅ）、それぞれの切片の小脳皮質における封入体の数（Ｇ）、それぞれの切片における分子層の厚さ（Ｈ）、を示す。
図１２は、Ｌ７プロモーターＬ（７−１）及びその各種改変型（Ｌ７−２〜Ｌ７−７）の構造を示す模式図を示す。
図１３は、Ｌ７−４プロモーターをレンチウイルスベクタープラスミド（ｐＣＬ２０ｃ）に挿入し、その下流に緑色蛍光タンパク質ＧＦＰを配置したプラスミドｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７−４−ＧＦＰの模式図を示す。
図１４は、種々のプロモーターを用いたときのプルキンエ細胞へのＧＦＰの発現割合を示す。（ａ）全ＧＦＰ発現細胞中のプルキンエ細胞の割合：ＧＦＰ発現プルキンエ細胞数／ＧＦＰ発現細胞数（ｂ）全プルキンエ細胞中のＧＦＰ発現プルキンエ細胞の割合：ＧＦＰ発現プルキンエ細胞数／全プルキンエ細胞数
図１５は、（ａ）種々のプロモーターを組み込んだレンチウイルスベクターを用いて培養小脳プルキンエ細胞にＧＦＰを発現させたときの蛍光強度の比較、（ｂ）ＣＭＶプロモーター制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターをさまざまなＭＯＩでＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させたときのＧＦＰ蛍光強度を示す。
図１６は、種々のプロモーターを組み込んだレンチウイルスベクターを用いて、培養小脳プルキンエ細胞にＧＦＰ遺伝子を発現させたときの蛍光免疫染色写真を示す。
図１７は、生体小脳への遺伝子導入の結果を示す。（ａ−ｄ）は、レンチウイルスベクターを用いて、従来のＬ７プロモーター（Ｌ７−１）制御下でＧＦＰを発現させたときのＧＦＰの蛍光写真、（ｃ），（ｄ）は抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫染色した写真（これにより蛍光は増強する）、（ｅ−ｈ）はＬ７−４プロモーターを用いた場合の小脳プルキンエ細胞のＧＦＰ蛍光写真を示す。
なお、上記図面のグラフ中、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  ｌｅａｓｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００６−０６２１９２号及び特願２００６−１９８３９８号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
１．プルキンエ細胞指向性ベクター
本発明にかかる「プルキンエ細胞指向性ベクター」（以下、「本発明のベクター」という）とは、小脳プルキンエ細胞に高い親和性を有し、プルキンエ細胞特異的に遺伝子導入を行うことができるベクターであって、小脳に存在するバーグマングリア、星状細胞、籠細胞等の他の神経細胞やグリア細胞よりも、プルキンエ細胞に対して高い選択性を有するベクターである。
本発明のベクターは、ウイルス由来プラスミドベクターに改変型Ｌ７プロモーターと外来遺伝子を機能しうる態様で連結して成る。あるいは、レンチウイルスプラスミドベクターに適当なプロモーターと外来遺伝子を機能しうる態様で連結して成る。
ここで、ウイルス由来プラスミドベクターとは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、及びレンチウイルス由来のプラスミドベクターを含み、特にプルキンエ細胞に対する選択性が高いアデノ随伴ウイルスとレンチウイルス由来のプラスミドベクターが好ましく、レンチウイルスベクターが最も好ましい。
「レンチウイルス」とは、逆転写酵素を有するＲＮＡウイルスの１つであって、非分裂細胞にもサイトカイン刺激なしに高効率で感染し、宿主染色体にウイルスゲノムを組み込むことができる。そのため、レンチウイルス由来のベクターは、哺乳動物への遺伝子導入用ベクターとして汎用されている。レンチウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヒツジ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディウイルス等が知られているが、ベクターとしては、一般にヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルスに由来するものが使用されている。
レンチウイルスのウイルス粒子は、２本のプラス鎖ＲＮＡとこれを囲むコア蛋白質（ｇａｇ蛋白質）、コアを囲むマトリックス、さらにその外側を囲む脂質二重膜で構成される。コアの中には、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、インテグラーゼ、プロテアーゼが含まれ、脂質二重膜には糖蛋白質であるエンベロープ蛋白質がスパイクしている。
ウイルスの感染、宿主中での増殖には、上記した蛋白質が複雑に関与する。特に、ウイルスエンベロープ上の糖蛋白質はウイルスの感染性に非常に重要であり、インフルエンザウイルスでは、この糖蛋白質が酵素により切断されることで感染性が変化することが知られている。ＨＩＶはＣＤ４陽性細胞にしか感染できないが、ＨＩＶ由来レンチウイルスベクターではさまざまな種類の細胞への感染を可能にするため、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＶＳＶ−Ｇ）ＶＳＶ−Ｇに置換されている。したがって、ＨＩＶ由来レンチウイルスベクターのプルキンエ細胞選択性についても、このＶＳＶ−Ｇが深く関与していることが予測される。
レンチウイルスプラスミドベクターは、通常２〜４つのコンポーネント［パッケージング（パッケージングプラスミド、ＲＥＶプラスミド）、エンベロープ、ベクター］から構成される。このうちパッケージングプラスミドは、エンベロープ以外のウイルス粒子形成に必要な蛋白質を供給するが、宿主内で複製できないよう、複製に必要なｔａｔ−ｒｅｖ領域を破壊したり、ｔａｔあるいはｒｅｖの一方を削除して他方を別なプラスミドに移している。エンベローププラスミドはエンベロープ形成に必要な蛋白質を供給するが、上述のごとくＨＩＶのエンベロープではＣＤ４陽性細胞にしか感染できないため、その蛋白質をＶＳＶ−Ｇに置換されている。ベクタープラスミドは、ＬＴＲ、パッケージングシグナル、逆転写に必要なプライマー結合部位を含む。汎用されているベクタープラスミドでは、安全性を高めるために、ＬＴＲのエンハンサー／プロモーター部分を削除し、代わりにＣＭＶプロモーター等の外来のプロモーターを組み込んでいる。
特に好ましい態様として、本発明ではプルキンエ細胞での外来遺伝子の適切かつ効率的な発現のために、前記外来プロモーターとして、改変型Ｌ７プロモーター使用する。この改変型Ｌ７プロモーターについては次項で詳述する。
本発明のベクターでは、レトロウイルスプラスミドベクターにプロモーター、特に改変型Ｌ７プロモーターと外来遺伝子が機能しうる態様で連結されている。ここで「機能しうる態様」とは、前記外来遺伝子が感染宿主に導入され、そこで適切に発現されることを意味する。
前記「外来遺伝子」は、レトロウイルスが本来有していない遺伝子であって、研究のためのレポーター遺伝子（ＧＦＰ遺伝子など）のほか、遺伝子治療のための治療用遺伝子や疾患モデルマウス作出のための疾患遺伝子が用いられる。これら「治療用遺伝子」及び「疾患遺伝子」については、後で詳述する。
本発明のベクターによって産生されるウイルスは、その蛋白質が実質的に分解修飾されていない状態にあることが望ましい。特に、ウイルスエンベロープ上に存在する糖蛋白質ＶＳＶ−Ｇが実質的に分解修飾されていない状態にあることが望ましい。これは、上述したように、ウイルスの蛋白質は感染や宿主での増殖において重要なはたらきをしているからであり、実際、発明者らはウイルス産生のための培養液にプロテアーゼを添加しておくことで、そのプルキンエ細胞選択性が大きく向上することを実証した。したがって、「実質的に」分解修飾されていない状態とは、ウイルスの産生から使用時まで、ウイルス蛋白質が１００％分解修飾されないことを厳密に要求したものではなく、その目的（プルキンエ細胞指向性）が達成される範囲において、影響を与えない程度の微細な不可避的に生じる分解修飾を許容する意味である。
２．改変型Ｌ７プロモーター
本発明で用いられる改変型Ｌ７プロモーターは、従来の３ｋｂの長さを持つ小脳プルキンエ細胞特異的Ｌ７プロモーター（配列番号１）を基に、約３分の１の長さ（１ｋｂ）で細胞特異性を保持したまま、より強い活性を持つプロモーター領域として同定されたものである。
具体的には、本発明の改変型Ｌ７プロモーターは、配列番号３（Ｌ７−３）又は配列番号４（Ｌ７−４）に示される塩基配列を有する。しかしながら、これらの配列に限定されず、配列番号３又は４で示される塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡもまた、それが前記改変型Ｌ７プロモーターと同等の塩基長（９００ｂｐ〜１５００ｂｐ程度）を有し、かつ同等のプルキンエ細胞特異的プロモーター活性を有する限り、本発明の改変型Ｌ７プロモーターに包含される。少なくとも配列番号４に示されるＬ７−４プロモーター配列を含む限り、Ｌ７プロモーター配列（配列番号１）上の連続した１００６ｂｐ〜１５００ｂｐの任意の断片、とくに配列番号４に示されるＬ７−４プロモーター配列を含むＬ７−３プロモーター配列（配列番号３）上の連続した１００６〜１３１９ｂｐの任意の断片は、本発明の改変型Ｌ７プロモーターとして利用可能なことは理解できるであろう。
なお、本明細書において、前記「ストリンジエントな条件」とは、６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５ｘデンハルトと１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ホルムアミドを含む溶液中、配列番号１に示される塩基配列からなる核酸とともに５５℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２ｘＳＳＣ、よりストリンジエントには、０．１ｘＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、３７℃以上、ストリンジエントには、４２℃以上、よりストリンジエントには、５０℃以上、より一層ストリンジエントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件により達成されうる。
３．プルキンエ細胞指向性ベクターの調製
本発明のベクターは、たとえば、ウイルスベクタープラスミドに治療用遺伝子を機能しうる態様で連結させ、適当な宿主細胞にトランスフェクションし、これをプロテアーゼ阻害剤を含む培養液中で培養して、ウイルスを産生させることにより作製される。
前記「宿主細胞」としては、通常ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等が用いられる。ベクタープラスミドのトランスフェクションは、カルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０−２１１４（１９７２）］や、エレクトロポレーション法等、公知の方法を用いて、前項に記載したベクターシステムを構成するすべてのプラスミド（パッケージング、エンベロープ、ベクター）を宿主細胞に導入することにより達成される。
ウイルスを培養するための培養液はとしては、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｄ−ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２等、公知の培養液を培養する細胞に合わせて適宜選択して用いることができる。
前記培養液に加えるプロテアーゼ阻害剤は特に限定されないが、カテプシンＫ阻害活性を有するものを好適に用いることができる。そのような物質としては、市販のカテプシンＫ阻害剤：たとえば、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩＩ（いずれも、メルク  カルビオケム社製等）のほか、カテプシン阻害剤：たとえば、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩＩ（いずれも、メルク  カルビオケム社製等）を使用することができる。
前記培養液は、ウイルス産生時においてｐＨ７．２〜ｐＨ８．０が維持されていることが好ましい。これ以下のｐＨではベクターのプルキンエ細胞指向性（選択性）が低下し、これ以上のｐＨでは細胞の増殖が悪くなるからである。細胞の増殖につれて、培養液のｐＨは酸性にシフトするため、培養液中にはプロテアーゼ阻害剤のほか、ＨＥＰＥＳ等のｐＨ低下を防ぐ効果のある試薬を適宜加えてもよい。
宿主細胞の培養は、一般には３〜１０％ＣＯ２、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ２、３７℃、の条件下で行われるが、これに限定されるものではない。トランスフェクション後の培養期間は、特に限定されないが、少なくとも２４時間、長い場合は２１６時間、好ましくは３６から７２時間、より好ましくは４０から４８時間程度である。
なお、インビトロシェン社製のレンチウイルスベクター（商品名：ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ）を用いる場合は、そのまま使用するとあまり高い力価は得られないが、該ベクターからＳＶ４０プロモーターとＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅ耐性遺伝子を除去することで、高力価（１０７ＴＵ／ｍｌ）を得ることができる（特願２００５−２３１５１４参照）。
４．プルキンエ細胞指向性ベクターによる遺伝子治療
本発明のベクターは、プルキンエ細胞に対する親和性、選択性が極めて高いため、プルキンエ細胞への送達ベクターとして、遺伝子治療に有用である。すなわち、本発明のベクターは、プルキンエ細胞における障害を病因とする「プルキンエ細胞障害性疾患」の治療用医薬組成物として有用である。前記医薬組成物は、本発明のベクターを薬理学的に許容しうる担体とともに適当なバッファーに溶解・懸濁することによって調製され、小脳皮質及び／あるいは小脳表面のクモ膜下腔に注入される。
前記「プルキンエ細胞障害性疾患」としては、脊髄小脳変性症やハンチントン病を含むポリグルタミン病、ニーマンピック病、毛細血管拡張性運動失調症、自閉症、アルツハイマー病、胎児アルコール症候群（ＦＡＳ）、アルコール中毒、ならびに加齢性小脳失調を挙げることができる。
本発明のベクターに連結される「治療用遺伝子」とは、プルキンエ細胞で発現された場合、前記したプルキンエ細胞障害性疾患の治療に有用な遺伝子であって、その治療対象とする疾患に合わせて、以下のように選択することができる。
ポリグルタミン病の治療を目的とした場合は、ＧＴＰａｓｅ  ＣＲＡＧ（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００６  Ｆｅｂ  １３；１７２（４）：４９７−５０４．）、ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆａｃｔｏｒ  Ｅ４Ｂ（ＵＦＤ２ａ）（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２００４  Ｆｅｂ  １１；２３（３）：６５９−６９．）、ＡＴＰａｓｅ  ＶＣＰ／ｐ９７（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００１  Ｏｃｔ；８（１０）：９７７−８４．）、分子シャペロンＨＤＪ−２  ＨＳＤＪ（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９８  Ｊｕｎ；１９（２）：１４８−５４．）や分子シャペロンＢｉＰ（Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８８  Ｍａｒ  ３１；３３２（６１６３）：４６２−４．）、小胞体蛋白質分解を促進する分子：ＥＲ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＤＥＭ）（Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３  Ｆｅｂ  ２８；２９９（５６１１）：１３９４−７．）、ＥＲのセンサー分子（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ（ＥＲ）ｓｔｒｅｓｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）：ＣＲＥＢ／ＡＴＦ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ＯＡＳＩＳ（Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００５  Ｆｅｂ；７（２）：１８６−９４．）、ＩＲＥ１（Ｗｅｌｉｈｉｎｄａ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｊｕｌ  ２６；２７１（３０）：１８１８１−７．）、ＰＥＲＫ，ＡＴＦ６（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８  Ｄｅｃ  １１；２７３（５０）：３３７４１−９．）をコードする遺伝子を用いることができる。
また、脊髄小脳変性症１型、２型、６型の治療を目的とした場合は、ａｔａｘｉｎ−１、ａｔａｘｉｎ−２、α１ａ電位依存型カルシウムチャネル、ＰＫＣγ遺伝子をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ハンチントン病の治療を目的とした場合は、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎに対するｓｉＲＮＡを用いて、これら遺伝子の発現を抑制してもよい。
ニーマンピック病の治療を目的とした場合は、スフィンゴミエリナーゼをコードする遺伝子を治療用遺伝子として用いることができる。毛細血管拡張性運動失調症の治療を目的とした場合は、ＡＴ−ｍｕｔａｔｅｄ（ａｔｍ）、自閉症の治療を目的とした場合は、ＲｅｅｌｉｎやＢｃｌ−２をコードする遺伝子を治療用遺伝子として用いることができる。アルツハイマー病の治療を目的とした場合は、ネプリライシンをコードする遺伝子を治療用遺伝子として用いることができる。さらに、胎児アルコール症候群（ＦＡＳ）、アルコール中毒、及び加齢性小脳失調の治療を目的とした場合は、Ｂｃｌ−２、ＤＮＦ、ＮＧＦをコードする遺伝子を治療用遺伝子として用いることができる。
こうした遺伝子治療の薬理評価は、治療対象となる疾患の種類により異なるが、脊髄小脳変性症の場合、ベクターを、小脳皮質及び／あるいは小脳表面のクモ膜下腔に投与した後、細胞学的にはプルキンエ細胞、星状細胞や籠細胞を含む小脳の神経細胞の変性脱落の防止によって、さらに臨床的（動物の場合は行動学的）には小脳失調の改善程度により行うことができる。
本発明の医薬組成物は、好ましくは、小脳表面のクモ膜下腔に注入することにより、投与される。注入されたベクターは、注入部位周辺のプルキンエ細胞のみに限局することなく、プルキンエ細胞全体に高い親和性で、かつ広範囲に治療用遺伝子を送達することができる。また、小脳表面のクモ膜下腔への本発明のベクターの注入は、ヘルペスウイルスやアデノ随伴ウイルスで報告された脳深部に位置する下オリーブ核や小脳核への注入に比べて簡便で、脳実質の損傷を抑制できるため、臨床応用に優れる。
投与にあたっては、注入の際、脳圧を安定して維持させる観点から、好ましくは、一定した速度で注入可能な手段、例えばマウスでは、ハミルトンシリンジとそれを取りつけることができるマイクロマニピュレーター及び注入のためのマイクルインジェクションポンプ等を用いることが望ましい。注入速度及び投与量は、脳圧を安定して維持できる範囲であれば特に限定されるものではなく、個体の年齢、体重、疾患状態等に応じて、適宜設定され得る。例えばマウスの場合、１０ｎｌ／分〜８００ｎｌ／分、好ましくは、５０ｎｌ／分〜４００ｎｌ／分、より好ましくは、１００ｎｌ／分〜２００ｎｌ／分、計２〜８μｌであることが望ましい。
本発明の医薬組成物の投与量は、治療効果を発揮させるに適した量であれば特に限定されるものではなく、個体の年齢、体重、疾患状態等に応じて、適宜設定され得る。また、本発明の治療剤の投与回数は、治療効果を発揮させるに十分な回数であればよい。アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスおよびレンチウイルスを用いた場合、長期の遺伝子発現が確認されているため１回の投与でもよいが、組み込まれる遺伝子のコピー数を増加させ、より広範囲の細胞に導入させるためには、治療効果を見ながら、小脳表面の場所を変更して３回程度投与してもよい。
５．小脳プルキンエ細胞障害性疾患のモデル動物
本発明のベクターを非ヒト哺乳動物のクモ膜下腔に注入することにより、対象動物のプルキンエ細胞特異的に特定遺伝子の発現を抑制したり、過剰発現させることができる。
使用可能な非ヒト哺乳動物は、特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サルを挙げることができる。特にマウス、ラット以外の動物ではトランスジェニックマウスを作出するのが極めて困難であるため、本発明のベクターの使用は非常に有効である。
たとえば、本発明のベクターに外来遺伝子として、前記した小脳疾患遺伝子（異常伸長したＣＡＧリピートを持つａｔａｘｉｎ−１、ａｔａｘｉｎ−２、ａｔａｘｉｎ−３、α１ａ電位依存型カルシウムチャネル、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎをコードする遺伝子や変異を持つＰＫＣγをコードする遺伝子（Ｋｌｅｂｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃｇａｍｍａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  １４．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００５  Ｎｏｖ；５８（５）：７２０−９）などを非ヒト哺乳動物に導入して発現させれば、当該遺伝子が関与する小脳プルキンエ細胞障害性疾患を発症させることができる。このようなトランスジェニック動物は、小脳プルキンエ細胞障害性疾患のモデル動物や小脳機能研究用モデル動物として有用である。
６．プルキンエ細胞指向性ウイルスベクター作製用培養液及びキット
本発明はまた、カテプシンＫ阻害活性を有する物質を含んで成る、プルキンエ細胞指向性ウイルスベクター作製用培養液や、そのような培養液（カテプシンＫ阻害活性を有する物質と細胞培養液、またはカテプシンＫ阻害活性を有する物質を含む細胞培養液）を構成要素として含む、プルキンエ細胞指向性ウイルスベクター作製用キットも提供する。
本発明の培養液は、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｄ−ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２等、公知の培養液にカテプシンＫ阻害活性を有する物質を添加して調製される。カテプシンＫ阻害活性を有する物質としては、カテプシンＫ阻害剤：たとえば、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩＩ（いずれも、メルク  カルビオケム社製等）のほか、カテプシン阻害剤：たとえば、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩＩ（いずれも、メルク  カルビオケム社製等）などを適宜用いることができるが、これらに限定されるものではない。
前記培養液は、ウイルス産生時においてｐＨ７．２〜ｐＨ８．０が維持されているように、ＨＥＰＥＳ等のｐＨ低下を防ぐ効果のある試薬を適宜含んでいてもよい。
本発明のキットは、前記した必須の構成要素（カテプシンＫ阻害活性を有する物質と細胞培養液、またはカテプシンＫ阻害活性を有する物質を含む細胞培養液）のほか、ウイルスプラスミドトランスフェクション用の塩化カルシウム溶液やＨａｎｋ’ｓ平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー、ろ過滅菌用フィルター（径０．２２μｍのものなど）等を含んでいてもよい。塩化カルシウムは、たとえば、３６．７６ｇ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏに精製水１００ｍｌを加え、ろ過滅菌することにより調製される。また、Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液（２ｘＨＢＳＳ）は、たとえば、ＮａＣｌ  ８．２ｇ（ｆｉｎａｌ  ０．２８Ｍ）、ＨＥＰＥＳ  ５．９５ｇ（ｆｉｎａｌ  ０．０５Ｍ）、Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．１０８ｇ（ｆｉｎａｌ  １．５ｍＭ）、Ｈ２Ｏ  ４００ｍｌを混合し、５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０５に調製し、精製水を加えて５００ｍｌにすることにより調製される。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：トランスフェクション後の培養時間がウイルスのプルキンエ細胞選択性に与える影響
＜方法＞
（１）ウイルスの産生
以下の操作を、Ｐ２実験室で行なった。ウイルス産生には、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を用いた。培養液は通常用いられている、１０％ウシ血清を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）を使用した。対数増殖期のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（Ｍｇ２＋とＣａ２＋とを含有しない）［ＰＢＳ（−）］に分散させ、ついで、１０ｃｍディッシュ（ファルコン社製）あたり５×１０５細胞となるように播種した。播種後の１０ｃｍディッシュに、１０重量％ウシ胎仔血清含有Ｄ−ＭＥＭ１０ｍｌを添加し、その後、細胞を、５体積％ＣＯ２，３７℃で培養した。２４時間後、前記ディッシュ中の培養液を、新しい培養液（１０重量％ウシ胎仔血清含有Ｄ−ＭＥＭ）１０ｍｌと交換した。その後、細胞を、５体積％ＣＯ２，３７℃で０．５時間培養した。
一方、ｐＣＡＧｋＧＰ１Ｒ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）６μｇ，ｐＣＡＧ４ＲＴＲ２（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）２μｇ，ｐＣＡＧ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）２μｇ，ｐＣＬ２０ｃ  ＭＳＣＶ−ＧＦＰ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ／Ｇｅｏｒｇｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）１０μｇそれぞれを４５０μｌ滅菌水に溶解させ、プラスミド溶液を得た。
・ｐＣＡＧｋＧＰ１Ｒ：ｇａｇ（ウイルスの構造蛋白質をコード）とｐｏｌ（逆転写酵素をコード）を含むパッケージングプラスミド。
・ｐＣＡＧ４ＲＴＲ２：ｔａｔ（転写調節遺伝子）を含むプラスミド。ｒｅｖを削除してあるため、ウイルス粒子は宿主内で複製することができない。
・ｐＣＡＧ−ＶＳＶ−Ｇ：ＶＳＶ−ＧはＶｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎの略。レンチウイルスの本来のＥｎｖｅｌｏｐｅではＣＤ４陽性細胞にしか感染できない。これをリン脂質をターゲットとするＶＳＶ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のＥｎｖｅｌｏｐｅに置換し、神経を含むさまざまな細胞に感染可能としたエンベローププラスミド。
・ｐＣＬ２０ｃ  ＭＳＣＶ−ＧＦＰ：レンチウイルスのメインベクターｐＣＬ２０ｃにおいて、２つのＬＴＲ内にＭＳＣＶプロモーターを配置し、これにＧＦＰ遺伝子を連結させたプラスミド（図１）。
このようにウイルス産生に不可欠な遺伝子を４つのプラスミドに分割し、複製に必要な領域等を削除することにより、産生されたウイルスは感染能を持つ一方、感染後は自己増殖能が欠如するため安全性が増す。
得られたプラスミド溶液に２．５Ｍ  ＣａＣｌ２  ５０μｌを添加して攪拌し、２ｘＨＢＳＳ〔組成：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．０５）〕５００μｌを添加し、すばやく攪拌した。
前記ディッシュにプラスミド溶液を均等に滴下し、穩やかにディッシュ内の培地と混合した。その後、細胞を、５体積％ＣＯ２，３５℃で培養した。以下、バイオハザード対策用安全キャビネットの中で操作を行なった。
１６時間後、前記ディッシュ中の培地を、新しい培地（１０重量％ウシ胎仔血清含有Ｄ−ＭＥＭ）１０ｍｌと交換した。さらに細胞を、５体積％ＣＯ２，３７℃で培養しトランスフェクション後から４０時間でウイルスを含む培養液を回収した（４０ｈ  ｖｉｒｕｓ）。その後、新しい培養液を加えてさらに２４時間培養し、トランスフェクション後６４時間（６４ｈ  ｖｉｒｕｓ）でウイルスを含む培養液を回収した（図２参照）。
（２）濃縮
前記（１）で回収した培地は、それぞれ５０ｍｌ遠心管に移し、１０００ｒｐｍ（１２０×ｇ）、４分間遠心分離して、上清を得た。得られた上清を、フィルター（ミリポア社製、０．２２μｍ径）に通した。得られた濾液を、ベックマン社製ローターＳＷ２８．１を用いた超遠心分離（２５，０００ｒｐｍ，２時間、４℃）に供してウイルス粒子を沈殿させ、上清を除去した。
得られたウイルス粒子沈殿物をＰＢＳ（−）に懸濁し、最終量を２００μｌとし、感染用ウイルス液を得た。なお、すぐに使用しないウイルス液を、２０μｌずつ分注し、−８０℃で保存した。
（３）ウイルス力価の測定
（ｉ）ＧＦＰの蛍光を指標とする方法
対数増殖期のＨＥＬＡ細胞をＰＢＳ（−）に分散させ、ついで、１２ウェルディッシュ（イワキ硝子社製）に１ウェルあたり５ｘ１０４細胞となるように播種した。播種後の１２ウェルディッシュに、１０重量％ウシ胎仔血清含有Ｄ−ＭＥＭを、１ｍｌ／ウェルとなるように添加し、その後、細胞を、５体積％ＣＯ２，３７℃で２４時間培養した。
ウイルス液を１０３〜１０５倍となるように前記ウェル内の培地に添加した。また、同時に、Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製、商品名：ポリブレン）を６μｇ／ｍｌとなるように各ウェルに添加した。その後、細胞を５体積％ＣＯ２，３７℃で８８時間培養した。
ウェルの中の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現細胞を蛍光顕微鏡（オリンパス社製商品名：ＣＫＸ４１）下でセルカウンター（アズワン社製、商品名：数取器）を用いて計測し、ウイルスの力価を算出した。１０Ｘ希釈ウイルス液を添加した中、Ｙ個の細胞のＧＦＰ発現細胞が見出された場合、ウイルス力価は、Ｙ×１０ＸＴＵ／ｍｌ（ＴＵ：ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｕｎｉｔ）として算出される。
（ｉｉ）培養細胞（ＨｅＬａ細胞）のゲノムに組み込まれるプロウイルスのコピー数による評価（Ｉｚｏｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｊａｎ；５４（１）：５４−９．）
ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍディッシュで培養し、播種２４時間後にウイルス液を感染させる。感染３日後に５．０ｘ１０６個の細胞を得た。これと平行して同数のＬＡＶ−８Ｅ５細胞（ＡＴＣＣ社，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を得た。ＬＡＶ−８Ｅ５細胞は１細胞にＨＩＶ１型のプロウイルスを１コピー持っており、これをスタンダードとした。これらの細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、最終的に１００μｌのＴＥバッファーに溶解した。このうち１μｌを用い、ＨＩＶプロウイルスのＲＲＥ（ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に含まれる２９０ベースペアの領域を、以下のプライマーを用いて増幅した：
５’−ＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＡ−３’（配列番号９）、５’−ＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＴＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴ−３’（配列番号１０）。
ゲノムに組み込まれるプロウイルスのコピー数はゲノムＤＮＡを段階希釈して求めた。すなわち、バンドが現れなくなる直前の希釈倍率を決定し、ＬＡＶ−８Ｅ５細胞を用いたスタンダードと比較することで、５．０ｘ１０６個のＨｅＬａ細胞あたり何個のプロウイルスが組み込まれているか（ゲノムコピー数／ウイルス液１ｍｌ）を計算した。
（４）マウス小脳クモ膜下腔へのベクターの接種
マウス（ＳＬＣ供給、４〜１０週齢）に、ペントバルビタール（商品名：ネンブタール）を、腹腔内投与（４０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）にて麻酔し、以下の操作を、バイオハザード対策用安全キャビネットの中で行なった。
麻酔後、マウスを、小動物固定装置〔ナリシゲ社製、商品名：ＳＧ−４〕を用いて固定した。また、体温コントローラー〔ＦＳＴ社製、商品名：体温コントロールシステム（マウス用）ＦＳＴ−ＨＰＳＭ〕にて、マウス体温を３７℃となるように維持した。マウスの頭部の毛を刈った後、Ｂｒｅｇｍａより数ミリ吻側から小脳直上にかけて皮膚を切開した。ついで、実体顕微鏡（ニコン社製、商品名１ＳＭＺ６４５）下で、Ｂｒｅｇｍａより５〜７ｍｍ尾側の正中部の頭蓋骨に、マイクロドリル〔浦和工業社製、商品名：パワーコントローラーＵＣ１００＋ＨＢ１（ドリル）〕を用いて、内径２〜３ｍｍの穴を開けた。また、注射針を用いて、骨の下の硬膜及びクモ膜に穴を開けた。
得られたレンチウイルスベクターを、商品名：レックスフィルマイクロシリンジ（ＷＰＩ社製、１０μｌ容量）に充填し、フレックスフィルマイクロシリンジをマイクロマニピュレーターに取りつけたウルトラマイクロポンプ２（ＷＰＩ社製）にセットした。
マイクロシリンジの針先を小脳直上に開けた硬膜の穴より約０．５ｍｍ刺入し、クモ膜下腔に留置後、前記レンチウイルスベクターを、ウルトラマイクロポンプ２専用デジタルコントローラーＭｉｃｒｏ４（商品名、ＷＰＩ社製）を用いて、１００ｎｌ／分の速度で４０分間、計４μＩ注入した。
注入後、切開したマウスの皮膚を、縫合糸付き眼科用微小針（夏目製作所社製、商品名．眼科用弱弩針Ｃ６７−０）で縫合した。その後、固定装置からマウスをはずし、ヒーティングパッド（昭和精機工業社製、商品名：ゴムマットヒーターＳＧ−１５）上に置いたケージ（安全キャビネット内）で観察した。マウスが、麻酔から覚醒した後、マウスケージをＨＥＰＡフィルター付の感染動物用ラック（トキワ科学器械株式会社製、商品名：バイオクリーンガプセルユニットＴ−ＢＣＣ−Ｍ４）内で飼育した。
接種後７日目のマウスについて、４％ホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で灌流固定後、脳を摘出した。蛍光実体顕微鏡を用いて脳全体の写真とＧＦＰの蛍光写真を撮影後、厚さ５０μｍ、あるいは１００μｍの小脳矢状断切片をマイクロスライサー（堂阪イーエム社製  商品名：ＤＴＫ−１０００）を用いて作製した。作製された脳切片を、一次抗体［Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ（星状細胞、籠細胞のマーカー）：ＳＩＧＭＡ社製、あるいはＭｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＧＦＡＰ（グリア細胞のマーカー）：ケミコン社製、あるいはＭｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮｅｕＮ、顆粒細胞のマーカー）：ケミコン社製、あるいはｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｍＧｌｕＲ２（ゴルジ細胞のマーカー）：生理学研究所重本隆一教授より譲り受け）と共に２４時間室温でインキュベーションし、ついで、二次抗体（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５６８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で２時間、室温でインキュベーションし、顕微鏡用標本を得た。その後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製  商品名：ＤＭＩ  ６０００Ｂ）及び共焦点顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製  商品名：ＬＳＭ５  Ｐａｓｃａｌ）で標本の観察を行なうことにより発現ＧＦＰ蛋白質の局在と発現細胞の種類を調べた。
＜結果＞
トランスフェクション後４０時間で培養液中に放出されたウイルスの接種では、全ＧＦＰ発現細胞のうち約半分（５１％）がプルキンエ細胞であった。バーグマングリア（２２％）、星状細胞／籠細胞（１６％）がこれに続いた（図２及び図３）。一方、トランスフェクション後、４０時間から６４時間で培養液中に放出されたウイルス（６４ｈ  ｖｉｒｕｓ）の接種では、ＧＦＰ発現プルキンエ細胞の割合は１５％、星状細胞／籠細胞（４％）に減少し、バーグマングリアは７７％にまで増加した（図２及び図３）。
表１に示すように、トランスフェクション後４０時間の培養液のｐＨは７．２であるが、トランスフェクション後６４時間後の培養液のｐＨは７．０に低下する。したがって、プルキンエ細胞への親和性の低下は培養液のｐＨの変化によるものではないかと考えた。
【表１】
2007105744.tif 000002
実施例２：プルキンエ細胞選択性に対するウイルス産生時の培養液のｐＨの影響
実施例１の結果に基づき、培養液のｐＨとプルキンエ細胞選択性の関係について検討した。
＜方法＞
実施例１に従い、トランスフェクション後４０時間のウイルスを含む培養液に希塩酸を加えてｐＨを７．０に調節した後、ウイルスを精製し、同様にマウス小脳に接種し、７日後の脳切片を観察した。さらにＨＥＫ２９３ＦＴ細胞より増殖が遅く、したがって培養液の増殖に伴う酸性化も遅いＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて同様の実験を行った。
＜結果＞
トランスフェクション後４０時間の培養液のｐＨ（７．２）を０．２だけ酸性側にシフト（ｐＨ７．０）させ、同じようにウイルスをマウス小脳に接種すると、予想通りトランスフェクション後６４時間で回収したときとほぼ同様の結果を得た。すなわち、ＧＦＰ発現プルキンエ細胞１４％、バーグマングリア７２％、星状細胞／籠細胞１．７％であった（図２の４０ｈ  ｖｉｒｕｓ（ｐＨ↓）、及び図４）。さらにＨＥＫ２９３ＦＴ細胞より育ちの遅いＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いると培養液の酸性化が遅くなり、同じようにウイルスを産生させても、プルキンエ細胞への親和性が高いウイルスが得られることがわかった。このことは細胞膜の構成成分であるリン脂質（フォスファチジルセリン）と結合能を持つＶＳＶ−Ｇエンベロープを用いても、プルキンエ細胞への選択性は、ウイルス産生時の培養液のｐＨに大きく影響されることを示している。
実施例３：プルキンエ細胞選択性に対する血清の影響
＜方法＞
表１に示すＬｏｔの異なる９種のウシ血清を用いて、実施例１と同様の手順でウイルスを産生させ、それぞれのプルキンエ細胞への選択性を検討した。
【表２】
2007105744.tif 000003
＜結果＞
図５に示すとおり、プルキンエ細胞への選択性は血清のＬｏｔの違いにより大きく異なることが明らかになった。さらに血清を加えなかった場合でもウイルスは産生されるが、プルキンエ細胞への選択性が低く、さまざまな細胞に遺伝子発現することが確認された。
実施例４：プルキンエ細胞選択性に対するプロテアーゼ阻害剤の影響
＜方法＞
血清の代わりに、表３に示す様々な種類のプロテアーゼ阻害剤の存在下で、実施例１の手順にしたがいＨＥＫ２９３Ｔ細胞にウイルスを産生させ、精製したウイルスのマウス小脳における遺伝子発現のプルキンエ細胞選択性を検討した。
【表３】
2007105744.tif 000004
ウイルスはすべて１ｘ１０９ＴＵ／ｍｌの力価に合わせた後、マウス小脳に接種し、１週間後に厚さ１００μｍの小脳矢状断切片を作製した。共焦点レーザー顕微鏡（２０倍の対物レンズ）を用いて切片を２μｍの厚みで切片の下から上までスキャンし、ＧＦＰのシグナルを３次元的に再構成した。評価は以下の２つの方法により行った。
（１）観察視野（０．９５ｍｍ２）における、ＧＦＰを発現している全細胞中のプルキンエ細胞の割合（％）を求めた。これはウイルス感染のプルキンエ細胞への選択性（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を表す。
（２）観察視野における、全プルキンエ細胞中のＧＦＰ発現プルキンエ細胞の割合（％）を求めた。これはウイルスのプルキンエ細胞への感染効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を表す。
＜結果＞
（１）プルキンエ細胞への選択性（図６）
血清もプロテアーゼ阻害剤も添加せず、Ｄ−ＭＥＭのみの培地で産生したウイルスベクターでは、プルキンエ細胞への選択性は４８％であった（ＧＦＰを発現している細胞のうち約半分がプルキンエ細胞）。血清を加えた培地で産生させたウイルスでは、選択性が大きく上昇するもの（ＧＩＢＣＯ、メキシコ産血清など）もあったが、ほとんど変わらないもの（ＨｙＣｌｏｎｅ社製血清）もあった。これに対し、血清を加えずにプロテアーゼ阻害剤を用いたものでは、ＴＩＭＰ−１を除く使用した薬剤いずれにおいてもプルキンエ細胞への選択性が大きく上昇した。特にカテプシンＫ阻害剤を加えたもの顕著であった。
（２）プルキンエ細胞の遺伝子発現効率（図７）
血清もプロテアーゼ阻害剤も添加せず、Ｄ−ＭＥＭのみの培地で産生したウイルスベクターでは、プルキンエ細胞への遺伝子発現効率は３７％であった（観察視野の全プルキンエ細胞中３７％の細胞がＧＦＰ遺伝子を発現していた）。選択性の結果とは異なり、プルキンエ細胞における遺伝子発現効率は、使用する血清のＬｏｔを変化させても有意な上昇は見られなかった。同様にプロテアーゼ阻害剤の添加でも、５種類中３種類で有意な上昇は見られなかった。しかし、カテプシンＫを添加したものでは、プルキンエ細胞の遺伝子発現効率は８６％と、著しい上昇が見られた。
以上の結果から、血清を添加する通常のプロトコールでレンチウイルスベクターを産生する場合、ウイルスベクターのプルキンエ細胞への選択性と遺伝子発現効率は培地中のプロテアーゼの働きにより、影響を受けていると考えられた。この現象には、特にシステインプロテアーゼファミリーの一つ、カテプシンＫが大きな役割を果たしていると考えられ、ウイルス産生時の培地にカテプシンＫの阻害剤を加えることで、プルキンエ細胞に極めて選択性が高く、かつ親和性も高いウイルスを産生することが可能となることが明らかとなった。
実施例５：プルキンエ細胞選択性とウイルスＶＳＶ−Ｇに対するカテプシンＫ阻害剤の影響
１．培養液のｐＨと培養液中のカテプシンＫ活性
＜方法＞
実施例１の手順でトランスフェクション後４０時間の培養液（ｐＨ７．２）と６４時間（ｐＨ７．０）の培養液を得る。これら２つの培養液中のカテプシンＫ活性をＣａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（メルク  カルビオケム社製）を用いて測定する。
２．カテプシンＫによるＶＳＶ−Ｇの切断
＜方法＞
４０時間ウイルスと６４時間ウイルスを産生、回収する。またトランスフェクション後４０時間の培養液をカテプシンＫで処理、あるいはｐＨを希塩酸を用いて７．０に低下させた後、ウイルスを回収する。これら４種のウイルスのＶＳＶ−Ｇ蛋白質の切断の状態を、直接アミノ末端シークエンシングを行い、どこで切断されているのか確認する。
３．ウイルスをカテプシンＫで処理することで、プルキンエ細胞選択性が低下すること
＜方法＞
実施例１の手順に従い、トランスフェクション後４０時間でウイルス粒子を含む培養液を得る。この培養液をカテプシンＫで２時間処理する。その後超遠心を行ないウイルスを回収、マウス小脳に接種する。１週間後にウイルスのプルキンエ細胞選択性が低下しているのを確認する。カテプシンＫに関しては、すでにＨＥＫ２９３Ｔ細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて遺伝子を得ている（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からＲＴ−ＰＣＲでカテプシンＫ遺伝子が得られたことは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞がカテプシンＫを発現していることを示している）。さらにカテプシンＫ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、これを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、３日後に培養液を回収したが、この培養液にカテプシンＫが十分量含まれることも、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ抗体（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）を用いたウエスタンブロット法にて確認している。このようにして得られたカテプシンＫを用いてウイルスを処理する。
実施例６：プルキンエ細胞障害遺伝子を用いた疾患モデルマウスの作出
＜方法＞
脊髄小脳変性症３型（ＭＪＤ病）の原因遺伝子はａｔａｘｉｎ−３であり、患者ではこの遺伝子内に存在するＣＡＧリピートが異常伸長している。そこでＣＡＧリピートが異常伸長したａｔａｘｉｎ−３を、レンチウイルスベクターを用いてプルキンエ細胞に発現させることにより、ＭＪＤ病のモデルマウスを作出した。
＜結果＞
ＣＡＧリピートが異常伸長したａｔａｘｉｎ−３をＭＳＣＶプロモーターの制御下で発現するようにベクタープラスミドを作製した（図８Ａ）。次に実施例１の手順に従い、４０時間ウイルスを得た。なお、ウイルス産生の宿主細胞としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。得られたウイルスをマウス小脳に接種し、２ヵ月後に小脳失調の程度をロータロッド（室町機械社製、ＭＫ−６６０Ｃ）にて解析した。ロッド（棒）は停止状態から次第に加速し１８０秒後に４０回転／分の速度になるように調節し、マウスがロッドに乗っている時間を測定した。実験は８回繰り返した。ウイルスで小脳にＧＦＰを発現させたマウスは、ウイルスを接種していないコントロールマウスとロータロッドの成績に差がないことはあらかじめ確認している。これに対して、ウイルスを接種したマウスは、ウイルスを接種していないコントロールのマウスに比べて、有意に短時間でロッドから落下し、運動失調が出現していることが示された（図８Ｂ）。実験終了後、マウスを灌流固定し、小脳切片を作製して観察したところ、プルキンエ細胞内にａｔａｘｉｎ−３の凝集塊が認められた（図８Ｃ矢印）。
このように、ウイルスを用いて小脳疾患原因遺伝子をプルキンエ細胞に発現することにより、小脳疾患モデルマウスの作出が可能であることが示された。
実施例７：脊髄小脳変性症モデルマウスを用いた治療用遺伝子発現ウイルスの治療効果の検討
＜方法＞
プルキンエ細胞特異的Ｌ７プロモーターの制御下で、ＣＡＧリピートが異常伸長した脊髄小脳変性症３型遺伝子ａｔａｘｉｎ−３［Ｑ６９］を発現するように配置したＤＮＡコンストラクト（図９Ａ）を作製した。これをマウス受精卵に接種し、小脳プルキンエ細胞特異的にａｔａｘｉｎ−３［Ｑ６９］を高発現するトランスジェニックマウス（脊髄小脳変性症モデルマウス）を３ライン得た。これらのマウスの小脳に治療用遺伝子候補であるＣＲＡＧ、あるいはＶＣＰ／ｐ９７の５２２番目のシステインをスレオニンに変換したＶＣＰ（Ｃ５２２Ｔ）を発現するウイルスベクター（図１０Ａ）を接種し、運動失調が回復するかを観察した（図１０Ｂ−Ｅ）。
＜結果＞
得られた３つのラインの脊髄小脳変性症モデルマウスのうち、ａ  ｌｉｎｅとｂ  ｌｉｎｅは生後すぐの時点から運動失調が極めて強く（図９Ｂ）、小脳の萎縮も顕著であった（図９Ｃ，Ｄ）。これに対し、ｃ  ｌｉｎｅの運動失調の程度は野生型とａ，ｂ  ｌｉｎｅと野生型の中間であった（図９Ｂ）。生後３０日のｃ  ｌｉｎｅのモデルマウスの小脳にＣＲＡＧを発現するウイルスを接種し、１週間おきにロータロッドテスト（ロッドは静止状態から、１８０秒で４０回転／分まで加速）を施行した。接種１週間後では、接種していないモデルマウスとほとんど差は認められなかった。しかしその後、ウイルスを接種したマウスは徐々に成績が向上した（図９Ｄ）。すなわち、ウイルスを用いたプルキンエ細胞選択的なＣＲＡＧの発現により、脊髄小脳変性症３型モデルマウスの運動障害が顕著に回復した。より運動失調が強いｂ  ｌｉｎｅマウス（生後２１日）にＣＲＡＧまたはＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを接種したところ、４週後にロータロッドの成績の有意な回復が観察された（図１０Ｄ）。８週後にはさらに長い間加速するロータロッドに乗ることができた（何も接種していないマウスとＧＦＰ発現レンチウイルスベクターを接種したマウスでは、２０秒弱しかのることができなかったのに対し、ＣＲＡＧ発現ウイルスベクターを接種したものでは４０秒以上ものることができた）。接種２ヶ月後に定速５回転でロータロッド試験を６回行ったところ、何も接種していないマウスとＧＦＰ発現レンチウイルスベクターを接種したマウスでは、何度行ってもロッドが回転するとすぐに落ちたのに対し、ＣＲＡＧ発現レンチウイルスベクターを接種したマウスでは、回数を重ねるごとに乗っていられる時間が長くなった（図１０Ｅ）。このことはＣＲＡＧやＶＣＰ（Ｃ５２２Ｔ）発現により小脳が司る運動学習機能も回復したことを示している。
ウイルスベクター接種２ヶ月後にｂ  ｌｉｎｅマウスを灌流固定し小脳切片を作製した。小脳切片は抗ＨＡタグ抗体（図１１Ａ，Ｃ，Ｅ）、と抗カルビンディン抗体を用いて二重免疫組織染色した（図１１Ｂ，Ｄ，Ｅ）。何も発現していない切片ではプルキンエ細胞層は大きく乱れ、細胞内部にａｔａｘｉｎ−３を含む封入体を認めた（図１１Ａ，Ｂ）。これに対し、ＣＲＡＧやＶＣＰ（Ｃ５２２Ｔ）発現させた切片では大部分の封入体が消失し、プルキンエ細胞層も１〜２層と野生型に近い状態であった（図１１Ｃ−Ｆ）。小脳皮質における封入体の数（図１１Ｇ）、小脳皮質分子層の厚さ（図１１Ｈ）を測定したところ、ＣＲＡＧやＶＣＰ（Ｃ５２２Ｔ）発現させた切片で封入体の数の有意な減少と分子層の厚さの有意な増大を認めた。
実施例８：
図１２に示されるように、従来のＬ７プロモーター（Ｌ７−１）を基に、種々の縮小型Ｌ７プロモーター（Ｌ７−２，Ｌ７−３，Ｌ７−４，Ｌ７−５，Ｌ７−６，Ｌ７−７）を作製し、レンチウイルスベクターを用いて、この縮小型プロモーター制御下でＧＦＰを発現させ、プルキンエ細胞選択性をＣＭＶプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、あるいは従来のＬ７プロモーター（Ｌ７−１）の場合と比較した。なお、Ｌ７−１〜Ｌ７−７の配列をそれぞれ配列表の配列番号１〜７に示す。
＜方法＞
（１）ウイルスの産生
以下の操作を、Ｐ２実験室で行なった。ウイルス産生には、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を用いた。培養液は通常用いられている、１０％ウシ血清を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）を使用した。対数増殖期のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（Ｍｇ２＋とＣａ２＋とを含有しない）［ＰＢＳ（−）］に分散させ、ついで、１０ｃｍディッシュ（ファルコン社製）あたり５×１０５細胞となるように播種した。播種後の１０ｃｍディッシュに、１０重量％ウシ胎仔血清含有Ｄ−ＭＥＭ１０ｍｌを添加し、その後、細胞を、５体積％ＣＯ２，３７℃で培養した。２４時間後、前記ディッシュ中の培養液を、新しい培養液（１０重量％ウシ胎仔血清含有Ｄ−ＭＥＭ）１０ｍｌと交換した。その後、細胞を、５体積％ＣＯ２，３７℃で０．５時間培養した。
一方、ｐＣＡＧｋＧＰ１Ｒ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）６μｇ，ｐＣＡＧ４ＲＴＲ２（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）２μｇ，ｐＣＡＧ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）２μｇ，ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７−Ｘ−ＧＦＰ又はｐＣＬ２０ｃ  ＭＳＣＶ−ＧＦＰ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ／Ｇｅｏｒｇｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）１０μｇそれぞれを４５０μｌ滅菌水に溶解させ、プラスミド溶液を得た。
・ｐＣＡＧｋＧＰ１Ｒ：ｇａｇ（ウイルスの構造蛋白質をコード）とｐｏｌ（逆転写酵素をコード）を含むパッケージングプラスミド。
・ｐＣＡＧ４ＲＴＲ２：ｔａｔ（転写調節遺伝子）を含むプラスミド。ｒｅｖを削除してあるため、ウイルス粒子は宿主内で複製することができない。
・ｐＣＡＧＳ−ＶＳＶＧ：ＶＳＶＧはＶｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎの略。レンチウイルスの本来のＥｎｖｅｌｏｐｅではＣＤ４陽性細胞にしか感染できない。これを細胞膜の構成成分であるリン脂質（フォスファチジルセリン）をターゲットとするＶＳＶのＥｎｖｅｌｏｐｅに置換することで、神経を含むさまざまな細胞に感染することが可能となる。
・ｐＣＬ２０ｃ  ＭＳＣＶ−ＧＦＰ：レンチウイルスのメインベクターｐＣＬ２０ｃのプロモーターをＭＳＣＶプロモーターに置換し、２つのＬＴＲ内にＧＦＰを連結させたプラスミド（図１）。
・ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７−Ｘ−ＧＦＰ：レンチウイルスのメインベクターｐＣＬ２０ｃのプロモーターをＬ７プロモータ（Ｌ７−１）又はその縮小型（Ｌ７−２〜７）に置換し、２つのＬＴＲ内にＧＦＰを連結させたプラスミド（図１３にｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７−４−ＧＦＰの構造を、またその全配列を配列表の配列番号８に示す）。
得られたプラスミド溶液に２．５Ｍ  ＣａＣｌ２  ５０μｌを添加して攪拌し、２ｘＨＢＳＳ〔組成：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．０５）〕５００μｌを添加し、すばやく攪拌した。
前記ディッシュにプラスミド溶液を均等に滴下し、穩やかにディッシュ内の培地と混合した。その後、細胞を、５体積％ＣＯ２，３５℃で培養した。以下、バイオハザード対策用安全キャビネットの中で操作を行なった。
１６時間後、前記ディッシュ中の培地を、新しい培地（１０重量％ウシ胎仔血清含有Ｄ−ＭＥＭ）１０ｍｌと交換した。さらに細胞を、５体積％ＣＯ２，３７℃で培養しトランスフェクション後から４０時間でウイルスを含む培養液を回収した（４０ｈ  ｖｉｒｕｓ）。
（２）濃縮
前記（１）で回収した培地は、それぞれ５０ｍｌ遠心管に移し、１０００ｒｐｍ（１２０×ｇ）、４分間遠心分離して、上清を得た。得られた上清を、フィルター（ミリポア社製、０．２２μｍ径）に通した。得られた濾液を、ベックマン社製ローターＳＷ２８．１を用いた超遠心分離（２５，０００ｒｐｍ，２時間、４℃）に供してウイルス粒子を沈殿させ、上清を除去した。
得られたウイルス粒子沈殿物をＰＢＳ（−）に懸濁し、最終量を２００μｌとし、感染用ウイルス液を得た。なお、すぐに使用しないウイルス液を、２０μｌずつ分注し、−８０℃で保存した。
（３）ウイルス力価の測定
培養細胞（ＨｅＬａ細胞）のゲノムに組み込まれるプロウイルスのコピー数によって評価した（Ｉｚｏｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｊａｎ；５４（１）：５４−９．）。ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍディッシュで培養し、播種２４時間後にウイルス液を感染させる。感染３日後に５．０ｘ１０６個の細胞を得た。これと平行して同数のＬＡＶ−８Ｅ５細胞（ＡＴＣＣ社，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を得た。ＬＡＶ−８Ｅ５細胞は１細胞にＨＩＶ１型のプロウイルスを１コピー持っており、これをスタンダードとした。これらの細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、最終的に１００μｌのＴＥバッファーに溶解した。このうち１μｌを用い、ＨＩＶプロウイルスのＲＲＥ（ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に含まれる２９０ベースペアの領域を、以下のプライマーを用いて増幅した：
５’−ＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＡ−３’（配列番号９）
５’−ＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＴＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴ−３’（配列番号１０）。
ゲノムに組み込まれるコピー数はゲノムＤＮＡを段階希釈して求めた。すなわち、バンドが現れなくなる直前の希釈倍率を決定し、ＬＡＶ−８Ｅ５細胞を用いたスタンダードと比較することで、５．０ｘ１０６個のＨｅＬａ細胞あたり何個のプロウイルスが組み込まれているか（ゲノムコピー数／ウイルス液１ｍｌ）を決定した。
（４）培養小脳プルキンエ細胞への遺伝子導入実験
胎生２０あるいは２１日のウイスターラットの小脳を用いて、１２ウエルディッシュに以下の手順で培養した。１．０ｘ１０７個／ｍｌの密度の小脳細胞懸濁液を１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ／Ｆ１２で作製した。予めｐｏｌｙ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅでコーティングした直径１３ｍｍのプラスチックカバースリップ（住友ベークライト社製、Ｓｕｍｉｌｏｎ  ＭＳ−８００６０）の上に、懸濁液を１ウェルあたり２０ｍｌ使用し（細胞２０万個分）、直径約６ｍｍになるように薄く伸ばした。その後、５％ＣＯ２、３７℃に保たれた加湿培養機の中に２時間静置した。細胞がカバースリップに貼りついた後、上清を吸引除去し３７℃に温めた培養液（以下の成分）を８００ｍｌずつ加えた。培養液の成分：ＤＭＥＭ−ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（シグマ社製）＋ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ（１０ｍｇ／ｍｌ）、ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（１００ｍｇ／ｍｌ）、ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（５ｍｇ／ｍｌ）、ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（２００ｍｇ／ｍｌ）、ｈｕｍａｎ  ａｐｏｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ（１００ｍｇ／ｍｌ）、ｐｒｏｓｔｅｇｅｒｏｎｅ（４０ｎＭ）、ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ（１００ｎＭ）、ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ（３０ｎＭ）、ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（０．５ｎｇ／ｍｌ）。次に２−４ｘ１０５ゲノムコピー／ｍｌの力価のウイルス液を１ｍｌ加えて感染させた。翌日（２４時間後）に最終濃度が１％になるようにＦＢＳを加えた。
１４日後に培養細胞のＧＦＰ蛍光写真を撮像し、４０個のプルキンエ細胞を無作為に選んで、その蛍光強度の平均を測定した。ＣＭＶプロモーターを使用した場合の平均ＧＦＰ蛍光強度を１００％として評価した。
（５）マウス小脳クモ膜下腔へのベクターの接種
マウス（ＳＬＣ供給、４〜１０週齢）に、ペントバルビタール（商品名：ネンブタール）を、腹腔内投与（４０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）にて麻酔し、以下の操作を、バイオハザード対策用安全キャビネットの中で行なった。
麻酔後、マウスを、小動物固定装置〔ナリシゲ社製、商品名：ＳＧ−４〕を用いて固定した。また、体温コントローラー〔ＦＳＴ社製、商品名：体温コントロールシステム（マウス用）ＦＳＴ−ＨＰＳＭ〕にて、マウス体温を３７℃となるように維持した。マウスの頭部の毛を刈った後、Ｂｒｅｇｍａより数ミリ吻側から小脳直上にかけて皮膚を切開した。ついで、実体顕微鏡（ニコン社製、商品名１ＳＭＺ６４５）下で、Ｂｒｅｇｍａより５〜７ｍｍ尾側の正中部の頭蓋骨に、マイクロドリル〔浦和工業社製、商品名：パワーコントローラーＵＣ１００＋ＨＢ１（ドリル）〕を用いて、内径２〜３ｍｍの穴を開けた。また、注射針を用いて、骨の下の硬膜及びクモ膜に穴を開けた。
得られたレンチウイルスベクターを、商品名：レックスフィルマイクロシリンジ（ＷＰＩ社製、１０μｌ容量）に充填し、フレックスフィルマイクロシリンジをマイクロマニピュレーターに取りつけたウルトラマイクロポンプ２（ＷＰＩ社製）にセットした。
マイクロシリンジの針先を小脳直上に開けた硬膜の穴より約０．５ｍｍ刺入し、クモ膜下腔に留置後、得られたレンチウイルスベクターを、ウルトラマイクロポンプ２専用デジタルコントローラーＭｉｃｒｏ４（商品名、ＷＰＩ社製）を用いて、１００ｎｌ／分の速度で４０分間、計４μＩ注入した。
注入後、切開したマウスの皮膚を、縫合糸付き眼科用微小針（夏目製作所社製、商品名．眼科用弱弩針Ｃ６７−０）で縫合した。その後、固定装置からマウスをはずし、ヒーティングパッド（昭和精機工業社製、商品名：ゴムマットヒーターＳＧ−１５）上に置いたケージ（安全キャビネット内）で観察した。マウスが、麻酔から覚醒した後、マウスケージをＨＥＰＡフィルター付の感染動物用ラック（トキワ科学器械株式会社製、商品名：バイオクリーンガプセルユニットＴ−ＢＣＣ−Ｍ４）内で飼育した。
接種後７日目のマウスについて、４％ホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で灌流固定後、脳を摘出した。蛍光実体顕微鏡を用いて脳全体の写真とＧＦＰの蛍光写真を撮影後、厚さ５０μｍ、あるいは１００μｍの小脳矢状断切片をマイクロスライサー（堂阪イーエム社製  商品名：ＤＴＫ−１０００）を用いて作製した。作製された脳切片を、一次抗体［Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ（星状細胞、籠細胞のマーカー）：ＳＩＧＭＡ社製、あるいはＭｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＧＦＡＰ（グリア細胞のマーカー）：ケミコン社製、あるいはＭｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮｅｕＮ、顆粒細胞のマーカー）：ケミコン社製、あるいはｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｍＧｌｕＲ２（ゴルジ細胞のマーカー）：生理学研究所重本隆一教授より譲り受け）と共に２４時間室温でインキュベーションし、ついで、二次抗体（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５６８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で２時間、室温でインキュベーションし、顕微鏡用標本を得た。その後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製商品名：ＤＭＩ  ６０００Ｂ）及び共焦点顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製  商品名：ＬＳＭ５  Ｐａｓｃａｌ）で標本の観察を行なうことにより発現ＧＦＰ蛋白質の局在と発現細胞の種類を調べた。
＜結果＞
図１４は、培養小脳神経細胞に、レンチウイルスベクターを用いて各種プロモーター制御下でＧＦＰを発現させたときの導入率（発現割合）を示す。（ａ）は、全ＧＦＰ発現細胞中のプルキンエ細胞の割合：ＧＦＰ発現プルキンエ細胞数／ＧＦＰ発現細胞数を示す。ＣＭＶプロモーターやＭＳＣＶプロモーターを用いた場合、ＧＦＰ発現細胞のほとんどがプルキンエ細胞以外であるのに対し、Ｌ７−１〜Ｌ７−４ではプルキンエ細胞にしか遺伝子発現が起こらなかった。Ｌ７−５、Ｌ７−６ではＧＦＰ発現細胞が存在しなかった。Ｌ７−７ではプルキンエ細胞に対する特異性が低下し、ＧＦＰ発現細胞の約半分はプルキンエ細胞以外であった。（ｂ）は、全プルキンエ細胞中のＧＦＰ発現プルキンエ細胞の割合：ＧＦＰ発現プルキンエ細胞数／全プルキンエ細胞数を示す。ＣＭＶプロモーターでは全プルキンエ細胞の約５分の１、Ｌ７−１では約３分の１のプルキンエ細胞にしかＧＦＰ発現が見られない。これに対し、Ｌ７−４ではほぼ１００％、すなわち存在するすべてのプルキンエ細胞にＧＦＰが発現している。少なくとも４回の独立した小脳神経細胞培養標本を用いた結果の平均を示している。また使用したウイルスベクターはほぼ同じ力価（２−４ｘ１０５ゲノムコピー／ｍｌ）のものを用いている。
図１５は、培養小脳プルキンエ細胞に、レンチウイルスベクターを用いて各種プロモーター制御下でＧＦＰを発現させたときの蛍光強度（ａ）を示す。４０個のプルキンエ細胞を無作為に選び、冷却ＣＣＤカメラで蛍光画像を取り込んだ後、その蛍光強度をＩＰＬａｂイメージングソフトウェアー（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ社製）を用いて測定した。（ｂ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＣＭＶプロモーター制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを、さまざまなＭＯＩで感染させたときのＧＦＰ蛍光強度を示すグラフである。無作為に４０個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を選び、その蛍光強度をＩＰＬａｂイメージングソフトウェアーを用いて測定した。ＭＯＩ１０から１０００にかけて、蛍光強度はＭＯＩの対数にほぼ比例した。
図１６は、培養小脳プルキンエ細胞に、レンチウイルスベクターを用いてＭＳＣＶプロモーター、従来のＬ７プロモーター（Ｌ７−１）あるいはその縮小型プロモーター（Ｌ７−２，Ｌ７−４，Ｌ７−５，Ｌ７−７）制御下でＧＦＰを発現させた結果を示す。左のパネルは、プルキンエ細胞特異的な抗カルビンディン抗体を用いた蛍光免疫染色写真を示す。ただしＭＳＣＶプロモーターを用いた場合（左上）のみ、抗カルビンディン抗体に加えて顆粒細胞特異的な抗ＮｅｕＮ抗体も用いて染色した（プルキンエ細胞と顆粒細胞が赤く見える）。中央のパネルはそれぞれのウイルスベクターによって発現したＧＦＰの蛍光写真を示す。右のパネルは左と中央のパネルを重ね合わせたもの（Ｏｖｅｒｌａｙ）である。ＭＳＣＶプロモーターを用いた場合は、プルキンエ細胞、顆粒細胞に加えてグリア細胞（矢印）や顆粒細胞とプルキンエ細胞の中間サイズの細胞体を持つ細胞（矢頭）にもＧＦＰの発現が見られた。これに対し、Ｌ７−１、Ｌ７−２、Ｌ７−４ではプルキンエ細胞のみにＧＦＰの発現が見られた。特に、Ｌ７−４では存在するすべてのプルキンエ細胞にＧＦＰが発現し、さらにＧＦＰの発現も強く、プロモーター活性が従来のＬ７−１より顕著に高いことが確認された。
図１５は、各種プロモーターを組み込んだレンチウイルスベクターによるマウス小脳への遺伝子発現実験の結果を示す。（ａ−ｄ）は、レンチウイルスベクターを用いて、従来のＬ７プロモーター（Ｌ７−１）制御下でＧＦＰを発現させたときのＧＦＰの蛍光写真である（力価：３．７ｘ１０５ゲノムコピー／ｍｌ）。（ｃ），（ｄ）は、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫染色した写真（これにより蛍光は増強する）である。（ｅ−ｈ）は、従来のＬ７−１プロモーターの代わりに、Ｌ７−４を持つレンチウイルスベクター（力価：２．４ｘ１０５ゲノムコピー／ｍｌ）を用いた場合の小脳プルキンエ細胞のＧＦＰ蛍光写真である。ほぼ同じ力価（ほぼ同じ数のプロウイルスを染色体に導入する）を用いているにもかかわらず、Ｌ７−４を用いた場合には、Ｌ７−１を用いた場合に比較して、ＧＦＰを発現するプルキンエ細胞の数、ＧＦＰ発現量が顕著に高いことが確認された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、小脳プルキンエ細胞に高い選択性を有するベクターを、血清を使用することなく作製することができる。本発明のベクターは、小脳が司る運動学習や協調運動の分子レベルでのメカニズム解明、及び脊髄小脳変性症等のプルキンエ細胞障害性疾患の遺伝子治療など、神経科学分野において基礎研究から臨床応用まで幅広く利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１−Ｌ７−１
配列番号２−Ｌ７−２
配列番号３−Ｌ７−３
配列番号４−Ｌ７−４
配列番号５−Ｌ７−５
配列番号６−Ｌ７−６
配列番号７−Ｌ７−７
配列番号８−ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７−４−ＧＦＰ
配列番号９−人工配列の説明：プライマー
配列番号１０−人工配列の説明：プライマー
［配列表］
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【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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